Jelaskan Imunoafinitas dari Kromatografi afinitas

Kegunaan lain prosedur ini adalah pemurnian afinitas antibodi dari serum darah. Jika serum diketahui mengandung antibodi terhadap antigen tertentu (misalnya jika serum dari organisme yang imun terhadap antigen yang akan dianalisis), maka serum tersebut dapat digunakan untuk pemurnian afinitas dari antigen tersebut. Ini dikenal juga sebagai Kromatografi Imunoafinitas. Sebagai contoh, jika suatu organisme imun terhadap protein GST-fusi, maka ia akan memproduksi antibodi yang melawan protein-fusi, dan kemungkinan antibodi tersebut melawan pula GST yang terlabel pada protein-fusi. Protein dapat berikatan secara kovalen pada penyangga padat seperti agarosa dan digunakan sebagai ligan afinitas dalam pemurnian antibodi dari serum imunitas.

Protein GST dan protein fusi-GST dapat dipisahkan secara sempurna. Serum pertama kali diikatkan dengan matriks afinitas GST. Ini akan menghilangkan antibodi yang melawan bagian GST dari protein fusi. Serum kemudian dipisahkan dari penyangga padat dan dibiarkan berikatan dengan matriks protein fusi-GST. Ini menyebabkan semua antibodi yang mengenali antigen untuk tertangkap pada penyangga padat. Elusi antibodi yang diinginkan biasanya dapat dilakukan menggunakan larutan dapar ber-pH rendah seperti glisin pH 2,8. Eluat dikumpulkan ke dalam larutan dapar tris atau fosfat untuk menetralkan eluen dapar ber pH rendah, dan menahan degradasi aktivitas antibodi. Ini merupakan contoh baik penggunakan pemurnian afinitas untuk memurnikan protein fusi-GST, untuk menghilangkan antibodi anti-GST dari dalam serum, dan memurnikan antibodi yang diinginkan.

Strategi yang lebih sederhana sering kali dilakukan untuk memurnikan antibodi yang terbentuk akibat perlawanan antigen peptida. Ketika antigen peptida diproduksi secara sintetis, residu sistein terminal ditambahkan di terminal N- atau C- dari peptida tersebut. Residu sistein mengandung gugus fungsi sulfhidril yang memungkinkan peptida dengan mudah berkonjugasi dengan suatu protein pembawa (misal: Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH)). Peptida dengan kandungan sistein yang sama juga diimobilisasi pada resin agarosa melalui residu sistein dan kemudian digunakan untuk memurnikan antibodi.

Kebanyakan antibodi monoklon telah dimurnikan menggunakan kromatografi afinitas di atas fasa diam imunoglobulin-spesifik Protein A atau Protein G, yang diturunkan dari bakteri.

Kromatografi afinitas ion logam imobilisasi

Kromatografi afinitas ion logam imobilisasi (En: Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC) berdasarkan pada ikatan kovalen koordinasi spesifik dari asam amino, terutama histidin, terhadap logam. Cara kerja teknik ini adalah membiarkan protein berafinitas dengan ion logam yang akan diretensi dalam kolom yang mengandung ion logam imobilisasi, seperti kobal, nikel, tembaga, untuk memurnikan protein atau peptida yang mengandung histidin, besi, seng atau galium untuk pemurnian protein atau peptida terfosforilasi. Sebagian besar protein alami tidak mempunyai afinitas dengan ion logam, oleh karenanya teknologi DNA rekombinan dapat digunakan untuk mengintrodusir label protein semacam ini ke dalam gen yang sesuai. Metode yang digunakan untuk mengelusi protein yang diinginkan meliputi perubahan pH, atau penambahan molekul kompetitor, misalnya imidazola.