Jelaskan Perhitungan resolusi kromatogram dari Kromatografi kolom

Ada juga kromatografi kolom yang dilengkapi dengan pompa peristaltik, mengalirkan dapar dan larutan sampel melalui bagian atas kolom. Larutan dan dapar mengalir melalui kolom hingga mencapai pengumpul fraksi di bagian akhir kolom untuk mengumpulkan sampel yang terelusi. Sebelum mencapai pengumpul sampel, sampel yang dielusi dari kolom melewati suatu detektor seperti spektrofotometer atau spektrometer massa sehingga konsentrasi sampel yang sudah dipisahkan dalam campuran dapat ditentukan.

Sebagai contoh, jika kita ingin memisahkan dua protein yang berbeda dengan kapasitas ikatan terhadap kolom yang berbeda dari suatu larutan, jenis detektor yang baik adalah spektrofotometer dengan panjang gelombang 280 nm. Semakin tinggi konsentrasi protein yang melalui kolom, semakin besar absorbansinya pada panjang gelombang tersebut.

Oleh karena kromatografi kolom mempunyai aliran tetap untuk semua eluat yang melalui detektor dengan berbagai macam konsentrasi, harus dibuat plot dari detektor antara konsentrasi sampel terelusi melawan waktu. Plot konsentrasi sampel versus waktu ini disebut dengan kromatogram.

Tujuan utama kromatografi adalah untuk memisahkan komponen yang berbeda dari suatu campuran larutan. Resolusi menyatakan daya pemisahan antar komponen dalam campuran. Semakin tinggi resolusi kromatogram, semakin baik pemisahan sampel yang dihasilkan oleh kolom. Data ini adalah cara terbaik menentukan sifat pemisahan kolom untuk sampel tertentu. Resolusi dapat dihitung dari kromatogram.

Kurva terpisah dalam diagram mewakili profil konsentrasi elusi sampel yang berbeda selama proses, berdasarkan afinitasnya terhadap resin kolom. Untuk menghitung resolusi, diperlukan waktu retensi dan lebar kurva.

Waktu retensi: waktu dari awal sinyal terdeteksi oleh detektor hingga titik puncak profil konsentrasi elusi masing-masing sampel yang berbeda.

Lebar kurva: lebar kurva profil konsentrasi sampel yang berbeda dalam kromatogram dalam satuan waktu.

Metode yang sudah disederhanakan dalam menghitung resolusi kromatogram adalah menggunakan model pelat. Model pelat berasumsi bahwa kolom dapat dibagi menjadi sejumlah seksi tertentu, atau pelat, dan kesetimbangan massa dapat dihitung untuk masing-masing pelat tunggal. Pendekatan ini memperkirakan kurva kromatogram sebagai kurva distribusi Gaussian. Dengan melakukan ini, lebar kurva diperkirakan 4 kali standar deviasi kurva, 4σ. Waktu retensi adalah waktu dari awal deteksi sinyal hingga waktu di titik puncak kurva Gaussian.

Dari variabel dalam gambar di atas, resolusi, jumlah pelat, dan tinggi pelat model pelat kolom dapat dihitung menggunakan persamaan: