Gw mau tau Gen Pengatur Kemampuan Remediasi dari Fitoremediasi Merkuri

Gen yang mengatur kemampuan organisme dalam melakukan fitoremediasi bagi lingkungan adalah kompleks gen rekombinan merA, merB, merC. Kompleks gen ini secara spesifik berperan menguraikan atau meremediasi cemaran logam merkuri. Gen merA mengkodekan ion merkuri reduktase yang berperan menguraikan dan mendetoksifikasi bentuk asli logam merkuri menjadi bentuk elementalnya, dengan reaksi sebagai berikut.

Gambar 1 Reaksi gen merA

Gen merB sebenarnya adalah gen milik bakteri yang mengkode organomercurial lyase berperan memotong (cleaved) merkuri organik alami menjadi bentuk metana dan ion merkuri. Dengan kata lain, membuat merkuri alami, menjadi less toxic .

Gambar 2 Reaksi gen merB

Gen merC terdapat pada organel sel tumbuhan. Gen ini memiliki peran yang sangat signifikan, terutama dalam proses transporter merkuri. Gen ini membantu mengubah merkuri yang toksik maksimum menjadi less toxic .

Gambar 3 Reaksi gen merC.

Jenis tanaman, gen, tempat ekspresi, dan tingkat resistensi

Beberapa jenis tanaman sudah digunakan untuk penelitian fitoremediasi ini, antara lain Arabidopsis thaliana, yaitu tanaman dari famili Brassicaceae. Tanaman ini sering digunakan sebagai media ekspresi gen dalam teknologi rekayasa tanaman. Proses rekayasa pada tumbuhan ini dilakukan dengan menyisipkan gen merA dan diekspresikan secara spesifik pada bagian akar. A. thaliana ini memiliki tingkat resistensi mencapai 80 μM HHgCl2. Gen merA banyak diaplikasikan secara spesifik untuk berekspresi di bagian akar, karena akar adalah bagian tumbuhan yang paling rentan terhadap cemaran logam merkuri. Tanaman lain yang digunakan sebagai media ekspresi adalah padi (Oryza sativa). Tanaman padi juga disisipkan gen merA sebagai perkembangan tumbuhan dan memiliki resistensi mencapai 250 μM HgCl2 untuk tanaman rekombinasi dan untuk tipe liar memiliki resistensi hanya 150 μM HgCl2. Tumbuhan lain ada Spartina alterniflora atau tanaman rumput-rumputan yang resisten hingga 500 μM HgCl2 ketika sudah direkayasa. Ada pula tanaman Chlorella sejenis mikro alga yang memiliki resistensi 40 μM HgCl2 setelah disisipkan merA.

Secara umum, gen merA mampu memproteksi tanaman, namun tidak dalam pencemaran skala besar dan high toxicity mercury. Tanaman membutuhkan kombinasi kerja gen merA dan merB untuk melindungi sel dari logam merkuri organik, karena bentuk organik merkuri lebih berbahaya daripada bentuk inorganiknya. Ketika gen merB ini disisipkan ke genom inti sel tanaman A. thaliana resistensinya meningkat sebanyak 1 μM PMA (phenylmercuric acetate). Namun, ketika tanaman ini dikombinasikan gen merA dan merB resistensinya mengkat sebanyak 5 μM PMA. Lokasi ekpresi dari gen-gen tersebut berada di retikulum endoplasma dan dinding sel untuk gen merB. Sedangkan kombinasi 2 gen tersebut terekspresi di sitoplasma.

Rekombinasi gen merA dan merB pada genom kloroplas

Aktivitas reaksi redoks yang dikatalisis oleh ekspresi gen merA dan merB membutuhkan ketersediaan nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) dalam jumlah yang banyak sebagaidonor elektron. NADPH dihasilkan oleh reaksi yang terjadi dalam kloroplas, yaitu fotosistem 1. Kebutuhan akan NADPH yang tinggi menyebabkan kebergantungan enzim (MerA) terhadap keberadaan kloroplas. Senyawa organomerkuri (senyawa

organik yang mengandung merkuri) bersifat sangat toksik bagi kloroplas. Oleh sebab itu, modifikasi genetik pada genom kloroplas diperlukan agar tercipta kondisi yang mendukung fungsi kerja enzim untuk mendetoksifikasi merkuri yang disandikan oleh gen merA dan merB.

Untuk mendapatkan tingkat resistensi yang lebih tinggi (> 5–10 </span>μM PMA), kloroplas memerlukan proteksi terhadap toksik merkuri, karena kloroplas merupakan target utama racun Hg. Toksik merkuri dapat menginhibisi kinerja kloroplas, seperti transpor elektron, reaksi Hill, fotofosforilasi, fotosintesis, metabolisme sulfur atau nitrogen, dan sintesis pati, asam amino, asam lemak, pigmen, serta vitamin.

Rekombinasi genetik kloroplas keuntungan, yaitu dapat dikembangakan pada tanaman transgenik yang membutuhkan ekspresi multiple gen untuk meningkatkan

efektivitas fitoremediasi. Dengan transformasi kloroplas, beberapa jalur biosintesis dapat dikembangkan dalam satu transformasi, tanpa membutuhkan backcross dengan galur tertentu. Keuntungan lainnya adalah mampu menutupi kekurangan dari transformasi inti, seperti gene silencing dan efek posisi. Tingkat ekspresi gen yang tinggi dapat diperoleh karena setiap sel tanaman transgenik memiliki lebih dari 10.000 kopi gen.

Di samping beberapa keuntungan yang telah disebutkan, ada beberapa kekurangan pada metode transformasi kloroplas, yaitu membutuhkan vektor spesifik spesies, sehingga sekuens genom kloroplas perlu diketahui, khususnya pada bagian intergenic spacer dan endogenous

regulatory sequences (promotor, 5′UTR, 3′UTR), untuk merancang vektor spesifik spesies. Kekurangan lainnya adalah homoplasmy

(integrasi gen ke dalam setiap genom kloroplas dan mengeliminasi genome kloroplas nontransforman). Fitoremediasi melalui genom kloroplas berlangsung dengan baik, karena merkuri, khususnya dalam bentuk organik, ditargetkan pada kloroplas. Merkuri ion reduktase berfungsi dengan baik di dalam kloroplas karena NADPH yang berlimpah. Keberhasilan fitoremediasi juga ditandai melalui efisiensi volatilitas Hg0, yang disebabkan oleh aktivitas merkuri ion redukase dan organomerkuri li<span lang="DE">ase pada kloroplas transgenik.

Konstruksi vektor kloroplas yang terdiri dari gen merA dan merB

<span lang="DE">Gen merA dan merB, yang berasal dari bakteri, diklon pada vektor transformasi kloroplas. Dengan vektor ini, gen yang akan

ditransformasi dapat berintegrasi secara site-specific pada situs pengulangan genom kloroplas, di antara trnI dan trnA. Promotor konstitutif Prrn, mengatur proses transkripsi pada downstream, termasuk aadA (gen aminoglycoside 3′- adenylyltransferase) yang menyandikan gen resistensi spectinomycin, dan operon merAB.

Ada dua metode pembuatan vektor transformasi kloroplas. Pada metode pertama, 3′untranslated region (3′UTR) dari gen pssbA kloroplas diinsersi pada downstream operon merAB, sehingga proses transkripsi berlangsung dengan stabil. Pada metode kedua, vektor tidak memiliki psbA 3′UTR. Vektor yang digunakan adalah pLDR-MerAB-3′UTR dan pLDR-MerAB.

Efek ekspresi merA dan merB terhadap pertumbuhan dan toleransi merkuri

Hg organik merupakan logam yang sangat toksik karena sifatnya yang hidrofobik sehingga memfasilitasi pergerakannya melalui membran dan akumulasinya pada membran yang terikat organel. Hal ini menghambat proses oksidasi dan fotosintesis pada tanaman karena akumulasinya dapat mengganggu reaksi transport elektron, evolusi oksigen, fotofosforilasi, reaksi Hill, dan fluoresensi klorofil. Hg dalam bentuk ion juga dapat merusak membran transporter seperti aquaporin sehingga mengganggu transportasi air dan nutrisi pada tanaman. Semua ini dapat menghambat pertumbuhan tanaman dan akhirnya menyebabkan kematian. Rekayasa genetik dengan gen merA (mercuric ion reductase) dan merB (organomercurial lyase) menyebabkan tanaman dapat mentoleransi kadar Hg yang tinggi dan memiliki pertumbuhan yang lebih baik. Hal ini dikarenakan, organomercurial lyase memiliki aktivitas protonolisis untuk mengubah Hg organik (bentuk yang sangat berbahya) menjadi Hg2+, sedangkan mercuric ion reductase

memiliki aktivitas untuk mengubah Hg2+ menjadi Hg0 yang kemudian menguap dari tanaman.

Rekayasa merAB melalui genom inti

Berbagai studi fitoremediasi memanfaatkan gen merA atau merB untuk memodifikasi tanaman melalui genom inti. Gen merA mengkodekan merkurik ion reduktase yang berperan dalam detoksifikasi merkuri (Hg2+ menjadi Hg0, yang akan diuapkan dari tanaman), sementara merB merupakan gen yang berperan untuk memotong merkuri organik menjadi bentuk yang kurang toksik seperti metan dan merkuri ionik. Penggunaan merA pada awalnya menemui beberapa kegagalan karena gen tersebut gagal mengekspresikan merkurik ion reduktase, seperti yang diujicobakan pada A. thaliana. Penggunaan merB pada tanaman serupa, resistensi terhadap merkuri meningkat sebanyak 1 µM fenilmerkurik asetat (PMA), yang berarti sangat rendah. Penggunaan merA dan merB secara bersamaan atau dengan rekombinasi menyebabkan resistensi pada A. thaliana transgenik meningkat hingga 5 µM PMA dan 10 µM CH3Hg, yang berarti lima kali lebih efektif daripada penggunaan merB saja.

Akumulasi Total Merkuri dan Volatilisasi Merkuri

Tanaman tembakau yang belum ditransformasi memiliki kemampuan untuk mengakumulasi merkuri hingga konsentrasi 500 µg/g dan terkena efek samping berupa penurunan pertumbuhan secara signifikan. Namun tanaman tembakau hasil transformasi mampu mengakumulasi merkuri pada jaringan akar hingga konsentrasi 2000 µg/g. Tembakau transforman ini juga dapat terus tumbuh tanpa hambatan dari sifat beracun merkuri. Kemampuan akumulasi tembakau transgenik terhadap merkuri organik lebih tinggi dibandingkan merkuri inorganik. Kemampuan akumulasi merkuri oleh tembakau transgenik juga tidak menunjukkan titik jenuh seperti pada tembakau biasa. Transfer akumulasi merkuri ke bagian tunas juga dapat dilakukan oleh tembakau transgenik secara lebih baik dibandingkan tembakau biasa yang hanya dapat mentransfer kurang dari 0.2% merkuri ke bagian tunas.

Volatilisasi merkuri adalah tahap akhir dalam jalur detoksifikasi merkuri organik. Insersi gen merA dan merB pada tembakau transgenik dapat meningkatkan volatilisasi secara signifikan. Proses volatilisasi merkuri dapat diukur dengan chamber khusus yang kedap udara. Laju volatilisasi tembakau transgenik yang diberikan merkuri organik akan mencapai puncak pada hari ke-2, namun menurun pada hari ke-5 karena proses detoksifikasi

telah berjalan sempurna. Bila diberikan merkuri inorganik, maka laju volatilisasi akan mencapai puncak pada hari ke-3, namun menuru pada hari ke-6.

Tanaman tembakau alami tidak menunjukkan proses volatilisasi yang signifikan sehingga tidak dapat diukur. Tembakau alami juga mengalami klorosis dan

kematian jaringan akibat sifat beracun merkuri, sedangkan pada tembakau transgenik terdapat ekspresi gen merA dan merB yang melindungi tanaman.