Jabarkan Metode Penelitian dari Cincalok

Penelitian ini bertujuan untuk menemukan berbagai spesies bakteri dari cincalok. Cairan dari sampel sebanyak 25 mL dicampur dengan bufer air pepton sebanyak 225 mL. Beberapa pengenceran dibuat dengan 0,1% air pepton. Sampel disebar pada agar MRS (De Man, Rogosa dan Sharpe) dan diinkubasi secara anaerob selama 48 jam pada suhu 37 oC. Koloni sel tunggal diambil dengan tusuk gigi steril dan diuji lebih lanjut. Uji morfologi, fisiologi, dan karakteristik biokimia dari isolat ditentukan dengan prosedur standar yaitu uji pewarnaan Gram, uji produksi katalase dan uji produksi gas dilakukan. Pada uji penggunaan laktosa, koloni yang dipilih diulas pada NA (Nutrient Agar) dengan penambahan laktosa dan 0.005 g/L dari ungu bromokresol sebagai indikator pH. Cawan petri diinkubasi pada suhu 30 oC selama 24 jam. Isolat yang menggunakan laktosa dan memproduksi asam akan terlihat dari perubahan warna pada media yang berwarna ungu menjadi warna kuning. Uji aktivitas katalase dilakukan dengan penambahan setetes larutan hidrogen peroksida dengan konsentrasi 30 % ke ulasan kultur. Reaksi positif didapatkan dengan gelembung udara yang muncul dari koloni yang menandakan produksi gas oksigen. Isolat bakteri asam laktat ditumbuhkan pada medium MRS broth dan diinkubasi secara anaerob selama 48 jam pada suhu 30 oC. Sel yang terdapat pada larutan kaldu dipipet ke filter kertas cakram, lalu dikeringkan selama 10 menit. Kertas cakram diletakkan pada permukaan agar yang sebelumnya telah diulas sebanyak 500 μL bakteri indikator. Uji anti bakteri dilakukan dengan 4 bakteri indikator yaitu E. coli ATCC 35215, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, dan Salmonella typhimurium. Uji ini dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali. Lalu cakram diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC dan zona inhibisi yang mengelilingi cakram diamati.

Analisis 16s dilakukan untuk mengetahui spesies bakteri yang berada pada cincalok. Dalam amplifikasi 16s digunakan primer forward pA dan primer reverse pE. Produk hasil amplifikasi dipurifikasi dengan spin column. Amplifikasi dilakukan dengan denaturasi awal pada suhu 94 oC selama 4 menit dan dengan 29 siklus denaturasi pada suhu 94 oC selama 2 menit. Penempelan primer pada suhu 55 oC selama 1 menit, dan pemanjangan (elongasi) pada suhu 72 oC. Fragmen hasil amplifikasi dikloning dengan menggunakan blunt end dari produk PCR ke vektor kloning pJET1.2 dan ditransformasikan ke E. coli dengan sel kompeten. Kemudian DNA dari isolat dianalisis dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa dengan kadar 1.0 % (b/v) dalam 1x bufer TAE (Tris-Cl Asetat EDTA) pada tegangan 90 V selama 65 menit. Lalu gel divisualisasikan dengan sistem dokumentasi gel. Untuk transforman yang berhasil, plasmid hasil rekombinasi diekstraksi kembali. Kemudian plasmid yang telah diekstraksi diverifikasi lebih lanjut dengan PCR menggunakan primer vektor yang dituju. Produk PCR hasil purifikasi juga langsung disekuensing dengan primer 16s rRNA. Sekuensing gen dianalisis dengan program BLAST di bank data NCBI GeneBank.