Jabarkan Periode Shinsengumi dari Kondō Isami

Pada tahun 1863, Keshogunan Tokugawa merekrut ronin dalam jumlah besar untuk melindungi Shogun Tokugawa Iemochi sewaktu berada di Kyoto. Kondō bergabung dengan unit yang baru dibentuk dan kemudian disebut Rōshigumi. Pada waktu itu teman dekatnya yang bernama Hijikata Toshizō juga ikut menjadi anggota Rōshigumi, ditambah anggota dan tamu Shieikan seperti Yamanami Keisuke, Okita Sōji, Harada Sanosuke, Nagakura Shinpachi, Tōdō Heisuke, dan Inoue Genzaburō. Setelah komandan de facto Kiyokawa Hachirō mengutarakan tujuan sebetulnya pembentukan Rōshigumi sebagai pendukung pihak kekaisaran, Kondō bersama Hijikata, dan Serizawa Kamo dari Mito, dan sejumlah anggota lainnya bertahan di Kyoto untuk membentuk kelompok baru bernama Mibu Rōshigumi. Berada di bawah perintah langsung keshogunan, Matsudaira Katamori dari Aizu mengawasi kelompok Mibu Rōshigumi. Di bawah lindungan Aizu yang berperan sebagai Pelindung Kyoto, mereka bekerja sebagai polisi di ibu kota kekaisaran.

Pada peristiwa Kinmon no Seihen 18 Agustus 1863, unit ini mendapat nama baru Shinsengumi. Pada bulan Juni 1864 (kalender lunar), Shinsengumi menjadi terkenal setelah berhasil membekuk sebuah sel shishi dalam peristiwa yang disebut Ikedaya Jiken.

Pada 10 Juli 1867, Kondō diangkat sebagai hatamoto bersama anggota Shinsengumi lainnya.

Perang Boshin dan meninggal dunia

Setelah Pertempuran Toba-Fushimi Januari 1868, ia kembali ke Edo, dan pangkatnya dinaikkan menjadi wakadoshiyori (wakadoshiyori-kaku 若年寄格) pada saat pemerintah Keshogunan Tokugawa mulai berantakan. Kondō bertempur melawan pasukan kekaisaran, namun kalah di Pertempuran Kōshū-Katsunuma dan di Nagareyama. Setelah menyerahkan diri, Kondō Isami dijatuhi hukuman penggal di Itabashi pada 17 Mei 1868 (25 April 1868 kalender lunar).

Menurut Tani Tateki (1837–1911) dari Domain Tosa, Kondō dieksekusi oleh pemerintah baru yang dibentuk oleh samurai asal Domain Chōshū dan Domain Satsuma. Ia dituduh sebagai pembunuh Sakamoto Ryōma. Bahkan setelah pengakuan mantan anggota Mimawarigumi, Imai Nobuo pada tahun 1870, Tani bersikeras bahwa Kondō difitnah sebagai pembunuh Sakamoto. Meskipun demikian, menurut teori yang umum diterima, otak pembunuhan gelap ini adalah Sasaki Tadasaburō dari Mimawarigumi.

Makamnya berada di beberapa tempat. Makam pertama yang dibuat untuknya di kuil Ten'nei-ji di Aizu dibangun oleh Hijikata Toshizō. Hijikata yang sedang dalam penyembuhan akibat cedera kaki di Pertempuran Utsunomiya, dan dikabarkan secara pribadi mengawasi pembangunan makam tersebut. Nama anumerta untuk Kondō, Kanten'inden'junchūseigi-daikōji (貫天院殿純忠誠義大居士) juga diberikan oleh Matsudaira Katamori.