Tolong jelaskan mengenai Prosedur dari Pyrosequencing

Pyrosequencing pada umumnya menggunakan fragmen Klenow pada DNA polimerase I yang berasal dari Escherichia coli, yang memiliki aktivitas polimerase relatif lambat. Sementara itu, ATP sulfurilase yang digunakan merupakan rekombinan yang berasal dari Saccharomyces cerevisiae dan luciferase yang digunakan berasal dari kunang-kunang Photinus pyralis. Reaksi keseluruhan dari proses polimerasi hingga deteksi cahaya membutuhkan 3-4 detik pada suhu ruang. Satu pmol DNA dalam reaksi pyrosequencing menghasilkan 6x1011 molekul ATP yang memancarkan lebih dari 6x109 foton dengan panjang gelombang 560 nm. Pancaran cahaya tersebut dapat dengan mudah dideteksi dengan kamera CCD (charge-coupled device). Berikut merupakan prosedur umum untuk analisis pyrosequencing:

DNA yang akan disekuensi dipotong menjadi fragmen-fragmen sepanjang kira-kira 100 bp.

Fragmen-fragmen DNA tersebut didenaturasi menjadi DNA untai tunggal (single-stranded DNA/ssDNA).

Tiap DNA untai tunggal tersebut ditempel pada manik-manik berukuran mikroskopis yang terpisah satu sama lainnya.

Reaksi berantai polimerase (PCR) dijalankan pada masing-masing manik-manik sehingga dari tiap manik-manik didapat kira-kira 10 juta kopi ssDNA yang identik.

Manik-manik dimasukkan ke dalam sumur-sumur mikroskopis (berjumlah kira-kira 200 ribu) yang masing-masingnya berisikan enzim, DNA polimerase untuk menambah deoksinukleotida pada DNA untai tunggal, ATP sulfurilase yang membentuk ATP dari APS dan pirofosfat (PPi), luciferase untuk katalisis luciferin menjadi oksiluciferin yang menghasilkan cahaya, dan apirase, serta substrat adenosin fosfosulfat (APS) dan luciferin.

Pada proses berjalannya sekuensi DNA, masing-masing sumur mikroskopis akan dipenuhi oleh deoksinukleotida, yaitu dTTP, dCTP, dan dGTP. dATP tidak digunakan karena memicu terjadinya reaksi luciferin, tetapi digunakan deoksiadenosin ά-tiotrifosfat (dATPάS) karena DNA polimerase tidak dapat membedakan antara dATP dengan dATPάS dan karena luciferase tidak mengenali dATPάS. Ini membuat sintesis untai komplemen DNA dari DNA untai tunggal terus berjalan.

Dalam tiap sumur terjadi penambahan nukleotida dan pelepasan pyrophosphate (PPi) secara stoikiometri. ATP sulfurilase mengubah pyrophosphate (PPi) menjadi ATP dengan adanya APS. ATP yang dihasilkan akan digunakan sebagai substrat untuk luciferase dalam menghasilkan cahaya dengan mengubah luciferin menjadi oksiluciferin.

Intensitas cahaya yang dihasilkan berbanding lurus dengan banyaknya ATP. Cahaya yang dihasilkan akan dideteksi dengan detektor dan dianalisis dengan program. Sisa nukleotida dan ATP yang tidak terpakai akan didegradasi dengan enzim apirase, dan reaksi dapat dilanjutkan dengan menambahkan nukleotida baru.