Jelaskan Prinsip dari Pyrosequencing

Metode sekuensi DNA ini bekerja berdasarkan urutan nukleotida dalam DNA dengan menggunakan prinsip sekuensi dari sintesis DNA. Teknik pyrosequencing menggunakan DNA yang diimobilisasi dalam fase solid dan diberi perlakuan dengan sistem tiga enzim. Teknik ini dilakukan dengan penambahan nukleotida yang berbeda secara berurutan kemudian cahaya yang dihasilkan dapat dideteksi untuk mengetahui di mana letak nukleotida dengan jenis tersebut berada, dilanjutkan dengan penambahan nukleotida berikutnya dan terus berulang-ulang hingga seluruh sekuen DNA terpetakan. Oleh karena itu pada teknik ini diperlukan proses pencucian di antara penambahan basa nukleotida untuk menghilangkan nukleotida pada proses sebelumnya.

Pada teknik pyrosequencing, pirofosfat inorganik yang dilepaskan dikonversikan menjadi ATP oleh ATP sulfurilase sehingga menyediakan energi bagi luciferase untuk mengoksidasi luciferin dan menghasilkan cahaya. Karena penambahan nukleotida telah diketahui jenis basanya, maka urutan cetakan DNA juga dapat ditentukan. Baik DNA maupun RNA dapat digunakan sebagai cetakan untuk pyrosequencing. Namun, DNA polimerase menunjukkan aktivitas katalitik yang lebih tinggi dibandingkan dengan RNA polimerase sehingga pada pyrosequencing lebih diutamakan penggunaan utas DNA sebagai cetakan. Secara umum, teknik ini menggunakan DNA untai tunggal yang akan disekuensi lalu mensintesis untai komplemennya dengan enzim. Aktivitas enzim DNA polimerase dalam proses sintesis untai komplemen dideteksi dengan menggunakan enzim kemiluminesens, di mana akan dihasilkan cahaya ketika penambahan nukleotida ke DNA template dan cahaya tersebut yang akan diinterpretasikan sebagai sekuen hasil.