Gw mau tau Metode dari Amplifikasi Acak Polimorfisme DNA

Metode RAPD memberikan kemudahan mereplikasi DNA yang tidak diketahui sekuensnya dan dalam konsentrasi yang kecil (nanogram) dengan primer-primer yang bersifat tidak tentu (arbitrary primers). Teknik RAPD yang umum dipakai memerlukan oligonukleotida sintesis pendek, berukuran sekitar 10 basa dari sekuens acak. Primer ini biasanya telah disiapkan dalam bentuk kit untuk analisis RAPD. Jika primer yang dipakai berukuran kurang dari 10 basa maka lebih cocok digunakan untuk menampilkan riwayat sidik jari DNA yang lebih kompleks (bidang forensik) dengan situs penempelan primer pada sekuens DNA yang lebih banyak. Perlu diperhatikan bahwa panjang primer menjadi faktor penentu berhasil tidaknya replikasi. Primer spesifik yang ideal berukuran tidak lebih panjang dari 15 bp.

Primer yang panjang akan menyebabkan peluang komplemen dengan utas DNA semakin kecil, bahkan nihil. Hal ini terjadi karena primer yang memiliki jangkauan primer reverse dan forward yang besar tidak dapat diamplifikasi karena fragmennya terlalu panjang.

Setelah dilakukan sintesis primer, tahapan selanjutnya adalah mereaksikan RAPD dalam DNA thermal cycler, yaitu suatu perangkat PCR untuk menaikkan dan menurunkan suhu dengan cepat. Reaksi ini bertujuan untuk mengamplifikasi (mereplikasi) fragmen-fragmen DNA (amplikon) dengan riwayat khusus. Amplifikasi ini meliputi 3 tahapan besar, yakni tahap denaturasi DNA 96oC selama 1 menit, tahap penempelan (annealing) 40oC selama 1 menit, dan tahap pemanjangan (ekstensi) 72oC selama 2 menit. Saat annealing, homologi sekuens antara primer dan utas DNA turut berperan menentukan keberhasilan reaksi. Tahapan-tahapan yang ada akan berulang sebanyak 40 siklus hingga diperoleh sejumlah produk amplikon yang memiliki sekuens acak.

Adanya variasi urutan nukleotida yang diakibatkan insersi atau delesi pada beberapa lokus gen nantinya akan dianggap sebagai polimorfisme yang menjadi penanda diversitas genetik suatu galur (breed). Hal ini dapat dilihat setelah divisualisasikan dengan elektroforesis gel agarosa. Keberadaan profil DNA unik antar lokus gen akan terlihat berupa pita terang setelah pewarnaan gel dengan EtBr yang dilihat di bawah pendaran sinar UV.