Jabarkan Acara tengah malam dari Conan O'Brien

Pada tanggal 25 April 1993, Lorne Michaels menyarankan O'Brien untuk ikut uji coba menjadi penerus David Letterman sebagai pembawa acara "Late Night with David Letterman", dengan Andy Richter sebagai pembantu pembawa acaranya. O'Brien melakukan audisi di studio acara "The Tonight Show" dimana ia mewawancarai Mimi Rogers dan Jason Alexander. O'Brien mendapatkan posisi tersebut. Ia kemudian mengundurkan diri dari posisinya di The Simpsons walaupun kontraknya disana masih belum habis.

Disiarkan pertama kali pada tanggal 13 September pada tahun yang sama, "Late Night with Conan O'Brien" secara umum menerima ulasan kritis yang kurang baik selama 2-3 tahun setelah debutnya tersebut. O'Brien sendiri, seseorang yang tidak dikenal publik sebelum dirinya ditunjuk sebagai pembawa acara tengah malam, dianggap oleh banyak orang tidak layak untuk acara itu. NBC bahkan menjadikan hal ini bahan olok-olokan di sebuah iklan radio yang disiarkan beberapa saat sebelum debut acara ini dimana O'Brien menceritakan sebuah cerita lucu ketika seseorang yang mengenalinya di tengah jalan berteriak, "Lihat, itu dia orang yang tidak berhak atas acaranya sendiri!". Sumber kritik lainnya adalah pada kenyataan bahwa O'Brien sendiri terlihat sangat gugup dan canggung selama hari-hari pertama acara tersebut. Untuk mengolok-olok dirinya sendiri mengenai hal ini, pembuka acara "Late Night with Conan O'Brien" dibuat sebagai animasi dan menampilkan O'Brien dalam bentuk karikatur sedang berkeringat dan membuka kerah bajunya dengan gugup.

Acara ini berada dalam status kontrak multi-mingguan selama NBC mencoba memutuskan nasibnya. Pada musim 1996-1997. Gaya penulisan dan komedi O'Brien dianggap telah semakin membaik dan dirinya mulai membangun kumpulan penggemar yang terus bertambah, terutama para pelajar SMA dan mahasiswa/i, serta bertambahnya rasa hormat dari para kritikus dan rekan-rekannya di industri yang sama. O'Brien nantinya sempat mengolok-olok tiga tahun pertama acaranya dalam episode khusus ulang tahun ke-10 acaranya. Dalam acara khusus tersebut, Mr. T tampak memberikan O'Brien sebuah kalung emas dengan sebuah angka "7" yang besar tergantung disana. Ketika O'Brien mencoba untuk memberitahu bahwa acaranya sudah disiarkan selama sepuluh tahun, Mr. T menjawab, "Aku tahu, bego ... tapi kamu baru menjadi lucu tujuh tahun terakhir!"

Semenjak saat itu, O'Brien dan tim penulis acaranya secara konsisten dinominasikan untuk menerima penghargaan Emmy Award untuk kategori Penulisan Terbaik bagi sebuah serial televisi Komedi atau Acara Hiburan lainnya, dan akhirnya memenangkannya pada tahun 2007. Pada tahun 1997, 2000, 2002, 2003, 2004 ia dan tim penulisnya memenangkan penghargaan Writers Guild Award untuk kategori Penulisan Terbaik bagi acara serial Komedi atau Acara Hiburan lainya.

Pada tahun 2001, O'Brien membentuk rumah produksi, Conaco, yang sejak itu juga menerima kredit untuk penampilan acara "Late Night with Conan O'Brien".

Pada episode pertama setelah 11 September, O'Brien tampil tidak seperti biasanya dan bercerita bahwa dirinya baru kembali lagi berdoa setelah delapan tahun berlalu semenjak ia diangkat menjadi pembawa acara tersebut. O'Brien diberitakan sangat tergoncang dengan peristiwa 11 September 2001 di New York dan berbicara mengenai kebutuhan akan iman.

Setelah bertemu dengan aktor dan sutradara Finlandia Lauri Nurkse pada tanggal 11 Oktober 2005, O'Brien menjadi tahu bahwa dirinya terkenal di Finlandia, dan kemudian memulai sebuah lelucon yang berlangsung cukup lama bahwa dirinya sangat mirip dengan wajah presiden wanita pertama negara tersebut, Tarja Halonen. Setelah beberapa bulan melakukan lelucon ini (termasuk adanya segmen "Conan O'Brien Benci Negara Saya" yang muncul berulang kali dan dukungan O'Brien atas kampanye Tarja Halonen sebagai presiden), O'Brien berkunjung ke Finlandia dan tampil di beberapa acara televisi serta bertemu dengan Presiden Halonen. Perjalanan ini direkam dan ditayangkan sebagai sebuah acara spesial.

O'Brien berseloroh mengenai sebuah situs internet fiksi "hornymanatee.com" pada tanggal 4 Desember 2006 menyusul sebuah sketsa komedi mengenai sebuah maskot Manatee fiktif dan tindak-tanduknya di depan kamera komputer yang tidak senonoh. NBC memilih untuk membeli alamat situs tersebut dengan harga 159 dollar karena situs tersebut ternyata tidak ada sebelumnya. Perusahaan televisi itu waswas kalau sampai seseorang membeli alamat situs tersebut dan menayangkan isi-isi yang tidak diinginkan oleh NBC. Kini NBC memiliki alamat situs www.hornymanatee.com untuk selama 10 tahun akibat ulah O'Brien. Menurut O'Brien, akhirnya diputuskan bahwa semenjak NBC memiliki situs tersebut, mereka lebih baik membuat situs website-nya sekaligus. O'Brien bersama tim-nya sejak itu membuat sebuah situs yang benar-benar ada yang kini telah dikunjungi oleh jutaan pengunjung, mencapai 4 juta halaman terbaca selama empat hari. Orang-orang mengirimkan karya-karya seni "horny manatee", puisi dan hal-hal lainnya. Menurut sistem posisi website Alexa, hornymanatee.com telah dikunjungi oleh lebih dari 10 juta pengunjung.

Sebuah sandiwara komedi pendek populer yang sering muncul di acara ini adalah "Pale Force", atau kekuatan pucat, sebuah serial episode animasi dimana pelawak Jim Gaffigan dan O'Brien adalah para pahlawan dengan kekuatan luar biasa yang berperang melawan kejahatan dengan "kepucatan" mereka. Setiap kali Gaffigan membuka sandiwara ini di tiap episode barunya, Conan selalu memprotes atas penggambaran dirinya yang tampil pengecut, lemah dan tidak mampu menahan diri.

Semenjak bulan Oktober 2005, "Late Night with Conan O'Brien" selama sebelas tahun berturut-turut telah menarik penonton sejumlah rata-rata 2,5 juta penonton per episodenya.

Pada tahun 2004, O'Brien ditunjuk sebagai pengganti Jay Leno saat Leno meninggalkan acara "The Tonight Show" pada tahun 2009. Leno menyatakan dalam salah satu episode acaranya bahwa ia ingin menghindari kontroversi dan perasaan tidak enak akibat terpilihnya dirinya oleh NBC sebagai pembawa acara "The Tonight Show" dan bukannya David Letterman.

Pada tahun 2008, O'Brien berpura-pura berkelahi dengan Jon Stewart dan Stephen Colbert dari stasium televisi Comedy Central mengenai siapa yang paling berhak menyatakan bahwa dirinya yang menyebabkan naiknya pamor Mike Huckabee dalam kampanyenya sebagai calon presiden dari Partai Republik Amerika Serikat. Perkelahian ini berlangsung di tiga acara televisi dan dua stasiun televisi.

Pada tanggal 13 Juni 2008, O'Brien hanya berjalan lalu saja pada saat pembukaan acaranya dan tidak melakukan hal-hal yang penuh semangat seperti biasanya. Ia terlihat sangat terganggu secara emosi saat mengumumkan kepada para penonton di studionya bahwa dirinya baru saja menerima berita mengenai kematian mendadak teman baik, rekan kerja di NBC dan tamu acaranya yang sering diundang, Tim Russert. O'Brien tidak melakukan monolognya dan menggunakan waktu yang ada untuk menayangkan dua cuplikan dari episode-episode favorit-nya bersama Tim Russert.