Gw mau tau Sintesis dari DNA komplemen

Sintesis cDNA ini dilakukan dengan mengunakan enzim reverse transcriptase dan primer oligo dT yang akan menempel pada daerah ekor poli A yang merupakan ciri khas dari mRNA. Hal ini dilakukan supaya mRNA yang digunakan dapat di amplifikasi saat dilakukan pengecekan dengan menggunakan PCR. Dalam melakukan sintesis cDNA diperlukan beberapa tahapan, yaitu isolasi mRNA yang akan digunakan, visualisasi dengan menggunakan elektroforesis, sintesis cDNA untai pertama dan amplifikasi cDNA yang didapatkan.

isolasi mRNA: mRNA yang digunakan merupakan hasil isolasi dari eukariot. mRNA digunakan karena lebih spesifik terhadap ekspresi gen yang dihasilkan. mRNA digunakan karena pada mRNA terdapat ekor polyA karena adanya proses poliadenilasi yang tidak dimiliki oleh RNA lainnya, seperti rRNA dan tRNA.

visualisasi: menggunakan gel agarosa untuk mengetahui hasil isolasi.

sintesis cDNA untai pertama: pada tahapan ini diperlukan enzim reverse transcriptase yang akan mengkatalisis sintesis pita tunggal DNA dari cetakan mRNA dengan bantuan primer oligo dT yang akan menempel pada poli A ujung 3’ dari mRNA. Kemudian, mRNA didegradasi dengan menggunakan ribonuklease atau larutan basa.

Terdapat 2 enzim yang berperan dalam proses sintesis cDNA, yaitu enzim DNA polimerase I (Klenow fragment) dan S1 nuklease.

Sintesis cDNA total ini menguntungkan karena dapat membantu penelitian dalam mengkarakterisasi struktur gen atau ekspresinya, cDNA bersifat lebih stabil dibandingkan dengan RNA yang merupakan molekul untai tunggal yang labil dan mudah terdegradasi, selain itu cDNA lebih tahan dalam jangka waktu panjang/ bersifat permanen. cDNA juga merupakan molekul yang cocok untuk digabungkan atau disisipkan ke dalam berbagai vektor kloning seperti plasmid, kosmid, dan bakteriofage, dan dapat digunakan untuk screening berbagai pustaka DNA genomik yang kompleks. Selain itu, populasi mRNA yang telah dibentuk menjadi cDNA dan diklon akan menghasilkan pustaka cDNA yang hanya mempresentasikan informasi pengkode/ sekuen yang terekspresi (ekson) saja, sehingga jauh lebih efektif dalam proses klon.