Jabarkan Masa Aristofanes hingga Aristarkos dari Perpustakaan Aleksandria

Aristofanes dari Bizantion (hidup sekitar tahun 257–180 SM) menjadi kepala perpustakaan keempat sekitar tahun 200 SM. Menurut legenda yang dicatat oleh penulis Romawi Vitruvius, Aristofanes adalah salah satu dari tujuh juri yang diangkat untuk lomba menulis puisi yang digelar oleh Ptolemaios III Euergetes. Enam juri lainnya mendukung salah satu peserta, tetapi Aristofanes memilih satu orang yang paling tidak disukai oleh penonton. Aristofanes menyatakan bahwa semua peserta (kecuali satu peserta yang ia pilih) telah melakukan kecurangan dan mereka pun dikeluarkan dari lomba. Sang raja menuntut bukti, dan Aristofanes kemudian mengambil naskah-naskah yang telah disalin oleh para penyair curang ini dari Perpustakaan Aleksandria. Aristofanes menemukannya dengan mengandalkan ingatannya. Berkat ketekunan dan kemampuannya dalam mengingat, ia diangkat sebagai kepala perpustakaan oleh Ptolemaios III.

Masa kepemimpinan Aristofanes dianggap telah membuka lembaran baru dalam sejarah Perpustakaan Aleksandria. Pada masa ini, kritik sastra mencapai puncak kejayaannya dan menjadi subjek yang mendominasi karya-karya yang dihasilkan oleh perpustakaan ini. Aristofanes dari Bizantion menyunting naskah-naskah puisi dan memperkenalkan konsep pembagian puisi menjadi baris-baris yang terpisah, sementara sebelumnya puisi ditulis seperti prosa. Ia juga memperkenalkan sistem diakritik Yunani, menulis karya-karya penting mengenai leksikografi, dan memperkenalkan tanda-tanda yang digunakan untuk menulis kritik tekstual. Ia menulis pembukaan untuk banyak drama, dan sebagian masih ada dalam bentuk yang sudah ditulis ulang sebagian.

Kepala Perpustakaan Aleksandria yang kelima adalah seseorang yang tak dikenal yang bernama "Apolonios" dengan gelar  ("penggolong bentuk"). Menurut salah satu sumber leksikografi dari zaman sesudahnya, gelar ini mengacu kepada penggolongan puisi berdasarkan bentuk musiknya. Pada awal abad kedua SM, beberapa cendekiawan di Perpustakaan Aleksandria mempelajari karya-karya mengenai kedokteran. Zeuxis sang Empirisis dikenal akan ulasan-ulasannya tentang Corpus Hippocraticum dan ia secara aktif berupaya memperoleh tulisan-tulisan kedokteran untuk melengkapi koleksi perpustakaan ini. Seorang cendekiawan yang bernama Ptolemaios Epitetes menulis sebuah risalah mengenai luka-luka dalam puisi-puisi Homeros, dan subjek ini melampaui batas antara filologi tradisional dengan kedokteran. Namun, pada masa ini kekuasaan Wangsa Ptolemaios juga mulai mengalami kemunduran. Seusai Pertempuran Raphia pada tahun 217 SM, keadaan menjadi semakin kacau. Pergolakan sering terjadi di Mesir, dan pada paruh pertama abad kedua SM, hubungan dengan wilayah Mesir Hulu sangat terganggu. Para penguasa Wangsa Ptolemaios juga mulai menekankan kemesiran mereka alih-alih keyunaniannya. Akibatnya, banyak cendekiawan Yunani yang mulai meninggalkan Aleksandria dan mendatangi negara yang lebih aman dengan pendukung yang juga lebih murah hati.

Aristarkos dari Samotrakia (hidup sekitar tahun 216–145 SM) adalah kepala perpustakaan keenam. Ia tidak hanya membuat naskah puisi-puisi klasik dan karya-karya prosa, tetapi juga menulis hipomnemata (ulasan) lengkap mengenai naskah-naskah tersebut. Ulasan-ulasan ini biasanya mengutip dari naskah klasik, menjelaskan maknanya, mendefinisikan kata yang tidak lazim, dan mencoba menjawab apakah kata-kata di bagian tersebut benar-benar kata yang dipakai oleh penulis aslinya atau merupakan kata yang ditambah-tambahkan oleh juru tulis. Ia banyak bersumbangsih dalam berbagai bidang ilmu, tetapi sumbangsihnya yang terbesar adalah dalam kajian puisi-puisi Homeros, dan pendapat-pendapatnya sering dikutip oleh penulis kuno. Salah satu bagian dari ulasan Aristarkos mengenai Historia karya Herodotos masih bertahan hingga zaman modern dalam sebuah penggalan di papirus. Namun, pada tahun 145 SM, Aristarkos terlibat dalam perselisihan politik di Mesir. Ia mendukung Ptolemaios VII Neos Filopator sebagai penguasa Mesir. Ptolemaios VII dibunuh dan digantikan oleh Ptolemaios VIII Fiskon, yang kemudian langsung ingin menghukum semua pendukung pendahulunya. Akibatnya, Aristarkos terpaksa melarikan diri dari Mesir dan mengungsi ke Pulau Siprus, dan di tempat tersebut ia menjemput ajalnya tak lama sesudahnya. Ptolemaios VIII mengusir semua cendekiawan asing dari Aleksandria, sehingga mereka pun pindah ke berbagai wilayah di kawasan Mediterania Timur.