Jabarkan Mary, Ratu Skotlandia dari Elizabeth I dari Inggris

Kebijakan pertama Elizabeth untuk Skotlandia adalah menentang keberadaan Prancis di sana. Ia khawatir bahwa Prancis berencana menyerang Inggris dan menjadikan Mary, Ratu Skotlandia, sebagai ratu, karena ia dianggap sebagai penerus takhta Inggris oleh banyak orang. Elizabeth dibujuk untuk mengirim pasukan ke Skotlandia agar dapat membantu pemberontak Protestan. Walaupun kampanye militer yang berlangsung cukup ganjil, Traktat Edinburgh pada Juli 1560 dapat menghilangkan ancaman dari Prancis di utara. Saat Mary kembali ke Skotlandia pada tahun 1561 untuk berkuasa, gereja Protestan telah didirikan dan dijalankan oleh dewan bangsawan-bangsawan Protestan yang didukung oleh Elizabeth. Mary menolak meratifikasi traktat tersebut.

Pada tahun 1563, Elizabeth mengusulkan agar Robert Dudley menjadi suami Mary, tanpa meminta persetujuan kedua orang tersebut. Keduanya tampak tidak antusias, dan pada tahun 1565 Mary menikahi Henry Stuart, Lord Darnley, yang juga memiliki klaim atas takhta Inggris. Pernikahan tersebut merupakan kesalahan pertama Mary yang membuatnya dikalahkan oleh Protestan Skotlandia dan Elizabeth. Darnley tidak populer di Skotlandia dan bernama buruk karena mendalangi pembunuhan sekretaris Italia Mary, David Rizzio. Pada Februari 1567, Darnley dibunuh oleh para konspirator yang hampir pasti dipimpin oleh James Hepburn, Earl Bothwell. Segera setelah itu, pada 15 Mei 1567, Mary menikahi Bothwell, sehingga menimbulkan kecurigaan bahwa ia terlibat dalam pembunuhan suaminya. Elizabeth menulis kepadanya:

Seburuk-buruknya pilihan bagi kehormatanmu adalah menikahi secara terburu-buru bawahan semacam itu, yang selain memiliki kekurangan yang terkenal buruk dan lainnya juga dituduh publik atas pembunuhan suamimu yang telah wafat, selain juga menyentuh dirimu di beberapa bagian, walaupun kami salah dalam memercayai hal tersebut.

Kejadian-kejadian ini membuat Mary dikalahkan dan dipenjara di Istana Loch Leven. Bangsawan-bangsawan Skotlandia memaksanya untuk mengundurkan diri dan membiarkan putranya James (yang lahir pada Juni 1566) naik takhta. James dibawa ke Istana Stirling untuk dibesarkan sebagai seorang Protestan. Mary melarikan diri dari Loch Leven pada tahun 1568, tetapi ia dikalahkan lagi sehingga melarikan diri ke Inggris karena Elizabeth pernah menjanjikan dukungannya. Insting Elizabeth mengarahkannya untuk mengembalikan Mary ke takhta; namun, ia dan penasihatnya malah memilih bermain aman. Daripada berisiko mengembalikan Mary ke Skotlandia dengan tentara Inggris atau mengirimnya ke Prancis dan musuh-musuh Inggris yang beragama Katolik, mereka menahannya di Inggris dan memenjarakannya selama sembilan belas tahun berikutnya.