平成１４年度特別講習会

36ae

## ノザンブロットハイブリダイゼーションと32Pの取り扱い

木村　博　　　（放射線基礎医学講座　教授、
放射線同位元素研究センター　センター長）
竹本　忠司　　（放射線基礎医学講座　助手）
福堀　順敏　　（放射線同位元素研究センター　教務職員）
寺戸　勅雄　　（放射線基礎医学講座　技術専門職員）

本講義では、「ノザンブロットハイブリダイゼーション」の実験過程について、スライドや実演を多く準備することで皆さんに
仮想体験していただこうと考えている。その中でRNA実験およびRI実験のポイントについて学んでいただきたい。初めての人には敷居が高く感じられがちであるこれらの実験が､実はいくつかのポイントに気を付けさえすれば、通常のDNA実験と同様に誰にでも簡単に出来るものであるということを強調したい。
RNA実験は､いかにRNAを分解せずに扱えるかにかかっているといっても過言ではない。RNA分解酵素(RNase)は実験者の皮膚
・汗・唾液や水道水中など至る所に存在する。またオートクレーブ程度では簡単には不活化できない。そこで、RNA実験の基本は
次の三点にかかっている。1)RNaseを失活させる。器具や試薬のDEPC処理や、高熱での処理などによる。
2)RNaseを実験系に入れない。手袋を着用する。素手で器具を触らないのはもちろんのこと、
手袋をした手で素手で触れたところを触らないように注意する。チューブ、チップ類はできるだけディスポのものを用いる。
3)喋らない。意外と守れないのがこれである。
現在ではRI以外の検出法いわゆるnon-RI実験系がたくさん開発されてきているが、
ライブラリーのスクリーニングやゲノミックサザンあるいはノザンブロットでわずかな発現まで検出したいなど高感度が要求される
場合には、やはりRIを用いた方が良い結果が得られるようである。RNA実験の基本がいかに実験系への汚染を防ぐかであるのに対して、
RI実験のポイントは汚染と被曝を極力避けるということである。核酸のハイブリダイゼーション実験で主に
用いられる32Pは、高エネルギーのβ線を放出するため外部被曝が問題となる。32Pのβ線は
約1.7MeVのエネルギーを持つため、空気中では最大数メートル飛ぶ。また､体内の透過性は最大1cmにも達するとされている。
それでは､どのようにして被曝を避ければよいのだろうか。放射線外部被曝防護の三原則を思い出して欲しい。
1)距離を取ること。これは自分の手の長さ以上に離れて実験することはできないために自ずと限界があるが、
特に被曝の影響が大きい目などを不必要に近づけないということに留意して欲しい。2)遮蔽すること。透明な厚さ
1cm程度のアクリル製の遮蔽板が市販されている。またサンプルチューブや使用済みの器具を収納するための専用箱などもあるので、
これらを用いて遮蔽する。対面式の実験台の場合、向かい合う実験者への配慮も必要である。3)時間を短くすること。
コールドランなどの下準備を十分にすることにより、実験時間を短くする工夫をする。また、指先だけはほとんど距離が
取れないので、原液を扱う場合などは不必要に長時間持たないことに注意する。
それでは、実際の実験の流れについて簡単に触れておこう。図1にノザンブロットハイブリダイゼー
ション実験の流れについて示した。1)まず調べたい組織からtotal RNAを抽出する。細胞が死んだり破壊されたりすると､
細胞自身が持っていたRNaseによるRNAの分解が起こるため、新鮮な組織からの素早いRNA抽出が重要となる。2)抽出したRNAの
濃度を測り、規定量を電気泳動する。RNaseのコンタミを防ぐことと正確な定量がきれいなデータを得る為のポイントとなる。
3)メンブレンに転写する。転写後UVでクロスリンクしたRNAは安定である。4)DNAプローブを32Pで標識する。
ランダムプライマー法（図2）でラベルする為のキットが多数市販されており、非常に簡単な操作で
効率よくラベルできるようになっている。5)ハイブリダイゼーションを行う。6)洗浄後、オートラジオグラフィーやインスタント
イメージャーなどで可視化する。
講義の後、放射線同位元素研究センター（RIセンター）に移動し、ランダムプライマー法によるDNAプローブのラベルおよび
インスタントイメージャーでのシグナルの検出過程の実演を行う。図２にあるように
ランダムプライマー法では、熱変性させた鋳型DNAに対しランダムな短い配列（6-8塩基程度）のプライマーをアニールさせた後、
クレノーフラグメントによって相補鎖を合成させる。このときの基質に[α-32P] dCTPを用いることでRI標識した
プローブが得られる。また、「ノザンブロットハイブリダイゼーション」実験で使用する器具の実物についても紹介したいと考えている。
最後に、RIセンターの機器の紹介とセンター使用にあたっての諸注意などについて述べる。液体シンチレーションカウンタやオート
ガンマなど使用頻度が高いと考えられるものについては、実演を交えて紹介する予定である。また、現場からの意見を参考に､
これからRI実験でお互いに気持ちよく実験ができるようにはどうすればよいのか考えていきたいと思う。