タンパク質の二次構造を決定する新たな手法を開発  | 理化学研究所

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理化学研究所
日本電子株式会社

# タンパク質の二次構造を決定する新たな手法を開発

－14N固体NMRでβシート配向の区別が可能に－

## 要旨

理研CLST-JEOL連携センター[1]固体NMR技術開発ユニットの西山裕介ユニットリーダーとマノジ・クマール・パンディ研究員らの国際共同研究グループ※は、同位体[2]標識を用いずにタンパク質の二次構造の解析を行う核磁気共鳴（NMR）法[3]を開発しました。

タンパク質は、複数のアミノ酸がつながってできた分子です。アミノ酸の並び方はタンパク質ごとに決まっており、これをタンパク質の一次構造[4]と呼びます。連結したアミノ酸が部分的に折り畳まれた構造は二次構造[4]と呼ばれ、タンパク質全体の形（三次構造[4]）の基礎となる重要な構造単位です。正確な二次構造の決定は、原子レベルのタンパク質構造解析の基本であり、生命科学や創薬分野における構造生物学において重要です。

代表的な二次構造の一つであるβシート[5]は、タンパク質内の直鎖状の部分（βストランド[5]）が隣り合って並ぶことで形成されます。βシートは、βストランドの並び方の違いにより、平行および反平行の二つに区別されます。アルツハイマー型認知症やプリオン病など、タンパク質の異常な凝集が原因とされる疾患では、凝集体を形成するそれぞれの原因タンパク質が、構造のばらついたβシートからなるアミロイド[6]構造を持つことが分かっています。これまで、原因タンパク質の立体構造を解析し、発症メカニズムの解明や治療薬の開発が試みられてきました。凝集したタンパク質の構造を決定するには、タンパク質を窒素の同位体15N[2]や炭素の同位体13C[2]などで標識し、固体マジックアングル試料回転NMR法（固体MAS NMR法）[7]を行う必要があります。しかし、この手法は複雑で費用がかかるため、構造解析の応用範囲は限られていました。

今回、国際共同研究グループはタンパク質を15Nや13Cなどの同位体で標識することなく二次構造を決定する、高感度・高分解能の固体MAS NMR測定法を開発しました。実際に解析したところ、従来法では必須だった同位体標識を用いることなく、99％と高い天然存在比の14N[2]のNMR相関信号を観測することで、平行および反平行βシートを区別できました。

本手法は今後、X線や電子顕微鏡での構造決定が困難なアミロイド構造をはじめとするタンパク質の構造解析への応用が期待できます。

成果は、英国の科学雑誌『PhysChemChemPhys』に掲載されるのに先立ち、オンライン版（8月1日付け）に掲載されます。

※国際共同研究グループ

理化学研究所 ライフサイエンス技術基盤研究センター
理研CLST-JEOL連携センター 固体NMR技術開発ユニット
ユニットリーダー 西山 裕介（にしやま ゆうすけ）
研究員 マノジ・クマール・パンディ（Manoj Kumar Pandey）

リール大学（フランス）
教授 ジャン-ポール・アモルー（Jean-Paul Amoureux）

東京農工大学
教授 朝倉 哲郎（あさくら てつお）

## 背景

タンパク質は生命活動を支える基本分子の一つで、複数のアミノ酸がつながってできています。アミノ酸の並び方はタンパク質ごとに決まっており、これをタンパク質の一次構造と呼びます。連結したアミノ酸が部分的に折り畳まれた構造は二次構造と呼ばれ、タンパク質全体の形（三次構造）の基礎となる重要な構造単位です。正確な二次構造の決定は、原子レベルのタンパク質構造解析の基本であり、生命科学や創薬分野における構造生物学において重要です。

タンパク質の代表的な二次構造の一つであるシート状のβシートは、タンパク質内の直鎖状の部分（βストランド）が隣り合って並ぶことで形成されます。βシートは、βストランドの並び方の違いにより、「平行βシート」および「反平行βシート」の二つに区別されます。

アルツハイマー型認知症やプリオン病など、タンパク質の異常な凝集が原因となる疾患では、凝集体を形成するそれぞれの原因タンパク質が構造のばらついたβシートからなるアミロイド構造を持つことが分かっています。近年、核磁気共鳴（NMR）、X線回折[8]、中性子線回折[9]、クライオ電子顕微鏡[10]といったさまざまな手法によって、タンパク質の原子レベルの構造解析が可能になり、構造生物学が進展しています。しかし、アミロイド構造をX線回折法やクライオ電子顕微鏡で解析することは困難であり、現在、タンパク質を窒素の同位体15Nや炭素の同位体13Cなどで標識して解析する固体マジックアングル試料回転NMR法（固体 MAS NMR法）が唯一の構造解析法として用いられています。

NMR法では、原子核が磁石の性質を持つことを利用し、強い磁場に置かれた分子が示す特徴的な振る舞い（核磁気共鳴＝NMR）を測定し、構造を解析します。この磁石の性質は同位体によって異なるため、固体MAS NMR法で測定できるものは限られます。タンパク質に必ず含まれる窒素の場合、十分な感度や分解能で測定できる同位体は窒素15（15N）です。しかし15Nは天然存在比が0.4％しかないため、固体 MAS NMR法ではタンパク質を人工的に15Nで標識する必要があります。このため、固体MAS NMR法によるタンパク質の構造解析の応用範囲は限られていました。

一方、窒素14（14N）は、地球に存在する窒素原子の99％以上を占める同位体ですが、NMRでの観測・解析が非常に難しく、これまで構造解析にほとんど用いられてきませんでした。天然状態で99％以上存在する14Nの測定が実現すると、NMRによる構造解析が飛躍的に進歩することが期待されます。そこで国際共同研究グループは、15Nによる標識を行うことなく、天然存在比の高い14Nを用いてタンパク質の固体MAS NMR構造解析を行うことを目指しました。

## 研究手法と成果

固体MAS NMR法は、高分解能のNMR信号を得るために試料を高速で回転させる固体NMR法の一種です。マノジ・クマール・パンディ研究員と西山裕介ユニットリーダーは先行研究において、試料を世界最速で回転させることができる超小型NMR試料管[11]（外径0.75mm～1mm）を開発しました（図1）。さらに2015年、14N原子核間の距離情報を得る14N/14N相関NMR測定法[12]の開発にも成功しました注1）。

本研究では、これらの手法をさらに拡張して感度を向上させ、平行βシートおよび反平行βシートの構造決定を行いました。平行βシートは隣り合うβストランド（タンパク質の直鎖状の部分）が平行に並んでおり、一方、反平行βシートはβストランドが交互に逆方向に並んでいます。隣り合うβストランドにおいて、最も近いアミド基（-C(=O)-NH-）のNHのH（水素）間の距離が近ければ、14N/14N相関NMRスペクトルには相関信号が現れます。平行βシートでは、隣り合うβストランドのアミド基のNHのH間の距離は5オングストローム（Å、1Åは100億分の1メートル）であるのに対し、反平行βシートでは3Åと短く、2Åの差があります。この差のために、平行βシートでは隣り合うβストランド間の14N/14N相関信号が得られませんが、反平行βシートでは隣り合うβストランド間の14N/14N相関信号が得られます。

今回は実証実験として、平行βシートおよび反平行βシートの構造を持つ2種類のアラニントリペプチド（アミノ酸の一種アラニンが3個つながったタンパク質モデル）の微結晶試料を作製し、14N/14N相関NMRを測定しました。その結果、反平行βシート構造を持つアラニントリペプチドでのみβストランド間の14N/14N相関信号が測定できたことから、本手法により平行βシートと反平行βシートを判別できることが示されました（図2）。

注1）Pandey MK, Nishiyama Y (2015). Proton-detected 3D14N/14N/1H isotropic shift correlation experiment mediated through1H-1H RFDR mixing on a natural abundant sample under ultrafast MAS, J. Magn. Reson. 2015 Sep;258:96-101.

## 今後の期待

天然存在比の高い14Nを用い、主要な二次構造であるβシート構造の違いを解析できる固体NMR法は、構造生物学の新たな基盤技術となるものです。従来法のように高価な同位体標識を用いる必要がないため、今後、アミロイド構造をはじめとするタンパク質の構造解析やそれを標的とする創薬への応用が一段と加速すると期待できます。

## 原論文情報

Manoj Kumar Pandey, Jean-Paul Amoureux, Tetsuo Asakura, Yusuke Nishiyama, "Sensitivity enhanced 14N/14N correlations to probe inter beta-sheet interactions using fast magic angle spinning solid-state NMR in biological solids", PhysChemChemPhys, doi: 10.1039/c6cp03848d

## 発表者

理化学研究所
ライフサイエンス技術基盤研究センター 理研CLST-JEOL連携センター 固体NMR技術開発ユニット
ユニットリーダー 西山 裕介 （にしやま ゆうすけ）
研究員 Manoj Kumar Pandey（マノジ・クマール・パンディ）

西山裕介ユニットリーダー（左）とマノジ・クマール・パンディ研究員

## お問い合わせ先

理化学研究所 ライフサイエンス技術基盤研究センター
広報・サイエンスコミュニケーション担当 山岸 敦（やまぎし あつし）
Tel: 078-304-7138 / Fax: 078-304-7112

## 報道担当

理化学研究所 広報室 報道担当
Tel: 048-467-9272 / Fax: 048-462-4715

日本電子株式会社 取締役兼常務執行役員 経営戦略室長 大井 泉（おおい いずみ）
Tel: 042-543-1111 / Fax: 042-546-9732

## 補足説明

1.理研CLST-JEOL連携センター
理研と日本電子株式会社（JEOL）が共同で設立した連携センター。分析・診断機器分野における独自技術の創出を目指し、2014年11月に開設された。
参考：2014年10月31日トピックス「 「理研CLST-JEOL連携センター」を開設」
2.同位体、15N、13C、14N
陽子の数が同じで中性子の数が異なる元素。同位体のうち、放射線を放出して別の元素に変換するものを放射性同位体と呼ぶ。一方、寿命が無限かそれに近い同位体は安定同位体と呼ばれる。窒素の場合、14Nと15Nが安定同位体であり、天然に存在する窒素の99％以上が14Nである。14Nは四極子相互作用と呼ばれる原子核相互作用のためにNMRスペクトルが非常に幅広になり、高分解能・高感度測定が困難であることから、これまで一般的にはNMR観測に用いられてこなかった。一方、15Nの解析は容易であるため、タンパク質の構造解析では、15Nの存在比を人工的に増やした標識サンプルがしばしば用いられる。同様に炭素の場合は、天然に1.1%存在しNMRで観測できる唯一の安定同位体13Cがしばしば用いられる。
3.核磁気共鳴（NMR）法
原子核には核スピンがあり、これがゼロではない水素や炭素原子の一部は強い磁場の中に置かれると、複数のエネルギー状態に分かれることが知られている。このエネルギー差に相当する電磁波を当てると共鳴現象が起きて電磁波が吸収される。その振動数は原子核の種類と磁場の強さで決まるが、原子核の周りの電子の状態に影響されるので周辺の電子の分布や原子の結合状態を知る手がかりになる｡従って、NMRは分子構造の決定手段として利用される。また、信号の強度から核スピンの数が分かるため定量測定の手段としても用いられる。
4.一次構造、二次構造、三次構造
タンパク質の構造は階層的に理解することができ、アミノ酸配列を一次構造、一次構造の部分的な折り畳みを二次構造、二次構造が空間的にまとまってできたタンパク質全体の立体構造を三次構造と呼ぶ。さらに、タンパク質同士が集まった多量体の構造を四次構造と呼ぶ。
5.βシート、βストランド
タンパク質の代表的な二次構造の一つ。タンパク質の直鎖状の部分が2本以上隣り合って並び、水素結合で形成された平面構造。βシートを形成するタンパク質領域はβストランドと呼ばれる。βシートはβストランドのN末端-C末端が同じ方向で並んだ平行βシートと、逆向きに並んだ反平行βシートに区別される。

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6.アミロイド
特殊な構造的性質を示すタンパク質の凝集体。内部はβシートが積層していると考えられているが、βシートをほとんど持たないタンパク質もアミロイド構造をとることが分かっている。アミロイドが臓器に沈着するとさまざまな疾患を引き起こすと考えらており、このような疾患はアミロイドーシスと呼ばれている。アルツハイマー型認知症やプリオン病はアミロイドーシスの一つ。
7.固体マジックアングル試料回転NMR法（固体MAS NMR法）
測定対象となる物質を溶媒に溶かす溶液NMR法に対し、固体状態の物質を測定するNMR法を固体NMR法と呼ぶ。固体サンプルのNMR信号は、分解能が非常に低いが、磁場方向に対して試料を54.7°傾けて高速回転させて計測するマジックアングル試料回転（MAS）法を用いることにより、分解能・感度ともに向上させることができる。固体サンプルの測定に広く用いられているNMR法。
8.X線回折
1Å程度のX線の波長は、タンパク質などの物質中の原子と原子の距離と同程度の長さで、物質が規則正しく並んだ結晶によって回折される。回折されたX線の強度を詳しく解析することにより、金属や無機物質、タンパク質などの結晶内の分子構造を解明することができる。
9.中性子線回折
単結晶による中性子線の回折現象を利用して、物質の結晶構造を解析する手法。X線とは異なり原子核によって散乱が起こるため、構造中の水素の位置を正確に捉えることができる。しかし、中性子線の強度の問題から0.5mm角以上の大きな単結晶を必要とする。
10.クライオ電子顕微鏡
タンパク質複合体を観察するために開発された電子顕微鏡。タンパク質複合体（試料）を含んだ溶液を薄く展開し、液体エタン中で急速凍結して試料をごく薄い氷の層に閉じ込めた上、さらに冷却して液体ヘリウム温度（－269℃）におき電子顕微鏡で観察する。試料を染色固定する方法に比べて二つの利点がある。一つは低温で電子線を照射するため、タンパク質試料の電子線による損傷が軽減される。もう一つはタンパク質試料を生理的（自然な）な溶液条件で観察することができる。
11.超小型NMR試料管
固体MAS NMR法で用いられる試料管は、一般的にセラミクスで作られており表面速度が音速に近い超高速で回転される。同じ表面速度でも試料管外径を小さくするとより回転周波数(速度)を高めることができる。そのため、より高速の試料回転を求めて試料管の小型化競争が起きている。本研究グループでは、商品化されたものとしては世界記録となる120kHz（1秒間に12万回転、7,200,000rpm）という超高速の試料回転を外径0.75mmや外径1mmの超小型試料管を用いて本成果を実現した。
12.14N/14N相関NMR測定法
14N同位体間のNMR信号の関係を解析する手法。NMR法では、同じ同位体でも周囲の環境により異なるNMR信号が測定される。このNMR信号の関係を二次元図上で相関スペクトルとして解析することで、同位体間の距離情報などを得ることができる。従来の方法では14Nの観測自体が困難であった。

図1　超高速の試料回転を実現する極細のNMR試料管

外径1mmのNMR試料管。本測定で必須の技術となる高速の試料回転を実現する。

図2　14N/14N相関NMRスペクトルと平行・反平行βシート構造

上段：平行βシート構造とその14N/14N 相関NMRスペクトル。
下段：反平行βシート構造と14N/14N 相関NMRスペクトル。

βストランド内の窒素原子間の距離は平行・反平行βシート構造のどちらも同じであり、その相関信号も平行・反平行βシート構造のどちらにも現れる（等高線のピークを一つだけ持つNMRスペクトル）。一方、βストランド間の相関信号は、隣り合うβストランドにおいて、最も近いアミド基（-C(=O)-NH-）のNHのH（水素）間の距離が短い反平行βシート構造のみに現れる（等高線のピークを複数持つNMRスペクトル、図中では三つのピークがある）。この信号の有無により、平行・反平行βシート構造を決定することができる。

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