転写因子「NtcA」により、ラン藻の増殖促進と代謝改変に成功  | 理化学研究所

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# 転写因子「NtcA」により、ラン藻の増殖促進と代謝改変に成功

－糖やアミノ酸などの有用物質生産の技術構築を目指す－

## ポイント

NtcAの量の増加によりラン藻の増殖が促進
NtcAの量の増加により糖やアミノ酸の量が変化
ラン藻の代謝制御メカニズムの理解を深め、二酸化炭素を使ったものづくりを推進

## 要旨

理化学研究所（理研、野依良治理事長）は、微細藻類「ラン藻」の転写因子「NtcA[1]」の遺伝子を改変してNtcAの量を増やすことで、ラン藻の増殖を促進させるとともに、代謝の改変にも成功しました。これは、理研環境資源科学研究センター（篠崎一雄センター長）代謝システム研究チームの小山内崇研究員、及川彰客員研究員（山形大学准教授）、平井優美チームリーダー、斉藤和季グループディレクターらの研究グループの成果です。

ラン藻は光合成をする微細藻類です。光エネルギーを利用して二酸化炭素を吸収できることから、二酸化炭素の資源化に役立ちます。また、その光エネルギーと二酸化炭素を使い、バイオプラスチックや糖、アミノ酸、色素などの有用物質を作ることができます。

ラン藻種に広く存在するNtcAは、窒素栄養条件が変化した時に、窒素や炭素の代謝、光合成関連タンパク質などの発現を制御します。また、同時に他の転写因子の遺伝子の発現も制御するなど、ラン藻の窒素栄養条件に応答する主要な制御因子であることが知られています。しかし、NtcAの遺伝子を改変した時に、細胞全体にどのような影響があるかは分かっていませんでした。

研究グループは、NtcAの遺伝子を改変してNtcAの量を増加させたラン藻を作製しました。その結果、二酸化炭素を炭素源、光をエネルギー源とした培養条件下で、対照株（野生株）に比べて増殖が促進されることが明らかになりました。また、メタボローム解析[2]を行ったところ、グリコーゲンやアスパラギン酸といった糖やアミノ酸の量が変化することが分かりました。

今回の成果により、NtcAを使った新しい代謝改変の方法が見つかりました。二酸化炭素を使った環境に優しいものづくりは、現時点では実用化には遠いものの、資源の枯渇や環境問題の悪化に備えて、基盤技術を構築しておくことが重要です。今後、ラン藻の代謝制御メカニズムの理解を深めていくことで、有用物質の生産につながると期待できます。

本研究は、JST戦略的創造研究推進事業個人型研究さきがけ（藻類バイオエネルギー領域）の一環として行われ、欧州の科学雑誌『Environmental Microbiology』のオンライン版（7月8日）に掲載されました。

## 背景

資源の枯渇や環境問題の悪化が懸念される中で、二酸化炭素を使ったものづくりの実用化は、現代に生きる私たちの重要な課題です。その解決策の1つとして有望視されているのが、光合成を行う植物・微生物を利用したバイオマスの活用です。

ラン藻は、酸素発生型の光合成をする微細藻類で、光エネルギーを使って二酸化炭素を吸収します。ラン藻はその光エネルギーと二酸化炭素を使い、バイオプラスチックや糖、アミノ酸、色素などの有用物質を作ることができます。しかし、工業的に利用されている他の細菌と比べ、ラン藻による有用物質の生産量は低いため、目的とする物質の収率を上げる必要があります。また、ラン藻は、藻類の中では増殖が速いとされていますが、工業化するには不十分です。したがって、ラン藻の増殖能力そのものを高めることも重要な課題になっています。

ラン藻に広く存在する転写因子「NtcA」は、窒素栄養条件に応じて、窒素や炭素の代謝に関連する酵素、光合成関連タンパク質、他の転写因子など、さまざまなタンパク質の遺伝子発現を制御しています。しかし、NtcAの遺伝子を改変した時に、細胞全体にどのような影響があるかは分かっていませんでした。

研究グループは、世界中で広く研究されているラン藻種のシネコシスティス[3]（Synechocystis sp. PCC 6803）に着目しました。シネコシスティスは、相同組換えによる遺伝子改変が可能という利点があります。そこで本研究では、シネコシスティスを用いて、ラン藻による有用物質生産の基盤技術を構築するために、NtcAに注目した代謝改変の新しい手法の開発を目指しました。

## 研究手法と成果

研究グループは、NtcAの遺伝子を改変してNtcAの量を増加させた株（NtcA過剰発現株）を作製、解析しました。NtcA過剰発現株の増殖を調べたところ、光独立栄養条件（光をエネルギー源、二酸化炭素を炭素源とした培養条件下）において、対照株よりも増殖が促進されました（図1）。

次にNtcAによる遺伝子の発現への影響を転写への影響を網羅的に調べるために、マイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析[4]でDNAからmRNAへの転写を網羅的に解析しました。その結果、特に窒素が欠乏した条件下では、NtcAの過剰発現によって、さまざまな遺伝子の発現が変化することが分かりました。この中には、これまでにNtcAの制御下にあることが知られていた遺伝子に加え、新たに糖やアミノ酸の代謝に関わる酵素の遺伝子が含まれていることが分かりました。

また、NtcA過剰発現による代謝産物の変化の全体像を明らかにするために、キャピラリー電気泳動マススペクトロメトリー[5]とガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー[6]を用いたメタボローム解析を行いました。その結果、NtcA過剰発現株では、グリコーゲンや糖リン酸の量が変化し、アスパラギン酸やフェニルアラニン、リジンなどのアミノ酸量が増加することが分かりました（図2）。

以上から、NtcAの遺伝子を改変することで、細胞内の炭素と窒素の代謝が大きく変化することが分かりました（図3）。また本成果は、ラン藻の増殖速度と特定の代謝産物の量を同時に増加させる珍しい例となりました。

## 今後の期待

本成果により、NtcAを使った新しい代謝改変の方法が見つかりました。また、今回作製した遺伝子を改変したラン藻は、増殖と代謝がともに変化しました。今後、NtcA過剰発現株を詳細に解析することによって、増殖と代謝の関係が明らかになる可能性があります。

ラン藻の代謝制御メカニズムを理解することで、将来的には、二酸化炭素を使ったものづくりなど、新しい産業への応用が期待できます。

## 原論文情報

Takashi Osanai*, Akira Oikawa*, Hiroko Iijima, Ayuko Kuwahara, Munehiko Asayama, Kan Tanaka, Masahiko Ikeuchi, Kazuki Saito, Masami Yokota Hirai, "Metabolomic Analysis Reveals Engineering of Synechocystis sp. PCC 6803 Primary Metabolism by ntcA-overexpression" Environmental Microbiology, 2014, doi:10.1111/1462-2920.12554
*Equally contributed

## 発表者

理化学研究所
環境資源科学研究センター 統合メタボロミクス研究グループ 代謝システム研究チーム
チームリーダー 平井 優美（ひらい まさみ）
研究員 小山内 崇（おさない たかし）

環境資源科学研究推進室
Tel: 048-467-9449 / Fax: 048-465-8048

1.転写因子「NtcA」
ラン藻に広く保存される転写因子で、窒素欠乏のシグナルを感知する窒素センサーとして働くことが知られている。窒素代謝遺伝子に加えて、炭素代謝遺伝子、他の転写因子遺伝子の転写を制御することが知られている。
2.メタボローム解析
細胞内の代謝産物を網羅的に解析すること。従来は、目的の代謝産物を個別に定量していたが、細胞全体の代謝を把握するために、キャピラリー電気泳動マススペクトロメトリー、ガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリーなどを用いて、可能な限り多くの代謝産物を定量する手法。
3.シネコシスティス
淡水性のラン藻。単細胞性の球菌で、直径が約1.5～2.5マイクロメートル。窒素固定を行わないラン藻である。ラン藻種の中で、最初に全ゲノム配列が決定された。相同組換えによる遺伝子の改変が可能であることから、モデルラン藻として広く研究されている。
4.トランスクリプトーム解析
細胞内の転写産物量（mRNA量）を網羅的に測定する解析のこと。細胞から得られたRNAを用いてラベル化したDNAを合成し、基盤上（マイクロアレイ上）に合成されたDNA断片と混合することで、mRNA量を調べる。
5.キャピラリー電気泳動マススペクトロメトリー
細胞中の代謝産物を一斉解析する「メタボローム解析」の手法の1つ。キャピラリー（毛細管）と呼ばれる細い管を用いて電気泳動を行うことにより、細胞抽出物中で混合物として存在する代謝産物を分離する。分離した代謝産物をイオン化し、質量分析器（マススペクトロメーター）によって検出する。
6.ガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー
代謝産物の解析手法の1つで、気化させた代謝産物をヘリウムなどの気体で分離させる。検出を質量分析器（マススペクトロメーター）によって行うことで、より多くの代謝産物の同定が可能となる。

図1　光独立栄養条件でのラン藻の増殖曲線

二酸化炭素を1%含んだ空気を通気し、光照射下で培養（光独立栄養条件）。対照株とNtcA過剰発現株の増殖を濁度（吸収波長730nm）により測定した。

図2　3種類（アスパラギン酸、フェニルアラニン、リジン）のアミノ酸量比較

窒素充足時または窒素欠乏時（4時間）のラン藻から抽出したアミノ酸量の比較。対照株の窒素源がある場合を100とした相対値で表している。アスパラギン酸は窒素充足時に、フェニルアラニンとリジンは窒素欠乏時に、NtcA過剰発現によって増加することが分かった。

図3　NtcA過剰発現によって変化する代謝の模式図

NtcAの遺伝子を改変してタンパク質量を増加させた株（NtcA過剰発現株）を作製（左上図）。NtcA過剰発現では、糖、アミノ酸、ヌクレオチドなど、炭素と窒素の代謝に関連する代謝産物の量が変化する。窒素充足時または窒素欠乏時に、NtcA過剰発現株で増える代謝産物を赤字、減る代謝産物を青字にした。プリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチドについては、NtcA過剰発現で減少していた。