단백질 공학 접근 방식
엑손 셔플링은 인트론에서 발생하는 재조합 이벤트를 통해 다른 단백질의 엑손을 조합하는 것이다. 직계 엑손 셔플링은 다른 종의 직계 유전자에서 엑손을 조합하는 것을 포함한다. 직계 도메인 셔플링은 다른 종의 직계 유전자에서 전체 단백질 도메인을 셔플링하는 것을 포함한다. 병렬 엑손 셔플링은 같은 종의 다른 유전자에서 엑손을 셔플링하는 것을 포함한다. 병렬 도메인 셔플링은 같은 종의 병렬 단백질에서 전체 단백질 도메인을 셔플링하는 것을 포함한다. 기능적 동족 셔플링은 기능적으로 관련된 비상동 도메인을 셔플링하는 것을 포함한다. 이 모든 과정은 키메라 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 다른 유전자에서 원하는 엑손을 증폭하는 것으로 시작된다. 이 증폭 산물은 프라이머 없는 PCR을 사용하여 전체 길이 유전자로 재조립된다. 이 PCR 주기 동안 단편은 주형 및 프라이머 역할을 한다. 이는 키메라 전체 길이 유전자를 생성하며, 이는 스크리닝을 거친다.
부모 유전자의 단편은 엑소뉴클레아제 III에 의한 통제된 소화를 통해 생성된다. 이 단편은 제한효소로 무딘 끝을 만들고 연결하여 하이브리드 유전자를 생산한다. THIOITCHY는 α-포스포티오에이트 dNTP와 같은 뉴클레오타이드 삼인산 유사체를 활용하는 수정된 ITCHY 기술이다. 이러한 뉴클레오타이드의 통합은 엑소뉴클레아제 III에 의한 소화를 차단한다. 엑소뉴클레아제 III에 의한 소화의 이러한 억제를 스파이킹(spiking)이라고 한다. 스파이킹은 먼저 엑소뉴클레아제로 유전자를 절단하여 짧은 단일 가닥 오버행을 가진 단편을 생성함으로써 달성할 수 있다. 이 단편은 소량의 포스포티오에이트 dNTP가 존재하는 DNA 중합효소에 의한 증폭을 위한 템플릿 역할을 한다. 이 결과 단편은 연결되어 전체 길이 유전자를 형성한다. 또는 온전한 부모 유전자는 정상 dNTP와 포스포티오에이트 dNTP가 존재하는 PCR로 증폭될 수 있다. 이 전체 길이 증폭 산물은 엑소뉴클레아제에 의한 소화에 노출된다. 소화는 엑소뉴클레아제가 α-pdNTP를 만날 때까지 계속되어 다른 길이의 단편을 생성한다. 이 단편은 연결되어 키메라 유전자를 생성한다.
이 방법은 DNA 셔플링과 ITCHY를 결합하여 여러 교차를 억제하는 하이브리드 유전자 라이브러리를 생성한다. 이 방법은 두 개의 독립적인 ITCHY 라이브러리 구축으로 시작된다. 첫 번째는 N-말단에 유전자 A를 가진다. 다른 하나는 N-말단에 유전자 B를 가진다. 이러한 하이브리드 유전자 단편은 아가로스 겔 전기영동을 통해 제한효소 소화 또는 말단 프라이머를 사용한 PCR로 분리된다. 이 분리된 단편은 함께 혼합되고 DNase1로 추가 소화된다. 소화된 단편은 템플릿 전환을 통해 프라이머 없는 PCR로 재조립된다.
이 방법은 키메라를 위한 주형으로 단일 가닥 DNA 단편이 있는 상태에서 단방향으로 성장하는 폴리뉴클레오타이드의 주형 전환을 통해 하이브리드 유전자 라이브러리를 생성한다. 이 방법은 표적 mRNA로부터 역전사를 통해 단일 가닥 DNA 단편을 준비하는 것으로 시작된다. 유전자 특이적 프라이머는 단일 가닥 DNA에 어닐링된다. 이 유전자는 PCR 주기 동안 확장된다. 이 주기에 이어서 주형 전환 및 초기 프라이머 확장으로 얻은 짧은 단편을 다른 단일 가닥 DNA 단편에 어닐링한다. 이 과정은 전체 길이 단일 가닥 DNA가 얻어질 때까지 반복된다.
이 방법은 서열 상동성이 거의 없거나 전혀 없는 유전자들 사이의 재조합을 생성한다. 이 키메라는 여러 제한 부위를 포함하는 링커 서열을 통해 융합된다. 이 구조는 DNase1으로 소화된다. 단편은 S1 뉴클레아제로 무딘 끝으로 만들어진다. 이 무딘 끝 단편은 연결에 의해 원형 서열로 결합된다. 이 원형 구조는 링커 영역에 제한 부위가 존재하는 제한 효소를 사용하여 선형화된다. 이는 시작 구조와 비교하여 5' 및 3' 말단에 대한 유전자의 기여가 역전될 키메라 유전자 라이브러리를 생성한다.
이 방법은 여러 부모 유전자로부터 여러 교차를 가진 유전자 라이브러리를 생성한다. 이 방법은 부모 유전자 간의 서열 동일성을 필요로 하지 않는다. 각 교차 위치에 하나 또는 두 개의 보존된 아미노산이 필요하다. 이 방법은 부모 서열을 정렬하고 교차 부위 역할을 하는 컨센서스 영역을 식별하는 것으로 시작된다. 이어서 제한 부위를 포함하는 특정 태그를 통합하고, Bac1으로 소화하여 태그를 제거하여 응집성 말단을 가진 유전자를 생성한다. 이 유전자 단편은 혼합되고 적절한 순서로 연결되어 키메라 라이브러리를 형성한다.
이 방법은 상동 유전자의 정렬로 시작하며, 이어서 다형성 영역의 식별이 이루어진다. 다음으로 유전자의 상단 가닥은 작은 퇴화 올리고뉴클레오타이드로 나뉜다. 하단 가닥도 올리고뉴클레오타이드로 소화되어 지지대 역할을 한다. 이 단편은 용액에서 결합되고 상단 가닥 올리고뉴클레오타이드는 하단 가닥 올리고뉴클레오타이드에 조립된다. 이 단편 사이의 틈은 중합효소로 채워지고 연결된다.
이 방법은 상동성이 없는 여러 DNA 단편을 단일 PCR에서 셔플링하는 것을 포함한다. 이는 서로 다른 구조 단위를 인코딩하는 모듈을 조립하여 완전한 단백질을 재구성하는 결과를 낳는다.
이 방법은 우라실 dNTP를 사용하여 재조합해야 하는 유전자 단편을 증폭하는 것으로 시작된다. 이 증폭 용액에는 프라이머, PfuTurbo 및 Cx Hotstart DNA 중합효소도 포함되어 있다. 증폭된 산물은 USER 효소와 함께 배양된다. 이 효소는 DNA에서 우라실 잔기를 제거하여 단일 염기쌍 틈을 만드는 것을 촉매한다. USER 효소 처리된 단편은 T4 DNA 리가아제를 사용하여 혼합 및 연결되고 주형 DNA를 제거하기 위해 Dpn1 소화를 거친다. 이 결과적인 단일 가닥 단편은 PCR을 사용하여 증폭되고 E. coli로 형질 전환된다.
이 방법은 제한 부위 외부를 절단하는 유형 2 제한 효소를 사용하여 수용체 벡터에서 최소 9개의 다른 단편을 재조합할 수 있도록 한다. 이는 양쪽에 Bsa1 플랭킹 서열을 생성하기 위해 단편을 별도의 벡터에 서브클로닝하는 것으로 시작된다. 이 벡터는 유형 II 제한 효소 Bsa1을 사용하여 절단되어 4개의 뉴클레오타이드 단일 가닥 오버행을 생성한다. 상보적인 오버행을 가진 단편은 T4 DNA 리가아제를 사용하여 하이브리드화되고 연결된다. 마지막으로 이 구조는 E. coli 세포로 형질 전환되며, 이 세포는 발현 수준에 대해 스크리닝된다.
이 방법은 구조 요소 또는 전체 단백질 도메인을 재조합하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 포스포로티오에이트 화학을 기반으로 하며, 이는 포스포로티오디에스터 결합의 특정 절단을 허용한다. 이 과정의 첫 번째 단계는 재조합해야 하는 단편과 벡터 백본의 증폭으로 시작된다. 이 증폭은 5' 말단에 포스포로티올화된 뉴클레오타이드를 가진 프라이머를 사용하여 이루어진다. 증폭된 PCR 산물은 고온에서 에탄올-요오드 용액에서 절단된다. 다음으로 이 단편은 실온에서 하이브리드화되고 닉을 복구하는 E. coli로 형질 전환된다.
이 시스템은 E. coli의 자연적인 부위 특이적 재조합 시스템을 기반으로 한다. 이 시스템은 인테그론 시스템이라고 불리며 자연적인 유전자 셔플링을 생성한다. 이 방법은 인테그론 시스템으로 개별 재조합 카세트 또는 trpA-E 유전자와 조절 요소를 전달하여 트립토판 결핍 E. coli에서 기능적인 트립토판 생합성 오페론을 구축하고 최적화하는 데 사용되었다.
이 방법은 5' 또는 3' 말단에 단일 블록 서열을 포함하고, 줄기 루프 영역에 상보적인 서열을 가지며, PCR을 위한 프라이머 결합 부위 역할을 하는 D 분기 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 가닥을 생성한다. 5' 및 3' 반 가닥의 등량은 혼합되어 줄기 영역의 상보성으로 인해 하이브리드를 형성한다. 3' 반 가닥의 유리 인산화 5' 말단을 가진 하이브리드는 0.1mM ATP 존재 하에 T4 DNA 리가아제를 사용하여 5' 반 가닥의 유리 3' 말단과 연결된다. 연결된 산물은 두 가지 유형의 PCR을 통해 증폭되어 사전 5' 반 및 사전 3' 반 PCR 산물을 생성한다. 이 PCR 산물은 비오틴 표지된 줄기 서열을 포함하는 프라이머의 5' 말단에 아비딘-비오틴 결합을 통해 단일 가닥으로 전환된다. 다음으로, 비오틴화된 5' 반 가닥과 비비오틴화된 3' 반 가닥은 다음 Y-연결 주기를 위한 5' 및 3' 반 가닥으로 사용된다.