タンパク質工学 アプローチ
エクソンシャッフリングとは、イントロンで起こる組換え現象によって、異なるタンパク質のエクソンが組み合わされることである。オルソログエクソンシャッフルは、異なる生物種のオルソログ遺伝子のエクソンを結合する。オルソログドメインシャッフリングは、異なる種のオルソログ遺伝子からタンパク質ドメイン全体をシャッフルするものである。パラロガスエクソンシャッフリングは、同一種の異なる遺伝子からのエクソンをシャッフルする。パラロガスドメインシャッフリングは、同じ生物種のパラログタンパク質からタンパク質ドメイン全体をシャッフルする。機能的相同ドメインシャッフルは、機能的に関連する非相同ドメインのシャッフルを行う。これらのプロセスはすべて、キメラ合成オリゴヌクレオチドを用いて、異なる遺伝子から目的のエクソンを増幅することから始まる。この増幅産物は、プライマーレスPCRを用いて全長の遺伝子に再構成される。このPCRサイクルの間、断片はテンプレートおよびプライマーとして機能する。この結果、キメラ全長遺伝子が得られ、スクリーニングに供される。
親遺伝子の断片は、エキソヌクレアーゼIIIによる制御切断で作られる。これらの断片はエンドヌクレアーゼで平滑末端化され、ハイブリッド遺伝子を生成するためにライゲーションされる。THIOITCHYは、ITCHYを改良したもので、α-ホスホチオエートdNTPなどのヌクレオチド三リン酸アナログを利用した手法である。これらのヌクレオチドを組み込むことで、エキソヌクレアーゼIIIによる切断を阻害することができる。このエキソヌクレアーゼIIIによる切断の阻害をスパイクと呼ぶ。スパイキングは、まずエキソヌクレアーゼで遺伝子を切断し、短い一本鎖のオーバーハングを持つ断片を作ることで達成できる。これらの断片は、少量のホスホチオエートdNTPsの存在下でDNAポリメラーゼによる増幅のためのテンプレートとして機能する。これらの断片は、その後、全長の遺伝子を形成するために一緒にライゲーションされる。あるいは、インタクトな親遺伝子を、通常のdNTPおよびホスホチオエートdNTPの存在下でPCRにより増幅することもできる。これらの全長増幅産物は、次にエキソヌクレアーゼによる切断に供される。切断はエキソヌクレアーゼがα-pdNTPに出会うまで続けられ、異なる長さの断片ができる。これらの断片をライゲーションしてキメラ遺伝子を生成する。
本方法は、DNAシャフリングとITCHYを組み合わせることにより、多重クロスオーバーを抑制するハイブリッド遺伝子のライブラリーを作成するものである。本方法は、まず2つの独立したITCHYライブラリーを構築する。一つは、遺伝子AをN末端に持つもの。そしてもう一つは、N末端に遺伝子Bを持つものである。これらのハイブリッド遺伝子断片は、制限酵素切断または末端プライマーを用いたPCRにより、アガロースゲル電気泳動で分離される。これらの分離された断片を混合し、さらにDNaseIを使って切断する。切断された断片は、テンプレートスイッチングによるプライマーレスPCRで再組み立てされる。
本方法は、キメラのテンプレートとなる一本鎖DNA断片の存在下で、一方向に成長するポリヌクレオチドのテンプレートスイッチングによりハイブリッド遺伝子のライブラリーを作成する。本方法は、まず、標的mRNAから逆転写して一本鎖DNA断片を調製する。次に、遺伝子に特異的なプライマーを一本鎖DNAにアニールさせる。そして、これらの遺伝子はPCRサイクルの間に伸長される。このサイクルの後、テンプレートを交換し、先のプライマー伸長から得られた短い断片を他の一本鎖DNA断片にアニールする。このプロセスは、全長の一本鎖DNAが得られるまで繰り返される。
この方法は、配列の相同性がほとんどない遺伝子間で組換えを生じさせるものである。これらのキメラは、いくつかの制限部位を含むリンカー配列を介して融合される。このコンストラクトはDNaseIで切断される。断片はS1ヌクレアーゼで平滑末端化される。これらの平滑末端端フラグメントは、ライゲーションによって環状配列にまとめられる。この環状コンストラクトを、リンカー領域に制限部位が存在する制限酵素を使用して線状化する。この結果、5'末端と3'末端への遺伝子の寄与が、出発時の構築物と比較して逆転したキメラ遺伝子のライブラリーが得られる。
この方法では、複数の親遺伝子から複数のクロスオーバーを持つ遺伝子のライブラリーが得られる。この方法では、親遺伝子間の配列の同一性は必要ないない。しかし、すべてのクロスオーバー位置に1～2個の保存アミノ酸が必要である。まず、親遺伝子の配列をアライメントし、クロスオーバー部位となるコンセンサス領域を特定する。その後、制限部位を含む特定のタグを組み込み、Bac1による切断でタグを除去することにより、末端が凝集した遺伝子が得られる。これらの遺伝子断片を適切な順序で混合してライゲーションし、キメラライブラリーを形成する。
この方法は、まず相同な遺伝子のアライメントを行い、次に多型の領域を特定する。次に、遺伝子の上鎖を小さな変性オリゴヌクレオチドに分割する。下側の鎖もオリゴヌクレオチドに切断され、足場となる。これらの断片は溶液中で結合され、トップ鎖のオリゴヌクレオチドはボトム鎖のオリゴヌクレオチドに組み合わされる。これらの断片間の隙間はポリメラーゼで埋められ、ライゲーションされる。
この方法は、相同性を持たない複数のDNA断片を、1回のPCRでシャッフルするものである。その結果、異なる構造単位をコードするモジュールが組み合わされ、完全なタンパク質が再構築される。
この方法は、まず、ウラシルdNTPを使用して、組み換えが必要な遺伝子断片を増幅することから始まる。この増幅液には、プライマー、PfuTurbo、Cx Hotstart DNAポリメラーゼも含まれている。増幅された生成物は、次にUSER酵素とインキュベートされる。この酵素は、DNAからウラシル残基を除去して1塩基対のギャップを作ることを触媒する。USER酵素で処理した断片を混合し、T4 DNAリガーゼでライゲーションし、Dpn1切断でテンプレートDNAを除去する。得られた一本鎖の断片はPCRで増幅され、大腸菌に形質転換される。
この方法では、制限部位の外側を切断する2型制限酵素を用いることで、少なくとも9種類の断片をアクセプターベクターに組み換えることができる。まず、断片を別々のベクターにサブクローニングし、両側にBsa1フランキング配列を作成する。次に、これらのベクターをII型制限酵素Bsa1で切断し、4ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを生成させる。相補的なオーバーハングを持つ断片はハイブリダイズされ、T4 DNAリガーゼを用いてライゲーションされる。最後に、これらのコンストラクトは大腸菌に形質転換され、発現レベルのスクリーニングが行われる。
この方法は、構造要素やタンパク質ドメイン全体の組み換えに使用することができる。この方法は、ホスホロチオエート化学に基づいており、ホスホロチオジエステル結合を特異的に切断することができる。プロセスの最初のステップは、ベクターバックボーンと一緒に組み換える必要があるフラグメントの増幅から始まる。この増幅は、5'末端にホスホロチオール化ヌクレオチドを持つプライマーを用いて達成される。増幅されたPCR産物は、エタノール-ヨウ素溶液中で高温で切断される。次に、これらの断片は室温でハイブリダイズされ、大腸菌に形質転換され、あらゆるニックが修復される。
このシステムは、大腸菌の自然な部位特異的組換えシステムをベースにしている。このシステムはインテグロンシステムと呼ばれ、自然な遺伝子シャッフルを生じさせる。この方法を用いて、trp欠損大腸菌において、個々の組換えカセットまたはtrpA-E遺伝子と調節エレメントをインテグロンシステムで送り込むことにより、機能的なトリプトファン生合成オペロンを構築し最適化した。
この方法では、5'または3'末端の単一ブロック配列、ステムループ領域の相補配列、PCRのプライマー結合部位となるD分岐領域を含む一本鎖DNA鎖を生成する。5'側と3'側の両半鎖が等量ずつ混合され、ステム領域での相補性によりハイブリッドが形成される。3'半鎖の5'末端がリン酸化されたハイブリッドは、0.1 mM ATPの存在下でT4 DNAリガーゼを用いて5'半鎖の3'末端と結合される。ライゲーションした生成物を2種類のPCRで増幅し、pre 5' halfとpre 3' halfのPCR生成物を生成する。これらのPCR産物は、ビオチン標識されたステム配列を含むプライムの5'末端へのアビジン-ビオチン結合を介して一本鎖に変換される。次に、ビオチン標識された5'ハーフストランドとビオチン標識されていない3'ハーフストランドは、次のYライゲーションサイクルの5'と3'のハーフストランドとして使用される。