تقنيات النسخ جمع البيانات
نظرًا لأن mRNAs أطول من أطوال القراءة الخاصة بأساليب التسلسل عالية الإنتاجية النموذجية، يتم عادةً تجزئة النصوص قبل التسلسل. تعد طريقة التجزئة جانبًا رئيسيًا في بناء مكتبة التسلسل. يمكن تحقيق التجزئة عن طريق التحليل المائي الكيميائي ، أو الإرذاذ، أو الصوتنة، أو النسخ العكسي باستخدام نيوكليوتيدات متسلسلة . بدلاً من ذلك، يمكن إجراء التجزئة وعلامات (كدنا) في وقت واحد باستخدام إنزيمات ترانسبوزيز .
أثناء التحضير للتسلسل، يمكن تضخيم نسخ (كدنا) من النصوص بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لإثراء الأجزاء التي تحتوي على تسلسل المحول المتوقع 5 'و 3'. يستخدم التضخيم أيضًا للسماح بتسلسل كميات إدخال منخفضة جدًا من RNA ، وصولاً إلى أقل من 50 بيكوغرام في التطبيقات المتطرفة. يمكن استخدام ضوابط الزيادة في RNAs المعروفة لتقييم مراقبة الجودة للتحقق من إعداد المكتبة وتسلسلها، من حيث محتوى GC ، وطول الجزء، بالإضافة إلى التحيز بسبب موضع التجزئة داخل النص. المعرّفات الجزيئية الفريدة (UMIs) عبارة عن تسلسلات عشوائية قصيرة تُستخدم لتمييز أجزاء التسلسل بشكل فردي أثناء إعداد المكتبة بحيث يكون كل جزء مميز فريدًا. توفر UMIs مقياسًا مطلقًا للتقدير الكمي، وفرصة لتصحيح تحيز التضخيم اللاحق الذي تم تقديمه أثناء إنشاء المكتبة، وتقدير حجم العينة الأولي بدقة. تعتبر UMIs مناسبة بشكل خاص لنسخة RNA-Seq أحادية الخلية، حيث يتم تقييد كمية إدخال الحمض النووي الريبي (RNA) والتضخيم الموسع للعينة مطلوبًا.
بمجرد أن يتم تحضير جزيئات النص، يمكن تسلسلها في اتجاه واحد فقط (طرف واحد) أو كلا الاتجاهين (نهاية مزدوجة). عادةً ما يكون إنتاج التسلسل أحادي النهاية أسرع، وأرخص من التسلسل ثنائي النهاية وكافٍ لتقدير مستويات التعبير الجيني. ينتج عن التسلسل المزدوج النهاية محاذاة / تجميعات أكثر قوة، وهو أمر مفيد للتعليق التوضيحي للجينات واكتشاف الشكل الإسوي للنسخ. تحافظ أساليب RNA-Seq الخاصة بالجدار على معلومات حبلا لنسخة متسلسلة. بدون معلومات الخيط، يمكن محاذاة القراءات مع موضع الجين ولكن لا تخبر في أي اتجاه يتم نسخ الجين. يعد Stranded-RNA-Seq مفيدًا لفك تشفير النسخ للجينات التي تتداخل في اتجاهات مختلفة ولإجراء تنبؤات جينية أكثر قوة في الكائنات غير النموذجية.
يعتمد RNA-Seq حاليًا على نسخ جزيئات RNA إلى جزيئات cDNA قبل التسلسل ؛ لذلك، الأنظمة الأساسية اللاحقة هي نفسها بالنسبة للبيانات الجينية والنسخية. وبالتالي، كان تطوير تقنيات تسلسل الحمض النووي سمة مميزة لـ RNA-Seq. التسلسل المباشر للحمض النووي الريبي باستخدام التسلسل النانوي يمثل أحدث تقنيات RNA-Seq الحالية. يمكن للتسلسل النانوي للحمض النووي الريبي أن يكتشف القواعد المعدلة التي يمكن إخفاؤها بطريقة أخرى عند تسلسل cDNA وأيضًا يلغي خطوات التضخيم التي يمكن أن تؤدي إلى التحيز.
تعتمد حساسية ودقة تجربة RNA-Seq على عدد القراءات التي تم الحصول عليها من كل عينة. هناك حاجة إلى عدد كبير من القراءات لضمان التغطية الكافية للنسخة، مما يتيح الكشف عن النصوص منخفضة الوفرة. يزداد التصميم التجريبي تعقيدًا عن طريق تقنيات التسلسل ذات نطاق الإخراج المحدود، والكفاءة المتغيرة لإنشاء التسلسل، وجودة التسلسل المتغير. يضاف إلى هذه الاعتبارات أن كل نوع لديه عدد مختلف من الجينات وبالتالي يتطلب إنتاج تسلسل مخصص لنسخة فعالة. حددت الدراسات المبكرة عتبات مناسبة تجريبيًا، ولكن مع نضوج التكنولوجيا، تم التنبؤ بالتغطية المناسبة حسابياً عن طريق تشبع النسخ. الطريقة الأكثر فاعلية لتحسين الكشف عن التعبير التفاضلي في الجينات منخفضة التعبير هي إضافة المزيد من التكرارات البيولوجية بدلاً من إضافة المزيد من القراءات. المعايير الحالية التي أوصى بها مشروع Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) هي لتغطية الإكسوم 70 ضعفًا لمعيار RNA-Seq وتغطية exome تصل إلى 500 ضعف لاكتشاف النصوص والأشكال الإسوية النادرة.