hotchpotch/wikipedia-multilingual-ir-pairs huggingface dataset:
ترينتينو ألتو أديجي التاريخ
في ظل دكتاتورية بينيتو موسوليني، الدكتاتور الفاشي لإيطاليا (1922-1943)، تعرض جنوب التيرول لبرنامج طلينة قسري حيث حظرت جميع الإشارات إلى التيرول القديمة وكان يشار إليها باسم فينيتسيا تريدنتينا بين عامي 1919-1947، في محاولة لتبرير المطالب الإيطالية في المنطقة من خلال ربطها تاريخيًا بإقليم من الأقاليم الرومانية في إيطاليا (الإقليم العاشر فينيشيا وهيستريا). اتفق هتلر وموسوليني في عام 1938 على نقل السكان الناطقين بالألمانية إلى الأراضي تحت الحكم الألماني أو تفريقهم في جميع أنحاء إيطاليا، ولكن اندلاع الحرب العالمية الثانية منعهم من تنفيذ كامل عملية إعادة التوطين. مع ذلك، تم نقل الآلاف من الناس إلى الرايخ الثالث، الذين تمكنوا مع صعوبات كبيرة من العودة إلى أرض آبائهم وأجدادهم بعد نهاية الحرب.
ترينتينو ألتو أديجي التاريخ
في عام 1943، عندما وقعت الحكومة الإيطالية هدنة مع الحلفاء، احتلت المنطقة من قبل ألمانيا والتي أعادت تنظيمها على أنها منطقة عمليات في سفوح جبال الألب ووضعتها تحت إدارة أمين الفرع النازي في المنطقة فرانز هوفر. ألحقت المنطقة بحكم الأمر الواقع إلى الرايخ الألماني (مع إضافة مقاطعة بلونو) حتى نهاية الحرب. انتهى هذا الوضع مع نهاية النظام النازي واستعادة الحكم الإيطالي في عام 1945.
توصلت إيطاليا والنمسا لاتفاق غروبر دي غاسبيري عام 1946 والذي دخل حيز التنفيذ في عام 1947 عندما صدر دستور الجمهورية الإيطالية والذي نصّ على منح المنطقة حكمًا ذاتيًا واسعًا. اعترف بالألمانية والإيطالية كلغات رسمية وسمح بتعليم الألمانية من جديد. سميت المنطقة باسم طرنطينة آدجة العليا/ تيرولر إتشلاند بين عامي 1947 و 1972.
ترينتينو ألتو أديجي التاريخ
مع ذلك، لم يكن تنفيذ الاتفاق مرضيًا للسكان الناطقين بالألمانية أو الحكومة النمساوية. تحولت القضية إلى سبب هام للاحتكاك بين البلدين ونقلت المسألة إلى الأمم المتحدة في عام 1960. عقدت جولة جديدة من المفاوضات في عام 1961 ولكنها باءت بالفشل، وذلك جزئيًا بسبب الاستياء الشعبي وحملة من التخريب والتفجيرات قام بها الاستقلاليون والانفصاليون من الناطقين بالألمانية بقيادة لجنة تحرير جنوب تيرول.
تم حل هذه المسألة في عام 1971، عندما تم التوقيع على معاهدة نمساوية إيطالية جديدة والمصادقة عليها. تنص على أن تقدم النزاعات في جنوب التيرول إلى محكمة العدل الدولية في لاهاي وأن الإقليم سينال المزيد من الحكم الذاتي داخل إيطاليا وأن النمسا لن تتدخل في الشؤون الداخلية لجنوب تيرول. أرضى الاتفاق الجديد جميع الأطراف المعنية وخفت التوترات الانفصالية. ساعدت أمور أخرى في تحسن الوضع منها انضمام النمسا إلى الاتحاد الأوروبي في عام 1995، مما ساعد على تحسين التعاون عبر الحدود.
في مايو 2006 قدم السناتور مدى الحياة فرانشيسكو كوسيغا مشروع قانون من شأنه السماح للمنطقة بإجراء استفتاء يختار الناخبون المحليون فيه إمكانية البقاء ضمن الجمهورية الإيطالية أو الاستقلال التام أو العودة إلى النمسا أو أن تصبح جزءًا من ألمانيا. رفضت جميع الأطراف بما في ذلك الانفصاليون، هذا الاقتراح لاحتمال أن يتسبب في إحياء التوترات العرقية.
ترينتينو ألتو أديجي الجغرافيا
يحد الإقليم النمسا (تيرول) من الشمال وسويسرا (غراوبوندن) إلى الشمال الغربي والأقاليم الإيطالية لومبارديا وفينيتو إلى الغرب والجنوب على التوالي. تبلغ مساحة الإقليم 13,607 كيلومتر مربع. يتمتع بتضاريس جبلية للغاية والتي تغطي جزءًا كبيرًا من الدولوميت وجبال الألب الجنوبية.
تبلغ مساحة طرنطينة 6,207 كم2 وأغلبها أراض جبلية (20% منها أعلى من 2000 متر و 70% فوق 1000م) وتغطيها الغابات الواسعة (50% من الأراضي). يختلف المناخ عبر المقاطعة من مناخ جبال الألب إلى المناخ شبه القاري مع صيف دافئ ومتقلب إلى شتاء بارد ومثلج. تعد المنطقة دائمًا الوجهة المفضلة للسياح، سواء في فصل الشتاء للتزلج في الجبال العالية وصيفًا لزيارة الوديان الواسعة والعديد من البحيرات (أكبرها بحيرة غاردا).
ترينتينو ألتو أديجي الجغرافيا
تبلغ مساحة جنوب التيرول 7,400 كم2 وهي جبلية كلية وتغطيها الغابات الشاسعة. في إيطاليا، يحد المقاطعة إقليم لومبارديا في الغرب وطرنطة في الجنوب وفينيتو في الشرق. المناخ قاري نظرًا لتأثير سلاسل الجبال المتعددة والتي تقف على ما يزيد عن 3000 متر فوق مستوى سطح البحر والوديان الواسعة التي يتدفق عبرها النهر الرئيسي أديجي من الشمال إلى الجنوب وروافده العديدة. في مدينة بلسانة عاصمة المقاطعة، متوسط درجة الحرارة الهواء 12.2 درجة مئوية ومتوسط هطول الأمطار 717.7 مم. يقع أدنى ممر عبر جبال الألب (ممر برينر) في أقصى شمال المنطقة على الحدود مع النمسا.
ترينتينو ألتو أديجي الحكومة والإدارة
يقسم الإقليم إلى مقاطعتين ذاتيتي الحكم: طرنطينة (مقاطعة طرنطة) وجنوب تيرول (مقاطعة بلسانة). اعترفت الدولة الإيطالية بدرجة معينة من الحكم الذاتي للإقليم ومقاطعتيه نتيجة لاتفاق غروبر دي غاسبيري عام 1946، فضلًا عن المكانة الخاصة للحكم الذاتي التي أقرها القانون الدستوري في عام 1948. أعطى هذا القانون المنطقة الحق في تشريع قوانينها الخاصة بشأن طائفة واسعة من المواضيع والاضطلاع بالمهام الإدارية المعنية.
في عام 1972، عنى تقديم تشريع الحكم الذاتي الثاني والذي كان في صلب المناقشات بين الحكومتين الإيطالية والنمساوية نقل الاختصاصات الرئيسية من الإقليم إلى المقاطعتين. الحكم الذاتي المعترف به في التشريع الخاص يغطي المؤسسات السياسية والتشريعية والإدارية والمالية. حول التشريع الثاني الإقليم بحكم الأمر الواقع إلى كومنويلث فضفاض بسلطة في متناول المقاطعتين واختصاصات تشريعية أو تنفيذية محدودة للغاية.
عاصمة الإقليم هي طرنطة، على الرغم من أن عاصمتي المقاطعتين تتناوبان كل سنتين كمقر للجمعية الإقليمية.
ترينتينو ألتو أديجي الاقتصاد
تنتج الوديان الخصبة في الإقليم النبيذ والفاكهة ومنتجات الألبان والأخشاب، بينما تشمل صناعاتها الورق والصناعات الكيماوية والمعدنية. كما أن المنطقة مصدر رئيسي للطاقة الكهرمائية. أهم ملامح الهيكل الاقتصادي للمنطقة هي السياحة والنظام خاص للتعاون بين الزراعة والصناعة. في العقد الماضي، أصبحت السياحة عنصرًا مهمًا جدًا لاقتصاد الإقليم. حيث وجدت المنطقة - التي هي نقطة انطلاق بين دول شمال أوروبا ووسط وجنوب إيطاليا - وظيفتها الحقيقية في هذا الفرع الرائد في مجال قطاع الخدمات بكل ما يأتي معه من نواح اقتصادية. تمتلك المنطقة أعلى تركيز للفنادق في إيطاليا (6178 منشأة في عام 2001 مع 236,864 سرير فندقي). الطاقة الاستيعابية الإجمالية للإقليم 651,426 سرير متاح في الفنادق والمنشآت الأخرى.
ترينتينو ألتو أديجي الديموغرافيا
يبلغ تعداد سكان الإقليم حوالي 1,017,000 نسمة (519,000 في طرنطينة و 498,000 في جنوب التيرول). تعتبر الكثافة السكانية منخفضة مقارنة ببقية إيطاليا. في عام 2008، بلغت 74.7 نسمة/كم2 بينما الرقم المتوسط لإيطاليا كان 198.8. كانت الكثافة السكانية في طرنطينة 83.6، وهي أعلى قليلًا من تلك المسجلة في جنوب التيرول والتي كانت تساوي 67.3. اعتبارًا من عام 2008، قدر المعهد الوطني الإيطالي للإحصاءات (إستات) أن 70,834 من السكان هم من المهاجرين المولودون في الخارج وبنتشرون في كامل المنطقة أي ما يعادل 6.9% من مجموع سكان المنطقة.
اللغات الرئيسية المستخدمة في الإقليم هي اللغة الإيطالية (حوالي 63%) والألمانية (33%) وأقلية صغيرة تتحدث اللادينية (4%).
لغة الأغلبية في طرنطينة هي الإيطالية على الرغم من أن هناك أقليات من الناطقين بالألمانية في بلدية لوسيرنا وأربع بلديات في وادي موكيني. هناك أيضًا أقليات ناطقة باللادينية في وادي فاسا. على عكس الوضع في جنوب التيرول، فإن حماية لغات الأقليات في طرنطينة ليس مشمولًا في قانون الاستقلال الذاتي الجديد على الرغم من أنه موجود بموجب القوانين المحلية الحالية.
ترينتينو ألتو أديجي الديموغرافيا
أما في جنوب التيرول، فلغة الأغلبية هي الألمانية (69% من السكان)، على الرغم من أن 73% من سكان العاصمة بلسانة يتحدثون الإيطالية كلغة أم بسبب الهجرة الداخلية من مناطق أخرى من إيطاليا. يشكل المتكلمون بالإيطالية أيضًا عنصرًا هامًا في المراكز الحضرية الرئيسية الأخرى في المقاطعة، كما هو الحال في ميرانو وبريكسن. كما أن اللادينية لغة رسمية إضافية في بعض البلديات. وفقًا لتعداد عام 2001، كانت 103 من أصل 116 بلدية ذات أغلبية من الناطقين بالألمانية و 8 من المتكلمين باللادينية و5 بالإيطالية. تشترك اليوم اللغتان الألمانية والإيطالية بالصفة الرسمية في جنوب التيرول.
تفاعل البوليمراز المتسلسل
تفاعل البوليمراز المتسلسل أو سلسلة تفاعل البوليمراز (اختصارًا PCR)،(1) هي طريقةٌ مُستعملةٌ بشكلٍ واسعٍ في علم الأحياء الجزيئي، حيثُ تعمل على إنتاجٍ سريعٍ لمليارات النُسخ من عينةٍ خاصةٍ للحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (دنا)(2)، مما يُمكن العلماء من أخذ عينةٍ صغيرةٍ جدًا من الدنا وتضخيمها إلى كميةٍ كبيرةٍ تكفي لدراستها بالتفصيل. اختُرع تفاعل البوليمراز المتسلسل عام 1983 بواسطة كاري موليس. يُعتبر هذا التفاعل أساسًا للعديد من الفحوصات الجينية، وتتضمن تحليل عيناتٍ قديمة من الدنا وتحديد العوامل المُسببة للعدوى. باستخدام تفاعل البوليمراز المتسلسل، يتم تضخيم نُسخٍ بكميات صغيرة جدًا من تسلسلات الحمض النووي في تسلسلاتٍ أو دوراتٍ من تغيرات درجة الحرارة. يُعتبر تفاعل البوليمراز المتسلسل شائعًا حاليًا ولا غنًى عنه في كثيرٍ من الأحيان حيثُ يستخدم في المختبرات الطبية والبحوث المخبرية السريرية في مجموعةٍ واسعة من التطبيقات العملية والتي تتضمن البحوث الطبية الحيوية والطب الشرعي الجنائي.
تفاعل البوليمراز المتسلسل
تعتمدُ مُعظم طُرق تفاعل البوليمراز المتسلسل على التدوير الحراري. يُعرض التدوير الحراري المواد المتفاعلة لدوراتٍ مُتكررة من التسخين والتبريد، مما يسمحُ بحدوث تفاعلاتٍ مختلفةٍ تعتمد على درجة الحرارة، خصوصًا انصهار الحمض النووي وتنسخ الدنا المُحرك بالإنزيم. يَستخدم تفاعل البوليمراز المتسلسل كاشفين رئيسيين: المشرعات (هي شظايًا من الدنا القصير مُفرد السلسلة وتعرف باسم قليلات النوكليوتيدات، وهي سلسلاتٌ متممة لمنطقة الدنا المستهدفة) وبوليميراز الدنا. في الخطوة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل، تُفصل سلسلة الدنا الحلزونية المزدوجة بنيويًا عند درجة حرارة عالية في عمليةٍ تُسمى إفساد الحمض النووي. في الخطوة الثانية، تنخفض درجة الحرارة وترتبط المُشرعات بالتسلسلات المتممة للحمض النووي، ثم تصبح سلسلات الدنا قوالب لبوليميراز الدنا وذلك للقيام بتجميعٍ إنزيمي لسلسلة دنا جديدةٍ من النيوكليوتيدات الحُرة، وهي الأجزاء الأساسية للحمض النووي (الدنا). مع استمرار تقدم تفاعل البوليمراز المتسلسل، يُستخدم الدنا المولّد نفسه قالبًا للنسخ المتماثل، مما يؤدي إلى تنشيط تفاعلٍ تسلسلي يُضخم فيه قالب الدنا الأصلي بشكلٍ كبير.
تفاعل البوليمراز المتسلسل
تستخدم جميع تطبيقات تفاعل البوليمراز المتسلسل تقريبًا بوليميراز دنا مستقرٌ بالحرارة، مثل بوليميراز المستحرة المائية، وهو إنزيمٌ معزولٌ في الأصل عن البكتيريا المستحرة المائية أليفة الحرارة. إذا كان البوليميراز المُستعمل عرضةً للحرارة، فإنه سوف يُفسد تحت درجات الحرارة العالية في خطوة الإفساد. قبل استخدام بوليميراز المستحرة المائية، كان يجب إضافة بوليمراز الدنا يدويًا في كل دورةٍ، والتي كانت عمليةً شاقةً ومُكلفة.
يُوجد عددٌ من تطبيقات تفاعل البوليمراز المتسلسل، وتتضمن استنساخ الدنا بهدف تحديد التسلسل، واستنساخ الجينات ومُعالجتها وتطفير الجينات، بالإضافة إلى بناء سلاسل مُستندة على الدنا، أو التحليل الوظيفي للجينات، وتشخيص ورصد الأمراض الوراثية، وتضخيم دنا قديم، وتحليل البصمات الجينية لتنميط الدنا (مثلًا في علم الأدلة الجنائية واختبار الأبوة بالدنا)، والكشف عن مسببات الأمراض في اختبارات الحمض النووي لتشخيص الأمراض المعدية.
تفاعل البوليمراز المتسلسل أسس التفاعل
يُضخم تفاعل البوليميراز المتسلسل مناطق محددة من شريط الدنا (الدنا الهدف). تضخم معظم طرائق تفاعل البوليميراز المتسلسل شظايا الدنا التي يتراوح طولها بين 0.1 و10 كيلو زوج قاعدي (kbp)، رغم أن بعض التقنيات تسمح بتضخيم للشظايا يصل إلى 40. تُحدد كمية الناتج المُضخم بواسطة الركائز المتاحة في التفاعل، التي تصبح محدودة مع تقدم التفاعل.
يتطلب إعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل العديد من العناصر والكواشف، بما فيها:
بوليميراز الدنا، وهو إنزيم يبلمر شرائط الدنا الجديدة؛ يشيع استخدام بوليميراز المستحرة المائية المقاوم للحرارة أيضًا، لأنه يبقى سليمًا في الغالب خلال عملية تمسخ الدنا عالية الحرارة.
تفاعل البوليمراز المتسلسل أسس التفاعل
اثنان من مشرعات الدنا التي تُعتبر نيكليوتيدات مكملة للنهاية 3' (ثلاثة مشرعات) لكل من المناطق الحساسة وغير الحساسة للدنا الهدف (يمكن لبوليميراز الدنا فقط أن يرتبط بمنطقة ثنائية الشريط من الدنا ويتطاول منها، ودون المشرعات لن تكون هناك منطقة ثنائية الشريط من الدنا ليرتبط بها البوليميراز)؛ تُختار المشرعات المحددة المكملة للمنطقة الهدف من الدنا مسبقًا، وغالبًا ما تُصنع بشكل مخصص في المختبر أو تُشترى من موردي المواد الكيميائية الحيوية التجاريين.
نيوكليوسيدات منقوصة الأكسجين ثلاثية الفوسفات، أو dNTPs (تُسمى أحيانًا «نيوكليوتيدات منقوصة الأكسجين ثلاثية الفوسفات»؛ هي نيوكليوتيدات تحتوي على مجموعة ثلاثي الفوسفات)، وهي الدعائم الأساسية التي يصنع منها بوليميراز الدنا شريطَ دنا جديدًا.
تفاعل البوليمراز المتسلسل أسس التفاعل
كاتيونات ثنائية التكافؤ، عادةً ما تكون أيونات المغنسيوم (Mg2+) أو المنغنيز (Mn2+)؛ المغنسيوم ثنائي التكافؤ هو الأكثر شيوعًا، ولكن يُستخدم المنغنيز في تطفر الدنا المتواسط بتفاعل البوليميراز المتسلسل، إذ إن تركيز المنغنيز الزائد يرفع معدل الخطأ في أثناء تصنيع الدنا. بالإضافة إلى الكاتيونات أحادية التكافؤ مثل أيونات البوتاسيوم (K).
تفاعل البوليمراز المتسلسل أسس التفاعل
يُجرى التفاعل عادةً بحجم 10-200 ميكرولتر في أنابيب تفاعل صغيرة (0.2-0.5 مليلتر) في جهاز تدوير حراري. يسخّن جهاز التدوير الحراري أنابيب التفاعل ويبردها لتحقيق درجات الحرارة المطلوبة في كل خطوة من خطوات التفاعل (انظر أدناه). تستخدم العديد من أجهزة التدوير الحرارية الحديثة التبريد الكهروحراري الذي يتيح تسخين الكتلة الحاملة لأنابيب تفاعل البوليمراز المتسلسل وتبريدها ببساطة من خلال عكس التيار الكهربائي. تسمح أنابيب التفاعل ذات الجدران الرقيقة بالتوصيل الحراري المناسب للسماح بالموازنة الحرارية السريعة. تحتوي معظم أجهزة التدوير الحرارية على أغطية ساخنة لمنع التكثف في الجزء العلوي من أنبوب التفاعل. تتطلب أجهزة التدوير الحرارية القديمة التي تفتقر إلى غطاء ساخن طبقةً من الزيت فوق خليط التفاعل أو كرة من الشمع داخل الأنبوب.
تفاعل البوليمراز المتسلسل أسس التفاعل
يتكون تفاعل البوليميراز المتسلسل عادةً من 20-40 تغير متكرر في درجة الحرارة، وتُسمى هذه التغيرات الدورات الحرارية، وتتكون كل دورة عادةً من قياسين أو ثلاثة قياسات منفصلة لدرجات الحرارة (انظر الشكل أدناه). غالبًا ما يسبق الدورة خطوة درجة حرارة واحدة عند درجة حرارة عالية جدًا (> 90 درجة مئوية (194 درجة فهرنهايت)) ويتبعها انتظار واحد في النهاية لتمديد المنتج النهائي أو التخزين القصير. تعتمد درجات الحرارة المستخدمة وطول مدة تطبيقها في كل دورة على مجموعة متنوعة من الثوابت، بما في ذلك الإنزيم المستخدم في تخليق الدنا، وتركيز الأيونات ثنائية التكافؤ وdNTPs في التفاعل، ودرجة حرارة انصهار (Tm) المشرعات. الخطوات الشائعة لمعظم طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل هي على النحو الآتي:
التهيئة: هذه الخطوة مطلوبة فقط لبوليميرازات الدنا التي تتطلب التنشيط الحراري عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل البادئ الساخن. وتتكون من تسخين حجرة التفاعل إلى درجة حرارة 94-96 درجة مئوية (201-205 درجة فهرنهايت)، أو 98 درجة مئوية (208 درجة فهرنهايت) إن استُخدمت مشرعات عالية الحرارة، والتي يُحتفظ بها بعد ذلك لمدة 1-10 دقائق.
تفاعل البوليمراز المتسلسل أسس التفاعل
الإفساد: هذه الخطوة هي أول حدث تدوير منتظم، وتتكون من تسخين حجرة التفاعل إلى 94-98 درجة مئوية (201-208 درجة فهرنهايت) لمدة 20-30 ثانية. يؤدي هذا إلى ذوبان قالب الدنا ثنائي الشريط، أو إفساده، عن طريق كسر روابط الهيدروجين بين الأسس المكملة، ما يُنتج جزيئَي دنا أحادي الشريط.
التصلب: في الخطوة التالية، تنخفض درجة حرارة التفاعل إلى 50–65 درجة مئوية (122-149 درجة فهرنهايت) لمدة 20-40 ثانية، ما يسمح بتصليب المشرعات لكل من قوالب الدنا أحادي الشريط. يتضمن خليط التفاعل عادةً اثنين من المشرعات: واحد لكل من المكملات أحادية الشريط التي تحتوي على المنطقة الهدف. المشرعات هي تسلسلات أحادية الشريط بحد ذاتها ولكنها أقصر بكثير من المنطقة الهدف، تكمل بذلك تسلسلات قصيرة جدًا في النهاية 3' لكل شريط.
تفاعل البوليمراز المتسلسل أسس التفاعل
من الضروري تحديد درجة حرارة ملائمة لمرحلة التصليب لأن الكفاءة والخصوصية تتأثران بشدة بدرجة حرارة التصليب. يجب أن تكون درجة الحرارة هذه منخفضة بما يكفي لتسمح بتهجين المشرع إلى الشريط، وعالية بما يكفي ليكون هذا التهجين محددًا، أي يجب أن يرتبط المشرع بجزء محدد مكمل من الشريط لا في أي مكان آخر. إن لم تكن درجة الحرارة كافية، فإن المشرع سيرتبط بصورة شاذة. وإن كانت مرتفعة جدًا، فقد لا يرتبط المشرع أساسًا. درجة الحرارة المثلى للتصليب هي 3-5 درجة مئوية وهي أقل من درجة حرارة المشرعات المستخدمة. لا تتكوّن روابط الهيدروجين المستقرة بين الأسس المكملة إلا عندما يكون تسلسل المشرعات متطابقًا مع تسلسل القالب. خلال هذه الخطوة، يرتبط البوليميراز بقالب المشرع الهجين ويبدأ تشكيل الدنا.
تفاعل البوليمراز المتسلسل أسس التفاعل
التمديد/الإطالة: تعتمد درجة الحرارة في هذه الخطوة على بوليميراز الدنا المستخدم؛ درجة حرارة النشاط المثلى لبوليميراز الدنا المستقر حراريًا لبوليميراز المستحرة المائية هي 75-80 درجة مئوية (167-176 درجة فهرنهايت) تقريبًا، مع أن درجة الحرارة التي يشيع استخدامها مع هذا الإنزيم هي 72 درجة مئوية (162 درجة فهرنهايت). في هذه الخطوة، يصنّع بوليميراز الدنا شريط دنا جديدًا مكملًا لقالب شريط الدنا عن طريق إضافة dNTPs حرة من خليط التفاعل المكمّل للقالب في الاتجاه من 5' إلى 3'، ما يكثف مجموعة 5'-فوسفات من dNTPs مع مجموعة 3'-هيدروكسيل الدنا الناتج (الممدد). يعتمد الوقت الدقيق المطلوب للتمديد على بوليميراز الدنا المستخدم وعلى طول منطقة الدنا الهدف المراد تضخيمها. كقاعدة عامة، عند درجة الحرارة المثلى، فإن معظم بوليميراز الدنا يبلمر ألف أساس نيوكليوتيدي في الدقيقة. في ظل الظروف المثلى (على سبيل المثال، إذا لم تكن هناك قيود متعلقة بنقص الركائز أو الكواشف)، يتضاعف عدد تسلسلات الدنا المستهدف في كل خطوة من التمديد/الإطالة. مع كل دورة ناجحة، تصبح أشرطة القالب الأصلية بالإضافة إلى جميع الأشرطة المنتجة حديثًا أشرطة قالب للدورة التالية من التمديد، ما يؤدي إلى تضخيم أسي (هندسي) لمنطقة الدنا المستهدف المحددة.
تشكل عمليات الإفساد والتمديد والتصليب دورة واحدة. تحصل الدورات المتعددة عندما يستوجب تضخيم منطقة الدنا المستهدف إلى ملايين النسخ. الصيغة المستخدمة لحساب عدد نسخ الحمض النووي المتشكلة بعد عدد معين من الدورات هي 2n، حيث n هو عدد الدورات. ومن ثم فإن التفاعل الذي يحصل على 30 دورة ينتج عنه 230، أو 1073741824، نسخة من منطقة الدنا ثنائي الشريط المستهدف.
الاستطالة النهائية: هذه الخطوة اختيارية، ولكنها تُنفذ عند درجة حرارة 70-74 درجة مئوية (158-165 درجة فهرنهايت) (نطاق درجة الحرارة المطلوب للنشاط الأمثل لمعظم البوليمرات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل) لمدة 5-15 دقيقة بعد دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل الأخيرة للتحقق من أن أي دنا أحادي الشريط متبقٍّ قد مُدد بالكامل.
الانتظار الأخير: يتم من خلال الخطوة الأخيرة تبريد حجرة التفاعل إلى 4-15 درجة مئوية (39-59 درجة فهرنهايت) لفترة غير محددة، ويمكن استخدامها للتخزين قصير المدى لنواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.
للتحقق مما إذا كان تفاعل البوليميراز المتسلسل قد نجح في إنشاء المنطقة المستهدفة المتوقعة من الدنا (التي يُشار إليها أحيانًا باسم المنطقة المُضخمة أو أمبليكون)، يمكن استخدامالرحلان الكهربائي باستخدام جيل الأغاروز لفصل نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بناءً على حجمها. يُحدد حجم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال المقارنة على دنا مدرج، مؤشر الوزن الجزيئي الذي يحتوي على شظايا دنا معروفة الحجم تُقاس على جيل الأغاروز إلى جانب نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.
كما هو الحال في التفاعلات الكيميائية الأخرى، يتأثر معدل تفاعل البوليميراز المتسلسل وكفاءته بعوامل محددة. بناء على ذلك، يمكن تقسيم عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل بالكامل إلى ثلاث مراحل وذلك تبعًا تقدم التفاعل:
التضخيم الأسي: تتضاعف كمية الناتج في كل دورة (على فرض أن كفاءة التفاعل 100%). بعد 30 دورة، يمكن مضاعفة النسخة الواحدة من الدنا حتى مليار نسخة. بمعنى ما، يجري التلاعب في تكرار شريط منفصل من الدنا في ظروف مخبرية خاضعة للسيطرة. الفاعل حساس للغاية، إذ يجب وجود كميات دقيقة جدًا من الدنا فقط.
تفاعل البوليمراز المتسلسل تحقيق مثالية التفاعل
من الناحية العملية، قد يفشل تفاعل البوليميراز المتسلسل لأسباب مختلفة، ويرجع ذلك جزئيًا إلى حساسيته للتلوث الذي يؤدي إلى تضخيم نواتج زائفة من الدنا. ونتيجةً لهذا، طُورت العديد من التقنيات والإجراءات لتحقيق الأمثلية في ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل. يجري التعامل مع التلوث بالدنا الدخيل من خلال بروتوكولات مخبرية وإجراءات تفصل مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل قبل إتمام التفاعل وقبل تلوثه بأي دنا دخيل. يتضمن هذا عادةً الفصل المكاني لمناطق إعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل عن مناطق تصفية نواتج التفاعل أو تحليلها، واستخدام المواد البلاستيكية التي يمكن التخلص منها لاحقًا، وتنظيف سطح العمل بالكامل بين التفاعلين. يمكن استعمال الدوارئ (المحاليل المنظمة) البديلة أو إنزيمات البوليميراز في تضخيم مناطق طويلة أو خلاف ذلك من الدنا. قد تؤدي إضافة الكواشف، مثل الفورماميد، في أنظمة الدوارئ إلى زيادة نوعية تفاعل البوليميراز المتسلسل وإنتاجه. يمكن إجراء المحاكاة الحاسوبية لنتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل النظرية للمساعدة في تصميم المشرعات.
تفاعل البوليمراز المتسلسل التطبيقات
يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل بعزل الدنا من العوامل الوراثية للدنا من خلال التضخيم الانتقائي لمناطق محددة من الدنا. يمكن تعزيز هذا الاستخدام لتفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال عدة طرق، مثل تصنيع مسابر التهجين لتهجين لطخة ساوثرن أو نورثرن وتنسيل الدنا الجزيئي، الذي يتطلب كميات أكبر من الدنا، ويمثّل منطقة محددة من الدنا. يزود تفاعل البوليميراز المتسلسل هذه التقنية بكميات كبيرة من الدنا النقي، ما يسمح بتحليل عينات الدنا حتى من كميات صغيرة من المواد الأولية.
تفاعل البوليمراز المتسلسل التطبيقات
تشمل التطبيقات الأخرى لتفاعل البوليمراز المتسلسل تسلسلَ الدنا لتحديد تسلسل مُضخم غير معروف من البوليميراز المتسلسل، ويمكن استخدام أحد مشرعات التضخيم في تسلسل سانغر، وعزل تسلسل دنا لتسريع تقنيات الدنا المأشوب التي تنطوي على إدخال تسلسل دنا في البلازميد، أو العاثية، أو الكوزميد (حسب الحجم)، أو المادة الوراثية لكائن آخر. يمكن فحص المستعمرات البكتيرية (مثل الإشريكية القولونية) بسرعة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل لبناء ناقلات دنا بشكل صحيح. يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للبصمات الوراثية، وهي تقنية مستخدمة في الطب الشرعي لتحديد هوية الشخص أو الكائن الحي من خلال مقارنة الدنا التجريبي بناءً على أساليب تفاعل البوليميراز المتسلسل المختلفة.
تفاعل البوليمراز المتسلسل التطبيقات
تتمتع بعض طرق «بصمات الأصابع» في تفاعل البوليميراز المتسلسل بقوة تمييزية عالية، ويمكن استخدامها لتحديد العلاقات الجينية بين الأفراد، مثل الوالدين والطفل أو بين الأشقاء، وتُستخدم في اختبار الأبوة. يمكن استخدام هذه التقنية أيضًا لتحديد العلاقات التطورية بين الكائنات الحية عند استخدام ساعات جزيئية معينة (على سبيل المثال، S16 rRNA وجينات recA للكائنات الحية الدقيقة).
نظرًا إلى أن تفاعل البوليميراز المتسلسل يضخم مناطق الدنا التي يستهدفها، فيمكن استخدامه لتحليل كميات صغيرة للغاية من العينة. هذا أمر بالغ الأهمية في كثير من الأحيان في تحاليل الطب الشرعي، عندما تتوفر فقط كمية ضئيلة من الدنا بصفتها دليلًا. يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في تحليل الدنا القديم الذي يبلغ عمره عشرات الآلاف من السنين أيضًا. استُخدمت هذه التقنيات المستندة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل بنجاح على الحيوانات، مثل الماموث البالغ من العمر أربعين ألف عام، وأيضًا على الدنا البشري، في تطبيقات تتراوح من تحليل المومياوات المصرية إلى تحديد القيصر الروسي وجسم الملك الإنجليزي ريتشارد الثالث.
تفاعل البوليمراز المتسلسل التطبيقات
تسمح طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي أو تفاعل البوليميراز المتسلسل بالزمن الحقيقي (qPCR، يجب عدم الخلط بينه وبين RT-PCR) بتقدير كمية تسلسل معين موجود في عينة؛ وهي تقنية غالبًا ما تُستخدم لتحديد مستويات التعبير الجيني كميًا. يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي أداة أساسية في قياس كمية الدنا التي تقيس تراكم نواتج تضخيم الدنا بعد كل دورة من تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.
يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالتحديد الكمي لكشف تسلسل دنا معين وكشفه في الوقت الحقيقي لأنه يقيس التركيز في أثناء عملية التصنيع. هناك طريقتان للكشف المتزامن والقياس الكمي. تتكون الطريقة الأولى من استخدام الأصباغ الفلورية التي يُحتفظ بها بشكل غير محدد بين الأشرطة المزدوجة. تشتمل الطريقة الثانية على مجسات تُشفر تسلسلات محددة وتَسِمها بالفلور. لا يمكن رؤية الكشف عن الحمض النووي باستخدام هذه الطرق إلا بعد تهجين المسابير باستخدام الدنا المكمل.
تفاعل البوليمراز المتسلسل التطبيقات
يمكن فحص الآباء المحتملين لتحري ما إذا كانوا حاملين لمرض ما أو يمكن فحص أبنائهم لتحديد ما إذا كانوا مصابين بالتليف الكيسي. يمكن تحصيل عينات من الدنا لفحصها قبل الولادة عن طريق بزل السائل السلوي، وأخذ عينات من الزغابات المشيمية، أو حتى عن طريق تحليل خلايا الجنين النادرة المنتشرة في الجريان الدموي الأموي. تحليل البوليميراز المتسلسل ضروري أيضًا للتشخيص الوراثي السابق للانغراس، إذ تُفحص خلايا الجنين النامي لتحري وجود طفرات.
يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل كجزء من اختبار حساس لتحري التوافق النسيجي، وهو أمر ضروري في عملية زراعة الأعضاء. اعتبارًا من عام 2008، هناك اقتراح للاستعاضة عن الاختبارات القائمة على الأجسام المضادة التقليدية لفصيلة الدم باختبارات قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل.
تفاعل البوليمراز المتسلسل التطبيقات
تتضمن العديد من أشكال السرطان تعديلات على الجينات السرطانية. باستخدام الاختبارات المستندة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل لدراسة هذه الطفرات، يمكن في بعض الأحيان تخصيص خطط علاجية فردية للمرضى. يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل بالتشخيص المبكر للأمراض الخبيثة مثل ابيضاض الدم والأورام اللمفاوية، التي تعد حاليًا الأكثر تطورًا في أبحاث السرطان وتُستخدم روتينيًا بالفعل. يمكن إجراء فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرةً على عينات من العوامل الوراثية للدنا للكشف عن الخلايا الخبيثة الخاصة بالإزفاء بحساسية تصل إلى عشرة آلاف ضعف حساسية الطرق الأخرى. تفاعل البوليميراز المتسلسل مفيد للغاية في المجال الطبي لأنه يسمح بعزل كابحات الورم وتضخيمها. يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مثلًا في تحديد كمية الخلايا المفردة وتحليلها، بالإضافة إلى التعرف على تركيبات الدنا والرنا والبروتين وتأكيداتها.
تفاعل البوليمراز المتسلسل التطبيقات
يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل بالتشخيص السريع والدقيق جدًا للأمراض المعدية، بما في ذلك الأمراض التي تسببها البكتيريا أو الفيروسات. يسمح أيضًا بتحديد الكائنات الحية الدقيقة غير القابلة للزراعة أو بطيئة النمو مثل المتفطرات أو البكتيريا اللاهوائية أو الفيروسات من فحوصات زراعة الأنسجة والنماذج الحيوانية. أساس تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل التشخيصي في علم الأحياء الدقيقة هو الكشف عن العوامل المعدية وتمييز السلالات غير الممرضة عن السلالات الممرضة من خلال جينات محددة.
أحدث تفاعل البوليميراز المتسلسل ثورة في عملية كشف الكائنات الحية المعدية وتمييزها بالطرق الآتية: