ポリアデニル化
ポリアデニル化（英：Polyadenylation）はRNAにポリA鎖（poly-A tail）を付加することである。ポリA鎖は多数のAMPから構成されており、RNAをアデニン塩基で伸長することに相当する。真核生物では、ポリアデニル化は翻訳可能な成熟mRNAを生産するために不可欠であり、広い意味では遺伝子発現過程の一部であるといえる。
ポリアデニル化は転写終了時から始まる。特定のタンパク質複合体がRNA3' 末端のセグメントを切り離し、そこからポリA鎖を合成する。いくつかの遺伝子では、切断できる部位が複数あり、その内1箇所にポリA鎖が追加される。そのため、ポリアデニル化は選択的スプライシングのように、1つの遺伝子から複数の転写産物を作り出す。
ポリA鎖はmRNAの安定性に関わり、核外輸送、翻訳に重要である。これは時間と共に短くなり、十分に短くなった時点でmRNAは酵素により分解される。だが、少数の細胞では、ポリA鎖の短いmRNAが再度のポリアデニル化に備えて細胞質に蓄えられている。細菌ではこれと反対に、ポリアデニル化はRNAの分解を引き起こす。これは真核細胞の非コードRNAでも見られる。ポリアデニル化が生物全般に見られることは、これが生命の歴史の中で早い段階に進化したことを意味する。
RNAは巨大な生体分子で、ヌクレオチドが繋がって構成されている。ポリA(ポリアデニル酸)とは、RNA塩基(A:アデニン・U:ウラシル・G:グアニン・C:シトシン)のうち、Aのみが繋がったものである。RNAは通常、鋳型DNAから転写されることで合成される。転写は5' 末端から3' 末端に向けて進むため、塩基配列も5'から3'に向けて表記される。ポリA鎖が付加されるのは3' 末端である。
伝令RNA(mRNA)は翻訳されてタンパク合成の鋳型となるコーディング領域を含む。その他の部分は非翻訳領域と呼ばれ、mRNAの活性を制御している。非コードRNAという翻訳されないRNAも多くあり、非翻訳領域と同じように様々な制御を行う。
核において、ポリA化は転写終了時に行われる。ポリA鎖はmRNAを細胞質での分解から保護し、転写終結、核外輸送、翻訳を補助する。真核細胞のmRNAはほぼ全てポリA化されているが、動物の複製依存的ヒストンmRNAは例外である。これは真核細胞のmRNAがポリA鎖を欠く唯一の例で、プリンリッチ配列に続くステムループ構造で終端し、切断箇所を示している。この構造は"ヒストン下流要素"(HDE)と呼ばれる。
多くの真核細胞の非コードRNAは転写終了時にポリA化される。miRNAのように、末端がプロセシングで除かれるため、転写中間体にはポリA鎖があるが成熟RNAにはないものもある。だが例えば、X染色体の不活性化を調節するXistなど、遺伝子発現制御を行う多くの長鎖非コードRNAでは、ポリA鎖は成熟RNAの一部である。
真核細胞核でのポリアデニル化の対象は、RNAポリメラーゼIIにより作られるmRNA前駆体などである。多タンパク複合体(構成要素は右表)が3' 末端近くを開裂し、そこからポリA化が始まる。開裂は酵素CPSFによって触媒され、結合部位から10–30塩基下流で起こる。この部位にはよくAAUAAA配列があるが、多少変化してもCPSFは結合することができる。別の2つのタンパク、CstFとCFIもこれに関与し、CstFはCPSF結合部位の下流にあるGUリッチ領域と結合する。CFIはさらに別の箇所(哺乳類ではUGUAA配列)を認識し、AAUAAA配列が失われてもCPSFを媒介することができる。ポリアデニル化シグナル(開裂複合体に認識される配列モチーフ)は分類群によって変化する。ヒトのポリA化部位はほぼAAUAAA配列を含むが、この配列は植物・菌類では珍しい。
CstFはRNAポリメラーゼIIとも結合しているため、転写後すぐに開裂を行うことができる。詳しくは分かっていないが、開裂にはCFIIというタンパクも関わる。ポリA化シグナルに伴う開裂部位は、50塩基程度は変化することができる。
RNAが開裂するとポリAポリメラーゼによるポリA化が始まり、ATPを用いてポリA鎖を伸長させていく。その後、別のタンパクPAB2が短く新しいポリA鎖に結合し、RNAとポリAポリメラーゼの親和性を増加させる。ポリA鎖が約250塩基に達すると酵素はCPSFから外れ、ポリA化は終了する。CPSFはRNAポリメラーゼIIと接触し、転写終結を伝達する。ポリA化機構はRNAイントロンを除去するスプライソソームとも物理的に結合している。
ポリA鎖はポリA結合タンパク質結合部位として機能する。ポリA結合タンパクはRNAの核外移送・翻訳を促進し、分解を妨げる。酵母では、ポリA鎖を短縮しmRNAの核外移送を可能にするポリAヌクレアーゼの結合も媒介する。mRNAはポリA結合タンパクと共に細胞質に移送されるが、移送されなかったmRNAはエキソソーム複合体によって分解される。ポリA結合タンパクは翻訳に影響する様々なタンパクの結合も媒介し、その内の1つが40Sリボソームサブユニットを媒介するeIF4Gである。だが、ポリA鎖は全てのmRNAの翻訳に不可欠というわけではない。
真核生物体細胞では、細胞質にあるmRNAのポリA鎖は次第に短くなり、翻訳が妨げられて分解が促進される。だが、これが起こるにはかなり時間がかかる。このプロセスは、mRNAの3' 非翻訳領域と相補的なmiRNAによって加速される。卵母細胞では、ポリA鎖が短縮されたmRNAは分解されないが、代わりに翻訳されずに貯蔵される。このRNAは卵母細胞活性化中に、細胞質でのポリA化によって再活性化される。
動物では、ポリAリボヌクレアーゼ(PARN)は5'キャップに結合しポリA鎖から塩基を除去する。5'キャップ・ポリA鎖の保護はmRNA分解の制御に重要である。RNAの5'キャップに翻訳開始因子4E(eIF4E)、かつポリA鎖に翻訳開始因子4G(eIF4G)が結合している場合、PARNによる脱アデニル化は減少する。脱アデニル化はRNA結合タンパクにも制御される。一旦ポリA鎖が除去されると5' キャップも除去され、RNAは分解される。酵母からは、脱アデニル化に関わると見られる他の酵素も見つかっている。
多くのコード遺伝子は複数のポリアデニル化部位を持つため、3' 末端が異なる複数のmRNAをコードしているといえる。代替ポリA化は3' 非翻訳領域の長さを変更するため、それが含むmiRNA結合部位も変更される。転写産物を安定化するmiRNAもあるが、miRNAは翻訳を抑制し、それが結合したmRNAの分解を促進する傾向がある。代替ポリA化はコーディング領域を短縮し、別のタンパクを作ることもあるが、3' 非翻訳領域の短縮よりは珍しい。
ポリA化部位の選択は細胞外からの刺激に影響される他、ポリA化酵素の発現にも依存する。例えば、マクロファージのリポ多糖(免疫応答を起こす細菌分泌物)への反応として、切断刺激因子(CstF)のサブユニットCstF-64の発現が上昇する。この結果ポリA化部位が変更され、防御タンパクmRNA(例えばリゾチームやTNF-α)の3' 非翻訳領域の調節エレメントが除去される。このようなmRNAは長い半減期を持ち、より多くのタンパクを作る。ポリA化機構以外のRNA結合タンパクもポリA化部位の選択に影響し、例えばポリA化シグナルの近くをDNAメチル化する、などの方法で行われる。
動物の初期胚発生、または神経細胞のシナプス後段では細胞質でのポリA化が行われる。短縮したポリA鎖を伸長することで、mRNAを翻訳することができる。短縮した鎖は約20塩基だが、伸長された鎖は80–150塩基になる。
マウス初期胚では母親由来のRNAを細胞質ポリA化することで、2細胞期の途中(ヒトでは4細胞期)まで転写が始まらないにもかかわらず、細胞は成長することができる脳では、細胞質ポリA化は記憶の形成に重要な長期増強に関わり、学習中に活性化される。
細胞質ポリA化はRNA結合タンパクCPSF・CPEBを必要とし、Pumilioのような他のRNA結合タンパクも関わる。細胞の種類により、核と同じポリAポリメラーゼ(PAP)・細胞質ポリメラーゼのGLD-2のどちらかが用いられる。
少なくとも酵母では、tRNA・rRNA・snRNA・snoRNAを含む多くの非コードRNAで、ポリA化はRNA分解を促進する。核においてはTRAMP複合体により、約40個の塩基が3' 末端に付加されることでポリA化が行われ、その後エキソソーム複合体により分解される。ポリA鎖はヒトrRNA断片からも発見され、Aのみのホモポリマー・ほぼAのヘテロポリマーの両方が見られる。
多くの細菌はmRNA・非コードRNA双方をポリA化できる。ポリA鎖はデグラドソームの2つのRNA分解酵素、PNPaseとRNaseEの働きを促進する。特有の二次構造が3' 末端をブロックしていても、ポリA鎖でRNAを伸長することでPNPaseは新しい3' 末端に結合することができる。伸長と分解を繰り返すことで、PNPaseは少しずつ二次構造を解体していく。ポリA鎖はエンドリボヌクレアーゼでの分解も促進する。細菌のポリA鎖は約30塩基の長さである。
動物・トリパノソーマのミトコンドリアは安定なポリA鎖・不安定なポリA鎖双方を持つ。不安定な鎖はmRNAと非コードRNA双方で見られる。ポリA鎖は平均43塩基である。安定な鎖では、ゲノムが終止コドン(UAA)のU・UAまでしかコードしていないため、ポリA鎖は終止コドンの一部となっている。植物ミトコンドリアは不安定なポリA鎖しかもたず、酵母ミトコンドリアはポリA鎖を全く持たない。
多くの細菌・ミトコンドリアはポリAポリメラーゼを持つが、PNPase自身もポリA化を行う。この酵素は細菌、ミトコンドリア、葉緑体、古細菌エキソソーム複合体の構成部品に見られる。Aへの選択性は完全ではないが、ほぼAのみを用いて3' 末端を伸長できる。葉緑体でも細菌のように、PNPaseによるポリA化はRNA分解を促進し、おそらく古細菌でも同じである。
ポリA化はあらゆる生物に見られるわけではない。だが、全ドメインの大部分の生物がこの機能を持つことから、全生物の共通祖先がおそらく何らかのポリA化機構を持っていたと推定される。mRNAをポリA化しない生物は、進化の過程でこの機能を喪失したと考えられる。その実例は細菌"Mycoplasma gallisepticum" ・高度好塩菌"Haloferax volcanii"から得られたmRNAのみで、真核生物では確認されていない。
最も古いポリA化酵素は、RNAを分解する複合体(細菌ではデグラドソーム、古細菌ではエキソソーム複合体)の一部であるPNPaseである。この酵素はRNAを3' 末端から加リン酸分解し、NDPに変換する。この反応は可逆なため、RNAにヌクレオチドを付加して伸長させることもできる。エネルギー通貨であるATPが他のNTPより高濃度であるため、伸長した鎖はAリッチである。RNA分解へのAリッチ鎖の関与が、その後のポリAポリメラーゼ(純粋なポリA鎖の合成酵素)の進化を促したことが示唆されている。
ポリAポリメラーゼの起源は古くなく、tRNAの3' 末端を終端するCCA付加酵素から、細菌と真核生物で独立に進化した。その活性ドメインは他のポリメラーゼと相同である。真核生物への、細菌のCCA付加酵素遺伝子の水平伝播により、古細菌様CCA付加酵素がポリAポリメラーゼに機能を変更することができたと推測されている。古細菌や藍藻はポリAポリメラーゼを進化させなかった。
ポリA化は1960年、細胞核抽出物内の酵素が、ATPをポリアデニンに変換したことから発見された。多様な細胞から見つかっていたにもかかわらず、1971年にポリA配列がmRNAから見つかるまでその機能は不明のままだった。当初は3' 末端をヌクレアーゼから保護するだけと考えられていたが、その後に核外移送や翻訳の際に果たす役割が解明された。関与するポリメラーゼは1960年代に精製され、1970年代に特定されたが、それを制御する無数の補助タンパクが発見されたのは1990年代始めになってからだった。