ミューズ細胞
ミューズ細胞（ミューズさいぼう、）は生体に内在する非腫瘍性の多能性幹細胞であり、ほぼすべての組織の結合組織や骨髄、末梢血に存在している。ヒト線維芽細胞やヒト骨髄間葉系細胞、脂肪由来幹細胞などの市販の間葉系細胞からも単離することができ、自発的に、またはサイトカインの誘導により単細胞から体を構成する要素である外胚葉系、中胚葉系、内胚葉系の細胞に分化することができる。さらに、この３胚葉性の分化能は自己複製可能である。多能性幹細胞の関連遺伝子の発現を認めるが、腫瘍性に関連する遺伝子は体細胞レベルと同等で低く、テロメラーゼ活性も低く抑えられているため、無限増殖を行わない。従ってミューズ細胞は生体に移植されても腫瘍形成の危険が極めて低い。ミューズ細胞は2010年に東北大学の出澤真理教授のグループによってはじめて発見・報告された。2018年1月には三菱ケミカルホールディングスグループ傘下の株式会社生命科学インスティテュートが急性心筋梗塞患者を対象とした探索的臨床試験を開始している。ミューズ細胞は未分化ヒトES細胞などの多能性幹細胞のマーカーとして知られているSSEA-3を発現している細胞として同定された。またCD105、 CD90、 CD29などの一般的な間葉系幹細胞マーカーも発現しており、間葉系幹細胞と多能性幹細胞の両マーカーを同時に発現している細胞でもある。抗SSEA-3抗体を使用して単離したミューズ細胞のサイズはおよそ直径13-15μmである。ミューズ細胞はCD34 (造血幹細胞、脂肪幹細胞、VSELsのマーカー)やCD117 (造血幹細胞のマーカー)、Snai1・Slug (共に皮膚前駆細胞のマーカー), CD271・Sox10 (共に神経堤由来幹細胞のマーカー)、NG2・CD146 (共に血管周囲細胞のマーカー)、CD31・von Willebrand factor (共に血管内皮前駆細胞のマーカー)をすべて発現していないことから、これまでに報告のあったどの幹細胞とも異なる幹細胞である。
ミューズ細胞は培養系において、以下のようなマーカー陽性の細胞に自発的、またはサイトカインによる誘導で分化することが報告されている。ヒト皮膚繊維芽細胞由来ミューズ細胞からサイトカインカクテルを用いて誘導されたメラニン産生細胞(メラノサイト)は生体の皮膚に移植された後も脱落することなく生着し、そのままメラニンを産生し続けることが土山らによって確認されている。
ヒトミューズ細胞が血中へ注入されると損傷部位へ遊走・生着した後に、自発的にその組織を構成する細胞へと分化し、組織修復へと寄与することが以下の損傷モデル動物で確認されている。ミューズ細胞の特徴として、腫瘍形成能の指標の一つであるテロメラーゼ活性が低いことが挙げられる。Hela細胞やiPS細胞ではこのテロメラーゼ活性が高いことが報告されているが、一方でミューズ細胞では線維芽細胞のような正常体細胞の活性と同程度である。このことはミューズ細胞が腫瘍形成能をもたない理由の一つである。
ミューズ細胞における多能性関連遺伝子の「発現パターン」はES細胞やiPS細胞とほぼ同じであるが、その「発現レベル」は低い。一方、ミューズ細胞での細胞増殖関連遺伝子の発現は正常体細胞と同レベルであり、ES細胞やiPS細胞と比べて低い。これらのことはミューズ細胞が多能性を示す一方で腫瘍形成能を示さない理由と考えられる。
幹細胞の腫瘍原性を調べる際に行われる免疫不全マウスの精巣内への移植実験において、ミューズ細胞は移植後6カ月経過してもテラトーマは形成されなかった。したがって、ミューズ細胞は多能性幹細胞でありながら腫瘍形成能を持たない細胞である。同様の例として、特定条件下で培養されたエピブラスト幹細胞は"in vitro"で多能性を示す一方、マウス精巣内に移植してもテラトーマを形成しなかったとの報告がある。従ってテラトーマの形成はあくまでも腫瘍原性の確認とその場合の多能性の証明法の一つであり、そもそも多能性幹細胞が常にテラトーマを形成するわけではないことに留意する必要がある。
ミューズ細胞は生体内で組織修復を担っている細胞である可能性がある。脳梗塞患者では、発症後24時間で末梢血中のミューズ細胞数が統計的有意差をもって増加することが報告されている。心筋梗塞患者の末梢血中の内因性ミューズ細胞の動態解析では、発症急性期に血液中のミューズ細胞が増加した患者では半年後、心機能回復や心不全回避の傾向が見られた。一方、急性期に増加しなかった患者ではこれらの効果を示さない傾向が見られた。このことから、内因性のミューズ細胞は傷害を受けた臓器の修復に関わっていることが示唆されている。
また実験的には、遺伝子導入やサイトカイン処理が施されていないミューズ細胞をそのまま静脈投与すると、損傷部位へと遊走・生着し、その組織に適した細胞へと自発的に分化して組織修復や機能回復をもたらすことが動物モデルで示されている。
また局所投与によっても同様に傷害部位へ遊走・生着し、組織に適した細胞に自発分化し、組織修復と機能回復をもたらすことが報告されている。
サイトカイン処理も人為的な遺伝子操作も必要なく、ただ血中に注入するだけで組織が修復できることは、再生医療での大きな利点である。現在、三菱ケミカルホールディングスグループ傘下の株式会社生命科学インスティテュートにより医薬品製造品質管理基準(GMP)および再生医療等製品に関わる規制要件(GCTP)を満たす細胞処理手順が確立されて、2018年1月より急性心筋梗塞患者を対象とした探索的臨床試験の治験が開始されている。
ミューズ細胞の持つ多能性 (多能性関連遺伝子の発現、3胚葉性細胞への分化、自己複製能)はヒト骨髄穿刺液から直接単離した細胞でも確認されており、培養操作により獲得したものではないことが示されている。
生体に存在する
ミューズ細胞は各種臓器の結合組織や末梢血、骨髄にもともと存在している多能性幹細胞であり、骨髄中では単核球細胞のうち、およそ3000個に1個の割合で存在することが示されている。培養を経ずにSSEA-3を指標に直接骨髄液から単離したミューズ細胞は、多能性因子の発現、3胚葉性分化、自己複製を示す。この事から、ミューズ細胞の示す多能性はストレスやサイトカイン、人為的な遺伝子操作などによって誘導されたものではないと言える。
周囲の環境による二面性
ミューズ細胞は結合組織中や骨髄内での接着環境、あるいは接着培養など、足場に接着できる状況では線維芽細胞様の形態を示すが、血中や浮遊培養などの浮遊環境に置かれることによって多能性因子の発現が顕著に亢進し、１細胞から増殖してES細胞様胚葉体を形成することが知られている。
ES細胞の胚様体のようなクラスターの形成
ミューズ細胞を浮遊培養で1細胞から培養すると増殖し、ES細胞由来の胚様体に似たクラスターを形成する。このクラスターは多能性幹細胞の指標であるアルカリフォスファターゼ、Nanog, Oct3/4, Sox2, PAR4の発現が接着状態のミューズ細胞よりも顕著に亢進することが報告されている。浮遊培養で形成されたクラスターはゼラチンコートした培養皿上に移動させると接着し、間もなくクラスターから細胞が増殖して広がっていく。増殖した細胞には外胚葉、中胚葉、内胚葉に属する細胞が含まれていることから、ミューズ細胞は1細胞から三胚葉性の細胞に自発的に分化する能力を有すると言える。
増殖速度
ミューズ細胞の細胞分裂速度は接着培養下で約1.3日程度であることが報告されており、線維芽細胞の約1日程度と比べて同等かあるいは若干遅いといえる。
ミューズ細胞は自己複製能を持ち、多能性幹細胞マーカーの発現を維持したまま増殖し、1細胞から3胚葉性の細胞への分化能力も自己複製されることが報告されている。また、その核型は正常が維持される。
ミューズ細胞は外来で採取可能な骨髄穿刺液から単離することができる。また、生検で得られる皮膚組織や、脂肪吸引で得られる脂肪組織からも採取可能である。脂肪吸引は美容外科で頻繁に行われる、安全かつ非侵襲的な処置であり、こういった組織からミューズ細胞が簡単に採取できることは、再生医療分野で自家/他家移植の両方に用いることが可能であることを示唆する。
ミューズ細胞はまた、市販の間葉系幹細胞（線維芽細胞や骨髄間葉系幹細胞、脂肪幹細胞など）からも採取することができ、容易に入手することが可能である。
以下はミューズ細胞のソースとして確認されているものである。ヤギ皮膚由来線維芽細胞から得られたSSEA-3陽性のクラスターは幹細胞様の形態を示し、アルカリフォスファターゼ陽性であった。[24]ウサギの骨髄からミューズ細胞が単離され、3胚葉性の分化等が再現されている。[34]またin vitro/in vivoの両方で三胚葉性の細胞へ分化する一方、浮遊状態で8回継代した後も未分化な状態を維持していたとの報告がある。
ミューズ細胞は以下のような方法で採集することができると報告されている。
組織や市販の細胞からSSEA-3陽性、またはSSEA-3/CD105両陽性の細胞として単離することができる。組織から採集する場合、SSEA-3/CD105の両方を指標としても良いが、培養間葉系細胞は大半がCD105あるいはCD90陽性のため、SSEA-3の単独染色で十分可能である。
ミューズ細胞の単離に関する一連の流れは以下のようになっている。培養間葉系幹細胞に対してストレス処理を行うことで、ある程度ミューズ細胞が濃縮できることが報告されている。ヒト皮膚由来線維芽細胞では16時間、ヒト骨髄間葉系細胞では8時間のトリプシン処理が濃縮に有効であったと報告されている。ただしこの処理はミューズ細胞を精製するのではなく、あくまでも濃縮するためのものであるため、移植実験や分化誘導などの厳密なミューズ細胞を使用して行う必要がある実験では上記のFACSによる単離の方が望ましい。
上記の長時間トリプシン処理よりもさらに過酷なストレス処理により、ミューズ細胞の高い濃縮細胞群が得られるとの報告がある。この報告では脂肪吸引液に対して特定のストレス処理を行うと最終的にミューズ細胞が高率に生き残り、その他の多くの細胞が死滅する。処理手順は以下のとおりである。このような手順で得られたミューズ細胞は、脂肪由来幹細胞とは異なる細胞集団であると報告されている。
間葉系幹細胞から単離したSSEA-3陽性のミューズ細胞と、それ以外のSSEA-3陰性の間葉系幹細胞（非ミューズ細胞）を比較した場合、大きく異なる点がいくつか報告されている。ヒト線維芽細胞中に存在するSSEA-3陽性細胞から効率的にiPS細胞が誘導されるとの報告が2009年にされている。さらに2011年にはヒト線維芽細胞の中の数パーセントを構成するミューズ細胞からのみiPS細胞が樹立され、一方ミューズ細胞を除いた線維芽細胞からは山中４因子を導入してもNanogやSox2などの多能性因子の発現が見られずiPS細胞も誘導されないことが報告された。これらの結果はiPS細胞の樹立は確率論的に誘導されるというstochastic modelではなく、特定の細胞集団から誘導されるというelite modelに従っていることを示唆している。ミューズ細胞はもともと多能性幹細胞であるため、iPS細胞との大きな違いは腫瘍形成能の有無である。つまりもともと細胞集団内に存在していた、多能性ではあるが腫瘍形成能のない幹細胞に対して山中因子が腫瘍形成能を与える事でiPS細胞ができるという可能性が示唆されている。
ヒト線維芽細胞由来ミューズ細胞から色素を作る機能的なメラノサイトが誘導されることが報告されている。ヒト線維芽細胞をミューズ細胞と非ミューズ細胞に分け、それぞれサイトカイン (Wnt3a, SCF, ET-3, bFGF, linoleic acid, cholera toxin, L-ascorbic acid, 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate, insulin, transferrin, selenium, and dexamethasone)で処理したところ、ミューズ細胞はL-DOPA反応性を示す機能的なメラノサイトへと分化したが、非ミューズ細胞は誘導によってメラノサイト関連因子の一部を一過性に発現したものの、最終的には機能的なメラノサイトには分化しなかった。上皮をミューズ細胞由来メラノサイトとケラチノサイト、真皮をI型コラーゲンと線維芽細胞で模した皮膚の三次元培養モデルでは、ミューズ細胞由来メラノサイトがメラニン色素を産生することが確認されている。さらにin vivoにおいても、SCIDマウスの背中に移植されたミューズ細胞由来メラノサイトは上皮の基底層に生着し、メラニンを産生することが確認されている。
複数のソースから得られたミューズ細胞が、様々な細胞種へと分化することが報告されている。
ヒト線維芽細胞由来ミューズ細胞は、メラノサイトへの誘導のソースである。ミューズ細胞と非ミューズ細胞を各種サイトカイン (Wnt3a, SCF, ET-3, bFGF, linoleic acid, cholera toxin, L-ascorbic acid, 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate, insulin, transferrin, selenium, and dexamethasone)で処理すると、最終的にミューズ細胞のみがL-DOPA反応性の機能的なメラノサイトへと分化し、三次元皮膚培養モデルでは実際にメラニンを産生することも確認された。
ヒト脂肪組織由来Muse細胞は、ゼラチンコートディッシュ上で自発的に、もしくはBMP4やall-trans-Retinoic acidなどのサイトカイン処理により角化細胞へと分化する。
ヒト骨髄由来または線維芽細胞由来ミューズ細胞は、ゼラチンコートディッシュ上で培養すると神経系の細胞へと自発的に分化することができる。単一のミューズ細胞由来のクラスターをゼラチンコートしたディッシュ上で培養すると、神経系細胞のマーカーであるnestin (1.9%), MAP-2 (3.8%), GFAP (3.4%), O4 (2.9%)陽性細胞へと分化することが確認されている。これらの結果はミューズ細胞が神経系の細胞へと分化可能であることを示している。MAP-2もしくはGFAP陽性細胞の割合は、bFGF, forskolin, CNTF存在下で培養することで増加する。
ミューズ細胞はゼラチンコートディッシュ上で培養することでDLK, α-フェトプロテイン, サイトケラチン18, サイトケラチン19陽性の肝細胞へ分化する。また、ITS, デキサメタゾン, HGF, FGF-4存在下で培養することでα-フェトプロテインおよびアルブミン発現細胞へと分化する。
ミューズ細胞をall-trans-Retinoic acid、activin A, BMP7存在下で3週間培養すると腎臓のマーカーであるWT1, EYA1を発現する。
5' -azacytidine存在下でミューズ細胞を培養後、初期心筋分化因子であるWnt-3a, BMP-2/4, TGFβ1存在下で接着培養し、その後さらに後期心筋分化因子であるcardiotrophin-1を含む培地で培養することで横紋様の模様を持ち、α-actininおよびtroponin-Iを発現する心筋様細胞へと分化する。
ミューズ細胞のクラスターから培養した細胞は、1-methyl-3-isobutylxanthine, dexamethasone, insulin, indomethacinを含む培地で培養することで、脂肪滴を持ち、oil red Oで染色される脂肪細胞へと分化する。また、dexamethasone, ascorbic acid, and β-glycerophosphateを含む培地で培養することで、オステオカルシン陽性の骨細胞へと分化する。
様々な組織から単離されたミューズ細胞が、疾患動物モデルで損傷修復効果を示している。
急性心筋梗塞モデルのウサギに骨髄由来ミューズ細胞を静脈経由で自家移植・他家移植・異種移植（ヒト）すると、3日目ですでに投与された細胞の14.5%程度が梗塞部へと選択的に遊走・生着することが認められた。ミューズ細胞はS1P (sphingosine monophosphate)　receptor 2を使い、傷害部位から産生されたS1Pに向かって遊走することで、静脈投与であっても選択的に傷害部位に集積できると考えられる。遊走・生着後、ミューズ細胞は自発的にcardiac troponin-I, sarcomeric α-actinin, connexin-43陽性の心筋や血管の細胞へと分化していた。また、GCaMP3を導入したミューズ細胞は、心電図と同期してGCaMP3蛍光のオンオフが確認されたことから、ミューズ細胞が生理学的に機能性を持つ心筋細胞へと分化し、周辺のホストの心筋細胞とも連結をしていることが示唆された。ミューズ細胞を移植した場合の梗塞サイズは、コントロール群と比較して52％程度減少(骨髄間葉系幹細胞MSC移植群と比べて2.5倍の縮小)し、心拍出量ejection fractionは38%程度増加(MSC移植群と比べて2.1倍の増加)した。ウサギーウサギの他家移植およびヒトーウサギの異種移植でもミューズ細胞は損傷部位に生着し、心筋細胞に自発的に分化することで機能回復に貢献していた。中でも他家移植の場合には、免疫抑制剤なしで最長6カ月の間、組織に心筋細胞として生着し続け、機能回復に貢献し続けていたことが確認されている。
ミューズ細胞の神経再生能については複数のモデルで示されている。
虚血再灌流による中大脳動脈閉塞（MCAO）ラット脳卒中モデルにおいて、3×10個のヒト皮膚由来ミューズ細胞を局所注射にて梗塞領域内の3カ所 (1カ所あたり1×10個)に投与したところ、2.5カ月の時点でコントロール群と比較して統計的に有意な機能回復が見られた。機能回復はミューズ細胞がラットの錐体路や感覚路へ生着したことで、後肢体性感覚誘発電位が正常に戻ったためであるとみられている。同様に、ヒト骨髄由来ミューズ細胞をマウスの永続的MCAOモデルやマウス小空洞性脳卒中モデルに局所注射した実験でも梗塞部位に生着し、神経細胞やオリゴデンドロサイトへと分化していたことが報告されている。マウス小空洞性脳卒中モデルではヒトミューズ細胞由来神経細胞は錐体路を形成する神経細胞に分化し、統計的に有意な機能回復をもたらした。マウス脳内出血モデルでもヒト骨髄由来ミューズ細胞を局所注射したところ、自発的に神経細胞へと分化した。このモデルではマウスは運動機能と空間学習、さらには記憶能力を回復した。
静脈注射によるヒト骨髄由来ミューズ細胞の投与により、CCL-4による肝硬変モデル免疫不全マウスの機能回復が見られた。この実験では移植されたマウス自身の肝細胞と融合することなく、ヒトミューズ細胞は自発的に肝細胞へと分化していた。さらには成熟した機能的肝細胞のマーカーであるヒトCYP1A2（解毒酵素）やヒトGlc-6-Pase（糖代謝のための酵素）を投与8週の時点で発現していた。
ヒト骨髄由来ミューズ細胞を肝部分切除モデル免疫不全マウスに静脈投与した場合、損傷部位への遊走後に肝臓の主要構成細胞である肝細胞(生着したGFP陽性ミューズ細胞の74.3%)、胆管細胞 (同17.7%)、類洞血管内皮細胞(同2.0%)、クッパー細胞(同6.0%)へとそれぞれ自発的に分化していた。
どちらのモデルにおいても、非ミューズ細胞を移植した場合は移植後数日から実験終了時までのどの段階でも、肝臓内に検出されなかった。従って肝細胞への分化も見られなかった。
ヒト骨髄由来ミューズ細胞を巣状分節性糸球体硬化症モデルのSCIDやBALB/cマウスに免疫抑制剤なしで静脈投与したところ、選択的に腎臓糸球体に生着し、自発的に糸球体構成細胞に分化することで腎機能回復をもたらした。静脈投与されたミューズ細胞は傷害を受けた糸球体へと遊走し、マウス自身の細胞と融合することなく、自発的に足細胞 (podocin陽性、～31%)、メサンギウム細胞 (megsin陽性、～13%)、血管内皮細胞 (CD31陽性、～41%)へと分化していた。その結果、糸球体硬化症と間質性線維症は軽減され、統計的有意差のあるクレアチニンクリアランスなどの腎機能の回復がもたらされた。
ヒト脂肪組織由来ミューズ細胞を濃縮した細胞群は、I型糖尿病モデルマウスの皮膚潰瘍の創傷治癒を有意に加速した。皮下に移植されたミューズ細胞は上皮と真皮に生着し、角化細胞や血管内皮細胞などへと自発的に分化した。ミューズ細胞を移植されたモデルマウスの潰瘍の治癒速度は非ミューズ細胞を移植されたマウスに比べて統計的有意差をもって早く、完治までにかかる時間は野生型のマウスよりもむしろ短かった。また上皮の厚みも増していた。
ヒト骨髄由来ミューズ細胞を大動脈瘤モデルSCIDマウスへ静脈経由すると、8週目には大動脈瘤の拡張が顕著に改善され、そのサイズはコントロール群のおよそ45.6%となっていた。移植されたミューズ細胞は動脈瘤の外膜側から内腔側へと侵入している様子も観察された。組織学的解析ではミューズ細胞が血管内皮細胞や血管平滑筋細胞へと自発的に分化しており、さらに血管を構成する弾性線維が産生されていることが確認された。
ミューズ細胞は健常なヒト骨髄に存在しており、末梢血中のミューズ細胞の数は脳卒中患者では発症の24時間後に劇的に上昇することが報告されている。急性心筋梗塞患者においては末梢血中のミューズ細胞の数は発症の24時間後に、血清中のスフィンゴシン1リン酸(S1P)の濃度とともに有意に上昇し、2～3週間以内に元のレベルまで戻る。重要な点は、急性期に末梢血中のミューズ細胞数が上昇した患者は、発症後6カ月の時点での心機能の回復や心不全の回避が見られる点であり、これは患者自身に内在しているミューズ細胞が組織の修復機能を持っていることを示唆している。現在、三菱ケミカルホールディングスグループ傘下の株式会社 生命科学インスティテュートにより医薬品製造品質管理基準(GMP)および再生医療等製品に関わる規制要件(GCTP)を満たす細胞処理手順が確立され、2018年1月より急性心筋梗塞患者を対象とした探索的臨床試験が開始されている。