Enzim restriksi
Enzim restriksi atau endonuklease restriksi adalah enzim yang memotong molekul DNA. Enzim ini memotong DNA pada rangka gula-fosfat tanpa merusak basa. Setiap enzim mempunyai sekuens pengenalan yang unik pada utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang basa.
Pada akhir 1960-an, ilmuwan Stewart Linn dan Werner Arber mengisolasi dua contoh enzim yang berperan dalam menghambat pertumbuhan bakteriofag yang menyerang "E. coli". Salah satu enzim bekerja memetilasi DNA, sedangkan enzim yang satunya bekerja memotong DNA yang tidak termetilasi pada beberapa lokasi di sepanjang molekul DNA. Enzim yang pertama disebut metilase ("methylase"), sedangkan enzim yang satunya disebut nuklease restriksi ("restriction nuclease"). Kemudian pada tahun 1968, H.O. Smith, K.W. Wilcox, dan T.J. Kelley, yang bekerja di Johns Hopkins University, mengisolasi dan mengkarakterisasi enzim nuklease restriksi pertama. Enzim ini berasal dari bakteri "Haemophilus influenzae", dan diberi nama HindII. Enzim ini selalu memotong molekul DNA pada sekuen spesifik dengan panjang situs pengenalan enam pasang basa.
Sekuen pengenalan atau sering disebut juga situs pengenalan merupakan sekuen DNA yang menjadi tempat menempelnya enzim restriksi dan melakukan pemotongan pada sekuen tersebut. Panjang sekuen pengenalan enzim restriksi berbeda-beda, seperti enzim EcoRI, SacI, dan SstI mempunyai sekuen pengenalan sepanjang 6 pasang basa, sedangkan NotI 8 pasang basa, dan Sau3AI hanya 4 pasang basa. Kebanyakan dari enzim restriksi bersifat palindromik ("palindromic") yang berarti sekuen pengenalan sama jika dibaca dari 5’formula_13’ baik utas atas maupun utas bawah. Contohnya adalah HindIII dengan situs pengenalan 5’-AAGCTT-3’ (utas atas)/3’-TTCGAA-5’ (utas bawah).
Enzim restriksi yang berbeda, dapat mempunyai situs pengenalan yang sama, contohnya: SacI dan SstI. Ezim yang mempunyai situs pengenalan yang sama disebut dengan istilah "isoschizomers". Dalam beberapa kasus, "isoschizomers" juga memotong DNA pada tempat yang sama, namun beberapa tidak demikian.
Situs pengenalan pada enzim restriksi dapat pasti atau ambigu. Seperti contohnya pada BamHI, enzim ini sudah pasti memotong pada sekuen GGATCC. Sementara itu, situs pengenalan HinfI adalah GANTC. N dalam situs pemotongan HinfI berarti dapat diganti oleh basa apa saja, inilah yang dimaksud dengan situs ambigu. Contoh lainnya situs ambigu adalah XhoII. Enzim ini mempunyai situs pemotongan PuGATCPy. Pu merupakan singkatan dari purin (basa A atau G), sedangkan Py merupakan singkatan dari pirimidin ("pyrimidine") (basa T atau C). Jadi XhoII dapat mengenali dan memotong sekuen AGATCT, AGATCC, GGATCT dan GGATCC.
Situs pengenalan satu enzim, dapat mengandung situs pengenalan enzim lainnya Situs pengenalan BamHI mengandung situs pengenalan Sau3AI. Oleh karena itu, semua sekuen pemotongan BamHI akan dipotong oleh Sau3AI, tetapi tidak sebaliknya.
Panjang dari sekuen pengenalan memengaruhi seringnya enzim restriksi memotong DNA dalam ukuran tertentu. Misalnya pada enzim yang memiliki panjang 4 basa, enzim ini diperkirakan akan memotong setiap 256 nukleotida. Perhitungan tersebut diperoleh dengan mengasumsikan setiap basa mempunyai kemungkinan yang sama untuk muncul, yaitu sebesar 1/4 (kemungkinan muncul 1 dari 4 basa). Jadi jika sekuen pengenalan mempunyai panjang 6 basa, maka perhitungannya menjadi: (1/4) = 1/4096. Perhitungan ini hanya sebagai perkiraan, pada kenyataannya belum tentu demikian. Beberapa sekuen bisa jadi lebih sering atau lebih jarang ditemui dalam suatu organisme. Seperti pada mamalia, sekuen CG sangat jarang ditemui sehingga enzim HpaII yang mempunyai sekuen pengenalan CCGG akan lebih jarang memotong pada DNA mamalia.
Enzim restriksi yang mempunyai sekuen pengenalan yang pendek akan menghasilkan banyak potongan DNA; sedangkan jika mempunyai sekuen pengenalan yang panjang, akan dihasilkan potongan DNA yang lebih sedikit. Baik enzim yang mempunyai sekuen pemotongan pendek maupun panjang, mempunyai fungsi masing-masing dalam rekayasa genetika.
Beberapa enzim sering yang digunakan dalam laboratorium dibagi menjadi tiga berdasarkan perkiraan pemotongan:
Ezim restriksi yang tergolong dalam 6-"cutters" memiliki situs pemotongan yang spesifik pada 6 nukleotida. Ezim ini cocok digunakan untuk pekerjaan kloning sehari-hari karena enzim ini lumayan sering memotong satu atau dua situs pada plasmid, namun jarang memotong bagian penting seperti titik asal replikasi ("origin of replication") atau gen resisten ampisilin. Contoh enzim 6-"cutters" adalah HindIII (Aformula_2AGCTT) yang memotong genome bakteriofage lambda (48 kbp) pada 7 situs.
Enzim restriksi ini mempunyai situs pengenalan sepanjang 8 nukleotida; cocok digunakan untuk membentuk kromosom menjadi potongan-potongan yang spesifik dalam ukuran yang besar. Sebagai contoh: PacI (enzim 8-"cutters") memotong-motong kromosom "E. coli" menjadi 20 bagian, sedangkan BamHI (enzim 6-"cutters") memotong sekitar 300 bagian. Jika langsung menggunakan enzim 6-"cutters", maka fragmen yang dihasilkan terlalu kecil dan banyak. Untuk itu digunakan enzim 8-"cutters" terlebih dahulu, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan enzim 6-"cutters".
Enzim restriksi ini cocok untuk percobaan yang menginginkan pemotongan pada beberapa situs yang potensial. Contohnya: jika ingin mengumpulkan fragmen DNA secara acak, dan pada potongan tersebut terdapat gen yang diinginkan; dapat dilakukan digestsi parsial ("partial digestion") menggunakan enzim 4-"cutters".
Pada dasarnya, penamaan enzim restriksi diambil dari nama bakteri yang menghasilkan enzim tersebut. Seperti contohnya enzim EcoRI yang memiliki pola:
Enzim restriksi secara tradisional dibagi menjadi 3 tipe berdasarkan komposisi subunit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuens dan kofaktor yang diperlukan:
Enzim restriksi ini kompleks dengan "multisubunit", memotong DNA secara acak dan jauh dari sekuens pengenalannya. Pada awalnya enzim ini dikira langka; tetapi setelah analisis sekuens genom, enzim ini ternyata umum. Enzim restriksi tipe I ini memiliki pengaruh besar dalam biokimia, namun mempunyai nilai ekonomis yang rendah karena tidak dapat menghasilkan potongan fragmen DNA yang diinginkan sehingga tidak diproduksi.
Enzim ini memotong DNA dekat atau pada situs pengenalan. Enzim ini menghasilkan fragmen-fragmen sesuai dengan yang diinginkan sehingga biasa digunakan untuk analisis DNA dan kloning gen. Enzim tipe II yang umum digunakan adalah HhaI, HindIII, EcoRI, dan NotI; dan enzim-enzim tersebut tersedia secara komersil. Enzim ini tergolong kecil dengan subunit yang memiliki 200-350 asam amino dan memerlukan Mg sebagi kofaktor. Selanjutnya enzim jenis tipe II yang umum, biasanya digolongkan sebagai tipe IIs, adalah FokI dan AlwI. Enzim ini memotong di luar situs pengenalan, berukuran sedang, 400-650 asam amino, dan memiliki 2 domain khusus. Domain pertama untuk berikatan dengan DNA, sedangkan domain yang satunya untuk memotong DNA.
Enzim restriksi tipe II ini merupakan enzim restriksi yang tidak digunakan dalam laboratorium. Hal ini dikarenakan enzim ini memotong di luar situs pengenalan dan membutuhkan dua sekuen dengan orientasi berlawanan pada DNA yang sama untuk menyelesaikan pemotongan sehingga enzim ini jarang menghasilkan potongan sempurna.
Enzim restriksi pada umumnya bekerja pada pH 7,4; suhu 37 °C; dan memerlukan bermacam-macam kekuatan ionik, tergantung dari jenis enzimnya. Akan tetapi, beberapa enzim memerlukan optimasi khusus agar proses restriksi berjalan dengan baik. Dalam larutan stok, enzim restriksi biasanya dikemas bersama dengan 10X larutan penyangga reaksi yang telah dioptimasi. Buffer reaksi dapat digolongkan menjadi empat jenis berdasarkan kekuatan ionik-nya:
Ketika melakukan digesti dengan 2 atau lebih enzim restriksi yang berbeda buffer reaksinya, perlu dilihat rujukan tabel aktivitas enzim tersebut pada buffer reaksi tertentu. Misalnya: reaksi digesti dilakukan dengan menggunakan EcoRI (garam tinggi) dan HpaII (garam rendah, KCl). Setelah dilihat pada tabel, kedua enzim aktif pada keadaan garam sedang. Oleh karena itu, digunakan buffer reaksi dengan konsentrasi KCl sedang. Buffer reaksi yang digunakan adalah KCl karena HpaII memerlukan KCl, bukan NaCl; sedangkan EcoRI dapat menggunakan kedua garam tersebut.
Kondisi optimal ketika melakukan proses digesti sangat penting. Karena jika kondisi optimal tidak tercapai, enzim akan memotong secara tidak normal. Contohnya: EcoRI pada buffer reaksi dengan konsentrasi garam rendah tidak hanya memotong pada situs pengenalan normal Gformula_2AAATTC, namun akan juga memotong situs pengenalan formula_2AATT. Aktifitas seperti ini dinamakan "star activity".
Enzim restriksi yang biasa digunakan dalam laboratorium biologi molekuler memotong molekul DNA pada situs pengenalan dan menghasilkan salah satu dari ketiga jenis pola hasil pemotongan. Ketiga pola hasil pemotongan enzim restriksi sebagai berikut:
Enzim restriksi memotong secara asimetris pada situs pemotongan, menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 5’. Contoh enzim yang menghasilkan ujung menggantung 5’ adalah BamHI
Enzim restriksi ini juga memotong secara asimetris pada situs pengenalan, namun menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 3’. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah KpnI
Enzim ini memotong secara simetris antara kedua utas DNA sehingga menghasilkan ujung tumpul. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah SmaI
Pola ujung menggantung, baik yang 3’ ataupun 5’, sering disebut juga dengan ujung lengket ("sticky ends") atau ujung kohesif ("cohesive ends"). Pola seperti ini lebih mudah menempel ("annealing") dengan pasangan DNA nya karena adanya ikatan basa antara ujung-ujung yang menggantung.
Setelah proses inkubasi selesai, reaksi digesti enzim dapat dihentikan dengan menambahkan EDTA. Penambahan EDTA akan mengkelat ion logam; dalam reaksi ini ion logam yang dikelat adalah Mg. Untuk beberapa tipe enzim lainnya, inaktivasi dapat dihentikan dengan cara pemanasan; menggunakan pendenaturasi protein, contohnya fenol atau kloroform; atau memisahkan enzim dari DNA menggunakan kolom kromatografi.
Enzim restriksi yang umum digunakan berasal dari tipe II, berikut contohnya:
^nukleotida yang termetilasi