Fraksinasi sel
Fraksinasi sel atau fraksinasi subselular ialah teknik untuk memisahkan bagian-bagian sel. Secara umum, teknik ini melibatkan homogenisasi, yaitu pemecahan sel secara halus, dan sentrifugasi, yaitu pemisahan komponen-komponen sel oleh gaya sentrifugal dalam alat sentrifuge. Pemutaran homogenat di dalam sentrifuge akan memisahkan bagian-bagian sel ke dalam dua fraksi, yaitu pelet, yang terdiri atas struktur-struktur lebih besar yang terkumpul di bagian bawah tabung sentrifuge, dan supernatan, yang terdiri atas bagian-bagian sel yang lebih kecil yang tersuspensi dalam cairan di atas pelet tersebut. Supernatan dapat disentrifugasi kembali dengan kecepatan yang lebih tinggi untuk mendapatkan pelet yang lebih ringan atau kecil daripada pelet pertama. Dengan sentrifugasi diferensial, supernatan disentrifugasi dengan kecepatan yang makin tinggi sehingga didapatkan komponen yang makin kecil dalam pelet yang berurutan. Pelet tersebut dapat diresuspensi dan dimurnikan lebih lanjut dengan sentrifugasi densitas gradien.
Fraksinasi sel memungkinkan para ilmuwan mendapatkan komponen tertentu sel dalam jumlah besar dan mengidentifikasi fungsinya. Teknik ini pertama kali dikembangkan dan diperkenalkan pada tahun 1930-an dan 1940-an oleh Albert Claude serta Robert Bensley dan Normand L. Hoerr, dan kemudian sudah diterima secara luas pada akhir tahun 1950-an dan tahun 1960-an.
Fraksinasi sel diawali dengan homogenisasi atau pengacauan sel. Maksudnya ialah untuk memecah sel tanpa terlalu merusak organelnya. Beberapa teknik yang dijelaskan di bawah ini dapat digunakan untuk melakukan hal tersebut.
Larutan penyangga dengan tekanan osmotik rendah dapat digunakan sebagai komplemen teknik mekanis untuk menghancurkan sel. Dalam larutan penyangga semacam itu, air akan cenderung memasuki sel dan organel dengan cara osmosis sehingga sel menjadi pecah.
Alu penghomogen dapat digunakan untuk menghancurkan sel hewan dengan efektif namun lembut. Teknik ini merusak seluruh sel kecuali organelnya. Ada dua macam alu penghomogen, yaitu penghomogen Dounce dan Potter–Elvehjem.
Penghomogen Dounce terdiri dari sebuah tabung gelas, tertutup pada salah satu ujungnya, dan dua buah alu (piston) yang dapat masuk ke dalam tabung tersebut namun berbeda keketatannya. Jaringan sampel dipotong kecil-kecil dan dimasukkan ke dalam tabung penghomogen bersama larutan penyangga, lalu alu "L" ("loose", longgar) digunakan terlebih dahulu untuk menghancurkan jaringan tersebut menjadi campuran cair. Alu "T" ("tight", ketat) lalu digunakan untuk menghancurkan sel dan mengeluarkan isinya. Umumnya homogenisasi dilakukan dalam jumlah tertentu gerakan alu naik dan turun di dalam tabung.
Penghomogen Potter–Elvehjem bekerja dengan cara sama, namun alu-nya berbentuk lebih tabung sehingga gaya pemecahnya dapat disebar ke permukaan yang lebih luas. Penghomogen tipe ini juga tersedia dalam versi automatis dan bermotor.
"Blendor" Waring merupakan sejenis blender yang terdiri dari rotor berkecepatan tinggi dengan bilah pemotong yang dipasang di dalam wadah kaca. Seberapa hancurnya sel bergantung pada kecepatan putaran bilah. Pada kecepatan tinggi, alat ini dapat merusak mitokondria dan nukleus serta bahkan mendenaturasi protein. Alat ini paling banyak digunakan untuk jaringan tumbuhan dan hewan, namun kurang efektif untuk mikroorganisme.
Beberapa jenis alat dapat digunakan untuk menggerus sel. Dengan alat yang disebut disintegrator Edmund-Bühler, sel bakteri digetarkan bersama manik-manik kaca di dalam wadah berpembungkus. Sel pecah akibat tumbukan, sobekan, dan gesekan antarpermukaan keras. Agar tidak memanas, cairan pendingin dialirkan melalui pembungkus.
Dengan alat yang disebut bom Parr, sampel diberi gas nitrogen dengan tekanan sangat tinggi sehingga nitrogen memasuki cairan sel. Ketika tekanannya dihilangkan, gelembung-gelembung nitrogen meledak keluar dan merusak sel, namun tidak terlalu merusak organel.
Dengan menggunakan alat seperti sel tekanan French, sel dipecah dengan ekstrusi melalui lubang sempit dalam tekanan sampai 8.000 psi.
Salah satu cara efektif untuk memecah sel yang dapat diterapkan pada mikroorganisme ialah dengan gelombang bunyi berfrekuensi tinggi. Efisiensi pemecahan sel dipengaruhi oleh keluaran daya alat, durasi penggunaan, dan volume bahan yang diproses. Pendinginan dibutuhkan untuk mencegah pemanasan berlebihan.
Enzim dapat merusak sel dengan lembut dan spesifik untuk mengeluarkan isinya. Contohnya, dinding sel bakteri Gram positif dapat didigesti oleh enzim lisozim, sementara dinding sel tumbuhan dapat didigesti oleh selulase dan dinding sel fungi oleh kitinase.
Sentrifuge ialah instrumen tempat sampel cair diputar (disentrifugasi) mengelilingi sumbu vertikal. Sampel diletakkan di dalam wadah plastik atau gelas yang ditempatkan pada rotor yang menempel pada suatu poros vertikal yang dikendalikan oleh motor. Rotasi rotor membuat sampel mengalami percepatan sentripetal dan gravitasi buatan yang biasanya dinyatakan dalam perkalian percepatan gravitasi bumi. Mesin yang paling canggih, yang disebut ultrasentrifuge, dapat berputar secepat 80.000 rotasi per menit (rpm) dan memberikan gaya pada partikel-partikel sampel hingga 500.000 kali gaya gravitasi bumi (500.000 "g").
Sentrifugasi diferensial memisahkan komponen-komponen sel berdasarkan ukuran dan densitasnya. Secara umum, komponen yang berukuran paling besar akan mengalami gaya sentrifugal yang terbesar dan bergerak paling cepat. Pada kecepatan yang relatif rendah, komponen besar seperti nukleus akan mengendap membentuk pelet pada bagian bawah tabung sentrifuge. Pada kecepatan yang sedikit lebih tinggi, pelet mitokondria dapat terkumpul. Pada kecepatan yang lebih tinggi dan waktu sentrifugasi yang lebih lama, mula-mula vesikel kecil tertutup dan kemudian ribosom dapat dikumpulkan. Semua fraksi tersebut tidaklah murni, tetapi berbagai kontaminan dapat disingkirkan dengan meresuspensi pelet tersebut dan mengulang prosedur sentrifugasi beberapa kali.
Sentrifugasi gradien densitas memisahkan komponen sel berdasarkan densitasnya. Fraksi organel tidak murni yang didapatkan dari sentrifugasi diferensial dipindahkan ke atas larutan yang mengandung gradasi konsentrasi zat non-ionik, seperti sukrosa atau gliserol. Tabung tersebut kemudian disentrifugasi pada kecepatan tinggi (sekitar 40.000 rpm) selama beberapa jam sehingga masing-masing partikel dapat bermigrasi ke posisi kesetimbangan tempat densitas cairan sekelilingnya sama dengan densitas partikel. Pada umumnya untuk sel hewan, retikulum endoplasma kasar (densitas = 1,20 g/cm) terpisah dengan baik dari badan Golgi (densitas = 1,14 g/cm) dan dari membran plasma (densitas = 1,12 g/cm). Metode ini juga efektif untuk memisahkan lisosom, mitokondria, dan peroksisom dalam fraksi campuran awal yang diperoleh dengan sentrifugasi diferensial.