Isolasi DNA
Isolasi DNA adalah metode untuk mendapatkan asam deoksiribonukleat dari suatu makhluk hidup.
Isolasi DNA pertama kali dilakukan oleh ilmuwan asal Swiss bernama Friedrich Miescher pada tahun 1869. Ia menemukan senyawa asam yang mengandung nitrogen dan fosfat pada inti sel dari sel darah putih. Senyawa ini diberi nama "nuklein", namun pada tahun 1889 muridnya yaitu Richard Altmann menamainya "asam nukleat". Metode yang digunakan oleh Miescher adalah "alkalyne lysis" untuk memecahkan sel dan mengisolasi DNA.
Metode ini adalah contoh metode "alkalyne lysis". Isolasi kromosom bakteri dimulai dengan menginokulasi biakan pada media "Luria Broth" dengan kondisi 37 °C selama 18 jam, lalu suspensi bakteri disentrifugasi pada 8000 rpm selama 2 menit. Kemudian supernatan dibuang hingga bersih dan pelet diresuspensi dengan penambahan 400 µL bufer Tris-EDTA 1X. Suspensi bakteri ditambahkan dengan 100 µL lisozim 50 mg/mL, selanjutnya diinkubasi dengan kondisi 37 °C selama 1 jam dan setiap 15 menit tabung di-flip. Lalu suspensi bakteri ditambahkan dengan 150 µL SDS 10% dan di-flip, serta ditambahkan 10 µL Proteinase K 10 mg/mL. Selanjutnya suspensi bakteri diinkubasi pada suhu 37 °C selama 1 jam dan setiap 15 menit tabung di-flip. Ke dalam suspensi ditambahkan 100 µL NaCl 5 M dan 100 µL CTAB 10% untuk mengikat protein sehingga DNA terpisah dari protein, kemudian tabung di-flip. Suspensi diinkubasi dengan kondisi 65 °C selama 20 menit, dan ditambahkan 200 µL P:C:I yang terdiri dari phenol yang berfungsi untuk degradasi protein. Dan juga terdiri dari kloroform untuk degradasi lemak, dan isoamil alkohol sebagai anti buih. Lalu dibolak-balik. Kemudian suspensi disentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 500 µL lapisan atas diambil dan dipindahkan ke tabung baru, lalu sebanyak 500 µL C:I ditambahkan ke tabung baru. Suspensi kembali disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit, dan lapisan atas sebanyak 300 µL diambil dan dipindahkan ke tabung baru. Selanjutnya isopropanol dingin sebanyak 300 µL ditambahkan ke tabung baru tersebut. Suspensi diinkubasi dengan kondisi -20 oC selama 1 jam, kemudian disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit. Lalu pelet ditambahkan dengan 700 µL etanol 70% kemudian di-spin selama 10 detik. Etanol dibuang dan tabung dikeringkan dalam inkubator dengan kondisi 37 °C, dan pelet diresuspensi dengan 50 µL ddH2O kemudian diinkubasi dengan kondisi 37 °C.
Sebanyak 1,5 mL garam fisiologis untuk menjaga tekanan isotonis dimasukkan ke tabung mikro lalu biakan sebanyak setengah cawan bakteri diambil dan dilakukan pengadukan. Tabung mikro disentrifugasi 6000 rpm selama 2 menit. Supernatan dibuang dari pelet. Pelet diresuspensi dengan 250 μL larutan A yang terdiri dari Tris-Cl sebagai pengatur pH, glukosa sebagai penjaga tekanan isotonis, dan EDTA sebagai chelating agent dingin. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Lalu larutan B yang terdiri dari NaOH sebagai pendenaturasi DNA dan SDS sebagai pelarut membran sel sebanyak 250 μL ditambahkan, dan tabung mikro dibolak balik 5 kali, lalu diinkubasi baki es selama 10 menit. Larutan C dingin yang terdiri dari kalium asetat dan asam asetat yang berfungsi untuk merenaturasi DNA sebanyak 250 μL ditambahkan ke campuran, kemudian dibolak balik 5 kali, lalu diinkubasi 5 menit tepat di baki es. Selanjutnya tabung mikro disentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit. Lalu supernatan sebanyak 600 μL dipindahkan ke tabung mikro steril baru. P:C:I yang terdiri dari phenol yang berfungsi untuk degradasi protein, kloroform untuk degradasi lemak, dan isoamil alkohol sebagai anti buih sebanyak 500 μL ditambahkan ke campuran, lalu dibolak balik 5 kali, lalu disentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan sebanyak 400 μL dipindahkan ke tabung mikro steril baru, lalu etanol 96% untuk mengikat air sehingga DNA mengendap sebanyak 1 mL ditambahkan. Suspensi diinkubasi freezer -20 °C, lalu disentrifugasi 10.000 rpm selama 2 menit. Supernatan dibuang dengan segera, lalu etanol 70% untuk mencuci DNA sebanyak 700 μL ditambahkan. Tabung mikro disentrifugasi 10.000 rpm selama 5 menit, lalu supernatan segera dibuang. Tabung mikro dikeringkan pada inkubator 37 oC hingga etanol 70% kering. TE atau ddH2O steril sebanyak 30 μL ditambahkan ke tabung mikro.
= Rujukan =
= Lihat pula =