इम्यूनोफ्लोरेसेंस
इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक ऐसी तकनीक है जिसका उपयोग प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के लिए प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ किया जाता है और इसका उपयोग प्रमुख रूप से जैविक नमूनों पर किया जाता है। यह तकनीक एक कोशिका के भीतर लक्षित विशेष बायोमोलिक्यूल को फ्लोरोसेंट रंजक को लक्षित करने के लिए अपने एंटीजेन के लिए प्रतिरक्षियों की विशिष्टता का उपयोग करता है और इसलिए नमूने के माध्यम से लक्ष्य अणु वितरण को देखना सम्भव बनाता है। एपिटॉप मैपिंग में भी प्रयास किए गए हैं क्योंकि कई एंटीबॉडी एक ही एपिटॉप से जुड़ सकते हैं और एक ही एपिटॉप पहचान सकने वाली एंटीबॉडी के बीच जुड़ाव के स्तर अलग-अलग हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोफोर का एंटीबॉडी के साथ जुड़ना एंटीबॉडी की प्रतिरक्षा विशिष्टता या इसके एंटीजन से जुड़ने की क्षमता में हस्तक्षेप नहीं कर सकता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस, इम्यूनोस्टेनिंग का व्यापक रूप से प्रयोग किया जाने वाला एक उदाहरण है और इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री का एक विशिष्ट उदाहरण है जो प्रतिरक्षियों की स्थिति को देखने के लिए फ्लोरोफोरस का उपयोग करता है।
इम्यूनोफ्लोरेसेंस को ऊतक वर्गों, कल्चर किए हुए कोशिका रेखाओं, या व्यक्तिगत कोशिकाओं पर उपयोग किया जाता है और इसका उपयोग प्रोटीन, ग्लाईकन और छोटे जैविक और गैर जैविक अणुओं के वितरण का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यदि कोशिका झिल्ली की टोपोलॉजी अभी तक निर्धारित नहीं की गई है, तो प्रोटीन में एपिटॉप सम्मिलन का उपयोग संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस के संयोजन के साथ किया जा सकता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग डीएनए मिथाइलीकरण के स्तर और स्थानीयकरण पैटर्न में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए "अर्ध-मात्रात्मक" विधि के रूप में भी किया जा सकता है क्योंकि यह वास्तविक मात्रात्मक तरीकों से अधिक समय लेने वाली विधि है और मिथाइलीकरण के स्तर के विश्लेषण में कुछ व्यक्तिपरकता है।
इम्यूनोफ्लोरेसेंस को फ्लोरोसेंट स्टेनिंग के अन्य गैर प्रतिरक्षी के साथ संयोजन करके उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, डीएनए को लेबल करने के लिए DAPI का उपयोग करके. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए कई सूक्ष्मदर्शी डिजाइनों का उपयोग किया जाता है; इनमें से सबसे सरल है एपीफ्लोरेसेंस सूक्ष्मदर्शी और कोंफोकल सूक्ष्मदर्शी हमेशा व्यापक रूप से प्रयोग की जाती है। विभिन्न सुपर-रिजॉल्यूशन सूक्ष्मदर्शी डिजाइन जो और अधिक उच्च परिणाम देने में सक्षम हैं, उनका उपयोग भी किया जा सकता है।
इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक के दो वर्ग होते हैं, प्राथमिक (या प्रत्यक्ष) और द्वितीयक (या अप्रत्यक्ष)।
प्राथमिक, या प्रत्यक्ष, इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक एकल प्रतिरक्षी का उपयोग करता है जो एक फ्लोरोफोरे के साथ रासायनिक तरीके से जुडी हुई होती है। यह प्रतिरक्षी लक्ष्य अणु को पहचानता है और उसे बांधता है और एक सूक्ष्मदर्शी के माध्यम से उसमें मौजूद फ्लोरोफोरे का पता लगाया जा सकता है। निम्नलिखित द्वितीयक (या अप्रत्यक्ष) प्रोटोकॉल के मुकाबले इस तकनीक के कई फायदे हैं जिसका कारण है फ्लोरोफोरे के साथ प्रतिरक्षी का प्रत्यक्ष संयोजन. यह स्टेनिंग प्रक्रिया के कई चरणों को कम कर देता है और इसलिए यह तेज़ है और यह प्रतिरक्षी विपरीत प्रतिकार या गैर विशिष्टता के साथ कुछ मुद्दों से बच सकते हैं, जो पृष्ठभूमि संकेत में वृद्धि की अगुवाई करता है।
द्वितीयक, या अप्रत्यक्ष, इम्यूनोफ्लोरेसेंस दो प्रतिरक्षियों का उपयोग करता है, पहला (प्राथमिक प्रतिरक्षी) जो लक्ष्य अणु को पहचानता है और उससे बंधता है और दूसरा (द्वितीयक प्रतिरक्षी), जो फ्लोरोफोरे को वहन करता है, प्राथमिक प्रतिरक्षी की पहचान करता है और उससे बंधता है। यह प्रोटोकॉल, उपरोक्त प्राथमिक (या प्रत्यक्ष) से अधिक जटिल है और इसमें अधिक समय लगता है लेकिन यह अधिक लचीलापन प्रदान करता है।
यह प्रोटोकॉल इसलिए संभव है क्योंकि एक प्रतिरक्षी में दो भाग होते हैं, एक परिवर्तनीय क्षेत्र (जो एंटीजेन को पहचानता है) और एक अपरिवर्तनीय क्षेत्र (जो प्रतिरक्षी अणु की संरचना करता है)। एक शोधकर्ता कई प्राथमिक प्रतिरक्षी उत्पन्न कर सकता है जो विभिन्न एंटीजनों की पहचान करता है (जिसमें विभिन्न परिवर्तनीय क्षेत्र है), लेकिन सभी एक ही अपरिवर्तनीय क्षेत्र को सांझा करते हैं। इसलिए यह सभी प्रतिरक्षी एक एकल द्वितीयक प्रतिरक्षी द्वारा पहचान लिए जाते हैं। यह प्राथमिक प्रतिरक्षी को प्रत्यक्ष रूप से एक फ्लोरोफोरे वहन करने के लिए संशोधित करने की लागत को बचाता है।
अपरिवर्तनीय क्षेत्रों वाले विभिन्न प्राथमिक प्रतिरक्षी आम तौर पर अलग-अलग प्रजातियों में प्रतिरक्षी को उगाने के द्वारा उत्पन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, एक शोधकर्ता एक बकरी में प्राथमिक प्रतिरक्षी पैदा कर सकता है जो कई एंटीजनों की पहचान करता है और तब डाई-युग्मित खरगोश की द्वितीयक प्रतिरक्षी को शामिल करता है जो बकरी की प्रतिरक्षी अपरिवर्तनीय क्षेत्र की पहचान करता है ("खरगोश गैर-बकरी" प्रतिरक्षी)। शोधकर्ता तब एक चूहे में प्राथमिक प्रतिरक्षी का एक दूसरा सेट तैयार करते हैं जिसे एक अलग "गधा गैर-चूहा" द्वितीयक प्रतिरक्षी द्वारा पहचाना जा सकता है। यह बनाने-में-मुश्किल डाई-युग्मित प्रतिरक्षियों के कई परीक्षणों में पुनः उपयोग को सम्भव बनाता हैं।
जैसा की अधिकांश प्रतिदीप्ति तकनीकों के मामले में है, इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ एक महत्वपूर्ण समस्या फोटोब्लीचिंग है। प्रकाश अनावरण की तीव्रता या समय काल को कम करके, फ्लोरोफोरेस के घनत्व को बढ़ाने के द्वारा, या ब्लीचिंग के प्रति कम सम्वेदनशील अधिक ठोस फ्लोरोफोरेस के प्रयोग द्वारा (जैसे, अलेक्सा फ्लोरस, सेटा फ्लोरस, या डाईलाईट फ्लोरस) के द्वारा फोटोब्लीचिंग की वजह से हुए गतिविधियों के नुकसान को नियंत्रित किया जा सकता है।
सामान्यतः, इम्यूनोफ्लोरेसेंस निश्चित नमूने (अर्थात् मृत,) तक सीमित हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस के द्वारा जीवित कोशिकाओं के भीतर की संरचना के विश्लेषण संभव नहीं है, चूंकि प्रतिरक्षी कोशिका झिल्ली को पार नहीं कर सकते. वैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस के कुछ उपयोगों को, फ्लोरोसेंट प्रोटीन डोमेन युक्त पुनः संयोजक प्रोटीन के विकास द्वारा अप्रचलित कर दिया गया, उदाहरण के तौर पर हरा प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP)। इस तरह के "टैग किए हुए" प्रोटीन का इस्तेमाल जीवित कोशिकाओं में उनके स्थानीयकरण को निर्धारित करने को सम्भव करता है।