Aryylihiilivetyreseptori
Ah-reseptori (Aryylihiilivetyreseptori, AhR, AHR) on useissa eläinkunnan lahkoissa ilmenevä reseptori, joka tunnistaa erityisesti tasomaisia, aromaattisia yhdisteitä. Ah-reseptorilla on laaja biologinen merkitys nisäkkäissä. Sillä on merkitystä yksilönkehitykseen, solujen erilaistumiseen ja solusyklin säätelemiseen, hormoonitasapainoon, solujen stressivasteeseen (mukaan lukien tulehdus ja apoptoosi), immuunivasteeseen, ikääntymiseen ja syövän esiintymiseen. Tämän lisäksi AhR suojaa elimistöä muun muassa polyaromaattisten hiilivetyjen (PAH) myrkyllisiltä vaikutuksilta aiheuttamalla niiden biotransformaation haitattomaan ja eritettävään muotoon..
Tietyissä tilanteissa AhR:stä on haittaa yksilölle, sillä se on vastuussa joidenkin yhdisteiden myrkyllisistä vaikutuksista. Erityisesti mielenkiinnon kohteena on ollut 2,3,7,8-tetrakloori-"p"-dioksiini (2,3,7,8-TCDD, TCDD tai usein pelkästään dioksiini) ja muut halogenoidut aromaattiset hiilivedyt (HAH). TCDD:n ja muiden aineiden myrkyllinen vaikutus on ymmärrettävissä virheellisenä reaktiona. Koska elimistön biotransformoivat entsyymit eivät pysty hajottamaan TCDD:tä, Ah-reseptorin signalointiteitä aktivoivaa nappulaa ikään kuin painetaan liian kovaa ja liian kauan, mikä aiheuttaa elimistön myrkytysreaktion.
AH-reseptori esiintyy inaktiivisessa muodossaan solulimassa, jossa se kohtaa ligandit, jotka aiheuttavat reseptorin kulkeutumisen solun tumaan. Sytosolissa AH-reseptori ei esiinny vapaana vaan osana useamman proteiinin kompleksia, joka kykenee sitomaan ligandeja, mutta ei DNA:ta. Kompleksin muita osia ovat lämpösokkiproteiini Hsp90:n muodostama dimeeri, X-assiosioitunut proteiini 2 (XAP2, myös nimet ARA9 ja AIP ovat käytössä) ja co-saperoni p23.
Ligandin liittyminen AH-reseptoriin paljastaa proteiinin tumaanohjaussignaalin (NLS, nuclear localization signal), minkä jälkeen AHR kulkeutuu tumaan, jossa Ah-reseptori yhdistyy Arnt-proteiiniin. (Vaikka Arnt tulee sanoista "Ah receptor nuclear translocator", se ei kuljeta Ah-reseptoria tumaan.) AhR-Arnt-kompleksin muodostuminen johtaa muiden proteiinien irtoamiseen Ah-reseptorista. AhR-Arnt-kompleksi sitoutuu geenien tiettyihin tehostajasekvensseihin, jotka tunnetaan DRE:nä ("dioxin responsive element", myös XRE eli "xenobiotic response element"). Tämä saa aikaan Ah-reseptorin säätelemien geenien ilmentymisen.
Ah-reseptori säätelee ensimmäisen ja toisen vaiheen biotransformontiin osallistuvien entsyymien geenejä sekä solukasvua ja erilaistumista sääteleviä geenejä. Biotransformointi tarkoittaa yhdisteiden muuttamista haitattomaan ja eritettävään muotoon aineenvaihdunnassa. Biotransformoiviin geeneihin/proteiineihin kuuluvat mm. sytokromi P450 (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1) ja UDP-glukuronosyylitransferaasi (UGT1A1, UGT1A6). AhR kiihdyttää myös Nrf2:n (NF-E2-related factor-2) tuotantoa, mikä avustaa biotransformaatiota, koska Nrf2 säätelee antioksidatiivisia entsyymejä.
Ah-reseptorin säätelemät geenit tuhoavat siis tasomaisia aromaattisia yhdisteitä, jotka ovat myös Ah-reseptorin ligandeja. AhR on hyvin epäspesifinen reseptori, mistä voi olla hyötyä organismille, sillä yksi reseptori saa aikaan useiden spesifisten detoksifikaatioentsyymeiden ilmenemisen, ja nämä entsyymit voivat neutralisoida samankin molekyylin eri kohtia.
Solukasvuun ja solujen erilaistumiseen liittyviä liittyviä Ah-reseptorin säätelemiä geenejä on löydetty myös useita.
Koska Ah-reseptorin merkitys on suuri, on tärkeää, että Ah-reseptorin määrää ja Ah-reseptorin aktiivisuutta säädellään. Ah-reseptorin aktiivisuuteen vaikuttavia tekijöitä on tunnistettu monia. Ligandien lisäksi aktiivisuuteen vaikuttavat muun muassa AhR-kompleksin muut proteiinit, solun tilan muutokset, koaktivaattorit ja korepressorit. Yhtenäistä mallia Ah-reseptorin vaikutuksista ei kuitenkaan ole nykytiedolla mahdollista tehdä. Ympäristömyrkkyjen ja muiden eksogeenisten ligandien sekä endogeenisten ligandien vaikutus riippuu eläinlajista, solutyypistä sekä yksilön kantamasta alleelista.
Ah-reseptorin määrää säädellään myös proteolyysillä eli hajottamalla. Proteolyysistä vastaa 26S-proteasomi, jonka toiminta edellyttää, että hajotettava proteeini on merkitty ubikitiini-proteiineilla. Ah-reseptorin hajotusta edeltää kuitenkin aina reseptorin kulkeutuminen tumaan, josta ubikitinoitu AhR kuljetetaan sytosoliin hajotettavaksi.
Ah-reseptorin säätely proteolyysillä on voimakasta, kun ligandina on TCDD. Aluksi Ah-reseptorin määrä vähenee nopeasti solulimassa ja lisääntyy tumassa translokaation seurauksena, mutta sen jälkeen Ah-reseptori alkaa kadota myös tumasta. TCDD-indusoinnin jälkeen Ah-reseptorin pitoisuus solussa laskee jopa yli 90 prosenttia. Ah-reseptorin säätelemien geenien aktiivisuus noudattaa samaa ensin nousevaa sitten laskevaa linjaa kuin tuman AhR-pitoisuus. Pitkällä aikavälillä tai pienillä TCDD-annoksilla Ah-reseptorin määrä palautuu kuitenkin normaalille tasolle tai jopa yli perustason. Richard Pollenz on arvellut, että Ah-reseptorin määrän rajoittaminen voi olla tärkeää siksi, ettei AhR sitoisi liikaa Arnt-proteiinia, jolla on osuutta myös muiden geenien säätelyssä.
TCDD:n aiheuttamaa reaktiota ei voida kuitenkaan yleistää edes kaikkiin vahvoivin ligandeihin. Joidenkin elimistössä hajoavien PAH-yhdisteiden aiheuttama vaikutus voi tietyissä soluissa olla päinvastainen. 7,12-demityylibenz[a]anthraseenin on todettu aiheuttavan Ah-reseptorin pitoisuuden nousemisen 25-kertaiseksi rotan maksasoluissa.
AhR-repressori (AhRR) on Ah-reseptorin sukulaismolekyyli (katso alla ). Se sitoo Arnt:tä, mutta AhRR-Arnt-kompleksi ei aktivoi geenien ekspressiota, mihin perustuu AhRR:n kyky estää Ah-reseptorin toiminta. AhRR ei kuitenkaan ole kovin tehokas repressori.
AhR on noin 100 kilodaltonin kokoinen monomeerinen proteiini. Proteiinien välillä on merkittäviä kokoeroja lajien sisällä ja lajien välillä (95–124 kD), mikä johtuu geenin lopetuskodonin sijainnista eikä esimerkiksi silmukoinnista tai translaation jälkeisestä muokkauksesta.
AhR kuuluu bHLH-PAS-proteiineihin. Kierre-käännös-kierre -motiivi (helix-loop-helix) esiintyy hyvin monissa transkriptiofaktoreissa, jollaisen AhR yhdessä Arnt:n kanssa muodostaa. PAS-domeeneja esiintyy enimmäkseen proteiineissa, jotka liittyvät suoraan tai epäsuorasti signaalinvälitykseen ja PAS-domeenien tunnetut tehtävät liittyvät proteiinien väliseen vuorovaikutukseen tai ligandien tai kofaktorien sitomiseen.
Ah-reseptorissa on kaksi PAS-domeenia, PAS-A ja PAS-B. Hiiren Ah-reseptorin (mAhR) ligandin sitoutumiskohta on paikallistettu jälkimmäiseen PAS-domeeniin eli PAS-B:hen. Ensimmäisen PAS-domeenin poistaminen vähentää ligandin sitoutumista 30 prosenttia, mutta PAS-B:n poistaminen estää ligandin sitoutumisen täysin.
Ah-reseptorin PAS-domeenin rakenne on selvitetty muiden proteiinien PAS-domeenien avulla. Domeenissa on viiden juosteen vastakkaissuuntainen β-laskosrakenne, jonka yhdellä puolella on alfaheliksejä. Ah-reseptorin aktiivinen kohta muodostuu hydrofobisista tähteistä. Tärkeä proteiinitähde on numero 375. Hiirten mAhr-alleelissa tässä kohtaa on pienikokoinen alaniini, kun taas mAhr-alleelissa on hieman suurempi valiini. Tähteen suurempi koko mAhr-muodossa aiheuttaa sen, että proteiini sitoo TCDD:tä kymmenen kertaa heikommin. Ihmisellä on vastaavassa kohdassa (381) valiini, ja ihmisenkin Ah-reseptori (hAhr) sitoo TCDD:tä kymmenen kertaa heikommin kuin mAhr. hAhr sitoo toisaalta TCDD:stä poikkeavia ligandeja kuten indirubiinia ja kversitiiniä voimakkaammin kuin mAhr, eikä valiinin korvaaminen alaniinilla paranna ligandin sitoutumista. Ihmisen Ah-reseptorista ei tiedetä luonnossa esiintyviä alleeleita, joissa valiini-381:n tilalla olisi jokin muu aminohappo
On esitetty, että TCDD saa aikaan Ah-respetorin konformaation muutoksen ja tumaanohjaussignaalin paljastumisen, kun asemassa 333 oleva arginiini osallistuu vuorovaikutukseen TCDD:n klooriatomin kanssa ja vetysidos glutamiinihappo-339:n kanssa katkeaa. Asemassa 345 olevan fenyylialaniinin aromaattinen rengas vuorovaikuttaa ligandien aromaattisten renkaiden kanssa.
AhR:n ligandit ovat hyvin monipuolisia. Niille on usein yhteistä se, että ne ovat aromaattisia ja tasomaisia. Löysäpiirteinen ligandintunnistus on hyödyllistä, sillä yhden reseptorin avulla solu pystyy aktivoimaan useita biotransformoivia geenejä laajaa myrkyllisten molekyylien joukkoa vastaan. Jotkin luonnossa esiintyvistä aineista, erityisesti flavonoidit, ovat Ah-reseptorin antagonisteja ja ne voivat vaimentaa TCDD:n vaikutusta.
Tarkimmin tutkitut ja ensimmäiset havaitut AH-reseptorin ligandit ovat halogenoituja aromaattisia hiilivetyjä (HAH) ja polysyklisiä aromaattisia hiilivetyjä (PAH). Dioksiinia on käytetty paljon eksogeenisten ligandien vaikutusten selvittämiseksi. AH-reseptorille on todettu kuitenkin monia muitakin ligandeja, joita esiintyy luonnontuotteissa ja joita syntyy jopa elimistön omassa metaboliassa. Ah-reseptorin ligandit voidaan jaotella esimerkiksi kolmella tavalla:
Kaiken kaikkiaan AhR:n ligandeina toimivat molekyylit ovat hyvin monimuotoisia. Voimakkaimmat ligandit ovat dibentso-p-dioksiineja, joissa on kolme tai neljä kloori- tai bromiatomeja, jotka kiinnittyvät hiiliin 2, 3, 7 ja 8. AhR:n ligandin sitoutumiskohta pystyy sitomaan tehokkaimmin tasomaisia molekyylejä, jotka ovat kooltaan korkeintaan 1,4 × 1,2 × 0,5 nm. Monet luonnolliset ligandit eivät mahdu tähän muottiin, mutta ne ovat toisaalta heikompia ligandeja.
Eksogeenisista ja antropogeenisista ligandeista tunnetaan parhaiten HAH- ja PAH-yhdisteet. Nämä yhdisteet ovat tunnettuja myrkkyjä, jotka aiheuttavat riutumista (), imusuoniston surkastumista, hepatotoksisuutta, klooriaknea, ruoansulatuskanavan leesioita ja virtsaputken liikakasvua. Yhdisteiden myrkylliset vaikutukset perustuvat nimenomaan niiden kykyyn aktivoida Ah-reseptori.
HAH-yhdisteet, kuten dioksiini, ovat metabolisesti pysyvämpiä kuin PAH-yhdisteet. Tämän vuoksi niiden vaikutus geenitoimintaan on pidempiaikaista ja ne ovat huomattavasti myrkyllisempiä.
PAH- ja HAH-yhdisteiden vaikutukset ihmiseen on opittu tietämään pitkälti erilaisten onnettomuuksien ja työperäisten altistumisien kautta. Esimerkiksi Vietnamin sodassa dioksiineja sisältävälle "Agent Orange" -kasvimyrkylle altistuneet sotilaat saivat myöhemmin poikkeavan paljon epämuodostuneita lapsia. Dioksiinien uskotaan aiheuttavan kehittyville lapsille suun ja kasvojen halkioita, kehityksen viivästymistä ja neuromotorisia ongelmia. Suuren dioksiinialtistuksen oireena ilmenee klooriakne, jonka sai esimerkiksi Ukrainan presidentti Viktor Juštšenko myrkytysyrityksen seurauksena vuonna 2004. Suomessa työturvallisuuslainsäädäntö määrittää kaikki PAH-yhdisteet ja TCDD:n syöpävaarallisiksi aineiksi.
Ah-reseptorille on löydetty myös luonnollisia ligandeja. Samoin kuin synteettisissä ligandeissa, myös luonnollisissa ligandeissa on aryyliryhmä.
Tryptofaani on monien Ah-reseptorin ligandien esiaste. Eliöiden entsyymit ja UV-säteily synnyttävät tryptofaanista luonnollisia ligandeja. Tryptofaanin johdannainen on muun muassa indoli-3-karbinoli (I3C), josta happamissa olosuhteissa, esimerkiksi mahalaukussa, muodostuu vielä voimakkaampaa Ah-reseptorin ligandia, indolo[3,2-b]karbatsolia (ICZ). Indolo-3-karbinolia esiintyy mm. kaalisuvun kasveissa. Monet karotenoidit ovat Ah-reseptorin luonnollisia ligandeja. Tällaisia ovat esimerkiksi β-Apo-8’-karotenaali, canthaxanthiini ja astaxanthiini, mutta eivät esimerkiksi β-karoteeni ja A-vitamiini.
Joillakin luonnollisilla ligandeilla on havaittu antagonistinen vaikutus Ah-reseptoriin. Erityisesti flavonoidien vaikutus on usein antagonistinen, ja jopa ravinnosta saatavat määrät riittävät vaimentamaan dioksiinin vaikutusta.
Ah-reseptorin on havaittu aktivoituvan tietyissä tilanteissa ilman, että kokeessa on ollut läsnä eksogeenisiä ligandeja. Lisäksi Ah-reseptorin puute vaikuttaa negatiivisesti yksilönkehitykseen. Tällä perusteella on päätelty, että Ah-reseptorilla olisi myös endogeenisiä eli sisäsyntyisiä ligandeja.
Erään todettujen endogeenisten ligandien ryhmän muodostavat tryptofaani ja endogeeniset tryptofaanin johdokset kuten tryptamiini, indolietikkahappo, kyneuriniinit, indigo ja indirubiini. Kolmen ensin mainitun yhdisteen pitoisuudet ovat normaalisti hyvin pienet ja kohoavat vain joidenkin sairauksien yhteydessä. Indirubiinia sitä vastoin saattaa olla ihmisen seerumissa jatkuvasti riittävästi aiheuttamaan vasteen. FiXL on Ah-reseptorin sukulaisproteiini, jonka koentsyyminä toimii hemiryhmä. Hemiryhmä kiinnittyy FixL:ään vastaavaan kohtaa kuin ligandit Ah-reseptoriin. Siksi ei liene ihme, että hemiryhmän hajoamistuote, bilirubiini, on yksi Ah-reseptorin endogeenisistä ligandeista. Ah-reseptorin aktivoituminen säätelee positiivisesti sytokromi P450:n tuotantoa ja sytokromi P450 hajottaa bilirubiinia, mikä synnyttää takaisinkytkentäsysteemin.
Käsitystä Ah-reseptorista on syventänyt sen evoluution selvittäminen. Ah-reseptoria ja sen sukulaisproteiineja esiintyy useissa pääjaksoissa, muun muassa sukkulamadoissa, nilviäisissä ja selkäjänteisissä, minkä perusteella Ah-reseptorin synty voidaan ajoittaa vähintään 970 miljoonan vuoden taakse.
"C. elegans" -sukkulamadon AhR vastaa hermosolujen kehityksestä ja banaanikärpäsen ("D. melanogaster") AhR ohjaa tuntosarvien ja raajojen kehitystä. Näiden lajien Ah-reseptorit eivät kuitenkaan sido TCDD:tä, joten voidaan päätellä, että Ah-reseptorin alkuperäinen merkitys on liittynyt yksilönkehitykseen. Myös hiirillä, joilta on poistettu "AhR"-geeni, on havaittu maksan ja immuunijärjestelmän epänormaalia kehittymistä sekä sydämen liikakasvua.
Selkärankaisten AhR-perheeseen kuuluu kaikkiaan kolme eri Ah-reseptoria, jotka ovat syntyneet geenin tai koko genomin kahdentumisen kautta. Rustokaloilla ("Chondrichthyes)" ja luukaloilla ("Osteichthyes") on kaksi geenejä aktivoivaa Ah-reseptoria, AhR1 ja AhR2, jotka ovat muodostuneet 410–450 miljoonaa vuotta sitten. Näistä AhR2 on kaloilla aktiivisempi ja AhR1 vastaa muun muassa nisäkkäiden Ah-reseptoria. Nisäkkäiltä ja ilmeisesti muiltakin tetrapodeilta AhR2 on kadonnut evoluution myöhemmässä vaiheessa.
Kolmas AhR-perheen proteiini on AhR-repressori (AhRR). AhRR muodostaa dimeerin Arnt:n kanssa ja sitoutuu DRE-sekvensseihin mutta ei aktivoi geenin ekspressiota, mihin perustuu sen repressiivisyys.
Kyky sitoa TCDD:tä on ilmestynyt selkäjänteisissä 410–500 miljoonaa vuotta sitten suikulaisten ("Cephalochordata") haarautumisen jälkeen ennen rustokalojen syntymistä. On spekuloitu, että luonnossa syntyneiden halogenoitujen aromaattisten ilmestyminen vesiin on saattanut vaikuttaa Ah-reseptorin kehitykseen.