Ribonukleotidireduktaasi
Ribonukleotidireduktaasi eli ribonukleosididifosfaattireduktaasi on entsyymi, joka katalysoi tiettyjen deoksiribonukleotidien muodostumista ribonukleotideista. Entsyymi osallistuu siten DNA:n synteesiin ja korjaamiseen ja sitä tavataan kaikista eliöistä, joskin rakenteellisesti ja koentsyymien suhteen eri ribonukleotidireduktaasit poikkeavat toisistaan huomattavasti. Ribonukleotidireduktaasin EC-numero on EC 1.17.4.1.
Ribonukleotidireduktaasin rakenne vaihtelee eri eliöissä ja eri luokkia on tunnistettu kolme. Kaikille näistä luokista on tyypillistä, että entsyymi on rakenteeltaan oligonukleotidi ja koostuu dimerisoituneista alayksiköistä R1 ja R" ja näistä alayksikkö R1 on molekyylimassaltaan kookkaampi. Alayksikössä R1 sijaitsee katalyyttisesti tärkeä kysteiiniaminohappo ja alayksikössä R2 on jokin radikaalin lähde Aerobisissa oloissa kasvavan "Escherichia coli" -bakteerin ja eukaryoottien ribonukleotidireduktaasi on R1- ja R2-dimeeristä koostuva tetrameeri, jossa radikaalin lähteenä toimii tyrosyyliradikaali, jota stabiloi kahdesta rauta-ionista ja yhdestä oksidi-ionista muodostunut klusteri, jossa rauta on sitoutunut myös veteen ja histidiiniaminohappoon. Anaerobisissa oloissa elävän "E. coli" -bakteerin entsyymi on rauta-rikkiproteiini, joka sisältää Fe4-S4-klusterin ja eräissä bakteereissa esiintyy ribonukleotidireduktaasia, jonka radikaalin lähteenä toimii kobamamidi eli adenosyylikobalamiini.
Ribonukleotidireduktaasin substraatteja ovat adenosiinidifosfaatti, guanosiinidifosfaatti, sytidiinidifosfaatti ja uridiinidifosfaatti ja niistä muodostuu niiden deoksiribonukleotidijohdannaisia dADP:tä, dGDP:tä, dCDP:tä ja dUDP:tä. Viidettä deoksiribonukleotididifosfaattia tymidiinidifosfaattia ribonukleotidireduktaasi ei tuota, vaan sitä muodostuu tymidylaattisyntaasin katalysoimana. Kaikkien ribonukleotidien R1 alayksikössä tapahtuvan reaktion mekanismi on sama, mutta R2 syntyvän radikaalin rakenne vaihtelee.
Ribonukleotidireduktaasin katalysoiman reaktion mekanismin ensimmäisessä vaiheessa yksi alayksikössä R1 sijaitsevan aktiivisen keskuksen kolmesta kysteiiniaminohaposta luovuttaa homolyyttisesti protonin R2-alayksikön tyrosinyyli- tai 5'-deoksiriboadenosyyliradikaalille, jolloin muodostuu erittäin reaktiivinen kysteinyyliradikaali. Tämä radikaali ottaa vastaa ribonukleotidin riboosiyksikön C3-asemassa olevalta hiileltä siihen sitoutuneen protonin. Näin muodostuneen uuden radikaalin C2-hiileen sitoutunut hydroksyyliryhmä ottaa vastaan protonin toiselta kysteiiniaminohapolta ja eliminoituu vetenä. Samanaikaisesti glutamaattisivuketju vastaanottaa protonin C3-asemaan sitoutuneelta hydroksyyliryhmänlt. jolloin muodostuu stabiili α-ketoradikaali. Kolmas kysteiiniaminohappo luovuttaa C2-hiilelle protonin ja sen ja edellisessä vaiheessa protonin luovuttaneen kysteiinin välille muodostuu disulfidisidos. Seuraavaksi muodostunut ketoni pelkistyy hydroksyyliradikaaliksi, joka vastaanottaa protonin kysteiiniaminohapolta muodostaen deoksiribonukleotididifosfaatin. Nyt entsyymi sisältää disulfidisillan kahden kysteiiniaminohapon välillä ja on inaktiivinen. Entsyymin pelkistää ja aktivoi uudelleen tioredoksiini tai jossain tapauksissa glutaredoksiini.
Ribonukleotidireduktaasin säätely on monimutkaista. Alayksikössä R1 on kaksi allosteeristä säätelykohtaa, jotka vaikuttavat entsyymin aktiivisuuteen tai spesifisyyteen. Entsyymiä aktivoi aktiivisuutta säätelevään allosteeriseen säätelykohtaan sitoutunut ATP-molekyyli. Mikäli soluissa on riittävästi deoksiribonukleotideja, sitoutuu samaan kohtaan dATP-molekyyli ja entsyymi inaktivoituu muodostaen heksameerin. Se, mitä deoksiribonukleotidia ribonukleotidireduktaasi tuottaa, riippuu siitä mikä nukleotididifosfaatti on sitoutunut spesifisyyttä säätelevään allosteeriseen säätelykohtaan. ATP:n sitoutuessa tähän säätelykohtaan entsyymi pelkistää uridiini- ja sytosiinidifosfaatteja vastaaviksi deoksiribonukleotideiksi. Jos samaan säätelykohtaan on sitoutuneena tymidiinitrifosfaatti, pelkistyy guanodiinidifosfaatti deoksiguoanosiinifosfaatiksi, joka konsentraation ollessa korkea sitoutuu spesifisyyttä säätelevään kohtaan ja tällöin ribonukleotidireduktaasi pelkistää ADP:tä dADP:ksi. Eräillä eliöillä on myös sepsifisesti ribonukleotidireduktaasin säätelyyn osallistuva inhiboiva säätelyproteiini. Syöpälääkkeenä käytettävän hydroksiurean vaikutusmekanismi perustuu ribonukleotidireduktasin inhiboimiseen, jolloin syöpäsolut eivät kykene tuottamaan DNA:ta eivätkä jakaantumaan.