CRISPR
CRISPR eli Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats ovat DNA-jaksoja, jotka muodostavat useiden bakteerien ja arkkien alkeellisen immuunipuolustuksen arkki- ja bakteeriviruksia vastaan. Näihin jaksoihin ja Cas-proteiineihin (CRISPR associated protein) pohjautuvia geenimuuntelutekniikoita on kehitetty, esimerkiksi CRISPR/Cas9-menetelmä.
CRISPR-systeemejä on useita, mutta kukin koostuu mm. nukleaaseina (DNA:ta pilkkovina proteiineina) toimivia Cas-proteiineja koodaavasta "cas"-sekvenssistä ja "muistina" toimivasta CRISPR-sekvenssistä, jota käytetään bakteerivirusten eli bakteriofagien vieraan perimän tunnistukseen ja tallettamiseen. Cas1 ja Cas2 ovat kaikissa luonnosta löydetyissä systeemeissä läsnä.
CRISPR-termi on englanninkielinen lyhenne. Infektion tunnistavat sekvenssit ovat bakteerin (tai arkin) DNA:ssa "ryppäytyneesti tasaisin välimatkoin toisistaan" (CRI). Bakteerit ottavat tunnistussekvensseihin vain osan viruksen perimästä. Tunnistussekvenssit erottavat toisistaan "lyhyet palindromiset toistosekvenssit" (SPR), jotka eivät ole peräisin viruksen genomista.
1. Kun bakteeriin (tai arkkiin) tuodaan viruksen DNA:ta, jolle bakteeri on jo immuuni, tuottaa bakteeri Cas-proteiinin ja CRISPR-sekvenssin alueelta aiemmin talletetun crRNA:n (CRISPR RNA). crRNA sisältää sekvenssin, joka on komplementaarinen eli emäksiltään yhteen sopiva lyhyeen sekvenssiin viruksen DNA:ssa.
2. Cas ja crRNA muodostavat kompleksin.
3. Kompleksi sitoo viruksen DNA:n crRNA:n komplementaarisen sekvenssin avulla.
4. Cas pilkkoo viruksen DNA:n toimimattomaksi ja estää siten viruksen monistumisen ja bakteerin infektoitumisen.
1. Kun bakteeriin (tai arkkiin) tuodaan viruksen DNA:ta, jolle bakteeri ei ole immuuni, bakteeri tuottaa Cas1-nukleaasin.
2. Cas1 sitoo jonkin sekvenssin viruksen DNA:sta ja pilkkoo sen sopivan pituiseksi pätkäksi.
3. Pätkä liitetään CRISPR-alueeseen bakteerin DNA:han pysyvästi. Tällöin bakteeri "muistaa" infektion ja voi puolustautua sitä vastaan.
Esimerkiksi CRISPR/Cas9-systeemi on geenimuuntelutekniikka, johon sisältyy yksinkertaisimmillaan vain Cas9-proteiini, Cas9:n ohjaukseen käytetty RNA-pätkä ja muuntelun kohteena oleva DNA. Tekniikka toimii elävissä soluissa. Muunteluun osallistuvat komponentit voidaan pistää soluun sisälle mikroskooppisen ohuella injektioneulalla.
Tekniikassa luonnossa normaalisti erillään olevista tracrRNA:sta (trans-activating crRNA) ja crRNA:sta on tuotettu kimeeri, yhtenäinen RNA-ohjausjakso. Kimeeriä kutsutaan sgRNA:ksi (single guide RNA) ja se muodostetaan, jotta muuntelussa on vähemmän osallistuvia RNA:ita (kahden sijaan yksi). sgRNA voidaan tuottaa synteettisesti.
Luonnossa tracrRNA:n tehtävänä on pitää crRNA:ta paikallaan Cas9:ssä crRNA:n kanssa komplementaarisen sekvenssinsä kanssa. crRNA:ssa puolestaan on normaalisti viruksen tunnistukseen käytetty sekvenssi, mutta sekvenssi on korvattu sgRNA:ssa muuntelun kohteena olevan DNA:n tietyn alueen kanssa komplementaariseksi.
Cas9-nukleaasi ohjautuu sgRNA:ssa olevan RNA-sekvenssin avulla tiettyyn kohtaan DNA:ssa, tämän kanssa komplementaariseen sekvenssiin. Oikeassa kohdassa ollessaan Cas9 leikkaa DNA:n tietystä kohtaa. Tätä voidaan käyttää ns. knock-out muunteluun, jossa tarkastellaan geenien poiston eli inaktivaation vaikutusta soluun tai suurempaankin eliöön. Solu pyrkii korjaamaan katkoksen ja liittämään DNA-pätkät yhteen. Vaihtoehtoisesti katkokseen voidaan useimmiten liittää eli insertoida halutunlainen geeni.
CRISPR/Cas9-menetelmässä täytyy periaatteessa vain ensin selvittää geenimuuntelun kohteena olevan DNA:n sekvenssi sekvensoimalla.
Moniin muihin geenimuuntelutekniikoihin verrattuna CRISPR/cas9 on äärimmäisen tarkka, laajalti sovellettavissa, halpa ja yksinkertainen käyttää. Tekniikka on viime vuosina mullistanut geenimuuntelua ja geenitutkimusta suuresti.