ترسيب مناعي للكروماتين
الترسيب المناعي للكروماتين هو تقنية ترسيب مناعي تجريبية تستعمل لتحري التفاعلات بين البروتين و الـ حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين في الخلية.
يهدف إلى:
بالمختصر الطريقة كالتالي:
من المفترض ان تكون تسلسل الـDNA هذه مرتبطة مع البروتين الهدف في الخلية.
هناك نوعان أساسيان للترسيب المناعي للكروماتين ChIP يختلفان بشكل أساسي في البدء بتحضير الكروماتين:
مناسبة لتحديد خريطة DNA عوامل الانتساخ وغيرها من البروتينات المرتبطة بالكروماتين.
يمكن استخدام المحدد المستضدي الموسوم للبروتين الهدف أو استخدام الاضداد الموسومة بالبيوتين دخل الخليةبدلا من الأضداد للبروتين الفطري الهدف.
مناسبة لتحديد موقع الهيستوناتالتي تقوم بالتعديل على الـDNA الهدف.
الفائدة الأساسية للـNChIPهي في نوعية الضد إذ انه من الضروري ملاحظة أن أغلب أضداد الهيستونات المعدلة متفوقة على المستضدات الصنعية الببتيدية غير الثابتة. كما أن المحدد المستضدي المستعمل في الـXChIP للتمييز قد يتعطل أو يتحطم بارتباط التصالبي مع الفورم ألدهيد. و ان الارتباط التصالبي يتضمن حل المجموعة الامينية على النهايات N مما يسبب تعطيل المحدد المستضدي وهذا يسفر قلة فعالية بروتوكول الـXChIP مقارنة مع الـNChIP.
لكن كلا الطريقتين تملك أهدافا وفوائد مختلفة مقارنة ببعضهما فالـXChIP تستعمل لتحديد المواقع الهدف لعوامل الانتساخ وغيرها من البروتينات المرتبطة بالكروماتين بينما الـNChIP تستعمل لتحديد المواقع الهدف للهيستونات المعدلة (انظر الجدول 1).
الجدول 1: فوائد ومساوئXChIP وNChIP
استخدم طالب متخرج في مخبر Lis اشعة أشعة فوق البنفسجية لربط البروتينات تصالبيا وبشكل تساهمي مع الـDNA المجاور في خلايا الجراثيم الحيةالسليمة.
بعد حل الخلايا المتصالبة وترسيب الـRNA بوليمراز الجرثومي مناعيا هجن الـDNA الغني بالـRNA بوليميراز مع مسبابير متناسبة مع اماكن مختلفة من جينات معروفة لتحديد توزع وكثافة البوليميراز عند تلك الجينات في الأحياء.
بعد سنة استخدمو الطريقة نفسها لدراسة توزع الـRNA بوليميراز II عند حقيقيات النوى على جينات الصدمة الحرارية في ذبابة الفاكهة.
ربما تعتبر تلك التقارير العمل الريادي في مجال ترسيب الكروماتين مناعيا.
بعدها قام ومساعديه بتطوير وتعديل XChIP اللذين درسوا توزع الهيستون H4 على جين الصدمة الحراريةالارتباط المتصالب بالفورم ألدهيد بعدها تم تطوير وتعديل هذه الطريقة.
وصفت طريقة الـNChIP أول مرة من قبل Hebbes وزملائه عام 1988 وتم تطويرها وتعديلها بسرعة.
تحتاج ChIP النموذجية أربعة إلى خمسة أيام و 106~ 107 خلايا على الاقل.
الان هناك طرق جديدة للـChIPيمكن انجازها بعدد أقل من الخلايا حوالي 100~1000 وبيوم واحد.
يمكن استخدام عدد فليل من الخلايا حوال 100 خلية من خلال اضافة خلايا Drosophila كحامل للكروماتين وذلك لتقليل خسارة الكروماتين الهدف وتسهيل عملية ترسيبه ولكنها تحتاج مشارع primers ذات نوعية عالية لتحديد كروماتين الخلية الهدف وتمييزه عن الكروماتين الحامل الغريب وتحتاج يومين إلى ثلاثة ايام.
تقلل هذه الطريقة من الوقت اللازم لاجراء المقايسة مقارنة بالـChIP التقليدية من خلال اختصار خطوتان:
لكن هذا البروتوكول السريع مناسب فقط عندما يكون عدد خلايا العينة كبير (حوالي106~ 107) تخضع عينات الكروماتين المجزأ إلى أكثر من 24 جزء الىPCR-ready DNA خلال 5 ساعات مما يسمح بأن تكون عوامل الكروماتين المتضاعفة مسابير خلال نقاط زمنية متعددة.
تستخدم هذه المقايسة 100,000 خلية كمواد بدء وهي مناسبة لاجراء ترسيب المناعي للكروماتين لأكثر من 100 هيستونأو 100 عامل انتساخ لذا يمكن تحضي العديد من عينات الكروماتين بشكل متوازي وحفظها وتجرى خلال يوم.
يحضر الكروماتين من 1,000 خلية ويمكن اجراء أكثر من 8 عمليات ترسيب منعي للكروماتين بشكل متوازي بدون حامل يمكن البدء بهذه المقايسة بـ 100 خلية لكنها مناسبة لاجراء ترسيب مناعي واحد ويمكن استخدام خزعة نسيجية صغيرة (1 mm3) . يتم اجراء هذا النوع خلال يوم.
تعتبر مقايسة ترسيب مناعي للكروماتين معتمدة على الصفيحة المكروية -based ChIP assaymicroplate حيث تتم جميع الخطوات ضمن ابار صفيحة مكروية بدون نقل العينة تسمح هذه الطريقة باجراء 96 ترسيب مناعي للكروماتين للهيستون وبروتينات متعددة مرتبطة بالـDNA خلال يوم.
كما تم تطبيق الترسيب المنعي للكروماتين لتحليل واسع للجينوم من خلال ربطه بتفنية الـmicroarray(ChIP-on-chip) أو تقنية الجيل الثاني من تسلسل الـDNA(Chip-Sequencing) كما يمكن ربطها بتسلسل النهاية الموسومة المتزاوجة paired-end tags sequencingفي تحليل تداخل الكروماتين باستخدام تقنية بتسلسل النهاية الموسومة المتزاوجة (ChIA-PET).