TCVN12621:2019

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12621:2019 về Phân bón - Xác định hàm lượng axit amin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12621:2019 PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Fertilizers - Determination of amino acids content by high performance liquid chromatography method (HPLC) Lời nói đ ầu TCVN 12621:2019 do Viện Q u y hoạch và Thiết k ế Nông nghiệp biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Fertilizers - Determination of amino acids content by high performance liquid chromatography method (HPLC) 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng axit amin tự do (tổng hợp và tự nhiên) và axit amin ở dạng tổng số (liên kết peptit và tự do) trong phân bón bằng thiết b ị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có cột trao đổi ion. Tiêu chu ẩ n này áp dụng cho các axit amin sau: tổng của cystin và cystein; methionin; lysin; threonin; alanin; arginin; axit aspartic; axit glutamic; glycin; histidin; iso leucin; leucin; phenylalanin; prolin; serin; tyrosin; valin. Tiêu chuẩn này không ph â n biệt giữa các muối của axit amin, cũng không phân biệt các dạng đ ồ ng phân D và L của axit amin. Tiêu chuẩn không áp dụng đ ể xác đ ị nh tryptophan hoặc các chất tương tự axit amin có chứa nhóm hydroxyl. 2 Thuật ngữ và định nghĩa Tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ v à định nghĩa sau: 2.1 Axit amin tự do (free amino acid) Nhóm axit amin ưa nước, có liên kết chặt chẽ với môi trường nước và thường tạo liên kết hydro với môi trường và giữa các axit amin với nhau. 2.2 Axit amin ở dạng liên kết peptit (peptide-linked amino acids) Nhóm axit amin kỵ nước không hoặc kh ó tan trong nước, do vậy phần lớn các axit amin nằm ở phần nội của protein. 2.3 Axit amin tổng (total amino acids) Bao gồm axit amin tự do v à axit amin ở dạng liên k ế t peptit. 3 Nguyên tắc 3.1 Các axit amin tự do Các axit amin tự do được chiết với dung dịch axit clohydric loãng. Các ch ấ t đ ồ ng chiết xu ấ t có phân tử lượng lớn ch ứ a nitơ được kết tủa với ax i t sulfosalicylic và được loại bằng cách lọc. Dịch lọc được điều chỉnh pH tới 2,20. Các axit amin được tách riêng biệt bằng cột trao đổi ion trong thiết bị HPLC và xác định bằng ph ả n ứng với ninhydrin sử dụng detector quang đo ở bước sóng 570 nm. 3.2 Các axit amin tổng số Quá trình lựa chọn phụ thuộc vào các axit amin cần xác định. Cystin, cystein và methionin sẽ b ị oxy hóa tạo thành axit cysteic và methionin sul f on tương ứng, trước giai đoạn thủy phân. Tyrosin được xác định trong dịch thủy ph â n của các mẫu không oxy hóa. Tất c ả các axit amin c ò n lại n ê u trong Điều 1 có thể được xác định cả ở dạng mẫu bị oxy hóa và không bị oxy hóa. Qu á trình oxy hóa được thực hiện ở 0 °C với hỗn hợp axit performic và phenol. Thuốc thử oxy hóa dư được loại bỏ bằng natri sulfit. M ẫ u oxy hóa hoặc không oxy hóa đều được thủy phân trong môi trường axit clohydric 6 mol/L. Dịch thủy phân được điều ch ỉ nh pH tới 2,20. Các axit amin được tách riêng biệt bằng cột trao đổi ion trong thiết bị HPLC và xác định bằng phản ứng với ninhydrin sử dụng detector quang đo ở bước sóng 570 nm. (bước sóng 440 nm đối với prolin). 4 Thuốc thử Trừ khi có quy định khác, trong quá trình phân t í ch ch ỉ sử dụng các hóa chất, thuốc th ử c ó cấp độ tinh khiết d ù ng cho phân tích sắc ký. 4.1 Nước , sử dụng nước cất hai lần hoặc nước c ó chất lượng tương tự (độ dẫn điện <10 µ S). 4.2 Hydro peroxit (H 2 O 2 ) đậm đặc. 4.3 Axit formic (HCOOH) đậm đặc. 4.4 Axit clohydric (HC l ) đậm đặc, d = 1,19 g/mL. 4.5 Natr i hydroxit (NaOH) dạng hạt. 4.6 Phenol (C 6 H 5 OH) thể rắn. 4.7 Thiodiglycol (C 4 H 10 O 2 S) độ tinh khiết > 99 %. 4.8 Axit 5-sulfosalicylic (C 7 H 6 O 2 S.2H 2 O) th ể rắn. 4.9 Natri citrat (Na 3 C 6 H 5 O 7 .2H 2 O) th ể r ắ n. 4.10 Natri clorua (NaCl) thể rắn 4.11 Natri sulfit (Na 2 SO 3 ) thể rắn. 4.12 Dung mô i 1 -octanol (C 8 H 18 O) 4.13 Dầu nhẹ , nhiệt độ sôi từ 40 °C đến 60 °C. 4.14 Norleucin , hay bất kỳ chất khác phù hợp để sử dụng làm chất nội chuẩn. 4.15 Khí nitơ 5.0. 4.16 Các axit amin. 4.16.1 Các chất chuẩn axit amin nêu trong Điều 1. 4.16.2 Axit cysteic. 4.16.3 Methionin sulfon. CHÚ THÍCH 1: Sử dụng các hợp chất tinh khiết không chứa nước kết tinh. Làm khô trong chân kh ô ng c ó ch ứ a P 2 O 5 hoặc H 2 SO 4 trong 1 tuần trước khi sử dụng. 4.17 Dung dịch natr i hydrox i t 7,5 mol/L: Hòa tan 300 g natri hydroxit (4.5) trong nước và định mức đến 1000 mL. 4.18 Dung d ị ch natri hydroxit 1 mol/L: Hòa tan 40 g natri hydroxit (4.5) trong nước và định mức đến 1000 mL. 4.19 Hỗn hợp chiết (axit clohydric 0,1 mol/L chứa 2 % thiodiglycol): Hút 8,2 mL axit clohydric đậm đặc (4.4) pha loãng với khoảng 900 mL nước. Thêm 20 mL thiodiglycol (4.7) và định mức đến 1000 ml bằng nước. CH Ú TH Í CH 2: Kh ô ng trộn trực tiếp axit clohydric đậm đặc (4.4) và thiodiglycol (4.7) 4.20 Dung dịch axit formic-phenol: Trộn 889 g axit formic (4.3) với 111 g nước và thêm 4,73 g phenol (4.6). 4.21 H ỗ n hợp thủy phân (axit clohydric 6 mol/L chứa 1 g phenol): Hòa tan 1 g phenol (4.6) vào 492 mL axit clohydric đậm đặc (4.4) và định mức đến 1000 mL bằng nước. 4.22 Dung dịch axit sulfosalicylic 6 %: Hòa tan 60 g axit sulfosa l icylic (4.7) trong nước và định mức đến 1000 mL bằng nước. 4.23 Hỗn hợp oxy hóa (axi t performic-phenol) Trộn 0,5 mL hydro peroxit (4.2) với 4,5 mL hỗn h ợ p axit formic-phenol (4.20) trong c ố c nh ỏ . Gi ữ ở nhiệ t độ trong khoảng 20 °C đến 30 °C trong 1 h nhằm tạo ra axi t performic, sau đó làm lạnh trong bể đi ề u nhiệt ở 0 °C (15 min) trước khi thêm vào mẫu. CHÚ THÍCH 3: Tránh tiếp xúc với da và n ê n mặc quần áo b ả o hộ. 4.24 Đệm citrat (Na + : 0,2 mol/L), pH = 2,20. H ò a tan 19,61 g natri citrat (4.9), 5 mL thiodiglycol (4.7), 1 g phenol (4.6) và 16,50 ml axit clohydric đậm đ ặc (4.4) trong khoảng 800 mL nước. Điều ch ỉ nh pH tới 2,20. Định m ứ c đến 1000 mL bằng nước. 4.25 Đệm rửa giải , chu ẩ n bị theo các điều kiện của thiết bị phân t í ch được sử dụng. 4.26 Thuốc thử ninhydrin , chu ẩ n bị theo các điều kiện của thiết b ị phân tích được sử dụng. 4.27 Dung dịch chuẩn của các axit amin 4.27.1 Dung dịch chuẩn gốc axit amin (theo Điều 1) có n ồ ng độ là 2,5 µ mol/mL trong axit HC l . Các dung dịch này thường c ó sẵn trên thị trường. 4.27.2 Dung dịch chuẩn g ố c axit cysteic và methionin sulfon , 1,25 µ mol/mL. H ò a tan 0,2115 g axit cysteic (4.16.2) và 0,2265 g methionin sulfon (4.16.3) trong đệm citrat (4.24) vào b ì nh định mức dung t í ch 1000 mL và định mức đến vạch bằng đệm citrat. CH Ú THÍCH 4: Các dung dịch chuẩn được bảo quản dưới 5 °C không quá 12 tháng. Dung d ị ch này không nên dùng nếu dung dịch chu ẩ n gốc (4.27.1) có ch ứ a axit cysteic v à methionin suIfon. 4.27.3 Dung dịch chuẩn gốc và chất nội chuẩn , ví dụ như norleucin 20 µ mol/mL. Hòa tan 0,6560 g norleucin (4.14) trong đệm citrat (4.24) vào b ì nh định mức dung tích 250 mL và định mức đến vạch bằng đệm citrat. Bảo quản dưới 5 0 °C không quá 6 tháng. 4.27.4 Dung dịch chuẩn làm việc của các ch ấ t chuẩn axit amin , sử dụng cho các dịch thủy phân, axit cysteic và methionin sulfon có n ồ ng độ 0,1 µ mol/mL và các axit amin khác là 0,2 µ mol/mL. Hòa tan 2 , 2 g natri clorua (4.10) trong cốc dung tích 100 mL với 30 mL đệm citrat (4.24). Thêm 4,00 mL dung dịch chu ẩ n gốc axit amin (4.27.1), 4,00 mL dung dịch chuẩn gốc axit cysteic v à methionin sulfon (4.27.2), và 0,50 mL chu ẩ n gốc của dung dịch nội chu ẩ n (4.27.3) nếu c ầ n sử dụng. Điều ch ỉ nh pH tới 2,20 bằng dung dịch natri hydroxit 1 mol/L (4.18). Chuyển định lượng vào b ì nh định mức dung tích 50 mL và định mức bằng đệm citrat (4.24), trộn đều. Bảo quản dưới 5 °C không quá 3 tháng. 4.27.5 Dung dịch hiệu chuẩn của các chất chuẩn axit amin Đối với đường chuẩn của các axit amin (Điều 1) sử dụng các dịch chiết đ ược chuẩn bị theo (6.2) và với dịch thủy ph â n được chuẩn bị theo 6.3.2 Đối với đường chuẩn axit cysteic và methionin sulfon chu ẩ n b ị dung dịch t ương tự 4.27.4 nhưng không dùng natri clorua. B ả o quản dung dịch này dưới 5 °C không quá 3 tháng. 5 Thiết bị và dụng cụ Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và các dụng cụ , thiết bị sau: 5.1 B ì nh cầu đáy tròn , dung tích 100 mL hoặc 250 mL có sinh hàn hồi lưu. 5.2 Bình th ủ y tinh bosilicat , dung tích 100 mL với nắp bằng cao su/teflon (v í dụ: Duran, Schott) chịu nhiệt. 5.3 T ủ sấy , có điều khiển nhiệt độ. 5.4 Thiết bị đo pH , đọc được đến ba s ố thập phân. 5.5 Màng lọc , 0,2 µ m. 5.6 Máy ly tâm. 5.7 Bộ cất quay chân không. 5.8 Máy lắc và m ấ y khuấy từ. 5.9 Rây 0,25 mm. 5.10 Bể điều nhiệt. 5.11 Thiết bị HPLC có cột trao đổi ion, thiết bị dẫn suất sau cột cho ninhydrin và detector quang. Cột được nhồi với các hạt nhựa polystyren đã được sulfonat hóa có khả năng tách axit amin ra khỏi nhau và khỏi các chất khác dương tính với ninhydrin. Tốc độ dòng của dung dịch đệm và ninhydrin được điều chỉnh bằng bơm để có tốc độ dòng ổ n định ± 0 , 5 % trong suốt quá trình chạy đường chuẩn v à phân tích mẫu. Đối với một số thiết bị, quá trình thủy phân có thể được sử dụng m à trong đó dịch thủy phân có n ồ ng độ natri 0,8 mol/L và chứa tất cả lượng ax i t formic dư từ bước oxy hóa. Một số thiết b ị khác sẽ không tách tốt một số axit amin nhất định nếu dung dịch thủy phân chứa n ồ ng độ axit formic quá dư và/hoặc n ồ ng độ ion natri cao. Trong trường hợp n à y, giảm thể tích axit bằng cách làm bay hơi tới xấp x ỉ 5 mL sau khi thủy phân và trước khi điều chỉnh pH. Quá trình b a y hơi nên thực hiện trong điều kiện chân không ở nhiệt độ không vượt quá 40 °C. 6 Cách tiến hành 6.1 Chuẩn bị mẫu thử 6.1.1 Ph â n bón dạng rắn Nghiền mẫu cho đến khi l ọ t qua lỗ sàng 0 , 25 mm. Các mẫu có độ ẩm cao sẽ được s ấ y khô bằng không khí ở nhiệt độ không quá 50 °C hoặc đ ô ng kh ô trước khi nghiền. Các mẫu có h à m lượng chất béo cao sẽ được chiết với dầu nhẹ (4.13) trước khi nghiền. 6.1.2 Phân bón dạng lỏng Dạng dung dịch: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 50 mL , trước khi lấy mẫu để tiến hành ph é p thử mẫu phải được lắc đều. Dạng lỏng sền sệt: M ẫ u l ấ y ban đầ u không ít hơn 200 g, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép th ử , mẫu phải được trộn đều. 6.2 Xác định các axit amin tự do Cân một lượng mẫu phân bón phù hợp (1 g đến 5 g) ch í nh xác đến 0,0001 g đã được chuẩn bị theo (6.1) vào b ì nh tam gi á c và thêm 100 mL của hỗn hợp dịch chiết (4.19). Lắc đều trong 60 min, sử dụng máy lắc hoặc máy khuấy từ. Đ ể cho lắng cặn rồi dùng pipet hút 10 mL dung dịch phía tr ê n cho vào cốc có mỏ dung tích 100 mL. CHÚ TH Í CH 5: Lượng mẫu cân n ê n ch ứ a lượng nitơ khoảng 10 mg và lượng nước không vượt qu á 100 mg; Lượng mẫu c ầ n chuẩn b ị được tính toán như sau: trong đ ó : N s là lượng nitơ trong mẫu thử , t í nh bằng phần trăm (%); W s là khối lượng của phần mẫu th ử tương đương với lượng nitơ khoảng 10 mg, t í nh bằng miligam (mg). Thêm 5 mL dung d ị ch axit sulfosalicylic 6 % (4.22) , trong khi dịch vẫn đang khuấy và tiếp tục khuấy bằng máy khuấy từ trong 5 min. Lọc hoặc ly tâm phần nổi phía trên để loại bỏ kết tủa. Lấy 10 mL dung dịch vào cốc dung tích 100 mL, điều ch ỉ nh pH t ớ i 2,20 bằng dung dịch natri hydroxit 1 moL/L (4.18). Chuyển toàn bộ dung dịch v à o bình định mức dung tích 100 mL, tráng r ử a bằng đệm citrat (4.24) và định m ứ c đến vạch bằng dung dịch đệm (4.24). Nếu sử dụng ch ấ t nội chuẩn, thêm 1,00 mL dung dịch nội chuẩn (4.27.3) cho m ỗ i 100 mL dịch cuối và định mức đến vạch bằng dung dịch đệm citrat (4.24). Chạy sắc ký tiếp theo 6.4 Nếu dịch chiết không được sử dụng cùng ngày th ì ph ả i b ả o quản ở nhiệt độ dưới 5 °C. 6.3 Xác định các axit amin tổng số 6.3.1 Qu á tr ì nh oxy hóa C â n một lư ợ ng m ẫ u phân bón phù hợp (1 g đến 5 g) chính xác đ ế n 0 , 0001 g đã được chu ẩ n bị theo (6.1) cho v à o - B ì nh tam giác dung tích 100 mL để thủy phân hở (6.3.2.3), hoặc - B ì nh tam giác dung tích 250 mL nếu yêu cầu n ồ ng độ natri thấp (6.3.3.2) hoặc - B ì nh dung tích 100 mL có nút nhám đậy đ ể thủy phân kín (6.3.2 4). Phần mẫu th ử đ ược cân nên chứa khoảng 10 mg nitơ (theo CHÚ TH Í CH 5). Đặt b ì nh đựng mẫu vào bể điều nhiệt và làm lạnh về 0 °C. Thêm 5 mL hỗn hợp oxy h ó a (4.23) và trộn đều bằng cách sử dụng que khuấy thủy tinh có đầu cong. Đậy k í n bình đựng mẫu có chứa que khuấy bằng màng bọc kín kh í , đặt bể điều nhiệt có chứa bình m ẫ u vào tủ lạnh ở 0 °C trong 16 h. Sau 16 h, lấy mẫu ra khỏi tủ lạnh và kh ử phần chất oxy hóa còn dư bằng cách thêm vào b ì nh mẫu 0,84 g natri su l fit (4.11). Quy tr ì nh tiếp tục theo 6.3.2.1. 6.3.2 Quá trình thủy phân 6.3.2.1 Thủy phân mẫu đã được oxy hóa Đ ố i với mẫu đã oxy h ó a được chu ẩ n bị như 6.3.1, thêm 25 mL hỗn hợp thủy phân (4.21), tráng cẩn thận b ì nh mẫu để lấy hết lượng mẫu còn bám trên thành bình và que khuấy. Tùy thuộc vào quá trình thủy ph â n được sử dụng, quy tr ì nh được thực hiện theo các bước nêu tại 6.3.2.3 hoặc 6.3.2 .4. 6.3.2.2 Thủy phân các mẫu chưa được oxy hóa Cân một lượng mẫu ph â n bón phù hợp (1 g đến 5 g) chính xác đến 0,0001 g đã được chuẩn bị theo (6.1) cho vào bình tam giác dung tích 100 mL hoặc 250 mL hoặc vào b ì nh có nắp đậy dung tích 100 mL. Phần mẫu th ử được cân nên chứa khoảng 10 mg nitơ (theo CH Ú TH Í CH 5). Thêm cẩn thận vào b ì nh 25 mL hỗn hợp thủy ph â n (4.21) và trộn đều mẫu. Quy tr ì nh được tiếp tục thực hiện theo các bước 6.3.2.3 hoặc 6.3.2.4. 6.3.2.3 Thủy phân h ở Thêm ba viên thủy tinh trợ sôi vào b ì nh đựng mẫu (đã được chuẩn bị ở 6.3.2.1 hoặc 6.3.2.2) và đun h ồ i lưu liên tục trong 23 h. Khi quá trình thủy phân kết thúc, rửa sinh hàn từ trên xu ố ng bằng 5 mL dung dịch đệm citrat (6.24). Tháo b ì nh mẫu và làm lạnh trong bể điều nhiệt ở 0 °C. Quá trình tiếp tục thực hiện theo 6.3.3. 6.3.2.4 Thủy ph â n k í n Đặt b ì nh có chứa hỗn hợp mẫu đã được chu ẩ n bị theo 6.3.2.1 và 6.3.2.2 vào tủ sấy đặt ở 110 °C. Trong 1 h đầu ti ê n , nhằm để ngăn sự tăng áp suất (do sự thoát ra của các ch ấ t kh í ) và đ ể tránh bị nổ, đặt nắp đậy l ê n trên b ì nh. Không vặn chặt nắp. Sau 1 h, v ặ n n ắ p b ì nh đựng mẫu v à đặt v à o nồi h ấ p ở 140 °C trong 3 h. Khi quá trình thủy phân kết thúc, lấy b ì nh mẫu ra khỏi t ủ sấy, c ẩ n thận m ở nút b ì nh và đặt b ì nh vào b ể điều nhiệt xuống ở 0 °C. Tùy thuộc vào qu á tr ì nh điều chỉnh pH (6.3.3), chuyển định lượng mẫu trong b ì nh sang bình tam giác dung t ích 250 mL hoặc b ì nh cầu đáy tròn dung tích 250 mL sử dụng dung dịch đệm citrat (4.24). Tiến hành tiếp tục theo 6.3.3. 6.3.3 Điều ch ỉ nh pH 6.3.3.1 Tùy thuộc vào mức độ dung nạp natri của thiết bị sử dụng đ ể phân tích axit amin, quá trình tiếp tục được thực hiện theo 6.3.3.2 hoặc 6.3.3.3 để điều chỉnh pH. 6.3.3.2 Khi thi ế t bị phân tích axit amin đòi h ỏ i n ồ ng độ natri thấp (th ì th ể tích axit phải giảm xuống) v à đ ố i với hệ th ố ng cột trao đổi ion cũng yêu cầu độ natri thấp, thì n ê n sử dụng dung dịch chuẩn gốc của chất nội chuẩn (4.27.3). Trong trường hợp này, th ê m 2,00 mL dung dịch chuẩn gốc của chất nội chuẩn (4.27.3) để thủy phân trước khi làm bay hơi. Thêm 2 giọt dung dịch 1-octanol (4.12) vào dung dịch thủy phân thu được từ 6.3.2.3 hoặc 6.3.2.4. Sử dụng thiết bị cất quay chân không để l à m giảm thể tích xuống 5 mL đến 10 mL dưới điều kiện ch â n không ở 40 °C. Nếu thể tích dung dịch còn dưới 5 mL, mẫu thủy phân phải b ỏ đi v à thực hiện lại quá trình phân tích từ đầu. Điều ch ỉ nh pH đế n 2,20 bằng dung dịch natri hydroxit 1 mol/L (4.18) v à thực hiện theo 6.3.2.4. 6.3.3.3 Đối với hệ th ố ng cột trao đổi ion không yêu cầu n ồ ng độ natri thấp, lấy mẫu thủy phân thu được theo 6.3.2.3 và 6.3.2.4 và trung hòa từ từ, c ẩ n thận bằng cách thêm 17 mL dung dịch natri hydroxit 7,5 mol/L (4.17), sử dụng máy khuấy từ, trong suốt quá trình này nhiệt độ phải luôn được giữ ở mức dưới 40 °C. Điều ch ỉ nh pH đến 2,20 ở nhiệt độ phòng bằng dung dịch natri hydroxit 7,5 mol/L (4.17) và cuối cùng bằng dung dịch natri hydroxit 1 mol/L (4.18). Tiếp tục thực hiện theo 6.4. 6.3.3.4 Dung dịch mẫu thử cho chạy sắc k ý Chuyển toàn bộ lượng dịch thủy ph â n đã điều chỉnh pH (6.3.3.2 hoặc 6.3.3.3) cùng dung dịch đệm c i trat (4.24) vào bình định mức dung tích 200 mL v à đ ị nh mức đến vạch mức bằng dung dịch đệm. Nếu chất nội chuẩn không có sẵn, thêm 2 mL dung dịch chuẩn gốc của chất nội chuẩn (4.27.3) và định mức đến vạch mức b ằ ng dung dịch đệm citrat (4.24). Trộn đều c ẩ n thận. Thực hiện bước chạy sắc ký (6.4) Nếu dung dịch mẫu không được thực hiện trong cùng ngày, mẫu phải được b ả o quản dưới 5 °C. 6.4 Chạy sắc ký Trước khi thực hiện chạy sắc ký, đưa dịch chi ế t (6.2) hoặc dịch thủy phân (6.3.3.4) v ề nhiệt độ phòng. Lắc đều hỗn hợp v à lọc một lượng ph ù hợp qua m à ng lọc cỡ 0,2 µ m. Đưa dịch lọc sạch vào cột trao đổi i on, sử dụng thiết bị HPLC. Bơm mẫu c ó thể thực hiện bằng tay hoặc tự động. Điều quan trọng là đưa lên cột phân tích cùng một lượng dung d ị ch chất chuẩn v à mẫu thử không sai khác quá 0,5 % trừ khi chất nội chuẩn được sử dụng, tỷ lệ giữa lượng natri:axit amin trong chất chuẩn v à dung dịch mẫu là tương tự nhau th ì mới có thể thực hiện được. Nói chung, tần suất chạy dung dịch chuẩn phụ thuộc độ ổn định của thuốc thử ninhydrin và hệ thống phân tích. Pha loãng chất chuẩn hoặc mẫu v ớ i dung dịch đệm citrat (4.24) để có được diện tích pic của chất chuẩn vào khoảng 30 % đến 200 % diện tích pic mẫu axit amin. Sắc k ý đ ồ của axit amin sẽ thay đổi một ít tùy theo máy phân t í ch và chất nhồi cột được sử dụng. Hệ thống phân tích được chọn phải có khả năng tách được các axit amin ra khỏi nhau và ra kh ỏ i các chất dương tính với ninhydr i n. Trong phạm vi hoạt động, hệ thống sắc ký phải đáp ứng tuy ế n tính với các thay đổi về lượng axit amin đưa v à o cột. Trong suốt quá trình chạy sắc ký, tỷ số giữa chiều cao lõm:pic đề cập ở dưới đây được áp dụng khi dung dịch có cùng n ồ ng độ mol (của các axit đang xác định) được phân tích. Dung dịch axit amin cùng n ồ ng độ mol n à y ch ứ a í t nhất 30 % của lượng axit amin tải tối đa của mỗi axit amin mà có thể đo được ch í nh xác. Đ ể tách threonin và serin, tỷ số giữa chiều cao lõm:pic của pic thấp hơn trong hai axit amin ch ồ ng lên nhau trong sắc ký đồ không vượt quá 2:10 (nếu chỉ cystein, methionin và lysin được xác định, sự tách không rõ ràng giữa các pic liền kề sẽ gây sai số đến phép đo). Đối với tất cả các axit amin t ỷ số tách tốt hơn nên l à 1:10. Hệ thống nên đảm bảo rằng lysin được tách khỏi "lysin nhân tạo" và ornithin. 7 Biểu thị kết quả Diện tích pic của mẫu và chất chuẩn được đo cho mỗi axit amin và lượng mẫu được tính theo gam axit amin /kilogam mẫu, được t í nh theo công thức (1): (1) Nếu chất nội chuẩn được sử dụng, th ì nhân với trong đó A e là diện tích pic của chất trong dịch thủy ph â n; A c là diện tích pic của chất trong dung dịch chuẩn hiệu chu ẩ n; A i e là diện tích pic của chất nội chuẩn trong dịc h thủy ph â n; A i c l à diện tích pic của chất nội chu ẩ n trong dung dịch chu ẩ n hiệu chu ẩ n; M là khối lượng ph â n tử của axit amin được xác định; C là n ồ ng độ của chất chuẩn, µ mol/mL; m là khối lượng mẫu, t í nh bằng g (t í nh về khối lượng ban đầu nếu mẫu được làm kh ô hoặc loại chất béo); V e l à t ổ ng th ể tích của dịch thủy phân (6.3.3.4) hoặc tổng th ể tích pha loãng của d ị ch chiết (6.2), tính bằng mililit. Cả cystin và cystein được xác định giống như axit cysteic trong thủy phân mẫu đã oxy h óa , nhưng được tính theo tổng của cystein và cystin sử dụng M = 120,15 g (= 0,5 x 240,30) (C 6 H 12 N 2 O 4 S 2 , M = 240,30 g). Methionin được xác đ ị nh như methionin sulfon trong thủy phân mẫu đã được oxy hóa, nhưng tính toán bằng cách sử dụng M của methionin = 149,21 g. Methionin tự do thêm vào được xác định sau khi chiết tách như methionin; tính toán tương tự sử dụng cùng chung M . T ổ ng thể tích của dịch chiết pha loãng ( V e ) dùng để xác định các axit amin tự do được tính theo công th ứ c (2) (2) trong đó V e f là thể tích chiết cuối cùng, tính bằng mililit. Các kết quả có thể chuyển đổi sang phần trăm (%): Kết quả t í nh theo % = 0,1 x kết quả t í nh theo gam trên kilogam. 8 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm bao gồm ít nhất những thông tin sau: a) Viện dẫn tiêu chuẩn này; b) Đặc điểm nhận dạng mẫu; c) Kết quả thử nghiệm, d) Mọi thao t ác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc dược coi là tùy chọn và các yếu tố có thể ả nh hư ở ng đ ến kết quả th ử nghiệm; e) Ngày th ử nghi ệ m.