TCVN5164:2018

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5164:2018 (EN 14122:2014) về Thực phẩm - Xác định vitamin B1 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 5164:2018 EN 14122:2014 THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH VITAMIN B 1 BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Foodstuffs - Determination of vitamin B 1 by high performance liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 5164:2018 thay thế TCVN 5164:2008; TCVN 5164:2018 hoàn loàn tương đương với EN 14122:2014; TCVN 5164:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chu ẩ n qu ố c gia TCVN/TC/F13 Phương ph á p phân tích và l ấy mẫu b iê n soạn, T ổ ng cục Ti ê u chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công b ố . THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH VITAMIN B 1 BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Foodstuffs - Determination of vitamin B 1 by high performance liquid chromatography CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này c ó thể cần phải s ử dụng các vật liệu, thiết b ị và các thao tác nguy h iể m. Tiêu chuẩn này không đề cập đến các v ấ n đề an toàn khi sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác đ ị nh kh ả năng áp dụng các gi ớ i hạn qu y đ ị nh trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định vitamin B 1 trong thực phẩm bằng sắc k ý lỏng hiệu năng cao (HPLC) xử lý bằng enzym và dẫn xuất h ó a trước cột hoặc sau cột. Phương pháp này được đánh giá xác nhận trong hai nghiên cứu liên ph ò ng. Nghiên cứu thứ nh ấ t phân tích mẫu bột m ì nguyên cám, sữa bột/sữa bột khô sấy phun, rau hỗn h ợ p đ ô ng khô và gan lợn đ ô ng lạnh, từ 0,295 mg/100 g đến 0,807 mg/100 g. Nghiên cứu thứ hai phân t í ch các mẫu thức ăn dùng b ằ ng đường xông, thức ă n trẻ em bổ sung rau, sữa bột, thức ăn bổ sung hoa quả, nấm men, ngũ cốc, bột s ô c ô la và thực phẩm b ổ sung từ 0,11 mg/100 g đến 486 mg/100 g. Vitamin B 1 là tổng các phần khối lượng của thiamin bao gồm các dẫn xuất phosphory l hóa. Thông tin th ê m về đánh g i á xác nhận, xem Điều 8 và Phụ lục B. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện d ẫ n ghi năm c ô ng bố thì áp dụng phiên bản được n ê u. Đối v ớ i các tài li ệ u viện dẫn kh ô ng gh i năm c ô ng bố th ì áp dụng phiên b ả n mới nh ấ t, bao gồm cả các sửa đổi. TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm. Y ê u cầu kỹ thuật và phương ph á p th ử . 3 Nguyên tắc Thiamin được chiết từ thực ph ẩ m bằng cách thủy phân axit, sau đó dephosphoryl hóa bằng enzym và định lượng bằng HPLC c ó dẫn xuất hóa trước cột hoặc sau cột với thiochrom. S ử dụng chất ngoại chuẩn đ ể đ ị nh lượng. Đ ể biết thêm th ô ng tin xem [1] đến [7] 4 Thuốc thử Ch ỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khi ế t phân t í ch và nước í t nhất đạt loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696) hoặc nước c ấ t hai lần, trừ khi có qu y định khác. 4.1 Metan ol , khối lượng w (CH 3 OH) ≥ 99,8 %, loại dùng cho HPLC. 4.2 Dung d ị ch axit axetic, n ồ ng độ ch ấ t c (CH 3 COOH) = 0,02 mo l / l . 4.3 Isobutanol , w (C 4 H 10 O) ≥ 98 %. 4.4 Natri d i hydro phosphat, w (NaH 2 P O 4 ) ≥ 99,8 %. 4.5 Dung d ị ch axit cl ohydric, w (HC l ) = 36 %. 4.6 Dung d ị ch ax it cl ohydr i c, c (HC l ) = 0,1 mo l / l . 4.7 Dung d ị ch axit sulfuric, c ( H 2 SO 4 ) = 0,05 mol/l. 4.8 Natrl hydroxit, w (NaOH) ≥ 99 %. 4.9 Dung dịch natri hydroxit, n ồ ng độ khối lượng ρ (NaOH) = 150 g/ l . 4.10 Dung d ị ch natr i hydrox i t, ρ (NaOH) = 200 g/ l . 4.11 Kali hexaxyanoferat III , w í K 3 [Fe(CN) 6 ] ý ≥ 99 %. 4.12 Dung dịch kali hexaxyanoferat III, ρ í K 3 [Fe(CN) 6 ] ý = 10 g/ l . 4.13 Dung d ị ch kali hexaxyanoferat III kiềm (dẫn xu ấ t trước cột), ρ í K 3 [Fe(CN) 6 ] ý = 0,4 g/l. Pha lo ã ng 2,0 ml dung dịch kali hexaxyanoferat III (4.12) bằng dung d ị ch natri hydroxit (4.9) đến 50 ml. Dung dịch nên được chu ẩ n b ị trong ngày sử dụng. 4.14 Dung d ị ch kali hexaxyanoferat III k iề m (dẫn xuất sau cột), ρ í K 3 [Fe(CN) 6 ] ý = 0,5 g /l. Pha loãng 2,5 ml dung d ị ch kali hexaxyanoferat III (4.12) bằng dung dịch natri hydroxit (4.10) đến 50 ml. 4.15 Enzym hoặc hỗn h ợ p enzym, c ó khả năng giải phóng vitamin B 1 từ thực phẩm kh ô ng chứa thiamin tự do. CH Ú THÍCH 1 D ữ liệu về độ chụm nêu trong Bảng B. 1 , sử dụng Taka-Diatase từ Pfaltz và Bauer 1) . Đối với độ chụm nêu trong Bảng B.2 và Bảng B.3, sử dụng kết hợp enzym β-amytase t ừ lúa mạch và Taka-Diataza 1) từ Serva. CHÚ TH Í CH 2 Nếu xảy ra hiện tượng dephosphory l h óa không đầy đủ, th ì có thể tiến hành định lượng ri ê ng TMP ( Thiamin Mono Phosphat), xem [7]. 4.16 Dung d ị ch natri axetat, c (CH 3 C OO Na.3H 2 O ) = 2,5 mo l / l . 4.17 Dung d ị ch natr i axetat, c (CH 3 C OO Na.3H 2 O ) = 0,5 mo l / l . 4.1 8 Pha động HPLC Các ví dụ về các hỗn hợp thích hợp với các phần th ể tích ví dụ từ 10 % đến 50 % metanol (4.1) trong nước hoặc sử dụng dung dịch đệm phosphat hoặc dung d ị ch đệm axetat được n ê u trong Phụ lục A và Phụ lục C . Khả năng sử dụng các tác nhân tạo cặp i on cũng được đưa ra. 4.19 Đ ệ m phosphat (pH = 3,5), c (KH 2 P O 4 ) = 9,0 mmo l / l . 4.20 Tetraetylamoniclorua, w ( C 8 H 2 0 NC l ) ≥ 98 %. 4.21 Natr i heptansulfonat, w (C 7 H 1 5 Na O 3 S) ≥ 98 %. 4.22 Đệm axêtat (pH = 4,0), c (CH 3 COOH) = 50 mmo l / l . 4.23 Chất chuẩn 4.23.1 Thiamin clorua hydroclorua, w (C 1 2 H 17 C l N 4 O S.HC l ) ≥ 99 %. Để hiệu chuẩn ngoài, xem 6.3. 4.23.2 Thiamin monophosphat clorua, w (C 1 2 H 1 7 C l N 4 O 4 PS) ≥ 98 %. Để kiểm tra enzym, xem 6.2.2. 4.23.3 Thiamin pyrophosphat c l orua (cocarboxylase), w (C 12 H 19 ClN 4 O 7 P 2 S) ≥ 98 %. Đ ể ki ể m tr a enzym, xem 6.2.2. 4.24 Dung d ị ch gốc 4.24.1 Dung d ị ch gốc thiamin clorua hydroc l orua, ρ (C 1 2 H 1 7 C l N 4 O S.HC l ) ≈ 0,1 mg/m l H òa tan một lượng chính xác chất chu ẩ n thiamin cl oroa hydroclorua (4.23.1) trong một thể tích dung môi thích hợp đ ã xác định, v í dụ 10 mg chất chu ẩ n vitamin B 1 trong 100 m l dung d ị ch axit clohydric (4.6). Dung d ị ch này có th ể bảo quản được bốn tuần ở nhiệt độ + 4 ° C . 4.24.2 Dung d ị ch gốc thiamin monophosphat, ρ (C 1 2 H 1 7 C l N 4 O 4 P S) ≈ 0,1 mg/m l H òa tan một lượng ch í nh xác thiamin monophosphat cl orua (4.23.2) trong một thể t í ch dung m ôi thích hợp đã xác định, ví dụ 10 mg thiamin monophosphat cl orua trong 100 m l dung d ị ch axit cl ohydric (4.6). Dung d ị ch này c ó thể bảo quản được bốn tuần ở nhiệt độ - 20 ° C . 4.24.3 Dung d ị ch gốc thiamin pyrophosphat, ρ (C 1 2 H 19 C l N 4 O 7 P 2 S) ≈ 0,1 mg/m l H òa tan một lượng ch í nh xác thiamin pyrophosphat cl orua (4.23.3) trong một th ể tích dung m ô i thích hợp đã xác định, v í dụ 10 mg thiamin pyrophosphat clorua trong 100 m l dung d ị ch axit cl ohydric (4.6). 4.24.4 Kiểm tra n ồ ng độ thiam i n clorua hydroclorua Pha lo ã ng 10 m l dung dịch thiamin clorua hydrodorua (4.24.1) bằng dung dịch axit clohydric (4.6) trong b ì nh đ ị nh mức 100 m l đến vạch. Đo độ h ấ p thụ của dung dịch n à y ở bước sóng tối đa 247 nm (A 247 ) trong cuvet 1 cm dựa vào dung dịch axit cl ohydric (4.6) trong cuvet chu ẩ n, sử dụng máy đo phổ UV (5.1). Tính n ồ ng độ khối lượng, ρ , bằng m i crogram tr ê n mi l i l it dung d ị ch thiamin cl orua hydro cl o ru a (4.24.1), sử dụng Công thức (1): Trong đó e là hệ số hấp thụ phân tử của thiamin cl orua hydro cl orua ở bước sóng tối đa kh o ảng 247 nm. Giá trị là 14 200 l.mol -1 .cm -1 . Giá trị tính được từ hệ số tắt, = 421 trong HCl 0 , 1 mol/l [8], [7] và khối lượng phân tử M = 337,21. Giá trị lấy đến bốn chữ số thập phân. M là khối lượng phân tử, tính bằng gam trên mol (g/mol). Giá trị là 337,21. A 247 là giá trị hấp thụ của dung dịch thiamin cl orua hydroclorua. 4.25 Dung dịch chuẩn 4.25.1 Dung d ị ch chuẩn thiamin clorua hydroclorua, ρ (C 1 2 H 1 7 C l N 4 O S.HC l ) ≈ 1 µg/m l đến 10 µg/ml Dùng pipet l ấ y t ừ 1 m l đến 10 ml dung dịch thiamin cl orua hydroc l orua (4.24.1) cho vào b ì nh đị nh mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ dung dịch axit clohydric (4.6). Dung dịch này có thể bảo quản được 1 tháng ở nhiệt độ 4 ° C , ở nơi tối. 4.25.2 Dung dịch chu ẩ n thiamin monophosphat, ρ (C 1 2 H 19 C l N 4 O 4 PS ) ≈ 1 µg/m l đến 10 µg/m l Dùng pipet lấy từ 1 m l đến 10 m l dung dịch thiamin monophosphat (4.24.2) cho vào b ì nh định mức 100 m l và pha loãng đến vạch bằng dung m ôi th í ch hợp, v í dụ dung dịch axit c l ohydr i c (4.6). Dung d ị ch này có thể bảo quản được 1 tháng ở nhiệt độ 4 ° C , ở nơi tối. 4.25.3 Dung dịch chuẩn thiamin pyrophosphat, ρ (C 1 2 H 19 C l N 4 O 7 P 2 S ) ≈ 1 µg/m l đến 10 µg/m l Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml dung dịch thiamin pyrophosphat (4.24.3) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung m ô i thích hợp, ví dụ dung dịch ax i t clohydric (4.6). Dung d ị ch này có thể b ả o quản được 1 tháng ở nhiệt độ 4 ° C , ở nơi tối. 5 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ ph ò ng thử nghiệm thông thường và cụ th ể như sau: 5.1 Máy đo phổ UV , c ó thể đo độ hấp thụ ở các bước s ó ng xác định (247 nm), với cuvet thích hợp, v í dụ chiều dài đường quang 1 cm. 5.2 Thiết bị hấp áp lực hoặc g i a nhiệt D ù ng thiết bị hấp áp lực cho mục đích chiết, v í dụ như kiểu nồi h ấ p áp lực, có bộ phận gh i nhiệt độ và áp suất, bộ phận đốt nóng bằng điện hoặc nồi cách thủy. 5.3 Hệ th ố ng HPLC Hệ thống HPLC gồm có bơm, bộ phận bơm mẫu, detector huỳnh quang có các bước sóng phát xạ 366 nm và kích th í ch 435 nm đã c à i đặt, (xem Ph ụ lục C) và hệ thống đánh gi á như bộ tích phân. 5.4 Cột HPLC 5.4.1 Yêu c ầu chung Có thể sử dụng các cột hoặc c ỡ hạt có k í ch cỡ khác với quy định trong tiêu chuẩn này. Các thông số tách phải phù hợp với vật li ệ u sử dụng để đảm bảo các kết quả tương đương. Tiêu chí vận hành đố i với các cột phân tích th í ch hợp là độ phân giải đường nền của thiamin từ các ch ấ t gây nhiễu 2) . 5.4.2 Trường hợp ôxy h óa trước cột Cột phân tích, v í d ụ như Lichropher ® 60 RP Select B 2) , cỡ hạt 5 µm, đường k í nh từ 4,0 mm đến 4,6 mm, dài từ 100 mm đến 250 mm. 5.4.3 Trường hợp ôxy h óa sau cột Cột phân tích, v í dụ như Supelco ® LC-18-DB 2) , c ỡ hạt 5 µm, đường kính từ 4,0 mm đến 4,6 mm, d ài từ 100 mm đến 250 m m. 5.5 Bộ lọc Lọc pha động c ũ ng như lọc dung dịch mẫu th ử qua màng lọc, v í dụ cỡ lỗ 0,45 µm trước khi sử dụng hoặc bơm sẽ kéo dài tu ổ i thọ của cột. 5.6 B ơ m phản ứng sau cột và ống dẫn xuất, hệ thống phân ph ố i thuốc th ử thích hợp là ống nối ki ể u chữ T và ống dẫn xu ấ t (ví dụ 10 m x 0,33 mm). 6 Cách tiến hành 6.1 Chuẩn b ị mẫu th ử Đ ồ ng h óa mẫu thử. Nghiền nguy ê n liệu thô trong máy nghiền th í ch hợp và trộn lại. C ần thực hiện các biện pháp như l à m nguội sơ bộ để tránh tiếp xúc với nhi ệ t độ cao trong thời gian dài. 6.2 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 6.2.1 Tách chiết Cân một lượng mẫu thử thích hợp ví dụ từ 2 g đến 10 g, ch í nh xác đến mg, cho vào b ì nh nón. Thêm một th ể t í ch xác đ ị nh từ 60 m l đến 200 m l dung dịch axit cl ohydric (4.6) hoặc dung dịch axit sulfuric (4.7). pH của dung dịch này kh ô ng được lớn hơn pH = 2,0 . Đậy nắp bình bằng mặt k í nh đồ ng hồ và hấp áp lực phần mẫu thử ở 121 ° C trong 30 min hoặc làm n ó ng ở 100° C trong 60 min. Dữ li ệ u từ nghi ê n cứu BCR cho th ấ y rằng có th ể áp dụng một dải rộng các điều ki ệ n đối với việc thủy phân bằng axit (nhiệt độ từ 95 ° C đến 130 ° C , th ời gian từ 15 m i n đ ế n 60 min). Nhiệt độ cao hơn th ì thời gian chiết ngắn hơn. 6.2.2 Xử lý bằng enzym Sau khi làm nguội đến nhiệt độ phòng, ch ỉ nh pH của dịch chiết tối ưu cho hoạt động của enzym bằng dung dịch natr i axetat (4.16) hoặc (4.17) và thêm một lượng th í ch hợp enzym hoặc hỗn hợp enzym (4.15) vào mẫu. Ủ hỗn hợp trong một khoảng thời gian và nhiệt độ tối ưu đối với enzym sử dụng. Sau khi l à m nguội đến nhiệt độ phòng, dùng nước cất hoặc dung môi thích hợp khác để chuyển dung d ị ch vào bình định mức và pha lo ã ng đến thể tích xác định ( V ts ). Đối với mỗi enzym sử dụng, cần kiểm tra pH tối ưu, nhiệt độ ủ và thời gian ủ. Để đảm bảo khử phosphoryl hóa tối ưu, bước xử lý bằng enzym cần được kiểm t ra bằng cách phân tích các mẫu đ ã thêm thiamin monophosphat clorua (4.23.2) hoặc thiamin pyrophosphat clorua (4.23.3) và vật l i ệu tương tự với mẫu thử. Vật liệu này phải là mẫu chu ẩ n đ ã được chứng nhận. Lượng thiamin c ó khả năng thêm v à o từ enzym (4.15) cần được t í nh đến trong phần tính kết quả. CHÚ THÍCH Đ ể xác đ ị nh dữ liệu về độ chụm trong Bảng B.1, B ả ng B.2 và B ả ng B.3, Taka-Diastase và Taka-Diastase k ế t hợp 1 ) với β-amylase từ lúa mạch đ ã được sử dụng đ ã khử phosphoryl dư ới các điều kiện sau đ â y. Dịch chiết đã được điều chỉnh đến pH = 4,0 và pH = 4,5 tương ứng, với dung dịch natri axetat (4.16) hoặc (4.17) và đ ã bổ sung 100 mg Taka- D iastase và 10 mg β-amylase tr ê n gam mẫu. Hỗn hợp này được ủ ở 37 ° C đến 45 ° C tr o ng 4 h đến 24 h, xem [5], [10] và [16]. 6.2.3 Dung dịch m ẫ u thử Lọc dung dịch mẫu (6.2.2) qua giấy lọc hoặc bộ lọc màng c ỡ lỗ 0,45 µm, nếu cần. Cũng có th ể sử dụng ly tâm. Đây là dung d ị ch mẫu thử dùng cho quá trình oxy hóa (6.3.2 hoặc 6.3.3). 6.3 Oxy hóa thiamin thành thiocrom 6.3.1 Yêu cầu chung Oxy hóa có thể được thực hi ệ n tr ước cột (6.3.2) hoặc sau cột (6.3.3). 6.3.2 Oxy hóa trước cột 6.3.2.1 Quy trình ox i hóa Dùng p i pet l ấ y 1 m l mẫu thử đã xử lý bằng enzym (6.2.3), dung dịch chuẩn (4.25.1) hoặc dung d ị ch trắng v í dụ dung d ị ch axit clohydric (4.6) hoặc dung dịch axit sulfuric (4.7) tùy thuộc vào việc sử dụng trong 6.2.1 cho vào b ì nh cầu hoặc lọ th í ch hợp, th ê m 1 m l dung d ị ch hexaxyanoferat kiềm (4.13). Lắc dung d ị ch mẫu thử trong thời gian quy định (ví dụ: 10 s), để yên trong khoảng thời gian quy định (ví dụ: 1 min). Đ ể loại bỏ các hợp chất gây nhiễu và b ả o v ệ cột HPLC th ì nên trung h òa dung dịch mẫu thử (ví dụ bằng H 3 PO 4 ) hoặc tiến hành làm sạch bằng chiết pha rắn (xem th ê m thông tin trong [5]). Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch mẫu thử được bơm vào hệ thống HPLC pha đảo (6.3.2.2). Cách khác, dung dịch đ ã oxy h óa có thể được chiết vào 1,5 m l isobutanol (4.2.3) và có thể bơm dịch chiết. CH Ú THÍCH Việc chuyển hóa thiamin th à nh thiocr o m có th ể bị ức ch ế trong một số loại thực phẩm. Hiện tư ợ ng này thường gặp tr o ng c á c thực phẩm chứa cacao, c ũ ng có th ể thấy trong một s ố thực phẩm khác. Nếu nghi ngờ c ó hiện tượng này th ì n ê n ki ể m tra độ thu hồ i của phương pháp bằng c á ch xử lý dịch chiết mẫu b ằ ng một thể tích th í ch hợp dung d ị ch chuẩn th i am i n tr ước phản ứng oxy h óa . 6.3.2.2 Nhận dạng bằng HPLC sau kh i oxy h óa trước cột Bơm các thể tích thích hợp giống nhau các dung dịch chuẩn (6.3.2.1), mẫu và mẫu trắng vào hệ thống HPLC. Nhận dạng thiocrom bằng so sánh thời gian lưu của các pic r iêng lẻ trong sắc k ý đ ồ thu được từ dung dịch mẫu thử và dung dịch thử chuẩn. Vi ệ c thêm các ch ấ t chuẩn vào dung dịch mẫu thử cũng c ó thể nhận dạng được pic. Việc tách và định lượng cho th ấ y th ỏa đáng nếu thực hiện theo các điều kiện thực nghiệm sau đây (xem th ê m Hình A.1 và Phụ l ục C v ề các điều kiện HPLC thay thế và v í dụ về sắc k í đồ). Pha tĩnh: Lichrospher ® RP Select B, 5 µm, 250 mm x 4,0 mm Pha động: 40 phần thể tích metanol (4.1) và 60 phần thể tích đệm axetat (4.22) Tốc độ dòng: 0,7ml/min Thể tích bơm: 20 µl Dertector: Huỳnh quang; bước sóng kích thích là 366 nm; bước sóng phát xạ là 435 nm. 6.3.3 Trường h ợ p ôxy h óa sau cột 6.3.3.1 Quy tr ì nh oxi hóa Oxy h óa thiamin thành thiocrom sử dụng phản ứng sau cột với dung d ị ch kali hexaxyanoferat ki ề m III (4.14). Thêm li ê n tục (ví dụ: 0,3 m l /min) thuốc thử dẫn xuất qua ống nối kiểu chữ T cho vào dịch rửa giải HPLC đ ể t ạ o thành thiocrom. CHÚ THÍCH Việc oxy hóa sau cột b ị ả nh hưởng ví dụ bởi n ồ ng đ ộ natri hydroxit . Các n ồ ng độ cao hơn trong dung d ị ch dẫn xu ấ t có th ể được bù bởi t ố c độ bơm th ấ p hơn và ngược lại. 6.3.3.2 Nhận dạng bằng HPLC sau oxy h óa sau cột Bơm các th ể t í ch thích hợp gi ố ng nhau của các chuẩn thiamin chlorua hydrochlorua (4.23.1) c ũ ng như các dung dịch mẫu (6.2.3) vào hệ thống HPLC. Xác định thiamin bằng cách so sánh thời gian lưu của các pic riêng trong sắc k ý đ ồ thu được với dung dịch mẫu thử và với chuẩn (4.23.1). Thêm thiamin chlorua hydroch l orua vào dung d ị ch mẫu thử cũng có thể nhận diện pic. Việc tách và định lượng được cho thấy là thỏa đáng nếu tuân theo các điều kiện thí nghiệm sau (xem Phụ lục C và H ì nh A.2 đối với các hệ thống HPLC thay thế và các ví dụ về sắc ký đồ). Pha tĩnh: Supelco ® LC-18-DB, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm Pha động: Metanol (4.2.1): đệm phosphat (4.2.19), chứa 1 g/l tetraetylamoni-clorua (4.2.20) và 5 mmol/l natri heptanesulfonat (4.2.21), (35:65) Tốc độ d ò ng: 1,0 ml/min Thể tích bơm: 20 µl Thuốc thử sau cột: dung dịch kali hexaxyanoferat III kiềm (4.2.14) Tốc độ dòng thuốc thử: 0, 3 ml/min Detector: h uỳnh quang; bước sóng kích thích là 368 nm; bước sóng phát xạ là 440 nm. CH Ú THÍCH Vi ệ c phân tích một số mẫu, v í dụ như thịt lợn nguyên liệu có th ể có thêm pic của 2(1-hydroxyety l ) thiamin trong sắc ký đ ồ xem Phụ lục D. 6.4 Phép xác định Tiến hành xác định bằng ngoại chu ẩ n sử dụng tích phân diện t í ch pic (nếu c ó th ể ) hoặc xác định chiều cao pic (t ù y chọn) của mẫu và so sánh các kết quả với các giá trị tương ứng đ ố i với thiocrom bằng cách sử dụng đường chuẩn. Kiểm tra độ tuyến tí nh của vi ệ c hiệu chuẩn. 7 Tính kết quả Sử dụng đường chu ẩ n hoặc sử dụng chương trình th í ch hợp của bộ t í ch phân hoặc sử dụng quy tr ì nh đã đơn giản h óa dưới đây. T í nh khối lượng vitamin B 1 , w , biểu th ị theo thiamin clorua hydroclorua, bằng mg/100 g mẫu, sử dụng C ô ng thức (2): Trong đ ó A ts là diện tích pic hoặc chiều cao pic của thiocrom thu được với dung dịch mẫu thử, tính bằng đơn vị chiều cao hoặc diện tích; A st là diện tích pic hoặc chiều cao pic của thiocrom thu được với dung dịch thử chuẩn, tính bằng đơn vị chiều cao hoặc diện tích; V ts là thể tích dung dịch mẫu thử (6.2.2), tính bằng mililit (ml); ρ là nồng độ khối lượng của thiamin clorua hydroclorua trong dung dịch chuẩn (4.25.1), tính bằng microgam trên mililit (µ g/ml); m s là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g) (6.2.1); 100 là hộ số để tính hàm lượng trên 100 g; 1000 là hệ số chuyển đổi µg/100 g thành mg/100 g. Báo cáo kết quả vitamin B 1 bằng mg/100 g được bi ể u thị theo thiamin cl orua hydro cl orua (M = 337,28). Nếu cần phải biểu th ị kết quả theo thiamin ( C 12 H 17 N 4 OS, M = 265,37) th ì nhân kết quả với h ệ s ố 0,787, theo thiamin clorua (C 12 H 17 C l N 4 OS, M = 300,82) th ì nhân kết quả với hệ s ố 0,892. 8 Độ chụm 8.1 Yêu cầu chung D ữ liệu về độ chụm của phương pháp này dựa tr ê n các phương pháp HPLC khác nhau áp dụng để xác định thiamin trong nghi ê n cứu so sánh quốc tế được tổ chức b ở i Chương trình của Ủy ban Châu Â u về Thử nghiệm v à Đo chu ẩ n thực hiện tr ê n mẫu bột m ì (CRM 121)/ sữa bột/sữa bột s ấ y phun (CRM 421), rau hỗn hợp đô ng kh ô (CRM 485) và gan lợn đông lạnh (CRM 487). Ngh iê n cứu cung cấp thông tin thống k ê nêu trong Phụ lục B, Bảng B.1. Hơn nữa, dữ liệu về độ chụm bao gồm các kết quả nghiên cứu cộng tác của Pháp đối với mẫu thức ăn dùng bằng đường x ô ng, thức ăn trẻ em bổ sung rau, sữa bột, thức ăn b ổ sung hoa quả, men, ngũ cốc, bột sô cô la và thực ph ẩ m bổ sung. Kết quả của nghi ê n cứu n à y được n ê u trong Ph ụ lục B, Bảng B.2 và Bảng B.3. 8. 2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giũa hai kết quả thử r i êng r ẽ , thu được khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thi ế t bị, trong một khoảng th ờ i gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r . Các giá trị đối với th i am i n cl orua hydroclorua là: Bột mì nguyên cám = 0,452 mg/100 g r = 0,043 mg/100 g Sữa bột/sữa bột sấy phun = 0,645 mg/100 g r = 0,071 mg/100 g Rau hỗn hợp đông khô = 0,295 mg/100 g r = 0,039 mg/100 g Gan lợn đông lạnh = 0,807 mg/100 g r = 0,088 mg/100 g Thức ăn dùng b ằ ng đường xông = 0,11 mg/100 g r = 0,02 mg/100 g Thức ăn cho trẻ có bổ sung rau = 0,20 mg/100 g r = 0,05 mg/100 g Sữa bột = 0,56 mg/100 g r = 0,1 mg/100 g Thức ăn có bổ sung hoa quả = 1,04 mg/100 g r = 0,2 mg/100 g N ấ m = 1,31 mg/100 g r = 0,34 mg/100 g Ngũ c ố c = 1,42 mg/100 g r = 0,16 mg/100 g Ngũ cốc = 2 , 95 mg/100 g r = 0,49 mg/100 g Bột socola = 1,55 mg/100 g r = 0,36 mg/100 g Thực ph ẩ m bổ sung = 486 mg/100 g r = 111 mg/100 g 8.3 Độ tái lập Ch ê nh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử r iê ng rẽ, thu được khi tiến hành trên vật li ệ u thử giống h ệ t nhau được phân tích b ở i hai phòng thử nghiệm, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn t ái lập R . Các giá tr ị đối với thiamin clorua hydro cl orua là: Bột mì nguyên cám = 0,452 mg/100 g R = 0,190 mg/100 g Sữa bộ t sữa bột sấy phun = 0,645 mg/100 g R = 0,243 mg/100 g Rau hỗn hợp đ ô ng khô = 0,295 mg/100 g R = 0,178 mg/100 g Gan lợn đông lạnh = 0,807 mg/100 g R = 0,623 mg/100 g Thức ăn dùng bằng đường xông = 0,11 mg/100 g R = 0,1 mg/100 g Thức ăn cho trẻ có bổ sung rau = 0,20 mg/100 g R = 0,12 mg/100 g Sữa bột = 0,56 mg/100 g R = 0,25 mg/100 g Thức ăn c ó bổ sung hoa quả = 1,04 mg/100 g R = 0,55mg/100 g Nấm = 1,31 mg/100 g R = 0,48 mg/100 g Ngũ cốc = 1,42 mg/100 g R = 0,75 mg/100 g Ngũ cốc = 2,95 mg/100 g R = 1,16 mg/100 g Bột socola = 1,55 mg/100 g R = 0,8 mg/100 g Bột socola = 1,55 mg/100 g R = 0,8 mg/100 g Thực ph ẩ m bổ sung = 486 mg/100 g R = 212 mg/100 g 9 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm nên phù hợp vớ i TCVN/ISO/IEC 17025 và ít nhất bao gồm các thông tin sau: a) mọi th ô ng tin cần thiết đ ể nhận biết đầy đủ về mẫu; b) phương pháp th ử đã sử dụng hoặc vi ệ n dẫn ti ê u chu ẩ n này; c) ngày và th ờ i gian lấy mẫu (nếu biết); d) ngày nhận mẫu; e) ngày thử nghiệm; f) kết quả và các đơn vị kết quả biểu thị; g) b ấ t kỳ điểm đặc biệt nào quan sát được trong quá trình thử nghiệm; h) mọi chi t iế t thao t á c không quy định trong ti ê u chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các có th ể ảnh hưởng tới kết quả. Phụ lục A (tham khảo) Các ví dụ về sắc đồ HPLC CHÚ DẪN Y Huỳnh quang X Th ờ i gian (m i n) 1 th i am i n trong chu ẩ n, 0,02 µg/ml ở 6,620 min 2 th i am i n trong gan lợn ở 6,616 m i n 3 thiamin trong thức ăn công thức dành cho tr ẻ sơ sinh ở 6,619 m i n 4 thiamin trong cá tuyết ở 6,614 min Pha tĩ nh: Gemini C18, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm (110 A) Pha động: Metanol (4.1): nước pH 9 (40:60) Tốc độ d ò ng: 0,8 m l /m i n Thể tích bơm: 20 µ l Detector: Huỳnh quang: bước sáng k í ch th í ch là 366 nm; bước sóng phát xạ là 435 nm. H ì nh A1 - Ví dụ về tách thiam i n bằng HPLC theo chuẩn thiocrom sử dụng dẫn xuất trước cột CHÚ DẪN Y Huỳnh quang X thời gian (min) Pha tĩnh: Purospher ® RP C18, được đậy nắp ở cuối, 5 µm, 250 mm x 4,6 mm Pha động: Metanol (4.1): đệm phosphat, pH 3,5, c (NH 4 H 2 PO 4 ) = 10 mmol/l, chứa 1 g/l tetraetylamoniclorua (420) v à 5 mmol/l natri heptanesulfonat (4.21), (35:70) Tốc độ dò ng: 1,5 ml/min Th ể t í ch bơm: 3 µ l Thuốc thử sau cột: dung dịch kali hexaxyanoferat III kiềm (4.14) Tốc độ dòng thuốc thử: 0,3 ml/min Detector: Huỳnh quang: bước sóng kích thích là 365 nm; bước s ó ng phát xạ là 435 nm. CH Ú THÍCH Sắc ký đồ bổ sung đối với thịt/gan nêu trong Phụ lục D H ì nh A.2 - Ví dụ về tách chu ẩ n thiamin b ằ ng HPLC sử dụng dẫn xuất sau cột trong rau diếp (a), c ơ m (b) và th ị t lợn luộc (c) Phụ lục B (tham khảo) Dữ liệu về độ chụm Theo những chỉ dẫn nghi ê n cứu chứng nhận EU SMT, các dữ liệu đưa ra trong Bảng B.1 đã được xác định trong một phép th ử liên phòng thử nghiệm [10]. Viện nghiên cứu thực ph ẩ m, Norwich, UK thay mặt cho Ủy ban E U tham gia nghiên c ứ u n à y. Các dữ liệu đưa ra trong B ả ng B.2 và Bảng B.3 đã được xác định trong một phép thử liên phòng thử nghiệm của Pháp [5]. B ả ng B.1 - Dữ liệu về độ chụm đ ối với bột m ì thô, sữa bộ t/ sữa bột sấy phun, rau hỗn h ợ p đông kh ô và gan lợn đông khô M ẫ u CRM 121 Bột mì thô CRM 421 Sữa bộ t/ sữa bột sấy phun CRM 485 Rau hỗn h ợ p đông khô a CRM 487 Gan l ợ n đ ô ng khô Năm thử nghiệm liê n phòng 1996 1996 1996 1996 Số phòng thử nghiệm 13 14 12 15 S ố lượng mẫu 2 2 2 2 Số lượng phòng thử nghi ệ m còn lại sau khi trừ ngoại l ệ 13 14 12 15 Số ngoại l ệ 0 0 0 0 Số k ế t quả được chấp nhận 65 70 58 72 Giá tr ị trung b ì nh , mg/100 g 0,452 0,645 0,295 0,807 Độ lệch chuẩn lặp l ạ i, s r , mg/100 g 0,015 0,025 0,012 0,031 H ệ số biến thi ê n l ặ p lạ i , % 3 , 2 3,8 4,2 3,9 G i á trị lặp l ạ i r [ r = 2,83 x s r ], mg/100 g 0,043 0,071 0,039 0,088 Độ lệch c hu ẩ n tái lập, s R , mg/100 g 0,053 0,085 0,063 0,182 H ệ số biến thiên tái lập, % 11,8 13,2 13,3 22,6 Giá trị tái lập R [ R = 2,83 x s R ], mg/100g 0,190 0,243 0,178 0,623 G i á tr ị HorRat, theo [13] 0,9 1,1 1,0 1,9 a Hỗn hợp của ngô ngọt, cà rốt và cà chua khô (10:1:1) CHÚ THÍCH Dữ liệu thu được trong ngh iê n cứu so sánh quốc tế này đ ã được tạo ra bằng cách sử dụng các phương pháp đã được xác định g i ống với các quy tr ì nh ki ể m đị nh đị nh kỳ tạ i nhà của các phòng thí nghiệm tham g i a v ới các hệ thống HPLC được mô tả trong Phụ l ục C . Bảng B.2 - Dữ liệu về độ chụm đối với thức ăn dùng bằng đ ường xông, thức ăn cho tr ẻ em bổ sung rau, sữa bột, thức ăn bổ sung hoa quả và nấm M ẫ u Dung d ị ch thức ăn trong chai Thức ăn cho tr ẻ em Sữa bột Bột trộn trái cây Nấm Năm nghiên cứu 1995 1995 1995 1995 1995 Số phòng thử nghiệm 10 10 10 10 10 S ố lượng mẫu 1 1 1 1 1 Số lượng phòng thử nghi ệ m còn lại sau khi trừ ngoại l ệ 8 10 10 10 10 Số ngoại l ệ 2 0 0 0 0 Số k ế t quả được chấp nhận 16 20 20 20 20 Giá tr ị trung b ì nh , mg/100 g 0 , 11 0,20 0,56 1,04 1 , 31 Độ lệch chuẩn lặp l ạ i, s r , 0,01 0,02 0,04 0,07 0,12 H ệ số biến thi ê n l ặ p lạ i , % 7 % 8 % 7 % 7 % 9 % G i á trị lặp l ạ i r [ r = 2,83 x s r ], mg/100 g 0,02 0,05 0 , 1 0 , 2 0,34 Độ lệch c hu ẩ n tái lập, s R , mg/100 g 0,04 0,04 0,08 0,19 0,17 H ệ số biến thiên tái lập 32 % 21 % 16 % 19 % 13 % Giá trị tái lập R [ R = 2,83 x s R ], mg/100 g 0,1 0,12 0,25 0,55 0,48 G i á tr ị HorRat, theo [13] 1,0 1,5 1,3 1,7 1,2 Bảng B.3 - Dữ liệu về độ chụm đ ối với ngũ cốc, bột sôcôla và th ứ c ă n bổ sung M ẫ u Ngũ cốc Ngũ cốc Bột sôcôla Thức ăn bổ sung Năm nghiên c ứ u 1995 1995 1995 1995 Số phòng thử nghiệm 10 10 10 10 S ố lượng mẫu 1 1 1 1 Số lượng phòng thử nghi ệ m còn lại sau khi trừ ngoại l ệ 9 9 9 9 Số ngoại l ệ 1 1 1 1 Số k ế t quả được chấp nhận 18 18 18 18 Giá tr ị trung b ì nh , mg/100 g 1,42 2,95 1,55 486 Độ lệch chuẩn lặp l ạ i, s r 0,06 0,18 0,13 39 H ệ số biến thi ê n l ặ p lạ i 4 % 6 % 8 % 8 % G i á trị lặp l ạ i r [ r = 2,83 x s r ], mg/100 g 0,16 0,49 0,36 111 Độ lệch c hu ẩ n tái lập, s R , mg/100 g 0,27 0,41 0,28 75 H ệ số biến thiên tái lập 19 % 14 % 19 % 15 % Giá trị tái lập R [ R = 2,83 x s R ], mg/100g 0,75 1,16 0,8 212 G i á tr ị HorRat, theo [13] 1,8 1 , 5 1,8 3 , 4 a a Năm 19 8 0, Hor wi t z et a l, xu ấ t bản đánh giá của 1000 so sánh liên phòng. T ừ những nghiên cứu này, kết lu ậ n r ằ ng g i á trị HorRat là 1, với giới hạn chấp nhận được trong khoảng 0,5 đến 2,0, cho thấy độ chính xác liên phòng là phù hợp. Sự tương ứng trong độ lệch chuẩn tương đối của phòng thí nghiệm cho thấy khoảng một nửa đến hai phần ba so với độ lệch chuẩn tương đối giữa các phòng thí nghiệm. Độ lệch liên tục từ tỷ lệ ở mặt dưới (giá trị < 0,3 hoặc 0,5) có thể cho thấy mức trung bình không được báo cáo hoặc được đào tạo tốt và có kinh nghiệm. Phụ lục C (tham khảo) Hệ thống HPLC thay thế Việc tách và định lượng được chứng minh là th í ch hợp nếu áp dụng các điều kiện về sắc k ý như sau [10]: Bảng C . 1 - Điều kiện HPLC thay thế Pha tĩnh Kích t hư ớc c ột mm x mm Pha động (V:V) Sự tách sóng (Ex/Em) nm Lưu lượng ml/min Kiểu ox i h óa Radial silica ® 10 µm 250 x 4,6 Etanol: dung dịch đệm phosphat pH = 7,4 c (K 2 HP O 4 ) = 0,1 mo l /l (50:50) F: 365/435 3,0 PC a Supelco ® LC-18-DB 5 µm 250 x 4,6 Metano l: dung dịch đệm phosphat pH = 3 , 5 c (K 2 HP O 4 ) = 9 mmo l / l chứa tetraetylamoniumclo rua , ρ (C 8 H 20 NC l ) = 1 g/ l và natri heptansulfonat, c ( C 7 H 15 Na O 3 S) = 5 mmo l / l (35:65) F: 368/420 1 , 0 PC Li chrospher ® RP 18 5 µm 250 x 4,6 Metanol : natri haxansulfonat, c (C 6 H 13 NaO 3 S.H 2 O ) = 1 mmo l /l, pH = 3 , 0 (70:30) F: 375/435 1 , 5 PC Eurospher ® 100 -C18 5 µm 250 x 4,6 Natr i dihydrophosphat, c ( NaH 2 P O 4 ) = 10 mmo l/l ): natri p e r cl orat, c (NaC l O 4 ) = 0,15 mol/l (50:50) F: 375/435 1 , 0 PC Li chrospher ® RP Select B 5 µm 250 x 4,6 Metanol : dung dịch đệm axetat pH = 4,0, c (CH 3 COONa) = 50 mmo l / l (40:60) F: 366/435 0,7 PRC b µ-Bondapak ® radial C18 5 µm 250 x 4,6 Metanol:dung dịch đệm axetat pH= 4 ,5, c (CH 3 COONa) = 0,5 mm l /l (40:60) F: 366/435 0,8 PRC Spherisorb ® O D S2 5 µm 250 x 4,6 Metano l:d ung dịch đệm phosphat pH = 4,0, c(KH 2 PO 4 ) = 0,1 mo l/l (70:30) F: 375/435 1,0 PRC L i chrospher ® RP 18 10 µm 250 x 4,6 Kali dihydrophosphat, c ( KH 2 PO 4 ) = 10 mmol/l/dimetyl formam i t (80:20) F: 368:440 1,5 PRC Hamilton ® PRP-1 5 µm 150 x 4,6 Metanol:nước (40:60); pH được điều chỉnh tới 4,5 bằng axit axet i c F: 366/435 1 , 0 PRC Hamiton ® PRP-1 5 µm 150 x 4,1 Metanol : nước (35:65); pH = 9,0 được điều chỉnh bằng amoniac, w ( NH 3 ) = 25% F: 366/435 1 , 0 PRC Hypersil ® NH 2 APS 2 5 µm 250 x 4,6 Di cl ometan/metanol (95:5) F: 365/440 1,0 PRC a PC = Dẫn xu ấ t sau cột. b PRC = D ẫ n xuất t r ước cột . Phụ lục D (tham khảo) Hợp chất vitamin B1: 2-(1-hydroxyetyl)thiamin (HET) thực hiện dẫn xuất sau cột Thông thường, hàm lượng vitamin B 1 được coi là thiamin và các dẫn xuất phosphat c ủ a nó. Tuy nhiên, việc sử dụng phương pháp dẫn xuất sau cột có thể cho thấy hai pic cho thiamin và xác nhận chất chuyển hóa phụ 2- (1-hydroxyety l ) thiamin (HET) đ ã được hiển thị, xem [11] và [12] và xem h ì nh D.1. Nếu sử dụng kỹ thuật dẫn xuất trước cột, th ì hai hợp chất thiamin và HET đ ồ ng rửa giải Hàm lượng tương đối của HET đ ược so s á nh với thiamin phụ thuộc vào loại mẫu. Hàm lượng HET trong thịt và gan là 7% đến 23% hàm lượng thiamin. Trong nấm men, hàm lượng 3,8 %, trong khi ở b ắ p cải trắng, bông cả i xanh, bột yến mạch, thức ăn công thức dà nh cho trẻ sơ sinh, sữa bột, bột sữa và bột m ì , hàm lượng không dưới 2 %, xem [7]. Phép x á c định định lượng vitamin B 1 trong thực phẩm bằng dẫn xuất sau cột được khuyến nghị bao gồm việc xác định đ ị nh lượng riêng thiamin và HET khi phân tích các mẫu thịt và đ ể kiểm tra các mẫu khác cho sự xuất hiện của HET tr ê n sắc k ý đồ. CHÚ D Ẫ N Y huỳnh quang X thời gian (min) 1 thiamin mono phosphat(TMP) trong gan l ợ n ở 4,034 min 2 thiamin trong gan lợn ở 10,138 min 3 2-(1-Hydroxy Etyl) Thiamin (HET) trong gan lợn ở 11,741 min 4 TMP trong chu ẩ n 4,034 m i n 5 thiamin trong chu ẩ n ở 10,044 m i n 6 HET trong chu ẩ n ở 11,613 min CHÚ THÍCH Thông tin v ề HP L C n ê u trong [ 7 ] . Hình D.1 - Sắc ký đồ của chất ch iế t CRM 487 gan lợn (a) và chuẩn 0,1 µg/ml TMP (thiamin mono phosphat), 0,1 µg/ml thiamin và 0,01 µg/ml HET (2-(1 -h y d roxyetyl)thiamin) (b) Thư mục tài liệu tham khảo [1] BOGNAR A. Bestimmung von Riboflavin und Thiamine i n Lebensmitteln mit Hilfe der Hochleistungsflussigkeitschromatographie (HPLC). Dtsch. Lebensmitt. Rundsch. 1981, 77 pp. 431-436 [2] HASSELMANN C., FRANCK D ., GRIMM P., DIOP P.A., SOULES C. High-performance liquid chromatographic analysis of thiamine and riboflavin in dietetic foods. J. Micronutr. Anal. 1989, 5 pp. 269-279 [3] BOGNAR A. Determination of vitamin B1 in food by High-Performance-Liquid-Chromatography and postcolumn derivatization. FreseniusJ. Anal. Ch e m. 1992, 343 pp. 155-156 [4] HAGG M., KUMPULAINEN J. Thiamine and riboflavin contents in domestic and imported cereal products in Finland. J. Food Compos. Anal . 1993, 6 pp. 299-306 [5] ARELLA F., LAH£LY S., BOURGUIGNON J.B., HASSELMANN C. Liquid chromatographic determination of vitamin B1 and B2 in foods. A collaborative study. Food Chem. 1996, 56 pp. 81 -86 [6] EITENMILLER R.R., LANDEN W.O. Vitamin Analysis for the Health and Food Sciences. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C., 1999, pp. 271-97. [7] JAKOBSEN J. Optimisation of the determination of thiamin, 2-(1-hydroxyethyl)thiamine, riboflavin in food samples by use of HPLC. Food Chem . 2008, 106 pp. 1209-1217 [8] DAWSON R.M.C., EL LI OTT D.C., ELLIOT W.H., JONES K. Data for Biochemical Research. Oxford Science Publication 3rd. ISBN 0 19 855299 8,1989 [9 ] HAGG M. Effect of various commercially available enzymes in the liquid chromatographic determination with external standardization of thiamine and riboflavin in foods. J. AOAC Int. 1994, 77 pp. 681-686 [10] FINGLAS P.M., SCOTT K.J., WTTTHOFT C.M., VAN DEN BERG H ., DE FROIDMONT-GORTZ I . The certification of the mass fractions of vitami n s in four reference materials: Wholemeal flour (CRM 121), milk powder (CRM 421), lyophilised mixed vegetables (CRM 485) and lyophilised pig’s liver (CRM 487). EUR-report 18320. Office for Official Publications of the European Communities, Luxembourg, 1999 [11 ] TAKASHI U., YUKIKO T., KOHEI M., MARI T., KANAME K . Simultaneous determination of 2(1-hydroxyethyl)thiamine and thiamine in foods by high performance liquid chromatography with post-column derivatisation. Vitamins (Japan). 1990, 64 pp. 379-385 [12] TAKASHI U., YUKIKO T., KOHEI M., MASAKO M., KANAME K. Distribution and stability of 2(1-hydroxyethyl)thiamine and thiamine in foods. Vitamins (Japan). 1991,65 pp. 249-256 [13] HORWITZ W., ALBERT R. The Horwitz Ratio (HorRat): A useful Index of Method Performance with Respect to Precision. J. AOAC Int . 2006, 89 pp. 1095-1109 [14] THOMPSON M. Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst (Lond.). 2000,125 pp. 385-386 [15] HORWITZ W., KAMPS L.R., BOYER K.W. Quality assurance in the analysis of foods and trace constituents. J. AOAC I nt . 1980, 63 pp. 1344-1354 [16] OL LI LAINEN V., FINGLAS P.M., VAN DEN BERG H., DE FROIDMONT-GORTZ I. Certification of B-Group Vitamins (B1, B2, B6, and B12) i n Four Food Reference Materials. J. Agric. Food Chem. 2001,49 pp. 315-321 [17] TCVN ISO/IEC 17025:2007 (ISO/IEC 17025:2005), Yêu cầu chung về năng lực của ph ò ng thử nghiệm và hiệu chuẩn 1) Taka-Diastase Nr . T00040 là tê n thương mại của sản ph ẩ m được cung c ấ p bởi Pfaltz & Bauer, Waterbury, CT 06708, Mỹ. Thông tin này đưa ra tạo thuận lợ i cho người sử dụng t iê u chu ẩ n này và CEN kh ô ng ấ n định phải sử dụng chúng. Có th ể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. 2) Cột nhồi s il ica ph ủ vật liệu th í ch hợp có bán sẵn l à Li chrosorb ® Si 60 , Spherisorb ® SI, Hyper si l ® S I và Li chrosph e r ® 100 DIOL. Các cột RP bao gó i vật liệu thích h ợ p như Spherisorb ® ODS, m -Bondapak ® radial C18, Supelco ® LC-18-D B và Hypersil ® ODS. Th ô ng t i n này đ ư a ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chu ẩ n n à y và CEN kh ô ng ấ n đ ị nh phải sử dụng chúng.