TCVN11668:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11668:2016 (ISO 20633:2015) về Thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh và sản phẩm dinh dưỡng dành cho người lớn - Xác định vitamin A và vitamin E bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha thường TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11668:2016 ISO 20633:2015 THỨC ĂN CÔNG THỨC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ SẢN PHẨM DINH DƯỠNG DÀNH CHO NGƯỜI LỚN - XÁC ĐỊNH VITAMIN A VÀ VITAMIN E BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA THƯỜNG Infant formula and adult nutritionals - Determination of vitamin E and vitamin A by normal phase high performance liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 11668:2016 hoàn toàn tương đương với ISO 20633:2015; TCVN 11668:2016 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỨC ĂN CÔNG THỨC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ SẢN PH Ẩ M DINH DƯỠNG DÀNH CHO NGƯỜI LỚN - XÁC ĐỊNH VITAMIN A VÀ VITAMIN E B Ằ NG PHƯƠNG PHÁP S Ắ C KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA THƯỜNG Infant formula and adult nutritionals - Determination of vitamin E and vitamin A by normal phase high performance liquid chromatography CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu và các thao tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đề cập đến tất cả các vấn đề về an toàn có liên quan trong việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thực hành liên quan đến sức khỏe và an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định đồng thời vitamin E ( α -tocopherol và α -tocopheryl axetat) và vitamin A [các đồng phân 13- c i s và tất cả đồng phân trans (all- t rans ) của retinyl palmitat và retinyl axetat] có trong tất cả các dạng thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh và sản phẩm dinh dưỡng dành cho người lớn (dạng bột, dạng lỏng ăn liền, dạng lỏng đậm đặc) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Retinol không được sử dụng cho mục đích bổ sung vi chất vì vậy không được đề cập trong tiêu chuẩn này. Lượng retinol có sẵn trong các sản phẩm là không đáng kể. Trong tiêu chuẩn này không phân biệt được các đồng phân lập thể của vitamin E, α -tocopherol và α - tocopheryl axetat. 2 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 2.1 Sản phẩm dinh dưỡng dành cho người lớn (adult nutritional) Thức ăn hoàn chỉnh về dinh dưỡng, thức ăn công thức đặc biệt được tiêu thụ ở dạng lỏng, có thể là nguồn dinh dưỡng duy nhất, được tạo thành từ hỗn hợp của sữa, đậu nành, gạo, whey, protein thủy phân, tinh bột và các axit amin, có và không có protein nguyên vẹn. 2.2 Thức ăn công thức dành cho tr ẻ sơ sinh (infant formula) Sản phẩm có thể dùng để thay thế sữa mẹ được chế biến đặc biệt đáp ứng được các nhu cầu về dinh dưỡng của trẻ trong những tháng đầu sau khi sinh đến giai đoạn ăn thức ăn bổ sung thích hợp. [Nguồn: TCVN 7108 (CODEX STAN 72-1981)]. 3 Nguyên tắc Tiêu chuẩn này sử dụng papain, enzym phân giải protein, để thủy phân lớp protein ưa nước của các mixen chất béo trong sữa hoặc thức ăn công thức từ đậu nành cho trẻ sơ sinh trong dung dịch nước. Hàm lượng chất kỵ nước của mixen được chiết định lượng một lần vào iso-octan. Dịch chiết được phân tích bằng HPLC pha thường, sử dụng cột phân tích có rửa giải gradient. Định lượng α -tocopherol và α -tocopheryl axetat bằng detector huỳnh quang ở bước sóng kích thích 280 nm và bước sóng phát xạ 310 nm. Retinyl palmitat ( cis và trans ) và retinyl axetat ( cis và trans ) được định lượng bằng detector UV ở bước sóng 325 nm. 4 Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 4.1 Metyl- t -butyl ete , còn gọi là t ert -butylmetylete, loại dùng cho HPLC. 4.2 n -hexan , loại dùng cho HPLC. 4.3 Etanol , loại dùng cho HPLC. 4.4 Metanol , loại dùng cho HPLC. 4.5 Iso-octan (2,2,4-trimetylpentan), loại dùng cho HPLC. 4.6 Papain (từ Carica papaya), ≥ 3 U /mg, Sigma 76220 1) hoặc tương đương. 4.7 Hydroquinon , Sigma H900 3 1) hoặc tương đương. 4.8 Axit axetic băng , loại tinh khiết phân tích. 4.9 Natri axetat khan . 4.10 Dung dịch axit clohydric loãng Pha loãng 100 ml dung dịch axit clohydric nồng độ 36 % khối lượng bằng nước đến 200 ml 4.11 Dung dịch papain , nồng độ khối lượng ρ = 20 g/l Hòa tan 100 mg hydroquinon và 4 g natri axetat khan trong khoảng 80 ml nước đựng trong bình định mức một vạch 100 ml (5.11). Chỉnh pH đến 5,0 bằng dung dịch axit clohydric loãng (4.10). Thêm 2 g papain và pha loãng đến vạch. Chuẩn bị dung dịch mới trước khi sử dụng. 4.12 Dung dịch metanol đã axit hóa Thêm 20 ml axit axetic băng vào 1 ℓ metanol và trộn. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng. 4.13 Pha động HPLC A n -hexan được lọc và khử khí 15 min trong bể siêu âm. 4.14 Pha động HPLC B Trộn 750 ml n -hexan với 250 ml metyl- t -butyl ete. Thêm 3 ml metanol, lọc và khử khí 15 min trong bể siêu âm. 4.15 Chất chuẩn 4.15.1 Chất chuẩn đối chứng retinyl palmitat , chất chuẩn đầu. Chất chuẩn phải chứa chất chống oxi hóa. CAS 78-81-2. 4.15.2 Chất chuẩn đối chứng rentinyl axetat , chất chuẩn đầu. CAS 127-47-9. 4.15.3 Chất chuẩn đối chứng α -tocopheryl axetat, chất chuẩn đầu. CAS 7695-91-2. 4.15.4 Chất chuẩn đối chứng α -tocopherol, chất chuẩn đầu. CAS 10191-41-0. 4.16 Dung dịch chuẩn 4.16.1 Dung dịch chuẩn gốc retinyl palmitat Cân khoảng 70 mg retinyl palmitat (4.15.1), chính xác đến 0,01 mg cho vào bình định mức 50 ml (5.11). Hòa tan và pha loãng bằng iso-octan (4.5) đến vạch. 4.16.2 Dung dịch chuẩn gốc retinyl axetat Cân khoảng 35 mg retinyl axetat (4.15.2), chính xác đến 0,01 mg cho vào bình định mức 50 ml (5.11). Hòa tan và pha loãng bằng etanol (4.3) đến vạch. 4.16.3 Dung dịch chuẩn gốc α -tocopheryl axetat Cân kho ả ng 180 mg α -tocopheryl axetat (4.15.3), chính xác đến 0,01 mg cho vào bình định mức 50 ml (5.11). Hòa tan và pha loãng bằng iso-octan (4.5) đến vạch. 4.16.4 Dung dịch chuẩn gốc α -tocopherol Cân khoảng 100 mg α -tocopherol (4.15.4), chính xác đến 0,01 mg cho vào bình định mức 50 ml (5.11). Hòa tan và pha loãng bằng iso-octan (4.5) đến vạch. CHÚ THÍCH Các dung dịch chuẩn gốc trên bền trong 7 ngày khi được bảo qu ả n trong tủ lạnh ở 4° C đến 8° C . 4.16.5 Dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp 1 Dùng pipet chuyển 4 ml dung dịch chuẩn gốc retinyl palmitat (4.16.1), 4 ml dung dịch chuẩn gốc retinyl axetat (4.16.2), 7 ml dung dịch chuẩn gốc α -tocopheryl axetat (4.16.3) và 20 ml dung dịch chuẩn gốc α -tocopherol (4.16.4) vào bình định mức 50 ml (5.11) và pha loãng bằng iso-octan (4.5) đến vạch. Chuẩn bị dung dịch này mới trước khi sử dụng. 4.16.6 Dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp 2 Dùng pipet chuyển 8 ml dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp 1 (4.16.5) vào bình định mức 100 ml (5.11) và pha loãng bằng iso-octan (4.5) đến vạch. Chuẩn bị dung dịch này mới trước khi sử dụng. 4.16.7 Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn Dùng pipet chuyển 0,5 ml, 2 ml, 4 ml, 8 ml, 16 ml và 32 ml dung dịch chuẩn làm việc hỗn h ợ p 2 (4.16.6) cho vào các bình định mức 50 ml (5.11) riêng rẽ, pha loãng bằng iso-octan (4.5) đến vạch. Các dung dịch này được sử dụng để dựng đường chuẩn đa điểm. Chuẩn bị các dung dịch này trong ngày trước khi sử dụng. CHÚ THÍCH Đối với phép thử thông dụng và tùy thuộc vào dải nồng độ chất phân tích trong mẫu thử, có th ể sử dụng đường chuẩn 3 điểm hoặc 4 điểm, với điều kiện các dải nồng độ nằm trong các điểm thấp nhất và cao nhất của đường chuẩn 6 điểm đã nêu trên. 4.17 Xác định độ tinh khiết chất chuẩn gốc 4.17.1 Độ tinh khiết quang phổ của dung dịch gốc retinyl palmitat Dùng pipet lấy 1 ml dung dịch chuẩn gốc retinyl palmitat (4.16.1) cho vào bình định mức 100 ml (5.11) và pha loãng đến vạch bằng etanol. Xác định độ hấp thụ ở bước sóng 325 nm, đưa độ hấp thụ về zero b ằng etanol trong cuvet thạch anh 1 cm. Lặp lại việc đọc số thêm hai lần, tráng rửa cuvet mẫu bằng dung dịch trước mỗi lần đọc. Tính giá trị độ hấp thụ trung bình. Tính độ tinh khiết quang phổ, SP RP , của retin y l palmitat là số thập phân, sử dụng Công thức (1): (1) Trong đó A là giá trị độ hấp thụ trung bình; 975 là hệ số tắt của retinyl palmitat ở bước sóng 325 nm (xem Tài liệu tham khảo [1]); m st là khối lượng của chất chuẩn đối chứng, tính bằng miligam (mg). 4.17.2 Độ tinh khiết quang phổ của dung dịch gốc retinyl axetat Dùng pipet lấy 1 ml dung dịch chuẩn gốc retinyl axetat (4.16.2) cho vào bình định mức 100 ml (5.11) và thêm etanol đến vạch. Xác định độ hấp thụ ở bước sóng 325 nm, đưa độ hấp thụ về zero bằng etanol trong cuvet thạch anh 1 cm. Lặp lại việc đọc số thêm hai lần, tráng rửa cuvet mẫu bằng dung dịch trước mỗi lần đọc. Tính giá trị độ hấp thụ trung bình. Tính độ tinh khiết quang phổ, SP RA , của retinyl axetat là số thập phân, sử dụng Công thức (2): (2) Trong đó A là giá trị độ hấp thụ trung bình; 1 560 là hệ số tắt của retinyl axetat ở bước sóng 325 nm (xem Tài liệu tham khảo [1]); m st là khối lượng của chất chuẩn đối chứng, tính bằng miligam (mg). 4.17.3 Độ tinh khiết quang phổ của dung dịch gốc α -tocopheryl axetat Dùng pipet lấy 3 ml dung dịch chuẩn gốc α -tocopheryl axetat (4.16.3) cho vào bình định mức 100 ml (5.11) và thêm etanol đến vạch. Xác định độ hấp thụ ở bước sóng 284 nm, đưa độ hấp thụ về zero bằng etanol trong cuvet thạch anh 1 cm. Lặp lại việc đọc số thêm hai lần, tráng rửa cuvet mẫu bằng dung dịch trước mỗi lần đọc. Tính giá trị độ hấp thụ trung bình. Tính độ tinh khiết quang ph ổ , SP TA , của α -tocopheryl axetat là số thập phân, sử dụng Công thức (3): (3) Trong đó A là giá trị độ hấp thụ trung bình; 43,6 là hệ số tắt của α -tocopheryl axetat ở bước sóng 284 nm (xem Tài liệu tham khảo [1]); m st là khối lượng của chất chuẩn đối chứng, tính bằng miligam (mg). 4.17.4 Độ tinh khiết quang phổ của dung dịch gốc α -tocopherol Dùng pipet lấy 3 ml dung dịch chuẩn gốc α -tocopherol (4.16.4) cho vào bình định mức 100 ml (5.11) và thêm etanol đến vạch. Xác định độ hấp thụ ở bước sóng 292 nm, đưa độ hấp thụ về zero bằng etanol trong cuvet thạch anh 1 cm. Lặp lại việc đọc số thêm hai lần, tráng rửa cuvet mẫu bằng dung dịch trước mỗi lần đọc. Tính giá trị độ hấp thụ trung bình. Tính độ tinh khiết quang phổ, SP T , của α - tocopherol là số thập phân, sử dụng Công thức (4): (4) Trong đó: A là giá trị độ hấp thụ trung bình; 75,8 là hệ số tắt của α -tocopherol ở bước sóng 292 nm (xem Tài liệu tham khảo [1]); m st là khối lượng của chất chuẩn đối chứng, tính bằng miligam (mg). 4.17.5 Độ tinh khiết sắc ký của các dung dịch chuẩn gốc Chuẩn bị từng dung dịch chuẩn gốc riêng rẽ như sau : Dùng pipet chuyển 1 ml từng dung dịch chuẩn gốc retinyl palmitat (4.16.1), retinyl axetat (4.16.2), α -tocopheryl axetat (4.16.3) và α -tocopherol (4.16.4) vào bốn bình định mức 100 ml (5.11) riêng rẽ. Đánh dấu từng bình bằng tên các chất phân tích riêng rẽ. Trộn và pha loãng từng bình bằng iso-octan đến vạch. Dùng pipet tự động chuyển 60 μl dung dịch retinyl palmitat, 30 μl dung dịch retinyl axetat, 100 μl dung dịch α -tocopheryl axetat và 400 μl dung dịch α -tocopherol vào bốn lọ lấy mẫu tự động 2 ml, riêng rẽ, đã đánh dấu. Làm đầy lọ đến xấp xỉ 2 ml bằng iso-octan. Trộn nhanh trên máy trộn Vortex và bơm vào hệ thống sắc ký lỏng theo các thông số của phương pháp được quy định trong 6.2. Phân tích retinyl palmitat và retinyl axetat bằng UV ở bước sóng 325 nm. Phân tích bằng UV đối với α -tocopheryl axetat ở bước sóng 284 nm và α -tocopherol ở bước sóng 292 nm. Tính độ tinh khiết s ắ c ký ( CP ) của từng pic quan tâm sau khi tích phân tất cả các pic xuất hiện trên từng sắc ký đồ, là số thập phân, sử dụng Công thức (5): CP = Diện tích pic quan tâm (5) Tổng diện tích pic không bao gồm dung môi Xác định lượng chất chuẩn đối chứng retinyl palmita t/ retinyl axetat dựa theo pic trans trong sắc ký đồ. 4.17.6 Tính nồng độ của các dung dịch chuẩn hiệu chuẩn Tính nồng độ, ρ w , của từng vitamin trong dung dịch chuẩn làm việc từ nồng độ dung dịch gốc, sử dụng hệ số pha loãng thích hợp đã cho trong Công thức (6) đến Công thức (9) tính bằng μg/ml đối với retinyl palmitat (RP) và retinyl axetat (RA), tính bằng mg/ml đối với α -tocopherol (T) và α -tocopheryl axetat (TA). (6) (7) (8) (9) Trong đó: V a là 0,5 ml, 2 ml, 4 ml, 8 ml, 16 ml và 32 ml tương ứng với các mức hiệu chuẩn; m st là khối lượng chất chuẩn đối chứng, tính bằng miligam (mg); SP là độ tinh khiết quang phổ UV; CP là độ tinh khiết sắc ký là số thập phân; 1 000 là hệ số chuyển đổi mg/ml thành μg/ml. 5 Thiết bị, dụng cụ Ch ỉ sử dụng các thiết bị, dụng cụ th ủ y tinh phòng th ử nghiệm và cụ thể như sau. 5.1 Hệ thống HPLC , gồm có bơm, bộ l ấ y mẫu tự động, detector UV được cài đặt ở bước sóng 325 nm đối với vitamin A, detector huỳnh quang cài đặt ở bước sóng kích thích 280 nm và bước sóng phát xạ 310 nm đối với vitamin E. 5.2 Cột HPLC , cột pha thường phân tích, ví dụ: Agilent Zorbax® NH 2 2) (cỡ hạt 5 μm, kích thước 150 mm x 4,6 mm) hoặc tương đương. 5.3 Nồi cách thủy , cài đặt ở nhiệt độ 37° C ± 2° C . 5.4 Máy li tâm , có các bộ tiếp hợp dùng cho các ống li tâm 50 ml, có thể quay 4 000 r/min. 5.5 Máy đo phổ UV-VIS , có cuvet thạch anh 1 cm. 5.6 Cân phân tích , có thể cân đến 4 chữ số thập phân. 5.7 Lọ HPLC màu hổ phách , dung tích 2 ml, c ó nắp bằng chất dẻo và vòng đệm bằng polytetrafloetylen (PTFE). 5.8 Ố ng li tâm dùng một lần , dung tích 50 ml. 5.9 Máy lắc ống nghiệm cơ học dùng trong phòng thử nghiệm. 5.10 Bể siêu âm. 5.11 Bình định mức một vạch , dung tích 50 ml và 100 ml. 5.12 Thiết bị lọc chân không , có màng lọc nilon cỡ lỗ 0,45 μm. 5.13 Chai thủy tinh phòng thử nghiệm , dung tích 250 ml, 1 ℓ và 2 ℓ . 5.14 Pipet và đầu tip. 6 Cách tiến hành 6.1 Chuẩn bị mẫu thử 6.1.1 Yêu cầu chung Nếu nền mẫu dạng bột là chưa biết độ đồng nhất, thì giả sử nền mẫu là không đồng nhất và tiến hành theo 6.1.2. 6.1.2 Mẫu dạng bột được trộn khô Đối với các mẫu dạng bột được trộn khô/không đồng nhất, cân chính xác khoảng 25,0 g ( m 1 ) mẫu, cho vào chai 250 ml (5.13). Hòa tan bằng nước ấm (khoảng 40° C đến 45°C), làm nguội và thêm 200 g nước. Ghi lại khối l ượ ng cuối cùng ( m 2 ). Cân chính xác khoảng 5,0 g ( m 3 ) mẫu đã được hoàn nguyên cho vào trong ống li tâm có nắp vặn. Tính khối lượng mẫu (tương đương dạng bột), m s , sử dụng Công thức (10): (10) 6.1.3 M ẫ u dạng bột được trộn ướt Đối với mẫu dạng bột đồng nhất được trộn ướt, cân chính xác khoảng 0,525 g mẫu cho vào ống li tâm 50 ml có nắp vặn. Thêm 5 ml nước ấm khoảng 40° C và lắc để hòa tan. 6.1.4 Mẫu dạng lỏng Đối với mẫu để dùng ngay hoặc các sản phẩm dạng lỏng đậm đặc, cân chính xác khoảng 5,0 g ( m 3 ) mẫu đã đồng hóa kỹ cho vào ống li tâm 50 ml có nắp vặn. 6.1.5 Chiết mẫu Cho 5 ml dung dịch papain (4.11) vào các dung dịch đã cân ở trên. Trộn để phân tán từng mẫu thử, đậy nắp và đặt các ống vào nồi cách thủy ở nhiệt độ 37°C ± 2°C trong 20 min đến 25 min. Lấy mẫu ra khỏi nồi cách thủy và để nguội. Cho mẫu vào tủ đông khoảng 5 min hoặc làm lạnh khoảng 20 min. Thêm 20 ml metanol đã axit hóa (4.12) vào từng ống mẫu và lắc 10 min, tốt nhất là bằng máy lắc cơ học. Dùng pipet lấy chính xác 10 ml iso-octan cho vào từng ống mẫu. Đậy chặt để tránh rò rỉ và lắc các ống 10 min, tốt nhất là bằng máy lắc cơ học. Li tâm trong 10 min ở 4 000 r/min để thu được lớp iso-octan trong. Chuyển dung dịch lớp iso-octan trong vào lọ màu hổ phách dùng để phân tích HPLC. 6.2 Phân tích HPLC 6.2.1 Yêu cầu chung Các điều kiện dưới đây là thích hợp để tách và định lượng: Cột: Aglient Zorbax® NH 2 3) (cỡ hạt 5 μm, kích thước 150 mm x 4,6 mm); Pha động A: n -hexan; Pha động B: hỗn hợp của 750 ml n -hexan, 250 ml metyl- t -butyl ete và 3 ml metanol; Tốc độ dòng: 1,5 ml/min; Thể tích bơm: 50 μl; Nhiệt độ lò cột: 40° C ± 2 °C; Thời gian chạy: 20 min. Ví dụ về sắc ký đồ điển hình được nêu trong Phụ lục A. 6.2.2 Cài đặt detector Cài đặt detector UV /mảng điốt quang (PDA) ở bước sóng 325 nm đối với retinyl palmitat và retinyl axetat. Cài đặt detector huỳnh quang ở bước sóng kích thích 280 nm và bước sóng phát xạ 310 nm đối với α -tocopheryl axetat và α -tocopherol. 6.2.3 Chu trình bơm rửa giải gradient Chu trình bơm r ử a giải gradient nêu trong Bảng 1. Bảng 1 - Chu trình bơm rửa giải gradient Thời gian min Tốc độ dòng ml/min Pha động A % Pha động B % 0 1,5 95 5 3,0 1,5 95 5 12,0 1,5 5 95 14,0 1,5 5 95 15,0 1,5 95 5 20,0 1,5 95 5 7 Sự phù hợp của hệ thống Cần kiểm tra lại độ phân giải giữa đồng phân cis và trans của retinyl palmitat, giữa đồng phân cis và trans của retinyl axetat khi chạy phương pháp này; trong chất chu ẩ n đối chứng độ phân giải này phải lớn hơn 1,5. 8 Tính kết quả Nhận biết các pic của tất cả các đồng phân trans và cis của retinyl palmitat và retinyl axetat, α -tocophero l và α -tocopheryl axetat trên sắc ký đồ của mẫu bằng cách so sánh thời gian lưu của các pic tương ứng trong dung dịch chuẩn. Tính nồng độ, w , các đồng phân của retinyl palmitat hoặc retinyl axetat, tính bằng μg/100 g và α -tocopherol hoặc α -tocopheryl axetat (dạng bột hoặc dạng lỏng), tính bằng mg/100 g trong mẫu thử theo Công thức (11): (11) Trong đó: A là diện tích pic hoặc chiều cao pic của retinyl palmita t/ retinyl axetat (13- c i s cộng với tất cả trans ) hoặc α -tocopherol hoặc α -tocopheryl axetat trong dung dịch mẫu thử; I là giao điểm của đường chuẩn đối với từng chất phân tích; S là độ dốc của đường chuẩn đối với từng ch ấ t phân tích; V i so là thể tích iso-octan đã dùng ( ở đây V i so = 10 ml); 100 là hệ số chuyển đổi thành 100 g; m s là khối lượng mẫu thử (đối với mẫu dạng lỏng) hoặc dạng bột tương đương (mẫu dạng bột), tính bằng gam (g). Trong tiêu chuẩn này không có sự phân biệt về tỷ lệ các đồng phân cis- và trans- trong tổng hoạt độ của retinyl palmitat/retinyl axetat. Đối với phép tính tích phân pic vitamin A, tính tổng diện tích các đồng phân 13- c i s và tất cả đồng phân trans của retinyl palmitat/retinyl axetat theo đồng phân trans . Quy đổi các kết quả vitamin A sang retinol sử dụng phép tính phức hợp theo Công thức (12): Vitamin A là retinol (μg/100 g) = (retinyl palmitat tính bằng μg/100 g x 0,55) + (retinyl axetat tính bằng μg/100 g x 0,87) (12) Quy đổi các kết quả vitamin E sang α -tocopherol sử dụng phép tính phức hợp: - 1 mg α -tocopheryl axetat bằng 1,10 α -tocopherol, và - 1 mg = 1,10 DL α -tocopherol (vitamin E tổng hợp; tất cả các raxemic α -tocopherol). Phụ lục A (Tham khảo) Ví dụ về sắc ký đồ CHÚ DẪN Pic 1 Đồng phân 13-C is X là thời gian lưu, tính bằng phút (min) Pic 2 Đồng phân Trans Y là thời gian hấp thụ milli (mAU) Hình A.1 - Sắc ký đồ HPLC của chất chuẩn hiệu chuẩn retinyl palmitat CHÚ DẪN Pic 1 Đồng phân 13- Cis X là thời gian lưu, tính bằng phút (min) Pic 2 Đồng phân Cis Y là thời gian hấp thụ milli (mAU) Pic 3 Đồng phân Trans Hình A.2 - Sắc ký đồ HPLC của mẫu th ử retinyl palmitat CHÚ DẪN Pic 1 Đồng phân 13-C is X là thời gian lưu, tính bằng phút (min) Pic 2 Đồng phân Trans Y là thời gian hấp thụ milli (mAU) Hình A.3 - Sắc ký đồ HPLC của chất chuẩn hiệu chuẩn retinyl axetat CHÚ DẪN Pic 1 Đồng phân 13-C is X là thời gian lưu, tính bằng phút (min) Pic 2 Đồng phân Cis Y là thời gian hấp thụ milli (mAU) Pic 3 Đồng phân Trans Hình A.4 - Sắc ký đồ HPLC của mẫu thử retinyl axetat CHÚ DẪN Pic 1 α -tocopheryl axetat X là thời gian lưu, tính bằng phút (min) Pic 2 α -tocopherol Y là thời gian hấp thụ milli (mAU) Hình A.5 - Sắc ký đồ HPLC của chất chuẩn hiệu chuẩn α -tocopheryl axetat và α -tocopherol CHÚ DẪN Pic 1 α -tocopheryl axetat X là thời gian lưu, tính bằng phút (min) Pic 2 α -tocopherol Y là thời gian hấp thụ milli (mAU) Hình A.6 - Sắc ký đồ HPLC của mẫu α -tocopheryl axetat và α -tocopherol Phụ lục B (Tham khảo) Dữ liệu độ chụm Dữ liệu nêu trong các Bảng B.1, Bảng B.2 và Bảng B.3 thu được trong một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm, được công bố năm 2015 [ 2] phù hợp với TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) [3] và Nghị định thư của AOAC-IUPAC về quy trình nghiên cứu cộng tác quốc tế để đánh giá các đặc tính của độ chụm phương pháp phân tích. [4 ] Nghiên cứu được thực hiện theo các yêu cầu nêu trong Tài liệu tham khảo [5] và [6]. Bảng B.1 - Dữ liệu độ chụm đối với retinyl axetat (1 a và 2 b ) và retinyl palmitat (3 c đến 8 h ) , tính theo retinol M ẫ u 1 a 2 b 3 c ,j 4 d 5 e 6 f 7 g 8 h Năm thử nghiệm liên phòng 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 Số lượng phòng th ử nghiệm 15 15 15 15 15 15 15 15 Số lượng phòng th ử nghiệm không phù hợp 0 0 0 0 0 0 0 0 Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 15 12 15 15 15 14 14 15 Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ 0 3 0 0 0 1 1 0 Số lượng các kết quả chấp nhận được 30 24 30 30 30 28 28 30 Giá trị trung bình, , μg/100 g RTF i 46,34 6 7 ,39 6,49 47,55 62,56 66,58 57,34 48,35 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , μg/100 g RTF 7,69 1,55 0,21 7,50 4,28 0,75 0,61 7,31 Độ lệch chuẩn tái lập, s R , μg/100 g RTF 10,48 8,04 0,52 10,33 6,04 4,33 4,13 7,86 Hệ số biến thiên lặp lại, C v ,r , % 16,60 2,30 3,26 15,78 6,84 1,13 1,06 15,13 Hệ số biến thiên tái lập, C V, R , % 22,61 11,93 8,02 21,73 9,66 6,51 7,20 16,25 Giới hạn lặp lại r , [ r = 2,8 x s r ], μg/100 g RTF 21,54 4,34 0,59 21,01 11,98 2,10 1,70 20,48 Giới hạn tái lập R , [ R = 2,8 x s R ], μg/100 g RTF 29,34 22,52 1,46 28,92 16,91 12,13 11,56 21,99 Giá trị Horat, theo Tài liệu tham khảo [7] 1,25 0,69 0,33 1,20 0,56 0,38 0,41 0,91 a Sản phẩm dinh dưỡng từ protein sữa, dạng bột dành cho người lớn , b Thức ăn công thức từ đậu nành đã thủy phân một phần, dạng bột dành cho tr ẻ sơ sinh , c SRM 1849a, d Sản phẩm dinh dưỡng có hàm lượng chất béo thấp, dạng bột dành cho người lớn, e Thức ăn công thức từ đậu nành, dạng bột dành cho trẻ sơ sinh, f Sữa công thức dạng bột dành cho trẻ sơ sinh, g Sữa c ô ng thức để dùng ngay dành cho trẻ sơ sinh, h Thức ăn bổ sung dạng bột dành cho tr ẻ sơ sinh , i RTF là thực phẩm để dùng ngay, j mg/kg bột. CHÚ THÍCH 1 Các kết quả được biểu thị bằng μg retinol/100 g RTF. CH Ú TH Í CH 2 Các giá trị SRM 1849a xác định được thấp hơn các giá trị đã được công nhận, có thể vì các điều kiện bảo quản trong nghiên cứu cộng tác không thích hợp. Các giá trị đã được công nhận (7,68 mg/kg ± 0,23 m g/kg) thu được trong một nghiên cứu đánh giá xác nh ậ n phòng thử nghiệm đơn lẻ đối với vật liệu này, xem Tài liệu tham khảo [10]. Bảng B.2 - Dữ liệu độ chụm đối v ớ i vitamin E ( α -tocopherol) M ẫ u 1 a 2 b 3 c ,j 4 d 5 e 6 f 7 g 8 h Năm thử nghiệm liên phòng 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 Số lượng phòng th ử nghiệm 15 15 15 15 15 15 15 15 Số lượng phòng th ử nghiệm không phù hợp 0 0 0 0 0 0 0 0 Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 14 11 14 14 14 13 14 14 Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ 1 4 1 1 1 0 1 1 Số lượng các kết quả chấp nhận được 28 22 28 28 28 26 28 28 Giá trị trung bình, , μg/100 g RTF i 0,58 0,48 36,38 0,14 0,46 0,49 0,45 0,41 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , μg/100 g RTF 0,023 0,008 2,103 0,012 0,036 0,008 0,012 0,064 Độ lệch chuẩn tái lập, s R , μg/100 g RTF 0,052 0,057 4,539 0,061 0,040 0,279 0,035 0,072 Hệ số biến thiên lặp lại, C v ,r , % 3,99 1,67 5,78 8,90 7,89 1,57 2,59 15,48 Hệ số biến thiên tái lập, C V, R , % 9,10 11,94 12,47 43,56 8,74 5,68 7,73 17,44 Giới hạn lặp lại r , [ r = 2,8 x s r ], μg/100 g RTF 0,064 0,022 5,889 0,035 0,101 0,022 0,033 0,178 Giới hạn tái lập R , [ R = 2,8 x s R ], μg/100 g RTF 0,147 0,159 12,71 0,170 0,112 0,078 0,098 0,201 Giá trị Horat, theo Tài liệu tham khảo [7] 0,930 0,920 1,870 2,180 0,680 0,440 0,600 1,340 a Sản phẩm dinh dưỡng từ protein sữa, dạng bột dành cho người lớn, b Thức ăn công thức từ đậu nành đã thủy phân một phần, dạng bột dành cho trẻ sơ sinh, c SRM 1849a, d Sản phẩm dinh dưỡng có hàm lượng chất béo thấp, dạng bột dành cho người lớn, e Thức ăn công thức từ đậu nành, dạng bột dành cho trẻ sơ sinh, f Sữa công thức dạng bột dành cho trẻ sơ sinh, g Sữa công thức để dùng ngay dành cho trẻ sơ sinh, h Thức ăn bổ sung dạng bột dành cho trẻ sơ sinh, i RTF là thực phẩm để dùng ngay, j mg/kg bột. B ả ng B.3 - Dữ liệu độ chụm đối với vitamin E ( α -tocopheryl axetat) M ẫ u 1 a 2 b 3 c ,j 4 d 5 e 6 f 7 g 8 h Năm thử nghiệm liên phòng 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 Số lượng phòng th ử nghiệm 15 15 15 15 15 15 15 15 Số lượng phòng th ử nghiệm không phù hợp 0 0 0 0 0 0 0 0 Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 14 15 14 13 14 13 13 15 Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ 1 0 0 0 0 2 2 0 Số lượng các kết quả chấp nhận được 28 30 28 26 28 26 26 30 Giá trị trung bình, , μg/100 g RTF i 12,73 1,80 172,89 1,84 1,30 1,44 1,56 1,79 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , μg/100 g RTF 0,489 0,066 3,374 0,388 0,022 0,021 0,009 0,061 Độ lệch chuẩn tái lập, s R , μg/100 g RTF 0,926 0,203 14,991 0,156 0,084 0,067 0,065 0,119 Hệ số biến thiên lặp lại, C v ,r , % 3,84 3,65 1,95 2,11 1,67 1,43 0,60 3,38 Hệ số biến thiên tái lập, C V, R , % 7,28 11,25 8,67 8,50 6,47 4,62 4,15 6,66 Giới hạn lặp lại r , [ r = 2,8 x s r ], μg/100 g RTF 1,369 0,184 9,447 0,109 0,061 0,058 0,026 0,170 Giới hạn tái lập R , [ R = 2,8 x s R ], μg/100 g RTF 2,594 0,567 41,976 0,437 0,236 0,187 0,181 0,334 Giá trị Horat, theo Tài liệu tham khảo [7] 0,330 1,070 0,580 0,810 0,580 0,420 0,380 0,630 a Sản phẩm dinh dưỡng từ protein sữa, dạng bột dành cho người lớn, b Thức ăn công thức từ đậu nành đã thủy phân một phần, dạng bột dành cho trẻ sơ sinh, c SRM 1849a, d Sản phẩm dinh dưỡng có hàm lượng chất béo thấp, dạng bột dành cho người lớn, e Thức ăn công thức từ đậu nành, dạng bột dành cho trẻ sơ sinh, f Sữa công thức dạng bột dành cho trẻ sơ sinh, g Sữa công thức để dùng ngay dành cho trẻ sơ sinh, h Thức ăn bổ sung dạng bột dành cho trẻ sơ sinh, i RTF là thực phẩm để dùng ngay, j mg/kg bột. Phụ lục C (Tham khảo) So sánh giữa AOAC 2012.10, EN 12822 và EN 12823-1 Để đảm bảo việc so sánh các dữ liệu thu được từ EN 12822 [8] , EN 12823-1 [9] và AOAC 2012.10 [10 ] , thì dữ liệu thu được từ phép phân tích trên cùng mẫu thử bằng tất cả các phương pháp. Các kết qu ả của phép so sánh này được nêu trong Bảng C.1, Bảng C.2 và được minh họa trong Hình C.1, Hình C.2. Bảng C.1 - So sánh các kết quả đối với vitamin A Mẫu AOAC 2012.10 AOAC 2012.10 EN 12823-1 EN 12823-1 EN 12823-1 n = 11 đến 15 phòng thử nghiệm n = 11 đến 15 phòng thử nghiệm Phòng thử nghiệm 1 Phòng thử nghiệm 2 Phòng thử nghiệm 3 μg/100 g RTF a C V ,R , % μg/100g RTF μg/100 g RTF μg/100 g RTF Sản phẩm dinh dưỡng từ sữa dạng bột dành cho người lớn 46,34 22,61 48,29 50,84 38,07 Thức ăn công thức từ đậu nành đã thủy phân một phần, dạng bột dành cho trẻ sơ sinh 67,39 11,93 74,93 76,92 51,28 SMR 1849a 6,49 b 8,02 7,38 6,99 6,14 Sản phẩm dinh dưỡng có hàm lượng chất béo thấp, dạng bột dành cho người lớn 47,55 21,73 62,16 61,16 53,61 Thức ăn công thức từ đậu nành, dạng bột dành cho trẻ sơ sinh 62,56 9,66 69,71 72,59 58,16 Sữa công thức dạng bột dành cho trẻ sơ sinh 66,58 6,51 70,60 69,71 60,27 Sữa công thức để dùng ngay, dạng bột dành cho tr ẻ sơ sinh 57,34 7,20 68,35 67,00 58,00 Thức ăn bổ sung dạng bột dành cho trẻ sơ sinh 48,35 16,25 47,51 47,29 37,30 a RTF = Thực phẩm để dùng ngay b mg/kg bột Đồ thị trong Hình C.1 thu được từ các giá trị xác định được theo EN 12823-1 do ba phòng thử nghiệm tham gia, với đường biên ± 2 C V,R xác định được bằng phép thử nhiều phòng thử nghiệm (MLT) trong AOAC 2012.10 có từ 11 đến 15 phòng thử nghiệm tham gia. Các đường biên 2 C V,R c ần bao gồm 95 % dữ liệu theo AOAC 2012.10. CHÚ THÍCH Hình minh họa đồ thị phép xác định vitamin A bằng EN 12823-1 do ba phòng thử nghiệm tham gia, với các giá trị 2 C V, R xác định được bằng AOAC 2012.10 có từ 11 đến 15 phòng thử nghiệm tham gia. Các giá trị của ba phòng thử nghi ệ m tham gia được chuẩn hóa theo giá trị trung bình của phép thử nhiều phòng thử nghiệm trong AOAC 2012.10. Hình C.1 - So sánh phép xác định vitamin A Bảng C.2 - So sánh các kết quả đối với vitamin E ( α-tocopheryl axetat cùng α-tocopherol tính theo α-tocophero l ) M ẫ u AOAC 2012.10 AOAC 2012.10 EN 12823-1 EN 12823-1 EN 12823-1 n = 11 đến 15 phòng thử nghiệm n = 11 đến 15 phòng th ử nghiệm Phòng th ử nghiệm 1 Phòng thử nghiệm 2 Phòng thử nghiệm 3 μg/100 g RTF a C V ,R . % μg/100g RTF μg/100g RTF μg/100 g RTF Sản phẩm dinh dưỡng từ sữa dạng bột dành cho người lớn 12,18 7,17 11,32 - 12,32 Thức ăn công thức từ đậu nành đã thủy phân một phần dạng bột dành cho trẻ sơ sinh 2,12 10,15 2,09 1,78 2,04 SMR 1849 a 193,90 b 3,91 186,50 125,00 191,00 Sản phẩm dinh dưỡng có hàm lượng chất béo thấp dạng bột dành cho người lớn 1,82 10,78 1,71 1,50 1,80 Thức ăn công thức từ đậu nành dạng bột dành cho trẻ sơ sinh 1,64 4,22 1,58 1,55 1,68 Sữa công thức dạng bột dành cho tr ẻ sơ sinh 1,80 4,13 1,69 1,54 1,83 Sữa công thức để dùng ngay, dạng bột dành cho trẻ sơ sinh 1,87 3,84 1,86 1,30 1,88 Thức ăn bổ sung dạng bột dành cho trẻ sơ sinh 1,77 5,55 1,81 1,70 2,03 a RTF = Thực phẩm để dùng ngay b mg/kg bột Đồ thị trong Hình C.2 thu được từ các giá trị xác định được theo EN 12822 do ba phòng thử nghiệm tham gia, với đường biên ± 2 C V , R xác định được bằng phép thử nhiều phòng th ử nghiệm (MLT) trong AOAC 2010.10 có từ 11 đến 15 phòng thử nghiệm tham gia. Các đường biên 2 C V ,R cần bao gồm 95 % dữ liệu theo đánh giá xác nhận của AOAC 2012.10. CHÚ THÍCH Hình minh họa đồ thị phép xác định vitamin E ( α -to c opheryl axetat cùng α -tocopherol tính theo α -tocopherol) bằng EN 12822 do ba phòng thử nghiệm tham gia, với các giá trị 2 C V,R xác định được b ằ ng AOAC 2012.10 có từ 11 đến 15 phòng thử nghiệm tham gia. Các giá trị của ba phòng thử nghiệm tham gia được chu ẩ n hóa theo giá trị trung bình của phép thử nhiều phòng thử nghiệm trong AOAC 2012.10 Hình C.2 - So sánh phép xác định vitamin E Thư mục tài liệu tham khảo [1] EITENMILLER R.R., LANDER Jr W.O . Vitamin Analysis for the Health and Food Science- CRC Press [2] OMA 2012.10, Simultaneous Determination of 13-Cis and all-trans Vitamin A Palmitate (retinyl palmitate), Vitamin A Acetat (retinyl acetate), and Total Vitamin E (α-Tocopherol and DL-α- Tocopherol Acetate) in Infant Formula and Adult Nutritionals by Normal Phase HPLC: Collaborative Study [3] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn [4] AOAC INTERNATIONAL AOAC Official Methods Program, Associate Referee's Manual on development, Study, Review, and Approval Process. Part IV AOAC Guidelines for Collaborative Studies, 1995, pp. 23-51 [5] AOAC SMPR 2011.003, Standard Method Performance Requirements for Vitamin A in infant formula and Adult/Pediatric Nutritional formula [6] AOAC SMPR 2011.010, Standard Method Performance Requirements for Vitamin E in infant formula and Adult/Pediatric Nutritional formula [7] THOMPSON M. Recent Trends in Inter-Laboratory Precision at ppb and sub-ppb Concentrations in Relation to Fitness for Purpose Criteria in Proficiency Testing. Analyst (Lond.). 2000, 125 pp. 385-386 [8] EN 12822:2014 Foodstuffs - Determination of vitamin E by high performance liquid chromatography - Measurement of α-, β-, γ- and δ-tocopheryl [9] EN 12823-1:2014 Foodstuffs - Determination of vitamin A by high performance liquid chromatography - Part 1: Measurement of all-E-retinol and 13-Z-retinol [10] J AOAC Int 2013, Sept - Oct; 96 (5): 1073 - 1081 - Simultaneous determination of 13-cis and all-trans vitamin A palmitate (retinyl palmitate), vitamin A acetate (retinyl acetate), and total vitamin E (alpha-tocophery l and alpha-tocopheryl acetate) in infant formula and adult nutritionals by normal phase HPLC: first action 2012.10 1) Đây là ví dụ về sản ph ẩ m thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho các kết quả tương đ ương . 2) Đây là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho các kết quả tương tự. 3) Đây là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho các kết quả tương tự.