TCVN10812:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10812:2015 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng amprolium - Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10812:2015 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMPROLIUM - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal f eeding stu ff s - Determination of amprolium content - High per f ormance liquid chromatographic method Lời nói đầu TCVN 10812:2015 được xây dựng dựa theo Commission Regulation (EC) No. 152/2009; TCVN 10812:2015 do Trung t â m Khảo, kiểm nghiệm và ki ể m định giống vật nuôi, thức ăn chăn nuôi bi ê n soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đ ề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng th ẩ m đ ị nh, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMPROLIUM - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal f eeding stu ff s - Determination of amprolium content - High per f ormance liquid chromatographic method 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng amprolium (1-[(4-amino-2-propylpyrimidin- 5-yl)methyl]-2-methyl-pyridinium chlorid hydrochlorid) trong thức ăn chăn nuôi bằng sắc k ý l ỏ ng hiệu năng cao. Tiêu chu ẩ n này cũng có th ể áp dụng đ ố i v ớ i premix. Phương pháp này có giới hạn phát hiện là 1 mg/kg và giới hạn định lượng là 5 mg/kg. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau r ấ t cần thi ế t cho việc áp dụng ti ê u chu ẩ n này. Đối với các t à i liệu viện dẫn ghi n ă m công bố th ì áp dụng phi ê n bản được n ê u. Đ ối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 6952 (ISO 9498) Th ứ c ăn chăn nuôi - Chuẩn bị m ẫ u th ử 3. Nguyên tắc Amprolium được chi ế t ra khỏi mẫu bằng hỗn hợp nước-metanol. Sau khi pha lo ã ng b ằ ng pha động và lọc qua bộ lọc màng, hàm lượng amprolium được xác định bằng sắc k ý lỏng hiệu năng cao (HPLC) trao đổi cation với detector UV. 4. Thuốc thử Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh k hiết phân tích và nước c ấ t hoặc nước đã loại k hoán g hoặc nước có chất lượng tương đương, tr ừ khi có quy định khác. 4.1 . Metanol. 4.2 . Axetonitr i l , loại dùng cho HPLC. 4.3 . N ướ c, loại dùng cho HPLC. 4.4 . Dung dịch natr i dihydro phosphat , c = 0,1 mol/l. H ò a tan 13,80 g natri dihydro phosphat ngậm một phân tử n ư ớc trong nước (4.3) đựng trong b ì nh định mức 1000 ml, th ê m nước (4.3) đ ế n vạch và trộn. 4.5 . Dung d ị ch natri perc hl orat , c = 1,6 mol/l. Hòa tan 224,74 g natri p e rchlorat ngậm một phân tử nước trong nước (4.3) trong bình định mức 1000 ml, th ê m nước (4.3) đ ế n vạch và trộn. 4.6 . Pha động dùng cho HPLC Trộn axetonitril (4.2), dung dịch natri dihydro phosphat (4.4) và dung dịch natr i perchlorat (4.5) v ớ i tỷ lệ 450 : 450 :100 (thể tích). Trước khi sử dụng, lọc hỗn hợp này qua bộ lọc màng c ỡ lỗ 0,22 μm (5.3) và lo ạ i kh í dung dịch (ví dụ: cho vào b ể siêu âm (5.4) í t nhất 15 min). CHÚ THÍCH: N ế u m ẫ u chứa thiam i n th ì pic thiam i n trong phổ đ ồ xu ấ t hiện ngay trước pic amprol i um, khi đ ó phải tách thiamin. Nếu không th ể tách thiamin tr ê n cột (5.1.1) th ì thay 50 % ph ầ n th ể t í ch axetonitril trong dung môi pha động bằng metanol. 4.7 . Ch ấ t chu ẩ n: amprolium [1-[(4-amino-2-propylpyrimidin-5-yl) methyl-2-methyl-pyridinium chlorid hydrochlorid] tinh khi ế t, k ý hiệu: E 750. 4.7.1 . Dung d ị ch chuẩn g ố c amprolium , 500 μ g /ml Cân 50 mg amprolium, chính xác đ ế n 0 , 1 mg, cho vào b ì nh định mức 100 ml, hòa tan trong 80 ml meta n ol (4 . 1) và đặt b ì nh vào bể siêu âm (5.4) trong 10 min. Sau k hi si ê u âm, làm nguội dung dịch đến nhiệt độ ph ò ng, thêm nước đ ế n vạch và trộn. Khi được bảo quản ở nhiệt độ không lớn h ơ n 4 ° C , dung dịch b ề n trong 1 tháng. 4.7.2 . Dung dịch chu ẩ n trung gian amprolium , 50 μg/ml Dùng pipet l ấ y 5,0 ml dung d ị ch chu ẩ n g ố c (4.7.1) cho vào b ì nh đ ị nh m ức 50 ml, thêm dung m ô i chiết (4.8) đến vạch và trộn. Kh i được bảo quản ở nhiệt độ không lớn hơn 4 ° C , dung dịch b ề n trong 1 tháng. 4.7.3 . Dung d ị ch hiệu chuẩn Chuy ể n 0,5 ml, 1,0 ml và 2,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.7.2) vào một dãy các b ì nh định mức 50 ml. Thêm pha động (4.6) đ ế n vạch và trộn. Các dung dịch này chứa nồng độ amprolium tương ứng 0,5 μg/ml, 1,0 μg/ml và 2,0 μg/ml. Các dung d ị ch này cần được chu ẩ n bị m ớ i trước khi sử dụng. CH Ú TH Í CH: Phổ đồ của dung dịch amprol i um (nồng độ 0,02 mol/l) trong axit cl ohydr i c cho th ấ y độ hấp thụ cực đại ở các bước sóng 246 nm và 262 n m . Độ hấp th ụ phải bằng 0,84 ở 246 n m và bằng 0,80 ở 262 nm. 4.8 . Dung môi chi ế t Hỗn hợp của metanol (4.1) và nư ớ c: tỷ l ệ 2:1 (th ể tích). 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thi ế t b ị , dụng cụ thông thư ờ ng của phòng thử nghiệm và các thi ế t bị, dụng cụ sau: 5.1 . Thiết b ị HPLC có h ệ th ố ng b ơ m, thích hợp để bơm các th ể t í ch 100 μ l . 5.1.1 . Cột sắc kí lỏng , kích thước 125 mm x 4 mm, Nucleosil 10 SA trao đ ổ i cation , c ỡ hạt nhồi 5 μm hoặc 10 μm hoặc loại tương đương. 5.1.2 . Detector UV , có thể thay đổi bước sóng hoặc detector mảng d i ot . 5.2 . Bộ lọc màng , c ỡ l ỗ 0,45 μm 5.3 . Bộ lọc màng , c ỡ lỗ 0,22 μm. 5.4 . B ể s iê u âm 5.5 . Máy lắc cơ học hoặc bộ khu ấ y từ 5.6 . B ì nh định mức , dung tích 50 ml, 100 ml và 1000 ml. 5.7 . B ì nh nón , dung t í ch 250 ml và 500 ml. 5.8 . Cân , có th ể cân được 50 mg, chính xác đến 0,1 mg. 5.9 . Cân , c ó th ể c â n được 5 g, chính xác đ ế n 0,001 g. 5.10 . Cân , có thể cân được 50 g, chính xác đến 0,01 g. 5.11 . Cân , có th ể cân được 500 g, ch í nh xác đến 0,1 g. 5.12 . P i pet , có th ể phân phối các thể tích thích hợp. 6. Lấy mẫu Mẫu phải đại diện và không b ị hư hỏng hoặc b ị biến đổi ch ấ t lượng trong suốt qu á trình vận chuyển và bảo quản. Tiêu chuẩn này không quy định việc l ấ y mẫu. N ê n l ấ y mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu. 7. Chuẩn bị mẫu thử Chu ẩ n bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498). 8. Cách tiến hành 8.1 . Y ê u cầu chung 8. 1 .1 . M ẫ u trắng Để kiểm tra độ thu hồi (8.1.2), cần phân tích mẫu trắng để chắc ch ắ n rằng không có m ặ t amprolium hoặc chất gây nhiễu. Mẫu trắng phải cùng loại với mẫu thử nhưng không phát hiện được amprolium hoặc chất gây nhiễu. 8.1.2 . K iể m tra độ thu hồi Kiểm tra độ thu hồi bằng cách phân t í ch mẫu trắng được bổ sung một lượng amprolium tương tự lượng dự ki ế n đó có mặt trong mẫu. Để bổ sung ở mức 100 mg/kg, chuyển 10,0 ml dung dịch chu ẩ n gốc (4.7.1) vào b ì nh n ó n 250 ml (5.7) và cho bay hơi dung d ị ch đến khoảng 0,5 ml. Th ê m 50 g mẫu trắng, trộn kỹ và để 10 min, trộn lại vài lần trước kh i tiếp tục chi ế t (8.2). Nếu không sẵn có mẫu trắng cùng loại với mẫu thử (xem 8.1.1) th ì có thể ki ể m tra độ thu hồi bằng phương pháp th êm chu ẩ n. Trong trư ờ ng hợp này, mẫu phân t í ch được b ổ sung một lượng amprolium tương tự với lượng dự ki ế n có trong mẫu. Mẫu này được phân tích cùng với mẫu không th ê m chuẩn và t ừ kết quả thu được t í nh độ thu hồi. 8.2 . Chi ế t 8.2.1 . Thức ăn chăn nuôi và premix (chứa hàm lượng amprolium < 1=""> Cân từ 5 g đ ế n 40 g mẫu, ch í nh xác đ ế n 0,01 g, tùy thuộc vào hàm lượng amprolium cho vào b ì nh n ó n 500 ml và thêm 200 ml dung môi chiết (4.8). Đặt b ì nh vào bể si ê u â m (5.4) và đ ể 15 min. L ấ y b ì nh ra khỏi b ể siêu âm và l ắ c b ì nh tr ê n máy lắc hoặc khu ấ y bằng máy khu ấ y từ (5.5) trong 1 h. Pha lo ã ng phần nước của dịch chi ế t bằng pha động (4.6) đến khi thu được hàm lượng amprolium từ 0,5 μg/ml đ ế n 2 μg/ml và trộn. Lọc khoảng 5 ml đ ế n 10 ml dung dịch đã pha lo ã ng bằng bộ lọc màng (5.2). Ti ế p t ụ c xác đ ị nh bằng HPLC (8.3). CHÚ THÍCH: Dịch chi ế t phải đ ư ợc pha lo ã ng bằng dung môi pha động, nếu không th ì thời gian lưu của pic amprolium có th ể bị thay đ ổ i đáng k ể do sự thay đ ổ i nồng độ ion. 8.2.2 . Premix (chứa hàm lượng amprolium ³ 1 %) Cân từ 1 g đến 4 g pre m ix, chính xác đến 0,001 g, tùy thuộc vào hàm lượng amprolium, cho vào b ì nh nón 500 ml và thêm 200 ml dung môi chiết (4.8). Đặt b ì nh vào b ể siêu âm (5.4) và để 15 min. L ấ y b ì nh ra kh ỏ i bể siêu âm và lắc trên máy lắc hoặc khuấy bằng m á y khuấy từ (5.5) trong 1 h. Pha loãng phần nước của dịch chiết bằng pha động (4.6) đ ể thu được hàm lượng amprolium từ 0,5 μg/ml đến 2 μg/ml v à trộn. Lọc khoảng 5 ml đế n 10 ml dung dịch đã pha lo ã ng tr ê n bộ lọc màng (5.2). Ti ế p tục xác định bằng HPLC (8.3). 8.3 . Xác đ ị nh bằng HPLC 8.3.1 . Th ô ng s ố N ê n sử dụng các điều ki ệ n sau đây, c ó thể sử dụng các điều kiện khác nếu cho kết quả tương đương: - Cột sắc k í lỏng (5.1.1): kích thước 125 mm x 4 mm, Nucleosil 10 SA trao đổi cation, c ỡ hạt nhồi 5 μm hoặc 10 μm, hoặc loại tương đương; - Pha động (4.6): Hỗn hợp của axetonitril (4.2), dung dịch natri dihydro phosphat (4.4) và dung dịch natri perchlorat (4.5), tỷ l ệ 450:450:100 (thể tích). - Tốc độ dòng: 0,7 ml/min đ ế n 1 ml/min; - Thể tích bơm: 100 μl; - Bước sóng ph á t hiện: 264 nm. Kiểm tra sự ổn định của hệ thống sắc kí bằng cách bơm vài lần dung dịch hiệu chu ẩ n (4.7.3) có nồng độ 1,0 μg/ml, cho đến khi đạt được chi ề u cao (diện tích) pic và thời gian lưu ổn định. 8.3.2 . Dựng đ ườ ng chuẩn B ơ m m ỗ i dung dịch hiệu chu ẩ n (4.7.3) vài l ầ n và xác định chi ề u cao (diện tích) pic trung bình đối với mỗi n ồ ng độ. Dựng đường chu ẩ n bằng cách sử dụng chi ề u cao (diện tích) pic trung b ì nh trên trục tung và n ồ ng độ tương ứng t í nh bằng μg/ml trên trục hoành. 8.3.3 . Dung d ị ch mẫu Bơ m vài lần dịch chi ế t m ẫ u thu được trong 8.2, sử dụng cùng một th ể tích như đ ã dùng đối với dung dịch hiệu chu ẩ n và xác định chiều cao (diện tích) trung b ì nh của pic amprolium. Xác định nồng độ amprolium có trong dung dịch mẫu từ chiều cao (diện tích) pic trung b ì nh có trong dung dịch mẫu, tính bằng microgam trên mililit, sử dụng đường chuẩn (8.3.2). 9. Tính kết quả Tính hàm lượng amprolium trong mẫu, w (mg/kg), theo công thức sau: Trong đó: V l à thể tích dung môi chiết (4.8), tương ứng với 8.2, tính b ằ ng mililit (trư ờ ng h ợ p này là 200 ml); c là nồng độ amprolium trong dịch chi ế t mẫu (8.2) t í nh bằng microgam tr ê n mililit (μg/ml); m là kh ố i lượng phần mẫu th ử (8.2) tính bằng gam (g); f là hệ s ố pha loãng theo 8.2. 10. Đánh giá xác nhận kết quả 10.1 . Nhận b iế t Việc nhận biết ch ấ t phân t í ch có thể được khẳng định bằng đ ồ ng sắc k ý hoặc sử dụng detector mảng diot để so s á nh phổ đ ồ của dịch chi ế t mẫ u (8.2) và của dung dịch hiệu chuẩn (4.7.3) c ó nồng độ 2,0 μ g /ml. 10.1.1 . Đồng sắc k ý B ổ sung một thể tích thích hợp dung dịch hiệu chu ẩ n (4.7.3) vào dịch chi ế t mẫu (8.2). Lượng amprolium bổ sung phải xấp x ỉ lượng amprolium dự ki ế n t ì m thấy trong dịch chi ế t mẫu. Chỉ có chi ề u cao pic amprolium tăng sau khi tính cả lượng bổ sung và độ pha loãng của dịch chiết. Sai khác v ề chiều rộng pic tại điểm giữa chi ề u cao phải nằm trong phạm vi ± 10 % chi ề u rộng gốc của pic amprolium trong dịch chi ế t m ẫ u không thêm chuẩn. 10. 1 .2 . Detector m ả ng diot Các kết quả được đánh gi á theo các ti ê u chí sau: a) tại bước sóng tương ứ ng với độ h ấ p thụ cực đại, phổ đ ồ của mẫu và của chất chuẩn, được gh i lại ở đỉnh c ao nh ấ t tr ê n sắc k ý đồ, phải giống nhau trong một bi ê n độ được xác định bằng khả năng phân giải của hệ thống detector. Đối với detector mảng diot, bi ê n độ đặc trưng là ± 2 nm; b) tại bước sóng từ 210 nm đ ế n 320 nm, phổ đồ của mẫu và của ch ấ t chu ẩ n được ghi lại ở đỉnh cao nhất trên s ắ c kí đồ không được khác v ớ i các ph ầ n phổ đồ trong khoảng từ 10 % đến 10 0 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu ch í này đáp ứng khi có cùng phổ cực đại và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ của ch ấ t phân tích ch uẩn ; c) tại bư ớ c sóng từ 210 nm đến 320 nm, phổ đ ồ của đi ể m u ố n l ê n, đ ỉ nh cao nh ấ t và điểm uốn xuống của pic ch ấ t phân tích không được khác với các ph ầ n phổ đồ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đ ố i. Tiêu chí này đáp ứng khi c ó cùng phổ cực đại và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ tương ứng với phổ đồ của đỉnh cao nh ấ t. Nếu một trong các ti ê u chí này không đáp ứng th ì không xác nhận được sự có mặt của chất phân tích trong mẫu. 11. Độ lặp lại và độ thu hồi 11.1 . Độ lặp lại Chênh lệch giữa kết quả của hai phép xác định song song, thực hiện trên cùng một mẫu không được vượt quá: - 15 % giá trị cao hơn, khi hàm lượng amprolium từ 25 mg/kg đ ế n 500 mg/kg; - 75 mg/kg, khi hàm lượng amprolium từ 500 mg/kg đ ế n 1000 mg/kg; - 7,5 % giá trị cao hơn, khi hàm lượng amprolium lớn hơn 1000 mg/kg. 11.2 . Độ thu hồi Đ ối với các mẫu thức ăn chăn nuôi (mẫu trắng) được thêm chu ẩ n, độ thu hồi í t nhất là 90 %. 12. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thi ế t đ ể nhận b iế t đầy đủ v ề mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chu ẩ n n à y; d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chu ẩ n này, hoặc được coi l à tùy chọn, cùng với mọi t ì nh huống b ấ t thường có thể ảnh hưởng đến kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc n ế u đáp ứng yêu cầu v ề độ lặp lại th ì ghi kết quả cuối cùng thu được. Phụ lục A (Tham khảo) Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác Một nghi ê n c ứ u cộng tác đ ã được tổ chức thực hiện trên ba mẫu thức ăn gia cầm (mẫu 1 đến mẫu 3), một mẫu k hoán g (mẫu 4) và một mẫu premix (mẫu 5). Kết quả của phép th ử nghiệm cộng tác được nêu trong Bảng A.1. Bảng A.1 - Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác Mẫu 1 (mẫu tr ắ ng) Mẫu 2 M ẫ u 3 M ẫ u 4 Mẫu 5 Số lượng phòng thử nghiệm 14 14 14 14 15 Số lượng kết quả đơn lẻ 56 56 56 56 60 Giá trị trung b ì nh [mg/kg] - 45,5 188 5129 25140 Độ lệch chu ẩ n lặp lại, s r [mg/kg] - 2,26 3,57 178 550 Hệ số bi ế n thiên lặp lại , CV r [%] - 4,95 1,90 3,46 2,20 Độ lệch chuẩn tái lập, s R [mg/kg] - 2,95 11 , 8 266 760 Hệ số bi ế n thi ê n tái lập , CV R [%] - 6,47 6,27 5,19 3,00 Hàm lượng danh định [ mg/kg] - 50 200 5000 25000