TCVN5750:1993

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5750:1993 về thức ăn chăn nuôi - Phương pháp xác định nấm men và nấm mốc do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5750:1993 THỨC ĂN CHĂN NUÔI PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH NẤM MEN VÀ NẤM MỐC Animal feeding stuffs Method for enumeration of yeasts and moulds TCVN 5750 -1993 dựa trên cơ sở tiêu chuẩn quốc tế ISO 7954-1987; TCVN 5750 - 1993 thay thế TCVN 4332-86 và TCVN 4333-86; TCVN 5750 - 1993 do Ban kỹ thuật Nông sản biên soạn. Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng đề nghị và được Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành . 1. Định nghĩa Nấm men và nấm mốc là các vi sinh vật đơn bào hoặc đa bào, hình thành khuẩn lạc trong môi trường lựa chọn ở 25 ± 1 o C theo các điều kiện xác định trong tiêu chuẩn này. 2. Nguyên tắc Cấy một lượng mẫu thử ở độ pha loãng phù hợp vào môi trường thạch YDC, nuôi trong điều kiện hiếu khí ở 25 ± 1 o C trong 3, 4 và 5 ngày. Đếm số khuẩn lạc nấm men, nấm mốc và biểu thị kết quả bằng số khuẩn lạc trong 1 g mẫu. 3. Dụng cụ và thiết bị Các dụng cụ thí nghiệm thông thường dùng để xác định vi sinh vật và các dụng cụ thiết bị sau: - Nồi hấp thanh trùng có thể duy trì ở 121 ± 1 o C hoặc tủ sấy thanh trùng có thể duy trì ở 170-175 o C; - Tủ nuôi cấy có thể duy trì ở 25 ± 1 o C; - Nồi chưng cách thuỷ có thể duy trì ở 45 ± 1 o C; - Đĩa petri, f 90-100 mm; - Pipet có dung tích 1 và 10 ml có vạch chia 0,5 và 0,1 ml đường kính miệng hút từ 2 đến 3 mm; - pH mét có bộ bù nhiệt, đo chính xác tới 0,1 pH ở 25 o C; - Thiết bị đếm khuẩn lạc có gắn nguồn sáng và kính phóng đại. 4. Hoá chất và môi trường 4.1. Dung dịch pha loãng, theo TCVN 4881-89 (ISO 6887-1983) 4.2. Môi trường nuôi cấy Dùng môi trường thạch YDC (Yeast extract Dextrose - Chloramphenicol agar) - Thành phần Cao men 5 g Dextrosa 20g Cloramphenicol (C 11 H 12 Cl 2 N 2 O 5 ) 0,1 g Aga 15 g Nước cất, đủ 1000 ml - Cách pha: Đun sôi để hòa tan thành phần trên trong nước cất, để nguội tới 45 ± 1 o C trong nồi cách thủy, điều chỉnh để pH là 6,6 ± 0,1 ở 25 o C, chứa từng lượng 100 ml vào bình có dung tích phù hợp, hấp thanh trùng ở 121 ± 1 o C trong 15 phút. Trong trường hợp không có cloramphenicol, có thể thay bằng oxytetracylin (C 22 H 30 N 2 O 11 ) và được chuẩn bị như sau: Từ các lọ đã chứa 100 ml môi trường không có cloramphenicol, làm chảy môi trường và duy trì ở 45 ± 1 o C trong nồi chưng cách thuỷ. Chuẩn bị dung dịch 0,1% oxytetracyclin bằng cách hoà tan 0,1g oxytetracyclin hydroclorua trong 100 ml nước cất, lọc thanh trùng. Cho 10 ml dung dịch 0,1% oxytetracyclin vào 100 ml môi trường đã nóng chảy, lắc để trộn đều. 5. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu 5.1. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu theo TCVN 4325-86 5.2. Tạo huyền phù ban đầu và pha loãng mẫu theo TCVN 4881-89 (ISO 6887-1983) 6. Tiến hành xác định 6.1. Nuôi cấy 6.1.1. Lấy hai đĩa petri vô trùng, dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1ml dạng huyền phù ban đầu của mẫu (có độ pha loãng d = 10 -1 ). Lấy hai đĩa petri vô trùng khác, dùng pipet lấy dung dịch mẫu ở độ pha loãng d = 10 -2 . Tiến hành như trên với các độ pha loãng cao hơn (phụ thuộc vào mức độ nhiễm nấm mốc, nấm men dự kiến của mẫu để sao cho mỗi đĩa chỉ mọc dưới 150 khuẩn lạc), cần sử dụng pipet riêng cho mỗi độ pha loãng 6.1.2. Đổ khoảng 15 ml môi trường thạch YDC ở 45 ± 1 o C vào mỗi đĩa petri. Thời gian từ khi cho dung dịch mẫu vào đĩa đến khi đổ môi trường không được quá 15 phút. Trộn cẩn thận dịch cấy và môi trường, để môi trường đông lại. Đổ một đĩa để kiểm tra độ vô trùng của môi trường cũng bằng 15 ml môi trường thạch YDC với thao tác tương tự như trên nhưng không có dịch cấy. 6.1.3. Lật úp các đĩa đã chuẩn bị đặt vào tủ ấm đã duy trì ở 25 ± 1 o C trong 3, 4 và 5 ngày. 6.2. Đọc kết quả Đếm khuẩn lạc nấm men, nấm mốc sau 3, 4 và 5 ngày nuôi cấy, có thể sử dụng thiết bị đếm nếu cần và chỉ giữ lại để đếm các đĩa mọc ít hơn 150 khuẩn lạc. Đếm ở hai độ pha loãng liên tiếp mỗi độ pha loãng đếm 2 đĩa. Nếu sau 5 ngày, các khuẩn lạc phát triển mạnh bao trùm cả mặt đĩa gây khó đếm hoặc khó phân biệt thì có thể lấy các số đếm của ngày thứ 3 hoặc thứ 4 để tính kết quả và cần ghi rõ trong biên bản thử. Nếu cần có thể dùng phương pháp kiểm tra hiển vi để phân biệt các khuẩn lạc của nấm men, nấm mốc với các khuẩn lạc của vi khuẩn dựa theo hình thái của chúng. Trong trường hợp nghi có nấm gây bệnh ở phủ tạng của gia súc gia cầm, cần tiến hành các bước xác định tiếp theo quy định của thú y. Dựa vào phần mô tả hình thái ở phụ lục để nhận dạng sự có mặt các loại nấm sinh độc tố có trong mẫu. 7. Tính kết quả 7.1. Tổng số nấm men, nấm mốc trong 1 g mẫu (X) được tính theo công thức sau: Trong đó: S C - tổng số khuẩn lạc nấm men, nấm mốc đếm được trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp; n 1 - số đĩa ở độ pha loãng đầu (n 1 = 2); n 2 - số đĩa ở độ pha loãng kế tiếp (n 2 = 2); d- hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng đầu. Làm tròn kết quả tới hai số có nghĩa (chẳng hạn 28.640 làm tròn là 29.000) và biểu thị theo biểu thức: a x 10 n Trong đó: a - số thập phân tương ứng có giá trị từ 1,0 đến 9,9; n- số mũ phù hợp của 10. 7.2. Ví dụ về cách tính Số khuẩn lạc nấm men và nấm mốc đếm được ở 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp là: - ở độ pha loãng d = 10 -2 : đếm được 83 và 97 khuẩn lạc; - ở độ pha loãng d = 10 -3 : đếm được 33 và 28 khuẩn lạc ta có : 10.954 được làm tròn là 11.000 Kết quả: X = 11.000 = 1,1 x 10 4 nấm men và nấm mốc/g mẫu. 7.3. Nếu không có khuẩn lạc nấm men, nấm mốc nào trên đĩa nuôi cấy của dịch huyền phù ban đầu (d=10 -1 ) thì kết quả là: X < 10="" nấm="" men,="" nấm="" mốc/g=""> PHỤ LỤC A ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CHỦ YẾU CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC GIỐNG ASPERGILLUS 1. Loài Aspergillus niger - Khuẩn lạc phẳng, có màu đen như than, mặt trái không màu, gấp nếp hình nan quạt; - Cơ quan sinh sản: thể hình hai tầng, cuống bào tử dài 4-5 m m, bào tử dính, hình cầu khi trưởng thành, xù xì, không màu 2. Loài Aspergillus fumigatus - Khuẩn lạc phẳng, mịn như nhung, có màu xanh lục nhạt, sau chuyển đậm và hơi ngả xám trắng; - Cơ quan sinh sản: thể hình một tầng xếp song song, cuống bào tử dài khoảng 100 m m trơn, không màu. Bọng phình dạng cầu. Bào tử dính, to, có gai. 3. Loài Aspergillus nidulans - Khuẩn lạc phẳng, mịn như nhung, màu xanh lục đậm, mặt trái đỏ tím, sau đỏ thẫm; - Cơ quan sinh sản: thể bình hai tầng, xếp song song, cuống bào tử dài khoảng 60 m m, trơn, màu nâu. Bào tử dính, to, có gai