TCVN11220:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11220:2015 về Sữa bò tươi nguyên liệu - Xác định dư lượng sulfamethazine - Phương pháp sắc kí lỏng TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11220:2015 SỮA BÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG SULFAMETHAZINE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG Raw bovine milk - Determination of sulfamethazine residues - Liquid chromatographic method Lời nói đầu TCVN 11220:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 992.21 Sulfamethaz i ne Residues in Raw Bov i ne Milk. Liquid Chromatographic Method; TCVN 11220:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/P12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục T iê u chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. SỮA BÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG SULFAMETHAZINE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG Raw bovine milk - Determination of sulfamethazine residues - Liquid chromatographic method 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng để xác định hàm lượng sulfamethazine trong s ữ a b ò tươi nguyên liệu. Khoảng định lượng của phương pháp là từ 10 ng/ml đến 20 ng/ml. 2 Nguyên tắc Sulfamethazine trong các phần mẫu thử được chi ế t bằng cloro f orm. Cho bay hơi cloro f orm, phần còn lại được h ò a tan trong hexan và được chiết bằng dung dịch kali dihydro phosphat. Sulfamethazine được tách bằng sắc ký lỏng (LC), sử dụng cột C18 đã khử hoạt tính và được phát hiện bằng đo độ hấp thụ UV ở bước sóng 265 nm. 3 Thuốc thử Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử d ụng nước loại dùng cho phân tích sắc ký lỏng, trừ khi có quy định khác. 3.1 Chất chuẩn sulfamethazine (SMZ). 3.2 Dung dịch kali dihydro phosphat (KH 2 P O 4 ), 0,1 M Hòa tan 27,2 g kali dihydro phosphat (loại dùng cho LC) vào nước đựng trong b ì nh định mức 2 lít, thêm nước đến vạch, trộn và lọc qua bộ lọc N66. Bảo qu ả n ở nhiệt độ phòng. Loại b ỏ dung dịch sau khi chuẩn bị 3 tháng. 3.3 Dung môi 3.3.1 Metanol (loại dùng cho LC). 3.3.2 Hexan (loại dùng cho LC) 3.3.3 Cloro f orm, đ ã được chưng cất bằng dụng cụ thủy tinh. CẢNH BÁO: Sử dụng cloroform trong tủ hút có th ô ng gió. Tránh hít phải hoặc đ ể tiếp xúc v ớ i mắt, da v à áo quần. Cloroform có thể gây ung thư. 3.4 Dung dịch sắc ký lỏng 3.4.1 Pha động Pha loãng 600 ml metanol đã lọc qua bộ lọc N66 (4.8) đến 2 lít bằng dung dịch kali d ihydro phosphat (3.2) và trộn kỹ. B ả o quản pha động ở nhiệt độ phòng và loại bỏ dung dịch này sau 3 tháng chuẩn bị. 3.4.2 Dung dịch rửa Pha loãng 1 200 ml metanol (3.3.1) đến 2 lít bằng nước, trộn và lọc qua bộ lọc N66 (4.8). B ả o quản dung dịch rửa ở nhiệt độ phòng và loại b ỏ dung dịch này sau 3 tháng chuẩn bị. 3.5 Dung dịch chuẩn sulfamethazine 3.5.1 Dung dịch chuẩn g ố c Cân khoảng 100 mg chất chuẩn sulfamethazine (3.1) ở nhiệt độ phòng trong chén cân thủy tinh, chính xác đến 0,1 mg, chuy ể n định lượng sang bình định mức 100 ml (4.10), hòa tan trong metanol (3.3.1), thêm metanol đến vạch rồi trộn kỹ. 3.5.2 Dung dịch chuẩn trung gian, 10 000 ng/ml Dùng pipet 1,0 ml (4.6) chuyển 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc (3.5.1) vào b ì nh định mức 100 ml (4.10), th ê m nước đến vạch rồi trộn kỹ. 3.5.3 Dung dịch thêm chuẩn, 1 000 ng/ml Dùng pipet 10 ml (4.6) chuyển 10 ml dung d ịch chuẩn trung gian (3.5.2) vào bình định mức 100 ml (4.10), thêm nước đến vạch rồi trộn kỹ. 3.5.4 Dung dịch chuẩn, 200 ng/ml Pha loãng 20 ml d ung dịch thêm chuẩn (3.5.3) bằng nước đến 100 ml và trộn kỹ. 3.5.5 Dung dịch chuẩn, 100 ng/ml Pha loãng 10 ml dung dịch chuẩn 100 ppb (3.5.3) bằng nước đến 100 ml và trộn kỹ. 3.5.6 Dung d ịch chuẩn, 50 ng/ml Pha loãng 5 ml dung dịch chuẩn 100 ppb (3.5.3) bằng nước đến 100 ml và trộn kỹ. Bảo quản tất c ả các dung dịch chuẩn dưới 10 °C và loại b ỏ sau 3 tháng chuẩn bị. 4 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau: 4.1 Máy sắc ký lỏng (LC) Gồm bộ bơm mẫu, bộ phận gia nhiệt cột, detector UV /V is (cài đặt ở bước sóng 265 nm) và bộ tích phân Các điều kiện vận hành: - tốc độ pha động đẳng dò ng: - thể tích bơm: - thời gian chạy: - nhiệt độ cột: 1,5 ml/min; 100 μl 15 min với 1 min cân bằng giữa các lần chạy; 35,0 °C ± 0,2 °C 4.2 Cột sắc ký lỏng Kích thước 250 mm x 4,6 mm đường kính trong và cột bảo vệ kích thước 20 mm x 4,6 mm đường kính trong, cả hai cột octadecyldimethylsilyl (đã khử hoạt tính) pha đảo, đường kính lỗ 10 nm, cỡ hạt: 5 µ m, và bộ lọc tiền cột phân tán thấp 0,5 μm với đường kính 3 mm. 4.3 Bộ cô quay, cài đặt ở nhiệt độ 32 °C ± 2 °C. 4.4 Máy trộn vortex. 4.5 Ống nghiệm polypropylen , dung tích 50 ml. 4.6 Pipet, dung tích 1 ml, 10 ml và 100 μl. 4.7 Giấy lọc gấp nếp, đường kính 12,5 cm, giữ được cỡ hạt thô với tốc độ chảy nhanh. 4.8 Bộ lọc với màng lọc nylon, cỡ lỗ 0,4 μm (N66), ví dụ: bộ lọc Supelco, Inc., PA là thích hợp. 4.9 Bình quả lê, dung tích 100 ml, bằng thủy tinh có cổ hình côn chuẩn 24/40, có nắp. 4.10 Bình định mức, dung tích 100 ml, 2 lít. 4.11 Phễu, đường kính 75 mm. 4.12 Pipet Pasteur. 4.13 Phễu chiết, dung tích 125 ml, có nắp đậy bằng thủy tinh mài. 5 Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) [1] M ẫ u gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. M ẫ u không b ị hư hỏng hoặc thay đ ổ i trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. M ẫ u sữa được bảo quản lạn h ở nhiệt độ dưới 10 °C. Nếu mẫu chưa được phân tích ngay thì bảo quản đông lạnh ở - 40 °C trong các ống nghiệm polypropylen (4.5) v ớ i các lượng khoảng 50 ml. Trộn nhẹ mẫu sữa trước khi lấy mẫu đ ể phân tích. 6 Cách tiến hành 6.1 Chiết Đặt giấy lọc gấp nếp (4.7) vào phễu (4.11), dùng 5 ml cloroform (3.3.3) để rửa, sau đó loại bỏ cloroform. Đặt bình quả lê 100 ml (4.9) dưới phễu để hứng dịch chiết. Dùng pipet 10 ml (4.6) lấy 10 ml phần mẫu thử cho vào phễu chiết 125 ml (4.13) và thêm 50 ml cloroform (3.3.3), lắc mạnh hỗn hợp 1 min. Cẩ n thận m ở hé nắp. Lắc 1 min, mở hé nắp và đ ể tách pha trong 1 min. Lắc 1 min, mở hé nắp, lắc 1 min. Mở h é nắp và để yên cho tách pha trên 5 min. Tháo lớp cloro f orm, lọc vào b ì nh qu ả l ê (4.9). Tráng bộ lọc 2 lần, mỗi lần dùng 5 ml cloroform, thu lấy nước tráng rửa vào bình quả lê (4.9). Cho bay hơi dung d ịch cloroform trong bình quả lê vừa đến khô trên bộ cô quay (4.3) ở 32 °C ± 2 °C. Thêm 5 ml hexan (3.3.2) vào b ì nh, đậy nắp và hòa tan phần dư lượng bằng cách khuấy trộn mạnh trên máy vortex (4.4) k hoảng 1 min. Bổ sung ngay 1,0 m l dung dịch kali dihydro phosphat (3.2) vào bình, l ắ c mạnh trên máy vortex (4.4) 3 hoặc 4 lần với các khoảng thời gian 1 min trong ít nhất 15 min. Dùng pipet Pasteur (4.12) để lấy lớp nước ra, chuyển vào ống thủy tinh hoặc lọ bơm tự động để bơm. 6.2 Định lượng Dùng dung dịch rửa (3.4.2) để tráng bộ bơm mẫu tự động và để làm sạch hệ thống và cột LC. Cho chạy sắc ký ít nhất ở 3 mức dung dịch chuẩn (50, 100 và 200 ng/ml) và sử dụng phân tích hồi quy tuyến tính đường chuẩn để tính các nồng độ. Định lượng các mức của chất phân tích bằng cách đo chiều cao pic, P . Đường chuẩn c ầ n có hệ số tương quan bằng hoặc lớn hơn 0,98 (nếu nh ỏ hơn, lặp lại việc bơm các dung dịch chuẩn). Tính nồng độ chất theo hệ số làm giàu 10 lần (10 ml sữa được chiết v à o 1 ml dung dịch kali d ihydro phosphat cuối cùng) khi tính nồng độ su l famethazine trong mẫu ban đầu nghĩa là dịch chiết cuối cùng hoặc của chất chuẩn với nồng độ 100 ng/ml tương ứng với nồng độ sulfamethazine 10 ng/m l trong mẫu sữa. Thời gian l ưu của sulfamethazine thay đ ổ i the o thiết bị, cột, nhiệt độ cột và mẻ pha động, nhưng phải nằm trong khoảng 4,5 min đến 6 min. Tuy nhiên, với các bi ế n đổi ổn định thì thời gian lưu vẫn rất ổn định và thay đổi k hông qu á 15 s trong ng à y. Các phần mẫu thử với các chất chuẩn dùng để dựng đường chuẩn đồng thời để kiểm tra độ ổn định của thiết bị. CHÚ THÍCH: Đôi khi trong một số ph ầ n m ẫ u thử sữa , xuất hiện pic rộng được r ử a giải sau trong lần chạy tiếp theo. Sử dụng bộ lấy mẫu tự động với 1 min cân bằng, th ì pic này s ẽ không đồng rửa gi ả i với pic su l famethazine . Để tránh đ ồ ng rửa giải các pic nếu thực hiện các lần bơm thủ c ô ng cách nhau ngẫu nhiên th ì tăng thời gian chạy v à i phú t sao cho p i c rộng rửa giải trong d ung m ô i trước lần chạy ti ế p theo. P i c này không được nhận biết. 6.3 Tính kết quả Tính hàm lượng sulfamethazine c ó trong mẫu thử, X , bằng nanogam trên mililit theo công thức sau: Trong đó: P là chiều cao pic; b và m là điểm c ắ t và độ dốc tương ứng, từ phương trình hồi quy tuyến tính. 7 Báo cáo thử nghiệm B á o cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn và các chi tiết bất thường khác có ảnh hưởng tới kết quả; e) kết qu ả thử nghiệm thu được. PHỤ LỤC A (Tham khảo) Phép thử liên phòng thử nghiệm B ả ng A.1 đưa ra các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm về chấp nhận phư ơ ng pháp. Bảng A.1 - Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm Nồng độ mẫu thêm chu ẩ n Độ lệch chuẩn l ặp lại Độ lệch chuẩn tái lập Độ lệch chuẩn tương đối lặp l ại Độ lệch chuẩn tương đối tái l ậ p ng/ml sr s R RSD r , % RSD R , % 10 0,59 1,92 7 , 16 23,16 20 1,18 3,84 6,76 22,05 14,8 0,83 2,74 5,62 18,51 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu