TCVN9711:2013

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9711:2013 (EN 14352:2004) về Thực phẩm - Xác định fumonisin B1 và B2 trong thực phẩm từ ngô - Phương pháp HPLC có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9711:2013 EN 14352:2004 THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH FUMONISIN B 1 VÀ B 2 TRONG THỰC PHẨM TỪ NGÔ - PHƯƠNG PHÁP HPLC CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM Foodstuffs - Determination of fumonisin B 1 and B 2 in maize based foods - HPLC method with immunoaffinity column clean up Lời nói đầu TCVN 9711:2013 hoàn toàn tương đương với EN 14352:2004; TCVN 9711:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F1 Ngũ cốc và đậu đỗ biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH FUMONISIN B 1 VÀ B 2 TRONG THỰC PHẨM TỪ NGÔ - PHƯƠNG PHÁP HPLC CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM Foodstuffs - Determination of fumonisin B 1 and B 2 in maize based foods - HPLC method with immunoaffinity column clean up C Ả NH BÁO: Fumonisin là chất độc đối với gan, thận và là chất gây ung thư đối với các loài gặm nhấm và chuột. Ả nh hư ở ng lên người chưa đư ợ c biết đ ầ y đủ. Cần phải có các cảnh báo an toàn thích hợp đối với việc xử lý f umonisin. Nếu fumonisin bị rớt ra ngoài phải được rửa bằng dung dịch natri hypoclorit 5 %. Axetonitril l à chất độc nguy hiểm và mẫu cần được lắc bằng máy lắc tiến hành trong t ủ hút. Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể cần phải sử dụng các vật liệu, thiết bị và các thao tác nguy hi ể m. Tiêu chuẩn này không đề cập đến các vấn đề an toàn khi sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp x á c định hàm lượng f umonisin B 1 (FB 1 ) và f umonisin B 2 (FB 2 ) trong thực ph ẩ m từ ngô sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm, xem [1], [2], [3]. Phương pháp này đã được đánh giá thành công trong một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm theo Hướng dẫn của AOAC về các quy trình nghiên cứu cộng tác [4] để đánh giá xác nhận tính đặc thù của phương pháp phân tích đối với phép xác định f umonisin trong bột ngô và bánh ngô chứa từ 323 m g/kg đến 1414 m g/kg FB 1 và 90 m g/kg đến 558 m g/kg FB 2 . 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau l à rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng th í nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp th ử . 3. Nguyên tắc Fumonisin được chiết từ mẫu b ằ ng hỗn hợp nư ớ c, metanol và axetonitril. Dịch chiết sau khi lọc được làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm và f umonisin được rửa giải bằ ng metanol. Cho bay hơi dịch chiết, phần cặn được hòa tan lại trong hỗn hợp axetonitril và nước, bổ sung o-phthaldialdehyt-2-mercaptoetanol (OPA-MCE) để tạo thành dẫn xuất fumonisin huỳnh quang. D ẫ n xuất được phân tích b ằ ng sắc kí l ỏ ng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) sử dụng detector huỳnh quang. 4. Thuốc thử 4.1. Yêu cầu chung Trong quá trình phân tích, tất cả các thuốc thử được sử dụng phải thuộc loại tinh khiết phân tích và nước được sử dụng phải là nước c ấ t hoặc nước loại 1 trong TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác. Dung môi phải đạt chất lượng dùng cho phân tích HPLC. 4.2. Metano l . 4.3. Axetonitril. 4.4. Axit o-phosphoric , phần thể tích j (H 3 P O 4 ) = 85 %. 4.5. o-phthaldialdehyt (OPA). 4.6. 2-mercaptoetanol (MCE). 4.7. Dung dịch natri dihydro phosphat , nồng độ c (NaH 2 P O 4 .2H 2 O ) = 0,1 mol/l Hòa tan 15,6 g NaH 2 P O 4 .2H 2 O trong 1 l nước cất. 4.8. Dung dịch dinatri tetraborat , c (Na 2 B 4 O 7 .10H 2 O ) = 0,1 mol/l Hòa tan 3,8 g Na 2 B 4 O 7 .10H 2 O trong 100 ml nước cất. 4.9. Natri clorua (NaCI). 4.10. Dinatri hydro phosphat (Na 2 HPO 4 ). 4.11. Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ). 4.12. Kali clorua (KCI). 4.13. Axit clohydric (HCI), đậm đặc. 4.14. Dung môi chiết Trộn 25 phần thể tích axetonitril (4.3) với 25 phần thể tích metanol (4.2) và 50 phần thể tích nước. 4.15. Dung dịch axetonitril-nước, phần th ể tích j (CH 3 CN) = 50 % Trộn 50 phần thể tích axetonitril (4.3) với 50 phần thể tích nước. 4.16. Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) Hòa tan 8,0 g natri clorua (4.9), 1,2 g dinatri hydro phosphat (4.10), 0,2 g kali dihydro phosphat (4.11) và 0,2 g kali clorua (4.12) trong khoảng 990 ml nước. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric đậm đặc (4.13) và thêm nước đến 1 l. Có thể sử dụng viên muối đệm phosphat hoặc dung dịch muối đệm phosphat pha sẵn. 4.17. Cột ái lực miễn nhiễm (IAC) Cột ái lực miễn nhiễm phải chứa các kháng thể kháng f umonisin FB 1 và f umonisin FB 2 . Cột phải có tổng dung lượng không nhỏ hơn 5 m g fumonisin và phải có độ thu hồi không nhỏ hơn 90 % đối với FB 1 và FB 2 khi cho dung dịch chuẩn chứa 5 m g fumonisin trong hỗn hợp của metanol và PBS đi qua cột. Có thể sử dụng lên đến 10 phần thể tích metanol hoặc axetonitril trong hỗn hợp với PBS. Trước khi sử dụng, cột phải được làm ấm đến nhiệt độ phòng. 4.18. Pha động HPLC Trộn 77 phần thể tích metanol (4.2) với 23 phần thể tích dung dịch natri dihydro phosphat (4.7). Điều ch ỉ nh đến pH 3,35 bằng axit o-phosphoric (4.4). Lọc d ung dịch qua bộ lọc m à ng (5.14). Có thể phải điều chỉnh thành phần pha động để phù hợp với từng đặc t í nh của cột HPLC. 4.19. Thuốc th ử tạo dẫn xuất Hòa tan 40 mg OPA (4.5) trong 1 ml metanol (4.2) và pha loãng bằng 5 ml dung dịch dinatri tetraborat (4.8). Thêm 50 m l MCE (4.6) và trộn. Dung dịch đã pha ổn định đến một tuần ở nhiệt độ phòng ở nơi tối trong bình nhỏ tối màu có nắp. 4.20. Dung dịch gốc FB 1 và FB 2 Chuẩn bị dung dịch gốc FB 1 và dung dịch gốc FB 2 trong axetonitril-nước (4.15) ở nồng độ khối lượng 50 m g/ml đối với từng chất chuẩn. Bảo quản các dung dịch này ở nhiệt độ khoảng 4 °C. Các dung dịch gốc fumonisin ổn định ít nhất 6 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ khoảng 4 °C. 4.21. Dung dịch gốc fumonisin h ỗ n hợp Chuẩn bị dung dịch gốc hỗn hợp b ằn g cách dùng pipet lấy 1000 m l dung dịch gốc FB 1 và 500 m l dung dịch gốc FB 2 cho vào bình định mức dung tích 5 ml. Pha loãng đến vạch bằng dung dịch axetonitril- nư ớ c (4.15) và lắc mạnh để thu được dung dịch gốc hỗn hợp chứa 10 ng FB 1 / m l và 5 ng FB 2 / m l. Dung dịch này ổn định ở + 4 °C ít nhất 6 tháng. Có thể dùng các thể tíc h ít hơn để chuẩn bị dung dịch gốc fumonisin hỗn hợp. 4.22. Dung dịch chuẩn fumonisin hỗn hợp cho HPLC Chuẩn bị bốn dung dịch chuẩn hỗn hợp HPLC trong bốn bình định mức dung tích 5 ml theo Bảng 1. Pha loãng từng dung dịch chuẩn đến vạch (5 ml) bằng dung dịch axetonitril-nước (4.15) và trộn kỹ. Dung dịch này ổn định ở + 4 °C ít nhất 6 tháng. Có thể dùng các thể tích ít hơn để chu ẩ n bị dung dịch chuẩn fumonisin hỗn hợp. Bảng 1 - Chuẩn bị dung dịch chu ẩ n hỗn hợp dùng cho HPLC Dung d ị ch chuẩn h ỗ n hợp Th ể tích lấy từ dung dịch gốc hỗn hợp, m l Thể tích dung dịch axetonitril-nước cần bổ sung, m l Nồng độ fumonisin cuối cùng của dung dịch chuẩn hỗn hợp, ng/ m l FB 1 FB 2 1 50 4 950 0 , 10 0,050 2 125 4 875 0,25 0,125 3 500 4 500 1,00 0,500 4 1 000 4 000 2,00 1,000 5. Thiết bị, dụng cụ 5.1. Dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường Và cụ thể như sau: 5.2. Máy lắc tròn. 5.3. Bình ly tâm , d ung tích 250 ml, có nắp vặn. 5.4. Máy ly t â m , có thể tạo lực ly tâm lên đến 2 500 g. 5.5. Giấy lọc , có c ỡ lỗ 20 m m đến 25 m m. 5.6. Giấy lọc vi sợi thủy tinh , có cỡ lỗ 11 m m. 5.7. Bầu chứa , dung tích 25 ml có bộ nối đầu tip dùng cho cột ái lực miễn nhiễm (IAC). 5.8. Xyranh microlit hoặc micropipet chia vạch, 25 m l đến 1 000 m l. 5.9. Cân phòng thử nghiệm , có thể cân chính xác đến 0,01 g. 5.10. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg. 5.11. Bộ cấp chân không để điều tiết cột ái lực miễn nhiễm. 5.12. Máy trộn Vortex. 5.13. Bộ cô dung môi, có modul nhiệt hoặc tương đương. 5.14. Bộ lọc m à ng , dùng để lọc nước, có cỡ lỗ 0,45 m m. 5.15. Thiết bị HPLC , bao gồm: 5.15.1. Bơm HPLC , đẳng dòng, phù hợp với tốc độ dòng không đổi, ví dụ: 1 ml/min. 5.15.2. Hệ thống bơm , có thể phân phối th ể tích, ví dụ: 20 m l. 5.15.3. Cột tách pha đảo ph â n tích , ví dụ octyldecylsilan (ODS), đảm bảo độ phân giải đường nền của các pic fumonisin so với các pic khác, có các đặc tính sau: - được làm b ằ ng thép không gỉ; - dài 150 mm; - đường kính trong 4,6 mm; - pha tĩnh có cỡ hạt 5 m m; - cột bảo vệ pha đảo tương ứng phù hợp. Có thể sử dụng cột có đ ường kính khác. 5.15.4. Detector huỳnh quang, được gắn với cuvet dòng chảy v à cài đặt ở bước sóng 335 nm (k í ch thích) và 440 nm (phát xạ). Có th ể phát hiện được ít nhất 0,5 ng FB 1 và FB 2 (tín hiệu/nhiễu = 3). 5.15.5. Hệ thống phân tích dữ liệu. 6. Lấy mẫu M ẫ u gửi đến ph ò ng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư h ỏ ng hoặc bị biến đổi chất lượng trong suốt quá trình b ả o quản và vận chuyển. 7. Cách tiến hành 7.1. Chuẩn bị mẫu thử Nghiền mẫu cho qua sàng 1 mm và đồng nhất mẫu. 7.2. Chiết Cân 20 g mẫu thử, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình l y tâm 250 ml (5.3) và thêm 50 ml dung môi chiết (4.14). Đậy bình ly tâm và lắc trong 20 min bằng máy lắc tròn (5.2). Ly tâm bằng máy ly tâm (5.4) trong 10 min với gia tốc 2 500 g và lọc lớp trên qua giấy lọc (5.5), tránh để phần chất khô vào giấy lọc. Chiết lại phần chất khô còn lại bằng cách thêm 50 ml dung môi chiết vào bình ly t â m và lắc tiếp trong 20 min. Ly tâm 10 min với gia tốc 2500 g và lọc dịch chiết qua giấy lọc. Trộn hai dịch lọc chiết được và hút 10 ml dịch lọc vào bình 100 ml. Thêm 40 ml PBS (4.16) vào 10 ml dịch lọc và trộn kỹ. Lọc dịch chiết đã pha loãng qua màng lọc vi sợi (5.6) và thu l ấ y 10 ml dịch lọc (tương đương 0,4 g mẫu th ử ) sau đó làm sạch qua cột ái lực miễn nhiễm (4.17). 7.3. Làm sạch bằng ái lực miễn nhiễm Tháo nắp trên khỏi cột v à nối với bầu chứa (5.7). Tháo nắp dưới khỏi cột và nối với bộ cấp chân không (5.11). Dùng pipet hút 10 ml phần lỏng của mẫu chiết đã lọc cho vào bầu chứa. Để dịch lọc chảy qua cột từ 1 giọt đến 2 giọt mỗi giây và loại bỏ dịch qua cột. Rửa cột bằng 10 ml PBS (4.16) ở tốc độ 1 giọt đến 2 giọt mỗi giây cho đến khi không khí đi qua cột. Loại bỏ nước rửa và đặt bình 4 ml dưới cột. Rửa giải fumonisin bằng 1,5 ml metanol (4.2), ở tốc độ dòng không quá 1 giọt mỗi giây. Dùng bộ cô (5.13) cho bay hơi dịch rửa giải đến khô dưới dòng hơi nitơ ở nhiệt độ khoảng 60 °C hoặc nhỏ hơn. Giữ lại phần cặn đã khô ở nhiệt độ khoảng 4 °C cho đến khi tạo dẫn xuất và phân tích tr ê n HPLC. 7.4. Tạo dẫn xuất 7.4.1. Dung dịch hiệu chuẩn Chuyển 50 m l của mỗi dung dịch chu ẩ n f umonisin hỗn hợp (4.22) vào đáy của ống nghiệm nhỏ v à thêm 50 m l thuốc thử tạo dẫn xuất (4.19) ngay trước khi phân tích mỗi dung dịch chuẩn. Trộn đều dung dịch trong 30 s bằng máy trộn Vortex (5.12) và tiến hành tách b ằ ng HPLC (7.5.2) ở các thời điểm lặp lại trong vòng 3 min sau khi bổ sung thuốc th ử tạo dẫn xuất. Ngoài ra, có thể tiến hành dẫn xuất trong hệ thống tự động. Nồng độ fumonisin cuối cùng trong các dung dịch hiệu chu ẩ n được liệt k ê trong Bảng 2. Bảng 2 - Nồng độ cuối c ù ng của dung dịch hiệu chuẩn sau khi dẫn xuất Dung dịch hiệu chuẩn Nồng độ fumonisin cuối c ùn g trong dung dịch hiệu chu ẩ n (ng/ m l) FB 1 FB 2 1 0,050 0 , 025 2 0,125 0,063 3 0,500 0 , 250 4 1 , 000 0,500 7.4.2. Dung dịch mẫu thử Hòa tan phần cặn mẫu đã tinh sạch từ 7.3 trong 200 m l dung dịch axetonitril-nước (4.15). Chuyển 50 m l dịch chiết vào đáy của ống nghiệm nhỏ và thêm 50 m l thuốc th ử tạo dẫn xuất (4.19) ngay trước khi phân tích mỗi dung dịch chiết. Trộn đều dung dịch trong 30 s b ằ ng máy trộn Vortex (5.12) và tiến hành tách bằng HPLC (7.5.3) ở các thời điểm lặp lại trong vòng 3 min sau khi bổ sung thuốc thử tạo dẫn xuất. 7.5. HPLC 7.5.1. Các điều kiện vận hành HPLC Khi cột đáp ứng quy định trong 5.15.3 (kích thước 4,6 mm x 150 mm có cỡ lỗ 5 m m) và sử dụng pha động quy định trong 4.18, các thông số cài đặt như sau được cho l à thích hợp: - tốc độ dòng pha động (cột): 1,0 ml/min; - detector huỳnh quang, bước sóng phát xạ: 440 nm; - detector huỳnh quang, bước sóng kích thích: 335 nm; - thể tích bơm: 20 m l. 7.5.2. Đường chu ẩ n Chuẩn bị đường chu ẩ n đối với FB 1 và FB 2 trong mỗi ngày phân tích hoặc khi thay đổi các điều kiện sắc ký b ằ ng cách sử dụng dung dịch hiệu chuẩn fumonisin 1, 2, 3 và 4 theo Bảng 2. Bơm 20 m l của từng dung dịch hiệu chu ẩ n đã tạo dẫn xuất (7.4.1) vào hệ thống HPLC ở các thời điểm lặp lại trong vòng 3 min sau khi bổ sung thuốc thử tạo dẫn xuất (4.19). Hệ số biến thiên lặp lại của các lần bơm HPLC đối với FB 1 và FB 2 phải nhỏ hơn 5 % tính trên 10 lần bơm lặp lại dung dịch chu ẩ n hỗn hợp fumonisin số 3 đã tạo dẫn xuất (xem Bảng 1). 7.5.3. Dung dịch mẫu thử Bơm v í dụ 20 m l (nghĩa là 0,02 g mẫu thử) theo 7.4.2 vào hệ thống HPLC ở các thời điểm lặp lại trong vòng 3 min sau khi thêm thuốc thử tạo dẫn xuất (4.19). 7.5.4. Nhận biết Nhận biết fumonisin B 1 và fumonisin B 2 bằng cách so sánh thời gian lưu của từng mẫu với thời gian lưu của dung dịch chuẩn. Đôi khi có thể cần nhận biết pic fumonisin bằng cách bơm hỗn hợp dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn. 7.5.5. Xác định Tiến hành xác định bằng phương pháp ngoại chu ẩ n, tích phân diện tích pic hoặc xác định chiều cao pic và so sánh các kết quả với đường chuẩn. Đối với phép xác định này, cần chuẩn bị dung dịch có nồng độ trong dải tuyến tính đ ể thiết lập đường hồi quy tuyến tính của đường chuẩn. Bơm các lượng b ằ ng nhau của dung dịch mẫu thử v à dung dịch chuẩn để dựng đường chuẩn. Nếu pic fumonisin thu được với dung dịch mẫu thử vượt quá điểm cao nhất của đường chuẩn, thì pha lo ã ng dịch chiết mẫu bằng dung dịch axetonitril-nước (4.15) và lặp lại quá trình tạo dẫn xu ất và xác định bằng HPLC. CHÚ THÍCH 1 : Việc tuân thủ thời điểm lặp lại giữa các lần bổ sung thuốc thử tạo dẫn xu ấ t và giữa các lần bơm v à o hệ thống HPLC l à rất quan trọng do huỳnh quang của dẫn xu ấ t fumonisin giảm nhanh sau thời gian quá 3 min. CH Ú THÍCH 2 : Giới hạn phát hiện và định lượng thay đ ổ i đáng kể theo độ nhạy của d etector được sử dụng . Giới hạn định lượng 50 m g/kg đối với FB 1 và FB 2 có thể thu được với detector thông dụng nh ấ t, dựa trên tín hiệu/nhiễu bằng 6. CH Ú THÍCH 3 : Sắc đồ điển hình của mẫu bột ngô và bánh ngô bị nhiễm tự nhiên được nêu trong Phụ lục B. 8. Tính kết quả Ghi lại khối lượng của fumonisin ( m a ) tương ứng với sự phát huỳnh quang của dung dịch mẫu thử từ đường chuẩn, tính b ằ ng nanogam. Tính phần khối lượng của từng fumonisin trong mẫu, w i , bằng microgam trên kilogam, sử dụng Công thức (1): (1) Trong đó: m a là khối lượng của từng fumonisin trong dung dịch thử l ỏ ng được bơm v à o cột HPLC, tính bằng nanogam (ng); V t là thể tích của dung dịch được tạo dẫn xuất, tính b ằ ng microlit ( V t = 100 m l); D là hệ số pha loãng có thể cần sử dụng; W là khối lượng tương đương của mẫu được tạo dẫn xuất, tính bằng gam ( W = 0,1 g trong 50 m l dung dịch mẫu thử); V i là thể tích bơm, tính bằng microlit ( V i = 20 m l ). 9. Độ chụm 9.1. Yêu cầu chung Chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị được lấy từ các phép thử liên phòng thử nghiệm có thể không áp dụng để phân tích dải nồng độ và chất nền khác ngoài dải nồng độ và chất nền đã cho trong Phụ lục. 9.2. Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa kết quả thu được từ hai phép thử riêng rẽ, trên vật liệu thử giống hệt nhau do cùng một người tiến hành, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, trong trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại, r, không lớn hơn 5 % trong các trường hợp. Các giá trị đối với fumonisin B 1 trong bột ngô là: = 369 m g/kg r = 249 m g/kg = 646 m g/kg r = 381 m g/kg (mẫu thêm chuẩn) = 780 m g/kg r = 412 m g/kg = 1414 m g/kg r = 792 m g/kg Các giá trị đối với fumonisin B 2 trong bột ngô là: = 90 m g/kg r = 56 m g/kg = 203 m g/kg r = 148 m g/kg = 295 m g/kg r = 154 m g/kg (mẫu thêm chuẩn) = 558 m g/kg r = 350 m g/kg Các giá trị đối với fumonisin B 1 trong bánh ngô là: = 323 m g/kg r = 188 m g kg = 565 m g/kg r = 238 m g/kg = 922 m g/kg r = 238 m g/kg (mẫu thêm chu ẩ n) = 1046 m g/kg r = 325 m g /kg Các gi á trị đối với fumonisin B 2 trong bánh ngô là: = 128 m g/kg r = 78 m g/kg = 237 m g/kg r = 98 m g/kg = 392 m g/kg r = 84 m g/kg (mẫu thêm chuẩn) = 457 m g/kg r = 134 m g/kg 9.3. Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa kết quả thu được của phép thử riêng rẽ trên mẫu thử giống hệt nhau, trong hai phòng th ử nghiệm khác nhau, trong trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập, R , không lớn hơn 5 % trong các trường hợp. Các giá trị đối với fumonisin B 1 trong bột ngô là: = 369 m g/kg R = 291 m g/kg = 646 m g/kg R = 459 m g/kg (mẫu thêm chu ẩ n) = 780 m g /kg R = 557 m g/kg = 1414 m g/kg R = 868 m g/kg Các giá trị đối với fumonisin B 2 trong bột ngô là: = 90 m g/kg R = 56 m g/kg = 203 m g/kg R = 168 m g/kg = 295 m g/kg R = 188 m g/kg (mẫu thêm chu ẩ n) = 558 m g/kg R = 403 m g/kg Các giá trị đối với fumonisin B 1 trong bánh ngô là: = 323 m g/kg R = 288 m g/kg = 565 m g/kg R = 440 m g/kg = 922 m g/kg R = 762 m g/kg (mẫu thêm chuẩn) = 1046 m g/kg R = 804 m g/kg Các giá trị đối với fumonisin B 2 trong bánh ngô là: = 128 m g/kg R = 123 m g/kg = 237 m g/kg R = 182 m g/kg = 392 m g/kg R = 339 m g/kg (mẫu thêm chuẩn) = 457 m g/kg R = 333 m g/kg 10. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải gồm các dữ liệu sau: - mọi thông tin cần thiết để nhận biết về mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc của mẫu, tên mẫu); - viện dẫn tiêu chuẩn này; - ngày v à loại quy trình lấy mẫu (nếu biết); - ngày nhận mẫu; - ngày thử nghiệm; - kết quả thử và đơn vị biểu thị kết quả ; - độ lặp lại nếu được kiểm tra; - mọi điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm; - mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chu ẩ n này hoặc những điều được coi là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả. Phụ lục A (Tham khảo) Dữ liệu về độ chụm Các dữ liệu sau đ â y thu được từ một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm do Chương trình Tiêu chuẩn, Đo lượng v à Thử nghiệm của Cộng đồng châu Âu tổ chức theo Hướng dẫn của AOAC về quy trình nghiên cứu cộng tác để đánh giá xác nhận tính đặc thù của phương pháp phân tích [4]. Bảng A.1 - Dữ liệu về độ chụm đối với bột ngô Bột ngô F umonisin B 1 Fumonisin B 2 M ẫ u (nhiễm tự nhiên) Trắng Thêm chu ẩ n 800 m g/kg Nhiễm tự nhiên ở mức thấp Nhiễm tự nhiên ở mức trung bình Nhiễm tự nhiên ở mức cao Trắng Thêm chuẩn 400 m g/kg Nhiễm tự nhiên ở mức thấp Nhiễm tự nhiên ở mức trung b ìn h Nhiễm tự nhiên ở mức cao Năm tiến hành 2000 2000 Số phòng thử nghiệm 21 a 21 a Số phòng thử nghiệm giữ lại sau khi trừ ngoại lệ 21 21 21 20 21 21 21 17 21 21 Số ngoại lệ (phòng thử nghiệm) 0 0 0 1 0 0 0 4 0 0 Số kết quả chấp nhận được 42 42 42 40 42 42 42 34 42 42 Giá trị trung b ì nh ( m g/kg) 41 646 369 780 1414 7 295 90 203 558 Độ lệch chuẩn lặp lại ( s r ) , ( m g/kg) - b 136 89 147 283 - b 55 20 54 125 Độ lệch chu ẩ n tương đối lặp lại (RSD r ), (%) - b 21 , 1 24,2 18,8 20,0 - b 18,5 22,0 26,8 22,5 Giới hạn lặp lại r ( r = 2,8 x s r ) , ( m g/kg) - b 381 249 412 792 - b 154 56 148 350 Độ lệch chuẩn tái lập ( s R ) , ( m g/kg) - b 164 104 199 310 - b 67 20 60 144 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSD R ), (%) - b 25 , 7 28,2 25,5 21,9 - b 22,6 22,1 29,7 25,9 Giới hạn tái lập R ( R = 2 , 8 x s R ), ( m g/kg) - b 459 291 557 868 - b 188 56 168 403 Độ thu hồi, ( %) - b 75,6 - b - b - b - b 72 , 0 - b - b - b a 2 phòng thử nghiệm trong s ố 23 phòng tham gia bị loại do kết quả bị đánh giá là sai. b Không th ể áp dụng. Bảng A.2 - Dữ liệu độ chụm đối với bánh ngô Bột ngô F umonisin B 1 Fumonisin B 2 M ẫ u (nhiễm tự nhiên) Trắng Thêm chu ẩ n 800 m g/kg Nhiễm tự nhiên ở mức thấp Nhiễm tự nhiên ở mức trung bình Nhiễm tự nhiên ở mức cao Trắng Thêm chuẩn 400 m g/kg Nhiễm tự nhiên ở mức thấp Nhiễm tự nhiên ở mức trung b ìn h Nhiễm tự nhiên ở mức cao Năm tiến hành 2000 2000 Số phòng thử nghiệm 21 a 21 a Số phòng thử nghiệm giữ lại sau khi trừ ngoại lệ 21 20 20 21 21 21 20 21 21 21 Số ngoại lệ (phòng thử nghiệm) 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 Số kết quả chấp nhận được 42 40 40 42 42 42 40 42 42 42 Giá trị trung b ì nh ( m g/kg) 42 922 323 565 1046 4 392 128 237 457 Độ lệch chuẩn lặp lại ( s r ) , ( m g/kg) - b 85 67 85 116 - b 30 28 35 48 Độ lệch chu ẩ n tương đối lặp lại (RSD r ), (%) - b 9,2 20,6 15,0 11,1 - b 7 , 7 21,7 14,6 10,4 Giới hạn lặp lại r ( r = 2,8 x s r ) , ( m g/kg) - b 238 188 238 325 - b 84 78 98 134 Độ lệch chuẩn tái lập ( s R ) , ( m g/kg) - b 272 103 157 287 - b 121 44 65 119 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSD R ), (%) - b 29,5 31,8 27,8 27,4 - b 30,9 34,8 27 , 5 26,1 Giới hạn tái lập R ( R = 2 , 8 x s R ), ( m g/kg) - b 762 288 440 804 - b 339 123 182 333 Độ thu hồi, ( %) - b 110,0 - b - b - b - b 97,0 - b - b - b a 2 phòng thử nghiệm trong s ố 23 phòng tham gia , do kết quả bị đánh giá là sai. b Không th ể áp dụng. Phụ lục B (Tham khảo) Sắc đồ điển hình CHÚ D Ẫ N x Thời gian ( tính bằng phút) y Độ nhạy huỳnh quang (mV) Hình B.1 - Sắc đồ điển hình của bánh ngô bị nhiễm tự nhiên CHÚ D Ẫ N x Thời gian ( tính bằng phút) y Độ nhạy huỳnh quang (mV) Hình B.2 - Sắc đồ điển hình của bộ t ngô bị nhiễm tự nhiên Điều kiện vận hành: tạo dẫn xuất trước cột, 50 m l dịch chiết đã tinh sạch + 50 m l thuốc thử OPA; thể tích bơm: 20 m l (tương đương với 20 mg mẫu); cột Discovery ® C 18 1) (đường kính trong 150 x 4,6 mm); pha động đệm metanol-phosphat (77 + 23, phần thể tích, pH 3,35), tốc độ d ò ng 1 ml/min; detector huỳnh quang có bước sóng kích thích 335 nm và bước sóng phát xạ 440 nm. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Visconti A., Solfrizzo M., De Girolamo A., 2001., Determination of fumonisin B 1 and B 2 in co rn and corn flakes by high per f ormance liquid chromatography and immunoaffinity column-clean-up: collaborative study. Journal of AOAC International 84, p, 1828 - 1837. [2] Visconti A., Solfrizzo M., De Girolamo A., 2001., Determination of fumonisin at levels of interest for f uture EU Legislation: development of an analytical method and interlaboratory validation for maize flour and corn f lakes. EU Final Report (European Commission, DG Science, Research and Development, Brussels, Belgium), EUR 19451. [3] Solfrizzo M., De Girolamo A., Visconti A., 2001, Determination of fumonisin B 1 and B 2 in corn flackes by HPLC and immunoaff in ity clean up. Food Additives and Contaminants, 18, p. 227-235. [4] AOAC International 1995, AOAC Official Methods Program, Associate Referee's Manual on development Study, Revie w , and Approval Process. Part IV AOAC Guidelines for Collaborative Studies p. 23-51. 1) Discovery ® C 18 là v í dụ về sản ph ẩ m thích hợp có bán sẵn. Thông tin n à y đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng sản ph ẩ m này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.