TCVN8685-12:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-12:2014 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 12: Vắc xin nhược độc, đông khô phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS) TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8685-12:2014 QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 12: VẮC XIN NHƯỢC ĐỘC, ĐÔNG KHÔ PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRS) Vaccine testing procedure - Part 12: Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine, living Lời nói đầu TCVN 8685-12:2014 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 12: VẮC XIN NHƯỢC ĐỘC, ĐÔNG KHÔ PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRS) Vaccine testing procedure - Part 12: Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine, living 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định y ê u cầu kỹ thuật để kiểm nghiệm vắc xin nhược độc, đông khô phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau r ấ t cần thi ế t cho việc áp dụng tiêu chu ẩ n này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phiên b ả n được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phi ê n bản mới nh ấ t, bao gồm c ả các sửa đ ổ i, bổ sung (nếu có). TCVN 8684:2011: Vắ c xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết. 3. L ấ y mẫu sản phẩm và chuẩn b ị động vật th í nghiệm 3.1. L ấ y mẫu sản phẩm: L ấ y mẫu sản ph ẩ m theo quy định trong bảng như sau: S ố lượng mẫu vắc xin v à ch ế phẩm sinh học dạng đông khô cần l ấ y Quy cách đóng gói (liều) Số lượng mẫu l ấ y (sản ph ẩ m) Cho tới 100 Từ 7 đ ế n 10 Tr ê n 100 Từ 5 đến 7 3.2 . Chuẩn b ị động vật th í nghiệm 11 con lợn khỏe mạnh từ 3 đến 4 tuần tuổi, âm tính với kháng thể kháng vi rút hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản. 4. Cách tiến hành 4.1. K iể m tr a cảm quan Kiểm tra bằng mắt thường: vắc xin dạng bánh xốp, dễ tách khỏi thành lọ. 4.2. Ki ể m tra độ thu ầ n kh iế t: Theo TCVN 8684:2011. 4.2.1. Kiểm tra tạp nh iễ m vi khuẩn 4.2.2. Ki ể m tra tạp nh iễ m n ấ m mốc 4.3. Kiểm tra t í nh an toàn Tiêm bắp cho 3 con lợn mẫn cảm, khỏe mạnh, mỗi con 10 li ề u vắc xin ghi trên nh ã n. Theo d õ i lợn trong 21 ngày. Vắc xin được coi là đạt n ế u t ấ t cả lợn sống khỏe mạnh, không có phản ứng cục bộ, có thể có phản ứng sốt nh ẹ (tăng 0,5 ° C sau khi tiêm từ 3 đến 5 ngày). 4.4. Ki ểm tra hi ệ u lực 4.4.1. Phương pháp trọng tài 4.4.1.1. Gây mi ễ n d ị ch Tiêm cho 5 con lợn, mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nh ã n. 3 con lợn đối ch ứ ng không tiêm vắc xin. 28 ngày sau mũi tiêm cuối cùng, 5 con lợn được tiêm và 3 con lợn đối chứng được tiến hành l ấ y máu và công cường độc bằng ch ủ ng vi rút gây hội ch ứ ng rối loạn hô hấp và sinh sản được phân lập tại Việt Nam. Theo dõi 21 ngày sau công cư ờ ng độc. 4.4.1.2. Các ch ỉ ti ê u đánh giá hi ệ u lực 4.4.1.2.1. Đánh giá kết qu ả công cường độc - Lô miễn dịch: 100 % lợn sống khỏe mạnh, có thể có biểu hiện sốt nh ẹ , kém ăn, ch ả y nước mũi sau công cường độc khoảng 3 đến 5 ngày, sau đó tr ở lại bình thường. - Lô đối chứng: Lợn chết v ì hội chứng PRRS hoặc có triệu chứng, bệnh tích điển h ì nh của hội chứng PRRS. 4.4.1.2.2. Đánh giá hiệu giá kháng th ể hội chứng rối loạn h ô hấp và sinh sản bằng ph ả n ứng E LI SA L ấ y máu, thu huy ế t thanh tại các thời điểm 0 và 21 ngày sau công cường độc và đánh giá hàm lượng kháng thể bằng phản ứng ELISA. Kết quả: Đánh giá theo bộ kit được sử dụng. 4.4.1.2.3. Đánh giá hiệu g i á kháng th ể hội chứng r ố i loạn h ô hấp và sinh s ả n bằng phản ứng m iễ n dịch có gắn men tr ê n t ế bào 1 lớp (IPMA - Immunoperoxidase monolayer assay) Lấy máu, thu huyết thanh tại các thời điểm 0 và 21 ngày sau công cường độc và đánh giá hàm lượng kháng th ể bằng phản ứng IPMA Kết quả: Hiệu giá kháng th ể ³ 1/640 (tại thời điểm 21 ngày sau công cư ờ ng độc): Đạt bảo hộ. 4.4.1.3. Đánh giá kết quả Vắc xin được coi là đạt nếu đáp ứng được 3 chỉ ti ê u nêu tr ê n. 4.4.2. Phương pháp thay th ế (Phương pháp chuẩn độ) 4.4.2.1. Chuẩn b ị t ế bào MARC-145 trên đĩa 96 giếng T ế bào MARC-145 được trypsin hóa thành huyễn dịch có mật độ 5 x 10 3 t ế bào/ml. Cho 100 μl huyễn dịch t ế bào trên vào tất cả các gi ế ng. Đậy nắp, ủ t ế bào ở 37 ° C trong môi trường 5 % C O 2 , theo d õ i hàng ngày. Khi quan sát th ấ y t ế bào bám đáy trên 80 % th ì ti ế n hành chu ẩ n độ vi rút. 4.4.2.2. Chuẩn độ vi rút - Pha loãng vắc xin trong ống nghiệm theo cơ số 10 bằng môi trường nuôi c ấ y t ế bào từ 10 - 1 đến 10 -6 hoặc th ấ p hơn tùy theo cách bố tr í thí nghiệm (xem H ì nh 1). - Láy đĩa t ế bào MARC-145 đã nuôi, loại bỏ môi trường cũ. - Rửa t ế bào b ằ ng d ung dịch PBS (-), 200 μ l /giếng, sau đ ó loại bỏ dung dịch PBS (-). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B 10 -1 10 -1 10 -1 10 -1 10 -1 ĐCTB C 10 - 2 10 - 2 10 - 2 10 - 2 10 - 2 ĐCTB D 10 - 3 10 - 3 10 - 3 10 - 3 10 - 3 ĐCTB E 10 -4 10 -4 10 -4 10 -4 10 -4 ĐCTB F 10 - 5 10 - 5 10 - 5 10 - 5 10 - 5 ĐCTB G 10 - 6 10 - 6 10 - 6 10 - 6 10 - 6 ĐCTB H Hình A.1 - Sơ đồ bố trí phản ứng chuẩn độ vi rút trên tế bào - Hút 100 μl huyễn dịch vắc xin đã pha lo ã ng l ầ n lượt vào các gi ế ng tương ứng tr ê n đ ĩ a t ế bào (từ B1 đến G5), dãy đ ố i chứng t ế bào (từ B6 đến G6), cho 100 μl môi trường duy trì vào mỗi gi ế ng. - Ủ tế bào ở 37 ° C trong môi trường có 5 % C O 2 trong 30 min. - Rửa t ế bào bằng dung dịch PBS (-), 200 μl/gi ế ng, loại bỏ dung dịch PBS (-). - Cho 200 μl môi trường duy tr ì vào mỗi gi ế ng. - Nuôi t ế b à o ở 37 ° C trong môi trường có 5 % C O 2 , theo d õ i hàng ngày, trong 5 ngày. - Đọc kết quả: gi ế ng có bệnh tích t ế bào là dương tính. 4.4.2.3. Tính kết quả Theo công thức Spearman-Karber: λ . TCID 50 (0,1 m l ) = X + 1/2 - ( N x /n ) Trong đó: X l à logarit cơ số 10 của độ pha loãng vi rút có 100 % giếng xuất hiện bệnh tích tế b à o; N x là tổng số giếng có bệnh tích tế bào trong thí nghiệm; n l à số giếng của mỗi độ pha loãng; λ là độ pha loãng vi rút. 4.4.2.4. Đánh giá kết quả Vắc xin được coi là đạt n ế u mỗi li ề u vắc xin c ó í t nh ấ t 10 5 TC I D 5 0 . THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Chapter 2.8.7: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, OIE Terrestrial Manual 2010