QCVN01-161:2014/BNNPTNT

Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-161:2014/BNNPTNT về quy trình giám định bệnh thối loét cà chua Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al. là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam QCVN 01 - 161 : 2014/BNNPTNT QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH THỐI LOÉT CÀ CHUA CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL. LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM National technical regulation on Procedure for identification of tomato canker (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis e t al.) - Plant Quarantine pest of Vietnam Lời nói đầu QCVN 01 - 161 : 2014/BNNPTNT do Trung tâm giám định Kiểm dịch thực vật biên soạn, Cục Bảo vệ thực vật trình duyệt Bộ Nông nghiệp & PTNT ban hành tại Thông tư số 16/TT-BNNPTNT ngày 05 tháng 6 năm 2014. QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH THỐI LOÉT CÀ CHUA CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL. LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM National technical regulation on Procedure for identification of tomato canker (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis e t al.) - Plant Quarantine pest of Vietnam I. QUY ĐỊNH CHUNG 1.1. Phạm vi điều chỉnh Quy chuẩn này quy định quy trình giám định bệnh thối loét cà chua ( C l avibacter michiganensis subsp. m i chiganensis (Smith) Davis et al.) là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam 1.2. Đ ối tượng áp dụng Quy chuẩn này áp dụng đối với các tổ chức, cá nhân Việt Nam hoặc nước ngoài có hoạt động l iên quan đến lĩnh vực bảo vệ và kiểm dịch thực vật thực hiện giám định bệnh thối loét cà chua ( Clavibacter mich i ganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.) là dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) nhóm I thuộc Danh mục d ịch hại KDTV của Việt Nam. 1.3. Giải thích từ ngữ Trong quy chu ẩ n này, các từ ngữ dưới đây được hiểu như sau: 1.3.1. Dịch hại kiểm dịch thực vật (plant quarantine pest) Là loài d ịch hại có nguy cơ gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật trong một vùng mà ở đó loài sinh vật này chưa xuất hiện hoặc xuất hiện có phân b ố hẹp và phải được kiểm soát chính thức. 1.3.2. Thực vật (plant) Là cây và những bộ phận của cây còn sống, kể cả hạt giống và sinh chất có khả n ă ng làm giống. 1.3.3. Mẫu (sample) Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật hoặc tàn dư của sản phẩm thực vật được lấy ra theo một qui tắc nhấ t định. 1.3.8. Tiêu bản (specimen) Là mẫu vật điển hình tiêu biểu của d ịch hại được xử lý đ ể dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật và trưng b à y thành các bộ sưu tập. 1.3.9. Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme ( (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay - ELISA) hay (Enzyme Immuno Assay - EIA) Là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích. 1.3.10. Phản ứng chuỗi trùng hợp hoặc phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction - PCR) L à một kỹ thuật trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các s i nh vật sống II. QUY ĐỊNH KỸ THUẬT 2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu 2.1.1. Thu thập mẫu Đối với hàng xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 4731:89 1 "Kiểm dịch thực vật - phương pháp lấy mẫu", quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-21:2010/BNNPTNT 1 "Phương pháp kiểm tra củ, quả xuất nhập khẩu và quá cảnh", QCVN 01-23:2010/BNNPTNT 1 "Phương pháp kiểm tra các loại hạt xuất, nhập khẩu và quá cảnh", QCVN 01-22:2010/BNNPTNT 1 "Phương pháp kiểm tra cây xuất nhập khẩu và quá cảnh". Đ ố i với cây trồng ngoài đồng ruộng: Lấy mẫu theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-38/2010/BNNPTNT 1 về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng 2.1.2. Bảo quản mẫu Các bộ phận tươi c ó triệu chứng bệnh (cành, lá, thân, quả...) chứa trong các túi ni-lông có lỗ thông khí bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3-5 o C. Mẫu hạt được chứa trong các túi ni- l ông hoặc hộp nhựa kín và bảo quản ở nhiệt độ phòng. 2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất Máy ly tâm, máy lắc, tủ sấy, tủ định ôn, cân điện tử, máy ủ, máy rửa, bể ổ n nhiệt, hệ thống ELISA, PCR, máy điện di, hệ thống chụp ảnh, tủ lạnh và tủ âm sâu. Bộ dao, kim giải phẫu, panh, kéo, bộ micro pipet, túi ni-lông, bản ELISA Đèn cồn, đĩa petri, ống hút, lam, lamen, cốc đong, giấy parafilm. Na 2 C O 3 , NaHCO 3 , NaN 3 , NaCI, KC l , MgCI 2 .6H 2 O , HN(CH 2 CH 2 OH) 2 , MgSO 4 .7H 2 O , KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , Na 2 HPO 4 , Na O H, Cồn tuyệt đối, cồn 70% nước cất vô trùng, Tween 20, glycerol, ethylium bromide, agarose, cycloheximide. môi trường NGA (Nutrient Glucose Agar) hoặc YPGA (Yeast Peptone Glucose Agar). Kít PCR, kháng th ể 2.3. Phương pháp phát hiện và giám định bệnh 2.3.1. Phát hiện và thu thập m ẫ u bệnh Trên lá, vết bệnh ban đầu là những đ ố m màu xanh nhợt có dạng giọt dầu ở phần phiến lá giữa các gân lá. Các vết này nhanh ch ó ng khô đi tạo ra các vết chết hoại có màu trắng hoặc màu nâu (hình 1, phụ lục 1). Khi bệnh từ phiến lá xâm nhiễm vào hệ thống mạch dẫn một số lá chét ở một phía của lá kép bị héo rũ (hình 2, phụ lục 1). Trên thân cây, triệu chứng bệnh có thể là các sọc vàng, đôi khi thân bị nứt dọc theo các đ ố t thân (hình 3, phụ lục 1). Bó mạch của các cây nhiễm b ệ nh có màu vàng sậm hoặc nâu (hình 4, phụ lục 1). Trên quả, triệu chứng thường bắt đầu từ những đốm nhỏ hơi lồi lên, v ế t bệnh có viền hoặc quầng trắng. Các vết bệnh phát triển to ra và có màu nâu ở tâm vết bệnh tạo ra dạng "mắt chim" (hình 5, phụ lụ c 1). Trên hạt, bệnh không biểu hiện triệu chứng. 2.3.2. Phân lập v i khuẩn 2.3.2.1. Tách chiết vi khu ẩ n Tách chiết vi khuẩn từ mô cây ( lá, thân, quả): C ắt một đoạn mô cây đã được khử trùng bề mặt bằng cồn 70 o ngâm trong nước c ấ t vô trùng 30 phút hoặc nghiền nhỏ mô cây trong nước c ấ t vô trùng. Tách chiết vi khuẩn từ hạt: Lượng mẫu tối thiểu để tách chiết là 2.000 hạt (khoảng 7g). Hạt được cho vào bình tam giác có chứa 20ml dịch chiết hạt (phụ lục 2) và lắc mạnh bằng tay trong 20-30 giây. Sau đó, đưa bình tam giác có dịch chiết hạt lên máy lắc v à lắc trong 36-48 giờ với tốc độ 150 vòng/phút. 2.3.2.2. Phân lập vi khuẩn trên môi trường nhân tạo Trải đều 1ml dịch chiết thu được từ mô cây hoặc từ hạt trên môi trường bán đặc hiệu và nuôi cấy ở 26 o C trong 8 ng à y.Theo dõi sự xuất hiện của khuẩn lạc. Khuẩn l ạc của vi khuẩn C . michiganensis subsp. michiganensis có màu vàng sáng, ph ồ ng, có dạng tròn đôi khi có dạng bất định. Các khuẩn lạc điển h ì nh được cấy truyền trên môi trường NGA (Nutrient Glucose Agar) hoặc YPGA (Yeast Peptone Glucose Agar) 2.3.3. Giám định bằng phương pháp ELISA (chỉ áp dụng đối với mẫu quả, cây, vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường nhân tạo) 2.3.3.1. Chuẩn bị dịch mẫu Mẫu mô cây (qu ả , thân, lá): lấy một mẫu nhỏ mô cây (quả hoặc thân hoặc l á ) ngâm trong 1ml nước cất khoảng 15-20 phút. Sau đó nước chứa vi khu ẩ n được l y tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút thu tủa vi khuẩn. Hòa tan tủa vi khuẩn thu được trong 1ml dung dịch đệm chiết mẫu (phụ lục 2). Đối với vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường nhân tạo: Hòa tan một phần khuẩn lạc trong 1ml dung dịch đệm chiết mẫu. 2. 3.3.2. Quy trình giám định bằng phương pháp ELISA Nhỏ vào mỗi giếng ELISA 100 m l dịch mẫu đã chuẩn bị. Bọc bản giếng bằng túi ni-lông ủ ở 37 o C qua đêm (khoảng 4-6 giờ). Sau đó, nhỏ thêm vào mỗi g i ếng 200 m l dung dịch đệm c ố định mẫu (phụ lục 2). Bọc bản giếng bằng túi ni-lông ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa giếng bằng đệm rửa (phụ lục 2) ba lần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thấm. Thêm vào mỗi giếng 100 m l kháng thể . Bọc bản giếng bằng túi ni-lông ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa giếng bằng đệm rửa tám l ần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thấm. Thêm vào mỗi giếng 100 m l Enzym gắn. Bọc bản giếng bằng túi ni-lông ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa giếng bằng đệm rửa tám lần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thấm. Thêm vào mỗi giếng 10 0 m l đệm cơ chất (phụ lục 2). Ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Đọc kết quả bằng mắt thường hoặc bằng máy đọc ở bước sóng 405nm. 2.3.4. Giám định bằng phương pháp PCR 2.3.4.1 . Tách chiết DNA Tách chiết DNA từ vi khuẩn đã phân lập (xem mục 2.3.2.2): Dùng que c ấ y vi khuẩn lấy một khuẩn lạc trên môi trường cho vào ống eppendorf đã chứa 100 m l nước cất vô trùng khu ấ y đều để hòa tan khuẩn lạc. Tiếp theo để ố ng eppendorf ở nhiệt độ 95 o C trong 15 phút trong bể ổn nhiệt sau đó đặt ngay lên đá lạnh. Ly tâm dịch vi khuẩn trong 5-10 giây. Tách chiết DNA từ dịch vi khuẩn (xem mục 2.3.2.1): Cho 10 0 m l dịch chiết vi khuẩn vào ống eppendorf và để ở nhiệt độ 95 o C trong 15 phút trong bể ổn nhiệt sau đó đặt ngay lên đá lạnh. Tiếp theo, ly tâm dịch chiết trong 5-10 giây. 2.3.4.2. Quy trình giám định bằng PCR Đoạn mồi sử dụng PSA-4: 5'-TCA TTG GTC AAT TCT GTC TCC C -3' PSA-R: 5-TAC TGA GAT GTT TCA CTT CCC C -3' Chu trình nhiệt: 94 o C trong 2,5 phút 94 o C trong 30 giây Lặp lại 30 chu kì 63 o C trong 20 giây 72 o C trong 45 giây 72 o C trong 10 phút Đọc kết quả sản phẩm đ ược điện di bằng gel agarose 2% trong đệm TAE, nhuộm bản gel trong dung dịch ethydium bromide và quan sát dưới đèn UV. M ẫ u dương tính cho đoạn gen kích thước 270bp. III. THẨM ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO Sau khi khẳng định kết quả giám định bệnh thối loét cà chua Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al. là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (phụ lục 3). Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được bệnh thối loét cà chua ( Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.) phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để th ẩ m định. Tất cả các đơn vị thuộc hệ thống Bảo vệ và KDTV phải lưu giữ, quản lý và khai thác dữ liệu về kết quả điều tra, báo cáo và giám định bệnh thối loét cà chua là dịch hại kiểm dịch thực vật nh ó m I của Việt Nam. Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định hiện hành. IV. TỔ CHỨC THỰC HIỆN Cục Bảo vệ thực vật có trách nhiệm phổ biến; tổ chức, hướng dẫn và kiểm tra việc thực hiện Quy chuẩn này trong hệ thống tổ chức chuyên ngành Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật cũng như các tổ chức, cá nhân khác có liên quan; Các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan đến điều tra, thu thập mẫu, xử lý và bảo quản mẫu bệnh thối loét cà chua tại Việt Nam phải tuân theo quy định của quy chuẩn này cũng như các quy định của pháp luật có liên quan hiện hành. Phụ lục 1. Thông tin về dịch hại 1. Phân bố và ký chủ 1.1. Phân bố Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam Trên thế giới: Châu Á (Israel, Thổ Nhĩ Kì, Armenia, Azerbaijan, Trung Quốc, Ấ n Độ, Indonesia, Iran; Nhật Bản, Hàn Quốc, Syria) , Châu Phi (Nam Phi, Ai Cập, Kenya, Madagascar, Togo, Uganda, Zambia, Morocco, Tanzania; Tunisia; Zimbabwe) , Châu Mỹ (Canada, Hoa Kì, Uruguay, Costa Rica, Cuba, Dominica, Dominican Republic, Grenada; Guadeloupe, Panama; Argentina, Brazil bang Pernambuco, Sao Paulo, Colombia, Peru, Chile, E c u a dor) , Châu Âu (Pháp, Hy Lạp, Liên bang Nga, Thụy Sỹ, Cộng hòa Séc, Lithuania, Hà Lan, Belarus, Ba Lan, Romania, Tây Ba n Nha, Bulgaria, Cyprus, Đức, Hungary, Italy, Serbia, Slovenia, Ukraine, Liên bang Nam Tư...) và Châu Đại Dương (Australia, New Zealand). 1.2. K í chủ: Kí chủ chính là cây Cà chua Solanum lycopersicum , ngoài ra còn gây hại trên ớt ngọt Capsicum annuum kí chủ dại họ cà như Solanum douglasii , S. nigrum and S. triflorum (Bradbury, 1986) 2. Tên khoa học và vị trí phân loại - Tên tiếng Việt: Bệnh thối loét cà chua - Tên khoa học: Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al. - Tên khác: Corynebacterium michiganense pv. michiganense (Smith) Dye & Kemp Corynebacter i um michiganense (Smith) Jensen - Vị trí phân loại: Lớp: Actinobacteria. Bộ: Actinomycetales Họ: Microbacteriaceae Giống: Clavibacter C. michiganensis subsp. michiganensis là một vi khuẩn hảo khí, hình gậy cong, không di động, gram dương. 3. Triệu chứng bệnh th ố i loét cà chua. H ì nh 1: Triệu chứng trên lá của bệnh thối loét cà chua (Nguồn: CABI, 2012) Hình 2: Triệu chứng héo lá một bên của bệnh thối loét cà chua (Nguồn: CAB I , 2012) Hình 3: Triệu chứng v ỡ th ân của bệnh thối loét cà chua (Nguồn: CAB I , 2012) Hình 4: Triệu chứng trên bó mạch của bệnh thối loét cà chua (Nguồn: CAB I , 2012) H ình 5: Triệu chứng trên quả của bệnh thối loét cà chua (Nguồn: CABI, 2012) 4. Đặc điểm vi khu ẩ n gây bệnh thối loét cà chua C. michiganensis subsp. michiganensis là một vi khuẩn hảo khí, gram dương, h ì nh gậy cong, không di động. Vi khuẩn phát triển chậm trên môi trường nutrient gluco agar (NGA) hoặc yeast peptone glucose agar (YPGA), khuẩn lạc có màu vàng, tròn, sáng, mịn. Phụ lục 2. 1. Dịch chiết hạt Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 Nước cất pH : 4,26 g : 2,72 g : 1000ml : 7,0 Hòa tan các thành phần trên vào 1.000 ml nước cất khử trùng ở 121 o C trong 15 phút. Khử trùng Tween 20 riêng rẽ để nguội tới 60 o C. Thêm Tween 20 với nồng độ 0.02%. Thêm vào 200mg cycloheximide (1.0 m l dung dịch 200 mg/ml trong 70% ethanol) 2. Dung dịch đệm ch i ết mẫu N a 2 C O 3 NaHCO 3 NaN 3 : 1,59g : 2,93g : 0,2g Hòa tan các thành phần trên trong 1000ml nước cất, chỉnh pH 9,6 bảo quản ở 4 o C. 3. Dung dịch đệm rửa NaC l Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 KCI Tween-20 : 8,0g : 1,15g : 0,2g : 0,2g : 0,5 g Hòa tan các thành phần trên trong 1000ml nước cất, chỉnh pH 7,4 4. Dung dịch đệm cố định mẫu Na 2 HPO 4 KCI KH 2 PO 4 NaCl NaN 3 : 1,15g : 0,2g : 0,2g : 8,0g : 0,2g Hòa tan các thành phần trên trong 930ml nước cất, chỉnh pH 7,4 thêm nước cất cho đủ 1000ml. Trước khi dùng cho thêm 5g sữa khô không béo/lít đệm đã pha. 5. Dung dịch đệm cơ chất MgCI 2 .6H 2 O NaN 3 HN(CH 2 CH 2 OH) 2 : 0,1g : 0,2g : 97ml Hòa tan trong 800ml nước, chỉnh pH về 9,8. Thêm nước cất cho đủ 1000m l . b ả o quản ở 4 o C. Trước khi dùng thêm viên cơ ch ấ t để đạt nồng độ 1mg/ml. Phụ lục 3. ( quy định ) Mẫu phiếu kết quả giám định Cơ quan Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật ……………………………………….. CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc -------------- ……….. ngày …. tháng …. năm 20….. PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH Bệnh thối loét cà chua Clavibacter michiganensis subsp. mich i ganensis (Smith) Davis et a l . - là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam 1. Tên hàng hóa : 2. Nước xuất khẩu : 3. Xuất xứ : 4. Phương tiện vận chuyển : Khối lượng: 5. Địa điểm lấy mẫu : 6. Ngày lấy mẫu : 7. Người lấy mẫu : 8. Tình trạng mẫu : 9. Ký hiệu mẫu : 10. Số mẫu lưu : 11. Người giám định : 12. Phương pháp giám định: Theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01 - 161 : 2014/BNNPTNT về "Quy trình g i ám định bệnh thối loét cà chua Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et a l. là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam". 13. Kết quả giám định Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et a l . Lớp: Actinobacteria. Bộ: Actinomycetales Họ: Microbacteriaceae Giống: Clavibacter Là dịch hại kiểm dịch thực vật thuộc danh mục dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam. TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT (hoặc người giám định) (ký, ghi rõ họ và tên) THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ (ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu) 1 Trường hợp các văn bản viện dẫn trong quy chuẩn này sửa đổi, bổ sung hoặc thay thế thì thực hiện theo quy định của văn bản mới. A