TCVN9049:2012

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9049 : 2012 THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH CLOSTRIDIUM BOTULINUM VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH Foodstuffs – Determination of Clostridium botulinum and its toxins by microbiological method Lời nói đầu TCVN 9049:2012 được xây dựng dựa trên cơ sở AOAC 977.26 Clostridium botulinum and Its Toxins in Foods. Microbiological Method; TCVN 9049:2012 do Cục An toàn vệ sinh thực phẩm tổ chức biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH CLOSTRIDIUM BOTULINUM VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH Foodstuffs – Determination of Clostridium botulinum and its toxins by microbiological method 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định Clostridium botulinum và các độc tố của chúng trong thực phẩm bằng phương pháp vi sinh. 2. Nguyên tắc Dịch chiết từ thực phẩm chứa một liều tối thiểu gây chết (MLD) từ độc tố botulinum được tiêm vào phúc mạch chuột, con vật sẽ chết trong vòng 48 h sau khi có biểu hiện tuần tự các triệu chứng nhiễm độc botulinum. Kháng độc tố tương đồng sẽ bảo vệ chuột khỏi các triệu chứng đó, trong khi các kháng độc tố khác lại không, dựa vào đó để xác định typ huyết thanh. Các bào tử sống trong thực phẩm sẽ phát triển trong môi trường nuôi cấy thích hợp và sinh độc tố, các độc tố này được phát hiện và định typ. 3. Thuốc thử và môi trường Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 3.1. Canh thang từ thịt và từ gan, vô trùng 3.1.1 Canh thang gan Nghiền nhỏ 500 g gan bò tươi trong 800 ml nước. Đun đến sôi và để trong 1 h. Để nguội, chỉnh pH đến 7,0 và đun sôi trong 10 min. Lọc qua vải thưa, ép loại bỏ phần chất lỏng. Cho vào canh thang này 10 g pepton, 1 g dikali hydrophosphat (K 2 HPO 4 ) và 1 g tinh bột hòa tan. Chỉnh đến pH 7,0 và pha loãng bằng nước đến 1 lít. Lọc qua giấy thô. Canh thang này có thể bảo quản riêng rẽ trong tủ lạnh để sử dụng sau này, nếu cần. Phân phối vào các ống nghiệm kích thước 18 mm x 150 mm hoặc 20 mm x 150 mm, lượng gan với chiều cao từ 1 cm đến 2 cm và chất lỏng từ 10 ml đến 12 ml. Hấp áp lực 20 min ở 121 °C. 3.1.2. Canh thang thịt Có thể sử dụng canh thang có bán sẵn trên thị trường có thành phần sau: 454 g tim bò, 20 g pepton proteoza, 2g dextroza và 5 g natri clorua. Hòa 12,5 g môi trường này vào 100 ml nước lạnh. Trộn kỹ và để yên cho đến khi các hạt đã thấm kỹ nước (khoảng 15 min). Cách khác, thêm 1,25 g môi trường đặc vào các ống nghiệm, thêm 10 ml nước lạnh và trộn kỹ cho đến khi các hạt thấm ướt nước. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng phải là 7,2 ± 0,1. 3.2. Canh thang dịch chiết nấm men trypticaza-pepton-glucoza (TPGY) hoặc TPGY với trypsin (TPGYT) Chỉ sử dụng TPGYT để thay thế khi vi sinh vật nghi ngờ thuộc chủng của typ B, E, hoặc F không phân giải protein. Hòa tan 50 g trypticaza, 5g bacto-pepton, 20 g chất chiết nấm men, 4 g dextroza và 1 g natri thioglycollat trong 1 lít nước và phân phối với các lượng 15 ml vào các ống nghiệm đựng môi trường kích thước 20 mm x 150 mm hoặc các lượng 100 ml vào các chai đựng quy định. Hấp áp lực 10 min đối với ống nghiệm hoặc 15 min đối với chai đựng ở 121 °C. pH cuối cùng phải là 7,2 ± 0,1. Bảo quản trong tủ lạnh và loại bỏ nếu không được sử dụng trong vòng 2 tuần. Ngay trước sử dụng, đun sôi hoặc hấp để loại bỏ oxi và làm nguội nhanh, sau đó bằng cách vô trùng thêm 1,0 ml dung dịch trypsin cho mỗi 15 ml canh thang. Chuẩn bị dung dịch trypsin bằng cách hòa tan 1,5 g trypsin trong 100 ml nước. Khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 m m hoặc tương đương và để trong tủ lạnh. 3.3. Thạch lòng đỏ trứng-thịt-gan bê hoặc thạch lòng đỏ trứng kị khí 3.3.1. Thạch lòng đỏ trứng-thịt-gan bê (LVEY) Rửa sạch 2 hoặc 3 quả trứng bằng bàn chải cứng và làm ráo nước. Ngâm trứng trong dung dịch thủy ngân(II) clora (HgCl 2 ) 0,1 % (khối lượng/thể tích trong 1 h. Để ráo dung dịch thủy ngân(II) clorua và ngâm trứng trong etanol 70% khoảng 30 min. Lấy trứng ra, bằng cách vô trùng đập vỡ vỏ và loại bỏ lòng trắng. Dùng xyranh lấy lòng đỏ cho vào vật đựng vô trùng và thêm một lượng thể tích tương tự của dung dịch natri clorua 0,85 % (khối lượng/thể tích), trộn kỹ. Cứ 500 ml thạch gan-thịt bê khô đã khử trùng có bán sẵn trên thị trường ở 50 °C thì thêm 40 ml huyền phù lòng đỏ trứng-natri clorua. Trộn kỹ và đổ đĩa. Làm khô các đĩa này 2 ngày ở nhiệt độ phòng hoặc 24 h ở 35 °C. Loại bỏ các đĩa bị nhiễm bẩn và bảo quản các đĩa vô trùng này trong tủ lạnh. 3.3.2. Thạch trứng kị khí Hòa tan 5 g chất chiết nấm men, 5 g trypton, 20 g pepton proteoza, 5g natri clorua và 20 g thạch trong 1 lít nước. Chỉnh pH đến 7,0, phân phối các lượng 500 ml vào bình cầu 1 lít và hấp áp lực 20 min ở 121 °C. Cho 40 ml huyền phù lòng đỏ trứng-natri clorua đã chuẩn bị như trong 3.3.1 vào 500 ml thạch đã làm tan chảy đến khoảng từ 45 °C đến 50 °C. Trộn và đổ đĩa ngay. Làm khô đĩa và bảo quản như trong 3.3.1. 3.4. Dung dịch đệm gel-phosphat, pH 6,2. Hòa tan 2 g gelatin và 4 g dinatri hydrophosphat (Na 2 HPO 4 ) trong 1 lít nước có đun nóng nhẹ. Phân phối vào các chai 100 ml. Hấp áp lực 20 min ở 121 °C. 3.5. Các chế phẩm kháng độc tố Clostridium botulinum Các typ từ A đến F hoặc kháng thể đa dòng từ A-F. CHÚ THÍCH: Các chế phẩm sinh học có thể mua ở Biological Products Branch, Office of Scientific Services, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333, USA. 3.6. Dung dịch natri hydroxit , 1 M. 3.7. Dung dịch axit clohydric , 1 M. 3.8. Dung dịch trypsin bão hòa Hòa tan 1 g trypsin vào 10 ml nước trong ống nghiệm sạch. 3.9. Dung dịch natri clorua , 0,85 %. 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể các thiết bị, dụng cụ sau: 4.1. Dụng cụ mở hộp. 4.2. Bình kị khí 1) . 4.3. Đĩa Petri, đường kính 100 mm. Làm khô các đĩa thạch đã chuẩn bị khoảng 24 h ở 35 °C trước khi cấy. 4.4. Máy li tâm lạnh , tốc độ cao. 4.5. Xyranh, dung tích 1,0 ml hoặc 3,0 ml, có mũi kim 15,9 mm để tiêm chuột. 4.6. Pipet , vô trùng. 4.7. Bình định mức , dung tích 1 lít. 4.8. Bếp điện. 4.9. Ống nghiệm, kích thước 15 mm x150 mm và 20 mm x 150mm. 4.10. Cối và chày , vô trùng. 4.11. Kẹp , vô trùng. 4.12. Vòng cấy , vô trùng. 5. Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. 6. Cách tiến hành 6.1. Chuẩn bị mẫu thử 6.1.1. Kiểm tra sơ bộ Giữ các mẫu ở trạng thái đông lạnh. Đối với các loại thực phẩm đóng hộp chưa mở, trừ khi đã bị phồng và có nguy cơ bị nổ, thì không cần bảo quản lạnh. Ghi lại mã số và tình trạng của vật chứa. Làm sạch và nhận biết các vật chứa mẫu. 6.1.2. Thực phẩm dạng rắn Chuyển một cách vô trùng phần mẫu sang cối giã vô trùng. Thêm một lượng tương tự dung dịch đệm gel-phosphat (3.4) và nghiền bằng chày vô trùng (4.10). Cách khác, dùng kẹp vô trùng (4.11) cấy các miếng mẫu thử nhỏ trực tiếp vào canh thang tăng sinh. 6.1.3. Thực phẩm dạng lỏng Dùng pipet vô trùng (4.6) chuyển trực tiếp mẫu vào canh thang tăng sinh. 6.1.4. Thực phẩm đóng hộp Chuẩn bị, khử trùng bằng dung dịch cồn iốt và mở hộp. Việc mở hộp được thực hiện trong phòng vô trùng. Tháo bỏ nhãn hộp, kiểm tra hộp về khuyết tật bên ngoài và ghi lại. Rửa hộp bằng xà phòng hoặc bằng chất tẩy rửa và nước rồi dùng khăn giấy sạch để lau khô. Dùng ngọn lửa đốt phần hộp không có mã số cho đến khi bay hết hơi nước ngưng tụ rồi đặt lại vào vị trí cũ. Lau sạch dao mở hợp bằng khăn giấy thấm cồn 70 %. Dùng ngọn lửa đủ đế diệt hết vi sinh vật trên nắp hộp. Dùng dao cắt một lỗ có đường kính khoảng 4 cm ở mặt hộp vừa khử trùng xong. Nếu hộp bị phồng thì đặt hộp sao cho mép dọc của hộp không hướng về người thao tác. Nếu hộp có khóa mở thì làm lạnh trước khi mở và khi sử dụng ngọn lửa phải cẩn thận để tránh làm nổ hộp. 6.1.5. Kiểm tra cảm quan Ghi lại kết quả quan sát bên ngoài, mùi và bằng chứng về sự phân hủy, nếu có. CHÚ Ý: Không thử nếm sản phẩm. 6.1.6. Phần mẫu thử dự phòng Sau khi cấy xong, bằng cách vô trùng lấy phần mẫu thử cho vào bình vô trùng để dùng cho các phép thử tiếp theo, nếu cần. 6.2. Phát hiện C. botulinum sống 6.2.1. Tăng sinh Loại oxi hòa tan ra khỏi môi trường trước khi nuôi cấy bằng cách đun cách thủy các ống đựng canh thang từ 10 đến 15 min và làm nguội nhanh, không lắc ống. Cấy vào 2 ống nghiệm, cứ 15 ml canh thang thịt (3.1) thì lấy từ 1 g đến 2 g mẫu dạng rắn hoặc từ 1 ml đến 2 ml mẫu dạng lỏng hoặc dịch chiết, đưa chất cấy từ từ vào ngay dưới bề mặt canh thang. Ủ ở nhiệt độ 35 °C. Tương tự, cấy vào 2 ống nghiệm đựng canh thang TPGY (3.2) và ủ ở nhiệt độ 26 °C. 6.2.2. Kiểm tra Sau 5 ngày, kiểm tra các ống nghiệm đã cấy về độ đục, sinh khí, phân hủy của các hạt thịt và mùi. Ngoài ra, cần kiểm tra tiêu bản sau khi nhuộm Gram, tím tinh thể, hoặc xanh metylen bằng kính hiển vi có vật kính dầu. Quan sát hình thể của các vi sinh vật và ghi lại có mặt của các tế bào clostridia điển hình, kích thước và số lượng tương đối của các bào tử, vị trí của các bào tử trong các tế bào. 6.2.3. Xử lí tiếp theo Thông thường, sau 5 ngày nuôi cấy thì độc tố sẽ được sinh ra và có nồng độ cao nhất, cũng như sự hình thành bào tử. Giữ lại dịch cấy trong tủ lạnh để phân lập khuẩn lạc thuần khiết. Nếu sau 5 ngày không thấy phát triển thì ủ tiếp 10 ngày để phát hiện khả năng sinh bào tử chậm của C. botulinum trước khi loại bỏ dịch cấy. 6.3. Phân lập khuẩn lạc thuần khiết Nếu hình thành bào tử tốt thì C. botulinum dễ dàng phân lập hơn từ hệ vi sinh hỗn hợp trong môi trường tăng sinh hoặc từ mẫu gốc. 6.3.1. Xử lí sơ bộ Thêm một thể tích tương tự của cồn tuyệt đối đã lọc để khử trùng vào khoảng từ 1 ml đến 2 ml dịch cấy hoặc phần mẫu thử đựng trong ống nghiệm vô trùng có nắp vặn. Trộn kỹ và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 h. Cách khác, đun từ 1 ml đến 2 ml dịch cấy đã tăng sinh ở 80 °C trong khoảng từ 10 min đến 15 min để diệt các tế bào sinh dưỡng. Không xử lí nhiệt đối với typ C. botulinum không phân giải protein. 6.3.2. Ria cấy Dùng vòng cấy vô trùng (4.12) lấy một hoặc hai vòng đầy dịch cấy đã xử lý bằng cồn hoặc nhiệt, pha loãng nếu cần, ria cấy vào các đĩa thạch lòng đỏ trứng kị khí (3.3.2) hoặc thạch lòng đỏ trứng-thịt-gan bê (3.3.1) khô, sao cho thu được các khuẩn lạc phân lập tốt. Ủ các đĩa này trong bình kị khí (4.2) ở 35 °C trong khoảng 48 h. 6.3.3. Chọn khuẩn lạc Cách khuẩn lạc điển hình là các khuẩn lạc lồi hoặc dẹt, trơn hoặc nhám, thường mọc lan tỏa và có mép không đều. Trên môi trường thạch lòng đỏ trứng, các khuẩn lạc thường có bề mặt óng ánh khi được kiểm tra bằng ánh sáng xiên. Vùng óng ánh này giống như “lớp ngọc trai”. Vùng này thường mở rộng và đường viền của khuẩn lạc không đều. Ngoài vùng ngọc trai, các khuẩn lạc typ C, D và E thường được bao quanh bởi vùng kết tủa màu vàng đường kính từ 2 mm đến 4 mm. Các khuẩn lạc typ A và B thường cho thấy có vùng kết tủa bao quanh nhỏ hơn. Chỉ có một số loài Clostridium có các đặc tính hình thái điển hình nhưng không sinh độc tố. 6.3.4. Chủng cấy Dùng vòng cấy vô trùng (4.12), cấy 10 khuẩn lạc được chọn vào ống đựng môi trường vô trùng như sau: - canh thang TPGY (3.2) đối với C. botulinum typ E, ủ 5 ngày ở 26 °C; - canh thang thịt vô trùng (3.1) đối với các typ độc tố khác, ủ 5 ngày ở 35 °C. Sử dụng các chủng cấy này để khẳng định, phát hiện và nhận dạng độc tố. 6.3.5. Khẳng định Cấy ria dịch cấy thu được trong 6.3.3 lặp lại hai lần trên các đĩa thạch lòng đỏ trứng (3.3), ủ một đĩa trong bình kị khí và một đĩa trong bình hiếu khí ở 35 °C. Nếu tìm thấy các khuẩn lạc điển hình của C. botulinum trên đĩa kị khí và không thấy phát triển trên đĩa hiếu khí thì đó có thể là dịch cấy thuần chủng. Việc phân lập không đúng C. botulinum từ một trong các khuẩn lạc được chọn có thể cho thấy rằng số lượng vi khuẩn trong nuôi cấy tăng sinh là thấp. Việc lặp lại các bước tăng sinh (6.2.1) bổ sung có thể cho đủ số lượng để phân lập. Bảo quản chủng cấy thuần khiết 6.3.3 trong tủ lạnh trên các viên thủy tinh hoặc bảo quản bằng phương pháp đông khô. 6.4. Phát hiện độc tố 6.4.1. Chuẩn bị mẫu thử Chiết thực phẩm dạng rắn bằng một thể tích tương đương của dung dịch đệm gel-phosphat (3.4), nghiền nhỏ bằng cối và chày vô trùng (4.10). Li tâm chất chiết và thực phẩm dạng lỏng chứa các hạt chất rắn bằng máy li tâm lạnh (4.4). Lấy vài mililit dung dịch đệm gel-phosphat để tráng hộp đựng rỗng mà có thể chứa độc tố thực phẩm. Sử dụng một lượng nhỏ nhất để không làm loãng độc tố. 6.4.2. Xử lí bằng trypsin Nếu có mặt các typ độc tố không phân giải protein thì cần hoạt hóa trypsin để phát hiện. Không xử lý bằng trypsin với chất cấy TPGYT có chứa sẵn trypsin. Ngoài ra, việc xử lí này có thể làm giảm độc tố đã hoạt hóa có mặt trong chất cấy. Lấy phần chất lỏng nổi phía trên (6.4.1) của mẫu thực phẩm dạng lỏng hoặc dịch cấy trong canh thang thịt vô trùng. Chỉnh pH bằng dung dịch natri hydroxit 1 M (3.6) hoặc axit clohydric 1 M (3.7) đến khi pH đạt 6,2. Trộn 0,2 ml dung dịch trypsin bão hòa (3.8) với 1,8 ml chất lỏng cần thử nghiệm. Ủ ở 37 °C trong 1 h, thỉnh thoảng lắc ống. 6.4.3. Phép thử độc tính Tiến hành mỗi phép thử lặp lại hai lần, nghĩa là thực hiện trên các mẫu thử chưa xử lí và đã xử lí bằng trypsin. Pha loãng các phần chất lỏng nổi phía trên, thực phẩm lỏng hoặc dịch cấy chưa xử lí và đã xử lí với dung dịch đệm gel-phosphat theo các tỉ lệ tương ứng 1:2, 1:10 và 1:100. Dùng xyranh (4.5) tiêm vào phúc mạc các cặp chuột riêng rẽ có trọng lượng khoảng 15 g đến 20 g các dung dịch gốc và dung dịch đã pha loãng, đã xử lí và chưa xử lí. Đun nóng 1,5 ml dung dịch gốc chưa xử lí trong 10 min ở 100 °C để kiểm tra. Để nguội và tiêm vào hai chuột, mỗi con 0,5 ml dung dịch đã đun nóng. Các chuột này sẽ không chết vì độc tố botulinum, nếu có mặt, cũng bị bất hoạt khi xử lí nhiệt. Quan sát chuột sau 48 h, ghi lại các triệu chứng và thời gian chuột chết. Các triệu chứng điển hình của ngộ độc botulinum thường bắt đầu trong vòng 24 h, con vật xù lông sau đó khó thở, chân run và cuối cùng liệt toàn thân, thở gấp và chết do suy hô hấp. Chuột chết mà không có các triệu chứng ngộ độc botulinum là không đủ bằng chứng về dung dịch tiêm có chứa độc tố botulinum. Con vật chết có thể do các hóa chất có mặt trong chất lỏng hoặc do chấn thương. Nếu sau 48 h, tất cả chuột được tiêm đều chết thì lặp lại phép thử độc tính, sử dụng các dung dịch pha loãng hơn. Cần phải có các dung dịch pha loãng để giết chết vật thí nghiệm cũng như các dung dịch pha loãng không giết chết để thiết lập một điểm kết thúc hoặc liều gây chết tối thiểu (MLD) cũng như ước tính lượng độc tố có mặt. MLD có chứa trong dung dịch pha loãng nhất giết chết cả hai con chuột (hoặc tất cả) đã tiêm. Tính liều gây chết tối thiểu theo mililit. 6.5. Xác định typ của độc tố Pha loãng các kháng độc tố đơn dòng typ A, B, E và F trong dung dịch natri clorua 0,85 % (3.9) đến nồng độ 1 IU/0,5 ml. Chuẩn bị đủ kháng độc tố pha loãng để tiêm vào 2 chuột, mỗi con 0,5 ml đối với mỗi dung dịch pha loãng đã chuẩn bị để thử nghiệm. Sử dụng chế phẩm độc tố cho liều gây chết tối thiểu (MLD) cao nhất, kể cả đã xử lí hoặc chưa xử lí. Nếu chưa xử lí thì có thể chuẩn bị tương tự như trong phép thử về độc tính. Nếu dùng chế phẩm đã xử lí bằng trypsin mà gây chết nhiều nhất thì chuẩn bị dung dịch vừa mới được xử lí bằng trypsin, vì hoạt tính của trypsin có thể phá hủy độc tố. Chuẩn bị các dung dịch pha loãng bao trùm ít nhất dải liều gây chết 10 MLD, 100 MLD và 1000 MLD thấp hơn điểm kết thúc của độc tính đã xác định trước đó. Khoảng từ 30 min đến 60 min trước khi công cường độc bằng chế phẩm độc tố, tiêm vào phúc mạc một số nhóm chuột, mỗi con nhận được 0,5 ml của một trong các kháng độc tố pha loãng. Tiêm mỗi độ pha loãng của chế phẩm độc tố vào phúc mạc các đôi chuột được tiêm phòng sau khi tiêm kháng độc tố đơn dòng. Đồng thời tiêm cho một đôi chuột chưa được phòng (chưa tiêm kháng độc tố) mỗi dung dịch độc tố làm đối chứng. Quy trình này cần đến 30 chuột, 3 cặp dùng cho một trong 4 loại kháng độc tố đơn dòng [A, B, E và F], mỗi cặp nhận được liều cường độc của một trong ba dung dịch pha loãng của chế phẩm độc tố [2 x 3 x 4 = 24] cộng với một cặp chưa tiêm phòng dùng cho mỗi dung dịch pha loãng của độc tố để làm đối chứng [2 x 3 = 6]. Quan sát chuột trong 48 h về các triệu chứng nhiễm độc và ghi lại thời gian chết. Nếu kết quả cho thấy chất độc bị trung hòa thì lặp lại phép thử, sử dụng các kháng độc tố đơn dòng typ C và typ D, cộng với nhóm kháng độc tố đa dòng typ A đến typ F. 7. Diễn giải kết quả Độc tố trong thực phẩm, nghĩa là khi dùng thực phẩm không được xử lí nhiệt kỹ có thể gây ngộ độc botulinum. Khi có mặt độc tố trong thực phẩm cần nghĩ ngay đến độc tố của botulinum. Vi khuẩn C. botulinum sống, nhưng chưa hẳn đã là độc tố, khi phát hiện có C. botulinum trong thực phẩm thì đó cũng chưa đủ bằng chứng về ngộ độc thực phẩm. Các sinh vật ăn phải độc tố có thể tìm thấy được trong đường tiêu hóa, nhưng độc tố thì không thể sinh sôi và phát triển trong cơ thể. Sự có mặt độc tố botulinum và/hoặc các vi sinh vật trong đồ hộp có môi trường axit thấp (pH > 4,6) thì đó là bằng chứng về sản phẩm chưa được chế biến kỹ hoặc bị nhiễm bẩn do sự rò rỉ sau chế biến. Các hộp bị phồng có nhiều khả năng hơn so với hộp phẳng về việc nhiễm độc tố botulinum bởi vì vi khuẩn sinh khí trong quá trình phát triển. Sự có mặt của độc tố trong hộp phẳng có thể có thể do mí ghép của hộp bị hở nên khí thoát được ra ngoài. Độc tố trong thực phẩm đóng hộp thường là typ A hoặc typ B phân giải protein, vì các bào tử phân giải protein có thể là các bào tử của vi khuẩn chịu nhiệt. Các bào tử không phân giải protein typ B, E, và F thường ít chịu nhiệt hơn và thường không sống được ngay cả khi xử lí ở nhiệt độ thấp. Nếu chuột được bảo vệ trước độc tố botulinum và chết bởi một trong số các kháng độc tố botulinum đơn dòng thì khẳng định sự có mặt của độc tố botulinum và xác định typ huyết thanh của độc tố trong mẫu thử. Nếu chuột không được bảo vệ bằng một trong các kháng độc tố đơn dòng thì có thể có nhiều độc tố botulinum trong mẫu thử, có thể có một vài typ độc tố có mặt, hoặc chuột bị chết có thể do một vài nguyên nhân khác. Khi đó, cần thử nghiệm lại ở các nồng độ pha loãng hơn của dung dịch kiểm tra và cần sử dụng các hỗn hợp kháng độc tố thay cho kháng huyết thanh đơn dòng. Nếu chuột vẫn không được bảo vệ thì có thể do một số chất độc khác không bền nhiệt, nếu cả chất lỏng đã xử lí nhiệt và chất lỏng chưa xử lí nhiệt đều gây chết. Điều này cũng có thể là có một chất độc chịu nhiệt khác có thể che lấp độ tố botulinum. 8. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) tất cả các thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp lấy mẫu được sử dụng; c) ngày và thời gian lấy mẫu (nếu biết); d) ngày nhận mẫu; e) ngày thử nghiệm; f) kết quả và đơn vị biểu thị kết quả; g) các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm; h) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn mà có thể ảnh hưởng đến kết quả. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] AOAC 972.44 Microbiological Method . [2] J.AOAC 60, 541(1977). [3] J.AOAC 73, 166(1990). 1) Có thể sử dụng sản phẩm GasPak (Becton Dickinson Microbiology Systems, 7 Lovton Circle, Sparks, MD 21152, USA, No. 219511) hoặc tương đương. Thông tin này tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng sản phẩm nêu trên.