TCVN8127:2009

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8127:2009 (ISO 10273 : 2003) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Yersinia enterocolitica gây bệnh giả định TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8127 : 2009 ISO 10273 : 2003 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN YERSINIA ENTEROCOLITICA GÂY BỆNH GIẢ ĐỊNH Microbiology of food and animal f eeding stuff s - Horizontal method for the detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica Lời nói đầu TCVN 8127 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 10723 : 2003; TCVN 8127 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/P13 Phương pháp phân t í ch và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN YERSINIA ENTEROCOLITICA GÂY BỆNH GIẢ ĐỊNH Microbiology of food and animal f eeding stuff s - Horizontal method for the detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica CẢNH BÁO - Khi áp dụng ti ê u chuẩn này có thể cần phải sử dụng các vật liệu, thiết bị và các thao tác nguy hi ể m. Người sử dụng ti ê u chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn th í ch h ợ p và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện Yersinia enterocolitica được giả định là gây bệ nh cho con người. Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho: - các sản ph ẩ m thực ph ẩ m và thức ăn chăn nuôi, và; - các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và ch ế biến thực ph ẩ m. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chu ẩ n này. Đối với các tài liệu viện d ẫ n ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 6263 (ISO 8261), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn chung về chuẩn bị mẫu th ử , huy ề n ph ù ban đầu và dung dịch pha lo ã ng thập phân để kiểm tra vi sinh vật . TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong th ự c phẩm và thức ăn chăn nuôi - Nguyên tắc chung v ề kiểm tra vi sinh vật . TCVN 6507 (ISO 6887) (t ấ t c ả các phần), Vi sinh vật trong th ự c phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật. TCVN 8128-1 : 2009 (ISO 11133-1 : 2009), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị và sản xuất môi trường nuôi cấy - Phần 1: Hướng dẫn chung v ề đảm bảo chất lượng đối với việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong phòng thử nghiệm. 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chu ẩ n này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 3.1 . Yersinia enterocolitica gây bệnh giả định (Presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica ) Vi khu ẩ n ưa lạnh tạo thành các khu ẩ n lạc đặc trưng trên môi trường đặc chọn lọc và có các đặc tính hóa sinh thỏa mãn các tiêu chí về tính gây bệnh như đ ã mô tả, khi tiến hành thử theo tiêu chu ẩ n này. 3.2 . Phát hi ệ n Yersinia enterocolitica gây bệnh giả định (Detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica ) Xác định sự có mặt hay không có mặt các vi khuẩn trong một lượng xác định của sản phẩm, khi tiến hành thử theo tiêu chuẩn này. 4. Nguyên tắc 4.1. Yêu c ầ u chung Yersinia enterocolitica gây bệnh giả định được phát hiện bằng ba giai đoạn liên ti ế p sau. 4.2. Tăng sinh trong m ô i tr ườ ng lỏng chọn lọc Phần mẫu thử được cấy vào hai môi trường tăng sinh: - canh thang pepton, sorbitol và muối mật (PSB), và; - canh thang irgasan™, ticarcilin và kal i clorat (ITC). Canh thang ITC được ủ ở 25 ° C trong 48 h và canh thang PSB được ủ ở nhiệt độ này từ 3 ngày đến 5 ngày. CHÚ TH Í CH 1 Việc t ă ng sinh trong canh thang ITC được khuyến nghị (xem [1]) đ ể ph â n lập Yersinia enterocolitica biovar 4/serovar O :3 nhưng không dùng cho biovar 1B serovar O :8, biovar 2/serovar O :9 (xem [2]). hoặc biovar 2/serovar O :5,27. Việc phân lập Yersinia enterocolitica biovar 2/serovar O :9 cần sử dụng môi trường ITC không có clorat và có ch ứ a 80 % n ồ ng độ gốc của magie clorua v à xanh malachit (xem [3 ] ). 4.3. Cấy đĩa và nhận dạng Từ dịch c ấ y thu được trong 4.2, cấy l ê n b ề mặt đ ĩ a của hai môi trường đặc chọn lọc: - thạch có ce f sulodin, irgasan™ và novobioxin (CIN) (xem [7]); - thạch Salmonella/Shigella , có natri desoxycolat và canxi clorua (SSDC). Môi trường này được ủ ở 30 ° C rồi kiểm tra sau 24 h và nếu c ầ n th ì kiểm tra sau 48 h, tùy thuộc v ào môi trường, để kiểm tra sự có mặt hay không có mặt khuẩn lạc đặc trưng của Yersinia enterocolitica 4.4. Khẳng đ ị nh Kiểm tra Yersinia enterocolitica giả định trên các khuẩn lạc trên đ ĩ a và tiếp theo bằng các phép th ử khẳng định, các phép thử biotyp, các phép thử để thiết lập các tiêu ch í gây bệnh và các phép thử huy ết thanh học có thể. 5. Thuốc thử và môi trường nuôi cấy V ề thực hành trong phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6404 (ISO 7218). Xem TCVN 8128-1 : 2009 (ISO/TS 11133-1 : 2009) về các yêu cầu cụ thể về đảm bảo ch ấ t lượng và hiệu năng của môi trường. CHÚ TH Í CH TCVN 8128-2 : 2009 (ISO 11133-2 : 2003) đưa ra các hướng dẫn thực hành về th ử nghiệm hiệu năng của môi tr ường nuôi c ấ y. Do trong tiêu chu ẩ n sử dụng một lượng lớn môi trường nuôi c ấ y và thuốc thử, để cho nội dung tiêu chu ẩ n được gọn nên các thành phần của thuốc thử được đưa riêng vào trong Phụ lục B, trong đó bao g ồ m các chi ti ế t về cách phân phối, bảo quản v.v... 5.1. Môi trường t ă ng sinh 5.1.1. Canh thang pepton, sorbitol v à mu ố i mật (PSB) Xem B.1. 5.1.2. Canh thang irgasan™, ticarcilin và kali clorat (ITC) Xem B 2. 5.2. M ô i tr ườ ng đổ đĩa 5.2.1. Thạch ce f sulodin, irgasan™ và novobioxin (CIN) (xem [7]) Xem B.3. 5.2.2. Thạch Salmonella/Shigella , có natri desoxycolat v à canxi clorua (SSDC) Xem B.4. 5.2.3. Thạch dinh d ưỡ ng Xem B.5. 5.3. M ô i tr ườ ng nhận dạng và thu ố c thử 5.3.1. M ô i tr ườ ng ure indol Xem B.6. 5.3.2. Thuốc thử phát hi ệ n indol Xem B.7. 5.3.3. Thạch Kligler Xem B . 8. 5.3.4. Thu ố c th ử phát hiện oxidaza Xem B.9. 5.3.5. Môi trường đã khử nhóm carboxyl 5.3.5.1. Môi trường lyz i n đ ã khử nhóm carboxyl Xem B.10. 5.3.5.2. M ô i trường ornithin đã khử nhóm carboxyl Xem B.11. 5.3.6. M ô i tr ườ ng l ê n men cacbohydrat (sacaroza, rhamoza, trehaloza và xyloza) Xem B.12. 5.3.7. Môi trường simmon xitrat Xem B.13. 5.3.8. M ô i trường tween™-esteraza Xem B.14. 5.3.9. Thạch mật và aesculin Xem B.15. 5.3.10. Thạch casein đ ậu tương Xem B.16. 5.3.11. Thạch casein đậu t ươ n g, đ ể phát hiện pyrazinamidaza X em B.17. 5.3.12. Dung d ị ch amoni sắt (II) su lf at , đ ể phát hiện pyrazinam i daza Xem B.18. 5.3.13. Thạch casein đậu tương , có magie và oxalat Xem B.19. 5.4. Dung dịch muối Xem B.20. 5.5. Kali hydroxit trong dung dịch muối Xem B.21. 5.6. Canh thang thịt b ê Xem B.22. 5.7. Glyxerol vô trùng Xem B.23. 6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Có thể dùng dụng cụ sử dụng một lần thay thế cho dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần, nếu có các quy định thích hợp. Sử dụng các thi ế t bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau: 6.1. Thi ế t b ị để khử trùng khô (tủ s ấ y) hoặc thi ế t bị đ ể khử tr ùng ướt (n ồ i h ấ p áp lực) Xem TCVN 6404 (ISO 7218). 6.2. Tủ ấ m , có thể duy tr ì nhiệt độ từ 22 ° C ± 1 ° C , 25 ° C ± 1 ° C , 30 ° C ± 1 ° C và 37 ° C ± 1 ° C . 6.3. Tủ s ấ y hoặc lò s ấ y , có đối lưu không khí, duy trì được nhiệt độ từ 37 ° C ± 1 ° C đến 50 ° C ± 1 ° C . 6.4. Nồi cách th ủy hoặc tủ ấ m , có th ể duy tr ì nhiệt độ ở 22 ° C ± 1 ° C , 24 ° C ± 2 ° C và 25 ° C ± 1 ° C , tốt nh ấ t là có bộ phận khu ấ y trộn thích hợp. 6.5. Nồi cách th ủy , có thể duy tr ì nhiệt độ ở 44 ° C đến 47 ° C . 6.6. Ố ng nghi ệ m , có kích thước 18 mm x 180 mm, 9 mm x 180 mm v à 12 mm x 50 mm. 6.7. Chai và/hoặc bình c ầ u , có dung tích thích hợp. 6.8. Đĩa Petri , bằng thủy tinh hoặc b ằ ng ch ấ t dẻo, có đường kính từ 90 mm đ ế n 100 mm. 6.9. Pipet xả h ế t , có dung tích danh định 1 ml và 10 ml, miệng rộng và được chia vạch tương ứng 0,1 ml. 6.10. Núm cao su , hoặc các hệ thống hút an to à n khác dùng cho vi sinh vật. 6.11. Que cấy vòng , có đường k í nh khoảng 3 mm, que cấy thẳng bằng hợp chất platin/iridi và/hoặc niken/crom, đũa th ủy tinh và p i pet Pasteur . Có thể sử dụng que c ấ y vòng bằng ch ấ t dẻo vô trùng hoặc que cấy th ẳ ng . Niken crom không thích hợp cho phép thử phát hiện oxidaza (xem 9.4.3.5). 6.12. Máy đo pH , có thể đo chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 ° C . 6.13. Đèn chi ế u , thích hợp cho việc rọi xiên. 6.14. Kính hiển vi lập t h ể hoặc k í nh lúp. 6.15. Bộ trộn nhu động. 7. Lấy mẫu Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản. Khuyến cáo không nên làm đông lạnh mẫu trước khi phân tích, cho dù Yersinia spp có thể phục h ồ i được từ các sản phẩm đông lạnh. Việc l ấ y mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nếu không có tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu s ả n phẩm có liên quan thì các bên tự thỏa thuận v ề v ấ n đ ề này. 8. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể đối với sản ph ẩ m có liên quan. Nếu không có tiêu chu ẩ n cụ thể đó th ì các bên tự thỏa thuận v ề vấn đề này. 9. Cách tiến hành (xem Phụ lục A) 9.1. Ph ầ n mẫu th ử và huyền phù ban đ ầ u 9.1.1. Xem phần có liên quan của TCVN 6507 (ISO 6887) hoặc TCVN 6263 (ISO 8261) , hoặc ti ê u chuẩn thích hợp đối với sản phẩm có liên quan. 9.1.2. Nhìn chung, để chuẩn bị huyền phù ban đầu, cho một lượng (x) phần mẫu thử (có khối lượn g hoặc thể tích đ ã biết) vào một lượng xác định của canh thang PSB (B.1) để thu được dung dịch pha loãng 1/10 (khối lượng/thể tích hoặc thể t í ch/thể tích). Đồng hóa huyền phù này bằng cách sử dụng b ộ trộn kiểu nhu động (6.15) trong 2 min. 9.1.3. Chuẩn bị dung dịch huyền phù ban đầu thứ hai theo cách tương tự với canh thang ITC (B.2 ) sao cho thu được dung dịch pha loãng 1/100 (khối lượng/thể tích hoặc thể tích/thể tích) của phần mẫu thử/m ô i trường tăng sinh. 9.2. Tăng sinh Ủ hai dung dịch huyền phù ban đầu (9.1.2 và 9.1.3) như sau: a) môi trường PSB ở 22 ° C đến 25 ° C trong 48 h đến 72 h có khuấy trộn, hoặc để yên không khuấ y / trộn trong 5 ngày; b) môi trường ITC ở 25 ° C trong 48 h. 9.3. C ấ y ra đĩa và nhận dạng 9.3.1. Sau khi ủ môi trường tăng sinh (9.2), tiến hành như sau: 9.3.2. Từ dịch cấy trong môi trường PSB (9.2), dùng que cấy vòng (6.11) cấy lên bề mặt đĩa thạch C.N (B.3) để thu được các khuẩn lạc tách biệt tốt. 9.3.3. Dùng pipet vô trùng (6.9) chuyển 0,5 ml dịch cấy trong môi trường PSB (9.2) vào 4,5 ml dung dịch kali hydroxit (B.21) và trộn (xem [5]). Sau 20 s ± 5 s dùng que cấy vòng (6.11) cấy ngay l ê n bề m ặ t đĩa thạch CIN (B.3) để thu được các khuẩn lạc tách biệt tốt. 9.3.4. Từ dịch c ấ y trong môi trường ITC (9.2), dùng que cấy vòng (6.11) cấy lên bề mặt đĩa thạch SSDC (B.4) đ ể thu được các khuẩn lạc tách biệt tốt. 9.3.5. Lật úp các đĩa (9.3.2 đ ế n 9.3.4) và đặt chúng vào tủ ấm (6.2) đ ể ở 30 ° C . 9.3.6. Sau khi ủ 24 h, kiểm tra các đ ĩ a bằng kính lúp (6.14) tốt nhất là được trang bị đèn chiếu rọi xiên (6.13) để phát hiện sự có mặt của các khu ẩ n lạc đặc trưng Yersinia enterocolitica như sau: a) trên thạch CIN, các khuẩn lạc đặc trưng của Yersi n ia enterocolitica l à nh ỏ ( £ 1 mm) và nhẵn trơn có tâm đỏ và có mép biên mờ và khi được kiểm tra bằng ánh sáng rọi xiên (6.13) cho thấy những hạt nh ỏ không óng ánh. b) tr ê n thạch SSDC, các khuẩn lạc đặc trưng của Yersinia enterocolitica là nhỏ ( £ 1 mm) và có mép bi ê n màu xám không rõ ràng, không óng ánh và khi được kiểm tra bằng ánh sáng rọi xiên cho thấy những hạt nhỏ li ti. CHÚ THÍCH Ánh sáng rọi xiên giúp cho việc phân biệt các khuẩn lạc đặc tr ư ng của Yersinia enterocolitica với các khu ẩ n lạc tương tự Pse ud omonas . 9.3.7. Nếu các khuẩn lạc mọc chậm, nếu màu sắc mờ nhạt hoặc nếu không có các khuẩn lạc đặc trưng th ì tiếp tục ủ các đĩa đến 48 h rồi kiểm tra lại. 9.4. Khẳng định 9.4.1. Y ê u c ầ u chung Có thể sử dụng các bộ kit thử nhận dạng h ó a sinh thu nhỏ có bán sẵn và cho phép nhận dạng Yersinia enterocolitica . Một số bộ kit thử nhận dạng h ó a sinh thu nhỏ không nhận dạng được ch í nh xác các loài Yersinia như Yersinia mollaretii và Yersinia bercovieri (ti ề n biovar Yersinia enterocolitica 3A và 3B) và Yersinia intermedia mà đ ã được nhận biết như Yersinia enterocolitica . Trong trường hợp sau, thì phải thực hiện phép thử Mucate đ ể phân biệt giữa các loài này. Việc c ả i tiến khả năng ph â n biệt của các bộ kit thử nhận dạng hóa sinh thu nhỏ này đã được đưa ra (xem [6] và [7]). 9.4.2. Chọn các khuẩn lạc đ ể khẳng định 9.4.2.1. Đ ể khẳng định, từ mỗi đ ĩ a đựng mỗi môi trường chọn lọc (xem 9.3.2 đến 9.3.4), lấy năm khuẩn lạc được coi l à đặc trưng hoặc nghi ngờ. Nếu trên một đĩa có chứa ít hơn năm khuẩn lạc đặc trưng hoặc nghi ngờ thì l ấ y tất cả để khẳng định. Ria cấy các khuẩn lạc đ ã chọn lên bề mặt đĩa thạch dinh dưỡng (B.5) sao cho các khuẩn lạc đ ã ph á t triển tách biệt r õ . Ủ các đĩa này ở 30 ° C trong 24 h. Kiểm tra các đĩa đã ủ về độ thuần khi ế t của dịch c ấ y. Nếu có mặt các dịch c ấ y hỗn hợp, thì cấy truyền từng loại khuẩn lạc riêng biệt vào các đĩa thạch dinh d ưỡ ng tiếp theo và ủ như trên. Sử dụng dịch c ấ y thuần khiết cho các phép thử khẳng định hóa sinh và phép thử khả năng gây bệnh. 9.4.2.2. Plasmit để xác định các đặc trưng liên quan đến tính gây bệnh của Yersinia có thể tự nhi ê n m ấ t đi trong giai đoạn cấy ở nhiệt độ cao hơn 30 ° C hoặc có dịch c ấ y dài hơn và trôi qua ở nhiệt đ ộ th ấ p hơn 30 ° C trong phòng th ử nghiệm. Do đó, bảo quản chúng như dịch cấy đông lạnh bằng cách c ấ y truyền ngay từng dịch cấy thu ầ n khiết vào canh thang thịt bê (B.22). Ủ các đĩa này ở 22 ° C đ ế n 25 ° C trong 24 h đ ế n 48 h. Bổ sung glyxerol vô trùng 10 % (B.2.3), trộn kỹ và làm đông lạnh, tốt nh ấ t là ở âm 70 ° C . 9.4.3. Phép thử giả định 9.4.3.1. Y ê u c ầ u chung Dùng que c ấ y vòng (6.11) c ấ y các khuẩn lạc được chọn trong 9.4.2 vào các m ô i tr ườ ng quy định trong 9.4.3.2 đ ế n 9.4.3 4 và tiến hành phát hiện phản ứng oxidaza theo 9.4.3 5. 9.4.3.2. Phát hi ệ n ureaza Sử dụng ch ấ t cấy đ ể c ấ y vào ngay dưới bề mặt môi trường canh thang ureaza/indol (B.6). Ủ các ống này ở 30 ° C trong 24 h , tốt nh ấ t là đ ể trong nồi cách thủy Màu h ồ ng-tím hoặc hồng-đỏ chứng tỏ phản ứ ng ureaza dương t í nh. Yersinia enterocolitica phần lớn cho phản ứng ureaza dương t í nh trong khoảng từ 1 min đ ế n 5 min. Việc ghi lại tốc độ phản ứng dương tính có th ể cho giá tr ị ch ẩ n đoán. Màu vàng-cam chứng tỏ phản ứng ureaza âm tính. Có th ể xu ấ t hiện các phản ứng âm t í nh giả nếu môi trường không được c ấ y đủ lượng vi sinh vật. 9.4.3.3. Phát hi ệ n indol Th ê m 0 , 1 ml đ ế n 0,2 ml thu ố c thử (B.7) vào các ống nghiệm (9.4.3.2) đ ể phát hiện indol. Vòng màu đỏ trên b ề mặt của dịch cấy trong 15 min chứng tỏ phản ứng dương t í nh. 9.4.3.4. Thạch K li gler Cấy đâm sâu trên đáy thạch và cấy vạch l ê n bề mặt nghiêng của thạch (B.7.2). Ủ ở 30 ° C trong 24 h đ ế n 48 h. Diễn giải các thay đổi trong môi trường như sau: a) Quan sát ở đáy cột thạch - màu vàng: dương t í nh glucoza (l ê n men glucoza); - màu đỏ hoặc không đổi màu: âm t í nh glucoza (không l ê n men glucoza); - màu đen: sinh kh í hydro su lf ua; - có bọt hoặc rạn nứt: sinh khí từ glucoza. b) Quan sát trên mặt nghiêng của thạch - màu vàng: dương tính lactoza (sử dụng lactoza); - màu đ ỏ hoặc không đổi màu: âm tính lactoza (không sử dụng lactoza). 9.4.3.5. Phát hi ệ n oxidaza Dùng que cấy vòng b ằ ng platin/iridi hoặc đũa th ủy tinh (6.11), lấy một phần của từng khuẩn lạc đặc trưng đã chọn (9.4.2) và cấy vạch lên giấy lọc đã làm ẩm bằng thuốc thử oxidaza (B.9) (một giọt), hoặc trên đĩa có bán sẵn. Không sử dụng que cấy vòng hoặc que cấy thẳng bằng niken/crom (6.11). Phép thử được coi là âm tính nếu màu của giấy lọc không đổi sang màu tím hoa cà, màu tím hoặc xanh sẫm trong 10 s đầu. 9.4.4. Phép th ử khẳng định hóa sinh 9.4.4.1. Chọn khuẩn lạc và cách ti ế n hành 9.4.4.1.1. Tiếp tục nhận dạng các khuẩn lạc có các đặc trưng sau đây: - phát hiện ureaza: dương tính; - phát hiện indol: d ương tính hoặc âm t í nh; - lên men glucoza: dương t í nh ; - sinh khí từ glucoza: âm tính; - lên men lactoza: âm tính; - sinh khí H 2 S: â m tính; - phát hiện oxidaza: âm tính. CHÚ THÍCH 1 Các chủng âm t í nh ureaza được ghi lại nhưng trong đó không có loại g â y bệnh. CHÚ TH Í CH 2 Đối với việc sinh khí t ừ glucoza , có th ể tạo ra một í t bọt kh í . Cho dù Yersinia thường được coi là l ê n men cacbohydrat mà không sinh kh í , th ì một s ố chủng của Yersinia enterocolitica (như Yersinia enterocolitica biovar 3) c ó th ể si nh một hoặc hai bọt kh í (sinh kh í y ế u). CHÚ TH Í CH 3 Một số chủng của Yers in ia enteroco l itica dương t í nh lactoza đ ã được phân l ậ p, đ ặ c biệt t ừ các sản ph ẩ m sữa . Thực t ế hiện nay , nh ì n chung các chủng này được coi l à không gây bệnh. 9.4.4.1.2. Dùng que cấy vòng hoặc que c ấ y thẳng (6.11) c ấ y các khuẩn lạc đã được phân lập (9.4.2; trên thạch dinh d ưỡ ng và được chọn trong 9.4.4.1.1 vào các môi trường quy định trong 9.4.4.2 đến 9.4 . 4.5. 9.4.4.2. Môi tr ườ ng lyzin đ ã khử nhóm carboxyl Cấy từng môi trường (B.10) ngay dưới bề mặt của môi trường lỏng. Nếu các ống nghiệm ch ứ a không đầy môi trường và kín khí, th ì phủ lên bề mặt b ằ ng một lớp dầu Vaselin ® (được làm nóng rồi làm nguội nhanh sao cho vẫn ở dạng lỏng) hoặc lớp para fi n lỏng vô trùng. Ủ ở 30 ° C trong 24 h. Sau khi ủ thấy có màu t í m ch ứ ng tỏ phản ứng dương t í nh. Màu vàng chứng tỏ ph ả n ứng âm t í nh. 9.4.4.3. M ô i tr ườ ng ornithin đ ã khử nhóm cacboxyl Cấy từng môi trường (B.11) ngay dưới b ề mặt của môi trường lỏng. Nếu các ống nghiệm chứa không đầy môi trường và k í n khí, th ì phủ lên bề mặt bằng một lớp dầu Vaselin ® (được làm nóng rồi làm nguội nhanh sao cho v ẫ n ở dạng l ỏ ng) hoặc lớp para f in lỏng vô trùng. Ủ ở 30 ° C trong 24 h. Sau khi ủ thấy có màu t í m chứng tỏ phản ứ ng dương tính. Màu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính. 9.4.4.4. M ô i trường l ê n men sacaroza, rhamnoza, trehaloza và xyloza Cấy từng môi trường (B.12) ngay dưới b ề mặt của môi trường lỏng . Ủ ở 30 ° C trong 24 h. Sau khi ủ th ấ y có màu vàng chứng tỏ phản ứng dương t í nh. Màu đỏ chứng tỏ ph ả n ứng âm tính. 9.4.4.5. Môi tr ường Simmon Cấy vạch trên bề mặt thạch nghiêng (B.13). Không đậy nắp các ống nghiệm quá chặt sao cho không khí có thể đi vào và tạo ra các đi ề u kiện phát triển hi ế u khí. Ủ ở 30 ° C trong 24 h. Sau khi ủ th ấ y có màu xanh chứng tỏ phản ứng dương tính. 9.4.4.6. Phép thử tween-esteraza Cấy vạch trên bề mặt thạch nghiêng (B.14). Ủ ở 25 ° C trong 5 ngày và định kỳ ki ể m tra. Sau khi ủ th ấ y có qu ầ ng mờ đục của kết tủa do xuất hiện các tinh th ể nhỏ canxi oleat chứng tỏ ph ả n ứng dương t í nh. 9.4.5. Phép thử t í nh g â y bệnh giả định (xem [8]) 9.4.5.1. Chọn khuẩn lạc và c á ch ti ế n hành 9.4.5.1.1. Chỉ sử dụng các khuẩn lạc có các đặc trưng sau đây: - phát hiện lyzin decarboxylaza: âm tính; - ph á t hiện ornithin decarboxylaza: dương t í nh; - lên men rhamnoza: âm t í nh; - lên men sacaroza: dương t í nh; - thủy phân xitrat: âm tính; CHÚ TH Í CH 1 Hi ế m khi các chủng Yersinia enterocolitica gây bệnh giả định là âm t í nh sacaroza được phân lập từ thịt lợn. CHÚ TH Í CH 2 Yersinia enterocolitica biovar 4 và 5 đã được ghi lại là âm t í nh o rn ithin decarboxylaza 9.4.5.1.2. Dùng que cấy vòng hoặc que cấy thẳng (6.11) c ấ y từng dịch c ấ y thuần khi ế t trên thạch dinh d ưỡ ng từ các khu ẩ n lạc được chọn (9.4.5.1) vào các môi trường quy định trong 9.4.5.2 đ ế n 9.4.5.4 9.4.5.2. M ô i trường l ê n men aesculin Cấy vạch trên b ề mặt thạch nghiêng (B.15). Ủ ở 30 ° C trong 24 h. Sau khi ủ th ấ y có quầng đen quanh các khuẩn lạc chứng tỏ phản ứng dương tính. CHÚ TH Í CH Phép th ử l ê n men aesculin này tương đương với phép th ử lên men salixin. 9.4.5.3. M ô i trường phát hi ệ n pyrazinamidaza Cấy vạch trên một vùng rộng của bề mặt thạch nghiêng (B.17). Ủ ở 30 ° C tro ng 48 h. Thêm 1 ml dung dịch sắt (II) amoni sun f at 1 % (B.18). Sau 15 min thấy có màu hồng-nâu chứng tỏ phản ứng dương tính. 9.4.5.4. Phép thử các yêu c ầ u canxi ở 37 ° C 9.4.5.4.1. Phép thử về các yêu cầu đối với canxi ở 37 ° C có thể được thay thế b ằ ng cách sử dụng natri axetat CHÚ TH Í CH 1 Các phép thử ủ ở 37 ° C có th ể làm cho đặc trưng này bị mất đi v ì các gen đ ã m ã hóa cho đặc tr ư ng n à y đ ượ c thực hiện trên plasmit. 9.4.5.4.2. Đối với từng dịch c ấ y thuần khiết được phân lập trên thạch dinh d ưỡ ng (9.4.5.1), hòa một phần nhỏ khuẩn lạc vào dung dịch natri clorua (B.20) để thu được huyền phù ch ứ a khoảng 1 000 tế bào vi khuẩn trên mililit. Cấy 0,1 ml từng huyền phù bằng cách dàn lên trên: - hai đĩa thạch casein đậu tương (B 16) (các đĩa kiểm ch ứ ng) và - hai đĩa thạch casein đậu tương có magie và oxalat (B.19). Ủ một đĩa của mỗi loại m ô i trường ở 25 ° C trong 48 h v à một đĩa còn lại ở 37 ° C trong 48 h. 9.4.5.4.3. Phản ứ ng được coi là dương tính nếu ở 25 ° C cho th ấ y các khuẩn lạc có các kích thước đồng đều và nếu ở 37 ° C khi có mặt magie và oxalat, sự ức ch ế khuẩn lạc th ấ y r õ khi có > 20 % các khuẩn lạc nhỏ hơn, có đường kính 0,1 mm và số còn lại có đường k í nh từ 0,5 mm đến 1 mm. Các khuẩn lạc bị ức chế phụ thuộc vào canxi và được cho là loại gây bệnh. 9.4.6. Di ễ n giải kết quả các ph é p thử hóa sinh và thử t í nh gây bệnh 9.4.6.1. Các chủng Yersinia enterocolitica gây bệnh giả định nhìn chung cho th ấ y các phản ứng như trong Bảng 1; có thể phải thực hiện các phép thử bổ sung (xem Bảng C.1). Bảng 1 – Di ễ n giải kết quả các phép thử hóa sinh và tính gây b ệ nh đối với Yersinia enterocolitica Ph é p thử Phản ứ ng Xác định các loài Ure (9.4.3 . 2) + Indol (9.4.3.3) - / + a Glucoza (9.4.3.4) + Sinh khí từ glucoza (9.4.3.4) - Lactoza (9.4.3.4) - Hydro sul f ua (9.4.3.4) - Oxidaza (9.4.3.5) - Lyzin decarboxylaza (9.4.4.2) - O rn ithin decarboxylaza (9.4.4 . 3) + Sacaroza (9.4.4 . 4) + Trehaloza (9.4.4.4) +/- b Rhamnoza (9.4.4 . 4) +/- b Xyloza (9.4.4 . 4) +/- b Xitrat (9.4 . 4.5) - Tween-esteraza (9.4.4.6) +/- b Xác định t í nh gây bệnh Aesculin (9.4.5.2) - Pyrazinamidaza (9.4.5.3) - Phụ thuộc vào canxi ở 37 ° C (9.4.5.4) c + a Biovar 1 và một s ố serovar của biovar 2 dương t í nh với indol. Biovar 3, 4 và 5 và một số serovar của biovar 2 âm t í nh với in d ol. b Phụ thuộc vào biovar của Yersinia enterocolitica (Phụ lục C). c Đ ặ c trưng gây bệnh được m ã h ó a b ằ ng plasmit độc lực. 9.4.6.2 . Việc xác định biovar của Yersinia enterocolitica theo các phép thử trong Bảng D.1 (Phụ lục D) cần được thực hiện đ ể khẳng định tính gây bệnh giả định (Tween-esteraza, aesculin, pyrazinamidaza, indol, xyloza, trehaloza), các Yersinia enterocolitica biovar 1B, 2, 3, 4 và 5 được biết là g â y bệnh. 9.4.6.3. Các phép thử aesculin, pyrazinamidaza phải được xây dựng để xác định tính gây bệnh gi ả định. Chủng dương t í nh với aesculin và/hoặc pyrazinamidaza và âm t í nh phụ thuộc canxi ở 37 ° C l à loại không g â y bệnh. Chủng â m t í nh với aesculin và pyrazinamidaza và dương tính phụ thuộc canxi ở 37 ° C là gây bệnh. Các phép thử t í nh gây bệnh cần được thực hiện thường xuyên (xem [9]). 9.4.6.4. Đối với các mục đích v ề dịch t ễ học, th ì việc xác định các kháng nguyên thân của Yersi n ia enteroco li tica cần được nghiên cứu. Các ch ủ ng gây bệnh giả định được kiểm tra kiểu huyết thanh b ằn g cách dùng kháng huyết thanh thích hợp thường là loại serovar O :3, O :8, O :9 và O :5,27. 10. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết đ ể nhận bi ế t đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp đ ã sử dụng, viện d ẫ n tiêu chuẩn này; d) nhiệt độ ủ đ ã sử dụng; e) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi ti ế t b ấ t thường kh á c có th ể ảnh hưởng tới kết quả; f) các kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng các yêu c ầ u về độ lặp lại th ì nêu kết qu ả thu được; Báo cáo thử nghiệm cũng phải nêu rõ nếu thực hiện các phép thử tiếp tại phòng thử nghiệm chuẩn và nếu có thì nêu kết quả thu được. PHỤ LỤC A ( Quy định ) SƠ ĐỒ QUI TRÌNH PHỤ LỤC B ( Quy định ) THÀNH PHẨN VÀ CÁCH CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ THUỐC THỬ B.1 . Canh thang pepton, sorbitol và mu ố i mật (PSB) B.1.1 . Thành ph ầ n Sản ph ẩ m th ủy phân casein b ằ ng enzym 5,0 g Sorbitol 10 , 0 g Natri clorua 5 , 0 g Dinatri hydro phosphat (Na 2 HP O 4 ) 8 , 23 g Natri dihydro phosphat ngậm một phân tử nước (Na 2 HP O 4 . H 2 O ) 1 , 2 g Muối mật 1.5 g Nước 1 000 m l B.1.2 . Chuẩn b ị H òa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường ho à n ch ỉ nh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu c ầ n. Ch ỉ nh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,6 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu cần. Phân phối môi trường vào các ống nghiệm hoặc b ì nh cầu có dung tích thích hợp để thu được c á c lượng cần thiết cho phép thử (xem 9.1.2). Khử trùng 15 min trong n ồ i h ấ p áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B.2 . Canh thang Irgasan™, ticarcillin và kali clorat (ITC) B.2.1 . Môi tr ườ ng cơ bản B.2.1.1 . Thành ph ầ n Sản ph ẩ m thủy phân casein b ằ ng enzym 10,0 g Ch ấ t chi ế t n ấ m men 1 , 0 g Magie clorua ngậm s á u phân tử nước (MgC l 2 .6H 2 O ) 60 , 0 g Natri clorua (NaCI) 5,0 g Xanh lục malachit , d ung dịch 0,2 % 5 , 0 ml Nước 1 000 ml B.2.1.2 . Chuẩn b ị H òa tan các th à nh phần cơ bản hoặc môi tr ườ ng hoàn chỉnh khô trong nước b ằ ng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 6,9 ± 0,2 ở 25 ° C , n ế u cần. Phân phối môi trường cơ bản vào các bình cầu (6.7) có dung tích thích hợp để thu được các lượng cần thi ế t (v í dụ: 988 ml đối với 1 I môi trường hoàn chỉnh). Khử trùng 15 min trong n ồ i hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B.2.2 . Dung d ị ch Ticarcillin (1 mg/m l ) B.2.2.1 . Thành ph ầ n Ticarcillin 10 , 0 mg Nước 10 ml B.2.2.2 . Chuẩn bị H òa tan ticarcillin trong nước. Lọc để khử trùng. B.2.3 . Dung d ị ch Irasan™ [5-clo-2- ( 2,4-diclorophenoxy)phenol] trong etanol (1 mg/ml) B.2.3.1 . Thành ph ầ n Irgasan™ 10,0 mg Etanol, 95 % (th ể t í ch) 10 , 0 ml B.2.3.2 . Chuẩn bị H òa tan Irgasan™ trong etanol khi c ầ n dùng hoặc dung dịch này được b ả o quản ở khoảng âm 20 ° C trong không quá 4 tuần. B.2.4 . Dung dịch kali clorat (100 mg/ml) B.2.4.1 . Thành phần Kali clorat (KC l O 3 ) 10,0 g Nước 100 ml B.2.4.2 . Chuẩn b ị H òa tan kali clorat trong nước. Lọc đ ể khử trùng. B.2. 5. M ô i trường hoàn ch ỉ nh B.2.5.1 . Thành ph ầ n Môi trường cơ bản (B.2.1) 988 ml Dung dịch tircacillin (B.2.2) 1 ml Dung dịch Irgasan (B.2.3) 1 ml Dung dịch kali clorat (B.2.4) 10 ml B.2.5.2 . Chuẩn b ị Khi cần, cho tircacillin, Irgasan™ và dung dịch kali clorat một cách vô trùng vào môi trường cơ b ả n đ ã được làm nguội đ ế n 47 ° C và tr ộ n. Phân phối môi trường này một cách vô trùng vào các ống nghiệm với các lượng 10 ml hoặc 100 ml vào các bình cầu có dung t í ch thích hợp (xem 9.1.3), sao cho thu được tỷ lệ diện tích/thể tích là tối thiểu ( k ỵ khí tương đối). B.3 . Thạch cefsulodin, lrgasan™và novobioxin (CIN) B.3.1 . M ô i tr ườn g cơ bản B.3.1.1 . Thành ph ầ n Sản ph ẩ m thủy phân gelatin b ằ ng enzym 17,0 g Sản ph ẩ m thủy phân casein và mô động vật 3 , 0 g Ch ấ t chi ế t n ấ m men 2 , 0 g Manitol 20 , 0 g Natri pyruvat 2,0 g Natri clorua 1 , 0 g Magie sultat ngậm bảy phân tử nước (MgS O 4 .7H 2 O ) 0,01 g Natr i desoxycolat 0 , 5 g Đỏ trung t í nh 0,03 g T í m tinh th ể 0 , 001 g Thạch 9 đ ế n18 g 1) Nước 1 000 ml B.3.1.2 . Chuẩn b ị H òa tan các thành ph ầ n cơ b ả n hoặc môi trường cơ bản khô trong nước b ằ ng cách đun nóng, nếu c ầ n. Ch ỉ nh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 o C , n ế u cần. Ph â n phối môi tr ườ ng v à o các b ì nh cầu (6.7) có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong n ồ i h ấ p áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B.3.2 . Dung dịch cef s ulodin (15 mg/ml) B.3.2.1 . Thành ph ầ n Cefsulodin 1,5g Nước 100 ml B.3.2.2 . Chuẩn bị H òa tan ce f sulodin trong nước. Lọc đ ể khử trùng. B.3.3 Dung dịch Irasan™ [5-clo-2- ( 2,4-diclorophenoxy)phenol] trong etanol (4 mg/ml) B.3.3.1 . Thành phần Irgasan™ 0 , 4 g Etanol , 95 % (th ể t í ch) 100 ml B.3.3.2 . Chuẩn bị H òa tan Irgasan™ trong etanol khi cần dùng hoặc dung dịch này được bảo quản ở khoảng âm 20 ° C trong không quá 4 tuần. B.3.4 . Dung dịch novobiocin (2 , 5 mg/ml) B.3.4.1 . Thành ph ầ n Novobiocin 0 , 25 g Nước 100 ml B.3.4.2 . Chuẩn bị H òa tan novobiocin trong nước. Lọc đ ể khử trùng. B.3.5 . Môi trường hoàn chỉnh B.3.5.1 . Thành phần Môi trường cơ bản (B.3.1) 997 ml Dung dịch ce f sulodin (B.3.2) 1 ml Dung dịch Irgasan (B.3.3) 1 ml Dung dịch novobiocin (B.3.4) 1 ml B.3.5.2 . Chuẩn b ị Cho từng dung dịch kháng sinh này một cách vô trùng vào môi trường cơ bản đã được làm nguội đến 45° C và trộn đ ề u. B.3.5.3 . Chuẩn b ị các đ ĩ a thạch CIN Rót khoảng 15 ml môi trường hoàn ch ỉ nh vào các đĩa Petri vô trùng (6.8). Để yên các đĩa. B.4 . Thạch Salmonella/Shigella có natri desoxycolat v à canxi clorua (SSDC) B.4.1 Thành phần Chất chi ế t n ấ m men 5,0 g Ch ấ t chiết thịt 5,0 g Sản ph ẩ m th ủy phân mô động vật b ằ ng enzym 5,0 g Lactoza 10,0 g Muối mật 8,5 g Natri desoxycolat 10,0 g Canxi clorua 1,0 g Natri xitrat 10,0 g Natri thiosul f at ngậm năm phân tử nước 8,5 g Sắt (III) xitrat 1,0 g Xanh brilliant 0,0003 g Đỏ trung t í nh 0,025 g Thạch 9 g đ ế n 18 g a Nước 1 000 ml a T ùy thu ộ c vào sức đông của thạch B .4. 2 . Chuẩn bị H òa tan các thành ph ầ n khô hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7, 4 ± 0,2 ở 25 ° C , n ế u cần. Không khử trùng B.4.3. Chuẩn bị các đĩa thạch SSDC Rót khoảng 20ml môi trường đã làm nguội đến khoảng 45 ° C vào các đĩa Petri vô trùng (6.8). Để yên các đĩa. Nếu môi trường đã được chuẩn bị trước thì các đĩa thạch chưa khô phải được để trong túi bằng chất dẻo ở nơi tối khoảng 1 tuần ở 8 ° C ± 2 ° C vì sẽ hình thành kết tủa trong môi trường và sẽ giảm hiệu năng của môi trường. B.5. Thạch dinh dưỡng B.5.1. Thành phần Chất chiết thịt 3,0 g Pepton 5,0 g Thạch 9 g đ ế n 18 g a Nước 1 000 ml a T ùy thu ộ c vào sức đông của thạch B .5. 2 . Chuẩn bị H òa tan các thành ph ầ n cơ b ả n hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước b ằ ng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 ° C , n ế u cần. Ph â n ph ố i môi trường vào các bình cầu (6.7) có dung tích thích hợp. Kh ử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B .5 .3 . Chuẩn b ị các đ ĩ a thạch dinh d ưỡ ng Rót khoảng 15 ml môi trường đã làm nguội đ ế n khoảng 45 ° C vào các đĩa Petri vô trùng (6.8). Để yên các đ ĩa. B.6 . Môi tr ườ ng ure indol B.6.1 . Th à nh ph ầ n L -Tryptophan, không chứa indol 3,0 g Kali dihydro phosphat (KH 2 P O 4 ) 1,0 g Dikali hydro phosphat (K 2 HPO 4 ) 1,0 g Natri clorua 5,0 g Ure 20,0 g Etanol 95 o (th ể tích) 10 ml Đ ỏ phenol 0,025 g Nước 1 000 ml B.6.2 . Chuẩn bị H òa tan L-Tryptophan trong nước ở 60 ° C . Làm nguội rồi hòa tan các thành phần còn lại trong nước, b ằ ng cách khu ấ y. Cách khác, h ò a tan môi trường hoàn ch ỉ nh khô trong nước bằng cách khuấy. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 6,9 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu cần. Lọc để khử trùng. Phân phối môi trường này một cách vô trùng, với các lượng 0,5 ml vào các ống nghiệm vô trùng c ó kích thước 12 mm x 50 mm (6.6). Bảo qu ả n môi trường này ở 3 ° C ± 2 ° C , nơi t ố i. B.7 . Thuốc th ử Kovac B.7.1 Thành ph ầ n 4-Dimetylaminobenzaldehyt 5,0 g Axit clohydric , r = 1,18 g/ml đ ế n 1,19 g/ml 25 ml 2-Metylbutan-2-ol 75 ml B.7.2 . Chuẩn b ị Hòa tan 4-Dimetylaminobenzaldehyt trong 2-Metylbutan-2-ol để trong nồi cách thủy ở 60 ° C . Làm nguội đến nhiệt độ phòng rồi đặt bình cầu trên bể nước đá. Sau đó thêm c ẩ n thận axit clohyric, trộn từ từ. Bảo quản ở 3 ° C ± 2 ° C , trong chai màu nâu. Không sử dụng chai có nút đậy bằng cao su vì sẽ làm h ỏ ng thuốc thử. B.8 . Thạch Kligler B.8.1 . Thành ph ầ n Ch ấ t chiết thịt 3 , 0 g Ch ấ t chiết n ấ m men 3,0 g Pepton pancreatic casein 20,0 g Natri clorua 5,0 g Lactoza 10,0 g Glucoza 1.0 g Sắt (II) su l fat 0,2 g Natri thiosultat ngậm năm phân tử nước (Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O ) 0 , 3 g Đỏ phenol 0,025 g Thạch 9 g đến 18 g a Nước 1 000 ml * Tùy thuộc vào s ức đông của thạch. B.8.2 Chuẩn bị H òa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu cần. Phân phối môi trường với các lượng 10 ml vào các ống nghiệm (6.6) có dung t í ch th í ch hợp. Kh ử trùng 15 min trong n ồ i hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . Đ ể các ống thạch ở tư thế nghiêng, sao cho thu được cột thạch có chiều sâu 3 cm và đoạn nghiêng dài 5 cm. B.9 . Thuốc th ử phát hi ệ n oxidaza B.9.1 . Th à nh ph ầ n N,N,N'N' -Tetrametyl- r -phenylendiamin dihydroclorua 1 , 0 g a Nước 100 ml a C ó th ể dùng oxalat đ ể thay th ế cho dihydroclorua nhưng hạn sử dụng c ủ a dung dịch s ẽ ngắn hơn. B.9.2 . Chuẩn bị Hòa tan thành phần trên trong nước ngay trước khi sử dụng. Khi được bảo quản ở 3 ° C ± 2 ° C và nơi tối, dung dịch b ề n không quá một tuần. B.10 . Môi trường lyzin decarboxylaza (LDC) B.10.1 . Thành ph ầ n L-lyzin monohydroclorua 5,0 g Ch ấ t chi ế t n ấ m men 3 , 0 g Glucoza 1 , 0 g Bromocresol t í a 0,015 g Nước 1 000 ml B.10.2 . Chuẩn bị H òa tan các thành phần tr ê n trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Ch ỉ nh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu cần. Phân phối môi trường này với các lượng 5 ml vào các ống nghiệm có k í ch thước 9 mm x 180 mm (6.6). Khử trùng 15 min trong n ồ i hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B.11 . Môi trường Ornithin d e carboxylaza B.11.1 . Thành ph ầ n L-Ornithin monohydroclorua 5 , 0 g Ch ấ t chi ế t n ấ m men 3 , 0 g Glucoza 1 , 0 g Bromocresol t í a 0 , 015 g Nước 1 000 ml B.11.2 . Chuẩn bị H òa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng, n ế u c ầ n. Ch ỉ nh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25 ° C , n ế u cần. Phân phối m ô i trường này với các lượng 5 ml vào các ống có kích thước 9 mm x 180 mm (6.6). Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B.12 . Môi tr ườ ng l ê n men cacbohydrat (nước pepton v ớ i đỏ phenol, rhamnoza hoặc sacaroza hoặc trehaloza hoặc xyloza) B.12.1 . Môi t rường cơ bản B.12.1.1 . Thành ph ầ n Pepton 10,0 g Natri clorua 5,0 g Đỏ phenol 0,02 g Nước 1 000 ml B.12.1.2 . Chu ẩ n bị H òa tan các thành phần trên hoặc môi trường cơ bản khô trong nước b ằ ng cách đun nóng, n ế u cần. Ch ỉ nh pH, sao cho sau khi khử trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 ° C , n ế u cần. Phân phối môi trường cơ bản này vào các bình cầu (6.7) có dung tích thích hợp. Khử trùng 10 min trong n ồ i h ấ p áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B.12.2 Dung dịch cacbohydrat (rhamnoza, sacaroza, trehaloza hoặc xyloza 100 mg/ml) B.12.2.1 Thành phần Cacbohydrat (rhamnoza , sacaroza , trehaloza hoặc xyloza) 10 , 0 g Nước 100 ml B.12.2.2 . Chuẩn bị Chu ẩ n bị riêng rẽ từng dung dịch cacbohydrat bằng cách cho vào nước cất. Lọc để khử trùng. B.12.3 . Môi trường hoàn ch ỉ nh B.12.3.1 . Thành phần Môi trường c ơ bản (B.12.1) 900 ml Dung dịch cacbohydrat (B.12.2) 100 ml B.12.3.2 . Chuẩn bị Đối với từng cacbon hydrat, thêm một cách vô trùng dung dịch cacbohydrat vào môi trường cơ bản đ ã làm nguội đến khoảng 45 ° C và trộn. Phân phối môi trường hoàn ch ỉ nh một cách vô trùng với các lượng 10 ml vào các ống nghiệm (6 . 6) hoặc các chai (6.7) có dung tích thích hợp. B.13 . Môi tr ườ ng Simmon xitrat B.13.1 . Thành ph ầ n Natri xitrat 2,0 g Natri clorua 5,0 g Dikali hydro phosphat (K 2 HPO 4 ) 1 , 0 g Xanh bromothymol 0,08 g Amoni dihydro phosphat (NH 4 H 2 PO 4 ) 1,0 g Magie sul f at 0 , 2 g Thạch 9 g đ ế n 18 g a Nước 1 000 ml a T ù y thuộc vào s ức đông của thạch . B.13.2 . Chuẩn bị H òa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn ch ỉ nh khô trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng l à 6,8 ± 0,2 ở 25 ° C , n ế u cần. Phân phối môi trường với các lượng 10 ml vào các ống nghiệm mới (6.6) có dung tích thích hợp. Nếu không có sẵn các ống nghiệm mới thì trước khi sử dụng phải làm sạch các ống nghiệm đ ể các ống nghiệm này không chứa các chất gây nhiễu đến phép thử. Khử trùng 15 min trong nồi h ấ p á p lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . Đ ể ống nghiệm ở tư thế nghiêng sao cho thu được mặt nghiêng có chiều sâu 2,5 cm. B.14 . M ổ i trường thử Tween-esteaza B.14.1 . Môi tr ườ ng cơ bản B.14.1.1 . Thành ph ầ n Dịch thủy phân peptic của thịt 10 , 0 g Natri clorua (NaC l ) 5 , 0 g Canxi clorua (CaC l 2 ) 0 , 1 g Thạch 9 g đ ế n 18 g a Nước 1 000 ml a Tùy thuộc v à o sức đông của thạch. B.14.1.2 . Chuẩn bị H òa tan các thành phần trên trong nước b ằ ng các h đun nóng, n ế u cần. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu c ầ n. Khử trùng 30 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B.14.2 Môi trường hoàn ch ỉ nh B.14.2.1 . Thành phần Môi trường cơ bản (B.14.1) 990 ml Tween 80™ (sorbitol mono-oleat) 10 ml B.14.2.2 . Chuẩn bị Cho dung dịch Tween 80™ vào môi trường lỏng cơ b ả n và đồng hóa. Khử trùng 30 min ở nhiệt độ 110 ° C . Phân phối môi trường hoàn ch ỉ nh này với các lượng 2,5 ml vào các ống nghiệm (6.6) có dung tíc h th í ch hợp. Để các ống nghiệm ở tư thế gần như nằm ngang sao cho mặt nghiêng d à i nhất có đáy nhỏ nh ấ t. B.15 . Thạch mật và aesculin B.15.1 . Thành ph ầ n Ch ấ t chi ế t thịt 3,0 g Pepton thịt 5,0 g Aesculin 1,0 g Muối mật 40 , 0 g Sắt (III) xitrat 0 , 5 g Thạch 9 g đến 18 g a Nước 1 000 ml a T ùy thuộc vào sức đông của thạch. B.15.2 . Chuẩn bị H òa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi nhẹ. Ch ỉ nh pH, sao cho sau khi khử trùng là 6,6 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu cần. Ph â n phối môi trường với các lượng 10 ml vào các ống nghiệm (6.6) có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . Để ống nghiệm ở tư thế nghiêng sao cho thu được mặt nghiêng có chiều sâu 2,5 cm. B.16 . Thạch casein đậu tương B.16.1 . Thành phần Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym 15,0 g Pepton đậu tương 5 , 0 g Natri clorua 5 , 0 g Thạch 9 g đ ế n 18 g a Nước 1 000 ml a Tùy thuộc vào sức đông c ủ a thạch. B.16.2 . Chuẩn bị H òa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước b ằ ng cách đun sôi. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng l à 7,3 ± 0,2 ở 25 ° C , n ế u cần. Phân phối môi trường vào các bình cầu (6.7) có dung tích thích hợp và với các lượng 830 ml (xem B.19.5.1). Môi trường này cần để sử dụng trong B. 19.5.1. Khử trùng 15 min trong nồi h ấ p áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B.17 . Thạch casein đậu t ươ ng để phát hiện pyrazinamidaza B.17.1 . Th à nh ph ầ n Sản ph ẩ m thủy ph â n casein b ằ ng enzym 15,0 g Pepton đậu tương 5,0 g Pyrazincarboxamid (C 5 H 5 N 3 O) 1 , 0 g Natri clorua 5,0 g Thạch 9 g đ ế n 18 g a Dung dịch đệm tris-maleat (0,2 mol/l, pH 6) 1 000 m l a T ùy thuộc vào sức đông c ủ a thạch. B.17.2 . Chuẩn bị H òa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu cần. Phân phối môi tr ườ ng với các lượng 10 ml vào các bình cầu (6.7) có dung tích thích hợp. Kh ử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . Sau khi khử trùng, đ ể ở tư thế nghiêng sao cho thu được mặt nghiêng dài. B.18 . Dung dịch amoni sắt (III) sulfat để phát hiện pyrazinamidaza B.18.1 . Thành ph ầ n Amoni sắt (II) sul f at 1,0 g Nước 100 ml B.18.2 . Chuẩn bị Ngay trước khi sử dụng, h òa tan amoni sắt (II) sulfat trong nước. B.19 . Thạch casein đậu tương có magie và oxalat B.19.1 . M ô i trường cơ b ả n (xem B.16) B.19.2 . Dung dịch magie clorua B.19.2.1 . Thành ph ầ n Magie clorua ngậm sáu phân tử nước (MgCI 2 .6H 2 O ) (0,25 mol/l) 5,09 g Nước 100 ml B.19.2.2 . Chuẩn bị H òa tan magie clorua trong nước. Lọc đ ể khử trùng. B.19.3 . Dung dịch natri oxalat B.19.3.1 . Thành ph ầ n Natri oxalat 3,35 g Nước 100 ml B.19.3.2 . Chuẩn bị H òa tan natri oxalat trong nước. Lọc để khử tr ù ng. B.19.4 . Dung dịch glucoza B.19.4.1 . Thành ph ầ n Glucoza 18 , 0 g Nước 100 ml B.19.4.2 . Chuẩn bị H òa tan glucoza trong nước. Lọc để khử trùng. B.19.5 . Môi tr ườ ng hoàn chỉnh B.19.5.1 . Thành ph ầ n Môi trường cơ bản (B.16) 830 ml Dung dịch magie clorua (B . 19 . 2) 80 ml Dung dịch natri oxalat (B.19.3) 80 ml Dung dịch glucoza (B.19.4) 10 ml B.19.5.2 . Chuẩn bị Bổ sung một c á ch vô trùng các dung dịch magie clorua, natri oxalat và glucoza vào môi trường cơ bản đã được làm nguội đ ế n 47 ° C và trộn. B.19.5.3 . Chuẩn bị các đĩa thạch Rót các lượng khoảng 15 ml môi trường hoàn ch ỉ nh vào các đĩa Petri vô trùng (6.8). Để yên các đ ĩ a này cho môi trường lắng xuống. B.20 . Dung d ị ch muối B.20.1 . Thành ph ầ n Natri clorua 5 , 0 g Nước 1 000 ml B.20.2 . Chuẩn bị H òa tan natri clorua trong nước. Phân phối dung dịch vào các b ì nh cầu (6.7) có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp á p lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B.21 . Kali hydroxit tr ong dung dịch muối B.21.1 . Thành phần Kali hydroxit (KOH) 0 , 5 g Dung dịch muối (B.20) 100 ml B.21.2 . Chu ẩ n bị H òa tan kali hydroxit trong dung dịch muối. Phân phối dung dịch vào các bình cầu (6.7) có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . CHÚ THÍCH Dung dịch gốc kali hydroxit 40 % c ó th ể được chu ẩ n b ị và bảo quản ở 3 ° C ± 2 ° C. Pha lo ã ng dung d ịch n à y b ằ ng dung dịch NaC l 0 , 5 % với tỷ lệ 1 : 80 đ ể c ó được dung dịch KOH 0,5 %. B.22 . Canh thang thịt b ê pha l oãng B.22.1 . Thành phần Ch ấ t chi ế t từ thịt bê (dạng khô) 5,0 g S ả n ph ẩ m thủy phân casein b ằ ng enzym 10 g Natri c l orua 5g Nước c ấ t 1 000 ml B.22.2 . Chu ẩ n bị H òa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước b ằ ng cách đun sôi. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu cần. Phân phối môi trường với các lượng 10 ml v à o các ống nghiệm (6.6) và đậy nắp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B.23 . Glyxerol vô trù ng Phân phối glyxerol với các lượng 100 ml vào các bình cầu hoặc chai và khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . PHỤ LỤC C (Tham khảo) CÁC ĐẶC TRƯNG HÓA SINH CỦA YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS, YERSINIA ENTEROCOLITICA VÀ CÁC LOÀI CÓ HÓA SINH LIÊN QUAN Bảng C.1 - Các đặc trưng hóa sinh c ủ a Yersinia Phép thử Yersinia ps e udotuberculosis Yersin i a ent ero co l itica Các loài có li ê n quan Glucoza + a + + Sinh khí từ glucoza - - (hoặc một số bọt kh í ) - (hoặc một số bọt kh í ) Lactoza - - - ONPG + +/- +/- Adonitol - - - Cellobioza - + D Dulcitol - - - Mannitol + + + Melibioza +/- - D Rhamnoza + - D Sacaroza - + D Sorbitol - +/- D Trehaloza + +/- + Xyloza + D + Aesculin + D D Salicin + D D Ure + + + Indol - D D Voges Proskauer - + * /- D Hydro sulfua - - - Deaminaza (APP) - - - Lysin - - - Ornithin - +/- + Xitrat (Simmons) - - D Lipaza (Tween 80) - D D Mucat - D a + dương t í nh; - âm t í nh; +/- phần lớn các chủng dương t í nh; D các ki ể u hóa sinh khác nhau. * Các chủng thường âm t í nh ở 37 o C. PHỤ LỤC D (Tham khảo) BIOVAR (BIOTYPE) C Ủ A YERSINIA ENTEROCOLITICA Biovar Tween-estera z a Aesculin Pyra zi namidasa Indol Xy lo za Treha loza 1A a + + + + + + 1B + - - + + + 2 - - - ( + ) b + + 3 - - - - + + 4 - - - - - + 5 - - - - D b - a Không gây bệnh b Thường yếu và phát tri ể n chậm. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Wauters . G., Goossens. V., Janssens. M . and V anoepitte , J. New enrichment method for isolation of pathogenic Yersinia enlerocolitica serogroup O :3 from pork. Appl . Environ. Microbiol. , 54 . 1988. pp. 851-854 [2] DE Boer. E. Isolation of Yersinia enlerocolitica from foods, Int. J. Food Microbiol. , 17 , 1992 , pp. 75-84 [3] De Zutter. L. Le Mort. L, Janssens. M. and Wauters. G. Short-comings of irgasan ticarcillin chlorate broth for the enrichment of Yersinia enlerocolitica biovar 2, serovar 9 from meat. Int. J. Food. Microbiol. , 23 , 1994. pp. 231-237 [4] S chiemann , D.A. Synthesis of selective agar medium for Yersinia enterocolitica. Can. J Microbiol. , 25. 1979, pp. 1298-1304 [5] Aulisio. C.C.G., Mehlman, I.J. and Sanders. A. C . Alkali method for rapid recovery of Yersinia enlerocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from foods. Appl. Environ. Microbiol. , 39 . 1980. pp. 135-140 [6] Archer, J.R., Schell, R.F., Pennell, D.R. and Wi ck , P.D. Identi f ication of Yersinia spp. with the API 20E system. J. Clin. Microbiol. , 25 ,1987. pp. 2398-2399 [7] Sharma. N.K.. Do y le, P.W., GERBasi, S.A. and Jessop. J.H. Identi f ication of Yersinia spec i es by the API 20E. J. Clin. Microbiol. , 28. 1990, pp. 1443-1444 [8] Farmer III, J.J.. Carter, G.P., Miller, V.L., Falkow, S . and Wachsmuth, I.K. Pyrazinamidase, CR-MOX Agar. Salicin Fermentation - Esculin Hydrolysis, and D-Xylose f ermentation for identifying pathogenic serotypes of Yersinia enterocolitica . J. Clin. Microbiol ., 30. 1992. pp. 2589-2594 [9] Food and Drug Administration. Protocol in FDA. Yersinia enlerocolitica and Yersinia pseudotuberculosis . In: Bacteriological Analytical Manual , 8 t h edn., Washington, DC, 1998 . 1) Tùy thuộc vào sức đông của thạch.