TCVN9676:2013

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9676:2013 (ISO 11702:2009) về Dầu mỡ động vật và thực vật - Xác định hàm lượng sterol tổng số bằng phương pháp enzym TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9676:2013 ISO 11702:2009 DẦU MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG STEROL TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYM Animal and vegetable fats and oils – Enzymatic determination of total sterols content Lời nói đầu TCVN 9676:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 11702:2009; TCVN 9676:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật và thực vật biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. DẦU MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG STEROL TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYM Animal and vegetable fats and oils – Enzymatic determination of total sterols content 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng sterol tổng số bằng phép thử nhuộm màu sử dụng enzym. Phương pháp này có thể áp dụng cho các sterol tự do và sterol đã este hóa có trong dầu mỡ động vật và thực vật, thực phẩm giàu chất béo và các sản phẩm có liên quan. Phép xác định này có thể áp dụng cho mẫu ở chứa từ 1 g đến 2 g chất béo. Phương pháp này không áp dụng cho các loại dầu và mỡ có màu tối, ví dụ: dầu cọ thô. Enzym không chỉ đặc hiệu đối với cholesterol mà còn oxy hóa các 3-hydrosterol khác. Phương pháp này chưa được thử nghiệm trên các sản phẩm bổ sung sterol ở mức cao hơn. CHÚ THÍCH: Về mặt kỹ thuật, phương pháp này tương đương với phương pháp IUPAC 2.404 [8] và phương pháp chuẩn DGF F-III 2 (91) [7] . 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử. TCVN 6128 (ISO 661), Dầu mỡ động vật và thực vật – Chuẩn bị mẫu thử. 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: 3.1. Hàm lượng sterol tổng số (total sterols content) w sterol Phần khối lượng sterol xác định được bằng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này. CHÚ THÍCH 1: Đối với dầu mỡ thực vật, hàm lượng sterol được biểu thị theo β-sitosterol; đối với mỡ động vật thì được biểu thị theo cholesterol. CHÚ THÍCH 2: Hàm lượng sterol tổng số được biểu thị bằng miligam trên 100 g chất béo. 4. Nguyên tắc Mẫu thử được xà phòng hóa và các sterol trong các chất không xà phòng hóa được xác định bằng phương pháp enzym. Chúng được oxy hóa bằng cholesterol oxidase tạo thành cholestenon. Số mol hydro peroxit tương đương được tạo thành trong quá trình trên sẽ oxy hóa metanol với sự có mặt của catalase tạo thành formaldehyd. Với sự có mặt của các ion amoni, formaldehyd phản ứng với acetylaxeton tạo thành thuốc nhuộm lutidin màu vàng (3,5-diacetyl-1,4-dihydrolutidin). Hợp chất màu này được xác định bằng đo quang phổ trong dải khả biến ở 405 nm. Nồng độ của thuốc nhuộm này tương ứng với lượng sterol. CHÚ THÍCH: Cholesterol oxidase oxy hóa cholesterol và các sterol khác có nhóm hydroxyl ở vị trí 3β. Do đó, các sterol thực vật như stigmasterol và sitosterol cũng xác định được. 5. Thuốc thử CẢNH BÁO – Cần chú ý các quy định đối với việc xử lý các chất nguy hại. Phải tuân thủ các biện pháp kỹ thuật an toàn cho tổ chức và cá nhân. Chỉ sử dụng các thuốc thử thuộc loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác. 5.1. Nước , phù hợp với loại 3 quy định trong TCVN 4851 (ISO 3696), hoặc loại tốt hơn. 5.2. Isopropanol. 5.3. Axeton. 5.4. Axetyl axeton. 5.5. Huyền phù cholesterol oxidase 1) (EC 1.1.3.6) từ Nocardia erythropolis, 15 U/ml. 5.6. Huyền phù catalase (hydro peroxit oxido-reductase) 1) (EC 1.1.1.6) từ gan bê. 5.7. Axit clohydric , c(HCl) = 8 mol/l. 5.8. Dung dịch kali hydroxit trong metanol , c(KOH) = 0,5 mol/l. Hòa tan 2,8 g kali hydroxit trong một lượng nhỏ metanol nóng, làm nguội và pha loãng bằng metanol đến 100 ml. 5.9. Dung dịch đệm amoni phosphat , chỉnh đến pH 7. 5.10. Dung dịch 1 Cho 19,1 ml axeton (5.3) và 230 000 U catalase (5.6) vào 50 ml dung dịch đệm (5.9) đựng trong bình định mức một vạch 100 ml (6.4) và thêm nước (5.1) đến vạch. 5.11. Dung dịch 2 Cho 0,26 ml axetyl axeton (5.4) và 1,10 ml axeton (5.3) vào 25 ml nước (5.1) đựng trong bình định mức một vạch 50 ml (6.4) và thêm nước đến vạch. 5.12. Dung dịch 3 Trước khi sử dụng, trộn 3 thể tích của dung dịch 1 (5.10) với 2 thể tích dung dịch 2 (5.11). CHÚ THÍCH: Dung dịch 3 có thể giữ trong chai tối màu khoảng 3 tháng ở 4 o C với điều kiện là được chuẩn bị trong các điều kiện vô trùng. 6. Thiết bị, dụng cụ 6.1. Ống nghiệm , đường kính 18 mm. 6.2. Phễu lọc . 6.3. Giấy lọc gấp nếp , thích hợp với phễu lọc (6.2). 6.4. Bình định mức một vạch , dung tích 25 ml, 50 ml và 100 ml, phù hợp với loại A quy định trong TCVN 7153 (ISO 1042) [2] . 6.5. Pipet enzym , dung tích 0,02 ml phù hợp với loại A quy định trong ISO 7550 [6] và dung tích 1 ml phù hợp với loại A quy định trong TCVN 7151 (ISO 648) [1] . 6.6. Pipet , dung tích 5 ml, phù hợp với loại A quy định trong TCVN 7151 (ISO 648) [1] . 6.7. Bình cầu đáy tròn , có khớp nối mài chuẩn, dung tích 50 ml. 6.8. Ống nghiệm , có nút mài. 6.9. Máy đo quang phổ , cài đặt ở 405 nm. 6.10. Cuvet thủy tinh , chiều dài đường quang 1 cm, thích hợp với máy đo quang phổ (6.9). 6.11. Nồi cách thủy , kiểm soát được nhiệt độ từ 37 o C đến 40 o C. 6.12. Tủ lạnh , có thể duy trì ở nhiệt độ 4 o C. 6.13. Hạt thủy tinh. 6.14. Bộ sinh hàn , có khớp nối mài chuẩn. 7. Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 2625 (ISO 5555) [3] . 8. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6128 (ISO 661). Mẫu thử được xử lý đặc biệt (lọc, làm nóng chảy v.v…) phải được đề cập trong báo cáo thử nghiệm. 9. Cách tiến hành 9.1. Xà phòng hóa 9.1.1. Cân từ 1 g đến 2 g mẫu thử, chính xác đến 0,001 g, cho vào bình cầu đáy tròn 50 ml (6.7). Nồng độ sterol trong dung dịch thử phải trong khoảng từ 0,02 g/l đến 0,4 g/l. Điều này phải được tính đến trong các bước cân và pha loãng. Trong trường hợp chất béo đã bão hòa thì phải giảm bớt lượng cân, nếu không quá trình lọc sẽ không loại bỏ được hoàn toàn các axit béo tự do được tạo thành sau khi xà phòng hóa và axit hóa và sẽ ảnh hưởng đến phép xác định. Đảm bảo dung dịch thu được luôn trong suốt. 9.1.2. Thêm 10 ml dung dịch kali hydroxit trong metanol (5.8) và vài hạt thủy tinh (6.13). Làm nóng hỗn hợp và khi sôi thì cho hồi lưu 25 min. 9.1.3. Chuyển định lượng dung dịch xà phòng vẫn còn ấm vào bình định mức một vạch 25 ml (6.4) và rửa bình cầu đáy tròn bằng vài mililit isopropanol (5.2). 9.1.4. Dùng pipet (6.5) lấy 1ml axit hydrocloric (5.7) cho vào bình định mức một vạch 25 ml, thêm isopropanol (5.2) đến vạch và lắc mạnh. Đảm bảo dung dịch thu được luôn trong suốt. 9.1.5. Đặt bình cùng với hỗn hợp (9.1.4) trong tủ lạnh (6.12) và duy trì ở 4 o C trong 20 min. 9.1.6. Tiếp theo, lọc dung dịch (đục) càng nhanh càng tốt qua giấy lọc gấp nếp (6.3) và sử dụng ngay dịch lọc này để xác định bằng phương pháp enzym. 9.2. Xác định hàm lượng sterol bằng phương pháp enzym 9.2.1. Dùng pipet (6.6) lấy 5 ml dung dịch 3 (5.12) cho vào ống nghiệm (6.1) và thêm 0,4 ml dịch lọc (9.1.6). Trộn kỹ. 9.2.2. Chuyển 2,5 ml hỗn hợp này vào ống nghiệm có nắp đậy (6.8) và dùng pipet (6.5) thêm 0,02 ml huyền phù cholesterol oxidase (5.5). Trộn kỹ. 9.2.3. Chuyển phần còn lại của dung dịch từ 9.2.1 vào ống nghiệm có nắp đậy khác (6.8) để sử dụng làm phép thử trắng. 9.2.4. Đậy các ống nghiệm chứa mẫu thử và mẫu trắng và ủ trong nồi cách thủy khoảng 60 min ở nhiệt độ từ 37 o C đến 40 o C. 9.2.5. Sau khi làm nguội đến nhiệt độ phòng, đo ngay hệ số tắt của mẫu thử và mẫu trắng so với nước (5.1), lần lượt trong cùng cuvet trong máy đo quang phổ ở bước sóng 405 nm. 10. Kết quả của phép xác định Nồng độ khối lượng sterol tổng số của dịch lọc mẫu, ρ, tính bằng gam trên lít, được biểu thị theo cholesterol đối với mỡ động vật và theo β-sitosterol đối với dầu mỡ thực vật, được tính theo Công thức (1): (1) Trong đó: V 1 là thể tích của dịch lọc đã pha loãng, tính bằng mililit (ml) (5,4 ml, xem 9.2.1); M là khối lượng phân tử của cholesterol (M chol = 386,64 g/mol) hoặc của β-sitosterol (M β-sito = 414,69 g/mol); ε là hệ số hấp thụ (hệ số tắt) của lutidin ở bước sóng 405 nm (7,4 l.mmol -1 cm -1 ); l là chiều dài đường quang của cuvet thủy tinh, tính bằng xentimet (cm) (1 cm); V 2 là thể tích của dịch lỏng chưa pha loãng, tính bằng mililít (ml) (0,4 ml, xem 9.2.1); ∆A là chênh lệch giữa độ hấp thụ của phép thử trắng và của phần mẫu thử, với hệ số pha loãng 1,008 (2,52/2,50) cần để đưa vào phép tính sau đây: ∆A = 1,008(A 1 – A 0 ) Trong đó: A 1 là độ hấp thụ của phần mẫu thử ở bước sóng 405 nm, A 0 là độ hấp thụ của mẫu trắng ở bước sóng 405 nm. Nồng độ khối lượng sterol tổng số của dịch lọc mẫu, ρ, tính bằng gam trên lít, được tính theo Công thức (2), đối với dầu mỡ động vật: (2) Hoặc tính theo Công thức (3) đối với dầu mỡ động vật: (3) Khi được pha loãng (25 ml trong 9.1.4) thì hàm lượng sterol tổng số của mẫu thử, w sterol , tính bằng miligam trên 100 g, được tính bằng công thức (4): (4) Trong đó m là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (9.1.1). Phần khối lượng sterol tổng số (theo cholesterol hoặc β-sitosterol) được làm tròn đến số nguyên. 11. Độ chụm của phương pháp 11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và các chất nền đã nêu. 11.2. Giới hạn lặp lại Giới hạn lặp lại, r, là giá trị thấp hơn hoặc bằng với giá trị chênh lệch tuyệt đối giữa hai giá trị cuối cùng, mỗi một trong hai giá trị đại diện cho một dãy kết quả thử thu được trong điều kiện lặp lại, với xác suất 95%. Các điều kiện lặp lại được xác định như các điều kiện sử dụng để thu được các kết quả thử với cùng phương pháp, trên cùng vật liệu thử, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng một thiết bị và thuốc thử, trong một khoảng thời gian ngắn. 11.3. Giới hạn tái lập Giới hạn tái lập, R, là giá trị thấp hơn hoặc bằng với giá trị chênh lệch tuyệt đối giữa hai giá trị cuối cùng, mỗi một trong hai giá trị đại diện cho một dãy kết quả thử thu được trong điều kiện tái lập, với xác suất 95%. Các điều kiện tái lập được xác định như các điều kiện sử dụng để thu được các kết quả thử với cùng phương pháp, trên vật liệu thử giống nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị và thuốc thử khác nhau, trong một khoảng thời gian ngắn. 12. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được, nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được. Phụ lục A (Tham khảo) Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm Phép thử cộng tác quốc tế này có 16 phòng thử nghiệm tham gia, thực hiện trên ba mẫu. Phép thử này do Viện Tiêu chuẩn Đức (DIN) cộng tác với Deutsche Gesellschaft für Fettwissenschaft (DGF) tổ chức thực hiện và phân tích thống kê các kết quả thu được theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) [4] và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) [5] , cho các dữ liệu về độ chụm trong Bảng A.1. Bảng A.1 – Tóm tắt các kết quả thống kê Thông số Mẫu Dầu ôliu Dầu ngô tinh chế Dầu đậu nành tinh chế Số lượng phòng thử nghiệm tham gia, N 16 16 16 16 Số lượng phòng thử nghiệm giữ lại sau khi trừ ngoại lệ, n 16 15 15 15 Số lượng kết quả riêng lẻ của tất cả các phòng thử nghiệm trên từng mẫu, z 32 30 30 30 Giá trị trung bình , m, mg/100 g 138,7 693,4 242,7 242,1 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , mg/100 g 4,6 12,0 4,7 8,2 Hệ số biến thiên lặp lại, C V,r , % 3,3 1,7 1,9 3,4 Giới hạn lặp lại , r(= s r x 2,8), mg/100 g 12,9 33,7 13,3 23,1 Độ lệch chuẩn tái lập, s R , mg/100 g 21,0 105,9 25,9 43,0 Hệ số biến thiên tái lập, C V, R , % 15,1 15,3 10,7 17,8 Giới hạn tái lập , R (=s R x 2,8), mg/100g 59,5 299,7 73,2 121,7 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 7151 (ISO 648), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Pipet một mức [2] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Bình định mức [3] TCVN 2625 (ISO 5555), Dầu mỡ động vật và thực vật – Lấy mẫu [4] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung [5] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn [6] ISO 7550, Laboratory glassware – Disposable micropipettes [7] DGF standard method F-III 2 (91), Sterols – Enzymatic determination; Vjissenschaftliche Verlags – gesellschaft mbH, Stuttgart, 2006 [8] UIPAC Method 2.404. Determination of the total sterols content. In: Reference [9], pp.902-904 [9] NAUDET, M., HAUTFENNE, A. Standard method for the determination of total sterols in fats and oils (including results of a collaborative study). Pure Appl. Chem. 1985, 57 , pp. 899-904. Available (2009-07-30) at: http://old.iupac.org/publications/pac/1985/pdf/5706x0899.pdf 1) Kit thử đã chuẩn bị sẵn thích hợp để xác định cholesterol trong thực phẩm và các chất khác bằng phương pháp so màu có bán sẵn từ hãng R-Biopharm. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm đó. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.