TCVN8764:2012

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8764:2012 (ISO 13903:2005) về Thức ăn chăn nuôi - Phương pháp xác định hàm lượng axit amin TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8764:2012 ISO 13903:2005 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN Animal feeding stuffs - Determination of amino acids content Lời nói đầu TCVN 8764:2012 hoàn toàn tương đương với ISO 13903:2005 TCVN 8764:2012 do Cục Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ khoa học và Công nghệ công bố. THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT AMIN Animal feeding stuffs - Determination of amino acids content 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định axit amin tự do (tổng hợp và tự nhiên) và axit amin tổng số (liên kết peptit và tự do) trong thức ăn chăn nuôi với việc sử dụng thiết bị phân tích axit amin hoặc thiết bị HPLC. Áp dụng cho các axit amin sau: - tổng của cystin và cystein; - methionin; - lysin; - threonin; - alanin; - arginin; - axit aspartic; - axit glutamic; - glycin; - histidin; - iso leucin; - leucin; - phenylalanin; - prolin; - serin; - tyrosin; - valin. Phương pháp này không phân biệt giữa các muối của axit amin, cũng không phân biệt các dạng đồng phân D và L của axit amin. Phương pháp không cho phép xác định tryptophan hoặc các chất tương tự axit amin có chứa nhóm hydroxyl. Giới hạn định lượng của phương pháp phụ thuộc vào thiết bị sắc ký, nhưng có thể đạt được các mức thấp tới: 0,3 g/kg cho tổng lysin; 0,25 g/kg cho tổng methionin; 0,35 g/kg cho tổng của cystin và cystein; 0,2 g/kg cho tổng threonin; 0,035 g/kg cho lysin tự do; 0,035 g/kg cho methionin tự do và 0,03 g/kg cho threonin tự do. CHÚ THÍCH: Có thể đạt được giới hạn định lượng thấp hơn nhưng điều này phải được thẩm định bởi người sử dụng. 2. Nguyên tắc 2.1 Các axit amin tự do Các axit amin tự do được chiết với dung dịch axit clohydric loãng. Các chất đồng chiết xuất có phân tử lượng lớn chứa nitơ được kết tủa với axit sulfosalicylic và được loại bằng cách lọc. Dịch lọc được điều chỉnh pH tới 2,20. Axit amin được tách bằng sắc ký trao đổi ion và xác định bằng phản ứng với ninhydrin sử sụng detector quang đo ở bước sóng 570 nm. 2.2 Tổng số các axit amin Quá trình lựa chọn phụ thuộc vào các axit amin cần xác định. Cyst(e)in và methionin sẽ bị oxy hóa tạo thành axit cysteic và methion sulphon tương ứng, trước giai đoạn thủy phân. Tyrosin được xác định trong dịch thủy phân của các mẫu không oxy hóa. Tất cả các axit amin khác đã được nêu trong Điều 1 có thể được xác định cả ở dạng mẫu bị oxy hóa và không bị oxy hóa. Quá trình oxy hóa được thực hiện ở 0 O C với hỗn hợp axit performic và phenol. Thuốc thử oxy hóa dư được loại bỏ bằng natri đisulfit. Mẫu oxy hóa hoặc không oxy hóa được thủy phân cùng axit clohydric ( c =6 mol/l) trong 23 h. Dịch thủy phân được điều chỉnh bằng pH tới 2,20. Các axit amin được tách bằng sắc ký trao đổi ion và xác định bằng phản ứng với ninhydrin, sử dụng detector quang ở bước sóng 570 nm (bước sóng 440 nm đối với prolin). 3 Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử thuộc loại tinh khiết phân tích trừ khi có chỉ định khác. 3.1 Nước, sử dụng nước cất hai lần hoặc nước có chất lượng tương tự (độ dẫn điện <10> 3.2 Hydro peroxit , w = 30 %. 3.3 Axit formic , w = 98 % đến 100 %. 3.4 Axit clohydric , tỷ trọng khoảng 1,19 g/ml. 3.5 2,2'- thiodiethanol (thiodiglycol) 3.6 Dầu nhẹ , nhiệt độ sôi từ 40 O C đến 60 O C. 3.7 NorLeucin , hay bất kỳ chất khác phù hợp để sử dụng làm chất nội chuẩn. 3.8 Khí nitơ, (<10 phần="" triệu=""> 3.9 Các axit amin 3.9.1 Các chất chuẩn chỉ ra trong Điều 1. Sử dụng các hợp chất tinh khiết không chứa nước kết tinh. Làm khô trong chân không có chứa P 2 O 5 hoặc H 2 SO 4 trong 1 tuần trước khi sử dụng. 3.9.2 Axit cysteic 3.9.3 Methionin sulfon 3.10 Dung dịch natrihydroxit l, c = 7,5 mol/l. Hòa tan 300 g NaOH (3.6) trong nước và định mức đến 1 l. 3.11 Dung dịch natrihydroxit ll , c = 1 mol/l. Hòa tan 40 g NaOH trong nước (3.1) và định mức đến 1 l. 3.12 Dung dịch axit formic-phenol Trộn 889 g axit formic (3.3) với 111 g nước (3.1) và thêm 4,73 g phenol. 3.13 Hỗn hợp thủy phân , HCl c = 6 mol/l chứa 1 g phenol trong 1 l. Thêm 1 g phenol vào 492 ml HCl (3.4) và định mức tới 1 l bằng nước (3.1). 3.14 Hỗn hợp chiết , c = 0,1 mol/l HCl chứa 2 % thiodiglycol. Hút 8,2 ml HCl (3.4) pha loãng với khoảng 900 ml nước (3.1). Thêm 20 ml thiodiglycol (3.5) và định mức tới 1 l bằng nước, Không trộn trực tiếp 3.4 và 3.5 3.15 Axit 5-sulfosalicylic, β = 6 %. Hòa tan 60 g axit 5-sulfosalucylic ngậm hai phân tử nước trong nước (3.1) và định mức đến 1 l bằng nước. 3.16 Hỗn hợp oxy hóa (axit perfomic-phenol). Trộn 0,5 ml hydro peroxit (3.2) với 4,5 ml dung dịch axit formic-phenol (3.12) trong cốc nhỏ. Giữ ở nhiệt độ trong khoảng 20 o C đến 30 o C trong 1 h nhằm tạo ra axit perfomic, sau đó làm lạnh trong bể nước đá (15 min) trước khi thêm vào mẫu. Tránh tiếp xúc với da và nên mặc quần áo bảo hộ. 3.17 Đệm xitrat, Na + c = 0,2 mol/l , pH = 2,20. Hòa tan 19,61 g natri xitrat ngậm hai phân tử nước, 5 ml thiodiglycol (3.5), 1 g phenol và 16,50 ml HCl (3.4) trong khoảng 800 ml nước (3.1). Điều chỉnh pH tới 2,20. Định mức đến 1 l bằng nước. 3.18 Đệm rửa giải , chuẩn bị theo các điều kiện của thiết bị phân tích được sử dụng (4.9). 3.19 Thuốc thử ninhydrin, chuẩn bị theo các điều kiện của thiết bị phân tích được sử dụng (4.9). 3.20 Dung dịch chuẩn của các axit amin Các dung dịch chuẩn này được bảo quản ở nhiệt độ dưới 5 o C. 3.20.1 Dung dịch chuẩn gốc axit amin (3.9.1), c = 2,5 μmol/ml đối với mỗi loại trong axit HCl. Các dung dịch này thường có sẵn trên thị trường. 3.20.2 Dung dịch chuẩn gốc axit cysteic và methionin sulfon , c = 1,25 μmol/ml. Hòa tan 0,2115 g axit cysteic (3.9.2) và 0,2265 g methionin sulfon (3.9.3) trong đệm citrat (3.17) vào bình định mức 1 l và định mức đến vạch bằng đệm xitrat. Bảo quản dưới 5 O C không quá 12 tháng. Dung dịch này không nên dùng nếu dung dịch chuẩn gốc (3.20.1) có chứa axit cysteic và methionin sulfon. 3.20.3 Dung dịch chuẩn gốc và chất nội chuẩn , ví dụ như norleucin, c = 20 μmol/ml. Hòa tan 0,6560 g norleucin (3.7) trong đệm xitrat (3.17) vào bình định mức 250 ml và định mức đến vạch bằng đệm xitrat. Bảo quản dưới 5 O C không quá 6 tháng. 3.20.4 Dung dịch xây dựng đường chuẩn của các chất chuẩn axit amin , sử dụng cho các dịch thủy phân, axit cysteic và methionin sulfon c = 0,1 μmol/ml và các axit amin khác c = 0,2 μmol/ml. Hòa tan 2,2 g natri clorua trong cốc 100 ml với 30 ml đệm xitrat (3.17). Thêm 4,00 ml dung dịch chuẩn gốc axit amin (3.20.1), 4,00 ml dung dịch chuẩn gốc axit cysteic và methionin sulfon (3.20.2), và 0,50 ml chuẩn gốc của dung dịch nội chuẩn (3.20.3) nếu cần sử dụng. Điều chỉnh pH tới 2,20 bằng dung dịch natri hydroxit (3.11). Chuyển định lượng vào bình định mức 50 ml và định mức bằng đệm citrat (3.17), trộn đều. Bảo quản thấp hơn 5 o C không quá 3 tháng. Xem 9.1. 3.20.5 Dung dịch hiệu chuẩn của các chất chuẩn axit amin , sử dụng cho các dịch thủy phân được chuẩn bị theo 5.3.3.2 và sử dụng với các dịch chiết (5.2). Chuẩn bị dung dịch cho xây dựng đường chuẩn theo 3.20.4 nhưng không dùng natri clorua. Bảo quản dung dịch này dưới 5 o C không quá 3 tháng. 4 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị thông thường và cụ thể sau đây 4.1 Bình cầu đáy tròn , dung tích 100 ml hoặc 250 ml có sinh hàn hồi lưu. 4.2 Bình thủy tinh bosilicat , dung tích 100 ml với nắp bằng cao su/ teflon (ví dụ: Duran, Schott) sử dụng được trong tủ sấy. 4.3 Tủ sấy , có thông gió và có bộ điều khiển nhiệt độ với độ chính xác trên ± 2 o C. 4.4 Máy đo pH , đọc được đến ba số thập phân. 4.5 Màng lọc , 0,2 μm. 4.6 Máy ly tâm 4.7 Bộ cất quay chân không 4.8 Máy lắc và mấy khuấy từ 4.9 Máy phân tích axit amin hoặc thiết bị HPLC có cột trao đổi ion, thiết bị dẫn suất sau cột cho ninhydrin và detector quang. Cột được nhồi với các hạt nhựa polystyren đã được sulfonat hóa có khả năng tách axit amin ra khỏi nhau và khỏi các chất khác dương tính với ninhydrin. Tốc độ dòng của dung dịch đệm và ninhydrin được điều chỉnh bằng bơm để có tốc độ dòng ổn định ± 0,5 % trong suốt quá trình chạy đường chuẩn và phân tích mẫu. Đối với một số máy phân tích axit amin, quá trình thủy phân có thể được sử dụng mà trong đó dịch thủy phân có nồng độ natri c = 0,8 mol/l và chứa tất cả lượng axit formic dư từ bước oxy hóa. Một số máy khác sẽ không tách tốt một số axit amin nhất định nếu dung dịch thủy phân chứa nồng độ axit formic quá dư và/hoặc nồng độ ion natri cao. Trong trường hợp này, giảm thể tích axit bằng cách làm bay hơi tới xấp xỉ 5 ml sau khi thủy phân và trước khi điều chỉnh pH. Quá trình bay hơi nên thực hiện trong điều kiện chân không ở nhiệt độ không vượt quá 40 o C. 5 Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử Nghiền mẫu cho đến khi lọt qua lỗ sàng 0,5 mm. Các mẫu có độ ẩm cao sẽ được sấy khô bằng không khí ở nhiệt độ không quá 50 o C hoặc đông khô trước khi nghiền. Các mẫu có hàm lượng chất béo cao sẽ được chiết với dầu nhẹ (3.6) trước khi nghiền. 5.2 Xác định các axit amin tự do trong thức ăn chăn nuôi và thức ăn hỗn hợp Cân chính xác đến 0,2 mg một lượng phù hợp (1 g đến 5 g) mẫu thử (5.1) vào bình nón và thêm 100,0 ml của hỗn hợp dịch chiết (3.14). Lắc đều trong 60 min sử dụng máy lắc hoặc máy khuấy từ (4.8). Để cho lắng cặn rồi dùng pipet hút 10,0 ml dung dịch phía trên cho vào cốc có mỏ 100 ml. Thêm 5,0 ml dung dịch axit sulfasalicylic (3.15), trong khi dịch vẫn đang khuấy và tiếp tục khuấy bằng máy khuấy từ trong 5 min. Lọc hoặc ly tâm phần nổi phía trên để loại bỏ kết tủa. Lấy 10,0 ml dung dịch vào cốc 100 ml, điều chỉnh pH tới 2,20 bằng dung dịch natri hydroxit (3.11). Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức, tráng rửa bằng đệm citrat (3.17) và định mức đến vạch bằng dung dịch đệm. Nếu sử dụng chất nội chuẩn, thêm 1,00 ml dung dịch nội chuẩn (3.20.3) cho mỗi 100 ml dịch cuối và định mức đến vạch bằng dung dịch đệm (3.17). Chạy sắc ký tiếp theo 5.4. Nếu dịch chiết không được sử dụng cùng ngày thì phải bảo quản ở nhiệt độ dưới 5 o C. 5.3 Xác định các axit amin tổng số 5.3.1 Quá trình oxy hóa Cân một lượng chính xác đến 0,2 mg một lượng khoảng 0,1 g đến 1 g mẫu thử đã chuẩn bị (5.1) cho vào: - bình nón 100 ml (4.1) để thủy phân hở (5.3.2.3), hoặc - bình tam giác 250 ml (4.1) nếu yêu cầu nồng độ natri thấp (5.3.3.2) hoặc - bình 100 ml có nút nhám đậy để thủy phân kín (5.3.2.4). Lượng mẫu cân nên chứa hàm lượng nitơ khoảng 10 mg và hàm lượng nước không vượt quá 100 mg. Đặt bình tam giác / bình đựng mẫu vào bể nước đá và làm lạnh về 0 o C. Thêm 5 ml hỗn hợp oxy hóa (3.16) và trộn đều bằng cách sử dụng que khuấy thủy tinh có đầu cong. Đậy kín bình nón/bình đựng mẫu có chứa que khuấy bằng màng bọc kín khí, đặt bể điều nhiệt có chứa bình mẫu vào tủ lạnh ở 0 o C trong 16 h. Sau 16 h, lấy mẫu ra khỏi tủ lạnh và khử phần chất oxy hóa còn dư bằng cách thêm vào bình mẫu 0,84 g natri disulfit. Quy trình tiếp tục theo 5.3.2.1. 5.3.2 Quá trình thủy phân 5.3.2.1 Thủy phân mẫu đã được oxy hóa Đối với mẫu đã oxy hóa được chuẩn bị như 5.3.1, thêm 25 ml hỗn hợp chất thủy phân (3.13), tráng cẩn thận bình mẫu để lấy hết lượng mẫu còn bám trên thành bình và que khuấy. Tùy thuộc vào quá trình thủy phân được sử dụng, quy trình được thực hiện theo các bước nêu tại 5.3.2.3 hoặc 5.3.2.4. 5.3.2.2 Thủy phân các mẫu chưa được oxy hóa Cân chính xác đến 0,2 mg một lượng khoảng 0,1 g đến 1 g mẫu thử đã được chuẩn bị (5.1) cho vào bình nón dung tích 100 ml hoặc 250 ml (4.1) hoặc vào bình có nắp đậy dung tích 100 ml (4.2). Phần mẫu thử được cân nên chứa lượng nitơ khoảng 10 mg. Thêm cẩn thận vào bình 25 ml hỗn hợp chất thủy phân (3.13) và trộn đều mẫu. Quy trình được tiếp tục thực hiện theo các bước 5.3.2.3 hoặc 5.3.2.4. 5.3.2.3 Thủy phân hở Thêm ba viên thủy tinh trợ sôi vào bình đựng mẫu (đã được chuẩn bị ở 5.3.2.1 hoặc 5.3.2.2) và đun hồi lưu liên tục trong 23 h. Khi quá trình thủy phân kết thúc, rửa sinh hàn từ trên xuống bằng 5 ml dung dịch đệm xitrat (3.17). Tháo bình mẫu và làm lạnh trong bể nước đá. Quá trình tiếp tục thực hiện theo 5.3.3. 5.3.2.4 Thủy phân kín Đặt bình có chứa hỗn hợp mẫu đã được chuẩn bị theo 5.3.2.1 và 5.3.3.2 vào tủ sấy (4.3) đặt ở 110 o C. Trong 1 h đầu tiên, nhằm để ngăn sự tăng áp suất (do sự thoát ra của các chất khí) và để tránh bị nổ, đặt nắp đậy lên trên bình. Không vặn chặt nắp. Sau 1 h, vặn nắp bình đựng mẫu và đặt vào tủ sấy (4.3) trong 23 h. Khi quá trình thủy phân kết thúc, lấy bình mẫu ra khỏi tủ sấy, cẩn thận mở nút bình và đặt bình vào bể nước lạnh. Làm lạnh. Tùy thuộc vào quá trình điều chỉnh pH (5.3.3), chuyển định lượng mẫu trong bình sang bình nón 250 ml hoặc bình cầu đáy tròn 250 ml sử dụng dung dịch đệm xitrat (3.17). Tiến hành tiếp tục theo 5.3.3. 5.3.3 Điều chỉnh pH 5.3.3.1 Tùy thuộc vào mức độ dung nạp natri của máy phân tích axit amin (4.9), quá trình tiếp tục được thực hiện theo 5.3.3.2 hoặc 5.3.3.3 để điều chỉnh pH. 5.3.3.2 Khi máy phân tích axit amin đòi hỏi nồng độ natri thấp (thì thể tích axit phải giảm xuống) và đối với hệ thống sắc ký (4.9) cũng yêu cầu độ natri thấp, thì nên sử dụng dung dịch chuẩn gốc của chất nội chuẩn (3.20.3). Trong trường hợp này, thêm 2,00 ml dung dịch chuẩn gốc của chất nội chuẩn (3.20.3) để thủy phân trước khi làm bay hơi. Thêm 2 giọt dung dịch 1-octanol vào dung dịch thủy phân thu được từ 5.3.2.3 hoặc 5.3.2.4. Sử dụng thiết bị cất quay chân không (4.7) để làm giảm thể tích xuống 5 ml đến 10 ml dưới điều kiện chân không ở 40 o C. Nếu thể tích dung dịch còn dưới 5 ml, mẫu thủy phân phải bỏ đi và thực hiện lại quá trình phân tích từ đầu. Điều chỉnh pH đến 2,20 bằng dung dịch natri hydroxit ll (3.11) và thực hiện theo 5.3.4. 5.3.3.3 Đối với hệ thống sắc ký (4.9) không yêu cầu nồng độ natri thấp, lấy mẫu thủy phân thu được theo 5.3.2.3 và 5.3.2.4 và trung hòa từ từ cẩn thận bằng cách thêm 17 ml dung dịch natri hydroxit l (3.10), sử dụng máy khuấy từ, trong suốt quá trình này nhiệt độ phải luôn được giữ ở mức dưới 40 o C. Điều chỉnh pH đến 2,20 ở nhiệt độ phòng bằng dung dịch natri hydroxit l (3.10) và cuối cùng bằng dung dịch natri hydroxit ll (3.11). Tiếp tục thực hiện theo 5.3.4. 5.3.4 Dung dịch mẫu thử cho chạy sắc ký Chuyển toàn bộ lượng dịch thủy phân đã điều chỉnh pH (5.3.3.2 hoặc 5.3.3.3) cùng dung dịch đệm xitrat (3.17) vào bình định mức 200 ml và định mức đến vạch mức bằng dung dịch đệm. Nếu chất nội chuẩn không có sẵn, thêm 2 ml dung dịch chuẩn gốc của chất nội chuẩn (3.20.3) và định mức đến vạch mức bằng dung dịch đệm xitrat (3.17). Trộn đều cẩn thận. Thực hiện bước chạy sắc ký (5.4). Nếu dung dịch mẫu không được thực hiện trong cùng ngày, mẫu phải được bảo quản dưới 5 o C. 5.4 Chạy sắc ký Trước khi thực hiện chạy sắc ký, đưa dịch chiết (5.2) hoặc dịch thủy phân (5.3.4) về nhiệt độ phòng. Lắc đều hỗn hợp và lọc một lượng phù hợp qua màng lọc cỡ 0,2 μm (4.5). Đưa dịch lọc sạch vào sắc ký trao đổi ion, sử dụng máy phân tích axit amin hoặc thiết bị HPLC (4.9). Bơm mẫu có thể thực hiện bằng tay hoặc tự động. Điều quan trọng là đưa lên cột phân tích cùng một lượng dung dịch chất chuẩn và mẫu thử không sai khác quá 0,5 % trừ khi chất nội chuẩn được sử dụng, và tỷ lệ giữa lượng natri:axit amin trong chất chuẩn và dung dịch mẫu là tương tự nhau thì mới có thể thực hiện được. Nói chung, tần suất chạy dung dịch chuẩn phụ thuộc độ ổn định của thuốc thử ninhydrin và hệ thống phân tích. Pha loãng chất chuẩn hoặc mẫu với dung dịch đệm xitrat (3.17) để có được điện tích pic của chất chuẩn vào khoảng 30 % đến 200 % điện tích pic mẫu axit amin. Sắc ký đồ của axit amin sẽ thay đổi một ít tùy theo máy phân tích và chất nhồi cột được sử dụng. Hệ thống phân tích được chọn phải có khả năng tách được các axit amin ra khỏi nhau và ra khỏi các chất dương tính với ninhydrin. Trong phạm vi hoạt động, hệ thống sắc ký phải đáp ứng tuyến tính với các thay đổi về lượng axit amin đưa vào cột. Trong suốt quá trình chạy sắc ký, tỷ số giữa chiều cao lõm : pic đề cập ở dưới đây được áp dụng khi dung dịch có cùng nồng độ mol (của các axit amin đang xác định) được phân tích. Dung dịch axit amin cùng nồng độ mol này chứa ít nhất 30 % của lượng axit amin tải tối đa của mỗi axit amin mà có thể đo được chính xác với hệ thống máy phân tích axit amin (4.9). Để tách threonin và serin, tỷ số giữa chiều cao lõm : pic của pic thấp hơn trong hai axit amin chồng lên nhau trong sắc ký đồ không vượt quá 2 : 10 (nếu chỉ cystein, methionin và lysin được xác định, sự tách không rõ ràng giữa các pic liền kề sẽ gây sai số đến phép đo). Đối với tất cả các axit amin tỷ số tách tốt hơn nên là 1: 10. Hệ thống nên đảm bảo rằng lysin được tách khỏi "lysin nhân tạo" và ornithin. 6 Tính toán kết quả Diện tích pic của mẫu và chất chuẩn được đo cho mỗi axit amin và lượng mẫu được tính theo gam axit amin /kilogam mẫu, được tính theo công thức: w= Nếu chất nội chuẩn được sử dụng, thì nhân với Trong đó A e là diện tích pic của chất thủy phân hoặc chất chiết; A c là diện tích pic của dung dịch chuẩn hiệu chuẩn; A ie là diện tích pic của chất nội chuẩn trong thủy phân hoặc chiết; A ic là diện tích pic của chất nội chuẩn trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn; M là khối lượng phân tử của axit amin được xác định; C là nồng độ của chất chuẩn, μmol/ml; m là khối lượng mẫu, tính bằng g (tính về khối lượng ban đầu nếu mẫu được làm khô hoặc loại chất béo); V e là thể tích của tổng dịch thủy phân (5.3.4), tính bằng mililit, được tính theo tổng thể tích pha loãng của dịch chiết (6.1) được tính bằng mililit. Cả cystin và cystein được xác định giống như axit cysteic trong thủy phân mẫu đã oxy hóa, nhưng được tính theo tổng của cystein và cystin sử dụng M = 120,15 (= 0,5 x 240,30) (C 6 H 12 N 2 O 4 S 2 , M =240,30). Methionin được xác định như methionin sulfon trong thủy phân mẫu đã được oxy hóa, nhưng tính toán bằng cách sử dụng M của methionin = 149,21. Methionin tự do thêm vào được xác định sau khi chiết tách như methionin; tính toán tương tự sử dụng cùng chung M. Tổng thể tích dịch chiết pha loãng ( V e ) dùng để xác định các axit amin tự do (5.2) được tính theo công thức sau: V e = 100 x Trong đó V ef là thể tích chiết cuối cùng, tính bằng mililit. Các kết quả có thể tính theo %: kết quả tính theo % = 0,1 x kết quả tính theo gam trên kilogam. 7 Độ chụm 7.1 Các phép thử liên phòng thí nghiệm Chi tiết về độ chụm của phép thử liên phòng thử nghiệm của phương pháp được nêu tóm tắt trong phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các nền mẫu khác với các giá trị đã nêu. 7.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ độc lập thực hiện trên cùng phương pháp, cùng vật liệu thử giống hệt nhau cùng một phòng thí nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng một thiết bị, trong khoảng thời gian ngắn có thể, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r (=2,83 s r ) được đưa ra trong Bảng A2 cho thí nghiệm đầu tiên và Bảng A.6 tới A.10 cho thí nghiệm thứ hai. 7.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, sử dụng cùng một phương pháp trên cùng vật liệu thử, tại các phòng thí nghiệm khác nhau bởi người thực hiện khác nhau, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R ( = 2,83 s R ) được đưa ra trong Bảng A.4 cho thí nghiệm đầu tiên và Bảng A.6 tới A.10 cho thí nghiệm thứ hai. 8 Sử dụng vật liệu chuẩn Việc áp dụng đúng phương pháp sẽ được thẩm định lại bằng thực hiện phép đo lặp lại vật liệu chuẩn đã được chứng thực khi có thể. Nên hiệu chuẩn các dung dịch axit amin đã được chứng nhận. 9 Một số lưu ý trong phương pháp 9.1 Do việc sử dụng các thiết bị phân tích axit amin khác nhau, nên các nồng độ cuối của các axit amin (mục 3.20.4 và 3.20.5) và của dịch thủy phân (5.3.4) nên thực hiện theo trong hướng dẫn. Khoảng đáp ứng tuyến tính của thiết bị phân tích nên được kiểm tra áp dụng cho tất cả các axit amin. 9.2 Khi thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng để phân tích các dung dịch thủy phân, các điều kiện thí nghiệm nên được tối ưu hóa phù hợp với các yêu cầu của nhà cung cấp thiết bị. 9.3 Với việc sử dụng phương pháp để phân tích các mẫu thức ăn chăn nuôi có chứa hơn 1 % hàm lượng clo (thức ăn đậm đặc, thức ăn bổ sung khoáng, thức ăn bổ sung…) thì việc ước lượng thiếu hàm lượng methionin có thể xảy ra và cần có phương pháp xử lý đặc biệt theo cách dưới đây (phương pháp Slump). Sau khi thêm 5 ml hỗn hợp chất oxi hóa ở 5.3.1, thêm tiếp 12,5 ml nước và khuấy đều mẫu trên máy khuấy từ trong 15 min. Sau đó lại tiếp tục thực hiện quy trình thông thường. Quy trình này không dùng để định lượng xác định hàm lượng tổng số của cystein và cystin. Phụ lục A (Tham khảo) Kết quả thử nghiệm liên phòng thí nghiệm A.1 Phép thử lần thứ nhất Phương pháp được sử dụng trong thử nghiệm liên phòng quốc tế năm 1990 với 4 loại thức ăn gia súc khác nhau (thức ăn hỗn hợp cho lợn, thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gà thịt, thức ăn bổ sung đạm và premix). Kết quả, sau khi loại bỏ những số liệu không đạt được nêu trong Bảng A.1. Độ lặp lại biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn nội bộ trong phòng thử nghiệm đưa ra ở Bảng A.2 và A.3. Kết quả độ lệch chuẩn giữa các phòng thử nghiệm chỉ ra trong Bảng A.4 và A.5. Bảng A.1 - Hàm lượng axit amin Chất chuẩn Axit amin Threonin (g/kg) Tổng cystin và cystein (g/kg) Methionin (g/kg) Lysin (g/kg) Thức ăn hỗn hợp cho lợn 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gà thịt 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Thức ăn bổ sung protein 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premix 58,42 n = 16 - 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n là số phòng thì nghiệm tham gia thử Bảng A.2 - Độ lệch chuẩn trong phòng thí nghiệm ( s r ) Vật liệu đối chiếu Axit amin Threonin (g/kg) Tổng cystin và cystein (g/kg) Methionin (g/kg) Lysin (g/kg) Thức ăn hỗn hợp cho lợn 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gà thịt 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Thức ăn bổ sung protein 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premix 1,30 n = 16 - 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n là số phòng thí nghiệm tham gia thử nghiệm Bảng A.3 - Hệ số biến thiên (%) của độ lệch chuẩn trong phòng thí nghiệm ( s r ) Vật liệu đối chiếu Axit amin Threonin (g/kg) Tổng cystin và cystein (g/kg) Methionin (g/kg) Lysin (g/kg) Thức ăn hỗn hợp cho lợn 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gà thịt 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Thức ăn bổ sung protein 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premix 2,2 n = 16 - 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n là số phòng thí nghiệm tham gia thử nghiệm Bảng A.4 - Độ lệch chuẩn giữa các phòng thử nghiệm ( S R ) Vật liệu đối chiếu Axit amin Threonin (g/kg) Tổng cystin và cystein (g/kg) Methionin (g/kg) Lysin (g/kg) Thức ăn hỗn hợp cho lợn 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gà thịt 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Thức ăn bổ sung protein 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premix 2,49 n = 16 - 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n là số phòng thì nghiệm tham gia thử nghiệm Bảng A.5 - Hệ số biến thiên (%) của độ lệch chuẩn giữa các phòng thử nghiệm ( S R ) Vật liệu đối chiếu Axit amin Threonin (g/kg) Tổng cystin và Cystein (g/kg) Methionin (g/kg) Lysin (g/kg) Thức ăn hỗn hợp cho lợn 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gà thịt 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Thức ăn bổ sung protein 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premix 4,3 n = 16 - 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n là số phòng thì nghiệm tham gia thử nghiệm A.2 Phép thử lần thứ hai Các mẫu thức ăn cho gà nuôi thịt giai đoạn vỗ béo, thức ăn cho gà nuôi thịt giai đoạn khởi động, ngô, bột cá và bột phụ phẩm gia cầm được gửi nhắc lại hai lần tới hai mươi ba phòng thử nghiệm. Kết quả được đưa ra trong các Bảng A.6 đến A.10. Bảng A.6 - Hiệu năng của phương pháp phân tích axit amin trong bột phụ phẩm gia cầm Axit Amin Số lần xác định đơn lẻ Giá trị trung bình s r Độ lệch chuẩn lặp lại (%) s R Độ lệch chuẩn tái lập (%) Alanin 42 4,26 0,087 2,04 0,210 4,93 Arginin 46 4,35 0,144 3,31 0,420 9,66 Axit aspartic 44 4,92 0,132 2,68 0,376 7,64 Cystin và cystein 42 0,81 0,037 4,57 0,143 17,65 Axit glutamic 46 7,97 0,216 2,71 0,728 9,13 Glycin 38 6,90 0,085 1,23 0,286 4,14 Histidin 38 1,31 0,036 2,75 0,242 18,47 Isoleucin 46 2,24 0,060 2,68 0,261 11,65 Leucin 46 4,09 0,101 2,47 0,310 7,58 Lysin 46 3,63 0,112 3,09 0,360 9,92 Methionin 40 1,17 0,025 2,14 0,140 11,97 Phenylalanin 44 2,33 0,082 3,52 0,215 9,23 Prolin 34 4,53 0,102 2,25 0,283 6,25 Serin 44 2,76 0,116 4,20 0,347 12,57 Threonin 44 2,32 0,073 3,15 0,212 9,14 Valin 44 2,82 0,090 3,19 0,361 12,80 Bảng A.7 - Hiệu năng của phương pháp phân tích axit amin trong thức ăn hỗn hợp cho gà nuôi thịt giai đoạn vỗ béo Axit Amin Số lần xác định đơn lẻ Giá trị trung bình s r Độ lệch chuẩn lặp lại (%) s R Độ lệch chuẩn tái lập (%) Alanin 44 1,17 0,032 2,74 0,099 8,46 Arginin 44 1,28 0,030 2,34 0,110 8,59 Axit aspartic 46 1,68 0,047 2,80 0,121 7,20 Cystin và cystein 38 0,32 0,010 3,13 0,036 11,25 Axit glutamic 44 3,25 0,052 1,60 0,226 6,95 Glycin 46 1,27 0,029 2,28 0,085 6,69 Histidin 34 0,50 0,020 4,00 0,099 19,80 Isoleucin 42 0,76 0,024 3,16 0,052 6,84 Leucin 46 1,66 0,044 2,65 0,105 6,33 Lysin 44 1,07 0,037 3,46 0,096 8,97 Methionin 38 0,53 0,006 1,13 0,040 7,55 Phenylalanin 44 0,87 0,038 4,37 0,127 14,60 Prolin 36 1,39 0,044 3,17 0,124 8,92 Serin 44 0,94 0,044 4,68 0,127 13,51 Threonin 40 0,73 0,020 2,74 0,060 8,22 Valin 44 0,92 0,035 3,80 0,117 12,72 Bảng A.8 - Hiệu năng của phương pháp phân tích axit amin trong thức ăn cho gà nuôi thịt giai đoạn khởi động Axit Amin Số lần xác định đơn lẻ Giá trị trung bình s r Độ lệch chuẩn lặp lại (%) s R Độ lệch chuẩn tái lập (%) Alanin 46 1,28 0,027 2,11 0,100 7,81 Arginin 46 1,57 0,042 2,68 0,129 8,22 Axit aspartic 40 2,29 0,035 1,53 0,137 5,98 Cystin và cystein 38 0,35 0,006 1,71 0,056 16,00 Axit glutamic 46 4,04 0,072 1,78 0,339 8,39 Glycin 46 1,27 0,034 2,66 0,090 7,09 Histidin 40 0,65 0,018 2,77 0,100 15,38 Isoleucin 46 0,95 0,019 2,00 0,098 10,32 Leucin 46 1,97 0,033 1,68 0,124 6,29 Lysin 46 1,35 0,032 2,37 0,122 9,04 Methionin 42 0,62 0,013 2,10 0,063 10,16 Phenylalanin 42 1,12 0,025 2,23 0,101 9,02 Prolin 36 1,47 0,060 4,08 0,128 8,71 Serin 44 1,12 0,028 2,50 0,153 13,66 Threonin 44 1,12 0,024 2,73 0,087 9,89 Valin 40 1,11 0,019 1,71 0,98 8,83 Bảng A.9 - Hiệu năng của phương pháp phân tích axit amin trong ngô Axit Amin Số lần xác định đơn lẻ Giá trị trung bình s r Độ lệch chuẩn lặp lại (%) s R Độ lệch chuẩn tái lập (%) Alanin 44 0,61 0,009 1,48 0,049 8,03 Arginin 44 0,40 0,013 3,25 0,038 9,50 Axit aspartic 44 0,54 0,015 2,78 0,045 8,33 Cystin và cystein 38 0,18 0,007 3,89 0,025 13,89 Axit glutamic 40 1,51 0,036 2,38 0,094 6,23 Glycin 46 0,33 0,010 3,03 0,030 9,09 Histidin 42 0,27 0,019 7,04 0,063 23,33 Isoleucin 44 0,28 0,015 5,38 0,041 14,62 Leucin 44 0,99 0,019 1,92 0,069 6,97 Lysin 44 0,26 0,008 3,08 0,034 13,08 Methionin 42 0,18 0,010 5,56 0,021 11,67 Phenylalanin 40 0,38 0,009 2,37 0,073 19,21 Prolin 34 0,73 0,019 2,60 0,044 6,03 Serin 40 0,39 0,007 1,79 0,040 10,26 Threonin 44 0,29 0,012 4,14 0,034 11,72 Valin 46 0,38 0,009 2,37 0,061 16,05 Bảng A.10 - Hiệu năng của phương pháp phân tích axit amin trong bột cá Axit Amin Số lần xác định đơn lẻ Giá trị trung bình s r Độ lệch chuẩn lặp lại (%) s R Độ lệch chuẩn tái lập (%) Alanin 42 3,50 0,073 2,09 0,223 6,37 Arginin 46 3,40 0,117 3,00 0,280 7,18 Axit aspartic 46 5,22 0,108 2,07 0,327 6,26 Cystin và cystein 38 0,48 0,019 3,96 0,091 18,96 Axit glutamic 46 7,37 0,063 0,85 0,347 4,71 Glycin 46 3,84 0,059 1,54 0,215 5,60 Histidin 38 1,37 0,033 2,41 0,176 12,85 Isoleucin 46 2,32 0,049 2,11 0,238 10,26 Leucin 46 4,07 0,079 1,94 0,276 6,78 Lysin 44 4,22 0,117 2,77 0,335 7,94 Methionin 42 1,61 0,030 1,86 0,156 9,69 Phenylalanin 40 2,29 0,037 1,62 0,176 7,69 Prolin 36 2,62 0,079 3,02 0,326 12,44 Serin 42 2,21 0,048 2,17 0,248 11,22 Threonin 44 2,28 0,081 3,55 0,244 10,70 Valin 44 2,78 0,063 2,27 0,311 11,19 Phụ lục B (tham khảo) Sắc ký đồ của mẫu X Thời gian lưu, min Y Điện áp, vol Hình B.1 - Chuẩn axit amin (570 nm) X Thời gian lưu, min Y điện áp, vol Hình B.2 - Mẫu thức ăn cho lợn đã oxy hóa (570 nm) THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Commission directive 98/64/EC of 3 September 1998, establishing community method of analysis for the determination of amino acid, crude oil and fat, and olaquindox in feeding stuffs. [2] Llames and Fontaine, Journal of AOAC international, 77, No.6, 1994, pp. 1362-1402.