TCVN9298:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9298:2014 về Vi sinh vật - Bảo quản dài hạn vi sinh vật dùng trong nông nghiệp - Phương pháp đông khô TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9298:2014 VI SINH VẬT - BẢO QUẢN DÀI HẠN VI SINH VẬT DÙNG TRONG NÔNG NGHIỆP - PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ Microorganisms - Long term preservation of microorganisms used in agriculture - Lyophilization method Lời nói đ ầ u TCVN 9298:2014 do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa biên soạn , Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị , Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. VI SINH VẬT - BẢO QUẢN DÀI HẠN VI SINH VẬT DÙNG TRONG NÔNG NGHIỆP - PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ Microorganisms - Long term preservation of microorganisms used in agriculture - Lyophilization methoơ 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc bảo quản dài hạn vi sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm sợi) dị dưỡng hiếu kh í và vi hiếu khí sử dụng trong nông nghiệp (trừ vi sinh vật dùng trong lĩnh vực thú y) dưới dạng sinh dưỡng và bào tử trong điều kiện vô trùng bằng phương pháp đông khô. 2. Thuật ngữ, định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau: 2.1 M ẫ u gióng (sample of culture) Giống đã được chọn lọc, lai tạo, có tính di truyền ổn đ ị nh và không bị tạp nhiễm. 2 . 2 Bảo quản dài hạn vi sinh vật (long term preservation of microorganisms) Việc duy trì các chủng vi sinh vật thuần khiết, trong điều kiện phù hợp, bảo đảm mật độ tế bào vi sinh vật không nhỏ hơn 10 3 CFU/ml, không bị tạp nhiễm, bảo tồn hoạt tính sinh học ban đầu và thời gian bảo quản không nhỏ hơn 10 năm. 2 . 3 Tỷ lệ sóng của vi sinh vật (survival rate of microorganisms) Phần trăm giữa lượng t ế bào hoặc bào tử tại thời đi ể m kiểm tra mẫu bảo quản và lượng tế bào hoặc bào tử ngay trước khi bảo quản. 2.4. Vi sinh vật tạp (contaminating microorganisms) Vi sinh vật không đồng nhất về hình thái tế bào và khuẩn lạc so với giống vi sinh vật ban đầu. 2.5 Hoạt tính sinh học của vi sinh vật (bioactivity of microorganisms) Khả năng của vi sinh vật thông qua hoạt động sống của chúng có tác dụng đến quá trình sinh trưởng, phát triển của cây trồng, vật nuôi, kiểm soát sinh học và sinh thái môi trường. 2.6 Môi trường nuôi cấy (cultural medium) Môi trường thích hợp cho sự phát triển của một loài hay một nhóm vi sinh vật nào đó. 3. Môi trường nuôi cấy và thuốc thử 3.1. Môi trường nuôi cấy 3.1.1. Thành phần Có thể sử dụng môi tr ườ ng có bán sẵn trên thị trường hoặc môi trường dưới đây: 3 . 1.1.1 Môi trường để nuôi cấy vi khuẩn - Môi trường YM (Yeast Mannitol) Xem A.1 của Phụ lục A. - Môi tr ườ ng Ashby Xem A.2 của Phụ lục A. - Môi trường DAC Xem A.3 của Phụ lục A. - Môi trường Pikovskaya Xem A.4 của Phụ lục A. - Môi trường King B Xem A.5 của Phụ lục A. - Môi trường SP (Sucrose Peptone) Xem A .6 của Phụ lục A. - Môi trường Thịt - Pepton Xem A.7 của Phụ lục A. 3.1.1 . 2 Môi trường để nuôi cấy xạ khuẩn - Môi trường Gauze Xem A .8 của Phụ lục A. - Môi trường ISP - 4 (Inorganic Salts starch - 4) Xem A.9 của Phụ lục A. 3.1.1.3. Môi trường để nuôi cấy nấm men - Môi trường Hansen Xem A.10 của Phụ lục A. 3.1.1 . 4 Môi trường để nuôi c ấ y nấm sợi - Môi trường Czapeck Xem A.11 của Phụ lục A. - Môi trường Czapeck - Dox Xem A.12 của Phụ lục A. - Môi trường PD (Potato Dextrose) Xem A.13 của Phụ lục A. 3.1.2. Cách chuẩn bị Cân và hòa tan các thành phần môi trường trong nước cất theo thứ tự đã cho. 3.1 . 2.1 Môi trường thạch nghiêng Phân phối từ 4 ml đến 6 ml môi trường (3.1.1) vào các ống nghiệm (4.2.3), đậy nút, khử trùng 30 min ở 121 °C trong nồi hấp áp lực (4.1.3), làm nguội đến 50 °C, đặt ống nghiệm nghiêng khoảng 45°, để yên cho đông đặc, đợi bề mặt thạch khô tiến hành cấy giống. 3.1.2.2 Môi trường dịch thể Phân ph ố i môi trường (3.1.1) vào bình tam gi á c (4.2.2), đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 °C trong nồi hấp áp lực (4.1.3). 3.1.2.3. Môi trường thạch đĩa Phân phối môi trường (3.1.1) vào b ì nh tam giác (4.2.2), đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 °C trong nồi hấp áp lực (4.1.3), làm nguội đến 50 °C, phân phối các lượng từ 15 ml đến 20 ml môi trường vào các đĩa Petri (4.2.4) đã chuẩn b ị sẵn (4.3); tiến hành trong t ủ cấy vô trùng (4.1.2). 3.2. Môi trường bảo vệ 3.2.1. Thành phần Sữa gầy (Skim milk) 20,0 g Meso - inositol (C 6 H 12 O 6 ) 5,0 g Nước cất vừa đủ 100 ml 3.2.2. Cách chuẩn bị Cân và hòa tan các thành phần môi trường bảo vệ trong nước cất theo thứ tự đã cho (3.2.1). Sau đó cho vào bình tam giác (4.2.2), khử trùng ở 115 °C không quá 15 min trong nồi hấp áp lực (4.1.3). 3.3. Dung dịch pha loãng Dung dịch pha loãng là nước mu ố i sinh lý (NaCI 0,85 %), pH = 7, không chứa các hợp chất nitơ; Lấy 9 ml dịch pha loãng cho vào các ống nghiệm (4.2.3) hoặc 90 ml dịch pha loãng cho vào các bình tam giác (4.2.2), đậy nút bông và khử trùng ở 121 °C không ít hơn 20 min trong nồi hấp áp lực (4.1.3). 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và cụ thể như sau: 4.1. Thiết bị 4.1. 1 Máy đông khô , nhiệt độ đông lạnh -50 °C, yêu cầu bơm chân không 144 L/min, cỏ hệ thống hàn ống tự động 4 . 1.2 Tủ cấy vô trùng , vận tốc dòng khí trung b ì nh 0,79 m/s, lưu lượng khí 1204 m 3 /h, màng lọc ULPA với kích thước lỗ từ 0,1 m m đến 0,3 m m. 4.1.3. Nồi hấp áp lực , áp suất tối thiểu 101,3 kPa, nhiệt độ 121 °C. 4.1.4 Tủ sấy , nhiệt độ từ 40 °C đến 260 °C. 4.1.5. Tủ ấm , nhiệt độ từ 20 °C đến 60 °C. 4.1. 6 Cân kỹ thuật, c ó độ chính xác đến 0,01 g. 4.1. 7 Máy đo pH , có dải đo pH từ 0 đến 14. 4.1.8 M á y trộn (Voltex), tốc độ 1000 r/min. 4.2. Dụng cụ 4.2.1. Ống đông khô (ampul ), bằng thủy tinh trung tính. 4.2.2. Bình tam giác, dung tích 250 ml. 4.2.3. Ống nghiệm, 18 mm X 180 mm. 4.2.4. Đĩa Petri , đường kính 90 mm. 4.2.5. Que cấy. 4.2.6. Que gạt mẫu (bàn trang). 4.2.7 . Pipet (Micropipet), có thể lấy các thể tích 0,1 ml và 1 ml. 4.2.8. Đèn đo chân không, có đèn UV . 4.3. Chuẩn bị dụng cụ Dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy, bảo quản vi sinh vật phải được rửa sạch, tiệt trùng bằng một trong các phương pháp dưới đây: + Khử trùng khô: Giữ ở nhiệt độ 180 °C không ít hơn 1 h trong tủ sấy (4.1.4) hoặc; + Khử trùng ướt: Giữ ở nhiệt độ 121 °C không ít hơn 30 min trong nồi hấp áp lực (4.1.3). Rửa sạch ố ng đông khô (ampul) (4.2.1); sau đó ngâm trong dung dịch HCI 2 % trong 12 h, rửa lại bằng nước máy từ 3 lần đến 4 lần, tráng lại bằng nước cất, làm khô và chuẩn bị nút bông, khử trùng bằng cách giữ ở nhiệt độ 121 °C không ít hơn 30 min trong nồi hấp áp lực (4.1.3). 5. Cách tiến hành 5.1. Tạo sinh khối vi sinh vật Mẫu giống (2.1) được nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng đã chuẩn bị sẵn (3.1.2.1), ở nhiệt độ và thời gian thích hợp (từ 28 °C đến 30 °C không ít hơn 2 ngày đối với vi khuẩn, nấm men, từ 28 °C đến 30 °C không ít hơn 3 ngày đối với nấm sợi và từ 35 °C đến 37 °C không ít hơn 5 ngày đối với xạ khuẩn) để vi sinh vật phát triển đồng đều trên vết cấy, thu sinh khối vi sinh vật đ ể tiến hành bảo quản; tiến hành trong tủ cấy vô trùng (4.1.2). 5.2. Tạo dịch huyền phủ vi sinh vật D ị ch huyền phủ vi sinh vật được chuẩn b ị bằng cách cho 2 ml dịch môi trường bảo vệ đã chuẩn b ị sẵn (3.2.2) vào ống thạch nghiêng đã nuôi cấy vi sinh vật (5.1), sau đó dùng pipet Pas t eur khuấy nhẹ tạo dịch huyền phù đồng nhất, đảm bảo mật độ tế bào vi sinh vật không nhỏ hơn 10 8 tế bào/ml. Dùng pipet vô trùng lấy 1 ml dịch huyền phù vi sinh vật nhỏ vào đáy ố ng đông khô (ampul), không để dính vi sinh vật lên mép hoặc t hành ống đông khô (ampul). Tiến hành trong tủ cấy vô trùng (4.1.2). 5.3. Quá trình đông khô Ống đông khô (5.2) được giữ ở nhiệt độ từ -40 °C đến -80 °C trong thời gian không ít hơn 6 h; Ống đông khô được lắp vào hệ thống đông khô và quá tr ì nh làm mất nước trong điều kiện lạnh được tiến hành trong thời gian từ 3 h đến 4 h; Tạo chỗ thắt trên ống đông khô, khoảng cách chỗ thắt từ 1,0 cm đến 1,5 cm; Ống đông khô sau khi được làm thắt tiếp tục được làm khô trong thời gian 3 h và áp suất không lớn hơn 6.10 - 1 mBar, Hàn kín ống đông khô được thực hiện trực tiếp trên máy đông khô. 5.4. Ch ấ t lượng của mẫu sau đông khô - Ống đông khô có độ chân không tuyệt đối; - Tỷ lệ sống của mẫu giống sau đông khô không ít hơn 10 6 CFU/ml; - Không chứa vi sinh vật tạp; - Hoạt tính sinh học của mẫu giống không thay đổi so với trước bảo quản. 5.5. Bảo quản M ẫ u được bảo quản ở 4 °C hoặc ở nhiệt độ phòng. Thời gian bảo quản không ít hơn 10 năm. 5.6. Kiểm tra mẫu 5.6.1. Độ chân không của mẫu Sử dụng đèn phát hiện mức độ chân không: Đổi với các mẫu đạt độ chân không cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím nhạt, đ ố i với các mẫu không đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu hoặc màu tím đậm. 5.6.2. Tỷ lệ sống của vi sinh vật 5.6.2.1. Chuẩn bị dung dịch huyền phù vi sinh vật Lấy mẫu bảo quản cần kiểm tra ra khỏi nhiệt độ bảo quản. Khi nhiệt độ của mẫu bảo quản bằng nhiệt độ phòng thí nghiệm, tiến hành kiểm tra mẫu. Vô trùng bên ngoài ampul bằng gạc tẩm cồn. M ở ống đông khô bằng cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn và làm lạnh đột ngột bằng cồn đốt. Dùng pipet vô trùng thêm 1 ml môi trường nuôi cấy dịch thể (3.1.2.2) vào ống đông khô để hydrat hóa mẫu giống. Lắc kỹ trong 5 min đ ể đảm bảo các tế bào được phân bổ đều. Dung dịch được tạo ra gọi là dịch huyền phù ban đầu. Dùng pipet vô trùng l ấ y toàn bộ dịch huyền phù ban đầu (1 ml) cho vào 9 ml dung dịch pha loãng đã chuẩn b ị sẵn (3.3), tránh chạm đầu pipet vào dung d ị ch pha loãng. Trộn kỹ bằng máy trộn Vortex (4.1.8) để dung dịch pha loãng mẫu có nồng độ pha loãng là 10 -2 . Tiếp tục pha loãng để đạt được độ pha loãng 10 - 4 , 10 - 5 , 10 -6 . Tiến hành trong tủ cấy vô trùng (4.1.2). 5.6.2.2. Cấy mẫu Dùng pipet vô trùng lấy một lượng (thường là 0,1 ml) dung dịch huyền phù vi sinh vật cấy vào đĩa Petri chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn (3.1.2.3). Mỗi nồng độ pha loãng được cấy lặp lại không ít hơn 2 đĩa Petri. Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dung dịch huyền phù vi sinh vật thấm đều trên bề mặt thạch. Tiến hành trong tủ c ấ y vô trùng (4.1.2). Đợi khô bề mặt thạch, úp ngược đĩa Petri, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ và thời gian thích hợp (từ 28 °C đến 30 °C không ít hơn 2 ngày đối với vi khuẩn, nấm men, từ 28 °C đ ế n 30 °C không ít hơn 3 ngày đối với nấm sợi và từ 35 °C đến 37 °C không ít hơn 5 ngày đối với xạ khuẩn). 5.6.2.3. Tính kết quả Đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng trên mỗi đĩa Petri. Số lượng vi sinh vật trong mẫu thử được tính theo công thức ( 1 ): N = x 100 (1) trong đó: N là số lượng vi sinh vật trong mẫu thử, tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mililit (CFU/ml); S C l à tổng s ố khu ẩ n lạc đặc trưng đ ế m được trên tất cả các đĩa Petri được giữ lại; V là thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa Petri, tính bằng mililit (ml); n 1 là số đĩa Petri được giữ lại ở độ pha loãng t hứ nhất; n 2 là số đĩa Petri được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai; d là hệ số pha lo ã ng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất. CH Ú TH Í CH: 1) Đếm ở các đĩa Petri có chứa không quá 300 khuẩn lạc ở hai độ pha loãng kế tiếp nhau và điều cơ b ả n là một trong các đĩa này có chứa ít nhất 15 khuẩn lạc; 2) Làm tròn kết quả đến hai chữ s ố có nghĩa; 3) Biểu thị kết quả bằng s ố từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10 x , trong đó X là lũy thừa tương ứng của 10. Tỷ lệ sống của mẫu giống được tính theo công thức (2): R = x 100 (2) trong đó: R là tỷ lệ s ố ng của mẫu giống, tính bằng phần trăm (%); N 1 là số lượng vi sinh vật trong thử sau bảo quản, tính bằng đơn v ị hình thành khuẩn lạc trên mililit (CFU/ml); N o là số lượng vi sinh vật trong mẫu thử trước bảo qu ả n, tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mililit (CFU/ml). 5 . 6.3 Kiểm tra vi sinh vật tạp 5.6.3.1. Chuẩn bị dung dịch huyền phù vi sinh vật Xem 5.6.2.1 5.6.3.2. Cấy m ẫ u Xem 5.6.2.2 5.6.3.3. Đọc kết quả Quan sát các khuẩn lạc vi sinh vật mọc trên đĩa Petri (5.6.2.2), nếu thấy các khuẩn lạc không đặc trưng của mẫu giống chứng tỏ mẫu thử chứa vi sinh vật tạp. 5.6.4. Hoạt tính sinh học Tiến hành theo những phương pháp cụ thể phụ thuộc vào đặc tính sinh học của từng mẫu gi ố ng. Phụ lục A (Qui định) Thành phần môi trường nuôi cấy A.1 Môi trường YM (Yeast Mannitol) Mannitol (C 6 H 8 (OH) 6 ) 10,0 g Dikali hydro phosphat (K 2 HPO 4 ) 0,5 g Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgS O 4 .7H 2 O ) 0,2 g Natri clorua (NaCI) 0,1 g Chất chiết n ấ m men 0,5 g Canxi cacbonat (CaC O 3 ) 0,5 g Dung dịch công gô đỏ (C 32 H 22 O 6 H 6 S 2 Na 2 ) 1% * 2,5 ml Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 6,8 đến 7,0 CHÚ THÍCH: 1) * Dung dịch công gô đỏ 1%: Hòa tan 1 g công gô đỏ trong 100 ml nước cất 2) Nếu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa th ì bổ sung 20,0 g thạch. A.2 Môi trường Ashby Mannitol (C 6 H 8 (OH) 6 ) 20, 0 g Dikali hydro phosphat (K 2 HPO 4 ) 0,2 g Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgS O 4 .7H 2 O ) 0,2 g Natri clorua (NaCI) 0,2 g Kali sulphat (K 2 SO 4 ) 0,1 g Canxi cacbonat (CaC O 3 ) 5,0 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 6,8 đến 7,0 CHÚ THÍCH: Nếu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa th ì b ổ sung 20,0 g thạch. A.3 Môi trường DAC Axit malic (C 4 H 6 0 5 ) 5,0 g Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) 0,5 g Sắt sulphat ngậm bảy phân tử nước (FeS O 4 .7H 2 O ) 0,05 g Mangan sulphat (MnS O 4 ) 0,01 g Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgS O 4 .7H 2 O ) 0,1 g Natri clorua (NaCI) 0,02 g Canxi clorua (CaCI 2 ) 0,01 g Natri molybdat (Na 2 Mo O 4 ) 0,002 g Dung dịch Bromotymol blue (C 27 H 2 8 Br 2 O 5 S) 5 %* 2,0 ml Hoặc dung dịch công gô đỏ (C 32 H 22 O 6 H 6 S 2 Na 2 ) 1 %** 2,5 ml Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 6,8 đến 7,0 CHÚ THÍCH : 1) * Dung dịch Bromotymol blue 5%: Hòa tan 5 g Bromotymol blue vào 100 ml Etanol (C 2 H 5 OH) 20% 2) ** Dung dịch công gô đỏ 1%: Hòa tan 1 g công gô đỏ trong 100 ml nước c ấ t 3) Nếu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa thì bổ sung 20,0 g thạch. A.4 Môi trường Pikovskaya Glucoza (C 6 H 12 O 6 ) 10,0 g Canxi (III) phosphat (Ca 3 (P O 4 ) 2 ) 5,0 g Amoni sulphat ((NH 4 ) 2 SO 4 ) 0,5 g Kali clorua (KCI) 0,2 g Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgSO 4 . 7H 2 O) 0,1 g Mangan sulphat (MnSO 4 ) 0,001 g Sắt sulphat ngậm bảy phân tử nước (FeSO 4 .7H 2 O) 0,001 g Chất chiết nấm men 0,5 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 6,8 đến 7,0 CHỦ THÍCH: Nếu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa th ì bổ sung 20,0 g thạch. A.5 Môi trường King B Pepton 20,0 g Glyxerin 10,0 g Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgSO 4 . 7H 2 O) 1,5g Dikali hydro phosphat (K 2 HP O 4 ) 1 ,5 g Sắt sulphat ngậm bảy phân tử nước (FeS O 4 .7H 2 O ) 0,001 g Chất chiết nấm men 0,5 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 7,0 đến 7,2 CH Ú THÍCH : Nếu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa thì bổ sung 20,0 g thạch. A.6 Môi trường SP (Sucrose Peptone) Sacaroza (C 12 H 22 O 11 ) 20,0 g Pepton 5,0 g Dikali hydro phosphat (K 2 HPO 4 ) 0,5 g Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgS O 4 . 7 H 2 O ) 0,25 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 6,8 đến 7,0 CHÚ THÍCH : Nếu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa thì b ổ sung 20,0 g thạch. A . 7 Môi trường Thịt - Pepton Chất chiết thịt bò 5,0 g Pepton 10,0 g Natri clorua (NaCI) 5,0 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 6,8 đến 7,0 CH Ú THÍCH: Nếu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa th ì b ổ sung 20,0 g thạch. A.8 Môi trường Gauze Tinh bột tan (C 6 H 10 O 5 )n) 20,0 g Kali nitrat (KN O 3 ) 1,0 g Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) 0,5 g Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgS O 4 .7H 2 O ) 0,5 g Natri clorua (NaCI) 0,5 g Sắt sulphat ngậm bảy phân tử nước (FeS0 4 .7H 2 O ) 0,01 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 7,0 đến 7,2 CHÚ THÍCH: Nếu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa th ì bổ sung 20,0 g thạch. A . 9 Môi trường ISP- 4 (Inorganic Salts starch - 4) Tinh bột tan (C 6 H 10 O 5 )n) 1 0,0 g Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) 1 g Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgS O 4 .7H 2 O ) 1 g Natri clorua (NaCI) 1 g Amoni sulphat (NH 4 ) 2 S O 4 2,0 g Canxi cacbonat (CaC O 3 ) 1,0 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 7,0 đến 7,2 CHÚ THÍCH: Nếu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa th ì bổ sung 20,0 g thạch. A.10 Môi trường Hansen Glucoza (C 6 H 12 O 6 ) 50,0 g Pepton 10,0 g Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) 3,0 g Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgS O 4 . 7 H 2 O ) 3,0 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 6,8 đến 7,2 CHÚ THÍCH: Nểu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa th ì bổ sung 20,0 g thạch. A.11 Môi trường Czapek Sacaroza (C 12 H 22 O n) 30,0 g Natri nitrat (NaNO 3 ) 3,0 g Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) 1,0 g Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgSO 4 .7H 2 O) 0,5 g Sắt sulphat ngậm bảy phân tử nước (FeS O 4 .7H 2 O ) 0,01 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 6,0 đến 6,5 CHÚ THÍCH: 1) pH môi của trường được điều chỉnh bằng axit axetic 1N; 2) Nếu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa thì bổ sung 20,0 g thạch. A.12 Môi trường Czapek - Dox Sacaroza (C 12 H 22 O 11 ) 30,0 g Natri nitrat (NaNO 3 ) 2,0 g Kali clorua (KCI) 1,0 g Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) 1,0 g Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgSO 4 .7H 2 O) 0,5 g Sắt sulphat ngậm bảy phân tử nước (FeS O 4 .7H 2 O ) 0,01 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 6,0 đến 6,5 CHÚ THÍCH: 1) pH môi của trường được điều chỉnh bằng axit axetic 1N; 2) Nếu môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa th ì bổ sung 20,0 g thạch. A.13 Môi trường PD (Potato Dextrose) Dextroza (C 6 H 12 O 6 ) 20,0 g Khoai tây* 200,0 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 6,0 đ ế n 6,5 CH Ú THÍCH: 1) Khoai tây thái nhỏ, cho vào 1 lít nước và đun sôi trong 20 min; sau đ ó lọc lấy nước trong để sử dụng làm môi trường; 2) pH môi của tr ườ ng được điều chỉnh bằng axit axetic 1N; 3) Nếu m ô i trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa th ì bổ sung 20,0 g thạch. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] 10 TCN 349:99. Bảo quản dài hạn nguồn gen vi sinh vật nông nghiệp bằng phương pháp đông khô.