TCVN10389:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10389:2014 ( EN 12148:1996) về Nước rau, quả - Xác định Hesperidin và Naringin trong nước rau quả có múi - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10389:2014 EN 12148:1996 NƯỚC RAU, QUẢ - XÁC ĐỊNH HESPERIDIN VÀ NARINGIN TRONG NƯỚC RAU QUẢ CÓ MÚI - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Fruit and vegetable juices - Determination of hesperidin and naringin in citrus j uices - Method using high pe rf ormance liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 10389:2014 hoàn toàn tương đương EN 12148:19 9 6; TCVN 10389:2014 d o Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F10 Rau quả và sản phẩm rau qu ả biên soạn, Tổng cục Ti ê u chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. NƯỚC RAU, QUẢ - XÁC ĐỊNH HESPERIDIN VÀ NARINGIN TRONG NƯỚC RAU QUẢ CÓ MÚI - PHƯƠNG PHÁP SẮC K Ý LỎNG HIỆU NĂNG CAO Fruit and vegetable juices - Determination of hesperidin and naringin in citrus j uices - Method using high pe rf ormance liquid chromatography 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn n à y qui định phương pháp sắc ký l ỏ ng hiệu năng cao (HPLC) để xác đ ị nh hàm lượng hesperidin và naringin trong nước rau, quả và các sản phẩm liên quan. 2. Tài liệu viện dẫn Các t à i liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chu ẩ n này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân t í ch trong phòng th í nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử. ISO 5725:1986 1) , Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a s tandard test method by inter-laboratory tests (Độ chụm của phương pháp thử - Xác định độ lặp lại và độ tái lập đối với phương pháp thử chuẩn bằng phép th ử liên phòng thử nghiệm). 3. Ký hiệu và chữ viết tắt 3.1 . Ký hiệu Trong tiêu chu ẩ n n à y sử dụng các ký hiệu sau đây: c là nồng độ chất; r là hàm lượng hesperidin hoặc naringin tương ứng trong mẫu (nồng độ khối lượng tính bằng miligam trên lít nước quả). 3.2 . Chữ viết tắt Trong tiêu chuẩn này sử dụng các chữ viết tắt sau đây: Hesperidin: hesperidin-7-rutinoside Naringin: naringenin-7-neohesperidoside HPLC: sắc ký lỏng hiệu năng cao UV: tia cực tím AUFS: đơn v ị hấp thụ trên toàn thang đo 4. Nguyên tắc Hesperidin và naringin chiết được trong dung dịch dimethyl f ormamid. Sau khi gia nhiệt ở 90 °C, phần l ỏ ng của mẫu đã lọc qua màng lọc được tách bằng HPLC pha đảo, sử dụng detector-UV và t í nh hàm lượng chất phân tích bằng phương pháp ngoại chu ẩ n. 5. Thuốc thử 5.1 . Yêu c ầ u chung Ch ỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước đạt loại 1 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987). 5.2 . Axit axetic. 5.3 . Axit axetic , c (CH 3 COOH) = 0,01 mol/l. 5.4 . Axetonitril , loại dùng cho HPLC. 5.5 . Di-amoni oxalat ngậm một ph â n tử nước , (NH 4 ) 2 C 2 O 4 .H 2 O . 5.6 . Dimethyl f ormamid. 5. 7. Hesperidin (3.2). 5.8 . Naringin (3.2). 5.9 . Dung dịch chuẩn naringin và hesperidin. Đ ể chuẩn bị dung dịch gốc, hòa tan 120 mg naringin (5.8) và hesperidin (5.7) trong 20 ml dimethy f ormamid (5.6) trong bình định mức 100 ml. Sau k hi hòa tan, thêm dung dịch axit axetic (5.3) đến vạch. Đ ể chuẩn bị dung dịch chu ẩ n làm việc hesperidin/naringin (120 mg/l đối với mỗi chất) thì pha loãng dung dịch gốc (1 200 mg/l) 1 phần th ể tích thành 10 phần thể tích, dùng hỗn hợp dung dịch axit axetic (5.3) và dimethyl f ormamid (5.6) (8:2 phần thể tích). Dung dịch chuẩn làm việc bền trong 30 ngày khi được b ả o quản ở 4 °C. Từ dung dịch gốc (1 200 mg/l) chuẩn bị các dung dịch chuẩn tiếp theo bằng cách pha lo ã ng dung dịch gốc v ớ i hỗn hợp c ủ a dung dịch axit axetic (5.3) v à dimethyl f ormamid (5.6) (8:2 phần thể tích) đ ể có được các dung d ịch chứa tương ứng 60 mg/l, 30 mg/l và 15 mg/l hesperidin và naringin. 5.10 . Dung dịch amoni oxalat , c (NH 4 ) 2 C 2 O 4 .H 2 O ) = 0,025 mol/l. Dung dịch ammoni oxalat được chuẩn bị b ằ ng cách hòa tan 3,55 g di-amoni-oxalat ngậm một phân tử nước (5.5) trong 1000 ml nước. 5.11 . Pha động dùng cho phân tích HPLC Pha động dùng cho phép xác định hesperidin và naringin được chuẩn bị bằng cách trộn 200 ml axetonitril (5.4), 800 ml nước và 0,5 ml axit axetic (5.2). Đong riêng axetonitril và nước, chuẩn bị ch í nh xác thành phần của pha động. 6. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau: 6.1 . Bình định mức , dung tích 50 ml. 6.2 . Pipet , dung tích 10 ml. 6.3 . Bộ lọc dùng một lần , không phải khử trùng, thấm nước (cỡ lỗ 0,45 μm) để lọc d u ng dịch mẫu. 6.4 . Cột HPLC Cột HPLC, C18, k í ch thước 250 mm x 4 mm, c ỡ hạt 5 μm; Cột HPLC, C18, kích thước 250 mm x 4,6 mm, cỡ hạt 5 μm. 6.5 . Thiết bị HPLC : gồm bơm, cột (6.4) và detector UV. 6.6 . Nồi cách th ủ y , có th ể duy trì nhiệt độ đến 90 °C. 7. Cách tiến hành 7.1 . Chuẩn bị mẫu Thông thường các mẫu không cần xử lý trước, tuy nhiên có thể cần pha loãng và phép phân tích theo phương pháp này nên dựa vào thể tích, các kết quả được biểu thị trên 1 lít mẫu. Đối với các mẫu cô đặc, có thể cũng tiến hành phân tích dựa vào thể tích, sau khi pha loãng đến t ỷ trọng tương đối đã biết. Trong trường hợp n à y, t ỷ trọng tương đối phải được nêu r õ . Dựa vào lượng mẫu đ ã cân và hệ số pha loãng, các kết quả có thể cũng được biểu thị trên 1 kg mẫu. Đối với các sản phẩm có độ nhớt cao và/hoặc có chứa lượng thịt quả rất cao thì thường tiến hành phép xác định theo khối lượng mẫu thử. Cần trộn kỹ mẫu đục trước khi pha loãng. 7.2 . Qui tr ì nh thử nghiệm 7.2.1 . Chuẩn bị mẫu thử Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng. Trộn kỹ mẫu trước khi m ở vật chứa và lấy ngay mẫu thử (7.1). Dùng pipet lấy 10 ml mẫu thử hoặc mẫu sản phẩm đặc đã pha loãng (7.1) cho v à o bình định mức 50 ml (6.1). Sau đó thêm 10 ml dung dịch amoni oxalat (0,025 mol/l) (5.10) và 10 ml dimethylformamid (5.6). Trộn kỹ mẫu đã pha loãng và thêm nước đến vạch (50 ml). Gia nhiệt mẫu trên nồi cách thủy (6.6) có kiểm soát nhiệt độ ở 90 °C trong 10 min. Sau khi nguội đến nhiệt độ phòng, lọc phần lỏng của dung dịch qua bộ lọc màng (6.3) trước khi phân tích bằng HPLC. 7.2.2 . Phép đo HPLC Sau khi cân b ằ ng hệ thống HPLC, tiến hành phân tích mẫu [dùng máy HPLC (6.5), cột (6.4), pha động (5.11)]. Khi sử dụng detector có bước sóng cố định th ì đo ở bước s ó ng 280 nm hoặc trong trường hợp dùng detector c ó bước sóng thay đổi thì đo ở 287 nm. Việc phát hiện thường nhạy trong khoảng 0,05 đến 0,2 AUFS. Tốc độ dòng: khoảng 1 ml/min Thể t í ch bơm: 20 μl Dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu được bơm liên tục. Độ ổn định của dung dịch mẫu b ị giới hạn do đó nên kết thúc phép thử trong vòng 24 h. 8. Tính kết quả Phép tính được tiến hành theo phương pháp ngoại chuẩn, bằng cách tích phân diện tích pic hoặc đo chiều cao pic cần tính đến thời gian lưu và cần t í nh đến độ tuyến tính của đường chuẩn. Trong suốt quá tr ì nh tính, có tính đến mọi hệ số pha loãng và mối liên hệ với khối lượng hoặc thể tích. Nếu s ả n phẩm đặc đã được pha loãng đến nồng độ đơn (nồng độ ban đầu) th ì phải ghi lại tỷ trọng tương đối của mẫu có nồng độ đơn đó. Tính hàm lượng hesperidin và naringin, ρ H v à ρ N của t ừ ng mẫu sử dụng các Công thức sau: (1) (2) Trong đó: A HP là diện tích pic của hàm lượng hespiridin trong mẫu; A NP l à diện tích pic của hàm lượng naringin trong mẫu; XF là hệ số pha loãng (bằng 5 đối với nước quả, đối với mẫu đặc đã pha loãng th ì cần tính đến hệ số pha loãng); RF H là hệ số đáp ứng đối với hesperidin; RF N l à hệ số đáp ứng đối với naringin. Tính hệ số đáp ứng sử dụng các Công thức sau: và Trong đó: A HS là diện tích pic của hàm lượng hesperidin trong dung dịch mẫu (5.9); A NS là diện tích pic của hàm lượng naringin trong dung dịch mẫu (5.9); r HS l à hàm lượng hesperidin trong dung dịch chuẩn (5.9); r N S là hàm lượng naringin trong dung dịch chuẩn (5.9); Biểu thị kết quả naringin và hesperidin bằng miligam trên lít. 9. Độ chụm Chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ các phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp d ụng được cho các d ả i nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu trong Phụ lục A. 9.1 . Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến h à nh thử trên vật liệu thử gi ố ng hệt nhau, do cùng một người phân tích, sử dụng cùng một thiết bị, trong m ột khoảng thời gian ngắn, kh ô ng được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r . Độ lặp lại là: Hesperidin r = 19 mg/l; Naringin r = 27 mg/l; 9.2 . Độ t á i lập Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu đư ợ c khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do hai phòng thử nghiệm phân tích, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R . Độ tái l ậ p là: Hesperidin R = 61 mg/l; Naringin R = 72 mg/l. 10. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm: - mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, ký hiệu); - viện dẫn tiêu chuẩn này; - ngày và kiểu quy tr ì nh lấy mẫu (nếu biết); - ngày nhận mẫ u; - ngày thử nghiệm; - kết quả thử nghiệm và các đơn vị biểu thị; - độ lặp lại của phương pháp đã được đánh giá; - các điểm cụ thể quan sát được trong quá trình thử nghiệm; - mọi thao tác không qui định t rong tiêu chuẩn này, hoặc được xem l à tùy chọn, cùng với mọi t ì nh huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm. PHỤ LỤC A (Tham khảo) Các kết quả thống kê của phép thử liên phòng thử nghiệm Các thông số sau đây thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725:1986 (Đối với tài liệu liên quan đến phương pháp, xem Thư mục Tài liệu tham khảo). Phép thử do Hiệp hội Qu ả quốc t ế , Paris, Pháp tổ chức thực hiện. Hesperidin Naringin Năm tiến hành phép thử liên phòng th ử nghiệm: 1989 1989 Số lượng các phòng thử nghiệm: 22 10 Số lượng mẫu: 1 1 Bảng A.1 - Kết quả của phép thử liên phòng th ử nghiệm Mẫu Hesperidin Naringin Số lượng phòng thử nghiệm được giữ l ạ i sau khi tr ừ ngoại lệ 21 10 Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ 1 - Số lượng các kết quả được ch ấ p nhận 109 53 Giá trị trung b ì nh (mg/l) 438 523 Độ lệch chuẩn lặp lại ( s r ) (mg/l) 6,74 9,53 Độ lệch chu ẩ n tương đối lặp lại ( RSD r ) [%] 1,5 1 , 8 Giới hạn lập lại ( r ) (mg/l) 19 27 Độ lệch chuẩn tái lập ( s R ) (mg/l) 21,48 25,40 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập ( RSD R ) [%] 4,9 4,9 Giới hạn tái l ậ p ( R ) (mg/l) 61 72 Phép xác định hesperidin đã được thực hiện trên nước cam. Phép xác định naringin đã được thực hiện trên nước nho. PHỤ LỤC B (Tham khảo) Ví dụ về sắc đồ Hình B.1 - Phổ UV của hesperidin kết tinh lại trong pha động Hình B.2 - Sắc đồ HPLC của dung d ịch chuẩn của hesperidin và narindin Hình B.3 - Sắc đồ HPLC của nước cam Hình B.4 - Sắc đồ HPLC của nước nho THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Determination of hesper i din and naringin by HPLC: No. 58, 1991. In: The collected Analyses of the International Federatio n of Fruit Juice Producers . Loose- l eaf edition, as of 1996. Zug: Swiss Fruit Union. [2] GREINER, G., W ALLRAUCH, S. Flussiger Obst 51, 1984, 626. 1) ISO 5725 : 1986 , Precision of test methods - Determi n a t ion of repea t abilily and reproducibility for a standard test method by in ter-laboratory tes t dùng để thu được dữ liệu v ề độ chụm. Ti ê u chuẩn này đ ã hủy và đư ợ c thay b ằ ng bộ ti ê u chuẩn ISO 5725 (gồm 6 ph ầ n) v à đã được ch ấ p nh ậ n thành bộ TCVN 6910 (ISO 5725).