TCVN11290:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11290:2016 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng ethopabate - Phương pháp đo màu TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 11290:2016 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ETHOPABATE - PHƯƠNG PHÁP ĐO MÀU An i mal f eeding st u ffs - Determ i nation of ethopabate content- Color i me tr ic method Lời nói đ ầ u TCVN 11290:2016 được xây dựng tr ê n cơ sở tham khảo AOAC 964.29 Ethopabate in feeds. Colorimetr i c met h od; TCVN 11290:2016 do Viện Chăn nuôi b i ên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Ch ấ t lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ETHOPABATE - PHƯƠNG PHÁP ĐO MÀU An i mal f eeding st u ffs - Determ i nation of ethopabate content- Color i me tr ic method 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đo màu để xác định hàm lượng ethopabate trong thức ăn chăn nuôi. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chu ẩ n này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công b ố th ì áp dụng phiên bản mới nh ấ t, bao gồm cả các sửa đ ổ i, bổ sung (nếu có). TCVN 6952 (ISO 9498), Thức ăn chăn nuôi- Chuẩn bị mẫu thử. 3 Nguyên tắc Ethopabate được chiết ra khỏi mẫu thử bằng metanol 50 % ở nhiệt độ phòng. Dịch lọc trong được axit hóa bằng axit clohydric loãng và chiết bằng cloro f orm để loại các chất gây nhi ễ u (amin, axit p -aminobenzoic, procaine). Dịch chiết trong cloro f orm được rửa bằng dung dịch natri cacbonat để loại sul f aquinoxaline, acetyl-( p -nitrophenyl) sul f an i lamide và chlortetracycline. Ethopabate được chuyển thành dạng amin tự do bằng cách thủy phân axit có kiểm soát sau đó được diazo hóa và tạo liên k ế t. Phức chất màu được chiết bằng n -butanol và đọc ở bước sóng 555 nm. 4 Thuốc thử v à vật liệu thử Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước c ấ t hoặc nước đã loại ion, trừ khi c ó quy định khác . 4.1 Metanol (CH 3 OH), tinh khiết phân tích. 4.2 Metanol, 50 % (th ể tích) Trộn metanol (4.1) trong nước với t ỉ lệ th ể tích 1:1. 4.3 Axit clohydric (HC l ) đặc, 36,5 % đến 38,0 % (khối lượng/thể tích). 4.4 Axit clohydric loãng Pha loãng 1 thể tích axit clohydric đặc (4.3) trong 9 thể tích nước. 4.5 Axit clohydric, dung d ịch 0,3 M Pha lo ã ng 25 ml axit clohydric đặc (4.3) bằng nước đến 1 l í t. 4.6 Cloro f orm (CHC l 3 ), tinh khiết phân tích. 4.7 Dung dịch natr i cacbonat (Na 2 C O 3 ), 4 % (khối lượng/thể tích) Hòa tan 40 g natri cacbonat khan trong nước đựng trong b ì nh định mức 1 lít và thêm nước đến vạch. 4.8 Dung dịch natri nitrit (NaNO 3 ), 0,2 % (khối lượng/thể tích) Hòa tan 100 mg natri nitrit trong nước đựng trong b ì nh định mức 50 ml và thêm nước đến vạch. Chuẩn bị dung dịch ngay trước khi sử dụng. 4.9 Dung dịch amoni sul f amat (NH 4 SO 3 NH 2 ), 1,0 % (khối lượng/thể tích). Hòa tan 500 mg amoni sul f amat trong nước đựng trong b ì nh định mức 50 ml và thêm nước đến vạch. Chuẩn bị dung dịch ngay trước khi sử dụ ng. 4.10 Thuốc thử liên kết (NED) Hòa tan 50 mg N -(1-naphthyl)etylendiamin dihydro cl o ru a (C 10 H 7 NHCH 2 CH 2 NH 2 -2HC l ) trong 25 ml nước. Chu ẩ n bị dung dịch ngay trước khi sử dụng. 4.11 Natri clorua (NaC l ), dạng khan. 4.12 n -Butanol (C 4 H 10 O), tinh khiết phân tích. 4.13 Dung dịch chuẩn athopabate (C 12 H 1 5 NO 4 ) 4.13.1 Dung dịch chuẩn gốc, 0,400 mg/ml Cân 40,0 mg chất chu ẩ n ethopabate, ch í nh xác đến 0,1 mg, cho vào b ì nh định mức 100 ml, h òa tan trong metanol 50 % (4.2) và thêm metanol đến vạch. 4.13.2 Dung dịch chu ẩ n trung gian ethopabate, 40 µg/ml Dùng pipet l ấ y 10 ml dung dịch ch uẩ n gốc (4.13.1) cho vào bình định mức 100 ml, pha loãng đến vạch bằng metanol 50 % (4.2), trộn đều. Bảo quản dung dịch đã pha trong b ì nh có nút đậy kín, dung dịch đ ã chu ẩ n bị có th ể b ề n trên 1 tháng. 4.13.3 Dung dịch chuẩn l àm việc ethopabate, 0,8 µg/ml Dùng pipet l ấ y 5 ml d ung dịch chu ẩ n trung gian (4.13.2) cho vào bình đ ị nh m ứ c 250 ml, pha loang đến vạch b ằ ng metanol 50 % (4.2), trộn đều. Chuẩn bị dung dịch ngay trước khi sử dụng. 5 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thư ờ ng của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau: 5.1 Cân ph â n tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg . 5.2 Máy trộn tốc độ cao. 5.3 Sàng th í nghiệm số 20. 5 .4 B ì nh định mức, dung tích 100 ml , 250 ml và 1000 m l . 5.5 B ì nh thủy tinh c ó nút đậy kín, dung tích 250 ml. 5.6 Cốc có m ỏ , d ung t ích 100 ml. 5.7 P i p e t 5.8 Thanh khuấy từ. 5.9 Máy lắc cơ học. 5.10 Máy l y tâm. 5.11 Ống ly tâm đáy tròn, dung t ích 50 ml. 5.12 Giấy lọc nhanh. 5.13 Xyranh, có kim d à i. 5.14 N ồ i cách thủy. 5.15 Nồi cách thủy đun sô i . 5.16 Bể nước lạnh. 5.17 Máy đo màu, đo ở bước sóng 555 nm. 5.18 Cuvet, chiều dài đường quang 1 cm. 6 Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng th ử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong su ố t quá trình vận ch uyể n hoặc bảo quản. Việc l ấ y mẫu không quy định trong tiêu chu ẩ n này, nén lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu. 7 Chuẩn bị mẫu th ử Chuẩn bị mẫu th ử theo TCVN 6952 (ISO 9498), nghiền mẫu thử để lọt hết qua sàng số 20 (5.3), trộn đều (nếu dùng máy trộn tốc độ cao thì có th ể mất khoảng 3 min). 8 Cách tiến hành 8.1 Chiết C â n ch í nh x á c một lượng mẫu thử có chứa khoảng 80 µg ethopabate (kh ô ng quá 20 g), chính xác đến 1 mg, chuyển sang b ì nh th ủ y tinh 250 ml (5.5) có nút thủy tinh đậy kín. Thêm 100,0 ml metanol 50 % (4.2) và khu ấ y trộn b ằ ng thanh khuấy từ (5.8), đậy chặt nút và khuấy trong 1 h, có thể sử dụng máy lắc cơ h ọ c. Ly tâm hoặc lọc dịch chiết qua giấy lọc nhanh (5.12). Thu lấy một lượng dịch lọc đủ cho phép ph â n t í ch. Nếu cần, b ả o quản dịch chiết qua đêm ở nhiệt độ phòng, để trong b ì nh đậy kín. 8.2 Tinh sạch Dùng pipet lấy 20 ml dịch chiết trong suốt cho vào ống ly tâm 50 ml (5.11). Thêm 5,0 ml axit clohydric loãng (4.4) và 10 ml cloro f orm (4.6), đậy bằng nút polyethylen và lắc mạnh 3 min trên máy lắc cơ học (5.9). Ly tâm và dùng xyranh c ó kim dài (5.13) c ẩ n thận ch u yển lớp cl oro fo rm phía dưới sang một ống ly tâm 50 ml sạch. Chiết lạ i hai lần nữa, mỗi lần dùng 10 ml cloro f orm. Gộp các phần dịch chiết, t h ê m 10 ml dung dịch natri cacbonat (4.7), đậy nút và lắ c 3 min. Thực hiện ly tâ m và sử dụng xyranh (5.13) hút bỏ phần lớn l ớ p nước ph í a trên mà kh ô ng làm xáo trộn lớp phân cách. Lặp lại việc rửa, dùng 10 ml dung dịch natri cacbonat, loại bỏ nước rửa. Thêm 10 ml nước vào dịch chiết cloro f orm, đậy nút, lắc mạnh khoảng 1 min và ly tâm. R ú t b ỏ lớp nước. Lặp lại việc r ử a với 10 ml nước. CHÚ Ý: Đ ể tránh hao hụt ch ấ t phân tích v à cho kết quả t h ấ p, không làm xáo trộn mặ t tiếp giáp trên cloro f orm, cần chiết v à rửa trong t hời gian ng ắ n nhất có thể. Thời gian tiếp xúc kéo d à i với axit clohydric và natri cacbonat có thể gây ra quá trình thủy phân một phần ethopabate. 8.3 Chuyển ethopabate về dạng amin tự do Chuy ể n đị n h lượng dịch chiết trong cloroform vào cốc có m ỏ 100 m l (5.6). Tráng rửa m ỗ i ống ly tâm hai lần, m ỗ i lần dùng 3 ml metanol 50 % (4.2), cho nước tráng rửa vào cốc có m ỏ . Đặt cốc vào nồi cách thủy (5.14) và cho bay hơi cloro f orm đến khi còn lại khoảng 2 ml. Th ê m 5,0 m l metanol 50 % (4.2) và xoay để hòa tan hoàn toàn lượng chứa trong cốc. Chuyển định lượng dung dịch sang ống ly tâm đáy tr ò n (5.11). Rửa cốc bằng các thể tích 10 ml, 10 ml và 5 ml dung dịch axit clohydric 0,3 M (4.5). Ngâm ống ly tâm trong nồi cách th ủ y đun s ô i (5.15) sao cho mức ch ấ t lỏng trong ống vừa dưới mức nước trong nồi cách th ủ y. Đun n ó ng trong 45 min. Lấy ống ra khỏi nồi cách thủy và làm lạnh đến khoảng t ừ 10 ° C đến 15 ° C trong bể nước lạnh (5.16). 8.4 Phát triển màu và đ o màu Lấy ố ng ra khỏi b ể nước lạnh. Thêm v à o m ỗ i ống 1,0 ml dung dịch natri nitrit 0,2 % (4.8) vừa m ớ i chu ẩ n bị, trộn và để yên trong 2 min. Thêm 1,0 ml dung dịch amoni sut f amat 1,0 % (4.9), trộn v à đ ể y ê n trong 2 min. Thêm tiếp 1,0 ml thuốc thử li ê n kết (4.10), trộn v à đ ể yên trong 10 min. Thêm 5,0 g natri clorua (4.11) và 5,00 ml n -butano l (4.12), đậy nút và lắc mạnh cho đến khi natri clorua hòa tan. Ly tâm v à c ẩ n thận chuyển lớp có màu trong su ố t sang cuvet 1 cm (5.18) và đọc gi á t rị độ hấp thụ của dịch ch iế t so với n -butanol trong máy đo màu (5.17) tạ i bước sóng 555 nm. Hiệu ch ỉ nh với mẫu trắng thuốc th ử . 8.5 Phép thử trắng (mẫu tr ắ ng thuốc thử) Dùng pipet l ấ y 20 ml metanol 50 % (4.2) cho vào ống ly tâm 50 ml (5.11) , thêm 5.0 ml axit clohydric loãng (4.4) và tiến hành như đối với ph ầ n mẫu th ử (từ 8.2 đến 8.4). 8.6 M ẫ u chuẩn D ù ng pipet l ấ y 20 ml dung dịch chu ẩ n làm việc (4.13.3) (chứa 16,0 ng ethopabate) cho vào ống ly tâm 50 m l (5.11), thêm 5,0 m l axit clohydric lo ã ng (4.4) và tiến hành như đối với phần mẫu th ử (t ừ 8.2 đến 8.4). 9 Tính k ế t quả Hàm tượng ethopabate c ó trong phần m ẫ u thử, X, t í nh bằng miligam trên k i logam, t í nh được bằng công thức sau đây: Trong đó: A l à giá trị độ h ấ p th ụ cực đại ở bước sóng 555 nm của phần mẫu thử; A B là giá trị độ h ấ p thụ cực đại ở bước s ó ng 555 nm của mẫu trắng thu ố c thử; A' lá giá trị độ h ấ p thụ cực đại ở bước sóng 555 nm của dung d ị ch chuẩn làm việc (4.13.3); V 1 là thể tích metanol loãng dùng để chiết phần mẫu thử, tính bằng mililit (V 1 = 100 ml); V 2 là thể tích dịch chiết đem đi ti nh sạch, tính bằng mililit ( V 2 = 20 ml); C là lượng eth o pabate có trong 20 ml dung dịch chu ẩ n l à m việc (xem 8,6), t í nh b ằ ng microgam (C= 16,0 µg); w là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g). 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo th ử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đ ủ về mẫu thử; b) phương pháp l ấ y mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chu ẩ n này; d) t ất c ả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thư ờ ng nào khác c ó th ể ảnh h ưở ng đến kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được.