629/2000/QĐ-BTS

Quyết định 629/2000/QĐ-BTS về tiêu chuẩn cấp ngành do Bộ trưởng Bộ Thủy sản ban hành BỘ THUỶ SẢN ------ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc ------------- Số: 629/2000/QÐ-BTS Hà Nội, ngày 28 tháng 07 năm 2000 QUYẾT ĐỊNH VỀ VIỆC BAN HÀNH TIÊU CHUẨN CẤP NGÀNH BỘ TRƯỞNG BỘ THUỶ SẢN Căn cứ Nghị định số 50/CP ngày 21 tháng 6 năm 1994 của Chính phủ về nhiệm vụ, quyền hạn và tổ chức bộ máy của Bộ Thuỷ sản; Theo đề nghị của Ông Vụ trưởng Vụ Khoa học Công nghệ tại Tờ trình ngày 10 tháng 7 năm 2000; QUYẾT ĐỊNH Ðiều 1 . Ban hành kèm theo Quyết định này 06 tiêu chuẩn cấp Ngành sau đây : 1. 28TCN157:2000 "Ðộc tố gây mất trí nhớ trong thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao" 2. 28TCN158:2000 "Ðộc tố gây tiêu chảy trong thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao" 3. 28TCN159:2000 "Ðộc tố gây liệt cơ trong thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao" 4. 28TCN160:2000 "Hàmlượng thuỷ ngân trong thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử" 5. 28TCN161:2000 "Hàmlượng chì trong thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử" 6. 28TCN162:2000 "Hàmlượng cađimi trong thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử" Ðiều 2. Các tiêu chuẩn trên được khuyến khích áp dụng cho các phòng kiểm nghiệm khi tiến hành kiểm tra chất lượng hàng thuỷ sản và có hiệu lực kể từ ngày ký. Ðiều 3 . Các ông Chánh Văn phòng Bộ; Thủ trưởng các Vụ, Cục; Chánh Thanh tra Bộ; Giám đốc các Sở Thuỷ sản, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn có quản lý thuỷ sản; Giám đốc Trung tâm Kiểm tra Chất lượng và Vệ sinh thuỷ sản; Thủ trưởng các đơn vị có phòng kiểm nghiệm nói tại Ðiều 2 và các cơ sở chế biến thuỷ sản chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này. KT/BỘ TRƯỞNG BỘ THUỶ SẢN THỨ TRƯỞNG Nguyễn Việt Thắng 28TCN 157:2000 ÐỘC TỐ GÂY MẤT TRÍ NHỚ TRONG THỊT NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Amnestic shellfish poisons (ASP) in bivalve mollusc flesh - Method for quantitative analysis by high performance liquid chromatography 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàmlượng độc tố gây mất trí nhớ (sau đây gọi tắt là ASP) trong thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp nằm trong khoảng 0,2 ppm. 2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn xây dựng theo phương pháp chuẩn số 959.08 của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC) xuất bản năm 1995 và phương pháp nêu trong Sổ tay hướng dẫn số 33 của Uỷ ban Hải dương học Quốc tế. 3 Nguyên tắc Do khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại, hàmlượng độc tố ASP (tính theo lượng axit domoic) trong thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ được xác định trên hệ thống HPLC dùng đầu dò tử ngoại khả kiến (sau đây gọi tắt là UV) ở bước sóng 242 nm theo phương pháp ngoại chuẩn. 4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, chất chuẩn và dung dịch thử 4.1 Thiết bị, dụng cụ 4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò UV. 4.1.2 Cột sắc ký loại RP C18, kích thước L x id là 25 cm x 4,6 mm có chứa hạt silica gel đường kính 5 - 10 m m. 4.1.3 Màng lọc mao quản kích thước 0,45 m m. 4.1.4 Rây cỡ số 5. 4.1.5 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/phút. 4.1.6 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g. 4.1.7 Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút. 4.1.8 Máy siêu âm. 4.1.9 Cột trao đổi anion SAX, dung tích 3 ml chứa khoảng 500 mg hạt silica gel đã được hoạt hoá với silan amon bậc 4, LC-8. 4.2 Hoá chất, chất chuẩn 4.2.1 Nước cất loại dùng cho HPLC. 4.2.2 Axetonitril loại dùng cho HPLC. 4.2.3 Methanol loại dùng cho HPLC. 4.2.4 Axit clohyđric loại dùng cho phân tích. 4.2.5 Axit trifloaxetic (sau đây gọi tắt là TFA) loại tinh khiết quang học. 4.2.6 Axit citric ngậm 1 phân tử nước, loại dùng cho phân tích. 4.2.7 Tri amon citric loại dùng cho phân tích. 4.2.8 Axit domoic chuẩn độ tinh khiết 98 %. 4.2.9 Mẫu thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ chuẩn, khối lượng 100m g/g. 4.3 Dung dịch thử 4.3.1 Pha động của HPLC Pha 100 ml axetonitril với khoảng 400 ml nước cất, sau đó cho thêm 1,0 ml TFA và định mức đến 1000 ml bằng nước cất. Loại bỏ khí hoà tan trong pha động bằng cách để trong máy siêu âm khoảng 10 phút. 4.3.2 Dung môi chiết: Pha hỗn hợp nước và methanol theo tỷ lệ 1:1 về thể tích. 4.3.3 Dung dịch đệm muối citrat, 0,5 M, pH 3,2 Hoà tan 40,4 g axit citric và 14,0 g triamon citric với 400 ml nước cất. Sau đó, thêm 50 ml axetonitril và định mức đến 500 ml bằng nước cất. 4.3.4 Các dung dịch chuẩn Pha chính xác axit domoic chuẩn thành các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 0,1 - 10 m g/ml bằng hỗn hợp dung dịch axetonitril và nước theo tỷ lệ 1:10 về thể tích. 5 Phương pháp tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu 5.1.1 Rửa sạch vỏ của nhuyễn thể trước khi mở để lấy thịt. Rửa nhanh thịt nhuyễn thể trong nước cất để loại bỏ cát sạn và các tạp chất khác. Khi lấy, phải tránh làm dập nát thịt nhuyễn thể. 5.1.2 Cân khoảng 150 g thịt nhuyễn thể và cho lên rây cỡ số 5, để yên trong 5 phút để loại bỏ hết nước. Sau đó, mẫu được nghiền trong máy nghiền đồng thể cho đến khi đồng nhất hoàn toàn. 5.2 Tách chiết độc tố từ mẫu thử 5.2.1 Phương pháp tách chiết ASP cùng với độc tố gây liệt cơ (theo AOAC - 1995) 5.2.1.1 Cân khoảng 100,0 g thịt nhuyễn thể đã được đồng nhất hoá theo Ðiều 5.1.2 vào một cốc dung tích 500 ml. Thêm 100 ml axit clohyđric nồng độ 0,1 N rồi khuấy đều và kiểm tra độ pH bằng giấy đo pH hoặc pH kế. Ðộ pH phải nhỏ hơn 4, tốt nhất là 3. Ðiều chỉnh pH nếu cần thiết theo qui định tại Ðiều 5.2.1.2. 5.2.1.2 Ðiều chỉnh độ pH a. Giảm độ pH bằng cách thêm từng giọt axit clohyđric nồng độ 5 N rồi khuấy đều. b. Tăng độ pH bằng cách cho thêm từng giọt dung dịch hyđroxit natri nồng độ 0,1 N. Khi thêm hyđroxit natri, phải khuấy mạnh và liên tục để tránh hiện tượng kiềm hoá cục bộ. 5.2.1.3 Ðun sôi hỗn hợp trong 5 phút, sau đó để nguội đến nhiệt độ trong phòng. Kiểm tra lại độ pH của hỗn hợp và điều chỉnh độ pH đến khoảng từ 2 đến 4 (chú ý pH không được vượt quá 4,5). 5.2.1.4 Chuyển hỗn hợp sang ống đong dung tích 250 ml rồi thêm nước tới vạch 200 ml. Sau đó, hỗn hợp được ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong thời gian 10 phút. Lọc lớp nước trong phía trên qua màng lọc (4.1.3). Dung dịch trong sau khi qua lọc được bơm vào HPLC. Chú thích: 1. Quá trình chiết độc tố và phân tích trên hệ thống HPLC phải được thực hiện trong vòng 24 giờ. 2. Phương pháp này đơn giản nhưng độ chính xác không cao, vì axit domoic đã bị phân hủy một phần trong môi trường axit và chỉ được sử dụng trong trường hợp hàmlượng axit domoic nhỏ hơn 5 ppm. Khi hàmlượng axit domoic lớn hơn 5 ppm, phải kiểm chứng lại bằng phương pháp Quilliam dưới đây. 5.2.2 Phương pháp Quilliam: Tách chiết bằng hỗn hợp methanol và nước theo IOC-1995 5.2.2.1 Cân khoảng 4,0 g mẫu đã được đồng nhất hoá theo Ðiều 5.1.2 cho vào một ống ly tâm. Thêm 16,0 ml dung môi chiết methanol và nước (4.3.2). 5.2.2.2 Ðồng nhất hoá hỗn hợp bằng máy nghiền đồng thể với tốc độ 10 000 vòng/phút trong thời gian 3 phút. Sau đó, hỗn hợp được ly tâm với tốc độ 3 000 vòng/phút trong thời gian 10 phút. Lọc lớp nước trong phía trên qua màng lọc (4.1.3). Dung dịch trong sau khi qua lọc được tinh chế theo phương pháp qui định tại Ðiều 5.3. 5.3 Tinh chế dung dịch chiết 5.3.1 Ðiều kiện hoá cột SAX Cho lần lượt 6,0 ml methanol, 3,0 ml nước và 3,0 ml hỗn hợp methanol và nước theo tỷ lệ 1:1 về thể tích qua cột SAX. Sau khi điều kiện hoá cột phải giữ mức dung môi trong cột cao hơn mặt trên của phần nhồi cột. 5.3.2 Tinh sạch dịch chiết 5.3.2.1 Cho 5,0 ml dung dịch chiết đã qua lọc ở Ðiều 5.2.2 chảy từ từ qua cột SAX đã được hoạt hoá với tốc độ chảy khoảng 1 giọt/giây. Loại bỏ dịch qua cột. 5.3.2.2 Cho 5,0 ml hỗn hợp axetonitril và nước theo tỷ lệ 1:9 về thể tích đi qua cột với tốc độ 1 giọt/giây. Thêm 0,5 ml dung dịch đệm muối citrat (4.3.3) khi mức dung dịch rửa xuống gần bề mặt gel của cột. Loại bỏ dịch qua cột. 5.3.3 Thu hồi độc tố Cho 2 ml dung dịch đệm muối citrat đi qua cột và hứng dung dịch chảy qua cột SAX bằng ống đong dung tích 2 ml cho tới vạch định mức. Dung dịch chiết thu được để phân tích trên HPLC. Chú thích: Không được để khô cột trong quá trình tinh chế dung dịch chiết. 5.4 Phân tích độc tố trên HPLC 5.4.1 Ðiều kiện phân tích a. Cột sắc ký HPLC; b. Pha động; c. Chế độ đẳng nhiệt ở 40 o C; d. Tốc độ dòng trong khoảng từ 1,0 đến 1,5 ml/phút; đ. Thể tích mỗi lần bơmlà 20 ml; e. Bước sóng cài đặt cho đầu dò UV là 242 nm. 5.4.2 Qui trình phân tích 5.4.2.1 Bơm các dung dịch axit domoic chuẩn nồng độ từ 0,1 đến 10,0 m g/ml vào HPLC và xây dựng đường chuẩn dựa trên độ hấp thụ của dung dịch chuẩn. Nếu đường chuẩn có độ tuyến tính tốt và đi qua gốc tọa độ thì trong các lần phân tích sau này, chỉ sử dụng 1 dung dịch chuẩn có hàmlượng gần với hàmlượng có trong mẫu. Ðường chuẩn lúc này được xây dựng từ độ hấp thụ của dung dịch sử dụng và gốc toạ độ. 5.4.2.2 Bơm các dịch chiết thu được vào HPLC. Mỗi dịch chiết được bơm 2 lần và xác định độ hấp thụ trung bình cho mỗi dịch chiết. 5.4.2.3 Bơm các dung dịch chuẩn vào HPLC với tần số 2 giờ bơm 1 lần. 5.5 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích 1. Ðộ lặp lại của 2 lần bơm Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo độ hấp thụ của 2 lần bơmliên tiếp của cùng một dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %. 2. Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 5 mẫu chuẩn đã biết chính xác hàmlượng độc tố ASP. Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %. 6 Tính kết quả Hàmlượng ASP (axit domoic) trong mẫu thử thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ được tính theo công thức sau: C ASP = x x 8 x F Trong đó: - C ASP là hàmlượng của độc tố ASP có trong mẫu thử (m g/g thịt); - A S là độ hấp thụ trung bình của dung dịch mẫu thử tính theo diện tích pic; - A C là độ hấp thụ trung bình của dung dịch chuẩn có nồng độ là Cc, tính theo diện tích pic; - C C là nồng độ của dung dịch chuẩn (m g/ml); - W S là khối lượng của mẫu thử (g); - F là hệ số pha loãng dịch chiết trước khi bơm vào HPLC. 28TCN 158:2000 ÐỘC TỐ GÂY TIÊU CHẢY TRONG THỊT NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Diarrhetic shellfish poisons (DSP) in bivalve mollucs flesh - Method for quantitative analysis by high performance liquid chromatography 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàmlượng độc tố gây tiêu chảy (sau đây gọi tắt là DSP) trong thịt nhuyễn thể 2 mảnh vỏ bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). 2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn xây dựng theo phương pháp nêu trong Sổ tay hướng dẫn số 33 của Uỷ ban Hải dương học Quốc tế. 3 Nguyên tắc Ðộc tố DSP trong thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở các dạng dẫn xuất axit okadeic (OA), dinophysistoxin-1 (DTX-1) và dinophysistoxin-2 (DTX-2) chứa nhóm chức carboxyl, được chuyển sang dạng huỳnh quang bằng phản ứng ester hoá với 9-anthryl-diazomethan (ADAM) và được định lượng trên hệ thống HPLC dùng đầu dò huỳnh quang. 4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất và chất chuẩn 4.1 Thiết bị và dụng cụ 4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang. 4.1.2 Cột sắc ký kích thước L x id là 25 cm x 4,6 mm, có chứa hạt RP-18 octadecylsilica đường kính 5 m m. 4.1.3 Màng lọc mao quản kích thước 0,45 m m. 4.1.4 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/phút. 4.1.5 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g. 4.1.6 Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút. 4.1.7 Máy siêu âm 4.1.8 Cột tách chiết lỏng rắn (sau đây gọi tắt là cột SPE), dung tích 7ml chứa hạt silica gel đường kính 40m m. 4.1.9 Lọ thuỷ tinh màu nâu nhỏ, dung tích 1,5 ml, có nút xoáy và vòng đệm bằng nhựa teflon, đã được rửa kỹ bằng axeton và sấy khô qua đêm trong tủ sấy ở nhiệt độ 70 0 C. 4.1.10 Micropipete có thang đo từ 10 ml đến 1000 ml. 4.2 Hoá chất và chất chuẩn 4.2.1 Nước cất loại dùng cho HPLC 4.2.2 Axetonitril loại dùng cho HPLC 4.2.3 Methanol loại dùng cho HPLC 4.2.4 Hexan loại dùng cho HPLC 4.2.5 Ethanol khan loại dùng cho phân tích 4.2.6 Diethyl ete loại dùng cho phân tích 4.2.7 Clorofomloại dùng cho phân tích 4.2.8 Alumin đã được hoạt hoá ở nhiệt độ 450 0 C qua đêm. 4.2.9 Hạt silica gel đường kính 40m m đã sấy ở nhiệt độ 130 0 C không ít hơn 24 giờ. 4.2.10 9-anthryl-diazomethan chứa trong lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu, mỗi lọ chứa 2 mg ADAM được bảo quản ở nhiệt độ - 80 0 C. 4.2.11 Axit 7-O- axetyl okadaic chuẩn (sau đây gọi tắt là AcOA). 4.2.12 Axit deoxycolic (sau đây gọi tắt là DCA) chuẩn, độ tinh khiết 98 %. 4.2.13 Axit okadaic chuẩn (sau đây gọi tắt là OA). 4.2.14 Mẫu thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ chuẩn đã biết hàmlượng DSP. 4.3 Dung dịch thử 4.3.1 Dung dịch ADAM Hoà tan 2 mg ADAM trong 1 ml methanol dưới ánh sáng vàng và bảo quản trong tối ở nhiệt độ - 80 0 C. Chú ý, chỉ chuẩn bị và sử dụng dung dịch ADAM trong vòng 24 giờ. 4.3.2 Dung dịch AcOA: Hoà tan 100 m g AcOA trong 1 ml methanol. 4.3.3 Dung dịch DCA: Hoà tan 3,5 mg DCA trong 100 ml methanol. 4.3.4 Dung dịch OA Pha chính xác dung dịch chất chuẩn OA trong methanol thành các dung dịch có nồng độ lần lượt là1,0; 2,5; 5,0 và 12,5 m g/ml. 4.3.5 Dung dịch chuẩn Cho chính xác 400 ml của một trong các loại nồng độ dung dịch OA (4.3.4) với 140 ml dung dịch DCA (4.3.3), 50 ml dung dịch AcOA (4.3.2) và 110 ml methanol vào một lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu. Nếu không có dung dịch AcOA, có thể thay bằng 50 ml methanol. 4.3.6 Dung dịch clorofom có chứa 1,15 % ethanol Cho 50 g alumin hoạt hoá vào trong một cột thuỷ tinh khô (kích thước L x id là 35 cm x 21 mm) có khoá chặn bằng nhựa teflon. Rót clorofom qua cột rồi loại bỏ 10 ml clorofom ban đầu qua cột. Hứng lấy 50 ml clorofom tiếp theo vào trong bình định mức dung tích 50 ml có chứa sẵn 575 ml ethanol khan. 5 Phương pháp tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu 5.1.1 Rửa sạch vỏ nhuyễn thể trước khi mở để lấy thịt. Rửa nhanh thịt nhuyễn thể trong nước cất để loại bỏ cát sạn và các tạp chất khác. Khi lấy, phải tránh làm dập nát thịt nhuyễn thể. 5.1.2 Cân chính xác một lượng thịt nhuyễn thể (ký hiệu là W 1 ) sao cho có được khối lượng phần nội tạng khoảng 20g. Tách phần nội tạng của nhuyễn thể ra cho lên rây cỡ số 5 rồi để yên trong 5 phút để loại bỏ hết nước. Cân chính xác lượng nội tạng này (ký hiệu là W 2 ). Sau đó, mẫu được nghiền trong máy nghiền đồng thể cho đến khi đồng nhất hoàn toàn. 5.2 Tách chiết độc tố từ mẫu thử 5.2.1 Cân chính xác khoảng 2,0 g nội tạng nhuyễn thể (ký hiệu là W 3 ) đã được đồng nhất hoá theo Ðiều 5.1.2 cho vào một ống ly tâm có dung tích 50 ml. Thêm chính xác vào ống 114 ml dung dịch AcOA và 7,886 ml hỗn hợp dung dịch methanol và nước theo tỷ lệ 80:20 về thể tích. Nếu không có dung dịch AcOA thì cho vào ống ly tâmlượng chính xác 8,0 ml hỗn hợp dung dịch methanol và nước theo tỷ lệ 80: 20 về thể tích. 5.2.2 Ðồng nhất hoá hỗn hợp trong ống bằng máy nghiền đồng thể với tốc độ từ 6 000 đến 10 000 vòng/phút trong 3 phút. Sau đó, đặt ống ly tâm vào bể nước của máy siêu âm khoảng 10 phút. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 5 000 vòng/phút trong 10 phút rồi gạn phần dung dịch trong ống sang một lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu. 5.3 Tinh chế dung dịch chiết 5.3.1 Cho chính xác 5,0 ml dung dịch đã chuẩn bị theo Ðiều 5.2.2 vào một ống ly tâm dung tích 15 ml. Tiến hành chiết 2 lần với n-hexan (mỗi lần cho vào 5 ml và lắc mạnh trong khoảng 30 giây), sau đó loại bỏ lớp n-hexan. 5.3.2 Thêm 1 ml nước và 6 ml clorofom vào ống ly tâm. Lắc mạnh ống trong khoảng 30 giây để trộn đều. Chuyển lớp clorofom ở phía dưới vào một ống nghiệm dung tích 50 ml. 5.3.3 Lớp dung dịch còn lại trong ống ly tâm được tách chiết lần nữa với 6 ml clorofom rồi tiếp tục chuyển lớp clorofom này vào ống nghiệm nói trên. 5.3.4 Làm bay hơi dung dịch trong ống nghiệm có clorofom đến khô bằng dòng khí nitơ. Hoà tan cặn còn lại bằng cách cho 200 ml dung dịch DCA và 800 ml methanol vào trong ống rồi lắc đều. Chuyển dung dịch trong ống nghiệm vào một lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu. 5.4 Tạo dẫn xuất huỳnh quang với ADAM 5.4.1 Chuẩn bị 3 lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu. Sau đó, cho 35,0 ml dung dịch đã chuẩn bị theo Ðiều 5.3.4 vào lọ thứ nhất (mẫu thử), 35,0 ml dung dịch chuẩn (4.3.5) vào lọ thứ hai (mẫu chuẩn) và 35,0 ml methanol vào lọ thứ ba (mẫu trắng). Cho thêm vào mỗi lọ 100 ml dung dịch ADAM (chú ý: phải sử dụng ánh sáng vàng trong giai đoạn này để tránh ADAM bị phân hủy). Ðậy chặt các lọ và để trong bể nước của máy siêu âm ở nhiệt độ khoảng 37 0 C trong 10 phút. Sau đó, tiếp tục lưu giữ các lọ ở nhiệt độ 37 0 C trong bóng tối với thời gian 2 giờ. 5.4.2 Làm khô dung môi trong các lọ thuỷ tinh bằng dòng khí nitơ hay máy ly tâm chân không. Hoà tan cặn trong các lọ bằng 300 ml hỗn hợp dung dịch clorofom và n-hexan theo tỷ lệ 1:1 về thể tích. 5.5 Tinh chế dẫn xuất bằng cột SPE 5.5.1 Hoạt hoá cột SPE Cho lần lượt 6 ml clorofom và 3ml hỗn hợp dung dịch clorofom và n-hexan theo tỷ lệ 1:1 về thể tích đi qua cột SPE. Không được để cột khô trong quá trình hoạt hoá. Sau khi hoạt hoá, phải giữ mức dung môi trong cột cao hơn mặt gel của cột nhồi. 5.5.2 Tinh chế dẫn xuất ADAM 5.5.2.1 Cho dung dịch dẫn xuất ADAM đã chuẩn bị theo Ðiều 5.4.2 qua cột SPE đã chuẩn bị theo Ðiều 5.5.1 với tốc độ 1 giọt/giây. Loại bỏ dung dịch đi qua cột. 5.5.2.2 Rửa cột lần lượt bằng 5 ml hỗn hợp dung dịch clorofom và n-hexan theo tỷ lệ 1:1 về thể tích và 5 ml clorofom chứa 1,15 % ethanol (4.3.6). Loại bỏ dung dịch rửa đi qua cột. 5.5.3 Thu hồi dẫn xuất ADAM Cho 5ml hỗn hợp dung dịch methanol và clorofom theo tỷ lệ 1:9 về thể tích qua cột SPE rồi hứng lấy dung dịch đi qua cột. Làm khô dung dịch thu được bằng dòng khí nitơ. Hoà tan cặn trong 500 ml methanol và đem phân tích trên HPLC. 5.6 Phân tích độc tố trên HPLC 5.6.1 Ðiều kiện phân tích a. Cột sắc ký HPLC; b. Pha động: hỗn hợp dung dịch acetonitril và nước theo tỷ lệ 8:2 về thể tích; c. Chế độ đẳng nhiệt ở 40 0 C; d. Tốc độ dòng 1,0 ml/phút; đ. Thể tích mỗi lần bơmlà 10 ml; e. Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang: Ex: 254 nm và Em: 410 nm. 5.6.2 Qui trình phân tích 5.6.2.1 Bơm các dẫn xuất ADAM của các dung dịch DSP chuẩn đã chuẩn bị theo Ðiều 5.5 vào HPLC và xây dựng đường chuẩn dựa trên độ hấp thụ nhận được theo diện tích pic. Nếu đường chuẩn có độ tuyến tính tốt và đi qua gốc tọa độ thì trong các lần phân tích sau này, chỉ sử dụng 1 dung dịch chuẩn có hàmlượng DSP gần với hàmlượng có trong mẫu thử. Ðường chuẩn lúc này được xây dựng từ độ hấp thụ của dung dịch sử dụng và gốc toạ độ. 5.6.2.2 Bơm các dẫn xuất ADAM của mẫu thử và mẫu trắng đã chuẩn bị theo các Ðiều 5.4 và 5.5 vào HPLC. Mỗi mẫu được bơm 2 lần. Tính độ hấp thụ trung bình cho mỗi mẫu theo diện tích pic sau khi đã trừ đi độ hấp thụ của mẫu trắng. 5.6.2.3 Bơm các dung dịch chuẩn vào HPLC với tần số 2 giờ bơm 1 lần. 5.7 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích 5.7.1 Ðộ lặp lại của 2 lần bơm Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo độ hấp thụ của 2 lần bơmliên tiếp của cùng một dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%. 5.7.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 5 mẫu chuẩn đã biết chính xác hàmlượng độc tố DSP. Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90%. 6 Tính kết quả Hàmlượng độc tố DSP (OA hoặc DTX-1 hoặc DTX-2) trong mẫu thử thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ được tính theo công thức sau: 6.1 Trong trường hợp có sử dụng AcOA C DSP = 2 x x x 6.2 Trong trường hợp không sử dụng AcOA C DSP = 2 x x Trong đó: - C DSP là hàmlượng của một loại độc tố DSP có trong mẫu thử (m g/g thịt); - A S là độ hấp thụ trung bình của độc tố có trong mẫu thử, tính theo diện tích pic; - Ac là độ hấp thụ trung bình của độc tố có trong dung dịch chuẩn nồng độ là C C , tính theo diện tích pic; - A IS là độ hấp thụ trung bình của AcOA có trong dung dịch mẫu thử, tính theo diện tích pic; - A IC là độ hấp thụ trung bình của AcOA có trong dung dịch chuẩn, tính theo diện tích pic; - W 1 là khối lượng mẫu thử thịt nhuyễn thể (g); - W 2 là khối lượng phần nội tạng thu được từ W1 (g) thịt nhuyễn thể; - W 3 là khối lượng phần nội tạng của nhuyễn thể lấy để phân tích (g); - C C là nồng độ của độc tố cần xác định trong dung dịch chuẩn (m g/ml). 28TCN 159:2000 ÐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ TRONG THỊT NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Paralytic shellfish poisons (PSP) in bivalve mollucs flesh - Method for quantitative analysis by high performance liquid chromatography 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàmlượng độc tố gây liệt cơ (sau đây gọi tắt là PSP) trong thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp nằm trong khoảng 1 m g/100g. 2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn được xây dựng dựa theo phương pháp nêu trong Sổ tay hướng dẫn số 33 của Uỷ ban Hải dương học Quốc tế. 3 Nguyên tắc 3.1 Ðộc tố PSP trong thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ gồm có các thành phần sau: a. Saxitoxin (ký hiệu là STX), neosaxitoxin (ký hiệu là neoSTX), decarbamoylsaxitoxin (ký hiệu là dcSTX); b. Các hợp chất thuộc nhóm gonyautoxin (gồm có các chất có ký hiệu từ GTX1 đến GTX6); c. Các hợp chất thuộc nhóm N-sulforcarbamoyl-11-hyđroxysulfat (gồm các chất có ký hiệu từ C1 đến C4); d. Các hợp chất nhóm decarbamoylgonyautoxin (gồm các chất có ký hiệu là dcGTX1 đến dcGTX4); 3.2 Các hợp chất trên không có tính huỳnh quang và không hấp thụ ánh sáng tử ngoại. Nhưng khi bị oxy hoá trong môi trường kiềm bởi axit periodic sẽ tạo thành dẫn xuất có tính huỳnh quang và có thể đo dễ dàng với đầu dò huỳnh quang. Ðể có thể xác định riêng các hợp chất nhóm C (gồm có các chất có ký hiệu là C1, C2, C3 và C4) phải thực hiện thêm quá trình thủy giải dịch chiết bằng axit clohyđric nồng độ 0,1N trước khi đưa vào hệ thống HPLC. Sau quá trình thủy giải, các hợp chất C1 sẽ chuyển đổi thành GTX2, C2 sẽ chuyển đổi thành GTX3. So sánh sắc ký đồ của dịch chiết trước và sau khi thủy giải để xác định hàmlượng của C1, C2. 4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, chất chuẩn và dung dịch thử 4.1 Thiết bị và dụng cụ 4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang có độ nhạy cao. 4.1.2 Cột sắc ký loại RP C8, kích thước L x id là 150 mm x 4,6 mm có chứa hạt silica gel. 4.1.3 Hệ thống phản ứng sau cột gắn ngay sau cột sắc ký: Xem sơ đồ cách lắp đặt hệ thống phản ứng sau cột theo Hình 1. 4.1.4 Màng lọc mao quản kích thước 0,45 m m. 4.1.5 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/phút. 4.1.6 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g. 4.1.7 Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút. 4.1.8 Máy siêu âm. 4.1.9 Micropipet có thang đong từ 10 ml đến 1000 ml. 4.2 Hoá chất và chất chuẩn 4.2.1 Nước cất loại dùng cho HPLC. 4.2.2 Axetonitril loại dùng cho HPLC. 4.2.3 Tetrahyđrofuran loại dùng cho HPLC. 4.2.4 Axit octanesulfonic loại dùng cho phân tích. 4.2.5 Axit axetic băng loại dùng cho phân tích. 4.2.6 Axit clohyđric loại dùng cho phân tích. 4.2.7 Muối axetat natri khan. 4.2.8 Axit periodic dạng tinh thể ngậm 2 phân tử nước (HIO 4 .2H 2 O), loại dùng cho phân tích. 4.2.9 Axit phosphoric đậm đặc loại dùng cho phân tích, độ tinh khiết 98%. 4.2.10 Các dung dịch chuẩn STX, NEO, GTX1, GTX2, GTX3, GTX4, dcGTX2, dcGTX3, dcSTX và các dung dịch được pha chính xác có nồng độ từ 0,1 đến 1 m g/ml. 4.2.11 Mẫu thịt nguyễn thể hai mảnh vỏ chuẩn đã biết hàmlượng PSP. 4.3 Dung dịch thử 4.3.1 Pha động HPLC 4.3.1.1 Pha động 1: 98,5 % dung dịch chứa muối octanesulfonat natri nồng độ 11 mM, axit phosphoric nồng độ 40 mM đã được chỉnh pH về 6,9 với hyđroxit amon (NH 4 OH) và 1,5 % tetrahyđrofuran. 4.3.1.2 Pha động 2: 83,5 % dung dịch chứa muối octanesulfonat natri nồng độ 11 mM, axit phosphoric nồng độ 40mM đã được chỉnh pH về 6,9 với hyđroxit amon), 15,0 % acetonitrile và 1,5 % tetrahyđrofuran. 4.3.1.3 Pha động 3: 98,5 % dung dịch axit phosphoric nồng độ 40mM đã được chỉnh pH về 6,9 với hyđroxit amon và 1,5 % tetrahyđrofuran. 4.3.2 Tác nhân oxi hoá trong hệ thống phản ứng sau cột: Dung dịch chứa axit periodic nồng độ 10mM và hyđroxit amon 550 mM. 4.3.3 Tác nhân axit hoá trong hệ thống phản ứng sau cột: Axit axetic nồng độ 1 M. 5 Phương pháp tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu 5.1.1 Rửa sạch vỏ nhuyễn thể trước khi mở để lấy thịt. Rửa nhanh thịt nhuyễn thể trong nước cất để loại bỏ cát sạn và các tạp chất khác. Khi lấy, phải tránh làm dập nát thịt nhuyễn thể. 5.1.2 Cân khoảng 150 g thịt nhuyễn thể và cho lên rây cỡ số 5, để yên trong 5 phút để loại bỏ hết nước. Sau đó, mẫu được nghiền trong máy nghiền đồng thể cho đến khi đồng nhất hoàn toàn. 5.2 Tách chiết và thủy giải độc tố từ mẫu thử 5.2.1 Tách chiết 5.2.1.1 Cân chính xác 1,0 g mẫu thịt nhuyễn thể đã được đồng nhất vào một ống ly tâm dung tích 15 ml. Thêm 1,0 ml axit axetic nồng độ 0,03 N vào ống rồi đặt vào máy siêu âm. Sau đó, ly tâm với tốc độ 5 000 vòng/phút trong thời gian 10 phút rồi lọc lấy dịch trên màng lọc mao quản. 5.2.1.2 Ðể kiểm tra độ thu hồi của phương pháp, sử dụng 1 g mẫu thịt nhuyễn thể chuẩn và thực hiện qui trình giống như với mẫu thử. 5.2.2 Thủy giải các độc tố thuộc nhóm N-sulfocarbamoyl Các độc tố thuộc nhóm C được thủy giải bằng cách đun nóng 150 ml của dung dịch chiết đã chuẩn bị theo Ðiều 5.2.1 với 37 ml axit clohydric nồng độ 1,0 N ở nhiệt độ 90 0 C trong 15 phút. Sau khi làm nguội hỗn hợp đến nhiệt độ trong phòng, thêm 75 ml dung dịch muối axetat natri (CH 3 COONa) nồng độ 1N rồi đưa phân tích trên hệ thống HPLC. 5.3 Phân tích độc tố trên HPLC 5.3.1 Ðiều kiện phân tích a. Cột sắc ký HPLC; b. Chế độ gradient theo qui định trong Bảng 1; c. Tốc độ dòng 1,2 ml/phút; d. Thể tích mỗi lần bơmlà 10 ml; đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang: Ex: 330 nm và Em: 395 nm. 5.3.2 Ðiều kiện trong hệ thống phản ứng sau cột a. Tác nhân oxy hoá: Ðặt tốc độ dòng là 0,3 ml/phút; b. Nhiệt độ phản ứng trong ống teflon thể tích 1 ml là 50 0 C; c. Tác nhân axit hoá: Ðặt tốc độ dòng là 0,4 ml/phút. Bảng 1 - Chế độ gradient Thời gian (phút) Pha động 1 (%) Pha động 2 (%) Pha động 3 (%) 0 50 0 50 10 50 0 50 12 0 100 0 35 0 100 0 36 100 0 0 47 100 0 0 48 50 0 50 57 50 0 50 5.3.3 Qui trình phân tích 5.3.3.1 Bơm các dung dịch PSP chuẩn nồng độ từ 0,1 đến 1m g/ml vào HPLC. Xây dựng đường chuẩn dựa trên độ hấp thụ nhận được. Nếu đường chuẩn có độ tuyến tính tốt và đi qua gốc tọa độ thì trong các lần phân tích sau này, chỉ sử dụng 1 dung dịch chuẩn có hàmlượng PSP gần với hàmlượng có trong mẫu. Ðường chuẩn lúc này được xây dựng từ độ hấp thụ của dung dịch sử dụng và gốc toạ độ. 5.3.3.2 Bơm các dung dịch mẫu đã chuẩn bị theo Ðiều 5.2 vào HPLC. Mỗi dung dịch mẫu được bơm 2 lần. Tính độ hấp thụ trung bình cho mỗi dung dịch mẫu theo diện tích pic tương ứng. 5.3.3.3 Bơm các dung dịch chuẩn vào HPLC với tần số 2 giờ bơm 1 lần. 5.4 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích 1. Ðộ lặp lại của 2 lần bơm Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo độ hấp thụ của 2 lần bơmliên tiếp của cùng một dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %. 2. Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 5 mẫu chuẩn đã biết chính xác hàmlượng độc tố PSP. Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90%. 6 Tính kết quả 6.1 Hàmlượng của từng loại độc tố PSP (ngoại trừ độc tố nhóm C) trong mẫu thử nhuyễn thể hai mảnh vỏ được tính theo công thức sau: C PSP = 2 x x x F Trong đó: - C PSP là hàmlượng của độc tố PSP có trong mẫu thử ( m g/100g thịt); - A S là độ hấp thụ trung bình của dung dịch mẫu thử, tính theo diện tích pic; - A C là độ hấp thụ trung bình của dung dịch chuẩn có nồng độ Cc, tính theo diện tích pic; - C C là nồng độ của dung dịch chuẩn (m g/ml); - W S là khối lượng của mẫu thử (g); - F là hệ số pha loãng của dung dịch mẫu thử trước khi đưa vào HPLC. 6.2 Hàmlượng độc tố PSP nhóm C Hàmlượng độc tố C 1 = Hàmlượng độc tố GTX 2 (sau quá trình thủy giải) - Hàmlượng độc tố GTX 2 (trước quá trình thủy giải). Hàmlượng độc tố C 2 = Hàmlượng độc tố GTX 3 (sau quá trình thủy giải) - Hàmlượng độc tố GTX 3 (trước quá trình thủy giải). 6.3 Hàmlượng độc tố PSP tổng cộng trong thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng tổng hàmlượng của các loại độc tố đã định lượng được. 28TCN 160:2000 HÀMLƯỢNG THUỶ NGÂN TRONG THỦY SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ Mercury in fish - Method for quantitative analysis by atomic absorption spectrophotometer 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàmlượng thuỷ ngân trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử. 2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp chuẩn số 974.14 của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC) công bố năm 1995. 3 Nguyên tắc 3.1 Mẫu thuỷ sản được vô cơ hoá bằng axit nitric (HNO 3 ) đậm đặc trong bình phá mẫu bằng nhựa teflon có nắp vặn kín. Thuỷ ngân (Hg) trong dung dịch mẫu bị hyđrit hoá bằng dòng khí hyđro. Hyđrit thuỷ ngân dễ bay hơi bị cuốn theo dòng khi hyđro và được bơm vào hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử. Tại đây, hyđrit thuỷ ngân bị phân huỷ thành hơi thuỷ ngân và được xác định theo phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử không dùng ngọn lửa. 3.2 Các phản ứng xảy ra trong hệ thống bay hơi nguyên tử Hyđrit: - NaBH 4 + HCl = NaCl + BH 2ư + 2H ư - 4 H + HgCl 2 = HgH 2ư + 2 HCl - HgH 2 ị Hg + H 2 4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất và chất chuẩn 4.1 Thiết bị và dụng cụ 4.1.1 Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng đèn catốt thuỷ ngân rỗng với hệ thống bay hơi nguyên tử hyđrit. 4.1.2 Bình phá mẫu bằng nhựa teflon có nắp vặn kín dung tích 50 ml. 4.1.3 Tủ sấy nhiệt độ 150 0 C. 4.1.4 Dụng cụ thuỷ tinh đã được rửa sạch bằng axit nitric nồng độ 8N và tráng lại bằng nước cất trước khi sử dụng. 4.1.5 Cân phân tích có độ chính xác loại đến 0,01g và loại đến 0,0001 g. 4.2 Hoá chất và chất chuẩn 4.2.1 Axit nitric đậm đặc 4.2.2 Axit sulfuric (H 2 SO 4 ) đậm đặc. 4.2.3 Axit clohyđric (HCl) nồng độ 1 N. 4.2.4 Dung dịch hoà tan: Cho khoảng 300 - 500 ml nước cất vào bình định mức 1000 ml, cho thêm 58 ml axit nitric và 67 ml axit sulfuric, sau đó định mức đến vạch bằng nước cất. 4.2.5 Dung dịch hyđroxit natri (NaOH) nồng độ 0,25 M: Hoà tan 10,0 g hyđroxit natri trong 1000 ml nước cất. 4.2.6 Dung dịch tetrahyđrua boric natri (NaBH 4 ), nồng độ 3 %: Hoà tan 1,50 g tetrahyđrua boric natri trong 10,0 ml dung dịch hyđroxit natri. 4.2.7 Dung dịch thuỷ ngân chuẩn a. Dung dịch chuẩn gốc, 1,0 mg/ml: Hoà tan 1,000 g thuỷ ngân trong 1000 ml axit sulfuric nồng độ 1N. b. Dung dịch chuẩn trung gian, 1m g/ml: Pha loãng 1ml dung dịch chuẩn gốc thành 1000 ml bằng dung dịch axit sulfuric nồng độ 1N. c. Dung dịch chuẩn làm việc: Pha loãng dung dịch chuẩn trung gian thành các dung dịch chuẩn làm việc có hàmlượng thuỷ ngân lần lượt là 0,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 và 10,0 m g/l bằng dung dịch axit nitric nồng độ 1N. 5 Phương pháp tiến hành 5.1 Vô cơ hoá mẫu 5.1.1 Cân khoảng 1,00 g mẫu sao cho khối lượng khô không nhiều hơn 300 mg. Ðối với mẫu có hàmlượng chất béo cao, lượng mẫu dùng sao cho khối lượng khô không lớn hơn 200 mg. Cho mẫu vào bình phá mẫu. Thêm 5,0 ml axit nitric đậm đặc rồi vặn chặt nắp đậy kín bình lại. 5.1.2 Ðể bình vào tủ sấy đã đặt ở nhiệt độ 150 0 C trong vòng 30 - 60 phút hoặc cho đến khi dung dịch trở nên trong. 5.1.3 Lấy bình ra khỏi tủ sấy, để nguội đến nhiệt độ trong phòng rồi mở nắp và chuyển dung dịch mẫu vào bình định mức 250 ml. Tráng rửa bình phá mẫu bằng khoảng 95 ml dung dịch hoà tan (4.2.4), rót nước rửa vào bình định mức và định mức bằng nước cất cho tới vạch rồi lắc đều. 2. Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách thay 1 g mẫu bằng 1ml nước cất rồi tiến hành theo các bước như quá trình vô cơ hoá mẫu. 5.3 Tiến hành phân tích 5.3.1 Tối ưu hoá các điều kiện làm việc của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử và hệ thống bay hơi nguyên tử hyđrit. 5.3.2 Nối hệ thống theo sơ đồ của Hình 1 (nhưng chưa nối đầu khí vào của bình đun chứa mẫu). Ðiều chỉnh lưu lượng không khí đầu ra của bơm để đạt được lưu lượng khoảng 2 lít/phút bằng cách điều chỉnh tốc độ của bơm thông qua điện áp kế. 5.3.3 Nối hoàn chỉnh hệ thống thiết bị theo sơ đồ lắp đặt hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử như Hình 1. 5.3.4 Xây dựng đường chuẩn bằng cách bơm các mẫu chuẩn với hàmlượng thuỷ ngân lần lượt là 0,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 và10,0 ppb rồi xác định độ hấp thụ của chúng thông qua diện tích pic. 5.3.5 Khi đường chuẩn có độ tuyến tính tốt, tiến hành bơm các dung dịch mẫu thử và mẫu trắng rồi xác định độ hấp thụ của chuẩn thông qua diện tích pic. Tính hàmlượng thuỷ ngân trong mẫu thông qua đường chuẩn sau khi đã trừ đi mẫu trắng. 5.4 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích 5.4.1 Ðộ lặp lại của 2 lần bơm Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo độ hấp thụ của 2 lần bơmliên tiếp của cùng một dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%. 5.4.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 5 mẫu đã cho vào một lượng dung dịch thuỷ ngân chuẩn biết chính xác nồng độ. Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90%. 6 Tính kết quả Hàmlượng thuỷ ngân trong mẫu thử thuỷ sản được tính theo công thức sau: C Hg = 10 -3 x - Trong đó: - C Hg là hàmlượng thuỷ ngân có trong mẫu thử (m g/g); - m Hg là hàmlượng thuỷ ngân có trong dung dịch mẫu tính được theo đường chuẩn (m g/l); - V là thể tích dung dịch dùng để hoà tan mẫu thử (ml); · Mlà khối lượng của mẫu thử (g) 28TCN 161:2000 HÀMLƯỢNG CHÌ TRONG THỦY SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ Lead in fish - Method for quantitative analysis by atomic absorption spectrophotometer 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàmlượng chì trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử. 2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp chuẩn số 972.23 của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC) công bố năm 1995. 3 Nguyên tắc Mẫu thuỷ sản sau khi được tro hoá trong lò nung sẽ được hoà tan hoàn toàn bằng dung dịch axit clohyđric loãng. Chì trong dung dịch mẫu được xác định trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử. 4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất và chất chuẩn 4.1 Thiết bị và dụng cụ 4.1.1 Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử có trang bị đèn catốt chì rỗng bước sóng cài đặt là 283,3 nm, sử dụng ngọn lửa axêtylen-không khí với chiều rộng của đầu đốt là 4 inch. 4.1.2 Chén sứ dung tích 50 ml, độ sâu 5 cm hoặc cốc thuỷ tinh có mỏ bằng thạch anh, dung tích 100 ml. 4.1.3 Tủ sấy nhiệt độ 150 0 C. 4.1.4 Lò nung kiểm soát được nhiệt độ trong khoảng từ 250 đến 600 0 C với sai lệch không quá 10 0 C. 4.1.5 Dụng cụ thuỷ tinh đã được rửa sạch bằng axit nitric nồng độ 8N và tráng lại bằng nước cất trước khi sử dụng. 4.1.6 Cân phân tích có độ chính xác loại đến 0,01g và loại đến 0,0001 g. 4.2 Hoá Chất và chất chuẩn 4.2.1 Dung dịch axit clohyđric (HCl), nồng độ 1N: Pha loãng 82 ml axit clohyđric đậm đặc bằng nước cất đến 1000 ml. 4.2.2 Dung dịch axit nitric (HNO 3 ) nồng độ 1N. 4.2.3 Axit percloric (HClO 4 ) đậm đặc, nồng độ 70,5 %. 4.2.4 Ôxit lantan (La 2 O 3 ). 4.2.5 Ethylendinitrilotetraaxetat (sau đây viết tắt là EDTA) 4.2.6 Dung dịch đệm 4.2.6.1 Cho 163 g EDTA vào trong bình định mức 2000 ml, sau đó thêm 200 ml nước cất và một lượng vừa đủ hyđroxit amon (NH 4 OH) để hoà tan hết EDTA. Thêm 8 giọt chỉ thị methyl da cam vào dung dịch ETDA. 4.2.6.2 Cho 500 ml nước cất vào một cốc thuỷ tinh rồi từ từ cho thêm 60 ml dung dịch axit percloric đậm đặc, khuấy đều rồi để nguội. Sau đó, cho 50 g ôxit lantan vào cốc rồi khuấy đều để hoà tan hết lượng ôxit lantan này. 4.2.6.3 Rót từ từ dung dịch ôxit lantan vào dung dịch ETDA pha ở trên, vừa rót vừa khuấy mạnh. Nếu cần thiết, thêm hyđroxit amon vào dung dịch trên để giữ cho dung dịch có tính kiềm đối với methyl da cam (dung dịch có màu vàng). Ðịnh mức đến vạch bằng nước cất. 4.2.7 Dung dịch chì chuẩn a. Dung dịch chuẩn gốc, 1,0 mg/ml Hoà tan 1,5985 g nitrat chì chuẩn trong khoảng 500 ml dung dịch axit nitric nồng độ 1N. Sau đó, định mức thành 1000 ml bằng dung dịch axit nitric nồng độ 1N trong bình định mức. b. Dung dịch chuẩn trung gian, 10m g/ml Lấy chính xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 1000 ml, thêm 82 ml dung dịch axit clohyđric nồng độ 1N vào bình. Sau đó, định mức lên bằng nước cất. c. Dung dịch chuẩn làm việc Pha loãng dung dịch chuẩn trung gian thành các dung dịch chuẩn làm việc có hàmlượng chì lần lượt là 0,0; 0,2; 0,6; 1,0; 3,0; 5,0 và 10,0 m g Pb/ml bằng dung dịch axit clohyđric nồng độ 1N trong các bình định mức dung tích 50 ml. 5 Phương pháp tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu trắng Làm bay hơi 4 ml dung dịch axit nitric đậm đặc trong chén sứ đến khô trên bếp cách thuỷ. Hoà tan cặn bằng 20 ml dung dịch axit clohyđric nồng độ 1N và chuyển dung dịch vào bình định mức 25 ml. Ðể nguội bình và định mức tới vạch bằng axit clohyđric nồng độ 1N. Chú thích: Yêu cầu tổng hàmlượng chì trong mẫu trắng không được lớn hơn 10 m g. 5.2 Chuẩn bị mẫu thử 5.2.1 Cân khoảng 25,0 g mẫu cho vào chén sứ rồi sấy khô trong tủ sấy trong thời gian 2 giờ ở nhiệt độ từ 135 0 C đến 150 0 C. Chuyển chén sứ vào lò nung và tăng dần nhiệt độ đến 500 0 C. Giữ nhiệt độ lò ở 500 0 C trong thời gian 16 giờ để tro hoá mẫu. 5.2.2 Lấy chén sứ ra để nguội đến nhiệt độ trong phòng. Cho 2 ml axit nitric đậm đặc vào chén rồi làm bay hơi dung dịch trong chén vừa đến khô trên bếp cách thuỷ. Ðặt chén sứ trở lại vào lò nung ở nhiệt độ thường, sau đó tăng dần nhiệt độ đến 500 0 C và giữ ở nhiệt độ này trong khoảng 1 giờ. 5.2.3 Lấy chén ra, để nguội và lặp lại thao tác qui định tại Ðiều 5.2.2 cho đến khi tro có màu trắng hoàn toàn. 5.2.4 Cho 10 ml dung dịch axit clohyđric nồng độ 1N vào chén có tro rồi hoà tan tro bằng cách đun nóng. Chuyển gạn dung dịch vào bình định mức dung tích 25 ml. 5.2.5 Ðun nóng phần tro còn lại trong chén 2 lần, mỗi lần với 5 ml dung dịch axit clohyđric nồng độ 1N rồi rót dung dịch vào bình định mức 25 ml nói trên. Ðể nguội và định mức tới vạch bằng axit clohyđric nồng độ 1N rồi lắc đều. 5.3 Tiến hành phân tích 5.3.1 Tối ưu hoá các điều kiện làm việc của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử tại bước sóng cộng hưởng 283,3 nm và đặt tốc độ dòng của hỗn hợp axêtylen-không khí theo hướng dẫn của nhà sản xuất về điều kiện làm việc chuẩn đối với chì. 5.3.2 Xây dựng đường chuẩn với các hàmlượng của chì lần lượt là 0,0; 0,2; 0,6; 1,0; 3,0; 5,0 và 10,0 m g/ml (4.2.7, c) dựa trên độ hấp thụ của chúng. Trong trường hợp tín hiệu nhận được yếu, phải điều chỉnh độ khuyếch đại để có được độ hấp thụ A của dung dịch chuẩn (hàmlượng 0,2 m g/ml) không nhỏ hơn 1 %. 5.3.3 Khi đường chuẩn có độ tuyến tính tốt, tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử và mẫu trắng đã chuẩn bị như sau: a. Ðối với dung dịch mẫu thử trong, không có cặn lắng Tiến hành xác định độ hấp thụ 3 lần theo các bước sau đây: Bơmlần lượt một dung dịch chuẩn sau đó là dung dịch mẫu thử. Nếu số lượng mẫu nhiều thì bơmlần lượt một dung dịch chuẩn và 3 dung dịch mẫu thử cho đến khi bơm hết dung dịch chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng. b. Ðối với các dung dịch mẫu thử đục Thêm 1 ml dung dịch đệm vào các dung dịch mẫu thử đã chuẩn bị theo Ðiều 5.2.5, mẫu trắng đã chuẩn bị theo Ðiều 5.1 và các dung dịch chuẩn. Sau đó, tiến hành xác định độ hấp thụ của các dung dịch theo Ðiều 5.3.3, a. 5.3.4 Tính hàmlượng chì trong mẫu thông qua đường chuẩn sau khi đã trừ đi mẫu trắng. 5.4 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích 5.4.1 Ðộ lặp lại của 2 lần bơm Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo độ hấp thụ của 2 lần bơmliên tiếp của cùng một dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %. 5.4.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 5 mẫu đã cho vào một lượng dung dịch chì chuẩn biết chính xác nồng độ. Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %. 6 Tính kết quả Hàmlượng chì trong mẫu thử thuỷ sản được tính theo công thức sau: 6.1 Ðối với dung dịch mẫu thử trong, không có cặn lắng C Pb = x 25 6.2 Ðối với dung dịch mẫu thử đục phải bổ sung thêm dung dịch đệm C Pb =m Pb x x Trong đó: - C Pb là hàmlượng chì có trong mẫu thử (m g/g); - m Pb là hàmlượng chì có trong dung dịch mẫu tính được theo đường chuẩn (m g/ml); - 25 là thể tích dung dịch axit clohyđric nồng độ 1N dùng để hoà tan mẫu (ml); - V đ là thể tích dung dịch mẫu thử đã bổ sung 1 ml dung dịch đệm để phân tích (ml); - Mlà khối lượng mẫu thử (g). 28TCN 162:2000 HÀMLƯỢNG CAĐIMI TRONG THỦY SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ Cadmium in fish - Method for quantitative analysis by atomic absorption spectrophotometer 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàmlượng cađimi trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử. 2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp chuẩn số 973.34 của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC) công bố năm 1995. 3 Nguyên tắc Mẫu thuỷ sản được vô cơ hoá bằng các axit nitric (HNO 3 ), axit sulfuric (H 2 SO 4 ) và hyđro peroxit (H 2 O 2 ). Các kimloại có trong dung dịch được chiết ra bằng đithizon trong clorofom (CHCl 3 ) ở pH = 9. Sau đó, dùng dung dịch axit chlohydric (HCl) loãng tách cađimi ra khỏi clorofom. Hàmlượng cađimi trong dung dịch mẫu được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử. 4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất và chất chuẩn 4.1 Thiết bị và dụng cụ 4.1.1 Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng đèn catốt cađimi rỗng, lò nung graphit và bước sóng thu là 228,8 nm. 4.1.2 Cối mã não. 4.1.3 Dụng cụ thuỷ tinh đã được rửa sạch bằng axit nitric nồng độ 8N và tráng lại bằng nước cất trước khi sử dụng. 4.1.4 Cân phân tích có độ chính xác loại đến 0,01g và loại đến 0,0001 g. 4.2 Hoá Chất và chất chuẩn 4.2.1 Hyđro peroxit nồng độ 50%. 4.2.2 Axit nitric đậm đặc không có chì và cađimi. 4.2.3 Axit xitric dạng tinh thể ngậm 1 phân tử nước. 4.2.4 Chỉ thị xanh methyl: Nghiền 0,1 g chỉ thị xanh methyl trong cối mã não với 4,3 ml dung dịch hyđroxit natri (NaOH) nồng độ 0,05 N rồi pha loãng thành 200 ml với nước cất. 4.2.5 Dung dịch đithizon a. Dung dịch đậm đặc, 1,0 mg/ml: Hoà tan 0,2 g đithizon trong 200 ml clorofom. b. Dung dịch loãng, 0,2mg/ml: Pha loãng dung dịch đậm đặc trên 5 lần bằng clorofom. Dung dịch này phải được chuẩn bị ngay trước khi tiến hành phân tích. 4.2.6 Dung dịch cađimi chuẩn a. Dung dịch chuẩn gốc, 1,0 mg/ml Hoà tan 1,000 g cađimi trong 165 ml axit clohyđric nồng độ 2N , định mức thành 1000 ml với nước cất. b. Dung dịch chuẩn trung gian, 10 m g/ml Pha loãng 10 ml dung dịch chuẩn gốc thành 1000 ml bằng dung dịch axit clohyđric nồng độ 2N. c. Dung dịch chuẩn làm việc Pha loãng lần lượt 0, 1, 5, 10 và 20 ml dung dịch chuẩn trung gian thành 100 ml bằng dung dịch axit clohyđric nồng độ 2N. 5 Phương pháp tiến hành 1. Vô cơ hoá mẫu 5.1.1 Cân khoảng 50,0 g mẫu cho vào cốc thuỷ tinh dung tích 1500 ml rồi thả vào 2 - 3 viên đá bọt. Từ từ cho 25 ml axit nitric đậm đặc vào cốc có mẫu trên rồi đậy cốc lại bằng mặt kính đồng hồ. Ðun nhẹ trên bếp cho phản ứng xảy ra. Khi phản ứng ngưng, tiếp tục làm tương tự 3 lần, mỗi lần cho 25 ml axit nitric đậm đặc và đun nóng (có thể thay thế các thao tác trên bằng cách cho ngay một lúc 100 ml axit nitric đậm đặc vào trong cốc đã có mẫu và để yên trong khoảng 8 - 10 giờ ở nhiệt độ trong phòng). 5.1.2 Tiếp tục đun nóng hỗn hợp cho đến khi khí oxit nitơ (NO) thoát ra gần hết. Chú ý để tránh mẫu bị trào ra, có thể phun một ít nước cất từ bình vào thành cốc. 5.1.3 Loại bỏ chất béo trong dung dịch mẫu bằng cách ngâm cốc vào bể nước đá để chất béo đông đặc lại. Sau đó, lọc gạn phần dung dịch qua bông thuỷ tinh vào cốc dung tích 1000 ml. 5.1.4 Cho thêm 100 ml nước cất vào cốc có mẫu rồi đun nóng và khuấy mạnh để rửa sạch chất béo dính trên thành cốc. Làmlạnh cốc dung dịch vừa rửa sạch chất béo rồi lọc qua bông thuỷ tinh. Dịch lọc thu được lại cho vào cốc 1000 ml đã chứa dung dịch lọc ở trên (5.1.3). Rửa phễu lọc và bông thuỷ tinh với khoảng 20 ml nước cất. Loại bỏ phần chất xơ và béo. 5.1.5 Cho thêm 20 ml axit sulfuric đậm đặc vào cốc 1000 ml đang chứa dung dịch lọc rồi pha loãng đến khoảng 300 ml bằng nước cất. Ðun nhẹ cốc trên bếp đến khi sự than hoá bắt đầu mạnh thì cho cẩn thận vào 1 ml hyđro peroxit nồng độ 50%. Ðể yên cho phản ứng ngừng, sau đó tiếp tục cho thêm mỗi lần không quá 1 ml hyđro peroxit nữa cho đến khi dung dịch trở nên không màu. 5.1.6 Ðun mạnh dung dịch cho đến khi xuất hiện khói trắng (khí SO 3 ). Cho thêm hyđro peroxit để loại bỏ hết than đen nếu có rồi để nguội cốc đến nhiệt độ trong phòng. 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách dùng 100 ml axit nitric, 20 ml axit sulfuric và cùng một lượng nước cất như đã thêm vào mẫu. Chú ý cho thêm cùng một lượng hyđro peroxit nồng độ 50% vào để loại bỏ hết axit nitric khỏi mẫu trắng. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng theo các bước như quá trình vô cơ hoá mẫu. 5.3 Chiết tách cađimi 5.3.1 Cho 2 g axit xitric vào dung dịch mẫu đã chuẩn bị theo Ðiều 5.1 rồi pha loãng đến khoảng 25 ml với nước cất, sau đó thêm 1 ml chỉ thị xanh methyl. 5.3.2 Ngâm cốc vào bể nước đá và điều chỉnh pH đến khoảng 8,8 bằng cách nhỏ từng giọt hyđroxit amôn (NH 4 OH) đậm đặc cho đến khi dung dịch đổi mầu từ xanh lá cây sang xanh dương. Chuyển dung dịch vào bình chiết dung tích 250 ml rồi dùng nước cất pha loãng đến khoảng 150 ml. 5.3.3 Ðể nguội dung dịch trong bình chiết, sau đó chiết 2 lần, mỗi lần với 5 ml dung dịch đithizon đậm đặc rồi thu dịch chiết vào bình chiết A dung tích 125 ml. Tiếp tục chiết với dung dịch đithizon loãng cho đến khi dung dịch đithizon không đổi màu. Sau đó, thu dịch chiết vào bình chiết A nói trên. 5.3.4 Thêm 50 ml nước cất vào bình chiết A, lắc để rửa lớp dung môi rồi chuyển lớp dung môi đithizon vào một bình chiết B dung tích 125 ml. 5.3.5 Cho 5 ml clorofom vào phần nước rửa còn lại trong bình chiết A. Lắc rửa và tách phần dung môi clorofom này cho vào bình chiết B. 5.3.6 Thêm 50 ml dung dịch axit clohyđric nồng độ 0,2N vào bình chiết B rồi lắc mạnh trong 1 phút. Sau đó, để yên cho tách lớp rồi loại bỏ lớp đithizon. 5.3.7 Rửa phần dung dịch còn lại trong bình chiết B với 5 ml clorofom rồi loại bỏ lớp clorofom. Chuyển phần dung dịch nước còn lại vào cốc có mỏ dung tích 250 ml và làm bay hơi từ từ đến khô. Sau đó, rửa thành cốc bằng 10 - 20 ml nước cất rồi lại làm bay hơi đến khô. 5.4 Tiến hành phân tích 5.4.1 Tối ưu hoá các điều kiện làm việc của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử, sử dụng lò graphit với bước sóng cộng hưởng 228,8 nm theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 5.4.2 Bơmlần lượt các dung dịch chuẩn có hàmlượng cađimi là 0,0; 0,1; 0,5; 1,0 và 2,0 m g/ml vào trong máy quang phổ hấp thụ nguyên tử để xác định độ hấp thụ của chúng thông qua diện tích píc. Xây dựng đường chuẩn thông qua hàmlượng cađimi và độ hấp thụ của chúng. 5.4.3 Hoà tan cặn khô trong cốc có mỏ chứa mẫu đã chuẩn bị theo Ðiều 5.3.7 bằng 5,0 ml dung dịch axit clohyđric nồng độ 2N. 5.4.4 Khi đường chuẩn có độ tuyến tính tốt, tiến hành bơm các dung dịch mẫu thử và mẫu trắng rồi xác định độ hấp thụ của chuẩn thông qua diện tích pic. Tính hàmlượng cađimi trong mẫu thông qua đường chuẩn sau khi đã trừ đi mẫu trắng. Chú thích: Ðối với hàmlượng cađimi lớn hơn 2 m g/ml thì hoà tan bằng lượng dung dịch axit clohyđric lớn hơn 5,0 ml . 5.5 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích 5.5.1 Ðộ lặp lại của 2 lần bơm Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo độ hấp thụ của 2 lần bơmliên tiếp của cùng một dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%. 5.5.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 5 mẫu đã cho vào một lượng dung dịch cađimi chuẩn biết chính xác nồng độ cađimi. Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90%. 6 Tính kết quả Hàmlượng cađimi trong mẫu thử thuỷ sản được tính theo công thức sau: C Cd = Trong đó: - C Cd là hàmlượng cađimi có trong mẫu thử (m g/g); - m Cd là hàmlượng cađimi có trong dung dịch mẫu tính được theo đường chuẩn (m g/ml); - V HCl là thể tích dung dịch axit clohyđric nồng độ 2N dùng để hoà tan mẫu (ml); - Mlà khối lượng mẫu thử (g).