TCVN5283:2018

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5293:2018 (ISO 13904:2016) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng tryptophan TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 5283:2018 ISO 13904:2016 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRYPTOPHAN Animal feeding stuffs - Determination of tryptophan content Lời nói đầu TCVN 5283:2018 thay thế TCVN 5283:2007; TCVN 5283:2018 hoàn toàn tương đương với ISO 13904:2016; TCVN 5283:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F17 Thức ăn chăn nuôi biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRYPTOPHAN Animal feeding stuffs - Determination of tryptophan content 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng tryptophan (Trp) tổng số và tự do trong thức ăn chăn nuôi (ví dụ: thức ăn hoàn chỉnh và thức ăn bổ sung, nguyên liệu thô, các thành phần thức ăn và thức ăn đậm đặc) và xác định tryptophan tự do trong các tryptophan tinh khiết và premix có chứa trên 2 % tryptophan thương mại. Tiêu chuẩn này không phân biệt được các dạng D- và L-. 2 Nguyên tắc Để xác định tryptophan tổng số, thủy phân mẫu trong môi trường kiềm bằng dung dịch bari hydroxit bão hòa và làm nóng đến 110 °C trong 20 h. Sau khi thủy phân, bổ sung chất nội chuẩn. Để xác định tryptophan tự do, chiết mẫu trong môi trường axit nhẹ với sự có mặt của chất nội chuẩn. Đối với các tryptophan tinh khiết và premix có chứa trên 2 % tryptophan thương mại, có thể bổ sung chất nội chuẩn sau khi chiết. Tryptophan và chất nội chuẩn trong dịch thủy phân hoặc dịch chiết được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) C18 pha đảo với detector huỳnh quang. 3 Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác. 3.1 Nước cất hai lần, hoặc nước có độ tinh khiết tương đương (độ dẫn điện < 10 µS/cm). 3.2 Chất chuẩn và chất kiểm soát: tryptophan (độ tinh khiết ≥ 99 %) được làm khô trong điều kiện chân không trên phospho pentoxit. Hai sản phẩm được coi như tinh khiết 100 %. Chất kiểm soát phải đến từ các nhà sản xuất khác với nhà sản chất chuẩn (xem 3.17.2). CHÚ THÍCH: Kiểm soát độ tinh khiết của chất chuẩn bằng cách đo độ hấp thụ dung dịch tryptophan ở bước sóng 280 nm. Chuẩn bị dung dịch có nồng độ khoảng 5 mg/ml trong HCl 10 -3 N từ dung dịch gốc và do mật độ quang (OD) ở bước sóng 280 nm so với HCl 10 -3 N. Sau đó tính nồng độ của tryptophan bằng công thức: C = OD/5 630 × 10 +06 Trong đó 5 630 là hệ số tắt phân tử của tryptophan trong nước ở bước sóng 280 nm; C được biểu thị bằng µmol/l. Độ tinh khiết của chất chuẩn bằng (C/C 0 ) × 100 trong đó C 0 là nồng độ lý thuyết của dung dịch pha loãng, được biểu thị bằng µmol/l (khoảng 25 µmol/l). Kiểm soát độ tinh khiết sau 6 tháng sử dụng; độ tinh khiết phải ≥ 99 %. 3.3 Chất nội chuẩn: α-metyltryptophan (độ tinh khiết ≥ 99 %), được làm khô trong điều kiện chân không qua phospho pentoxit. 3.4 Bari hydroxit ngậm tám phân tử nước Cẩn thận không để bari hydroxit ngậm tám phân tử nước [Ba (OH) 2 .8 H 2 O] tiếp xúc lâu với không khí để tránh hình thành BaCO 3 , điều này có thể gây cản trở cho việc xác định (xem B.3). 3.5 Natri hydroxit. 3.6 Axit orthophosphoric, w = 85 %. 3.7 Axit clohydric đặc, ρ 20 = 1,19 g/ml. 3.8 Metanol, loại dùng cho HPLC. 3.9 Dầu nhẹ, có dải sôi từ 40 °C đến 60 °C. 3.10 Dung dịch natri hydroxit, c = 1 mol/l. Hòa tan 40,0 g dung dịch natri hydroxit (NaOH) (3.5) trong nước (3.1) và thêm nước (3.1) đến 1 lít. 3.11 Axit clohydric, c = 6 mol/l. Lấy 492 ml axit clohydric (HCl) đặc (3.7) và thêm nước (3.1) đến 1 lít. 3.12 Axit clohydric, c = 1 mol/l. Lấy 82 ml axit clohydric (HCl) (3.7) và thêm nước (3.1) đến 1 lít. 3.13 Axit clohydric, c = 0,1 mol/l. Lấy 8,2 ml axit clohydric (3.1) và thêm nước (3.1) đến 1 lít. 3.14 Axit orthophosphoric, c = 0,5 mol/l. Lấy 34 ml axit orthophosphoric (3.6) và thêm nước (3.1) đến 1 lít. 3.15 Dung dịch chuẩn tryptophan và dung dịch kiểm soát (3.2) đặc, c = 0,50 g/l. Hòa tan 0,25 g tryptophan (3.2) (được cân chính xác đến 0,1 mg) trong axit clohydric (3.13) đựng trong bình định mức 500 ml, và thêm axit clohydric (3.13) đến vạch. Bảo quản ở nhiệt độ -18 °C trong tối đa bốn tuần. 3.16 Dung dịch nội chuẩn đặc, c = 0,54 g/l. Hòa tan 0,27 g α-metyltryptophan (3.3) (cân chính xác đến 0,1 mg) trong axit clohydric (3.13) đựng trong bình định mức 500 ml và thêm axit clohydric (3.13) đến vạch. Bảo quản ở nhiệt độ -18 °C trong tối đa bốn tuần. 3.17 Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn của tryptophan và chất nội chuẩn 3.17.1 Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn dùng để phân tích tryptophan trong thức ăn chăn nuôi, ( c = 0,010 g/l). Lấy 2,00 ml dung dịch tryptophan đặc (3.15) và 2,00 ml dung dịch nội chuẩn đặc ( α -metyltryptophan) (3.16). Pha loãng bằng nước (3.1) và metanol (3.8) đến cùng một thể tích và cùng một nồng độ metanol (10 % đến 30 %) khi kết thúc thủy phân. Chuẩn bị dung dịch này ngay trước khi sử dụng. Trong quá trình chuẩn bị, bảo vệ dung dịch tránh ánh nắng trực tiếp. 3.17.2 Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn của tryptophan dùng để phân tích tryptophan trong các tryptophan tinh khiết và premix có chứa trên 2 % tryptophan thương mại, ( c = 0,010 g/l). Lấy 2,00 ml dung dịch tryptophan đặc (3.15) và 2,00 ml dung dịch nội chuẩn đặc ( α -metyltryptophan) (3.16). Pha loãng bằng axit clohydric 0,1 mol/l (3.13) đựng trong bình định mức 100 ml. Thêm axit clohydric đến vạch. Chuẩn bị dung dịch này ngay trước khi sử dụng. Trong quá trình chuẩn bị, bảo vệ dung dịch tránh ánh nắng trực tiếp. Để kiểm tra xác nhận dung dịch chuẩn hiệu chuẩn, có thể sử dụng dung dịch kiểm soát tryptophan. Dung dịch kiểm soát này được chuẩn bị và phân tích như dung dịch chuẩn hiệu chuẩn, nhưng phải lấy từ nhà sản xuất khác với nhà sản xuất chất chuẩn (3.2). Độ thu hồi tryptophan trong mẫu dung dịch kiểm soát phải từ 99 % đến 101 %. 3.18 Etanolamin > 98 %. 3.19 Dung dịch 1,1,1-Triclo-2-metyl-2-propanol. Cho 1 g 1,1,1-triclo-2-metyl-2-propanol vào 100 ml metanol (3.8). CHÚ THÍCH: Dung dịch 1,1,1-triclo-2-metyl-2-propanol (3.19) có thể được coi là độc hại đối với môi trường và có thể cần xử lý thải bỏ đặc biệt. 3.20 Pha động dùng cho HPLC. Hòa tan 3,00 g axit axetic trong 900 ml nước (3.1) và thêm 50,0 ml dung dịch 1,1,1-triclo-2-metyl-2-propanol (3.19). Chỉnh pH đến 5,00 bằng etanolamin (3.18). Thêm nước (3.1) đến 1 000 ml. Thời hạn sử dụng của pha động (đặc biệt là sự ổn định của hỗn hợp axit axetic và etanolamin) phải được kiểm tra bằng thời gian lưu. Xem thêm Phụ lục B về pha động thay thế: Hỗn hợp đệm phosphat và metanol này rẻ hơn và ít độc hơn; không cần chỉnh pH. Hỗn hợp này rất ổn định. 4 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau: 4.1 Thiết bị HPLC, có detector đo phổ huỳnh quang. 4.2 Cột sắc ký lỏng, kích thước 125 mm x 4 mm, C 18 , được nhồi hạt cỡ 3 µm, hoặc tương đương. 4.3 Máy đo pH. 4.4 Bình polypropylen, dung tích 125 ml, cổ rộng và nắp vặn. 4.5 Bộ lọc màng bằng xenlulose axetat (cỡ lỗ 0,45 µm hoặc 0,22 µm). 4.6 Nồi hấp áp lực, có khả năng duy trì ở nhiệt độ (110 ± 2) °C, [(140 ± 10) kPa (1,4 ± 0,1) bar]. Có thể sử dụng đĩa có nắp đậy kín đặt trong nồi có khả năng duy trì đến nhiệt độ (110 ± 2) °C. 4.7 Máy lắc cơ học hoặc máy khuấy từ. 4.8 Máy trộn Vortex, 4.9 Bộ lọc bằng thủy tinh. 4.10 Bình nón (Erlen meyers) chia vạch, dung tích 200 ml, 250 ml, 600 ml. 4.11 Bình định mức, dung tích 100 ml, 500, 1 000 ml (tất cả đều loại A). 5 Cách tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.1.1 Thức ăn chăn nuôi Nghiền mẫu sao cho lọt hết qua sàng cỡ lỗ 0,5 mm. Các mẫu có độ ẩm cao được làm khô trong không khí ở nhiệt độ không quá 50 °C hoặc được làm đông khô trước khi nghiền. Các mẫu có hàm lượng chất béo cao phải được chiết bằng dầu nhẹ (3.9) trước khi nghiền. 5.1.2 Các tryptophan tinh khiết và premix có chứa trên 2 % tryptophan thương mại N ghiền mẫu sao cho lọt hết qua sàng cỡ lỗ 0,25 mm và đồng hóa kỹ mẫu nghiền. 5.2 Xác định tryptophan tự do (dịch chiết) 5.2.1 Thức ăn chăn nuôi Cân một lượng thích hợp (từ 1 g đến 5 g) mẫu đã chuẩn bị (5.1.1), chính xác đến 1 mg vào bình nón. Thêm 100,0 ml axit clohydric (3.13) và 5,00 ml dung dịch nội chuẩn đặc (3.16). Sử dụng máy lắc cơ học hoặc máy khuấy từ (4.7) lắc hoặc trộn trong 60 min. Để lắng và dùng pipet lấy 10,0 ml dịch nổi phía trên cho vào cốc có mỏ. Thêm 5 ml axit orthophosphoric (3.14). Chỉnh pH đến 3,0 bằng natri hydroxit (3.10). Cho metanol (3.8) đủ để có nồng độ metanol từ 10 % đến 30 % trong thể tích cuối cùng. Chuyển một lượng thích hợp dung dịch vào bình định mức và thêm nước (3.1) đến thể tích cần thiết cho phép đo sắc ký [thể tích tương tự như dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (3.17.1)]. Lọc vài mililit dung dịch qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,45 µm hoặc 0,22 µm (4.5) trước khi bơm vào cột HPLC. Tiến hành chạy sắc ký theo 5.4 Bảo vệ dung dịch chuẩn và dịch chiết tránh ánh nắng trực tiếp. Nếu không thể phân tích các dung dịch thủy phân trong cùng một ngày thì bảo quản các dung dịch này ở nhiệt độ 5 °C trong tối đa ba ngày. 5.2.2 Các tryptophan tinh khiết và premix có chứa trên 2 % tryptophan thương mại Cân từ 0,5 g đến 5 g mẫu đồng nhất (5.1.2), tùy thuộc vào nồng độ dự kiến của tryptophan trong mẫu thử (ví dụ: xem Phụ lục C), chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 1 000 ml. Thêm axit clohydric 0,1 mol/l (3.13) đến vạch. Hỗn hợp được khuấy trong 30 min trên máy lắc cơ học hoặc máy khuấy từ (4.7). Để lắng. Chuyển 2 ml dung dịch trong suốt vào bình định mức 100 ml. Thêm 2 ml chất nội chuẩn đặc (3.16). Thêm axit clohydric 0,1 mol/l (3.13) đến vạch. Dung dịch thử đã pha loãng này phải có nồng độ tryptophan gần với nồng độ tryptophan trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (3.17.2) và nồng độ chất nội chuẩn phải tương tự ( c = 0,010 8 g/l) nồng độ chất nội chuẩn trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (c = 0,010 g/l, 3.17.2). Xem Phụ lục A ví dụ về việc chuẩn bị mẫu thử. Lọc vài mililit dung dịch qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm hoặc 0,22 µm (4.5) trước khi bơm vào cột HPLC. Tiến hành chạy sắc ký theo 5.4. Bảo vệ dung dịch chuẩn và dịch chiết tránh ánh nắng trực tiếp. Nếu không thể phân tích trong cùng ngày thì bảo quản các dịch chiết ở nhiệt độ dưới 5 °C trong tối đa ba ngày. 5.3 Xác định tryptophan tổng số (dịch thủy phân) Cân từ 0,1 g đến 1 g mẫu đã chuẩn bị (5.1.1), chính xác đến 0,2 mg, cho vào bình polypropylen (4.4). Phần mẫu thử đã cân phải có hàm lượng nitơ khoảng 10 mg. Thêm 8,4 g bari hydroxit octahydrat (3.4) và 10 ml nước (3.1). Trộn trên máy trộn Vortex (4.8) hoặc máy khuáy từ (4.7). Để con khuấy từ bằng nam châm được bọc teflon trong hỗn hợp. Rửa thành bình bằng 4 ml nước (3.1). Đậy kín bình và vặn nắp. Chuyển bình sang nồi hấp áp lực (4.6) và hấp trong 30 min đến 60 min. Đậy nồi hấp áp lực và hấp ở nhiệt độ (110 ± 2) °C trong 20 h. Trước khi mở nồi hấp áp lực, giảm nhiệt độ chỉ vừa dưới 100 °C. Để tránh kết tinh Ba(OH) 2 .8H 2 O, thêm 30 ml nước (3.1) ở nhiệt độ phòng vào hỗn hợp đang ấm. Lắc hoặc khuấy nhẹ bình. Thêm 2,00 ml dung dịch nội chuẩn đặc ( α -metyltryptophan) (3.16). Làm nguội bình trong bể nước/đá trong 15 min. Sau đó thêm 5 ml axit orthophosphoric (3.14). Giữ bình trong bể làm mát và trung hòa bằng HCl 6 mol/l (3.11) trong khi vẫn khuấy và sử dụng HCl 1 mol/l (3.12) chỉnh pH đến 3,0. Thêm metanol vừa đủ để có nồng độ metanol từ 10 % đến 30 % trong thể tích cuối cùng. Chuyển một lượng dung dịch thích hợp vào bình định mức và thêm nước (3.1) đến thể tích cần thiết để chạy sắc ký (ví dụ: 100 ml). Việc bổ sung metanol không được tạo kết tủa. Lọc vài mililit dung dịch qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,45 µm hoặc 0,22 µm (4.5) trước khi bơm lên cột HPLC. Tiến hành chạy sắc ký theo 5.4. Bảo vệ dung dịch chuẩn và dịch thủy phân tránh ánh nắng trực tiếp. Nếu không thể phân tích các dịch thủy phân trong cùng một ngày thì bảo quản dịch thủy phân ở nhiệt độ 5 °C trong tối đa ba ngày. 5.4 Xác định bằng HPLC Sử dụng các điều kiện sau đây để rửa giải đẳng dòng; có thể sử dụng các điều kiện khác nếu cho các kết quả tương tự. Cột sắc ký lỏng (4.2): Cột C 18 , kích thước 125 mm × 4 mm, cỡ hạt 3 µm hoặc tương đương Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng Pha động (3.20): Hòa tan 3,00 g axit axetic trong 900 ml nước (3.1) và thêm 50,0 ml dung dịch 1,1,1-triclo-2-metyl-2-propanol (3.19). Chỉnh pH đến 5,00 bằng etanolamin (3.18). Thêm nước đến 1 000 ml. Tốc độ dòng: 1 ml/min Tổng thời gian chạy: Khoảng 34 min Bước sóng detector: Kích thích: 280 nm; phát xạ: 356 nm Thể tích bơm: 20 µl 6 Tính kết quả 6.1 Thức ăn chăn nuôi Hàm lượng tryptophan, w, tính bằng gam trên 100 g mẫu, theo Công thức (1): (1) Trong đó: A is,cal là diện tích pic của chất nội chuẩn trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (3.17.1); A trp, sam là diện tích pic của tryptophan trong dịch chiết (5.2) hoặc dịch thủy phân (5.3); V trp là thể tích dung dịch tryptophan đặc (3.15) được thêm vào dung dịch chuẩn tryptophan (3.17.1), tính bằng mililit (2 ml); c trp là nồng độ dung dịch tryptophan đặc (3.15) được thêm vào dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (5.2.1), tính bằng gam trên lít (g/l). V is, sam là thể tích dung dịch nội chuẩn đặc (3.16) được thêm vào dịch chiết (5.2.1) (= 5,00 ml) hoặc dịch thủy phân (5.3) (= 2,00 ml), tính bằng mililit (ml); V is,cal là thể tích dung dịch nội chuẩn đặc (3.16) được thêm vào dung dịch hiệu chuẩn (3.17.1), tính bằng mililit (= 2,00 ml); A is,sam là diện tích pic của chất nội chuẩn trong dịch chiết (5.2.1) hoặc dịch thủy phân (5.3); A trp,cal là diện tích pic của dung dịch chuẩn hiệu chuẩn tryptophan (3.17.1); m là khối lượng mẫu thử (được chỉnh về khối lượng ban đầu nếu đã được sấy khô và/hoặc khử chất béo), tính bằng gam (g). 6.2 Các tryptophan tinh khiết và premix có chứa trên 2 % tryptophan thương mại 6.2.1 Dung dịch kiểm soát việc hiệu chuẩn Cần kiểm tra xác nhận chất lượng của dung dịch này. Nếu dung dịch này không phù hợp, phải chuẩn bị dung dịch (3.17.2) mới. Sau bốn lần phân tích dung dịch thử thì phân tích một dung dịch hiệu chuẩn. 6.2.2 Tính kết quả Hàm lượng tryptophan, w , tính bằng gam trên 100 g mẫu, tính theo Công thức (2): (2) Trong đó: A is,cal là diện tích pic của chất nội chuẩn trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (3.17.2); A is,sam là diện tích pic của chất nội chuẩn trong dung dịch thử đã pha loãng (5.2.2); A trp,sam là diện tích pic tryptophan trong dung dịch thử đã pha loãng (5.2.2); A trp,cal là diện tích pic của tryptophan trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (3.17.2); C trp là nồng độ dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (3.17.2), tính bằng gam trên lít (g/l). m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g); d là hệ số pha loãng (xem Phụ lục C). 7 Độ chụm 7.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm 7.1.1 Thức ăn chăn nuôi Chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với dải nồng độ và nền mẫu đã nêu. 7.1.2 Các tryptophan tinh khiết và premix có chứa trên 2 % tryptophan thương mại Chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục D. Các giá trị thu được từ phép thử này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với dải nồng độ và nền mẫu đã nêu. 7.2 Độ lặp lại 7.2.1 Thức ăn chăn nuôi Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, độc lập, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại, r , nêu trong Bảng A.1 và Bảng A.3. 7.2.2 Các tryptophan tinh khiết và premix chứa trên 2 % tryptophan thương mại Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, độc lập, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại, r , nêu trong Phụ lục D. 7.3 Độ tái lập 7.3.1 Thức ăn chăn nuôi Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do người thực hiện khác nhau, sử dụng thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập, R , nêu trong Bảng A.1 và Bảng A.3. 7.3.2 Các tryptophan tinh khiết và premix có chứa trên 2 % tryptophan Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, độc lập, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do người thực hiện khác nhau, sử dụng thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập, R , nêu trong Phụ lục D. 8 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã dùng, nếu biết; c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm; e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được. Phụ lục A (Tham khảo) Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm Một phép thử liên phòng thử nghiệm đối với thức ăn chăn nuôi do liên minh Châu Âu tổ chức tiến hành phân tích trên ba mẫu gồm 12 phòng thử nghiệm tham gia để kiểm tra, xác nhận phương pháp thủy phân. Mỗi mẫu thực hiện năm phép phân tích lặp lại. Các kết quả được nêu trong Bảng A.1. Bảng A.1 Mẫu 1 Thức ăn cho lợn Mẫu 2 Thức ăn cho lợn có bổ sung L-tryptophan Mẫu 3 Thức ăn đậm đặc cho lợn Số lượng phòng thử nghiệm gửi kết quả 12 12 12 Số lượng kết quả thử nghiệm từ các phòng thử nghiệm còn lại 50 55 50 Giá trị trung bình, , g/kg 2,42 3,40 4,22 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , g/kg 0,05 0,05 0,08 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, % 1,9 1 , 6 1 , 9 Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 s r ), g/kg 0,14 0,14 0,22 Độ lệch chuẩn tái lập, s R , g/kg 0,15 0,20 0,09 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, % 6,3 6,0 2 , 2 Giới hạn tái lập, R (= 2,8 s R ), g/kg 0,42 0,56 0,25 Các nghiên cứu cộng tác khác tiến hành phân tích trên hai mẫu gồm 13 phòng thử nghiệm tham gia để kiểm tra xác nhận phương pháp chiết tryptophan tự do. Mỗi mẫu thực hiện năm phép phân tích lặp lại. Các kết quả được nêu trong Bảng A.2. Bảng A.2 Mẫu 4 Hỗn hợp lúa mì và đậu tương Mẫu 5 Hỗn hợp lúa mì và đậu tương (= mẫu 4) có bổ sung tryptophan (0,457 g/kg) Số lượng phòng thử nghiệm gửi kết quả 12 12 Số lượng kết quả thử nghiệm từ các phòng thử nghiệm còn lại 55 60 Giá trị trung bình, , g/kg 0,391 0,931 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , g/kg 0,005 0,012 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, % 1,34 1,34 Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 s r ), g/kg 0,014 0,034 Độ lệch chuẩn tái lập, s R , g/kg 0,018 0,048 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, % 4,71 5,11 Giới hạn tái lập, R (= 2,8 s R ), g/kg 0,05 0,134 Các phép thử liên phòng thử nghiệm khác tiến hành phân tích trên bốn mẫu gồm 7 phòng thử nghiệm tham gia để kiểm tra xác nhận phương pháp thủy phân tryptophan. Các kết quả được nêu trong Bảng A.3. Mỗi mẫu thực hiện năm phép phân tích lặp lại. Bảng A.3 Mẫu 1 Thức ăn hỗn hợp cho lợn (CRM 117) Mẫu 2 Bột cá có hàm lượng chất béo thấp (CRM 118) Mẫu 3 Bột đậu tương (CRM 119) Mẫu 4 Bột sữa gầy (CRM 120) Số lượng phòng thử nghiệm gửi kết quả 7 7 7 7 Số lượng kết quả thử nghiệm từ các phòng thử nghiệm còn lại 25 30 30 30 Giá trị trung bình, , g/kg 2,064 8,801 6,882 5,236 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , g/kg 0,021 0 , 101 0,089 0,040 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, % 1,04 1,15 1,30 0,76 Giới hạn lặp lại, r (= 2,8 s r ), g/kg 0,059 0,283 0,249 0,112 Độ lệch chuẩn tái lập, s R , g/kg 0,031 0,413 0,283 0,221 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, % 1,48 4,69 4,11 4,22 Giới hạn tái lập, R (= 2,8 s R ), g/kg 0,087 1,156 0,792 0,619 Phụ lục B (Tham khảo) Các lưu ý về phương pháp B.1 Các điều kiện sắc ký cụ thể sau đây có thể giúp cho việc tách tryptophan và α-metyl tryptophan tốt hơn. Việc rửa giải được thực hiện sau khi làm sạch cột gradient: Cột sắc ký lỏng: Cột C 18 , kích thước 125 mm x 4 mm, cỡ hạt 5 µm hoặc tương đương Nhiệt độ cột: 32 °C Pha động: A: 0,001 mol/l KH 2 PO 4 /metanol, 95 + 5 (phần thể tích) B: metano l Chương trình gradient: 0 min 100% A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100% A 0 % B Tốc độ dòng: 1,2 ml/min Tổng thời gian chạy: Khoảng 33 min B.2 Việc chạy sắc ký sẽ thay đổi tùy theo loại HPLC và vật liệu nhồi cột được sử dụng. Hệ thống được chọn phải có khả năng tách đường nền của tryotophan và chất nội chuẩn. Tuy nhiên, điều quan trọng là các sản phẩm phân hủy được tách ra khỏi tryptophan và chất nội chuẩn. Dịch thủy phân không chứa chất nội chuẩn phải được chạy sắc ký để kiểm tra đường nền về tạp chất của chất nội chuẩn. Điều quan trọng là thời gian chạy đủ dài để rửa giải tất cả các sản phẩm phân hủy, ngoài ra các pic rửa giải chậm có thể cản trở việc chạy sắc ký sau đó. Hệ thống sắc ký cần cho đáp ứng tuyến tính trên dải vận hành. Đáp ứng tuyến tính phải được đo bằng nồng độ không đổi (chuẩn) của chất nội chuẩn và nồng độ khác nhau của tryptophan. Điều quan trọng là cỡ pic của cả trytophan và chất nội chuẩn nằm trong dải tuyến tính của hệ thống HPLC/huỳnh quang. Nếu pic tryptophan và/hoặc pic chất nội chuẩn quá thấp hoặc quá cao thì phải lặp lại phép phân tích với cỡ mẫu và hoặc thay đổi thể tích cuối cùng. B.3 Nếu để quá lâu, bari hydroxit trở nên khó hòa tan. Điều này dẫn đến dung dịch không trong đối với phép xác định HPLC và cho kết quả thấp đối với tryptophan. Phụ lục C (Tham khảo) Chuẩn bị mẫu thử: Ví dụ về phép phân tích các tryptophan tinh khiết và premix Bảng C.1 Tryptophan tự do dự kiến, % Khối lượng mẫu, g/1 000 ml Pha loãng Dung dịch nội chuẩn đặc (3.16), ml Hệ số pha loãng d Nồng độ tryptophan tự do dự kiến trong dung dịch, g/ l 2 - 10 5,00 g 2 ml th à nh 100 ml 2 50 từ 0,002 0 đến 0,010 0 10 - 20 2,50 g 2 ml thành 100 ml 2 50 từ 0,005 0 đến 0,010 0 20 - 40 1,25 g 2 ml thành 100 ml 2 50 từ 0,005 0 đến 0,010 0 40 - 60 0,80 g 2 ml thành 100 ml 2 50 từ 0,006 4 đến 0,009 6 60 - 80 0,60 g 2 ml thành 100 ml 2 50 từ 0,007 2 đến 0,009 6 80 - 100 0,50 g 2 ml thành 100 ml 2 50 từ 0,008 0 đến 0,010 0 Phụ lục D (Tham khảo) Các kết quả phép thử liên phòng thử nghiệm đối với tryptophan trong các tryptophan tinh khiết và premix có chứa trên 2 % tryptophan Năm 2011, một so sánh liên phòng thử nghiệm đã được tiến hành để đánh giá các đặc tính hiệu năng phương pháp của phương pháp phân tích xác định tryptophan tự do trong các tryptophan tinh khiết và premix có trên 2 % tryptophan thương mại. Trong tổng số, mười sáu mẫu tương ứng có tám cặp mẫu mù đã được gửi đến mười tám phòng thử nghiệm. Mười bảy phòng thử nghiệm báo cáo kết quả về bộ mẫu. Năm phòng thử nghiệm đã bị loại trừ vì không tuân theo quy định. Hàm lượng tryptophan thu được trong các vật liệu thử trong dải từ 1,26 g/100 g đến 49,99 g/100 g đối với các hỗn hợp premix và từ 90,30 g/100 g đến 99,78 g/100 g đối với các tryptophan tinh khiết thương mại. Các giá trị đo được phù hợp với các giá trị dự kiến được đưa ra bởi nhà sản xuất premix, ngoại trừ giá trị thấp nhất (giá trị dự kiến sai đối với mẫu premix 1). Bảng D.1 Premix 1 (Tryptophan tự do 2,5 %) Premix 2 (Tryptophan tự do 10,0 %) Premix 3 (Tryptophan tự do 15,0%) Premix 4 (Tryptophan tự do 50,0%) Tryptophan tinh khiết 1 (Tryptophan tự do 90,0%) Tryptophan tinh khiết 2 (Tryptophan tự do 94,0%) Tryptophan tinh khiết 3 (Tryptophan tự do 96,0%) Tryptophan tinh khiết 4 (Tryptophan tự do 98,0%) Số lượng phòng thử nghiệm sau khi trừ ngoại lệ, p 12 11 12 11 12 11 12 11 Giá tr ị trung bình X , g/100 g 1,26 9,94 19,33 49,99 90,30 93,84 95,77 99,78 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , g/100 g 0,07 0,14 0,42 0,46 0,63 0,71 0,86 0,51 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, CV r , ( s r /X%) 5,26 % 1,38% 2,18 % 0,93 % 0,69 % 0,76 % 0,90 % 0,51 % Giới hạn lặp lại, r 0,19 0,38 1,18 1,30 1,75 1,99 2,42 1,42 Độ lệch chuẩn tái lập, s R , g/100 g 0,12 0,30 0,64 1,05 1,18 1,13 1,29 0,96 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, CV R ( s R / X %) 9,50 % 3,04 % 3,31 % 2,11 % 1,30% 1,20% 1,34% 0,96 % Giới hạn tái lập R , g/100 g 0,34 0,85 1,79 2,95 3,29 3,16 3,60 2,67 Thư mục tài liệu tham khảo [1] Commission Directive 2000/45/EC of 6 July 2000, establishing Community methods of analysis for the determination of vitamin A, vitamin E and tryptophan in feedingstuffs [2] I nterlaboratory comparisons report from BIPEA: RCIL n° 2011-2012- 0334: Precision test “Determination of free tryptophan in premixes and pure products”