TCVN9744:2013

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9744:2013 (ISO 10727:2002) về Chè và chè hòa tan dạng rắn - Xác định hàm lượng cafein - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao TIÊU CHU Ẩ N QUỐC GIA TCVN 9744:2013 ISO 10727:2002 CHÈ VÀ CHÈ HÒA TAN DẠNG RẮN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Tea and instant tea in solid form - Determination of caffeine content - Method using high-performance liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 9744:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 10727:2002; TCVN 9744:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F20 Chè và s ả n phẩm ch è biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công b ố . CHÈ VÀ CHÈ HÒA TAN DẠNG RẮN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Tea and instant tea in solid form - Determination of caffeine content - Method using high-performance liquid chromatography 1. Phạm vi áp dụng Ti ê u chu ẩ n này qui đ ị nh phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác đ ị nh h à m lượng cafein của chè v à chè hòa tan. Ti ê u chu ẩ n này c ó thể áp dụng cho ch è xanh, chè đen và các sản ph ẩ m ch è đã tách cafein. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau r ấ t c ầ n thi ế t cho việc áp dụng tiêu chu ẩ n này. Đối v ớ i các tài liệu viện dẫn ghi n ă m công bố th ì áp dụng phi ê n bản được nêu. Đối với các tài liệu viện d ẫ n không ghi năm công bố th ì áp dụng phi ê n bản mới nh ấ t, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng đ ể ph â n t í ch trong phòng th í nghi ệ m. Y ê u c ầ u kỹ thuật và phương ph á p th ử TCVN 9738:2013 ( ISO 1572:1980), Ch è - Chu ẩ n bị mẫu nghiền và xác định hàm lượng ch ấ t kh ô . TCVN 9741:2013 (ISO 7513:1990), Ch è hòa tan dạng rắn - X á c đ ị nh độ ẩ m (hao hụt khối lượng ở 103 °C) . 3. Nguyên tắc Cafein từ ph ầ n mẫu thử được chi ế t bằng cách cho hồi lưu với nước c ó magie oxit. Sau khi lọc, hàm lượng cafein được định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao có detector UV . 4. Thuốc thử Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khi ế t phân tích, trừ khi có quy định khác. 4.1. Nước, phù hợp loại 1 qui đ ị nh trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987). 4.2. Metanol , loại HPLC. 4.3. Pha động, hỗn hợp metanol/nước Cho 600 ml metanol (4.2) vào b ì nh định mức một vạch 2 l í t. Pha lo ã ng đ ế n vạch b ằ ng nước và trộn. Lọc hỗn hợp qua bộ l ọc cỡ lỗ 0,45 m m (5.3). Bằng cách ch ỉ nh nồng độ metanol, có thể c ả i ti ế n th ờ i gian lưu của cafein để tối ưu việc tách của HPLC. Cũng có thể cải ti ế n thời gian lưu bằng cách tăng nhiệt độ cột , nh ư ng không được quá 60 ° C . 4.4. H ỗ n hợp etanol/n ước , 1/4 (phần thể t í ch). 4.5. Mag i e ox i t (c ò n được gọi “magie oxit nặng”). CHÚ THÍCH : Magie oxit nhẹ c ó th ể cho giá tr ị hàm lượng cafein không ch í nh x á c. 4.6. Dung dịch chuẩn gốc cafein, tương ứng v ớ i 500 m g/ml Cân 0,125 g cafein, ch í nh xác đ ế n 0,001 g , cho vào b ì nh định mức một vạch 250 ml. Thêm hỗn hợp etanol/n ướ c (4.4) đủ đ ế n nửa b ì nh. L ắ c để hòa tan cafe i n rồi pha loãng đ ế n vạch bằng hỗn h ợ p etanol/nước. Dung dịch này bền đến 1 tháng n ế u được bảo quản trong tủ lạnh. 4.7. Các dung d ị ch chu ẩ n cafe i n Các dung dịch chu ẩ n A, B, C và D phải được chu ẩ n bị trong ngày sử dụng. 4.7.1. Dung d ị ch chuẩn cafein A , t ươ ng ứng với 15 m g/ml Đưa nhiệt độ của dung dịch chu ẩ n g ố c ca f e i n (4.6) đ ế n nhiệt độ phòng. Dùng pipet chuy ể n 3,0 m l dung dịch này vào b ì nh định mức một vạch 100 m l . Pha lo ã ng đ ế n vạch bằng nước và trộn. 4.7.2. Dung dịch chu ẩ n cafein B , tương ứ ng với 10 m g/ml Tiến hành theo qui trình nêu trong 4.7.1 nhưng dùng pipet lấy 2,0 ml dung d ị ch chu ẩ n gốc (4.6). 4.7.3. Dung dịch chuẩn cafein C , tương ứ ng với 5 m g/ml Tiến hà nh theo qui trình n ê u trong 4.7.1 nhưng dùng pipet l ấ y 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.6). 4.7.4. Dung d ị ch chuẩn caf e in D , tương ứng với 2 m g/ml Dùng pipet chuyển 20 ml dung dịch chu ẩ n B (4.7.2) vào b ì nh đ ị nh mức một vạch 100 ml. Pha lo ã ng đến vạch bằng nước v à trộn. 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết b ị , dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường v à cụ thể các thi ế t bị, dụng cụ sau đây: 5.1. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao , được trang bị detector UV , cho phép đo ở bước sóng từ 254 nm đến 280 nm và c ó hệ thống thu nhận/tích ph â n dữ liệu hoặc bộ ghi biểu đồ. CHÚ TH Í CH : Bước sóng g ầ n 28 0 nm l à tốt nh ấ t v ì bước s ố ng h ấ p thụ UV của cafein tối đa ở 272 nm. V ì nhiệt độ h ằ ng ngày dao động lớn, n ê n phải có biện pháp để đảm bảo nhiệt độ cột không đổi, ví dụ sử dụng lò cột hoặc túi n ướ c. 5.2. Cột sắc k ý dùng cho HPLC , loại pha đảo C18, tốt nhất c ó các hạt h ì nh cầu và hiệu qu ả ở í t nhất 5 000 đĩa lý thuyết 1) . Từ diện tích pic thu được b ằ ng cách bơm một trong số các dung dịch chuẩn cafein (4.7), số lượng đĩa theo lý thuyết N của cột c ó thể được tính như sau: Trong đó t là thời gian l ưu của pic; W 0,5 là chi ề u rộng pic tại nửa chiều cao pic. CH Ú TH Í CH : Trong tiêu chuẩn này, các điều kiện v ề sắc k ý và th à nh ph ầ n của pha động (4.3) đ ược quy định l à t hích hợp đối với cột C18 Partisphere kích thước 110 mm x 4,6 mm, phù h ợ p với h ệ th ố ng HPLC của h ã ng Whatman. N ếu sử dụng các l oại cột kh á c, th ì có th ể cần ph ả i thay đ ổ i pha động và các điều kiện s ắ c k ý . 5.3. Dụng cụ lọc , bộ lọc màng c ỡ lỗ 0,45 m m. 5.4. B ế p điện , phù hợp v ớ i b ì nh cầu đáy tròn dung tích 1 lít. 5.5. B ì nh cầu , đáy tròn dung tích 1 lít, có cổ th ủ y tinh mài. 5.6. Hạt ch ố ng tr à o. 5.7. Ố ng sinh hàn , được làm l ạnh b ằ ng nước, có khớp thủy tinh mài g ắ n với b ì nh cầu đáy tr ò n dung tích 1 l í t. 5.8. C â n phân tích , c ó th ể cân chính xác đến ± 0,001 g. 6. Lấy mẫu Đi ề u quan trọng l à phòng thử nghiệm nhận đúng mẫu đại diện v à không bị hư hỏng hoặc thay đ ổ i trong suốt quá trình bảo qu ả n hoặc vận chuyển. Việc lấy mẫu kh ô ng quy định trong tiêu chuẩn này. Nên l ấ y mẫu theo: TCVN 5609 (ISO 1839), đ ố i v ớ i chè xanh v à chè đen; TCVN 9743 (ISO 7516) , đối với chè hòa tan. 7. Chuẩn bị mẫu thử Nghiền mẫu chè xanh hoặc chè đen theo TCVN 9738 (ISO 1572). Không c ầ n nghiền đối v ớ i m ẫ u chè hòa tan. 8. Cách tiến hành 8.1. Yêu cầu chung N ế u đáp ứng yêu c ầ u độ lặp lại, th ì ti ế n hành hai lần xác định đơn lẻ theo 8.2 đ ế n 8.6 trong các đi ề u kiện lặp lại. 8.2. Xác đ ị nh hàm lư ợng ch ấ t khô T í nh hàm lượng ch ấ t khô từ phương pháp xác định độ ẩ m (hao hụt khối l ượ ng ở 103 °C) đ ã được xác định tr ê n ph ầ n m ẫ u thử theo: - TCVN 9738 (ISO 1572), đối v ớ i chè xanh hoặc chè đen; - TCVN 9741 (ISO 7513), đối với chè hòa tan. 8.3. Ph ầ n m ẫ u th ử 8.3.1. Ch è xanh và ch è đen C â n 1,0 g mẫu thử (Đi ề u 7), ch í nh xác đ ế n 0,001 g, cho vào b ì nh cầu đ á y tròn (5.5) 8.3.2. Chè hòa tan Cân 0,5 g mẫu thử (Điều 7), ch í nh xác đ ế n 0,001 g, cho vào b ì nh cầu đáy tròn (5.5). 8.4. Chi ết caf e in 8.4.1. Cho 4,5 g ± 0,5 g magie ox i t (4.5) vào chè đự ng trong b ì nh cầu, thêm vài hạt chống trào (5.6) và 300 ml nước. Cân b ì nh và lượng chứa bên trong, ch í nh xác đ ế n 0,1 g. 8.4.2. Trộn lượng chứa bên trong b ì nh. G ắ n ống sinh hàn (5.7), đặt b ì nh cầu lên b ế p điện (5.4) v à đun nhanh đến sôi. Giảm nhiệt độ và cho sôi nhẹ trong 20 min, th ỉ nh thoảng xoay b ì nh. 8.4.3. L ấ y b ì nh chứa mẫu ra khỏi bếp điện và để nguội đ ế n nhiệt độ phòng. Làm khô phía b ê n ngoài b ì nh rồi cân ch í nh xác đ ế n 0,1 g. Khối lượng của b ì nh đ ã nguội và lượng ch ứa b ê n trong phải bằng khối lượng xác định được trong 8.4.1. N ế u có ch ê nh lệch khối lượng, th ì th ê m đủ n ướ c đ ể tăng đến khối lượng xác định được trong 8.4.1 r ồ i trộn đ ề u lượng mẫu này. 8.4.4. Lấy b ì nh ra , để yên cho lượng chứa trong b ì nh lắng xuống lấy khoảng 10 ml dịch nổi phía trên rồi lọc qua bộ lọc (5.3). 8.5. Dịch pha loãng (chỉ đối với chè xanh, chè đen và chè hòa tan thông thường) Dùng pipet chuyển 1,0 ml d ị ch lọc thu được trong 8.4.4 vào b ì nh đ ị nh mức một vạch 10 ml. Pha loãng đ ế n vạch b ằ ng nước và trộn. Đối với các s ả n phẩm đã tách cafein, th ì không cần pha loãng. 8.6. Xác định 8.6.1. Chỉnh các thi ế t b ị C à i đặt máy sắc ký (5.1) theo chỉ d ẫ n của nhà s ả n xu ấ t và chỉnh như sau: - tốc độ dòng của pha động (4.3): 0,5 ml/min đ ế n 1,5 m l /min tùy thuộc vào cột được sử dụng (xem 5.2); - nhiệt độ cột (5.2): tối ưu 40 o C (nhưng xem 4.3). 8.6.2. Ph â n tích HPLC Ngay khi tốc độ dòng của pha động (4.3) và nhiệt độ ổn định, bơm l ê n cột 20 m l của từng dung dịch chu ẩ n cafein A, B, C và D (4.7.1 đến 4.7.4) sau đó bơm d ung dịch mẫu thử (thu được b ằ ng qui trình trong 8.4.4 đối với chè đã tách cafein, qui trình trong 8.5 đối với chè và ch è hòa tan thông thường) với c á c th ể t í ch bằng nhau. Lặp lại việc bơm các dung dịch chuẩn ở các khoảng cách đều đặn (thường sau sáu dung dịch thử). Thu thập và ghi lại dữ liệu đối v ớ i các pic của t ấ t cả các chất chuẩn và m ẫ u thử. 9. Tính kết quả Nhận biết v à đo diện tích pic hoặc c hiều cao pic (tốt nhất l à diện tích pic) đối v ớ i các chất chuẩn và mẫu. Dựng đường chu ẩ n tuyến t í nh nồng độ của chất chu ẩ n cafein (microgam trên milil i t) dựa vào diện t í ch pic hoặc chi ề u cao pic và thu lấy hệ số đáp ứng (RF), dùng h ệ thống thu nhận/ t í ch ph â n dữ liệu tự động hoặc bằng tay từ điểm đ ã chọn trên đ ườ ng chu ẩ n: trong đó RF là hệ s ố đáp ứng của cafein; C c huẩn là nồng độ của ca f ein trong dung dịch chuẩn, tính b ằ ng microgam trên milil ít ( m g/ml); A chuẩn là diện t í ch pic của dung dịch chuẩn cafein; h chuẩn là chiều cao pic của dung dịch chuẩn cafein. Hàm lượng cafein, w , được biểu thị theo ph ầ n trăm ch ấ t kh ô , tính bằng công th ứ c sau đây: w = A mẫu x RF x hoặc w = h mẫu x RF x trong đó A m ẫu l à diện tích pic của mẫu thử; h mẫu là c h iều cao pic của mẫu thử; RF là h ệ số đáp ứng của ca f ein; d là hệ s ố pha lo ã ng (10 đ ố i với chè lá và chè h ò a tan); m là khối lượng của mẫu th ử , t í nh bằng ga m (g). w DM l à h à m lượng ch ất khô ( theo khối l ượng , t í nh bằng phần trăm), được xác định theo 8.2. 10. Độ chụm 10.1. Phép th ử l iê n ph ò ng thử nghiệm Các chi tiết về phép thử liên phòng thử nghiệm để xác đ ị nh độ chụm của phương pháp được thống k ê trong Phụ lục A. Các gi á tr ị thu được t ừ phép thử li ê n phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các d ả i nồng độ v à các ch ấ t n ề n khác với các giá trị đ ã nê u . 10.2. Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử nghiệm độc lập, đ ơn l ẻ thu đ ược khi sử dụng cùng phương pháp, tiến h ành trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết b ị , trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % trường hợp vượt quá giá trị gi ớ i hạn lặp lại, ( r ), n ê u trong Bảng A.1. 10.3. Độ tái lập Ch ê nh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai ph é p th ử nghiệm đơn l ẻ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, ti ế n hành trên vật liệu th ử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những ng ườ i khác nhau thực hiện, sử dụng các thi ế t bị khác nhau, không được quá 5 % tr ườ ng hợp v ượt quá giá t rị giới hạn tái lập, (R ) , n ê u trong Bảng A.1. 11. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo th ử nghiệm phải nêu r õ : - mọi thông tin cần thiết để nhận biết đ ầ y đủ về mẫu thử; - phương pháp l ấ y mẫu đ ã sử dụng, n ế u biết; - phương pháp thử đã sử dụng , viện d ẫ n ti ê u chu ẩ n này; - mọi chi t iế t thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là t ùy chọn cũng như các sự cố b ấ t kỳ có th ể ả nh hưởng đ ế n kết quả thử nghiệm; - kết quả thử nghiệm thu được; và - nếu kiểm tra độ lặp lại, th ì n ê u kết qu ả cuối cùng thu được. Phụ lục A (Tham khảo) Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm Một ph é p thử liên phòng thử nghiệm được tiến hành năm 1999 dưới sự bảo hộ của Tổ chức ti ê u chuẩn h ó a quốc t ế , cho các kết quả thống k ê [đ ã được đánh giá theo TCVN 6910-2 (ISO 5725-2)] nêu trong Bảng A.1. Bảng A.1 - Dữ liệu v ề độ chụm Nhận dạng m ẫ u Mẫu a A B C D E F G H Số lượng các ph ò ng thử nghiệm tham gia 11 11 11 11 11 11 11 11 S ố lượng các phép th ử được chấp nhận 8 8 8 8 8 7 8 8 Hàm lượng cafein t r ung b ì nh, % khối lượng chất kh ô 4,120 3,932 0,256 0,091 0,118 0,260 7,729 5 , 116 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r 0,1029 0,1182 0,0096 0,0054 0,0071 0,0104 0,2964 0,1132 Hệ s ố bi ế n thiên lặp lại, % 2 , 50 3,01 3 , 75 5,93 6,02 4 , 00 3,84 2,21 Giới h ạ n lặp lại r (2,8 x S r ) 0,288 0 , 331 0 , 027 0 , 015 0,020 0,029 0,830 0,317 Độ lệch chuẩn tái lập , S R 0 , 165 0 0 , 1564 0 , 0121 0 , 0079 0 , 0071 0,0140 0,3557 0,2361 Hệ s ố bi ế n thi ê n tái lập, % 4,01 3 , 98 4,74 8,68 6,02 5 , 37 4,60 4 , 61 Giới h ạ n tái lập , R (2 , 8 x S R ) 0,462 0,438 0,034 0 , 022 0,020 0,039 0,996 0,661 a M ẫ u A: Chè xanh M ẫ u B: Chè đen (orthodox) Mẫu C: Ch è đen đã tách cafein M ẫ u D: Chè đen đã tách cate i n M ẫ u D : Ch è đen đã t á ch cafein M ẫ u F: Chè đen hòa tan đ ã t ách ca f e i n Mẫu G: Chè đen hòa t an M ẫ u H: Ch è đen hòa tan THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1 ] TCVN 5609:2007 (ISO 1839:1980), Chè - L ấ y m ẫ u [2 ] TCVN 6910-2: 2001 (ISO 5725-2:1994), Độ ch í nh x á c (độ đúng và độ chụm) của phương ph á p đo và kết qu ả đo. Ph ầ n 2: Ph ương pháp cơ bản xác định độ lặp và độ t á i lập của phương ph á p đo ti ê u chu ẩ n [ 3] TCVN 9743:2013 (ISO 7516:1994), Ch è hòa tan d ạng r ắ n - L ấ y mẫu 1) Spherisob 5 ODS , Spher i sob 10 ODS, Nu cl esil 5 C18, Nuclesil 7 C18, Nu cl es i l 10 C18, Zorbax BP C18, Hypersil ODS , CP- Sp e r C18 , Bondapak C1 8 , Supelcos i l C18 và Partisphere C18 là các v í dụ v ề sản ph ẩ m phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chu ẩ n và không ấ n định phải sử d ụng sản ph ẩ m n à y.