TCVN11294:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11294:2016 về Thịt và sản phẩm thịt - Xác định dư lượng B2-agonist trong thịt gia súc bằng phương pháp sắc ký lỏng phổ khối lượng hai lần TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11294:2016 THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG B2-AGONIST TRONG THỊT GIA SÚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG PHỔ KHỐI LƯỢNG HAI LẦN Meat and meat p roducts - Determination of b2-agonist residues in cattle meat by liquid chromatography tandem mass spectrometry Lời nói đầu TCVN 11294:2016 do Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và thủy sản biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông th ô n đề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố; Tiêu chuẩn này được biên soạn trên cơ sở phương pháp "Phân tích sàng lọc và khẳng định Beta Agonist bằng HPLC/MS/MS" của Tổ chức Nông lương Mỹ (USDA), CLG- AGON1. 0 4, trang 1-25, ban hành năm 2012. THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG b 2-AGONIST TRONG THỊT GIA SÚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG PHỔ KHỐI LƯỢNG HAI LẦN Meat and meat p roducts - Determination of b 2-agonist residues in cattle meat by liquid chromatography tandem mass spectrometry 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này áp dụng đ ể xác định dư lượng nhóm β 2 - agonist gồm các chất clenbuterol, salbutamol và ractopamin trong thịt bò, thịt heo bằng kỹ thuật sắc ký l ỏ ng ph ổ khối lượng hai lần. Giới hạn định lượng của phương pháp là clenbuterol 0,1 m g/kg, salbutamol 2,5 m g/kg và ractopamin là 5 m g/kg. 2 Nguyên tắc Dư lượng clenbuterol, salbutamol và ractopamin tự do trong mẫu thử được chiết bằng hỗn h ợ p axetonitrile và isopropanol. Sử dụng các muối natri clorua, natri sul f at và magie sulfat để tủa protein và loại nước có trong dịch chiết. Dịch chiết được bay hơi dung môi đến khô, phần cặn được hòa tan bằng dung dịch nước chứa 10 % axetonitril, sau đó l à m sạch bằng n-hexan. Phần dịch chiết sau khi làm sạch đ ược phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng phổ khối lượng hai lần để xác định clenbuterol, salbutamol và ractopamin. 3 Thuốc thử Trong tiêu chu ẩ n này, chỉ sử dụng thuốc thử có c ấ p độ tinh khiết phân t í ch và nước cất hai lần đã khử ion. 3.1 Chất chuẩn clenbuterol.HC l , ≥ 98,5 % theo khối lượng; 3.2 Chất chuẩn salbutamol sulfat , ≥ 99 % theo khối lượng; 3.3 Chất chuẩn ractopamin.HC l , ≥ 98 % theo khối l ượ ng; 3.4 Chất nội chuẩn clenbuterol D9 , > 99 % theo khối lượng; 3.5 Ch ấ t nộ i chuẩn salbutamo l D3 , ≥ 98 % theo khối lượng; 3.6 Chất nộ i chuẩn r actopamin D6 , > 99 % theo khối lượng; 3.7 Axetonitri l (CH 3 CN) , loại dùng cho LC-MS; 3.8 Nước , loại dùng cho LC-MS; 3.9 Metanol (CH 3 OH) , loại dùng cho LC-MS; 3.10 Isopropanol ; 3.11 n-hexan; 3.12 Natri clorua (NaC l ); 3.13 Natri su lf at (Na 2 S O 4 ); 3.14 Magie sulfat (MgS O 4 ) khan; 3.15 Ax i t f ormic, độ tinh khiết tối thiểu 99 %; 3.16 Amonium f ormat, độ tinh khiết tố i thiểu 99 %; 3.17 Khí argon, tinh khiết 99,9 %; 3.18 Kh í n i t ơ , tinh khiết 99,9 %. 3.19 Pha ch ế dung dịch chuẩn và nội chuẩn 3.19.1 Dung dịch chu ẩ n g ố c clenbuterol, salbutamol, 1000 m g/ml trong metanol Dùng cân phân tích (4.7) cân chính xác khoảng 22,98 mg chất chuẩn clenbuterol.HC l (3.1) và 24,34 mg chất chuẩn salbutamol sulfat (3.2) cho vào các bình định mức dung tích 20 ml (4.4). H òa tan và định mức đến vạch b ằ ng metanol (3.9) để đ ược dung dịch chuẩn gốc c l enbuterol, salbutamol có nồng độ 1000 m g/ml. Dung dịch chu ẩ n gốc được bảo quản ở âm 18 ° C , hạn sử dụng 1 năm. 3.19.2 Dung dịch chuẩn gốc ractopam i n , 1000 m g/ml trong metanol Dùng cân phân tích (4.7) cân chính xác khoảng 22,42 mg chất chuẩn ractopamin.HC l (3.3) vào bình định mức dung tích 20 ml (4.4). H òa tan và định mức đến vạch bằng metanol (3.9) đ ể được dung dịch chuẩn gốc ractopamin có nồng độ 1000 m g/ml. Dung dịch chu ẩ n gốc được bảo quản ở âm 18 ° C , hạn sử dụng 1 năm. LƯU Ý: Lượng cân của ch ấ t chuẩn cl e nbuterol.HC l , sa l butamol sul fat và ractopam i n.HC l ph ả i được đ iều ch ỉ nh v ề dạng clenbuterol, salbutamol và ractopamin và hiệu chỉnh thao độ ti nh kh iế t của ch ấ t chu ẩ n. 3.19.3 Dung d ị ch chất chuẩn hỗn h ợ p trung gian (S1) , clenbutero l 2 m g/ml; salbutamol 50 m g/ml ,và ractopamin 100 m g/ml Hút lần lượt 40 m l dung dịch chuẩn gốc Clenbuterol 1000 m g/ml (3.19.1), 1000 m l dung d ịch chuẩn gốc Salbutamol 1000 m g/ml (3.19.1) v à 2000 m l dung d ịch chuẩn gốc ractopamin 1000 m g/ml (3.19.2) cho vào b ì nh định mức 20 ml (4.4), định mức đến vạch bằng metanol (3.9). Dung dịch được bảo quản ở âm 18 ° C , hạn sử dụng 6 tháng. 3.19.4 Dung dịch chất chuẩn hỗn hợp trung gian (S2) , clenbuterol 100 ng/ml; salbutamol 2500 ng/ml và ractopam i n 5000 ng/ml Hút ch í nh xác 1000 m l dung dịch chất chuẩn hỗn hợp trung gian (S1) (3.19.3) cho vào b ì nh định mức 20 ml (4.4), định mức đến vạch bằng axetonitril (3.7). Dung dịch được bảo quản ở âm 18 ° C , hạn sử dụng 3 tháng. 3.19.5 Dung dịch chất chuẩn hỗn hợp (S3) , clenbuterol 10 ng/m l ; salbut a mol 250 ng/ml và ractopamin 500 ng/ml Hút chính xác 2 ml dung dịch chất chuẩn hỗn hợp trung gian (S2) (3.19.4) cho vào b ì nh định mức 20 ml (4.4), định mức đến vạch bằng axetonitril (3.7). Dung dịch được bảo qu ả n ở âm 18 ° C , hạn sử dụng 3 tháng. 3.19.6 Dung dịch chất nội chuẩn gốc salbutamol D 3 , nồng độ 9,8 m g/m l trong metanol Pha loãng 1ml dung dịch chu ẩ n gốc salbutamol D3 (3.5) nồng độ 100 ng/ m l, độ tinh khiết 98 % trong b ì nh định mức 10 ml (4.4), định mức đến vạch bằng metanol (3.9), để được dung dịch chất nội chuẩn có nồng độ 9,8 m g/ml. Dung dịch được bảo quản ở âm 18 ° C , hạn sử dụng năm. LƯU Ý: Nồng độ của các nộ i chu ẩ n phải được t í nh toán và hiệu ch ỉ nh theo giấy chứng nhận độ tinh khiết của nhà sản xu ấ t. 3.19.7 Dung dịch chất nộ i chuẩn gốc clenbuterol D9 , nồng độ 100 m g/ml trong metanol Lấy một ít metanol (3.9) cho vào l ọ chứa 1 mg ch ấ t chu ẩ n gốc clenbuterol D9 (3.4), lắc cho đến khi chất rắn tan hoàn toàn, sau đ ó chuyển dung dịch vào b ì nh đ ị nh mức 10 ml (4.4), tráng rửa ống chứa chất chu ẩ n vài lần bằng metanol (3.9), gộp tất cả dung dịch vào b ì nh định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng metanol (3.9) để được dung dịch chất nội chuẩn c ó nồng độ 100 m g/ml. Dung dịch chất chuẩn này được bảo quản ở âm 18 ° C , hạn sử dụng 1 năm. 3.19.8 Dung dịch chất nội chuẩn gốc ractopamin D6 , n ồ ng độ 100 m g/ml trong metanol Lấy một í t metanol (3.9) cho v à o lọ chứa 1 mg chất chu ẩ n gốc ractopaminl D6 (3.6), lắc cho đến khi ch ấ t rắn tan hoàn toàn, sau đó chuyển dung dịch vào b ì nh định mức 10 ml (4.4), tráng r ử a lọ chứa chất chuẩn vài lần bằng metanol (3.9), gộp tất cả dung dịch vào b ì nh định mức, định mức đến vạch b ằ ng metano l (3.9) để được dung dịch nội chuẩn có nồng độ 100 m g/ml. Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở âm 18 ° C , hạn sử dụng 1 năm. 3.19.9 Dung d ị ch hỗn hợp chất nội chuẩn (IS1) , clenbuterol D9 và ractopa mi n D6 nồng độ 10 m g/ml Hút lần lượt 1 ml dung dịch ch ấ t nội chuẩn gốc clenbuterol D9 nồng độ 100 m g/ml (3.19.7) và dung dịch chất nội chuẩn gốc ractopamin D6 nồng độ 100 m g/ml (3.19.8) cho vào b ì nh định mức 10 ml (4.4), định m ứ c đến vạch bằng metanol (3.9). Dung dịch bảo quản ở âm 18 ° C , hạn sử dụng 6 tháng. 3.19.10 Dung dịch hỗn hợp chất nội chuẩn làm việc (IS2) , clenbuterol D9, salbutamol D3 và ractopamin D6 nồng độ 50 ng/ml trong axetonitril Hút lần lượt 100 m l dung dịch hỗn hợp chất nội chuẩn IS1 (3.19.9) và 102 m l dung dịch chất nội chuẩn gốc Salbutamol D3 nồng độ 9,8 m g/ml (3.19.6) cho vào b ì nh định mức 20 m l (4.4), định mức đến vạch bằng axetonitril (3.7). Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở âm 18 ° C , hạn sử dụng 3 tháng. 3.19.11 Dung dịch chất chuẩn làm việc 3.19.11.1 Dung dịch chất chuẩn l à m việc 1 , nồng độ clenbuterol 0,1 ng/ml, salbuta m ol 2,5 ng/ml và ractopamin 5 ng/ml trong dung dịch 10 % axetonitril trong nước (3.20) Cho 20 m l d ung dịch chất chuẩn hỗn hợp S3 (3.19.5) vào bình định mức 2 ml (4.4) và định mức đến vạch b ằ ng dung dịch axetonitril 10 % trong nước (3.20). Dung d ị ch được pha mới trước khi sử dụng. 3.19.11.2 Dung dịch chất chuẩn làm việc 2 , nồng độ cl enbuterol 0,2 ng/ml, salbutamol 5 ng/ml và ractopamin 10 ng/ml trong dung d ịch axetonitril 10 % trong nước (3.20) Cho 40 m l dung dịch chất chuẩn hỗn hợp S3 (3.19.5) vào b ì nh định mức 2 ml (4.4) và định mức đến vạch bằng dung dịch axeton i tril 10 % trong nước (3.20). Dung dịch được pha mới trước khi sử dụng. 3.19.11.3 Dung dịch chất chuẩn làm việc 3 , nồng độ clenbuterol 0,3 ng/ml, salbutamol 7,5 ng/m l và ractopamin 15 ng/ml trong dung d ị ch axetonitril 10 % trong nước (3.20) Cho 60 m l dung dịch chất chuẩn hỗn hợp S3 (3.19.5) vào b ì nh định mức 2 ml (4.4) và đ ị nh mức đến vạch bằng dung dịch axetonitril 10 % trong nước (3.20). Dung dịch được pha mới trước khi sử dụng. 3.19.11.4 Dung dịch chất chuẩn làm việc 4 , nồng độ clenbuterol 0,4 ng/ml, salbutamol 10 ng/ml và ractopamin 20 ng/ml trong dung dịch axetonitril 10 % trong nước (3.20) Cho 80 m l dung dịch chất chuẩn hỗn hợp S3 (3.19.5) vào bình định mức 2 ml (4.4) và định mức đến vạch bằng d ung d ịch axetonitr i l 10 % trong nước (3.20). Dung d ịch được pha mớ i tr ướ c khi sử dụng. 3.19.11.5 Dung dịch ch ấ t chuẩn làm việc 5 , nồng độ clenbuterol 0,8 ng/ml, salbutamol 20 ng/ml v à ractopamin 40 ng/ml trong dung dịch axetonitrit 10 % t rong nước (3.20) Cho 160 m l dung dịch chất chuẩn hỗn hợp S3 (3.19.5) vào b ì nh định mức 2 ml (4.4) và đ ị nh mức đến vạch bằng dung dịch axetonitril 10 % trong nước (3.20). Dung dịch được pha mới trước khi sử dụng. 3.20 Dung d ị ch axeton i tr i l 10 % trong nước Lấy 10 ml axetonitril cho vào bình định mức 100 ml (4.4), định mức đến vạch bằng nước cất, lắc đều. Dung dịch pha trước kh i sử dụng và bảo quản ở nhiệt độ phòng. 3.21 Dung dịch 2mM amonium f ormat, pH = 3,0 Hòa tan 0,126 g amonium f ormat vào cốc thủy tinh 1000 ml (4.18) bằng 990 ml n ư ớc cất, sau đó chỉnh pH của dung dịch đ ế n pH = 3,0 bằng axit fo rmic (3.15). Cho dung dung dịch vào b ì nh định mức 1000 ml (4.4) và định mức đến vạch b ằ ng nước cất, lắc đều, lọc và đuổi khí bằng cách siêu âm dung dịch tron g bể siêu âm trước kh i sử dụng. 4 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và như sau: 4.1 Hệ thống máy sắc k ý lòng ghép hai làn kh ố i ph ổ LC-MS/MS - Thiết bị LC-MS/MS: thiết bị sắc ký l ỏ ng ghép khối phổ đầu d ò ba tứ cực, nguồn ion hóa phun điện tử (ESI); - Cột phân tích: cột C18 (dà i 100mm, đường kính trong 2,1 mm, kích thướ c hạt nhồi 1,9 m m); 4.2 Ống ly tâm nhựa , dung t í ch 50 m l có nắp; 4.3 Ố ng ly tâm th ủy tinh , dung tích 10 ml; 4.4 Bình định m ứ c thủy tinh , dung tích 2 ml, 10 ml, 20 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml và 1000 ml, phù hợp với loại A của TCVN 7153 (ISO 1042); 4.5 Pipet tự động , dung tích 50 m l, 100 m l , 250 m l, 1000 m l, 5000 m l ; 4.6 Máy ly tâm lạnh , tốc độ 4000 r/min; 4.7 Cân phân tích , có độ chính xác đến 0,1 mg; 4.8 Cân , c ó độ chính xác đến 0,1 gam; 4.9 M à ng lọc dung m ôi , đường kính 45 mm, k ích th ướ c lỗ 0,2 m m, làm bằng chất liệu chịu được cả nước và dung môi hữu cơ; 4.10 Bộ lọc dung mô i bằng thủy tinh; 4.11 Máy lắc , tốc độ tối thiểu 4000 r/min; 4.12 Máy lắc ngang , tốc độ tối thiểu 300 r/min; 4.13 Lọ đựng mẫu , dung t ích 2 ml; 4.14 Màng lọc mẫu , đường kính 13 mm, kích thước lỗ 0,2 m m, làm b ằ ng Te f lon; 4.15 Bộ bay h ơ i n i tơ , có điều chỉnh nhiệt độ; 4.16 Máy xay thịt, 4.17 Cốc thủy tinh , 1000 m l ; 4.18 Bơm hút chân không. 5 Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định trong ti ê u chuẩn này. Mẫu phân t í ch tại phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không b ị hư hỏng hoặc bị biến đ ổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. 6 Chuẩn bị mẫu Cắt thịt thành từng miếng nhỏ, chỉ lấy phần nạc, đồng hóa mẫu bằng cách cho mẫu đi qua máy xay thịt (4.17) hai lần và trộn. Chuyển mẫu đã đồng nhất sang dụng cụ đựng mẫu, đậy nắp k í n và bảo qu ả n ở nhiệt độ âm 20 ° C . Khi thực hiện phân t ích , phải đưa mẫu về nhiệt độ phòng. 7 Cách tiến hành 7.1 Chiết mẫu Cân 5,00 g ± 0,1 g mẫu thử đã chuẩn bị (xem Điều 6) vào ống ly tâm 50 ml (4.2). Cho vào 50 m l dung dịch hỗn hợp chất nội chuẩn l àm việc I S2 (3.19.10). Vặn kín nắp ống, lắc mạnh bằng tay khoảng 30 s, để yên 15 m i n. Cho vào ống 4 ml axeton i tri l (3.7) và 1 ml isopropanol (3.10). Vặn kín nắp ống, trộn đều bằng máy lắc (4.11) trong 2 min. Thêm vào mỗi ống 1,2 g NaC l (3.12), lắc mạnh 2 min, tiếp tục thêm vào ố ng 4 g Na 2 S O 4 và 0,5 g MgSO 4 , đậy k í n nắp, lắc đều 2 min trên m á y lắc (4.11) . Ly tâm khoảng 5 min ở tốc độ 4000 r/min. Dùng pipet, chuyển 1 m l lớp trên sang ống ly tâm thủy tinh (4.3). Cho bay hơi dung môi đến khô bằng bộ bay hơi nitơ (4.16) ở nhiệt độ 40 ° C . 7.2 Xử lý dịch chiết mẫu thử H òa tan phần cặn bằng 1 ml dung dịch CH 3 CN 10 % trong nước (3.20). Thêm 1 ml n-hexan (3.11), vặn k í n nắp ống. Trộn đều bằng máy lắc (4.11) trong 10 s, ly tâm 6 min ở 4000 r/min. Loại bỏ lớp dung dịch phía trên. Lọc dịch chiết qua màng lọc mẫu (4.14) vào lọ đựng mẫu (4.13). Thực hiện phân tích trên thiết bị LC-MS/MS. 7.3 M ẫ u trắng Cân 5,00 g ± 0,1 g mẫu trắng (mẫu đã được xác định không chứa các chất phân tích) và o ố ng ly tâm 50 m l (4.2). M ẫ u trắng được tiến hành như mẫu thử. Thực hiện tố i thiểu một mẫu trắng trong một dãy mẫu. 7.4 M ẫ u kiểm soát Cân 5,00 g ± 0,1 g mẫu trắng vào ống ly tâm 50 ml (4.2), Thêm 50 m l dung d ị ch chuẩn hỗn hợp S3 (3.19.5) vào mẫu để thu được nồng độ m ẫ u kiểm soát là cl e nbuterol 0,1 ng/g, salbutamol 2,5 ng/g và ractopamin 5,0 ng/g. Vặn kín nắp ống, lắc mạnh bằng tay khoảng 30 s, để yên 15 min. Mẫu kiểm soát được tiến như mẫu thử. Thực hiện tố i thiểu một kiểm soát trong một dãy mẫu. 7.5 Dựng đường chuẩn 7.5.1 Ch iế t mẫu trắng Cân 6 mẫu trắng, mỗi mẫu 5 g, cho vào các ống ly tâm 50 ml (4.2). Thêm 50 m l dung dịch hỗn hợp chất nội chuẩn làm việc IS2 (3.19.10) vào các ống ly tâm, vặn k í n nắp ống và lắc bằng tay khoảng 30 s, để yên 15 min. Cho vào ống 4 m l axeton i tril (3.7) và 1 ml isopropanol (3.10). Đậy nắp ố ng, trộn đều bằng máy lắc (4.11) trong 2 min. Thêm vào mỗi ống 1,2 g N a C l (3.12), lắc mạnh 2 phút, tiếp tục thêm vào ống 4 g Na 2 S O 4 và 0,5 g MgS O 4 , đậy kín nắp, l ắc đều 2 min trên máy lắc (4.11). Ly tâm khoảng 5 min ở tốc độ 4000 r/min. Mở nắp ống, dùng pipet, chuyển 1 ml lớp trên sang ống ly tâm thủy tinh (4.3). Cho bay hơi dung môi đến khô b ằ ng bộ bay hơi nitơ (4.16) ở nhiệt độ 40 ° C . 7.5.2 Chuẩn bị dung d ị ch chuẩn l à m việc Th ê m 1 ml dung dịch axetonitril 10 % trong nước (3.20) vào mẫu chuẩn "0" và 1 ml các dung dịch chuẩn làm việc tương ứng (từ 3.19.11.1 đến 3.19.11.5) vào 5 ống ly tâm thủy tinh tương ứng ch ứ a phần cặn của dịch chiết mẫu tr ắ ng để được các dung d ị ch chuẩn có nồng độ tươ n g ứng như bảng 1. Đậy nắp ống, lắc kỹ sau đó m ở nắp và thêm 1 ml n-hexan (3.11). Trộn đều bằng máy lắc trong 10 s, đậy nắp ống, ly tâm 6 min ở 4000 r/min. Loại b ỏ lớp dung dịch phía trên. Lọc d ị ch chiết qua màng lọc mẫu (4.14) vào lọ đựng mẫu (4.13). Thực hiện phân t ích trên thiết b ị LC-MS/MS. 7.5.3 Đường chuẩn Đường chuẩn c ó dạng: RF = ax + b RF là hệ số tín hiệu, tính theo điều 8.1; x là nồng độ chất chuẩn, tính theo đơn vị ng/ml; b là điểm cắt của đường chuẩn với trục tung; a là hệ số góc của đường chuẩn Bảng 1 - Nồng độ các dung d ị ch chuẩn d ù ng để xây dựng đ ườ ng chuẩn T ê n mẫu Nồng độ chu ẩ n (ng/ml) Clenbuterol Salbutamol Ractopamin Chuẩn 0 0 0 0 Chuẩn 1 0,1 2,5 5 Chuẩn 2 0,2 5 10 Chuẩn 3 0,3 7,5 15 Chuẩn 4 0,4 10 20 Chuẩn 5 0,8 20 40 LƯU Ý: Nếu m ẫ u nhi ề u béo, khi cho n-hexan v à o v à l ắ c quá mạnh, dung dịch sẽ tạo huy ề n phù khó tách lớp. Nên l ắc vừa phải và ti ế n hành loại béo lần thứ ha i (nếu c ầ n). 7.6 Đ iề u kiện phân tích của LC-MS/MS 7.6.1 Yêu cầu chung Thực hiện bảo dưỡng LC và MS để đảm bảo thiết bị hoạt động tốt. C ần thực hiện chuẩn hóa các điều kiện của sắc ký lỏng như tốc độ dòng, thành phần pha động, nhiệt độ cột và các điều kiện của đầu dò MS/MS như điện th ế mao quản, điện thế đ ầ u cone, n ă ng lượng va chạm, tốc độ khí va chạm...để mỗi chất phân t í ch thu được tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) lớn hơn 3 cho các phân mảnh ion và luôn tồn tại 4 điểm nhận dạng (IP) bao gồm 1 ion mẹ, 2 ion con; không có píc nhiễu tại vị trí của píc phân tích. 7.6.2 V í dụ v ề đ iều kiện phân tích LC-MS/MS a) Điều kiện đối với LC: - Nhiệt độ cột: 40 °C; - Thể tích bơm mẫu: 10 m l; - Pha động: grad i ent hai kênh như Bảng 2. Kênh A: axetonitril (3.7). Kênh B: dung dịch 2 mM amonium format, pH = 3,0 (3.21). Bảng 2 - Điều kiện gradient cho hệ thống U PLC Thời gian, min T ốc độ dòng, (ml/min) Kênh A, % Kênh B, % 0 0,2 5 95 0,5 0,2 5 95 1 , 0 0,2 20 80 4,0 0,2 80 20 4,2 0,2 5 95 6,0 0,2 5 95 b) Điều kiện trên MS - Chế độ ion hóa : ion dương; - Nhiệt độ nguồn i on hóa: 150 °C; - Nhiệt độ hóa hơi dung mô i : 400 °C; - Tốc độ dòng khí l à m bay hơi dung môi: 800 l/h; - Tốc độ dòng khí qua cone Gas: 30 l/h; - Chế độ MRM: theo các điều kiện như Bảng 3. B ả ng 3 - Điều kiện phân mảnh MS-MS Tên hợp chất lon mẹ, m/z I on định l ượ ng, m/z (năng l ượ ng, eV ) I on định tính, m/z (năng lượng, eV ) Năng l ượ ng (Sample Co n e) (V) Clenbuterol 276 202 (14) 167 (28) 18 Clenbuterol D9 286 203 (16) 168 (30) 18 Salbutamol 240 222 (10) 148 (18) 16 Salbutamol D3 243 255 (10) 151 (16) 18 Ractopamin 302 164 (16) 121 (28) 20 Ractopamin.HC l D6 308 168 (16) 290 (22) 20 7.7 Trình tự bơm mẫu Trình tự bơm mẫu theo th ứ tự đề nghị như sau: dung dịch các chất chuẩn (bảng 1, 7.5.3); mẫu kiểm soát; nước cất không chứa các chất phân tích; mẫu tr ắng; mẫu thử; sau tối đa 24 mẫu phải bơm lại dung dịch các chất chuẩn (b ả ng 1, 7.5.3), mẫu kiểm soát và mẫu trắng; mẫu kiểm soát n ê n được tiêm lại sau cuối mỗi dãy mẫu. Không đ ược có píc nhiễu của các chất phân t ích trong mẫ u nước c ấ t được bơm vào thiết bị. 8 Tính kết quả 8.1 Tính hệ số tín hiệu Tính cho từng chất cần phân tích theo phương trình : RF là hệ số tín hiệu; Area l à diện tích píc của ion định lượng của chất phân tích; I SConc là nồng độ ion định lượng của chất nội chuẩn tương ứng chất phân tích; ISArea l à diện tích píc của ion định l ượ ng của chất nội chuẩn tương ứng chất phân tích. 8.3 H à m lượng chất phân tích trong mẫu Dư lượng các chất cần phân tích trong mẫu thử, C , được biểu thị bằng nanogam trên gam (ng/g) và được tính theo công thức sau: C là nồng độ của Agonist có trong mẫu, tính bằng ng/g; C x là nồng độ Agonist đo được suy ra từ đường chuẩn tương ứng với chất phân tích, ng/m l ; V 1 là thể tích dịch chiết ban đầu (5 ml), t í nh bằng ml; V 2 là thể tích dịch chiết dùng cho bước xử lý (1ml), tính b ằ ng ml; V 3 là thể t í ch định mức cuối cùng (1ml), tính bằng ml; F là hệ số pha loãng mẫu kh i đo (nếu không pha loãng, F = 1); m là khố i lượng mẫu thử, tính bằng gam (g). 9 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm ph ả i ghi rõ: - mọi thông t i n cần thiết để nhận b iế t đầy đủ về mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; - phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường n à o khác có thể ảnh hưởng đến kết quả; - kết quả thử nghiệm thu được. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] United States Department of Agriculture Food Safety and Inspection Service, Office of Public Health Science, Screening and Confirmation of Beta-Agonists by HPLC/MS/MS , CLG- AGON1.04. [3] AO A C Offical Method 2011.03, Pa ren t and total Ractopam i ne in Bovine, Swine and Turkey tissues, LC-MS-MS .