TCVN6506-1:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6506-1:2015 (ISO 11816-1:2013) về Sữa và sản phẩm sữa - Xác định hoạt độ phosphatasa kiềm - Phần 1: Phương pháp đo huỳnh quang đối với sữa và đồ uống từ sữa TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6506-1:2015 ISO 11816-1:2013 SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PHOSPHATASE KIỀM - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP ĐO HUỲNH QUANG ĐỐI VỚI SỮA VÀ ĐỒ UỐNG TỪ SỮA Milk and milk products - Determination of alkaline phosphatase activity - Part 1: Fluorimetric method f or milk and milk-based drinks Lời nói đầu TCVN 6506-1:2015 thay thế TCVN 6506-1:2007; TCVN 6506-1:2015 hoàn toàn tương đương với ISO 11816-1:2013; TCVN 6506-1:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, T ổ ng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố; Bộ tiêu chuẩn TCVN 6506 (ISO 11816) Sữa và sản phẩm sữa - Xác định hoạt độ phosphatase kiềm gồm các phần sau đây: - TCVN 6506-1:2015 (ISO 11816-1:2013), Phần 1: Phương pháp đo huỳnh quang đối với sữa và đồ uống từ sữa - TCVN 6506-2:2009 (ISO 11816-2:2003), Phần 2: Phương pháp đo huỳnh quang đối với phomat. SỮA VÀ SẢN PH Ẩ M SỮA - XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PHOSPHATAS E KIỀM - PHẦN 1 : PHƯƠNG PHÁP ĐO HUỲNH QUANG ĐỐI VỚI SỮA VÀ ĐỒ UỐNG TỪ SỮA Milk and milk products - Determination of alkaline phosphatase activity - Part 1: Fluorimetric method f or milk and milk-based drinks 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đo huỳnh quang để xác định hoạt độ phosphatase ki ề m (ALP, EC 3.1.3.1) trong sữa tươi nguyên liệu, sữa nguyên chất đã qua xử lý nhiệt, sữa tách một phần chất béo, sữa gầy và sữa có bổ sung hương liệu. Phương pháp này có thể áp dụng cho sữa và đồ uống từ sữa bò, sữa cừu, sữa dê. Tiêu chuẩ n này có thể áp dụng cho sữa bột sau khi hoàn nguyên. Thiết bị có thể đọc được hoạt độ đến 7 000 mili đơn vị trên lít (mU/l). Nếu hoạt độ lớn hơn 7 000 mU/l thì pha loãng mẫu thử bằng sữa không chứa phosphatase kiềm (7.1) sao cho thu được kết quả không lớn hơn 7 000 m U /l. 2 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 2.1 Hoạt độ phosphatase kiềm (ALP) (alkaline phosphatase activity) Hoạt độ phosphatase kiềm có mặt trong sản phẩm, xác định được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này. CHÚ THÍCH 1 Hoạt độ phosphatase kiềm được biểu thị bằng mili đơn vị hoạt độ enzym trên lít mẫu (mU/I). 2.2 Đơn vị hoạt độ phosphatase kiềm (unit of alkaline phosphatase activity) Lượng enzym phosphatase kiềm xúc tác để biến đổi 1 µmol cơ chất trên phút. 3 Nguyên tắc Hoạt độ phosphatase kiềm của mẫu được đo bằng cách phân tích động học trực tiếp huỳnh quang liên tục. Cơ chất este monophosphoric thơm không phát huỳnh quang, 2’-[2-benzothiazolyl]-6’- hydroxybenzothiazol phosphat, khi có mặt của bất kỳ phosphatase kiềm có nguồn gốc từ mẫu, thì sẽ thủy phân phần gốc phosphat tạo ra sản phẩm phát huỳnh quang cao. Việc đo huỳnh quang của hoạt độ phosphatase kiềm (ALP) được đo ở nhiệt độ 38 °C trong thời gian 3 min sử dụng cơ chất Fluorophos®. Việc này bao gồm ủ ấm sơ bộ cơ chất và mẫu, sau đó lấy số đọc liên tục của tốc độ ph ả n ứng. CHÚ THÍCH : Mặc d ù quy trình này kéo dài 3 min, nhung ở phút đầu l à thời gian cân b ằ ng để đảm b ả o cho mẫu đạt tới nhiệt độ 38 °C. Việc đo hoạt độ thực t ế ch ỉ bắt đầu từ phút thứ hai đến hết ph ú t th ứ ba (nghĩa là chu kỳ 2 min). 4 Thuốc thử Tất cả các thuốc thử được sử dụng phải thuộc loại tinh khiết phân tích và nước phải l à nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 4.1 Cơ chất 1) Fluorophos®, đựng trong chai, mỗi chai chứa 144 mg bột cơ chất Fluorophos®, khối lượng phân tử 580 g/mol. Fluorophos® là loại cơ chất este monophosphoric thơm không phát huỳnh quang, 2’-[2-benzothiazoly l ]- 6’-hydroxybenzothiazol phosphat (Fluorophos®). Cơ chất Fluorophos® có thể bền trong 2 năm kể từ ngày sản xuất nếu được bảo quản trong chai đậy kín, ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C, tránh ánh sáng. 4.2 Dung dịch đệm cơ chất , dung dịch đệm dietanolamin (DEA), c (DEA) = 2,4 mol/l có pH 10,0, được đựng trong các chai 240 ml. Dung dịch đệm cho cơ chất này có thể bền trong 2 năm kể từ ngày sản xuất nếu được bảo quản trong chai đậy kín, ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C, tránh ánh sáng. 4.3 Cơ chất làm việc Để cơ chất Fluorophos® (4.1) và dung dịch đệm cho cơ chất (4.2) đạt đến nhiệt độ phòng. Cho lượng dung dịch đệm cơ chất chứa trong một chai (240 ml) (4.2) vào một chai đựng cơ chất Fluorophos® (144 mg) (4.1) và lắc kỹ bằng cách đảo chiều vật chứa trong 3 min để tạo dung dịch 1,0 milimol (pH 10). Sử dụng chai màu nâu để bảo vệ tránh ánh sáng. Để yên dung dịch thu được ở nhiệt độ phòng ít nhất 30 min trước khi sử dụng. Dùng phép thử A/D (tương tự kỹ thuật số) trong 8.2 để kiểm tra t í nh ổn định của dung dịch cơ chất làm việc sẵn sàng để sử dụng. Không sử dụng dung dịch cơ chất làm việc có số đọc trên 1200 FL U (đơn vị huỳnh quang) thu được (8-2) Cơ chất làm việc n à y có thể bền trong 60 ngày khi được bảo vệ tránh ánh sáng v à được bảo quản ở nhiệt độ t ừ 2 °C đến 8 °C, hoặc 8 h khi bảo quản ở 38 °C. CHÚ THÍCH : Thể tích cơ chất làm việc t hu được (240 ml) l à đủ cho khoảng 115 phép thử. 4.4 Dung dịch hiệu chuẩn , Fluoroyellow®(FY) [2’-(2-benzothiazolyl)-6’-hydroxybenzothiazol] trong dung dịch đệm cơ chất (4.2). Các dung dịch hiệu chuẩn này có thể bền trong 18 tháng kể từ ngày sản xuất khi được bảo quản trong chai kín ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C. Lắc trộn nhẹ trước khi sử dụng để đảm bảo thu được kết quả tối ưu. 4.4.1 Dung dịch hiệu chuẩn A , chứa 0 µmol/l Fluoroyellow®. 4.4.2 Dung dịch hiệu chuẩn B , chứa 17,24 x 10 -3 µmol/l Fluoroyellow®. 4.4.3 Dung dịch hiệu chuẩn C , chứa 34,48 x 10 -3 µmol/l Fluoroyellow®. 4.5 Dung dịch kiểm soát thiết bị hàng ngày , chứa 34,48 x 10 -3 µmol/l Fluoroyellow®. Các dung dịch kiểm soát thiết bị hàng ngày này có thể bền trong 18 tháng kể từ ngày sản xuất khi được bảo quản trong chai kín ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C. Lắc trộn nhẹ trước khi sử dụng để đảm bảo thu được kết quả thích hợp. 5 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thư ờ ng và các thiết bị dụng c ụ sau: 5.1 Máy đo huỳnh quang có bộ lọc , có bộ đỡ cuvet kiểm soát được nhiệt độ ổn định, có thể hoạt động ở 38 °C ± 1 °C, bộ phận quang học góc vuông, kích thích ở bước s ó ng 440 nm và phát xạ ở 520 nm đến 560 nm [ví dụ: thiết bị Fluorophos® 1) ]. 5.2 Cuvet, dùng một lần, bằng thủy tinh không phát huỳnh quang. 5.3 Pipet 5.3.1 Bộ phận phân phối thể tích cố định , đ ể phân phối 2,0 ml. 5.3.2 Pipet dạng xyranh hút hoặc loại tương tự , dung tích 0,075 ml. Cần thực hiện theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất về kỹ th u ật sử dụng pipet để thu được kết quả chính xác. Đ ả m b ả o rằng pitông của pipet kín trước khi sử dụng. 5.3.3 Pipet, dung tích 2 ml và 3 ml. 5.4 Tủ ấ m, thích hợp để giữ cuvet và có khả năng duy trì nhiệt độ ở 38 °C ± 1 0 C . 5.5 Fi l m , loại dùng cho phòng thử nghiệm. 5.6 Máy trộn Vortex. 5.7 Nồi cách th ủy , có khả năng duy trì nhiệt độ ở 63 °C ± 1 °C và 95 °C ± 1 °C. 5.8 Bình định mức một vạch , dung tích 100 ml. 6 Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707). Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư h ỏ ng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. 7 Chuẩn bị 7.1 Sữa không chứa phosphatase ki ề m Chuẩn bị sữa không chứa phosphatase kiềm cùng dạng với mẫu cần phân tích, bằng cách chuyển cẩn thận một lượng sữa vào ống nghiệm hoặc vật chứa thích hợp, không để sữa chạm vào mép hoặc cạnh của vật chứa. Đặt ống thử hoặc vật chứa phần mẫu sữa trên nồi cách thủy (5.7) để ở 95 °C. L à m nóng sơ bộ phần mẫu sữa đến 95 °C, trước khi bắt đầu giai đoạn đun nóng 5 min ở nhiệt độ này. Kiểm tra nhiệt độ bằng cách sử dụng nhiệt kế hoặc đầu dò nhiệt được đặt v à o giữa ố ng hoặc vật chứa. Khi nhiệt độ của phần mẫu thử đạt đến 95 °C, bắt đầu đun ngay trong 5 min. Làm nguội nhanh mẫu sau giai đoạn đun nóng. Kiểm tra phần mẫu thử đã xử lý để chắc chắn rằng hoạt độ ALP của mẫu nhỏ hơn 10 mU/l. 7.2 Chuẩn bị mẫu thử 7.2.1 Yêu cầu chung Trộn kỹ tất cả các mẫu thử trước khi sử dụng. CHÚ THÍCH : Thông thư ờ ng, các mẫu thử nghiệm không cần phải lầm ấm sơ bộ. 7.2.2 M ẫ u thử thanh trùng Sử dụng các lượng cần thiết của mẫu thử đã thanh trùng. 7.2.3 Pha loãng các mẫu thử có các giá trị ALP cao Chuẩn bị các dịch pha loãng của mẫu sữa không có phosphatase (7.1) để đưa mức ALP nằm trong d ả i ph â n tích của phép thử (< 7="" 000="" mu/l).="" trộn="" kỹ="" các="" dung="" dịch="" pha=""> 8 Cách tiến hành 8.1 Đánh giá hiệu năng của thiết bị 8.1.1 Y êu cầu chung Cần đánh giá hiệu năng của thiết bị về độ trôi, ánh sáng phân tán và độ ổn định trước khi phân tích các mẫu thử. Tu â n theo các nguyên tắc Thực hành Ph ò ng thử nghiệm T ố t khi vận hành máy đo huỳnh quang c ó bộ lọc (5.1). Các phép thử kiểm soát chất l ượng bao gồm: a) phép t hử A / D (ana l og-to-digital) hàng ngày, dùng để kiểm tra chức năng của thiết bị b) phép thử kiểm soát thiết bị hàng ngày, sử dụng dung dịch kiểm soát thiết bị hàng ngày (4 . 5) để theo dõi độ trôi quang học hoặc điện tử trong máy đo huỳnh quang; và c) nên sử dụng các phép kiểm soát chuẩn, dương tính và âm tính bên ngoài, như trong 8.1.3, để theo dõi hàng ngày các thông s ố độ chụm của thiết bị. 8.1.2 Phép thử AID 8.1.2.1 Khi sử dụng thiết bị Fl uorophos®, thực hiện phép thử A /D hàng ngày trước khi bắt đầu thử nghiệm. 8.1.2.2 Thực hiện phép thử A/D qua bảng chọn “SETUP”. Ấn phím “SETUP”, chọn “phép thử A/D” bằng cách án ị phải là 302 ± 4. Nếu số đọc nằm ngoài d ả i này, thì làm sạch bộ lọc kích thích và phát xạ và lặp lại phép thử A/D. 8.1.2.3 Chuyển 2,0 ml dung dịch ki ể m soát thiết bị hàng ngày (4.5) vào cuvet đã dán nhãn. Đặt cuvet này vào tủ ấm (5.4) ở 38 °C trong 20 min. Đặt cuvet đã làm ấm sơ bộ vào giá đỡ. Đậy nắp. Khi số hiển thị đ ã ổn định, ghi lại giá trị hiển thị, giá trị n à y phải ở 602 ± 12. Nếu nằm ngoài dải này, thì sử dụng tua vít vặn từ từ vít của dụng cụ đo điện thế ở phía trên tay trái theo chiều kim đồng hồ hoặc ngược chiều kim đồng hồ của thiết bị, cho đến khi các số đọc hiển thị là 602, nếu cần. Để các số đo ổn định 15 min. 8.1.3 Kiểm soát Tiến hành các phép kiểm soát dương tính, âm tính và PhosphaCheck-N 2) sử dụng nền sữa bột có phosphatase và chất bảo quản. Các chất kiểm soát thanh trùng PhosphaCheck bền được 18 tháng khi được bảo quản trong chai kín ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C. Khi được hoàn nguyên, dung dịch này bền được 3 ngày khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C. Không làm đông lạnh. Để các chất kiểm soát cân bằng đến nhiệt độ phòng. Hoàn nguyên chất kiểm soát thanh trùng PhosphaCheck® trước khi sử dụng. M ở nắp đậy bằng kim loại và cao su, thêm 3,0 ml nước đã loại ion ở nhiệt độ phòng. Đậy nắp và lắc nhẹ bằng cách đảo chiều vật chứa 1 min và để yên 15 min. Không lắc vật chứa hoặc để chất kiểm soát tạo bọt . Trộn nh ẹ vật chứa trước mỗi lần sử d ụ ng để thu được kết quả t ố i ưu. Sau khi hiệu chuẩn kênh chưa sử dụng bằng chất kiểm soát âm tính, phân tích ba d ung dịch chất kiểm soát (dương tính, âm tính và PhosphaCheck-N™) bằng cách cho 75 µl mỗi dung dịch kiểm soát vào 2 ml cơ chất đã làm ấm sơ bộ. Thực hiện phép thử ALP. Số đọc đối với kiểm soát âm tính phải nhỏ hơn 10 mU/l, chất chu ẩ n PhosphaCheck-N™ phải trong khoảng từ 10 mU/l đến 40 mU/l và kiểm soát dương tính phải bằng (500 ± 100) mU/l. H à ng ngày có thể sử dụng các chất kiểm soát này để theo dõi độ chụm của thiết bị. 8.2 Kiểm soát thuốc thử để kiểm tra sự phù hợp của cơ chất làm việc sử dụng ngay Phân phối 2,0 ml cơ chất làm việc (4.3) vào cuvet đã dán nh ã n. Đặt cuvet này vào tủ ấm (5.4) ở 38 °C trong 20 min. Đặt cuvet đã làm ấm sơ bộ c ó chứa cơ chất làm việc vào giá đỡ cu v et. Đậy nắp. Khi số hiển thị đã ổn định, ghi lại giá trị hiển thị. Dung dịch cơ chất vừa mới pha chế theo phương thức A/D thường cho số đọc hiển thị ở khoảng 650 FLU tăng dần theo thời gian. Không sử dụng cơ chất làm việc khi số đọc hiển thị thu được trên 1 200 FLU. 8.3 Hiệu chuẩn Các đường chuẩn phải luôn ổn định. Tuy nhiên, cần phải hiệu chuẩn lại thiết bị khi bắt đầu lắp đặt máy đo huỳnh quang, khi bảo dưỡng (ví dụ: thay đèn hoặc bộ lọc) mà có thể ảnh hưởng đến việc hiệu chuẩn, khi các giá trị kiểm soát thử nghiệm cho các kết quả không chấp nhận được. Nếu có các thay đổi trong đường chuẩn, thì hiệu chuẩn lại thiết bị sử dụng một dãy mới các dung dị c h hiệu chuẩn A, B và C (4.4.1,4.4.2 và 4.4.3). Dựng đuờng chuẩn cho mỗi loại sản phẩm cần thử nghiệm. Trộn các dung dịch hiệu chuẩn A, B và C bằng cách đảo nhẹ vật chứa trước khi sử dụng. Dùng pipet (5.3.3) chuyển tương ứ ng 2,0 m l dung dịch hiệu chuẩn A, B và C (4.4.1, 4.4.2 và 4.4.3), mỗi lần lấy hai mẫu vào sáu cuvet đã dán nhãn trước (5.2). Đặt các cuvet này vào tủ ấm (5.4) để ở 38 °C và làm nóng sơ bộ trong 20 min. Dùng pipet (5.3.2) chuy ể n 0,075 ml sữa không có phosphatase kiềm (7.1) vào tất cả sáu cuvet. Dùng film (5.5) đậy cuvet lại. Trộn bằng máy trộn Vortex (5.6) trong 5 s, hoặc bằng cách lắc đảo chiều nhẹ các cuvet. Đặt lại các cuvet vào tủ ấm (5.4). Hoàn tất việc hiệu chuẩn trong vòng 10 min sau khi cho mẫu thử vào máy hiệu chuẩn. B ắ t đầu tiến hành từ dung dịch hiệu chuẩn A, thực hiện quy trình hiệu chuẩn thông thư ờ ng như sau. Dùng khăn mềm lau sạch phía ngo à i từng cuvet trước khi đặt chúng vào máy đo huỳnh quang có bộ l ọc (5.1). Khi sử dụng thiết bị Fluorophos®, thì ấn “CALIB” và chọn chế độ “APL Dairy ” . Kéo cuộn b ả ng chọn và ấn ‘‘ENTER” khi sản phẩm cần hiệu chuẩn đã hiển thị. Bắt đầu bằng dung dịch hiệu chuẩn A (4.4.1), cho dung dịch này vào máy đo huỳnh quang và ấn “START”. Khi kết thúc việc đo, đo dung dịch hiệu chuẩn A thứ hai. Thực hiện quy trình tương tự đối với các dung dịch hiệu chuẩn B (4.4.2) và C (4.4.3) cho đến khi kết th ú c quy trình. Thiết bị Fluorophos® tự động tính lượng huỳn h quang thu được với dung dịch B và C dựa theo dung dịch A để cho tỷ l ệ hiệu chuẩn nằm trong dải của thiết bị. Khi việc hiệu chuẩn kết thúc, tiến hành phân tích các mẫu thử. 8.4 Xác định Dùng pipet hoặc bộ phân phối thể tích cố định (5.3.1) chuy ể n 2,0 ml cơ chất l à m việc (4.3) vào cuvet đã dán nhãn. Đặt cuvet vào tủ ấm (5.4) và để ở 38 °C và gia nhiệt trong 20 min. Dùng pipet (5.3.2) cho thêm 0,075 ml phần mẫu thử đã trộn đều (7.2.2 hoặc 7.2.3) vào cơ chất. Đậy cuvet lại bằng film (5.5). Trộn ngay lượng chứa trong cuvet bằng máy trộn Vortex (5.6) trong 5 s, hoặc bằng cách đảo chiều nhẹ cuvet. Lau khô thành ngoài của cuvet bằng giấy mềm rồi đặt cuvet vào máy đo huỳnh quang có bộ lọc (5.1). Thực hiện ph é p thử trong 20 s sau khi cho mẫu thử vào cơ chất. Khi dùng thi ế t bị Fluorophos®, ấn phím “TEST”, “ALP Dairy” xuất hiện rồi ấn “ENTER”. Kéo cuộn bảng chọn và ấn “ENTER” khi sản phẩm cần hiệu chuẩn đã hiển thị. Rồi ấn phím “START” để bắt đầu thử nghiệm. Việc hi ể n thị sẽ đếm giảm dần trong 60 s trong k hi cơ chất và mẫu vẫn giữ ấm đến 38 °C. Sau 60 s, máy huỳnh quang bắt đầu đo, hiển thị huỳnh quang của mẫu bằng đơn vị huỳnh quang (FLU). Việc hiển thị bắt đầu ở khoảng 200 FLU và tăng chậm đần trong 2 min tiếp theo, ở cuối giai đ oạn 3 min, thiết bị Fluorophos® thực hiện tự động các phép tính cần thiết và hi ể n thị số nhận biết mẫu, hoạt độ ALP tính theo mili đơn vị trên lít và giá trị trung bình t ăng dần của huỳnh quang, n ế u trước đó đ ã chọn. Thông tin này sau đó được in ra. N ế u kết quả phải tính thủ công (9.2), th ì chia chênh lệch giữa hai số đọc huỳnh quang cho khoảng thời gian (tính theo phút) để thu được trung bình tăng dần của huỳnh quang trên phút (F/min). Dùng giá trị F/min này để tính hoạt độ ALP của mẫu thử. Nếu hoạt độ lớn hơn 7 000 mU/l, thì pha loãng mẫu bằng sữa không có phosphatase kiềm (7.1) sao cho thu được kết quả nhỏ hơn 7 000 mU/l. Thiết bị F l uorophos® có th ể hiển thị và in ra d òng thông báo “Sai số: Số đọc không ổn định, lặp lại phép thử”. Đối với các kết quả rất thấp (thường nhỏ hơn 6 FLU/min), thường các số đọc không ổn định, để cuvet mẫu trong buồng của thiết bị Fluorophos® và thực hiện phép xác định khác. Sa u đó thường thu được kết quả hợp lý. Tuy nhiên, nếu lại thu được sai số đọc không ổn định th ì lặp lại toàn bộ phép xác định với mẫu thử mới. 8.5 Phép kiểm soát liên quan đến mẫu thử 8.5.1 Phép thử kiểm soát d ương tính và âm tính 8.5.1.1 Phép thử kiểm soát âm t í nh Bao gồm một phép thử kiểm soát âm tính với từng mẻ mẫu thử. Gia nhiệt mẫu thử như trong 7.1. Số đọc của thiết bị phải nhỏ hơn 10 m U /l. 8.5.1.2 Phép thử kiểm soát dương tính Bao gồm một hoặc nhiều phép kiểm soát dương tính với từng mẻ mẫu thử. Chuẩn bị các mẫu thử ở mức hoặc ở gần các mức quyết định sử dụng các mẫu sữa nguyên liệu đã pha loãng với sữa không có phosphatase (7.1). 8.5.2 Phép thử chất gây nhiễu Khi thu được các giá trị ALP lớn hơn giá t rị mong đợi, thì dùng pipet (5.3.2) thêm 0,075 ml ph ầ n mẫu thử (7.2.2 hoặc 7.2.3) vào cuvet chứa 2,0 ml dung dịch hiệu chuẩn A (4.4.1), trước đó đã được làm ấm sơ bộ trong tủ ấm (5.4) để ở 38 °C trong 20 min và trộn. Đặt cuvet chứa hỗn hợp này vào thiết bị Fluorophos® (5.1) và thử nghiệm theo 8.4. Nếu gi á trị thu được vượt quá 20 mU/l, chứng t ỏ có mặt chất gây nhiễu. Trong trường hợp này, lặp lại phép thử, sử dụng mẫu mới. 8.5.3 Phép thử kiểm soát phosphatase kiềm của vi khuẩn bền nhiệt Nếu kết quả của phép xác định trong 8.4 cho kết quả cao hơn dự kiến th ì thực hiện như sau: Cho một ph ầ n mẫu thử khác (7.2.2 hoặc 7.2.3) vào ống nghiệm. Đặt nhiệt kế hoặc đầu dò nhiệt v à o ố ng và đặt t ấ t cả vào nồi cách thủy (5.7) để ở 63 °C. Khi nhiệt độ của phần mẫu thử đạt đến 63 °C, giữ ở nhiệt độ này trong 30 min, rồi làm nguội nhanh. Xác định hoạt độ phosphatase còn sót lại theo 8.4. Vẫn còn hoạt độ là do sự có m ặ t phosphatase kiềm của vi khuẩn bền nhiệt 9 Tính và biểu thị kết quả 9.1 T ỷ lệ hiệu chuẩn Các kết quả được tính tự động bằng thiết bị F luorophos®, bằng cách x â y dựng thuật toán đưa vào trong thiết bị đo huỳnh quang có lọc (5.1). Nếu các kết quả được tính bằng tay thì tiến hành như sau: Ghi lại giá trị huỳnh quang của dung dịch hiệu chuẩn B (4.4.2) và dung dịch hiệu chuẩn C (4.4.3), dựa vào dung dịch hiệu chu ẩ n A (4.4.1), chỉnh mức huỳnh quang của máy đo huỳnh quang có lọc (5 . 1) về zero. Tính tỷ lệ hiệu chuẩn, K, bằng công thức (1): (1) trong đó K là tỷ lệ hiệu chuẩn của đường chuẩn đã thiết lập; F C là giá trị huỳnh quang thu được bằng cách đo dung dịch hiệu chuẩn C (4.4.3) dựa vào dung dịch hiệu chuẩn A (4.4.1) đã đặt mức huỳnh quang về zero (xem 8.3); F B là giá trị huỳnh quang thu được bằng cách đo dung dịch hiệu chuẩn B (4.4.2) dựa vào dung dịch hiệu chuẩn A (4.4.1) đã đặt mức huỳnh quang về zero (xem 8.3). 9.2 Tính kết quả T í nh hoạt độ phosphatase kiềm, A p , theo công thức sau đây: Trong đó A p là hoạt độ phosphatase kiềm của mẫu thử (7.2.2 hoặc 7.2.3), tính bằng mili đơn vị hoạt tính enzym trên lit; F av là lượng huỳnh quang trung bình do phần mẫu thử (8.4) phát ra trong 1 min, được đo dựa vào dung dịch hiệu chuẩn A (xem 8.3) tại thời điểm bắt đầu phút thứ hai đến cuối phút thứ ba; C B là nồng độ Fluoroyellow® trong dung dịch hiệu chuẩn B (4.4.2), tính bằng micromol trên 2 ml dung dịch hiệu chuẩn; f l à giá trị hệ số chuyển đổi tử đơn vị trên mililit sang m i li đơn vị trên lít; f = 1 x 106; trong trường hợp mẫu thử được pha loãng để thu được hoạt độ nh ỏ hơn 7 000 mU/l thì f = (hệ số pha loãng mẫu thử) x 10® V là thể tích phần mẫu thử, tính bằng mililit (ml). 9.3 Biểu thị kết quả Bi ể u thị kết quả đến đơn vị số nguyên gần nhất của mili đơn vị. 10 Độ chụm 10.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm Các chi tiết của phép thử li ên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được đưa ra trong phụ lục A. Các gi á trị giới hạn độ lặp lại và độ tái lập b i ểu thị ở mức xác suất 95 % và có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và các chất nền k hác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu. 10.2 Độ lặp lại Đối với các giá trị nhỏ hơn 125 mU /l thì chênh lệch tuyệt đ ố i giữa hai kết quả thử độc lập riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử, tiến hành trên cùng một nguyên liệu thử, trong cùng một phòng thử nghiệm, sử dụng cùng thiết bị, trong khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn 14 mU/l. Đối với các giá trị bằng hoặc lớn hơn 125 mU/l nhưng nhỏ hơn 620 mU/l thì chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử, tiến h à nh trên cùng một nguyên liệu thử, trong cùng một phòng thử nghiệm, sử dụng cùng thiết bị, t rong kho ả ng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp l ớ n hơn 12 % trung b ì nh của hai kết quả. 10.2 Độ tái lập Đối với các giá trị nhỏ hơn 125 mU/l thì chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi áp dụng cùng một phương pháp, tiến h à nh trên cùng mẫu thử, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các kỹ thuật viên khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường h ợ p lớn hơn lớn hơn 23 mU/l. Đối với các giá trị bằng hoặc lớn hơn 125 mU/l nhưng nhỏ hơn 620 mU/l thì chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi áp dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên cùng mẫu thử, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các kỹ thuật viên khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn 24 % trung bình của hai kết quả. 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu bi ế t; c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) tất cả các điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn n à y, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi t ì nh huống bất thường có thể ả nh hưởng đến kết quả. e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được. Phụ lục A ( Tham khảo) Phép thử liên phòng thử nghiệm Một phép thử liên phòng thử nghiệm bao gồm 13 phòng thử nghiệm từ bảy quốc gia (Mỹ, Anh, Pháp, Nauy, Italia, Hà lan, Thuy S ỹ) đã tham gia thử nghiệm theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) do phòng thử nghiệm QuadraChem và Frank Harding t ổ chức, thực hiện trên bốn loại mẫ u sữa bò (sữa nguyên chất, sữa tách một phần chất béo, sữa gầy và sữa bổ sung hương liệu), sữa dê nguyên chất và sữa c ừ u nguyên chất. Phép thử này đ ã kết thúc vào tháng 3 năm 2004. CH Ú THÍCH 1: Ch ỉ có các kết quả của sữa bổ sung hương liệu, sữa cừu nguyên chất và sữa dê thực hiện trong tháng 3 n 8 m 2004 đư ợ c báo cáo trong Phụ l ụ c này. Các kết quả nghiên cứu trên sữa bò (sữa nguyên chất, sữa tách một phần chất b é o, sữa gầy) được bổ sung vào năm 2008. Một nghiên cứu cộng tác khác do ANSES và Marina N i colas tổ chức, gồm có 19 phòng thử nghiệm của 18 quốc gia (Bắc Ailen, Pháp, ủc, Thụy Sĩ, Hungari, Ailen, NaUy, Đức, Phần Lan, Bỉ, Tây Ban Nha, Síp, Bungari, Bồ Đào Nha, New Zealand, Séc và Hy Lạp) đã thực hiện theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) v à TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) trên sữa bò (nguyên chất, tách một phần chất béo và sữa gầy). Phép thử kết thúc tháng 1 năm 2008. Dữ liệu thu được sau này thay thế cho dữ liệu năm 2004. Một nghiên cứu cộng tác khác do ANSES v à Marina Nicolas tổ chức thực hiện theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) trên sữa dê đã tách một phần chất béo được xử lý bằng UHT. Phép thử kết thúc tháng 12 năm 2010. Dữ liệu thu được như báo cáo dưới đây. Các kết quả thu được đã được phân tích thống kê theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 {ISO 5725-2) để cho độ chụm của phương pháp nêu trong Điều 10. Các mức enzym trung bình thực tế của mẫu nghiên cứu được nêu trong Bảng A.1. Bảng A.2 và Bảng A.3 đưa ra các giá trị giới hạn lặp lại và tái lập. Bảng A.4 và Bằng A.5 đưa ra các hệ s ố biến thiên về độ lặp lại và độ tái lập tương ứng. CHÚ THÍCH 2: Chuẩn có thể được tạo ra từ các dữ liệu của các B ả ng A.2, A.3, A.4 và A.5 để kiểm soát hiệu năng của phòng thử nghiệm. Báo cáo toàn diện của nghiên cứu ban đầu được xuất b ả n trong Tài liệu tham khảo [5] và báo cáo nghiên cứu b ổ sung được Ph ò ng thí nghiệm chuẩn của Liên minh Châu Âu về sữa và các sản phẩm sữa, ANSES (EX-AFSSA), ủ y ban An toàn Thực phẩm Pháp xuất bản. Bảng A.1 - Giá trị enzym trung b ì nh (mU/l) của mỗi mức nghiên cứu trong mỗi nền mẫu Loại mẫu Mức enzym đích 20 40 100 350 500 (mU/l) (mU/l) (mU/l) (mU/l) (mU/l) Sữa bò nguyên chất 24 40 120 350 488 Sữa bò tách một phần chất béo 27 40 124 345 479 Sữa bò tách chất béo 31 42 96 349 449 Sữa bò bổ sung hương vị a - 54 108 436 618 Sữa cừu nguyên chất 31 47 110 428 608 Sữa dê nguyên chất 22 47 125 407 570 Sữa d ê tách một ph ầ n chất béo 29 57 110 317 474 a Sữa b ổ sung hương vị dâu Bảng A.2- Các giá trị giới hạn lặp lại, r Loại mẫu Mức enzym đích b 20 40 100 350 500 (mU/l) (mU/l) (mU/l) (mU/l) (mU/l) Sữa bò nguyên chất 9 11 17 32 37 Sữa bò tách một phần chất béo 6 16 18 30 45 Sữa bò tách chất béo 17 11 12 25 20 Sữa bò bổ sung hương vị a - 20 16 59 59 Sữa cừu nguyên chất 10 16 34 97 100 Sữa dê nguyên chất 9 8 26 43 29 Sữa d ê tách một ph ầ n chất béo 9 9 12 26 22 a Sữa b ổ sung hương vị dâu ; b Các giá trị này liên quan đến giá trị trung bình nêu trong bảng A.1 và không phải giá trị đích Bảng A.3 - Các giá tr ị giới hạn tá i lập, R Loại mẫu Mức enzym đích b 20 40 100 350 500 (mU/l) (mU/l) (mU/l) (mU/l) (mU/l) Sữa bò nguyên chất -10 16 18 70 100 Sữa bò tách một phần chất béo 14 18 27 78 86 Sữa bò tách chất béo 28 21 19 86 75 Sữa bò bổ sung hương vị a - 34 35 131 169 Sữa cừu nguyên chất 17 20 47 170 233 Sữa dê nguyên chất 11 21 29 128 88 Sữa d ê tách một ph ầ n chất béo 18 26 20 64 62 a Sữa b ổ sung hương vị dâu ; b Các giá trị này liên quan đến giá trị trung bình nêu trong bảng A.1 và không phải giá trị đích Bảng A.4 - Hệ số biến thiên lặp lại, Cv,r Các giá trị tính bằng phần trăm Loại mẫu Mức enzym đích b 20 40 100 350 500 (mU/l) (mU/l) (mU/l) (mU/l) (mU/l) Sữa bò nguyên chất 13 10 5 3 2 Sữa bò tách một phần chất béo 8 14 5 3 3 Sữa bò tách chất béo 19 9 4 3 2 Sữa bò bổ sung hương vị a - 13 5 5 3 Sữa cừu nguyên chất 12 12 11 8 6 Sữa dê nguyên chất 14 6 7 4 2 Sữa d ê tách một ph ầ n chất béo 10 6 4 3 2 a Sữa b ổ sung hương vị dâu ; b Các giá trị này liên quan đến giá trị trung bình nêu trong bảng A.1 và không phải giá trị đích B ản g A.5 - Hệ số biến thiên tái lập, C V .R , Các gi á trị tính bằng phần trăm Loại mẫu Mức enzym đích b 20 40 100 350 500 (mU/l) (mU/l) (mU/l) (mU/l) (mU/l) Sữa bò nguyên chất 15 14 5 7 7 Sữa bò tách một phần chất béo 18 16 8 8 6 Sữa bò tách chất béo 31 18 7 9 6 Sữa bò bổ sung hương vị a - 22 11 10 10 Sữa cừu nguyên chất 19 15 15 14 13 Sữa dê nguyên chất 17 15 8 11 5 Sữa d ê tách một ph ầ n chất béo 22 16 6 7 5 a Sữa b ổ sung hương vị dâu ; b Các giá trị này liên quan đến giá trị trung bình nêu trong bảng A.1 và không phải giá trị đích CHÚ THÍCH: Hiện vẫn chưa có đ ủ dữ liệu đối với trường hợp sữa bò để tí nh các giá trị C Vr và C VR ở mức hoạt độ 20 mU/l do thiết bị Fluorophos® ghi lại giá trị < 10="" mu/l="" đối="" với="" các="" giá=""> ị ALP rất thấp v à không được đưa vào phân tích thống kê. Điều này có nghĩa rằng tất cả các giá tri đúng được báo cáo là < 10=""> mU/l đều không được đưa vào phân tích thống kê. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1 ] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản ph ẩ m sữa - Hướng dẫn lấy mẫu. [2] TCVN 6910-1:2001 ( ISO 5725-1:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung. [3] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn. [4] International Union of Biochemistry Nomenclature. JAMA. 1988, 260 (73). [5] HARDING, F and GARRY, E. Collaborative evaluation of a f luorimetric method for measuring alkaline phosphatase activity in cow’s, sheep’s and goat’s milk. J. Food Prot. 2005, 68 (5) pp. 1047-53. 1) C á c thuốc thử quy định trong 4.1 đến 4.5 và các dụng cụ quy định trong 5.1 đến 5.4 (trừ 5.3) có sẵn như Hệ thống thử nghiệm F luorophos của Hãng Advanced istruments Inc., Two technology Way, Nor w ood, MA 02062 , USA. Nh à sản xuất có thể thay đổi hình dạng bao gói do Hệ thống thử nghiệm Fl uorophos cung c ấ p. Người sử dụng cần tham khảo các chỉ dẫn của nhà sản xuất về chuẩn bị thuốc thử nếu n ó khác với quy định trong tiêu chuẩn n à y. Fluorophos và Fluoroyellow là nh ã n hiệu thương mại đã đăng ký của H ã ng Advanced Instruments Inc và l à cá c ví dụ của s ả n phẩm thương mại phù hợp sẵn có. Thông tin này được đưa ra để tiện lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và Không ấn định phải sử dụng những sản phẩm này. 2) Các hướng d ẫ n kiểm soát và đánh giá hiệu năng của thiết bị là sản ph ẩ m được áp dụng của h ã ng Advanced Instruments, Inc.,Two Technology Way , Norwood, Massachusetts 02062, USA. Thông t i n này được đưa ra để tiện lợi cho ngư ờ i sử dụng ti ê u chu ẩ n và Không ấn định phải sử dụng những sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu có thể đưa ra các kết quả tương đương.