TCVN8160-5:2010

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN8160-5:2010 (EN 12014-5:1997) về Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit - Phần 5: Xác định hàm lượng nitrat trong thực phẩm chứa rau dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ bằng phương pháp enzym TIÊU CHU Ẩ N QUỐC GIA TCVN 8160-5:2010 EN 12014-5:1997 THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT VÀ/HOẶC NITRIT - PHẦN 5: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT TRONG THỰC PHẨM CHỨA RAU DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYM Foodstuffs - Determination of nitrate and/or nitrite content - Part 5: Enzymatic determination of nitrate content of vegetable-containing food for babies and intants Lời nói đầu TCVN 8160-5:2010 hoàn toàn tương đương với EN 12014-5:1997; TCVN 8160-5:2010 do Ban kỹ thuật tiêu chu ẩ n quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp ph â n t í ch và l ấ y mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ TCVN Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit bao gồm các phần sau: - TCVN 7814:2007 (EN 12014-2:1997), Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit - Xác định hàm lượng nitrat trong rau và sản ph ẩ m rau bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao /t rao đổi ion ; - TCVN 8160-3:2010 (EN 12014-3:2005), Thực ph ẩ m - X á c định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit - Phần 3: Xác định hàm lượng nitrat và nitrit trong sản phẩm thịt bằng đo phổ sau khi kh ử nitrat thành nitrit bằng enzym ; - TCVN 8160-4:2009 (EN 12014-4:2005), Thực phẩm - X á c định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit - Ph ầ n 4: Phương pháp xác định hàm lượng nitrat và nitrit trong s ả n ph ẩ m thịt bằng sắc ký trao đổi ion ; - TCVN 8160-5:2010 (EN 12014-5:1997), Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit - Phần 5: Xác định hàm lượng nitrat trong thực phẩm chứa rau dành cho tr ẻ sơ sinh và trẻ nhỏ bằng phương pháp enzym ; - TCVN 8160-7 : 2010 (EN 12014-7:1998), Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit - Phần 4: X á c định hàm lượng nitrat trong rau và sản phẩm rau bằng phương pháp phân t í ch dòng liên tục sau khi khử bằng cadimi . Bộ tiêu chuẩn EN 12014 còn có phần sau: - EN 12014-1 , Foodstuffs - Determination of nitrate an d /or nitr i te co n tent - Part 1: General considerations (Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitr i t - Phần 1: Xem xét chung) . THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT VÀ/HOẶC NITRIT - PHẦN 5: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT TRONG THỰC PHẨM CHỨA RAU DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYM Foodstuffs - Determination of nitrate and/or nitrite content - Part 5: Enzymatic determination of nitrate content of vegetable-containing food for babies and intants 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn n à y quy định phương pháp enzym đ ể xác định hàm lượng nitrat trong thực phẩm có chứa rau dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ [1], [2]. Phương pháp này có thể dùng để xác định hàm lượng nitrat trong dải nồng độ từ 50 mg/kg đến 200 mg/kg. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên b ả n được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì á p dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng th í nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử . EN 12014-1, Foodstuffs - Determination of nitrate and/or nitr i te content - Part 1: General considerations (Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitr i t - Phần 1: Xem xét chung) 3. Nguyên tắc Hàm lượng nitrat trong dịch chiết mẫu được xác định bằng phương pháp enzym b ằ ng cách đo lượng NADPH sử dụng hết theo phương trình phản ứng d ướ i đây: Nitrat + NADPH + H + nitrit + NADP + + H 2 O trong đó lượng NADPH được sử dụng hết là tương đương với lượng nitrat. 4. Thuốc thử Các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân t í ch và nước được sử dụng phải là loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696) , trừ khi có quy định khác. Khi chuẩn bị các dung dịch, phải t í nh đến độ tinh khiết của các thuốc thử. 4.1. Dung dịch Carrez s ố 1 H òa tan 150 g kali hexaxyano f erat (II) (K 4 [Fe(CN) 6 ].3H 2 O ) trong nước và pha loãng b ằ ng nước đến 1 000 ml. Bảo quản dung dịch này trong chai màu nâu và cứ sau hai tháng lại thay dung dịch mới. 4.2. Dung dịch Carrez số 2 H òa tan trong nước 300 g kẽm sulfat (ZnS O 4 .7H 2 O ) và thêm nước đến 1 000 ml. 4.3. Dung dịch natri hydroxit , c 1) (NaOH) = 2 mol/l 4.4. Dung dịch đệm imidazol , pH = 7,3 Hòa tan 0 , 68 g imidazol (C 3 H 4 N 2 ) trong 80 ml nước, ch ỉ nh pH đến 7 , 3 b ằ ng dung dịch axit clohydric 2 mol/l và pha loãng b ằ ng nước đến 100 ml. Nếu bảo quản ở 4 ° C dung dịch này có thể bền một năm. 4.5. Dung dịch FAD 2) Chuẩn bị dung dịch 0,17 mg muối dinatri của flavin adenine dinucleotide, FAD-Na 2 trên mililit bằng cách sử dụng FAD-Na 2 có hàm lượng không nhỏ hơn 88 %. Khi được bảo qu ả n ở 4 ° C thì dung dịch này có thể bền được một ngày. 4.6. Dung dịch NADPH 2) Chu ẩ n bị dung dịch 5,6 mg muối tetranatri của b -nicotinamide adenine dinucleotide phosphat dạng khử , b -NADPH-Na 4 trên mililit b ằ ng cách sử dụng b -NADPH-Na 4 c ó h à m lượng không nhỏ hơn 98 %. Nếu bảo quản ở 4 ° C thì dung dịch này có thể bền được một ngày, còn khi để ở nhiệt độ phòng th ì có thể bền được 2 h. 4.7. Dung dịch enzym kh ử nitrat (nitrat reductaza) 2 ) H òa tan 65 mg nitrat reductaza đã được làm đông khô , có hoạt độ khoảng 0 , 4 U /mg 3) thu được từ các loài Aspergillus (EC 1.6.6.2) [4] trong 5 ml nước. Khi được b ả o quản ở 4 ° C thì dung dịch n à y có thể bền được đến hai tuần. 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể các thiết b ị, dụng cụ sau: 5.1. Bộ đồng hóa (bộ phân phối, máy trộn dùng điện hoặc loại tương tự). Phải đảm bảo r ằ ng thiết bị này làm phân tán đều mẫu hoặc đồng hóa kỹ mẫu và không làm thôi nhiễm kim loại đến mức làm ức chế các enzym được sử dụng. 5.2. B ế p điện c ù ng với máy khu ấ y từ. 5.3. Gi ấ y lọc gấp nếp. 5.4. Pipet chia độ , dùng cho phân tích enzym, bộ ph â n phối từng phần 0,05 ml, 0,1 ml, 1 ml và 2 ml hoặc các pipet dạng pitt ô ng 5.5. Cuvet thủy tinh hoặc cuvet chất d ẻ o có chiều dài đường quang 1 cm và không hấp thụ đáng kể tại bước sóng 334 nm, 340 nm hoặc 365 nm. 5.6. Máy đo phổ , để đo ở bước sóng 340 nm, có chiều rộng phổ không quá ± 5 nm. CH Ú TH Í CH: C ó th ể sử dụng các máy đo quang có bộ lọc phổ có gắn đèn hơi thủy ngân, đo được ở 365 nm hoặc 334 nm . 5.7. Máy ly tâm , có thể tạo gia tốc hướng tâm 2900 g tại đáy ống ly tâm (5.8), tùy chọn. 5.8. Máy ly tâm , có dung tích thích hợp. 5.9. Tủ lạnh , có thể duy trì nhiệt độ ở 4 ° C . 6. Cách tiến hành 6.1. Chuẩn b ị m ẫ u Đưa mẫu được bảo quản lạnh về nhiệt độ phòng. Trộn toàn bộ mẫu trong vật chứa bằng máy trộn thích hợp (5.1), nghiền và đồng hóa mẫu, nếu cần. Đ ả m bảo r ằ ng nhiệt độ của mẫu không quá 60 ° C . Đối với các mẫu dạng lỏng, pha loãng mẫu cần phân tích cho đến khi hàm lượng nitrat n ằ m trong khoảng từ 30 mg/l đến 300 mg/l, nếu cần. Dung dịch mẫu thử thu được có thể dùng ngay để ph â n tích mà không cần phải xử lý thêm kể c ả khi dung dịch có màu , lấy một thể tích 0,1 ml (V 2 ) để ph â n tích. 6.2. Phương pháp xác định 6.2.1. Chuẩn b ị dung dịch mẫu Cân khoảng 5 g hoặc một lượng thích hợp khác của mẫu đã được chuẩn bị theo 6.1, chính xác đến miligam cho vào bình nón 100 ml, thêm 50 ml nước sôi. Đậy n ắ p bình b ằ ng mặt kính đồng hồ , đặt b ì nh vào nồi cách thủy (ví dụ: cốc thủy tinh có mỏ) trong khoảng từ 20 min đến 30 min, khuấy đ ể tránh b ị v ó n cục (xem 5.2). Tránh đ ể quá nhiệt tại đáy b ì nh nón b ằ ng cách không để đáy b ì nh tiếp xúc với đáy nồi cách thủy. Lấy que khuấy từ ra, thêm 5,0 ml dung dịch Carrez số 1 (4.1) và lắc hỗn hợp trong 5 s đến 10 s. Sau đó thêm 5,0 ml dung dịch Carrez số 2 (4.2) v à lắc lại trong khoảng từ 5 s đến 10 s. Ch ỉ nh pH của hỗn hợp đến giá trị từ 8 đến 9 (không để vượt quá 9) bằng dung dịch natri hydroxit (4.3) và lắc lại. Làm nguội lượng chứa trong b ì nh nón đến nhiệt độ phòng và lọc cho vào bình định mức 100 ml, thu được V 1 , tráng b ì nh bằng nước rồi thêm nước đến vạch. Nếu khối lượng mẫu ban đầu cao, ví dụ trên 10 g, th ì cần phải ly tâm hỗn hợp mẫu đã làm sạch trong 10 min ở 2900 g trước khi lọc sang bình định mức 100 ml. Rửa ch ấ t lắng hai lần với nước v à ly tâm một lần nữa, thu lấy phần nổi ph í a trên vào b ì nh định mức 100 ml và pha loãng dung dịch bằng nước đến vạch. Lắc b ì nh định mức và đặt bình v à o tủ lạnh (5.9) ở nhiệt độ khoảng 4 ° C trong 30 min để tách hết chất béo. Sau đó lọc lượng chứa trong bình qua giấy lọc gấp nếp (5.3), loại bỏ vài mililit dịch lọc đầu tiên. Thu lấy phần dịch lọc (dung dịch mẫu) vào b ì nh nón có nút đậy bằng thủy tinh m à i. Dùng 1 , 0 ml (V 2 ) dung dịch mẫu để xác định hàm lượng nitrat. Dung dịch có màu hơi đục thường sẽ không g â y nhiễu đến phép thử. 6.2.2. Đo phản ứng enzym Tiến hành xác định ở nhiệt độ khoảng 20 ° C . Độ hấp thụ cực đại của NADPH là ở bước sóng 340 nm. Nếu sử dụng máy đo phổ (5.6), th ì thực hiện các phép đo chỉ ở bước sóng có độ hấp thụ cực đại, nhưng khi sử dụng máy đo quang có bộ lọc phổ dùng đèn hơi thủy ngân thì đo ở bước sóng 365 nm hoặc 334 nm. Sự chênh lệch (giảm) độ hấp thụ của dung dịch thử (A 1 - A 2 ) dung dịch thử nên nằm trong khoảng từ 0,1 đến 0,5. Nếu chênh lệch độ hấp thụ quá nhỏ thì có thể tăng lượng dung dịch mẫu trong cuvet (đến 2 , 00 ml) . Trong các trường hợp này, giảm lượng nước được sử dụng sao cho lượng mẫu thử v à lượng mẫu trắng trong các cuvet bằng nhau. Nếu chênh lệch độ hấp thụ quá lớn , th ì pha loãng dung dịch mẫu. Nếu các bước này l à cần thiết th ì phải tính đến hệ số pha loãng (F) trong phần tính kết quả. Chỉ cần một mẫu trắng cho một dãy mẫu thử. Bảng 1 - Phương án dùng pipet Dung dịch đ ược hút b ằ ng pipet cho vào cuvet M ẫ u trắng Dung dịch thử Dung dịch đệm (4.4) 1,00 ml 1 , 00 ml Dung dịch FAD (4 . 5) 0,05 ml 0 , 05 ml Dung d ịch NADPH (4.6) 0,10 ml 0 , 10 ml Dung dịch mẫu (6.2.1) - 1,00 ml Nước 2,00 ml 1,00 ml Trộn và sau khoảng 5 min đo độ h ấ p thu (A 1 ) không dùng cuvet so sánh (5.5), sau đ ó b ắ t đầu cho phản ứng bằng cách thêm như sau: Dung dịch nitrat reductaza (4.7) 0,05 ml 0,05 ml Trộn và sau 40 min đo nhanh liên ti ế p các độ hấp thụ ( A 2 ) của các dung dịch, không dùng cuvet so sánh. Lặp lại phép đo này sau 20 min ti ế p theo thu được độ h ấ p th ụ ( A 3 ). 7. Tính kết quả Trong phản ứ ng hình thành cơ sở của phép xác định n à y là đường tuyến tính thể hiện mối quan hệ giữa lượng NADPH sử dụng hết và chênh lệch độ hấp thụ với nồng độ nitrat. Tính chênh lệch độ hấp thụ của mẫu trắng Δ A trắng theo công thức (1): ΔA mẫu trắng = ( A 1 - A 2 ) mẫu trắng - 2x ( A 2 - A 3 ) mẫu trắng (1) Tính chênh lệch độ hấp thụ của dung dịch thử ΔA dung dịch thử theo công thức (2): Δ A dung dịch thử = ( A 1 - A 2 ) dung dịch thử - 2x ( A 2 - A 3 ) dung dịch thử (2) T í nh chênh lệch độ hấp thụ của mẫu trắng ΔA cho giá trị trắng theo c ô ng thức (3): ΔA = ΔA dung dịch thử - ΔA mẫu trắng (3) T í nh nồng độ chất trong dung dịch đ ã pha loãng dùng các phép đo hấp thụ quang theo định luật Beer- Lambert. T í nh phần khối lượng w, của nitrat , b ằ ng miligam trên kilogam mẫu, theo công thức (4): (4) trong đó Δ A là chênh lệch độ hấp thụ trong công thức (3); M là khối lượng phân tử tương đối của ion nitrat ( M = 62,0 g/mol); V 1 là tổng thể t í ch dung dịch mẫu (6.2.1) (V 1 = 100 ml), t í nh bằng mililit (ml); V 2 là thể tích dung dịch mẫu dùng để chuẩn bị dung dịch th ử (6.2.2) ( V 2 = 1,0 ml), t í nh b ằ ng mililit (ml); V 3 là tổng thể tích dung dịch thử (6.2.2) (V 3 = 3,20 ml), tính bằng mililit (ml); F là hệ số pha loãng ( F = 1); m l à khối lượng mẫu ban đầu, tính bằng gam (g); e là độ hấp thụ phân tử của NADPH, nghĩa là 6,3 x 10 3 l.mol -1 . cm - 1 ở 340 nm, 3,5 x 10 3 l. mol - 1 .cm - 1 ở 365 nm (Hg), 6,18 x 10 3 l.mo l -1 . cm - 1 ở 334 nm (Hg); d là chiều dài đường quang của cuvet (1 cm), tính bằng centimet (cm). Nếu dùng phương án theo Bảng 1 và dung dịch mẫu không phải pha loãng, thì tính ph ầ n khối lượng w của nitrat, bằng miligam trên kilogam mẫu, theo công thức (5): (5) trong đó: Δ A xem công thức (3); e và m xem công thức (4). Báo cáo kết quả theo miligam trên kilogam hoặc miligam trên lít theo số nguyên và ghi theo quy định hiện hành. 8. Độ chụm Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm của phương pháp này được nêu trong Phụ lục A Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm n à y có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ của chất phân t í ch và chất nền khác với các dải nồng độ của chất phân tích và chất nền đã nêu. 8.1. Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ độc lập, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, trong không quá 5 % trường hợp vượt quá giá trị lặp lại r sau đây: Các giá trị đó là: Sản ph ẩ m rau chân vịt (spinach) = 64 mg/kg r = 15,5 mg/kg Nước cà rốt = 200 mg/l r = 12,2 mg/l 8.2. Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ độc lập, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, do hai phòng thử nghiệm khác nhau thực hiện, trong không quá 5 % trường hợp vượt quá giá trị tái lập R sau đây: Các giá trị đó là: Sản phẩm rau chân vịt (spinach) = 64 mg/kg R = 24,5 mg/kg Nước cà rốt = 200mg/l R = 17,7 mg/l 9. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo th ử nghiệm phải bao gồm í t nhất các thông tin nêu trong EN 12014-1. Phụ lục A (Tham khảo) Dữ liệu về độ chụm Các thông số sau đây đã thu được trong hai phép thử liên phòng thử nghiệm [1], [2] phù hợp với ISO 5725:1986 [5] * . Các phép thử này do Max von Pettenko f er-lnstitute thuộc Cơ quan Y tế Liên bang, Cục Hóa chất Thực ph ẩ m, Berlin, Đức thực hiện. B ả ng A.1 - Dữ liệu về độ chụm Rau chân vịt Nước ép cà rốt Năm thử nghiệm 1988 1992 Số lượng mẫu 1 1 Số lượng phòng thử nghiệm 19 9 Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 16 7 Số lượng ngoại lệ 3 2 Số lượng kết quả ch ấ p nhận 80 35 Gi á trị trung b ì nh 64 mg/kg 200 mg/kg Đô lệch chu ẩ n lặp lại , s r 5,5 mg/kg 4 mg/l Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r 8 , 7 % 2,1 % Giới hạn lặp lại , r 15,5 mg/kg 12 , 2 mg/l Độ lệch chuẩn tái l ậ p, s R 8,7 mg/kg 6 mg/l Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R 13,6% 3,3 % Giới hạn tái lập, R 24,5 mg/kg 17,7 mg/l THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung von Nitrat in Gemtisesaften: L 26.26-2 1088-06 (Food Analysis: Determination of nitrate in vegetable Juices: L 26.26-21988-05) in: Amtitiche Sammtung von Ihuersuckitnasver f ahren nach § 35LMBG: Ver f ahren zur Probenahme und Untersuchung von lebensmittteln , TaboJcerxeugnissen, hosmetisdien Mittetn und Bedai f sgegensltinden un d Bedar f sgegenssundheitsamt (In: Collection of o ff icial methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of Sampling an d analysis of foo d s, tobacco p roducts, cosme t ics and commodity goods/Fe d eral Health Office) Losebbiiausgabe, S tand Aug. 1993 Bd 1 (Loose leaf edition, as of 1993-08 Vo l .1 ) Berlin, Kohu Beuth Verlag GmbH. [2] Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung von Nitrat in Gemiisebrei fur Saugltnge und Kleinkinder L 48.03.05- 11988-05 (Food Analysis Determination of nitrate in mashed vegetables for babies and in f ants: L 48.03.05- 11988-05) in: AmUiche Sommlung von Untersuchungsver f ahren nac f t § 35LMBG: Ver f ahren zur Probenahme und IhUersuchung von LebensmiUet n , labakerzeugnissen, kosmeUschen Mitteln und Bed ^ rfsgegenstanden/Bimdf ^ tmAd ^ iisamt (In: Collection of official methods under ar t icle 35 of the German Federal Foods Act ; Methods of Sampling and analysis of foods , tobacco p roducts, cosmetics and commodity goods/Fedacal Health Office) Loseblattausgabe, S tand Aug. 1993 Bd . 1 (Loose leaf edition , as of 1993-08 Vol 1.) Berlin, Kola Beuth Verlag GmbH. [3] BeuUer, H.-O., W urst, B., and Fischer, S .,: Eine neue Methode zur enzymatischen Bestimmung von Nitrat in Lebensmitteln (A new method for the enzymatic determination of nitrate in foodstuffs), In: DL Lebensm. Bundsch . 82,1986, 283-289 [4] Enzyme commission (EQ: Classi f ication System. Enzyme Handbook , Springer Berlin 1969 [5] ISO 5725:1986 Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a s tandard test method by inter-laboratory tests . 1) c là n ồ ng đ ộ chất . 2) Những bộ thuốc thử này có bán sẵn trên th ị trường. Khi sử dụng nên theo hướng dẫn của nhà sản xuất 3) Đơn vị U (là đơn vị quốc t ế hay đơn vị chu ẩ n) được xác định là lượng enzym xúc tác quá trình chuyển hóa 1 m mol ch ấ t n ề n mỗi phút dưới điều kiện chu ẩ n. * ISO 5725:1986 hiện nay đ ã hủy.