TCVN9975:2013

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9975 : 2013 THỰC PHẨM – ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM VÀ ESCHERICHIA COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TM Foodstuffs – Enumeration of coliforms and Escherichia coli using Petrifilm TM count plate Lời nói đầu TCVN 9975:2013 được xây dựng trên cơ sở AOAC 991.14 Coliforms and Escherichia coli Counts in Foods. Dry Rehydratable (Petrifilm TM E. coli/ Coliform Count Plate TM and Petrifilm TM Coliform Count Plate TM ) Methods; TCVN 9975:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỰC PHẨM – ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM VÀ ESCHERICHIA COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TM Foodstuffs – Enumeration of coliforms and Escherichia coli using Petrifilm TM count plate 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sử dụng đĩa đếm Petrifilm TM để định lượng coliform và Escherichia coli trong thực phẩm. Phương pháp này đã được đánh giá liên phòng thử nghiệm, các kết quả được nêu trong Phụ lục A và Tài liệu tham khảo [1]. 2. Nguyên tắc Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô và chất tạo đông tan được trong nước lạnh. Cho các dung dịch huyền phù mẫu thử chưa pha loãng hoặc đã pha loãng vào các đĩa với lượng 1 ml mỗi đĩa. Dàn đều dung dịch huyền phù trên diện tích khoảng 20 cm 2 . Chất tạo đông có trong thành phần của đĩa sẽ làm môi trường dinh dưỡng trong đĩa đông lạnh. Đĩa được ủ ấm ở 35 °C ± 1 °C trong thời gian thích hợp rồi đếm khuẩn lạc. 3. Thuốc thử và môi trường Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác. 3.1. Nước dùng để pha loãng (dung dịch nước đệm phosphat) Hòa tan 34 g kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) vào 500 ml nước đựng trong bình định mức 1 lít, chỉnh pH đến 7,2 bằng khoảng 175 ml dung dịch natri hydroxit 1 M và thêm nước đến vạch. Pha loãng 1,25 ml dung dịch này đến 1 lít bằng nước đã đun sôi và để nguội, rồi hấp áp lực 15 min ở 121 °C. Nước dùng để pha loãng không được chứa xitrat, bisulfit hoặc thiosulfat vì có thể gây ức chế sự phát triển của vi sinh vật. 3.2. Chất chỉ thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua. 3.3. Chất chỉ thị 5-brom-4-clo-3-indolyl-ß-D-glucuronid. 3.4. Chất dinh dưỡng mật đỏ-tím (violet red bile nutrients) 1) . 3.5. Chất tạo đông tan được trong nước lạnh. 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau đây: 4.1. Đĩa đếm coliform Petrifilm TM 2) Đĩa chứa các chất dinh dưỡng mật đỏ-tím (3.4), chất tạo đông tan được trong nước lạnh (3.5) và chất chỉ thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua (3.2) để tăng khả năng quan sát sự phát triển của khuẩn lạc. Vùng sinh trưởng được khoanh tròn trên mỗi đĩa chứa khoảng hai mươi ô vuông, mỗi ô có diện tích 1 cm 2 trên màng nền. 4.2. Đĩa đếm E. coli/coliform Petrifilm TM 2) Đĩa chứa các chất dinh dưỡng mật đỏ-tím (3.4), chất tạo đông tan được trong nước lạnh (3.5), chất chỉ thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua (3.2) và chất chỉ thị hoạt độ glucuronidase là 5-brom-4-clo-3-indolyl-ß-D-glucuronid (3.3), có thể đếm coliform và E. coli trên cùng một đĩa. Vùng sinh trưởng được khoanh tròn trên mỗi đĩa chứa khoảng hai mươi ô vuông, mỗi ô có diện tích 1 cm 2 trên màng nền. 4.3. Dụng cụ dàn mẫu bằng chất dẻo (gồm một mặt có gờ và một mặt láng), được cung cấp cùng với đĩa đếm, để dàn đều huyền phù lên khắp vùng sinh trưởng của đĩa. 4.4. Pipet , đã được hiệu chuẩn, dùng để phân tích vi sinh vật hoặc pipet dạng xyranh có thể phân phối 1,0 ml, chia vạch đến 0,1 ml. Có thể dùng pipet tự động. Pipet phải phân phối được chính xác các thể tích yêu cầu. Không sử dụng pipet để phân phối thể tích nhỏ hơn 10 % dung tích của pipet. Ví dụ, không dùng pipet có dung tích lớn hơn 10 ml để phân phối 1 ml. 4.5. Thiết bị đếm khuẩn lạc , loại chuẩn hoặc loại có độ khuếch đại và độ nhìn thấy tương đương 4.6. Cân , có thể cân chính xác đến 0,1 g. 4.7. Thiết bị trộn tốc độ cao , có bình chứa vô trùng. 4.8. Tủ ấm , có thể duy trì được nhiệt độ ở 35 °C ± 1 °C. 4.9. Nồi hấp áp lực , có thể duy trì nhiệt độ ở 121 °C. 5. Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. 6. Chuẩn bị mẫu thử 6.1. Yêu cầu chung Chuẩn bị tất cả các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo từ 90 ml nước dùng để pha loãng (3.1) và 10 ml dung dịch mẫu thử pha loãng trước đó, trừ khi có quy định khác. Lắc các dung dịch pha loãng 25 lần với biên độ dao động 30 cm. 6.2. Thực phẩm nói chung Cân vô trùng 50 g mẫu thử, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình trộn vô trùng của thiết bị trộn tốc độ cao (4.7). (Đối với mẫu đông lạnh, cân mẫu chưa rã đông. Ổn định mẫu thử đông lạnh ở 2 °C đến 5 °C trong thời gian không quá 18 h để lấy 50 g phần mẫu thử, nếu cần). Thêm 450 ml nước dùng để pha loãng (3.1) và trộn trong 2 min. Thời gian trộn mẫu thử đến khi cấy mẫu lên đĩa môi trường không được quá 15 min. Nếu tổng khối lượng mẫu không đủ 50 g thì lấy khoảng một nửa rồi thêm thể tích nước dùng để pha loãng (3.1) cần thiết để có dung dịch pha loãng 10 -1 . Tổng thể tích trong bình trộn phải phủ hoàn toàn dao trộn. 6.3. Hạt vỡ Cân vô trùng 50 g mẫu thử, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình trộn vô trùng của thiết bị trộn (4.7). Thêm 50 ml nước dùng để pha loãng (3.1) và lắc mạnh (lắc 50 lần với biên độ dao động 30 cm) để thu được dung dịch pha loãng 10 0 . Để yên trong 3 min đến 5 min và lắc ngay trước khi chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo và trước khi cấy mẫu. 6.4. Bột từ các loại hạt Cân vô trùng 10 g mẫu thử, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình trộn vô trùng của thiết bị trộn (4.7). Thêm 90 ml nước dùng để pha loãng (3.1) và lắc mạnh (lắc 50 lần với biên độ dao động 30 cm) để thu được dung dịch pha loãng 10 -1 . Để yên trong 3 min đến 5 min và lắc ngay trước khi chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo và trước khi cấy mẫu. 7. Cách tiến hành 7.1. Đếm coliform Đặt đĩa đếm coliform Petrifilm TM (4.1) hoặc đĩa đếm E. coli/ coliform Petrifilm TM (4.2) lên bề mặt phẳng. Nhấc tấm màng mỏng phía trên ra và nhỏ 1 ml huyền phù mẫu thử vào chính giữa màng nền. Đậy cẩn thận tấm màng mỏng phía trên xuống chất cấy. Dàn đều huyền phù trên diện tích 20 cm 2 bằng cách ấn nhẹ xuống tâm dụng cụ dàn mẫu (4.3) (mặt láng của dụng cụ dàn mẫu hướng xuống dưới). Lấy dụng cụ dàn mẫu ra và để yên đĩa trong 1 min cho gel đông đặc lại. Đặt các đĩa vào tủ ấm (4.8) theo phương nằm ngang với nắp hướng lên trên, không chồng cao quá 20 đĩa, ủ ấm đĩa ở nhiệt độ 35 °C ± 1 °C trong 24 h ± 2 h. Sau khi ủ xong, có thể bảo quản đông lạnh ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng - 15 °C đến 7 ngày, nếu cần. Đếm khuẩn lạc trên các đĩa này ngay sau giai đoạn ủ, sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc (4.5). Có thể sử dụng bộ khuếch đại được rọi sáng để thuận tiện cho việc đếm. Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu đỏ kèm theo một hoặc nhiều bọt khí (trong vòng đường kính một khuẩn lạc) trên các đĩa chứa từ 15 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc. Các khuẩn lạc có màu đỏ nhưng không có bọt khí không được coi là coliform. Không đếm các khuẩn lạc phát triển ngoài vòng tròn giới hạn của môi trường chọn lọc, không đếm các bọt khí giả có thể được tạo ra do thao tác chưa đúng trong quá trình cấy mẫu lên đĩa. 7.2. Đếm E. coli Sử dụng đĩa đếm E. coli /coliform Petrifilm TM (4.2) và tiến hành theo 7.1, nhưng thời gian ủ là 48 h ± 4 h. Trường hợp đếm E. coli và coliform trên cùng một đĩa thì ngay sau khi đếm coliform, tiếp tục ủ ấm đĩa ở nhiệt độ 35 °C ± 1 °C trong 24 h ± 2 h (tổng thời gian là 48 h ± 4 h). Các khuẩn lạc E. coli có màu xanh kèm theo các bọt khí, các vi khuẩn coliform khác có màu đỏ kèm theo bọt khí. 8. Tính và biểu thị kết quả Để tính số lượng coliform hoặc E. coli , nhân tổng số lượng khuẩn lạc trên một đĩa (hoặc số lượng trung bình các khuẩn lạc trên một đĩa, nếu đếm các đĩa kép của cùng một độ pha loãng) với số nghịch đảo của độ pha loãng tương ứng. Khi đếm các khuẩn lạc trên các đĩa kép của các độ pha loãng kế tiếp, tính số lượng trung bình các khuẩn lạc cho mỗi độ pha loãng trước khi xác định trung bình số đếm coliform hoặc E. coli . Nếu không có đĩa nào có số đếm lớn hơn 15 khuẩn lạc với màu đặc trưng kèm bọt khí trở lên (màu đỏ đối với khuẩn lạc coliform, màu xanh đối với khuẩn lạc E. coli ) thì ghi lại số đếm chính xác trên đĩa có độ pha loãng thấp nhất (tương ứng với dung dịch ít pha loãng nhất). Nếu tất cả các đĩa có số đếm lớn hơn 150 thì xác định số đếm ước tính bằng cách đếm số khuẩn lạc trong một hoặc nhiều ô vuông đại diện, tính số đếm trung bình trên một ô vuông và nhân số đếm này với 20 (diện tích vùng sinh trưởng khoảng 20 cm 2 ). Trong trường hợp này, phải báo cáo đây là số ước tính. Nếu các đĩa đều có mật độ khuẩn lạc quá lớn để ước tính số đếm thì kết quả được báo cáo là “quá nhiều để đếm”. 9. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin dưới đây: - mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; - viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp đã sử dụng; - kết quả và đơn vị biểu thị kết quả; - ngày tháng lấy mẫu và phương thức lấy mẫu (nếu có); - ngày tháng nhận mẫu phòng thử nghiệm; - ngày tháng thử nghiệm; - các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm; - mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là tùy chọn, cùng với các chi tiết của sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả. Phụ lục A (Tham khảo) Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm được nêu trong Bảng A.1. Bảng A.1 – Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm đối với E. coli và coliform tổng số Sản phẩm Mức nhiễm Trung bình các giá trị log 10 của số khuẩn lạc trên gam Độ lệch chuẩn lặp lại, s r Độ lệch chuẩn tái lập, s R Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r , % Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R , % Coliform tổng số từ các đĩa đếm coliform Thịt gà tây xay Thấp 1,845 0,193 0,296 10,5 16,1 Trung bình 2,235 0,361 0,361 16,2 16,2 Cao 2,744 0,105 0,270 3,8 9,9 Nấm tươi Thấp 4,241 0,278 0,808 6,6 19,0 Trung bình 4,999 0,662 1,141 13,2 22,8 Cao 5,197 0,120 0,872 2,3 16,8 Thịt bò trong nước sốt Thấp 1,069 0,243 0,288 22,7 27,0 Trung bình 2,062 0,257 0,391 12,5 18,9 Cao 2,732 0,233 0,320 8,5 11,7 Phomat Thấp 0,783 0,172 0,172 21,9 21,9 Trung bình 2,411 0,092 0,206 3,8 8,5 Cao 3,434 0,212 0,364 6,2 10,6 Bột mì Thấp 2,635 0,291 0,874 11,1 33,2 Trung bình 3,460 0,746 1,291 21,6 37,3 Cao 4,049 0,873 1,550 21,6 38,3 Bột từ các loại hạt Thấp 0,896 0,336 0,443 37,5 49,5 Trung bình 1,345 0,486 0,699 36,2 52,0 Cao 2,370 0,267 0,831 11,3 35,1 Coliform tổng số từ các đĩa đếm E. coli/ coliform Thịt gà tây xay Thấp 1,934 0,177 0,261 9,2 13,5 Trung bình 2,216 0,285 0,315 12,9 14,2 Cao 2,835 0,113 0,242 4,0 8,5 Nấm tươi Thấp 4,550 0,079 0,722 1,7 15,9 Trung bình 5,278 0,600 1,001 11,4 19,0 Cao 5,227 0,346 0,817 6,6 15,6 Thịt bò trong nước sốt Thấp 1,016 0,215 0,284 21,2 27,9 Trung bình 2,060 0,256 0,295 12,4 14,3 Cao 2,679 0,191 0,331 7,1 12,4 Phomat Thấp 0,813 0,172 0,192 21,1 23,6 Trung bình 2,507 0,109 0,238 4,3 9,5 Cao 3,620 0,074 0,106 2,1 2,9 Bột mì Thấp 2,639 0,243 0,883 9,2 33,4 Trung bình 3,432 0,826 1,318 24,1 38,4 Cao 4,064 0,929 1,557 22,9 38,8 Bột từ các loại hạt Thấp 0,759 0,028 0,295 3,7 38,8 Trung bình 1,403 0,378 0,728 26,9 51,8 Cao 2,355 0,425 0,915 18,0 38,9 E. coli từ các đĩa đếm E. coli /coliform Thịt gà tây xay Thấp 1,419 0,316 0,316 22,3 22,3 Trung bình 1,923 0,364 0,364 18,9 18,9 Cao 2,607 0,098 0,233 3,8 8,9 Nấm tươi Thấp 2,500 0,261 0,343 10,4 13,7 Trung bình 3,058 0,296 0,422 9,7 13,8 Cao 3,436 0,715 0,760 20,8 22,1 Thịt bò trong nước sốt Thấp 0,753 0,028 0,172 3,7 22,8 Trung bình 0,991 0,154 0,601 15,6 60,7 Cao 1,312 0,161 0,828 12,3 63,1 Phomat Thấp 0,819 0,190 0,190 23,2 23,2 Trung bình 2,454 0,098 0,166 4,0 6,8 Cao 3,440 0,112 0,123 3,2 3,6 Bột mì Thấp 1,175 0,524 0,737 44,6 62,7 Trung bình 3,095 0,967 1,362 31,3 44,0 Cao 3,549 0,821 1,442 23,1 40,6 Bột từ các loại hạt Thấp 0,716 0,067 0,236 9,4 33,0 Trung bình 1,268 0,268 0,605 21,1 47,7 Cao 2,314 0,265 0,857 11,4 37,0 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] AFNOR Validation of Alternative Methods. Report (Preliminary and Collaborative studies according to the NF EN ISO 16140 standard) ISO 16140 validation of 3M TM Petrifilm TM Coliforms count plates (CC) for gas producing colonies enumeration – Quantitative method. PCC Coliforms gas producers Synthesis (Version 2) September 3, 2008 1) Tham khảo tiêu chuẩn APHA nêu trong Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Tuyển tập phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm), 3 rd Ed., 1992, American Public Health Association (Hiệp hội Y tế Hoa Kì), Washington, DC 20001-3710, USA. 2) Sản phẩm của 3M Center, St. Paul, MN 55144, USA. Thông tin này đưa ra để thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.