TCVN10331:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10331:2014 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng robenidine - Phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10331:2014 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ROBENIDINE - PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal f eeding stuffs - Determination of robenidine content - Method using high-performance liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 10331:2014 được xây dựng dựa theo Commission regulation (EC) No. 152/2009; TCVN 10331:2014 do Trung tâm Khảo, kiểm nghiệm và kiểm định giống vật nuôi, thức ăn chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, T ổ ng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ROBENIDINE - PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal f eeding stuffs - Determination of robenidine content - Method using high-performance liquid chromatography 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng robenidine (1,3-bis [(4-chlorobenzylidene) amino]guanidine-hydrochloride) trong thức ăn chăn nuôi sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Giới hạn định lượng của phương pháp là 5 mg/kg. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài li ệ u viện dẫn sau r ấ t cần thi ế t cho việc áp dụng ti ê u chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản được nêu. Đ ố i với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công b ố th ì áp dụng phi ê n bản mới nhất, bao g ồ m cả các sửa đ ổ i, bổ sung (n ế u có). TCVN 6952 (ISO 9498) Thức ăn chăn nuôi- Chuẩn b ị mẫu thử. 3. Nguyên tắc Mẫu được chiết bằng metanol đã axit hóa. Chất chiết được làm khô và một phần mẫu được làm sạch trên cột nhôm oxit. Robenidine được rửa giải ra khỏi cột bằng metanol, cô đặc và bổ sung một lượng thích hợp pha động. Hàm lượng robenidine được xác định sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo sử dụng detector UV. 4. Thuốc thử Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có ch ấ t lượng tương đương, trừ khi có quy đ ị nh khác. 4.1. Metanol. 4.2. Metanol đã ax i t hóa Chuyển 4,0 ml axit clohydric ( p 20 = 1,18 g/ml) vào bình định mức 500 ml, thêm metanol (4.1) đến vạch v à trộn. Chuẩn bị dung dịch m ới ngay trư ớ c khi sử d ụ ng. 4.3. Axetonitr i l, loại dùng cho. HPLC. 4.4. Rây phân tử Loại 3A, c ỡ hạt từ 8 mesh đến 12 mesh (hạt cỡ 1,6 mm đến 2,5 mm, nhôm silicat dạng tinh th ể , đường kính lỗ 0,3 mm). 4.5. Nhôm oxit có hoạt t í nh ax i t, loại I, dùng cho sắc k ý cột Chuyển 100 g nhôm oxit vào bình chứa thích hợp và thêm 2,0 ml nước. Đậy n ắ p và lắc bình trong khoảng 20 min. Bảo quản bằng vật chứa đậy k í n. 4.6. Dung d ị ch kali dihydro phosphat, c = 0,025 mol/ l Hòa tan 3,40 g kali dihydro phosphat vào nước (loại dùng cho HPLC) trong bình định mức 1 000 ml, thêm nước đến vạch và trộn. 4.7. Dung dịch di-natri hydro phosphat, c = 0,025 mol/l Hòa tan 3,55 g di-natri hydro phosphat khan (hoặc 4,45 g dạng ngậm hai phân tử nước hoặc 8,95 g dạng ngậm mười phân tử nước) (loại dùng cho HPLC) vào nước đựng trong bình định mức 1 000 ml, thêm nước đến vạch và trộn. 4.8. Pha đ ộng dùng cho HPLC Trộn các thuốc thử sau đây với nhau: - 650 ml axeto ni tril (4.3); - 250 ml nước (loại dùng cho HPLC); - 50 ml dung dịch kali di-hydro phosphat (4.6); - 50 m l dung dịch di-natr i hydro phosphat (4.7). Lọc qua bộ lọc màng c ỡ lỗ 0,22 μm (5.6) và đuổi kh í dung d ị ch (ví dụ bằng cách siêu âm 10 min). 4.9. Ch ấ t chuẩn Robenidine tinh khiết: 1,3-bis [(4-chlorobenzylidene) amino] guanidine-hydrochloride. 4.9.1. Dung dịch chuẩn g ố c robenldine, 300 mg/ml Cân 30 mg ch ấ t chuẩn robenidine (4.9), chính xác đến 0,1 mg. Hòa tan bằng metanol đ ã axit hóa (4.2) trong b ì nh đ ị nh mức 100 ml, thêm cùng loại dung môi đến vạch và trộn. Bọc b ì nh bằng giấy nhôm và bảo quản ở nơi t ố i. 4.9.2. Dung dịch chuẩ n trung gian robenid i n e , 12 μg/ml Chuy ể n 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.9.1) vào bình định mức 250 ml, thêm pha động (4.8) đến vạch và trộn. Bọc bình bằng giấy nhôm và bảo quản ở nơi tối. 4.9.3. Dung d ị ch hi ệ u chuẩn Chuyển các lượng 5,0 ml, 10,0 ml, 15,0 ml, 20,0 ml và 25,0 ml d ung dịch chuẩn trung gian (4.9.2) vào một dãy các bình 50 ml đã được hiệu chuẩn, thêm pha động (4.8) đến vạch và trộn. Các dung dịch này chứa tương ứng 1,2 μg/ml, 2,4 μg/ml, 3,6 μg/ml, 4,8 μg/ml và 6,0 μg/ml robenidine. Chuẩn bị các dung dịch này ngay trước khi sử dụng. 4.10. Nước loại dùng cho HPLC 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thi ế t bị, dụng cụ của ph ò ng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau: 5.1. Cộ t thủy t i nh Cột được làm bằng thủy tinh màu nâu có khóa và có b ể chứa dung tích khoảng 150 ml, đường kính trong từ 10 mm đến 15 mm, dài 250 mm. 5.2. Máy lắc cơ học hoặc bộ khuấy từ. 5.3. Bộ c ô quay. 5.4. Thi ế t b ị HPLC, c ó detector UV có thể thay đổi bước sóng hoặc detector mảng diod hoạt động trong phạm vi 250 nm đến 400 nm và c ó cột sắc ký lỏng, C18, pha đảo, kích thước 300 mm x 4 mm, cỡ h ạ t 10 μm hoặc loại tương đương. 5.5. Màng lọc bằng sợi thủy tinh ( W hatman GF/A hoặc loại tương đương). 5.6. Bộ lọc màng, c ỡ lỗ 0,22 μm. 5.7. Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 μm. 5.8. Bình định mức, dung t í ch 10 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml và 1 000 ml. 5.9. Bình c ầ u đáy tròn, dung tích 250 ml. 5.10. Bình nón, dung tích 150 ml và 250 ml. 5.11. Cân, có thể cân chính xác đến 0,01 g. 5.12. Cân phân tích, có th ể cân ch í nh xác đến 0,1 mg. 6. Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá tr ì nh vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên l ấ y mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu. 7. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498). 8. Cách tiến hành CHÚ TH Í CH: Robenidine rất nhạy với ánh sáng. S ử dụng thủy tinh m à u nâu đ ể đ ự ng mẫu. 8.1. Y ê u cầu chung 8.1.1. Mẫu trắng cần được phân tích để chắc chắn rằng không chứa robenidine và các chất gây nhiễu. 8.1.2. Cần thực hiện phép thử ki ể m tra độ t hu h ồ i bằng cách phân tích mẫu trắng (8.1.1) bổ sung ch ấ t chuẩn robenidine ở mức t ươ ng tự c ó trong mẫu. Để bổ sung roben i dine ở mức 60 mg/kg, chuyển 3,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.9.1) vào bình n ó n 250 ml (5.10). Cho bay h ơ i dung d ị ch đến khoảng 0,5 ml dưới dòng kh í nitơ. B ổ sung 15 g mẫu trắng, trộn và đợi 10 min trước khi tiếp tục chiết (8.2). CHÚ TH Í CH: Mẫu trắng phải có dạng tương tự mẫu thử và không phát hi ệ n c ó robenidin e . 8.2. Chiết mẫu Cân khoảng 15 g mẫu đ ã chuẩn b ị , chính xác đến 0,01 g. Chuyển sang bình nón 250 ml (5.10) và thêm 100,0. ml metanol đã axit hóa (4.2), đậy nắp v à lắc 1 h trên máy lắc (5.2). Lọc dung d ị ch qua màng lọc sợi thủy tinh (5.5) và thu l ấ y dịch lọc vào bình nón 150 ml (5.10). Thêm 7,5 g rây phân tử (4.4), đậy nắp và lắc trong 5 min. Lọc ngay qua màng lọc sợi thủy tinh. Bảo qu ả n dung dịch này đ ể tinh sạch (8.3). 8.3. Tinh sạch 8.3.1. Chuẩn b ị cột nhôm oxit Ch è n nút bông thủy tinh n h ỏ vào đầu dưới cột thủy tinh (5.1) và lèn chặt bằng đũa thủy tinh. Cân 11,0 g nhôm oxit đ ã chuẩn bị (4.5) và chuy ể n sang cột. Chú ý ở giai đoạn này để giảm thiểu tiếp xúc với kh ô ng khí. Gõ nh ẹ vào phía dưới cột nạp đ ể nhôm oxit lắng xuống dưới. 8.3.2. Tinh sạch mẫu Dùng pipet l ấ y 5,0 ml dịch chiết mẫu đ ã chuẩn b ị (8.2) chuyển lên cột. Đ ể đầu tip pipet gần thành cột và để cho dung dịch h ấ p thụ lên nhôm oxit. Rửa giải robenidine ra khỏi cột bằng cách sử dụng 100 ml metanol (4.1) ở tốc độ 2 ml/min đến 3 ml/min và thu lấy dịch rửa giải vào bình cầu đáy tròn 250 ml (5.9). Làm bay hơi dung d ị ch metanol đến khô dưới áp suất giảm ở 40 ° C tr ê n bộ cô quay (5.3). Hòa tan lại cặn trong 3 ml đến 4 ml pha động (4.8) và chuy ể n nước rửa sang bình định mức 10 ml (5.8). Rửa b ì nh b ằ ng 1 ml đến 2 ml pha động và chuyển nước rửa sang bình định mức. Thêm cùng loại dung môi đến vạch và trộn. Lấy một lượng dung dịch lọc qua bộ lọc màng c ỡ lỗ 0,45 μm (5.7). Sử dụng dung dịch này đ ể phân tích HPLC (8.4). 8.4. Xác định b ằ ng HPLC 8.4.1. Các th ô ng số Các đi ề u kiện sau đây được dùng để hướng dẫn, có thể sử dụng các đi ề u kiện khác nếu cho kết quả tương đ ư ơng: - Cột sắc ký l ỏ ng (5.4), - Pha động dùng cho HPLC (4.8), - Tốc độ dòng: từ 1,5 ml/min đến 2 ml/min, - Bước sóng detector: 317 nm, - Thể tích bơm: 20 μl đến 50 μl. Kiểm tra sự ổn định của hệ thống sắc ký, bơm vài lần dung dịch hiệu chuẩn (4.9.3) nồng độ 3,6 μg/ml, cho đến khi đạt được chi ề u cao pic và thời gian lưu ổn định. 8.4.2. Dựng đường chuẩn Bơm mỗi dung dịch hiệu chuẩn (4.9 . 3) vài l ầ n và đo chi ề u cao hoặc diện t í ch pic đối với mỗi n ồ ng độ . Dựng đường chuẩn từ chi ề u cao hoặc diện t í ch trung b ì nh của pic của các dung dịch hiệu chuẩn trên trục tung và nồng độ tương ứng b ằ ng microgam trên mililit tr ê n trục hoành. 8.4.3. Dung d ị ch mẫu Bơm dịch chiết mẫu (8.3.2) vài l ầ n, bằng cách sử dụng cùng một thể tích như đ ã thực hi ệ n đối với các dung dịch hiệu chuẩn và xác định chiều cao (diện tích) trung bình của các pic robenidin e . 9. Tính kết quả Từ đường chuẩn (8.4.2), xác định nồng độ của dung dịch mẫu bằng microgam trên mililit theo chiều cao hoặc diện t í ch trung bình của các pic robenidine của dung d ị ch mẫu thử. Hàm lượng robenidine có trong mẫu thử, w , t í nh bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được t í nh bằng công thức sau: Trong đó: c là nồng độ robenidine trong dung dịch m ẫ u, tính bằng microgam trên mililit (μg/ml); m l à khối lượng của phần mẫu thử, t í nh bằng gam (g). 10. Đánh giá xác nhận kết quả 10.1. Nhận b i ết Việc nhận biết ch ấ t phân tích có thể đ ư ợc khẳng định bằng đồng sắc ký, hoặc bằng cách sử dụng detector mảng dio d , bằng cách này so sánh ph ổ của ch ấ t chi ế t mẫu và của dung dịch hiệu chuẩn (4.9.3) nồng độ 6 μg/ml. 10.1.1. Đ ồ ng s ắ c k ý Chất chi ế t mẫu được bổ sung một lượng th í ch hợp dung dịch hiệu chuẩn (4.9.3). Lượng robenidine được bổ sung phải tương tự lượng robenidine dự ki ế n t ì m th ấ y trong ch ấ t chiết mẫu. Chiều cao pic robenidine ph ả i tăng sau kh i bổ sung chất chuẩn và c ầ n t í nh đến độ pha loãng của dịch chiết. Chi ề u rộng pic tại điểm giữa chiều cao tối đa chỉ được dao động tr ong phạm vi ± 10 % chiều rộng tương ứng trước khi bổ sung. 10.1.2. Detector mảng diod Các kết quả được đánh giá theo các tiêu chí sau: (a) bước s ó ng hấp thụ cực đại của mẫu và của phổ chuẩn, được ghi lại ở đ ỉ nh pic trên sắc ký đ ồ , phải giống nhau trong một bi ê n độ phụ thuộc vào khả năng phân giải của hệ thống detector. Đối với detector mảng diod, thường là xấp xỉ 2 nm; (b) trong dải bước sóng từ 250 nm đến 400 nm, sắc ký đồ của mẫu v à của ch ấ t chu ẩ n được ghi lại ở đ ỉ nh pic trên sắc ký đồ, không được khác với những phần của ph ổ trong dải từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này được đáp ứng khi cùng có các cực đại như nhau và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ h ấ p thụ của ch ấ t phân tích; (c) trong dải bước s ó ng từ 250 nm đến 400 nm, phổ c ủ a đỉnh pic và độ dốc hai ph í a của pic thu được từ dịch chiết mẫu không được khác so với các ph ầ n quang phổ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này được đáp ứng khi cùng một cực đại có mặt và khi tất c ả các đi ể m quan sát được có độ l ệch giữa các phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ của phổ cao nhất. N ế u một trong các tiêu ch í này không đáp ứng th ì sự có mặt của các chất ph â n tích không được xác nhận. 10.2. Độ lặp lại Chênh lệch giữa kết quả của hai phép xác định song song, thực hiện tr ên cùng một mẫu không được vượt quá 10 % có hàm lượng robenidine lớn hơn 15 mg/kg. 10.3. Độ thu hồi Đ ố i v ớ i mẫu trắng thêm chuẩn, độ thu h ồ i ít nhất là 85 %. 11. Phép thử liên phòng thử nghiệm Một nghiên cứu cộng tác do châu Âu tổ chức thực hiện trên bốn mẫu thức ăn gia cầm và thức ăn chăn nuôi thỏ ở dạng bột hoặc dạng viên, gồm 12 phòng thử nghiệm tham gia. Các phép phân tích lặp lại đã thực hiện trên m ỗ i m ẫ u. Các kết quả được nêu trong Bảng 1. Bảng 1 - K ế t quả thử nghi ệ m cộng tác Thức ă n g i a c ầ m Thức ăn cho th ỏ Dạng bột D ạ ng vi ê n Dạng bột Dạng vi ê n Giá trị trung bình [mg/kg] 27,00 27,99 43,6 40,1 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r [mg/kg] 1,46 1,26 1,44 1,66 Hệ số biến thiên lặp lại, CV r [% ] 5,4 4,5 3,3 4,1 Độ lệch chuẩn tái lập , S R [mg/kg] 4,36 3,36 4,61 3,91 Hệ số biến thiên tái lập, CV R [%] 16,1 12,0 10,6 9,7 Độ thu h ồ i [%] 90,0 93,3 87,2 80,2 12. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi r õ : a) tất cả các thông tin cần thiết đ ể nhận biết đ ầ y đủ v ề mẫu thử; b) phương pháp l ấ y mẫu đã sử dụng, n ế u bi ế t; c) phư ơ ng pháp thử đã d ùng, viện dẫn ti ê u chuẩn này; d) mọi chi ti ế t thao tác không quy đ ị nh trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là t ùy chọn cũng như các sự cố b ấ t kỳ có thể ảnh hư ở ng đến k ế t quả thử. e) k ế t quả thử nghiệm thu được. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi -Lấy mẫu