TCVN8710-13:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-13:2005 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-13:2015 BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN- PHẦN 13: BỆNH GAN TỤY DO PARVOVIRUS Ở TÔM Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 13: Hepatopancreatic parvovirus disease in shrimp L ờ i nói đầu TCVN 8710-13:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo OIE (2007), Manual of diagnostic test for aquatic animals , Hepatopancreatic parvovirus disease . TCVN 8710-13:2015 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ TCVN 8710 Bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán gồm 15 phần: - TCVN 8710-01 : 2011, phần 1: Bệnh Còi d o vi rút ở tôm ; - TCVN 8710-02 : 2011 , ph ầ n 2: Bệnh Hoại t ử thần kinh ở cá biển; - TCVN 8710-03 .2011, ph ầ n 3: Bệnh Đốm trắng ở tôm ; - TCVN 8710-04 : 2011, phần 4: Bệnh Đầu vàng ở tôm; - TCVN 8710-05 : 2011, ph ầ n 5: Bệnh Taura ở tôm He; - TCVN 8710-06 : 2012, phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép; - TCVN 8710-07 : 2012, ph ầ n 7: Bệnh xuất huyết m ù a xuân ở cá chép; - TCVN 8710-08 : 2012, ph ầ n 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm; - TCVN 8710-09 : 2012, phần 9: Bệnh hoại t ử gan tụy ở t ô m; - TCVN 8710-10 : 2015, phần 10: Bệnh do Perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh v ỏ ; - TCVN 8710-11 : 2015, phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai m ả nh v ỏ ; - TCVN 8710-12 : 2015 , phần 12: Bệnh do Vi bào t ử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm; - TCVN 8710-13 : 2015, phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm - TCVN 8710-14 : 2015, phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá; - TCVN 8710-15 : 2015, phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas ở cá. BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN- PHẦN 13: BỆNH GAN TỤY DO PARVOVIRUS Ở TÔM Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 13: Hepatopancreatic parvovirus disease in shrimp CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết t ấ t c ả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả n ă ng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh gan tụy do Parvovirus (HPV) ở tôm. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau: 2.1. Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm (Hepatopancreatic parvovirus disease). Bệnh do vi rút thuộc nhóm Parvovirus ký sinh trong nh â n tế bào gan tụy và b iể u bì ruột trước của tôm, làm nhân sưng to và gây hoại tử tế bào vật ch ủ . CHÚ THÍCH: Tác nh â n gây bệnh gan tụy ở tôm l à vi rút thuộc nhóm Parvovirus , cấu trúc axit nh â n l à ADN, l à vi rút có k í ch thước nh ỏ , h ì nh cầu, đường kính từ 22 nm đ ế n 24 nm. Cấu t rúc không có màng bao, có 20 mặt, kh ô ng có thể ẩ n (occ l usion body), có th ể vùi (in cl usion body). 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân t í ch, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp c ó quy định khác. 3.1 . Thu ố c thử và vật liệu th ử d ù n g chun g 3.1.1 . Etano l 70 % (thể t ích ) , 9 0 % ( thể tích) và eta n o l t u yệt đố i. 3.2 . Thuốc thử và vật liệu th ử d ùng cho phương pháp chẩn đoán b ằn g PCR. 3.2.1 . Cặp mồi (p r imes) gồm mồi xuôi và mồi ngược 3.2.2 . Agarose. 3.2.3 . Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris-aceta te - EDTA) (xem A.1). 3.2.4 . Chất nhuộm màu , ví dụ: Sybr safe 3.2.5 . Chất đệm t ả i mẫu (Loading dye 6X). 3.2.6 . Dung dịch đệm TE (Tris-EDTA). 3.2.7 . Thang chuẩn ADN (Marker). 3.2.8 . Nước tinh khiết , không có nuclease. 3.2.9 . Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit) 3.2.10 . Kít tách chiết ADN (acid deoxyribo nucleic), protein K . 3.3 . Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng parafin. 3.3.1 . Formalin 10 % , được chuẩn bị từ dung dịch formaldehyde 38 % và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (tỷ lệ thể tích 1 : 9). 3.3.2 . Xylen. 3.3.3 . Dung dịch Davidson (xem A.2). 3.3.4 . Thuốc nhuộm Haematoxylin (xem A.3). 3.3.5 . Thuốc nhuộm Eosin . (xem A.4). 3.3.6 . Para f in , c ó độ nóng chảy từ 56 o C đến 60 o C. 3.3.7 . Keo dán lamen. 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau: 4.1 . Thiết bị, dụng cụ dùng ch o phương pháp chẩn đoá n bằng PCR. 4.1.1 . Máy nhân gen ( PCR ). 4.1.2 . Máy ly t â m , c ó thể l y t â m vớ i gi a tốc 6 000 g và 20 000 g. 4.1.3 . Máy lắc trộn vortex. 4.1.4 . Máy spindown. 4.1.5 Bộ điện di , gồm bộ nguồn và bể ch ạ y điện di. 4.1.6 . Máy đọc gel. 4.2 . Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi th ể bằng parafin. 4.2.1 . Khuôn nhựa , loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể. 4.2.2 . Máy xử lý mẫu mô tự động. 4.2.3 . Nồi đun parafin , có thể duy tr ì nhiệt độ từ 56 o C đến 65 o C. 4.2.4 . Khay sắt , l oại chuyên dụng cho l à m tiêu bản vi thể. 4.2.5 . Máy làm lạnh tiêu bản , có thể duy trì nhiệt độ từ âm 10 o C đến 4 o C. 4.2.6 . Máy cắt tiêu bản , cắt ở độ m ỏ ng từ 3 m m đến 5 m m. 4.2.7 . Nồi dãn tiêu b ả n , có thể duy tr ì nhiệt độ từ 35 o C đến 65 o C 4.2.8 . Phiến kính , vô trùng. 4.2.9 . Lamen , vô trùng. 4.2.10 . Kính hiển vi quang học , vật k í nh 10 X, 20X, 40 X và 100 X. 5. Chẩn đoán lâm sàng 5.1 . Đặc điểm dịch tễ. Bệnh gan tụy do HPV gây ra cho tôm nuôi và tôm tự nhiên có thể xảy ra quanh năm ở khắp các vùng nuôi tôm. CH Ú TH Í CH Bện h g an tụy do HPV thường xảy ra ở các nước: China, Korea, Taiwan, Thailand, Singapore, Malaysia, Indonesia , the P hilippin es , Austral i a , K enya, M adag ascar , I s ra e l ; K uwait, Mexico, Honduras, El Salvador, Colombia, Ecuador, Peru, Brazil ; T ôm nhiễm bệnh ở giai đoạn ấu trùng và tôm giống với tỷ lệ nhiễm cao. Tỷ lệ chết từ 50 % đến 100 % số tôm trong ao nuôi. Bệnh gan tụy do HPV l ây truyền ch ủ y ế u theo trục dọc từ tôm b ố mẹ sang đàn con , m ột số ít l â y nhiễm theo trục ngang t ừ con n à y sang con khác. 5.2 . Triệu chứng l â m sàng. Tôm nhiễm bệnh gan tụy do HPV thường không có dấu hiệu đặc thù, b ỏ ăn ho ặ c ít ăn , sinh trư ở n g chậm, hoạt động y ế u và dễ bị nhiễm các sinh vật cơ hội bám trên mang, v ỏ và các phần phụ, hệ cơ bụng đục mờ; Bệnh thường xảy ra với tôm nuôi thương ph ẩ m (từ tháng thứ 3 đến tháng thứ 4). Tôm nhiễm bệnh có dấu hiệu b ỏ ă n, hoạt động chậm chạp, th ả i phân trắng và chết rải rác. 5.3 . Bệnh tích. Gan tụy của tôm nhiễm HPV bị teo lại hoặc hoại tử và c ó máu trắng nhợt. 6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). 6.1.1 . L ấ y mẫu. - Thu mẫu tôm có dấu hiệu bệnh lý, còn sống hoặc vừa mới chết. - Bệnh phẩm: Tôm nguyên con hoặc khối gan tụy . - S ố lượng t ô m trên mỗi mẫu phụ thuộc vào kích cỡ của tôm: + Tôm giống: lấy từ 5 con/mẫu đến 10 con/mẫu; + Tôm trư ở ng thành, tôm bố mẹ: lấy từ 3 con/mẫu đến 5 con/mẫu. - Lấy mẫu mỗi loại bệnh phẩm, cho vào từng lọ hay túi nilon vô trùng riêng biệt, đậy kín, thao tác lấy mẫu, dụng cụ đựng mẫu và tiếp xúc với mẫu phải đ ả m b ả o vô trùng. 6.1.2 . B ả o quản mẫu. Trong quá trình vận chuyển mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 o C đến 8 o C không quá 24h hoặc bảo quản trong etanol tuyệt đối (3.1.1); Mẫu chuyển đến phòn g th í n g hi ệ m nếu chưa p hân t í ch ng a y phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 o C đến âm 80 o C hoặc trong etanol tuyệt đối (3.1.1). 6.1.3 . Chuẩn bị mẫu. Bệnh phẩm: tôm giống và h ậ u ấu trùng sử dụng nguyên con ; Bệnh phẩm: tôm bố mẹ, tôm thương phẩm d ùng panh , kéo v ô trùng cắt lấy một phần khối gan tụy. Lượng mẫu cần chuẩn bị: khoảng 30 mg. 6.1.4 . Cách tiến hành. 6.1.4.1 . Tách chiết AND. Sử dụng bộ kít thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. VÍ DỤ: Sử d ụng quy trình tách chi ế t ADN b ằ ng protein K v à kít tách chiết b ằ ng cột l ọ c của Qiagen (xem Phụ lục B) 1) . 6.1.4.2 . Chuẩn bị mồi. Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.1.1) theo phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của bệnh hoại tử gan tụy sử dụng cặp mồi H441F/ H441R) (3.2.1). Trình tự cặp mồi được nêu trong b ả ng 1. Bảng 1 : Trình tự cặp mồi M ồ i Trình tự cặp mồi H441F 5’-GCATTACAAGAGCCAAGCAG-3’ H441R 5’-ACACTCAGCCTCTACCTTGT- 3 ’ Cặp mồi H441F/ H441R dùng để khuếch đại đoạn của gen HPV có kích thước 441 bp. Mồi được chuẩn bị như sau: Chuẩn bị mồi gốc: - Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để m ồ i l ắ ng xu ố ng đáy ố ng trước khi m ở v à ho àn nguyê n. Khi hoàn nguyên, nên dùng đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 m M làm mồi gốc . Chuẩn bị mồi sử dụng - Mồi sử dụng ở nồng độ 20 m M: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (10 m l mồi gốc và 90 m l nước). 6.1.4.3 . Tiến hành phản ứng PCR. Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (6.1.4.2) sử dụng kít nhân gen (3.2.9) theo hướng dẫn của nhà sản xuất . VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen của Thermo Scienti fi c Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656) 2) Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 2 Bảng 2: Th à nh ph ầ n phản ứng PCR Th à nh phần Thể tích Taq PCR Master Mix Kit 12,5 m l Mồi xuôi 20 m M 1 m l Mồi ngược 20 m M 1 m l Nước không có nuclease 8 m l Tổng thể tích 22 , 5 m l Chuyển 22,5 m l hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng: - Màu kiểm chứng d ương: Cho 2,5 m l mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các ch ủ ng Aphanomyces invadans chu ẩ n vào ống ph ả n ứng; - Mẫu kiểm ch ứ ng âm: Cho 2,5 m l nước (3.2.8) vào ống phản ứng; - M ẫ u th ử : Cho 2,5 m l mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng. Ti ế n hành p h ản ứn g PCR bằ n g m áy n hâ n g en (4.1.1) đ ã cài đặt chu trình nhiệt và được nêu trong bảng 3. B ả ng 3 : Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Nhiệt độ Thời gian số chu kỳ Số chu kỳ 95 o C 5 m in 1 95 o C 1 min 35 60 o C 1 min 72 o C 1 min 72 o C 1 min 1 CHÚ THÍCH: - Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu t hử , mẫu kiểm chứng dương và m ẫ u kiểm chứng âm; - Mẫu và nguy ê n liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng. 6.1.4.4 . Điện di. 6.1.4.4.1 . Chuẩn bị bản gel. Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.2) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.3) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi; Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 o C đến 50 o C thì bổ sung 10 m l ch ấ t nhuộm màu (3.2.4) cho 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều; Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm; Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch ; Chuyển b ả n gel vào bể điện di (4.1.5), đ ổ dung dịch đệm (3.2.3) cùng loại v ớ i dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch. CHÚ THÍCH: Có th ể dùng các sản phẩm có sẵn ch ấ t nhuộm A D N đ ể pha chế thạch agarose (ví dụ: Sybr safe ADN gel stai n 3) ) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất. 6.1.4.4.2 . Chạy điện di. Hút 2 m l chất đệm tải mẫu (3.2.5) vào 8 m l sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch. Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.1.5) , chạy kèm theo t h ang c huẩ n A D N ( 3 . 2.7 ) để dự đoán kí ch thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 m l thang chuẩn AND (3.2.7.) vào một giếng trên bản thạch . Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min. 6.1 . 4 . 5 . Đọc kết qu ả Sau khi điện di , đọc kết quả trên máy đọc gel (4.1.6) theo bảng 4. Bảng 4: Kết quả điện di Giếng S ả n ph ẩ m có kích thước 441 bp K ế t qu ả Thang chuẩn Sáng và chia vạch rõ ràng Điện di tốt M ẫ u kiểm chứng dương t í nh Có Hỗn hợp phản ứng PCR tốt Không Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng hoặc e nz ym hỏng Mẫu kiểm chứng âm t í nh Không Không bị tạp nhiễm có Bị tạp nhiễm M ẫ u thử c ó Dương tính với HPV Không Âm t í nh với HPV Đánh giá kết qu ả : - Kết quả mẫu th ử dương tính khi: tại giếng mẫu th ử xuất hiện vạch sáng có kích thước 441 bp, thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, mẫu ki ể m chứng dương có kích thước 441 bp, mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng. - Kết quả mẫu thử âm tính khi: tại giếng mẫu thử không có vạch sáng, thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, mẫu kiểm chứng dương tính có vạch sáng 441 bp, mẫu kiểm chứng âm tính không có vạch sáng. 6.2. Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp parafin. 6.2.1 . Lấy mẫu. Xem 6.1.1 6.2.2 . Bảo qu ả n mẫu. - Mẫu bệnh phẩm được đảm bảo ngập trong Davidson (3.3.3) đảm bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và Davidson (3.3.3) đạt tỷ lệ khoảng 1 : 10; tránh đổ vỡ, rơi vãi Davidson (3.3.3) ra ngoài môi trường; khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu b ằ n g túi nilon, miệng túi được dán kín. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bổ sung Davidson (3.3.3) hoặc thay mới bằng formalin (3.3.1), đảm bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin (3.3.1.) đạt tỷ lệ khoảng 1 : 10. 3.2.3 . Chuẩn bị mẫu. Đ ố i với tôm giống và hậu ấ u trùng lấy nguyên con: Đối với tôm bố mẹ hoặc tôm thương ph ẩ m cắt to à n bộ phận giáp đầu ngực (< 1 cm 3 ); Mẫu b ệ nh phẩm cố định trong Davidson (3.3.3) khoảng từ 24 h đến 72 h tùy thuộc vào kích thước mẫu; M ẫ u bệnh phẩm được chuyển sang cố định trong f ormalin 10 % (3.3.1) không quá 24 h. M ẫ u bệnh phẩm cố định trong f o r malin 10% ra, cắt miếng nh ỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm cho vào khuôn nhựa (4.2.1). 6.2.4 . Cách tiến hành. 6.2.4.1 . Đúc khuôn. - Đặt khuôn nhựa (4.2.1) r ử a dưới vòi nước ch ả y, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ 2 , thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) l ầ n thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đ ế n 3 h; - Ngâm khuôn nhựa v à o cốc para fi n (3.3.6) lần thứ nhất trong thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.3 6) lần thứ hai, thời gian từ 2 h đến 3 h; CHÚ THÍCH: Tất c ả các thao tác tr ê n có thể được thực hiện trong máy xử lý mẫu mô tự động (4.2.2). - Đúc khuôn rót para f in (3.3.6) nóng chảy từ nồi đun para f in (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4), gặp bệnh phẩm từ k h uô n nhựa đặt vào khay sắt (4.2.4 ), đ ặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên. Để nguội , t ách lấ y khối para f in. 6 .2.4.2 . C ắ t tiêu b ả n. - Cắt gọt khối para f in (6.2.4.1) cho bằng phẳng, đặt lên trên mặt máy làm lạnh tiêu bản (4.2.5). - Đặt khối para f in l ên m á y cắt tiêu bản (4. 2 . 6 ) sao cho m ặ t kh ối para f in song song với mép lưỡi dao cắt b ỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đ ủ các bệnh phẩm, điều chỉnh độ dày của lát cắt từ 3 m m đến 5 m m, cắt một vài l á t; - Chọn lát cắt phẳng th ả vào nồi dãn tiêu b ả n (4.2.7) với nhiệt độ nước từ 35 o C đến 40 o C. Dùng phiến kính (4.2.8) vớt dán lát cắt. Dựng nghiêng tiêu bản và để khô . 6.2.4.3 . Nhuộm tiêu bản - Ngâm tiêu bản (6.2.4.2) vào cốc xylen (3.3.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản và o cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) 2 lần, thời gian mỗi l ầ n từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản v à o cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ng âm tiêu bản v à o cốc eta nol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.3.4), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.3.5), thời gian từ 60 s đến 90 s; - Rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;; - Loại b ỏ nước còn bám tr ê n tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etano l tuyệt đối (3.1.1) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuy ể n tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.3.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.2.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.3.7). Để khô, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (4.2.10). 6.2.5 . Đọc kết qu ả . Mẫu dương tính khi có dấu hiệu mô học đặc thù của HPV được thể hiện dưới dạng 1 thể vùi trong nhân tế bào phình to. Thời kỳ đầu thể vùi này nằm ở trung tâm của nhân sau lớn dần lên nằm gần kín nhân, thường có dạng hình cầu hoặc hơi bầu dục. Trong các tế bào bị cảm nhiễm vi rút hạch nhân cũng phình to hơn các tế bào bình thường khác. M ô hình ố n g g an t ụy h ầ u h ết hoại t ử (rỗng) v à có c hứ a n hiều giọt mỡ. Một số tế bào trương to chứa đầy các hạt nhỏ, nhân phân hóa. Thể ẩ n trong nh â n tế b à o bi ể u b ì m ô h ình ố ng gan tụ y b ắt màu đ ỏ hoặc đỏ sẫm gần kín nhân t ế bào. 7. Kết luận M ẫ u tôm được xác định l à nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử gan tụy (HPV) khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và có kết quả dương tính một trong hai phương pháp sau: - Phản ứng PCR phát hiện HPV dương tính; - M ẫ u c ắ t m ô thể hiện những dấu hiệu bệnh tích vi th ể đặc trưng cho bệnh HPV trên tôm. PHỤ LỤC A (Quy định) THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ THUỐC THỬ A.1 . Dung dịch đệm TAE hoặc TBE A.1.1 . Thành ph ầ n Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml Nước khử io n: 900 m l Tổng: 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X A.1.2 . Chuẩn bị Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X h òa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và l ắ c đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. A.2 . Dung dịch Davidson A.2.1 . Thành phần Etanol tuyệt đối: 330 ml Formalin: 220 ml (dung dịch nước bão hòa khí f ormaldehyde là dung dịch từ 36 % đến 38 %) Axit acetic: 115 ml Nước cất: 355 ml A.2.2 . Chuẩn bị Hòa tan axit acetic, formalin và etanol tuyệt đối trong 355 ml nước cất, khuấy và lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. A.3 . Thuốc nhuộm Hematoxylin ( dung dịch Hematox yl in – M ayer ) A.3.1 . Thành ph ầ n He m atoxyl i n dạ n g tinh thể : 1 g Na tri iod at : 0 , 2 g Amoni alum sulphate: 50 g (hoặc Postasium alum sulphate) Axit citric: 1 g Chloral hydrate: 50 g Nước : 1000 ml A.3.2 . Chu ẩ n bị Hòa tan Hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni alum sulphate hoặc postasium alum sulphate , h òa tan, tiếp tục cho axit citric và chloral hydrate rồi lọc qua giấy lọc. B ả o quản dung dịch đã pha trong chai tối màu. A.4 . Thuốc nhuộ m Eosin A.4.1 . Thành ph ầ n Eosin Y: 1 g Etanol 70 % (thể tích) : 1 lít Axit axetic: 5 ml A.4.2 . Chu ẩ n bị Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 % (thể tích). H òa tan eosin trong cồn, sau đ ó thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc. Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị trong chai tối màu. PHỤ LỤC B ( Tham khảo) QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ADN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng h óa chất nguy hi ể m và có khả năng g â y hại nếu thao tác không c ẩ n thận. Do vậy nên tránh tiếp xúc trực tiếp v ớ i d a và h í t ph ả i h ơi của c á c h óa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này. Quy trình tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNeasy ® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506): - Nh ỏ 20 m l protease K vào ống ly tâm 1,5 ml; - Chuyển 30 mg mẫu bệnh phẩm (6.1.3) vào ống ly tâm đã c ó protease K; - Thêm 200 m l dung dịch AL (L y sis buffer); - Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.1.4); - Ủ ấm ở 56 o C trong 10 min, sau đ ó ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.1.4); - Thêm 200 m l etanol tuyệt đối vào ố ng ly tâm; - Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.1.4); - Hút 420 m l huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển sang cột ly tâm có ống thu ở dưới; - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ ph ò ng: - Thêm 500 m l dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới; - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ ph ò ng; - Thay ống thu ở dưới cột ly tâm; - Thêm 500 m l dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột ly tâm c ó ống thu ở dưới; - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng; - Chuyển cột ly tâm sang ống ly tâm 1,5 m l ; - Nhỏ 200 m l dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min; - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min; - Chuyển ADN đã thu được sang ống 1,5 ml khác. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [ 1 ] Đỗ Thị Hòa , B ùi Quang T ề, Nguyễn Hữu Dũng , Nguyễn Th ị Muội , 202-204 , 2004. Bệnn học t hủy s ả n. [2] E. Manj an aik , K. R. Umesha, In d ra n i Karunasa g a r, Id dy a Kar una sag a r , 2005 . D etect ion of nepatopancreatic parvovirus (HPV) in wild shrimp from India by nested polymerase chain reaction (PCR) [3] Jurairat Phromjai, Vichai Boonsaeng, Boonsirm With y achumnarnkul , Timothy W. Flegel , Detection o f hepatopancreatic parvovirus in Thai shrimp Penaeus monod o nby in sit u hybr i diza t ion, d ot b l o t hybridization and PCR amplification , Diseases of aquatic organisms Dis Aquat Org, 2002, 51. p 227-232. 1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thu ậ n tiện cho ng ườ i sử dụng tiêu chu ẩ n và không ấn định sử dụng sản phẩm c ủ a nh à cung cấp này. Có th ể sử dụng các s ả n ph ẩ m tương tự nếu cho các kết quả tương đương. 2) Thông tin n à y đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chu ẩ n và không ấ n định sử dụng s ả n ph ẩ m n à y. Có th ể sử dụng các sản phẩm t ương tự nếu cho các kết quả tương đương. 3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và kh ô ng ấ n định sử dụng sản ph ẩ m này. Có thể s ử dụng các s ả n ph ẩ m tư ơ ng tự n ế u cho các kết qu ả tương đương.