TCVN8140:2009

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8140:2009 (ISO 13493 :1998) về Thịt và sản phẩm thịt - Xác định hàm lượng cloramphenicol - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8140 : 2009 ISO 13493 :1998 THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CLORAMPHENICOL - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Meat and meat products - Determination of chloramphenicol content - Method using liquid chromatography Lởi nói đầu TCVN 8140 : 2009 hoàn toàn tương đương v ớ i ISO 13493 : 1998; TCVN 8140 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chu ẩ n quốc gia TCVN/TC/F8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lư ờ ng Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Thịt và sản phẩm thịt - Xác định hàm lượng cloramphenicol - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Meat and meat products - Determination of chloramphenicol content - Method using liquid chromatography 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn n à y qui định phương pháp xác định hàm lượng cloramphenicol trong mô của cơ thịt, kể cả thịt gia c ầ m b ằ ng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Phương pháp n à y d ùng để xác định hàm lượng cloramphenicol lớn hơn 6,5 /kg. Mẫu thử đ ã bị giảm chất lượng không thể phân tích được b ằ ng phương pháp này. CHÚ THÍCH Tiêu chuẩn n à y có t hể dùng đ ể xác định hàm lượng clora m phenicol trong tất c ả các loại thịt v à sản ph ẩ m thịt. Tuy nhi ê n, các cơ thịt không đ ề c ậ p trong phép thử cộng tác của phương pháp 2. Tài liệu viện dẫn C á c tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản được n ê u. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp d ụng phiên b ả n mới nhất, bao gồm c ả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 4851 : 1989 (ISO 3696 : 1987) , Nước dùng để phân tích trong phòng thử nghiệm - Yêu c ầ u kỹ thuật và phương pháp th ử . 3. Thuật ngữ, định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ, định nghĩa sau đ â y: Hàm l ượ ng cloramphenicol trong thịt và sản ph ẩ m thịt (chloramphenicol content of meat and meat products): Phần khối lượng của cloramphenicol còn lại xác định được theo qui tr ì nh quy định trong tiêu chuẩn này CH Ú THÍCH Hàm lượng cloramphenicol được biểu thị theo microgam trên kilogam. 4. Nguyên tắc Phần mẫu thử được chiết bằng nước. L ọ c và chi ế t pha rắn để tách thành phần chất béo ra khỏi dung d ịch l ỏ ng. Cloramphenicol được rửa giải ra kh ỏ i cột bằng diclorometan . Pha hữu cơ được làm bay hơi và được tinh sạch bằng cách chiết pha lỏng-lỏng với nước và toluen. Cloramphenicol được đo b ằ ng sắc ký pha đảo có detector UV . 5. Thuốc thử Ch ỉ sử dụng c á c thuốc thử đạt chất lượng tinh khi ế t phân tích, tr ừ khi c ó qui định khác. 5.1. Nước, phù hợp với loại 3 của TCVN 4851 : 1989 (ISO 3696 : 1987). Nước không chứa các hợp chất hữu cơ. 5.2. Nit ơ , thích hợp để l à m bay hơi dung môi. 5.3. Diclometan. 5.4. Toluen. 5.5. Dung dịch đệm axetat, c (CH 3 C O 2 Na) = 0,01 mol/l, pH = 4,3. Hoà tan 0,82 g natri axetat khan trong khoảng 970 ml nước. Chỉnh pH đến 4,3 b ằ ng axit axetic (CH 3 C O 2 H) loãng 50 % (khối lượng) bằng m á y đo pH (6.1). Chuyển dung dịch vào bình định mức một vạch 1 000 ml . Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn đều. 5.6. Axetonitril, thích hợp cho đo phổ UV . 5.7. Pha động. Thêm 750 ml dung dịch đệm axetat (5.5) vào 250 ml axetonitril (5.6) và trộn kỹ. Trước khi sử dụng, lọc dịch rửa gi ả i qua bộ lọc cỡ lỗ 0,22 (6.2) và khử khí. 5.8. Dung dịch gốc cloramphenicol, 100 . Cân 10 mg cloramphenicol, ch í nh xác đến 0,1 mg và chuyển vào b ì nh định mức một vạch 100 ml. Pha lo ã ng bằng metanol đến v ạ ch và trộn. Dung dịch gốc bền trong 1 tháng khi được b ả o quản ở nơi tối. 5.9. Dung dịch chuẩn cloramphenicol. Dùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch gốc (5.8) cho v à o bình định mức một vạch 100 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch và tr ộ n. Chu ẩ n bị bốn dung dịch chuẩn b ằ ng cách pha loãng 1,0 ml, 2 , 0 ml, 5,0 ml và 15,0 ml dung dịch này bằng nước để thu được các dung dịch có hàm lượng cloramphenicol 0,05 , 0,10 , 0,25 và 0,75 tương ứng. Các dung dịch chuẩn này bền trong 1 tuần khi được bảo qu ả n ở nơi tối. 6. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị , dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thư ờ ng và cụ thể như sau 6.1. Máy đo pH. 6.2. Bộ lọc màng, thể tích chết thấp và cỡ lỗ 0,22 . 6.3. Thiết bị đ ồ ng hoá bằng cơ hoặc b ằ ng điện có khả n ă ng đồng hoá mẫu phòng thử nghiệm. Thiết bị này bao gồm: máy c ắ t quay tốc độ cao, hoặc máy xay có gắn t ấ m đục l ỗ, đường kính lỗ không quá 4,0 mm. 6.4. Máy trộn phòng thử nghiệm ( ví dụ bộ trộn nhu động 1) hoặc máy Vortex). 6.5. Gi ấ y lọc, loại định lượng, lọc tốc độ nhanh, đư ờ ng kính khoảng 15 cm. CHÚ THÍCH Ví dụ, Whatman số 41 đ ã được chứng minh là phù hợp 1) 6.6. Ố ng chiết, có dung tích 20 ml, chứa điatomit, chiết được các th à nh phần ưa béo ra khỏi dung dịch nước CH Ú THÍCH Extrelu® do Merck Darmstadt. Đức (S ố 11737) sản xuất, đã được chứng minh là phù hợp 1) 6.7. N ồ i cách thuỷ hoặc bếp gia nhiệt , có thể duy tr ì được ở (40 ± 1) o C , có bộ phận sấy khô d ùng nitơ (5.2); hoặc máy cô quay ch â n không . 6.8. Ố ng ly tâm , dung tích 25 ml. 6.9. Máy trộn Vortex , vận hành ở tốc độ quay khoảng 700 min -1 6.10. Máy ly tâm , vận hành ở gia tốc quay khoảng 1 000 g . 6.11. Micropipet , dung t í ch 300 . 1) Đây là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin đưa ra để thuận lợi cho ngưởi sử dụng tiêu chuẩn và ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. 6.12. Máy Sắc ký lỏng, gồm: - bơm có dòng cố định; - bơm; - cột C 8 hoặc C 18 pha đảo có đường kính trong 3 mm, dài 20 cm, cỡ hạt 5 hoặc cột có chất lượng tương đương; - detector UV/VIS phù hợp cho ph é p đo ở bước sóng 285 nm; detector DAD (dùng để khẳng định), nếu sẵn có. - máy ghi có d ả i đo thay đổi hoặc máy tích ph â n. 7. Lấy mẫu Việc lấy m ẫ u không qui định trong tiêu chu ẩ n này. Nên lấy mẫu theo (ISO 3100 : 1991) 2) [1]. Mẫu gửi đến phòng th ử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc không bị biến đổi chất lượng trong quá tr ì nh vận chuyển hoặc bảo qu ả n. Lấy ít nhất 200 g mẫu đại diện. Bảo quản mẫu sao cho mẫu kh ô ng bị giảm chất lượng v à không b ị thay đổi thành ph ầ n. 8. Chuẩn bị mẫu thử Để mẫu đạt đến nhiệt độ phòng. Loại b ỏ chất béo th ừ a và những phần không ă n được. Đồng hoá mẫu phòng thử nghiệm b ằ ng dụng cụ thích hợp (6.3). Chú ý đ ể nhiệt độ của mẫu nguyên liệu không tăng quá 25 o C . Nếu sử dụng máy xay thịt, th ì xay mẫu í t nhất hai lần. Cho đầy mẫu đã chuẩn bị v ào v ật ch ứ a có nắp đậy k í n kh í . Đậy nắp vật ch ứ a và bảo quản sao cho mẫu không bị giảm chất lượng và không bị thay đ ổ i th à nh phần. Bảo qu ả n mẫu ở nhiệt độ dưới âm 18 o C , nếu c ầ n. Phân tích mẫu càng sớm càng tốt, ch ỉ trong vòng 24 h sau khi đồng hóa. 9. Cách tiến hành CHÚ THÍCH Nếu phải kiểm tra về giới h ạ n lặp lại (xem 11.2) , th ì tiến h à nh hai l ầ n xác định đ ơ n lẻ t heo 9 . 1 đến 9 . 6 9.1. Yêu c ầ u chung Phân tích dung dịch th ử (hoặc d ã y các dung dịch thử) đồng th ờ i với phân tích mẫu trắng đã bổ sung hàm lượng cloramphenicol 10 /kg và một mẫu trắng. 9.2. Phần mẫu thử C â n 10 g ( m ) mẫu th ử đã chuẩn bị (xem Điều 8), chính xác đến 0 , 1 g cho vào bình nón 100 ml. 9.3. Chuẩn bị dịch chiết Thêm 40,0 ml n ước và trộn kỹ trong 3 min bằng máy trộn phòng th ử nghiệm (6.4). Thể tích ( V 1 ) của pha nước thu được là 40,0 ml cộng với thể t í ch nước trong phần mẫu thử (thư ờ ng khoảng 7,5 ml nước trong 10 g mẫu). Lọc mẫu qua giấy I ọ c (6.5). 9.4. Chiết pha rắn Chuyển 20,0 ml ( V 2 ) dịch lọc vào ố ng chiết (6.6). Sau (15 ± 0,2) min , rử a giải cloramphenicol bằng 70 ml diclom e tan (5.3). Cho bay hơi pha hữu cơ dưới dòng kh í nitơ (5.2) nhẹ trong n ồ i cách thu ỷ (6.7) hoặc d ùng máy c ô quay chân không (6.7) đến thể tích còn khoảng 1 ml. Dùng khoảng 10 ml diclometan (5.3) chuyển phần còn lại sang ống ly t â m (6.8). Làm bay hơi c ẩ n thận cho đến khô hoàn toàn. 9.5. Chiết pha l ỏ ng-lỏng Cho 400 µl ( V 3 ) nước và 2,0 ml toluen (5.4) vào cặn và trộn nhẹ trong 1 min b ằ ng máy trộn Vortex (6.9) ở tốc độ quay khoảng 700 min -1 Ly t â m 5 min ở gia tốc quay 1000 g trong máy ly tâm (6.10). Dùng pipet loại bỏ pha hữu cơ càng triệt để càng tốt. Th ê m 1,5 ml toluen và trộn nhẹ trong 1 min ở tốc độ quay khoảng 700 min -1 trên máy trộn Vortex (6.9). Ly tâm 5 min ở gia tốc quay 1 000 g trong máy ly tâm (6.10). Dùng pipet loại b ỏ pha hữu cơ c àn g triệt để c à ng tốt. Dùng micropipet (6.11) chuyển 300 pha nước vào vật chứa thích hợp. 9.6. Phân tích sắc ký 9.6.1 Điều kiện sắc ký Thông s ố Cài đặt Bước sóng 285 nm D ả i detector độ hấp thụ 0,005 đến 0,01 trên to à n bộ thang ghi Dải ghi 10 m V Tốc độ chạy của giấy 1 , 0 cm/min Tốc độ d ò ng của pha động (5.7) 0,6 ml/min Thể tích bơm 100 CHÚ THÍCH Th ể tích bơm v à t ố c độ d òng phụ thuộc v à o kích thước cột . 9.6.2. Quy tr ì nh đo sắc k ý Ch ờ cho đến khi hệ thống sắc ký lỏng (6.12) đã ổn định. Bơm một m ẫ u trắng, một mẫu trắng đã bổ sung cloramphenicol, bốn d ung dịch chu ẩ n cloramphenicol (5.9), dung dịch thử thu được trong 9.5 và bơm l ạ i dung dịch chuẩn cloramphenicol (5 . 9). Kiểm tra tín hiệu cloramphenicol trong sắc ký mẫu tại th ờ i gian lưu cloramphenicol. 9.6.3. Phương pháp đo Đo chiều cao pic cloramphenicol ho ặ c diện tích pic của dung dịch th ử và các dung dịch chu ẩ n cloramphenicol. Các kết quả thu được đối với các d ung dịch chu ẩ n cloramphe nic ol phải tuyến tính với các hàm lượng cloramphenicol c ủ a c á c dung d ịch n à y. CHÚ THÍCH Việc kh ẳ ng định có th ể tiến hành bằng de t ector DAD ( diode orray detector) đối với hàm lượng cloramphenicol vượt quá 10 /kg 10. Tính toán T í nh hàm lượng cloramphenicol của mẫu th ử theo công thức: W = trong đó w là h à m lượng cloramphenicol của mẫu thử , t í nh bằng microgam trên kilogam ( /kg); h là chiều cao pic hoặc diện t í ch pic t ì m được trong dung dịch thử , t í nh b ằ ng đơn vị đ 6 ộ dài hoặc đơn vị diện t í ch; h s là chiều cao pic hoặc diện tích pic tìm thấy được trong một dung dịch chuẩn (5.9), t í nh b ằ ng đơn vị độ dài hoặc đơn vị diện t í ch; p l à hàm lượng cloramphenicol của dung d ịch chuẩn, t í nh b ằ ng microgam tr ê n mililit ( /ml), m là khối lượng của ph ầ n mẫu th ử (9.2), t í nh b ằ ng gam (g); V 1 là thể tích của pha nước thu được sau khi trộn trong 9.3 ( V 1 = 40 ml + thể tích nước trong dung dịch thử), tính b ằ ng mililit (ml); V 2 là thể tích của dịch lọc đ ã chuyển vào ống chiết trong 9.4 ( V 2 = 20 ml), tinh b ằ ng mililit (ml); V 3 l à thể tíc h của nước th ê m vào cặn trong 9.5 ( V 3 = 400 ) , tính bằng mililit (ml). Kết qu ả được làm tròn đ ế n 0,1 /kg. Kết qu ả về độ thu hồi không được hiệu ch ỉ nh. Độ thu h ồ i phải được nêu trong báo c á o thử nghiệm (Điều 12). 11. Độ chụm 11.1. Phép thử liên ph ò ng thử nghiệm Độ chụm của phương pháp được thiết lập bởi phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành theo ISO 5725 [ 2] 3) Các kết qu ả của phép thử liên phòng th ử nghiệm này đ ã được c ô ng bố (xem tài liệu tham khảo [5]). Các gi á trị nhận được từ phép thử liên ph ò ng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và ch ấ t nền đã nêu. Các kết quả của một phép thử liên phòng thử nghiệm khác, tiến hành theo ISO 5725 , cho th ấ y độ thu h ồ i đối với thịt, sản phẩm thịt và gia cầm có thể lặp lại và xấp xỉ 55 %. 11.2. Độ lặp lại Ch ê nh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, ri ê ng rẽ thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một loại v ậ t liệu th ử , trong cùng phòng th ử nghiệm, do cùng một ngư ờ i thao tác, sử dụng cùng một loại thiết b ị , trong cùng một khoảng th ờ i gian ngắn, không quá 5 % trường hợp lớn hơn 2,1 / kg đối với hàm lượng cloramphenicol 10 / kg. 11.3. Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử đơn lẻ, thu được khi sử d ụng cùng một phương pháp, trên cùng một loại vật liệu thử , trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những ng ườ i thao tác khác nhau thực hiện và sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % c á c trường hợp lớn hơn 4 , 9 / kg đối với hàm lượng cloramphenicol 10 / kg . 12. Báo cáo thử nghiệm B áo cáo th ử nghiệm phải ghi rõ: - mọi thông tin c ầ n thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu đ ã sử dụng, nếu biết; - phương pháp thử đ ã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này , cùng với các chi tiết b ấ t th ườ ng nào khác có th ể ảnh hưởng t ớ i kết quả thử nghiệm; - kết qu ả th ử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu hai kết qu ả thử nghiệm thu được; - độ thu hồi. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] ISO 3100-1 : 1991, Thịt và sản ph ẩ m thịt –L ấ y mẫu và chu ẩ n bị mẫu th ử - Phần 1: Lấy mẫu [2] ISO 5725 : 1986, precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for standard test method by inter-laboratory test. [3] TCVN 6910-1 : 2001 (ISO 5725-1 : 1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo v à kết quả đo - Phần 1: Nguyên t ắ c và định nghĩa chung. [4] TCVN 6910-2 : 1994 ISO 5725-2 :1994 ). Độ chính xác (độ đ ú ng và độ chụm) của phương pháp đo và kết qu ả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác đ ị nh độ lặp lại và độ t á i lập của phương pháp đo tiêu chuẩn. [5] Aerts M.L. , Keukens H.J. , Werdmuller G.A. Liquid Chromatographic Determination of Chloramphenicol Residues in Meat: Interlaboratory S tudy, J.AOAC , 72, (4), 1989. pp. 570-576. 1) Đây là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin đưa ra để thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. 2) ISO 3100-1 : 1991 (đã được biên soạn thành TCVN 4833-1 : 2002). Hiện nay, ISO 3100-1 : 1991 đã bị hủy và được thay thế bằng ISO 17604 : 2003 (được biên soạn thành TCVN 7925:2008 Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp lấy mẫu thân thịt tươi để phân tích vi sinh vật) 3) ISO 5725:1986 (hiện nay đã huỷ) được dùng để thu các kết quả về độ chụm