TCVN9658:2013

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9658:2013 (ISO 3356:2009) về Sữa - Xác định phosphatase kiềm TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9658:2013 ISO 3356:2009 SỮA - XÁC ĐỊNH PHOSPHATASE KIỀM Milk - Determination of alkaline phosphatase Lời nói đầu TCVN 9658:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 3356:2009; TCVN 9658:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. SỮA - XÁC ĐỊNH PHOSPHATASE KIỀM Milk - Determination of alkaline phosphatase CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có sử dụng các vật liệu, thuốc thử và các thao tác nguy hiểm. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải thành thục với các thao tác phòng thử nghiệm thông thường. Tiêu chuẩn này không đề cập đến các vấn đề an toàn khi sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hoạt độ phosphatase kiềm trong sữa. Phương pháp này áp dụng cho hoạt độ phosphatase kiềm không nhỏ hơn 1 μg phenol trên mililit. Phương pháp này cũng có thể thích hợp để xác định hoạt độ phosphatase kiềm trong sữa bột, buttermilk và buttermilk bột, whey và whey bột. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này áp dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 2.1. Hoạt động phosphatase kiềm (alkaline phosphatase activity) Hoạt độ APL (APL) CHÚ THÍCH Hoạt độ phosphatase kiềm được biểu thị bằng lượng phenol tính bằng microgam được giải phóng ra từ 1 ml mẫu thử hoặc mẫu hoàn nguyên trong các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn này. Trong các tiêu chuẩn khác [ví dụ: TCVN 6506-1 (ISO 11816-1) [6] , TCVN 7851 (ISO 22160) [7] biểu thị hoạt độ phosphatase kiềm bằng mili đơn vị hoạt độ trên lít. Tài liệu có đưa thông tin về sự tương đương của các đơn vị khác nhau của các đơn vị khác nhau được sử dụng để biểu thị hoạt độ phosphatase kiềm. 3. Nguyên tắc Mẫu được pha loãng bằng dung dịch đệm pH 10,6 và được ủ ở 37 o C trong 1h. Trong các điều kiện phân tích, mọi phosphatase kiềm có mặt trong mẫu giải phóng phenol ra khỏi dinatri phenylphosphat được bổ sung vào. Phenol được giải phóng phản ứng với quinoneimid (dibromoquinonechloroimid) tạo thành dibromoindophenol (màu xanh) được đo quang phổ ở bước sóng 610 nm. 4. Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước phải là nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 4.1. Dung dịch đệm bari borat-hydroxit Hòa tan 25,0 g bari hydroxit [Ba(OH) 2 .8H 2 O] không chứa cacbonat trong nước đựng trong bình định mức một vạch 500 ml (5.8). Thêm nước đến vạch và trộn. Hòa tan 11,0 g axit boric (H 3 BO 3 ) trong nước đựng trong một bình định mức một vạch 500 ml (5.8) khác. Thêm nước đến vạch và trộn. Làm ấm cả hai dung dịch này đến 50 o C. Trộn lẫn hai dung dịch và khuấy trộn. Làm nguội nhanh dung dịch thu được đến khoảng 20 o C. Chỉnh pH của dung dịch đến 10,6 ± 0,1 bằng một lượng dung dịch bari hydroxit bổ sung, nếu cần. Lọc dung dịch qua giấy lọc (5.10). Bảo quản dung dịch đệm bari borat-hydroxit đã lọc trong chai đậy kín. Pha loãng dung dịch đệm với một lượng nước tương đương, trước khi sử dụng. 4.2. Dung dịch đệm hiện màu 4.2.1. Dung dịch đệm màu I Hòa tan 6,0 g natri metaborat (NaBO 2 ) hoặc 12,6 g NaBO 2 .4H 2 O và 20,0 g natri clorua (NaCl) trong nước đựng trong bình định mức một vạch 1000 ml (5.8). Thêm nước đến vạch và trộn. 4.2.2. Dung dịch đệm màu II Chuyển 10 ml dung dịch đệm màu I (4.2.1) vào bình định mức một vạch 100 ml (5.8). Thêm nước đến vạch và trộn. 4.3. Dung dịch đệm cơ chất 4.3.1. Dinatri phenylphosphat ngậm hai phân tử nước (Na 2 C 6 H 5 PO 4 .2H 2 O), chứa không qua 0,01 % khối lượng phenol. 4.3.2. Hòa tan 0,1 g dinatri phnylphosphat ngậm hai phân tử nước (4.3.1) trong 100 ml dung dịch đệm bari borat-hydroxit đã pha loãng (4.1). 4.4. Dung dịch làm kết tủa kẽm-đồng Hòa tan 3,0 g kẽm sulfat (ZnSO 4 .7H 2 O) va 0,6 g đồng sulfat (CuSO 4 .5H 2 O) trong nước đựng trong bình định mức một vạch 100 ml (5.8). Thêm nước đến vạch và trộn. 4.5. Dung dịch 2,6 - dibromoquinonechloroimid (BQC) (thuốc thử Gibb) Hòa tan 40 mg ± 1 mg BQC (C 6 H 2 Br 2 CINO) trong 10 ml etanol 96 % thể tích. Bảo quản dung dịch này trong chai thủy tinh tối màu ở 4 o C ± 2 o C. Loại bỏ dung dịch khi bị mất màu hoặc để lâu quá 1 tháng. 4.6. Dung dịch đồng sulfat Hòa tan 0,05 g đồng sulfat (CuSO 4 .5 H 2 O) trong nước đựng trong bình định mức một vạch 100 ml (5.8). Thêm nước đến vạch 100 ml và trộn. 4.7. Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,5 mol/l. 4.8. Dung dịch chuẩn phenol 4.8.1. Dung dịch chuẩn gốc phenol Chuyển khoảng 200 mg ± 2 mg phenol khan có độ tinh khiết lớn hơn 99,5 % khối lượng vào bình định mức một vạch 100 ml (5.8). Hòa tan phenol trong nước. Thêm nước đến vạch và trộn. Dung dịch chuẩn gốc phenol khi được bảo quản ở 4 o C ± 2 o C có thể bền được 6 tuần. 4.8.2. Dung dịch chuẩn làm việc phenol Dùng pipet lấy 10 ml dung dịch chuẩn gốc phenol (4.8.1) cho vào bình định mức một vạch 100 ml (5.8). Thêm nước đến vạch và trộn (1 ml chứa 200 μg phenol). Sử dụng dung dịch chuẩn đã pha loãng để chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc phenol thích hợp, có chứa tương ứng 2 μg, 5 μg, 10 μg và 20 μg phenol trên mililit. 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau: 5.1. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 1 mg, có thể đọc được đến 0,1 mg. 5.2. Máy đo quang, thích hợp để đo ở bước sóng 610 nm. 5.3. Nồi cách thủy, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 37 o C ± 1 o C, có kiểm soát nhiệt độ ổn định. 5.4. Nồi cách thủy đun sôi. 5.5. Máy trộn Vortex. 5.6. Pipet, dung tích 0,1 ml, 1 ml, 5 ml và 10 ml, loại A trong TCVN 7151 (ISO 648) [1] . 5.7. Ống nghiệm thủy tinh, có các dung tích thích hợp, được nút bằng nút có lớp lót không chứa phenol. 5.8. Bình định mức một vạch, dung tích 100 ml, 500 ml và 1000 ml, loại A trong TCVN 7153 (ISO 1042). 5.9. Phễu thủy tinh đường kính khoảng 60 mm và khoảng 100 mm. 5.10. Giấy lọc, loại nhanh, đường kính khoảng 110 nm và khoảng 185 mm. 6. Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707). Bảo quản mẫu thử sao cho không bị suy giảm chất lượng và thay đổi thành phần. 7. Chuẩn bị mẫu thử 7.1. Chuẩn bị Trộn cẩn thận mẫu thử trước khi sử dụng. Thông thường, không cần thiết phải làm ấm sơ bộ mẫu thử để trộn. Tuy nhiên, nếu cần làm ấm sơ bộ thì không được quá 35 o C. 7.2. Sữa bột, bột buttermilk và whey bột Hòa tan 10 g mẫu thử trong 90 ml nước, làm ấm, nếu cần. Tuy nhiên, nhiệt độ làm ấm để hòa tan hết mẫu thử không được vượt quá 35 o C. 7.3. Trung hòa các mẫu thử có tính axit Nếu mẫu thử có tính axit (pH < 7,0) thì chỉnh về pH trung tính bằng dung dịch natri hydroxit (4.7). 8. Cách tiến hành 8.1. Chuẩn bị đường chuẩn 8.1.1. Chuẩn bị một dãy các dung dịch chuẩn thích hợp trong năm ống nghiệm bằng thủy tinh (5.7), bằng cách dùng pipet lấy 1 ml nước cho vào một ống nghiệm để làm ống kiểm chứng hoặc mẫu trắng và cho vào bốn ống nghiệm còn lại mỗi ống 1 ml dung dịch chuẩn làm việc phenol (4.8.2). Các ống nghiệm chuẩn có chứa tương ứng: 0 μg (mẫu kiểm chứng hoặc mẫu trắng) 2 μg, 5 μg, 10 μg và 20 μg phenol. 8.1.2. Thêm vào mỗi ống nghiệm (8.1.1) 1 ml dung dịch đồng sulfat (4.6), 5 ml dung dịch đệm màu II (4.2.2), 3 ml nước và 0,1 ml dung dịch BQC (4.5) và trộn. Để yên cho hiện màu ở nhiệt độ phòng trong 30 min. 8.1.3. Đo mật độ quang của các dung dịch chuẩn dựa vào dung dịch kiểm chứng hoặc dung dịch mẫu trắng ở bước sóng 610 nm. 8.1.4. Dựng đồ thị của mật độ quang với các lượng phenol tính bằng microgam (8.1.1). Tính phương trình của đường chuẩn. 8.2. Xác định 8.2.1. Trong quá trình xác định tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời. Cần tránh các vết nước bọt hoặc mồ hôi vì có thể cho các kết quả dương tính giả. 8.2.2. Dùng pipet cho vào cả hai ống nghiệm (5.7) mỗi ống 1 ml mẫu thử hoặc mẫu thử đã hoàn nguyên. Sử dụng một ống nghiệm để kiểm chứng hoặc để làm mẫu trắng. 8.2.3. Đậy nút ống nghiệm mẫu trắng. Đặt ống vào cốc có mỏ trong nồi cách thủy đun sôi. Đậy cốc có mỏ bằng lá nhôm. Làm nóng ống nghiệm trong nồi cách thủy đun sôi trong 2 min. Sau đó làm nguội ống nghiệm đến nhiệt độ phòng trong nước lạnh. Từ thời điểm này trở đi, xử lý ống nghiệm đựng mẫu trắng cũng như ống nghiệm đựng mẫu thử theo cách như nhau. 8.2.4. Cho 10 ml dung dịch đệm cơ chất (4.3) vào cả ống nghiệm đựng mẫu thử (8.2.2) và ống đựng mẫu trắng (8.2.2) và trộn. 8.2.5. Làm nóng ngay cả hai ống nghiệm trên nồi cách thủy (5.3) ở 37 o C trong 60 min, thỉnh thoảng khuấy trộn lượng chứa bên trong. 8.2.6. Đặt cả hai ống nghiệm này vào cốc có mỏ trong nồi cách thủy đun sôi. Đậy cốc có mỏ bằng lá nhôm. Làm nóng cả hai ống trong nồi cách thủy đun sôi 2 min và làm nguội trong nước lạnh đến nhiệt độ phòng. 8.2.7. Thêm 1 ml dung dịch làm kết tủa kẽm - đồng (4.4) vào mỗi ống nghiệm và trộn kỹ. 8.2.8. Lọc lượng chứa trong mỗi ống qua giấy lọc (5.10), loại bỏ vài mililit đầu tiên. Dùng pipet lấy 5 ml của từng dịch lọc cho vào ống nghiệm thủy tinh khác (5.7). 8.2.9. Cho vào mỗi ống nghiệm (8.2.8) 5 ml dung dịch đệm màu I (4.2.1) và trộn. 8.2.10. Cho 0,1 ml dung dịch BQC (4.5) vào mỗi ống nghiệm và trộn. Để cho cả hai dung dịch hiện màu ở nhiệt độ phòng trong 30 min. 8.2.11. Đo mật độ quang của dung dịch mẫu thử dựa vào dung dịch mẫu trắng ở bước sóng 610 nm. 8.2.12. Nếu mật độ quang của mẫu thử đo được trong 8.2.11 vượt quá mật độ quang của dung dịch chuẩn làm việc phenol chứa 20 μg phenol trên mililit đo được trong 8.1.3 thì lặp lại phép xác định bằng một dung dịch pha loãng thích hợp của mẫu thử hoặc mẫu thử hoàn nguyên như sau: Trộn 1 thể tích mẫu thử hoặc mẫu thử hoàn nguyên với một thể tích thích hợp của cùng mẫu thử hoặc mẫu thử hoàn nguyên đã được đun cẩn thận đến sôi để làm bất hoạt phosphatase. Sau đó tiếp tục theo 8.2.2. 9. Tính và biểu thị kết quả 9.1. Tính kết quả 9.1.1. Chuyển mật độ quang xác định được trong 8.2.11 sang microgam phenol bằng cách đối chiếu với đường chuẩn (8.1.4). 9.1.2. Tính hoạt độ phosphatase, a p , bằng microgam phenol trên mililit sữa, theo công thức sau: a p = 2,4 x m x f d Trong đó m là khối lượng của phenol thu được trong 9.1.1, tính bằng microgam (μg); f d là hệ số pha loãng của mẫu thử hoặc mẫu thử hoàn nguyên (8.2.12), nếu cần (không pha loãng thì f d = 1); 9.2. Biểu thị kết quả Biểu thị kết quả đến một chữ số thập phân. 10. Độ chụm 10.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm Các giá trị giới hạn lặp lại và tái lập thu được từ các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành phù hợp với TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) [4] và TCVN6910-2 (ISO 5725-2) [5] . Các giá trị này được biểu thị ở mức xác suất 95 % và có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và các chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu. 10.2. Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người phân tích, sử dụng cùng thiết bị, trong khoảng thời gian ngắn, không được quá 5% các trường hợp lớn hơn 1,5 μg/ml. 10.3. Độ tái lặp Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ, thu được khi áp dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các kỹ thuật viên khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn 3,9 μg/ml. 11. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả. e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được. PHỤ LỤC A (Tham khảo) KẾT QUẢ CỦA PHÉP THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM Một phép thử liên phòng thử nghiệm bao gồm chín phòng thử nghiệm từ bảy quốc gia khác nhau tham gia thực hiện trên sáu mẫu sữa bò nguyên chất đã bổ sung các mức khác nhau của sữa bò tươi nguyên liệu, tổ chức vào tháng 5 năm 2005. Các kết quả thu được đã được phân tích thống kê phù hợp với TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) [4] và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) [5] để cho dữ liệu về độ chụm nêu trong Bảng A.1. Cơ quan An toàn và An ninh Thực phẩm của Pháp đã tổ chức phép thử liên phòng này. Bảng A.1 - Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm về phosphatase kiềm Thông số Mẫu Trung bình a 1 2 3 4 5 6 Giá trị được quy về b , μg/ml 2,3 4,2 6,5 9,9 11,9 35,7 Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 8 8 8 8 8 8 Giới hạn lặp lại, r (=2,8 x s r ), μg/ml 0,82 0,47 1,36 0,91 0,98 3,73 1,5 Độ lệch chuẩn lặp lại s r­ , μg/ml 0,29 0,17 0,48 0,32 0,35 1,32 0,5 Hệ số biến thiên lặp lại, CV(r), % 12,78 3,94 7,47 3,24 2,92 3,69 4,3 Giới hạn tái lập, R (=2,8 x s R ), μg/ml 1,59 1,51 2,52 2,62 3,22 9,70 3,9 Độ lệch chuẩn tái lập s R , μg/ml 0,56 0,54 0,89 0,93 1,14 3,43 1,4 Hệ số biến thiên tái lập, CV(R), % 24,83 12,70 13,80 9,36 9,54 9,59 11,0 a Giới hạn lặp lại và tái lập và các độ lệch chuẩn tính được không bao gồm các kết quả thu được ở giá trị quy về 2,3 μg/ml b Trung bình của tất cả các phòng thử nghiệm sau khi trừ ngoại lệ. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 7151 (ISO 648), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Pipet một mức. [2] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu. [3] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức. [4] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1 : Nguyên tắc và định nghĩa chung. [5] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn. [6] TCVN 6506 (ISO 11816-1), Sữa và sản phẩm sữa - Xác định hoạt độ phosphataza kiềm - Phần 1: Phương pháp đo huỳnh quang đối với sữa và đồ uống từ sữa. [7] TCVN 7851 (ISO 22160), Sữa và đồ uống từ sữa - Xác định hoạt độ phosphataza kiềm - Phương pháp dùng hệ thống quang hoạt bằng enzym (EPAS).