TCVN5149:1990

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5149:1990 về thịt và sản phẩm thịt - phương pháp xác định dư lượng aureomycin do Ủy ban Khoa học Nhà nước ban hành TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5149:1990 THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH AUREOMYCIN Meat and meat products Determination or aureomycin residues Cơ quan biên soạn: Trung tâm kiểm dịch động vật xuất nhập khẩu Hà Nội Cơ quan đề nghị ban hành: Bộ Nông nghiệp và Công nghiệp thực phẩm Cơ quan trình duyệt: Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Cơ quan xét duyệt và ban hành: Ủy ban Khoa học Nhà nước Quyết định ban hành số 736/QĐ ngày 31 tháng 12 năm 1990 Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định kháng sinh aureomycin (tên hóa học là clotetracylin) tồn dư trong thịt và sản phẩm của thịt, dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc. 1. ĐẶC TÍNH CHUNG Họ tetracylin là một nhóm kháng sinh gồm các dẫn xuất như: tetracylin, clotetracylin, oxytetracylin… là những kháng sinh tương đối mạnh và bền. Đối với người và động vật, nó nhiễm vào dưới tác dụng của thuốc chữa bệnh như uống hoặc tiêm và tồn tại trong máu, tế bào hay dịch của cơ thể động vật. Hàm lượng của chúng lớn hay nhỏ là tùy thuộc quá trình sử dụng thuốc đó nhiều hay ít, thời gian sử dụng lâu hay mau và khả năng tự loại của cơ thể. Vì vậy, người ta thường kiểm tra hàm lượng của chúng trong máu, serum hay trong nước tiểu sau thời gian sử dụng thuốc. 2. NGUYÊN TẮC Dùng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (viết tắt là HPLC) để xác định riêng aureomycin. Trước hết, chất cần phân tích phải được chiết ra khỏi dung dịch mẫu bằng hệ dung dịch đệm phù hợp, sau đó bơm dung dịch này vào cột sắc ký HPLC có chứa chất nhồi (pha tĩnh) là nhựa RP - 18, khi đó aureomycin bị hấp thụ lên pha tĩnh này. Muốn xác định chất cần phân tích, người ta rửa giải nó ra khỏi cột sắc ký bằng một hệ dung môi phù hợp (pha động). Aureomycin bị pha động tách ra khỏi cột sắc ký ra ngoài và được phát hiện bằng đêtếcto UV-VIS ở sóng 355 nm. Nồng độ chất phân tích được xác định bằng phương pháp đường chuẩn. Bằng cách này có thể tách và xác định đồng thời 3 kháng sinh họ tetracylin nói ở mục 1. 3. LẤY MẪU Theo TCVN 4833 - 89 (ST SEV 2433-80) 4. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 4.1. Dụng cụ, thiết bị: + Hệ thống HPLC với đêtếcto UV - VIS hay loại tương đương. + Máy li tâm + Bình định mức các loại + Pipét các loại + Cốc chịu nhiệt + Cột sắc ký loại 150 x 4,6 mm hay 150 x 2 mm + Một vài dụng cụ khác. 4.2. Hóa chất; dùng loại tinh khiết cho HPLC + Chất nhồi cột: nhựa RP - 18 cỡ 5 MmØ + Natriclorua (NaCl), dung dịch 0,01 M; natripeclorat, dung dịch 0,1 M; natridihydrophotphat (NaH 2 PO 4 ), dung dịch 0,02M. + Axít photphoric (H 3 PO 4 ), dung dịch 85% và 0,1 M + Dung dịch N, N-Dimethyformamid 40% trong nước + Hệ đệm xitrat - phốtphat pH ~ 8 và 6,4 + Dung dịch gốc tiêu chuẩn của aureomycin nồng độ 1mg/ml. + Nước cất 2 lần. 5. CHUẨN BỊ THỬ 5.1. Chuẩn bị mẫu phân tích: Mẫu thịt cần phân tích được thái nhỏ, nghiền mịn, trộn đều và cân 1 lượng 10 g, thêm 5 ml MeOH và 5 ml hệ đệm xitrát - phốt phát, lắc kỹ trong 15 phút. Chuyển hỗn dịch này sang bình định mức và định mức bằng nước cất đến thể tích V = 25ml, sau đó ly tâm lắng cặn, lấy phần dung dịch nước trong. Dung dịch này sẽ được bơm trực tiếp vào cột sắc ký để phân tích aureomycin. 5.2. Pha dãy chuẩn: Dùng dung dịch gốc tiêu chuẩn của aureomycin có nồng độ 1 mg/ml tính lấy lượng phù hợp để pha và định mức bằng nước cất trong bình định mức có thể tích 25 ml, sao cho nồng độ aureomycin trong các bình là 2 - 4 - 6 - 8 - 10 - 12 g/ml. 5.3. Mẫu trắng: Đồng thời với việc chuẩn bị mẫu phân tích phải chuẩn bị thêm mẫu trắng để so sánh và bổ chính nền. Mẫu trắng được chuẩn bị như mẫu phân tích nhưng không có mẫu phân tích. 5.4. Các điều kiện thực nghiệm: + Hệ thống HPLC với đêtêcto UV - VIS sóng đo 355 nm + Cột tách HPLC: 150 x 4,6 mm nhồi nhựa RP - 18 cỡ 5 MmØ + Máy gui píc (Recorder) có thể ghi 5 - 10 mV và tốc độ giấy là 2 mm/phút. + Pha động: dung dịch N, N-Dimethylformamid có chứa natriclorua 0,01M; natripeclorát 0,1M; natridihydrophotphat 0,02M. Chỉnh pH =3,3 bằng axit - phôtphoric 0,1M. + Tốc độ pha động: 1 ml/phút + Lượng mẫu bơm vào cột là 50 Ml/mỗi lần thí nghiệm + Nhiệt độ sắc ký: 22 - 25 0 C. + Các điều kiện khác chọn phù hợp với hệ HPLC 6. TIẾN HÀNH THỬ + Đặt các thông số đã chọn ở mục 5.4 cho máy + Cho máy chạy, bơm pha động để ổn định cột tách và đường nền. Khi đường nền thẳng là được. + Bơm lần lượt các mẫu chuẩn, mẫu trắng, rồi đến mẫu phân tích vào cột tách (mỗi mẫu bơm 3 lần lấy giá trị trung bình) và ghi píc sắc ký của chúng. + Hiệu chỉnh giá trị của mẫu trắng (nếu có). + Dựng đường chuẩn theo hệ tọa độ H - C. Trong đó H là chiều cao của píc sắc ký tương ứng với các nồng độ C của mẫu chuẩn. + Xác định nồng độ Cx theo đường chuẩn trên. 7. TÍNH KẾT QUẢ Hàm lượng aureomycin trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau đây: Co = (Cx . V)/a Tính bằng Mg/g Trong đó: a là lượng mẫu cân để phân tích và định mức trong thể tích V ml. Theo mục 5.1 thì a = 10g và V = 25 ml. Cx là nồng độ aureomycin tìm được qua đường chuẩn của dung dịch phân tích.