TCVN6686–2:2000

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6686–2:2000 (ISO 13366 – 2 : 1997) về sữa – định lượng tế bào xôma - phần 2: phương pháp đếm hạt điện tử do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6686–2 : 2000 SỮA – ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO XÔMA - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP ĐẾM HẠT ĐIỆN TỬ Milk – Enumeration of somatic cells - Part 2: Electronic particle counter method LỜI NÓI ĐẦU TCVN 6686-2 : 2000 hoàn toàn tương đương với ISO 13366 – 2 : 1997 TCVN 6686–2 : 2000 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn – Đo lường – Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường ban hành. Cảnh báo – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các chất liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đề cập đến các vấn đề an toàn khi sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đếm tế bào xôma trong sữa nguyên liệu và sữa bảo quản bằng hóa chất, sử dụng máy đếm hạt điện tử. [1] ) Chú thích – Người sử dụng tiêu chuẩn này nên biết rằng tùy theo nguyên tắc đếm (đếm hạt), mà các kết quả thu được trong tiêu chuẩn này không phải lúc nào cũng có thể so sánh được với các kết quả thu được trong các tiêu chuẩn TCVN 6686-1:2000 (ISO 13366-1) và TCVN 6686-3 : 2000 (ISO 13366-3). 2. Định nghĩa Trong tiêu chuẩn này áp dụng định nghĩa sau đây: 2.1. Tế bào xôma: Tế bào đếm được bằng máy đếm hạt điện tử, sau khi được nhuộm màu ở ngưỡng nhỏ hơn và loại bỏ các hạt chất béo phủ lên dãy tế bào xôma. 3. Nguyên tắc Cho dung dịch focmaldehyt (fomalin) vào mẫu thử để nhuộm màu các tế bào xôma. Pha loãng hỗn hợp chất điện phân tạo nhũ hóa và làm nóng tiếp để phá vỡ các hạt chất béo phủ lên tế bào xôma. Đọc trực tiếp số lượng tế bào xôma hàng nghìn đơn vị trên mililit. Chú thích – Trong máy đếm hạt điện tử, sữa lọt qua khe hở giữa các điện cực. Khi một hạt đi qua khe hở, nó đổi chỗ chất lỏng có tính dẫn điện cao cho chất lỏng có tính dẫn điện thấp hơn. Điện trở tăng sẽ tăng điện áp, tạo xung điện áp tỷ lệ thuận với thể tích của hạt. Số lượng xung cho biết số lượng hạt đi qua. Chỉ được đếm các xung ở trên mức độ hãm ban đầu. 4. Thuốc thử Cảnh báo – Focmaldehyt là chất độc. Việc chuẩn bị và sử dụng hỗn hợp chất điện phân nhũ hóa phải được thực hiện trong tủ hốt. Chỉ sử dụng thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước đã loại ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. 4.1. Hỗn hợp điện phân nhũ tương 4.1.1. Thành phần Etanol 95% (V/V) 125,0 ml Poly(etylen glycol) mono-p-(1,1,3,3-tetrametylbutyl) phenyl ete *) 20,0 ml Dung dịch muối natri clorua 0,9 g/100 ml 885,0 ml *) Thí dụ, Triton X-100 đậm đặc 4.1.2. Chuẩn bị Trộn kỹ poly (etylen glycol) và etanol. Cho thêm dung dịch natri clorua. Lọc hỗn hợp qua bộ lọc thích hợp (5.6). Hàng ngày phải kiểm tra để xác định lượng hạt lạ có trong hỗn hợp điện phân nhũ tương. Hỗn hợp này và dụng cụ bằng chất dẻo và thủy tinh được coi là sạch nếu số lượng hạt nhỏ hơn 20 trong 0,1 mililit hỗn hợp điện phân nhũ tương. Để ngăn ngừa vi khuẩn phát triển, có thể cho 10 ml dung dịch focmaldehyt 35% (m/m) vào hỗn hợp điện phân nhũ tương (4.1). Chú thích – Có thể sử dụng dung dịch điện phân nhũ tương có bán sẵn, thí dụ, dung môi Xômaton [2] ) . 4.2. Dung dịch nhuộm màu 4.2.1. Thành phần Eoxin 0,02 g Dung dịch focmaldehyt, 35% (m/m) 1) 9,40 ml 1) Nồng độ focmaldehyt của focmalin thương mại dao động từ 35% (m/m) đến 40% (m/m). Điều này cần được tính đến khi chuẩn bị dung dịch nhuộm màu. 4.2.2 Chuẩn bị Chuyển eoxin và dung dịch focmaldehyt vào bình định mức dung tích 100 ml và trộn. Pha loãng bằng nước đến vạch mức 100 ml và trộn lại. Lọc hoặc ly tâm chất lỏng để loại bỏ các hạt. Chú thích – Eoxin có trong dung dịch nhuộm màu để cố định màu mẫu thử. 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị của phòng thí nghiệm thông thường và đặc biệt như sau: Tất cả các dụng cụ thủy tinh trước khi sử dụng phải rửa sạch các chất hạt. 5.1. Máy đếm hạt, máy đếm hạt điện tử có ống mao dẫn đường kính 10 m m và thể tích đếm là 0,1 ml hoặc 0,5 ml (thí dụ, máy đếm Coulter Counter F hoặc FN). Cách khác, máy đếm tự động (thí dụ, máy đếm tế bào sữa) có thể sử dụng với ống có đường kính lỗ 140 m m và thể tích đếm là 0,3 ml. Chú ý – Khi lắp đặt máy đếm cần đảm bảo là đã loại trừ hết các ảnh hưởng điện tử. Liên tục kiểm tra màn đếm và thời gian đếm. Hiệu chuẩn thiết bị trước khi xác định mối quan hệ giữa thể tích hạt cần đếm và ngưỡng đếm cao hơn. Hiệu chuẩn theo chỉ dẫn của nhà sản xuất bằng dung dịch huyền phù hạt chuẩn. Kiểm tra việc hiệu chuẩn bằng các phép đếm khác nhau trên một số mẫu có các số đếm từ 300000 tế bào/ml đến 1 000 000 tế bào/ml. Phải chứng minh được rằng đường kính mẫu của các tế bào là từ 5,45 m m đến 6,25 m m. Đánh giá giá trị giới hạn cho số ước đoán thông thường theo đường kính tương đương từ 4,7 m m đến 5,0 m m, dựa trên sự phân bố kích cỡ tìm được. Kiểm tra từng áp kế để chắc chắn rằng số tế bào đếm được trong 0,1 ml là đúng bằng 1/5 của số tế bào đếm được trong 0,5 ml (về chi tiết xem TCVN 6686-3 : 2000 (ISO 13366-3), phụ lục C). 5.2. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở bất kỳ điểm nào trong khoảng từ 20 0 C đến 37 0 C. 5.3. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 55 0 C ± 1 0 C và ở 80 0 C ± 1 0 C. 5.4. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 30 0 C ± 1 0 C. 5.5. Dụng cụ pipet, có thể chuẩn bị dung dịch pha loãng 1: 100 (không bắt buộc, xem 8.1.2). 5.6. Bộ lọc, chịu được dung môi sử dụng, có cỡ lỗ 0,5 m m hoặc nhỏ hơn. 5.7. Ống thủy tinh hoặc ống bằng chất dẻo, thí dụ: loại có chiều dài 100 mm và đường kính 16 mm, đáy tròn, cổ thẳng và được đóng kín một cách thích hợp. Khi sử dụng ống bằng chất dẻo, cần kiểm tra để chắc chắn rằng các tế bào xôma không bị thất thoát do bám vào mặt ngoài của ống. Sau khi rửa ống, phải tráng lại bằng nước cất đã lọc. 5.8. Dụng cụ pipet, có thể phân phối 0,2 ml dung dịch nhuộm màu. 5.9. Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,01 mg. 6. Lấy mẫu 6.1. Điều quan trọng là phòng thí nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 : 1998 (ISO 707). 6.2. Nếu sử dụng bộ lấy mẫu tự động thì chúng phải được kiểm tra một cách chính xác. 6.3. Trước khi thử nghiệm hoặc lưu giữ, nên bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 2 0 C đến 6 0 C. 6.4. Đối với các mẫu sữa nguyên liệu, nếu các mẫu không được thử ngay trong vòng 6h sau khi lấy mẫu thì phải bảo quản bằng cách bổ sung axit boric. Nồng độ cuối cùng của axit này có trong mẫu thử không được lớn hơn 0,6 g trong 100 ml mẫu. Bảo quản các mẫu đó ở nhiệt độ từ 6 0 C đến 15 0 C không quá 24h. 6.5. Ngay sau khi lấy mẫu xong, các mẫu nên được nhuộm bằng focmalin (xem điều 7). Nên tiến hành bằng cách sử dụng ống mẫu có chứa sẵn một lượng chính xác dung dịch nhuộm màu. Các ống này được hàn kín để tránh làm bay hơi focmalin. 7. Chuẩn bị mẫu thử Sau khi trộn đều, lấy 10ml mẫu. Dùng pipet (5.8) lấy 0,2 ml dung dịch thuốc nhuộm màu (4.2) cho vào mẫu. Trộn để nhuộm màu các tế bào xôma. Việc nhuộm màu các tế bào thông thường được thực hiện bằng cách cho focmaldehyt vào sữa với tỷ lệ khoảng 1: 1500, nghĩa là cho 0,2 ml dung dịch thuốc nhuộm vào 10 ml mẫu thử. Có thể sử dụng nồng độ focmaldehyt cao hơn (thí dụ như với tỷ lệ khoảng 1 : 500, bằng cách tăng lượng dung dịch focmaldehyt, 35% (m/m) trong dung dịch thuốc nhuộm đến 30,0 ml) nhưng đặc biệt chú ý để tránh đánh giá sai các số đếm [thí dụ, bằng cách làm nóng mẫu đến 55 0 C trong nồi cách thủy (5.3) trong 50 phút]. Giữ các mẫu thử ở 30 0 C trong tủ ấm (5.4) từ 15h đến 18h, hoặc ở nhiệt độ từ 18 0 C đến 25 0 C từ 22h đến 26h. Không bảo quản các mẫu đã nhuộm màu quá 48h ở nhiệt độ từ 6 0 C đến 15 0 C, để đảm bảo độ chính xác của phép đếm nằm trong giới hạn quy định (về chi tiết xem TCVN 6686 – 3 : 2000 (ISO 13366-3), phụ lục B). 8. Cách tiến hành 8.1. Phần mẫu thử 8.1.1. Làm ấm các mẫu thử đã nhuộm màu đã làm đông lạnh trong nồi cách thủy (5.2) đến nhiệt độ từ 20 0 C đến 37 0 C. Sau khi trộn kỹ, cho vào mỗi ống (5.7) 0,1 ml mẫu thử và pha loãng bằng hỗn hợp chất điện phân nhũ tương (4.1) để có được 10 ml. 8.1.2. Việc pha loãng này có thể thực hiện bằng tay hoặc bằng pipet (5.5). Sai số không vượt quá ±1,5%. Nên kiểm tra thường xuyên độ chính xác của việc pha loãng bằng cách cân, thực hiện ít nhất 20 lần xác định riêng rẽ, dùng mẫu thử đã đồng nhất. 8.2. Phân bố các hạt chất béo Làm nóng phần mẫu thử (8.1) khoảng 10 phút trong nồi cách thủy (5.3) đến 80 0 C. Kiểm tra nhiệt độ của nồi cách thủy bằng kiểm tra mẫu trắng, để đảm bảo rằng nhiệt độ của phần mẫu thử đã đạt và đã duy trì đúng nhiệt độ này. Chú ý cho nồi cách thủy có đủ nước để đảm bảo được mức chất lỏng trong ống nghiệm luôn thấp hơn mức nước. Lấy phần mẫu thử ra khỏi nồi cách thủy và làm nguội đến nhiệt độ từ 15 0 C đến 25 0 C. Chú thích – Màu trắng đục của phần mẫu thử sau khi xử lý nhiệt là do focmalin làm đông cứng các Mixen casein. Các Mixen này có đường kính nhỏ hơn 1 m m và không ảnh hưởng đến việc đếm. 8.3. Tiến hành xác định Đếm các tế bào có trong phần mẫu thử (8.2) trong vòng 1h khi làm nguội. Trộn kỹ phần mẫu thử ngay trước khi đếm để thu được các tế bào phân bố càng đồng đều càng tốt. Chuyển phần mẫu thử vào bình đong. Chú ý không để tạo bọt khí và các tế bào không bị bỏ sót trong ống nghiệm. Sau đó tiến hành đếm tế bào bằng máy đếm hạt điện tử (5.1). Trong suốt quá trình đếm, điện cực bên ngoài ống luôn luôn phải thấp hơn bề mặt chất lỏng. Trong khi đếm nên kiểm tra bộ phận theo dõi xung để phát hiện khả năng bị gây nhiễu. Ngoài ra, thời gian đếm của từng phần mẫu thử nên nằm trong khoảng cho phép. 9. Biểu thị kết quả Sử dụng một thể tích đo 0,1 ml và dung dịch pha loãng của 0,1 ml sữa trong 10 ml hỗn hợp điện phân nhũ tương (4.1), ghi số lượng tế bào xôma theo cách đọc trực tiếp, tính bằng đơn vị hàng nghìn trên 1 mililit sữa. Về việc thảo luận cách dùng các mẫu chuẩn đếm tế bào, xem phụ lục C của TCVN 6686-3 : 2000 (ISO 13366-3). 10. Độ chính xác Phụ lục B của TCVN 6686-3 : 2000 (ISO 13366-3) đưa ra các khuyến cáo về quy trình kiểm tra chất lượng và thử nghiệm của liên phòng thí nghiệm. 11. Báo cáo kết quả Báo cáo kết quả phải chỉ rõ: - phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; - phương pháp sử dụng; - kết quả thử nghiệm thu được, và - nếu kiểm tra độ lặp lại, thì nêu kết quả cuối cùng thu được. Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả. Báo cáo kết quả cũng bao gồm tất cả các thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử. PHỤ LỤC A (tham khảo) TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 : 1998 (ISO 707 : 1997) Sữa và sản phẩm sữa – Các phương pháp lấy mẫu. [2] TCVN 6686-1 : 2000 (ISO 13366-1) Sữa – Định lượng tế bào xôma. Phần 1: Phương pháp dùng kính hiển vi. [3] TCVN 6686-3 : 2000 (ISO 13366-3) Sữa – Định lượng tế bào xôma. Phần 3: Phương pháp huỳnh quang điện tử. [1] ) Máy đếm Coulter do Công ty trách nhiệm hữu hạn điện tử Counter cung cấp, Northwell Drive, Luton LV 33 RH, Bedfordshire, Anh quốc, đây là một thí dụ về sản phẩm bán sẵn thích hợp. Thông tin này đưa ra tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và không được Tổ chức tiêu chuẩn hóa Quốc tế xác nhận. [2] Xômaton là thí dụ của sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và không được tổ chức tiêu chuẩn hóa Quốc tế xác nhận.