TCVN12606:2018

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12606:2018 (ISO 12824:2016) về Sữa ong chúa - Các yêu cầu TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12606:2019 ISO 12824:2016 SỮA ONG CHÚA - CÁC YÊU CẦU Royal jelly - Specifications Lời nói đầu TCVN 12606:2019 hoàn toàn tương đương với ISO 12824:2016; TCVN 12606:2019 do Cục Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. SỮA ONG CHÚA - CÁC YÊU C Ầ U Royal jelly - Specifications 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này đưa ra yêu cầu về sản xuất, vệ sinh đ ố i với sữa ong chúa và quy định các phương pháp thử cảm qu a n và hóa học để kiểm nghiệm chất lượng sữa ong chúa. Tiêu chuẩn này cũng đưa ra yêu cầu về vận chuyển, bảo qu ả n, bao g ói và ghi nhãn đối với sữa ong chúa. Tiêu chuẩn này áp dụng cho quá trình sản xuất sữa ong chúa (thu gom, sơ chế và đóng gói) và liên kết thương mại. Tiêu chuẩn này đưa ra các yêu cầu đối với sữa ong chúa, không áp dụng cho các sản phẩm sữa ong chúa được trộn lẫn trong các loại thực phẩm khác. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thi áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp định lượng vi sinh vật - Phần 1: Đếm khuẩn lạc ở 30 °C bằng kỹ thuật đ ổ đ ĩ a TCVN 5518-2:2007 (ISO 21528-2:2004) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Enterobacteriaceae - Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc TCVN 10780-1:2017 (ISO 6579-1:2017) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp phát hiện, định lượng và xác định typ huyết thanh của Salmonella - Phần 1: Phương pháp phát hiện Salmonella spp. 3 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau: 3.1 Sữa ong chúa (royal jelly) Hỗn hợp chất tiết từ tuyến hầu và tuyến dưới hàm của ong thợ và không có chất bổ sung. CHÚ THÍCH: Sữa ong chúa là thức ăn của ấu trùng và ong chúa trư ở ng thành. Sữa ong chúa là thực ph ẩ m tự nhiên ở dạng nguyên liệu thô, chưa qua chế biến trừ việc lọc, không bổ sung bất kỳ chất nào khác. Màu sắc, hương vị và thành phần hóa học của sữa ong chúa được xác định bởi sự hấp thu và chuyển hóa do những con ong thợ được ăn với hai loại thức ăn sau đây trong thời gian sản xuất sữa ong chúa: - loại 1: chỉ các thức ăn tự nhiên của ong (phấn hoa, mật hoa và mật ong); - loại 2: thức ăn tự nhiên của ong và các chất dinh dưỡng khác (protein, carbohydrat, v.v...). 3.2 Axit 10-Hydroxy-2-Decenoic (10-hydroxy-2-decenoic acid) 10-HDA Axit 10-Hydroxy-2-Decenoic là thành phần chính của sữa ong chúa. 4 Các yêu cầu 4.1 Mô tả Sữa ong chúa có màu trắng sữa, vàng nhạt, sáng màu, có dạng nhão hoặc giống như thạch không có bọt khí và các chất ngoại lai. Ở nhiệt độ phòng, sữa ong chúa bị hóa lỏng. Trong quá trình bảo quản, sữa ong chúa có thể tự kết tinh thành hạt nhỏ. 4.2 M ù i và vị Sữa ong chúa có mùi hăng, không lên men, có vị hơi chua, hơi cay để lại vị ch á t trong vòm miệng và cổ họng. 4.3 Yêu cầu về các ch ỉ tiêu hóa học Sữa ong chúa cần đáp ứng các yêu cầu nêu trong Bảng 1. Bảng 1 - Yêu cầu về hóa học đ ối với sữa ong chúa Đặc tính Yêu cầu Phương pháp phân tích Loại 1 Loại 2 1. Độ ẩm, % Không nhỏ hơn 62,0 Phụ lục A Không lớn hơn 68,5 2. 10-HDA, % Không nhỏ hơn 1,4 Phụ lục B 3. Protein, % Không nhỏ hơn 11 Phụ lục C Không lớn hơn 18 4. Đường tổng số, % Không nhỏ hơn 7 Phụ lục D Không lớn hơn 18 5. Fructose, % 2 ÷ 9 Phụ lục D 6. Glucose, % 2 ÷ 9 Phụ lục D 7. Sucrose, % < 3,0 KAD Phụ lục D 8. Erlose, % < 0,5 KAD Phụ lục D 9. Maltose, % <1,5 KAD Phụ lục D 10. Maltotriose, % < 0,5 KAD Phụ lục D 11. Độ axit tổng số, [(1 mol/L NaOH) ml/100 g] Không nh ỏ hơn 30,0 Phụ lục E Không lớn hơn 53,0 12. Lipid t ổ ng số, % 2 Phụ lục F 8 13. Tỷ lệ đồng vị C13/C12, (δ ‰ ) - 29 đến - 20 -29 đến - 14 Phụ lục G a KAD = không áp dụng Furosine là chỉ số chất lượng xem xét thêm, không bắt buộc sử dụng để đánh giá độ tươi của sữa ong chúa (xem phương pháp tham khảo trong Phụ lục H). Có thể sử dụng sàng lọc phấn hoa để xác định nguồn gốc của sữa ong chúa (xem phương pháp trong Phụ lục I). 4.4 Yêu cầu vệ sinh Sữa ong chúa phải đáp ứng các yêu cầu nêu trong Bảng 2. Bảng 2 - Yêu cầu vệ sinh đối với sữa ong chúa Chỉ tiêu Yêu cầu Phương pháp thử 1. Số khuẩn lạc (cfu/g), tối đa 500 TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013) 2. Enterobacteriaceae (cfu/g) Không có mặt trong 10 g TCVN 5518-2:2007 (ISO 21528- 2:2004) 3. Salmonella (cfu/g) Không có mặt trong 25 g TCVN 10780-1:2017 (ISO 6579-1:2017) 5 Phương pháp thử 5.1 Yêu c ầ u chung Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết được công nhận và sử dụng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 5.2 Lấy mẫu Sử dụng que, ống hoặc thìa lấy mẫu bằng thép không gỉ. Lấy mẫu cho vào bình đựng mẫu vô trùng, khuấy để trộn đều. Mỗi mẫu thử không được nhỏ hơn 20 g. M ẫ u thử phải được kiểm tra ngay hoặc phải được bảo quản trong tủ lạnh dưới 5°C. 5.3 Phương pháp thử các chỉ tiêu hóa học Mẫu được thử nghiệm theo các phương pháp quy định trong các Phụ lục A, B, C , D, E, F và G hoặc các phương pháp thử khác có độ chính xác tương đương đã được xác nhận”. 6 Bao gói, ghi nhãn, vận chuyển, bảo quản 6.1 Bao gói Bao bì tiếp xúc với sữa ong chúa phải là bao bì thực phẩm. 6.2 Ghi nhãn Í t nhất thông tin sau phải được ghi trên từng bao gói hoặc trên nhãn: a) Tên sản phẩm, tên thương mại hoặc tên thương hiệu, nếu có b) Tên và địa chỉ của nhà sản xuất hoặc nhà đóng gói c) Khối lượng tịnh d) Tên nước sản xuất e) Năm thu hoạch f) Hạn dùng tối thiểu g) Bảo quản và hướng dẫn sử dụng h) Tháng làm đông lạnh, nếu có i) Loại, theo tiêu chuẩn nà y j) S ố lô hàng. 6.3 Bảo quản và v ậ n chuy ể n Nhiệt độ bảo quản phải nằm trong khoảng +2 °C và + 5 °C hoặc để bảo quản trong thời gian dài ở nhiệt độ nhỏ hơn -18 °C. Sữa ong chúa được sản xuất ở các khu vực và thời gian khác nhau cần được bảo quản riêng biệt theo số lô hàng khác nhau (trong chai hoặc hộp). Sữa ong chúa phải được vận chuyển ở nhiệt độ thấp, không được bảo quản và vận chuyển bằng vật liệu có chất độc và thôi nhiễm hoặc vật liệu có mùi hoặc các vật liệu có thể gây nhiễm bẩn sản phẩm. Phụ lục A (quy định) Xác định độ ẩm A.1 Phương pháp sấy chân không (Phương pháp chuẩn) A.1.1 Thiết bị, dụng cụ A.1.1.1 Tủ sấy chân không. A.1.1.2 Đĩa cân, chiều cao từ 25 mm đến 30 mm, đường kính từ 35 mm đến 50 mm. A.1.1.3 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,000 1 g. A.1.2 Cách tiến hành Sử dụng đ ĩa cân được sấy khô đến khối lượng không đổi, cho sữa ong chúa dàn đều, cân chính xác 0,5 g. Đặt đĩa đựng mẫu vào tủ sấy chân không, sấy trong 4 h ở 75 °C và dưới áp suất từ 0,000 MPa đến 0,005 MPa. Lấy đĩa ra và đặt vào tủ sấy hoặc bình hút ẩ m, để nguội 30 min rồi cân, lặp lại việc sấy 2 h và lặp lại quá trình này cho đến khi chênh lệch khối lượng giữa hai lần liên tiếp không quá 2 mg, cụ thể là cho đến khi thu được khối lượng không đổi. A.1.3 Tính kết quả Độ ẩm trong sữa ong chúa, X 1 , tính bằng phần trăm khối lượng, tính theo Công thức (A.1) (A.1) Trong đó: X 1 là độ ẩm của sữa ong chúa, tính bằng %; m 1 là khối lượng của đĩa cân và mẫu, tính bằng gam; m 2 là khối lượng của đĩa cân và mẫu được sấy khô đến khối lượng không đ ổ i, tính bằng gam; m 3 là khối lượng của đĩa cân, tính bằng gam. A.1.4 Độ chụm Độ lệch tương đối của các thực nghiệm song song không được lớn hơn 0,8 %. A.2 Phương pháp chuẩn độ Karl Fisher A.2.1 Thiết bị, dụng cụ A.2.1.1 Hệ thống chuẩn độ Karl Fischer Mettler DL 18 chuẩn độ 1) hoặc tương đương. A.2.1.2 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,000 01 g. A.2.1.3 Hydranal Composite 5 R.D.H 1) , làm dung dịch chuẩn độ hoặc tương đương. A.2.1.4 Metanol , tinh khiết UV hoặc tinh khiết phân tích, làm dung môi. A.2.2 Cách tiến hành Trong ngày phân tích, trước khi chuẩn độ mẫu thử, cần xác định độ chuẩn độ của thuốc thử một thành phần được sử dụng [ví dụ: Hydranal (R) -Composite SJ. Tiêu chuẩn nước thích hợp [ví dụ: Hydranal (R) -nước chuẩn 10,0, nước siêu tinh khiết hoặc terpine hydrat có độ ẩm được xác định là 10,46 %] được xác định lặp lại ba lần trong môi trường chuẩn độ được sử dụng. Cân xyranh 1 ml. Cân khoảng 30 mg mẫu sữa ong chúa trong xyranh. Đưa mẫu vào giếng của thiết bị chuẩn độ có chứa sẵn khoảng 40 ml metanol. Cân lại xyranh. Lượng sữa ong chúa được đưa vào giếng chuẩn độ tính bằng chênh lệch giữa hai lần cân xyranh. Sau khi khuấy 600 s, độ ẩm được xác định và được tính tự động bằng máy chuẩn độ theo % và mg/kg. Độ chuẩn độ được dùng để tính toán hàm lượng nước có trong mẫu. A.2.3 Độ chụm Mỗi mẫu phải được phân tích lặp lại hai lần và độ lệch tương đối giữa hai lần không được lớn hơn 0,4 %. A.3 Phương pháp đông khô Xem Tài liệu tham khảo [1], A.3.1 Thiết bị, dụng cụ A.3.1.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,000 1 g. A.3.1.2 Ố ng ly tâm. A.3.1.3 Máy đông khô. A.3.1.4 Tủ đ ô ng. A.3.2 Cách tiến hành Cân ống ly tâm cùng với nắp. Cho sữa ong chúa vào ống ly tâm, cân chính xác khoảng 1 g sữa ong chúa. M ở nắp và làm đông khô ít nhất 36 h. Ngay khi kết thúc quá trình đông khô, đậy nắp và cân mẫu. A.3.3 Tính kết quả Tỷ lệ chất khô được tính theo Công thức (A.2) % chất khô - 100 x (m 1 - m 0 )/m (A.2) Trong đó: m 1 là khối lượng của ống ly tâm với nắp sau quá trình làm khô lạnh, tính bằng gam; m 0 là khối lượng của ống rỗng có nắp, tính bằng gam; m là khối lượng của mẫu, tính bằng gam. Độ ẩm trong sữa ong chúa được tính theo Công thức (A.3): % độ ẩm = 100 - % chất khô (A.3) A.3.4 Độ chụm Độ lệch tương đối của các lần phân tích không được lớn hơn 0,8 %. Phụ lục B (quy định) Xác định 10-HDA B.1 Phương pháp ngoại chuẩn sắc ký lỏng hiệu năng cao-UV (HPLC-UV) (Phương pháp chuẩn) B.1.1 Thuốc thử Chỉ sử dụng nước siêu tinh khiết. B.1.1.1 Metanol, tinh khiết UV hoặc tinh khiết phân tích với độ truyền quang trên 30 % ở bước sóng phát hiện. B.1.1.2 Chất chuẩn đối chứng 10-HDA, có độ tinh khiết trên 99,0 % (có giấy chứng nhận phân tích của nhà cung cấp) B.1.1.3 Dung dịch chuẩn gốc 10-HDA S 0 c = 0,13 mg/ml. Ví dụ, cân chính xác 6,50 mg chất chuẩn đối chứng cho vào bình định mức 50 ml, hòa tan bằng metanol và thêm metanol đến vạch. Để pha loãng: hệ số x (chuẩn gốc S 0 ) = 0,13 (mg/ml)/nồng độ tính được S 0 (mg/ml). Nồng độ tính được phải hiệu chính theo độ tinh khiết của chất chuẩn. B.1.1.4 Dung dịch đệm phosphat 25 mm có pH 2,5, làm dung môi rửa giải A (dùng cho dung dịch chiết và dung môi hòa tan mẫu). Ví dụ, cân 6,90 g natri dihydro phosphat monohydrat (M = 137,99 g/mol) vào bình định mức 2 L, hòa tan trong khoảng 1 800 ml nước, chỉnh pH đến 2,5 bằng H 3 PO 4 85 % và thêm nước đến vạch mức. B.1.1.5 Dung dịch chiết, 55 % dung dịch đệm phosphat 25 mm pH 2,5/45 % metanol (thể tích) Ví dụ, trộn 550 ml dung dịch đệm phosphat 25 mm pH 2,5 với 450 ml metanol, để cân bằng đến nhiệt độ phòng. B.1.6 Dung môi hòa tan mẫu, 70 % dung dịch đệm 25 mm phosphat pH 2,5/30 % metanol (thể tích) Ví dụ, trộn 700 ml dung dịch đệm phosphat 25 mm pH 2,5 với 300 ml metanol, ổn định ở nhiệt độ phòng B.1.2 Thiết bị, dụng cụ B.1.2.1 HPLC với detector UV, bộ ghi hoặc bộ vi xử lý B.1.2.2 Cột sắc ký, Zorbax SB-CN 150 x 3,0 mm; 3,5 μ m hoặc tương đương B.1.2.3 Bể siêu âm B.1.2.4 Bộ đồng nhất mẫu, Ultraturrax hoặc tương đương. B.1.2.5 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,000 01 g B.1.3 Cách tiến hành B.1.3.1 Xử lý mẫu Cân chính xác 80,00 mg mẫu sữa ong chúa đông lạnh hoặc 200 mg sữa ong chúa tươi vào ống ly tâm 50 ml. Thêm 40,0 ml dung dịch chiết mẫu. Đồng hóa mẫu trong khoảng từ 10 s đến 20 s bằng máy đồng hóa mẫu ultraturrax với tốc độ 15 000 rpm cho đến khi toàn bộ sữa ong chúa được nhũ h óa . Xử lý 10 min trong b ể siêu âm. Hút 1 ml dịch chiết đã đồng nhất cho vào bình định mức 10 m l và thêm dung môi hòa tan mẫu đến vạch. Lọc dịch chiết đã pha loãng qua màng lọc (0,45 μ m). B.1.3.2 Điều kiện sắc k ý Bước sóng xác định: 216 nm Dung môi A: Dung dịch đệm phosphat 25 mm pH 2,5 Dung môi B: Metanol Gradient: 34 % dung môi B 34 đến 43 % dung môi B 43 đến 80 % dung môi B 34 % dung môi B 0 đến 2,0 min 2,0 đến 9,0 min 9,0 đến 10,0 min 10,1 đến 16,0 min B 1.3.3 Phương pháp ngoại chuẩn Dựng đường ngoại chuẩn (các dung dịch tương ứng với nồng độ 10-HDA: 1,0 g/1 00 ml, 1,5 g/100 m l , 2,0 g/100 ml, 2,5g/100ml) Đường cong hiệu chuẩn là đường tuyến tính được tạo nên bởi sự định lượng trực quan với hệ số tương quan r > 0,99. Các dung dịch chuẩn để dựng đường chuẩn là: Dung dịch chuẩn 10-HDA 2,5 g/100 ml c = 12,5 μg/ml (tương đương với 2,5 g/100 g trong mẫu) Dùng pipet lấy (x * 385) μ l dung dịch chuẩn gốc 10- HDA S 0 vào b ì nh định mức 10 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi hòa tan mẫu Dung dịch chuẩn 10-HDA 2,0 g/100 ml c = 10 μ g/ml (tương đương với 2,0 g/100 g trong mẫu) Dùng pipet hút (x * 578) μ l dung dịch chuẩn gốc 10-HAD S 0 vào b ì nh định mức 10 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi hòa tan mẫu Dung dịch chuẩn 10-HDA 1,5 g/100 ml c = 7,5 μg/ml (tương đương với 1,5 g/100 g trong mẫu) Dùng pipet lấy (x * 770) μ l dung dịch chuẩn gốc 10- HDA S 0 vào bình định mức 10 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi hòa tan mẫu Dung dịch chuẩn 10-HDA 1,0g/100 ml c = 5 μ g/ml (tương đương với 1,0 g/100 g trong mẫu) Dùng pipet lấy (x * 963) μ l dung dịch chuẩn gốc 10-HDA S 0 vào bình định mức 10 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi hòa tan mẫu x = hệ số của dung dịch chuẩn gốc 10-HDA S 0 (xem B.1.1.3) B.1.3.4 Phân tích mẫu Bơm 20 μl mẫu vào m á y sắc ký. Đo dịch chiết đã lọc (đã pha loãng) bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao ở bước sóng 216 nm so với đường ngoại chuẩn. B.1.4 Tính kết quả 1) Đường chuẩn Thiết lập phương trình đường thẳng cho đồ thị diện tích pic so với nồng độ (μg/ml) đã được hiệu chính về độ tinh khiết của các dung dịch chuẩn 10-HDA theo dạng: y = ax + b (B.1) Trong đó: y là diện tích pic 10-HDA; a là độ dốc của đường chuẩn; x là nồng độ đã được hiệu chính của chất chuẩn; b là giao điểm với trục y của đường hiệu chuẩn. 2) Dùng diện tích pic 10-HDA từ mẫu phân tích, tính lượng 10-HDA trong dung dịch đo từ đường hiệu chuẩn như sau: x’ = (y’-b) / a (B.2) Trong đó: x’ là nồng độ 10-HDA ( μ g/ml) trong dung dịch đo của mẫu phân tích; y’ là diện tích Pic của 10- HDA trong mẫu. Nồng độ 10-HDA (C 10 -HDA ) trong mẫu sữa ong chúa (g/100 g) được tính theo công thức (B.3) C 10 -HDA = x’ x 40 / m (B.3) Trong đó: x ’ là nồng độ tính được ( μ g/ml) của 10-HDA trong dung dịch đo mẫu; 40 là hệ số pha lo ã ng tính cho 40 ml dịch chiết, dùng pipet lấy một lượng để pha loãng (1 ml) và dùng bình định mức để pha loãng (10 ml); m là khối lượng thực của mẫu sữa ong chúa, tính bằng mg. B.1.5 Độ chụm Độ lệch tương đối của các lần phân tích đồng thời không được lớn hơn 2,0 % đ ố i với sữa ong chúa đông khô và 5,0 % đối với sữa ong chúa tươi. B.2 Phương pháp nội chuẩn HPLC - UV (Phương pháp thay thế) B.2.1 Thuốc thử Chỉ sử dụng nước cất hai lần. B.2.1.1 Metanol c ó độ tinh khiết (UV) hoặc tinh khiết phân tích với độ truyền quang trên 30 % ở bước sóng phát hiện (210 nm). B.2.1.2 Cồn khan B.2.1.3 Chất nội chuẩn, axit trans-2-hexenoic với độ tinh khiết 99,0 %. B.2.1.4 Chất chuẩn 10-HDA có độ tinh khiết trên 99,0 %. Giải nén và sấy khô 24 h trong tủ sấy chân không hoặc bình hút ẩm bằng axit sulfuric đậm đặc trước khi sử dụng. B.2.1.5 Dung dịch chuẩn 10-HDA: Cân chính xác 12,5 mg mẫu chuẩn 10-HDA khô, hòa tan với cồn khan và chuyển vào bình định mức 25 ml, thêm cồn khan đến vạch định mức và lắc đều. Nồng độ 10-HDA thu được trong dung dịch này là 0,5 mg/ml. B.2.1.6 Dung dịch nội chuẩn: Cân chính xác 650 mg axit trans-2-hexenoic, hòa tan với cồn khan và chuyển vào bình định mức 1000 ml, thêm cồn khan đến vạch định mức và lắc đều. Nồng độ của dung dịch nội chuẩn trong dung dịch này là 0,65 mg/ml. B.2.1.7 Axit clohydric (c = 0,03 mol/l). Lấy 100 ml axit clohydric 0,1 mol/l, thêm 200 ml nước cất 2 lần. B.2.1.8 Pha động, φ (CH 3 OH + 0,03 mol/l HCI + H 2 O ) = 55 + 10 + 35 hoặc (CH 3 OH + 25 mmol/l dung dịch đệm phosphat pH 2,5) = 55 + 45 B.2.2 Thiết bị, dụng cụ B.2.2.1 HPLC với detector UV, đầu ghi hoặc bộ vi xử lý. B.2.2.2 Cột sắc ký bằng thép không g ỉ , kích thước 4,6 mm x 250 mm, đổ đầy silica gel dạng vô định hình với pha liên kết cố định C18, kích thước hạt 5 μ m hoặc 10 μm . B.2.2.3 Thiết bị làm sạch siêu âm B.2.2.4 Máy trộn, máy trộn Vortex hoặc tương đương. B.2.2.5 Cân ph â n tích, có thể cân chính xác đến 0,00 001 g. B.2.3 Cách tiến hành B.2.3.1 Xử l ý mẫu Rã đông mẫu đ ế n nhiệt độ phòng và khuấy đều bằng que thủy tinh, cân chính xác 0,5 g vào bình định mức 50 ml đã được cân, thêm 1 ml dung dịch axit clohydric 0,03 mol/l và 2 ml nước, đặt bình vào máy trộn và trộn để hòa tan mẫu, thêm 30 ml cồn khan đồng thời lắc nhẹ, thêm chính xác 10 ml dung dịch nội chuẩn, pha loãng đến vạch định mức bằng cồn khan và trộn đều, đặt ngay vào bể siêu âm trong 15 min hoặc đặt vào máy trộn vortex và lắc trong 15 min, lấy ra ly tâm trong 10 min ở tốc độ 3000 r/min, lọc bằng màng lọc 0,45 μm (nếu cần) và tiến hành phân tích. Bảo quản trong tủ lạnh nếu chưa phân tích ngay. B.2.3.2 Điều kiện sắc k ý Bước sóng kiểm tra: 210 nm; nhiệt độ cột: 35 °C; tốc độ pha động: 1 ml/min B.2.3.3 Xác định hệ s ố hiệu chính Cân 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 ml dung dịch chuẩn 10-HDA riêng rẽ và chuyển vào các bình định mức 10 ml tương ứng. Thêm chính xác 2 ml dung dịch nội chuẩn vào mỗi bình, pha loãng đến vạch mức bằng cồn khan và trộn đều. Lấy 10 μl từng dung dịch này, bơm vào máy sắc ký, thiết lập tỷ số chuẩn 10-HDA so với nội chuẩn theo diện tích pic và dựng đường chuẩn. B.2.3.4 Xác định Cân 10 μl dung dịch mẫu, bơm dung dịch vào máy sắc ký và hiệu chỉnh phép đo bằng “phương pháp nội chuẩn” B.2.4 Tính kết quả Hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa, được tính theo công thức (B.4) (tuyến tính) (B.4) Trong đó X 2 là hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa, tính bằng %; F là hệ số hiệu chính; A i là diện tích pic của nhóm thử nghiệm có trong mẫu; A s là diện tích pic của chất nội chuẩn có trong mẫu; m s là khối lượng của ch ấ t nội chuẩn, tính bằng gam; m i là khối lượng của mẫu, được tính bằng gam. B.2.5 Độ chụm Độ lệch tương đối của các lần phân tích không được lớn hơn 2,0 %. Phụ lục C (quy định) Xác định protein C.1 Phương pháp Kjeldahl (tự động) (Phương pháp chuẩn) C .1.1 Thuốc thử C .1.1.1 Axit sulfuric đặc, 95 % đến 98 %, độ tinh khiết. C .1.1.2 Chất xúc tác. Cân 7,0 g kali sulfat và 0,4 g đồng sulfat. C .1.1.3 Chỉ thị hỗn hợp. Hòa tan 100 mg metyl đỏ trong 100 ml metanol và 100 mg bromocresol green trong 100 ml metanol. Khi sử dụng chuẩn độ điện thế, không cần chất chỉ thị. C .1.1.4 Dung dịch axit boric 4 % (khối lượng/thể tích): Hòa tan 400 g axit boric trong 5 L đến 6 L nước đã khử ion nóng, khuấy đều và thêm nước khử ion nóng đến khoảng 9 L. Làm nguội đến nhiệt độ phòng, thêm 100 ml dung dịch bromoccresol green và 70 ml dung dịch metyl đỏ. Điều chỉnh pH của dung dịch axit boric đến 4,6 đến 4,8 bằng NaOH 0,1 mol/l hoặc HCI 0,1 mol/l. Hoặc 25 ml hỗn hợp chỉ thị Sher và pha loãng đến thể tích cuối cùng là 10 L. C .1.1.5 Dung dịch natri hydroxit: Cân 32 g natri hydroxit, pha loãng đến 100 ml bằng nước cất. C .1.1.6 Dung dịch chuẩn axit clohydric, 0,1 mol/l. C .1.2 Dụng cụ, thiết bị C .1.2.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,0001 g . C .1.2.2 Buồng phân hủy mẫu Buồng phân hủy mẫu là hợp kim nhôm có thiết bị điều chỉnh nhiệt độ để đo và điều chỉnh nhiệt độ khoang (dùng hệ thống phá mẫu Tecator 20, 2025 Digestor hoặc KjelDigester K-4492), SpeedDigester K- 4392) hoặc tương đương) C .1.2.3 Ống phân hủy, dung tích 250 ml đến 300 ml. C .1.2.4 Thiết bị chưng cất: Dùng các bộ chưng cất Foss Tecator 22002), BUCHI KjelMaster K- 3752) hoặc tương đương, để có thể tiếp nhận được 250 ml đến 300 ml. C .1.2.5 Bình chuẩn độ: bình chia độ Erlenmeyer 500 ml (để thu và chuẩn độ chất chưng cất) C .1.2.6 Bộ thu khói có lớp đệm polytetrafluoroethylen (PTFE), được nối với máy hút nước trong bồn có nắp đậy C .1.2.7 Máng/thuyền cân không chứa nitơ C .2.1.8 Bộ phân phối ống, dung tích 25 ml, thể tích điều chỉnh được, được gắn vào chai axit 2,4 L. C .1.3 Cách tiến hành C .1.3.1 Phân hủy Cân khoảng 1 g mẫu sữa ong chúa vào máng cân không có Nitơ đã được cân bì trước. Cuộn giấy quanh mẫu và thả vào ống Kjeldahl Thêm chất xúc tác, thêm 12 ml axit sulfuric bằng cách sử dụng bộ phân phối ống. Giữ hỗn hợp qua đêm. Lắp chặt bộ thu khói lên trên các ống và bật máy hút nước. Đặt giá ống vào khoang đã được làm nóng trước (ở 420 °C). Sau 10 min, bật máy hút nước. Nên duy trì một khoảng ngưng tụ trong các ống. Sau khi một lượng lớn khói ôxit lưu huỳnh được tạo ra trong giai đoạn đầu của quá trình phân hủy thì giảm nguồn chân không để ngăn ngừa việc mất axit sulfuric. Xử lý thêm 50 min. Tổng thời gian xử lý khoảng 60 min. Để nguội ống. Thêm nước khử ion vào mỗi ống đến tổng thể tích khoảng 80 ml. C .1.3.2 Chưng cất Cho NaOH 32 % vào khoang kiềm của bộ chưng cất. Điều chỉnh thể tích được điều tiết đến 50 ml. Gắn ống phân hủy có chứa chất phân hủy đã được pha loãng với bộ chưng cất hoặc sử dụng tính năng pha loãng tự động. Thêm 60 ml dung dịch H 3 BO 3 vào bình thu có chỉ thị trên nền thu, nhúng đuôi sinh hàn ngập vào dung dịch H 3 BO 3 . Tiến hành chưng cất sục hơi nước cho đến khi thu được ≥ 150 ml dịch chưng cất; tháo bình thu nhận ra. C .1.3.3 Chuẩn độ Chuẩn độ dung dịch H 3 BO 3 nhận bằng HCI 0,1 mol/l đến màu tím hoặc điểm kết thúc là màu xám. Ghi lại số mililit của HCI tiêu tốn trong phép chuẩn độ, chính xác đến 0,05 ml. C .1.4 Tính kết quả Hàm lượng protein trong sữa ong chúa được tính theo công thức (C.1): (C.1) Trong đó: N là hàm lượng protein trong sữa ong chúa tính theo % khối lượng. V s là thể tích của axit đã được chuẩn hóa, tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu phân tích, tính bằng ml; V b là thể tích của axit đã được chuẩn hóa, tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng, tính bằng ml M là nồng độ dung dịch chuẩn axit clohydric, tính bằng mol/l; 14,01 là khối lượng phân tử của N; m là khối lượng mẫu, tính bằng gam; 10 là hệ số chuyển đổi từ mg/g thành %; 6,25 là hệ số chuyển đổi N thành protein. C.2 Phương pháp Kjheldal (cổ điển) C .2.1 Thuốc thử C .2.1.1 Axit sulfuric đặc, w = 95 % đến 98 % C .2.1.2 Chất xúc tác hỗn hợp gồm đồng sulfat và kali sulfat: Cân 1 g đồng sulfat và 10 g kali sulfat, cho vào cối, trộn đều và xay mịn để sử dụng. C .2.1.3 Chỉ thị hỗn hợp: Đong 2 phần thể tích dung dịch metyl đỏ trong etanol (p = 1 g/l) và 3 phần thể tích dung dịch xanh bromocresol trong etanol (p = 2 g/l), trộn đều hoặc sử dụng chỉ thị hỗn hợp Sher. C .2.1.4 Dung dịch hấp thụ axit boric (p = 20 g/l): Lắc cho đến khi axit boric tan hết. C .2.1.5 Dung dịch natri hydroxit (p = 400 g/l): Hòa tan thành 100 ml bằng nước cất. C .2.1.6 Axit sulfuric loãng: Dùng pipet lấy 5,7 ml axit sulfuric đậm đặc và pha loãng thành 100 ml bằng nước cất. C .2.1.7 Dung dịch chuẩn axit clohydric (0,1 mol/l): Pha loãng gấp 10 lần trước khi sử dụng C .2.2 Dụng cụ, thiết bị C .2.2.1 Thiết bị phá mẫu để xác định nitơ theo phương pháp Kjeldahl, bình Kjeldahl 50 ml (nếu sử dụng lò điện phá mẫu bằng tia hồng ngoại thì phải dùng ống phân hủy 50 ml nối thông với phễu) C .2.2.2 Buret dùng cho axit, 10 ml C .2.2.3 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,000 01 g. C .2.2.4 Thiết bị chưng cất theo phương pháp Semimicro (xem Hình C.1) CHÚ GIẢI A bình cầu đáy tròn 1000 ml B chai an toàn C bộ chưng cất nối với quả cầu chứa nitơ D phễu E ống sinh hàn F bình nón 100 ml G, H kẹp ống cao su I ống an toàn J nước Hình C.1 - Bộ chưng cất theo phương pháp Semimicro để xác định hàm lượng protein C .2.3 Cách tiến hành C .2.3.1 Làm sạch thiết bị chưng cất Lắp bộ chưng cất, cho vào bình A một lượng nước cất vừa đủ và vài giọt metyl đỏ, thêm axit sulfuric loãng để làm cho n ó c ó tính axit, bỏ vào đó vài hạt thủy tinh và zeolit, thêm 50 m l nước cất từ phễu D, đóng kẹp G, mở nước sinh hàn và đun sôi nước cất trong bình A. Khi hơi đến từ đầu ống sinh hàn, tắt lửa, đóng kẹp H, và là cho nước cất trong khoang C chảy ngược vào khoang B, m ở kẹp G, xả nước cất trong khoang B, đóng kẹp B và G. Nhúng đầu sinh hàn vào khoảng 50 ml nước cất, làm cho nước cất từ đầu sinh hàn chảy ngược vào khoang C và sau đó chảy vào khoang B, xả nước cất theo phương pháp trên. Làm sạch thiết bị như vậy hai đến ba lần. C .3.3.2 Phân hủy Cân chính xác 1 g mẫu sữa ong chúa vào giấy lọc hoặc giấy paraffin đã được cân, gói giấy lại và cho vào bình Kjeldahl hoặc ống phân hủy. Thêm 2 g chất xúc tác hỗn hợp đồng sulfat và kali sulfat; rót 10 ml axit sulfuric đậm đặc từ từ dọc theo thành bình, lắc đều; đặt một phễu nhỏ vào miệng bình, nghiêng bình 45 °C; lúc đầu đun ở nhiệt độ tương đối thấp, giữ nhiệt độ của dung dịch dưới điểm sôi, tăng nhiệt dần dần cho đến khi sôi thì cẩn thận giữ ở trạng thái này sao cho dung dịch không bị trào cho đến khi dung dịch chuy ể n màu xanh trong thì đun thêm 30 min; chuyển dung dịch sang bình định mức 100 ml, để nguội và pha loãng đến vạch mức bằng nước cất, lắc đều để sử dụng sau. C .2.3.3 Chưng cất Cho 10 ml axit boric nồng độ 20 g/l vào bình tam giác 100 ml, thêm 5 giọt chỉ thị hỗn hợp, nhúng đầu sinh hàn ngập vào vào dung dịch; lấy chính xác 5 ml dung dịch vừa phân hủy ở trên, rót vào ống phản ứng qua phễu D, sau đ ó thêm 10 ml natri hydroxit 400 g/l, tráng kỹ phễu D bằng nước cất; đóng kẹp G và thêm vài millilit nước cất vào phễu D để giữ tuyệt đối kín. Đun sôi bình A (cho từng giọt axit sulfuric loãng vào bình để giữ độ axit của nó) để chưng cất xục hơi. Khi dung dịch boric bắt đầu chuyển từ màu rượu vang đỏ sang màu lục lam thì tiếp tục chưng cất thêm 10 min; nâng đầu sinh hàn lên khỏi dung dịch, tiếp tục chưng cất thêm 1 min, dùng bình tia để tráng đầu sinh hàn bằng nước cất kết thúc việc chưng cất. C .2.3.4 Chuẩn độ Dung dịch hấp thụ phải được chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn axit clohydric 0,01 mol/l. Khi màu chuyển từ màu lục lam sang màu xám tím thì kết thúc việc chuẩn độ. C .2.4 Tính kết quả Hàm lượng protein trong sữa ong chúa được tính theo công thức (C.2): (C.2) Trong đó X 3 là hàm lượng protein trong sữa ong chúa, tính theo % khối lượng; V 1 là thể tích dung dịch chuẩn axit clohydric 0,01 mol/l tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu phân tích tính bằng mililít; V 0 là thể tích dung dịch chuẩn axit clohydric 0,01 mol/l tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng, tính bằng mililít; c 1 là nồng độ dung dịch chuẩn axit clohydric, tính bằng mol/l; 0,014 là khối lượng millimol của nitơ tính bằng gam; m 4 là khối lượng mẫu, tính bằng gam; 6,25 là hệ số chuyển đổi từ nitơ sang protein. C .2.5 Độ chụm Độ lệch tương đối của các lần phân tích không được lớn hơn 3,0 % C.3 Máy phân tích nguyên tố C .3.1 Thiết bị, dụng cụ C .3.1.1 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,000 01 g C .3.1.2 Hệ thống phân tích nguyên tố Xem hình C.2 CH Ú GIẢI: 1 bộ đốt 2 Bộ đốt thêm 3 lò khử 4 heli (khoảng 1,5 bar) 5 bộ điều chỉnh tốc độ dòng helium (50 ml/min) 6 bộ điều chỉnh áp suất oxy (khoảng 1,5 bar) 7 điều chỉnh lưu lượng oxy ( ở mức 2 ml/min) Hình C.2 - Hệ thống phân tích nguyên tố C .3.2 Quy trình xác định hàm lượng nit ơ Cân chính xác 2 mg sữa ong chúa đông lạnh vào một chén nung bằng bạc. Đưa chén vào bộ đốt, giữ ở 1050 °C. Một dòng khí heli chứa 5 % oxy thổi khí từ bộ đốt đến bộ đốt thêm có chứa đầy oxit đồng và giữ ở 850 °C. Nitơ ở dạng nitơ oxit và (NOx) được khử thành N2 trong lò khử đồng giữ ở 450 °C Nước bị hút bởi magie perchlorat khan N2 được tách ra khỏi C O 2 và nước bằng cách sử dụng cột sắc kí khí (Hayesep Q 60/80 mesh, Supelco3), 3,5 x 0,63 cm) giữ ở 45 °C. Hàm lượng nitơ sau đó được định lượng bằng máy đo catharometer (cường độ dòng điện Wheatstone: 200 mA) C. 3.3 Hiệu chuẩn Hiệu chuẩn của máy phân tích được thực hiện mỗi ngày với độ tinh khiết từ 99,5% C. 3.4 Độ chụm Độ lệch tương đối giữa các lần phân tích đồng thời không được lớn hơn 0,3 %, C. 3.5 Tính kết quả Hàm lượng N (%N) trong sữa ong chúa được tính bằng công thức (C.3): (C.3) Trong đó: % N là hàm lượng nitrogen m nitrogen là khối lượng nitrogen thu được từ đường chuẩn, tính bằng μ g; m tổng số là khối lượng của sữa ong chúa, tính bằng μg . Hàm lượng protein của sữa ong chúa được tính bằng công thức (C.4): Hàm lượng protein = 6,25 x %N Trong đ ó % N là hàm lượng nitrogen 6,25 là hệ số chuyển đổi N thành protein Phụ lục D (quy định) Xác định hàm lượng đường D.1 Phân tích sắc ký lỏng (Phương pháp chuẩn) D.1.1 Thuốc thử D.1.1.1 Axetonitril, loại dùng cho HPLC. D.1.1.2 Metanol, loại dùng cho HPLC. D1.1.3 Nước siêu t i nh khiết D.1.1.4 Chất chuẩn đường, có độ tinh khiết cao hoặc có hàm lượng là 98,0 % D.1.2 Thiết bị, dụng cụ D 1.2.1 Máy sắc k ý lỏng detector chỉ số khúc xạ, đầu ghi hoặc bộ vi xử lý D.1.2.2 Cột HPLC, cột sắc ký lỏng hiệu năng cao có pha biến đổi amino D.1.2.3 Bể siêu âm. D.1.2.4 Máy ly tâm. D.1.2.5 Cân phân tích, có khả năng cân chính xác đến 0,0001 g. D.1.3 Các bước tiến hành D.1.3.1 Xử lý mẫu Cân chính xác 2 g sữa ong chúa vào cốc thủy tinh có mỏ. Thêm vài mililít dung dịch MeOH/ H 2 O với tỷ lệ 75/25, khuấy bằng máy khuấy từ. Chuyển dung dịch mẫu vào bình định mức 20 ml và thêm dung dịch MeOH/ H 2 O đến vạch mức. Quay 10 min trong máy ly tâm ở tốc độ 4 000 r/min. Lọc phần nổi phía trên trước khi bơm vào máy sắc ký. D .1.3.2 Các điều kiện sắc ký Pha động: axetonitril/nước (tỷ lệ 75:25) Tốc độ dòng: 1 ml/min Nhiệt độ cột: 30 °C D.1.3.3 Hiệu chuẩn Dung dịch chuẩn (M): cân chính xác một lượng đường chuẩn tương đương để thu được dung dịch có nồng độ 1 g/100 ml. Chuyển lượng đường này vào bình 100 ml. Thêm khoảng 25 ml nước và lắc đều. Thêm metanol đến vạch mức. Dung dịch chuẩn F1: Pha loãng 10 ml dung dịch chuẩn M trong bình định mức 20 ml bằng hỗn hợp MeOH/H 2 O : 75/25 Dung dịch chuẩn F2: Pha loãng 5 ml dung dịch M trong bình định mức 20 ml bằng hỗn hợp MeOH/H 2 O : 75/25 D.1.4 Tính kết quả Nồng độ của đường i trong mẫu được tính bằng công thức (D.1): C i = k i x A i (D.1) Trong đó: C i là nồng độ của đường i trong mẫu, tính bằng mg/ml k i là hệ số đáp ứng của đường i , tính được từ độ dốc của đường chuẩn được thiết lập bởi diện tích so với nồng độ của các dung dịch chuẩn (M, F1, F2); A i là diện tích tương ứng với hàm lượng đường i trong mẫu. Tổng lượng đường trong sữa ong chúa được tính bằng công thức (D.2); % đường i = C i x 20 / m x 100 (D.2) Trong đó: % đường i là tỷ lệ phần trăm của đường i trong sữa ong chúa; C i là nồng độ của đường i trong mẫu; tính bằng mg/ml; m là khối lượng của mẫu, tính bằng mg. % Tổng lượng đường = % đường (fructose + glucose + sucrose) D.1.5 Độ chụm Độ lệch tương đối giữa các lần phân tích đồng thời không được lớn hơn 3,0 %. D.2 Phương pháp chuẩn độ D.2.1 Thuốc thử D.2.1.1 Dung dịch chuẩn glucose. Cân chính xác 1,000 g đường tinh khiết (có độ quay cực là +52,5 ~ + 53°) c ó khối lượng không đổi sau khi sấy ở nhiệt độ 98 °C đến 100 °C, hòa tan bằng nước cất và thêm 5 ml dung dịch axit hydrochloric (c = 6 mol/l) và pha loãng thành 1 000 ml bằng nước cất. Mỗi mililít dung dịch này tương đương với 1 mg glucose. D.2.1.2 Dung dịch kiềm TS đồng tartrat A: H òa tan 15 g đồng sulfat (CUSO 4 .5H 2 O) và 0,05 g metylen blue trong 1 000 ml nước và bảo quản trong chai đậy kín. D.2.1.3 Dung dịch TS đồng tartrat kiềm B: Cân 50 g kali natri tartrat và 75 g natri hydroxit, hòa tan bằng nước cất, thêm 4 g kali ferrocyanide, pha loãng đến 1 000 ml bằng nước cất cho đến khi tan hoàn toàn và bảo quản trong chai nhựa polyethylen có nút đậy kín. Hiệu chuẩn dung dịch kiềm đồng tartrat TS: L ấ y chính xác 5 ml kiềm TS đồng tartrat A và B, cho vào bình tam giác 150 ml, thêm 10 ml nước cất, dùng buret thêm khoảng 9 ml dung dịch chuẩn glucose; đun sôi hỗn hợp này, sau khi sôi 2 min thì tiếp tục nhỏ giọt dung dịch chuẩn glucose từ buret với tốc độ 2 s một giọt trong khi đang sôi cho đến khi dung dịch màu xanh dương bị nhạt màu thì dừng và ghi lại tổng thể tích dung dịch chuẩn glucose đã tiêu tốn: thực hiện ba lần song song cùng một lúc, lấy giá trị trung bình và tính khối lượng (mg) của glucose tương đương 10 ml dung dịch kiềm TS đồng tartrat. (gồm 5 ml dung dịch A và 5 ml dung dịch B). D.2.1.4 Dung dịch kẽm axetat, ρ = 219 g/l: Cân 21,9 g kẽm axetat, thêm 3 ml axit axetic, hòa tan bằng nước cất và pha loãng thành 100 ml. D.2.1.5 Kali ferrocyanua, ρ = 106 g/l. D.2.1.6 Axit clohydric đặc, w = 36 % ~ 38 %. D.2.1.7 Dung dịch axit clohydric, c = 6 mol/l: Đong 50 ml axit clohydric, cho vào nước cất và pha loãng đến 100 ml. D.2.1.8 Dung dịch natri hydroxit, ρ = 200 g/l. D.2.1.9 Chỉ thị đỏ metyl, dung dịch ρ = 1 g/l trong etanol. D.2.2 Thiết bị, dụng cụ D.2.2.1 Bể ổn nhiệt điện tử, nhiệt độ dao động ± 1 °C. D.2.2.2 Cân phân tích hoặc cân điện tử có độ chính xác tới 0,000 1 g D.2.3 Cách tiến hành D.2.3.1 Xử lý mẫu Cân chính xác 4 g mẫu sữa ong chúa, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 50 ml nước cất, lắc cho đến khi hòa tan mẫu hoàn toàn, sau đỏ thêm từ từ 5 ml dung dịch kẽm axetat và 5 ml kali natri tartrat, pha loãng đến vạch bằng nước cất và trộn đều. Để yên trong 30 min và lọc bằng giấy lọc khô, loại bỏ vài mililit dịch lọc ban đầu. Dịch lọc là để sử dụng sau này. Lấy chính xác 50 ml dịch lọc ở trên, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 10 ml axit clohydric ( c = 6 mol/l), lắc đều, đặt vào nồi điện cách thủy bảo ôn; thủy phân trong 10 min ở nhiệt độ từ 68 °C đến 70 °C, làm nguội đến nhiệt độ phòng bằng dòng nước máy, thêm hai giọt chỉ thị metyl đỏ và lắc đều, trung hòa bằng natri hydroxit ( ρ = 200 g/l) cho đến khi dung dịch trở thành màu vàng; pha loãng đến vạch mức bằng nước cất và lắc đều. Dung dịch này gọi là dung dịch mẫu để sử dụng sau này. D.2.3.2 Chuẩn độ dung dịch mẫu Lấy chính xác 5 ml của từng dung dịch kiềm TS đồng tartrat A và B, cho vào bình tam giác 150 ml; lúc đầu đun nhanh hỗn hợp này, sau đó đun chậm lại cho đến khi sôi; sau khi sôi 2 min thì từ buret nhỏ từng giọt dung dịch mẫu vào đó trong khi dung dịch vẫn tiếp tục sôi. Khi dung dịch bắt đầu phai màu th ì chuẩn độ chậm lại với tốc độ 2 s một giọt cho đến khi màu xanh dương chuyển sang màu xanh nhạt th ì dừng và ghi lại tổng thể tích dung dịch mẫu đã tiêu tốn. D.2.4 Tính kết quả Hàm lượng đường tổng trong sữa ong chúa được tính bằng công thức (D.3): (D.3) Trong đó: X 4 là hàm lượng đường tổng (tính theo glucose), tính bằng % khối lượng (phần khối lượng) T là giá trị chuẩn độ của dung dịch TS đồng tartrat kiềm, khối lượng của 10 ml dung dịch kiềm TS đồng tartrat (gồm 5 ml dung dịch A và 5 ml dung dịch B) tương đương với glucose, tính bằng miligam. m 5 là khối lượng của mẫu, tính bằng gam; V 2 là thể tích dung dịch mẫu tiêu tốn khi chuẩn độ, tính bằng mililít. D.2.5 Độ chụm Độ lệch tương đối giữa các lần phân tích không được lớn hơn 3,0 %. D.3 Phân tích sắc ký khí D.3.1 Thuốc thử D.3.1.1 Hexametyldisilazan, có độ tinh khiết ≥ 99 %. D.3.1.2 Trimetylchlorosilan, có độ tinh khiết ≥ 99 %. D.3.1.3 Pyridin, có độ tinh khiết ≥ 99,8 %. Pyridin khan thu được bằng cách chưng cất qua canxi hydrua. D.3.1.4 Sorbitol (chất chuẩn nội), có độ tinh khiết ≥ 99 % D.3.2 Thiết bị, dụng cụ D.3.2.1 Máy sắc ký khí có detector i on hóa ngọn lửa, đầu ghi hoặc bộ vi xử lý. D.3.2.2 Cột sắc ký, cột HP5-MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 μm ). D.3.2.3 Cân phân tích hoặc cân điện tử, có khả năng cân chính xác đến 0,000 01 g. D.3.3 Cách tiến hành D.3.3.1 Xử lý mẫu Cân chính xác khoảng 40 mg sữa ong chúa đông khô và 1 mg sorbitol, đưa vào bình phản ứng. Đóng chặt bình. Sau đỏ, thêm 1 ml pyritin khan. Khuấy hỗn hợp trong 5 min với lò phản ứng được đóng kín. Sau đó thêm 200 μl hexametyldisilazan và khuấy hỗn hợp trong 5 min. Thêm 100 μl trimetylchlorosilan. Khuấy trong 30 min. Để hỗn hợp trong 20 h ở nhiệt độ phòng với lò phản ứng kín. D.3.3.2 Các điều kiện sắc ký D.3.3.2.1 Khí heli làm khí mang Áp suất không đ ổ i 22 psi. D.3.3.2.2 Thể tích bơm, 2 μl . D.3.3.2.3 Nhiệt độ bơm và detector: 280 °C D.3.3.2.4 Lập trình nhiệt độ lò: Duy trì nhiệt độ ban đầu (150 °C) trong 5 min, sau đó tăng lên 325 °C ở tốc độ 3 °C/min. Duy trì nhiệt độ cuối cùng trong 10 min. D.3.3.3 Xác định đường Dùng các tiêu chuẩn tham chiếu hoặc chỉ số duy trì đ ể nhận biết các loại đường khác nhau. Xác định các chỉ số duy trì của mỗi loại đường bằng cách bơm chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích và chạy sắc ký. Bơm các hỗn hợp parafin từ C15 đến C40 trước mỗi mẻ mẫu. D.3.3.4 Định lượng đường - Xác định hệ số hiệu chính Tiến hành định lượng đường bằng phương pháp nội chuẩn, dùng sorbitol làm chất chuẩn nội. Hệ số đáp ứng hoặc hệ số hiệu chính khối lượng cho mỗi loại đường được tính theo công thức (D.4). (D.4) Trong đó: k i là hệ số đáp ứng của đường i ; A SI là diện tích của chất nội chuẩn; A i là diện tích chuẩn của đường thứ i ; M SI là khối lượng của chất nội chuẩn; M i là khối lượng chuẩn của đường i . Đối với các hợp chất có mặt ở hai dạng dị thường thì tính diện tích bằng cách cộng diện tích của cả 2 dạng dị thường. D.3.3.5 Tính kết quả Khối lượng đường i trong mẫu sữa ong chúa được tính bằng công thức (D.5) m i = k i x x m SI (D.5) Trong đó: m i là khối lượng đường i trong mẫu sữa ong chúa, tính bằng mg; k i là hệ số đáp ứng của đường i ; A SI là diện tích của chất nội chuẩn; A i là diện tích của đường i trong mẫu sữa ong chúa; m SI là khối lượng của chất nội chuẩn, tính bằng mg; Tỷ lệ phần trăm của đường i trong mẫu sữa ong chúa được tính bằng công thức (D.6). % đường i = %MS x (D.6) Trong đó: m i là khối lượng đường thứ i trong mẫu sữa ong chúa, tính bằng mg; m samp l e là khối lượng mẫu sữa ong chúa, tính bằng mg; %MS là phần trăm chất khô. D.3.4 Độ chụm Độ lệch tương đối của các phân tích đồng thời không được lớn hơn 3,0 %. Phụ lục E (quy định) Xác định độ axit tổng số E.1 Thuốc thử E.1.1 Natri hydroxit, c = 0,1 mol/l. E.2 Thiết bị, dụng cụ E.2.1 Máy đo pH, đo giá trị pH chính xác đến 0,1. E.2.2 Ố ng nhỏ giọt buret, 10 ml. E.2.3 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,000 1 g. E.3 Cách tiến hành Cân 1,00 g mẫu sữa ong chúa, đặt vào cốc đong 100 ml và thêm 75 ml nước cất và làm lạnh bằng nước cất, chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn natri hydroxit (c = 0,1 mol/l). Điểm cuối đạt được khi máy đo pH ch ỉ ở pH 8,3. E.4 Tính kết quả Số millilit dung dịch chuẩn natri hydroxit tiêu tốn trong chuẩn độ được nhân với giá trị nồng độ (mol/l) và chia cho khối lượng mẫu và nhân với 100 thu được độ axit. Độ axit của mẫu được xác định: Độ axit của sữa ong chúa được xác định b ởi Công thức (E.1): Độ axit [(1 mol/l NaOH) ml/100g] = ( V x c x 100) Im (E.1) Trong đó: V là thể tích dung dịch chuẩn 0,1 mol/l NaOH tiêu tốn trong chuẩn độ, tính bằng mililít; c là nồng độ dung dịch chuẩn NaOH, tính bằng mol/l; m là khối lượng mẫu, tính bằng gam. E.5 Độ chụm Độ lệch tương đối của các thử nghiệm song song không được lớn hơn 5,0 %. Phụ lục F (quy định) Xác định tổng hàm lượng lipit F.1 Thuốc thử F.1.1 Dyethyl ete, có độ tinh khiết trên 99,5 %. Hoặc sử dụng t er t -butylmetyl ete (MTBE) làm dung môi chiết xuất thay thế. F.1.2 Celite F.2 Thiết bị, dụng cụ F.2.1 Thiết bị chiết Soxhlet, với ống chiết soxhlet (đường kính trong khoảng 40 mm), chai chiết và ống ngưng tụ F.2.2 Bộ lọc dạng ống, đường kính trong từ 25 mm đến 30 mm, chiều dài từ 100 mm đến 120 mm F.2.3 Bể ổn nhiệt F.2.4 Tủ sấy F.2.5 Tủ sấy chân không F.3 Cách tiến hành Cân chính xác 2,5 g mẫu sữa ong chúa cho vào cốc có mỏ, cho thêm 3 g đến 5 g Celite. Trộn mẫu và Celite t ố t bằng một đũa thủy tinh cho đến khi hỗn hợp được cân bằng. Chuyển hỗn hợp từ cốc thủy tinh để lọc và lau cẩn thận cốc và đũa thủy tinh bằng bông đã khử chất tẩm ete die ty l, cho bông đã khử chất béo vào nửa trên của bộ lọc dạng ố ng. L à m khô trong không khí trong bộ lọc cho đến khi mùi ete dietyl đã hết. Làm khô bộ lọc 2 h ở 70 °C dưới áp suất trong tủ sấy chân không. Thêm từ 100 ml đến 150 ml dietyl ete vào bình chiết đã được s ấ y khô cho đến khi khối lượng không đổi, đặt bộ lọc vào ố ng chiết, làm bay hơi hoặc khí nitơ. Lau bên ngoài chai chiết, s ấ y khô trong tủ s ấ y ở 105 °C trong 1 h và cân sau khi làm nguội trong bình hút ẩm trong 1 h. F.4 Tính kết quả Tổng hàm lượng lipid trong sữa ong chúa được tính theo Công thức (F.1) Phụ lục H (quy định) Xác định furosine H.1 Tổng quát Xem tài liệu tham khảo [3] H.2 Thuốc thử Chỉ sử dụng nước siêu tinh khiết. H.2.1 Methanol với HPLC. H.2.2 Natri Hidroxit, HCI, 8 mol/l. H.2.3 Natri Hidroxit, HCI, 3 mol/l. H.2.4 Natri axetat H.2.5 Axit axetic H.2.6 Tiêu chuẩn tham khảo furosine (Hệ sinh thái Lao động- Strasbourg- Strasbourg, Pháp 4 hoặc tương đương) H.3 Thiết bị, dụng cụ H.3.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,000 01 g. H.3.2 HPLC với hệ thống bơm nhị phân và máy dò tia cực tím (ưu tiên DAD), đầu ghi hoặc bộ vi xử lý H.3.3 Cột sắc ký bằng thép không gỉ H.3.4 Hộp SPE, C18, 500 mg (Hộp SPE- PAK từ Waters Corp, Milford, MA4) hoặc tương đương H.3.5 Ống tiêm - bộ lọc đầu, 0,45 μ m, [màng: polytetrafluoroetylen (PTFE) hoặc tương đương] H.3.6 Lọ, lọ thủy tinh màu h ổ phách H.3.7 Lọ, lọ thủy tinh để thủy phân với sự đ ó ng dấu của polytetrafluoroetylen (PTFE) (Duran 4) hoặc tương đương). H.4 Điều kiện sắc k ý Pha động: 0,06 mol/l sodium acetate, pH 4,3 axit acetic Tốc độ dòng: 2 ml/min Nhiệt độ cột: 30 °C Máy dò: UV- VIS: 280 nm. Dung tích thuốc tiêm: 20 μl đến 50 μl H.5 Cách tiến hành Một lượng mẫu (0,35 g), tương ứng với khoảng 30 mg đến 70 mg thủy phân, 0,5 ml dịch thủy phân được tinh lọc trên hộp SPE C18 (quy trình SPE: điều chỉnh hộp SPE với 5 ml MeOH, tiếp theo với 10 ml nước siêu tinh khiết, ứng dụng mẫu: 0,5 ml mẫu thủy phân, tách rửa bằng trọng lực) (xả dịch giải hấp phụ và không làm khô hộp); tách rửa bằng 1 ml x 4 HCI 3 mol /1, làm khô hộp trong không khí, thu tất cả rửa giải trong một lọ thủy tinh màu hổ phách thể tích 5 ml ở mức 5 ml bằng dung dịch HCI 3 mol /I. Lọc bằng ống tiêm có đầu lọc 0,45 ml trong lọ thủy tinh màu hổ phách, bảo quản ở - 20°C cho đến khi phân tích HPLC Tiêm 50 ml trong hệ thống HPLC Xác định protein: được tiến hành như Phụ lục C H.6 Tính kết quả Định lượng furosine theo tiêu chuẩn hiệu chuẩn ngoại và biểu thị giá trị là: Furosine = mg Furosine/100 g protein - Loại bỏ chất lỏng n ổ i phía trên, úp ống nghiệm lên giấy thấm để loại bỏ hoàn toàn chất lỏng dư thừa. - Làm nóng tấm gia nhiệt đến 40 °C và làm tan chảy keo gelatin glyxerin (môi trường lên tiêu bản). - Bôi keo lên mặt sau của lam kính theo hình vuông và đặt lam lên tấm gia nhiệt - Chuyển toàn bộ phần cặn lên lam kính bằng cách dùng pipet Pasteur và trải đều ra khu vực đã được đánh dấu trên lam kính. Lấy lam kính ra khỏi ngu ồ n nhiệt (chỉ để trong thời gian cần thiết khi cặn đã khô) - Nhỏ một giọt keo gelatin glyxerin lên lamen và đặt lamen nay lên lam kính ở phần mẫu cần xác định. I .2.3 Nhận diện và đếm số lượng hạt phấn Đếm số lượng hạt phấn bằng kính hiển vi theo nền mẫu được nêu trong Hình I .1. Hạt phấn hoa được đếm dọc theo năm hàng song song được phân bố đồng đều từ cạnh của hình vuông 10 mm x 10 mm tới cạnh khác (tổng số hạt phấn được đếm ít nhất 500 hạt). Các hạt phấn bất thường, méo mó hoặc bị vỡ được đếm nếu chúng được nhận diện. Lưu ý cách ly các hạt không thể nhận dạng hoặc không xác định được. Đối với mỗi dạng hạt phấn hoa, cần tính tần suất tương đối theo tỷ lệ phần trăm của tổng số hạt phấn được đếm. Lamen 10mm x 10mm Dòng 1: đếm 100 hạt phấn hoa Dòng thứ hai: đếm bổ sung 100, đến 200 hạt Dòng thứ ba: đếm bổ sung 100, đến 300 hạt Dòng thứ tư: đếm b ổ sung 100, đến 400 hạt Dòng thứ năm: đếm bổ sung 100, đến 500 hạt Hình I .1- Nền mẫu được sử dụng để đếm hạt phấn hoa, đảm bảo kết quả đại diện Thư mục tài liệu tham khảo [1] Abeille de France (1990), n° 753, p.405 [2] AOAC 998: 12 for honey [3] J. Agr i c. Food Chem. 2002, 50 pp. 2825-2829 [4] Pollen analysis, Moore/Webb/ Collinson, Second Edition [5] Atlas photographiques de Maurice Reille: Pollens et Spores d'Europe et d'Afrique du Nord [6] Pollen flora of China, Second Edition [7] RICCIARDELLI D'ALBORE G., & BATTAGLINI M. Origine geographique de la gelee royale. Apidologie (Celle). 1978, 9 pp. 1-17 [8] VON DER OHE w . , PERSANO ODDO L . , PIANA M. L . , MORLOT M., MARTIN P. Harmonized methods of melissopalynology, Apidologie 35 (2004), suppl. 1, 18-25 [9] DIN 10760:2002, Determination of the relative pollen content of honey 1) Ví dụ một sản phẩm thương mại sẵn có. Thông tin này được đưa ra để thuận tiện cho người sử dụng tài liệu này và ISO không chứng nhận cho sản ph ẩ m này. 4 Ví dụ về một sản phẩm phù hợp có sẵn trên thị trường. Thông tin này được cung cấp để thuận tiện cho người dùng tài liệu này và không cấu thành sự chứng thực bởi ISO của sản phẩm này