TCVN10376:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10376:2014 (ISO 5377:1981) về Sản phẩm thủy phân từ tinh bột - Xác định khả năng khử và đương lượng dextrose - Phương pháp chuẩn độ hằng số Lane và Eynon TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10376:2014 ISO 5377:1981 SẢN PHẨM THỦY PHÂN TỪ TINH BỘT - XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHỬ VÀ ĐƯƠNG LƯỢNG DEXTROSE - PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ HẰNG SỐ LANE VÀ EYNON Starch hydrolysis p roducts - Determination o f reducing power and dextrose equivalent - Lane and Eynon constant titre method Lời nói đầu TCVN 10376:2014 hoàn toàn tương đương với ISO 5377:1981, đã được rà soát lại năm 2009, không thay đổi về bố cục và nội dung; TCVN 10376:2014 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F18 Đường, mật ong và sản phẩm tinh bột biên soạn, T ổ ng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. SẢN PHẨM THỦY PHÂN TỪ TINH BỘT - XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHỬ VÀ ĐƯƠNG LƯỢNG DEXTROSE - PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ HẰNG SỐ LANE VÀ EYNON Starch hydrolysis p roducts - Determination o f reducing power and dextrose equivalent - Lane and Eynon constant titre method 1. Phạm vi áp dụng Ti êu chuẩn này quy định phương pháp xác định khả năng khử v à đương lượng dextrose của các s ả n ph ẩ m thủy phân tử tinh bột bằng chuẩn độ hằng số Lane và Eynon. 2. Tài liệu viện dẫn Các t à i liệu viện dẫn sau rất cần thi ế t cho việc áp dụng tiêu chuẩn n à y. Đ ố i với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các s ử a đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 7149:2007 (ISO 385:2005), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Buret 1) TCVN 7151 (ISO 648), Dụng cụ thí nghiệm b ằ ng thủy tinh - Pipet một mức. TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - B ì nh định mức. TCVN 9940 (ISO 5809), Tinh bột và s ả n phẩm tinh bột - Xác định tro sul f at. TCVN 10373 ( ISO 1741), Dextrose - Xác định hao hụt khối lượng sau khi sấy - Phương ph á p dùng t ủ s ấ y chân không. TCVN 10374 (ISO 1742), Syro glucose - Xác định hàm lượng chất khô - Ph ươ ng pháp dùng tủ sấy chân không. TCVN 10375 (ISO 1743), Syro glucose - Xác định hàm lượng chất khô - Phương pháp đo ch ỉ số khúc xạ. ISO 1773 Laboratory glass w are - Boiling f lasks (narro w -necked) [Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - B ì nh đ un s ô i (c ổ hẹp)] 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn n à y sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau: 3.1. Khả năng khử (reducing po w er) Hàm lượng đường khử đượ c biểu thị b ằ ng số gam D-glucose khan trên 100 g m ẫ u xác định được bằng phương pháp quy định t rong tiêu chuẩn này. 3.2 . Đương lượng dextrose (dextrose equivalent) Hàm lượng đường khử được biểu thi bằng s ố gam D-glucose khan trên 100 g chất khô trong mẫu xác định được bằng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này. 4. Nguyên tắc Chuẩn độ một thể tích quy định dung dịch mẫu thử bằng dung dịch Fehling hỗn hợp trong các đi ề u kiện quy định, sử dụng xanh metylen l à m ch ấ t ch ỉ thị. 5. Thuốc thử Ch ỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. 5.1 . Dung dịch gốc Fehling Sử dụng thiết bị, dụng cụ nêu trong Điều 6 để chuẩn b ị các dung dịch sau đây: 5.1.1 . Dung dịch g ố c A Đồng (II) sul f at ngậm năm ph â n tử nước (C u SO 4 .5H 2 O) 69,3 g Nước, vừa đủ 1 000 , 0 ml 5.1.2 . Dung dịch gốc B Kali natri tartrat ngậm bốn ph â n tử nước (KNaC 4 H 4 O 6 .4H 2 O ) 346.0 g Natri hydroxit (NaOH) 100,0 g Nước, vừa đủ 1 000,0 ml Trước khi sử dụng, gạn lấy dung d ịch trong, n ế u có cặn. 5.1.3 . Dung dịch Fehling hỗn hợp Chuyển lần lượt theo thứ tự 100 ml dung dịch gốc A (5.1.1) và 100 ml dung dịch B (5.1.2) vào chai th ủ y tinh khô. Trộn đều. CHÚ THÍCH : Không lưu gi ữ d ung d ịch Fehling. Chu ẩ n b ị dung dịch hỗn hợp này ngay trước khi s ử dụng và chuẩn hóa như quy định trong 7.1 5.2 . D-glucose khan, đáp ứng các yêu cầu sau a) Dung d ịch nồng độ 400 g/l không được đ ục, không có cặn và màu không được đậm hơn màu nước sử dụng để chuẩn bị d ung d ịch này, được kiểm tra bằng cách cho đầy đến vạch ống Nessler 50 ml (6.5). b) Hàm lượng tro sulfat không được lớn hơ n 0,01 % (khối lượng) so với hàm lượng khi xác định bằng phương pháp quy định trong TCVN 9940 (ISO 5809) v ớ i những điều chỉnh như sau: 1) khối lượng c ủ a phần mẫu thử phải tăng đến 20 g, 2) ch ỉ sử dụng đĩa platin để nung, 3) đĩa platin phải được cân ch í nh xác đến 0,1 mg trước và sau khi nung; c) Hàm lượng maltose và/hoặc i so maltose không được vượt quá 0,1 % (khối lượng) và không phát hiện với đường có khối lượng phân tử tương đ ố i lớn hơn. 5.3 . D-glucose, dung dịch so sánh chuẩn. 5.3.1 . Xác định hàm lượng ch ấ t khô của D-glucose khan bằng phương pháp quy định trong TCVN 10373 (ISO 1741). 5.3.2 . Cân một lượng D-glucose khan (5.2) có chứa 0,600 g chất khô, ch í nh xác đến 0 , 1 mg, hòa tan lượng này trong nước, chuyển định lượng dung dịch v à o bình định mức một vạch 100 ml (6.4), pha loãng bằng nước đến vạch v à trộn. Chuẩn b ị dung dịch này ngay trong ngày sử dụng. 5.4 . Chất chỉ thị xanh metylen (C 16 H 18 C l N 2 S . 2H 2 O ), dung d ịch nước 1 g/l. 6. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm, cụ thể như sau: 6.1 . Bình đun sôi cổ hẹp, dung tích 250 ml, phù hợp với các yêu cầu trong ISO 1773. 6.2 . Buret, dung tích 25 ml, được chia vạch đến 0,05 ml, phù hợp với yêu cầu loại A trong TCVN 7149 (ISO 385). 6.3 . Pipet một vạch, dung tích 1 ml và 25 ml, phù hợp với y ê u cầu loại A trong TCVN 7151 (ISO 648). 6.4 . Bình định mức một vạch, dung tích 100 ml, 500 ml và 1 000 ml phù hợp với các yêu cầu loại A trong TCVN 7153 (ISO 1042). 6.5 . Ố ng Nessler , dung tích 50 ml. 6.6 . Thiết bị gia nhiệt, thích hợp để duy trì quá trình sôi như yêu cầu trong 7.1.4 trong khi vẫn có thể quan sát được sự thay đổi màu ở điểm kết thúc chuẩn độ mà không cần phải lấy bình ra kh ỏ i thiết bị gia nhiệt. 6.7 . Đồng hồ b ấ m giờ. 7. Cách tiến hành CHÚ TH Í CH 1 : Đ ể không sôi quá mạnh c ó th ể thêm vài viên trợ s ô i (ví dụ các viên thủy tinh), nếu cần. CHÚ THÍCH 2 : Luôn đ ể buret cách xa nguồn nhiệt (6.6). 7.1 . Chuẩn hóa dung dịch Fehling hỗn hợp (5.1.3) 7.1.1 . Dùng pipet (6.3) lấy 25,0 ml dung dịch Fehling (5.1.3) cho vào bình đun sôi (6.1) khô, sạch. 7.1.2 . Rót dung dịch so sánh chuẩn D-glucose (5.3) v à o buret (6.2) đến vạch zero. 7.1.3 . Từ buret cho 18,0 ml dung dịch D-glucose (5.3) chảy vào bình đun sôi. Xoay bình để trộn lượng chứa trong bình. 7.1.4 . Đặt bình đun sôi vào thiết bị gia nhiệt (6.6) đã được điều chỉnh trước để thời gian sôi trong khoảng 120 s ± 15 s sử dụng đồng hồ bấm giờ (6.7). Tiếp theo, không điều ch ỉ nh thiết bị gia nhiệt. Đ ả m bảo rằng khi sôi, sự bay hơi diễn ra nhanh và liên tục trong suốt quá trình chuẩn độ , để ngăn ngừa đến mức tối đa sự xâm nhập của không kh í vào bình chu ẩ n độ dẫn đến oxy hóa các chất đựng trong bình. 7.1.5 . Đun sôi liên tục lượng chứa trong bình trong 120 s (sử dụng đồng hồ b ấ m giờ). Thêm 1 ml dung dịch xanh metylen (5.4) v à o cuối giai đoạn này. Sau khi kết thúc giai đoạn đun sôi trong 120 s, từ buret thêm 0,5 ml dung dịch D-glucose v à o bình cho đ ế n khi xanh metylen mất màu, đun sô i liên tục trong suốt quá trình chuẩn độ. Ghi lại tổng thể tích dung dịch D-glucose ( V ml), là lượng được thêm vào và cả lượng tăng thêm 0,5 ml cuối cùng. CH Ú THÍCH : Quan sát sự m ấ t màu của xanh metylen tốt nh ấ t bằng cách nh ì n vào các lớp phía tr ê n và mặt khum của các l ượ ng ch ứ a trong bình ch uẩ n độ, v ì các lượng này kh ô ng bị đồng (I) oxit đỏ làm k ế t tủa. Quan sát sự m ất m à u dễ dàng hơn khi sử dụng ánh sáng gián t iếp. Dùng mộ t màn ch ắ n màu trắng ph í a sau bình chuẩn độ đ ể trợ giúp. 7.1.6 . Lặp lại 7.1.1 và 7 . 1.2. 7.1.7 . Từ buret cho chảy vào bình đun sôi một lượng dung dịch D-glucose bằng ( V - 0.3) ml. 7.1.8 . Lặp lại 7.1.4. 7.1.9 . Để lượng chứa trong bình sôi liên tục trong 120 s (sử dụng đồng hồ b ấ m giờ). Thêm 1 ml dung dịch xanh metylen (5.4) vào cuối giai đoạn này. Sau khi kết thúc giai đoạn đun sôi trong 120 s, dùng buret th ê m dung dịch D-glucose vào bình, giai đoạn đầu thêm 0,2 ml và cuối cùng thêm từng giọt, cho đến khi mất màu xanh metylen (5.4), giữ sôi liên tục trong suốt quá trình chuẩn độ. Sau đó, thêm lần lượt các lượng dung dịch D-glucose trong khoảng 10 s đến 15 s. Kết thúc việc bổ sung trong 60 s đ ể tổng thời gian đun s ô i không quá 180 s. L ầ n chuẩn độ thứ ba được điều chỉnh thích hợp bằng cách bổ sung dung dịch D-glucose l ớ n hơn ban đầu một chút để hoàn thành việc chuẩn độ. 7.1.10 . Ghi lại thể t í ch dung dịch D-glucose được sử dụng cho lần chuẩn độ cuối cùng. 7.1.11 . Lượng dung dịch D-glucose cần thiết để chuẩn độ vào khoảng 19,0 ml đến 21,0 ml. Nếu nằm ngoài giới hạn này th ì điều chỉnh nồng độ dung dịch Fehling A (5.1.1) thích hợp v à lặp l ạ i quá trình chuẩn hóa. 7.1.12 . Lặp lại 7.1.6 đến 7.1.10 và tính trung bình hai lần chuẩn độ ( V 1 ml). 7.1.13 . Đối với việc chuẩn hóa h à ng ngày dung dịch Fehling hỗn hợp, khi V 1 được bi ế t ch í nh xác, nên chỉ cần chuẩn độ một lần, s ử dụng (V 1 - 0,5) ml dung dịch D-glucose b ổ sung ban đầu. CHÚ THÍCH : M ỗ i người thao t ác c ầ n thực hiện việc hiệu chuẩn phương pháp chuẩn độ và s ử dụng giá trị V 1 của m ì nh trong t í nh toán (8.1.1). 7.2 . Phép xác định 7.2.1 . Chuẩn bị m ẫ u thử Nếu mẫu thử ở dạng bột hoặc dạng tinh thể thì lấy mẫu ra khỏi vật chứa, làm vỡ các cục vón, trộn bằng phương pháp thích hợ p và đặt mẫu vào trong vật chứa k í n kh í thích hợp. N ế u mẫu ở dạng rắn, thô, v í dụ: đường bột (glucose dạng rắn), thì làm tan chảy mẫu trong vật chứa k í n ng â m trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 60 °C đến 70 °C, để nguội đến nhiệt độ m ô i trường xung quanh và lắc một vài lần mà không th á o nắp để trộn lẫn hơi nước đọng lại bên trong vào mẫu. Nếu mẫu ở dạng lỏng, th ì trộn bằng cách khuấy mẫu trong vật chứa, sau khi loại b ỏ lớp máng tạo thành trên bề mặt, nếu có. 7.2.2 . N ế u không biết hàm lượng đường khử của mẫu thì lấy một lượng x ấ p x ỉ giá trị của l ầ n chuẩn độ trước, thường được quy định trong 7.1.1 đến 7.1.5, nhưng c ó điều ch ỉ nh như sau a) Thêm 10 ml dung dịch mẫu thử thay v ì thêm dung dịch D-glucose trong 7.1.3. b) Sau khi thực hiện theo 7.1.4 1) Ngay sau khi bắt đầu đun sôi, thêm 1 ml dung dịch xanh metylen v à từ buret bắt đầu thêm các lượng 1,0 ml dung dịch mẫu thử vào bình trong khoảng 10 s cho đến khi mất màu xanh metylen. Nếu màu xanh mất màu trước khi thêm 1,0 ml dung dịch mẫu th ử thì giảm nồng độ của dung dịch mẫu thử và lặp lại quy trình chuẩn độ. 2) Ghi lại tổng thể tích của dung dịch thử được thêm vào ( V’ ml) và bao gồm cả phần thêm lần cuối cùng. V' không được lớn hơn 50 ml. Nếu lớn hơn, tăng nồng độ của dung dịch thử và lặp lại quy trình chuẩn độ. 3) Khả năng khử (xem 3.1) gần đúng (ARP) của mẫu thử t í nh bằng công thức: Trong đó: F = (0,6 x V 1 )/100 = 0 , 006 x V 1 m 0 là khối lượng của phần mẫu thử trong 500 ml dung dịch mẫu thử, t í nh bằng gam (g) Khối lượng của phần mẫu th ử cần lấy, t í nh bằng gam (g), như sau: 7.2.3 . Ph ầ n mẫu thử Cân khối lượng của phần mẫu thử ( m g), chứa khoảng 2,85 g đến 3,15 g đường khử (biểu thị theo D- glucose khan), chính xác đến 1 mg. 7.2.4 . Dung dịch thử Hòa tan phần mẫu thử (7.2.3) trong nước, chuyển định lượng dung dịch vào bình định mức một vạch 500 ml (6.4), pha loãng bằng nước đến vạch và trộn. 7.2.5 . Chuẩn độ 7.2.5.1 . Lặp lại 7.1.1 đến 7.1.9 sử dụng dung dịch mẫu thử (7.2.4) thay cho dung dịch D-glucose (5.3). 7.2.5.2 . Ghi lại thể t í ch ( V 2 ) của dung dịch mẫu thử (7.2.4) được sử dụng đến điểm kết thúc chuẩn độ cuối cùng. 7.2.5.3 . Thể tích ( V 2 ) của dung dịch mẫu thử (7.2.4) cần thiết trong khoảng 19,0 ml đến 21,0 m l . Nếu V 2 n ằ m ngoài giới hạn n à y thì điều ch ỉ nh nồng độ d ung dịch thử th í ch hợp và lặp lại 7.2.5.1 và 7.2.5.2. 7.2.5.4 . Thực hiện hai phép x á c định trên cùng một mẫu thử. 7.3 . Hàm lượng chất khô Xác định hàm lượng chất khô [DMC % (phần khối lượng)] của mẫu thử như sau: a) Đối v ớ i syro glucose khô, xác định bằng phương pháp quy định trong TCVN 10374 (ISO 1742). b) Đối với dextrose (khan và ngậm một ph â n tử nước), xác định b ằ ng phương pháp quy định trong TCVN 10373 (ISO 1741). c) Đối với syro glucose, xác định bằng phương pháp quy định trong TCVN 10375 (ISO 1743). 8. Biểu thị kết quả 8.1 . Phương pháp tính và công thức 8.1.1 . Kh ả năng khử (Lane và Eynon) (xem 3.1) 8.1.2 . Đương lượng dextrose (Lane và Eynon) (xem 3.2) Trong đó: V 1 là thể tích của du ng dịch D-glucose (5.3) được sử dụng trong quá trình chuẩn hóa dung dịch Fehling hỗn hợp (7.1) , t í nh bằng mililit (ml); V 2 là thể tích của dung dịch mẫu thử (7.2.4) được sử dụng trong phép xác định (7.2.5), t í nh bằng mililit (ml); m là khối lượng phần mẫu thử (7.2.3) được sử dụng để chuẩn bị dung dịch mẫu thử trong bình định m ứ c một vạch 500 ml, t í nh bằng gam (g) (xem 7.2.4); DMC là hàm lượng chất khô của mẫu thử, biểu thị bằng phần trăm khối lượng (xem 7.3). 8.1.3 . Báo cáo kết quả là trung bình cộng của hai phép xác định và đáp ứng được các yêu cầu về độ lặp lại (xem 8.2). 8.2 . Độ lặp lại Kết qu ả của hai phép xác định nhanh liên tiếp do một người thực hiện không chênh lệch quá 0,75 % giá trị trung bình cộng. 8.3 . Độ tái lặp Các kết quả được báo cáo của hai phòng thử nghiệm khác nhau trên cùng một mẫu thử không chênh lệch quá 1,5 % giá trị trung bình cộng. 9. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đ ủ về mẫu thử, ngày thử nghiệm, phương pháp thử đã sử dụng, các kết quả thử nghiệm thu được, mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ả nh hư ở ng đến kết quả. PHỤ LỤC A ( Tham khảo) Phương pháp kiểm tra D-glucose khan so sánh chuẩn về sự phù hợp với các yêu cầu trong 5.2 c) A.1 . Nguyên tắc Tách maltose v à các loại đường khối lượng phân tử tương đối lớn ra khỏi mẫu D-glucose khan đ ã biết khối lượng bằng s ắ c ký giấy. Phát hiện các loại đường tách được theo các chấm màu bằng cách nhúng gi ấ y sắc ký đã khai triển v à o dung dịch thuốc thử tạo màu và gia nhiệt. Kiểm tra xác nhận r ằ ng hàm lượng maltose (dạng khan) không quá 0,10% (khối lượng) bằng cách d ùng mắt thư ờ ng so sánh cường độ màu của chấm maltose với cường độ màu của chấm dextrose v à chấm maltose chuẩn. Kiểm tra bằng mắt thường về sự có mặt các chấm đường khác với D-glucose v à dextrose. CHÚ THÍCH : Maltose v à iso maltose không tách được bằng phương pháp n à y; do đó "maltose " cầ n được hiểu l à " maltose v à /hoặc i so mallose". A.2 . Thuốc thử Trong quá trình phân tích, ch ỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. A.2.1 . Giấy sắc ký: cenllulose bông tinh khiết, 185 g/m 2 , có hàm lượng α-cenllulose lớn hơn 97% (khối lượng) và tro ít hơn 0,06 % (khối lượng), c ả hai được tính theo ch ấ t khô và chiều rộng tối thiểu 140 mm x chiều dài tối thiểu 420 mm theo hướng chạy của d ung môi. CHÚ THÍCH : Gi ấ y sắc ký W hatman s ố 3 là thích hợp. A.2.2 . Dung môi khai triển n -propanol 7 ph ầ n thể tích Etyl axetat 1 phần thể tích Nước 2 phần thể tích Chuẩn bị dung m ô i này ngay trong ngày sử dụng. A.2.3 . Thuốc thử màu Diphenylamin 1 g Anilin 1 ml Ax e ton 100 ml Axit orthophosphoric (H 3 P O 4 ) 88 % (khối lượng) 6 ml Hòa tan diphenylamin và anilin trong axeton, thêm axit orthophosphoric v à trộn. Chuẩn bị dung môi này ngay trong ngày sử dụng. A.2.4 . Maltose hydrat 10 μ l dung dịch ch ứ a 20 g/l maltose khan không được cho thấy chấm nào khác với maltose khi được xử lý theo quy định trong A.4.4, A.4.5, v à A.4.6. Các đường khác maltose có mặt không được quá 1,0 % (khối lượng) (theo maltose khan) (xem A 5.3). A.2.5 . Ma l tose, dung dịch chuẩn tương ứng với 5 g maltose khan trên lít. Cân 0,526 g maltose hydrat (A.2.4) tương đương với 0,500 g maltose khan, chính xác đến 1 mg, hòa tan trong nước, chuyển định lượng dung dịch này vào bình định mức một vạch 100 ml (A.3 1), pha loãng bằng nước đến vạch và trộn. 1 ml dung dịch chuẩn n à y chứa 0,005 g maltose khan. Chuẩn bị dung dịch này ngay trong ngày sử dụng. A.2.6 . Maltose, dung dịch chuẩn tương ứng với 0,5 g maltose khan trên lít. Dùng pipet (A.3.2) chuyển 10,0 ml dung dịch maltose chuẩn (A.2.5) vào bình định mức một vạch 100 ml (A.3.1), pha loãng bằng nước đến vạch và trộn. 1 ml dung dịch chuẩn này ch ứ a 0,5 mg maltose khan. Chuẩn bị dung dịch này ngay trong ngày sử dụng. A.3 . Thiết bị, dụng cụ A.3. 1. Bình định mức một vạch, dung tích 100 ml, phù hợp với loại B, trong TCVN 7153 (ISO 1042). A.3.2 . Pipet một vạch, dung tích thích hợp 10 ml, phù hợp với loại B trong TCVN 7151 (ISO 648). A.3.3 . Micropipet, có thể phân phối được 10 μl A.3.4 . Máy sấy tóc hoặc nguồn khí ấm thích hợp khác ở nhiệt độ kh ô ng lớn hơn 40 °C. A.3.5 . Bể s ắ c ký, để khai triể n sắc ký. A.3.6 . Máng, thích hợp để ngâm giấy sắc ký (A.4.6.1) trong thuốc thử màu (A.2.3). A.3.7 . T ủ sấy không kh í nóng tu ầ n hoàn cưỡng bức, có kích cỡ thích h ợ p đ ể làm nóng giấy sắc ký (A.4.6.3) và có thể kiểm soát ở nhiệt độ 80 °C ± 1 °C. A.4 . Cách tiến hành A.4.1 . Mẫu thử Trộn kỹ mẫu thử. A.4.2 . Dung dịch mẫu thử Chuẩn bị ngay trong ngày sử dụng dung dịch chứa 250 g mẫu thử (A.4.1) trong một lít. A.4.3 . Chuẩn bị giấy sắc ký A.4.3.1 . Dùng bút chì vẽ trên giấy sắc ký (A.2.1) một đường thẳng song song và cách mép bên 140 mm, cách mép dưới 80 mm. CHÚ THÍCH : Có thể sử dụng kho ả ng cách thay đổi 80 mm đ ể phù hợp v ớ i bể sắc ký (A.3.5). A.4.3.2 . Đánh dấu bằng bút ch ì trên đường thẳng n ă m chấm gốc A, B, C, D và E, cách nhau 20 mm, bắt đầu 30 mm t í nh từ cạnh 420 mm. A.4.4 . Sử dụng dung dịch maltose chuẩn và dung dịch thử A.4.4.1 . Ở từng chấm gốc B và D (A.4.3.2) dùng micropipet (A.3.3) chấm hai lần mỗi lần 10 μ l dung dịch thử (A.4.2) (ch ứ a 5 000 μg D-glucose khan), sấy khô các chấm bằng dòng không khí ấm (xem A.3.4) ngay sau mỗi lần chấm dung dịch. A.4.4.2 . Ở t ừ ng điểm gốc A, C và E dùng micropipet (A.3.3) chấm 10 μl dung dịch maltose chuẩn (A.2.6) (chứa 5 μg maltose khan), sấy khô các chấm bằng d òng không kh í ấm ngay sau khi chấm dung dịch. A.4.5 . Khai triển sắc ký A.4.5.1 . Đặt giấy đã chấm dung dịch (A.4.4) vào bể s ắ c ký đ ã cân bằng (A.3.5) ch ứ a dung môi khai triển (A.2.2). CH Ú THÍCH : Bể s ắ c ký ph ải đặt ở nơi tối , không x ê dịch v ị tr í , t ố t nhất l à duy tr ì ở nhiệt độ không đ ổ i A.4.5.2 . Cho khai triển sắc ký trong 8 h. Thời gian này là th í ch hợp ở nhiệt độ 20 °C nhưng có thể giảm n ế u nhiệt độ cao hơn đáng kể. Điều quan trọng l à tâm của chấm D-glucose (xem A 4.6) dịch chuyển được ít nhất 50 mm ra khỏi gốc nhưng không được chạy khỏi gi ấ y sắc ký. A.4.5.3 . L ấ y giấy ra khỏi bể sắc ký v à sấy khô bằng dòng không khí ấm. CHÚ THÍCH : Giấy n à y có thể được làm khô trong tủ sấy thích hợp duy tr ì nhi ệ t độ không lớn hơn 40 °C. A.4.6 . Phát hiện các chấm của đường A.4.6.1 . Cho giấy sắc ký khai triển đã kh ô (A.4.5.3) ở tốc độ không đ ổ i đi qua mán g (A.3.6) có ch ứ a thuốc thử m à u (A.2.3). A.4.6.2 . Để ráo giấy sắc ký và sấy khô dưới dòng không khí ấm (xem A.3.4) hoặc trong tủ s ấ y thích hợp (xem Chú thích trong A.4.5.3). A.4.6.3 . Đặt giấy sắc ký kh ô (A.4.6.2) vào t ủ sấy bằng không khí nóng tuần hoàn cưỡng bức (A.3.7). A.4.6.4 . Cứ sau 5 min kiểm tra gi ấ y sắc ký. Lấy giấy sắc ký ra khỏi tủ sấy khi các chấm màu đã hiện rõ nhưng toàn bộ giấy sắc ký chưa bị nhuộm màu. A.4.7 . Kiểm tra sắc ký đồ A.4.7.1 . Quan sát để đánh giá cư ờ ng độ màu tương đối của các chấm maltose từ các ch ấ m gốc B và D (A.4.4.1, dung dịch thử) và các chấm maltose từ các chấm gốc A, C và E (A.4.4.2, dung dịch maltose chuẩn). A.4.7.2 . Quan sát đ ể kiểm tra sắc ký đồ để ch ỉ ra các loại đường khác với D-glucose và maltose từ các chấm gốc B v à D. A.5 . Đánh giá kết quả A.5.1 . Nếu các chấm ma l tose từ các ch ấ m gốc B và D (A.4.4.1) có cường độ màu nh ỏ hơn cường độ màu của các chấm maltose từ các chấm gốc A, C và E (A.4.4.2) th ì hàm lượng maltose (v í dụ maltose khan) của mẫu D-glucose khan không lớn hơn 0,1 % (khối lượng). A.5.2 . Nếu chỉ có các chấm màu từ các chấm gốc B và D (A.4.4.1) l à của D-glucose và maltose và phần còn lại của gi ấ y sắc ký l à không màu, thì mẫu D-glucose khan đáp ứng yêu cầu về sự không có mặt các loại đường có khối lượng phân tử tương đối lớn hơn so với phân tử lượng của maltose. A.6 . Độ nhạy của phương pháp Khối lượng maltose khan nhỏ nh ấ t cho ch ấ m màu có thể nhìn thấy l à 2 μg. 1) TCVN 7149:2007 (ISO 385:2005) Dụng cụ th í ngh iệm bằng thủy t inh - Buret thay thế hai tiêu chuẩn đã h ủ y TCVN 7149-1 (ISO 385-1), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy t i nh - Bur e t - Phần 1: Y ê u c ầ u chung và TCVN 7149-2 (ISO 385-2). Dụng cụ th í n g hiệ m bằng thủy tinh - Bure t - Ph ầ n 2: Bur e t kh ô ng quy định th ờ i gian chờ.