TCVN8710-10:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-10:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chuẩn đoán - Phần 10: Bệnh do Perkinsus Marinus ở nhuyễn thể hai mảnh nhỏ TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-10:2015 BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 10: BỆNH DO PERKINSUS MARINUS Ở NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 10: Perkinsus marinus disease in bivalve molluscs Lời nói đầu TCVN 8710-10 : 2015 được xây dựng trên cơ s ở tham khảo OIE (2012), Manual of diagnostic tests for aquatic animals . Chapter 2.4.5 I nfection with Perkinsus marinus; TCVN 8710-10 : 2015 do Trung tâm Ch ẩ n đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, T ổ ng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ TCVN 8 710 Bệnh thủy s ả n - quy trình chẩn đoán gồm 15 phần: - TCVN 8710-01 : 2011, ph ầ n 1: Bệnh Còi do vi rút ở t ô m; - TCVN 8710-02 : 2011, ph ầ n 2: Bệnh Hoại tử th ầ n kinh ở cá bi ể n; - TCVN 8710-03 : 2011, phần 3: Bệnh Đốm tr ắ ng ở tôm ; - TCVN 8710-04 : 2011, phần 4: Bệnh Đầu vàng ở tôm ; - TCVN 8710-05 : 2011, phần 5: Bệnh Taura ở tôm He; - TCVN 8710-06 : 2012, phần 6: Bệnh d o Koi herpesvirus ở cá chép; - TCVN 8710-07 : 2012, phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép; - TCVN 8710-08 : 2012, ph ầ n 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm ; - TCVN 8710-09 : 2012, phần 9: Bệnh hoại t ử gan tụy ở tôm; - TCVN 8710-10 : 2015, phần 10: Bệnh do Perkinsus marinus ở nhuyễn th ể ha i m ả nh vỏ; - TCVN 8710-11 : 2015 , ph ầ n 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai m ả nh v ỏ ; - TCVN 8710-12 : 2015, phần 12: Bệnh do Vi bào tử d o Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm; - TCVN 8710-13 : 2015, ph ầ n 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm ; - TCVN 8710-14 : 2015, phần 14: Hội chứng lở loét (EUS ) ở cá; - TCVN 8710-15 : 2015, phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas ở cá. BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 10: BỆNH DO PERKINSUS MARINUS Ở NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Aquatic animal diseases - Diagnostic procedure - Part 10: Perkinsus marinus disease in bivalve mol lucs C Ả NH BÁO - Việc áp dụng ti ê u chu ẩ n này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không th ể đưa ra đ ược hết tất cả các v ấ n đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người s ử dụng tiêu chu ẩ n này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức kh ỏ e thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trư ớ c khi sử dụng ti ê u chu ẩ n. 1. Phạm vi áp dụng Ti ê u chu ẩ n n à y quy định quy trình ch ẩ n đoán bệnh g â y ra do Perkinsus marinus ở nhuyễn thể ha i mảnh vỏ. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau: 2.1. Perkinsus marinus (Perkinsus marinus) Sinh v ậ t đơn bào thuộc ngành bào tử Apicomplexa (Levine , 1978) , ký sinh trên mang, m à ng áo , tế bào biểu mô ruột, các tổ chức mô liên kết của tuyến tiêu hóa và tuyến sinh dục của nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Chu kỳ sống của Perkinsus marinus gồm ba giai đoạn chính: Giai đoạn dinh dưỡng (trophozoite). giai đoạn tăng trư ở ng (hypnospore), giai đoạn bào t ử động (zoospores). 2.1.1 . Giai đoạn dinh dưỡng (trophozoite) Giai đoạn nhân Giai đoạn xảy ra trong các mô của vật ch ủ trực tiếp. Trong giai đoạn này Perkinsus marinus có dạng t ế bào h ì nh c ầ u với sự xuất hiện của không bào lớn, hơi lệch tâm và có nhân ở ngoại biên . 2.1.2 . Giai đoạn tăng trư ở ng (hypnospore) Giai đoạn này quan sát được khi ủ m ô ký chủ bị nhiễm Perkinsus m a ri nus trong m ô i trư ờ ng lỏng thioglycollat (FTM) , thể dinh dư ỡn g được phóng lớn ( dạng h ìn h cầu) và lớp vỏ của ký sinh trùng được ph át triển dày hơn. Sau khi hypnospor e s đ ược nu ô i trong FTM bị c ô lập v à chuyển vào n ư ớc biển, h y pnospores bắt đ ầ u sự phân chia nh â n tế bào và sự ph â n bào chu kỳ liên tiếp. 2.1.3 . Giai đ oạn bào tử động (z oospores) Giai đoạn t ă ng sinh Giai đoạn này hàng trăm bào tử động được hình thành trong màng tế bào gốc. Bào tử động ch ỉ có một nhân với không b à o trong tế bào chất và di động hơn do hai roi chèn ở bên. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Ch ỉ sử dụng thu ố c thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất , nước khử khoáng hoặc nước có đ ộ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác. 3.1 . Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp nu ô i cấy. 3.1.1. M ô i trường lỏng thioglycollat (FTM - fluid thioglycollate med i um) (xem A.1). 3.1.2. Dung dịch penicilin-streptomycin (xem A.2). 3.1.3. Thuốc nhuộm Lugol’s iodine (xem A.3). 3.1.4. Nystatin. 3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán b ằ ng PCR 3.2.1. Etanol, 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) v à etanol tuyệt đ ố i. 3.2.2. Kít tách chiết ADN (acid deoxyribo nucleic), protein K . 3.2.3. Kit nh â n gen (PCR Master Mix Kit). 3.2.4. Cặp mồi (primers) , gồm mồi xuôi và mồi ngược. 3.2.5. Nước tinh khiết, không có nuc l ease. 3.2.6. Agarose. 3.2.7. Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris-acetate - EDTA) (xem A . 4). 3.2. 8. Chất nhuộm màu , v í dụ : Sybr sa f e 3.2.9 . Chất đệm t ả i mẫu (Loading dye 6X). 3.2.10 . Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic). 3.2.11 . Thang chuẩn A DN (M a rk e r) 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng th ử nghiệm sinh học v à những thiết bị , dụng cụ sau: 4.1 . Thiết bị, dụng cụ sử dụng cho phương pháp nuôi cấy. 4.1.1 . Nồi hấp vô trùng , có th ể duy tr ì ở nhiệt độ 115 °C . 4.1.2 . K í nh hiển vi quang học , v ậ t k í nh 10 X, 20 X, 40 X và 100 X. 4.1.3 . Ống nghiệm vô trùng, d ung tích 15 ml. 4.1.4 . Phiến kính v ô trùng . 4.1.5 . Lamen v ô trùng . 4.1.6 . Dao mổ, panh, kéo v ô trùng. 4.1.7 . Pipet pasteur. 4.2 . Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR 4.2.1 . Máy nh â n gen (PCR). 4.2.2 . Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g . 4.2.3 . Máy lắc trộn vortex. 4.2.4 . Máy spindown. 4.2.5 . Bể ủ nhiệt, duy tr ì nhiệt độ từ 55 °C đến 60 °C. 4.2.6 . Bộ điện di , gồm bộ nguồn và bể ch ạ y điện di. 4.2.7 . Máy đọc gel. 4.2.8 . Ố ng eppendor f , dung tích 1,5 ml. 5. Chẩn đoán lâm sàng 5.1 . Đặc điểm dịch tễ - Bệnh xảy ra ở đối tượng nhuyễn thể hai m ả nh v ỏ như hàu , vẹm, ngao... ; - Bệ nh xảy ra quanh năm nhưng thường t ập trung nhiều nhất v à o mùa thu và ít nhất v ào đ ầ u mùa xuân kh i n h iệ t độ môi tr ư ờ ng tr ê n 20 o C , độ mặn từ 9‰ đ ế n 12‰ . Cường độ n hiễ m b ện h tă ng cao k h i m ô i trường t ă ng độ mặn trên 12 ‰ ; - Perkinsus marinus l â y truyền trực tiếp giữa động vật thân mềm mà không cần vật chủ trung gian; - Giai đoạn lâ y nhiễm là lúc bào tử động có 2 roi chuyển sang giai đoạn cơ thể d i nh dưỡng xâm nhập v à o các m ô của vật chủ; - Nhuyễn thể hai mảnh v ỏ bị nhiễm bệnh với tỷ lệ cao, t ỷ lệ chết có thể lên đến 95 % khi đi ề u k iện môi trường bất lợi đối với v ậ t ch ủ . Perkinsus marinus có thể tồn tại dai dẳng suốt v ò ng đời v ậ t ch ủ . 5.2 . Triệu chứng lâm sàng - Biểu hiện chủ yếu của bệnh l à nhuyễn thể hai mảnh v ỏ sinh trư ở ng chậm; - Tuyến sinh dục của nhuyễn thể hai mảnh vỏ chậm phát triển, giảm sức sinh sản v à làm chậm chu kỳ sinh s ả n: - Nhuy ễ n thể hai mảnh vỏ có hiện tượng nổi l ê n cát, m ở vỏ và chết hàng loạt. 5.3 . B ệ nh tích - Nhuyễn thể hai mảnh vỏ gầy rạc, mô ch ả y nước, co màng áo, tuyến tiêu hóa nhợt máu; - B à o t ử Perkinsus marinus xu ấ t hiện từng đám trên màng áo, mang, mô liên kết, tuyến tiêu hóa v à tuyến sinh dục với biểu hiện là nh ữ ng nốt sần màu nâu trắng hoặc những cái nang trên mặt của màng áo, man g; - Sự nhiễm Perkinsus marinus nặng gây tổn thương và xung huyết nghiêm trọng trên mang, mô ru ộ t và mô li ê n kết của nhuyễn thể hai mảnh vỏ. 6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1. Phương pháp nuôi cấy 6.1.1 . L ấ y m ẫ u Số lượng nhuyễn th ể hai mảnh vỏ tr ê n mỗi mẫu tùy thuộc vào k í ch c ỡ của nhuyễn thể nhuyễn thể hai mảnh vỏ: - N huy ễ n thể hai m ả nh vỏ gi ố ng: l ấy t ừ 10 con/mẫu đ ế n 15 con/mẫu. - Nhuyễn th ể hai mảnh vỏ trư ở ng th à nh: lấy từ 5 con/mẫu đ ến 1 0 con/m ẫ u. 6.1.2 . Bảo quản m ẫ u Trong qu á tr ì nh v ậ n chuyển từ nơi thu mẫu về đến ph ò ng t hử nghiệm m ẫ u được bảo qu ả n ở nhi ệt độ từ 2 o C đế n 8 o C khô ng qu á 24 h . M ẫ u chu yể n đến ph ò n g th í nghiệm phải được p hân tích nga y . 6.1.3 . Chu ẩ n bị m ẫ u - Nhuyễn th ể hai mảnh vỏ còn sống hoặc vừa chết chưa tách vỏ; - D ù ng da o mổ vô trù n g c ắ t cơ mở vỏ nhuyễn t hể hai mảnh v ỏ v à tách ra làm hai; - Dùng panh, kéo v ô trùng cắt 1 mẫu bệnh phẩm từ 5 mm đến 10 mm của phần mô áo , mang , ruột, phần cơ bị tổn thương; CHÚ THÍCH: Ph ả i dùng c á c dụng c ụ v ô tr ù ng khi lấy mô ở các mẫu kh á c nhau để trán h lây nhiễm . 6.1.4 . Cách tiến hành Bước 1: Cho mẫu bệnh ph ẩ m đ ã chu ẩ n bị (6.1.3) vào các ống nghiệm (4.1.3) chứa 9,5 ml FTM (3.1.1) c ó b ổ sung thêm 0,5 ml dung dịch penicilin-streptomycin (3.1.2) và 50 m l nystatin (3.1.4). Ố ng nghi ệ m được đóng k í n và l ắ c để mẫu bệnh phẩm chìm trong môi trường ; Bước 2: Ủ ống nghiệm chứa mẫu bệnh ph ẩ m trong điều kiện không có ánh sáng, ở nhiệt độ từ 22 °C đ ế n 25 °C trong 5 ng à y đến 7 ngày; Bước 3: Dùng panh vô trùng l ấ y m ẫ u bệnh ph ẩ m được ủ ra khỏi môi trường FTM và đặt l ê n phiến k í nh (4.1.4); Bước 4: Dùng đầu c ô n vô trùng xé nh ỏ mẫu bệnh phẩm đ ể nhuộm lugol iodine; Bước 5: Nh ỏ 1 hoặc 2 giọt lugol iodine (3.1.3) vào mẫu bệnh phẩm bằng pipet pasteur (4.1.7) , đặ t lamen l ê n mẫu bệnh ph ẩ m và kiểm tra dưới kính hiển vi quang học (4.1.2), sử dụng vật k í nh 10 X, 40 X và 100 X; CHÚ THÍCH: N ế u không ti ế n h à nh các bước tiếp theo để đọc kết qu ả sau 7 ng à y ủ, các ống nghi ệ m chứa m ẫ u được b ả o q uản ở nhiệt đ ộ từ 2 °C đ ế n 3 °C trong khoảng 3 tuần ở điều ki ệ n kh ô ng c ó ánh sáng. 6.1.5 . Đọc kết quả Mẫu dương tính với Perkinsus sp . khi quan sát dưới kính hiển vi thấy thể bà o t ử dinh dưỡng c ó v á ch tế bào nhuộm hình cầu tròn c ó màu xanh hoặc xanh đen, kích th ướ c (từ 2 m m đến 10 m m) x ( t ừ 20 m m đến 70 m m). Mẫu â m tính với Perki n sus sp. khi quan sát dưới kính hiển vi không thấy thể bào tử dinh d ư ỡ ng có đặc điểm như trên. 6.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 6.2.1 . Lấy mẫ u Xem 6.1 1. 6.2.2 . Bảo quản mẫu Trong quá tr ì nh vận chuy ể n, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 24 h hoặc b ả o quản trong etanol tuyệt đối (3.2.1) ; Mẫu chuy ể n đến phòng th í nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải b ả o quản mẫu ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 60 °C hoặc trong etanol tuyệt đối (3.2.1). 6.2.3 . Chuẩn bị mẫu Lượng mẫu c ầ n chu ẩ n bị: khoảng 30 mg. a) Mẫu trực tiếp Thực hiện chu ẩ n bị mẫu như m ô tả tại 6.1.3; Bảo quản mẫu trong etanol tuyệt đối (3.2.1); Trước khi tách chiết, lấy mẫu ra khỏi etanol và làm khô b ằ ng giấy thấm. b) M ẫ u tăng sinh Thực hiện như mô tả tại bước 1 và bước 2 của 6.1.4; Dùng panh vô trùng lấy mẫu bệnh phẩm ra kh ỏ i m ô i trường FTM và đặt vào ống eppendor f 1,5 ml (4.2.8) đ ể tách chiết ADN. 6.2.4 . Cách tiến hành 6.2.4.1 . Tách chiết ADN Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.2) thích hợp v à an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xu ấ t. VÍ DỤ : Sử dụng kít tách chiết DNeasy ® Blood & T i ssue Kit (205) (Cat No. 69506) 1) (xem phụ lục B). 6.2.4.2. Chuẩn bị mồi Pnản ứ ng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.2.1) theo phương pháp PCR khuếch đạt đoạn g en đặc hiệu của Perkinsus marinus s ử dụng cặp mồi Pmar l TS-70F/Pma rlTS600 R (3.2.4). Tr ì nh tự c ặ p mồi được nêu trong Bảng 1. Bảng 1: Tr ì nh tự cặp m ồ i Mồi Trình tự cặp mồi PmarlTS-70F 5’-CCT-TTG-YT W -GAG- W GT-TGC-CAG-ATG-3' PmarlTS 600R 5'-CGA-GTT-TGC-GAG-TAC-CTG-KAG-AG-3' Cặp mồi PmarlTS-70 F/ PmarlTS600R dùng để khuếch đại đoạn gen của P e rkinsus ma ri nus có kích thước 509 bp . Mồi được chu ẩ n bị như sau: Chu ẩ n bị mồi gốc: - Mồi gốc ở t rạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh b ằ ng máy spindown (4.2.4) trong 30 s để mồi lắng xuống đ áy ố ng trước khi m ở v à hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.10) được mồi ở nồng độ 200 m M l à m mồi g ố c; Chu ẩ n bị m ồ i sử dụn g : - Mồi sử dụng ở nồng độ 20 m M: pha lo ã ng mồi gốc bằng nước (3.2.5) (10 m l mồi gốc v à 90 m l nước (3.2.5)). 6.2.4.3 . Tiến hành ph ả n ứng PCR S ử dụng cặp mồi đ ã được chu ẩ n bị (6.2.4.2) sử dụng kít nhân ge n (3.2.3) theo hướng d ẫ n của nhà sản xuất. VÍ D Ụ: Sử d ụng kit nhân gen của Themo Scienti f ic Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lo t: 00316656) 2) Thành phần cho 1 ph ả n ứng được nêu trong bảng 2 Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR Thành ph ầ n Thể tích Taq PCR Master Mix ( 2X) 12,5 m l Mồi xuôi 20 m M 1 m l Mồi n g ược 20 m M 1 m l Nước kh ô ng c ó nuclease 8 m l Tổng thể tích 22,5 m l Chuyển 22,5 m l hỗn hợp nhân gen v à o m ỗ i ố ng phản ứng: - M ẫ u kiểm chứng d ương: Cho 2,5 m l m ẫ u ADN đ ã được giám định hoặc sử dụng các ch ủ ng Perkinsus marinus chuẩn vào ố ng phản ứng; - Mẫu kiểm chứng âm: Cho 2,5 m l nước (3.2.5) vào ống ph ả n ứng: - M ẫ u thử: Cho 2,5 m l mẫu ADN kiểm tra vào ống ph ả n ứng. Tiến hành ph ả n ứng PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đ ã c à i đặt chu tr ì nh nhiệt được nêu trong b ả ng 3. Bảng 3: Chu trình nhiệt của ph ả n ứng PCR Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 94 °C 4 min 1 94 °C 1 min 40 57 °C 1 min 65 °C 3 min 65 °C 10 min 1 CHÚ THÍCH : - Ph ả n ứng PCR ph ả i bao g ồ m: mẫu kiểm tra , m ẫ u kiểm chứng d ương và m ẫ u kiểm ch ứ ng âm; - Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR c ầ n đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá tr ì nh chu ẩ n b ị h ỗ n hợp ph ả n ứng . 6.2.4.4 . Điện di 6.2.4.4.1 . Chuẩn bị bản gel Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.6) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.7) vào b ì nh thủy tinh 250 m l , lắc đều rồi đun sôi; Khi nhiệt đ ộ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C t h ì b ổ sun g 10 m l c h ấ t n h uộm màu ( 3 . 2 .8) v à o mỗi 100 m l thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đ ề u ; Chu ẩ n bị khuôn đổ th ạ ch, đ ặ t lược v à o khuôn rồi đ ổ thạch v à o khuôn, kh ô ng n ê n đổ bản th ạ ch dày quá 0,8 cm; Khi bản thạch đ ô n g lại thì t i ến hành g ỡ lược kh ỏ i bản th ạ ch: Chuyển bản thạch vào b ể chạy điện d i (4.2.6), đổ dung dịch đệm (3.2.7) c ù ng loại với d ung dịch pha thạc h agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản th ạc h . CHÚ THÍCH : Có t h ể dùng c á c s ả n ph ẩ m có sẵn ch ấ t nhu ộ m ADN để ph a ch ế th ạ ch a g arose (ví d ụ Sy b r sa f e A D N gel st ain 3) ) và sử d ụ ng t heo quy đ ị nh của nh à s ả n xu ấ t. 6.2.4.4.2 . Chạy đ iện di Hút 2 m l chất đệm tải mẫu (3.2.9) v à o 8 m l sản phẩm PCR trộn đ ề u v à c h o vào các giếng tr ê n b ả n thạch. Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.2.6), chạy kèm theo thang chu ẩ n ADN (3.2.11) để dự đoán k í ch thước sản ph ẩ m khuếch đại. Hút 10 m l thang chu ẩ n ADN (3.2.11) v à o một gi ế ng tr ê n b ả n thạch. Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min. 6.2.4.5 . Đọc kết qu ả Sau khi điện d i, đọc kết quả ở máy đọc ge l (4.2.7) th eo B ả ng 4. Bảng 4: Kết qu ả điện di Giếng Vạch 509 bp Kết quả Thang chuẩn ADN Các vạch sáng rõ ràng Điện di tốt Mẫu kiểm chứng dương tính Có Hỗn hợp phản ứng PCR tốt Không M ẫ u đối chứng dương tính hỏng hoặc enzym hỏng Mẫu kiểm chứng âm tính Có Bị tạp nhiễm Không Không tạp nhi ễ m M ẫ u thử Có Dương tính v ớ i P e rkinsus marinus Không Âm t í nh với Perkinsus marinus Đánh g iá kế t quả: - Kết quả mẫu thử dương tính khi: Tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 50 9 bp. Thang chuẩn ADN phân vạch r õ ràng, mẫu kiểm chứng dương có kích thước 509 bp. mẫu ki ể m chứn g âm khôn g có vạch sáng. - Kết qu ả mẫu thử â m tính khi: Tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng. Than g ch uẩ n A D N p h â n vạch r õ r à ng, mẫu kiểm chứng d ương có kích thước 50 9 bp, mẫu kiểm ch ứ ng âm không c ó vạch sáng . 7. Kết luận Mẫu được xác định nhiễm bệnh do Perkinsus marinus khi có đặc điểm dịch tễ , triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh và có kết qu ả dương tính với Perkinsus marinus b ằ ng phương pháp PCR trong phòng th í nghiệm. Phụ lục A (Quy định) Thành phần và chuẩn bị môi trường, thuốc thử A. 1. Môi trường l ỏ ng thioglycollat (FTM) A.1.1 . Thành ph ầ n Môi trường FTM: 29,3 g Natri clorua: 22 g Nước cất: 1000 ml A.1.2 . Chu ẩ n bị Trộn 22 g natri clorua và 29,3 g FTM vào 1000 ml nước cất. Đun cho tan hoàn toàn đến khi dung d ịc h có màu vàng trong. Chia ra các ống nghiệm vô trùng, m ỗ i ống khoảng 9,5 ml. Hấp tiệt trùng trong nồi h ấ p (4.1.1) ở 115 °C trong 20 min. Các ống nghiệm này được giữ nơi tối và bảo qu ả n ở nhiệt độ 4 °C. A.2 . Dung dịch penicilin-streptomycin A.2.1 . Thành ph ầ n Streptomycin sul f at (500 IU/ml): 3,13 g Penicilin G (500 IU/ml): 6,55 g Nước khử ion: 500 ml A.2.2 . Chu ẩ n bị Trộn 3,13 g streptomycin sul f at và 6,55 g penicillin G vào 500 ml nước khử ion và lắc đến khi các kháng sinh tan ho à n toàn. Dung dịch được b ả o quản ở nhiệt độ 4 °C. A.3 . Thu ố c nhuộm Lugo l iodine A.3.1 . Thành phần Ka l i iodua : 6g I - ố t: 4 g Nước c ất: 100 ml A.3.2 . Chu ẩ n bị Trộn 6 g Kali iodua và 4 g I -ốt vào 100 m l cho nước cất, lắc cho tan. Đ ể yên trong 24 h sau đó được lọc qua gi ấ y lọc. Dung dịch được giữ trong chai màu nâu ở nhiệt độ phòng để tránh s ự kết tủa. Dung d ị ch c ó thể đư ợ c giữ trong nhiều tuần nhưng nên th ỉ nh thoảng lọc để loại bỏ các hạt kết t ủ a có thể xu ấ t hiện. A.4 . Dung dịch đệm TAE hoặc TBE A.4.1 . Thành phần Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml Nước khử ion: 900 ml Tổng : 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X A.4.2 . Chuẩn bị L ấ y 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X h òa chung với 900 ml nước khử ion , khuấy và lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Phụ lục 6 (Tham khảo) Quy trình tách chiết ADN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng h óa ch ấ t nguy hiể m và có kh ả năng gây hại nếu thao tác không c ẩ n t hận. Do vậy, n ê n tránh tiếp xúc trực tiếp với d a v à hí t phải h ơi c ủ a c á c hó a ch ấ t này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này. Quy tr ì nh tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNeasy ® Bloo d & Tissue Kit (250) (Cat No . 69506) và protein K ủ qua đ ê m ở 56 °C như sau: - Nh ỏ 20 m l protein K vào ống ly tâm 1,5 ml; - Chuyển 30 mg mẫu bệnh ph ẩ m (6.2.3) vào ống ly t â m đ ã có protein K: - Th ê m 200 m l dung dịch AL (Lysis buffer); - Trộn kỹ huyễn d ịch trong 15 s , sau đó ly tâm nhanh b ằ ng máy spindown (4.2.4); - Ủ qua đêm ở 56 °C trong bể ủ nhiệt (4.2.5), sau đó l y t â m nhanh bằng máy spindo w n (4.2.4); - Thêm 200 m l etanol tuyệt đối (3.2.1) v à o ống ly tâm; - Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh b ằ ng máy spindown (4.2.4); - Hút 420 m l huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển sang cột ly tâm có ố ng thu ở dưới; - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g (8 000 r/min) trong 1 min ở nhiệt độ phòng; - Thêm 500 m l dung dịch AW1 (Wash buffer 1) v à o cột ly tâm có ống thu ở dưới; - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g (8 000 r/min) trong 1 min ở nhiệt độ ph ò ng; - Thay ống thu ở dưới cột ly t â m; - Thêm 500 m l dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới; - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 20 000 g (14 000 r/min) trong 3 min ở nhiệt độ ph ò ng: - Chuyển cột ly t â m sang ống eppendor f 1,5 ml; - Nhỏ 200 m l dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm v à giữ ở nhiệt độ phòng 1 min; - Ly tâ m b ằ ng m áy I y tâm (4.2 . 2) với gia tốc 6 000 g (8 000 r/min) trong 1 m in; - Chuyển 200 m l A D N đ ã thu đ ược sang ống eppendorf 1,5 m l kh á c. B ảo quản ADN ở nhiệt độ từ 2°C đến 8 °C nếu thực hiện ph ả n ứ ng PCR ngay hoặc ở nhiệt đ ộ âm 20 °C đ ế n âm 80 °C nếu thực hiện ph ả n ứng PCR sau 24 h. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] FAO/NACA, Asia d iagnostic gui d e to aqua t ic animal d iseases. FAO F ish , Pap , No . 402/2 , 2001, M5 . P 133-137 [2] Antonio Villalba, Kimberly S . Reece, M. Camino Ordás, Sandra M. Casas and Antonio Figueras , P erkinsosis in mol l uscs. Aquat. Living Resour , 2004 ,17. p 411-432 [3] Céline Garcia , Ricardo Leite , Isabelle Arzul , Parasites of the g enus Per ki nsus . W orksho p for the analysis of the impact of Perkinsosis to the European shell f ish industry session [4] David Bushek , Susan E . Ford , and Standish K. Al l en. Jr . Evaluation of me t ho d s using ray ’ s f l ui d t hi o g lycolla t e me d ium for d iagnosis of Perkinsus mar i nus in f ectio n in the eastern oyster , crassostrea virginica , Annual revie w of fish diseases, 1994, Vol 4. p 201-217 [5] Kenneedyt. Paynter, Vincent politano, Hillary A. Lane, Stevenm. Allen And dona l d meritt, Growth rates and prevalence of Perkinsus mar i nus prevalence in restore d oyster population in Marylan d - Journal of shell f ish research, 2010, Vol 29. No2. p 309-317 [6] Nguyễn Văn Hảo và CS , Sự hiện d iện của Perkinsus sp trên nghêu (Meretrix Lyrata) tại vùng bi ể n Cầ n Giờ - Thành Phố Hồ Chí Minh, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, Chi cục Thú y TP. Hồ Ch í Minh (2010) [7] Nguyễn Thị Thu Hiền, Tr ầ n Thị Nguyệt Minh, Kết quả nghiên cứu một số tác nh â n g â y bệnh thường gặp trên ngao Meretrix sp tại vùng ven bi ể n Hải Phòng , Bản tin Viện Nghiên c ứ u Nuôi trồng Thủy sản I, Số 6 (Quý II năm 2012) [8] Bùi Quang Tề, Bệnh do ngành bào t ử Apicomplexa (Levine, 1978) Perkinsiosis , phần 3, Bệnh ký sinh trùng của động v ậ t th ủ y s ả n, Bệnh học thủy sản, 2008, Trang 259-266 [9] Ng ô Thị Thu Th ả o, Một số đặc điểm của ký sinh trùng Perkinsus sp. lây nhiễm trên nghêu lụa Paphia un d ulata ở Kiên Giang và Bà Rịa - Vũng Tàu , Tạp chí Khoa học, Trường Đại học C ần Thơ , 2008, trang 222-230 . 1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. 2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. 3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.