TCVN7700-2:2007

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7700-2:2007 (ISO 11290-2:1998, With Amendment 1:2004) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes - Phần 2: Phương pháp định lượng TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7700-2:2007 ISO 11290-2:1998 WITH AMENDMENT 1:2004 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG LISTERIA MONOCYTOGENES - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes - Part 2: Enumeration method Lời n ói đ ầ u TCVN 7700-2:2007 hoàn toàn tương đương với ISO 11290-2:1996, sửa đổi 1:2004; TCVN 7700-2:2007 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F13 Ph ươ ng pháp ph â n tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Ti ê u chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học v à Công nghệ c ô ng bố. TCVN 7700:2007 Vi sinh vật trong th ực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện v à định lượng Listeria monocytogens, bao g ồ m: - Ph ầ n 1: Ph ươ ng pháp phát hiện; - Ph ầ n 2: Phương ph á p định lượng. L ờ i gi ớ i thiệu Do tính đa dạng của thực phẩm và th ức ăn chăn nuôi nên phư ơ ng pháp này có thể không thích hợp đến từng chi tiết cho từng sản phẩm cụ thể. Trong tr ườ ng hợp này, c ó thể sử dụng các phương pháp khác đặc trưng cho từng sản phẩm, nếu hoàn toàn chỉ vì lý do kỹ thuật. Tuy nhiên, cần cố gắng áp dụng phương pháp này khi có thể. Khi tiêu chuẩn này được soát xét thì cần phải tính đến mọi thông tin liên quan đến phạm vi mà phư ơ ng pháp đếm đĩa này phải tuân theo và các nguyên nhân gây sai lệch so với phương pháp trong tr ườ ng hợp các sản phẩm cụ thể. Việc hài hoà các phương pháp thử có thể không thực hiện được ngay và đối với một vài nhóm sản phẩm c ó thể t ồ n tại các tiêu chuẩn quốc tế và/hoặc tiêu chuẩn quốc gia mà không phù hợp với tiêu chuẩn n à y. Trong trường hợp có sẵn tiêu chuẩn cho sản phẩm cần thử nghiệm thì phải tuân theo tiêu chuẩn đó. Th ô ng thường khi các ti ê u chuẩn như vậy được soát xét, thì chúng phải được sửa đổi để phù hợp với tiêu chuẩn này, sao cho cuối cùng chỉ còn các sai lệch với phư ơ ng pháp đếm đĩa này là các lý do kỹ thuật được thừa nhận. VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG LISTERIA MONOCYTOGENES - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes - Part 2: Enumeration method CẢNH BÁO - Đ ể đ ả m bảo an toàn cho nhân viên phòng thử nghiệm, c ầ n chú ý rằng các phép thử phát hiện Listeria monocytogenes phải được thực hiện trong các phòng thử nghiệm đ ư ợc trang bị đ úng, dưới sự kiểm soát của các nhà vi sinh vật học có kinh nghiệm và hết sức thận trọng với công việc th ả i tất cả các nguyên vật liệu đã nuôi ấm. Đặc biệt, phụ nữ mang thai không được tiếp xúc trực tiếp với dịch cấy L. monocytogenes. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng Listeria monocytogenes. CHÚ THÍCH Phương pháp này dùng đ ể định lượng các loài Listeria kh á c mà chúng có thể được d ùng làm ch ỉ thị về chất lượng v ệ sinh của s ả n phẩm thực phẩm và thức ăn chăn nu ô i. Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho các sản phẩm thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi như đã n ê u trong lời giới thiệu. Nh ì n chung (xem chú thích trong 9.2.1), giới hạn dưới của việc định lượng của phương pháp này là 10 L. monocytogenes trong một mililit mẫu ở dạng lỏng hoặc 100 L. monocytogenes trong một gam sản phẩm ở dạng khác. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành th ì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi. TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), [1] ) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử , dung dịch huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha lo ã ng thập phân. TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thự c phẩm và trong th ứ c ăn chăn nuôi - Nguyên tắc chung v ề kiểm tra vi sinh vật. TCVN 7100-1 (ISO 11290-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và trong thức ă n chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes - Phần 1: Phương pháp phát hiện. 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 3.1. Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes) Các vi sinh vật tạo thành các khuẩn lạc điển hình trên môi trường đặc chọn lọc và cho thấy rõ các đ ặ c điểm h ì nh thái, sinh lý và sinh hoá như đã mô tả, khi tiến hành thử theo tiêu chuẩn này. 3.2 . Định lượng Listeria monocytogenes (Enumeration of Listeria monocytogenes) Xác định số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) Listeria monocytogenes (xem 3.1) có trong mộl lượng xác định của sản phẩm, khi tiến hành thử theo tiêu chuẩn này. 4. Nguyên tắc Trong giới hạn của tiêu chuẩn này th ì việc phát hiện định lượng L. monocytogenes cần đến ít nhất sáu giai đoạn liên tiếp (Xem sơ đồ trong phụ lục A). 4.1. Chuẩn bị huyền phù ban đầu trong mỗi dịch pha loãng qui định. 4.2. Hồi phục trong 1 giờ ở 20 ° C . 4.3. C ấ y lên b ề mặt đĩa một lượng xác định của mẫu thử dạng lỏng hoặc của huyền phù ban đầu nếu sản phẩm dạng khác, trên môi trường nuôi c ấ y chọn lọc đặc đự ng trong hai đĩa Petri. Chuẩn bị các đĩa khác, sử dụng các dung dịch pha loãng thập ph â n từ mẫu thử hoặc từ huyền phù ban đầu, trong cùng điều kiện. 4.4. Ủ các đĩa này ở 37 ° C và kiểm tra sau 24 giờ hoặc 48 giờ. 4.5. Kh ẳ ng định các khuẩn lạc Listeria monocytogenes giả định bằng các phép thử qui định. 4.6. Từ số lượng khuẩn lạc đã khẳng định, tính số lượng Listeria monocytogenes có trong một gam hoặc m ộ t mililit mẫu thử. 5. Môi trường nuôi cấy và thuốc thử Về thực hành trong phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6404 (ISO 7218). CHÚ TH Í CH Do trong tiêu chuẩn sử dụng một lượng lớn môi trường nuôi cấy và thuốc thử, để cho nội dung tiêu chuẩn được gọn n ê n thành phần và cách chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thuốc thử được đưa riêng vào trong phụ lục B. 6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau: 6.1. Thiết b ị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc thiết bị để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) Xem TCVN 6404 (ISO 7218). 6.2. Tủ sấy hoặc tủ ấm , có thể duy trì nhiệt độ từ 25 ° C ± 1 ° C đến 50 ° C ± 1 ° C . 6.3. Tủ ấm, có thể duy trì môi trường, các đĩa và các ống nghiệm trong dải nhiệt độ sau: a) ở 20 ° C ± 1° C (tùy chọn); b) ở 25 ° C + 1° C (tùy chọn); c) 37° C ± 1° C . 6.4. N ồ i cách thuỷ, có thể duy trì nhiệt độ ở 44 ° C đến 47 ° C . 6.5. Que cấy vòng hoặc que cấy, bằng hợp chất platin/iridin hoặc niken/crom, hoặc pipet Pasteur hoặc que cấy vòng sử dụng một l ầ n . 6.6. Que dàn mẫu v ô trùng bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo . 6.7. Máy đo pH , có thể đọc ch í nh xác đến 0.01 đơn vị pH ở nhiệt độ 25 ° C và có thể đo ch í nh xác đến 0.1 đơn vị pH. 6.8. Ống nghiệm hoặc b ì nh c ầ u , có dung tích thích hợp, để khử trùng và bảo quản môi trư ờ ng nuôi cấy và nuôi ấm môi tr ườ ng lỏng. 6.9. Pipet chia độ xả h ế t , dung tích danh định 1 ml và 10 ml, đ ược chia vạch tương ứng là 0,1 ml và 0,5 ml. 6.10. Đĩa Petri, đường kính 90 mm và 140 mm. 6.11. B ì nh, thích hợp cho việc ủ trong môi tr ư ờng vi hiếu khí (tuỳ chọn). 6.12. Hỗn hợp kh í (tuỳ chọn), có thành phần qui định dùng để ủ vi hiếu khí: hàm lư ợ ng C O 2 từ 5 % đến 12%, O 2 từ 5 % đến 15 % và N 2 đến 100 % 6.3. Thiết bị dùng cho phép thử rọi Henry (tuỳ chọn) Xem phụ lục B. 6.14. Kính hiển vi , tốt nhất l à loại phản pha, có thêm lam kính và l amen (coverslip). 7. Lấy mẫu Vi ệ c lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nếu không có tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu sản phẩm c ó liên quan th ì các b ê n tự thoả thuận v ề vấn đ ề này. Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc b ị bi ế n đổi trong suốt quá tr ì nh vận chuyển và bảo quản [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]. 8. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn riêng cho sản phẩm có liên quan. Nếu không có tiêu chuẩn riêng đó th ì các b ê n tự thoả thuận về vấn đề này. 9. Cách tiến hành 9.1. Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn cụ thể thích hợp của sản phẩm có liên quan. Để chuẩn bị huyền phù ban đ ầ u, sử dụng dung dịch pepton đệm (B.1) hoặc môi trường cơ bản của canh thang nửa Fraser (B.2) làm dịch pha lo ã ng. Có thể sử dụng môi trường cơ bản của canh thang nửa Fraser không bổ sung các chất chọn lọc làm dịch pha lo ã ng cho mẫu thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi khi tiến hành tr ê n cùng một mẫu thử đồng thời cho cả ph ươ ng pháp phát hiện [TCVN 7700 (ISO 11290-1)] và phư ơ ng pháp định lượng. Qui trình này là để tránh phải chuẩn bị hai dung d ị ch huyền phù ban đầu; các chất chọn lọc được bổ sung vào huyền phù ngay khi sử dụng phần mẫu thử để định lư ợ ng. Việc sử dụng qui trình này phải được ghi vào báo cáo kết quả thử nghiệm. Đ ể y ê n huyền phù ban đ ầ u 1 giờ ± 5 phút ở 20 ° C ± 2 ° C [ sử dụng tủ ấm 6.3 a), nếu cần ] , để phục hồi lại các vi sinh vật bị ức chế. Nếu sử dụng một dãy pha loãng th ì cần chuẩn bị sau khi đã phục h ồ i. 9.2. Cấy và nuôi ấm 9.2.1. Dùng pipet v ô trùng (6.9) chuyển 0,1 ml huyền phù ban đ ầ u (9.1) cho vào hai đĩa Thạch Listeria theo ottaviani và Agosti (B.3), đã đ ượ c làm khô trong tủ ấm (6.2) nếu c ầ n. Lặp lại qui tr ì nh này sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, nếu cần. CH Ú THÍCH Đ ố i với một s ố sản phẩm nhất định, khi c ầ n ước tính một l ượ ng nhỏ Listeria monocytogenes , th ì giới hạn định lượng có thể giảm đi 10 l ầ n bằng việc kiểm tra 1,0 ml huyền phù ban đ ầ u. Cho 1 ml dịch cấy lên b ề m ặ t m ô i trường thạch của đĩa Petri to (140 mm) hoặc trên kh ắ p b ề mặt môi trường thạch của ba đĩa Petri nhỏ (90 mm) sử d ụ ng que dàn m ẫ u vô trùng (6.6). Trong cả hai trường hợp, chuẩn bị kép bằng cách sử dụng hai đĩa to hoặc sáu đĩa nhỏ. 9.2.2. Dàn c ẩ n thận dịch cấy lên b ề mặt thạch càng nhanh càng tốt mà không chạm que dàn vào mép đĩa. Sử dụng mỗi que dàn mẫu v ô trùng cho mỗi đĩa [2] ) . Để y ê n các đĩa đ ã đậy nắp khoảng 15 phút ở nhiệt độ m ô i trường để d ị ch cấy hấp thụ vào thạch. 9.2.3. Lật ngược các đĩa thạch đã chuẩn bị trong 9.2.2 và đặt chúng vào tủ ấm [6.3 c)] ở 37 ° C . 9.3. Định lượng các khuẩn lạc đặc trưng 9.3.1. Sau khi ủ 24 gi ờ , và ủ tiếp 18 gi ờ đến 24 giờ nếu mọc yếu hoặc nếu không quan sát thấy khuẩn lạc nào sau khi ủ 24 giờ, kiểm tra các đĩa này (9.2.3) về sự có mặt của các khuẩn lạc giả định là Listeria spp. (xem 9.3.3). 9.3.2. Các khuẩn lạc màu xanh được bao quanh bởi qu ầ ng sáng đục (các khuẩn lạc điển h ì nh) được coi là L. monocytogenes . Nếu mọc rất thưa, hoặc nếu không quan sát thấy khuẩn lạc nào, hoặc nếu sau khi ủ 24 gi ờ ± 3 giờ mà không có mặt khuẩn lạc điển h ì nh nào, th ì ủ lại các đ ĩ a th ê m 24 gi ờ ± 3 giờ. CH Ú THÍCH 1 Một số chủng L. monocytogenes cho thấy qu ầ ng sáng rất yếu (th ậ m chí không có quầng s á ng) trong các t rường hợp bị ức chế , cụ thể là ứ c ch ế b ở i axit. CH Ú THÍCH 2 Một số chủng L . monocy t ogenes được đ ặ c trưng b ở i hoạt tính PIPCL (phospholipaza inositol phosphatidyl C) chậm. Các vi khuẩn như thế được phát hiện khi thời gian ủ t ă ng lên, ví dụ: 4 ngày. Một s ố các ch ủ ng như th ế có thể là loại gây bệnh (xem [1]). 9.3.3. Đếm tất cả các khuẩn lạc nghi ngờ là Listeria spp. (9.3.2) tr ê n t ừ ng đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc đặc trưng hoặc không đ ặ c trưng. 9.4. Khẳng định Listeria spp 9.4.1. Chọn lọc các khuẩn lạc để khẳng định 9.4.1.1. Sau khi ủ ấm (9.3.1), giữ lại các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc Listeria spp giả định ở tất c ả các độ pha lo ã ng và ở hai độ pha loãng liên tiếp, nếu có thể. Tr ê n mỗi đĩa được giữ lại, chọn năm khuẩn lạc. Nếu trên một đĩa c ó ít hơn năm khuẩn lạc thì lấy tất c ả để kh ẳ ng định. 9.4.1.2. Ria cấy các khuẩn lạc đã chọn l ê n b ề m ặ t đĩa thạch TSYEA (B.4) sao cho các khuẩn lạc mọc tách biệt rõ. Đặt các đĩa này trong tủ ấm [6.3 c) ] ở 37 ° C trong 18 giờ đến 24 gi ờ , ho ặ c cho đến khi có các khuẩn lạc mọc đủ. C á c khuẩn lạc điển hinh có đường kính từ 1 mm đến 2 mm , lồ i, không màu và toàn bộ mép mờ đục. Nếu các khuẩn lạc không tách biệt rõ th ì lấy một khuẩn lạc Listeria spp , điển h ì nh cho v à o một đĩa TSYEA kh á c. Tiến hành các phép thử sau đ â y tr ê n các khuẩn lạc của dịch cấy thu ầ n khiết tr ê n TSYEA. CHÚ THÍCH Có thể thực hi ệ n phép thử rọi Henry (xem phụ lục C và chú thích trong B.4.2). nếu cán. Màu của khuẩn lạc sau đ ó hơi xanh có b ề m ặ t nổi hạt. 9.4.2. Ph ả n ứng catalaza Lấy một khuẩn lạc tách biệt thu được trong 9.4.1.2 và hoà vào một giọt dung dịch hydro peroxit (B.10) tr ê n phi ế n kính. Sự hình thành ngay bọt khí chứng t ỏ ph ả n ứng dương t í nh [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]. 9.4.3. Nhuộm gram Tiến hành nhuộm Gram các khuẩn lạc đã tách trong 9.4.1.2 [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]. Listeria spp. cho Gram d ươ ng, dạng que ng ắ n và mảnh ( đường k í nh khoảng 0,4 m m đến 0,5 m m và dài từ 1 m m đến 2 m m). 9.4.4. Thử tính di động (nếu cần) [3] Lấy một khuẩn lạc tách biệt tốt thu được trong 9.4.1.2, hoà vào ống nghiệm đựng TSYEB (B.5). Ủ trong tủ ấm [6.3 b)] để 8 gi ờ đến 24 giờ ở 25 ° C cho đến khi quan sát thấy môi trường m ờ đục. Dùng que cấy (6.5) lấy một giọt dịch cấy ở tr ê n cho l ê n phiến kính thuỷ tinh sạch. Đậy lamen lên đỉnh và kiểm tra bằng kính hiển vi (6.14). Listeria spp có dạng h ì nh que ngắn, mảnh chuyển động hỗn loạn. Các chủng vi khuẩn mọc ở nhiệt độ tr ê n 25 ° C có thể không cho thấy chuyển động này. Phải lu ô n luôn so sánh với một chủng vi khuẩn đã biết trước. Các dạng trực c ầ u khuẩn lớn, hoặc các trực khuẩn chuyển động nhanh, dạng bơi thì không phải là Listeria spp. Một phép thử khác v ề tính di động, dùng kim cấy (6.5) lấy dịch cấy từ khuẩn lạc điển h ì nh tr ê n thạch TSYEA (9.4.1.2) cấy đ â m sâu vào môi truờng thạch di động (B.8). Ủ 48 giờ trong tủ ấm [6.3 b)] để ở 25 ° C . Kiểm tra kiểu mọc xung quanh vết cấy. Listeria spp. là loại di động, cho kiểu mọc điển h ì nh giống như cái ô. Nếu mọc chưa đủ, thì nuôi ấm th ê m 5 ngày và kiểm tra lại vết cấy. 9.5. Khẳng định L. monocytognes 9.5.1. Phép thử đặc tính phân giải huyết 9.5.1.1. Nếu các đặc tính hình thái, sinh lý học và phản ứ n g catalaza cho thấy có khả năng có Listeria spp., thì cấy l ê n các đ ĩa thạch huyết (B.6) để xác định phản ứng phân giải huyết cừu. Làm kh ô b ề mặt thạch trước khi sử dụng. Lấy một khuẩn lạc điển hình tách biệt tốt trong 9.4.1.2 và dùng que cấy (6.5) chấm vào mỗi ô một khuẩn lạc. Đ ồ ng thời chấm các chủng kiểm tra dương tính ( L. monocytogenes ) và â m tính ( L.innocua ). Sau khi ủ ở 37 ° C trong 24 giờ ± 2 gi ờ , kiểm tra các chủng từ mẫu thử và chuẩn so sánh. L. monocytogenes tạo ra các vùng sáng, trong và hẹp (phân giải huyết b ) [4] ) ; L. innocua có thể tạo ra vùng không trong xung quanh vết chấm. L. seeligeri tạo ra vùng ph â n giải huyết b yếu. L. ivanovii thường tạo ra các vùng vạch trong, rộng trong vùng phân giải huyết b . Đặt các đĩa vào vùng rọi sáng để so s á nh các chủng xét nghi ệ m với chủng chuẩn. 9.5.1.2. Phản ứng phân giải huyết cũng có thể được th ực hiện bằng phép thử CAMP (9.5.3) hoặc bằng cách sử dụng các tế bào huyết cầu trong huyền phù như sau đây. Hoà một khuẩn lạc vào 150 m l TSYEB (B.5); ủ 2 gi ờ ở 37 ° C . Thêm 150 m l huyền phù huyết cừu (B.12). Ủ 15 phút đến 60 phút ở 37 ° C , rồi để khoảng 2 gi ờ trong tủ l ạnh ở 3 ° C ± 2 ° C . Kiểm tra sự có mặt hay kh ô ng có mặt của ph ầ n giải huyết b . Nếu không xác định được phản ứng th ì để tiếp đến 24 giờ ở 3 ° C ± 2 ° C . 9.5.2. S ử dụng hydrat cacbon Sử dụng que cấy vòng (6.5) lấy dịch cấy thu được từ TSYEB (9.4.4) cấy vào từng ố ng canh thang hydrat cacbon (B.7). Nuôi ấm ở 37 ° C đến 5 ngày. Các phản ứng dư ơ ng tính (sinh axit) có màu tím đến vàng và ph ầ n lớn xảy ra trong vòng từ 24 giờ đến 48 gi ờ . 9.5.3. Phép thử CAMP Ria cấy các chủng Staphylococcus aureus và Rhodococcus equi (B.9.4) thành những vạch đơn ngang đ ĩ a thạch huyết cừu (B.6 hoặc B.9.3) sao cho hai vệt cấy này song song và c â n đối nhau tr ê n đĩa (xem h ì nh 1). Vết cấy c ầ n phải mảnh và đều. Điều này được thực hiện bằng cách giữ vòng cấy hoặc que cấy (6.5) vuông góc với mặt thạch. Ria cấy chủng xét nghiệm đã chuẩn bị trong 9.4.1.2 theo cách tương tự , vuông góc với các vệt cấy trên sao cho chủng xét nghiệm và các chủng cho phản ứng không chạm nhau nhưng phải rất gần nhau, cách nhau từ 1 mm đến 2 mm. Một vài chủng xét nghiệm có thể được ria cấy tr ê n cùng một đĩa thạch. Đồng thời, ria cấy các chủng đối chứng L. monocytogenes , L. innocua và L. ivanivii . Nếu dùng thạch huyết cừu (B.6), thi nuôi ấm các đĩa ở 37 ° C từ 18 giờ đến 24 gi ờ . Nếu dùng đĩa lớp kép (B.9.3) thì nuôi ấm các đĩa từ 12 gi ờ đến 18 gi ờ ở 37 ° C . Vùng phân giải huyết b ở điểm giao nhau của chủng xét nghiệm với m ỗ i chủng S .aureus và R.equi tăng lên thì được coi là phản ứng dương tính. Phản ứng dương tính v ớ i R.equi cho thấy một quầng ph â n giải huyết rộng (5 mm đến 10 mm) "h ì nh đ ầ u mũi tên". Phản ứng được coi là â m tính nếu một quầng phân giải huyết nhỏ trải ra chỉ khoảng 1 mm ở điểm giao nhau của chủng xét nghiệm v à vùng khuếch tán của chủng R.equi . Phản ứng dương tính với S .aureus cho thấy như một vùng tròn nhỏ từ qu ầ ng phân giải huyết lan rộng hơn chỉ khoảng 3 mm đến 4 mm so với chủng xét nghiệm và nằm trong vùng phân giải huyết b yếu do sự phát triển của chủng S .aureus. Các vùng phân giải huyết b rộng kh ô ng xuất hiện xung quanh vệt cấy của chủng S .aureus và L. monocytogenes. CHÚ THÍCH 1. Cấy các đ ĩ a thạch huyết lớp m ỏ ng (B.6 hoặc B.9.3) như tr ê n biểu đ ồ . Các vạch thẳng đứng biểu thị các vật c ấ y của các chủng S . aureus (S) và R. equi (R). Các đường ngang biểu thị các vệt cấy của chủng xét nghi ệ m. Các vùng gạch chéo cho thấy các vị tr í qu ầ ng phân giải huy ế t tăng lên. 2. Các vùng đánh dấu lấm chấm biểu thị vùng chịu ảnh hư ở ng của S . aureus . Hình 1 - Cấy v à diễn giải các đĩa thử CAMP 9.6. Diễn giải các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá T ấ t c ả các chủng Listeria spp. đều là các tr ự c khuẩn nhỏ, Gram dương di động (xem 9.4.4). Nếu qua phép rọi Henry, thì quan sát thấy chúng có màu xanh nhạt với b ề mặt nổi hạt. Chúng thư ờ ng dương tính với catalaza. L. monocytogenes được ph â n biệt với c á c loài khác bằng c á c đ ặ c trưng trong bảng 1. 9.7. Khẳng định cuối cùng Các chủng được coi là L. monocytogenes (9.6) có thể đưọc gửi tới phòng thử nghiệm chuẩn Listeria đã được công nh ậ n để kh ẳ ng định về huyết thanh học ho ặ c kiểu loại tiềm tan , nếu có thể ho ặ c sử dụng phư ơ ng pháp định danh bằng sinh học ph â n tử tin cậy khác. Việc g ửi đến phòng thử nghiệm phải kèm theo tất cả các thông tin có liên quan đến các chủng này. Bảng 1 - Các phản ứng nhận dạng Listeria spp. Các loài Phân giải huyết Sinh axit Thử CAMP Ramnoza Xyloza S. aureus R. equi L.monocytogenes L. innocua L. ivanovii L. seeligeri L. welshimeri L. grayi + - + (+) - - + v - - v - - - + + + - + - - (+) - - - - + - - - v = phản ứng có thể thay đổi; (+) = phản ứng yếu; + => 90% phản ứng dương tính; - = không phản ứng CHÚ THÍCH Hiếm khi gặp các chủng L . monocytogenes không cho thấy phân giải huyết b hoặc phản ứng CAMP dương tính dưới các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn này. 10. Biểu thị kết quả [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] 10.1. Đếm khuẩn lạc L. monocytogenes Tính số lượng a của các khuẩn lạc L. monocytogenes có mặt trong mỗi đĩa, theo công thức sau đây: trong đ ó b là s ố lượng khuẩn lạc phù hợp với các chuẩn cứ nhận dạng (9.6); A là số khuẩn lạc trên đĩa được chọn để khẳng định (9.4.1.1); C là tổng số khuẩn lạc đặc trưng đếm được trên đ ĩa (9.3.3); Làm tròn kết quả đến số nguyên. 10.2. Phương pháp tính 10.2.1. Trường hợp các đĩa ch ứ a í t hơn 150 khu ẩ n lạc L. monocytogenes , một trong s ố các đĩa chứa ít nhất 15 khuẩn lạc L. monocytogenes T í nh số lượng N của L. monocytogenes có mặt trong 1 ml ho ặ c 1 g sản phẩm, theo c ô ng thức sau đ â y: trong đó S a là tổng các khuẩn lạc L. monocytogenes tính được sau khi khẳng định, trên tất cả các đĩa được giữ lại từ hai độ pha loãng liên tiếp và trong đó ít nhất một dĩa có chứa ít nhất 15 khuẩn lạc. V là thể tích dịch cấy tr ê n mỗi đ ĩa, t í nh bằng mililit; n 1 l à số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất; n 2 l à số đ ĩa được giữ tại ở độ pha lo ã ng thứ hai; d là hệ s ố pha loãng t ươ ng ứng với độ pha lo ã ng thứ nhất được giữ lại. Làm tròn số các kết quả thu được đến hai chữ s ố có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218) ] . Lấy kết quả s ố L. monocytogenes trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc gam (sản phẩm dạng khác) là số thích hợp giữa 1,0 và 9 , 9 nh â n với lũy thừa tương ứng của 10. CHÚ THÍCH Ví dụ , xem TCVN 6404 (ISO 7218). 10.2.2. Ư ớ c tính s ố lượng nhỏ các khuẩn lạc 10.2.2.1. Nếu hai đĩa huyền phù ban đầu của mẫu thử, chứa ít hơn 15 khuẩn lạc L. monocytogenes , th ì t í nh số lượng các khuẩn lạc đã khẳng định trên mỗi đĩa, sử dụng công thức trong 10.1. Tính giá trị trung b ì nh y của các khuẩn lạc đếm được tr ê n hai đĩa. Biểu thị kết quả như sau: - số lư ợ ng ước tính L. monocytogenes có trong một gam hoặc m ộ t mililit N E = trong đó d là hệ s ố pha loãng của huyền phù ban đ ầ u; V là thể tích dịch cấy đã cấy tr ê n mỗi đĩa, tính bằng mililit; 10.2.2.2 Nếu hai đ ĩa huy ề n phù ban đ ầ u của mẫu thử kh ô ng chứa khuẩn lạc nào, thì biểu thị kết quả như sau: - ít hơn L . monocytogenes trong mililit hoăc trong gam sản phẩm. trong đó d là hệ s ố pha lo ã ng của huyền phù ban đ ầ u; V là thể tích dịch cấy đ ã cấy l ê n mỗi đ ĩ a, tính bằng mililit; 11. Độ chụm Xem TCVN 6404 (ISO 7218). 12. Kiểm soát chất lượng môi trường cấy Do chưa có tiêu chuẩn chung nào qui định về vấn đ ề này, nên thực hiện việc ki ể m tra khả n ă ng của môi trường nuôi cấy L. monocytogenes chọn lọc như sau: Cho dịch pha lo ã ng của dịch cấy đối chứng của các chủng L . monocytogenes vừa t ách xong và các chủng k iểm chứng âm tính (ví dụ: lactobac illi , Streptococcus ) vào b ì nh cầu kiểm chứng đựng môi trường tăng sinh chọn lọc ban đầu (xem 9.2). Cho vào mỗi bình cầu từ 10 t ế bào đến 100 tế bào L. monocytogenes hoặc các chủng kiểm chứng âm tính. Thục hiện với các bình kiểm chứng giống như đối với các chủng xét nghiệm để chứng minh rằng đã thu hồi lại đưạc chủng kiểm chứng dư ơ ng tính. 13. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ phương pháp đã sử dụng, nhiệt độ ủ và kết quả thu được . Báo cáo kết quả thử nghiệm cũng c ầ n phải đ ề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này. hoặc được xem là t ùy ý, cùng với mọi tình huống bất th ườ ng có thể ảnh h ư ởng đến kết quả. Báo c á o thử nghiệm cũng bao g ồ m các thông tin c ầ n thiết về việc nhận biết đ ầ y đủ mẫu thử. PHỤ LỤC A (qui định) Sơ đồ qui trình PHỤ LỤC B (qui định) Thành phần và cách chuẩn bị môi trường và thuốc thử B.1 . Dung dịch đệm pepton B.1.1 . Thành ph ầ n Dịch thuỷ phân mô động vật bằng e nz ym 10,0 g Natri clorua (NaCI) 5 , 0 g Dinatri hydro phosphat ngậm mười hai phân tử nước (Na 2 HP O 4 12H 2 O) 9 , 0 g Kali dihydro phosphat (KH 2 P O 4 ) 1,5 g Nước 1 000 ml B.1.2 . Chuẩn bị Hoà tan các thành ph ầ n trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH [sử dụng máy đo pH (6.7)], sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu c ầ n. Ph â n phối môi trường vào các bình c ầ u (6.8) có dung tích thích hợp để thu được các lượng cần thiết cho phép thử (xem 9.1). Khử trùng 15 phút trong n ồ i hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B.2 . Môi trường c ơ bản đối với canh thang nửa Fraser có sắt (III) amoni x i trat [xem TCVN 7700-1 (ISO 11290-1)] B.2.1 . Môi trường cơ bản đối vái canh thang nửa Fraser Dịch thuỷ ph â n m ô động vật bằng enzym 5 , 0 g Dịch thuỷ phân casein bằng enzym 5 , 0 g Cao thịt 5 , 0 g Cao men 5 , 0 g Natri clorua (NaCI) 20 , 0 g Dinatri hydro phosphat ngậm hai phân tử nước (Na 2 HP O 4 2 H 2 O) 12 , 0 g Kali dihydro phosphat (KH 2 P O 4 ) 1 , 35 g Aesculin 1 , 0 g Nước 1 000 ml B.2.1.2 . Chuẩn b ị Hoà tan các thành phần hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu c ầ n. Ch ỉ nh pH, sao cho sau khi khử trùng l à 7.2 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu c ầ n. Phân phối môi tr ườ ng vào các bình cầu (6.8) c ó dung tích thích hợp để thu được các lượng cần thiết cho phép thử (xem 9.1). Khử trùng 15 phút trong n ồ i hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B.2.2 . Dung dịch sắt (III) amoni xitrat B.2.2.1 . Th à nh ph ầ n Sắt (III) amoni xitrat 5 , 0 g Nước 100 ml B.2.2.2 . Chuẩn bị Hoà tan sắt (III) amoni xitrat trong n ư ớc. Khử trùng bằng cách lọc. B.2.3 . Chuẩn bị môi trường Ngay trước khi sử dụng, cho 1,0 ml sắt (III) amoni xitrat (B.2.2) vào mỗi phần 100 ml môi trường cơ bản đ ố i với canh thang nửa Fraser (B.2.1). B.3 . Thạch Listeria theo O ttaviani và Agosti (ALOA [5] ) ) B.3.1 Môi tr ường cơ bản B.3.1.1 Thành ph ầ n Dịch thuỷ phân mô động vật bằng enzym 18 g Dịch thuỷ phân casein bằng enzym 6g Cao men 10 g Natri pyruvat 2g Glucoza 2g Magie glyxerolphosphat 1 g Magie sulfat (khan) 0 , 5 g Natri clorua (NaCI) 5g Liti clorua 10 g Dinatri hydro phosphat (khan) 2 , 5 g 5-bromo - 4-cloro-3-indolyt- b -D-glucopyranosit 0 , 05 g Thạch 12 g đến 18 g a Nước 930 ml b a Tùy thuộc vào sức đông của thạch b 925 ml nếu sử dụng dung dịch amphoterixin B (xem B.3.5.2). B.3.1.2 . Chuẩn bị Hoà tan các thành ph ầ n hoặc m ô i trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nuớc bằng cách đun sôi. Khử trùng 15 phút trong n ồ i hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . Ch ỉ nh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,2 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu c ầ n. B.3.2 . Dung dịch axit nalidixic Muối natr i của axit nalidixic 0 , 02 g Natri hydroxit (0,05 mol/l) 5 ml Hòa tan muối natri của axit nalidixic tr ong 5 ml natri hydroxit và lọc để khử trùng. B.3.3. Dung dịch xeftazidim Xeftazidim 0 , 02 g Nước 5 m l Hòa tan xeftazidim trong 5 ml nước và lọc qua màng 0,45 m m để khử trùng. B.3.4 . Dung dịch polymyxin B Polymyxin B sulfat 76 700 IU Nước 5 ml Hòa tan polymyxin B trong 5 ml nước và lọc qua màng 0,45 m m để khử trùng. B.3.5 . Kháng sinh bổ sung B.3.5.1 . Dung dịch xycloheximit Xycloheximit 0,05 g Etanol 2 , 5 ml Nước 2 , 5 ml Hòa tan xycloheximit trong 2,5 ml etanol và sau đó thêm 2,5 ml n ư ớc. Lọc qua màng 0,45 m m để khử trùng. B.3.5.2 Dung dịch amphoterixin B (làm dung dịch thay thế cho xycloheximit) Amphoterixin B 0 , 01 g HCI (1 mol/l) 2,5 ml Dimetylformamit (DMF) 7,5 ml H ò a tan amphoterixin trong dung dịch HCI/DMF. Lọc qua màng 0,45 m m để khử trùng. C Ả NH BÁO - Dung dịch HCI/DMF rất độc, c ầ n thận trọng khi sử dụng. B.3.6 . Dung dịch bổ sung Hòa tan 2 g L- a -phosphatidylinositol (Sigma P 6636 [6] ) ) trong 50 ml nước lạnh. Khuấy khoảng 30 phút cho đến khi thu được dung dịch đ ồ ng nhất. Khử trùng 15 phút trong n ồ i hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ° C và làm nguội đến khoảng nhiệt độ từ 48 ° C đến 50 ° C . B.3.7 . Môi trường hoàn chỉnh B.3.7.1 . Thành ph ầ n Môi trường cơ bản (B.3.1) 930 ml a Dung dịch axit nalidixic ( B .3.2) 5 ml Dung dịch xeftazidim (B.3.3) 5 ml Dung dịch polymyxin B (B.3.4) 5 ml Dung dịch xycloheximit (B.3.5.1) hoặc dung dịch amphoterixin B (B.3.5.2) 10 m l Dung dịch bổ sung (B.3.6) 50 ml a 925 ml nếu sử dụng dung dịch amphoterixin B. B.3.7.2 . Chuẩn bị Cho các dung dịch tr ê n vào môi trư ờ ng cơ bản tan chảy đến 50 ° C , trộn kỹ sau m ỗ i lần th ê m. pH của môi trường ho à n chỉnh phải là 7,2 ± 0,2 ở 25 ° C . Môi trường hoàn chỉnh phải mờ đục đ ồ ng đều. B.3.7.3 Chuẩn bị các đĩa thạch Cho v à o mỗi đĩa Petri từ 15 ml đến 20 ml môi trường hoàn chỉnh vừa mới chuẩn bị, rồi để cho đông đặc B.4 . Môi trường nuôi cấy đặc: Thạch từ dịch chiết nấm men trypton dậu tương (TSYEA) B.4.1 Thành ph ầ n Dịch thuỷ ph â n casein bằng enzym 17 , 0 g Dịch thuỷ ph â n đậu tư ơ ng bằng enzym 3 , 0 g Natri clorua (NaCI) 5,0 g Dikali hydro phosphat (K 2 HP O 4 ) 2 , 5 g D-Glucoza 2 , 5 g Cao men 6 g Thạch 9 g đến 18 g 1 ) Nước 1 000 ml 1) Tùy thuộc vào sứ c đông của thạch. Hoà tan các thành ph ầ n hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu cần. Phân phối môi trường này vào các ống nghiệm có dung tích thích hợp để có được các lượng c ầ n thiết cho phép thử. Khử trùng 15 phút trong nối hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . Để yên trong tư thế nghiêng. Để chuẩn bị các đĩa thạch, phân phối vào các đĩa Petri vô trùng v ớ i các lượng m ô i trường thích hợp cho phép thử. Để yên cho đ ô ng đặc. CHÚ THÍCH Nếu th ực hiện phép thử rọi Henry, thì lớp môi trường phải m ỏ ng (khoảng 12 ml cho một đĩa có đường kính 90 mm). B.5 . Môi trường nuôi cấy lỏng: Canh thang từ dịch chiết nấm men trypton đậu tương (TSYEB) B. 5 .1 . Th à nh ph ầ n Dịch thuỷ ph â n casein bằng enzym 17,0 g Dịch thuỷ ph â n đậu tương bằng enzy m 3 , 0 g Natri clorua (NaCI) 5,0 g Dikali hydro phosphat (K 2 HPO 4 ) 2,5 g D-Glucoza 2 , 5 g Cao men 6g Nước 1 000 ml B. 5 .2 . Chuẩn bị Hoà tan các thành ph ầ n hoặc môi trư ờ ng hoàn chỉnh kh ô trong nước bằng cách đun sôi, nếu cần. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu c ầ n. Phân phối m ô i trường này vào các ống nghiệm hoặc bình có dung tích thích hợp để có được các lượng cần thiết cho phép thử. Khử trùng 15 phút trong n ồ i hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B.6. Thạch huyết cừu B.6.1 . Môi trường cơ bản B.6.1.1 . Thành ph ầ n Dịch thuỷ phân mô động vật bằng enzym 15 g Dịch thuỷ ph â n gan bằng enzym 2 , 5 g Cao men 5g Natri clorua (NaCI) 5g Thạch 9 g đến 18 g 1) Nước 1 000 ml 1) Tùy thuộc vào sức đông của thạch. B.6.1.2 . Chuẩn bị Hoà tan các thành ph ầ n hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,2 ± 0,2 ở 25 ° c , nếu cần. Phân phối môi trường này vào các bình có dung tích thích hợp để có được các lượng cần thiết cho phép thử. Khử trùng 15 phút trong nỗi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 ° C . B.6.2 . Môi trư ờ ng hoàn chỉnh B.6.2.1 . Thành ph ầ n Môi trường cơ bản (B.6.1) 100 ml Huyết c ừu đã khử fibrin 5 ml đến 7 ml B.6.2.2 Chuẩn bị Cho huyết cừu vào m ô i trường cơ bản đã làm nguội đến 47 ° C . Trộn đều. Ph â n phối m ô i trường này vào các đĩa Petri v ô trùng với các lượng thích hợp cho phép thử. Để yên cho đ ô ng đặc. B.7 . Canh thang sử dụng cacbohydrat (ramnoza và xyloza) B.7.1 . Môi trường cơ bản B.7.1.1. Thành phần Dịch th ủy phân m ô động vật bằng enzym 10 g Cao thịt 1 g Natri clorua (NaCI) 5 g Bromocresol t í a 0 , 02 g Nước 1 000 ml B.7.1.2 Chuẩn b ị Hoà tan các th à nh phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu c ầ n. Ch ỉ nh pH, sao cho sau khi khử trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu c ầ n. Ph â n phối môi trường này vào các ống nghiệm c ó dung tích thích hợp để có được các lượng c ầ n thiết cho phép thử. Khử trùng 15 phút trong n ồ i hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ° C . B.7.2 Dung dịch hydrat cacbon B.7.2.1 Thành ph ầ n Hydrat cacbon 1) 5g Nước 100 ml 1) L -Ramnosa hoặc D-xylosa B.7.2.2 . Chuẩn bị Hòa tan riêng rẽ từng hydrat cacbon vào 100 ml nước. Lọc để khử trùng. B.7.3 . Môi trường hoàn chỉnh Đối với từng loại hydrat cacbon, thêm x ml dung dịch B.7.2 vào 9x ml m ô i tr ư ờng cơ bản (B.7.1). B.8 . Môi trường thạch di động B.8.1. Thành phần Dịch thuỷ phân casein bằng enzym 20 , 0 g Dịch thuỷ phân mô động vật bằng enzym 6,1 g Thạch 3,5 g Nước 1 000 ml B. 8 .2 Chuẩn bị Hoà tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu cần. Ph â n phối môi trường này với các lượng 5 m l vào các ống nghiệm. Khử trùng 15 phút trong n ồ i hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ° C . B.9 . Môi trường CAMP (Christie, Atkins, Munch-Paterson) v à chủng xét nghiệm Đối với phép thử này có thể sử dụng các đĩa thạch huyết cừu (B.6), nhưng tốt nhất là sử dụng các đĩa thạch hai lớp c ó lớp môi trư ờ ng huyết cừu rất mỏng (xem B.9.3). B.9.1 . M ô i trường cơ b ả n Xem B.6.1. B.9.2 . M ô i trưởng huyết cừu Xem B.6.2. B.9.3 . Môi trư ờ ng hoàn chỉnh Phân phối môi trường cơ bản (B.9.1) vào các đĩa Petri vô trùng, với các lượng khoảng 12 ml cho mỗi đĩa Petri đường kính 90 mm, để y ê n cho đông đặc. Rót đều một lớp rất mỏng môi trường huyết cừ u ( B .9.2) với các lượng không lớn hơn 3 ml trên một đ ĩa. Để yên cho đông đặc. Nếu cho môi trường huyết cừu vào các đĩa m ô i trường cơ b ả n đã chuẩn bị trước, thì có thể phải làm ấ m các đĩa này 20 phút bằng cách đặt chúng vào tủ ấm để ở 37 ° C trước khi rót lớp môi trường huyết cừu. B.9.4 Các chủng phản ứng CAMP Chủng ph â n giải huyết b của S . aureus (ví dụ: NCTC 1803 hoặc ATCC 25923), chủng R.equi (v í dụ: NCTC 1621 hoặc ATCC 6939) và chủng L. monocytogenes (ví dụ: NCTC 11994) cần phải qua phép thử CAMP. Không phải tất cả các chủng S . aureus và chủng L. monocytogenes đều thích hợp đối v ớ i phép thử CAMP. Bảo quản các chất cấy gốc của S . aureus , R. equi , L. monocytogenes , L. innocua và L. ivanivii bằng cách nuôi cấy lên môi trường TSVEA (B.4) đổ nghiêng, nu ô i ấm ở 37° C từ 24 giờ đến 28 gi ờ , hoặc cho đến khi thấy mọc và bảo quản trong tủ lạnh +3 °C ± 2 ° C . C ấy truyền ít nhất một l ầ n trong một tháng và khẳng định độ thuần khiết của chúng bằng cách ria cấy lên các đĩa thạch TSYEA (B.4). B.10 . Dung dịch hydro peroxit Sử dụng dung dịch 3 % (m/m). B.11 . Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (tùy chọn) B.11.1. Thành ph ầ n Dinatri hydro phosphat ngậm hai phân tử nước (Na 2 HP O 4 . 2H 2 O) 8,98 g Natri dihydro phosphat (NaH 2 PO 4 ) 2 , 71 g Natri clorua (NaCI) 8 , 5 g Nước 1 000 ml B.11.2 . Chuẩn bị Hoà tan các thành phần trong nước. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 7.2 ± 0,2 ở 25 ° C , nếu c ầ n. Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121 ° C . B.12 . Huy ề n phù huyết cầu cừu (tùy chọn) Giữ tế bào huyết cừu ở +3 ° C ± 2 ° C truớc khi sử dụng. Trước khi sử dụng phải kiểm tra dấu hiệu phân giải huyết (bị đỏ) trong l ớ p huyết thanh phía trên. Nếu không ph â n giải huyết, th ì lấy 2 ml lớp tế bào đỏ phía dưới cho vào 98 ml dung dịch đệm PBS (B.11). Nếu thấy xuất hiện ph â n giải huyết, thì hòa khoảng 4 ml lớp tế bào đỏ trong 10 ml d ung dịch đệm PBS và trộn nhẹ, rồi ly t â m. Nếu thấy có lớp nổi phía trên màu đỏ chứng t ỏ có sự phân giải huyết, th ì không sử dụng nữa và loại bỏ huyền phù gốc này. Nếu không thì gạn lớp nổi phía trên và cho 2 ml huyền phù tế bào này vào 98 ml dung dịch đệm PBS. Bảo quản huyền phù này đến 5 ngày ở +3 ° C ± 2 ° C . N ế u thấy xuất hiện ph â n giải huyết thì loại b ỏ . PHỤ LỤC C (tham khảo) Phép thử rọi Henry Kiểm tra các đĩa, sử dụng nguồn ánh sáng tr ắ ng, đủ để rọi tốt các đĩa, rọi vào đáy đĩa một góc 45° (xem h ì nh C.1). Khi được kiểm tra dưới ánh sáng truyền trệch góc này (rọi Henry) trực tiếp trên đĩa, th ì các khu ẩ n lạc Listeria spp cho thấy có màu xanh nhạt và bề mặt nổi hạt. Hình C.1 - Kiểm tra các đĩa về khuẩn lạc nghi ngờ THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] LECLERCQ. A. Colonial atypical morphology and low recoveries of Listeria monocytogenes strains on Oxford, PALCAM, Rapid’L.mono and ALOA solid media. J. Microbiol. Methods 57 , 2004, pp.251- 258 . [1] Tại thời điểm ban hành ISO này, ISO 6887:1993 đang được soát xét và đến nay đã được ban hành. [2] Đối với một m ẫ u đã cho c ó thể sử dụng cùng một bộ dàn m ẫ u, bằng cách bắt đ ầ u với độ pha lo ã ng cao hơn. [3] Việc Kiểm tra này là kh ô ng c ầ n thiết nếu người ph â n tích thường xuy ê n ph â n tích phát hiện L .monocytogens . [4] Vùng ph â n gi ải huyết b c ó th ể nhìn th ấ y rõ hơn bằng cách chuyển b ấ t kỳ một khuẩn lạc mọc trên b ề m ặ t đĩa thạch xung quanh dịch cấy đ ánh dấu. [5] ALOA là một v í dụ v ề môi trường thích hợp có bán s ẵ n. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiê u chuẩn và tổ chức ISO không ấn định phải sử dụng s ả n phẩm này. Có thể sử dụng các m ô i trường kh á c nếu chúng cho các kết qu ả tương đư ơ ng. [6] P6636 là t ê n thương mại của sản ph ẩ m do h ã ng Sigma cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử d ụng tiêu chuẩn và tổ chức ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng sản phẩm khác nếu chúng cho các kết qu ả tương đương.