TCVN11201:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11201:2016 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng sulfamethazin bằng phương pháp sắc kí lỏng có tạo dẫn xuất sau cột TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 11201:2016 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SULFAMETHAZIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG CÓ TẠO DẪN XUẤT SAU CỘT Animal feeding stuffs - Determination of sulfamethazine content by liquid chromatographic method using post-column derivatization Lời nói đầu TCVN 11201:2016 được xây dựng dựa theo AOAC 999.16 Sulfamethazine in Animal Feeds. Liquid Chromatographic-Post - Column Derivatization Method; TCVN 11201:2016 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục T iê u chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SULFAMETHAZIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP S Ắ C KÍ L Ỏ NG CÓ TẠO DẪN XU Ấ T SAU CỘT Animal feeding stuffs - Determination of sulfamethazine content by liquid chromatographic method using post-column derivatization C Ả NH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các v ậ t liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc s ử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này cần thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định sulfamethazin trong thức ăn chăn nuôi lợn và trâu bò bằng sắc kí lỏng có tạo dẫn xuất sau cột (LC-PCD). Khoảng định lượng sulfamethazin của phương pháp từ 0,005 mg/kg đến 0,22 mg/kg. Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục B. Phương pháp này kh ô ng áp dụng để phân tích sulfathiazol. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công b ố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có). TCVN 6952 (ISO 9498) Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử. 3 Nguyên tắc Mẫu nghiền được bổ sung chất chuẩn nội sulfamerazin, sau đó được chiết b ằ ng dung môi chiết của hỗn hợp axit clohydric 0,2 M và dietylamin 1,5% trong metanol 25%. Sulfamethazin được tách ra bằng sắc k í lỏng ( L C) và được đo ở bước sóng 450 nm , có tạo dẫn xuất sau cột với dimetylaminobenzaldehyd. 4 Thuốc thử 4.1 Nước cấ t hoặc nước đã loại khoáng dùng cho LC . 4.2 Metanol, loại dùng cho LC. 4.3 Axit axetic, 2% Pha loãng 20 ml axit axetic b ằ ng trong 1 lít nước. 4.4 Axetonitril, loại dùng cho LC. 4.5 Axit oxalic, 0,2 M Hòa tan 25,2 g axit oxalic ngậm hai phân tử nước (khối lượng phân từ = 126,07 g) trong nước (4.1) đựng trong bình định mức 1 lít và thêm nước đến vạch, 4.6 Dietylamin, 1,5%. 4.7 Chất chuẩn sulfamethazin (SMT) 4.8 Dimetylaminobenzaldehyd (DMAB), có thể dùng loại Sigma D 2004 1) (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) hoặc loại tương đương. 4.9 Hydroquinon (HQ). 4.10 Sulfamerazin (SMR). 4.11 Dung môi chiết, hỗn hợp của axit clohydric (HC l ) 0,2 M và dietylamin 1,5% (4.6) trong metanol 25% Cho khoảng 300 ml nước và 16,7 ml ax i t clohydric đặc (nồng độ từ 36,5% đến 37% khối lư ợ ng/thể tích) v à o bình định mức 1 lít có chứa 250 ml metanol (4.2), trộn đều. Thêm 15 ml dietylamin, thêm nước gần đến vạch và trộn, ch ỉ nh đến nhiệt độ môi trường, sau đó thêm nước đến vạch và trộn. pH của dung môi chiết này được thiết kế để sử dụng với 5 g mẫu thử, khả năng đệm của phần mẫu thử lớn hơn sẽ cần đến một lượng dung môi chiết lớn hơn tương ứng hoặc nồng độ axit clohydric cao hơn. Độ pH của dịch chiết nên xấp xỉ 2. 4.12 Dung dịch pha loãng, axit clohydric 0,15 M và dietylamin 1,5% (4.6) trong metanol 25% Chuẩn bị theo 4.11 nhưng sử dụng 12,5 ml axit clohydric đặc. 4.13 Dung dịch chuẩn nội 4.13.1 Dung dịch chuẩn gốc SMR, 1 mg/ml Cân khoảng 0,1 g SMR (4.10), cho vào bình định mức 100 ml. Hòa tan và pha lo ã ng đến vạch b ằ ng dung m ô i chiết (4.11). Thêm từ 2 giọt đến 5 giọt axit clohydric đặc, siêu âm để hòa tan. Dung dịch bền khi được bảo quản ở nơi tối. 4.13.2 Dung dịch bổ sung chất chuẩn nội 4.13.2.1 Dung dịch chuẩn nội A , khoảng 100 μg/ m l Pha loãng 10 ml dung dịch chuẩn gốc SMR (4.13.1) đến 100 ml bằng dung môi chiết (4.11). 4.13.2.2 Dung dịch chuẩn nội B, khoảng 200 μg/ml Pha loãng 20 ml dung dịch chuẩn gốc SMR (4.13.1) đến 100 ml bằng dung môi chiết (4.11). 4.13.2.3 Dung dịch chuẩn nội C, khoảng 400 μg/ml Pha loãng 20 ml dung dịch chuẩn gốc SMR (4.13.1) đến 50 ml bằng dung môi chiết (4.11). CH Ú TH Í CH : Các dung dịch chuẩn nội B và C ch ỉ sử dụng đ ối v ớ i thức ăn chăn nuôi ch ứ a hàm lượng SMT lớn hơn 0,016% (xem B ả ng 2). 4.14 Dung dịch chuẩn SMT 4.14.1 Dung dịch chuẩn gốc SMT, khoảng 1,1 mg/ml Cân ch í nh x á c từ 0,105 g đến 0,115 g chất chu ẩ n SMT (4.7) (khối lượng thực = W s ) cho vào bình định mức 100 ml. Hòa tan và pha loãng tới vạch bằng dung môi chiết (4.11), siêu âm đ ể hòa tan. Dung dịch này bền khi được bảo quản ở nơi tố i . 4.14.2 Dung dịch chuẩn trung gian SMT, khoảng 55 μg/ml Pha loãng 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc SMT (4.14.1) đến 200 ml bằng dung dịch pha loãng (4.12). 4.15 Dung dịch chuẩn làm việc SMT-SMR, nồng độ SMT (4.7) khoảng 5,5 μg/ml và nồng đ ộ SMR (4.10) khoảng 5,0 μg/ml. Pha loãng 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian SMT (4.14.2) và 5,00 ml dung dịch bổ sung chất chuẩn nội A (4.13.2.1) đến 100 ml bằng dung dịch pha lo ã ng (4.12) rồi trộn. Th ể tích dung dịch pha loãng của chất chuẩn D s = 20 000 ml (xem Bảng 1). Nếu sử dụng dung môi chiết (4.11) thay cho dung dịch pha loãng (4.12) thì dung dịch sẽ có độ axit quá cao và h ì nh dạng pic bị xấu đi. CHÚ TH Í CH: Dung dịch này cần được chuẩn bị mới trong ngày sử dụng, tránh ánh sáng khi không sử dụng. Bảng 1 - Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn sulfamethazin/sulfamerazin Nồng độ SMT, μ g/m L a Thể tích dung dịch chuẩn trung gian b (4.14.2), ml Thể tích dung dịch chuẩn nộ i A (4.13.2.1), ml Pha loãng đ ến, ml Thể tích dung dịch pha loãng của ch ấ t chu ẩ n, D s c , ml 1,1 2,0 5,00 100,0 100 000 2,2 4,0 5,00 100,0 50 000 5,5 10,0 5,00 100,0 20 000 6,6 12,0 5,00 100,0 16667 a Nồng độ thực tế của SMT , b Dung dịch chuẩn trung gian SMT (khoảng 55 μg/ml). c D s là tổng th ể tích pha loãng của chất chuẩn, ml. 4.16 Thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột, nồng độ DMAB (4.8) 15 mg/ml và nồng độ HQ (4.9) 0,5 mg/ml Hòa tan 3,0 g DMAB (4.8) và 0,1 g HQ (4.9) trong 100 ml axit axetic băng (nồng độ không nhỏ hơn 99,7%). C ẩ n thận thêm 60 ml metanol (4.2) và trộn đều. Thêm 40 ml nước (4.1), trộn đều và lọc chân không. Loại khí khoảng từ 2 min đến 3 min bằng chân không trong vẫn khi khu ấ y. Khi được bảo quản ở nơi tối, dung dịch này c ó thể bền được hơn một tháng. CHÚ TH Í CH: Nếu tiến hành phân tích nhiều hơn vài mẫu th ì tăng lượng thuốc thử sử dụng. CẢNH BÁO: Tránh tiếp xúc thuốc thử này với da hoặc quần áo. 4.17 Pha động, hỗn hợp axetonitril (4.4) và axit axetic 2% (4.3) (tỷ lệ thể tích 17 : 83) hoặc được điều chỉnh để tối ưu hóa cho sắc k í . C ó thể sử dụng pha động thay thế: hỗn hợp của axeton i tr i l (4.4), metanol (4.2) và axit axetic 2% (4.3) (tỷ lệ thể tích 4 : 16 : 80) hoặc hỗn hợp của [A] a xeton i tril (4.4) và metanol (4.2) (tỷ lệ thể tích 2 : 3), cộng với [B] axit axetic 2% (4.3), với tỷ lệ thể tích A : B = 20 : 80 nếu pha trộn bằng thiết bị. Các t ỷ lệ khác giữa axetonitril v à metanol có thể được tối ưu cho các loại cột cụ th ể . Việc sử dụng pha động thay thế có th ể gây ra sự thay đổi đáng k ể các y ế u tố gây nhiễu pic và do đ ó tăng độ phân giải pic sul f onamid. Độ ph â n giải sulfonamid trên một số cột cũng có thể được cải thiện b ằ ng cách sử dụng các pha động thay thế. 5 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thủy tinh của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau: 5.1 Máy sắc kí lỏng, có thể duy tr ì được dòng ổn định của pha động với bộ lấy mẫu tự động. Th ể tích bơm từ 10 μl đến 200 μl (xem 8.1); tốc độ dòng pha động từ 1 ml/min đến 1,3 ml/min. 5.2 Detector UV/Vis, đo được ở bước sóng 450 nm, có độ nhạy đáp ứng yêu cầu nêu trong 8.1. 5.3 Cột sắc kí Cột pha đảo C18 hoặc C8, đáp ứng yêu cầu nêu trong 8.1. Sử dụng cột bảo vệ. Ví dụ: Spherisorb ODS2 2) (dài 250 mm, đường kính trong 4,6 mm, cỡ hạt 5 μm), GL Science's Inerts i l ODS2, 5 μm, 25 cm và Macherey-Nagel’s Nucleosil 120A, 5 μm, 25 cm là các loại cột phù hợp. 5.4 Hệ thống bơm thuốc thử sau cột, có thể duy trì dòng ổn định của thu ố c thử từ 0,5 ml/min đến 1.5 ml/min. Có thể cần làm kín bơm bằng Teflon. Áp lực tối đa > 14 MPa (2000 psi) là thích hợp. 5.5 Vòng phản ứng, ống Teflon c ó đường kính ngoài 1,5 mm, đường kính trong 0,5 mm x 3048 mm, sử dụng cho hệ sau cột. 5.6 Ống trộn chữ T Ống chữ T có đường kính 1,5 mm, thể tích chết bằng 0 đ ể chất phân tích qua cột được trộn đều với thuốc thử vào vòng phản ứng trước khi vào detector. 5.7 Xyranh lọc mẫu, có thể dùng xyranh Nylon 66 có đầu lọc (c ỡ lỗ 0,2 μm). 5.8 Máy ly tâm, có thể ly tâm các ống 50 ml ở lực ly tâm 1200g. 6 Lấy mẫu M ẫ u gửi đến phỏng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong su ố t quá trình vận chuy ể n hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thúc ăn chăn nuôi - Lấy mẫu. 7 Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498). 8 Cách tiến hành 8.1 Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống CHÚ THÍCH: Nếu thực hiện phép xác định bằng th ủ công th ì các thông số sử dụng về đ ộ phân giải v à tính độ nghiêng pic c ầ n được đo từ sắc kí đồ được ghi ở tốc độ nhanh (khoảng 5 cm/min) và đ ộ n hạy được điều ch ỉ nh để cho các pic bằng hoặc lớn hơn 80% trên to à n thang đo. 8.1.1 Độ phân giải của hệ thống Chuẩn bị chất chuẩn để phân giải hệ thống như chất chuẩn làm việc không bao gồm sulfathiazol ở cùng nồ n g độ như SMR. Dung dịch này dùng kiểm tra chất lượng và có thể bền trong vài tháng nếu được bảo quản ở nơi tối. Khi bắt đầu và cuối mỗi dãy phân tích, cần kiểm tra độ phân giải của sulfonamid. Thứ tự rửa giải là STZ, SMR, SMT (xem Hình A.1). Hệ thống (máy sắc kí lỏng, cột và detector) cần cho phép tách các pic STZ, SMR v à SMT ra khỏi nhau và ra khỏi các chất được chi ế t cùng. Cặp pic SMR-SMT phải có độ phân giải đường nền tốt và các pic không có đuôi kéo dài. Nếu STZ (k’ ≥ 1) có mặt trong mẫu SMT như chất nhiễm bẩn thì phải tách STZ ra khỏi SMR đ ể đo. 8.1.2 Độ chụm của thể t í ch bơm Bơm lặp lại trên năm lần ch ấ t chuẩn làm việc (hoặc dung dịch khác có ch ứ a nồng độ SMT và SMR thích hợp). Độ lệch chuẩn tương đối của tỷ lệ tín hiệu pic SMT/SMR phải nh ỏ hơn 2%. 8.1.3 Độ tuyến t í nh của hệ thống Chu ẩ n bị đường chuẩn bốn điểm tr ê n khắp dải nồng độ SMT trong khoảng từ 1 μg/ml đến 6 μg/ml (xem Bảng 1). Sử dụng cùng một nồng độ chất chuẩn nội. Dựng đường chuẩn của tín hiệu pic ch ấ t phân tích với chất chuẩn nội so với nồng độ chát phân tích. Đường chuẩn phải tuyến tính và đi qua gốc tọa độ. 8.1.4 Độ nhạy của hệ thống Kh i độ nhạy của detector được thiết lập để tạo ra chiều cao pic của dung dịch chuẩn làm việc SMT từ 50% đến 80% trên toàn thang đo, th ì chiều cao pic SMT của dung dịch chuẩn làm việc có độ pha loãng 1/10 phải bằng hoặc lớn hơn bốn l ầ n độ nhiễu đường nền. 8.2 Chiết Cân từ 4,75 g đến 5,25 g mẫu thử đã nghiền và trộn kỹ ( W u ), chính xác đến 0,001 g, chuyển sang bình nón 250 ml. M ẫ u thức ăn chăn nuôi chứa SMT thường được nghiền nh ỏ đ ể thu được độ lặp lại tốt. Nghiền khoảng 5 g mẫu cho lọt qua sàng cỡ lỗ 0,75 mm, sau đó nghiền lần hai để mẫu lọt qua s à ng cỡ lỗ 0,5 mm. Kiểm tra quá trình nghiền và trộn đ ể thu được độ chụm thích hợp. Thêm khoảng 100 ml dung môi chiết (4.11), sau đó thêm một l ư ợ ng dung dịch thêm chu ẩ n nội (xem Bảng 2 và 4.13.2). Đậy bình bằng nắp polyetylen (có thể đ ể qua đêm). Thể tích dung môi chiết không cần thiết phải chính xác 100 ml vì phép tính dựa trên lượng chất chuẩn nội được bổ s ung; thứ tự bổ sung dung môi chiết và dung dịch chuẩn nội rất quan trọng. Bàng 2 - Dung dịch thêm chất chuẩn nội/độ pha loãng của dịch chiết Hàm lượng SMT công bố trên nhãn mg/kg Dung dịch chuẩn nội a Thể tích dung dịch chuẩn nội, ml D ịch chiết pha loãng tiếp theo Thể tích dung dịch pha loãng của mẫu thử, D u b , ml 50 đến 160 A (4.13.2.1) 5,00 Không 100 170 đến 300 B (4.13.2.2) 5,00 25/50 200 310 đến 600 C (4.13.2.3) 5,00 25/100 400 1100 Gốc (4.13.1) 5,00 10/100 1000 2200 Gốc (4.13.1) 10,00 10/200 2000 a Xem 4.13. b D u l à tổng thể tích dung dịch pha loãng mẫu đ ã sử dụng đ ể tính kết quả. Lắc 1 h (l ắ c bằng tay và x ả áp trước khi lắc bằng máy). Dùng băng dính để giữ nắp. Để cho các hạt to lắng x uố ng và r ó t dịch chiết sang ống ly tâm 50 ml. Có thể giữ qua đ ê m ở 4 °C (để làm trong) hoặc ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết được làm trong nhanh hơn nếu trước đó được làm lạnh trong b ể nước đá từ 30 min đến 60 min. Ly tâm 5 min ở 2000 r/min (khoảng 1200 g ). Tiếp tục pha loãng dịch chiết có ch ứ a hàm lượng chất phân tích cao hơn so với dịch pha loãng (theo Bảng 2). Lọc một phần qua bộ lọc (5.7) và bơm. 8.3 Chạy sắc kí 8.3.1 C ấ u hình LC-PCD 8.3.2 Điều kiện sắc kí - Cột (5.3); - Pha động (4.17); - Tốc độ dòng của pha động: 1,1 ml/min của thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột (4.16): từ 0,6 ml/min đến 0,7 m l/min; - Thể tích bơm: 10 μl; - Dung dịch chuẩn làm việc đậm đặc (4.15), nồng độ SMT ( C s ) khoảng 5,5 pg/ml; - Bước sóng detector: 450 nm. Ổ n định cột: cột được bảo quản trong dung môi hữu cơ (axetonitril hoặc metanol), bơm axetonitril trong v à i phút, sau đó bằng axetonitril 17% trong axit axetic 2%. Cần có các điều kiện phù hợp đ ể đáp ứng phép thử sự phù hợp của hệ thống. 8.3.3 Khởi động hệ thống LC-PCD Trong khi bơm pha động, đưa hệ thống sau cột vào vận hành. Để cho hệ thống cân bằng cho đến khi thu được đường nền ổn định (từ 10 min đến 30 min). Tốc độ dòng tối ưu là từ 1 ml/min đến 1,5 ml/min đối với pha động, 0,5 ml/min đến 1 ml/min đối v ớ i thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột, c ò n tốc độ dòng pha động là 1,1 ml/min và tốc độ dòng của thuốc thử khoảng 0,7 ml/min là đạt yêu cầu. Cầ n chỉnh để có được đường nền và độ đáp ứng của chất phân tích tối ưu. Nguyên nh â n gây nhiễu đường nền có thể là: - giảm xung của thuốc thử t ừ bơm PCD, không đáp ứng yêu cầu; - giảm xung của bơm LC không đáp ứng yêu cầu; - thời gian đáp ứng của detector được cài đặt không đúng; - van bơm bị rò rỉ; - đèn của detector không ổn định ( đ ặc biệt là nếu sử dụng đèn hydro); - có mặt bọt khí trong cuvet dòng chảy của detector; - vòng phản ứng đã cũ; - tốc độ dòng của pha động và thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột được chỉnh chưa đúng (với pha động khoảng 1,3 ml/min, tăng tốc độ dòng thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột trong khoảng từ 0 , 5 ml/min đến 0,75 ml/min để hiệu chỉnh độ nhiễu đường nền). 8.4 Xác định - Bơm dung dịch chuẩn phân giải hệ thống (xem 8.1.1) và chỉnh độ nhạy/th ể tích bơm để c ó chiều cao pic từ 50% đến 80% trên toàn thang đo. Ghi lại h ì nh dạng pic và độ phân giải đạt yêu cầu. CHÚ TH Í CH: Thời gian ph â n tích l à 12 min đ ến 20 min tùy thuộc vào pha động đư ợ c s ử dụng. - Tiến hành bơm dung dịch chuẩn làm việc từ hai lần trở lên để đảm bảo tín hiệu pic ( đ ộ lệch chuẩn tương đ ố i của tín hiệu pic <> - Bơm các dung dịch chuẩn làm việc r ồ i bơm tiếp các dung dịch thử nghiệm. C ứ hai lần bơm mẫu lại bơm dung dịch chuẩn làm việc. Trong hệ thống ổn định, có thể bơm nhiều dung dịch thử giữa các lần bơm dung dịch chuẩn. - Nghiên cứu sắc k í đồ để xác định kết quả đo pic bằng điện t ử (độ chụm, p i c phân tích, đường nền), nếu không thì xác định chiều cao pic theo phương pháp th ủ công. - Tính tỷ lệ tín hiệu pic SMT/SMR. Nếu các tỷ lệ tín hiệu của dung dịch chuẩn làm việc chạy ngẫu nhiên th ì sử dụng giá trị trung bình để tính kết quả, nếu không phải ngẫu nhiên thì gộp các t ỷ số của dung dịch chuẩn làm việc của từng giai đoạn lấy trung bình để tính kết quả. 8.5 Làm sạch cột LC sau khi phân tích Th á o cột ra khỏi bộ trộn chữ T (5.6), cài đặt chương trình từ pha động sang 100% nư ớ c và để từ 20 ml đến 30 ml nước chảy qua, sau đó cài đặt để 100% pha dung môi hữu cơ chảy qua (khoảng 10 min). Cho khoảng 20 ml đến 30 ml pha hữu cơ đi qua cột trước khi dừng máy LC và bảo quản cột trong pha hữu cơ. Nếu cột có độ phân giải và h ì nh dạng pic b ị suy giảm t hì có thể sử dụng dung dịch axit oxalic 0,2 M (4.5) để l à m mới cột. Cài đặt chương trình để bảo quản cột: bơm từ 20 ml đến 30 ml nước; bơm 20 ml đến 30 ml axit oxalic 0,2 M, rồ i bơm 20 ml đến 30 ml nước và bảo quản trong pha hữu cơ. 8.6 Làm sạch hệ thống sau cột (kể cả vòng phản ứng và detector) Sau khi tháo cột LC ra khỏi bộ trộn chữ T, nối đầu ra của bơm LC vào bộ chữ T và bơm metanol (khoảng 10 min) tiếp theo bơm isopropanol (từ 10 min đến 15 min) qua hệ thống. Metanol là dung môi tốt nhất đ ể làm sạch thuốc thử khỏi đường ống và detector; isopropanol là chất bảo vệ độ kín của hệ thống. 9 Tính kết quả Hàm lượng sulfamethazin c ó trong mẫu, X 1 , t í nh bằng phần trăm (%) khối lượng theo công thức sau: X 1 = R u x W s x D u x P s x 100 R s x W u x D s Hàm lượng sulfamethazin có trong mẫu, X 2 , tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg) theo công thức sau: X 2 = R u x W s x D u x P s x 10 6 R s x W u x D s Trong đó: R s là tỷ lệ tín hiệu của thiết bị đối với chất chuẩn; R u là tỷ lệ tín hiệu của thiết bị đối với mẫu thử; W s là khối lượng chất chuẩn (4.14.1), tí nh bằng gam (g); W u là khối lượng mẫu thử (8.2), tính bằng gam (g); D s là thể tích dung dịch chuẩn pha loãng (tổng số), t í nh bằng mililit (ml); D u là th ể tích dung dịch m ẫ u thử pha loãng (t ổ ng số), tính bằng mililit (ml); P s là độ tinh khiết của chất chuẩn. T í nh thể tích dung dịch pha loãng: Th ể tích dung dịch pha loãng của chất chuẩn ( D s ), từ W s (g) chất chuẩn được hòa tan trong dung môi, pha loãng đến 100 ml và tiếp tục được pha loãng theo tỷ lệ 10/200 và 10/100, được tính như sau: D s = 100 x 200 x 100 = 20 000 ml 10 x 10 Thể tích dung dịch pha loãng của mẫu thử: D u = 100 ml hoặc được lấy theo Bảng 2. 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết đ ể nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng v ớ i các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được. Phụ lục A (Tham khảo) Sắc kí đồ chuẩn phân giải hệ thống Hình A.1 - Sắc kí đồ chuẩn phân giải hệ thống của sulfathiazol (STZ), chất chuẩn nội sulfamerazin (SMR) và sulfamethazin (SMT), sử dụng các điều kiện trong 8.1 Phụ lục B (Tham khảo) Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm Bảng B.1 - Kết quả thử nghiệm liên phòng về xác định sulfamethazin trong thức ăn cho lợn và thức ăn cho trâu, bò bằng sắc kí lỏng có tạo dẫn xuất sau cột Thức ăn cho lợn 1 Thức ăn cho l ợn 2 Thức ăn cho trâu, bò 1 Thức ăn cho lợn 3 Thức ăn cho lợn 4 Thức ăn cho trâu, bò 2 S ố lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 10 (1) a 10 10 10 10 10 (1) SMT trung b ì nh ghi trên nh ã n,% 0,22 (0,19) 0,11 (0,11) 0,0154 (0,014) 0,011 (0,010) 0,011 (0,010) 0,0077 (0,0068) Độ lệch chuẩn lặp lại, s r 0,00052 0,0036 0,00043 0,00049 0,00015 0,00014 Giới hạn lặp lại, r (2,8 x s r ) 0,0015 0,0099 0,0012 0,0014 0,00041 0,00039 Độ lệch chuẩn tương đ ố i lặp lại, RSD r 0,28 3,1 3,1 4,7 1,4 2,0 Độ lệch chuẩn tái lập, s R 0,0023 0,0036 0,00044 0,00049 0,00037 0,00032 Giới hạn t á i lập, R (2,8 x s R ) 0,0065 0,010 0,0012 0,0014 0,0010 0,00093 Độ lệch chuẩn tương đ ố i tái lập, RSD R 1,3 3,2 3.1 4,7 3,6 4,9 Chỉ s ố HorRat 0,25 0,57 0,41 0,59 0,45 0,58 a Số trong ngo ặc đơn là ngoại lệ. 1) Sigma D 2004 l à v í dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. 2) C ột pha đả o Spherisorb ODS2 l à v í dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thu ậ n tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn v à không ấn định phải sử dụng sản phẩm này