10TCN445:2001

Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 445:2001 về phương pháp kiểm tra - Phân vi sinh vật kị khí cố định nitơ và phân giải xenlulo do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 445:2001 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA PHÂN VI SINH VẬT KỊ KHÍ CỐ ĐỊNH NITƠ VÀ PHÂN GIẢI XENLULO Anaerobic nitrogen fixing and cellulotic degradating biofertylizer Method for quality control Ban hành kèm theo quyết định số: 16-2001/QĐ-BNN-KHCN ngày 23 tháng 2 năm 2001 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. 1. Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc kiểm tra mật độ các vi sinh vật có khả năng cố định nitơ hoặc phân giải xenlulo kị khí trong phân bón vi sinh vật. 2. Thuật ngữ, định nghĩa: 2.1. Phân vi sinh vật (gọi tắt là phân vi sinh) là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống hữu ích đã được tuyển chọn có mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành thông qua các hoạt động sống của chúng trong đất tạo nên chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được (N, P, K) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng nông sản. Phân vi sinh vật không gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng nông sản, người, động vật, thực vật và môi trường sinh thái. 2.2. Phân vi sinh vật kị khí cố định nitơ là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn với mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành, có khả năng cố định nitơ trong điều kiện kị khí, tạo điều kiện nâng cao năng suất hoặc chất lượng sản phẩm. Các chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người, động vật, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản. 2.3. Phân vi sinh vật kị khí phân giải xenlulo là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn với mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành, có khả năng phân giải xenlulo trong điều kiện kị khí, tạo điều kiện nâng cao năng suất hoặc chất lượng sản phẩm. Các chủng vi sinh vật này không ảnh hưởng xấu đến người, động vật, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản. 2.4. Vi sinh vật đã được tuyển chọn là vi sinh vật đã được nghiên cứu, đánh giá hoạt tính sinh học và hiệu quả đối với đất, cây trồng dùng để sản xuất phân vi sinh vật. 2.5. Vi sinh vật tạp là vi sinh vật có sẵn trong phân vi sinh vật nhưng không thuộc loại vi sinh vật đã được tuyển chọn. 3. Nội dung, phương pháp: 3.1. Trang thiết bị: - Tủ sấy (thiết bị tiệt trùng khô) và nồi hấp áp lực (thiết bị tiệt trùng ướt) - Tủ ấm - Tủ cấy vô trùng - Cân kỹ thuật có độ chính xác tới 0,01g - Que cấy - Que gạt thủy tinh - ống nghiệm thủy tinh - ống đong - Bình tam giác - Đĩa petri (hộp lồng) - Pipet chia độ, pipetman - Đèn cồn hoặc đèn gas - Dụng cụ lấy mẫu phải là loại thép không gỉ hoặc bằng thuỷ tinh. - Dụng cụ nuôi cấy kị khí: có thể sử dụng một trong các dụng cụ sau: + Tủ nuôi kị khí + Bình chân không + Bình nuôi kị khí: Gas Pak 3.2. Tiến hành: 3.2.1. Chuẩn bị dụng cụ: Các dụng cụ lấy mẫu và dụng cụ dùng trong xác định vi sinh vật phải tiệt trùng bằng một trong các phương pháp dưới đây: - Trong tủ sấy ở nhiệt độ 160 - 175 0 C không ít hơn 2 giờ. - Trong nồi hấp áp lực 1 at (121 0 C) không ít hơn 20 phút. 3.2.2. Chuẩn bị môi trường: 3.2.2.1.Môi trường dùng để kiểm tra phân vi sinh vật kị khí cố định nitơ, phân giải xenlulo phụ thuộc vào chủng loại vi sinh vật mà nhà sản xuất sử dụng. Nếu không có yêu cầu của nhà sản xuất, khi kiểm tra sử dụng môi trường ( phụ lục kèm theo). Môi trường được pha chế theo thứ tự các hoá chất trong thành phần đã cho. Sau đó phân phối vào các dụng cụ thuỷ tinh đã chuẩn bị trước rồi khử trùng ở những điều kiện phù hợp. Để nguội môi trường đến 45-50 0 C rồi phân phối vào các đĩa petri vô trùng. Thao tác này được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Kiểm tra độ sạch của môi trường sau 2 ngày ở nhiệt độ từ 28 đến 30 0 C. Chỉ sử dụng các đĩa petri chứa các môi trường nuôi cấy vi sinh vật không phát hiện thấy tạp nhiễm. 3.2.2.2. Dịch pha loãng là nước muối sinh lý (NaCl 0,85%), không chứa các hợp chất nitơ, sau khi khử trùng có độ pH là 7,0. Phân phối dịch pha loãng vào các ống nghiệm, bình tam giác có dung tích thích hợp với một lượng sao cho sau khi khử trùng, mỗi ống nghiệm chứa 9ml, mỗi bình tam giác chứa 90ml. Làm nút bông và khử trùng ở 1 at (121 0 C) trong 30 phút. Nếu chưa sử dụng ngay, dịch pha loãng cần được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-10 0 C, thời gian bảo quản không quá 1 tháng kể từ ngày chuẩn bị. Ghi chú: Để tránh làm ảnh hưởng đến các vi sinh vật do thay đổi nhiệt độ đột ngột, nên điều chỉnh nhiệt độ của dịch pha loãng đến nhiệt độ phòng thử nghiệm trước khi sử dụng. 3.2.3. Lấy mẫu: 3.2.3.1. Qui định chung: Việc lấy mẫu được tiến hành sao cho mẫu kiểm tra phải là mẫu đại diện cho cả lô hàng. Người lấy mẫu phải được huấn luyện và có kinh nghiệm trong việc lấy mẫu. Trong quá trình lấy mẫu, vận chuyển và xử lý mẫu, phải đảm bảo tránh sự lây nhiễm từ bên ngoài và phải đảm bảo là mẫu phải được giữ nguyên trạng như ban đầu cho tới khi đem phân tích trong phòng thí nghiệm. Không được bổ sung thêm bất cứ một tác nhân bảo quản, diệt khuẩn hoặc diệt nấm nào vào mẫu kiểm tra. Mẫu được lấy phải từ các bao nguyên gói. Phải tiến hành lấy mẫu ở những nơi không có hơi nước nóng, hoá chất độc hại, không có ánh nắng gay gắt hoặc bụi và được đưa ngay vào dụng cụ chứa mẫu. Các dụng cụ lấy mẫu và chứa mẫu phải vô trùng. 3.2.3.2. Số lượng mẫu: Lô hàng bao gồm các bao (túi) được sản xuất cùng một đợt với cùng một nguồn nguyên liệu. Số lượng bao (túi) cần lấy để kiểm tra đối với mỗi lô hàng phụ thuộc vào độ lớn của lô hàng đó và phù hợp với qui định trong bảng 1 Bảng 1 : Số lượng bao (túi) cần lấy để kiểm tra Cả lô hàng (bao, túi) Số lượng mẫu cần lấy (bao, túi) Đến 100 Từ 101 đến 1000 Từ 1001 đến 10000 Lớn hơn 10000 7 11 15 19 Các bao (túi) mẫu được lựa chọn ngẫu nhiên theo TCVN 1964-75 Tiến hành lấy mẫu trung bình từ mẫu cibm là tập hợp các mẫu ban đầu trong lô hàng kiểm tra. Chia mẫu trung bình làm 2 phần bằng nhau rồi bao gói phù hợp với yêu cầu của sản phẩm. Một phần dùng để kiểm tra và một phần để lưu và bảo quản trong điều kiện qui định mà mỗi loại sản phẩm yêu cầu để dùng khi phân tích trọng tài. Trên mỗi gói mẫu phải có nhãn ghi rõ: Tên mẫu và đối tượng cây trồng được sử dụng Tên cơ sở sản xuất Thời gian sản xuất Thời gian và địa điểm lấy mẫu Tên người lấy mẫu, cơ quan lấy mẫu. 3.2.4. Kiểm tra: 3.2.4.1. Mật độ vi sinh vật kị khí cố định nitơ: 3.2.4.1.1. Pha loãng mẫu: a) Đối với mẫu dạng lỏng: Dùng pipet vô trùng lấy 10ml mẫu cho vào 90ml dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn (xem 3.2.2.2), tránh chạm pipet vào dịch pha loãng. Trộn kỹ bằng cách dùng một pipet vô trùng khác hút lên xuống 10 lần hoặc bằng dụng cụ trộn cơ học trong 5-10 giây. Dung dịch tạo ra được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu. b) Đối với mẫu dạng bột: Cân 10g mẫu có độ chính xác tới 0,01g và cho vào 90ml dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn (xem 3.2.2.2). Trộn kỹ bằng dụng cụ trộn cơ học từ 5 đến 10 phút sao cho có được một dung dịch có phân bố đồng đều, để lắng các phần tử nặng trong khoảng 15 phút, gạn được dung dịch huyền phù ban đầu. c) Dùng pipet đã vô trùng hút 1ml dịch huyền phù ban đầu (a hoặc b) cho vào 9 ml dịch pha loãng, tránh chạm pipet vào dịch pha loãng. Trộn kỹ bằng cách dùng một pipet vô trùng khác hút lên xuống 10 lần hoặc bằng dụng cụ trộn cơ học trong 5-10 giây, để có dịch pha loãng mẫu có nồng độ là 10 -2 . Lặp lại các thao tác này để thu được dịch pha loãng đối với phân vi sinh vật trên nền chất mang khử trùng là 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 và đối với phân vi sinh vật trên nền chất mang không khử trùng là 10 -3 , 10 -4 và 10 -5 . 3.2.4.1. 2. Cấy mẫu: Dùng pipet vô trùng lấy từ dịch mẫu pha loãng 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 đối với phân vi sinh vật trên nền chất mang khử trùng và 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 đối với phân vi sinh vật trên nền chất mang không khử trùng một lượng dịch là 0,05 ml (1 giọt) cấy vào 1 đĩa petri chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn (xem 3.2.2.1). Mỗi mẫu pha loãng được cấy lặp lại trên 3 đĩa petri. Dùng que gạt vô trùng gạt đều dịch mẫu trên bề mặt thạch, đợi khô và úp ngược hộp petri sau đó đưa vào nuôi ở điều kiện kị khí (*) trong thời gian và nhiệt độ thích hợp với từng loại vi sinh vật. Đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng của mẫu giống vi sinh vật trên mỗi đĩa petri. Mật độ vi sinh vật trên một đơn vị kiểm tra (ml) được tính theo công thức sau: Trong đó: A: Mật độ vi sinh vật cố định nitơ trên đơn vị kiểm tra (g hoặc ml) a: số khuẩn lạc trung bình có trong đĩa petri d: nồng độ dịch pha loãng Ghi chú : Số lượng khuẩn lạc trung bình được tính là trung bình cộng số khuẩn lạc của các đĩa petri được cấy từ cùng một độ pha loãng, trong đó chỉ tính các đĩa petri chứa từ 5-50 khuẩn lạc. Số lượng khuẩn lạc trung bình cũng có thể được tính là trung bình. Cộng số lượng khuẩn lạc của các đĩa petri được cấy từ hai độ pha loãng kế tiếp nhau bằng cách tính số khuẩn lạc trung bình cộng ở mỗi độ pha loãng, trong đó số khuẩn lạc ở độ pha loãng cao hơn được nhân với 10, sau đó lấy trung bình cộng của hai giá trị trên nếu tỷ số giữa giá trị lớn và giá trị nhỏ không lớn hơn 2. Nếu tỷ số này lớn hơn 2 thì lấy giá trị nhỏ làm kết quả. Mật độ vi sinh vật trên một đơn vị kiểm tra được biểu thị bằng một số giữa 1,00 và 9,99 nhân với 10 n , n là số mũ thích hợp. (*): Có thể sử dụng một trong các phương pháp tạo điều kiện kị khí sau: - Loại bỏ ôxy bằng phương pháp vật lí: + Tủ nuôi kị khí hoặc + Bình hút ẩm có vòi hút chân không, hàn kín bằng vadơlin, không khí trong bình được hút ra và thay bằng hỗn hợp khí CO 2 , N 2 , H 2 (bình chân không). Để loại bỏ ôxy một cách triệt để, trước đó nên đặt vào trong bình các cốc đựng chất hấp thụ ôxy như dithionit, clorua đồng, iot... Có thể làm giảm tác dụng của ôxy bằng cách thêm vào môi trường dinh dưỡng các chất khử ôxy như axit thioglycolic (0,3 ml/l) và systein (0,75 g/l). - Loại bỏ ôxy trong không khí bằng phương pháp hoá học: + Bình nuôi kị khí Gas Pak. + Sử dụng dung dịch xanh metylen-NaOH-glucoza: Trộn đều 3 dung dịch với 1 lượng bằng nhau (6ml NaOH 10N trong 100ml nước cất; 3,0ml xanh metylen 5% trong 100ml nước cất và 6g glucoza trong 100ml nước cất có bổ sung một chút thymol kết tinh) rồi cho vào ống nghiệm và đun cách thuỷ đến mất màu. Đặt ống chỉ thị này vào thiết bị nuôi cấy kín. ống chỉ thị sẽ tạo ra tình trạng yếm khí trong thiết bị (ôxy được khử hoàn toàn khi màu xanh của dung dịch chỉ thị bị biến mất và không tái hiện trở lại). - Nuôi cấy trong môi trường làm ngập kép: Dịch pha loãng mẫu được trộn với môi trường thạch dinh dưỡng phù hợp với từng loại vi sinh vật sau khi khử trùng đã để nguội đến 40 - 45 0 C và đổ vào đĩa petri. Sau khi thạch đông đổ thêm một lớp thạch - nước vô trùng (nguội đến 40 - 45 0 C). ủ các đĩa thạch ở nhiệt độ thích hợp. 3.2.4.2. Kiểm tra mật độ vi sinh vật kị khí phân giải xenlulo: 3.2.4.2.1. Pha loãng mẫu: Xem 3.2.4.1.1 3.2.4.2.2. Cấy mẫu: Xem 3.2.4.1.2 - Phát hiện vòng phân giải: Sau khi khuẩn lạc vi sinh vật đã phát triển trên đĩa petri chứa môi trường kiểm tra, để đĩa petri vào tủ lạnh trong 12 giờ. Sau đó cho vào tủ ấm 40 0 C trong 6 giờ. Lấy ra, cho vào mỗi đĩa petri 5ml thuốc thử lugon, tráng đều khắp mặt thạch, để trong 15 phút rồi gạn bỏ hết thuốc thử lugon đi. Đếm số khuẩn lạc trong đĩa petri tạo vòng phân giải (vòng trong suốt) bao quanh khuẩn lạc. - Tính toán kết quả: xem 3.2.4.1.2. PHỤ LỤC I. Môi trường kiểm tra vi sinh vật cố định nitơ kị khí: 1. Môi trường 1: Nước cất 1000ml Glucoza 20,0g K 2 HPO 4 1,0g MgSO 4 .7H 2 O 0,5g NaCl vết FeSO 4 .7H 2 O vết MnSO 4 .5H 2 O vết CaCO 3 40,0g axit ascobic 1,0g E.D.T.A. (Trilon B) 1,0g Thạch bột 15,0g 2. Môi trường 2: Nước chiết khoai tây (*) 1000ml Glucoza 20,0g K 2 HPO 4 0,2g MgSO 4 .7H 2 O 0,2g Axit ascobic 1,0g CaCO 3 3,0g Thạch bột 15,0g (*) Nước chiết khoai tây: Khoai tây: 200,0g Nước cất: 500ml Khoai tây gọt vỏ, cắt nhỏ, đun sôi trong 15 phút, lọc trong, bổ sung đủ 1000ml II. Môi trường kiểm tra vi sinh vật phân giải xenlulo kị khí: 1. Môi trường 3: Nước máy 1000ml NaNH 4 HPO 4 1,5g KH 2 PO 4 0,5g NaCl 0,1g K 2 HPO 4 0,5g MgSO 4 .7H 2 O 0,4g Pepton 5,0g CaCO 3 2,0g Dung dịch MnSO 4 .5H 2 O 1% 1 giọt Dung dịch FeSO 4 .7H 2 O 1% 1 giọt CMC 20,0g Thạch bột 15,0g pH: 7,0-7,4 2. Môi trường 4: Nước máy 500ml Nước thịt-pepton 500ml CaCO 3 2,0g CMC 15,0g Thạch bột 15,0g pH: 7,0-7,4 3. Môi trường 5: Nước máy 900ml Nước chiết nấm men 100ml Glucoza 0,5g Pepton 5,0g CMC 3,0g Thạch bột 15,0g pH: 7,4