TCVN6505-3:1999

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6505-3:1999 về sữa và sản phẩm sữa - định lượng E.Coli giả định - Phần 3: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44oC sử dụng màng lọc do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6505 - 3 : 1999 ISO 11866 - 3 : 1997 (E) SỮA VÀ CÁC SẢN PHẨM SỮA - ĐỊNH LƯỢNG E.COLI GIẢ ĐỊNH – PHẦN 3 : KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 44°C SỬ DỤNG MÀNG LỌC M il k and m i lk p ro ducts - Enum e ration o f p re sumpti ve Es cherichia coli - Part 3 – Colony – count technique at 44 o C using membranes Lời nói đ ầ u TCVN 6505 - 3 :1999 hoàn toàn t ư ơng đương với I SO 11866-3 :1997(E) TCVN 6505 - 3 :1999 do Ban kỹ thuật tiêu c huẩn TCVN/T C /F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo l ườ ng - C hất lư ợng đ ề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi tr ườ ng ban hành. TCVN 6505 - 3 : 1999 SỮA VÀ CÁC SẢN PHẨM SỮA - ĐỊNH LƯỢNG E.COLI GIẢ ĐỊNH – PHẦN 3 : KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 44°C SỬ DỤNG MÀNG LỌC M il k and m i lk p ro ducts - Enum e ration o f p re sumpti ve Es cherichia coli - Part 3 – Colony – count technique at 44 o C using membranes 1. Phạm vi áp dụng TCVN 6505 - 3 : 1999 (ISO 11866-3) qu y định ph ư ơng pháp định l ư ợng E.coli giả định bằ ng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44°C. Ph ươ ng pháp này có thể áp dụng cho: - sữa và các sản phẩm sữa dạng lỏng; - sữa bột, bột whey có đ ườ ng, buttermilk bột và lactoza; - casein axit, casein lactic và casein rennet; - caseinat, whey bột axit; - phom a t và phom a t chế biến; - bơ; - sản phẩm sữa đông lạnh (bao g ồ m cả kem lạnh th ự c phẩm); - custard, món tráng miệng và váng kem. Ph ư ơng pháp này thích hợp đối với các mẫu có số l ư ợng E.Coli giả định dự đoán t ư ơng đối cao (nhiều hơn 100 E.Coli trong một gam, hoặc nhiều hơn 10 E.Coli trong một mililít). CHÚ Ý - Một số loài E.Coli gây bệnh không phát triển ở 44 °C. 2. Tiêu chuẩn trích dẫn TCVN 6264 : 1997 (ISO 6610 : 1992) Sữa và sản phẩm sữa - Định l ượ ng đơn vị vi sinh vật hình thành khuẩn lạc - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 °C. TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996) Vi sinh vật trong th ự c phẩm và trong th ứ c ăn gia súc. Nguyên t ắ c chung về kiểm tra vi sinh vật. TCVN 6263 :1997 (ISO 8261) Sữa và các sản phẩm sữa - Chuẩn bị mẫu thử và các dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh vật. 3. Định nghĩa Áp dụng định nghĩa sau đây trong 6505-3 :1999: 3.1. E.Coli giả định: Là các vi khuẩn ở nhiệt độ 44°C hình thành các khuẩn l ạc có màu h ồ ng của indol d ư ơng tính trên màng xelulo axetat đặt trên thạch trypton mật d ướ i các điều kiện qu y định trong 6505-3. 4. Nguyên tắc Việc định lư ợng E.Coli giả định yêu cầu bốn giai đoạn liên tiếp như sau : 4.1. Khôi phục Cấy một l ượ ng mẫu thử qu y định hoặc huyền phù ban đầu lên màng xelulô ax e tat đã được cấy t rên thạch glutamat khoáng cải tiến, sau đó nuôi ấm ở 37 °C trong 4 h. Chú thích - Qui trình này cho phép khôi phục lại các E.Coli giả định bị hư hại do bảo quản đông lạnh, làm khô hoặc do các điều kiện lạnh, hoặc hư hại do xử lí nhiệt hoặc do h óa chất. Đ ồ ng thời cũng làm giảm nồng độ cao của bất kì cacbon hidrat nào mà có thể lên men có trong mẫu thử, mà đi ề u này có thể làm cản trở việc sinh indol trong giai đoạn phân lập tiếp theo. 4.2. Phân l ập Chuyển các màng ở giai đoạn khôi phục trên thạch glutamat khoáng cải tiến sang thạch t rypton mật. Nuôi ấm ở 44 °C từ 18 h đến 24 h. 4.3. Phát hiện Sự có mặt của E.Coli giả định trên màng l ọc được chứng minh bằng tính sinh indol từ mỗi khuẩn lạc. 4.4. Tính toán Tính số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) của E.Coli giả định trong một gam hoặc trong một mililit mẫu thử từ s ố khuẩn lạc indol d ư ơng tính thu được trên các màng lọc ở các m ứ c pha loãng đã chọn sao thu được kết quả có ý nghĩa. 5. Chất pha loãng, môi trường nuôi cấy và thuốc thử 5.1. Khái quát Về các phòng thí nghiệm hiện hành, xem TCVN 6404:1998 (ISO 7218) và TCVN 6263:1997 (ISO 8261). Đối với môi tr ườ ng và thuốc thử đã chuẩn bị nh ư ng không sử dụng ngay, nếu không có qu y định khác, phải bảo quản chỗ tối ở nhiệt độ từ 0 °C đến + 5°C không quá 1 tháng trong các điều kiện không làm thay đổi thành phần của chúng. 5.2. Chất pha loãng Xem TCVN 6263:1997 (ISO 8261). 5.3. Môi tr ư ờng nu ô i cấy và thuốc thử 5.3.1. Môi trường khôi phục: thạch glutamat khoáng cải tiến 5.3.1.1 Thành phần Natri g l utamat 6,35 g Lactoza 10,0 g Natri f ocmat 0,25 g L( -) Xistin 0,02 g L( -) Axit aspactic 0,02 g L( +) arginin 0,024 g Thiamin 0,001 g Axit nicotinic 0,001 g Axit pantothenic 0,001 g Magiê sun f at ngậm 7 phân tử nước (MgS0 4 .7H 2 O ) 0,100 g Sắt (III) amon i xitrat 1) 0,010 g Canxi clorua ngậm 2 phân tử n ư ớc (CaCl 2 .2H 2 O ) 0,010 g Dikali hidro phôtphat (K 2 HPO 4 ) 0,90 g Amoni c l orua 2,5 g Thạch 12 g -18 2) Nước 1 000 ml 1) Hàm l ư ợng sắt nhỏ nhất là 15% (m/m). 2) T ùy vào s ứ c đông của thạch. 5.3.1.2. Chuẩn bị H òa tan amoni clorua trong nước. Cho thêm các thành phần còn lại vào và đun đến s ô i. Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 6,7 ở 25°C. Phân phối môi tr ườ ng này theo c á c thể tích 100 ml vào các vật chứa thích hợp. Khử trùng 10 phút ở 115 °C trong n ồi hấp áp l ự c (6.1). 5.3.1.3. Chuẩn bị các đĩa thạch Rót vào các đĩa Petri vô trùng (6.12) từ 12 ml đến 15 ml môi tr ườ ng đã làm mát đến khoảng 45 °C và để cho đông đặc lại. Các đĩa này có thể bảo quản từ 0 °C đ ế n + 5 °C đến 4 ngày. Ngay tr ư ớc khi sử dụng, làm khô các đĩa này trong tủ sấy hoặc trong lò (6.3) ở 50 °C trong 30 phút, tốt nhất l à mở nắp và lật sấp đĩa để mặt thạch h ư ớng xuống d ướ i, hoặc cho đến khi các hạt nhỏ trên mặt của môi tr ườ ng biến mất. Chú thích - Thạch nên để đủ khô 15 phút tr ướ c khi ria cấy (1 ml). 5.3.2. Môi tr ư ờng chọn lọc : Thạch mật trypton 5.3.2.1. Thành phần Trypton 20,0 g Muối mật 1,5 g Thạch từ 12 g đến 18 g (t ùy vào sức đông của thạch) Nước 1 000 ml 5.3 .2 .2 . Chuẩn bị H òa tan các thành phần trong nước và đun đến sôi. Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 7,2 ở 25°C. Phân phối môi tr ườ ng theo các l ư ợng đến 500 ml vào các vật chứa thích hợp. Khử trùng 15 phút ở 121 °C trong n ồ i hấp áp l ự c (6.1). 5 .3.2.3 . Chuẩn bị các đĩa thạch Rót vào các đĩa Petri vô trùng (6.12) từ 12 m l đến 15 ml môi trường đã làm mát đến khoảng 45 °C và để cho đông đặc lại. Các đĩa này có thể bảo quản từ 0 °C đến + 5 °C đến 4 ngày. Ngay tr ư ớc khi sử dụng, làm khô các đĩa này trong tủ sấy hoặc trong lò (6.3) ở 50 °C trong 30 phút, tốt nhất là mở nắp và lật sấp đĩa để mặt thạch h ướ ng xuống d ướ i, hoặc cho đến khi các hạt nhỏ trên mặt của môi trường biến mất. 5.3.3. Thuốc thử phát hiện indol (thuốc thử Vracko và Sherr i s) 5.3.3.1. Thành phần 4-Dimetylanimobenzaldehyt 5,0 g Axit clohidric , c (HCI = 1 mol/l) 100 ml 5.3.3.2. Chuẩn bị H òa tan 4-Dimetylanimobenzaldehyt trong axit clohidric, b ằ ng cách đun nóng khi c ầ n thiết. Thuốc thử này có thể bảo quản ở nơi tối từ 0 °C đến +5 °C tối đa là 3 tháng. 6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Đối với các yêu cầu chung, xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996) và TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261). Dụng cụ thủy tinh phải b ề n khi khử trùng lại. Sử dụng các thiết bị thí nghiệm vi sinh thông th ườ ng và đặc biệt là: 6.1. Nồi hấp áp lực, có thể duy trì nhiệt độ ở 115°C ± 1 °C và 121 °C ± 1 °C. Về chi tiết xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218). 6.2. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 37°C ± 1 °C và ở 44°C ± 0,5°C. 6.3. Tủ sấy hoặc lò, được thông gió b ằ ng dòng đối lư u, có thể duy trì nhiệt độ ở 50°C ± 1°C. 6.4. Tủ lạnh (để bảo quản môi trường và thuốc thử đã chuẩn bị), có thể duy trì nhiệt độ từ 0°C đến 5°C. 6.5. Màng xelul o axetat, có c ỡ lỗ từ 0,45 m m đến 1,2 m m và đường kính 85 mm. 6.6. Đèn tia cực tím (UV) sóng dài, có bước sóng từ 360 nm đến 366 nm, có gắn với bộ lọc thích hợp để loại bỏ phóng xạ UV dưới 310 nm. 6.7. Bộ kẹp đầu t ù vô trùng, có chi ề u dài khoảng 12 cm. 6.8. pH-met, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 °C. 6.9. Pipet, đã hiệu chuẩn để dùng cho vi khuẩn học có dung tích danh định là 1 ml, được chia độ 0,1 ml và miệng có đường kính từ 2 mm đến 3 mm. 6.10. Ống đong, để chuẩn bị môi trường và thuốc thử. 6.11. Chai hoặc bình cầu, để khử trùng và bảo quản môi trường nuôi cấy. 6.12. Đĩa Petri, làm b ằ ng t hủy tinh hoặc plastic, có đường kính khoảng 90 mm hoặc 100 mm. 6.13. Que cấy gạt, làm bằng thủy tinh hoặc plastic, thí dụ như que thủy tinh có đường kính khoảng 3,5 mm và dài khoảng 20 cm, uốn vuông góc ở khoảng 3 cm cách một đ ầ u và đ ầ u cắt kia đ ược làm nhẵn b ằ ng cách đốt nóng. 7. Lấy mẫu Đi ề u quan trọng là phòng t hí nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản. L ấ y mẫu không qu y định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo ph ư ơng pháp qu y định trong TCVN 6400 1998 (ISO 707). 8. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6263 :1997 (ISO 8261). 9. Cách tiến hành Chú thích - Nếu c ầ n kiểm tra độ lặp lại có th ỏa mãn hay không (xem đi ề u 11), tiến hành hai phép xác định riêng rẽ theo 9.1 đến 9.5. 9.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng Chuẩn bị phần mẫu thử, huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng đầu tiên) và các dung dịch pha loãng tiếp t heo, theo TCVN 6263 :1997 (ISO 8261). 9.2. Khôi phục 9.2.1. Dùng bộ kẹp vô trùng (6.7) đặt màng xelul o axetat lên mỗi b ề mặt đã khô của hai đĩa có chứa thạch glutamat (5.3.1.3) 1 cách vô trùng, chú ý tránh tạo bọt khí ở dưới màng. Dàn đều các màng một cách nhẹ nhàng bằng que gạt vô trùng (6.13). Dùng pipet vô trùng (6.9), lấy 1 ml mẫu thử hoặc huy ề n phù ban đ ầ u cho vào giữa mỗi màng. Dùng que vô trùng (6.13), phết đều chất cấy lên khắp b ề mặt của màng, không để tràn khỏi màng. 9.2.2. Dùng một pipet vô trùng khác (6.9), cấy các thể tích bằng nhau của các dung dịch mẫu thử pha loãng tiếp theo hoặc huyền phù ban đầu lên các màng khác, như qu y định trong 9.2.1. 9.2.3. Để các đĩa đã nuôi cấy trong tư thế n ằ m ngang ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút cho đến khi chất cấy ngập vào trong thạch. Nuôi ấm các đĩa này 4 h trong tủ ấ m (6.2) để ở 37 °C với các màng/mặt thạch h ướ ng lên trên. 9.3. Chuy ể n sang môi tr ư ờng chọn l ọc và nuôi ấm 9.3.1 . Dùng bộ kẹp vô trùng (6.7) chuyển các màng từ thạch glutamat (5.3.1.3) sang các đĩa thạch trypton - mật (5.3.2.3). Cảnh báo - Màng ẩm ướ t sẽ dính chặt vào mặt thạch. Tránh tạo bọt khí. Không sử dụng que gạt . 9.3.2. N u ôi ấm các đĩa này từ 18 h đến 24 h trong tủ ấm (6.2) để ở 44 °C với các màng/mặt thạch hướng lên trên. Không ch ồ ng các đĩa cao quá ba chiếc. 9.4. Phát hiện tính sinh indol do các khuẩn lạc trên màng lọc. 9.4.1. Ghi nhãn trên nắp của mỗi đ ĩ a (9.3.2) cho việc nhận biết. 9.4.2. Dùng pipet lấy 2 ml thuốc thử indol (5.3.3) cho vào đĩa đã mở nắp đặt ở tư thế nằ m ngang. 9.4.3. Dùng bộ kẹp vô trùng (6.7) lấy màng ra khỏi mặt thạch t ư ơng ứng và cho vào thuốc thử indol. Nếu cần, phải để nghiêng sao cho tất cả b ề mặt của màng được thuốc thử indol làm cho ướ t. Sau 5 phút, dùng pipet loại bỏ thuốc thử còn lại. 9.4. 4 . Các khuẩn lạc indol d ư ơng tính cho màu h ồ ng trong vài phút. Nếu c ầ n để ổn định, đặt màng này dưới đèn tia c ự c tím (6.6) trong 30 phút. 9.5. Đếm khuẩn lạc Đếm các khuẩn lạc indol dương tính (màu h ồ ng) trên các màng, tốt nhất là trên các màng có từ 10 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc màu h ồ ng. Các chi tiết v ề kỹ thuật đếm khuẩn lạc xem TCVN 6264 :1997 (ISO 6610). 10. Tính toán và biểu thị kết quả 10.1. Tính toán Tín h số C F U của E.Coli giả định, N, trong một gam hoặc trong một mililit sản phẩm theo công thức sau : trong đó là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại hai lần pha loãng liên tiếp; n 1 : là số đĩa được giữ lại của độ pha loãng thứ nhất; n 2 là số đĩa được giữ lại của độ pha loãng thứ hai; d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất. Chú thích 1) Hệ số pha loãng 10 - 2 nghĩa là 10 - 2 g hoặc 10 - 2 m l mẫu thử ch ư a pha loãng (ở trạng thái lỏng) đã được lấy để thử. 2) Độ pha loãng thấp hơn là độ pha loãng có nồng độ mẫu thử cao hơn. 10.2. Biểu thị kết quả 10.2.1. Làm tròn số kết quả thu được đến hai chữ s ố có nghĩa . N ếu như, chữ số cuối cùng d ư ới 5, giữ nguyên chữ số đ ứ ng trước; nếu chữ số cuối cùng là 5 hoặc lớn hơn, tăng số đ ứ ng trước lên một đơn vị. Tiến hành như vậy cho đến khi thu được hai chữ số có nghĩa. Lấy kết quả là số đơn vị khuẩn lạc CFU của E.Coli giả định trong 1 mililít (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong 1 gam (sản phẩm dạng khác), biểu thị b ằ ng một s ố từ 1,0 đến 9,9 nhân với lũy thừa t ư ơng ứng của 10. 10.2.2. Nếu có hai đĩa tương ứng với mẫu thử (sản phẩm lỏng) hoặc huyền phù ban đ ầ u (sản phẩm dạng khác) có chứa ít hơn 10 khuẩn lạc thì báo cáo kết quả như sau: - ít hơn 10 CFU của E.Coli giả định trong một mililít (sản phẩm lỏng) - ít hơn 10 x 1/ d CFU của E.Coli giả định trong một gam (sản phẩm dạng khác), trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu. 10.2.3. Nếu tất cả các đĩa đều chứa nhiều hơn 300 khuẩn lạc, thì tính số lượng ước tính từ các đĩa có số khuẩn lạc gần 150 nhất và nhân số này với số nghịch đảo của độ pha loãng cao nhất. Báo cáo kết quả theo "số l ư ợng đơn vị hình thành khuẩn lạc E .Coli giả định ước tính trong một gam h oặc một mililít" . 10.3. Thí dụ về cách tính Việc đếm khuẩn l ạc E.Co l i giả định ở 44 °C cho các kết quả sau : - độ pha loãng thứ nhất (10 - 2 ) được giữ lại chứa: 138 và 125 khuẩn lạc - độ pha loãng thứ hai (10 - 3 ) được giữ lại chứa: 20 và 18 khuẩn lạc. Làm tròn kết quả như qu y định trong 10.2.1 thu được 14 000 hoặc 1,4 x 10 4 CFU của E.Coli giả định trong một gam hoặc trong một mililít sản phẩm. 11. Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa kết quả thu được từ hai lần thử riêng rẽ, khi sử dụng cùng một phương pháp, phân tích trên cùng nguyên liệu, do cùng một người tiến hành trong cùng một phòng thí nghiệm dùng cùng thi ế t bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được v ư ợt quá 50% của kết quả th ấ p hơn. Chú thích 1) Nếu các trường hợp không thỏa mãn yêu cầu v ề độ lặp l ại là 5%, hoặc lớn hơn thì c ầ n xem xét nguồn gốc có khả năng gây ra sai l ỗi. 2 ) Định ngh ĩa về độ lặp lại xem TCVN 4550 :1988 (ISO 5725). 12. Báo cáo kết quả Ban báo cáo kết quả phải ghi rõ: - phương pháp lấy mẫu đ ã áp dụng, nếu biết; - ph ư ơng pháp đã áp dụng; - kết quả thử thu được; và - nếu kiểm tra độ lặp lại, ghi kết quả cuối cùng thu được. Báo cáo kết quả cũng phải đ ề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qu y định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh h ư ởng tới kết quả. B áo cáo kết quả cũng bao g ồ m tất cả các thông tin cần thiết về việc nhận biết hoàn toàn mẫu thử. Phụ lục A (tham khảo) Thư mục [1] TCVN 6400 :1998 (ISO 707) Sữa và sản phẩm sữa. Các phương pháp lấy mẫu [2] ISO 5725-1 :1994 Độ chính xác của các phương pháp đo và kết quả. Phần 2 - Các nguyên tắc chung và định nghĩa. [3] ISO 5725-3 : 1994 Độ chính xác của các phương pháp đo và kết quả. Ph ầ n 2 - Ph ư ơng pháp cơ bản để xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo chuẩn. [4] ISO 6391 Thịt và sản phẩm thịt - Định l ư ợng E.Coli - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44 °C dùng màng lọc.