TCVN7852:2008

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7852:2008 THỰC PHẨM - ĐẾM NẤM MEN VÀ NẤM MỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG KHÔ CÓ THỂ HOÀN NƯỚC (PHƯƠNG PHÁP PETRIFILM TM ) Foodstuffs - Enumeration of yeast and mold by dry rehydratable film method (Petrifilm TM method) Lời nói đầu TCVN 7852:2008 được xây d ự ng trên cơ sở AOAC 997.02 Yeast and Mold Counts in Foods. Dry Rehydratable Film Method . TCVN 7852:2008 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F13 Phương pháp ph â n tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đ ề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ c ô ng bố. THỰC PHẨM - ĐẾM NẤM MEN VÀ NẤM MỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP MÀNG KHÔ CÓ THỂ HOÀN NƯỚC (PHƯƠNG PHÁP PETRIFILM TM ) Foodstuffs - Enumeration of yeast and mold by dry rehydratable film method (Petrifilm TM method) 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đếm nấm men và nấm mốc trong thực phẩm bằng phương pháp sử dụng màng khô có thể hoàn nước. 2. Nguyên tắc Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường kh ô được bổ sung các kháng sinh, thuốc nhuộm để tăng khả năng quan sát sự phát triển và các chất tạo đ ô ng có thể tan trong n ướ c lạnh. Các dung dịch huyền phù chưa pha loãng hoặc đã pha loãng được cho vào các đĩa với l ượ ng 1 ml/đĩa. Dàn đ ề u dung dịch huyền phù tr ê n diện tích khoảng 30 cm 2 . Có thể dùng chất tạo đ ô ng để là m đông đặc các đĩa, ủ ấm và đếm nấm men và nấm mốc. 3. Thuốc thử T rong quá tr ì nh phân tích, chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước có chất lượ ng tương đương, trừ khi có qui định khác. 3.1. Nước pha loãng, dung dịch nước đệm phosphat Cho 34 g KH 2 PO 4 (3.2) vào 500 ml nước đựng trong bình định mức 1 lít (4.6). Dùng natri h y droxit (3.3) để ch ỉ nh pH đến 7,2 và pha loãng bằng nước đến vạch. Khử trùng dung dịch 15 min trong n ồ i hấp áp lực (4.7) ở 121 ° C . Bảo quản dung dịch gốc này trong t ủ lạnh. Chuẩn bị dung dịch m ẫ u tr ắ ng pha lo ã ng bằng cách dùng pipet (4.3) lấy 1,25 ml dung d ị ch gốc cho vào b ì nh định mức 1 I (4.6) và pha loãng bằng nước đến vạch. Ph â n phối 90 ml ± 1 ml hoặc 99 ml ± 1 ml dung dịch này vào các chai. Khử trùng các chai này 15 min trong n ồ i hấp áp lực (4.7) ở 121 ° C . 3.2. Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ). 3.3. Natri hydroxit (NaOH), dung dịch 1 M (40 g/L) 3.4. Dung dịch clotetraxyclin. 3.5. Dung dịch cloramphenicol. 3.6. Chất tạo đông có thể tan trong n ướ c lạnh. 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau đây: 4.1. Đĩa đếm nấm men và nấm mốc Các đĩa chứa chất dinh dưỡng được bổ sung clotetraxyclin (3.4), c l oramphenicol (3.5), chất tạo đông tan trong nước lạnh (3.6) và thuốc nhuộm màu nhạy với phosphataza (5-brom-4-clo-3-indolyl phosphat) để tăng khả năng quan sát sự phát triển của nấm men và nấm mốc. Khoanh tròn vùng phát triển tr ê n mỗi đĩa có ba mươi ô vuông 1 cm x 1 cm trên n ề n màng mỏng 1) . 4.2. Que dàn mẫu bằng ch ấ t dẻo , để dàn đều huyền phù lên khắp vùng phát triển của đĩa. 4.3. Pipet, dùng cho huyết thanh học hoặc pipet dạng xy l anh có thể phân phối 1,0 ml. 4.4. Dụng cụ đếm khuẩn lạc, loại chuẩn hoặc loại có độ khuếch đại tương đương 1,5 lần. 4.5. Bộ trộn Bộ trộn cơ có tốc độ cao từ 10 000 v ò ng/min đến 12 000 vòng/min hoặc loại túi nhu động. 4.6. Binh định mức 1 I. 4.7. Nồi hấp áp lực. 5. Chuẩn bị 5.1. Yêu cầu chung Bảo quản các túi đĩa đ ự ng đĩa đếm nấm men và nấm mốc chưa mở ở nhiệt độ dưới 8 ° C . Sau khi mở, để các đĩa chưa sử dụng vào lại trong túi. Đóng kín túi bằng cách gấp và cuộn đầu mỏ. Bảo quản túi đựng đã đóng kín lại này ở nhiệt độ dưới 8 ° C , nơi khô ráo. Các đĩa sau khi đã mở chỉ được dùng trong một tháng. Để các đĩa đếm nấm men và nấm mốc tiếp xúc với nhiệt độ cao hơn 25 ° C và độ ẩm tương đối cao hơn 50 % có thể ảnh hưởng đến tính năng của đĩa. Sau khi sử dụng, các đĩa vẫn còn chứa khuẩn lạc nấm men và/ho ặ c nấm mốc mà có thể phát triển được, n ê n trước khi thải bỏ cần được khử trùng bằng hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . 5.2. Chuẩn bị huyền phù thử nghiệm Chuẩn bị huyền phù từ sản phẩm thực phẩm trong điều kiện vô trùng với độ pha loãng 1/10 hoặc lớn hơn bằng nước. Trộn bằng bộ trộn (4.5) hoặc túi nhu động trong 2 min và đổ đĩa. Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, nếu cần. 6. Cách ti ế n hành Đặt đĩa đếm nấm men và nấm mốc lên bề mặt mặt pbẳng. Nhấc tấm màng mỏn g phía trên ra, giữ pipet vuông góc với đĩa và cấy cẩn thận 1 ml huyến phù thử nghiệm vào chính giữa mảng mỏng. Đậy tấm màng mòng ph í a tr ê n xuống chất cấy. Dùng tay nhấc que dàn mẫu bằng chất dẻo (4.2). Dóng thẩng t â m que dán mẫu với tâm dĩa. Dàn đều huyền phù bằng cách ấ n nhẹ que dàn mẫu xuống tâm đĩa. Không gạt que dàn mẫu từ bên này sang bẽn kia màng mỏng. Lấy que dàn mẫu ra và để yên đĩa trong 1 min cho đông đ ặ c lại. Đặt các đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang, hướng lên trên, không chồng cao quá 20 đĩa. Ủ các đĩa này năm ngày ở nhiệt độ từ 20 ° C đến 25 ° C . Đếm các đ ĩa ngay sau giai đoạn ủ. Các khuẩn lạc nhỏ có màu xanh lục hoặc trắng nhạt là nấm men. Các khuẩn lạc nấm mốc thường có màu xanh nh ư ng cũng có thể có sắc tố tự nhiên của chúng (v í dụ: m à u đen, v à ng, xanh l ục), chúng có khuynh hướng lớn h ơ n và khuếch tán nhiều hơn so với các khuẩn lạc nấm men. Để tính số nấm men và nấm mốc, nhân số lượng tổng số nấm men và nấm mốc/ đ ĩa (hoặc s ố lương trung b ì nh các khuẩn lạc/đĩa , n ếu đếm các đĩa kép của cùng một đ ộ pha loãng) với hệ s ố pha lo ã ng tương ứng. Khi đếm các khuẩn lạc tr ê n các đĩa kép của các độ pha loãng kế tiếp, thì tính số lượng trung b ì nh các khuẩn lạc cho mỗi độ pha loãng trước khi xác định trung bình số đếm của nấm men và nấm môc. Các số đếm ước tính có thể được thực hiện trên các đĩa có nhiều hơn 150 khuẩn lạc và phải được ghi là số ước tính. Trong việc đếm như th ế , xác định số đ ế m trung bình/1 cm 2 và nhân với 30 (diện tích phát triển là khoảng 30 cm 2 ). Với số lượng lớn các khuẩn lạc nấm men có thể làm cho toàn bộ diện tích phát triển trở thành màu xanh. Với số lượng lớn các khuẩn lạc nấm mốc có thể làm cho toàn bộ diện tích phát triển trở thành màu xanh, màu đen, màu vàng ...Khi đó, không thể có được số đếm ước tính, nhưng có thể pha loãng tiếp và đổ đ ĩa huyền phù thử nghiệm để thu được số đếm chính xác hơn. 7. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin dưới đây: - mọi thông tin cần thiết để nhận biết hoàn toàn mẫu thử; - viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp đã sử dụng; - kết quả và đ ơ n vị biểu thị kết quả; - ngày tháng lấy mẫu và phương thức lấy mẫu (nếu c ó ); - ngày tháng nhận mẫu phòng thử nghiệm; - ngày thán g thử nghiệm; - các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm; - mọi thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tuỳ chọn, cùng với các chi tiết của s ự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả. 1) C ó t hể s ử d ụ ng các đĩa đếm n ấ m men, nấm móc 3M™ Pe t ri f ilm™ có b á n sẵn của s ả n phẩm Vi sinh 3M , 3M Center, Bl d g. 274-5 W05, St. Paul. MN 55144-1000 , USA.