TCVN8400-24:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-24:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-24 : 2014 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 24: BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM Animal disease - Diagnostic procedure - Part 24: In f ectious bronchitis disease CẢNH B Á O - Việc áp dụng ti ê u chuẩn này có th ể liên quan đến các vật liệu, thiết b ị và các thao tác gây nguy hiểm. Ti ê u chuẩn này kh ô ng th ể đưa ra được h ế t các v ấ n đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi s ử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh viêm ph ế quản truyền nhiễm do vi rút thuộc giống Coronavirus gây ra trên gà. 2. Thuật ngữ và định nghĩa 2.1. Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm là bệnh hô hấp ở gà, do vi rút thuộc giống Coronavirus , họ Coronaviridae gây ra. Gà nuôi thương phẩm và gà đẻ trứng là những đối tượng bị ảnh hư ở ng chính của bệnh này. 2.2. IB (infectious bronchitis): Viêm phế quản truyền nhiễm. 2.3. IBV (in f ectious bronchitis virus): Vi rút gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm. 2.4. PBS (Phosphate buffered saline): Dung d ị ch muối đệm phosphat. 2.5. TMB: Tetrametyl be nz idin (ch ấ t phát màu). 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khi ế t tương đương. 3.1. Etanol 70 %. 3.2. Etid i bromua 10 mg/ml. 3.3. Nước tinh khiết không có Nuclease. 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết b ị , dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học và cụ thể như sau: 4.1. Cối , chày sứ, kéo, vô trùng; 4.2. M i cropipet, có đầu típ các cỡ sử dụng cho micropipet (có lọc và không lọc); 4.3. Đĩa 96 giống, đáy chữ V hoặc chữ U; 4.4. Máy ly tâm, có thể thực hiện ở gia tốc 900g, 8000g; 4.5. Máy PCR; 4.6. Thiết b ị đ i ệ n di (bể điện di, khuôn đúc thạch, lược, máy chi ế u UV ...); 4.7. Xi ranh, dung tích 1 ml và 5 ml; 4.8. Tăm bông, vô trùng. 5. Cách tiến hành 5.1. Chẩn đoán lâm sàng 5.1.1. Đặc điểm dịch t ễ Gà ở mọi lứa tu ổ i đều có thể bị mắc bệnh viêm ph ế quản truyền nhiễm. Mặc dù có nhiều thể bệnh khác nhau, nhưng viêm đường hô hấp là thể chính của bệnh này. Mức độ tr ầ m trọng của bệnh tuỳ thuộc vào lứa tuổi gà mắc bệnh và t ì nh tr ạ ng nhiễm kh uẩ n kế phát, ví dụ: với Mycoplasma gallisepticum. Gà nhỏ mẫn cảm với bệnh hơn gà lớn và có thể bị chết sau t ừ 6 đến 7 ngày do nhiễm khuẩn kế phát và kiệt sức, tỷ lệ chết có thể đến 15%. Gà đẻ trứng c ó biểu hiện giảm đẻ khoảng từ 10 % đến 30 % trong từ 3 tuần đến 4 tuần sau khi nhiễm bệnh. Bệnh lây truyền qua đường hô hấp do con vật h í t phải không khí trong chuồng nuôi đã nhiễm mầm bệnh, qua thức ăn nước uống, dụng c ụ chăn nuôi và người chăn nuôi đã mang mầm bệnh. Vi rút có khả năng truyền lây qua trứng. 5.1.2. Triệu chứng lâm sàng Gà bị bệnh nói chung có những biểu hiện như thở khó, th ở khò khè, vươn cổ lên thở, hắt hơi, kém ăn, xù lông, ở gà đẻ trứng có biểu hiện dừng đẻ hoặc giảm đẻ, v ỏ trứng đẻ ra mềm và nhăn nheo. Một số gà chết do bị nhiễm khu ẩ n kế phát và sức đ ề kháng giảm. Nếu gà mắc bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm mà ghép với nhiễm khuẩn Mycoplasma (bệnh gây viêm khớp, bại liệt), th ì có phân màu trắng, mào xanh tím, uống nước nhiều. Nếu bị nhiễm kế phát với vi khuẩn thương hàn hoặc E. co l i th ì gà bị tiêu chảy có phân trắng xanh và loãng. 5.1.3. Bệnh tích - Viêm tích dịch ở xoang mũi, khí qu ả n. - T ú i khí đục, có thể chứa dịch tiết vàng. - Viêm phổi - Thận s ư ng, nhạt màu, trong ống d ẫ n niệu chứa tinh thể urat. - Thoái hóa buồng trứng, vòi d ẫ n trứng sưng. Đôi khi thấy lòng đỏ trong bụng của gà mắc bệnh do màng trứng bị viêm. 5.2. Chẩn đoán tr ong phòng th í nghiệm 5.2.1. Lấy mẫu 5.2.1.1. L ấ y mẫu bệnh phẩm đ ể phát hiện kháng nguyên L ấ y mẫu bệnh ph ẩ m để xét nghiệm c ầ n được thực hiện sớm, ngay khi gà có biểu hiện triệu chứng lâm sàng. Bệnh phẩm bao gồm: - D ị ch đường h ô h ấ p trên của gà còn sống, dùng tăm b ô ng (xem 4.8) để ngoáy dịch - Phổi được bảo quản trong hộp đựng m ẫ u bệnh ph ẩ m hoặc trong túi nilon vô trùng. - Đối với những con bị viêm thận hoặc vi ê m buồng trứng th ì có thể lấy thận hoặc ố ng dẫn trứng làm mẫu. Tất cả mẫu bệnh phẩm sau khi lấy phải bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2 ° C đến 8 ° C và vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm sớm nh ấ t kh i có thể (kèm theo phi ế u bệnh phẩm). 5.2.1.2. L ấ y mẫu bệnh phẩm để phát hiện kháng thể L ấ y máu gà đ ể chắt huyết thanh. Dùng bơm ti ê m (xem 4.7) l ấ y máu gà kiểm tra, đặt nghiêng, yên tĩnh cho máu đông và tránh dung huyết, sau đ ó chắt huyết thanh cho xét nghiệm phát hiện kháng thể IB. Bảo quản mẫu trong điều kiện lạnh từ 2 ° C đ ế n 8 ° C và vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm sớm nh ấ t khi có thể (kèm theo phi ế u bệnh ph ẩ m). CHÚ TH Í CH: kh ô ng l ấ y mẫu huyết thanh của g à đã tiêm phòng vắc xin IB đ ể xét nghiệm kháng thể cho mục đ í ch ch ẩ n đoán bệnh. 5.2.2. Phát hiện và giám đ ị nh kh á ng nguy ê n 5.2.2.1. Xử lý bệnh phẩm Mẫu bệnh ph ẩ m là phủ tạng (phổi, thận, ống dẫn trứng): l ấ y từ 1 g đến 2 g, d ù ng kéo (xem 4.1) cắt nhỏ rồi nghiền trong cối chày sứ (xem 4.1) vô trùng v ớ i dung dịch PBS thành huyễn dịch 10 %, bổ sung 0,1 ml dung dịch kháng khuẩn. Ly tâm với gia tốc 900 g trong 10 min, rồi thu l ấ y dịch nổi đ ể xét nghiệm vi rút bằng phương pháp RT-PCR. Bệnh phẩm là máu được giữ ở 4 ° C đến 8 ° C , chờ đông rồi chắt l ấ y huyết thanh để chẩn đoán phát hiện kháng thể (xem 5.2.3) bằng phương pháp HI hoặc ELISA. 5.2.2.2. Ph ươ ng pháp RT-PCR 5.2.2.2.1. Nguyên tắc Phản ứng RT-PCR dùng để phát hiện ARN của vi rút IB bằng việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu. C ặ p m ồ i được thiết kế để khuếch đại đoạn S1 của gen glycoprotein có độ dài khoảng 700 bp. Cặp mồi này có thể phát hiện được nhiều chủng IBV khác nhau. Tr ì nh tự đoạn các mồi như sau: Bảng 1 - Tr ì nh tự c ặ p m ồ i M ồ i (primers) Trình tự Mồi xuôi (forward primer) 5 ’ -TGA-AAA-CTG-AAC-AAA-AGA-3’ Mồi ngược (reverse primer) 5’-CNG-TRT-TRT-AYT-GRC-A-3’ 5 .2.2.2.2 . Cách tiến hành Mẫu bệnh phẩm sau khi được xử lý (xem 5.2.2.1) đem chiết tách ARN, việc chiết tách có thể bằng kít thương mại (xem phụ lục A mục A.1). a) Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và chu tr ì nh nhiệt Công thức pha hỗn hợp phản ứng và chu tr ì nh nhiệt có thể được thay đổi cho phù hợp với t ừ ng loại mồi và từng loại kít RT-PCR khác nhau (xem A.2 và A.3 phụ lục A). b) Tiến hành phản ứng Sau khi chu ẩ n bị hỗn hợp phản ứng, đưa mẫu vào máy PCR (4.5) và chạy chương trình (chu trình nhiệt) đã được c à i đặt (xem A.3 phụ lục A) Mỗi một lần chạy phản ứng, ngoài mẫu xét nghiệm, cần có một đối chứng dương và một đối chứng âm. Đối chứng dương là mẫu ARN của vi rút IB đã bi ế t, đối chứng âm là nước tinh khiết không có nuclease (xem 3.3). c) Điện di và hiển thị sản phẩm PCR Sau khi chạy phản ứng RT-PCR, ti ế n hành điện di sản ph ẩ m PCR (xem A.4 ph ụ lục A) d) Đọc kết quả Đặt gel đã điện di vào máy chi ế u UV(xem 4.6) (UV transilliuminator) có bước sóng 590 nm. Các mẫu có hiển thị sản ph ẩ m giống như đối chứng dương và có kích thước 700 bp là âm tính. Mẫu âm tính không có vạch sản phẩm xuất hiện. Nếu sản phẩm hiện lên mờ hoặc không r õ nét (trường hợp nghi ngờ) th ì tiến hành lặp lại phản ứng RT- PCR một lần nữa. 5.2.3. Phát hiện kháng thể Ph ả n ứ ng huyết thanh học có ý nghĩa chẩn đoán khi gà mắc bệnh có triệu chứng, bệnh tích nghi IB và chưa tiêm phòng vắc xin IB, hoặc sử dụng để đ ánh giá kết quả tiêm phòng vắc xin IB. 5.2.3.1. Xử lý bệnh phẩm Bệnh phẩm là máu sau được xử lý (xem 5.2.2.1) lấy huyết thanh làm phản ứng HI 5.2.3.2. Phương pháp HI Dùng đĩa ngưng kết 96 gi ế ng (xem 4.3) để làm phản ứng. a) Cách ti ế n hành (Xem B.3 phụ l ụ c B) b) Đọc k ế t quả Phản ứng dương tính: có sự ức ch ế ngưng k ế t hồng cầu ở hiệu giá pha loãng ≥ 1/16. Ph ả n ứng âm tính: không có sự ức chế ngưng kết hoặc có sự ức ch ế ngưng k ế t ở hiệu giá pha loãng <> CH Ú TH Í CH: Phương pháp này không đòi hỏi nhi ề u thi ế t b ị máy móc, thực hiện đơn giản. Tuy nhiên, phương pháp này không phân biệt được kháng th ể IB do ti êm phòng vắc xin hay do nhiễm th ự c địa. 5.2.3.3. Phương pháp ELISA C ó thể s ử dụng các kít thương mại đã được c ấ p phép sử d ụ ng và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xu ấ t để xét nghiệm kháng th ể bệnh IB (tham khảo Phụ lục C). CHÚ TH Í CH: Phương pháp này nhanh, nhạy v à d ễ thực hiện. Tuy nhiên, không phân biệt được kháng thể do tiêm phòng vắc xin IB hay kháng th ể do nhiễm thực địa. 6. Báo cáo kết quả Gà được xác định là m ắ c bệnh viêm phế quản truyền nhiễm khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu ch ứ ng lâm sàng của bệnh viêm phế quản truyền nhiễm và có kết quả xét nghiệm dương tính bằng một trong những phương pháp RT-PCR, HI hoặc ELISA. PHỤ LỤC A (Tham khảo) Chuẩn bị phản ứng RT-PCR A.1 . Chiết tách ARN từ mẫu bệnh phẩm Chi ế t tách ARN theo qui tr ì nh của kit Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc #74106 250 được thực hiện như sau: - Nhỏ 200 μl dịch nghi ề n phủ tạng vào ống ly tâm 1,5 ml cùng với 500 μl Qiagen® buffer RLT có 1 % β-ME, l ắ c đ ề u trên máy lắc Vortex rồi ly tâm nhẹ; - Thêm 500 μl etanol 70 % (xem 3.1) v à o ống, lắc mạnh bằng máy Vortex rồi ly tâm nhẹ; - Chuyển toàn bộ dịch nổi sang cột lọc RNeasy® Qiagen, ly t â m trong 15 s với gia tốc bằng hoặc lớn hơn 8 000 g (xem 4.4) ở nhiệt độ phòng; - Cho 700 μl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với gia tốc bằng hoặc lớn hơn 8 000 g, thay ống thu mới vào cột lọc; - Nhỏ 500 μl d ung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy® và ly tâm trong 15 s với gia tốc bằng hoặc lớn hơn 8 000 g, thay ống thu mới, lặp lại 2 lằn với dung dịch rửa RPE buffer; - Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở tốc độ tối đa, bỏ ống thu; - Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 μl nước tinh khiết không c ó Nuclease (xem 3.3) vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong í t nhất 1 min. Tách ARN bằng cách ly tâm trong 1 min với gia tốc bằng hoặc lớn hơn 8 000 g, b ỏ cột lọc, gi ữ lại dịch trong ống thu ARN; - Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 ° C trong th ờ i gian ngắn trước khi ti ế n hành RT-PCR. Nếu thực hiện sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở nhiệt độ không lớn hơn -20 ° C . A.2 . Chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng RT-PCR dùng kít của h ã ng Invitrogen (Cat. 11732-020). Thành ph ầ n Lượng Nước 6 μ l Hỗn hợp phản ứng (2X reaction mix) 12,5 μ l Mồi xuôi 0,5 μ l Mồi ngược 0,5 μ l Hỗn hợp enzym 0 , 5 μ l Mẫu ARN 5 μ l T ổ ng lượng 25 μ l A.3 . Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR được cài đặt theo hướng dẫn kèm theo kit Invitrogen (Cat. 11732-020) như sau: Chu kỳ 1 (RT) X 1 vòng Chu kỳ 2 (PCR) X 40 vòng Chu kỳ cuối 50 ° C , 15 min 95 ° C , 2 min 95 ° C , 10 s 52 ° C , 30 s 68 ° C , 30 s 4° C , 15 min A.4 . Điện di và hiển thị sản phẩm PCR Pha 1,5 g bột agarose (gel) với 100 ml 1xTAE rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đ ế n khi tan hoàn toàn. Khi hỗn hợp nguội bớt (khoảng 50 ° C đ ế n 60 °C), thêm ti ế p 2 μ l etidium bromua 10 mg/ml (xem 3.2). Sau đó, đổ vào khay rồi cắm lược. Đ ể gel cứng lại trong vòng 30 min -1 h, rồi rút lược ra. Đổ đầy dung dịch 1xTAE vào bể điện di (xem 4.6) (đến vạch “ full level ” ), đặt khay gel vào v ị tr í trong bể điện di. Pha 2 μ l đệm tải mẫu (loading dye) với 6 μ l 100 bp ladder rồi dùng micropipet (xem 4.2) đưa vào giếng đầu tiên của miếng gel. Pha 2 μ l đệm tải mẫu với 10 μ l mẫu (sản phẩm PCR) r ồ i đưa vào các giếng còn lại của miếng gel. Điện di gel ở 80 V đến 100 V trong 25 min đến 35 min. PHỤ LỤC B (Quy đ ị nh) Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng HI B.1 . Dung d ị ch PBS, pH từ 7,0 đến 7 4, chuẩn bị như sau: NaC l 8g KC l 0,2 g Na 2 HP O 4 .2H 2 O 2 , 9 g KH 2 P O 4 0,2 g Nước c ấ t 1 000 ml Đi ề u chỉnh pH = 7,2 bằng dung dịch NaOH hoặc dung dịch HC l . Hấp vô trùng ở 121 ° C trong vòng 20 min. Bảo quản ở 4 ° C . B.2 . Cách pha kháng nguyên 4 đ ơ n vị HA Ví dụ: Hiệu giá kháng nguyên được ghi tr ê n lọ là 1/256 th ì 4HA bằng 1/256 x 4 = 1/64 Kháng nguyên pha 4 đơn vị HA cần phải điều chỉnh để phản ứng HI có k ế t quả chính xác. Cách pha: Ví dụ: 4HA b ằ ng 1/64. Pha 4HA g ồ m 1 phần kháng nguyên và 63 phần nước sinh lý (hoặc PBS). Kiểm tra kháng nguyên 4 HA đ ã pha: Ti ế n hành phản ứng HA n ế u kết qu ả ngưng kết đến giếng thứ 2 là kháng nguy ê n pha đạt. N ế u ngưng k ế t đ ế n giếng thứ 3 (hoặc hơn) là k háng nguyên pha đặc. Nếu ngưng kết chỉ ở gi ế ng đầu ti ê n là kháng nguyên pha loãng. Dựa vào k ế t quả đó để bổ sung thêm kháng nguyên hoặc nước sinh lý đ ể có kháng nguyên 4HA chu ẩ n. B.3 . Cách tiến hành phản ứng HI - Cho dung dịch PBS (xem phụ lục B mục B.1) vào các gi ế ng từ giếng 1 đế n gi ế ng 12, mỗi giếng 25 μ l . - Cho 25 μ l huy ế t thanh cần kiểm tra vào gi ế ng 1. - Pha loãng huy ế t thanh: Trộn đều huy ế t thanh với PBS ở gi ế ng 1, hút 25 μ l chuyển sang giếng 2 trộn đều, hút 25 μ l chuyển sang gi ế ng 3 tiếp tục làm như vậy đ ế n gi ế ng 11, hút bỏ 25 μ l đi ở gi ế ng 11. - Cho kháng nguyên IB chuẩn 4 đơn vị HA (xem B.2 phụ lục B) vào các giếng từ 1 đến 11, mỗi giếng 25 μ l . - Lắc nhẹ, để 30 min ở nhiệt độ phòng. - Cho 25 μ l hồng cầu vào t ấ t cả các gi ế ng, lắc nhẹ 1 min. Giữ đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng. Đọc kết qu ả sau từ 15 min đến 30 min. (xem sơ đồ ph ả n ứng HI bên dưới) Sơ đ ồ thực hiện phản ứng HI Bước tiến hành Nguyên li ệ u Gi ế ng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (đối chứng HC) Pha loãng HT PBS ( μ l ) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 HT kiểm tra 25 Trộn đều, chuyển 25 μ l lần lượt từ giếng 1 đến 11 rồi hút b ỏ 25 μ l . 0 Cho KN 4 HA IB(μ l ) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 0 Lắc nhẹ, để 30 min ở nhiệt độ phòng Thêm HC HC ( μ l ) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha loãng HT CH Ú TH Í CH: HT: huy ế t thanh; KN: Kháng nguyên; HC: H ồ ng cầu. PHỤ LỤC C (Tham khảo) Phương pháp Elisa phát hiện kháng thể IB Bước 1: Nguyên liệu trong bộ k í t n ê n để ra nhiệt độ ph ò ng 30 min trước khi làm ph ả n ứng. Bước 2: Mẫu huyết thanh cần kiểm tra được pha loãng bằng dung dịch pha loãng mẫu tỷ l ệ 1:500 trong các ống pha loãng mẫu vô trùng. Bước 3: Nước rửa (trong bộ kít) được pha lo ã ng 10 lần với nước cất. Bước 4: Nhỏ 100 μ l đối chứng âm chuẩn vào giếng A1 và A2; Bước 5: Nh ỏ 100 μ l đối chứng dương chu ẩ n vào giếng B1 và B2; Bước 6: Nh ỏ 100 μ l huyết thanh c ầ n kiểm tra được pha loãng vào giếng C1 và C2 , D1 và D2, nh ỏ lần lượt cho đến hết các mẫu cần kiểm tra (mỗi mẫu hai giếng); Bư ớ c 7: Ủ đ ĩ a ở nhiệt độ phòng trong 30 min; Bước 8: Rửa đĩa từ 3 lần đến 5 lần với lượng 350 μ l cho mỗi giếng bằng nước rửa đã pha lo ã ng; Bước 9: Nhỏ 100 μ l chất gắn kết vào tất cả các giếng; Bước 10: Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min; Bước 11: Lặp lại bước 5; Bước 12: Nh ỏ 100 μ l TMB vào t ấ t cả các giếng; Bước 13: Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 min; Bư ớ c 14: Nh ỏ 100 μ l dung dịch dừng phản ứng vào tất c ả các giếng; Bước 15: Đưa vào máy đọc với giá tr ị đo ở bước sóng 650 nm và đọc kết quả Sơ đồ vị trí mẫu trong đĩa ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A NC NC S7 S7 S15 S15 S23 S23 S31 S31 S39 S39 B PC PC S8 S8 S16 S16 S24 S24 S32 S32 S40 S40 C S1 S1 S9 S9 S17 S17 S25 S25 S33 S33 S41 S41 D S2 S2 S10 S10 S18 S18 S26 S26 S34 S34 S42 S42 E S3 S3 S11 S11 S19 S19 S27 S27 S35 S35 S43 S43 F S4 S4 S12 S12 S20 S20 S28 S28 S36 S36 S44 S44 G S5 S5 S13 S13 S21 S21 S29 S29 S37 S37 S45 S45 H S6 S6 S14 S14 S22 S22 S30 S30 S38 S38 S46 S46 Đọc kết quả: Phản ứng được công nhận khi PCx TB - NCx TB ≥ 0,075; NCx TB ≤ 0,150 Giá trị trung b ì nh đối chứng âm: NC x TB = giếng A1 + giếng A2 2 Giá trị trung b ì nh đối chứng âm: PC x TB = giếng B 1 + giếng B 2 2 Giá trị của mẫu: S/P = TN mẫu - NCx TB PCx TB - NCx TB - Giá trị S/P của mẫu ≤ 0,2: âm tính - Giá tr ị S/P của mẫu > 0,2: dương t í nh CH Ú TH Í CH: NC (negative control): đối chứng âm; NCx TB : đố i chứng âm trung b ì nh PC (positive con tr ol): kiểm soá t đối chứng dương; PCx TB : đố i chứng dư ơn g trung b ì nh S/P (sample/positive): mẫu/đố i ch ứ ng dương TB mẫu: Giá tr ị trung b ì nh mẫu x TB : Giá tr ị trung b ì nh. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. OIE (2008). In f ectious bronchitis. In Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestr i al Animals (P443-452), Chapter 2.3.2. [2]. OIE, FAO - avian inf l uenza and Ne w castle Disease-A field and Laboratory Manual; llar i a Capua.Dennis J.AIexander Editors (P175-176). [3]. Bộ Nông nghiệp và PTNT - Viện Th ú y Quốc gia - Tổ chức hợp tác quốc t ế Nhật Bản JICA (2002). Bệnh Viêm phế qu ả n truyền nhiễm. Trong Cẩ m nang chẩn đoán tiêu chuẩn v ề các bệnh gia súc ở Việt Nam (trang 164-165) .