TCVN11136:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11136:2015 về Vi sinh vật trong thực phẩm - Phát hiện Bacillus anthracis trong môi trường nuôi cấy bằng phân tích sắc ký khí các metyl este của axit béo TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11136:2015 VI SINH VẬT TRONG THỰC PH Ẩ M - PHÁT HIỆN BACILLUS A NTHRACIS TRONG M Ô I TRƯỜNG NUÔI C Ấ Y B Ằ NG PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ CÁC METYL ESTE CỦA AXIT BÉO Microbiology of food - Detection of botulinal neurotoxins A, B, E and F Lời nói đầu TCVN 11136:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2004.11 I denti f ication of Bacillus an t hracis from culture. Gas chromatographic analysis of f atty acid methyl esters (FAMEs) ; TCVN 11136:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân t í ch và lấy mẫu biên soạn, T ổ ng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng t hẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công b ố . VI SINH VẬT TRONG THỰC PH Ẩ M - PHÁT HIỆN BACILLUS A NTHRACIS TRONG M Ô I TRƯỜNG NUÔI C Ấ Y B Ằ NG PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ CÁC METYL ESTE CỦA AXIT BÉO Microbiology of food - Detection of Bacillus anthracis from culture by gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters 1 . Phạm v i áp dụng Tiẻu chuẩn này quy định phương pháp xác định các chủng phân lập Bacillus anthracis thuần trong môi trường nuôi cấy. 2 . Nguyên tắc Nuôi cấy vi khu ẩ n bằng phương pháp MIDI (Microbial IDenti f ication Inc) và chiết các axit béo sau khi xà phòng hóa trong dung dịch metanol-natri hydroxit loãng, sau đó được tạo dẫn xuất bằng d ung dịch metanol-axit clohydric loãng để thu được các metyl este của axit béo (FAME) tương ứng. Các metyl e s te của axit béo được chiết ra khỏi pha nước bằng dung môi hữu cơ và dung d ịch tạo thành được phân tích bằng sắc ký khí (GC). Phần mềm MIDI tự động thực hiện mọi quá trình phân tích và sử dụng thuật toán nhận dạng mẫu được công nhận để nhận dạng FAME chưa biết so với thư viện phổ. 3 . Thuốc thử và vật liệu thử 3.1 . Yêu c ầ u chung Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích LC và sử dụng nước cất hoặc nước đ ã loại ion có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác. CHÚ Ý: Rửa sạch t ấ t c ả các dụng cụ thủy tinh, kể cả các chai đựng thuốc thử b ằ ng cách ngâm trong chất làm sạch chất lượng cao về sinh học, sau đó được rửa kỹ bằng nước cất. Làm khô các chai đựng Thuốc thử 2 và Thu ố c thử 3 trước khi chuẩn bị hoặc bổ sung các chất phản ứng. Các ống đựng m ô i trường nuôi cấy và các chai đựng thuốc thử phải c ó nắp v ớ i lớp lót bằng Te f lo n. Chuẩn bị các thuốc thử trong chai màu nâu sạch, dung tích 1 lít đã dán nhãn, trong có que khuấy ph ủ Te f lon để hỗ trợ cho việc trộn. Ch ỉ có phần thủy tinh và lớp Teflon có thể tiếp xúc với thuốc thử. Các thuốc thử phải bền ít nhất 60 ngày ở nhiệt độ phòng. 3.2 . Thuốc thử 1, natri hydroxit trong metanol Hòa tan 45 g natri hydroxit (NaOH) trong 150 ml metanol và 150 ml nước cất. 3.3 . Thu ố c thử 2, axit clohydr i c trong metanol Trộn 325 ml axit clohydric (HCI) đã được chứng nhận hoặc đã được chuẩn hóa 6,00 M với 275 ml metanol. 3.4 . Thuốc thử 3, dung môi h ỗ n hợp Trộn 200 ml hexan với 200 m metyl-tert-butyl ete (MTBE). 3.5 . Thuốc thử 4, dung dịch natri h y droxit Hòa tan 10,8 g natri hydroxit trong 900 ml nước đ ã khử ion hoặc nước cất. 3.6 . Dung dịch natri clorua b ã o hòa Cho 40 g natri clorua (NaCI) vào 100 ml nước cất. 3.7 . Dung dịch hiệu chuẩn Hỗn hợp của các axit béo bão hòa mạch thẳng từ C9 đến C20 và 5 hy d roxy axit, được cung cấp cùng hệ thống GC. Các hydroxy axit đặc biệt nhạy với các thay đổi về áp suất/nhiệt độ và nhiễm bẩn lớp lót c ổ ng bơm. V ì vậy, các h ợ p chất này được dùng để kiểm soát chất lượng của hệ thống. 3.8 . Môi tr ườ ng nuôi c ấ y Thạch trypticase đậu tư ơ ng với 5% m á u cừu đã khử fibrin, v í dụ BD Biosciences Codi fi ed Cat. No. 221239. 3.9 . Vi sinh vật kiểm soát ch ấ t lượng (QC): B. cereus ATCC 14579. 3.10 . Chuẩn hiệu chuẩn MIS (Microbial Identi f ication System). 4 . Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể các thiết bị, dụng cụ sau: 4.1 . Hệ thống nhận dạng, v í dụ: hệ thống nhận dạng vi khu ẩ n (MIS) Sherlock, phần mềm phiên bản 4.0 hoặc cao hơn (MIDI). 4.2 . Thư v iện các vi khuẩn khủng b ố sinh học MIDI và phương pháp phiên bản BTR20 hoặc mới hơn. 4.3 . Máy sắc ký khí, được trang bị detector ion hóa ngọn lửa (FID), bộ lấy mẫu tự động, bộ bơm mẫu, bộ điều khiển và khay lấy mẫu. Điều kiện hoạt động: Nhiệt độ bơm: T ỷ lệ phân dòng: Nhiệt độ detector: Tốc độ tăng nhiệt độ l ò : Thời gian chạy GC: Các loại khí: Môi trường: 250 °C 100 : 1 (55 ml/min ± 0,5 ml/min) 300 °C tăng từ 170 °C đến 270 °C với tốc độ 5 °C/min 22 min dùng khí hydro làm khí mang và kh í nitơ làm khí phụ trợ (cả hai loại khí có độ tinh khiết đến 99,999%) và không khí khô sắc ký khí hoạt động trong dải nhiệt độ từ 10 °C đ ế n 40 °C và độ ẩ m tương đối từ 20% đến 80%. 4.4 . Cột mao quản, ví dụ kích thước 25 m x 0,2 mm x 0,33 m m độ dày màng v ớ i 5% diphenyl + 95% dimetylsiloxan, ho ặ c tương đ ươ ng. 4.5 . Hệ thống máy t í nh, hệ thống MIDI chạy trên một máy tính tương thích. 4.6 . Xyranh. 4.7 . Lớp lót cổng bơm. 4.8 . T ủ ấ m, có thể duy tr ì nhiệt độ ở 35 °C ± 1 °C. Không sử dụng t ủ ấm có C O 2 . 4.9 . Nồi cách thủy, c ó thể duy trì nhiệt độ từ 95 °C đến 100 °C v à ở 80 °C ± 1 °C. Không sử dụng kh ố i gia nhiệt. 4.10 . Máy trộn Vortex. 4.11 . Que cấy, đường kính vòng 4 mm. 4.12 . Bộ trộn quay. 4.13 . Pipet, điều chỉ nh được dung tích 2 ml và 5 ml. 4.14 . P i pet Pasteur , dùng một lần. 4.15 . Lọ lấy mẫu tự động , dung tích 2 ml, có nắp vặn. 4.16 . Ố ng nuô i cấy, kích thước 13 mm x 100 mm, có nắp vặn. 5 . Cách tiến hành 5.1 . Yêu c ầ u chung Sử dụng pipet ch ỉ có các phần Te f lon hoặc thủy tinh tiếp xúc với thuốc thử. Không sử dụng pipet có bầu cao su. Làm nóng hoặc dùng ngọn l ửa đốt đầu tip pipet Pasteur dùng một lần, có miếng đệm ngăn bọt kh í để tránh nhiễu pic sắc ký. Các pipet tự động cần được kiểm tra trước khi dùng. Kiểm tra lượng phân phối của các p i pet 2 ml và 5 ml bằng cách phân phối các lượng xác định vào ống đong chia vạch 10 m l . 5.2 . Phân lập tế bào Phòng thử nghiệm thực hiện theo quy trình thao tác chuẩn (SOP). Lấy các đĩa thạch máu ra và đ ể cho cân bằng đến nhiệt độ phòng. Ghi l ại mã nhận biết cho các đĩa thạch máu. Một người thứ hai kiểm tra ống thạch nghiêng và đĩa thạch máu để khẳng định chính xác việc truyền lại mã nhận biết. Cấy đĩa thạch thứ nhất: Sử dụng kiểu ria cấy bốn vùng để c ó b ố n mức mật độ và để kiểm tra độ thuần khiết. Ủ đĩa thứ nhất trong tủ ấm (4.8) ở 35 °C ± 1 o C trong 24 h ± 2 h. Cấy đĩa thạch th ứ hai: tiệt trùng và làm nguội v ò ng cấy (4.11) bằng cách di vòng cấy trên phần không có vi khuẩn mọc của đĩa thạch thứ nhất. Chọn phần vi khuẩn thuần có mật độ thưa nhất, lấy một ít vi khuẩn ria cấy bốn vùng lên đĩa thạch thứ hai. Ủ đĩa thứ hai trong tủ ấm (4.8) ở 35 °C ± 1 °C trong 24 h ± 2 h. Chuyển khoảng 40 mg tế bào (khoảng một vòng cấy đầy) từ vùng thưa nhất có vi khuẩn mọc theo đường cấy (pha log). Trường hợp đi ể n h ì nh, sinh khối tế bào được thu lấy từ vùng cấy thứ ba nhưng với các ch ủ ng Bacillus phát triển nhanh thì c ó thể thu lấy tế bào từ vùng thứ ba hoặc thứ tư. Chuyển các tế bào sang ống nuôi cấy có n ắ p vặn (4.16) sạch, k hô, dán nh ã n. 5.3 . Chuẩn bị các metyl este axit béo từ tế bào nuôi c ấ y CHÚ Ý: Phải thực hiện ch í nh xác các bước quy định. Mọi sai lệch sẽ cho kết quả không chính xác. 5.3.1 . Xà phòng hóa Đặt giá đựng các ống sinh khối tế bào vào nồi cách th ủ y đun sôi (4.9). Dùng pipet lấy 1,0 ml ± 0,1 ml thuốc thử 1 (3.2) cho vào mỗi ống. Vặn chặt nắp ống. Sau 30 min, l ấ y gi á đựng ố ng nghiệm ra và làm nguội dưới vòi nước lạnh. 5.3.2 . Mety l hóa Cho 2,0 ml ± 0,1 ml thuốc thử metyl hóa (thuốc thử 2) (3.3) vào mỗi ống. Trộn d ung dịch trên máy trộn Vortex (4.10) khoảng từ 5 s đến 10 s và vặn chặt nắp. Làm nóng các ống nghiệm ở 80 °C ± 1 °C trong nồi cách thủy (4.9) kho ả ng 10 min ± 1 min. Lấy giá đựng ống nghiệm ra và làm nguội dưới vòi nước lạnh. 5.3.3 . Chi ế t Cho 1,25 ml ± 0,1 ml dung môi hỗn hợp (thuốc thử 3) (3.4) vào mỗi ống. Vặn chặt nắp. Đặt các ống nghiệm trong bộ trộn quay (4.12) và trộn nhẹ tr ong 10 min. Sử dụng một pipet Pasteur (4.14) sạch cho mỗi ống và loại bỏ pha nư ớ c. 5.3.4 . Rửa B ổ sung 3,0 ml ± 0,1 ml dung dịch natri hydroxit (thuốc thử 4) (3.5) vào mỗi ống. Vặn chặt nắp. Đặt các ống vào bộ trộn quay của phòng thử nghiệm (4.12) và trộn nh ẹ trong 5 min. Nếu cần, thêm vài giọt dung dịch natri clorua bão hòa (3.6) ống để hỗ trợ cho việc phá nhũ tương. Giữ ống theo phương th ẳ ng đứng, cuộn ống nhanh giữa hai lòng bàn tay và để yên trong vài phút. Ngoài ra, có thể ly tâm 3 min ở tốc độ 2000 r/min. Chuyển ngay pha phía trên và không để lớp phía tr ê n tiếp xúc v ớ i dịch rửa. 5.3.5 . Chuy ể n dịch ch i ết Dán nhãn các lọ lấy mẫu tự động tương ứng chính xác với các lọ thử nghiệm. Sử dụng một pipet Pasteur (4.14) cho mỗi dung dịch , chuyển khoảng 2/3 lớp hữu cơ phía trên vào các lọ l ấ y mẫu tự động đã dán nhãn. Đậy nắp với màng ngăn PTFE. 5.3.6 . Bảo qu ả n d ị ch ch iế t Bảo quản các lọ đã đậy nắp ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh (từ 2 °C đến 8 °C) đến 7 ngày. Sau khi ph â n tích GC, dịch chiết c ó thể được bảo quản trong tủ lạnh đến 7 ngày. 5.4 . Chuẩn hiệu chuẩn Các dữ liệu thời gian lưu được chuyển đ ổ i bởi hệ thống phần mềm sang số liệu chiều d ài chuỗi tương đương (ECL) để xác định tên axit béo của vi khuẩn. Giá tr ị ECL đối với mỗi axit béo thu được là hàm số thời gian rửa giải liên quan đến các thời gian rửa giải của các axit béo mạch thẳng đã biết và được thiết lập theo 0,010 đơn vị ECL. Phần mềm này so sánh giá trị ECL cho các dãy ổn định nhất (mạch thẳng bão hòa hoặc axit mạch nhánh) với các giá trị thiết lập về lý thuyết. Nếu có sự khác biệt so với các chu ẩ n, th ì hệ thống có thể tự động hiệu chuẩn lại. 5.5 . Sự phù hợp của hệ thống Điền v à o b ả ng định tính hiệu năng (PQ) đối với mỗi m ẻ thử nghiệm. Mỗi mẻ có 2 lần chạy hiệu chuẩn, một kiểm chứng dương tính vi khuẩn Bacillus cereus (ATCC 14.579) và một mẫu trắng để kiểm chứng âm tính ban đầu. Phép kiểm chứng dương tính B. cereus là phép ch ẩ n đoán đối với quy trình ch uẩ n b ị m ẫ u và y ê u cầu phải có chỉ số tương tự Similarity Index (SI) > 0,600. Phép ki ể m chứng âm tính là ch ẩ n đoán về các chất nhiễm bẩn. Các dữ liệu hiệu chuẩn thứ hai là ch ẩ n đoán về các vấn đề của phần cứng. 5.6 . Xác định Mỗi phép xác định bao gồm: - Bơm chất chuẩn hiệu chuẩn MIS (3.10) hai l ầ n. - Bơm mẫu trắng QC. - Bơm chủng vi khu ẩ n kiểm chứng Bacillus cereus. Điền các thông số vào bảng MIDI PQ ngay sau khi hai lần chạy 2 GC. Nếu thông số bất kỳ n ằ m ngoài phạm vi, th ì dừng lại và thực hiện hành động khắc phục. - Nếu bảng MIDI PQ được thông qua, thì tiếp tục b ơ m từng dịch chiết thử nghiệm. - Hệ thống sẽ tự động bơm dung dịch chuẩn hiệu chuẩn bổ sung sau lần chạy thứ 11. 5.7 . Giải thích kết quả Việc nhận biết vi khuẩn được dựa trên hệ thống SI, biểu thị mối tương quan giữa các thành phần axit béo của vi khuẩn thử nghiệm so với các thành phần axit béo của mẫu chuẩn. Sự phù h ợ p chính xác cho S I = 1,000. Chủng c ấ y được xác định là B. anthracis khi đây là lựa chọn thứ nhất và S I > 0,400, như đ ã được xác đ ị nh trong nghiên cứu chọn lọc dương/chọn lọc âm. Hệ thống tự động kiểm tra phản ứng GC tổng và các pic một cách chính xác. Đánh dấu sắc ký đồ kh ô ng đáp ứng được các quy định về chất lượng. Các hướng dẫn được đưa ra để khắc phục sự cố và thử nghiệm lại. Nếu kết qu ả thử vẫn có vấn đề thì phép thử không hợp lệ. a) Xác định Bacillus anthracis l à dương tính hay âm t ính, áp dụng các quy tắc sau đây: - nếu phép thử bị đánh dấu thì phép thử đó không hợp lệ. - nếu Bacillus anthracis (BA) có S I < 0,400="" và="" ba="" có=""> I < nn="" si,="" khi="" đó="" phép="" thử="" là="" âm="" tính=""> Bacillus anthracis. - nếu BA có SI > 0,400 và BA SI > NN SI, khi đó phép thử l à dương tính Bacillus anthracis. BA SI là chỉ số tương đồng cao nhất được báo cáo cho hệ thống MIDI về B. anthracis . NN SI là chỉ số tương đồng cao nhất được báo cáo cho hệ th ố ng MIDI về mục nhập lân cận gần nhất. Điểm ngắt S I 0,400 đối với B. anthracis được thiết kế để đ ả m bảo sự phù hợp với cơ sở dữ liệu phản ánh sự thích ứng mức loài xác định. b) T ỷ lệ độ nhạy Độ nhạy là kh ả năng mà phương pháp sẽ phân loại mẫu thử là dương tính, mẫu thử được biết là dương t í nh. Ước tính độ nhạy ( p +) thu được bằng cách đếm s ố lượng dương tí nh đã biết đối với phương ph á p thử (ai) ngoài các mẫu thử B. anthracis ( n i ) đối với phòng thử nghiệm thứ i: c) Tỷ lệ đặc hiệu Tỷ lệ đặc hiệu là khả năng mà phương pháp sẽ phân loại mẫu thử là â m tính, mẫu thử được biết là âm tính. Ước t í nh t ỷ lệ đặc hiệu ( p _) thu được bằng cách đếm số lượng âm tính đã biết đối với phương pháp thử ( b i ) ngoài các mẫu thử lân cận gần nhất ( m i ) đối với phòng thử nghiệm thứ i : 6 . Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm các thông tin sau đây: a) mọi thông tin cần thiế t để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; c) c á c kết quả thu được; d) ngày kết thúc thử nghiệm; e) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu ch uẩ n này cùng với mọi t ì nh huống bất thường khác có thể ảnh hưởng đến kết quả.