TCVN8400-20:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-20:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 20: Bệnh đóng dấu lợn TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-20 : 2014 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 20: BỆNH ĐÓNG DẤU LỢN Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 20: Swine erysipelas Lời nói đầu TCVN 8400-20 : 2014 do Trung tâm Ch ẩ n đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 20: BỆNH ĐÓNG DẤU LỢN Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 20: Swine Erysipelas C ẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thi ết bị và các thao tác gây nguy hiểm cho người xét nghiệm. Tiêu chu ẩ n này không thể đưa ra được t ấ t cả các v ấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Khi áp dụng ti ê u chu ẩ n ng ười s ử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập các thao tác ph ù hợp để đảm bảo an toàn sức khỏe và xác định khả năng áp dụng các gi ới hạn quy định. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh đóng dấu lợn do vi khuẩn Erysipelothrix rhusiopathiae gây ra. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: Bệnh đóng dấu lợn (S w ine Erysipelas) Bệnh truyền nhiễm, triệu ch ứ ng điển hình c ủa bệnh là trên da có những đám xu ấ t huy ế t theo hình vuông, h ình tròn, do vi khuẩn Gram dương Erysipelothrix rhusiopathiae ( E. rhusiopathiae ) gây ra. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Ch ỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích; sử dụng nước cất hoặc nước đ ã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không c ó Rnase, trừ các trường hợp có quy đ ịnh khác. 3.1 . Môi trường nước thịt 3.2 . Môi trường thạch máu , thạch cơ bản được bổ sung từ 5 % đ ế n 7 % máu cừu, máu bê, hoặc máu th ỏ (pha chế thạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất). 3.3 . Huyết thanh ngựa. 3.4 . Động vật th í nghiệm: chuột bạch hoặc chim bồ câu. 3.5 . Bộ thu ốc nhuộm Gram (Phụ lục A). 3. 6. Thu ố c nhuộm Giemsa (Phụ lục B). 3.7 . Bộ giám định sinh h óa (Phụ lục C). 3.8 . Nguyên liệu cho PCR (Phụ lục D ). 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết b ị , dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học và cụ thể như sau: 4.1 . Tủ ấ m , duy tr ì ở nhiệt độ 37 ° C , có chứa 5 % C O 2 . 4.2 . Kính h iển vi quang học: có vật kính với độ phóng đại 10 lần, 40 lần, 100 lần. 4.3 . Đèn cồn. 4.4 . Phi ế n k í nh , sạch. 4.5 . Que cấy , vô trùng. 4.6 . Ố ng nghiệm, sạch, vô trùng. 4.7 . Que c ấ y chích sâu , vô trùng 5. Cách tiến hành 5.1 . Chẩn đoán l â m sàng 5.1.1 . Đặc đi ể m dịch tễ - Vi khuẩn c ó thể ph â n lập được từ khoảng 50 loài động vật bao gồm: chim, cá, bò sát, động vật có v ú ; nhưng vi khuẩn gây bệnh ch ủ y ế u ở lợn. Lợn 3 tháng đến 3 năm tuổi mẫn cảm nh ấ t với bệnh, lợn dưới 2 tháng t uổi ít mắc bệnh do có miễn dịch thụ động. - Vi khuẩn c ó th ể gây bệnh ở người, nguy cơ mắc bệnh đóng d ấ u cục bộ tại nơi da có vết trầy xước. Một số trường hợp người mắc bệnh bị viêm nội tâm mạc và bại huyết c ấ p t í nh. Hiện nay chưa có bằng chứng cho th ấ y bệnh lây từ người sang người. - Bệnh lây truyền trực tiếp do tiếp xúc giữa lợn mắc bệnh và lợn khỏe hoặc gián tiếp qua các yếu tố trung gian như: phân, nước tiểu, ch ấ t độn chuồng hoặc chất tiết của miệng, mũi. - Bệnh đóng dấu lợn có thể xảy ra quanh năm, nhưng chủ yếu là mùa hè và cuối mùa đông sang mùa xuân. - Lợn khỏe mạnh có thể mang trùng, vi khu ẩ n thường cư trú tại hạch amiđan và các tổ chức lympho. - Tỷ lệ nhiễm bệnh cao và t ỷ lệ chết cao ở những nơi không được tiêm phòng. 5.1.2 . Triệu chứng lâm sàng 5.1.2.1 . Thể cấp tính hoặc nhiễm trùng máu - Lợn mắc bệnh s ố t cao 40 ° C - 42 ° C , điên cuồng, húc đầu vào tường hoặc hộc máu ra mà chết. Một vài lợn chết đột ngột khi chưa có triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng của bệnh. Người ta gọi thể n à y là "Đóng dấu lợn tr ắ ng". - Lợn bỏ ăn, mắt đỏ ngầu, ch ả y nước mắt, nước mũi và khó th ở . - Đi lại khập khiễng và thường nằm một chỗ. - Lợn nái chửa thường bị sảy thai. Lợn tr ưởng thành thường ỉ a phân táo, phân có màng bọc lầy nhầy. Lợn nh ỏ hơn có thể ỉ a chảy. - Lợn mắc bệnh sau 2 đến 3 ngày, trên da xuất hiện các đám đỏ hay đ ỏ tía nổi như mề đay h ình vuông hay hình thoi, đặc biệt l à ở tai, cổ, bụng, trong đùi v à đuôi. Nếu lợn không chết th ì phần da bị hoại tử, khô, cứng, sẫm màu tạo thành v ả y, l úc n à y r ấ t dễ b ị nhiễm trùng kế phát, đặc biệt là ở vùng c ổ và đuôi. - Bệnh tiến triển từ 3 đến 5 ngày, lợn yếu dần, khó th ở , th â n nhiệt giảm, kiệt sức mà chết. - Ở thể cấp tính, tỷ lệ chết 50 % đến 60 %. 5.1.2.2 . Thể á c ấ p tính Thể á cấp tính biểu hiện nhẹ hơn thể c ấ p tính. Lợn không c ó biểu hiện ốm, không sốt cao, không b ỏ ăn, có một s ố triệu chứng ng oài da. 5.1.2.3 . Thể mãn tính Lợn bệnh ở thể cấp tính mà không chết, bệnh kéo dài chuyển sang thể m ã n tính. Lợn ăn uống kém, gầy còm, thiếu máu, thân nhiệt bình thường hoặc sốt nhẹ. Lợn c ó 3 triệu chứng chủ yếu: - C ó tổn thương ở da: da bị hoại tử ở nhiều nơi, rụng lông, da dày lên và bị tróc ra đặc biệt ở vùng tai và đuôi. - Viêm đa khớp, hay gặp ở khớp bàn chân, khớp g ối làm cho lợn bị què, đi khập khiễng hoặc có thể nằm liệt một ch ỗ không đi lại được. - Viêm nội t âm mạc: làm tắc hoặc trở ngại tuần hoàn g â y phù thũng ở phổi, ở chân, có thể bị liệt chân sau do tắc mạch: 5.1.3 . Bệnh tích đại thể 5.1.3.1 . Thể c ấ p tính - Trên da xuất hiện đám xuất huyết h ì nh thoi hay h ì nh vuông. Mô liên kết dưới da tụ máu, thấm nước nhớt màu đỏ. Niêm mạc tụ máu, xu ấ t huyết. - Lách sưng to và tụ huyết, bề mặt sần s ù i, nổi phồng từng chỗ. Lách m ề m, c ắ t ra có màu nâu. - Thận sưng to, tụ huyết, vỏ thận c ó chấm xuất huyết do viêm tiểu cầu thận. - Tim, gan, phổi tụ huyết. Ngoại tâm mạc có tích dịch vàng. Màng bao tim có lấm chấm xuất huyết. - Hạch lympho sưng, phù nề, có xuất huyết l ấ m chấm. - Viêm cata xuất huyết ở dạ dày, ruột (nhất là đoạn tá tràng, không tràng, h ồi tràng). 5.1.3.2 . Thể mãn tính - Hoại tử trên da. - Viêm khớp. - Viêm van tim, đặc biệt là van 2 lá (van tim trái) viêm ở thể loét s ủi như hoa súp lơ. 5.2 . Chẩn đoán trong phòng th í nghiệm 5.2.1 . L ấ y mẫu Bệnh ph ẩ m bao g ồ m: Lợn sống: lấy máu ở vịnh tĩnh mạch cổ hoặc ở tai hoặc ở đuôi. Lấy máu có b ổ sung chất chống đông là h e parin, citrat natri hoặc ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA). Lợn chết: l ấ y gan, lách, tim, dịch khớp. Lấy mẫu vô trùng từ 50 g đến 100 g mỗi loại bệnh phẩm, cho v à o từng lọ hay t úi ni lon vô trùng riêng biệt, đậy kín, bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2 ° C đ ế n 8 ° C và gửi về phòng th í nghiệm chậm nh ấ t 24 h sau khi lấy mẫu. Gửi kèm theo bệnh phẩm giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích và đặc điểm dịch tễ. 5.2.2 . Kiểm tra hình thái vi khuẩn từ bệnh ph ẩ m 5.2.2.1 . Cách làm tiêu bản Bệnh phẩm máu: Lấy một giọt máu nh ỏ lên một phiến kính (xem 4.4), sau đó dàn mỏng đều bằng một phiến k í nh (xem 4.4) khác, để khô. Bệnh ph ẩ m tổ chức: cắt một miếng nhỏ phủ tạng (gan, lách, tim) phết lên phiến kính (xem 4.4), để khô 5 .2.2.2 . Cố định tiêu bản Tiêu bản đã để khô, nh ỏ cồn metanol ngập tiêu bản, để khô. Nhuộm Gram theo quy định của Phụ lục A. Nhuộm Giemsa theo quy định c ủ a Phụ lục B. 5.2.2.3 . Xem hình thái vi khuẩn Nhuộm Gram: vi khuẩn bắt màu tím (m à u của Gram dương). Đối với thể cấp t ính thấy vi khu ẩ n có hình sợi ngắn, còn với thể mãn tính thấy vi khuẩn có hình sợi m ảnh dài. Nhuộm Giemsa: vi khuẩn bắt màu xanh, có hình sợi ngắn hoặc sợi m ả nh dài. 5.2.3 . Tiêm truyền động vật thí nghiệm Tiêm động vật th í nghiệm (xem 3.4): Máu, ph ủ tạng (gan, lách) nghiền nát, hòa với nước muối sinh lý 0,9 % theo t ỷ lệ 1/10. Tiêm cho chuột bạch (từ 0,1 ml đến 0,2 ml/con), chim b ồ câu (từ 0,1 ml đến 0,4 ml/con) vào dưới da, xoang ph úc mạc hoặc tĩnh mạch. Vi khuẩn E. rhusiopathiae làm chết động vật thí nghiệm sau 72 h đến 96 h tiêm bệnh ph ẩ m. Máu và gan của động vật th í nghiệm được lấy để phết phiến k ính (xem 4.4) làm tiêu bản kiểm tra trực tiếp dưới kính hiển vi quang học (xem 4.2) và tiến hành phân lập, giám định vi khu ẩ n. 5.2.4 . Phân lập vi khuẩn Bệnh phẩm được nuôi cấy vào môi trường nước thịt (xem 3.1), môi trường thạch m áu (xem 3.2), nuôi ở tủ ấm (xem 4.1) từ 24 h đến 48 h. Vi khuẩn mọc tốt hơn khi môi trường có bổ sung huyết thanh ngựa (xem 3.3). Môi trường nước thịt (xem 3.1): sau 24 h nuôi cấy, phía trên môi trường trong, ph ía dưới đáy ống nghiệm có cặn nhày, màu tro, khi lắc l ê n có v ẩ n đục như “mây bay”, sau đó môi t rường lại trong. Môi trường thạch máu (xem 3.2): sau 24 h đến 48 h nuôi c ấ y thấy trên bề mặt thạch xuất hiện khu ẩ n lạc nhỏ (nhỏ hơn 1 mm), trong suốt, không dung huyết (dung huy ế t alpha), trông giống nh ư “hạt sương". Có hai loại kh uẩn lạc: dạng S (Smooth) - khu ẩ n lạc nh ẵ n, láng bóng bề mặt, r ìa nhẵn v à dạng R (Rough) - khuẩn lạc xù x ì , bề mặt không nhẵn b ó ng, rìa nhăn. Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường thạch máu (xem 3.2) và môi tr ường nước thịt (xem 3.1) có bổ sung huyết thanh ngựa (xem 3.3), nuôi ở tủ ấm (xem 4.1) từ 24 đến 48 h để kiểm tra đặc tính sinh hóa. 5.2.5 . Xác định vi khuẩn 5.2.5.1 . Quan sát hình thái vi khuẩn - Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc hòa đều vào giọt nước sinh lý trên phiến kính (xem 4.4) hoặc lấy một vòng que cấy (xem 4.5) canh trùng đã nuôi cấy vi khuẩn dàn mỏng lên trên phiến kính (xem 4.4), để khô và cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn (xem 4.3). - Tiêu bản sau khi đã được cố định, nhuộm bằng phương pháp Gram (xem Phụ lục A) - Vi khuẩn E. rhusiopathiae bắt màu tím (gram dương), kích thước (từ 0,2 μm đến 0,4 μm) x (0,5 μm đến 2,5 μm). Nếu nhuộm từ khu ẩ n lạc dạng S: vi khuẩn có h ình sợi ngắn. Nhuộm từ khu ẩ n lạc dạng R vi khu ẩ n có h ì nh sợi, mảnh và dài. 5.2.5.2 . Ki ể m tra đặc tính sinh hóa Xác định vi khu ẩ n E. rhusiopathiae dựa vào một số đặc t ính sinh hóa được nêu trong Bảng 1. Bảng 1 - Một s ố đặc tính sinh h óa đặc trưng của vi khuẩn E. rhusiopathiae H2S (trong TSI) Arginin Catalaza Oxidaza MR D i động + + - - - - Kiểm tra đặc tính sinh hóa theo quy định tại Phụ lục C . 5. 2.5.3 . Xác đ ịnh vi khuẩn E. rhusiopathiae bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Sử dụng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu và chu tr ì nh nhiệt được nêu trong Bảng 2. B ả ng 2 - Các cặp mồi và chu tr ì nh nhiệt cho PCR Gen đích Kí hiệu Tr ì nh tự từ đầu 5’ đến 3’ Kích c ỡ sản ph ẩ m (bp) Chu trình nhiệt 16S rRNA ER1 CGATTATATTCTTAGCACGCAACG 937 94 ° C - 15 min; Chu tr ì nh 30 vòng: 94 ° C -1 min; 63 ° C - 30 s; 72°C-1 min. 72° C -7min; Giữ: 4 ° C ER2 TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG Ti ế n hành phản ứng PCR theo quy định tại Phụ lục D. 6. Kết luận Lợn được xác định l à mắc bệnh đóng d ấ u khi c ó đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển h ình của bệnh và phân lập được vi khu ẩ n E. rhusiopathiae trong phòng thí nghiệm có t ính chất sinh hóa đặc trưng theo quy định tại 5.2.5.2 hoặc kết quả phản ứng PCR dương tính. PHỤ LỤC A (Quy định) Phương pháp nhuộm Gram A.1 . Thuốc th ử A.1.1 . Dung dịch tím tinh thể Tím tinh th ể (C 25 H 30 N 3 C l ) 2,0 g Etanol 95 % 20,0 ml Amoni ox a lat [(NH 4 ) 2 C 2 O 4 .2H 2 O ] 0,8 g Nước 80,0 ml H òa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết. A.1.2 . Dung dịch fuchsin đậm đặc Fuchsin basic (C 20 H 20 C l N 3 ) 1 g Etanol 95 % 10 ml Phenol (C 6 H 6 O) 5 g Nước 100ml Khi dùng, pha loãng dung dịch fuchsin đậm đặc với nước theo tỉ lệ 1:10 (thể tích). A.1.3 . Dung dịch lugol Kali iodua (K I ) 2 g I ôt ( I 2 ) tinh thể 1 g Nước 200 ml Nghi ề n kali iodua và iôt tinh thể, cho nước vào từ từ và lắc cho tan. A.1.4 . Axeton Etano l 95 % 3 phần Axeton (C 2 H 6 O) 1 ph ầ n A.2 . Cách tiến hành Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu b ả n (đã cố định), để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và đ ể khô. Nhỏ dung dịch lugol, đ ể 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô. Nhỏ cồn axeton, rửa nước thật nhanh và để khô. Nhỏ dung dịch f uchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi thấm khô hoặc sấy khô. A.3 . Xem tiêu b ản Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bả n và xem tiêu bản bằng kính hiển vi (xem 4.2) với vật kính độ ph ó ng đại 100 lần. PHỤ LỤC B (Quy định) Phương pháp nhuộm Giemsa B.1 . Thuốc thử Dung dịch Giemsa đậm đặc Giemsa dạng bột 1,0 g G l yxerin [C 3 H 5 (OH) 3 ] 66 ml Metanol nguyên chất 66 ml Làm nóng glyxerin đến khoảng 55 ° C đến 60 ° C trong n ồi đun cách thủy. Th ê m thuốc nhuộm Giemsa trộn đ ề u và ủ trong 2 h. Sau đ ó để nguội và thêm cồn methanol vào và giữ trong khoảng 2 tuần trước khi s ử dụng. Khi sử d ụng pha loãng theo tỷ lệ 1/10 (phần thể t ích ) trong dung dịch đệm phosphate 0,01 M (pH = 7,0) và giữ trong 30 min. Dung dịch đệm phosphate Dung dịch Natri phosphat, Na 2 HP O 4 (9,47 g / l ) hoặc Na 2 HP O 4 .2H 2 O (11,87 g / l ) 61,1 ml Dung dịch Kali phosphat, KH 2 PO 4 (9,08 g /I) 38,9 ml Nước 900 ml CHÚ TH Í CH: c ó th ể sử dụng thuốc nhuộm Giemsa thương mại và pha lo ã ng theo hướng dẫn của nhà sản xu ấ t. B.2 . Cách tiến hành Nhỏ dung dịch Giemsa ngập tiêu bản (đã cố định), để trong 20 min đến 30 min, rồi rửa nhanh với nước và s ấ y khô. B.3 . Xem tiêu bản Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem ti ê u bản bằng k ính hiển vi (xem 4.2) với vật k í nh độ phóng đại 100 lần. PHỤ LỤC C (Quy định) Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hóa C.1 . Ki ể m tra đặc tính s i nh H2S C .1.1 . Môi trường Chu ẩ n b ị m ô i trường TSI hay Kligler(theo hướng dẫn của nhà sản xu ất ) Th ạ ch nghiêng chế từ Kligler hoặc TSI. Thạch màu đỏ và có 2 phần: ph ầ n thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả năng lên men đường glucoza, sinh hơi, sinh H 2 S , phần thạch nghiêng đ ể kiểm tra khả năng l ê n men đường lactoza. C .1.2 . Cách tiến hành Dùng que cấy chích sâu (4.7) lấy khu ẩ n lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính giữa ph ầ n thạch đúng) xuống đáy ống nghiệm chứa môi trường TSI hay Kligler (xem C .1.1), rút dần que cấy l ê n và tiếp tục c ấ y trên bề mặt nghiêng, nuôi c ấ y trong điều kiện hiếu khí ở t ủ ấm (xem 4.1), kiểm tra sau 24 h đ ế n 48 h. C .1.3 . Đọc k ế t quả - Dương tính: đáy ố ng nghiệm có màu đen; - Âm t í nh: đáy ống nghiệm không có màu đen. C.2 . Kiểm tra khả năng phân h ủy arginin C .2.1 . Môi trường Thành phần: Peptone 4g L - arginine 0 , 5 g Glucose 0,1 g Ch ỉ thị màu Bromocresol purple 0,1 ml Nước 100 ml Ch ỉnh pH đến 6,0 Dung dịch ch ỉ thị màu Bromocresol purple Bromocresol purple 1,5 g Cồn 90% 100 ml C .2.2 . Tiến hành Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khu ẩ n lạc nghi ngờ cho vào môi trường có chứa arginin và ch ỉ th ị màu, nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấm (xem 4.1), kiểm tra sau 24 h đến 48 h. C .2.3 . Đọc kết quả - Dương t í nh: m ôi trường chuyển màu tím; - Â m tính: m ô i tr ường có màu vàng (không chuyển màu). N ếu sử dụng m ôi trường thương mại thì pha chế và đọc kết qu ả theo hướng d ẫ n của nhà sản xuất. C.3 . Phản ứng Catalaza Nhỏ một giọt dung dịch H 2 O 2 3 % lên phiến k í nh (xem 4.4). Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khu ẩ n lạc nghi ngờ cho vào giọt dung dịch H 2 O 2 3 %. Đọc kết quả sau 5 s như sau: - Dương tính: có hiện t ượng s ủi bọt; - Âm t í nh: kh ô ng có hiện tượng s ủi bọt. C.4 . Phản ứng Oxidaza Tiến hành trên gi ấ y có t ẩ m dung dịch 1% Tetrammethyl-P. phenylene diamin hydrochloride. Dùng que cấy (xem 4.5) l ấ y khuẩn lạc nghi ngờ phết l ên mặt giấy đã thấm thuốc thử. Đọc k ế t quả sau 30 s như sau: - Dương tính: tại chỗ phết khuẩn lạc có xuất hiện màu tím; - Â m t í nh: không xuất hiện màu tím. C.5 . Phản ứng đ ỏ methyl (Phản ứng MR - Methyl Red) C .5.1 . Môi trường - Chu ẩ n b ị môi tr ường VP - MR (theo hướng dẫn c ủ a nhà sản xuất). - Chu ẩ n b ị dung dịch đỏ methyl trong cồn 95 %: Đ ỏ methyl 0,04 g C ồ n 95 % 60 ml Nước 40 ml C .5.2 . Tiến hành Dùng que cấy (xem 4.5) l ấ y khu ẩ n lạc nghi ngờ cho vào môi trường VP - MR, nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấm (xem 4.1), sau 24 h nhỏ vào môi trường nuôi c ấ y 5 giọt dung dịch đỏ methyl trong cồn 95 %. Đọc kết quả sau 5 min. C .5.3 . Đọc kết quả - Dương t í nh: m ôi trường có màu đỏ; - Â m tính: môi trường có màu v à ng. C.6 . Kiểm tra đặc t ính di động Kiểm tra đặc tính di động của vi khu ẩ n có thể dùng phương pháp giọt treo dưới k í nh hiển vi (xem 4.2) hoặc cấy vi khu ẩ n vào môi tr ường thạch lỏng (semi-solid). Phương pháp giọt treo d ưới kính hiển vi: Dùng phiến k í nh (xem 4.4) đặc biệt có phần l õ m h ì nh tròn ở giữa. Cho một giọt canh khuẩn lên giữa kính phủ vật. Thận trọng xoay ngược lá k í nh cho giọt canh khuẩn quay xuống phía dưới rồi đặt l ê n phần lõm của phiến kính. Chú ý không giọt canh khu ẩ n lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm. Đặt tiêu bản lên kính hiển vi (xem 4.2) v à quan sát ở vật kính độ phóng đại 10 lần hoặc 40 lần. Trên thị trường hiện nay đ ã xuất hiện một dụng cụ có tên gọi l à vòng O (O-ring) dùng để thực hiện giọt treo mà không cần lam kính l õ m. Đây là một miếng đệm h ình tròn, có k í ch thước vòng trong 12 mm, cao 3 mm có thể s ử dụng nhiều lần. Khi thực hiện, đặt vòng O lên giữa lam kính thường, đưa giọt canh khuẩn vào một mặt của kính phủ vật, xoay ngược kính phủ vật và úp lên vòng O . Ki ể m tra kh ả năng di động của vi khu ẩ n bằng môi trường thạch lỏng: Chuẩn b ị môi trường: Môi trường thạch l ỏ ng (từ 0,2 % đến 0,5 % thạch) đựng trong ống nghiệm (xem 4.6). Cách tiến hành: Dùng que cấy ch ích s â u (xem 4.7) l ấ y khuẩn lạc rồi cấy ch ích s â u v à o ống ch ứa môi trường thạch lỏng trên, nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấ m (xem 4.1), sau 24 h đọc kết quả. - Khả năng di động dương t í nh: Vi khuẩn mọc lan ra xung quanh đường cấy chích sâu. - Khả năng di động âm t í nh: Vi khuẩn ch ỉ mọc theo đường cấy chích sâu. PHỤ LỤC D (Quy định) Phát hiện vi khuẩn E. rhusiopathiae bằng phương pháp PCR D.1 . Nguyên liệu PCR D.1.1 . Taq PCR Master Mix Kit D.1.2 . Cặp mồi (primers): mồi xuôi và mồi ngược (Bảng 2) D.1.3 . N ước tinh khiết không có nuclease D1.4 . Dung dịch đệm TAE hoặc TBE D.1.5 . Ethidi bromua hoặc chất nhuộm màu SYBR green D.1.6 . Loading dye D.1.7 . DNA chuẩn (Ladder, marker) D.2 . Chuẩn bị mẫu M ẫ u vi khu ẩ n kiểm tra là vi khu ẩ n nghi ngờ là E. rhusiopathiae đã nuôi cấy thuần khiết tr ê n môi trường thạch máu (xem 3.2) trong điều kiện hiếu khí ở tủ ấ m (xem 4.1) từ 24 h đến 48 h. M ẫ u vi khuẩn làm đối chứng dương: chủng vi khu ẩ n đã được giám định l à E. rhusiopathiae hoặc sử dụng các ch ủng E. rhusiopathiae chuẩn. D.3 . Tách chiết DNA Các vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm và các mẫu đối ch ứng dương được tách chiết DNA bằng các kit thương mại hoặc bằng phương pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit th ì các bước ti ế n hành theo chỉ dẫn c ủa nhà s ả n xuất. Tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt: Dùng que c ấ y (xem 4.5) lấy từ 3 khu ẩ n lạc đến 4 khu ẩ n lạc, hòa vào 100 nl nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min r ồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly t â m huyễn dịch với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần trong phía trên đ ể thực hiện phản ứng PCR. D.4 . Phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn E. rhusiopathiae Sử dụng cặp mồi ở Bảng 2 và chuẩn bị mồi ở n ồ ng độ 20 μM. Hỗn hợp phản ứng được chu ẩ n b ị trong ống 0,2 ml. Thành phần cho 1 phản ứng (theo hướng dẫn của Kit Taq PCR master mix Kit-Qiagen) như sau: - Taq PCR Master Mix Kit 12,5 μ l - Mồi xuôi 20 μM 1 μl - Mồi ngược 20 μM 1 μ l - Nước không có nuclease 8,5 μl - Mẫu DNA 2 μl Tổng th ể tích 25 μl Chu tr ình nhiệt trong B ả ng 2. Đối ch ứng dương: DNA tách chiết từ vi khuẩn E. rhusiopathiae (xem D.2). Đối chứng âm: gồm đầy đủ thành phần của một phản ứng PCR, nhưng không có DNA c ủa vi khu ẩ n. D.5 . Chạy điện di S ả n phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1,5 % đ ế n 2 % trong dung d ịch đệm TAE hoặc TBE. Cho 2 μl d ung dịch loading dye vào 8 μl s ả n phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μl thang chu ẩ n (marker) v ào một giếng. Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại dung d ịch đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian 30 min đến 40 min , ở 100 V. Sau đó nhuộm bằng dung dịch ethidi bromua 0,2 mg /100 ml. Có thể dùng chất nhuộm màu khác như SYBR green để nhuộm bản thạch (sản ph ẩ m PCR) và sử dụng theo qui định của nhà sản xu ất (v í dụ: SYBR safe DNA gel stain của Invitrogen). D.6 . Đọc kết quả Ph ản ứng dương tính khi: - M ẫu đối chứng dương có một vạch duy nh ấ t đúng kích c ỡ của sản phẩm. - M ẫ u đối chứng âm: không xu ấ t hiện vạch. - Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương. Phản ứng âm tính khi: - Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nh ấ t đúng k í ch cỡ của sản phẩm. - Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch. - Mẫu kiểm tra khô n g có vạch giống mẫu đối chứng dương. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] JICA. Third edition, 2003. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand . p.110 - 111. [2] J.Quinn, M.E.Carter, B.Markey, G.R.Carter, 2004. Veterinary Clinical Microbiology . 6th Edition. Printed in Spain, p.191 -208. [3] G.l. Barro w , R.K.A. Feltham. Co w an and Steel's. Mannual f or the identi f icatio n o f media bacteria . Third edition, 1993. [4] Richard L.Wood, Louis M.Henderson, 2006. Chapter 37: Erysipelas. Diseases of Swine . 9th Edition. B l ackwell P u blishing, p.646-655. [5] Y oshihiro Shimoji, Yasuyuki Mori, Koji Hyakutake, Tsutomu Sekizaki, Yuichi Vokomizo, 1998. Use of an Enrichment Broth Cultivation-PCR Combination Assay for Rapid Diagnosis of S w ine Erysipelas . J Clin Microbiol, 36(1): 86-89. [6] G.M.Cross and G.J.Eamens, 1993. Erysipelothrix rhusiopathiae in f ection. Australian Standard diagnostic techniques for animal diseases . [7] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2012. Gi áo tr ì nh bệnh truyền nhiễm thú y .