TCVN10784:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10784:2015 về Vi sinh vật - Xác định khả năng sinh tổng hợp axit 3-indol-axetic (IAA) TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10784:2015 VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP AXIT 3-INDOL-ACETIC (IAA) M i croorganisms - Determination of indole-3-acetic acid (IAA) synthesis capability Lời nói đầu TCVN 10784:2015 do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển N ô ng thôn đề nghị, T ổ ng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP AXIT 3-INDOL- AXETIE (IAA) Microorganisms - Determination of inclole-3-acetic acid (IAA) synthesis capability 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chu ẩ n n à y quy định phương pháp đ ị nh tính và định lượng khả năng sinh tổng hợp axit 3-indol- axetic (IAA) của vi sinh vật. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau đây là cần thiết đ ể áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các t à i liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng cho phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật v à phương pháp thử. 3. Thuật ngữ, định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau. 3.1. Ax i t 3-indol-axetic (lndole-3-acetic acid (IAA)) Một loại hoocmôn thực vật, thuộc nh ó m auxin, công thức phân tử là C 10 H 9 O 2 N, khối lượng phân tử tương đối 175 , 184. 3.2. Vi sinh vật sinh tổng hợp axit 3-indol-axetic (lndole-3-acetic acid synthesis microorganisms) Các vi sinh vật có khả năng sinh t ổ ng hợp axit 3-indol-axetic. 4. Nguyên tắc 4.1 . Nguyên tắc định tính Vi sinh vật dùng để xác định khả năng sinh tổng hợp axit 3-indol-axetic (IAA) là vi sinh vật thuần. IAA được sinh t ổ ng hợp trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật tiết ra môi trường bao quanh khuẩn lạc/cụm khu ẩ n lạc. Khi có mặt của thuốc thử Salkowski, dư ớ i tác dụng của tia UV, sẽ xuất hiện vòng màu đỏ bao quanh khu ẩ n lạc/cụm khu ẩ n lạc. 4.2 . Nguyên tắc định l ư ợ ng Lượng IAA trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật được xác định bằng phương pháp đo độ h ấ p thụ quang (OD) ở bước sóng 530 nm trên máy quang ph ổ với thu ố c thử Sa l kowski. 5. Thuốc thử, dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy H óa chất sử dụng để pha các ch ấ t chuẩn đạt loại tinh khiết hóa học, hóa chất sử dụng để phân tích đ ạ t loại tinh khiết phân tích. 5.1 . Nư ớ c cất , đáp ứng các yêu cầu nước loại 3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987). 5.2 . Thu ố c thử Salko w ski 5.2.1 . Thành phần S ắ t (III) clorua (FeCI 3 ) 0,5 M 15 ml Axit sun f uric (H 2 SO 4 ) 98% 300 ml Nước cất 500 ml 5.2.2 . Cách chuẩn b ị Đổ từ t ừ 300 ml d ung dịch axit sun fu ric 98% vào 500 ml nước cất (không đổ ngược lại). Sau đó dùng pipet hút 15 ml dung dịch sắt (III) clorua 0,5 M bổ sung vào dung dịch tr ê n. Bảo quản trong chai có màu sẫm và đặt trong tối. 5.3 . Dung dịch chuẩn IAA 5.3.1. Dung d ị ch chuẩn g ố c IAA (IAA stock) S ử dụng axit 3-indol-axetic (IAA) c ó độ tinh khiết ≥ 99%, độ ẩm <0,1%. Cân 10 mg I AA , cho vào b ì nh định mức dung t í ch 10 ml. Thêm nước cất đến vạch định mức, trộn đều. Dung dịch thu được là dung dịch chu ẩ n gốc IAA gốc (IAA stock), có nồng độ 1000 µ g/ml. 5.3.2. Dung dịch chuẩn làm việc IAA Chu ẩ n b ị 10 bình định mức dung tích 10 ml, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Dùng pipet lần lượt hút dung dịch chuẩn gốc IAA (IAA stock), có nồng độ 1000 µ g/ml (5.3.1) vào các b ì nh định mức theo thể t í ch ghi trong bảng 1. Thêm nước cất đến vạch định mức, trộn đều. Bảng 1 - H ư ớng dẫn pha dung dịch chuẩn làm việc IAA STT Nồng độ dung dịch chuẩn làm vi ệ c IAA ( µ g/ml) Th ể tích dung d ị ch chuẩn gốc IAA (IAA stock) 1000 µ g/ml (ml) cho vào mỗi b ì nh định mức dung tích 10 ml 1 00,0 0,0 2 10,0 0,1 3 20,0 0 , 2 4 30,0 0,3 5 40,0 0,4 6 50,0 0,5 7 60,0 0,6 8 70,0 0 , 7 9 80,0 0 , 8 10 90 , 0 0,9 5.3.3 . Thang chuẩn IAA Chuẩn b ị 10 b ì nh định mức dung tích 10 ml, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Lấy 2 ml dung dịch chuẩn làm việc IAA (5.3.2) có các nồng độ 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 pg/ml cho vào các b ì nh định mức. Thêm thuốc thử Salko w ski đã chuẩn b ị sẵn (5.2) đến vạch định mức, trộn đều. CHÚ TH Í CH 1: Tùy theo hàm lượng IAA do vi sinh vật tổng hợp được, c ó th ể pha dung dịch chu ẩ n làm việc và thang chu ẩ n c ó nồng độ IAA th ấ p hơn hoặc cao hơn. 5.3.4 . Đ ườ ng chuẩn IAA Đo thang chuẩn IAA tr ê n máy quang phổ , ở bước sóng 530 nm, hiệu chỉnh máy sao cho đường chuẩn có dạng y=ax + b (với R 2 lớn hơn 0,95); Lập đồ thị đường chuẩn (hoặc phương trình tương đương) biểu diễn tương quan giữa số đo trên máy và nồng độ dung dịch chuẩn IAA. 5.4 . Dịch pha lo ã ng Dùng dịch pha loãng l à nước muối sinh lý (NaC l 0,85 %), vô trùng, pH = 7, không chứa các hợp chất có axit 3-indol-axetic (IAA); Lấy 9 ml dịch pha loãng cho vào các ống nghiệm (6.2.5), đậy n ú t bông và khử trùng ở 121 ° C không ít hơn 20 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2). 5.5 . Môi trường nuôi c ấ y 5.5.1 . Thành phần M ô i trường Luria Bertani có bổ sung L - Tryptophan Bacto - Trypton 10,0 g Cao nấm men 5,0 g Natri clorua (NaC l ) 5,0 g L - Tryptophan ( C 11 H 12 N 2 O 2 ) 1,0g Nước cất 1000 ml pH 1,0 g CH Ú TH Í CH 2: - pH được điều ch ỉ nh b ằ ng dung dịch NaOH 1N, HC l 1N trước khi khử trùng m ô i trường - N ế u môi trư ờ ng thạch đĩa th ì bổ sung 20,0 g thạch 5.5.2 . Cách chuẩn bị Cân và hòa tan các thành phần môi trường trong nước cất theo th ứ tự đã cho (5.5.1). 5.5.2.1 . Môi trường dịch thể Phân phối 100 ml môi trường Luria Bertani (5,5.1) vào b ì nh tam giác dung tích 250 ml (6.2.1), đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 ° C trong nồi hấp áp lực (6.1.2). 5.5.2.2 . Môi trường thạch đĩa Phân phối 200 ml môi trường Luria Bertan i (5.5.1) vào bình tam gi á c dung tích 500 m l (6.2.1), đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 ° C trong nồi hấp áp lực (6.1.2), làm nguội đến 50 ° C, phân ph ố i lượng từ 20 ml đến 25 ml môi trường vào các đĩa Petri (6.2.4) đã chuẩn bị sẵn (6.4); mọi thao tác tiến hành trong t ủ cấy vô trùng (6.1.1). 6. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng th í nghiệm và cụ thể như sau: 6.1 . Thiết b ị 6.1.1 . Tủ c ấ y vô trùng (Box cấy) , vận tốc dòng khí trung bình 0,79 m/s, lưu lượng khí 1204 m 3 /h, màng lọc ULPA v ớ i k í ch thước hạt từ 0,1 µ m đến 0,3 µ m. 6.1.2 . Nồi hấp áp lực, áp suất tối thiểu 101,3 kPa, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 121 ° C. 6.1.3 . Tủ sấy, có khả năng duy tr ì nhiệt độ từ 40 ° C đến 260 °C. 6.1.4 . Tủ ấ m, có khả năng duy trì nhiệt độ từ 20 °C đến 60 °C. 6.1.5 . M á y lắc ổn nhiệt, tốc độ 150 r/min, có khả n ă ng duy trì nhiệt độ từ 20 °C đến 40 °C. 6.1.6 . Cân phân t í ch, c ó độ chính xác đ ế n 0,0001 g. 6.1.7 . Cân kỹ thuật, có độ chính xác đến 0,01 g. 6.1.8 . Máy trộn Vortex, tốc độ 1000 r/min. 6.1.9 . Máy ly tâm, tốc độ 6000 r/min. 6.1.10 . Máy quang phổ, đo được ở bước sóng 530 nm. 6.1.11 . Đèn soi UV, soi được hai bước sóng 254 nm và 366 nm, tấm lọc bước sóng trung tâm: 50 mm x 200 mm. 6.1.12 . Mặt nạ ch ố ng UV. 6.1.13 . Máy đo pH, có độ ch í nh xác đến 0,1 đơn vị pH ở 25 °C. 6.2 . Dụng cụ 6.2.1 . Bình tam giác, dung tích 250 ml, 500 ml. 6.2.2 . Cốc th ủy tinh, d ung tích 100 ml, 500 ml, 1000 ml. 6.2.3 . B ì nh định mức, dung tích 10 ml. 6.2.4 . Đĩa Petri, đường kính 90 mm. 6.2.5 . Ống nghiệm, k í ch thước 18 mm x 180 mm. 6.2.6 . Que c ấ y vòng 6.2.7 . Que gạt mẫu (bàn trang) 6.2.8 . Kẹp (panh) 6.2.9 . Pipet (M i cropipet), có thể lấy các thể tích 0,1 ml và 1 ml. 6.3 . M ả ng th ẩ m th ấ u nitrôxenlulô , 100% nitrôxenlulô tinh khiết, kích thước lỗ 0,2 µ m 6.4. Chu ẩ n bị dụng cụ - Dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật được phải rửa sạch, tiệt trùng b ằ ng một trong các phương pháp d ư ới đây: + Khử trùng khô: Giữ ở nhiệt độ 180 °C không ít hơn 1 h trong tủ sấy (6.1.3) hoặc; + Khử trùng ướt: Giữ ở nhiệt độ 121 °C không ít hơn 30 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2). - Dụng cụ sử d ụng trong xác định nồng độ IAA phải được rửa sạch, tráng l ạ i bằng nước cất. 7. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu 7.1 . L ấ y m ẫ u Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thí nghiệm phải l à đại diện và mẫu không bị hư h ỏ ng hoặc suy giảm chất lượng trong quá trình b ả o quản và vận chuyển. 7.2 . Chuẩn b ị mẫu Lấy một v ò ng que cấy sinh khối vi sinh vật cấy v à o b ì n h t am giác chứa 100 ml môi trường d ịch thể Luria Bertani đã chuẩn bị sẵn (5.5.2.1). Nuôi lắc trong m á y lắc ổn nhiệt (6.1.5) ở tốc độ 150 r/min, trong th ờ i gian từ 2 ngày đến 3 ngày, nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C; đảm b ả o mật độ tế bào vi sinh vật kh ô ng nhỏ hơn 10 8 CFU/ml (dung dịch mẫu ban đ ầ u). 8. Định tính khả năng sinh tổng hợp IAA của vi sinh vật 8.1 . Cách ti ế n hành Dùng pipet đã vô trùng hút 1 ml dung dịch mẫu ban đầu (7.2) cho vào ống nghiệm c ó chứa 9 ml dung dịch pha loãng đã chu ẩ n bị sẵn (5.4), tránh chạm pipet vào dịch pha lo ã ng, trộn đều bằng m á y trộn Vortex (6.1.8) trong thời gian 1 min để c ó dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng là 10 - 1 . Tiếp tục pha loãng để đạt được độ pha lo ã ng 10 - 5 , 10 -6 ; Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dung dịch m ẫ u pha loãng c ấ y vào đĩa Petri chứa môi trư ờ ng thạch đĩa Luria Bertani đã chuẩn bị sẵn (5.5.2.2). Mỗi nồng độ pha loãng được cấy lặp lại không ít hơn 2 đĩa Petri; Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dung d ịch m ẫ u th ấ m đều trên bề mặt thạch, úp ngược đĩa Petri, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C trong thời gian 24 h; Dùng kẹp vô trùng đặt màng th ẩ m thấu nitrôxenlulô (6.3) lên trên bề mặt đĩa Petri; giữ nguyên đ ĩa Petri, tiếp tục nu ô i trong tủ ấm (6.1.4) ở nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C trong thời gian từ 24 h đến 48 h; Dùng kẹp vô trùng nhấc màng th ẩ m th ấ u nitrôxenlulô ra khỏi đĩa Petri và ngâm trực tiếp trong thuốc thử Salko w ski (5.2) hoặc đặt lên tr ê n một miếng giấy lọc đ ã được th ấ m thuốc thử Salko w ski (5.2). Thời gian thẩm thấu không í t hơn 30 min; Sau đó soi màng th ẩ m thấu nitr ô xenlulô dưới đèn UV. 8.2 . Khẳng định Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp IAA là vi sinh vật tạo được vòng màu đỏ bao quanh khuẩn lạc/cụm khu ẩ n lạc. CHÚ TH Í CH 3: Các khu ẩ n lạc tạo được vòng m à u h ồ ng nhạt, màu h ồ ng, màu đỏ nhạt, màu đỏ, màu đỏ đậm bao quanh đ ề u được t í nh là c ó khả năng sinh tổng hợp IAA. 9. Định lượng khả năng sinh tổng hợp IAA của vi sinh vật 9.1 . Cách ti ế n hành 9.1.1 . M ẫ u thử Dùng một p i pet vô trùng lấy 1 ml dung dịch mẫu ban đầu (7.2) cho vào bình tam giác chứa 100 ml môi trường dịch thể Luria Bertani đ ã chu ẩ n bị sẵn (5.5.2.1). Nuôi lắc ở tốc độ 150 r/min, trong tối hoàn toàn, thời gian từ 3 ngày đến 5 ngày, nhiệt độ từ 28 °C đến 30 °C; đảm b ả o m ậ t độ t ế bào vi sinh vật không nhỏ hơn 108 CFU/ml ( dung dịch mẫu th ử ). Mỗi mẫu được cấy lặp lại kh ô ng ít hơn 2 lần; Ly t âm không ít hơn 3 ml dung dịch mẫu thử bằng máy ly tâm (6.1.9) với t ố c độ 6000 r/min , trong thời gian 10 min. L ấ y 2 ml phần dung dịch trên bề mặt (phần nước trong) cho vào bình định mức dung tích 10 ml. Thêm thuốc thử Salko w ski đã chuẩn bị sẵn (5.2) đến vạch định mức, trộn đều; Giữ yên trong thời gian 25 min. Xác định hàm lượng IAA trong mẫu thử b ằ ng máy quang phổ ở bư ớ c sóng 530 nm. 9.1.2 . M ẫ u trắng Ly tâm không í t hơn 3 ml môi trư ờ ng dịch thể Luria Bertani đã chu ẩ n b ị sẵn (5.5.2.1) b ằ ng máy ly tâm (6.1.9) với tốc độ 6000 r/min, trong thời gian 10 min; Lấy 2 ml phần dung d ịch trên bề mặt (phần nước trong) cho vào bình định mức dung tích 10 ml. Thêm thuốc thử Salko w ski đã chuẩn bị sẵn (5.2) đến vạch định mức, trộn đều; Giữ yên trong thời gian 25 min. Xác định hàm lượng IAA trong mẫu trắng bằng máy quang phổ ở bước sóng 530 nm. CHÚ THÍCH 4: Tiến hành đo dung dịch mẫu thử và mẫu trắng đồng nhất với điều kiện đo d ung dịch chuẩn. Sau khi đ o khoảng 10 mẫu phải kiểm tra lại thang chu ẩ n. Nếu sai lệch phải hiệu ch ỉ nh máy , l ặ p lại đường chuẩn và đo lại mẫu. 9.2 . T í nh và biểu th ị kết quả Hàm lượng IAA do vi sinh vật sinh tổng hợp được tính theo công thức: M = a - ao Trong đ ó : M Hàm lượng IAA do vi sinh vật sinh t ổ ng hợp, tính bằng microgam/milil í t ( µ g/ml); a Hàm lượng IAA sinh t ổ ng hợp được trong 1 ml mẫu thử, tính b ằ ng microgam/mililít ( µ g/ml); ao Hàm lượng IAA sinh tổng hợp được trong 1 ml mẫu trắng, tính bằng microgam/mililít ( µ g/ml). 10. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm ph ả i bao gồm ít nhất các thông tin sau: - Mọi thông tin cần thi ế t để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; - Phương pháp lấy mẫu đ ã sử dụng, nếu biết; - Tất c ả các thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả; - Các kết qu ả thử nghiệm thu được; - Nếu độ lặp lại được kiểm tra, th ì nêu kết quả cuối cùng thu được. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1 ] Bric, J. M., Bostock, R. M. and Silverstone, S. E. 1991. Rapi d in situ assay for indol acetic acid production by bacteria immobilized on a nitro celluloso membrane. Appl Environ Microbiol. Feb; 57(2):535-538 [ 2] Gordon, S. A. , and R. P. Weber. 1951. Colorimetric estimation of indoleacetic acid. Plant Physiol. 26:192-195.