TCVN5154:1990

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:1990 về thịt và sản phẩm của thịt - phương pháp phát hiện Bacillus Anthracis do Ủy ban Khoa học Nhà nước ban hành TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5154:1990 THỊT VÀ SẢN PHẨM CỦA THỊT PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BACILLUS ANTHRACIS Meat and meat products - Detection of Bacillus Anthracis Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện Bacillus Anthracis trong thịt và sản phẩm của thịt dùng làm thực phẩm cho người, thức ăn gia súc và các sản phẩm động vật khác nhau như da, xương, sừng, lông; đất, nước, rơm, cỏ dùng trong chăn nuôi. 1. Đặc tính chung Vi khuẩn hình gậy, to, gram dương, kích thước 1-1, 5 x 5-10 micromet, có giáp mô, không di động, hai đầu vuông góc, đứng riêng lẻ, ghép đôi hoặc thành chuỗi ngắn từ 3-6 vi khuẩn. Sau khi tiếp xúc với không khí hoặc nuôi cấy lâu ngày trong môi trường thì hình thành nha bào, tồn tại rất lâu trong thiên nhiên. Vi khuẩn có những đặc tính riêng được quy định kiểm nghiệm trong tiêu chuẩn này. 2. Nguyên tắc Căn cứ vào hình dạng vi khuẩn và khuẩn lạc; vào độc tính và phản ứng lắng cặn (Ascoli test) để xác định. 3. Lấy mẫu 3.1. Theo quy định thú y, cấm giết mổ gia súc có bệnh nhiệt thán, khi giết mổ nếu phát hiện bệnh hoặc nghi là bệnh thì ngừng ngay việc giết mổ, lấy mẫu xét nghiệm và thi hành những biện pháp phòng chống lây lan 3.2. Lấy mẫu kiểm tra thường quy định, định kỳ - theo quy định mục 3 TCVN 5153-90 ghi bệnh khi chưa mổ; cắt một bên tai (phía giáp mặt đất), lợn lấy hạch dưới hàm; đã mổ: lấy gan, lách, hạch. 3.3. Da, xương, sừng, lông động vật - Xuất phát từ vùng an toàn dịch bệnh: lấy mẫu theo quy định ở mục 3 TCVN 5153-90 không rõ nguồn gốc: lấy mẫu kiểm tra từng tấm da (50cm 2 /1 tấm). Xương, sừng, lông chia thành những lô nhỏ; lông không quá 50 kg; xương, sừng không quá 100 kg; lượng mẫu lấy bằng 0,1-0,2% trọng lượng lô hàng. 3.4. Đất, rơm, cỏ -1 kg ở các vị trí khác nhau, nước 1.000 ml ở lớp trên mặt, giữa và dưới đáy. 3.5. Lấy, bảo quản và chuyển mẫu thử đi xét nghiệm phải bảo đảm tuyệt đối an toàn, không gây ô nhiễm ra ngoài. Mẫu thử là sản phẩm mềm còn tươi sống phải đựng trong hộp (lọ) thuỷ tinh, chất dẻo, kim loại không gỉ, có nắp đậy kín, để trong phích (thùng) lạnh có đá vụn và chuyển nhanh về cơ quan kiểm dịch trong vòng 24 - 48 giờ. Các mẫu thử khác đựng trong túi polyetylen (PE) kín, bảo đảm độ bền và an toàn dịch bệnh. 3.6. Một nửa mẫu thử để kiểm nghiệm, phần còn lại để lưu Thời gian lưu mẫu không quá 1 tháng Chú thích: Cơ quan kiểm dịch chỉ nhận mẫu thử theo đúng quy định trên, kèm theo bản khai báo tình hình dịch bệnh trong đàn, trong vùng nếu có. 4. Thiết bị và dụng cụ: Theo TCVN 5153-90 5. Môi trường, kháng huyết thanh, thuốc nhuộm (Phụ lục C) 5.1. Phải dùng các loại hoá chất tinh khiết phân tích. Nên sử dụng những thành phẩm cơ bản hoặc đã chế sẵn; khi dùng phải tuân theo chỉ dẫn của nơi sản xuất. Môi trường phải bảo quản ở nơi tối, nhiệt độ 4 oC , không quá 1 tháng. Định kỳ kiểm tra lại hiệu lực bằng giống vi khuẩn tiêu chuẩn. 5.2. Môi trường nước thịt. 5.3. Môi trường thạch dinh dưỡng. 5.4. Môi trường thạch máu. 5.5. Huyết thanh lắng cặn và các loại kháng nguyên âm tính, dương tính tiêu chuẩn. 5.6. Nước muối đẳng trương. 5.7. Thuốc nhuộm gram. 5.8. Thuốc nhuộm Wright. 5.9. Thuốc nhuộm giáp mô (Rabiger). 6. Cách tiến hành 6.1. Yêu cầu cibm: Các dụng cụ, môi trường, thao tác phải vô khuẩn, bảo đảm an toàn, không gây ô nhiễm. 6.2. Giám định hình dạng vi khuẩn trong mẫu thử tươi sống ; chọn những chỗ có bệnh tích làm đồ phiến (từ 3 phiến kính trở lên), nhuộm gram, Wright và giáp mô. Giám định bằng kính hiển vi có vật kính dầu. Bacillus Anthracis hình gậy, to, gram dương, hai đầu vuông góc, có giáp mô, đứng riêng lẻ, thành đôi hoặc chuỗi ngắn 3-6 vi khuẩn. 6.3. Giám định sinh trưởng của vi khuẩn 6.3.1. Chuẩn bị mẫu thử 6.3.1.1. Sản phẩm tươi sống: Bổ đôi hạch lợn, còn các mẫu thử khác thì dùng dao mổ bistouri đã hơ nóng trên ngọn lửa, áp nhanh lên mặt (chỗ có bệnh tích), trong phạm vi đã tiêu độc trích sâu mũi dao, dùng que cấy lấy mẫu. 6.3.1.2. Sản phẩm khô cứng: Cân 5-10 g mẫu thử, cắt hoặc nghiền vụn thành mảnh, hạt nhỏ, ngâm trong 5-10 phần nước muối đẳng trương vô khuẩn, để ở nhiệt độ trong phòng từ 4-5 giờ và cứ sau 30 phút lắc nhẹ 2-3 phút. Thu lớp nước trong. Nếu nghi có nhiễm tạp khuẩn thì đun nóng cách thuỷ huyết dịch 65 oC từ 15-30 phút. Chú thích: Có thể dùng que tăm pông ướt vô khuẩn quét trên mặt mẫu thử (ở các vị trí khác nhau và cả 2 mặt) rồi chuyển tăm pông vào bình đã đựng sẵn 20-50 ml môi trường nước thịt, ủ 37 oC trong 24 giờ. 6.3.1.3. Đất, rơm, cỏ. Theo 6.3.1.2. 6.3.1.4. Nước: Đong 500 ml, ly tâm 30.000 vòng/ phút trong 1 giờ. Thu lớp nước trên mặt và cặn dưới đáy (khoảng 5 ml). Nếu nghi có nhiễm tạp khuẩn thì đun nóng cách thuỷ 65 oC từ 15-30 phút. 6.3.2. Ria cấy trên môi trường thạch máu, thạch dinh dưỡng, mỗi loại 2 đĩa, ủ 37 oC trong 24 giờ, đọc kết quả và làm đồ phiến nhuộm gram, Wright. Khuẩn lạc Bacillus Anthracis tròn, to, màu trắng đục, ướt nhầy, rìa mép nhăn nheo. Qua kính lúp thấy hình sóng, cibm quanh có nếp soăn như làn tóc uốn, không tan máu. Trên lam kính vi khuẩn có nha bào hình bầu dục ở giữa thân. 6.3.3. Chọn những khuẩn lạc điển hình (6.3.2) cấy chuyển sang môi trường nước thịt, ủ 37 oC từ 18 - 24 giờ; đọc kết quả và làm đồ phiến nhuộm gram, Wright kiểm tra thuần khiết. Trong nước có những sợi xốp như bông mầu trắng đục, sau lắng xuống đáy ống, phần nước trên trong. Nếu có lẫn tạp khuẩn cần ria cấy lại trên môi trường thạch. 6.4. Giám định độc tính của vi khuẩn: Mỗi mẫu thử dùng 2 chuột nhắt trắng, nặng từ 18-20 g. Tiêm dưới da bụng cho mỗi chuột 0,1 ml canh khuẩn (6.3.3). Thường sau 12-24 giờ chuột có triệu chứng ủ rũ, lưng còng, lông sù, chết sau 24-96 giờ, bệnh tích xuất dưới da và thủy thũng ở vùng tiêm, lách sưng. Nếu cần giám định lại hình dạng vi khuẩn (6.2), đặc tính sinh trưởng (6.3) và thử phản ứng lắng cặn (Ascoli test). Chú thích: 1) Có thể dùng huyễn dịch mẫu thử (1:5-1:10) với liều tiêm gấp đôi thay cho canh trùng. 2) Nếu mẫu thử nghi nhiễm tạp khuẩn thì dùng phương pháp khía da chuột, sát mẫu thử hoặc canh khuẩn lên chỗ xây sát thay cho tiêm dưới da. 3) Những lô chuột chết do tiêm mẫu thử: Đất, nước, rơm, cỏ cần thử phản ứng lắng cặn (Ascoli test). 6.5. Thử phản ứng lắng cặn (Ascoli test) 6.5.1. Chuẩn bị mẫu thử (chế kháng nguyên) 6.5.1.1. Sản phẩm tươi sống: Cân 5-10 g nghiền nát trong cối sứ, pha loãng bằng nước muối đẳng trương thành huyễn dịch 1:5-1:10. Đun sôi cách thuỷ từ 15-30 phút. Lọc qua giấy lọc cho trong. 6.5.1.2. Sản phẩm khô cứng: Cân 5-10 g xương, sừng, lông hoặc 15-25 cm 2 da, hấp ướt 102 oC từ 30-60 phút; để nguội cắt nhỏ hoặc nghiền vụn, hoà trộn trong 5-10 phần nước muối đẳng trương. Đun sôi cách thuỷ từ 15-30 phút. Lọc qua giấy lọc cho trong. 6.5.2. Trong ống nghiệm cỡ nhỏ hoặc ống nghiệm chuyên dụng đã chứa sẵn 0,5 ml huyết thanh lắng cặn; dùng pipet pasteur hút 0,5 ml kháng nguyên (6.5.1), nhỏ từ từ theo thành ống để kháng nguyên không bị hòa tan trong huyết thanh, có đường ranh giới rõ rệt; kèm theo 2 ống đối chứng dương tính và âm tính cho mỗi đợt kiểm nghiệm. Đọc kết quả sau 1-15 phút. Nếu đường ranh giới xuất hiện vòng trắng đục là dương tính. 7. Tính toán kết quả 7.1. Căn cứ vào các kết quả giám định ở mục 6. 7.2. Nếu chỉ thử phản ứng lắng cặn thì tuỳ theo kết quả mà trả lời phản ứng Ascoli âm tính hoặc dương tính. PHỤ LỤC A PHÁC ĐỒ KIỂM NGHIỆM PHỤ LỤC B PHÂN BIỆT NHIỆT THÁN VỚI MỘT SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ CÓ NHA BÀO Vi khuẩn Di động Giáp mô Hình dạng vi khuẩn Hình cong khuẩn lạc Tan máu Trong môi trường nước thịt Phản ứng Ascoli B. Anthracis - + Trực trùng, 2 đầu vuông, xếp chuỗi dài Xoăn như làn tóc uốn - Cặn xốp như sợi bông, nước trong + B. Anthracoides + - Hai đầu lồi, đứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Không xoăn + Đục đều hoặc có màng vi khuẩn ± B. Subtilis + - “ Nhăn nheo, không xoăn + Nước trong, màng vi khuẩn dày - B. Mycoides + - “ Giống rễ cây - “ - B. Vulgaris + - “ Nhăn nheo, mầu vàng đục + “ - B. Mesentericus + - “ “ + Đục đều, không có màng vi khuẩn - B. Megatherium + - “ Màu trắng đục, mặt mịn + “ - B. Cereus + - “ Như sáp ong + Đục đều, có màng vi khuẩn - PHỤ LỤC C PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG, THUỐC NHUỘM C1. Môi trường nước thịt: - - Nước thịt bò 1.000ml - - Pepton 10g - - Natri clorua 5g Hoà tan pepton và Natri clorua trong nước thịt bò đun sôi. Để nguội chỉnh pH 7,4 - 7,6. Chia vào các ống nghiệm mỗi ống 5 ml. Hấp 121 oC trong 20 phút. Chú thích: Có thể dùng 5g bột cao thịt hoà tan trong 1.000 ml nước cất thay cho 1.000 ml nước thịt bò. C2. Môi trường thạch dinh dưỡng - Môi trường nước thịt (C1) 1.000 ml - Thạch 18-20g Hoà tan thạch vào môi trường nước thịt đun sôi. Để nguội chỉnh pH 7,4 - 7,6. Hấp 121 oC trong 20 phút. Chia vào các đĩa petri, mỗi đĩa 15 - 20 ml và vào các ống nghiệm, mỗi ống 5 ml, để ống nghiệm nằm nghiêng. C3. Môi trường thạch máu: - Môi trường thạch dinh dưỡng (C2) 100 ml - Máu thỏ hoặc máu cừu vô khuẩn (đã tách fibrin) 10 ml Đun nóng cho tan môi trường thạch. Khi nhiệt độ xuống còn 45 oC thì cho máy vào trộn đều, chia vào các đĩa petri vô khuẩn, mỗi đĩa 15-20 ml C4. Nước muối đẳng trương - Natri clorua 8,5g - Nước cất 1.000 ml Hòa tan Natri clorua. Hấp 121 oC trong 20 phút. C5. Thuốc nhuộm gram. C5.1. Dung dịch kết tinh tím (crystal violet) - Kết tinh tím (crystal violet) 2g - Cồn 95 o 20 ml C5.2. Dung dịch ammonium oxalat. - Ammonium oxalat (NH 4 ) 2 C 2 O 4 . H 2 O 0,8 g - Nước cất 80 ml. Hoà lẫn 2 dung dịch trên(C5.1, C5.2). Sau 24 giờ, lọc qua giấy lọc. C5.3. Dung dịch Iod: - Iod 1g - Kali iodua (KI) 2 g - Nước cất 300 ml Hòa tan Kali iodua trong 5 ml nước, sau cho Iode vào, lắc mạnh cho tan rồi bổ xung phần nước còn lại. C5.4. Dung dịch tẩy màu: Cồn 95 o C5.5. Dung dịch safranin - Safranin 0,25 g - Cồn 95 o 10 ml - Nước cất 90 ml Hòa tan safranin trong cồn, rồi cho nước cất vào, lắc đều. C6. Thuốc nhuộm Wright - Bột nhuộm Wright 0,1 g - Glycerin lỏng thuần khiết 1 ml - Methanol (CH 3 OH) 60 ml Nghiền nhuyễn bột Wright trong glycerin bằng cối sứ, sau cho cồn vào. Đựng trong lọ màu sau 1 tuần đem lọc qua giấy. Bảo quản ở nơi tối trong lọ màu nâu C7. Thuốc nhuộm giáp mô (Rabiger) C7.1. Dung dịch kết tinh tím- formalin: - Kết tinh tím (Crystal violet) 10 g - Formalin 100 ml Hòa tan, sau 1 ngày lọc qua giấy C7.2 Dung dịch fuchsin basic: - Fuchsin basic 1 g - Cồn 95 o 9 ml - Nước cất 90 ml Hòa tan trước fuchsin basic trong cồn, sau dùng nước cất pha loãng