TCVN11037:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11037:2015 về Sản phẩm cacao - Xác định hàm lượng theobrom và cafein - Phương pháp sắc ký lỏng TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11037 : 2015 SẢN PHẨM CACAO - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG THEOBROM VÀ CAFEIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG Cacao p roducts - Determination of theobromine and caffeine content - Liquid chromatographic method Lời nói đầu TCVN 11037:2015 đư ợ c xây dựng trên cơ s ở tham khảo AOAC 980.14 Theobromine and caffeine in cacao p roducts. TCVN 11037:2015 do tiểu ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F16/SC2 Cacao và sản phẩm cacao biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. SẢN PHẨM CACAO - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG THEOBROM VÀ CAFEIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG Cacao products - Determination of theobromine and caffeine content - Liquid chromatographic method 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng để xác định hàm lượng theobrom và ca f ein trong các sản phẩm cacao. Phương pháp này chỉ áp dụng đối với mẫu chứa hàm lượng chất khô không béo không lớn hơn 0,5 g/100 ml nước. CH Ú TH Í CH: Theobrom gần như không tan trong nước (độ tan khoảng 0,5 g/l í t ở nhiệt độ phòng). 2. Nguyên tắc Hòa tan theobrom và ca f ein trong phần cặn còn lại vào nước nóng sau đó lọc và phân tích các alkaloid (theobrom và ca f ein) trong dịch lọc bằng phương pháp sắc ký lỏng. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích. 3.1. Dung dịch chuẩn alkaloid, chứa theobrom và ca f ein. Tinh sạch các alkaloid bằng cách cho thăng hoa ở áp suất khí quyển và bảo quản trên silica gel. Cân chính xác một lượng alkaloid thích hợp và pha lo ã ng bằng nước đến nồng độ 50 m g/ml. Lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,45 m g/ml và bảo quản trong lọ polyetylen. Chuẩn bị dung dịch mới sau 3 tuần. 3.2. Pha động, hỗn hợp c ủ a metanol (dùng cho sắc ký), axit axetic (CH 3 COOH) và nước (20:1:79) (tính theo thể tích). 3.3. Hạt tr ợ sôi, silic cacbua (SiC) hoặc vật liệu khác không hấp thụ. 3.4. N ướ c dùng cho sắc ký lỏng, đã cất và khử ion để loại b ỏ các vết hữu cơ. 3.5. Ete dầu mỏ. 4. Thiết b ị , dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông th ư ờng và cụ thể như sau: 4.1. Máy sắc ký, gồm có các bộ phận sau: - Hệ thống phân phối dung môi, ví dụ model M6000A 1) . - Detector hấp thụ, dùng cho mọi máy quang phổ, c à i đặt ở bước sóng 280 nm. - Hệ thống bơm mẫu. - Bộ ghi, 10 mV có tốc độ ghi trên giấy 0,5 cm/min hoặc bộ tích phân. - Cột C 18 , c ỡ hạt 10 m m, đường kính trong 4 mm, dài 30 cm. 4.2 . Ố ng nghiệm có nút vặn te f lon. 4.3 . N ồi cách thủy. 4.4 . B ì nh nón, dung tích 250 ml. 4.5 . Bộ lọc màng, c ỡ lỗ 45 m m. 4.6 . Tủ hốt. 4.7 . Máy li tâm, có thể vận hành ở 2 000 r/min. 4.8 . Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 m g. 5 . Lấy mẫu M ẫ u gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư h ỏ ng hoặc biến đổi trong su ố t quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc l ấ y m ẫ u không quy định trong tiêu chu ẩ n này. Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa c ó tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm th ì các bên có liên quan nên th ỏa thuận với nhau về vấn đề này. 6. Cách tiến hành 6.1. Chiết chất béo Cân (4.8) khoảng 0,6 g cacao, 4,5 g sôcôla sữa hoặc 1,0 g sôcôla dạng lỏng, chính xác đến 0,1 mg, vào ống nghiệm có nút vặn Teflon (4.2) đã được cân. Chiết chất béo hai lần, mỗi lần dùng 30 ml ete dầu m ỏ (3.5), lắc kỹ và ly tâm ở 2 000 r/min trong 10 min và cẩn thận gạn dung môi. Đặt ống vào nồi cách thủy (4.3) để trong t ủ hốt (4.6) để loại bỏ ete. Cân ống và cặn đã khô rồi tính khối lượng cặn. Dùng nước để chuyển định lượng lượng chứa trong ống sang b ì nh nón 250 ml (4.4) đã cân trư ớ c có chứa vài hạt trợ sôi (3.3). 6.2. Xác đ ị nh Thêm nước vào bình nón (6.1) đến khoảng 95 ml. Gia nhiệt đến 100 ° C và duy tr ì trong 25 min. Làm mát đến 20 ° C rồi thêm nước sao cho khối lượng cuối cùng bằng tổng khối lượng của bình, các hạt trợ sôi, cặn đã khử chất béo cộng với 100,0 g. Đậy nút b ì nh và lắc kỹ. Chuyển hỗn hợp vào ống ly tâm sau đó ly tâm 5 min ở 2 000 r/min và lọc phần nổi phía trên qua bộ lọc màng c ỡ l ỗ 45 m m (4.5) . Bơm dịch lọc vào máy sắc ký (4.1). Bơm các dung dịch chu ẩ n đã lọc vào máy sắc ký (4.1) với tốc độ dòng 1 ml/min ở áp suất danh định 2 000 psi 2) , mỗi dãy dung dịch mẫu thử bơm đồng thời í t nhất một dung dịch chu ẩ n. Nếu cần phân tích nhiều hơn 5 mẫu thì bơm lại d ung dịch chuẩn ở các khoảng thời gian đều đặn. Sử dụng chiều cao pic hoặc bộ tích phân để tính nồng độ của từng alkaloid trong dung dịch mẫu th ử theo t ỷ lệ đơn vị. 7. Tính kết quả Hàm lượng của từng alkaloid trong mẫu, X, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg) tính bằng công thức: Trong đó: A 2 l à cường độ tín hiệu (chiều cao pic hoặc diện tích pic) của dung dịch mẫu thử; A 1 là cư ờ ng độ tín hiệu của dung dịch chuẩn; C 1 là nồng độ của của alkaloid trong dung d ị ch chuẩn, tính bằng microgam trên mililit ( m g/ml); m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g); 100 là thể tích dung dịch mẫu phân tích cuối cùng, tính bằng mililit (ml). 8. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chu ẩ n này, hoặc những điều được coi là tự chọn, v à bất kỳ chi tiết nào có ảnh hư ở ng t ớ i kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được. 1) Thông tin này đưa ra để thuận tiện cho người sử dụng. Tiêu chu ẩ n này không ấn đ ị nh phải sử dụng sản ph ẩ m này. 2) 1 psi = 6894,757 Pa.