TCVN7138:2002

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7138:2002 (ISO 13720 : 1995) về thịt và sản phẩm thịt - định lượng Pseudemonas SPP do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7138:2002 THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT – ĐỊNH LƯỢNG PSEUDOMONAS SPP. Meat and meat products – Enumeration of Pseudomonas spp. Lời nói đầu TCVN 7138 : 2002 hoàn toàn tương đương với ISO 13720 : 1995; TCVN 7138 : 2002 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này mô tả phương pháp định lượng Pseudomonas spp. có trong thịt và sản phẩm thịt, kể cả thịt gia cầm. 2. Tiêu chuẩn viện dẫn TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218) Vi sinh vật trong thực phẩm và trong thức ăn gia súc – Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật. TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887 : 1983) Vi sinh vật học – Hướng dẫn chung về chuẩn bị các dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh vật. TCVN 4833 – 2 : 2002 (ISO 3100-2: 1988) Thịt và sản phẩm thịt – Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử - Phần 2: Chuẩn bị mẫu thử để kiểm tra vi sinh vật. 3. Định nghĩa Trong tiêu chuẩn này áp dụng định nghĩa sau: 3.1 Pseudomonas: Vi khuẩn thuộc loại Pseudomonas ở 25 0 C tạo thành các khuẩn lạc trong thạch xetrimit, fuxidin và xephacloridin (CFC) khi phép thử được tiến hành theo tiêu chuẩn này. 4. Nguyên tắc 4.1 Cấy lên bề mặt môi trường nuôi cấy chọn lọc đặc, sử dụng các cặp đĩa, một lượng qui định của mẫu thử nếu sản phẩm dạng lỏng hoặc một lượng qui định của huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác. Dưới các điều kiện tương tự, cấy các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu, dùng hai đĩa cho mỗi độ pha loãng. 4.2 Ủ các đĩa 48 h ở nhiệt độ 25 0 C trong điều kiện ưa khí. 4.3 Tính lượng Pseudomonas trong một mililit, hoặc trong một gam mẫu từ số khuẩn lạc điển hình và/ hoặc không điển hình thu được trên các đĩa ở các mức pha loãng được chọn sao để cho kết quả có ý nghĩa và được thử khẳng định bằng phép thử oxidaza và cho phát triển trên thạch Kligler 5. Dịch pha loãng, môi trường nuôi cấy và thuốc thử 5.1 Khái quát Về thực hành phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218). 5.2 Dịch pha loãng Xem TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887). 5.3 Thạch xetrimit, fuxidin và xephacloridin (CFC) [1] 5.3.1 Môi trường cơ sở 5.3.1.1 Thành phần Gelatin pepton Casein hydrolysat Kali sunfat (K 2 SO 4 ) Magie clorua (MgCl 2 ) Thạch Nước 16,0 g 10,0 g 10,0 g 1,4 g 12,0 đến 18,0 g 1) 1 000ml 1) Tùy thuộc vào sức đông của thạch. 5.3.1.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,2 ± 0,2 ở 25 0 C, nếu cần. Phân chia môi trường thành các lượng 100 ml vào các bình hoặc các chai có dung tích thích hợp. Khử trùng môi trường trong nồi hấp áp lực (6.1) 15 phút để ở 120 0 C. 5.3.2 Các dung dịch ức chế Không giữ các dung dịch quá 7 ngày trong tủ lạnh. 5.3.2.1 Dung dịch Xetrimit: Dung dịch A 5.3.2.1.1 Thành phần Xetrimit 1) Nước 0,1 g 100 ml 1) Hỗn hợp gồm chủ yếu là tetradexyltrimetylamoni bromua với các lượng nhỏ hơn của dodexyltrimetylamoni bromua và xetrimoni bromua. 5.3.2.1.2 Chuẩn bị Hòa tan xetrimit trong nước. Lọc để khử trùng. 5.3.2.2 Dung dịch fuxidin: Dung dịch B 5.3.2.2.1 Thành phần Fuxidin (C 31 H 47 NaO 6 ) Nước 0,1 g 100 ml 5.3.2.2.2 Chuẩn bị Hòa tan fuxidin trong nước. Lọc để khử trùng. 5.3.2.3 Dung dịch xephacloridin: Dung dịch C 5.3.2.3.1 Thành phần Xephacloridin (C 19 H 17 N 3 O 4 S 2 ) Nước 0,1 g 100 ml 5.3.2.3.2 Chuẩn bị Hòa tan xephacloridin trong nước. Lọc để khử trùng. 5.3.3 Môi trường hoàn chỉnh 5.3.3.1 Thành phần Môi trường cơ sở Dung dịch A Dung dịch B Dung dịch C 100 ml 1 ml 1 ml 5 ml 5.3.3.2 Chuẩn bị Dưới các điều kiện vô trùng, bổ sung các dung dịch chất ức chế vào môi trường cơ sở, làm tan chảy, duy trì ở 47 0 C và trộn cẩn thận. 5.3.4 Chuẩn bị các đĩa thạch CFC Rót khoảng 15 mm môi trường hoàn chỉnh vào các đĩa Petri vô trùng (6.9). Để yên cho đặc lại. Ngay trước khi sử dụng, làm khô các đĩa thạch, tốt nhất là mở nắp ra và lật ngược đĩa thạch xuống dưới, đặt vào tủ sấy (6.2) để ở nhiệt độ từ 35 0 C đến 55 0 C, cho đến khi các giọt nước đã biến khỏi mặt của môi trường. Tiếp theo không làm khô thêm nữa. Các đĩa thạch cũng có thể được làm khô trong tủ cấy vô trùng an toàn khoảng 30 phút khi đĩa được mở một nửa nắp hoặc đĩa đậy nắp thì để qua đêm. Nếu đĩa đã được chuẩn bị trước thì các đĩa thạch chưa được làm khô không được để lâu quá 1 tháng ở nhiệt độ từ 0 0 C đến 5 0 C. 5.4 Thạch dinh dưỡng 5.4.1 Thành phần Cao thịt Pepton Natri clorua (NaCl) Thạch Nước 3,0 g 5,0 g 5,0 g từ 12,0 đến 18,0 g 1) 1 000 ml 1) Tùy vào sức đông của thạch 5.4.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần khô hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 0 C, nếu cần. Chia môi trường thành các lượng 100 ml vào các bình hoặc các chai dung tích không lớn hơn 500 ml. Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.1) 20 phút để ở 121 0 C. 5.4.3 Chuẩn bị các đĩa thạch dinh dưỡng Chuyển các phần mỗi phần khoảng 15 ml môi trường nuôi cấy mới chuẩn bị sang các đĩa Petri đường kính 90 mm (6.9) và để cho đông đặc lại. Ngay trước khi sử dụng, làm khô các đĩa thạch như mô tả trong 5.3.4. Nếu đã được chuẩn bị trước, thì các đĩa thạch chưa được làm khô không được để lâu quá 1 tháng ở nhiệt độ từ 0 0 C đến 5 0 C. 5.5 Thạch Kligler 5.5.1 Thành phần Cao thịt bò 3,0 g Cao men 3,0 g Pancreatic casein pepton 20,0 g Natri clorua (NaCl) 5,0 g Lactoza 10,0 g Glocoza 1,0 g Sắt (II) amoni sunfat ngậm 6 phân tử nước [(NH 4 ) 2 SO 4 .FeSO 4 .6H 2 O] 0,5 g Natri thiosunfat ngậm 5 phân tử nước (Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O) 0,5 g Đỏ phenol 0,025 g Thạch từ 12,0 g đến 18,0 g 1) Nước 1 000 ml 1) Tùy thuộc vào sức đông của thạch 5.5.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần khô hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,4 ± 0,2 ở 25 0 C, nếu cần. Phân chia môi trường thành các lượng 10 ml vào các ống thử nghiệm (6.7). Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.1) 15 phút để ở 121 0 C. Để yên ở trạng thái nghiêng sao cho đoạn đầu mút ngập sâu được 2,5 cm. Chú ý – Không chuẩn bị môi trường này quá 7 ngày hoặc 8 ngày trước khi sử dụng. Mặt khác, môi trường này phải được làm tan chảy và phải được phục hoạt trong nồi cách thủy đun sôi, sau đó để đông đặc lại trạng thái đúng của nó. 5.6 Thuốc thử để phát hiện oxidaza 5.6.1 Thành phần N,N,N’,N’-Tetrametyl-p-phenylenediamin dihidroclorua 1,0 g Nước 100 ml 5.6.2 Chuẩn bị Hòa tan thuốc thử trong nước ngay trước khi sử dụng. 6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218). Tất cả các dụng cụ thủy tinh phải bền với việc khử trùng nhiều lần. Xem TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887). Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và đặc biệt là: 6.1 Thiết bị khử trùng khô (tủ sấy) hoặc thiết bị khử trùng ướt (nồi hấp áp lực). Xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218) 6.2 Tủ sấy hoặc tủ thông gió (để làm khô các đĩa thạch), có thể duy trì được nhiệt độ từ 35 0 C ± 1 0 C đến 55 0 C ± 1 0 C, hoặc tủ cấy vô trùng. 6.3 Tủ ấm, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 25 0 C ± 1 0 C. 6.4 Nồi cách thủy, có khả năng duy trì ở 47 0 C ± 2 0 C. 6.5 pH-met, có độ chính xác đến ± 1 đơn vị pH ở 25 0 C. 6.6 Que cấy vòng, bằng platin/iridi, niken/crom hoặc bằng chất dẻo vô trùng, đường kính khoảng 3 mm và dây cùng chất liệu hoặc đũa thủy tinh. Chú thích 1 – Không sử dụng que cấy vòng bằng niken/crom trong phép thử oxidaza (xem 9.4.2.1). 6.7 Ống và chai thử nghiệm, có dung tích thích hợp. 6.8 Pipet chia độ xả hết, được hiệu chuẩn chỉ dùng cho kiểm tra vi khuẩn, dung tích danh định 1 ml, được chia vạch 0,1 ml và có lỗ xả đường kính từ 2mm đến 3mm. 6.9 Đĩa Petri, làm bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100 mm. 6.10 Que gạt, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo, thí dụ cán cầm bằng đũa thủy tinh dài 20 cm và có đường kính khoảng 3,5 mm, một đầu dài khoảng 3 cm được uốn vuông góc và đầu mút được làm nhẵn bằng nhiệt. 7. Lấy mẫu Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc giảm chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 4833-1 : 2002 (ISO 3100 – 1). Bảo quản mẫu để tránh bị hư hỏng và thay đổi thành phần, nếu cần. 8. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 4833 – 2 : 2002 (ISO 3100 -2). 9. Cách tiến hành 9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng Xem TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887). 9.2 Cấy và ủ 9.2.1 Lấy hai đĩa thạch CFC (5.3.4). Dùng pipet vô trùng (6.8) chuyển vào mỗi đĩa 0,1 ml huyền phù ban đầu. Lấy hai đĩa CFC khác. Dùng pipet vô trùng (6.8) chuyển vào mỗi đĩa 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất của huyền phù ban đầu (10 -2 ). Lặp lại các thao tác trên đối với từng độ pha loãng tiếp theo, dùng pipet vô trùng mới cho mỗi độ pha loãng. 9.2.2 Dùng que gạt mẫu vô trùng (6.10) để dàn đều chất lỏng trên bề mặt đĩa thạch cho đến khô. 9.2.3 Lật ngược các đĩa đã chuẩn bị và làm mát đến 25 0 C rồi ủ trong tủ ấm (6.3) 48 h ở nhiệt độ 25 0 C. 9.3 Đếm và chọn các khuẩn lạc Sau khi kết thúc thúc thời gian ủ qui định, đếm số khuẩn lạc trên từng đĩa và giữ lại các đĩa chứa từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc. Từ mỗi đĩa được giữ lại chọn năm khuẩn lạc một cách ngẫu nhiên. 9.4 Thử khẳng định 9.4.1 Cấy truyền Ria cấy từ mỗi khuẩn lạc đã chọn lên các đĩa thạch dinh dưỡng (5.4.3) để thử khẳng định. Ủ các đĩa này 24 h ở nhiệt độ 25 0 C. Trên mỗi đĩa chọn lấy một khuẩn lạc phân lập tốt để thử khẳng định đặc tính sinh hóa (xem 9.4.2). 9.4.2 Thử khẳng định đặc tính sinh hóa 9.4.2.1 Phản ứng oxidaza 9.4.2.1.1 Thành phần N,N,N’,N’-Tetrametyl-p-phenylenediamin dihidroclorua 1,0 g Nước 100 ml 9.4.2.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thuốc thử trong nước. Thuốc thử phải được chuẩn bị ngay trước khi sử dụng. Có thể sử dụng các đĩa hoặc que cấy bán sẵn. Khi đó, theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. 9.4.2.1.3 Cách tiến hành Làm ẩm mảnh giấy lọc bằng thuốc thử. Dùng dây platin hoặc bằng đũa thủy tinh hoặc đũa bằng chất dẻo (dây bằng niken/crom cho kết quả dương sai) để lấy mẫu vi khuẩn thu được trên môi trường thạch cho lên giấy lọc đã được làm ẩm. 9.4.2.1.4 Giải thích kết quả Trong trường hợp có mặt oxidaza, thì có màu tím đến màu đỏ tía trong khoảng từ 5s đến 10s. Nếu sau 10s mà màu sắc không đổi thì phép thử được coi là âm tính. 9.4.2.2 Đặc tính chuyển hóa đường trong thạch Kligler Cấy ria xiên lên bề mặt thạch (5.5.2) bằng các khuẩn lạc tương tự trong 9.4.2 và đâm xuyên xuống đáy của ống thạch. Ủ 24h ở 25 0 C. 9.4.2.3 Giải thích kết quả Các khuẩn lạc cho thấy phản ứng oxidaza dương tính và khi cấy vào trong thạch Kligler chỉ thấy phát triển trên bề mặt (ưa khí) được coi là các khuẩn lạc Pseudomonas. 10. Biểu thị kết quả 10.1 Phương pháp tính Sau khi nhận dạng, tính số lượng vi sinh vật, a, đã được khử khẳng định trên mỗi đĩa, dùng công thức sau: trong đó A là số lượng khuẩn lạc được chọn để thử khẳng định (trong trường hợp này là 5); b là số khuẩn lạc phù hợp với chuẩn mực nhận dạng; C là tổng số khuẩn lạc đếm được. Tính số lượng vi sinh vật đã nhận dạng, N, trong mẫu thử là trung bình của hai độ pha loãng liên tiếp, theo công thức sau: trong đó å a là tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại sau khi nhận dạng; V là thể tích mẫu cấy đã sử dụng trên mỗi đĩa, tính bằng mililit; n 1 là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng đầu tiên; n 2 là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai; d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại. Làm tròn các kết quả tính được đến hai chữ số có nghĩa. Như vậy, nếu chữ số sau cùng nhỏ hơn 5 thì số đứng trước số đó không bị thay đổi, còn nếu chữ số sau cùng là 5 hoặc lớn hơn 5 thì tăng số đứng trước lên một đơn vị. Làm tròn tiếp theo cho đến khi thu được hai chữ số có nghĩa. Lấy kết quả là số lượng vi sinh vật trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm dạng khác), được biểu thị bằng số từ 1,0 đến 9,9 nhân với lũy thừa tương ứng của 10. 10.2 Các số đếm ước tính 10.2.1 Nếu có hai đĩa mẫu thử gốc (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm ở dạng khác) chứa ít hơn 15 khuẩn lạc, thì tính trung bình số học y của các khuẩn lạc đếm được trên cả hai đĩa. Biểu thị kết quả như sau: - đối với sản phẩm dạng lỏng: số lượng vi sinh vật ước tính trong một mililit là: N E = y - đối với sản phẩm dạng khác: số lượng vi sinh vật ước tính trong một gam sản phẩm là: N E = y/d trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu. 10.2.2 Nếu trên hai đĩa mẫu thử gốc (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) không có bất kỳ một khuẩn lạc nào thì biểu thị kết quả như sau: - ít hơn 1 vi sinh vật trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng); - ít hơn 1/d vi sinh vật trong một gam (sản phẩm dạng khác); trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu. 10.3 Giới hạn tin cậy Xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218). 11. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ: - phương pháp lấy mẫu; - phương pháp đã sử dụng; - số ngày ủ; - kết quả thử nghiệm thu được; - kết quả cuối cùng thu được, nếu kiểm tra độ lặp lại. Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra phương pháp đã sử dụng và kết quả thu được. Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả. Báo cáo thử nghiệm cũng phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử. PHỤ LỤC A (tham khảo) TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] MEAD, G.C and ADAMS, B.W.A setective medium for the rapid isolation of Pseudomonas associated with poultry meat spoilage. Br. Poult, Sci, 18,1977, pp. 661-670. [2] TCVN 4833-1 : 2002 (ISO 3100-1 : 1991) Thịt và sản phẩm thịt – Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử - Phần 1: Lấy mẫu.