TCVN10806-1:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10806 -1:2015 (ISO 7346-1:1996) về Chất lượng nước - Xác định độc tính gây chết cấp tính của các chất đối với cá nước ngọt [brachydanio rerio hamilton-buchanan (teleostei, cyprinida] - Phần 1: Phương pháp tĩnh TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10806-1:2015 ISO 7346-1:1996 CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH GÂY CHẾT CẤP TÍNH CỦA CÁC CHẤT ĐỐI VỚI CÁ NƯỚC NGỌT [BRACHYDANIO RERIO HAMILTON-BUCHANAN (TELEOSTEI, CYPRINIDAE)] - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP TĨNH Water quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater f i sh [Brachy d anio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cypr i nidae)] - Part 1: Static method Lời nói đầu TCVN 10806-1:2015 hoàn toàn tương đương với ISO 7346-1:1996 TCVN 10806-1:2015 do Ban kỹ thuật T iêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 147 Chất lượng nước biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ tiêu chu ẩ n TCVN 10806 (ISO 7346) , Chất lượng nước - X á c định độc tính gây ch ế t cấp t í nh của các chất đối với cá nước ngọt [ Brachydanio rer i o Hamilton-Buchanan (Teleostei Cyprinidae) ] gồm các phần sau: - TCVN 10806-1:2015 (ISO 7346-1:1996), Phần 1: Phương pháp tĩnh; - TCVN 10806-2:2015 (ISO 7346-2:1996), Phần 2: Phương pháp bán t ĩnh; - TCVN 10806-3:2015 (ISO 7346-3:1996), Phần 3: Phương pháp dòng ch ả y. Lời giới thiệu Bộ tiêu chu ẩ n 10806 (ISO 7346) đưa ra các phương pháp xác định độc tính gây chết cấp tính c ủ a các chất đối với cá ngựa vằn ( Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan ), nhưng phải nhấn mạnh r ằ ng phương pháp áp dụng đối với cá ngựa vằn không loại trừ việc sử dụng cho các loài khác. Các phương pháp sinh học nêu ra ở đây có thể sử dụng cho các loài cá nước ngọt, nước mặn hoặc nước lợ khác, với các c ả i biên thích hợp, ví dụ, chất lượng nước pha loãng và điều kiện nhiệt độ của phép thử. Trong bộ tiêu chuẩn này, xác định độc tính gây chết cấp tính của các chất có thể thực hiện bằng phương pháp tĩnh, bán tĩnh và dòng chảy. Phép thử tĩnh, được mô tả trong tiêu chu ẩ n n à y, trong đó d ung dịch không được làm mới, vì thế có ưu điểm là yêu cầu thiết bị, dụng cụ đơn giản, nhưng các ch ấ t trong bình thử có thể bị thất thoát trong quá trình thử và chất lượng nước có thể bị giảm. Trong phương pháp dòng chảy, được qui định trong phần TCVN 10806-3 (ISO 7346-3), dung dịch thử được bổ sung liên tục, giải quyết đ ư ợc vấn đề của phương pháp tĩnh nhưng lại yêu cầu sử dụng các thiết bị, dụng cụ phức tạp hơn. Trong phương pháp bán tĩnh, được mô tả trong TCVN 10806-2 (ISO 7346-2), d ung dịch th ử được làm mới sau mỗi 24 h hoặc 48 h, phương pháp này là sự kết hợp giữa hai phương pháp còn lại. Phương pháp dòng chảy có thể được s ử dụng cho hầu hết các loại chất, bao gồm c ả chất không bền trong nước, t uy nhiên nồng độ ch ấ t thử được xác định bất cứ khi nào có thể. Phương pháp tĩnh bị giới hạn trong trong phép thử các chất có nồng độ th ử được duy trì tương đối ổn định trong suốt thời gian thử. Phương pháp bán tĩnh có thể được sử dụng để nghiên cứu chất có nồng độ được duy trì hợp lý trong suốt phép thử bằng cách l à m mới dung dịch sau mỗi 24 h hoặc 48 h. Sự chuẩn bị đ ặc biệt có th ể là cần thiết đ ố i với các chất bay hơi nhanh. Để hỗ trợ cho việc chuẩn bị và duy trì nồng các độ chất có th ể gây chết tại n ồ ng độ g ầ n v ớ i độ hòa tan trong nước của chúng có thể sử dụng một lượng nh ỏ dung môi, như đã qui định trong các phương pháp. CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH GÂ Y CH Ế T C Ấ P TÍNH CỦA CÁC CH Ấ T Đ Ố I VỚI CÁ NƯỚC NGỌT [ BRACHYDANIO RERIO HAMILTON -BUCHANAN (TELEOSTEI, CYPRINIDAE)] - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP TĨNH Water quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater f i sh [Brachy d anio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cypr i nidae)] - Part 1: Static method 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp tĩnh để xác định độc tính g â y chết cấp tính c ủ a các đơn ch ấ t, không bay hơi, bền và tan trong nước trong các điều kiện xác định lên c á nước ngọt [ Brachy d anio rer i o Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae) - tên thư ờ ng gọi là cá ngựa vằn] trong nước có chất lượng đ ã định. Phương pháp này c ó th ể áp dụng để đánh giá, đối với mỗi chất thử, các phạm vi độc tính gây chết cấp tính đối với Brachydanio rer i o trong các điều kiện thử. Kết quả của phương pháp này không đủ căn cứ để xác định các tiêu chuẩn về ch ấ t lượng nước cho bảo vệ môi trường. Phương pháp này cũng có thể áp dụng khi sử dụng một số loài cá nước ngọt khác làm sinh vật thử 1) . Phương pháp này cũng có thể áp dụng cho cá nước ngọt, cá nước mặn và nước lợ khác bằng những điều chỉnh thích hợp với điều kiện thử, đặc biệt về số lượng và chất lượng của nước pha loãng và nhiệt độ. 2. Nguyên tắc Trong điều kiện nhất định, xác định nồng độ một chất mà tại n ồ ng độ đó gây chết cho 50 % cá thể Brachydanio rer i o sau th ờ i gian tiếp xúc 24 h, 48 h, 72 h, 96 h với ch ấ t đó trong môi trường nước. Các nồng độ gây chết tr u ng b ì nh tương ứng được qui định LC 50 -24 h, LC 50 -48 h, LC 50 -72 h và LC 50 -96 h. Phép thử được tiến hành trong hai giai đoạn: a) Phép thử sơ bộ đưa ra chỉ số gần đúng về nồng độ trung b ì nh gây chết cấp tính và phục vụ cho việc xác định khoảng nồng độ cho phép thử cuối cùng; b) Chỉ báo cáo các kết quả của phép thử cuối cùng. Nếu có sẵn bằng chứng cho thấy nồng độ thử còn lại tương đối ổn đ ị nh (tức là trong khoảng 20 % các giá tr ị danh định) trong qu á trình thử, th ì hoặc nồng độ được đo hoặc nồng độ danh định được sử dụng để t í nh giá tr ị LC 50 . Nếu phép phân tích cho thấy nồng độ hiện tại còn lại có giá trị tương đối ổ n định nhưng nhỏ hơn khoảng 80 %, hoặc lớn h ơ n 120 % giá trị danh định, th ì sử dụng giá trị phân tích để t í nh giá trị LC 50 . Nếu không có bằng chứng cho thấy nồng độ thử còn lại ở mức chấp nhận được thông qua quá tr ì nh thử, hoặc được biết (hoặc nghi ngờ) rằng nồng độ c ủ a chất th ử giảm đáng kể ở bất kỳ giai đoạn nào trong quá tr ì nh thử, th ì , dù có số liệu phân tích hóa học hay không, giá trị LC 50 không th ể xác định được bằng phương pháp này. Trong trường hợp này, phép thử không cần xác nhận, nhưng chỉ có thể công bố giá trị LC 50 c ủ a chất là ≤ x mg/l, sử dụng nồng độ danh đ ị nh để ước tính giá trị, x . 3. Sinh vật thử và thuốc thử Thuốc thử sử dụng phải được công nhận chất lượng phân tích. Nước sử dụng để chu ẩ n bị dung dịch phải là nước được cất bằng thiết b ị thủy tinh hoặc nước đã loại ion với độ tinh khiết tương đương. 3.1 . Sinh vật thử nghiệm Loài thử nghiệm là Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (lớp phụ Teleostei, họ cá chép Cypr i nidae ), thường g ọ i l à cá ngựa vằn. Mỗi cá th ể c á thử nghiệm có chiều dài tổng là 30 mm ± 5 mm, về nguyên tắc, tương ứng với khối lượng là 0,3 g ± 0,1 g. Cá thể thử được chọn từ cùng một qu ầ n thể trong một đàn. Đàn cá này ph ả i được nuôi thích nghi với môi trường và, trong mọi trường hợp, phải được nuôi í t nhất 7 ngày trước khi thử trong nước pha loãng, có sục khí liên tục (xem 3.2). trong điều kiện chất lượng nước và chiếu sáng giống với điều kiện trong phép thử. Cá được cho ăn b ì nh thường cho đến 24 h trước khi tiến hành phép thử. Cá th ử phải không mắc bệnh hoặc có d ị tật nh ì n thấy. Cá phải không được chữa trị bệnh trong quá trình thử hoặc trong hai tuần trước khi thử. Cá còn sống sau khi thử phải được th ả i bỏ theo cách phù hợp. Điề u k iện môi trường để duy tr ì và nuôi cá ngựa vằn được nêu trong Phụ lục A. 3.2 . Nước pha loãng tiêu chuẩn Nước pha lo ã ng tiêu chuẩn được chuẩn b ị m ớ i phải có pH bằng 7,8 ± 0,2, và độ cứng canxi khoảng 250 mg/l t í nh theo canxi cacbonat, và trước thử nghiệm phải chứa các muối tan trong nước cát hoặc nư ớ c đã loại ion với nồng độ sau: CaCI 2 .2H 2 O 294,0 mg/l MgS O 4 .7H 2 O 123,3 mg/l NaHCO 3 63,0 mg/I KCI 5,5 mg/l Sục khí vào nước pha loãng cho đến khi nồng độ của oxy hòa tan đạt tới ít nhất 90 % giá trị bão hòa khi trong dung dịch (AVS) và pH ổ n đ ị nh ở 7,8 ± 0,2. Nếu cần, điều ch ỉ nh pH của dung dịch bằng cách thêm dung dịch natri hydroxit hoặc ax í t clohydric. V ì thế nước pha loãng đ ã chu ẩ n b ị không nhận thêm sục khí cưỡng bức trước khi sử dụng trong phép th ử . 3.3 . Dung d ị ch gốc c ủ a ch ấ t thử Dung dịch gốc là một hỗn hợp xác định của chất thử phải được chu ẩ n b ị bằng cách hòa tan một lượng chất thử đ ã biết vào một thể tích xác định c ủ a nước pha loãng, nước đ ã loạ i ion hoặc nước được cất bằng thiết bị thủy tinh. Để có thể chuẩn b ị dung dịch gốc và hỗ trợ trong việc chuyển vào bình thử, chất í t tan trong nước có thể được hòa tan hoặc phân tán bằng biện pháp thích hợp, k ể c ả các thiết bị sóng siêu âm và dung môi hữu cơ có độc tính thấp đối với cá. Nếu dung môi hữu cơ nào đó được sử dụng thì nồng độ dung môi trong dung dịch th ử không quá 0,1 m l /l, hoặc thể tích chứa 0,1 g/l, tùy mức nào lớn hơn. Nếu s ử dụng dung môi, cần có hai bộ mẫu đối chứng, trong đó một bộ chứa dung môi ở nồng độ cao nhất được sử dụng cho mọi bình thử và một bộ không chứa dung môi hoặc chất thử. 3.4 . Dung dịch thử Dung dịch thử được chuẩn bị b ằ ng cách thêm một lượng thích hợp dung dịch gốc của chất thử vào nước pha loãng để đạt được nồng độ yêu cầu. Khi chuẩn bị dung dịch gốc bằng nước cất hoặc nước khử ion th ì không nên thêm quá 100 m l dung d ịch gốc vào 10 l nước pha loãng. 4. Thiết bị, dụng cụ Tất c ả vật liệu có thể tiếp x ú c với chất l ỏ ng mà cá sẽ được th ả vào, hoặc với vật m à cá có khả năng tiếp xúc phải là chất trơ hoặc không hấp thụ chất thử đáng kể. Thiết bị phòng th ử nghiệm thông thường và các thiết bị sau: 4.1 . Bình th ử , có dung tích thích hợp (có thể cần lớn hơn 10 I), với diện tích bề mặt giữa không kh í và môi trường thử lớn (khoảng 800 cm 2 cho 10 l môi trường) và có nút đậy v ừ a khít và cố định an toàn. Dung tích của b ì nh thử phải đ ủ l ớ n đ ể tỷ lệ cá thả không quá 1 g cá trên 1 I nư ớ c trong thời gian thử. Trước khi sử dụng, b ì nh th ử phải được rửa sạch, ví dụ bằng chất tẩy không chứa ion (tiếp theo rửa với axit và dung môi để loại b ỏ các chất bám chặt vào thành bình). 4.2 . Thiết b ị kiểm soát nhiệt độ , để điều tiết nhiệt độ của dung dịch thử và nước trong b ể dung dịch gốc ở 23 ° C ± 1 ° C bằng các phương pháp phù hợp. 4.3 . V ợt , làm bằng nilon hoặc vật liệu trơ về hóa học khác dùng cho bình đối chứng v à các vợt khác cho tất c ả các bình thử (4.1). 5. Môi trường thử Việc chu ẩ n bị và bảo quản dung d ị ch, nuôi cá, và t ấ t cả các thao tác và phép thử được thực hiện trong phòng có không khí sạch, không chứa các chất ô nhiễm ở nồng độ có hại trong không khí. Phải cẩn thận tránh sự xáo trộn không mong muốn vì có thể làm thay đ ổ i hành vi của cá. Thực hiện tất cả các phép thử trong điều kiện ánh sáng phòng thử nghiệm thông thường với thời gian chiếu sáng hàng ngày từ 12 h đến 16 h. 6. Cách tiến hành 6.1 . Đi ều kiện về cá Bất k ể khi nào có thay đổi về qu ầ n thể gốc, phải tiến hành phép thử độc t í nh sử dụng phương pháp đã định trong tiêu chu ẩ n n à y sử dụng hóa chất chuẩn thích hợp [ví dụ kali dicromat ( K 2 Cr 2 O 7 )). Kết quả của phép thử này phải thống nhất hợp lý với kết qu ả trong phép thử trước trong cùng một phòng thử nghiệm. Không sử dụng cá thử đã sử dụng trong quá trình thử trước. Duy trì nhiệt độ của nước trong bể gốc ở 23 ° C ± 1 ° C (4.2). 6.2 . Phép thử giới hạn Sử dụng quy tr ì nh mô t ả trong tiêu chu ẩ n này, phép thử giới hạn có th ể được tiến hành tại giới hạn của dịch thể l ỏ ng hòa tan trong nước trong đi ề u kiện c ủ a phép thử hoặc ở 100 mg/l, tùy theo mức nào thấp hơn, đ ể cho th ấ y giá trị LC 50 -96 h lớn hơn nồng độ này. Nếu không có cá chết trong phép th ử giới hạn thì không yêu cầu phép thử tiếp theo. Tiến hành phép thử giới hạn bằng cách s ử d ụng 10 con cá, và cùng số lượng trong (các) mẫu đối chứng. CHÚ THÍCH 1: Lý thuyết nhị thức ch ỉ ra rằng, khi sử dụng 10 con cá, với tỷ lệ chết bằng “không” c ó độ tin cậy 99,9 % th ì giá trị LC 50 -96 h lớn hơn nồng độ thử giới hạn. N ế u có tỷ lệ chết, phải xem xét tiến hành một nghiên c ứ u hoàn chỉnh (xem 6.3 và 6.4). C ần ghi lại nếu quan sát thấy ả nh hư ở ng gần gây chết. 6.3 . Phép thử sơ bộ Thêm ít nhất 2,5 I, tốt nhất là 5 I, nư ớ c pha loãng tiêu chuẩn (3.2) vào từng bình trong số sáu bình thử (4.1) và sục khí nếu cần khôi phục nồng độ oxy hòa tan đến ít nhất 90 % giá trị b ã o hòa kh í của dung dịch. Chuẩn b ị dung dịch thử bằng cách thêm lượng thích hợp dung dịch gốc của ch ấ t thử (3.3) vào năm b ì nh để thu được dãy cấp số mũ về n ồ ng độ, ví dụ 1000 mg/l; 100 mg/l; 10 mg/l; 1 mg/l và 0,1 mg/l. Không thêm gì vào b ì nh thứ sáu là bình đối chứng, Dung d ịch được điều c h ỉ nh và duy trì ở 23 ° C ±1 ° C (4.2) không được sục kh í trong quá tr ình thử này. Cho ba con cá vào mỗi bình. Í t nhất hai lần một ngày, ghi lại số cá chết và nồng độ oxy hòa tan trong mỗi bình. Loại bỏ cá ch ế t. Nếu chưa có đủ số liệu để thiết lập khoảng nồng độ cần ch o phép thử cuối cùng, thì lặp lại phép thử sơ bộ với khoảng nồng độ khác. 6.4 . Phép thử cuối c ù ng Chọn ít nhất năm nồng độ tạo thành một dãy cấp số mũ, ví dụ 8 mg/ l ; 4 mg/ l ; 2 mg/I; 1 mg/l và 0,5 mg/l, nhưng phải bao gồm cả nồng độ thấp nhất làm chết toàn bộ cá trong phép thử sơ bộ và nồng độ không gây chết cao nhất trong vòng 96 h. Dãy nồng độ được chọn này phải cung cấp xác suất thu được tỷ lệ chết từ 0 % đến 100 % trong í t nhất hai nồng độ liên tiếp của dãy cấp số mũ được sử dụng, điều này cần để ư ớ c t í nh LC 50 bằng sử dụng phương pháp “ tin cậy xác suất “ prob it”“ . Trong một số trường hợp, có thể yêu cầu khoảng nồng độ hẹp hơn để cung cấp các s ố liệu cần thi ế t và trong trường hợp kh á c lại cần khoảng nồng độ rộng hơn. Lấy ít nhất sáu bình thử (4.1) và đổ vào mỗi b ì nh, ví dụ, 10 l nước pha loãng tiêu chuẩn (3.2). Không thêm gì vào một trong số các bình n à y (đ ố i chứng), nhưng với các bình khác thêm t ừ ng lượng khác nhau của dung dịch gốc (3.3) được yêu cầu để tạo nên một dãy nồng độ riêng của chất thử đã chọn. Nếu sử dụng dung môi hữu cơ để h òa tan một chất, ph ả i chu ẩ n b ị mẫu đối chứng thứ hai với nước pha loãng tiêu chuẩn có chứa một lượng vừa đủ dung môi hữu cơ để có được nồng độ dung môi cao nhất mà tại nồng độ này dung môi có trong mọi dung dịch thử. Khi dung dịch thử (3.4) được điều chỉnh về nhiệt độ 23 ° C ± 1 ° C (4.2), cho ít nhất bảy con cá vào mỗi bình như sau. Chọn ngẫu nhiên cá trong đàn cá gốc vã ngay lập tức thả ngẫu nhiên vào các bình thử, sử dụng vợt có lỗ nhỏ, l à m bằng vật liệu trơ mềm (4.3). Loại b ỏ b ấ t kỳ con c á nào bị rơi hoặc thao tác không đúng trong quá trình di chuyển. Trong phép thử này, cho tất cả cá vào bình trong khoảng thời gian 30 min. Không được phép sục khí dung dịch. Ghi số cá chết trong mỗi b ì nh ít nhất hàng ngày trong quá trình th ử . Loại bỏ từng con cá chết kh ỏ i b ì nh càng nhanh càng t ố t. Việc quan sát có thể diễn ra thường xuyên hơn, ví dụ để tính toán khoảng thời gian sống trung b ì nh thu được cho mỗi nồng độ. Ghi lại mọi hành vi bất thư ờ ng của cá. Nếu chất được nêu có tính bền trong thời gian tiếp xúc, nếu có thể, đo nồng độ chất thử trong bình thử í t nhất tại thời điểm b ắ t đầu và kết thúc phép th ử . Đo nồng độ oxy hòa tan, pH và nhiệt độ c ủ a dung dịch đang th ử đi qua từ mỗi b ì nh ít nhất một lần một ngày và tại thời đi ể m bắt đầu và kết thúc phép thử. Nhiệt độ và pH của dung dịch không thay đ ổ i quá ± 1 ° C hoặc 0,2 đơn vị pH. Biểu mẫu gợi ý đ ể ghi số liệu được nêu trong Phụ lục B. 7. Biểu thị kết quả 7.1 . Tính hợp lệ Kết qu ả được coi là hợp lệ nếu đáp ứng đầy đủ các yêu cầu sau: a) Nồng độ oxy hòa tan c ủ a dung dịch thử trong quá trì nh thử phải đạt ít nhất 60 % ASV; b) Nồng độ chất thử không được biết (hoặc nghi ngờ) bị thất thoát đáng kể trong quá tr ì nh thử (xem Điều 2); c) Tỷ lệ chết c ủ a cá đối chứng không quá 10 % hoặc một con trong một bể; d) Tỷ lệ cá đối chứng có hành vi bất thường không quá 10 % hoặc một con trong một bể; e) Giá trị LC 50 -24 h của hóa chất chu ẩ n [ví dụ kali dicromat (K 2 Cr 2 O 7 )] nếu áp dụng, cho bể cá gốc phải thống nhất hợp lý với kết qu ả trong phép thử trước trong cùng một phòng thử nghiệm. 7.2 . Ư ớc tính giá trị LC 50 Trong trường hợp ước tính LC 50 bằng đồ th ị đơn gi ả n được coi là th ỏ a đáng, th ì giá trị n à y c ó thể nhận được bằng cách vẽ đ ồ thị tỷ lệ giữa cá chết (tính theo phần trăm cá th ử trong mỗi b ì nh thử) v ớ i nồng độ chất thử. Sử dụng các trục có thang chia tuyến tính, để tạo nên tương quan sigma, từ tương quan này có thể được tính giá trị LC 50 bằng cách nội suy từ nồng độ dự ki ế n sẽ gây nên tỷ lệ chết 50 % (xem Hình 1). Sẽ thích hợp hơn nếu vẽ số liệu trên giấy vẽ đồ thị trên các trục với thang chia theo logarit và đơn vị xác suất. Số liệu được vẽ theo cách này sẽ tạo nên tương quan tuyến tính, từ đó có thể nội suy LC 50 như trên (xem H ì nh 2). Nếu cần ước t í nh độ dốc, giới hạn tin cậy 95 % và LC 50 , thì khuyến nghị các phân tích thống k ê này thường c ó giá trị trong việc biểu thị kết qu ả , số liệu có th ể được ph â n tích bằng đồ thị (xem tài liệu tham khảo [2] tr ong thư mục tài liệu tham khảo). Nếu có sẵn thiết b ị tính toán, có thể áp d ụng phân tích probit (xem tài liệu tham khảo [1] trong thư mục tài liệu tham khảo). Hình 1- Nội suy giá trị LC 50 bằng đồ th ị (thang chia độ tuy ế n tính) Hình 2 - N ội suy giá trị LC 5 0 bằng đồ thị (thang chia logarit và đ ơn vị xác suất) Nếu chưa có đ ủ số liệu để ước tính LC 50 tại 24 h và 48 h và, có thể tại 72 h và 96 h, phải ghi lại nồng độ thấp nhất mà tại đó xuất hiện tỷ lệ cá chết 100 % và nồng độ cao nhất cho tỷ lệ cá chết 0 % tại 24 h; 48 h; 72 h và 96 h. Nồng độ này chỉ ra giới hạn trong đó có khả năng chứa LC 50 . 8. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau: a) Viện dẫn tiêu chuẩn này; b) Nhận dạng h óa chất và mọi thông tin có sẵn về chất thử (như tính tan, tính bay hơi, hệ số tỷ lệ octano l /nước, tốc độ phân hủy); c) Phương pháp chu ẩ n b ị nước pha lo ã ng, dung dịch g ố c và dung dịch thử; d) Tất cả số liệu hóa học, sinh học, vật lý liên quan đến phép thử và không được đưa ra trong tiêu chu ẩ n này, bao g ồ m các chi tiết về điều kiện thích nghi của cá thử, và khối lượng cá, tính theo gam trên lít; e) Các s ố liệu được xem x é t khi đánh giá tính hợp lệ của phép th ử : 1) Nồng độ của oxy hòa tan, 2) Tỷ lệ chết được quan sát thấy ở cá đối chứng, 3) T ỷ lệ cá đối chứng có hành vi bất b ì nh thường, 4) LC 50 của chất chuẩn; f) Bảng liệt kê nồng độ danh định được thử (với giá tr ị phân tích hóa học, nơi công bố), và phần trăm tổng số cá chết trong 24 h, 48 h, 72 h và 96 h tính từ lúc b ắ t đầu phép th ử ; g) Các gi á trị LC 50 và giới hạn tin cậy, nếu có, của chất thử tại 24 h, 48 h, 72 h và 96 h, tài liệu tham khảo cần có cho các phương pháp tính toán, và các phương pháp phân t í ch hóa học, ở bất cứ nơi nào được áp dụng; h) Độ dốc c ủ a đường cong nồng độ - đáp ứng (và giới hạn tin cậy 95 % nếu có); i) Minh họa bằng đồ thị các mối tương quan n ồ ng độ - đáp ứng; j) Mọi phản ứng bất thường của cá trong điều kiện phép thử và mọi tác động bên ngoài quan sát được sinh ra do chất thử; k) Mọi sai khác so với quy trình được qui định trong tiêu chu ẩ n n à y, và nguyên nhân. Phụ lục A (Tham khảo) Thông số môi trường để nuôi và tạo giống cá ngựa vằn (Brachydanio rer i o Hamilton-Buchanan) A.1 . Kh á i quát Cá ngựa vằn có nguồn gốc từ bờ biển Coromandel c ủ a Ấ n Độ nơi c ó các dòng ch ả y mạnh. Đây l à loại cá thường được nuôi trong bể, v ì thế các thông tin về các quy tr ì nh chăm sóc và nuôi cá có thể được nêu trong các tài liệu tham khảo về nuôi cá nhiệt đới. Đặc tính sinh học c ủ a các loài n à y đã được tổng kết bởi Laale [5]. Loài cá này hiếm kh i dài quá 45 mm. Thân hình trụ với 7 đến 9 sọc dọc xanh đậm trên nền màu bạc. Các sọc này chạy đến vây đuôi và vây bụng. Phần lưng có màu xanh ô liu. Con đực mảnh hơn con cái và c ó màu ánh vàng. Con cái có màu bạc hơn và bụng phồng to, đặc biệt là trước khi đẻ trứng. A.2. Thông số môi trường Loài cá này có khả năng chịu đựng kho ả ng rộng về nhiệt độ, pH và độ cứng c ủ a nước. Axelrod [4] đưa ra khoảng nhiệt độ là 15,5 ° C đến 43,3 ° C và pH từ 6,6 đến 7,2. Cá có thể sinh sản, nuôi và s ố ng trong nước vòi có độ c ứ ng tổng s ố cao nhất là 300 mg/l (theo canxi cacbonat) và pH từ 7,7 đến 8,2. Nhiệt độ được duy trì ổn định ở 26 ° C ± 1 ° C và tăng lên 27 ° C ± 1 ° C đ ể kích thích đẻ trứng. A.3 . Vật liệu và phương pháp Loài cá này có thể đẻ trứng trong b ể thủy tinh có mức chứa khoảng 70 l . Cá mới n ở sau đó được chuyển sang bể có mức chứa 200 l . Vì cá trưởng thành là loài tham ăn trứng, cần c ó phương pháp để bảo vệ trứng mới đ ẻ và cá non. Một phương pháp đã được sử dụng thành công bằng cách giam cá trư ở ng thành trong lồng lưới dưới nước để khi con cái đẻ trứng, trứng sẽ r ơ i qua lưới xuống đáy b ể tránh xa các con trư ở ng th à nh. Lồng lưới có kích thước là 250 mm x 250 mm x 80 mm, được l à m từ sợi nhựa, có đ ường kính mắt lưới 3 mm. Lồng này được kẹp vào miệng bể để phần gờ phía trên c ủ a lồng ở trên nước còn lư ớ i nhúng xu ố ng nước khoảng 60 mm. Không sử d ụng hệ thống l ọc bằng sỏi ở đáy đ ể làm sạch nước vì n ó c ó khả năng làm hại trứng. B ể phải được chiếu sáng 8 h một ngày. A.4 . Điều kiện Giai đoạn này kéo dài khoảng 2 tuần. Con đực v à con cái được cách ly và nuôi ăn thức ăn sống. Bao gồm giun trắng (enchytraeids) , Daphnia và tôm biển (Artemia) . Mật độ c ủ a bể trong quá tr ì nh quy định luôn được giữ dưới 30 con cá trong bể c ó mức chứa 70 l. Vào cuối c ủ a 2 tuần, con đực c ó màu ánh vàng đậm và con cái có bụng trứng to. A.5 . Giai đoạn đẻ trứng Có th ể thiết lập bể đẻ trứng như sau. Làm đầy bể r ỗ ng bằng nước vòi sạch có nhiệt độ 27 ° C trong 48 h và đặt lồng nhựa vào dưới mép bể, để cá bơi trong một khoảng th ể tích 1 I. Cho vào lồng sáu con cái vào bu ổ i sáng và cho ăn bằng tôm biển đã đông khô. Thêm chín con đực vào lồng v à o buổi tối và cho cá ăn một lần nữa bằng tôm biển đã đông khô trước khi tắt đèn. Quá tr ì nh đẻ trứng được kích thích b ằ ng ánh sáng buổi sáng và hoàn thành sau khi bật đèn khoảng 4 h. Trứng, không dính vào nhau, rơi qua lưới, cách biệt v ớ i các con trư ở ng thành. Khi con cái đẻ trứng xong, chuyển các con trư ở ng thành ra và đ ẻ cho trứng n ở . A.6 . Phát triển cá con Trứng nở sau k hoảng từ 4 ngày đến 5 ng à y và các cá non bám vào thành bể và giữ bất động từ 24 h đến 48 h. Khi con non tự bơi được, cho chúng ăn thức ăn dành cho cá loại có đăng ký phù hợp với kích thước hạt nh ỏ . Khi được 3 tuần, cá non có thể được cho ăn bằng tôm biển mới n ở và tốc độ tăng trưởng trở nên nhanh hơn. Sau 1 tháng, có thể chuyển chúng sang bể 200 I và cho ăn bằng hỗn hợp thức ăn đã được đ ă ng ký phù hợp và thức ăn sống. Cá sẽ hoàn thiện cơ quan sinh sản sau 3 tháng và đạt đến chiều dài 3,5 cm. C ần chú ý là các d ị tật tự phát ở ấu trùng đang phát triển có thể quan sát được ở những giống nhất định (xem tài liệu tham khảo [9] trong thư mục tài liệu tham khảo). Các nghiên cứu khác (xem tài liệu tham khảo [7] trong thư mục tài liệu tham khảo) chỉ ra rằng các yếu tố trong chế độ ăn có thể dẫn đến dị h ì nh và cá ngựa vằn đặc biệt nhạy cảm với yếu t ố này (các loài khác sinh sản và phát triển b ì nh thường khi cho ăn th ứ c ăn cá đã đăng ký phù hợp tương tự). Phụ lục B (Tham khảo) Mẫu gợi ý để ghi số liệu Phòng thử nghiệm Người thực hiện K ý hiệu m ẫ u Ngày bắt đ ầ u phép thử Ch ấ t Độ tinh khi ế t T ạ p ch ấ t N ế u thử một phương thức, nhận dạng các thành phần Phương pháp chuẩn bị dung dịch gốc Nồng độ dung dịch gốc (mg/ l ) Nồng độ tối đa dung môi trong các bình th ử ( mg/ l ) Phương pháp phân tích hóa học B ì nh đối chứng 1 Ch ỉ có nước pha lo ã ng Thông số xác định Thời gian bắt đầu phép thử (h) 0 Nồng độ oxy hòa tan (% ASV 1) ) pH Nhiệt độ (°C) Số cá chết 2 Nước pha lo ã ng và m g /l dung môi Thông số xác định Thời g ian bắt đầu phép thử (h) 0 Nồng độ oxy hòa tan (% ASV 1) ) pH Nhiệt độ (°C) Số cá chết Ký hiệu bình thử Nồng độ ban đầu (đã đo và đã t í nh) của chất th ử mg/l Thông số xác định Thời gian bắt đầu phép thử (h) 0 Nồng độ chất thử [mg/l (trong phân tích)] Nồng độ oxy hòa tan ( % ASV 1) ) pH Nhiệt độ (°C) Số cá chết 1 ) Giá trị b ã o hòa kh í . THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Asay , Wycombe, Kingdom, Griffin (1978). [2] Litch f ield, J.T. and Wilcoxon, F.A simpli f ied method for evaluating dose-eff e ct experient. J. Pharmacol.Exp.Ther . 96 (1949), pp 99-113. [3] S tephan, C.E. Method for calculating an LC 50 . Aquatic Toxycology and Hazard Evaluataion . ASTM (1977), ST , p 634. [4] Axelrod, H. P . Breeding Quar i um Fish es Book 1 . T.F.H. Publication, 1967. [5] Laale, H. W . The biology and use of zebra fish ( Brachydanio rerio) in fisheries rearch. A literature revie w . J. Fish Biol . 10 (2) (1977), pp 121-173. [6] Mertens, J. Year-round controlled mass reprodu ct ion of zebra fish. Aquaculture 2 (1973), pp 245-249. [7] Newsome, C.S . and Piron, R.D. Aetiology of skeletal deformities in the Z ebra Danio fish ( Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan ). J. Fish Biol . 21 (1982), pp 231-237. [8] N II MI,A.J and LA HAM, Q.N. In f luence of breeding time interval on egg number, mortality and hatching of the zebra fish (Brachydanio rer i o) . Can. J.Zool. 52 (1974), pp 515-517. [9] PIRON, R.D. Spontaneous skeletal de f ormities in the zebra fish (Brachydanio rerio) bre d for fish toxicity tests. J. Fish Biol . 13 (1978), pp 79-84. 1) Ngoài Brachydanio rerio , có th ể sử d ụng các loài cá nước ngọt sau mà không sửa đ ổ i tiêu chu ẩ n này. - Lepomismacrochirus (Teleostei, Centrarchidae) - Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) - Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) - Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)