TCVN11286:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11286:2016 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng buquinolate - Phương pháp đo huỳnh quang TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 11286:2016 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BUQUINOLATE - PHƯƠNG PHÁP ĐO HUỲNH QUANG Anima l f eeding stuffs - Determination of buquinolate conten t - F lurometric method Lời nói đầu TCVN 11286:2016 được xây dựng tr ê n cơ sở tham khảo AOAC 967.34 Buquinolate in feeds. F lurometric method ; TCVN 11286:2016 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ N ô ng nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BUQUINOLATE - PHƯƠNG PHÁP ĐO HUỲNH QUANG Anima l f eeding stuffs - Determination of buquinolate conten t - F lurometric method 1 Phạm vi áp dụng Ti êu chuẩn này quy đ ị nh phương pháp đo huỳnh quang để xác định hàm lượng buquinola t e trong th ứ c ăn chăn nuôi. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu v i ện dẫn sau r ấ t cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện d ẫ n ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện d ẫ n không ghi năm công b ố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đ ổ i, bổ sung (nếu có). TCVN 6952 (ISO 9498), Thức ăn chăn nuôi - Chu ẩ n bị mẫu thử. 3 Nguyên tắc Buquinolate được chiết ra khỏi ph ầ n m ẫ u thử bằng cloro f orm, dịch chiết được cô đặc v à tách ra khỏi các chất gây nhiễu bằng sắc k ý lớp mỏng sử dụng hai hệ d ung môi. Buquinolate được rửa giải ra kh ỏ i c ơ chất và được xác định bằng phép đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích 265 nm v à bước sóng phát xạ 375 nm. 4 Thuốc thử và vật liệu thử Ch ỉ sử dụng các thuốc thử t i nh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đ ã loạ i ion, trừ khi có quy định khác. 4.1 Etanol (C 2 H 5 OH), dung dịch 80 % (thể tích) Pha lo ã ng 84,3 m l etanol 95 % (thể t í ch) đến 100 m l bằng nước. 4.2 Cloro f orm (CHC l 3 ). 4.3 Dung mô i khai tr i ển Trộn c l oro f orm và etano l theo tỷ lệ 10 : 1 (phần th ể tích). Chu ẩ n bị d ung môi này trong ngày sử dụng. 4.4 Dung dịch chuẩn buquinolate (C 20 H 27 NO 5 ) 4.4.1 Dung d ị ch chuẩn gốc buquinolate, 0,5 mg/ml C â n 50,0 mg chất chu ẩ n buquinolate, chính xác đến 0,1 mg, hòa tan bằng cloro f orm (4.2) trong b ì nh định mức 100 ml, thêm cloro f orm đến vạch. Làm ấm hỗn hợp trên nồi cách thủy nếu cần. Dung dịch này khi được bảo quản trong lọ k í n, tránh bay hơi có th ể bền được 1 tháng. 4.4.2 Dung dịch chu ẩ n làm việc buquinolate, 100 µg/m l Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch chu ẩ n gốc (4.4.1) cho vào bình định mức 25 ml, thêm cloro f orm đến vạch v à trộn đều. Chu ẩn bị dung dịch này trong ngày sử dụng. 4.5 Axeton (C 3 H 6 O ). 5 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ th ể như sau: 5.1 Máy đo huỳnh quang, có thể sử dụng máy đo phổ huỳnh quang hoặc máy đo huỳnh quang có bộ lọc thích hợp, hoạt động ở bước sóng kích th í ch 265 nm và bước sóng phát xạ 375 nm. 5.2 B ể khai triển, c ó lót b ằ ng giấy sắc ký W ha t man 3 MM ( đối với các tấm kích thước nhỏ hơn 20 cm x 20 cm). Cho 100 ml cloro f orm v à o một bể và cho 100 ml dung môi khai triển (4.3) vào một bể khác. Chu ẩ n bị b ể ngay t rong ngáy sử dụng. 5.3 T ấ m sắc ký l ớ p m ỏ ng (TLC), làm sạch kỹ các tấm bằng chất tẩy rửa alky l be nz en sul f onat và b à n chải. Tráng các tấm n à y bằng nước, sau đó bằng axeton (4.5). Để các tấm này khô trong không khí. Tạo hồ nhão từ 60 g silica gel G bằng 120 ml nước. Rót h ồ nh ã o này sang d ụng cụ tráng thích hợp và d àn th à nh lớp dày 0,5 mm lên các tấm sắc ký kích thước 20 cm x 20 cm. Làm khô trong không kh í từ 15 min đến 30 min, sau đó sấy khô ở 110 ° C trong 2 h. Làm nguội và b ả o quản các tấm đã chuẩn bị trong b ì nh hút ẩ m cho đến kh i sử dụng. 5.4 Bình định mức, d u ng t í ch 10 ml, 25 ml, 100 ml. 5.5 B ì nh nón, dung tích 25 ml và 250 ml, có nút thủy tinh đậy kín. 5.6 Cốc có mỏ, dung tích 150 ml. 5.7 Pipet 5.8 Nồi cách thủy. 5.9 M á y lắc cơ học. 5.10 Máy ly t â m. 5.11 Cuvet thạch anh (10 mm x 10 mm). 5.12 Phễu Buchner. 5.13 Giấy lọc W hatman s ố 54. 5.14 Rây số 30. 5.15 Cân phân tích, có th ể cân chính xác đến 0,1 mg. 6 Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đạ i diện. M ẫ u không b ị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc b ả o quản. Việc lấy mẫu không q u y định trong tiêu chu ẩ n n à y, nên l ấ y mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nu ô i - Lấy mẫu. 7 Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498), nghiền kho ả ng 100 g mẫu thử đến khi ph ầ n mẫu th ử lọt h ế t qua rây s ố 30 (5.14). 8 Cách t i ến hành Cân phần mẫu thử chứa khoảng 1,25 mg buquinolate, chính xác đến 1 mg, cho vào b ì nh nón 250 ml có nút đậy kín (5.5). Dùng p i pet lấy 100 ml cl oro f o r m (4.2) cho vào phần mẫu thử trong b ì nh. Lắc 1 h trên máy l ắ c cơ học (5.9), lọc dịch chiết qua giấy lọc W hatman số 54 (5.13) để tr ê n phễu Buchner (5.12) có hút chân không nh ẹ . Chú ý kh ô ng để th ấ t thoát dung môi d o bay hơi. Chuyển chính xác 80 ml d ị ch chiết sang c ố c c ó m ỏ 150 ml (5.6) và cho bay hơi đến khô tr ê n nồi cách thủy (5.8). Lấy phần cặn ra bằng các lượng nhỏ cloro f orm và d ùng các lượng nhỏ cloro f orm để chuyển sang b ì nh định mức dung tích 10 ml (5.4). Thêm cloro f orm đến vạch và trộn kỹ. Đưa 250 µl dịch chiết ( d ịch pha lo ã ng cuối cùng trong b ì nh định mức dung tích 10 m l ) và 250 µl dung dịch chu ẩ n làm việc (4.4.2) lên tấm sắc ký lớp m ỏ ng (5.3). Tạo các chấm cách đáy tấm sắc ký khoảng 25 mm và cách nhau 40 mm. Không đ ể pipet chạm vào tấm sắc ký. Đặt tấm sắc ký vào bể khai triển chứa cloro f orm (5.2) cho đến khi d ung môi gần chạm vào đỉnh của tấm sắc ký (mất khoảng 1 h). L ấ y ra , đ ể khô t ấ m sắc ký trong không kh í từ 5 min đến 10 min. Quan sát t ấ m sắc ký dưới ánh sáng UV bước s ó ng ng ắ n, buquinolate giữ nguyên điểm ban đầu và nền mẫu d ịch chuyển. Chuy ể n tấ m s ắ c k ý (đã làm kh ô trong không khí từ 5 min đến 10 min) vào bể ch ứ a dung m ô i khai triển (4.3). Đặt t ấ m sắc ký trong b ể cho đến khi dung môi cách đỉnh t ấ m 12 cm. Lấy ra, để khô tấm sắc ký trong k hông kh í từ 5 min đến 10 min. Quan sát tấm sắc ký dưới ánh sáng UV bước sóng ngắn. Buquinolate dịch chuyển ra khỏi điểm ban đ ầ u ( R f từ 0,4 đến 0,6). Dùng dao khoanh từng chấm buquinolate cùng với chấm trắng có R f và d iện tích tương đương. Loại b ỏ ch ấ t hấp phụ xung quanh các chấm buquinolate. Chuyển đ ị nh lượng từng chấm vào từng b ì nh nón 25 ml có n ú t thủy tinh (5.5). Dùng pipet lấy 10 ml etanol 80 % thể t í ch (4.1) cho vào mỗi b ì nh và lắc trên máy lắc cơ học 20 min rồi ly tâm. Xác định cường độ bức xạ huỳnh quang ( l ) của phần mẫu thử, mẫu chu ẩ n v à mẫu trắng trong các cuvet thạch anh (5.11) t rong máy đo huỳnh quang (5.1) ở bước sóng kích thích 265 nm và bước s ó ng phát xạ 375 nm. 9 Tính kết quả Hàm lượng buquinolate có trong phần mẫu thử, X , t í nh b ằ ng phần trăm khối lượng, được tính bằng công thức sau: Trong đó: I T là cường độ phát xạ huỳnh quang của phần mẫu th ử ; I B là Cường độ phát xạ huỳnh quang của mẫu trắng; l S là cường độ phát xạ huỳnh quang của mẫu chuẩn; 0,250 là thể t í ch dung dịch chu ẩ n làm việc được chuyển lên t ấ m sắc ký lớp mỏng, t í nh b ằ ng mililit (tương đương 250 µ l ); 100 là nồng độ d ung dịch chuẩn làm việc buquinolate, tính b ằ ng microgam trên mililit; 10 -6 l à hệ số chuyển đ ổ i từ microgam sang gam; V 1 là th ể tích cloro f orm cho vào phần mẫu thử, tính bằng mililit ( V 1 = 100 ml); V 2 l à th ể tích d ịch ch iế t được chuyển s a ng cốc có mỏ, t í nh bằng mi l i l it (V 2 = 8 0 ml); V 3 là dung tích b ì nh đị nh mức chứa dịch pha loãng cuối cùng, t í nh bằng mililit ( V 3 = 10 ml); V 4 là thể tích dịch pha loãng cuối cùng được chuyển lên t ấ m sắc ký lớp mỏng, tính b ằ ng mililit (V 4 = 0,250 ml); w là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam. 10 Báo cáo th ử nghiệm Báo c á o thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết để nh ậ n bi ế t đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ch ọ n cùng với các chi tiết b ấ t t hường nào khác có th ể ảnh hưởng đến kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được.