TCVN6262-2:1997

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6262-2:1997 (ISO 5541 – 2 : 1986 (E)) về sữa và các sản phẩm sữa - định lượng coliform do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6262-2:1997 SỮA VÀ CÁC SẢN PHẨM SỮA- ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM Milk and milk products – Enumeration of coliforms PHẦN 2: KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT Ở 30 0 C (MPN) Part 2: Most probable number technique at 30 o C TCVN 6262 - 2 : 1997 hoàn toàn tương đương với ISO 5541 – 2 : 1986 (E) TCVN 6262 - 2 : 1997 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường – Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường ban hành. 1. Phạm vi và lĩnh vực áp dụng Phần này của TCVN 6262 :1997 (ISO 5541) quy định phương pháp định lượng coliform bằng kỹ thuật nuôi cấy trong môi trường lỏng, và tính số có xác suất lớn nhất (MPN) sau khi nuôi ấm ở 30 o C. Phương pháp này có thể áp dụng cho: - Sữa và các sản phẩm sữa dạng lỏng; - Sữa bột, bột của dịch tách ra khi sản xuất phomát có đường, bột bơ loãng và lactoza; - Casein axit, casein lactic và casein rennet; - Caseinat, bột của dịch tách ra khi sản xuất phomát axit; - Phomát và phomát chế biến; - Bơ; - Sản phẩm sữa đông lạnh (bao gồm cả kem lạnh); - Custard, món tráng miệng và váng kem. Phương pháp này thích hợp đối với các mẫu có số lượng Coliform dự tính tương đối thấp (ít hơn 100 coliform trong một gam, hoặc ít hơn 10 coliform trong một mililít). Chú thích - Đối với các mẫu có số lượng Coliform lớn hơn (trên 100 Coliform trong một gam, hoặc trên 10 Coliform trong một mililít) xem TCVN 6262-1 : 1997 (ISO 5541 – 1). 2. Tiêu chuẩn trích dẫn ISO 707 Sữa và các sản phẩm sữa – Các phương pháp lấy mẫu. TCVN 4832 Vi sinh vật học – Hướng dẫn chung về đếm Coliform – Kỹ thuật đếm xác xuất lớn nhất ở 30 o C. TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261) Sữa và các sản phẩm sữa - Chuẩn bị mẫu thử và các dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh. 3. Định nghĩa áp dụng định nghĩa sau đây cho phần này của tiêu chuẩn: Coliform: Là các vi khuẩn ở nhiệt độ 30 o C, tạo thành các khuẩn lạc đặc trưng và có thể lên men lactoza kèm theo sự sinh hơi trong các điều kiện thao tác đã mô tả. 4. Nguyên tắc 4.1. Nuôi cấy một phần mẫu thử và/hoặc một lượng từ một loạt mẫu thử pha loãng theo hệ thập phân vào từng dãy ba ống môi trường nuôi cấy lỏng chọn lọc đã qui định có chứa ống Durham. 4.2. Nuôi ấm các ống nghiệm ở 30oC trong 48 giờ. 4.3. Lấy từ các ống nghiệm coi là dương tính, nghĩa là các ống cho thấy có sự sinh hơi trong ống Durham trong canh thang lục sáng mật lactoza, cấy truyền lên bề mặt thạch eosin xanh metylen. 4.4. Nuôi ấm ở 30oC trong 24 giờ. 4.5. Từ các ống nghiệm dương tính đã khẳng định, nghĩa là các ống nghiệm cho thấy có sự sinh hơi trong ống Durham trong canh thang lục sáng - lactoza - mật, và có tính sinh trưởng đặc trưng trên thạch eosin- xanh metylen, tính số Coliform có trong một mililít, hoặc có trong một gam mẫu thử bằng cách sử dụng bảng (MPN). 5. Chất pha loãng và môi trường 5.1. Nguyên liệu chính Để làm tăng độ tái lập của kết quả, nên sử dụng các thành phần chính khô, hoặc các môi trường hoàn chỉnh khô để chuẩn bị các chất pha loãng và các môi trường nuôi cấy. Cần tuân thủ nghiêm ngặt các hướng dẫn của nhà sản xuất. Các hoá phẩm sử dụng phải đạt chất lượng phân tích. Nước sử dụng phải là nước được cất bằng dụng cụ thuỷ tinh hoặc nước đã khử ion. Nước này không được chứa các chất có thể ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật trong các điều kiện thử đã nêu. Điều này phải được kiểm tra định kỳ, đặc biệt khi sử dụng nước khử ion. Có thể sử dụng các dung dịch natri hidroxit và axit clohidric (khoảng 0,1 mol/l) để điều chỉnh pH của chất pha loãng và môi trường. 5.2. Chất pha loãng dùng cho mục đích chung Chất pha loãng dùng cho mục đích chung 5.2.1. Dung dịch pepton/muối Chú thích - Dung dịch pepton/muối là loại chất pha loãng do tổ chức ISO chọn dùng cho mục đích chung. Thành phần Pepton 1,0 g Natri clorua (Nacl) 8,5 g Nước 1000 ml Chuẩn bị. Hoà tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần. Điều chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,0 ± 0,1, ở 25 o C. 5.2.2. Dung dịch Ringer nồng độ một phần tư Thành phần Natri clorua (NaCl) 2,25 g . Kali clorua (KCL) 0,105 g Canxi clorua (CaCl2) 0,06 g Natri hidro cacbonat (NaHCO3) 0,05 g Nước 1000 ml Chuẩn bị Hoà tan các muối trong nước. Điều chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 6,9 ± 0,1, ở 25oC. 5.2.3. Dung dịch pepton Thành phần Pepton 1,0 g Nước 1000 ml Chuẩn bị Hoà tan pepton trong nước. Điều chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,1, ở 25oC. 5.2.4. Dung dịch đệm photphát Thành phần Kali dihidro photphát (KH2PO4) 42,5 g Nước 1000 ml Chuẩn bị Hoà tan muối trong 500 ml nước. Điều chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng pH là 7,2 ± 0,1, ở 25 o C. Pha loãng tới 1000 ml. Bảo quản dung dịch gốc này từ 0oC đến 5 o C. Thêm 1,0 ml dung dịch này vào 1000 ml nước. 5.3. Chất pha loãng dùng cho các mục đích riêng biệt 5.3.1. Dung dịch natri xitrat (dùng đối với trường hợp phomát, phomát chế biến và sữa sấy màng). Thành phần Trinatri xitrat ngậm 2 phân tử nước (Na3C6H5O7.2H2O) 20 g Nước 1 000 ml. Chuẩn bị Hoà tan muối trong nước bằng cách đun nóng từ 45oC đến 50oC. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,5 ± 0,1,ở 25oC. 5.3.2. Dung dịch dikali hidrophotphat (dùng đối với trường hợp phomát, phomát chế biến, casein, casein axit, bột casein lactic, casein rennet, caseinat, bột của dịch tách ra khi sản xuất phomát axit và sữa sấy màng). Thành phần Dikali hidro photphat (K2HPO4) 20 g Nước 1000 ml Chuẩn bị Hoà tan muối trong nước bằng cách đun nóng từ 45oC đến 50oC. Điều chỉnh pH. Đối với dung dịch pha loãng ban đầu của casein axit và casein lactic, sau khi khử trùng pH phải là 8,4 ± 0,1,ở 25oC. Còn đối với các caseinat, phomát, phomát chế biến, bột của dịch tách ra khi sản xuất phomát axit và sữa sấy màng, sau khi khử trùng pH phải là 7,5 ± 0,1, ở 25 o C. 5.4. Phân phối, khử trùng và bảo quản chất pha loãng Phân phối chất pha loãng (5.2 hoặc 5.3) dùng cho độ pha loãng ban đầu vào các bình hoặc các lọ (6.4). Phân phối chất pha loãng dùng cho các độ pha loãng tiếp theo (5.2) vào các ống nghiệm hoặc các lọ nhỏ (6.6). Lượng được phân phối sau khi khử trùng chứa trong mỗi bình hoặc lọ (6.4) phải là 90ml chất pha loãng hoặc một bội số của 90 ml, và mỗi ống nghiệm hoặc lọ nhỏ (6.6) phải chứa 9,0 ml chất pha loãng hoặc một bội số của 9,0 ml (hoặc các lượng khác tuỳ theo yêu cầu). Đậy nắp các ống nghiệm, bình hoặc các lọ này. Khử trùng bằng hấp áp lực ở 121oC ± 1oC trong 15 phút (đối với các thể tích lớn hơn có thể phải hấp lâu hơn). Nếu chất pha loãng không sử dụng ngay, bảo quản ở chỗ tối, từ 0oC đến 5oC, nhưng không quá 1 tháng dưới các điều kiện không làm thay đối thể tích hoặc thành phần của chúng. 5.5. Môi trường nuối cấy 5.5.1. Canh thang lục sáng lactoza mật, môi trường lỏng chọn lọc Thành phần Pepton 10 g Lactoza (C12H22O11.H2O) 10 g Mật bò khô 20 g Xanh lục sáng 0,0133 g Nước 1000 ml Chuẩn bị Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước. Nếu cần, điều chỉnh pH để sau khi khử trùng pH phải là 7,2 ± 0,1, ở 25oC. Phân phối môi trường theo từng lượng 10 ml vào các ống nghiệm (6.7) có chứa ống Durham (6.8). Khử trùng bằng hấp áp lực ở 121oC ± 1oC trong 15 phút. ống Durham không được chứa bọt không khí sau khi khử trùng. 5.5.2. Canh thang nồng độ kép Tiến hành theo qui định trong 5.5.1, nhưng chỉ sử dụng một nửa lượng nước và phân phối vào các ống nghiệm 20 mm x 200 mm không chứa ống Durham. 5.5.3. Thạch eosin xanh metylen, môi trường khẳng định. Thành phần Pepton 10 g Lactoza (C12H22O11.H2O) 10 g Dikali hidro photphát 2 g Eosin Y 0,4 g Xanh metylen 0,065 g Thạch 12 g đến 18 g (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) Nước 1000 ml Chuẩn bị Hoà các thành phần rắn vào nước. Nếu cần, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 6,8 ± 0,2, ở 25oC. Đun tới sôi để hoà tan hoàn toàn. Phân phối môi trường thành các lượng từ 100 ml đến 150 ml vào các bình (6.5). Khử trùng bằng hấp áp lực ở 121oC ± 1oC trong 15 phút. Để nguội tới 60oC, lắc môi trường để oxi hoá xanh metylen (nghĩa là để khôi phục lại màu xanh của nó) và để các chất kết tủa trở thành huyền phù, đấy là một phần quan trọng của môi trường. Chuẩn bị các đĩa chứa từ 10 ml đến 15 ml môi trường để dùng trong 8.6. 6. Thiết bị và dụng cụ thuỷ tinh Chú thích - Có thể dùng các dụng cụ sử dụng một lần để thay cho các dụng cụ thuỷ tinh có thể sử dụng nhiều lần, nếu như nó phù hợp với các yêu cầu qui định. Dụng cụ thuỷ tinh tái sử dụng phải có độ bền tốt khi khử trùng lặp lại và phải trơ về mặt hoá học. Sử dụng các thiết bị thí nghiệm vi sinh thông thường và đặc biệt là: 6.1. Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc thiết bị để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) (nồi hấp có thể dùng riêng rẽ hoặc dùng như một phần của 1 thiết bị dùng để chuẩn bị và phân phối môi trường). Mọi dụng cụ tiếp xúc với chất pha loãng, mẫu thử, hoặc các dung dịch pha loãng, ngoài các dụng cụ đã khử trùng sẵn, (các túi bằng chất dẻo, pipet bằng chất dẻo…) đều phải được khử trùng bằng một trong các phương pháp sau: a) Giữ trong tủ sấy từ 170oC đến 175oC không ít hơn 1 giờ; b) Giữ trong nồi hấp áp lực ở 121oC ± 1oC không ít hơn 20 phút. 6.2. Thiết bị nghiền - trộn Có thể sử dụng một trong các thiết bị sau đây: a) Máy trộn quay, có tần số quay từ 8.000 đến 45.000 vòng trên phút, có cốc đựng mẫu bằng thuỷ tinh hoặc bằng kim loại gắn với nắp, chịu được các điều kiện khử trùng. b) Máy trộn kiểu nhu động, có các túi bằng chất dẻo vô trùng, c) Cối và chày. Chú thích - Các cốc đựng mẫu, túi bằng chất dẻo hoặc bộ cối chày phải có đủ dung tích để trộn mẫu với lượng chất pha loãng thích hợp. Nói chung, thể tích của vật đựng phải gấp đôi thể tích của mẫu thử cộng với chất pha loãng . 6.3. Máy khuấy, có khả năng khuấy - trộn 1 ml hoặc 2 ml mẫu thử (trong trường hợp mẫu dạng lỏng), hoặc các dung dịch pha loãng thập phân với 9 ml hoặc 18 ml chất pha loãng trong 1 ống nghiệm có kích thước thích hợp, để thu được dịch huyền phù đồng nhất, và có nguyên tắc vận hành dựa trên chuyển động quay lệch tâm lượng chứa trong ống nghiệm (máy trộn Vortex). 6.4. Bình hoặc lọ, có đủ dung tích để chứa 90 ml chất pha loãng dùng để tạo huyền phù gốc, hoặc các bội số của 90 ml, và còn có khoảng trống để trộn. 6.5. Bình, có dung tích từ 150 ml đến 250 ml, để chứa thạch eosin - xanh metylen (5.5.3). 6.6. ống nghiệm, bình hoặc lọ nhỏ, có đủ dung tích để chứa 10 ml mẫu thử (hoặc bội số của 10 ml) (khi mẫu thử dạng lỏng) hoặc dung dịch pha loãng ban đầu (trong các trường hợp khác) hoặc các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, và còn có khoảng trống phía trên để trộn. 6.7. ống nghiệm, dung tích 20 ml, để chứa canh thang lục sáng mật lactoza (5.5.1). 6.8. ống Durham có kích thước phù hợp với các ống nghiệm (6.7). 6.9. Pipet (được nhét nút bông ở đầu), dung tích danh định là 1 ml và có lỗ thoát có đường kính từ 2 mm đến 3 mm. Chú thích - Chỉ sử cụng các pipet có đầu còn nguyên vẹn, tốt nhất là loại có vạch chia rõ để phân biệt dung tích. 6.10. Pipet chia độ (được nhét nút bông ở đầu) có dung tích lớn, thí dụ: 10 ml hoặc 20 ml. Chú thích - Chỉ sử dụng các pipet có đầu còn nguyên vẹn, tốt nhất là loại có vạch chia rõ để phân biệt dung tích. 6.11. Đĩa Petri bằng thuỷ tinh hoặc bằng chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm. 6.12. Bi thuỷ tinh có đường kính khoảng 6 mm. 6.13. pH mét, có độ chính xác tới ± 0,1 đơn vị pH, ở 25oC. 6.14. Cân, có khoảng cân phù hợp và có độ chính xác nằm trong giới hạn 1% khối lượng được cân. 6.15. Nồi cách thuỷ, có thể duy trì nhiệt độ ở 45oC ± 1oC. 6.16. Nồi cách thuỷ, có thể duy trì nhiệt độ ở 37oC ± 1oC. 6.17. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 30oC ± 1oC ở bất kỳ điểm nào trong tủ. 6.18. Que cấy vòng, bảng hợp kim platin - iridi hoặc niken - crom, đường kính khoảng 3 mm. 7. Lấy mẫu Xem ISO 707. 8. Cách tiến hành Chú thích 1) Các thao tác mô tả trong các điều từ 8.1 đến 8.5 không được tiến hành trực tiếp dưới ánh sáng mặt trời. 2) Luôn luôn phải chú ý đảm bảo vô trùng. 8.1. Chuẩn bị mẫu thử và dung dịch pha loãng ban đầu Để tránh làm ảnh hưởng các vi sinh vật do thay đổi nhiệt độ đột ngột, nhiệt độ của chất pha loãng trong suốt quá trình thao tác mô tả dưới đây luôn phải bằng nhiệt độ của mẫu thử, trừ khi có qui định khác. 8.1.1. Sữa và các sản phẩm sữa dạng lỏng Trộn mẫu thử thật kỹ sao cho các vi sinh vật phân bố càng đều càng tốt bằng cách đảo chiều lọ chứa liên tục 25 lần. Cần phải tránh tạo bọt hoặc để bọt tan hết. Khoảng thời gian từ khi trộn đến khi lấy phần mẫu thử không được quá 3 phút. Dùng pipet lấy 1 ml mẫu thử và cho vào 9 ml chất pha loãng (5.2) (hoặc lấy 10 ml mẫu thử cho vào 90ml chất pha loãng, hoặc lấy 11 ml mẫu thử cho vào 99 ml chất pha loãng). Lắc đều dung dịch pha loãng ban đầu này (thí dụ, lắc 25 lần với khoảng di động là 300 mm, trong khoảng 10 giây). Như vậy thu được dung dịch pha loãng 10-1. Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo 8.2. 8.1.2. Sữa bột, bột của dịch tách ra khi sản xuất phomát có đường, bột bơ loãng và lactoza. Trộn kỹ lượng chứa trong lọ kín bằng cách lắc và đảo chiều liên tục. Nếu mẫu thử đựng trong lọ kín còn nguyên, quá đầy nên khó lắc trộn, thì chuyển sang lọ chứa to hơn. Trộn đều. Mở nắp, dùng thìa xúc lấy phần mẫu thử theo yêu cầu và tiến hành theo chỉ dẫn dưới đây. Đóng nắp hộp lại ngay. Hâm nóng lọ chứa 90 ml chất pha loãng thích hợp tới 45oC ± 1 o C trong nồi cách thuỷ (6.15). Cân 10 g mẫu thử cho vào bình thuỷ tinh (thí dụ như cốc có mỏ) và rót dần bột vào lọ pha loãng có chứa chất pha loãng thích hợp (5.2 hoặc, nếu cần đối với sữa sấy màng dùng chất pha loãng 5.3.1 hoặc 5.3.2 ở pH 7,5 ± 0,1). Cách khác, cân 10 g mẫu thử cho trực tiếp vào lọ chứa chất pha loãng. Để hoà tan, xoay tròn từ từ lọ cho bột thấm ướt và sau đó lắc lọ 25 lần với khoảng di động là 300 mm trong khoảng 10 giây. Có thể dùng máy trộn kiểu nhu động (6.2.b) để thay cho việc lắc. Đặt lọ mẫu vào nồi cách thuỷ trong 5 phút và thỉnh thoảng lắc. Như vậy, thu được dung dịch pha loãng 10-1. Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo 8.2. Chú thích - Để hoà tan được tốt hơn, đặc biệt đối với sữa sấy màng nên sử dụng bi thuỷ tinh (6.12). Nếu sử dụng thì phải cho vào lọ trước khi khử trùng. 8.1.3. Phomát và phomát chế biến Cân 10 g phomát hoặc phomát chế biến trong 1 đĩa. Chuyển vào cốc đựng của máy trộn quay (6.2.a), hoặc túi đựng của máy trộn kiểu nhu động (6.2.b) hoặc cho vào cối nghiền (6.2.c). Khi dùng máy trộn quay hoặc máy trộn kiểu nhu động, cho thêm 90 ml chất pha loãng (5.2, 5.3.1 , hoặc 5.3.2, ở pH 7,5 ± 0,1). Trộn cho đến khi phomát tan (từ 1 phút đến 3 phút). Tốt nhất là phải đảm bảo nhiệt độ của quá trình tan không vượt quá 40oC và trong mọi trường hợp không để nhiệt độ vượt quá 45oC. Để cho bọt tan hết. Nếu dùng cối để nghiền thì cho thêm lượng chất pha loãng tối thiểu và trộn bằng chày để thu được bột nhão đồng nhất không vón cục. Thêm chất pha loãng còn lại của tổng 90ml chất pha loãng. Như vậy thu được dung dịch pha loãng 10-1. Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo 8.2. 8.1.4. Casein axit, casein lactic và casein rennet Cân 10 g sản phẩm trong đĩa. Chuyển vào lọ pha loãng có chứa bi thuỷ tinh (6.12.) và 90 ml chất pha loãng dikali hidrophotphat (5.3.2) ở pH 8,4 đối với trường hợp axit casein, casein lactic. Để yên 15 phút và sau đó tăng nhiệt độ lên 37oC ± 1oC trong nồi cách thuỷ (6.16). Giữ lọ ở 37 o C thêm 15 phút nữa và lắc mạnh từng đợt. Như vậy thu được dung dịch pha loãng 10-1. Chú thích - không nên sử dụng máy trộn quay (6.2.a) hoặc máy trộn kiểu nhu động (6.2.b) vì sẽ tạo nhiều bọt. Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo 8.2. 8.1.5. Caseinat và bột của dịch tách ra khi sản xuất phomát axit Cân 10 g sản phẩm vào 1 đĩa. Rót thật chậm lên bề mặt của 90 ml chất pha loãng dikali hidrophotphát (5.3.2) ở pH 7,5 ± 0,1 trong lọ pha loãng, sau lắc hỗn hợp sau mỗi lần rót. Cách khác, cho sản phẩm khô vào một thể tích tối thiểu chất pha loãng và khuấy bằng đũa thuỷ tinh để thu được khối bột nhão đồng nhất không vón cục. Thêm phần chất pha loãng còn lại của tổng 90 ml chất pha loãng. Để yên 15 phút và sau đó tăng nhiệt độ lên 37oC ± 1oC trong nồi cách thuỷ (6.16). Giữ lọ mẫu pha loãng ở 37oC thêm 15 phút nữa. Trộn kỹ hỗn hợp bằng máy trộn quay (6.2.a), hoặc máy trộn kiểu nhu động (6.2.b). Để cho bọt tan hết trước khi tiếp tục tiến hành. Như vậy thu được dung dịch pha loãng 10-1. Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo 8.2. 8.1.6. Bơ Cho mẫu thử vào vật chứa đặt trong nồi cách thuỷ ở 45 o C ± 1 o C (6.15). Khuấy cho chóng tan chảy và để đến khi mẫu thử vừa tan hết. Lắc đều và dùng pipet đã sấy nóng đến 45 o C để sấy 10 ml cho vào 1 bình có chứa 90ml chất pha loãng (5.2). Trước mỗi lần lấy phải lắc kỹ. Có thể dùng máy trộn kiểu nhu động (6.2.b) để trộn. Như vậy thu được dung dịch pha loãng 10-1. Cách khác, chỉ sử dụng pha nước để pha loãng như sau: Lấy phần mẫu thử 50 g (có chứa khoảng 8 ml nước) và thêm 42 ml chất pha loãng (5.2.3) đã được hâm nóng đến 45 o C. Đặt vật chứa mẫu vào nồi cách thuỷ ở 45 o C ± 1 o C (6.15) cho đến khi bơ tan hết. Lắc kĩ và để cho tách pha không quá 15 phút. Dùng pipet hút từ lớp dưới đáy; 1 ml này tương đương với 1 g bơ. Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo 3.2. 8.1.7. Sản phẩm sữa đông lạnh (bao gồm cả kem lạnh) Tiến hành như trường hợp đối với bơ (8.1.6) (cách thứ nhất) nhưng dùng nồi cách thuỷ ở nhiệt độ không vượt quá 37oC (6.16). Nhiệt độ của mẫu thử không được vượt quá 37oC. Như vậy thu được dung dịch pha loãng 10-1. 8.1.8. Custard, món tráng miệng, sữa lên men và váng kem Cân 10 g sản phẩm cho vào 1 bình (6.4) có chứa bi thuỷ tinh (6.12). Đối với custard, món tráng miệng và váng kem ngọt thêm 90 ml chất pha loãng (5.2) và lắc cho tan đều. Đối với sữa lên men và váng kem chua sử dụng chất pha loãng 5.2 hoặc 5.2.3 ở pH 7,5 ± 0,1. Có thể sử dụng máy trộn kiểu nhu động (6.2.b). Như vậy thu được dung dịch pha loãng 10-1. Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, theo 8.2. 8.2. Dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo Dùng 1 pipet sạch lấy 1 ml dung dịch pha loãng ban đầu cho vào 1 ống nghiệm khác chứa 9 ml chất pha loãng vô trùng, không để pipet tiếp xúc với chất pha loãng. Mỗi lần pha loãng phải sử dụng một pipet mới. Cách khác, lấy 10 ml dung dịch pha loãng ban đầu cho vào lọ chứa 90 ml chất pha loãng vô trùng, hoặc 11 ml dung dịch pha loãng ban đầu cho vào lọ chứa 99 ml chất pha loãng vô trùng. Trong cách tiến hành thông thường, nếu cần dung dịch pha loãng 10-3, lấy 1 ml dung dịch pha loãng ban đầu cho vào 99 ml chất pha loãng vô trùng. Trộn kĩ, hoặc bằng cách dùng pipet sạch hút thả 10 lần, hoặc dùng máy trộn cơ học (6.3) trong khoảng từ 5 giây đến 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10-2. Chọn tần số quay sao cho chất lỏng khi xoáy dâng cao từ 20 mm đến 30 mm trên thành bình chứa. Nếu thấy cần, lặp lại các thao tác này sử dụng dung dịch pha loãng 10-2 và các dung dịch pha loãng tiếp theo để nhận được dung dịch pha loãng 10-3, 10-4, v.v… Khi lấy tỷ lệ 10 ml cộng 90 ml, 11 ml cộng 99 ml hoặc 1 ml cộng 99 ml thì lắc bằng tay (thí dụ, lắc 25 lần với khoảng di động là 300 mm trong khoảng 10 giây). Pha đủ số lượng các dung dịch pha loãng để đảm bảo rằng tất cả các ống nghiệm tương ứng với độ pha loãng cuối cùng cho kết quả âm tính. 8.3. Thời gian thao tác Khoảng thời gian từ lúc bắt đầu cân đo phần mẫu thử hoặc từ lúc kết thúc việc chuẩn bị dung dịch pha loãng ban đầu và cho đến khi trộn các dung dịch cấy với môi trường không được quá 15 phút, trừ khi có qui định khác. 8.4. Cấy mẫu 8.4.1. Lấy ba ống nghiệm đựng canh thang nồng độ kép (5.5.2) và dùng pipet cho vào mỗi ống 10 ml mẫu thử dạng lỏng, hoặc 10 ml dung dịch pha loãng ban đầu. 8.4.2. Lấy ba ống nghiệm đựng canh thang nồng độ đơn (5.5.1) và dùng pipet cho vào mỗi ống 1 ml mẫu thử dạng lỏng, hoặc 1 ml dung dịch pha loãng ban đầu. 8.4.3. Đối với mỗi một dung dịch pha loãng tiếp theo (10-1 hoặc 10-2, tuỳ theo từng trường hợp) lấy ba ống nghiệm canh thang nồng độ đơn (5.5.1). Cho vào mỗi ống 1 ml dung dịch pha loãng thích hợp. Đối với mỗi độ pha loãng dùng một pipet mới. Trộn cẩn thận chất nuôi cấy với môi trường. 8.5. Nuôi ấm 8.5.1. Nuôi ấm các ống nghiệm canh thang nồng độ kép (8.4.1) ở 30oC ±1oC trong 24 h ± 2 h. 8.5.2. Nuôi ấm các ống nghiệm canh thang nồng độ đơn (8.4.2 và 8.4.3) ở 30oC ± 1oC trong 48h ± 2h. 8.6. Cấy truyền từ các ống nghiệm canh thang nồng độ kép đã nuôi ấm. Từ mỗi ống nghiệm canh thang nồng độ kép (8.4.1) đã nuôi ấm dùng que cấy vòng (6.18) cấy vào 1 ống nghiệm canh thang nồng độ đơn (5.5.1). Nuôi ấm ở 30oC ± 1oC trong 48h ± 2h. 8.7. Thử khẳng định 8.7.1. Từ mỗi ống nghiệm nuôi ấm (8.5.2 và 8.6) cho thấy có sự sinh hơi trong ống Durham, cấy một vòng đầy lên thạch eosin xanh metylen (5.5.3). Nuôi ấm ở 30oC ±1oC trong 24h ± 2h. 8.7.2. Các khuẩn lạc mọc có màu đỏ / hồng, ánh kim và đục được coi là đặc trưng. Nếu cần khẳng định thêm nữa, nuôi cấy các khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa canh thang nồng độ đơn (5.5.1) và kiểm tra sự sinh hơi sau khi nuôi ấm (8.5.2). 8.7.3. Ghi lại số ống khẳng định dương tính đối với mỗi độ pha loãng. 9. Biểu thị kết quả 9.1. Lựa chọn các độ pha loãng Đối với mỗi mẫu cần kiểm tra, chọn ba độ pha loãng liên tiếp phù hợp với một trong ba qui luật sau đây: a) Khi ít nhất có một dung dịch pha loãng cho ba ống khẳng định dương tính. Chọn độ pha loãng cao nhất (có nồng độ mẫu thử thấp nhất) cho kết quả ba ống khẳng định dương tính, với hai độ pha loãng tiếp theo (nghĩa là có nồng độ mẫu thử của dung dịch pha loãng 10-1 và 10-2 của dung dịch pha loãng thứ nhất đã chọn). Xem thêm qui luật c). Nếu không có đủ các dung dịch pha loãng tiếp theo từ dung dịch pha loãng nhất cho kết quả ba ống khẳng định dương tính, thì chọn ba dung dịch pha loãng nhất trong cả loạt ống thử đó (nghĩa là các dung dịch có nồng độ mẫu thử thấp nhất trong dãy) để thay thế. b) Khi không có dung dịch pha loãng nào cho kết quả ba ống khẳng định dương tính Nếu không áp dụng được qui luật a), chọn ba dung dịch pha loãng nhất trong dãy thử (nghĩa là các dung dịch có nồng độ mẫu thử thấp nhất trong dãy) Xem thêm qui luật c). c) Trường hợp đặc biệt Trong tất cả các trường hợp, khi có nhiều hơn một trong ba độ pha loãng được chọn theo qui luật a) và b) không cho các ống khẳng định dương tính, thì chọn ra từ các độ pha loãng ở trên độ pha loãng thấp nhất không cho các ống khẳng định dương tính (nghĩa là có nồng độ mẫu thử cao nhất) và hai độ pha loãng thấp hơn tiếp liền theo trong cùng dãy (nghĩa là có nồng độ của mẫu thử cao hơn 10 lần và 100 lần của độ pha loãng thứ nhất được chọn) trừ khi các ống khẳng định dương tính chỉ được tìm thấy ở độ pha loãng thứ nhất chuẩn bị từ mẫu thử. Trong trường hợp cuối cùng này, cần thiết phải chọn ba độ pha loãng thứ nhất để tính số có xác xuất lớn nhất (MPN) thậm chí ngay cả khi dãy thử này có hai độ pha loãng không cho ống khẳng định dương tính nào. Xem các thí dụ trong bảng 1. Bảng 1 – Thí dụ về cách chọn các độ pha loãng Thí dụ Số ống khẳng định dương tính ở mỗi nồng độ mẫu thử1) MPN 10 g hoặc 10 ml 1 g hoặc 1 ml 0,1 g hoặc 0,1 ml 0,01 g hoặc 0,01 ml A 3 1 1 0 7 trên 10 g hoặc 10 ml B 2 1 0 0 1,5 trên 10g hoặc 10 ml hoặc 15 trên 100 g hoặc 100 ml C 3 2 0 9 trên 1 g hoặc 1 ml D 3 2 2 21 trên 1 g hoặc 1 ml E 3 0 1 4 trên 1 g hoặc 1 ml 1) Các độ pha loãng lựa chọn có gạch ở dưới 9.2. Xác định chỉ số MPN Xác định chỉ số MPN của coliform từ số ống nghiệm khẳng định dương tính đối với mỗi độ pha loãng lựa chọn, theo bảng 2. 9.3. Tính số có xác xuất lớn nhất (MPN) Nhân chỉ số MPN (9.2) với tỷ lệ nghịch của độ pha loãng thấp nhất được chọn (nghĩa là có nồng độ mẫu thử cao nhất) cho ra số coliform có trong 1 mililit hoặc trong 1 gam. Khi độ pha loãng thấp nhất được chọn tương ứng với các ống đã cấy với môi trường nồng độ kép (cấy vào 10 ml) thì trước hết chia chỉ số MPN cho 10. Kết quả có thể biểu thị theo một số trong khoảng 1,0 và 9,9 nhân với 10x, trong đó x là luỹ thừa tương ứng của 10 9.4. Độ chính xác Thực nghiệm cho thấy rằng trong kết quả của kỹ thuật MPN có thể xảy ra sai số lớn. Do đó, phải thận trọng khi sử dụng các kết quả thu được bằng phương pháp này. Các giới hạn tin cậy được đưa ra trong bảng 2. 10. Báo cáo kết quả Báo cáo kết quả phải chỉ ra phương pháp đã sử dụng và các kết quả thu được, chỉ rõ phương pháp biểu thị đã dùng. Nó cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong phần này của tiêu chuẩn, hoặc được xem là tuỳ ý cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả. Báo cáo kết quả cũng bao gồm các thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử. Bảng 2 – Chỉ số MPN và các giới hạn tin cậy Số lượng các ống khẳng định dương tính của ba độ pha loãng được chọn Chỉ số MPN Các giới hạn tin cậy Thứ nhất Thứ hai Thứ ba >95% >95% >99% >99% 0 0 0 <0,30 0,00 0,94 0,00 1,40 0 0 1 0,30 0,01 0,95 0,00 1,40 0 1 0 0,30 0,01 1,00 0,00 1,60 0 1 1 0,61 0,12 1,70 0,05 2,50 0 2 0 0,62 0,12 1,70 0,05 2,50 0 3 0 0,94 0,35 3,50 0,18 4,60 1 0 0 0,36 0,02 1,70 0,01 2,50 1 0 1 0,72 0,12 1,70 0,05 2,50 1 0 2 1,1 0,4 3,5 0,2 4,6 1 1 0 0,74 0,13 2,00 0,06 2,70 1 1 1 1,1 0,4 3,5 0,2 4,6 1 2 0 1,1 0,4 3,5 0,2 4,6 1 2 1 1,5 0,5 3,8 0,2 5,2 1 3 0 1,6 0,5 3,8 0,2 5,2 2 0 0 0,92 0,15 3,5 0,07 4,60 2 0 1 1,4 0,4 3,5 0,2 4,60 2 0 2 2,0 0,5 3,8 0,2 5,2 2 1 0 1,5 0,4 3,8 0,2 5,2 2 1 1 2,0 0,5 3,8 0,2 5,2 2 1 2 2,7 0,9 9,4 0,5 14,2 2 2 0 2,1 0,5 4,0 0,2 5,6 2 2 1 2,8 0,9 9,4 0,5 14,2 2 2 2 3,5 0,9 9,4 0,5 14,2 2 3 0 2,9 0,9 9,4 0,5 14,2 2 3 1 3,6 0,9 9,4 0,5 14,2 3 0 0 2,3 0,5 9,4 0,3 14,2 3 0 1 3,8 0,9 10,4 0,5 15,7 3 0 2 6,4 1,6 18,1 1,0 25,0 3 1 0 4,3 0,9 18,1 0,5 25,0 3 1 1 7,5 1,7 19,9 1,1 27,0 3 1 2 12 3 36 2 44 3 1 3 16 3 38 2 52 3 2 0 9,3 1,8 36,0 1,2 43,0 3 2 1 15 3 38 2 52 3 2 2 21 3 40 2 56 3 2 3 29 9 99 5 152 3 3 0 24 4 99 3 152 3 3 1 46 9 198 5 283 3 3 2 110 20 400 10 570 3 3 3 >110 1) Xem các bảng MPN của Man đã hiệu chỉnh. J.C.Eur.J.Appl. Biotechnol.17, 1983, 301 – 305.