TCVN10786:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10786:2015 về Phân bón vi sinh vật - Xác định hoạt tính cố định nitơ của Azotobacter - Phương pháp định lượng khí etylen TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10786:2015 PHÂN BÓN VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỐ ĐỊNH NITƠ CỦA AZOTOBACTER - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG KHÍ ETYLEN Microbial fertilizer - Determination of nitrogen f ixing activity of azotobacter - Method for quantitation of ethylene gas Lời nói đầu TCVN 10786:2015 do V i ện Thổ nhưỡng N ô ng hóa biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Ph á t tri ể n Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. PHÂN BÓN VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỐ ĐỊNH NITƠ CỦA AZOTOBACTER - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG KHÍ ETYLEN Microbial fertilizer - Determination of nitrogen f ixing activity of Azotobacter - Method for quantitation of ethylene gas 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng khí etylen để xác đ ị nh khả năng cố định nitơ c ủ a phân vi sinh vật, phân hữu cơ vi sinh vật có chứa vi khuẩn Azotobacter . 2 Tài liệu viện dẫn Tài liệu viện dẫn sau là r ấ t cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện d ẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, b ổ sung (nếu có). TCVN 6166:2002, Phân bón vi sinh vật cố định nitơ. 3 Thuật ngữ, định nghĩa Trong tiêu chu ẩ n này sử dụng thuật ngữ, định nghĩa sau: 3.1 Hoạt tính cố định nitơ của A z otobacter (nitrogen f ixing activ i ty of Azotobacter) Khả năng c ủ a Azotobacter tạo hợp chất chứa nitơ từ nitơ trong khí quyển dưới tác dụng c ủ a nitrogenaza. 4 Nguyên tắc Hoạt tính cố định nitơ được xác định bằng cách đo lượng etylen tạo thành bằng phương pháp sắc ký khí với detector ion hóa ngọn lửa qua quá tr ì nh khử axetylen thành etylen dưới sự x ú c tác c ủa nitrogenaza. Phản ứng khử axetylen thành etylen theo phương tr ì nh sau: C 2 H 2 + 2H + 2e → C 2 H 4 5 Thuốc thử, dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy Hoá chất sử dụng để pha các chất chuẩn đạt loại tinh khi ế t hoá học, hoá chất sử dụng đ ể phân t í ch đạt loại tinh khiết phân tích. 5.1 Khí ety l en chuẩn, có độ tinh khiết 99,9 %. 5.2 Khí axetylen, có độ tinh khiết 99,9 %. 5.3 Dịch pha loãng Dịch pha loãng là nước mu ối sinh lý (NaCI 0,85 %), vô trùng, pH = 7, không chứa các hợp chất nitơ; Lấy 9 ml dịch pha loãng cho vào ống nghiệm (6.2.4) hoặc 90 ml dịch pha l oãng cho vào b ì nh tam giác (6.2.1), đậy nút bông và khử trùng ở 121 ° C không ít hơn 20 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2). 5.4 Môi trường nuôi c ấ y 5.4.1 Thành phần Có thể sử dụng các môi trường có bán sẵn trên thị trường hoặc môi trường dưới đây: 5.4.1.1 Môi trường Ashby Mannitol (C 6 H 8 (OH) 6 ) 20,0 g Dikali hydro phosphat (K 2 HPO 4 ) 0,2 g Magie sulphat ngậm bảy phân t ử nước (MgS O 4 .7 H 2 O ) 0,2 g Natri clorua (NaCI) 0,2 g Kali sulphat (K 2 SO 4 ) 0,1 g Canxi cacbonat (CaC O 3 ) 5 , 0 g Thạch 20,0 g Nư ớ c cất vừa đủ 1000 ml pH : 7,0 đến 7.2 5.4.1.2 Môi trường Azotobacter chroococum Glucoza (C 6 H 12 O 6 ) 20,0 g Canxi cacbonat (CaCO 3 ) 20,0 g Dikali hydro phosphat (K 2 HPO 4 ) 0,8 g Kali dihy d ro phosphat (KH 2 P O 4 ) 0,2 g Magie sulphat ngậm b ả y phân tử nước (MgSO 4 .7 H 2 O ) 0,5 g Sắt (III) clorua ngậm sáu phân t ử nước (FeCI 3 .6 H 2 O ) 0 , 1 g Natri molybdat ngậm hai phân tử nước (Na 2 MoO 4 .2 H 2 O ) 0,05 g Thạch 20,0 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH: 7,2 đến 7,4 5.4.2 Cách chu ẩ n bị C â n v à hòa tan các thành phần môi trường trong nước cất theo thứ tự đã cho (5.4.1). Phân phối lượng từ 100 ml đến 150 ml môi trường vào b ì nh tam giác dung tích 250 m l (6.2.1), đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 ° C trong nồi hấp áp lực (6.1.2), làm nguội đến 50 ° C . Phân phối lượng từ 15 ml đến 20 ml môi trường vào các đĩa Petri (6.2.3) đã được chuẩn bị sẵn (theo 6.3); Các thao tác tiến hành trong t ủ cấy vô trùng (6.1.1). 6 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và cụ thể như sau: 6. 1 Thiết bị 6.1.1 Tủ cấy vô trùng, vận tốc dòng khí trung b ì nh 0,79 m/s, lưu lượng khí 1204 m 3 /h, màng lọc ULPA với kích thước hạt từ 0,1 μm đến 0,3 μm. 6.1.2 Nồi hấp áp lực, áp suất tối thiểu 101,3 kPa, nhiệt độ 121 ° C . 6.1.3 Tủ sấy, nhiệt độ từ 40 ° C đến 260 ° C . 6.1.4 Tủ ấm, nhiệt độ từ 20 ° C đến 60 ° C . 6. 1 .5 Máy sắc ký khí, detector ion hóa ngọn lửa (FID). 6.1.6 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,001 g. 6.1.7 Cân kỹ thuật, có độ chính xác đến 0,01 g. 6.1.8 Máy lắc ổn nhiệt, tốc độ 150 r/min, nhiệt độ từ 20 ° C đến 40 ° C . 6.1.9 Máy trộn Vortex, tốc độ 1000 r/min. 6.1.10 Máy đo pH, có độ chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở 25 ° C . 6.2 D ụng cụ 6.2.1 Bình tam giác, có dung tích 250 ml 6.2.2 Lọ/bình tam giác, có nút cao su, dung t í ch 100 ml. 6.2.3 Đĩa Petri, đường kính 90 m m. 6.2.4 Ống nghiệm, kích thước 18 mm x 180 mm. 6.2.5 Que gạt m ẫ u (que trang). 6.2.6 Pipet (Micropipet), có thể lấy các thể tích 0,1 ml, 1ml, 10 m l . 6.2.7 Xylanh (bơm ti ê m), có thể l ấ y các thể tích 0,1 ml, 9 ml. 6.2.8 Cốc th ủy tinh, dung tích 1000 ml. 6.3 Chu ẩ n bị dụng cụ Dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật phải được rửa sạch, tiệt trùng bằng một trong các phương pháp dưới đây: - Khử trùng khô: Giữ ở nhiệt độ 180 ° C không ít hơn 1 h trong t ủ sấy (6.1.3) hoặc; - Kh ử trùng ướt: Giữ ở nhiệt độ 121 ° C không ít hơn 30 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2). 7 Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu 7.1 Lấy mẫu L ấy mẫu theo Đi ề u 5 TCVN 6166:2002. 7.2 Chuẩn bị mẫu Đối với mẫu dạng l ỏ ng: Dùng pipet vô trùng lấy 10 ml mẫu cho vào b ì nh tam giác chứa 90 ml dịch pha lo ã ng đã chuẩn bị sẵn (5.3). Trộn bằng máy l ắ c (6.1.8), khoảng từ 5 min đến 10 min, sao cho vi sinh vật trong dung dịch phân bố đồng đều. Dung dịch tạo ra được gọi là dung dịch mẫu ban đầu; Đối với mẫu dạng đặc : Cân 10 g mẫu cho vào bình tam giác ch ứ a 90 ml d ị ch pha loãng đ ã chu ẩ n bị sẵn (5.3). Trộn bằng máy lắc (6.1.8), khoảng từ 5 min đến 10 min, sao cho vi sinh v ật trong dung dịch phân bố đồng đều. Để cho các ph ầ n tử nặng lắng xu ố ng trong thời gian không quá 15 min , gạn, được dung dịch mẫu ban đầu. 8 Xác định sự có mặt của Azotobacter trong phân bón 8.1 Cách tiến hành Dùng một pipet v ô trùng lấy 1 ml dung dịch mẫu ban đầu (7.2) cho vào ố ng nghiệm c ó chứa 9 ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn (5.3), tránh chạm pipet vào dịch pha loãng, trộn đều bằng máy trộn Vortex (6.1.9) để có d ung dịch mẫu có nồng độ pha loãng là 10 - 2 . Tiếp tục pha loãng để đạt được độ pha lo ã ng 10 - 3 , 10 -4 , 10 - 5 đối với phân bón vi sinh vật trên nền chất mang không thanh trùng và đạt được độ pha loãng 10 - 5 , 10 -6 , 10 -7 đối với phân bón vi sinh vật trên n ề n chất mang thanh trùng; Dùng pipet v ô trùng khác lấy 0,1 ml dịch mẫu pha loãng c ấ y v à o đĩa Petri chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn (5.4). Mỗi nồng độ pha loãng được cấy lặp lại không ít hơn 2 đĩa Petri; Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dung dịch mẫu thấm đều trên bề mặt thạch, đợi bề mặt thạch khô, úp ngược đĩa Petri. Nuôi cấy ở nhiệt độ từ 28 ° C đến 30 ° C , trong thời gian từ 3 ngày đến 4 ngày. Quan sát khuẩn lạc Azotobacter đặc trưng (Xem phụ lục A ) tr ê n các đ ĩ a Petri. 8.2 Khẳng định Tr ê n đĩa Petri xuất hiện khuẩn lạc Azotobacter đặc trưng chứng tỏ phân bón có chứa Azotobacter . 9 Xác định khả năng cố định nitơ của phân bón vi sinh vật 9.1 Cách tiến hành Cân chính xác 2 g phân bón cho vào lọ/b ì nh tam giác dung t í ch 1 00 ml (6.2.2) đã chuẩn bị ở trên (6.3), b ổ sung v à o lọ/b ì nh tam giác 1 g glucoza và 7 ml nước cất. Nút kín l ọ/bình tam giác bằng nút cao su. Dùng xi lanh thay thế 9 m l khí trong lọ/b ì nh tam giác bằng 9 ml axetylen (5.2). Tiến hành ủ mẫu ở điều kiện nhiệt độ từ 28 ° C đến 30 ° C , trong thời gian 7 ng à y. Định lượng khí etylen được tiến hành trên máy sắc ký khí dựa trên việc so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu th í nghiệm với mẫu chu ẩ n. Tùy theo cấu trúc và tính năng tác dụng của từng loại m á y sắc ký kh í mà chế độ đo của các máy khác nhau. Các điều kiện chạy máy cần tham khảo tài liệu hướng dẫn của máy như nhiệt độ đầu bơm mẫu, nhiệt độ lò, cột tách, tốc độ khí mang, nhiệt độ detector, tố c độ khí đ ốt cho phù hợp (Xem phụ lục B ) . Nguyên t ắ c chung có th ể tiến hành như sau: - Bật máy sắc ký khí cho máy đạt chế độ làm việc ổn định; - Bơm 0,1 ml mẫu etylen chuẩn (5.1) vào máy sắc ký khí, xác định diện tích (hoặc chiều cao) pic; - Bơm 0,1 ml mẫu thử vào máy sắc ký kh í , xác định d iện tích (hoặc chiều cao) pic. CHÚ THÍCH: Kh í etylen chuẩn nên pha lo ã ng 100 l ầ n. 9.2 Tính v à biểu thị kết quả Kết quả được tính dựa trên sự so s á nh diện tích (hoặc chiều cao) pic etylen của mẫu thử và mẫu chuẩn. Lượng etylen tạo thành M x , được tính theo công thức: (nM) trong đó M x là lượng etylen tạo thành, tính bằng nmol (nM); C s l à nồng độ etylen trong mẫu chuẩn; tính bằng nmol (nM); L s là diện tích (hoặc chiều cao) pic c ủ a mẫu chuẩn, tính bằng xentimét vuông (cm 2 ) hoặc xentimét (cm); L x là diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử, t í nh bằng xentimét vuông (cm 2 ) hoặc xentimét (cm); V x là thể tích pha khí c ủ a lọ th ử nghiệm, t í nh bằng mililit (m l ); 22,4 x 10 -6 hằng s ố Avogadro. 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nh ấ t các thông tin sau: - Thông tin cần thiết để nhận biết đ ầ y đủ về mẫu thử; - Phương pháp l ấ y mẫu đã sử d ụng, nếu biết; - Tất cả các thao tác không quy định trong ti ê u chu ẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả; - Các kết quả thử nghiệm thu được; - Nếu độ lặp lại được kiểm tra, thì nêu k ế t quả cuối cùng thu được. Phụ lục A (Tham khả o ) Đặc điểm khuẩn lạc đặc trưng của một số loài thuộc Azotobacter thường sử dụng trong phân bón vi sinh vật STT Tên loài Đặc đi ể m khuẩn lạc 1 Azotobacter chroococcum Khu ẩ n lạc nhày, mép trơn, khá lồi, màu nâu sáng, về già chuyển nhăn nheo, màu nâu đen, sắc tố không khuếch tán vào môi trường, kích thước 5-7 mm. 2 Azotobacter vinelan d ii Khuẩn lạc nhày, mép trơn, khá l ồ i, m à u v à ng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường, kích thư ớ c 4-5 mm. 3 Azotobacter beje i nckii Khuẩn lạc nhày, mép trơn, lồi, màu vàng hoặc không màu, sắc t ố không khuếch tán vào môi trường, kích thước 4-5 mm. Phụ lục B (Tham khảo) Chế độ đo cho máy sắc k ý khí B.1 Nhiệt độ đầu bơm m ẫ u: 150 ° C B.2 Nhiệt độ lò: 250 ° C B.3 Cột tách: Cột nhồi, 2 m x 2 mm B. 4 Tốc độ khí mang (nitơ): 30 m l /min B.5 Nhiệt độ detector: 140 ° C B.6 Tốc độ khí đốt: B.6.1 Khí hydro: 35 ml/min B.6.2 Không khí : 350 ml/min