TCVN9780:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9780:2014 về Mật ong - Xác định dư lượng chloramphenicol bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS-MS TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9780: 2014 MẬT ONG - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CHLORAMPHENICOL BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC-MS-MS Honey- Determination of chloramphenicol residue by liquid chromatography mass - spectrometry LC-MS-MS Lời nói đầu TCVN 9780:2014 do Trung tâm Kiểm tra Vệ sinh Thú y TƯ1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, T ổ ng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. MẬT ONG - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CHLORAMPHENICOL BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC-MS-MS Honey- Determination of chloramphenicol residue by liquid chromatography mass - spectrometry LC-MS-MS 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng chloramphenicol trong mật ong bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối ph ổ LC-MS-MS. Gi ớ i hạn phát hiện của phương pháp là 0,1 μg / kg. 2. Nguyên tắc Dư lượng chloramphenicol trong mật ong được chiết ra từ mẫu bằng ethylacetate. Dịch chi ế t được làm sạch và đưa vào phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS-MS để xác định và định lượng chloramphenicol có trong mẫu. 3. Thuốc thử Trong tiêu chu ẩ n này, chỉ sử dụng thuốc thử c ó cấp độ tinh khiết, phân tích và nước cất hai lần đã khử ion. 3.1 . Chuẩn nội chloramphenicol (CAP-d 5 ), 99,0 %; 3.2 . Chuẩn chloramphenicol (CAP), 98,5 %; 3.3 . Acetonitril , loại dùng cho LC-MS; 3.4 . Nước , loại dùng cho LC-MS; 3.5 . Methanol , loại dùng cho LC-MS; 3.6 . Ethyl acetate , loại dùng cho HPLC; 3.7 . n-Hexan , loại dùng cho HPLC; 3.8 . Axít f ormic; 3.9 . Khí argon , tinh khiết 99,9%; 3.10 . Khí nitơ , tinh khiết 99,9%. 3.11 . Dung d ị ch chuẩn gốc CAP, CAP-d 5 1000 μg / ml trong methanol Cân 50 mg chuẩn CAP (3.2) vào các bình định mức dung t í ch 50 ml (4.4). H òa tan và định mức đến vạch bằng methanol (3.5) để được dung dịch chuẩn gốc CAP c ó nồng độ 1000 m g / ml. Dung dịch chuẩn gốc CAP được bảo quản ở -20 °C trong 3 tháng. Hòa tan chuẩn nội CAP-d 5 (3.1) đóng trong ampul bằng một thể tích methanol (3.5) thích hợp để được dung dịch chuẩn gốc CAP-d 5 có nồng độ 1000 μg / ml. Dung dịch chuẩn gốc CAP-d 5 được bảo quản ở -20 °C trong 3 tháng. LƯU Ý: - Lượng chuẩn CAP (3.2) phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn gốc CAP 1000 μg / ml sau khi tính toán và hiệu chỉnh theo giấy chứng nhận độ tinh khiết của nhà sản xuất. - Thể t í ch methanol (3.5) thích hợp phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn nội gốc CAP-d 5 1000 μg / ml tùy theo quy cách đóng gói c ủ a nhà sản xuất. 3.12 . Dung d ị ch chuẩn trung gian CAP, 1 μg / ml tr ong methanol Lấy 100 μL từ dung dịch chuẩn gốc CAP, nồng độ 1000 μg / ml cho v à o bình định mức 100 ml (4.4) định mức đến vạch với methanol (3.5). Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở -20 °C trong 1 tháng. 3.13 . Dung d ị ch chuẩn nội trung gian CAP-d 5 , 1 μg / ml trong methanol Lấy 100μL từ dung dịch chuẩn gốc CAP-d 5 , nồng độ 1000 μg / ml cho vào bình định mức 100 m l (4.4), định mức đến vạch với methanol (3.5). Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở -20 °C trong 1 tháng. 3.14 . Dung dịch chuẩn làm vi ệ c CAP, 10 μg / l trong n ướ c Lấy 100 μl dung dịch chuẩn trung gian (CAP 1 μg / ml trong methanol) (3.12) cho vào bình định mức 10 ml (4.4), định mức đ ế n vạch bằng nước (3.4). Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh trong 2 tuần. 3.15 . Dung dịch chuẩn nội làm việc CAP-d 5 , 10 μg / l trong n ư ớc L ấ y 100 μl dung dịch chuẩn trung gian (CAP-d 5 , 1 μg / ml trong methanol) (3.13) cho vào b ì nh định mức 10 m l (4.4), định mức đến vạch bằng nước (3.4). Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh trong 2 tuần. 3.16 . Pha động A: Acetonitril (3.3) + 0,1% axit formic (3.8). B: Nước (3.4) + 0,1 % axit f ormic (3.8). 4. Thiết bị, dụng cụ S ử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và c ụ thể như sau: 4.1 . Hệ th ố ng máy sắc k ý lỏng kh ố i phổ LC-MS-MS - Bơm 2 kênh dung môi biến đổi dòng; - Detector MS-MS; - Máy tính và phần m ề m phân tích; - Cột sắc ký RP C18, đường kính trong là 2,1 cm, kích thước hạt nhồi là 1,7 μm, độ dài của cột là 50 mm. 4.2 . Ố ng ly t â m polypropylene , dung tích 50 ml có nắp; 4.3 . Ống th ủy tinh , dung tích 10 ml; 4.4 . B ì nh định mức , dung tích 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml; 4.5 . Pipet tự động , dung tích 50 μl, 100 μL, 250 μl, 1000 μl, 5000 μl; 4.6 . Máy ly tâm lạnh , tốc độ 4000 r / min; 4.7 . Cân phân tích , có độ chính xác đến 0,1 mg; 4.8 . B ơ m hút chân không; 4.9 . Bộ bay hơi Nitơ , có điều chỉnh nhiệt độ; 4.10 . Bộ hút dung môi tự động , thể t í ch 25 ml; 4.11 . Máy lắc , tốc độ 400 r / min; 4.12 . Máy lắc ngang , tốc độ 300 r / min; 4.13 . Lọ đựng m ẫ u , dung tích 2 ml. 4.14 . Màng lọc , 0,2 μm, PTFE. 5. Lấy mẫu Việc lấy mẫu kh ô ng qui định trong tiêu chuẩn này nhưng mẫu phân tích tại phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư h ỏ ng hoặc bị bi ế n đổi trong quá tr ì nh vận chuyển hoặc b ả o quản. 6. Chuẩn bị mẫu 6.1 . Chuẩn bị mẫu thử Cân 2,0 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml (4.2). Cho vào 80 μl dung d ịch chuẩn nội làm việc CAP-d 5 có nồng độ 10 μg/1 (3.15). 6.2 . Chuẩn b ị mẫu trắng Mẫu trắng là mẫu mật ong đã được xác định không nhiễm chloramphenicol. Mẫu trắng được chuẩn b ị như mẫu thử. 6.3 . Chuẩn b ị mẫu kiểm soát Mẫu kiểm soát được chuẩn bị từ mẫu trắng như mẫu thử nhưng sau khi cân có bổ sung 100 μL dung dịch chu ẩ n làm việc CAP có nồng độ 10 μg /1 (3.14) vào mẫu. Trộn đ ề u bằng máy lắc, sau đó để yên 15 min trước khi ti ế n hành các bước ti ế p theo. 6.4 . Chuẩn b ị mẫu xây dựng đường chuẩn Mẫu thêm chuẩn được chuẩn b ị từ mẫu trắng. Cân 2,0 g mẫu đã đồng nh ấ t vào ố ng ly tâm 50 ml (4.2), cho dung dịch chuẩn làm việc CAP 10 /1 (3.14) và dung dịch chuẩn nội l à m việc CAP 10 μg / l (3.15) vào các ống nghiệm có chứa mẫu trắng theo b ả ng 1. Tiến hành trộn đều bằng máy lắc (4.11) trong 15 s, sau đó đ ể yên 15 min trước khi tiến hành các b ướ c tiếp theo. Bảng 1 - Xây dựng đ ư ờng chuẩn STT N ồ ng độ chu ẩ n th ê m vào (μ g/l ) Th ể tích chuẩn thêm vào (μ l ) Nồng độ chuẩn lý thuyết (μ g / kg) Nồng độ chuẩn nội thêm vào (μ g/l ) Th ể tích chuẩn nội th ê m vào (μ l) Nồng độ chuẩn nội (μ g / kg) Mẫu 1 10 10 0,05 10 80 0,4 Mẫu 2 10 20 0,10 10 80 0,4 Mẫu 3 10 50 0,25 10 80 0,4 Mẫu 4 10 100 0,50 10 80 0,4 Mẫu 5 10 200 1 , 0 10 80 0,4 Mẫu 6 10 400 2,0 10 80 0,4 7. Tiến hành thử nghiệm 7.1 . Chiết mẫu và làm sạch mẫu Cho 2,0 ml nước (3.4) vào từng lọ mẫu. Trộn đ ề u bằng m á y lắc (4.11) trong 30 s. Tiếp theo, thêm vào mỗi ống 8 ml Ethylacetate (3.6). Sau đó lắc bằng máy lắc ngang (4.12) ở tốc độ 300 r / min trong 10 min. Sau khi lắc mẫu, ly tâm ở tốc độ 4000 r / min trong 5 min ở nhiệt độ 4 °C (4.6). Dùng pipet, chuyển 6 ml lớp tr ê n sang ống nghiệm th ủy tinh (4.3). Sau đó cho bay hơi bằng bộ bay hơi N 2 (4.9) đến khô ở nhiệt độ 40 °C. Sau khi bay hơi tới khô, hòa tan lại bằng 0,6 ml n-Hexan (3.7) và 0,45 ml nước (3.4). Trộn đều bằng máy lắc trong trong 30 s (4.11), ly tâm ở 4000 r/min trong 5 min (4.6). Sau đó loại bỏ lớp trên. Hút lớp dưới, lọc qua màng lọc 0,2 μm (4.14) vào lọ đựng mẫu (4.13). 7.2 . Ti ế n hành thử nghiệm trên LC-MS-MS 7.2.1 . Điều kiện HPLC - Cột sắc ký RP C18, đường k í nh trong là 2,1 cm, kích thước hạt nhồi là 1,7 μm, độ dài của cột là 50 mm; - Nhiệt độ cột theo nhiệt độ phòng; - Thể t í ch b ơ m mẫu: 10 μ l ; - Thời gian phân tích: 3 min; - Tốc độ dòng toàn phần: 0,3 ml / min; Pha động: chương trình gradient thể hiện theo bảng 2: Bảng 2 - Chương tr ì nh pha động Thời gian (min) Tốc độ dòng (μL/min) Pha động A (%) Pha động B (% ) 0 , 1 300 80 20 2,0 300 50 50 3,0 300 80 20 7.2.2 . Đi ề u kiện trên MS Điều kiện trên MS như sau: Kiểu ion hóa: ESI (-); Nhiệt độ nguồn ion hóa: 120°C; Nhiệt độ hóa hơi dung môi: 400 °C; Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi: 500 l / h; Tốc độ dòng khí qua khối nón: 30 I / h. Các điều kiện phân ly MS-MS như sau: B ả ng 3 - Điều kiện phân ly MS-MS T ê n hợp ch ấ t I on sơ c ấ p (m/z) I on thứ c ấ p (m/ z ) Năng lư ợn g mặt nón (V) Năng lượng va chạm (eV) CAP 321 152 (*) -18 15 321 257 -18 20 CAP-d 5 326 157 -18 15 GHI CH Ú : ion có kí hiệu (*) là ion dùng để định lượng. 7.3 . Trình tự bơm mẫu 7.3.1 . Bơm dung môi kiểm tra máy: Nước (3.4); 7.3.2 . Bơm các dung dịch lập đường chuẩn; 7.3.3 . Bơm mẫu tr ắng; 7.3.4 . Bơm mẫu kiểm soát; 7.3.5 . Bơm mẫu th ử . 8. Tính toán và biểu thị kết quả 8.1 . Tính hệ s ố tín hiệu Tính cho từng chất cần phân t í ch theo phương trình: Trong đó: RF: hệ số tín hiệu; Sp: tổng diện tích pic của các ion thứ cấp của ch ấ t cần phân t í ch; Sp IS : diện tích pic của ion thứ cấp của chất chuẩn nội tương ứng. 8.2 . Xây d ự ng đường chuẩn Xây dựng phương tr ì nh bậc nh ấ t giữa hệ số tín hiệu với nồng độ ch ấ t chuẩn bổ sung vào mẫu và chu ẩ n bị mẫu theo mục 6.4. Phương trình có dạng: RF = ax + b. Trong đ ó : - RF: hệ số tín hiệu, t í nh theo mục 8.1; - x: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu, chuẩn bị theo mục 6.4; - b: điểm cắt của đường chuẩn với trục tung; - a: hệ số góc của đường chuẩn. Phương tr ì nh đạt yêu cầu khi hệ số h ồ i quy R 2 ≥ 0.99. 8.3 . Hàm l ượ ng ch ấ t phân tích trong m ẫ u Dư lượng chloramphenicol cần phân tích trong mẫu được tính theo phương pháp đường chuẩn xây dựng theo mục 8.2. Nồng độ trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau: Trong đ ó : C : là nồng độ chloramphenicol có trong mẫu, tính bằng μg / kg; C x : là nồng độ chloramphenicol đo được suy ra từ đường chuẩn, μg / l ; V: là thể tích định mức cuối cùng, tính bằng ml; F: là hệ số pha loãng mẫu khi đo (n ế u không pha loãng, F = 1); a: là khối lượng mẫu thử, t í nh bằng gam (g). 8.4 . Biểu thị kết quả Kết quả được biểu thị bằng đơn vị μg / kg (ppb), hai số sau d ấ u phẩy. 9. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo th ử nghiệm phải ghi r õ : - Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đ ủ mẫu thử; - Phương pháp l ấ y mẫu đã sử dụng, n ế u có; - Phương pháp thử đã sử dụng, việ n dẫn tiêu chuẩn này; - Các chi tiết b ấ t thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm; - Độ lập lại của phương pháp; - Kết qu ả thử nghiệm thu được. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] AFSSA-FOUGERES: Chloramphenicol identification by liquid chromatography tandem mass- spectrometry, 35133 France. [2] A con f irmatory method for the determination of chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol in honey, Waters Applications Note. [3] Decision 2002/657/ EC of August 2002.