TCVN8376:2010

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8376:2010 về tôm và sản phẩm tôm – Phát hiện virut gây hội chứng taura (TSV) bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp - Phiên mã ngược (RT-PCR) TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8376:2010 TÔM VÀ SẢN PHẨM TÔM – PHÁT HIỆN VIRUT GÂY HỘI CHỨNG TAURA (TSV) BẰNG KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP - PHIÊN MÃ NGƯỢC (RT-PCR) Shrimp and shrimp products – Detection of taura syndrome virus (TSV) by reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) Lời nói đầu TCVN 8376 : 2010 do Cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thuỷ sản biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. CẢNH BÁO – Để đảm bảo an toàn cho nhân viên, các thao tác phân tích chỉ được thực hiện trong các phòng thử nghiệm được trang bị thích hợp, dưới sự kiểm soát của cán bộ thử nghiệm có kinh nghiệm. Etidi bromua (EB) là chất có khả năng gây ung thư. Vì vậy phải mang găng tay, đeo kính và mặc quần áo bảo hộ để tránh tiếp xúc. Nên đánh dấu rõ ràng thiết bị và dụng cụ tiếp xúc với EB và không di chuyển chúng ra khỏi khu vực quy định. Để chất thải có chứa EB trong vật chứa và có phương pháp loại bỏ thích hợp. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện virut gây hội chứng taura (TSV) trên tôm bố mẹ, tôm giống, tôm nuôi thương phẩm của các loài tôm thuộc chi Tôm he ( Penaeus ) bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp - phiên mã ngược (RT-PCR). 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). ISO 22174 : 2005 Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens – General requirements and definitions (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phản ứng chuỗi trùng hợp để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Yêu cầu chung và định nghĩa). 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa nêu trong ISO 22174 và các thuật ngữ, định nghĩa sau đây: 3.1 Virut gây hội chứng taura (TSV) [Taura syndrome virus (TSV)] Virut thuộc chi Picornavirus , họ Picornaviridae , dạng hình cầu 20 mặt, kích thước từ 30 nm đến 32 nm, vật chất di truyền là RNA có kích thước khoảng 10,2 Kb. 3.2 Phát hiện virut gây hội chứng taura (Detection of taura syndrome virus) Việc xác định sự có mặt hay không có mặt của TSV trong một khối lượng cụ thể của sản phẩm khuếch đại khi tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn này. 4. Nguyên tắc 4.1 Phương pháp phân tích định tính, sử dụng kỹ thuật RT-PCR một bước để phát hiện TSV dựa vào việc xác định đoạn RNA đích có được khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm sau khuếch đại trên thạch agaroza, nhuộm màu cDNA và quan sát dưới ánh sáng UV có bước sóng 302 nm. 4.2 Quy trình phát hiện TSV bằng kỹ thuật RT-PCR qua 4 giai đoạn kế tiếp nhau (xem Phụ lục A): tách chiết RNA; phiên mã ngược RNA thành cDNA; khuếch đại cDNA; điện di để phát hiện cDNA và đọc kết quả. 5. Thuốc thử và vật liệu thử Trong mọi trường hợp, chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích thích hợp và nước cất loại dùng cho sinh học phân tử. Việc pha chế, bảo quản và sử dụng thuốc thử phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nhìn chung, nên lấy lượng cần thiết vừa đủ các dung dịch phản ứng cho phép thử PCR và bảo quản chúng trong điều kiện thích hợp. 5.1 Mồi 5.1.1 Mồi đặc hiệu của TSV sử dụng trong kỹ thuật RT-PCR một bước gồm có cặp mồi 7171F/ 7511R. Trình tự mồi cụ thể như sau: Mồi Trình tự Sản phẩm 7171 F 5'- CGA CAG TTG GAC ATC TAG TG -3' 341 bp 7511 R 5'- GAG CTT CAG ACT GCA AGT TC -3' 5.1.2 Dung dịch mồi Dùng dung dịch đệm TE (5.1.3) để pha loãng mồi đến nồng độ 25 mM. 5.1.3 Dung dịch đệm TE (Tris - EDTA) Chuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1 mM, dùng HCl để chỉnh pH 7,6. 5.2 Thuốc thử tách chiết RNA dùng hệ thống cột ly tâm 5.2.1 Dung dịch đệm ly giải Chuẩn bị 25 ml dung dịch gồm: guanidin-HCl 4,5 M, natri phosphat 100 mM, pH 6,6. Bảo quản ở 25 o C. 5.2.2 Dung dịch đệm I (DNAaza I) Chuẩn bị 500 µl dung dịch DNAaza I gồm enzym DNAaza 5 U/µl và dung dịch đệm rửa giải (5.2.6), trộn kỹ, bảo quản ở –15 o C đến –25 o C. 5.2.3 Dung dịch đệm ủ Chuẩn bị 10 ml dung dịch gồm NaCl 1 M, Tris-HCl 20 mM, MnCl 2 10 mM, có pH 7,0. Bảo quản ở 25 o C. 5.2.4 Dung dịch đệm rửa I Chuẩn bị 33 ml dung dịch gồm guanidin-HCl 5 M, Tris-HCl 20 mM, có pH 6,6. Thêm 20 ml etanol tinh khiết. Bảo quản ở 25 o C. 5.2.5 Dung dịch đệm rửa II Chuẩn bị 10 ml dung dịch gồm NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, có pH 7,5. Thêm 40 ml etanol tinh khiết. Bảo quản ở 25 o C. 5.2.6 Dung dịch đệm rửa giải Chuẩn bị 30 ml n ước cất hai lần vô trùng và đã được khử enzym nucleaza. CHÚ THÍCH Tách chiết RNA được thực hiện bởi nhiều phương pháp khác nhau, nhưng để đạt được kết quả mong muốn có thể sử dụng một số kit tách chiết RNA thương mại có bán sẵn. Nên sử dụng thuốc thử và các sản phẩm dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng hợp thành bộ chế phẩm đang được lưu hành trên thị trường có thành phần phù hợp như dưới đây. 5.3 Hỗn hợp phản ứng RT-PCR Có thể sử dụng hỗn hợp phản ứng RT-PCR có bán sẵn hoặc được pha chế từ các thành phần riêng lẻ như sau: Thành phần 25 µl/ống phản ứng Nồng độ cuối Nước thêm vào 6,5 µl Dung dịch đệm EZ đậm đặc 5 lần 5,0 µl 1X Hỗn hợp dNTP (10 mM mỗi loại) 3,0 µl 300 µM mỗi loại Mồi ngẫu nhiên pd (T) 12-18 1,0 µl 0,62 µM Mồi 7171 F 1,0 µl 0,62 µM Mồi 7511 R 1,0 µl 0,62 µM Mn(OAc) 2 2,5 µl 2,5 mM Enzym rTth DNA polymeraza 1,0 µl 2,5 U DNA đích 4,0 µl 5.4 Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA 10X) Hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 ml nước. Thêm 40 ml EDTA 0,5 M (5.5) và thêm nước cho đủ 1 l. Hấp vô trùng ở 121 o C trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khi sử dụng, pha loãng dung dịch với nước thành dung dịch 1X. 5.5 Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 ml nước, chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH nồng độ 4 M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Hấp vô trùng ở 121 o C trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. 5.6 Dung dịch đệm tải mẫu DNA đậm đặc 6 lần Chuẩn bị dung dịch gồm Tris-HCl 10 mM (pH 7,6); bromophenol blue 0,03 %; xylen xyanol FF 0,03 %; glycerol 60 % và EDTA 60 mM [sử dụng dung dịch EDTA 0,5 M (5.5)]. Bảo quản ở nhiệt độ –20 ° C. 5.7 Dung dịch DEPC Dung dịch di-etypyrocacbonat 0,1 % thể tích, lắc trộn đều khoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng ở 121 ° C trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ – 20 ° C. 5.8 Thạch agaroza 1,5 % Cân 1,5 g agaroza, hoà tan trong 100 ml dung dịch đệm TBE 1X, đun nóng làm tan hoàn toàn agaroza. Để nguội đến khoảng 55 ° C đến 60 ° C , lắc đều, tránh tạo bọt khí. 5.9 Bảng thạch agaroza Chuẩn bị khuôn, cân bằng mặt khuôn bằng giọt nước, gắn lược vào khuôn, đổ thạch agaroza (5.8) vào khuôn với bề dày từ 3 mm đến 5 mm. Để nguội và đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Gỡ lược, đặt t hạch agaroza vào trong máng điện di, các giếng của bảng thạch phải ở phía gần điện cực âm. Đổ dung dịch TBE 1X cho ngập mặt t hạch agaroza trước khi cho sản phẩm khuếch đại vào để điện di. 5.10 Dung dịch etidi bromua (ethidium bromide) Hút 5 µl dung dịch etidi bromua (10 mg/ml) hoà tan trong 100 ml nước. Bảo quản ở nhiệt độ không lớn hơn – 20 ° C. 5.11 Thang DNA Sử dụng thang đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 341 bp. Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 341 bp đã biết trước. 6. Thiết bị và dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau: 6.1 Máy chu trình nhiệt , có thể thực hiện chính xác và lặp lại chu trình thời gian và nhiệt độ được quy định trong 7.4.5. 6.2 Máy lắc Vortex . 6.3 Máy ly tâm lạnh , có thể hoạt động với tốc độ tối đa trên 13 000 r/min. 6.4 Hệ thống phát hiện các sản phẩm PCR , bao gồm: a) bộ điện di; b) khuôn, khay, lược dùng để tạo bảng thạch agaroza; c) bàn đọc kết quả, với tia UV bước sóng 302 nm; d) bộ phận chụp ảnh để lưu kết quả, ví dụ: máy đọc Gel- Doc (nếu có). 6.5 Tủ đông , có thể hoạt động ở nhiệt độ không lớn hơn – 20 o C. 6.6 Tủ lạnh , có thể hoạt động ở nhiệt độ từ 2 o C đến 8 o C. 6.7 Tủ thao tác vô trùng . 6.8 Cân phân tích , có thể cân chính xác đến 0,001 g. 6.9 Micropipet , dung tích 10 µl, 20 µl, 100 µl và 1000 µl; có đầu típ (với dung tích không lớn hơn 10 µl phải sử dụng đầu típ có lọc). 6.10 Ống phản ứng , chuyên dùng cho PCR , dung tích 1,5 ml và 0,2 ml. 6.11 Ống lọc tinh , dạng ống nhựa có 2 lớp màng lọc polypropylen, để chứa dịch mẫu. 6.12 Ống góp , dùng bọc ngoài ống lọc tinh. 7. Cách tiến hành 7.1 Chuẩn bị mẫu 7.1.1 Đối với mẫu tôm hậu ấu trùng (postlarvae) Lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng từ 10 cá thể đến 15 cá thể; lấy phần đuôi, không lấy gan tuỵ. 7.1.2 Đối với mẫu tôm bố mẹ Lượng mẫu dùng cho mỗi phản ứng từ 100 mg đến 200 mg, lấy cuống mắt hoặc 1 phần chân bơi. 7.1.3 Đối với mẫu tôm thương phẩm Lượng mẫu cần dùng cho mỗi phản ứng từ 100 mg đến 200 mg, lấy ở phiến mang tôm, hoặc chân bơi, chân bò hoặc phần cơ hoặc dịch bạch huyết của tôm khoảng 100 µl. 7.2 Tách chiết RNA dùng hệ thống cột ly tâm Cho mẫu (7.1) vào các ống phản ứng dung tích 1,5 ml, thêm 400 µl dung dịch đệm ly giải (5.2.1), n ghiền mẫu bằng chày nghiền vô trùng. Ly tâm lạnh với tốc độ 13 000 r/min trong 2 min, nhằm loại bỏ mô chưa thủy phân. Chuyển 200 µl phần dịch nổi sang các ống phản ứng dung tích 1,5 ml chứa 200 µl etanol tinh khiết, trộn đều. Gắn ống lọc tinh (6.11) vào ống góp (6.12), chuyển toàn bộ dung dịch trên vào ống lọc tinh. Ly tâm lạnh với tốc độ 13 000 r/min trong 30 s. Loại bỏ phần nước chứa trong ống góp, gắn ống góp mới vào ống lọc tinh. Thêm 90 µl dung dịch đệm ủ DNA polymeraza (5.2.3) và 10 µl dung dịch đệm DNA polymeraza I (5.2.2) vào ống lọc tinh , để 15 min ở nhiệt độ phòng. Thêm 500 µl dung dịch đệm rửa I (5.2.4) vào ống lọc tinh, ly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 15 s, loại bỏ dịch trong ống góp. Thêm 500 µl dung dịch đệm rửa II (5.2.5) vào ống lọc tinh, ly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 15 s, loại bỏ dịch trong ống góp. Thêm 3 00 µl dung dịch đệm rửa II (5.2.5) vào ống lọc tinh, ly tâm với tốc độ 13 000 r/min trong 2 min, loại bỏ dịch trong ống góp. Ly tâm các ống góp chứa ống lọc tinh ở tốc độ cao nhất (có thể) trong 20 s để loại bỏ hoàn toàn dung dịch đệm rửa. Gắn ống lọc tinh sang một ống phản ứng mới, dung tích 1,5 ml. Thêm 100 µl dung dịch đệm rửa giải (5.2.6) vào ống lọc tinh, ly tâm với tốc độ 8 000 r/min trong 1 min. Loại bỏ ống lọc tinh, sản phẩm RNA được chứa trong ống phản ứng 1,5 ml. Dịch tách chiết RNA sử dụng ngay cho phản ứng khuếch đại hoặc bảo quản ở nhiệt độ – 20 o C. 7.3 Chuẩn bị các kiểm chứng cho phản ứng RT-PCR 7.3.1 Mẫu kiểm soát Nước cất hai lần hoặc dung dịch DEPC. 7.3.2 Mẫu kiểm chứng âm tính Mẫu tôm không bị bệnh đã biết trước. 7.3.3 Mẫu kiểm chứng dương tính Mẫu tôm nhiễm TSV đã biết trước hoặc plasmid của TSV. 7.4 Tổng hợp cDNA và khuếch đại cDNA một bước 7.4.1 Mẫu thử Hút 5 µl dịch RNA của mẫu vào ống hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.3). 7.4.2 Mẫu kiểm soát Hút 5 µl dung dịch nước cất hai lần hoặc dung dịch DEPC vào ống hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.3). 7.4.3 Mẫu kiểm chứng âm tính Hút 5 µl dịch RNA của mẫu tôm đã biết trước không bị bệnh vào ống hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.3). 7.4.4 Mẫu kiểm chứng dương tính Hút 5 µl dịch RNA của mẫu tôm nhiễm TSV đã biết trước hoặc plasmid của TSV vào ống hỗn hợp phản ứng RT-PCR (5.3). CHÚ THÍCH Đánh số cho các ống và đậy chặt nắp ống. Ly tâm nhẹ trước khi cho các ống vào máy chu trình nhiệt. Mẫu kiểm soát dùng để kiểm tra độ tinh sạch của mồi, hỗn hợp phản ứng RT-PCR và các thuốc thử. 7.4.5 Đặt các ống vào máy chu trình nhiệt để thực hiện phản ứng chuỗi trùng hợp - phiên mã ngược (RT-PCR) theo chu kỳ luân nhiệt như sau: Số chu kỳ Nhiệt độ, o C Thời gian Bước 1 42 15 min Tổng hợp cDNA 94 2 min Biến tính ban đầu 39 94 45 s Biến tính 60 45 s Lai/ bắt cặp 72 45 s Kéo dài mạch 1 72 1 min Kéo dài mạch 4 Giữ ổn định 7.4.6 Giữ các sản phẩm khuếch đại ở 4,0 0 C cho đến khi điện di. 7.5 Điện di 7.5.1 Cho từ 5 µl đến 7 µl dung dịch đệm tải mẫu (5.6) vào các ống sản phẩm khuếch đại (7.4.6) trộn đều. 7.5.2 Hút từ 5 µl đến 7 µl dịch tương ứng từ các ống (7.5.1), theo thứ tự: thang DNA, các mẫu thử, mẫu kiểm chứng âm tính và mẫu kiểm chứng dương tính, nhỏ vào từng giếng trên bảng thạch agaroza (5.9). 7.5.3 Điện di với hiệu điện thế từ 70 V đến 120 V. Kiểm tra bằng cách quan sát các bóng khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện. CHÚ THÍCH Dung dịch đệm tải mẫu gồm hai thành phần màu: màu xanh đậm của xanh bromophenol; màu xanh nhạt của xylen xyanol. Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agaroza, dừng quá trình điện di. Sau đó, lấy thạch agaroza từ buồng điện di ra để nhuộm với etidi bromua. 7.5.4 Nhuộm etidi bromua: Đặt bảng thạch agaroza vừa điện di vào khay nhựa sạch, đ ổ dung dịch etidi bromua (5.10) ngập bảng thạch. 7.5.5 Lắc nhẹ trong khoảng 20 min. Vớt bảng thạch ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa bằng nước cất trong 10 min để loại bỏ dung dịch nhuộm còn dư trên bề mặt bảng thạch. 7.5.6 Đặt bảng thạch trên bàn đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm hoặc chụp hình ảnh bằng máy Gel- Doc (nếu có). 7.6 Đọc kết quả 7.6.1 Dưới ánh sáng của tia UV, các đoạn cDNA có gắn etidi bromua phát quang tạo thành vạch sáng. 7.6.2 Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang DNA, mẫu kiểm chứng dương tính và mẫu kiểm chứng âm tính để đưa ra kết luận. 7.6.3 Cách đọc kết quả Giếng Vạch 341 bp Kết quả Thang DNA Các vạch sáng rõ ràng Điện di tốt Mẫu kiểm chứng âm tính Không Không ngoại nhiễm Có Bị ngoại nhiễm Mẫu kiểm chứng dương tính Có Hỗn hợp phản ứng RT-PCR tốt Không Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng hoặc enzym hỏng Mẫu thử Có Dương tính với TSV Không Âm tính với TSV 8. Diễn giải kết quả 8.1 Kết quả âm tính với TSV Kết quả được coi là âm tính khi: a) mẫu thử không có vạch sáng kích thước 341 bp hoặc vạch sáng kích thước khác với mẫu kiểm chứng dương tính; b) có vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính; c) không có vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính; d) thang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng. 8.2 Kết quả dương tính với TSV Kết quả được coi là dương tính khi: a) mẫu thử có vạch sáng kích thước 341 bp; b) có vạch sáng của mẫu kiểm chứng dương tính; c) không có vạch sáng của mẫu kiểm chứng âm tính; d) thang DNA phân vạch rõ ràng theo kích thước sử dụng. 9 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: – mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; – phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu có); – phương pháp thử sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này; – mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều kiện được coi là tự chọn và bất kỳ chi tiết nào có thể ảnh hưởng tới kết quả (nếu có); – kết quả thử nghiệm thu được.