TCVN7135:2002

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7135:2002 (ISO 6391 : 1997) về thịt và sản phẩm thịt - định lượng E.coli - kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44oC sử dụng màng lọc do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7135:2002 THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - ĐỊNH LƯỢNG E.COLI - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 44 0 C SỬ DỤNG MÀNG LỌC Meat and meat products - Enumeration of Escherichia coli - Colony - count technique at 44 C using membranes Lời nói đầu TCVN 7135 : 2002 hoàn toàn tương đương với ISO 6391 : 1997; TCVN 7135 : 2002 do Ban Kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F 8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Escherichia coli có trong tất cả các loại thịt và sản phẩm thịt, kể cả thịt gia cầm. Phương pháp này cho phép phát hiện Escherichia coli (tip sinh học 1) và các biến thể không lên men lactoza hoặc sinh trưởng kỵ khí (xem tham khảo [1]). Chú thích 1 - Phương pháp này có thể không thích hợp cho việc kiểm tra thịt đã chế biến có nhiều vi khuẩn sinh bào tử hiếu khí. Chú thích 2 - Một số chủng Escherichia coli gây bệnh có thể không phát hiện được bằng phương pháp này. 2. Tiêu chuẩn viện dẫn TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887 : 1983), Vi sinh vật học - Hướng dẫn chung về cách pha chế các dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh vật. TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996), Vi sinh vật trong thực phẩm và trong thức ăn gia súc - Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật. 3. Định nghĩa Trong tiêu chuẩn này áp dụng định nghĩa sau đây: 3.1. E.coli (Escherichia coli): Vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc indol dương tính (màu hồng) ở 44 0 C trên màng xelulo axetat đặt trên môi trường thạch mật trypton dưới các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn này. 4. Nguyên tắc Nhìn chung, việc phát hiện Escherichia coli cần đến ba giai đoạn liên tiếp dưới đây. 4.1. Hồi phục Cấy một lượng quy định của huyền phù ban đầu lên màng xenlulo axetat được đặt trên môi trường thạch glutamat khoáng cải tiến và ủ ở nhiệt độ 37 0 C khoảng 4h. Chú thích - Quy trình này cho phép hồi phục lại các E.Coli bị hư hại do bảo quản đông lạnh, do làm khô hoặc do các điều kiện lạnh hoặc bị hư hại do xử lý nhiệt hoặc do hóa chất. Đồng thời cũng làm giảm nồng độ của tất cả các cacbon hidrat có thể lên men nếu chúng có mặt trong mẫu thử với nồng độ cao, điều có thể gây cản trở việc sinh indol trong giai đoạn phân lập tiếp theo. 4.2. Phân lập Chuyển các màng trên môi trường thạch glutamat khoáng cải tiến ở giai đoạn hồi phục sang môi trường thạch mật trypton. Ủ ở nhiệt độ 44 0 C trong thời gian từ 18h đến 20h. 4.3. Phát hiện Sự có mặt E.Coli trên màng được biểu hiện bằng sự sinh indol từ mỗi khuẩn lạc. 4.4. Tính toán Tính số lượng E.Coli có trong một mililit hoặc trong một gam mẫu từ số khuẩn lạc indol dương tính thu được trên màng ở các độ pha loãng đã chọn để thu được các kết quả có ý nghĩa. 5. Dịch pha loãng, môi trường nuôi cấy và thuốc thử 5.1. Khái quát Về thực hành tại phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218). 5.2. Dịch pha loãng Để chuẩn bị các dung dịch pha loãng, xem TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887). 5.3. Môi trường hồi phục: Thạch glutamat khoáng cải tiến 5.3.1. Thành phần Natri glutamat Lactoza Natri fomat L(-)-xystin Axit L(-) aspactic L(+)-aginin Thiamin Axit nicotinic Axit pantothenic Magie sunfat (MgSO 4 , 7H 2 O) Sắt (III) amoni xitrat [tối thiểu là 15% Fe (m/m)] Canxi clorua (CaCl 2 .2H 2 O) Dikali hidro phosphat Amoni clorua Thạch Nước 6,35 g 10,0 0,25 g 0,02 g 0,024 g 0,02 g 0,001 g 0,001 g 0,001 g 0,100 g 0,010 g 0,010 g 0,90 g 2,5 g 12 g đến 18 g 1) 1000 ml 1) Tùy vào sức đông của thạch 5.3.2. Chuẩn bị Hòa tan amoni clorua trong nước. Bổ sung các thành phần khác vào và đun sôi. Chỉnh pH sao cho giá trị pH sau khi khử trùng là 6,7 ở 25 0 C. Chuyển vào mỗi dụng cụ chứa thích hợp (6.5) 100 ml môi trường này và khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 0 C trong 10 phút. 5.3.3. Chuẩn bị các đĩa thạch Rót vào các đĩa Petri vô trùng (6.6) từ 12 ml đến 15 ml môi trường, đã được làm nguội đến 47 0 C trong nồi cách thủy (6.10), và để cho đông đặc lại. Các đĩa này có thể bảo quản trong vòng một tuần ở nhiệt độ từ 0 0 C đến + 5 0 C. Ngay trước khi sử dụng, làm khô các đĩa thạch này một cách cẩn thận [thí dụ: để trong buồng sấy hoặc tủ sấy (6.4) ở 50 0 C], tốt nhất là mở nắp và để mặt thạch hướng xuống dưới, cho đến khi các giọt nước nhỏ trên mặt thạch biến mất. Không tiếp tục làm khô thêm. Chú thích - Môi trường thạch cần được làm khô đủ để sao cho 1 ml dịch mẫu cấy được hấp thụ hoàn toàn lên màng/thạch trong vòng 15 phút (xem 9.2.3). 5.4. Môi trường chọn lọc: Thạch mật trypton (Xem tham khảo [3]) 5.4.1. Thành phần Trypton (thủy phân pepsin của casein) Muối mật (tinh chế) Thạch Nước 20,0 g 1) 1,5 g 2) Từ 12 g đến 18 g 3) 1 000 ml 1) Nên sử dụng các loại bán sẵn thuận lợi cho việc hình thành indol. 2) Muối mật Oxoid No.3 là một thí dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra để tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tổ chức Tiêu chuẩn hóa quốc tế không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. 3) Tùy thuộc vào sức đông của thạch. 5.4.2. Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trên trong nước và đun đến sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng giá trị pH là 7,2 ở 25 0 C. Chuyển từng lượng 100 ml môi trường vào các dụng cụ chứa thích hợp và khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.1) ở nhiệt độ 121 0 C trong 15 phút. 5.4.3. Chuẩn bị các đĩa thạch Rót vào các đĩa Petri vô trùng (6.6) từ 12 ml đến 15 ml môi trường, đã được làm nguội đến 47 0 C trong nồi cách thủy (6.10), và để cho đông đặc lại. Các đĩa này có thể bảo quản trong vòng 4 ngày ở nhiệt độ từ 0 0 C đến + 5 0 C. Ngay trước khi sử dụng, làm khô các đĩa thạch này một cách cẩn thận (thí dụ: để trong buồng sấy hoặc tủ sấy (6.4) ở 50 0 C], tốt nhất là mở nắp và để mặt thạch hướng xuống dưới, cho đến khi các giọt nước nhỏ trên mặt thạch biến mất. Không tiếp tục làm khô thêm. 5.5. Thuốc thử phát hiện Indol (Thuốc thử Vracko và Sherris) 5.5.1. Thành phần p-Dimetylaminobenzaldehyt A xit clohydric c(HCl) = 1 mol/l 5 g 100 ml 5.5.2. Chuẩn bị Hòa tan thuốc thử trong axit clohidric và bảo quản ở nhiệt độ phòng không quá một tháng. 6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm phân tích vi sinh và đặc biệt là: 6.1. Thiết bị khử trùng khô (tủ sấy) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) Xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218). 6.2. Tủ ấm, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 35 0 C ± 1 0 C hoặc 37 0 C ± 1 0 C. 6.3. Tủ ấm, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 44 0 C ± 0,5 0 C. 6.4. Buồng sấy hoặc tủ sấy, được thông gió bằng đối lưu, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 50 0 C ± 1 0 C. 6.5. Ống nghiệm, có kích thước 18 mm x 18 mm và bình hoặc lọ có dung tích từ 125 ml đến 300 ml, dùng để khử trùng và bảo quản môi trường nuôi cấy. 6.6. Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100 mm. 6.7. Màng xenlulo axetat, có cỡ lỗ từ 0,45 m m đến 1,2 m m và đường kính 85 mm. 6.8. Pipet, được hiệu chuẩn để dùng cho vi sinh vật, có dung tích danh định 1 ml, được chia độ 0,1 ml và có đường kính lỗ xả từ 2 mm đến 3 mm. 6.9. Que gạt, bằng chất dẻo hoặc bằng thủy tinh, thí dụ: que gạt làm bằng đũa thủy tinh có đường kính khoảng 3,5 mm, dài 20 cm, một đoạn đầu dài khoảng 3 cm được uốn để tạo thành góc vuông và đầu mút được làm nhẵn bằng nhiệt. 6.10. Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự, có thể duy trì nhiệt độ ở 47 0 C ± 0,2 0 C. 6.11. Đèn cực tím sóng dài (365 nm), được gắn với bộ lọc thích hợp để loại bức xạ UV dưới 310 nm. 6.12. pH-met, chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 0 C. 7. Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo quy định trong TCVN 4833 - 1: 2002 (ISO 3100 - 1 [4]). Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. 8. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp đối với sản phẩm có liên quan. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể thì các bên liên quan cần thỏa thuận với nhau về vấn đề này. Phương pháp lấy mẫu được khuyến nghị nêu trong TCVN 4833 - 2 : 2002 (ISO 3100 : 2 [5]). 9. Cách tiến hành 9.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng Xem TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887) và tiêu chuẩn cụ thể thích hợp liên quan đến sản phẩm. 9.2. Quy trình hồi phục 9.2.1. Dùng bộ kẹp vô trùng đặt các màng xenlulô axetat (6.7) trong điều kiện vô trùng lên bề mặt đã khô của từng cặp hai đĩa có chứa môi trường thạch glutamat khoáng cải tiến (5.3.1), chú ý tránh tạo bọt khí ở dưới màng. Dàn phẳng các màng một cách nhẹ nhàng bằng que gạt vô trùng (6.9). Dùng pipet vô trùng (6.8) lấy 1 ml huyền phù ban đầu cho vào chính giữa mỗi màng. Dùng que gạt vô trùng (6.9), dàn đều phần mẫu cấy lên toàn bộ bề mặt của màng, tránh không để tràn khỏi màng. 9.2.2. Dùng các pipet vô trùng khác nhau (6.8) để cấy các thể tích giống nhau của các dịch có độ pha loãng khác nhau chuẩn bị từ huyền phù ban đầu lên các màng khác nhau, như quy định trong 9.2.1. Thời gian từ khi chuẩn bị mẫu thử (điều 8) đến khi cấy dịch lên màng không được vượt quá 45 phút, trừ khi có quy định khác trong các tiêu chuẩn có liên quan. 9.2.3. Để các đĩa đã nuôi cấy trong tư thế nằm ngang ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút cho đến khi phần mẫu cấy ngập vào trong thạch. Ủ các đĩa petri trong tủ ấm (6.2) ở 35 0 C hoặc ở 37 0 C trong 4h ± 0,5h, để các màng/mặt thạch hướng lên trên. 9.3. Chuyển sang môi trường chọn lọc 9.3.1. Dùng bộ kẹp có đầu tù vô trùng chuyển các màng, với phần mẫu cấy hướng lên trên, từ môi trường thạch glutamat khoáng cải biến (5.3.1) sang môi trường thạch mật trypton (5.4). Màng ẩm nói trên phải dính vào mặt thạch, tránh tạo bọt khí. Không sử dụng que gạt vì sẽ làm phân tán mọi khuẩn lạc có mặt, làm kết quả định lượng cao hơn giá trị thực. 9.3.2. Ủ các đĩa này từ 18 h đến 24 h trong tủ ấm (6.3) ở 44 0 C, các màng/mặt thạch hướng lên trên, không chồng các đĩa lên nhau quá ba chiếc. 9.4. Phát hiện đặc tính sinh indol của các khuẩn lạc trên màng 9.4.1. Ghi nhãn trên nắp của mỗi đĩa để nhận biết. 9.4.2. Dùng pipet lấy 2 ml thuốc thử phát hiện indol (5.5) cho vào nắp của đĩa petri lật ngược, đặt ở tư thế nằm ngang. 9.4.3. Dùng bộ kẹp vô trùng lấy màng ra khỏi mặt thạch tương ứng và cho các thuốc thử indol. Nếu cần, phải nghiêng nắp sao cho tất cả bề mặt của màng được thấm ướt bằng thuốc thử indol. Sau 5 phút, dùng pipet loại bỏ thuốc thử còn lại. 9.4.4. Đặt màng dưới đèn cực tím (6.11) trong 30 phút. Các khuẩn lạc indol dương tính có màu hồng. 9.5. Đếm khuẩn lạc Đếm các khuẩn lạc indol dương tính (màu hồng) trên các màng, tốt nhất là trên các màng có từ 15 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc màu hồng. 10. Biểu thị kết quả Sử dụng chuẩn cứ sau đây để xác định số lượng E.Coli có mặt. 10.1. Phương pháp tính 10.1.1. Nếu một hoặc cả hai màng lọc của một độ pha loãng nhất định chứa từ 15 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc màu hồng, thì tính giá trị trung bình số học của số khuẩn lạc đếm được trên hai màng. Chỉ giữ lại hai chữ số có nghĩa, tiến hành như sau: - nếu số đó nhỏ hơn 100, thì làm tròn đến bội số gần nhất của 5; - nếu số đó lớn hơn 100 và kết thúc bằng số 5, thì làm tròn số đó đến bội số gần nhất của 20; - nếu số đó lớn hơn 100 và tận cùng không phải là 5, thì làm tròn số đó đến bội số gần nhất của 10. Nhận giá trị này với số nghịch đảo của độ pha loãng tương ứng thu để được số E.Coli trong một gam sản phẩm. Biểu thị kết quả này dưới dạng tích của một số nằm trong khoảng 1,0 đến 9,9 với lũy thừa cơ số 10 và số mũ thích hợp. 10.1.2. Nếu có các màng chứa từ 15 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc màu hồng ở hai độ pha loãng liên tiếp, thì tính số lượng E.Coli theo quy định trong 9.3.5.1 của TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996). 10.1.3. Nếu trên các màng có ít hơn 15 khuẩn lạc màu hồng tương ứng với dịch huyền phù ban đầu, thì tính giá trị trung bình số học, y, của số các khuẩn lạc đếm được trên hai đĩa. Báo cáo kết quả thu được bằng số lượng E.Coli tính trong một gam N E : N E = y/d Trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu. 10.1.4. Nếu trên các màng không có các khuẩn lạc màu hồng nào tương ứng với huyền phù ban đầu thì báo cáo kết quả như sau: - ít hơn 1/d. E.Coli trong một gam Trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu. 10.2. Giới hạn tin cậy Để tính dải tin cậy, xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996). 11. Báo cáo kết quả Bản báo cáo kết quả phải ghi rõ: - mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết hoàn toàn mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu đã dùng, nếu biết; - phương pháp thử đã áp dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả; - kết quả thử thu được; - nếu kiểm tra độ lặp lại, thì nêu kết quả cuối cùng thu được. PHỤ LỤC A (tham khảo) TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Holbrook, R. and Andreson, J.M. Society of Applied Bacteriology, Technical Series, No.17, Corry. J.E.L., Roberts, D. and Skinner, F.A (eds). Academic Press, London, pp.239-254. [2] The bacteriologycal examination of drinking water supplies. Report No.71, 1982, Her Majesty’s Stationary Office, London. [3] Delaney, J.E., McCarthy, J.A. and Grasso, R.J. Water Sewage Wks., 1962, pp. 109; 289. [4] TCVN 4833 - 1 : 2002 (ISO 3100 - 1: 1991) Thịt và sản phẩm thịt - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử - Phần 1 : Lấy mẫu. [5] TCVN 4833 - 2 : 2002 (ISO 3100 - 2 : 1988) Thịt và sản phẩm thịt - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử - Phần 2: Chuẩn bị mẫu thử để kiểm tra vi sinh vật.