TCVN8142:2009

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8142:2009 (ISO 3496 : 1994) về Thịt và sản phẩm thịt - Xác định hàm lượng hydroxyprolin TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8142 : 2009 ISO 3496 : 1994 THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HYDROXYPROLIN Meat and meat products - Determination of content hydroxyproline content Lời nói đầu TCVN 8142 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 3496 : 1994; TCVN 8142 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn. Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HYDROXYPROLIN Meat and meat products - Determination of content hydroxyproline content 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng hydroxyprolin trong t ấ t c ả các loại thịt v à s ả n phẩm thịt, k ể cả thịt gia c ầ m. Ti ê u chuẩn này có th ể áp dụng cho th ị t v à sản phẩm thịt chứa hàm lượng hydroxyprolin nhỏ hơn 0 , 5 % (khối lượng). 2. Thuật ngữ, định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây: H à m lượng hydroxyprolin trong thịt và sản phẩm thịt (hydroxyproline content of meat and meat products): Hàm lượng hydroxyprolin xác định được theo quy trình quy định trong tiêu chuẩn này. Hàm lượng hydroxyprolin được bi ể u thị bằng phần trăm khối lượng. 3. Nguyên tắc Thủy phân phần mẫu thử trong a xit sulfuric ở 105 o C . Lọc và pha loãng dịch thủy phân. Oxi hoá hydroxyprolin bằng cloramin-T, sau đó tạo phức m à u đ ỏ với p -dimetyl-aminobenzaldehyt. Đo quang phổ ở bước sóng 558 nm. 4. Thuốc thử Ch ỉ sử dụng các thuốc th ử đạt chất lượng ph â n tích và nước cất hoặc nước đ ã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. 4.1. D ung dịch axit sulfuric , c (H 2 SO 4 ) ≈ 3 mol/l. Cho 750 ml nước vào b ì nh định mức một vạch dung tích 2 I. Vừa th ê m t ừ từ vừa khuấy 320 ml axit sulfuric đậm đặc ( r 20 = 1 , 84 g/ml). Đ ể nguội đến nhiệt độ phồng và thêm nước đ ế n vạch. 4.2. Dung dịch đệm, pH = 6,8, gồm 26,0 g axit xitric ngậm một phân tử nước (C 6 H 8 O 7 . H 2 O ); 14,0 g natri hydroxit; 78,0 g natri axetat khan [Na(CH 3 C O 2 )]. Hoà tan các thuốc th ử trong 500 ml nước và chuyển hết vào b ì nh định mức một vạch dung t í ch 1 I. Thêm 250 ml propan-1-ol và thêm nước đ ế n vạch. Khi được bảo qu ả n ở 4 o C , nơi tối , dung dịch này có thể b ề n trong vài tuần. 4.3. Thuốc thử Cloramin-T Hoà tan 1,41 g natri N -clo- p -toluen-sulfonamit ngậm ba ph â n tử nước (cloramin-T) trong 100 ml dung dịch đệm (4.2). Chuẩn bị dung dịch ngay tr ước khi sử dụng. 4.4. Thu ố c thử màu Hoà tan 10 , 0 g p -dimetylaminobenzaldehyt trong 35 ml dung dịch ax i t percloric [60 % (khối lượng)] sau đó th ê m từ từ 65 ml propan-2-ol Chu ẩ n bị dung dịch này trong ngày sử dụng. N ế u cần tinh sạch p -dimetylaminobenzaldehyt (xem chú th í ch 3 trong 8.4), thì tiến h à nh như sau: Chu ẩ n bị dung dịch b ã o hoà p -dimetylaminobenzaldehyt trong etanol nóng 70 % (thể tích). Làm nguội, đầu tiên ở nhiệt độ phòng, sau đ ó để trong t ủ lạnh. Sau khoảng 12 h, l ọ c b ằ ng phễu Bunchner. Rửa bằng một í t etanol 70 % (thể t í ch). Hoà tan lại trong etanol nóng 70 % (thể tích). Thêm nước nguội và khuấy kỹ. Lặp lại thao tác này cho đến kh i hình thành đủ một lượng tinh thể màu trắng sữa. Để trong tủ lạnh qua đêm. Lọc bằng phễu Bunchner. Rửa bằng etanol 50 % (thể tích) và sấy chân không tr ê n oxit phospho ( V ) 4.5. Hydroxyprolin, dung dịch chuẩn. Chuẩn bị dung dịch gốc b ằ ng cách hoà t an 50 mg axit 4-hydroxypyrolidin- a -cacbocnic (hydroxyprolin) trong nước đựng trong bình định mức một vạch dung t í ch 100 ml. Th ê m 1 giọt dung dịch axit sulfuric (4.1) và thêm nước đến vạch. Khi được bảo quản ở 4 o C dung dịch này c ó thể b ề n ít nh ấ t trong 1 tháng. Trong ngày sử dụng, chuyển 5 ml dung dịch gốc vào bình định mức một vạch dung tích 500 ml và thêm nước đến vạch. Sau đó chuẩn b ị bốn dung dịch chuẩn b ằ ng cách pha lo ã ng 10 ml, 20 ml , 30 ml và 40 ml dung dịch này trong 100 ml nước để thu được các nồng độ hydroxyprolin tương ứng 0,5 , 1 , 1,5 v à 2 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị , dụng cụ phòng thử nghiệm, cụ thể như sau: 5.1. Máy xay thịt bằng điện, có các lưỡi dao nằm ngang, có kh ả năng quay ở tốc độ cao. 5.2. Bình thủy phân đáy tròn hoặc đáy ph ẳ ng, có dung tích khoảng 200 ml, cổ rộng. 5.3. Tủ s ấ y, có khả năng hoạt động ở 105 o C ± 1 o C . 5.4. Đĩa b ằ ng gi ấ y lọc, đường kính 12,5 cm. 5.5. Máy đo pH. 5.6. Lá nhôm hoặc lá bằng ch ấ t dẻo m ờ . 5.7. N ồ i cách thủy, có khả năng duy trì được ở 60 o C ± 0,5 o C . 5.8. Máy đo phổ , phù hợp khi sử dụng ở bước sóng 558 nm ± 2 nm, máy đo màu quang điện c ó bộ lọc nhiễu với độ hấp thụ tối đa ở bước sóng 558 nm ± 2 nm. 5.9. Cuvet thủy tin h, chiều dài đường quang 10 mm 5.10. C â n phân tích , có thể cân ch í nh xác đến ± 0,001 g. 5.11. B ì nh định mức , dung t í ch 250 ml. 5.12. Mặt kính đồng hồ , đường k í nh từ 5 cm đến 6 cm 6. Lấy mẫu M ẫ u gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng l à mẫu đại diện v à không bị hư hỏng hoặc không b ị biến đổi chất lượng trong quá tr ì nh vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên l ấ y m ẫ u theo ISO 3100-1 1) L ấ y í t nhất 200 g mẫu đại diện. Bảo qu ả n mẫu sao cho mẫu không bị giảm chất lượng và không bị thay đổi thành phần. 7. Chuẩn bị mẫu thử 7.1. Thịt nguyên liệu và sản phẩm thịt Cắt miếng thịt thành các khối lập phương nh ỏ (khoảng 0,5 cm 3 , nghĩa là các cạnh d à i khoảng 8 mm) bằ ng cách d ù ng dao s ắ c cắt trong khi thịt vẫn còn lạnh (dưới 0 °C). Cho mẫu vào vật chứa rồi h à n k í n hoặc đóng gói chân không mẫu trong mảng chất dẻo ch ịu nhiệt. Sau đó gia nhiệt vật ch ứ a và mẫu sao cho duy trì được nhiệt độ ở ít nh ấ t 70 o C trong ít nhất 30 min. Để nguội và tiến hành theo 7.2. Trong suốt giai đoạn còn lại của qu á tr ì nh chuẩn bị mẫu thử và cân phần mẫu th ử , đ ả m bảo rằng mẫu đ ã được trộn kỹ, cụ thể là tất cả chất béo hoặc dịch lỏng được phân bố đồng đều. CHÚ THÍCH 1 : Việc xử lý nhiệt làm m ề m mô liên k ế t và l à m độ bền kém đi khi đ ồ ng hoá b ằ ng cách xay. Tuy nhi ê n , điều n à y cũng l à m tách chất lỏng c ó ch ứ a gelatin. Sự có mặt của ch ất béo có t h ể phải đặc biệt chú ý khi t ạo mẫu thử đồng nhất 7.2. Thịt nấu chín và sản phẩm thịt đã nấu chín Đ ồ ng hoá mẫu trong máy xay thịt (5.1). Cho đầy mẫu đ ã đồng nh ấ t vào vật chứa kín khí, đậy n ắ p vật ch ứ a và bảo quản sao cho kh ô ng bị giảm chất lượng và thay đ ổ i thành phần. Phân tích mẫu c à ng sớm càng tốt , chỉ trong vòng 24 h. 8. Cách tiến hành 8.1. Ph ầ n mẫu thử Cân khoảng 4 g mẫu thử , chính xác đ ế n 0,001 g vào b ì nh thủy phân (5.2). Đảm bảo r ằ ng nguyên liệu mẫu kh ô ng bị bám dính tr ê n thành b ì nh. 8.2. Thủy phân 8.2.1. Cho 30 ml ± 1 ml dung dịch axit sulfuric (4.1) vào bình. Đậy b ì nh b ằ ng mặt kính đồng hồ (5.12) và đặt trong tủ sấy (5.3) trong 16 h (thích h ợ p nhất l à đ ể b ì nh qua đêm) ở 105 o C . 8.2.2. Lọc dịch thủy ph â n nóng qua giấy lọc (5.4) vào bình định mức một vạch (5.11) 250 ml. Rửa b ì nh và gi ấ y lọc ba lần b ằ ng 10 ml phần d ung d ịch axit sulfuric nóng (4.1) và cho nước rửa vào dịch thủy phân. Th ê m nước đến vạch 8.3. Hiện màu và đo độ hấp thụ 8.3.1. Dùng pipet chuyển vào b ì nh định mức một vạch 250 ml (5.11) thể tích (V) dịch thủy phân (8.2 . 2) sao cho sau khi pha lo ã ng đến 250 ml th ì nồng độ hydroxyprolin sẽ trong khoảng từ 0 , 5 đến 2 . Thêm nước đến vạch. CHÚ TH Í CH 2 : Trong hầu h ế t các trường hợp , V sẽ t ừ 5 ml đến 25 ml, tu ỳ thuộc vào lượng mô liên k ế t c ó m ặ t trong mẫu. 8.3.2. Chuyển 4,00 ml dung dịch này (8.3.1) vào ống nghiệm và thêm 2,00 ml thuốc thử cloramin-T (4.3). Trộn đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 20 min ± 1 min. 8.3.3. Th ê m 2,00 ml thuốc thử màu (4.4), trộn kỹ và đậy nắp ống b ằ ng lá nhôm hoặc lá bằng ch ấ t dẻo (5.6). 8.3.4. Chuyển nhanh ống vào n ồ i cách thủy (5.7) ở 60 o C và làm nóng đúng 20 min. 8.3.5. Làm nguội ống dưới vòi nước chảy ít nh ấ t 3 min và đ ể ở nhiệt độ phòng trong 30 min. 8.3.6. Dùng máy đo phổ hoặc máy đo màu quang điện có bộ lọc nhiễu (5.8) để đo độ h ấ p thụ ở 558 nm ± 2 nm trong cuvet thủy tinh (5.9) ch ứ a nước. 8.3.7. L ấ y độ hấp thụ thu được của dung dịch mẫu trừ đi độ hấp thụ thu được của dung dịch trắng r ồ i đọc nồng độ hydroxyprolin của dịch thủy ph â n pha loãng từ đường chu ẩ n thu được trong 8.5. 8.4. Phép thử tr ắ ng Tiến hành lặp lại hai l ầ n các quy tr ì nh trong 8.3.2 đến 8.3.7, nhưng thay phần dịch thủy phân pha loãng bằng nước. CHÚ THÍCH 3 : N ế u độ h ấ p thụ của mẫu trắng v ượt quá 0 , 040 , thì phải chuẩn bị thuốc thử màu mới (4.4) và p -dimety l aminobenzaldehyt phải đ ược tinh sạch (xem chú th í ch 1 trong 4.4) , nếu c ầ n . 8.5. Đường chuẩn 8.5.1. Tiến hành quy tr ì nh trong 8.3.2 đến 8.3.7 , nhưng thay dịch thủy phân pha loãng b ằ ng bốn dung dịch hydroxyprolin chuẩn pha loãng (4.5), mỗi dung dịch 4,00 ml. 8.5.2. Vẽ giá trị độ hấp thụ đo được, đã hiệu ch ỉ nh với giá trị trắng, dựa vào n ồ ng độ của các dung dịch hydroxyprolin chuẩn. Dựng đường thẳng đi qua các điểm và gốc toạ độ. Chu ẩ n bị đường chuẩn mới đối với từng d ã y phân tích. 9. Tính toán Đối v ớ i từng phần mẫu thử , t í nh hàm lượng hydroxyprolin, biểu thị bằng phần trăm khối lượng theo công thức: w h = trong đó w h là hàm lượng hydroxyprolin theo công thức, được biểu thị bằng ph ầ n trăm khối lượng; c là nồng độ hydroxyprolin của d ị ch thủy ph â n loãng đọc được từ đ ườ ng chuẩn, tính bằng microgam tr ê n mililit ( m g/ml); m l à khối lượng phần mẫu thử (8.1), t í nh bằng gam (g); V là thể tích phần dịch lỏng của dịch thủy ph â n đ ã l ấ y để pha loãng đến 250 ml (xem 8.3.1), t í nh bằng mililit (ml). Lấy kết quả chính xác đến 0,01 %. 10. Độ chụm Độ chụm của phương pháp này được thi ế t lập b ở i liên phòng thử nghiệm quốc tế, tiến h à nh thử nghiệm theo ISO 5725. Đối với các gi á trị thu được về độ lặp lại và độ tái lập , được tính ở mức xác suất 95 %. 10.1. Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai lần xác định độc lập , riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng một phương pháp trên cùng một loại vật liệu thử trong cùng phòng thử nghiệm, do cùng một người thao tác , sử dụng cùng thiết bị trong một khoảng thời gian ngắn, không lớn hơn giá trị r trong công thức: r = 0,0131 + 0,0322 trong đó l à trung bình của hai kết qu ả thử nghiệm về hàm lượng hydroxyprolin , biểu thị theo phần trăm khối lượng . Loại bỏ cả hai kết quả nếu chênh lệch vượt quá giá trị trên và tiến hành hai phép xác định riêng rẽ mớ i . 10.2. Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm ri ê ng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên c ù ng một loại vật liệu thử trong các ph ò ng thử nghiệm kh á c nhau, do những ng ườ i thao tác khác nhau thực hiện và sử dụng các thiết bị khác nhau, không lớn hơn gi á tr ị R trong công thức: R = 0 , 0195 + 0 , 0529 trong đó l à trung b ì nh của hai kết qu ả th ử nghiệm về hàm lượng hydroxyprolin , biểu thị theo phần tr ă m khối lượng 11. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: - phương pháp tiến hành l ấ y mẫu, nếu biết; - phương pháp đ ã sử dụng; - kết qu ả th ử nghiệm thu được, và - nếu đáp ứng được yêu cầu độ lặp lại, th ì nêu kết quả cuối cùng thu được. Báo cáo thử nghiệm cũng cần đ ề cập đ ế n mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này , hoặc được xem là tù y ý, cùng với mọi tình huống bất thường c ó thể ảnh hưởng đến kết quả. Báo cáo thử nghiệm cũng phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu . Phụ lục A (Tham khảo) Th ư mục tài liệu tham khảo [1] ISO 3100-1 : 1991, Thịt và sản phẩm thịt. Lấy mẫu và chu ẩ n bị mẫu thử. Phần 1: Lấy mẫu . [2] ISO 5725 : 1986, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for standard tests methods by inter-laboratory tests. 1) ISO 3100-1 19 9 1 (đ ã được bi ê n so ạ n th à nh TCVN 4833-1 : 2002) . Hiện nay , ISO 3100-1 : 1991 đã b ị hủy v à được thay th ế b ằ ng ISO 17604 : 2003 (được bi ê n so ạ n thành TCVN 7925 : 2008 Vi s inh vật trong thực ph ẩ m và thức ă n chăn nuôi - Phương ph á p lấy mẫu th â n thịt tươi đ ể phân tích vi sinh vật ).