TCVN10388:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10388:2014 (EN 12138:1997) về Nước rau, quả - Xác định hàm lượng axit D-malic bằng enzym - Phương pháp đo phổ NAD TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10388:2014 EN 12138:1997 NƯỚC RAU, QUẢ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT D-MALIC BẰNG ENZYM - PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ NAD Fruit and vegetable juices - Enzymatic determination of D-malic acid content-NAD spectrometric method Lời nói đầu TCVN 10388:2014 hoàn toàn tương đương EN 12138:1997; TCVN 10388:2014 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F10 Rau quả và sản phẩm rau quả biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. NƯỚC RAU, QUẢ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT D-MALIC BẰNG ENZYM - PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ NAD Fruit and vegetable juices - Enzymatic determination of D-malic acid content-NAD spectrometric method 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qu y định phương pháp enzym để xác định hàm lượng axit D-malic tổng số trong nước rau, quả v à các sản phẩm liên quan. 2. Tài liệu viện dẫn Các t à i liệu viện dẫn sau r ấ t cần thiết cho việc áp d ụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phiên b ả n được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản m ớ i nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng đ ể phân tích trong phòng th í nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp th ử . ISO 5725:1986 1) , Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a s tandard test method by inter-laboratory tests (Độ chụm của phương pháp th ử - Xác định độ lặp lại và độ tái lập đối với phương pháp thử chuẩn bằng phép thử liên phòng thử nghiệm) . 3. Ký hiệu và chữ viết tắt Trong tiêu chuẩn này s ử dụng các ký hiệu v à chữ viết tắt sau đây: D-MDH D-Malat dehydrogenase decarboxyl NAD b -Nicotinamid-adenin-dinucleotid IU 1 đơn vị quốc tế (IU) của hoạt độ e nz ym xúc tác chuyển h ó a 1 m mol cơ chất trong 1 min ở 25 ° C trong các điều kiện chuẩn c là nồng độ chất r là nồng độ khối lượng. 4. Nguyên tắc Axit D-malic (D-malat) bị oxy hóa b ở i b -nicotinamid-adenin-dinucleotid (NA D ) với sự có mặt của D-malat dehydrogenase decarboxyl (D-MDH) thành oxaloaxetat, mà sau đó phân hủy thành pyruvat và axit cacbonic. D-malat + NAD+ D-MDH pyruvat + C O 2 + NADH + H + D Lượng NADH tạo th à nh (đo được bằng sự tăng độ hấp thụ cực t í m của dung dịch) tương đương với lượng D-malat có mặt. D-malat dehydrogenase không phải là 100 % đặc trưng cho axit D-malic. Chất này phản ứng với axit L-tartaric ở tốc độ thấp hơn nhiều. Nếu cần phải phân tích axit D-malic khi có mặt axit tartaric với nồng độ cao như trong rượu vang th ì mẫu phải được xử lý trước để loại b ỏ axit tartaric. 5. Thuốc thử 5.1. Yêu cầu chung Ch ỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích v à nước đạt loại 3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987). CHÚ TH Í CH: Có t hể t hực hiện phép t hử sử dụng các thuốc thử đơn l ẻ . 5.2. Bộ kit thử kết hợp , bộ kit thử Boehringer Mannheim 2) bao gồm: 5.2.1. Chai 1 gồm khoảng 30 ml dung dịch chứa chất đệm HEPES. (axit 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethansulfonic), pH = 9,0 và các chất ổn định. 5.2.2. Chai 2 gồm khoảng 210 mg NAD khô lạnh; 5.2.3. Ba chai D-MDH khô lạnh, mỗi chai khoảng 8 IU. 5.3. Canxi hydroxit. 5.4. Etanol khoảng 98 %. 5.5. Kali hydroxit. 6. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm v à các thiết bị, dụng cụ sau: 6.1. Pipet dùng để thử enzym , được chia độ dọc theo thân, có đầu tip phân phối dài, không chia độ. 6.2. Pipet , có độ ch í nh xác tương đương với 6.1, v í dụ: pipet mao qu ả n dịch chuyển dương. 6.3. Cuvet , bằng thạch anh, thủy tinh hoặc chất dẻo, có chiều dài đường quang 10 mm v à h ấ p thụ không đáng kể ở bước sóng 334 nm, 340 nm hoặc 365 nm. 6.4. Máy đo quang phổ vạch , có đèn thủy ngân và bộ lọ c đ ể đo ở bước sóng 365 nm hoặc 334 nm. 6.5. Máy đo quang phổ , có bước sóng thay đổi, đ ể đo ở 340 nm (có thể thay thế 6.4). 6.6. B ì nh định mức , dung t í ch 50 m l . 6.7. Bộ lọc màng , có cỡ lỗ 0,2 m m. 7. Cách tiến hành 7.1. Chuẩn bị mẫu thử 7.1. 1. Chuẩn bị mẫu th ô ng thường Thông thường các mẫu không cần xử lý trước, tuy nhiên có thể cần pha loãng và phép phân tích theo phương pháp n à y nên dựa vào th ể tích, các kết quả được biểu thị trên 1 lít mẫu. Đối với các mẫu c ô đặc, c ó thể cũng tiến hành phân tích dựa vào thể tích, sau khi pha loãng đến tỷ trọng tương đối đã biết. Trong trường hợp này, tỷ trọng tương đối phải được nêu rõ. Dựa v à o lượng mẫu đã cân v à hệ số pha loãng, các kết quả có thể cũng được biểu thị trên 1 kg mẫu. Đối với các sản phẩm có độ nhớt cao và/hoặc c ó chứa lượng thịt quả rất cao thì thường tiến hành phép xác định theo khối lượng mẫu thử. L à m trong các mẫu đục chứa nồng độ axit D-malic thấp bằng cách ly tâm trước hoặc lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,2 m m (6.7). 7.1.2. Chuẩn bị các m ẫ u thử chứa các mức axit tartaric cao Lấ y 25 ml nước qu ả v à trộn với 125 mg canxi hydroxit (5.3) và 5 ml etanol (5.4) (xấp x ỉ 98 %) trong 2 min. Ch ỉ nh pH của dung dịch đến khoảng từ 7 đến 8 bằng dung dịch kali hydroxit (5.5), chuyển định lư ợ ng vào b ì nh đ ị nh m ứ c 50 ml (6.6) và pha loãng đến vạch. Làm trong dung dịch (như trong 7.1.1) và s ử d ụ ng dung dịch trong không màu trong phép phân tích bằng enzym. 7.2. Qu y trình thử nghiệm 7.2.1. Yêu cầu chung Tiến hành phép xác định trong khoảng nhiệt độ từ 20 ° C đến 25 ° C hoặc nhiệt độ không đổi trong khoảng từ 25 ° C đến 37 ° C để thu được các kết quả tương tự. Độ hấp thụ tối đa của NADH là ở bư ớ c sóng 340 nm. Khi sử dụng máy đo phổ có bước sóng thay đổi (6.5) t hì ch ỉ đo ở bước sóng có độ h ấ p thụ tối đa. Khi sử dụng máy đo quang phổ vạch có đèn bay hơi thủy ng â n (6.4) th ì đo ở bước sóng 334 nm hoặc 365 nm. Không sử dụng pipet phân phối một vạch để lấy dung dịch. Có thể dùng pipet tự động thích hợp đ ể b ổ sung các dung dịch enzym, co-enzym và dung dịch đệm. Sử dụng pipet dùng cho phép thử enzym (6.1) hoặc pipet tương đương (6.2) để lấy dung dịch mẫu. Nên dùng axit D-malic làm dung dịch chuẩn trong phép thử này. 7.2.2. Dung d ịch thử trắng Dùng pipet l ấ y 1,00 ml chất đệm HEPES (5.2.1), 0,10 ml dung dịch NAD (5.2.2), 1,80 m l nước cho vào cuvet. Trộn và sau 6 min, đọc độ hấp thụ (A 1 m ẫ u t rắng ) so với không khí (không có cuvet trong đường quang). 7.2.3. Dung dịch mẫu thử Dùng pipet l ấy 1,00 ml chất đệm HEPES (5.2.1), 0,10 ml dung dịch NAD (5.2.2), 1,70 ml nước và 0,10 ml dung dịch mẫu thử cho vào cuvet. Trộn và sau 6 min, đ ọ c độ hấp thụ (A 1mẫu thử ) so với không khí (không có cuvet trong đường quang). 7.2.4. Ph ả n ứng enzym và phép định lượng Khi bổ sung 0,05 ml dung dịch D-MDH (5.2.3) vào từng dung dịch nêu trong 7.2.2 và 7.2.3 thì phản ứng b ắ t đầu xảy ra. Trộn và đợi cho đến khi kết thúc ph ả n ứng (khoảng 20 min) và đọc độ hấp thụ (A 2 ) của dung dịch so với không khí. Nếu phản ứng chưa kết thúc sau 20 min th ì cứ sau 5 min tiếp tục đ ọ c độ hấp thụ cho đến khi độ hấp thụ tăng với t ố c độ không đ ổ i và ngoại suy ngược lại kể từ khi thêm dung d ịch D-MDH enzym cuối cùng. (Qu y tr ì nh này cho phép có ph ả n ứng phụ và được gọi là phản ứng trượt nêu trong Phụ lục A). 8. Tính kết quả Dựa v à o phản ứng của phép xác định, có tỷ lệ tuyến tính giữa lượng NADH tạo thành (có chênh l ệ ch độ h ấ p thụ) và nồng độ axit D-malic, được t í nh theo C ô ng thức (1): D A = ( A 2 - A 1 ) mẫu thử - ( A 2 - A 1 ) mẫu trắng (1) T í nh nồng độ chất trong dung d ịch pha loãng bằng cách đo độ hấp thụ theo đ ị nh luật Beer-Lambert. Hàm lượng axit D-malic của mẫu (tính bằng gam trên lít), tính được theo Công thức (2): (2) Trong đó: M l à khối lượng phân tử của axit D-malic (134,09 gmol - 1 ); V là tổng thể tích của dung d ịch thử trong cuvet, tính bằng mililit (ml); v là th ể t í ch mẫu, t í nh bằng mililit (ml); d là chiều d à i đường quang của cuvet, tính bằng centimet (cm); e là hệ s ố tắt của NADH: ở bước sóng 340 nm = 6,3 ( l .mmol - 1.cm - 1) ở bước sóng 365 nm = 3,4 ( l .mmol - 1.cm - 1) ở bước sóng 334 nm = 6 , 18 ( l .mmol - 1.cm - 1 ) Nếu sử dụng các thể tích nêu trong 7.2 th ì axit D-malic, tính bằng gam trên l í t (g/l), theo Công thức (3): (3) Cần tính đ ế n mọi hệ số pha loãng và mối liên hệ với khối lượng hoặc thể tích trong phép tính cuối cùng. Nếu sản phẩm đặc đã được pha loãng đến nồng độ đơn (nồng độ ban đầu) thì phải ghi lại tỷ trọng tương đối của mẫu có nồng độ đơn đó. Báo cáo hàm lượng axit D-malic bằng gam trên lít (g/l) đến một chữ số thập phân. 9. Độ chụm Chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục B. Các giá t rị thu được từ các phép thử liên phòng thử nghiệm này có th ể không áp dụng được cho các d ả i nồng độ v à nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu trong Phụ lục B. 9.1. Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do cùng một người phân tích, sử dụng cùng một thiết b ị , trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r . Độ lặp lại là: r = 2,03 + 0,044 x r ( axi t D-ma l ic) m g/ l Trong đó: r ( axi t D-ma l ic) là hàm lượng đo được 9.2. Độ tái l ậ p Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do hai phòng thử nghiệm phân tích, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R . Độ tái lập là: R = 6,46 + 0,108 x r ( axi t D-ma l ic) mg/l Trong đó r ( axi t D-ma l ic) l à hàm lượng đo được. 10. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm: - mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, ký hiệu); - viện dẫn tiêu chuẩn này; - ngày v à phương pháp lấy mẫu (nếu biết); - ngày nhận mẫu; - ngày thử nghiệm; - k ế t quả thử nghiệm và các đơn vị biểu thị; - độ lặp lại của phương pháp đã được đánh giá; - các điểm cụ th ể quan sát được trong quá tr ì nh thử nghiệm; - mọi thao tác không qu y định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường c ó thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm. Phụ lục A (Tham khảo) Thông tin về việc xử lý các phản ứng “trượt” Ph ả n ứng "trượt" là do ph ả n ứng phụ của enzym, khi c ó mặt của các enzym khác trong nền mẫu, hoặc tác động tương hỗ của một hoặc nhiều thành phần nền mẫu với đồng hệ số của ph ả n ứng enzym. Trong ph ả n ứng thông thường độ h ấ p thụ giữ nguyên giá trị không đ ổ i sau thời gian ch í nh phụ thuộc v à o tốc độ của ph ả n ứng của loại enzym cụ th ể , điển hình từ 10 min đến 20 min. Tuy nhiên, khi xuất hiện ph ả n ứng phụ thì độ hấp thụ không đạt đến giá trị ổ n định nhưng tăng đều theo thời gian và qu y tr ì nh này thường được gọi l à phản ứng “trượt ” . Nếu có ph ả n ứng phụ xảy ra thì độ hấp thụ của dung dịch sẽ đo được ở khoảng cách đều nhau (2 min đến 5 min) sau thời gian cần để dung dịch chuẩn đạt đến độ hấp thụ cuối cùng. Khi độ hấp thụ tăng với t ố c độ không đổi th ì lấy 5 số đọc đến 6 số đọc và sau đ ó ngoại suy bằng đồ thị hoặc phép toán học đối với độ hấp thụ của dung dịch c ó ở một điểm khi enzym cuối dùng được thêm vào ( T 0 ). Sử dụng chênh lệch độ hấp thụ ( A f - A i ) để t í nh nồng độ cơ chất. H ì nh A.1 - Phản ứng trượt Phụ lục B ( Tham khảo) Các kết quả thống kê của phép thử liên phòng thử nghiệm Các thông số sau đây thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp v ớ i ISO 5725:1986 (Đối với tài l iệu liên quan đến phương pháp, xem Thư mục tài liệu tham khảo). Phép thử do Hiệp hội Qu ả quốc tế, Paris, Pháp tổ ch ứ c thực hiện. Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm 1991 Số lượng các phòng thử nghiệm 24/18 Số lượng mẫu 3 c ó b ổ sung axit D-malic Loại mẫu: A nước cam; B nước táo; C nước nho đỏ. Bảng B.1 - Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm M ẫ u A B C Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ ngoại lệ 19 24 15 Số lượng ph ò ng thử nghiệm ngoại lệ 5 - 3 S ố lượng các kết quả được chấp nhận 77 101 61 Giá trị trung b ì nh ( ) (mg/l) 80,3 98,2 514,4 Độ lệch chuẩn lặp lại ( s r ) (mg/l) 1,62 2,64 8,75 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại ( RSD r ) [%] 2 , 0 2 , 7 1,7 Giới hạn lặp lại ( r ) (mg/l) 4,5 7 , 5 24,8 Độ lệch chuẩn tái lập ( s R ) (mg/l) 4 , 90 6,53 21,87 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập ( RSD R ) [%] 6,1 6 , 8 4 , 3 Gi ớ i hạn tái l ậ p ( R ) (mg/l) 13 , 7 18 , 5 61,9 CHÚ THÍCH : Có mối liên hệ t uy ế n t í nh giữa r, R và hàm lượng r . THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] D-Malic acid enzymatic method: Official Journal of the European Communities, L 272, Volume 33, pages 106 - 108, p u slished 3.10.90 [2] Determination of the D-malic acid content: No. 64, 1994. In: The coll e cted Analyses of the International Fede r ation of F ruit Juice Producers . Loose-leaf edition, as of 1996-Zug: Swiss Fruit Union. [3] Methods of e nz y m atic food analysis, Boehringer Mannheim. 1) ISO 5725 : 1986. Pr e cision of t est methods - Determination o f repeatability and reproduci bi li t y f o r a s t andar d tes t me thod by in t er-laboratory t es t d ù ng để thu được dữ liệu v ề độ chụm. Tiêu chuẩn n à y đ ã h ủ y và được thay bằng bộ tiêu chuẩn ISO 5725 (gồm 6 phần) v à đã được ch ấ p nh ậ n thành bộ TCVN 6910 (ISO 5725). 2) Boeh ri nger Mannheim l à v í dụ v ề s ả n phẩm t h í ch hợp có b á n sẵn. Th ô ng tin đưa ra tạo thuận lợi cho người s ử d ụng ti ê u chuẩn n à y và kh ô ng ấ n định ph ả i sử d ụng chúng.