TCVN8685-13:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-13:2014 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 13: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS) TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8685-13:2014 QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 13: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRS) Vaccine testing procedure - Part 13: Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine, Inactivated Lời nói đầu TCVN 8685-13:2014 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 13: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRS) Vaccine testing procedure - Part 13: Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine, Inactivated 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định yêu cầu kỹ thuật để kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh s ả n ở lợn. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối v ớ i các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 8684:2011, V ắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết. 3. Lấy mẫu sản phẩm và chuẩn bị động vật thí nghiệm 3.1. Lấy mẫu sản phẩm: Lấy mẫu s ả n phẩm theo quy định trong bảng như sau: S ố lượng mẫu vắc xin và chế phẩm sinh học cần l ấ y Quy cách đóng gói (ml) Số lượng mẫu lấy (sản phẩm ) Cho tới 100 Từ 7 đến 10 Trên 100 Từ 5 đến 7 3.2 . Chuẩn bị động vật thí nghiệm - 11 con lợn từ 3 đến 4 tuần tuổi, kh ỏ e mạnh, âm tính với kháng thể kháng vi rút hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản; - 3 con th ỏ khỏe mạnh có khối lượng từ 1,8 kg đến 2 kg; - 15 con chuột lang c ó khối lượng từ 300 g đến 350 g; - 5 con chuột nhắt trắng c ó khối lượng từ 15 g đến 20 g. 4. Cách tiến hành 4.1. Kiểm tra cảm quan Kiểm tra bằng mắt thường: Vắc xin đồng nhất, không đông vón, không lắng cặn. 4.2. Ki ể m tra độ thu ầ n khiết: Theo TCVN 8684:2011. 4.2.1. Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn. 4.2.2. Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc. 4.3. Kiểm tra tính an toàn 4.3.1. Phương pháp trọng tài Tiêm cho 3 con lợn, mỗi con 2 liều vắc xin ghi trên nhãn. Theo dõi lợn trong 21 ngày. Vắc xin được coi là đạt nếu tất cả lợn sống khỏe mạnh, không có ph ả n ứng cục bộ, có thể có phản ứng sốt nhẹ (tăng 0,5 ° C sau khi tiêm từ 3 đến 5 ngày). 4.3.2. Phương pháp thay thế Sử dụng cả 3 phương pháp sau: - Tiêm xoang bụng cho 5 con chuột nhắt trắng, mỗi con 0,5 ml vắc xin; - Tiêm bắp cho 3 con chuột lang, mỗi con 2 ml vắc xin; - Tiêm bắp cho 3 con thỏ, mỗi con 2 ml vắc xin; Theo dõi trong 7 ngày, vắc xin được coi là đạt nếu tất cả động vật sống khỏe mạnh, không có phản ứng cục bộ hay ph ả n ứng toàn thân. 4.4 . Kiểm tra hiệu lực 4.4.1. Phương pháp trọng tài 4.4.1.1. Gây miễn dịch Tiêm cho 5 con lợn, mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn. 3 con lợn đối chứng không tiêm vắc xin. 28 ngày sau mũi tiêm cuối cùng, 5 con lợn được tiêm và 3 con lợn đối chứng được tiến hành lấy máu v à công cường độc bằng ch ủ ng vi rút gây hội chứng rối loạn hô h ấ p và sinh sản được phân lập tại Việt Nam. Theo dõi 21 ngày sau công cường độc. 4.4.1.2. Các ch ỉ tiêu đánh giá hiệu lực 4.4.1.2.1. Đánh giá kết quả công cường độc Tiến hành theo Phụ lục A. - Lô miễn dịch: 100 % lợn sống khỏe mạnh, có thể có biểu hiện sốt nhẹ, kém ăn, chảy nước mũi sau công cường độc khoảng 3 đến 5 ngày, sau đ ó tr ở lại bình thư ờ ng. - Lô đối chứng: Lợn chết vì hội chứng PRRS hoặc có triệu chứng, bệnh tích điển h ì nh của hội ch ứ ng PRRS. 4.4.1.2.2. Đánh giá hiệu giá kháng th ể hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản bằng phản ứng ELISA Lấy máu, thu huyết thanh tại các thời điểm 0 và 21 ngày sau công cường độc. Đánh giá hàm lượng kháng thể bằng phản ứng ELISA. Kết quả: Đánh giá theo bộ kit được sử dụng. 4.4.1.2.3. Đánh giá hiệu giá kháng thể hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản bằng phản ứng miễn dịch có gắn men trên tế bào 1 lớp (IPMA - Immunoperoxidase monolayer assay) Lấy máu, thu huyết thanh tại các thời điểm 0 và 21 ngày sau công cường độc. Đánh giá hàm lượng kháng thể bằng ph ả n ứng IPMA theo Phụ lục B. Kết quả: Hiệu giá kháng th ể ³ 1/640 (tại thời điểm 21 ngày sau công cường độc): Đạt bảo hộ. 4.4.1.3. Đánh giá kết quả Vắc xin được coi là đạt nếu đáp ứng được 3 ch ỉ tiêu nêu trên. 4.4.2. Phương pháp thay thế Tiêm bắp cho 10 con chuột lang, mỗi con 1 ml vắc xin ghi tr ê n nhãn. 2 con chuột đối chứng không tiêm vắc xin. Sau 3 tuần tiêm lại lần 2 với một liều tương tự lần 1. 14 ngày sau mũi tiêm lần 2, chuột được tiêm và chuột đối chứng được lấy máu và tiến hành làm phản ứng trung hòa với ch ủ ng vi rút tương ứng. Vắc xin được coi là đạt nếu: + 2 mẫu huyết thanh của chuột đối chứng âm tính; + 10 mẫu huyết thanh của chuột được tiêm đạt nếu cho kết quả trung hòa huyết thanh 1/8 tr ở lên. PHỤ LỤC A (Quy định) Phương pháp chuẩn độ vi rút TCID 50 (Chuẩn độ vi rút xác định liều công cường độc) A.1 . Chuẩn bị tế bào MARC-145 trên đĩa 96 giếng Tế bào MARC-145 được trypsin hóa thành huyễn dịch có mật độ 5 x 10 3 tế bào/ml. Cho 100 μl huyễn dịch tế b à o trên vào tất c ả các giếng. Đậy nắp, ủ tế bào ở 37 ° C có 5 % C O 2 , theo dõi h à ng ngày. Khi quan sát thấy tế bào bám đáy trên 80 % th ì tiến hành chuẩn độ vi rút. A.2 . Chuẩn độ vi rút - Lấy ống vi rút. - Pha loãng vắc xin trong ống nghiệm theo cơ số 10 bằng môi trường nuôi cấy tế bào từ 10 - 1 đến 10 - 6 hoặc thấp hơn tùy theo cách bố trí thí nghiệm (xem Hình A.1). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B 10 -1 10 -1 10 -1 10 -1 10 -1 ĐCTB C 10 - 2 10 - 2 10 - 2 10 - 2 10 - 2 ĐCTB D 10 - 3 10 - 3 10 - 3 10 - 3 10 - 3 ĐCTB E 10 -4 10 -4 10 -4 10 -4 10 -4 ĐCTB F 10 - 5 10 - 5 10 - 5 10 - 5 10 - 5 ĐCTB G 10 - 6 10 - 6 10 - 6 10 - 6 10 - 6 ĐCTB H Hình A.1 - Sơ đồ bố trí phản ứng chuẩn độ vi rút trên tế bào - Lấy đ ĩ a tế bào MARC-145 đã nuôi, loại bỏ môi trường cũ. - Rửa tế bào bằng dung dịch PBS (-), 200 μl/giếng, sau đ ó l o ại bỏ dung dịch PBS (-). - Hút 100 μl huyễn dịch vi rút đã pha lo ã ng lần lượt vào các giếng tương ứng trên đ ĩ a tế bào (từ B1 đến G5), d ã y đối chứng tế bào (từ B6 đến G6), cho 100 μl môi trường duy trì vào mỗi giếng. - Ủ tế bào ở 37 ° C trong môi trường có 5 % C O 2 trong 30 min. - Loại b ỏ huyễn dịch trong các giếng. - Rửa tế báo bằng dung dịch PBS (-), 200 μl/giếng, loại b ỏ dung dịch PBS (-). - Cho 200 μl môi trường duy tr ì vào mỗi giếng. - Nuôi tế bào ở 37 ° C trong môi trường có 5 % C O 2 , theo dõi hàng ngày, trong 5 ngày. - Đọc kết quả: giếng có bệnh tích tế bào là dương tính. A.3 . T í nh kết quả Theo công th ứ c tính Spearman-Karber: λ . TCID 50 (0,1 m l ) = X + 1/2 - ( N x / n ) Trong đó: X l à logarit cơ số 10 của độ pha loãng vi rút có 100 % giếng xuất hiện bệnh tích tế b à o; N x là tổng số giếng có bệnh tích tế bào trong thí nghiệm; n l à số giếng của mỗi độ pha loãng; λ là độ pha loãng vi rút. PHỤ LỤC B (Quy định) Phương pháp phản ứng miễn dịch có gắn men trên tế bào 1 lớp (IPMA) B.1 . Cấy giống các đại thực bào trên đĩa phản ứng - Giải đông một chai chứa 6 x 10 7 đại thực bào/1,5 ml. - Rửa tế bào một lần với 50 ml PBS và ly tâm dịch ch ứ a tế bào này trong 10 min ở 300 g (nhiệt độ phòng). - Thu tế bào b ằ ng 40 ml môi trường RPMI 1640 (được bổ sung 5% dung dịch FBS, 100 IU penicillin và 100 μg streptomycin). - Chia 100 μ l dịch ch ứ a tế bào này vào từng giếng của một đĩa . - Ủ đĩa tế bào từ 18-24 h ở 37° C trong môi trường có 5 % C O 2 . B.2 . Gây nhiễm các tế bào bằng vi rút PRRS - Cho vào từng giếng 50 μl dung dịch chứa vi rút nồng độ 10 5 TCID 50 /ml, để lại hai giếng làm đối chứng. - Ủ đĩa này trong 18-24 h, ở 37° C trong môi trường có 5 % C O 2 B.3 . Cố định các tế bào - Bỏ môi trường nuôi cấy và rửa đĩa một lần trong PBS- - Gõ nhẹ đĩa v à o giấy thấm để loại b ỏ dịch thừa và sau đó để khô đĩa trong 45 min ở 37 ° C . - Làm lạnh đĩa trong 45 min ở -20 ° C . - Ủ đĩa tế bào trong 10 min ở nhiệt độ phòng với para f ormaldehyd 4%. - Bỏ para f ormaldehyd và rửa đĩa một lần trong PBS- B.4 . Chuẩn bị pha loãng huyết thanh - Cho 180 μl của NaC l 0,5 M với 4 % huyết thanh ngựa và 0,5 % T w een 80, có pH 7,2 vào từng giếng của các hàng A và E của đĩa. - Chia 120 μl dung dịch đệm vào tất cả các giếng khác. - Pha 20 μ l huyết thanh xét nghiệm hay huyết thanh đối chứ n g vào các giếng của các hàng A và E (độ pha loãng 1/10), và lắc đều. - Pha loãng huyết thanh bốn lần bằng chuyển 40 μl từ các hàng A và E sang các h à ng B và F, và tiếp tục, để cho ra các độ pha loãng 1/40, 1/160 và 1/640. B.5 . Ủ huyết thanh trong đĩa đã có đại thực bào c ố định - Chuyển 50 μl từ mỗi giếng của đĩa đệm vào các giếng tương ứng của đ ĩ a đã có đại thực bào cố định. Đậy đĩa và ủ trong 1 h ở 37 ° C . - Bỏ dung dịch huyết thanh và rửa đĩa ba lần bằng dung dịch NaC l 0,15 M và T w een 80 nồng độ 0,5 %. B.6 . Ủ với dung dịch conjugate - Pha loãng HRPO co nj ugate (th ỏ kháng lợn) thành độ pha loãng xác định trước trong dung dịch NaC l 0,15 M và Tween 80 nồng độ 0,5 %. Thêm 50 μl dịch pha loãng này v à o từng giếng của đĩa. Đậy và ủ trong 1 h ở 37 ° C . Rửa đĩa ba lần. B.7 . Phương pháp nhuộm - Chia 50 μl dung dịch chất AEC (3-amino-9-ethy l carbazole) đã lọc v à o các giếng của đĩa. - Ủ với dung dịch AEC này trong 30 min ở nhiệt độ phòng. - T hay thế dung dịch AEC bằng 50 μl natri acetat 0,05 M, có pH 5,0. B.8 . Đọc và gi ải thích các kết quả - Nếu các kháng thể có trong huyết thanh xét nghiệm, cytoplasm của khoảng 30 % đến 50 % các tế bào trong một giếng được nhuộm màu đ ỏ đậm b ở i chất nhiễm sắc. Huyết thanh âm tính được nhận biết do cytoplasm vẫn không bắt m à u. Huyết thanh có phản ứng không đặc hiệu sẽ nhuộm màu tất cả các tế bào trong một giếng (so sánh với huyết thanh dương t í nh đối chứng). - Hiệu giá của huyết thanh được thể hiện là mẫu số của độ pha loãng cao nhất mà nhuộm màu 50 % tế bào hay nhiều hơn trong các giếng. - Huyết thanh với hiệu giá <10 được coi là âm t í nh. - Huyết thanh với hiệu giá từ 10 đến 40 được coi là dương tính yếu. Thư ờ ng màu nhuộm không đặc hiệu được phát hiện thấy ở những độ pha loãng này. - Huyết thanh với hiệu giá ³ 160 được coi l à dương tính. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Chapter 2.8.7: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, OIE Terrestrial Manual 2010