TCVN11395:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11395:2016 (ISO/TS 17919:2013) về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm – Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm – Phát hiện clostridia sinh độc tố thần kinh botulinum typ A,B,E và F TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11395:2016 ISO/TS 17919:2013 VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN CLOSTRIDIA SINH ĐỘC TỐ THẦN KINH BOTULINUM TYP A, B, E VÀ F Microbiology of the food chain - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Detection of botulinum type A, B, E and F neurotoxin-producing c lostridia Lời nói đầu TCVN 11395:2016 hoàn toàn tương đương với I SO/TS 17919:2013; TCVN 11395:2016 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN CLOSTRIDIA SINH ĐỘC TỐ THẦN KINH BOTULINUM TYP A, B, E VÀ F Microbiology of the food chain - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Detection of botulinum type A, B, E and F neurotoxin-producing c lostridia 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sinh học phân tử phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện c lostridia mang các gen độc tố thần kinh botu li num A, B, E và F. Phương pháp này phát hiện được các typ gen và không phát hiện các độc tố, do đó khi cho kết quả dương tính thì không có nghĩa là độc tố này có mặt trong mẫu được kiểm tra. Tiêu chuẩn này áp dụng cho các sản phẩm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và các mẫu môi trường. Các phép thử PCR để phát hiện các trình tự gen mã hóa các typ độc tố cụ thể được nêu trong Phụ lục B và Phụ lục E. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đ ổ i, bổ sung (nếu có). TCVN 6404 (ISO 7218) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chu ẩ n bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 1: Các nguyên tắc chung đ ể chuẩn bị huyền phù ban đ ầ u và các dung dịch pha loãng thập phân TCVN 8128 (ISO 11133), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và kiểm tra hiệu năng của môi trường nuôi cấy TCVN 7682 (ISO 20838) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp định tính TCVN 11134 (ISO 22174), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực ph ẩ m - Định nghĩa và yêu cầu chung ISO 20837, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Requirements for sample preparation for qualitative detection [Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về chu ẩ n bị mẫu để phát hiện định t í nh] . 3 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa nêu trong TCVN 11134 (ISO 22174). 4 Ký hiệu và chữ viết tắt 4.1 Ký hiệu c là nồng độ cơ chất; r là nồng độ khối lượng; j là phần thể tích; w là phần khối lượng. 4.2 Chữ viết tắt BoNT là độc t ố thần kinh botulinum. 5 Nguyên tắc 5.1 Yêu cầu chung Phương pháp này bao gồm các bước sau đây: a) tăng sinh vi khuẩn (xem 5.2); b) tách chiết axit nucleic (xem 5.3); c) khuếch đại (xem 5.4); d) phát hiện các sản phẩm PCR (xem 5.5); e) khẳng định (xem 5.6). CHÚ THÍCH: Real-time PCR kết hợp các bước từ c) đến e). 5.2 Tăng sinh vi khuẩn S ố lượng BoTN của clostridia (bào t ử hoặc tế bào sinh dưỡng) cần phát hiện được tăng l ê n bằng cách kích thích nẩy mầm và cho phát triển trong môi trường dinh dưỡng lỏng không chọn lọc (canh thang dịch chiết nấm men trypton-peptose-glucose) trong các điều kiện kỵ khí. 5.3 Tách chiết axit nucleic Tế bào sinh dưỡng được tách ra khỏi môi trường dinh dưỡng, được dung giải và các axit nucleic được tách chiết để sử dụng trong phản ứng PCR. 5.4 Khuếch đại bằng PCR Axit nuc l eic đã chiết được chuyển vào hỗn hợp PCR và khuếch đại trong máy chu trình nhiệt. 5.5 Phát hiện các sản phẩm PCR Các sản phẩm PCR được ph á t hiện bằng điện di gel hoặc phương pháp thay thế thích hợp. 5.6 Khẳng định Việc nhận biết các sản phẩm PCR cần được khẳng định bằng phương pháp thích hợp, ví dụ: phân tích trình tự, lai hoặc phân tích giới hạn. 6 Thuốc thử 6.1 Yêu cầu chung Đối với tất cả các bước từ b) đến e) trong 5.1, chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và thích hợp cho ứng dụng sinh học phân tử như quy định trong ISO 20837 và TCVN 7682 (ISO 20838). Áp dụng các yêu c ầ u về thuốc thử quy định trong Điều 5 của TCVN 7682 (ISO 20838). 6.2 Môi trường nuôi cấy 6.2.1 Yêu cầu chung Thực hiện theo TCVN 8128 (ISO 11133) về việc chuẩn bị, sản xuất và thử hiệu năng môi trường nuôi cấy. 6.2.2 Dịch pha loãng Thực hiện theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và phần có li ên quan trong TCVN 6507 (ISO 6887) đối với sản phẩm cần phân tích. 6.2.3 Môi trường nuôi cấy tăng sinh không chọn lọc, canh thang dịch chiết nấm men trypton- pepton-glucose (canh thang TPGY) (xem Tài liệu tham khảo [7]). 6.2.3.1 Yêu cầu chung Có thể sử dụng môi trường nuôi cấy tăng sinh không chọn lọc đã được công nhận nếu cho hiệu năng tương đương. 6.2.3.2 Thành phần và độ pH Trypton 50 g Pepton 5 g Chất chiết nấm men 20 g D-Glucose 4 g Natri thioglycolat, HSCH 2 COONa 1 g Nước đến 1000 ml pH 7,0 ± 0,2 6.2.3.3 Chuẩn bị Hòa tan các thành ph ầ n trên trong nước bằng cách đun sôi. Sau khi khử trùng, chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ở 25 ° C . Phân phối môi trường này vào các bình hoặc lọ có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min ở 121 ° C . Bảo quản trong tủ lạnh ở 5 ° C ± 3 ° C . Không sử dụng môi trường sau khi chuẩn bị 4 tuần. 6.2.4 Canh thang đệm TPGY ch ỉ để dùng cho thực phẩm axit và axit hóa 6.2.4.1 Dung dịch gốc (đệm phosphat) 6.2.4.1.1 Dung dịch 1 Natri dihydro phosphat ngậm một phân tử nước [NaH 2 P O 4 .H 2 O ] 138 g Nước đến 1000 ml 6.2.4.1.2 Dung dịch 2 Dinatri hydro phosphat [Na 2 HP O 4 ] 142 g Nước đến 1000 ml 6.2.4.1.3 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Cho dung dịch 2 vào 250 ml dung dịch 1 cho đến khi pH đạt 7,2. Bảo quản trong tủ lạnh ở 5 ° C ± 3 ° C . 6.2.4.2 Chuẩn bị môi trường hoàn chỉnh Hòa tan các thành phần cơ bản (6.2.3.2) trong 500 ml nước bằng cách đun sôi. Thêm 100 ml dung dịch đệm phosphat (6.2.4.1). Nồng độ phosphat cuối cùng trong môi trường hoàn chỉnh là 0,1 mol/l. Thêm nước đến 1000 ml. Phân phối môi trường hoàn chỉnh này vào các bình hoặc lọ có dung tích thích hợp. Phân phối môi trường này vào các bình hoặc lọ có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min ở 121 ° C . Bảo quản trong tủ lạnh ở 5 ° C ± 3 ° C . Không sử dụng môi trường sau khi chuẩn bị 4 tuần. 6.3 Chiết axit nucleic 6.3.1 Cloro f orm , CHC l 3 6.3.2 Etanol , j ( C 2 H 5 OH) = 96 %. 6.3.3 Muối dinatri của axit etylendiamintertra axetic (Na 2 EDTA) , C 10 H 14 N 2 O 8 Na 2 . 6.3.4 Hexadecyl (trimetyl) amoni bromua [(cetyl(tr i metyl) amoni bromua, CTAB ], C 19 H 42 BrN 6.3.5 Axit clohydric , j ( HC l ) = 37 % 6.3.6 Isopropanol, CH 3 CH(OH)CH 3 6.3.7 Proteinase-K , khoảng 20 đơn vị/mg đ ô ng khô. 6.3.8 Natri clorua , NaC l . 6.3.9 Natri hydroxit , NaOH. 6.3.10 Tris(hydroxymetyl)aminometan (tris) , C 4 H 11 N O 3 6.3.11 Dung dịch đệm chiết CTAB , r (CTAB) = 20 g/l, c (NaC l ) = 1,4 mol/l, c (tris) = 0,1 mol/l, c (Na 2 EDTA) = 0,02 mol/l Chỉnh pH đến 8,0 bằng HC l hoặc NaOH. 6.3.12 Dung dịch đệm kết tủa CTAB , r (CTAB) = 5 g/l, c (NaC l ) = 0,04 mol/ l 6.3.13 Dung dịch natri clorua , c (NaC l ) = 1,2 mol/l. 6.3.14 Dung dịch etanol , j ( C 2 H 5 OH) = 70 % 6.3.15 Dung dịch proteinase-K , r = 20 mg/ml, được hòa tan trong nước vô trùng. Không hấp áp lực. Bảo quản ở - 20 ° C , nhưng không tái cấp đông và rã đông. 6.3.16 Dung dịch đệm Tris-EDTA (TE) , c (tris) = 0,01 mol/l, c (Na 2 EDTA) = 0,001 mol/l Chỉnh pH đến 8,0 bằng HC l hoặc NaOH. 6.4 Thuốc thử dùng cho PCR 6.4.1 ADN polymerase bền nhiệt , theo quy định trong TCVN 7682 (ISO 20838) và TCVN 11134 (ISO 22174). 6.4.2 Deoxyribonucleosid triphosphat (dNTP) chứa dATP, dCTP, dGTP và dTTP hoặc dUTP như quy định trong TCVN 7682 (ISO 20838) và TCVN 11134 (ISO 22174). 6.4.3 Dung dịch đệm PCR , theo quy định trong TCVN 7682 (ISO 20838) và TCVN 11134 (ISO 22174) Thông thường dung dịch đệm PCR được cung cấp cùng với ADN polymerase, có thể có hoặc không có MgC l 2 ở nồng độ do nhà sản xuất quy định. Nồng độ MgC l 2 cu ố i cùng được quy định theo phương pháp cụ thể và được nêu trong các phụ lục. Cũng có thể dùng thuốc thử có bán sẵn. Nếu không, tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 6.4.4 Mồi và đầu dò Các mồi và đầu dò để phát hiện đặc hiệu các trình tự gen độc tố thần kinh được nêu trong các Phụ lục B và Phụ lục C . 7 Thiết bị, dụng cụ 7.1 Yêu cầu chung Sử dụng các thiết b ị , dụng cụ thông thường của phòng th ử nghiệm vi sinh [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau: 7.2 Dụng cụ để chu ẩ n bị mẫu trước khi tăng sinh 7.2.1 Nồi cách thủy , có thể duy trì ở 50 ° C ± 1 ° C . 7.2.2 Máy ly tâm , để ly tâm các ống nghiệm 50 ml và 100 ml, có thể thay đổi gia tốc đến 12 000 x g 7.2.3 Bộ lọc màng , có màng nitrocellulose, cỡ lỗ 0,45 m m. 7.2.4 Ố ng ly tâm , dung tích 50 ml và 100 ml. 7.3 Thiết bị dùng cho tăng sinh vi khuẩn 7.3.1 Nồi cách thủy , có thể duy trì 30 ° C ± 1 ° C , 65 ° C ± 1 ° C và 100 ° C ± 1 ° C . 7.3.2 Bình k ỵ khí hoặc t ủ kỵ khí , có thể duy trì ở 30 ° C ± 1 ° C , phù hợp với TCVN 6404 (ISO 7218). 7.3.3 Tủ ấm , có thể duy trì ở 30 ° C ± 1 ° C 7.3.4 Bình hoặc chai có dung tích thích hợp. 7.4 Dụng cụ dùng để chiết axit nucleic Sử dụng các dụng cụ thích hợp trong ISO 20837 và như sau: 7.4.1 Ống ly tâm , dung tích 1,5 ml và 2,0 ml. 7.4.2 Bộ khuấy trộn sử dụng nhiệt (thermoblock) , có thể trộn với tốc độ từ 300 r/min đến 1 400 r/min. 7.4.3 Pipet chia vạch và pipep có đầu lọc , có thể tích từ 1 m l đến 1 000 m l. 7.4.4 Máy ly tâm , dùng cho các ống phản ứng có dung tích 1,5 ml và 2,0 ml, ví dụ: ống ly tâm nhỏ, có thể đạt gia tốc đến 12 000 x g . 7.4.5 Bộ trộn , ví dụ: kiểu Vortex. 7.5 Dụng cụ dùng cho PCR Sử dụng các dụng cụ thích hợp đối với phương pháp và cụ thể như sau: 7.5.1 Pipet và pipet có đ ầ u lọc , dung tích từ 1 m l đến 1 000 m l 7.5.2 Ố ng ly tâm nhỏ , dung tích 1,5 ml và 2,0 ml. 7.5.3 Ố ng PCR , ống phản ứng 0,2 ml hoặc 0,5 ml, đĩa nhiều giếng PCR hoặc loại thích hợp khác. 7.5.4 Máy chu trình nhiệt 7.6 Thiết bị dùng để phát hiện các sản phẩm PCR Sử dụng thiết bị thích hợp với phương pháp và cụ thể như sau: 7.6.1 PCR gel 7.6.1.1 Hệ thống điện di gel ngang 7.6.1.2 Nguồn cung cấp điện 7.6.1.3 Máy chiếu tia UV hoặc hộp đèn UV 7.6.1.4 Hệ thống ghi dữ liệu gel 7.6.2 Máy real time PCR 7.6.2.1 Máy chu trình nhiệt rea l time PCR 7.6.2.2 Bộ phát hiện và ph ầ n mềm phân tích thích hợp. 8 Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến việc lấy mẫu sản phẩm thì các bên có liên quan cần thống nhất về việc l ấ y mẫu. Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện của sản phẩm và không b ị hư hỏng hoặc bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản. 9 Cách tiến hành 9.1 Chuẩn bị mẫu trước khi tăng sinh 9.1.1 Yêu cầu chung Xem Hình A.1. Nên phân tích ít nhất 25 g, đặc biệt là đối với các mẫu mật ong, tuy nhiên, nếu nguồn mẫu bị hạn chế thì có thể sử dụng cỡ mẫu nhỏ hơn. 9.1.2 Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị và đồng h ó a mẫu theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và các phần có liên quan trong TCVN 6507 (ISO 6887) [9]-[ 13 ] đối với mẫu cần phân tích. 9.1.3 Chuẩn bị mẫu mật ong Đặt lọ đựng mật ong vào nồi cách thủy (7.2.1) ở 50 ° C ± 1 °C trong 30 min để cho mật ong tan chảy. Đảo chiều lọ vài lần để trộn mẫu. Cân 25 g ± 2 g mật ong cho vào ống ly tâm vô trùng dung tích 100 ml (7.2.4) và thêm ít nhất 50 ml nước cất hoặc nước đã khử ion có chứa 1 % phần thể tích polysorbate 80 đã được l à m nóng trước đến 50 °C ± 1 ° C . Trộn cho đến khi dung dịch đồng nhất. Ly tâm hỗn hợp ở 12 000 x g (7.2.2) trong 30 min. Cẩ n thận lấy phần nổi phía trên và lọc qua màng lọc 0,45 m m (7.2.3). Trong trường hợp bộ lọc bị tắc, cho phần hỗn hợp còn lại qua bộ lọc mới. Sử dụng tất cả phần giữ lại trên các màng lọc cho các bước ti ế p theo. Bảo quản tạm thời ở 5 ° C ± 3 ° C . 9.2 Tăng sinh vi khuẩn 9.2.1 Nuôi cấy 9.2.1.1 Yêu c ầ u chung Đuổi oxy hòa tan ra kh ỏ i môi trường tăng sinh (6.2) bằng cách đun sôi 10 min đến 15 min trong nồi cách thủy (7.3.1). Nếu mẫu có tính ax i t hoặc đã ax i t hóa, thì chuẩn bị canh thang tăng sinh theo 6.2.4. 9.2.1.2 Nuôi cấy phần m ẫ u th ử 9.2.1.2.1 Phục hồi các tế bào sinh dưỡng và các bào tử Chỉnh nhiệt độ của môi trường tăng sinh đến 30 ° C ± 1 o C trong nồi cách thủy (7.3.1). Chuyển phần th ử nghiệm vào môi trường tăng sinh đã loại khí để thu được dung dịch pha loãng cuối cùng 10 - 1 . 9.2.1.2.2 Phục hồi các bào tử Chỉnh nhiệt độ của môi trường tăng sinh đến 65 ° C ± 1 ° C trong nồi cách thủy (7.3.1). Chuyển phần thử nghiệm vào môi trường tăng sinh đã làm nóng trước để thu được dung dịch pha loãng cuối cùng 10 - 1 ở 65 ° C ± 1 ° C . Sau khi nuôi cấy, duy tr ì bình hoặc chai ở 65 o C ± 1 ° C trên 10 min, sau đó làm ngu ộ i nhanh đến 30 ° C ± 1 ° C trong nồi cách thủy (7.3.1). 9.2.1.3 Nuôi cấy các phần mẫu thử mật ong Chỉnh nhiệt độ của canh thang tăng sinh đến 65 ° C ± 1 ° C (7.3.1). Chuyển phần giữ lại trên bộ lọc (9.1.3) vào một bình hoặc chai (7.3.4) và màng lọc hoặc bộ lọc (9.1.3) vào bình hoặc chai (7.3.4) thứ hai, mỗi bình hoặc chai, chứa ít nhất 10 ml canh thang tăng sinh đã làm nóng, trong mọi trường hợp cần đảm bảo đủ để làm ngập màng lọc. Ủ cả bình hoặc chai ở 65 o C ± 1 o C trong 10 min trong nồi cách thủy (7.3.1). CHÚ THÍCH: Mẫu mật ong ch ỉ d ùng để phân tích b à o tử. 9.2.2 Ủ ấm Ủ trong các điều kiện kỵ khí (7.3.2) ở 30 ° C ± 1 ° C . Sau khi ủ 24 h ± 2 h, lấy ra 1 ml phần đã tăng sinh để phân tích PCR và phần còn lại vẫn giữ ở các điều kiện k ỵ khí. N ế u kết quả phân tích PCR đầu tiên là âm tính, thì tiếp tục ủ 48 h ± 2 h trong cùng điều kiện, sau đó chuyển 1 ml môi trường tăng sinh này vào b ì nh hoặc chai (7.3.4) có chứa 9 ml canh thang tăng sinh mới (6.2.3). Ủ kỵ khí (7.3.2) ở 30 ° C ± 1 ° C trong 18 h ± 2 h và thực hiện phản ứng PCR lần thứ hai. 9.2.3 Kiểm soát quá trình Thực hiện kiểm soát quá trình âm tính và dương tính theo TCVN 11134 (ISO 22174). Ví dụ về phương pháp chuẩn bị các bào tử được nêu trong Phụ lục D. 9.3 Chuẩn bị axit nucleic 9.3.1 Yêu cầu chung Sử dụng quy trình chiết axit nucleic thích hợp đối với vi khuẩn Gram dương. Ví dụ về quy trình được nêu trong 9.3.2 đến 9.3.4. Quy trình này bao gồm bước dung giải - dung giải nhiệt trong sự có mặt của CTAB - tiếp theo là một số bước chiết để loại bỏ các chất ức chế như các polysaccharid và protein. Khi phần nền mẫu thử đã được chuẩn bị, áp dụng nguyên tắc chiết ADN và tinh sạch nêu trong 9.3.2 đến 9.3.4. Mức độ tương thích giữa khối lượng và thể tích dung dịch đệm phụ thuộc vào cỡ mẫu thử được chọn. 9.3.2 Chiết mẫu Chuyền 1 000 m l môi trường tăng sinh (9.2.2) vào ống ly tâm nhỏ (7.4.1). Ly tâm (7.4.4) trong 5 min ở khoảng 12 000 x g . Loại bỏ phần nổi phía trên ống (dung dịch l ỏ ng). Thêm 500 m l dung dịch đệm chiết CTAB (6.3.11) đã làm ấm trước (65 °C) vào các hạt cặn và trộn nhẹ cho đến khi dung giải hết. Ủ 30 min ở 65 ° C , trong khi vẫn khuấy trộn (7.4.2). Thêm 20 m l dung dịch proteinase-K (6.3.7), trộn nhẹ ống và ủ 30 min ở 65 ° C , trong khi vẫn khuấy trộn (7.4.2). Cho ly tâm 10 min ở k hoán g 12 000 x g . Chuyển phần nổi phía trên sang một ống mới, thêm 0,7 đến 1 lần thể tích cloroform (6.3.1) và trộn kỹ. Ly tâm 15 min ở khoảng 12 000 x g . Chuyển phần nổi phía trên (dung dịch lỏng) vào một ố ng mới. 9.3.3 Kết tủa CTAB Thêm 2 lần thể tích dung dịch đệm kết tủa CTAB (6.3.12). Ủ 60 min ở nhiệt độ ph ò ng mà không khuấy trộn. Ly tâm 15 min ở 12 000 x g . Loại b ỏ phần nổi phía trên. Hòa tan ADN đã kết tủa bằng cách thêm 350 pl dung dịch NaC l (6.3.13). Thêm 350 m l cloroform (6.3.1) và trộn kỹ. Cho ly tâm 10 min ở 12 000 x g . Chuy ể n pha nước vào một ố ng mới. CH Ú THÍCH: Việc làm k ế t tủa CTAB là không cần thiết đối với tất cả c á c nền mẫu, chỉ dùng cho các nền mẫu giàu protein v à p olysaccharid. Cách khác, việc tinh sạch pha rắn các ADN (ví dụ: sử dụng các cột xoáy) có thể cho kết quả tương đương. 9.3.4 Kết tủa ADN Bổ sung 0,6 thể tích isopropanol (6.3.6), trộn kỹ bằng cách đảo ngược ống và giữ ống ở nhiệt độ phòng trong 20 min. Ly tâm 15 min ở 12 000 x g . Loại bỏ phần nổi phía trên. Thêm 500 m l dung dịch etano l (6.3.14) vào ống và đ ả o chiều ống vài lần. Bước này rất cần để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn CTAB. Ly tâm 10 min ở 12 000 x g . Loại bỏ phần nổi phía trên. Làm khô các hạt ADN và hòa tan lại bằng 100 m l dung dịch đệm thích h ợ p, ví dụ dung dịch đệm TE (6.3.16), thu được dung dịch gốc ADN và được bảo quản ở - 20 ° C cho đến khi sử dụng. 9.4 Khuếch đại PCR Có thể sử dụng các quy trình khác nhau để khuếch đại các sản phẩm PCR. Phát hiện sản phẩm PCR có thể dựa vào gel hoặc bằng các tín hiệu huỳnh quang. Tất cả các yêu cầu cho việc khuếch đại PCR được quy định trong TCVN 7682 (ISO 20838). Ví dụ về các phương pháp PCR gel-based được nêu trong Phụ lục B và các phương pháp real-time PCR được nêu trong Phụ lục C . 9.4.1 Kiểm soát PCR Thực hiện kiểm soát PCR theo TCVN 11134 (ISO 22174). 9.4.2 Phát hiện sản phẩm PCR Có thể sử dụng các quy trình khác nhau để phát hiện các sản phẩm PCR. Ví dụ về các phương pháp PCR gel-based được nêu trong Phụ lục B và các phương pháp real-time PCR được nêu trong Phụ lục C . 9.5 Khẳng định kết quả PCR dương tính Thực hiện quy trình quy định trong TCVN 7682 (ISO 20838). 9.5.1 Giải thích các kết quả Các kết quả thu được, bao gồm cả các kiểm soát quy định trong TCVN 11134 (ISO 22174), cần rõ ràng và các bước kiểm soát phải cho kết quả như dự kiến, nếu không thì phải lặp lại quy trình. Kết quả PCR là: a) dương t í nh, nếu một sản phẩm PCR đặc hiệu được phát hiện và khẳng định và tất cả các kết quả kiểm chứng như dự kiến; b) âm tính trong các giới hạn phát hiện, nếu không phát hiện sản phẩm PCR cụ thể và và tất cả các kết quả kiểm soát như dự kiến. Kết quả PCR dương tính có nghĩa là chỉ ra sự có mặt của độc tố thần kinh botulinum. Để khẳng định sự có mặt của độc tố thần kinh phải áp dụng các phương pháp thích hợp. Phụ lục A (Quy định) Sơ đồ quy trình Hình A.1 Phụ lục B (Tham khảo) Phân tích PCR đa mồi để phát hiện các gen mã hóa độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F sử dụng điện di gel agarose B.1 Phương pháp 1 B.1.1 Giới thiệu Điều này mô tả phương pháp khuếch đại đặc hiệu và phát hiện các gen mã hóa độc tố thần kinh botulinum các typ A, B, E và F và sử dụng điện di gel agarose. Đối với các hạn chế xem B.1.7.6. B.1.2 Các đặc tính hiệu năng B.1.2.1 Yêu c ầ u chung Phương pháp n à y đã được đánh giá xác nhận cho ADN được chiết tách từ các chủng đối chứng C . botulinum typ A , B, E và F và từ các mẫu bị nhiễm tự nhiên. Phương pháp này có trong tài liệu tham khảo [1] [2] [5]. B.1.2.2 Đánh giá lý thuyết của phương pháp Đánh giá lý thuyết đã được thực hiện bằng cách nghiên cứu trình tự tương đồng với các cơ sở dữ liệu GenBank/EMB L/ DD B J , trong đó EMBL là Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử châu Âu và DD B J là cơ sở dữ liệu ADN của Nhật Bản (Tài liệu tham khảo [16], 2009-09-20). Kết quả nghiên cứu đã khẳng định việc nhận biết hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự kiến. B.1.2.3 Tính chọn lọc B.1.2.3.1 Phép th ử chọn lọc dương Độ chọn lọc dương của phương pháp đã được thử nghiệm với 86 chủng C . botulinum typ A, 70 chủng C .botulinum typ B, 15 chủng C . botulinum/butyr i cum typ E và 6 ch ủ ng C . botulinum typ F, xem Bảng B.1. Bảng B.1 - Chọn lọc dương của PCR đa mồi sử dụng các chủng đích Ch ủ ng, typ và phân typ Số ch ủ ng Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát hiện được Typ A Typ B Typ E Typ F C .botulinum typ A phân typ A1 a 3 3 0 0 0 C .botulinum typ A phân typ A2 b 9 9 0 0 0 C .botulinum typ A phân typ A3 c 1 1 0 0 0 C .botulinum typ A phân typ A5 d 4 4 0 0 0 C .botulinum typ A không xác định phân typ e 69 69 0 0 0 C .botulinum typ Ba phân typ A4 f 1 1 1 0 0 C .botulinum typ Ab phân typ A2 9 4 4 4 0 0 C .botulinum typ B h 70 0 70 0 0 C .botulinum typ E i 4 0 0 4 0 C .botulinum typ E j 11 0 0 11 0 C .botulinum typ F k 6 0 0 0 6 a Bộ sưu tập quốc gia C . botulinum typ chủng cấy (NCTC 4587), C . botulinum chủng 62A, C . botulinum NCTC 7272. b Các chủng phân lập từ Trung tâm chất chuẩn quốc gia Ý về Botulism (NRCB). c C . botulinum NCTC 2012 Loch Maree. d các chủng C . botulinum từ Viện Nghiên cứu Thực phẩm (IFR), Vương quốc Anh. e tổng số 64 chủng từ bộ sưu tập NRCB và năm chủng từ các phòng thí nghiệm tư vấn về Vi khuẩn kỵ kh í (CLAB) của Đại học Leipzig, Đức. f chủng C . botulinum 657Ba từ IFR, Vương quốc Anh. g chủng được phân lập bởi NRCB, Ý . h C . botulinum NCTC 7273 và 69 chủng từ bộ sưu tập NRCB. i Ba chủng từ CLAB và một chủng từ NRCB. j Bảy chủng được phân lập tại Ý bởi NRCB, b ố n chủng cung cấp theo tài liệu tham khảo [17] . k C . botulinum NCTC 10281: ba ch ủ ng được phân lập tại Ý bởi NRCB; hai chủng được phân lập tại Đức bởi CLAB B.1.2.3.2 Phép thử chọn lọc âm Tính chọn lọc âm của phương pháp đã được thử nghiệm với 34 sinh vật không phải đích, xem Bảng B.2. Không quan sát được phản ứng chéo với các vi khuẩn không phải đích. B ả ng B.2 - Tính chọn lọc âm của PCR đa mồi sử dụng các ch ủ ng không phải đích Các chủng a Số lượng chủng Typ gen độc tố thần kin h botulinum phát hiện đ ược Typ A Typ B Typ E Typ F C . sporogenes WDCM 00008 1 0 0 0 0 C . perfringens (WDCM 00007 v à các chủng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 C . carnis NCTC 13036 1 0 0 0 0 C . histolyticum NCTC 503 1 0 0 0 0 C . butyr i cum NCTC 7423 1 0 0 0 0 C . barati NCTC 10986 1 0 0 0 0 Bacillus subtilis WDCM 00003 1 0 0 0 0 B. cereus (NCTC 11143 và các chủng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 Thermophilic Campylobacter spp. (các chủng ngoài thực địa) 2 0 0 0 0 Escherichia coli (WDCM 00013 và các chủng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 Salmonella spp. (WDCM 00030 và chủng ngoài thực địa) 2 0 0 0 0 Listeria spp. (WDCM 00017 v à WDCM 00109) 2 0 0 0 0 Brochotrix thermospacta WDCM 00071 1 0 0 0 0 Enterococcusfaecalis WDCM 00087 1 0 0 0 0 Citrobacterfreundii WDCM 00078 1 0 0 0 0 Pseudomonas spp. (các chủng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 Yersinia enterocolit i ca (các chủng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 Lactobacillusfermentum (chủng ngo à i thực địa) 1 0 0 0 0 Aspergillus spp. (các ch ủ ng ngoài thực địa) 2 0 0 0 0 Saccharomyces cervisiae (chủng ngoài thực địa) 1 0 0 0 0 a WDCM = World Data Centre for Microorganisms. B.1.2.4 Độ nhạy B.1.2.4.1 Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu nhiễm nhân tạo (Tài liệu tham khảo (2]) Các giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo các mẫu nhiễm nhân tạo với các mức nuôi cấy khác nhau (0,1 cfu đến 10 cfu và từ 10 cfu đến 100 cfu trước khi tăng sinh) trong 10 g các nền mẫu thực phẩm khác nhau (cá đóng hộp, xúc xích đóng hộp và mật ong) được nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy (Tài liệu tham khảo [1]). Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp sử dụng các mẫu nhiễm bẩn nhân tạo là 0 % và tỷ lệ âm tính gi ả là 0 %). Giới hạn phát hiện của phương pháp được quy định l à 1 cfu đến 10 cfu hoặc số bào tử trên 10 g trước khi tăng sinh. B.1.2.4.2 Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu nhiễm tự nhiên (Tài liệu tham khảo [2]) Giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo 382 mẫu nhiễm tự nhiên (ví dụ như mật ong, thực vật v à các loại thịt đóng hộp), sử dụng cách thử sinh học trên chuột làm phương pháp đ ố i chứng. Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả đ ố i với phương pháp sử dụng các mẫu nhiễm tự nhiên là 0 % và tỷ lệ âm tính giả là 0 %. CHÚ THÍCH: Các thực nghi ệ m được thực hiện với các phần mẫu th ử là 10 g. B.1.2.5 Kiểm soát phân tích Tất cả các phép th ử đã được thực hiện sử dụng quá trình kiểm chứng dương tính và âm tính đối với PCR, kiểm chứng khuếch đại nội bộ (IAC) được mô tả trong B.1.6. B.1.2.6 Thiết bị, dụng cụ và thuốc thử Việc đánh giá xác nhận đ ã được thực hiện trên MyCycler ® 1) và Mastercycle r ® 2) Gradient sử dụng 2xMultiplex qPCR MasterMix ® 3) (Tài liệu tham khảo [1]) và hỗn hợp mồi theo Bảng B.7 (Tài liệu tham khảo [2], [5]). B.1.3 Nguyên tắc Các đoạn ADN đặc hiệu của BoNT/typ gen A, B, E và F, được khuếch đại bằng PCR đa mồi kết hợp với IAC tương đồng sử dụng tám mồi. Việc phát hiện các sản phẩm PCR được thực hiện bằng điện di gel agarose. B.1.4 Thuốc thử B.1.4.1 Yêu cầu chung Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng , xem TCVN 11134 (ISO 22174). B.1.4.2 Thuốc thử dùng cho PCR B.1.4.2.1 Nước không chứa nuclease. B.1.4.2.2 Dung dịch đệm PCR, 10x 4) Thông th ườ ng dung dịch đệm PCR được cung cấp cùng với ADN polymerase, có thể có hoặc không có MgC l 2 ở nồng độ do nhà sản xuất quy định. Nồng độ MgC l 2 cuối cùng được quy định theo phương pháp cụ thể và được nêu trong Bảng B.7. Cũng có thể dùng thuốc thử có bán sẵn. Nếu không th ì tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất. B.1.4.2.3 Dung dịch MgC l 2 , c (MgC l 2 ) = 25 mmol/l. B.1.4.2.4 ADN polymerase bền nhiệt , 5 lU/ m l. B.1.4.2.5 Dung dịch dNTP , c (dNTP) = 10 mmol/l. B.1.4.2.6 Oligonucleotid. Trình tự của các oligonucleotid được nêu trong Bảng B.3. Bảng B.3 - Trình tự của các oligonucleotid Typ Mồi Trình tự (5 ' - 3 ' ) Kích thước amplicon bp A IA_03_fw ggg CCT AgA ggT AgC gTA R a Tg 101 IA_04_rev TCT TY a A TTT CCA gAA gCA TAT TTT B CBMLB1 CAg gAg AAg Tgg AgC gAA AA 205 CBMLB2 CTT gCg CCT TTg TTT TCT Tg E CBMLE1 CCA AgA TTT TCA TCC gCC TA 389 CBMLE2 gCT ATT gAT CCA AAA Cgg TgA F CBMLF1 Cgg CTT CAT TAg AgA ACg gA 543 CBMLF2 TAA CTC CCC TAg CCC CgT AT a trong trình tự của các oligonucleotid R = A,G và Y = C,T B.1.4.3 Hóa chất điện di gel B.1.4.3.1 Yêu cầu chung Điện di gel agarose có thể được thực hiện với dung dịch đệm TAE hoặc dung dịch đệm TBE. Các dung dịch được mô tả trong phương pháp này thường không cần phải hấp áp lực. B.1.4.3.2 Agarose , thích hợp dùng cho điện di ADN và cho việc tách kích thước dự định của các phân t ử ADN. B.1.4.3.3 Axit boric , H 3 B O 3 , chỉ dùng cho hệ thống đệm TBE. B.1.4.3.4 Bromophenol xanh , C 1 9 H 9 Br 4 O 5 SNa và/hoặc xylen xyanol FF, C 25 H 27 N 2 O 6 S 2 Na. B.1.4.3.5 Chu ẩ n khối lượng phân tử ADN , ví dụ: chế phẩm thương mại có chứa các đoạn ADN từ kh ố i lượng phân t ử rất cao đến khối lượng phân tử rất thấp. B.1.4.3.6 Axit axetic băng , CH 3 COOH, chỉ dùng cho hệ thống đệm TAE. B.1.4.3.7 Muối dinatri của axit etylendiaminetetraaxetic (Na 2 EDTA) , C 10 H 14 O 8 Na 2 . B.1.4.3.8 Ethidium bromide (EthBr) , C 21 H 20 N 3 Br. B.1.4.3.9 Glycerol , C 3 H 8 O 3 . B.1.4.3.10 Natri axetat , C 2 H 3 O 2 Na, chỉ dùng cho hệ thống đệm TAE. B.1.4.3.11 Axit clohydric , j (HC l ) = 37 %. B.1.4.3.12 Natri hydroxit , NaOH. B.1.4.3.13 Tris (hydroxymethyl) aminometan (tris) , C 4 H 11 N O 3 . B.1.4.3.14 Dung dịch đệm Tris-axetat-EDTA (TAE) (1x) , c (tris) = 0,050 mol/l, c (C 2 H 3 O 2 Na) = 20 mmol/l, c (Na 2 EDTA) = 0,001 mol/l. Chỉnh đến pH 8,0 bằng axit axetic băng hoặc NaOH. Nên chuẩn bị dung dịch đệm TAE theo dung dịch gốc đậm đặc (đậm đặc tối đa 50 lần). Loại bỏ dung dịch nếu nhìn thấy có kết tủa. Có thể tiến hành pha loãng các dung dịch đệm điện di đậm đặc, ngay trước khi sử dụng, với nước không tiệt trùng, nước c ấ t một lần hoặc nước đã khử ion. B.1.4.3.15 Dung dịch đệm Tris-borat-EDTA (TBE) (0,5x) , c (tris) = 0,055 mol/l, c (axit boric) = 0,055 mol/l, c (Na 2 EDTA) = 0,001 mol/l. Chỉnh pH đến 8 , 0 bằng HC l hoặc NaOH. Nên chuẩn bị d ung dịch đệm TBE theo dung dịch gốc đậm đặc (đậm đặc tối đa 10 lần). Loại bỏ dung dịch nếu nhìn thấy có kết tủa. Có thể pha loãng các dung dịch đệm điện di đậm đặc ngay trước khi sử dụng với nước không tiệt trùng, nước cất một lần hoặc nước đã khử ion. B.1.4.3.16 Dung dịch đệm nạp mẫu (5x) , j (glycerol) = 50 %, r (bromophenol xanh) = 2,5 g/l và/hoặc r (xylen xyanol) = 2,5 g/l, được hòa tan trong dung dịch đệm điện di (B.1.4.3.14 hoặc B.1.4.3.15). B.1.4.3.17 Dung dịch ethidium bromide , c (EthBr) = 0,5 mg/l Nên b ả o quản các dung dịch ethidium bromide ở dạng đậm đặc (ví dụ: 10 mg/ml) ở 5 ° C ở nơi tối (EthBr nhạy với ánh sáng). Đồng thời nên tránh cân EthBr. Dung dịch gốc cần được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong một lượng nước thích hợp, đựng trong bình đã chứa bột EthBr, hoặc sử dụng các viên EthBr đã biết trước khối lượng. Việc hòa tan EthBr cần thực hiện tránh sánh sáng, có khuấy trộn ở nhiệt độ phòng. Việc hòa tan này thường mất khoảng 1 h. C Ả NH BÁO - Ethidium bromide là một chất gây đột biến, cần thực hiện theo quy trình xử lý an toàn. B.1.5 Thiết bị, dụng cụ B.1.5.1 Yêu c ầ u chung Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thích hợp với phương pháp và cụ thể như sau: B.1.5.2 Thiết bị dùng cho PCR B.1.5.2.1 Pipet và pipet có dầu lọc, có dung tích từ 1 m I đến 1 000 m l. B.1.5.2.2 Ố ng ly tâm nhỏ , có dung tích 1,5 ml và 2,0 ml. B.1.5.2.3 Ống PCR , ống phản ứng 0,2 ml hoặc 0,5 ml, đĩa PCR vi giếng hoặc dụng cụ phù hợp khác. B.1.5.2.4 Máy chu trình nhiệt. B.1.5.2.5 Thiết bị sử dụng để phát hiện các sản phẩm PCR. B.1.5.2.6 Lò vi sóng hoặc nồi cách thủy đun sôi. B.1.5.2.7 Hệ thống điện di gel ngang. B.1.5.2.8 Nguồn cung cấp điện. B.1.5.2.9 Máy chiếu tia UV hoặc hộp đèn UV. B.1.5.2.10 Hệ thống ghi dữ liệu gel B.1.6 Kiểm soát khuếch đại nội bộ (Tài liệu tham khảo [2]) B.1.6.1 Nguyên tắc Một đoạn ADN plasmid pUC 19 được khuếch đại bằng PCR sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu. Các mồi có các đuôi -5' giống với các mồi được sử dụng để phát hiện các gen BoNT/F, trong khi các mồi có đuôi 3' được bổ sung cho pUC 19 xác định trước trình tự ADN có chiều dài và trình tự xác định. Đoạn ADN được sử dụng làm khuôn mẫu cho IAC cạnh tranh. B.1.6.2 Thuốc thử B.1.6.2.1 Yêu c ầ u chung V ề chất lượng thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174). B.1.6.2.2 Nước, không chứa nuclease. B.1.6.2.3 Dung dịch magie clorua , c (MgC l 2 ) = 25 mmol/l. B.1.6.2.4 ADN polymerase bền nhiệt , 5 lU/ m l . B.1.6.2.5 Dung dịch dNTP , c (dNTP) = 10 mmol/l. B.1.6.2.6 Dung dịch kali clorua , c (KCI) = 0,5 mol/l. B.1.6.2.7 Tris (hydroxymetyl) aminometan hydroclorua , c (C 4 H 11 N O 3 HC l ) = 0,1 mol/l. Chỉnh pH đến 8,3 bằng HC l hoặc NaOH. B.1.6.2.8 Plasmid pUC 19 (nhập số L09137). B.1.6.2.9 Oligonucleotid Trình tự của các oligonucleotid được nêu trong Bảng B.4 Bảng B.4 - Trình tự của các oligonucleotid M ồ i Trình tự (5' - 3') Kích thước amplicon của IAC bp IAC f Cgg CTT CAT TAg AgA ACg gAC gTT Tgg TAT ggC TTC ATT C 698 lAC r TAA CTC CCC TAg CCC CgT ATT AgA CgT CAg gTg gCA CTT T B.1.6.3 Cài đặt PCR để xây dựng IAC Phương pháp n à y quy định tổng thể tích PCR là 50 m l ch o mỗi phản ứng với các thuốc thử được liệt kê trong Bảng B.5. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích nhỏ hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc thử nêu trong Bảng B.5 đã chứng minh là phù hợp. Bảng B.5 - Bổ sung thuốc thử Thuốc th ử Giá trị cuối cùng Thể tích trên mẫu m l Khuôn mẫu ADN (pUC 19), 0,5 m g/ m l 0,5 m g 1 Nước không ch ứ a nuclease 26 Dung dịch KC l , c (KC l ) = 0,5 mol/l 50 mmol/l 5 Tris-HC l (pH 8,3), c (tris·HC l ) = 0,1 mol/l 10 mmol/l 5 Dung dịch MgC l 2 , c (MgC l 2 ) = 25 mmol/l 2,5 mmol/l 5 Dung dịch dNTP, c (dNTP) = 10 mmol/l 0,8 mmol/l 4 Mồi IAC f , 5 m mol/l 0,1 m mol/l 1 Mồi IAC f , 5 m mol/l 0,1 m mol/l 1 ADN polymerase b ề n nhiệt, 5 l U / m l 2,5 IU 1 B.1.6.4 Chu trình nhiệt Chu trình nhiệt nêu trong Bảng B.6 đã được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá xác nhận sử dụng các chu trình nhiệt MyCycler ® hoặc Mastercycler ® Gradient 2 ) và Taq ADN polymerase 5) . Việc sử dụng các chu trình nhiệt khác có thể điều chỉnh khi cần. Thời gian kích hoạt và làm biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymerase được sử dụng. Nếu sử dụng polymerase khởi động nóng, th ì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bảng B.6 - Chu trình nhiệt Khuếch đại 60 s/95° C 60 s/55 ° C 2 min/72° C Số lượng chu trình (khuếch đại) 30 Thời gian kéo dài cuối cùng 10 min/72 ° C B.1.6.5 Sử dụng IAC Sử dụng phương pháp thích hợp để tinh sạch sản phẩm PCR. Thường 1 500 bản sao/gi ế ng IAC là thích hợp đối với các phương pháp PCR gel-based. IAC được quy định như một IAC cạnh tranh và được xây dựng để cạnh tranh với các mồi khuếch đại gen độc tố thần kinh typ F. B.1.7 Cách tiến hành B.1.7.1 Cài đặt PCR Phương pháp n à y quy định tổng thể tích PCR là 50 m l cho mỗi phản ứng với các thuốc thử được liệt kê trong Bảng B.7. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích nhỏ hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc th ử nêu trong Bảng B.7 đã chứng minh l à phù hợp. B ả ng B.7 - Bổ sung thuốc thử Thuốc thử Thể tích cuối cùng Thể tích trên mẫu m l Khuôn mẫu ADN 10 ng to 50 ng 3 Nư ớ c không chứa nuclease 2,6 Dung dịch đệm PCR 10x (không chứa MgC l 2 ) a 1x 5 Dung dịch MgC l 2 , c (MgC l 2 ) = 25 mmol/l 4,8 mmol/l 9,6 Dung dịch dNTP, c (dNTP) = 10 mmol/l 0,8 mmol/l 4 Các mồi PCR (theo Bảng B.3) 5 m mol/l 0,3 m mol/l cho mỗi mồi 3 cho mỗi mồi IAC, 1 500 bản sao/ m l 1 500 bản sao 1 ADN polymerase bền nhiệt, 5 IU/ m l 2 IU 0,8 a Nếu dung dịch đệm PCR chứa sẵn MgC l 2 , th ì nồng độ cuối cùng của MgC l 2 trong hỗn hợp phản ứng cần được chỉnh đến 4,8 mmol/l. B. 1.7.2 Ki ể m chứng PCR B.1.7.2.1 Yêu cầu chung Cần thực hiện các phép kiểm chứng trong B.1.7.2.2 đến B.1.7.2.4 của TCVN 11134 (ISO 22174). B.1.7.2.2 Kiểm chứng PCR âm tính Sử dụng nước không chứa ADN làm kiểm chứng âm tính. B.1.7.2.3 Kiểm chứng PCR dương tính Hỗn hợp ADN của clostridia sinh ra BoNT, dương tính đối với tất cả bốn trình tự đích (các gen độc tố thần kinh typ A, B, E và F), khoảng 1 000 bản sao. B.1.7.2.4 Kiểm soát khuếch đại Sử dụng IAC hoặc kiểm soát khuếch đại bên ngoài (EAC) phù hợp. Ví dụ của IAC được nêu trong B.1.6. B.1.7.3 Chu trình nhiệt Chu trình nhiệt nêu trong Bảng B.8 đã được sử dụng cho các nghiên cứu đánh giá xác nhận với MyCycler ® và với Mastercycler ® Gradient, sử dụng 2x Multiplex qPCR MasterMix (Tài liệu tham khảo [1]) và MasterMix theo Bảng B.7 (Tài liệu tham khảo [2] [5]). Việc sử dụng các chu trình nhiệt khác có thể phải điều chỉnh cho phù hợp. Thời gian kích hoạt và làm biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymerase được sử dụng 6) . Nếu sử dụng polymerase khởi động nóng, thì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bảng B.8 - Chương trình thời gian-nhiệt độ Kích hoạt và làm biến tính ban đầu 15 min/95 ° C Khuếch đại 30 s/95 ° C 30 s/56 ° C 90 s/72 °C Số lượng chu trình (khuếch đại) 35 Thời gian kéo dài cuối cùng 7 min/72 ° C B.1.7.4 Phát hiện sản phẩm PCR (điện di gel) B.1.7.4.1 Yêu cầu chung Có thể thực hiện điện di gel agarose với dung dịch đệm TAE hoặc dung dịch đệm TBE. Sử dụng cùng dung dịch đệm để hòa tan agarose và để nạp đầy bình điện di. B.1.7.4.2 Chuẩn bị gel agarose Các sản phẩm PCR được khuếch đại nên phát hiện bằng cách sử dụng gel agarose 2,0 %. Cân một lượng thích hợp agarose (B.1.4.3.2) cho vào dung dịch đệm điện di (B.1.4.3.14 hoặc B. 1.4.3.15). Làm sôi dung dịch trong lò vi sóng hoặc trong nồi cách thủy (B.1.5.2.6) cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Bù lượng hao hụt do bay hơi bằng một lượng nước tương đương, xoay b ì nh để trộn (tránh không tạo bọt khí), làm nguội dung dịch xuống khoảng 60 ° C và giữ ở nhiệt độ này cho đến khi sử dụng. Chuẩn bị giá đỡ gel (khay đựng gel) với lượng thích hợp. Rót dung dịch agarose vào khay gel và để gel đông đặc ở nhiệt độ phòng (thường l à 1 h). B.1.7.4.3 Điện di gel agarose Cẩn thận tháo lược mẫu ra khỏi gel. Chuyển gel (trên khay) vào bể điện di, sao cho các giếng nằm gần với catot (điện cực âm). Đ ổ đầy bể điện di bằng dung dịch đệm điện di (B.1.4.3.14 hoặc B.1.4.3.15). Phủ lên trên gel bằng khoảng 2 mm của cùng dung dịch đệm. Trộn dung dịch đệm với các sản phẩm PCR (10 m l) (B.1.4.3.16) theo tỷ lệ 1 đến 5 (ví dụ: cho 2,5 m l dung dịch đệm vào 10 m l sản phẩm PCR), trộn và sử dụng micropipet để đưa hỗn hợp này vào các giếng. Nếu các mẫu chưa biết nghi ngờ quá đặc, thì cần pha loãng để nạp vào gel. Để xác định kích thước của s ả n phẩm PCR, bổ sung dung dịch đệm (B.1.4.3.16) và chuẩn khối lượng phân tử ADN (B.1.4.3.5) theo tỷ lệ 1 đến 5. Chất chuẩn khối lượng phân tử ADN được nạp vào gel ít nhất là trước giếng mẫu đầu tiên và sau giếng mẫu cuối cùng. Tiến hành điện di ở nhiệt độ phòng với điện áp và cường độ dòng điện thích hợp (thư ờ ng điện áp ổn định tối đa là 5 V /cm và nên quan tâm đến khoảng cách giữa các điện cực). Trong các điều kiện quy định, ADN tích điện âm, vì vậy di chuyển từ cực âm đến cực dương. Thời gian điện di phụ thuộc vào khoảng cách dịch chuyển yêu cầu, dòng điện được cung cấp, dung dịch đệm được sử dụng, sự điện thấm và nồng độ agarose trong gel. B.1.7.4.4 Nhuộm màu Sau khi kết thúc điện di, ủ gel từ 15 min đến 50 min trong dung dịch ethidium bromide (B.1.4.3.17) ở nhiệt độ phòng, tốt nhất là để ở nơi tối với lắc nhẹ. Nếu cần, giảm màu nền bằng khử màu gel trong nước từ 10 min đến 30 min. Cách khác để nhuộm màu sau điện di, có thể b ổ sung EthBr vào gel trước khi rót . Trong trường hợp này, EthBr được cho vào gel để có nồng độ cuối cùng là 0,01 mg/ml gel khi gel đã được làm nguội đến 60 ° C . Để giảm thiểu các vấn đề di chuyển của EthBr trong gel, có thể bổ sung một số EthBr vào bể đệm điện di. Sau khi điện di gel, thường không cần có bước khử màu. CH Ú THÍCH: Việc nhuộm có thể được thực hiện bằng cách sử dụng chất nhuộm màu xen giữa ADN khác. B.1.7.4.5 Ghi h ì nh gel Chuyển gel lên bề mặt chiếu sáng, bật đèn UV và ghi lại huỳnh quang ADN bằng cách chụp ảnh hoặc ghi video. Các trình tự đích được coi là phát hiện được nếu kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với chiều dài dự kiến của các trình tự ADN đích. Xem Bảng B.9. Để giải thích các kết quả, xem TCVN 11134 (ISO 22174). Bảng B.9 - Kích thước sản phẩm khuếch đại Typ Mồi Kích thước sản phẩm bp A IA_03_fw/IA_04_rev 101 B CBMLB1/CBMLB2 205 E CBMLE1/CBMLE2 389 F CBMLF1/CBMLF2 543 IAC lAC f / ACr 698 B.1.7.5 Khẳng định kết quả PCR dương tính Kết quả PCR dương tính phải được khẳng định, ví dụ: bằng trình tự của các s ả n ph ẩ m PCR. Có th ể sử dụng các phương pháp thích hợp khác để khẳng định. B.1.7.6 Hạn chế của phương pháp Phương pháp này đã được thử nghiệm để phát hiện các typ và phân typ hiện có của các độc tố thần kinh của clostridia typ A, B, E và F. Tại thời điểm công b ố , chưa có xác nhận liệu các mồi được liệt kê trong Bảng B.3 có thể phát hiện các phân typ mới của BoNT/A, B, E và F hay không. B.2 Phương pháp 2 B.2.1 Giới thiệu Điều này mô tả phương pháp khuếch đại đặc hiệu và phát hiện các gen mã hóa các typ độc tố thần kinh botulinum A, B, E và F, sử dụng điện di gel agarose. V ề những hạn chế xem B.2.7.6. B.2.2 Đặc tính hiệu năng B.2.2.1 Yêu cầu chung Phương pháp này đã được điều chỉnh đối với ADN được chiết từ typ A, B, E, và F của C . botulinum từ các chủng đ ố i chứng và từ mẫu bị nhiễm tự nhiên. Các phần của phương pháp này đã được công bố trong Tài liệu tham khảo [5]. B.2.2.2 Đánh giá lý thuyết của phương pháp Đ á nh giá lý thuyết đã được thực hiện bằng cách nghiên cứu trình tự tương đồng với các cơ sở dữ liệu GenBank/EMB L/ DD B J (Tài liệu tham khảo [16], 2009/09/20). Kết quả nghiên cứu đã khẳng định việc nhận biết hoàn toàn với các trình tự đích dự kiến. B.2.2.3 Tính chọn lọc B.2.2.3.1 Phép thử chọn lọc dương Phép thử chọn lọc dương của phương pháp đã được thử nghiệm với 19 chủng C . botulinum typ A, 19 chủng C .botulinum typ B, 17 chủng C . botulinum typ E và 9 chủng C . botulinum typ F, xem Bảng B.10. Bảng B.10 - Phép thử chọn lọc dương của PCR đa mồi sử dụng các chủng đích Chủng, typ và phân typ Số chủng Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát hiện được Typ A Typ B Typ E Typ F C . botulinum typ A 19 19 0 0 0 C . botulinum typ B 19 0 19 0 0 C . botulinum typ E 17 0 0 17 0 C . botulinum typ F 9 0 0 0 9 CHÚ THÍCH: Các chủng được phân lập tại Ý bởi NRCB, IFR, Phòng thử nghiệm tư v ấ n về vi khuẩn kỵ khí (CLAB) của trường đại học Leipzig, Đức. B.2.2.3.2 Phép th ử chọn lọc âm Phép thử chọn lọc âm của phương pháp đã được thử nghiệm với 34 sinh vật không phải đích, xem Bảng B.11. Không quan sát được phản ứng chéo với các v i khuẩn không phải đích. Bảng B.11 - Phép thử chọn lọc âm của PCR đa mồi sử dụng các chủng không phải đích Các ch ủ ng Số lượng chủng Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát hiện đ ược Typ A Typ B Typ E Typ F C . s porogenes WDCM 00008 1 0 0 0 0 C . perfringens (WDCM 00007 và các chủng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 C . carnis NCTC 13036 1 0 0 0 0 C . histolyticum NCTC 503 1 0 0 0 0 C . butyricum NCTC 7423 1 0 0 0 0 C . barati NCTC 10986 1 0 0 0 0 B. subtilis WDCM 00003 1 0 0 0 0 B. cereus (NCTC 11143 v à các chủng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 Thermophilic Campylobacter spp. (các chủng ngoài thực địa) 2 0 0 0 0 E. coli (WDCM 00013 và các chủng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 Salmonella spp. (WDCM 00030 và chủng ngoài thực địa) 2 0 0 0 • 0 Listeria spp. (WDCM 00017 and WDCM 00109) 2 0 0 0 0 - B . t hermospacta WDCM 00071 1 0 0 0 0 E.faecalis WDCM 00087 1 0 0 0 0 C.freund ii WDCM 00078 1 0 0 0 0 Pseudomonas spp. (các chủng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 Y . enterocolitica (các chủng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 L.fermentum (các chủng ngoài thực địa) 1 0 0 0 0 Aspergillus spp. (các chủng ngoài thực địa) 2 0 0 0 0 S . cerevisiae (chủng ngoài thực địa) 1 0 0 0 0 B.2.2.4 Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu bị nhiễm nhân tạo (Tài liệu tham khảo [5]) Các giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo các mẫu nhiễm nhân tạo với các mức nuôi cấy khác nhau (0,1 cfu đến 10 cfu và từ 10 cfu đến 100 cfu trước khi tăng sinh) trong 10 g các nền mẫu thực phẩm khác nhau, (cá đ ó ng hộp, xúc xích đóng hộp và mật ong) được khảo sát, sử dụng phương pháp nuôi cấy (T à i liệu tham khảo [5]). Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp sử dụng các mẫu nhiễm nhân tạo là 0 % và tỷ lệ âm tính giả là 0 %. Giới hạn phát hiện của phương pháp được quy định l à 1 cfu đến 10 cfu hoặc số bào tử trên phần mẫu thử trước khi tăng sinh. CHÚ THÍCH: Các thực nghiệm được thực hiện với các phần mẫu thử 10 g. B.2.2.5 Phân tích ki ể m chứng Tất cả các phép thử đã được thực hiện sử dụng các phép kiểm chứng dương tính và âm tính và bổ sung đối với PCR, I AC được mô tả trong B.2.6.5. B.2.2 . 6 Thiết bị, dụng cụ và thuốc thử Việc đánh giá xác nhận đã được thực hiện trên Mastercycler ® Gradient 2) sử dụng 2x Multiplex qPCR MasterMix ®,3) và M a sterMix theo Bảng B.16. B.2.3 Nguyên tắc Các đoạn ADN đặc hiệu của BoNT/typ gen A, B, E và F, được khuếch đại bằng PCR đa mồi kết hợp với IAC tương đồng, sử dụng tám mồi. Việc phát hiện các sản phẩm PCR được thực hiện bằng việc sử dụng phương pháp điện di gel agarose. B.2.4 Thuốc thử B.2.4.1 Yêu cầu chung Đối với chất lượng của thuốc th ử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174). B.2.4.2 Thuốc thử dùng cho PCR B.2.4.2.1 Nước, không chứa nuclease. B.2.4.2.2 Dung dịch đệm PCR (không chứa MgC l 2 ), 10x Thông thường dung dịch đệm PCR được cung cấp cùng với ADN polymerase, có thể có hoặc không có MgC l 2 ở nồng độ do nhà sản xuất quy định. Nồng độ MgC l 2 cuối cùng được quy định theo phương pháp cụ thể và được cho trong B ả ng B.14. Cũng có thể dùng thuốc thử có bán sẵn. Nếu không thì tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất. B.2.4.2.3 Dung dịch MgC l 2 , c (MgC l 2 ) = 25 mmol/l. B.2.4.2.4 ADN polymerase bền nhiệt , 5 lU/ m l . B.2.4.2.5 Dung dịch dNTP , c (dNTP) = 10 mmol/l. B.2.4.2.6 Oligonucleotid. Trình tự của các oligonucleotid được liệt kê trong B ả ng B.12. Bảng B.12 - Trình tự của các oligonucleotide Typ Mồi Trình tự (5' - 3 ' ) Kích thước amplicon bp A CBMLA3-F ATT CAg gAT ggA AAg TAT CAC TTA AT 698 CBMLA3-R TTC TAC gCC TgC CTg TgA Tg B CBMLB1 CAg gAg AAg Tgg AgC GAA AA 205 CBMLB2 CTT gCg CCT TTg TTT TCT Tg E CBMLE1 CCA AgA TTT TCA TCC gCC TA 389 CBMLE2 gCT ATT gAT CCA AAA Cgg TgA F CBMLF1 Cgg CTT CAT TAg AgA ACg gA 543 CBMLF2 TAA CTC CCC TAg CCC CgT AT B.2.4.3 Hóa chất điện di gel Theo quy định trong B. 1.4.3. B.2.5 Thiết bị, dụng cụ Theo quy định trong B.1.5. B.2.6 Kiểm soát khuếch đại nội bộ B.2.6.1 Nguyên tắc Một đoạn ADN plasmid pUC 19 được khuếch đại bằng PCR sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu. Các mồi có các đuôi 5' giống với các mồi được sử dụng để phát hiện các gen BoNT/F, trong khi các mồi có đuôi 3' được bổ sung cho pUC 19 xác định trước trình tự ADN có chiều dài và trình tự xác định. Đoạn ADN được sử dụng làm khuôn mẫu cho IAC cạnh tranh. B.2.6.2 Thuốc th ử B.2.6.2.1 Yêu cầu chung V ề chất lượng thuốc th ử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174). B.2.6.2.2 Nước, không chứa nuclease. B.2.6.2.3 Dung dịch magie clorua , c (MgC l 2 ) = 25 mmol/l. B.2.6.2.4 ADN polymerase bền nhiệt , 5 l U / m l. B.2.6.2.5 Dung dịch dNTP , c (dNTP) = 10 mmol/l. B.2.6.2.6 Dung dịch kali clorua , c (KC l ) = 0,05 mol/l. B.2.6.2.7 Tris (hydroxymetyl) aminometan hydrochlorua , c (C 4 H 11 NO 3 .HC l ) = 0,01 mol/l. Chỉnh pH đến 8,3 bằng HC l hoặc NaOH. B.2.6.2.8 pUC 19 plasmid (nhập số L09137). B.2.6.2.9 Oligonucleotid Trình tự của các oligonucleotid được nêu trong Bảng B.13. Bảng B.13 - Trình tự oligonucleotid Mồi Trình tự (5' - 3') Kích thước amplicon của IAC bp IOF-new- F Cgg CTT CAT TAg AgA ACg GAT gTC gTg CCA gCT gCA T T A A 800 IOF-new- R TAA CTC CCC TAg CCC CgT ATgCC ggA TCA AgA gCT ACC AAC B.2.6.3 Cài đặt PCR để xây dựng IAC Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR là 50 m l cho mỗi phản ứng với các thuốc thử được liệt kê trong Bảng B.14. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích nhỏ hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc th ử nêu trong Bảng B.14 được chứng minh là phù hợp. B ả ng B.14 - Bổ sung thuốc thử Thuốc th ử Giá trị cuối cùng Thể tích trên mẫu m l Khuôn mẫu ADN (pUC 19), 0,5 m g/ m l 0,5 m g 1 Nước không chứa nuclease 27 Dung d ị ch KC l , c (KC l ) = 0,05 mol/l 50 mmol/l 5 Tris-HC l (pH 8,3), c (tris-HC l ) = 0,01 mol/l 10 mmol/l 5 Dung dịch MgC l 2 , c (MgC l 2 ) = 25 mmol/l 2,5 mmol/l 5 Dung dịch dNTP, c (dNTP) = 10 mmol/l 0,8 mmol/l 4 Mồi IAC f , 5 m mol/1 0,1 m mol/l 1 Mồi IAC r , 5 m mol/l 0,1 m mol/l 1 Khu ô n mẫu ADN polymerase, 5 IU 2,5 IU 1 B.2 . 6.4 Chu trình nhiệt Chu trình nhiệt nêu trong Bảng B.15 đã được sử dụng tr o ng nghiên cứu đánh giá xác nhận sử dụng các chu trình nhiệt MyCycler ® hoặc Mastercycler ®1 ) Gradient 2 ) và Taq ADN polymerase 3 ) . Việc sử dụng các chu trình nhiệt khác có thể điều chỉnh khi cần. Thời gian kích hoạt và làm biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymerase được sử dụng. Nếu sử dụng polymerase khởi động nóng, thì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bảng B.15 - Chu trình nhiệt Kích hoạt v à làm biến tính ban đầu 15 min/95 ° C Khuếch đại 60 s/95 ° C 60 s/55 ° C 2 min/72 ° C S ố lượng chu trình (khuếch đại) 30 Kéo dài cuối cùng 10 min/72 ° C B.2.6.5 Sử dụng lAC Sử dụng bộ kit thử thích h ợ p có bán sẵn để tinh sạch các sản phẩm PCR. Thường 1 500 bản sao/giếng IAC là thích hợp đối với các phương pháp PCR gel-based. IAC được quy định như một I A C cạnh tranh và được xây dựng để cạnh tranh với các mồi khuếch đại gen độc tố thần kinh typ F. B.2.7 Cách tiến hành B.2.7.1 Cài đặt PCR Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR là 50 m l cho mỗi phản ứng với các thuốc th ử được liệt kê trong Bảng B.16. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích nh ỏ hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc thử nêu trong Bảng B.16 được ch ứ ng minh là phù hợp. Bảng B.16 - Bổ sung thuốc thử Thuốc th ử Thể tích cuối cùng Thể tích tr ê n mẫu m l Khuôn mẫu AD N 10 ng đến 50 ng 3 Nước không chứa nuclease 2,6 Dung dịch đệm PCR 10x (không chứa MgC l 2 ) a 1x 5 Dung dịch MgC l 2 , c (MgC l 2 ) = 25 mmol/l 4,8 mmol/l 9,6 Dung dịch dNTP, c (dNTP) = 10 mmol/l 0,8 mmol/l 4 Các mồi PCR (theo Bảng B.3) 5 m mol/l 0,3 m mol/l cho mỗi mồi 3 cho mỗi mồi IAC , 1 500 bản sao/ m l 1 500 bản sao 1 ADN polymeras e bền nhiệt, 5 lU/ m l 2 IU 0,8 a Nếu dung dịch đệm PCR chứa sẵn MgC l 2 , th ì nồng đ ộ cuối cùng của MgC l 2 trong hỗn hợp phản ứng cần được ch ỉ nh đến 4,8 mmol/l. B.2.7.2 Kiểm chứng PCR B.2.7.2.1 Yêu cầu chung Cần thực hiện các phép kiểm chứng trong B.2.7.2.2 đến B.2.7.2.4 của TCVN 11134 (ISO 22174). B.2.7.2.2 Kiểm chứng PCR âm tính Sử dụng nước không chứa ADN không gây ức chế PCR làm kiểm chứng âm tính. B.2.7.2.3 Ki ể m chứng PCR dương tính Hỗn hợp ADN của clostridia sinh ra BoNT, dương tính đối với tất cả bốn trình tự đích (các gen độc tố thần kinh typ A, B, E và F), k ho ả n g 1 000 bản sao. B.2.7.2.4 Kiểm soát khuếch đại Sử dụng IAC hoặc EAC phù hợp. Ví dụ của IAC được nêu trong B.2.6. B.2.7.3 Chu trình nhiệt Chu trình nhiệt nêu trong B ả ng B.17 đã được sử dụng cho các nghiên cứu đánh giá xác nhận sử dụng chu trình nhiệt Mastercycler ® Gradient và Tag polymerase. Việc sử dụng các chu trình nhiệt khác có thể phải điều chỉnh cho phù hợp. Thời gian kích hoạt và làm biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymerase được sử dụng. Nếu sử dụng polymerase khởi động nóng, thì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bảng B.17 - Ch ươ n g trình thời gian-nhiệt độ Kích hoạt và làm biến tính ban đầu 15 min/95 ° C Khuếch đại 30 s/95° C 30 s/60° C 85 s/72° C S ố lượng chu trình (khuếch đại) 27 Thời gian kéo dài cuối cùng 3 min/72 ° C B.2.7.4 Phát hiện sản ph ẩ m PCR (điện di gel) B.2.7.4.1 Yêu c ầ u chung Các điện di gel agarose có thể được thực hiện như điện di dung dịch đệm TAE hoặc TBE. Sử dụng cùng dung dịch đệm để h ò a tan các agarose và để nạp đầy vào bể điện di. Việc chuẩn bị agarose gel, chuẩn bị mẫu ADN, điện di và nhuộm được mô tả trong B. 1.7.4. B.2.7.4.2 Ghi hình gel Chuyển gel lên bề mặt chiếu sáng, bật đèn UV và ghi lại huỳnh quang ADN bằng cách chụp ảnh hoặc ghi video. Các trình tự đích được coi là phát hiện được nếu kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với chiều dài dự kiến của các trình tự ADN đích. Xem Bảng B.18. Việc phát hiện các đoạn có kích thước 205 bp, 389 bp, 543 bp và/hoặc 698 bp cho thấy r ằ ng dung dịch ADN mẫu chứa ADN của clostridia sinh ra BoNT tương ứng có thể khuếch đại được. Bảng B.18 - Kích thước s ả n phẩm khuếch đại Typ Mồi Kích thước sản phẩm bp A CBMLA3-F/CBMLA3-R 698 B CBMLB1/CBMLB2 205 E CBMLE1/CBMLE2 389 F CBMLF1/CBMLF2 543 IAC IOF-new-F/IOF-new-R 800 B.2.7.5 Khẳng định kết quả PCR dương tính Kết quả PCR dương tính phải được khẳng định, ví dụ: bằng trình tự của các sản phẩm PCR. Có thể sử dụng các phương pháp thích hợp khác để khẳng định. B.2.7.6 Hạn chế và diễn giải của phương pháp Phương pháp này đã được thử nghiệm để phát hiện các typ và phân typ hiện có của các độc tố thần kinh của clostridia typ A, B, E và F. Tại thời điểm công bố, chưa có xác nhận liệu các mồi được liệt kê trong Bảng B.12 có thể phát hiện các phân typ mới của BoNT/A, B, E và F hay không. Phụ lục c (Tham khảo) Phép thử phát hiện các gen mã hóa độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F sử dụng real-time PCR C.1 Ph ương pháp 1 - Phân tích PCR đa mồi C .1.1 Giới thiệu Phụ lục này mô tả một phương pháp real-time PCR đa mồi probe-based dựa trên công nghệ TaqMan ® 7) đ ể phát hiện các các gen m ã hóa độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F. V ề những hạn chế của phương pháp, xem C .1.6.5. C .1.2 Đặc tính hiệu năng C .1.2.1 Yêu cầu chung Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận đ ố i với ADN được tách chiết từ các chủng đối chứng khác nhau của C . botulinum typ A B, E, F và từ mẫu bị nhiễm tự nhiên. Phương pháp này đã được xuất bản trong Tài liệu tham khảo [6]. C .1.2.2 Đánh giá lý thuyết của phương pháp Đánh giá lý thuyết đã được thực hiện bằng cách nghiên cứu trình tự tương đồng với các cơ sở dữ liệu GenBank/EMB L/ DD B J (Tài liệu tham khảo [16], 2009/09/20). Kết quả nghiên cứu đã khẳng định việc nhận biết hoàn toàn với các trình tự đích dự kiến. C .1.2.3 Tính chọn lọc C .1.2.3.1 Phép th ử chọn lọc dương Phép thử chọn lọc dương của phương pháp đã được thử nghiệm với 14 chủng C . botulinum typ A, 20 chủng C . botulinum typ B, 2 chủng C . botulinum typ E và 1 chủng C . botulinum typ F, xem Bảng C.1. Bảng C.1 - Phép th ử chọn lọc dương của PCR đa mồi sử dụng các ch ủ ng đích Ch ủ ng, typ và phân typ Số ch ủ ng Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát hiện được Typ A Typ B Typ E Typ F C . botulinum typ A 14 14 0 0 0 C . botulinum typ B 20 0 20 0 0 C . botulinum typ E 2 0 0 2 0 C . botulinum typ F 1 0 0 0 1 CH Ú THÍCH: Các chủng được phân lập tại Phòng th ử nghiệm tư vấn về vi khuẩn kỵ khí (CLAB) của trường đại học Leipzig, Đức; trường Đại học Giessen, Đức; Viện Thú y của Đức, Cơ quan An to à n thực ph ẩ m và Y tế Bavarian của Đức. C.1.2.3.2 Phép thử chọn lọc âm Phép thử chọn lọc âm của phương pháp đã được th ử nghiệm với 34 sinh vật không phải đích. Không quan sát được phản ứng chéo với các vi khuẩn không phải đích, xem Bảng C.2. Bảng C.2 - Phép th ử chọn lọc âm của PCR đa mồi sử dụng các chủng không phải đích Các chủng Số lượng ch ủ ng Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát hiện đ ược Typ A Typ B Typ E Typ F C . sporogenes WDCM 00008 1 0 0 0 0 C . perfringens (WDCM 00007 và các chủng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 C . carnis NCTC 13036 1 0 0 0 0 C . histolyticum NCTC 503 1 0 0 0 0 C . butyr i cum NCTC 7423 1 0 0 0 0 C . barati NCTC 10986 1 0 0 0 0 B. subtilis WDCM 00003 1 0 0 0 0 B. cereus (NCTC 11143 và các chủng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 Campylobacter spp. chịu nhiệt (các ch ủ ng ngo à i thực địa) 2 0 0 0 0 E. coli (WDCM 00013 và các ch ủ ng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 Salmonella spp. (WDCM 00030 và chủng ngoài thực địa) 2 0 0 0 0 Listeria spp. (WDCM 00017 và WDCM 00109) 2 0 0 0 0 B. thermospacta WDCM 00071 1 0 0 0 0 E. faecalis WDCM 00087 1 0 0 0 0 C . freundii WDCM 00078 1 0 0 0 0 Pseudomonas spp. (các chủng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 Y. enterocolitica (các chủng ngoài thực địa) 3 0 0 0 0 L.fermentum (ch ủ ng ngoài thực địa) 1 0 0 0 0 Aspergillus spp. (các chủng ngo à i thực địa) 2 0 0 0 0 S . cerevisiae (ch ủ ng ngoài thực địa) 1 0 0 0 0 C.1.2.4 Độ nhạy C.1.2.4.1 Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu bị nhiễm nhân tạo (Tài liệu tham khảo [5]) Các giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo các mẫu nhiễm nhân tạo với các mức nuôi cấy khác nhau (0,1 cfu đến 10 cfu và từ 10 cfu đến 100 cfu trước khi tăng sinh) trong 10 g các nền mẫu thực phẩm khác nhau (cá đóng hộp, xúc xích đóng hộp và mật ong) được nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy (Tài liệu tham khảo [4]). Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả đ ố i với phương pháp sử dụng các mẫu nhiễm nhân tạo là 0 % và tỷ lệ âm tính giả là 0 %. Giới hạn phát hiện của phương pháp được quy định là 1 cfu đến 10 cfu hoặc số bào tử trên phần mẫu thử trước khi tăng sinh. CHÚ THÍCH: Các thực nghiệm được thực hiện với c á c ph ầ n mẫu thử là 10 g. C.1.2.4.2 Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu bị nhiễm tự nhiên Giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo 20 mẫu nhiễm tự nhiên (ví dụ như mật ong, thực vật và các loại thịt đóng hộp), sử dụng phương pháp nuôi cấy làm phương pháp đối chứng. Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp sử dụng các mẫu nhiễm tự nhiên l à 0 % và tỷ lệ âm tính giả là 0 %. CH Ú TH ÍCH : C á c thực nghiệm được thực hiện với các phần mẫu thử là 10 g. C .1.2.5 Kiểm soát phân tích Tất cả các phép thử đã được thực hiện sử dụng các phép kiểm soát quá trình dương tính và âm tính và bổ sung đối với PCR một IAC khác loại. C.1.2.6 Thiết bị, dụng cụ và thuốc thử Việc đánh giá xác nhận đã được thực hiện trên stratagene MX 3000P 8) và với S tratagene MX 3005P 9) , sử dụng 2x Brilliant Multiplex qPCR MasterMix 10) (Tài liệu tham khảo [6]). C .1.3 Nguyên tắc Các đoạn ADN cụ th ể của BoNT/typ gen A, B, E và F, được khuếch đại bằng real-time PCR đa mồi. Các sản phẩm PCR được phát hiện bằng đo huỳnh quang tại các đầu dò. C .1.4 Thuốc thử C .1.4.1 Yêu c ầ u chung Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174). C .1.4.2 Nước không chứa nuclease. C .1.4.3 MasterMix sẵn để sử dụng cho real-time PCR MasterM i x sẵn để sử dụng có chứa dung dịch đệm PCR, dung dịch MgC l 2 , dung dịch dNTP, hệ thống khử nhiễm tùy chọn (dUTP bao gồm urac i l N -glycosylase) và Taq polymerase và phần lớn thích nghi với chu trình nhiệt được sử dụng. Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. C.1.4.4 Plasmid pUC 19 (nhập số L09137). C .1.4.5 Oligonucleotid Trình tự của các oligonucleotid được liệt kê trong Bảng C.3. Bảng C.3 - Trình tự của các oligonucleotid Typ M ồ i Trình tự (5 ' - 3') A CBOT A fw TCT TAC gCg AAA Tgg TTA Tgg CBOT A re TgC CTg CAC CTA AAA gAg gA CBOT A S C HEX-Tgg TTT TgA ggA gTC ACT TgA A-TAMRA b B CBOTB fw AggA gAA gTg gAg CGR e AAA CB O TB re TTC CCT TgA TgC AAA ATg AT CBOTB S a FAM-CCT ggg CCA gTT TTA AAT gA-TAMRA b E CBOT E fw TCA gCA CCT ggA CTT TCA gA CBOT E re CAT gTT gTT CTA TAT CAC TTg TTC CA CBOT E S a FAM-TCC AAA ATg ATg CTT ATA TAC CAA AA-TAMRA b F CBOT F fw ATA Cgg ggC TAg ggg AgT TA CBOT F re AAA TCC TgA CCT CCA AAg gTT CBOT F S c HEX-CCg AAA AAC CCA TAA ggC TA-TAMRA b Kiểm soát cation khuếch đại nội bộ IAC_pUC_fw TgT gAA ATA CCg CAC AgA Tg IAC_pUC_re AgC Tgg CgT AAT AgC gAA g IAC_pUC_S d ROX-gAg AAA ATA CCg CAT CAg gC-TAMRA b a FAM: 6-carboxyfluorescein. b TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine. c HEX: 5’-(hexachlorofluorescein). d ROX = carboxy-X-rhodamine. ° Trong trình tự ol i gonucleotid R l à (A,G). CH Ú THÍCH: Việc sử dụng các nhãn huỳnh quang khác đối với các đầu dò chưa được kiểm tra và đánh giá xác nhận. C.1.5 Thiết bị, dụng cụ C .1.5.1 Yêu cầu chung Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thích hợp đối với phương pháp và cụ thể như sau: C .1.5.2 Thiết bị dùng cho PCR C.1.5.2.1 Pipet và pipet có đ ầ u lọc , dung tích 1 m l và 1 000 m l. C.1.5.2.2 Ố ng ly tâm nhỏ , dung tích 1,5 ml và 2,0 ml. C.1.5.2.3 Ố ng PCR , các ống phản ứng 0,2 ml hoặc 0,5 ml, đĩa vi giếng PCR hoặc thiết bị phù h ợ p khác. C.1.5.2.4 Thiết bị Real-time PCR. C .1.6 Cách tiến hành C .1.6.1 Cài đặt PCR Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR là 25 m l cho mỗi phản ứng với các thuốc thử được liệt kê trong các Bảng C.4 và C.5. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích lớn hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc thử nêu trong Bảng C.4 và C.5 đã chứng minh là phù hợp. Hai hệ thống đa kênh được sử dụng , một hệ thống để phát hiện các gen mã hóa typ A và B và IAC và một hệ thống để phát hiện các gen mã hóa typ E và F. Bảng C.4 - Bổ sung thuốc thử (hệ thống Real-time PCR ba kênh, BoNT/A, B và IAC) Thuốc thử Thể tích cuối cùng Thể tích trên mẫu m l Khuôn mẫu ADN Tối đa 250 ng 5 T aqMan ®7 ) ADN polymerase 2x Bril l iant Multi- plex qPCR MasterMix 10) 1 x 12,5 Dung dịch đệm PCR Dung dịch MgC l 2 Dung dịch dNTP Các mồi PCR đối với BoNT/A, B và IAC (theo Bảng C.3), 10 m mol/l 0,3 m mol/l cho mỗi mẫu 0,75 cho mỗi mẫu Các đầu dò PCR đối với BoNT/A, B và IAC (theo Bảng C.3), 10 m mol/l 0,2 m mol/l cho mỗi mẫu 0,5 cho mỗi mẫu Nước không chứa nuclease 0,5 pUC 19-plasmid, 1 fg 1 fg 1 Bảng C.5 - Bổ sung thuốc th ử (hệ thống real-time PCR hai kênh, BoNT/E và F) Thuốc thử Thể tích cuối cùng Thể tích trên mẫu m l Khuôn mẫu ADN Tối đa 250 ng 5 TaqMan ®7 ) ADN polymerase 2x Brilliant Multiplex qPCR MasterMix 1 0) 1 x 12,5 Dung dịch đệm PCR Dung dịch MgC l 2 Dung dịch dNTP Mồi PCR đối với BoNT/E và F (theo B ả ng C.3), 10 m mol/l 0,5 m mol/l cho mỗi mẫu 1,25 cho mỗi mẫu Đầu d ò PCR đối với BoNT/E và F (theo Bảng C.3), 10 m mol/l 0,2 m mol/l cho mỗi mẫu 0,5 cho mỗi mẫu Nước không chứa nuclease 1,5 C .1.6.2 Kiểm ch ứ ng PCR C .1.6.2.1 Yêu cầu chung Cần thực hiện các phép kiểm chứng trong C .1.6.2.2 đến C .1.6.2.4 của TCVN 11134 (ISO 22174). C.1.6.2.2 Kiểm chứng PCR âm tính Sử dụng nước không chứa ADN làm kiểm chứng âm tính. C.1.6.2.3 Kiểm chứng PCR dương tính Hỗn hợp ADN của clostridia sinh ra BoNT, dương tính đối với tất cả bốn trình tự đích (các gen độc tố thần kinh typ A, B , E và F), khoảng 100 bản sao. C.1.6.2.4 Kiểm soát khuếch đại Sử dụng IAC hoặc EAC phù hợp. Ví dụ IAC khác loại được nêu trong C.1.6. C .1.6.3 Chu trình nhiệt Chu trình nhiệt nêu trong Bảng C.6 đã được sử dụng cho việc nghiên cứu đánh giá xác nhận, sử dụng hệ thống S tratagene MX 3000P 8 ) và Stratagene MX 3005P 9) kết hợp với 2x Brilliant Multiplex qPCR MasterMix ®10 ) . Vi ệ c sử dụng các chu trình nhiệt khác có thể cần phải điều chỉnh cho phù hợp. Thời gian kích hoạt và làm biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymerase được sử dụng. Nếu sử dụng polymerase khởi động nóng thì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất, trừ khi có quy định khác. B ả ng C.6 - Chu trình nhiệt Kích hoạt và làm biến tính ban đầu 10 min/95 ° C Số lượng chu trình (khuếch đại) 45 Khuếch đại 15 s/95 ° C 60 s/55° C C.1.6.4 Giải thích kết quả Giá trị ngưỡng để xác định chu trình ngưỡng, C t, được xác định bởi người phân tích hoặc bằng phần mềm của máy chu trình cụ thể. M ẫ u dương tính cho đồ thị khuếch đại với ít nhất là pha mũ của đường khuếch đại điển hình, xem TCVN 11133 (ISO 22119) [15 ] . Đường khuếch đại của các mẫu này đi qua ngưỡng xác định thiết lập sau một số chu trình nhất định. M ẫ u có tín hiệu huỳnh quang trên ngưỡng được coi l à dương tính. C .1.6.5 Hạn chế của phương pháp Phương pháp này đã được thử nghiệm để phát hiện các typ và phân typ hiện có của các độc tố thần kinh của clostridia typ A, B, E và F. Tại thời điểm công b ố , chưa có xác nhận liệu các mồi nêu trong Bảng C.3 có thể phát hiện các phân typ mới của BoNT/A, B, E và F hay không. C.2 Phương pháp 2 - Phân tích PCR C .2.1 Giới thiệu Đi ề u này quy định phương pháp real-time PCR đầu dò dựa trên công nghệ TagMan ®7) để phát hiện các gen mã hóa các typ độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F. V ề những hạn chế xem C .2.6.5. C .2.2 Đặc tính hiệu năng C .2.2.1 Yêu cầu chung Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận đối với ADN được tách chiết từ các chủng đối chứng typ A, B, E, và F của C . botulinum và từ các mẫu bị nhiễm tự nhiên (Tài liệu tham khảo [2]). C .2.2.2 Đánh giá lý thuyết của phương pháp Đánh giá lý thuyết đã được thực hiện bằng cách nghiên cứu trình tự tương đồng với các cơ sở dữ liệu GenBank/EMB L/ DD B J (Tài liệu tham khảo [16], 2009/09/20). Kết quả nghiên cứu đã khẳng định việc nhận biết hoàn toàn ch ỉ với các trình tự đích dự kiến. C.2.2.3 Tính chọn lọc C .2.2.3.1 Phép thử chọn lọc dương Phép thử chọn lọc dương của phương pháp đã được thử nghiệm với 60 chủng C . botulinum typ A 68 ch ủ ng C . botulinum typ B, 4 chủng C . botulimum t y p AB/Ab, 21 chủng C . botulinum / buty ri cum typ E và 7 chủng C . botulinum/baratii typ F [ 2 ] , xem Bảng C.7. Bảng C.7 - Phép thử chọn lọc dương của PCR đa mồi sử dụng các chủng đích Các chủng, typ và phân typ S ố lượng chủng Typ gen đ ộc tố thần kinh botulinum phát hiện được Typ A Typ B Typ E Typ F C . botulinum typ A 60 60 0 0 0 C . botulinum typ B 68 0 68 0 0 C . botulinum typ AB 3 3 3 0 0 C . botulinum typ Ab 1 1 1 0 0 C . botulinum/butyricum typ E 21 0 0 21 0 C . botulinum/baratii typ F 7 0 0 0 7 C .2.2.3.2 Phép thử chọn lọc âm Phép thử chọn lọc âm của phương pháp đã được th ử nghiệm với 27 sinh vật không phải đích. Không quan sát được phản ứng chéo với các vi khuẩn không phải đích (Tài liệu tham khảo [2]), xem Bảng C.8. Bảng C.8 - Phép th ử chọn lọc âm của PCR đa mồi sử dụng các chủng không phải đích Các chủng Số lượng chủng Typ gen độc t ố thần kinh botulinum phát hiện được Typ A Typ B Typ E Typ F Clostridia spp. Không phải là C . botulinum 24 0 0 0 0 Không phải là Clostridia spp. 3 0 0 0 0 C .2.2.4 Độ nhạy C .2.2.4.1 Phép thử độ nhạy sử dụng độ pha loãng 10 lần của ADN chiết được (Tài liệu tham khảo [2]) Các giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo các dung dịch ADN tinh sạch pha loãng 10 lần. Giới hạn phát hiện đối với BoNT typ A là 25 bản sao gen, đối với BoNT typ B và F là từ 25 bản sao gen đến 250 bản sao gen, đối với BoNT typ E là 250 bản sao gen. C .2.2.4.2 Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu bị nhiễm tự nhiên Giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo 11 mẫu thực phẩm bị nhiễm tự nhiên, sử dụng phương pháp phân tích sinh học trên chuột làm phương pháp đối chứng. Theo kết quả, t ỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp sử dụng các mẫu bị nhiễm tự nhiên là 0 % và tỷ lệ âm tính giả là 0 %. CH Ú THÍCH: Các thực nghiệm được thực hiện với các ph ầ n mẫu thử 10 g. C .2.2.4.3 Thử nghiệm cộng tác Các mồi và đầu dò đã được đánh giá trong nghiên cứu hợp tác quốc tế thực hiện trong bốn phòng thử nghiệm của Châu Âu, sử dụng Real-time PCR khác nhau. Kết quả của nghiên cứu này đã được báo cáo trong Tài liệu tham khảo [2]. C .2.2.5 Kiểm soát phân tích Tất cả các phép thử đã thực hiện sử dụng các phép kiểm chứng âm tính và dương tính và bổ sung cho PCR EAC. C .2.2.6 Thiết bị, dụng cụ và thuốc thử Việc đánh giá xác nhận đã được thực hiện đối với ABI 7700 11) và S tratagene MX 3005P 9) đối với các phép thử (Tài liệu tham khảo [2]) sử dụng kỹ thuật TaqMan ® Universal PCR MasterMix 12) hoặc dung dịch đệm qPCR MasterMix 13) . C .2.3 Nguyên tắc Các đoạn ADN cụ thể của các gen BoNT/A, B, E, F được khuếch đại bằng Real-time PCR . Các sản phẩm PCR được phát hiện bằng cách đo sự phát huỳnh quang tại các đầu dò. C .2.4 Thuốc thử C .2.4.1 Yêu cầu chung Đối với chất lượng thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174). C.2.4.2 Nước không chứa nuclease. C .2.4.3 MasterMix sẵn để sử dụng cho real-time PCR MasterMix sẵn để sử dụng có chứa dung dịch đệm PCR, dung dịch MgC l 2 , dung dịch dNTP hệ thống khử nhiễm tùy chọn (dUTP bao gồm uracil N -glycosylase) và Taq polymerase và phần lớn thích nghi với chu trình nhiệt được sử dụng. Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. C .2.4.4 Oligonucleotid Trình tự của các o l igonucleotid được nêu trong Bảng C.9. Bảng C.9 - Trình tự của các oligonucleotid Typ Mồi Trình tự (5' - 3') A A.1 ggA gTC ACT TGA AGT TGA TAC AAA TC A.2 gCT AAT gTT ACT gCT ggA TCT gTA g A.3 FAM b -TCT TTT Agg TgC Agg CAA ATT T-BHQ1 c B B.1 gAT gAA CAg CCA ACA TAT AgT TgT CA B.2 gTT TCC TTT TTA CCT CTT TTA AgT ACC ATT B.3 FAMb-TgA TgA K a AT Agg ATT gAT Tgg TAT TCA-BHQ1 c E E.1 CTA TCC AAA ATg ATg CTT ATA TAC CAA A E.2 ggC ACT TTC TgT gCA TCT AAA TA E.3 FAM b -ATg ATT CTA ATg gAA CAA gTg ATA TAg AAC AAC ATg ATg T -BHQ1 c F F.1 gCA ATA TAg gAT TAC TAg gTT TTC ATT C F.2 gAA ATA AAA CTC CAA AAg CAT CCA TT F.3 FAM b -TTg gTT gCT AgT AgT Tgg TAT TAT AAC AA-BHQ1 c Kiểm soát cation khuếch đại nội bộ EAC1 TAC CAT Agg Agg AAg CCA C EAC2 CTT CTT CCT AAT CTC TAC gCA T EAC3 HEX d -gTg CCA gCA gCC gCg gTA ATA Cg-BHQ1 c a Trong trình tự oligonucleotid K là (G,T). b FAM: 6-carboxyfluorescein. c BlackHole TM Dark Quencher 1. BlackHole là tên thương mại của sản phẩm do Biosearch Technilogies cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và trong tiêu chu ẩ n này không ấn định phải sử dụng sản ph ẩ m n à y , có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương. d HEX: 5'-(hexachlorofluorescein). CHÚ THÍCH: Việc sử dụng các nhãn huỳnh quang khác cho các đầu d ò chưa được thử nghiệm hoặc đánh giá xác nhận. C .2.4.5 Kiểm soát khuếch đại bên ngoài C .2.4.5.1 Nguyên tắc chung ADN được chiết từ chủng C . butyricum ATCC ® 19398 TM 14) được khuếch đại bằng PCR sử dụng các mồi đặc hiệu nêu trong Bảng C.9 trong ống phản ứng riêng biệt cùng với khuôn mẫu ADN (Tài liệu tham khảo [8]). C .2.4.5.2 Chủng C . butyricum ATCC ® 19398 TM Cấy chủng C . butyr i cum ATCC ® 19398 TM trong canh thang TPGY ở 30 ° C ± 1 ° C trong 24 h ± 2 h trong các điều kiện kỵ khí. Chiết ADN từ môi trường tăng sinh (9.3). Sử dụng khoảng 2 500 bản sao ADN làm EAC. C .2.4.5.3 Sử dụng EAC Kích thước của sản phẩm khuếch đại của chủng C . butyr i cum ATCC ® 19398 TM là 232 bp. Tổng số 2 500 bản sao ADN cho giá trị C t xấp xỉ 30. C .2.5 Thiết bị, dụng cụ C .2.5.1 Yêu cầu chung Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thích hợp phù hợp với phương pháp và cụ thể như sau: C.2.5.2 Thiết bị dùng cho PCR C .2.5.2.1 Pipet và pipet có đầu lọc , có dung tích từ 1 m l đến 1 000 m l C .2.5.2.2 Ố ng ly tâm nh ỏ , có dung tích 1,5 ml và 2,0 ml. C .2.5.2.3 Ố ng PCR , ống ph ả n ứng 0,2 ml hoặc 0,5 ml, đĩa PCR vi giếng hoặc thiết bị phù hợp khác. C.2.5.2.4 Thiết bị real-time PCR C .2.6 Cách tiến hành C .2.6.1 Cài đặt PCR Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR là 25 m I cho mỗi phản ứng với các thuốc thử được liệt kê trong Bảng C.10 và C.11. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích lớn hơn nếu c á c dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc thử nêu trong Bảng C.10 và Bảng C.11 được chứng minh l à phù hợp. Các hệ thống mồi được chia thành năm phản ứng khác nhau: bốn phép thử PCR đặc hiệu cho từng typ độc tố và một phép th ử cho EAC. B ả ng C.10 - Bổ sung thuốc thử (các hệ thống real-time PCR BoNT/A, B, E hoặc F) Thuốc th ử Giá trị cuối c ù ng Thể tích trên mẫu m l Khuôn mẫu ADN Tối đa 250 ng 5 ADN polymerase TaqMan® 7 ) 2x TaqMan ® Uni- versal PCR MasterMix 12) 1x 12,5 Dung dịch đệm PCR Dung dịch MgC l 2 Dung dịch dNTP Mồi PCR dùng cho BoNT/A, B, E hoặc F (theo Bảng C.9) 10 m mol/l 0,3 m mol/1 cho mỗi mẫu 0,75 cho mỗi mẫu Đầu dò PCR dùng cho BoNT/A, B, E hoặc F (theo Bảng C.9), 10 m mol/l 0,1 m mol/l cho mỗi mẫu 0,25 cho mỗi mẫu Nước không chứa nuclease 0,75 B ả ng C.11 - Bổ sung thuốc thử (EAC) Thuốc thử Giá trị cuối cùng Thể tích tr ê n mẫu m l Khuôn mẫu ADN Tối đa 250 ng 5 ADN polymerase TaqMan® 7 ) 2x TaqMan ® Uni-versal PCR MasterMix 12) 1 x 12.5 Dung dịch đệm PCR Dung dịch MgC l 2 Dung dịch dNTP Mồi PCR dùng cho EAC (theo Bảng C.9) 10 m mol/l 0,9 m mol/l cho mỗi mẫu 2,25 cho mỗi mẫu Đầu dò PCR dùng cho BoNT/E và F (theo Bảng C.9), 10 m mol/l 0,3 m mol/l cho mỗi mẫu 0,75 cho mỗi mẫu C . butyricum ADN (2 500 bản sao/ m l) 2 500 b ả n sao 1 Nước không chứa nuclease 1,25 C .2.6.2 Kiểm chứng PCR C .2.6.2.1 Yêu cầu chung Cần thực hiện các phép ki ể m chứng trong C .2.6.2.2 đến C .2.6.2.4 của TCVN 11134 (ISO 22174). C .2.6.2.2 Kiểm chứng PCR âm tính Sử dụng nước không chứa ADN làm kiểm chứng âm tính. C .2.6.2.3 Kiểm chứng PCR dương tính Hỗn h ợ p ADN của c lostridia sinh ra BoNT, dương tính đối với tất cả bốn trình tự đích (các gen độc tố thần kinh typ A, B, E và F), khoảng 1 000 bản sao. C .2.6.2.4 Kiểm soát khuếch đại Sử dụng IAC hoặc EAC phù hợp. Ví dụ của EAC được nêu trong C .2.4.5. C .2.6.3 Chu trình nhiệt Chu trình nhiệt nêu trong Bảng C.12 đã được sử dụng cho việc nghiên cứu đánh giá xác nhận sử dụng hệ thống ABI 7700 11) và S tratagene MX 3005P 9) kết hợp với TaqMan ® Universal PCR Master Mix 12) hoặc đệm qPCR MasterMix 13) . Việc sử dụng các chu trình nhiệt khác có thể phải điều chỉnh cho phù hợp. Thời gian kích hoạt và làm biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymerase được sử dụng. Nếu sử dụng polymerase khởi động nóng, th ì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất, trừ khi có quy định khác. Bảng C.12 - Chu trình nhiệt Kích hoạt và làm bi ế n tính ban đầu 10 min/95 ° C Số lượng chu trình (khuếch đại) 35 Khuếch đại 15 s/95 ° C 60 s/60 ° C C .2.6.4 Giải thích kết quả Giá trị ngưỡng để xác định chu trình ngưỡng, C t, được xác định bởi người phân tích hoặc bằng phần mềm của máy chu trình cụ thể. M ẫ u dương tính cho đồ thị khuếch đại với ít nhất l à pha mũ của đường khuếch đại điển hình, xem TCVN 11133 (ISO 22119) [1 5 ] . Đường khuếch đại của các mẫu này đi qua ngưỡng xác định thiết lập sau một số chu trình nhất định. M ẫ u có tín hiệu huỳnh quang trên ngưỡng được coi là dương tính. C.2.6.5. Hạn chế của phương pháp Phương pháp này đã được th ử nghiệm đ ể phát hiện các typ và phân typ hiện có của các độc tố thần kinh của clostridia typ A, B, E và F. Tại thời điểm công bố, chưa có xác nhận liệu các mồi nêu trong Bảng C.9 có thể phát hiện các phân typ mới của BoNT/A, B, E và F hay không. Phụ lục D (Tham khả o ) Chuẩn bị các bào tử của C. botulinum D.1 Giới thiệu Phụ lục này mô tả việc chuẩn bị các bào tử C . botulinum (cả ch ủ ng phân giải protein và không phân giải protein) để kiểm soát quá trình (9.2.3). Xem Hình D.1. Chi tiết có trong Tài liệu tham khảo [4]. D.2 Môi trường nuôi cấy D.2.1 Yêu cầu chung Thực hiện theo TCVN 8128 (ISO 11133) để chuẩn bị, sản xuất và thử nghiệm hiệu năng của mô i trường nuôi cấy. D.2.2 Canh thang Anellis cải biến Có thể sử dụng môi trường nuôi cấy tăng sinh khác đã được phê duyệt nếu đã biết có hiệu năng tương đương. D.2.2.1 Môi trường thạch D.2.2.1.1 Thành phần và độ pH Trypton 25 g Pepton 2,5 g Chất chiết nấm men 0,5 g Thạch 0,5 g Kali hydro Phosphat [K 2 HPO 4 ] 0,625 g Nước đến 500 ml pH 7,5 ± 0,1 D.2.2.1.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Ch ỉ nh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,5 ± 0,1 ở 25 ° C . Phân ph ố i vào bình hoặc chai có dung tích thích hợp. Tiệt trùng trong 15 min ở 121 ° C . Môi tr ườ ng được làm đông đặc (phần đặc của canh thang Anellis cải biến). Môi trường này cần được sử dụng trong ngày chuẩn bị. D.2.2.2 Môi trường lỏng D.2.2.2.1 Thành phần và độ pH Chất chiết nấm men 0,25 g Amoni sul f at [(NH4) 2 S O 4 ] ( w ±2 %) 5 g Thiamin hydrochlorua [C 12 H 17 CIN 4 OS.HC l ] ( w ± 0,0001%) 0,25 m g Nước đến 250 ml pH 7,5 ±0,1 D.2.2.2.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,5 ± 0,1 ở 25 o C. Phân phối vào bình hoặc chai có dung tích thích hợp. Tiệt trùng 15 min ở 121 ° C . Bảo quản trong tủ lạnh ở 5 ° C ± 3 ° C cho đến khi sử dụng. Môi trường này cần được sử dụng trong ngày chuẩn bị. D.2.2.3 Chuẩn bị môi trường hoàn chỉnh Đối với môi trường cuối cùng sử dụng lượng chất rắn với lượng chất l ỏ ng là 4 + 1. Sau khi làm mát thạch đã đông đặc t ừ 20 ° C đến 30 ° C , chuy ể n một lượng thích hợp dịch cấy của chủng C . botulinum phân giải protein (xem D.5) vào môi trường đặc và phủ bằng một lớp môi trường lỏng. D.2.3 Môi trường hai pha Có th ể sử dụng môi trường nuôi cấy tăng sinh khác đã được phê duyệt nếu cho hiệu năng tương đương. D.2.3.1 Pha thạch (thạch gan) D.2.3.1.1 Thành phần và độ pH Huyễn dịch từ gan tươi 30 g Pepton 0,6 g Natri clorua, NaC l 0,3 g Thạch 1,2 g Nước đến 500 ml pH 6,9 ± 0,1 D.2.3.1.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi kh ử trùng pH là 6,9 ± 0, 1 ở 25 ° C . Phân phối vào bình hoặc chai có dung tích thích hợp. Tiệt trùng 15 min ở 121 ° C . Bảo quản trong tủ lạnh ở 5 ° C ± 3 ° C cho đến khi sử dụng. Môi trường này cần được sử dụng trong ngày chuẩn bị. D.2.3.2 Môi trường lỏng Nước cất 500 ml D.2.3.3 Chuẩn bị môi trường hoàn chỉnh Đối với môi trường cuối cùng sử dụng lượng chất rắn với lượng chất l ỏ ng là 2 + 1. Sau khi làm mát thạch đã đông đặc từ 20 o C đến 30 ° C , chuyển một lượng thích hợp dịch cấy của chủng C . botulinum không phân giải protein (xem D.5) vào môi trường đặc và phủ bằng một lớp môi trường lỏng. D.3 Thuốc thử D.3.1 Hóa chất làm sạch các bào t ử D.3.1.1 Natri clorua, NaC l . D.3.1.2 Dung dịch natri clorua , r (NaC l ) = 0,85 g/l, được hòa tan trong nước vô trùng. D.3.2 Thuốc thử để nhuộm Gram D.3.2.1 Tím tinh thể , [(CH 3 ) 2 NC 6 H 4 ] 2 C:C 6 H 4 :N + (CH 3 ) 2 C l - . D.3.2.2 Etanol , r (C 2 H 5 OH) = 96 %. D.3.2.3 Amoni oxalat , NH 4 OCOCOONH 4 . D.3.2.4 Nước. D.3.2.5 Tinh th ể iốt. D.3.2.6 Kali iodua. D.3.2.7 Sa f ranin , C 2 0 H 19 CIN 4 . D.3.2.8 Dung d ị ch Safranin , r (C 2 0 H 19 CIN 4 ) = 0,1 g/l. D.3.2.9 Dung dịch nhuộm màu tím tinh thể Hòa tan 2,0 g tím tinh thể (D.3.2.1) trong 20 ml etanol (D.3.2.2) và 0,8 g amoni oxalat trong 80 ml nước. Trộn nhẹ hai dung dịch với nhau. Hỗn hợp này có thể bền đến khoảng 2 năm đến 3 năm. D.3.2.10 I ot để nhuộm Gram Hòa tan 2 g kali i o dua (D.3.2.6) trong 2 ml nước cất. Các tinh thể được hòa tan và dung dịch trở nên rất lạnh. Hòa tan các tinh thể iot (D.3.2.5) trong dung dịch kali iodua. Pha loãng hỗn hợp với 298 ml nước. Hỗn hợp n à y có thể bền đến khoảng 2 năm đến 3 năm. D.3.2.11 Dầu soi kính. D.4 Thiết bị, dụng cụ D.4.1 Yêu cầu chung Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau. D.4.2 Thiết bị để tăng sinh vi khuẩn D.4.2.1 Nồi cách thủy , có khả năng duy tr ì ở 30 ° C ± 1 ° C . D.4.2.2 Bình kỵ khí hoặc tủ kỵ khí , có khả năng duy trì ở 30 ° C ± 1 ° C , theo TCVN 6404 (ISO 7218). D.4.2.3 Tủ ấm , có khả năng duy trì ở 30 ° C ± 1 ° C . D.4.2.4 Bình cầu hoặc chai , dung tích thích hợp. D.4.3 Thiết bị làm sạch các bào t ử D.4.3.1 M áy siêu âm , với tần số hoạt động lên đến 38 Hz. D.4.3.2 Máy ly tâm , dùng cho các ống 50 ml và 100 ml, với gia tốc có thể điều chỉnh đến 6 000 x g . D.4.3.3 Kính hiển vi quang học có độ phóng đại của vật kính lên đ ế n 100x . D.4.3.4 Lam kính , k ích thước 75 mm x 25 mm. D.5 Cách tiến hành D.5.1 Nuôi cấy D.5.1.1 Chủng C . botulinum phân giải protein (canh thang Anellis cải biến) Đối với môi trường cuối cùng sử dụng lượng chất rắn với lượng chất lỏng là 2 + 1. Sau khi làm mát thạch đã đông đặc từ 20 ° C đến 30 ° C , cấy 1 ml của dịch cấy TPGY (9.2) của chủng C . botulinum phân giải vào pha đặc (D.2.2.1) của môi trường và phù bằng một lớp môi trường lỏng (D.2.2.2). D.5.1.2 Chủng C . botulinum không phân giải protein (môi trường hai pha) Đ ối với môi trường cuối cùng sử dụng lượng chất rắn với lượng chất lỏng là 4 + 1. Sau khi làm mát thạch đã đông đặc từ 20 ° C đến 30 ° C , cấy 1 ml của dịch cấy TPGY (9.2) của ch ủ ng C . botulinum không phân giải protein vào pha đặc (D.2.3.1) của môi trường và phủ bằng một lớp môi trường l ỏ ng (D.2.3.2). D.5.2 Tăng sinh Ủ các chủng C . botulinum phân giải protein trong canh thang Anellis cải biến, các chủng không phân giải protein trong môi trường hai pha 7 ngày ở 30 ° C ± 1 ° C ở điều kiện kỵ khí (D.4.2.3). D.5.3 Phân lập và làm sạch các bào tử từ dịch cấy tăng sinh Cho ly tâm 20 ml phần chất lỏng của môi trường tăng sinh 15 min ở 6 000 x g (D.4.3.2) và loại bỏ phần nổi phía trên. Hòa lại các hạt cặn trong 20 ml dung dịch natri clorua (D.3.1.2.), ly tâm mẫu 15 m i n ở 6 000 x g và siêu âm mẫu 5 m i n trong máy siêu âm (D.4.3.1). Lặp lại các bước ly tâm, hòa tan lại và siêu âm năm lần. Hòa lại các hạt cặn trong 1 ml dung dịch natri clorua (D.3.1.2), ly tâm mẫu 1 h ở 6 000 x g v à loại bỏ phần nổi phía trên. Hòa lại các hạt cặn trong 20 ml dung dịch natri clorua (D.3.1.2), ly tâm mẫu 15 min ở 6 000 x g (D.4.3.2), loại b ỏ phần nổi phía trên và siêu âm mẫu 5 min trong máy siêu âm (D.4.3.1). Lặp lại các bước ly tâm, hòa tan lại và siêu âm bốn lần. Hòa lại các hạt cặn trong 1 ml dung dịch natri clorua (D.3.1.2) và bảo quản các bào tử ở 1 ° C cho đến khi sử dụng. D.5.4 Khẳng định kết quả D.5.4.1 Yêu cầu chung Có thể sử dụng các quy trình khác nhau để nhuộm màu vi khuẩn và bào tử, sử dụng kính hiển v i để khẳng định kết quả phân lập và làm sạch. Ví dụ được đưa ra trong D.5.4.2. D.5.4.2 Nhuộm Gram D.5.4.2.1 Chuẩn bị vết bôi Chuyển 1 giọt hoặc 2 giọt huyền phù bào tử vào l am kính (D.4.3.4) và dàn đều thành màng mỏng. Đ ể khô trên bề mặt phẳng. Sau khi đã khô trong không khí, h ơ phiến kính qua ngọn lửa hai hoặc ba lần. Làm nguội phiến kính trước khi nhuộm. D.5.4.2.2 Nhuộm Nhỏ dung dịch tím tinh thể (D.3.2.9) ngập vết bôi, để nhuộm trong 30 s. Rửa nhanh bằng nước để loại bỏ tím tinh thể dư thừa. Nhỏ iot nhuộm màu Gram (D.3.2.10) để trong 3 s. Rửa nhanh bằng nước mà không để bị khô. Rửa nhẹ dưới dòng nước chảy. Kh ử màu bằng cách cho dung dịch etanol (D.3.2.2) chảy qua vết nhuộm và dừng lại khi nước chảy trong. Rửa bằng nước vòi và nhuộm màu b ổ sung với dung dịch safranin (D.3.2.8) trong 15 s. Loại bỏ chất nhuộm dư dưới dòng nước chảy nhẹ. Dựng thẳng lam kính cho chảy hết nước và để khô trong không khí. D.5.4.2.3 Kiểm tra bằng kính hiển vi Soi tế bào với vật kính dầu có độ phóng đại 100x (D.4.3.3) có ngâm dầu (D.3.2.11). Các tế b à o sinh dưỡng C . botulinum là vi khuẩn Gram dương hình que và sinh các nội bào tử gần cuối. Các tế bào sinh dưỡng có màu xanh. Các bào tử có thể nằm trong tế bào hoặc tồn tại dưới dạng bào tử tự do. Chỉ có một vài tế bào sinh dưỡng nằm trong trường quan sát của kính hiển vi. H ì nh D.1 - S ơ đồ chuẩn bị các bào tử THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] De Medici D., Anniballi F., Wyatt G.M., Lindstrom M., Messelhausser U., Aldus C.F., Delibato E., Korkeala H., Peck M.W., Fenicia L Multiplex PCR to detect botulinum neurotoxin-producing c lostridia in clinical, food and environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75 pp.6457- 6461 [2] Fach P., Fenicia L., Knutsson R., Wielinga P.R., Anniballi F., Delibato E., Auricchio B., Woudstra C., Agren J., Segerman B., De Medici D., Van Rotterdam B J An innovative molecular detection tool for tracking and tracing C lostridium botulinum types A, B, E, F and other botulinum neurotoxin producing c lostridia based on the GeneDisc cycler. Int. ]. Food Microbiol. 2011, 145 (Suppl 1) pp. S145-S151 [3] Fenicia L., De Medici D., Anniballi F., Delibato E., Aureli P. Multiplex PCR method to detect Botulinum neurotoxins producing c lostridia in food and clinical samples. Abstract Book of MED-VET-NET 2nd Annual General meeting 2006-05-03/06, Malta [4] Fenicia L, Fach P., Van Rotterdam B., Author S.V.A., Anniballi F., Wielinga P ., Auricchio B., Woudstra C., Delibato E., De Medici D., Knutsson R. Towards an international standard for detection and typing botulinum neurotoxin-producing c lostridia types A, B, E and F in food, feed and environmental samples: A European ring trial study to evaluate a real-time PCR assay. Int. J. Food Microbiol. 2011, 145 (Suppl 1) pp. S152-S157 [5] Grecz N., Anellis A., Schneider M.D. Procedure for cleaning of Clostridium botulinum spores. J. Bacteriol. 1962, 84 pp. 552-558 [6] Lindstrom M., Keto R., Markkula A., Nevas M., Hielm S., Korkeala H. Multiplex PCR assay for detection and identification of Clostridium botulinum types A, B, E, and F in food and fecal material. Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67 pp. 5694-5699 [7] Messelhausser U., Zucker R., Ziegler H., Elmer-Englhard D., Kleih W., Holler C., Busch U. Nachweis von Clostridium botulinum TVp A, B, E und F mittels real-time-PCR [Detection of Clostridium botulinum type A, B, E and F with real-time-PCR]. J. Verbrauch. Lebensm. 2007, 2 pp. 198-201 [8] Center for Food Safety and Applied Nutrition. M151: Trypticase-peptone-glucose- yeast extract broth. I n: Bacteriological analytical manual online. Silver Spring, MD: U.S. Food & Drug Administration, 2001. Available (viewed 2013-04-22) at: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063710.htm [9] TCVN 6507-2 (ISO 6887-2) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 2: Các nguyên tắc cụ thể để chu ẩ n bị các mẫu thịt và sản ph ẩ m thịt [10] TCVN 6507-3 (ISO 6887-3) Vi sinh vật trong th ự c phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 3: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các mẫu th ủy sản và sản ph ẩ m th ủy sản [11] TCVN 6507-4 (ISO 6887-4) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 4: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các sản phẩm kh á c với sữa và s ả n phẩm sữa, thịt và sản ph ẩ m thịt, th ủy sản và sản phẩm th ủy s ả n [12] TCVN 6507-5 (ISO 6887-5) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 5: Các nguyên tắc cụ thể đ ể chuẩn bị mẫu sữa và sản phẩm sữa [13] TCVN 6507-6 (ISO 6887-6) Vi sinh vật trong thực ph ẩ m và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi s i nh vật - Phần 6: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị mẫu được lấy từ giai đoạn sản xuất ban đầu [14] TCVN 11132 (ISO 22118) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện và định lượng vi sinh vật gây bệnh từ thực ph ẩ m - Đặc tí nh hiệu năng [15] TCVN 11133 (ISO 22119) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase real-time (Real-time PCR ) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung [16] National Center for Biotechnology Information (NCBI] Blast 15) ! search , European Molecular Biology Laboratory [EMBL] database. Available (viewed 2013-04-22] at: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi [17] Nakamura S School of Medicine, Kanazawa University, Kanazawa, Japan 1) MyCycler ® Gradient là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi BioRad. Thông tin n à y đưa ra tạo thuận tiện cho ng ườ i sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể s ử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương. 2) Mastercycler ® Gradient là tên thương mại của sản ph ẩ m được cung cấp b ở i Eppendorf. Thông tin n à y đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải s ử dụng ch ú ng. Có thể sử dụng sản ph ẩ m tương tự nếu cho k ế t quả tương đương. 3) 2x Multiplex qPCR MasterMix ® là tên thương mại c ủ a sản phẩm được cung c ấ p b ở i Qiagen. Thông tin n à y đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng v à tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể s ử dụng s ả n phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương. 4) 10x nghĩa là nồng độ của dung dịch đệm PCR cao gấp 10 lần. 5) Tap ADN polymerase l à tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Applied Biosystem. Th ô ng tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấ n định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương. 6) Tap AON polymerase là tên thương mạ i của sản phẩm được cung c ấ p b ở i Qu i agen. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn n à y không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự n ế u cho k ế t quả tương đương. 7) TapMan® l à tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Roche Mo l ecular System. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người s ử dụng v à tiêu chuẩn này không ấn định phải s ử dụng ch ú ng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương. 8) S tratagene MX 3000P là tên thương mại của s ả n phẩm được cung c ấ p bởi Ag i lent Technologies. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn n à y không ấ n định phải sử dụng chúng . Có th ể s ử dụng s ả n phẩm tương tự nếu cho k ế t quả tương đương. 9) S tratagene MX 3005P l à tên thương mại của sản phẩm được cung cấp b ở i Ag i lent Technologies. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng v à tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương. 10) 2x Brilllant Multiplex qPCR MasterMix là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp b ở i Agilent Technologies. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải s ử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương. 11) ABI 7700 l à tên thương mại của sản phẩm được cung cấp b ở i Agilent Technologies. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chu ẩ n này không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản ph ẩ m tương tự nếu cho kết quả tương đương. 12) TaqMan ® Universal PCR MasterMix là tên thương mại của sản phẩm được cung c ấ p b ở i Agilent Technologies. Th ô ng tin n à y đưa ra tạo thuận tiện cho người s ử dụng v à tiêu chu ẩ n n à y không ấn định phải sử dụng ch ú ng. Có thể s ử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương. 13) qPCR MasterMix là t ê n thương mại của sản ph ẩ m được cung cấp b ở i Eurogentec. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng v à tiêu chuẩn n à y không ấ n định phải sử dụng chúng. Có th ể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương. 14) Butyricum ATCC® 19398 là tên thương mại c ủ a sản ph ẩ m được cung cấp b ở i ATCC. Thông tin n à y đưa ra tạo thuận tiện cho người s ử dụng và ti ê u chu ẩ n này không ấn định phải sử dụng ch ú ng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết qu ả tương đương. 15) Blast® l à tên thương mại của sản phẩm được cung c ấ p b ở i National Library of Medidne. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng và tiêu chuẩn này không ấn định phải s ử dụng chúng. Có thể s ử dụng sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.