TCVN10413-1:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10413-1:2014 (ISO 9167-1:1992) về Hạt cải dầu - Xác định hàm lượng glucosinolat - Phần 1 - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10413-1:2014 ISO 9167-1:1992 HẠT CẢI DẦU - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLUCOSINOLAT - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Rapeseed - Determination of glucosinolates content - Part 1: Method using high-performance liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 10413-1:2014 hoàn toàn tương đương với ISO 9167-1:1992, sửa đổi 2013; TCVN 10413-1:2014 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật và thực vật biên soạn, T ổ ng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. HẠT CẢI D Ầ U - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLUCOSINOLAT - PH Ầ N 1: PHƯƠNG PHÁP S Ắ C KÝ L Ỏ NG HIỆU NĂNG CAO Rapeseed - Determination of glucosinolates content - Part 1: Method using high-performance liquid chromatography 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chu ẩ n này quy định phương pháp xác định hàm lượng các glucosinolat khác nhau trong hạt cải dầu sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao. CHÚ THÍCH 1 . Phương pháp n à y không x á c định các glucosinolat được thay thế phân tử glucose, tuy nhi ê n các hợp chất này kh ô ng quan t rọng trong hạt cải dầu th ươ ng mại. 2 . Phưong pháp xác định nhanh hàm lượng các glucosinolat sử dụng quang phổ huỳnh quang tia X quy định trong ISO 9167-2 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công b ố th ì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các t à i liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm c ả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân t í ch trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử. ISO 664:1990 1) , Oilseeds - Reduction of laboratory sample to test sample (Hạt có dầu - Phương pháp lấy mẫu thử từ mẫu phòng thử nghiệm) ISO 665:1977 2) , Oilseeds - Determination of moisture and volatile matter content (Hạt có dầu - Xác định độ ẩm và hàm lượng chất bay hơi) 3. Nguyên tắc Chiết glucosinolat bằng methanol, sa u đó t i nh sạch và khử sul f at bằng enzym trên resin trao đổi ion. Phép xác định sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đ ả o với rửa giải gradient và detector UV. 4. Thuốc thử Ch ỉ sử dụng thuốc thử đạt chất lượng phân tích và nước phải phù hợp với loại 2 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác. 4.1 . Metanol, loại dùng cho HPLC, dung dịch 70 % (thể tích). 4.2 . Natri axetat, 0,02 mol/l ở pH 4,0. 4.3 . Natri axetat, dung dịch 0,2 mol/l. 4.4 . lmidazol format, dung dịch 6 mol/l. Hòa tan 204 g imidazol trong 113 m l axit f ormic đựng trong b ì nh định mức một vạch 500 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch. 4.5 . Chất chuẩn nội, sử dụng sinigrin ngậm một phân tử nước (kali allylglucosinolat ngậm một phân tử nước M r = 415,49) (xem 4.5.1) hoặc glucotropaeolin (benzylglucosinolat, muối kali, M r = 447,52) (xem 4.5.2) đối với hạt cải dầu (được trồng hoặc mọc hoang) chứa sinigrin tự nhiên. Đối với hạt cải dầu có hàm lượng glucos i nolat thấp (< 20=""> m m/g), giảm nồng độ chất chuẩn nội (từ 1 mmol/l đến 3 mmol/l) trong 4.5.1 và 4.5.2.1. 4.5.1 . Sinigrin ngậm một phân tử nước 4.5.1.1 . Sinigrin ngậm một phân tử nước, dung dịch 5 mol/l Hòa tan trong nước 207,7 mg kali allylglucosinolat ngậm một phân tử nước đựng trong bình định mức một vạch dung tích 100 ml. Thêm nước đến vạch. Dung dịch này có thể bảo qu ả n một tuần trong tủ lạnh ở khoảng 4 °C hoặc trong thời gian dài hơn nếu bảo quản trong t ủ lạnh đông ở -18 °C. 4.5.1.2 . Sinigrin ngậm một phân tử nước, dung dịch 20 mmol/l. Hòa tan trong nước 831,0 mg kali allylglucosinolat ngậm một phân tử nước đựng trong b ì nh định mức một vạch dung tích 100 ml. Thêm nước đến vạch. Dung dịch này có t hể bảo quản một tuần trong tủ lạnh ở khoảng 4 °C hoặc trong thời gian d à i hơn nếu b ả o quản trong tủ lạnh đông ở -18°C. 4.5.1.3 . K iể m tra đ ộ tinh khiết S ử dụng một hoặc một số trong 3 phép thử dưới đây: - ph â n tích HPLC sử dụng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này; - phân tích sinigrin bằng HPLC (k ỹ thuật ghép cặp ion); - phân tích sinigrin đã silyl hóa và khử sulfat bằng sắc ký khí. Đối với mỗi phép thử, sắc ký đ ồ chỉ có một pic ch í nh chiếm ít nhất 98 % tổng diện tích pic. Xác nh ậ n độ tinh khiết bằng cách định lượng glucose tách ra sau khi thủy phân bằng myrosinase (thioglucoside glucohydrolase, EC 3.2.3.1). Đo glucose bằng phương pháp enzym. Sử dụng các bộ thử có bán sẵn trên thị trường thì thuận tiện hơn cho việc xác định. Đưa v à o t í nh toán bất kỳ glucose tự do hiện có; chất này được xác định theo cách tương tự nhưng không bổ sung myrosinase. Nồng độ phân tử của glucose tách ra đạt ít nh ấ t bằng 98 % nồng độ phân tử của dung dịch sinigrin đã kiểm tra. 4.5.2 . Glucotropaeol in CHÚ TH Í CH 3 Glucotropaeolin thư ờ ng kh ó phân t ách ra khỏi các glucosinolate tự nhiên khác. 4.5.2.1 . Glucotropae o lin, dung dịch 5 mmol/l. Hòa tan trong nước 233,8 mg glucotropaeolin đựng trong bình định mức dung tích 100 ml. Thêm nước đến vạch. 4.5.2.2 . Glucotropae o lin, dung dịch 20 mmo l/ l. Hòa tan trong nước 895,0 mg glucotropaeolin đựng trong bình định mức dung tích 100 ml. Thêm nước đến vạch. 4.5.2.3 . Kiểm tra độ tinh khiết Kiểm tra độ tinh khiết theo quy trình quy định trong 4.5.1.3. 4.5.2.4 . Hệ s ố đáp ứng Xác nhận các hệ số đáp ứng của glucotropaeolin, so sánh với sinigrin tương ứng với các hệ số đáp ứng được đưa ra trong 9.2. 4.6 . Pha động 4.6.1 . Dung môi A: nước, được tinh lọc qua hệ thống cột than hoạt t í nh (ví dụ: hệ thống Norganic Millipore 1) ) hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. 4.6.2 . Dung môi B: axetonotril, loại dùng cho HPLC, dung dịch 20% (thể tích) trong nước đã tinh sạch. Nồng độ c ó thể thay đổi tương ứng với các cột được sử dụng. 4.7 . Resin trao đổi ion, sử dụng 4.7.1 hoặc 4.7.2. 4.7.1 . Huy ề n phù DEAE Sepharose CL-6B 2) có bán sẵn trên thị trường đ ể sử dụng hoặc sản phẩm tương đương. 4.7.2 . Huyền phù DEAE Sephadex A25 2) , được chuẩn bị như sau: Trộn 10 g resin DEAE Sephadex A25 (hoặc resin tương đương) trong dung dịch axit a x etic 2 mol/l dư. Để cho lắng xuống. Thêm axit axetic 2 mol/l cho đ ế n khi thể tích của dịch l ỏ ng bằng hai lần thể tích của phần lắng. 4.8 Sul f atase, loại Helix pomati typ H1 (EC 3.1.6.1), có hoạt độ lớn hơn 0,5 đơn vị hoạt độ tr ê n mililit dung dịch sul f atase đ ã tinh lọc. Tinh lọc, kiểm tra và pha lo ã ng sul f atase theo phương pháp quy định trong 4.8.1 đến 4.8.4. 4.8.1 . Chu ẩ n bị cột trao đổi ion Cắt 7 cm phía trên cổ của năm pipet Pasteur (5.9) và đặt n ú t bông thủy tinh (5.8) vào cổ. Đặt pipet thẳng đứng trên giá và thêm từng lượng vừa đ ủ resin trao đổi ion (4.7), khi nước chảy hết thi thu l ấ y 500 m l thể tích resin. Rót 1 ml dung dịch imidazole format (4.4) v à o từng pipet và rửa hai lần, mỗi lần 1 ml nước. 4.8.2 . Tinh sạch C â n 25 mg Helix pomatia typ H1 (4.8), chính xác đến 0,1 mg, hòa tan trong 2,5 ml nước và chuyển 500 m l dung dịch này vào từng cột đ ã chuẩn b ị trong 4.8.1. Rửa từng cột với 1,5 ml nước và loại bỏ dịch rửa giải. Sau đó thêm 1,5 ml dung dịch natri axetat (4.3) và thu dịch rửa giải từ n ă m cột vào ống nghiệm. Cô đặc dịch rửa giải bằng cách lọc, sử dụng màng lọc Millipore PTGC 11K25 3) cho đến khi thu được khoảng 100 m l dịch lỏng (không cho sulfatase có khối lượng phân tử cao hơn 5 000 đi qua). Th ê m 2,5 ml nước và cô đặc thêm một lần nữa b ằ ng cách lọc cho đến khi thu được khoảng 100 m l dịch l ỏ ng. Pha loãng đến 2,5 ml với nước và bảo quản sul f atase đã tinh sạch trong tủ lạnh đông ở - 18 °C với một lượng nh ỏ cho phép rã đông một lượng cần thiết để sử dụng ngay. 4.8.3 . Kiểm tra hoạt độ sul f atase 4.8.3.1 . Chuẩn bị dung dịch s i nigrin 0,15 mmol/l, được bổ sung đệm đến pH 5,8. Chu ẩ n bị ba dung dịch liên ti ế p như sau: a) chuyển 1 ml axit axetic vào bình định mức một vạch dung tích 500 ml và thêm nước đến vạch; b) chuyển 1 ml etylen diamin vào bình định mức một vạch dung tích 500 ml và thêm nước đến vạch; c) trộn 73 ml dung d ịch a) với 40 ml dung dịch b) và sử dụng dung dịch a) hoặc dung dịch b) để chỉnh hỗn hợp đến pH 5,8 là thích hợp. Rót 3 ml dung dịch sinigrin 5 mmol/l (4.5.1.1) vào bình định mức một vạch 100 ml và thêm dung dịch c) đến vạch. 4.8.3.2 . Kiểm tra hoạt độ Dùng pipet chuy ể n 2 ml d ung dịch sinigrin đã bổ sung đệm (4.8.3.1) vào cuvet đo và cuvet so sánh của máy đo phổ (5.3) được chỉnh đến bước sóng 229 nm với nhiệt độ cuvet là 30 °C. Ở thời gian t = 0, thêm 50 m l sul f atase đã tinh sạch (4.8.2) v à o cuvet đo và bật máy ghi ngay. Dừng máy ghi khi không có sự chênh lệch độ hấp thụ ( A e ), dựng đường tiếp tuyến tới điểm t = 0 và đo gradient D A/ D t . Hoạt độ của sul f atase (nghĩa l à : s ả n phẩm của 1 m mol sinigrin desul f at trên 1 min ở 30 °C và pH 5,8), được biểu thị bằng đơn vị hoạt độ tr ê n mililit dung dịch sul f atase, bằng công thức: Trong đó: D A/ D t là gradient của đường tiếp tuyến tới điểm t = 0, tính bằng đ ơ n vị độ hấp thụ trên phút; V là thể tích môi trường phản ứng (nghĩa là 2,05 x 10 -3 l ), t í nh b ằ ng lít (I); D e (khoảng 1 500 l.mo l -1 .cm -1 ) là chênh lệch giữa hệ số t ắ t phân tử của sinigrin và desul f osinigrin ở 228 nm, nghĩa là: Trong đ ó A e là chênh lệch giữa độ hấp th ụ của sinigrin kh ử sul f at ở điểm cân bằng và độ h ấ p thụ tại thời điểm t = 0; I là chiều dài đường quang của cuvet, tính bảng centimet (nghĩa là: 1 cm); c là nồng độ của sinigrin đã khử sul f at ở điểm cân bằng, tính bằng mol trên lit , nghĩa l à : mol/l 0,95 là hiệu su ấ t ở điểm c â n bằng của sinigrin khử sul f at. Ngoài ra , hoạt độ của sulfatase có thể được tính theo công thức sau: 4.8.4 . Pha loãng Dùng pipet chuyển 1 ml sul f atase đã tinh sạch (4.8.2) vào bình định mức một vạch dung tích 10 ml. Thêm nước đến vạch và trộn. Chia dung dịch thành các lượng nhỏ và bảo quản trong tủ lạnh đông ở - 18 °C. 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm, và cụ thể như sau: 5.1 . S ắ c ký lỏng hiệu năng cao, thích hợp đ ể thu được garient r ử a giải và kiểm soát nhiệt độ cột ở 30 °C, nối với detedor UV cho phép đo ở bước sóng 229 nm. 5.2 . Cột sắc ký dùng cho HPLC, loại C 18 hoặc C 8 có cỡ hạt nh ỏ hơn hoặc bằng 5 m m , ví d ụ 4) : Cột Lichrosorb RP 18, £ 5 m m (150 mm x 4,6 mm) Cột Spherisorb ODS2, £ 5 m m (250 mm x 4 mm; 250 mm x 5 mm) Cột Novapak C18, 4 m m (150 mm x 4 mm) Cột Lichrospher RP8, £ 5 m m (125 mm x 4 mm) Cột Nucleosil C18, £ 5 m m (200 mm x 4 mm) Hiệu năng của cột phải được kiểm tra thường xuyên, tốt nhất là sử dụng mẫu so sánh của desul f og l ucosinolat từ dầu hạt cải 5) . Đặc biệt, cột không được làm suy giảm 4-hydroxyglucobrassicin, m ộ t glucosinolat quan trọng nhưng tương đối không ổn đ ị nh. Các cột mới phải tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất để ổn định cột sao cho thu được các kết qu ả tái lập. 5.3 . Máy đo ph ổ hai chùm tia, có khả năng hoạt động trong vùng tia UV của quang phổ và ở nhiệt độ được kiểm soát l à 30 °C, được trang bị các cuvet thạch anh có chiều dài đường quang 1 cm và một hệ thống ghi . 5.4 . Máy nghiền tinh, v í dụ: cối xay cafê. 5.5 . Máy ly tâm, thích hợp để sử dụng với các ống nghiệm (5.6), có thể đạt được gia t ố c hướng tâm l à 5 000 g . 5.6 . Ố ng nghiệm polypropylen, dung tích 6 ml. 5.7 . Nồi cách thủy hoặc thiết bị gia nhiệt khác, có thể duy trì nhiệt độ ở 75 °C ± 1 °C. 5.8 . Bông thủy tinh. 5.9 . Pipet Pasteur, chiều dài 150 mm có giá đỡ thích hợp hoặc vài dụng cụ thích hợp khác. 6. Lấy mẫu Việc lấy mẫu có thể được tiến hành theo TCVN 8946 (ISO 542) [3] . Nếu phần lớn các tạp chất không ch ứ a dầu đã được loại ra trước khi giảm mẫu phòng thử nghiệm, thì cho phép đưa vào trong tính toán. 7. Chuẩn bị mẫu thử Giảm m ẫ u phòng thử nghiệm theo ISO 664. Nếu các hạt có hàm lượng ẩm và hàm lượng chất bay hơi vượt quá 10 % (khối lượng), thì cần sấy khô, sử dụng dòng kh í ở khoảng 45 °C. Mức tạp ch ấ t thường là 2 % (khối lượng). Nếu có sinigrin trong mẫu thử thì thực hiện phép thử trên hạt tinh khiết và phân tích tạp chất được tách ra. Xác định hàm lượng ẩm và hàm lượng chất bay hơi của mẫu thử theo TCVN 8949 (ISO 665). Nếu các hạt đã được xử lý, r ử a chúng với dichlorometan. Nghiền các hạt bằng máy nghiền tinh (5.4) trong 20 s. Trộn và sau đó nghiền thêm 5 s. 8. Cách tiến hành 8.1 . Phần m ẫ u thử Ghi nh ã n hai ống nghiệm A và B (5.6) và chuyển 200 mg của mẫu thử đã chuẩn bị (Điều 7) v à o từng ống nghiệm, cân chính xác đến 0,1 mg. 8.2 . Chiết glucosinolat 8.2.1 . Đặt ống nghiệ m trong nồi cách thủy hoặc thiết bị gia nhiệt khác ở 75 °C và trong 1 min. Th ê m 2 ml dung dịch metanol đun sôi (4.1) và sau đó thêm ngay: - vào ống nghiệm A 200 m l dung dịch chuẩn nội 5 mmol/l (4.5.1.1), và - vào ống nghiệm B 200 m l dung dịch chuẩn nội 20 mmol/l (4.5.1.2) 8.2.2 . Tiếp tục gia nhiệt ở 75 °C th ê m 10 min, lắc ống nghiệm sau mỗi khoảng thời gian nhất định. Trộn các lượng ch ứ a trong mỗi ống nghiệm v à sau đó ly tâm ở gia tốc hướng t â m 5 000 g trong 3 min. Chuyển phần dịch l ỏ ng phía trên trong mỗi ống nghiệm vào hai ống nghiệm khác (5.6) được ghi nhãn A' và B'. 8.2.3 . Thêm 2 ml dung dịch metanol đang sôi (4.1) vào hai ống nghiệm chứa chất rắn còn lại và gia nhiệt lại 10 min trong nồi cách thủy hoặc thiết bị gia nhiệt khác (5.7) ở 75 °C, lắc ống nghiệm sau mỗi khoảng thời gian nh ấ t định. Ly tâm 3 min và sau đó chuyển phần dịch l ỏ ng phía trên từ hai ống nghiệm vào phần dịch lỏng bề m ặ t tương ứng thu được trong 8.2.2. 8.2.4 . Điều chỉnh thể tích của các chất chiết hỗn hợp đến khoảng 5 ml bằng nước và trộn. Các dịch chiết này có thể giữ được 2 tuần nếu bảo quản ở nơi tối trong tủ lạnh đông ở - 18 °C. 8.3 . Chuẩn bị cột trao đổi ion Cắt một số pipet Pasteur (5 . 9) theo yêu c ầ u, ví dụ một pipet chứa một dịch chiết hỗn h ợ p sao cho có được thể tích 1,2 ml lên cổ từng pipet và nút bông thủy tinh ( 5.8) trên từng c ổ của pipet. Đặt pipet thẳng đứng trên giá. Chuy ể n 0,5 ml huy ề n phù đã trộn kỹ của resin trao đổi ion (4.7) vào từng pipet và để lắng. Rửa pipet với 2 ml imidazole f ormat (4.4) và sau đó rửa 2 lần, mỗi lần dùng 1 ml nước. 8.4 . Tinh sạch và khử sulfat 8.4.1 . Thực hiện các thao tác n ê u ra trong 8.4.2 đến 8.4.5 đ ố i với từng dịch chiết hỗn hợp. 8.4.2 . Chuyển 1 ml dịch chiết (8.2.4) vào cột đã chuẩn b ị (8.3) kh ô ng làm đảo trộn bề mặt resin và để ráo. Thêm hai lần, mỗi lầ n 1 ml đệm natri axetat (4.2), để cho đệm ráo sau mỗi lần thêm. 8.4.3 . Thêm 75 m l dung dịch sul f ata đã tinh sạch và đã pha loãng (4.8.4) vào cột. Để qua đ ê m ở nhiệt độ m ô i trường. 8.4.4 . Đặt ống nghiệm (5.7) dưới cột để thu dịch rửa giải. Rửa giải desul f oglucosinolat thu được hai lần, mỗi l ầ n 1 ml nước, để nước ráo sau mỗi lần thêm . 8.4.5 . Trộn kỹ dịch rửa giải. Nếu không ph â n tích sắc ký ngay, th ì dịch rửa giải có thể bảo quản được một tuần ở nơi tối trong tủ lạnh đông ở - 18 °C. 8.5 . Phép thử trắng N ế u c ầ n (xem 9.3), t hực hiện phép thử trắng sử dụng cùng quy trình trên phần mẫu thử được lấy từ cùng một mẫu thử, nhưng không dùng dung dịch chu ẩ n nội sinigrin để phát hiện và định lượng sự có mặt của sinigrin trong phần mẫu thử. 8.6 . Chạy sắc ký 8.6.1 . Điều ch ỉ nh thiết bị Điểu ch ỉ nh điều ki ệ n sắc ký của máy để đưa ra : - Tốc độ d ò ng của pha động (4.6), phụ thuộc vào bản chất của cột (xem 8.6.2), thường là 1 ml/min. - Nhiệt độ cột (5.2) l à 30 °C, và - bước sóng phát hiện 229 nm. 8.6.2 . Phân tích Vận hành theo hướng d ẫn sử dụng thiết bị, bơm vào máy sắc ký không qu á 50 m l dung dịch desul f oglucosinolat thu được trong 8.4.4. Sử dụng rửa giải gradient thích hợp với cột được sử dụng. CHÚ THÍCH 4 . C á c r ử a gi ả i gradient sau đây được đưa ra l à m v í dụ: a) Cột Lichrosorb RP 18, £ 5 m m (150 mm x 4,6 mm) - cho 100 % d ung m ô i A (4.6.1) qua trong 1 min - áp dụng rửa giải gradient tuy ế n t í nh đ ế n 20 m i n cho đến khi thu được 0 % dung môi A và 100 % dung m ô i B (4.6.2) - áp dụng r ử a giải gradient tuyến t í nh đến 5 min cho đến khi thu được 100 % dung môi A và 0 % dung môi B - cho 100 % dung môi A qua trong 5 min để đạt được sự cân bằng b) Cột Lichrosorb RP 8, £ 5 m m (125 mm x 4 mm) - cho 100 % dung môi A qua 2 min 30 s - áp dụng rửa giải gradient tuyến t í nh trong 18 min cho đến khi thu được 0 % dung môi A v à 100 % dung m ô i B - cho 100 % dung m ô i B qua 5 min - áp dụng rửa giải gradient tuyến t í nh qua 2 min cho đến khi thu được 100 % dung môi A v à 0 % dung môi B - cho 100 % dung m ô i A qua trong 5 min đ ể đạt được sự cân bằng 5 . Các ch ế độ gradient c ó th ể được đi ề u ch ỉ nh đ ể ph â n tách tối ưu t h eo các cột được sử dụng. 8.6.3 . Ki ể m tra sắc ký Chỉ đưa vào tính toán các pic có diện tích lớn hơn 1 % t ổ ng diện tích các pic. Thứ tự rửa giải của các pic với cột loại C 18 và rửa giải gradient thích hợp (xem các ví dụ nêu trong 8.6.2) thể hiện trong Hình 1. 9. Tính và biểu thị kết quả 9.1 . Tính hàm lượng của từng glucosinolat Hàm lượng của từng glucosinolat, biểu th ị bằng micromol trên gam ch ấ t khô của sản phẩm, theo công thức: Trong đó: A g là diện tích pic của với desu f oglucosinolat, tính bằng đơn vị tích phân; A s là diện t í ch pic tương ứng với chất chuẩn nội đã sử d ụ ng, tính bằng đơn vị t í ch ph â n; K g l à hệ số đáp ứng của desul f oglucosino l at (9.2); K s là hệ số đáp ứng của chất chuẩn nội sử dụng; m là khối lượng phần mẫu thử, t í nh bằng gam (g); n là khối lượng chất chuẩn nội được th ê m vào ống nghiệm trong 8.2, tính bằng micromol ( m m); w l à hàm lượng độ ẩm và chất bay hơi của mẫu thử, được biểu thị bằng phần trăm khối lượng. Nế u cần biểu thị kết quả theo độ ẩm và hàm lượng chất dễ bay hơi w s , [ví dụ: w s = 9% (khối lượng)], th ì nhân kết quả thu được theo chất khô (như tr ê n) với 9.2 . Hệ số đ áp ứng Các hệ số đáp ứng sau được chấp nhận. CHÚ TH Í CH 6 Hệ số đáp ứng này đã được xác định bằng thực nghiệm và đ ượ c thống nh ấ t b ằ ng sự th ỏ a thuận giữa các ph ò ng thử nghiệm khác nhau đã tham gia thử nghiệm, các hệ số này có thể cần được s ử a đ ổ i vào thời đi ể m thích h ợ p. 1 Desul f oglucoiberin 1,07 2 D esul f oprogoitrin 1,09 3 Desul f oepi-progoitrin 1,09 4 Desul f osinigrin 1,00 5 Desu lf oglucoraphanin 1 , 07 6 Desu lf ogluconapolei f erin 1 , 00 7 D esu lf oglucoalyssin 1,07 8 Desul f ogluconapin 1,11 9 Desulfo-4-hydroxyglucobrassicin 0 , 28 10 Desul f oglucobrassicanap in 1 , 15 11 Desul f ogluco t ropaeolin 0 , 95 12 Desulfoglucobrassicin 0,29 13 Desul f ogluconasturtin 0 , 95 14 Desulfo-4-methoxyglucobrassicin 0,25 15 Desul f oglucobrassicin 0 , 20 16 Các desul f oglucosinolate khác 1,00 9.3 . T í nh hàm lượng glucosinolat tổng số Hàm lượng glucosinolat tổng số, được biểu thị bằng micromol trên gam chất khô của sản phẩm, bằng tổng h à m lượng của từng glucosinolat (diện tích các pic tương ứng lớn hơn 1 % tổng diện tích các pic). Nếu chênh lệch giữa kết quả của h à m lượng glucosinolat tổng số sử dụng c ả hai nồng độ đáp ứng theo các yêu cầu đ ố i với độ lặp lại (xem 10.2), thì chất chuẩn nội kh ô ng bị nhiễm bẩn. Trong trường hợp này lấy kết quả là trung bình cộng của hai phép xác định. 10. Độ chụm 10.1 . Các kết quả phép thử liên phòng thử nghiệm Phép thử liên phòng thử nghiệm, thực hiện ở c ấ p quốc tế năm 1988, với 11 phòng thử nghiệm tham gia, thực hiện hai phép xác định trên từng mẫu, cho các kết quả thống kê (đánh giá theo ISO 5725) thể hiện trong Bảng 1 B ả ng 1 - Cá c kết quả thống kê của phép thử liên phòng thử nghiệm Mẫu H ạt cải d ầ u A Hạt cả i d ầ u B Hạt cải dầu C Hạt cải dầu D S ố phòng t hử nghiệm giữ lại s a u k hi đ ã trừ ngoại lệ 11 11 11 11 Hàm lượng glucosinolat trung bình ( m mol/g ch ấ t khô) 20 , 6 14,1 4,9 25,6 Độ lệch chuẩn lặp lại , s r 1 , 7 0 , 6 0 , 3 0,8 Hệ số biến thiên lặp lại 8 , 5% 4,4 % 6,7 % 3 , 3 % Độ lặp lại, 2,83 s r 4,9 1,7 0,9 2,4 Độ lệch chu ẩ n tái lập, s R 3,4 2 , 5 1 , 5 2,4 Hệ số bi ế n thiên tái lập 17% 18% 31 % 9 , 4% Độ tái lập, 2 , 83 s R 9 , 6 7,1 1,4 6 , 8 10.2 . Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa hai k ết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thi ế t bị, trong một khoảng thời gian ng ắ n, không lớn hơn 2 m mol/g đối với hàm lượng glucosinolat ít hơn 20 m mol/g và 4 m mol/g đối với hàm lượng glucosinolat trong dải từ 20 m mol/g đến 35 m mol/g. 10.3 . Độ tái lập Ch ênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống thử hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không lớn hơn 4 m mol/g đối với hàm lượng glucosinolat ít hơ n 20 m mol/g và 8 m mol/g đối với hàm lượng glucosinolat trong d ả i từ 20 m mol/g đến 35 m mol/g. 11. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ phương pháp thử đã sử dụng và các kết quả thu được, cùng v ớ i tất cả các hoạt động được đề cập đến không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn cùng với mọi tình huống bất thường có thể ả nh hư ở ng đến kết quả. Báo cáo kết q u ả phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đ ầ y đủ về mẫu thử. Hình 1 - Ví dụ về sắc ký đồ điển hình THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 8946:2011 (ISO 542:1990) Hạt có dầu - Lấy mẫu [2] ISO 5725:1986, Precision of test methods - Detemnination of repeatability and reproducibility for a s tandard test method by inter-laboratory tests 1) ISO 664:1990 đ ã hủy v à được thay thế bằng ISO 664:2008. ISO 664:2008 đã được ch ấ p nhận t hà nh TCVN 9608:2013 (ISO 664:2008) Hạt có dầu - Phương pháp l ấ y mẫu thử t ừ mẫu phòng thử nghiệm . 2) ISO 665:1997 đã h ủy và được th a y th ế bằng ISO 665:2005. ISO 665:2005 đã đ ượ c ch ấ p nh ậ n th à nh TCVN 8949:2011 (ISO 665 : 2005) Hạt có d ầ u - Xác định độ ẩm v à hàm l ượ ng ch ất bay hơi. 1) H ệ thống Norganic Millipore là ví dụ về sản ph ẩ m thích hợp có bán sẵn trên thi trư ờ ng. Thông tin n à y đưa ra tạo thuậ n tiện cho người sử dụng tiêu chu ẩ n v à kh ô ng ấ n định phải s ử dụng các sản ph ẩ m n à y. 2) DEA Sepharose v à Sephadex là v í dụ về sản phẩm thích hợp c ó bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thu ậ n tiện cho người sử dụng ti ê u chu ẩ n và kh ô ng ấ n định phải sử dụng các sản phẩm này. 3) Millipore PTGC 11K24 là v í dụ v ề sản phẩm t hích hợp c ó bán sẵn tr ê n th ị trường. Th ô ng tin này đưa ra tạo thu ậ n tiện cho người sử dụng ti ê u chu ẩ n v à kh ô ng ấ n định ph ả i sử dụng các sản ph ẩ m này. 4) V í d ụ đưa ra s ả n phẩm thích hợp c ó bán s ẵ n trên thị tr ườ ng. Th ô ng ti n n à y đưa ra tạo thuận t iện cho ng ườ i s ử dụ ng t iêu chu ẩ n v à khô ng ấ n định phải sử d ụ ng các sản ph ẩ m n à y. 5) C á c m ẫ u so sánh của desul f oglucosinolat d ầ u hạt c ả i có thể thu được t ừ Community Re f erence B ureau.