TCVN11453-2:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11453-2:2016 (ISO 5565-2:1999) về Vani [Vanilla fragrans (Salisbury) Ames] - Phần 2: Phương pháp thử TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11453-2:2016 ISO 5565-2:1999 VANI [VANILLA FRAGRANS (SALISBURY) AMES] - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP THỬ Vanilla [Vanilla fragrans (Salisbury) Ames] - Part 2: Test methods Lời nói đầu TCVN 11453-2:2016 hoàn toàn tương đương với ISO 5565-2:1999; TCVN 11453-2:2016 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F4 Gia vị và phụ gia thực phẩm biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố; Bộ tiêu chuẩn TCVN 11453 (ISO 5565) Vani [Vanilla fragrans (Salisbury) Ames], gồm các phần sau đây: - TCVN 11453-1:2016 (ISO 5565-1:1999), Phần 1: Các yêu cầu ; - TCVN 11543-2:2016 (ISO 5565-2:1999), Phần 2: Phương pháp thử. VANI [VANILLA FRAGRANS (SALISBURY) AMES] - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP THỬ Vanilla [Vanilla fragrans (Salisbury) Ames] - Part 2: Test methods 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phân tích vani thuộc l oài Vanilla fragrans (Salisbury) Ames, syn. Vanilla planifolia Andrews. Tiêu chuẩn này áp dụng cho quả vani, vani dạng miếng, vani dạng rời và vani dạng bột. Tiêu chuẩn này không áp dụng cho chất chiết vani. Tiêu chuẩn này quy định ba phương pháp thử đ ể phân tích vani. a) xác định độ ẩm của quả vani và bột vani (4.1); b) xác định vanilin, axit vanilic, 4-hydroxybenzaldehyd và axit 4-hydroxybenzoic b ằ ng sắc ký lỏng hiệu năng cao (4.2); c) xác định hàm lượng vanilin bằng phương pháp đo phổ UV (4.3). CHÚ THÍCH Các yêu cầu đối với vani đ ư ợc nêu trong TCVN 11453-1 (ISO 5565-1). 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm c ô ng bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ th í nghiệm bằng thủy tinh. 3 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này, sử dụng thuật ngữ và định nghĩa dưới đây. 3.1 Độ ẩ m (moisture content) Lượng nước được lôi cuốn và thu được bằng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này. CHÚ THÍCH Độ ẩ m được biểu thị b ằ ng phần trăm khối lượng. 4 Phương pháp thử 4.1 Xác định độ ẩm của quả vani và bột vani CH Ú THÍCH Các phương pháp chung được mô tả trong TCVN 7040 (ISO 939) không áp dụng cho vani. 4.1.1 Nguyên tắc Lượng nước được lôi cuốn bằng phương pháp chưng cất đẳng phí được xác định bằng cách sử dụng dung dịch hữu cơ không trộn lẫn được với nước. Nước được thu vào ống chia vạch. 4.1.2 Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc th ử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. 4.1.2.1 Toluen Làm bão hòa toluen b ằ ng cách lắc với một lượng nước nhỏ rồi chưng cất. Sử dụng dịch chưng cất để xác định độ ẩm. 4.1.3 Thiết bị, dụng cụ Ch ỉ sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm và cụ thể sau đây: 4.1.3.1 Thiết b ị chưng cất lôi cuốn, gồm có một bình cầu thủy tinh được gia nhiệt bằng phương pháp thích hợp và một bộ sinh hàn ngược được nối với bình thu nhận và được nối thông với bình cầu. Các khớp nối giữa bình thu nhận với ống sinh hàn và bình cầu là các khớp nối thủy tinh mài có th ể lắp lẫn. Bình thu nhận dùng để thu, đo lượng nước ngưng tụ và thu dung môi vào bình cầu. Việc l ắ p ráp các thiết bị được nêu trong Hình 1 và các bộ phận khác nhau được mô tả dưới đây: 4.1.3.1.1 Bình cầu, bằng thủy tinh chịu nhiệt, dung tích 500 ml, có h ì nh dạng như trong Hình 1, không có vân và các vết tương tự. 4.1.3.1.2 Bộ sinh hàn, bằng th ủ y tinh, dài khoảng 400 mm và ống lồng trong có đường kính từ 9,5 mm đến 12,5 mm, được làm lạnh bằng nước. Phần đầu của ống sinh hàn lồng vào trong bình thu nhận được mài vát một góc 30° so với trục đứng của bộ sinh hàn. Khi lồng ống sinh hàn vào b ì nh thu nhận, thì phần đầu của ống sinh hàn phải cao hơn bề mặt chất lỏng trong bình thu nhận từ 6 mm đến 7 mm sau khi thiết lập các điều kiện chưng cất. 4.1.3.1.3 Bình thu nhận, bằng thủy tinh chịu nhiệt, dung t í ch 5 ml, không có vân và các vết tương tự, có các khớp nối thủy tinh mài, có hình dáng, kích thước và dung sai nêu trong Hình 1. Bình thu nhận bao gồm một khoang trên nối với ống và có khớp nối mài dẫn đến bình cầu và bình chia vạch. Phần chia vạch phải có dung tích 5 ml khi được làm đầy đến vạch cao nhất. Thang đo phải có dải từ 0 ml đến 5 ml và được chia vạch nh ỏ nhất đến 0,10 ml. Các vạch chia tương ứng với mỗi mil i lit phải được đánh s ố và vạch vòng tròn quanh ống. Các vạch chia n ằ m giữa các vạch được đánh số phải được vạch dài ba phần tư quanh ống, các vạch còn lại phải được vạch dài một nửa quanh ống. Sai số của phần dung tích được biểu thị bằng các vạch không được quá 0,05 ml. 4.1.3.1.4 Nguồn nhiệt, bếp cách dầu hoặc bếp điện, có hộp số hoặc bộ phận kiểm soát nhiệt khác. Nhiệt độ của dầu trong bếp cách dầu không nên cao hơn đi ể m sôi của toluen quá nhiều. 4.1.3.1.5 Dây đồng, đủ dài để xuyên qua ống sinh hàn và có một đầu xoắn lại thành lò xo. Đường kính của vòng xoắn lò xo phải vừa khít với lòng trong ống được chia vạch của bình thu nhận và vẫn c ó thể chuyển động lên xuống được. 4.1.3.2 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 g. Đơn vị tính bằng milimét CHÚ D Ẫ N: 1 Bộ sinh hàn (4.1.3.1.2) 2 B ì nh thu nhận (4.1.3.1.3) 3 Ố ng chia vạch, dung tích 5 ml, được chia vạch 0,10 ml 4 Bình cầu (4.1.3.1.1) Hình 1 - Thiết bị ch ư ng cất 4.1.4 Chuẩn bị mẫu thử 4.1.4.1 Quả van i , van i dạng miếng hoặc vani dạng rời Chuẩn bị mẫu thử bằng cách cắt qu ả vani thành các miếng dày tối đa 5 mm, cắt c ẩ n thận để không làm thay đ ổi độ ẩm của mẫu. 4.1.4.2 Vani dạng bột N ghi ề n kĩ mẫu phòng thử nghiệm. 4.1.5 Cách tiến hành 4.1.5.1 Chuẩn b ị thiết b ị , dụng cụ Làm sạch toàn bộ thiết bị bằng dung dịch rửa kali dichromat/axit sulfuric đ ể hạn chế các giọt nước bám dính trên thành bộ sinh hàn và bình thu nhận. Tráng rửa kỹ bằng nước và làm khô hoàn toàn trước khi sử dụng. 4.1.5.2 Phần mẫu thử Cân khoảng 10 g mẫu thử (4.1.4), chính xác đến 0,1 g sao cho lượng nước thu được không vượt quá 4,5 ml. 4.1.5.3 Xác định Chuyển định lượng phần mẫu thử (4.1.5.2) vào bình chưng cất (4.1.3.1.1) sử dụng toluen (4.1.2.1). Thêm vừa đủ toluen (khoảng 75 ml) để mẫu thử ngập hoàn toàn và xoay bình để trộn. Lắp các thiết bị và rót đầy toluen qua ống sinh hàn (4.1.3.1.2) vào bình thu nhận (4.1.3.1.3) cho đến khi toluen bắt đầu chảy tràn sang b ì nh chưng cất. Nếu cần, đậy nút bông vào đ ỉ nh bộ sinh hàn hoặc gắn vào một ống canxi clorua nhỏ để tránh sự ngưng tụ ẩm của không khí trong ống sinh hàn. Để kiểm soát quá trình hồi lưu, bọc bình cầu và ống dẫn đến bình thu nhận bằng một lớp vải để cách nhiệt. Gia nhiệt bình cầu sao cho tốc độ chưng cất khoảng 100 giọ t/ min. Khi đã cất được phần lớn nước thì tăng tốc độ chưng cất khoảng 200 giọt/min và tiếp tục chưng cất cho đến khi không thu được nhiều nước. Thỉnh thoảng rửa sạch bộ sinh hàn trong quá trình chưng cất bằng các phần toluen 5 ml để rửa trôi hết các giọt nước bám trên thành bộ sinh hàn. Nước trong bình thu nhận có thể được tách khỏi toluen bằng cách th ỉ nh thoảng di chuyển sợi dây đồng dạng lò xo lên xuống trong bộ sinh hàn và bình thu nhận, v ì vậy làm nước đọng lại ở đáy bình thu nhận. Hồi lưu cho đến khi mức nước trong bình thu nhận duy trì ở mức không đổi trong 30 min và sau đó tắt nguồn nhiệt. Rửa sạch ống sinh hàn bằng toluen khi cần, sử dụng sợi dây đồng dạng lò xo để loại bỏ hết các giọt nước. Ngâm bình thu nhận trong nước ở nhiệt độ phòng ít nhất 15 min hoặc cho đến khi lớp toluen tách ra hẳn; sau đó đọc thể tích của nước. 4.1.6 Biểu thị kết quả Độ ẩ m, w , được biểu thị bằng phần trăm khối lượng, tính bằng công thức: Trong đó: V là thể tích nước thu được, tính bằng mililit (ml); m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g). Khối lượng riêng của nước được lấy chính xác là 1 g/ml. 4.2 Xác định vanilin, axit vanilic, 4-hydroxybenzaldehyd và axit 4-hydroxybenzoic trong quả vani, vani dạng rời, vani dạng miếng hoặc vani dạng bột bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 4.2.1 Nguyên tắc Phần mẫu thử được chiết và/hoặc pha loãng (nếu cần) sau đ ó được tách bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), sử dụng ch ấ t chuẩn nội và được xác định bằng detector UV . 4.2.2 Thuốc thử Ch ỉ sử dụng thuốc thử đạt ch ấ t lượng phân tích và nước c ất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. 4.2.2.1 Etanol, 96 % (thể tích). 4.2.2.2 Metanol 4.2.2.3 Axit phosphoric loãng, c (H 3 P O 4 ) = 0,01 mol/l. 4.2.2.4 Pha động (để hướng dẫn). Trộn 75 phần axit phosphoric loãng (4.2.2.3) với 25 ph ầ n metanol (4.2.2.2). Lọc qua màng lọc (4.2.3.3). Khử khí. 4.2.2.5 Chất đối chứng, có độ tinh khiết tối thiểu 99 %. 4.2.2.5.1 Van i lin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd). 4.2.2.5.2 Ax i t van i lic (axit 4-hydroxy-3-methoxybenzoic). 4.2.2.5.3 4-hydroxybenza l dehyd. 4.2.2.5.4 Axit 4-hydroxybenzoic. 4.2.2.6 Ch ấ t chu ẩ n nội: axit axetylsalicylic có độ tinh khiết tối thiểu 99 %. 4.2.2.7 Dung dịch chuẩn gốc, có thể hòa tan được trong pha động. 4.2.2.7.1 Dung dịch gốc vanil i n, nồng độ 1 g/l, được cân chính xác đến 0,001 g. 4.2.2 .7 .2 Dung dịch gốc axit vanil i c, nồng độ 0,1 g/l, đ ược cân chính xác đến 0,001 g. 4.2.2.7.3 Dung dịch gốc 4-hydroxybenzaldehyd, nồng độ 0,1 g/l, được cân chính xác đến 0,001 g. 4.2.2.8 Dung dịch làm việc Dung dịch làm việc thu được bằng cách hòa tan dung dịch gốc (4.2.2.7), tốt nhất trong pha động (4.2.2.4) sao cho nồng độ cuối cùng của dung dịch làm việc như trong 4.2.2.8.1 đến 4.2.2.8.4. Các dung dịch đã được chuẩn bị theo cách này có thể để được vài ngày ở nơi tối, ở nhiệt độ 4 ° C . 4.2.2.8.1 Dung d ị ch làm việc vanilin, nồng độ 0,1 g/l. 4.2.2.8.2 Dung dịch l à m việc axit vanil i c, nồng độ 0,008 g/l. 4.2.2.8.3 Dung dịch làm việc 4-hydroxybenzaldehyd, nồng độ 0,008 g/l. 4.2.2.8.4 Dung dịch làm việc axit 4-hydroxybenzo i c, nồng độ 0,002 g/l. 4.2.2.9 Dung d ị ch chất chuẩn nội Hòa tan axit axetylsalicylic (4.2.2.6), được cân chính xác đến 0,001 g trong pha động (4.2.2.4) đ ể thu được nồng độ khoảng 0,6 g/l. CHÚ THÍCH Các nồng độ c ầ n x ấ p xỉ với nồng độ đã biết có trong dung dịch mẫu thử. 4.2.3 Thiết bị, dụng cụ Chỉ sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ th ể như sau: 4.2.3.1 Máy nghiền kín khí 4.2.3.2 B ì nh định mức một vạch, dung tích 100 ml và 200 ml, phù hợp với các yêu cầu nêu trong TCVN 7153 (ISO 1042). 4.2.3.3 Màng lọc, cỡ lỗ 0,45 µm. 4.2.3.4 Thiết b ị chiết liên tục, kiểu Soxh l et, gồm các bộ phận dưới đây. 4.2.3.4.1 Bộ chiết Soxh l et, dung tích 125 ml. 4.2.3 .4. 2 Bình ng ưng . 4.2.3.4.3 B ì nh cầu, dung tích 250 ml, có c ổ thủy tinh mài. 4.2.3 .4. 4 Hộp. 4.2.3.4.5 Nguồn nhiệt hoặc ống gia nhiệt bằng đ i ện hoặc bể dầu, có hộp số hoặc bộ phận kiểm soát nhiệt khác và áptomat. 4.2.3.5 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao, gồm các bộ phận dưới đây. 4.2.3.5.1 Detector đ o phổ, cho phép đo ở bước s ó ng 254 nm. 4.2.3.5.2 Bộ bơm mẫu, dùng để b ơ m lượng mẫu thử từ 10 µl đến 100 µl. 4.2.3.5.3 Cột nhồi, C 18 với silica cỡ hạt từ 5 µm đến 10 µm. 4.2.3.6 Xyranh, dùng cho máy sắc kí lỏng hiệu nâng cao. 4.2.3 . 7 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,001 g. 4.2.4 Chuẩn b ị m ẫ u thử 4.2.4.1 Quả vani, vani dạng miếng hoặc van i dạng rời Nghiền mẫu rồi đồng hóa kĩ mẫu. 4.2.4.2 Vani dạng bột T rộn kĩ mẫu. 4.2.5 Phần mẫu thử Cân 20 g mẫu đã chuẩn bị (4.2.4.1 hoặc 4.2.4.2), chính xác đến 0,001 g. 4.2.6 Chiết Chiết phần mẫu thử (4.2.5) trong thiết bị chiết (4.2.3.4) bằng khoảng 200 ml etanol (4.2.2.1) trong 16 h; nghĩa là sử dụng dung môi từ 25 lần đến 30 lần. Sử dụng các lượng quả vani hoặc bột vani và dung môi chiết để thu được dịch chiết có nồng độ tối đa là 100 g dịch quả trên một lít. Chuyển dịch chiết vào bình định mức 200 ml (4.2.3.2). Rửa bình cầu của thiết bị chiết vài lần bằng các lượng nh ỏ etanol v à cho nước rửa vào bình định mức. Pha loãng đến vạch b ằ ng etanol và trộn kỹ để thu được dung dịch đã biết độ chuẩn. Pha loãng dung dịch này mười lần bằng pha động (4.2.2.4). 4.2.7 Cách tiến hành 4.2.7.1 Điều kiện tiến hành sắc kí Thực hiện phân tích ở nhiệt độ môi trường với các điều kiện quy định trong 4.2.3.5, sử dụng pha động (4.2.2.4) với tốc độ dòng khoảng 1 ml/min. 4.2.7.2 Hiệu chuẩn 4.2.7.2.1 Bơm riêng rẽ chất đối chứng và chất chuẩn nội rồi sau đó bơm hỗn hợp. Thay đổi các điều kiện thao tác sao cho hệ số phân giải các pic của tất cả các thành ph ầ n ít nh ấ t là bằng 1. 4.2.7.2.2 Bơm mẫu đã chuẩn bị trong 4.2.6 sau khi lọc qua màng lọc (4.2.3.3). Kiểm tra để chắc chắn rằng chất chuẩn nội không ảnh hưởng đến các thành phần của mẫu. 4.2.7.2.3 Trộn 10 ml dung dịch chu ẩ n thu được trong 4.2.2.7 với 10 ml dung dịch chất chuẩn nội (4.2.2.9). Lọc trên màng lọc và bơm. Hệ số đáp ứng (K i ) đư ợ c tính theo công thức: Trong đó: K i là hệ s ố đáp ứng của thành phần thứ i c ầ n xác định; m i là khối lượng thành phần thứ i trong dung dịch bơm; m s là khối lượng chát chuẩn nội trong dung dịch bơm; h i là chiều cao pic của thành phần thứ i đo được trên sắc kí đồ. CHÚ THÍCH Trong công thức tính, chi ề u cao pic có thể được thay bằng diện tích pic. 4.2.7.3 Xác định 4.2.7.3.1 Trộn 10 ml dung dịch mẫu đã chuẩn bị như trong 4.2.6 với 10 ml dung dịch chất chuẩn nội (4.2.2.6). Lọc qua màng lọc. 4.2 .7 .3.2 Bơm dung dịch thu được trong 4.2.7.3.1 dưới các điều kiện đã cho trong 4.2.7.2.3. Phần trăm của các chất được tính b ằ ng công thức: Trong đó các ký hiệu tương tự như trong 4.2.7.2.3. CH Ú THÍCH Trong công thức tính, chiều cao pic có th ể được thay bằng diện t í ch pic. 4.3 Xác định hàm lượng vanilin trong quả vani, vani dạng miếng, vani dạng rời và vani dạng bột bằng phương pháp đo phổ UV 4.3.1 Nguyên tắc Vanilin có trong phần mẫu thử được chiết b ằ ng etanol. Vanilin có trong dung dịch etanol được xác định bằng phương pháp đ o phổ. 4.3.2 Thuốc thử Ch ỉ sử dụng các thuốc thử đạt chất lượng phân tích và nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. 4.3.2.1 Etanol, 96 % (thể tích) dùng cho phép đo phổ UV . 4.3.2.2 Dung dịch natr i hydrox i t, c(NaOH) ≈ 1 mol/l. 4.3.2.3 Vanilin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd). 4.3.3 Thiết bị, dụng cụ Ch ỉ sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau. 4.3.3.1 Máy nghiền kín khí. 4.3.3.2 B ì nh định mức một vạch, dung tích 100 ml và 250 ml, phù hợp v ớ i các yêu cầu nêu trong TCVN 7153 (ISO 1042). 4.3.3.3 Pipet, có thể phân phối các lượng 10 ml, 20 ml và 25 ml. 4.3.3.4 Bình hút ẩm, có chứa ch ấ t hút ẩ m hiệu quả. 4.3.3.5 Thiết bị chiết, như trong 4.2.3.4 đến 4.2.3.4.5. 4.3.3.6 Máy đo phổ, thích hợp đ ể đo trong vùng cực tím. 4.3.3.7 Cuv e t silica, dùng cho phép đo phổ, có chiều dài đường quang 1 cm. 4.3.3.8 Bình cân, dung tích 25 ml, có nắp đậy kín khí. 4.3.3. 9 Xyranh, dùng cho sắc kí lỏng hiệu năng cao. 4.3.3.10 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,001 g. 4.3.4 Cách tiến hành 4.3.4.1 Xác định độ hấp thụ riêng của van i lin 4.3.4.1.1 Chuẩn b ị dung dịch chuẩn Cân khoảng 30 mg vanil i n ( 4.3.2.3), chính xác đến 0,001 g vào bình cân (4.3.3.8) đã được làm khô trước trong bình hút ẩm (4.3.3.4). Hòa tan vanilin trong khoảng 20 ml etanol (4.3.2.1) và chuyển định lượng vào bình định mức 250 ml (4.3.3.2). Tráng rửa bình cân vài lần b ằ ng etanol và cho nước rửa vào bình định mức. Thêm etanol đến vạch và trộn đều (dung dịch A1). Dùng pipet lấy 25 ml dung dịch A1 cho vào bình định mức 100 m l (4.3.3.2). Thêm etanol đến vạch và trộn đều (dung dịch B1). Dùng pipet lấy 10 ml dung dịch B1 cho vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 60 ml etanol và 2 ml dung dịch natri hydroxit (4.3.2.2). Trộn đều. Thêm etanol đến vạch và trộn đều (dung dịch C1). 4.3.4.1.2 Chuẩn b ị dung d ị ch đố i chứng Chuẩn bị dung dịch đối chứng bằng cách dùng pipet l ấ y 2 ml dung dịch natri hydroxit (4.3.2.2) cho vào bình đ ị nh mức 100 ml, thêm etanol đến vạch. Trộn đều. 4.3.4.1.3 Xác định Ghi lại phổ của dung dịch C1 tương ứng với phổ của dung dịch đối chứng (4.3.2.2) trong dải bước sóng từ 250 nm đến 420 nm, sử dụng máy đo phổ (4.3.3.6) và cuvet (4.3.3.7). 4.3.4.1.4 Tính kết quả Độ hấp thụ cực đại ở bước sóng (350 ± 3) nm và phải nằm trong khoảng từ 0,2 đến 0,8. Dựng đường nền trong khoảng bước sóng từ 270 nm đến 380 nm. Lưu ý, khi tính kết quả thì sử dụng độ hấp thụ cực đại (A max ) và độ hấp thụ tại đường nền ở cùng bước sóng (A b a se ). Tính độ hấp thụ riêng của vanilin bằng công thức sau: Trong đó: m là khối lượng của vanilin đ ã dùng đ ể chuẩn bị dung dịch, tính bằng miligam (mg). 4. 3.4. 2 Chuẩn bị mẫu thử 4.3.4.2.1 Quả vani, vani dạng miếng hoặc vani dạng rời Nghiền mẫu và trộn đều. 4.3 .4. 2.2 Van i dạng bột Trộn đều mẫu. 4.3.4.3 Phần mẫu thử Cân khoảng 20 g mẫu đã chu ẩ n bị (4.3.4.2.1 hoặc 4.3 .4. 2.2) chính xác đến 0,001 g. 4.3 .4. 4 Chiết Chiết phần mẫu thử (4.3 .4. 3) trong thiết bị chiết (4.3.3.5) bàng khoảng 200 ml etanol (4.3.2.1) trong 16 h; nghĩa là sử dụng dung môi t ừ 25 lần đến 30 lần. Chuyển dịch chiết vào bình định mức 250 ml (4.3.3.2). Tráng rửa bình của thiết bị chiết v à i lần bằng các lượng nhỏ etanol, rồi cho nước rửa vào bình định mức (4.3.3.2). Thêm etanol đến vạch và trộn đều (dung dịch A2). 4.3 .4. 5 Chuẩn b ị dung d ị ch đối chứng Chu ẩ n bị dung dịch đối chứng bằng cách dùng pipet lấy 2 ml dung dịch natri hydroxit (4.3.2.2) cho vào bình định mức 100 ml (4.3.3.2). Thêm etanol đến vạch. Trộn đều. 4.3 .4. 6 Xác định Dùng pipet lấy 25 ml dung dịch A2 cho vào b ì nh định mức 100 ml. Thêm etanol đến vạch và trộn đều (dung dịch B2). Dùng pipet lấy 20 ml dung dịch B2 cho vào b ì nh định mức 100 ml. Thêm etanol đến vạch và trộn đều (dung dịch C2). Dùng pipet lấy 10 ml dung dịch C2 cho vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 60 ml etanol và 2 ml dung dịch natri hydroxit (4.3.2.2). Thêm etanol đến vạch và trộn đều (dung dịch D2). Ghi lại phổ của dung dịch D2 tương ứng với phổ của dung dịch đ ối chứng (4.3 .4. 5) trong d ả i bước sóng từ 250 nm đến 420 nm, sử dụng máy đ o phổ (4.3.3.6) và cuvet (4.3.3.7). 4.3.4.7 Biểu thị kết quả Hàm lượng vanilin, w v , biểu thị bằng phần trăm khối lượng mẫu thử, được tính bằng công thức: Trong đó: A m ax là độ hấp thụ cực đại; A b ase là độ hấp thụ tại đường nền ở cùng một bước sóng; là độ hấp thụ riêng của vanilin (4.3.4.1.4); m là khối lượng phần mẫu thử đã dùng để chiết, tính bằng gam (g). Nếu muốn biểu thị kết quả theo hàm lượng chất khô thì trong công thức cần tính đến độ ẩ m sản phẩm. 5 Báo cáo thử nghiệm Đối với ba phương pháp mô tả trong 4.1, 4.2 và 4.3 thì báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: - mọi thông tin cần thiết đ ể nhận biết đầy đủ về mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu đã dùng, nếu biết; - phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống b ất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả; - kết quả thử nghiệm thu được, nếu có liên quan đến chất khô hoặc không; - nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.