TCVN5150:1990

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5150:1990 về thịt và sản phẩm thịt - phương pháp xác định dư lượng hoocmôn thyroxin TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5150:1990 THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT Phương pháp xác định dư lượng hoocmôn thyroxin Meat and meat products Determination of thyroxin residues Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hoócmôn thyroxin tồn dư trong thịt và sản phẩm của thịt dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc. 1. ĐẶC TÍNH CHUNG Thyroxin tên hóa học là 3,3,5,5-Tetra-Iodo-Tyroxin là một loại hoócmôn. Trong thực phẩm (chủ yếu là thịt động vật) có chứa hàm lượng rất nhỏ chất này (thường từ cỡ namô-gam đến micrôgam). Để phân tích định lượng, trước hết phải chiết nó ra khỏi mẫu, sau đó xác định bằng các phương pháp phân tích có độ nhạy cao. Ngày nay để xác định thyroxin, người ta thường dùng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). 2. NGUYÊN TẮC Sau khi xử lý mẫu, thyroxin được chiết vào dung dịch đệm phù hợp. Thí dụ đệm xitrát - phốtphat. Lấy phần dung dịch này bơm vào hệ HPLC với chất nhồi (pha tĩnh) là nhựa RP - 8, RP - 18 hay Hypersil CDS. Khi đó, thyroxin bị hấp thụ trên chất nhồi trong cột sắc ký. Để tách và phân tích thyroxin, người ta rửa giải nó bằng hỗn hợp dung môi (pha động) gồm MeOH/H 2 O với tỷ lệ 65/35 có thêm chất đệm và chất phụ gia axit propylic. Thyroxin ra khỏi cột sắc ký được phát hiện bằng dêtếcto UV ở sóng 240 nm và nồng độ của nó được xác định theo phương pháp đường chuẩn. 3. LẤY MẪU Theo TCVN 4833-89 (ST SEV 2433 - 80) 4. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 4.1. Dụng cụ, thiết bị: + Hệ máy HPLC với detector UV + Máy li tâm + Máy lắc + Phễu, chiết cỡ 250 ml + Bình định mức các loại + Pipét các loại + Cốc chịu nhiệt + Cột sắc ký loại 250 x 3,2 mm + Một vài dụng cụ khác. 4.2. Hóa chất: dùng loại tinh khiết cho HPLC + Chất nhồi cột RP - 8 hay RP - 18 cỡ của Ø = 5 - 7 Mm + Đệm xitrát - phốt phát pH - 8 và 6,4 + Natrihydro cacbonat (NaHCO 3 ), dung dịch 0,1 và 1 M + Thuốc thử Methanolic + Trifluoro axetic axit + Methanol (CH 3 OH) + Nước cất 2 lần + Dung dịch gốc tiêu chuẩn của thyroxin nồng độ 1 mg/ml 5. CHUẨN BỊ THỬ 5.1. Chuẩn bị mẫu phân tích: Mẫu thịt cần phân tích được thái nhỏ, nghiền mịn, trộn đều và cân một lượng bằng 10g cho vào bình nón. Thêm 15 ml dung dịch đệm xitrát - phốtphat pH = 8. Đậy nút lại và lắc kỹ trong 30 phút. Lọc hay li tâm lấy dung dịch trong. Thêm 1 ml natrihydrocácbonat 0,1M và 2ml thuốc thử methanolic, lắc kỹ và để trong chậu nước đá trong 30 phút. Sau đó làm bay hơi đến cạn ở 30 - 35 0 C. Thêm 0,5 ml trifluoro axetic axit, lắc nhẹ và để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó trung hòa bằng 2 - 4 ml natrihydrocácbonát, dung dịch 1M. Ly tâm lấy kết tủa, hòa tan kết tủa này trong hỗn hợp methanol/natrihydrocácbonát 0,1M với tỷ lệ 1/1 (về thể tích) và định mức bằng nước cất đến 10 ml sau đó ly tâm lấy dung dịch trong bơm vào cột sắc ký để phân tích thyroxin. 5.2. Pha dãy dung dịch chuẩn: Dùng dung dịch gốc tiêu chuẩn của thyroxin nồng độ 1 mg/ml, tính lấy lượng phù hợp để pha và định mức bằng nước cất đến 25 ml sao cho nồng độ thyroxin trong các bình định mức là 2 - 4 - 6 - 8 - 10 - 12 Mg/ml. 5.3. Mẫu trắng: Mẫu trắng phải được chuẩn bị cùng một điều kiện như mẫu phân tích nhưng không có mẫu phân tích, và vì vậy phải tiến hành làm đồng thời với mẫu phân tích. 5.4. Các điều kiện thực nghiệm: + Hệ thống HPLC với đêtếcto UV sóng đo 240 nm + Cột tách HPLC: 250 x 3,2 mm nhồi nhựa RP - 18 có cỡ hạt 5 - 7 Mm Ø + Máy ghi píc sắc ký (recorder) có thế ghi 10 - 20 mV và tốc độ giấy là 5 - 10 mm/phút + Pha động: methanol/dung dịch đệm xitrát - phốtphát pH - 6 và tỷ lệ là 60/40 (về thể tích). + Tốc độ pha động: 1 ml/phút + Lượng mẫu bơm vào cột: 50 Ml/1 lần thí nghiệm + Nhiệt độ thí nghiệm là 25 0 C + Các điều kiện khác chọn phù hợp với hệ HPLC. 6. TIẾN HÀNH THỬ + Đặt các thông số đã chọn ở mục 5.4 cho máy HPLC + Đặt máy chạy, bơm pha động để ổn định cột cách và đường nền. Khi đường nền thẳng là được. + Bơm lần lượt các mẫu chuẩn, mẫu trắng rồi đến mẫu phân tích (mỗi mẫu bơm 3 lần lấy giá trị trung bình) vào cột tách và ghi píc sắc ký tương ứng. + Hiệu chỉnh giá trị của mẫu trắng (nếu có) + Dựng đường chuẩn theo hệ tọa độ H - C. Trong đó H là chiều cao của píc sắc ký tương ứng với các nồng độ C của mẫu chuẩn. + Xác định nồng độ Cx của mẫu phân tích theo đường chuẩn trên. 7. TÍNH KẾT QUẢ Hàm lượng thyroxin, tính bằng dlg/g, trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau: Co = (Cx . V) / a Trong đó: a là lượng mẫu thịt để phân tích (10g) và định mức trong thể tích V ml. Theo mục 5.1 thì V = 10ml. Cx là nồng độ thyroxin của dung dịch phân tích tìm được qua đường chuẩn.