TCVN11039-4:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11039-4:2015 về Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật - Phần 4: Phát hiện và định lượng coliform và E.coli bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (Phương pháp thông dụng) TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 11039-4:2015 PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 4: PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM VÀ E.COLI BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT (PHƯƠNG PHÁP THÔNG DỤNG) Food aditive - Microbiological analyses - Part 4: Detection and enumerat i on of coli f orms and E.coli by most probable number technique (Routine method) Lời nói đầu TCVN 11039-4:2015 được xây dựng trên cơ sở tham kh ả o JECFA 2006, Combined compendium of food additive speci f ications, Volume 4: Analytical methods, test procedures and laboratory solutions used by and re f erenced in the food additive specifications ; TCVN 11039-4:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F4 Gia vị và phụ gia th ự c phẩm biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và C ô ng nghệ công bố; Bộ tiêu chu ẩ n TCVN 11039 Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật gồm các phần sau: - TCVN 11039-1:2015, Phần 1: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật đ ế m đĩa ; - TCVN 11039-2:2015, Phần 2: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu kh í bằng kỹ thuật đếm đ ĩ a xoắn ; - TCVN 11039-3:2015, Phần 3: Ph á t hiện và định lượng coli f orm và E. coli bằng kỹ thuật đếm s ố có xác suất lớn nhất (Phương pháp chu ẩn ) ; - TCVN 11039-4:2015, Ph ầ n 4: Phát hiện và định lượng co lif orm và E. coli bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nh ấ t (Phương pháp thông dụng) ; - TCVN 11039-5:2015, Phần 5: Phát hiện Salmonella ; - TCVN 11039-6:2015, Phần 6: Phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ; - TCVN 11039-7:2015, Phần 7: Phát hiện và đ ị nh lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đ ế m số có xác su ấ t lớn nhất (MPN) ; - TCVN 11039-8:2015, Phần 8: Định lượng n ấ m men và nấm mốc . PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 4: PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM VÀ E.COLI BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT (PHƯƠNG PHÁP THÔNG DỤNG) Food aditive - Microbiological analyses - Part 4: Detection and enumerat i on of coli f orms and E.coli by most probable number technique (Routine method) 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp thông dụng đ ể phát hiện và định lượng coliform và E. coli trong phụ gia thực phẩm bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (MPN). 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 2.1. Coli f orm (coliform) Vi khuẩn ở nhiệt độ quy định (30 ° C hoặc 37 ° C theo thỏa thuận ) lên men lactose có sinh khi theo các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn này. 2.2. E.coli giả định (presumptive Escherichia coli ) Vi khuẩn lên men lactose có sinh khí ở 44 ° C và sinh indol từ tryptophan ở 44 ° C theo các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn này. 3. Nguyên tắc 3.1 . Cấy phần mẫu thử vào ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc và ủ 48 h ở 35 ° C . Các ống thu được cho thấy có sinh khí là ống chứa coli f orm giả định. 3.2 . Để khẳng định coli f orm , cấy tiếp vào ống đựng môi trường khẳng định và ủ ở 35 °C trong 48 h. Sau khi kiểm tra ống thu được trong 4.1.2 mà có sinh khí th ì khẳng định sự có mặt của coliform. Đ ị nh lượng coliform b ằ ng kỹ thuật MPN. 3.3 . Để khẳng định E. coli , cấy tiếp vào ống đựng môi trường EC và ủ ở 45 ° C trong 48 h rồi tiếp tục cấy vào thạch L-EMB, ủ ở 45 ° C trong thời gian từ 18 h đến 24 h và thực hiện phép thử h ì nh thái học và các phép th ử sinh hóa. 4. Môi trường cấy, dịch pha loãng và thuốc thử 4.1 . Canh thang lauryl tryptose (LST) (xem A.1). 4.2 . Canh thang brilliant green-lactose-mật (BGLB), 2 % (xem A.2). 4.3 . Canh thang EC (xem A.3). 4.4 . Thạch eosin Levine-metylen xanh (L-EMB) (xem A.4). 4.5 . Thạch đ ế m đĩa (PCA) (xem A.5). 4.6 . Canh thang trypton (tryptophan) ( xem A.6). 4.7 . Canh thang MR-VP (xem A.7). 4.8 . Canh thang xitrat Koser (xem A.8). 4.9 . Thu ố c thử Kovacs (xem A.9). 4.10 . Các thu ố c thử Voges-Proskauer (VP) (xem A.10). 4.11 . Dung dịch đệm phosphat Butterfie l d (xem A.11). 4.12 . Chất ch ỉ thị metyl đỏ (xem A.12). 4.13 . Thuốc nhuộm Gram. 4.14 . Creatin , dạng tinh thể. 5. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Có thể dùng dụng cụ th ủy tinh sử dụng một lần thay thế cho các dụng c ụ th ủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp. Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh và cụ thể là: 5.1 . Nồi cách th ủy , tuần hoàn, có nắp, duy trì được nhiệt độ 45,5 ° C ± 0,2 ° C . Mực nước phải cao hơn môi trường mà ống được nhúng vào. 5.2 . Nhiệt k ế kiểu nhúng , dài khoảng 55 cm, có th ể đo trong d ả i từ 1 ° C đến 55 ° C, chia độ đ ế n 0,1 ° C . 5.3 . Tủ ấ m , có thể hoạt động ở 35 ° C ± 1 ° C . 5.4 . Cân , có th ể cân chính xác đến 0,1 g. 5.5 . Cân phân tích , có thể cân ch í nh xác đến 1 mg. 5.6 . B ì nh trộn. 5.7 . Máy trộn Vortex. 5.8 . Pipet chia vạch , vô trùng, dung tích 1,0 ml và 10,0 ml. 5.9 . Th iết bị khử trùng để xử lý m ẫ u. 5.10 . Chai pha lo ã ng , bằng thủy tinh borosilicat, có nút hoặc nắp vặn b ằ ng polyetylen với vòng đệm te fl on. Có thể sử dụng c á c chai pha loãng chứa dung dịch đệm phosphat Butter f ield có bán sẵn trên thị trường. 5.11 . Thiết bị đ ếm khuẩn lạc , loại cơ học hoặc điện tử, có nguồn sáng thích hợp, đĩa lưới và bộ đếm. 5.12 . Thiết b ị đo pH. 5.13 . Vòng cấ y. 5.14 . Ố ng nghiệm , k íc h thước 13 mm x 100 mm. 6. Lấy mẫu Mẫu gửi đến ph ò ng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không b ị hư h ỏ ng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản ph ẩ m. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến s ả n ph ẩ m th ì các b ê n có liên quan n ê n thỏa thuận với nhau về v ấ n đề n à y. 7. Chuẩn bị mẫu thử M ẫ u được trộn đều để thu được các phần mẫu th ử đ ồng nhất. 8. Cách tiến hành 8.1. Phép thử coliform, coliform phân và E. coli giả định C â n 50 g vào b ì nh trộn tốc độ cao (5.6) đã khử trùng. Thêm 450 ml dung dịch đệm phosphat Butter f ield vô trùng (4.11) và trộn trong 2 min. Nếu chỉ có < 50 g thì cân phần mẫu thử tương đương với một nửa lượng mẫu và thêm thể tích thích hợp chất pha l oãng vô trùng để có dung dịch pha loãng 1:10. Lượng chứa trong b ì nh trộn phải bao trùm lưỡi trộn. Chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập ph â n b ằ ng dung dịch pha lo ã ng phosphat Butter f ield vô trùng (4.11). Số d ung dịch pha lo ã ng cần chuẩn bị phụ thuộc vào mật độ col if orm dự kiến. Lắc tất c ả huyền phù 25 lần với biên độ 30 cm hoặc dùng máy trộn Vortex (5.7) trong 7 s. Không dùng pipet để phân phối cá thể tích nhỏ hơn 10 % dung tích. Chuyển 1 ml phần mẫu thử vào ba ống đựng canh thang LST (4.1) đối với mỗi độ pha loãng đối với it nhất ba độ pha loãng liên tiếp. Giữ pipet với góc sao cho pipet thấp hơn cạnh dưới đối diện của ống. Để pipet ch ả y trong 2 s đến 3 s. Thời gian từ khi trộn mẫu đến khi kết thúc cấy mẫu là kh ô ng quá 15 min. Ủ các ố ng ở 35 ° C trong t ủ ấm (5.3). Kiểm tra sự sinh kh í của các ống sau 24 h ± 2 h, về sự thay đổi môi tr ườ ng trong ống Durham do l ê n men hoặc sự sủi bọt khi các ống được khuấy nhẹ. Ủ thêm các ống âm tính trong 24 h. Kiểm tra và ghi lại ph ả n ứ ng sau 48 h ± 2 h. Thực hiện phép thử khẳng định tr ê n t ấ t cả các ống dương tính giả định (có sinh kh í ). 8.2. Phép thử khẳng định coliform T ừ mỗi ống LST sinh kh í (xem 8.1), chuyển vòng cấy (5.13) chứa đầy huyền phù vào ố ng canh thang BGLB (4.2), không lấy lớp màng, nếu có. Ủ các ống BGLB ở 35 ° C và kiểm tra sự sinh khí sau 48 h ± 2 h. Ố ng nghiệm thu được có sinh khí sau khi ủ 48 h ± 2 h ở 35 ° C được coi là dương t í nh. 8.3. Phép thử khẳng định coliform phân và E. coli T ừ mỗi ống LST sinh khí trong phép th ử gi ả định (xem 8.1), chuyển một vòng cấy chứa đầy huyền phù v à o ống đựng canh thang EC (4.3) (có thể dùng que cấy gỗ vô trùng để chuyển chủng cấy), Ủ các ống EC trong 24 h ± 2 h ở 45,5 ° C trong nồi cách thủy (5.1) và Kiểm tra sự sinh khí. Nếu âm tính thì ủ lại và kiểm tra ở 48 h ± 2 h. Ố ng nghiệm thu được c ó sinh khí sau khi ủ 48 h ± 2 h ở 45,5 ° C được coi là dương tính với coli f orm phân và E. coli . Sử dụng các kết quả của phép th ử này để tính s ố MPN của coli f orm phân. Để tiếp tục phân tích E. coli , tiến hành theo 8 4. Chú ý: Các phép phân tích coli f orm ph â n được thực hiện ở 45,5 ° C ± 0,2 ° C . 8.4. Phép thử cuối cùng (completed test) đối với E. Coli Khuấy nhẹ mỗi ống EC sinh khí (xem 8.3) và đánh dấu đề phân lập, đưa một vòng cấy vào đĩa thạch L-EMB (4.4) và ủ trong tủ ấ m (5.3) trong thời gian từ 18 h đến 24 h ở 35 ° C . Kiểm tra các đĩa nghi ngờ chứa các khuẩn lạc E. coli , là các khuẩn lạc có tâm tối màu, có hoặc kh ô ng có ánh kim loại. Chuyển năm khuẩn lạc nghi ngờ từ mỗi đĩa L-EMB sang thạch nghiêng PCA (4.5), ủ trong thời gian từ 18 h đến 24 h ở 35 °C và dùng cho thử nghiệm tiếp theo. Nế u nhận diện được bất kì một trong năm khuẩn lạc là E. coli là đ ủ để coi ống EC dương tính; vì vậy, không nhất thiết thử cả năm khuẩn lạc. Tiến hành nhuộm Gram để xem h ì nh thể. Kiểm tra các tính chất sinh hóa sau đây (bốn phép th ử đầu tiên g ọi chung l à IMViC) đối với các vi khu ẩ n hình que ngắn hoặc hình cầu bắt màu Gram âm. a) Khả năng sinh indol Cấy vi khu ẩ n vào canh thang trypton (4.6) và ủ 24 h ± 2 h ở 35 °C . Kiểm tra việc sinh indol bằng cách th ê m từ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử Kovacs (4.9). Phép thử dương tính nếu xuất hiện màu đỏ đặc trưng ở l ớ p phía trên. b) Phản ứng Voges-Proskauer Cấy vi khuẩn vào canh thang MR-VP (4.7) và ủ 48 h ± 2 h ở 35 ° C . Chuyển 1 ml vào ống 13 mm x 100 mm (5.14). Thêm 0,6 ml dung dịch alpha-naphthol trong etanol (4.10.1) cùng với 0,2 ml dung d ịch kali hydroxit 40 % (4.10.2) và trộn. Thêm vài tinh thể creatine (4.14). Lắc và để yên trong 2 h. Phép thử dương tính nếu xuất hiện màu hồng eosin. c) Ph ả n ứng với metyl đỏ Ủ ống MR-VP thêm 48 h ± 2 h ở 35 ° C sau phép thử Voges-Proskauer. Thêm 5 giọt dung dịch metyl đỏ (4.12) vào mỗi ống. Phép thử dương tính nếu có màu đ ỏ đặc trưng. Phép thử âm t í nh nếu xuất hiện màu vàng. d) Sử dụng xitrat Cấy nhẹ vào canh thang xitrat Koser (4.8); tránh làm đục ống. Ủ 96 h ± 2 h ở 35 ° C . Nếu canh thang đục là phản ứng dương tính. e) Sinh khí từ lactose Cấy vào canh thang LST (4.1) và ủ 48 h ± 2 h ở 35 ° C . Nếu có bọt khí trong ống Dur h am thì ph ả n ứng dương tính. CHÚ TH Í CH: Thay v ì thực hiện các phép th ử IMViC, có th ể dùng các phép thử sinh hóa dùng d ả i vật liệu chu ẩ n b ị sẵn. C ấy vi khu ẩ n tr ê n thạch nghiêng PCA đ ể t hực hiện phép th ử . T ấ t cả ch ủ ng c ấ y được coi l à E. coli n ế u: • lên men lactose có sinh khí trong 48 h ở 35 ° C , • xuất hiện dưới dạng h ì nh que ngắn hoặc hình cầu không sinh bào tử, bắt màu Gram â m, và • cho IMViC (bốn phép th ử đầu tiên) kiểu ++ -- (dạng sinh học 1) hoặc -+-- (dạng sinh học 2). 9. Tính và biểu thị kết quả Theo các kết quả diễn gi ả i (xem 8.2, 8.3 hoặc 8.4), ch ỉ r õ sự có mặt hay không có mặt của coli f orm, coli f orm phân và E. coli trong phần mẫu thử. Tham khảo TCVN 6404 (ISO 7218) [ 3 ] . Tính số MPN của coliform dựa trên các ph ầ n của các ống LST có sinh kh í đã được khẳng định (xem 8.2) đối với ba độ pha loãng li ê n tiếp. Tham khảo TCVN 6404 (ISO 7218) [3] . Tính số MPN của coli f orm ph ầ n dựa trên các phần của các ống EC có sinh khí đã được khẳng định (xem 8.3) đối với ba độ pha loãng liên tiếp. Tham khảo TCVN 6404 (ISO 7218) [3] . 10. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu th ử ; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện d ẫ n tiêu chuẩn này; d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chu ẩ n này hoặc những điều được coi là tùy chọn cũng như các sự cố b ấ t kỳ có th ể ảnh hưởng đến kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được. Phụ lục A (Quy định) Thành phần và chuẩn bị môi trường cấy và thuốc thử A.1 . Canh thang lauryl tryptose (LST) A.1.1 . Thành phần Tryptose hoặc trypticase 20 g Lactose 5 g Kali hydro phosphat (K 2 HP O 4 ) 2,75 g Kali d ihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) 2,75 g Natri clorua (NaC l ) 5 g Natri lauryl sulfat 0,1 g Nước cất 1 lít A.1.2 . Chuẩn bị Phân phối các phần 10 ml vào các ống Durham 20 mm x 150 mm chứa các ống lên men 10 mm x 75 mm đã úp ngược. H ấ p áp lực 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 6,8 ± 0,2. A.2 . Canh thang brilliant green-lactose-mật A.2.1 . Thành ph ầ n Pepton 10 g Lactose 10 g Mật bò khô 20 g Brilliant green 0,0133 g Nước cất 1 lít A.2.2 . Chuẩn b ị Hòa tan pepton và lactose trong 500 ml nước cất. Thêm 20 g mật bò khô đã hòa tan trong 200 ml nước cất, pH của dung dịch này phải đạt tử 7,0 đến 7.5. Trộn và thêm nước đến 975 ml. Ch ỉ nh pH đến 7,4. Thêm 13,3 ml brilliant green 0,1 % trong nước cất. Thêm nước cất vừa đủ 1 lit. Phân phối vào các ống Durham, sao cho mức chất lỏng ph ủ các ống Durham đã được úp ngược. Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 7,2 ± 0,1. A.3 . Canh thang EC A.3.1 . Thành ph ầ n Trypticase hoặc tryptose 20 g Hỗn hợp các muối mật No. 3 1.5 g Lactose 5 g Kali hydro phosphat ( K 2 HP O 4 ) 4 g Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) 1.5 g Natri clorua (NaCI) 5 g Nước cất 1 lít A.3.2 . Chuẩn bị Phân phối các phần 8 ml v à o các ống 16 mm x 150 mm chứa các ống lên men 10 mm x 75 mm đã úp ngược. H ấ p áp lực 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2. A.4 . Thạch eosin Levine-metylen xanh (L-EMB) A.4.1 . Thành ph ầ n Pepton 10 g Lactose 10 g Kali hydro phosphat 2 g Thạch 15g Eosin Y 0,4 g Metylen xanh 0,065 g Nước cất 1 lít A.4.2 . Chuẩn bị Đun sôi để hòa tan pepton, phosphat và thạch trong 1 lít nước. Bù nước đến thể tích ban đầu, nếu cần. Phân phối các phần 100 hoặc 200 ml và hấp áp lực 15 min ở nhiệt độ không quá 121 ° C . pH cuối cùng đạt 7,1 ± 0,2. Trước khi sử dụng, làm tan chảy thạch và cứ mỗi phần 100 ml th ì thêm: 5 ml dung dịch la ct ose 20 % vô trùng; 2 ml dung dịch 2 % eosin Y; 4,3 ml dung dịch metylen xanh 0,15 %. Khi sử dụng sản phẩm khô, đun sôi để hòa tan tất cả các thành phần trong 1 lít nước. Ph â n phối các phần 100 ml hoặc 200 ml và hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 7,1 ± 0,2. A.5 . Môi trường thạch đ ể đ ế m đ ĩ a (PCA) A.5.1 . Thành ph ầ n Trypton 5,0 g Chất chiết n ấ m men 2,5 g Dextrose 1,0 g Thạch 15 g Nước cất 1 lít A.5.2 . Chuẩn bị Đun sôi nước để h òa tan các thành phần. Phân phối môi trường vào các ố ng hoặc b ì nh thủy tinh c ó dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi h ấ p áp lực ở 121 ° C . pH cuối cùng 7,0 ± 0,2. A.6 . Canh thang trypton (tryptophan) , 1 % A.6.1 . Thành ph ầ n Trypton hoặc trypticase 10 g Nước cất 1 lít A.6.2 . Chuẩn bị Ph â n phối các phần 5 ml vào các ống Durham 16 mm x 125 mm hoặc 16 mm x 150 mm. Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2. A.7 . Canh thang MR-VP A.7.1 . Môi trường 1 A.7.1.1 . Thành ph ầ n Bột nước đệm pepton 7 g Glucose 5 g Kali hydro phosphat 5 g N ướ c cất 1 l í t A.7.1.2 . Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong 800 ml nước c ó đun nhẹ. Lọc và để ng u ội đến 20 ° C và thêm nước đến 1 lít. Hấp áp lực từ 12 min đến 15 min at 121 ° C . pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2. A.7.2 . Môi trường 2 A.7.2.1 . Thành phần Pepton casein 3,5 g Pepton thịt 3,5 g Dextrose 5 g Kali ph o sphat 5 g Nước cất 1 lít A.7.2.2 . Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước có đun nhẹ nếu cần. Phân ph ố i 10 ml vào các ống Durham 16 mm x 150 mm và hấp áp lực 15 min ở nhiệt độ từ 118 ° C đến 121 ° C . pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2. A.7.3 . Môi trường 3 A.7.3.1 . Thành ph ầ n Pepton 5 g Glucose 5 g Đệm phosphat 5 g N ước cất 1 l í t A.7.3.2 . Chuẩn b ị Hòa tan các thành phần trong nước. Phân phối 10 ml vào các ống Durham 16 mm x 150 mm v à h ấ p áp lực 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 7,5 ± 0,2. A.8 . Canh thang x i trat Koser A.8.1 . Thành ph ầ n Natri amoni hydro phosphat ngậm b ố n phân tử nước (NaNH 4 HPO 4 · 4H 2 O ) 1,5 9 Kali hydro phosphat 1 g Magie sul f at ngậm bảy phân tử nước (MgS O 4 ·7H 2 O ) 0,2 g Natri xitrat ngậm hai phân tử nước 3 g Nước cất 1 lít A.8.2 . Chuẩn bị Phân phối vào các ống nắp vặn nếu có yêu cầu. Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 6,2 ± 0,2. CH Ú TH ÍCH : C ô ng thức n à y được nêu trong các phương pháp phân t ích của AOAC. Công thức n à y khác với m ô i tr ườ ng khô bán sẵn. Môi trường này được coi là thích hợp. A.9 . Thuốc thử Kovacs A.9.1 . Thành phần ( Tham khảo [1 ] ) p-Dimethylaminobenzaldehyde 5 g 2-Metylbutan-2-ol (amyl alcohol) 75 ml Axit clohydric (HC l ) đặc 25 ml A.9.2 . Chuẩn bị H ò a tan p-dimethylaminobenzaldehyde trong 2-metylbutan-2-ol. Thêm từ từ axit clohydric đặc. Bảo quản ở 4 ° C . Đ ể thử indol, nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc th ử đã chuẩn bị v à o 5 ml ch ủ ng cấy vi khuẩn trong canh thang trypton 24 h. Phản ứng dương tính indol nếu có màu đ ỏ sẫm trên lớp bề mặt. Đối với E. co li gây bệnh đường ruột, nếu âm tính sau 24 h th ì thử thêm sau 72 h. A.10 . Các thuốc thử Voges-Proskauer (VP) A.10.1 . Dung d ị ch alpha-naphthol trong etanol Thành phần: alpha-Naphthol 5 g Etanol (tuyệt đối) 100 ml A.10.2 Dung d ị ch kali hydroxit, 40 % (khối lượng) Thành phần: Kali hydroxit 40 g N ướ c cất 100 ml A.10.3 . Phép thử Voges-Proskauer (VP) Ở nhiệt độ phòng, chuyển 1 ml ch ủ ng cấy 48 h vào ống nghiệm và thêm 0,6 ml dung dịch 1 và 0,2 ml dung dịch 2. Lắc sau khi thêm mỗi dung dịch. Để tăng cường độ và tốc độ ph ả n ứng, thêm v à i tinh thể creatine vào hỗn hợp. Đọc kết quả sau khi thêm các thuốc th ử 4 h. Ph ả n ứng dương tính nếu xuất hiện màu hồng eosin. A.11 . Dung d ị ch pha loãng phosphat Butter fi eld A.11.1 . Thành phần Kali dihydro phosphat (KH 2 P O 4 ) 34 g Nước cất 500 ml A.11.2 . Chuẩn bị Ch ỉ nh pH đến 7,2 bằng dung dịch natri hydroxit 1 M. Thêm nước đến 1 lít. Tiệt trùng 15 min ở 121 ° C . Bảo quản trong tủ lạnh. Thuốc thử trắng pha lo ã ng: Lấy 1,25 ml dung dịch gốc nêu trên, thêm nước đến 1 lít. Ph â n phối vào các chai 90 ml hoặc 99 ml ± 1 ml. Tiệt trùng 15 min ở 121 ° C . A.12 . Chất ch ỉ thị metyl đỏ Metyl đỏ 0,1 g Etanol (95 %) 300 ml Nước cất 500 ml THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Cor 1:2004) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch [2] TCVN 4882:2007 (ISO 4831:2006) Vi sinh vật trong thực phẩm và th ứ c ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng coliform - Kỹ thuật đếm số có xác su ấ t lớn nhất [3] TCVN 6404 (ISO 7218) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật [4] TCVN 6848:2007 (ISO 4832:2006) Vi sinh vật trong th ự c phẩm và thức ăn chăn nuôi - Ph ươ ng pháp định lượng col if orm - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc