TCVN12384:2018

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12384:2018 về Thực phẩm - Xác định hàm lượng xơ không tan, xơ hòa tan và xơ tổng số - Phương pháp enzym - Khối lượng - Sắc ký lỏng TIÊU CHU Ẩ N QUỐC GIA TCVN 12384:2018 THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG XƠ KHÔNG TAN, XƠ HÒA TAN VÀ XƠ TỔNG SỐ - PHƯƠNG PHÁP ENZYM-KHỐI LƯỢNG-SẮC KÝ LỎNG Foodstuffs - Determination of insoluble, soluble, and total dietary fiber - Enzymatic-gravimetric-liquid chromatographic method Lời nói đầu TCVN 12384:2018 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2011.25 Insoluble, Soluble, and Total Dietary Fiber in Foods. Enzymatic-Gravimetric- Liquid Chromatography ; TCVN 12384:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG XƠ KHÔNG TAN, XƠ HÒA TAN VÀ XƠ TỔNG SỐ - PHƯƠNG PHÁP ENZYM-KHỐI LƯỢNG-SẮC KÝ LỎNG Foodstuffs - Determination of insoluble, soluble, and total dietary fiber - Enzymatic-gravimetric-liquid chromatographic method 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp enzym-khối lượng-sắc ký lỏng để xác định hàm lượng xơ không tan (IDF), xơ hòa tan (SDF) và xơ tổng số (TDF) trong thực phẩm bao gồm cả tinh bột bền (RS) và các oligosaccharide và polysaccharide không phân hủy được có thể hòa tan trong hỗn hợp nước: ancol có chỉ số polyme hóa (DP) ≥ 3. Các kết quả của nghiên cứu liên phòng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A. 2 Nguyên tắc Hai phần mẫu thử lặp lại được ủ với α-amylase tuyến tụy và amyloglucosidase (AMG) 16 h ở 37 °C trong bình 250 ml đậy kín, lắc trộn đủ mạnh để duy trì huyền phù liên tục. Trong bước này, tinh bột không bền được hòa tan và thủy phân thành glucose và maltose do hoạt động kết hợp của hai enzym. Phản ứng được tạm dừng bằng cách chỉnh pH và làm nóng nhẹ. Protein trong mẫu sau đó được phân hủy bởi protease. Để xác định IDF, dịch phân hủy được lọc và IDF được xác định bằng phương pháp khối lượng sau khi hiệu chỉnh protein hoặc tro trong cặn. Để xác định xơ hòa tan trong nước, nhưng không hòa tan trong hỗn hợp của nước: ancol (SDFP) thì thêm etanol vào dịch lọc IDF; lọc để giữ lại SDFP kết tủa và xác định bằng phương pháp khối lượng sau khi hiệu chỉnh protein hoặc tro có trong kết tủa. Xơ hòa tan trong nước: ancol (SDFS) không tạo kết tủa có trong dịch lọc thu được bằng cách cô đặc dịch lọc, khử ion bằng nhựa trao đổi ion, cô đặc và định lượng bằng sắc ký lỏng (LC), hoặc bằng cách cô đặc dịch lọc sau đó đồng thời khử ion và định lượng bằng LC. 3 Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước sử dụng là nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương. 3.1 Etanol, 95 % (thể tích) hoặc rượu metyl hóa [industrial methylated spirit (IMS)] Chuẩn bị IMS như sau: Trộn 100 thể tích etanol 95 % với 5 thể tích metanol để thu được etanol biến tính. Trộn 5 thể tích 2-propanol với 95 thể tích etanol biến tính để thu được IMS. 3.2 Etanol, 78 % (th ể t í ch) hoặc IMS . Cho 207 ml nước vào bình định mức 1 L (4.31). Pha loãng đến vạch bằng etanol 95 % hoặc IMS (3.1). Trộn đều. 3.3 Axeton. 3.4 Dung dịch AMG gốc, 3300 U 1) /ml trong glycerol 50 % (thể tích). Dung dịch AMG không được chứa β-glucanase, β -xylanase và không có khả năng phát hiện được mức glucose tự do (xem 7.1 về việc tinh sạch enzym). Dung dịch AMG bền đến 5 năm khi được bảo quản ở 4 °C. 3.5 α -amylase tuyến tụy (50 U/ml)/AMG (3,4 U/ml) Ngay trước khi sử dụng, hòa tan 0,10 g α -amylase tuyến tụy lợn đã tinh sạch khoảng 130 000 U/g trong 290 ml đệm natri maleat (3.10) và khuấy trong 5 min. Thêm 0,3 ml dung dịch gốc AMG (3.4) (xem 7.1 về việc tinh sạch enzym). 3.6 Protease, 50 mg/ml, hàm lượng tyrosine khoảng 350 U/ml, trong glycerol 50 % (th ể tích) Khi phân phối dung dịch này, cần sử dụng bộ phân phối thích hợp. Protease không được chứa α -amylase và đặc biệt không chứa β -glucanase và β -xylanase. 3.7 Nước đã khử ion. 3.8 Celite, được rửa bằng axit và tro hóa trước. 3.9 Dung dịch làm sạch. Chuẩn bị dung dịch Micro-90 ® 2) 2 % (khối lượng/thể tích) với nước đã khử ion (3.7). 3.10 Dung dịch đệm natri maleat, 50 mM, pH 6,0 cùng với canxi clorua 2 mM và natri azide 0,02 %. Hòa tan 11,6 g axit maleic trong 1600 ml nước cất và chỉnh pH đến 6,0 bằng dung dịch natri hydroxit 4 M (160 g/l). Bổ sung 0,6 g canxi clorua ngậm hai phân tử nước và 0,4 g natri azide. CHÚ THÍCH: Không nên thêm natri azide trước khi điều chỉnh pH. Việc axit hóa natri azide giải phóng khí độc. Chỉ sử dụng natri azide và axit maleic sau khi xem xét các chỉ dẫn an toàn hóa chất, sử dụng dụng cụ bảo hộ cá nhân thích hợp và tủ hút phòng thử nghiệm và chỉnh thể tích đến 2 L. Dung dịch này bền được hơn 1 năm khi được bảo quản ở 4 °C. 3.11 Tris base, 0,75 M Cho 90,8 g Tris base vào khoảng 800 ml nước cất và hòa tan. Chỉnh thể tích đến 1 L. Dung dịch này bền được hơn 1 năm khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng. 3.12 Dung dịch axit axetic, 2 M Cho 115 ml axit axetic băng vào bình định mức 1 L (4.31). Thêm nước cất đến vạch. 3.13 Các dung dịch chuẩn pH, dung dịch đệm ở pH 4,0; 7,0 và 10,0. 3.14 Fructooligosaccharide, từ rau diếp xoăn. 3.15 Dung dịch chuẩn thời gian lưu LC Hòa tan 2,0 g phần hỗn hợp oligosaccharide và 0,50 g maltose trong một lượng nước đã khử ion (3.7) đủ để hòa tan và chuyển sang bình định mức 100 ml (4.31). Dùng pipet (4.13) lấy 10 ml dung dịch nội chuẩn (3.16). Thêm dung dịch natri azide 0,02 % (3.20) đến vạch. Chuyển dung dịch vào bình polypropylen 100 ml. Dung dịch bền trong 1 năm khi bảo quản ở nhiệt độ phòng. 3.16 Dung dịch D-sorbitol (dung dịch nội chuẩn gốc), 100 mg/ml. Cân 100 g D-sorbitol khô vào cốc có mỏ, hòa tan trong nước, chuyển vào bình định mức 1 L (4.31) và thêm nước đến vạch. Chuyển sang bình polypropylen và thêm 0,2 g natri azide làm chất bảo quản. CHÚ THÍCH 1: Sorbitol có trong một số sản phẩm như đậu đỗ, táo. Nếu mẫu thử chứa sorbitol, sử dụng phương pháp nội chuẩn sẽ cho kết quả lượng SDFS thấp. Do đó nên sử dụng phương pháp ngoại chuẩn. CHÚ THÍCH 2: Chú ý chỉ sử dụng natri azide sau khi xem xét các chỉ dẫn an toàn hóa chất, sử dụng dụng cụ bảo vệ cá nhân thích hợp và tủ hút phòng thử nghiệm. Dung dịch này bền hơn 1 năm khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng. 3.17 Các chuẩn D-glucose LC, 5 mg/ml, 10 mg/ml và 20 mg/ml Cân chính xác 0,5 g; 1,0 g và 2,0 g D-glucose có độ tinh khiết cao (> 99,5 %) và chuyển vào ba bình định mức riêng rẽ dung tích 100 ml (4.31). Dùng pipet (4.13) cho vào mỗi bình 10 ml dung dịch nội chuẩn (3.16). Thêm dung dịch natri azide 0,02 % (3.20) đến vạch. Chuyển dung dịch vào bình polypropylen 100 ml. Dung dịch này bền 1 năm khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng. 3.18 Dung dịch dinatri canxi etylenediaminetetraxetat (Na 2 CaEDTA), 50 mg/l (nếu sử dụng cột Sugar-Pak LC và khử ion bằng phương pháp thủ công). Hòa tan 50 mg Na 2 CaEDTA trong khoảng 500 ml nước đã khử ion (3.7) đựng trong bình định mức 1 L (4.31), thêm nước đến vạch. 3.19 Dung dịch dinatri canxi etylenediaminetetraxetat (Na 2 CaEDTA), 500 mg/l; nếu sử dụng cột Sugar-Pak LC, đồng thời khử ion và định lượng). Hòa tan 500 mg Na 2 CaEDTA trong khoảng 500 ml nước đã khử ion (3.7) đựng trong bình định mức 1 L (4.31), thêm nước đến vạch. 3.20 Dung dịch natri azide, 0,02 % (khối lượng/thể tích) Cho 0,2 g natri azide vào 1 L nước đã khử ion (3.7) và khuấy để hòa tan. CHÚ THÍCH Chỉ sử dụng natri azide sau khi xem xét các chỉ dẫn an toàn hóa chất, sử dụng dụng cụ bảo vệ cá nhân thích hợp và tủ hút phòng thử nghiệm. Dung dịch này bền hơn 1 năm khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng. 4 Thiết bị, dụng cụ Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thiết bị và dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và như sau: 4.1 Máy nghiền, có khả năng ly tâm, với rôto 12 bánh răng và sàng đường kính 0,5 mm hoặc thiết bị tương tự. Ngoài ra, có thể sử dụng máy nghiền xoáy (cyclone mill) cho các mẫu phòng thử nghiệm cỡ nhỏ với điều kiện máy nghiền có đủ tốc độ dòng không khí hoặc có bộ phận làm mát khác để tránh làm các mẫu bị quá nhiệt. 4.2 Bình phân hủy, dung tích 250 ml, bằng thủy tinh soda Fisherbrand®, miệng rộng có nắp đậy với lớp lót bằng polyvinyl hoặc bình polypropylen, dung tích 250 ml có nắp đậy bằng polypropylen. 4.3 Chén lọc xốp, dung tích 50 ml. Chuẩn bị bốn chén như sau: tro hóa qua đêm ở 525 °C trong lò buồng. Đưa lò về nhiệt độ 130 °C trước khi lấy chén ra để hạn chế vỡ. Loại bỏ hết Celite và tro còn sót lại bằng cách sử dụng chân không. Ngâm trong dung dịch làm sạch 2 % (3.9), ở nhiệt độ phòng khoảng 1 h. Tráng chén bằng nước và nước đã khử ion (3.7). Trong lần tráng rửa cuối cùng, sử dụng 15 ml axeton và làm khô trong không khí. Thêm khoảng 1,0 g Celite (3.8) vào chén nung đã khô và sấy ở 130 °C đến khối lượng không đổi. Làm nguội chén trong bình hút ẩm (4.11) khoảng 1 h và ghi lại khối lượng chén chứa Celite. 4.4 Bình lọc, dung tích 1 L, có tay cầm. 4.5 Bộ điều chỉnh vòng đệm cao su, để lắp chén nung với bình lọc. 4.6 Nguồn chân không, bơm chân không hoặc máy hút có bộ điều chỉnh có khả năng điều chỉnh chân không. 4.7 Nồi cách thủy, có chuyển động quay, dung tích lớn (từ 20 L đến 24 L) có nắp đậy; có khả năng duy trì nhiệt độ 37 °C ± 1 °C và 60 °C ± 1 °C; được trang bị bộ hẹn giờ tự động cho hoạt động để bật- tắt hoặc loại tương đương. Đảm bảo rằng việc lắc/khuấy mẫu trong nồi cách thủy đầy đủ để duy trì mẫu ở dạng huyền phù và không có cặn tích lũy trong quá trình phân hủy mẫu bằng enzym. Có thể sử dụng máy (lắc qua lại) nếu các bình được đặt ở góc 45° để đảm bảo khuấy trộn đủ (nếu bình đặt thẳng đứng hoặc nằm ngang sẽ không khuấy trộn đầy đủ). Ngoài ra, có thể sử dụng bộ trộn khuấy từ trong nồi cách thủy được duy trì ở 37 °C ± 1 °C có bộ gia nhiệt tuần hoàn. 4.8 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg. 4.9 Tủ sấy, duy trì nhiệt độ ở 105 °C ± 2 °C và 130 °C ± 3 °C. 4.10 Đồng hồ hẹn giờ. 4.11 Bình hút ẩm, kín khí, chứa silic dioxit hoặc chất hút ẩm tương đương. Chất hút ẩm được làm khô hai tuần một lần trong tủ sấy (4.9) ở 130 °C. 4.12 Máy đo pH. 4.13 Pipet và đầu tip, thể tích thay thế từ 50 µl đến 200 µl và dung tích 5 ml. 4.14 Ống phân phối, dung tích 15 ml ± 0,5 ml dùng cho etanol 95 %, etanol 78 %, IMS, axeton và dung tích 40 ml ± 0,5 ml dùng cho dung dịch đệm. 4.15 Ống đ o ng chia vạch, dung t í ch 500 ml. 4.16 Máy khuấy từ và thanh khuấy. 4.17 Dao trộn bằng cao su. 4.18 Lò nung, vận hành được ở nhiệt độ 525 °C ± 5 °C. 4.19 Cột polypropylen (nếu thực hiện khử ion bằng phương pháp thủ công). 4.20 Cột bảo vệ trao đổi cation và anion (nếu thực hiện đồng thời khử ion và định lượng) cột bảo vệ trao đổi cation và anion, dạng H + và CO 2 3- , tương ứng, có bộ phận giữ cột bảo vệ để giữ hai ống cột bảo vệ trong dãy ống, ống cation phía trước cột anion. 4.21 Máy sắc ký lỏng, gồm có các bộ phận: 4.21.1 Bơm, có khả năng tạo áp suất đến 10 000 psi 3) ở tốc độ dòng 0,5 ml/min. 4.21.2 Bơm vòng, được trang bị vòng bơm 50 µl. 4.21.3 Cột LC, ví dụ: Waters Sugar-pak, 6,5 × 300 mm hoặc loại tương đương. 4.21.4 Detector chỉ số khúc xạ (RI), có khả năng duy trì ở 50 °C. 4.21.5 Lò cột, có thể duy trì ở nhiệt độ 90 °C. 4.22 Máy tích phân dữ liệu hoặc máy tính, để đo diện tích pic. 4.23 Bộ lọc dùng cho xyranh dùng một lần, bằng polyvinyliden florua, cỡ lỗ 0,45 µm, đường kính 13 mm hoặc 25 mm. 4.24 Bộ lọc nước, bằng polyvinyliden florua, cỡ lỗ 0,45 µm, đường kính 47 mm. 4.25 Thiết bị lọc, để giữ bộ lọc (4.24), để lọc lượng nước lớn hơn. 4.26 Xyranh dùng một lần, bằng chất dẻo, dung tích 10 ml. 4.27 Xyranh, dung tích 100 µl. 4.28 Máy cô quay, có bình cô quay 250 ml và 1 L. 4.29 Nhiệt kế, có thể đo được đến 110 °C. 4.30 Thiết bị đông khô. 4.31 Bình định mức, dung tích 100 ml và 1 L. 5 Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này. 6 Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu như khi chế biến để ăn, nghĩa là đối với hỗn hợp bột nhão cần được nhào và nước, mì cần phải nấu. Khử chất béo nếu nhiều hơn 10 % chất béo: trước khi nghiền, sử dụng 3 lần ete dầu mỏ, mỗi lần 25 ml/g mẫu thử. Ghi lại khối lượng tổn thất do việc loại bỏ chất béo và tính hệ số hiệu chỉnh trong kết quả xác định cuối cùng. Đối với các mẫu có độ ẩm cao (> 25 %), có thể làm đông khô. Nghiền khoảng 50 g trong máy nghiền (4.1), sao cho lọt qua sàng 0,5 mm. Chuyển tất cả mẫu vào lọ bằng chất dẻo có miệng rộng, làm kín và trộn đều bằng cách lắc và đảo ngược. Bảo quản lọ mẫu có chứa chất hút ẩm. 7 Cách tiến hành 7.1 Tinh sạch enzym Để đảm bảo rằng không có mặt các hoạt độ enzym không mong muốn và sự có hiệu lực của enzym mong muốn, cho chạy các dung dịch chuẩn được nêu trong Bảng 1 mỗi khi thay đổi lô enzym hoặc trong khoảng thời gian tối đa 6 tháng. Bảng 1 - Chế phẩm để tinh sạch enzym Mẫu thử Enzym thử nghiệm Phần khối lượng mẫu thử , g Độ thu hồi dự kiến, % Pectin của cây có múi Pectinase 0,1 từ 95 đến 100 Stractan Hemicellulase 0,1 từ 95 đến 100 Tinh bột lúa mì Amylase 1,0 từ 0 đến 1 Tinh bột ngô Amylase 1,0 từ 0 đến 2 Casein Protease 0,3 từ 0 đến 2 β-Glucan a β-Glucanase 0 , 1 từ 95 đến 100 a Chế phẩm của công ty Sigma Chemical. 7.2 Phân hủy mẫu bằng enzym 7.2.1 Mẫu trắng Với mỗi lần phân tích, cho chạy các mẫu trắng đồng thời cùng với các mẫu. 7.2.2 Mẫu thử a) Cân mẫu chính xác hai lần, mỗi lần 1,000 g ± 0,005 g mẫu cho vào bình phân hủy 250 ml (4.2). b) Bổ sung enzym Làm ẩm mẫu với 1,0 ml etanol (hoặc IMS) và thêm 40 ml hỗn hợp α-amylase/AMG tuyến tụy (3.5) vào mỗi bình. Vặn nắp bình. Chuyển bình vào nồi cách thủy (4.7) để lắc theo quỹ đạo hoặc lắc tuyến tính và đảm bảo các bình nằm đúng vị trí. Cách khác, sử dụng thiết bị có máy khuấy từ (4.7). c) Ủ ấm với α-amylase tuyến tụy/AMG Ủ các dung dịch phản ứng có lắc 150 dao động/min (chuyển động xoay) hoặc ở tốc độ phù hợp để đảm bảo huyền phù trong máy lắc luôn ở 37 °C trong 16 h ± 10 min. Cách khác, khuấy lượng chứa trong bình để phân hủy mẫu trên thiết bị khuấy từ (với thanh khuấy 7 mm × 30 mm) được ngâm trong nồi cách thủy ở 37 °C trong 16 h ± 10 min (Hình 1). d) Chỉnh pH đến khoảng 8,2 (pH từ 7,9 đến 8,4), bất hoạt α-amylase và AMG Sau 16 h, lấy các bình đựng mẫu ra khỏi nồi cách thủy có lắc và thêm ngay 3,0 ml dung dịch Tris base 0,75 M (3.11) để kết thúc các phản ứng phân hủy tinh bột (tại cùng thời điểm này, nếu chỉ có sẵn một nồi cách thủy có lắc thì tăng nhiệt độ của nồi cách thủy có lắc đến 60 °C sẵn sàng cho bước ủ protease.) Nới nhẹ nắp bình và đặt bình vào nồi cách thủy (không lắc) ở 95 °C đến 100 °C và ủ 20 min, thỉnh thoảng lắc (bằng tay). Sử dụng nhiệt kế (4.29) đo để chắc chắn rằng nhiệt độ cuối cùng của lượng chứa trong bình lớn hơn 90 °C (kiểm tra chỉ một bình là đủ). e) Làm nguội Lấy tất cả các bình đựng mẫu ra khỏi nồi cách thủy (sử dụng găng tay thích hợp) và làm nguội đến khoảng 60 °C. f) Xử lý bằng protease Thêm 0,1 ml dung dịch protease (3.6), sử dụng bộ phân phối thích hợp, thu được dung dịch sánh. Ủ ấm ở 60 °C trong 30 min. g) Chỉnh pH Bổ sung 4,0 ml axit axetic 2 M (3.12) vào từng bình và trộn đều. Dung dịch này cho độ pH cuối cùng khoảng 4,3. h) Bổ sung dung dịch nội chuẩn Bổ sung 1 ml dung dịch nội chuẩn 100 mg/ml (3.16) vào từng mẫu. i) Tiến hành theo 7.3 (a) để xác định IDF khi cần xác định các giá trị IDF và SDF. Tiến hành theo Phụ lục B (a) khi TDF được yêu cầu không phân tách thành IDF và SDF. Hình 1 - Bố trí cách thủy phân mẫu sử dụng Mixdrive 15 có khuấy từ trong nồi cách thủy thông thường Hình 2 - Bố trí bơm và cột để khử ion của dịch chiết mẫu CH Ú GIẢI a: Cột sắc k ý dùng một l ầ n [Ví dụ: Bio-Rad Econo-Pac® (Cat. No. 732-1010)] b: Nút b ô ng côtt ô ng c: Van một chiều d: Hỗn hợp khoảng 4 g nhựa Ambersep 200 (H +) và khoảng 4 g nhựa Amberlite FPA53 (OH - ) e: Bơm Minipuls® Evolution f: Vật chứa bình Duran 7.3 Xác định IDF a) Cài đặt chế độ lọc Cân chén có chứa Celite (đã nung đến khối lượng không đổi) (xem 4.3), chính xác đến 0,1 mg. Làm ướt và phân phối lại Celite trong chén nung, sử dụng 15 ml etanol 78 % (thể tích) hoặc IMS (4.2) từ bình rửa. Dùng dụng cụ hút để chuyển Celite vào chén lọc xốp. Loại bỏ dịch lọc. b) Lọc Sử dụng chân không để lọc dịch phân hủy (7.2.2) qua chén. Sử dụng bình rửa với 21,9 ml hoặc một lượng ít hơn nước đã khử ion (3.7) (được làm ấm đến 60 °C) để chuyển các hạt còn lại vào chén và tráng rửa cặn. Giữ lại dịch lọc đã gộp để xác định xơ hòa tan trong nước theo 7.4 (a). c) Rửa Sử dụng chân không để rửa phần cặn liên tiếp với các phần thể tích 15 ml như sau: hai phần etanol 78 % (thể tích) hoặc IMS (3.2); sau đó là hai phần etanol 95 % (thể tích) hoặc IMS (3.1); cuối cùng là hai phần axeton (3.3). Loại bỏ nước. CHÚ THÍCH Việc trì hoãn rửa cặn IDF bằng etanol 78 %, etanol 95 % và axeton có thể làm tăng giá trị IDF. d) Sấy chén chứa cặn qua đêm trong tủ sấy (4.9) ở 105 °C. e) Làm nguội chén trong bình hút ẩm (4.11) trong khoảng 1 h. Cân chén chứa cặn IDF và Celite, chính xác đến 0,1 mg. Lấy khối lượng này trừ đi khối lượng của chén đã cân để thu được khối lượng cặn. f) Xác định protein và tro Phần cặn của một trong hai chén nung được dùng để phân tích protein và phần cặn của chén thứ hai được dùng để phân tích tro. Thực hiện phân tích protein bằng phương pháp Kjeldahl hoặc đốt. Cẩn thận khi sử dụng máy phân tích đốt dùng để phân tích protein trong phần cặn; Celite hóa hơi từ mẫu có thể làm tắc nghẽn đường truyền của thiết bị. Sử dụng hệ số 6,25 cho tất cả các trường hợp để tính số miligam protein. Để phân tích tro, nung phần cặn của chén thứ hai trong 5 h ở 525 °C. Làm nguội trong bình hút ẩm (4.11) và cân chính xác đến 0,1 mg. Lấy khối lượng này trừ đi khối lượng của chén và Celite để xác định tro. g) Tiến hành xác định xơ hòa tan trong nước theo 7.4 (a). 7.4 Xác định xơ hòa tan trong nước a) Tạo kết tủa SDFP tan trong nước Đối với từng dịch lọc mẫu, thêm phần nước còn lại từ quá trình chuyển IDF và tráng IDF [xem 7.3 (b)] hoặc thêm một lượng nước, nếu cần để đưa tổng thể tích chính xác đến 70 ml, sau đó thêm 279 ml etanol 95 % (thể tích) hoặc IMS (3.1) (đo ở nhiệt độ phòng), được làm nóng trước đến 60 °C và trộn kỹ. Tạo kết tủa SDFP ở nhiệt độ phòng trong 60 min. b) Cài đặt chế độ lọc Cân chén chứa Celite (xem 4.3), chính xác đến 0,1 mg. Làm ướt và phân phối lại Celite trong chén, sử dụng 15 ml etanol 78 % (thể tích) hoặc IMS (3.2) từ bình rửa. Dùng dụng cụ hút để chuyển Celite vào chén. Loại bỏ dịch lọc. c) Lọc Sử dụng chân không để lọc SDFP đã kết tủa [7.4 (a)] từ phần nổi phía trên qua chén. Sử dụng bình rửa với etanol 78 % (thể tích) hoặc IMS (3.2), chuyển hết các hạt còn lại trên thành chén. Giữ lại dịch lọc và nước rửa [7.4 (d)] để xác định SDFS. d) Rửa Sử dụng chân không để rửa phần cặn liên tiếp với các phần thể tích 15 ml như sau: hai phần etanol 78 % (thể tích) hoặc IMS (3.2); sau đó là hai phần etanol 95 % (thể tích) hoặc IMS (3.1); cuối cùng là hai phần axeton (3.3). Gộp với dịch lọc của bước lọc [7.4 (c)]. e) Sấy chén chứa cặn qua đêm trong tủ sấy (4.9) ở 105 °C. f) Làm nguội trong bình hút ẩm (4.11) trong khoảng 1 h. Cân chén chứa phần xơ và Celite còn lại, chính xác đến 0,1 mg. Lấy khối lượng này trừ đi khối lượng chén rỗng (nghĩa là khối lượng của chén nung và Celite khô) để thu được khối lượng cặn. g) Xác định hàm lượng protein và tro Phần cặn của một trong hai chén được dùng để phân tích protein và phần cặn của chén thứ hai được dùng để phân tích tro. Thực hiện phân tích protein bằng phương pháp Kjeldahl hoặc đốt. Cẩn thận khi sử dụng máy phân tích đốt dùng để phân tích protein trong phần cặn; Celite hóa hơi từ mẫu có thể làm tắc nghẽn đường truyền của thiết bị. Sử dụng hệ số 6,25 cho tất cả các trường hợp để tính số miligam protein. Để phân tích tro, nung phần cặn của chén thứ hai trong 5 h ở 525 °C. Làm nguội trong bình hút ẩm (4.11) và cân chính xác đến 0,1 mg. Lấy khối lượng này trừ đi khối lượng của chén và Celite để xác định tro. h) Tiến hành theo 7.5.5. 7.5 Xác định SDFS 7.5.1 Yêu cầu chung Sắc ký đồ của maltodextrin, maltose, glucose, sorbitol và glycerol trên cột Sugar-Pak (4.21.3) được thể hiện trong Hình A.1 và của xơ hòa tan (WASDF hoặc SDFS) trong hỗn hợp nước: cồn, glucose và sorbitol trong Hình A.2. CHÚ THÍCH: Việc khử ion đúng cách là một phần quan trọng của việc thu dữ liệu sắc ký chính xác về SDFS. Đối với việc khử ion bằng phương pháp thủ công, phải hiểu rõ về xuất hiện của các pic muối trong sắc ký đồ của SDFS có thể ảnh hưởng đến việc xác định xơ. Trong việc đánh giá cột chứa khoảng 8 g nhựa hỗn hợp, hòa tan 10 mg natri clorua vào 9 ml nước đã khử ion, thêm 1 ml dung dịch nội chuẩn LC (3.16) 100 mg/ml và tiến hành theo 7.5.6 “chuyển 2 ml lên đỉnh cột...”. Sắc ký lỏng của dung dịch này sẽ không có các pic trong khoảng thời gian tương ứng với cacbohydrat của DP > 3. Để đồng thời khử ion và định lượng bằng LC, xem Hình A.2 về sự thay đổi xảy ra trong chạy sắc ký khi khả năng trao đổi ion của cột bị vượt quá. 7.5.2 Cài đặt hệ thống LC a) Cài đặt hệ thống LC theo Hình 3 và Hình 4 tùy thuộc vào cách đồng thời khử ion cùng với quá trình sắc ký hoặc thủ công. Các điều kiện hoạt động của cột Sugar-Pak (4.21.3) là: - Nhiệt độ: 90 °C. - Pha động-khử ion bằng phương pháp thủ công: Nước cất cộng với dung dịch Na 2 CaEDTA 50 mg/l (3.18); tốc độ dòng, 0,5 ml/min. Đồng thời khử ion và định lượng: + Pha động dùng cho bơm thứ nhất: nước cất; tốc độ dòng, 0,45 ml/min. + Pha động dùng cho bơm thứ hai: Na 2 CaEDTA 500 mg/l (3.19); tốc độ dòng 0,05 ml/min. - Hệ thống phải tách được maltose ra khỏi các malto-oligosaccharide cao hơn (Hình A.1). - Thời gian chạy: 30 min để đảm bảo rằng tất cả các mẫu từ quá trình bơm được làm sạch khỏi cột trước khi bơm tiếp. - Detector RI (4.21.4) ở 50 °C. CHÚ THÍCH đối với các mẫu có chứa một lượng lớn polyfructose chuỗi ngắn, nên dùng sắc ký của SDF trên hai cột sắc ký lòng ngoại cỡ (TSK-Gel 30 cm x 7,8 mm) để kết nối (ví dụ Sigma Aldrich Part No. 808020) sử dụng các điều kiện được mô tả trong AOAC 2009.01). Hình 3 - Sơ đồ lắp thiết bị hệ thống sắc ký lỏng dùng cho cột phân tích Sugar-Pak-khử ion bằng phương pháp thủ công Hình 4- Sơ đồ lắp thiết b ị hệ thống sắc k ý lỏng dùng cho cột phân tích Sugar-Pak-khử ion và định lượng đ ồ ng thời 7.5.3 Hiệu chuẩn diện tích sắc đồ cần đo đối với SDFS Sử dụng xyranh LC 100 µl (4.27), đưa mẫu vào vòng bơm 50 µl (4.21.2) với dung dịch chuẩn có thời gian lưu LC (3.15). Xác định điểm phân giới giữa DP 2 và 3 oligosaccharide (disaccharide sucrose và maltose so với oligosaccharides cao hơn). Xem Hình A.1 và Hình A.2. 7.5.4 Xác định hệ số đáp ứng (R f ) đối với D-glucose Vì D-glucose cho đáp ứng RI của LC tương đương với R f của các polysaccharide không phân hủy được tạo nên SDFS, nên LC được hiệu chuẩn bằng D-glucose và R f được sử dụng để xác định khối lượng của SDFS. Đối với từng dung dịch nội chuẩn/D-glucose (3.17), sử dụng xyranh dung tích 100 µl (4.27), để đổ đầy vào vòng bơm 50 µl. a) Phương pháp nội chuẩn Ghi lại các giá trị diện tích pic của D-glucose và dung dịch nội chuẩn từ sắc ký đồ. Giá trị nghịch đảo của độ dốc thu được bằng cách so sánh tỷ lệ diện tích pic của D-glucose/diện tích pic của dung dịch nội chuẩn (trục y) với tỷ lệ khối lượng của D-glucose/khối lượng của nội chuẩn (trục x) là “Hệ số đáp ứng”. Xác định hệ số đáp ứng trung bình ( R f ) (thường là 0,91 so với dung dịch nội chuẩn D-sorbitol). Hệ số đáp ứng trung bình, R f , được tính bằng Công thức (1): (1) Trong đó S IS là diện tích pic của dung dịch nội chuẩn (D-sorbitol); S Gl u là diện tích pic D-glucose; m Glu là khối lượng D-glucose chứa trong 1 ml dung dịch chuẩn, tính bằng miligam (m Glu = 5 mg, 10 mg hoặc 20 mg); m IS là khối lượng của dung dịch nội chuẩn có trong 1 ml dung dịch chuẩn nội gốc, tính bằng miligam (m IS = 10 mg). b) Phương pháp ngoại chuẩn Thu lấy các giá trị diện tích pic của D-glucose từ ba sắc ký đồ. Hệ số đáp ứng trung bình ( R f ), được tính bằng Công thức (2): (2) Trong đó m Glu là khối lượng của D-glucose có trong 1 ml dung dịch chuẩn, tính bằng miligam ( m Glu = 5 mg, 10 mg, hoặc 20 mg); S Glu l à diện tích pic D-glucose. 7.5.5 Lọc thu hồi, khử ion và phân tích LC Chuyển phần dịch lọc 7.4 (c) của mẫu thử vào bình cô quay 1 L và cô đặc bằng máy cô quay (4.28) đến khô ở 50 °C. Hòa tan cặn trong 10 ml nước đã khử ion (3.7) và chuyển sang bình chứa kín, bảo quản ở 4 °C nếu có phương án bảo quản qua đêm trước khi khử ion. Khi thực hiện tiếp thì một nửa dịch lọc được cô đặc đến khô và hòa tan lại trong 5 ml nước. Điều này cho kết quả tương tự, nhưng giảm một nửa thời gian cô quay. Để khử ion bằng phương pháp thủ công, tiến hành theo 7.5.6. Để đồng thời khử ion và định lượng LC, tiến hành theo 7.5.7. 7.5.6 Khử ion của mẫu Ly tâm hoặc lọc dung dịch mẫu rồi chuyển 2 ml lên đỉnh cột nhựa hỗn hợp và cho phép cột rửa giải ở khoảng 1 ml/min. Thu lấy dịch rửa giải vào bình cầu đáy tròn 250 ml của máy cô quay (4.28). Khi mức chất lỏng giảm đến nút bông trên đỉnh cột thì tráng mẫu bằng 2 ml nước cất và cho dịch chảy qua nhựa. Thu lấy dịch rửa giải. Sau đó, thêm khoảng 20 ml nước cất lên đỉnh cột và rửa giải vào bình cầu đáy tròn 250 ml ở tốc độ khoảng 1 ml/min. Thu lấy dịch rửa giải cho đến khi mức chất lỏng đạt đến đỉnh của nhựa trên cột. Làm bay hơi dung dịch ở 50 °C đến khô. Hòa tan mẫu bằng nước cất và thêm nước đủ đến 2 ml bằng cách xoay trong khoảng 2 min. Dùng pipet Pasteur chuyển mẫu vào ống bảo quản polypropylen. 7.5.7 Chuẩn bị mẫu để phân tích HPLC Sử dụng xyranh dùng một lần dung tích 10 ml (4.26) và lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45 µm (4.23) để chuyển dung dịch từ 7.5.5 hoặc 7.5.6. 7.5.8 Phân tích HPLC đối với dung dịch mẫu Dùng xyranh (4.27) đổ đầy dịch chiết mẫu đã lọc vào vòng bơm 50 µl (4.21.2) trên hệ thống LC. Đối với các mẫu được khử ion bằng phương pháp thủ công (7.5.6) sau bước lọc (7.5.7), cho các dung dịch qua vòng bơm (4.21.2), trực tiếp lên cột Waters sugar-pak (4.21.3) bố trí như trong Hình 3. Đối với các mẫu được khử ion theo 7.5.5 sau bước lọc 7.5.7, áp dụng các dung dịch cho vòng bơm và cột bảo vệ khử muối (4.20), bố trí như trong Hình 4. 7.5.9 Xác định diện tích pic Xác định diện tích pic của S DFS (S SDFS ) và dung dịch nội chuẩn nếu được sử dụng (S IS ) trong sắc ký đồ của dịch chiết mẫu Ghi lại diện tích của tất cả các pic của DP lớn hơn điểm DP 2/DP 3 như S SDFS . Ghi lại diện tích pic của dung dịch nội chuẩn là S IS . 7.6 Xác định hàm lượng TDF Hàm lượng TDF có thể xác định gián tiếp từ tổng hàm lượng IDF (xem 7.3) và SDF (xem 7.4 và 7.5) hoặc xác định trực tiếp (xem Phụ lục B). 8 Tính kết quả 8.1 Tính hàm lượng IDF 8.1.1 Đối với mẫu trắng Khối lượng IDF của mẫu trắng, B 1 , biểu thị bằng miligam (mg), được tính bằng Công thức (3); (3) Trong đ ó B R1 và B R2 là khối lượng cặn của mẫu trắng, dùng cho phép xác định mẫu trắng IDF lặp lại tương ứng, tính bằng mil i gam (mg); P B và A B là khối lượng của protein và tro tương ứng, xác định được trên phần cặn của mẫu trắng thứ nhất và thứ hai, tính bằng miligam (mg). 8.1.2 Đối với mẫu thử Hàm lượng IDF của mẫu thử, X 1 , biểu thị bằng miligam trên 100 g (mg/100g), được tính bằng Công thức (4); (4) Hàm lượng I D F của mẫu th ử , X 1 ’ , biểu thị bằng phần trăm (%) được t í nh bằng Công thức (5): (5) Trong đó: R 1 là khối lượng thứ nhất của cặn IDF từ phần mẫu thử thứ nhất, m 1 , tính bằng miligam (mg); R 2 là khối lượng thứ hai của cặn IDF từ phần mẫu thử thứ hai, m 2 , tính bằng miligam (mg); m 1 là khối lượng phần mẫu thử thứ nhất, tính bằng gam (g); m 2 là khối lượng phần mẫu thử thứ hai, tính bằng gam (g); A là khối lượng tro từ R 1 , t í nh b ằ ng miligam (mg); P là khối lượng protein từ R 2 , tính bằng miligam (mg); B 1 là khối lượng IDF của mẫu trắng, tính bằng miligam (mg). 8.2 Tính hàm lượng SDFP 8.2.1 Đối với mẫu trắng Hàm lượng SDFP của mẫu trắng, B 2 , biểu thị bằng miligam (mg), được tính bằng Công thức (6); (6) Trong đó B R1 và B R2 là khối lượng cặn của mẫu trắng dùng cho phép xác định mẫu trắng SDFP lặp lại tương ứng, tính bằng miligam (mg); P B và A B là khối lượng của protein và tro xác định được trên phần cặn của mẫu trắng thứ nhất và thứ hai, tính bằng miligam (mg) tương ứng. 8.2.2 Đối với mẫu thử SDFP Hàm lượng SDFP của mẫu thử, X 2 , biểu thị bằng miligam trên 100 g (mg/100 g), được tính bằng Công thức (7); (7) Hàm lượng SDFP của mẫu thử, X 2 ’ , biểu thị b ằ ng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (8): (5) Trong đ ó R 1 là khối lượng thứ nhất của cặn SDFP từ phần mẫu th ử thứ nhất , m 1 , tính bằng miligam (mg); R 2 là khối lượng thứ hai của cặn SDFP từ phần mẫu th ử thứ hai, m 2 , tính bằng miligam (mg); m 1 là khối lượng phần m ẫ u th ử thứ nhất, tính b ằ ng gam (g); m 2 là khối lượng phần mẫu thử thứ hai, tính bằng gam (g); A là khối lượng tro từ R 1 , tính b ằ ng miligam (mg); P là khối lượng protein từ R 2 , tính bằng miligam (mg); B 2 là hàm lượng SDFP của mẫu trắng, tính bằng miligam (mg). 8.2.3 Tính hàm lượng SDFS a) Phương pháp nội chuẩn CHÚ THÍCH: Sorbitol có trong một số sản phẩm như đậu đỗ, táo. Nếu mẫu thử chứa sorbitol, sử dụng phương pháp nội chuẩn sẽ cho kết quả lượng SDFS thấp. Do đó nên sử dụng phương pháp ngoại chuẩn. Ngoài ra, dung dịch chuẩn nội vẫn được khuyến cáo làm chuẩn thời gian lưu. Hàm lượng SDFS của mẫu thử, X 3 , biểu thị bằng miligam trên 100 g (mg/100 g) được tính bằng Công thức (9): (9) Hàm lượng SDFP của mẫu thử, X 3 ’ , biểu thị bằng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (10): (10) Trong đó R f là hệ số đáp ứng tính được trong 7.5.4; m IS là khối lượng của dung dịch nội chuẩn có trong 1 ml mẫu (nghĩa là 10 mg/ml; thể tích mẫu cuối cùng, 10 ml); S SDFS là diện tích pic của chất xơ hòa tan trong nước:ancol; S IS là diện tích pic của nội chuẩn; 10 là hệ số chuyển đổi từ 1 ml đến 10 ml (thể tích mẫu cuối cùng); 100 l à hệ số chuyển đổi sang 100 g m ẫ u; m là khối lượng phần mẫu thử thứ nhất, m 1 hoặc thứ hai, m 2 , của mẫu có dịch lọc được cô đặc và được phân tích bằng LC, tính bằng gam (g). b) Phương pháp ngoại chuẩn Hàm lượng SDFS của mẫu thử, X 3 , biểu thị bằng miligam trên 100 g (mg/100 g) được tính bằng Công thức (11): (11) Hàm lượng SDFS của mẫu thử, X 3 ’ , biểu thị bằng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (12): (12) Trong đó (13) m G l u là khối lượng của D-glucose c ó trong 1 ml dung dịch chuẩn tính bằng miligam (mg) ( m G l u = 5 mg, 10 mg hoặc 20 mg); S Glu là diện tích pic D-glucose ( S Glu = 5, 10 hoặc 20 mg); S là diện tích pic của chất xơ hòa tan trong nước:ancol; 10 là hệ số chuyển đổi từ 1 ml đến 10 ml (thể tích mẫu cuối cùng); 100 là hệ số chuyển đổi sang 100 g mẫu; M là khối lượng phần mẫu thử thứ nhất, m 1 hoặc phần mẫu thử thứ hai, m 2 , của mẫu có dịch lọc được cô đặc và được phân tích bằng LC, tính bằng gam (g). 8.2.4 Tính hàm lượng SDF Hàm lượng SDF của mẫu thử, X 4 , biểu thị bằng miligam trên 100 g (mg/100 g), được tính bằng Công thức (14): X 4 = X 2 + X 3 (14) Hàm lượng SDF, X ’ 4 , biểu thị bằng phần trăm (%), được tính bằng Công thức (15): (15) 8.2.5 Tính hàm lượng TDF a) Phương pháp gián tiếp Hàm lượng TDF của mẫu thử, X’ 5 , biểu thị bằng phần trăm (%), được tính bằng Công thức (16): X’ 5 = X’ 1 + X’ 4 (16) b) Phương pháp trực tiếp: xem Phụ lục B. 9 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được. Phụ lục A (Tham khảo) Sắc ký đồ Hình A.1 - Sắc ký đồ của hỗn hợp các maltodextrin, maltose, D-glucose, D-sorbitol và glycerol trên cột Waters Sugar-Pak. Mũi tên phải cho thấy ranh giới giữa DP 2 (maltose) và DP 3 (các maltodextrin cao hơn) Hình A.2 - Sắc ký đồ của SDFS điển hình trong mẫu trên cột Sugar-Pak được phân tích trước và sau khi sử dụng ống khử ion. Lưu ý khi không có mặt của pic ở 18,4 min chứng tỏ ống khử ion hoạt động bình thường và có xuất hiện pic ion ở 18,4 min thì phải thay ống Phụ lục B (Tham khảo) Xác định TDF không tách riêng IDF và SDP B.1 Cách tiến hành a) Tạo kết tủa SDFP tran trong nước với sự có mặt của IDF Đối với từng dịch phân hủy bằng enzym của mẫu từ bước 7.2 (b) bổ sung nước để đưa tổng thể tích chính xác đến 71 ml. Sau đó thêm 279 ml etanol 95 % (thể tích) hoặc IMS (3.1) (đo ở nhiệt độ phòng). Làm nóng trước đến 60° và trộn kỹ. Tạo kết tủa SDFP trong cốc có IDF ở nhiệt độ phòng trong 60 min. b) Chuẩn bị chén nung Cân chén nung chứa Celite (xem 4.3), chính xác đến 0,1 mg. Làm ướt và phân bố lại Celite trong chén, sử dụng 15 ml etanol 78 % thể tích hoặc IMS (3.2) từ bình rửa. Dùng dụng cụ hút để chuyển Celite vào chén thành lớp, trộn đều. Loại bỏ dịch lọc này. c) Lọc Sử dụng chân không để lọc SDFP:IDF đã kết tủa từ phần nổi phía trên qua chén. Sử dụng bình rửa với etanol 78 % (thể tích) hoặc IMS (3.2), chuyển tất cả các hạt còn lại vào chén. Giữ lại dịch lọc và nước rửa để xác định SDF có khối lượng phân tử thấp. d) Rửa và giữ lại dịch lọc Sử dụng chân không để rửa phần cặn liên tiếp với các phần thể tích 15 ml như sau: hai phần etanol 78 % (thể tích) hoặc IMS (3.2); sau đó là hai phần etanol 95 % (thể tích) hoặc IMS (3.1); cuối cùng là hai phần axeton (3.3). Gộp dịch lọc từ ngay bước trước đó. e) Sấy chén chứa cặn qua đêm trong tủ sấy (4.9) ở 105 °C. f) Làm nguội và cân chén trong bình hút ẩm (4.11) trong khoảng 1 h. Cân chén chứa cặn xơ và Celite, chính xác đến 0,1 mg. Lấy khối lượng này trừ đi khối lượng chén rỗng (nghĩa là khối lượng của chén và Celite khô) để thu được khối lượng cặn. g) Xác định hàm lượng protein và tro. Phần cặn của một trong hai chén thực hiện lặp lại được phân tích protein và phần cặn của chén thứ hai phân tích tro. Thực hiện phân tích protein trong cặn bằng phương pháp Kjeldahl hoặc đốt. Cẩn thận khi sử dụng máy phân tích đốt dùng để phân tích protein trong phần cặn; Celite hóa hơi từ mẫu có thể làm tắc nghẽn đường truyền của thiết bị. Sử dụng hệ số 6,25 cho tất cả các trường hợp để tính số miligam protein. Để phân tích tro, nung phần cặn của chén thứ hai trong 5 h ở 525 °C. Làm nguội trong bình hút ẩm (4.11) và cân chính xác đến 0,1 mg. Lấy khối lượng của chén và Celite để xác định tro. h) Tiến hành theo 7.5.5 để xác định SDFS. B.2 Tính kết quả B.2.1 Tính tỷ lệ SDFP:IDF B.2.1.1 Tính khối lượng mẫu trắng Khối lượng IDF của mẫu trắng, B , tính bằng miligam (mg), được tính bằng Công thức (B.1) (B.1) Trong đó B R1 và B R2 là khối lượng cặn của mẫu trắng đối với hai phép xác định mẫu trắng lặp lại SDFP:IDF tương ứng, tính bằng miligam (mg), và P B và A B là khối lượng của protein và tro, xác định được trên cặn của mẫu trắng thứ nhất và thứ hai tương ứng, tính bằng miligam (mg). B.2.1.2 Tính tỷ lệ SDFP:IDF - Tỷ lệ SDFP:IDF, X 6 , biểu thị bằng miligam trên 100 g (mg/100 g) được tính bằng Công thức (B.2): (B.2) - Tỷ lệ SDFP:IDF, X 6 ’ , biểu thị bằng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (B. 3 ): (B.3) Trong đó R 1 là tỷ lệ SDFP:IDF của khối lượng cặn thứ nhất từ phần mẫu thử thứ nhất, m 1 , tính bằng miligam (mg); R 2 là tỷ lệ SDFP:IDF của khối lượng cặn từ phần mẫu thử thứ hai, m 2 , tính bằng miligam (mg); m 1 là tỷ lệ SDFP:IDF của phần mẫu thử thứ nhất, tính bằng gam (g); m 2 là tỷ lệ SDFP:IDF của phần mẫu thử thứ hai, tính bằng gam (g); A là khối lượng tro từ R 1 , tính bằng miiigam (mg); P là khối lượng protein từ R 2 , tính bằng miligam (mg); B là khối lượng mẫu trắng. B.2.3 Tính hàm lượng TDF Hàm lượng TDF, X' 5 , biểu thị bằng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (B.4): X’ 5 = X’ 6 + X’ 3 (B.4) Trong đó X’ 6 là tỷ lệ SDFP:IDF, tính bằng phần trăm (%); X’ 3 là hàm lượng SDFS của mẫu thử, tính bằng phần trăm (%) [(xem 8.2.3 a) hoặc 8.2.3 b)]. Phụ lục C (Tham khảo) Khử ion bằng phương pháp thủ công C.1 Phương pháp ban đầu Cột 1 - 10 g nhựa Ambersep 200 (H + ), khả năng trao đổi ion (dữ liệu về khả năng trao đổi RH do nhà sản xuất cung cấp) 1,6 meq/ml (min), hoặc tương đương. Cột 2 -10 g nhựa Amberlite FPA53 (OH - ), 1,6 meq/ml (min) hoặc tương đương được nhồi trong các cột riêng biệt [bình hứng sạch dùng để chiết (15 ml) (3.19)] để phân tích từng phần mẫu thử. Trước khi kết nối các cột, rửa nhựa trong từng cột với đủ nước để có được giá trị pH từ 4 đến 7 đối với cột thứ nhất và từ 7 đến 8 đối với cột thứ hai. C.2 Phương pháp được sửa đổi Trộn khoảng 4 g nhựa Ambersep 200 (H + ) hoặc tương đương, 1,6 meq/ml (phút) hoặc tương đương với khoảng 4 g nhựa Amberlite FPA53 (OH - ), 1,6 meq/ml (min) hoặc tương đương có khả năng trao đổi ion (dữ liệu về khả năng trao đổi R-OH do nhà sản xuất cung cấp), trong 100 ml cốc và hồ nhão với lượng nước cất tối thiểu. Rót hỗn hợp này vào cột sắc ký dùng một lần Bio-Rad Econo-Pac (Cat. No. 732-1010) được gắn với khóa Allc One stopcock (Cat. No. 211524). Nút miếng bông lên đỉnh cột và rửa nhựa với 20 ml nước cất. Cột này sau đó sẵn sàng để sử dụng. Nếu sử dụng nhựa khác, xác định rằng carbohydrat không được nhựa giữ lại bằng cách chuẩn bị dung dịch thử bao gồm 1 ml dung dịch nội chuẩn 100 mg/ml (3.16) và 2,5 ml fructooligosaccharide 10 mg/ml được pha loãng thành 10 ml. Thêm 2 ml dung dịch này vào nhựa đã khử ion hỗn hợp (khoảng 8 g) như 7.5.6. Khôi phục các dung dịch chuẩn nội bộ và các fructooligosaccharide phải phù hợp với các dung dịch bơm trực tiếp vào LC. Phụ lục D (Tham khảo) Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm Bảng D.1 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với IDF M ẫ u/thông s ố A B C D E F G H Số lượng phòng thử nghiệm 14 15 15 15 13 13 12 13 Gi á trị trung b ì nh, % 25,74 4,79 9,23 1,05 8,26 11,63 11,52 9,90 Độ lệch chuẩn lặp lại, S r 0,52 0,18 0,71 0,13 0,19 0,48 0,33 0,29 Độ lệch chuẩn tái lập, S R 1,23 0,47 2,24 0,42 0,48 1,12 1,21 0,77 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr 2,03 3,76 7,67 12,25 2,26 4 , 11 2,87 2,98 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD R 4,76 9,82 24,35 39,64 5,81 9,65 10,53 7,80 Ch ỉ số HorRat 1,94 3,11 8,51 9,98 2,00 3,49 3,80 2,75 Bảng D.2 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với SDF M ẫ u/thông số A B C D E F G H Số lượng phòng thử nghiệm 14 14 15 15 14 13 15 13 Giá trị trung bình, % 3,80 5,58 17,32 10,74 12,94 4,56 11,29 8,30 Độ lệch chuẩn lặp lại, S r 0,44 0,28 1,03 0,46 0,50 0,83 0,71 0,51 Độ lệch chuẩn tái lập, S R 0,99 0,85 1,30 1,12 1,52 1,66 1,61 1,33 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr 11,71 5,10 5,97 4,33 3,86 18,10 6,29 6,18 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R 26,20 15,20 7,53 10,46 11,73 36,40 14,25 16,07 Ch ỉ số HorRat 8,01 4,92 2,89 3 , 74 4,31 11,44 5,13 5,53 Bảng D.3 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với TDF M ẫ u/thông số A B C D E F G H Số lượng phòng thử nghiệm 15 15 15 15 14 13 14 13 Gi á trị trung b ì nh, % 29,90 10,45 26,55 11,79 21,37 16,39 23,71 18,40 Độ lệch chuẩn lặp lại, S r 0,86 0,47 1,39 0,49 0,52 1,41 0,87 0,64 Độ lệch chuẩn tái lập, S R 2,05 0,95 2,74 1 , 10 1,72 2,37 3,14 1,56 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr 2,88 4,51 5,25 4,17 2,43 8,60 3,65 3,47 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD R 6,85 9,11 10,31 9,30 8,04 14,48 13,23 8,47 Ch ỉ số HorRat 2,85 3,24 4,22 3,37 3,19 5,51 5,33 3,28 Bảng D.4 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với phương pháp đo trực tiếp TDF M ẫ u/thông số A B C D E F G H Số lượng phòng thử nghiệm 9 8 9 9 9 7 9 9 Giá trị trung bình, % 28,08 9,97 24,60 11,00 21,21 16,47 21,27 16,47 Độ lệch chuẩn lặp lại, S r 1,26 0,41 0,70 0,39 1,11 0,72 1,19 1,16 Độ lệch chuẩn tái lập, S R 1,31 1,24 1,95 2,54 2,30 5,27 2,10 2,58 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr 4,50 4,16 2,83 3,57 5,23 4,38 5,61 7,04 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R 4,67 12,41 7,95 23,11 10,86 32,00 9,89 15,66 Ch ỉ số HorRat 1,93 4,39 3,22 8,29 4,30 12,20 3,92 5,97 B ả ng D.5 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối SDF được đo bằng khử ion M ẫ u/thông số A B C D E F G H Số lượng phòng thử nghiệm 6 6 6 6 6 6 5 6 Giá trị trung bình, % 3,45 4,87 16,29 8,60 11,93 2,95 10,98 7,11 Độ lệch chuẩn lặp lại, S r 0,34 0,29 0,58 0,49 0,24 0,16 0,24 0,26 Độ lệch chuẩn tái lập, S R 0,64 0,49 1,24 1,99 0,83 0,49 0,40 1,07 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr 9,98 5,94 3,55 5,73 2,00 5,28 2,18 3,64 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R 18,63 10,12 7,60 23,12 6,96 16,73 3,64 15,08 Ch ỉ số HorRat 5,61 3,21 2,89 7,99 2,53 4,92 1,31 5,07 B ả ng D.6 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với TDF (tổng IDF và SDF) được đo bằng khử ion M ẫ u/thông số A B C D E F G H Số lượng phòng thử nghiệm 6 6 6 4 6 6 5 6 Giá trị trung bình, % 29,65 9,95 26,96 11,21 20,47 15,06 23,04 17,43 Độ lệch chuẩn lặp lại, S r 0,73 0,36 0,73 0,27 0,32 0,43 0,25 0,24 Độ lệch chuẩn tái lập, S R 1,29 0,66 2 , 41 0,37 0,90 1,16 1,71 0,77 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr 2,47 3,58 2,70 2,42 1,58 2,87 1,09 1,36 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R 4,33 6,62 8,95 3,33 4,40 7,67 7,40 4,41 Ch ỉ số HorRat 1,81 2,34 3,67 1,20 1,73 2,88 2,97 1,69 Bảng D.7 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với SDF được tính bằng phương pháp ngoại chu ẩ n M ẫ u/thông số A B C D E F G H Số lượng phòng thử nghiệm 11 12 12 12 12 11 11 10 Giá trị trung bình, % 3,94 5,49 16,04 10,06 12,52 3,92 11,34 8,09 Độ lệch chuẩn lặp lại, S r 0,45 0,54 1,48 0,81 0,67 0,69 0,44 0,63 Độ lệch chuẩn tái lập, S R 1,00 1,11 2,02 1,81 2,10 1,20 0,95 1,99 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr 11,42 9,92 9,21 8,06 5,37 17,58 3,93 7,81 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R 25,40 20,20 12,62 17,95 16,74 30,58 8,39 24,58 Ch ỉ số HorRat 7,80 6,53 4,79 6,35 6,12 9,39 3,02 8,42 1) Một đơn vị (1 U) hoạt độ enzym là lượng enzym cần thiết đ ể giải phóng 1 µmol glucose từ tinh bột hòa tan trong 1 min ở 40 ° C và pH 4,5. 2) Micro-90 ® là s ả n phẩm của International Products Corp, Burlington, NJ, Hoa Kỳ. Thông tin n à y đ ưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng ti ê u chu ẩ n v à kh ô ng ấ n định phải sử dụng s ả n ph ẩ m này. Có thể sử dụng sản phẩm khác có hiệu quả tương đương. 3) 1 psi = 6 894,76 Pa.