TCVN4830-2:2005

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4830-2:2005 (ISO 6888-2 : 1999, AMD 1 : 2003) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng staphylococci có phản ứng dương tính coagulase (staphylococcus aureus và các loài khác) trên đĩa thạch - Phần 2: Kỹ thuật sử dụng môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4830-2 : 2005 ISO 6888-2 : 1999 WITH AMENDMENT 1 : 2003 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCI CÓ PHẢN ỨNG DƯƠNG TÍNH COAGULASE (STAPHYLOCOCCUS AUREUS VÀ CÁC LOÀI KHÁC) TRÊN ĐĨA THẠCH - PHẦN 2: KỸ THUẬT SỬ DỤNG MÔI TRƯỜNG THẠCH FIBRINOGEN HUYẾT TƯƠNG THỎ Microbiology of f o od and animal feeding stuffs - Horizontal me th od for th e enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) - Part 2 : Technique using rabbit plasma fi br i nogen agar medium L ờ i giới thiệu 0.1 Do tính đa dạng của thực phẩm và thức ăn chăn nuôi nên phương pháp này có thể không thích hợp đến từng chi tiết cho từng sản phẩm cụ thể. Trong trường hợp này, có thể sử dụng các phương pháp khác đặc trưng cho từng sản phẩm, nếu hoàn toàn chỉ vì lý do kỹ thuật. Tuy nhiên, cần cố gắng á p dụng phương pháp này khi có thể. Khi tiêu chuẩn này được soát xét tiếp thì cần phải tính đến mọi thông tin liên quan đến phạm vi mà phương pháp đếm đĩa này phải tuân theo và các nguyên nhân gây sai lệch so với phương pháp trong trư ờ ng hợp các s ả n phẩm cụ thể. Việc h à i hoà các phương pháp thử có thể không thực hiện được ngay và đối với một vài nhóm sản phẩm có thể tồn tại các tiêu chuẩn quốc tế và/hoặc tiêu chuẩn quốc gia mà không phù hợp với tiêu chuẩn này. Trong trường hợp có sẵn tiêu chuẩn quốc tế cho sản phẩm cần thử nghiệm thì phải tuân theo tiêu chuẩn đó. Hy vọng rằng khi các tiêu chuẩn như thế được soát xét, thì chúng phải được sửa đổi để phù hợp với tiêu chuẩn này, sao cho cuối cùng chỉ còn các sai lệch với phương pháp đếm đĩa này là các lý d o kỹ thuật được th ừ a nhận. 0.2 T C VN 4830-1 (ISO 68 8 8-1) và T C VN 4830-2 (ISO 6888-2) mô tả các phương pháp định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trên đĩa thạch, trong đó có thể gặp phải các chủng si n h độc tố. Nó liên quan chủ yếu đến Staphylococcus aureus , nhưng cũng có cả S.intermedius và các chủng nhất đị n h của S.hyicus . Cả hai tiêu chtiẩn TCVN 4830-1 (ISO 6888-1) và TCVN 4830-2 (ISO 6888-2) đều cho các kết quả tương đương. Tuy nhiên, nên sử dụng qui trình mô t ả trong TCVN 4830-2 (ISO 6888-2) (xem [1]) đối với các thực phẩm (như pho mát chế biến từ sữa nguyên liệu và các sản phẩm thịt nguyên liệu) bị nhiễm bẩn do: - S taphylococci hình thành các khuẩn lạc không điển hình trên môi trường thạch Baird-Parker - H ệ vi khuẩn nền mà có thể che khuất các khuẩn lạc cần tìm. 0.3 Tiêu chuẩn này khẳng định staphylococci dựa tr ê n phản ứng với coagulase dương tính, nhưng phải công nhận rằng một số chủng của Staphylococcus aureus cho phản ứng dương tính yếu với coagulase. Các chủng này có thể bị nhầm lẫn với các vi khuẩn khác nhưng chúng có thể được phân biệt bằng cách sử dụng các phép thử bổ sung mà không đề cập đến tiêu chuẩn này như phép thử về độ nhạy với lysostaphin, sinh hemolizin, nucleaze chịu nhiệt và sinh axit từ manitol (xem [1]). VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCI CÓ PHẢN ỨNG DƯƠNG TÍNH COAGULASE (STAPHYLOCOCCUS AUREUS VÀ CÁC LOÀI KHÁC) TRÊN ĐĨA THẠCH - PHẦN 2: KỸ THUẬT S Ử DỤNG MÔI TRƯỜNG THẠCH FIBRINOGEN HUYẾT TƯƠNG THỎ Microbiology of f o od and animal feeding stuffs - Horizontal me th od for th e enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) - Part 2 : Technique using rabbit plasma fi br i nogen agar medium 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng staphylococci có phản ứ ng dương tính với coagulase trên đĩa thạch có trong các sản phẩm dùng cho con người hoặc thức ăn chăn nuôi, bằng cách tính các khuẩn lạc thu được trên m ô i trường đặc (môi trường thạch f ibrinogen huyết tương thỏ) sau khi ủ trong điều kiện hiếu khí ở 35 o C hoặc 37 o C (xem tài liệu tham khảo [2]). 2 Tài liệu viện dẫn. C ác tà i liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi n ă m ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn kh ô ng ghi năm ban hành th ì áp d ụ ng phiên bản mới nhất, bao gồm c ả các sửa đổi. TCVN 6507 - 1 (ISO 6887-1). Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử , huyền phù ban đ ầ u và các dung d ịch pha loãng thập ph â n để kiểm tra v i sinh vật. Ph ầ n 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân. TCVN 4830-1: 2005 (ISO 6888-1 : 1999, with amendment 1 : 2003) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn ch ă n nuôi - Phương pháp định lượng staphylococci có ph ả n ứng dương tính với coagulase Staphylococcus aureus là các loài khác trên đĩa thạch. Phần 1 Kỹ thuật sử dụng môi trường thạch … TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và trong thức ăn gia súc - Nguyên tắc chung v ề kiểm tra vi sinh vật. 3 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau: 3.1 S taphylococci có phản ứng dương tính với coagulase ( coagulase-positive staphylococci) V i khuẩn hình thành khuẩn lạc điển hình trong môi trường thạch chọn lọc f ibrinogen huyết tương thỏ khi tiến hành thử nghi ệ m theo phương pháp qui định trong tiêu chuẩn này. 3.2 Đ ịnh lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (enumeration of the coaglulase- positive staphylococci) V iệc xác định số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase có trong một mililit hoặc trong một gam mẫu khi tiến hành thử nghiệm theo phương pháp qui định trong tiêu chuẩn này. 4 Nguyên tắc 4.1 Chuẩn bị hai đĩa rót m ô i trường thạch chọn lọc fibrinogen huyết tương thỏ, với một lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc với một lượng huyền phù ban đ ầ u qui định nếu sản phẩm ở dạng khác. Trong cùng một đi ề u kiện, cấy các dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đ ầ u , dùng hai đĩa cho một độ pha loãng. 4.2 Ủ các đĩa ở 35 o C hoặc 37 o C 1) trong 18 h đến 24 h, và ủ thêm 24 h, nếu c ầ n. 4.3 Từ số lượng các khuẩn lạc điển hình trên đĩa Petri, tính số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong 1 mililit, hoặc trong 1 gam mẫu thử. 5 Dịch pha loãng và môi trường cấy 5.1 Yêu cầu chung Đ ối với th ự c hành trong phòng thử nghi ệ m, xem TCVN 6404 (ISO 721 8 ). 5.2 Dịch pha loãng Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn riêng liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra. 5.3 Môi trường thạch fibrinogen huyết tương thỏ (xem tài liệu tham khảo [3] và [4]). CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng môi trường bán s ẵ n phù hợp với yêu c ầ u của tiêu chuẩn này. Tuy nhiên, cần xem xét các thay đổi về điều kiện thực nghiệm đối với các s ả n phẩm dạng này, đối với từng lô dung dịch f ibrinogen bovin/ huyết tương thỏ nên được thử nghiệm trước khi sử dụng, bằng cách kiểm tra dương tính và âm tính. 5.3.1 Môi trường cơ bản Chuẩn bị m ô i trường cơ bản theo 5.3.1 của TCVN 4830-1: 2005 (ISO 6888-1 : 1999), ngoại trừ việc phân phối môi tr ư ờng cơ bản từng lượng 90 ml vào bình hoặc lọ. 5.3.2 Dung dịch 5.3.2.1 Dung dịch kali telurit Chuẩn bị dung dịch dung dịch kali telurit theo 5.3.2.1 của TCVN 4830-1 : 2005 (ISO 6888-1 : 1999). 5.3.2.2 Dung dịch f ibrinogen bovin 5.3.2.2.1 Thành ph ầ n Fibrinogen bovin 5 g đến 7 g 1 ) Nước vô trùng 100 ml 1 ) T ù y thu ộ c vào độ tinh khiết của fĩbrinogen bovin 5.3.2.2.2 Chuẩn bị Ho à tan f ibrinogen bovin trong nước ở điều kiện vô trùng ngay trước khi sử dụng. 5.3.2.3 Dung dịch ức chế tripsin và huyết tương thỏ 5.3.2.3.1 Thành phần Huyết tương thỏ có EDTA dùng cho coagulase (huyết tương coagulase EDTA) 30 ml Chất ức chế trypsin 30 mg 5.3.2.3.2 Chuẩn bị Ngay trước khi sử dụng, hoà tan các thành phần trong nước dưới các điều kiện vô trùng. 5.3.3 Môi trường hoàn chỉnh 5.3.3 . 1 Thành phần Môi trường cơ bản (5.3.1) 90 ml Dung dịch kali telurit (5.3.2.1) 0,25 ml Dung dịch fibrinogen bovin (5.3.2.2) 7,5 ml Dung dịch ức chế tripsin và huyết tương thỏ (5.3.2.3) 2,5 ml 5.3.3 . 2 Chuẩn bị Làm tan chảy môi tru ờ ng cơ bản, sau đó làm nguội trong nồi cách thuỷ (6.3) đến khoảng 48 o C ± 1 o C . Dưới các điều kiện vô trùng, thêm ba dung dịch còn lại đã được làm ấm trước đến 48 o C ± 1 o C trong nồi cách thuỷ. Trộn kỹ sau mỗi lần thêm bằng cách xoay tròn để hạn chế tối đa việc tạo bọt. Sử dụng môi trường hoàn chỉnh ngay sau khi chuẩn bị , để tránh việc tạo kết tủa của huyết tương. CẢNH BÁO - Nếu sử dụng dung dịch bovin fibrinogen/ huyết tương thỏ bán s ẵ n, thì tuân thủ nghiêm ngặt các chỉ dẫn của nhà sản xuất khi chuẩn bị dung dịch này và môi tr ườ ng hoàn chỉnh ( đ ặc biệt là nhiệt độ của môi tr ườ ng cơ bản). Ng ượ c lại, có thể làm mất hoàn toàn hoạt tính môi trường. 5.4 Chuẩn bị các đĩa thạch Xem 5.3.4 của TCVN 4830-1: 2005 (ISO 6888-1 : 1999). 6 Thiết bị và dụng cụ thuỷ tinh CHÚ THÍCH: Có thể sử d ụ ng các thiết bị dùng một lần thay cho dụng cụ thu ỷ tinh sử dụng nhi ề u lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp. Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh vật thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] v à cụ thể là: 6.1 Thiết bị để khử trùng kh ô (lò sấy) và khử trùng ướt (n ồ i hấp áp lực) Xem TCVN 6 404 (ISO 7218 ) 6.2 Tủ ấm , để duy tr ì nhiệt độ của m ô i trường đã cấy, các đĩa và ống trong dải nhiệt độ 35 o C ± 1 o C ho ặ c 37 o C ± 1 o C . 6.3 N ồ i cách thuỷ , hoặc thiết bị tương tự, có thể duy trì được ở nhiệt độ 48 o C ± 1 o C . 6.4 Đĩa Petri , vô trùng, bằng thuỷ tinh hoặc chất dẻo. 6.5 Pipet chia độ xả hết , có dung tích danh định 1 ml, 2 ml và 10 ml, được chia vạch 0,1 ml, 0,1 ml và 0,5 ml tương ứng. 7 Lấy mẫu Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng, thì các b ê n có liên quan tự thoả thuận về vấn đ ề này. Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình bảo quản hoặc vận chuyển. 8 Chuẩn bị mẫu thử Việc chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn riêng phù hợp với sản phẩm tương ứng. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng, thì các b ê n có liên quan tự thoả thuận về vấn đ ề này. 9 Cách tiến hành 9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn riêng phù hợp với s ả n phẩm liên quan. 9.2 Cấy và ủ 9.2.1 L ấ y 2 đĩa Petri vô trùng (6.4). Dùng p i pet vô trùng (6.5) chuyển vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử sản phẩm dạng lỏng, ho ặ c 0,1 ml huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác. Lấy hai đĩa Petri vô trùng khác v à chuyển vào mỗi đĩa 1 ml dịch pha loãng thập phân thứ nhất. L ặ p lại tr ì nh tự này với các độ pha loãng liên tiếp, sử dụng pipet mới vô trùng đối với mỗi dung dịch pha lo ã ng thập ph â n. 9.2.2 Rót ngay vào từng đĩa Petri (9.2.1) môi trường hoàn chỉnh vừa chuẩn bị (5.3.3) dày khoảng 3 mm (không giữ môi trường này ở dạng lỏng). Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường và để cho đông đặc lại bằng cách đặt đĩa Petri lên trên mặt phẳng nằm ngang. 9.2.3 Sau khi đông đặc hoàn toàn, lật ngược các đĩa này và đặt chúng vào tủ ấm (6.2) để ở 35 o C hoặc 37 o C 2) 2) từ 18 h đến 24 h. Ủ lại từ 18 h đến 24 h, nếu c ầ n. 9.3 Đếm khuẩn lạc Sau khi kết thúc giai đoạn ủ (xem 9.2.3), staphylococci hình thành khuẩn lạc nhỏ màu đen hoặc màu xám hoặc thậm chí màu trắng được bao quanh bởi vòng sáng kết tủa dấu hiệu cho hoạt tính coagulase. Khi b ắ t đầu ủ, các khuẩn lạc Proteus có thể cho thấy vẻ bên ngoài giống v ớ i các khuẩn lạc staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase. Tuy nhiên, sau khi ủ 24 h hoặc 48 h, chúng có thể phát triển thành khuẩn lạc mọc rộng có màu nâu đậm hoặc nâu nhạt do đó có thể phân biệt được với vi khuẩn staphyloccocci. Đếm các khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa. CHÚ THÍCH: Vì thạch fibrinogen huyết tương thỏ được dựa vào phản ứng coagulase, nên không cần thử khẳng định hoạt tính này. 10 Biểu thị kết quả 10 . 1 Trường hợp chung Chọn các đĩa chứa tối đa 300 khuẩn lạc, có 100 khuẩn lạc điển hình ở hai độ pha loãng liên tiếp. Mỗi đĩa chứa ít nhất 15 khuẩn lạc điển hình. Tính số lượng N staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase có trong một mililit hoặc trong một gam sản phẩm là số trung bình của hai độ pha loãng liên tiếp, sử dụng công thức sau: N = trong đó å C là tổng số các khuẩn lạc staphylococcal điển h ì nh trên tất cả các đĩa đã chọn; V là thể tích chất cấy trên mỗi đĩa , tính bằng mililit; n 1 là số lượng các đĩa đã chọn ở độ pha loãng thứ nhất; n 2 là số lượng các đĩa đã chọn ở độ pha loãng thứ hai; d là hệ số pha loãng t ươ ng ứng với độ pha loãng thứ nhất đã chọn (huyền phù ban đầu là một độ pha loãng), Làm tròn các kết quả tính được đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]. Lấy kết quả là số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm ở dạng khác), được biểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân 10 x , trong đó x là luỹ thừa tương ứng của 10. V Í DỤ Số đếm của sản phẩm sau khi cấy 0,1 ml sản phẩm cho các kết quả sau: - Đ ối với độ pha loãng thứ nhất đã chọn ( 10 - 2 ): 66 khuẩn lạc điển hình và 54 khuẩn lạc điển hình; - Đ ối với độ pha loãng thứ hai đã chọn (10 -3 ): 4 khuẩn lạc điển hình và 7 khuẩn lạc điển hình. N = 5 955 Kết quả sau khi được làm tròn là 6,0 x 10 3 . 10.2 Ư ớ c tính các số lượng nhỏ 10.2.1 Nếu hai đĩa, tương ứng với mẫu thử (nếu các sản phẩm dạng lỏng) hoặc huy ề n phù ban đầu (nếu các sản phẩm ở dạng khác), mỗi đ ĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc thì báo cáo các kết quả như sau: a) Đối với các sản phẩm dạng lỏng, số staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase được ư ớ c t í nh trong một mililit: N = trong đó: C là tổng số các khuẩn lạc staphylococci có phản ứ n g dương tính với coagulase đếm đư ợ c (9.3) trên hai đĩa đã chọn: b) Đ ối với các sản phẩm ở dạng khác, staphyloc o cci có phản ứng dương tinh với coagulase được ước tính trong một gam: N = t rong đó C l à tổng số các khuẩn lạc staphylococci có p hản ứng dương tính với coagulase đếm được (9.3) trên hai đĩa đã chọn d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu. 10.2.2 Nếu hai đĩa, tương ứng với mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huy ề n phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) không chứa bất kỳ một khuẩn lạc staphylococcal nào có phản ứng dương tính với coagulase th ì báo cáo kết quả như sau: - Í t h ơ n 1 staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong 1 mililit (sản phẩm dạng lỏng); - Í t h ơ n 1/ d staphylococci có ph ả n ứ ng dương tính với coagulase trong một gam (sản phẩm dạng khác), trong đó d là hệ s ố pha loãng của huyền phù ban đầu. 11 Độ chụm 11.1 Yêu cầu chung Độ chụm của các phương pháp định lượng có thể được biểu thị theo các thuật ngữ về độ lặp lại và độ tái lập, và được định nghĩa trong TCVN 6910-2 (ISO 5725-2). Tuy nhiên phương pháp tính được sử dụng trong TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) dựa vào trung bình không phải bao giờ cũng thích hợp cho các phép phân tích vi sinh vật, mà không phải lúc nào cũng cho sự phân bố chuẩn (Gaussian). Do đó ISO 16140 đã được xây dựng riêng cho các phương pháp ph â n tích vi sinh vật và trong tiêu chuẩn này sử dụng các bộ ước tính để t í nh độ lặp lại và độ tái lập. Các phép thống kê n à y có ưu điểm là ít nhạy đối với các giá trị c ực điểm, nên loại trừ được các giá trị ngoại lai bằng các phép thống kê. Do đó các bộ ước t í nh n ày được sử dụng trong tiêu chuẩn. Các chi tiết của phép thử li ê n phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được tóm tắt trong phụ lục A. Các giá trị nhận được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và mẫu nền khác với các giá tr ị đ ã nêu. Dữ liệu độ chụm được xác định khi sử dụng ba loại thực phẩm đã bị nhiễm ở các mức khác nhau và các vật liệu chuẩn. Các yếu tố như ch ủ ng loại c ầ n xem xét , hệ vi sinh vật cạnh tranh, đặc điểm sinh lý của đối tượng và của chủng loại cạnh tranh cũng ảnh hưởng đ ế n giá trị độ chụm. 11.2 Độ lặp lại 11.2.1 Gi ớ i hạn về độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả (được chuyển về log 10 ) của hai phép thử độc lập đơn lẻ (số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một gam hoặc trong một mililit) hoặc tỷ số của giá trị cao hơn và giá trị thấp hơn của hai kết quả thử nghi ệ m trên thang danh định, thu được khi sử dụng cùng phương pháp thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị tiến hành trong khoảng thời gian ng ắ n, không quá 5 % các tr ường h ợp lớn hơn giới hạ n lặp l ạ i (r). 11.2 . 2 Các giá trị tổng thể Để biểu th ị chung của giới hạn l ặ p lại (r), các giá tr ị sau có thể được sử dụng khi kiểm tra các mẫu thực phẩm nói chung. Các g iá trị r này là các giá trị trung b ì nh của tất cả các mẫu được xem xét: r = 0,22 (được biểu thị theo chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả thử nghiệm đ ượ c chuyển về log 10 ), hoặc r = 1,7 (được biểu thị theo tỷ số của giá trị cao hơn và giá trị thấp hơn trên thang danh định). Đối với các vật liệu chuẩn (các viên nang ch ứ a khoảng 5 000 CFU, xem phụ lục A), các giá trị sau đây có thể đ ượ c sử dụng: r = 0,17 (đ ượ c biểu thị theo chênh lệch tuyệt đối gi ữ a các kết quả thử nghiệm đ ượ c chuyển thành log 10 ), hoặc r = 1,5 (được biểu thị theo tỷ số của giá trị cao hơn và giá trị thấp hơn của hai kết quả thử tr ê n thang danh định). VÍ DỤ: Kết qu ả thử nghiệm thứ nhất là 10 000 hoặc 1,0 x 10 4 staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase có trong một gam thực thẩm. Dưới các đi ề u kiện lặp lại, tỷ số của giá trị cao hơn và giá trị thấp hơn không được lớn h ơ n 1,7. Do đó, kết quả thứ hai phải từ 5 882 (= 10 000/1,7) đến 17 000 (310 000 x 1,7) staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một gam. 11.3 Độ tái lập 11.3.1 Giới hạn tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả (được chuyển về log 10 ) của hai phép thử độc lập (số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong 1 gam hoặc trong 1 mililit) hoặc tỷ số c ủ a giá tr ị cao hơn và giá trị thấp hơn của hai kết quả thử nghiệm trên thang danh định, thu được khi sử dụng cùn g phương p háp trên cùng vât liệu thử nghiệm tiến hành trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập (R). 11.3.2 Các giá trị tổng thể Để biểu thị chung của gi ớ i hạn tái lập (R). các giá trị sau đây có thể được sử dụng khi kiểm tra các mẫu t hực phẩm nói chung. Các gi á trị R này l à các trung trình của tất cả các mẫu. R = 0,33 (được biểu thị theo sự chênh lệch giữa các kết quả thử nghi ệ m đ ượ c chuyển thành log 10 ), hoặc R = 2 , 2 (được biểu thị theo tỷ số của giá trị cao hơn và giá trị thấp hơn tr ê n thang danh định). Đ ố i với các v ậ t liệu chuẩn (viên nang chứa khoảng 5 000 CFU, xem phụ lục A) các giá trị sau đây có thể đ ư ợc sử d ụng : R = 0,31 được biểu thị theo sự chênh lệch giữa các kết quả th ử n ghi ệ m được chu y ể n th à nh l o g 10 ), hoặc R = 2,0 (được biểu thị theo tỷ s ố của giá trị cao hơn và giá trị thấp hơn của hai kết quả thử trên than g danh định). VÍ DỤ 1: Kết quả thu được trong thử nghiệm thứ nhất là 1,0 X 1 0 4 staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một gam sản phẩm thực phẩm. Dưới các điều kiện tái lập, thì tỷ số giữa kết quả thu được trong phòng thử nghiệm thứ nhất và phòng thử nghiệm thứ hai không được lớn hơn 2,2. Do đó, kết quả của phòng thử nghiệm thứ hai phải nằm trong khoảng từ 4,5 x 10 3 (=1,0 x 10 4 /2,2) đến 2 ,2 x 10 4 (=1,0 x 10 4 x 2,2) staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một gam. VÍ DỤ 2: Một phòng thử nghiệm muốn biết mức tối đa để có thể thấy rằng vẫn còn phù hợp với giới hạn đã định (ví dụ giới hạn 10 5 hoặc log 10 5). V ề điều này, giá trị R (trên thang danh định) cần phải nhân với hệ số 0,59. Giá trị 0,19 (0,33 x 0,59) là chênh lệch giữa các kết quả thử nghiệm chuyển sang log 1 0 hoặc 10 0,1 9 . Do đ ó , các kết quả đến log 1 0 5,19 (log 10 5 + log 1 0 0,19) hoặc 1,55 x 10 5 không cho thấy sự không phù hợp với giới hạn. H ệ số 0,59 phản ánh thực tế rằng phép thử có khoảng lệch 95 % được dùng để thử nghiệm cho dù giới hạn đã bị vượt quá. Hệ số 0,59 thu đ ư ợc bằng công thức sau: 0,59 = 12 Báo cáo kết quả B á o cáo thử nghiệm phải chỉ rõ: - T ất cả thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu; - P hương pháp lấy m ẫ u đã sử dụng, nếu biết; - P hương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - N hiệt độ ủ đã sử dụng; - M ọi chi tiết không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc xem như tuỳ ý lựa chọn, cũng như bất kỳ chi tiết bất thường mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử: - C ác kết quả thu được. Phụ lục A (tham khảo) Các kết quả của nghiên cứu liên phòng thử nghiệm Một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm quốc t ế đ ược tổ chức b ở i Phòng thử nghi ệ m về Nghiên cứu Chất lư ợ ng và Vệ sinh th ực phẩm (LERHQA) của cơ quan An toàn thực phẩm Pháp (AFSSA) vào năm 1999 trong khuôn khổ của dự án Châu Âu SMT CT 96 2098 (xem tài liệu tham khảo [7]). Ngh iê n cứu này gồm có 24 phòng thử nghiệm của 16 nước Châu Âu tham gia và đã tiến hành trên phomát, thịt, bột trứng và các vật liệu chuẩn. Các mẫu thực phẩm mỗi loại đ ư ợc thử nghiệm ở ba mứ c nhiễm bẩn staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase khác nhau và có kiểm tra âm tính. Dữ liệu về độ chụm nhận được từ nghiên cứu liên phòng thử nghiệm này đ ề cập đến từng loại mẫu trong bảng từ A.1 đến A.4. Chúng được tính sử dụng kỹ thuật thống kê như mô tả trong ISO 16140. Dữ liệu thu được bởi một số các phòng thử nghiệm đã không đưa vào tính toán khi cho thấy sai lệch khỏi thủ tục nghiên cứu qui định. Bảng A . 1 - Các k ế t quả ph â n tích dữ liệu thu được với các m ẫ u phomát M ẫ u/mức nhiễm bẩn Pho mát m ứ c thấp Pho mát m ức trung b ì nh Pho mát m ức cao Số lượng phòng thử nghiệm tr ả lại kết quả 19 19 19 Số lượng m ẫ u trong một phòng thử nghiệm 2 2 2 Số lư ợ ng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 18 18 18 Số lư ợ ng mẫu được chấp nhận 36 36 36 Giá trị trung bình (log 1 0 CFU/g) 3,25 5,03 6,00 Độ lệch chuẩn l ặ p lại, s r (log 1 0 CFU/g) 0,09 0,04 0,06 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%) 2,74 0,88 0,98 Gi ới hạn l ặ p lại (r), theo ch ê nh lệch tr ê n thang log 1 0 (log 1 0 CFU/g) 0,25 0 , 13 0 , 17 Độ lệch chuẩn tái lập, S R (log 10 CFU/g) 0,09 0,12 0,11 Độ lệch chuẩn tương đối tái lặp (%) 2 , 94 2 , 33 1,91 Giới hạn tái lập (R) theo chênh lệch trên thang log 10 (log 10 CFU/g) 0, 27 0 , 33 0 , 32 Bảng A.2 - Các kết quả phân tích dữ liệu thu được với các mẫu thịt M ẫ u/mức nhiễm bẩn Thịt mức thấp Thịt mức trung bình Thịt mức cao Số lượng phòng thử nghiệm trả lại kết quả 20 20 20 Số lượng mẫu trong một phòng thử nghiệm 2 2 2 Số lượng ph ò ng thử nghiệm còn lại sau khi t r ừ ngoại lệ 17 17 17 Số lượng mẫu được chấp nhận 34 34 34 Giá t rị trung bình (log 1 0 CFU/g) 3 , 16 4 , 13 6,08 Đ ộ l ệ ch chuẩn l ặ p lại, s r (log 1 0 CFU/g) 0,09 0,07 0,07 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại ( % ) 2,85 1,79 1 , 22 Giới hạn lặp lại ( r ), theo chênh lệch tr ê n thang log 10 (log 10 CFU/g) 0,25 0,21 0,21 Độ lệch chuẩn tái lập, s R (log 10 CFU/g) 0,11 0,10 0,12 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%) 3,66 2,38 1 , 96 Giới hạn tái lập (R), theo chênh lệch trên thang log 1 0 (log 10 CFU/g) 0,32 0,28 0,33 Bảng A.3 - Các kết quả phân tích dữ liệu thu được với các mẫu bột trứng M ẫ u/mức nhiễm bẩn Bột trứng mức thấp Bột trứng mức trung binh Bột trứng mức cao Số lượng phòng thử nghiệm tr ả lại kết qu ả 20 20 20 S ố lượng m ẫ u trong một phòng thử nghiệm 2 2 2 Số l ượ ng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 19 19 19 Số lư ợ ng mẫu đư ợ c chấp nh ậ n 38 38 38 G iá trị trung bình (log 1 0 CFU/g) 3,25 4,20 5,32 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r (log 1 0 CFU/g) 0,12 0,06 0,09 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%) 3,66 1,41 1,68 Giới hạn lặp lại (r ), theo chênh lệch trên thang log 1 0 (log 1 0 CFU/g) 0,33 0 , 17 0,25 Độ lệch chuẩn tái lập, s R (log 1 0 CFU/g) 0,14 0,11 0,14 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%) 4,20 2,74 2,64 Giới hạn tái lập (R). theo chênh lệch trên thang log 1 0 (log 1 0 CFU/g) 0,38 0,32 0,39 Bảng A.4 - Các kết quả phân tích dữ liệu thu được với các vật liệu chuẩn Mẫu/mức nhiễm bẩn Vật liệu chuẩn (các viên nang chứa khoảng 5 000 CFU Số lượng phòng thử nghiệm tr ả lại kết qu ả 20 S ố lượng m ẫ u trong một phòng thử nghiệm 2 Số l ượ ng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 19 Số lư ợ ng mẫu đư ợ c chấp nh ậ n 38 G iá trị trung bình (log 1 0 CFU/g) 3 , 85 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r (log 1 0 CFU/g) 0,06 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (%) 1,52 Giới hạn lặp lại (r ), theo chênh lệch trên thang log 1 0 (log 1 0 CFU/g) 0,17 Độ lệch chuẩn tái lập, s R (log 1 0 CFU/g) 0,11 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (%) 2,81 Giới hạn tái lập (R) , theo chênh lệch trên thang log 1 0 (log 1 0 CFU/g) 0,31 a Vật liệu chuẩn được sản xuất bởi RIVM, Netherlands. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] KLOOS W.E. Systematic and the natural history of staphylococci. In: S taphylococci, J. Appl. Bacteriol. Symp. Suppl. , 69, 1990, pp. 25 s - 37 s; and Bergey's manua l of determination bacteriology, 9 th edn. , 1994. [2] IDF 145 A : 1997, Milk and milk p roducts - Enumeration of coagulase - positive staphylococci staphylococci - Colony-count technique. [3] BECKERS H.L. et. , Evaluation of a pour-plate system with rabit plasma-bovine fibrinogen agar for the enumeration of Staphylococcus aureus in food. Can. J. Microbiol. , 30, 1984. pp. 470-474. [4] SA W HNEY D, The toxicity of potassium tellurite to Staphylococcus aureus in rabit plasma f ibrinogen agar, J. Applied Bacteriology , 61,1986, pp.149 - 155. [5] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của ph ươ ng pháp đo và kết quả đo. Ph ầ n 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của ph ươ ng pháp đo tiêu chuẩn. [6] ISO 16140, Microbiology of food and animal f eeding stuffs - Protocol for the validation of altemative methods. [7] DE BUYSER, M.L ., LOMBARD, B ., SHULTEN, S.M., IN’T VELD, P.H., SCOTTER, S.L., ROLLIER, R. , LAHELLEC, C . T í nh hiệu lực của TCVN 4830-1 và TCVN 4830-2. Int. J. Food Microbiol., 83 (2), 2003, pp. 1 8 5- 194. 1) Nhiệt độ được thỏa thuận giữa các bên có liên quan và được nêu trong báo cáo thử nghiệm 2) Nhiệt độ được thỏa thuận giữa các bên có liên quan và được nêu trong báo cáo thử nghiệm