TCVN11135:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11135:2015 về Vi sinh vật trong thực phẩm - Phát hiện độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11135:2015 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ THẦN KINH BOTULINUM TYP A, B, E VÀ F Microbiology of food - Detection of botulinal neurotoxins A, B, E and F Lời nói đầu TCVN 11135:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2002.08 Detection of Botulinal Neurotoxins A, B, E, and F. Ampli f ied ELISA System ; TCVN 11135:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. VI SINH V Ậ T TRONG TH Ự C PH Ẩ M - PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ THẦN KINH BOT U LINUM TYP A, B, E VÀ F Microbiology of food - Detection of botulinal neurotoxins A, B, E and F 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện các độc t ố thần kinh typ A, B, E và F d o vi khu ẩ n Clos tr idium botulinum sinh ra (botulinal neurotoxin) khi nuôi cấy trong môi trường chất chiết n ấ m men glucose pepton trypton (TPGY) và môi trường canh thang thịt (CMM) nguyên chất. Kết quả nghiên c ứ u liên phòng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc á p dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên b ả n được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nh ấ t, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 9049:2012, Thực ph ẩ m - Xác định Clostridium botulinum và độc tố của chúng bằng phương pháp vi sinh 3. Nguyên tắc Phương pháp này được dùng để phát hiện các độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F tr ong các môi trường nuôi cấy TPGY và CMM nguyên chất, sử dụng kỹ thuật ELISA (Th ử nghiệm hấp thụ miễn dịch gắn kết enzym). Các độc tố b ị bắt giữ bởi các kháng thể immunoglobin G (IgG) được phủ trên các đĩa vi giếng (microtiter plate) và được phát hiện bằng cách sử dụng các IgG đ ã biotinyl hóa và các chất cộng hợp phosphatase kiềm streptavidin. Enzym gắn kết được quan sát bằng cách sử dụng cơ ch ấ t được khuếch đại. 4. Thuốc thử 4.1 . Yêu cầu chung Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi c ó quy định khác. 4.2 . Dung dịch đệm cacbonat-bicacbonat, 0,05 M, pH 9,6 ± 0,1 Hòa tan lượng chứa trong một viên nang bicacbonat (ví dụ: Cat.No.C-3041; Sigma, S t. Louis, MO) trong 100 m l nước. 4.2 . Dung dịch đệm casein, 1,0 % Cho một túi bột muối đệm phosphat (PBS) (ví dụ: Sigma; Cat.No. P3813) vào 800 ml nước, 10 g casein không chứa vitamin (ví dụ: Research Organics, Cleve l and, OH 44125-1083, www.resorg.com ; Cat. N o .1087C) và 3 ml dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1 M (tương đương 4,0 g NaOH/100 ml nước). Làm nóng đến khoảng 80 °C trong khi vẫn khu ấ y. Chỉnh đến pH 7,9 ± 0,1 bằng dung dịch natri hydroxit 1 M; sau đó pha loãng đến 1 lít. Khử trùng ở 121 °C trong 20 min. pH cuối cùng phải là 7,6 ± 0,1. 4.3 . Dung dị ch natri hydrox i t (NaOH), 1 M. 4.4 . Kháng độc tố typ A, B, E hoặc F , ví dụ: Southeast Regional Laboratory, Atlanta, GA 30309-3998. 4.5 . Kháng độc tố typ A, B, E hoặc F đã biotin hóa, ví dụ: Atlanta, GA 30309-3998. 4.6 . Dung dịch đệm rửa T w een (TBS-T) - nước muối đệm Tris , Tris-axit clohydric (HCI) 0,05 M, natri clorua (NaCI) 0,138 M, kali clorua (KCI) 0,0027 M Cho lượng chứa trong một gói TBS, ví dụ: Sigma; Cat.No. T6664 hoặc loại tương tự vào 900 ml nước, chỉnh pH đến 7,5 ± 0,1 bằng axit clohydric 2 M, cho 0,05 ml Tween-2 0 (ví dụ: Curtin Ma t heson Inc., PO Box 1546, Houston, TX 77251-1546) hoặc tương đương và pha loãng đến 1 lít. Nồng độ cuối cùng của Tween là 0,005 %. 4.7 . Chất cộng hợp (conjugate) phosphatase kiềm-ExtraVidin , ví dụ: Cat. No. E2636. B ả o qu ả n dung dịch ở 4 °C. 4.8 . Hệ cơ chất ELISA khuếch đại , gồm cơ chất và chất khuếch đại (ví dụ: Invitrogen Corp., PO Box 6482, Carlsba d , CA 92008, www.invitrogen.com ; Cat. No. 19589-019). 4.9 . Axit sul f ur i c (H 2 SO 4 ), 0,3 M Pha lo ã ng axit su lf uric đậm đặc (96 % đến 98 %), bằng cách cho 1 ml axit này vào 59 ml nước. 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết b ị , dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể các thiết b ị , dụng cụ sau: 5.1 . Khay vi giếng hoặc đĩa 96 giếng . 5.2 . Màng chất d ẻ o để bọc đĩa vi giếng. 5.3 . Pipet đa kênh , 8 hoặc 12 v ị trí, dung tích từ 50 μl đến 200 μl. 5.4 . Pipet dùng cho đĩa vi g iế ng, có thể phân phối được từ 0,2 μl đến 100 μ l . 5.5 . T ủ ấ m , có thể duy trì nhiệt độ ở 35 °C ± 2 °C. 5.6 . Máy rửa đĩa vi giếng , có cài đặt chương tr ì nh. 5.7 . Máy l ắc đĩ a vi gi ế ng. 5.8 . Máy đọc đĩa v i gi ế ng, có các bộ lọc cỡ lỗ 490 nm và 630 nm. 5.9 . Pipet dùng một lần , dung tích 1 ml, 5 ml v à 10 ml, được chia vạch tương ứng là 0,01 ml, 0,1 ml và 0,1 m l . 5.10 . B ể chứa pipet đa k ênh. 6. Cách tiến hành 6.1 . Yêu cầu v ề an toàn Độc tố botulinum là chất cực độc đối với con người. Chỉ cần một lượng nhỏ qua đường tiêu hóa, hô hấp, hấp thụ qua mắt, hoặc tiếp xúc trực tiếp qua v ế t xước ở da cũng có thể gây nhiễm độc sâu và dẫn đến tử vong. Nhân viên phòng thử nghiệm cần được tiêm phòng vacxin phòng ngừa độc tố botulinum. Sau khi sử dụng, rửa sạch máy rửa đĩa vi giếng bằng nước cất, sử dụng nguyên tắc b ả o dưỡng. Thu lấy chất thải vào bể chứa chất thải và kh ử trùng ở 121 °C trong 60 min. Không được có độc tố trong đư ờ ng ống máy rửa sau khi sử dụng thiết bị. 6.2 . Quy trình E LI SA khuếch đại Chu ẩ n bị 1 đĩa vi giếng (5.1), cho từng loại độc tố cần kiểm tra. Đánh d ấ u đ ĩ a typ A, B, E hoặc F. Sử dụng micropipet (5.4) đ ể hút các kháng độc tố gốc. Pha loãng kháng độc tố (4.4) với dung dịch đệm bicacbonat (4.2), trong các ống nghiệm thủy tinh theo quy định của nhà cung cấp. Chuyển các kh á ng độc tố pha loãng vào các kênh của bể chứa pipet đa kênh (5.10). Sử dụng pipet đa kênh 8 v ị trí (5.3) hút 100 μl dung dịch pha loãng thích hợp của các kháng độc tố typ A, B, E hoặc F từ các kênh của bể chứa, phân phối vào t ừng giếng của mỗi đĩa vi giếng . C ần có bốn đĩa (mỗi đĩa cho một typ: A, B, E và F). Các đĩa được ph ủ bằng màng ch ấ t d ẻ o (5.2) và bảo quản ở 4 °C ± 2 °C qua đêm. Lấy đ ĩ a ra khỏi t ủ bảo quản ở 4 °C ± 2 °C và rửa đĩa 5 lần t rong TBS-T (4.6), thời gian giữa các lần rửa cách nhau 45 s ± 5 s. Sử dụng máy rửa đĩa (5.6) hoặc thiết bị cơ học khác. Không sử dụng chai dạng bóp để r ử a. Cho dung dịch đệm casein (4.2) đầy đến miệng các giếng của mỗi đĩa (khoảng 300 μl) và để trong tủ ấm (5.5) từ 60 min đến 90 min ở 35 °C ± 2 °C. Không r ử a đĩa khi lấy ra. Các đĩa vẫn ph ủ màng chất dẻo trong thời gian rã đông dịch cấy thử nghiệm ở nhiệt độ ph ò ng. Sau đó, tháo tấm phủ, loại b ỏ dung dịch đệm casein và cho mẫu thử đã rã đông và mẫu kiểm chứng vào từng cặp giếng (100 μl cho mỗi giếng). Khi thêm thuốc thử phải thực hiện từ bên trái đĩa sang bên phải của đĩa. Ủ các đ ĩ a chứa các chất cấy độc tố và mẫu kiểm chứng trong 2 h ± 5 min ở 35 °C ± 2 °C. Ủ lặp lại các độc tố kiểm chứng đặc hiệu typ A, B, E và F đã biết trên các đĩa tương ứng. Ủ 100 μ l dung dịch đệm casein trong các cặp giếng thay cho các chất cấy th ử nghiệm hoặc kiểm chứng để kiểm chứng mẫu trắng. Chuẩn bị các thuốc thử kháng th ể dán nhãn biotin typ A, B, E và F (4.5) như hư ớ ng d ẫn kèm theo khoảng 15 min đến 30 min trước khi sử dụng và trong khi ủ các mẫu thử nghiệm. Pha loãng các kháng độc tố đ ã biotin h ó a trong dung dịch đệm casein theo hướng dẫn đi kèm. Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch TBS-T như trên. Cho các kháng độc tố đã pha loãng typ A, B, E hoặc F đã biotin hóa (100 μl cho mỗi giếng) vào các đĩa thích hợp tương ứng đã d án nhãn và ủ ấm khoảng 60 min ± 5 min ở 35 °C ± 2 °C. Rửa các đĩa 5 lần b ằ ng dung dịch TBS-T như trên. B ổ sung 100 μl dung dịch chất cộng hợp phosphatase kiềm-ExtraVidin (4.7), (pha loãng 1 μ l /10 ml dung dịch đệm casein) vào từng giếng và ủ trong 60 min ± 5 min ở 35 °C ± 2 °C. Rửa đĩa 5 lần bằng TBS-T với lần cuối ngâm trong dung dịch đệm rửa (4.6) khoảng 10 min ± 2 min. Loại b ỏ hết dung dịch đệm rửa bằng c á ch ú p đĩa và vỗ nhẹ trên khăn giấy. Hoàn nguyên cơ chất GIBCO và các dung dịch khuếch đại bằng cách cho dung dịch chất pha loãng thích hợp vào chai đựng cơ chất đông khô và chất khuếch đại (4.8). Sử d ụ ng theo hướng d ẫn của nh à sản xuất sản phẩm này. Thêm 50 μl dung dịch cơ chất GIBCO v à ủ khoảng 11 min đến 13 min ở 25 °C ± 2 °C trên máy lắc đĩa (5.7) (khoảng 100 r/min), sau đó thêm 50 μl dung dịch khuếch đại GIBCO và ủ 2 min đến 10 min mà không lắc. 6.3 . Đọc đĩa Cho dung d ịch chất khuếch đại vào đĩa gần với máy đọc đĩa (4.8). Đọc độ hấp thụ ở 490 nm và 630 nm (bộ lọc chuẩn) khi các phép kiểm chứng dương tính đạt độ hấp thụ từ 0,8 đến 1,2 và các phép kiểm chứng âm tính được chấp nhận. Lấy độ hấp thụ ở bước sóng 490 nm trừ đi độ hấp thụ ở bước sóng 630 nm. Dừng phân tích ( cho hiện màu) bằng cách thêm 50 μl dung d ịch axit sul f uric 0,3 M (4.9), có th ể đọc độ hấp thụ sau đó ( trong khoảng 2 h). Thuốc th ử dừng phản ứ ng được cho vào ở thời gian b ấ t kỳ (từ 2 min đến 12 min) sau khi thêm chất khu ế ch đại vào lúc các phép kiểm ch ứ ng dương tính cho độ hấp thụ khoảng 1,0 và các phép kiểm chứng âm tính là chấp nh ậ n được (không quá 0,2 trên mức nền). 6.4 . Giải thích kết quả Phép thử d ương tính là khi có giá tr ị độ hấp thụ > 0,2 trên giá tr ị độ hấp thụ quan sát được trong các giếng kiểm chứng âm tính. Có thể có phản ứng chéo giữa các mẫu độc tố. Nếu các đĩa không được rửa sạch hoàn toàn, th ì có thể quan sát thấy hấp thụ nền cao hơn trong tất cả các giếng. 6.5 . Khẳng định k ế t quả Các kết quả ELISA dương tính là giả định về độc tố C . botulinum và ph ả i được khẳng định bằng phương pháp chu ẩ n quy định trong TCVN 9049:2012. 7. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm các thông tin sau đây: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp th ử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chu ẩ n này; c) các kết quả thu được; d) ngày kết thúc thử nghiệm; e) tất cả các chi tiết thao tác không quy đ ị nh trong tiêu chu ẩ n này cùng v ớ i mọi tình huống bất thường khác có th ể ảnh hư ở ng đ ế n kết quả. PHỤ LỤC A (Tham Khảo) KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM LIÊN PHÒNG Bảng A.1 - Kết quả thử nghiệm li ê n phòng v ề việc phát hiện các độc t ố botulinum (≥ 1 MLD/ml) tr ong TPGY a b ằ ng các phương pháp ELISA khuếch đại và phương pháp chuẩn Typ độc tố A B E F Mức độc tố b) Cao Cao không có A T h ấp Th ấ p kh ô ng có A Cao Cao không có B T h ấp Th ấ p kh ô ng có B Cao Cao không có E T h ấp Th ấ p kh ô ng có E Cao Cao không có F T h ấp Th ấ p kh ô ng có F Số phòng thử nghiệm 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 9 Số phép thử 60 340 60 340 120 280 120 280 60 340 60 340 110 290 98 261 Các phép thử giả định d ương t í nh + ELISA 60 16 60 6 119 20 103 9 59 22 59 11 101 83 91 26 + AOAC c) 60 0 60 0 120 0 120 0 60 0 60 0 110 0 98 0 Khi bình ph ươ ng d) 14,1 4,17 15,4 3,12 17,4 6,75 57,9 3,69 Độ nhạy, % + ELISA 100 100 99,2 85,8 98,3 98,3 91,8 87,5 + AOAC 100 100 100 100 100 100 100 100 Tỷ lệ âm t í nh giả trong tổng s ố các mẫu dương tính, % + ELISA 0 0 0,8 14,2 1,7 1,7 8,2 12,5 + AOAC 0 0 0 0 0 0 0 0 Độ đ ặc hi ệ u, % + ELISA 95,3 98,5 92,9 96,8 94,5 97,3 71,4 90 + AOAC 100 100 100 100 100 100 100 100 Tỷ l ệ dư ơ ng t í nh giả trong tổng số các mẫu âm tính, % + ELISA 4 , 7 1 , 5 7,1 3,2 5,5 2,7 28,6 10 + AOAC 0 0 0 0 0 0 0 0 Sự thống nhất giữa ph ươ ng pháp E LI SA và AOAC , % e) 96 99 95 94 94 97 77 91 CH Ú TH Í CH: a) TPGY l à canh thang ch ấ t chiết n ấ m men glucose pepton trypton b ) Kết quả cao là cá c mẫu chứa độc tố ở mức cao; Kết quả th ấ p là c á c mẫu chứa độc tố ở mức thấp; Không c ó B là các mẫu ch ấ t c ấ y không sinh độc tố typ A; Không có A là các mẫu chất cấ y không sinh độc t ố typ B; Không có E là các mẫu chất cấy không sinh độc t ố typ E; Không có F là các mẫu chất cấy kh ô ng sinh độc tố typ F. c) Kết quả dương t í nh giả đ ị nh. Phương pháp AOAC đ ã được thực hiện ch ỉ trong phòng th ử nghiệm nghiên c ứ u. d) Khi b ì nh phương được x á c định b ở i McNemar là (la - bl - 1) 2 /(a-b), trong đó: a là các phần m ẫ u th ử (A cao hoặc cao không có A) dương tính bằng ELISA và âm t í nh bằng AOAC, b là các phần mẫu thử âm t í nh b ằ ng ELISA và dương t í nh bằng AOAC. Giá trị khi b ì nh phương > 3,84 cho thấy có nghĩa tại ρ < 0,05. e) T ỷ lệ thống nh ấ t phản ánh s ố lượng phép x á c định tương đ ươ ng giữa các phương pháp ELISA và AOAC. Bảng A.2- Kết quả thử nghiệm li ê n phòng về việc phát hiện các độc tố botulinum (≥ 1 MLD/ml) trong CMM a) bằng các phương pháp ELISA khuếch đại và phương pháp chuẩn Typ độc tố A B E F Mức độc tố b) Cao Cao không có A T h ấp Th ấ p kh ô ng có A Cao Cao không có B T h ấp Th ấ p kh ô ng có B Cao Cao không có E T h ấp Th ấ p kh ô ng có E Cao Cao không có F T h ấp Th ấ p kh ô ng có F Số phòng thử nghiệm 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 9 Số phép thử 60 340 60 340 120 280 120 280 60 340 60 340 110 290 98 261 Các ph é p thử giả định d ươ ng t í nh + ELISA 55 8 58 0 119 22 110 17 45 1 46 11 60 33 52 24 + AOAC c) 50 0 5 0 0 120 0 120 0 30 0 30 0 50 0 44 0 Khi b ì nh phương d) 11 , 1 6,13 17,4 1,3 14,1 2,89 41 13,3 Độ nhạy, % + ELISA 100 100 99,2 91,7 75 76,7 54,5 53,1 + AOAC 83,3 83,3 100 100 50 5 0 45,5 44,9 Tỷ l ệ â m tính g i ả trong tổng s ố các mẫu dương t í nh, % + ELI SA 0 0 0,8 8,3 0 37 45,5 46,9 + AOAC 16,7 16,7 0 0 50 50 54,5 55,1 Độ đặc hiệu, % + ELISA 97,6 100 92,1 93,9 99,7 96,7 88,6 90 , 8 + AOAC 100 100 100 100 100 100 100 100 Tỷ l ệ dư ơ ng t í nh giả trong tổng số các mẫu âm tính, % + ELI SA 2,4 0 7,9 6,1 0 , 3 3,3 11 , 4 9,2 + AOAC 0 0 0 0 0 0 0 0 Sự thống nhất giữa phương pháp EL I SA và AOAC, % e) 97 99 94 93 96 97 79 81 CH Ú THÍCH: a) CMM là canh thang thịt b ) Kết quả cao là cá c mẫu chứa độc tố ở mức cao; Kết quả th ấ p là c á c mẫu chứa độc tố ở mức thấp; Không c ó B là các mẫu ch ấ t c ấ y không sinh độc tố typ A; Không có A là các mẫu chất cấ y không sinh độc t ố typ B; Không có E là các mẫu chất cấy không sinh độc t ố typ E; Không có F là các mẫu chất cấy kh ô ng sinh độc tố typ F. c) Kết quả dương t í nh giả đ ị nh. Phương pháp AOAC đ ã được thực hiện ch ỉ trong phòng th ử nghiệm nghiên c ứ u. d) Khi b ì nh phương được x á c định b ở i McNemar là (la - bl - 1) 2 /(a-b), trong đó: a là các phần m ẫ u th ử (A cao hoặc cao không có A) dương tính bằng ELISA và âm t í nh bằng AOAC, b là các phần mẫu thử âm t í nh b ằ ng ELISA và dương t í nh bằng AOAC. Giá trị khi b ì nh phương > 3,84 cho thấy có nghĩa tại ρ < 0,05. e) T ỷ lệ thống nh ấ t phản ánh s ố lượng phép x á c định tương đ ươ ng giữa các phương pháp ELISA và AOAC.