TCVN11039-8:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11039-8:2015 về Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật - Phần 8: Định lượng nấm men và nấm mốc TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 11039-8:2015 PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 8: ĐỊNH LƯỢNG NẤM MEN VÀ NẤM MỐC Food aditive - Microbiological analyses - Part 8: Enumeration o f yeasts and moulds Lời nói đầu TCVN 11039-8:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo JECFA 2006, Combined compendium o f food additive speci f ications, Volume 4: Analytical methods, test proce d ures a nd laboratory solutions used by and re f erenced in the food ad d itive spec if ications; TCVN 11039-8:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F4 Gia vị và phụ gia thực phẩm biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Ch ấ t lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học v à Công nghệ công bố; Bộ ti ê u chuẩn TCVN 11039 Phụ gia thực ph ẩ m - Phương pháp phân tích vi sinh vật gồm các phần sau: - TCVN 11039-1:2015, Phần 1: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu kh í bằng kỹ thuật đ ế m đĩa ; - TCVN 11039-2:2015, Ph ầ n 2: Xác đ ị nh tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật đếm đĩa xoắn ; - TCVN 11039-3:2015, Phần 3: Phát hiện và định lượng coli f orm và E. co li bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (Phương pháp chuẩn) ; - TCVN 11039-4:2015, Phần 4: Phát hiện và đ ịnh lượng coli f orm và E. coli bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nh ấ t (Phương ph á p thông dụng) ; - TCVN 11039-5:2015, Phần 5: Phát hiện Salmonella ; - TCVN 11039-6:2015, Phần 6: Phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm khu ẩ n lạc ; - TCVN 11039-7:2015, Phần 7: Phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (MPN) ; - TCVN 11039-8:2015, Phần 8: Định lượng nấm men và n ấ m mốc . PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 8: ĐỊNH LƯỢNG NẤM MEN VÀ NẤM MỐC Food a d ditive s - Microbiological analyses - Part 8: Enumeration o f yeasts and moulds 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng nấm men và nấm mốc trong phụ gia thực ph ẩ m. 2 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 2.1 Nấm men (yeast) Vi sinh vật hiếu khí ưa ấm, ở nhiệt độ 25 ° C dưới các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn này, phát tri ể n thành các khuẩn lạc tròn, bóng hoặc m ờ trên bề mặt môi trường thạch n ấ m, thường có mép viền đều và bề mặt lồi ít hoặc lồi nhiều. CHÚ THÍCH Nấm men trong m ô i trường, nhất l à trên bề mặt m ô i trường phát tri ể n thành các khu ẩ n lạc tr ò n, hình hạt đậu. 2.2 Nấm mốc (mould) Vi sinh vật dạng sợi nhỏ hiếu kh í ưa ẩ m, ở nhiệt độ 25 ° C dưới các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn này, phát triển thành các mầm/chồi mọc lan như lông tơ hoặc dẹt hoặc thành các khuẩn lạc trên bề mặt môi trường thạch nấm, thường có màu trái cây hoặc có cấu trúc mang bào tử. CH Ú THÍCH Nấm mốc trong môi trường, nhất l à tr ê n bề mặt môi trường có thể phát tri ể n thành các khuẩn lạc tròn, hình hạt đậu. 3 Nguyên tắc 3.1 Chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân. 3.2 Ủ các đĩa đã cấy trong điều kiện hiếu khí ở 25 ° C ± 1 ° C trong 5 ngày. 3.3 Đếm các khuẩn lạc/các chồi, khẳng định việc nhận dạng các khuẩn lạc nghi ngờ bằng kính phóng đại hoặc kính hiển vi (để ph â n biệt các khuẩn lạc của nấm men với các khuẩn lạc của vi khuẩn), nếu cần. 3.4 Số lượng n ấ m men và nấm m ố c trong một gam mẫu được tính từ s ố lượng khuẩn lạc/ch ồ i/mầm thu được trên các đĩa đã chọn ở các mức pha lo ã ng tạo ra các khu ẩ n lạc có thể đếm được. N ấ m men và nấm mốc được đếm riêng, nếu cần. 4 Môi trường cấy, dịch pha loãng và thuốc thử 4.1 Thạch dichloran rose bengal chloramphen i col (DRBC) (xem A.1). 4.2 Thạch dichloran 18 % glycerol (DG18) (xem A.2). 4.3 Thạch đếm đ ĩ a (PCA) (xem A.3). Thêm chloramphenicol vào môi tr ườ ng với nồng độ 100 mg/l. Môi trường này không thích hợp khi nấm mốc mọc lan rộng. 4.4 Các dung d ị ch kháng sinh. 4.5 Nước đệm pepton, 0,1 %. 5 Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Có thể dùng dụng cụ th ủy tinh sử dụng một lần thay thế cho các dụng cụ th ủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng có các đặc t í nh thích hợp. Sử dụng các thiết b ị của phòng thử nghiệm vi sinh v à cụ thể là: 5.1 Thiết b ị trộn hoặc máy dập mẫu (stomacher). 5.2 Đĩa Petri. 5.3 Pipet vô tr ùng . 5.4 T ủ ấ m , có th ể duy trì ở nhiệt độ 25 ° C . 5.5 Que cấy vòng , vô trùng. 5.6 Que cấy gạt , b ằ ng thủy tinh được uốn cong một đầu, vô trùng. 5.7 Thiết bị đ ế m khuẩn lạc , loại cơ học hoặc điện tử, có nguồn sáng thích hợp, đĩa lưới và bộ đ ế m . 5 .8 Dụng cụ đo pH. 5.9 Nồi cách thủy , có thể duy trì ở nhiệt độ 45 ° C ±1 ° C . 6 Lấy mẫu M ẫ u gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể có li ê n quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản ph ẩ m th ì các bên c ó liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này. 7 Chuẩn bị mẫu thử M ẫ u được trộn đều để thu được các phần mẫu thử đồng nhất. 8 Cách tiến hành 8.1 Chuẩn b ị dung dịch pha loãng Cân 25 g hoặc 50 g phần mẫu thử đ ã chu ẩ n bị (Điều 7). CHÚ TH ÍCH : Th ô ng thường, cỡ mẫu lớn hơn sẽ tăng độ tái lập và cho ph ươ ng sai nh ỏ hơn so với c ỡ m ẫ u nhỏ hơn. Thêm lượng thích hợp nước pepton 0,1 % (4.5) vào mẫu đã cân để đạt độ pha loãng 10 -1 , sau đó đồng hóa 2 min trong máy dập mẫu (5.1). Cách khác, trộn trong thời gian từ 30 s đến 60 s nhưng hiệu quả kém hơn. Chuẩn b ị các dung dịch pha loãng 1 : 10 thích hợp trong nước pepton 0,1 %. Thông thường, các độ pha loãng đến 10 -6 là thích hợp. 8.2 Nuôi cấy 8.2.1 Phương pháp cấy gạt Dùng pipet vô trùng (5.3) nhỏ 0,1 ml mỗi dung dịch pha loãng ( 8.1) vào các đĩa thạch DRBC (4.1) đã chuẩn bị, cấy gạt bằng que cấy thủy tinh cong vô trùng (5.6). Thạch DG18 (4.2) thích hợp hơn với mẫu th ử có hoạt độ nước thấp hơn 0,95. C ấy đồng thời ba đĩa cho mỗi độ pha loãng. 8.2.2 Phương pháp đổ đĩa Sử dụng pipet nút bông vô trùng (5.3) để chuyển 1 ml phần dung d ị ch mẫu thử pha loãng (8.1) vào các đĩa Petri 15 m m x 100 mm (5.2) bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đã ghi nhãn. Trong vòng từ 1 min đến 2 min, đổ vào mỗi đĩa từ 20 ml đến 25 ml m ô i trường thạch DG18 (4.2) đã ổn định nhiệt độ. Trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa theo chiều kim đồng hồ sau đó ngược chiều kim đồng hồ, cẩn thận đ ể tránh dây lên nắp đ ĩa. Cách khác, dung dịch pha loãng có thể để dưới đáy đ ĩ a (đặc biệt nếu mẫu chứa hàm lượng tinh bột cao và đĩa làm từ chất dẻo) và có thể không cần trộn đồng nhất . Cấy đồng thời ba đĩa cho mỗi độ pha loãng, sử dụng các pipet miệng rộng. Thời gian từ khi chuẩn bị dung dịch mẫu thử pha loãng ban đầu đến khi rót vào đĩa cuối cùng không đ ượ c quá 20 min, tốt nhất là 10 min. Ủ các đĩa nơi tối ở 25 ° C . Không chồng các đĩa cao quá 3 đĩa và không lật úp đĩa. Để yên các đĩa cho đến khi đọc kết quả. 8.3 Đếm đ ĩ a Đ ế m các đĩa sau 5 ngày kể từ khi ủ. Nếu không có vi s i nh vật phát tri ể n sau 5 ngày thì ủ thêm 48 h. Không đếm các khuẩn lạc trước khi kết thúc thời gian ủ quy định bởi vì việc di chuyển đĩa có thể dẫn đến sự phát triển thứ cấp từ các bào tử rơi xuống l àm sai lệch số đếm cuối cùng. Đếm các đĩa chứa từ 10 đến 150 khuẩn lạc. Nếu chủ yếu là n ấ m men mọc th ì thường đếm các đĩa chứa 150 khu ẩ n lạc. Tuy nhiên, nếu nấm mốc có số lượng đáng kể thì tùy theo loại nấm mốc, giới hạn số đếm cao như thế này có thể được giảm đi theo phán đoán của người ph â n tích. 9 Biểu thị kết quả Báo cáo kết quả theo số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/g hoặc CFU/m l d ựa trên s ố đếm trung bình của dãy ba đĩa thử. Làm tròn s ố đếm đến hai chữ số c ó nghĩa. Nếu chữ số có nghĩa thứ ba là 5 hoặc cao hơn th ì l àm tròn lên chữ số cao hơn (ví dụ 456 ≈ 460, 455 ≈ 460); nếu chữ số có nghĩa thứ ba là 4 hoặc thấp hơn thì làm tròn xuống (ví dụ 454 ≈ 450). Nếu các đĩa từ tất cả các độ pha loãng đều không có khuẩn lạc th ì báo cáo l à số đếm nấm men và nấm mốc (MYC) ít hơn 1 l ầ n so với độ pha loãng thấp nh ấ t đã sử dụng. 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải chi rõ: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử nghiệm đ ã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong ti ê u chu ẩ n này hoặc những điều được coi là tùy chọn cũng như các sự cố b ấ t kỳ c ó thể ảnh hưởng đến kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được. Phụ lục A (Quy đ ị nh) Thành phần và chuẩn bị môi trường cấy và thuốc thử A.1 Thạch Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC) A.1.1 Thành phần Glucose 10 g Pepton dùng cho vi sinh vật 5 g Kali dihydro phosphat ( KH 2 PO 4 ) 1 g Magie sul f at ngậm 7 phân tử nước (MgS O 4 ·7H 2 O ) 0,5 g Dung dịch Rose bengal (5 % khối lượng/thể tích) 0,5 ml Dung dịch d ichloran (2,6-dichloro-4-nitroanilin) (0,2 % khối lượng/th ể tích trong etanol) 1 ml Chloramphenicol 0,1 g Thạch 15 g Nước cất 1 lít A.1.2 Chuẩn bị Trộn các thành phần, đun để hòa tan thạch và khử trùng bằng cách hấp áp lực ở 121 ° C trong 15 min. pH cuối cùng phải đạt 5.6. Giảm nhiệt độ xuống 45 ° C ± 1 ° C trong nồi cách thủy và đổ đĩa. A.1.3 Chuẩn b ị kháng sinh bổ sung Các kháng sinh được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nấm để ức chế sự phát triển của vi khu ẩ n. Nên sử dụng chloramphenico l v ì kháng sinh này bền khi hấp áp lực. Do đó, việc chuẩn bị môi tr ườ ng sẽ dễ hơn và nhanh hơn vì lược bỏ bước lọc. Nồng độ khuyến cáo đối với kháng sinh này là 100 mg/l môi trường. Nếu vi khuẩn mọc quá dày th ì chuẩn bị môi trường bằng cách thêm 50 mg chloramphenicol/l trước khi hấp áp lực và 50 mg chlortetracycline/l khi môi tr ườ ng này ổn định nhiệt độ, ngay trước khi đổ vào đĩa. Chu ẩ n bị dung d ịch gốc bằng cách hòa tan 0,1 g chloramphenicol trong 40 ml nước cất; cho dung dịch này vào 960 ml hỗn hợp môi trường tr ướ c khi hấp áp lực. Khi sử dụng cả ch l oramphenicol và chlortetracycline thì thêm 20 ml dung dịch gốc chloramphenicol nêu trên vào 970 ml môi trường trước khi hấp áp lực. Sau đó, ch uẩn bị dung dịch gốc chlortetracyc l ine bằng cách hòa tan 0,5 g kháng sinh vào 100 ml nước cất và lọc để khử trùng. Cho 10 m l dung dịch này vào 990 ml môi trường đã hấp áp lực v à ổ n định nhiệt độ. Làm lạnh trong tối và sử dụng các dung dịch còn lại trong một tháng. Các dung dịch gốc cần được đưa về nhiệt độ phòng trước khi cho vào môi trường đã ổn định nhiệt độ. A.2 Thạch dichloran 18 % glycero l (DG18) A.2.1 Thành ph ầ n Glucose 10 g Pepton dùng cho vi sinh vật 5 g Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) 1 g Magie sul f at (MgS O 4 · 7H 2 O ) 0,5 g Dichloran (0,2% khối lượng/thể tích trong etanol) 1 ml Chloramphenicol 0,1 g Thạch 15 g Nước cất 1 lít A.2.2 Chuẩn bị Trộn các thành phần và đun cách thủy để hòa tan thạch, thêm nước cất đến 1 000 ml. Th ê m 220 g glycero l và kh ử trùng bằng cách hấp áp lực ở 121 ° C trong 15 min. pH cuối cùng phải đạt 5,6 và hoạt độ nước cuối cùng đạt a w = 0,955. CHÚ THÍCH 1 : Môi tr ườ ng này dùng cho các mục đích chung để định l ượ ng n ấ m mốc v à thích hợp nhất khi a w của mẫu thử thấp hơn hoặc b ằ ng 0,95. Hoạt độ nước th ấ p của môi trườ ng sẽ làm giảm s ố lượng vi khuẩn v à các loại n ấ m s ẽ phát triển nhanh. CHÚ THÍCH 2: Khi định lượng đồng thời n ấ m men và n ấ m mốc th ì cần dùng thạch DRBC (A.1). A.3 Môi trường thạch để đếm đ ĩ a (PCA) A.3.1 Thành ph ầ n Trypton 5 , 0 g Ch ấ t chiết n ấ m men 2,5 g Dextrose 1,0 g Thạch 15 g Nước cất 1 000 ml A.3.2 Chuẩn bị Đun nóng nước để h òa tan các thành phần. Phân phối môi trường vào các ống hoặc bình th ủy tinh có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở 121 o C. pH cuối cùng 7,0 ± 0,2. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008) Vi sinh vật trong t hực ph ẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng nấm men và nấm mốc - Phần 1: Kỹ thuật đếm khu ẩ n lạc trong các s ả n phẩm có hoạt độ nước lớn hơn 0,95 [2] TCVN 8275-2:2010 (ISO 21527-2:2008) Vi sinh vật trong thực phẩm và th ứ c ă n ch ă n nuôi - Phương pháp định lượng nấm men và nấm mốc - Phần 2: Kỹ thuật đ ế m khu ẩ n lạc trong c á c sản phẩm có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0,95 [3] TCVN 7852:2008 Thực phẩm - Đếm nấm men và n ấ m mốc bằng phương pháp màng khô c ó thể hoàn nước (Phương pháp Petr ifi l m TM ) [ 4 ] TCVN 5750:1993 Thức ă n chăn nuôi - Phương pháp xác định nấm men v à nấm mốc