TCVN8400-32:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-32:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-32:2015 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 32: BỆNH GUMBORO Ở GIA CẦM Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 32: In f ectious bursal disease Lời nói đầu TCVN 8400-32:2015 do Trung tâm Ch ẩ n đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình ch ẩ n đoán gồm 38 phần: - TCVN 8400-1 : 2010, phần 1: Bệnh lở mồm long móng ; - TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn ; - TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn ; - TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn ; - TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng ; - TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ ; - TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê ; - TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm ; - TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I ; - TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò ; - TCVN 8400-11 : 2011, phần 11: Bệnh dịch tả vịt ; - TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà ; - TCVN 8400-13 : 2011, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucela ; - TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò ; - TCVN 8400-15 : 2011, phần 15: Bệnh xoắn khu ẩ n do Leptospira ; - TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli ; - TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà ; - TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza) ; - TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn ; - TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn ; - TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) ; - TCVN 8400-22 : 2014 , phần 22: Bệnh giả dại ở lợn ; - TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán ; - TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ; - TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn ; - TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1 ; - TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh sán lá gan ; - TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium per f ringens ; - TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà ; - TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà ; - TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm ; - TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm ; - TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò ; - TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở tr â u bò ; - TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh theileria ở trâu bò ; - TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2 ; - TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn ; - TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus . BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PH Ầ N 32: B Ệ NH GUMBORO Ở GIA C Ầ M Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 32: In f ectious bursal disease CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có th ể liên quan đến các v ậ t liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không th ể đưa ra đ ược hết t ấ t cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chu ẩ n. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh Gumboro do virus thuộc giống Avibirnavirus , họ Birnaviridae gây ra ở gia cầm. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: 2.1 . Bệnh Gumboro (In f ectious bursal disease) Bệnh do virus thuộc giống Avibirnavirus , họ Bi rn avir i dae gây ra ở gà; gà tây, vịt, gà sao và đà điểu cũng có thể bị nhiễm. CHÚ THÍCH: Bệnh Gumboro đặc trưng b ở i sự phá hủy các cơ quan lympho, đặc biệt là các t ế b à o lympho ở túi Fabricius, tuy nhiên chỉ ở gà có bi ể u hiện triệu chứng lâm sàng. Tế bào đích của virus l à lympho B ở giai đoạn chưa biệt hóa dẫn đến suy giảm miễn dịch. Virus Gumboro thuộc nhóm ARN virus, c ấ u tạo virus bao gồm axit ribonucleic b ê n trong, bao quanh là lớp vỏ bọc cấu tạo bằng protein, ngoài phần vỏ bọc protein virus không có v ỏ bọc lipid. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử k hoán g hoặc nước c ó độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 3.1 . Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp para f in 3.1.1 . Formalin , dung dịch 10 % (th ể tích) Chuẩn bị từ dung dịch formaldehyde 38 % (thể tích) và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (xem Phụ lục A) với tỷ lệ 1 : 9 (thể tích). 3.1.2 . Etanol 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối. 3.1.3 . Xylen. 3.1.4 . Haematoxylin. 3.1.5 . Eosin. 3.1.6 . Para f in , c ó độ nóng ch ả y từ 56 ° C đến 60 ° C . 3.1.7 . Keo dán lamen. 3.2 . Thuốc th ử và vật liệu thử dùng cho phương pháp realtime RT-PCR (phản ứng phiên mã ngược chuỗi polymerase theo thời gian thực) 3.2.1 . Kít tách chiết ARN (axit ribonucleic) 3.2.2 . Kít nhân gen , dùng cho phản ứng realtime RT-PCR. 3.2.3 . Cặp mồi và mẫu dò (primers và probe). 3 .2.4 . Etanol tuyệt đối , dùng cho tách chiết mẫu ARN/ADN. 3.2.5 . Dung dịch PBS , pH 7,0 (xem Phụ lục A). 3.2.6 . M ẫ u ARN đối chứng dương , tách chiết từ virus gây bệnh Gumboro, có giá trị C t (chu kỳ ngưỡng) đã biết trước. 3.2.7 . Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic). 3.2.8 . Nước , tinh khiết không có nuclease. 3.3 . Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA (phép thử miễn dịch liên kết enzym) Hiện nay các kít ELISA thương mại có sẵn trên thị trường d ù ng để phát hiện kháng thể Gumboro. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau: 4.1 . Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung 4.1.1 . Tủ lạnh âm sâu , có thể duy trì nhiệt độ từ âm 80 ° C đến âm 20 ° C . 4.1.2 . Tủ lạnh , có thể duy trì nhiệt độ từ 2 ° C đến 8 ° C . 4.1.3 . Máy lắc trộn vortex , có thể hoạt động với tốc độ từ 200 r/min đến 2 500 r/min. 4.2 . Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp para f in 4.2.1 . Khuôn nhựa , loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể. 4.2.2 . Máy xử lý mẫu mô tự động. 4.2.3 . Nồi đun para f in , c ó thể duy trì nhiệt độ từ 56 ° C đến 65 ° C . 4.2.4 . Khay sắt , loại chuyên dụng cho l à m tiêu bản vi thể. 4.2.5 . Máy làm lạnh , có thể duy trì nhiệt độ từ âm 10 ° C đến 4 ° C . 4.2.6 . Máy cắt tiêu bản , cắt ở độ mỏng từ 3 m m đến 5 m m. 4.2.7 . Nồi dãn tiêu bản , có thể duy trì nhiệt độ từ 35 ° C đến 65 ° C . 4.2.8 . Phiến kính , vô trùng. 4.2.9 . Lamen , vô trùng. 4.2.10 . Bộ cốc nhuộm tiêu bản. 4.2.11 . Kính hiển vi quang học , vật kính 4 X, 10 X, 20 X, 40 X, 60 X. 4.3 . Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp realtime RT- PCR 4.3.1 . Máy nhân gen (realtime PCR). 4.3.2 . Máy ly tâm , tạo gia tốc ly tâm 3 000 g , 6 000 g và 20 000 g . 4.3.3 . Cối chày sứ , vô trùng. 4.3.4 . Máy spindo w n. 4.4 . Thiết bị, dụng cụ d ù ng cho phương pháp ELISA 4.4.1. Máy đọc ELISA , có thể đọc được bước sóng 650 nm. 5. Chẩn đoán lâm sàng 5.1 . Đặc điểm dịch tễ - Gà, gà tây, vịt, gà sao và đà điểu có thể bị nhiễm, nhưng thường chỉ thấy gà c ó biểu hiện triệu chứng l â m sàng; - Ở gà lứa tuổi mẫn cảm nhất với bệnh là từ 3 tuần tuổi đến 6 tuần tuổi; - Thời gian ủ bệnh kéo dài từ 2 ngày đến 3 ngày; - Tỷ lệ chết lên đến 30 % ở các đàn gà hướng thương ph ẩ m và 60 % ở các đàn gà hướng sinh sản. Tỷ lệ chết cao nhất trong khoảng thời gian từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 5 sau khi nhiễm virus; - Virus bài tiết qua phân 2 ngày sau khi nhiễm và kéo dài ít nhất từ 10 ngày đến 14 ngày; - Virus lây lan qua không khí hoặc qua thức ăn, nước uống. 5.2 . Triệu chứng lâm sàng - Giai đoạn đầu của bệnh: đàn gia cầm xơ xác, bay nhảy lung tung, mổ nhau; sau đ ó xuất hiện các triệu chứng nghoẹo đầu, rúc mỏ vào cánh, có khi gục sang một bên, gia cầm thường thích n ằ m, mắt lim dim, m ệt mỏi và thường dồn về một góc chuồng; - Giai đoạn sau: cơ vùng hậu môn co bóp nhanh, mạnh, không bình thường, giống như gia cầm muốn đi ngoài nhưng không thực hiện được; biểu hiện ngứa vùng hậu môn, hay quay đầu lại mổ vùng hậu môn; con vật bị tiêu chảy. Phân loãng, lúc đầu có màu trắng ngà sau đó chuyển dần sang màu vàng trắng, xanh vàng, đôi khi lẫn máu. Gia cầm kém ăn hoặc bỏ ăn, s ố t, thân nhiệt tăng cao sau đ ó giảm xuống và chết sau vài ngày. 5.3 . Bệnh tích đại thể - Xác gia cầm thường khô do bị mất nước, quanh hậu môn thường bẩn; - Cơ đùi và cơ ngực sung huyết, xuất huyết l ấ m chấm: tr ườ ng hợp sung huyết, khi lột da thấy cơ khô nhanh và có màu sẫm; trường hợp xuất huyết, lột da thấy có các vệt xuất huyết, có khi chạy d à i thành tia; - Túi Fabricius ở giai đoạn đầu (khoảng 3 ngày đầu) sưng to, xung quanh túi có thủy thũng, đặc biệt là vùng cuống túi tiếp giáp trực tràng; túi chuyển màu trắng đục; túi b ở , các nếp múi kh ế rìa tù; giai đoạn tiếp theo túi thường có xuất huyết điểm hoặc kéo dài thành vệt ở niêm mạc túi. Giai đoạn sau cùng kích thước túi Fabricus tr ở về b ì nh thường sau đó teo nhỏ đi; - Đôi khi thấy xuất huyết ở dạ dày tuyến, tăng dịch nhày trong ruột; - Gan có thể bị sưng và nhồi huyết, lách phì đại, thận sưng. 5.4 . Ch ẩ n đoán phân biệt về lâm sàng Ch ẩ n đoán phân biệt về lâm sàng giữa bệnh Gumboro và một số bệnh khác trên gia cầm theo Bảng 1. Bảng 1 - Chẩn đoán phân biệt về l â m sàng Bệnh Biểu hiện Gumboro Xác gia cầm thường khô do bị mất nước, quanh hậu môn thường bẩn. Cơ đùi và cơ ngực sung huyết, xuất huyết lấm chấm hoặc thành tia. Túi Fabricius ở giai đoạn đầu (khoảng 3 ngày đầu) sưng to, thủy thũng, các nếp múi khế rìa tù; giai đoạn tiếp theo túi thường có xuất huyết điểm hoặc kéo dài thành vệt ở niêm mạc túi. Giai đoạn sau cùng kích thước túi Fabricus tr ở về bình thường sau đó teo nhỏ đi. Ne w castle Xảy ra ở gà mọi l ứ a tuổi, có triệu chứng ủ rũ, phân trắng và bệnh tích xuất huyết dạ dày tuyến giống Gumboro. Nhưng diễn biến bệnh Ne w castle kéo dài còn bệnh Gumboro thường ch ỉ xảy ra trong vòng từ 5 ngày đến 10 ngày là kết thúc; trong bệnh Ne w castle túi Fabricius không sưng, không xuất huyết, không teo và không sung huyết. Cúm gia cầm Xảy ra ở nhiều loài gia cầm và mọi lứa tuổi, có triệu chứng giống bệnh Gumboro là xù lông, tiến triển bệnh nhanh, xuất huyết dạ dày tuyến. Nhưng bệnh cúm gia cầm sưng phù đầu, mặt, xuất huyết da chân, các cơ quan phù tạng sung huyết, xuất huyết tràn lan. Viêm phế quản truyền nhiễm (IB) Bệnh xảy ra rất nhanh trong toàn đàn với các triệu chứng: sốt, ủ rũ, xù lông, kém ă n, th ở khó, th ở bằng miệng và luôn kèm theo tiếng khò khè, ch ả y nước mũi, nước mắt. Khí quản, phế quản xuất huyết, có chứa dịch nhầy. 6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1 . Phương pháp para f in phát hiện bệnh Gumboro 6.1.1 . Lấy mẫu Chọn từ 3 con gà đến 5 con gà nghi mắc bệnh mổ lấy các mẫu bệnh phẩm sau: - Túi Fabricius: cắt ngang túi; - Lách: cắt một miếng với độ dày khoảng 0,5 cm; - Hạch ruột vùng đầu manh tràng: cắt toàn bộ hạch. Các mẫu bệnh phẩm trên cho vào lọ chứa f ormalin (3 1.1) sao cho thể tích mẫu bệnh phẩm và f ormalin có t ỷ lệ khoảng 1:10, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ. CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh ph ẩ m ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch t ể , các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh. 6.1.2 . Bảo quản mẫu Mẫu bệnh phẩm đ ả m bảo ngập trong f ormalin (3.1.1), tránh đổ vỡ, rơi vãi f ormalin ra ngoài môi trường; khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu bằng túi nilon, băng dính gói kín. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bổ sung hoặc thay mới f ormalin (3.1.1), đảm b ả o thể tích mẫu bệnh phẩm và f ormalin đạt tỷ lệ khoảng 1:10. 6.1.3 . Chuẩn bị mẫu - Mẫu bệnh phẩm được c ố định trong dung dịch f ormalin (3.1.1) thời gian 24 h; - Cắt các bệnh phim đã cố định trên thành miếng nh ỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm rồi đặt v à o khuôn nhựa (4.2.1). 6.1.4 . Cách tiến hành 6.1.4.1 . Đúc khuôn - Rửa khuôn nhựa (6.1.3) dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc para f in (3.1.6) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc para f in (3.1.6) lần thứ 2 , thời gian từ 2 h đến 3 h; CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy chuyển mẫu mô tự độn g (4.2.2) th ì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etanol. - Đúc khuôn: rót parafin nóng chảy từ nồi đun para f in (4.2.3) vào khay sắt chuyên dụng (4.2.4), gắp bệnh phẩm vào rồi đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên. Đ ể nguội, tách lấy khối para f in. 6.1.4.2 . Cắt tiêu bản - Cắt gọt khối para f in (6.1.4.1) cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh (4.2.5); - Đặt khối para fi n lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối para f in song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các bệnh phẩm, điều chỉnh độ dày của lát cắt từ 3 μm đến 5 m m, cắt một vài lát; - Chọn lát cắt phẳng thả vào nồi dãn tiêu b ả n (4.2.7) với nhiệt độ nước từ 35 ° C đến 40 ° C . Dùng phiến kính (4.2.8) vớt. Dựng nghiêng tiêu bản và để khô. 6.1.4.3 . Nhuộm tiêu bản - Ngâm tiêu bản (6.1.4.2) vào cốc xylen (3.1.3) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu b ả n vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.1.4), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu b ả n vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.1.5), thời gian từ 60 s đến 90 s; - Rửa dưới vòi nước chảy làm sạch eosin (3.1.5) còn bám trên phiến kính; - Loại b ỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (th ể tích) (3.1.2) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đ ó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuy ể n tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.1.3) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.2.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.1.7). Đ ể khô, soi tiêu bản dưới kinh hiển vi quang học (4.2.11). 6.1.5 . Đọc kết quả [1] - M ẫ u lấy vào giai đoạn đầu của quá trình viêm: c ấ u trúc các nang lympho của túi Fabricius không còn rõ hình đa giác, chuyển sang hình tròn hoặc h ì nh ovan, vách ngăn các nang giãn rộng, phù, xuất huyết, có sự xâm nhập của các tế bào bạch cầu đa nhân trung tính, tế bào lympho hoại tử. Tế bào lưới nội mô tăng sinh; - M ẫ u lấy vào giai đoạn phản ứng viêm giảm: nang túi Fabricius tăng sinh các tế bào biểu mô phần giữa lớp vỏ và tủy; - Lách, hạch lympho manh tràng có các tế bào lympho bị hoại tử. 6.2 . Phương pháp realtime RT-PCR phát hiện virus Gumboro 6.2.1 . Lấy mẫu Chọn 3 đến 5 con gia cầm nghi bệnh, mổ lấy từ 3 g đ ế n 5 g túi Fabricius cho vào túi hoặc lọ đựng mẫu vô trùng, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ. 6.2.2 . B ả o quản mẫu Mẫu bệnh ph ẩ m virus: được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 o C đến 8 o C). M ẫ u được gửi đến phòng thí nghiệm không quá 48 h. Trong phòng thí nghiệm, nếu mẫu chưa xét nghiệm ngay phải được bảo qu ả n trong tủ âm 20 ° C (4.1.1). CHÚ TH Í CH: Đồng thời kèm theo Phi ế u gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những th ô ng tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh. 6.2.3 . Chu ẩ n bị mẫu Lấy 1 g mẫu mô túi Fabricius, cắt nh ỏ rồi nghiền thành huyễn dịch với dung dịch PBS (3.2.5) theo t ỉ lệ 1 : 10 (thể tích) trong cối chày sứ (4.3.3). Ly tâm (4.3.2) huyễn dịch ở gia tốc 3 000 g trong 5 min rồi hút lấy dịch nổi để tách chiết ARN cho ph ả n ứng realtime RT-PCR. 6.2.4 . Cách tiến hành 6.2.4.1 . Tách chiết ARN Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.1) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. VÍ D Ụ : sử dụng kít tách chiết QIAGEN RNeasy miniKit (Cat. No.74104) 1) (xem Phụ lục B) 6.2.4.2 . Chuẩn bị mồi và mẫu dò Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.3.1) theo phương pháp realtime RT- PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút Gumboro sử dụng cặp mồi và mẫu dò (primers và probe) (3.2.3) được nêu trong Bảng 2. Bảng 2 - Trình tự cặp mồi và mẫu dò [2 ] M ẫ u dò, mồi Trình tự từ 5’ đến 3’ Mẫu dò FAM-TC TTTTT CCCTGGATTCCCTGGCTCA-TAMRA Mồi xuôi GGACACAGGGTCAGGGTCAAT Mồi ngược GCAGTGTGTAGTGAGCACCCA Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau: - Chuẩn bị mồi gốc và m ẫu dò gốc: mồi và mẫu dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.3.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi m ở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.7) để hoàn nguyên mồi và mẫu dò ở nồng độ 100 m M làm mồi gốc và mẫu dò gốc; - Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 m M: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (20 m l mồi gốc v à 80 m l nước (3.2.8)); - Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 6 m M: pha loãng m ồ i g ố c b ằ ng nước (3.2.8) (6 m l mồi gốc và 94 m l nước(3.2.8)). 6.2.4.3 . Tiến hành phản ứng Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (6.2.4.2). Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR system (Cat # 11732 - 020) 2) , thành phần cho 1 phản ứng được n ê u trong B ả ng 3. Bảng 3 - Thành phần ph ả n ứng Thành phần Thể tích m l Reaction Mix 2X 12,5 Hỗn hợp Enzym (Enzyme mix) 0,5 Mồi/ mẫu dò 1,5 Nước tinh khiết không có nuclease 5,5 Tổng th ể tích 20,0 Chuyển 20 m l hỗn h ợ p nhân gen vào mỗi ống phản ứng: - M ẫ u kiểm chứng dương: cho 5 m l mẫu ARN có giá trị Ct đã biết trước vào ống phản ứng. - M ẫ u kiểm chứng âm: cho 5 m l nước tinh khiết không có nuclease vào ống ph ả n ứng. - M ẫ u bệnh phẩm: cho 5 m l mẫu ARN (phụ lục B) vào ống phản ứng. CHÚ Ý: - Phản ứng realtime RT-PCR phải bao gồm: mẫu bệnh ph ẩ m, m ẫ u kiểm chứng dương, mẫu kiểm chứng âm. - Mẫu và nguyên v ậ t liệu cho phản ứng realtime RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp ph ả n ứng. Tiến hành ph ả n ứng bằng máy realtime PCR (4.3.1) đã được cài đặt chu trình nhiệt nêu trong bảng 4. Bảng 4 - Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 50 ° C 15 min 1 95 ° C 2 min 95 ° C 10 s 40 60 ° C 30 s 40 6.2.5 . Đọc kết quả Đọc kết quả bằng máy reatime PCR (4.3.1) dựa trên giá trị Ct (Ct là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền) Điều kiện phản ứng được công nhận: mẫu kiểm chứng dương t í nh có giá trị Ct biết trước (± 2 C t), mẫu kiểm chứng âm tính không có C t; Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính; mẫu không có Ct được coi là âm tính; mẫu có giá trị 35 < C t ≤ 40 được coi là nghi ngờ; Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại theo quy trình hoặc bằng phương pháp khác để khẳng định. 6.3 . Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể Gumboro 6.3.1 . Lấy mẫu Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu tĩnh mạch cánh hoặc máu tim của gà nghi mắc bệnh nhưng chưa tiêm phòng v ắ c xin. Sau khi l ấ y, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp. 6.3.2 . Bảo quản mẫu Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 ° C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp chưa xét nghiệm ngay, mẫu huyết thanh phải được ly tâm, chắt lấy phần huyết thanh sang ố ng khác, b ả o quản trong t ủ lạnh âm sâu (4.1.1). 6.3.3 . Chuẩn bị mẫu Chắt huyết thanh từ xy lanh (6.3.1) sang ống nghiệm vô trùng, k ể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh. 6.3.4 . Cách tiến hành VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng thể Gumboro (In f ectious Brusal disease test kit) của hãng IDEXX 3) 6.3.4.1 . Chuẩn bị nguyên liệu - Các nguyên liệu của bộ kit được bảo quản ở nhiệt độ 4 ° C , trước khi tiến hành phản ứng phải được đ em ra để cân bằng với nhiệt độ phòng (từ 18 ° C đến 26 °C); - M ẫ u huyết thanh (6.3.3): được pha loãng thành 1/500 với dung dịch pha loãng mẫu (Lấy 1 m l huyết thanh pha với 500 m l dung dịch pha loãng mẫu); - P h a loãng dung dịch rửa đậm đặc 10 lần (Wash Concentrate 10 X): l ấ y 1 phần nước rửa đậm đặc pha với 9 phần nước cất; - Tính thể tích dung dịch nước rửa cần pha: 300 m l/giếng x 3 lần rửa x 2 bước rửa x số giếng sử dụng; - Sơ đồ bố trí mẫu: trong sơ đồ bố trí mẫu phải có mẫu trắng (Blank), kiểm ch ứ ng âm (Negative Control - NC), kiểm chứng dương (Positive Control - PC). 6.3.4.2 . Tiến hành phản ứng Bước 1: Nhỏ huyết thanh - Nhỏ 100 m l dung dịch pha loãng mẫu vào giếng c ó mẫu trắng (Blank); - Nh ỏ 100 m l kiểm chứng âm không pha loãng vào hai giếng đối chứng âm; - Nh ỏ 100 m l kiểm chứng dương không pha loãng vào hai giếng đối ch ứ ng dương; - Nh ỏ 100 m l huyết thanh (6.3.4.1) đã pha loãng vào các giếng thích hợp; - Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 ° C đến 26 ° C trong 30 min; - Đ ổ b ỏ dung dịch trong đĩa; - Nh ỏ 350 m l dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần. Bước 2: Nhỏ kháng kháng thể (con j ugate) - Nh ỏ 100 m l dung dịch kháng kháng thể vào các giếng; - Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 ° C đến 26 ° C trong 30 min; - Đổ b ỏ dung dịch trong đĩa; - Nhỏ 350 m l dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần. Bước 3: Nhỏ cơ chất - Nh ỏ 100 m l dung dịch cơ chất TMB vào các giếng; - Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18 ° C đến 26 ° C trong 15 min. Bước 4: Dừng ph ả n ứng - Nhỏ 100 m l dung dịch dừng phản ứng (S t op Solution) vào các giếng; Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy đọc ELISA (4.4.1) ở bước sóng 650 nm. 6.3.5 . Đọc kết quả Điều kiện phản ứng được công nhận khi: - Giá trị OD của đối chứng dương trừ giá trị OD của đ ố i chứng âm phải lớn hơn 0,075; - Giá trị OD của đối chứng âm lớn hơn hoặc bằng 0,15. Tính kết quả: - Trung b ì nh của đ ố i chứng âm: [NC1 A (650) + NC2 A(650)] / 2 = NC x tb - Trung bình của đ ố i chứng dương: [PC1 A (650) + PC2 A (650)] / 2 = PC x tb - Tỷ lệ S/P = (giá trị OD của mẫu - NC x tb) / (PCx tb - NC x tb) - Hiệu giá của mẫu: log 10 Titer = 1,09 (log 10 S/P) + 3,36 CHÚ THÍCH: S/P l à tỉ lệ được tính toán giữa giá trị OD của m ẫ u b ệ nh ph ẩ m so với giá trị OD củ a mẫu kiểm chứng dương. Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh phẩm: - Mẫu huyết thanh dương tính với kháng thể Gumboro có S / P lớn hơn hoặc bằng 0,20; - Mẫu huyết thanh âm tính với kháng thể Gumboro có S/P nhỏ hơn 0,20. 7. Kết luận Gia cầm được xác định mắc bệnh Gumboro khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng l â m sàng, bệnh tích đại thể đặc trưng của bệnh và dương t í nh với một trong các phương pháp xét nghiệm quy định trong tiêu chuẩn này. PHỤ LỤC A (Quy định) Chuẩn bị dung dịch muối đệm phosphat (PBS) A.1 . Thành phần Natri hydrophosphat (Na 2 HP O 4 ) 9,47 gm Kali dihydrophosphat (KH 2 PO 4 ) 9,08 gm Nước cất 900 ml A.2 . Chuẩn bị Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Ch ỉ nh pH đến 7,0 b ằ ng axit clohydric. CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nh à sản xuất. PHỤ LỤC B (Tham khảo) Quy trình tách chiết ARN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ARN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo b ả o hộ khi thực hiện các thao tác này. Qu y trình tách chiết ARN sử dụng kít QIAGEN RNeasy miniKit (CAT. No. 74104) như sau: - Lấy 600 m l dung dịch RLT (lysis buffer) vào ố ng 1,5 ml; - Lấy 200 m l mẫu (dịch nổi được xử lý ở 6.2.3) vào ống có chứa dung dịch RLT. Lắc ống bằng máy lắc (4.1.3) trong 15 s; - Cho tiếp 400 m l etanol tuyệt đối (3.2.4) vào ống. Lắc ống b ằ ng máy lắc (4.1.3) trong 15 s; - Chuy ể n 600 m l dung dịch sang cột lọc (dùng cho tách chiết ARN) đ ựng trong ống thu, ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 15 s; - Đổ b ỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống thu và lặp lại bước trên với 600 m l dung dịch còn lại; - Lấy 700 m l dung dịch RW1 nhỏ vào cột lọc, ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 15 s. Đỗ b ỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống; - Lấy 500 m l RPE nhỏ vào cột lọc, ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 15 s: Đổ b ỏ nước trong ố ng thu, đặt lại cột lọc vào ống. Lặp lại bước này 1 lần nữa; - Chuyển cột lọc sang ống thu mới. Ly tâm (4.3.2) cột lọc với gia t ố c 12 000 g trong 2 min; - Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml sạch Rnase; - Nh ỏ 50 m l nước sạch Rnase vào cột lọc, ủ trong 1 min ở nhiệt độ phòng; - Ly tâm (4.3.2) với gia tốc 10 000 g trong 1 min; - Bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml c ó chứa ARN; - Cất mẫu ARN ở 4 ° C trong ngày nếu chạy phản ứng realtime RT-PCR ngay và b ả o qu ả n ở âm 20 ° C để lưu mẫu trong thời gian dài. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Thierry van den Berg, 2008 . Poultry disease . 6 t h Edition. Saunders Elsevier . p.359 - 366. [2] Judit Iván, Maja Velhner, Krisztina Ursu, Péter Germán, Tamás Mató, Csaba Nick Drén, and János Mészáros, 2005. Delayed vaccine virus replication in chickens vaccinated subcutaneously with an immune complex in f ectious bursal disease vaccine: Quanti fi cation of vaccine virus by real-time polymerase c hain reaction, Can J Vet Res. Apr ; 69(2): 135-142. [3] JICA, 2003., Standard Diagnostic Manual f or livestock diseases in Thailand . Third edition. p 163-164. [4] N.Eterradossi and Y.M.Sai f , 2008. Disease of Poultry. 12 th Edition . Black w ell Publishing. p.185-208. [5] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thuý, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y. NXB Đại Học Nông Nghiệp . [6] T. P . van den Berg, N. Eterradossi, D. Toquin & G. Meulemans, “In f ectious bursal disease (Gumboro disease)”, Rev. sci. tech. Off. int Epiz, 2000, 19 (2), 527-543. Available at: http://www.oie.int/doc/ged/D9315.PDF. [7] Overvie w of lnfectious bursal disease in poultry. Available at: http://www.merckmanuals.com/vet/poultry/infectious_bursal_disease/overview_of_infectious_bur s al _disease_in_poultry.htm l [8] In f ectious bursal disease (Gumboro). Available at: http://www.thepoultrysite. c om/publications/6/diseases-of-poultry/193/infectious-bursal-disease-gumboro [9] Thierry van den Berg (2000), Acute in f ectious bursal disease in poultry: A revie w , Avian Pathology, Taylor and Francis publishers, p.175-194. 1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho n g ười sử dụng tiêu chuẩn và không ấ n định sử dụng sản phẩm của nhà cung c ấ p này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. 2) Thông tin này đ ưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản ph ẩ m của nh à cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. 3) Th ô ng tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chu ẩ n và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung c ấ p này. Có thể sử dụng các sản ph ẩ m tương tự n ế u cho các kết quả tương đương.