TCVN10910:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10910:2016 về Hạt giống cây trồng - Hướng dẫn xác định khả năng sống bằng phép thử Tetrazolium TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 10910:2016 HẠT GIỐNG CÂY TRỒNG - HƯỚNG DẪN XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SỐNG BẰNG PHÉP THỬ TETRAZOLIUM Crop Seeds - Guidelines for Viability Testing by Tetrazolium L ời nói đầu TCVN 10910:2016 được xây dựng dựa trên tài liệu “ Th ử n ghiệm khả năng s ố ng bằng sinh hóa, phép thử Tetrazoli um” (Chương 6, điều lệ Kiểm nghiệm hạt giống quốc tế, Hội Ki ể m nghiệm hạt giống Quốc tế (ISTA), 2011). TCVN 10910:2016 do Trung tâm khảo ki ể m nghiệm gi ố ng, s ả n phẩm cây trồng Quốc gia - Cục Trồng trọt biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, T ổ ng cục Tiêu chuẩn, Đo lường, Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. HẠT GIỐNG CÂY TRỒNG - HƯỚNG DẪN XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SỐNG BẰNG PHÉP THỬ TETRAZOLIUM Crop Seeds - Guidelines for Viability Testing by Tetrazolium 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này hướng dẫn phương pháp xác định khả năng sống của hạt giống các loài cây trồng trong bảng A.1 bằng phép thử Tetrazolium. 2 Tài liệu viện dẫn Các t à i liệu viện dẫn sau đây rất c ầ n thiết cho việc áp dụng ti ê u chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì á p dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu, không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm các sửa đổi bổ sung (nếu có): TCVN 8548:2011 Hạt giống cây trồng - Phương pháp kiểm nghiệm. 3 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chu ẩ n này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 3.1 Hạt sạch (Pure seed) Hạt của loài cây trồng mà người gửi mẫu yêu cầu kiểm tra hoặc chiếm ưu thế trong phân tích, bao gồm tất cả các giống của lo à i cây tr ồ ng đó. 3.2 Hạt tươi (Fresh seed) Hạt không phải hạt cứng nhưng không nảy mầm dưới các điều kiện của phép thử nảy mầm, tuy nhiên vẫn sạch, chắc và c ó khả năng phát triển thành cây mầm bình thường khi á p dụng các phương pháp xử lý. 3.3 Hạt cứng (Hard seed) Hạt vẫn còn cứng ở giai đoạn k ế t thúc thời gian thử nghiệm nảy mầm do không hấp thụ được nước và c ó khả năng phát triển thành cây mầm bình thư ờ ng, c ó thể là dạng hạt ngủ nghỉ; thường gặp ở nhiều loài thuộc họ Đậu Fabaceae (Leguminose) nhưng cũng có thể có ở các họ cây trồng khá c . 3.4 Hạt có khả năng sống (V i able seed) Hạt sau khi nhuộm màu bằng dung dịch muối Tetra zo lium, phôi được nhuộm đỏ hoàn toàn hoặc nhuộm đ ỏ một phần ở những vùng mô cơ bản quyết định sự phát triển bình thường của cây mầm. 4 Nguyên tắc - Dung dịch không màu 2,3,5-triphenyl tetraz o lium chloride hoặc bromide được dùng làm chất chỉ th ị để phát hiện quá trình khử oxy xảy ra bên trong các tế bào sống, chất ch ỉ thị này tiếp nhận hydr o gen từ men d ehydrogenase của hạt giống. Do sự thủy phân của chất 2,3,5 tripheny l tetrazolium chloride hoặc bromide trong các tế bào sống sinh ra một chất triphenyl formazan màu đ ỏ , ổn định và không khuyếch tán. - Chất màu đ ỏ này dùng để phân biệt những hạt giống có khả năng sống được nhuộm màu hoàn toàn và những h ạ t kh ô ng có khả năng sống không nhuộm màu. Có thể có những hạt chỉ nhuộm màu một phần nên tùy thuộc vào vị trí, kích thước và có thể cả mức độ nhuộm màu của phôi để xác định những hạt giống là có khả năng sống hoặc không có khả n ă ng sống. 5 Thiết bị, dụng cụ và thuốc thử 5.1 Thiết bị và dụng cụ - Thiết bị: Đèn chiếu sáng, kính lúp hoặc kính hiển vi soi n ổ i. - Dụng cụ : panh, dao cắt hạt (l ưỡi dao mổ, lư ỡi dao cạo..), gạt mẫu, dụng c ụ ngâm m ẫ u, cốc đong, ống đong, đĩa thủy tinh. 5.2 Thuốc thử - Dung dịch 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride hoặc bromide nồng độ 1,0%, pH từ 6,5 đến 7,5. - Chuẩn b ị thuốc th ử : C á ch 1: pH nước cất từ 6,5 đến 7,5: pha 1g muối tetrazolium (chloride hoặc bromide) trong 100 ml nước cất. Cách 2: pH nước cất không trong khoảng từ 6,5 đến 7,5. Muối Tetrazolium được pha trong dung dịch đệm. Dung dịch đệm được chuẩn bị như sau: Dung d ị ch 1: H ò a tan 9,078g KH 2 P O 4 trong 1000 ml nước cất Dung d ịch 2: Hòa tan 9,472g Na 2 HP O 4 trong 1000 ml nước cất hoặc hòa tan 1 1,876g Na 2 HP O 4 .2H 2 O trong 1000 ml nước cất Trộn dung dịch 1 và 2 theo tỷ lệ 2:3, kiểm tra pH trong khoảng t ừ 6,5 đến 7,5. Pha 1 g muối tetrazolium (chlori d e hoặc bromide) trong 100 ml dung dịch đệm này đ ể có nồng độ d ung dịch muối Tetr az ol i um 1%. 6 Cách tiến hành 6.1 M ẫ u phân tích Mẫu phân tích gồm 400 hạt, đ ư ợc lấy ngẫu nhiên từ phần hạt sạch đã được trộn đều và được chia thành 4 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 100 hạt giống nh ư chuẩn b ị mẫu phân tích trong phép thử nảy mầm (theo TCVN 8548:2011). Phép thử c ũ ng được tiến hành trên những hạt tươi, hạt cứng (được phát hiện là ngủ ngh ỉ ) khi kết thúc phép thử nảy mầm. Số lượng hạt giống phân tích phụ thuộc vào l ượng hạt tươi, hạt cứng. 6.2 Chuẩn bị hạt giống trướ c khi nhuộm màu 6.2.1 Làm ẩm hạt trước khi nhuộm màu Làm ẩm hạt là biện pháp ban đầu cần thiết ở một số loài trước khi nhuộm màu. Thời gian làm ẩm tối thiểu ở 20 °C phụ lục A (bảng A.1). Nếu vỏ hạt cản trở sự hút nước thì ph ả i chọc thủng vỏ hạt như các loài thuộc họ đ ậ u đỗ Fabaceae (Leguminoseae). - L à m ẩm chậm: Hạt giống được làm ẩ m chậm ở trên h o ặc giữa giấy đặt nẩ y mầm. Kỹ thuật này nên được sử dụng đối với những loài dễ bị gãy vỡ nếu ngâm trực tiếp trong nước. - Ngâm trong n ướ c: Hạt giống phải được ngâm trong nước để hút đủ nước. Xác định khả năng sống của hạt cứng đối với các loài thuộc họ đậu đỗ F abaceae (Leguminoseae) bằng cách ngâm trong nước ở nhiệt độ 20 °C trong 22h. 6.2.2 Làm h ở các mô trước khi nhuộm màu Hạt cần phải làm h ở các mô trước khi nhuộm màu để dung dịch tetrazolium xâm nhập được dễ dàng và dễ đánh gi á hơn. Xem hướng dẫn phụ lục (b ả ng A. 1 và B.1). - Chọc thủng hạt: Dùng kim mũi mác hoặc dao m ổ nhọn chọc vào phần phần nội nhũ và/hoặc ngoại nhũ của hạt. - Cắt theo chiều dọc: Hạt giống ngũ cốc cắt hạt theo chiều dọc đi qua phần giữa của trụ phôi và khoảng ¾ chiều dài của nội nhũ. Hạt gi ố ng thuộc loài thực vật hai lá mầm không có nội nh ũ và có phôi thẳng thì cắt theo chiều dọc đi qua phần giữa phía nửa lá mầm ở xa phôi, để lại trụ phôi không cắt. - Cắt theo chiều ngang: Hạt giống hai lá mầm có phôi thẳng và không có nội nhũ: cắt rời và vứt b ỏ một đoạn bằng 1/3 đến 2/5 ở phía đầu xa phôi của lá mầm. - Tách phôi: Tách phôi có thể được dùng đối với loài l úa mì, lúa mạch và lúa mạch đen. Phôi được tách bằng l ưỡ i dao mỏng, đ ẩ y qua nội nhũ ở ngay phía trên vảy bao (scutellum) và hơi xuống đến giữa nội nhũ, sau đó lách nhẹ da o để nội nhũ mở rộng ra theo chiều cắt. Phôi (cùng với scutellum) sẽ long ra kh ỏ i nội nhũ, chuyển phôi sang dung dịc h Tetrazolium. - Loại b ỏ vỏ hạt: Toàn bộ vỏ hạt (và các mô bao ph ủ khác) ph ả i được loạ i bỏ bằng cách rạch bằng dao nhọn hoặc kim mũi mác đ ể tách chúng ra tr ánh làm h ỏ ng ph ô i. 6.3 Nhuộm màu - Qu á trình nhuộm màu được để trong t ố i. Dung dịch Tetrazolium không được để hở ra ngoài ánh sáng vì muối Tetrazolium sẽ b ị khử. Các hạt giống phải hoàn toàn ngập trong dung dịch tetrazolium. Thời gian nhuộm màu đối với các loài khác nhau được nêu chi tiết tr o ng phụ lục A (b ả ng A.1). - Thời gian nhuộm màu thích hợp là 2h ở nhiệt độ 30°C đối với ngũ c ố c. - Các hạt giống nhỏ khó thao tác bằng tay như hạt xà lách (Lactuca spp.) hoặc hạt cà chua (Lycopersicon spp.) ; cà chua lai (Lycopers i con hybrids) thì có thể được làm ẩ m và chuẩn bị ở tr ê n một dải giấy, cuộn lại và ngâm v à o dung dịch Tetrazolium. 6.4 Đánh g i á Mụ c đích ch í nh của phép thử Tetrazolium là đ ể phân biệt các hạt có khả năng sống v à không có khả năng sống. Quan sát b ề mặt v ết cắt để đánh giá sự nhuộm màu của các mô. Tùy vị trí và mức độ nhuộm màu để xác định những hạt giống nào có khả n ăng sống và những hạt không có kh ả năng sống. a) Những hạt có khả n ă ng sống: Những hạt có khả năng sống là những hạt chỉ ra khả năng sinh ra các câ y mầm b ì nh thường. Nh ữ ng hạt như thế: - Phôi được nhuộm thành màu đỏ hoàn toàn. - Phôi nhuộm màu không hoàn toàn: Xem hướng dẫn phụ lục A (bảng A.2). b) Những hạt không có khả năng sống : Phôi không nhuộm đỏ hoặc nhuộm đ ỏ không đặc trưng. Xem hướng dẫn phụ lục A (bảng A.2) và phụ lục B (bảng B.2) 7 Tính và biểu thị kết quả 7.1 T í nh kết quả Tính tỷ lệ phần trăm trung bình các hạt có khả năng sống của 4 lần nhắc lại 100 hạt và làm tròn đến s ố nguyên khi kết quả của 4 lần nhắc lại nằm trong khoảng sai số cho phép quy định tại ph ụ lục A (bảng A.3). 7.2 Sai số cho phép Kết quả của phép thử xác định khả năng sống của hạt giống đáng tin cậy nếu sự sai khác giữa các lần nhắc cao nh ấ t và thấp nhất nằm trong gi ớ i hạn sai số cho phép, phép thử hai chiều ở mức ý nghĩa 2,5% quy đ ị nh tại phụ lục A (bảng A.3.1). Kết quả thử nghiệm khả năng sống của hạt giống bằng phép thử tetrazolium của cùng một mẫu hoặc khác mẫu gửi ở cùng một phòng kiểm nghiệm, phép thử hai chiều ở mức ý nghĩa 2,5% quy định tại phụ lục A (bảng A.3.2). Kết quả thử nghiệm khả năng s ố ng của hạt giống bằng phép thử tetrazolium được thực hiện trên các mẫu gử i khác nhau ở các ph ò ng thí nghiệm khác nhau, phép thử một chiều ở mức ý nghĩa 5% quy đ ị nh tại phụ lục A (b ả ng A 3.3). Các kết quả là tương thích nếu sự sai khác giữa t ỉ lệ hạt có khả năng sống của phép thử không vượt quá sai số cho phép. 7.3 Báo cáo kết quả Kết quả phép th ử xác định khả năng sống của hạt giống bằng Tetrazolium được báo cáo là tỷ lệ ph ầ n trăm trung b ì nh của hạt có khả năng sống trên tổng số hạt kiểm tra. Hạt có khả năng sống đượ c biểu th ị bằng (% số hạt). Phụ lục A (Quy định) Trình tự thử A.1. Cách tiến hành phép thử Tetrazolium đ ối với hạt giống một số loài cây tr ồng nông nghiệp Cây tr ồ ng Là m ẩ m trư ớ c ở 20°C Chuẩn bị trước khi nhuộm Thời gian nhuộm thích hợp (h ) Bộ phận cần quan sát H ì nh thức Thời gian t ố i thiểu (h) Lúa ( Oryza sativa) Ng â m trong nước 18 Cắt dọc q ua phôi và ¾ nội nnũ 2 Quan sát bề mặt vết cắt Ngô (Zea mays) Ngâm trong nước 18 Cắt dọc qua phôi và ¾ nội nhũ 2 Qu a n sát bề mặt vết cắt Cây thuộc họ cải Brassica spp. như su hào, su lơ, c ả i dầu, cải thìa, cải xạnh, cải bẹ, cải bắp... Ngâm trong nước 18 Rạch chéo phần vỏ một bên lá mầm, tránh tổn thương thân mầm hoặc rễ mầm . Loại bỏ vỏ hạt bằng cách ấn nhẹ 3 Quan s á t phôi Yến mạch ( Avena spp.) Loại bỏ lá mày trước khi làm ẩm; phương pháp giữa giấy hoặc ngâm trong nước 18 Cắt hạt ngang gần phôi 18 Quan s á t mặt ngoài của phôi Cắt dọc qua phôi và ¾ nội nhũ 2 Quan sát: mặt ngo à i của phôi; mặt vết cắt; phía sau scutellum Dưa bở, dưa gang, dưa chuột ( Cucumis spp.) Ng â m trong n ướ c 18 Cắt ngang một ph ầ n nhỏ ngoại biên của hạt. Cắt dọc một b ê n qua v ỏ hạt. Loại bỏ vỏ hạt và lớp màng mỏng bên trong 6 Quan sát phôi Hạt hướng dương ( Helianthus spp.) Ngâm trong n ư ớc 18 Loại bỏ vỏ quả và vỏ hạt 3 Cắt dọc qua lá mầm, rễ mầm và thân mầm. Quan sát c ả hai ph í a của hạt Hạt sen ( Lotus spp.) Ngâm trong nước 18 Để nguyên hạt 18 Loại bỏ vỏ hạt để làm hở phôi Xà lách ( Lactuc a spp.) Chuẩn bị hạt khô, cắt dọc ¼ qua ngoại bi ê n quả (quả bế). Ngâm trong nước 18 Làm h ở phôi bằng cách ấn nh ẹ vào v ỏ hạt 3 Quan sát phôi Cà chua ( Lycopersicon spp.); c à chua lai ( Lycopersicon hybrids) Ngâm trong nước 18 Cắt giữa lá mầm và thân mầm 1/3 qua nộ i nhũ 18 Cắt phẳng một mặt của hạt thành hai nửa. Quan sát bề mặt cắt Lúa mạch đen (secale cerea l e) Ngâm trong nước 4 Cắt phôi cùng v ớ i scutellum 3 Quan sát: Bề mặt ngoài của phôi; phía sau scutel l um Ngâm trong nước 18 Cắt dọc qua phôi và ¾ nội nhũ. 3 Bề mặt ngoài của phôi; bề mặt vết cắt; phía sau scutellum Cao lương ( Sorghum spp.) Ngâm nước ở 7°C 18 Cắt dọc qua ph ô i và ¼ nội nhũ. 3 Bề mặt cắt L ú a mì ( Triticum spp.) Ngâm trong n ư ớc 4 Cắt phôi cùng với scutellum 3 Quan sát: bề mặt ng oài của phôi; phía sau scutellum. Ngâm trong nước 18 Cắt dọc qua phôi và ¾ nội nhũ 3 Quan sát: bề mặt ngoài của phôi; bề mặt vết cắt; phía sau scutellum Lúa mạch (Hordeum vulg a re) Ngâm trong nước 4 Cắt phôi cùng với scut e llum 3 Quan sát: mặt ngoài của phôi; phía sau scutellum 18 C ắ t dọc qua phôi và ¾ nội nhũ 3 Quan sát: mặt ngoài của phôi; mặt vết cắt; ph í a sau scutellum A.2. Hướng dẫn đánh giá đối với một số cây tr ồ ng nông nghiệp S TT Loài cây trồ ng T ế bào kh ô ng có khả năng sống được phép 1 Lúa ( Oryza sativa) 2/3 rễ mầm 2 Ng ô (Zea mays) Rễ sơ cấp, tổng số 1/3 diện tích phần mép của scutellum. 3 Cây thuộc họ cải Brassica spp. như su h à o, su lơ, cả i dầu, cải th ì a, cải xanh, cải bẹ, c ả i bắp... 1/3 rễ mầm, đo từ đầu rễ mầm, 1/3 các mô thối trên bề mặt lá mầm không tiếp nối với trụ mầm. 4 Yến mạch ( Avena spp.) Diệ n tích rễ trừ một đầu rễ, tổng số 1/3 d iện tích phần mép của scutellum 5 Dưa bở, dưa g a ng, dưa chuột ( Cucumis spp.) 1/3 rễ mầm đo từ đỉnh rễ, ½ diện tích ngoại bi ê n của mầm. 6 Hạt hướng dương ( Helianthus spp.) 1/3 rễ mầm đo từ đ ỉ nh rễ, ½ phía xa l á mầm nếu tr ê n bề mặt. 7 Hạt sen ( Lotus spp.) 1/3 rễ mầm đo từ đ ỉ nh rễ, ½ phía xa lá mầm nếu trên bề mặt. 8 Xà lách ( Lactuca spp.) 1/3 rễ mầm đo từ đỉnh rễ, ½ diện tích ngoại bi ê n của mầm nếu tr ê n b ề mặt; 1/3 diện tích ngoại biên nếu vết thối không lan rộng. 9 Cà chua ( Lycopersicon spp.); cà chua l ai ( Lycopersicon hybrids) Không 10 L ú a mạch đen (seca l e cereale) Diện tích rễ, trừ phần đầu của rễ, tổng số 1/3 diện tích phần mép của scutellum. 11 C a o lương ( Sorghum spp.) 1/3 rễ mầm được đo t ừ đỉnh 12 Lúa m ì ( Triticum spp.) Diện t í ch rễ, trừ phần đầu của rễ, tổng số 1/3 diện tích phần mép của scutellum. 13 Lúa mạch (Hordeum vulgare) Diện tích rẽ trừ một đầu rễ, tổng số 1/3 diện tích phần mép của scutellum. A.3. Bảng sai số cho phép Các sai số cho phép được tính toán dựa vào sai s ố thí nghiệm được quy định tại Bảng A.3.1, A.3.2, A.3.3. Bảng A.3.1: Bảng sai số cho ph é p giữa 4 lần nhắc 100 hạt trong cùng một ph é p thử Tetrazolium (phép thử 2 chiều ở mức ý nghĩa 2,5%). Tỷ lệ hạt có khả năng sống tr ung b ì nh (%) Sai số cho phép (hạt) Tỷ lệ hạt có khả nă ng sống trung b ì nh (%) Sai số cho ph é p (hạt) 99 2 5 87 - 88 13 - 14 13 98 3 6 84 - 86 15 - 17 14 97 4 7 81 - 83 18 - 20 15 96 5 8 78 - 80 21 - 23 16 95 6 9 73 - 77 24 - 28 17 93 - 94 7 - 8 10 67 - 72 29 - 34 18 91 - 92 9 - 10 11 56 - 66 35 - 45 19 89 - 90 11 - 12 12 51 - 55 46 - 50 20 B ả ng A.3.2: Bảng sa i số cho phép giữa các kết quả thử khả năng sống bằng tetrazolium tr ê n 400 hạt ở cùng hoặc khác mẫu gửi, khi các phép thử được thực hiện ở cùng một ph ò ng th í nghiệm (phép thử hai chiều ở mức ý nghĩa 2,5%). Tỷ lệ hạt có k hả năng sống trung bình (%) Sai số cho ph é p (hạt) Tỷ lệ hạt có khả năng s ố ng trung bình (%) Sa i số cho phép (hạt) 98 - 99 2 - 3 2 83 - 88 13 - 18 6 96 - 97 4 - 5 3 75 - 82 19 - 26 7 93 - 95 6 - 8 4 58 - 74 27 - 43 8 89 - 92 9 - 12 5 51 - 57 44 - 50 9 Bảng A.3.3: Bảng sai số cho phép giữa các kết quả thử khả năng sống bằng tetrazoliu m tr ê n h ai mẫu gửi khác nhau ở các phòng thí nghiệm khác nhau, mỗi mẫu 400 hạt (phép thử một chiều ở mức ý nghĩa 5%). Tỷ lệ hạt có k hả năng sống trung bình (%) Sai số cho ph é p (hạt) Tỷ lệ hạt có khả năng s ố ng trung bình (%) Sa i số cho phép (hạt) 99 2 4 86 - 88 13 - 15 11 98 3 5 82 - 85 16 - 19 12 97 4 6 78 - 81 20 - 23 13 95 - 96 5 - 6 7 73 - 77 24 - 28 14 93 - 94 7 - 8 8 65 - 72 29 - 36 15 91 - 92 9 - 10 9 51 - 64 37 - 50 16 89 - 90 11 - 12 10 Phụ lục B (Tham khảo) Hướng dẫn thao tác và cách đọc kết quả B.1. Phương pháp làm h ở mô trước khi nhuộm 1. Cắt đôi dọc qua phôi và khoảng ¾ nội nhũ ở hạt ngũ cốc. 2. Cắt ngang - rạch ngang gần phôi. 3. Cắt dọc qua phần nội nhũ ở xa phôi của hạt cỏ. 4. Chọc nội nhũ ở hạt cỏ. 5. Cắt dọc qua một nửa lá mầm ở xa phôi, ví dụ hạt xà tách ( Lactuca spp.), hạt thuộc họ Asteraceae (Compositae). 6. Phần cắt dọc cho thấy vị trí của dao khi thực hiện cắt như hình 5. 7. Cắt dọc sát cạnh phôi (Các loài thuộc họ Apiaceae (Umbelli f erae) và các loài khác có phôi thẳng. 8. Cắt dọc sát cạnh phôi ở hạt giống cây lá kim. 9. Cắt dọc ở 2 đầu để h ở khoang phôi và loại bỏ các phần nội nhũ (mô đơn bội). B.2. Cách nhận biết hạt có khả năng sống và hạt không có khả năng sống (đại diện hạt giống thuộc họ ngũ cốc) Hạt có khả năng sống Hạt không có khả năng sống Cột I: nhuộm màu hoàn toàn, hạt có khả năng sống. Cột II, III: rễ mầm, phôi không nhuộm màu một phần (tối đa < 2/3="" rễ="" mầm="" không="" nhuộm="" màu),="" hạt="" có="" khả="" năng=""> Cột I , II , III, IV: lớn hơn 2/3 rễ mầm không nhuộm màu, hạt không có khả năng sống. Cột V: Phôi không nhuộm màu hoàn toàn. Thư mục tài liệu tham khảo [1] Chương 6, Điều lệ kiểm nghiệm hạt giống Quốc tế, ISTA 2011; Thử nghiệm khả năng sống bằng sinh hóa, phép thử Tetrazol i um.