TCVN8710-14:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-14:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-14:2015 BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 14: HỘI CHỨNG LỞ LOÉT (EUS) Ở CÁ Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 14: Epizootic ulcerative syndrome-EUS in fish Lời nói đầu TCVN 8710-14:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo OIE (2013), Manual of diagnostic tests for aquatic animals , Chapter 2.3.2. Epizootic ulcerative syndrome; TCVN 8710-14:2015 do Trung tâm Ch ẩ n đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ TCVN 8710 B ệ nh thủy sản - quy trình chẩn đoán gồm 15 p hầ n: - TCVN 8710-01 : 2011, phần 1: Bệnh Còi do vi rút ở t ô m: - TCVN 8710-02 : 2011, phần 2: Bệnh Hoại t ử th ầ n kinh ở cá biển; - TCVN 8710-03 : 2011, ph ầ n 3: Bệnh Đốm trắng ở tôm - TCVN 8710-04 : 2011, ph ầ n 4: Bệnh Đầu vàng ở tôm. - TCVN 8710-05 : 2011, ph ầ n 5: Bệnh Taura ở tôm He ; - TCVN 8710-06 : 2012, phần 6 : Bệnh d o Koi herpesvirus ở cá chép; - TCVN 8710-07 : 2012, ph ầ n 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép; - TCVN 8710-08 : 2012, ph ầ n 8: Bệnh hoại t ử cơ ở tôm ; - TCVN 8710-09 : 2012, ph ầ n 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm; - TCVN 8710-10 : 2015, phần 10: Bệnh do Perkinsus marinus ở nhuyễn th ể hai m ả nh v ỏ; - TCVN 8710-11 : 2015, phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn th ể hai mảnh vỏ; - TCVN 8710-12 : 2015, ph ầ n 12: Bệnh do Vi bào t ử do Enterocytozoon hepatopenaei ở t ô m; - TCVN 8710-13 : 2015, phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở t ô m - TCVN 8710-14 : 2015, phần 14: Hội chứng lở loét (EUS)ở cá ; - TCVN 8710-15 : 2015, phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas ở cá. BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CH Ẩ N ĐOÁN - PH Ầ N 14: HỘI CHỨNG LỞ LOÉT (EUS) Ở CÁ Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 14: Epizootic ulcerative syndrome-EUS in fish CẢNH BÁO - Việc áp dụng ti ê u chu ẩ n này có thể liên quan đến các v ậ t liệu, thiết bị v à các thao tác gây nguy hi ể m. Tiêu chu ẩ n này kh ô ng th ể đưa ra được hết t ấ t c ả các vấn đề an toàn li ê n quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức kh ỏ e thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Ti ê u chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán hội chứng lở loét do nấm Aphanomyces invadans (Syn. Aphanomyces piscici d a) gây ra ở cá. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau: 2.1. Hội chứng lở loét ở cá (Epizootic ulcerative syndrome) - EUS: H ộ i ch ứ ng do nhi ề u tác nhân gây ra, trong đó n ấ m Aphanomyces inva d ans l à t á c nhân ch í nh g â y ra những đốm đ ỏ và vết loét tr ê n thân cá bệnh. CHÚ THÍCH: Sợi n ấ m có đ ườ ng k í nh t ừ 12 đế n 25 n m v à c ó cấu trúc gi ốn g h ệ sợi nấ m k hôn g c ó vách ngăn. Lo à i nấm nà y c ó hai dạng bào t ử động điển h ì nh g ồ m: bào t ử đ ộng ch í nh và các b à o tử động thứ c ấ p . Bào tử động ch í nh bao gồm các t ế b ào hình t r ò n phát tri ể n bên trong bọc bào tử. Các bào tử đ ộ ng ch í nh t ậ p trung ở trên đ ầ u mút c ủ a b ọ c b à o t ử t ạ o th à nh m ộ t c ụ m b à o t ử và nhanh ch ó ng chuyển thành các bào tử động th ứ c ấ p, có thể bơi tự do trong nước. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Ch ỉ sử d ụng thuốc thử loại tinh khiết đ ể phân tích, sử dụng n ước c ấ t, nư ớc khử khoáng hoặc nước tinh khiết, trừ các trường h ợ p c ó quy định khác. 3.1. Thuốc thử và vật liệu th ử dùn g chun g . 3.1.1. E tanol , 7 0 % (thể tích) , 9 0 % ( t hể tích) v à etanol tuyệt đối. 3.2. Thuốc thử v à vật liệu thử dùng cho phương pháp ch ẩ n đoán b ằ ng PCR. 3.2.1. Cặp mồi (primers), gồm mồi xu ô i và mồi ngược. 3.2.2. Agarose. 3.2.3. Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris-acetate - EDTA) (xem A.1). 3.2.4. Chất nhuộm màu , ví dụ: Sybr safe. 3.2.5. Chất đệm tải m ẫ u (Loading dye 6X). 3.2.6. Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic). 3.2.7. Thang chu ẩ n AND (Marker) 3.2.8. Nước t i nh khiết , không có nuclease. 3.2.9. Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit) 3.2.10 . Kít tách chiết ADN (acid deoxyribo nucleic), protein K. 3.3. Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng parafin. 3.3.1. F ormalin 10 %, được c h u ẩ n bị từ dung dịch f ormaldehyde 38 % và dung dịch muối đệm ph o sphat (PBS) (tỷ lệ thể tích 1 : 9). 3.3.2. Xylen. 3.3.3. Thuốc nhuộm Haematoxylin (xem A.2). 3.3.4. Thuốc nhuộm Eosin (xem A.3). 3.3.5. Para f in , có độ nóng chảy từ 56 °C đến 60 °C. 3.3.6. Keo dán lamen. 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị , dụng cụ thông thường c ủ a phòng thử nghi ệm sinh học về những thi ế t b ị, dụng cụ sau 4.1. Thiết bị , dụng cụ dùng cho phương pháp ch ẩ n đoán bằng PCR. 4.1.1. Máy nhân gen (PCR). 4.1.2. Máy ly tâm , có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g. 4.1.3. Máy lắc trộn vortex. 4.1.4. Máy spindo w n. 4.1.5. Bộ điện di , gồm bộ nguồn và bể chạy điện di 4.1.6. Máy đọc gel. 4.2. Thiết bị, dụng cụ d ùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng parafin. 4.2.1. Khuôn nhựa , loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể. 4.2.2. Máy xử lý mẫu mô tự động. 4.2.3. Nồi đun parafin , có thể duy trì nhiệt độ từ 56 °C đến 65 °C. 4.2.4. Khay sắt , loại chuy ê n d ụ ng cho l à m tiêu bản vi thể. 4.2.5. Máy làm lạnh tiêu bản , có th ể duy trì nhiệt độ từ âm 10 °C đến 4 °C. 4.2.6. Máy cắt tiêu bản , cắt ở độ m ỏ ng từ 3 µm đến 5 µm. 4.2.7. Nồi dãn tiêu bản , có thể duy trì nhiệt độ t ừ 35 °C đến 65 °C. 4.2.8. Phiến kính , vô trùng. 4.2.9. Lamen , vô trùng. 4.2.10 . Kính hiển vi quang học , vật kính 10 X, 20 X, 40 X và 100 X 5. Chẩn đoán lâm sàng 5.1. Đặc điểm dịch tễ - Hội chứng lở loét ở cá (EUS) xảy ra phổ biến ở các loài cá nước ngọt, trên cả quần thể cá tự nhiên và cá nuôi; - Cá nhiễm nấm A. invadans thư ờ ng ở giai đoạn tiền trư ở ng th à nh và trư ở ng thành: - T á c nhân chín h của bệnh l à nấm A ph anom y ces invadans (A. p iscici d a ) có đườn g kính t ừ 12 n m đ ế n 25 nm; - A . in va d ans l â y lan qua bà o tử động t rong môi trường nước. C á c bào tử động x â m nhập v à gắn v ào da , bào tử n ả y mầm trong điều kiện thích hợp và sợi nấm xâm nhập vào da cá , mô c ơ gây ra c á c v ết viêm trên da, mang, đuôi và các vết loét tr ê n cơ: - EUS xuấ t hiện trên c á c ao nu ô i với t ỷ l ệ m ắ c bệnh và t ỷ l ệ tử vong c a o (> 50 % ). Thường xuất hiện trong những năm có mùa lạnh d à i, với nhiệt độ nước từ 18 °C đến 22 °C v à thường xảy ra từ tháng 11 đến tháng 12 . 5.2. Triệu chứng lâm sàng. - Cá chán ăn, bỏ ăn và da cá tr ở lên sẫm màu hơn: - Cá bệnh thường n ổ i gần bề mặ t nước và tr ở lên linh hoạt hơn với kiểu di chuyển co giật; - Cá bệnh xu ấ t hiện các đốm màu đỏ trên bề mặt cơ thể, đầu, n ắ p mang hay cuống đuôi; - Cá bệnh nặng thường xu ấ t hiện các đốm đỏ lớn hoặc các vết loét nông màu xám với phần hoại tử màu nâu; 5.3. Bệnh tích. - Cá bị bệnh nặng, các vết loét lõm sâu tới xương, làm phần cơ hai bên hoại tử và để lộ ra nội t ạ n g bên trong. Tại các vết loét lớn, vùng trung tâm có màu xám, các mép xung quanh có màu đen; - Những tổn thương bề mặt lớn thường xảy ra trên sườn v à lưng c á ; - Ở một số loài cá nhạy cảm với bệnh, các t ổ n thương lan rộng có thể ă n mòn hết các phần sau của cơ thể cá hoặc hoại tử c ả phần mô mềm và mô cứng của hộp sọ. 6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). 6.1.1. Lấy mẫu. - Thu mẫu c á có d ấ u hiệu bệnh lý, còn sống hoặc vừa mới chết. - Bệnh phẩm: Cá nguyên con. - Số lượng cá trên mỗi mẫu phụ thuộc vào kích c ỡ của cá: - C á giống: lấy từ 3 con/m ẫ u đế n 5 con/mẫu - Cá trư ở ng thành, cá b ố m ẹ : lấy 1 con/mẫu. - Lấy mẫu mỗi l o ại bệnh phẩm, cho vào từng l ọ hay túi ni l on vô trùng riêng biệt, đậy kí n , tha o tác lấy mẫu, dụng cụ đựn g mẫu v à ti ếp xúc với mẫu phải đ ả m b ả o vô trùng. 6.1.2. Bảo quản m ẫ u. Trong qu á tr ình v ậ n c h uy ể n, m ẫ u được bả o quản ở n h i ệ t đ ộ từ 2 °C đ ế n 8 °C khô ng qu á 24 h h oặc bả o quản trong etanol tuyệt đối (3.1.1); M ẫ u chuy ể n đến phòng th í nghiệm nếu chưa phân tích ngay ph ả i được b ả o quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong etanol tuyệt đối (3.1.1). 6.1.3. Chuẩn bị mẫu. B ệ nh phẩm: cá nguyên con v ô trùng bên ngoài bề mặt cá bằng e t anol 70 % (th ể tích) (3.1.1), dùng panh, kéo vô trùng lấy phần cơ bên cạnh hoặc b ê n dưới vết loét. Lượng mẫu cần chuẩn bị: khoảng 30 mg. 6.1.4. Cách tiến hành. 6.1.4.1. Tách chiết ADN. Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.10) thích hợp và an toàn theo hư ớ ng dẫn của nhà sản xuất, VÍ D Ụ . Sử dụng kit t ách chiết DNeasy ® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) 1) (xem ph ụ l ụ c B). 6.1.4.2. Chu ẩ n bị m ồi . Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.1.1) theo phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu c ủ a A. invadans sử dụng cặp mồi ITS1-2 F /ITSR1 (3.2.1). Tr ì nh tự cặp mồi được n ê u trong bảng 1. Bảng 1: Trình tự cặp mồi M ồ i Trình tự cặp mồi ITS1-2 F 5 ’ -TCA-TTG-TGA-GTG-AAA-CGG-T G -3 ’ ITSR1 5’-GGC-TAA-GGT-TTC-AGT-ATG-TAG-3 ’ Cặ p mồ i ITS1-2F/ITSR1 dùng để khuếch đại đoạ n gen của n ấ m A inv adans có kích thước 234 b ộ Mồi được chuẩn bị nh ư sau: Chu ẩ n bị mồi gốc: - Mồi ở trạng thái đông khô phải đư ợ c ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.1.4) ở gia t ố c 6 000g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống tr ướ c khi m ở v à hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên , nên dù ng đ ệ m TE (3 2 6) để hoàn nguy ê n mồi ở nồng độ 200 µM làm mồi gốc. Chuẩn bị mồi sử dụng: - Mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (10 µl mồi gốc v à 90 µl nước). 6.1.4.3. Tiến hành ph ả n ứng PCR. Sử dụng cặp mồi đã chu ẩ n bị (6.1.4.2) sử dụng kit nhân gen (3.2.9) theo hướng dẫn của nh à s ả n xu ất . VÍ DỤ: Sử dụng kít nh â n gen của Thermo S ci enti f ic Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656) 2) Th à nh ph ầ n cho 1 ph ả n ứng được nêu trong b ả ng 2 Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích Taq PCR Master Mix Kit 12,5 µl Mồi xuôi 20 µM 1 µl Mồi ngược 20 µM 1 µl Nước không có nuclease 8 µl Tổng thể tích 22 , 5 µl Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nh â n gen vào mỗi ống ph ả n ứ ng: - M ẫ u kiểm chứng dương: Cho 2,5 µl mẫu ADN đ ã được giám định hoặc sử dụng c á c ch ủ ng Aphanomyces inva d ans chuẩn vào ống phản ứn g; - Mẫu kiểm chứng âm: Cho 2,5 µl nước (3.2.8) vào ống phản ứng; - M ẫ u thử: Cho 2 , 5 µ l mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng . T iến hành phản ứng PCR bằng máy nh â n gen (4.1.1) đ ể c à i đặ t c hu tr ì nh nhiệt v à được nếu tron g bả ng 3 . Bảng 3 : Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 95 °C 2 min 1 94 °C 30 s 35 56 °C 45 s 72 °C 2,5 min 72 °C 5 min 1 CHÚ THÍCH. - Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu ki ể m chứng dương và m ẫ u kiểm ch ứ ng âm; - M ẫ u và nguyên li ệ u cho ph ả n ứ ng PCR c ầ n đ ặ t trong khay đá l ạ nh trong suốt quá trình chuẩn bị h ỗ n hợp ph ả n ứng 6.1.4.4. Điện di. 6. 1 .4.4.1. C h u ẩ n bị b ả n ge l . Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.2) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm T B E 1X hoặc TAE 1X (3.2.3) vào chai thủy tinh 250 ml , lắc đều rồi đun sôi; Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C th ì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.4) cho 100 ml t hạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều; Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đ ã được cài lược; không n ê n đ ổ bản thạch dày quá 0,8 cm; Khi b ả n thạch đ ô ng lại thì tiến hành g ỡ lược khỏi bản thạch; Chuyển bản gel vào bể điện di (4.1.5), đổ dung dịch đệm (3.2.3) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đ ã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch CHÚ THÍCH: Có th ể dùng các sản ph ẩ m có sẵn chất nhuộm ADN đ ể pha chế th ạ ch agarose (v í dụ: Sybr safe A D N gel stain 3) ) v à sử d ụ ng theo quy định của nh à s ả n xu ấ t. 6.1.4.4.2. Chạ y điện di. Hút 2 µ l chất đệm tải m ẫu (3.2.5) vào 8 µ l sản phẩm PCR trộn đề u và cho vào c á c giếng trên bả n thạch. Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.1.5) , chạy kèm theo thang chuẩ n ADN (3.2.7) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µ l thang chuẩn AND (3.2.7) vào một giếng trên bản thạch Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min. 6.1.4.5. Đọc kết quả. Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.1.6) theo bảng 4. Bảng 4 : Kết qu ả điện di Giếng S ả n phẩm có kích thước 234 bp Kết quả Thang chuẩn ADN Sáng và chia vạch rõ ràng Điện d i tốt Mẫu kiểm chứng dương Có Hỗn hợp phản ứng PCR tốt Không M ẫ u đối chứng dương h ỏ ng hoặc enzym h ỏ ng M ẫ u ki ể m ch ứ ng â m Không Không bị tạp nhiễm Có Bị tạp nhiễm Mẫu thử C ó Dương tính với EUS Không Âm tính với EUS Đánh giá kết quả: - Kết quả mẫu thử dương tính khi: tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 234 bp. Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, m ẫ u kiểm chứng dương có kích thước 234 bp, mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng. - Kết qu ả mẫu thử âm tính khi: tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng. Thang chuẩn A D N phân vạch r õ ràng, mẫu kiểm chứng dương c ó kích thước 234 bp, mẫu kiểm chứng âm kh ô ng có vạch sáng. 6.2. Phương pháp kiểm tra bệnh t í ch vi thể bằng phương pháp parafin. 6.2.1. Lấy mẫu. Xem 6.1.1 6.2.2. B ả o quản mẫu. M ẫ u bệnh ph ẩ m được đảm bảo ngập tron g f ormalin (3.3.1) , tránh đổ v ỡ, rơi vãi fo rmalin (3.3.1) ra ngoài môi trường; khi gửi mẫu đến ph ò ng thí nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu bằng túi nilon , miệng túi được dán kín. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay mẫu phải được bổ sung hoặc thay mới fomalin (3 3.1), đảm b ả o thể tích mẫu bệnh phẩm và f ormalin (3.3.1) đạt tỷ l ệ khoảng 1 - 10. 6.2.3. Chu ẩ n bị mẫu. - Đối với cá giống cố định c ả con; - Đối với cá trư ở ng thành cố định b ằ ng cách lấy cá sống cắt lấy phần da, mô cơ (< 1 cm 3 ) xung quan h v ế t loét; - Mẫu bệnh phẩm cố định trong f ormalin (3.3.1) từ 24 h đến 72 h tùy thuộc vào kích thước mẫu; 6.2.4. Cách tiến hành. 6.2.4.1. Đúc khuôn. - Đặt khuôn nhựa (4.2.1) rửa dưới vòi nước ch ả y, th ờ i gian t ừ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1) , thời gian từ 2 h đến 3 h: - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 2 đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ng â m khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) l ầ n thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h: - Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.3.5) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa v à o cốc parafin (3.3.5) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy x ử lý mẫu m ô tự động (4.2.2) th ì tiến h à nh tiếp theo từ bư ớ c ng â m etanol. - Đ úc khuôn: rót parafin (3.3.5) nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4), gắp bệnh phẩm từ khuôn nhựa đặt vào khay sắt (4.2.4), đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên. Đ ể nguội, tách lấy khối parafin. 8.2.4.2. Cắt tiêu bản. - Cắ t g ọ t khối para fin (6.2.4.1) ch o b ằn g phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh tiêu bản (4.2.5), - Đặ t khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối parafin son g song với mép lưỡi dao cắt b ỏ những lát đầu đến khi lát c ắ t có đ ủ c á c bệnh phẩm, điều ch ỉ nh độ dày của lát cắt từ 3 µm đến 5 µ m, cắt một vài lát; - Chọn lát c ắ t phẳng th ả vào nồi dãn tiêu bản (4.2.7) với nhi ệ t đ ộ nước từ 35 °C đến 40 °C Dùng phiến k í nh (4.2.8) vớt dán lát cắt. Dựng nghiêng tiêu bản và để khô. 6.2.4.3. Nhuộm tiêu b ả n - N gâ m tiêu bản (6.2 4 2 ) vào cốc xylen ( 3.3 . 2 ) 3 l ầ n, thờ i g ian m ỗ i lần từ 3 min đến 5 min ; - Ngâm tiêu bản vào cốc etano l tuyệt đối (3.1.1) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể t í ch) (3.1.1) , thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Rửa tiêu bản dưới v ò i nước chảy, thời gian từ 3 min đ ế n 5 min; - Ngâm ti ê u bản v à o cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.3 3), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Rửa ti ê u bản dưới vòi nước chảy, th ờ i gia n t ừ 3 min đến 5 min; - Ngâm ti ê u bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.3.4), thời gian từ 60 s đến 90 s; - Rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Loại b ỏ nước còn bám trên tiêu bản b ằ ng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (th ể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1 1) 3 lần , thời gian mỗi l ầ n từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.3.2) 2 lần, thời gian mỗi l ầ n từ 2 min đến 3 min ; gắn lamen (4.2.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.3.6). Để khô, soi tiêu bản dưới k í nh hiển vi quang học (4.2.10). 6.2.5. Đọc kết quả. M ẫ u m ô được soi dưới k í nh hi ể n vi quang h ọ c (4.2.10) cho thấy sự hiện diện của các khối u hình tròn màu trắng không bắt màu của H & E; Giai đoạn sớm quan sát th ấ y sợi nấm tại vị trí hoại tử thể hiện ở những chấm đen nh ỏ trên tiêu bản nhuộm. D ầ n hình th à nh những u hạt nấm màu tr ắ ng. 7. Kết luận M ẫ u cá được xác định l à nhiễm b ệ nh do A. invadans khi có đ ặ c điểm dịch tễ , triệu c h ứn g l â m sang bệnh tích đặc trưng của bệnh v à có kết quả dương tính một trong hai phương pháp sau: - Phản ứng PCR phát hiện nấm A. Invadans dương tính - M ẫ u c ắ t mô thể hiện nhữn g dấu hiệu bệnh tích vi th ể đ ặ c t rưn g cho h ộ i chứ ng l ở loét tr ê n c á. PHỤ LỤC A (Quy định) Thành phần và chuẩn bị thuốc thử A.1 . Dun g dịch đệm TAE hoặc TBE A.1.1 . Thành phần Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml Nước khử ion: 900 ml Tổng 1000 ml dung dịch TAE ( T B E) 1X A.1.2 . Chuẩn bị Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X h òa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. A.2 . Thuốc nhuộm Hematoxylin (dung d ịch Hematoxylin - Mayer) A.2.1 . Thành phần Hematoxylin dạng tinh thể: 1 g Natri iodat: 0,2 g Amoni alum sulphate: (hoặc Postasium alum sulphate) 50 g Axit citric: 1 g Chloral hydrate: 50 g Nước: 1000 ml A.2.2 . Chuẩn bị Hòa tan Hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và Amoni alum sulphate hoặc kali nhôm sul f at, h òa tan, tiếp tục cho axit citric v à chloral hydrate rồi lọc qua giấy lọc. Bảo qu ả n dung dịch đã pha trong chai tối m à u. A.3 . Thuốc nhuộm Eosin A.3.1 . Thành phần Eosin Y 1 g Etano l 70 % ( th ể tích) 1 l ít Axit axetic: 5 ml A.3.2 . Chu ẩ n bị Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 % (thể tích). H òa tan eosin trong cồn , sau đó thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc. B ả o quản dung dịch đ ã chu ẩ n b ị trong chai tối màu. PHỤ LỤC B (Tham khảo) Quy trình tách chiết ADN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng h óa chất nguy hiểm và c ó khả năng gây hại nếu thao tác không c ẩ n thận. Do vậy, nên tránh ti ế p xúc trực ti ế p với da và hít phải hơi của các h óa ch ấ t này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao t á c này. Quy trình tách chiết A D N sử dụng kit tách chiết DNAeasy ® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506): - Nh ỏ 20 µl protease K v à o ố n g I y tâm 1 , 5 ml; - Chuyển 30 mg bệnh ph ẩ m ( 6 .1.3) v à o ống ly tâm đã có protease K; - Thêm 200 µl dung d ịch AL (Lysis buffer): - Trộn kỹ huy ễ n dịch trong 15 s, sau đó ly t â m nhanh bằng máy spindo w n (4.1.4); - Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4 1.4): - Thêm 200 µl etanol tuyệt đối (từ 96 % đến 100 %) (3.1.1) vào ống ly tâm; - Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s , sau đ ó ly t â m nhanh bằng máy spindown (4.1.4); - Hút 420 µ l huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển sang cột ly tâm có ống thu ở d ư ớ i: - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng; - Thêm 500 µl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới; - Ly tâm bằng máy ly t â m (4.1.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt đ ộ phòng; - Thay ống thu ở dưới cột ly tâm; - Thêm 500 µl dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột ly tâm c ó ống thu ở dưới: - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.2) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng; - Chuyển cột ly tâm sang ống ly tâm 1,5 ml; - Nh ỏ 200 µl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min; - Ly t â m b ằ ng máy ly tâm (4.1.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min; - Chuyển ADN đã thu được sang ống 1,5 ml khác. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] AAHRI - J.H. Lilley. R.B. Callinan. S . Chinabu t , S . Kanchanaknan , l.H. MacRse end M.J. Phil l ips. 2002. Epizootic Ulcerative Syndrome (EUS) Technical Handbook. The Aquatic Anima l Health Research Institute , Bangkok. [2] D.A.Huchzermeyer. Benjamin C. W va n der Waal. 2012. Epizootic u lce r ative syndr ome . Exotic fish disease threatens Africa’s aquatic ecosystems. Journal of the South A fri can Vete rin ar y Association , September 2012. [3] FAO and NACA - Asia Diagnosstic Guide to Aquatic A ni mal Diseases. Fisheries technical paper 402/2, Page 52, 88. [4] L illey J.H. , Callinan R.B., Chinabut S . , Kanchanakhan S ., MacRae I.H. & Phillips M .J (1998) Epizootic ulcerative syndrome (EUS) technical handbook. Aquatic Animal Health Research Institute , Bangkok, Thailand. [5] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang T ề , Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội. 2004. Bệnh học thủy sản NXB NN. [7] Phạm Minh Đức, Khoa Thủy sản, ĐH C ần Thơ. Hội chứng l ở loét ở cá - Epizoot i c Ulcerative Syndrome (EUS). 1) Th ô ng tin này đưa ra tạo đ iều kiện thu ậ n ti ệ n cho người sử dụng tiêu chu ẩ n và không ấ n đ ị nh sử d ụng s ản ph ẩ m c ủ a nhà cung c ấ p này . C ó thể sử d ụ ng c á c s ả n ph ẩ m t ương t ự n ế u cho các k ết qu ả tương đươ n g. 2) Th ô ng tin này đưa ra t ạo đi ề u kiện thuận tiện cho người sử dụng ti ê u chu ẩ n v à không ấn đ ị nh s ử dụng s ả n ph ẩ m n à y . Có thể sử dụ ng các s ả n ph ẩ m tươ n g tự nếu cho c á c kết quả tương đương. 3) Thông tin n à y đ ưa ra tạ o đ iề u kiện thuận ti ệ n cho người sử dụng tiêu c h u ẩ n và không ấ n định sử d ụng s ả n phẩm này. C ó th ể s ử dụn g các sản ph ẩ m tương tự nế u cho các k ế t qu ả tương đương.