TCVN11134:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11134:2015 ISO 22174:2005 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM - ĐỊNH NGHĨA VÀ YÊU CẦU CHUNG Microbiology of f ood and animal f eeding stuffs - Polymerase c hain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - General requirements and de fi nitions Lời nói đầu TCVN 11134:2015 hoàn toàn tương đương với ISO 22174:2005; TCVN 11134:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Lời giới thiệu PCR l à phương pháp nhanh, có độ nhạy v à độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm. Mặc dù đây là công nghệ tương đối mới, nhưng đang được ứng dụng nhiều trong phân tích thực phẩm. Tóm lại, các nguyên tắc hiện hành có thể được chia thành hai nhóm chính, tùy thuộc vào kiểu axit nucleic được dùng làm đích để khuếch đại: - Khuếch đại theo ARN (RT-PCR); - Khuếch đại theo ADN (PCR). C ó nhiều biến đổi của hai phương pháp đã được thiết lập và có thể đặc trưng cho mức độ phức tạp của chúng và kỹ thuật tự động. Mức độ đặc hiệu của các phương pháp khác nhau từ các phép thử sàng lọc phát hiện các trình tự axit nucleic thông thường đến chi vi sinh vật, đến các phép th ử đặc thù nhận biết thống nhất các tr ì nh tự axit nucleic đến chủng riêng biệt hoặc kiểu trình tự axit nucleic đặc hiệu. Tiêu chuẩn này đưa ra danh mục các yêu cầu đối với các phương pháp PCR được sử dụng để phát hiện các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm. Tiêu chuẩn này đưa ra các thuật ngữ và định nghĩa được dùng trong PCR và RT-PCR. Tiêu chuẩn này nằm trong bộ tiêu chu ẩ n với tên chung là Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Ph ả n ứ ng chuỗi polymer a se (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm: TCVN 7682 (ISO 20838), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Y ê u cầu về khuếch đại và phát hiện đối với c á c phương pháp định tính TCVN 10781 (ISO/TS 13136) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực p hẩ m bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thời gian thực - Phát hiện Escherichia coli sinh độc tố Shiga (STEC) và xác định các nhóm huyết thanh O 157, O 111, O 26, O 103 và O 145 TCVN 11131 (ISO/TS 20836), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phá t hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Phép th ử hiệu năng đối với máy chu trình nhiệt TCVN 11132 (ISO 22118) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện và định lượng vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Đặc tính hiệu năng TCVN 11133 (ISO 22119), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase real-time (PCR real-time) để phát hiện và định lượng vi sinh vật gây bệnh từ thực ph ẩ m - Định nghĩa và yêu c ầ u chung TCVN 11134 (ISO 22174), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Ph ả n ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh t ừ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung ISO 20837, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase c hain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Requirements for sample preparation for qualitat i ve detection [Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ th ự c phẩm - Yêu cầu về chuẩn bị mẫu đ ể phát hiện định t í nh]. VI SINH VẬT TRONG THỰC PH Ẩ M VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHẢN ỨNG CH UỖ I POLYMERASE (PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PH Ẩ M - ĐỊNH NGHĨ A VÀ YÊU CẦ U CHUNG Microbiology of f ood and animal f eeding stuffs - Real-time p olymerase c hain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - General requirements and de fi nitions CẢNH BÁO - Kh i áp dụng tiêu chuẩn này có thể li ê n quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiể m. Ti ê u chuẩn này không đ ư a ra được hết t ấ t c ả các v ấ n đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Ng ườ i sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng hoặc các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này đưa ra các yêu cầu chung để khuếch đại in vitro các trình tự axit nucleic (ADN hoặc ARN). Tiêu chuẩn này có thể áp dụng để phân tích thực phẩm và các chủng sinh được phân lập từ thực phẩm sử dụng phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Các yêu cầu tối thiểu được quy định trong tiêu chuẩn này được sử dụng để đảm bảo thu được các kết quả so sánh và kết quả tái lập trong các phòng thử nghiệm khác nhau. Tiêu chuẩn này đã được thiết lập đối với các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm hoặc các chủng phân lập t ừ thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng cho các nền mẫu khác (ví dụ: các mẫu môi trường) và để phát hiện các vi sinh vật không gây bệnh. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng ph i ên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có). TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung. TCVN 7682 (ISO 20838) V i sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Ph ả n ứng chuỗi polymeraza (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp định tính. TCVN 8244-1 (ISO 3534-1), Thống kê học - Từ vựng và ký hiệu - Phần 1: Thuật ngữ chung về thống kê và thuật ngữ dùng trong xác suất. ISO 20837, Microbiology of food and anima l f eeding stuffs - Polymerase c hain reaction (PCR) f or the detection of f ood-borne pathogens - Requirements for sample preparation for qualitative detection [Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Ph ả n ứng chuỗi polymerase (PCR) đ ể phát hiện vi sinh vật g â y bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về chuẩn bị mẫu đ ể phát hiện định tính]. 3 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau. Đối với các định nghĩa liên quan đến đánh giá xác nhận, xem TCVN 8244-1 (ISO 3534-1) và TCVN 6910-1 (ISO 5725-1). 3.1 Thuật ngữ chung 3.1.1 Axit nucleic (nucleic acid) Đại phân tử cung cấp thông tin di truyền hoặc hoạt động như một chất biểu hiện thông tin. CHÚ TH Í CH: Có hai lo ạ i axit nucleic: ADN và ARN. 3.1.2 ADN (DNA) Axit deoxyribonucleic (deoxyribonu cl eic acid) Polyme của deoxyribonucleotid ở dạng sợi đôi (dsADN) hoặc dạng mạch đơn thẳng (ssADN). 3.1.3 ARN (RNA) Axit ribonucleic ( r ibon u cleic acid) Polyme của ribonucleotid trong dạng mạch đôi hoặc dạng mạch đơn thẳng. 3.1.4 N ề n mẫu (matrix) Các sản phẩm để phân tích, c ó thể có các thành phần hóa học và trạng thái vật lý khác nhau. 3.1.5 Đi ề u kiện lặp lại (repeatability condition) Điều kiện mà tại đó các kết quả thử nghiệm độc lập nhận được với cùng một phương pháp, trên những mẫu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thí nghiệm, bởi cùng người thao tác, sử dụng cùng một thiết bị, trong khoảng th ờ i gian ngắn. [ISO 3534-1] 3.1.6 Đi ề u kiện tái lập (reproducibility condition) Điều kiện mà trong đ ó các kết quả thử nghiệm nhận được bởi cùng một phương pháp, trên các mẫu thử giống hệt nhau trong các phòng thí nghiệm khác nhau, với những người thao tác khác nhau, sử dụng các thiết bị khác nhau. [ISO 3534-1]. 3.1.7 Phát hiện (detection) Công nhận sự c ó mặt của axit nucleic đích. 3.1.8 Giới hạn phát hiện (LOD) (detection limit/limit of detection) (LOD) Hàm lượng tối thiểu hoặc nồng độ tối thiểu của vi sinh vật đích trong một lượng nền mẫu xác định có thể phát hiện được trong các điều kiện thực nghiệm quy định trong phương pháp. 3.1.9 Nhận b iế t (identification) Quá tr ì nh xác định chủng phân lập thuộc một trong các chủng c ầ n tìm. 3.2 Thuật ngữ liên quan đến tách chiết và tinh sạch ADN/ARN 3.2.1 Chiết ax i t nucleic (nucleic acid extraction) Xử lý mẫu thử để giải phóng axit nucleic đích. 3.2.2 Tinh sạch ax i t nucleic (nucleic acid puri fi cation) Phương pháp tạo ra ADN tinh sạch hơn. CHÚ THÍCH : Trong trường hợp này, tinh sạch là gi ả m bớt các ảnh hưởng c ó thể quan sát thấy của các chất ức chế phản ứng PCR trên các phép kiểm soát ức ch ế PCR. 3.2.3 ADN có ch ấ t lượng cho phản ứng PCR (PCR quality DNA) Khuôn mẫu ADN có độ dài và số lượng phù h ợ p cho PCR. 3.2.4 ARN có chất lượng cho phản ứng RT-PCR (RT-RCR quality RNA) Khuôn mẫu ARN có độ dài và số lượng phù hợp cho phiên mã ngược và PCR. 3.3 Thuật ngữ liên quan đến phiên mã ngược của ARN đến ADN 3.3.1 RT (RT) Phiên mã ngược (reverse transcription) T ổ ng hợp ADN từ khuôn mẫu ARN sử dụng enzym phiên mã ngược kết hợp với mồi RT trong sự có mặt của deoxyribonucleoside triphosphat. 3.3.2 Enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) Enzym xúc tác phiên mã ngược ARN thành A D N sử dụng các mồi RT. 3.3.3 R i bonuclease (ribonuclease) Enzym làm phân hủy ARN. 3.3.4 Ch ấ t ức chế ribonuclease (ribonu cl ease inhibitor) Chất l à m bất hoạt ribonuclease. 3.3.5 Mồi RT (RT-primer) M ồ i được s ử dụng trong phiên mã ngược. 3.3.6 Hỗn h ợ p RT (RT mix) Hỗn hợp thuốc thử dùng trong phiên mã ngược. 3.3.7 Deoxyribonucleos i d e triphosphat (deoxyribonucleoside triphosphate) dNTP (dNTP) Dung dịch chứa aATP, d C TP, dGTP, dTTP và/hoặc dUTP. 3.4 Thuật ngữ liên quan đến khuếch đại ADN bằng PCR/RT-PCR 3.4.1 Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) PCR (PCR) Quy trình enzym cho phép khuếch đại in vitro ADN. 3.4.2 RT-PCR (RT-PCR) Phương pháp gồm c ó hai phản ứng, phiên mã ngược (RT) của ARN thành ADN và chạy PCR. 3.4.3 RT-PCR một bước (one step RT-PCR) Phương pháp kết hợp phiên mã ngược (RT) ARN thành ADN và PCR trong một phản ứng đơn lẻ. 3.4.4 RT-PCR hai bước (two-step RT-PCR) Phương pháp bao gồm phiên mã ngược (RT) và PCR trong hai phản ứng riêng rẽ. CH Ú TH Í CH: RT-PCR hai bước có th ể được thực hiện liên liếp trong một ống đơn hoặc trong hai ống khác nhau. 3.4.5 Sản phẩm PCR (PCR product) ADN được khuếch đại bằng PCR. 3.4.6 Phát hiện s ả n phẩm PCR (detection of PCR product) Quá trình nhận t í n hiệu về sự có mặt của s ả n phẩm PCR. 3.4.7 Khẳng định sản phẩm PCR (confirmation of PCR product) Quá tr ì nh chứng minh s ả n phẩm PCR có nguồn gốc từ tr ì nh tự đích. 3.4.8 PCR-ELISA (PCR-ELISA) Phương pháp phát hiện các sản phẩm PCR trong pha lỏng sau thời gian lưu của chúng trên pha rắn, như trong các giếng của đĩa nhiều giếng. CHÚ THÍCH: Sự có mặt của các sản phẩm PCR được quan sát b ằ ng việc ph á t hiện enzym miễn dịch t i ếp theo và lai. 3.4.9 PCR khởi động nóng (hot-start PCR) Hoạt hóa polymerase ADN chịu nhiệt bằng bước l à m nóng ban đầu để tránh khuếch đại không đặc hiệu. 3.4.10 PCR lồng (nested PCR) PCR khuếch đại trình tự trong sản phẩm PCR đầu tiên. 3.4.11 PCR đa mồi (multiplex PCR) Ph ả n ứng PCR sử dụng nhiều cặp mồi. 3.4.12 Mồi (primer) Oligonucleotid c ó chiều dài xác định và trì nh tự b ổ sung cho một đoạn trình tự ADN cần phân tích có liên quan. CHÚ THÍCH: Mồi giống như tr ì nh tự ADN đ í ch. 3.4.13 ADN đích (DNA target) Trình tự ADN được chọn đ ể khuếch đại. 3.4.14 Biến tính (denaturation) Quá tr ì nh tách ADN sợi kép thành ADN sợi đơn. 3.4.15 Bắt cặp (annealing) Việc gắn kết mồi vào tr ì nh tự axit nucle i c b ổ sung trong các điều kiện quy định. 3.4.16 Kéo dài mồi (primer extention) Phản ứng enzym đ ể tổng hợp sợi ADN mới bằng cách thêm các deoxyribonucleotid đơn lẻ v à o đầu 3' của tr ì nh tự m ồ i. 3.4.17 ADN polymerase dùng cho PCR (ADN polymerase for PCR) Enzym bền nhiệt xúc tác tổng hợp ADN lặp lại. 3.4.18 Hỗn hợp gốc (mastermix) Hỗn hợp thuốc thử dùng cho PCR, không dùng cho ADN đích và các phép kiểm chứng. 3.4.1 9 UGN (UGN) Uracil N -glycosylat (uracil N -glycosylate) Enzym đ ể cắt mọi trình tự axit nucleic có chứa deoxyuridine (dUTP) tại vi trí c ủ a nucleotid đó. 3.4.20 Máy chu trình nhiệt (thermal cycler) Thiết bị tự động thực hiện các chu tr ì nh gia nhiệt và làm nguội cần thiết cho PCR. 3.4.21 Phân tích điểm kết thúc (endpoint analysis) Phân tích định tính để phát hiện các sản phẩm PCR. 3.4.22 Phân tích thời gian thực (real time analysis) Phương pháp phát hiện các s ả n phẩm PCR trong quá trình khuếch đại. 3.5 Thuật ngữ liên quan đến kiểm soát 3.5.1 Kiểm soát quá tr ì nh dương tính (positive process control) Mẫu được bổ sung các vi sinh vật đích, cần được xử lý theo cùng cách như xử lý mẫu thử. 3.5.2 Kiểm soát quá tr ì nh âm tính (negative process control) Mẫu không chứa sinh vật gây bệnh đích của nền mẫu thực phẩm được chạy qua tất cả các giai đoạn của quá trình phân tích. CHÚ TH Í CH: Quá tr ì nh n à y có thể bao gồm chuẩn bị m ẫ u, làm giàu, tách chi ế t A D N và khuếch đại đ í ch. 3.5. 3 Ki ể m soát khuếch đại 3.5.3.1 Kiểm soát khuếch đại bên trong (internal ampli f ication control) ADN được b ổ sung vào mỗi phản ứng với một lượng hoặc một số lượng bản sao xác định dùng để kiểm soát b ê n trong của việc khuếch đại. 3.5.3.2 Ki ể m soát khu ế ch đại bên ngoài (exte rn al ampli f ication contro l ) Kiểm soát ADN bổ sung vào một lượng axit nucleic chiết được với một lượng hoặc một số lượng bản sao xác định dùng để kiểm soát khuếch đại trong một phản ứng riêng biệt. 3.5.4 Kiểm soát tách chiết â m tính (negative extraction control) Mẫu chiết trắng (extraction blank) Việc kiểm soát thực hiện trong tất cả các bước của quy trình tách chi ế t ADN khi không có mặt mẫu thử. 3.5.5 Ki ể m chứng PCR dương tính (positive PCR control) Ph ả n ứng chứa ADN đích trong một lượng hoặc s ố lượng b ả n sao xác định. 3.5.6 Kiểm chứng PCR âm tính (negative PCR contro l ) Phản ứng thực hiện với nước không chứa ADN, không chứa chất ức chế PCR. 3.6 Thuật ngữ liên quan đến mẫu dò 3.6.1 M ẫ u dò ADN (DNA probe) Phân tử axit nucleic dán nhãn có trình tự xác định được sử dụng để phát hiện ADN đích bằng cách lai. 3.6.2 Thuốc thử hãm (blocking agent) Hợp chất được sử dụng đ ể l à m bão hòa các vị trí liên kết không đặc hiệu còn sót lại của pha rắn trước và trong quá trình l ai với mẫu dò ADN. 3.6.3 Lai (hybridization) Sự liên kết đặc hiệu của các trình tự axit nucleic bổ sung trong các điều kiện ph ả n ứng thích hợp. 3.6.4 Tính đặc hiệu ( specif i city) Khả năng nhận biết duy nhất cần phát hiện, phân biệt rõ ràng đích với các chất và các tạp chất tương tự. 4 Nguyên tắc 4.1 Yêu cầu chung Việc kiểm tra bao gồm các bước liên tiếp sau đây: a) làm giàu các vi sinh vật ban đầu của vi sinh vật gây bệnh từ mẫu thử, nếu cần (xem 4.2); b) tách chiết axit nucleic và tinh sạch, nếu cần (xem 4.3); c) khuếch đại trình tự axit nucleic bằng PCR sử dụng các mồi đặc hiệu (xem 4.4); d) phát hiện các sản phẩm PCR đặc hiệu (xem 4.5). 4.2 Làm giàu vi sinh vật ban đầu Nếu cần, tăng số lượng tế b à o sinh vật gây bệnh từ thực phẩm được phát hiện bằng cách kích thích phát triển các vi sinh vật đích trong mẫu trong môi trường dinh dưỡng l ỏ ng chọn lọc hoặc không chọn lọc. CHÚ THÍCH: Đố i với virus, c ó sẵn các kỹ thuật khác như lọc và/hoặc c ô đặc. 4.3 Chuẩn b ị axit nucleic Các tế bào vi sinh vật có trong mẫu thử hoặc trong giống cấy đã làm giàu được thủy gi ả i để giải phóng các ADN. Nếu cần, bước tách được bổ sung trước thủy giải và/hoặc bước tinh sạch được thực hiện sau khi thủy giải. 4.4 Khu ế ch đại PCR Các trình tự axit nucleic đặc hiệu được khuếch đại bằng PCR. Phản ứng l à quá tr ì nh theo chu k ỳ gồm ba bước sau: a) biến tính axit nucleic sợi đôi (dADN) b) mồi bắt cặp vào trình tự đích bổ sung; c) kéo dài mồi đã gắn bằng ADN polymerase ch ị u nhiệt. ARN c ó thể phát hiện được bằng PCR nếu đích đầu tiên đã được phiên mã thành một ADN bản sao (cADN) bằng phiên mã ngược. CHÚ TH Í CH 1: Sau biến tính ADN sợi đ ô i, hai cặp mồi oligonucleotid sẽ bắt cặp với đoạn ADN đích c ầ n khuếch đại. Các mồi đị nh hướng ngược nhau theo hướng của chúng với trình tự đích. CH Ú TH Í CH 2: C á c vùng sợi kép được h ì nh thành l à kết quả của cặp base đặc hiệu g i ữa các mồi và trình tự đích bao quanh đoạn A D N cần khuếch đại và là các vị trí khởi động để tổng hợp ADN bằng cách sử dụng ADN polymerase chịu nhiệt. CHÚ THÍCH 3: Quá trình lặp lại của việc bi ế n tính nhiệt, bắt cặp mồi và tổng hợp ADN (các chu tr ì nh) dẫn đến việc khuếch đại số mũ đoạn A D N được bao quanh bởi các mồi. 4.5 Phát hiện và kh ẳ ng định các sản phẩm PCR C á c sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di gel hoặc phương pháp thích hợp khác. Việc nhận biết các sản phẩm PCR được khẳng định lại bằng phương pháp thích hợp, nếu cần. 5 Vật liệu thử nghiệm Mọi loại thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi đều thích hợp làm vật liệu thử, với điều kiện là dung dịch axit nucleic được chuẩn bị từ mẫu không ức chế PCR. 6 Yêu cầu chung đối với phòng thử nghiệm 6.1 Yêu cầu chung Việc nhiễm b ẩ n ADN ngẫu nhiên có thể bắt nguồn từ bụi và phân t án sol khí. Do đó, việc tổ chức khu vực làm việc trong phòng thử nghiệm và thực hành phòng thử nghiệm tốt cần: a) ngăn chặn có hệ thống về các bước phương pháp luận liên quan đến việc thu được các kết qu ả b) theo nguyên tắc “một chiều" để xử lý mẫu. Các biện pháp này đảm bảo rằng A D N trong v ậ t liệu thử nghiệm và ADN khuếch đại được tạo ra bởi PCR giữ nguyên tính chất vật lý riêng rẽ. 6.2 Nhân sự Tất cả mọi người tham gia vào quá trình thử nghiệm phải được đào tạo về kỹ thuật PCR và vi sinh vật. Phải mặc các bộ áo b ả o hộ khác nhau trước và sau khi chạy PCR. Sử dụng găng tay dùng một lần khi chuẩn bị mẫu và khi chạy PCR. Áo choàng và găng tay phòng thử nghiệm phải thay đ ổ i định kỳ. 6.3 Bố tr í phòng thử nghiệm 6.3.1 Yêu cầu chung Để tránh nhiễm bẩn hỗn hợp phản ứng bởi các trình tự đích được khuếch đại trước đó, cần đ ả m bảo rằng có sẵn các khu vực làm việc tách biệt với đầy đủ thiết bị, dụng cụ. 6.3.2 Khu vực làm việc và thiết bị làm việc Có ít nhất bốn khu vực làm việc chuyên dụng riêng rẽ và thiết bị làm việc cần thiết: a) khu vực làm việc để chuẩn bị dung dịch axit nucleic từ mẫu thử; b) khu vực làm việc đề chuẩn b ị hỗn hợp g ố c; c) khu vực làm việc để bổ sung dung dịch axit nucleic đã chu ẩ n bị từ mẫu thử; d) khu vực làm việc để phát hiện và khẳng định các sản phẩm PCR. Việc khuếch đại có thể được thực hiện trong khu vực làm việc c) hoặc khu vực làm việc d). Nếu máy chu tr ì nh nhiệt được đặt trong khu vực làm việc c), thì các ống ch ứ a các s ả n p hẩ m phản ứng khuếch đại không được m ở trong khu vực làm việc c). Phải sử d ụ ng các bộ pipet khác nhau để chuẩn bị mẫu và chuẩn bị hỗn hợp gốc. Cần thực hiện các thực nghiệm trong các điều kiện môi trường thích hợp. Việc sử dụng các phòng khác nhau là hiệu qu ả nhất và là cách thích hợp để đảm bảo các khu vực làm việc và các thiết bị riêng biệt. CH Ú TH Í CH: Các s ả n phẩm PCR c ó thể bị phá hủy b ở i d ung dịch hypoclori d e 3 % khối lượng. 6.4 Quản lý ch ấ t thải Cần sử dụng các quy trình quản lý chất thải và khử nhiễm thích hợp. 7 Thuốc thử Sử dụng các thuốc thử nêu trong ISO 20837 và TCVN 7682 (ISO 20838). 8 Thiết bị và dụng cụ 8.1 Yêu c ầ u chung Các phòng thử nghiệm cần sử dụng thi ế t bị được b ả o dưỡng đúng cách theo hướng dẫn của nhà sản xuất và các yêu cầu nêu trong TCVN ISO/IEC 17025. Ngoài ra, các thiết bị phòng thử nghiệm chuẩn, d ụng cụ quy định cụ thể được miêu tả trong các tiêu chuẩn cụ thể. 8.2 Các xem x é t đặc biệt Khi thích hợp, cần hiệu chuẩn thiết bị định kỳ nếu hiệu năng có ảnh hưởng đến kết quả. 9 Cách tiến hành 9.1 Chuẩn bị mẫu Thực hiện thủy giải tế bào , chu ẩ n bị axit nucleic và/hoặc tinh sạch mẫu thử theo phương pháp nêu trong ISO 20837. 9.2 Khuếch đạ i Cho dung dịch axit nucleic vào hỗn hợp phản ứng và thực hiện các bước còn lại của PCR, sử dụng chương trình nhiệt độ/thời gian và số chu trình thích hợp đối với hệ thống mồi và hỗn hợp phản ứng được sử dụng theo phương pháp. Việc không c ó mặt chất ức chế PCR phải được chứng minh bằng các phép kiểm ch ứ ng thích hợp. 9.3 Ki ể m chứng phản ứng Các phép kiểm chứng cần thiết để phát hiện các vi sinh v ậ t gây bệnh b ằ ng PCR nêu trong B ả ng 1. Các kiểm chứng PCR dương tính thích hợp (có mặt trình tự đích) và các phép kiểm chứng âm tính (không có mặt trình tự đích) phải bao gồm trong mỗi bước. Các phép kiểm chứng cần được bổ sung trong các khoảng thời gian định kỳ và phải thường xuyên thực hiện nếu một trong các phép kiểm ch ứ ng khác không cho kết quả như mong đợi. Bảng 1 - Các phép kiểm chứng cần cho phân tích mẫu bằng PCR Kiểm soát quá trình âm tính a Kiểm soát quá trình d ươ ng tính a Ki ể m soát chiết â m tính b Kiểm soát khuếch đ ại b ê n trong/ bên ngoài c Kiểm soát PCR dương tính d Kiểm soát PCR âm tính d Xử lý mẫu ↓ ↓ Chiết axit nuc l eic ↓ ↓ ↓ Khu ế ch đại ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Phát hiện ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ a Tần su ấ t sử dụng phải được xác định như một phần của chương trì nh đảm bảo chất lượng của ph ò ng thử nghiệm; b Phép kiểm chứng này l à kh ô ng cần thiết khi đã thực hiện kiểm soát quá tr ì nh âm tính . c Kiểm soát khuếch đại bên tr ong hoặc bên ngo à i phải thực hiện với mỗi ph ả n ứ ng PCR. d Kiểm so á t này cần đối vớ i từng mẻ của mẫu t rong chạy chu tr ì nh . ↓ Các quá trình bao gồm trong phép kiểm chứng này. 9.4 Khẳng định các kết quả PCR Sự có mặt sản phẩm PCR và tính đặc hiệu của sản ph ẩ m này phải được chứng minh bằng phản ứng kh ẳ ng định thích hợp (xem 4.5). Kết quả PCR dương tính cũng có thể được khẳng định bằng phương pháp nuôi cấy. 10 Đánh giá Có thể đánh giá nếu các kết quả thu được bằng các phép kiểm chứng quy định trong 9.3 là rõ ràng. Các kết qu ả PCR dương tính và việc diễn giải các kết qu ả này được nêu trong B ả ng 2. Bảng 2 - K ế t quả PCR M ẫ u thử Ki ể m soát quá trình dương tính PCR dương tính Ki ể m soát quá trình âm t ính Kiểm soát chiết â m tính Ki ể m soát PCR âm t í nh Ki ể m soát khuếch đại b ê n trong Kiểm soát khuếch đại b ê n ngoài Diễn giải k ế t quả + + + - +/- + Dương t í nh - + + - + + Â m t í nh + + + + +/- +/- Không kết luận a - - + - - - Không k ế t luận b + Phát hiện được sản phẩm PCR - Không phát hiện được s ả n ph ẩ m PCR a Có thể bị nhiễm b Có khả năng bị ức chế. 11 Báo cáo kết quả Báo cáo kết quả này phải tuân thủ các yêu cầu trong TCVN/ISO/IEC 17025 và phải bao gồm ít nhất các thông tin sau: a) mọi thông tin cần thi ế t về nhận biết mẫu thử; b) mọi chi tiết liên quan đến mẫu phòng thử nghiệm (ví dụ: cỡ không đủ, tình trạng suy gi ả m chất lượng); c) viện dẫn tiêu chuẩn được sử dụng để thử nghiệm và c ác phương pháp phải thực hiện; d) ngày nhận mẫu; e) các điều kiện bảo quản; f) ngày bắt đầu/ngày kết thúc phân tích; g) người thực hiện phân tích; h) c ỡ mẫu thử; i) kết quả thử nghiệm; j) mọi điểm bất thường quan sát được trong quá trình thử nghiệm; k) mọi sai lệch, b ổ sung hoặc gi ả m bớt so với quy định của phép thử và mọi thông tin liên quan đến phép thử đặc hiệu. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] SAMBROOK J ., FRITSCH E.F. ADN MANIATIS T. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual . Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (ISBN: 0879693096)