TCVN8400-27:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-27:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 27: Bệnh sán lá gan TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-27:2014 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 27: BỆNH SÁN LÁ GAN Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 27: Fasciolosis Lời nói đầu TCVN 8400-27:2014 do Trung tâm Ch ẩ n đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 27: BỆNH SÁN LÁ GAN Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 27: Fasciolosis CẢNH BÁO - Vi ệ c áp dụng tiêu chu ẩ n này có thể li ê n quan đến các vật liệu, thi ế t bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không th ể đưa ra được h ế t t ấ t cả các v ấ n đề an toàn liên quan đến vi ệ c sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phả i tự thi ế t lập các thao tác an toàn sức khỏe th í ch h ợ p và xác đ ị nh khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng t i êu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chu ẩ n này quy định quy trình chẩn đoán bệnh sán lá gan trên gia súc. 2. Thuật ngữ và định nghĩa 2.1. B ệ nh sán lá gan (Fasciolosis) Bệnh sán l á gan là một bệnh lây giữa người và động vật, do hai loài Fasciola hepatica và Fasciola gigantica gây ra. Các sán này thường ký sinh ở ống dẫn mật, có khi ở cả phổi, tim, hạch lâm ba, tuyến tụy của gia súc, thậm chí trên cả người. Bệnh lây lan qua loài ký ch ủ trung gian là ốc nước ngọt như Limnaea aur i cular i a, L . swinhoci... CHÚ TH Í CH: bệnh thường th ấ y ở thể mạn t í nh tr ên gia súc và vật nuôi, tuy nhi ê n gần đây bệnh nổi lên nh ư một bệnh lý quan trọng ở người, ảnh hưởng sức kh ỏe cộng đồng. 2.2. ELISA (Enzymed Linked Immunosorbent Assay): phép thử miễn dịch liên kết enzyme. 2.3. PCR (Polymerase Chain Reaction): phản ứng chuỗi polymeraza. 2.4. TAE (tris acetate EDTA): dung dịch đệm axetat. 2.5. PBS (phosphate buffere d saline): dung dịch đệm phosphat. 2.6. OD (optical density): mật độ quang học. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng các thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích được công nhận và nước cất hoặc nước có độ tinh khi ế t tương đương. 3.1. Dung dịch kẽm - mu ố i (xem đ iều A.2 phụ lục A) 3.2. Cặp m ồ i dùng để phát hiện sán lá gan (xem b ả ng 1) 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết b ị , dụng cụ của phòng thử nghiệm sinh học và cụ thể như sau: 4.1. T ủ lạnh âm sâu , có thể duy tr ì nhiệt độ từ âm 20 ° C đến âm 80 ° C . 4.2. Tủ lạnh , có thể duy tr ì nhiệt độ từ 2 ° C đến 8 ° C. 4.3. Kính hiển vi quang học , có độ phóng đại 40 lần, 100 lần, 400 lần. 4.4. T ủ ấ m , có th ể duy trì nhiệt độ ở 37 ° C . 4.5. Cân phân tích , c ó th ể từ 0,1 g đến 10 g. 4.6. Máy ly tâm , có thể ly tâm với gia tốc 500 g, 1 000 g, 3 000 g. 4.7. Máy đọc ELISA. 4.8. Máy PCR. 4.9. Phiến k í nh . 4.10. Lamen. 4.11. L ư ới lọc phân , có kích thước lỗ lọc 200 μm. 5. Cách tiến hành 5.1. Chẩn đoán lâm sàng 5.1.1. Đặc điểm dịch tễ - Sán lá gan gây bệnh cho động vật ăn cỏ như tr âu, bò, dê, c ừu , ngoài ra bệnh còn gặp ở lợn và người; - Bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi, mọi giống và không phân biệt tính biệt. Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán tỷ lệ thuận với tuổi của động vật cảm nhiễm; - Bệnh thường gặp ở vùng đồng bằng và miền núi, nh ấ t là những nơi lầy lội, ẩm th ấ p, nước ngập quanh năm. 5.1.2. Triệu chứng 5.1.2.1. Thể c ấ p tính - Bệnh ở th ể cấp t í nh thư ờ ng gặp ở gia súc non. Bê, nghé, d ê , cừu bỏ ăn, mệt mỏi, lười vận động, chướng h ơ i dạ cỏ, sau đó tiêu chảy dữ dội, phân l ỏ ng màu xám, có mùi tanh. Chỉ vài ngày sau con vật nằm bệt và ch ế t trong tình trạng mất nước, rối loạn điện giải và kiệt sức; - Bệnh nặng hơn khi bê nghé nhiễm thứ phát các vi khu ẩ n gây bệnh có sẵn trong đư ờ ng ruột như: Salmonella, E. coli, Proteus . Đôi khi, trâu bò chết cấp t í nh mà không biểu hiện triệu chứng; - Ở bê, nghé hoặc cừu non bệnh thường thấy ở trạng thái cấp hoặc ở cấp tỉnh, có hiện tượng xuất huyết do sán di hành hoặc nhiễm độc k ế phát từ bệnh gây ra do Clostr i dium (viêm ruột hoại tử) hoặc bệnh Corynebacter i a (áp xe gan); - Ở giai đoạn sớm và trong tr ườ ng h ợ p số lượng sán lá gan trong đường mật chưa có nhiều, các biểu hiện của bệnh thường ít được chú ý. Các biểu hiện có thể gặp là đau vùng thượng vị, sốt, nôn, tiêu chảy, ngứa. 5.1.2.2. Thể mạn tính - Phổ biến ở trâu, bò, dê, cừu trư ở ng thành được nuôi dưỡng tốt và sán đã ở giai đoạn trư ở ng thành, k ý sinh trong ống mật với số lượng ít. Triệu chứng thể mạn t í nh xuất hiện sau thể cấp tính nửa tháng tới hai tháng; - Gia s ú c ăn ít, gầy còm, suy nhược; - Con vật có biểu hiện thiếu máu, niêm mạc nhợt nhạt, lông xù x ì , th ủy thũng mi mắt, ngực; - Tiêu chảy kéo dài, đôi khi táo bón, phân màu đen, m ấ t dần khả năng sinh sản và làm việc; - Gia súc có thể chết do suy kiệt. 5.1.3. B ệ nh tích 5.1.3.1. Thể c ấ p tính - Gan xuất huyết, trên mặt gan có khi thấy những đường đi của sán non làm thành những vệt đỏ thẫm dài từ 2 mm đến 4 mm, trong ống dẫn mật có sán non nhỏ, số lượng nhi ề u; - Lớp thanh mạc xuất huy ế t nhẹ, đôi khi có tơ huy ế t; - Khi nhiễm nặng th ì viêm phúc mạc, gan xuất huy ế t nhiều, niêm mạc nhợt nhạt. 5.1.3.2. Thể mạn t í nh - Viêm túi mật mạn tính, ống dẫn mật dày lên do mô liên kết tăng sinh; - Thành ống mật có hiện t ư ợng canxi hóa; - Tổ chức gan tổn thương thoái hóa và cuối cùng là dẫn đến xơ gan. Những nơi mô gan bị phá hủy, có những đám màu vàng xám, khi kiểm tra dưới kính hi ể n vi th ấ y nh ư mô gan mất màu; - Bệnh ở thể mạn t í nh xuất hiện sán tr ưở ng thành trong túi mật và ống dẫn mật. 5.2. Chẩn đoán trong phòng th í nghiệm 5.2.1. L ấ y mẫu 5.2.1.1. Lấy mẫu cho x é t nghi ệ m kháng th ể - Mẫu huyết thanh: sử dụng xy lanh vô trùng để l ấ y 1 ml đến 5 ml máu ở t ĩ nh mạch c ổ hoặc động mạch đuôi của trâu, bò, dê, cừu nghi mắc bệnh chưa tiêm vắc xin phòng bệnh sán lá gan. Máu lấy ra được chứa trong bơm tiêm, rút pit tông tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên bơm ti ê m hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghi ê ng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đ ế n 2 h ở nhiệt độ b ì nh thư ờ ng, tránh ánh nắng trực ti ế p. Sau đó, ch ấ t huyết thanh sang ống nghiệm vô trùng khác (hoặc ống eppendor f ) thực hiện xét nghiệm mô tả tại 5.2.3 - phát hiện kháng thể bằng phương pháp ELISA; - Mẫu sữa: l ấ y sữa trực ti ế p ngay từ con vật hoặc lấy sữa đ ã vắt cho vào ống vô trùng c ó n ắ p đậy để thực hiện xét nghiệm mô tả tại 5.2.3 - phát hiện kháng thể bằng ph ươ ng ph á p EL I SA. 5.2.1.2. L ấ y mẫu cho xét nghi ệ m kháng nguyên - Mẫu phân: dùng túi nilon sạch, lộn ngược rồi đeo vào tay hoặc đeo găng tay bảo hộ , đưa tay vào trực tràng l ấ y phân trực tiếp trong trực tràng con vật hoặc lấy phân con vật vừa th ả i ra ngoài môi trường, đựng mẫu ph â n lấy được vào lọ miệng rộng hoặc túi nilon sạch thực hiện xét nghiệm mô tả tại 5.2.2.1 - phát hiện kháng nguy ê n bằng phương pháp lắng cặn; 5.2.1.2 - phát hiện kháng nguy ê n bằng phương pháp lắng cặn - phù nổi; và 5 .2.2.3 - phát hiện kháng nguyên bằng ph ươ ng pháp ELISA; - Trứng sán: thu hồi trong phân của gia súc bằng phương pháp lắng cặn hoặc lắng cặn - phù nổi thực hiện xét nghiệm mô tả tại 5 .2.2.4 - phát hiện kháng nguyên bằng phương pháp PCR; - Con sán: cắt nhỏ từng nhu mô gan hay bộc lộ ống dẫn mật, t ú i mật để lấy sán thực hiện xét nghiệm mô tả tại 5.2.2 .4 - phát hiện kháng nguyên bằng phương pháp PCR. 5.2.1.3. Bảo quản mẫu Trong quá trình vận chuyển phải bảo quản mẫu trong thùng bảo ôn (nhiệt độ từ 2 ° C đến 8 °C) không quá 48 h. Ở phòng thí nghiệm, n ế u chưa xét nghiệm ngay, phải được giữ trong tủ lạnh âm sâu (4.1) đối với mẫu huyết thanh và t ủ lạnh (4.2) đối với mẫu máu chống đông. CHÚ TH Í CH: không l ấ y m ẫ u huy ế t thanh ở trâu bò đã được tiêm vắc xin phòng bệnh sán lá gan để xét nghiệm kháng thể vì các phương pháp trong tiêu chu ẩ n này không phân biệt được kháng thể nhiễm tự nhiên hay kháng th ể d o tiêm vắc xin. 5.2.2. Phát hiện kháng nguyên 5.2.2.1. Phát hiện kháng nguy ê n b ằ ng ph ư ơng pháp lắng cặn 5.2.2.1.1. Nguy ê n tắc Dựa vào sự chênh lệch khối lượng riêng giữa trứng sán lá gan và khối lượng riêng của nước, trứng sán lá gan có khối lượng riêng lớn sẽ chìm xuống. CHÚ THÍCH: ph ư ơng pháp này cho phép phát hiện trứng sán trong phân khi sán đã t rưở ng thành và thải trứng, tức là sau nhiễm từ 8 tuần đ ế n 10 tuần. 5.2.2.1.2. Cách tiến hành - Dùng cân phân tích (4.5) cân 3 g phân cần xét nghiệm, cho v à o cốc thủy tinh hoặc cốc nhựa thứ nhất; - Đổ 50 ml nước cất vào cốc chứa phân. Dùng đũa thủy tinh khuấy cho tan thành huyễn dịch; - Dùng lư ớ i lọc phân (4.11) lọc huyễn dịch ở cốc th ứ nh ấ t chuyển sang cốc thứ hai và loại b ỏ c ặn l ớ n; - Để lắng cốc thứ hai trong 3 min, đổ b ỏ phần nước phía trên và thu l ấ y phần cặn; - Thêm 50 ml nước cất vào cốc chứa ph ầ n cặn trên, khuấy đ ề u; - Đ ể lắng trong 3 min, đổ bỏ phần nước phía trên và thu lấy ph ầ n cặn; - Thêm 50 m l nước sạch vào cốc chứa phần cặn, khuấy đều; - Để lắng trong 3 min, đổ bỏ phần dung dịch phía trên và thu lấy ph ầ n cặn đổ vào đĩa petri; - Kiểm tra trên kính hiển vi quang học (4.3) ở độ phóng đại 40 lần hoặc 100 lần. CHÚ THÍCH: có thể giữ cặn trong đĩa petri ở 4 ° C đ ể kiểm tra vào hôm sau. 5.2.2.1.3. Đọc kết quả - Kết quả được coi là d ương tính khi t ì m thấy trứng sán lá gan, màu vàng chanh, trong chứa ph ô i bào xếp kín, kích thước chiều d à i từ 0,11 mm đến 0,15 mm, chiều rộng từ 0,07 mm đến 0,08 mm; - Cần phân biệt về kích thước và màu sắc giữa trứng sán lá gan với trứng sán lá dạ cỏ: 1) Sán l á dạ cỏ: trứng có màu tro, phôi bào xếp thành từng cụm, rời rạc, kích thước chiều dài từ 0,12 mm đến 0,19 mm và chiều rộng từ 0,07 mm đến 0,09 mm; 2) Sán lá gan: trứng có màu vàng chanh, phôi bào xếp k í n, đều, kín vỏ trứng, có nắp, kích thước chiều dài từ 0,11 mm đến 0,15 mm và chiều rộng từ 0,07 mm đến 0,08 mm. 5.2.2.2. Phát hiện kháng nguyên bằng ph ươn g pháp lắng cặn - phù nổi 5.2.2.2.1. Nguyên tắc Dựa vào khối lượng riêng giữa trứng sán lá gan và dung d ị ch kẽm - muối (xem điều A.2 phụ lục A), trứng sán lá gan có khối lượng riêng nhỏ hơn sẽ nổi lên phía trên. CHÚ TH Í CH: Phương pháp n à y cho phép phát hiện trứng sán trong phân khi sán đ ã trưởng thành và thải trứng, tức là sau nhiễm từ 8 tuần đ ế n 10 tuần. 5.2.2.2.2. Cách tiến hành - Dùng cân phân t í ch (4.5) cân 4 g phân cho vào cốc nhựa có dung tích 100 m l ; - Đổ 50 ml dung dịch f ormol 1 % (xem đi ề u A.3 phụ lục A) vào cốc chứa phân; - Hòa nhuyễn dung dịch phân, lọc ba lần qua lưới lọc phân (4.11) để loại bỏ cặn l ớ n; - Đổ thêm 50 ml dung dịch f ormol 1 %, để dung dịch lắng ít nh ấ t 1 h; - Đ ổ phần dung dịch nổi phía trên, thu lấy phần cặn r ồ i đổ vào ống có dung tích 15 ml; - Ly tâm ống với gia tốc 1 000 g trong 5 min (4.6); - Đổ dung dịch nổi phía trên; - Cho dung dịch kẽm - muối (xem đi ề u A.2 phụ lục A) đến cách mép ống 2 cm. Đào đều dung dịch phân trong ống; - Ly tâm ống với gia tốc 500 g trong 5 min (4.6); - Đ ổ thêm d ung dịch kẽm - muối (xem điều A.2 phụ lục A) đầy ố ng, phủ lamen (4.10) lên phía trên miệng ống và để yên 1 min; - Nh ấ c lamen lên cho vào phiến kính (4.9); - Kiểm tra trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 40 l ầ n hoặc 100 làn (4.3). 5.2.2.2.3. Đọc k ế t quả Kết quả được coi là dương tính khi tìm thấy trứng sán lá gan, màu vàng chanh, trong chứa phôi bào xếp kín, kích thước chiều dài từ 0,11 mm đến 0,15 mm, chiều rộng từ 0,07 mm đến 0,08 mm. CH Ú THÍCH: do khối lượng riêng của d ung dịch k ẽ m - muối b ã o hòa cao do đ ó trứng có th ể b ị phá hủy, gây khó khăn cho v iệ c chẩn đoán ph â n biệt với trứng sán lá dạ cỏ n ê n c ầ n đọc kết quả ngay sau khi t iế n hành các bước. 5.2.2.3. Phát h iệ n kháng nguyên bằng ph ươ ng pháp ELISA Hiện nay các kít ELISA thương mại đã có sẵn trên thị trư ờ ng dùng để phát hiện kháng nguyên sán lá gan trên trâu b ò (xem phụ lục B). 5.2.2.4. Phát hiện kháng nguyên b ằ ng phương pháp PCR 5.2.2.4.1. Tách chi ế t ADN - Xử lý mẫu 1) Sán lá gan: cắt một mẩu sán có kích thước khoảng 0,5 mm x 0,5 mm; 2) Trứng sán lá gan thu hồi từ phân gia súc bằng phương pháp lắng cặn hoặc phương pháp lắng cặn phù nổi; 3) Các mẫu trên rửa ba lần với dung dịch PBS 0,01 M pH 7,2, sau đ ó bảo quản trong etanol 70° ở nhiệt độ từ 4 ° C đến 8 ° C cho đến khi sử dụng. - Tách chiết ADN: sử dụng kít tách chiết mô thương mại: Các mẫu được cắt nhỏ, nghi ề n nhuyễn bằng cối chày sứ, cho vào ống chứa 600 μl dung dịch đệm (Tris-HC l 100 mM, pH 8,0; EDTA 100 mM, pH 8,0; SDS 2 %; NaC l 150 mM và proteinase K 200 mg/ml), trộn đều, sau đó ủ ở nhiệt độ 56 ° C trong 2 h hoặc qua đêm ở nhiệt độ 37 ° C . Lọc huyễn dịch qua màng lọc chuyển phần nư ớ c lọc vào ống 2 ml, ly tâm dung dịch với gia tốc 3 000 g (4.6) trong 3 min. Bỏ phần nước trong phía trên, thu l ấ y phần cặn. 5.2.2.4.2. Ti ế n hành phản ứng PCR Phản ứng PCR xét nghiệm Fasciola hepatica trong qu y trình này sử dụng các cặp mồi để phát hiện gen đích COX 1. Trình tự cặp mồi đ ượ c nêu trong Bảng 1. Bảng 1 - Trình tự cặp m ồ i Gen đích Mồi Trình tự cặp mồi 5’ - 3' F. hepat i ca Kích c ỡ sản phẩm bp Ch u trình nhiệt COX1 Mồi xuôi TATGTTTTGATTTTACCCGGG 405 Chu trình 30 vòng: 95 ° C , 60 s; 56 ° C , 90 s; 72 ° C , 90 s Mồi ngược ATGAGCAACCACAAACCATGT 5.2.2.4.3 . Hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt - Chu ẩ n b ị hỗn hợp (master - mix) (ví dụ theo hướng dẫn bộ k i t Qiagen của nhà sản xuất) với tổng lượng 50 μ l bao gồm KC l 50mM; Tris-HC l 10mM (pH 9.0); Triton X - 100; dNTP 200 mM; MgC l 2 2,5 mM; mồi xuôi 0,1 mM; mồi ngược 0,1 mM; Taq ADN 1,0 U . GHI CHÚ: ph ả n ứng PCR phải bao gồm mẫu kiể m tra, mẫu đ ố i chứng dương và mẫu đ ố i chứng âm. 5.2.2 . 4 .4. Điện di s ả n ph ẩ m PCR Pha 1,2 g bột agarose (gel) với 100 ml TAE 1 X, rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn. Khi hỗn hợp nguội bớt (khoảng 50 ° C đến 60 °C), cho tiếp 2 μl etidium brom u a vào. Sau đó đổ vào khay và cắm lược. Để gel cứng lại trong khoảng 1 h, rồi rút lược ra. Đổ đầy dung dịch TAE 1 X vào bể điện di (đến vạch "full level"), đặt khay gel v à o vị trí trong bể điện di. Pha 2 μ l đệm tải mẫu với 15 μ l của sản phẩm mẫu vừa khuếch đại, mẫu đối chứng dương, âm cho vào giếng của miếng gel. Điện di gel ở 80 V đến 100 V trong 30 min đ ế n 40 min. Đặt gel đã điện di vào máy chiếu UV có bước sóng 590 nm. 5.2.2.4.5. Đọc kết quả - Mẫu dương t í nh khi hiển thị vạch sản phẩm giống như đ ố i chứng dương và có k ích thước 405 bp với điều kiện đối ch ứ ng âm không có vạch sản ph ẩ m xu ấ t hiện; - Mẫu âm tính khi không có vạch sản ph ẩ m xuất hiện và giống đối chứng âm; - M ẫ u nghi ngờ hiển thị vạch sản phẩm không r õ nét hoặc hiển thị nhiều hơn 1 vạch sản ph ẩ m. Trường hợp này cần xét nghiệm lại hoặc sử dụng các phương pháp để kh ẳ ng định. 5.2.3. Phát hiện kháng thể b ằ ng phương pháp EL I SA Hiện nay các k í t ELISA thương mại đã có sẵn trên thị trường dùng để phát hiện kháng thể sán lá gan trên trâu bò (xem phụ lục C). CHÚ TH Í CH: k í t phát hiện kháng th ể sán lá gan không thể ph â n biệt được kháng th ể do nhiễm tự nhiên hay kháng th ể do tiêm vắc xin. 6. Kết luận Gia súc được kết luận là mắc bệnh sán lá gan khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh và có kết qu ả xét nghiệm kháng nguyên hoặc kháng thể dương tính bằng một trong những phương pháp quy định trong tiêu chu ẩ n này. PHỤ LỤC A (Quy định) Môi trường và dung dịch thuốc thử cho phương pháp lắng cặn - phù nổi phát hiện trứng sán lá gan A.1 . Nước muối bão hòa , khối lượng riêng 1,2 Natri clorua (NaC l ): 400 g Nước: 1 lít Dùng đũa thủy tinh khuấy đ ề u cho đến khi muối khống tan được nữa th ì ngừng. A.2 Dung dịch kẽm - muối , khối lượng riêng 1,53 Kẽm clorua (ZnC l 2 ) 1280 g Nước 610 ml Nước muối bão h òa 650 ml A.3 . Dung dịch f ormol 1 % Formaldehyd: 1 ml Nước c ấ t: 99 ml PHỤ LỤC B (Tham khảo) Phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên sán lá gan B.1 . Chuẩn bị nguyên liệu - Dung dịch đệm pha loãng mẫu (5 X): pha loãng dung dịch đệm với nước c ấ t đã khử ion theo tỷ lệ 1/5 (cho 20 ml dung dịch đệm 5 X vào 80 ml nước c ấ t đã khử ion); - Dung dịch rửa (20 X): pha loãng dung dịch rửa với nước cất đã khử ion theo tỷ lệ 1/20 (cho 50 ml dung dịch rửa 20X vào 950 ml nước cất đã khử ion); - Kháng thể gắn enzyme biotin (50 X): pha loãng kháng thể gắn er xz yme biotin với d ung dịch đệm đã pha loãng theo t ỷ lệ 1/50 (cho 20 μl kháng thể gắn enzyme biotin 50 X và o 980 μl dung dịch đệm đ ã pha loãng); - Kháng thể gắn enzyme avidine - peroxidase (50 X): pha loãng kháng thể gắn enzyme avidine - peroxidase với dung dịch đệm đã pha loãng theo tỷ lệ 1/50 (cho 20 μ l kháng thể gắn enzyme avidine - peroxidase 50 X và o 980 μ l dung dịch đệm đã pha lo ã ng); - Pha loãng mẫu phân phân cần kiểm tra: dùng cân phân tích (4.5) cân 2 g phân, rồi cho 2 ml dung dịch đệm pha loãng sau khi đã pha loãng. Ly tâm với gia tốc 1 000 g trong 10 min (4.6). Thu lấy phần dịch nổi phía trên. B.2 . Cách tiến hành - Nhỏ 100 μl mẫu phân đã pha lo ã ng v à o 2 giếng. Đ ố i chứng dương cho vào 2 giếng (theo sơ đ ồ đĩa phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên). Ph ủ đĩa bằng giấy nhôm, giữ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2h; - Rửa đĩa ba lần bằng dung dịch rửa đã pha loãng; - Nhỏ 100 μl kháng thể gắn enzyme biotin đ ã pha lo ã ng vào mỗi giếng, ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 1 h; - Rửa đĩa ba lần bằng dung dịch rửa đã pha loãng; - Nhỏ 100 μl kháng thể gắn enzyme avidine - peroxidase đã pha loãng vào mỗi giếng, ủ dĩa ở nhiệt độ phòng trong 1 h; - Rửa đĩa ba lần bằng dung dịch rửa đã pha loãng; - Nh ỏ 100 μl TMB vào mỗi giếng, tránh ánh sáng; - Ủ đĩa 10 min ở nhiệt độ phòng; - Nh ỏ 50 μl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng; - Đọc đĩa ở bước sóng 450 nm bằng máy đọc ELISA (4.7) B.3 . Đọc kết quả OD = ∆ OD mẫu x 100 OD mẫu đối chứng dương Trong đỏ: - OD: là mật độ quang học của mẫu - ∆ OD mẫu: giá trị trung b ì nh giữa 2 giá tr ị OD của mẫu - ∆OD mẫu đối chứng dương: giá trị trung bình giữa 2 giá trị OD của mẫu đối chứng dương: 1) Mẫu dương tính: OD của mẫu lớn hơn 7,99. 2) Mẫu â m t í nh: OD của mẫu nhỏ hơn 7,99. CHÚ TH Í CH: với mỗi bộ kit khác nhau thì ng ưỡ ng OD đ ể đánh giá là khác nhau Sơ đồ đĩa phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A ĐC(+) M4 M8 M12 M16 M20 M24 M28 M32 M36 M40 M44 B ĐC(+) M4 M8 M12 M16 M20 M24 M28 M32 M36 M40 M44 C M1 M5 M9 M13 M17 M21 M25 M29 M33 M37 M41 M45 D M1 M5 M9 M13 M17 M21 M25 M29 M33 M37 M41 M45 E M2 M6 M10 M14 M18 M22 M26 M30 M34 M38 M42 M46 F M2 M6 M10 M14 M18 M22 M26 M30 M34 M38 M42 M46 G M3 M7 M11 M15 M19 M23 M27 M31 M35 M39 M43 M47 H M3 M7 M11 M15 M19 M23 M27 M31 M35 M39 M43 M47 CHÚ TH Í CH: các d ò ng A, C, E, G phủ kháng th ể đ ặc hiệu; các dòng B, D, F, H không phủ kháng th ể đặc hiệu ĐC (+): đối chứng d ư ơng (c ó sẵn trong bộ kit) Từ M1 đ ế n M47: mẫu xét nghiệm từ số 1 đ ế n số 47. PHỤ LỤC C (Tham khảo) Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể sán lá gan C ó thể sử dụng bộ kit có bán sẵn để phát hiện kháng thể sán l á gan có trong mẫu huyết thanh và sữa. CH Ú THÍCH: do chi ph í phát hiện kháng th ể sán lá gan bằng phương pháp ELISA cao nên thường dùng trong điều tra huy ế t thanh học. C.1 . Chuẩn bị nguy ê n liệu - Dung dịch rửa (20 X): pha loãng dung dịch rửa với nước cát đã khử ion theo tỷ lệ 1/20 (cho 50 ml dung dịch rửa 20 X vào 950 ml nước cát đã khử ion); - Kháng kháng thể gắn enzyme peroxidase (100 X): pha loãng kháng kháng thể gắn enzyme peroxidase với dung dịch đệm 1 theo tỷ lệ 1/100 (cho 10 μl kháng kháng thể gắn enzyme peroxidase 100 X và o 990 μ l dung dịch đệm 1); - Pha loãng mẫu: 1) Đối với mẫu đối chứng và đối chứng dương cầ n pha loãng theo t ỷ lệ 1/20 bằng dung dịch đệm 2); 2. Đối với mẫu huyết thanh kiểm tra: pha loãng mẫu huyết thanh cần kiểm tra theo tỷ lệ 1/20 bằng dung dịch đêm 2 (cho 10 μ l huyết thanh cần kiểm tra ( cho 10 μ l mẫu huyết thanh cần kiểm tra vào 190 μ l dung dịch đệm 2); C.2 . Cách tiến hành - Nh ỏ vào hai giếng, mỗi giếng 200 μl đối chứng âm đã pha lo ã ng; - Nhỏ vào bốn giếng, mỗi gi ế ng 200 μl đối chứng dương đã pha lo ã ng; - Nhỏ vào hai giếng, mỗi giếng 200 μ l huy ế t thanh c ầ n kiểm tra đã pha loãng; - Hoặc nhỏ vào hai giếng, mỗi gi ế ng 200 μl mẫu sữa không pha loãng (theo sơ đ ồ , đĩa. phản ứng ELISA phát hiện kháng thể); - Lắc đều đĩa; phủ đỉa bằng giấy nhôm hoặc giấy dính, ủ đĩa 1 h ở tủ ấm 37 ° C (4.4); - Rửa đ ĩ a ba lần bằng dung dịch rửa đã pha loãng; - Cho 100 μl kháng kháng thể gắn enzyme peroxidase đ ã pha loãng vào từng giếng, phủ đĩa và ủ ở t ủ ấm 37 ° C (4.4) trong vòng 30 min; - Rửa đ ĩ a ba lần bằng dung dịch rửa đã pha loãng; - Cho 100 μ l TMB v à o từng giếng; - Ủ đ ĩa ở 21 °C trong 20 min, tránh ánh sáng; - Cho 100 μl dung dịch dừng phản ứng; - Lắc đều đ ĩ a cho đến khi có màu đồng nhất; - Đọc đ ĩ a ở bước sóng 450 nm bằng máy đọc ELISA (4.7) C.3 . Đánh giá kết quả - OD hiệu chỉnh của mẫu = (OD của giếng phủ kháng nguyên đặc hiệu - OD của giếng chưa phủ kháng nguyên đặc hiệu); - Kết quả tin cậy nếu thỏa mãn 2 điều kiện sau: 1) Giá trị OD trung b ì nh hiệu ch ỉ nh của đối chứng dương lớn hơn 0,35; 2) Tỷ lệ giữa OD trung b ì nh hiệu chỉnh của đối chứng dương. và OD trung bình hiệu chỉnh của đối chứng âm không nhỏ hơn 3,5. - Đối với mẫu kiểm tra, t ỷ lệ S/P tính như sau: S/P (%) = OD hiệu chỉnh của mẩu kiểm tra x 100% OD trung bình hiệu chuẩn của mẫu đối chứng dương Kết quả S/P (%) được trình bày ở bảng sau: S/P của m ẫ u kiểm tr a % Độ nhiễm ( đối với từng cá thể) Mức độ nhiễm b ệ nh (trong đàn) Bằng hoặc lớn hơn 150 +++ Nhi ễ m nặng (lớn hơn 50 % nhiễm) +++ Lớn hơn 80 đ ế n 150 ++ Nhiễm trung bình (từ 20 % đến 50 % nhiễm) ++ Lớn hơn 30 đến 80 + Nhiễm thấp (ít hơn 20 % nhiễm) + Bằng hoặc nhỏ hơn 30 0 Không nhiễm hoặc nhiễm kh ô ng đáng kể 0 CH Ú THÍCH: độ nhi ễ m (đối với từng cá th ể ) +++: nhiễm nặng ++: nhiễm trung b ì nh +: nhiễm th ấ p 0: không nhi ễ m hoặc nhi ễ m kh ô ng đáng k ể Sơ đồ đĩa phản ứng ELISA phát hiện kháng thể 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A N N M6 M6 M14 M14 M22 M22 M30 M30 M38 M38 B P P M7 M7 M15 M15 M23 M23 M31 M31 M39 M39 C P P M8 M8 M16 M16 M24 M24 M32 M32 M40 M40 D M1 M1 M9 M9 M17 M17 M25 M25 M33 M33 M41 M41 E M2 M2 M10 M10 M18 M18 M26 M26 M34 M34 M42 M42 F M3 M3 M11 M11 M19 M19 M27 M27 M35 M35 M43 M43 G M4 M4 M12 M12 M20 M20 M28 M28 M36 M36 M44 M44 H M5 M5 M13 M13 M21 M21 M29 M29 M37 M37 M45 M45 CHÚ TH Í CH: Cột 1, 3, 5, 7 , 9, 11: phủ kháng nguyên đặc hi ệ u Cột 2, 4, 6 , 8, 10: không phủ kháng nguyên đặc hiệu N: đối ch ứ ng âm (Có sẵn trong bộ kít) P: đ ố i chứng d ư ơng (C ó sẵn trong bộ kit) T ừ M1 đ ế n M45: mẫu xét nghiệm từ số 1 đ ế n số 45 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Văn Khuê và Phan Lục, 1996. Giáo trình ký sinh trùng thú y. Nhà xuất b ả n Đại học Nông Nghiệp I, trang 53 - 64. [2]. Marcela A.Cucher et all, Diagnosis of Fas ciola hepatica in field-collected Lymnaea. columella. and Lymnaea viatrix snails , Veterinary Parasitology 137 (2006). 74-82PCR [3]. Levecke B et all, Mixed Giardia duodenalis assemblage A, B, C and E in f ections in pet chinchillas (Chinchilla lanigera) in Flanders (Belgium). Veterinary Parasitology 2011 Apr 19;177(1-2):166-70. Epub 2010 Nov 21. [4] http://www.biox.com/Default.aspx?tabid=64&udtid=46 [5] http ://w ww.idexx.com/pubwebresources/pdf/en_us/livestock-poultry/fasciolosis-verification-test- insert.pdf [6]. http://www.fao.org/wairdocs/ILRI/x5492E/x5492e05.htm [7] JICA. Third edition, 2003. Standard Diagnostic Manual f or livestock diseases in Thailand. p.73 - 74 .