10TCN298:1997

Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 298:1997 về phân vi sinh vật - Phân giải hợp chất phot pho khó tan TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 298:1997 PHÂN VI SINH VẬT PHÂN GIẢI HỢP CHẤT PHOT PHO KHÓ TAN Phương pháp định lượng hoạt tính phân giải 1. Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này hướng dẫn phương pháp định lượng khả năng phân giải hợp chất phot pho khó tan của chủng vi sinh vật hay phân bón vi sinh vật phân giải lân. 2. Nội dung của phương pháp 2.1. Thiết bị dụng cụ hoá chất: - Thiết bị khử trùng: nồi hấp khử trùng, tủ sấy - Thiết bị nuôi cấy vi sinh vật: tủ ấm, buồng cấy vi sinh vật - Thiết bị phân tích lân tan: máy so màu, máy ly tâm - Thiết bị đo lường: cân phân tích, cân kỹ thuật - Dụng cụ thuỷ tinh: bình thuỷ tinh ml, ống nghiệm 180 x 15mm, pipet 1ml, 5ml, 10ml, ống đong, cốc thuỷ tinh, hộp lồng, bình định mức. - Hoá chất làm môi trường: Đường sácarosa, Ca(PO 4 ) lexitin, (NH 4 ) 2 SO 4 , NaCl, MgSO 4 , KCl, MnSO 4 , FeSO 4 , cao nấm men. - Hoá chất phân tích: (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 .7H 2 O, HCl, ZnCl 2 .7H 2 O, H 2 SO 4 , KH 2 PO 4 - Nước cất 2.2. Chuẩn bị: 2.2.1 Môi trường nuôi cấy: Pha chế môi trường nuôi cấy có thành phần dưới đây và chia vào 8 ống nghiệm, mỗi ống 15 ml, khử trùng môi trường ở điều kiện 121 o C trong thời gian 15 phút. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật phân giải lân (môi trường pikovskaya) - Ca 3 (PO 4 ) 2 5,0g - Sacaroza 10,0g - (NH 4 ) 2 SO 4 0,5g - NaCl 0,2g - MgSO 4 .7H 2 O 0,1g - KCl 0,2g - Cao nấm men 0,5g - MnSO 4 vết - FeSO 4 vết - Nước cất 1000 ml - pH 7,0 ± 0,2g Chú ý : Đối với chủng vi sinh vật hoặc phân vi sinh vật phân giải hợp chất phot pho hữu cơ khó tan trong thành phần môi trường nuôi cấy cần thay thế 5g Ca(PO 4 ) 2 bằng 2g lexitin. 2.2.2. Xây dựng đường chuẩn nồng độ phot pho 2.2.2.1 . Chuẩn bị dung dịch: 2.2.2.1.1. Dung dịch axit clo molybdic Cân chính xác 15g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 vào 400ml nước cất nóng, lọc trong nếu cần và bổ sung thêm 400ml HCl 10N hoặc 342ml HCl 12N, lắc đều. Để nguội và cho thêm nước cất để thể tích dung dịch đạt l000ml. Bảo quản dung dịch trong lọ thuỷ tinh màu đến khi sử dụng. 2.2.2.1.2. Dung dịch thiếc - axít clo hydric Dung dịch gốc: hoà tan l0g tinh thể SnCl 2 .2H 2 O vào 25ml HCl đậm đặc bảo quản trong bình kín. Dung dịch pha loãng: Lấy lml dung dịch gốc hoà đều vào 132ml nước cất. Dung dịch này phải pha lại thường xuyên cho mỗi lần thí nghiệm. 2.2.2.1.3. Dung dich phot pho chuẩn : Cân chính xác 0,4390g KH 2 PO 4 khô cho vào 400ml nước cất, bổ sung 25ml H 2 SO 4 7N và cho thêm nước cất để đạt l000ml ta có dung dịch phot pho l00ppm . Dùng nước cất pha loãng tiếp, ta sẽ có các dung dịch phot pho với nồng độ thấp hơn (0, 1, 2, 4, 10, 15 ppm). 2.2.2.2. Xây dựng nồng độ phot pho chuẩn Lấy l0ml từ mỗi dung dịch phot pho pha loãng (2.2.2.1.3) cho vào các bình định mức 50ml. Bổ sung thêm 10ml dung dịch xít clo molybdic (2.2.2.1.1) . Pha loãng tiếp dung dịch bằng nước cất sao cho thể tích đạt 40ml. Nhỏ vào đó 5 giọt dung dịch thiếc axit clo hydric (2.2.2.1.2) pha loãng và thêm nước cất đến vạch. Trộn đều dung dịch và đo trên máy so màu ở bước sóng 600nm. Xác định mật độ quang của mỗi dung dịch. Lập đồ thị tương quan giữa nồng độ phot pho và mật độ quang. 2.2.3 . Lấy mẫu: Mẫu phân vi sinh vật phân giải lân được lấy theo TCVN 6167-96 . Phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất phot pho khó tan. 2.2.4. Tiến hành: Cân chính xác và cho vào mỗi ống nghiệm đựng môi trường được chuẩn bị ở trên (2.2.2) 1g mẫu trong điều kiện vô trùng (cấy chủng vi sinh cần xác định vào mỗi ống nghiệm, nếu xác định khả năng phân giải của chủng vi sinh vật), trong đó 4 ống đối chứng được tiệt trùng nhiệt ngay sau khi cho mẫu vào . Giữ các ống nghiệm trong điều kiện nhiệt độ phù hợp . Sau 10-14 ngày nuôi cấy, tiến hành ly tâm các ống nghiệm trên máy ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong thời gian 20 phút, gạn lấy phần nước trong và tiến hành xác định mật độ quang của mẫu như phần 2.2.2.2. Đối chiếu với đồ thị chuẩn để xác định nồng độ phot pho tan của mẫu. 2.2.5. Đánh giá kết quả: Chênh lệch giữa mẫu đối chứng đã tiệt trùng và mẫu xác định là số lượng lân tan mà vi sinh vật đã phân giải được, số lượng này có thể biểu thị bằng tỷ lệ % hoặc bằng mg lân tan trong số lượng P 2 O 5 tổng số, kết quả được tính là trung bình cộng của cả 4 ống nghiệm.