TCVN11289:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11289:2016 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng dimetridazole - Phương pháp đo quang phổ TIÊU CHU Ẩ N QUỐC GIA TCVN 11289:2016 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DIMETRIDAZOLE - PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ Animal f ee di ng stuffs - Determinat i on of dimetr i dazo l e content- Spectropho to metr i c metho d Lời nói đầu TCVN 11289:2016 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 970.85 Dimetr i dazole in Feeds. Spectrophotometric Method; TCVN 11289:2016 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển n ô ng thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DIMETRIDAZOLE - PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ Animal f ee di ng stuffs - Determinat i on of dimetr i dazo l e content- Spectrophotometr i c metho d 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chu ẩ n này quy định phương pháp đo quang ph ổ để xác định hàm lượng dimetridazole trong thức ăn chăn nuôi. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chu ẩ n này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đ ổ i, bổ sung (nếu có). TCVN 6952 (ISO 9498), Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử. 3 Nguyên tắc Dimetridazole được chiết ra khỏi phần mẫu thử bằng metanol, sau đó tách các ch ấ t gây nhiễu bằng hai bước sắc ký nhôm oxit và xác đ ị nh bằng đo quang phổ ở bước sóng UV có độ h ấ p thụ cực đ ại đối với dimetridazole. CH Ú THÍCH: Các ch ấ t gây nhiễu gồm nihydrazone, furazolidone, zoalene, 2-chloro-4-nitrobenzamide , tylosin v à procaine (một lượng lớn từ penicillin procain). 4 Thuốc thử và vật liệu th ử Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại ion, trừ khi có quy định khác. 4.1 Nhôm oxit ( Al 2 O 3 ), thích hợp dùng cho sắc ký Nhôm oxit thích hợp dùng cho sắc ký kh i đạt yêu cầu của phép thử sau đây: L ắ c mạnh 10 g nhôm oxit (alumina) v ớ i 100 ml nước đựng trong b ì nh cầu 250 ml có nút đậy thủy tinh trên 2 min. Đ ể lắng, gạn và xác định pH bằng đo điện thế. Trị s ố pH phải trong khoản g từ 9,5 đến 10,5. Hiệu quả chiết dimetridazole có th ể thay đ ổ i tùy thuộc vào các loại nhôm oxit khác nhau. Kiểm tra hiệu quả chiết của cột b ằ ng cách thực hiện phép xác định trên mẫu thử không chứa dimetridazole hoặc các imidazole khác. Nếu mẫu có chứa lớn hơn 0,004 % imetridazole th ì sử dụng loại nhôm oxit khác. 4.2 Dung dịch chuẩn 1,2-dimethyl-5-n it roimidazole (dimetridazole, C 5 H 7 N 3 O 2 ) 4.2.1 Dung dịch chuẩn g ố c , 0,1 mg/ml Cân 100 mg chất chuẩn dimetridazole, ch í nh xác đến 0,1 mg, cho vào b ì nh định mức 100 ml. Hòa tan trong nước bằng cách lắc trong khoảng 20 min. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn. Dùng pipet lấy 20 ml cho vào bình định mức 200 ml, thêm nước đến vạch và trộn. 4.2.2 Dung dịch chu ẩ n làm việc, nồng độ tương ứng 2,5; 5; 10; 15 và 20 µg/ml Dùng pipet lấy 5 ml, 10 ml , 20 ml, 30 ml và 40 ml dung d ịch chu ẩ n gốc (4.2.1) cho v à o các b ình đ ịnh m ứ c 100 ml riêng r ẽ . Th ê m 5,0 ml dung dịch axit cl ohydric 3 M (4.3) vào mỗi b ì nh, thêm nước ngay đến vạch và trộn. Dùng pipet l ấy mỗi d ung dịch 5 ml và 5 ml dung dịch natri hydroxit 0,10 M (4.5) cho vào các b ì nh n ó n 50 ml r iê ng rẽ. Đ ậ y n ú t b ì nh nón và trộn. 4.3 Dung d ịch axit clohydric (HCI), 3 M. 4.4 Dung dịch axit clohydric , 0,15 M. 4.5 Dung dịch natr i hydroxit (NaOH), 0,10 M. 4.6 Metanol (CH 3 OH). 5 Thiết bị, dụng cụ S ử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng th ử nghiệm và cụ thể như sau: 5.1 Máy đo quang phổ , đo được ở bước s ó ng UV có độ hấp thụ cực đại với dimetridazole. 5.2 Ố ng sắc ký , kích thước 13 mm x 150 mm và 15 mm x 250 mm, phần đáy được thu hẹp để giữ nút bông thủy t inh và giữ ống thoát có đường kính ngoài 6 mm. 5.3 Bình định mức , dung tích 50 ml, 100 ml và 200 ml. 5.4 B ì nh n ó n , dung tích 50 ml. 5.5 Bình cầu đáy tròn , dung tích 125 ml. 5.6 Pipet 5.7 Nồi cách thủy , có thể duy tr ì ở nhiệt độ 60 °C. 5.8 Bếp điện. 5.9 Cân phân tích , có thể cân ch í nh xác đến 0,1 mg. 6 Lấy mẫu Mẫu gửi đến ph ò ng thử nghiệm phải đúng là mẫ u đạ i diện. Mẫu không bị hư h ỏ ng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy đị nh trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi- Lấy mẫu. 7 Chuẩn bị mẫu thử Chu ẩ n bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498). 8 Cách ti ế n hành 8.1 Dựng đường chu ẩ n Tiến hành theo 8.4, sử dụng các dung dịch chu ẩ n làm việc (4.2.2) v à mẫu trắng được chuẩn b ị bằng cách trộn 5 ml dung dịch ax i t clohydric 0,15 M (4.4) với 5 ml dung dịch natri hydroxit 0,10 M (4.5). Xác định độ hấp thụ so với mẫu trắng. Dựng đường chuẩn của độ hấp thụ theo nồng độ dimetridazo l e, t í nh bằng microgam trên milil i t. 8.2 Chuẩn b ị dung d ị ch mẫu thử Cân phần m ẫ u thử có chứa từ 0,5 mg đến 2,0 mg dimetridazole (thường là 5 g phần mẫu thử), chính xác đến 1 mg, cho vào b ì nh đ ị nh mức 100 ml (5.3). Thêm từ 70 ml đến 75 ml metanol (4.6) và đặt vào n ồ i cách thủy ở 60 °C (5.7) trong 30 min. Đảm bảo mức nước ngập b ì nh cầu đến khoảng 3 mm dưới mức metanol. Xoay bình hai hoặc ba lần trong 5 min đầu tiên đ ể làm nóng đồng đều. Làm nguội đến nhiệt độ phòng, pha lo ã ng tới vạch bằng metanol và trộn đều. Để yên từ 5 min đến 10 min để cho các hạt thô của mẫu lắng xuống. 8.3 Chuẩn b ị cho sắc k ý Chèn nút bông thủy tinh nhỏ vào đáy cột sắc ký 15 mm x 250 mm (5.2) và phủ một lớp nhôm oxit dày 8 cm, nhồi chặt cột. Gạn lớp dịch chiết trong metano l sang cột sao cho các hạt lắ ng của mẫu không đi vào cột. Thu lấy khoảng 30 ml d ịch chiết cho v à o bình định mức 50 ml (5.3). Đậy nút b ì nh cho đến khi sử dụng. LƯU Ý : Dimetridazole th ă ng hoa ở nhiệt độ trên 70 °C, do đó cách loại bỏ dung môi l à rất quan trọng. Đối với mẫu thử c ó chứa hàm lượng dimetridazole 150 mg/kg, dùng pipel lấy 15 ml d ịch rửa giải (lấy 4 ml nếu mẫu chứa 600 mg/kg, 3 ml nếu mẫu chứa 1000 mg/kg) vào bình hút 125 ml hoặc bình cầu đáy tròn 125 ml (5.5) và cho bay hơi dư ớ i áp suất thấp. Nếu lấy 15 ml th ì sử dụng bếp điện (5.8) (c ó nhiệt độ thấp) hoặc nồi cách thủy (5.7) để giảm thể tích còn khoảng từ 3 m l đến 4 ml. Lắc để tránh sôi mạnh. Khi đạt đến khoảng từ 3 ml đến 4 ml, l ấ y b ì nh ra khỏi nguồn nhiệt và sử dụng nhiệt từ lòng bàn tay để đuổi 3 ml đến 4 ml cuối cùng này. Tiếp t ục lắc đ ể tránh sôi mạnh. Không cố gắng để làm khô hoàn toàn, v ì khoảng 2 đến 3 giọt còn lại chính là dimetridazole. R ử a thành b ì nh, bắt đầ u từ cổ b ì nh, dùng 5,0 ml dung dịch natri hydroxit 0,10 M (4.5). Xoay để rửa thành b ì nh. Đ ể yên 5 min và thêm 5,0 ml dung dịch axit dohydric 0,15 M (4.4). Xoay b ì nh để trộn và r ử a thành b ì nh. Đậy nút cho đến khi chạy sắc ký. 8.4 Phép xác định Chu ẩ n bị cột nh ó m oxit thứ hai b ằ ng cách chèn bông thủy tinh nhỏ vào đáy cột sắc ký 13 mm x 150 mm (5.2), phủ lớp nhôm oxit 4 cm và gõ nhẹ đ ể nhồi cột. Rót toàn bộ 10 ml dung dịch vào cột v à để cho dung dịch đi qua cột. Thu l ấ y dịch rửa giải vào b ì nh nón 50 ml (5.4). Đẩy phần ch ấ t lỏng bám vào cột bằng cách dùng áp lực không khí từ bóng cao su. Xoay b ì nh để trộn. Đậy nút b ì nh cho đến khi sẵn sàng đo quang. Thực hiện với mẫu trắng, dùng 5 ml dung d ị ch axit cl ohydr i c 0,15 M (4.4) và 5 ml d ung dịch natri hy d roxit 0,10 M (4.5) qua cột riêng biệt có lớp nhôm oxit cao 4 cm nó i trên. a) S ử dụng máy quang phổ tự ghi Cho t huốc th ử trắng và dung dịch mẫu thử (luôn luôn sử dụng cùng một cuvet cho m ẫ u trắng) vào đ ầ y hai cuvet silic diox i t (silica) đã đánh d ấ u v à quét từ 310 nm đến 330 nm. Đọc độ hấp th ụ ở pic và xác định nồng độ c ủ a dung dịch (microgam trên mililit) từ đường chu ẩ n. b) S ử dụng máy đo quang phổ thủ công Xác định vị tr í pic hấp thụ cực đại của dung dịch mẫu (khoảng 318 nm), sử dụng cặp cuvet silica đã đánh dấu và cài đặt bước sóng theo pic. Đọc độ h ấ p thụ của dung dịch phần mẫu thử và của dung dịch mẫu trắng, rồi hiệu ch ỉ nh theo độ h ấ p thụ của mẫu trắng. Đọc độ hấp thụ ở pic và xác định nồng độ của dung dịch (tính bằng microgam trên mililit) từ đường chuẩn. 9 Tính kết quả Hàm lượng dimet r idazole của phần mẫu thử, X, t í nh bằng miligam trên kilogam (mg/kg), theo c ô ng thức sau: Trong đó: C là nồng độ d i metridazole của dung dịch, xác định từ đường chuẩn, t í nh bằng microgam trên mililit (µg/ml); D l à hệ s ố pha lo ã ng : D = 66,67 nếu mẫu thử chứa hàm lượng dimetridazole 150 mg/kg; D = 250,0 nếu mẫu thử chứa hàm lượng dimetridazole 600 mg/kg; D = 333,3 nếu mẫu thử chứa hàm lượng dimetridazole 1000 mg/kg; w là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam. 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi r õ : a) mọi thông tin cần thiết để nhận bi ế t đầ y đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương ph á p thử đ ã dùng, viện dẫn tiêu chu ẩ n n à y; d) tất cả các chi tiết thao tác không quy đ ị nh trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác c ó th ể ảnh hưởng đến kết quả; e) kết quả th ử nghiệm thu được.