QCVN01-159:2014/BNNPTNT

Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-159:2014/BNNPTNT về quy trình giám định bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam QCVN 01 - 159 : 2014/BNNPTNT QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH PHẤN ĐEN LÚA MỲ TILLETIA INDICA MITRA LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM National technical regulation on Procedure for identification of Ka rnal bunt of wheat (Ti l letia indica Mitra) - Plant quarantine pest of Vietnam Lời nói đ ầ u QCVN 0 1 - 159 : 2014/BNNPTNT do Trung tâm Giám định Kiểm dịch thực vật biên soạn, Cục Bảo vệ thực vật trình duyệt Bộ Nông nghiệp & PTNT ban hành tại Thông tư số 16/TT-BNNPTNT ngày 05 tháng 6 năm 2014. QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH PHẤN ĐEN LÚA MỲ TILLETIA INDICA MITRA LÀ DỊCH HẠI KIỂM DỊCH THỰC VẬT CỦA VIỆT NAM National technical regulation on Procedure for identification of Ka rnal bunt of wheat (Ti l letia indica Mitra) - Plant quarantine pest of Vietnam I. QUY ĐỊNH CHUNG 1.1. Phạm vi điều chỉnh Quy chuẩn này quy định quy trình giám định bệnh ph ấ n đen lúa mỳ Ti l letia indica Mitra - là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam 1.2. Đối tượng áp dụng Quy chuẩn n à y áp dụng đối với các tổ chức, cá nhân Việt Nam hoặc nước ngoài có hoạt động liên quan đ ế n lĩnh vực bảo vệ và kiểm dịch thực vật thực hiện giám định bệnh phấn đen lúa mỳ T ill etia indica Mitra - là dịch hại kiểm dịch thực vật (KDTV) nhóm I thuộc Danh mục dịch hạ i KDTV của Việt Nam. 1.3. Giải thích từ ngữ Trong quy chuẩn này, các từ ngữ dưới đây được hiểu như sau: 1.3.1. Dịch hại kiểm dịch thực vật (plant quarantine pest): Là loài dịch hại có nguy cơ gây hại nghiêm trọng tài nguyên thực vật trong một vùng mà ở đó loài sinh vật này chưa xuất hiện hoặc xuất hiện có phân b ố hẹp và phải được kiểm soát chính thức. 1.3.2. Thực vật (plant): Là cây và những bộ phận của cây còn sống, kể cả hạt giống và sinh chất có khả năng làm giống. 1.3.3. M ẫ u (sample): Là khối lượng thực vật, sản phẩm thực vật hoặc tàn dư của sản phẩm thực vật được lấy ra theo một qui tắc nhất định. 1.3.8. Tiêu bản (specimen): Là mẫu vật điển hình tiêu biểu của dịch hại được xử lý để dùng cho việc định loại, nghiên cứu, giảng dạy, phổ biến kỹ thuật và trưng bày thành các bộ sưu tập. 1.3.9. Phản ứng chuỗi trùng hợp hoặc ph ả n ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction - PCR): Là kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống. II. QUY ĐỊNH KỸ THUẬT 2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu 2.1.1. Thu thập mẫu Đối với hàng xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước: Tiến hành lấy mẫu theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4731:89 1 "Kiểm dịch thực vật - phương pháp lấy mẫu", quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-23:2010/BNNPTNT 1 "Phương pháp kiểm tra các loại hạt xuất, nhập khẩu và quá cảnh". Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng; Lấy mẫu theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-38/2010/BNNPTNT 1 "Phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng". 2.1.2. Bảo quản mẫu Các bộ phận tươi (bông) có triệu chứng bệnh chứa trong các tú i ni- l ông có lỗ thông khí bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3 - 5 o C. M ẫu hạt được chứa trong các t ú i ni-lông hoặc hộp nhựa kín và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Các tiêu bản lam của nấm được dán nhãn, để trong hộp chuyên dụng đựng tiêu bản lam và bảo quản ở nhiệt độ phòng. 2.2. Thiết bị dụng cụ, hóa chất Kính lúp soi nổi có độ ph ó ng đại 10 - 40 lần, kính hiển vi có độ phóng đại 40 - 1.000 lần. Lưới lọc (kích thước mắt lưới 53 m m, 20 m m), bình tam giác, máy ly tâm, máy lắc, tủ sấy, tủ định ôn, cân điện, b ể ổn nhiệt, máy PCR, máy điện di, hệ thống chụp ảnh... Bộ dao, kim giải phẫu, panh, kéo, bộ micro pipet. Đèn c ồ n, đĩa petri, ố ng hút, lam, lamen, cốc đong, giấy parafilm. Cồn 70 o , lactophenol, acid lactic, nước cất vô trùng, Tween 20, Na 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , Glycerol, ethylium bromide, agarose, cycloheximide. Kít chiết tách DNA, kit PCR 2.3. Phương pháp phát hiện và giám định bệnh 2.3.1. Phát hiện và thu thập mẫu bệnh Cây nhiễm bệnh thấp hơn, bông ngắn, số lượng hạt trên bông giảm (hình 1, phụ lục 1). Nấm chỉ gây bệnh trên một số hạt trên bông, các hạt nhiễm bệnh thường bị lép. Ban đầu c ó chấm đen nhỏ dưới phần nội nhũ và rãnh hạt. Khi xâm nhiễm trên hạt, nấm làm cho hạt có mùi tanh (do trimethylamine) tương tự như nấm T. tritici, T. foetida và T. controversa . Hạt bị xâm nhiễm từ phần rốn hạt và chạy dọc theo đường rãnh hạt (không gây nhiễm nội nhũ), hạt có thể bị vỡ hoàn toàn hoặc bị nứt một phần (hình 2, phụ lục 1). Khi bệnh nặng, mô dọc theo rãnh hạt và vùng tiếp giáp nội nhũ bị thay thế bởi các bào tử. Mày hạt bị tách ra làm cho hạt bị nhiễm bệnh l ộ ra ngoài, cả hạt và phần mày hạt có thể bị rụng khỏi bông. 2.3.2. Phương pháp giám định bằng đặc điểm hình thái nấm gây bệnh 2.3.2.1. Phương pháp kiểm tra trực tiếp Dùng kim khêu nấm khêu lớp bào tử trên hạt đặt lên l am kính đ ã có sẵn một giọt axit lactic và đậy lamen. Đặt lam l ên kính hiển vi và quan sát đặc điểm hình thái và đo kích thước của bào tử n ấ m. Đối chiếu với hình dạng và kích thước bào tử phấn đen lúa mỳ T i lletia indica Mitra (phụ lục 1). 2.3.2.2. Phương pháp rửa quay ly tâm Lấy 50g hạt lúa mỳ cho vào bình tam giác 250ml. Thêm vào bình 1 0 0ml dung dịch Tween-20 nồng độ 0,01%, đậy nắp bình (có thể bao kín bằng giấy parafilm). Đặt bình tam giác lên máy lắc hoặc l ắc bằng tay trong vòng 3 phút để các bào tử rời ra khỏi hạt lúa mỳ. Chuẩn bị một bình lọc bao gồm một bình tam giác, một phễu trong đó có 1 l ưới lọc kích thước 53 m m. Đỗ dịch và hạt lúa mỳ lên phễu của bình tam giác đã chuẩn bị. Dùng bình phun nước cất rửa hạt lúa mì còn ở trên lưới 3 lần (mỗi lần dùng 20-50ml nước cất). Tiếp tục rửa hạt lúa mì bằng nước c ấ t đến khi lượng nước trong bình đạt từ 300-400ml. Bỏ l ưới lọc, rửa phễu lọc 2 lần bằng nước cất mỗi lần 10-20ml nước. Chuẩn bị bộ lọc thứ 2 bao gồm 1 bình tam giác; 1 phễu trong đó có đặt một lưới lọc 20 m m (lưới lọc này có thể ngâm trong nước trước để có hiệu quả lọc tốt hơn). Rót d ịch thu được ở trên qua bộ lọc đã chuẩn bị. Rửa bình chứa dịch 2 lần bằng 10ml nước cất . Nghiêng lưới l ọc một góc 30-35 o rửa nhẹ nhàng lưới lọc bằng nước cất sao cho phần cặn còn lại trên lưới lọc dồn sang bên cạnh của lưới lọc. Dùng công tơ hút hút dịch và cặn trên lưới lọc vào ống ly tâm. Ly tâm dịch thu được ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 3 phút. Phần cặn thu được sau ly tâm hòa tan lại trong nước cất để đạt dung tích khoảng 50- 100 m l. Hút dịch lên lam kính, đậy lamen quan sát và đo đếm đặc điểm hình thái của bào tử nấm gây bệnh tr ê n kính hiển vi và so sánh với đặc điểm bào tử của nấm Tilletia indica ( phụ lục 1) L ưu ý: Trong trường hợp mẫu hạt đã qua xử lý hóa chất diệt nấm, hạt phải được ngâm trong NaOH (0,2% hoặc 1%) trong 24 giờ trước khi rửa, quay l y tâm 2.3.2. Phương pháp giám định PCR Sử dụng phương pháp PCR để giám định đối với nấm gây bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra. Quy trình chi tiết như phụ lục 2. III. THẨM ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO Sau khi khẳng định kết quả giám định bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra - là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gử i báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (phụ lục 3). Tất cả các đơn vị thuộc hệ thống Bảo vệ và KDTV phải lưu giữ, quản l ý và khai thác dữ liệu về kết quả điều tra, báo cáo và giám định bệnh ph ấ n đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra. Đ ố i với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật đ ể thẩm định. Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định hiện hành. IV. TỔ CHỨC THỰC HIỆN Cục Bảo vệ thực vật có trách nhiệm phổ bi ế n; tổ chức, hướng dẫn và kiểm tra việc thực hiện Quy chuẩn này trong hệ thống tổ chức chuyên ngành Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật cũng như các tổ chức, cá nhân khác có liên quan; Các tổ chức , cá nhân có hoạt động liên quan đến điều tra, thu thập mẫu, xử lý và bảo quản mẫu bệnh phấn đen lúa mỳ tại Việt Nam phải tuân theo quy định của quy chuẩn này cũng như các quy định của pháp luật có liên quan hiện hành. Phụ lục 1. Thông tin về dịch hại 1. Phân bố và ký chủ 1.1. Phân bố Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam Trên thế giới: Châu Á ( Ấ n Độ, Afghanistan, Iraq, Nepal, Iran, Pakistan), Châu Ph i (Nam Phi) , Châu Mỹ (Kenya, Hoa K ì , Mexico) . 1.2. Ký chủ: Lúa Mỳ (Triticum aestivum) Ngoài ra trong l ây nhiễm nhân tạo nấm còn kí sinh trên Aegilops spp., Bromus spp., Lo l ium spp. và Oryzopsis . 2. Tên khoa học và vị trí phân loại Tên tiếng Việt: Bệnh phấn đen lúa mỳ Tên khoa học: Tilletia indica Mitra Tên khác: Neovossia indica (Mitra) Mundk. Vị trí phân loại: Lớp: Ustilaginomycetes Bộ: Tilletia l es Họ: Ti l letiaceae 3. Triệu chứng bệnh phấn đen lúa mỳ Hình 1: bông lúa mì nhiễm bệnh (Nguồn: CABI, 2012) Hình 2: hạt lúa mỳ nhiễm bệnh (Nguồn: CABI, 2012) 4. Đặc điểm hình thái bào tử nấm Tilletia indica Bào tử đông (Teliospore) dạng cầu tới gần cầu, đường kính thông thường 22-47 m m, có thể lớn hơn (35-41 m m); Màu sắc từ vàng cam nhạt tới nâu tới nâu đậm, đỏ nâu; một số bào tử có màu đen hoặc màu đen mờ. Gai dày đầu gai nhọn hoặc tù, một số trường hợp đầu hơi cong, độ dài gai 1,5-5,0 m m. Bề mặt gai có dạng vỏ não với những rãnh hẹp. Các gai được bao bọc bởi một màng mỏng trong suốt (hình 3 hình 4). Tế bào bất dục: hình cầu tới gần cầu hoặc hình giọt lệ, màu vàng nâu, 10-28x48 m m, có hoặc không có đỉnh nhỏ (gai ngắn), vách tế bào mượt dày khoảng 7 m m và tạo phiến. Hình 3: Bề mặt bào tử T. indica (Nguồn: EPPO, 2012) Hình 4: Bào tử T. indica quan sát ở điểm giữa (Nguồn: EPPO, 2012) 5. Phân biệt v ớ i một s ố nấm Tilletia khác Bào tử đông của T. indica có thể bị nhầm lẫn bởi một số loài Tilletia lẫn tạp trong hạt lúa mỳ như: T . walkeri (hình 5) và T. horri d a (hình 6) có thể phân biệt như sau. T. horr i da T. walkeri T. indica Kích thước bào tử to nhất ( m m) <> 36-45 45-50 Kích thước trung bình ( m m) 24-28 30-31 35-41 Màu sắc bào tử đông Vàng nhạt tới màu hạt dẻ nhạt hoặc đậm (tới đen mờ) Vàng nhạt tới nâu đỏ (không có màu đen đục) Màu cam nhạt nhưng chủ yếu là màu đỏ nâu đậm tới đen mờ Hình thái và phân bố gai Gai nhọn, nhìn bề mặt c ó nhiều góc cạnh; ít khi có dạng rãnh vỏ não hoặc hiếm khi có dạng bụi. Đầu gai nhọn, có thể trở thành cụt, ít khi cong Dạng thô; dạng vân tương tự vỏ não không hoàn hảo hoặc bụi dày. Gai dạng nón tới cụt Gai dày, có dạng vỏ não. Đầu gai nhọn hoặc g ẫ y đầu. Hình 5: Bào tử T. walkeri (thước 10um) Nguồn: PaDIL, 2012 Hình 6: Bào tử T. horrida (thước 10um) Nguồn: PaDIL, 2012 Phụ lục 2. (quy định) Quy trình giám định nấm T. indica bằng PCR 1. Nhân sinh khối. Rửa sạch bào tử thu được ở phương pháp rửa bằng cách rửa bằng nước c ấ t trên l ưới lọc 20 m m. Hút dịch thu được vào ống mới thêm nước cất cho đủ 3ml ngâm qua đêm ở 21 o C . Ly tâm 4000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ dịch trong ống chỉ thu phần cặn ly tâm. Hòa tan cặn ly tâm trong nước xà phòng 10%, thay nắp mới và lắc nhẹ ống ly tâm. Ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 1 phút loại bỏ dịch rửa. Thêm vào 1m l nước cất vô trùng để rửa cặn ly tâm (Ly tâm và rửa 2 lần).Ti ế p tục ly tâm 1200g trong 5 phút loại bỏ dịch rửa. Hòa tan lại cặn ly tâm trong 1ml nước cất vô trùng. Trang 200 m l dịch hòa tan ở bước 10 lên môi trường Agar (WA) nuôi cấy ở 21 o C chu kì ánh s á ng 12 giờ tối /12 giờ sáng trong 5 ngày. Bọc các đĩa môi trường bằng giấy para f ilm hoặc cho vào túi bóng, tiếp tục nuôi cấy trong 7-14 ngày. Kiểm tra sự nảy mầm của bào tử. Cắt miếng thạch có bào tử nảy mầm gắn trên nắp hộp petri trong đ ó chứa 5m l môi trường khoai tây dextrose lỏng (potato dextrose broth), nuôi cấy ở 21 o C chu kì ánh sáng 12 giờ tối/12 giờ sáng trong 2-3 ngày. Kiểm tra sự hình thành bào tử đảm trên bề mặt môi trường nếu chưa thấy nuôi cấy thêm 5 ngày . ( hình 7). Dùng kim khêu vô trùng l ấ y những màng nấm trong môi trường đặt trên các miếng giấy lọc vô trùng để loại bỏ môi trư ờ ng bám dính. Đặt các màng nấm vào các ống để tách chiết DNA. T. indica T. walkeri T. horrida Hình 7: Tản nấm trên môi trường PDA sau 14 ngày Nguồn: EPPO, 2007 2. Tách chiết DNA 0,1g nấm thu được cho vào ống ly tâm 2ml. Thêm vào 1ml nước tinh khiết dùng trong công nghệ phân tử (MGW) nghiền đều bằng chày thủy tinh hoặc chày nhựa vô trùng. Ủ trong 30 giây. Tách DNA bằng kít tách chiết DNA tổng số của nấm. 3. Giám định bằng PCR - Cặp mồi sử dụng Mồi xuôi Tin 3 (5'-CAA TGT TGG CGT GGC GGC GC-3') Mồi ngược Tin 4 (5 ' -CAA CTC CAG TGA TGG CTCCG-3'). - Master mix: 20,2 m l of MGW 2,5 m L of 10 X PCR buffer chứa 15 mM MgCI2 0, 25 m L dNTPs [10 mM] 0, 1 m L AmpliTaq [5 U m L-1] 0, 1 m L of mỗi mồi [25 m M] 1,0 m L dịch DNA chiết tách từ nấm - Chu trình nhiệt 94 o C trong 1 phút, 25 chu kỳ: 94 o C trong 15 giây, 65 o C trong 15 giây và 72 o C trong 15 giây, 72 o C trong 6 phút. - Đọc kết quả: - Điện d i bằng agarose gel 2% Mẫu dương tính sẽ cho đoạn gen có kích thước 414kbp Phụ lục 3. (quy định) Mẫu phiếu kết quả giám định Cơ quan Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật ……………………………………….. CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc -------------- ……….. ngày …. tháng …. năm 20….. PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH Bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra - là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam 1. Tên hàng hóa : 2. Nước xuất khẩu : 3. Xuất xứ : 4. Phương tiện vận chuyển : Khối lượng: 5. Địa điểm lấy mẫu : 6. Ngày lấy mẫu : 7. Người lấy mẫu : 8. Tình trạng mẫu : 9. Ký hiệu mẫu : 10. Số mẫu lưu : 11. Người giám định : 12. Phương pháp giám định: Theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01 - 159 : 2014/BNNPTNT về "Quy trình giám định bệnh phấn đen lúa mỳ Tilletia indica Mitra - là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam". 13. Kết quả giám định Tên khoa học: Tilletia indica Mitra Lớp: Ustilaginomycetes Bộ: Tilletiales Họ: Tilletiaceae Là dịch hại kiểm d ịch thực vật thuộc danh mục dịch hại kiểm dịch thực vật của Vi ệ t Nam. TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT (hoặc người giám định) (ký, ghi rõ họ và tên) THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ (ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu) 1 Trường hợp các văn bản viện dẫn trong quy chuẩn này sửa đổi, bổ sung hoặc thay thế thì thực hiện theo quy định của văn bản mới.