TCVNVI:2017

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN VI:2017 về Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc (Gồm 64 tiêu chuẩn, chia thành 5 phần) TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN Vl:2017 BỘ TIÊU CHUẨN QUỐC GIA VỀ THUỐC (GỒM 64 TIÊU CHUẨN, CHIA THÀNH 5 PHẦN) Set of national standards for medicines MỤC LỤC Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc và chuyên mục Phụ lục 1.27 Thuật ngữ dạng thuốc theo mô hình gi ả i phóng (phóng thích) dược chất Phụ lục 4.6 Phổ khối - plasma cảm ứng (ICP- MS) Phụ lục 4.7 Phổ huỳnh quang tia X Phụ lục 4.8 Phổ Raman Phụ lục 12.24 Lỗ khí và chỉ số lỗ khí Phần 2: Nguyên liệu hóa dược Abacavir sulfat Arginin Arginin aspartat Attapulgit Bisoprolol fumarat Calcitriol Cefdinir Cefepim hydroclorid monohydrat Celecoxib Esomeprazol magnesi trihydrat Felodipin Glutathion Histidin Histidin hydroclorid monohydrat Isoleucin Lopinavir Lycin acetat Nifuroxazid Nitrazepam Penicilamin Quinapril hydroclorid Sucrafat Sulfasalazin Sultamicilin Sultamicilin tosilat dihydrat Terbutalin sulfat Tinh bột biến tính natri glycolat typ A Tinh bột biến tính natri glycolat typ B Tinh bột biến tính natri glycolat typ C Tramadol hydroclorid 2. Thành phẩm hóa dược Bột pha hỗn dịch uống cefaclor Bột pha hỗn dịch uống cefdinir Bột pha hỗn dịch uống cefpodoxim Bột pha tiêm ceftazidim Nang ambroxol hydroclorid Nang cefdinir Nang cefpodoxim Nang indinavir Nang itraconazo l Nang mềm calcitriol Nang oseltamivir Nang tan trong ruột esomeprazol Viên nén ambroxol hydroclorid Viên nén atovastatin Viên nén bao tan trong ruột esomeprazol Viên nén bao tan trong ruột pantoprazol Viên nén glimepirid và metformin Viên nén losartan kali Viên nén lovastatin Viên nén perindopril t ert -butylamin Viên nén simvastatin Viên nén telmisartan 3. Dược liệu Bán biên liên Cao đặc diệp hạ châu đắng Cao khô huyết giác Côn bố Ngoi (Lá) 4. Vắc x i n Vắc xin phế cầu Vắc xin phế cầu cộng hợp L ờ i nói đầu Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc TCVN VI:2017 được xây dựng trên nguyên tắc nối tiếp B ộ TCVN I :2017, Bộ TCVN II :2012, Bộ TCVN III :2014, Bộ TCVN IV:2015 và Bộ TCVN V:2017. Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc TCVN VI:2017 do Hội đồng Dược điển Việt Nam biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Lời giới thiệu Tiêu chuẩn quốc gia về thuốc là văn bản kỹ thuật về tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm chất lượng thuốc. Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc này gồm 64 tiêu chuẩn, chia thành 5 phần như sau: - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc và chuyên mục, gồm 5 tiêu chuẩn; - Phần 2: Nguyên liệu hóa dược, gồm 30 tiêu chuẩn; - Phần 3: Thành phẩm h óa dược, gồm 22 tiêu chuẩn; - Phần 4: Dược liệu, gồm 5 tiêu chuẩn; - Phần 5: Vắc xin, gồm 2 tiêu chuẩn. Danh pháp, thuật ngữ trong Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc được viết theo quy định của Hội đồng Dược điển Việt Nam, Bộ Y tế. Các thuật ngữ dược phẩm được viết dựa trên nguyên tắc việt hóa tên chung quốc tế Latin (DCI Latin) một cách hợp lý nhằm giữ các ký tự cho sát với thuật ngữ quốc tế. Tên hợp chất hữu cơ được viết theo danh pháp do Hiệp hội quốc tế hóa học thuần túy và ứng dụng (I.U.P.A.C) quy định. Trong một số trường hợp cá biệt, các thuật ngữ tiếng Việt đã quen dùng đối với một số nguyên tố, hóa chất hay tên dược liệu vẫn tiếp tục sử dụng. B Ộ TIÊU CHUẨN QUỐC GIA VỀ THUỐC Set of national standards for medicines 1 Phạm vi áp dụng Bộ tiêu chuẩn này quy định các chỉ tiêu, yêu cầu kỹ thuật, phương pháp kiểm nghiệm, bảo quản và các yêu cầu có liên quan đến chất lượng đối với nguyên liệu hóa dược, thành phẩm hóa dược, dược liệu, vắc xin. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn có ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả sửa đổi bổ sung (nếu có). TCVN 1-1:2017, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc; có 18 Phụ lục như sau: Phụ lục 1: Từ phụ lục 1.1 đến phụ lục 1.24; Phụ lục 2: Từ phụ lục 2.1 đến phụ lục 2.5; Phụ lục 3 : Từ phụ lục 3 .1 đến phụ lục 3 . 6 ; Phụ lục 4 : Từ phụ lục 4 .1 đến phụ lục 4.4 ; Phụ lục 5 : Từ phụ lục 5 .1 đến phụ lục 5 . 7 ; Phụ lục 6 : Từ phụ lục 6 .1 đến phụ lục 6 . 11 ; Phụ lục 7 : Từ phụ lục 7 .1 đến phụ lục 7 . 11 ; Phụ lục 8 : Từ phụ lục 8 .1 đến phụ lục 8 . 3 ; Phụ lục 9 : Từ phụ lục 9 .1 đến phụ lục 9 . 10 ; Phụ lục 10 : Từ phụ lục 10 .1 đến phụ lục 10 . 19 ; Phụ lục 11 : Từ phụ lục 11 .1 đến phụ lục 11 . 8 ; Phụ lục 12 : Từ phụ lục 12 .1 đến phụ lục 12 . 20 ; Phụ lục 13 : Từ phụ lục 13 .1 đến phụ lục 13 . 10 ; Phụ lục 14 : Phụ lục 15 : Từ phụ lục 15 .1 đến phụ lục 15 . 41 ; Phụ lục 16 : Từ phụ lục 16 .1 đến phụ lục 16 . 2 ; Phụ lục 17 : Từ phụ lục 17 .1 đến phụ lục 17 . 8 ; Phụ lục 18 : TCVN I -2:2017 , Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 2: Nguyên liệu hóa dược. TCVN II :2012, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc; gồm 5 phụ lục như sau: phụ lục 1.25; phụ lục 4.5; phụ lục 6.12; phụ lục 12.21 và phụ lục 12.22. TCVN III :2014, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc; gồm 2 phụ lục như sau: phụ lục 15.42 và phụ lục 15.43. TCVN IV:2015, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc; có một phụ lục 10.20. TCVN V:2017, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc và chuyên mục; gồm 13 phụ lục và hướng dẫn như sau: phụ lục 1.26, phụ lục 6.13, phụ lục 10.21, phụ lục 10.22, phụ lục 11.9, phụ lục 11.10, phụ lục 12.23, phụ lục 13.11, phụ lục 15.44, phụ lục 15.45, phụ lục 15.46 (có một phụ lục và một hướng dẫn), phụ lục 15.47. 3 Ký hiệu và chữ viết tắt Ký hiệu in nghiêng tên hóa chất, thuốc thử biểu thị thuốc thử đó phải đạt yêu cầu quy định tại Phụ lục 2. Chữ viết tắt: CĐ: Chuẩn độ. TT: Thuốc thử. TT 1 , TT 2 , TT 3 ...: Thuốc thử 1, thuốc thử 2, thuốc thử 3... tt/tt: thể tích trên thể tích . kl/tt: khối lượng trên thể tích. PHẦN 1 PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ CHUYÊN MỤC PHỤ LỤC 1 (Quy định) THUẬT NGỮ DẠNG THUỐC THEO MÔ HÌNH GIẢI PHÓNG (PHÓNG THÍCH) DƯỢC CHẤT Dạng thuốc giải phóng quy ước (conventional-release dosage form): Là dạng thuốc trong đó không dùng các giải pháp đặc biệt thuộc về thiết kế công thức và/hoặc kỹ thuật sản xuất đ ể tác động đến sự giải ph ó ng dược chất khỏi dạng thuốc. Với các dạng thuốc rắn, đồ thị hòa tan phụ thuộc chủ yếu vào tính chất vốn có của dược chất. Khi thử độ hòa tan, dược chất thường được giải phóng ngay khỏi dạng thuốc, do đó dạng thuốc giải phóng quy ước còn được gọi là dạng thuốc giải phóng tức thời (immediate-release form). Dạng thuốc giải phóng biến đổi (modified-release dosage form): Là dạng thuốc trong đó áp dụng các giải pháp đặc biệt thuộc về thiết kế công thức và/hoặc kỹ thuật sản xuất để làm thay đổi tốc độ ho ặ c/và nơi gi ả i phóng dược chất so với dạng thuốc giải phóng quy ước có cùng đường dùng. Dạng thuốc giải phóng biến đổi bao gồm các dạng thuốc giải phóng kéo dài, giải phóng muộn và giải phóng theo chương trình. Dạng thuốc giải phóng kéo dài (prolonged-release dosage form, extended-release dosage form): Là dạng thuốc giải phóng biến đổi, trong đó các giải pháp đặc biệt về thiết kế công thức và/hoặc k ỹ thuật sản xuất được áp dụng đ ể làm chậm và kéo dài quá trình giải phóng dược chất nhằm kéo dài tác dụng điều trị của thuốc (thuốc tác dụng kéo dài). Dạng thuốc giải phóng muộn (delayed-release dosage form): Là dạng thuốc giải phóng biến đổi, trong đ ó các giải pháp thuộc về công thức và/hoặc k ỹ thuật sản xuất được áp dụng để trì hoãn giải phóng dược chất sau một khoảng thời gian tiềm tàng nhất định. Dạng thuốc gi ả i phóng muộn bao gồm dạng thuốc bao tan trong ruột (bao kháng dịch vị) và dạng thuốc giải phóng theo nhịp (pulsatile-release dosage form). Dạng thuốc giải phóng theo chương trình (programmed-release dosage form): Là dạng thuốc giải phóng biến đổi, trong đó các giải pháp đặc biệt về thiết kế công thức và/hoặc kỹ thuật sản xuất được áp dụng để kiểm soát quá trình giải phóng dược chất khỏi dạng thuốc theo chương trình đã định sẵn. Hệ điều trị (therapeutic systems) là những chế phẩm giải phóng dược chất theo mô hình này. PHỤ LỤC 4 (Quy định) PHỔ KHỐI - PLASMA CẢM ỨNG (ICP-MS) Phổ khối-plasma kết hợp cảm ứng, gọi tắt là Phổ khối-plasma cảm ứng (ICP-MS) là một phương pháp phổ khối với nguồn ion hóa là plasma kết hợp cảm ứng (inductively-coupled plasma-ICP). Nguyên lý cơ bản của sự hình thành ICP được mô tả dưới đây: Plasma cảm ứng ICP là một nguồn khí trơ (thường là kh í argon) được ion hóa cao độ, có số ion và s ố electron bằng nhau và được duy trì bằng một trường điện từ tần số radio (RF). Khi mẫu thử tiếp xúc với ICP, nhiệt độ cao của plasma sẽ khử dung môi, hóa hơi, kích thích và ion hóa các nguyên tử trong mẫu. Giới hạn phát hiện của phương pháp ICP-MS đạt tới cỡ nanogam/lít. Plasma được hình thành khi một dòng kh í mang chạy “ngọn đèn" hay “torch" gồm 3 ống đồng tâm bằng thạch anh. Một cuộn dây kim loại cuốn quanh đầu trên của đèn và được nối với một nguồn phát tần số radio. Cuộn dây này được cấp một công suất thường là 700-1500 W, tạo nên một từ trường cảm ứng dao động ứng với tần số của nguồn tần số radio, thường là 27 MHz, 40 MHz. Plasma hình thành khi khí mang được kích thích bởi một nguồn phóng điện, sinh ra các ion và electron mầm. Trong từ trường cảm ứng, các phần tử t í ch điện (ion và electron) bị ép chạy qua con đường hình vành khuyên khép kín. Do cản trở dòng chảy của chúng, quá trình sinh nhiệt xảy ra và tạo thêm ion. Quá trình hình thành plasma xảy ra hầu như tức thời và plasma đạt được toàn bộ cường độ và kích thước. Sự dao động với tần số radio của công suất đặt trên cuộn dây tạo ra điện trường và từ trường tại khu vực phía trên phần đầu của đèn. Khi tia lửa điện (được tạo ra bởi ống Tesla hay một thiết bị kích thích khác) tác động lên luồng khí mang đi qua đèn, thì một số electron bị bứt khỏi các nguyên tử khí mang. Các electron này bắt gặp từ trường cảm ứng và tăng tốc. Sự tăng năng lượng cho các electron nhờ cuộn dây điện này được gọi là sự kết hợp cảm ứng (inductive coupling). Các electron năng lượng cao này lại va đập với các nguyên tử khí mang khác làm bật ra thêm nhiều electron hơn nữa. Sự ion hóa (do va đập) của khí mang tiếp tục xảy ra theo một ph ả n ứng dây chuyền, làm cho khí mang biến th à nh một thực thể plasma bao gồm các nguyên tử, các electron, và các ion khí mang. Plasma được duy trì trong phạm vi đèn và cuộn dây nhờ năng lượng có tần số radio được liên tục truyền cho plasma qua quá trình kết h ợ p cảm ứng. ICP được thấy như một plasma hình lông chim mạnh mẽ và sáng chói. Phần đáy của plasma có hình vòng xuyến, được gọi là vùng cảm ứng, là vùng ở đó có quá trình truyền năng lượng c ả m ứng từ cuộn dây cho plasma. Mẫu thử được đưa qua vùng cảm ứng này vào trung tâm của plasma. Trong ICP-MS, plasma sẽ ion hóa các nguyên tố có trong mẫu. Các ion này được đưa vào máy phổ khối và được tách theo t ỷ số kh ố i/điện tích (m/z). Hầu hết các máy phổ khối có một hệ tứ cực hoặc một nam châm. Các ion đi từ plasma qua bộ phận giao diện {gồm một côn lấy mẫu (sampler cone) và một côn gạn lọc (skimmer cone)} tới bộ quang học ion. Bộ quang học ion này gồm có một thấu kính tĩnh điện, thấu kính này đưa các ion từ một vùng có áp suất khí quyển sang bộ phận lọc khối có chân không được duy trì ở mức bằng 10 -8 Pa hoặc nhỏ hơn, nhờ một bơm turbo phân tử. Sau khi được lọc, các ion có tỷ số khối/điện tích được chọn đi tới detector (là một nhân quang, một cốc Faraday hay các dynod), tại đây các dòng ion được chuyển thành tín hiệu điện. Nguyên tố được định lượng dựa trên số ion đi tới detector và tạo ra các xung điện trong một đơn vị thời gian. Trong máy phổ ICP-MS còn có một hệ thống nạp mẫu và bộ xử lý dữ liệu như trong máy phổ ICP-AES. Thiết bị Một máy ICP-MS bao gồm các thành phần chủ yếu sau: • Bộ nạp mẫu gồm một bơm nhu động để bơm dung dịch đến bộ phận phun sương với tốc độ dòng không đổi; • Bộ sinh tần số radio; • Bộ đèn plasma (plasma torch); • Giao diện có hai côn để chuyển các ion đến bộ quang học ion; • Máy phổ khối; • Detector; • Bộ thu nhận dữ liệu. Yếu tố ảnh hưởng Vấn đề chính là nhiễu kh ố i lượng, đặc biệt là trong khoảng giữa của dải khối (ví dụ 40-80 đơn vị a.m.u), các phần t ử có cùng khối lượng che phủ đáng kể tín hiệu khối của ion phân tích. Tổ hợp các ion nguyên tử cũng dẫn đến các nhiễu đa nguyên tử hay nhiễu phân tử (như ảnh hưởng của 40 Ar 16 O lên 56 Fe hay của 40 Ar 40 Ar lên 80 Se). Nền mẫu cũng có thể ả nh hư ở ng lên một số chất phân tích. Một số nền mẫu có tác động lên sự hình thành giọt sương hay lên nhiệt độ ion hóa trong plasma. Những hiện tượng này có thể làm mất các tín hiệu của chất phân tích. Có thể tránh ảnh hưởng vật lý bằng cách sử dụng phương pháp chuẩn nội hay thêm chuẩn. Nguyên tố dùng làm chuẩn nội tùy thuộc vào nguyên tố cần đo: ví dụ có thể dùng 59 Co và 115 ln làm chuẩn nội. Đặc tính hàng đầu của một thiết bị ICP-MS là độ phân giải, tức là hiệu lực tách hai khối gần nhau . Về mặt này, các máy dùng tứ cực kém hơn các máy dùng nam châm. Tiến hành Chuẩn bị mẫu và nạp mẫu Việc chuẩn bị mẫu thư ờ ng có bước phá hủy nền mẫu bằng một phương pháp phù hợp như dùng lò vi sóng. Ngoài ra cần đảm bảo nồng độ chất phân tích nằm trong khoảng làm việc của máy (bằng cách pha loãng hay làm đậm đặc dung dịch mẫu) và đ ả m b ả o dung dịch mẫu có thể được phun sương ổn định. Nhiều hệ thống nạp mẫu cho phép sử dụng các acid đậm đặc, nhưng acid sulfuric và acid phosphoric có thể ảnh hưởng đến đường nền. Vì thế nên dùng acid nitric và acid hydrocloric. Nếu có bộ nạp mẫu và đèn plasma làm bằng vật liệu ch ị u acid hydrofluoric (như polymer perfluoroalkoxy) th ì có thể dùng acid hydrofluoric. Khi lựa chọn phương pháp nạp mẫu, cần tính đến yêu cầu về độ nhạy, độ ổn định, t ố c độ, cỡ mẫu, khả năng chống ăn mòn và chống bị tắc. Một bộ phun sương phun ngang kết hợp với một buồng phun và đèn plasma có thể đáp ứng với hầu hết các yêu cầu. Dung dịch mẫu thường được bơm bằng bơm nhu động với tốc độ khoảng 20 -1000 μl/min. Khi có sử dụng dung môi hữu cơ thì khi đưa oxygen vào phải tránh lớp dung môi hữu cơ. Chọn điều kiện làm việc Cần tuân theo các điều kiện thao tác chuẩn do nhà sản xuất thiết bị đưa ra. Thông thường, có các nhóm điều kiện thao tác khác nhau cho các dung dịch trong nước và dung dịch trong dung môi hữu cơ. Cần lựa chọn đúng các thông số làm việc: • Lựa chọn các côn bằng vật liệu thích hợp (côn lấy mẫu và côn gạn lọc); • Lựa chọn tốc độ dòng kh í mang (các ống ngoài, giữa và trong của đèn); • Lựa chọn công suất của dòng tần s ố radio (RF); • Lựa chọn tốc độ bơm; • Lựa chọn một hay nhiều đồng vị của nguyên tố cần đo. Lựa chọn đồng vị Có nhiều tiêu chí để lựa chọn chất đồng vị. Để đạt được độ nhạy tối đa, chọn đồng vị có mật độ cao nh ấ t. Ngoài ra, nên chọn một đồng v ị ít chịu ảnh hưởng bởi các phần tử khác trong nền mẫu và của khí mang. Trong phần mềm của nhà sản xuất thiết bị ICP-MS thường có sẵn thông tin về ảnh hưởng của các phần tử có cùng khối lượng và các ion đa nguyên t ử thuộc nhiều loại khác nhau như các hydrid, các oxyd, các clorid, v.v. Kiểm tra hiệu năng của máy Tính phù hợp của hệ thống Trước khi chạy mẫu, phải chỉnh máy đ ể có thể theo dõi và điều chỉnh các phép đo. Kiểm tra độ đúng của khối, dùng một dung dịch chứa nhiều đồng vị phủ kín thang khối, ví dụ dung dịch có chứa 9 Be, 59 Co, 89 Y, 1 1 5 ln , 140 Ce và 2 0 9 Bi. Ghi lại độ nhạy, độ ổn định ngắn hạn và dài hạn. Tối ưu hóa các thông số máy (điều kiện plasma, các thấu kính ion, thông số tứ cực) để thu được s ố lần đếm cao nhất có thể. Chỉnh độ phân giải và trục khối (sử dụng một dung dịch Li, Y và TI) đ ể đạt được một đáp ứng chấp nhận được trên một dải khối rộng. Ph ải đánh giá hiệu lực phân hủy các oxyd của plasma đ ể giảm thiểu ảnh hưởng của oxyd. Tỷ s ố Ce/CeO và/hay Ba/BaO là một chỉ thị tốt và chỉ số này cần nh ỏ hơn kho ả ng 3%. Giảm thiểu sự hình thành các ion hai điện tích với Ba và Ce. Tỷ số tín hiệu của các ion hai điện tích trên nguyên tố phân tích phải nhỏ hơn 2%. Kiểm tra độ ổn định d à i hạn bằng cách chạy một dung dịch chuẩn trước và sau khi chạy một chuỗi dung dịch mẫu và kiểm tra xem muối đọng trên các côn có làm giảm tín hiệu đo trong quá trình chạy hay không. Thẩm định phương pháp Các phương pháp được mô t ả trong các chuyên luận phải có hiệu năng đạt yêu cầu trong các kiểm tra định kỳ với khoảng cách thời gian thích hợp. Độ tuyến tính Chu ẩ n bị và chạy ít nhất 4 dung dịch chuẩn nằm trong khoảng hiệu chuẩn và một mẫu trắng. Với mỗi dung dịch làm lặp lạ i ít nhất 5 lần. Đường chuẩn được tính toán bằng phương pháp hồi quy b ì nh phương tối thiểu, dựa trên tất cả các dữ liệu thu được. Đường hồi quy, các trị giá trung bình, các dữ liệu đo, và khoảng tin cậy phải được ghi lại. Phương pháp có giá trị sử dụng khi: • Hệ số hồi quy đạt tối thiểu là 0,99; • Các điểm thực nghiệm thu được tại mỗi nồng độ chuẩn phải phân bố ngẫu nhiên hai bên đường chuẩn. Tính các trị giá trung bình và độ lệch chuẩn tương đ ố i tại mức nồng độ chuẩn th ấ p nhất và cao nhất. Nếu tỷ số giữa hai độ lệch chuẩn tính được nhỏ hơn 0,5 hay lớn hơn 2,0 thì có thể tính lại theo phương pháp hồi quy tuyến tính hữu trọng (hay hồi quy tuyến tính có trọng số - weighted linear regression) để có được đường chuẩn chính xác hơn. Áp dụng c ả hai hàm hữu trọng bậc 1 và bậc 2 để biết được dùng hàm nào là thích hợp nhất. Nếu các trị giá trung bình so với đường chuẩn cho thấy có độ lệch khỏi sự tuyến tính thì phải dùng phép hồi quy tuyến tính hai chiều. Độ đúng Nên kiểm tra độ đúng bằng cách sử dụng chất đối chiếu có chứng chỉ (CRM). Nếu không thể làm việc đó thì tiến hành thử độ thu hồi. Độ thu hồi Với phép thử định lượng, cần đạt độ thu hồi 90% đến 110%. Khi xác định một lượng vết nguyên tố, phải đạt độ thu hồi từ 80% đến120% tr ị giá lý thuyết. Có thể xác định độ thu hồi trên một dung dịch đ ố i chiếu (dung dịch trong nền mẫu) có cho thêm một lượng đã biết của chất phân tích (khoảng nồng độ có phải phù hợp với mẫu đem phân tích). Độ lặp lại Độ lặp lại (độ lệch chuẩn tương đối) không được lớn hơn 3% trong các phép định lượng và 5% trong phép thử xác định tạp chất. Giới hạn định lượng Kiểm tra để đảm bảo rằng giới hạn định lượng nhỏ hơn giá trị cần đo (ví dụ dùng phương pháp 10 σ). 4.7 PHỔ HUỲNH QUANG TIA X Khi nguyên tử của một nguyên tố nhận được năng lượng của một chùm tia X chiếu vào (tia X sơ cấp), nguyên tử đó có thể mất đi một electron lớp trong của n ó (v í dụ lớp K) và bị ion hóa, để lại một chỗ khuyết (trong lớp K). Trong một khoảng thời gian rất ngắn sau đó, một electron lớp ngoài (có năng lượng cao hơn) có thể rơi vào chỗ khuyết ở lớp trong và phát ra một tia X khác, đó là tia X huỳnh quang. Ph ổ huỳnh quang tia X là một kỹ thuật phân tích dựa trên việc đo cường độ bức xạ huỳnh quang phát ra bởi một nguyên t ố có nguyên tử số từ 11 đến 92 được kích thích bởi một bức xạ tia X sơ cấp liên tục. Cường độ huỳnh quang của một nguyên tố không chỉ phụ thuộc vào nồng độ nguyên tố đó có trong mẫu mà còn phụ thuộc vào sự hấp thụ bức xạ tới và bức xạ huỳnh quang bởi nền mẫu. Ở mức nồng độ vết, khi đường chuẩn tuyến tính, cường độ bức xạ huỳnh quang phát ra bởi một nguyên tố trong một nền mẫu xác định, ở một bước s ó ng xác định, sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ của nguyên tố đó và tỷ lệ nghịch với hệ s ố hấp thụ kh ố i (mass absorption coefficient) của nền mẫu tại bước sóng đ ó . Tiến hành Chuẩn bị và sử dụng thiết bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các mẫu l ỏ ng được đặt trực tiếp vào máy; mẫu rắn phải được ép thành viên trước, đôi khi mẫu rắn còn ph ả i trộn thêm với một chất kết dính trước khi ép viên. Để xác định được nồng độ của một nguyên tố có trong mẫu, cần đo tốc độ xung thật (net impulse rate) tạo nên bởi một hay nhiều mẫu chuẩn có hàm lượng đã biết của nguyên tố đó trong các nền mẫu xác định và tính hoặc đo hệ số hấp thụ khối của nền mẫu cần phân tích. Hiệu chuẩn Từ một dung dịch hay một dãy các dung dịch hiệu chuẩn của nguyên t ố phân tích trong các nền mẫu khác nhau, ta có thể tính được độ dốc b 0 của đường chuẩn theo phương trình sau: trong đó: μ M là hệ số hấp thụ của nền mẫu M, đã được tính hay đo; l à t ố c độ xung thật; C là nồng độ của nguyên tố cần định lượng trong dung dịch chuẩn. Hệ số hấp thụ khối của nền m ẫ u Nếu biết công thức phân tử của mẫu phân tích, có thể tính hệ số hấp thụ khối dựa trên thành phần nguyên tố và bảng hệ số hấp thụ khối của nguyên t ố . Nếu không biết thành phần nguyên tố, có thể đo cường độ l U của tia X tán xạ (tán xạ Compton) và tính hệ số hấp thụ khối của nền mẫu μ MP theo phương trình: trong đó: μ MP là hệ s ố hấp thụ khối của nền mẫu , I U là cường độ tia X tán xạ. Xác định t ố c độ xung thật của nguyên tố phân tích trong mẫu T í nh tốc độ xung thật của nguyên tố phân tích dựa trên cường độ của vạch huỳnh quang và cường độ của vạch (hay các vạch) nền do các tạp nhiễm có trong bất kỳ ố ng nào. Tính hàm lượng vết của nguyên t ố Nếu nồng độ của nguyên tố nằm trong phần tuyến tính của đường chuẩn thì ta có thể tính được nồng độ C của nguyên tố đó theo công thức sau: trong đó: f là hệ số pha loãng. 4.8 PHỔ RAMAN Phổ Raman là phổ dao động nên có liên quan đến phổ hồng ngoại (IR) và cận hồng ngoại hay hồng ngoại gần (NIR). Hiệu ứng Raman là kết qu ả của một sự thay đ ổ i độ phân cực của các liên kết phân tử tro n g một kiểu dao động xác định và được đo dưới dạng tia tán xạ không đàn hồi. Ta có thể thu được một phổ Raman khi kích thích mẫu phân tích lên đến một trạng thái ảo bằng một nguồn sáng đơn sắc, đặc biệt là nguồn laser. Tia tán xạ đàn hồi (không có thay đổi bước sóng) được gọi là tán xạ Rayleigh và không được quan tâm trong phổ Raman, trừ việc nó được dùng để đánh dấu bước sóng tia laser. Tuy vậy, nếu mẫu từ trạng thái kích thích rơi về một mức năng lượng dao động khác với ban đầu th ì tia tán xạ sẽ có chuyển dịch về năng lượng (có thay đổi về bước sóng). Sự chuyển dịch này trùng với hiệu năng lượng giữa các trạng thái năng lượng dao động đầu và cuối. Đây là tia “tán xạ không đàn hồi” và được gọi là tán xạ Raman. Chỉ có khoảng 1 trong s ố 10 6 - 10 8 các photon đi tới là cho tán xạ Raman. Vì thế, các tia laser được sử dụng trong các phổ kế Raman. Nếu photon tán xạ Raman có năng lượng thấp th ì nó được gọi là tán xạ Stokes. Nế u nó có năng lượng cao thì được gọi là tán xạ đối Stokes. Trên thực tế, hầu như tất cả các phép đo có ý nghĩa về mặt phân tích đều sử dụng sự tán xạ Raman chuyển dịch Stokes. Một phổ Raman trông rất gi ố ng như một phổ hồng ngoại tuyến tính về độ hấp thụ. Cường độ tia Raman (số photon Raman đếm được), được vẽ đ ố i chiếu với độ chuyển dịch năng lượng. Trục hoành thường được ghi là " Chuyển dịch Raman/c m -1 " hay " Số sóng/cm -1 " . Độ chuyển dịch Raman thường được biểu thị theo số sóng và bằng giá trị tuyệt đối của hiệu giữa số sóng của pic và s ố sóng của tia laser. Phổ Raman được biện giải theo cách như với phổ hồng ngoại giữa tương ứng. Các vị trí của các số sóng (chuyển dịch Raman) cho một kiểu dao động xác định là đúng với các số sóng của các dải tương ứng của một phổ hấp thụ hồng ngoại. Tuy nhiên, các pic mạnh trong phổ Raman lại ứng với các pic yếu trong phổ hồng ngoại, và ngược lại. Vì thế, hai kỹ thuật phổ Raman và hồng ngoại thường được cho là hai kỹ thuật bổ sung cho nhau. Kỹ thuật phổ Raman có ưu điểm là thường cho kết quả đo đúng và nhanh mà không cần phải phá hủy mẫu và không cần chuẩn bị mẫu hoặc chỉ cần chuẩn bị tối thiểu; mẫu có thể là chất rắn, nửa rắn, l ỏ ng và đôi khi là ch ấ t khí. Phổ Raman cung c ấ p thông tin về các kiểu dao động cơ bản của phân tử trong mẫu thử mà nhờ đó ta có thể hiểu thêm c ả về mẫu thử lẫn quá trình chế biến. Tín hiệu ch ủ yếu nằm trong vùng khả kiến và cận hồng ngoại, nên có thể ghép nối có hiệu qu ả với sợi quang học. Điều này cũng có nghĩa là có thể thu nhận tín hiệu từ bất kỳ một môi trường nào trong suốt đối với tia laser, như thủy tinh, chất dẻo, hay các mẫu trong môi trường nước. Hơn nữa, vì trong phổ Raman thường dùng các tia khả kiến hay cận hồng ngoại để kích thích, nên các bộ phận quang học có thể l à m bằng thạch anh hoặc thủy tinh thường . Về mặt thiết bị, các hệ thống máy hiện đại dễ sử dụng và cho kết quả phân tích đáng tin cậy và nhanh, trong thời gian tính bằng giây đến phút. Tuy thế, cần chú ý là tia laser năng lượng cao, nhất là trong vùng cận hồng ngoại, rất nguy hiểm, không được nhìn vào. Các đầu dò bằng sợi quang cần được sử dụng thận trọng, và tuân thủ các quy định hiện hành về tia laser và các loại laser. Bên cạnh phổ Raman “thường”, còn có nhiều kỹ thuật Raman chuyên biệt khác như Raman cộng hưởng (RR), phổ Raman nhạy bề mặt (SERS), phổ Raman quang hoạt (ROA) và nhiều kỹ thuật khác. Các kỹ thuật này ít được dùng trong ngành dược nên sẽ không được đề cập đến ở đây. CÁC PHÉP ĐO RAMAN ĐỊNH TÍNH VÀ Đ Ị NH LƯỢNG Có hai nhóm phép đo thường được thực hiện bằng kỹ thuật phổ Raman là định tính và định lượng. Định tính bằng phổ Raman Phổ Raman cho các thông tin về các nhóm chức hóa học có trong mẫu. Vì phổ Raman là đặc trưng cho một hợp chất nhất định nên phép đo Raman định tính có thể được dùng như một phép thử định tính một chất cũng như dùng để suy đoán cấu trúc phân tử của chất đó. Định lượng bằng phổ Raman Sử dụng một thiết b ị có detector đo công suất quang (như máy quang phổ Raman chuyển dạng Fourier, FT-Raman), có thể định lượng bằng phổ Raman dựa trên mối quan hệ giữa tín hiệu S v tại một số sóng đã cho v , và nồng độ chất phân tích C: S v = Kσ v (v L - v β ) 4 P 0 C trong đó: K là một hằng số phụ thuộc vào đường k í nh của chùm tia laser, hệ thu quang, thể tích mẫu và nhiệt độ; σ v là mặt cắt ngang Raman của một kiểu dao động nhất định; v L là số sóng của tia laser; v β l à s ố sóng của kiểu dao động; P 0 là công suất của tia laser. Mặt cắt ngang σ v đặc trưng cho bản chất của kiểu dao động nhất định đ ó . Thể tích mẫu được xác định bởi kích thước tiêu điểm của chùm tia laser trên mẫu, phần quang học dùng để hội tụ, và tính chất quang học của bản thân mẫu. Kích thước của điểm chiếu laser trên mẫu có thể thay đổi từ dưới 1 μm cho một vi đầu dò đến 6 mm cho một hệ mẫu diện tích lớn. Với các phổ kế Raman có thể đo số photon trên một giây (như các phổ kế Raman có bộ ghép-thay đổi (change-coupled device [CCD]-Raman spectrometers) thì dùng phương tr ì nh sau: S v = Kσ v v L (v L - v β ) 3 P 0 C Từ các phương trình nêu trên, ta thấy tín hiệu của pic tỷ lệ thuận với nồng độ. M ố i quan hệ tuyến tính này là cơ sở cho đa số các áp dụng định lượng của phổ Raman. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN VIỆC ĐỊNH LƯỢNG Các yếu tố do mẫu Các yếu tố thuộc về mẫu quan trọng nhất có thể gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến việc định lượng bằng phổ Raman là sự huỳnh quang, sự làm nóng mẫu, sự hấp thụ bởi nền mẫu hay bản thân mẫu và ảnh hưởng bởi sự phân cực. Nếu nền mẫu có chất huỳnh quang th ì tín hiệu đo được thường có phần đóng góp của sự huỳnh quang đ ó . Ch ỉ c ó thể quan sát được sự huỳnh quang nếu bước sóng của tia laser kích th í ch xen ph ủ lên một d ả i hấp thụ của chất huỳnh quang. Huỳnh quang có thể được quan sát thấy như là một nền rộng và dốc nằm dưới đường cong phổ Raman. Sự huỳnh quang làm cho đường nền bị chênh và làm giảm tỷ s ố tín hiệu trên nhiễu. Khoảng bư ớ c sóng và cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào thành phần hóa học của vật liệu huỳnh quang. Vì huỳnh quang thường có hiệu suất mạnh hơn so với tán xạ Raman, nên chỉ một chút tạp huỳnh quang cũng có thể làm cho tín hiệu Raman suy giảm đáng kể. Có thể làm giảm ảnh hưởng của huỳnh quang bằng cách sử dụng nguồn kích thích có bước sóng dài hơn như 785 nm hoặc 1064 nm (bước sóng dài hơn th ì số sóng nh ỏ hơn). Tuy nhiên, nên nhớ rằng cường độ của tín hiệu Raman là tỷ lệ với ( v L - v β ) 4 vì thế ưu điểm của việc sử dụng tia laser kích thích có bước sóng dài để làm giảm thiểu huỳnh quang đã bù trừ phần nào cho sự làm yếu tín hiệu Raman của bước sóng dài. Tỷ số tín hiệu trên nhiễu lớn nhất có thể đạt được bằng cách cân bằng các yếu t ố như sự loại bỏ huỳnh quang, cường độ tín hiệu và đáp ứng của detector. Huỳnh quang ở chất rắn đôi khi có thể được làm yếu đi bằng cách phơi mẫu dưới bức xạ laser trong một khoảng thời gian trước khi đo. Sự giảm huỳnh quang này là không rõ rệt khi lượng chất huỳnh quang không phải ở dạng vết hoặc khi mẫu là chất lỏng. Sự làm nóng mẫu bởi tia laser có thể tạo ra một số hiệu ứng khác nhau như sự nóng chảy, thay đổi trạng thái thù hình, cháy mẫu. Mẫu dễ bị nóng nhất khi điểm chiếu trên mẫu có kích thước nhỏ tức là khi dùng vi đầu dò. Nóng mẫu thường là một vấn đề đối với các vật liệu có màu, có tính hấp thụ mạnh hay các hạt rất nhỏ có khả năng truyền nhiệt thấp. Ảnh hưởng do làm nóng mẫu thường quan sát được dưới dạng sự thay đ ổ i phổ Raman theo thời gian, hoặc khi kiểm tra mẫu bằng mắt. Để giảm thiểu sự nóng mẫu do tia laser, bên cạnh việc làm gi ả m luồng laser, có thể sử dụng nhiều phương pháp khác như di chuyển mẫu hay di chuyển tia laser trong khi đo hay cải thiện sự truyền nhiệt từ mẫu bằng cách nhúng vào chất l ỏ ng. T í n hiệu Raman có thể được hấp thụ bởi nền mẫu hoặc bản thân mẫu. Điều này xảy ra nhiều hơn với các hệ máy FT-Raman bước sóng dài. Ở đây, tín hiệu Raman có thể xen ph ủ với một dải hấp thụ hòa cao (overtone) trong NIR. Hiệu ứng này phụ thuộc vào bộ quang của hệ thống cũng như cách trình bày mẫu, sự khác nhau của kích thước hạt trong chất rắn. Dù sao, những hiệu ứng này là không nghiêm trọng như trong phổ NIR. Cuối cùng, nên biết rằng bức xạ laser là phân cực và các phổ Raman của các chất kết tinh và các mẫu định hướng khác có thể khác nhau đáng kể, phụ thuộc vào cách mẫu được định vị. Nếu máy phổ Raman có thể cho bức xạ phân cực phẳng trên mẫu th ì nên dùng một bộ trộn (scrambler) phân cực trong việc phân tích mẫu hàng ngày. Các yếu tố do lấy mẫu Thuật ngữ lấy mẫu ở đây có thể được hiểu là phương cách lấy thông tin từ mẫu. Kỹ thuật phổ Raman là một kỹ thuật nền bằng không, nghĩa là khi không có mẫu th ì tín hiệu tại detector bằng không. Trong phổ hấp thụ thì ngược lại, khi không có mẫu thì tín hiệu tại detector lại là cực đại (T = 100%). Các kỹ thuật nền bằng không vốn rất nhạy, chỉ một thay đổi nhỏ về nồng độ chất trong mẫu cũng sẽ có một thay đổi cường độ tín hiệu theo tỷ lệ tương ứng. Các nguồn sáng khác (như tia lạc) cũng có thể làm thay đổi tín hiệu đo được. Ngoài ra, một tín hiệu nền lớn do huỳnh quang tạo ra sẽ làm tăng mức nhiễu. V ì thế, việc dùng tín hiệu Raman tuyệt đối để xác định trực tiếp một chất phân tích có thể sẽ rất khó khăn. Các yếu tố khác là sự thay đổi độ đục và độ không đồng nhất trong mẫu, sự thay đổi công suất laser chiếu lên mẫu và sự thay đổi vị trí của mẫu. Có thể giảm thiểu những ảnh hưởng này bằng cách lấy mẫu một cách ổ n định, có tính đại diện. Thiết kế c ẩ n thận thiết bị cũng có thể giảm bớt nhưng không thể loại bỏ được hoàn toàn những ảnh hưởng đó. Có nhiều cách để hạn chế sự dao động của kết quả do thăng giáng cường độ tuyệt đối gây nên. Cách thông dụng và hiệu quả nhất là thêm chất chuẩn nội và sử dụng các pic được tách khỏi chất chuẩn đó; cũng có thể dùng một dải hình thành do một phần của phân tử như một vòng thơm mà mặt cắt ngang Raman của nó không thay đổi theo cách chuẩn bị mẫu. Với phổ của một dung dịch, có thể sử dụng một pic dung môi tách biệt vì dung môi tương đ ố i ít thay đổi từ mẫu này sang mẫu khác. Cũng vậy, với một chế phẩm, có thể dùng pic của một tá dược nếu pic đ ó là đáng kể so với pic chất phân tích. Với giả thiết là những thay đổi định hướng của tia laser hay của mẫu có ảnh hưởng đồng đều lên toàn phổ, thì toàn bộ một phổ cũng có thể sử dụng như một phổ đối chiếu. Một yếu tố quan trọng thứ hai do lấy mẫu cần được xem xét là tạp nhiễm phổ. Tán xạ Raman là một hiệu ứng yếu, có thể bị che lấp bởi một số yếu tố bên ngoài. Các nguồn tạp nhiễm thông thường là những dị biệt của giá mẫu (như bình chứa hay giá thể/cơ chất) và ánh sáng môi trường xung quanh. Những vấn đề này có thể được xác định và giải quyết qua các thực nghiệm thận trọng. THIẾT B Ị Các bộ phận Tất cả các thiết bị phổ Raman hiện đại đều có quá trình đo bao gồm việc chiếu một chùm tia laser lên mẫu, thu nhận các tia tán xạ, loại bỏ các tia tán xạ Rayleigh, tách các tia Raman theo bước sóng, và cho kết quả là một phổ Raman. Để có thể thực hiện các công việc trên, tất cả các máy phổ Raman trên thị trường đều có các bộ phận chính sau đây: • Nguồn laser kích thích • Bộ phận lấy mẫu • Bộ phận lọc/loại bỏ tán xạ tại bước sóng laser • Bộ xử lý bước sóng • Detector và mảng điện tử Nguồn laser kích thích Bảng 1 chỉ ra nhiều nguồn laser thông dụng trong ngành Dược hoặc trong phổ Raman. Các laser UV cũng được dùng cho các ứng dụng chuyên biệt khác, nhưng chúng có những điểm bất lợi cho các phép đo phân tích. Vì ngày càng có nhiều áp dụng mới của laser UV được đưa ra, có khả năng là chúng cũng sẽ được dùng trong kỹ thuật phổ Raman. Bảng 1. Các nguồn laser được ứng dụng trong ngành Dược Laser λ, nm (số nguyên gần nh ấ t) Loại C ô ng suất tại nguồn laser Dải bước sóng (Vùng Stokes, độ dịch chuyển 100 cm - 1 đến 3000 cm -1 ) Chú th í ch Laser cận hồng ngoại (NIR) 1064 Hộp trọn bộ (Nd:YAG) Cho đến 3 W 1075-1563 Thường được dùng trong các máy chuyển dạng Fourier 830 Diod Cho đến 300 mW 827 - 980 Điền h ì nh là có giới hạn đến 2000 cm - 1 ; chuyển dịch Raman do đáp ứng phổ CCD; í t phổ biến hơn các laser khác 785 Diod Cho đến 500 mW 791 -1027 Ngu ồ n laser tán sắc được sử dụng rộng rãi nhất Laser khả ki ế n 632,8 He-Ne Cho đến 500 mW 637 - 781 Nguy cơ huỳnh quang tương đối thấp 532 Bộ đ ô i (Nd:YAG) Cho đến 1 W 535 - 632,8 Nguy cơ huỳnh quang cao 514,5 Ar+ Cho đến 1 W 517-608 Nguy cơ huỳnh quang cao 488-632,8 Ar+ Cho đến 1 W 490 - 572 Nguy cơ huỳnh quang cao Bộ phận lấy mẫu Có nhiều thiết kế khác nhau, trong đó có giao diện quang học trực tiếp, k í nh hiển vi, đầu dò s ợ i quang (loại không tiếp xúc hoặc loại quang học nhúng) và khoang chứa mẫu (bao gồm giá đỡ mẫu chuyên dụng và bộ phận thay đổi mẫu tự động). Đầu quang học lấy mẫu cũng có thể được thiết kế để có thể thu được một phổ Raman phụ thuộc vào sự phân cực và như vậy thường có thêm thông tin. Việc lựa chọn thiết bị lấy mẫu thường tùy thuộc vào chất phân tích và mẫu. Tuy nhiên cũng cần xem xét đến những vấn đề như thể tích mẫu lấy, tốc độ đo, an toàn laser, sự đồng nhất của mẫu để chọn bộ lấy mẫu tối ưu cho một ứng dụng cụ thể. Bộ phận lọc Tán xạ Rayleigh tại bước sóng của tia laser có cường độ lớn hơn nhiều bậc so với tín hiệu Raman và cần phải được loại bỏ trước khi đến detector. Lọc Notch được dùng phổ biến và vừa có kích thước nhỏ, vừa cho phép loại bỏ hết tán xạ Rayleigh. Phương pháp lọc truyền thống dùng các bộ đơn sắc nhiều cấp tuy vẫn còn nhưng ít được sử dụng. Ngoài ra, tùy theo bố trí hình học đ ể thu góp tín hiệu của máy, có thể cần dùng nhiều bộ lọc hay lá chắn để che chắn mẫu khỏi các bức xạ bên ngoài (như ánh sáng trong phòng, các vạch plasma laser). Bộ xử lý bước sóng Thang bước sóng có thể được mã hóa hoặc bởi một bộ đơn sắc quét, một bộ đa sắc cách tử (trong các phổ kế Raman-CCD) hay một giao thoa kế hai chùm tia (trong các phổ kế FT-Raman). Thiết bị phù hợp để sử dụng phải có thể dùng cho các phép đo định tính. Nhưng để đo định lượng, cần lựa chọn máy cẩn thận vì sự tuyến tính của độ tán sắc và của đáp ứng có thể không đồng đều trên toàn thang phổ. Detector Chuỗi CCD trên nền silic là detector phổ biến nhất cho các máy tán sắc. Chuỗi CCD được làm mát cho phép đo trên thang phổ với độ chuyển dịch Raman từ 4500 - 100 cm - 1 với nhiễu thấp khi sử dụng hầu hết các nguồn laser khả kiến như Nd:YAG, 532 nm (frequency-doubled neodymium-doped yttrium- aluminum-garnet) hay heli-neon, 632,8 nm. Với diod laser 785 nm, dải sóng giảm xuống còn khoảng 3100 - 100 cm - 1 . Với các CCD dùng phổ biến nhất, độ đáp ứng bước sóng đạt đỉnh khi dùng nguồn laser thông dụng 632,8 nm của laser khí He-Ne hay 785 nm của laser diod. Các máy FT thường sử dụng các detector một kênh germani hay indi-gali-arsenid (InGaAs) có đáp ứng trong vùng cận hồng ngoại để hợp với bước sóng kích thích 1064 nm của laser Nd:YAG. Hiệu chuẩn Ghi chú: Các phương pháp hiệu chuẩn thiết bị dưới đây nhằm cung cấp thông tin tham khảo. Việc hiệu chuẩn máy Raman bao gồm ba phần: bư ớ c sóng sơ cấp (trục x), bước sóng tia laser và cường độ (trục y). Hiệu chuẩn bước sóng sơ cấp (trục x) Trong trường hợp c á c máy Raman FT, việc hiệu chuẩn bước sóng sơ cấp được thực hiện ít nhất đến mức gần đúng đầu tiên, với nguồn laser He-Ne nội tại. Hầu hết các thiết bị tán sắc đều sử dụng đèn phát xạ nguyên tử để hiệu chuẩn bước sóng sơ cấp. Với các máy phù hợp cho phép đo phân tích Raman, nhà cung cấp sẽ đưa ra một quy trình hiệu chuẩn trục x mà người sử dụng có thể thực hiện được. Với các máy tán sắc Raman, phương pháp hiệu chuẩn dựa trên nhiều vạch phát xạ nguyên tử được dùng nhiều hơn. Giá trị của cách hiệu chuẩn này có thể kiểm tra qua hiệu chuẩn bước sóng laser tiếp theo bằng cách sử dụng một chuẩn độ chuyển dịch Raman thích hợp. Với các thiết bị tán sắc quét, có thể cần hiệu chuẩn thường xuyên hơn và cần kiểm tra độ chính xác (precision) trong cả hai phương thức vận hành tĩnh tại và vận hành quét. Hiệu chuẩn bước sóng tia laser Bước sóng laser dao động có thể tác động lên cả độ chính xác của bước sóng lẫn độ chính xác của tín hiệu quang của máy. Ngay cả những nguồn laser ổn định nhất vẫn có thể cho các tia có bước sóng khác nhau đôi chút. Vì vậy cần khẳng định bước sóng để đảm bảo độ đúng của vị trí độ chuyển dịch Raman cho các máy Raman FT hay Raman tán sắc. Để làm được việc này, có thể dùng một vật liệu chuẩn của độ chuyển dịch Raman như mô tả trong ASTM E1840-96 (2002) 1 hay một vật liệu được kiểm tra thích hợp. Ghi chú: Các giá trị chuẩn đáng tin cậy của độ chuyển dịch Raman cho các thuốc thử thường dùng, dạng l ỏ ng hay rắn cần cho việc hiệu chuẩn số sóng cho các phổ kế Raman được cung cấp trong ASTM E1840-96 (2002) đ ã nêu. Các giá trị này có thể được dùng cùng với các vạch phát xạ có độ đúng và độ chính xác cao của đèn hồ quang áp suất thấp, các vạch này có sẵn đ ể dùng trong hiệu chuẩn máy Raman. Các vật liệu tinh khiết phổ có thể mua tại các nhà cung cấp phù hợp. Một số máy có thể dùng một chuẩn Raman có sẵn bên cạnh quang trình ban đầu. Thiết bị chuẩn ngoại tái lập đúng quang trình của tia tán xạ (Khi sử dụng các chuẩn hóa học, cần chú ý tránh làm nhiễm tạp và khẳng định t í nh ổn định của chuẩn). Trừ khi máy dùng là loại có hiệu chuẩn liên t ụ c, ngay trước khi đo bước sóng laser, nên hiệu chuẩn trục bước sóng sơ cấp theo quy trình của nhà cung cấp máy. Trong hiệu chuẩn ngoại, nên đặt chuẩn độ chuyển dịch ở nơi đặt mẫu và tiến hành đo, sử dụng các thông số thu nhận tín hiệu thích hợp. Nên đánh giá trung tâm của pic trên một dải mạnh, phân giải tốt trong vùng phổ cần quan tâm. Có thể xác định vị trí pic bằng phương pháp thủ công hoặc dùng một thuật toán xác định pic đáng tin cậy. Phần mềm do người bán máy cung cấp có thể cho phép đo bước sóng laser và hiệu chỉnh bước sóng laser một cách thích hợp sao cho pic này nằm đ ú ng vị trí. Nếu người bán máy không cung cấp phần mềm có chức năng này th ì phải điều chỉnh bước sóng laser bằng tay. Tùy theo loại laser, bước sóng laser có thể thay đổi theo nhiệt độ, dòng, và thế. Dung sai bước sóng có thể thay đ ổ i tùy theo áp dụng cụ thể. Hiệu chuẩn cường độ (trục y) Việc hiệu chỉnh trục đo cường độ tín hiệu có thể quyết định sự định lượng thành công, nhờ có một số phương pháp phân tích { như đo lường hóa học (chemometrics)} và chuyển phương pháp giữa các máy. Cả hai loại phổ kế Raman FT và Raman tán xạ nên được hiệu chuẩn theo các quy trình tương tự. Dung sai chấp nhận được của độ chính xác cường độ tín hiệu (photometric precision) cho một phép đo cụ thể cần được đánh giá trong giai đoạn xây dựng phương pháp. Để hiệu chuẩn đáp ứng quang của một máy Raman, nên dùng một nguồn phát xạ băng rộng. Có hai phương pháp được chấp nhận là: Phương pháp A sử dụng một đèn wolfram phát ánh sáng trắng đã được hiệu chuẩn. Nhiều nhà cung cấp máy cũng cung cấp các chuẩn hiệu chuẩn độ bức xạ được nối chuẩn đến các phòng thí nghiệm đo lường quốc gia. Phương pháp này được áp dụng cho tất cả các bước sóng laser kích thích thông thường được nêu trong Bảng 1. Phương pháp B sử dụng các vật liệu chuẩn (SRM) do các phòng thí nghiệm đo lường quốc gia cung cấp. Một số chuẩn huỳnh quang bằng thủy tinh k í ch thích (doped-glass) có sẵn trên th ị trường. Phương pháp A: Nguồn được đặt vào vị trí của mẫu, với tia laser tắt và đo đáp ứng detector (sử dụng các thông số thích hợp cho máy). Đầu ra của nguồn được sử dụng để hiệu chuẩn phải được biết. Phải xác định tỷ số giữa đáp ứng đo được và đáp ứng thực và lập ra một hồ sơ hiệu chỉnh. Việc hiệu chỉnh phải được áp dụng cho tất cả các phổ thu được từ máy đó. Hầu hết các nhà cung cấp sẽ cung cấp cả nguồn hiệu chuẩn và phần mềm thích hợp. Nếu nhà sản xuất không cung cấp quy trình hay phương pháp thì người sử dụng có thể dùng một nguồn được hiệu chuẩn và một phần mềm thích hợp. Nếu dùng một phương pháp của nhà sản xuất th ì cần chú ý đến tính giá trị hợp lệ của nguồn và quy trình hiệu chuẩn. Người dùng phải có được tài liệu thích hợp từ nhà sản xuất để đảm bảo là cách làm đã được thẩm định đánh giá. Phương pháp B: Đặt chuẩn huỳnh quang vào chỗ đặt mẫu. Với nguồn laser bật, ghi phổ của vật liệu chuẩn SRM (có các thông số thích hợp cho máy). Đầu ra của nguồn được sử dụng để hiệu chuẩn phải được biết. Phải xác định tỷ số giữa đáp ứng đo được và đáp ứng thực, và lập ra một hồ sơ hiệu chỉnh. Việc hiệu chỉnh phải được áp dụng cho tất cả các phổ thu được từ máy đó. Hầu hết các nhà cung cấp sẽ cung cấp cả nguồn hiệu chuẩn và phần mềm thích hợp. Nếu nhà s ả n xuất không cung cấp quy trình hay phương pháp thì người sử dụng có thể dùng một vật liệu chuẩn và một phần mềm thích hợp. Nếu dùng một phương pháp của nhà sản xuất thì cần chú ý đến tính giá trị hợp lệ của vật liệu chuẩn và quy trình hiệu chuẩn. Người dùng phải có được tài liệu thích hợp từ nhà sản xuất để đảm bảo là cách làm đã được thẩm định đánh giá. Hiệu chuẩn ngoại Nên sử dụng chuẩn ngoại để hiệu chuẩn đầy đủ chức năng của máy, nhằm chứng minh tính phù hợp của các máy trong phòng thí nghiệm, ngay cả khi máy có phương pháp hiệu chuẩn nội bộ. Việc sử dụng chuẩn ngoại không loại bỏ yêu cầu phải có các quy trình kiểm tra nội bộ; mà là để có tư liệu về sự phù hợp của thiết bị cho mục đích hoặc phép phân tích cụ thể. Với các thiết bị được lắp đặt tại một dây chuyền hay trong một lò phản ứng, là nơi không thể thường xuyên đặt một chuẩn ngoại và ngay cả với các máy có hiệu chuẩn nội bộ thì việc so sánh hiệu năng của phương pháp hiệu chuẩn nội và ngoại cũng phải được định kỳ kiểm tra. Mục đích của việc này là để kiểm tra những thay đổi trong các thành ph ầ n mà có thể không có được trong phương pháp hiệu chuẩn nội (thấu kính quá trình, đầu dò sợi quang, v . v .), ví dụ như việc hiệu chuẩn quang của hệ quang. ĐÁNH GIÁ VÀ KI Ể M TRA CÁC PHỔ KẾ RAMAN C ó thể đánh giá phổ kế Raman thông qua: Tính phù hợp của hệ thống, đánh giá vận hành và kiểm tra hiệu năng (xem mục Định nghĩa các thuật ngữ và k ý hiệu). Mục đích của việc đánh giá tính phù hợp là để đảm bảo rằng công nghệ của thiết bị là phù hợp cho phương pháp định áp dụng. Mục đích của việc đánh giá vận hành là để đảm bảo rằng máy phù hợp cho mục đích sử dụng và qua đánh giá lại định kỳ, máy sẽ tiếp tục hoạt động tốt trong thời gian dài. Cần thường xuyên kiểm tra hiệu năng của máy khi máy được dùng cho một phép đo định tính hay định lượng cụ thể. Vì có nhiều cách đo phổ Raman khác nhau, nên trong việc đánh giá vận hành và kiểm tra hiệu năng có thể dùng những chuẩn ngoại mà có thể dùng cho một máy bất kỳ. Như với bất kỳ một phổ kế nào, phổ kế Raman cần được đánh giá về cả độ chính xác số sóng (cho trục x và độ chuyển dịch từ nguồn kích thích) cũng như độ chính xác đo quang (trục tín hiệu y). Trong kiểm tra hiệu năng, có thể sử dụng sự đánh giá mức độ phù hợp (quality-of-fit) với phổ quét ban đầu hay một nhóm phổ quét (thường được tập hợp trong các máy không quét). Trong một phép phân tích như thế, có thể cho rằng các phổ chuẩn thu được trên một máy mới hay máy mới được s ử a chữa và được vận hành đúng cách là đại diện cho các phổ tốt nhất có thể có được. Việc so sánh các phổ thu được qua thời gian với các chuẩn tương đồng (hoặc là chuẩn gốc hay các chuẩn mới cùng loại, khi có quan ngại về độ ổn định của chuẩn) là cơ sở để đánh giá độ ổn định lâu dài của hệ đo phổ Raman. Tần số thử nghiệm Việc đánh giá thiết bị được tiến hành theo từng khoảng thời gian xác định hay sau khi sửa chữa, thay đổi cấu hình quang học như thay nguồn laser, thay detector hay thay các lọc. Việc đánh giá lại toàn bộ thiết bị có thể không cần thiết khi thay đổi các phụ tùng như vi đầu dò, buồng chứa mẫu, đầu dò sợi quang cố định. Trong những trường hợp này có thể chỉ cần tiến hành đánh giá hiệu năng là đủ; và nên làm theo chỉ dẫn cụ thể của nhà cung cấp về các yêu cầu đánh giá cho một loại máy xác định. Các phép thử bao gồm thử độ chính xác bước sóng (của trục x và độ chuyển dịch từ nguồn kích thích), và độ chính xác đo quang (của trục tín hiệu y). Các phép thử đánh giá thiết bị đòi h ỏ i phải đạt yêu cầu về dung sai cho ứng dụng phân tích cụ thể. Việc kiểm tra hiệu năng được thực hiện trên thiết bị được cấu hình cho các phép đo phân tích và được thực hiện thường xuyên hơn đánh giá thiết bị. Kiểm tra hiệu năng bao gồm việc đo độ không đảm bảo của bước sóng và độ chính xác của thang cư ờ ng độ. Trước khi thu thập dữ liệu cho một ngày cần tiến hành các phép thử độ chính xác bước sóng và độ chính xác thang cường độ là cần thiết. Hiệu năng được kiểm tra bằng cách so các phổ thu được với các phổ thu được trong lần đánh giá thiết bị trước. Đánh giá vận hành thiết bị (Thẩm định vận h à nh) Trong đánh giá vận hành cũng như đánh gi á hiệu năng , điều quan trọng cần lưu ý là các tiêu chuẩn cần đạt được nên chỉ là các yêu cầu chung. Các tiêu chuẩn cụ thể cho các máy và các áp dụng cụ thể có thể thay đổi theo phương pháp phân tích được sử dụng và độ đúng mong muốn của kết quả cuối cùng. Các vật liệu chuẩn ASTM được chỉ đ ị nh với quy ước là trong một số trường hợp (đặc biệt là các áp dụng trực tuyến ở xa) việc sử dụng một trong số các vật liệu chuẩn này là không thực tế và có thể dùng các vật liệu khác đã được kiểm tra thích hợp. Trong trường hợp này, điều quan trọng là cần lưu ý các thông số cụ thể như nhiễu của phổ kế, các giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) và độ rộng chấp nhận được của dải phổ cho một áp dụng đã cho sẽ phải được xác định trong quá trình xây dựng phương pháp phân tích. Các giá trị cụ thể cho phép thử như độ lớn của nhiễu và độ rộng của chùm tia của phổ kế sẽ phụ thuộc vào thiết bị sử dụng và mục đ í ch được đưa ra. Vì vậy, những phép thử thiết bị cụ thể cho các thông số nói trên sẽ không được trình bày trong chương này. Độ đúng bước sóng (trục x) Điều quan trọng là đảm bảo độ đúng của trục bước sóng thông qua hiệu chuẩn để duy trì tính toàn vẹn của vị trí các pic Raman. Việc hiệu chuẩn bước sóng của phổ kế Raman gồm có hai phần: hiệu chuẩn trục bước sóng sơ cấp và hiệu chuẩn bước sóng laser. Sau khi hiệu chuẩn trục bước sóng sơ cấp và bước sóng laser có thể xác định độ không đảm bảo đo bước sóng của thiết bị. Để hoàn thiện có thể sử dụng một chuẩn của độ dịch chuyển Raman, ví dụ như chuẩn ASTM hay một vật liệu đã được kiểm tra phù hợp khác. Nên chọn một chuẩn với các dải có mặt trên toàn thang phổ Raman để có thể đánh giá độ không đảm bảo bước sóng của thiết bị tại nhiều vị trí trên phổ. Dung sai của độ chính xác bước sóng cho một thiết bị nên được đánh giá trong giai đoạn xây dựng phương pháp. Ghi chú: Với các thiết bị tán sắc quét, việc hiệu chuẩn có thể cần thực hiện thường xuyên hơn và có thể cần kiểm tra độ chính xác trong cả hai kiểu vận hành tĩnh và vận hành quét. Độ chính xác đo quang Độ dao động của laser, tính theo tổng photon phát ra, xảy ra giữa hai lần đo có thể gây nên sự thay đổi độ chính xác đo quang của thiết bị. Điều không may là rất khó tách được những thay đổi của đáp ứng đo quang (gắn với dao động của tổng photon phát ra) khỏi các biến động do cảm ứng bởi mẫu và lấy mẫu. Đây là một lý do vì sao không nên thực hiện các phép đo Raman tuyệt đối và vì sao những yêu cầu về độ chính xác đo quang được quy định tương đối lỏng lẻo. Nên đánh giá dung sai độ chính xác đo quang của một thiết bị ngay trong giai đoạn xây dựng phương pháp. Đánh giá hiệu năng (thẩm định hiệu n ă ng) Mục tiêu của việc đánh giá hiệu năng là để đảm b ả o rằng thiết bị đang hoạt động đúng trong giới hạn đã chỉ ra về độ chính xác bước sóng, độ chính xác đo quang và độ nhạy. Trong một số trường hợp, thiết bị đã được thiết kế để dùng cho một phép đo cụ thể (ví dụ, để đặt trong trong dây chuyền một lò phản ứng), thì không thể hoặc không cần đo bước sóng và tín hiệu đo quang, sử dụng các chuẩn đánh giá đã nêu. Nếu như việc đánh giá vận hành đã chứng minh rằng máy là phù hợp cho mục đích sử dụng, th ì có thể dùng một chuẩn bên ngoài duy nhất để thường xuyên kiểm tra lại chức năng của máy (v í dụ, sau khi làm sạch lò phản ứng, kiểm tra tín hiệu của dung môi xử lý cả về độ chính xác bước sóng và độ chính xác đo quang). Chuẩn kiểm tra hiệu năng phải phù hợp với khuôn hình của mẫu đang phân tích càng nhiều càng tốt và phải dùng các thông số thu nhận phổ giống nhau. Các phép đo định lượng của một phổ chuẩn kiểm tra hiệu năng sẽ kiểm tra cả độ chính xác bước sóng (trục x và bước sóng laser) và độ chính xác tín hiệu đo quang. Nếu việc so sánh một chuỗi các phổ là tốt thì điều đó ch ứ ng minh rằng thiết bị đang tiếp tục hoạt động tốt. Độ chính xác bước sóng Độ chính xác bước sóng được xác định bằng cách thu thập dữ liệu của một phổ của một vật liệu chuẩn độ dịch chuyển Raman đã chọn, trong một khoảng thời gian bằng với thời gian dùng để thử độ ổn định đo quang. Nếu thuận tiện thì các mẫu đã nghiền bột nên được đ ó ng gói lại (repack) giữa hai loạt đo. Vị trí các pic trên toàn bộ vùng phổ đáng quan tâm được dùng để tính độ chính xác. Hiệu năng được kiểm tra bằng cách đối chiếu vị trí các pic với vị trí thu được trong lần đánh giá thiết bị trước và không được sai khác quá ±0,3 cm - 1 so với độ lệch chuẩn, mặc dù tiêu chuẩn này có thể điều chỉnh theo độ đúng yêu cầu cho phép đo. Độ chính xác đo quang Độ chính xác đo quang phải được đo bằng cách thu thập các dữ liệu phổ của một vật liệu chuẩn kiểm tra thích hợp, trong một thời gian đã định. Sau khi hiệu chỉnh đường nền, phải dùng một thuật toán thích hợp đ ể tính diện tích một số các dải trên vùng phổ quan tâm. Diện tích của dải mạnh nhất được cho là 1 và các dải (envelopes) khác được chuẩn hóa theo dải này. Hiệu năng được kiểm tra bằng cách so sánh diện tích các dải hiện đo được với các diện tích tương ứng đã thu được trong lần đánh giá thiết bị trước đó. Sự sai khác không được vượt quá 10% mặc dù chỉ tiêu này có thể được điều chỉnh theo yêu cầu về độ đúng của phép đo. Độ chính xác và độ đúng của công suất laser đầu ra Phép thử này chỉ được áp dụng cho các thiết bị Raman có máy đo công suất laser nội tại và tự động. Thiết bị không có máy này thì phải sử dụng một máy đo công suất laser đã được hiệu chuẩn của một nhà cung cấp có uy tín. Đầu ra của laser phải được thiết lập sao cho có t í nh đại diện và đáp ứng được các yêu cầu của phép đo phân tích và của công suất laser được đo. Đầu ra phải được đo và kiểm tra đối chiếu với đầu ra đo được khi đánh giá thiết bị. Công suất (tính theo milliwatt hay watt) phải không sai khác q u á 25% so với mức khi đánh giá. Nếu sai khác lớn hơn thì thiết bị cần được bảo dưỡng (vì sự sai khác này có thể chỉ ra rằng, bên cạnh những điều khác, có sự lệch lạc lớn của hệ thống hoặc n ả y sinh hư hỏng của nguồn laser). Với các thiết bị có máy đo công suất laser bên trong, độ đúng của các giá trị do máy đo công suất laser bên trong cho ra phải được so sánh với một máy đo công suất bên ngoài đã hiệu chuẩn trong khoảng thời gian không quá 12 tháng. Giá trị tính được của máy bên trong phải được so với giá trị của máy bên ngoài. Hiệu năng được kiểm tra bằng cách so sánh giá trị hiện có với giá trị thu được trong l ầ n đánh giá thiết bị trước đây. Nhà sản xuất thiết bị có thể cung cấp một phần mềm để việc phân tích này được dễ dàng. Nếu thiết kế của thiết bị không cho phép sử dụng một máy đo công suất bên ngoài thì khi đó nhà cung cấp phải đưa ra tài liệu đ ả m bảo chất lượng của thiết bị và cung cấp một quy trình được khuyến cáo để có thể thực hiện được việc phân tích nói trên cùng với kỳ bảo dưỡng đã định. TH Ẩ M ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP Việc thẩm định các phương pháp phổ Raman được làm theo các quy định chung đối với các tiêu chí về độ đúng, độ chính xác v.v. Tuy nhiên, nhiều tiêu chí trong đó bị ảnh hưởng bởi các biến đặc trưng của phổ Raman. Huỳnh quang có thể là biến đầu tiên có thể ảnh hưởng đến tính phù hợp của một phương pháp. Sự có mặt của các tạp huỳnh quang trong mẫu có thể rất khác nhau và có ít ảnh hưởng đến tính chấp nhận được của vật liệu. Phương pháp phải đủ linh hoạt để chấp nhận được các chế độ l ấ y mẫu cần áp dụng để giảm thiểu ảnh hưởng của các tạp này. Độ tuyến tính của detector phải được khẳng định trên thang các mức tín hiệu có thể có. Huỳnh quang có thể đẩy cao cả đường nền lẫn nhiễu so với khi thẩm định; trong trường hợp này, phải làm giảm huỳnh quang hoặc phải sửa đổi phương pháp cho phù hợp với mức huỳnh quang cao. Khi nhiễu đường nền tăng cao sẽ có tác động tiêu cực đến độ chính xác, gi ớ i hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp. Vì huỳnh quang có thể ảnh hưởng đến kết quả định lượng do chuyển dịch đường nền, nên phải khẳng định việc định lượng là có thể chấp nhận được ở các mức khử quang (photobleaching) khác nhau. Tác động của laser lên mẫu phải được xác định. Với các phép đo dùng các công suất laser và thời gian tiếp xúc với tia khác nhau, việc kiểm tra mẫu bằng mắt và kiểm tra định tính của phổ Raman sẽ khẳng định được là mẫu không bị biến đổi (không tính đến sự khử quang). Để khẳng định trong phổ Raman, các biến đặc trưng là sự chuyển dịch vị trí của pic, những thay đổi chiều cao pic và độ rộng dải và những thay đổi không mong đợi của cường độ nền. Độ chính xác của phương pháp cũng phải tính đến vị trí của mẫu. Cách trình bày mẫu là một yếu tố trọng yếu cho cả chất lỏng lẫn chất rắn và phải được kiểm soát chặt chẽ hoặc phải tính đến trong mô hình hiệu chuẩn. Độ nhạy c ả m của vị trí mẫu thường có thể được hạn chế bằng cách chuẩn bị mẫu thích hợp hoặc bằng hình học của giá đỡ mẫu, nhưng nó còn thay đổi từ máy này sang máy khác tùy theo cấu hình quang học của bộ thu nhận và kích thích. ĐỊNH NGHĨA CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU • Mô hình hiệu chuẩn (calibration model) là một biểu thức toán học của sự liên hệ giữa đáp ứng của một máy phân tích và các tính chất của mẫu. • Độ rộng dải phổ (intrument bandpass) hay Độ phân giải (resolution) là thước đo khả năng tách các bức xạ có bước sóng gần nhau của một phổ kế. • Đánh giá vận hành (operational qualification) là quá trình làm việc và ghi chép để chứng minh rằng máy hoạt động theo đúng các chỉ tiêu kỹ thuật của máy và có thể đáp ứng được mục đích sử dụng. Cần thực hiện việc này sau khi có bất kỳ sự thay đổi có ý nghĩa nào như lắp đặt, đổi chỗ, s ử a chữa quan trọng, v.v. • Đánh giá hiệu năng (performance qualification) là quá trình sử dụng một hay nhiều vật liệu đối chiếu ổn định và có các đặc t í nh xác định rõ để kiểm chứng hiệu năng làm việc ổn định của máy. Trong việc đánh giá này có thể sử dụng các chuẩn khác nhau cho các đặc tính hiệu năng khác nhau. • Phổ Raman (Raman spectra) 2 là đồ thị chỉ trên trục tung năng lượng bức xạ, hay số photon, tán xạ bởi mẫu khi có tương tác giữa dao động phân tử trong mẫu và một bức xạ đơn sắc có tần số cao hơn nhiều so với tần số dao động. Trục hoành thường là hiệu số sóng giữa ánh sáng tới và ánh sáng tán xạ. • Tán xạ Raman (thường) (Nomal Raman scattering) 2 là sự tán xạ không đàn hồi của ánh sáng x ả y ra khi có thay đổi độ phân cực của các liên kết liên quan trong một dao động phân tử. Phổ Raman (thường) xuất hiện khi mẫu được kích thích bởi một bức xạ không cộng hư ở ng với sự chuyển dịch điện tử trong mẫu. • Độ chuyển dịch số sóng Raman (Raman wavenumber shift) 2 : trong đó: β là mặt cắt ngang Raman vi phân, có giá trị dương với tán xạ Stokes và âm với tán xạ đối Stokes. là hiệu của số sóng của vạch kích thích và số sóng của tia tán xạ, với đơn vị SI là m - 1 . Đơn vị thường dùng là cm - 1 = 100 m - 1 . Gh i chú: 1 ASTM E1840-96 (2002) Hướng dẫn về các chuẩn độ dịch chuyển dùng cho hiệu chuẩn phổ kế. Standard Guide for Raman Shift Standards for Spectrometer Calibration. 2 Chalmers, J., Griffiths, P., Eds. Sổ tay phổ dao động (Handbook of Vibrational Spectroscopy ), 2002. PHỤ LỤC 12 (Quy định) LỖ KHÍ VÀ CHỈ SỐ LỖ KHÍ Một số trường hợp, lỗ kh í và chỉ số lỗ khí có ý nghĩa trong kiểm nghiệm dược liệu . Số lượng lỗ khí (số lỗ khí trên 1 cm 2 biểu bì) và chỉ số lỗ khí (tỷ lệ lỗ khí và số tế bào biểu bì trên một diện tích) thường là những đại lượng tương đối cố định đối với một loài, trong nhiều trường hợp cho phép phân biệt các loài trong cùng một chi. Các ki ể u lỗ khí Hình ảnh một số kiểu lỗ khí cơ b ả n được đưa trong Hình 12.24, dựa vào hình dạng và cách s ắp xếp của các tế bào xung quanh lỗ khí để phân biệt các ki ể u lỗ khí, hay gặp các kiểu như sau: (1) Ki ể u hỗn bào (irregular-celled): Lỗ khí được bao bọc bởi nhiều tế bào giống như tế bào biểu bì, không có tế bào phụ (các tế bào xung quanh lỗ khí có số lượng không xác định, sắp xếp lộn xộn không theo thứ tự). (2) Ki ể u dị bào (unequal-celled): Lỗ khí được bao bọc b ở i 3 tế bào phụ, trong đó có 1 tế bào nhỏ hơn 2 tế bào còn lại. (3) Ki ể u trực bào (cross-celled): Lỗ khí được bao bọc bởi 2 tế bào phụ nằm thẳng góc với trục dọc của lỗ khí (khe lỗ khí). (4) Kiểu song bào (parallel-celled): Lỗ khí được bao bọc bởi 2 tế bào phụ nằm song song với trục dọc của lỗ kh í . Chỉ s ố lỗ kh í Sử dụng một trong các phương pháp sau đây để xác định số lỗ khí trên một diện tích biểu bì: • Sao chép bề mặt biểu bì bằng nhựa colodion hoặc bóc biểu b ì rồi cắt các mẫu có kích thước thích hợp (hoặc kích thước 1 cm 2 nếu cần xác định số lỗ khí trên 1 cm 2 ) để quan sát dưới kính hiển vi. Đếm số lỗ khí trong một diện tích hoặc 1 cm 2 . • Quan sát trực tiếp dưới kinh hiển vi phản xạ các m ẫ u lá được cắt với kích thước thích hợp. • Chụp ảnh một diện tích bề mặt biểu bì, đếm lỗ khí và các loại tế bào trên ảnh. Xác định chỉ số lỗ khí theo công thức sau: Chỉ số lỗ khí = 100 x S E + S trong đó: S là số lỗ khí trên một diện tích (thường tính trên một vi trường); E là số tế bào biểu bì (bao gồm cả các loại hình thái lông) trong cùng một diện tích (thường tính trên một vi trường). Yêu cầu: Đối với mỗi mẫu thử, chỉ số lỗ khí thu được là giá tr ị trung b ì nh của ít nhất 10 lần thực hiện. CHÚ DẪN: 1. Lỗ khí kiễu hỗn bào; 2. Lỗ khí kiểu dị bào; 3. Lỗ khí kiểu trực bào; 4. Lỗ khí kiểu song bào Hình 12.24 - Các kiểu lỗ khí PHẦN 2 NGUYÊN LIỆU HÓA DƯỢC ABACAVIR SULFAT Abacaviri sulfas C 28 H 38 N 12 O 6 S P.t.l: 671 Abacavir sulfat là bis[[(1S,4 R )-4-[2-amino-6-(cyclopropylamino)-9 H -purin-9-yl]cyclopent-2- enyl ] methanol] sulfat, phải chứa từ 99,0% đến 101,0% C 28 H 38 N 12 O 6 S , tính theo chế phẩm khan. Tính chất Bột màu trắng hoặc gần như trắng. Tan trong nước, thực tế không tan trong ethanol 96% và methylen clorid. Định tính Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau: Nhóm I: A, B và D. Nhóm II: A, C và D. A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của abacavir sulfat chuẩn. B. Góc quay cực riêng phải từ -58,0° đến -54,0° (Phụ lục 6.4). Dùng dung dịch S để đo. Dung dịch S: Hòa tan 0,250 g chế phẩm trong nước và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. C. Chế phẩm phải đáp ứng phép thử Tạp chất đồng phân đối quang. D. Dung dịch S phải cho ph ả n ứng (A) của ion sulfat (Phụ lục 8.1). Tạp chất đồng phân đối quang Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động A: Diethylamin - 2-propanol - heptan (0,1 : 15 : 85). Pha động B: Heptan - 2-propanol (50 : 50). Dung dịch A: Acidtrifluoroacetic - methanol (0,5 : 100). Dung dịch B: Methanol - 2-propanol - heptan (30 : 30 : 40). Dung dịch thử: Hòa tan 40 mg chế phẩm trong 30 ml dung dịch A, lắc siêu âm đến khi tan hoàn toàn, thêm 30 ml 2- propanol (TT) và pha loãng thành 100,0 ml bằng heptan (TT). Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 2 mg abacavir chuẩn dùng đ ể kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc k ý (chứa tạp chất A và D) trong 1,5 ml dung dịch A. Lắc siêu âm cho tan hoàn toàn, thêm 1,5 ml 2- propanol (TT) và pha loãng thành 5,0 ml bằng heptan (TT). Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử th à nh 100,0 ml bằng dung dịch B. Tiếp tục pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 10,0 ml bằng dung dịch B. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm), được nhồi pha tĩnh là dẫn xuất amylose của silica gel dùng cho sắc ký phân tách đồng phân đối quang (10 μm). Nhiệt độ cột: 30 °C. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 286 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 20 μl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) 0 - 25 100 0 25 - 27 100 -> 0 0 -> 100 27 - 37 0 100 Định tính các tạp chất: Sử dụng sắc ký đồ cung cấp kèm theo abacavir chuẩn dùng để kiểm tra tính phù hợp của hệ thống và sắc ký đồ thu được từ dung dịch đối chiếu (1) để xác định pic của tạp chất A và D. Thời gian lưu tương đối của các pic tạp chất so với pic abacavir (thời gian lưu khoảng 17 min): Tạp chất D khoảng 0,8; tạp chất A khoảng 0,9. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc ký: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1), độ phân giải giữa hai pic tạp chất D và tạp chất A ít nhất là 1,5; và độ phân giải giữa hai pic tạp chất A và pic abacavir ít nhất là 1,5. Giới hạn: Trên sắc ký đồ dung dịch thử: Diện tích pic tạp chất A không được lớn hơn 3 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,3%). Ghi chú: Tạp chất A: [(1 R ,4 S )-4-[2-amino-6-(cyclopropylamino)-9 H -purin-9-yl]cyclopent-2-enyl]methanol. Tạp chất D: [(1 R ,4 R )-4-[2-amino-6-(cyclopropylamino)-9 H -purin-9-yl]cyclopent-2-enyl]methanol. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Chuẩn bị các dung dịch ngay trước khi sử dụng, dùng dụng cụ thủy tinh màu nâu, trung tính. Pha động A: Pha loãng 0,5 ml acid trifluoroacetic (TT) trong 1000 ml nước. Pha động B: Nước - methanol (15 : 85). Dung dịch thử: Hòa tan 25 mg chế phẩm trong nước và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi. Lắc siêu âm đến khi chế phẩm tan hoàn toàn. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 2,5 mg abacavir chuẩn dùng để định tính pic (chứa tạp chất B và D) trong 10,0 ml nước . Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng nước . Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 10,0 ml bằng nước . Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (15 cm x 3,9 mm), được nhồi end-capped octadecylsilyl silica gel dùng cho sắc ký (5 μm). Nhiệt độ cột: 30 °C. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 20 μl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình dung môi như sau: Th ờ i gian (min) Pha động A (% tt/tt ) Pha động B (% t t/ tt) 0 - 5 95 5 5 - 25 95 -> 70 5 -> 30 25 - 40 70 -> 10 30 -> 90 Định tính các tạp chất: Sử dụng sắc ký đồ cung cấp kèm theo abacavir chuẩn dùng để định tính pic và sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) để xác định pic của tạp chất B và D. Thời gian lưu tương đối của các pic tạp chất so với pic abacavir (thời gian lưu khoảng 22 min): Tạp chất D khoảng 1,04; tạp chất B khoảng 1,3. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc k ý : Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1), độ phân giải giữa hai pic abacavir và tạp chất D ít nhất là 1,5. Giới hạn: Trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử: Diện tích pic tạp chất B không được lớn hơn 2 lần diện tích pic chính thu được trên sắc k ý đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,2%). Tạp chất khác: Với mỗi tạp ch ấ t, diện tích pic không được lớn hơn diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,10%). Tổng diện tích của t ấ t cả các pic tạp chất không được lớn hơn 5 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,5%). Bỏ qua các pic tạp chất có diện tích nhỏ hơn 0,5 lần diện tích của pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,05%). Ghi chú: Tạp chất B: 6-(cyclopropylamino)-9-[(1 R ,4 S )-4-[[(2,5-diamino-6-cloropyrimidin-4-yl)oxy]methyl]cyclopent-2-enyl]-9 H -purin-2-amin Kim loại nặng Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Lấy 12 ml dung dịch S tiến hành thử theo phương pháp 1. Dùng 2 ml dung dịch chì mẫu 1 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị dung dịch đối chiếu. Nước Không được quá 0,5% (Phụ lục 10.3). Dùng 60,0 mg chế phẩm. Tro suIfat Không được quá 0,2% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Cân chính xác khoảng 0,300 g chế phẩm, hòa tan trong 50 ml nước . Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ). Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (Phụ lục 10.2). 1 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ) tương đương với 33,54 mg C 28 H 38 N 12 O 6 S. Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Thu ố c kháng virus HIV. Chế phẩm Viên nén, dung dịch uống. ARGININ Argininum C 6 H 14 N 4 O 2 P.t.l: 174,2 Arginin là acid ( S )-2-amino-5-guanidinopentanoic, phầi chứa từ 98,5% đến 101,0% C 6 H 14 N 4 O 2 , tính theo chế phẩm đã làm khô. Tính chất Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng hay tinh thể không màu. Dễ tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96%. Định t í nh Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau: Nhóm I: A, C. Nhóm II: B, C, D, E. A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của arginin chuẩn. Chuẩn bị mẫu đo dưới dạng đĩa nén. B. Trên sắc ký đồ thu được trong phần Các chất dương tính với ninhydrin, vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử (2) phải tương tự về vị trí, màu sắc và kích thước với vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1). C. Chế phẩm phải đáp ứng phép thử Góc quay cực riêng. D. Dung dịch S phải có pH lớn hơn 10 (Phụ lục 6.2). E. Hòa tan khoảng 25 mg chế phẩm trong 2 ml nước . Thêm 1 ml dung dịch α-naphthol (TT) và 2 ml hỗn hợp đồng th ể tích của dung dịch natr i hypoclorit (TT) và nước , sẽ xuất hiện màu đỏ. Độ trong và màu sắc của dung dịch Dung dịch S: Hòa tan 2,5 g chế phẩm trong nước và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Dung dịch S phải trong (Phụ lục 9.2) và màu không được đậm hơn màu mẫu VN 6 (Phụ lục 9.3, phương pháp 2). Góc quay cực riêng Từ +25,5° đến +28,5°, tính theo chế phẩm đã làm khô (Phụ lục 6.4). Hòa tan 2,00 g chế phẩm trong dung dịch acid hydroclor i c 25% (TT) và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. Các chất dương tính với ninhydrin Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4). B ả n mỏng: Silica gel. Dung môi khai triển: Amoniac - 2-propanol (30: 70). Dung dịch thử (1): Hòa tan 0,10 g chế phẩm trong dung dịch acid hydrocloric loãng (TT) và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi. Dung dịch thử (2): Pha loãng 1 ml dung dịch thử (1) thành 50 ml bằng nước . Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 10 mg arginin chuẩn trong dung dịch acid hydroclor i c 0,1 M (TT) và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 5 ml dung dịch thử (2) thành 20 ml bằng nước . Dung dịch đối chiếu (3): Hòa tan 10 mg arginin chuẩn và 10 mg lysin hydroclorid chuẩn trong dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) và pha loãng thành 25 ml với cùng dung môi. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 μl mỗi dung dịch trên. Để khô bản mỏng ngoài không khí. Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi đi được 15 cm. Sấy bản mỏng ở nhiệt độ 100 °C đến 105 °C đến khi amoniac bay hơi hết. Phun dung dịch ninhydrin 0,2% (TT) và sấy b ả n mỏng ở nhiệt độ 100 °C đến 105 °C trong 15 min. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử (1), bất kỳ vết phụ nào ngoài vết chính không được có màu đậm hơn vết chính của dung dịch đối chiếu (2) (0,5%). Phép thử chỉ có giá trị khi trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) cho hai vết tách biệt rõ ràng. Clorid Không được quá 0,02% (Phụ lục 9.4.5). L ấ y 5 ml dung dịch S, thêm 0,5 ml dung dịch acid nitric loãng (TT) và pha loãng bằng nước thành 15 ml để tiến hành thử. Sulfat Không được quá 0,03% (Phụ lục 9.4.14). Lấy 10 ml dung dịch S, thêm 1,7 ml dung dịch acid hydrodoric loãng (TT) và pha loãng bằng nước cất thành 15 ml để tiến hành thử. Amoni Không được quá 0,02% (Phụ lục 9.4.1). Lấy 50 mg chế phẩm tiến hành theo phương pháp B. Dùng 0,1 ml dung dịch amoni mẫu 100 phần triệu NH 4 (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Sắt Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.13). Hòa tan 1,0 g chế phẩm trong 10 ml dung dịch acid hydrocloric loãng (TT). Chiết 3 lần, mỗi lần với 10 ml methyl isobutyl keton ( TT 1 ) và lắc trong 3 min. Tập trung dịch chiết hữu cơ, thêm 10 ml nước , lắc 3 min. Lấy lớp nước và tiến hành thử. Kim loại nặng Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Hòa tan 2,0 g chế phẩm trong nước và pha loãng thành 20 ml với cùng dung môi. Lấy 12 ml dung dịch thu được tiến hành theo phương pháp 1. Dùng dung dịch chì mẫu 1 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượ n g do làm khô Không được quá 0,5% (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 105 °C). Tro sulfat Không được quá 0,1% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Hòa tan 0,150 g chế phẩm trong 50 ml nước và chuẩn độ bằng dung dịch acid hydrocloric 1 N (CĐ), dùng 0,2 ml dung dịch hỗn hợp đỏ methyl (TT) làm chỉ thị, đến khi màu chuyển từ xanh lục sang đỏ tím. 1 ml dung dịch acid hydroc l oric 1 N (CĐ ) tương đương với 17,42 mg C 6 H 14 N 4 O 2 . Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Acid amin. Chế phẩm Nang. ARGININ ASPARTAT Arginini aspartas C 6 H 14 N 4 O 2 .C 4 H 7 N O 4 P.t.l: 307,3 Arginin aspartat là acid (2 S )-2-amino-5-guanidinopentanoic (2 S )-2-aminobutandioat, phải chứa từ 99,0% đến 101,0% C 6 H 1 4 N 4 O 2 .C 4 H 7 N O 4 , tính theo chế phẩm đã làm khô. Tính chất Bột hay cốm màu trắng hoặc gần như trắng. R ấ t tan trong nước, thực tế không tan trong ethanol 96% và methylen clorid. Định tính A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của arginin aspartat chuẩn. B. Chế phẩm phải đáp ứng phép thử Góc quay cực riêng. C. Trong phần Các chất dương tính với ninhydrin, 2 vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử (2) phải tương tự về vị trí, màu sắc và kích thước với 2 vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1). Độ trong và màu sắc của dung dịch Dung dịch S: Hòa tan 5,0 g chế phẩm trong nước không có carbon dioxyd (TT) và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Dung dịch S phải trong (Phụ lục 9.2) và màu không được đậm hơn màu mẫu V 7 (Phụ lục 9.3, phương pháp 2). pH Từ 6,0 đến 7,0 (Phụ lục 6.2). Dùng dung dịch S để đo. Góc quay cực riêng Từ +25° đến +27°, tính theo chế phẩm đã làm khô (Phụ lục 6.4). Hòa tan 2,50 g chế phẩm trong dung dịch acid hydrocloric loãng (TT) và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. Các chất dương tính với ninhydrin Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4). Bản m ỏ ng: Silica gel G. Dung môi khai triển: Amoniac - propanol (36 : 64). Dung dịch thử (1): Hòa tan 0,20 g chế phẩm trong nước và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi. Dung dịch thử (2): Pha loãng 1 ml dung dịch thử (1) thành 10 ml bằng nước . Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 25 mg arginin (TT) và 25 mg acid aspartic (TT) trong nước và pha loãng thành 25 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 2 ml dung dịch đối chiếu (1) thành 50 ml bằng nước . Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 μl mỗi dung dịch trên. Để khô bản mỏng ngoài không khí. Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi đi được 2/3 chiều dài bản mỏng . Sấy bản mỏng ở nhiệt độ 100 °C đến 105 °C trong 10 min. Phun dung dịch ninhydrin 0,2% (TT) và sấy bản mỏng ở nhiệt độ 100 °C đến 105 °C trong 10 min. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử (1), bất kỳ vết phụ nào ngoài 2 vết chính không được có màu đậm hơn màu của mỗi vết chính của dung dịch đối chiếu (2) (0,2%). Phép thử chỉ có giá trị khi trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) cho hai vết tách nhau biệt rõ ràng. Clorid Không được quá 0,02% (Phụ lục 9.4.5). Lấy 2,5 ml dung dịch S và pha loãng thành 15 ml bằng nước để tiến hành thử. Sulfat Không được quá 0,03% (Phụ lục 9.4.14). Cân 0,5 g chế phẩm, thêm 2,5 ml dung dịch acid hydrocloric loãng (TT) và pha loãng thành 15 ml bằng nước c ấ t . Sau 30 min tiến hành thử. Amoni Không được quá 0,01% (Phụ lục 9.4.1). Dùng 100 mg chế phẩm. Kim loại nặng Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Lấy 12 ml dung dịch S để tiến hành theo phương pháp 1. Dùng dung dịch chì mẫu 2 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượng do làm kh ô Không được quá 0,5% (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 60 °C; 24 h). Tro sulfat Không được quá 0,1% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Hòa tan 80,0 mg chế phẩm trong 2 ml acid formic khan ( TT ), thêm 50 ml acid acetic khan (TT). Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ). Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (Phụ lục 10.2). 1 ml dung dịch acid perclor i c 0,1 N (CĐ) tương đương với 10,24 mg C 10 H 2 1 N 5 O 6 . Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Acid amin. Chế phẩm Nang. ATTAPULGIT Attapulgitum Attapulgit là magnesi nhôm silicat hydrat thiên nhiên tinh khiết, thành phần chủ y ế u của một loại đất sét vô cơ. Tính chất Bột rất mịn, màu vàng sẫm hoặc màu kem sáng, không có hoặc hầu như không có sạn. Định tính A. Nung 0,5 g chế phẩm với 2 g natri carbonat khan (TT) trong 20 min, để nguội và chiết bằng 25 ml nước s ô i. Để nguội, lọc, rửa cắn bằng nước và gộp nước rửa và dịch lọc. Giữ cắn để dùng cho phép thử định tính B. Acid hóa cẩn thận dịch thu được bằng acid hydrocloric (TT), bay hơi tới khô, làm ẩm cắn bằng 0,2 ml acid hydrocloric (TT), thêm 10 ml nước và khuấy đều. Xuất hiện tủa sền sệt màu trắng. B. Rửa cắn thu được trong phép thử A bằng nước và hòa tan trong 10 ml acid hydroclor i c 2 M ( TT). Lấy 2 ml dung dịch thu được, thêm dung dịch amoni thiocyanat 10% (TT). Xuất hiện màu đỏ đậm. C. Lấy 2 ml dung dịch thu được trong phép thử B, thêm 1 ml dung dịch natri hydroxyd 42% (TT), lọc. Thêm 3 ml dung dịch amoni clorid 10,7% vào dịch lọc. Xuất hiện tủa sền sệt màu trắng. D. L ấ y 2 ml dung dịch thu được trong phép thử B, thêm amoni clorid (TT) và thêm một lượng dư amoniac (TT) và lọc. Lấy dịch lọc thu được, thêm 0,15 ml thu ố c thử magneson (TT) và một lượng dư dung dịch natr i hydroxyd 5 M (TT). Xuất hiện tủa màu xanh dương. pH Từ 7,0 đến 9,5 (Phụ lục 6.2). L ắ c 5 g chế phẩm trong 100 ml nước không có carbon dioxyd (TT) trong 5 min. Dùng hỗn dịch thu được để đo. Khả năng hấp phụ Khả năng hút ẩm từ 5% đến 14%. Nghiền một lượng chế phẩm đã làm khô trong không khí và rây qua rây số 150. Trải 0,5 g bột chế phẩm thu được thành một lớp mỏng trên một lá nhôm có kích thước 60 mm x 50 mm, dày 17,5 μm đã được làm khô và cân xác định khối lượng. Để lá nhôm có chứa chế phẩm vào một bình hút ẩm có đĩa chứa natri clorid tinh thể nhúng ngập một phần trong dung dịch natri clorid bão hòa ở 25 °C. Sau 4 h, l ấ y lá nhôm ra và cân lại ngay. Sau đ ó , sấy trong t ủ sấy ở 110 °C trong 4 h, để nguội trong bình hút ẩm và cân. Khả năng hút ẩm là khối lượng tăng thêm của chế phẩm tính theo phần trăm so với khối lượng chể phẩm đã làm khô trong tủ sấy. Arsenic Không được quá 8 phần triệu (Phụ lục 9.4.2, phương pháp A). L ấ y 0,13 g chế phẩm, thêm 5 ml nước , 2 ml acid sulfuric (TT) và 10 ml dung dịch sulfur dioxyd ( T T). Bay hơi trên cách thủy đến khi hết sulfur dioxyd và thể tích dung dịch còn lại khoảng 2 ml. Dùng 5 ml nước để chuy ể n hết dung dịch còn lại vào b ì nh chứa mẫu thử của bộ dụng cụ thử arsen. Kim loại nặng A. Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8, phương pháp 1). Lắc 6,0 g chế phẩm với 40 ml dung dịch acid hydrocloric 0,5 M (TT) ở 37 °C trong 30 min, để nguội và lọc. Rửa cắn bằng nước , gộp dịch lọc và dịch r ử a và pha loãng thành 50 ml bằng nước . Hòa tan 2 g amoni clorid (TT) và 2 g amoni thiocyanat (TT) trong 20 ml dung dịch thu được. Lắc dung dịch này với 80 m l hỗn hợp đồng th ể tích của ether (TT) và alcohol isoamyl (TT), để phân lớp, lấy lớp nước. Tiếp tục chiết lớp nước với 80 ml hỗn hợp dung môi trên. Lấy lớp nước và thêm 2 g acid citric (TT), trung hòa bằng amoniac 13,5 M (TT) và pha loãng thành 25 ml bằng nước . Lấy 12 ml dung dịch thu được để tiến hành thử. Dùng dung dịch chì mẫu 2 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. B. Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.8, phương pháp 1). Lắc 6,0 g chế phẩm với 40 ml dung dịch natr i hydroxyd 0,5 M (TT) ở 37 °C trong 30 min, để nguội và lọc. Rửa cắn bằng nước , gộp dịch lọc và dịch rửa và pha loãng thành 50 ml bằng nước . Trung hòa 20 ml dung dịch thu được bằng acid hydrocloric (TT) và pha loãng thành 25 ml bằng nước . Lấy 12 ml dung dịch thu được để tiến hành thử. Dùng dung dịch chì mẫu 1 phần triệu Pb (TT) đ ể chuẩn bị mẫu đối chiếu. Chất tan trong acid Đun sôi 2 g ch ế phẩm trong 100 ml dung dịch acid hydrocloric 0,2 M (TT) dưới sinh hàn hồi lưu trong 5 min, để nguội và lọc. Bay hơi 50 ml dịch lọc tới cắn khô. Khối lượng cắn sau khi nung ở 600 °C trong 30 min không được quá 0,25 g. Chất tan trong nước Đun sôi 10 g chế phẩm trong 100 ml nước dư ớ i sinh hàn hồi lưu trong 5 min, để nguội và lọc. Bay hơi 50 ml dịch lọc tới cắn khô. Khối lượng cắn sau khi nung ở 600 °C trong 30 min không được quá 50 mg. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 17,0% (Phụ lục 9.6). (1 g, 105 °C). M ấ t khối lượng sau khi nung Từ 15,0% đ ế n 27,0%. Nung 1 g chế phẩm ở 600 °C đến khối lượng không đổi. Bảo quản Trong bao bì kín. Loại thuốc Chất hấp phụ, bảo vệ niêm mạc dạ dày, ruột. Chế phẩm Bột pha hỗn dịch. BISOPROLOL FUMARAT Bisoprololi fumaras C 40 H 66 N 2 O 12 P.t.l: 767 Bisoprolol fumarat là (2 RS )-1-[4-[[2-(1-methylethoxy)ethoxy]methyl]phenoxy]-3-[(1-methylethyl)amino] propan-2-ol fumarat, phải chứa từ 99,0% đến 101,0% C 4 0 H 66 N 2 O 12 , tính theo chế phẩm khan. Tính chất Bột kết tinh màu trắng hay gần như trắng, ít hút ẩ m. Đa hình. Rất tan trong nước, dễ tan trong methanol. Định tính Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của bisoprolol f umarat chuẩn. Nếu phổ hồng ngoại ở trạng thái rắn của mẫu thử và bisoprolol fumarat chuẩn khác nhau thì hòa tan riêng biệt chế phẩm và chuẩn trong methanol ( TT ), bốc hơi dung môi và sấy khô cắn ở 60 °C và áp suất không quá 0,7 kPa rồi tiến hành ghi lại phổ của cắn thu được. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động A: Dung dịch acid phosphoric (TT) 10 g/l. Pha động B: Dung dịch acid phosphoric (TT) 10 g/l trong acetonitr i l (TT 1 ). Hỗn hợp dung mô i . Acetonitril (TT 1 ) - nước dùng cho sắc ký (20 : 80). Dung dịch thử : Hòa tan 25 mg chế phẩm trong hỗn hợp dung môi và pha lo ã ng thành 25,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng hỗn h ợ p dung môi. Pha loãng 2,0 ml dung dịch thu được thành 10,0 ml bằng hỗn hợp dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan bisoprolol chuẩn dùng để định tính pic có trong một lọ chuẩn (chứa tạp chất A và E) trong 1,0 ml hỗn hợp dung môi. Dung dịch đối chiếu (3): Hòa tan bisoprolol chuẩn dùng để kiểm tra tính phù hợp của hệ thống có trong một lọ chuẩn (chứa tạp chất G) trong 1,0 ml hỗn hợp dung môi. Điều kiện sắc k ý: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 μm). Nhiệt độ cột: 20 °C ± 2 °C. Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt ở bước sóng 225 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 10 μl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) 0 - 4 95 5 4 - 8 95 -> 80 5 -> 20 8 - 15 80 20 15 - 34 80 -> 20 20 -> 80 34 - 36 20 80 Định t í nh các tạp chất: Sử dụng sắc ký đồ cung cấp kèm theo bisoprolol chuẩn dùng để định tính pic và sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) để xác định pic của acid fumaric và tạp chất A, E. Sử dụng sắc ký đồ cung cấp kèm theo bisoprolol chuẩn dùng đ ể kiểm tra tính phù hợp của hệ thống và sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) để xác định pic của tạp chất G. Thời gian lưu tương đối so với bisoprolol (thời gian lưu khoảng 18 min): Tạp chất A khoảng 0,5; tạp chất G khoảng 1,1; tạp chất E khoảng 1,2. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc k ý đồ của dung dịch đối chiếu (3), tỷ số đỉnh - hõm (Hp/Hv) ít nhất là 2,5; trong đó Hp là chiều cao đ ỉ nh pic tạp chất G so với đường nền và Hv là chiều cao tính từ đường nền lên đến đáy hõm giữa pic tạp chất G và pic bisoprolol. Gi ớ i hạn: Tạp chất G: Diện tích pic tạp chất G không được lớn hơn 2,5 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,5%). Tạp chất A: Diện tích pic tạp chất A không được lớn hơn 1,5 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,3%). Tạp chất E: Diện tích p i c tạp chất E không được lớn hơn diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đ ố i chiếu (1) (0,2%). Tạp chất khác: Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn 0,5 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,10%). Tổng diện tích pic của tất cả các tạp chất không được lớn hơn 2,5 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,5%). Bỏ qua những pic có diện tích nhỏ hơn 0,25 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,05%); bỏ qua pic của acid fumaric. Ghi chú: Tạp chất A: (2 RS )-1-(4-hydroxymethyl-phenoxy)-3-isopropylaminopropan-2-ol. Tạp chất B: (2 R S )-1-isopropylamino-3-[4-(2-propoxy-ethoxymethyl)phenoxy]propan-2-ol. Tạp chất C: 1-[4-[4-(2-hydroxy-3-isopropylamino-propoxy)benzyl]phenoxy]-3-isopropylaminopropan-2-ol. Tạp chất D: 1-[4- [ 4-(2-hydroxy-3-isopropylaminopropoxy)benzyloxylmethyl]phenoxy]-3-isopropylaminopropan-2-ol. Tạp chất E: ( EZ )- [ 3-[4-(2-isopropoxy-ethoxymethyl)phenoxy]allyl]isopropylamin. Tạp chất F: (2 RS )-2-[4-(2-isopropoxy-ethoxymethyl)phenoxy]-3-isopropyIaminopropan-2-ol. Tạp chất G: (2 RS )-1 -[4-[[(2-isopropoxyethoxy)methoxy]methyl]phenoxy]-3-isopropylaminopropan-2-ol. Tạp ch ấ t K: 2-isopropoxyethyl 4-[[(2 RS )-2-hydroxy-3-(isopropylamino)propyl]oxy]benzoat. Tạp chất L: 4-[[(2 RS )-2-hydroxy-3-(isopropylamino)propyl]oxy]benzaldehyd. Tạp chất N: (2 R S )-1-[4-[(2-ethoxyethoxy)methyl]phenoxy]-3-isopropylaminopropan-2-ol. Tạp ch ấ t Q: (2 RS )-1-(isopropylamino)-3-[4-(2-methoxyethoxy)methyl]phenoxypropan-2-ol. Tạp chất R: (2 RS )-1-(isopropylamino)-3-(4-methylphenoxy)propan-2-ol. Tạp chất S: 4-hydroxybenzaldehyd. Tạp chất T: 4-[(3-isopropyl-2-oxo-1,3-oxazolidin-5-yl)methoxy]benzaldehyd. Tạp chất U: 5-[[4-(hydroxymethyl)phenoxy]methyl]-3-isopropyl-1,3-oxazolidin-2-on. Nước Không được quá 0,5% (Phụ lục 10.3). Dùng 1,000 g chế phẩm. Trosulfat Không được quá 0,1% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Hòa tan khoảng 0,300 g chế phẩm trong 50 ml acid acetic khan (TT). Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ). Xác định điểm tương đương bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (Phụ lục 10.2). 1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) tương đương với 38,35 mg C 40 H 66 N 2 O 12 . Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Thuốc chẹn β-adrenergic. Chế phẩm Viên nén. CALCITRIOL Calcitriolum C 27 H 44 O 3 P.t.l: 416,6 Calcitriol là (5 Z ,7 E )-9,10 secocolesta-5,7,10(19)-trien-1α-3β,25-triol, phải chứa từ 97,0% đến 103,0% C 27 H 44 O 3 . Tính chất Tinh th ể trắng hoặc gần như trắng, dễ biến đổi khi tiếp xúc với không khí, nhiệt độ và ánh sáng. Trong dung dịch, tùy thuộc vào nhiệt độ và thời gian mà có thể xảy ra hiện tượng đồng phân hóa thuận nghịch thành pre-calcitriol. Dễ tan trong ethanol 96%, tan trong dầu béo, thực t ế không tan trong nước. Định tính A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của calcitriol chuẩn. B. Trong phần Định lượng, thời gian lưu của pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic chính thu được trên sắc ký đ ồ của dung dịch đối chiếu (1). Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Tiến hành nhanh, tránh ánh sáng trực tiếp và không khí. Pha động: Dung dịch tris(hydroxymethyl)aminomethan 0,1% đã được điều chỉnh đến pH từ 7,0 đến 7,5 bằng hỗn hợp acid phosphoric - acetonitril (45 : 55). Dung dịch thử : Hòa tan (không đun nóng) 1,00 mg chế phẩm trong 10,0 ml pha động. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan (không đun nóng) 1,00 mg calcitriol chuẩn trong 10,0 ml pha động. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 1,0 ml dung dịch đ ố i chiếu (1) thành 100,0 ml bằng pha động. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 10,0 ml bằng pha động. Dung dịch đối chiếu (3): Đun nóng 2 ml dung dịch đối chiếu (1) ở nhiệt độ 80 °C trong 30 min. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 μm). Nhiệt độ cột: 40 °C. Detector quang phổ tử ngoại ở bước sóng 230 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/min. Thể tích tiêm: 50 μl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với thời gian gấp 2 lần thời gian lưu của calcitriol. Thời gian lưu tương đối so với pic calcitriol (thời gian lưu khoảng 14 min): Tạp chất C kho ả ng 0,4; pic pre-calcitriol khoảng 0,88; tạp chất A khoáng 0,95; tạp chất B khoảng 1,1. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đ ố i chiếu (1), số đĩa lý thuyết tính trên pic calcitriol không được nhỏ hơn 10 000. Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3), độ phân giải giữa pic pre-calcitriol và pic calcitriol ít nhất là 3,5. Giới hạn: Áp dụng quy trình chuẩn hóa để tính phần trăm các tạp chất nếu có. Tạp chất A, B, C: Với mỗi tạp chất, không được quá 0,5%. Các tạp chất khác: Với mỗi tạp chất, không được quá 0,10%. Tổng tạp: Không được quá 1,0%. Bỏ qua các pic có diện tích nhỏ hơn 0,5 lần diện tích của pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,05%) và pic pre-calcitriol. Ghi chú: Tạp chất A: (5 E ,7 E )-9,10-secocolesta-5,7,10(19)-trien-1α,3β,25-triol ( t rans -calcitriol). Tạp chất B: (5 Z ,7 E )-9,10-secocolesta-5,7,10(19)-trien- 1β ,3β,25-triol (1β-calc i triol). Tạp chất C: (6a R ,7 R ,9a R )-11-[(3 S ,5 R )-3,5-dihydroxy-2-methylcyclohex-1-enyl]-7-[(1 R )-5-hydroxy-1,5-dimethylhexyl ] -6a-methyl-2-phenyl-5,6,6a,7,8,9,9a,11-octahydro-1 H ,4a H -cyclopenta[ f ][1,2,4]triazolo[1,2- a ]cinnolin-1,3(2 H )-dion (sản phẩm cộng triazolin của pre-calcitriol). Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) với pha động, điều kiện sắc ký, dung dịch thử, dung dịch đối chiếu (1) như mô tả trong phần Tạp chất liên quan. Tiến hành sắc k ý với dung dịch thử, dung dịch đối chiếu (1). Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic calcitriol trên sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (1) thu được từ 6 lần tiêm không được lớn hơn 1,0%. Tính hàm lượng phần trăm của C 27 H 44 O 3 trong chế phẩm dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch đối chiếu (1) và hàm lượng của C 27 H 44 O 3 trong calcitriol chuẩn. Bảo quản Trong bình kín chứa khí nitrogen, tránh ánh sáng và ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C. Khi đã mở bình phải dùng ngay. Loại thuốc Vitamin D. Chế phẩm Nang. CEFDINIR Cefdinirum C 14 H 13 N 5 O 5 S 2 P.t.l: 395,41 Cefdinir là acid (6R,7R)-7-[(Z)-2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(hydroxyimino)acetylamino]-8-oxo-3-viny l -5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxylic, phải chứa từ 940 μg/mg đến 1030 μg/mg C 14 H 13 N 5 O 5 S 2 , tính theo chế phẩm khan. Tính chất Bột kết tinh màu trắng đến vàng nhạt. Thực tế không tan trong nước, trong ethano l 96% và trong diethylether. Hơi tan trong dung dịch đệm phosphat hỗn hợp 0,1 M pH 7,0. Định tính A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của ce f dinir chuẩn. B. Trong phần Định lượng, thời gian lưu của pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Góc quay cực riêng Từ -61° đến -67°, tính theo chế phẩm khan (Phụ lục 6.4). Hòa tan 0,25 g chế phẩm trong dung dịch đệm trong phần Định lượng và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Các dung dịch A, dung dịch B, dung dịch C, dung dịch D và dung dịch đệm chuẩn bị như mô tả trong phần Định lượng. Pha động E: Thêm 0,4 ml dung dịch D vào 1000 ml dung dịch C. Pha động F: Acetonitril - methanol - dung dịch C - dung dịch D (300 : 200 : 500 : 0,4). Dung dịch thử gốc: Hòa tan 200,0 mg chế phẩm trong dung dịch đệm và pha loãng thành 20,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch thử: Pha loãng dung dịch thử gốc với dung dịch C để được dung dịch có chứa cefdinir 1,5 mg/ml. Dung dịch này chỉ pha ngay trước khi dùng. Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng dung dịch thử với dung dịch C để được dung dịch có chứa cefdinir 15 μg/ml. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng dung dịch đối chiếu (1) với dung dịch C để được dung dịch có chứa ce f dinir 1,5 μg/ml. Dung dịch đối chiếu (3): Dung dịch có chứa 1,5 mg/ml cefdinir chuẩn và 0,1 mg/ml tạp chất A chuẩn của cefdinir trong dung dịch C (ban đầu có thể hòa tan trong dung dịch đệm nhưng dung dịch đệm chỉ được chiếm 15% trong thể tích cuối cùng). Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (15 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 μm). Nhiệt độ cột: 40 °C. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 10 μ l Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với chương trình dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động E (% tt/tt) Pha động F (% tt/tt) 0 95 5 2 95 5 22 75 25 32 50 50 37 50 50 38 95 5 58 95 5 Tiến hành sắc ký với thời gian gấp 1,8 lần thời gian lưu của cefdinir. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3), tạp chất A cho 4 pic: pic 1 và pic 2 rửa giải trước pic cefdinir, pic 3 và pic 4 rửa giải sau pic ce f dinir; hệ số phân giải giữa pic cefdinir và pic thứ 3 của tạp chất A ít nhất là 1,5; độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic cefdinir từ 6 lần tiêm lặp lại dung dịch đối chiếu (3) không lớn hơn 2,0%. Tỷ số đáp ứng của diện tích pic cefdinir thu được trên sắc ký đ ồ của dung dịch đối chiếu (2) từ 7% đến 13% so với diện tích pic cefdinir thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1). Giới hạn: Hàm lượng của mỗi tạp riêng được đánh giá dựa trên diện tích pic của từng tạp so với tổng diện tích tất cả các pic trên sắc ký đồ dung dịch thử. Thời gian lưu tương đối và giới hạn của từng tạp chất thể hiện ở bảng sau Tên tạp Thời gian lưu tương đối Giới hạn, không lớn hơn (%) Thiazolylacetyl glycin oxim a 0,10 0,5 Thiazolylacetyl glycin oxim acetal b 0,12 0,5 3-Methyl cefdinir c 0,74 07 Tạp chất A của cefdinir (cefdinir mở vòng lacton a) d,e 0,85 0,7 Tạp chất A của cefdinir (cefdinir mở vòng lacton b) d ,e 093 Tạp chất A của cefdinir (cefdinir mở vòng lacton c) d,e 1,11 Tạp chất A của cefdinir (cefdinir mở vòng lacton d) d , e 1,14 Cefdinir lacton f 1,22 0 , 5 Cefdinir isoxazol analog g 1,36 0,5 E-Cefdinir h 1,51 0,7 Cefdinir decarboxy mở vòng lacton a i ,j 1,61 0,5 Cefdinir decarboxy mở vòng lacton b i ,j 1,64 Tạp chất khác - 0,2 Tổng tạp chất - 3,0 Ghi chú: a 1 N -[( Z )-2-(2-Aminothiazol-4-yl)-2-(hydroxyimino)acetyl]glycin. b ( Z )-2-(2-Aminothiazol-4-yl)- N -(2,2-dihydroxyethyl)-2-(hydroxyimino)acetamid. c Acid (6 R ,7 R )-7-[( Z )-2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(hydroxyimino)acetamido]-3-methyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] oct-2-en-2-carboxylic. d Acid 2( R )-2-[( Z )-2-(2-Aminothiazol-4-yl)-2-(hydroxyimino)acetamido)]-2-[(2 RS ,5 RS )-5-methyl-7-oxo-2,4,5,7-tetrahydro- 1 H -furo[3,4- d ][1,3]thiazin-2-yl]acetic. e Tạp chất A của cefdinir là hỗn hợp của 4 đồng phân: cefdinir mở vòng lacton a, b, c và d. Tổng diện tích 4 pic là giá trị báo cáo. Giới hạn của tổng 4 đồng phân là 0,7%. f ( Z )-2-(2-Aminothiazol-4-yl)-2-(hydroxyimino)- N -{(3 RS ,5a R ,6 R )-3-methyl-1,7-dioxo-1,3,4,5a,6,7- hexahydroazeto[2,1- b ]furo[3,4- d ][1,3]thiazin-6-yI}acetamid. g Acid (6 R ,7 R )-7-(4-hydroxyisoxazole-3-carboxamido)-8-oxo-3-vinyl-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxylic. h Acid (6 R ,7 R )-7-[( E )-2-(2-aminothiazol-4-yl-)-2-(hydroxyimino)acetamido]-8-oxo-3-vinyI-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxylic. i ( Z )-2-(2-Aminothiazol-4-yl)-2-(hydroxyimino)- N -{[(2 RS ,5 RS )-5-methyl-7-oxo-2,4,5,7-tetrahydro-1 H -furo[3,4- d ][1,3]thiazin-2-yl]methyl}acetamid. j Cefdinir decarboxy mở vòng lacton là hỗn hợp của 2 đồng phân: cefdinir decarboxy mở vòng lacton a và b. Tổng diện tích 2 pic là giá trị báo cáo. Giới hạn của tổng 2 đồng phân là 0,5%. Nước Không được quá 2,0%. Dùng hỗn hợp formamid - methanol (2 : 1) làm dung môi pha mẫu. Tro sulfat Không được quá 0,20% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2) Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch A: Hòa tan 14,2 g dinatri hydrophosphat khan (TT) trong vừa đủ 1000 ml nước . Dung dịch B: Hòa tan 13,6 g kali dihydrophosphat (TT) trong vừa đủ 1000 ml nước . Dung dịch C: Pha loãng dung dịch tetramethylamoni hydroxyd (TT) với nước để được dung dịch có nồng độ 0,1%. Điều chỉnh pH của dung dịch thu được đến pH 5,5 bằng dung dịch acid phosphoric 10% (TT). Dung dịch D: Hòa tan 3,72 g natri edetat (TT) trong vừa đủ 100 ml nước . Dung dịch đệm: Phối hợp dung dịch A và dung dịch B với lượng thích hợp (khoảng 2 : 1) để được dung dịch có pH 7,0. Pha động: Ace t onitril - methanol - dung dịch C - dung dịch D (300 : 200 : 4500 : 2). Dung dịch thử: Hòa tan 20,0 mg chế phẩm trong dung dịch đệm và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch chuẩn: Hòa tan 20,0 mg ce f dinir chuẩn trong dung dịch đệm và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch phân giải: Pha dung dịch có ch ứ a 0,2 mg/ml cefdinir chuẩn và 0,5 mg/ml tạp ch ấ t A chuẩn của cefdinir trong dung dịch đệm. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (15 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 μm). Nhiệt độ cột: 40 °C. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 5 μ l . Cách tiến hành Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên s ắ c ký đồ của dung dịch phân giải, tạp chất A phải cho 4 pic đáp ứng; hệ số phân giải giữa pic thứ 2 của tạp chất A chuẩn và cefdinir ít nhất là 1,2; hệ số đối xứng của pic cefdinir không lớn hơn 1,5. Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic cefdinir giữa 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn không lớn hơn 1,0%. Tính hàm lượng cefdinir, C 14 H 13 N 5 O 5 S 2 , từ diện tích pic cefdinir thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 14 H 13 N 5 O 5 S 2 c ủa cefdinir chuẩn. Bảo quản Để trong bao bì kín, nơi khô mát, tránh ánh s á ng. Loại thuốc Kháng sinh cephalosporin. Chế phẩm Viên nén, nang, thuốc bột. CEFEPIM HYDROCLORID MONOHYDRAT Cefepimi hydrochloridum monohydricum C 19 H 24 N 6 O 5 S 2 .2HCI.H 2 O P.t . l: 571,5 Cefepim hydroclorid monohydrat là (6 R ,7 R )-7-[[(2 Z )-(2-aminothiazol-4-yl)(methoxyimino)acetyl]amino]- 3-[(1-methylpyrolidinio)methyl]-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxylat dihydroclorid monohydrat, phải chứa từ 97,0% đến 102,0% C 19 H 24 N 6 O 5 S 2 .2HCI, tính theo chế phẩm khan. Là sản phẩm bán t ổ ng hợp từ một sản phẩm lên men. Tính chất Bột kết tinh màu trắng hay gần như trắng. Dễ tan trong nước và methanol, thực tế không tan trong methylen clorid. Định tính A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của cefepim dihydroclorid monohydrat chuẩn. B. Chế phẩm phải cho phản ứng (A) của clorid (Phụ lục 8.1). Độ trong và màu sắc của dung dịch Hòa tan 2,0 g chế phẩm trong nước và pha loãng thành 20 ml với cùng dung môi. Dung dịch thu được phải trong (Phụ lục 9.2) và không được có màu đậm hơn dung dịch màu mẫu V 3 (Phụ lục 9.3, phương pháp 2). Góc quay cực riêng Từ +40° đến +45°, tính theo chế phẩm khan (Phụ lục 6.4). H òa tan 0,250 g chế phẩm trong nước và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. Tạp chất G Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Chuẩn bị các dung dịch ngay trước khi dùng. Pha động: Acetonitril - dung dịch acid nitric 0,01 M (1 : 100), lọc qua màng lọc 0,2 μm. Dung dịch thử: Hòa tan 0,100 g chế phẩm trong dung dịch acid nitric 0,01 M (TT ) và pha loãng thành 10,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 0,250 g N-methy l pyrolidin (TT) (tạp chất G) trong nước và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi. Pha loãng 2,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml bằng dung dịch acid nitric 0,01 M (TT). Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan 0,250 g pyrolidin (TT) trong dung dịch acid nitric 0,01 M (TT) và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi. Pha loãng 2,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml bằng dung dịch acid nitric 0,01 M (TT). Trộn 5 ml dung dịch thu được với 5 ml dung dịch đối chiếu (1). Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (5 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh là nhựa trao đổi cation mạnh (5 μm). Detector dẫn điện. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 100 μl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với thời gian gấp 1,1 lần thời gian lưu của cefepim. Với điều kiện sắc ký như trên, thời gian lưu của cefepim khoảng 50 min, pic doãng. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch đối chiếu (1), hệ số đối xứng không lớn hơn 2,5 đối với tạp chất G; độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic tạp chất G của 6 l ầ n tiêm lặp lại dung dịch đối chiếu (1) không lớn hơn 5,0%. Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch đối chiếu (2), tỷ số đỉnh-hõm (Hp/Hv) giữa pic pyrolidin và pic tạp chất G không nhỏ hơn 3. Tính hàm lượng của tạp chất G trong chế phẩm dựa vào dung dịch đối chiếu (1). Giới hạn: Tạp chất G: Không được quá 0,5%. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Chuẩn bị các dung dịch ngay trước khi dùng hoặc b ả o quản trong t ủ lạnh ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C không quá 12 h. Pha động A: Acetonitril - dung dịch A (10 : 90). Pha động B: Acetonitril - dung dịch A (50 : 50). Dung dịch A: Hòa tan 0,68 g kali dihydrophosphat (TT) trong 1000 ml nước , điều chỉnh đến pH 5,0 bằng dung dịch kali hydroxyd 0,5 M (TT). Dung dịch thử: Hòa tan 70,0 mg chế phẩm trong pha động A và pha loãng thành 50,0 ml bằng pha động A. Siêu âm trong 30 s và khuấy trong 5 min. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 70,0 mg cefepim dihydroclorid monohydrat chuẩn trong pha động A và pha loãng thành 50,0 ml bằng pha động A. Siêu âm trong 30 s và khuấy trong 5 min. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 10,0 ml bằng pha động A. Pha loãng 2,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml bằng pha động A. Dung dịch đối chiếu (3): Hòa tan 7 mg cefepim dihydroclorid monohydrat chuẩn dùng để kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc ký (ch ứ a tạp chất A, B và F) trong pha động A và pha loãng thành 5 ml bằng pha động A. Dung dịch đối chiếu (4): Hòa tan 2 mg tạp chất E chuẩn của cefepim trong pha động A và pha loãng thành 25,0 ml bằng pha động A. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 10,0 ml bằng pha động A. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh end-capped octadecylsilyl silica gel dùng cho sắc ký (5 μm). Detector quang phổ t ử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 10 μl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với chương trình dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) 0 - 10 100 0 10 - 30 100 -> 50 0 -> 50 30 - 35 50 50 35 - 36 50 -> 100 50 -> 0 36 - 45 100 0 Tiến hành sắc ký với mẫu trắng, dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (2), (3) và (4). Định tính các tạp chất: Sử dụng sắc ký đồ cung cấp kèm theo cefepim dihydroclorid monohydrat chuẩn dùng đ ể kiểm tra tính phù hợp hệ thống và sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) để xác định pic của của tạp chất A, B và F. Sử dụng sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (4) để xác định pic của tạp chất E. Thời gian lưu tương đối so với cefepim (thời gian lưu khoảng 7 min): Tạp chất E khoảng 0,4; tạp chất F khoảng 0,8; tạp chất A khoảng 2,5; tạp chất B khoảng 4,1. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3), độ phân giải giữa pic của tạp chất F và pic cefepim ít nhất là 1,5. Giới hạn: Hệ số hiệu chỉnh: Để tính hàm lượng, nhân diện tích pic của các tạp chất sau với hệ số hiệu chỉnh tương ứng: Tạp chất A là 1,4; tạp chất B là 1,4; tạp chất E là 1,8. Trên sắc ký đồ dung dịch thử: Tạp chất A: Diện tích pic tạp chất A đã hiệu chỉnh không được lớn hơn 1,5 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,3%). Tạp chất B, F: Với mỗi tạp chất, diện tích pic đã hiệu chỉnh, nếu cần, không được lớn hơn diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,2%). Tạp chất E: Diện tích pic tạp chất E đã hiệu chỉnh không được lớn hơn 0,5 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,1%). Tạp chất khác: Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn 0,5 lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,10%). Tổng diện tích pic của tất cả các tạp chất không được lớn hơn 5 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (1,0%). Bỏ qua những pic có diện tích nhỏ hơn 0,25 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,05%). Ghi chú: Tạp chất A: (6 R ,7 R )-7-[[(2 E )-(2-aminothiazol-4-yl)(methoxyimino)acetyl]amino]-3-[(1-methylpyrolidinio)methyl]-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxylat ( an t i- cefepim). Tạp chất B: (6 R ,7 R )-7-[[(2 Z )-[2-[[(2 Z )-(2-aminothiazol-4-yl)(methoxyimino)acetyl]amino]thiazol - 4-yl](methoxyimino) acetyl]amino]-3-[(1-methylpyrolidinio)methyl]-8-oxo-5-th i a-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxylat. Tạp chất C: (2 Z )-2-(2-aminothiazol-4-yl)- N -(formylmethyl)-2-(methoxyimino)acetamid. Tạp chất D: Acid (2 Z )-(2-aminothiazol-4-yl)(methoxyimino)acetic. Tạp chất E: (6 R ,7 R )-7-amino-3-[(1-methylpyrolidinio)methyl]-8-oxo-5-thia-1-azabicycIo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxylat. Tạp chất F: (6 R ,7 R )-7-[[[(6 R ,7 R )-7-[[(2 Z )-(2-aminothiazol - 4-yl)(methoxyimino)acetyl]amino]-3-[(1-methylpyrolidinio)methyl ] -8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-yl]carbonyl]amino]-3-[(1-methylpyrolidinio)methyl]-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxylat. Tạp chất G: 1-methylpyrolidin ( N -methylpyrolidin). Nước Từ 3,0% đến 4,5% (Phụ lục 10.3). Dùng 0,400 g chế phẩm. Nội độc tố vi khuẩn Không được quá 0,04 EU/mg (Phụ lục 13.2) nếu chế phẩm dự định dùng để sản xuất thuốc tiêm mà không có phương pháp hữu hiệu nào loại bỏ nội độc tố vi khuẩn. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Điều kiện sắc ký như mô tả trong phần Tạp chất liên quan. Pha động: Pha động A. Tiến hành sắc ký với dung dịch thử, dung dịch đối chiếu (1). Tiến hành sắc ký với thời gian gấp 1,4 lần thời gian lưu của cefepim. T í nh hàm lượng phần trăm của C 19 H 26 CI 2 N 6 O 5 S 2 trong ch ế phẩm dựa v à o diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch đối chiếu (1) và hàm lượng của C 19 H 26 CI 2 N 6 O 5 S 2 trong cefepim dihydroclorid monohydrat chuẩn. Bảo quản Tránh ánh sáng. Nếu chế phẩm vô khuẩn thì phải bảo quản trong đồ bao gói kín, vô khuẩn. Loại thuốc Kháng sinh nhóm cephalosporin. Chế phẩm Viên nén, nang, bột pha tiêm. CELECOXIB Celecoxibum C 1 7 H 14 F 3 N 3 O 2 S P.t.l: 381,4 Celecoxib là 4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1 H -pyrazol-1-yl]benzensulfonamid, phải chứa từ 98 , 0% đến 102,0% C 17 H 1 4 F 3 N 3 O 2 S, tính theo chế phẩm khan. Tính chất Bột kết tinh hoặc vô định hình màu trắng hay gần như trắng. Đa hình. Thực tế không tan trong nước, dễ tan và tan trong ethanol khan, tan trong methylen clorid. Định tính Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của celecoxib chuẩn. Nếu phổ hấp thụ hồng ngoại của mẫu thử và mẫu chuẩn ở trạng thái rắn khác nhau thì hòa tan riêng biệt chế phẩm và celecoxib chuẩn trong 2-propanol (TT) , bay hơi dung môi đến khô, ghi phổ mới các cắn thu được. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Trộn đều 10 thể tích acetonitril (TT 1 ) , 30 thể tích methanol (TT 2 ) và 60 thể tích dung dịch kali dihydrophosphat (TT) 0,27% đã được điều chỉnh đến pH 3,0 bằng acid phosphoric (TT). Hỗn hợp dung môi: Nước - methanol (TT 2 ) (25 : 75). Dung dịch thử: Hòa tan 50,0 mg chế phẩm trong hỗn hợp dung môi và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 50,0 mg celecoxib chuẩn trong hỗn hợp dung môi và pha loãng thành 100 , 0 ml v ớ i cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan 3 mg tạp chất A chuẩn của celecoxib và 3 mg tạp chất B chuẩn của celecoxib trong hỗn hợp dung môi và pha loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 25,0 ml bằng dung dịch đối chiếu (1). Dung dịch đối chiếu (3): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng hỗn hợp dung môi. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 10,0 ml bằng hỗn hợp dung môi. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh end-capped phenylsilyl silica gel dùng cho sắc ký (5 μm). Nhiệt độ cột: 60 °C. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 215 nm. Tốc độ dòng: 1,5 ml/min. Thể tích tiêm: 25 μl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch thử, dung dịch đối chiếu (2) và (3). Tiến hành sắc ký với thời gian gấp 1,5 lần thời gian lưu của celecoxib. Định tính các tạp chất: Sử dụng sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) để xác định các pic của tạp chất A và B. Thời gian lưu tương đối so với celecoxib (thời gian lưu khoảng 27 min); Tạp chất A khoảng 0,9, tạp chất B khoảng 1,1. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2), độ phân giải giữa pic tạp chất A và pic celecoxib ít nhất là 1,8; độ phân giải giữa pic celecoxib và pic tạp chất B ít nhất là 1,8. Tính hàm lượng phần trăm của tất cả các tạp chất dựa vào nồng độ của celecoxib trong dung dịch đối chiếu (3). Giới hạn: Tạp chất A: Không được quá 0,4%. Các tạp chất khác: Với mỗi tạp chất, không được quá 0,10%. Tổng các tạp chất: Không được quá 0,5%. Mức tạp chất phát hiện phải báo cáo: 0,05%. Ghi chú: Tạp chất A: 4-[5-(3-methylphenyI)-3-(trifluoromethyl)-1 H -pyrazol-1-yl]benzensulfonamid. Tạp chất B: 4-[3-(4-methylphenyl)-5-(trifluoromethyl)-1 H -pyrazol-1-yl]benzensulfonamid. Kim loại nặng Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Hỗn hợp dung môi: Nước - aceton (15 : 85). Dùng 0,5 g chế phẩm, tiến hành thử theo phương pháp 8. Dùng 1 ml dung dịch ch ì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Nước Không được quá 0,5% (Phụ lục 10.3). Dùng 0,400 g chế phẩm. Tro sulfat Không được quá 0,2% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm, sử dụng chén platin. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Điều kiện sắc ký như mô tả trong phần Tạp chất liên quan. Tiến hành sắc ký với dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (1). Tính hàm lượng phần trăm C 17 H 14 F 3 N 3 O 2 S trong chế phẩm dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử, dung dịch đối chiếu (1) và hàm lượng C 17 H 14 F 3 N 3 O 2 S trong celecoxib chuẩn. Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng, tránh ẩm. Để ở nhiệt độ phòng. Loại thuốc Chất ức chế chế cyclo-oxygenase (COX-2); thuốc giảm đau, chống viêm. Chế phẩm Viên nén. ESOMEPRAZOL MAGNESI TRIHYDRAT Esomeprazolum magnesicum trihydricum C 34 H 36 MgN 6 O 6 S 2 .3H 2 O P.t.l: 767,2 Esomeprazol magnesi trihydrat là magnesi bis[5-methoxy-2-[( S )-[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl)methyl]sulfinyl]-1 H -benzimidazol-1-id] trihydrat, phải chứa từ 98,0% đến 102,0% C 34 H 36 MgN 6 O 6 S 2 , tính theo chế phẩm khan. Tính chất Bột màu trắng hoặc gần như trắng, hơi hút ẩm. Khó tan trong nước, tan trong methanol, thực tế không tan trong heptan. Định tính Có thể chọn một trong bốn nh ó m định tính sau: Nhóm I: A, B, C. Nhóm II: A, C, E. Nhóm III: A, B, D. Nhóm IV: A, D, E. A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của esomeprazol magnesi trihydrat chuẩn. B. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên t ử (Phụ lục 4.4, Phương pháp 1) như mô tả trong phép thử Magnesi. Dung dịch thử phải cho vạch hấp thụ cực đại ở 285,2 nm. C. Góc quay cực riêng: Từ -137° đến -155°, tính theo chế phẩm khan (Phụ lục 6.4). Hòa tan 0,250 g chế phẩm trong methanol (TT) và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. D . Chế phẩm phải đáp ứng phép thử Tạp chất đồng phân. E. Nung khoảng 0,5 g chế phẩm như ở phép thử Tro sulfat (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Hòa tan cắn trong 10 ml nước . 2 ml dung dịch thu được phải cho phản ứng đặc trưng của ion magnesi (Phụ lục 8.1). Độ hấp thụ ánh sáng Hòa tan 0,500 g chế phẩm trong methanol (TT) và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. Lọc dung dịch này qua màng lọc 0,45 μm. Độ hấp thụ của dung dịch thu được tại bước sóng 440 nm (Phụ lục 4.1) không được lớn hơn 0,20. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Áp dụng phương pháp chuẩn hóa. Sử dụng các dung dịch mới pha. Pha động: Acetonitril - dung dịch dinatri hydrophosphat (TT) 0,14% được chỉnh đến pH 7,6 bằng acid phosphoric (27: 73). Dung dịch thử: Hòa tan 3,5 mg chế phẩm trong pha động và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 1 mg omeprazol chuẩn và 1 mg tạp chất D chuẩn của omeprazol trong pha động và pha loãng thành 10,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan 3 mg omeprazol chuẩn dùng để định tính pic (chứa tạp chất E) trong pha động và pha loãng thành 20,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (3): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng pha động. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 10,0 ml bằng pha động. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (12,5 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 μm). Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt ở bước sóng 280 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/min. Th ể tích tiêm: 40 μl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với thời gian gấp 5 lần thời gian lưu của esomeprazol. Định tính các tạp chất: Sử dụng sắc ký đồ cung cấp kèm theo esomeprazol chuẩn dùng để định tính pic và sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) để xác định pic của tạp chất E. Sử dụng sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) để xác định pic của các tạp chất D. Thời gian lưu tương đối so với pic esomeprazol (thời gian lưu khoảng 9 min): Tạp chất E khoảng 0,6; tạp chất D khoảng 0,8. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1), độ phân giải giữa pic của tạp chất D và pic của omeprazol ít nhất là 3,0. Nếu cần thiết, điều chỉnh pH của pha nước của pha động hoặc điều chỉnh tỷ lệ acetonitril trong pha động; tăng pH sẽ làm tăng độ phân giải. Giới hạn: Tạp chất D: Không được quá 0,2%. Tạp chất E: Không được quá 0,1%. Các tạp chất khác: Không được quá 0,10%. Tổng tạp: Không được quá 0,5%. Bỏ qua tất cả các pic có diện tích nhỏ hơn 0,5 lần diện tích pic chính thu được từ sắc ký đ ồ của dung dịch đối chiếu (3) (0,05%). Ghi chú: Tạp chất A: 5-methoxy-1 H -benzimidazole-2-thiol. Tạp chất B: 2-[( R S )-[(3,5-dimethylpyridin-2-yl)methyl]sulfinyl]-5-methoxy-1 H -benzimidazol. Tạp chất C: 5-methoxy-2-[[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl)methyl]sulfanyl]-1 H -benzimidazol (ufiprazol). Tạp chất D: 5-methoxy-2-[[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl)methyl]sulphonyl]-1 H -benzimidazol (omeprazol sulphon). Tạp chất E: 4-methoxy-2-[[( R S )-(5-methoxy-1 H -benzimidazol-2-yl)sulphinyl]methyl]-3,5- dimethylpyridin 1-oxyd. Tạp chất đ ồ ng phân đối quang Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Acetonitril - dung dịch đệm pH 6,0 (65 : 435). Dung dịch đệm pH 6,0: Trộn 70 ml dung dịch natri dihydrophosphat (TT) 15,6% với 20 ml dung dịch dinatri hydrophosphat (TT) 17,91%, pha loãng hỗn hợp này thành 1000 ml bằng n ư ớc . Pha loãng 250 ml dung dịch thu được thành 1000,0 ml bằng nước . Dung dịch đệm pH 11,0: Trộn 11 ml dung d ịch natri phosphat tribasic (TT) 9,5% với 22 ml dung dịch dinatr i hydrophosphat (TT) 17,91%, pha loãng hỗn hợp này thành 1000,0 ml bằng nước . Dung dịch thử: Hòa tan 40 mg chế phẩm trong 5 ml methanol ( TT ) và pha loãng thành 25,0 ml bằng dung dịch đệm pH 11,0. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 50,0 ml bằng dung dịch đệm pH 11,0. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 2 mg omeprazol chuẩn trong dung dịch đệm pH 11,0 và pha loãng thành 10,0 m l với cùng dung môi. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 50,0 ml bằng dung dịch đệm pH 11,0. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 1,0 ml dung dịch đối chiếu (1) thành 50,0 ml bằng dung dịch đệm pH 11,0. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (10 cm x 4,0 mm) được nhồi pha tĩnh silica gel AGP (α 1 - acid glucoprotein) dùng cho sắc ký phân tách đ ồ ng phân quang học (5 μm). Detector quang phổ hấp thụ t ử ngoại đặt ở bước sóng 302 nm. Tốc độ dòng: 0,6 ml/min. Thể tích tiêm: 20 μl. Cách tiến hành: Với các điều kiện sắc ký như trên, thứ tự rửa giải các chất lần lượt là tạp chất F, esomeprazol; thời gian lưu của esomeprazol khoảng 4 min. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1), độ phân giải giữa pic của tạp chất F và pic của esomeprazol ít nhất là 3,0. Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2), tỷ số tín hiệu trên nhiễu ít nhất là 10 đối với pic tạp chất F. Tính hàm lượng phần trăm của tạp chất F theo công thức sau: Trong đó: r i : Là diện tích pic tạp chất F trong sắc ký đồ thu được của dung dịch thử. r s : Là tổng diện tích các pic esomeprazol và pic tạp chất F trong sắc ký đồ thu được của dung dịch thử. Giới hạn: Tạp chất F: Không được quá 0,2%. Ghi chú: Tạp chất F: 5-methoxy-2-[( R )-[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl)methyl]sulphinyl]-1 H -benzimidazol (( R ) - omeprazol). Magnesi Từ 3,30% đến 3,55%, tính theo chế phẩm khan. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (Phụ lục 4.4, phương pháp 1). Dung dịch thử: Hòa tan 0,250 g chế phẩm trong 20 ml dung dịch acid hydrocloric 1 M (TT) bằng cách thêm từ từ dung dịch acid vào chế phẩm và pha loãng thành 100,0 ml với nước. Pha loãng 10,0 ml dung dịch này thành 200,0 ml với nước . Thêm 4 ml dung dịch lanthan clorid (TT) vào 10,0 ml dung dịch thu được ở trên và pha loãng thành 100,0 ml với nước . Dung dịch chuẩn: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dùng dung dịch magnesi chuẩn 1000 phần triệu Mg (TT), pha loãng nếu cần với một hỗn hợp gồm 1 ml dung dịch acid hydrocloric 1 M (TT) pha trong 1000.0 ml nước . Đo độ hấp thụ ở bước sóng 285,2 nm, dùng đèn cathod rỗng của magnesi làm nguồn phát xạ và ngọn lửa không khí - acetylen. Nước 6.0% đến 8,0% (Phụ lục 10.3). Dùng 0,200 g chế phẩm. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Acetonitril - dung dịch dina t ri hydrophosphat (TT) 0,14% được chỉnh đến pH 7,6 bằng acid phosphoric (TT) (35 : 65). Dung dịch đệm pH 11,0: Trộn 11 ml dung dịch natri phosphat tribasic (TT) 9,5% với 22 ml dung dịch dinatri hydrophosphat (TT) 17,91% và pha loãng thành 100,0 ml với nước . Dung dịch thử: Hòa tan 10,0 mg chế phẩm trong khoảng 10 ml methanol (TT), thêm 10 ml dung dịch đệm pH 11,0 và pha loãng thành 200,0 ml với nước . Dung dịch chuẩn: Hòa tan 10,0 mg omeprazol chuẩn trong khoảng 10 ml methanol (TT), thêm 10 ml dung d ị ch đệm pH 11,0 và pha loãng thành 200,0 ml với nước . Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (12,5 cm x 4,0 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 μm). Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại tại bước sóng 280 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/min. Thể tích tiêm: 20 μl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với thời gian gấp 1,5 lần thời gian lưu của esomeprazol. Thời gian lưu của esomeprazol khoảng 4 min. Tính hàm lượng phần trăm của C 34 H 36 MgN 6 O 6 S 2 trong chế phẩm dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng của C 34 H 36 MgN 6 O 6 S 2 trong omeprazol chuẩn. 1 g omeprazol tương đương với 1,032 g esomeprazol magnesi. Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Thu ố c ức chế bơm proton. Chế phẩm Viên nén, nang. FELODIPIN Felodipinum C 18 H 19 Cl 2 NO 4 P.t.l: 384,3 Felodipin là ethyl methyl (4 R S )-4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat, phải chứa từ 99,0% đến 101,0% C 18 H 19 Cl 2 NO 4 , tính theo chế phẩm đã làm khô. Tính chất Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng. Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong aceton, trong ethanol khan, trong methanol và trong methylen clorid. Định tính Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau: Nhóm I: A. Nhóm II: B, C, D. A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của felodipin chuẩn. Chuẩn bị mẫu đo dưới dạng đĩa nén. B. H òa tan 50 mg chế phẩm trong methanol (TT) và pha loãng thành 100 ml với cùng dung môi. Pha loãng 3 ml dung dịch thu được thành 100 ml bằng methanol (TT). Phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến (Phụ lục 4.1) của dung dịch thu được trong kho ả ng bước sóng từ 220 nm đến 400 nm, phải cho 2 cực đại hấp thụ ở bước sóng 238 nm và 361 nm. Tỷ số độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 361 nm so với độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 238 nm từ 0,34 đến 0,36. C. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4). Bản m ỏ ng: Silica gel F 2 5 4 . Dung mỗi khai triển: Ethyl acetat - cyclohexan (40: 60). Dung dịch thử. Hòa tan 10 mg chế phẩm trong methanol (TT) và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 10 mg felodipin chuẩn trong methanol (TT) và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan 5 mg nifedipin chuẩn trong dung dịch đối chiếu (1) và pha loãng thành 5 ml với dung dịch đối chiếu (1). Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên b ả n mỏng 5 μl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 15 cm. Để khô ngoài không khí. Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Vết chính trên sắc đồ của dung dịch thử phải tương tự về vị trí, huỳnh quang và kích thước so với vết chính trên sắc đồ của dung dịch đối chiếu (1). Phép thử chỉ có giá trị khi sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) cho hai vết tách ra rõ ràng. D. Hòa tan 150 mg chế phẩm trong hỗn hợp 25 ml 2-methyl-2-propanol (TT) và 25 ml dung dịch acid percloric 1 M (TT). Thêm 10 ml dung dịch ceri su lf at 0,1 M (TT), để yên trong 15 min. Thêm 3,5 ml dung dịch natri hydroxyd 42% (TT) và trung hòa bằng dung dịch natri hydroxyd loãng (TT). Lắc với 25 ml methylen clorid (TT). Lấy lớp dưới, bay hơi đến khô trên cách thủy, dưới luồng khí nitơ (cắn này cũng được sử dụng cho phép thử Tạp chất liên quan). Hòa tan khoảng 20 mg cắn trong methanol (TT) và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Pha loãng 2 ml dung dịch thu được thành 50 ml với methanol (TT). Phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến (Phụ lục 4.1) của dung dịch thu được ở trên, trong khoảng bước sóng từ 220 nm đến 400 nm, phải cho cực đại h ấ p thụ ở 273 nm. Độ trong và màu sắc của dung dịch Dung dịch S: Hòa tan 1,00 g chế phẩm trong methanol (TT) và pha loãng thành 20,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch S phải trong (Phụ lục 9.2). Độ hấp thụ ánh sáng Không được quá 0,10 ở bước sóng 440 nm (Phụ lục 4.1). Dùng dung dịch S để đo. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Methanol - acetonitril - dung dịch đệm phosphat pH 3,0 chứa acid phosphoric (TT) 0,08% và natri dihydrophosphat (TT) 0,8 % (20 : 40 : 40). Dung dịch thử: Hòa tan 25,0 mg chế phẩm trong pha động và pha loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng pha động. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 1,0 ml dung dịch đối chiếu (1) thành 10,0 ml bằng pha động. Dung dịch đối chiếu (3): Hòa tan 50,0 mg cắn thu được trong phép thử định tính D (tạp chất A) và 25 , 0 mg felodipin chuẩn trong pha động và pha loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi. Pha loãng 1 , 0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml với pha động. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thành 10,0 ml bằng pha động. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (12,5 cm đến 15 cm x 4 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 μm). Detector quang phổ hấp thụ t ử ngoại tại bước sóng 254 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/min. Th ể tích tiêm: 20 μl. Thứ tự rửa giải: Tạp chất B, tạp chất A, f elodipin, tạp chất C. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với thời gian gấp 2 lần thời gian lưu của felodipin. Thời gian lưu của felodipin khoảng 12 min. Kiểm tra t í nh phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3), độ phân giải giữa pic tạp chất A và pic felodipin ít nhất là 2,5. Giới hạn: Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử: Tổng tạp chất B và C: Tổng diện tích pic của tạp chất B và C không được lớn hơn diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (1,0%). Tạp chất khác: Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,10%). Tổng tạp: Tổng diện tích pic của tất cả các tạp chất khác trừ tạp chất B và C không được lớn hơn 3 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,3%). Bỏ qua những pic có diện tích nhỏ hơn 0,2 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,02%). Ghi chú: Tạp chất A: Ethyl methyl 4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethylpyridin-3,5-dicarboxylat. Tạp chất B: Dimethyl 4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4dihydropyridin-3,5-dicarboxylat. Tạp chất C: Diethyl 4-(2 , 3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridin-3 , 5-dicarboxylat. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 0,5% (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 105 °C; 3 h) Tro sulfat Không được quá 0,1% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Hòa tan 0,160 g chế phẩm trong hỗn hợp gồm 25 ml 2-methyl-2-propanol (TT) và 25 ml dung dịch acid percloric 1 M (TT). Thêm 0,05 ml dung dịch feroin sulfat (TT) và chuẩn độ từ từ bằng dung dịch ceri sulfat 0,1 M (CĐ) cho đến khi mất màu hồng. 1 ml dung dịch ceri sulfat 0,1 M (CĐ) tương đương với 19,21 mg C 18 H 19 Cl 2 NO 4 . Bảo quản Tránh ánh sáng. Loại thuốc Thuốc chẹn kênh calci. Chế phẩm Viên nén. GLUTATHION Glutathionum C 10 H 17 N 3 O 6 S P.t.l : 307,3 Glutathion là L-γ-glutamyl-L-cysteinylglycin, phải ch ứ a từ 98,0% đến 101,0% C 10 H 17 N 3 O 6 S, tính theo chế phẩm đã làm khô. Chế phẩm thu được từ s ả n phẩm lên men. Tính chất Bột kết tinh trắng hay gần như trắng hoặc tinh thể không màu. Dễ tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96% và trong methylen clorid. Định tính A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của glutathion chuẩn. B. Chế phẩm phải đáp ứng phép thử Góc quay cực riêng (Phụ lục 6.4). Độ trong và màu sắc của dung dịch Dung dịch S: Hòa tan 5,0 g chế phẩm trong nước cất (TT) và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Dung dịch S phải trong (Phụ lục 9.2) và không màu (Phụ lục 9.3, phương pháp 2). Góc quay cực riêng Từ -15,5° đến -17,5°, tính theo chế phẩm đã làm khô (Phụ lục 6.4). Hòa tan 1,0 g chế phẩm trong nước (TT) và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. Tạp chất liên quan Phương pháp điện di mao quản (Phụ lục 5.7). Chuẩn bị các dung dịch ngay trước khi dùng. Dung dịch chuẩn nội (1): Hòa tan 0,100 g phenylalanin (TT) trong dung dịch điện giải và pha loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch chuẩn nội (2): Pha loãng 10,0 ml dung dịch chuẩn nội (1) thành 100,0 ml bằng dung dịch điện giải. Dung dịch thử (1): Hòa tan 0,200 g chế phẩm trong dung dịch điện giải và pha loãng thành 10,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch thử (2): Hòa tan 0,200 g chế phẩm trong dung dịch chuẩn nội (2) và pha loãng thành 10,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 20,0 mg chế phẩm trong dung dịch chuẩn nội (1) và pha loãng thành 10,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 5,0 ml dung dịch đối chiếu (1) thành 50,0 ml bằng dung dịch điện giải. Dung dịch đối chiếu (3): Hòa tan 0,200 g chế phẩm trong 5 ml dung dịch điện giải. Thêm 1,0 ml dung dịch chuẩn nội (1), 0,5 ml dung dịch L-cystein (TT) (tạp chất B) 2 mg/ml trong dung dịch điện giải, 0,5 ml dung dịch L-glutathion đã oxy hóa (TT ) (tạp chất C) 2 mg/ml trong dung dịch điện giải và 0,5 ml dung dịch L-γ-glutamyl-L-cystein (TT) (tạp chất D) 2 mg/ml trong dung dịch điện giải. Pha loãng th à nh 10,0 ml với cùng dung môi. Điều kiện điện di: Cột mao quản bằng silica nung chảy không có lớp bao. Chiều dài tổng cộng của cột: 60 cm, chiều dài hiệu dụng của mao quản 50 cm (từ đầu đến detector); đường kính trong 75 μm. Nhiệt độ cột: 25 °C. Dung dịch điện giải: Hòa tan 1,50 g natri dihydrophosphat khan (TT) trong 230 ml nước (TT) và điều chỉnh đến pH 1,80 bằng acid phosphoric (TT). Pha loãng dung dịch thu được thành 250,0 ml bằng nước . Kiểm tra pH và nếu cần, điều chỉnh pH bằng acid phosphoric (TT) hoặc dung dịch natri hydroxyd loãng (TT). Quy trình rửa cột mao quản mới: Rửa cột mao quản mới trước khi tiêm lần đầu với dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) ở áp suất 138 kPa trong 20 min và với nước ở áp suất 138 kPa trong 10 min; Để cân bằng cột mao quản hoàn toàn, rửa mao quản với dung dịch điện giải ở áp suất 350 kPa trong 40 min, và sau đó ở mức điện thế 20 kV trong 60 min Rửa cột mao quản trước khi bắt đầu phân tích mẫu: Rửa cột mao quản với dung dịch điện giải ở áp suất 138 kPa trong 40 min. Quy trình rửa cột mao quản giữa các lần tiêm mẫu: Rửa cột mao quản với nước ở áp suất 138 kPa trong 1 min, với d ung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) ở áp suất 138 kPa trong 2 min, sau đ ó lại rửa với nước ở áp suất 138 kPa trong 1 min, tiếp theo rửa với dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) ở áp suất 138 kPa trong 3 min và cuối cùng rửa với dung dịch điện giải ở áp suất 138 kPa trong 10 min. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 200 nm. Điện thế sử dụng: 20 kV. Tiêm mẫu: Dưới áp suất 3,45 kPa trong 5 s. Thời gian chạy điện di: 45 min. C á ch tiến hành: Tiến hành điện di với dung dịch thử (1) và (2), dung dịch đối chiếu (2) và (3) và dung dịch điện giải (mẫu trắng). Thời gian di chuyển tương đối so với chuẩn nội (thời gian di chuyển khoảng 14 min): Tạp chất A khoảng 0,77; tạp chất B khoảng 1,04; tạp chất E khoảng 1,2; tạp chất C khoảng 1,26; tạp chất D khoảng 1,3. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống điện di: Trên điện di đồ thu được của dung dịch đối chiếu (3), độ phân giải giữa pic chuẩn nội và tạp chất B ít nhất là 1,5. Nếu cần, tăng giá trị pH của dung dịch điện giải bằng dung dịch natri hydroxyd 8,5%. Tỷ số đỉnh-hõm (p/v) phải ít nhất là 2,5; trong đó H p là chiều cao của pic tạp chất D so với đường nền và H v là chiều cao so với đường nền của điểm thấp nhất của đường cong phân tách giữa pic tạp chất D và pic glutathion trên điện di đồ thu được từ dung dịch đối chiếu (3). Nếu cần, giảm giá trị pH của dung dịch điện giải bằng acid phosphoric (TT). Kiểm tra điện di đồ thu được từ dung dịch thử (1), không được xuất hiện pic nào có cùng thời gian di chuyển với chuẩn nội (trong trường hợp như vậy hiệu chỉnh lại diện tích của pic phenylalanin). Giới hạn: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử (2). Diện tích pic hiệu chỉnh: Chia diện tích của các pic cho thời gian di chuyển tương ứng. Hệ số hiệu chỉnh: Để tính hàm lượng, nhân tỷ số giữa diện tích pic hiệu chỉnh theo thời gian của tạp chất và chuẩn nội với hệ số hiệu chỉnh tương ứng: Tạp chất B là 3,0; tạp chất D là 1,4. Tạp chất C: Tỷ số giữa diện tích pic hiệu chỉnh của tạp chất C và diện tích pic hiệu chỉnh của chuẩn nội không được lớn hơn 1,5 lần tỷ số giữa diện tích pic hiệu chỉnh của glutathion và diện tích pic hiệu chỉnh của chuẩn nội thu được trên điện di đồ của dung dịch đối chiếu (2) (1,5%). Tạp chất D: Tỷ số giữa diện tích pic hiệu chỉnh của tạp chất D và diện tích pic hiệu chỉnh của chuẩn nội không được lớn hơn tỷ số giữa diện tích pic hiệu chỉnh của glutathion và diện tích pic hiệu chỉnh của chuẩn nội thu được trên điện di đồ của dung dịch đối chiếu (2) (1,0%). Tạp chất A, B và E: Với mỗi tạp chất, tỷ số giữa diện tích pic hiệu chỉnh của từng tạp chất và diện tích pic hiệu chỉnh của chuẩn nội không được lớn hơn 0,5 lần tỷ số giữa diện tích pic hiệu chỉnh của glutathion và diện tích pic hiệu chỉnh của chuẩn nội thu được trên điện di đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,5%). Tạp chất khác: Với mỗi tạp chất, tỷ số giữa diện tích pic hiệu chỉnh của từng tạp chất và diện tích pic hiệu chỉnh của chuẩn nội không được lớn hơn 0,2 lần tỷ số giữa diện tích pic hiệu chỉnh của glutathion và diện tích pic hiệu chỉnh của chuẩn nội thu được trên điện di đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,2%). Tổng tất cả các tạp chất: Tổng tỷ số giữa diện tích pic hiệu chỉnh của tất cả các tạp chất và diện tích pic hiệu chỉnh của chuẩn nội không được lớn hơn 2,5 lần tỷ số giữa diện tích pic hiệu chỉnh của glutathion và diện tích pic hiệu chỉnh của chuẩn nội thu được trên điện di đồ của dung dịch đối chiếu (2) (2,5%). Bỏ qua các tạp chất có tỷ số giữa diện tích pic hiệu chỉnh của tạp chất và diện tích pic hiệu chỉnh của chuẩn nội nhỏ hơn hoặc bằng 0,05 lần tỷ số giữa diện tích pic hiệu chỉnh của glutathion và diện tích pic hiệu chỉnh của chuẩn nội thu được trên điện di đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,05%). Ghi chú: Tạp chất A: L-cysteinylglycin, Tạp chất B: Acid (2 R )-2-amino-3-sulfanylpropanoic (cystein), Tạp chất C: bis(L-γ - glutamyl-L-cysteinylglycin) disulfid (L-glutathion đã oxy hóa), Tạp chất D: L- γ - glutamyl-L-cystein, Tạp chất E: Chưa biết cấu trúc (sản phẩm phân hủy). Clorid Không được quá 200 phần triệu (Phụ lục 9.4.5). Pha loãng 2,5 ml dung dịch S thành 15 ml bằng nước để đo. Sulfat Không được quá 300 phần triệu (Phụ lục 9.4.14). Pha loãng 5 ml dung dịch S thành 15 ml bằng nước cất đ ể đo. Amoni Không được quá 200 phần triệu (Phụ lục 9.4.1). Dùng 50 mg chế phẩm và tiến hành thử theo phương pháp B. Dùng 0,1 ml dung dịch amoni mẫu 100 phần triệu NH 4 (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Sắt Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.13). Hòa tan 1,0 g chế phẩm trong 10 ml dung dịch acid hydrocloric loãng (TT). Chiết 3 lần, mỗi lần với 10 ml methyl isobutyl keton ( TT 1 ) và lắc trong 3 min. Tập trung dịch chiết hữu cơ, thêm 10 ml nước và lắc trong 3 min. Lấy lớp nước và tiến hành thử. Kim loại nặng Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Dùng 12 ml dung dịch S và tiến hành thử theo phương pháp 1. Dùng dung dịch chì mẫu 1 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 0,5% (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 105 °C; 3 h). Tro sulfat Không được quá 0,1% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Trong một bình nón nút mài, hòa tan 0,500 g chế phẩm và 2 g kali iodid (TT) trong 50 ml nước . Làm lạnh dung dịch thu được trong nước đá và thêm 10 ml dung dịch acid hydroclor i c 25% (TT) và 20,0 ml dung dịch iod 0,1 N (CĐ). Đậy nút bình và để yên ở chỗ tối trong 15 min. Chuẩn độ iod thừa bằng dung dịch natri thiosulfat 0,1 N (CĐ), dùng 1 ml dung dịch hồ tinh bột (TT) làm chỉ thị, cho vào lúc gần kết thúc chuẩn độ. Song song tiến hành làm mẫu trắng. 1 ml dung dịch iod 0,1 N (CĐ) tương ứng với 30,73 mg C 10 H 17 N 3 O 6 S. Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Acid amin. Chế phẩm Viên nén, nang, thuốc tiêm. HISTIDIN Histidinum C 6 H 9 N 3 O 2 P.t.l: 155,2 Histidin là acid (S)-2-amino-3-(imidazol - 4-yl)propanoic, phải chứa từ 98,5% đến 101,0% C 6 H 9 N 3 O 2 , tính theo chế phẩm đã làm khô. Tính chất Bột kết tinh trắng hay gần như trắng hoặc tinh thể không màu, tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96%. Định tính Có thể chọn một trong hai nh ó m định tính sau: Nhóm I: A , B. Nhóm II: B, C, D. A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của histidin chuẩn. Nếu phổ hấp thụ hồng ngoại của mẫu thử và mẫu chuẩn khác nhau thì hòa tan riêng rẽ chế phẩm và histidin chuẩn trong một thể tích tối thiểu nước , bay hơi đến khô ở 60 °C và ghi phổ mới các cắn thu được. B. Chế phẩm phải đáp ứng yêu cầu phép thử Góc quay cực riêng. C. Trong phần Các chất dương tính với ninhydrin, vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử (2) phải tương tự về vị trí, màu sắc và kích thước với vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1). D. Hòa tan 0,1 g chế phẩm trong 7 ml nước và thêm 3 ml dung dịch natri hydroxyd 20% (TT). Hòa tan 50 mg acid sulfanilic (TT) trong hỗn hợp gồm 0,1 ml acid hydroclor i c (TT) và 10 ml nước , thêm 0,1 ml dung dịch natri nitr i t 10% (TT). Thêm dung dịch thứ hai vào dung dịch thứ nhất và trộn đều. Màu đ ỏ cam tạo thành. Độ trong và màu sắc của dung dịch Dung dịch S: Hòa tan 2,5 g chế phẩm trong nước cất bằng cách đun nóng trong cách thủy và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Dung dịch S phải trong (Phụ lục 9.2) và không được đậm màu hơn màu mẫu VN 7 (Phụ lục 9.3, phương pháp 2). Góc quay cực riêng Từ +11,4° đến +12,4°, tính theo chế phẩm đã làm khô (Phụ lục 6.4). Hòa tan 2,75 g chế phẩm trong 12,0 ml dung dịch acid hydrocloric 25% (TT) và pha loãng thành 25,0 ml bằng nước . Chất dương tính với ninhydrin Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4). Bản mỏng: Silica gel. Dung môi khai triển: Butanol - acid acetic băng - nước (60 : 20 : 20) Dung dịch thử (1): Hòa tan 0,10 g chế phẩm trong nước và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi. Dung dịch thử (2): Pha loãng 1 ml dung dịch thử (1) thành 50 ml bằng nước . Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 10 mg histidin chuẩn trong nước và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 5 ml dung dịch thử (2) thành 20 ml bằng nước . Dung dịch đối chiếu (3): Hòa tan 10 mg histidin chuẩn và 10 mg prolin chuẩn trong nước và pha loãng thành 25 ml với cùng dung môi. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 μl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 2/3 chiều dài bản mỏng. Đ ể khô bản mỏng ngoài không khí và phun dung dịch ninhydrin 0,2% (TT). Sấy bản mỏng ở 100 °C đến 105 °C trong 15 min. Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử (1), bất kỳ vết phụ nào, ngo à i vết ch í nh không được đậm màu hơn vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,5%). Phép thử chỉ có giá trị khi sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) cho 2 vết tách rõ ràng. Clorid Không được quá 0,02% (Phụ lục 9.4.5). Pha loãng 5 ml dung dịch S thành 15 ml bằng nước và tiến hành thử. Sulfat Không được quá 0,03% (Phụ lục 9.4.14). Pha loãng 10 ml dung dịch S thành 15 ml bằng nước và tiến hành thử. Amoni Không được quá 0,02% (Phụ lục 9.4.1). Lấy 50 mg chế phẩm và tiến hành thử theo phương pháp B. Dùng 0,1 ml dung dịch amoni mẫu 100 phần triệu NH 4 (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Sắt Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.13) Hòa tan 1,0 g chế phẩm trong 10 ml dung dịch acid hydrocloric loãng (TT). Chiết 3 lần, mỗi lần với 10 ml methyl isobutyl keton (TT 1 ) và lắc trong 3 min. Tập trung dịch chiết hữu cơ, thêm 10 ml nước và lắc trong 3 min. Lấy lớp nước và tiến hành thử. Kim loại nặng Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Hòa tan 2,0 g chế phẩm trong hỗn hợp gồm 3 ml dung dịch acid hydrochloric loãng (TT) và 15 ml nước bằng cách đun nóng nhẹ nếu cần, và pha loãng thành 20 ml bằng nước. Lấy 12 ml dung dịch thu được thử theo phương pháp 1. Dùng dung dịch chì mẫu 1 phần triệu Pb (TT) đ ể chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 0,5% (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 105 °C). Tro sulfat Không được quá 0,1% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Hòa tan 0,130 g chế phẩm trong 50 ml nước . Chuẩn độ bằng dung dịch acid hydrocloric 0,1 N (CĐ). Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (Phụ lục 10.2). 1 ml dung dịch acid hydroc l oric 0,1 N (CĐ) tương đương với 15,52 mg C 6 H 9 N 3 O 2 . Bảo quản Tránh ánh sáng. Công dụng Acid amin. Chế phẩm Viên nén, nang, thuốc tiêm. HISTIDIN HYDROCLORID MONOHYDRAT Histidini hydrochloridum monohydricum C 6 H 9 N 3 O 2 .HCI.H 2 O P.t.l: 209,6 Histidin hydroclorid monohydrat là acid (2S)-2-Amino-3-(1 H -imidazol-4-yl)propanoic hydroclorid monohydrat, phải chứa từ 98,5% đến 101,0% C 6 H 10 CI N 3 O 2 , tính theo chế phẩm đã làm khô. Tính chất Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng hoặc tinh thể không màu, dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%. Định tính Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau: Nhóm I: A, B, C, F. Nhóm II: B, C, D, E, F. A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của histidin hydroclorid monohydrat chuẩn. B. Chế phẩm phải đáp ứng yêu cầu phép thử Góc quay cực riêng . C. Chế phẩm phải đáp ứng yêu cầu phép thử pH. D. trong phần Các chất dương tính với ninhydrin, vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử (2) phải tương tự về vị trí, màu sắc và kích thước với vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1). E. Hòa tan 0,1 g chế phẩm trong 7 ml nước và thêm 3 ml dung dịch natri hydroxyd 20% (TT). Hòa tan 50 mg acid sulfanilic (TT) trong hỗn hợp 0,1 ml acid hydrocloric (TT) và 10 ml nước , thêm 0,1 ml dung dịch natri nitrit 10% (TT). Thêm dung dịch thứ hai vào dung dịch thứ nhất và trộn đều. Màu đỏ cam tạo thành. F. Khoảng 20 mg chế phẩm cho ph ả n ứng (A) của clorid (Phụ lục 8.1). Độ trong và màu sắc của dung dịch Dung dịch S: Hòa tan 2,5 g chế phẩm trong nước không có carbon d i oxyd (TT) và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Dung dịch S phải trong (Phụ lục 9.2) và không được đậm màu hơn màu mẫu VN 6 (Phụ lục 9.3, phương pháp 2). pH Từ 3,0 đến 5,0 (Phụ lục 6.2). Dùng dung dịch S để đo. Góc quay cực riêng Từ +9,2° đến +10,6°, tính theo chế phẩm đã làm khô (Phụ lục 6.4). Hòa tan 2,75 g chế phẩm trong 12,0 ml dung dịch acid hydrocloric 25% (TT) và pha loãng thành 25,0 ml với nước . Chất dương tính với ninhydrin Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4). Bản mỏng: Silica gel. Dung môi khai triển: Butanol - acid acetic băng - nước (60 : 20 : 20). Dung dịch thử (1): Hòa tan 0,10 g chế phẩm trong nước v à pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi. Dung dịch thử (2): Pha loãng 1 ml dung dịch thử (1) thành 50 ml bằng nước . Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 10 mg histidin hydroclorid monohydrat chuẩn trong nước và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 5 ml dung dịch thử (2) thành 20 ml bằng nước . Dung dịch đối chiếu (3): Hòa tan 10 mg histidin hydroclorid monohydrat chuẩn và 10 mg prolin chuẩn trong nước và pha loãng thành 25 ml với cùng dung môi. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 μl mỗi dung dịch trên. Làm khô vết chấm bằng luồng không khí. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 15 cm. Để khô bản mỏng ngoài không khí và phun dung dịch ninhydrin 0,2% (TT). Sấy bản mỏng ở 100 °C đến 105 °C trong 15 min. Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử (1), bất kỳ vết phụ nào, ngoài vết chính không được đậm màu hơn vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,5%). Phép thử chỉ có giá trị khi sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) cho 2 vết tách rõ ràng. Sulfat Không được quá 0,03% (Phụ lục 9.4.14). Pha loãng 10 ml dung dịch S thành 15 ml bằng nước v à tiến hành thử. Amoni Không được quá 0,02% (Phụ lục 9.4.1). Lấy 50 mg chế phẩm và tiến hành thử theo phương pháp B. Dùng 0,1 ml dung dịch amoni mẫu 100 phần triệu NH 4 (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Sắt Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.13). Trong một bình gạn, hòa tan 1,0 g chế phẩm trong 10 ml dung dịch acid hydrocloric loãng (TT). Chiết 3 lần, mỗi lần với 10 ml methyl isobutyl keton (TT 1 ) và lắc trong 3 min. Gộp các lớp dung môi hữu cơ đã chiết, thêm 10 ml nước và lắc trong 3 min. L ấ y lớp nước và tiến hành thử. Kim loại nặng Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Hòa tan 2,0 g chế phẩm trong nước và pha loãng thành 20 ml với cùng dung môi. Lấy 12 ml dung dịch thu được thử theo phương pháp 1. Dùng dung dịch chì mẫu 1 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượng do làm khô Từ 7,0% đến 10,0% (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 145 °C đến 150 °C). Tro sultat Không được quá 0,1% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Hòa tan 0,160 g chế phẩm trong 50 ml nước không có carbon dioxyd (TT). Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ). Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (Phụ lục 10.2). 1 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ) tương đương với 19,16 mg C 6 H 10 CIN 3 O 2 . Bảo quản Tránh ánh sáng. Công dụng Acid amin. Chế phẩm Viên nén, nang, thuốc tiêm. ISOLEUCIN Isoleucinum C 6 H 13 NO 2 P.t.l: 131,2 Isoleucin là acid (2 S ,3 S )-2-amino-3-methylpentanoic, phải chứa từ 98,5% đến 101,0% C 6 H 13 NO 2 , tính theo chế phẩm đã làm khô. Chế phẩm thu được từ sản phẩm lên men, chiết xuất hoặc thủy phân protein. Tính chất Bột kết tinh hay dạng bông màu trắng hoặc gần như trắng. Hơi tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%. Tan trong dung dịch acid vô cơ loãng và trong dung dịch ki ề m loãng. Định tính Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau: Nhóm I: A, C. Nhóm II: B, C. A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của isoleucin chuẩn. B. Trong phần Các chất dương tính với ninhydrin, vết chính trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử (2) phải tương ứng về vị trí, màu sắc và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch đối chiếu (1). C. Chế phẩm phải đáp ứng yêu cầu của phép thử Góc quay cực riêng (Phụ lục 6.4). Độ trong và màu sắc của dung dịch Hòa tan 0,5 g chế phẩm trong dung dịch acid hydrocloric 1 M (TT) và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi. Dung dịch thu được phải trong (Phụ lục 9.2) và không được có màu đậm hơn màu mẫu VN 6 (Phụ lục 9.3, phương pháp 2). Góc quay cực riêng Từ + 40,0° đến + 43,0°, tính theo chế phẩm đã làm khô (Phụ lục 6.4). Hòa tan 1,00 g chế phẩm trong dung dịch acid hydrocloric 25% (TT) và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. Các chất dương tính với ninhydrin Phương pháp sắc ký lớp m ỏ ng (Phụ lục 5.4). Bản mỏng: Silica gel. Dung môi khai triển: Butanol - acid acetic băng - nước (60 : 20 : 20). Dung dịch thử (1): Hòa tan 0,1 g chế phẩm trong dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi. Dung dịch thử (2): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử (1) thành 50 ml bằng dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT). Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 10 mg isoleucin chuẩn trong dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) và pha loãng thành 50 m l với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 5,0 ml dung dịch thử (2) thành 20 ml bằng dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT). Dung dịch đối chiếu (3): Hòa tan 10 mg isoleucin chuẩn và 10 mg valin chuẩn trong dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) và pha loãng thành 25 ml với cùng dung môi. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 μl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 15 cm. Lấy bản mỏng ra, để khô bản mỏng ngoài không khí. Phun lên bản mỏng dung dịch ninhydrin 0,2% (TT) và sấy ở 100 °C đến 105 °C trong khoảng 15 min. Trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử (1), bất kỳ vết phụ nào ngoài vết chính, không được lớn hơn hay đậm màu hơn vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,5%). Phép thử chỉ có giá trị khi trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch đối chiếu (3) cho hai vết tách biệt rõ ràng. Clorid Không được quá 200 phần triệu (Phụ lục 9.4.5). Hòa tan 0,25 g chế phẩm trong nước và pha loãng thành 15 ml với cùng dung môi. Sul f at Không được quá 300 phần triệu (Phụ lục 9.4.14). Hòa tan 0,5 g chế phẩm trong 3 ml dung dịch acid hydrocloric loãng (TT) và pha loãng thành 15 ml bằng nước cất (TT). Amoni Không được quá 0,02% (Phụ lục 9.4.1). Lấy 50 mg chế phẩm và tiến hành thử theo phương pháp B. Dùng 0,1 ml dung dịch amoni mẫu 100 phần triệu NH 4 (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Sắt Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.13). Hòa tan 1,0 g chế phẩm trong 10 ml dung dịch acid hydrocloric loãng (TT). Chiết 3 lần, mỗi lần với 10 ml methyl isobutyl keton (TT 1 ) và lắc trong 3 min. Tập trung dịch chiết hữu cơ, thêm 10 ml nước và lắc trong 3 min. L ấ y lớp nước và tiến hành thử. Kim loại nặng Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Dùng 0,25 g chế phẩm và tiến hành thử theo phương pháp 8. Dùng 0,25 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 0,5% (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 105 °C). Tro sulfat Không được quá 0,1% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Hòa tan 0,100 g chế phẩm trong 3 ml acid formic khan (TT), thêm 30 ml acid acetic khan (TT). Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ), xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (Phụ lục 10.2). Song song tiến hành làm mẫu trắng. 1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N (C Đ ) tương đương với 13,12 mg C 6 H 13 NO 2 . Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh s á ng. Loại thuốc Acid amin. Chế phẩm Viên nén, nang, thuốc tiêm. LOPINAVIR Lopinavirum C 37 H 48 N 4 O 5 P.t.l: 629 Lopinavir là (2 S )- N -[(1 S ,3 S ,4 S )-1-benzyl-4-[[2-(2,6-dimethylphenoxy)acetyl]amino]-3-hydroxy-5- phenylpentyl]-3-methyl-2-[2-oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )-yl]butanamid, phải chứa từ 98,0% đến 102 , 0% C 37 H 48 N 4 O 5 , tính theo chế phẩm khan. Tính chất Bột màu trắng hoặc trắng ngà, hút ẩm nhẹ. Đa h ì nh. Thực tế không tan trong nước, rất dễ tan trong methanol và methylen clorid. Định tính A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của lopinavir chuẩn. Nếu phổ của chế phẩm ở trạng thái rắn khác với phổ của chất chuẩn, hòa tan riêng rẽ chế phẩm và chuẩn trong methanol (TT), bốc hơi đến cắn và ghi phổ của cắn mới thu được. B. Chế phẩm phải đáp ứng phép thử Góc quay cực riêng. Góc quay cực riêng Từ -27,0° đến -22,0°, tính theo chế phẩm khan (Phụ lục 6.4). Hòa tan 0,200 g chế phẩm trong methanol (TT) và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. Tạp chất liên quan A. Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động A: Acetonitril (TT 1 ) - dung dịch đệm phosphat (45 : 55). Pha động B: Acetonitr i l (TT 1 ) - dung dịch đệm phosphat (75 : 25). Dung dịch đệm phosphat: Hòa tan 0,9 g dikali hydrophosphat (TT) và 2,7 g kali dihydrophosphat (TT) trong 900 ml nước , điều chỉnh đến pH 6,0 bằng acid phosphoric (TT), và pha loãng thành 1000 ml bằng nước . Dung môi pha mẫu: Hỗn hợp đồng thể tích của acetonitril (TT 1 ) và nước. Dung dịch thử (1): Hòa tan 50,0 mg chế phẩm trong dung môi pha mẫu và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch thử (2): Pha loãng 5,0 ml dung dịch thử (1) thành 100,0 ml bằng dung môi pha mẫu. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 50,0 mg lopinavir chuẩn trong dung môi pha mẫu và pha loãng thành 100 , 0 ml với cùng dung môi. Pha loãng 5,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml bằng dung môi pha mẫu. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 5,0 ml dung dịch thử (2) thành 250,0 ml bằng dung môi pha mẫu. Dung dịch đối chiếu (3): Hòa tan 2,5 mg lopinavir chuẩn dùng để kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc ký (chứa các tạp chất A, B, C, F, G, I, N, Q, R, S và T) trong dung môi pha mẫu và pha loãng thành 5 , 0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (4): Hòa tan 2,5 mg lopinavir chuẩn dùng để định tính pic (chứa tạp chất D và tạp chất O) trong dung môi pha mẫu và pha loãng thành 5,0 ml với cùng dung môi. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi end-capped octadecylsilyl silica gel dùng cho sắc ký (4 μm). Nhiệt độ cột: 50 °C. Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt ở bước sóng 215 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 20 μl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch thử (1), dung dịch đối chiếu (2), (3), (4). Tiến hành sắc ký theo chương trình dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% t t/ tt) 0 - 60 100 0 60 - 61 100 -> 0 0 -> 100 61 - 81 0 100 Định tính các tạp chất: Sử dụng sắc ký đồ cung cấp kèm theo lopinavir chuẩn dùng để kiểm tra tính phù hợp của hệ thống và sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) để xác định pic của tạp chất A, B, C, F, G, I và N. Sử dụng sắc ký đồ cung cấp kèm theo lopinavir chuẩn dùng để định tính pic và sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (4) để xác định pic của tạp chất D. Thời gian lưu tương đối của các pic tạp chất so với pic lopinavir (thời gian lưu khoảng 37 min) như sau: Tạp chất A khoảng 0,03; tạp chất B khoảng 0,07; tạp chất C khoảng 0,10; tạp chất D khoảng 0,13; tạp chất F khoảng 0,59; tạp chất G khoảng 0,62; tạp chất I khoảng 1,1; tạp chất N khoảng 1,4. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch đối chiếu (3), độ phân giải giữa hai pic tạp chất F và tạp chất G ít nhất là 1,5. Giới hạn: Để tính hàm lượng phần trăm của các tạp chất, dựa vào diện tích pic, nồng độ lopinavir của dung dịch đối chiếu (2) và nhân diện tích của pic tạp chất trên sắc ký đồ của dung dịch thử (1) với hệ số hiệu chỉnh tương ứng sau: Tạp chất A: 1,6; tạp chất B: 1,3; tạp chất C: 1,5; tạp chất D: 1,3. Tạp chất B, I: Với mỗi tạp chất, không được quá 0,2%. Tạp chất A, C, D, F, G: Với mỗi tạp chất, không được quá 0,15%. Tạp chất khác: Với mỗi tạp chất không được quá 0,10%. Bỏ qua các tạp chất được rửa giải ra sau tạp chất N và các tạp chất có hàm lượng nhỏ hơn 0,05%. B. Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) như mô tả trong mục A với các thay đổi như sau: Pha động: Pha động A - pha động B (30: 70). Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với thời gian gấp 8,5 lần thời gian lưu của lopinavir. Định tính các tạp chất: Sử dụng sắc ký đồ cung cấp kèm theo lopinavir chuẩn dùng để kiểm tra tính phù hợp của hệ thống và sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) để xác định pic của tạp chất Q, R, S và T. Sử dụng sắc ký đồ cung cấp kèm theo lopinavir chuẩn dùng để định tính pic và sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (4) để xác định pic của tạp chất O. Thời gian lưu tương đối của các pic tạp chất so với pic lopinavir (thời gian lưu khoảng 6 min) như sau: Tạp chất N khoảng 1,4; tạp chất O khoảng 1,5; tạp chất Q khoảng 4,4; tạp chất R khoảng 6,0; tạp chất S khoảng 7,1; tạp chất T khoảng 8,5. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch đối chiếu (3), độ phân giải giữa hai pic tạp chất S và tạp chất T ít nhất là 3,0. Tiến hành sắc ký lần lượt với mẫu trắng, dung dịch đối chiếu (2) và dung dịch thử (1). Để tính hàm lượng phần trăm của các tạp chất, dựa vào diện tích pic, nồng độ lopinavir của dung dịch đối chiếu (2) và nhân diện tích của pic tạp chất trên sắc ký đồ của dung dịch thử (1) với hệ số hiệu chỉnh tương ứng sau: Tạp chất O :1,3; tạp chất Q: 0,7. Giới hạn: Tạp chất O , Q, R, T: Với mỗi tạp chất, không được quá 0,15%. Tạp chất khác: Với mỗi tạp chất, không được quá 0,10%. Bỏ qua các tạp chất rửa giải trước tạp chất N, tạp chất N và các tạp chất có hàm lượng nhỏ hơn 0,05%. Tổng các tạp chất rửa giải ra trước tạp chất N bao gồm cả tạp chất N trong phép thử ở mục A và các tạp chất rửa giải ra sau tạp chất N trong phép thử ở mục B không được quá 0,7%. Ghi chú: Tạp chất A: (2 S )- N -[(1 S ,3 S ,4 S )-1-benzyl - 4-amino-3-hydroxy-5-phenylpentyl]-3-methyl-2-[2- oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )-yl)butanamid. Tạp chất B: (2 S )- N - [(1 S ,3 S ,4 S )-1-benzyl-4-(formylamino)-3-hydroxy-5-phenylpentyl]-3-methyl-2- [ 2-oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )-yl]butanamid. Tạp chất C: (2 R )- N -[(1 S ,2 S ,4 S )-1-benzyl-2-hydroxy-4-[[{2 S )-3-methyl-2-[2-oxotetrahydropyrimidin-1 ( 2 H )-yl]butanoyl] amino]-5-phenylpentyl]-3-methyl-2-[2- oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )-yl]butanamid. Tạp chất D: (1 R ,3 R )-1-[(1 R )-1-[[2-(2,6-dimethylphenoxy)acetyl]amino]-2-phenylethyl]-3-[[(2 R )-3-methyl-2-[2-oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )-yl]butanoyl]amino]-4-phenylbutyl hydro sulfat. Tạp chất E: N -[(1 S ,2 S ,4 S )-4-amino-1-benzyl-2-hydroxy-5-phenylpentyl]-2-(2,6- dimethylphenoxy)acetamid. Tạp chất F: N -[(1 S ,2 S ,4 S )-1-benzyl-4-(formylamino)-2-hydroxy-5-phenylpentyl]-2-(2,6- dimethylphenoxy)acetamid. Tạp chất G: N -[(1 S ,2 S ,4 S )-(4-acetylamino)-1-benzyl-2-hydroxy-5-phenylpentyl]-2-(2,6- dimethylphenoxy)acetamid. Tạp chất H: N -[(1 S )-1-[(4 S ,6 S )-4-benzyl-2-oxo-1,3-oxazinan-6-yl]-2-phenylethyl]-2-(2,6- dimethylphenoxy)acetamid. Tạp chất I: (2 S )- N -[(1 S ,2 S ,4 S )-1-benzyl-4-[[2-(2,6-dimethylphenoxy)acetyl]amino]-2-hydroxy-5-phenylpentyl]-3-methyl-2-[2-oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )- yl]butanamid. Tạp chất J: (2 S )- N -[(1 S ,3 S ,4 S )-1-benzyl-4-[[2-(2,4-dimethylphenoxy)acetyl]amino]-3- hydroxy-5-phenylpentyl)-3-methyl-2-[2-oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )- yl]butanamid. Tạp chất K: (2 R )- N -[(1 S ,3 S ,4 S )-1-benzyl-4-[[2-(2,6-dimethylphenoxy)acetyl]amino]-3- hydroxy-5-phenylpentyl]-3- methyl-2-[2-oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )- yl]butanamid. Tạp chất L: N , N' -( Z )-ethen-1,2-diylbis[2-(2,6-dimethylphenoxy)acetamid]. Tạp chất M: (2 S )- N -[(1 R ,3 R ,4 S )-1-benzyl-4-[[2-(2,6-dimethylphenoxy)acety l ]amino]-3- hydroxy-5-phenylpentyl]-3- methyl-2-[2-oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )- yl]butanamid. Tạp chất N: (2 S )- N -[(1 S ,3 R ,4 S )-1-benzyl-4-[[2-(2,6-dimethylphenoxy)acetyl]amino]-3- hydroxy-5-phenylpentyl]-3- methyl-2-[2-oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )-yl]butanamid. Tạp chất O: ( 1S, 3 S )-1-[(1 S )-1-[[2-(2,6-dimethylphenoxy)acetyl]amino ] -2-phenylethyl]-3-[[(2 S )-3-methyl-2-[2-oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )-yl]butanoyl]amino]-4-phenylbutyl (2 S )-3-methyl-2-[2-oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )-yl]butanoat. Tạp chất P: (2 S )- N -[(1 R ,3 S ,4 S )-1-benzyl-4-[[2-(2,6-dimethylphenoxy)acetyl]amino]-3- hydroxy-5-phenylpentyl]-3-methyl-2-[2-oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )-yl]butanamid. Tạp chất Q: N -[(1 S ,2 S ,4 S )-1-benzyl-4-[[2-(2,6-dimethylphenoxy)acetyl]amino]-2-hydroxy-5- phenylpentyl]-2-(2,6-dimethylphenoxy)acetamid. Tạp chất R: (2 S )- N -[(1 S ,3 S ,4 S )-1-benzyl-4-[[2-(2,6-dimethylphenoxy)acetyl]amino]-3- hydroxy-5-pheny l pentyl]-2-[3-[2-(2,6-dimethylphenoxy)acetyl]-2-oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )-yl]-3-methylbutanamid. Tạp chất S: (1 S ,3 S )-1-[(1 S )-1-[[2-(2,6-dimethylphenoxy)acetyl]amino]-2-phenylethyl]-3-[[(2 S )-3-methyl-2-[2-oxotetrahydropyrimidin-1(2 H )-yl]butanoyl]amino]-4-phenylbutyl 2-(2,6-dimethylphenoxy)acetat. Tạp chất T: N , N' -bis[(1 S ,3 S ,4 S )-1-benzyl-4-[[2-(2,6-dimethylphenoxy)acetyl]amino]-3-hydroxy-5-phenylpentyl]ure. Kim loại nặng Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.8, phương pháp 8). Dùng 0,25 g chế phẩm để thử. Dung môi pha mẫu: Nước - ethanol 96% (5 : 95) Dùng 0,25 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Nước Không được quá 4,4% (Phụ lục 10.3). Dùng 0,250 g chế phẩm. Tro sulfat Không được quá 0,2% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Điều kiện sắc ký được mô tả ở trong mục A của phần Tạp chất liên quan với thay đổi như sau: Pha động: Pha động A. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký dung dịch thử (2) và dung dịch đối chiếu (1). Tiến hành sắc ký với thời gian sắc ký gấp 1,6 lần thời gian lưu của lopinavir. Tính hàm lượng phần trăm của C 37 H 48 N 4 O 5 trong chế phẩm dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử (2), dung dịch đối chiếu (1) và hàm lượng của C 37 H 48 N 4 O 5 trong lopinavir chuẩn. Bảo quản Trong bao bì kín. Loại thuốc Thuốc kháng virus HIV. Chế phẩm Phối hợp với ritonavir: Thuốc nang và dung dịch uống. LYSIN ACETAT Lysini acetas C 6 H 14 N 2 O 2 . C 2 H 4 O 2 P.t.l: 206,2 Lysin acetat là acid (2 S )-2,6-diaminohexanoic acetat, phải chứa từ 98,5% đến 101,0% C 6 H 14 N 2 O 2 .C 2 H 4 O 2 , tính theo chế phẩm đã làm khô. Tính chất Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng hay tinh thể không màu. Dễ tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96%. Định tính Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau: Nhóm I: A, C, E. Nhóm II: B, C, D, E. A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của lysin acetat chuẩn. Nếu phổ của chế phẩm và lysin acetat chuẩn ở trạng thái rắn khác nhau thì hòa tan riêng rẽ chế phẩm và chuẩn trong một thể tích nước tối thiểu, bay hơi ở 60 °C và ghi phổ của cắn mới thu được. B. Trong phần Các chất dương tính với ninhydrin, vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử (2) ph ả i tương tự về vị trí, màu sắc và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1). C. Chế phẩm phải đáp ứng phép thử Góc quay cực riêng. D. Lấy 0,1 ml dung dịch S (xem Độ trong và màu sắc của dung dịch), thêm 2 ml nước và 1 ml dung dịch acid phosphomolybdic 5% (TT). Tủa trắng hơi vàng tạo thành. E. Chế phẩm cho phản ứng của acetat (Phụ lục 8.1). Độ trong và màu sắc của dung dịch Dung dịch S: Hòa tan 5,0 g ch ế phẩm trong nước c ấ t và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Dung dịch S phải trong (Phụ lục 9.2) và không màu (Phụ lục 9.3, phương pháp 2). Góc quay cực riêng Từ +8,5° đến +10,0°, tính theo chế phẩm đã làm khô (Phụ lục 6.4). Dùng dung dịch S để đo. Các chất dương tính với ninhydrin Phương pháp sắc ký lớp m ỏ ng (Phụ lục 5.4). Bản mỏng: Silica gel. Dung môi khai triển: Amoniac - 2-propanol (30 : 70). Dung dịch thử (1): Hòa tan 0,10 g chế phẩm trong nước và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi. Dung dịch thử (2): Pha loãng 1 ml dung dịch thử (1) thành 50 ml bằng nước . Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 10 mg lysin acetat chuẩn trong nước và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Dung dịch đ ố i chiếu (2): Pha loãng 5 ml dung dịch thử (2) thành 20 ml bằng nước . Dung dịch đối chiếu (3): Hòa tan 10 mg lysin acetat chuẩn và 10 mg arginin chuẩn trong nước và pha loãng thành 25 ml với cùng dung môi. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 μl mỗi dung dịch trên. Để khô bản mỏng ngoài không khí. Triển khai bản mỏng đến khi dung môi đi được 2/3 bản mỏng . Sấy bản mỏng ở nhiệt độ 100 °C đến 105 °C đến khi amoniac bay hơi hết. Phun dung dịch ninhydrin 0,2% (TT) và sấy bản mỏng ở nhiệt độ 100 °C đến 105 °C trong 15 min. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử (1), bất kỳ vết phụ nào ngoài v ế t chính không được có màu đậm hơn vết chính của dung dịch đối chiếu (2) (0,5%). Phép thử chỉ có giá tr ị khi trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) cho hai vết tách nhau hoàn toàn. Clorid Không được quá 0,02% (Phụ lục 9.4.5). Pha loãng 2,5 ml dung dịch S thành 15 ml bằng nước để thử. Sulfat Không được quá 0,03% (Phụ lục 9.4.14). Pha loãng 5 ml dung dịch s thành 15 ml bằng nước cất để thử. Amoni Không được quá 0,02% (Phụ lục 9.4.1). Lấy 50 mg chế phẩm tiến hành theo phương pháp B. Dùng 0,1 ml dung dịch amoni mẫu 100 phần triệu NH4 (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Sắt Không được quá 30 phần triệu (Phụ lục 9.4.13). Hòa tan 0,33 g chế phẩm trong 10 ml dung dịch acid hydrocloric loãng (TT) trong một bình gạn. Chiết 3 lần, mỗi lần với 10 ml methyl isobutyl keton ( TT 1 ) và lắc trong 3 min. Tập trung dịch chiết hữu cơ, thêm 10 ml nước , lắc trong 3 min. Lấy lớp nước và tiến hành thử. Kim loại nặng Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). L ấ y 12 ml dung dịch S tiến hành theo phương pháp 1. Dùng dung dịch chì mẫu 1 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 0,5% (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 60 °C; 3 h). Tro sulfat Không được quá 0,1% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Hòa tan 80,0 mg chế phẩm trong 3 ml acid formic khan (TT). Thêm 50 ml acid acetic khan (TT). Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ), xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ điện thế (Phụ lục 10.2). Song song tiến hành một mẫu trắng. 1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) tương đương với 10,31 mg C 8 H 18 N 2 O 4 . Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Acid amin. Chế phẩm Viên nén, nang, thuốc tiêm. NIFUROXAZID Nifuroxazidum C 12 H 9 N 3 O 5 P.t.l: 275,2 Nifuroxazid là ( E )-4-Hydroxy- N ' -[(5-nitrofuran-2-yl)methyliden]benzohydrazid, phải chứa từ 98,5% đến 101,5% C 12 H 9 N 3 O 5 tính theo chế phẩm đã làm khô. Tính chất Bột kết tinh màu vàng sáng. Thực tế không tan trong nước và methylen clorid, khó tan trong ethanol 96%. Định tính Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của nifuroxazid chuẩn. Độ hấp thụ riêng Tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng. Hòa tan 10,0 mg chế phẩm trong 10,0 ml ethylen glycol monomethyl ether (TT), và pha loãng thành 100,0 ml bằng methanol (TT). Pha loãng 5,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 m l bằng methanol (TT). Độ hấp thụ riêng của dung dịch thu được ở bước sóng cực đại 367 nm (Phụ lục 4.1) phải từ 940 đến 1000. Tạp chất A Không được quá 0,05%. Dung dịch thử(1): Hòa tan 1,0 g chế phẩm trong dimethyl sulfoxid (TT) và pha loãng thành 10,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch thử (2): Lấy 5,5 ml dung dịch thử (1), thêm 50,0 ml nước trong khi khuấy. Để yên trong 15 min và lọc. Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5 ml dung dịch thử (1), thêm 5,0 ml dung dịch 4-hydroxybenzohydrazid (tạp chất A) trong dimethyl sulfoxid (TT) nồng độ 50 mg/L. Thêm 50,0 ml nước , vừa thêm vừa khuấy. Để yên trong 15 min và lọc. Lần lượt thêm 0,5 ml thuốc thử phosphomolybdotungstic (TT) và 10,0 ml dung dịch natri carbonat (TT) 10,6% v à o 10,0 ml dung dịch thử (2) và 10,0 ml dung dịch đối chiếu. Để yên 1 h. Đo độ hấp thụ ánh sáng (Phụ lục 4.1) của hai dung dịch trên ở bước sóng 750 nm. Độ hấp thụ của dung dịch thử (2) không được lớn hơn độ hấp thụ của dung dịch đối chiếu. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Sử dụng bình định mức màu nâu nếu không có chỉ dẫn khác. Pha động A: Tetrahydrofuran - nước (5 : 95). Pha động B: Acetonitril. Dung môi pha mẫu: Acetonitril - nước (40 : 60). Dung dịch thử: Hòa tan 10,0 mg chế phẩm trong dung môi pha mẫu, siêu âm không quá 5 min, pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng dung môi pha mẫu. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 10,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Để chuẩn bị tạp chất E, hòa tan 5 mg chế phẩm trong dung môi pha mẫu trong bình định mức không màu, siêu âm 5 min, pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Để yên 1 h. Dung dịch đối chiếu (3): Hòa tan 5,0 mg methyl parahydroxybenzoat chuẩn (tạp chất B) trong dung môi pha mẫu và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml với cùng dung môi. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 μm, hình cầu). Nhiệt độ cột: 10 °C. Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 280 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 50 μl. Cách tiến hành : Tiến hành sắc ký theo chương trình dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) 0-10 67 33 10-30 67 - > 43 33 - > 57 Tiến hành sắc ký với dung dịch thử, dung dịch đối chiếu (1), (2) và (3). Thời gian lưu tương đối của các tạp chất so với nifuroxazid (thời gian lưu khoảng 8 min): Tạp chất A (đồng phân hỗ biến keto-enol) khoảng 0,36 và 0,39; tạp chất E khoảng 0,9; tạp chất B khoảng 1,2; tạp chất C khoảng 2,6; tạp chất D khoảng 3,4. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2), độ phân giải giữa pic của tạp chất E và pic của nifuroxazid ít nhất là 2,0. Giới hạn: Tạp chất E: Diện tích pic tạp chất E không được lớn hơn 3 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,3%). Tạp chất B, C, D: Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn 0,6 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) (0,3%). Không quá 1 pic trong số 3 pic trên có diện tích lớn hơn 0,2 lần diện tích của pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) (0,1%). Tạp chất khác: Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,10%). Tổng diện tích pic của tất cả các tạp chất trừ tạp chất E không được lớn hơn diện tích pic ch í nh thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) (0,5%). Bỏ qua những pic có diện tích nhỏ hơn 0,1 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) (0,05%), bỏ qua các pic của tạp chất A. Ghi chú : Tạp chất A: 4-hydroxybenzohydrazid ( p -hydroxybenzohydrazid). Tạp chất B: methyl 4-hydroxybenzoat (methyl parahydroxybenzoat). Tạp chất C: (5-nitrofuran-2-yl)methylidendiacetat. Tạp chất D: (E, E )- N , N' -bis[(5-nitrofuran-2-yl)methyliden]hydrazin (5-nitrofurfural azin). Tạp chất E: ( Z )-4-hydroxy- N ' -[(5-nitrofuran-2-yl)methyliden]benzohydrazid. Kim loại nặng Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Lấy 1,0 g tiến hành theo phương pháp 4. Dùng 2 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 0,5% (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 105 °C; 3 h) Tro sulfat Không được quá 0,1% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Hòa tan 0,200 g chế phẩm, đun nóng nếu cần, trong 30 ml dimethyl formamid (TT), thêm 20 ml nước . Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ). Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (Phụ lục 10.2). 1 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ) tương đương 27,52 mg C 12 H 9 N 3 O 5 Bảo quản Tránh ánh sáng. Loại thuốc Kháng khuẩn. Chế phẩm Nang. NITRAZEPAM Nitrazepamum C 15 H 11 N 3 O 3 P.t.l: 281,3 Nitrazepam là 7-nitro-5-phenyl-1,3-dihydro-2 H -1,4-benzodiazepin-2-on, phải chứa từ 99,0% đến 101 , 0% C 15 H 11 N 3 O 3 , tính theo chế phẩm đã làm khô. Tính chất Bột kết tinh màu trắng hoặc vàng. Thực tế không tan trong nước, kh ó tan trong ethanol 96%. Định tính Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của nitrazepam chuẩn. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng. Pha động A: Dung dịch natri dihydrophosphat (TT) 7,8 g/l, chỉnh đến pH 3,0 với acid phosphoric (TT). Pha động B: Acetonitril. Dung dịch thử: Hòa tan 50 mg chế phẩm trong acetonitril (TT) và pha loãng thành 20,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng acetonitril (TT). Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 10,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan 2 mg clonazepam chuẩn trong acetonitril (TT) và pha loãng thành 100 , 0 ml với cùng dung môi. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 10,0 ml bằng dung dịch thử. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,0 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 μm). Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt ở bước sóng 270 nm. Nhiệt độ cột: 40 °C. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 10 μ l . Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) 0 - 3 65 35 3 - 10 65 -> 50 35 -> 50 10 - 20 50 50 Thời gian lưu tương đối so với nitrazepam (thời gian lưu khoảng 9 min): clonazepam khoảng 1,1. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2), tỷ số đỉnh-hõm (Hp/Hv) ít nhất là 4,0; trong đó Hp là chiều cao đ ỉ nh pic clonazepam so với đường nền và Hv là chiều cao tính từ đường nền lên đến đáy hõm phân tách giữa pic clonazepam và pic nitrazepam. Giới hạn: Với mỗi tạp chất bất kỳ, diện tích pic không được lớn hơn diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,10%). Tổng diện tích pic của tất cả các pic tạp chất không được lớn hơn 2 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,2%). Bỏ qua những pic có diện tích nhỏ hơn 0,5 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,05%). Ghi chú Tạp chất A: 3-amino-6-nitro-4-phenylquinolin-2(1 H )-on. Tạp chất B: (2-amino-5-nitrophenyl)phenylmethanon. Tạp chất C: 2-bromo - N -[4-nitro-2-(phenylcarbonyl)phenyl]acetamid. Tạp chất D: 2-(1,3-dioxo-1,3-dihydro-2 H -isoindol-2-yl)- N -[4-nitro-2-(phenylcarbonyl) phenyl] acetamid. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 0,5% (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 105 °C; 4 h). Tro sulfat Không được quá 0,1% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Hòa tan 0,250 g chế phẩm trong 25 ml anhydrid acetic (TT). Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ), xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (Phụ lục 10.2). 1ml dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) tương đương với 28,13 mg C 15 H 11 N 3 O 3 . Bảo quản Tránh ánh sáng. Loại thuốc An thần, gây ngủ. Chế phẩm Viên nén. PENICILAMIN Penicillaminum C 5 H 11 NO 2 S P.t.l: 149,2 Penicilamin là acid (2 S )-2-amino-3-methyl-3-sulfanylbutanoic, phải chứa từ 98,0% đến 101,0% C 5 H 11 NO 2 S , tính theo chế phẩm đã làm khô. Tính chất Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng. Dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%. Định tính Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau: Nhóm I: A, B, D. Nhóm II: A, C, D. A. Hòa tan 0,5 g chế phẩm trong hỗn hợp 0,5 ml acid hydrocloric (TT) và 4 ml aceton (TT) ấm, làm nguội trong nước đá và tạo tủa kết tinh bằng cách cọ đũa thủy tinh vào thành ống nghiệm. Tủa trắng tạo thành. Lọc chân không lấy tủa, rửa tủa bằng aceton (TT), làm khô tủa bằng cách hút chân không. Dung dịch 1% t ủ a trong nước là hữu tuyền. B. Trong phép thử Tạp chất A, pic chính trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử phải có thời gian lưu và diện tích tương tự thời gian lưu và diện tích của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1). C. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4). Bản mỏng: Silica gel G. Dung môi khai triển: Acid acetic băng - nước - butanol (18 : 18 : 72). Dung dịch thử: Hòa tan 10 mg chế phẩm trong 4 ml nước Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 10 mg penicilamin chuẩn trong 4 ml nước . Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 2 μl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 10 cm. L ấ y bản mỏng ra và làm khô bằng cách s ấ y ở nhiệt độ 100 °C đến 105 °C trong 10 min. Để bản mỏng trong bình bão hòa hơi iod trong 5 min đến 10 min. Vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung d ị ch thử phải tương tự về vị trí, màu sắc và kích thước với vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. D. Hòa tan 40 mg chế phẩm trong 4 ml nước và thêm 2 ml dung dịch acid phosphotungstic (TT). Để yên 5 min, dung dịch xuất hiện màu xanh dương. Độ trong và màu sắc của dung dịch Dung dịch S: Hòa tan 2,5 g chế phẩm trong nước không có carbon dioxyd (TT) và pha loãng thành 25 ml bằng cùng dung môi. Dung dịch S phải trong (Phụ lục 9.2) và không có màu đậm hơn dung dịch màu mẫu số 6 của dãy dung dịch màu đối chiếu phù hợp nhất (Phụ lục 9.3, phương pháp 2). pH Pha loãng 1 ml dung dịch S thành 10 ml bằng nước không có carbon dioxyd (TT). pH của dung dịch thu được phải từ 4,5 đến 5,5 (Phụ lục 6.2). Góc quay cực riêng Từ -61,0° đến -65,0°, tính theo chế phẩm đã làm khô (Phụ lục 6.4). Hòa tan 0,500 g chế phẩm trong dung dịch natri hydroxyd 1 M (TT ) và pha loãng thành 10,0 ml với cùng dung môi. Các chất hấp thụ ánh sáng tử ngoại Không được quá 0,5% acid peniloic. Hòa tan 0,100 g chế phẩm trong nước và pha loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi. Độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch thu được ở bước sóng 268 nm không được lớn hơn 0,07. Tạp chất A Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Chuẩn bị các dung dịch ngay trước khi dùng. Pha động: Pha dung dịch chứa natri edetat (TT) 0,01% và acid methansu l fonic (TT) 0,2% trong nước . Dung dịch thử: Hòa tan 40,0 mg chế phẩm trong pha động và pha loãng thành 10,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 40 mg penicilamin chuẩn trong pha động và pha loãng thành 10,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan 20,0 mg penicilamin disulfid chuẩn (tạp chất A) trong pha động và pha loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 10,0 ml bằng pha động. Điều kiện sắc ký : Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh B (10 μm). Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 220 nm. Tốc độ dòng: 1,7 ml/min. Thể tích tiêm: 20 μl. Cách tiến hành: Thời gian lưu tương đối của tạp chất A so với penicilamin (thời gian lưu khoảng 6 min) khoảng 1,8. Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch đối chiếu (1), độ phân giải giữa pic penicilamin và pic tạp chất A ít nhất là 4,0. Giới hạn: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử: Diện tích pic của tạp chất A không được lớn hơn diện tích pic tương ứng thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (1%). Tạp chất B Không được quá 0,1 phần triệu. Tiến hành trong môi trường không có penicilin và với các thiết bị chuyên dụng cho phép thử. Tiệt trùng dụng cụ ở 180 °C trong 3 h và các dung dịch đệm ở 121 °C trong 20 min trước khi dùng. Dung dịch thử (1): Hòa tan 1,000 g chế phẩm trong 8 ml dung dịch đệm pH 2,5 (TT) và thêm 8 ml ether (TT). Lắc mạnh trong 1 min. Gạn lấy lớp ether. Tiếp tục chiết với ether một lần nữa, gộp dịch chiết ether. Thêm 8 ml dung dịch đệm pH 2,5 (TT) vào dịch chiết ether và lắc 1 min. Để yên cho tách lớp và gạn cẩn thận lấy lớp trên sao cho loại bỏ hoàn toàn được lớp nước (penicilin không bền ở pH 2,5 vì vậy c ầ n thực hiện toàn bộ thao tác chiết trong vòng 6 đến 7 min). Thêm 8 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,0 (TT 2 ) vào lớp ether, lắc 5 min, đ ể tách lớp và gạn lấy lớp nước, kiểm tra pH dung dịch phải bằng 6,0. Dung dịch thử (2): Thêm 20 μl dung dịch penicilinas (TT) vào 2 ml dung dịch thử (1) và ủ ấm ở 37 °C trong 1 h. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 5 mg benzylpenicilin natri (TT) trong 500 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,0 (TT 2 ). Pha loãng 0,25 ml dung dịch thu được thành 200,0 ml bằng dung dịch đệm pH 2,5 (TT). Lấy 8 ml dung dịch thu được và tiến hành quy trình chiết như với dung dịch thử (1). Dung dịch đối chiếu (2): Thêm 20 μl dung dịch penicilinase (TT) vào 2 ml dung dịch đối chiếu (1) và ủ ấ m ở 37 °C trong 1 h. Dung dịch mẫu trắng: Tiến hành như chuẩn bị dung dịch thử (1) nhưng không có chế phẩm. Đun chảy môi trường dinh dưỡng có công thức dưới đây và cấy vào môi trường ch ủ ng vi khuẩn Kocuria rhizophila (ATCC 9341) ở nhiệt độ thích hợp để thu được nồng độ 5 x 10 4 vi khuẩn trong 1 ml môi trường, nồng độ chủng vi khuẩn có thể thay đổi miễn là thu được độ nhạy mong muốn và vòng vô khuẩn rõ ràng, sắc nét, có đường kính phù hợp. Đổ môi trường đã cấy chủng vào 5 đĩa petri đường kính 10 cm để tạo thành lớp môi trường có độ dày từ 2 mm đến 5 mm. Có thể đổ môi trường 2 lớp, trong đó ch ỉ có lớp môi trường phía trên được cấy chủng. Bảo quản các đ ĩa petri sao cho vi khuẩn không phát triển thêm hoặc bị chết đi và bề mặt của môi trường khô trước khi sử dụng. Với mỗi đĩa petri, đặt 5 ống trụ bằng thép không g ỉ có đường kính trong 6 mm lên bề mặt môi trường theo đường tròn đồng tâm với đĩa petri và có bán kính 25 mm. Với mỗi đĩa petri, nhỏ vào mỗi ống trụ 0,15 ml dung dịch thử (1) và (2), dung dịch đối chiếu (1) và (2) và mẫu trắng . Ủ ở 30 °C trong ít nhất 24 h. Đo đường kính vòng vô khuẩn tạo thành bằng thiết bị đo có độ chính xác ít nhất 0,1 mm. Phép thử chỉ có giá trị nếu dung dịch đối chiếu (1) có vòng vô khuẩn rõ ràng, dung dịch đối chiếu (2) và mẫu trắng không có vòng vô khuẩn. Nếu dung dịch thử (1) có vòng vô khuẩn và dung dịch thử (2) không có vòng vô khuẩn, có nghĩa vòng vô khuẩn này do penicilin trong dung dịch thử (1) tạo ra. Trong trường hợp này, đường kính vòng vô khuẩn trung bình của dung dịch thử (1) của 5 đĩa petri phải nhỏ hơn đường kính vòng vô khuẩn trung bình của dung dịch đối chiếu (1) trong cùng điều kiện. Môi trường dinh dưỡng (pH 6,0) Pepton Cao nấm men Cao thịt Natri clorid Thạch Nước cất 5,0 g 1,5 g 1,5 g 3,5 g 15,0 g 1000 ml Ghi chú: Tạp chất B: penicilin. Thủy ngân Không được quá 10 phần triệu. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (Phụ lục 4.4, phương pháp 1). Dung dịch thử. Thêm vào 1,00 g chế phẩm 10 ml nước và 0,15 ml acid percloric (TT) và lắc tròn đến khi hòa tan hoàn toàn. Thêm 1,0 ml dung dịch amoni pyrolidindithiocarbamat 1% (TT) đã được rửa 3 lần, mỗi lần bằng cùng thể tích methyl isobutyl keton (TT), rửa ngay trước khi dùng. Trộn đều và thêm 2 ml methyl isobutyl keton (TT) và lắc trong 1 min. Pha loãng thành 25,0 ml bằng nước và để yên cho tách lớp, gạn lấy lớp methyl isobutyl keton . Dung dịch đối chiếu : Hòa tan một lượng thủy ngân oxyd vàng (TT) tương đương với 0,108 g HgO trong một thể tích nhỏ nhất dung dịch acid hydrocloric loãng (TT) và pha loãng thành 1000,0 ml bằng nước (dung dịch thu được có nồng độ 100 phần triệu Hg). Chuẩn bị dung dịch đối chiếu tương tự như dung dịch thử nhưng thay chế phẩm bằng một thể tích thích hợp dung dịch chứa 100 phần triệu Hg. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 254 nm, dùng đèn cathod rỗng thủy ngân làm nguồn bức xạ và ngọn l ử a không khí - acetylen. Điều chỉnh thiết bị về 0 bằng lớp methyl isobutyl keton thu được bằng cách chuẩn bị một mẫu trắng như với dung dịch thử nhưng không có chế phẩm. Kim loại nặng Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Lấy 12 ml dung dịch S tiến hành theo phương pháp 1. Dùng dung dịch chì mẫu 2 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 0,5% (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 60 °C trong chân không áp suất không quá 0,67 kPa, phosphor pentoxyd). Tro sulfat Không được quá 0,1% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Hòa tan 0,1000 g chế phẩm trong 30 ml acid acetic khan (TT). Chuẩn độ bằng dung dịch acid perclor i c 0,1 N (CĐ), xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ điện thế (Phụ lục 10.2). 1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) tương đương với 14,92 mg C 5 H 11 NO 2 S. Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Tác nhân tạo phức, giải độc kim loại. Chế phẩm Viên nén. QUINAPRIL HYDROCLORID Quinaprili hydrochloridum C 25 H 31 CIN 2 O 5 P.t.l: 475,0 Quinapril hy d roclorid là acid (3 S )-2-[(2 S )-2-[[(1 S )-1-(ethoxycarbonyl)-3-phenylpropyl]amino]propanoyl]-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-carboxylic hydroclorid, phải chứa từ 98,5% đến 101,5% C 25 H 31 CIN 2 O 5 , tính theo chế phẩm khan. Tính chất Bột màu trắng hay gần như trắng hoặc hồng nhạt, hút ẩm. Dễ tan trong nước và ethanol 96%, r ấ t kh ó tan trong aceton. Định tính A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của quinapril hydroclorid chuẩn. B. Chế phẩm phải đáp ứng phép thử Góc quay cực riêng. C. Chế phẩm phải cho phản ứng (A) của clorid (Phụ lục 8.1). Góc quay cực riêng Từ +14,4° đến +16,6°, tính theo chế phẩm khan (Phụ lục 6.4). Hòa tan 0,500 g chế phẩm trong methanol (TT) và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. Tạp chất đồng phân không đối quang Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Chuẩn bị các dung dịch ngay trước khi dùng. Pha động: Trộn 260 ml tetrahydrofuran (TT) với 740 ml dung dịch mới pha có chứa 0,80 g natri octansulfonat (TT) và 2,13 g amoni dihydrophosphat (TT) đã được điều chỉnh đến pH 4,5 bằng acid phosphoric (TT). Hỗn hợp dung môi: Điều chỉnh 500 ml pha động đến pH 6,5 bằng amoniac (TT). Dung dịch thử : Hòa tan 100 mg chế phẩm trong hỗn hợp dung môi và pha loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng hỗn hợp dung môi. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 20,0 ml bằng hỗn hợp dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan quinapril chuẩn dùng đ ể định tính pic (ch ứ a tạp chất G, H và I) có trong 1 lọ chuẩn trong hỗn hợp dung môi và pha loãng thành 5,0 ml với cùng dung môi. Điều kiện sắc ký : Cột kích thước (25 cm x 4,0 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 μm). Nhiệt độ cột: 25 °C. Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt ở bước sóng 220 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 20 μl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với thời gian gấp 3,5 lần thời gian lưu của quinapril. Định tính các tạp chất: Sử dụng sắc ký đồ cung cấp kèm theo quinapril chuẩn dùng để định tính pic và sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) để xác định pic của tạp chất G, H và I. Thời gian lưu tương đối so với quinapril (thời gian lưu khoảng 18 min): Tạp chất G khoảng 0,9; tạp chất H khoảng 1,2; tạp chất I khoảng 1,3. Kiểm tra t í nh phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2), độ phân giải giữa pic của tạp chất G và pic của quinapril ít nhất là 1,5. Tỷ số đỉnh - hõm (Hp/Hv) ít nhất là 2,0; trong đ ó Hp là chiều cao đỉnh pic tạp chất H so với đường nền và Hv là chiều cao t í nh từ đường nền lên đến đáy hõm phân tách giữa pic tạp chất H và pic quinapril. Giới hạn: Tạp chất G, H và I: Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn 3 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,15%). Ghi chú: Tạp chất G: Acid (3 R )-2-[(2 S )-2-[[(1 S )-1-(ethoxycarbonyl)-3-phenylpropyl]amino]propanoyl]-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin -3-carboxylic. Tạp chất H: Acid (3 R )-2-[(2 S )-2-[[(1 R )-1-(ethoxycarbonyl)-3-phenylpropyl]amino]propanoyl]-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-carboxylic. Tạp chất I: Acid (3 S )-2-[(2 S )-2-[[(1 R )-1-(ethoxycarbonyl)-3-phenylpropyl]amino]propanoyl]-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-carboxylic. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Acetonitril (TT 1 ) - dung dịch natri dodecyl sulfat 5,77 g/l được điều chỉnh đến pH 2,2 bằng acid phosphoric (48 : 52). Hỗn hợp dung môi: Acetonitril (TT 1 ) - dung dịch amoni dihydrophosphat (TT) 2,88 g /l được chỉnh đến pH 6,5 bằng dung dịch amoniac loãng (TT) (40 : 60). Dung dịch thử : Hòa tan 50 mg ch ế phẩm trong hỗn hợp dung môi và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng hỗn hợp dung môi. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 10,0 ml bằng hỗn hợp dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan quinapril chuẩn dùng để kiểm tra tính phù hợp của hệ thống (chứa tạp chất A, C, D, E và G) có trong một lọ chuẩn trong hỗn hợp dung môi và pha loãng thành 5,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (3): Để tạo tạp chất M, hòa tan 250 mg chế phẩm trong methylen clo ri d (TT) và pha loãng thành 5,0 ml với cùng dung môi. Đ ể dung dịch thu được dưới đèn tử ngoại trong 2,5 h sau đó bay hơi dung môi. Hòa tan 40 mg cắn trong hỗn hợp dung môi và pha loãng thành 20,0 ml với cùng dung môi. Điều kiện sắc ký : Cột kích thước (15 cm x 3,9 mm) được nhồi pha tĩnh end-capped octylsilyl silica gel dùng cho sắc ký (5 μm). Nhiệt độ cột: 30 °C. Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 5 °C. Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt ở bước sóng 214 nm. Tốc độ dòng: 1,4 ml/min. Thề tích tiêm: 10 μ l . Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với thời gian gáp 3 lần thời gian lưu của quinapril. Định tính các tạp chất: Sử dụng sắc ký đồ cung cấp kèm theo quinapril chuẩn dùng để kiểm tra tính phù hợp của hệ thống và sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) để xác định pic của tạp chất A, C, D, E và G. Sử dụng sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) để xác định pic của tạp chất M. Thời gian lưu tương đối so với quinapril (thời gian lưu khoảng 12 min): Tạp chất A khoảng 0,1; tạp chất C khoảng 0,3; tạp chất D khoảng 0,4; tạp chất M khoảng 0,7; tạp chất G + H khoảng 0,9; tạp chất E khoảng 2,3. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2), độ phân giải giữa pic của tạp chất C và pic của tạp chất D ít nhất là 1,5; độ phân giải giữa pic của tạp chất G và pic của quinapril ít nhất là 1,5. Giới hạn: Hệ số hiệu chỉnh: Để tính hàm lượng, nhân diện tích pic của tạp chất E với 1,5. Tạp chất C, D: Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn 5 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,5%). Tạp chất A: Diện tích pic tạp chất A không được lớn hơn 3 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,3%). Tạp chất E, M: Với mỗi tạp chất, diện tích pic đã hiệu chỉ nh, nếu cần, không được lớn hơn 1,5 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,15%). Tạp chất khác: Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,10%). Tổng diện tích pic của tất cả các tạp chất không được lớn hơn 10 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (1,0%). Bỏ qua những pic có diện tích nhỏ hơn 0,5 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,05%); bỏ qua pic của tạp chất G + H. Ghi chú: Tạp chất A: Acid (3 S )-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-carboxylic. Tạp chất B: Acid (2 S )-2-[[(1 S )-1-(ethoxycarbonyl)-3-phenylpropyl]amino]propanoic. Tạp chất C: Acid (3 S )-2-[(2 S )-2-[[(1 S )-1-carboxy-3-phenylpropyl]amino]propanoyl]-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-carboxylic. Tạp chất D: Ethyl (2 S )-2-[(3 S , 11a S )-3-methyl-1,4-dioxo-1,3,4,6,11,11ahexahydro-2 H -pyrazino[1,2- b ]isoquinolin-2-yl]-4-phenylbutanoat. Tạp chất E: Acid (3 S )-2-[(2 S )-2-[[(1 S )-3-cyclohexyl-1-(ethoxycarbonyl)propyl]amino]propanoyl]-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-carboxylic. Tạp chất J: Acid (1 R ,3 S )-2-[(2 S )-2-[[(1 S )-1-(ethoxycarbonyl)-3-phenylpropyl] (hydroxy)amino]propanoyl]-1-hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-carboxylic. Tạp chất M: Acid (1 R ,3 S )-2-[(2 S )-2-[[(1 S )-1-(ethoxycarbonyl)-3-phenylpropyl]amino]propanoyl]-1-hydroperoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-3-carboxylic. Kim loại nặng Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Dung môi : Dimethyl sulfoxid (TT). Lếy 1,0 g chế phẩm tiến hành thử theo Phương pháp 8. Dùng 2,0 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Nếu chế phẩm kết tủa sau khi thêm đệm acetat pH 3,5 (TT) th ì pha loãng thành 100 ml bằng dimethyl sulfoxyd (TT), chế phẩm lại tan hoàn toàn. Làm tương tự đối với dung dịch đối chiếu. Nước Không được quá 1,0% (Phụ lục 10.3). Dùng 0,500 g chế phẩm. Tro sulfat Không được quá 0,1% (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Hòa tan khoảng 0,200 g chế phẩm trong 50 ml nước . Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ). Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (Phụ lục 10.2). 1 ml dung dịch natr i hydroxyd 0,1 N (CĐ) tương đương với 23,75 mg C 25 H 31 CIN 2 O 5 . Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng, nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C. Loại thuốc Ứ c chế men chuyển angiotensin. Chế phẩm Viên nén. SUCRALFAT Sucralfatum C 1 2 H 3 0 Al 8 O 51 S 8 [AI(OH) 3 ] n [H 2 O ] n ’ với n = 8 đến 10 và n' = 22 đến 31. Sucralfat là β-D-fructofuranosyl-α-D-glucopyranosid octakis (nhôm dihydroxy sulfat) có từ 8 đến 10 phân tử nhóm hydroxyd và từ 22 đến 31 phân t ử nước. Phải chứa từ 30,0% đến 36,0% β-D- fructofuranosyl-α-D-glucopyranosid octakis sulfat (sucrose octasulfat) (C 12 H 14 O 35 S 8 8 - ; P.t.l: 975) và từ 16,5% đến 18,5% nhôm (AI; N.t.l: 26,98). Tính chất Bột vô định hình màu trắng hay gần như trắng. Thực tế không tan trong nước, trong ethanol 96% và trong methylen clorid. Tan trong các dung dịch acid vô cơ loãng và hydroxyd kiểm loãng. Định tính A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của sucralfat chuẩn. B. Hòa tan 2 g chế phẩm trong 10 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) và đun sôi. Để nguội và trung hòa bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT). Lấy 5 ml dung dịch thu được, thêm 0,15 ml dung dịch đồng sulfat 12,5% (TT) mới pha, 2 ml dung dịch natri hydroxyd loãng (TT) mới pha. Dung dịch thu được có màu xanh lam và trong, màu được duy trì sau khi đun sôi dung dịch. Thêm 4 ml dung dịch acid hydroclor i c loãng (TT) vào dung dịch nóng và đun sôi trong 1 min. Thêm 4 ml dung dịch natri hydroxyd loãng (TT), tủa màu cam xuất hiện ngay lập tức. C. Hòa tan 15 mg chế phẩm trong hỗn hợp 0,5 ml dung dịch acid hydrocloric loãng (TT) và 2 ml nước . Dung dịch thu được phải cho phản ứng của nhôm (Phụ lục 8.1). Tạp chất A Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Dung dịch amoni sulfat (TT) 7% được điều chỉnh đến pH 3,5 bằng acid phosphoric (TT). Dung dịch thử. Hòa tan 450,0 mg chế phẩm trong hỗn hợp đồng thể tích của dung dịch natri hydroxyd 8,8% (TT) và dung dịch acid sulfuric (TT) 19,62% và pha loãng thành 10,0 ml với cùng hỗn hợp dung môi. Ngay sau khi pha, vừa lắc vừa thêm chính xác V ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) để thu được dung dịch có pH 2,3. Thêm (15,0 - V) ml nước vào dung dịch thu được, lắc trong 1 min. Nếu pH không trong khoảng từ 2,3 đến 3,5, phải tiến hành lại với lượng V ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) khác. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 40,0 mg kali sucrose octasulfat chuẩn trong pha động và pha loãng thành 5,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 1,0 dung dịch đối chiếu (1) thành 10,0 ml bằng pha động. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,0 mm) được nhồi pha tĩnh aminopropylsily l silica gel dùng cho sắc ký (5 μm). Detector khúc xạ vi sai. T ố c độ dòng: 1 ml/min. Thể tích tiêm: 50 μl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (2). Thời gian lưu tương đối so với sucrose octasulfat (thời gian lưu khoảng 6 min) của tạp chất A khoảng 0,6. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2), số đĩa lý thuyết không được nhỏ hơn 400 và hệ số đối xứng không được lớn hơn 4,0 tính theo pic của kali sucrose octansulfat. Giới hạn: Tạp chất A: Diện tích pic tạp chất A không được lớn hơn 1,5 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (5,0%). Ghi chú: Tạp chất A: β-D-fructofuranosyl-α-D-glucopyranosid heptakis (hydrogensulfat). Khả năng trung hòa Phân tán 0,25 g chế phẩm trong 100,0 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 N (CĐ) đã được làm ấm đến 37 °C, giữ ấm trong cách thủy ở 37 °C và khuấy liên tục trong 1 h, để nguội. Chuẩn độ 20,0 ml dung dịch thu được bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ ) đến pH 3,5. Lượng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CĐ) đã dùng không được quá 14,0 ml. Clorid Không được quá 0,50% (Phụ lục 9.4.5). Hòa tan 0,10 g chế phẩm trong 5 ml dung dịch acid nitric loãng (TT ) và pha loãng thành 50 ml bằng nước. Pha loãng 5 ml dung dịch thu được thành 15 ml bằng nước để thử. Arsen Không được quá 4 phần triệu (Phụ lục 9.4.2, phương pháp A). Lấy 0,25 g chế phẩm vào bình đốt và thêm 5 ml acid sulfuric (TT). Thêm cẩn thận vài ml dung dịch hydrogen peroxyd 100 tt (TT) và đun sôi đến khi thu được dung dịch trong, không màu. Tiếp tục đun để loại nước và acid sulfuric nhiều nhất có thể, pha loãng thành 25 ml bằng nước . Kim loại nặng Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Lấy 2,0 g chế phẩm thử theo Phương pháp 6. Dùng 2 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Định lượng Nhôm: Phân tán 1,0 g chế phẩm trong 10 ml dung dịch acid hydrocloric 6 M (TT ), đun trong cách thủy ở 70 °C và khuấy liên tục trong 5 min. Để nguội đến nhiệt độ phòng, chuyển vào bình định mức và pha loãng thành 250,0 ml bằng nước , trộn đều. Lọc và bỏ một phần dịch lọc đầu. Lấy 10,0 ml dịch lọc, thêm 10,0 ml dung dịch natri edetat 0,1 M (CĐ ) và 30 ml hỗn hợp đồng thể tích của dung dịch amoni acetat (TT) và dung dịch acid acetic loãng (TT). Đun n ó ng trong cách thủy ở 70 °C trong 5 min, để nguội. Thêm 25 ml ethanol 96% (TT) và 1 ml dung dịch dithizon 0,025% trong ethanol 96% mới pha. Chuẩn độ lượng natri edetat thừa bằng dung dịch kẽm sulfat 0,1 M (CĐ) đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng. 1 ml dung dịch natri edetat 0,1 M (CĐ) tương đương với 2,698 mg AI. Sucrose octasulfat Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Điều kiện sắc ký được mô tả ở phần Tạp chất A với thay đổi sau. Pha động : Dung dịch amoni sulfat (TT) 13,2% được điều chỉnh đến pH 3,5 bằng acid phosphoric (TT). Tiến hành sắc ký với dung dịch thử, dung dịch đối chiếu (1). Tính hàm lượng phần trăm của C 12 H 14 O 35 S 8 trong chế phẩm dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch đối chiếu (1) và hàm lượng kali sucrose octasulfat chuẩn nhân với 0,757. Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Điều trị loét dạ dày và tá tràng. Chế phẩm Viên nén, bột pha hỗn dịch. SULFASALAZIN Sulfasalazinum C 18 H 14 N 4 O 5 S P.t.l: 398,4 Sulfasalazin là acid 2-hydroxy-5-[2-[4-(pyridin-2-ylsulfamoyl)phenyl]diazenyl]benzoic, phải chứa từ 97 , 0 % đến 101,5 % C 18 H 14 N 4 O 5 S, tính theo chế phẩm đã làm khô. Tính chất Bột mịn màu vàng sáng hay màu vàng nâu. Thực tế không tan trong nước và methylen clorid, rất kh ó tan trong ethanol 96 %. Tan trong các dung dịch hydroxyd kiềm loãng. Định tính Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của su l fasalazin chuẩn. Chuẩn b ị mẫu đo dạng đĩa nén. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động A: Hòa tan 1,13 g natri dihydrophosphat (TT) và 2,5 g natri acetat (TT) trong 900 ml nước, điều chỉnh đến pH 4,8 bằng acid acetic băng (TT) và pha loãng thành 1000,0 ml bằng nước . Pha động B: Pha động A - methanol (10: 40). Dung dịch thử: Hòa tan 25,0 mg chế phẩm trong dung dịch amoniac 0,1 M (TT) và pha loãng thành 25 , 0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng dung dịch amoniac 0,1 M (TT) . Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan 1,0 mg dẫn xuất của sulfasalazin chuẩn để kiểm tra độ phân giải trong 10 , 0 ml dung dịch đối chiếu (1). Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 10,0 ml bằng dung dịch đ ố i chiếu (1). Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt ở bước sóng 320 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) 0-15 60 → 45 40 → 55 15-25 45 55 25-60 45 → 0 55 → 100 60-65 0 100 Thời gian lưu tương đối so với sulfasalazin: Tạp chất H khoảng 0,16; tạp chất I khoảng 0,28; tạp chất C khoảng 0,80; tạp chất F khoảng 0,85; tạp chất G khoảng 1,39; tạp chất E khoảng 1,63; tạp chất B khoảng 1,85; tạp chất D khoảng 1,90; tạp chất A khoảng 2,00. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2), độ phân giải giữa pic của sulfasalazin và dẫn xuất của sulfasalazin để ki ể m tra độ phân giải ít nhất là 3,0. Giới hạn: Tạp chất A, B, C, D, E, F, G, I ; Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (1 %). T ổ ng diện tích pic của tất cả các tạp chất không được lớn hơn 4 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (4 %). Bỏ qua những pic có diện tích nhỏ hơn 0,05 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,05 %); bỏ qua bất kỳ pic nào có thời gian lưu nhỏ hơn 6 min (tạp chất H và tạp chất J). Ghi chú: Tạp chất A: 4,4’-[(4-hydroxy-1,3-phenylen)bis(diazendiyl)]bis[ N -(pyridin-2-yl)benzensulfonamid]. Tạp chất B: Acid 2-hydroxy-3,5-bis[2-[4-(pyridin-2-ylsu l famoyl)phenyl]diazenyl]benzoic. Tạp chất C: Acid 2-hydroxy-5-[2-[4-(2-iminopyridin-1(2 H )-yl)phenyl]diazenyl]benzoic. Tạp ch ấ t D: 4-[2-(2-hydroxyphenyl)diazenyl]- N -(pyridin-2-yl)benzenesulfonamid. Tạp chất E: Acid 2-hydroxy-4'-(pyridin-2-ylsu l famoyl)-5-[2-[4-(pyridin-2-ylsulfamoyl)phenyl]diazenyl]biphenyl-3-carboxylic. Tạp chất F: Acid 2-hydroxy-3-[2-[4-(pyridin-2-ylsulfamoyl)phenyl]diazenyl]benzoic. Tạp ch ấ t G: Acid 5-[2-[4’,5-bis(pyridin-2-ylsulfamoyl)biphenyl-2-yl]diazenyl]-2-hydroxybenzoic. Tạp ch ấ t I: Acid 2-hydroxy-5-[2-(4-sulfophenyl)diazenyl]benzoic. Tạp chất H và J Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Pha động B - pha động A (30: 70) (Pha động A và pha động B như mô tả trong phần Tạp chất liên quan). Dung dịch thử: Hòa tan 25,0 mg chế phẩm trong dung dịch amoniac 0,1 M (TT) và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 5,0 mg acid salicylic (TT) (tạp chất H) và 5,0 mg sulfapyridin chuẩn (tạp chất J) trong dung dịch ammoniac 0,1 M (TT) và pha loãng thành 10,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 2,0 ml dung dịch đối chiếu (1) thành 100,0 ml bằng dung dịch amoniac 0,1 M (TT) . Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt ở bước sóng 300 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Thời gian tiến hành sắc ký: 10 min. Tiến hành sắc ký với dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (2). Thời gian lưu của tạp chất H khoảng 6 min; tạp chất J khoảng 7 min. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2), độ phân giải giữa pic của tạp chất H và tạp chất J ít nhất là 2,0. Giới hạn: Tạp chất H và J: Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn 0,5 lần diện tích pic tương ứng thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,5 %). Bỏ qua những pic có diện tích nhỏ hơn 0,05 lần diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,05 %). Clorid Không được quá 140 phần triệu (Phụ lục 9.4.5). Hòa tan 1,25 g chế phẩm trong 50 ml nước cất. Đun nóng ở 70 o C trong 5 min, để nguội và lọc. Thêm 1 ml acid nitric (TT) vào 20 ml dịch lọc, để yên 5 min và lọc để thu được dịch lọc trong. Sulfat Không được quá 0,04 % (Phụ lục 9.4.14). Thêm 1 ml dung dịch acid hydrocloric 2 M (TT) vào 20 ml dịch lọc thu được ở phép thử Clorid, để yên 5 min và lọc. Kim loại nặng Không được quá 10 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Lấy 2,0 g chế phẩm tiến hành thử theo phương pháp 4. Dùng 2,0 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 1,0 % (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 105 o C; 2 h). Tro sulfat Không được quá 0,5 % (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Hòa tan khoảng 0,150 g chế phẩm trong dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi. Chuyển 5,0 ml dung dịch thu được vào bình định mức 1000 ml có chứa sẵn 750 ml nước, thêm 20,0 ml dung dịch acid acetic 0,1 M (TT) và pha loãng thành 1000,0 ml bằng nước. Song song chuẩn bị dung dịch chuẩn với cách tương tự như chuẩn bị dung dịch thử, dùng 0,150 g sulfasalazin chuẩn. Đo độ hấp thụ của hai dung dịch ở bước sóng hấp thụ cực đại 359 nm. Tính hàm lượng C 18 H 14 N 4 O 5 S trong chế phẩm dựa vào độ hấp thụ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 18 H 14 N 4 O 5 S trong sulfasalazin chuẩn. Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Thuốc chống viêm. Chế ph ẩ m Viên nén. SULTAMICILIN Sultamicillinum C 25 H 30 N 4 O 9 S 2 P.t.l: 594,7 Sultamicilin là methylen (2 S ,5 R ,6 R )-6-[[(2 R )-aminophenylacetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1- azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylat (2 S ,5 R )-3,3-dimethyl-4,4,7-trioxo-4λ 6 -thia-1-aza- bicyclo[3.2.0] heptan-2-carboxylat, ph ả i chứa từ 96,0 % đến 102,0 % C 25 H 30 N 4 O 9 S 2 , tính theo chế phẩm khan. Sản phẩm được bán tổng từ một sản phẩm lên men. Tính chất Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, hơi hút ẩm. Thực tế không tan trong nước và ethanol 96 %, rất khó tan trong methanol. Định tính Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với ph ổ hấp thụ hồng ngoại của sultamicilin chuẩn. Góc quay cực riêng Từ +190° đến +210°, tính theo chế phẩm khan (Phụ lục 6.4). Hòa tan 0,500 g chế phẩm trong dimethylformamid (TT) và pha loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Chuẩn bị các dung dịch ngay trước khi dùng hoặc b ả o qu ả n các dung dịch này không quá 6 h ở nhiệt độ từ 2 o C đến 8 o C. Pha động A: Dung dịch natri dihydrophosphat (TT) 4,68 g/l được điều chỉnh đến pH 3,0 bằng acid phosphoric (TT) . Pha động B: Acetonitril (TT 1 ) . Dung dịch A: Methanol (TT 1 ) - acetonitril (TT 1 ) (20: 80). Dung dịch B: Hòa tan 1,56 g natri dihyrophosphat (TT) trong 900 ml nước. Thêm 7,0 ml acid phosphoric (TT) và pha loãng thành 1000 ml bằng nước. Dung dịch mẫu trắng: Dung dịch B - dung dịch A (30: 70). Dung dịch thử: Hòa tan 50,0 mg chế phẩm trong 35 ml dung dịch A và lắc siêu âm khoảng 1 min. Thêm 13 ml dung dịch B, trộn đều và lắc siêu âm khoảng 1 min. Pha loãng dung dịch thu được thành 50,0 ml bằng dung dịch B và trộn đều. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 70,0 mg sultamicilin tosilat chu ẩ n trong 35 ml dung dịch A và lắc siêu âm khoảng 1 min. Thêm 13 ml dung dịch B, trộn đều và lắc siêu âm khoảng 1 min. Pha loãng dung dịch thu được thành 5 0 ,0 ml bằng dung dịch B và trộn đều. Dung dịch đối chiếu (2): Phân tán 15 mg sultamicilin tosilat chuẩn trong 20 ml dung dịch natri hydroxyd 0,04 % (TT) và lắc siêu âm khoảng 5 min. Thêm 20 ml dung dịch acid hydrocloric (TT) 0,36 g/l và pha loãng thành 100 ml bằng nước . Dung dịch đối chiếu (3): Pha loãng 1,0 ml dung dịch đối chiếu (1) thành 100,0 ml bằng dung dịch mẫu trắng. Dung dịch đối chiếu (4): Hòa tan 17,3 mg ampicilin trih y drat chuẩn (tạp chất C) và 15,0 mg sulbactam chuẩn (tạp chất A) trong nước và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml bằng nước . Dung dịch đối chiếu (5): Hòa tan 5 mg sultamicilin chuẩn dùng định tính pic (chứa tạp chất G) trong 7,0 ml dung dịch A và lắc siêu âm khoảng 1 min. Pha loãng dung dịch thu được thành 10,0 ml bằng dung dịch B, trộn đều và l ắ c siêu âm trong khoảng 1 min. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (10 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (3,5 µm). Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt ở bước sóng 215 nm. Nhiệt độ cột: 25 o C. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 5 µl. Cách tiến hành Tiến hành sắc ký với chương trình dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% t t/ tt) 0-15 95 → 3 0 5 → 70 15-16 30 70 16-16,5 30 → 95 70 → 5 16,5-20 95 5 Tiến hành sắc ký với dung dịch mẫu trắng, dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (2), (3), (4) và (5). Định tính các tạp chất: Sử dụng sắc ký đồ cung cấp kèm theo sultamicilin chuẩn dùng để định tính pic và sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (5) để xác định pic của tạp chất G. Thời gian lưu tương đối so với sultamicilin (thời gian lưu khoảng 9,3 min): Tạp ch ấ t A khoảng 0,41; acid ampicilin peniciloic khoảng 0,47; tạp chất B khoảng 0,50; tạp chất C khoảng 0,55; tạp chất D khoảng 0,94; tạp chất E khoảng 1,09; tạp chất F khoảng 1,26; tạp chất G khoảng 1,42. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2), độ phân gi ả i giữa pic acid ampicilin peniciloic và pic tạp chất B ít nhất là 2,5 và độ phân giải giữa pic tạp chất B và pic tạp chất C ít nhất l à 2,5. Giới hạn: Trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch th ử : Tạp chất G: Diện tích pic tạp chất G không được lớn hơn diện tích pic sultamicilin thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) (1,0 %). Tạp chất A: Diện tích pic tạp chất A không được lớn hơn diện tích pic tương ứng thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (4) (0,3 %). Tạp chất B: Diện tích pic tạp chất B không được lớn hơn diện tích pic tương ứng thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) (0,3 %). Tạp chất C: Diện tích pic tạp chất C không được lớn hơn diện tích pic tương ứng thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (4) (0,3 %). Tạp chất D, E, F: Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn 0,3 lần diện tích pic sultamicilin thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đ ố i chiếu (3) (0,3 %). Tạp chất khác: Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn 0,3 lần diện tích pic sultamicilin thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) (0,3 %). Tổng diện tích pic của tất cả các tạp chất không được lớn hơn 3 lần diện tích pic sultamicilin thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) (3,0 %). B ỏ qua những pic có diện tích nhỏ hơn 0,1 lần diện tích pic sultamicilin thu được trên sắc ký đ ồ của dung dịch đối chiếu (3) (0,1 %). Ghi chú: Tạp chất A: Acid (2 S ,5 R )-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylic-4,4-dioxid (sulbactam). Tạp ch ấ t B: Acid 4-methylbenzensulfonic (acid p -toluensulfonic). Tạp chất C: Acid (2 S ,5 R ,6 R )-6-[[(2 R )-2-amino-2-phenylacetyl]amino]-3,3-dimethyI-7-oxo-4-thia-1-aza- bicyclo[3.2.0] heptan-2-carboxylic (ampicilin). Tạp chất D: Acid [[(2 R )-aminophenylacetyl]amino][(4 S )-4 -[[[[[(2 S ,5 R )-3,3-dimethyl-4,4,7-trioxo-4λ 6 -thia-1-azabicyclo [3.2.0]hept-2-yl]carbonyl]oxy]methoxy]carbonyl]-5,5-dimethylthiazolidin-2-yl]acetic (acid peniciloic của sultamicilin). Tạp ch ấ t E: Methylen ( 2 S ,5 R ,6 R )-3,3-dimethyl-6-[[(2 R )-[(1-methyl-4-oxopentyliden)amino]phenyl- acetyl]amino]-7- oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylat (2 S ,5 R )-3,3-dimethyl-7-oxo-4-oxa-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2- carboxylat. Tạp ch ấ t F: Methylen (2 S ,5 R ,6 R )-6-[[(2 R )-[[[(2 S ,5 R ,6 R )-6-[[(2 R )-aminophenylacetyl]amino]-3,3-dimethyI-7-oxo-4- thia-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-yl]carbonyl]amino]phenylacetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0] heptan-2-carboxylat (2 S ,5 R )-3,3-dimethyl-4,4,7-trioxo-4λ 6 -thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylat (ampicilin sultamicilin amid). Tạp chất G: Methylen (2 S ,5 R ,6 R )-6-[[(2 R )-[[[[(2 R )-aminophenylacetyl]amino][(4 S )-4-[[[[[(2 S ,5 R )-3,3-dimethyl- 4,4,7-trioxo-4λ 6 -thia-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-yl]carbonyl]oxy]methoxy]carbonyl]-5,5-dimethylthiazolidin-2-yl] acetyl]amino]phenylacetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo [3.2.0]heptan-2-carboxylat (2 S ,5 R )-3,3- dimethyl-4,4,7-trioxo-4λ 6 -thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylat (sultamicilin dimer). Ethyl acetat Không được quá 2,5 %. Phương pháp sắc ký khí tiêm pha hơi (Phụ lục 5.2). Dung dịch thử: Hòa tan 0,200 g chế phẩm trong 7,0 ml hỗn hợp nước - dimethylformamid (1: 99). Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 0,200 g ethyl acetat (TT) trong 240 ml hỗn hợp nước - dimethylfo rm amid (1: 99), sau đó pha loãng thành 250,0 ml với cùng dung môi. Pha loãng 5,0 ml dung dịch thu được thành 7,0 ml với hỗn hợp nước - dimethylformamid (1: 99). Đậy ngay các lọ bằng nút cao su kín có phủ polytetrafluoroethylen và kẹp nắp nhôm bảo vệ. Lắc để thu được dung dịch đồng nhất. Điều kiện sắc ký: Cột silica nung chảy kích thước (50 m x 0,32 mm), ph ủ lớp pha tĩnh poly(dimethyl)siloxan dày 1,8 µm hoặc 3,0 µm. Khí mang: Heli dùng cho sắc ký. Detector ion hóa ngọn l ử a. Vận tốc tuyến tính: 35 cm/s. Tỷ lệ chia dòng: 1: 5. Điều kiện tiêm pha hơi tĩnh: Nhiệt độ cân bằng: 105 0 C Thời gian cân bằng: 45 min. Nhiệt độ đường dẫn mẫu: 110 0 C. Thời gian điều áp: 30 s. Chương trình nhiệt độ: Thời gian Nhiệt độ (min) ( 0 C) Cột 0-6 70 6-16 70 → 220 16-18 220 Buồng tiêm 140 Detector 250 Thể tích tiêm: 1 ml. Thời gian lưu tương đối so với dimethylformamid (thời gian lưu khoảng 14 min): Ethyl acetat khoảng 0,7. Kim loại nặng Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Dung dịch thử: Hòa tan 2,0 g chế phẩm trong hỗn hợp methanol - acetonitril (40: 60) và pha loãng thành 20,0 ml với cùng hỗn hợp dung môi. Lấy 12 ml tiến hành thử theo phương pháp 2. Dùng dung dịch chì mẫu 2 phần triệu Pb để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Dung dịch chì mẫu 2 phần triệu Pb được pha từ dung dịch chì mẫu 100 phần triệu Pb (TT) bằng hỗn hợp methanol - acetonitril (40: 60). Nước Không được quá 1,0 %. (Phụ lục 10.3). Dùng 0,50 g chế phẩm. Tro sulfat Không được quá 0,1 % (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Tiến hành như mô tả trong phần Tạp chất liên quan với những thay đổi sau: Tiến hành sắc ký với dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (1). Tính hàm lượng phần trăm của sultamicilin (C 25 H 30 N 4 O 9 S 2 ) trong chế phẩm dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch đối chiếu (1) và hàm lượng của C 25 H 30 N 4 O 9 S 2 trong sultamicilin tosilat chuẩn và nhân hàm lượng sultamicilin tosilat với 0,7752. Bảo quản Trong bao bì kín. Loại thuốc Thuốc ức chế men beta-lactamase. Chế phẩm Viên nén, nang, bột pha hỗn dịch. SULTAMICILIN TOSILAT DIHYDRAT Sultamicillini tosilas dihydricus C 25 H 30 N 4 O 9 S 2 .C 7 H 8 O 3 S.2H 2 O P.t.l: 803 Sultamicilin tosilat dihydrat là 4-methylbenzensulfonat của methylen (2 S ,5 R ,6 R )-6-[[(2 R )-aminophenyl- acetyl]-amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylat(2 S ,5 R )-3,3-dimethyl-4,4,7-trioxo-4λ 6 -thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylat dihydrat, phải chứa từ 95,0 % đến 102,0 % C 32 H 38 N 4 O 12 S 3 , tính theo chế phẩm khan. Sản phẩm được bán tổng từ một sản phẩm lên men. Tính chất Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng. Thực tế không tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96%. Định tính Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của sultamicilin tosilat chuẩn. Góc quay cực riêng Từ +178° đến +195°, t í nh theo chế phẩm khan (Phụ lục 6.4). Hòa tan 1,000 g ch ế phẩm trong dimethylformamid (TT) và pha loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Chuẩn bị các dung dịch ngay trước khi dùng hoặc bảo quản các dung dịch này không quá 6 h ở nhiệt độ từ 2 0 C đến 8 0 C. Pha động A: Dung dịch natri dihydrophosphat (TT) 4,68 g/l được điều chỉ nh đến pH 3,0 bằng acid phosphoric (TT) . Pha động B: Acetonitril (TT 1 ). Dung dịch A: Methanol (TT 1 ) - acetonitril (TT 1 ) (20: 80). Dung dịch B: Hòa tan 1,56 g natri dihyrophosphat (TT) trong 900 ml nước . Thêm 7,0 ml acid phosphoric (TT) và pha loãng thành 1000 ml bằng nước. Dung dịch mẫu trắng: Dung dịch B - dung dịch A (30: 70). Dung dịch thử: Hòa tan 70,0 mg chế phẩm trong 35 ml dung dịch A và siêu âm khoảng 1 min. Thêm 13 ml dung dịch B, trộn đều và siêu âm khoảng 1 min. Pha loãng dung dịch thu được thành 50,0 ml bằng dung dịch B và trộn đều. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 70,0 mg sultamicilin tosilat chuẩn trong 35 ml dung dịch A và siêu âm khoảng 1 min. Thêm 13 ml dung dịch B, trộn đều và siêu âm khoảng 1 min. Pha loãng dung dịch thu được thành 50,0 ml bằng dung dịch B và trộn đều. Dung dịch đối chiếu (2): Phân tán 15 mg chế phẩm trong 20 ml dung dịch natri hydroxyd 0,04 % (TT) và siêu âm khoảng 5 min. Thêm 20 ml dung dịch acid hydroc l oric (TT) 0,36 g/l và pha loãng thành 100 , 0 ml bằng nước. Dung dịch đối chiếu (3): Hòa tan 0,200 g chế phẩm trong 70,0 ml dung dịch A và siêu âm khoảng 1 min. Thêm 25 ml dung dịch B, trộn đều và siêu âm khoảng 1 min. Pha loãng dung dịch thu được thành 100 , 0 ml bằng dung dịch B và trộn đều. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml bằng dung dịch mẫu trắng. Dung dịch đối chiếu (4): Hòa tan 32,3 mg ampicilin trihydrat chuẩn (tạp chất B) và 7,0 mg sulbactam chuẩn (tạp chất A) trong nước và pha loãng thành 1000 ml với cùng dung môi. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (10 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (3,5 µm). Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại đặt ở bước sóng 215 nm. Nhiệt độ cột: 25 0 C. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 5 µl. Cách tiến hành Tiến hành sắc ký với chương trình dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) 0-15 95 → 30 5 → 70 15-16 30 70 16-16,5 30 → 95 70 → 5 16,5-20 95 5 Tiến hành sắc ký với dung dịch mẫu trắng, dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (2), (3) và (4). Thời gian lưu tương đối so với sultamicilin (thời gian lưu khoảng 9,3 min): Tạp chất A khoảng 0,41; acid ampicilin peniciloic khoảng 0,47; tosilat khoảng 0,50; tạp chất B khoảng 0,55; tạp chất C khoảng 0,94; tạp chất D khoảng 1,09; tạp chất F khoảng 1,23; tạp chất E khoảng 1,26; tạp chất G khoảng 1,42. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2), độ phân giải giữa pic acid ampicilin peniciloic và pic tosilat ít nhất l à 2,5 và độ phân giải giữa pic tosilat và pic tạp chất B ít nhất là 2,5. Giới hạn: Trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử, Tạp chất B: Diện tích pic tạp chất B không được lớn hơn diện tích pic tương ứng thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (4) (2,0 %). Tạp chất A: Diện tích pic tạp chất A không được lớn hơn diện tích pic tương ứng thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (4) (0,5 %). Tạp chất C, D, E, F, G: Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn 0,5 lần diện tích pic sultamicilin thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) (0,5 %). Tạp chất khác: Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn 0,5 lần diện tích pic sultamicilin thu được trên s ắ c ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) (0,5 %). Tổng diện tích pic của tất cả các tạp chất không được lớn hơn 4 lần diện tích pic sultamicilin thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) (4,0 %). Bỏ qua những pic có diện tích nhỏ hơn 0,1 lần diện tích pic sultamicilin thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (3) (0,1 %). Ghi chú: Tạp chất A: Acid (2 S ,5 R )-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylic 4,4-dioxid (sulbactam). Tạp chất B: Acid (2 S ,5 R ,6 R )-6-[[(2 R )-2-amino-2-phenylacetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylic (ampicilin). Tạp chất C: Acid [[(2 R )-aminophenylacetyl]amino][ ( 4 S )-4-[[[[[(2 S ,5 R )-3,3-dinnethyl-4,4,7-trioxo-4λ 6 -thia-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-yl]carbonyl]oxy]methoxy]carbonyl]-5,5-dimethylthiazolidin-2-yl]acetic (acid peniciloic của sultamicilin). Tạp chất D: Methylen(2 S ,5 R ,6 R )-3,3-dimethyl-6-[[(2 R )-[(1-methyl-4-oxopentyliden)amino]phenyl- acetyl]amino]-7- oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylat (2 S ,5 R ) - 3,3-dimethyl-7-oxo-4-oxa-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2- carboxylat. Tạp chất E: Methylen bis[(2 S ,5 R )-3,3-dimethyl-4,4,7-trioxo-4λ 6 -thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylat] (sulbactam methylen ester). Tạp chất F: Methylen (2 S ,5 R ,6 R )-6-[[(2 R )-[[[(2 S ,5 R ,6 R )-6-[[(2 R )-aminophenylacetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4- thia-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-y l) carbonyl]amino]-phenylacetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylat(2 S ,5 R )-3,3-dimethyl-4,4,7-trioxo-4λ 6 -thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylat (ampicilin sultamicilin amid). Tạp chất G: Methylen (2 S ,5 R ,6 R )-6-[[(2 R )-[[[[(2 R )-amino-phenylacetyl]amino][(4 S )-4-[[[[[(2 S ,5 R )-3,3-dimethyl- 4,4,7-trioxo-4λ 6 -thia-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-yl]-carbonyl]oxy]methoxy]carbonyl]-5,5-dimethylthiazolidin-2-yl] acetyl]amino]phenylacetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo [3.2.0]heptan-2-carboxylat (2 S ,5 R )-3,3- dimethyl-4,4,7-trioxo-4λ 6 -thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carboxylat (sultamicilin dimer). Ethyl acetat Không được quá 2,0 %. Phương pháp sắc ký khí tiêm pha hơi (Phụ lục 5.2). Dung dịch thử: Hòa tan 0,200 g chế ph ẩ m trong 7,0 ml hỗn hợp nước - dimethylformamid (1: 99). Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 0,200 g ethyl acetat (TT) trong 240 ml hỗn hợp nước - dimethylformamid (1: 99), sau đó pha loãng thành 250,0 ml với cùng dung môi. Pha loãng 5,0 ml dung dịch thu được thành 7,0 ml với hỗn hợp nước - dimethylformamid (1: 99). Đậy ngay các lọ bằng nút cao su kín có phủ polytetrafluoroethylen và kẹp nắp nhôm bảo vệ. Lắc để thu được dung dịch đồng nhất. Điều kiện sắc ký: Cột silica nung chảy kích thước (50 m x 0,32 mm) phủ lớp pha tĩnh poly(dimethyl)siloxan dày 1,8 µm hoặc 3,0 µm. Khí mang: Heli dùng cho sắc ký. Detector ion h ó a ngọn l ử a. Vận tốc tuyến tính: 35 cm/s. T ỉ lệ chia dòng: 1: 5. Điều kiện tiêm pha hơi: Nhiệt độ cân bằng: 105 0 C. Thời gian cân bằng: 45 min. Nhiệt độ đường dẫn mẫu: 110 0 C. Thời gian điều áp: 30 s. Chương trình nhiệt độ: Thời gian Nhiệt độ (min) ( o C) Cột 0-6 70 6-16 70 → 220 16-18 220 Buồng tiêm 140 Detector 250 Thể tích tiêm: 1 ml. Thời gian lưu tương đối so với dimethylformamid (thời gian lưu khoảng 14 min): Ethyl acetat khoảng 0,7. Kim loại nặng Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Dung dịch thử: Hòa tan 2,0 g ch ế phẩm trong hỗn hợp methanol - acetonitril (40: 60) và pha loãng thành 20,0 ml với cùng hỗn hợp dung môi. Lấy 12 ml tiến hành thử theo phương pháp 2. Dùng dung dịch chì mẫu 2 phần triệu Pb để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Dung dịch chì mẫu 2 phần triệu Pb được pha từ dung dịch chì mẫu 100 phần triệu Pb (TT) bằng hỗn hợp methanol - acetonitril (40: 60). Nước Từ 4,0 % đến 6,0 % (Phụ lục 10.3). Dùng 0,200 g chế phẩm. Tro sulfat Không được quá 0,2 % (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Tiến hành như mô tả trong phần Tạp chất liên quan với những thay đổi sau: Tiến hành sắc ký với dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (1). T í nh hàm lượng phần trăm của sultam i cilin tosilat trong chế phẩm dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch đối chiếu (1) và hàm lượng của C 32 H 38 N 4 O 12 S 3 trong sultamicilin tosilat chuẩn. Bảo quản Trong bao bì kín. Loại thuốc Thuốc ức chế men beta-lactamase. Chế phẩm Viên nén, nang, bột pha hỗn dịch. TERBUTALIN SULFAT Terbutalini sulfas (C 12 H 19 N O 3 ) 2 .H 2 S O 4 P.t.l: 548,7 Terbutalin sulfat là bis[(1 R S )-1-(3,5-dihydroxyphenyl)-2-[(1,1-dimethylethyl)amino]ethanol] sulfat, phải chứa từ 98,0 % đến 101,0 % (C 12 H 19 N O 3 ) 2 .H 2 S O 4 , tính theo chế phẩm đã làm khô. Tính chất Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Đa hình. Dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96 %. Định tính A. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của terbutalin sulfat chuẩn. Nếu phổ đo được ở trạng thái rắn của chế phẩm và terbutalin sulfat chuẩn khác nhau thì hòa tan riêng biệt chế phẩm và chuẩn trong một lượng nh ỏ methanol không có aldehyd (TT), bốc hơi đến khô, ghi phổ của cắn thu được. B. 5 ml dung dịch S ở mục Giới hạn acid phải cho phản ứng (A) của sulfat (Phụ lục 8.1). Độ trong và màu sắc của dung dịch Hòa tan 2,0 g chế phẩm trong nước không có carbon dioxyd (TT) và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Dung dịch thu được phải trong (Phụ lục 9.2) và c ó độ hấp thụ ở bước sóng 400 nm (dùng cốc đo 1 cm) không l ớ n hơn 0,11 (Phụ lục 4.1) Giới hạn acid Dung dịch S: Hòa tan 1,0 g chế phẩm trong nước không có carbon dioxyd (TT) và pha loãng thành 50 ml với cùng dung môi. Thêm 0,05 ml dung dịch đỏ methyl (TT) vào 10 ml dung dịch S. Màu của chỉ thị phải chuyển sang vàng khi thêm không quá 1,2 ml dung dịch natri hydroxyd 0,01 N (CĐ) . Góc quay cực Từ -0,10° đến +0,10° (Phụ lục 6.4). Dùng dung dịch S để đo. Tạp chất liên quan Phương pháp s ắ c ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch đệm amoni format 0,05 M: Hòa tan 3,15 g amoni format (TT) trong 980 ml nước , điều chỉnh đến pH 3,0 bằng cách thêm khoảng 8 ml acid formic khan (TT) và thêm nước vừa đủ 1000 ml. Pha động: Hòa tan 4,23 g natri hexansulfonat (TT) trong 770 dung dịch đệm amoni format 0,05 M và thêm 230 ml methanol (TT) , trộn đều. Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 75,0 mg chế phẩm, hòa tan trong pha động và pha loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu (1): Hòa tan 7,5 mg tạp chất C chuẩn của terbutalin và 22,5 mg terbutalin sulfat chuẩn trong pha động và pha loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi. Pha loãng 1,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml bằng pha động. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 50,0 ml bằng pha động. Pha loãng 2,0 ml dung dịch thu được thành 20,0 ml bằng pha động. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (15 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh base-deactivated octadecylsilyl silica gel dùng cho sắc ký (5 µ m). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 276 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với thời gian bằng 6 lần thời gian lưu của terbutalin. Thời gian lưu của tạp chất C khoảng 9 min, của terbutalin khoảng 11 min. Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1), độ phân giải giữa pic tạp chất C và pic terbutalin ít nhất bằng 2,0. Điều ch ỉ nh pha động nếu cần, giảm tỷ lệ methanol làm tăng thời gian lưu. Giới hạn: Trên sắc ký đồ của dung dịch th ử : Tạp chất C không được có diện tích lớn hơn hai lần diện tích pic tương ứng trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,2 %). Các tạp chất khác, mỗi tạp chất không được có diện pic pic lớn hơn diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,2 %). Tổng diện tích các pic tạp chất ngoại trừ tạp chất C không được lớn hơn hai lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,4 %). Bỏ qua các pic có diện tích nhỏ hơn 0,1 lần diện tích pic chính trên sắc k ý đồ của dung dịch đ ố i chiếu (2) (0,02 %). Ghi chú: Tạp ch ấ t C: 1-(3,5-dihydroxyphenyl)-2-[(1,1-dimethylethyl)amino]ethanon. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 0,5 % (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 105 0 C; 3 h). Định lượng Hòa tan 0,400 g chế phẩm bằng cách đun nóng trong 70 ml acid acetic khan (TT) . Chuẩn độ bằng dung dịch acid perclor i c 0,1 N (CĐ) , xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ điện thế (Phụ lục 10.2). 1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) tương đương với 54,87 mg C 24 H 4 0 N 2 O 10 S. Bảo quản Trong bao bì k ín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Thuốc giãn phế quản, chủ vận chọn lọc beta 2 . Chế phẩm Viên nén, thuốc tiêm. TINH BỘT BIẾN TÍNH NATRI GLYCOLAT TYP A Carboxymethylamylum natricum A Tinh bột biến tính natri glycolat typ A là muối natri của tinh bột khoai tây đã được O-carboxymethylat hóa một phần liên kết chéo, phải chứa từ 2,8 % đến 4,2 % Na (N.t.l: 22,99) tính theo chế phẩm đã được rửa bằng ethanol 80 % và làm khô. Tính chất Bột mịn, trơn chảy, màu trắng hoặc gần như trắng, rất hút ẩm. Thực tế không tan trong methylen clorid. Tạo hỗn dịch trong mờ khi hòa với nước. Dưới kính hiển vi thấy: Hạt tinh bột đơn, không đều, hình trứng hay hình quả lê (kích thước 30 µm đến 100 µm) hoặc hình tròn (kích thước 10 µm đến 35 µm); r ố n lệch và các vòng đồng tâm rõ. Đôi khi th ấ y hạt tinh bột kép 2 đến 4. Dưới kính hiển vi phân cực thấy: Hình chữ thập màu đen ở rốn hạt, trên bề mặt có các tinh thể nhỏ. Khi tiếp xúc với nước bị phồng lên. Định tính A. Chế phẩm phải đáp ứng phép thử pH. B. Lấy 4,0 g chế phẩm, thêm 20 ml nước không có carbon dioxyd (TT) , lắc đều không đun nóng. Hỗn hợp tạo thành ở dạng gel. Thêm 100 ml nước không có carbon dioxyd (TT) và lắc đều. Hỗn dịch tạo thành sẽ lắng cặn sau khi để yên. C. Dung dịch chế phẩm đã acid hóa phải chuyển màu xanh lam hoặc màu tím khi thêm dung dịch iod-iodid ( TT 1 ). D. Dung dịch S2 phải cho phản ứng của của natri (Phụ lục 8.1). Dung dịch S2: Lấy 2,5 g chế phẩm cho vào chén nung bằng sứ hoặc platin, thêm 2 ml dung dịch acid sulfuric 50 %. Đun nóng trên cách thủy, sau đ ó đốt trực tiếp trên b ế p, nâng nhiệt độ từ từ và nung ở 600 0 C + 25 0 C cho đến khi không còn các tiểu phân màu đen. Để nguội, làm ẩm bằng vài giọt dung dịch acid sulfuric 1 M (TT) , bốc hơi rồi đốt và nung lại như trên, sau đ ó để nguội. Thêm vài giọt dung dịch amoni carbonat (TT) , bay hơi đến khô và nung lại c ẩ n thận. Để nguội rồi hòa tan cắn thu được trong 50 ml nước. Độ trong và màu sắc của dung dịch S1 Dung dịch S1: Ly tâm hỗn dịch thu được trong phép thử định tính B ở tốc độ 2500 g trong 10 min. Cẩn thận lấy lớp dịch ở trên. Dung dịch S1 phải trong (Phụ lục 9.2) và không màu (Phụ lục 9.3, phương pháp 2). pH Từ 5,5 đến 7,5 (Phụ lục 6.2). Phân tán 1,0 g chế phẩm trong 30 ml nước để đo. Natri glycolat Không được quá 2,0 %. Tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng. Dung dịch thử: Lấy 0,20 g chế phẩm vào cốc có mỏ, thêm 5 ml acid acetic (TT) và 5 ml nước . Khuấy cho đến khi tan hoàn toàn (khoảng 10 min). Thêm 50 ml aceton (TT) và 1 g natri clorid (TT) , trộn đều. Lọc qua giấy lọc đã thấm aceton (TT) , rửa cốc và giấy lọc bằng aceton (TT) . Gộp dịch lọc và dịch rửa rồi pha loãng thành 100,0 ml bằng aceton (TT) . Để yên trong 24 h. Dùng lớp dung dịch trong. Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 0,310 g acid glycollic (TT) (đã được làm khô trước trong chân không bằng diphosphor pentoxyd (TT) ở nhiệt độ phòng qua đêm) trong nước rồi pha loãng thành 500,0 ml bằng cùng dung môi. Lấy 5,0 ml dung dịch thu được, thêm 5 ml acid acetic (TT) rồi để yên khoảng 30 min. Thêm 50 ml aceton (TT) và 1 g natri clorid (TT) , trộn đều. Lọc qua giấy lọc đã thấm aceton (TT) , rửa cốc và giấy lọc bằng aceton (TT) . Gộp dịch lọc và dịch rửa rồi pha loãng thành 100,0 ml bằng aceton (TT) . Để yên trong 24 h. Dùng lớp dung dịch trong. Lấy 2,0 ml dung dịch thử, đun nóng trên cách thủy trong 20 min. Để nguội tới nhiệt độ phòng rồi thêm 20,0 ml dung dịch 2,7-dihydroxynaphthalen (TT) . Lắc kỹ rồi đun nóng trong cách thủy trong 20 min. Làm nguội dưới vòi nước, chuyển toàn bộ dịch thu được vào bình định mức và pha loãng thành 25,0 ml bằng acid sulfuric (TT) trong khi vẫn làm nguội bình định mức dưới vòi nước. Trong vòng 10 min phải tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở bước sóng 540 nm (Phụ lục 4,1), dùng nước làm mẫu trắng. Độ hấp thụ của dung dịch được chuẩn bị từ dung dịch thử không được lớn hơn độ hấp thụ của dung dịch được chuẩn bị song song và cùng điều kiện từ 2,0 ml dung dịch đối chiếu. Natri clorid Không được quá 7,0 %. Lấy 0,500 g chế phẩm vào cốc có mỏ, tạo hỗn dịch với 100 ml nước. Thêm 1 ml acid nitric (TT) . Chuẩn độ bằng dung dịch bạc nitrat 0,1 M (CĐ) , xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (Phụ lục 10.2). Sử dụng điện cực chỉ thị là điện cực bạc. 1 ml dung dịch bạc nitrat 0,1 M (CĐ) tương đương với 5,844 mg NaC l . Sắt Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.13). Dùng 10 ml dung dịch S2 để thử. Kim loại nặng Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Lấy 1,0 g chế phẩm, tiến hành thử theo phương pháp 4. Dùng 2 ml dung dịch chì mẫu 10 ph ầ n triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đ ố i chiếu. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 10,0 % (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 130 0 C; 1,5 h). Độ nhiễm khuẩn Chế phẩm phải đáp ứng yêu cầu phép thử Escherichia coli và Salmonella (Phụ lục 13.6). Định lượng Lắc 1,000 g chế phẩm với 20 ml ethanol (TT) 80 % (tt/tt), khuấy trong 10 min và lọc. Lập lại quy trình trên cho đến khi ion clorid được rửa hết (xác định bằng dung dịch bạc nitrat (TT) 1,7 %), s ấ y khô cắn ở 105 0 C đến khối lượng không đổi. Lấy 0,700 g cắn khô, thêm 80 ml acid acetic băng (TT) và đun hồi lưu trong 2 h. Để nguội dung dịch thu được đến nhiệt độ phòng. Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) , xác định điểm kết thúc bằng phương pháp đo điện thế (Phụ lục 10.2). Song song tiến hành một mẫu trắng. 1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) tương đương với 2,299 mg Na. B ả o quản Trong bao b ì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Tá dược. TINH BỘT BIẾN TÍNH NATRI GLYCOLAT TYP B Carboxymethylamylum natricum B Tinh bột bi ế n tính natri glycolat typ B là muối natri của tinh bột khoai tây đã được O-carboxymethylat hóa một phần liên kết chéo, phải chứa từ 2,0 % đến 3,4 % Na (N.t.l: 22,99) tính theo chế phẩm đã được rửa bằng ethanol 80 % và làm khô. Tính chất Bột mịn, trơn chảy, màu trắng hoặc gần như trắng, rất hút ẩm. Thực tế không tan trong methylen clorid. Tạo hỗn dịch trong mờ khi hòa với nước. Dưới kính hiển vi thấy: Hạt tinh bột đơn, không đều, hình trứng hay hình quả lê (kích thước 30 µm đến 100 µm) hoặc hình tròn (kích thước 10 µm đến 35 µm); rốn lệch và các vòng đồng tâm rõ. Đôi khi thấy hạt tinh bột kép 2 đến 4. Dưới kính hiển vi phân cực thấy: Hình chữ thập màu đen ở rốn hạt, trên bề mặt có các tinh thể nhỏ. Khi tiếp xúc với nước b ị phồng lên. Định tính A. Ch ế phẩm phải đáp ứng phép thử pH. B. Lấy 4,0 g chế phẩm, thêm 20 ml nước không có carbon dioxyd (TT) , lắc đều không đun nóng. Hỗn hợp tạo thành ở dạng gel. Thêm 100 ml nước không có carbon dioxyd (TT) và lắc đều. Hỗn dịch tạo thành sẽ lắng cặn sau khi để yên. C. Dung dịch chế phẩm đã acid hóa phải chuyển màu xanh lam hoặc màu tím khi thêm dung dịch iod- iodid (TT 1 ). D. Dung dịch S2 phải cho phản ứng của natri (Phụ lục 8.1). Dung dịch S2: Lấy 2,5 g chế phẩm cho vào chén nung bằng s ứ hoặc platin, thêm 2 ml dung dịch acid sulfuric 50 % . Đun nóng trên cách thủy, sau đó đốt trực tiếp trên bếp, nâng nhiệt độ từ từ và nung ở 600 0 C ± 25 0 C cho đến khi không còn các tiểu phân màu đen. Để nguội, làm ẩ m bằng vài giọt dung dịch acid sulfuric 1 M (TT) , bốc hơi rồi đốt và nung lại như trên, sau đó để nguội. Thêm vài giọt dung dịch amoni carbonat (TT) , bay hơi đến khô và nung lại c ẩ n thận. Để nguội rồi hòa tan cắn thu được trong 50 ml nước. Độ trong và màu sắc của dung dịch Dung dịch S1: Ly tâm hỗn dịch thu được trong phép thử định tính B ở tốc độ 2500 g trong 10 min. Cẩn thận lấy lớp dịch ở trên. Dung dịch S1 phải trong (Phụ lục 9.2) và không màu (Phụ lục 9.3, phương pháp 2). pH Từ 3,0 đến 5,0 (Phụ lục 6.2). Phân tán 1,0 g chế phẩm trong 30 ml nước để đo. Natri glycolat Không được quá 2,0 %. Tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng. Dung dịch thử: Lấy 0,20 g chế phẩm vào cốc có mỏ, thêm 5 ml acid acetic (TT) và 5 ml nước. Khuấy cho đến khi tan hoàn toàn (khoảng 10 min). Thêm 50 ml aceton (TT) và 1 g natri clorid (TT) , trộn đều. Lọc qua giấy lọc đã thấm aceton (TT) , rửa c ố c và giấy lọc bằng aceton (TT) . Gộp dịch lọc và dịch rửa rồi pha loãng thành 100,0 ml bằng aceton (TT) . Đ ể yên trong 24 h. Dùng lớp dung dịch trong. Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 0,310 g acid glycollic (TT) (đã được làm khô trước trong chân không bằng diphosphor pentoxyd (TT) ở nhiệt độ phòng qua đêm) trong nước rồi pha loãng thành 500,0 ml bằng cùng dung môi. Lấy 5,0 ml dung dịch thu được, thêm 5 ml acid acetic (TT) rồi để yên khoảng 30 min. Thêm 50 ml aceton (TT) và 1 g natri clorid (TT) , trộn đều. Lọc qua giấy lọc đã thấm aceton (TT) , rửa cốc và giấy lọc bằng aceton (TT) , Gộp dịch lọc và dịch rửa rồi pha loãng thành 100,0 ml bằng ace t on (TT) . Để yên trong 24 h. Dùng lớp dung dịch trong. Lấy 2,0 ml dung dịch thử, đun nóng trên cách thủy trong 20 min. Để nguội tới nhiệt độ phòng rồi thêm 20,0 ml dung dịch 2,7-dihydroxynaphthalen (TT) . Lắc kỹ rồi đun nóng trong cách thủy trong 20 min. Làm nguội dưới vòi nước, chuyển toàn bộ dịch thu được vào bình định mức và pha loãng thành 25,0 ml bằng acid sulfuric (TT) trong khi vẫn làm nguội bình định mức dưới vòi nước. Trong vòng 10 min phải tiến hành đo độ h ấ p thụ của dung dịch thu được tại 540 nm (Phụ lục 4,1), dùng nước làm mẫu trắng. Độ h ấ p thụ của dung dịch được chuẩn b ị từ dung dịch thử không được lớn hơn độ hấp thụ của dung dịch được chuẩn bị song song và cùng điều kiện từ 2,0 ml dung dịch đối chiếu. Natri clorid Không được quá 7,0 %. Lấy 0,500 g chế ph ẩ m vào cốc c ó mỏ, tạo hỗn dịch với 100 ml nước . Thêm 1 ml acid nitric (TT) . Chuẩn độ bằng dung dịch bạc nitrat 0,1 M (CĐ) , xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (Phụ lục 10.2). Sử dụng điện cực chỉ thị là điện cực bạc 1 ml dung dịch bạc nitrat 0,1 M (CĐ) tương đương với 5,844 mg NaCI. Sắt Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.13). Dùng 10 ml dung dịch S2 để thử. Kim loại nặng Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Lấy 1,0 g chế phẩm, tiến hành thử theo phương pháp 4. Dùng 2 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 10,0 % (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 130 0 C; 1,5 h). Độ nhiễm khuẩn Chế phẩm phải đáp ứng yêu cầu phép thử Escherichia coli và Salmonella (Phụ lục 13.6). Định lượng Lắc 1,000 g chế phẩm với 20 ml ethanol 80 % (TT) , khuấy trong 10 min và lọc. Lặp lại quy tr ì nh trên cho đến khi ion clorid được rửa hết (xác định bằng dung dịch bạc nitrat (TT) 1,7 %), sấy khô cắn ở 105 0 C đến khối lượng không đ ổ i. Lấy 0,700 g cắn khô, thêm 80 ml acid acetic băng (TT) và đun hồi lưu trong 2 h. Để nguội dung dịch thu được đến nhiệt độ phòng. Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) , xác định điểm kết thúc bằng phương pháp đo điện thế (Phụ lục 10.2). Song song tiến hành một mẫu trắng. 1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) tương đương với 2,299 mg Na. Bảo quản Trong bao b ì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Tá dược. TINH BỘT BIẾN TÍNH NATRI GLYCOLAT TYP C Carboxymethylamylum natricum C Tinh bột biến tính natri glycolat typ C là muối natri của tinh bột đã được O -carboxymethylat h ó a một phần, liên kết chéo bởi sự mất nước bằng phương pháp vật lý, phải chứa từ 2,8 % đến 5,0 % Na (N.t.l: 22,99) tính theo chế phẩm đã được rửa bằng ethanol 80 % và làm khô. Tính chất Bột mịn, trơn ch ả y, màu trắng hoặc gần như trắng, rất hút ẩm. Tan trong nước, thực tế không tan trong methylen clorid. Tạo hỗn dịch trong mờ giống gel khi hòa với nước. Dưới kính hiển vi thấy: Hạt tinh bột đơn, không đều, hình trứng hay hình quả lê (kích thước 30 µm đến 100 µm) hoặc hình tròn (kích thước 10 µm đến 35 µm); rốn lệch và các vòng đồng tâm rõ. Đôi khi thấy hạt tinh bột kép 2 đến 4. Dưới kính hiển vi phân cực thấy: Hình chữ thập màu đen ở rốn hạt, trên bề mặt có các tinh thể nh ỏ . Khi tiếp xúc với nước bị phồng lên. Định tính A. Chế phẩm phải đáp ứng phép thử pH. B. Lấy 4,0 g chế phẩm, thêm 20 ml nước không có carbon dioxyd (TT) , lắc đều không đun nóng. Hỗn hợp tạo thành ở dạng gel. Thêm 100 ml nước không có carbon dioxyd (TT) và lắc đều: dạng gel của hỗn dịch vẫn bền vững (phân biệt với tinh bột biến tính typ A và B). Giữ hỗn dịch thu được để tiến hành phép thử pH và Độ trong và màu sắc của gel. C. Lấy 5 ml gel thu được trong phép thử B, thêm 0,05 ml dung dịch iod- i odid (TT 1 ) . Màu xanh lam đậm được tạo thành. D. Dung dịch S phải cho phản ứng của natri (Phụ lục 8.1). Dung dịch S: Lấy 2,5 g chế phẩm cho vào chén nung bằng sứ hoặc platin, thêm 2 ml dung dịch acid sulfuric 50 % . Đun nóng trên cách thủy, sau đó đốt trên bếp hở, nâng nhiệt độ từ từ và nung ở 600 0 C ± 25 0 C cho đến khi không còn các tiểu phân màu đen. Để nguội, làm ẩm bằng vài giọt acid sulfuric (TT) , bốc hơi rồi đốt và nung lại như trên, sau đó để nguội. Thêm vài giọt dung dịch amoni carbonat (TT) , bay hơi đến khô và nung lại cẩn thận. Để nguội rồi hòa tan cắn thu được trong 50 ml nước. Độ trong và màu sắc của gel Gel thu được trong phép Định tính B phải không màu (Phụ lục 9.3, phương pháp 2). pH Từ 5,5 đến 7,5 (Phụ lục 6.2). Dùng gel thu được trong phép thử Định t í nh B đ ể đo. Natri glycolat Không được quá 2,0 %. Tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng. Dung dịch thử: Lấy 0,20 g chế phẩm vào cốc c ó mỏ, thêm 5 ml acid acetic (TT) và 5 ml nước. Khuấy cho đến khi tan hoàn toàn (khoảng 10 min). Thêm 50 ml aceton (TT) và 1 g natri clorid (TT) , trộn đều. Lọc qua giấy lọc đã thấm aceton (TT) , rửa cốc và giấy lọc bằng aceton (TT) . Gộp dịch lọc và dịch rửa rồi pha loãng thành 100,0 ml bằng aceton (TT) . Đ ể yên trong 24 h. Dùng lớp dung dịch trong. Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 0,310 g acid glycollic (TT) (đã được làm khô trước trong chân không bằng diphosphor pentoxyd (TT) ) trong nước rồi pha loãng thành 500,0 ml bằng cùng dung môi. Lấy 5,0 ml dung dịch thu được, thêm 5 ml acid acetic (TT) rồi để yên khoảng 30 min. Thêm 50 ml aceton (TT) và 1 g natri clorid (TT) , rồi pha loãng thành 100,0 ml bằng aceton (TT) . Lấy 2,0 ml dung dịch thử, đun nóng trên cách thủy trong 20 min. Để nguội tới nhiệt độ phòng rồi thêm 20,0 ml dung dịch 2,7-dihydroxynaphthalen (TT) . Lắc kỹ rồi đun nóng trong cách thủy trong 20 min. Làm nguội dưới vòi nước, chuyển toàn bộ dịch thu được vào bình định mức và pha loãng thành 25,0 ml bằng acid sulfuric (TT) trong khi vẫn làm nguội bình định mức dưới vòi nước. Trong vòng 10 min phải tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thu được tại 540 nm (Phụ lục 4,1), dùng nước làm mẫu trắng. Độ hấp thụ của dung dịch được chuẩn b ị từ dung dịch thử không được lớn hơn độ hấp thụ của dung dịch được chuẩn bị song song và cùng điều kiện từ 2,0 ml dung dịch đối chiếu. Natri clorid Không được quá 1 %. Lắc 1,00 g chế phẩm với 20 ml ethanol 80 % (TT) trong 10 min, lọc. Lặp lại quy trình trên 4 lần. Sấy khô cắn đến khối lượng không đ ổ i ở 100 0 C để dùng cho phép thử Định lượng. Gộp dịch lọc. B ố c hơi đến khô, hòa tan cắn bằng nước và pha loãng thành 25,0 ml với cùng dung môi. Lấy 10,0 ml dung dịch thu được, thêm 30 ml nước và 5 ml dung dịch acid nitric loãng (TT) . Chu ẩ n độ bằng dung dịch bạc nitrat 0,1 M (CĐ) , xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (Phụ lục 10.2). Sử dụng điện cực chỉ thị l à điện cực bạc 1 ml dung dịch bạc nitrat 0,1 M (CĐ) tương đương với 5,844 mg NaCI. Sắt Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.13). Dùng dung dịch S để thử. Kim loại nặng Không được quá 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Lấy 1,0 g chế phẩm, tiến hành thử theo phương pháp 4. Dùng 2 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 7,0 % (Phụ lục 9.6). (1,000 g; 105 0 C; 4 h). Độ nhiễm khuẩn Chế phẩm phải đáp ứng yêu cầu phép thử Escherichia coli và Salmonella (Phụ lục 13.6). Định lượng Lấy 0,500 g cắn đã được sấy khô thu được trong phép thử Natri clorid, thêm 80 ml acid acetic khan (TT) và đun hồi lưu trong 2 h. Để nguội dung dịch thu được đến nhiệt độ phòng. Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) , xác định điểm kết thúc bằng phương pháp đo điện thế (Phụ lục 10.2). Song song tiến hành một mẫu trắng. 1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) tương đương với 2,299 mg Na. Bảo quản Trong bao b ì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Tá dược. TRAMADOL HYDROCLORID Tramadoli hydrochloridum C 16 H 25 N O 2 .HC l P.t.l: 299,8 Tramadol hydroclorid là (1 RS ,2 RS )-2-[(dimethylamino)methyl]-1-(3-methoxyphenyl)-cyclohexanol hydroclorid phải ch ứ a từ 98,0 % đến 102,0 % C 16 H 25 N O 2 .HC l , tính theo chế ph ẩ m khan. Tính chất Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Dễ tan trong nước và trong methanol, rất khó tan trong aceton. Định tính A. Ph ổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng ngoại của tramadol hydroclorid chuẩn. B. Trong phần Định lượng, thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic tramadol trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. C. Dung dịch chế phẩm 1 % phải cho phản ứng (A) của clorid (Phụ lục 8.1). Độ trong và màu sắc của dung dịch Dung dịch S: Hòa tan 1,0 g chế phẩm trong nước và pha loãng thành 20 ml với cùng dung môi. Dung dịch S phải trong (Phụ lục 9.2) và không màu (Phụ lục 9.3, phương pháp 2). Giới hạn acid Thêm 0,2 ml dung dịch đỏ methyl (TT) và 0,2 ml dung dịch acid hydrocloric 0,01 N (CĐ) vào 10 ml dung dịch S. Dung dịch có màu đỏ. Màu của chỉ thị phải chuyển sang vàng khi thêm không quá 0,4 ml dung dịch natrihydroxyd 0,01 N (CĐ) . Góc quay cực Từ -0,10° đến +0,10° (Phụ lục 6.4). Dùng dung dịch S để đo. Hàm lượng clorid Từ 11,6 % đến 12,1 %. Hòa tan 150 mg chế ph ẩ m trong 40 ml nước , vừa thêm 7,5 ml dung dịch acid nitric 4 N (TT) và 15,0 ml dung dịch bạc nitrat 0,1 N (CĐ) vừa khuấy đều. Chuẩn độ bằng dung dịch amoni thiocyanat 0,1 N (CĐ) , xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế, dùng hệ điện cực bạc - thủy tinh (Phụ lục 10.2). Thực hiện song song mẫu trắng trong cùng điều kiện. 1 ml dung dịch amoni thiocyanat 0,1 N (CĐ) tương đương với 3,545 mg clorid. Tạp chất B Không được quá 0,2 %. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4). Bản mỏng: Silica ge l . Dung môi khai triển: Toluen - 2-propanol - dung dịch amoniac 25 % (80: 19: 1). Dung dịch thử: Dung dịch chế phẩm nồng độ 50 mg/ml trong m ethanol (TT) . Dung dịch đối chiếu: Dung dịch tạp chất B chuẩn nồng độ 0,1 mg/ml trong m ethanol (TT) . Cách tiến hành: Đặt bản mỏng trong b ì nh sắc ký đã được bão hòa với hơi amoniac và đ ể yên ít nhất 20 min. Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 10 cm. Lấy bản mỏng ra, phun lên bản mỏng thuốc thử Dragendorff (TT) và làm khô trong 5 min. Phun bản mỏng đã làm khô với dung dịch natri nitrit (TT) 50 mg/ml đến khi vết tạp chất B trong dung dịch đối chiếu xuất hiện. Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử, bất kỳ v ế t phụ nào tương ứng với vết tạp chất B không được đậm màu hơn vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,2 %). Tạp chất hữu cơ Phương pháp sắc ký l ỏ ng (Phụ lục 5.3). Pha động, dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống, dung dịch thử, điều kiện sắc ký và quy định sự phù hợp của hệ thống sắc ký như mô tả trong phần Định lượng. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký dung dịch thử với thời gian gấp 4 lần thời gian lưu của pic tramadol. Tính phần trăm mỗi tạp chất (nếu có) dựa vào diện tích pic của mỗi tạp chất và tổng diện tích của tất cả các pic trên sắc ký đồ dung dịch thử. Giới hạn: Tạp chất A: Không được quá 0,2 %. Tạp chất khác: Với mỗi tạp chất, không được quá 0,1 %. Tổng các tạp chất: Không được quá 0,4 %. Nước Không được quá 0,5 % (Phụ lục 10.3). Dùng 1,0 g chế phẩm. Tro sulfat Không được quá 0,1 % (Phụ lục 9.9, phương pháp 2). Dùng 1,0 g chế phẩm. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch A: Hòa tan 2 ml acid trifluoroacetic (TT) trong 1000 ml nước . Pha động: Acetonitril - dung dịch A (30: 70). Nếu cần th ì điều chỉnh tỷ lệ các thành phần trong pha động để đạt yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống. Dung dịch thử: Hòa tan một lượng chính xác chế phẩm trong pha động và pha loãng bằng pha động để thu được dung dịch c ó nồng độ tramadol hydroclorid 1,5 mg/ml. Dung dịch chuẩn: Hòa tan một lượng chính xác tramadol hydroclorid chuẩn trong pha động và pha loãng bằng pha động để thu được dung dịch có nồng độ tramadol hydroclorid 1,5 mg/ml. Dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Dung dịch chứa tramadol hydroclorid chuẩn 0,05 mg/ml và tạp chất A chu ẩ n 0,05 mg/ml trong pha động. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 270 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống và ghi lại sắc ký đồ. Thời gian lưu tương đối của pic tạp chất A l à 0,9 và của pic tramadol là 1,0; độ phân giải giữa pic tạp chất A và tramadol không được nhỏ hơn 2,0; độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic giữa các lần tiêm lặp lại không được lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng C 16 H 25 NO 2 .HC l dựa vào diện tích pic tramadol thu được trên sắc ký đồ của dung dịch chu ẩ n, dung dịch thử và hàm lượng C 16 H 25 N O 2 .HC l trong tramadol hydroclorid chuẩn. Ghi chú: Tạp ch ấ t A: ( RS , SR )-1-(3-Methoxyphenyl)-2-(dimethylaminomethyl)cyclohexanol hydroclorid. Tạp chất B: (2-[(Dimethylamino)methyl]cyclohexanon hydroclorid. Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Thuốc giảm đau loại opioid. Chế phẩm Viên nén, nang. PHẦN 3 THÀNH PHẨM HÓA DƯỢC BỘT PHA HỖN DỊCH UỐNG CEFACLOR Pulveres Cefaclori ad suspensionum peroralum Là thuốc bột dùng để pha hỗn dịch uống ch ứ a cefaclor, c ó thể có thêm các tá dược thích hợp tạo mùi vị, tạo màu, chất bảo quản, chất ổ n định hỗn dịch.... Hỗn dịch tạo thành sau khi pha theo hướng dẫn trên nhãn thuốc phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Hỗn dịch thuốc” (Phụ lục 1.5). Bột pha hỗn dịch phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Thuốc bột” (Phụ lục 1.7) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng cefaclor khan, C 15 H 14 CIN 3 O 4 S , từ 90,0 % đến 120,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Tính chất Bột thuốc khô tơi, không bị ẩm, v ó n, màu sắc đồng nhất. Định tính A. Lắc một lượng bột thuốc tương ứng với khoảng 0,3 g cefaclor khan với 100 ml nước , lọc và pha loãng 1 ml dịch lọc thành 100 ml với nước . Phổ hấp thụ t ử ngoại của dung dịch thu được ở dải sóng 190 nm đến 310 nm chỉ có một cực đại hấp thụ ở 264 nm (Phụ lục 4.1). B. Trong phần Định lượng, pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic cefaclor trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Nước Không được quá 2,0 % (Phụ lục 10.3). Dùng 0,5 g chế phẩm. pH Từ 2,5 đến 5,0 (Phụ lục 6.2). Sử dụng hỗn dịch pha theo hướng dẫn ghi trên nhãn để đo. Tạp chất liên quan Phương pháp s ắ c ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động A: Dung dịch natri dihydrophosphat 0,78 % được điều chỉnh về pH 4,0 bằng acid phosphoric (TT) . Pha động B: Acetonitr i l - pha động A (45: 55). Dung môi pha mẫu: Dung dịch natri dihydrophosphat 0,27 % (TT) đã được điều chỉnh tới pH 2,5 bằng acid phosphoric (TT) . Pha các dung dịch sau trước khi dùng. Dung dịch thử: Cân một lượng bột thuốc hoặc một lượng hỗn dịch tạo thành pha như quy định trên nhãn tương ứng với 0,25 g cefaclor khan. Thêm 200 ml dung môi pha mẫu và lắc, pha loãng thành 250,0 ml với cùng dung môi, trộn đều và lọc. Dung dịch đối chiếu: Dung dịch cefaclor chuẩn 0,001 %. Dung dịch phân giải: Hỗn hợp dung dịch chứa cefaclor chuẩn có nồng độ 0,0025 % và delta-3-cefaclor chuẩn có nồng độ 0,005 %. Dung dịch giả dược (thực hiện khi có đủ điều kiện) : Cân một lượng hỗn hợp tá dược (t ỷ lệ thành phần như trong chế phẩm) tương ứng với lượng được trộn cùng 0,25 g cefaclor khan. Thêm 200 ml dung môi pha mẫu và lắc, pha loãng thành 250,0 ml với cùng dung môi, trộn đều và lọc. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 220 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Cân bằng cột với hỗn hợp pha động A - pha động B (95: 5) trong ít nhất 15 min. Tiến hành sắc ký với dung dịch thử, dung dịch đối chiếu, dung dịch phân giải và d ung dịch giả dược (nếu có). Tiến hành sắc ký theo chương trình dung môi sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) Ghi chú 0-30 95 → 75 5 → 25 Tuyến tính 30-45 75 → 0 25 →100 Tuyến t í nh 45-55 0 100 Đẳng dòng 55-70 0 → 95 100 → 5 C â n bằng lại cột Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Trên sắc ký đồ của dung dịch phân giải, độ phân giải giữa hai pic cefaclor và delta-3-cefaclor không nhỏ hơn 2,0; nếu cần điều chỉnh tỷ lệ acetonitril trong pha động. Giới hạn: Trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử: Diện tích của bất kỳ pic phụ nào không được lớn hơn diện tích của pic chính trên sắc ký đồ đạt được của dung dịch đối chiếu (1 %). Tổng diện tích của các pic phụ không được lớn hơn 3 lần diện tích của pic chính trong sắc ký đồ đạt được của dung dịch đ ố i chiếu (3 %). Bỏ qua các pic có diện tích nhỏ hơn 0,1 lần diện tích của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,1%) và các pic tương ứng với các pic xuất hiện trên sắc ký đồ của d ung dịch giả dược. Định lượng Phương pháp sắc ký l ỏ ng (Phụ lục 5.3). Pha động: Hòa tan 1,0 g natri pentansulfonat (TT) trong hỗn hợp gồm 780 ml nước và 10 ml tr i ethylamin (TT), điều chỉnh pH đến 2,5 bằng acid phosphoric (TT) , thêm 220 ml m ethanol (TT) và trộn đều. Dung dịch chuẩn: Hòa tan một lượng chính xác cefaclor chuẩn trong pha động để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 0,3 mg trong 1 ml. Siêu âm để hòa tan, nếu cần, tránh không làm nóng dung dịch. Dung dịch thử: Đối với chế phẩm đóng gói đơn liều, cân chính xác một lượng bột thuốc sau khi xác định độ đồng đều khối lượng; đối với chế phẩm đóng gói đa liều, cân chính xác một lượng hỗn dịch tạo th à nh pha như quy định trên nhãn tương ứng với khoảng 60 mg cefaclor khan vào bình định mức 200 ml, thêm khoảng 150 ml pha động và lắc siêu âm 15 min, tránh không làm nóng dung dịch. Pha loãng bằng pha động vừa đủ đến vạch và lắc đều, lọc. Dung dịch phân giải: Hòa tan một lượng cefaclor chu ẩ n và delta-3-cefaclor chuẩn trong pha động để thu được dung dịch có nồng độ 0,3 mg/ml mỗi chất. Điều kiện sắc k ý: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 265 nm. Tốc độ dòng: 1,5 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiêm dung dịch phân giải, thời gian lưu tương đối của cefaclor và delta-3-cefaclor lần lượt là 0,8 và 1,0; độ phân giải giữa hai pic cefaclor và delta-3-cefaclor không nhỏ hơn 2,5; hệ số đối xứng của pic cefaclor không lớn hơn 1,5. Tiến hành sắc ký đối với d ung dịch chuẩn : Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic cefaclor trong 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn không được lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Từ diện tích pic thu được từ dung dịch th ử , dung dịch chuẩn, hàm lượng C 15 H 14 CIN 3 O 4 S của cefaclor chu ẩ n và khối lượng riêng của hỗn dịch (đối với dạng đ ó ng gói đa liều, xác định theo phụ lục 6.5), tính hàm lượng cefaclor, C 15 H 14 CIN 3 O 4 S, có trong chế phẩm. Bảo quản Thuốc bột được bảo quản trong bao bì kín. Để nơi khô mát, tránh ánh sáng. Hỗn dịch đa liều sau khi pha được bảo quản trong khoảng thời gian và ở nhiệt độ như hướng dẫn trên nhãn. Nhãn Nhãn cần quy định cách pha bột thuốc thành hỗn dịch và ghi lượng tương ứng cefaclor (C 15 H 14 CIN 3 O 4 S) có trong một đơn vị thể tích hỗn dịch tạo thành (đ ố i v ớ i d ạng đóng gói đa liều). Loại thuốc Kháng sinh nhóm cephalosporin. Hàm lượng thường dùng Chế phẩm đơn liều: 125 mg; 250 mg. Chế ph ẩ m đa liều: 125 mg/5 ml; 250 mg/5 ml. BỘT PHA HỖN DỊCH UỐNG CEFDINIR Pulveres Cefdiniri ad suspensionum perora l um Là thuốc bột dùng để pha hỗn dịch uống chứa cefdinir. Có thể có thêm các tá dược thích hợp tạo mùi vị, tạo màu, chất bảo quản, chất ổn định hỗn dịch.... Hỗn dịch tạo thành sau khi pha theo hướng dẫn trên nhãn thuốc phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “ Hỗn dịch thuốc” (Phụ lục 1.5). Bột pha hỗn dịch phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận "Thuốc bột" (Phụ lục 1.7) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng cefdinir, C 1 4 H 1 3 N 5 O 5 S 2 , từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Tính chất Bột thuốc khô tơi, không bị ẩm, vón, màu sắc đồng nhất. Định tính Trong phần Định lượng, pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic cefdinir trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Môi trường: 900 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8 (Trộn 250 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2 M (TT) với 112,0 ml dung dịch natri hydroxyd 0,2 N (CĐ) và thêm nước vừa đủ 1000 ml). Tốc độ quay : 50 r/min. Thời gian: 30 min. Cách tiến hành: Đối với chế phẩm đóng gói đơn liều, lấy toàn bộ lượng thuốc của từng đơn vị, phân tán trong 5 ml nước . Đối với chế phẩm đóng gói đa liều, cân chính xác 5 ml hỗn dịch thuốc đã pha như hướng dẫn ghi trên nhãn để thử. Dung dịch thử: Sau thời gian hòa tan quy định, lấy một phần dịch hòa tan, lọc. Pha loãng dịch lọc với môi trường hòa tan (nếu cần) để thu được dung dịch có nồng độ cefdinir khoảng 10 µg/ml. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng cefdinir chuẩn, hòa tan và pha loãng bằng môi trường hòa tan đ ể thu được dung dịch có nồng độ tương đương nồng độ của dung dịch thử . Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) của dung dịch thử và dung dịch chuẩn ở bước sóng 290 nm, cốc đo dày 1 cm, mẫu trắng là môi trường hòa tan. Tính hàm lượng cefdinir, C 14 H 13 N 5 O 5 S 2 , hòa tan dựa vào độ hấp thụ của dung dịch thử, dung dịch cefdinir chuẩn và hàm lượng C 14 H 13 N 5 O 5 S 2 trong cefdinir chuẩn. Yêu cầu: Không ít hơn 80 % lượng cefdinir, C 14 H 13 N 5 O 5 S 2 , so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 30 min. pH Từ 3,2 đến 4,8 (Phụ lục 6.2). Sử dụng hỗn dịch pha theo hướng dẫn ghi trên nhãn đ ể đo. Định lượng Phương pháp sắc k ý lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch A: Hòa tan 14,2 g dinatr i hydrophosphat khan (TT) trong nước vừa đủ 1000 ml. Dung dịch B: Hòa tan 13,6 g kali dihydrophosphat (TT) trong nước vừa đủ 1000 ml. Dung dịch C: Pha loãng dung dịch tetramethylamoni hydroxyd (TT) bằng nước để thu được dung dịch có nồng độ 0,1 %. Điều chỉnh đến pH 5,5 ± 0,1 bằng dung dịch acid phosphoric 10% (TT) . Dung dịch D: Hòa tan 3,72 g natri edetat (TT) trong nước vừa đủ 100 ml. Dung dịch đệm: Trộn một tỷ lệ thích hợp dung dịch A và dung dịch B (khoáng 2: 1) để thu được dung dịch có pH 7,0. Pha động: Acetonitr i l - methanol - dung dịch C - dung dịch D (300: 200: 4500: 2), điều chỉnh tỷ lệ pha động nếu cần. Dung dịch phân giải: Hòa tan một lượng cefdinir chuẩn và tạp chất A chuẩn của cefdinir trong dung dịch đệm để thu được dung dịch có nồng độ cefdinir khoảng 0,2 mg/ml và tạp chất A khoảng 0,5 mg/ml. Dung dịch chuẩn: Hòa tan một lượng cefdinir chuẩn trong dung dịch đệm để thu được dung dịch c ó nồng độ khoảng 0,2 mg/ml. Dung dịch thử: Đối với chế ph ẩ m đ ó ng gói đơn liều, cân chính xác một lư ợ ng bột thuốc sau khi xác định độ đồng đều khối lư ợ ng; đối với chế phẩm đ ó ng gói đa liều, cân chính xác một lượng hỗn dịch tạo thành pha như quy định trên nhãn tương ứng với khoảng 100 mg cefdinir vào b ì nh định mức 100 ml, thêm 70 ml dung dịch đệm và lắc siêu âm 30 min. Pha loãng bằng dung dịch đệm đến định mức, lắc đều, ly tâm lấy dịch trong. Hút chính xác 10,0 ml dịch trong vào bình đ ị nh mức 50 ml, pha loãng bằng dung dịch đệm đến định mức, lắc đều. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (15 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Nhiệt độ cột: 40 o C. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min, có thể điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lưu của ce f dinir khoảng 8 min. Thể tích tiêm: 5 µl. Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký đối với dung dịch phân giải, dung dịch chuẩn. Trên sắc ký đồ thu được, tạp chất A cho 4 pic: pic 1 và pic 2 rửa giải trước pic cefdinir, pic 3 và pic 4 rửa giải sau pic cefdinir. Phép thử chỉ có giá trị khi độ phân giải giữa pic 2 của tạp chất A và pic cefdinir không nhỏ hơn 1,2; Hệ số đối xứng của pic cefdinir không lớn hơn 1,5; Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic cefdinir trong các lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Từ diện tích pic thu được từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn, hàm lượng cefdinir, C 14 H 13 N 5 O 5 S 2 của cefdinir chuẩn và khối lượng riêng của hỗn dịch (đối với dạng đóng gói đa liều, xác đ ị nh theo phụ lục 6.5), tính hàm lượng cefdinir, C 1 4 H 13 N 5 O 5 S 2 , c ó trong chế phẩm. Ghi chú: Tạp chất A: Hợp chất mở vòng lacton của cefdinir. Bảo quản Thuốc bột được bảo quản trong bao bì kín. Để nơi khô mát, tránh ánh sáng. Hỗn dịch đa liều sau khi pha được bảo quản trong khoảng thời gian và ở nhiệt độ như hướng dẫn trên nhãn. Nhãn Nhãn cần quy định cách pha bột thuốc thành hỗn dịch và ghi lượng tương ứng ce f dinir (C 14 H 1 3 N 5 O 5 S 2 ) có trong một đơn v ị thể tích hỗn dịch tạo thành (đối với dạng đ ó ng g ó i đa liều). Loại thuốc Kháng sinh nh ó m cephalosporin. Hàm lượng thường dùng Chế phẩm đơn liều: 125 mg, 250 mg và 300 mg. Chế ph ẩ m đa liều: 125 mg/5 ml và 250 mg/5 ml. BỘT PHA HỖN DỊCH UỐNG CEFPODOXIM Pulveres Cefpodoximi ad suspens i onum peroralum Là thuốc bột dùng để pha hỗn dịch uống chứa cefpodoxim proxetil. Có thể có thêm các tá dược thích hợp tạo mùi vị, tạo màu, chất bảo quản, chất ổn định hỗn dịch.... Hỗn dịch tạo thành sau khi pha theo hướng dẫn trên nhãn thuốc phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Hỗn dịch thuốc” (Phụ lục 1.5). Bột pha hỗn dịch phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Thuốc bột” (Phụ lục 1.7) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng cefpodoxim, C 15 H 1 7 N 5 O 6 S 2 , từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Tính chất Bột thuốc khô tơi, không bị ẩm, vón, màu sắc đồng nhất. Định tính Trong phần Định lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho 2 pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic cefpodoxim proxetil S-epimer và cefpodoxim proxetil R -epimer trên sắc k ý đồ của dung dịch chuẩn. Nước Không được quá 1,5 % (Phụ lục 10.3). Dùng khoảng 1,0 g chế phẩm để thử. pH Từ 4,0 đến 5,5 (Phụ lục 6.2). Sử dụng hỗn dịch pha theo theo hướng dẫn trên nhãn thuốc để đo. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Dung dịch amoni acetat 0,02 M- acetonitril (6: 4). Điều chỉnh t ỉ lệ nếu cần. Dung môi pha mẫu: Nước - acetonitril (6: 4). Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lư ợ ng cefpodoxim proxetil chu ẩ n tương ứng với khoảng 50 mg cefpodoxim vào bình định mức dung tích 100 ml. Thêm 10 ml m ethanol (TT) , lắc siêu âm khoảng 5 min đ ể hòa tan, thêm dung môi pha mẫu vừa đ ủ đến vạch, lắc đều. Pha loãng 5,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml bằng dung môi pha mẫu. Dung dịch thử: Đối với chế phẩm đóng gói đơn liều: Lấy bột thuốc sau khi xác định độ đồng đều khối lư ợ ng và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với khoảng 100 mg cefpodoxim vào bình định mức 200 ml, thêm 20 ml nước , lắc đều để bột phân tán, thêm 40 ml acetonitril (TT) , lắc siêu âm khoảng 15 min, để nguội, thêm dung môi pha mẫu vừa đ ủ đến vạch, lắc đều, lọc. Pha loãng 5,0 ml dịch lọc thành 100,0 ml bằng dung môi pha mẫu. Đối với chế phẩm đóng gói đa liều: Tiến hành pha hỗn dịch như chỉ dẫn trên nhãn, lắc đều. Xác đ ị nh khối lượng riêng của hỗn dịch thu được (Phụ lục 6.5). Cân chính xác một lượng hỗn d ị ch tương ứng với khoảng 100 mg cefpodoxim vào bình định mức 200 ml, thêm 20 ml nước , thêm 20 ml acetonitril (TT) , lắc siêu âm khoảng 15 min, để nguội, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc. Pha loãng 5,0 ml dịch lọc thành 100,0 ml bằng dung môi pha mẫu. Điều kiện sắc k ý: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Nhiệt độ cột: 30 o C. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 235 nm. Tốc độ dòng: 2 ml/min. Th ể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn. Trên sắc ký đồ thu được, thời gian lưu tương đối của pic cefpodoxim proxetil S -epimer khoảng 0,9 và cefpodoxim proxetil R -epimer l à 1,0; độ phân giải giữa hai pic này không nh ỏ hơn 2,5. Hệ số đối xứng của pic cefpodoxim proxetil R -epimer không lớn hơn 1,5. Độ lệch chuẩn tương đối của tổng diện tích pic cefpodoxim proxetil S -epimer và cefpodoxim proxetil R -epimer từ 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Từ tổng diện tích pic cefpodoxim proxetil S -epimer và cefpodoxim proxetil R -epimer thu được trên sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn, hàm lượng C 15 H 1 7 N 5 O 8 S 2 của cefpodoxim proxetil chu ẩ n và khối lượng riêng của hỗn dịch (đối với dạng đóng gói đa liều, xác định theo phụ lục 6.5), tính hàm lượng C 15 H 17 N 5 O 6 S 2 trong chế phẩm. Bảo quản Trong bao bì kín. Để nơi khô mát, tránh ánh sáng. Hỗn dịch đa liều sau khi pha được bảo quản trong khoảng thời gian và ở nhiệt độ như hướng dẫn trên nhãn. Nhãn Nhãn cần quy định cách pha bột thuốc thành hỗn dịch và ghi lượng tương ứng cefpodoxim (C 1 5 H 17 N 5 O 6 S 2 ) có trong một đơn vị thể tích hỗn dịch tạo thành (đối với dạng đóng gói đa liều). Loại thuốc Kháng sinh nhóm cephalosporin. Hàm lượng thường dùng Tính theo cefpodoxim. Chế phẩm đơn liều: 50 mg, 100 mg. Chế phẩm đa liều: 50 mg/5ml. BỘT PHA TIÊM CEFTAZIDIM Ceftazidimi pulvis ad injectionem Bột pha tiêm ceftazidim là hỗn hợp vô khuẩn của ceftazidim pentahydrat và natri carbonat khan, đóng trong lọ thủy tinh nút kín. Chế phẩm phải đạt các yêu cầu quy định trong chuyên luận chung về “Thuốc tiêm, thuốc tiêm truyền” (Phụ lục 1.19) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng ceftazidim, C 22 H 22 N 6 O 7 S 2 , từ 90,0 % đến 105,0 % tính trên bột thuốc khan không ch ứ a natri carbonat và so với lượng ghi trên nhãn. Hàm lượng natri carbonat khan, Na 2 C O 3 , từ 8,0 % đến 10.0 %. T í nh chất Bột màu trắng hoặc vàng nhạt. Định tính A. Trong phần Định lượng ceftazidim, thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic ceftazidim trên sắc ký đồ của dung dịch chu ẩ n. B. Chế phẩm phải cho phản ứng (A) của carbonat (Phụ lục 8.1). pH Dung dịch chế phẩm chứa ceftazidim 10,0 % trong nước không có carbon dioxyd (TT) phải có pH từ 5 , 0 đến 7,5 (Phụ lục 6.2). Độ trong của dung dịch Dung dịch chế phẩm có nồng độ ceftazidim 10,0 % trong nước không có carbon dioxyd (TT) phải trong (Phụ lục 9.2). Mất khối lượng do làm khô Không được quá 13,5 % (Phụ lục 9.6). Dùng 0,3 g chế phẩm, làm khô trong chân không với áp suất không quá 0,67 kPa ở 25 o C trong 4 h; sau đó tiếp tục sấy trong chân không ở 100 o C với áp suất không quá 0,67 kPa trong 3 h. Nội độc tố vi khuẩn Không được quá 0,10 EU/mg ceftazidim (Phụ lục 13.2). Pyridin Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Dung dịch amoni dihydrophosphat 2,88 % được điều chỉnh pH đến 7,0 bằng amoniac - acetonitril - nước (8 : 24 : 68). Các dung dịch pha ngay trước khi sử dụng. Dung môi pha mẫu: Hỗn hợp gồm 10 thể tích dung dịch đệm phosphat pH 7,0 (TT 4 ) và 90 thể tích nước . Dung dịch thử: Phân tán một lượng chế phẩm tương ứng với khoảng 0,5 g ceftazidim trong 10 ml dung môi pha mẫu và thêm vừa đủ thành 100,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch đối chiếu: Lấy 1,0 ml dung dịch pyridin 0,025 % thêm 10,0 ml dung dịch đệm phosphat pH 7 , 0 (TT 4 ) và pha loãng thành 100,0 ml với nước . Dung dịch phân giải: Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 200,0 ml với dung môi pha mẫu. Lấy 1,0 ml dung dịch thu được, thêm 20,0 ml dung dịch đối chiếu và pha loãng thành 200,0 ml với dung môi pha mẫu. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 255 nm. Tốc độ dòng: 1,0ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Tiến hành s ắ c ký với dung dịch phân giải, phép thử chỉ có giá trị khi độ phân giải giữa các pic tương ứng với ceftazidim và pyridin tối thiểu là 7,0. Tiến hành sắc ký với dung dịch đối chiếu, điều chỉnh độ nhạy của hệ thống sao cho chiều cao của pic chính trên sắc ký đồ phải ít nhất bằng 50 % của thang đo. Tiến hành sắc ký lần lư ợ t với dung dịch thử và dung dịch đối chiếu, diện tích của pic tương ứng với pyridin trên sắc ký đồ của dung dịch thử không được lớn hơn 10 lần diện tích của pic pyridin thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,5 %). Natr i carbonat Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (Phụ lục 4.4, phương pháp 1). Dung dịch chuẩn gốc natr i 1000 µg/ml. Dung dịch kali clo ri d 4 %: Hòa tan 4 g kali clorid (TT) trong nước thành 100,0 ml. Chuẩn bị dãy chuẩn natri: Pha loãng 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc natr i 1000 µg/ml thành 100,0 ml bằng nước để được dung dịch natri có nồng độ 100 µg/ml. Tiến hành pha dãy chuẩn natri có các nồng độ 2,0 µg/ml; 4,0 µg/ml; 6,0 µg/ml và 8,0 µg/ml theo b ả ng sau: Nồng độ chuẩn natri (µg/ml) Dung dịch chu ẩ n natri 100 µg/ml (ml) Dung dịch kali clorid 4 % (ml) Nước vừa đủ (ml) 0 (Trắng) 0 10 100 2,0 2,0 10 100 4,0 4,0 10 100 6,0 6,0 10 100 8,0 8,0 10 100 Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột chế phẩm tương ứng với 100 mg ceftazidim vào bình định mức 100 ml, thêm 30 ml nước , lắc đ ể hòa tan, thêm nước đến định mức, lắc đều (dung d ị ch A). Pha loãng dung dịch A từng bước bằng nước để thu được dung dịch thử có nồng độ natri khoảng 4 µg/ml, thêm dung dịch kali clorid 4 % vào dung dịch cuối với tỷ lệ 1/10. Cách tiến hành: Sử dụng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử có trang b ị đèn cathod rỗng natri, đầu đốt sử dụng ngọn lửa acetylen - không khí nén. Tiến hành đo độ hấp thụ nguyên t ử của các dung dịch chuẩn và dung dịch thử tại vạch phổ cực đại của natri 589,0 nm. Từ độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn và dung dịch thử, lập đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ natri và tính nồng độ natri trong dung dịch thử dựa vào đường chuẩn. 1 mg natri tương ứng với 2,305 mg natri carbonat, Na 2 C O 3 . Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Hòa tan 4,26 g dinatri hydrophosphat (TT) và 2,73 g kali dihydrophosphat (TT) trong 980 ml nước, thêm 20 ml acetonitril (TT) . Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột chế phẩm tương ứng với 100 mg ceftazidim phân tán trong 10 ml pha động và thêm vừa đủ 100,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch chuẩn: Dung dịch ceftazidim chuẩn 0,1 % trong pha động. Dung dịch phân giải: Hòa tan 5,0 mg tạp chất A chuẩn của ceftazidim trong 5,0 ml dung dịch chuẩn. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (15 cm x 4,6 mm) được nhồi hexylsilyl silica gel dùng cho sắc ký (5 µm) . Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 245 nm. Tốc độ dòng: 2,0 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Kiểm tra t í nh phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký với dung dịch phân giải, điều chỉnh độ nhạy của hệ thống sao cho chiều cao của pic chính trên sắc ký đồ phải ít nhất bằng 50 % của thang đo. Phép thử ch ỉ có giá trị khi độ phân giải giữa pic tương ứng với ceftazidim và tạp chất A tối thiểu là 1,5. Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic đáp ứng từ 6 lần tiêm lặp lại không được lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch thử và dung dịch chuẩn. Tính hàm lượng ceftazidim, C 22 H 22 N 6 O 7 S 2 , trong chế phẩm dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 22 H 22 N 6 O 7 S 2 trong ceftazidim chuẩn. Bảo quản Chế ph ẩ m phải để ở nơi khô, tránh ánh sáng, ở nhiệt độ không quá 30 o C. Loại thuốc Kháng sinh. Hàm lượng thường dùng 500 mg; 1g, tính theo ceftazidim. NANG AMBROXOL HYDROCLORID Capsulae Ambroxoli hydrochloridi Là nang cứng chứa ambroxol hydroclorid. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Thuốc nang” (Phụ lục 1.13) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng ambroxol hydroclorid, C 1 3 H 18 Br 2 N 2 O.HC l , từ 95,0 % đến 105,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Tính chất Nang cứng nhẵn bóng, không méo m ó , bột thuốc bên trong đồng nhất. Định tính A. Trong phần Đ ị nh lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic ambroxol hydroclorid trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. B. Đo phổ h ấ p thụ tử ngoại (Phụ lục 4.1) của dung dị c h thử trong phần Độ hòa tan, phổ thu được có hai cực đại hấp thụ tại bước sóng 244 nm và 308 nm. Độ hòa tan Thiết bị: Kiểu giỏ quay. Môi trường hòa tan: 900 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 M ( TT ). Tốc độ quay: 100 r/min. Thời gian: 30 min. Cách tiến hành: Sau thời gian hòa tan quy định, lấy một phần dịch hòa tan, lọc. Pha loãng dịch lọc thu được với môi trường hòa tan để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 15 µg/ml. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) của dung dịch thu được ở bước sóng 244 nm, c ố c đo dày 1 cm, mẫu trắng là môi trường hòa tan. Tính hàm lượng ambroxol hydroclorid hòa tan trong mỗi nang dựa vào độ hấp thụ của dung dịch ambroxol hydroclorid chuẩn được pha trong môi trường hòa tan c ó nồng độ tương đương nồng độ ambroxol hydroclorid của dung dịch thử. Yêu cầu: Không ít hơn 80 % lượng ambroxol hydroclorid, C 13 H 1 8 Br 2 N 2 O.HC l , so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 30 min. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc k ý lỏng (Phụ lục 5.3) với pha động, điều kiện sắc ký như mô tả trong phần Định lượng. Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với 100 mg ambroxol hydroclorid vào b ì nh định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml pha động, lắc siêu âm để hòa tan, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc. Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng pha động. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch đối chiếu và dung dịch thử với thời gian gấp đôi thời gian lưu của pic chính. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử, tổng diện tích các pic phụ (không t í nh đến pic do dung môi) không được lớn hơn diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1,0 %). Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Acetonitr i l - dung dịch diamoni hydrophosphat 0,01 M được chỉnh đến pH 7,0 bằng acid phosphoric (50:50). Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 30 mg ambroxol hydroclorid chu ẩ n hòa tan trong pha động và thêm pha động vừa đủ 50,0 ml. Pha loãng 5,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml bằng pha động. Dung dịch thử: C â n 20 nang, tính khối lượng trung b ì nh của bột thuốc trong nang, trộn đều và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với khoảng 30 mg ambroxol hydroclorid vào bình định mức 50 ml, thêm 30 ml pha động, lắc kỹ để hòa tan và thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc. Pha loãng 5,0 ml dịch lọc thành 100,0 ml bằng pha động. Dung dịch phân giải: Hòa tan 10 mg ambroxol hydroclorid chuẩn trong 0,2 ml m ethanol (TT) , thêm 0,04 ml hỗn hợp formaldehyd - nước (1: 99). Đun nóng trong cách thủy ở 60 o C trong 30 min. Làm bay hơi đến khô dưới luồng khí nitrogen. Hòa tan cắn trong 5 ml nước và pha loãng thành 20,0 ml với pha động. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 248 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µI. Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký với dung dịch phân giải, thời gian lưu tương đối của pic sản phẩm phân hủy (tạp chất B) so với ambroxol (thời gian lưu khoảng 9 min) khoảng 0,6; độ phân gi ả i giữa pic tạp chất B và pic ambroxol không nhỏ hơn 4,0. Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng ambroxol hydroclorid có trong chế phẩm dựa vào diện tích pic của ambroxol hydroclorid trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 13 H 18 Br 2 N 2 O.HC l của ambroxol hydroclorid chuẩn. Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Thuốc long đờm. Hàm lượng thường dùng 30 mg. NANG CEFDINIR Capsulae Cefdiniri Là nang cứng chứa cefdinir. Chế ph ẩ m phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận "Thuốc nang" (Phụ lục 1.13) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng cefdinir, C 14 H 1 3 N 5 O 5 S 2 , từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính A. Phổ hấp thụ tử ngoại (Phụ lục 4.1). Dung dịch đệm: Chuẩn bị như phần Định lượng. Dung dịch đối chiếu: Hòa tan một lượng ce f dinir chuẩn trong dung dịch đệm để thu được dung dịch có nồng độ cefdinir khoảng 10 µg/ml. Dung dịch thử: Lấy một lượng bột th u ốc trong nang, hòa tan và pha loãng bằng dung dịch đệm để thu được dung dịch có nồng độ cefdinir khoảng 10 µg/ml, lọc. Cách tiến hành: Ghi phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thử và dung dịch đối chiếu trong dải sóng từ 220 nm đến 350 nm, cốc đo dày 1 cm, mẫu trắng là dung dịch đệm. Phổ hấp thụ t ử ngoại của dung dịch thử phải cho các cực đại và cực ti ể u hấp thụ tại các bước sóng tương tự như trên phổ của dung dịch đối chiếu. B. Trong phần Định lượng, pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử ph ả i có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic cefdinir trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Môi trường: 900 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8 (Trộn 250 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2 M (TT) với 112,0 ml dung dịch natri hydroxyd 0,2 N (CĐ) và thêm nước vừa đủ 1000 ml). Tốc độ quay: 50 r/min. Thời gian: 30 min. Cách tiến hành: Dung dịch thử: Sau thời gian hòa tan quy định, l ấ y một phần dịch hòa tan, lọc. Pha loãng dịch lọc với môi trường hòa tan (nếu cần) để thu được dung dịch có nồng độ cefdinir khoảng 10 µg/ml. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng cefdinir chuẩn, hòa tan và pha loãng bằng môi trường hòa tan để thu được dung dịch có nồng độ tương đương nồng độ của dung dịch thử. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) của dung dịch thử và dung dịch chuẩn ở bước sóng 290 nm, cốc đo dày 1 cm, mẫu trắng là môi trường hòa tan. Tính hàm lượng cefdinir, C 14 H 1 3 N 5 O 5 S 2 , hòa tan trong mỗi nang dựa vào độ hấp thụ của dung dịch thử, dung dịch cefdinir chuẩn và hàm lượng C 14 H 13 N 5 O 5 S 2 trong cefdinir chuẩn. Yêu cầu: Không ít hơn 80 % lượng cefdinir, C 14 H 13 N 5 O 5 S 2 , so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 30 min. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch A: Hòa tan 14,2 g dinatri hydrophosphat khan (TT) trong nước vừa đủ 1000 ml. Dung dịch B: Hòa tan 13,6 g kali dihydrophosphat (TT) trong nước vừa đủ 1000 ml. Dung dịch C: Pha loãng dung dịch tetramethylamoni hydroxyd (TT) bằng nước đ ể thu được dung dịch có nồng độ 0,1 %. Điều chỉnh đến pH 5,5 ± 0,1 bằng dung dịch acid phosphoric 10 % (TT) . Dung dịch D: Hòa tan 3,72 g natri edetat (TT) trong nước vừa đủ 100 ml. Dung dịch đệm: Trộn một tỷ lệ thích hợp dung dịch A và dung dịch B (khoảng 2: 1) để thu được dung dịch có pH 7,0. Pha động: Acetonitril - methanol - dung dịch C - dung dịch D (300: 200: 4500: 2), điều chỉnh tỷ lệ pha động nếu cần. Dung dịch phân giải: Hòa tan một lượng cefdinir chuẩn và tạp chất A chuẩn của cefdinir trong dung dịch đệm để thu được dung dịch có nồng độ cefdinir khoảng 0,2 mg/ml và tạp chất A khoảng 0,5 mg/ml. Dung dịch chuẩn: Hòa tan một lượng cefdinir chuẩn trong dung dịch đệm để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 0,2 mg/ml. Dung dịch thử: Cân 20 nang, xác định khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang, nghiền thành bột m ị n và trộn đều. Cân chính xác một lượng bột thuốc trong nang tương ứng với khoảng 100 mg cefdinir vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml dung dịch đệm và lắc siêu âm 30 min. Pha loãng bằng dung dịch đệm đến định mức, lắc đều, lọc. Hút chính xác 10,0 ml dịch lọc vào b ì nh định mức 50 ml, pha loãng bằng dung dịch đệm đến định mức, lắc đều. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (15 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Nhiệt độ cột: 40 o C. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min, có thể điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lưu của cefdinir khoảng 8 min. Thể tích tiêm: 5 µl. Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký đối với dung dịch phân giải và dung d ị ch chuẩn. Trên sắc ký đồ thu được, tạp chất A cho 4 pic: pic 1 và pic 2 rửa giải trước pic cefdinir, pic 3 và pic 4 rửa giải sau pic cefdinir. Phép thử chỉ có giá trị khi độ phân giải giữa pic 2 của tạp chất A và pic cefdinir không nh ỏ hơn 1,2; Hệ số đối xứng của pic cefdinir không lớn hơn 1,5; Độ lệch chuẩn tương đ ối của diện tích pic cefdinir trong các lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng cefdinir, C 1 4 H 13 N 5 O 5 S 2 , có trong nang dựa vào diện tích pic thu được từ dung dịch th ử , dung dịch chuẩn và hàm lượng cefdinir, C 14 H 13 N 5 O 5 S 2 có trong cefdinir chuẩn. Ghi chú: Tạp ch ấ t A: Hợp ch ấ t m ở vòng lacton của cefdinir. Bảo quản Trong đồ đựng kín. Để nơi khô mát, tránh ánh sáng. Loại thuốc Kháng sinh nhóm cephalosporin. Hàm lượng thường dùng 300 mg. NANG CEFPODOXIM Capsulae Cefpodoximi Là nang cứng chứa cefpodoxim proxetil. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Thuốc nang” (Phụ lục 1.13) và các yêu cầu sau: Hàm lượng cefpodoxim, C 15 H 17 N 5 O 6 S 2 , từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính Trong mục Định lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho 2 pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic cefpodoxim proxetil S -epimer và cefpodoxim proxetil R -epimer trên sắc ký đồ của dung dịch chu ẩ n. Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Môi trường hòa tan: Cân 54,5 g glycin (TT) , 42,6 g natri clorid (TT) và chuyển vào b ì nh định mức 1000 ml. Thêm kho ả ng 500 ml nước, lắc để hòa tan. Thêm cẩn thận, vừa thêm vừa lắc 14,2 ml acid hydrocloric (TT) , để nguội. Pha loãng vừa đ ủ đến vạch với nước . Pha lo ã ng 50 ml này thành 900 ml với nước để thu được dung dịch có pH 3,0 ± 0,1 [Điều chỉnh pH của môi trường hòa tan với dung dịch natri hydroxyd 1 M (TT) nếu cần ] . Tốc độ quay: 75 r/min. Thời gian: 30 min. Cách tiến hành: Dung dịch thử: Sau thời gian hòa tan quy định, hút dịch hòa tan, lọc, pha loãng bằng môi trường hòa tan, nếu cần. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng cefpodoxim chuẩn tương ứng với khoảng 25 mg cefpodoxim vào b ì nh định mức 50 ml, thêm 30 ml m ethanol (TT) và lắc để hòa tan, thêm m ethanol (TT) vừa đủ đến định mức, lắc đều. Pha loãng chính xác dung dịch thu được bằng môi trường hòa tan để thu được dung dịch có nồng độ cefpodoxim tương đương với nồng độ trong dung dịch thử. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) của dung d ị ch thử và dung dịch chuẩn ở bước sóng cực đại khoảng 259 nm, sử dụng cốc đo dày 1 cm, mẫu trắng là môi trường hòa tan. Yêu cầu: Không í t hơn 70 % lượng cefpodoxim, C 15 H 17 N 5 O 6 S 2 , được hòa tan trong 30 min. Nước (Phụ lục 10.3) Không được quá 5,0 %. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (phụ lục 5.3). Pha động: Dung dịch amoni acetat 0,02 M- acetonitril (6:4). Điều chỉnh tỷ lệ nếu cần. Dung môi pha mẫu: Nước - acetonitril (6: 4). Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng cefpodoxim proxetil chuẩn tương ứng với khoảng 50 mg cefpodoxim vào bình định mức 100 ml, thêm 10 ml m ethanol (TT) , lắc siêu âm khoảng 5 min để hòa tan. Thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều. Pha loãng 5,0 ml dung dịch này thành 100,0 ml v ớ i dung môi pha mẫu. Dung dịch thử: Cân 20 nang, xác định khối lượng trung b ì nh bột thuốc trong nang và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với 50 mg cefpodoxim vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm khoảng 10 min để hòa tan. Pha loãng với dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc. Pha loãng 5,0 ml dịch lọc thành 100,0 ml với dung môi pha mẫu. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm) Nhiệt độ cột: 30 o C. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 235 nm. Tốc độ dòng: 2,0 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn. Trên sắc ký đồ thu được, thời gian lưu tương đối của pic cefpodoxim proxetil S -epimer khoảng 0,9 và cefpodoxim proxetil R -epimer là 1,0; độ phân giải giữa hai pic này không nhỏ hơn 2,5. Hệ số đối xứng của pic cefpodoxim proxetil R -epimer không lớn hơn 1,5. Độ lệch chuẩn tương đối của tổng diện tích pic cefpodoxim proxetil S -epimer và cefpodoxim proxetil R -epimer từ 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng cefpodoxim, C 15 H 17 N 5 O 6 S 2 , có trong nang từ tổng diện tích pic cefpodoxim proxetil S -epimer và cefpodoxim proxetil R -pimer thu được trên sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 1 5 H 1 7 N 5 O 6 S 2 trong cefpodoxim proxetil chuẩn. Bảo quản Trong đ ồ đựng kín, nơi khô mát, tránh ánh sáng. Loại thuốc Kháng sinh nhóm cephalosporin. Hàm lượng thường dùng 100 mg; 200 mg tính theo cefpodoxim. NANG INDINAVIR Capsulae Indinaviri Là nang cứng chứa indinavir sulfat. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận "Thuốc nang" (Phụ lục 1.13) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng indinavir, C 36 H 47 N 5 O 4 , từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính A. Lắc một lượng bột thuốc tương ứng với khoảng 0,1 g indinavir sulfat v ớ i 80 ml nước để hòa tan. Pha loãng bằng n ướ c vừa đ ủ 100 ml và lọc. Pha loãng 5 ml dịch lọc thành 100 ml với nước . Phổ hấp thụ tử ngoại (Phụ lục 4.1) của dung dịch thu được ở dải sóng từ 200 nm đến 300 nm phải cho cực đại hấp thụ ở bước sóng khoảng 260 nm. B. Trong phần Định lượng, pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic indinavir trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Thiết bị : Kiểu cánh khuấy, sử dụng dụng cụ giữ mẫu. Môi trường hòa tan: 900 ml dung dịch đệm pH 3,8. Dung dịch đệm pH 3,8: Hòa tan 21 g acid citric (TT) trong 880 ml nước , điều chỉnh đến pH 3,8 ± 0,05 bằng dung dịch natri hydroxyd 50 % và pha loãng bằng nước vừa đủ 1000 ml, trộn đều. Tốc độ quay : 50 r/min. Thời gian: 30 min. Cách tiến hành: Sau thời gian hòa tan quy định, hút dịch hòa tan, lọc. Pha loãng dịch lọc với môi trường hòa tan (nếu cần) để thu được dung dịch có nồng độ indinavir phù hợp. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) của dung dịch thu được ở bước sóng hấp thụ cực đại khoảng 260 nm, cốc đo dày 1 cm, mẫu trắng là môi trường hòa tan. Tính hàm lượng indinavir, C 36 H 47 N 5 O 4 , hòa tan trong mỗi viên so sánh với dung dịch indinavir sulfat chuẩn có nồng độ indinavir tương đương trong dung dịch thử pha trong môi trường hòa tan. Yêu cầu: Không ít hơn 75 % lượng indinavir, C 36 H 47 N 5 O 4 , so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 30 min. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch đệm phosphat pH 7,5: Hòa tan 8,7 g dikali hydrophosphat (TT) trong 800 ml nước , điều chỉnh đến pH 7,5 ± 0,05 bằng dung dịch acid phosphoric loãng (TT) và pha loãng bằng nước vừa đ ủ 1000 ml. Pha động A: Dung dịch đệm phosphat pH 7,5. Pha động B: Acetonitril (TT) . Dung môi pha mẫu: Acetonitril - dung dịch đệm phosphat pH 7,5 (40: 60). Dung dịch đối chiếu: Cân ch í nh xác một lượng indinavir sulfat chuẩn, tương ứng với khoảng 50 mg indinavir, vào bình định mức 100 ml, thêm 80 ml dung môi pha mẫu và lắc kỹ đ ể hòa tan. Thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch và lắc đều. Pha loãng 1,0 ml dung dịch trên thành 100,0 ml bằng dung môi pha mẫu. Dung dịch thử: Trộn đều bột thuốc của không dưới 20 nang, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với kho ả ng 50 mg indinavir, vào bình định mức 100 ml, thêm 60 ml dung môi pha mẫu và lắc siêu âm 10 min. Thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều và lọc. Dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Cân chính xác một lượng indinavir sulfat chuẩn tương ứng với khoảng 50 mg indinavir và 5 mg indinavir 4-epimer chuẩn vào bình định mức 100 ml. Thêm 80 ml dung môi pha mẫu, lắc kỹ để hòa tan và pha loãng bằng dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (15 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 260 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) 0-3 80 20 3-5 80 → 65 20 → 35 5-11 65 35 11-17 65 → 30 35 → 70 17-20 30 70 20-21 30 → 80 70 → 20 21-25 80 20 Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký đối với dung dịch kiểm tra tính phù hợp hệ thống: số đĩa lý thuyết của cột tính trên pic indinavir không được dưới 10 000; hệ s ố đối xứng của pic indinavir không được quá 1,5; và độ phân giải giữa pic của indinavir và indinavir 4-epimer phải không dưới 1,5. Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch đối chiếu và dung dịch thử. Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử, ngoại trừ pic chính và các pic xuất hiện tương ứng trên sắc ký đ ồ của dung dịch đối chiếu, diện tích của bất kỳ pic nào khác đều không được lớn hơn 1,0 % và tổng diện tích của tất cả các pic đó không được lớn hơn 2,5 %, áp dụng theo phương pháp chuẩn hóa. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch đệm phosphat pH 7,5: Như mô tả ở mục Tạp chất liên quan. Pha động: Acetonitril - dung dịch đệm phosphat pH 7,5 (40: 60). Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng indinavir sulfat chuẩn, tương ứng với khoảng 50 mg indinavir vào bình định mức 50 ml, thêm 40 ml pha động và lắc kỹ để hòa tan. Thêm pha động vừa đ ủ đến vạch và lắc đều. Pha loãng 10,0 ml dung dịch trên thành 50,0 ml bằng pha động. Dung dịch thử: Lấy 20 nang, cân xác định khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với khoảng 100 mg indinavir vào bình định mức 100 ml, thêm 80 ml pha động và lắc siêu âm 10 min. Pha loãng bằng pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều và lọc. Pha loãng 10,0 ml dịch lọc thành 50,0 ml bằng pha động. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 260 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký 6 lần riêng biệt đối với dung dịch chuẩn, số đĩa lý thuyết của cột tính trên pic indinavir không được dưới 6000; hệ số đối xứng của pic indinavir không được lớn hơn 1,5; độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic indinavir không được lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng indinavir, C 36 H 47 N 5 O 4 , có trong một đơn vị chế phẩm dựa vào diện tích pic indinavir thu được từ dung dịch th ử , dung dịch chuẩn và hàm lượng C 36 H 47 N 5 O 4 trong indinavir sulfat chuẩn. Bảo quản Trong đồ đựng kín. Để nơi khô mát, tránh ánh sáng. Loại thuốc Kháng virus. Hàm lượng thường dùng 400 mg. NANG ITRACONAZOL Capsulae Itraconazoli Là nang cứng chứa itraconazol. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “ Thuốc nang ” (Phụ lục 1.13) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng itraconazol, C 35 H 38 CI 2 N 8 O 4 , từ 95,0 % đến 105,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính Trong mục Định lượng, pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic itraconazol trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Điều kiện sắc ký như mô tả trong phần Định lượng. Pha động A: Dung dịch tetrabutylamonihydrosulfat 0,02 M. Pha động B: Acetonitril (TT) . Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột viên, hòa tan với hỗn hợp methanol - tetrahydrofuran (4:1), pha loãng với cùng dung môi để thu được dung dịch có nồng độ itraconazol chính xác kho ả ng 2 mg/ml, lọc. Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử trong vừa đ ủ 200 ml hỗn hợp methanol - tetrahydrofuran (4:1). Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) 0 80 20 20 60 40 25 60 40 30 50 50 44 50 50 45 80 20 50 80 20 Tiến hành sắc ký với dung dịch đ ố i chiếu. Điều chỉnh độ nhạy của hệ thống sao cho chiều cao của pic chính trên sắc ký đồ thu được ít nhất bằng 20 % thang đo. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch đ ố i chiếu và dung dịch thử, với điều kiện sắc ký như mô tả, thời gian lưu của itraconazol khoảng 23 min. Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử không được có pic phụ nào có diện tích lớn hơn diện tích pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,5 %) và t ổ ng diện tích của tất cả các pic phụ không được lớn hơn 3 lần diện tích của pic chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1,5 %). B ỏ qua bất kỳ pic nào có diện tích nhỏ hơn 0,1 lần diện tích của pic chính của dung dịch đối chiếu. Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Thiết bị : Kiểu cánh khuấy. Môi trường hòa tan: 1000 ml dung dịch acid hydroclor i c 0,1 M (TT). Tốc độ quay: 75 r/min. Thời gian: 45 min. Cách tiến hành: Dung dịch thử: Sau thời gian hòa tan quy định, hút dịch hòa tan, lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu. Lấy 5,0 ml dịch lọc thu được, pha loãng với hỗn hợp methanol - môi trường hòa tan (5: 95) vừa đủ 25 ml. Dung dịch chuẩn: Hòa tan khoảng 20 mg itraconazol chuẩn trong 40 ml m ethanol (TT) , làm ấm trong cách thủy ở 40 o C, lắc để hòa tan. Để nguội, pha loãng với môi trường hòa tan vừa đủ 200 ml. Lấy 5,0 ml dịch thu được, pha loãng với môi trường hòa tan vừa đủ 25 ml. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) của dung dịch thử, dung dịch chuẩn ở bước sóng 255 nm, cốc đo dày 1 cm, mẫu trắng là hỗn hợp methanol - môi trường hòa tan (5: 95). T í nh hàm lượng itraconazol, hòa tan trong mỗi nang dựa vào độ hấp thụ của dung dịch th ử , dung dịch chuẩn và hàm lượng C 35 H 38 C 1 2 N 8 O 4 trong itraconazol chuẩn. Yêu cầu: Không ít hơn 80 % lượng itraconazol, C 35 H 38 O 2 N 8 O 4 , so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 45 min. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Acetonitril - dung dịch tetrabutylamoni hydrosulfat 0,02 M (40: 60). Dung dịch thử: Cân 20 nang, t í nh khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang, nghiền mịn. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với 50 mg itraconazol vào bình định mức 250 ml, hòa tan bằng cách lắc siêu âm với hỗn hợp methanol - tetrahydrofuran (4:1). Để nguội và pha loãng với cùng dung môi đến vạch, lắc kỹ và lọc. Dung dịch chuẩn: Hòa tan một lượng cân chính xác itraconazol chuẩn trong hỗn hợp methanol - tetrahydrofuran (4:1) bằng cách lắc siêu âm. pha loãng với cùng dung môi để thu được dung dịch có nồng độ itraconazol chính xác khoảng 0,2 mg/ml. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (3 µm). Detector quang phổ t ử ngoại đặt tại bước sóng 225 nm. Tốc độ dòng: 1,5 ml/min. Thể tích tiêm: 10 µl. Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký 6 lần riêng biệt đối với dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic itraconazol không được lớn hơn 2,0 %, s ố đĩa lý thuyết của cột không được nhỏ hơn 3000. Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung dịch thử: T í nh hàm lượng itraconazol, C 35 H 38 C l 2 N 8 O 4 , có trong một đơn vị chế phẩm dựa vào diện tích pic thu được từ dung dịch thử, dung dịch chu ẩ n và hàm lượng C 35 H 38 C 1 2 N 8 O 4 trong itraconazol chuẩn. Bảo quản Trong đồ đựng k í n, tránh ẩm và ánh sáng, nhiệt độ không quá 30 o C. Loại thuốc Thuốc chống nấm. Hàm lượng thường dùng 100 mg. NANG MỀM CALCITRIOL Molles capsulae calcitrioli Là nang mềm chứa dung dịch calcitriol trong dầu không bay hơi. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Thuốc nang” (Phụ lục 1.13) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng calcitriol, C 27 H 44 O 3 , từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Tính chất Nang mềm, màu đồng nhất, bên trong đựng dung dịch trong dầu trong suốt. Định tính Trong phần Định lượng, trên sắc ký đồ của dung dịch thử ph ả i cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic calcitriol của dung dịch chuẩn. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: hexan - tetrahydrofuran - ethanol (59: 40:1). Dung dịch thử: Trộn đều dung dịch thuốc trong nang của ít nhất 20 nang. Cân ch í nh xác một lượng dung dịch thuốc trong nang tương ứng với 5 µg calcitriol và chuyển vào bình định mức nâu dung tích 10 ml, thêm pha động vừa đ ủ và lắc đều. Dung dịch chuẩn: Dung dịch 0,5 µg/ml của calcitriol chuẩn trong pha động. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh A (5 µm) (Lichrosorb S i 60 là thích hợp). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 265 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 100 µI. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký l ầ n lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng calcitriol, C 27 H 44 O 3 , trong nang dựa vào diện tích pic calcitriol thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 27 H 44 O 3 của calcitriol chuẩn. Bảo quản Trong bao gói kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Vitamin D. Hàm lượng thường dùng 0,25 µg; 0,5 µg. NANG OSELTAMIVIR Capsulea Oseltamiviri Là nang cứng chứa oseltamivir phosphat. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “ Thuốc nang ” mục (1.13) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng oseltamivir, C 16 H 2 8 N 2 O 4 , từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính A. Sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) Bản m ỏ ng: Silica gel GF 254 . Dung môi khai triển: Methanol - ethyl acetat - toluen - amoniac (8: 6: 4: 2). Dung dịch thử: Lắc một lượng bột thuốc trong nang tương ứng với khoảng 15 mg oseltamivir với 10 ml m ethanol (TT) , lọc. Dung dịch đối chiếu: Hòa tan khoảng 20 mg oseltamivir phosphat chuẩn trong 10 ml m ethanol (TT) . Cách tiến hành: Chấm 10 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu lên bản mỏng. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 3/4 bản m ỏ ng. Lấy bản mỏng ra, để khô ngoài không kh í . Soi bản m ỏ ng dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Trên sắc ký đồ thu được, vết chính của dung dịch thử phải có cùng vị tr í , hình dạng và kích thước với vết của dung dịch đ ố i chiếu. B. Trong phần Định lượng, pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic oseltamivir trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Môi trường hòa tan: 900 ml acid hydrocloric 0,1 M (TT) Tốc độ quay : 50 r/min. Thời gian: 20 min. Cách tiến hành: Sau thời gian hòa tan quy định, lấy một phần dịch hòa tan, lọc. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) của dung dịch thu được ở bước sóng có hấp thụ cực đại khoảng 240 nm, c ố c đo dày 1 cm, mẫu trắng là môi trường hòa tan. Tính hàm lượng oseltamivir C 16 H 28 N 2 O 4 , hòa tan từ mỗi nang dựa vào độ hấp thụ của dung dịch oseltam i vir phosphat chuẩn có nồng độ tương đương pha trong cùng dung môi. Yêu cầu: Không ít hơn 75 % hàm lượng oseltamivir C 16 H 28 N 2 O 4 so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 20 min. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký l ỏ ng (Phụ lục 5.3). Pha động, điều kiện sắc ký như mô tả ở phần Định lượng. Dung dịch đối chiếu: Dung dịch chuẩn ở phần Định lượng. Dung dịch thử: Dung dịch thử ở phần Định lượng. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký dung dịch đối chiếu và dung dịch thử. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử, nếu xuất hiện các pic tạp chất thì tỷ lệ phần trăm của mỗi tạp chất được tính theo công thức sau: Trong đó: A c Diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu; A i Diện tích pic tạp chất trên sắc ký đồ của dung dịch thử; m c Lượng cân oseltamivir phosphat chuẩn ở phần Định lượng (mg); m t Lượng cân của mẫu thử ở phần Định lượng (mg); a Hàm lượng của oseltamivir phosphat chuẩn (%); M Khối lượng trung b ì nh của bột thuốc trong nang (mg); L Lượng oseltamivir ghi trên nhãn (mg). 312,4; 410,4: Phân t ử lượng của oseltamivir và oseltamivir phosphat. F Hệ số đáp ứng tương đ ố i (trong Bảng 1). B ả ng 1: Thời gian lưu, hệ số đáp ứng tương đối và giới hạn của các tạp chất Thời gian lưu tương đối Hệ số đáp ứng tương đối F Giới hạn tối đa cho phép (%) Tạp ch ấ t A a 0,18 1,4 2,0 Tạp chất B b 0,49 2,7 0,3 Oseltamivir 1,00 1,0 - Tạp chất C c 1,45 0,9 0,5 Tạp đơn chưa xác định 1 , 0 0,2 Tổng tạp đơn chưa xác định 1,0 0,5 Tổng tạp chất 1,0 3,0 a : (3R,4R,5S)-4-Acetylamino-5-amino-3-(1-ethylpropoxy0-1-cyclohexen-1-carboxylic acid. b : 4-Acetylamino-3-hydroxybenzoic acid ethyl ester. c :((3R,4R,5S)-4-Amino-5-acetylamino-3-(1-ethylpropoxy)-1 - cyclohexen-1-carboxylic a ci d ethyl ester. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch đệm phosphat pH 6,0: Hòa tan 6,8 g kali dihydrophosphat (TT) trong 980 ml nước , điều chỉnh đến pH 6,0 bằng dung dịch kali hydroxyd 1 M (TT) . Thêm nước vừa đủ 1000 ml. Pha động: Acetonitril - methanol - dung dịch đệm phosphat pH 6,0 (135: 245: 620). Hỗn hợp dung môi: Acetonitr i l - methanol - acid phosphoric 0,01 N (135: 245: 620). Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng oseltamivir phosphat chuẩn tương ứng với 50 mg oseltamivir, hòa tan bằng hỗn hợp dung môi và pha loãng thành 50,0 ml với cùng dung môi. Dung dịch thử: Cân 20 nang, tính khối lượng trung bình của bột thuốc trong nang và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với khoảng 100 mg oseltamivir vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 40 ml hỗn hợp dung môi và lắc siêu âm 20 min. Để nguội và thêm hỗn hợp dung môi vừa đ ủ đến vạch, l ắ c đều, ly tâm ở t ố c độ 3000 r/min trong 5 min lấy dịch trong. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 207 nm. Tốc độ dòng: 1,2 ml/min. Nhiệt độ cột: 50 o C. Thể tích tiêm: 15 µl. Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký 6 lần riêng biệt đối với dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic oseltamivir không được lớn hơn 2,0 %. Hệ số đối xứng không lớn hơn 2,0 Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng oseltamivir, C 16 H 28 N 2 O 4 , có trong một đơn v ị chế phẩm dựa vào diện tích pic thu được từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng oseltamivir C 16 H 28 N 2 O 6 có trong oseltamivir phosphat chuẩn. Bảo quản Trong đồ đựng k í n. Để nơi khô mát, nhiệt độ không qu á 30 o C, tr á nh ánh sáng. Loại thuốc Kháng virus cúm A. Hàm lượng thường dùng 45 mg, 75 mg và 150 mg. NANG TAN TRONG RUỘT ESOMEPRAZOL Capsulae Esomeprazoli Là nang cứng chứa các vi hạt được bao tan trong ruột có chứa esomeprazol magnesi. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Thuốc nang” (Phụ lục 1.13) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng esomeprazol, C 17 H 19 N 3 O 3 S, từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nh ã n. Định tính Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch đệm phosphat pH 6,0: Dung dịch chứa dinatri hydrophosphat dihydrat 2,66 % và natri dihydrophosphat monohydrat 5,52 %. Pha động: Trộn 150 ml acetonitril (TT) với 85 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,0 và pha loãng bằng nước thành 1000 ml. Dung môi pha mẫu: Hòa tan 5,24 g natri phosphat tribasic (TT) trong nước , thêm 110 ml dung dịch dinatri hydrophosphat 0,5 M và thêm nước vừa đ ủ 1000 ml. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 20 mg omeprazol chuẩn vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml ethanol 96 % (TT) và lắc kỹ đ ể hòa tan, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều. Hút 10 ml dung dịch thu được vào bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch, lắc đều. Dung dịch thử: Cân một lượng thuốc trong nang tương ứng với 20 mg esomeprazol vào bình định mức 200 ml, thêm 120 ml dung môi pha mẫu và lắc khoảng 20 min để hòa tan vi hạt, lắc siêu âm thêm vài phút nếu cần để hòa tan hoàn toàn. Thêm 40 ml ethanol 96 % (TT) và lắc siêu âm vài phút. Để nguội và thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, lọc. Pha loãng 10 m l dịch lọc thành 100 m l bằng nước , lắc đều. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (10 cm x 4 mm) được nhồi các hạt silica hình cầu có gắn α 1 - racid glycoprotein (5 µm) (Loại cột tương tự L41 của dược điển Mỹ). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 302 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µL . Cách tiến hành: Tiến hành s ắ c ký với dung dịch chuẩn. Thứ tự rửa gi ả i: pic đồng phân R ra trước, pic esomeprazol đồng phân S ) ra sau. Phép thử ch ỉ có giá trị khi độ phân giải giữa các pic của hai đồng phân không nhỏ hơn 1,0. Tiến hành sắc ký với dung dịch thử. Tính tỉ số giữa thời gian lưu của pic esomeprazol thu được từ dung dịch thử và dung dịch chuẩn. Tỉ số này phải nằm trong khoảng từ 0,98 đến 1,02. Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Giai đoạn trong môi trường acid Môi trường hòa tan: 300 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) . Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Tốc độ quay: 100 r/min. Thời gian: 2 h. Giai đoạn trong môi trường đệm Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Môi trường hòa tan: 1000 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8. Sau 2 h thử trong môi trường acid, tiếp tục thử trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 như sau: Thêm 700 ml dung dịch dinatri hydrophosphat 0,086 M vào mỗi bình thử. Điều chỉnh đến pH 6,8 ± 0,05 bằng dung dịch acid hydrocloric 2 M (TT) hoặc dung dịch natri hydroxyd 2 M (TT) . Tốc độ quay: 100 r/min. Thời gian: 30 min. Cách tiến hành: Xác định lượng esomeprazol hòa tan bằng phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch đệm phosphat pH 6,8: Thêm 300 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) vào 700 ml dung dịch dinatri hydrophosphat 0,086 M , điều chỉnh đến pH 6,8 ± 0,05 bằng dung dịch acid hydrocloric 2 M (TT) hoặc dung dịch natri hydroxyd 2 M (TT) . Pha động và điều kiện sắc ký: Thực hiện như mô tả trong phần Định lượng. Dung dịch chuẩn: H ò a tan chính xác một lượng omeprazol chuẩn trong ethanol 96 % (TT) để được dung dịch có nồng độ khoảng 2 mg/ml. Tiếp tục pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat pH 6,8 để được dung dịch có nồng độ L/ 1000 mg/ml (L là hàm lượng ghi trên nhãn mg/viên). Thêm ngay 2,0 ml dung dịch n atr i hydroxyd 0,25 M vào 10,0 ml dung dịch này, lắc đều. Lưu ý, không để dung dịch lâu trước khi thêm dung dịch natri hydroxyd. Dung dịch thử: Sau 30 min trong môi trư ờ ng đệm pH 6,8, hút dịch hòa tan, lọc. Hút 5,0 ml dịch lọc thu được vào trong một ống nghiệm có chứa sẵn 1,0 ml dung dịch natr i hydroxyd 0,25 M . Lắc đều. Tránh ánh s á ng. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử . Tính lượng esomeprazol hòa tan từ mỗi nang dựa vào diện tích pic esomeprazol trên sắc ký đồ của dung dịch thử, diện tích pic omeprazol trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và từ hàm lượng của C 17 H 19 N 3 O 3 S trong omeprazol chuẩn. Yêu cầu: Không ít hơn 75 % (Q) lượng esomeprazol, C 17 H 19 N 3 O 3 S, so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong cả hai giai đoạn (Phụ lục 11.4, mục 4.3). Tạp chất liên quan Phương ph á p sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung môi pha mẫu: Như mô t ả trong phần Định lượng. Dung dịch đệm phosphat pH 7,6: Trộn 5,2 ml dung dịch natri dihydrophosphat 1,0 M với 63 ml dung dịch dinatri hydrophosphat 0,5 M và pha loãng với nước thành 1000 ml. Pha động A: Trộn 100 ml acetonitril (TT) với 100 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,6 và pha loãng với nước th à nh 1000 ml. Pha động B: Trộn 800 ml acetonitril (TT) với 10 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,6 và pha loãng với nước thành 1000 ml. Dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Hòa tan một lượng omeprazol chuẩn và omeprazol sulfon chuẩn trong m ethanol (TT) để được dung dịch có nồng độ mỗi chất khoảng 1 mg/ml. Hút 1,0 ml dung dịch thu được vào bình định mức 100 ml, thêm hỗn hợp dung môi pha mẫu - nước (1: 4) đến vạch, lắc đều. Tiếp tục pha loãng 1,0 ml dung dịch này thành 10,0 ml bằng cùng hỗn hợp dung môi. Dung dịch thử: Lấy các vi hạt trong 20 nang và nghiền thành bột. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với khoảng 20 mg esomeprazol vào bình định mức 200 ml, thêm 20 ml m ethanol (TT) và lắc 30 s. Thêm 40 ml dung môi pha mẫu, lắc tay 30 s và lắc siêu âm vài phút. Để nguội và thêm nước đến định mức, lắc đều, lọc. Lưu ý, dung dịch ổn định trong vòng 3 h nếu bảo quản tránh ánh sáng. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (10 cm x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh C (3 µm). Detector quang phổ t ử ngoại đặt ở bước sóng 302 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) 0-10 100 → 80 0 → 20 10-30 80 → 0 20 → 100 30-31 0 → 100 100 → 0 31 -45 100 0 Tiến hành sắc ký với dung dịch thử tính phù hợp của hệ thống, thời gian lưu tương đối của omeprazol sulfon so với omeprazol là 0,93. Phép thử chỉ c ó giá trị khi độ phân giải giữa pic omeprazol sulfon và pic omeprazol không nh ỏ hơn 2,5. Tiến hành sắc ký với dung dịch thử. Tính hàm lượng từng tạp chất dựa vào diện tích pic tạp ch ấ t (nếu có) trên sắc ký đồ của dung dịch thử so với tổng diện tích các pic đáp ứng trên sắc đồ của dung dịch thử. Giới hạn: Omeprazol sunfon không được quá 0,5 %; các tạp chất khác mỗi loại không được quá 0,2 %; tổng các tạp chất không được quá 2,0 %. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch đệm phosphat pH 7,3: Trộn 10,5 ml dung dịch natri dihydrophosphat 1 M với 60 ml dung dịch dinatri hydrophosphat 0,5 M và pha loãng với nước thành 1000 ml. Pha động: Trộn 350 ml acetonitril (TT) với 500 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,3 và pha loãng bằng nước thành 1000 ml. Dung môi pha mẫu: Hòa tan 5,24 g natri phosphat tribasic (TT) trong nước , thêm 110 ml dung dịch dinatri hydrophosphat 0,5 M và thêm nước vừa đủ 1000 ml. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg omeprazol chuẩn vào bình định mức 250 ml, hòa tan bằng 10 ml ethanol 96 % (TT) , thêm 40 ml dung môi pha mẫu và pha loãng bằng nước đến định mức, lắc đều. Dung dịch này có nồng độ omeprazol khoảng 0,04 mg/ml. Dung dịch thử: Cân 20 nang, t í nh khối lượng trung b ì nh của thuốc trong nang và trộn đều. Cân một lượng thuốc tương ứng 20 mg esomeprazol vào bình định mức 100 ml, thêm 60 ml dung môi pha mẫu, lắc khoảng 20 min để hòa tan các vi hạt, lắc siêu âm thêm vài phút nếu cần để hòa tan hoàn toàn. Thêm 20 ml ethanol 96 % (TT) lắc siêu âm vài phút, Để nguội và thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, lọc. Hút 10,0 ml dịch lọc vào bình định mức 50 ml và thêm nước tới vạch, lắc đều. Bảo quản dung dịch tránh á nh sáng. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (15 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µ m). Detector quang phổ t ử ngoại đặt ở bước sóng 302 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µ l. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic omeprazol trên sắc ký đồ thu được trong 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. T í nh hàm lượng esomeprazol, C 17 H 19 N 3 O 3 S, dựa vào diện tích pic esomeprazol thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, diện tích pic omeprazol thu được trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và hàm lượng C 17 H 19 N 3 O 3 S trong omeprazol chuẩn. Bảo quản Trong bao bì kín, để nơi khô mát, tránh ánh sáng. Loại thuốc Thuốc chống loét dạ dày, tá tràng, ức chế bơm proton. Hàm lượng thường dùng 20 mg, 40 mg. VIÊN NÉN AMBROXOL HYDROCLORID Tabellae Ambroxoli hydrochloridi Là viên nén chứa ambroxol hydroclorid. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Thuốc viên nén” (Phụ lục 1.20) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng ambroxol hydroclorid, C 13 H 18 Br 2 N 2 O .HC l, từ 95,0 % đến 105,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính A. Trong phần Định lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử ph ả i cho pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic ambroxol hydroclorid trên sắc ký đồ của dung dịch chu ẩ n. B. Đo phổ hấp thụ tử ngoại (Phụ lục 4.1) của dung dịch thử ở mục Độ hòa tan, phổ thu được có hai cực đại hấp thụ tại bước sóng 244 nm và 308 nm. Độ hòa tan Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Môi trường hòa tan: 900 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) . Tốc độ quay: 75 r/min. Thời gian: 30 min. Cách tiến hành: Sau thời gian hòa tan quy định, lấy một phần dịch hòa tan, lọc. Pha loãng dịch lọc thu được với môi trường hòa tan để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 15 µ g/ml. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) của dung dịch thu được ở bước sóng 244 nm, cốc đo dày 1 cm, mẫu trắng là môi trường hòa tan. Tính hàm lượng ambroxol hydroclorid hòa tan trong mỗi viên dựa vào độ hấp thụ của dung dịch ambroxol hydroclorid chuẩn được pha trong môi trường hòa tan có nồng độ tương đương nồng độ ambroxol hydroclorid của dung dịch thử. Yêu cầu: Không ít hơn 75 % lượng ambroxol hydroclorid, C 13 H 18 Br 2 N 2 O .HC l , so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 30 min. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) với pha động, điều kiện sắc ký như mô tả ở mục Định lượng. Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với 100 mg ambroxol hydroclorid vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml pha động, lắc siêu âm để hòa tan, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc. Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng pha động. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch đối chiếu và dung dịch thử với thời gian gấp 2 lần thời gian lưu của pic chính. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử, tổng diện tích các pic phụ (không t í nh đến pic do dung môi) không được lớn hơn diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1,0 %). Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha độn g: Acetonitril - dung dịch diamoni hydrophosphat 0,01 M được chỉnh đến pH 7,0 bằng acid phosphoric (50:50). Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 30 mg ambroxol hydroclorid chuẩn hòa tan trong pha động và thêm pha động vừa đủ 50,0 ml. Pha loãng 5,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml bằng pha động. Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 30 mg ambroxol hydroclorid vào bình định mức 50 ml, thêm 30 ml pha động, lắc kỹ để hòa tan và thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc. Pha loãng 5,0 ml dịch lọc thành 100,0 ml bằng pha động. Dung dịch phân giải: Hòa tan 10 mg ambroxol hydroclorid chuẩn trong 0,2 ml m ethanol (TT) , thêm 0,04 ml hỗn hợp formaldehyd - nước (1: 99). Làm nóng ở 60 o C trong 30 min. Làm bay hơi đến khô dưới luồng khí nitrogen. Hòa tan cắn trong 5 ml nước và pha loãng thành 20,0 ml với pha động. Điều kiện sắc k ý: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µ m). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 248 nm. Tốc độ dòng: 1,0ml/min. Thể tích tiêm: 20 µ l Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký với dung dịch phân giải, thời gian lưu tương đ ố i của pic sản phẩm phân hủy (tạp chất B) so với ambroxol (thời gian lưu khoảng 9 min) khoảng 0,6; độ phân giải giữa pic tạp chất B và pic ambroxol không nh ỏ hơn 4,0. Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng ambroxol hydroclorid có trong chế phẩm dựa vào diện tích pic của ambroxol hydroclorid trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 1 3 H 18 Br 2 N 2 O.HC l của ambroxol hydroclorid chuẩn. Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Thuốc long đờm. Hàm lượ n g thường dùng 30 mg. VIÊN NÉN ATORVASTATIN Tabellae Atorvastatini Là viên nén hoặc viên nén bao phim chứa atorvastatin. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Thuốc viên nén” (Phụ lục 1.20) và các yêu cầu sau: Hàm lượng atorvastatin, C 33 H 35 FN 2 O 5 , từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính A. Lấy lượng bột viên tương ứng 10 mg atorvastatin, thêm 50 ml m ethanol (TT) , lắc kỹ, ly tâm. Lấy 2,5 ml dịch trong pha loãng với m ethanol (TT) vừa đủ 50 ml. Phổ hấp thu tử ngoại (Phụ lục 4.1) của dung dịch thu được phải có cực đại trong khoảng bước sóng từ 244 nm đến 248 nm. B. Trong phần Định lượng, pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic atorvastatin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Môi trường hòa tan: 900 ml nước . Tốc độ quay: 75 r/min. Thời gian: 30 min. Cách tiến hành: Dung dịch thử: Sau thời gian hòa tan quy định, lấy dịch hòa tan, lọc. Pha loãng dịch lọc với nước nếu cần để được dung dịch có nồng độ atorvastatin khoảng 6 µg/ml. Dung dịch chuẩn: Cân ch í nh xác một lượng atorvastatin calci chuẩn tương tương với 30 mg atorvastatin, hòa tan trong 100,0 ml m ethanol (TT) . Hút chính xác 5 ml dung dịch thu được và pha loãng thành 250,0 ml bằng nước . Định lượng dược chất hòa tan bằng phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) với pha động, điều kiện sắc ký tương tự phần Định lượng. Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính lượng atorvastatin, C 33 H 35 FN 2 O 5 , trong mỗi viên đã hòa tan dựa vào vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 33 H 35 FN 2 O 5 trong atorvastatin calci chuẩn. Yêu cầu: Không được ít hơn 75 % lượng atorvastatin, C 33 H 35 FN 2 O 5 , so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 30 min. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động A: Acetonitr i l - tetrahydrofuran (92,5: 7,5). Pha động B: Dung dịch amoni dihydrophosphat 0,05 M- pha động A (58:42). Pha động C: Dung dịch amoni dihydrophosphat 0,05 M- pha động A - methanol (20: 20: 60). Hỗn hợp dung môi: Acetonitr i l - nước (40: 60). Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng 50 mg atorvastatin, hòa trong 10 ml m ethanol (TT) , thêm 20 ml hỗn hợp dung môi, lắc siêu âm để hòa tan (nếu cần), thêm hỗn hợp dung môi vừa đủ 100,0 ml. Lọc. Dung dịch đối chiếu (1): Cân chính xác một lượng atorvastatin calci chuẩn tương đ ư ơng với 25 mg atorvastatin, hòa tan trong 5 ml m ethanol (TT) và pha loãng thành 50,0 ml bằng hỗn hợp dung môi. Dung dịch đối chiếu (2): Pha loãng 1,0 ml dung dịch đối chiếu (1) thành 100,0 ml bằng hỗn hợp dung môi. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm), nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 246 nm. Thể tích tiêm: 20 µl. Thời gian chờ tiêm: 10 min. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với chương trình dung môi như sau: Thời gian (min) Tốc độ dòng (ml/min) Pha động B (% tt/tt) Pha động C (% tt/tt) 0-20 1,8 100 0 20- 35 1,8 100 → 25 0 → 75 35-40 1 , 5 25 75 40-55 1,5 25 → 0 75 → 100 55-60 1,8 0 → 100 100 → 0 Tiêm dung dịch đối chiếu (1). Phép thử có giá trị khi hiệu lực cột không í t hơn 5000 đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng của pic atorvastatin không lớn hơn 1,5. Tiêm dung dịch đối chiếu (2) và dung dịch thử. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử, diện tích của bất cứ pic phụ nào cũng không được lớn hơn diện tích của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (1,0 %) và tổng diện tích của tất cả các pic phụ không được lớn hơn 4 lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (4,0 %). Bỏ qua các pic có diện tích nhỏ hơn 0,05 lần diện tích của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2) (0,05 %). Độ đồng đều hàm lượng (Phụ lục 11.2) Áp dụng đối với viên có hàm lượng atovastatin bằng hoặc nhỏ hơn 10 mg. Xác định hàm lượng atorvastatin trong mỗi viên bằng phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) với pha động, dung dịch chuẩn, điều kiện sắc ký tương tự trong phần Định lượng. Dung dịch thử: Cho một viên vào bình định mức 50 ml, thêm 3 ml nước , để viên rã và phân tán trong nước , thêm 20 ml m ethanol (TT) , lắc siêu âm, thêm m ethanol (TT) đến vạch, lắc đều và lọc. Pha loãng 10,0 ml dịch lọc thành 25,0 ml bằng dung môi pha mẫu. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động A: Acetonitr i l - tetrahydrofuran (92,5: 7,5). Dung dịch đệm: Hòa tan 1,54 g amoni acetat (TT) trong 1000 ml nước , điều chỉnh đến pH 4,0 bằng acid acetic (TT) . Pha động: Dung dịch đệm - pha động A (50: 50). Dung môi pha mẫu: Hòa tan 6,8 g kali dihydrophosphat (TT) và 0,9 g natri hydroxyd (TT) trong 1000 ml nước , điều chỉnh pH dung dịch đến 6,8 bằng acid phosphoric (TT) hoặc dung dịch natri hydroxyd 0,2 M (TT) . Dung dịch thử: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng 40 mg atorvastatin cho vào bình định mức 50 ml, thêm 40 ml m ethanol (TT) , lắc kỹ, siêu âm để hòa tan, để nguội, thêm m ethanol (TT) vừa đủ đến vạch. Lọc. Pha loãng 5,0 ml dịch lọc thành 50,0 ml bằng dung môi pha mẫu. Dung dịch chuẩn: Cân một lượng atorvastatin calci chuẩn tương đương với 40 mg atorvastatin cho vào bình định mức 50 ml, hòa tan trong m ethanol (TT) vừa đủ đến vạch, lấy 5,0 ml dung dịch thu được pha loãng thành 50,0 ml bằng dung môi pha mẫu. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm), nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ t ử ngoại đặt ở bước sóng 246 nm. Tốc độ dòng: 2 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Tiêm dung dịch chuẩn. Phép thử có giá trị khi hiệu lực cột không nhỏ hơn 2000 đĩa lý thuyết, hệ số đ ố i xứng không lớn hơn 1,5; độ lệch chuẩn tương đối của pic atorvastatin không lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch chu ẩ n và dung dịch thử. Tính hàm lượng atorvastatin, C 33 H 35 FN 2 O 5 , trong chế phẩm dựa vào vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 33 H 35 FN 2 O 5 trong atorvastatin calci chuẩn. Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng, để nơi khô mát hoặc ở nhiệt độ phòng. Loại thuốc Chống tăng lipid máu. Hàm lượng thường dùng 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg. VIÊN NÉN BAO TAN TRONG RUỘT ESOMEPRAZOL Tabellae Esomeprazoli Là viên nén bao tan trong ruột có chứa esomeprazol magnesi. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Thuốc viên nén ” (Phụ lục 1.20) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng esomeprazol, C 17 H 19 N 3 O 3 S, từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch đệm phosphat pH 6,0: Dung dịch chứa dinatri hydrophosphat dihydrat 2,66 % và natri dihydrophosphat monohydrat 5,52 %. Pha động: Trộn 150 ml acetonitril (TT) với 85 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,0 và pha loãng bằng nước thành 1000 ml. Dung môi pha mẫu: Hòa tan 5,24 g natri phosphat tribasic (TT) trong nước , thêm 110 ml dung dịch dinatri hydrophosphat 0,5 M và thêm nước vừa đủ 1000 ml. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 20 mg omeprazol chuẩn vào bình định mức 100 ml, thêm 20 ml ethanol 96 % (TT) và lắc kỹ đ ể hòa tan, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều. Hút 10 ml dung dịch thu được vào bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch, lắc đều. Dung dịch thử: Cân một lượng bột viên tương ứng với 20 mg esomeprazol vào bình định mức 200 ml, thêm 120 ml dung môi pha mẫu và lắc khoảng 20 min để hòa tan vi hạt, lắc siêu âm thêm vài phút nếu cần để hòa tan hoàn toàn. Thêm 40 ml ethanol 96 % (TT) và lắc siêu âm vài phút. Để nguội và thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, lọc. Pha loãng 10 ml dịch lọc thành 100 ml bằng nước , lắc đều. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (10 cm x 4 mm) được nhồi các hạt silica hình cầu có gắn α 1 -acid glycoprotein (5 µm) (Loại cột tương tự L41 của dược điển Mỹ). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 302 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn. Thứ tự rửa giải: pic đồng phân R ra trước, pic esomeprazol (đồng phân S ) ra sau. Phép thử chỉ có giá trị khi độ phân giải giữa các pic của hai đồng phân không nhỏ hơn 1,0. Tiến hành sắc ký với dung dịch thử. Tính tỉ số giữa thời gian lưu của pic esomeprazol thu được từ dung dịch thử và dung dịch chuẩn. Tỉ số này phải nằm trong khoảng từ 0,98 đến 1,02. Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Giai đoạn trong môi trường acid M ô i trường hòa tan: 300 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) . Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Tốc độ quay: 100 r/min. Thời gian: 2 h. Giai đoạn trong môi tr ường đệm Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Môi trường hòa tan: Dung dịch đệm phosphat pH 6,8. Sau 2 h thử trong m ô i trường acid, tiếp tục thử trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 như sau: Thêm 700 ml dung dịch dinatri hydrophosphat 0,086 M vào mỗi b ì nh thử. Điều chỉnh đến pH 6,8 ± 0,05 bằng dung dịch acid hydrocloric 2 M (TT) hoặc dung dịch natri hydroxyd 2 M (TT) . Tốc độ quay: 100 r/min. Thời gian: 30 min. Cách tiến hành: Xác định lượng esomeprazol hòa tan bằng phương pháp sắc ký l ỏ ng (Phụ lục 5.3). Dung dịch đệm phosphat pH 6,8: Thêm 300 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) vào 700 ml dung dịch dinatri hydrophosphat 0,086 M , điều chỉnh đến pH 6,8 ± 0,05 bằng dung dịch acid hydrocloric 2 M (TT) hoặc dung dịch natri hydroxyd 2 M (TT) . Pha động và điều kiện sắc ký: Thực hiện như mô tả trong phần Định lượng. Dung dịch chuẩn: Hòa tan chính xác một lượng omeprazol chuẩn trong ethanol 96 % (TT) để được dung dịch có nồng độ khoảng 2 mg/ml. Tiếp tục pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat pH 6,8 để được dung dịch có nồng độ L/ 1000 mg/ml (L là hàm lượng ghi trên nhãn mg/viên). Thêm ngay 2,0 ml dung dịch natri hydroxyd 0,25 M vào 10,0 ml dung dịch này, lắc đều. Lưu ý, không để dung dịch lâu trước khi thêm dung dịch natri hydroxyd. Dung dịch thử: Sau 30 min trong môi trường đệm pH 6,8, hút dịch hòa tan, lọc. Hút 5,0 ml dịch lọc thu được vào trong một ống nghiệm có chứa sẵn 1,0 ml dung dịch natri hydroxyd 0,25 M . Lắc đều. Tránh ánh sáng. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính lượng esomeprazol hòa tan từ mỗi viên dựa vào diện tích pic esomeprazol trên sắc ký đồ của dung dịch th ử , diện tích pic omeprazol trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và từ hàm lượng của C 17 H 19 N 3 O 3 S trong omeprazol chuẩn. Yêu cầu: Không ít hơn 75 % (Q) lượng esomeprazol, C 17 H 19 N 3 O 3 S, so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan (Phụ lục 11.4, mục 4.3). Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung môi pha mẫu: Như mô tả ở mục Định lượng. Dung dịch đệm phosphat pH 7,6: Trộn 5,2 ml dung dịch natri dihydrophosphat 1,0 M với 63 ml dung dịch dinatri hydrophosphat 0,5 M và pha loãng với nước thành 1000 ml. Pha động A: Trộn 100 ml acetonitril (TT) với 100 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,6 và pha loãng với nước thành 1000 ml. Pha động B: Trộn 800 ml acetonitril (TT) với 10 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,6 và pha loãng với nước thành 1000 ml. Dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Hòa tan một lượng omeprazol chuẩn và omeprazol sulfon chuẩn trong m ethanol (TT) để được dung dịch có nồng độ mỗi chất khoảng 1 mg/ml. Hút 1,0 ml dung dịch thu được vào bình định mức 100 ml, thêm hỗn hợp dung môi pha mẫu - nước (1: 4) đến vạch, lắc đều. Tiếp tục pha loãng 1,0 ml dung dịch này thành 10,0 ml bằng cùng hỗn hợp dung môi. Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 20 mg esomeprazol vào bình định m ứ c 200 ml, thêm 20 ml m ethanol (TT) và lắc 30 s. Thêm 40 ml dung môi pha mẫu, lắc tay 30 s và lắc siêu âm vài phút. Để nguội và thêm nước đến định mức, lắc đều, lọc. Lưu ý, dung dịch ổ n định trong vòng 3 h nếu bảo quản tránh ánh sáng. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (10 cm x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh C (3 µm). Detector quang ph ổ tử ngoại đặt ở bước sóng 302 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µ l Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương tr ì nh dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% t t/ tt) 0-10 100 → 80 0 → 20 10-30 80 → 0 20 → 100 30-31 0 → 100 100 → 0 31-45 100 0 Tiến hành sắc ký với dung dịch thử t í nh phù hợp của hệ thống, thời gian lưu tương đối của omeprazol sulfon so với omeprazol là 0,93. Phép thử chỉ có giá trị khi độ phân giải giữa pic omeprazol sulfon và pic omeprazol không nhỏ hơn 2,5. Tiến hành sắc ký với dung dịch thử. Tính hàm lượng từng tạp chất dựa vào diện tích pic tạp chất (nếu có) trên sắc ký đồ của dung dịch thử so với tổng diện tích các pic đáp ứng trên sắc đồ của dung dịch thử. Giới hạn: Omeprazol sunfon không được quá 0,5 %; các tạp chất khác mỗi loại không được quá 0,2 %; tổng các tạp chất không được quá 2,0 %. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch đệm phosphat pH 7,3: Trộn 10,5 ml dung dịch natri dihydrophosphat 1 M với 60 ml dung dịch dinatri hydrophosphat 0,5 M và pha loãng với nước thành 1000 ml. Pha động: Trộn 350 ml acetonitril (TT) với 500 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,3 và pha loãng bằng nước thành 1000 ml. Dung môi pha mẫu: Hòa tan 5,24 g natri phosphat tribasic (TT) trong nước , thêm 110 ml dung dịch dinatri hydrophosphat 0,5 M và thêm nước vừa đủ 1000 ml. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg omeprazol chuẩn vào bình định mức 250 ml, hòa tan bằng 10 ml ethanol 96 % (TT) , thêm 40 ml dung môi pha mẫu và pha loãng bằng nước đến định mức, lắc đều. Dung dịch này có nồng độ omeprazol khoảng 0,04 mg/ml. Dung dịch thử: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung b ì nh viên và nghiền thành bột mịn. Cân một lượng bột viên tương ứng 20 mg esomeprazol vào bình định mức 100 ml, thêm 60 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm để hòa tan. Thêm 20 ml ethanol 96 % (TT) lắc siêu âm vài phút, Để nguội và thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, lọc. Hút 10,0 ml dịch lọc vào bình định mức 50 ml và thêm nước tới vạch, lắc đều. B ả o quản dung dịch tránh ánh sáng. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (15 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 302 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/min. Thể tích tiêm/ 20 µl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic omeprazol trên sắc ký đồ thu được trong 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng esomeprazol, C 17 H 19 N 3 O 3 S, có trong viên dựa vào diện tích pic esomeprazol thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, diện t í ch pic omeprazol thu được trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và hàm lượng C 17 H 1 9 N 3 O 3 S trong omeprazol chuẩn. Bảo quản Trong bao bì kín, để nơi khô mát, tránh ánh sáng. Loại thuốc Thuốc chống loét dạ dày, tá tràng, ức chế bơm proton. Hàm lượng thường dùng 20 mg, 40 mg. VIÊN NÉN BAO TAN TRONG RUỘT PANTOPRAZOL Tabellae Pantoprazoli Là viên nén bao tan trong ruột chứa pantoprazol natri. Chế ph ẩ m phải đáp ứ ng các yêu cầu trong chuyên luận “Thuốc viên nén ” (Phụ lục 1.20) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng pantoprazol, C 16 H 15 F 2 N 3 O 4 S, từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính Trong phần Định lượng, thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử ph ả i tương ứng với thời gian lưu của pic pantoprazol trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Giai đoạn trong môi trường acid Môi trường hòa tan: 1000 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) . Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Tốc độ quay: 75 r/min. Thời gian: 2 h. Cách tiến hành: Phương pháp sắc ký l ỏ ng (Phụ lục 5.3). Pha động: Acetonitril - triethylamin - nước (40: 1: 60). Điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0,05 bằng acid phosphoric (TT) . Dung dịch chuẩn gốc: Cân một lượng pantoprazol natri chuẩn tương ứng 20 mg pantoprazol vào bình định mức 50 ml, thêm 30 ml dung dịch natri hydroxyd 0,02 M (TT) và lắc siêu âm đến khi hòa tan hoàn toàn. Thêm 2 ml acetonitril (TT) và thêm dung dịch natri hydroxyd 0,02 M (TT) đến vạch, lắc đều. Dung dịch chuẩn: Hút 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức thích hợp và pha loãng với hỗn hợp gồm dung dịch acid hydrocloric 0,1 M - dung dịch natri hydroxyd 0,5 M (1: 1) để được dung dịch có nồng độ pantoprazol tương ứng với nồng độ của dung dịch thử. Dung dịch thử: Sau 2 h, hút dịch hòa tan, lọc. Pha loãng 10,0 ml dịch lọc thu được thành 20,0 ml bằng dung dịch natri hydroxyd 0,5 M. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (7,5 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (3 µm). Nhiệt độ cột: 30 o C. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 290 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm; 10 µl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị khi hệ s ố đối xứng của pic pantoprazol không lớn hơn 2,5 và độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic pantoprazol trên sắc ký đồ thu được từ 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử . Tính lượng pantoprazol hòa tan từ diện tích pic pantoprazol trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng của C 16 H 15 F 2 N 3 O 4 S trong pantoprazol natri chuẩn (phân tử lượng của pantoprazol là 383,37 và pantoprazol natri là 405,35). Yêu cầu: Không quá 10 % lượng pantoprazol so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 2 h (Phụ lục 11.4, mục 4.3) Giai đoạn trong môi tr ường đệm Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Môi trường hòa tan: 1000 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8. Tốc độ quay: 75 r/min. Thời gian: 30 min. Dung dịch đệm phosphat pH 6,8: Trộn dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) với dung dịch natri phosphat tribasic 0,2 M theo tỷ lệ 3: 1 và điều chỉnh pH = 6,8 ± 0,05 bằng dung dịch acid hydrocloric 2 M (TT) hoặc dung dịch natri hydroxyd 2 M (TT) , nếu cần. Dung dịch chuẩn: Hút 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc ở giai đoạn môi trường acid vào bình định mức thích hợp và pha loãng với hỗn hợp gồm dung dịch đệm phosphat pH 6,8 và dung dịch natri hydroxyd 0,5 M (1: 1) để được dung dịch có nồng độ pantoprazol tương ứng với nồng độ của dung dịch thử. Dung dịch thử: Chuyển viên đã qua thử giai đoạn acid ở trên vào b ì nh thử, thêm 1000 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8 đã được làm nóng trước đến nhiệt độ 37 ± 0,5 o C. Sau 30 min, lấy dịch hòa tan, lọc. Pha loãng 10,0 ml dịch lọc thành 20,0 ml bằng dung dịch natri hydroxyd 0,5 M . Cách tiến hành: Xác định lượng pantoprazol hòa tan bằng phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) với các điều kiện sắc ký giống như giai đoạn acid. Yêu cầu: Không ít hơn 75 % (Q) lượng pantoprazol, C 16 H 15 F 2 N 3 O 4 S, so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong c ả hai giai đoạn (Phụ lục 11.4, mục 4.3). Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động, dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống, dung dịch thử và điều kiện sắc ký như mô tả trong phần Định lượng. Dung dịch đối chiếu: Pha loãng dung dịch chuẩn ở phần Định lượng với dung dịch natri hydroxyd 0,02 M để được dung dịch có nồng độ pantoprazol 0,0004 mg/ml. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống. Phép thử chỉ có giá trị khi độ phân gi ả i giữa pic pantoprazol và pic tạp chất A không nh ỏ hơn 3; Hệ số đối xứng của pic pantoprazol không lớn hơn 2,0. Tiến hành sắc ký v ớ i d ung dịch đối chiếu: Độ lệch chuẩn tương đ ố i của diện tích pic pantoprazol trên sắc ký đồ thu được trong 6 lần tiêm nhắc lại không lớn hơn 10,0 %. Tiến hành sắc ký dung dịch thử với thời gian gấp 3 lần thời gian lưu của pic pantoprazol. Thời gian lưu tương đối so với pantoprazol; của tạp chất D và F khoảng 1,2; tạp chất A khoảng 1,3; tạp chất B khoảng 2,7. Giới hạn: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử: Tạp chất A: Diện tích pic tạp chất A không được lớn hơn 2,5 lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đ ố i chi ế u (0,5 %). Tổng tạp chất D và F (hai tạp chất này không tách hoàn toàn nên có thể tích phân cùng nhau): Tổng diện t í ch pic tạp chất D và F không được lớn hơn 2,5 lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đ ố i chiếu (0,5 %). Tạp chất B: Diện tích pic tạp chất B không được lớn hơn 1,5 lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,3 %). Các tạp chất khác: Với mỗi tạp chất, diện tích pic không được lớn hơn diện tích pic ch í nh trên sắc ký đồ của d u ng dịch đối chiếu (0,2 %). Tổng diện tích tất cả các pic tạp chất không được lớn hơn 5 lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1,0 %). B ỏ qua các pic có diện tích không lớn hơn 0,5 lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,05 %). Ghi chú: Tạp chất A: 5-(difluoromethoxy)-2-[[(3,4-dimethoxypyridin-2-yl)methyl]sulfonyl]-1 H -benzimidazol. Tạp chất B: 5-(difluoromethoxy)-2-[[(3,4-dimethoxypyridin-2-yl)methyl]sulfanyl]-1 H -benzimidazol. Tạp chất D: 5-(difluoromethoxy)-2-[( RS )-[(3,4-dimethoxypyridin-2-yl)methyl]sulfinyl]-1 -methyl-1 H -benzimidazol. Tạp chất F: 6-(difluoromethoxy)-2-[( R S )-[(3,4-dimethoxypyridin-2- yl)methyl]sulfinyl]-1-methyl-1 H -benzimidazol. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch đệm pH 7,9: Hòa tan 3,85 g amoni acetat (TT) và 1,1 g tetrabutylamoni hydrosulfat (TT) trong 1000 ml nước và điều chỉnh pH đến 7,9 bằng dung dịch amoniac 12,5 % . Pha động: Acetonitril - dung dịch đệm pH 7,9 (35: 65). Dung môi pha mẫu: Acetonitril - dung dịch natri hydroxyd 0,02 M (1:1). Dung dịch chuẩn: Cân một lượng pantoprazol natri chuẩn tương ứng 20 mg pantoprazol vào bình định mức 100 ml, thêm 60 ml dung dịch natri hydroxyd 0,02 M (TT) và lắc siêu âm 5 min để hòa tan. Thêm 2 ml acetonitril (TT) và dung dịch natri hydroxyd 0,02 M đến vạch, lắc đều. Dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Pha pantoprazol natri chuẩn và tạp chất A chuẩn của pantoprazol trong dung dịch natri hydroxyd 0,02 M (TT) để được dung dịch chứa pantoprazol natri 0,2 mg/ml và tạp chất A 0,0004 mg/ml. Dung dịch thử: Lấy 20 viên, bóc bỏ vỏ bao, cân xác định khối lượng trung bình và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với 20 mg pantoprazol vào bình định mức 100 ml, thêm 60 ml dung môi pha mẫu và lắc siêu âm 15 min. Thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, lọc. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 290 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/min. Thể tích tiêm; 20 µl Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống. Phép thử chỉ có giá tr ị khi độ phân giải giữa pic pantoprazol và pic tạp chất A không nh ỏ hơn 3; Hệ số đối xứng của pic pantoprazol không lớn hơn 2,0. Tiến hành sắc ký với d ung dịch chuẩn: Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic pantoprazol trên sắc ký đồ thu được trong 6 lần tiêm nhắc lại không lớn hơn 2,0 %. T í nh hàm lượng pantoprazol trong viên từ diện tích pic pantoprazol trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng của C 16 H 1 5 F 2 N 3 O 4 S trong pantoprazol natri chuẩn. Bảo quản Trong bao bì kín, để nơi khô m á t, tránh ánh sáng. Loại thuốc Thu ố c ch ố ng loét dạ dày, tá tràng, ức chế bơm proton. Hàm lượng thường dùng 20 mg, 40 mg. VIÊN NÉN GLIMEPIRID VÀ METFORMIN Tabellae Glimepiridi et Me t formini Là viên nén chứa glimepirid và metformin hydroclorid. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “ Thuốc viên nén” (Phụ lục 1.20) và các yêu cầu sau: Hàm lượng glimepirid, C 24 H 34 N 4 O 5 S, từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Hàm lượng metformin hydroclorid, C 4 H 11 N 5 .HC l , từ 95,0 % đến 105,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính Trong phần Định lượng, dung dịch thử phải cho hai pic ch í nh có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic glimepirid và metformin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Độ hòa tan của glimepirid Môi trường hòa tan: 500 ml dung dịch natri laurylsulfat 0,5 %. Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Tốc độ quay: 100 r/min. Thời gian: 45 min. Cách tiến hành: Dung dịch thử: Sau thời gian hòa tan quy định, hút dịch hòa tan, lọc. Dung dịch chu ẩ n gốc glimepir i d: Cân chính xác khoảng 20 mg glimepirid và chuyển vào b ì nh định mức dung tích 100 ml. Thêm kho ả ng 80 ml m ethanol (TT) , lắc siêu âm để hòa tan. Thêm m ethanol (TT) vừa đủ đến vạch, lắc đều. Pha loãng 5,0 ml dung dịch này thành 50,0 ml bằng môi trường hòa tan. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 25 mg hoặc 50 mg metformin hydroclorid (tương ứng với viên chứa 250 mg hoặc 500 mg metformin hydroclorid) vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm 30 ml môi trường hòa tan, lắc siêu âm để hòa tan. Thêm 5,0 ml hoặc 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc glimepirid (tương ứng với viên chứa 1 mg hoặc 2 mg glimepirid), thêm môi trường hòa tan vừa đủ đến vạch, lắc đều. Định lượng glimepirid hòa tan bằng phương pháp sắc ký l ỏ ng với Điều kiện sắc ký như ở phần Định lượng. Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, tiến hành sắc ký và ghi lại sắc ký đồ. Trên sắc ký đồ thu được, số đĩa lý thuyết tính theo pic glimepirid không dưới 4000. Hệ số đối xứng của pic glimepirid không lớn hơn 2,0. Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic glimepirid từ 6 lần tiêm lặp lại không quá 2,0%. Tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Từ diện tích pic glimepirid thu được từ dung dịch chuẩn, dung dịch thử và hàm lượng C 24 H 34 N 4 O 5 S trong glimepirid chuẩn, t í nh lượng glimepitid hòa tan trong mỗi viên. Yêu cầu: Không í t hơn 70 % lượng glimepirid, C 24 H 34 N 4 O 5 S, so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 45 min. Độ hòa tan của metformin Môi trường hòa tan: 900 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,68 % được chỉnh đến pH 6,8 bằng dung dịch natri hydroxyd 1 M. Thiết bị: Kiểu gi ỏ quay. Tốc độ quay: 100 r/min. Thời gian: 45 min. Cách tiến hành: Dung dịch thử: Sau thời gian hòa tan quy định, hút dịch hòa tan, lọc. Pha loãng 10,0 ml dịch lọc thành 100,0 ml bằng nước . Pha loãng 10,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml bằng nước . Đo độ hấp thụ của dung dịch thử ở bước sóng 233 nm (Phụ l ụ c 4.1) trong cốc đo dày 1 cm, mẫu trắng là nước . Tính hàm lượng metformin hydroclorid, C 4 H 11 N 5 .HC l , theo A (1 %; 1cm). Lấy 806 là giá trị A (1 %; 1cm) ở bước sóng 233 nm. Yêu cầu: Không í t hơn 70 % lượng metformin hydroclorid, so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 45 min. 1-Cyanoguanidin Pha động: Dung dịch amoni dihydrophosphat 1,7% được chỉnh pH đến 3,0 bằng acid phosphoric (TT) . Dung dịch đối chiếu: Cân chính xác khoảng 10 mg 1-cyanoguanidin và chuyển vào bình định mức 50 ml. Thêm khoảng 30 ml nước và lắc siêu âm để hòa tan. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Pha loãng 1 ml d u ng dịch thu được thành 200 ml bằng pha động. Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 500 mg metformin hydroclorid và chuyển vào bình định mức dung tích 100 ml, thêm khoảng 80 ml pha động và lắc siêu âm trong 30 min. Để nguội, thêm pha động đến định mức, lắc đều, lọc. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (12,5 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh silica gel gắn với các nhóm acid benzen sufonic (Partisphere 5 µ SCX là phù hợp). Detector quang ph ổ tử ngoại đặt ở bước sóng 218 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký với dung dịch đối chiếu. Điều chỉnh độ nhạy của hệ thống sao cho chiều cao của pic chính ít nhất bằng 50 % thang đo. Tiến hành sắc ký với dung dịch thử, trên sắc ký đồ thu được, pic tương ứng với 1-cyanoguanidin không được có diện tích pic lớn hơn diện tích pic 1-cyanoguanidin thu được trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,02 %). Độ đồng đều hàm lượng glimepirid Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) với pha động, dung dịch chuẩn gốc metformin, dung dịch chuẩn gốc glimepirid và dung dịch chuẩn hỗn hợp như mô tả trong phần Định lượng. Dung dịch thử: Chuyển một viên nén vào bình định mức dung tích 100 ml. Thêm khoảng 80 ml pha động, lắc siêu âm khoảng 60 min để hòa tan. Để nguội, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều. Ly tâm với tốc độ 3500 rpm trong 15 min. Pha loãng 5,0 ml dịch trong thành 25,0 ml với pha động, trộn đều. Tiến hành tương tự với 9 viên còn lại. Cách tiến hành: Tiêm dung dịch chuẩn hỗn hợp, tiến hành sắc ký và ghi lại sắc ký đồ. Thay đổi tỷ lệ pha động nếu cần để đạt được độ thích hợp hệ thống như ở mục Định lượng. Tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn hỗn hợp và các dung dịch thử. Từ diện tích pic glimepirid thu được từ dung dịch chuẩn hỗn hợp, dung dịch thử và hàm lượng C 24 H 34 N 4 O 5 S trong glimepirid chuẩn, tính hàm lượng glimepirid có trong mỗi viên. Định lượng Phương pháp sắc ký l ỏ ng (Phụ lục 5.3). Pha động: Acetonitril - dung dịch a moni acetat 0,001 M - triethylamin (500: 500: 0,1). Điều chỉnh đến pH 6,1 ±0,1 với dung dịch acid acetic 10%. Dung dịch chuẩn gốc metformin: Cân chính xác khoảng 25 mg metformin hydroclorid chuẩn và chuyển vào bình định mức dung tích 100 ml. Thêm khoảng 80 ml pha động và lắc siêu âm để hòa tan. Thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch chuẩn gốc glimepirid: Cân chính xác khoảng 20 mg glimepirid chuẩn và chuyển vào bình định mức dung tích 100 ml. Thêm khoảng 80 ml pha động và lắc siêu âm đ ể hòa tan. Thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều. Pha loãng 5,0 ml dung dịch thu được thành 50,0 ml bằng pha động. Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút 5,0 ml chuẩn gốc metformin hydroclorid và 5,0 ml hoặc 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc glimepirid (tương ứng với viên chứa 1 mg hoặc 2 mg glimepirid) vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch. Dung dịch thử gốc: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với một viên vào bình định mức dung tích 100 ml. Thêm khoảng 80 ml pha động và lắc siêu âm khoảng 30 min. Thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều. Ly tâm với tốc độ 3500 rpm trong 15 min. Dung dịch thử glimepirid: Pha loãng 5,0 ml dung dịch thử gốc thành 25,0 ml bằng pha động. Dung dịch thử metformin: Pha loãng 5,0 ml dung dịch thử gốc thành 100,0 ml bằng pha động. Tiếp tục pha loãng 5,0 ml dung dịch thu được thành 50 ml bằng pha động. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 229 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Tiêm dung dịch chuẩn hỗn hợp, tiến hành sắc ký và ghi lại sắc ký đồ. Trên sắc ký đồ thu được, số đĩa lý thuyết tính theo pic metformin không dưới 2000 và tính theo glimepirid không dưới 4000. Hệ số đối xứng của pic metformin không lớn hơn 2,5 và của glimepirid không lớn hơn 2,0. Độ phân giải giữa pic metformin và glimepirid không dưới 8,0. Độ lệch chu ẩ n tương đối của diện tích các pic metformin và glimepirid từ 6 lần tiêm lặp lại không quá 2,0 %. Tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn hỗn hợp và các dung dịch thử. Từ diện tích pic thu được từ dung dịch chuẩn hỗn hợp, các dung dịch thử, hàm lượng C 4 H 11 N 5 . HC l trong metformin hydroclorid chuẩn và hàm lượng C 24 H 34 N 4 O 5 S trong glimepirid chuẩn, tính hàm lượng metformin hydroclorid và glimepirid trong mỗi viên. Bảo quản Trong bao bì kín. Để nơi khô mát, tránh ánh sáng. Loại thuốc Điều trị đái tháo đường. Hàm lượng thường dùng Glimepirid/metformin hydroclorid: 1 mg/250 mg; 1 mg/500 mg; 2 mg/250 mg; 2 mg/ 500 mg. VIÊN NÉN LOSARTAN KALI Tabellae Kalii Losartanas Là viên nén chứa losartan kali. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Thuốc viên nén” (Phụ lục 1.20) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng losartan kali, C 22 H 22 CIKN 6 O , từ 95,0 % đến 105,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính Trong phần Định lượng, thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic losartan trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động A, pha động B, chương tr ì nh dung môi, điều kiện sắc ký, dung dịch thử tính phù hợp của hệ thống, dung dịch thử: như mô tả ở phần Định lượng. Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml với pha động A. Dung dịch thử độ nhạy: Pha loãng 1 ml dung dịch đối chiếu với pha động A vừa đủ 10 ml. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký dung dịch thử độ nhạy. Trên sắc ký đồ thu được, tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N) của pic chính trong lần tiêm đầu tiên không được nh ỏ hơn 10. Nếu không đạt, tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N) của pic chính phải lớn hơn 3 với độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic từ 3 lần tiêm lặp lại phải nhỏ hơn 25 %. Tiến hành sắc ký với dung dịch thử tính phù hợp của hệ thống, hệ số phân giải giữa hai pic tương ứng với 1H-dimer và 2H-dimer trên sắc ký đồ không nh ỏ hơn 2,0; hệ số đối xứng của các pic tương ứng với losartan, 1H-dimer và 2H-dimer không lớn hơn 2,0. Tiến hành sắc ký với dung dịch đối chiếu, số đĩa lý thuyết của cột không nhỏ hơn 3000; hệ số đối xứng của pic losartan không lớn hơn 2,0; độ lệch chuẩn tương đ ố i của diện tích pic từ 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 5,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch đ ố i chiếu và dung dịch thử. Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử, pic tương ứng với 1H-dimer và 2H-dimer nếu có không được có diện tích l ớ n hơn 0,5 lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,5 %). T ổ ng diện tích các pic tạp chất, bao gồm cả pic 1H-dimer và 2H-dimer và các tạp chất chưa xác định không được lớn hơn diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1,0 %). Bỏ qua các pic có diện tích nhỏ hơn 0,1 lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,1 %). Ghi chú: 1H-dimer: [2-butyl-1 -[[2’-[1-[[2-butyl-4-cloro-1-[[2'-(1 H -tetrazol-5-yl)biphenyl-4-yl]methyl]-1 H -imidazol-5-yl]methyl] -1 H -tetrazol-5-yl]biphenyl-4-yI]methyl]-4-cloro-1 H -imidazol-5-yl]methanol (Tạp chất L). 2H-dimer: [2-butyl-1 -[[2’-[2-[[2-butyl-4-cloro-1- [ [2’-(1 H -tetrazol-5-yl)bipheny l -4-yl]methyl]-1 H -imidazol-5-yl]methyl]-2 H -tetrazol-5-yl]biphenyl-4-yl]methyl]-4-cloro-1 H -imidazol-5-yl]methanol (Tạp chất M). Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Thiết bị: Kiểu cánh khuấy Môi trường hòa tan: 900 ml nước đã được đuổi khí. Tốc độ quay : 50 r/min. Thời gian: 30 min. Cách tiến hành: Dung dịch thử: Sau thời gian hòa tan quy định, lấy một phần dịch hòa tan và lọc, loại bỏ dịch lọc đầu. Pha loãng dịch lọc (nếu cần) với nước để thu được dung dịch có nồng độ losartan kali khoảng 0,025 mg/ml. Dung dịch chuẩn: Dung dịch losartan kali chuẩn trong nước có nồng độ khoảng 0,025 mg/ml. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) của các dung dịch thu được ở bước sóng cực đại khoảng 256 nm, trong cốc đo dày 1 cm, dùng nước làm mẫu trắng. Tính hàm lượng losartan kali, C 22 H 22 CIKN 6 O, đã hòa tan trong mỗi viên dựa vào độ hấp thụ đo được của dung dịch chuẩn, dung dịch thử và hàm lượng C 22 H 22 CIKN 6 O trong losartan kali chuẩn. Yêu cầu: Không được ít hơn 75 % lượng losartan kali, C 22 H 22 CIKN 6 O, so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 30 min. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch đệm: Hòa tan 1,25 g kali dihydrophosphat (TT) và 1,5 g dinatri hydrophosphat khan (TT) trong vừa đủ 1000 ml nước . Dung dịch thu được có pH khoảng 7,0. Pha động A: Acetonitril - dung dịch đệm (15:85) Pha động B: Acetonitril. Dung dịch thử t í nh phù hợp của hệ thống: Hòa tan 12 mg losartan kali chuẩn trong bình định mức 50 ml. Thêm 5 ml nước và 5 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) , làm nóng bình ở nhiệt độ 105 o C trong 1 h đến 2 h. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm tiếp 5 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) và thêm nước vừa đủ thể tích. Điều chỉnh pH của dung dịch thu được đến 6,0 bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) hoặc dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) . Dung dịch thu được có chứa 1H-dimer và 2H-dimer, dung dịch này có thể hơi đục. Thêm 3 ml acetonitril (TT) vào 7 ml dung dịch trên, trộn đều, thu được dung dịch trong, dùng để thử tính phù hợp của hệ thống. Dung dịch chuẩn: Dung dịch có nồng độ losartan kali chuẩn khoảng 0,25 mg/ml trong pha động A. Dung dịch thử gốc: Chuyển 10 viên vào bình định mức 500 ml, thêm 250 ml pha động A, lắc siêu âm khoảng 15 min, thỉnh thoảng lắc tay trong thời gian siêu âm. Tiếp tục lắc siêu âm thêm 10 min. Để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm pha động A vừa đủ thể tích, lắc đều, lọc. Dung dịch thử: Pha loãng dung dịch thử gốc với pha động A để thu được dung dịch có nồng độ losartan kali khoảng 0,25 mg/ml. Điều kiện sắc ký Cột kích thước (15 cm x 3,9 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 250 nm. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Thể tích tiêm: 10 µl. Cách tiến hành: Tiến hành chạy sắc ký với chương tr ì nh dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt )) Pha động B (% tt/tt) 0 80 20 10 40 60 11 80 20 15 80 20 Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký với dung dịch thử tính phù hợp của hệ thống, hệ số phân giải giữa hai pic tương ứng với 1H-dimer và 2H-dimer trên sắc ký đồ không nhỏ hơn 2,0; hệ số đối xứng của các pic tương ứng với losartan, 1H-dimer và 2H-dimer không l ớ n hơn 2,0. Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, số đĩa lý thuyết của cột không nhỏ hơn 3000; hệ số đ ố i xứng của pic losartan không lớn hơn 2,0; độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic từ 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng losartan kali, C 22 H 22 CIKN 6 O , trong mỗi viên dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 22 H 22 CIKN 6 O trong losartan kali chuẩn. Bảo quản Để nơi mát, trong đồ đựng kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Đối kháng thụ th ể angiotensin II (loại AT 1 ). Hàm lượng thường dùng 25 mg, 50 mg, 100mg. VIÊN NÉN LOVASTATIN Tabellae Lovastatini Là viên nén hoặc viên nén bao phim chứa lovastatin. Chế phẩm phải đ á p ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Thuốc viên nén” (Phụ lục 1.20) và các yêu cầu sau: Hàm lượng lovastatin, C 24 H 36 O 5 , từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính A. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) Bản mỏng: Silica gel GF 25 4 . Dung môi khai triển: Cyclohexan - cloroform - isopropanol (5:2:1). Dung dịch thử: Lấy một lượng bột viên đã nghiền mịn tương ứng 10 mg lovastatin vào ống nghiệm, thêm 0,4 ml nước và 1,6 ml acetonitril (TT) , lắc mạnh, siêu âm 4 min, ly tâm 4 min, lấy lớp dịch trong. Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 5 mg lovastatin chuẩn trong 1 ml acetonitril (TT) . Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch trên.Triển khai sắc ký trong bình đã bão hòa dung môi đến khi dung môi di chuyển được 3/4 chiều dài bản m ỏ ng, để khô ngoài không kh í , quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết tương ứng về v ị tr í , màu sắc và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. B. Trong phần Định lượng, pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic lovastatin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Môi trường hòa tan: 900 ml dung dịch đệm pH 7,0. Dung dịch đệm pH 7,0: Hòa tan 1,56 g natri dihydrophosphat (TT) , 20 g natri laurylsulfat (TT) trong 900 ml nước . Điều chỉnh đến pH 7,0 bằng dung dịch natri hydroxyd 1 M (TT) , pha loãng với nước vừa đủ 1000 ml, khuấy đều. Tốc độ quay: 50 r/min. Thời gian: 30 min. Cách tiến hành: Dung dịch thử: Sau thời gian hòa tan quy định, lấy một phần dịch hòa tan, lọc. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 44 mg lovastatin chuẩn cho vào bình định mức 500 ml, hòa tan với không quá 20 ml m ethanol (TT) . Pha loãng với môi trường hòa tan vừa đủ 500 ml. Lắc đều. Pha loãng dung dịch thu được với môi trường hòa tan để được dung dịch có nồng độ tương đương với nồng độ lovastatin của dung dịch thử: Định lượng dược chất hòa tan bằng phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) với pha động và điều kiện sắc ký như trong phần Định lượng. Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử: Tính lượng lovastatin, C 24 H 36 O 5 , trong mỗi viên đã hòa tan dựa vào vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 24 H 36 O 5 trong lovastatin chuẩn. Yêu cầu: Không ít hơn 80 % lượng lovastatin, C 24 H 36 O 5 , so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 30 min. Đồng đều hàm lượng (Phụ lục 11.2) Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) với hỗn hợp dung môi, pha động, dung dịch chu ẩ n, điều kiện sắc ký, cách tiến hành tương tự phần Định lượng. Dung dịch thử: Cho một viên vào bình định mức dung tích thích hợp từ 5 0 , 100 ml,... (tương ứng với với viên có hàm lượng 10 mg, 20 mg,...), thêm một lượng thích hợp hỗn hợp dung môi để hòa tan, lắc siêu âm 10 min, để nguội và pha loãng tới vạch bằng cùng hỗn hợp dung môi, trộn đều và lọc. Pha loãng dịch lọc bằng hỗn hợp dung môi để được dung dịch có nồng độ lovastatin khoảng 40 µg/ml. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Acetonitril - dung dịch đệm - methanol (5:3:1). Điều chỉnh tỷ lệ nếu cần. Dung dịch đệm: Hòa tan 3,9 g natri dihydrophosphat (TT) trong 900 ml nước , điều chỉnh đến pH 4,0 bằng acid phosphoric (TT) , pha loãng với nước vừa đủ 1000 ml, lắc đều. Hỗn hợp dung môi: Thêm 3,0 ml acid acetic băng (TT) vào 900 ml nước đựng trong cốc dung tích 1 lít, điều chỉnh đến pH 4, 0 bằng dung dịch natri hydroxyd 20 % (TT) , trộn đều. Chuyển vào bình định mức, thêm nước vừa đủ 1000 ml. Trộn 20 thể tích dung dịch thu được với 80 thể tích acetonitril (TT) . Dung dịch chuẩn: Hòa tan lovastatin chuẩn trong hỗn hợp dung môi để được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 40 µg/ml. Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung b ì nh viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng 40 mg lovastatin cho vào bình định mức 200 ml. Thêm 150 ml hỗn hợp hỗn hợp dung môi, lắc, siêu âm trong 20 min, để nguội đến nhiệt độ phòng và để yên 30 min, thêm hỗn hợp dung môi vừa đủ 200 ml, lắc đều. Lấy một phần dung dịch thu được, ly tâm, lấy 5,0 ml dịch trong cho vào bình định mức 25 ml, thêm hỗn hợp dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm), nhồi pha tĩnh C (5 µm). Nhiệt độ cột: 45 o C. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 230 nm. Tóc độ dòng: 1,5 ml/min. Thể tích tiêm: 50 µl. Cách tiến hành: Tiêm dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị khi hiệu lực cột ph ả i lớn hơn 3000 số đĩa lí thuyết, hệ s ố đ ố i xứng nhỏ hơn 2,0, độ lệch chuẩn tương đối của pic lovastatin không lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng lovastatin, C 24 H 36 O 5 , trong chế phẩm dựa vào vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 24 H 3 6 O 5 trong lovastatin chu ẩ n. Bảo quản Trong bao b ì kín, tránh ánh sáng, để nơi khô mát hoặc nhiệt độ phòng. Loại thu ố c Chống tăng lipid máu. Hàm lượng thường dùng 10 mg, 20 mg, 40 mg. VIÊN NÉN PERINDOPRIL tert-BUTYLAMIN Tabellae tert-Butylamini perindoprilum Là viên nén chứa perindopril t ert- butylamin. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận "Thuốc viên nén" (Phụ lục 1.20) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng perindopril tert -butylamin, C 19 H 32 N 2 O 5 .C 4 H 11 N, từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính A. Lấy một lượng bột viên đã nghiền mịn tương ứng với khoảng 50 mg perindopril tert -butylamin, thêm 10 ml dicloromethan (TT) , lắc siêu âm khoảng 2 min để hòa tan và ly tâm trong 5 min. Gạn lấy dịch trong và lọc, chiết dịch lọc với 10 ml nước . Để yên tách lớp, gạn lấy lớp nước ở trên và rửa bằng hexan (TT) 2 lần, mỗi lần 10 ml. Bay hơi lớp nước trên cách thủy đến khô và sấy cắn ở 60 o C dưới áp suất không quá 0,7 kPa, chú ý không để nhiệt độ bay hơi và sấy lên cao quá. Phổ hấp thụ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của cắn thu được phải phù hợp với phổ hồng ngoại của perindopril tert -butylamin chuẩn. B. Trong phần Định lượng, pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic perindopril t er t -butylamin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Môi trường hòa tan: 500 ml dung dịch acid hydrocloric 0,05 M (TT) Tốc độ quay: 50 r/min. Thời gian: 45 min. Cách tiến hành: Định lượng dược chất hòa tan bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với điều kiện tiến hành như mục Định lượng, thể t í ch tiêm là 50 µl. Dung dịch thử: Sau thời gian hòa tan quy định, lấy một phần dịch hòa tan, lọc, pha loãng dịch lọc nếu cần với dung dịch acid hydrocloric 0,05 M (TT) để được dung dịch có nồng độ perindopril t er t -butylamin 0,004 mg/ml. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 20,0 mg perindopril t ert- butylamin chuẩn và chuyển vào bình định mức 250 ml. Thêm khoảng 150 ml dung dịch acid hydrocloric 0,05 M (TT) , lắc siêu âm để hòa tan và thêm cùng dung môi đến định mức, lắc đều. Pha loãng 5,0 ml dung dịch thu được thành 100,0 ml bằng dung dịch acid hydrocloric 0,05 M (TT) . Yêu cầu: Không ít hơn 75 % lượng perindopril tert -butylamin, C 19 H 32 N 2 O 5 .C 4 H 11 N so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 45 min. Độ đồng đều hàm lượng (Phụ lục 11.2) Phương pháp sắc ký l ỏ ng (Phụ lục 5.3) với pha động, điều kiện sắc ký, dung dịch chuẩn và cách tiến hành thực hiện như mục Định lượng. Dung dịch thử: Lấy 1 viên, nghiền thành bột mịn rồi chuyển vào bình định mức 50 ml, thêm 40 ml pha động, lắc siêu âm đ ể hòa tan và thêm pha động vừa đủ đến định mức, lắc đều, lọc. Pha loãng nếu cần với pha động để được dung dịch có nồng độ perindopril t er t -butylamin 0,04 mg/ml. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Acetonitril - nước được điều chỉnh pH đến 2,0 bằng hỗn hợp đồng thể tích acid perclor i c và nước (34: 66). Dung dịch chuẩn: Cân ch í nh xác khoảng 20,0 mg perindopril t ert -butylamin chuẩn và chuyển vào bình định mức 100 ml. Thêm 70 ml pha động, lắc siêu âm để hòa tan, để nguội và thêm pha động đến vạch, lắc đều. Pha loãng 10,0 ml dung dịch thu được thành 50,0 ml bằng pha động. Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 20 mg perindopril ter t -butylamin cho vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml pha động và lắc siêu âm 20 min. Để nguội và thêm pha động vừa đủ 100 ml, lắc đều, lọc. Pha loãng 10,0 ml dung dịch lọc th à nh 50,0 ml bằng pha động. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (15 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 215 nm. Tốc độ dòng: 2 ml/min. Nhiệt độ cột: 40 o C. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký 6 lần riêng biệt đối với dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đ ối của diện tích pic perindopril t ert -butylamin không được lớn hơn 2,0 %. Hệ số đối xứng pic không lớn hơn 2,0. Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. T í nh hàm lượng perindopril ter t -butylamin C 19 H 32 N 2 O 5 .C 4 H 11 N có trong một đơn v ị chế phẩm dựa vào diện tích pic thu được từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 19 H 32 N 2 O 5 .C 4 H 11 N trong perindopril ter t -butylamin chuẩn. Bảo quản Trong đồ đựng kín, để nơi khô mát, nhiệt độ không quá 30 o C, tránh ánh sáng. Loại thuốc Điều trị tăng huyết áp. Hàm lượng thường dùng 2 mg, 4 mg và 8 mg. VIÊN NÉN SIMVASTATIN Tabellae Simvastatin i Là viên nén hoặc viên nén bao phim chứa simvastatin. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Thuốc viên nén” (Phụ lục 1.20) và các yêu cầu sau: Hàm lượng simvastatin, C 25 H 38 O 5 , từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính Trong phần Định lượng, pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic simvastatin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Thiết bị: Kiểu cánh khuấy. Môi trường hòa tan: 900 ml dung dịch đệm pH 7,0. Dung dịch đệm pH 7,0: Hòa tan 30 g natri laurylsulfat (TT) và 9,36 g natri dihydrophosphat (TT) trong 6000 ml nước , điều chỉnh đến pH 7,0 bằng dung dịch natri hydroxyd 10 M (TT) . Tốc độ quay: 50 r/m i n. Thời gian: 30 min. Cách tiến hành: Dung dịch thử: Sau thời gian hòa tan quy định, lấy một phần dịch hòa tan, lọc. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng simvastatin chuẩn hòa tan trong môi trường hòa tan để được dung dịch có nồng độ tương đương với nồng độ simvastatin trong dung dịch thử . Định lượng dược chất hòa tan bằng phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) với pha động, điều kiện sắc ký tương tự phần Định lượng và thể tích tiêm 20 µl. Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính lượng simvastatin, C 25 H 38 O 6 , trong mỗi viên đã hòa tan dựa vào vào diện tích pic thu được từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn, hàm lượng C 25 H 38 O 5 trong simvastatin chuẩn. Yêu cầu: Không ít hơn 75 % lượng simvastatin, C 25 H 38 O 5 , so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 30 min. Đồng đều hàm lượng (Phụ lục 11.2) Xác định hàm lượng simvastatin trong mỗi viên bằng phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) với hỗn hợp dung môi, pha động, dung dịch chuẩn, điều kiện sắc ký, cách tiến hành tương tự phần Định lượng. Dung dịch thử: Cho một viên vào b ì nh định mức dung tích 50, 100, 200 ml,... (tương ứng với viên có hàm lượng 5 mg, 10 mg, 20 mg,...), thêm hỗn hợp dung môi để hòa tan và pha loãng tới vạch bằng cùng hỗn hợp dung môi, trộn đều và lọc. Dùng dịch lọc làm dung dịch thử hoặc pha loãng bằng hỗn hợp dung môi để được dung dịch có nồng độ simvastatin khoảng 0,1 mg/ml. Định lượng Phương pháp sắc ký l ỏ ng (Phụ lục 5.3). Pha động: Acetonitril - dung dịch đệm (65: 35). Điều chỉnh tỷ lệ nếu cần. Dung dịch đệm: Hòa tan 4,4 g natri dihydrophosphat (TT) trong 900 ml nước , điều chỉnh đến pH 4,5 bằng acid phosphoric (TT) hoặc bằng dung dịch natri hydroxyd 10 M (TT) , pha loãng với nước vừa đủ 1000 ml, lắc đều. Hỗn hợp dung môi: Thêm 3,0 ml acid acetic băng (TT) vào 900 ml nước đựng trong cốc dung tích 1 lít, điều chỉnh đến pH 4,0 bằng dung dịch natri hydroxyd 5 M (TT) , trộn đều. Chuyển vào bình định mức, thêm nước vừa đủ 1000 ml. Trộn 20 thể tích dung dịch thu được với 80 thể tích acetonitril (TT) . L ắ c đều. Dung dịch chuẩn: Hòa tan simvastatin chuẩn trong hỗn hợp dung môi để được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 0,1 mg/ml. Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng 20 mg simvastatin cho vào bình định mức 200 ml, thêm 120 ml dung hỗn hợp dung môi, lắc, siêu âm trong 15 min, để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm hỗn hợp dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm), nhồi pha tĩnh C (5 µm). Nhiệt độ cột: 45 o C. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 238 nm. Tốc độ dòng: 1,5 ml/min. Thể tích tiêm: 10 µl. Cách tiến hành: Tiêm dung dịch chu ẩ n. Phép thử chỉ có giá trị khi hệ số dung lượng k’ không nhỏ hơn 3,0. Hiệu lực cột không nhỏ hơn 4500 đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng của pic simvastatin nh ỏ hơn 2,0; độ lệch chuẩn tương đ ố i của pic simvastatin không quá 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tính hàm lượng simvastatin,C 25 H 38 O 5 , trong ch ế phẩm dựa v à o diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 25 H 38 O 5 trong simvastatin chuẩn. Bảo quản Trong bao bì kín, tránh ánh sáng, để nơi nơi khô mát hoặc nhiệt độ phòng. Loại thuốc Chống tăng lipid máu. Hàm lượng thường dùng 5 mg, 10 mg, 20 mg, 40 mg. VIÊN NÉN TELMISARTAN Tabel l ae Telmisartani Là viên nén chứa telmisartan. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Thuốc viên nén” (Phụ lục 1.20) và các yêu cầu sau đây: Hàm lượng telm i sartan, C 33 H 30 N 4 O 2 , từ 90,0 % đến 110,0 % so với lượng ghi trên nhãn. Định tính A. Trong phần Độ hòa tan, phổ hấp thụ tử ngoại (Phụ lục 4.1) của dung dịch thử phải tương ứng với phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch chuẩn. B. Trong phần Định lượng, thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic telmisartan trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Tạp chất liên quan Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động A: Hòa tan 0,5 g kali dihydrophosphat (TT) trong 1000 ml nước , thêm 2 ml triethylamin (TT) , điều chỉnh đến pH 3,2 bằng acid phosphoric (TT) . Pha động B: Acetonitril (TT) . Dung môi pha mẫu: Hòa 2 ml triethylamin (TT) trong 800 ml nước , thêm 200 ml m ethanol (TT) . Dung dịch thử: Cân 20 viên, nghiền thành bột mịn. Phân tán một lượng bột viên tương ứng với 100 mg telmisartan trong 100,0 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm khoảng 45 min và lọc. Dung dịch đối chiếu: Dung dịch có chứa telmisartan chuẩn trong dung môi pha mẫu, nồng độ 0,005 mg/ml. Điều kiện sắc ký Cột kích thước (15 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 298 nm. Tốc độ dòng: 1,8 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương tr ì nh dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% tt/tt)) Pha động B (% tt/tt) 0 78 22 6 80 20 7 70 30 15 60 40 25 60 40 26 40 60 35 20 80 40 78 22 Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký với dung dịch đ ố i chiếu, phép thử chỉ có giá trị khi s ố đĩa lý thuyết không nhỏ hơn 3000, hệ số đối xứng không lớn hơn 2 và độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic từ 6 lần tiêm lặp lại dung dịch đối chiếu không lớn hơn 5,0 %. Tiến hành sắc ký với dung dịch thử, trên sắc ký đồ thu được, bất kỳ pic phụ nào không được có diện tích lớn hơn diện t í ch của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,5 %). Tổng diện tích của các pic phụ không được lớn hơn 4 lần diện tích của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (2,0 %). Bỏ qua các pic có diện tích nhỏ hơn 0,1 lần diện tích của pic ch í nh trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,05 %). Độ hòa tan (Phụ lục 11.4) Thiết bị: Kiểu cánh khuấy Môi trường hòa tan: 900 ml dung dịch đệm pH 7,5. Tốc độ quay : 75 r/min. Thời gian: 30 min. Dung dịch đệm pH 7,5: Hòa tan 13,61 g kali dihydrophosphat (TT) trong 800 ml nước , điều chỉnh đến pH 7,5 bằng dung dịch natri hydroxyd 2 M (TT) , thêm nước đến vừa đủ 1000 ml.. Cách tiến hành: Dung dịch thử: Sau thời gian hòa tan quy định, lấy một phần dịch hòa tan và lọc, loại bỏ dịch lọc đầu. Pha loãng dịch lọc với môi trường hòa tan để thu được dung dịch có nồng độ telmisartan khoảng 0,011 mg/ml. Dung d ị ch chuẩn: Cân chính xác khoảng 44 mg telmisartan chuẩn và chuyển vào bình định mức 100 ml. Thêm 1 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) và pha loãng với m ethanol (TT) vừa đ ủ thể tích. Pha loãng dung dịch này với môi trường hòa tan để thu được dung dịch có nồng độ telmisartan khoảng 0,011 mg/ml. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) của dung dịch thu được ở bước sóng cực đại khoảng 296 nm, trong c ố c đo dày 1 cm, dùng môi trường hòa tan làm mẫu trắng. Tính hàm lượng telmisartan, C 33 H 30 N 4 O 2 , đã hòa tan trong mỗi viên dựa vào độ hấp thụ đo được của dung dịch chu ẩ n, dung dịch thử và hàm lượng C 33 H 30 N 4 O 2 trong telmisartan chuẩn. Yêu cầu: Không ít hơn 75 % lượng telmisartan, C 33 H 30 N 4 O 2 , so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan trong 30 min. Định lượ n g Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Dung dịch đệm: Hòa tan 2,72 g kali dihydrophosphat (TT) trong vừa đủ 1000 ml nước , thêm 2 ml triethylamin (TT) và chỉnh đến pH 2,4 bằng acid phosphoric (TT) . Pha động: Dung dịch đệm - acetonitril (60: 40). Dung môi pha mẫu: Hòa 2 ml triethylamin (TT) trong 800 ml nước , thêm 200 ml m ethanol (TT) . Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 40 mg telmisartan chuẩn, hòa tan và pha loãng bằng dung môi pha mẫu vừa đ ủ 100,0 ml. Pha loãng 5,0 ml dung dịch thu được thành 50,0 ml bằng dung môi pha mẫu. Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với 40 mg telmisartan vào bình định mức 100 ml, thêm 80 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm khoảng 45 min. Để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ thể tích, lắc đều, lọc. Pha loãng 5,0 ml dịch lọc thành 50,0 ml với dung môi pha mẫu. Điều kiện sắc ký Cột kích thước (15 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 298 nm. T ố c độ dòng: 1 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, phép thử chỉ có giá trị khi số đ ĩa lý thuyết không nhỏ hơn 3000, hệ số đối xứng của pic telmisartan không lớn hơn 2,0; độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic từ 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chu ẩ n và dung dịch thử . Tính hàm lượng telmisartan, C 33 H 30 N 4 O 2 , trong mỗi viên dựa vào diện tích pic telmisartan thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 33 H 30 N 4 O 2 trong telmisartan chuẩn. Bảo quản Để nơi mát, trong đồ đựng kín, tránh ánh sáng. Loại thuốc Đ ố i kháng thụ thể angiotensin II (loại AT 1 ). Hàm lượng thường dùng 20 mg; 40 mg; 80 mg. PHẦN 4 DƯỢC LIỆU BÁN BIÊN LIÊN Herba Lobeliae chinensis Toàn cây phơi hay sấy khô của cây Bán biên liên (Lobelia chinensis Lour.) , họ Hoa chuông (Campanunlaceae). Mô tả Thường cuốn với nhau tạo thành khối. Thân rễ có màu vàng nâu nhạt, mặt ngoài nhẵn hoặc có nếp nhăn dọc nhỏ, đường kính 1 mm đến 2 mm. Rễ nhỏ mảnh, màu vàng, mang nhiều rễ phụ. Thân cây nhỏ, mảnh, phân nhánh nhiều, màu lục xám, có nhiều nốt sần nhỏ, đôi khi mang rễ sợi. Lá mọc so le, không cuốn, phiến lá hình ngọn giáo hẹp, dài 1 cm đến 2,5 cm, rộng 2 cm đến 5 cm, m é p lá có răng cưa nông, thưa, lá thường xoăn lại, màu nâu lục. Hoa nhỏ có cuống mảnh, mọc đơn độc, tràng hoa dính liền thành ống ở phần dưới, xẻ 5 thùy ở phần trên, quay sang một phía, màu đ ỏ tím nhạt, có lông tơ mịn ở mặt trong ống tràng. Mùi nhẹ, vị hơi ngọt, cay. Bột Màu lục vàng xám hoặc màu vàng nâu nhạt. Tế bào bi ể u bì lá có thành hơi lồi lên, uốn lượn, lỗ kh í ki ể u hỗn bào có 3 t ế bào đến 7 t ế bào kèm. Mạch xoắn, mạch lưới có đường kính 7 µm đến 34 µm. Bó tinh thể calci oxalat thường thấy ở bên các bó mạch, đôi khi xếp thành hàng, ống nhựa m ủ chứa các giọt dầu. Tế bào mô mềm hình chữ nhật, thành hơi dày lên, chứa các hạt inulin. Định tính Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4). Bản m ỏ ng: Silica gel G . Dung môi khai triển: Cloroform - methanol (9:1). Dung dịch thử: Lấy 1 g bột dược liệu, thêm 50 ml m ethanol (TT) , siêu âm trong 30 min, để nguội, lọc. Bay hơi dịch lọc tới khô và hòa tan cắn trong 2 ml m ethanol (TT) được dung dịch chấm sắc ký. Dung dịch đối chiếu: Lấy 1 g bột Bán biên liên (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như dung dịch thử. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản m ỏ ng 5 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, phun dung dịch acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT) , sấy bản m ỏ ng ở 105 o C đến khi các vết hiện rõ. Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng ban ngày và dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 365 nm. sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng giá trị R f và màu sắc với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Độ ẩm Không được quá 10,0 % (Phụ lục 9.6, 1 g, 4 h). Chất chiết được trong dược liệu Không được ít hơn 12,0 % tính theo dược liệu khô kiệt. Tiến hành theo phương pháp chiết nóng (Phụ lục 12.10) dùng ethanol 96 % (TT) làm dung môi. Chế biến Thu hái vào mùa hạ, loại bỏ tạp chất, rửa sạch, cắt đoạn, phơi hoặc sấy khô. Bảo quản Để nơi khô, mát. Tính vị, quy kinh Vị ngọt, cay, tính hàn. Vào kinh tâm, tiểu tràng, phế. Công năng, chủ trị Thanh tâm, giải độc, lợi tiểu, tiêu sưng. Chủ trị: Ung nhọt sưng đau, côn trùng hoặc rắn độc cắn, bụng chướng to, phù thũng, viêm gan vàng da, eczema. Liều lượng, cách dùng Ngày dùng 9 g đến 15 g, dạng thuốc sắc, hoặc hãm; thường phối hợp với các vị thuốc khác. CAO ĐẶC DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG Extrac tum Phyllanthi amar i spissum Cao đặc diệp hạ châu được bào chế từ lá cây Diệp hạ châu đắng ( Phyllanthus amarus Schum . et Thonn.) họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) bằng phương pháp thích hợp để chế phẩm có hàm lượng hoạt chất ổ n định. Chế phẩm phải đáp ứng các y êu cầu trong chuyên luận “Cao thuốc ” (Phụ lục 1.1) và các yêu cầu sau đây: Mô tả Thể chất mềm, dẻo, đồng nhất. Màu nâu sẫm đến đen. Mùi hăng đặc biệt. Vị rất đắng. Định tính A. Lấy 0,5 g chế phẩm, thêm 50 ml ethanol 90 % (TT) , lắc đều, đun hồi lưu trong cách thủy 30 min. Lọc, bay hơi dịch lọc trên cách thủy đến còn khoảng 10 ml, chuyển vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch chiết để làm các phản ứng sau đây: Ống 1: Thêm 4 - 5 giọt acid hydrocloric (TT) , rồi thêm một ít bột magnesi (TT) , xuất hiện màu đỏ. Ống 2: Thêm 3 - 4 giọt dung dịch sắt (III) clorid 9 % (TT) , xuất hiện màu xanh tím. B. Lấy 0,1 g chế phẩm, thêm 5 ml nước , đun sôi trong vài min rồi lọc. Để nguội, lấy 2 ml dịch lọc thêm 2 - 3 giọt dung dịch gelatin 1 % (TT), xuất hiện tủa bông trắng. C. Phương pháp sắc ký lớp m ỏ ng (Phụ lục 5.4). Bản mỏng: Silica gel 60 F 254 . Dung môi khai triển: Cloroform - methanol (7: 3). Dung dịch thử: Lấy 0,5 g chế phẩm, hòa tan trong 20 ml nước nóng, để nguội, kiềm hóa bằng amoniac (TT) đến pH 9 -10, lắc dung dịch thu được với cloroform (TT) 2 lần, mỗi lần 20 ml. Gộp các dịch chiết cloroform, bay hơi trên cách thu ỷ đến còn khoảng 2 ml, dùng làm dung dịch thử. Dung dịch đối chiếu: Lấy 5 g Diệp hạ châu đắng (mẫu chuẩn), thêm 100 ml nước , đun sôi nhẹ trong 30 min, để nguội, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến còn 20 ml, để nguội, kiềm hóa bằng amoniac (TT) đến pH 9 - 10, lắc dung dịch thu được với cloroform (TT) 2 lần, mỗi lần 20 ml. Gộp các dịch chiết cloroform, bay hơi trên cách thủy đến còn khoảng 2 ml, dùng làm dung dịch đối chiếu.. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên cùng bản mỏng 20 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai, lấy b ả n mỏng ra, để khô ngoài không khí rồi phun thuốc thử Dragendorff (TT) . S ắc ký đồ thu được của dung dịch thử phải có vết cùng màu sắc và giá trị R f với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. D. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4). Bản mỏng: Silica gel 60 F 254 . Dung môi khai triển: n-Hexan - ethyl acetat (2:1). Dung dịch thử: Lấy 0,4 g chế phẩm, hòa tan trong 20 ml nước nóng, để nguội, lắc kỹ dung dịch thu được với cloroform (TT) 2 lần, mỗi lần 20 ml. Gộp các dịch chiết cloroform, bay hơi trên cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong 1 ml ethanol (TT) , dùng làm dung dịch thử. Dung dịch đối chiếu (1): Lấy 4 g Diệp hạ châu đắng đã cắt nhỏ (mẫu chuẩn), thêm 100 ml nước , đun sôi nhẹ trong 30 min, để nguội, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến còn 20 ml, để nguội, lắc dịch thu được với cloroform (TT) 2 lần, mỗi lần 20 ml. Gộp các dịch chiết cloroform, bay hơi trên cách thu ỷ đến cắn, hòa tan cắn trong 1 ml ethanol (TT) . Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan phyllanthin chuẩn trong ethanol (TT) để được dung dịch có nồng độ khoảng 2 mg/ml. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên cùng bản mỏng 10 µ l mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai, l ấ y bản mỏng ra, để khô ngoài không khí rồi phun dung dịch acid sulfuric 10 % (TT) . S ấy bản mỏng ở 120 o C đến khi hiện rõ vết. Quan sát bản m ỏ ng dưới ánh sáng thường hoặc ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 366 nm. Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử phải có vết cùng màu sắc và giá trị R f với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) và (2). Mất khối lượng do làm khô Không được quá 20,0 % (Phụ lục 9.6, 1 g, 85 o C, 5 h). Tro toàn phần Không được quá 10,0 % (Phụ lục 9.8). Tro không tan trong acid hydrocloric Không được quá 0,15 % (Phụ lục 9.7). Cắn không tan trong nước Hòa tan 1,0 g chế phẩm trong 50 ml nước cất nóng, lọc qua giấy lọc đã cân bì, rửa cắn và giấy lọc bằng nước cất cho tới khi nước rửa không màu, sấy cắn và giấy lọc ở 100 o C đến 105 o C trong 3 h, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 min, cân nhanh để xác định khối lượng cắn. Lượng cắn không được quá 1,0 % tính theo chế phẩm khô kiệt. pH Dung dịch chế phẩm 1,0 % trong nước phải có pH từ 6,0 đến 7,0 (Phụ lục 6.2). Kim loại nặng Không được q u á 20 phần triệu (Phụ lục 9.4.8). Lấy 1 g chế phẩm, tiến hành theo phương pháp 3. Dùng 2 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Định lượng Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3). Pha động: Pha động A: M ethanol (TT) . Pha động B: Dung dịch acid phosphoric 0,1 % (TT). Dung dịch chuẩn: Hòa tan phyllanthin chuẩn trong m ethanol (TT) để được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 30 µg/ml. Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,2 g chế phẩm đã xác định độ ẩm vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm 5 ml nước , lắc kỹ đ ể phân tán mẫu đều. Thêm 30 ml m ethanol (TT) , lắc siêu âm trong 30 min. Để nguội, bổ sung m ethanol (TT) vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 µm). Detector quang phổ h ấ p thụ tử ngoại đặt ở bước sóng 230 nm. Tốc độ dòng: 1,3 ml/min. Thể tích tiêm: 20 µl Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương tr ì nh dung môi như sau: Thời gian (min) Pha động A (% t t/ tt) Pha động B (% t t/ tt) 0-25 65 35 25-26 65 → 80 35 → 20 26-34 80 20 34-35 80 → 65 20 → 35 35-45 65 35 Tiêm lần lượt dung dịch chu ẩ n, dung dịch thử. Ghi sắc ký đồ. Tính hàm lượng phyllanthin trong chế phẩm dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 24 H 34 O 6 trong phyllathin chuẩn. Hàm lượng phyllanthin (C 24 H 34 O 6 ) không được ít hơn 0,5 % tính theo chế phẩm khô kiệt. Bảo quản Bảo quản trong bao b ì hút chân không, chống ẩm. Để nơi khô, mát. CAO KHÔ HUYẾT GIÁC Extractum Dracaenae siccus Cao khô Huyết giác được điều chế từ phần gỗ có chứa nhựa của cây Huyết giác Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep hoặc Dracaena cochinchinensis (Lour.) S.C.Chen, họ Huyết giác (Dracaenaceae) bằng cách chiết bằng ethanol 96 % hay bằng dung môi thích hợp khác. Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu trong chuyên luận “Cao thuốc” (Phụ lục 1.1) và các yêu cầu sau đây: Mô tả Bột màu nâu đỏ, mùi thơm nhẹ đặc trưng, vị hơi chát. Không tan trong nước, ether và các dung dịch acid loãng; tan trong methanol, ethanol và các dung dịch kiềm l o ãng. Định tính A. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4). Bản mỏng: Silica gel HF 2 5 4 chứa 0,3 % natri carboxymethylcelulose , hoạt h ó a ở 105 o C trong 30 min. Dung môi khai triển: Cloroform - methanol (99: 1). Dung dịch thử: Lấy khoảng 0,5 g chế phẩm, thêm 25 ml ether dầu hỏa (40 o C đến 60 o C) (TT) lắc siêu âm trong 15 min. Để nguội, lọc, giữ lại cắn cho phép thử B. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn, hòa cắn trong 1 ml cloroform (TT) được dung dịch chấm sắc ký. Dung dịch đối chiếu: Lấy 3 g bột Huyết giác (mẫu chuẩn) cho vào bình nón, thêm 20 ml ethanol 96 % (TT) , lắc siêu âm trong 15 min, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Thêm vào cắn 25 ml ether dầu h ỏ a (40 o C đến 60 o C) (TT) lắc siêu âm trong 15 min. Để nguội, lọc, giữ lại cắn cho phép thử B. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn, hòa cắn trong 1 ml cloroform (TT) được dung dịch chấm sắc ký. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên b ả n mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được được khoảng 12 cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, phun dung dịch acid sulfuric 10 % trong ethanol , sấy bản mỏng ở 110 o C đến khi hiện rõ vết. Quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366 nm. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và giá trị R f với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. B. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4). Bản m ỏ ng: Silica gel HF 254 chứa 0,3 % natri carboxymethylcellulose hoạt hóa ở 105 o C trong 30 min. Dung môi khai triển: Ether dầu h ỏ a (40 o C đến 60 o C) - ethyl acetat (10: 1). Dung dịch thử: Lấy cắn thu được ở phần dung dịch thử trong phép thử A, để trên cách thủy cho bay hơi hết ether dầu hỏa, thêm 25 ml ethyl acetat (TT) , lắc siêu âm trong 15 min, để nguội, lọc. Cô dịch lọc trên cách th ủy đến khi còn khoảng 5 ml, để nguội rồi chuyển lên cột thủy tinh đường kính khoảng 10 mm có chứa 1 g chất nhồi polyamid đ ã được xử lý, kích thước hạt 14 - 20 µm, được nhồi ướt. Rửa gi ả i bằng 100 ml ethanol 50 % (TT) với tốc độ 1,5 ml/min, loại bỏ dịch rửa giải. Tiếp tục rửa giải bằng 50 ml ethanol (TT) với tốc độ 1,5 ml/min, gộp dịch rửa giải, cô trên cách thủy đến cạn, hòa cắn trong 1 ml cloroform (TT) được dung dịch chấm sắc ký. Dung dịch đối chiếu: Lấy cắn thu được ở phần dung dịch đối chiếu trong phép thử A, tiến hành chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử . Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản m ỏ ng 10 µl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 12 cm, lấy bản mỏng ra, đ ể khô ở nhiệt độ phòng, phun dung dịch acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT) . Sấy bản m ỏ ng ở 110 o C đến khi hiện rõ vết. Quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366 nm. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và giá trị R f với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Xử lý polyamid: Lấy polyamid vào cốc có mỏ, thêm ethanol 96 % (TT) ngập bề mặt, khuấy đều, sau khi h ế t bọt khí thì chuyển toàn bộ hỗn hợp vào cột th ủ y tinh có khóa, đường kính thích hợp (từ 10 mm tr ở lên), dùng ethanol 90-95 % (TT) để r ử a cho đến khi dịch rửa trong suốt. Rửa tiếp bằng hỗn hợp dung dịch natri hydroxyd 5 % - nước cất (2,5: 1) có chứa 2,5 % acid acetic (TT) , cuối cùng rửa bằng nước cất đến khi nước rửa trung tính, lấy polyamid đã rửa ra đ ể khô ở nhiệt độ phòng . C. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4). Bản mỏng: Silica gel 60F 254 , hoạt hóa ở 105 o C trong 30 min. Dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat (9: 1). Dung dịch thử: Hòa tan 0,15 g chế phẩm trong 10 ml ethanol 96 % (TT) được dung dịch chấm sắc ký. Dung dịch đối chiếu: Lấy 1 g bột Huyết giác (mẫu chuẩn) cho vào bình nón, thêm 10 ml ethanol 96 % (TT) , lắc siêu âm trong 10 min, lọc, dùng dịch lọc làm dung dịch chấm sắc ký. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản m ỏ ng 5 µl mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 12 cm, lấy b ả n m ỏ ng ra, đ ể khô ở nhiệt độ phòng, phun dung dịch acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT) . Sấy bản m ỏ ng ở 110 o C đến khi hiện rõ vết. Quan sát bản mỏng ở ánh sáng thường và dưới ánh sáng t ử ngoại ở bước sóng 366 nm. Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các v ế t có cùng màu sắc và giá trị R f với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. D. Trong phần định lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho pic có cùng thời gian lưu với thời gian lưu của pic loureirin B trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Độ hấp thụ Cân chính xác khoảng 20 mg chế phẩm vào bình định mức 50 ml, thêm 30 ml ethanol (TT) , lắc kỹ để hòa tan, thêm ethanol (TT) vừa đ ủ đến vạch, lắc đều, lọc. Loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu, hút chính xác 5,0 ml dịch lọc sau vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol (TT) vừa đủ đến vạch, lắc đều. Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được (Phụ lục 4.1) ở bước sóng 284 nm, mẫu trắng là ethanol (TT) . Độ hấp thụ đo đượ c không được dưới 0,40. Cắn không tan trong ethanol Không được quá 1,5 %. Cân chính xác khoảng 1,0 g chế phẩm vào b ì nh nón nút mài 100 ml, thêm 50 ml ethanol (TT) , ngâm trong 30 min, tiếp tục lắc mạnh để hòa tan trong 20 min. Lọc qua giấy lọc (đã được sấy ở 105 o C trong 3 h và cân trước), rửa cắn bằng ethanol (TT) đến khi dịch lọc không màu. Sấy giấy lọc và cắn ở 105 o C trong 3 h. Đ ể nguội trong bình hút ẩ m 30 min và cân nhanh. Tính hàm lượng phần trăm chất không tan trong ethanol theo chế phẩm khô kiệt. Tro toàn phần Không được quá 1,0 % (Phụ lục 9.8, phương pháp 1). Kim loại nặng Không qu á 20 phần triệu (Ph ụ lục 9.4.8). Lấy 1 g chế phẩm, tiến hành theo phương pháp 3. Dùng 2 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) để chuẩn bị mẫu đối chiếu. Mất khối lượng do làm khô Không được quá 7,0 % (Phụ lục 9.6). (1 g; 100 o C; 5 h). Định lượng Phương pháp sắc ký l ỏ ng (Phụ lục 5.3). Pha động: Dung dịch acid acetic 1 %- acetonltril (61: 39), điều chỉnh tỷ lệ nếu cần. Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 3,5 g chế phẩm vào bình định mức 50 ml, thêm 40 ml m ethanol (TT) , lắc siêu âm trong 15 min, để nguội, thêm m ethanol (TT) vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu, hút chính xác 5,0 ml dịch lọc sau vào bình định mức 50 ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µ m . Dung dịch chuẩn: Hòa tan Loureirin B chuẩn trong m ethanol (TT) đ ể được dung dịch có nồng độ ch í nh xác khoảng 0,45 mg/ml. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch trên vào bình định m ứ c 50 ml, thêm pha động vừa đ ủ đến vạch, lọc qua màng 0,45 µm. Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (250 mm x 4,6 mm), nhồi pha tĩnh C (5 µm) hoặc tương đương. Cột Inertsil ODS-3 là thích hợp. Tốc độ dòng: 1,0 ml/min. Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 276 nm. Thể tích tiêm: 20 µl. Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã nêu, ghi lại thời gian lưu, diện tích của pic loureirin B. Dựa vào diện tích pic của loureirin B trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 18 H 20 O 5 trong loureirin B chuẩn để tính hàm lượng loureirin B trong chế phẩm. Hàm lượng loureirin B (C 18 H 2 0 O 5 ) trong chế phẩm không ít hơn 0,45 % tính theo chế phẩm khô kiệt. Bảo quản Đựng trong bao b ì kín, để nơi khô ráo, thoáng mát, tránh ánh sáng. CÔN BỐ Laminariae Thallus Toàn cây phơi hoặc sấy khô của cây Tảo dẹt (Laminaria japonica Aresch .) hoặc Eckolonia kurome Okam , họ Côn bố (Laminariaceae). Mô tả Laminaria japonica: Thường cuộn bết lại với nhau thành b ó , thành khối. Dược liệu có màu lục nhạt, màu nâu ánh lục hoặc màu nâu đen, bên ngoài có lớp bột màu trắng. Phần gốc có dạng sợi hình trụ, mang nhiều sợi nhỏ, màu nâu đen. Sau khi ngâm trong nước, trương n ở thành dải, dài 50 cm đến 150 cm, rộng 10 cm đến 40 cm, dày lên ở phần giữa, mỏng hơn và và uốn lượn ở mép. Chất hơi dai. Mùi tanh của rong biển, vị mặn. Eckolonia kurome: Thường cuộn, xoắn lại thành khối tròn không đều. Dược liệu có màu đen. Sau khi ngâm trong nước , trương n ở thành dạng lá, dài và rộng từ 16 cm đến 26 cm, dày 1,6 mm; hai mặt có gân dạng chân vịt, thùy dẹt mỏng, mép có răng cưa hoặc nguyên. Chất xốp và trơn mượt. Định tính A. Khi ngâm trong nước sẽ trương nở, dày lên, mặt ngoài nhẵn, có dịch nhớt là chất nhày trong suốt. Khi cuốn bằng các ngón tay, không cuộn thành nhiều lớp được (đối với L. japonica ) hoặc có thể cuộn lại được (đối với E . kurome ). B. Ngâm khoảng 10 g dược liệu đã cắt thành m ả nh nhỏ trong 200 ml nước trong vài giờ, lọc và cô dịch lọc đến còn khoảng 100 ml. Lấy 2 ml đến 3 ml dịch thu được, thêm 1 giọt acid nitric (TT) và vài giọt dung dịch bạc nitrat 2 % (TT) , một tủa keo màu vàng được tạo thành, tủa này kh ó tan trong amoniac (TT) và không tan trong acid nitric (TT) . Định lượng Cân chính xác khoảng 10 g dược liệu đã cắt thành m ả nh nhỏ, cho vào chén nung, sấy ở nhiệt độ 100 o C trong 10 min, nung ở 400 o C đến 500 o C trong 40 min. Đ ể nguội và chuy ể n cắn nung vào một cốc có mỏ, thêm 100 ml nước , đun sôi khoảng 5 min và lọc. Làm như vậy đối với cắn thêm 2 lần nữa, mỗi lần 100 ml nước , gộp các dịch lọc, rửa cắn 3 lần, mỗi lần bằng một ít nước nóng. Gộp dịch rửa và dịch lọc, cô đến còn khoảng 80 ml. Để nguội, chuyển dịch thu được vào bình định mức 100 ml và pha loãng bằng nước đến vạch. Lấy chính xác 5 ml dịch thu được cho vào bình thủy tinh có nắp, thêm 50 ml nước và 2 giọt dung dịch đỏ methyl (TT) , thêm từng giọt dung dịch acid sulfuric loãng (TT) đến khi màu đỏ được tạo thành. Thêm 5 ml dung dịch brom vừa mới pha (TT) , đun sôi, thêm 5 ml dung dịch natri format 20 % dọc theo thành bình đựng, đun sôi trong 10 min đến 15 min. Rửa thành bình bằng nước nóng, để nguội, thêm 5 ml dung dịch acid sulfuric loãng (TT) và 5 ml dung dịch kali iodid 15 % (TT) , chuẩn độ ngay bằng dung dịch natri thiosulfat 0,01 N (CĐ) tới khi dung dịch chuyển màu vàng nhạt, thêm 1 ml dung dịch hồ tinh bột (TT) , tiếp tục chuẩn độ cho đến khi hết màu xanh. 1 ml dung dịch natri thiosulfat 0,01 N (TT) tương đương với 0,2115 mg I. Chế phẩm phải chứa không ít hơn 0,35 % I (đối với L . japonica ) và không ít hơn 0,20 % I (đối với E . kurome ), tính theo dược liệu khô kiệt. Chế biến Thu hoạch vào mùa hè và mùa thu, vớt lấy toàn cây, phơi hoặc sấy khô. Trước khi dùng, loại bỏ tạp chất, rửa sạch, để ráo nước, cắt thành sợi rộng, phơi khô. Bảo quản Nơi khô mát. Tính vị, quy kinh V ị mặn, tính hàn. Vào kinh can, vị, thận. Công năng, chủ trị Nhuyễn kiên, hành thủy. Chủ trị: Bướu c ổ , tràng nhạc, sán khí, phù thũng. Cách dùng, liều lượng Ngày dùng 6 g đến 12 g dạng thuốc sắc hoặc hoàn t á n. Thường phối hợp với các vị thuốc khác. NGOI (Lá) Folium Solani erianthi Cà ngoi Lá đã phơi hay sấy khô của cây Ngoi ( Solanum erianthum D. Don), họ Cà (Solanaceae). Mô tả Lá đã phơi hay sấy khô có màu xanh xám. Cuống lá phủ một lớp lông mịn hình sao, dài 1,5 cm đến 5,5 cm. Phiến lá thuôn hình trứng hay elip, dài 10 cm đến 29 cm, rộng từ 4 cm đến 12 cm. Mùi hắc, khai; vị đắng, cay. Vi phẫu Vi phẫu lá có thiết diện đối xứng qua trục giữ a. C ấu tạo gồm có các phần: Gân lá: Mặt trên hơi lồi, mặt dưới rất lồi. Biểu b ì gồm các t ế bào hình chữ nhật xếp thành một lớp. Tế bào biểu bì mang lông che ch ở đa bào hình sao (5 đến 1 1 tế bào) và lông tiết d ầu đa bào (4 đến 6 tế bào), chân đa bào (2 tế bào). Mô dày gồm 5 đến 7 dãy tế bào thành dày. Bó libe-gỗ hình cung xếp giữa gân lá, gồm cung libe bao quanh cung gỗ. Mô mềm gồm các tế bào hình tròn hay nhiều cạnh, thành mỏng, nằm giữa mô dày và b ó libe, tế bào chứa tinh thể calci oxalat dạng cát nằm rải rác. Phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm một lớp tế bào mang lông che ch ở đa bào và lông tiết đa bào. Nằm sát lớp biểu bì trên là mô giậu, cấu tạo b ở i các tế bào hình chữ nhật xếp đứng cạnh nhau. Dưới mô giậu là mô mềm cấu tạo b ở i các tế bào không đều, thành mỏng. Bột Bột có màu xanh xám, rất xốp. Quan sát dưới kính hiển vi thấy: Mảnh bi ể u b ì mang lỗ khí; mảnh mạch xoắn; tinh thể calci oxalat hình cầu gai; lông che ch ở đa bào; lông tiết chân 2 tế bào, đầu đa bào. Định tính Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4). Bản m ỏ ng: Silica gel G. Dung môi khai triển: Cloroform - methanol (10: 1). Dung dịch thử: Lấy 5 g bột dược liệu, thêm 70 ml dung dịch acid acetic 5 % , ngâm qua đêm. Lọc dịch chiết qua giấy lọc. Kiềm hóa dịch lọc bằng amoniac (TT) đến pH 9,5 -10, chiết 3 lần với cl oro f orm (TT) , mỗi lần 30 ml. Gộp dịch chiết cloroform, thu hồi dung môi đến cắn, hòa tan cắn trong 1 ml m ethanol (TT) được dung dịch chấm sắc ký. Dung dịch đối chiếu: Lấy 5 g bột lá Ngoi (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô trong không khí, phun thuốc thử Dragendorff (TT) . Sắc ký đồ của dung dịch thử quan sát dưới ánh sáng thường phải có 7 vết chính, có màu từ xanh đến xanh tím, cùng màu sắc và giá trị R f với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Độ ẩm Không được quá 13,0 % (Phụ lục 9.6, 1 g, 100 o C, 4 h). Tạp chất Không được quá 1,0% (Phụ lục 12.11). Tỷ lệ vụn nát Qua rây có kích thước mắt rây 4 mm: Không được quá 5 % (Phụ lục 12.12). Tro toàn phần Không được quá 14,0 % (Phụ lục 9.8). Định lượng Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại (Phụ lục 4.1). Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,05 g solasodin chuẩn, cho vào bình định mức 100 ml, thêm một ít m ethanol (TT) , lắc cho tan hết solasodin, thêm tiếp m ethanol (TT) đến vạch và lắc đều. Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1,0 g bột dược liệu (qua rây 1,25 mm), đun hồi lưu trong cách thủy 3 h với 50 ml dung dịch acid acetic 5 % trong methanol . Để nguội, lọc, rửa bã dược liệu 2 lần, mỗi l ầ n bằng 30 ml dung dịch acid acetic 5 % trong methanol . Gộp dịch lọc và dịch rửa, thu hồi dung môi và cô trong chân không ở 50 0 C tới khô. Dùng m ethanol (TT) để hòa tan và chuyển toàn bộ cắn vào bình định mức 25 ml, thêm m ethanol (TT) đến vạch. Đậy nút và lắc đều. Lọc. Cách tiến hành: Lần lượt cho vào 3 bình gạn dung tích 50 ml các dung dịch sau: Dung dịch sử dụng B ì nh 1 dung dịch chuẩn (ml) B ì nh 2 dung dịch thử (ml) B ì nh 3 mẫu trắng (ml) Dung dịch đệm phosphat 0,1 M pH 8,0 (TT) 5 5 5 Dung dịch xanh bromothymol 0,2 % (Hòa tan 0,2 g xanh bromthymol (TT) trong ethanol 20 % (TT) , thêm ethanol 20 % vừa đ ủ 100 ml). 0,5 0,5 0,5 Dung dịch solasodin chu ẩ n (0,5 mg/ml) 0,5 0 0 Dung dịch thử 0 0,5 0 Methanol (TT) 0 0 0,5 Cloroform (TT) 10 10 10 Lắc kỹ 3 b ì nh trên trong 15 min, sau đ ó đ ể yên khoảng 30 min cho phân lớp. Gạn lấy lớp cloroform vào 3 bình gạn khác. L ắ c lớp cloroform với 10 ml dung dịch natri hydroxyd 0,05 N (TT). Để yên 30 min cho phân lớp. Gạn lấy dung dịch kiềm màu xanh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 616 nm (Phụ lục 4.1) của các dung dịch kiềm thu được. Tính hàm lượng glycoalcaloid trong mẫu thử theo solasodin dựa vào độ hấp thụ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C 27 H 43 NO 2 trong solasodin chuẩn. Hàm lượng glycoalcaloid toàn phần trong dược liệu không được ít hơn 0,45 % tính theo solasodin (C 27 H 43 NO 2 ) và theo dược liệu khô kiệt. Chế biến Thu hái lá quanh năm, phơi hay sấy khô ở nhiệt độ 50 o C đến 60 o C. Có thể dùng tươi. Bảo quản Để nơi khô, thoáng mát. Tính vị, qui kinh Vị đắng, cay, tính ấ m, có độc. Công năng, chủ trị Thanh nhiệt tiêu thũng, sát trùng, chỉ huyết, hành khí ch ỉ thống, sinh cơ thu liễm. Chủ trị: Đau dạ dày, phong thấp tê bại, mụn nhọt ung độc, đòn ngã tổn thương, gẫy xương, bệnh bạch cầu hạt mạn tính. Dùng ngoài trị viêm da có mủ, lòi dom, hắc lào, lao hạch. Cách dùng, liều lượng Ngày dùng 10 g đến 15 g, dạng thuốc sắc. Dùng ngoài: Lượng thích h ợ p, rửa sạch, đập dập, sao nóng, đắp vào chỗ đau. PHẦN 5 VẮC XIN VẮC XIN PHẾ CẦU Vacc i num pneumococcale polysacchari dicum Định nghĩa Vắc xin phế cầu (dạng polysacharid) là ch ế phẩm gồm 23 kháng nguyên vỏ polysaccharid tinh khiết pha với tỷ lệ bằng nhau của các chủng phế cầu S . pneumoniae (gọi tắt là kháng nguyên phế cầu): 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17A hoặc 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F. Vắc xin phế cầu là chế p hẩ m dạng lỏng, tro ng suốt và không màu. Sản xuất Chủng gốc và chủng sản xuất Sản xuất vắc xin phải dựa vào hệ chủng g i ống cho từng loại typ. Chủng S . pneumoniae dùng để sản xuất vắc xin phế cầu polysacharid ph ả i được cơ quan Kiểm định quốc gia chấp thuận. Mỗi chủng phải có khả năng s ả n sinh polysaccharid của t ừ ng typ huyết thanh tương ứng với sản lượng ổn định, đủ đáp ứng miễn dịch và an toàn cho người. Mỗi chủng gốc ph ả i có hồ sơ chủng (nguồn gốc ch ủ ng, các kết quả kiểm tra xác định các đặc tính, sinh lý, sinh hóa, huyết thanh học và di truyền của chủng...). Canh trường nuôi cấy chủng s ả n xu ấ t ph ải có những đặc tính giống ch ủ ng gốc: là vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bà o , quan sát dưới kính hiển vi có hình th á i điển hình của S . pneumonia , phát triển thích hợp ở 37 o C, kh u ẩn lạc trơn có vòng tan máu alpha; bị ly giải b ở i muối mật, lên mem inulin, nhạy cảm với optochin, dương tính với phản ứng Quellung. Phương pháp sản xuất phải được thẩm đ ịn h để chứng minh sản phẩm đạt yêu cầu về an toàn theo tiêu chu ẩ n vắc xin và huyết thanh miễn dịch dùng cho người. Nuôi cấy và gặt Các chủng sản xuất được nuôi cấy trên m ô i trường không chứa các thành phần tạo tủa khi tinh chế polysaccharid, các thành phần nhóm máu ho ặc các polysaccharid có phân tử lượng lớn. Sự thuần khiết của vi khuẩn trước khi tách , chiết thu polysaccharid phải được kiểm tra theo phương pháp thích hợp. Nếu có sự nhiễm tạp, canh tr ường nuôi cấy bị h ủ y bỏ. Bán thành ph ẩ m đơn giá Sau khi bất hoạt bằng phenol, các polysac ch arid được tách và tinh chế bằng các phương pháp như tủa phân đoạn, thủy phân bằng enzym và siêu lọc , rửa, làm khô trong điều kiện chân không sao cho có độ ẩm thích hợp cho tính ổn định của polysac h arid và được bảo quản ở điều kiện thích hợp để tránh bị ẩm. Độ ẩm tồn dư được xác định bằng cách làm khô dưới áp xuất giảm hoặc nhiệt và phải đạt yêu cầu so với mẫu đối chiếu. Polysaccharid tinh chế phải đạt các chỉ tiêu dưới đây mới được sử dụng để pha chế bán thành phẩm cuối cùng: Nhận dạng: Dùng phương pháp huyết than h học (khuyếch tán miễn dịch kép hoặc điện di miễn dịch); dương tính với từng kháng nguyên phế c ầ u. Thành phần polysaccharid: Theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất. Được xác định dựa trên khối lượng khô của polysaccharid hoặc phần trăm nitrogen tổng số, phosphorus, acid uronic, hexosamin, methyl pentose và nhóm O-acetyl bằng cách sử dụ n g các phương pháp so màu hoặc sắc ký trao đổi ion. Protein tạp chất: Không được quá 3,0 % so với khối lượng polysaccharid. Xác định bằng phương pháp Lowry. Acid nucleic tạp chất : Không được quá 2,0 % so với khối lượng polysaccharid. Xác định bằng cách đo độ hấp thụ của acid nucleic ở bước sóng 26 0 nm hoặc phương pháp khác đã được thẩm đ ị nh. Kích thước ph â n t ử: Theo tiêu chuẩn của nh à sản xuất. Xác định bằng phương pháp sắc ký lọc gel hoặc sắc ký trao đổi ion. Hằng số phân bố K D được xác định bằng cách đo sự phân bố theo kích thước phân tử của polysacharid của đỉnh (pic) chính của đường cong phân tách. Vô khuẩn: Đạt yêu cầu về vô khuẩn (Phụ lục 15.7). Độ đặc hiệu: Không có ph ả n ứng chéo giữa từng kháng nguyên phế cầu với tất cả các kháng huyết thanh đặc hiệu kháng các kháng nguyên phế cầu còn lại có trong vắc xin phế cầu. Bán thành phẩm cuối c ù ng Bán thành phẩm cuối cùng được điều ch ế bằng cách t r ộn bột polysachrid của các typ khác nhau trong điều kiện vô trùng. Hỗn hợp đồng nhất được hòa vào dung dịch đẳng trương thích hợp sao một liều dùng cho người chứa 25 µg từng typ polysacharid. Bán thành ph ẩ m cuối cùng chỉ được phép pha chế thành thành ph ẩ m khi đạt yêu cầu sau: Vô khuẩn: Đạt yêu cầu về vô khuẩn (Phụ lục 15.7). Vắc xin thành phẩm Nhận dạng: Phải dương tính với từng kháng nguyên phế cầu. Sử dụng phương pháp miễn dịch học. Vô khuẩn: Đạt yêu cầu về vô khuẩn (Phụ lục 15.7). Hàm lượng pol y saccharid: Trong khoảng ± 30,0 % hàm lượng polysaccharid ghi trên nhãn. Xác định hàm lượng polysacharid của từng kháng nguyên phế cầu và hàm lượng polysacharid tổng số bằng phương pháp miễn dịch học hay phương pháp khác đã được thẩm định. Chất bảo quản: Chất bảo quản kháng khuẩn: Trong khoảng 85 % - 115 % hàm lượng ghi trên nhãn. Tiến hành theo phương pháp thích hợp đã được thẩm định. Phenol: Không được quá 2,5 g/l. Xác định bằng phương pháp thích hợp. Ch ấ t gây sốt: Đạt về chất gây sốt (Phụ lục 15.12). Tiến hành trên thỏ với liều tiêm tĩnh mạch tai thỏ là 2,5 µg mỗi kháng nguyên phế cầ u /m L/ kg thỏ. An toàn không đặc hiệu: Vắc xin đạt yêu cầu về an toàn không đặc hiệu khi tất cả các chuột thử nghiệm sống sót và tăng cân sau 7 ngày theo dõi (Phụ lục 15.11). pH: 4,5 - 7,4 (Phụ lục 15.33). Cảm quan: Quan sát bằng mắt thường vắc xin không có dấu hiệu bất thường: lỏng nút, nắp, hàn không đạt yêu cầu, nứt, vỡ, có vật thể lạ... Đóng gói Phải tuân thủ theo GMP và các quy định hiện hành. Nhãn, hộp Những thông tin ghi trên nhãn, hộp, tờ hướng dẫn sử dụng phải đáp ứng những yêu cầu của các quy định hiện hành và đặc biệt phải ghi đủ các thông tin về tên, hàm lượng của mỗi polysacchar i d và hàm lượng polysaccharid tổng số. Bảo quản Trong bao bì kín, ở nhiệt độ từ 2 o C đến 8 o C. Hạn sử dụng Các tuyên bố về hạn sử dụng, nhiệt độ bảo quản sẽ phải dựa trên kết qu ả nghiên cứu về tính ổn định của vắc xin và phải được cơ quan quản lý phê chu ẩ n. VẮC XIN PHẾ CẦU CỘNG HỢP HẤP PHỤ Vaccinum pneumococcale polysacharidicum coniugatum adsorbatum Định nghĩa Vắc xin phế cầu cộng hợp hấp phụ gồm các kháng nguyên vỏ tinh khiết po l ysacharid của các typ huyết thanh phế cầu S . pneumoniae (gọi tắt là kháng nguyên phế cầu), mỗi kháng nguyên phế cầu được liên kết cộng hợp riêng rẽ với một protein mang (carrier protein) . V ắc xin phế cầu được hấp phụ với một chất hấp phụ hoặc tá chất phù hợp (thường được hấp phụ với nhôm phosphat). Sản xuất Phương pháp sản sản xuất phải tạo ra được một vắc xin phế cầu cộng hợp đảm bảo về tính an toàn và tính sinh miễn dịch ở người. Qui tr ì nh sản xuất polysacharid và chất mang phải dựa trên cơ sở một hệ thống chủng giống. Phương pháp sản xuất phải được thẩm định để chứng minh sản phẩm đạt yêu cầu về an toàn theo tiêu chuẩn vắc xin và huyết thanh miễn dịch dùng cho người. Chủng gốc và chủng sản xuất Mỗi chủng gốc phải có hồ sơ chủng (nguồn gốc chủng, các kết quả kiểm tra xác định các đặc t í nh sinh lý, sinh hóa, huyết thanh học và di truyền của chủng,..). Ch ủ ng S . pneumoniae dùng để sản xuất vắc xin phế cầu cộng hợp phải được cơ quan Kiểm định quốc gia chấp thuận. Mỗi chủng phải có khả năng sản sinh polysacharid của từng typ huyết thanh tương ứng với sản lượng ổn định, đủ đáp ứng miễn dịch và an toàn cho người. Canh trường nuôi cấy chủng sản xuất phải có những đặc tính giống chủng gốc: là vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào, quan sát dưới kính hiển vi có h ì nh thái điển hình của S . pneumonia , phát triển thích hợp ở 37 o C, khuẩn lạc trơn có vòng tan máu alpha; bị ly giải bởi muối mật, lên men inulin, nhạy cảm với optochin, dương tính với phản ứ ng Quellung. Nuôi cấy và gặt Các ch ủ ng sản xuất được nuôi cấy trên môi trường không chứa các thành phần tạo tủa khi tinh chế polysacharid. Sự thuần khiết của vi khuẩn trước khi tách chiết thu polysacharid phải được kiểm tra theo phương pháp thích hợp như nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa phù hợp. Nếu có sự nhiễm tạp, môi trường nuôi cấy bị h ủ y b ỏ . Tinh chế po l ysacharid Mỗi một typ huyết thanh S . pneumonia được nuôi cấy riêng biệt trên môi trường lỏng không chứa polysacharid khối lượng phân t ử cao, nếu một trong các thành phần nuôi cấy có chứa thành phần các nhóm máu th ì qui tr ì nh sản xuất phải được thẩm định để chứng minh rằng sau khi tinh chế sẽ loại bỏ được chất này. Sau khi bất hoạt, polysacharid được tách và tinh chế bằng các phương pháp như tủa phân đoạn, sắc ký, xử lý bằng enzyme và siêu ly tâm. Polysacharid tinh chế phải đạt các chỉ tiêu dưới đây mới được sử dụng để pha chế bán thành phẩm cộng hợp: Nhận dạng: Phải dương tính với từng typ kháng nguyên phế cầu. Xác định bằng phương pháp huyết thanh học hoặc quang phổ cộng hư ở ng từ 1 H (hoặc 13 C). Thành phần polysacharid: Được xác định dựa trên khối lượng khô của polysacharid hoặc phần trăm nitrogen tổng số, phosphorus, acid uronic, hexosamin, methyl pentose và O-acetyl nhóm bằng cách sử dụng các phương pháp so màu hoặc sắc ký trao đổi ion. Tiêu chuẩn phải được cơ quan quản lý quốc gia chấp thuận. Độ ẩm: Nếu polysacharid được bảo quản dưới dạng đông khô, hàm lượng ẩm phải được kiểm tra và nằm trong giới hạn tiêu chuẩn được cơ quan quản lý quốc gia chấp thuận. Protein tạp chất : Không được quá 3,0 % so với khối lượng polysacharid. Xác định bằng phương pháp Lowry. Acid nucleic tạp chất : Không được quá 2,0 % so với khối lượng polysacharid. Xác định bằng cách đo độ hấp thụ của acid nucleic ở bước sóng 260 nm. hoặc phương pháp khác đã được thẩm định. Chất gây sốt : Đạt yêu cầu về chất gây s ố t (Phụ lục 15.12). Sử dụng phương pháp xác định chất gây sốt trên thỏ. Nội độc tố vi khuẩn: Xác định nội độc tố theo Phụ lục 13.2. Hàm lượng nội độc tố ít hơn 0,5 lU/µg polysacharid. Kích thước phân tử : Theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất. Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel hoặc sắc ký trao đổi ion. Hằng số phân bố K D được xác đ ị nh bằng cách đo sự phân bố theo kích thước phân tử của polysacharid của đỉnh (pic) chính của đường cong phân tách. Hoạt hóa po l ysacharid Polysacharid được hoạt hóa bằng phương pháp hóa học trước khi cộng h ợ p. Trước và trong quá tr ì nh hoạt hóa bằng phương pháp hóa học, các polysacharid được chia thành các đơn phân (partially depolymerized). Các polysacharid được hoạt hóa đạt các chỉ tiêu dưới đây m ớ i được sử dụng trong quá tr ì nh cộng hợp: Kích thước phân t ử: Kích thước phân tử của từng kháng nguyên phế cầu nằm trong tiêu chuẩn được cơ quan qu ả n l ý quốc gia chấp thuận. Xác định bằng phương pháp sắc ký lọc gel hoặc phương pháp khác đã được thẩm định. Protein mang Protein mang được sử dụng để tăng khả năng đáp ứng miễn dịch ở tế bào T. Chủng sản xuất protein mang (cộng hợp) phải có hồ sơ ch ủ ng bao gồm nguồn gốc ch ủ ng, các đặc tính sinh lý, sinh hóa, t í nh an toàn. Sự phát triển của chủng phải cho thấy có tính ổn định bằng cách giám sát t ỷ lệ mọc của vi khuẩn, pH của nuôi cấy và sản lượng. Độ tinh khiết của canh trường nuôi cấy phải được kiểm tra, canh trường nuôi cấy được bất hoạt và được tinh chế bằng phương pháp thích hợp. Các protein mang thường được sử dụng là: giải độc tố uốn ván, giải độc tố bạch hầu, protein CRM 197, protein D - protein bề mặt tế bào của vi khuẩn không điển hình Haemophilus influenza . Protein mang đạt các yêu cầu dưới đây mới được sử dụng để pha chế bán thành phẩm cộng hợp: Nhận dạng: Phải cho ph ả n ứng dương tính. Xác định bằng phương pháp huyết thanh học. Vô khuẩn: Đạt yêu cầu về vô khuẩn (Phụ lục 15.7). Nội độc tố vi khuẩn: Không được quá 1,0 IU/µg protein. Hàm lượng protein: Không được ít hơn 90 % hàm lượng protein tổng số. Được xác định bằng phương pháp phù hợp đã được thẩm định. Bán thành phẩm đơn giá Sự cộng hợp xảy ra khi có polysacharid đã được hoạt hóa gắn với protein mang qua liên kết cộng hóa trị bằng nhiều phương pháp khác nhau, phụ thuộc vào nhà s ả n xuất. Quy tr ì nh tinh chế sản phẩm cộng hợp nhằm loại bỏ hóa chất tồn dư của quá tr ì nh cộng hợp bằng phương pháp thích hợp. Chỉ bán thành ph ẩ m đơn đạt các yêu cầu dưới đây mới được pha chế thành bán thành phẩm cuối cùng. Nhận dạng: sử dụng phương pháp huyết thanh học, phản ứng dương tính với từng kháng nguyên phế cầu. Hóa chất tồn dư: Không được có hóa chất tồn dư. Xác định bằng phương pháp sắc ký khối phổ hoặc phương phác khác đã được thẩm định. Tỷ lệ polysacharid - protein: Từ 0,3 đến 3,0 đối với từng kháng nguyên phế cầu. Thực hiện bằng cách xác định từng hàm lượng polysacharid và hàm lượng protein hoặc xác định trực tiếp tỷ lệ này bằng cách sử dụng phương pháp quang phổ cộng hư ở ng từ 1 H hoặc phương pháp khác đã được thẩm định. Polysacharid cộng hợp và polysacharid tự do: Theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất. Xác định bằng phương pháp thích hợp đã được thẩm định. Hàm lượng protein: Theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất đối với từng typ kháng nguyên. Xác định bằng phương pháp thích hợp đã được thẩm định như phương pháp sắc ký lỏng, sắc ký mao quản ,…. Vô khuẩn: Đạt yêu cầu về vô khuẩn (Phụ lục 15.7). Tính độc đặc hiệu của protein mang: Không có tính độc. Áp dụng với protein mang là giải độc tố uốn ván, giải độc tố bạch hầu; tiến hành theo phương pháp đã được thẩm định. Nội độc tố: Không được lớn hơn 0,75 lU/µg polysacharid. Sử dụng phương pháp LAL test. Bán thành phẩm cuối c ù ng T á dược, chất bảo quản được bổ sung với một lượng thích hợp các bán thành phẩm cộng hợp của từng kháng nguyên phế cầu đ ể được b á n thành phẩm cuối cùng. Bán thành phẩm cuối cùng chỉ được phép pha chế thành thành phẩm khi đạt yêu cầu sau: Vô khuẩn: Đạt yêu cầu về vô khuẩn (Phụ lục 5.7). Vắc xin thành phẩm Nhận dạng: Phải dương tính với từng kháng nguyên phế cầu. Xác định bằng phương pháp miễn dịch học. Vô khu ẩ n: Đạt yêu cầu về vô khuẩn (Phụ lục 15.7). Hàm lượng polysacharid: Trong khoảng ± 30,0 % hàm lượng polysacharid ghi trên nhãn. Xác định hàm lượng polysacharid của từng kháng nguyên phế cầu hoặc polysacharid tổng số bằng phương pháp miễn dịch học hay phương pháp khác đã được thẩm định. Độ ẩm t ồ n dư: Không được quá 2,5 % và không có lọ nào quá 3,0 % (Phụ lục 15.35). Áp dụng cho vắc xin phế cầu dạng đông khô. Nội độc tố vi khuẩn: Đạt theo tiêu chuẩn đã đăng ký với cơ quan Kiểm định quốc gia. Phương pháp xác định theo Phụ lục 13.2. Nhôm: Không được quá 1,25 mg trong 1 liều đơn dùng cho người (Phụ lục 15.27). Hàm lượng chất bảo quản: Tiến hành theo phương pháp thích hợp đã được thẩm định, tiêu chuẩn phải được cơ quan Kiểm định quốc gia chấp thuận. An toàn không đặc hiệu: vắc xin đạt yêu cầu về an toàn không đặc hiệu khi tất cả các chuột thử nghiệm s ố ng sót và tăng cân sau 7 ngày theo dõi (Phụ lục 15.11). pH: Đối với vắc xin là chế ph ẩ m dạng l ỏ ng: giá trị pH nằm trong khoảng mà cho thấy là an toàn và hiệu quả trong thử nghiệm lâm sàng và nghiên cứu tính ổn định (Phụ lục 15.33). Đối với vắc xin l à chế phẩm đông khô: Tiến hành đo pH sau khi hoàn nguyên với dung dịch thích hợp; giá trị pH nằm trong kho ả ng mà cho thấy là an toàn và hiệu quả trong thử nghiệm lâm sàng và nghiên cứu tính ổn định (Phụ lục 15.33). Cảm quan: Quan sát bằng mắt thư ờ ng vắc xin không có dấu hiệu bất thường: l ỏ ng nút, nắp, hàn không đạt yêu cầu, nứt, vỡ, không có vật thể lạ... Đóng gói Phải tuân thủ theo GMP và các quy định hiện hành. Nhãn, hộp Những thông tin ghi trên nhãn, hộp, tờ hướng dẫn sử dụng phải đáp ứng những yêu cầu của các quy định hiện hành và đặc biệt phải ghi đủ các thông tin về hàm lượng của từng polysacharid; tên và hàm lượng của protein mang của 1 liều sử dụng cho người; tên, hàm lượng của chất hấp phụ; điều kiện sử dụng, bảo quản vắc xin (lắc trước khi dùng, không được để đông băng). Bảo quản Trong bao bì k í n, ở nhiệt độ từ 2 o C đến 8 o C. Hạn sử dụng Các tuyên bố về hạn sử dụng, nhiệt độ bảo quản sẽ phải dựa trên kết quả nghiên cứu về tính ổn định của vắc xin và phải đệ tr ì nh lên cơ quan quản lý quốc gia phê chu ẩ n.