TCVN10807-2:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10807-2:2015 (ISO 13641-2:2003) về Chất lượng nước - Xác định sự ức chế quá trình tạo khí của vi khuẩn kỵ khí - Phần 2: Phép thử đối với nồng độ sinh khối thấp TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10807-2:2015 ISO 13641-2:2003 CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH SỰ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH TẠO KHÍ CỦA VI KHUẨN KỴ KHÍ - PHẦN 2: PHÉP THỬ ĐỐI VỚI NỒNG ĐỘ SINH KHỐI THẤP Water quality - Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria - Part 2: Test for low biomass concentrations Lời nói đầu TCVN 10807-2:2015 hoàn toàn tương đương với ISO 13641-2:2003 TCVN 10807-2:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 147 Chất l ượ ng nước biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ tiêu chuẩn TCVN 10807 (ISO 13641) , Ch ấ t l ượ ng nước - Xác định sự ức chế quá trình tạo khí của vi khuẩn kỵ khí gồm các phần sau: - TCVN 10807-1:2015 (ISO 13641-1:2003), Phần 1: Phép thử chung; - TCVN 10807-2:2015 (ISO 13641-2:2003), Phần 2: Phép thử đối với nồng độ sinh khối thấp. CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH SỰ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH TẠO KHÍ CỦA VI KHUẨN KỴ KHÍ - PHẦN 2: PHÉP THỬ ĐỐI VỚI NỒNG ĐỘ SINH KHỐI THẤP Water quality - Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria - Part 2: Test for low biomass concentrations CẢNH BÁO - M ẫ u bùn thả i có thể chứa chất nguy hạ i và d ễ cháy. Mẫu bùn chứa các vi sinh vật gây bệnh và có khả năng tạo ra các tác động sinh học. Do đó, khuy ế n nghị xử lý mẫu đặc biệt c ẩ n thận. Hoạt t í nh sinh học của vi sinh vật có thể tạo ra các loại khí dễ cháy tiềm ẩn và t ă ng áp suất trong chai k í n. Việc n ổ các bình đựng mẫu thường kéo theo sự phát tán các mảnh nhi ễ m khuẩn hoặc các hạt ch ấ t l ỏ ng mang m ầ m b ệ nh. N ê n tránh sử dụng chai thủy tinh. Việc l ấ y mẫu, vận chuyển và sử dụng mẫu bùn và dùng các ống tiêm nh ỏ và các kim ti ê m đo áp su ấ t phải hết sức cẩn trọng. Phải tuân thủ các quy định quốc gia đối với các mối nguy hại từ vi sinh vật liên quan đến phương pháp này. Cần thao tác thận tr ọng với các vật liệu thử độc hại và các vật liệu không r õ đặc tính. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp sàng lọc để đánh giá độc tính tiềm ẩ n của các ch ấ t, hỗn hợp, nước mặt, nước ngầm, nước th ả i, nước th ả i đã qua xử lý, bùn thải hoặc các mẫu môi trường khác bằng cách xác định sự tạo khí sinh học (cacbon đioxit và metan) từ bùn, trầm t í ch và môi t rư ờng kỵ khí khác c ó nồng độ sinh khối thấp. Tốc độ sinh trư ở ng của vi khuẩn kỵ khí thấp hơn nhiều so với tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật hiếu khí. Vì lý do này, khoảng thời gian thử trong phương pháp kỵ khí dài hơn so với phương pháp sử dụng cho vi khu ẩ n hiếu khí. Điều kiện của phép thử này (ví dụ lượng chất cấy và ch ấ t nền trong chai thử) được chấp nhận cho một thời gian thử nhất định qua vài ngày. Chất cấy có thể được l ấ y từ trầm tích kỵ khí, hoặc phòng thí nghiệm qui m ô lớn, hệ thống phân hủy kỵ khí. Phương pháp này có thể áp dụng cho các chất, tan hoặc không tan trong nước, bao gồm cả hóa chất dễ bay hơi (xem trong tài liệu tham khảo [1] trong thư mục tài liệu tham khảo). CHÚ THÍCH: C ầ n đặc bi ệ t c ẩ n trọng với các hợp ch ấ t í t hòa t a n trong nước, và trong trường hợp này, xem ví dụ. TCVN 6918 (ISO 10634). Đối với các thông tin chung v ề phép thử sinh học xem ISO 5667-16 [ 2 ] . Thông tin thu được từ tiêu chuẩn này có thể cũng hữu í ch trước phép thử phân hủy sinh học kỵ khí với nồng độ khối lượng chất cấy thấp và để ước tính ảnh hưởng tiềm ẩn của các hóa chất và nước thải tới quá trình kỵ khí trong tr o ng môi trường sống đặc trưng bởi sinh khối kỵ khí thấp, ví trầm tích và ch ấ t rắn tự nhiên. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 6918 (ISO 10634), Chất lượng nước - Hướng dẫn chuẩn bị và xử lý hợp chất hữu cơ ít tan trong nước để đánh giá sự phân huỷ sinh học trong môi trường nước. 3. Nguyên tắc Các lượng nhỏ của h ỗ n hợp bùn đang phân hủy kỵ khí pha lo ã ng hoặc nguồn vi khuẩn kỵ khí khác, và chất nền có khả n ă ng phân hủy được ủ riêng và đồng thời với một dãy nồng độ khối lượng của vật liệu thử trong chai kín trong thời gian ủ nhất định ở 35 o C. Lượng khí sinh học (metan và cacbon đioxit) tạo ra được đo b ằ ng sự gia tăng về áp suất trong chai trước và sau khi thêm axit đến khi giải phóng cacbon đ i oxit từ cacbonat. Phần trăm ức chế tạo khí sinh học ở các nồng độ khối lượng khác nhau của vật liệu thử được tính bằng lượng khí tạo ra trong phép thử tương ứng và trong chai đối chứng. Chỉ số EC 50 và nồng độ khối lượng hiệu quả khác được tính t ừ đồ thị phần trăm ức chế đối với logarit của nồng độ khối lượng của vật liệu thử. Nếu có thể sử dụng kỹ thuật này cho các điều tra đánh giá đặc biệt, ví dụ với các trầm tích từ những nơi sống của vi sinh vật kỵ khí ngo à i tự nhiên. Trong trường hợp này, nhiệt độ ủ trong chai thử có thể là nhiệt độ của các trầm tích tự nhiên. Các trầm tích kỵ khí có thể chứa một lượng lớn các chất vô cơ và một số tế bào và v ì vậy hoạt t í nh của vi khuẩn có thể rất thấp trong những trường hợp như vậy, do đó cần thời gian ủ dài hơn. 4. Thuốc thử và môi trường nuôi cấy 4.1 . Thuốc thử 4.1.1 . Nước pha loãng, đã được loại khí và loại ion Các kiểm soát về phân tích của nước này là không cần thiết, nhưng phải đảm bảo rằng hệ thống loại ion được bảo trì thường xuyên. Trước khi thêm chất cấy kỵ khí vào bất kỳ dung dịch hoặc dịch pha loãng nào của vật liệu thử, cần đảm bảo dịch này không chứa oxy. Vì thế, c ầ n sục khí nitơ (4.1.2) qua nước pha lo ã ng hoặc qua dịch pha loãng trong 1 h trước khi thêm chất cấy, hoặc thay thế bằng cách đun sôi nước pha loãng và để nguội ở nhiệt độ phòng trong môi trường không có oxy. 4.1.2 . Khí nitơ, độ tinh khiết cao chứa hàm lượng khí oxy nh ỏ h ơ n 5 m l/l. 4.1.3 . Axit phosphoric (H 3 PO 4 ), 85 % theo khối lượng trong nước. 4.2 . Môi trường nu ô i cây 4.2.1 . Chất cấy Thu thập bùn kỵ khí đang phân hủy mạnh từ toàn thang đo, hoặc phòng thí nghiệm, hệ thống ph â n hủy hoặc trầm tích kỵ khí từ các nguồn tự nhiên thích hợp. Ghi lại nguồn gốc và chủng loại của chất cấy trong báo cáo thử. Nh ữ ng chai lấy mẫu phải được trang bị gioăng kín khí và được làm b ằ ng polyetylen tỷ trọng cao hoặc vật liệu tương tự, có thể co dãn. Chai thủy tinh không được khuyến nghị vì chai này có thể nổ. Làm đầy chai mẫu tới cách miệng khoảng 1 cm, gioăng chai chặt và đặt vào thùng b ả o ôn (5.1) để giảm tối đa sự sốc nhiệt, cho đến khi được chuyển vào tủ ủ (5.10) duy trì ở nhiệt độ thử mong muốn. Khi mở chai, cẩn trọng xả áp suất khí bằng cách nới l ỏ ng gioăng từ từ hoặc lắp van xả áp ba chiều (5.3) vào nắp chai. Tốt nhất là sử dụng chất cấy trong vài giờ sau khi lấy mẫu, hoặc bảo quản chai ở nhiệt độ thử (6.1) mà phần trống của chai có chứa khí nitơ tối đa 3 ngày v ì trong khoảng thời gian này việc mất hoạt tính thường x ả y ra ở mức độ th ấ p. Ngay trước khi sử dụng, trộn chất c ấ y bằng cách khuấy nhẹ và lọ c qua rây (5.2) vào chai thích hợp (5.4) c ó d ò ng khí nitơ đi qua ở phần trống của bể (4.1.2). Đặt ri ê ng một mẫu để xác định nồng độ khối lượng của tổng chất rắn khô (ví dụ xem TCVN 6625 (ISO 11923 )) . Nồng độ khối lượng của hệ thống bùn phải trong khoảng từ 20 g/ l đến 40 g/l ch ấ t rắn khô nhưng trầm tích kỵ khí sẽ c ầ n khoảng biến đổi nhiều hơn. Do đó, một số bùn có thể yêu cầu pha loãng sử dụng nước pha loãng (4.1.1) và một số trầm tích cần phải cô đặc bằng ly tâm. Sử dụng nồng độ khối lượng cuối cùng khoảng 0,20 g/l ± 0,05 g/l tổng chất rắn khô. Ki ể m tra giá trị pH của chất cấy và nếu cần điều chỉnh về 7 ± 0,5. Trong quá trình ly tâm hoặc pha loãng chất cấy phải chắc chắn rằng không có oxy xâm nhập vào huyền phù. Ví dụ, đ ể ly tâm sử dụng các chai đ ã đóng nắp và phủ chất lỏng bằng khí nitơ. Nên sử dụng hộp găng tay (5.9), đ ã làm đầy b ằ ng khí nitơ (4.1.2), cho tất cả các bước chuẩn bị. 4.2.2 . Môi trường thử, chuẩn bị môi trường thử đậm đặc 10 lần (4.2.2.1) với một dung dịch nguyên t ố vết (4.2 2.2). Sử dụng natri sun f it nonahyrat cung cấp mới [4.2.2.1 h)] hoặc r ử a và làm khô trước khi sử dụng, để đảm bảo rằng môi trường có đủ khả năng khử. Nếu tiến hành phép thử mà không sử dụng hộp găng tay (5.9), nồng độ khối lượng của natri sun f it trong dung dịch gốc phải t ă ng tới 2 g/l. Natri sunfit có thể cũng được thêm từ dung dịch gốc kỵ khí thích hợp qua đệm nắp của chai thử đã đóng kín, khi đó quy trình này sẽ giảm nguy cơ oxy hóa, để thu được nồng độ khối lượng cuối cùng là 0,2 g/ l . Hoặc có thể thay thế bằng cách sử dụng titani (III) xitrat [4.2.2.1 h)]. Thêm titani III xitrat qua đệm nắp của chai thử đã đóng kín để thu được nồng độ khối lượng cuối cùng từ 0,8 mmol/l đến 1,0 mmol/l. Titani (III) xitrat là tác nhân khử có hiệu ứng cao và là tác nhân khử có độc tính thấp, được chuẩn bị như sa u . Hòa tan 2,94 g trinatri xitrat dihydrat vào 50 ml nước pha loãng không có oxy (để thu được dung dịch 200 mmol/l) v à thêm 5 ml dung dịch titani (III) clorit (15 g/100 ml nước pha loãng). Trung hòa tới pH = 7 ± 0,5 b ằ ng natri cacbonat và phân chia vào chai dạng huyết thanh thích hợp trong dòng khí nitơ. Nồng độ của titani (III) xitrat trong dung dịch gốc là 164 mmol/l. Sử dụng ngay môi trường thử hoặc bảo quản ở 4 o C không quá 1 ngày. 4.2.2.1 . Môi trường thử đậm đặc mười lần, được chuẩn bị như sau: a) Kali dihy d rophosphat khan (KH 2 PO 4 ) 2,7 g b) Natri hydrophosphat (Na 2 HPO 4 ) 4,44 g (hoặc 11,2 ngậm mười phân tử nước) c) Amoni clorua NH 4 CI 5,3 g d) Canxi clo ru a ngậm hai phân tử nước (CaCI 2 .2H 2 O) 0,75 g e) Magie clorua ngậm sáu phân tử nước (MgCI 2 .6H 2 O) 1,0 g f) Sắt (II) clorua ngậm bốn phân tử nước (FeCI 2 .4H 2 O) 0,2 g g) Resazu (ch ỉ thị oxy hóa kh ử ) (diazoresoxin C 12 H 7 O 4 N) 0,01 g h) Natri sunfit ngậm chín phân tử nước (Na 2 S . 9H 2 O) 1,0 g hoặc titani (III) xitrat nồng độ cu ố i cùng 0,8 mmol/l tới 1,0 mmol/ l i ) Dung dịch nguyên tố vết (xem 4.2.2.2) 10,0 ml j) Chiết nấm 50 g H ò a tan vào trong nước pha loãng (4.1.1) và làm đầy tới 1 000 ml. 4.2.2.2 . Dung dịch nguyên t ố vết , đã chuẩn bị như sau: a) Mangan (II) clorua ngậm bốn phân tử nước (MnCI 2 .4H 2 O) 0,5 g b) Ortho axit boric (H 3 BO 3 ) 0,05 g c) Kẽm clorua (ZnCI 2 ) 0,05 g d) Đồng (II) clorua (CuCI 2 ) 0,03 g (hoặc dihydrat 0,035 g) e) Natri molypdat ngậm hai ph â n t ử nước (Na 2 Mo O 4 .2H 2 O) 0,01 g f) Coban (II) clorua ngậm sáu phân tử nước (CoCI 2 .6H 2 O) 1,0 g g) Niken (II) clorua ng ậ m sáu phân tử nước (NiCI 2 .6H 2 O) 0,1 g h) Dinatri selenit (Na 2 Se O 3 ) 0,05 g Hòa tan trong nước pha loãng và làm đầy tới: 1000 ml 5. Thiết bị, dụng cụ 5.1 . Thùng bảo ôn , để vận chuyển chất cấy. 5.2 . Rây , có kích thước lỗ 1 mm 2 . 5.3 . Van xả áp chạc ba , có thể gắn vừa khít với nắp chai thu chất cấy. 5.4 . Bể chứa bùn phân hủy hoặc chất cấy khác , bao gồm một chai nhựa hoặc thủy tinh (dung tích khoảng 5 I) gắn với một máy khuấy và thiết bị dẫn chuyển dòng khí nitơ đi qua phần trống của chai. 5.5 . Máy ly tâm , để xác định nồng độ khối lượng của chất rắn đem cấy. 5.6 . Chai thử thủy tinh đã kín khí chịu áp suất , kích thước danh định thích hợp. Ví dụ, sử dụng chai huyết thanh dung tích danh định 125 ml có thể tích tổng thực tế là 160 ml, được gioăng kín khí bằng đệm nắp và các vòng nhôm khía rãnh. Tốt nh ấ t là sử dụng đệm nắp làm bằng silicon hoặc cao su butyl phủ polytetra f loroeten c ó khả năng chịu áp suất khoảng 2 x 10 5 Pa. Sử dụng độ kín khí của nắp, đặc biệt đệm nắp bằng cao su butyl, nên được kiểm tra trước vì nhiều đệm nắp có sẵn trên th ị trường không đ ủ kín đối với metan, và một số loại đệm nắp khác khi bị kim xuyên qua th ì không còn kín như yêu cầu về điều kiện của phép thử này. 5.7 . Micro xyranh , để nối kín khí giữa máy đo áp suất với ph ầ n trống của chai; đồng thời để thêm d ị ch l ỏ ng không tan hoặc axit vào chai và đ ể xả khí sinh học. 5.8 . Máy đo áp suất chính xác để đo t ổ ng lượng khí sinh học (metan cộng với cacbon dioxit). Kim được gắn vào nhằm thực hiện phép đo và xả khí sinh học tạo ra. Ví dụ về thiết bị thích hợp l à máy đo áp suất chính xác cầm tay được nối với kim tiêm; một van kín khí chạc ba dùng để xả áp khí quá mức. Hiệu chuẩn máy đo (xem Phụ lục A) đ ể cho phép chuyển đổi đại lượng đo áp suất sang thể tích khí, nếu cần. Thể tích bên trong của hệ thống ống đo áp suất và van phải giữ thấp tới mức có thể, sao cho sai số do bỏ qua thể tích thiết bị là không đáng kể. Nếu sử dụng máy đo áp suất có ch ấ t lượng như đã mô tả (ví dụ đóng nắp bằng màng thép), thì không cần hiệu chuẩn trong phòng th í nghiệm. M á y đo áp suất này phải do một đơn vị được cấp phép hiệu chuẩ n trong khoảng thời gian như khuyến nghị của nhà sản xuất. Độ chính xác của hiệu chuẩn có thể được kiểm tra trong phòng thí nghiệm bằng phép đo một điểm ở 1 x 10 5 Pa so với máy đo áp suất có bộ hiển thị cơ học. Khi điểm đo này được đo đúng cách thức, thì độ tuyến tính cũng sẽ không bị thay đổi. Nếu sử dụng thiết bị đo khác (mà không có hiệu chuẩn được xác nhận bởi nh à sản xuất), th ì nên tiến h à nh hiệu chuẩn trên toàn thang đo tại những khoảng thời gian qui định. 5.9 . Hộp găng tay (tùy chọn), có áp suất dương nitơ thấp. 5.10 . Tủ nuôi ủ ch ố ng cháy , tốt nhất là được trang bị thiết bị lắc, và c ó khả năng duy trì nhiệt độ ở 35 o C ± 1 o C hoặc nhiệt độ yêu cầu khác. 6. Môi trường thử và cản trở 6.1 . Môi trường thử Tiến hành phép thử bằng cách ủ chai thử đã gioăng kín ở nhiệt độ ổn định 35 o C ± 1 o C trong điều kiện không có oxy, ban đầu trong môi trường khí nitơ, trong tối hoặc trong sáng khuyếch tán. Sử dụng nitơ có độ khiết cao (4.1.2). Trong trường hợp đặc biệt, ví dụ sử dụng trầm tích kỵ khí làm chất cấy, nếu có thể thực hiện phép thử ở nhiệt độ tương tự để môi trường tự nhiên nằm trong khoảng có thể so sánh được (ví dụ 20 o C ± 1 o C). 6.2 . C ả n tr ở 6.2.1 . Độ ẩm trong kim tiêm của xyranh Độ ẩ m trong kim tiêm và ống n ố i của máy đo áp suất có thể dẫn đến số đọc áp suất không chính xác (xem 7.4). 6.2.2 . Nhiễm oxy Phương pháp kỵ khí thường bị sai số t ừ việc nhiễm oxy. Trong phương pháp này, ch ấ t gây cản trở được giảm thiểu bằng sử dụng kỹ thuật xử lý kỵ khí nghiêm ngặt. 6.2.3 . pH của môi trường nuôi c ấ y Hoạt tính của vi sinh vật nuôi cấy kỵ khí là rất nhạy cảm với giá trị pH. Phải đảm bảo pH của hỗn hợp phản ứng được điều chỉnh về pH 7 ± 0,5 và duy trì trong khoảng từ pH 6,2 đến pH 7,5 cho đến khi kết thúc quá trình ủ (xem 7.5). 6.2.4 . Ch ấ t lượng nắp chai Các loại đệm nắp khác nhau có sẵn trên thị trường. Nhiều loại trong số đó không giữ chặt được khí sau khi b ị xuyên kim trong điều kiện phép thử (6.1). Đôi khi áp suất giảm rất chậm khi đệm nắp b ị xuyên bởi kim tiêm của xyranh. 6.2.5 . Tồn d ư chất nền trong ch ấ t cấy Quá trình t ạo khí sinh học kỵ khí và độ nhạy của chất c ấ y bị ảnh hưởng bởi chất nền được chuyển từ dịch cấy vào trong chai thử. Bùn b ị phân hủy trong hệ thống phân hủy kỵ khí quy mô gia đình thường chứa vật liệu như cát, tó c hoặc chất bã xeluloza từ thực vật. Sàng lọc bùn để loại bỏ các chất thô không tan để thu được mẫu đại diện. 6.2.6 . Hóa chất d ễ bay hơi Hóa chất dễ bay hơi có thể được giải phóng vào trong phần trống của chai huyết thanh. Việc n à y có thể dẫn đến thất thoát một số vật liệu thử từ hệ t hống trong quá trình sục khí sau khi đo áp suất, làm cho giá trị EC 50 cao gi ả . Chi tiết xem t à i li ệu tham khảo [1] trong thư mục tài liệu tham khảo. 7. Cách tiến hành 7.1 . Thiết lập phép thử và ph é p thử sơ bộ 7.1.1 . Thiết lập phép thử Số lượng các lần lặp lại cần thiết phụ thuộc vào mức độ chính xác cần c ó để thu được ch ỉ số ức chế c ó thể chấp nhận được. Nếu gioăng của chai đủ chặt trong suốt quá trình thử, chỉ cần thiết lập một mẻ thử tốt nh ấ t là với ba lần lặp lại của chai thử cho mỗi nồng độ kh ố i lượng. Tương tự thiết lập một mẻ chai cho chất chuẩn và một mẻ cho chất đối chứng. Tuy nhiên, nếu gioăng của chai ch ỉ đáng tin cậy cho một hoặc vài l ầ n châm kim, nên thiết lập một mẻ chai thử với ba lần lặp lại cho mỗi khoảng thời gian ( t ) và thiết lập này phải tiến hành thử cho tất cả các nồng độ khối lượng vật liệu thử. Tương tự thiết lập thời gian “ t ” cho mẻ chai chất chuẩn và đối chứng. Nên sử dụng hộp găng tay (5.9). Í t nhất 30 min trước khi bắt đầu phép thử, cho khí nitơ ch ả y vào hộp găng tay chứa tất cả các thiết bị thử cần thiết. Nếu không sử dụng hộp găng tay, loại khí trong chai b ằ ng cách sử dụng nitơ để thay thế không khí. Phải đảm bảo nhiệt độ của chất cấy tương ứng với nhiệt độ ủ (6.1) trong suốt kho ả ng thời gian xử lý và gioăng kín chai. 7.1.2 . Phép thử s ơ bộ Nếu chưa biết hoạt t í nh của chất c ấ y (4.2.1), nên tiến hành phép thử sơ bộ. Ví dụ, thiết lập mẫu đối chứng với nồng độ khối lượng của chất rắn là 0,1 g/ l , 0,2 g/ l và 0,4 g/I được th ê m vào chất nền mà không sử dụng vật liệu thử. Đồng thời sử dụng chai có thể tích khác nhau để có 3 hoặc 4 tỷ l ệ khác nhau giữa thể tích của phần trống của chai và thể tích của chất lỏng. Đo khí sinh học trong các khoảng thời gian đị nh kỳ. Từ những kết quả về khí sinh học được sinh ra có thể thiết lập các điều kiện phù hợp nhất cho phép thử chính để có lượng khí sinh học đ ủ cho phép đo và do đó có độ nhạy tối ưu mà không sợ nổ. Sử dụng kết quả từ phép thử sơ bộ , lựa chọn tần suất mà tại đó phải tiến hành phép đo áp suất, thời gian thử và sự cần t hiết của axit hóa ở cuối phép thử. 7.2 . Vật liệu thử và đối chứng 7.2.1 . Vật liệu thử 7.2.1.1 . Dung dịch hợp ch ấ t thử Chuẩn bị dung dịch gốc riêng biệt cho mỗi hợp chất thử tan trong nước bằng nước pha loãng không chứa oxy (4.1.1) đ ể thu được, ví dụ như, 10 g/l vật liệu thử. Sử dụng các thể tích dung dịch gốc thích hợp để chuẩn bị các hỗn hợp phản ứng có chứa các nồng độ khối lượng đạt mức. Phương pháp thay thế có thể tiến hành bằng cách chuẩn bị một dãy pha loãng của từng dung dịch gốc để thể tích được thêm vào các chai thử là như nhau cho mỗi nồng độ khối lượng cuối cùng đã yêu cầu. Thêm các chất ít hoặc không tan trong nước, ví dụ, như các dung dịch trong dung môi bay hơi. Chuẩn bị dung dịch như vậy ở nồng độ khối lượng thích hợp trong dung môi phù hợp, ví dụ, axeton hoặc dietyl ete (nhưng không sử dụng dung môi ức chế như triclorometan hoặc tetraclorometan). Thêm dung dịch vào chai thử rỗng (5.6) và làm bay hơi dung môi trước khi thêm chất cấy. Vật liệu thử lỏng không tan trong nước có thể được bơm trực tiếp vào chai huyết thanh bằng micro xyranh (5.7). S ử dụng TCVN 6918 (ISO 10634), nhưng cần hiểu rằng mọi chất hoạt động bề mặt được sử dụng đều tạo ra dịch nhũ tương có thể ức chế quá trình tạo kh í sinh học kỵ kh í . Thêm vật liệu thử vào chai (5.6) để tạo ra dãy các nồng độ khối lượng theo cấp số nhân, ví dụ, 500 mg/l, 250 mg/l, 125 mg/l, 62,5 mg/l, 31,2 mg/l và 15,6 mg/l. Nếu chưa biết dãy độc t í nh của các hợp chất tươ ng t ự , phải tiến h à nh phép thử để t ì m dãy nồng độ sơ bộ với các nồng độ khối lượng, ví dụ như, 1000 mg/ l , 100 mg/I và 10 mg/l để xác định chính xác dãy nồng độ thích hợp. 7.2.1.2 . M ẫ u nước và nước thải Sử dụng mẫu nước và nước thải ban đầu làm dung dịch gốc, và, nếu cần, điều chỉnh pH về 7 ± 0,5 nếu chưa xác định được ức chế là do mẫu có tính axít hoặc tính kiềm. Thêm nước và nước thải vào chai (5.6) để tạo ra dãy dung dịch pha loãng cuối cùng theo cấp số nhân: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 và v.v.. trong đó các tỷ lệ pha lo ã ng tính bằng tương quan giữa thể tích của nước hoặc nước thải với thể tích tổng cuối cùng. Khi thử nước thải, nồng độ khối lượng phép thử lớn nhất có thể có là tương ứng với 50 % mẫu nước thải. Đó là kết quả của việc thêm nước thải ban đầu vào chai thử (5.6) và một thể tích tương đương huyền phù chất c ấ y. Phải bảo đảm nước thải hoặc nước thử khác là hoàn toàn không chứa oxy. Ví dụ, sục bọt khí nitơ (4.1.2) qua các dịch pha loãng ít nhất 1 h hoặc sử dụng nước pha loãng không có kh í oxy (4.1.1) 7.2.2 . Hợp ch ấ t chuẩn và đối chứng Chuẩn bị dung dịch thể lỏng của hợp chất chuẩn, 3,5-diclorophenol (10 g/l), bằng cách vừa thêm từ từ dung dịch natri hydroxit (250 g/l) vào chất rắn, vừa lắc liên tục cho đến khi chắt rắn được hòa tan. Sau đó thêm nước pha loãng đã khử oxy (4.1.1) tới thể tích yêu cầu. Có thể sử dụng rung siêu âm để hỗ trợ việc hòa tan. Có thể sử dụng chất chuẩn khác khi dãy giá trị trung bình của EC 50 đ ã được thử. Trong trường hợp này, thích ứng với chuẩn cứ đánh giá giá trị sử dụng. Thiết lập m ẻ chai với ít nhất ba lần lặp lại (5.6), ch ỉ chứa bùn (4.2.1) và chất nền (4.2.2), để làm đối chứng. Thiết lập thêm các chai lặp lại (5.6), chứa chất cấy (4.2.1) và môi trường thử (4.2.2). Thêm lượng vừa đủ d ung dịch gốc của chất chuẩn (3,5- d icloropheno l ) vào các chai này để thu được nồng độ khối lượng cuối cùng là 113 mg/l. Nồng độ khối lượng này của 3,5-diclorophenol sẽ ức chế việc tạo khí sinh học khoảng 50 %. Cách khác, có thể thiết lập một dãy nồng độ khối lượng thích hợp với cùng chất chuẩn. Ngoài ra, thiết lập thêm 4 chai (5.6) sử dụng để đo pH có chứa chất cấy (4.2.1), môi trường vô cơ và chất nền. Thêm vật liệu thử (7.2.1) vào 2 chai có nồng độ khối lượng lớn nhất được thử và thêm nước pha loãng đã khử oxy vào 2 chai còn lại. 7.3 . Thêm ch ấ t cấy và môi trường thử Khuấy một thể tích thích hợp chất bùn đang phân hủy qua sàng lọc hoặc chất cấy khác (4.2.1) trước khi điều chỉnh từ n ồ ng độ khối lượng từ 0,4 g/l đến 2 g/ l chất r ắ n khô tổng trong chai 5 I (5.4), trong lúc cho dòng khí nitơ đi qua (4.1.2) phần trống của chai. Phun một dòng khí nitơ vào chất thử (7.2.1.1). trong khoảng 2 min để loại bỏ không khí. Thêm nước pha loãng đã khử oxy (4.1.1) vào chai chứa vật liệu thử không tan (7.2.1) để thu được thể tích l ỏ ng t ổ ng tương tự trong chai thử. Ví dụ về thiết lập phép thử cho mẻ thử được nêu trong Bảng 1. Phải bảo đảm thể tích phần trống của chai trong khoảng đã chỉ thị bằng phép thử sơ bộ và tất cả các chai này (chất đối chứng, chất thử và chất chuẩn) có chứa cùng một thể tích chất lỏng; nếu cần, thêm nước pha lo ã ng đã loại oxy để thu được thể tích cần. Ví dụ chọn tỷ lệ giữa khí sinh học với thể tích chất lỏng từ các các kết quả của các phép thử sơ bộ (7.1.2). Sau khi mỗi chai đã định lượng xong, rứt kim cung cấp khí nitơ và gioăng kín chai bằng nút cao su và nắp nhôm và làm ẩ m nút bằng vài giọt nước đã loại ion để hỗ trợ việc đóng nắp. Trộn đều các chất trong mỗi chai bằng lắc và ủ . Bảng 1 - Ví dụ về thiết lập phép thử cho m ẻ thử Hỗn hợp phản ứng Ví dụ 1 Ví dụ 2 Nồng độ khối lượng của ch ấ t c ấ y đã chuẩn bị (4.2.1) 0,42 g/l 2,1 g/l Thể tích thêm vào của chất cấy (4.2.1) 45 ml 9 ml Nồng độ khối lượng cuối của chất cấy trong chai thử 0,20 g/ l 0,20 g/ l Lượng thêm vào của môi trường thử (4.2.2) 9 ml 9 ml Lượng thêm vào của nước pha loãng (4.1.1) 36 ml 72 ml N ồ ng độ khối lượng của chiết n ấ m trong chai thử [4.2.2.1 j)] 9,7 g/l 9,7 g/l Dung dịch gốc của hợp chất thử (7.2.1) 3 ml 3 ml Thể tích chất lỏng tổng 93 ml 93 ml 7.4 . Ủ chai và đo áp suất Chuyển chai đã đóng kín vào t ủ ủ ổn nhiệt tốt nhất tủ ủ có thiết b ị lắc (5.10) và ủ ở nhiệt độ mong đợi. Nếu ủ chai không có phương tiện lắc, th ì lắc chai bằng tay hai lần mỗi ngày trong toàn bộ thời gian ủ để c â n bằng hệ thống. Úp ngược chai có thể ngăn ng ừ a việc thất thoát khí sinh học qua đệm nắp. Tuy nhiên, úp ngược không thích hợp trong trường hợp chất không tan có thể dính chặt vào đáy của chai. Sau khoảng 1 h, cân bằng áp suất trong chai với áp suất khí quyển b ằ ng cách lần lượt xuyên kim xyranh đã g ắ n với máy đo áp suất qua đệm nắp của mỗi chai. Tốt nhất nên xuyên kim tạo góc khoảng 45 o để ngăn thoát khí thoát ra từ chai. Mở van cho đến khí áp suất đạt tới “không” và đ ó ng van. Thường ủ các chai trong 7 ngày. Sử dụng kinh nghiệm của phép thử sơ bộ (7.1.2) để quyết định thời gian thử. Ví dụ, nếu sử dụng trầm tích làm ch ấ t cấy và nhiệt độ ủ của phép thử thấp, nếu có thể cần để phải kéo dài phép thử cho đến khi tạo ra đủ khí sinh học. Nếu tạo ra đ ủ kh í sinh học ngắn hơn 7 ngày, th ì phép thử ph ả i được rút ngắn tương ứng. Xác đ ị nh tổng lượng khí sinh học đã sinh ra b ằ ng phép đo áp suất đều đặn trong toàn bộ thời gian ủ . Chọn khoảng thời gian đo sao cho các điểm số liệu đ ủ để vẽ một đường về tạo kh í sinh học tích lũy. Sử dụng các kết quả t ừ phép thử sơ bộ (7.2.1) để quyết định tần suất đo. Hoặc thay th ế khác, ví dụ nếu biết rõ sự tạo khí sinh học của chất cấy, th ì có thể chỉ đo áp suất ở cu ố i phép thử. Để đo áp suất xuyên kim xyranh được nối với máy đo áp suất chính xác (5.8), qua đệm nắp của chai. Để số đọc áp suất ổ n định và ghi lại kết quả. Sau đó mở van x ả khí. Đóng van khi áp suất đọc giá trị là “không”. Làm khô kim thật kỹ trước khi gắn vào chai tiếp theo và đo bằng cách tương tự. Nếu áp suất có giá trị âm, không m ở van. Đôi khi hơi nước tích tụ trong k i m xyranh và ống dẫn. Việc tích tụ của hơi nước được chỉ thị bằng chỉ s ố áp suất hơi âm thấp. Trong trường hợp này loại b ỏ kim, lắc ống dẫn, làm khô bằng gi ấ y và gắn một kim mới. Sử dụng kết quả từ phép thử sơ bộ (7.1.2) để quyết định sự axit h ó a ở cuối phép thử có hữu ích không. Nếu chỉ thực hiện một phép đo hoặc tại phép đo cuối sử dụng micro xyranh (5.7) thêm 0,5 ml ax i t phosphoric (4.1.3) vào mỗi chai. Lắc chai ít nhất 30 min. Sau đó cacbon đioxit được tạo ra sẽ thoát khỏi chất lỏng sang pha khí. Cách khác phép đo áp suất trước và sau khi thêm axit, để phân biệt giữa khí sinh học có ch ứ a chủ yếu cacbon đioxit, c ó trong chất lỏng, và khí sinh học có chứa chủ yếu metan, có trong phần trống của chai. Thông tin này có thể hữu ích đ ể kiểm soát chất lượng của chất cấy. Khi tỷ lệ của cacbon đioxit tạo ra lớn hơn nhiều so với sự tạo kh í metan, t í nh nhạy c ả m của vi khu ẩ n lên men có thể bị thay đổi. Tỷ lệ này cũng có thể chỉ thị rằng vi khuẩn lên men metan bị ảnh hưởng chủ yếu do vật liệu thử. Sự thay đổi như vậy sẽ không x ảy ra khi chất cấy có một ít dư lượng chất nền và khi sự chuẩn bị phép thử được tiến hành nghiêm ngặt trong điều kiện kỵ khí ví dụ trong hộp găng tay. 7.5 . Đo pH Đo và ghi lại pH trong các chai thiết lập cho mục đích của phép thử (7.2.2) tại lúc bắt đầu và kết thúc của phép thử. Thêm vào đó, có thể đo pH tại điểm cuối của phép thử trong tất cả các chai để xem có phải phải thêm axit vào hay không. Nếu giá trị pH n ằ m ngoài khoảng từ 6,2 đến 7,5 tại điểm cuối của phép thử, thì kết quả không hợp lệ và phải lặp lại phép thử (xem Điều 9). 8. Tính toán Tính tổng, và giá trị trung bình, của giá trị áp suất được ghi tại từng khoảng thời gian của t ừng bộ chai lặp lại và tính tổng trung bình của áp suất tích lũy khí sinh học. Vẽ đường cong biểu diễn sự tạo khí sinh học tích lũy trung bình ( p , tính bằng Pa) theo thời gian của các chai đối chứng, chai thử và chai chuẩn. Chọn một mốc thời gian ở phần tuyến tính của đường cong, thường là 48 h, và tính phần trăm ức chế ( I ) đối với từng nồng độ khối lượng của vật liệu thử theo Công thức (1). (1) Trong đó: I là phần trăm ức chế; p t là áp suất kh í sinh học tạo ra từ vật liệu thử trong thời gian đã chọn, tính bằng pascals (Pa); p c là áp suất khí sinh học tạo ra trong bình đối chứng ở cùng thời gian, tính b ằ ng pascals (Pa); Vẽ đồ thị biểu diễn phần tr ă m ức chế I dựa vào logarit nồng độ khối lượng của vật liệu thử. Ước tính giá trị EC 50 (mg/l) bằng m ắ t hoặc bằng phân tích hồi quy. Biểu thị nồng độ khối lượng của chất theo phần khối lượng (mg/g) của chất rắn khô tổng đôi khi trợ giúp tốt hơn cho mục đ í ch so sánh. Để có được phần khối lượng n à y, chia nồng độ thể tích (mg/l) với nồng độ khối lượng của chất rắn bùn khô (g/l) (xem 4.2.1). Tính phần trăm ức chế thu được từ nồng độ khối lượng đơn của hợp chất chuẩn (7.2.2) hoặc EC 50 , nếu có đ ủ số nồng độ khối lượng được điều tra nghiên cứu. Trong phép thử ức chế vi khuẩn hiếu khí, I thư ờ ng được vẽ đồ thị dựa vào hàm logarit của nồng độ khối lượng của vật liệu thử. Trong phép thử ức chế chất bùn kỵ khí với một số chất, đồ thị tuy ế n t í nh của I dựa vào nồng độ khối lượng sẽ thích hợp để chỉ sự phụ thuộc gi ữ a nồng độ khối lượng và sự ức chế hơn là so với đồ thị của hàm bán logarit. Sử dụng loại đồ thị n à y cho thấy đường cong gần tuyến tính nhất ở dải n ồ ng độ rộng hơn. Chuyển đổ i áp suất trung bình của khí sinh học tạo ra trong mẫu đối chứng sang thể tích khí sinh học b ằ ng cách tham chiếu đường cong hiệu chuẩn của máy đo áp suất (Phụ lục A) và từ đó tính sản lượng khí sinh học, t í nh bằng thể tích khí tạo ra tại thời gian đã chọn (trong 48 h) từ 100 ml chất cấy pha loãng ở phần khối lượng từ 0,2 g/l đến 0,5 g/l chất rắn khô tổng Trong phép thử nước thải, mức pha loãng thấp nhất không gây ảnh hưởng (giá trị LID), được quan sát trong phép thử, có thể được nêu như kết quả của phép thử. Xem Phụ lục B đ ể biết thêm chi tiết. 9. Tiêu chí đánh giá xác nhận Các giá trị từ phép thử liên phòng thí nghiệm cho thấy chất chuẩn 3,5-diclorophenol gây ra ức chế 50 % hoạt tính của vi khuẩn kỵ khí trong khoảng nồng độ khối từ 60 mg/l đến 200 mg/l (trung bình 113 mg/l). Phép thử có giá trị khi sự ức chế lớn hơn 20 % thu được trong mẫu đối chứng chứa 110 mg/l 3,5-diclorophenol, có hơn 20 ml khí sinh học trên gram mỗi chất khô được tạo từ mẫu đối chứng và giá trị pH trong khoảng từ 6,2 đến 7,5 khi kết thúc phép thử. 10. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau: a) Viện dẫn tiêu chuẩn này; b) Tên, nồng độ khối lượng và phương thích thêm vào của vật liệu thử; c) Nguồn chất cấy (ví dụ bùn kỵ khí đang phân hủy kỵ khí hoạt tính hoặc trầm tích kỵ khí); d) Thời gian và khoảng thời gian thử; e) Tên chất chuẩn và kết quả của sự ức chế (ví dụ EC 50 ); f) Thể tích chất lỏng và phần trống của chai thử; g) Đặc tính tính năng cơ bản của phép đo áp suất và loại máy đo áp suất; h) Tất cả số liệu được đo trong phép thử, chai đối chứng và chai chuẩn (ví dụ áp suất p tính bằng pascals) i) Các kết quả của phép thử, đặc biệt là EC 50 ( tính bằng mg/g của chất khô) và đường cong ức chế. Phụ lục A (Tham khảo) Hiệu chuẩn máy đo áp suất Máy đo phải được hiệu chuẩn tại các khoảng thời gian đều đặn. Việc đọc áp suất có thể liên quan đến các thể tích khí sinh học qua một đường chuẩn được tạo ra khi việc bơm các thể tích khí đã biết ở 35 o C ± 1 o C vào các chai huyết thanh chứa thể tích nước bằng với lượng hỗn hợp phản ứng, V R . - Phân phối V R ml dung dịch vào năm chai huyết thanh, giữ ở 35 o C ± 2 o C. gioăng kín các chai và đặt vào bể nước ổ n nhiệt ở 35 o C trong 1 h để cân bằng nhiệt. - Bật m á y đo áp suất, để ổn định, và điều chỉnh về “không ” . - Châm kim xyranh qua gioăng của một trong s ố các chai, mở van cho đến khi máy đo áp suất chỉ “không ” và đóng van. - Lặp lại quy trình với các chai còn lại. - Bơm 1 ml khi tại nhiệt độ 35 o C ± 1 o C vào mỗi chai. Ch â m kim xyranh (gắn với máy đo) xuyên qua gioăng của một trong các chai và để cho máy đo áp suất đến ổ n định. Ghi l ại áp suất, m ở van đến khi áp suất đọc về “không” và sau đó đ ó ng van. - Lặp lại quy trình với các chai còn lại. - Lặp l ại toàn bộ quy trình trên sử dụng 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 16 ml, 20 ml và 50 ml khí. - V ẽ đường hiệu chuẩn của áp suất (Pa) theo thể tích khi được bơm V b (ml). Phản h ồ i của máy đo l à tuyến tính trong khoảng từ 0 Pa đến 70 000 Pa, và 0 ml đến 50 ml khí. Phụ lục B (Tham khảo) Thể hiện kết quả trong các phép thử với nước thải Trong phép thử nước thải, mức pha loãng thấp nhất không có hiệu ứng được t ì m ra trong quá trình thử (giá trị LID) có thể được dùng để thay thế hoặc thêm vào cùng với giá trị EC. Giá trị LID là mức pha loãng thấp nhất không gây ảnh hưởng (nồng độ khối của nước thải cao nhất) thể hiện ở mức ức chế dưới 20 % trong phép thử. Việc xác định giá trị LID trong nhiều trư ờ ng hợp là đ ủ cho mục đích kiểm soát nước thải tại các khoảng thời gian đều đặn. Nếu khoảng giá trị LID nh ỏ , thì giá trị này thậm ch í có thể được xác định trong các phép thử giới hạn với hai hoặc bốn mức pha loãng. Đánh giá ước lượng giá trị EC là thích hợp hơn để xác định tác động độc của các hợp chất trong các phép thử riêng lẻ. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] WOODS V., PAINTER H.A. and BATTERSBY N.S. A creening method for assessing the inhibition of the anaerobic gas production from se w age sludge. Eds. Steinberg, C. and Kettup, Proc. Int. Symp. om Ecotox i cology; Ecotoxilogical Relevance of Test Method . A. GSF Forschungszentrum, Neuherberg, Germany, 1992, pp. 117 - 132. [2] ISO 5667-16:1998, Water quality - Sampling - Part 16: Guidance on biotesting of samples. [3] TCVN 6825:2001 (ISO 11734:1995), Chất lượng nước - Đánh giá sự phân huỷ sinh học kỵ khí “ hoàn toàn ” các hợp chất hữu cơ trong bùn phân huỷ - Phương pháp đo sự sinh khí sinh học. [4] TCVN 6625:2000 (ISO 11923:1997), Chất lượng nước. Xác định chất rắn lơ l ử ng bằng cách lọc qua c á i lọc sợi thuỷ tinh.