TCVN8710-15:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-15:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas Hydrophila ở cá TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-15:2015 BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 15: BỆNH NHIỄM TRÙNG DO AEROMONAS HYDROPHILA Ở CÁ Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 15: Aeromonas hydrophila in f ection in fish Lời nói đầu TCVN 8710-15:2015 do Trung tâm Ch ẩ n đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ TCVN 8710 Bệnh thủy sản - quy trình ch ẩ n đoán gồm 15 phần: - TCVN 8710-01 : 2011, phần 1: Bệnh Còi do vi rút ở tôm ; - TCVN 8710-02 : 2011, phần 2 : Bệnh Hoại t ử thần kinh ở cá biển ; - TCVN 8710-03 : 2011, phần 3: Bệnh Đốm trắng ở tôm ; - TCVN 8710-04 : 2011, phần 4: Bệnh Đầu vàng ở tôm ; - TCVN 8710-05 : 2011, phần 5: Bệnh Taura ở tôm He ; - TCVN 8710-06 : 2012, phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép ; - TCVN 8710-07 : 2012, phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép; - TCVN 8710-08 : 2012, phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm; - TCVN 8710-09 : 2012, phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm; - TCVN 8710-10 : 2015, phần 10: Bệnh do Perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh v ỏ ; - TCVN 8710-11 : 2015, phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ; - TCVN 8710-12 : 2015, phần 12: Bệnh do Vi bào t ử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm; - TCVN 8710-13 : 2015, phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm - TCVN 8710-14 : 2015, phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá; - TCVN 8710-15 : 2015, phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas ở cá. BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 15: BỆNH NHIỄM TRÙNG DO AEROMONAS HYDROPHILA Ở CÁ Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 15: Aeromonas hydrophila in f ection in fish CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này c ó thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc s ử dụng chúng. Người s ử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi s ử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh nhiễm trùng do Aeromonas hydrophila ở cá. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau: 2.1 . Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas hydrophila (Aeromonas hydrophila lnfection) Bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết do Aeromonas hydrophila ở một số loài cá như cá ba sa, cá tra, cá trắm cỏ, cá rô phi, cá bống tượng... CHÚ THÍCH: Aeromonas hydrophila là vi khuẩn gram âm, di động, h ì nh que ngắn, hai đầu hơi tròn, đầu có một tiêm mao, không có nha bào, không có giác mạc, hiếu kh í v à yếm kh í không bắt buộc, khử nitrat, c ó khả năng lên men, oxidase dương tính. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác. 3.1 . Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung. 3.1.1 . Etano l , từ 70 % (th ể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối. 3.2 . Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp giám định sinh hóa. 3.2.1 . Thạch dinh d ưỡ ng (NA ). 3.2.2 . Thạch chọn lọc Aeromonas spp. (R i mler-Shotts - R-S). 3.2.3 . Thuốc thử cho phương pháp nhuộm Gram (xem A.1). 3.3 . Thuốc thử và vật liệu th ử dùng cho phương pháp PCR. 3.3.1 . Cặp mồi (primes) , gồm mồi xuôi và mồi ngược. 3.3.2 . Agarose. 3.3.3 . Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris-acetate - EDTA) (xem A.2). 3.3.4 . Chất nhuộm màu , ví dụ: Sybr safe. 3.3.5 . Chất đệm tải mẫu (Loading d y e 6X) 3.3.6 . Dung dịch đệm TE (Tris-EDTA). 3.3.7 . Thang chuẩn ADN (Marker) 3.3.8 . Nước tinh khiết , không có nuclease. 3.3.9 . Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit). 3.3.10 . Kít tách chiết ADN (acid deoxyribo nucleic), protein K . 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau: 4.1 . Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp giám định sinh hóa. 4.1.1 . Phiến kính vô trùng. 4.1.2 . Lamen vô trùng. 4.1.3 . Kính hiển vi quang học , vật kính 10 X, 20X, 40 X và 100 X. 4.1.4 . Tủ ấm , duy trì ở nhiệt độ 23 °C. 4.1.5 . Nồi hấp , có thể duy trì ở nhiệt độ 115°C. 4.2 . Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ch ẩ n đoán bằng PCR. 4.2.1 . Máy nhân gen (PCR). 4.2.2 . Máy ly tâm , có thể ly tâm với g ia tốc 6 000 g và 20 000 g . 4.2.3 . Máy lắc trộn vortex. 4.2.4 . Máy spindo w n. 4.2.5 . Bộ điện di , gồm bộ nguồn và bể chạy điện di. 4.2.6 . Máy đọc gel. 5. Chẩn đoán lâm sàng 5.1 . Đặc điểm dịch tễ. Ở Việt Nam, các loài cá nuôi lồng, bè và ao hồ nước ngọt đều c ó thể bị bệnh như: cá ba sa, cá tra, cá trắm cỏ, cá rô phi, cá bống tượng... Cá bị nhiễm Aeromonas hydrophila từ 1 tuần đến 2 tuần có thể chết, tỷ lệ chết thường từ 30 % đến 70 %; Bệnh có thể xảy ra ở các giai đoạn khác nhau từ cá giống, cá thịt, cá bố mẹ; Tại Việt Nam, bệnh xuất hiện quanh năm nhưng thường hay xảy ra vào mùa xuân, mùa thu ở miền Bắc và đầu mùa mưa ở miền Nam khi nhiệt độ môi trường từ 25 °C đến 28 °C. 5.2 . Triệu chứng làm sàng. Cá bị bệnh c ó biểu hiện kém ăn hoặc bỏ ăn, nổi lờ đờ trên tầng nước mặt, da cá thường đổi màu tối không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, rụng vẩy để lộ da bị xuất huyết; Xuất hiện các đốm xuất huyết trên thân, gốc vây, quanh miệng, râu xuất huyết hoặc bạc trắng; Xuất hiện các vết loét ăn sâu vào cơ, có mùi hôi thối, trên vết loét thường c ó nấm và ký sinh trùng ký sinh; Mắt lồi đục, hậu môn viêm xuất huyết, bụng chướng to, các vây xơ rách, tia vây cụt dần. 5.3 . Bệnh tích. Ruột c ó thể đầy hơi và hoại tử; Xoang bụng xuất huyết, gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng. 6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1. Giám định Aeromonas hydrophila bằng phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn. 6.1.1 . Lấy mẫu. - Thu mẫu cá có dấu hiệu bệnh lý, còn sống hoặc vừa mới ch ế t. - Bệnh phẩm: + Cá nguyên con; + Gan, thận, lách. - Số lượng cá trên mỗi mẫu phụ thuộc vào kích cỡ của cá: + Cá giống: lấy từ 3 con/mẫu đến 5 con/mẫu; + C á trư ở ng thành, cá b ố mẹ: lấy 1 con/mẫu. - Lấy mẫu mỗi loại bệnh phẩm, cho vào từng lọ hay túi nilon vô trùng riêng biệt, đậy kín, thao tác lấy mẫu, dụng cụ đựng mẫu và tiếp xúc với mẫu phải đảm bảo vô trùng. 6.1.2 . Bảo quản mẫu. - Trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 24 h - Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm phải được phân tích ngay. 6.1.3 . Chuẩn bị mẫu. - Bệnh phẩm: cá nguyên con vô trùng bên ngo à i bề mặt cá bằng etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), dùng panh, kéo vô trùng m ổ để bộc lộ tổ chức bên trong, sau đó dùng bông cồn để thấm và vô trùng bề mặt của t ổ chức định lấy (gan, thận, lách). - Bệnh phẩm: gan, thận, lách vô trùng bề mặt của tổ ch ứ c định lấy. 6.1.4 . Cách tiến hành. 6.1.4.1 . Phân lập vi khu ẩ n. - Dùng que cấy chọc sâu xuống vị trí vô trùng ở mục (6.1.3) để lấy bệnh phẩm cấy trên môi trường thạch chọn lọc cho Aeromonas spp. Rimler-Shotts (R-S) (3.2.2). - Ủ đĩa thạch đã cấy mẫu tron g tủ ấm (4.1.4) từ 18 h đến 24 h. Trên môi tr ườ ng th ạ ch Rimler-Shot t s khuẩn lạc c ó dạng tròn, lồi, nhẵn có màu vàng nhạt. - Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào môi trường NA (3.2.1). Ủ trong t ủ ấm (4.1.4) để kiểm tra hình thái và xác định các đặc t í nh sinh hóa của vi khuẩn. Trên môi trường NA, khuẩn lạc của Aeromonas h y drophila có d ạ n g hình tròn, hơ i lồi , nhẵn và có màu trắng đục 6.1.4.2 . Xác định vi khuẩn. 6.1.4.2.1 . Quan sát h ì nh thái. - Dùng que cấy lấy khuẩn lạc hòa đều vào giọt nước sinh lý trên phiến kính (4.1.1), dàn m ỏ ng, để khô và cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn; - Tiêu bản sau khi đã được cố đ ị nh, nhuộm b ằ ng phương pháp Gram (xem Phụ lục A); - Aeromonas hydrophila bắt màu hồng (màu gram âm), hình que ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,5 µ m x (từ 1,0 µm đến 1,5 µm). 6.1.4.2.2 . Xác định đặc tính sinh hóa. - Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh h ó a truyền thống: Xác định vi khuẩn dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản: Vi khuẩn gram âm, oxidase dương tính, catalase dương tính và một số đặc tính sinh h ó a đặc trưng được trình bày trong Bảng 1. Tiến hành các phản ứng sinh h ó a (xem Phụ lục B). Bảng 1 - Một số đặc tính sinh hóa đặc trưng của Aeromonas hydrophila Sinh indol Sử dụng glucose Sử dụng sucrose Sử dụng manitol Sử dụng lactose Sinh H 2 S Sử dụng citrat Phân hủy ornithine Sinh khí từ glucose Sử dụng urê Di động O /F + + + + -/+ - + + + - + +/+ - Định danh vi khuẩn bằng kít thương mại (ví dụ bộ kít API 20E): Xác định vi khuẩn dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản: Vi khuẩn gram âm, oxidase dương tính, catalase dương tính, O /F dương tính và các ch ỉ tiêu sinh hóa nêu trong Bảng 2. Tiến hành các phản ứng sinh hóa bằng bộ kít API 20E (tham khảo Phụ lục C). Bảng 2 - Các chỉ tiêu sinh hóa c ủ a Aeromonas hydrophila qua bộ kít API 20E ONPG ADH LDC ODC CIT H 2 S URE TDA IND VP + + + - + - - - + - GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA + + + - - - + - + - 6.1.4.3 . Đọc kết quả. Cá được xác định l à nhiễm bệnh do Aeromonas hydrophila khi nuôi cấy, phân lập, định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống hoặc nuôi cấy, phân lập, định danh được Aeromonas hydrophila bằng bộ kít thương mại. 6.2. Xác định Aeromonas hydrophila bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). 6.2.1 . Lấy mẫu. 6.2.1.1 . Lấy mẫu trực tiếp. Xem 6.1.1. 6.2.1.2 . Lấy mẫu nuôi c ấ y. Mẫu vi khuẩn: lấy khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy (xem 6.1.4.1). 6.2.2 . B ả o qu ả n mẫu. Trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C đến 8 °C không quá 48 h hoặc bảo quản trong etanol tuyệt đối (3.1.1). Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích n g ay phải được bảo qu ả n ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong etanol tuyệt đ ố i (3.1.1). 6.2.3 . Chuẩn bị mẫu. Xem 6.1.3. Lượng mẫu cần chuẩn bị: khoảng 30 mg. 6.2.4 . Cách tiến hành. 6.2.4.1 . Tách chiết ADN. S ử dụn g bộ kít tách chiết (3.2.10) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn c ủ a nhà sản xuất. VÍ DỤ: S ử dụng k í t tách chi ế t DNeasy ® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) 1) (xem phụ lục D). 6.2.4.2 . Chuẩn bị mồi. Phản ứng khuếch đại được t hực hiện trong máy nhân gen (4.2.1) theo phương pháp PCR khuếch đ ại đoạn gen đặc hiệu của bệnh nhiễm trùng do Aeromonas hydrophila sử dụng cặp mồi AeroFd/AeroRs (3.3.1). Trình tự cặp mồi được nêu trong B ả ng 3. Bảng 3 - Trình tự cặp mồi [9] Mồi Tr ì nh tự cặp mồi AeroPd (mồi xuôi) 5 ’ - CCAAGGGGTCTGTGGCGACA - 3 ’ AeroRs (mồi ngược) 5 ’ - TTT C ACCGGTAACAGGATTG - 3’ Mồi được chuẩn bị như sau: Chuẩn bị mồi gốc: - Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.2.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi m ở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 µM làm mồi gốc. Chuẩn bị mồi sử dụng: - Mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (10 µl mồi gốc và 90 µ l nước). 6.2.4.3 . Tiến hành ph ả n ứng PCR. S ử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (6.2.4.2) sử dụng kít nhân gen (3.2.9) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen của Thermo Scienti f ic Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656) 2) Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 4 Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR Thành phần Th ể tích Taq PCR Master Mix Kit 12,5 µ l Mồi xuôi 20 µM 1 µl Mồi ngược 20 µM 1 µ l Nước không có nuclease 8 µ l T ổ ng thể tích 22,5 µ l Chuyển 22,5 µ l hỗn hợp nhân g e n v à o mỗi ống phản ứng: - Mẫu kiểm chứng dương: Cho 2,5 µ l mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng Aeromonas h y drophila chuẩn; - M ẫu kiểm c hứ ng âm: C ho 2,5 µ l nước tinh k hiết k h ông c ó nuc l easa (3.2.8) v à o ống p h ản ứ ng; - Mẫu thử: Cho 2,5 µ l mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng. Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) B ả ng 5: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR [9] Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 95 °C 4 min 1 95 °C 30 s 30 54 °C 45 s 72 °C 30 s 72 °C 10 min 1 CHÚ THÍCH : - Phán ứ ng PCR ph ả i bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu ki ể m chứng âm; - Mẫu và nguyên liệu cho phản ứ n g PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng. 6.2.4.4 . Điện di. 6.2.4.4.1 . Chuẩn bị b ả n gel. Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.2) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.3.3) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi; Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µ l chất nhuộm màu (3.3.4) cho 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều; Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm; Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch; Chuyển bản gel vào bể điện di (4.2.5), đổ dung dịch đệm (3.3.4) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch. CH Ú THÍCH: C ó thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agaross (v í dụ: Sybr sa f e ADN gel stain 3) ) và s ử dụng t heo quy đ ị nh của nh à s ả n xuất. 6.2.4.4.2 . Chạy điện di. Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (3.3.5) vào 8 µl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch . Thực hiện điện di trong bô điện di (4.2.5) chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.3.7) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µ l thang chuẩn ADN (3.3.7) vào một giếng trên bản thạch. Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min. 6.2.4.5 . Đọc kết quả. Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.2.6) theo bảng 6. Bảng 6: Kết quả điện di Giếng Sản phẩm có kích thước 209 bp Kết quả Thang chuẩn Sáng và chia vạch rõ ràng Điện di tốt Mẫu kiểm chứng dương C ó Hỗn hợp ph ả n ứng PCR tốt Không M ẫ u đối chứng dương tín h hỏng hoặc enzym hỏng M ẫ u kiểm chứng âm Không Không t ạ p nhiễm có Bị tạp nhiễm Mẫu thử có Dương tính với A. hydrophila Không Âm tính với A. hydrophila Đánh giá kết quả: - Kết quả mẫu th ử dương tính khi: Tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước bằng k í ch thước giống mẫu kiểm chứng dương có kích thước 209 bp. Thang chuẩn phân vạch rõ ràng, mẫu kiểm chứng â m không có vạch s á ng. - Kết quả mẫu thử âm tính khi: Tại giếng mẫu thử không có vạch sáng, thang chu ẩ n ADN phân vạch rõ ràng, mẫu kiểm chứng dương tính có vạch sáng 209 bp, mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng. 7. Kết luận Cá được xác định là nhiễm bệnh do Aeromonas hydrophila khi c ó đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm s à ng, bệnh tích điển hình của bệnh và c ó kết quả dương tính một trong hai phương pháp sau: - Phản ứng PCR phát hiện Aeromonas hydrophila dương tính; - Nuôi cấy, phân lập và định danh được Aeromonas hydrophila . PHỤ LỤC A (Quy định) Thành phần và chuẩn bị thuốc thử A. 1 . Thuốc thử cho phương pháp nhuộm Gram A. 1.1 . Thuốc thử A. 1.1.1 . Dung dịch tím tinh thể Thành phần Tím tinh thể 2,0 g Cồn tuyệt đối 20,0 ml Amoni oxalat 0,8 g Nước 80,0 ml Chuẩn bị Hòa tan tím tinh th ể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đ ó , trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết. A.1.1.2 . Dung dịch Fuchsin đậm đặc Thành phần Fuchsin basic 1 g Cồn tuyệt đ ố i 10 ml Phenol 5 g Nước 100 ml Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước. Khi dùng, pha l oãng dung dịch fuchsin đậm đặc với nước theo tỉ lệ thể tích 1:10. A.1.1.3 . Dung dịch lugol Thành phần Kali iodua 2 g l-ốt tinh th ể 1 g Nước 200 ml Chuẩn bị Nghiền ka l i iodua v à iodine tinh thể, cho nước v à o từ từ và lắc cho tan. A.1.1.4 . C ồ n axeton Trộn đầu dung dịch cồn tuyệt đối với dung d ịch axeton với tỷ lệ thể tích 3:1. A.1.2 . Cách tiến hành Nhỏ dung dịch tím tinh thể (A.1.1) lên tiêu bản, để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và đ ể khô; Nhỏ dung dịch lugol (A.1.3), để 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô; Nh ỏ cồn axeton (A.1.4), rửa nước thật nhanh và để khô; Nhỏ dung dịch f uchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước và để khô. A.1.3 . Xem tiêu bản Nh ỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (4.1.3) có vật kính có độ ph ó ng đại 100 X. A.2 . Dung dịch đệm TAE hoặc TBE A.2.1 . Thành ph ầ n Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml Nước khử ion: 900 ml Tổng: 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X A. 2.2 . Chuẩn bị L ấ y 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X (3.3.3) h òa chung với 900 ml nước kh ử ion, khuấy và lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. PHỤ LỤC B (Quy định) Các phản ứng sinh hóa của Aeromonas hydrophila B.1 . Nguyên liệu cho giám định sinh hóa B.1.1 . Môi trường nước pepton Chuẩn bị môi trường nước pepton theo h ướ ng dẫn của nh à sản xuất. B.1.2 . Thuốc thử Kovac’s B.1.2.1 . Thành phần Paradimetyl aminobenzaldehyt 5 g Cồn amylic 75 ml Axit clohydric đặc 25 ml B.1.2.2 . Chuẩn bị Trộn dung dịch paradimetyl aminobenzaldehyt vào cồn amylic cho tan hết và để trong tủ lạnh. Thêm từ từ 5 ml đến 10 ml axit clohydric đặc, trộn đều rồi để tủ lạnh, sau đó tiếp tục bổ sung axit clohydric đặc. Bảo quản thuốc thử trong lọ màu, ở 4 °C. CH Ú THÍCH: C ó thể s ử dụng thuốc thử Kovac's thương mại và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất. B.1.3 . Thuốc thử H 2 O 2 , 3 %. B.1.4 . Môi trường nước pepton - đường B.1.4.1 . Thành phần - Nước pepton; - Dung dịch chỉ thị màu bromocrezol: cho 0,2 g bromocrezol vào 100 ml etanol 90 % (thể tích) và lắc cho tan hết; - Dung dịch đường: glucose, sucrose. B.1.4.2 . Chuẩn bị Pha glucose hoặc sucrose thành dung dịch 10 % (trong nước), hấp tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp (4.1.5) ở 115 °C trong 15 min hoặc hấp cách quãng 3 lần ở 100 °C trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm. Cho 0,1 m l chỉ thị màu bromocrezol vào 100 ml môi trường nước pep t on, chia ra các ống (4 m l mỗi ống). Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp (4.1.5) ở 120 °C trong 30 min. Chỉnh pH môi trườn g ở 6 , 8 ± 0 , 2. Thêm 0,4 ml dung dịch đường 10 % vào ống chứa 4 ml môi tr ườ ng. B.1.5 . Môi trường thạch TSI (Tripie Sugar Iron agar) Chuẩn bị môi trường thạch TSI (theo hướng dẫn của nhả sản xuất); Thạch nghiêng chế từ TSI: thạch màu đỏ và c ó 2 phần: phần thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả năng l ên men g l ucose, sinh hơi, sinh H 2 S, phần thạch nghiêng để kiểm tra khả năng lên men đường lactose. B.1.6 . Môi trường thạch urê Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (urea agar base - Christensen). Chuẩn bị môi trường và bổ sung urê theo hướng dẫn c ủ a nhà sản xuất. B.1.7 . Môi trường thạch lỏng kiểm tra khả năng di động B.1.7.1 . Thành ph ầ n Pepton 10 g Chất chiết thịt 3 g Natri clorua 5 g Thạch 4 g Gelatin 80 g Nước cất 1000 m l B.1.7.2 . Chuẩn bị Hòa gelatine vào nước để 30 min, bổ sung các thành phần khác, đun cho tan hoàn toàn. Chia ra các ống nghiệm khoảng 6 ml/ống. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (4.1.5) ở 115 °C trong 15 min. B.1. 8. Môi trườn g ornithine decacbo l xylase B.1.8.1 . Thành phần Pepton 0,5 g Chất chiết nấm men 0,3 g Glucose 0,1 g Chỉ thị bromocresol đỏ tía 0,2 % 0,1 ml L-ornithin clohydric 0,5 g Nước 100 ml B.1.8.2 . Chuẩn bị Hòa tan pepton, chất chiết nấm men, glucose trong nước, chỉnh môi trường về pH = 6,7 và thêm chất chỉ thị màu bromocresol đỏ tía 0,2 %. Hấp môi trường trong nồi hấp (4.1.5) ở 115 °C trong 15 min. Bổ sung thêm L-ornithine hydrochloride 0,5%. Chỉnh lại pH môi trường về 6,7. Chia môi trường ra các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm khoảng 2 ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (4.1.5) ở 115 °C trong 15 min. B.1.9 . Môi trường OF B.1.9.1 . Thành phần Thạch OF 1 g Glucose 2 g Nước cất 100 ml B.1.9.2 . Chuẩn bị Hòa các thành phần trên vào lọ sạch, đun cho tan hoàn toàn. Chia ra các ống nghiệm, mỗi ống 6 ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (4.1.5) ở 115 o C trong 15 min. B.1.10 . Thuốc thử cho phản ứng Oxidase B.2 . Cách tiến hành Tiến hành định danh vi Khuẩn theo phương pháp truyền thống hoặc sử dụng kit sinh h ó a API 20 E. s B.2.1 . Phương pháp sinh hóa truyền thống B.2.1.1 . Phản ứng sinh indol Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường nước pepton (B.1.1). Ủ trong t ủ ấ m (4.1.4). Sau 24 h, nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử K o vac’s (B. 1.2) vào môi trường, lắc nhẹ. Đọc kết quả: - Ph ả n ứng dương t í nh (sinh indol): xuất hiện vòng màu đỏ phía trên mô i trườn g ; - Phản ứng âm tính (không sinh indol): không xuất hiện vòng màu đỏ. B.2.1.2 . Phản ứng catalase Nh ỏ một giọt dung dịch H 2 O 2 3 % (B.1.3) lên phiến kính (4.1.1). Dùng que cấy lấy khuẩn lạc nghi ng ờ cho vào giọt dung dịch H 2 O 2 3 %. Đọc kết quả sau 5 s: - Phản ứng dương tính: có hiện tượng sủi bọt; - Phản ứng âm tính: không có hiện tượng sủi bọt. B.2.1.3 . Kiểm tra đặc tính lên men glucose và sinh H 2 S trên môi trường thạch TSI Dùng que cấy chích sâu lấy khuẩn lạc cấy thẳng (chính giữa phần thạch đứng) xuống đáy ống nghiệm môi trường thạch TSI (B.1.5). Ủ trong tủ ấm (4.1.4), sau 24 h đọc kết quả. Lên men glucose: - Phản ứng dương tính: phần đứng cửa môi trường thạch chuyển sang màu vàng; - Phản ứng âm tính: phần đứng của môi tr ườ ng thạch không chuyển màu. Khả năng sinh H 2 S: - Phản ứng dương t í nh: đáy ống nghiệm có màu đen; - Phản ứng âm tính: đáy ống nghiệm không có màu đen. B.2.1.4 . Kiểm tra đặc tính lên men sucrose hoặc g l ucose Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào ống môi trường nước pepton có sucrose hoặc glucose (B.1.4). Ủ trong tủ ấm (4.1.4), đọc kết quả sau 24 h: - P h ản ứ ng d ương tính: m ô i tr ườ ng c h uy ể n m à u v à ng ; - Phản ứng âm tính: môi trường không thay đổi màu. B.2.1.5 . Kiểm tra khả năng ph â n giải urê Dùng que cấy lấy khu ẩ n lạc cấy vào môi trường thạch urê (B.1.6). Ủ trong t ủ ấm (4.1.4), đọc kết quả sau 24 h: - Phản ứng dương tính: môi trường chuyển sang màu hồng; - Phản ứng âm tính: môi trường không chuy ể n màu. B.2.1.6 . Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn bằng môi trường thạch l ỏ ng Dùng que cấy chích sâu lấy khuẩn lạc cấy thẳng xuống gần đáy của ống nghiệm c ó môi trường thạch lỏng (B.1.7). Ủ trong tủ ấm (4.1.4), đọc kết quả sau 24 h: - Phản ứng dương tính (có khả năng d i động): môi trường đục, không nhìn rõ đường cấy chích sâu; - Phản ứng âm tính: môi trường trong v à nhìn thấy đường cấy chích sâu. B.2.1.7 . Kiểm tra khả năng phân hủy ornithine Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào m ô i trường có chứa ornithine decarboxylase (B.1.8). Ủ trong tủ ấm (4.1.4), sau 24 h đọc kết quả: - Dương tính: môi trường chuyển màu tím; - Âm tính: môi trường có màu vàng B.2.1.8 . Thử phản ứng Oxidase Đặt miếng giấy lọc c ó thấm thuốc thử vào đĩa lồng. Dùng que cấy vô trùng lấy vi khu ẩ n cần nghiên cứu đã thuần chủng nuôi cấy sau 24 h bôi lên miếng giấy lọc có thuốc thử. Đọc kết quả sau 10 s đến 30 s. - Phản ứng dương tính: Vi khuẩn có màu xanh tím là dươn g tính (+). - Phản ứng âm tính: Vi khuẩn không thay đổi màu sắc l à âm t í nh (-). B.2.1.9 . Thử khả năng lên men và oxy h óa của vi khuẩn ( O /F) Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ ống nghiệm đã thuần chủng nuôi cấy sau 24 h, cấy vào hai ống nghiệm có chứa môi trường OF. Một ống được ph ủ một lớp para f in l ỏ ng dày khoảng 1 cm. Nuôi cấy trong tủ ấm (4.1.5). Đọc kết quả sau 24 h đến 48 h như sau: - Vi khuẩn có khả năng lên men: cả hai ống đều chuyển màu vàng. - Vi khuẩn có khả năng oxy h óa : ống không phù dầu c ó màu vàng, ống phủ parafin có màu xanh. - Vi khuẩn không c ó khả năng oxy h óa và lên men: Cả hai ống vẫn giữ nguyên màu xanh của môi trường. PHỤ LỤC C (Tham khảo) Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20 E C.1 . Cách tiến hành Dùng que tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý hoặc nước cất tiệt trùng, lắc trộn đều. Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩ m khi ủ trong tủ ấ m (4.1.5). Dùng pipet với đầu týp tiệt trùng hút dung dịch vi khu ẩ n cho vào mỗi ô của bộ kít. Nh ỏ dung dịch vi khuẩn vừa đủ vào tất cả các ô CIT, VP, GEL thì nh ỏ đầy, 5 ô ADH, LDC, ODC, H 2 S và URE cho thêm Parafin tiệt trùng để tạo điều kiện yếm khí. Đậy nắp khay lại và ủ trong tủ ấm (4.1.5). C.2. Đọc kết quả Đọc kết quả sau 18 h đến 24 h - Kiểm tra và ghi nhận tất cả các chỉ tiêu không cần cho thêm thuốc thử đọc kết quả dựa vào Bảng C.1. - Các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử + TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Màu đen xuấ t hiện th ì kết quả là phản ứng dương tính, màu vàng thì kết quả phản ứng â m t í nh. + IND: Nh ỏ một giọt thuốc thử JAMES. Đợi 2 min, xuất hiện một vòng màu đỏ là phản ứng dương tính, màu vàng là â m tính + VP: Thêm một giọt lần lượt mỗi dung dịch thuốc thử VP 1 , VP 2 . Đợi ít nhất 10 min, màu hồng hoặc đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính. Nếu màu hồng nhạt xuất hiện trong vòng 10 min đến 12 min là phản ứng âm tính. Bảng C.1 - Các chỉ tiêu định danh Aeromonas hydrophila bằng bộ kít API 20 E Ch ỉ tiêu Âm tính Dương tính ONPG Không máu Vàng ADH Vàng Đỏ/ cam LDC Vàng Đỏ/ cam ODC V à ng Đỏ/ cam CIT Vàng Xanh/ xanh lá H 2 S Không màu Đen URE V à ng Đ ỏ / cam TDA Vàng Nâu sậm IND Vàng Đỏ (2 min) VP Không màu Hồng/ đỏ (10 min) GEL Không màu (còn kết tủa đen) Đen GLU Xanh/ xanh lá Vàng MAN Xanh/ xanh lá Vàng INO Xanh/ xanh lá Vàng SOR Xanh/ xanh lá Vàng RHA Xanh/ xanh lá Vàng SAC Xanh/ xanh lá Vàng MEL Xanh/ xanh lá Vàng AMY Xanh/ xanh lá Vàng PHỤ LỤC D (Tham khảo) Quy trình tách chiết ADN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng h óa chất nguy hiểm và có kh ả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các h óa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này. Quy tr ì nh tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNeasy ® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506): - Nhỏ 20 µ l protease K vào ống ly tâm 1,5 ml; - Chuyển 30 mg mẫu bệnh phẩm (6.2.3) vào ống ly tâm đã có protease K; - Thêm 200 µl dung dịch AL (Lysis buffer); - Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.2.4); - Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.2.4); - Thêm 200 µl etanol tuyệt đối vào ống ly tâm; - Trộn kỹ huyễn dịch tron g 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.2.4); - Hút 420 µl huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển sang cột ly tâm có ống thu ở dưới; - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng; - Thêm 500 µl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới; - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng; - Thay ống thu ở dưới cột ly tâm; - Thêm 500 µ l dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới; - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng; - Chuyển cột ly tâm sang ống ly tâm 1,5 ml; - Nh ỏ 200 µl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min; - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min; - Chuyển ADN đã thu được sang ống 1,5 ml khác. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] ThS. Từ T hanh Dung, TS Đặng Thị Hoàng Oanh, Th S T rần T hị T uyết Hoa, Giáo trình bệnh học T hủy sản, 2005, trang 64-67. [2] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, B ệ nh học Thủy sản, 2004, t rang 218-223. [3] Bùi Quang Tề, Thực hành chẩn đoán bệnh Thủy sản, 2007, trang 13-24. [4] Bergey. Berge y ’s Manual of Systematic bacteriology. Part B The Gram m aproteob a cteria , 557-572. [5] Nicky B. Buller,. Bacteria from Fish and Other Aquatic Animals 2004, p197. [6] M. J. A. Sarkar and M. M. Rashi d , Pathogenicity of the bacteria l iso l ate Aeromonas hydrophila to cat f ishes, carps and perch, 2012, p 157-161. [7] T.Raja Swaminathan, Gaurav Rathore, Rehana Abidi and D. Kapoor, Detection of Aeromonas hydrophila by polymerase c hain reaction, 2004, 251-254. [8] Trần Nguyễn Diễm Tú và Đặng Thị Hoàng Oanh, Chuẩn hóa quy trình phát hiện vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila và Flavobacterium columnare từ máu cá tra, tạp chí khoa học 2012. [9] Victor S . Panangala, Craig A. Shoemaker, Vicky L.van Santen, Kevin Dybvig, Phillip H. Klesius, Multiplex-PCR for simultaneous detection of 3 bacterial fish pathogens, Flavobacterium columnare, Ed w ardsiel l a ictalur i , and Aeromonas hydrophila , Diseases of aquatic organisms, 2007, Vol. 74: 199-208. 1) Thông tin n à y đưa ra tạo đi ề u kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và kh ô ng ấn định sử dụng sản phẩm c ủ a nhà cung c ấ p n à y. Có thể sử dụng các s ả n phẩm tương tự nếu cho các kết qu ả tương đương. 2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn v à không ấn định sử dụng sản phẩm của nh à cung cấp n à y. Có th ể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. 3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người s ử dụng tiêu chuẩn và không ấ n định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả t ương đương.