TCVN5153:1990

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5153:1990 về thịt và sản phẩm thịt - phương pháp phát hiện Salmonella do Ủy ban Khoa học Nhà nước ban hành TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5153:1990 THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SALMONELLA Meat and meat products Detection of Salmonella Trên cơ sở tiêu chuẩn TCVN 4829-89 hướng dẫn cibm về các phương pháp phát hiện Salmonella. Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện Salmonella trong thịt và sản phẩm của thịt dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc. 1. Đặc tính chung Vi khuẩn hình gậy, mập, ngắn, gram âm, kích thước 0,5 - 0,7 x 1 - 3 micrômét, hai đầu hơi tròn, không có giáp mô, không có nha bào, di động.Vi khuẩn có những đặc tính sinh hoá và huyết thanh được quy định kiểm nghiệm trong tiêu chuẩn này. 2. Nguyên tắc Căn cứ vào tính chất sinh hoá và kháng nguyên của vi khuẩn để kết luận. 3. Lấy mẫu 3.1. Lấy mẫu trung bình trong từng lô hàng đồng nhất. 3.2. Lô hàng đồng nhất là một lượng thịt hoặc sản phẩm của thịt có cùng một tên gọi, cùng loại sản phẩm, cùng mức chất lượng, được đựng trong bao bì cùng kiểu, cùng kích thước, cùng khối lượng, được sản xuất, chế biến, đóng gói, bảo quản trong cùng một cơ sở sản xuất, theo cùng một quy trình công nghệ, trong khoảng một thời gian liên tục, được giao nhận cùng một lần, kiểm tra cùng một lúc và không quá 20 tấn với thịt tươi hoặc lạnh đông, 5 tấn với thịt đã chế biến đóng hộp hoặc đựng trong bao bì. 3.3. Mẫu trung bình là lượng sản phẩm bằng 0,1 - 0,2% khối lượng một lô hàng nhưng không ít hơn 3 túi đối với thịt lạnh đông, 10 hộp đối với các loại sản phẩm đã chế biến và được lấy ở các vị trí khác nhau bằng phương pháp ngẫu nhiên. 3.4. Trước khi lấy mẫu trung bình phải kiểm tra các giấy tờ, xác định tính đồng nhất, điều kiện bảo quản, . . . loại bỏ những kiện không đúng tiêu chuẩn. 3.5. Mẫu thử trung bình là lượng sản phẩm bằng 80% mẫu trung bình được dùng như sau: - 20% để kiểm tra cảm quan. - 20% để kiểm tra lý hoá, kim loại nặng, tồn dư thuốc trừ sâu, thuốc kháng khuẩn. - 40% để kiểm tra vi sinh vật. - 20% để lưu mẫu. 3.6. Mẫu lưu do cơ quan kiểm dịch giữ để thử lại khi cần thiết và được bảo quản theo đúng quy định với từng loại sản phẩm; thịt tươi, thịt lạnh đông ở nhiệt độ không lớn hơn -15 oC , các sản phẩm khác không lớn hơn 4 oC . 3.7. Thời gian lưu mẫu không quá 4 tháng đối với đồ hộp đã thanh trùng và không quá 1 tháng đối với các sản phẩm khác. 3.8. Nếu kết quả còn nghi ngờ thì cơ quan kiểm dịch phải thông báo cho chủ hàng biết và lấy mẫu thử lại lần hai với số lượng gấp đôi. 3.9. Khi cần thiết cơ quan kiểm dịch được phép gửi mẫu đến các cơ quan chuyên trách trong và ngoài nước để nhờ kiểm nghiệm. 3.10. Trong quá trình kiểm tra, lấy và lưu mẫu cần có hồ sơ ghi chép đầy đủ. 4. Thiết bị và dụng cụ 4.1. Thiết bị 4.1.1. Phòng cấy vô khuẩn (thanh trùng không khí trong phòng cấy bằng đèn cực tím 1,5 - 2,5 oát/1cm 3 trong 3 giờ hoặc xông phóc môn, phenol 5%, ...). 4.1.2. Tủ ấm có điều chỉnh nhiệt độ ổn định 35 - 37 - 43 oC . 4.1.3. Tủ sấy khô. 4.1.4 Tủ hấp ướt. 4.1.5. Nồi hấp cách thuỷ. 4.1.6. Tủ lạnh 0 - 4 oC . 4.1.7. Tủ lạnh -35 oC . 4.1.8. Nồi cách thủy có điều chỉnh nhiệt độ ổn định từ 35 - 56 oC . 4.1.9. Cân phân tích có độ chính xác 0,01g và 0,1g. 4.1.10. Cân thiên bình 50 - 100g. 4.1.11. Máy đo pH có độ chính xác hiệu chỉnh là 0,1 đơn vị pH ở 25 oC . 4.1.12. Máy li tâm 3.000- 15.000 vòng/ phút. 4.1.13. Kính hiển vi có vật kính dầu. 4.1.14. Cối chày sứ cỡ trung bình. 4.1.15. Máy xay nghiền 10.000 vòng/ phút trở lên. 4.1.16. Dao mổ, kéo cắt, pince kim loại. 4.1.17. Que cấy có vòng tròn ở đầu đường kính khoảng 3 mm và que cấy thẳng. 4.1.18. Khay men. 4.1.19. Đèn cồn. 4.1.20. Phễu lọc Seitz, Sephadex G 25. 4.2. Dụng cụ thuỷ tinh. 4.2.1. Bình tam giác và bình cầu đáy bằng 150, 200, 250 và 500 ml. 4.2.2. Cốc đong hình trụ 20, 50, 100, 500 ml. 4.2.3. Pipét có khắc độ 1,5 và 10 ml. 4.2.4. ống nghiệm 18 x 160 mm. 4.2.5. Đĩa petri đường kính 150 mm, chiều cao 15mm, mặt đĩa phẳng và song song với đáy. 4.2.6. Phiến kính . 5. Môi trường, thuốc thử và kháng huyết thanh. 5.1. Phải dùng các hoá chất tinh khiết phân tích. Nên sử dụng những thành phẩm cơ bản hoặc đã chế sẵn; khi dùng phải tuân theo chỉ dẫn của nơi sản xuất. Môi trường, thuốc thử phải bảo quản ở nơi tối, nhiệt độ 4 oC , không quá 1 tháng. Định kỳ kiểm tra lại môi trường, thuốc thử bằng các giống vi khuẩn tiêu chuẩn. 5.2. Môi trường và thuốc thử (phụ lục B). 5.2.1. Môi trường tetrationat (Muller - Kauffman). 5.2.2. Môi trường Salmonella - Shigella (S.S). 5.2.3. Môi trường thạch deoxycholatxitrat. 5.2.4. Môi trường thạch sắt đường trisaccarit (TSI). 5.2.5. Môi trường nước thịt. 5.2.6. Môi trường thạch dinh dưỡng. 5.2.7. Môi trường thạch urê (Christensen). 5.2.8. Môi trường lysin decarboxylas. 5.2.9. Môi trường nước pepton (thử phản ứng Indol). 5.2.10. Môi trường nước pepton glucose (thử phản ứng V.P.). 5.2.11. Thuốc thử B - Galactosidas (O.N.P.G.). 5.2.12. Thuốc thử Indol (dung dịch Kowacs). 5.2.13. Thuốc thử Voges - Proskauer (dung dịch Barritt). 5.2.14. Nước muối đẳng trương. 5.2.15. Kháng huyết thanh Salmonella đa giá, đơn giá, Vi và H. 6. Cách tiến hành. 6.1. Yêu cầu chung: Các dụng cụ, môi trường, thuốc thử, v.v... và thao tác phải vô khuẩn. 6.2. Chuẩn bị mẫu thử: Thịt lạnh đông phải giải đông tự nhiên ở nhiệt độ trong phòng cho đến khi đạt 13 - 15 oC ; đồ hộp phải cọ rửa sạch vỏ ngoài, lau khô, ủ 37 oC từ 5 - 7 ngày. 6.3. Làm phong phú vi khuẩn trong mẫu thử: Cân 25g (không lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu có), nghiền trước trong cối sứ, nghiền nhuyễn tiếp trong máy xay thịt từ 2 - 3 phút với tốc độ 10.000 vòng/phút, vừa nghiền vừa bổ sung dần 225 ml môi trường tetrationat, ủ 43 oC từ 20 - 24 giờ. 6.4. Giám định tính chất sinh hoá. 6.4.1. Lấy một vòng que cấy canh trùng tetrationat (6.3) ria lên mặt thạch SS. và thạch deoxycholat-xitrat mỗi loại 2 đĩa, hoặc dùng một trong hai loại môi trường, còn loại thứ hai cơ sở xét nghiệm được tùy ý chọn như thạch Endo, Macconkey, E.M.B, Istrati, v.v..., úp sấp đĩa môi trường, ủ 37 oC trong 24 giờ, đọc kết quả. Khuẩn lạc Salmonella hình tròn, đường kính từ 1-2 mm, rìa gọn, mặt lồi, không mầu, bóng láng(dạng S). Làm đồ phiến nhuộm gram, giám định bằng kính hiển vi với vật kính dầu: Vi khuẩn gram âm, có hình dạng như mục 1. 6.4.2. Chọn 5 khuẩn lạc điển hình, ria cấy 2 - 4 đĩa thạch, ủ 37 oC từ 18 - 24 giờ để giám định tiếp. 6.4.3. Trên đĩa môi trường thạch sắt đường trisaccarit (TSI): Dùng que cấy đầu thẳng, ria cấy vi khuẩn trên mặt thạch nghiêng sau đó cắm sâu xuống đáy theo đường thẳng đứng, ủ 37 oC trong 24 giờ, đọc kết quả. Salmonella thể hiện: Trên mặt thạch nghiêng có màu đỏ (không phân giải lactose và sucrose); thân và đáy có màu vàng, có bọt khí hoặc vết nứt (phân giải glucose, sinh hơi), có màu đen (H 2 S) . 6.4.4. Trên môi trường thạch urê (Christensen): Ria cấy vi khuẩn trên mặt thạch nghiêng, ủ 37 oC trong 24 giờ, đọc kết quả. Salmonella có phản ứng âm tính: không chuyển màu (dương tính: màu đỏ). 6.4.5. Trên môi trường lysin decacboxylas: Cấy vi khuẩn xuống dưới bề mặt môi trường hoặc sau khi cấy vi khuẩn nhỏ parafin lỏng vô khuẩn, dầy khoảng 4 - 5 mm lên môi trường, ủ 37 oC trong 24 giờ, đọc kết quả. Salmonella có phản ứng dương tính: màu tím. (âm tính: màu vàng). 6.4.6. Thử B - Galactosidas (O.N.P.G): Hoà tan một vòng que cấy khuẩn lạc từ môi trường T.S.I trong ống nghiệm có 0,25 ml nước muối đẳng trương vô khuẩn. Nhỏ 1 giọt toluen, lắc đều, ủ cách thuỷ 37 oC trong 15 phút; nhỏ tiếp 0,25 ml thuốc thử, lắc đều, tiếp tục ủ cách thuỷ 37 oC trong 24 giờ; đọc kết quả. Salmonella có phản ứng âm tính: không chuyển màu. (dương tính: màu vàng) 6.4.7. Thử phản ứng Indol: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton, ủ 37 oC từ 24 - 48 giờ, sau nhỏ 1 ml thuốc thử, đọc kết quả. Salmonella có phản ứng âm tính: màu vàng nhạt (dương tính: màu đỏ). 6.4.8. Thử phản ứng Voges- Proskauer: Cấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton glucos, ủ 37 oC trong 48 giờ, chuyển 1 ml canh trùng sang một ống nghiệm khác, rồi nhỏ 0,6 ml dung dịch cồn a -naptol, 0,2ml dung dịch 40% Kalihydroxyt, lắc đều, đọc kết quả sau 5 - 15 phút. Salmonella có phản ứng âm tính: không màu hoặc vàng nhạt (dương tính: màu đỏ). 6.4.9. Nhận định tính sinh hoá đặc hiệu: Tính chất sinh hoá Dương hoặc âm tính Tỷ lệ % với vi khuẩn Salmonella TSI lactos - 99,2 TSI sucros - 99,5 TSI glucos + 100 TSI glucos sinh hơi + 91,2 TSI hydro-sulfua + 91,6 Phân giải urê - 100,0 Lysin decacboxylas + 94,6 B- Galactosidas (O.N.P.G) - 98,5 Phản ứng V.P - 100,0 Phản ứng Indol - 98,2 6.5. Giám định huyết thanh học bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính 6.5.1. Loại bỏ những vi khuẩn tự ngưng kết (6.4.2) bằng phương pháp nhỏ 1 giọt nước muối đẳng trương lên phiến kính dùng que cấy lấy một lượng vi khuẩn vừa đủ trộn đều thành huyền dịch, đọc kết quả. Nếu có những hạt ngưng kết thì loại bỏ, nếu huyễn dịch vẫn đục đều thì tiến hành giám định. 6.5.2. Với kháng huyết thanh O đa giá. Phương pháp làm theo 6.5.1. chỉ khác là dùng kháng huyết thanh O đa giá thay cho nước muối. Nếu là Salmonella thì xuất hiện những hạt ngưng kết, tuỳ theo mức độ ngưng kết nhiều hay ít, hạt ngưng kết to hay nhỏ, nước đục hay trong mà đánh giá từ một đến bốn cộng. Huyễn dịch vẩn đục đều là âm tính. 6.5.3. Khi dương tính với O đa giá thì làm ngưng kết tiếp với O đơn giá và H. Với kháng huyết thanh O đơn giá. Phương pháp làm và đọc kết quả theo 6.5.2. Chỉ khác là dùng kháng huyết thanh O đơn giá thay cho O đa giá. Với kháng huyết thanh H: Cấy chuyển vi khuẩn vào môi trường nước thịt, ủ 37 oC từ 24 -48 giờ, lấy ra ly tâm 3.000 vòng/phút, trong 5 phút, chắt lấy cặn. Phương pháp làm và đọc kết quả theo 6.5.2, chỉ khác là dùng kháng huyết thanh H thay cho O đa giá. 6.5.4. Trường hợp âm tính với kháng huyết thanh O đa giá thì thử làm ngưng kết với kháng huyết thanh Vi. Nếu có phản ứng dương tính thì cấy chuyển vi khuẩn vào 2 ống môi trường thạch nghiêng và 2 ống môi trường nước thịt, ủ 37 oC từ 24 - 48 giờ. 6.5.4.1. Dùng nước muối đẳng trương thu hoạch vi khuẩn trên mặt thạch nghiêng, đun sôi cách thuỷ 20 phút để làm lại phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh O. Phương pháp làm và đọc kết quả theo 6.5.2. và 6.5.3. 6.5.4.2. Ly tâm canh khuẩn (môi trường nước thịt) chắt lấy cặn để làm phản ứng với kháng huyết thanh H. Phương pháp làm và đọc kết quả theo 6.5.3. 7. Tính toán kết quả 7.1. Căn cứ vào kết quả giám định tính chất sinh hoá. 7.2. Căn cứ vào kết quả giám định huyết thanh để định nhóm và sero-týp. PHỤ LỤC A PHÁC ĐỒ KIỂM NGHIỆM PHỤ LỤC B PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ VÀ THUỐC NHUỘM B1. Môi trường Tetrationat (Muller-Kuafman) B1.1. Môi trường cơ bản: - Nước thịt bò 1.000 ml - Pepton 10 g - Natri clorua 5 g - Canxi cacbonat 45 g Đun sôi nước thịt, hoà tan các thành phần còn lại. Hấp 121 oC trong 20 phút. Chú thích: Có thể thay nước thịt bò bằng 5g bột cao thịt hoà tan trong 1.000 ml nước cất. B1.2. Dung dịch Natri-thiosulfat: - Natri-thiosulfat (Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O) 50 g - Nước cất 100 ml Hoà tan. Hấp 121 oC trong 20 phút. B1.3. Dung dịch Iod: - Iod 20 g - Kali iodua (KI) 25 g - Nước cất 10 ml Hoà tan trước Kali iodua trong 5 ml nước; rồi cho iod vào, tiếp tục lắc mạnh cho tan rồi cho thêm phần nước còn lại. Bảo quản trong lọ mầu nút kín B1.4. Dung dịch lục sáng (Brillant green): - Lục sáng 0,5 g - Nước cất 100 ml Chú thích: Có thể thay dung dịch lục sáng bằng đỏ phenol, dung dịch 0,2% trong nước (phenol red) B1.5. Dung dịch mật bò: - Mật bò khô 10 g - Nước cất 100 ml Hoà tan mật bò trong nước sôi. Hấp 121 oC trong 20 phút. B1.6. Môi trường hoàn chỉnh: - Môi trường cơ bản (B1.1) 900 ml - Dung dịch Natri-thiosulfat (B1.2) 28 ml - Dung dịch Iod (B1.3) 20 ml - Dung dịch lục sáng (B1.4) 2 ml - Dung dịch mật bò (B1.5) 50 ml Lần lượt hoà lẫn các dung dịch theo thứ tự từ trên xuống, chia môi trường vào các ống với dung tích thích hợp cho kiểm nghiệm. B2. Môi trường thạch S.S - Pepton 5 g - Lactos 10 g - Muối mật 10 g - Natri-xitrat 12 g - Natri-thiosulfat 12 g - Sắt xitrat 0,5 g - Bột cao thịt 5 g - Thạch 18-20 g - Đỏ trung tích, dung dịch 0,5% trong nước (neutral red) 4,5 ml - Lục sáng, dung dịch 0,1% trong nước (brillant green) 0,33 ml - Nước cất 1.000 ml Trừ dung dịch đỏ trung tính và lục sáng ra, lần lượt hoà tan các thành phần còn lại trong nước sôi. Để nguội, chỉnh pH 7,2 - 7,4 hoà lẫn dung dịch đỏ trung tính và lục sáng vào. Đun sôi, để nguội xuống còn 55 oC . Chia vào các đĩa petri vô khuẩn, mỗi đĩa từ 15-20 ml B3. Môi trường thạch deoxycholat-xitrat: - Bột cao thịt 5 g - Pepton 5 g - Thạch 18-20 g - Natri deoxycholat 5g - Natri- xitrat: Na 3 C 6 H 5 O 7 . 11H 2 O 25 g hoặc Na 3 C 6 H 5 O 7 . 2H 2 O 20 g - Sắt xitrat 1 g - Lactos 10 g - Đỏ trung tính, dung dịch 1% trong cồn (neutral red) 2 ml - Nước cất 1.000 ml Hoà tan cao thịt, pepton, thạch trong 1.000 ml nước cất, đun sôi. Chỉnh pH 7,4 lần lượt hoà tan các thành phần còn lại, chỉnh pH 7,4. Đun sôi cách thuỷ hoặc hấp cách thuỷ từ 20-30 phút. Chia ra các đĩa petri, mỗi đĩa từ 15-20 ml B4. Môi trường thạch sắt, đường trisaccarit: - Pepton 20 g - Natri clorua 5 g - Lactos 10 g - Saccaros 10 g - Glucos 1 g - Sắt xitrat 0,3 g - Natri-thiosulfat 0,3g - Đỏ phenol 0,025g - Thạch 18-20 g - Nước cất 1.000 ml Lần lượt hoà tan các thành phần trên trong nước sôi chỉnh pH 7,4 chia vào các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml. Hấp 121 oC từ 10-15 phút. Đặt ống nghiệm nằm nghiêng để thân môi trường có chiều cao 2,5 cm B5. Môi trường nước thịt: - Nước thịt bò 1.000 ml - Pepton 10 g - Natri clorua 5 g Hoà tan pepton, muối trong nước thịt đun sôi. Để nguội, chỉnh pH 7,4-7,6. Chia vào các ống nghiệm, mỗi ống 5 ml. Hấp 121 oC trong 20 phút B6. Môi trường thạch dinh dưỡng: - Môi trường nước thịt (B5) 1.000 ml - Thạch 18-20 g Hoà tan thạch vào môi trường nước thịt, đun sôi. Để nguội, chỉnh pH 7,4-7,6. Hấp 121 oC trong 20 phút. Chia vào các đĩa petri mỗi đĩa 15-20 ml và vào các ống nghiệm, mỗi ống 5 ml. Đặt ống nghiệm nằm nghiêng B7. Môi trường thạch urê (Christensen): B7.1. Dung dịch cơ bản: - Pepton 1 g - Glucos 1 g - Natri clorua 5 g - Kali dihydro photphat 2 g - Đỏ phenol 0,012 g - Thạch 18-20 g - Nước cất 1.000 ml Hoà tan các thành phần trên trong nước cất đun sôi. Chỉnh pH 7,0. Hấp 121 oC trong 20 phút. B7.2. Dung dịch urê: - Urê 400 g - Nước cất vừa đủ 1.000 ml Hoà tan urê trong nước. Lọc vô khuẩn B7.3. Môi trường hoàn chỉnh: - Dung dịch cơ bản (B7.1) 950 ml - Dung dịch urê (B7.2) 50 ml Trong điều kiện vô khuẩn, đun nóng dung dịch cơ bản, để nguội xuống còn 45 oC trộn dung dịch urê vào. Chia ra các ống nghiệm vô khuẩn, mỗi ống 5 ml, đặt ống nghiệm nằm nghiêng cho đông lại. B8. Môi trường lysin decacboxylas: - L. Lysin monohydro clorit 5 g - Chất chiết men (yeast extract) 3 g - Glucos 1 g - Tím bromocresol 0,015 g - Nước cất 1.000 ml Hoà tan các thành phần trên trong nước cất đun sôi. Chỉnh pH 7,0. Chia vào các ống nghiệm có đường kính 8 mm, mỗi ống 5 ml. Hấp 121 oC trong 10 phút B9. Môi trường nước pepton (để thử phản ứng Indol) - Pepton 10 g - Natri clorua 5 g - Nước cất 1.000 ml Hoà tan các thành phần trên trong nước nóng, chỉnh pH 7,4 - 7,6. Chia vào các ống nghiệm, mỗi ống 5 ml. Hấp 121 oC trong 20 phút. B10. Môi trường nước pepton glucos (để thử phản ứng V.P.) - Pepton 10 g - Natri clorua 5 g - Glucos 5 g - Kalihydro photphat (K 2 HPO 4 ) 5 g - Nước cất 1.000 ml Hoà tan các thành phần trên trong nước nóng, chỉnh pH 7,4 - 7,6 chia vào ống nghiệm, mỗi ống 3 ml. Hấp 121 oC trong 20 phút. B11. Thuốc thử B. Galactosidas (O.N.P.G.): B11.1. Dung dịch đệm: - Natri dihydro photphat (NaH 2 PO 4 ) 6,9 g - Natri hydroxyt, dung dịch 0,1 N trong nước (NaOH) khoảng 3 ml - Nước cất vừa đủ 50 ml Hoà tan Natri dihydro photphat trong khoảng 45 ml nước. Chỉnh pH 7,0 bằng Natri hydroxyt, dung dịch 0,1 N. Bổ sung nước vừa đủ 50 ml. Bảo quản lạnh. B11.2. Dung dịch O.N.P.G. - O-Nitrophenyl - B.D. Galactopyranosid (O.N.P.G.) 80 mg - Nước cất 37 oC 15 ml Hoà tan trong nước, để nguội B11.3. Thuốc thử hoàn chỉnh: - Dung dịch đệm (B11.1) 5 ml - Dung dịch O.N.P.G. (B11.2) 15 ml Hoà lẫn, bảo quản lạnh, trước khi dùng đun nóng cách thuỷ 37 oC B12. Thuốc thử Indol (dung dịch Kowacs): - Paradithylaminobenjaldehyd 5 g - Cồn amyl hoặc iso-amyl 75 g - Axitclohydric tinh khiết 25 g Hoà tan aldehyd trong cồn, nhỏ từng giọt axit vào, vừa nhỏ vừa lắc cho tan đều. B13. Thuốc thử Voges- proskauer (dung dịch Barritt); - Dung dịch 5% cồn a - napthol + a - napthol 5 g + Cồn etanol 100 ml - Dung dịch 40% Kalihydroxyt + Kalihydroxyt (KOH) 40 g + Nước cất 100 ml B14. Nước muối đẳng trương: - Natri clorua 8,5 g - Nước cất 1.000 ml Hoà tan muối, hấp 121 oC trong 20 phút.