TCVN8276:2018

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8276:2018 (EN 12822:2014) về Thực phẩm - Xác định vitamin E bằng ký sắc lỏng hiệu năng cao - Định lượng α-, β-, γ- và δ- tocopherol TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8276:2018 EN 12822:2014 THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH VITAMIN E BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - ĐỊNH LƯỢNG α -, β -, γ - VÀ δ -TOCOPHEROL Foodstuffs - Determination of vitamin E by high performance liquid chromatography - Measurement of α-, β -, γ - and δ -tocopherol Lời nói đầu TCVN 8276:2018 thay thế TCVN 8276:2010 TCVN 8276:2018 hoàn toàn tương đương với EN 12822:2014; TCVN 8276:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Lời giới thiệu Tiêu chuẩn này cung cấp cơ sở cho các phương pháp phân tích. Tiêu chuẩn này được dùng như một khung pháp lý trong đó các nhà phân tích có thể xác định việc phân tích theo quy trình chuẩn. Vì tiêu chuẩn này liên quan đến phép đo phần khối lượng α-, β -, γ - và δ - tocopherol trong thực phẩm nê n phần tham chiếu được nêu trong Thư mục tài liệu tham khảo về cách tính và biểu thị hàm lượng vitamin E theo các hoạt tính sinh học. Xem thêm thông tin trong [1], [2], [3] và [4]. Với phương pháp này không có sự khác biệt giữa RRR-tocopherol và tất cả các tocopherol racemic. THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH VITAMIN E BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - ĐỊNH LƯỢNG α -, β -, γ - VÀ δ - TOCOPHEROL Foodstuffs - Determination of vitamin E by high performance liquid chromatography - Measurement of α-, β -, γ - and δ -tocopherol CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể cần phải sử dụng các vật liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đề cập đến các vấn đề an toàn khi sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn qu i định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng vitamin E trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Việc xác định hàm lượng vitamin E được thực hiện bằng cách định lượng α-, β -, γ - và δ - tocopherol . Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong hai phép nghi ê n cứu đánh giá liê n phòng. Nghiên cứu đầu tiên là phân tích α -tocopherol trong margarin và sữa bột, dao động từ 9,89 mg/100 g đến 24,09 mg/100 g. Nghiên cứu thứ hai là phân tích α-, β-, γ - và δ - tocopherol và δ - tocopherol trong sữa bột và - và β- tocopherol trong bột yến mạch dao động từ 0,057 mg/100 g ( β - Mooopherol) đến 10,2 mg/100 g ( α- tocopherol). CHÚ THÍCH Hoạt tính của vitamin E có thể tính được từ hàm lượng tocopherol chép nhận các hệ số thích hợp nêu trong [1] , [2], [3] và [4]. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi nă m công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài li ệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 4851 (ISO 3696), Nước sử dụng để phân tích trong phòng thử nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử. 3 Nguyên tắc α-, β-, γ - và δ -tocopherol trong dung dịch mẫu được xác định bằng HPLC dertecto UV hoặc huỳnh quang. Trong phần lớn các trường hợp, xà phòng hóa mẫu thử, sau đó chiết nếu cần. Việc nhận biết dựa vào thời gian lưu và được định lượng bằng phương pháp ngoại chuẩn sử dụng diện tích pic hoặc chiều cao pic. Các phương pháp nội chuẩn có thể được sử dụng nếu các phép thử độ thu hồi tương ứng cho thấy có cùng tính năng của chất nội chuẩn trong quá trình phân tích như chất phân tích, thông tin xem thêm [4] đến [14]. CHÚ THÍCH Sử dụng các cột pha thông thường, việc tách các tocopherol và tocotr i enol cũng là khả thi. 4 Thuốc thử Sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước được sử dụng phải phù hợp với loại 1 của TCVN 4861 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác. 4.1 Metanol. 4.2 Etanol nguyên chất, φ(C 2 H 5 OH) = 100 % thể tích. 4.3 Etanol, φ(C 2 H 5 OH) = 96 %. 4.4 Natri sulfat, khan. 4.5 Dung dịch KOH, để xà phòng hóa, nồng độ khối lượng thích hợp, ví dụ ρ (KOH) = 50 g/100 ml hoặc ρ (KOH)=60 g/100 ml hoặc các dung dịch cồn, ví dụ: 28 g KOH trong 100 ml hỗn hợp của 9 phần thể tích etanol và 1 phần thể tích nước. 4.6 Chất chống oxi hóa, như axit ascorbic (AA), natri ascorbat, pyrogallol, natri sulfua (Na 2 S), hydroquinon hoặc hydroxyto l uen đã buty l at hóa (BHT). 4.7 Dung môi và các dung môi chiết , như ete dietyl (không chứa perox i t), diclo metan, dầu nh ẹ (dải sôi từ 40 °C đến 60 °C), n -hexan, etylaxetat hoặc các hỗn hợp thích hợp. 4.8 Pha động của HPLC: Các hỗn hợp thích hợp được biểu thị theo thể tích, ví dụ: 1,4-dioxan 3 % hoặc 2-propanol 0,5 %, mety l tert-butyl ete 3 % trong n -hexan hoặc n -heptan đối với sắc ký pha thuận (NP) hoặc 1 % đến 10 % nước trong metanol đối với sắc ký pha đảo (RP). Đối với các hệ thống HPLC thay thế, xem Phụ lục C. 4.9 Chất chuẩn 4.9.1 Yê u cầu chung β-, γ - và δ - tocopherol được cung cấp bởi Calbiochem 1) còn α -tocopherol được cung cấp từ các nhà cung cấp khác nhau. Độ t i nh khiết của các chất chuẩn tocopherol có thể dao động từ 90 % đến 100 %. Do đó, cần phải xác định nồng độ của dung dịch hiệu chuẩn bằng đo phổ UV (các phép thử về độ tinh khiết, xem 4.10.5). 4.9.2 α -tocopherol M ( C 29 H 50 O 2 ) = 430,7 g/mol, có độ tinh khiết ít nhất là 95 %. α -tocopherol axetat M (C 31 H 52 O 3 ) = 472,7 g/mol cũng có thể được dùng làm chất chuẩn sau kh i xà phòng hóa. 4.9.3 β - tocopherol M (C 28 H 48 O 2 ) = 416,7 g/mol, có độ t i nh khiết ít nhất là 90 %. 4.9.4 γ - tocopherol M ( C 28 H 48 O 2 ) = 416,7 g/mol, có độ tinh khiết ít nhất là 90 %. 4.9.5 δ -tocopherol M (C 27 H 46 O 2 ) = 402,6 g/mol , có độ t i nh khiết ít nhất là 90 %. 4.10 Dung dịch gốc 4.10.1 Dung dịch gốc otocopherol Cân một lượng chất chuẩn α -tocopherol (4.9.2), chính xác đến m ili gam, ví dụ: khoảng 10 mg và hòa tan trong một thể tích dung môi xác định, ví dụ: 100 ml n -hexan đối với hệ thống NP hoặc 100 ml metanol đối với hệ thống RP. 4.10.2 Dung dịch gốc β - tocopherol Cân một lượng chất chuẩn β -tocopherol (4.9.3), chính xác đến mi li gam, ví dụ: khoảng 10 mg và hòa tan trong một thể tích dung m ô i xác định, ví dụ: 100 ml n -hexan đối với hệ thống NP hoặc 100 ml metanol đối với hệ thống RP. 4.10.3 Dung dịch gốc γ - tocopherol Cân một lượng chất chuẩn γ - tocopherol (4.9.4), chính xác đến miligam, ví dụ: khoảng 10 mg và hòa tan trong một thể tích dung m ô i xác định, ví dụ: 100 ml n -hexan đối với hệ thống NP hoặc 100 ml metanol đối với hệ thống RP. 4.10.4 Dung dịch gốc δ -tocopherol Cân một lượng chất chuẩn δ -tocopherol (4.9.5), chính xác đến miligam, ví dụ: khoảng 10 mg và hòa tan trong một thể tích dung môi xác định, ví dụ: 100 ml n -hexan đối với hệ thống NP hoặc 100 ml metanol đối với hệ thống RP. 4.10.5 Phép thử về nồng độ và độ tinh khiết Đo độ hấp thụ của các dung dịch gốc (4.10.1 đến 4.10.4) ở các bước sóng thích hợp bằng máy đo phổ UV (5.1). Nếu sử dụng dung môi n -hexan thì dùng pipet lấy 10 ml dung dịch gốc cho vào bình đáy tr òn bằng thủy tinh hổ phách và loại bỏ dung môi trên máy cô quay (5.2) dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 50 °C. Sau khi hồi lạ i áp suất khí quyển bằng nitơ, lấy bình ra và hòa tan lượng cặn trong 10 ml metanol bằng cách xoay bình. Lấy dung dịch này để đo phổ. Tính nồng độ khối lượng của vitamin E, ρ của các α-, β-, γ - và δ - tocopherol tương ứng, bằng m i crogam trên mililit theo Công thức (1): Trong đó: A là giá trị độ hấp thụ của từng tocopherol trong dung dịch gốc tương ứng trong metanol; ε là hệ số hấp thụ phân tử tr ong metanol tính bằng l x mo l - 1 x c m - 1 ở bước sóng xác định nêu trong Bảng 1; M là khối lượng phân tử của từng tocopherol nêu trong Bảng 1, tính bằng gam tr ên mo l (g/mol). Bảng 1 - Các ví dụ về giá trị và tính ε Chất Bước sóng (metanol) Khối lượ n g phân tử (g.mol -1 ) ε (l.mo l -1 . c m - 1 ) Tài liệu tham khảo α- tocopherol 292 nm 76 430,7 3273,3 [12], [13], [15] β- tocopherol 296 nm 89 416,7 3708,6 [12], [13], [15] γ - tocopherol 298 nm 91 416,7 3782 [12] , [13], [15] δ - tocopherol 298 nm 87 402,6 3502,6 [12], [13], [15] Ngoài giá trị α -tocopherol thu được ở bước sóng 292 nm, thì cần đo độ hấp thụ ở bước sóng 255 nm (nhỏ nhất). Tỷ lệ ở bước sóng này không được vượt quá E 255 /E 292 = 0,18. Nếu không, các chất này sẽ bị phân hủy (xem thêm thông tin [15]). 4.11 Dung dịch chuẩn 4.11.1 Dung dịch chuẩn α- tocopherol Dùng pipet lấy 10 ml dung dịch gốc α- tocopherol (4.10.1) cho vào bình định mức một vạch 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp (ví dụ: n -hexan cho NP và metanol cho RP). Dung dịch chuẩn cần có nồng độ khối lượng từ 1 µg/ml đến 10 µg/ml α- tocopherol . Nếu sử dụng detector UV để kiểm soát sắc ký thì cần sử dụng dung dịch có nồng độ cao hơn. Dung dịch chuẩn phải được bảo quản tránh ánh sáng, để ở nhiệt độ nhỏ hơn 4 °C và cần được kiểm tra như mô tả trong 4.10.5. 4.11.2 Dung dịch chuẩn của hỗn hợp α-, β-, γ - và δ - tocopherol Dùng pipet lấy từng dung dịch gốc (4.10), ví dụ 10 ml, cho vào bình định mức một vạch 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp (ví dụ: n -hexan cho NP và metanol cho RP). Dung dịch chuẩn cần có nồng độ khối lượng từ 1 µg/ml đến 10 µg/ml đồ với mỗi dạng tocopherol. Dung dịch chuẩn phải được bảo quản tránh ánh sáng, để ở nhiệt độ nhỏ hơn 4 °C và cần được kiểm tra như mô tả trong 4.10.5. 5 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của ph ò ng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau: 5.1 Máy đo phổ UV, có thể đo độ hấp thụ ở các bước sóng xác định, có các cuvet thích hợp, ví dụ: chiều dài đường quang 1 cm. 5.2 Bộ cô quay, có nồi cách thủy và bộ phận chân không. Nên sử dụng nitơ để tạo chân không. 5.3 Hệ thống HPLC Hệ thống HPLC gồm có bơm, bộ phận bơm mẫu, detector huỳnh quang có bước sóng kích thích 295 nm, bước sóng phát xạ 330 nm và hệ thống đánh giá như máy tích phân. Có thể sử dụng detector UV. Bước sóng được cài đặt ở 292 nm và trong trường hợp này, dung dịch mẫu và dung dịch chuẩn cần phải đậm đặc hơn. Ngoài ra, khả năng phát hiện các hợp chất gây nhiễu số tăng. 5.4 Cột HPLC Cột phân tích pha thuận, ví dụ: đường kính từ 4,0 mm đến 4,6 mm, dài từ 100 mm đến 250 mm, được nhồi silica cỡ hạt 5 µm. Có thể sử dụng cỡ hạt và kích thước cột khác với quy định trong tiêu chuẩn này. Các thông số tách cần phải phù hợp với vật liệu để đảm bảo cho kết quả tương đương. Các tiêu chí về hiệu năng đối với các cột phân tích thích hợp là độ phân giải đường nền của chất phân tích có liên quan. Các vật liệu nhồi cột silica thích hợp có sẵn từ hãng L ichrosorb ® 60 2) Spherisorb ® S i 2) , Hypers i l ® Si 2) và Lichrosphe r ® 100 D I OL 2) . Có thể sử dụng các cột pha đảo phân tích, ví dụ: C 1 8 , có cỡ hạt 5 µm, đường kính 4,0 mm đến 4,6 mm, dài 100 mm đến 250 mm. Các vật liệu nhồi cột pha đảo phân tí ch thích hợp là Spherisorb ® ODS 2) và Hypersil ® ODS 2 ) . Phần lớn các cột RP không tách được β - tocopherol và γ -tocopherol. Tuy nhiên, các cột này có thể được sử dụng để định lượng α -, δ - tocopherol và có thể cho các giá trị tổng của β - + γ - tocopherol. 5.5 Bộ lọc Các bộ lọc cỡ nhỏ và c ỡ lớn để lọc pha động HPLC và các dung dịch mẫu tương ứng, ví dụ: cỡ lỗ 0,45 µm là thích hợp. CHÚ THÍCH Lọc pha động cũng như lọc dung dịch mẫu thử qua màng lọc trước khi sử dụng hoặc bơm thường sẽ kéo dài thời gian sử dụng của cột. 5.6 Bộ lọc tách pha (tùy chọn). 6 Cách tiến hành 6.1 Chuẩn bị mẫu Đồng hóa mẫu thử. Nghiền mẫu bằng dụng cụ thích hợp và trộn lại. 6.2 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 6.2.1 Biện pháp phòng ngừa Điều quan trọng là các dung dịch mẫu thử cần được bảo vệ tránh ánh sáng trước khi phân tích. 6.2.2 Các mẫu dầu và mỡ có hàm lượng nước thấp có chứa các tocopherol chưa este hóa 6.2.2.1 Dầu và mỡ có hàm lượng nước thấp Qui trình này chỉ có thể áp dụng cho các mẫu có chứa các tocopherol chưa este hóa. Nếu không, tiến hành theo 6.2.3. Cân 2 g mẫu thử, chính xác đến 1 mg, cho vào bình định mức một vạch 25 ml. Thêm n -hexan hoặc dung môi thích hợp khác (4.7) và hòa tan phần mẫu thử bằng cách xoay bình. Siêu âm dung dịch để hỗ trợ cho việc hòa tan. Pha loãng bằng cùng loại dung môi đến vạch. Dung dịch mẫu thử này chỉ được sử dụng cho các hệ thống pha thường. Có thể pha loãng dung dịch này trước khi đo sắc ký hoặc sử dụng một lượng mẫu nhỏ hơn. 6.2.2.2 Margar i n và bơ Cần tách chất béo của margarin và của bơ trước khi pha loãng mẫu. Có thể thực hiện bằng cách, ví dụ: trộn mẫu với natri sul f at khan (4.4), thêm n -hexan (4.7) và xử lý hỗn hợp trong thiết bị s iêu âm. Lấy ra chất rắn và rửa ít nhất hai lần bằng n -hexan. Loại bỏ dung môi bằng bộ c ô quay (5.2) và áp suất giảm, hòa tan cặn bằng một thể tích xác định n -hexan và định lượng bằng HPLC pha thường. 6.2.3 Các loại mẫu khác 6.2.3.1 Xà phòng hóa Xà phòng hóa từ 2 g đến 10 g mẫu thử bằng hồi lưu tốt nhất là dưới dòng nitơ sử dụng các lượng thích hợp etanol (4.3) hoặc metanol (4.1), nước và chất chống oxi hóa như axit ascorbic, hydroquinon, pyrogalol hoặc BHT (4.6) và dung dịch kali hydroxit (4.5). Thêm cồn và các chất chống oxi hóa vào mẫu trước khi bổ sung kali hydroxit. Các ví dụ về tỷ lệ thuốc thử thích hợp được nếu trong Bảng 2. Bảng 2 - Tỷ lệ thuốc thử thích hợp Khối lượng mẫu Cồn Chất chống oxi hóa Kal i hydrox i t < 2 g đến 5 g 50 ml metanol 0,25 g AA 5 ml dung dịch 50 g/100 ml > 5 g đến 10 g 100 ml etanol 1 , 0 g AA +0,04 g Na 2 S 20 ml dung dịch 60 g /100 ml > 10g đến 20g 150 ml etan ol 1,0 g AA 50 ml dung dịch 60 g/100 ml Thời gian xà phòng hóa thường tr ong khoảng từ 15 min đến 40 min ở nhiệt độ từ 80 °C đến 100 °C. Nếu sau khi xà phòng hóa và làm nguội, có dầu hoặc mỡ trên bề mặt của hỗn hợp xà phòng hóa thì cần thêm một lượng dư dung dịch kali hydroxit (4.5) và thời gian xà phòng hóa phải kéo dài. 6.2.3.2 Chiết Để tránh tạo nh ũ tương, cần bổ sung một lượng nước vào dung dịch mẫu đã xà phòng hóa sao cho tỷ lệ của cồn và nước có tr ong dung dịch tạo thành là 1:1. Chiết các tocopherol bằng dung môi thích hợp (4.7). Nếu n - hexan được dùng làm dung môi đ ể chiết γ -tocopherol và δ -tocopherol, thì cần bổ sung một lượng nhất định dung môi phân cực hơn để có được độ thu hồi tốt nhất. Sử dụng hỗn hợp, ví dụ như dầu nhẹ và ete dietyl 20 % để chiết được h ế t các hợp chất này. Kiểm tra độ thu hồi để nhận biết khả năng thất thoát (thông tin thêm xem [16], [17]). Lặp lại qui trình chiết 3 lần đến 4 lần với các thể tích từ 50 m l đến 150 ml. Rửa các phần chiết thu được bằng nước (từ 2 lần đến 4 lần dùng 50 đến 150 ml) đến trung tính. Việc chiết có thể được thực hiện bằng kỹ thuật lỏng/lỏng có hỗ trợ pha rắn (ví dụ: Extrelut ® 3) ) khi hàm lượng vitamin E không quá thấp [thông tin thêm xem [18], [22]. 6 .2.3.3 Làm bay hơi Làm bay hơi dịch chiết bằng bộ cô quay (5.2). Loại bỏ hết nước bằng cách làm kh ô với natri sulfat (4.4) hoặc được chưng cất đẳng phí với etanol (4.2) hoặc toluen. Có thể sử dụng các kỹ thuật tương đương khác như giấy lọc tách pha để loại bỏ các vết nước, với điều kiện đã được chứng minh là không ảnh hưởng đến kết quả. 6 .2.3.4 Pha loãng Hòa tan lại cặn bằng pha động (4.8) hoặc dung môi HPLC tương đương khác đến nồng độ cuối cùng đối với từng tocopherol từ 1 µ g/ml đến 10 µ g/ml. 6.3 Nhận biết Nhận biết các tocopherol bằng cách so sánh thời gian lưu của pic riêng rẽ trong sắc ký đồ thu được với dung dịch mẫu thử và với dung dịch chuẩn. Việc nhận biết pic có thể được thực hiện bằng cách thêm lượng nhỏ các dung dịch chuẩn thích hợp vào dung dịch mẫu thử. CHÚ THÍCH Việc tách và định lượng cho thấy là thỏa đáng nếu tuân theo các điều kiện thí nghiệm sau đây (xem thêm Hình A.1 và A.2). Đối với các hệ thống HPLC thay thế, xem Bảng C.1. Pha tĩnh: L i chnosorb ® Si 60, 5 µ m; Kích thước cột: 125 mm x 4 mm; Pha động: Một phần thể tích của 1,4-dioxan 3 % trong n -h e xan; Tốc độ dòng: 1,0 ml/min; Th ể tích b ơ m: 10 µ l đến 100 µ l; Dertector; huỳnh quang; bước sóng kích thích: 295 nm; bước sóng phát xạ: 330 nm. 6.4 Xác đị nh Bơm các thể tích thích hợp ( l ên đến 100 µ l) của dung dịch chuẩn cũng như dung dịch mẫu thử vào hệ thống HPLC. Tiến hành định lượng bằng phương pháp ngoại chuẩn, tích phân các d i ện tích hoặc xác định chiều cao pic và so sánh các kết quả với các giá trị tương ứng đối với chất chuẩn. Bơm các thể tích bằng nhau của dung dịch mẫu và của dung dịch chuẩn hoặc bù bằng hệ số tương ứng trong phần tính toán kết quả (xem Điều 7). Kiểm tra độ tuyến tính của hàm hiệu chuẩn. 7 Tính kết quả Việc tính toán dựa vào đường chuẩn hoặc sử dụng các chương trình tương ứng của bộ tích phân hoặc theo công thức đã được giản lược sau đây. Tính nồng độ khối lượng, w , của α - , β -, γ - hoặc δ -tocopherol bằng mg/100 g mẫu thử sử dụng Công thức (2): Trong đó: A S là diện tích pic hoặc chiều cao pic của α-, β-, γ - và δ - tocopherol thu được trong dung dịch mẫu thử; A ST là diện tích pic hoặc chiều cao pic của α-, β-, γ - và δ - tocopherol thu được trong dung dịch chuẩn; V là tổng thể tích dung dịch mẫu thử (xem 6.2.2 đến 6.2.3), tính bằng mililit (ml); ρ là nồng độ của α-, β-, γ - và δ - tocopherol trong dung dịch chuẩn (xem 4.11.1 và 4.11.2), được hiệu chính độ tinh khiết (xem 4.10.5), tính bằng microgam trên m ililit ( µ g/ml); m là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g); V S T là thể tích bơm của dung dịch chuẩn, tính bằng microlit ( µ l); V S là thể tích bơm của dung dịch mẫu thử, tính bằng microlit ( µ l); 1 000 là hộ số chuy ể n đ ổ i từ microgam sang miligam; 100 là hệ số chuyển đổi phần khối lượng trên 100 g. Báo cáo kết quả về α-, β-, γ - và δ - tocopherol theo mg/100 g. Đối với hoạt tính vitamin E, xem phần giới thiệu và [1], [ 2], [3] . 8 Độ chụm 8.1 Yêu cầu chung Dữ liệu v ề độ chụm của các phương pháp HPLC khác nhau để xác định α -tocopherol được thiết lập năm 1994 bằng nghiên cứu so sánh quốc tế [xem 18] do Chương trình thử nghiệm và Đo chuẩn của Ủy ban Châu âu thực hiện trên mẫu margarin (Chất chuẩn đã được chứng nhận CRM 122 và sữa bột CRM 421) và đưa ra các thông tin thống kê như trong Phụ lục B. Các dữ liệu thu được từ các nghiên cứu so sánh này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và các chất nền mẫu khác với các giá trị nêu trong Phụ lục B. Dữ liệu về độ chụm đối với sữa bột và bột yến mạch đã được thiết lập trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm theo ISO 5725:1986, xem [19], do Viện Max von Pettenkofer của Ủy ban Y tế Liên bang (nay là Viện Bảo vệ Sức khỏe Người tiêu dùng và Thú y), cục Hóa thực phẩm, Berlin, Đức, xem [20] thực hiện. Các dữ liệu thu được từ các nghiên cứu liên phòng này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và các chất nền mẫu khác với các giá trị nêu tr ong Phụ lục B. 8.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử ngh iệ m riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật l iệ u thử giống h ệ t nhau, do cùng một người phân tích, sử dụng cùng một thiết bị, tr ong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r . Độ lặp lại phụ thuộc vào nồng độ của chất phân tích có tr ong mẫu. Các giá trị đó là: margarin α- tocopherol = 24,09 mg/100 g r = 2,765 mg/100 g sữa bột α- tocopherol = 9,89mg/100g r = 1,130 mg/100 g sữa bột α- tocopherol = 10,2 mg/100g r = 0,853 mg/100 g β- tocopherol = 0,081 mg/100 g r = 0,025 mg/100 g γ - tocopherol = 1,989 mg/100 g r = 0,311 mg/100 g δ - tocopherol = 0,280 mg/100g r = 0,082 mg/100 g bột yến mạch α- tocopherol = 0,279 mg/100 g r = 0,071 mg/100g β- tocopherol = 0,057 mg/100 g r = 0,017 mg/100 g 8.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, thực hiện trong hai phòng thử nghiệm khác nhau, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R . Các giá trị đó là: margar i n α- tocopherol = 24,09 mg/100 g R = 4,18mg/100 g sữa bột α- tocopherol =9,89 mg/100g R =1,96 mg/ 1 00 g sữa bột α- tocopherol = 10,2 mg/100 g R = 3,705 mg/100 g β- tocopherol =0,081 mg/100g R = 0,046 mg/100 g γ - tocopherol = 1,989 mg/100 g R = 0,978 mg/100 g δ - tocopherol = 0,280 mg/100 g R = 0,134 mg/100 g bột yến mạch α- tocopherol = 0,279 mg/100 g R = 0,133 mg /100 g β- tocopherol = 0,057 mg/100 g R = 0,030 mg/100 g 9 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm nên phù hợp với TCVN/ISO/IEC17025 và ít nhất bao gồm các thông tin sau: a) mọi thông tin cần thiết cho việc nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp đã sử dụng; c) ngày lấy mẫu và qui trình lấy mẫu (nếu biết); d) ngày nhận mẫu; e) ngày thử nghiệm; f) kết quả và đơn vị đo mà kết quả biểu thị; g) bất kỳ điểm đặc biệt nào quan sát được trong quá trình thử nghiệm; h) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả. Phụ lục A (Tham khảo) Ví dụ về sắc ký đồ của HPLC CHÚ DẪN Y X 1 2 3 4 Pha tĩnh: Kích thước cột: Pha động: Tốc độ dòng: Thể tích bơm: Detector: huỳnh quang thời gian (min) α- tocopherol β -tocopherol γ -tocopherol δ - tocopherol Lichrosorb ® Si 60, 5 µ m 125 mm x 4 mm Một phần thể tích của 1,4-dioxan 3 % trong n -hexan; 1,0 m l/ min; 20 µl ; huỳnh quang; bước s ó ng kích thích: 295 nm và bước sóng phát xạ: 330 nm Hình A.1 - Ví dụ về tách α-, β-, γ - và δ - tocopherol từ mẫu margarin (CRM 122) bằng KPLC CHÚ DẪN Y X 1 2 3 Pha tĩnh: Kích thước cột: Pha động: Tốc độ dòng: Thể tích bơm: Detector: huỳnh quang thời gian (min) α-tocopherol γ -tocopherol δ -tocopherol Lichrosorb ® Si 60, 5 µ m 125 mm x 4 mm Một phần thể tích của 1,4-dioxan 3 % trong n -hexan; 1,0 m l/ min; 20 µl ; huỳnh quang; bước s ó ng kích thích: 295 nm và bước sóng phát xạ: 330 nm Hình A.2 - Ví dụ về tách α-, β-, γ - và δ - tocopherol từ mẫu sữa bột (CRM 421) bằng HPLC Phụ lục B (Tham khảo) Dữ liệu về độ chụm Dữ liệu trong B ảng B.1 của các phương pháp khác nhau đ ể xác định vitamin E ( α -tocopherol) đã xác định được trong nghiên cứu so sánh quốc tế do Chương trình thử nghiệm, Đo lường và Tiêu chuẩn của Ủy ban châu Âu tổ chức, xem [18]. Dữ liệu trong Bảng B.2 và Bảng B.3 được xác định trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm theo ISO 5725:1986 *) [19], do Viện Max von Pettenkofer của Ủy ban Y tế Liên bang (nay là Viện Bảo vệ Sức khỏe Người tiêu dùng và Thú y), Cục Hóa thực phẩm, Berlin, Đức [20] thực hiện. Bảng B.1 - Dữ liệu về độ chụm đối với margarin và sữa bột Mẫu CRM122 Margarin CRM421 Sữa bột Chất phân tích α -tocopherol α -tocopherol Năm thực h iệ n phép thử liên phòng 1994 1994 Số lượng phòng thử nghiệm 9 10 Số lượng mẫu 1 1 Số lượng phòng thử nghiệm còn lạ i sau khi trừ ngoại lệ 9 10 Số lượng ngoại lệ 0 0 Số lượng bộ dữ liệu 9 10 Số lượng phép đo lặp lại 45 50 Giá trị trung bình, , mg/100 g 24,09 9,89 Độ lệch chuẩn lập lại. s r , mg/100 g 0,977 0,399 Độ lệch chuẩn tương đối l ặp lại, RSD r , % 4,1 4,0 Giá trị độ lặp lại, r ( r = 2,83 x s r ), mg/100 g 2,765 1,130 Độ lệch chuẩn tái lập, s R , mg /100 g 1,477 0,693 Độ lệch chuẩ n tương đối tái lập, RSD r , % 6,1 7,0 Giá trị độ tái lập, R ( R = 2,83 x s R ), mg/100 g 4,180 1,960 Giá trị HorRat, theo [21] 0,87 0,87 CHÚ THÍCH: Dữ liệu thu được từ nghiên cứu so sánh quốc tế này thu được sử dụng các phương pháp giống nhau trong các qu i trình phân tích thông dụng của các phòng thử nghiệm tham gia với các hệ thống HPLC như trong Phụ lục C . Bảng B.2 - Dữ liệu về độ chụm đối với sữa bột Chất phân tích α -tocopherol β -tocopherol γ -tocopherol δ -tocopherol Năm thực hiện phép thử li ên phòng 1993 1993 1993 1993 Số lượng phòng thử nghiệm 13 12 13 10 Số lượng mẫu 5 5 5 5 Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 12 9 11 8 Số lượng ngoại lệ 1 3 2 2 Số lượng kết quả được chấp nhận 66 51 65 40 Giá trị trung bình, , mg/100 g 10,2 0,081 1,989 0,280 Độ lệch chuẩn l ặp lại, s r , mg/100 g 0,301 0,009 0,110 0,029 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r , % 3 , 0 11,1 5,5 10,4 Giá trị độ lặp lại, r ( r = 2,83 x Sr), mg/100 g 0,853 0,025 0,311 0,082 Độ lệch chuẩn tái lập, s R , mg/100 g 1,31 0,016 0,346 0,047 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD r , % 12,8 19,8 17,4 16,8 Giá trị độ tái lập, R ( R = 2,83 x s R ), mg/100 g 3,705 0,046 0,978 0,134 Giá trị HorRat, theo [21] 1,1 1,2 1,7 1,2 Bảng B.3 - Dữ liệu về độ chụm đối với bột yến mạch Chất phân tích α -tocopherol β -tocopherol Năm thực hiện phép thử liên phòng 1993 1993 Số lượng phòng thử nghiệm 13 13 Số lượng mẫu 5 5 Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 12 11 Số lượng ngoại lệ 1 2 S ố lượng kết quả được chấ p nhận 70 64 Giá trị trung bình, , mg/100 g 0,279 0,057 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , mg/100 g 0,025 0,006 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lạ i , RSD r , % 9 , 0 10,5 G i á trị độ lặp lại, r ( r = 2,83 x s r ), mg/100 g 0,071 0,016 Độ lệch chuẩn tái lập, s R , mg/100 g 0,047 0,011 Độ lệch chuẩn tương đối tá i lập, RSD r , % 16,8 19,3 Giá trị độ tái lập, R ( R = 2,83 x s R ), mg/100 g 0,133 0,030 Giá trị HoRat, theo [21] 1,2 1,1 Phụ lục C (Tham khảo) Hệ thống HPLC thay thế Việc tách và định lượng đã được chứng minh là phù hợp khi áp dụng các điều kiện sắc ký sau đ ây [18]. Bảng C.1 - Đ i ều kiện HPLC thay thế Pha tĩnh a Kích thước cột (mm x mm) Pha động (Phần thể tích) Tốc đ ộ (ml/min) Phát hiện (nm) Knauer po l ygosi l ® 60-5 250 x 4,6 n -hexan + d i -isopropyl ete (80 + 20) 1,5 F: Ex: 296 Em: 320 Si 60 250 x 4,6 n -hexan + 2-propanol (98 + 2) 1 , 5 F: Ex: 284 Em: 330 Silica , 5 µ m 100 x 8 i so - octane + d i -isopropy l ete (vớ i 0,15 % propanol) (97,5 + 2 , 5) 2,0 F: Ex : 295 Em: 330 Li chrosphe r ® S i 100,5 µ m 250 x 4 n -hexan + 2-propanol (99,85 + 0,15) 2,5 F: Ex: 290 Em: 330 L i chrosorb ® S i 60,5 µm 250 x 4,6 n -hexan + 2-propanol (99,3 + 0,7) 1,2 F: Ex: 290 Em: 330 Lichrosor b ® Si 60 , 5 µm 250 x 4 n -hexan + dioxan (97 + 3) 1,0 F: Ex: 293 Em: 326 Li chrosor b ® S l 60,5 µm 250 x 4 Gradient: 1 % 2-propanol trong n -heptan trong 7 min đến 1,5 % 2-pr o panol tr o ng n -heptan 1,0 F: Ex: 290 Em: 327 Amino, 3 µm 100 x 4,6 i so -octan + iso -butanol (98 + 2) 1 , 5 F: Ex 290 Em: 330 Nudeosll C 18 , 5 µm 250 x 4 metanol + nước (97 + 3) 2,0 UV: 292 RP-8,10 µm 250 x 4,6 acetonitril + metanol + nước (50 + 45 + 5) 2 , 0 F: Ex: 293 Em: 326 UV: 290 a Nhãn hiệu của các sản phẩm được liệt kê là ví dụ về các sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông t i n này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng sản phẩm đó. F = đo huỳnh quang UV = T ử ngoại RP = Pha đảo Ex = Bước sóng kích thích Em = Bước sóng phát xạ CHÚ THÍCH Các cột pha đảo Nuc l eos il C18 và RP-8 đ ã được sử dụng trong nghiên cứu liên phòng thử ngh iệ m của α - tocopherol của margarin và sữa bột (xem Bảng B.1). Thư mục tài liệu tham khảo [1] Dietary Reference Intakes for vitamin C , vitamin E, selenium and carotenoids. Institute of Medicine. Nat . Acad. Press, Washington, 2000 [2] Deutsche gese ll schaft für E rn ährung (DGE): Referenzwerte fü r Nährstoffeufuhr; 5. Überarbeitung 1991 [3] Brubacher, g. and Wiss, O . (1972), Vitamin E active compounds, synergists and antagonists in: Sebre ll, W.H. Jr. and Harris eds The Vitamins, Chemistry, Physiology, Pathology, Methods 2nd edn Vol 5, Academic Press, New York, 255 - 258 [4] DAB 10 (1991), Deutsches Arzneibuch 10. Ausgabe 1991, Stand 1997; T 5.6/0692 int-rac-cr- Tocopherolum Comment to Ph. Eur. 5.6. D eutscher Apotheker Verlag Stuttgart [5] Brubacher, g. et al., (1985). Methods for the Determination of Vitamins in Food, Elsevier App. Science Publishers, London, 97-106 [6] G ERTZ C., K ERRMAN K . Zur Analytik der Tocopherole und Tocotrienole in Lebensm i tteln. Z . Lebensmitte lu nters. Forsch . 1982, 174 pp. 390-394 [7] N OBILE S., MOOR H. Analysenmethode zur Bestimmung von Vitamin E in Lebensmitteln und Futterm i tteln. Mitt. Lebensmittel Unters . Hyg. 1953, 44 p. 396 [8] Determination of Tocopherois in fats and oils. L-13.03/04. September 1987 in: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB: Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakeizeugn i ssen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenständen/Bundesgesundheitsamt (In: Collection of official methods under article 64 of the german Federal Foods and Feeds Act, Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal Health Office), Loseblattausgabe September 1998, Bd. 1 ( Loo se leaf edition as of 1998-09, V ol . 1) Berlin, Köln: Beuth Verlag gmbH [9] B ALZ M., S CHULTE E., T HIER H.P. Trennung von Tocopherolen und Tocotrienolen durch HPLC. Faf.Se i . Techno l . 1992, 6 pp. 209-213 [10] S PEEK A.J., S CHRIJVER J., S CHREURS W.H.P. Vitamin E composition of some seed oil s as determined by high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection. J. Food Sei . 1985, 50 pp. 121 - 124 [11] M ANZ U., P HILLIP K. A method for the routine determination of tocopherds in animal feed and human foodstuffs . I nt. J. Vitam . Nutr. Res. 1981, 51 pp. 342-348 [12] Pocklington, W.D. and Diefenbacher, A. (1988). Determination of tocopherols and tocotriends in vegetable oils and fats by high performance liquid chromatography: results of a c ol laborat i ve study and the standardised method [13] B OURGEOIS C. Determination of Vitamin E: Tocopherols and Tocotrienols, Elsevier App. Science Publishers, London, 1992 [14] L UMLEY I .D. (1993), Vitamin analysis in food in: The Technology of Vitamins in Food, ed. by P.B. O ttaway, Blade Academic & Professional, glasgow, 186-190 [15] Balz M ., S CHULTE E., T HIER H.P. A new parameter for checking the suitability of tocopherol standards, Z. Lebensm. Unters. Forsch . 1996, 202 pp. 80-81 [16] VDLUFA-Methodenbuch: Die chemische Untersuchung von Futtermitteln (The chemical analysis of animal feeding stuffs), Band III (Vol lii ), Bestimmung der Tocopherole, HPLC-Verfahren (Determinatio of Tocopherols HPLC-method) 4. Erg (4th Add), Kapitel 13.5.5 (Chapter 13.5.5), VDLUFA-Vertag, Darmstadt [17] K ONINGS E.J.M., R OOMANS H.H.S., B ELJAARS P.R. Liquid Chromatographic Determination of Tocopherols and Tocotrienols in Margarine. Infant Foods and Vegetables, JAOAC . 1996, 79 (4) pp. 902-906 [18] F INGLAS P.M., VAN D EN B ERG H., DE F ROIDMONT-GORTZ I. The certification of the mass fractions of vitamins in three reference materials: margarine (CRM 122), milk powder (CRM 421), and lyophilized Brussels sprouts (CRM 431). EUR-Report 18039. Commission of the European Union, Luxembourg, 1997 [19] ISO 5725:1986, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility fora standard test method by inter-laboratory tests [20] Untersuchung von Lebensmitteln - Bestimmung von Tocopherolen und Tocotrienolen in dietätischen Lebensmitteln L 49.00-5 September 1998 (Food analysis - Determination of tocopherols and tocotrienols in dietetic foodstuffs L 49.00-5 September 1998) in: Am tl iche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB: Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedartsgegenständen/Bundesgesundheitsamt (In: Collection of official methods under article 64 of the german Federal Foods and Feed Act, Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal Health Office), Loseblattausgabe September 1998, Bd. 1 ( Loo se leaf edition as of 1998-09, Vol. 1) Berlin, K ö ln: Beuth Verlag gmbH [21] H ORWITZ W., A LBERT R., The Horwitz Ration. (HorRat): A useful Index of Method Performance with Respect to Precision. J. AOAC In t . 2006, 89 pp. 1095-1109 [22] Bourgeois, C.F. and C i ba, N ., 1988. Disposal cartridge extraction of retinol and alpha-tocopherol from fatty samples. J.A.O.A.C. 71 (1), 12-15 [23] TCVN ISO/IEC17025:2007 (ISO/IEC17025:2005), Yêu cầu c hung về năng lực của ph ò ng thử nghiệm và hiệu chuẩn 1) Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng còn EN không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho kết quả tương đương. 2) Liehroso r b ® Si 60, Spherisorb ® Si, Hyper sil ® S i , Uchrospher ® 100 D I OL, Spherisorb ® ODS và Hypersi l ® ODS là các ví dụ về sản p hẩ m thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn còn EN khô n g ấn định phải sử dụng chúng. 3) E xtrelut ® là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. *) ISO 5725:1986 hiện nay đã hủy.