TCVN10780-3:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10780-3:2016 (ISO/TR 6579-3:2014) về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp phát hiện, định lượng và xác định typ huyết thanh của Salmonella - Phần 3: Hướng dẫn xác định typ huyết thanh của Salmonella spp TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 10780-3:2016 ISO/TR 6579-3:2014 VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN, ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA - PHẦN 3: HƯỚNG DẪN XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA SPP Microbiology of the food c hain - Horizontal met h od for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella - Part 3: Guidelines for serotyping of Salmonella spp Lời nói đầu TCVN 10780-3:2016 hoàn toàn tương đương với ISO/TR 6579-3:2014; TCVN 10780-3:2016 do Ban kỹ thuật tiêu chu ẩ n quốc gia TCVN/TC/F13 Phương ph á p ph â n tí ch v à lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ tiêu chuẩn Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nu ô i này gồm có các phần sau: TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Cor 1:2004) Vi sinh vật trong thực ph ẩ m và thức ă n ch ă n nuôi - Phương ph á p phát hiện Salmonel l a t r ê n đ ĩ a thạch và Sửa đổi 1:2008 TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Amd. 1:2007) V i sinh vật trong thực ph ẩ m và thức ăn chăn nuôi - Phương ph á p ph á t hiện Salmonella spp. trên đĩa thạch - Sửa đ ổ i 1: Phụ lục D: Ph át hiện Salmonella spp. trong phân động vật và trong mẫu môi trường từ giai đoạn s ả n xuất ban đầ u; TCVN 10780-2:2015 (ISO/TS 6579-2:2012) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện, đ ị nh lượng và xác định kiểu h uy ế t thanh của Salmonella - Phần 2: Định lượng bằng kĩ thuật số đ ế m có xác su ấ t lớn nh ất được thu nhỏ; TCVN 10780-3:2016 (ISO/TR 6579-3:2014) Vi sinh vật trong chuỗi thực ph ẩ m - Phương pháp phát hiện, đ ị nh lượng v à xác định typ huyết thanh của Salmonella - Ph ầ n 3: Hướng dẫn x á c định typ huy ế t thanh của Sa l monella spp. VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN, ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA - PHẦN 3: HƯỚNG DẪN XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA SPP Microbiology of the food c hain - Horizontal met h od for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella - Part 3: Guidelines for serotyping of Salmonella spp CẢNH BÁO - Đ ể bảo vệ sức khỏe c ủ a nhân vi ê n phòng th í nghiệm, chỉ th ử nghiệm đ ể phát hiện Salmonella trong phòng thử nghiệm đ ư ợc trang bị phù hợp, dưới sự kiểm soát của người phân tích vi sinh vậ t có k i nh nghiệm và r ấ t cẩn thận trong quá trình xử lý tất cả các vật liệu đã ủ. Người sử dụng t iê u chuẩn này phải thành thạo các thao tác th ô ng th ườ ng trong phòng thử ngh iệ m. Tiêu chuẩn này không đ ề c ậ p đến t ấ t cả các v ấ n đề an toàn, liên quan đến việc sử dụng tiêu chuẩn. Người sử dụng t i êu chuẩn phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và đảm bảo tuân thủ các quy định hiện hành. 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chu ẩ n này đưa ra hướng dẫn về việc xác định typ huyết thanh các serovar Salmonella và có thể á p dụng để xác định typ huyết thanh của các ch ủ ng cấy Salmonella spp. thuần khi ế t, phụ thuộc vào nguồn mà chúng được phân lập. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chu ẩ n này . Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đ ổ i, bổ sung (nếu có). TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực ph ẩ m v à thức ăn chăn nu ô i - Yêu cầu chung và hướng dẫn ki ể m tra vi sinh vật. TCVN 8128 (ISO 11133), Vi sinh vật trong thực phẩm, th ứ c ăn chăn nuôi và nước - Chu ẩ n bị, sản xuất, b ả o quản và kiểm tra hiệu năng của môi trường nuôi cấy. ISO 6579-1, Microbiology of the food Chain - Hor i zontal method for the detection, enumeration and serotyping o f Salmonella -Par t 1:Horizor i ta l method for the detection of Salmonella spp. 3 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chu ẩ n này sử dụng các thuật ngữ v à định nghĩa sau: 3.1 Salmonella ( Salmonella ) Trực khuẩn gram âm, oxidase âm tính, kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, thư ờ ng tạo thành các khuẩn lạc đường kính từ 2 mm đến 4 mm trên môi trường đặc chọn lọc và có các đặc t í nh sinh h ó a và huyết thanh điển h ì nh khi phép thử được thực hiện theo tiêu chu ẩ n này. 3.2 Xác định typ huyết thanh Salmonella (serotyping of Salmonella ) Xác định sự c ó mặt hay không c ó mặt các kháng nguyên-O, kháng ngu y ên-H và kháng nguy ê n-Vi cụ thể trong chủng vi khuẩn phân lập đã khẳng định là Salmone l la (3.1). 3.3 Công thức Kháng nguyên (anligenic f ormula) Sự kết hợp của các con số và chữ cái thể hiện các kháng nguyên O-, H- và Vi- của chủng vi khuẩn phân lập được khẳng định là Salmonella (3.1). 4 Nguyên tắc Để xác định typ huyết thanh của Salmonella spp., các kháng nguyên sau đây được xác định cho các chủng vi khu ẩ n ph â n lập đ ã được khẳng định sinh hóa l à Salmonella spp.: Kháng nguyên-O, kháng nguyên-H và kháng nguyên-Vi. CHÚ THÍCH: Có th ể sử dụng c á c quy tr ì nh kh á c đ ể khẳng định chủng vi khu ẩ n phân l ậ p được là Salmonella spp. với điều kiện sự phù hợp của quy tr ì nh t hay th ế đã được xác nhận [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]. 5 Môi trường nuôi cấy và huyết thanh 5.1 Quy định chung Đối v ớ i thực hành trong phòng thử nghiệm hiện tại, áp dụng TCVN 6404 (ISO 7218). Đối với phép th ử hiệu năng của môi trường nuôi cấy, theo TCVN 8128 (ISO 11133). 5.2 M ô i trường nuôi cấy và thu ố c thử Xem Phụ l ục A. 5.3 Kháng huyết thanh Kháng huyết thanh-O, Kháng huyết thanh-H và kháng huyết thanh-Vi có bán sẵn từ các nhà cung cấp kh á c nhau. Th ô ng tin về các kháng huyết thanh đa giá và kháng huyết thanh đơn g i á được nêu trong Phụ lục B. 6 Thiết bị, dụng cụ Có thể sử dụng các d ụng cụ thủy tinh dùng một lần để thay cho các dụng c ụ dùng nhi ề u lần, nếu chúng có các quy định kỹ thuật tương tự. Sử dụng các thi ế t b ị , dụng cụ thông thường của ph ò ng th ử nghiệm vi sinh và cụ thể như sau: 6.1 T ủ ấ m , đ ể nuôi cấy và ph â n lập Salmonella , có khả n ă ng d uy tr ì nhiệt độ trong khoảng t ừ 34 °C đến 38 °C. CH Ú THÍCH: Trong t iêu chu ẩ n này , nhiệt độ ủ kh ô ng phải là một th ô ng số t ới hạn. Các chủng phân lập được nuôi c ấ y đ ể t hu đ ược đ ầ y đ ủ sinh khối v i khu ẩ n thuần khi ế t, đ ể thực hiện các phép th ử . V ì vậy, bước nuôi cấy được thực hiện ở nhiệt độ phát triển t ố i ưu. Đ ố i v ớ i S a lmonella nhiệt độ thường t ừ 34 °C đến 38 °C. 6.2 Tủ sấy (để khử trùng khô) hoặc nồ i h ấ p (để kh ử trùng ướt). Xem TCVN 6404 (ISO 7218). 6.3 Tủ lạnh ( đ ể bảo quản môi trường nuôi cấy đã chuẩn b ị ), có khả năng duy tr ì nhiệt độ ở 5 °C ± 3 °C. 6.4 Lam kính. 6.5 Dụng cụ cấy vô trùng , ví dụ kim cấy, que cấy hoặc vòng cấy (ví dụ 1 µl). 6.6 Ống nghiệm và b ì nh cầu vô trùng , có dung tích th í ch hợp. Có th ể sử dụng b ì nh hoặc chai và ống nghiệm c ó nắp bằng kim loại hoặc bằng ch ấ t dẻo (nắp vặn) không độc. 6.7 Đĩa Petr i vô trùng , có đường kính khoảng 55 mm đến 90 mm. 6.8 Nồi cách thủy , có khả năng duy tr ì nhiệt độ ở 47 °C đến 50 °C. 6.9 Nồi cách th ủ y (hoặc tủ ấm ), có khả năng duy trì nhiệt độ ở 50 °C ± 2 °C. 7 Lấy mẫu Điều quan tr ọ ng là phòng thử nghiệm làm việc với chủng cấy thuần khiết đã được khẳng định s i nh hóa là Sa l monella spp. 8 Phân loại Salmonella 8.1 Tổng quan C ứ khoảng 7 năm, Trung tâm nghiên cứu về chuẩn Salmonella của WHO ( Viện Pasteur, Paris) s ẽ công b ố bản cập nhật v ề “ Công thức kháng nguyên của các serovar Salmonella ” , đ ó là cơ sở để định d anh các tên typ huyết thanh serovar và công thức đối với các chủng vi khu ẩ n phân lập Salmonella spp. Thời điểm công bố phi ê n b ả n m ớ i nhất của sơ đồ White-Kauffmann-Le Minor là năm 2007 (T à i liệu tham khảo [9]). CH Ú TH Í CH: Những b ổ sung cho sơ đồ White-Kauff m ann-Le- Minor đã được công bố trong cuốn Nghiên cứu Vi sinh , là một ấ n ph ẩ m của Viện Pasteur (trước đây gọi là Annales de I ’I nst i tut Pasteur/Microbiologie ). V í dụ, bổ sung s ố 47 đã được c ô ng bố nă m 2010 v à đưa ra các serovar mới đã phát hiện từ năm 2003 đ ế n năm 2007 (Tài liệu tham khảo [10]). Tiêu chu ẩ n n à y đưa ra hướng d ẫ n về xác định typ huy ế t thanh của các serovar Salmonella . 8.2 Danh pháp (cách đặt tên) Các danh pháp khác nhau đã được sử dụng (hoặc vẫn đang được sử dụng) cho các chủng Salmonella : - Ban đầu, Kauffmann (Tài liệu tham khảo [12]) đã coi mỗi serovar Salmonella l à một loài riêng biệt; - Các kiểu lo à i khác nhau đã được sử dụng: S. enterica vs. S. choleraesuis , mỗi loài có một chủng khác; - Một số chủng Salmonella "quan trọng" (như Salmonella Typhi và Salmonella Paratyphi) được coi là các l o à i và không phải "chỉ" các serovar của các loài. Hội đ ồ ng trọng tài của Tiểu ban kỹ thuật quốc tế về hệ thống tự động nghiên cứu về sinh v ậ t nh â n nguyên thủy (Procaryotes) cho thấy rằng có thể sử dụng nhiều từ đồng nghĩa trong việc gọi tên Sa l monella (Tài liệu tham Khảo [22]). Trong tiêu chuẩn này, các tên gọi hiện tại đã được chấp nhận sử dụng rộng rãi, đã được Trung tâm nghiên c ứ u về chu ẩ n Salmonella của WH O [T à i liệu tham khảo 9], Hiệp hội về Vi sinh vật của Mỹ (Tài l iệu tham khảo [20]), Trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa bệnh tật ( Tài liệu tham khảo [3]) và Sổ tay Bergey's (Tài liệu tham kh ả o [17]) chấp nhận. Theo dan h pháp hiện hành, các chi Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae và chỉ bao gồm hai loài: S. enterica và S. bongor i . S. enter i ca được chia thành sáu phân loài: S. enterica subsp ; enterica , S. enterica subsp. salamae , S. enterica subsp. ar i zonae , S. enter i ca subsp. diarizonae , S. enter i ca subsp. houtenae và S . enteri c a subsp. indica . Các serovar Salmonella thuộc S. enteri c a subsp. enterica thường phân lập được nhiều nhất (trên 99,5 % trong số các chủng Salmonella phân lập được) và chúng được đặt tên, thư ờ ng liên quan đến vị trí địa lý nơi serovar được phân lập lần đầu. Các serovar thuộc các phân loài khác của S. enter i ca và của S. bongori được đặt tên theo công thức kh á ng nguyên của chúng. Do c ó sự kết hợp của các phân loài và nhiều serovar, nên tên đ ầ y đủ rất dài (ví dụ: Salmonella e nter i ca subsp. Enterica serovar Typhimurium). Do đ ó , cách gọi ngắn hơn thường sử dụng để chỉ tên của các serovar của các phân loài enter i ca . Hệ thống White-Kauffmann- L e-Minor đưa ra gợi ý các tên gọi rút gọn sau đây: S. enterica serovar Typhimurium hoặc Salmonella ser. Typhimurium. Theo Tài liệu tham khảo [ 3 ], ở trích dẫ n đầu tiên của serovar trong tên ch i cần theo sau là t ừ "serovar" viết tắt là "ser." và sau đó tên là tên của serovar. Sau đó, tên có thể được viết b ằ ng tên chi theo sau là tên serovar (ví dụ Salmonella Typhimurium). Cách gọi tên serovar Salmonella này cũng được chấp nhận ở hầu hết các tạp chí [ví dụ: Tạp chí của Hiệp hội Vi sinh vật Mỹ (ASM)] và cũng được sử dụng trong tiêu chu ẩ n n à y. Tóm lại, gọi tên Salmonella như sau: Họ: Enterobacteriaceae (chữ cái đầu ti ê n viết hoa, chữ in nghiêng) Chi: Salmonel l a (chữ cái đầu tiên viết hoa, chữ in nghiêng) Loài : enterica (không viết hoa, chữ in nghiêng) Phân loài: ente ri ca (không viết hoa, chữ in nghiêng) Serovar (typ huyết thanh hoặc ser.): v í d ụ: Typhimurium (chữ cái đầu tiên viết hoa, không in nghiêng) Phân loài: salamae ar iz onae d i arizonae houtenae in d ica Loài: bongori Trong ph ầ n bổ sung cho hệ thống White-Kauffmann-Le-Minor (Tài liệu tham khảo [10]) c ó trên 2 600 serovar Salmonel l a được đề cập đến và số lượng được tăng đều, như thống kê trong Bảng 1. Bảng 1 - Số lượng 80 serovar Salmonella qua các năm Loà i/ phân loài Bổ sung 1998 a 2001 b 2007 c S ố l ượ ng serovar Salmonella enter i ca 2 443 2 502 2 5 87 subsp. enter i ca 1454 1492 1547 subsp. salamae 489 500 513 subsp. arizonae 94 95 100 subsp. diar iz onae 324 331 341 subsp. houtenae 70 71 73 subsp. indica 12 13 13 Salmonella bongor i 20 21 23 Tổng số serovar (chi Salmonella ) 2 463 2 523 2 610 a T à i liệu tham khảo [18]. b Tài liệu tham khảo [19]. c Tài liệu tham khảo [10], qua các năm 2003 đến 2007. 8.3 Các đặc t í nh sinh h ó a Các loài và phân loài Salmonella được xác định dựa trên các phép thử sinh hóa khác nhau. Trong B ả ng 2 đưa ra các đặc tính khác nhau. Xem Tài liệu tham khảo [9] và Phụ lục C đ ể biết thêm chi tiết. B ả ng 2 - Các đặc tính sinh hóa của các loài và ph â n loài Salmone ll a (Tài liệu tham khảo [9]) Loài S. enterica S. bongori Phân l oài enterica salamae ar iz onae diarizonae houtenae indica Dulcitol + + - - - d + ONPG a ( 2 h) - - + + - d + Malonate - + + + - - - Gelatinase - + + + + + - Sorbitol + + + + + - + Ph á t triển với KCN b - - - - + - + L (+)-tartrate c + - - - - - - Galacturonate - + - + + + + g -Glu t amyltransferase + e + - + + + + β-Glucuron i dase d d - + - d - Mucate + + + - ( 70 %) - + + Salicin - - - - + - - L actose - - - (75 %) + (75 %)+ - d - Dung giải bởi pha O 1 + + - + - + d + ≥ 90 % phản ứ ng dương tính; - ≥ 90 % phản ứng âm t í nh; d các phản ứng khác nhau của các serovar kh á c nhau; a o-Nitrophenyl-β-D-galaclopyranosi d e (phép thử [β-galactosidase]. b Kali xyanua; c = D-Tartrat, Parat y phi B:-, Paratyph i B b i ovar Java: + e = Typhimurium:d. Dublin:-. 8.4 Đặc tính kháng nguyên 8.4.1 Yêu cầu chung Các đ ặ c t í nh kháng nguyên quan trọng của Salmonella đối với các phép thử huyết thanh được chia thành ba loại chính như sau: - Kháng nguy ê n-O, còn gọi là kháng nguyên thân; - Kh á ng nguy ê n-H, c ò n gọ i là kháng nguy ê n lông; - Kháng nguy ê n-Vi, còn gọi là kháng nguyên v ỏ . Các công thức kh á ng nguyên của Salmonella spp. g ồ m có ba typ kháng nguyên sau đây: kháng nguyên-O, kháng nguyên-Vi (nếu có]: kháng nguyên-H của pha thứ nh ấ t: kháng nguy ê n-H của pha th ứ hai. Ví dụ: c ô ng thức kháng nguyên của Salmonella Paratyphi C là: 6,7[Vi]:c:1,5 , với kháng nguyên- O :6 và O :7; với kháng nguy ê n-Vi, có thể c ó mặt hoặc không có mặt (ký hiệu b ở i các dấu ngoặc vuông), với kháng nguyên-H H:c của pha thứ nh ấ t, với các kháng nguy ê n-H H:1 và H:5 của pha thứ hai. 8.4.2 Kháng nguyên- O (kháng nguyên th â n) Kháng nguyên này bao gồm thành phần vách tế bào và các chất chính là polysaccharid, protein và phospholipi d . Kháng nguyên- O rất bền và c ó thể chịu được nhiệt độ đến 100 o C trong 150 min, xử lý bằng etanol 95 % thể tích hoặc axit loãng (Tài liệu tham khảo [16]). Phản ứng của kháng nguyên- O với kháng huyết thanh làm ngưng kết hạt. Trước đ â y, trong tà i liệu của Kauffmann-White (Tài liệu tham khảo [9]) các kháng nguy ê n- O được phân loại thành các nhóm kháng nguyên-O. Các nh ó m này được đặt tên với chữ cái La Mã bất đầu với nhóm A, trong đ ó gồm có kháng nguyên O :2 đến nhóm Z có chứa kháng nguyên O :50. V ì có nhiều các kháng nguyên-O, n ê n các kháng nguyên còn lại không được đưa váo nhóm, nhưng đã được đặ t t ê n th à nh các kháng nguyên- O từ O :51 đến O :67. Ngày nay, mỗi nhóm O sử dụng O-yếu t ố điển hình được dùng nhiều hơn. Các chữ cái này đã được giữ lại và được đưa vào trong dấu ngoặc đơn, v í dụ: O :4 [B] (Tài liệu tham khảo [9]). Trong B ả ng 3 đưa ra các tên gọi cũ và mới. Bảng 3 - Các nhóm huyết thanh Salmonella (tên gọi cũ) và các kháng nguyên-O có liên quan (tên gọi mới) Nhóm Kháng nguyên- O Nh ó m Kh á ng nguyên- O Nhóm Kháng nguyên-O A 2 G 1 - G 2 13 Q 39 B 4 H 6,14 R 40 C 1 (C 4 ) a 6,7 I 16 S 41 C 2 , C 3 8 J 17 T 42 D 1 9 K 18 U 43 D 2 9,46 L 21 V 44 D 3 9,46 , 27 M 28 W 45 E 1 (E 2 , E 3 ) b 3,10 N 30 X 47 E 4 1,3 , 19 O 35 Y 48 F 11 P 38 Z 50 a C 4 đa đ ư ợc gộp v à o C 1 . b E 2 và E 3 đ ã được gộp vào E 1 . 8.4.3 Kháng nguyê n -H (kháng nguyên l ô ng) Kháng nguyên n à y nằm trên sợi lông và các thành ph ầ n chính là protein. Kháng nguyên này không bền bằng kháng nguyên-O, dễ b ị phân h ủ y trong ancol, axit và nhiệt độ trên 60 o C, nhưng c ó khả năng chịu được dung d ịch f o r malin 0,5 % thể tích (Tài liệu tham khảo [16]). Ph ả n ứ ng của kháng nguyên-H với kháng huyết thanh là m ngưng kết bông. Nhiều Salmonella spp . c ó hai pha kháng nguyên-H , nhưng các biến thể một pha và ba pha chưa được biết. Pha đầu tiên được gọi là pha đặc hiệu và pha thứ hai được gọi là pha không đặc hiệu. Pha đầu được k ý hiệu bằng chữ thường từ a đến z. Tuy nhiên, từ khi nhận biết kháng nguyên-z, th ì nhiều kháng nguyên-H mới đã được phát hiện và được đặt tên z 1 , z 2 , z 3 ... z 9 1 . Các ví d ụ về các serovar một pha là: - Salmonel l a Paratyphi A: 1 ,2,12:a:[1,5] với H:a đối với pha đầu tiên, trong dấu ngoặc vuông là pha thứ hai (H:1,5) có thể có mặt hoặc không c ó mặt; - Salmonella Typhi: 9,12,[Vi]: d :-; với H:d đối với pha đầu; - Salmone l la Derby: 1 ,4,[5], 12:f,g [ 1,2 ] ; với H:f,g đối với pha đầu tiên, khi đó pha thứ hai (H:1,2) có thể có hoặc không có mặt; - Salmonella Enteritidis: 1 ,9,12:g,m:-; với H:g,m đối với pha đầu. Ngoài các H:g,m, một số chủng có thể có H:p , hoặc H:f, hoặc H:t. Các chủng đặc biệt có thể có kháng nguy ê n H:1,7 là pha th ứ hai; - Salmonella Dublin: 1 ,9,12,[V i ]:g,p :- ; v ớ i H:g,p đối với pha đầu. CHÚ THÍCH 1: Các yếu tố-O gạch chân được x á c đ ị nh b ằ ng biến trạng thực khu ẩ n. Ch ú ng ch ỉ có mặt nếu ch ủ ng c ấ y được dung giải b ằ ng th ể thực kh uẩ n biến trạng tương ứng (T à i l i ệu tham khảo [2]). CH Ú THÍCH 2: Các yếu tố-O hoặc -H trong ngoặc vuông có thể c ó mặt hoặc không có mặt , mà không liên quan đến thực khu ẩ n thể tiến trạng (Tài liệu tham khảo [2]). CH Ú THÍCH 3: Các chủng Sa l monella Derby và Salmonella Enteritidis r ấ t hiếm gặp. C ó th ể cần chuyển đổi pha đề phát hiện các chủng hiếm gặp n ày. Tuy nhiên, điều này ch ỉ cần thiết v ớ i những tr ường hợp nh ấ t đ ị nh [ví dụ trong trường hợp sai lệch nguồn và/hoặc trư ờ ng hợp có di chuyển (đặc biệt)]. 8.4.4 Kháng nguyên-Vi (kháng nguyên v ỏ ) Kháng nguyên này là kháng nguyên v ỏ và c ó th ể che khuất các kháng nguyên-O làm cho các vi khuẩn không ngưng kết với kháng huyết thanh-O. Thành phần chính của kháng nguyên-Vi l à polysaccharid. Các chủng Salmonella c ó kháng nguyên-Vi độc hơn so với các chủng không có kháng nguyên-Vi. Kháng nguyên-Vi có th ể chỉ c ó mặt trong ba Salmonella serova r: - Salmonella Typhi: 9,12, [ V i]:d:-; - Salmonella Paratyphi C: 6,7,[Vi]:c:1,5; - Salmonella Dublin: 1 ,9,12, [Vi]:g,p :- . Trong các dấu ngoặc vuông cho thấy có thể có hoặc không có mặt kháng nguyên-Vi. CH Ú THÍCH: Sự c ó mặt c ác kháng nguy ên -V i trong các chủng phân lập của Salmon e lla từ mẫu thực phẩm hoặc mẫu thú y l à r ấ t hiếm gặp. Nếu có mặt kháng nguy ê n-Vi, n ó sẽ che khu ấ t các kháng nguyên-O. Đ ể phát hiện các kháng nguyên-O, c ó th ể cần l à m n ó ng huy ề n phù mẫu phân lập (ví dụ: trong dung dịch nước m u ối sinh lý) ở 100 o C trong 60 min, hoặc ở 120 o C trong 15 min. 9 Quy trình xác định typ huyết thanh Salmonella 9.1 Y ê u cầu chung Trước khi bắt đầu xác định typ huyết thanh, c ầ n khẳng định sinh hóa rằng chủng phân lập được thuộc chi Salmonella (như quy định trong ISO 6579-1). Mặc dù các kháng nguy ê n-H là đặc hiệu cho Salmonella , thì một số kháng nguy ê n-O thường gặp ở các chi khác nhau của Enterobacter i aceae (ví dụ: Salmonella , Citrobacter, Hafnia ). CHÚ TH Í CH: Có th ể sử dụng các quy tr ì nh khác đ ể kh ẳ ng đ ị nh rằng chủng phân lập được thuộc ch i Salmonella , với điều kiện là quy trình thay thế n à y đã được xác nhận (xem TCVN 6404 (ISO 7218)]. Mỗi nhà cung cấp các kháng huyết thanh sản xuất ra các bộ kháng huyết thanh riêng, kèm theo hướng dẫn sử dụng. Do đó, không thể đưa ra một bộ hư ớ ng dẫn cho việc xác định typ huyết thanh, v ì cần phải thực hiện theo đúng hướng dẫn của nhà cung cấp để có được kết qu ả tối ưu. Một số nhà sản xuất cung cấp các kháng huyết thanh (hỗn hợp của nhiều kháng huyết thanh-O hoặc kháng huyết thanh-H) rất hữu ích cho việc xác định typ huyết thanh chưa biết. Khi chủng ngưng kết với kháng huyết thanh hỗn hợp, th ì có thể tiếp tục thử nghiệm với nhóm kháng huyết thanh và/hoặc chỉ với loại kháng huyết thanh hỗn hợp dương t í nh. Khi cần nhấn mạnh các serovar nh ấ t định và khả năng để ch ỉ ra các serovar khác theo Salmonel l a spp. thì có thể tiến hành ngưng kết ngay chỉ với kháng huyết thanh đơn giá cụ thể của serovar có liên quan. Trong Phụ lục B đưa ra quy tr ì nh chung về việc xác định typ huyết thanh chưa biết của chủng phân lập Salmonella . 9.2 Ví dụ về quy tr ì nh xác định typ huyết thanh cho năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng 9.2.1 Yêu cầu chung Trong v í dụ dưới đ â y mô tả quy tr ì nh xác định typ huyết thanh cho năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (xem Phụ lục D). Trong Bảng 4 đưa ra các chủng này với công thức kháng nguyên của chúng. Trong các phần sau, mô tả việc ngưng kết các chủng phân lập Salmonella , quy tr ì nh này thư ờ ng được thực hiện nhiều nhất. Tuy nhiên, vẫn c ó các quy tr ì nh khác, ví d ụ : phương pháp đĩa vi giếng ( xem Phụ lục E). Bảng 4 - C ô ng thức kháng nguyên của năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức kh ỏ e cộng đồng Tên Kháng nguyên-O b Kháng nguy ê n-H Pha 1 Pha 2 Salmonella Typhimurium 1 ,4,[5]12 i 1,2 Salmonella Enteritidis a 1 ,9,12 g,m - Salmonella In f antis 6,7, 14 r 1,5 Salmonella V i rchow 6 , 7, 14 r 1,2 Salmonella Hadar 6,8 Z 10 e , n , x a Ngoài các yếu t ố H:g,m, một số chủng có thể c ó yếu t ố H:p hoặc H:f hoặc H:t. Trừ c á c chủng có t hể c ó kháng nguyên H:1 , 7 là pha thứ 2 ( Tài liệu tham kh ả o [9]). b Các yếu tố O g ạch chân được xác định bằng biến trạng thực khu ẩ n. Ch ú ng ch ỉ có mặt nếu chủng c ấ y được d ung giải b ằ ng th ể thực khu ẩ n bi ế n trạng tương ứng (T à i liệu t ham khảo [9]). 9.2.2 Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmone ll a Cấ y một khu ẩ n lạc từ chủng cấy thuần khiết nghi ngờ là Salmonella theo đặc t í nh sinh hóa. Sử dụng môi trường nuôi cấy và các phương pháp do nh à sản xu ấ t quy định đối với kháng huyết thanh được sử dụng. Nếu không có sẵn thông tin, thì có thể sử dụng môi trường thạch không chọn lọc như thạch dinh dưỡng ( v í d ụ : xem A.2). Ủ các đ ĩ a thạch dinh dưỡng đã cấy từ 34 °C đến 38 °C (6.1) "qua đêm" (khoảng 18 h). 9.2.3 Kiểm tra phản ứ ng tự ngưng kết Ví dụ về phép thử kiểm tra phản ứng tự ngưng kết được mô tả sau đây. Có th ể sử dụng các phương pháp khác. Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xu ấ t. - Cho một giọt nước muối (có th ể thay đổi lừ NaCI 8,5 g/ l đến NaCI 35 g/l , nồng độ cao hơn có thể nhạy hơn) trên lam kính (6.4). - Chuyển một lượng nhỏ chủng c ấ y vi khu ẩ n (v í d ụ : có thể lấy một lượng 1 µl bằng que c ấ y dùng một lần) sang lam kính và trộn với giọt nước muối. - Nghiêng nhẹ lam k í nh qua lại. Tùy thuộc vào nhà sản xuất và/hoặc nồng độ muối, thường khoảng 5 s đến 60 s . - Đánh giá huyền phù. Khi có mặt các hạt trong huyền phù chứng tỏ có sự tự ngưng kết. Các chủng c ó ph ả n ứng dương tính trong phép th ử tự ngưng kết rất khó kiểm tra thêm để xác định typ huyết thanh. Đối với các chủng tự ngưng kết, không thể thực hiện được phép th ử kháng nguyên-O. Tuy nhiên, đôi khi vẫn có thể điều tra về các kháng nguyên-H. Nếu một chủng cho thấy tự ngưng kết, có thể thử trên một hoặc hai cách dưới đây trên cùng một khuẩn lạc v à /hoặc tr ê n các khuẩn l ạ c khác. - Hòa khuẩn lạc trong nước vô trùng thay v ì trong dung dịch nước mu ố i và tiến hành quy tr ì nh tự ngưng kết như trên. - Cấy các chủng trên m ô i trường thạch bán đặc như mối trường thạch Rappaport Vassiliadis cải biến (MSRV) (theo quy định trong ISO 6579-1) và s ử dụng khu ẩ n lạc từ thạch bán đặc đ ể thực hiện quy tr ì nh tự ngưng kết như trên. CH Ú TH Í CH: C ác chủng tự ngưng kết c ò n được gọi là các chủng "ráp". 9.2.4 Ngưng kết với kháng huyết thanh-O Các hướng dẫn sử dụng của các kháng huyết thanh có thể khác nhau giữa các nhà sản xuất. Do đó, điều quan trọng là luôn tuân thủ các hướng dẫn của nhà sản xuất. Hầu hết các nhà sản xu ấ t sử dụng phương pháp ngưng kết lam kính để phát hiện các kháng nguyên- O . Trong phương pháp n à y, trộn một giọt huyết thanh với huyền phù v i khuẩn (trực tiếp từ đĩa, ống hoặc canh thang) t rên lam kính. Nghiêng nhẹ lam kính qua lại. Sau đó, quan sát sự ngưng kết trên lam kính. Sự có mặt các hạt chứng tỏ phản ứng dương t í nh. Đối với các nhà sản xuất khác nhau, có thể có những thay đổi trong cách tiến hành như sau: - K í ch thước của giọt trên lam kính (ví dụ: 25 µl hoặc một “giọt ” ]; - Cách trộn kháng huyết thanh với vi khuẩn tr ê n lam kính (vi kh uẩ n được l ấ y trực tiếp từ môi trường thạch hoặc huyền phù, kháng huyết thanh được cho trực tiếp trên lam kính hay được cho vào huy ề n phù vi khu ẩ n); - Thời gian nghiêng trượt lam kính (có thể dao động từ 5 s đến 60 s]; - Cách quan sát sự ngưng kết (phóng đại hay không, nền tối hoặc ánh sáng bình thường]; - Giải thích các kết quả (đọc các chú th í ch liên quan đến nh ữ ng hạn chế của quy trình]. 9.2.5 Ngưng kết với kháng huyết thanh-H Sau khi ngưng kết với kháng nguyên-O, tiến hành ngưng kết với kháng nguyên-H. Salmonella thường có hai loại kháng nguyên-H (pha 1 và pha 2). Nếu một pha-H được tìm thấy â m t í nh với các chủng hai pha, thì cần thực hiện phương pháp đ ả o pha. Pha-H chính bị kh ố ng ch ế bằng phương pháp đảo pha. Bằng cách khống ch ế pha-H ch í nh, th ì pha-H thứ hai có thể được thể hiện và xác định. Phương pháp thường được sử dụng để đảo pha là phương pháp của Sven Gard, xem 9.2.7. Đối với việc này, kháng huy ế t thanh đảo pha cụ thể được cho vào môi trường thạch và chủng Salmonella được cấy thành điểm tr ê n đĩa. Môi trường thạch phải đủ mềm để cho Salmonella di chuyển dễ dàng trong môi trường. N ồ ng độ thạch trong môi trường c ó thể thay đổi từ 0,5 % đến 1 % khối lượng (tùy thuộc vào nồng độ gel của thạch). Ví dụ sự di chuyển trên bề mặt môi trường được đưa ra trong A.3. Các ví dụ khác về đ ả o pha được đưa ra trong Phụ lục F. Đ ể kiểm tra về sự ngưng kết, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 9.2.6 Phép thử ng ưn g k ế t để xác định typ huyết thanh của năm serovar Salmonella ảnh hưởng đ ến sức khỏe cộng đồng 9.2.6.1 Yêu cầu chung Để phát hiện năm serovar Salmonella đ ề cập trong Bảng 4, cần đến các kháng huyết thanh-O và kháng huyết thanh-H sau đây: O:4, O:5, O:6 (O:61 hoặc O:6,7 hoặc O:6,14 , 24), O:7. O:8, O:9 và O:46. H:i, H:2, H:G hoặc H:g (đơn giá), H:m, H:q, H:s, H:t, H:r, H:5, H: z 10 và H:x. Để xác định các typ huyết thanh của các chủng Salmonella theo thứ tự nêu trong Bảng 4, thực hiện quy trình quy định trong 9.2.6.2 đến 9.2.6.5 (xem s ơ đồ tại Phụ lục D). Để biết thêm thông tin về các phép th ử tuần tự các kháng nguyên khác nhau, xem Phụ lục B. 9.2.6.2 Nếu O :4 dương tính Ngưng kết với O :5. Kết qu ả có thể là dương tính hay âm tính đối với Salmonella Typh i murium, v ẫ n còn có thông t i n có thể liên quan đến các m ụ c đích dịch tễ. Ngưng kế t với các kháng huyết thanh H:i và H:2 (có thể cần đảo pha). Các serovar là ch ủ ng Typ h imurium nếu cả hai phản ứng này là dương tính. Ngưng kết với O :12 là không c ầ n thiết để chứng tỏ ch ủ ng phân lập Salmonella Typhimurium, v ì O :4 dương tính chứng tỏ có mặt O :12. Tương tự , việc phát hiện kháng nguyên H:1 không có khả năng phân biệt và kh ô ng cần ph ải kiểm tra bổ sung. 9.2.6.3 Nếu O :9 dương tính Ngưng kết với kháng huyết thanh H:G (hỗn hợp) hoặc với kháng huyết thanh H:g (kháng thể đơn giá). Nếu ph ả n ứng này dương tính, tiến hành ngưng kết tiếp với kháng huyết thanh H:m. Nếu kết quả dương tính, ngưng k ế t với các kháng huyết thanh H:q và H:s để kiểm chứng âm. Nếu những phản ứ ng n à y âm tính, ngưng kết tiếp v ớ i O:46 và nếu muốn, ng ư ng k ế t tiếp với O:12. Nếu O:46 âm t í nh (và O:12 dương tính), th ì serovar của chủng là Enteritidis. CH Ú THÍCH: Ngoài các yếu tố H : g , m , mộ t số chủng Salmonella Enteritidis có thể cho phản ứng dương tính với kháng huyết thanh H:p ho ặ c H:f hoặc H:t. Tuy nhi ê n , các chủng này là rất hi ế m. T rừ các chủng đặc biệt có th ể có kháng nguyên H:1,7 như là pha thứ hai 9.2.6.4 Nếu O :7 dương tính Ngưng kết với kháng nguyên H:r, H:2 và H:5 (có thể cần đ ả o pha). Nếu H:r và H:2 dương tính, serovar của chủng là: Vircho w . Nếu H:r và H:5 dương tính, serovar của chủng là: In f anti s . Việc phát hiện kháng nguyên H:1 không có khả năng phân biệt và không cần phải kiểm tra bổ sung. 9.2.6.5 Nếu O :8 dương tính Ngưng kết với các kháng nguyên H: z 10 và H:x. Nếu c ả hai đều dương tính, ngưng kết tiếp với các kháng huyết thanh O:6 1 hoặc O:6,7 hoặc O:6,14,24. Nếu O:6 1 hoặc O:6,7 hoặc O:6,14,24 dương tính thì các serovar của chủng là:Hadar. Một số m ẻ kháng huyết thanh O:6,7 không phản ứng với chủng O:6,8. Khi mua kháng huyết thanh này, cần chắc chắn r ằ ng có ph ả n ứng với chủng O:6,8 (h ỏ i các nhà sản xuất). CH Ú TH Í CH : Dạng biến th ể khu ẩ n l ạ c có th ể xảy ra với các biểu hiện của kh á ng nguyên O:6 1 b ở i một số serovar nh ó m huyết thanh C 2 (T à i liệu tham khảo [11]). V ì lý do đ ó, kh ô ng phải lúc nào cũng có thể nh ậ n biết được, v í dụ Salmonella Hadar và S a lmonella Istanbul như các serovar rõ ràng. 9.2.7 V í dụ về đảo pha sử dụng phương pháp Sven Gard Ví dụ này mô tả việc đảo pha d ùng cho việc xác định typ h u yết thanh Salmonella Typhimurium. Nh ì n chung, phương pháp này cũng áp dụng được cho các serovar Salmonella khác. Khi O:4 v à H:i dương tính, còn H:2 âm tính, thì chu ẩ n b ị một đĩa thạch di chuyển (xem A.3 hoặc F.1), với kháng-H:i (ví dụ: hỗn hợp huyết thanh đảo pha có chứa H:i). Ch ấ m chủng vi khuẩn vào giữa đĩa thạch. Ủ đĩa từ 34 °C đến 38 °C (6.1) qua đêm (khoảng 18 h). Sau khi ủ, tàm lại việc ngưng kết chủng với kháng nguyên H:2. Nếu H:2 lại âm tính, ng ư ng kết tiếp với H:i. Nếu H:i âm tính hoặc có phản ứng yếu, th ì chủng n à y không phải là Salmonella Typhimurium. N ế u H:i cho ph ả n ứng dương tính (mạnh), thì lặp l ạ i việc đảo pha. Chuẩn b ị lại đ ĩ a thạch v ớ i kháng-H:i và lấy vi khu ẩ n từ điểm xa nhất mọc lan trên đĩa thạch, đảo pha thứ nhất để cấy vào đĩa thứ hai. Lặp lại quy trình đảo pha như trên. CHÚ TH Í CH 1: Đ ô i khi c ầ n bổ sung kháng huyết thanh H:i v à o thạch (của đĩa đảo pha lặp lại) để thu được phản ứng tốt hơn. CH Ú TH Í CH 2: Cũng có t hể c ó các bi ế n thể mộ t pha của Salm o nella Typhimuri u m, ví dụ do thiếu hoặc kh ô ng thể hiện pha H thứ hai 1 .4.[5]12:i:-. Trong khi x á c định typ huyết thanh biến thể này, c ó thể ph ả i lặp lại một lần hoặc nhiều l ầ n việc đảo pha đ ể loại tr ừ sự có mặt của pha th ứ ha i . Ngoài ra, cò th ể sử dụng phương pháp phân tử đ ể kh ẳ ng đ ị nh có phải biến thể của Salmonella Typhimurium hay kh ô ng. 10 Kiểm soát chất lượng Huyết thanh được sử dụng để ngưng kết phải trong (trừ các kháng huyết thanh được sử dụng để thử nghiệm latex). Luôn luôn phải kiểm tra huyết thanh trước khỉ s ử dụng. Trường hợp b ị đục, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các quy trình kiểm soát chất lượng của quy trình xác định typ huyết thanh như sau: - Mỗi tuần làm việc chọn hai chủng (hoặc s ố lượng chủng chiếm khoảng 2 % khối lượng chủng phân lập được). Mỗi chủng được cấy hai lần. Các chủng cấy chuyển được xử lý như là hai chủng mới phân lập để xác định typ huyết thanh. Sau khi ho à n thành công việc, các kết quả của hai chủng và các chủng cấy chuyển đ ư ợc so sánh về sự khác biệt. Nếu có bất kỳ một sự khác biệt nào, th ì sẽ được nghiên cứu tiếp. - Phòng thử nghiệm lư u giữ đầy đủ chủng gốc các serovar Salmonella đặc hiệu (ví dụ: từ bộ sưu tập chủng cấy hoặc từ các nghiên cứu so sánh liên phòng). Chủng lưu gốc này, định k ỳ (ví dụ: hàng tuần) chọn một hoặc hai serovar của 10 serovar thường gặp nhất trong phòng thử nghiệm để kiểm tra quy trình xác định t yp huyết thanh. Các serovar được sử dụng để thực hiện việc kiểm soát chất lượng có thể thay đổi hàng tuần đ ể đảm bảo rằng trong một khoảng thời gian các kháng huyết thanh khác nhau đều đ ã được kiểm tra. - Phải kiểm tra khả năng xác định typ huyết thanh giữa các phòng thử nghiệm khác nhau. Đ ể thực hiện, nên thư ờ ng xuyên tham gia vào các nghiên cứu so sánh li ê n phòng, khi có thể. 11 Báo cáo kết quả Đối với các chủng phân lập thuộc S. enter i ca subsp. enter i ca , th ì báo cáo tên (đầy đ ủ ) và khi có thể/khi cần kèm theo công thức kháng nguyên. Đối với các loài (phân loài) khác, thì báo cáo công thức kháng nguyên t ì m thấy được. Các ký hiệu của các công thức kháng nguyên là như sau: Kháng nguyên-O (cách nhau bằng d ấ u ph ẩ y), kháng nguyên-Vi (nếu có): các kháng nguy ê n-H của pha đầu tiên (cách nhau bằng d ấ u ph ẩ y): các kháng nguyên-H của pha thứ hai (nếu có; cách bằng dấu phẩy); kháng nguyên-H của pha thứ ba (nếu có). Ví dụ, theo hệ thống White-Kauffmann-Le-Minor (Tài liệu tham khảo [9]), công thức Kháng nguyên đầy đủ của Salmonella Typhimurium là: 1 ,4,[5],12:i:1,2. Với các kháng nguyên-O O : 1 ,4,[5],12; trong đó yếu tố O được gạch dưới được xác định b ằ ng thể thực khu ẩ n bi ế n trạng và chỉ xuất hiện nếu chủng c ấ y được dung gi ả i b ằ ng thực khuẩn thể biến t rạng tương ứng và trong d ấ u ngoặc vuông ch ỉ ra r ằ ng có thể có hoặc không có mặt yếu t ố liên quan đến thực khuẩn thể biến trạng (Tài liệu tham khảo [9]); với các kháng nguyên-H, H:i đối với pha t hứ nhất và H:1,2 đối với pha thứ hai. Để báo cáo ch í nh thức, công thức kháng nguyên của chủng phân lập, tốt nhất là không có ngoặc vuông hoặc không có gạch dư ớ i. Báo cáo công thức kháng nguyên đã được xác định, ví dụ 4,12: i :1,2. Đối với các phân loài khác của S. enter i ca , loài có serovar phù hợp được thể hiện bằng ký hiệu sa u đ â y (Tài liệu tham khảo [9]): II đối với serovar S. en t erica subsp. salamae ; llla đối với serovar S. en t erica subsp. arizonae ; lllb đối v ớ i serovar S. en t erica subsp. diarizonae ; IV đối v ớ i serovar S. en t erica subsp. houtenae ; VI đối với serovar S. en t erica subsp. in d ica . Ví dụ về báo cáo kết quả của các loài khác với S. enterica subsp. enterica là S. II 30:z 10 :e,n,x, z 15 . Phụ lục A (Tham khảo) Thành phần và chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thuốc thử A.1 Yêu cầu chung Trong Phụ lục này đưa ra các môi trường nuôi cấy liên quan đến các phép th ử s i nh hóa (xem Phụ lục C). Thành phần của các môi trường nuôi cấy nêu trong phụ lục này được lấy làm ví dụ. Môi trường nuôi cấy có các tên gọi tương tự có thể được n ê u trong tài liệu hoặc được bán sẵn với các thành phần hơi khác nhau. Do đó, điều quan trọng đối với mỗi phép thử sinh hóa cần kiểm tra các phản ứng của môi trường nuôi cấy với các chủng ki ể m chứng dương tính và âm tính điển hình. ĐIỀU QUAN TRỌNG - Nếu môi tr ườ ng nu ô i cấy hoặc thuốc thử được chuẩn b ị từ mô i trường nuôi cấy hoàn ch ỉ nh khô hoặc thuốc thử hoặc m ô i trường nuôi cấy đ ã chuẩn bị sẵn đ ư ợc sử dụng, thì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất v ề chuẩn bị, điều kiện bảo qu ả n, hạn sử dụng và cách sử dụng. Thời hạn sử dụng của các môi trường nuôi cấy nêu trong phụ lục n à y đã được thể hiện trong một số tài liệu nghiên cứu. Người sử dụ ng cần kiểm tra xác nh ậ n điều này trong các đều kiện bảo quản của m ì nh [xem TCVN 8128 (ISO 11133)]. A.2 Thạch dinh dưỡng A.2.1 Thành phần Chất chiết từ thịt 3,0 g Pepton a 5,0 g Natri clorua (NaCI) ( tùy chọn) 5,0 g Thạch từ 9g đến 18 g b Nước 1 000 ml a Ví dụ: thủy phân casein b ằ ng enzym b Tùy thuộc v à o sức đông của thạch. A.2.2 Chuẩn bị Đun nóng để hòa tan các thành phần trong nước. Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH tương ứ ng là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, n ếu cần. Chuy ể n môi trường nuôi cấy vào b ì nh (6.6) có dung tích thích hợp. Khử trùng trong nồi hấp á p lực (6.2) ở 121 °C trong 15 min. Chuyển kho ả ng 20 ml môi trường đã tan chảy v à o các đĩa Petri vô trùng v ới đường kính 90 mm (6.7). Để cho đ ô ng đặc. Bảo quản các đĩa đã rót (hướng lên trên), tránh hút ẩm và để ở nơi t ố i ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng. Nếu cần, làm khô các đĩa t rư ớ c khi sử dụng. A.3 M ô i trường thạch - Sven Gard (ví dụ) A.3.1 Ví dụ 1 (Tài liệu tham khảo [16]) Sử dụng thạch dinh dưỡng với nồng độ thạch c ả i biến Cần xác định nồng độ thạch của thạch dinh dư ỡ ng dùng cho đảo pha H trong đ ĩ a Petri. Nồng độ này có thể thay đổi từ 0,5 % đến 1 % phần kh ố i l ư ợng, tùy thuộc vào mẻ thạch được sử dụng. Môi trường thạch yêu cầu phải đủ mềm cho Salmonella di chuyển dễ d à ng trên khắp môi trường sau khi ủ qua đêm từ 34 °C đến 38 °C (6.1). Các thử nghiệm sơ bộ, không bổ sung kháng huyết thanh, do đó c ầ n sử dụng môi trường thạch dinh dư ỡ ng (pH 7,4) được chu ẩ n b ị cho mục đ í ch đó hoặc thạch dinh dưỡng của phòng thử nghiệm th ô ng thường, được làm bán đặc bằng cách bổ sung canh thang với t ỷ lệ thích hợp để qua đêm. Thể t í ch cần cho một đĩa Petri 10 cm là 30 ml. Việc di chuyển trên bề mặt thạch sẽ dễ hơn nếu bổ sung natri desoxycholate (0,3 g/l) vào môi trường (natri desoxycholate kích thích sự di chuyển), xem A.3.2. A.3.2 Ví dụ 2 A.3.2.1 Thành ph ầ n Chất chiết từ thịt 5,0 g Chất chiết n ấ m men 1,0 g Canh thang đậu tương trypto-casein 30,0 g Glucose 0,35 g Natri desoxycholat 1,0 g Thạch từ 5 g đến 9 g a Nước 1 000 ml a Tùy thuộc vào sức đ ô ng của thạch. C ó t h ể c ầ n c ả i thiện để xác định nồng độ của thạch đối với m ôi tr ư ờng c ầ n thiết cho sự d i chuy ể n tối ưu c ủ a Salmone ll a . A.3.2.2 Chuẩn bị H ò a tan các thành phần trong nước bằng cách đun n ó ng, nếu cần. Chỉnh pH đ ể sau khi khử trùng pH tương ứng là 7,6 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Chuyển môi trường nuôi cấy vào bình (6.6) có dung tích thích hợp. Khử tr ù ng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 110 °C trong 20 min. Làm nguội thạch đến khoảng từ 47 °C đến 50 °C (6.8), hoặc bảo quản trong chai đậy kín ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng. Ngay trước khi sử dụng: - bổ sung một giọt kháng huyết thanh có li ê n quan ( SG1 đến SG6) vào môi trường tan ch ả y và trộn đều; - rót khoảng 10 ml vào các đĩa Petri đường kính 55 mm (6.7) hoặc rót kho ả ng 20 ml v à o các đĩa Petri đường k í nh 90 mm. A.4 Canh thang malonat A.4.1 Thành ph ầ n (Tài liệu tham khảo [14]) Amoni sul f at 2,0 g Dikali phosphat 0,6 g Monokali phosphat 0,4 g Natri clorua 2,0 g Natri malonat 3,0 g Bromo t hymol xanh 0,025 g Nước 1 000 ml A.4 . 2 Chuẩn bị Hòa tan các th à nh phần trong nước bằng cách đun n ón g, nếu cần. Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH tương ứng là 6,7 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần. Chuyển môi trường nuôi cấy v ớ i các lượng 5 ml vào các ố ng cho phép có đủ oxy đ ể xảy ra phản ứng ma l onat. Ví dụ, sử dụng các ống kích thước xấp xỉ 22 mm x 220 mm. Khử trùng trong n ồ i h ấ p áp lực (6.2) được duy tr ì ở 121 °C trong 15 min. B ả o qu ả n ở nơi t ố i ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng. A.5 Canh thang Du l citol (Tài liệu tham khảo [2]) A.5.1 M ô i trường hoàn ch ỉ nh A.5.1.1 Thành ph ầ n Chất chiết từ thịt 3,0 g Pepton a 10,0 g Natri clorua 5,6 g Chất c hỉ th ị Andrade (A.5.2) 10 ml Dung dịch Dulcitol (A.5.3) 50 ml Nước 1 000 ml a Ví dụ: phân giải casein b ằ ng enzym. A.5.1.2 Chu ẩ n bị Hòa tan các thành phần trong nước. Chỉnh pH để sau khi khử tr ù ng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C , nếu cần. Chuyển môi trường nuôi cấy với các lượng 5 ml vào các ống có dung tích d anh nghĩa 15 ml. Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy tr ì ở 121 °C trong 15 min. Bảo quản ở nơi tối ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng. A.5.2 Chất ch ỉ thị Andrade A.5.2.1 Thành phần (sau Andrade-Penny năm 1895; trích dẫn trong Tài liệu tham kh ả o [7]) Fuchsin axit 0,5 g Natri hydroxit (1,0 mol/l) 0,5 g Nước 1 000 ml A.5.2.2 Chuẩn bị H ò a tan f uchsin trong nước, thêm natri hy d rox i t. Nếu sau vài giờ mà f uchsin không mất màu th ì thêm 1 ml hoặc 2 ml natri hydroxit. Thuốc thử này có hạn sử dụng dài và cần chuẩn bị một lượng đủ lớn để d ùng trong nhi ề u năm. A.5.3 D ung dịch Dulcitol A.5.3.1 Thành phần Dulcitol 10 g Nước 1 000 ml A.5.3.2 Chuẩn bị Hòa tan dulcitol trong nước. Tiệt trùng b ằ ng cách l ọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 µm. B ả o quản ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng. A.6 Dung d ịch ONPG (0,013 3 mol/l) (Tài liệu tham khảo [2]) A.6.1 Môi trường hoàn ch ỉ nh A.6.1.1 Thành phần o-Nitrophenyl-D-galactoside (ONPG) 0,08 g Dung d ịch mononatri phosphat (NaH 2 P O 4 .H2O; A.6.2) 5 ml Nước 15 ml A.6.1.2 Chuẩn bị Hòa tan ONPG trong nước ở khoảng 37 °C. Thêm dung dịch NaH 2 PO 4 1,0 mol/l (A.6.2.1). Dung dịch phải không màu. Bảo quản dung dịch ở 5 °C (6.3). Trước khi sử dụng, làm ấm một lượng thích hợp (đủ cho s ố lượng phép thử) dung dịch ONPG đến khoảng 37 °C . A.6.2 Dung dịch mononatri phosphat (1,0 mol/l) A.6.2.1 Th à nh phần NaH 2 P O 4 .H 2 O 6,9 g Dung dịch NaOH, 300 g/l 3 ml Nước 45 ml A.6.2.2 Chuẩn bị Hòa tan NaH 2 P O 4 .H 2 O trong nước. Thêm dung dịch NaOH 300 g/ l và chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ( ở 25 °C). Thêm nước đến 50 ml và b ả o quản dung dịch ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng . A.7 C anh thang D-tartrat (ax i t tartrat hữu cơ) A.7.1 Thành ph ầ n Pepton a 10,0 g Kali natri (+ ) tartrat 10,0 g Dung dịch bromothymol xanh, 10 g/l 2,4 ml Nước 1 000 ml a Ví dụ: phân gi ả i casein b ằ ng enzym. A.7.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu c ầ n. Ch ỉ nh pH để sau khi khử trùng pH tương ứng là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C , nếu cần. Chuyển môi trường nuôi cấy với các lượng 5 ml vào các ố ng có dung tích danh định 15 ml. Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được d uy trì ở 115 °C trong 10 min. Bảo quản ở nơi t ố i ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng. A.8 Dung dịch chì axetat A.8.1 Thành phần Ch ì axetat khoảng 50 g Nước 10 ml A.8.2 Chuẩn bị Cho nước vào chai có nắp vặn thích hợp. Bổ sung đủ lượng ch ì axetat để tạo dung dịch b ả o hòa (nghĩa là có thấy ch ì axetat không tan r õ trên đ á y chai). Bảo qu ả n ở nhiệt độ ph ò ng đến 6 tháng. A.9 Canh tha n g tim-não (BHI) A.9.1 Thành phần Bột n ã o 12, 5 g Bột tim bò 5,0 g Pepton proteose 10,0 g Glucose 2,0 g Natri clurua 5,0 g Dina tr i phosphat 2,5 g Nước 1 00 0 ml A.9.2 Chuẩn bị Hòa t an các thành phần trong nước b ằ ng cách đun nóng, nếu cần. Ch ỉ nh pH đ ể sau khi khử trùng pH tương ứng là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C , nếu cần. Chuy ể n m ô i trường nuôi cấy với các lượng 5 ml vào các ống có dung tích danh nghĩ a 15 ml. Kh ử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy tr ì ở 121 ° C trong 15 min. B ả o qu ả n nơi tối ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng. A.1 0 Dung dịch nước muối formal (1 % phần th ể tích) A.10.1 Thành phần Dung dịch f or m aldehyd, 370 g/ l 40,0 ml Dung dịch natri clurua 170 g/l 200 ml Nước Lên đến 4 000 ml A.10.2 Chuẩn bị Cho dung dịch f or m aldehyd vào dung dịch natri clurua. Thêm nước đến tổng th ể tích 4 I. A.11 ỐNG Craigie A.11.1 Thành phần Canh thang d inh dư ỡ ng a 25,0 g Thạch 2,75 g Nước 1 000 ml a Đối với các thành ph ầ n, xem A.2 (không có thạch). A.11.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành ph ầ n trong nước bằng cách đun nóng. Ch ỉ nh pH để sau khi khử trùng pH tương ứng là 7,2 ± 0,2 ở 25 °C , nếu cần. Chuyển môi trường nuôi cấy với các lượng 5 ml vào các ố ng hoặc chai miệng rộng có nắp vặn có dung t í ch danh nghĩa khoảng 15 ml và chứa các ống Craigie (các ống hẹp ngắn, m ở ở c ả hai đầu) . Ố ng Craigie c ầ n cao hơn bề mặt thạch. Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 115 °C trong 10 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng đến 2 tháng. A.12 Gelatin dinh dư ỡ ng A.12.1 Thành ph ầ n Chất chiết từ thịt 3,0 g Pepton a 5,0 g Gelatin 120,0 g Nước 1 000 ml a Ví dụ: phân giải c a sein bằng enzy m. A.12.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước b ằ ng cách đun nóng. Chỉnh pH để sau kh i khử trùng pH tương ứng tà 6,8 ± 0,2 ở 25 °C , nếu cần. Chuyển môi nuôi cấy trường với các lượng 5 ml vào các ống có dung tích danh nghĩa 15 ml. Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 121 °C trong 15 min. Để m ô i trường nguội theo vị trí thẳng đứng và bảo quản ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng. Phụ lục B (Tham khảo) Ví dụ về các quy trình xác định typ huyết thanh của chủng phân lập Salmonella chưa biết Trong Hình B . 1 chỉ ra các bước cần thực hiện trư ớ c khi xác định typ huyết thanh các chủng phân lập Salmonella . Đưa ra các đề xuất về cách xử lý với các chủng tự ngưng kết ( chủng thô), xem 9.2.3. Các ví dụ về quy trình có thể được sử dụng để xác định typ huyết thanh chủng phân lập Salmonella chưa biết được t ó m tắt trong Bảng B.1 và H ì nh B.2. Trong B ả ng B.2 đưa ra thông tin về thành phần của các kháng huyết thanh đa giá (có thể khác nhau giữa các nhà cung cấp). Hình B.2 và Bảng B.2 thu được từ Tài liệu tham khảo [6]. Hình B.1 - Các bước cần thực hiện trư ớ c kh i x á c định typ huyết thanh Salmonella spp. Bảng B.1 - Quy trì nh xác định typ huyết thanh chủng phân lập Salmonella chưa biết bằng cách ngưng kết với các kháng huyết thanh OMA và OMB đa giá Bước 1 Phân tích kháng nguyên-O Sử dụng c á c kháng huyết thanh đa giá 1.1 OMA N ế u dương tính: bước 2.1.1 Nếu âm tí nh: san g bư ớ c 1.2 1.2 OMB Nếu dương tính: bước 2.2.1 Nếu âm t í nh: xem chú th í ch a Bước 2 Phân t í ch kháng nguyên-O Sử dụng các nh ó m kháng huyết thanh đặc hiệu - dùng cho một chủng phân l ậ p đối với nh ó m huy ế t thanh b 2.1.1 O :4,5 hoặc nhóm B Nếu dư ơ ng t í nh: bước 3.1.1 Nếu âm tính: bư ớ c 2.1.2 2.1.2 O :9 hoặc nh ó m D Nếu dương t í nh: bước 3.1.2 Nếu âm tính : bước 2.1.3 2.1.3 O :3,10,15 hoặc nh ó m E Nếu dương tính: bước 3.1.3 N ế u âm t ính: bư ớ c 2.1.4 2.1.4 O :21 hoặc nhóm L Nếu âm t í nh: bước 2.1.5 2.1.5 O : 1, 2 hoặc nh ó m A 2.2.1 O :6,7,8 hoặc nhóm C Nếu dương tính: bước 3.2.1 Nếu âm tính: bước 2.2.2 2.2.2 O :13.22,23 hoặc O :13 Nếu dương tính: bư ớ c 3.2.2 Nếu âm tính: bước 2.2.3 2.2.3 O :11 Bước 3 Ph â n tích kháng nguyên-O Sử dụng các kháng huyết thanh đơn giá - nhận biết serovar kháng nguyên-O đặc hiệu 3.1.1 Ch ủ ng phân lập nh ó m B: O :5, O :27 3.1.2 Chủng phân lập nh ó m D: O:46 đối với nh ó m D 2 O:2 7 đối với nh ó m D 3 3.1.3 Chủng phân lập nhóm E: O:10,O:15,O:34 đ ố i với nhóm E 1 O:19 đối với nhóm E 4 3.2.1 Chủng phân lập nhóm C O :7 đối với nhóm C 1 O :8, O :6 1 , O :20 đối với nhóm C 2-3 O :14, O :24, O :25 đối v ớ i nhóm H 3.2.2 Ch ủ ng phân lập nhóm G O :22, O :23 Bước 4 Phân t í ch kháng nguyên lông Sử dụng các kháng huyết t hanh đa giá H đa giá ( pha 1 và pha 2) H đa giá (pha 2) Sử dụng các kháng huy ế t thanh đơn giá H:1(1,2) → (H:2, H:5, H:6, H:7) d H:a, H:b, H:c, H:d, H:E→(H:h, H:n, H:x, H z 15 ) d H:G(g.m) → ( H:f, H:g, H:m; H:p, H:q H: s, H:t, H:u] d H:i, H:k. H:L→(H:v, H:w, H:l,z 1 3 , H:l ,z 28 ) d H:y H:z , H:Z 4 → (H:z 23 , H:z 24 , H:z 3 2 )d H:z 6 , H: z 10 , H :z 29 , H:z 35 , v.v... a Trong trường hợp ph ả n ứ ng âm tính với cả hai kháng huyết thanh đa gi á th ì thử phân lập tiếp với kh á ng huyết thanh đa gi á hoặc nhóm kh á ng huyết thanh đặc hiệu cho phép nhận biết lên đến nhóm O :67 hoặc gử i chủng phân lập đến phòng th ử nghiệm chu ẩ n. b Nếu trong Bư ớ c 1 kháng huyết thanh đa giá của kháng thể khác với OMA và OMB được sử dụng thi kháng huyết thanh nhóm đặc hiệu trong bước 2 phải được s ử a l ại tương ứng. c Có th ể b ỏ qua việc sử dụng kháng huyết thanh đa giá kháng H và chọn kháng huyết thanh đơn gi á tương ứng với bằng ch ứ ng ph â n l ậ p serovar của nhóm huyết thanh được ước tính. d Kháng huyết thanh trong ngoặc đơn cần thi ế t đ ể nh ậ n biế t các kháng nguyên của phức hợp kháng nguyên H tương ứng. * Có th ể sử dụng h u y ế t thanh O :1,2 đ ể kiểm tra sự có mặt của kháng nguyên O :1 a) Các kháng nguyên thân - Các ph é p thử tu ầ n tự có th ể tiến hành v ới các kháng huyết thanh đ ơ n giá và đa giá để phát hiện kháng nguyên Salmonella thân (Tài liệu tham khảo [6]) [Bước tiếp theo trong dãy hàng ngang đ ượ c thực hiện khi các thử nghiệm trư ớ c đó cho th ấ y có phản ứng dương tính (ví dụ: nếu O :4,5 là dương tính, thì tiếp theo kiểm tra đố i vớ i O :5, v.v...). Thành phần của các kháng huyết thanh đa giá đ ượ c s ử dụng trong sơ đ ồ được đưa ra trong B ả ng B.2.] b) Kháng nguyên l ô ng - Các phép thử tuần tự có thể tiến hành với các kháng huyết thanh đ ơ n gi á và đa giá để phát hiện các kháng nguyên Salmonel l a lông (Tài liệu tham khảo [6]) [Bước tiếp theo trong đường ngang đượ c thực hiện khi các th ử nghiệm trướ c đ ó cho thấy có phản ứng dương tính. Thành ph ầ n của các kháng nguyên đa giá được sử dụng trong sơ đ ồ n à y đ ượ c nêu trong Bảng B.2.] Hình B.2 - Phát hi ệ n kháng nguyên Bảng B.2 - Thành phần của các kháng huyết thanh đa giá liên quan đến Hình B.2 (T à i liệu tham khảo [6]) Y ế u t ố Kháng huyết thanh đa g i á Kháng nguy ê n tương ứng O OMA 1,2,12 + 4,5,12 + 9,12 + 9,46 + 3,10 + 3,15 + 1,3,19 + 21 OMB 6,7 + 6 , 8+ 11 + 13,22+ 13,23 + 6,14,24 + 8,20 H H1 1,2 + 1,5 + 1,6 + 1,7 + z 6 HE e,h + e , n,x + e,n, z 15 HG f,g + g,p + g,m, s + g,m + m,t HMA a + b + c + d + i + z 10 + z 2 9 HMB e,h + e,n,x + e,n,z 15 + G HMC k + y + L + z 4 + r Phụ lục C (Tham khảo) Phép thử sinh hóa C.1 Phân biệ t các phân loài Salmonella C .1.1 Yêu c ầ u chung Để ph â n biệt các phân lo à i Salmonella , cần thực hiện một số phép thử sinh h ó a ( xem b ả ng 2). Một số ví dụ v ề các phép thử được đưa ra trong C.1.2 đến C.1.5. C.1.2 Phép thử malonat Cấy vào canh thang malonat (xem A.4) dịch cấy thu được từ thạch nghiêng hoặc từ canh thang mới cấy (tốt nhất l à cấy một vòng c ấ y 3 mm đầy canh khu ẩ n). Ủ ấm canh thang đã cấy trong kho ả ng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) và quan sát phản ứng sau 24 h ± 3 h và sau 48 h ± 3 h. Trong trường hợp có phản ứng dương tính, màu sắc của môi trường thay đổi từ m à u xanh lá cây sang màu xanh chàm ( P ru ssian blu e ). C.1.3 Phép th ử dulc i tol Cấy vào canh thang dulcitol (xem A.5) v ớ i 1 ml canh khu ẩ n hoặc từ môi trường thạch nghiêng mới. Ủ canh thang đã c ấ y trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) và quan sát các phản ứng sau 24 h ± 3 h và sau 48 h ± 3 h. Trong trường hợp có phản ứng d ương tính (axit hóa), thì môi trường sẽ chuy ể n sang màu h ồ ng. C .1.4 Phép thử ONPG Nuôi c ấ y chủng ph â n lập cần thử nghiệm trên thạch dinh dưỡng nghiêng (hoặc môi trường khác) (xem A.2) có chứa 1,0 % khối lượng lactose. Nhũ h ó a mọt vòng cấy đầy sinh khối vi khuẩn vào 0,25 ml dung dịch nước muối sinh lý để thu được huy ề n phù “đặc ” . Thêm 1 giọt toluen v à o mỗi ống và lắc đều để gi ả i phóng enzym. Để các ống ở nhiệt độ trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) trong 5 min. Thêm 0,25 mol dung dịch ONPG 0,013 3 mol/ l (A.6) vào mỗi ống dung dịch huyền phù cần th ử nghiệm . Ủ các ống trong khoảng từ 34 ° C đến 38 ° C (6.1) và kiểm tra các ống ở các kho ả ng thời gian đến 24 h. Màu vàng chứng tỏ kết quả dương tính. C.1.5 Phép thử gelat i nase Cấy đâm sâu chất cấy thu được từ chủng cấy thuần được ủ “qua đêm” vào môi trư ờ ng gelatin dinh dưỡng (xem A.12). Ủ các ống trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) trong 24 h ± 3 h. Đặt ống trong nước đá hoặc để trong t ủ lạnh khoảng 30 min. Nếu gelatin b ị phân giải, th ì môi trường trong ố ng đông đặc sau khi làm lạnh, điều này cho thấy sự có mặt của gelatinase. Ngoài ra, ống có thể được ủ ở 25 °C đến 1 tuần, kiểm tra hàng ngày về sự hóa lỏng của gelatin. V ì gelatin có thể hó a l ỏ ng ở nhiệt độ 28 °C , nên cần làm mát các ống đã ủ đ ể đảm bảo rằng việc hóa l ỏ ng là do gelatinase v à kh ô ng phải do nhiệt độ ủ. Điều n à y có t hể hữu ích cho việc sử dụng một ống không nuôi cấy làm kiểm chứng. C. 2 Phân b iệt giữa Salmonella Paratyphi B và Salmonella Paratyphi B typ sinh học Java Để phân biệt giữa Salmonella Paratyphi B và Sa l monella Paratyphi B biovar Java, c ầ n thực hiện phép thử phản ứng trên D-tartrat. Ngoài ra, có thể thực hiện phép thử PCR, như trong Tài liệu tham khảo [15]. Đối với phản ứng D-tartrat, có th ể thực hiện quy trình sau đây (T à i liệu tham khảo [1]). - Nuôi cấy chủng cần thử nghiệm trên môi trường thạch không chọn lọc. - Hòa khuẩn lạc trong dung dịch nước muối 8,5 g/l đến mật độ kho ả ng 10 9 cfu/ml. - Cấy các phần 50 µl của từng chủng vào hai ống chứa canh thang D-tartrat (xem A.6). Cũng cấy hai chủng ki ể m chứng vào hai ống canh thang D-tartrat. Phép kiểm chứng: dương t í nh là Salmonella Paratyphi B typ sinh học Java, âm tính là Salmonella Paratyphi B. - Ủ các ống hiếu khí (không lắc) trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) trong 18 h ± 2 h. - Sau khi ủ, kiểm tra các ống về sự đổi màu. Nếu môi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng thì chứng t ỏ phản ứng dương tính. - Thêm vào một dãy các ống đựng canh thang mỗi ống 0,5 ml dung dịch ch ì axetat b ã o h ò a (xem A.8) và để yên các ố n g tối thiểu 30 min để cho kết tủa lắng xu ố ng. - Sau đó, kiểm tra các ống v ề kết tủa (thường sau 1 h đến 2 h). Trường hợp phản ứng d ương tính th ì có kết tủa lắng ở đáy ố ng và trường hợp phản ứng âm tính thì kết tủa vẫn còn lơ l ử ng trong môi trường canh thang. Các ống nghiệm này được so sánh với các ống kiểm chứng dương tính và âm tính. Nếu phép thử dương tính th ì chủng được coi l à Salmonella Paratyph i B typ sinh học Java và ố ng D-tartrat th ứ hai được loại b ỏ . - Nếu phép thử âm tính th ì ống thứ hai và các ống kiểm chứng được ủ thêm 6 ng à y (tổng thời gian ủ là 7 ngày). - Sau khi ủ xong, bổ sung chì axetat vào các ố ng như tr ê n. - Các chủng d ư ơng tính sau 7 ngày được coi là Salmonella Paralyphi B typ sinh học Java và chủng â m tính được coi là Salmonella Paratyphi B. Phụ lục D (tham kh ả o) Sơ đồ tổng thể về xác định typ huyết thanh của năm sarovar Salmonella có ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cộng đồng 0:4 0:9 0:7 0:7 0:8 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ + + + + + ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ (O:5→ + hoặc -) H:G hoặc H:g H:r H:r H:z 10 │ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ + + + + H:i ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ H:m H:2 H:2 H:x + ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ H:2 + + - + ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ + H:q, H:s H:5 H:5 O:6 (O:6 1 , O:6,7) hoặc O:6,14,24] ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ │ - - + + │ ↓ │ │ │ │ 0:46 │ │ │ │ ↓ │ │ │ │ - │ │ │ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Salmonella ser. Typhimurium Salmonella ser. Enteritidis Salmonella ser. Virchow Salmonella ser. Infantis Salmonella ser. Hadar Phụ lục E (Tham khảo) Phương pháp đĩa chuẩn độ vi giếng để xác định typ huyết thanh Salmonella spp. E.1 Yêu c ầ u chung Quy trình nêu trong phụ lục này được dựa trên T à i liệu tham khảo [21]. Trong các ph ò ng thử nghiệm việc xác định typ huyết thanh với số lượng lớn các chủng Salmonella , sử dụng kỹ thuật đĩa chuẩn độ vi giếng kết hợp với hệ thống phân phối kháng huyết thanh bán tự động vào các đĩa có t hể có nhiều ưu điểm. Tổng quan về các phương pháp: - Các huyền phù vi khu ẩ n được chu ẩ n bị để phát hiện các kháng nguyên O (huyền phù- O ) và các kháng nguyên-H (huyền phù H). Huyền phù vi khuẩn được chu ẩ n bị bằng cách nuôi cấy từng chủng c ầ n thử nghiệm trong hai canh thang não-tim (xem A.9): một trong chai đối với huyền phù O và một trong ống nghiệm đối với huyền phù H. Cả hai canh thang được ủ ở nhiệt độ trong kho ả ng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) trong 4 h đến 5 h. - Sau khi ủ, các huyền phù O được hấp bằng hơi nước trong 30 min và sau đó pha loãng v ớ i một lượng tương đương dung dịch nước mu ố i 8,5 g/l. - Sau khi ủ , các huyền phù H bị diệt bằng cách thêm một lượng tương đương dung dịch nước muối f ormal 1 % (xem A.10) và để yên ở nhiệt độ phòng qua đ ê m trước khi thử nghiệm. - Kháng huyết thanh được phân ph ố i vào đ ĩ a 96 giếng đáy tròn, sử dụng pipet đa kênh hoặc hệ thống phân phối tự động. Các đĩa đã chu ẩ n b ị có thể được gắn k í n và bảo qu ả n ở 5 °C (6.3) tối đa 2 tuần. - Các huyền phù O và H đã chuẩn bị được phân phối thủ công vào các đĩa vi giếng đ ã được chu ẩ n b ị , sử dụng pipet bằng ch ấ t dẻo d ù ng một lần hoặc pipet có đầu tip dùng một lần. - Các đĩa ng ư ng kết O được gắn k í n và ủ ở 50 °C (6.9) trong 18 h ± 3 h. - Các đĩa ngưng kết H được ủ trong 2 h trong n ồ i cách thủy ở 50 °C (6.9). T ố t nhất là sử dụng n ồ i cách thủy có giá đỡ không có lỗ nằm ngang bằng mức nước. - Sau khi ủ, kiểm tra ngưng kết. Quan sát sự ngưng kết lắng dưới đáy giếng và tốt nhất là quan sát từ ph í a dưới đĩa, sử dụng gương. Trước khi sử dụng; xác định độ chuẩn của các kháng huyết thanh cần thử nghi ệ m trong các đĩa vi giếng. Các kháng huyết thanh dự định sử dụng trong phương ph á p đĩa vi giếng là 23 kháng huyết t hanh-O được sắp xếp trong hai đĩa vi giếng có kiểm soát dung dịch mu ố i trong đĩa thứ hai. Đĩa đ ầ u ti ê n chứa kháng huyết thanh-O đa giá (PSO), bảy kháng huyết thanh đối với các nhóm 4,5,12; 6,7; 6,8; 9,12; 3,10; 13,22; 6,14,24 và bốn kháng huyết thanh hấp thụ 1, 20, 27 và 46. Các đĩa thứ hai chứa các kháng huy ế t thanh hấp thụ 4, 5, 7,8,9,10,14,15,19, 22 và 23. E.2 Đĩa vi giếng 1 đối với các kháng nguyên O Cột của đĩa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Huyết thanh trong từng giếng của cột PSO 4,5,12 6,7 6,8 9,12 3,10 13,22 6,14,24 1 20 27 46 E.3 Đĩa vi giếng 2 đối với các kháng nguyên O Cột của đ ĩa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Huyết thanh trong từng giếng của cột 4 5 7 8 9 10 14 15 19 22 23 Kiểm chứng Mỗi chủng được thử nghiệm đối với tất cả các huyết thanh trong đ ĩa vi giếng. Tám chủng có thể được thử nghiệm trong mỗi bộ hai đ ĩ a vi giếng. Đ ể xác định kháng nguyên-H, mỗi chủng được thử nghiệm với một bộ gồm 11 kháng huyết thanh và nước muối kiểm chứng. Các kháng huyết thanh được gợi ý là Salmonella H đa giá (PSH 1+2) có chứa kháng thể H = a cho đến H = z 2 9 để bao tr ù m pha 1 và kháng thể đối với pha 2 phức H = 1,2,5,6,7 (PSH 2). Bốn kháng huyết thanh đối v ớ i các phức H = E;G;L;1,2,5,6,7 và sáu kháng huyết thanh hấp thụ đối với H = b , d,i,r,z,z 10 E.4 Đĩa vi gi ế ng đối với các kháng nguy ê n-H Cột của đ ĩa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Huyết thanh trong từng giếng của cột PSH 1+2 E G L PSH2 b d i r z z 10 Kiểm chứng Việc nhận biết pha 1 là hoàn ch ỉ nh đ ối với các chủng ngưng kết với PSH 1+2 và một trong sáu kháng huyết thanh hấp thụ và không c ầ n tiếp tục thử đối với pha 1. Đối với c á c chủng ngưng kết với PSH và một trong bốn phức, thì cần thử nghiệm tiếp để nhận biết các kháng nguyên đơn giá. Các chủng chỉ ngưng kết với PSH được thử nghiệm với các kháng huyết thanh H = a , c , k , y ,z 4 và z 29 . Sau khi đảo pha, cần lặp lại quy trình thử kháng nguyên-H để xác định các Kháng nguyên của pha khác. Phụ lục F (Tham khảo) Ví dụ về các quy trình đảo pha F.1 Phương pháp Sven Gard rút gọn Phương pháp n à y được trích dẫn từ Tài liệu tham khảo [8], [13]. Chuẩn bị đĩa Petri đ ư ờ ng k í nh 55 mm (6.7) v ớ i 10 ml thạch di động bồ mặt đã đông đặc (A.3). Thêm 0,1 ml kháng Sa l monella H từng gi ọ t một và dàn đều trên bề mặt, sử dụng một th ì a vô trùng ( t h ủ y tinh). Cấy chủng tại một điểm duy nhất ở giữa đĩa. Ủ đĩa đã cấy ở 34 °C đến 38 °C (6.1) từ 18 h đến 21 h. Chủng di động trên bề mặt không bị ức chế pha H sử dụng để xác định lần thứ hai. Phương pháp rút gọn này thường cho phép nhận biết pha thứ hai ở lần thử đầu tiên. Phương pháp này có ưu thế là các đĩa thạch được chuẩn bị trước và được b ả o qu ả n để sử dụng khi cần nhằm c ả i thiện sự biểu hiện của kháng nguyên-H hoặc để xác định pha. F.2 Phương pháp ống Craigie F.2.1 Yêu cầu chung Ống Craigie được sử dụng để biểu lộ kh ả năng di động. Phương pháp này gồm có một ống hoặc lọ rộng miệng, có nắp vặn, có chứa thạch bán đặc (thạch từ 0,2 % đến 0,4 % phần khối lượng) ở giữa có ống hẹp, ngắn m ở ở hai đ ầ u, sao cho nó nhô ra trên mặt thạch (xem H ì nh F.1). cẩn thận cấy đâm sâu chủng c ầ n thử nghiệm vào trong từng ống. Sau khi ủ, lấy chủng cấy trên bề mặt thạch di động bên ngoài ống trung tâm tạo ra một qu ầ n thể tế bào di động (Tài liệu tham kh ả o [5]). F.2.2 Chuẩn b ị ống Craigie cho đảo pha - Đặt ống môi trường Craigie (xem A.11) vào trong nồi hấp (hoặc các thiết bị thích hợp khác) trong 30 min để làm tan chảy t hạch. - Đặt ống Craigie với thạch đã tan chảy vào trong nồi cách thủy ở 47 °C đến 50 °C ( 6.8) đ ể cho cân bằng nhiệt. - Thêm 200 m l kháng huyết thanh cần thiết v à o ống Craigie. - Trộn đều bằng cách lắc nhẹ. - Đặt ống Craigie ở 5 °C (6.3) để cho đặc lại. F.2.3 Quy trình đảo pha sử dụng ố ng Craigie - Cấy Salmonella v à o ống Craigie bằng que cấy nhựa d ùng một l ầ n hoặc que cấy thẳng (chủng cấy được cấy vào trong ống bên trong). - Ủ ống Craigie ở nhiệt độ trong khoảng từ 34 °C đến 30 ° C (6.1). - Ki ể m tra sự phát triển vi khu ẩ n trong ống Craig i e sau 24 h, 48 h và 72 h. - Khi xu ấ t hiện vi khuẩn trên b ề mặt thạch (bên ngoài ống trung tâm), gạt phần vi khuẩn phát triển vào canh thang não-tim (xem A.9). - Sau đó canh khuẩn được đêm thử về kháng nguyên-H của nó. CHÚ D Ẫ N 1 nắp 5 đường đi của Salmo ne lla sau đảo pha 2 miệng ống 6 b ề mặt được cấy truy ề n 3 đi ể m c ấ y 7 ống Craigie 4 m ô i trườ ng b á n đ ặ c Hình F.1 - Ph ươ ng pháp ố ng Cra i g i e F.3 Phương pháp cầu-gi ấ y Quy trình nêu trong điều này được lấy từ T à i l iệu tham khảo [4], là quy trình được sửa đổi từ quy trình ban đầu nêu trong Tài liệu tham khảo [23]. Xem Hình F.2. Lấy một dải thạch trypton đậu tương (rộng 1 cm) đ ể tạo thành rãnh đi qua tâm của đĩa. Các dài giấy lọc (3 mm x 3 cm) được bố trí trên rãnh này. Kháng huyết thanh dựa theo pha nhận biết được chấm vào giữa cầu-giấy (được nhận biết bằng các vòng tròn màu trắng). Các chủng vi khuẩn được cấy v à o phần cuối b ê n trái của các dải (được nhận biết bằng các vòng tròn màu trắng). Sau khi ủ, các pha biến thể, th ể hiện một kháng nguyên lông khác, di chuyển về phía cuối bên phải của d ả i. Sau khi ủ 16 h, có thể nhìn thấy sự phát triển vi khuẩn xung quanh viền giấy lọc (thể hiện bằng các điểm tam giác màu trắng). Các chủng được cấy trong đĩa ở H ì nh F.2 là (A) S. Cho l eraesuis var. Kunzendorf (6,7:c :-); (B) S . Typhimurium (1,4,5,12: i :1,2); và (C) S. Stanley (4,5,12:d:1;2) Hình F.2 - Phương pháp cầu-gi ấ y đối với đảo pha Salmonella Thư mục tài liệu tham khảo [1] ALFREDSSON G.A., BARKER R.M., OLD D.C., DUGUID J.p. Use of tartaric acid isomers and citric a ci d in the biotyping of Salmonella typhimurium. J. Hyg. (Lond) . 1972, 70 pp. 651-666 [2] US Food and Drug official s . 2001.Bacterio l ogicalAnalyticalManual.BAMR53:ONPGtest. Available (viewe d 2013- 0 6- 0 4] at: htt p ://www.fda. g ov/Food/FoodScienceResearch/Laborator y Methods/ucm062262.htm [3] BRENNER F.W., VlLLAR R.G., ANGULO F.J. , TAUXE R ., SWAMINATHAN B. Salmonella n o menclature. J . Clin. Microbiol . 2000, 38 pp. 2465-2467 [ 4 ] CHIOU C.S., HUANG J.F., TSAI L.H., Hsu K.M., LIAO C.S., CHANG H.L. A simple and low-cost paper- bridged method for Salmonella phase reversal. Diagn. Microbiol. Infect . Dis. 2006, 54 pp. 315-317 [5] Craigie J. STUDIES ON THE SEROLOGICAL REACTIONS OF FLAGELLA OF B. TYPHOSUS. J. IMMUN. 1931, 21 p. 417 [ 6] DANAN C., FREMY S., MOURY F ., BOHNERT M., BRISABOIS A. 2009. Determining the serotype of isolated Salmonella strains in the veterinary sector using the rapid slide agglutination test. Cahiers de la Référence, N°.2, CR2- 0 9M01, December 2009. Available (viewed 2013- 0 6- 0 4] at: http://www.afssa.fr/euroreference/numero2/index.htm [7] EWING W.H. Ed w ards and Ewing's ident if ication of Enterobacter i aceae. New York:Elsevier, Fourth edition, 1986 [8] GARD s . Das Sch w armphanomen in der Salmonella -Gr u ppe und seine praktische Ausniitzung. [The s w arming phenomenon in the Salmonella group and its practica l use], z . Hyg. I nfektionskr. 1938, 120 pp. 615-619. [9] GRIMONT P.A.D., & W EILL F.-X. 2007. Ant i genic f ormulae of the Salmonella serovars, 9th edition 1) . WHO Co l laborating Centre for Re f erence and Research on Salmonella . Paris:lnstitut Pasteur. Available (viewed 2013- 0 6- 0 4] at: http://www. pasteur.fr/ip/porta l/ action/ WebdriveActionEvent/oid/01s- 0 00036- 0 89. [10] GUIBOURDENCHE M. , ROGGENTIN R , MlKOLEIT M. , FlELDS P.I. , BOCKEM Ü H L J ., GRIMONT P.A.D. et al. Supplement 2003-2007 (No. 47) to the White-Kauffmann-Le Minor scheme. Re s . Microbiol . 2010, 161 pp. 26-29 [11] HENDRIKSEN R.S., MlKOLEIT M ., CARLSON V.P., KARLSMOSH s . , VlEIRA A.R., [ENSEN A.B. , et al. WHO Global Salm-Surv Exle rn al Quality Assurance System for Xác định typ huyết thanh of Salmonella - Isolates from 2000 to 2007. J . Clin. Microbiol. 2009, 47 pp. 2729-2736 [12] KAUFFMANN F. On the principles of classi fi cation and nomenclature of Enterobacter i aceae . Int. Bull. Bacte ri ol. Nomencl . Taxon. 1959, 9 pp. 1-6 [13] KOEHN A; Technical modification of the swarming p l ate metho d according to Sven Gard in Salmonella diagnosi s . Zentralbl. Bakter i ol. 1970, 215 pp. 449-455 [14] LEIFSON E. Fermentation of natri malonate as a means of differentiating Aerobacter and Escherichi a coli. ]. Bacteriol. 1933, 26 pp. 329-330 [15] MALORNY B., BUNGE C., HELMUTH R. Discrimination of D-tartrate-fermenting and non-fermenting Salmonella entér i ca subsp. ent é rica isolates by genotypic and phenotypic method s . J. Clin. Microb i ol. 2003, 41 pp. 4292-4297 [16] POPOFF M. Y. Gui d elin e s for the preparation of Salmonella an t isera. WHO Collaborating Centre for Reference and Research o n Salmone l la. Par is :lnstitut Pasteur, 2001 [17] POPOFF M.Y., & LE MINOR L.E. Genus XXXIII. Salmonella L i gnieres 1900, 389. InBRENNER D. J ., KRIEG N.R., STALEY J.T. editor s . Bergey' s manua l of systematic bacter i ology , 2nd edition, Vol. 2. The Proteobacter i a , Part B The Gammaproteobacteria . New York, NY:Springer, 2005, pp. 764-799 [18] POPOFF M.Y., BOCKEMUHL J., BRENNER F.W. Supplement 1998 (No. 42] to the Kauffmann- W hite scheme. Re s . Microbiol . 2000, 154 pp. 63-65 [19] POPOFF M.Y., BOCKEMUHL J., GHEESLING L.L. Supplement 2001 (No. 45] to the Kau ff mann- White scheme. Re s . Microbiol . 2003, 151 pp. 173-174 [20] American Society for Microbiology. Publications Board meeting minute s . Salmonella nomenclature. ASM New s . 1999, 65 p. 769 [21] SHIPP C.R., & ROWE B. A me c hanized microtechnique for Salmonella serotyping . J. Clin. Pathol. 1980, 33 pp. 595-597 [22] TINDALL B.J., GRIMONT P.A.D., GARRITY G.M., EUZEBY J.P. Nomenclature and taxonomy of the genus Salmonella . I nt.J.Syst.Evo l . Microbiol. 2005, 55 pp. 521-524 [23] Wang T.K., TSENG T.C. , LEE J.H., Wang W.T ., TSAI J.L., Ho S.I., Pan T.M. Analysis of Salmonella serovars in Taiwan by the phase induction method] [Article in Chinese]. Zhanghua Min Guo Wei S h ang Wu Ji Mian YiXue Za Zhi [Chin. J. Microbiol. Immunol.]. 1994, 27 , pp. 13-24 1) Supp l emen t s t o the White-Kauffmann-L e Minor sc h eme are publishe d in Res . M i c ro biol., a publication of t h e Institut Pasteur ( f ormer l y Ann. Inst. Pasteur/Mic ro biol ), e.g. Refere n ce [10].