TCVN6599:2000

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6599:2000 (ISO 6651 : 1987) về thức ăn chăn nuôi - xác định hàm lượng aflatoxin B1 do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6599 : 2000 ISO 6651 : 1987 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN B 1 Animal feeding stuffs - Determination of aflatoxin B 1 content TCVN 6599:2000 hoàn toàn tương đương với ISO 6651:1987. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định hai phương pháp xác định hàm lượng aflatoxin B 1 , trong thức ăn chăn nuôi. 2. Lĩnh vực áp dụng. 2.1. Phương pháp A: Áp dụng cho các thức ăn đơn sau: - Các hạt có dầu và khô dầu của chúng, đặc biệt là dừa, cùi dừa khô, hạt lanh, hạt đậu tương, hạt vừng, hạt cây cọ babassu; - Bột sắn; - Mầm ngô; - Ngũ cốc và các sản phẩm của ngũ cốc; - Bột đậu; - Bã và bột khoai tây. Trong trường hợp có những chất làm cản trở việc xác định theo phương pháp A, nên xác định theo phương pháp B. 2.2. Phương pháp B: Áp dụng cho thức ăn dạng hỗn hợp và các loại nguyên liệu thức ăn đơn không được đề cập tại điều 2.1. Phương pháp này không áp dụng cho thức ăn chứa bã ép của cam, chanh. 2.3. Giới hạn dưới để phát hiện aflatoxin B 1 là 0,01 mg/kg. 3. Tiêu chuẩn trích dẫn ISO 6498 Thức ăn chăn nuôi – chuẩn bị mẫu thử. 4. Nguyên tắc Chiết aflatoxin từ phần mẫu thử bằng clorofooc, lọc và làm sạch phần dịch lọc qua cột silicagel. Cho bay hơi phần dịch lọc và hòa tan phần cặn bằng một thể tích clorofooc xác định hoặc hỗn hợp benzen và axetonitril. Chấm một phần dung dịch hòa tan này trên sắc ký lớp mỏng, dùng sắc ký một chiều đối với phương pháp A và sắc ký hai chiều đối với phương pháp B. Xác định hàm lượng aflatoxin B 1 bằng mắt thường hoặc bằng máy đo cường độ huỳnh quang, bằng cách kiểm tra sắc ký đồ dưới đèn tử ngoại và so sánh với những dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 đã biết trước nồng độ được chấm trên cùng một bản với dịch chiết phần mẫu thử. Sự tạo thành dẫn xuất hemiaxetat khẳng định sự có mặt của aflatoxin B 1 . 5. Thuốc thử Tất cả các thuốc thử phải được công nhận đạt chất lượng phân tích. Nước sử dụng phải là nước cất hoặc ít nhất là nước có độ tinh khiết tương đương. 5.1. Clorofooc, được làm ổn định với 0,5 đến 1% etanol 96% (v/v). 5.2. N-Hexan. 5.3. Dietyl ete khan, không chứa peroxit. 5.4. Benzen/axetonitril, hỗn hợp theo tỷ lệ 98: 2. Hỗn hợp 98 thể tích Benzen với 2 thể tích axetonitril. 5.5. Clorofooc/metanol, hỗn hợp theo tỷ lệ 97:3. Hỗn hợp 97 thể tích clorofooc với 3 thể tích metanol. 5.6. Các hệ dung môi khai triển 1) 5.6.1. Clorofooc/axeton, hỗn hợp theo tỷ lệ 90:10 Hỗn hợp 90 thể tích clorofooc với 10 thể tích axeton trong bình chưa bão hòa. 5.6.2. Dietyl ete/metanol/ nước, hỗn hợp theo tỷ lệ 96:3:1 Hỗn hợp 96 thể tích dietyl ete với 3 thể tích metanol và 1 thể tích nước trong bình chưa bão hòa. 5.6.3. Dietyl ete/metanol/ nước, hỗn hợp theo tỷ lệ 94:4,5:1,5 Hỗn hợp 94 thể tích dietyl ete với 4,5 thể tích metanol và 1,5 thể tích nước trong bình đã bão hòa. 5.6.4. Clorofooc/ metanol, hỗn hợp theo tỷ lệ 94:6 Hỗn hợp 94 thể tích clorofooc với 6 thể tích metanol trong bình đã bão hòa. 5.6.5. Clorofooc/ metanol, hỗn hợp theo tỷ lệ 97:3 Hỗn hợp 97 thể tích Clorofooc với 3 thể tích metanol trong bình đã bão hòa. 5.7. Silicagel, dùng cho sắc ký cột với kích thước hạt từ 0,05 đến 0,20mm. 5.8. Silicagel, G-HR hoặc loại tương đương dùng cho sắc ký lớp mỏng. 5.9. Đất diatomit (Hyflocupercel), đã rửa sạch axit 5.10. Natri sunfat, khan ở dạng hạt 5.11. Axit trifluoroaxetic 5.12. Khí trơ, ví dụ khí nitơ 5.13. Dung dịch axit sunfuric, 50% (v/v). 5.14. Dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 chứa khoảng 0,1 m g aflatoxin B 1 ­ pha trong 1 ml Clorofooc (5.1) hoặc trong 1 ml hỗn hợp benzen/axetonitril (5.4). Cảnh báo – Các aflatoxin rất dễ gây ung thư do vậy phải được bảo quản hết sức cẩn thận. Chuẩn bị và kiểm tra dung dịch như sau: 5.14.1. Chuẩn bị dung dịch gốc và xác định nồng độ Chuẩn bị dung dịch aflatoxin B 1 trong clorofooc (5.1) hoặc trong hỗn hợp benzen/axetonitril (5.4) sao cho nồng độ vào khoảng 8 đến 10 m g/ml. Xác định phổ hấp thụ từ bước sóng 330 đến 370nm bằng quang phổ kế (6.9). Đo độ hấp thụ (A) tại bước sóng 363 nm đối với dung dịch clorofooc hoặc tại bước sóng 348 nm đối với dung dịch hỗn hợp benzen/axetonitril. Tính nồng độ aflatoxin B 1 theo m g/ml dung dịch, theo công thức sau: a. Đối với dung dịch clorofooc: b. Đối với dung dịch hỗn hợp benzen/axetonitril: 5.14.2. Pha loãng Tiến hành pha loãng dung dịch gốc (5.14.1), tránh ánh sáng, để đạt được dung dịch chuẩn có nồng độ aflatoxin B 1 khoảng 0,1 m g/ml. Nếu bảo quản trong tủ lạnh ở 4 0 C thì dung dịch có thể giữ trong 2 tuần. 5.14.3. Kiểm tra độ tinh khiết của dung dịch bằng phương pháp sắc ký. Trên bản sắc ký (6.7) chấm 1 điểm 5 m l dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 có nồng độ khoảng 8 đến 10 m g/ml (5.14.1). Chạy sắc ký như 8.5.1. Dưới ánh sáng tử ngoại, sắc đồ sẽ cho duy nhất một điểm và vùng lưu giữ không phát huỳnh quang. 5.15. Aflatoxin B 1 và B 2 (xem cảnh báo ở 5.14) dung dịch để kiểm tra định tính chứa khoảng 0,1 m g aflatoxin B 1 và B 2 pha trong 1 ml clorofooc (5.1) hoặc trong 1ml dung dịch hỗn hợp benzen/axetonitril (5.4). Nồng độ này đưa ra có tính chất tham khảo. Có thể điều chỉnh nồng độ để cả hai loại aflatoxin này có cường độ phát huỳnh quang giống nhau (xem 8.5.1). 6. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và các dụng cụ chuyên dùng sau đây: 6.1. Máy nghiền/trộn. 6.2. Sàng, có đường kính lỗ 1,0 mm 1) 6.3. Máy lắc hoặc máy khuấy từ 6.4. Cột sắc ký, làm bằng thủy tinh (đường kính trong 22mm, dài 300mm), bình chứa dung môi 250ml có van polytetrafluoroetylen, phía dưới cột được nút bằng bông hoặc bằng sợi thủy tinh. 6.5. Thiết bị cất quay chân không, có bình cầu dung tích 500ml. 6.6. Thiết bị sắc ký lớp mỏng (TLC), theo yêu cầu để chuẩn bị các bản mỏng (6.7) và dụng cụ chấm các điểm (pipet mao quản hoặc micro xi-ranh), bình khai triển và thiết bị phun axit sunfuric (5.13) lên các bản mỏng. 6.7. Các tấm thủy tinh, cho sắc ký lớp mỏng có kích thước 200mm x 200mm được chuẩn bị như sau (với lượng làm sao đủ cho 5 bản). Cân 30g silicagel (5.8) cho vào một bình nón, thêm 60ml nước cất, đậy nút và lắc trong 1 phút. Phun huyền phù này lên các tấm kính sao cho thu được lớp mỏng silicagel đồng nhất có độ dày 0,25mm. Để khô trong không khí sau đó bảo quản trong bình hút ẩm có chứa silicagel. Trước khi sử dụng hoạt hóa các tấm này bằng cách đặt trong tủ sấy ở 110 0 C trong 1 giờ. Có thể sử dụng các tấm silicagel có sẵn, nếu chúng cho kết quả tương đương với kết quả của những tấm được chuẩn bị như đã nói ở trên. 6.8. Đèn tử ngoại bước sóng dài (360nm). Cường độ phát ra sẽ giúp ta dễ dàng nhận ra điểm có nồng độ aflatoxin B 1 tới 1,0 ng trên tấm TLC ở cách đèn một khoảng 10cm. Cảnh báo- Đèn tử ngoại rất nguy hiểm đối với mắt, do đó phải đeo kính bảo vệ. 6.9. Quang phổ kế, có thể đo trong vùng phổ tử ngoại 6.10. Máy đo cường độ huỳnh quang (tự chọn) 6.11. Giấy lọc đã gấp rãnh 6.12. Ống nghiệm chia độ, dung tích 10,0ml và có nút bằng polyetylen 6.13. Bình nón, có nút mài dung tích 500 ml. 6.14. Pipet, dung tích 50ml 6.15. Cân 7. Lấy mẫu Lấy mẫu thí nghiệm từ nguyên liệu, tuân theo tiêu chuẩn đối với từng loại nguyên liệu ngoại trừ việc lấy mẫu không nằm trong lĩnh vực áp dụng của tiêu chuẩn này. Nếu không có tiêu chuẩn nào phù hợp, các bên liên quan sẽ phải thỏa thuận với nhau dựa theo các đặc tính của nguyên liệu mẫu. 8. Cách tiến hành 8.1. Chuẩn bị mẫu thử 8.1.1. Nếu mẫu có hàm lượng chất béo trên 5% thì phải loại chất béo bằng dung môi ete dầu hỏa trước khi nghiền. Trong trường hợp này các kết quả phân tích sẽ được biểu thị dưới dạng khối lượng của mẫu không loại chất béo. 8.1.2. Nghiền mẫu sao cho hoàn toàn qua được sàng (6.2). Trộn đều. (Xem ISO 6498) 8.2. Phần thử mẫu Cân 50g mẫu với độ chính xác đến 0,01g, cho vào bình nón (6.13) 8.3. Chiết tách Cho vào phần mẫu thử (8.2) 25g đất diatomit (5.9), 25ml nước cất và 250ml clorofooc (5.1) đong chính xác bằng ống đong. Đậy nút chặt và lắc bằng máy lắc hoặc máy khuấy từ (6.3) trong 30 phút. Lọc qua giấy lọc gấp rãnh (6.11), chú ý bỏ 10ml dịch lọc đầu, sau đó lấy ít nhất 50ml dịch lọc tiếp theo. 8.4. Làm sạch cột 8.4.1. Chuẩn bị cột Đổ clorofooc (5.1) đến 2/3 cột sắc ký (6.4) và thêm 5g natri sunfat (5.10). Kiểm tra sao cho bề mặt natri sunfat phải thật phẳng, sau đó từ từ thêm 10g silicagel (5.7) vào mẫu phân tích. Khuấy nhẹ và cẩn thận sau mỗi lần rót silicagel để loại bỏ bọt khí. Đợi 15 phút thêm dần dần 10g natri sunfat (5.10). Mở khóa sao cho dịch lỏng chảy xuống từ từ đến khi dịch lỏng vừa ngập bề mặt lớp natri sunfat. Khóa van lại. 8.4.2. Làm sạch Dùng pipet (6.4) chuyển 50ml dịch lọc thu được ở 8.3 vào bình nón 250ml và thêm 100ml dung dịch n-hexan (5.2). Trộn đều và chuyển một cách định lượng hỗn hợp vào cột, tráng rửa bình bằng n-hexan. Mở van và cho dung dịch chảy với lưu lượng dòng khoảng 8-12 ml/phút sao cho dung dịch ngập trên bề mặt lớp natri sunfat. Khóa van. Tiếp tục cho dung dịch chảy ra và rót 100 ml dietyl ete (5.3) vào cột. Lại mở van và cho dịch lỏng chảy qua đến khi ngập bề mặt lớp natri sunfat. Trong quá trình này phải đảm bảo không để cột bị khô. Rửa giải bằng 150ml dung dịch hỗn hợp clorofooc/metanol (5.5) và thu toàn bộ dịch chảy ra vào bình của máy cất quay chân không dung tích 500ml (6.5). Làm bay hơi đến khô bằng máy cất quay chân không hoặc cũng có thể làm khô bằng dòng khí trơ (5.12) ở nhiệt độ dưới 50 0 C và áp suất thấp. Chú thích: Nếu không có máy cất quay chân không thì thêm chất làm sôi và cho bay hơi hoàn toàn đến khô trong nồi cách thủy. Dùng clorofooc (5.1) hoặc hỗn hợp benzen/axetonitril (5.4) chuyển một cách định lượng phần cặn vào ống nghiệm 10ml có chia độ (6.12). Cho dung dịch bay hơi một lần nữa, ví dụ trong nồi cách thủy, tốt nhất là dùng dòng khí trơ (5.12) và lượng clorofooc (5.1) hoặc hỗn hợp benzen/axetonitril (5.4) tối đa là 2,0 ml. 8.5. Sắc ký lớp mỏng 8.5.1. Phương pháp A – Sắc ký lớp mỏng một chiều 8.5.1.1. Chọn dung môi Lựa chọn dung môi (5.6.1; 5.6.2; 5.6.3; 5.6.4 hoặc 5.6.5) phải thực hiện trước khi khẳng định rằng aflatoxin B 1 và B 2 được tách ra hoàn toàn khi bản mỏng được chạy sắc ký, điều này phụ thuộc vào loại bản mỏng sử dụng. Chấm 25 m l dung dịch chuẩn (5.15) lên bản đã chuẩn bị sẵn (6.7) (kiểm tra từng bản cho mỗi dung môi). Tiến hành thực hiện theo 8.5.1.2 để chạy sắc ký, cho bay hơi và chiếu đèn tử ngoại. Với dung môi thích hợp hai điểm sẽ được phân tách rõ ràng. 8.5.1.2. Cách tiến hành Dùng pipet mao quản hoặc micro xi-lanh chấm các thể tích dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 lên tấm TLC (6.7) và dịch chiết như sau (các điểm này cách cạnh đáy 20mm và cách nhau 20mm). - Lấy 10, 15, 20, 30 và 40 m l dung dịch aflatoxin B 1 chuẩn (5.14). - Lấy 10 m l dịch chiết ở 8.4.2 chấm chồng lên điểm 20 m l dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 (5.14) - Lấy 10 và 20 m l dịch chiết ở 8.4.2. Chạy sắc ký ở chỗ tối với hệ dung môi đã chọn (xem 8.5.1.1). Lấy bản sắc ký ra khỏi bình sắc ký, để dung môi bay hơi ở chỗ tối sau đó đem kiểm tra dưới đèn tử ngoại, đặt bản sắc ký cách đèn 10cm (6.8). Các vết aflatoxin B 1 sẽ cho huỳnh quang màu xanh da trời. 8.5.2. Phương pháp B – Sắc ký lớp mỏng hai chiều. 8.5.2.1. Sử dụng các dung dịch (xem hình 1) Kẻ hai đường thẳng trên bản sắc ký (6.7) giao nhau và song song với hai cạnh bản (một đường cách cạnh 50mm, đường kia cách cạnh 60mm) để giới hạn sự di chuyển của dung môi. Dùng pipet mao quản hoặc micro xi-ranh chấm các dung dịch sau lên bản: - Tại điểm A: 20 m l dịch chiết mẫu đã được làm sạch ở 8.4.2; - Tại điểm B: 20 m l dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 (5.14). - Tại điểm C: 10 m l dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 (5.14). - Tại điểm D: 20 m l dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 (5.14). - Tại điểm E: 40 m l dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 (5.14). Làm khô nhờ luồng không khí thổi nhẹ hoặc nhờ khí trơ (5.12). Các vết chấm thu được phải có đường kính khoảng 5mm. 8.5.2.2. Chạy sắc ký (xem hình 1) Chạy sắc ký theo chiều I ở chỗ tối, sử dụng dung môi khai triển (5.6.3) (bình được bão hòa bằng một lớp dung môi 1cm) đến khi dung môi tiến tới đường giới hạn. Lấy bản sắc ký ra khỏi bình, để khô chỗ tối ở nhiệt độ phòng ít nhất là 15 phút. Sau đó chạy sắc ký theo chiều II ở chỗ tối, sử dụng dung môi khai triển (5.6.1) (bình chưa bão hòa, lớp dung môi 1cm) đến khi dung môi tiến tới đường giới hạn. Lấy bản sắc ký ra khỏi bình và để khô chỗ tối ở nhiệt độ phòng. 8.5.2.3. Giải sắc phổ (xem hình 2) Kiểm tra sắc phổ dưới đèn tử ngoại, bằng cách đặt bản mỏng cách đèn 10cm (6.8). Xác định vị trí của các điểm huỳnh quang màu xanh da trời B, C, D và E của aflatoxin B 1 từ dung dịch chuẩn và kẻ hai đường thẳng mờ đi qua những điểm này tạo thành các góc ở phía phải hướng chạy sắc ký. Giao điểm P của hai đường này là điểm nghi vấn có aflatoxin B 1 trong dịch chiết chấm ở điểm A (xem hình 1). Tuy nhiên, vị trí thực của aflatoxin B 1 có thể nằm tại điểm Q là giao điểm của hai đường kẻ ở trên tạo với nhau một góc khoảng 100 0 theo thứ tự đi qua điểm B và điểm C. 8.5.2.4. Sắc ký bổ sung. Kẻ hai đường thẳng trên bản sắc ký khác (6.7) giao nhau và song song với hai cạnh bản như hình vẽ 1 và chấm ở điểm A, 20 m l dịch chiết đã được làm sạch ở 8.4.2 và chấm chồng lên nó 20 m l dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 (5.14). Chạy sắc ký như ở 8.5.2.2. Kiểm tra sắc phổ dưới đèn tử ngoại và xem: - Vết aflatoxin B 1 của dịch chiết và của dung dịch chuẩn phải trùng nhau; - Huỳnh quang của vết này phải mạnh hơn quỳnh quang của vết aflatoxin B 1 đã khai triển ở điểm Q của bản mỏng thứ nhất. 8.6. Xác định. Có thể sử dụng hai phương pháp xác định bằng mắt thường hoặc bằng máy đo cường độ phát huỳnh quang. 8.6.1. Xác định bằng mắt 8.6.1.1. Phương pháp A Xác định hàm lượng aflatoxin B 1 trong dịch chiết bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang của vết dịch chiết với cường độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn. Nếu thấy cần thiết dùng phép nội suy. Huỳnh quang của vết dịch chiết chấm chồng lên dung dịch chuẩn phải mạnh hơn huỳnh quang của vết 10 m l dịch chiết và phải trùng nhau. Nếu cường độ huỳnh quang của vết 10 m l dịch chiết đậm hơn cường độ huỳnh quang của vết 40 m l dung dịch chuẩn thì phải pha loãng dịch chiết 10 hoặc 100 lần bằng clorofooc (5.1) hoặc bằng dung dịch hỗn hợp benzen/axetonitril (5.4) trước khi tiến hành làm lại sắc ký lớp mỏng. 8.6.1.2. Phương pháp B Xác định hàm lượng aflatoxin B 1 trong dịch chiết bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang của vết dịch chiết với cường độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn C, D và E. Nếu cần thiết dùng phép nội suy. Nếu cường độ huỳnh quang của vết 20 m l dịch chiết mạnh hơn cường độ huỳnh quang của vết 40 m l dung dịch chuẩn thì phải pha loãng dịch chiết 10 hoặc 100 lần bằng clorofooc (5.1) hoặc bằng dung dịch hỗn hợp benzen/axetonitril (5.4) trước khi tiến hành làm lại sắc ký lớp mỏng. 8.6.2. Xác định bằng máy đo cường độ huỳnh quang Đo cường độ huỳnh quang của vết aflatoxin B 1 bằng máy đo cường độ huỳnh quang (6.10) tại bước sóng kích thích là 365nm và bước sóng phát xạ là 443nm. Đối với phương pháp A, xác định hàm lượng aflatoxin B 1 trên các chấm của dịch chiết bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang của vết dịch chiết với cường độ huỳnh quang của các vết dung dịch chuẩn và đối với phương pháp B xác định hàm lượng aflatoxin B 1 của vết dịch chiết bằng cách so sánh cường độ huỳnh quang của vết dịch chiết với cường độ huỳnh quang của các vết dung dịch chuẩn C, D và E. 8.7. Khẳng định sự có mặt của aflatoxin B 1. Khẳng định sự có mặt của aflatoxin B 1 trong dịch chiết bằng thử nghiệm dự đoán với axit sunfuric (xem 8.7.1) và nếu kết quả của phép thử này là dương tính thì tiến hành thí nghiệm thực tế (8.7.2). Nếu kết quả phép thử với axit sunfuric là âm tính thì không cần tiến hành thí nghiệm và trong trường hợp này khẳng định không có aflatoxin B 1 . 8.7.1. Thử nghiệm dự đoán bằng axit sunfuric Phun dung dịch axit sunfuric (5.13) lên bản sắc ký ở 8.5.1 hoặc ở 8.5.2. Huỳnh quang của các vết aflatoxin B 1 sẽ chuyển từ màu xanh da trời sang màu vàng dưới ánh sáng tử ngoại. 8.7.2. Thí nghiệm khẳng định: Sự tạo thành aflatoxin B 1 – hemiaxetal (aflatoxin B 2a ) Trong trường hợp đơn giản và chỉ với những thức ăn có màu nhạt thì dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng một chiều được mô tả ở 8.7.2.1. Trường hợp những thức ăn có màu đơn, những thức ăn hỗn hợp hoặc những thức ăn có sự nghi ngờ thì dùng phương pháp sắc ký mỏng hai chiều được mô tả ở 8.7.2.2. 8.7.2.1. Sắc ký lớp mỏng một chiều Kẻ một đường thẳng trên bản sắc ký (6.7) để chia bản thành hai phần bằng nhau. Chấm lên mỗi phần, cách cạnh đáy 20mm và cách vạch phân chia 15mm các thể tích dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 và dịch chiết như sau: - 25 m l dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 (5.14) - Một thể tích dịch chiết ở 8.4.2 chứa khoảng 2,5 ng aflatoxin B 1 . - 25 m l dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 (5.14) và chấm chồng lên nó một thể tích dịch chiết ở 8.4.2 chứa khoảng 2,5 ng aflatoxin B 1 . Chọn một trong hai phần, chấm chồng lên những điểm trước 1 đến 2 m l axit trifluoroaxetic (5.11). Sấy nhẹ để làm khô các vết ở nhiệt độ phòng. Chạy sắc ký ở chỗ tối dùng một trong các dung môi khai triển (5.6). Tiến hành lựa chọn dung môi trước khi chạy sắc ký. Hệ dung môi phải đảm bảo aflatoxin B 1 – hemiaxetal (aflatoxin B 2a ) được tách hoàn toàn ra khỏi các chất cản trở. Dung môi chạy khoảng 120mm. Để dung môi bay hơi ở chỗ tối, sau đó phun axit sunfuric (5.13) lên phần bản không chấm axit trifluoroaxetic. Kiểm tra bản sắc ký dưới đèn tử ngoại. Khẳng định sự có mặt của aflatoxin B 1 nếu: a. Giá trị R f của aflatoxin B 1 của dịch chiết tương tự với giá trị R f của aflatoxin B 1 của dung dịch chuẩn; b. Cường độ huỳnh quang của aflatoxin B 1 của dung dịch chuẩn chấm chồng lên dịch chiết phải mạnh hơn cường độ huỳnh quang của aflatoxin B 1 của dịch chiết. Vì các vết huỳnh quang của dịch chiết có cùng giá trị R f với vết huỳnh quang của aflatoxin B 1 – hemiaxetal có thể dẫn đến sự nhầm lẫn qua việc đọc sắc phổ, chính vì vậy ta phải kiểm tra sự có mặt của chúng trên phần được xử lý bằng axit sunfuric. Trong trường hợp không khẳng định được chính xác thì phải sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hai chiều (8.7.2.2). 8.7.2.2. Sắc ký lớp mỏng hai chiều (xem hình 3) 8.7.2.2.1. Chấm các dung dịch Kẻ hai đường thẳng trên bản sắc ký (6.7) giao nhau và song song với hai cạnh của bản (cách mỗi cạnh 60mm) để giới hạn sự di chuyển của dung môi. Dùng pipet mao quản hoặc micro xi-ranh chấm các dung dịch sau lên bản sắc ký: - Tại điểm A: Một thể tích dịch chiết lấy từ mẫu được làm sạch ở 8.4.2 chứa khoảng 2,5ng aflatoxin B 1 và một giọt (1 đến 2 m l) axit trifluoroaxetic (5.11). - Tại điểm B và C: 25 m l dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 (5.14) và một giọt axit trifluoroaxetic (5.11). Làm khô bằng dòng không khí nóng ở nhiệt độ phòng. 8.7.2.2.2. Chạy sắc ký Chạy sắc ký theo chiều I ở chỗ tối, sử dụng dung môi khai triển (5.6.2) (lớp dung môi khoảng 1cm trong bình chưa bão hòa) đến khi dung môi tiến tới đường giới hạn. Lấy bản sắc ký ra khỏi bình, để khô chỗ tối ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó chạy sắc ký theo chiều II ở chỗ tối, sử dụng dung môi khai triển (5.6.1) (lớp dung môi khoảng 1cm trong bình chưa bão hòa) đến khi dung môi tiến tới đường giới hạn. Lấy bản sắc ký ra khỏi bình, để khô chỗ tối ở nhiệt độ phòng. 8.7.2.2.3. Giải sắc phổ Kiểm tra sắc phổ dưới ánh sáng tử ngoại (6.8) ở những điểm sau: a. Xuất hiện vết huỳnh quang màu xanh da trời của aflatoxin B 1 – hemiaxetal và đôi khi vết huỳnh quang màu xanh da trời nhạt của aflatoxin B 1 không phản ứng với axit trifluoroaxetic, các vết này là của dung dịch chuẩn chấm ở điểm C (di chuyển theo hướng I) và của điểm B (di chuyển theo hướng II); b. Xuất hiện các vết tương tự như các vết mô tả ở (a) là của dịch chiết chấm ở điểm A. Vị trí của những vết này được xác định nhờ các vết của dung dịch chuẩn chấm tại điểm B và C. 8.8. Số phép xác định Tiến hành hai phép xác định trên cùng mẫu thử nghiệm. 9. Biểu thị kết quả 9.1. Cách tính và công thức 9.1.1. Xác định bằng mắt Hàm lượng aflatoxin B 1 tính bằng m g/kg mẫu, được tính theo công thức: Trong đó: C: Là nồng độ dung dịch chuẩn (5.14), tính bằng m g/ml (khoảng 0,1 m g/ml); m: Là khối lượng của phần mẫu thử tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột, tính bằng gam (10,0g) V 1 : Là thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, tính bằng microlit; V 2 và V 3 : Là thể tích dịch chiết và thể tích dung dịch chuẩn aflatoxin B 1 (5.14) chấm lên bản mỏng có cường độ phát huỳnh quang giống nhau, tính bằng microlit; 9.1.2. Đo bằng máy đo cường độ huỳnh quang ( m g) Hàm lượng aflatoxin B 1 tính bằng m /kg mẫu, được tính theo công thức: Trong đó: m: Là khối lượng của phần mẫu thử tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột, tính bằng gam (10,0g) m 1 : Là hàm lượng aflatoxin B 1 của vết chấm dịch chiết (kể cả thể tích V 2 ), tính bằng nanogam; V 1 : Là thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, tính bằng microlit; V 2 : Là thể tích của dịch chiết mẫu chấm lên bản mỏng (10 hoặc 20 m l), tính bằng microlit; 9.2. Độ chính xác Ba lần kiểm tra chéo, hai trong ba lần kiểm tra được tiến hành ở cấp quốc tế (Nos.1 và 2) trên thức ăn chăn nuôi hỗn hợp (phương pháp B) cho ta kết quả trong bảng dưới đây: 11 phòng thí nghiệm tham gia thử nghiệm lần 2 phân tích theo phương pháp A trên mẫu giống nhau định lượng bằng mắt hoặc bằng máy đo cường độ huỳnh quang đều cho kết quả tương tự với kết quả tiến hành theo phương pháp B. 10. Báo cáo kết quả Báo cáo kết quả cần ghi rõ phương pháp đã sử dụng (A hoặc B), phương pháp xác định (bằng mắt hoặc bằng máy đo cường độ huỳnh quang) và kết quả thu được. Báo cáo cũng phải đề cập chi tiết về các thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này hoặc được phép lựa chọn cùng với các chi tiết của bất kỳ yếu tố nào có thể ảnh hưởng đến kết quả. Báo cáo phải bao gồm tất cả các thông tin cần thiết để nhận biết toàn diện về mẫu thử. Thông số Mẫu 1 2 3 Số phòng thí nghiệm 23 11 13 Giá trị trung bình 162,7 m g/kg 25,4 m g/kg 13,4 m g/kg Độ lệch chuẩn của độ lặp lại (S r ) 16,9 m g/kg 2,7 m g/kg 1,7 m g/kg Hệ số biến đổi của độ lặp lại 10% 11% 13% Độ lặp lại (2,83S r ) 47,8 m g/kg 7,6 m g/kg 4,8 m g/kg Độ lệch chuẩn của độ tái lập do các phòng thử nghiệm khác nhau xác định (S R ) 45,2 m g/kg 6,8 m g/kg 4,0 m g/kg Hệ số biến đổi của độ tái lập 28% 27% 30% Độ tái lập (2,83S R ) 128,0 m g/kg 19,2 m g/kg 11,3 m g/kg Kích thước, tính bằng milimét Hình 1 – Chấm các dung dịch Kích thước, tính bằng milimét Hình 2- Giải sắc đồ Kích thước, tính bằng milimét Hình 3- Thử khẳng định 1) Các dung môi chứa trong bình có nắp kín. Khi yêu cầu dùng bình bão hòa có nghĩa là những bình này được lót giấy lọc xung quanh phía trong thành bình và làm cho trong bình bão hòa hơi dung môi. 1) Tham khảo ISO 565 Sàng thử nghiệm lưới dệt bằng sợi kim loại, tấm được đục lỗ và tấm đúc bằng điện. Kích thước danh nghĩa của lỗ.