TCVN8710-2:2011

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8710-2:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 2: bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-2:2011 BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 2: BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ BIỂN Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 2: Viral nervous necrosis (VNN) disease in marine fish Lời nói đầu TCVN 8710-2:2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Pháttriển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượngthẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. TCVN 8710-2:2011 BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 2: BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ BIỂN Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 2: Viral nervous necrosis (VNN) disease in marine fish CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn, sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh (VNN) ở cá biển. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây: Bệnh hoại tử thần kinh trên cá biển (viral nervous necrosis disease in marine fish) Bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây ra bởi vi rút thuộc giống Betanodavirus họ Nodaviridae. Khi cá bịcảm nhiễm, vi rút có kích thước nhỏ 25 nm đến 30 nm, không có màng bao, cấu trúc di truyền là ARNchuỗi đơn (+ARN). CHÚ THÍCH: Hiện nay có 4 kiểu gen Betanodavirus gây bệnh VNN, được phân loại thành: SJNNV (striped jack nevousnecrosis virus), TPNNV (tiger puffer nervous necrosis virus), RGNNV (red-spotted grouper nervous necrosis virus) và BFNNV (barfin flounder nervous necrosis virus). 3. Phương pháp chẩn đoán 3.1 Chẩn đoán lâm sàng 3.1.1 Dịch tễ học Hiện nay, đã có khoảng 30 loài cá biển thuộc 16 họ nhiễm VNN. Vi rút gây bệnh VNN ngoài lây truyền theo chiều dọc (từ mẹ sang con) còn có thể lây truyền theo trục ngang như qua dòng nước, lây truyền từ cá thể bị bệnh sang cá thể khỏe mạnh trong cùng một bể, chúng có thể lây lan qua các dụng cụ vận chuyển cá và các sản phẩm từ cá bị nhiễm vi rút từ nơi này đến nơi khác. Ở Việt Nam hiện nay bệnh VNN có gần như quanh năm và bùng phát mạnh từ tháng 5 đến tháng 10, đặc biệt khi mưa nhiều. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của bệnh là 25 ºC đến 30 ºC, tỷ lệ chết lên đến 100 %. 3.1.2 Triệu chứng lâm sàng Dấu hiệu bệnh lý điển hình của cá nhiễm VNN là các biểu hiện thần kinh như: bơi lội không bìnhthường (bơi vòng tròn, bơi ngửa, bơi hỗn loạn không định hướng…), bỏ ăn, da tối màu, trương bóng hơi và tỷ lệ chết lớn. Cơ quan đích của Betanodavirus thường xuất hiện mô não và võng mạc cá bị bệnh. Giai đoạn cấp tính thường xuất hiện tại các trại ương giống ấu trùng (từ 10 ngày tuổi đến 25 ngày tuổi). Cá giống bỏ ăn, cá chết rải rác, bơi không bình thường, bơi lội mạnh không định hướng, đầu lao xuống dưới. Cá chết và hấp hối hầu hết bóng hơi trương phồng, có sự xung huyết trong. Cá bệnh hoạt động yếu đầu treo trên mặt nước hoặc nằm dưới đáy bể hoặc đáy lồng. Triệu chứng tăng dần khi cả quần đàn nhiễm bệnh. Cá chết sau khoảng từ 3 ngày đến 5 ngày sau khi có dấu hiệu bệnh. Trong lồng, cá lớn (trên 150 g) bị bệnh VNN có ít triệu chứng hơn và tỷ lệ chết giảm. Cá thườngchuyển màu đen và bơi chậm chạp với bóng hơi trương phồng và có thể hoặc không có vết bệnh ở đầu. Giải phẫu cơ quan nội tạng bình thường và ruột không có thức ăn. 3.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 3.2.1 Phương pháp RT PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) 3.2.1.1 Nguyên tắc Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) dựa trên hoạt động của ADN polymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham gia của mồi, bốn loại nucleotit gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (dCTP), dùng để khuếch đại đoạn ADN đích thông qua các chu kì luân nhiệt. Để thực hiện phản ứng khuếch đại ADN đích cần có 3 quá trình: biến tính, bắt cặp và kéo dài mạch tổng hợp mạch mới. RT PCR là phương pháp PCR mà nucleic axit đích là ARN. Để có thực hiện được PCR này thì trước hết ARN đích phải được phiên mã ngược (RT- reverse transcription) thành cADN bằng mồi đặc hiệu cho phản ứng này. Giai đoạn phiên mã ngược RT, enzym được sử dụng là Reverse Transcriptase. Đây là một loại enzym không chịu nhiệt, sử dụng mạch ARN là mạch khuôn để tổng hợp nên sợi ADN bổ sung (cADN) có sự tham ra của mồi, dNTP và dung dịch đệm cho phản ứng. Có hai phương pháp thực hiện RT PCR, đó là RT PCR một bước và RT PCR hai bước. Trong quytrình này, phương pháp PCR một bước được thực hiện khuếch đại ARN đích. 3.2.1.2 Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước cóđộ tinh khiết tương đương không có ARNase, trừ khi có quy định khác. - Trizol; - Cloroform; - Isopropanol; - Cồn 75 % và 95 %; - Dung dịch TBE 1 X Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA 10X): Hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 mL nước. Thêm 40 mL EDTA 0,5 M và thêm nước cho đủ 1 lít. Hấp vô trùng ở 121oC trong 15 min, bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khi sử dụng, thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc (10X) thành dung dịch TBE 1X. - Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 mL nước, chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH nồng độ 4 M. Thêm nước cho đủ 500 ml. Hấp vô trùng ở 121 oC trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Dung dịch DEPC Dung dịch di-etypyrocacbonat 0,1 % thể tích, lắc trộn đều khoảng 10 min. Sau đó để qua đêm trong bình kín, nới lỏng nắp và hấp khử trùng ở 121 C trong 15 min, bảo quản ở nhiệt độ -20 C. - Dung dịch TE (Tris - EDTA) Chuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1 mM, dùng HCl để chỉnh pH 7,6. - Dung dịch TBE 1X hoặc TAE 1X Thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TAE gốc (10X) hoặc dung dịch TBE gốc (10X). - AMV RT(Reverse Transcriptase); - Hỗn hợp phản ứng RT-PCR; - Dung dịch đệm tải mẫu ADN đậm đặc 6 lần (loading dye 6X); - Thang chuẩn ADN (ADN marker) gồm có các thang 100 bp; 200 bp; 300bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp; 1500 bp; - Etidi bromua (EtBr); - Gel agarose; 3.2.1.3 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau: - Tủ lạnh. - Tủ lạnh âm sâu, có thể hoạt động ở nhiệt độ -20 ºC; - Máy li tâm, có thể hoạt động với vận tốc 13000 r/min. - Máy lắc trộn; - Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg; - Đèn cồn; - Khay hay hộp để đựng đá lạnh; - Micropipet đơn kênh có dải từ 0,5 µl đến 10 µl, từ 2 µl đến 20 µl, từ 10 µl đến 100 µl, từ 100 µl đến 1000 µl; - Giá eppendorf có kích thước 0,2 ml và 1,5 ml; - Bộ kéo panh vô trùng, chày nghiền mẫu, bút đánh dấu, sổ ghi chép; - Hộp đựng giấy thấm lau tay, gang tay, khẩu trang; - Hộp đựng đầu típ micropipet các loại; - Máy PCR; - Bếp điện hoặc lò vi sóng; - Ống đong, dung tích 100 ml; 500 ml; 1000 ml; - Bình nón chịu nhiệt, dung tích 250 ml; - Bộ điện di gồm bộ nguồn và máng chạy điện di; - Buồng đổ gel; - Bàn đọc gel (UV); - Giấy parafin. 3.2.1.4 Lấy mẫu Cá bột: lấy cả con (20 con). Cá giống: 1 con đến 5 con, lấy phần trước của đầu (20 con). Cá lớn: lấy não, mắt, trứng hoặc sẹ. Lượng mẫu lấy để tách chiết ARN khoảng 20 mg, có thể dùng cá còn sống, tiến hành làm ngay hoặc mẫu cố định trong cồn 95 % để làm sau đó. 3.2.1.5 Cách tiến hành 3.2.1.5.1 Tách chiết ARN CHÚ THÍCH: Có rất nhiều quy trình tách chiết ARN từ mô động vật theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hiện nay có rất nhiều các thuốc thử và bộ kít thương mại hữu ích cho việc tách chiết ARN…). Người sử dụng có thể lựa chọn bộ kít thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phương pháp tách chiết ARN bằng trizol: Cho 20 mg mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml. Nếu mẫu được cố định trong cồn 95 %, cần làm khô cồn bằng cách đổ cồn và dốc ngược trên tờ giấy lọc, để khô tự nhiên. Cho vào ống Eppendorf có chứa mẫu khoảng 100 µl đến 200 µl dung dịch trizol (lượng mẫu không quá 10 % trizol). Nghiền nhỏ và mịn bằng chày nghiền, sau đó thêm vào khoảng 550 µl đến 650 µl dung dịch trizol và nghiền tiếp đến khi nhuyễn. Giữ ở nhiệt độ phòng đến 5 min. Ly tâm 12000 r/min trong thời gian 10 min, sau đó chuyển dịch trong sang ống Eppendorf mới, nhỏ thêm 200 µl cloroform/1 ml trizol. Lắc cẩn thận bằng tay trong 15 s. Ủ 15 oC đến 30 oC từ 2 min đến 3 min. Ly tâm 12000 r/min từ 2 oC đến 8 oC trong 15 min, sau đó chuyển phần trong phía trên sang ốngEppendorf 1,5 ml mới. Thêm 500 µl dung dịch isopropanol/1 ml trizol, ủ ở 15 oC đến 30 oC trong 10 min. Ly tâm 12000 r/min tại 4 oC trong 10 min, sau đó rút bỏ isopropanol. Rửa phần viên bằng etanol 75 %; 1 ml etanol 75 %/1 ml trizol. Trộn đều bằng máy vortex và ly tâm ở 7500 r/min trong 5 min ở 4 oC, sau đó rút bỏ etanol. Làm khô phần viên. Hòa tan ARN bằng nước tinh khiết hoặc DEPC (dietyl pyrocarbonat) với lượng khoảng từ 50 µl đến 100 µl tùy thuộc vào lượng ARN tách chiết được. CẢNH BÁO AN TOÀN: Việc tách chiết ARN sử dụng hoá chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hoá chất này. Luôn luôn đeo gang tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này. 3.2.1.5.2 Tiến hành phản ứng RT PCR 3.2.1.5.2.1 Cặp mồi ngoài sử dụng trong phản ứng RT PCR Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy luân nhiệt theo phương pháp RT PCR một bước, sử dụng cặp mồi khuếch đại đoạn gen vùng T4 mã hoá protein vỏ của chủng SSJNNV. R3: 5'-CGA-GTC-AAC-ACG-GGT-GAA-GA-3' F2: 5'-CGT-GTC-AGT-CAT-GTG-TCG-CT-3' Chuẩn bị mồi: - Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm ngắn để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/µL làm gốc. - Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 pmol/µL: pha loãng mồi gốc bằng nước không có nuclease (10 µl mồi gốc và 90 µl nước). Tùy theo điều kiện phòng thí nghiệm chọn lựa hỗn hợp Mix phản ứng cho phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng theo số mẫu chẩn đoán, cộng thêm một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm, trộn chung vào một ống Eppendorf. Sau đó hút 22,5 µl hỗn hợp phản ứng vào ống Eppendorf 0,2 ml. Ghi kí hiệu mẫu lên nắp ốngEppendorf, chứng dương và chứng âm. 3.2.1.5.2.3 Hỗn hợp phản ứng RT PCR một bước Thêm 2,5 µl ARN mạch khuôn (tách chiết được) vào ống PCR chứa sẵn 22,5 µl hỗn hợp phản ứng RT PCR để thu được 25 µl hỗn hợp có thành phần như sau: dNTP mỗi loại có nồng độ 1 mM; mồi R3 có nồng độ 0,5 µM pmol; mồi F2 có nồng độ 0,1 µM pmol; dung dịch đệm cho phản ứng RT PCR; ADN polymerase chịu nhiệt (0,625 U); enzym phiên mã ngược AMV reverse transcriptase (2,5 U); Nhiều hỗn hợp phản ứng thương mại có chứa sẵn các thành phần cho tổng hợp ADN từ ARN. Ví dụ hỗn hợp phản ứng sử dụng Mix RT PCR độ đậm đặc 2 lần (2X), có thành phần: Tfl ADN polymerase, dNTP, magie sulfat và dung dịch đệm phản ứng, enzym phiên mã ngược AMV RT. Bảng 1 - Ví dụ về hỗn hợp phản ứng RT PCR Thành phần Thể tích cho 1 mẫu, µl Nồng độ cuối cùng RT PCR Master Mix, 2X 12,5 1 X Mồi F2 0,125 (20 µM) 0,1 µM Mồi R3 0,625 (20 µM) 0,5 µM ARN mạch khuôn 2,5 AMV RT(Reverse Transcriptase) (5 U) 0,5 Nước 8,45 Bảng 2 - Chu kì luân nhiệt của phản ứng RT PCR Bước Nhiệt độ/thời gian Số chu kỳ Tạo cADN 45 oC/45 min Biến tính 94 oC/2 min 35 chu kỳ Biến tính 94 oC/40 s Kéo dài mạch 55 oC/40 s Kéo dài mạch 72 ºC/40 s 72 ºC/5 min Giữ ổn định 4 ºC Giữ ổn định CHÚ Ý: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng. CẢNH BÁO: Do bản chất của ARN là rất dễ bị phân huỷ trong môi trường cũng như enzymARNase tiết ra từ các vi sinh vật, môi trường chai, lọ, thiết bị, dụng cụ và dung dịch. Enzym ARNase rất bền, khó bị phân huỷ bởi nhiệt độ. Vì vậy, tất cả mọi dụng cụ, thiết bị, thuốc thửdùng trong RT PCR phải tuyệt đối vô trùng. 3.2.1.5.3 Chạy điện di 3.2.1.5.3.1 Chuẩn bị bản gel Pha thạch nồng độ từ 1,5 % đến 2 % agarose bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình nón 250 ml, lắc cho tan. Sau đó cho vào lò vi sóng đun đến sôi, đợi đến khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 oC đến 50 oC, cho vào 5 µl ethidi bromua/100 ml. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để ethidi bromua tan đều. Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch vào khuôn. Tiến hành đổ vào bản gel (chú ý không nên đổ bản gel dày quá 0,8 cm). Khi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel. Chuyển bản gel vào máng điện di, đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch đã đun agaroza) vào máng điện di cho tới khi ngập bản gel. 3.2.1.5.3.2 Điện di Hút 10 µl sản phẩm PCR nhỏ vào một giếng trên bản gel. Khi thực hiện điện di, chạy kèm theo AND marker để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang ADN vào một giếng trên bản gel. Điện di ở hiệu điện thế 100 volt đến 150 volt (quan sát thấy bóng khí nổi lên từ hai phía điện cực của máy điện di sau khi nối điện). Khi quan sát thấy màu xanh đậm của thuốc nhuộm cách giếng khoảng 2/3 chiều dài bảng thạch agaroza, dừng quá trình điện di. CHÚ Ý: Trong trường hợp Master Mix không có sẵn đệm tải mẫu thì khi tiến hành điện di nhỏ 2 µl loading dye 6X lên giấy parafin, hút 10 µl sản phẩm PCR ra, nhỏ vào và trộn đều, sau đó lấy khoảng 10 µl nhỏ vào một giếng trên bản gel. 3.2.1.5.4 Đọc kết quả Sau khi điện di xong, đọc kết quả trên bàn đọc UV, đọc kết quả với tia UV bước sóng 302 nm. Đối chiếu các vạch sáng của mẫu với các vạch sáng từ thang ADN, mẫu kiểm chứng dương tính và mẫu kiểm chứng âm tính để đưa ra kết luận. Bảng 3 Giếng Vạch 427 bp Kết quả Thang ADN Các vạch sáng rõ ràng Điện di tốt Mẫu kiểm chứng âm tính Không Không ngoại nhiễm Có Bi ngoại nhiễm Mẫu kiểm chứng dương tính Có Hỗn hợp phản ứng RT-PCR tốt Không Mẫu kiểm chứng dương tính hỏng hoặc enzym hỏng Mẫu thử Có Dương tính với VNN Không Âm tính với VNN Kết quả mẫu thử dương tính khi: Xuất hiện vạch sáng có kích thước bằng kích thước giống mẫu đối chứng dương có kích thước 427 bp, thang ADN phân vạch rõ ràng, mẫu đối chứng âm không có vạch sáng. Kết quả mẫu thử âm tính khi không có vạch sáng kích thước 427 bp. Không có vạch sáng của mẫu đối chứng âm tính, có vạch sáng mẫu đối chứng dương tính. Thang ADN phân vạch rõ ràng. 3.2.2 Phương pháp mô học 3.2.2.1 Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước cóđộ tinh khiết tương đương không có ARNase, trừ khi có quy định khác. - Dung dịch Bouin (xem A.1); - Dung dịch formalin 10 % (có bổ sung 2 % muối) (xem A.2); - Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.3); - Thuốc nhuộm eosin (xem A.4); - Cồn 70 %, 75 %, 90 % và cồn tuyệt đối; - Parafin; - Xylen; - Keo dán, ví dụ Bom Canada. 3.2.2.2 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh và cụ thể như sau: - Kính giải phẫu. - Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen. - Lọ nhỏ cố định mẫu. - Bình rót parafin. - Bộ phận làm lạnh mẫu. - Máy cắt mẫu microtome. - Nồi nước có chỉnh nhiệt độ. - Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu. - Kính hiển vi quang học. - Cassete. - Khung đúc mẫu. 3.2.2.3 Lấy mẫu Thu những mẫu cá có dấu hiệu không bình thường, Cá giống bỏ ăn, cá chết rải rác, bơi không bìnhthường, bơi lội mạnh không định hướng, đầu lao xuống dưới. Không dùng cá chết hoặc cá bảo quảnđá để cắt mô. 3.2.2.4 Cách tiến hành 3.2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu Đối với cá lớn lấy phần đầu hoặc não, mắt cắt thành những lát mỏng (0,5 cm) trước khi ngâm trongdung dịch cố định formalin 10 % (có bổ sung 2 % muối) hoặc dung dịch Bouin ở nhiệt độ phòng. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10, ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó chuyển sang dung dịch bảo quản là cồn 70 %. Đối với cá bột có thể cố định cả con, cá giống lấy phần đầu hoặc não, mắt ngâm trong dung dịch cố định từ 12 h đến 24 h. Sau đó cố định trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng. 3.2.2.4.2 Khử mẫu cố định Ngâm trong cồn 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong cồn tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. 3.2.2.4.3 Làm trong mẫu Ngâm sang lọ xylen 1 để trong 30 min đến 60 min. Ngâm sang lọ xylen 2 để trong 30 min đến 60 min. Sau đó ngâm tẩm parafin hai lần, mỗi lần 56 ºC đến 58 ºC trong 1 h. Đúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắtđược tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh. 3.2.2.4.4 Cắt mẫu Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá. Đặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 µm đến 5 µm. Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước từ 30 ºC đến 35 ºC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô. 3.2.2.4.5 Nhuộm tiêu bản H&E Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượt trong cồn tuyệt đối, cồn 90 % và cồn 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min. Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min. Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ cồn 75 %, cồn 90 % và cồn tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, vídụ Bom Canada. Để khô và soi kính. 3.2.2.4.6 Đọc kết quả Soi tiêu bản từ độ phóng đại thấp đến độ phóng đại cao. Tổ chức não và mắt của cá bị bệnh xuất hiện nhiều không bào màu trắng và xám có đường kính từ 5 µm đến 10 µm. Trong mô não và mắt cá cũng tồn tại hiện tượng hoại tử, sự xâm nhập của các tế bào máu vào các vùng mô bị hoại tử. 4. Kết luận Cá được xác định nhiễm bệnh VNN khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng và kết quả dương tính thu được từ một trong hai phương pháp sau: - Phản ứng RT PCR phát hiện vi rút dương tính; - Mẫu cắt mô có bệnh tích của vi rút VNN. PHỤ LỤC A (Quy định) THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH THUỐC THỬ A.1 Dung dịch Bouin: Axit picric (dung dịch bão hoà): 750 ml Formalin (formaldehyd 37 %) : 250 ml Axit axetic đậm đặc: 50 ml A.2 Dung dịch formalin 10 % (có bổ sung 2 % muối) Formalin (formaldehyd 37 %): 100 ml Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4): 6,5 g Natri hydro phosphat (NaH2PO4): 0,4 g Natri clorua (NaCl): 20 g Nước: 900 ml A.3 Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin - Mayer) Hematoxylin dạng tinh thể: 1 g Natri iodat: 0,2 g Amoni alum [NH4Al(SO4)2] hoặc kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g Axit axetic: 1 g Cloral hydrat: 50 g Nước: 1000 ml Hoà tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni alum hoặc kali alum, hoà tan, tiếp tục cho axit axetic và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc. Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu. A.4 Thuốc nhuộm eosin Eosin Y: 1 g Cồn 70 %: 1 lít Axit axetic băng: 5 ml Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào cồn 70 %. Hoà tan eosin trong cồn, sau đó cho thêm axitaxetic rồi lọc qua giấy lọc. Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bùi Quang Tề và cộng sự. 1998., Bệnh học thủy sản. [2] Danayadol, Y., Direkbusarakom, S. and Supamattaya, K., 1995. Viral nervous necrosis in brownspotted grouper, Epinephelus malabaricus, cultured in Thailand. In: Diseases in Asian Aquaculture II, M. Shariff, [3] Frerichs G.N., Tweedie A.; Starkey W.G.; Richards R.H., 2000. Temperature, pH, and electrolyte sensitivity, and heat, UV and disinfectant inactivation of sea bass (Dicentrarchus labrax) neuropathy nodavirus. Aquaculture. 185: p. 13-24. [4] Fukuda, Y., Nguyen, H.D., Furuhashi, M., Nakai, T., 1996. Mass mortality of cultured sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus, associated with viral nervous necrosis. Fish Pathology. 31: p. 165-170 [5] Iwamoto, T., Nakai, T., Mori, K., Arimoto, M., Furusawa, I., 2000. Cloning of the fish cell line SSN-1 for piscine nodaviruses. Diseases of Aquatic Organisms. 43: p. 81- 89. [6] Johansen, R., Grove, S., Svendsen, A.K., Modahl, I., Dannevig, B.H, A., 2004. Sequential study of pathological findings in Alantic halibut, Hippoglossus hippoglossus (L.), throughout one year after an acute outbreak of viral encephalopathy and retinopathy. Journal of Fish Diseases. 27: p. 327-341. [7] Mladineo, I., 2003. The immunohistochemical study of nodavirus changes in larval, juvenile and adult sea bass tissue. Journal Applied Ichthyology. 19: p. 366-370. [8] Mori, K., Mangyoku, T., Iwamoto, T., Arimoto, M., Tanaka, S., Nakai, T., 2003. Serological relationships among genotypic variants of Betanodavirus. Diseases of Aquatic Organisms. 57: p. 19-26. [9] Munday, B.L., Kwang, J., Moody, N., 2002. Betanodavirus infections of teleost fish: a review. Journal of Fish Diseases, 25: 127-142. [10] Nishizawa, T., K. Mori, T. Nakai, I. Furusawa, and K. Muroga. 1994. Polymerase chain reaction (PCR) amplification of RNA of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV). Dis. Aquat. Org. 18:103-107. [11] Nishizawa, T., Furuhashi, M., Nagai, T., Nakai, T., Muroga, K., 1997. Genomic classification of fish nodaviruses by molecular phylogenetic analysis of the coat protein gene. Applied and Environmental Microbiology. 64: p. 1633-1636 [12] Sohn, S.G. and Park, M.A., 1998. Viral diseases of cultured marine fish and shrimp in Korea. Fish Pathology. 33 : p. 189-192. [13] Tanaka, S., Takagi, M., Miyazaki, T.,2004. Histopathological studies on viral nervous necrosis of sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus Thunburg, at the grow-out stage. Journal of Fish Diseases. 27: p. 385-399. [14] Toyohiko Nishizawa, Koh-ichiro Mori, Toshihiro Nakail, Iwao Furusawa, Kiyokuni Muroga. 1994. Polymerase chain reaction (PCR) amplification of RNA of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV). Dis. aquat. Org., 18: p. 103-107. [15] Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals, 2006. Viral encephalopathy and retinopathy