TCVN11039-5:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11039-5:2015 về Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật - Phần 5: Phát hiện Salmonella TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 11039-5:2015 PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 5: PHÁT HIỆN SALMONELLA Food aditive - Microbiologica l analyses - Part 5: Detection of salmonella Lời nói đầu TCVN 11039-5:2015 được xây dựng tr ê n cơ sở tham khảo JECFA 2006 , Combined compen d ium o f food additive speci fi cations, Volume 4: Analytical methods, test procedures and laboratory solutions used by and re f erenced in the food additive specitications ; TCVN 11039-5:2015 d o Ban kỹ thuật tiêu chu ẩ n TCVN/TC/F4 Gia vị và phụ gia thực phẩm biên soạn, Tổng cục Ti ê u chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố; Bộ tiêu chuẩn TCVN 11039 Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật g ồ m các phần sau: - TCVN 11039-1:2015, Phần 1: X á c định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật đếm đĩa; - TCVN 11039-2:2015, Phần 2: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu kh í bằng kỹ thuật đếm đĩa xoắn; - TCVN 11039-3:2015, Phần 3: Phát hiện và định lượng coli f orm và E. coli bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nh ấ t (Phương pháp chuẩn); - TCVN 11039-4:2015, Phần 4: Phát hiện và định lượng coli f orm v à E. coli bằng kỹ thuật đếm s ố có xác suốt lớn nh ấ t (Phương pháp thông dụng); - TCVN 11039-5:2015, Phần 5: Phát hiện Salmonella; - TCVN 11039-6:2015, Phần 6: Ph á t hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm khu ẩ n lạc; - TCVN 11039-7:2015, Phần 7 : Phát hiện v à định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm số có x á c suất lớn nhất (MPN); - TCVN 11039-8:2015, Phần 8: Định lượng nấm men và nấm mốc . PHỤ GIA THỰC PH Ẩ M - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 5: PHÁT HIỆN SALMONELLA Food a d ditive - Microbiologica l analyses - Part 5: Detection of Salmonella 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chu ẩ n này quy định phương pháp phát hiện Salmonella trong phụ gia thực phẩm. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công b ố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi. AOAC 967.28 Salmonella in foods. Serological tests (Salmonella trong thực phẩm. Phép th ử huyết thanh) AOAC 978.24 Salmonella spp. in foods. Biochemical identi f ication kit method (Salmonella spp. trong thực phẩm. Phương pháp nhận diện bằng kit sinh hóa) AOAC 989.12 Salmonella spp., Escherichia coli, and other Enterobacteriaceae in foods. Biochemical identification k i t method (Salmonella spp., Escherichia coli và các vi khuẩn Enterobacteriaceae khác trong thực phẩm. Phương pháp nhận diện bằng kit sinh hóa) AOAC 991.13 Salmonella, Escherichia coli, and other Enterobacteriaceae in foods. Biochemical system identi fi cation (Vitek GNI+) screening method [ Salmonella, Escherichia coli và các vi khuẩn Enterobacteriaceae khác trong thực phẩm. Phương ph á p sàng lọc nhận diện bằng hệ sinh hóa (Vitek GNI+) ] AOAC 994.04 Salmonella in dry foods. Re f rigerated pre-enrichment and selective enrichment broth culture methods (Salmonella trong thực ph ẩ m dạng khô. Phương pháp sử dụng tiền tăng sinh lạnh đông và canh thang tăng sinh chọn lọc) 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chu ẩ n này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 3.1 Salmonella (Salmonella) Các vi sinh vật h ì nh thành khu ẩ n lạc điển hình hoặc khuẩn lạc không điển h ì nh tr ê n môi trường đặc chọn lọc và có những đặc điểm về sinh h óa và huyết thanh như được mô tả khi tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn này. 3 Nguyên tắc Quy trình phát hiện Salmonella cần qua bốn giai đoạn kế tiếp nhau: a) Tăng sinh sơ bộ trong môi trường lỏng không chọn lọc (canh thang lactose hoặc môi trường thích hợp khác), ủ 24 h ± 2 h ở 35 ° C . b) Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc (môi trường Tetrathionat, môi trường Rappaport- Vassiliadis hoặc môi trường th í ch hợp khác), với nhiệt độ và thời gian thích hợp. c) Đổ đĩa và nhận dạng: cấy dịch tăng sinh thu được lên các môi trường đặc chọn lọc (thạch BS, thạch XLD và thạch HE) với nhiệt độ và thời gian thích hợp. d) Khẳng định Salmonella bằng các phép thử sinh h óa v à huyết thanh thích hợp (xem 8.5). 4 Môi trường cấy, dịch pha loãng và thuốc thử 4.1 Canh thang lactose (xem A.1). 4.2 Canh thang selenit cystin (SC) (xem A.2). 4.3 Canh thang tetrathionat (TT) (xem A.3). 4.4 Môi trường Rappaport-Vassiliadis (RV) (xem A.4). 4.5 Thạch xylose lysin desoxycholat (XLD) (xem A.5). 4.6 Thạch Hektoen enteric (HE) ( xem A.6). 4.7 Thạch bismuth sul fi t (BS) (xem A.7). 4.8 Thạch sắt ba đường (TSI) (xem A.8). 4.9 Thạch lysin sắt (LIA) (Ed w ards và Fife) (xem A.9). 4.10 Canh thang trypton (tryptophan) (xem A.10). 4.11 Canh thang trypticase đậu tương-tryptose (xem A.11). 4.12 Canh thang MR-VP (xem A.12). 4.13 Thạch xitrat Simmons (xem A.13). 4.14 Canh thang ure (xem A.14). 4.15 Canh thang ure (chuẩn bị nhanh) (xem A.15). 4.16 Canh thang malonat (xem A.16). 4.17 Canh thang lysin decarboxylase (xem A.17). 4.18 M ô i trường th ử nghiệm tính di động (bán đặc) (xem A.1 8 ). 4.19 Canh thang kali xyanua (KCN) (xem A.19). 4.20 Canh thang cacbohydrat phenol đỏ (xem A.20). 4.21 Canh thang cacbohydrat đỏ t í a (xem A.21). 4.22 Thạch MacConkey (xem A.22). 4.23 Canh thang dịch tim não (BHI) (xem A.23). 4.24 Thạch máu tryptose cơ bản (xem A.24). 4.25 Dung dịch papain, 5 % (khối lượng) (xem A.25). 4.26 Thuốc th ử Kovacs (xem A.26). 4.27 Các thuốc thử Voges-Proskauer (VP) (xem A.27). 4.28 Creatin phosphat tinh thể 4.29 Dung dịch kali hydroxit, 40 % (khối lượng) (xem A.28). 4.30 Dung dịch thuốc nhuộm bromcresol đ ỏ tía , 0,2 % 4.31 Chỉ thị metyl đỏ (xem A.31). 4.32 Dung dịch natri clorua (NaCI), 5 % (khối lượng/thể tích). 4.33 Nước muối sinh lý , 0,85 % (khối lượng/th ể tích) (v ô trùng) (xem A.29). 4.34 Nư ớ c muối sinh lý f ormalin (xem A.3 0 ). 4.35 Dung dịch mannan endo-1,4- betamannosidase (EC 3.2.178), 1,0 % (khối lượng/thể tích) Thêm 1 g mannosidase vào 99 ml nước c ấ t vô trùng. 4.36 Kháng huy ế t thanh Salmonella đa giá (O) 4.37 Kháng huyết thanh Salmonella đa giá (H) 4.38 Các kháng huyết thanh Salmonella đơn giá nhóm (O): A, B, C 1 , C 2 , C 3 , D 1 , D 2 , E 1 , E 2 , E 3 , E 4 , F, G, H, I, Vi, và các nhóm thích h ợp khác 4.39 Các k háng huy ế t thanh Salmonella Spicer-Edwards (H) 4.40 Nước cất vô trùng 5 Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Có thể dùng dụng cụ th ủy tinh sử dụng một lần thay thế cho các dụng cụ th ủy tinh sử dụng nhi ề u lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp. Sử dụng các thiết bị c ủ a phòng thử nghiệm vi sinh và cụ thể là: 5.1 Máy đ ồ ng hóa. 5.2 B ì nh trộn v ô trùng. 5.3 B ì nh nón nắp xoáy , miệng rộng, dung tích 500 ml. 5.4 B ì nh nón , dung tích 500 ml, vô trùng. 5.5 Cốc c ó mỏ , dung tích 250 ml, vô trùng. 5.6 Phễu giấy hoặc ph ễ u thủy tinh vô trùng, có c ỡ phù h ợ p. 5.7 Bộ dàn mẫu , bằng ch ấ t d ẻ o hoặc thủy tinh được uốn một đầu, vô trùng. 5.8 Cân và qu ả cân , có thể cân đến 2000 g, có độ nhạy 0,1 g. 5.9 Cân và quả c â n, có thể cân đến 120 g, có độ nhạy 5 mg. 5.10 Tủ ấm , có thể duy trì nhiệt độ 35 °C ± 2 ° C . 5.11 T ủ ấ m, có chế độ l à m lạnh hoặc tủ lạnh ph ò ng thử nghiệm , có thể duy tr ì nhiệt độ 4 ° C ± 2 ° C . 5.12 Nồi cách thủy , kiểm soát được nhiệt độ ở 49 ° C ± 1 ° C . 5.13 Nồi cách thủy , tuần hoàn, kiểm soát được nhiệt độ ở 43 ° C ± 0,2 ° C . 5.14 Nồi cách th ủ y , tuần hoàn, kiểm soát được nhiệt độ ở 42 ° C ± 0,2 ° C . 5.15 Thìa hoặc dụng cụ thích hợp khác để chuyển các mẫu phụ gia thực ph ẩ m, vô trùng. 5.16 Đ ĩ a c ấ y , vô trùng, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, kích thước 15 mm x 100 mm. 5.17 Pipet vô trùng , c ó thể phân phối 1 ml, chia vạch đến 0,01 ml; có thể phân phối 5 ml và 10 ml, chia vạch 0,1 ml. 5.18 Kim cấy và vòng c ấ y (đường kính trong khoảng 3 mm), nicrom, platin-iridi, dây cromel hoặc ch ấ t d ẻ o vô trùng. 5.19 Ống nghiệm hoặc ống c ấ y vô trùng , kích thước 16 mm x 150 mm và 20 mm x 150 mm; ống huy ế t thanh , kích thước 10 mm x 75 mm hoặc 13 mm x 100 mm. 5.20 Máy trộn Vortex. 5.21 Kéo, dao, kẹp , vô trùng. 5.22 Đèn (để quan sát phản ứng huyết thanh học). 5.23 Đèn Fisher hoặc Bunsen (đèn có đầu đốt sử dụng ga) hoặc đèn cồn . 5.24 Gi ấ y thử pH, có dải pH từ 6 đến 8, chia vạch 0,4 đơn vị pH trên mỗi d ả i màu. 5.25 Máy đo pH 6 Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. M ẫ u không bị hư hỏng hoặc bi ế n đổi trong suốt quá tr ì nh vận chuyển hoặc bảo qu ả n. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn c ụ thể có liên quan đến sản ph ẩ m. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản ph ẩ m thì các bên có l iê n quan nên th ỏa thuận với nhau về vấn đề này. 7 Chuẩn bị mẫu thử M ẫ u được trộn đều để thu được các phần mẫu thử đồng nhất. 8 Cách tiến hành 8.1 Tăng sinh sơ bộ Cân v ô trùng 25 g mẫu, cho vào bình nắp vặn miệng rộng vô tr ù ng dung tích 500 ml (5.3) hoặc vật chứa thích hợp khác. Thêm 225 ml canh thang l actose vô tr ù ng (4.1) và trộn đều, chuẩn b ị về cơ bản theo t ỉ lệ mẫu : canh thang = 1 : 9 (thể tích). Vặn chặt nút bình và để yên 60 min ± 5 min ở nhiệt độ phòng. Trộn kỹ bằng cách xoay và xác định pH bằng giấy thử (5.24). Chỉnh pH nếu cần, đến 6,8 ± 0,2. N ới lỏng nắp bình khoảng 1/4 vòng và ủ 24 h ± 2 h ở 35 ° C trong t ủ ấm (5.10). Trong một s ố trường hợp đặc biệt, việc phân tích mẫu có thể b ị cản tr ở b ở i độ nhớt c ủ a các chất làm dày. Có thể b ổ sung các bước xử lý như sau: - Đối với gum ghatti, bổ sung natri clorua 5 % (4.32) (n ồ ng độ cuối cùng là 0,1 %) vào môi trường t ă ng sinh sơ bộ canh thang lactose, ch ỉ nh pH đến 6,5. - Đối với phân tích getatin, thêm 5 ml dung dịch 5 % papain (4.25) (nồng độ cuối cùng là 0,1 %) vào môi trường tăng s i nh sơ bộ canh thang lactose, trộn kỹ. Vặn chặt nút bình và ủ ở 35 ° C t rong t ủ ấm (5.10) trong 60 min ± 5 min. Trộn bằng cách xoay và ch ỉ nh pH đến 6,8, nếu cần. Nới l ỏ ng bình khoảng 1/4 vòng và ủ 24 h ± 2 h ở 35 ° C trong tủ ấm (5.10). - Đối với carob bean gum và guar gum, cân vô tr ù ng 25 g mẫu cho vào cốc có mỏ vô trùng d ung tích 250 ml (5.5) hoặc vật chứa thích hợp khác. Chu ẩ n bị dung dịch mannan endo-1,4-betamannosidase 1,0 % (4.35). Phân phối vào các chai 150 ml. Dung dịch có thể bảo qu ả n được ở 2 ° C đến 5 ° C trong 2 tuần. Thêm 225 m l canh thang lactose vô trùng và 2,25 ml dung dịch mannosidase 1 % vô trùng vào bình nắp xoáy miệng rộng 500 ml (5.3) hoặc vật chứa thích hợp. Khuấy mạnh canh thang mannosidase/lactose bằng que khuấy từ, đ ồ ng thời đổ nhanh 25 g m ẫ u thử qua phễu thủy tinh vô trùng (5.6) vào canh thang mannosidase/lactose. Vặn chặt nút bình và để yên 60 min ± 5 min ở nhiệt độ phòng. Nới lỏ ng bình và ủ 24 h ± 2 h ở 35 ° C trong tủ ấm (5.10) mà không điều chỉnh pH. 8.2 Tăng sinh chọn lọc 8.2.1 Đối với gum carob bean và gum guar Chuyển 1 ml dịch cấy đã tăng sinh sơ bộ (xem 8.1) v à o 10 ml canh thang SC (4.2) và 1 ml dịch cấy đ ã tăng sinh sơ bộ khác vào 10 ml canh thang TT (4.3). Trộn bằng máy Vortex (5.20). Ủ canh thang SC và canh thang TT trong 24 h ± 2 h ở 35 ° C trong tủ ấ m (5.10). Tiến hành theo 8.2.2 b. 8.2.2 Đ ố i với các mẫu khác Chuyển 0,1 ml dịch cấy đã tăng sinh sơ bộ (xem 8.1) vào 10 ml môi trường RV (4.4) và 1 ml dịch c ấ y đ ã t ă ng sinh sơ bộ khác vào 10 ml canh thang TT (4.3). Trộn bằng máy Vortex (5.20). b) Ủ các môi trường tăng sinh chọn lọc như sau: - M ậ t độ vi sinh vật cao: Ủ môi trường RV trong 24 h ± 2 h ở 42 ° C ± 0,2 ° C trong nồi cách thủy tuần hoàn có kiểm soát nhiệt (5.14); ủ canh thang TT trong 24 h ± 2 h ở 43 ° C ± 0,2 ° C trong nồi cách th ủ y tu ầ n hoàn có kiểm soát nhiệt (5.13). - Mật độ vi sinh vật thấp (ngoại tr ừ gum carob bean và gum guar): Ủ môi trường RV trong 24 h ± 2 h ở 42 ° C ± 0,2 ° C (nồi cách th ủ y tuần hoàn có kiểm soát nhiệt) (5.14); ủ canh thang TT trong 24 h ± 2 h ở 35 ° C ± 2,0 ° C trong tủ ấm (5.10). c) Trộn (vortex, nếu là ống) và cấy ria vòng cấy 3 mm (5.18) 10 µl canh thang TT đã ủ lên thạch BS (4.7) (chuẩn b ị các đĩa BS một ngày trước khi cấy ria và bảo qu ả n nơi tối ở nhiệt độ phòng), thạch XLD (4.5) và thạch HE (4.6). d ) Cấy lặp lại với v ò ng cấy 3 mm (10 µl) canh thang SC (đối v ớ i guar gum) hoặc môi trường RV (đối với các n ề n mẫu khác). e) Đối với các tùy chọn về tăng sinh sơ bộ mẫu đã ủ được làm lạnh và t ă ng sinh chọn lọc mẫu đã ủ (riêng đối với các canh thang SC và TT) của thực phẩm c ó độ ẩm th ấ p, xem AOAC 994.04. f) Ủ các đĩa trong 24 h ± 2 h ở 35 ° C trong t ủ ấm (5.10). g) Kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc có thể là Salmonella. 8.3 Sàng lọc khuẩn lạc Kiểm tra các đĩa (xem 8.2) như sau: a) H ì nh thái khuẩn lạc Salmonella điển hình - Thạch HE: khuẩn lạc có màu xanh (từ lục lam đến lam), có hoặc không có tâm đen. Nhiều ch ủ ng cấy Salmonella có th ể cho khu ẩ n lạc có tâm lớn, màu đen bỏng hoặc có thể x u ất hiện dư ớ i dạng khu ẩ n lạc đen gần như hoàn toàn . Số ít loài Salmonella sinh khuẩn lạc màu vàng, có hoặc k hông có tâm màu đen, nhưng không đặc trưng. - Thạch BS: khuẩn lạc Salmonella điển hình có th ể có màu nâu, xám hoặc đen, đôi khi có ánh kim loại. Xung quanh môi trường thường ban đầu có màu nâu, sau một thời gian ủ chuyển màu đen, tạo thành quầng. Một số ch ủ ng có thể cho các khuẩn lạc màu xanh lá, môi trường xung quanh hơi sẫm màu hoặc không. - Thạch XLD: các khuẩn lạc màu hồng có hoặc không có tâm màu đen. Nhiều ch ủ ng cấy Salmonella cho các khu ẩ n lạc có t â m lớn màu đen, b ó ng hoặc có th ể cho khuẩn lạc gần như đen hoàn toàn . S ố ít loài Salmonella không điển hình sinh khu ẩ n lạc màu vàng, có hoặc không có tâm màu đen. b) H ì nh thái khuẩn lạc Salmonella không điển h ì nh Khi không thấy có khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ l à Salmo n ella , tìm các khuẩn lạc Salmonella không điển hình như sau: - Thạch HE v à thạch XLD: Số í t ch ủ ng c ấ y Salmonella không điển hình sinh khuẩn lạc màu v à ng, có hoặc không có tâm màu đen trên thạch HE v à thạch XLD. Khi không c ó khu ẩ n l ạc Salmonella điển hình trên thạch HE và thạch XLD sau khi ủ 24 h ± 2 h thì chọn hai hoặc nhiều khuẩn lạc Salmonella không đi ể n h ì nh. - Thạch BS: Một vài chủng không điển hình sinh các khu ẩ n lạc màu xanh lá , môi trường xung quanh sẫm màu hoặc không. Nếu không xuất hiện các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ trên thạch BS sau 24 h ± 2 h thì không ch ọ n khu ẩ n lạc mà ủ lại thêm 24 h ± 2 h. N ế u không xuất hiện các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ sau khi ủ 48 h ± 2 h thì chọn hai hoặc nhiều khu ẩ n lạc không điển h ì nh. c) Chủng cấy kiểm chứng được khuyến cáo sử dụng C ù ng với các chủng cấy kiểm chứng dương t í nh ( Salmonella điển hình), ba chủng cấy Salmonella được k huyến cáo sử dụng khi lựa chọn hình hình thái khuẩn lạc Salmonella không điển hình trên các môi trường thạch chọn lọc. Các chủng cấy này là S . diarizonae (ATCC 12325) dương tính với l actose, dương t í nh với hydro sul f ua (H 2 S) và S . abortus equi (ATCC 9842) âm tính với lactose, âm tính với hydro sul f ua; hoặc S . diar i zonae (ATCC 29934) dương tính với lactose, âm t í nh với hydro sul f ua. CHÚ TH Í CH: Các chủng cấy này có thể lấ y từ Bảo t à ng gi ố ng chu ẩ n Hoa K ì , 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. 8.4 Cấy chuyển sang thạch nghiêng a) Chọn hai hoặc nhiều hơn các khuẩn lạc điển h ì nh hoặc nghi ngờ là Salmonella từ mỗi loại thạch chọn lọc (xem 8.3). C ấy vào thạch TSI (4.8) và thạch LIA (4.9). N ế u các đĩa thạch BS không có khu ẩ n lạc Salmonella điển hình hoặc nghi ngờ hoặc không thấy có khu ẩ n lạc mọc th ì ủ thêm 24 h. Dùng que cấy vô trùng chạm nhẹ vào chính giữa khuẩn lạc được chọn và ria cấy lên mặt nghiêng thạch TSI, sau đó đâm sâu xuống đáy. Không cần khử trùng que c ấ y, cấy luôn vào thạch L I A bằng cách đâm sâu xuống đáy thạch hai lần và sau đó ria lên mặt nghiêng. Do phản ứng decarboxyl hóa lysin là yếm khí bắt buộc nên thạch nghiêng LIA phải c ó phần chân cao 4 cm. Bảo qu ả n các đĩa thạch chọn lọc đã chọn ở nhiệt độ từ 5 ° C đến 8 ° C . b) Ủ thạch nghiêng TSI và LIA ở 35 ° C trong 24 h ± 2 h. Nới lỏng nắp ống đ ể duy trì điều kiện hiếu khí trong khi ủ, nhằm ngăn ngừa sinh quá nhiều hydro sul f ua. Sa l monella điển hình sinh kiềm (màu đỏ) trên bề mặt nghiêng và sinh axit (màu vàng) khi cấy đâm sâu, c ó hoặc không sinh hydro sul f ua (làm đen thạch) trên thạch TS I . Trên LIA, Salmonella điển hình sinh phản ứng kiềm (màu đ ỏ tía) ở đáy ống. Ch ỉ duy nh ấ t ố ng có màu vàng đặc trưng ở đáy mới được coi l à phản ứng axit (âm tính). Vì vậy, không loại b ỏ các ống cấy ch ỉ dựa trên cơ s ở thấy nhạt màu. Hầu hết các chủng Salmonella sinh hydro sul f ua tr ê n LIA. Một s ố ch ủ ng không phải Salmonella sinh phản ứng màu đỏ gạch trên mặt nghiêng thạch LIA. c) Nếu có mặt các khuẩn lạc điển hình trên thạch BS sau khi ủ 24 h ± 2 h th ì chọ n hai hoặc nhiều hơn các khuẩn lạc. Tất c ả các đĩa thạch BS đã chọn sau 24 h ± 2 h đều được ủ lại thêm 24 h ± 2 h. Sa u khi ủ 48 h ± 2 h, chọn hai hoặc nhiều khuẩn lạc điển hình, nếu có, từ các đĩa thạch BS. Ch ỉ khi các khu ẩ n lạc đã chọn từ các đĩa thạch BS sau khi ủ 24 h ± 2 h cho các ph ản ứng không đi ể n hình trong thạch TSI và LIA th ì mới loại b ỏ v ì đó không phải là Salmon e lla. d) Tất cả chủng cấy cho phản ứng kiềm ở chân thạch LIA, chưa kể đến phản ứng ở TSI, đều có khả năng là Salmonella , c ầ n thử tiếp các phản ứng sinh hóa và huy ế t thanh. Các chủng cấy cho phản ứng axit ở chân thạch LIA, cho phản ứng kiềm trên mặt nghiêng v à ph ả n ứng axit ở ch â n thạch TSI cũng cần được xem xét kh ả năng là Salmonella và nên thử ti ế p các ph ả n ứng sinh hóa và huy ế t thanh. Các chủng c ấ y cho phản ứng axit ở chân thạch LIA, cho ph ả n ứng axit trên c ả mặt nghiêng và chân thạch TSI không được coi là Salmonella . Các ch ủ ng giả định dương tính ở TSI đã giữ lại được thử nghiệm như hướng dẫn dư ớ i đây để khẳng đ ị nh là Salmonella, bao gồm c ả S . arizonae . Nếu trên thạch TSI không thấy phản ứng đặc trưng của Salmonella ( phản ứng kiềm trên mặt nghiêng và ph ả n ứng axit ở chân thạch) th ì chọn thêm các khuẩn lạc nghi ngờ từ đĩa môi trường chọn lọc cấy vào thạch nghiêng TSI và LIA như mô tả ở trên. e) Áp dụng các phép thử sinh hóa đối với: - Ba ch ủ ng gi ả định trên thạch TSI chuyển từ d ãy đĩa ria cấy môi trường RV, nếu có, v à ba ch ủ ng giả định trên thạch TSI chuyển từ dãy đĩa ria cấy môi trường tetrathionat, nếu có. - Nếu từ một dãy các đ ĩ a thạch không phân lập được ba chủng giả định dư ơ ng tính trên TSI thì phân lập ba ch ủ ng giả định dương tính trên TSI từ dãy các đĩa thạch khác, nếu được, để thử các phản ứng sinh hóa và huyết thanh. Ki ể m tra tối thiểu sáu chủng cấy TSI từ mỗi 25 g phần mẫu thử. 8.5 Thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh 8.5.1 Thử nghiệm v ới chủng chưa cấy thuần Cấ y ria lên thạch TSI (xem 8.4) các khuẩn lạc chưa thuần chủng chọn trên thạch MacConkey (4.22), thạch HE (4.6) hoặc thạch XLD (4.5). Ủ các đ ĩ a 24 h ± 2 h ở 35 ° C trong t ủ ấm (5.10). Chọn các khu ẩ n lạc nghi ngờ là Salmonella trên các loại thạch đĩa chọn lọc như sau: a) Thạch MacConkey: Khuẩn lạc điển hình trong suốt và không màu, đôi khi c ó t â m màu sẫm. Các khu ẩ n lạc Salmonella sẽ làm trong các vùng kết tủa mật đôi khi xuất hiện do sự c ó mặt các vi sinh vật khác. b) Thạch HE: Xem quy trình nêu trong điểm a của 8.3. c) Thạch XLD: Xem quy trình nêu trong điểm a của 8.3. Chuyển ít nhất hai khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella vào mặ t nghiêng thạch TS I và LIA như mô t ả ở trên và tiếp tục như trong 8.4. 8.5.2 Thử nghiệm với ch ủ ng cấy thuần a) Phép thử urease (phép thử thông thường) Dùng que cấy vô trùng, lấy vi khu ẩ n trên mặt nghiêng của thạch TSI dương tính giả định (xem 8.4) cấy vào các ống canh thang ure (4.14). Hiếm khi các ống canh thang ure chưa c ấ y có màu đỏ tía bền (như kết quả dương tính), do đó các ống chưa cấy canh thang n à y được dùng làm kiểm chứng . Ủ 24 h ± 2 h ở 35 ° C trong t ủ ấm (5.10). b) Ph é p thử urease tùy chọn (phép thử nhanh) Chuyển hai vòng cấy 3 mm từ mỗi ch ủ ng cấy tr ê n mặt nghiêng thạch TSI dương tính giả định (xem 8.4) v à o các ống canh thang ure thử nhanh (4.15). Ủ 2 h ở 37 ° C ± 0,5 ° C trong nồi cách th ủy . Lo ạ i bỏ tất c ả ch ủ ng cấy cho phản ứng dương tính. Giữ lại để xem xét thêm tất cả chủng cấy cho phản ứng âm t í nh (không đ ổ i màu môi trường). 8.5.3 Phép thử ng ư ng kết kháng huyết thanh lông (H) đa giá a) Thực hiện phép thử ngưng kết kháng huyết thanh đa giá tại điểm này hoặc muộn hơn như m ô t ả dư ớ i đây. C ấy vi sinh vật phát triển từ mặt nghiêng thạch TSI âm tính urease (xem 8.5.2) vào một trong hai môi trường sa u : - Canh thang dịch tim não (4.23) v à ủ từ 4 h đến 6 h ở 35 ° C trong tủ ấm (5.10) cho đến khi nhìn bằng mắt thường thấy vi sinh vật phát triển (để thử nghiệm trong cùng ngày); hoặc - Canh thang tr y pticase đậu tương-tryptose (4.11) và ủ 24 h ± 2 h ở 35 ° C trong t ủ ấm (5.10) (để thử nghiệm trong ngày hôm sau). Thêm 2,5 ml nước muối sinh lý f ormalin (4.34) vào 5 ml của mỗi dịch c ấ y. b) Từ canh thang f ormalin, chọn hai ch ủ ng cấy v à thử v ớ i kháng huyết thanh ngưng kết đa giá Salmonella (H) (4.37). Cho 0,5 ml kháng huyết thanh ngưng kết đa giá Salmonella đ ã pha loãng t hích hợp vào các ống huyết thanh 10 mm x 75 mm hoặc 13 mm x 100 mm (5.19). Thêm 0,5 ml kháng nguyên cần thử. Chuẩn bị nước mu ố i kiểm chứng bằng cách trộn 0,5 ml nước muối sinh lý f orma l in (4.34) với 0,5 m l kháng nguyên f ormalin. Ủ các hỗn hợp ở nhiệt độ từ 48 ° C đến 50 ° C trong nồi cách thủy (5.12). Quan sát sau từng khoảng 15 min v à đọc kết qu ả cuối cùng trong 1 h. Dương tính: ngưng kết trong ống kháng huyết thanh thử nghiệm nhưng kh ô ng ngưng kết trong ống kiểm chứng. Â m t í nh: kh ô ng ngưng kết c ả trong ống kháng huyết thanh thử nghiệm và ống kiểm ch ứ ng. Không đặc hiệu: ngưng kết cả trong ống kháng huyết thanh th ử nghiệm và ống kiểm chứng. Tiếp t ục thử nghiệm các chủng cấy cho các kết quả nêu trên với kháng huyết thanh Spicer-Ed w ards theo 8.5.4. 8.5.4 Ph é p thử huy ế t thanh Sp i cer-Edwards Sử dụng phép thử này thay th ế cho phép thử ngưng kết (H) đa giá (8.5.3). Phép thử này cũng được sử dụng cho các chủng c ấ y ngưng kết không đặc hiệu trong phép thử ngưng k ế t kháng huyết thanh (H) đa giá. Thực hiện phép thử kháng huy ế t thanh ngưng kết Spicer-Ed w ards (H) (4.39) như mô tả ở trên. Thực hiện các phép thử sinh hóa bổ sung (8.5.6.2) v ớ i các chủng cấy cho kết quả th ử ngưng kết (H) dương tính như mô tả ở dưới. Nếu cả hai dịch cấy đã f ormalin hóa đều âm t í nh thì thực hiện phép thử huyết thanh với bốn ch ủ ng bổ sung cấy trong canh thang (như trên). Nếu có thể, thu l ấ y hai chủng cấy dư ơ ng tính để th ử nghiệm sinh hóa. N ế u các chủng cấy tr ê n TSI â m tính urease mà cho kết quả âm tính trong phép th ử ngưng k ế t huyết thanh (H) thì cũng cần thực hiện các phép thử sinh hóa b ổ sung. 8.5.5 Th ử nghiệm ch ấ t cấy âm t í nh urease a) Canh thang lysin decarboxylase Nếu phép thử LIA đáp ứng th ì không cần lặp lại phép th ử này. S ử dụng canh thang lysin decarboxylase (4.17) trong phép xác định cuối cùng của lysin decarboxylase nếu ch ủ ng cấy cho ph ả n ứng còn nghi ngờ tr ê n LIA. C ấy vào canh thang một lượng nh ỏ vi sinh vật phát triển trên mặt nghiêng c ủ a thạch TSI nghi ngờ là Salmonella (xem 8.5.2). Vặn chặt nắp và ủ 48 h ± 2 h ở 35 ° C trong tủ ấm (5.10), kiểm tra sau mỗi 24 h. Các loài Salmonella gây phản ứng kiềm l à m cho môi trường chuyển màu đỏ tía (ph ả n ứng dương tính). Nếu phép thử â m tính, m ô i trường chuyển màu vàng. Nếu môi trường b ị mất màu (không vàng cũng không đ ỏ tía) thì thêm vài giọt thuốc nhuộm bromcresol đỏ t í a 0,2 % (4.30) v à đọc lại ph ả n ứng trong ống. b) Canh thang phenol đỏ dulcito l hoặc canh thang đỏ t í a cơ bản có 0,5 % dulcitol Ủ canh thang phenol đỏ dulcitol (4.20) hoặc canh thang đỏ tía ( 4.21) một lượng nhỏ vi sinh vật phát triển tr ê n thạch TSI (xem 8.4). Nới lỏng nắp và ủ 48 h ± 2 h ở 35 ° C trong tủ ấm (5.10), có kiểm tra sau 24 h. Hầu hết các loài Salmonella cho ph ả n ứng dương tính, được chỉ thị b ở i việc sinh khí trong ống Durham và pH axit (môi trường chuyển màu vàng). Phép thử âm t í nh được chỉ th ị b ở i việc không sinh khí trong ống Durham và màu đỏ (v ớ i chất ch ỉ thị phenol đ ỏ ) hoặc đ ỏ t í a (với chất ch ỉ th ị bromcresol đỏ tía) trên toàn bộ môi trường. c) Canh thang trypton (hoặc tryptophan) Cấy vào canh thang trypton (hoặc tryptophan) (4.10) một lượng nh ỏ vi sinh vật phát triển tr ê n thạch TS I (xem 8.4). Ủ 24 h ± 2 h ở 35 ° C trong tủ ấm (5.10) và tiến hành các thử nghiệm sau: 1) Khả năng phát triển trong canh thang kali xyanua (4.19): Chuyển một vòng cấy 3 mm (5.18) canh thang tryptophan đã cấy vi khuẩn sau 24 h vào canh thang KCN. Hơ nóng miệng ống sao cho ống được bịt kín khi đậy b ằ ng nút bần ph ủ sáp. Ủ 48 h ± 2 h ở 35 ° C trong tủ ấ m (5.10) kiểm tra sau mỗi 24 h. Vi sinh vật phát triển (làm đục môi trường) được coi là dương tính. Hầu hết các loài Salmonella không sinh trư ở ng trong môi trường này, biểu hiện qua việc không làm đục môi trường. 2) Sử dụng canh thang malonat (4.16): Chuyển một vòng cấy 3 mm (5.18) canh thang tryptophan đ ã cấy vi khu ẩ n sau 24 h vào canh thang malonat. Hiếm khi các ống canh thang malonat chưa cấy cho màu xanh lam bền ( như phép thử dư ơ ng tính), do đó các ống canh thang chưa cấy này được dùng làm ki ể m chứng . Ủ 48 h ± 2 h ở 35 °C trong t ủ ấm (5.10), kiểm tra sau 24 h. Hầu hết các loài Salmonella cho phản ứng âm tính trên canh thang này (màu xanh l á hoặc không đổi màu). 3) Phép thử indol: Chuyển 5 ml canh thang tryptophan đ ã cấy vi khuẩn 24 h vào ống nghiệm. Thêm từ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử Kovacs (4.26). Hầu hết các chủng cấy Salmonella cho phản ứng âm tính (không có màu đ ỏ đậm trên bề mặt canh thang). Màu sắc trung gian, sự chuyển màu da cam và hồng không ổn định được báo cáo kết quả là ±. 4) Các phép thử ngưng kết huyết thanh (H) đ ố i với Salmonella : Nếu ở trên chưa thực hiện cả ph é p thử ngưng kết (H) đa giá (8.5.3) và phép thử ngưng kết (H) Spicer-Ed w ards (8.5.4) thì thực hiện phép th ử ở giai đo ạ n này. 5) Loại bỏ tất cả các chủng cấy không phải Salmonella vừa dương tính với phép thử indol vừa âm tính với phép thử ngưng kết kháng huyết thanh (H), hoặc vừa dương tính với phép thử KCN vừa âm tính với phép thử lysin decarboxylase. 8.5.6 Phép thử ngưng kết huyết thanh th â n (O) đối với Salmonella Ch ú ý: Kiểm tra trư ớ c tất cả kháng huyết thanh Salmonella với các ch ủ ng cấy đã biết. 8.5.6.1 Phép thử kh á ng huyết thanh thân (O) đa giá Dùng ch ì sáp để đ á nh dấu hai phần khoảng 1 cm x 2 cm ở hai phía đĩa Petri (15 mm x 100 mm) bằng thủy tinh hoặc chất d ẻ o (5.16). Có thể sử dụng các lam kính bán sẵn. Nhũ hóa một v ò ng cấy 3 mm vi khuẩn cấy trên mặt nghiêng thạch TSI đ ã ủ từ 24 h đến 48 h hoặc tốt nhất l à cấy trên thạch máu tryptose cơ bản (chưa bổ sung máu) (4.24) với 2 ml nước mu ố i 0,85 % (4.33). Nh ỏ một giọt huy ề n phù vi khuẩn lên phần trên của mỗi ô h ì nh chữ nhật đã đánh dấu bằng chì sáp. Nh ỏ tiếp một giọt nước muối vào phía dưới của một ô và một giọt kháng huyết thanh thân (O) Salmonella đa giá (4.36) vào phần còn lại. Dùng que cấy vô trùng để trộn huyền phù vi khuẩn với nước muối ở ô thứ nhất và lặp lại với ô nhỏ kháng huyết thanh. Chao nghiêng hỗn dịch trong 1 min và quan sát trên nền tối được chiếu sáng tốt. Phân loại kết qu ả th ử ngưng kết kháng huyết thanh thân (O) đa giá nh ư sau: Dương tính: ngưng kết trong các h ỗ n dịch thử nghiệm và không ngưng k ế t trong nước muối kiểm chứng. Âm tính: không ngưng kết cả trong các hỗn dịch thử nghiệm và nước muối kiểm chứng. Không đặc hiệu: ngưng kết cả trong hỗn dịch thử nghiệm và mẫu kiểm chứng, cần thực hiện các phép thử huyết thanh và sinh hóa tiếp theo. 8.5.6.2 Th ử nghiệm kháng huy ế t thanh đ ơn giá nhóm ( O ) Thực hiện theo 8.5.6.1, có thể sử dụng các kháng huyết thanh đơn giá nhóm (O), kể cả Vi (4.38) thay cho kháng huyết thanh (O) đa giá. Đối với việc x ử lý cụ thể các chủng cấy cho ph ả n ứ ng ngưng kết Vi dương tính, xem AOAC 967.28B. Các chủng c ấ y ngưng kết d ương tính với các kháng huy ế t thanh thân (O) đơn giá cũng được báo cáo là dương t í nh với nhóm (O). Các chủng cấy không ngưng kết với kháng huyết thanh đơn giá được báo cáo là âm tính với nhóm (O). Xác định các chủng cấy là Salmonella với các phản ứng Salmonella điển hình từ phép thử số 1 đến 11, trong B ả ng 2. Nếu một chủng cấy tr ê n TSI từ 25 g mẫu thử được xác đ ị nh là Salmonella thì không cần thử các chủng cấy trên TSI khác từ cùng một mẫu thử. Nếu chủng cấy được chứng minh là mang kháng nguyên Salmonella qua phép thử ngưng k ế t (H) Salmonella dương tính nhưng không có các đặc t í nh sinh hóa của Salmonella thì cần được thuần nh ấ t và thử nghiệm lại. B ả ng 2 - Tổng h ợ p các phản ứng sinh hóa và huyết thanh của Salmonella Phép thử hoặc cơ ch ấ t D ươ ng t í nh Âm tính Các phản ứng a) 1. Glucose (TSl) Chân thạch màu vàng Ch â n thạch màu đỏ + 2. Lysin decarboxylase (LIA) Chân thạch màu đỏ tía Chân thạch màu v à ng + 3. Hydro su lf ua (TSI và LIA) Có màu đen Không có màu đen + 4. Urease Màu đ ỏ tía Không đổi màu - 5. Canh thang lysin decarboxylase Màu đ ỏ tía Màu vàng + 6. Canh thang phenol đỏ dulcitol Màu vàng và/hoặc sinh khí Không sinh khí; kh ô ng đổi màu + b 7. Canh thang KCN Vi sinh vật phát triển Vi sinh vật không phát triển - 8. Canh thang malonat Màu xanh lam trên bề mặt Không đổi m à u - c 9. Phép th ử indol Màu đ ỏ đậm trên b ề mặt Màu v à ng trên bề mặt - 10. Phép thử ngưng kết đa giá Ngưng kết Không ngưng kết + 11. Ph é p thử tế bào đa giá Ngưng kết Không ngưng kết + 12. Canh thang phenol đỏ lactose Màu vàng và/hoặc sinh khí Không sinh k hí; không đổi màu - c 13. Canh thang phenol đỏ sacarose Màu vàng và/hoặc sinh khí Không sinh khí; không đổi màu - 14. Phép thử Voges- Proskauer Màu hồng đến đỏ không đ ổ i màu - 15. Ph é p thử metyl đỏ Màu đ ỏ phai Màu vàng phai + 16. Thạch xitrat S i mmons Vi sinh vật phát triển; màu xanh lam Vi sinh vật không phát triển; không đổi màu v a) (+) là ≥ 90 % dương t í nh trong 1 ngày hoặc 2 ng à y; (-) là ≥ 90 % âm tí nh trong 1 ngày hoặc 2 ngày; (v) l à thay đ ổ i. b) Phần lớn chủng c ấ y S . ari z onae â m tính. c) Phần lớn chủng cấy S. ari z onae dương tính. 8.6 Thử nghiệm khuẩn lạc Salmonella không điển hình Thực hiện các phép thử sinh hóa bổ sung sau đ â y trên các chủng cấy không cho các phản ứng Salmonella điển hình đối với phép thử số 1 đến 11 trong Bảng 2, v à cũng không được phân loại là Salmonella (xem B ả ng 3). a) Canh thang phenol đỏ lactose hoặc canh thang đỏ tía lactose 1) Cấy vào canh thang phenol đỏ lactose (4.20) hoặc canh thang đỏ tía lactose (4.21) một l ượng nhỏ vi khuẩn phát triển trên mặt nghiêng c ủ a thạch TSI từ 14 h đến 48 h. Ủ 48 h ± 2 h ở 35 ° C trong t ủ ấm (5.10), kiểm tra sau mỗi 24 h. Dương tính : sinh axit (màu vàng) và sinh khí trong ống Du rh am . Nếu ch ỉ sinh axit cũng được coi là phản ứng dương tính. Hầu hết các chủng cấy Salmonella cho kết qu ả âm tính, được chỉ thị b ở i việc không sinh khí trong ống Durham và đổi màu m ô i trường thành m à u đ ỏ ( chất chỉ th ị phenol đỏ) hoặc màu đỏ tía (ch ấ t chỉ thị bromcresol đ ỏ tía). 2) Loại bỏ các ch ủ ng cấy không phải Salmonella (dương tính với các phép thử lactose), ngoại trừ các chủng cấy sinh axit trên mặt nghiêng của TSI v à c ó phản ứng dương t í nh trong LIA hoặc các chủng cấy cho các phản ứng dương tính với canh thang malonat. Thực hiện các phép th ử tiếp theo trên các chủng c ấ y để xác định có phải là S . arizonae. b) Canh thang phenol đỏ sacarose (4.20) hoặc canh thang đ ỏ tía sacarose (4.21) Thực hiện quy tr ì nh như mô t ả ở trên. Loại b ỏ các ch ủ ng cấy không phải Salmonella (dương tính với sacarose), trừ các ch ủ ng sinh axit trên bề mặt nghiêng của TSI và cho phản ứng dương t í nh trên LIA. c) Canh thang MR-VP Cấy vào môi trường MR-VP (4.12) một lượng nhỏ vi sinh vật phát triển trên mặt nghiêng của TSI chưa được xác định, nghi ngờ c ó Salmonella . Ủ 48 h ± 2 h ở 35 ° C trong tủ ấ m (5.10). 1) Thực hiện phép thử Voges-Proskauer (VP) ở nhiệt độ ph ò ng nh ư sau: Chuyển 1 ml ch ủ ng cấy 48 h vào ống nghiệm và ủ phần còn lại của canh thang MR-VP th êm 48 h ở 35 ° C . Thêm 0,6 ml naphthol (4.27) và lắc đều. Tiếp tục thêm 0,2 ml dung dịch kali hydroxit 40 % (4.29) và lắc đều. Đ ể tăng nồng độ và tăng tốc độ phản ứng, thêm v à i tinh thể creatin (4.28). Đọc kết qu ả sau 4 h; Nếu môi trường chuyển màu đ ỏ hồng ruby l à phản ứng dương tính. Hầu hết chủng cấy Salmonella âm t í nh VP (môi trường không chuyển màu). 2) Thực hiện phép th ử metyl đ ỏ như sau: cho 5 ml canh thang 96 h MR-VP, th ê m 5 đến 6 gi ọ t chất ch ỉ thị mety l đỏ (4.31). Đọc kết qu ả ngay. Hầu hết ch ủ ng cấy Salmonella cho kết quả dương tính, cho thấy bởi màu đ ỏ phai trong môi trường. Phản ứng âm tính có màu vàng đặc trưng. Loại b ỏ các chủng cấy không phải Salmonella (có các ph ả n ứng KCN và VP dương tính và phản ứng mety l đ ỏ âm tính). Bảng 3 - Các tiêu chí đ ể loại bỏ các chủng cấy không phải Salmonella Phép th ử hoặc cơ ch ấ t Kết quả 1. Urease dương tính (màu đ ỏ tía) 2. Phép thử indol và phép thử ngưng kết (H) đa giá hoặc phép thử ngưng kết Spicer-Edwards dương tính (màu tím trên bề mặt) âm tín h (kh ô ng ngưng kết) 3. Canh thang lysin decarboxylase KCN âm t í nh (màu vàng) dương tính (vi sinh vật phát triển) 4. Canh thang phenol đỏ lactose dương tính (màu vàng và/hoặc sinh khí) a, b 5. Canh thang phenol đỏ sacarose dương tính (màu vàng và/hoặc sinh khí) b 6. Canh thang KCN, phép thử Voges-Proskauer, phép thử metyl đỏ dương tính (Vi sinh vật phát triển) dương tính (màu hồng đến đỏ) âm tính (màu vàng phai) a Thử tiếp các chủng c ấ y dương t í nh với canh thang malonat đ ể xác định có phải là Salmonella ari z onae . b Không bỏ các chủng c ấ y canh thang dương t í nh nếu các ch ủ ng cấy LIA tương ứng cho các phản ứ ng Salmonella điển hình; th ử ti ế p đ ể xác định c ó phải là các loài Salmonella d) Thạch xitrat Simmons Ria cấy trên mặt nghiêng và cấy đâm sâu vào thạch xitrat Si m mons (4.13) vi khu ẩ n phát triển trên mặt nghiêng c ủ a thạch TSI chưa xác định . Ủ 96 h ± 2 h ở 35 ° C trong tủ ấm (5.10). Đọc kết quả như sau: Dương tính: có vi sinh vật phát triển, thường kèm theo sự thay đổi từ m à u xanh lá sang m à u xanh lam. Hầu hết chủng cấy Salmonella dương tính xitrat. Âm t í nh: không có vi sinh vật phát triển hoặc c ó rất ít vi sinh vật phát triển nhưng không đ ổ i màu. 8.7 Phương pháp thay thế xác định Salmonella Phương pháp thay thế cho cách th ử các ph ả n ứng sinh hóa thông thư ờ ng, d ùng một trong n ă m kit sinh hóa thương mại (API 20E, Enterotube II , Ente ro bacter i aceae II, MICRO-ID hoặc Vitek GNI) để nhận diện Salmonella giả định. Lựa chọn kit thương mại phù hợp với các tính chất sinh hóa trong phần nhận diện. Các kit sinh hóa thương mại không được sử dụng để thay th ế các phép thử huyết thanh. Lắp ráp các bộ phận của thiết bị và chuẩn b ị thuốc thử cần cho bộ kít. Cấ y từng đơn vị theo AOAC 978.24 (API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II), AOAC 989.12 (MICRO-ID), AOAC 991.13 (Vitek GNI), ủ trong thời gian và nhiệt độ quy định. Bổ sung thuốc thử, quan sát và ghi kết quả. Đối v ớ i việc nhận diện vi sinh vật gi ả định, phân loại chủng cấy, thực hiện theo AOAC là Salmonella hoặc không phải Salmonella. Đối với việc khẳng định các ch ủ ng cấy giả định được nhận diện là Salmonella, thực hiện phép th ử ngưng kết kháng huyết thanh thân (O) Salmonella (8.5.6) v à phép thử ngưng kết kháng huyết thanh lông (H) Sa l monella (8.5.3) hoặc phép thử ngưng kết (H) Spicer-Edwards (8.5.4) để phân loại chủng c ấ y theo hướng dẫn sau: a) Báo cáo các ch ủ ng cấy l à Salmonella được khẳng định từ Salmonella giả định bằng các kit sinh hóa thương mại nếu chủng cấy dương t í nh với phép thử ngưng kết kháng huyết thanh (O) Salmonella và phép thử (H) Salmonella. b) Loại b ỏ các ch ủ ng cấy giả định không phải là Salmone l la bằng các kit sinh hóa thương mại nếu ch ủ ng cấy phù hợp với các tiêu chí AOAC về chủng cấy k hông phải Salmonella. c) Đối với chủng cấy không ph ù hợp với a hoặc b, phân loại theo các phép thử bổ sung (8.6) hoặc gửi đến phòng thử nghiệm để xác định typ huyết thanh và nhận diện. 8.8 Xử lý các chủng cấy âm tính với phép thử ngưng kết kháng huyết thanh lông (H) N ế u ch ủ ng cấy có các t í nh chất sinh hóa phù h ợ p với Salmonella nhưng cho kết quả ngưng k ế t với kháng huyết thanh (H) âm tính (xem 8.5.3) có thể là do các ch ủ ng này không di động hoặc các kháng nguyên lông phát triển không trọn vẹn. Tiến hành kiểm tra như sau: Đ ổ môi trường thử t í nh di động (4.18) vào đ ĩ a Petri (5.16). Dùng que cấy lấy một lượng nh ỏ vi khuẩn phát triển trên mặt nghiêng thạch TSI c ấ y đâm sâu lên đĩa môi trường, cách cạnh đĩa kho ả ng 10 mm, sâu từ 2 mm đến 3 mm. Không cấy chạm đến đáy đ ĩ a hoặc ở vị trí khác . Ủ 24 h ở 35 ° C trong t ủ ấm (5.10). Nếu thấy vi khuẩn di chuyển 40 mm hoặc lớn hơn thì thử nghiệm lại như sau: Chuyển một vòng cấy vi khuẩn đã di chuyển xa nhất vào canh thang trypticase đậu tương-tryptose (4.11). Lặp lại phép th ử ngưng kết (H) đa giá hoặc phép thử huyết thanh Spicer-Ed w ards. Nếu các chủng cấy không di động sau 24 h đầu th ì ủ thêm 24 h ở 35 ° C trong t ủ ấ m (5.10); Nếu vẫn không di động thì ủ tiếp 5 ngày ở 25 ° C . Kết luận chủng cấy không di động n ế u các phép th ử trên vẫn cho kết quả âm tính. 9 Biểu thị kết quả Theo các kết quả diễn giải ( xem 8.6, 8.7 hoặc 8.8), chỉ rõ sự có mặt hay không có mặt của Salmonella trong 25 g phần mẫu thử. 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ch ỉ r õ : a) mọi thông tin c ầ n thiết đ ể nhận biết đầy đ ủ về mẫu thử; b ) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử nghiệm đã d ùng, viện d ẫ n tiêu chuẩn này; d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi l à tù y chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả; e) k ế t quả thử nghiệm thu được. Phụ lục A (Quy đ ị nh) Thành phần và chuẩn bị môi trường cấy và thuốc thử A.1 Canh thang lactose A.1.1 Thành phần Chất chiết thịt bò 3 g Pepton 5 g Lactose 5 g Nư ớ c cất 1 lít A.1.2 Chuẩn bị Phân phối các phần 225 ml vào các bình nón 500 ml. Sau khi h ấ p áp lực ở 121 ° C trong 15 min và ngay trước khi sử dụng, ch ỉ nh vô trùng đến thể t í ch 225 ml. pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2. A.2 Canh thang selen i t cystin A.2.1 Môi trường 1 A.2.1.1 Thành phần Tryptone hoặc polypepton 5 g Lactose 4 g Natri hydro selenit (NaHSeO 3 ) 4 g Natri hydro phosphat (Na 2 HP O 4 ) 10 g L-Cystin 0,01 g Nước cất 1 lít A.2.1.2 Chuẩn bị Đun đến sôi để hòa tan. Phân phối các phần 10 ml vào các ố ng nghiệm 16 mm x 150 mm vô trùng. Đun 10 min trong hơi nước (flowing steam). Không hấp áp lực. pH cuối cùng đạt 7,0 ± 0,2. Không khử trùng môi trường này. Sử dụng trong ngày chu ẩ n bị. A.2.2 Môi trường 2 (North-Bartram đi ề u chỉnh) A.2.2.1 Thành ph ầ n Polypepton 5 g Lactose 4 g Natri hydro selenit (NaHSe O 3 ) 4 g Natri hydro phosphat (Na 2 HPO 4 ) 5,5 g Kali dihydro phosphat (KH 2 P O 4 ) 4,5 g L-Cystin 0,01 g Nước cất 1 lít A.2.2.2 Chuẩn b ị Gia nhiệt có khuấy để hòa tan. Phân phối các phần 10 ml vào các ố ng nghiệm 16 mm x 150 mm vô trùng. Gia nhiệt 10 min trong hơi nước. Kh ô ng khử trùng môi trường này. Sử dụng trong ngày chu ẩ n bị. A.3 Canh thang tetrathionat A.3.1 Thành ph ầ n Polypepton 5 g Các muối mật 1 g Canxi cacbonat 10 g Natri thiosul f at ngậm năm phân tử nước 30 g Nước c ấ t 1 lít A.3.2 Chuẩn b ị Tạo huyền phù các th à nh phần trong 1 lít nư ớ c cất, trộn v à đun sôi (phần kết tủa sẽ không tan hoàn toàn). Không hấp áp lực. Để nguội đến dưới 45 ° C . Bảo quản ở nhiệt độ từ 5 ° C đ ế n 8 ° C . pH cu ố i cùng đạt 8,4 ± 0,2. A.4 Môi trường Rappaport-Vassiliad i s A.4.1 Th à nh phần a) Canh thang cơ bản Tryptone 5 g Natri clorua (NaCI) 8 g Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) 1,6 g Nước cất 1 lít b) Dung dịch magie clorua: Magie clorua ngậm sáu phân tử nước (MgCI 2 · 6 H 2 O ) 400 g Nước c ấ t 1 lít c) Dung dịch malachite green oxalat: Malach i te green oxalat 0,4 g Nước cất 100 ml A.4.2 Chuẩn b ị Để chu ẩ n bị môi trường hoàn chỉnh, gộp 1000 ml canh thang, 100 ml Dung dịch magie clorua và 10 ml Dung dịch malachite green oxalat (tổng thể tích môi trường hoàn ch ỉ nh là 1110 ml). Canh thang cơ bản phải được chu ẩ n b ị cùng ngày với các thành phần c ấ u tạo nên môi trường hoàn chỉnh. Dung dịch magie clorua có thể bảo quản trong tối ở nhiệt độ phòng được 1 năm. Để chuẩn bị dung dịch này, hòa tan hoàn toàn lượng MgCI 2 .6H20 từ vật chứa mới mở nắp dựa theo công thức, b ở i vì loại muối này rất hút ẩ m. Dung dịch malachite green oxalat có thể bảo quản trong chai tối màu ở nhiệt độ phòng đến 6 tháng. Phân phối các thể tích 10 m l môi trường hoàn ch ỉ nh vào các ố ng nghiệm 16 mm x 150 mm. H ấ p áp lực 15 min ở 115 ° C . pH cu ố i cùng đạt 5,5 ± 0,2. Bảo quản trong t ủ lạnh và d ùng trong 1 tháng. Môi trường này ph ả i chuẩn bị từ các thành ph ầ n ri ê ng l ẻ . Không nên sử dụng môi trường khô bán sẵn. Người sử dụng môi trường này cần nhận thức rõ công thức và nhiệt độ ủ môi trường này khác với hướng d ẫ n của tiêu chuẩn n à y. A.5 Thạch xylose lysin desoxycholat (XLD) A.5.1 Thành phần C hấ t chiết nấm men 3 g Sắt ( III ) amoni xitrat 0,8 g L-lysin 5 g Natri thiosul f at 6,8 g Xylose 3,7 5 g Natri clorua (NaCI) 5 g Lactose 7, 5 g Thạch 1 5 g Sacarose 7,5 g Phenol đỏ 0,08 g Natri desoxycholat 2,5 g Nước cất 1 lít A.5.2 Chuẩn b ị Gia nhiệt có khuấy ngay đến khi sôi ở mức độ trung bình. Kh ô ng để quá nhiệt. Rót vào các đĩa khi môi trường nguội đến 50 ° C . Để khô trong khoảng 2 h, m ở hé nắp. Sau đó đậy nắp. pH cuối cùng 7 , 4 ± 0,2. Không bảo quản qu á 1 ngày. A.6 Thạch Hektoen Enteric (HE) A.6.1 Thành ph ầ n Pepton 12 g Natri thiosu lf at 5 g Ch ấ t chiết nấm men 3 g Sắt (III) amoni xitrat 1,5 g Muối mật 9 g Bromthymol xanh 0,064 g Lactose 12 g Fuchsin axit 0,1 g Sacarose 12 g Thạch 13,5 g Salicin 2 g Nước cất 1 lít Natri clorua (NaCI) 5 g A.6.2 Chuẩn bị Đun đến sôi, khuấy liên tục để hòa tan. Để sôi không quá 1 min. Không để quá nhiệt. Để nguội trong nồi cách thủy. Rót các phần 20 ml vào các đĩa Petri 15 mm x 100 mm vô trùng. Để khô trong khoảng 2h, m ở hé nắp. pH cuối cùng 7,6 ± 0,2. Không bảo quản qu á 1 ngày. A.7 Thạch bismuth sulfit ( W ilson and Blair) A.7.1 Thành ph ầ n Polypepton (hoặc pepton) 10 g Chất chiết thịt bò 5 g Dextrose 5 g Natri hydro phosphat (Na 2 HP O 4 ) (dạng khan) 4 g FeS O4 (dạng khan) 0,3 g Bismuth sulfit (chất ch ỉ thị) 8 g Brilliant green 0,025 g Thạch 20 g Nước c ấ t 1 lít A.7.2 Chuẩn b ị Trộn kỹ và đun có khuấy. Để sôi khoảng 1 min đến khi thu được huyền phù đồng nhất (nếu kết l ắ ng sẽ không h ò a tan). Đ ể nguội đến nhiệt độ từ 45 ° C đến 50 ° C . Tạo huyền phù phần kết lắng bằng cách khuấy nhẹ v à rót các phần 20 ml vào các đĩa Petri 15 mm x 100 mm vô trùng. Để các đĩa khô trong kho ả ng 2 min, có m ở hé nắp, sau đó đậy các đ ĩa. pH cuối cùng đạt 7,7 ± 0,2. Không hấp áp lực. Chuẩn b ị các đĩa một ngày trước khi cấy ria và bảo quản trong tố i. Độ chọn lọc giảm trong 48 h. Bảo quản các đĩa nơi tối. A.8 Thạch sắt ba đường (TS I ) A.8.1 Mô i trường Môi trường 1 Polypepton 20 g Natri clorua (NaCI) 5 g Lactose 10 g Sacarose 10 g Glucose 1 g Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 )·6H 2 O 0,2 g Na 2 S 2 O 3 0,2 g Phenol đỏ 0,025 g Thạch 13 g Nước cất 1 lít Môi trường 2 Chất chiết thịt bò 3 g Chất chiết nấm men 3 g Pepton 15 g Proteose pepton 5 g Glucose 1 g Lactose 10 g Sacarose 10 g Sắt (II) sul f at (FeS O 4 ) 0,2 g Natri clorua (NaCI) 5 g N a 2 S 2 O 3 0,3 g Phenol đỏ 0,024 g Thạch 12 g Nước cất 1 lít Hai môi trường này nói chung c ó thể thay thế nhau. A.8.2 Chuẩn b ị Tạo huyền phù các thành phần c ủ a Môi trường 1 trong nước cất, trộn kỹ và gia nhiệt, th ỉ nh thoảng có khuấy. Đ ể sôi khoảng 1 min cho hòa tan các thành phần. Cho vào 1/3 các ống 16 mm x 150 mm v à đậy nắp hoặc nút lại để duy tr ì các điều kiện hiếu khí. Hấp áp lực Môi trường 1 trong 15 min ở 118 ° C . Chu ẩ n bị Môi trường 2 như đối với Môi trường 1, nhưng không hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . Trước khi môi trường đông đặc, nghiêng các ống để có các bề mặt nghiêng từ 4 cm đến 5 cm và độ sâu từ 2 cm đến 3 cm. pH cuối cùng đạt 7,3 ± 0,2 đối với Môi trường 1 và 7,4 ± 0.2 đối với Môi trường 2. A.9 Thạch sắt lysin ( Edwards and Fife) A.9.1 Thành ph ầ n Gelysate hoặc pepton 5 g Ch ấ t chiết n ấ m men 3 g Dextrose 1 g L-Lysin hydroclorua 10 g Sắt (III) amoni xitrat 0,5 g Natri thiosu lf at (dạng khan) 0,04 g Bromcresol tía 0,02 g Thạch 15 g Nước cất 1 lít A.9.2 Chuẩn b ị Gia nhiệt để hòa tan các thành phần. Phân phối các phần 4 ml vào các ống nắp xoáy 13 mm x 100 mm. Hấp áp lực 12 min ở 121 ° C . Để cho đông đặc ở v ị trí nghiêng để tạo thành c á c đ á y 4 cm và bề mặt nghiêng 2,5 cm. pH cuối cùng đạt 6,7 ± 0,2. A.10 Canh thang trypton (tryptophan), 1 % A.10.1 Thành ph ầ n Tryptone hoặc trypticase 10 g Nước cất 1 lít A.10.2 Chuẩn bị Phân phối các phần 5 ml v à o các ống nghiệm 16 mm x 125 mm hoặc 16 mm x 150 mm. Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2. A.11 Canh thang trypticase đậu tương-tryptose A.11.1 Thành ph ầ n Canh thang trypticase đậu tương (loại k hô, bán sẵn) 15 g Canh thang tryptose (loại khô, bán sẵn) 13,5 g Chất chiết nấm men 3 g Nước cất 1 lít A.11.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong 1 lít nước. Đun nhẹ để hòa tan. Phân phối các phần 5 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 150 mm. Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 7,2 ± 0,2. A.12 Canh thang MR-VP A.12.1 Môi trường 1 A.12.1.1 Thành ph ầ n Bột nước đệm pepton 7 g Gl u cose 5 g Kali hy d ro phosphat (K 2 HP O 4 ) 5 g Nước cất 1 lít A.12.1.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong 800 ml nước có đun nh ẹ . Lọc và để nguội đến 20 °C và pha loãng đến 1 lít. Hấp áp lực từ 12 min đến 15 min ở 121 °C. pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2. A.12.2 Mô i trường 2 A.12.2.1 Thành ph ầ n Pepton casein 3,5 g Pepton thịt 3,5 g Dextrose 5 g Kali phosphat 5 g Nước cất 1 lít A.12.2.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước có đun nhẹ nếu cần. Phân phối 10 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 150 mm v à hấp áp lực 15 min ở nhiệt độ từ 118 ° C đến 121 ° C . pH cuối cùng đạt 6,9 ± 0,2. A.12.3 M ôi trường 3 A.12.3.1 Thành ph ầ n Pepton 5 g Glucose 5 g Đệm phosphat 5 g Nước c ấ t 1 lít A.12.3.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước. Phân phối 10 ml v à o các ống nghiệm 16 mm x 150 mm và hấp áp lực 12 min đến 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 7,5 ± 0,2. A.13 Thạch xitrat Simmons A.13.1 Thành ph ầ n Natri xitrat ngậm hai phân tử nước 2g Natri clorua (NaCI) 5 g Kali hydro phosphat (K 2 HPO 4 ) 1 g Amoni d ihydro phosphat (NH 4 H 2 PO 4 ) 1 g Magie sul f at (MgS O 4 ) 0,2 g Bromthymol xanh 0,08 g Thạch 15 g Nước cất 1 lít A.13.2 Chuẩn bị Đun nhẹ, thỉnh thoảng khuấy. Đ ể sôi từ 1 min đến 2 min đến khi thạch h òa tan. Cho vào các ố ng nắp xoáy 13 mm x 100 mm hoặc 16 mm x 150 mm đến 1/3 ống. Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . Trước khi môi trường đông đặc, nghiêng các ống để có các bề mặt nghiêng từ 4 cm đến 5 cm và độ sâu từ 2 cm đến 3 cm. pH cuối cùng đạt 6,8 ± 0,2. A.14 Canh thang ure A.14.1 Thành phần Ure 20 g Chất chiết nấm men 0,1 g Kali hydro phosphat (K 2 HPO 4 ) 9,1 g Natri hydro phosphat (Na 2 HPO 4 ) 9,5 g Phenol đỏ 0,01 g Nước cất 1 lít A.14.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước c ấ t. Kh ô ng gia nhiệt. K h ử trùng bằng cách lọc qua màng 0,45 µm. Phân phối vô trùng các phần từ 1,5 ml đến 3,0 ml vào các ống nghiệm 13 mm x 100 mm vô trùng. pH cuối cùng đạt 6,8 ± 0,2. A.15 Canh thang ure (chu ẩ n bị nhanh) A.15.1 Th à nh ph ầ n Ure 20 g Chất chiết nấm men 0,1 g Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) 0,091 g Natri hydro phosphat (Na 2 HP O 4 ) 0,095 g Phenol đỏ 0,01 g Nước cất 1 lít A.15.2 Chuẩn bị Chuẩn bị như Canh thang ure (A.14). A.16 Canh thang malonat A.16.1 Thành phần Chất chiết nấm men 1 g Amoni sulfat [ ( NH 4 ) 2 S O 4 ] 2 g Kali hydro phosphat (K 2 HPO 4 ) 0,6 g Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) 0,4 g Natr i clorua (NaCI) 2 g Natri malonat 3 g Dextrose 0,25 g Bromthymol xanh 0,025 g Nước cất 1 lít A.16.2 Chuẩn bị Đun để hòa tan, nếu cần. Phân ph ố i các phần 3 ml vào các ố ng nghiệm 13 mm x 100 mm. Hấp áp l ự c 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 6,7 ± 0,2. A.17 Canh thang lysin decarboxylase (Falkow) A.17.1 Thành ph ầ n Gelysate hoặc pepton 5 g Chất chiết nấm men 3 g Glucose 1 g L-Lysin 5 g Bromcresol tía 0,02 g Nước cất 1 lít A.17.2 Chuẩn b ị Đun đến khi hòa tan. Phân phối các phần 5 ml và các ống n ắ p vặn 16 mm x 125 mm. Hấp áp lực các ống đã vặn lỏng nắp trong 15 min ở 121 ° C . Vặn nắp kín khi bảo qu ả n và sau mỗi lần c ấ y. pH cuối cùng đạt 6,8 ± 0,2. A.18 Môi trường thử nghiệm tính di động (bán đặc) A.18.1 Thành ph ầ n Ch ấ t chiết thịt b ò 3 g Pepton hoặc gelysate 10 g Natr i clorua (NaCI) 5 g Thạch 4 g Nước cất 1 lít A.18.2 Chuẩn bị Gia nhiệt đồng thời khuấy và đun sôi 1-2 min để hòa tan thạch. Phân phối các phần 20 ml v à o các ống nắp xoáy 20 mm x 150 mm, thay bằng nắp lỏng. Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . Để nguội đến 45 ° C sau khi hấp áp lực. Vặn chặt nắp và bảo qu ả n lạnh ở nhiệt độ từ 5 ° C đến 8° C . Để sử dụng, làm tan chảy trong nước sôi hoặc dòng hơi nước rồi để nguội đến 45 ° C . Phân phối vô trùng các phần 20 ml vào các đ ĩ a Petri 15 mm x 100 mm vô trùng. Đậy các đĩa và đ ể cho đông đặc. Sử dụng trong ngày chuẩn bị. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2. A.19 Canh thang kal i xyanua (KCN) A.19.1 Thành phần Kali xyanua 0,075 g Proteose pepton No. 3 hoặc polypepton 3 g Natri clorua (NaCI) 5 g Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) 0,225 g Natri hydro phosphat (Na 2 HP O 4 ) 5,64 g Nước cất 1 lít A.19.2 Chuẩn bị Hòa tan các th à nh phần trên, ngoại trừ kali xyanua và hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . Để nguội rồi l à m lạnh đến nhiệt độ t ừ 5 °C đến 8 ° C . pH cuối cùng đạt 7,6 ± 0,2. Chuẩn bị dung dịch gốc kali xyanua b ằ ng cách hòa tan 0,5 g kali xyanua trong 100 ml nước cất vô trùng đ ã làm lạnh đến nhiệt độ từ 5 ° C đ ế n 8 ° C . Dùng pipet bầu, thêm 15 ml dung dịch gốc kali xyanua vào 1 lít base lạnh vô trùng. Không hút pipet bằng miệng. Sử dụng găng tay. Trộn và phân phối vô trùng các phần từ 1,0 ml đến 1,5 ml vào các ống 13 mm x 100 mm vô trùng. Dùng kỹ thuật vô trùng, nút các ống bằng nút bần No. 2 có tẩm para f in. Chuẩn bị nút bần bằng cách đun sôi trong para f in khoảng 5 min. Nút các ống bằng nút bần sao cho para f in không chảy vào canh thang mà tạo thành lớp xi giữa miệng ống v à nút bần. Bảo quản ống ở nhiệt độ từ 5 ° C đến 8 ° C kh ô ng quá 2 tuần trước khi sử dụng. A.20 Canh thang cacbohydrat phenol đ ỏ A.20.1 Thành phần Trypticase hoặc proteose pepton No . 3 10 g Natri clorua ( NaCI) 5 g Chất chiết thịt bò (tùy chọn) 1 g Phenol đ ỏ (7,2 ml dung dịch phenol đỏ 0,25 %) 0,018 g Nước c ấ t 1 lít Cacbohydrat, sử dụng một trong ba loại đường sau: Dulcitol 5 g Lactose 10 g Sacarose 10 g A.20.2 Chuẩn b ị Hòa tan cacbohydrat vào canh thang cơ bản này. Phân phối các phần 2,5 ml v à o các ống nghiệm 13 mm x 100 mm chứa các ống Durham. Hấp áp lực 10 min ở 118 ° C . pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2. Cách khác, hòa tan các thành phần, ngoại trừ cacbohydrat, trong 800 ml nước cất có đun và thỉnh thoảng khuấy. Phân phối các phần 2,0 ml vào các ống nghiệm 13 mm x 100 mm chứa các ống lên men đã úp ngược. Hấp áp lực 15 min ở 118 ° C và để nguội. Hòa tan cacbohydrat trong 200 ml nư ớ c c ấ t và khử trùng bằng cách cho dung dịch qua bộ lọc vi khu ẩ n. Thêm vô trùng 0,5 ml dịch lọc vào mỗi ống canh thang đã khử trùng sau khi làm nguội đến 45 ° C . Lắc nhẹ để trộn. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2. A.21 Canh thang cacbohydrat đ ỏ t í a A.21.1 Thành phần Proteose pepton No. 3 10 g Ch ấ t chiết thịt bò ( tùy chọn) 1 g Natri clorua (NaCI) 5 g Bromcresol tía 0,02 g Nước cất 1 lít A.21.2 Chuẩn bị Chuẩn b ị như đối với canh thang phenol đỏ cacbohydrat (A.20). pH cuối cùng đạt 6,8 ± 0,2. A.22 Thạch MacConkey A.22.1 Thành phần Proteose pepton hoặc polypepton 3 g Pepton hoặc gelysate 17 g Lactose 10 g Các muối mật No. 3 (hoặc hỗn hợp các muối m ậ t): 1,5 g Natri clorua (NaCI) 5 g Đ ỏ trung t í nh 0,03 g T í m tinh thể 0,001 g Thạch 13,5 g Nước cấ t 1 lít A.22.2 Chuẩn bị Tạo huy ề n phù các thành phần và đun có khuấy để hòa tan. Để sôi trong từ 1 min đến 2 min. Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C , đ ể nguội đến nhiệt độ từ 45° C đến 50 ° C, v à rót các phần 20 ml vào các đ ĩ a Petri 15 mm x 100 mm vô trùng. Để khô ở nhiệt độ phòng, có đậy nắp. Không dùng các đĩa ẩm. pH cuối cùng đạt 7,1 ± 0,2. A.23 Canh thang và thạch dịch tim não (BHI) A.23.1 M ô i trường 1 A.23.1.1 Thành phần Dịch não b ê 200 g Dịch tim bò 250 g Proteose pepton hoặc gelysate 10 g Natri clorua (NaCI) 5 g Na 2 HP O 4 ·12H 2 O 2,5 g Dextrose 2 g Nước cất 1 lít A.23.1.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước cất, có đun nhẹ. Phân phối canh thang vào các chai hoặc các ống nghiệm để bảo. Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2. A.23.2 Môi trường 2 A.23.2.1 Thành ph ầ n Bột tim não 6 g Pepton thịt 6 g Natri clorua (NaCI) 5 g Dextrose 3 g Pepton gelatin 14,5 g Natri hydro phosphat (Na 2 HP O 4 ) 2,5 g Nước c ấ t 1 lít A.23.2.2 Chuẩn bị Tạo huyền phù các thành phần Môi trường 2 trong nước cất và đun trong 1 min để hòa tan hoàn toàn. Đối với c ả M ô i trường 1 và Môi trường 2, phân phối canh thang vào cả hai và ống nghiệm để b ả o quản. Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2. Có thể dùng B HI có bán sẵn. Để chu ẩ n bị thạch tim não, thêm 15 g thạch vào 1 lít canh thang BHI. Đun để hòa tan thạch trước khi phân phối vào các chai hoặc các bình nón. Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . A.24 Thạch máu tryptose c ơ bản A.24.1 Thành phần Tryptose 10 g Ch ấ t chiết thịt bò 3 g Natri clorua (NaCI) 5 g Thạch 15 g Nước cất 1 lít A.24.2 Chuẩn b ị Tạo huyền phù các thành phần trong nước cất, trộn kỹ và gia n hiệt, thỉnh thoảng khuấy. Đ ể sôi khoảng 1 min. Cho vào các ố ng 16 mm x 150 mm đến 1/3 ống và đậy n ắ p hoặc vặn nút để duy tr ì các điều kiện hiếu khí. Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . Trước khi môi trường đông đặc, nghiêng các ống để có các bề mặt nghiêng từ 4 cm đến 5 cm và độ sâu từ 2 cm đến 3 cm. A.25 Dung dịch papa i n , 5 % (khối lượng/thể tíc h ) A.25.1 Thành ph ầ n Papain 50 g Nước cất 1 lít A.25.2 Chuẩn bị Thêm papain vào nước cất vô trùng và xoay b ì nh để hòa tan hoàn toàn. Phân phối các phần 100 ml vào các chai. A.26 Thu ố c thử Kovacs A.26.1 Thành ph ầ n p-Dimethylam i nobenzaldehyde 5 g 2-Metylbutan-2-ol (amyl alcohol) 75 ml Axit clohydric (HCI) đ ặc 25 ml A.26.2 Chuẩn bị Hòa tan p-dimethylaminobenzaldehy d e trong amyl alcohol. Thêm t ừ từ axit clohydric (HCI) đặc. Bảo quản ở 4 ° C . Để thử indo l , thêm từ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử đã chuẩn bị vào 5 ml ch ủ ng cấy vi khuẩn trong canh thang trypton 24 h. Phản ứng dương tính indol nếu có màu đỏ sẫm trên lớp bề mặt. A.27 Các thu ốc thử Voges-Proskauer (VP) A.27.1 Thành ph ầ n Dung dịch 1: alpha-Naphthol 5 g Etanol (tuyệt đối) 100 ml Dung dịch 2: Kali hydroxit 40 g Nước cất đến 100 ml A.27.2 Chuẩn bị Phép th ử Voges-Proskauer (VP). Ở nhiệt độ phòng, chuy ể n 1 ml ch ủ ng cấy 48 h vào ống nghiệm và thêm 0,6 ml dung dịch 1 và 0,2 ml dung dịch 2. Lắc sau khi thêm mỗi dung d ịch. Để t ă ng cường độ và tốc độ ph ả n ứng, thêm vài tinh thể creatin vào hỗn hợp. Đọc kết quả 4 h sau khi thêm các thuốc thử. Phản ứ ng dương t í nh nếu xuất hiện màu hồng eos i n. A.28 Dung dịch kali hydrox i t , 40 % (khối lượng/thể tích) Kali hydroxit (KOH) 40 g Nước cất vừa đủ 100 ml A.29 Nước muối vô trùng , 0,85 % A.29.1 Thành ph ầ n Natri clorua (NaC l ) 8,5 g Nước c ấ t 1 lít A.29.2 Chuẩn b ị Hòa tan 8,5 g natri clorua trong nước. Hấp áp lực 15 min ở 121 °C. Để nguội đến nhiệt độ phòng. A.30 Nước muối formalin A.30.1 Thành phần Dung dịch f ormaldehyde (từ 36 % đến 38 %) 6 ml Natri clorua (NaCI) 8,5 g Nước cất 1 lít A.30.2 Chuẩn b ị Hòa tan 8,5 g natri clorua trong 1 lít nước cất. Hấp áp lực 15 mi n ở 121 ° C . Để nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm 6 ml dung dịch formaldehyde. Không hấp áp lực sau khi thêm f ormal d ehyde. A.31 Ch ấ t ch ỉ thị metyl đ ỏ A.31.1 Thành phần Mety l đ ỏ 0,1 g Etanol (95 %) 300 ml Nước cấ t 500 ml THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [ 1] TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Cor 1:2004) Vi sinh vật trong t hực ph ẩ m và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Salmonella trên đ ĩ a thạch [2] TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật. [3] TCVN 8128-1:2009 (ISO/TS 11133-1:2009) Vi sinh vật trong thực ph ẩ m và thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị và sản xuất môi trường nuôi cấy - Phần 1: Hướng dẫn chung về đ ả m bảo chất lượng đối với việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong phòng th ử nghiệm. [4] FDA, Bacteriological Analytical Manual , Chapter 5, Salmonella