TCVN8400-29:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-29:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 29: Bệnh Lympho Leuko ở gà TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-29:2015 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 29: BỆNH LYMPHO LEUKO Ở GÀ Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 29: Lymphoid leukosis of chicken Lời nói đầu TCVN 8400-29:2015 do Trung tâm Ch ẩ n đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, T ổ ng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm 38 phần: - TCVN 8400-1 : 2010, phần 1: Bệnh lở mồm long móng; - TCVN 8400-2 : 2010, ph ầ n 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên l ợ n; - TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn; - TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn; - TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng; - TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ; - TCVN 8400-7 : 2011, ph ầ n 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê; - TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm; - TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I; - TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò; - TCVN 8400-11 : 2011, phần 11: Bệnh d ịch t ả vịt; - TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà; - TCVN 8400-13 : 2011, phần 13: Bệnh s ả y thai truyền nhiễm do Brucela; - TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-15 : 2011, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira; - TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli; - TCVN 8400-17 : 2011, ph ầ n 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà; - TCVN 8400-18 : 2014, ph ầ n 18: Bệnh phù đầu gà (coryza); - TCVN 8400-19 : 2014, ph ầ n 19: Bệnh phó thương hàn lợn; - TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng d ấ u lợn; - TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh s ả n và hô hấp ở lợn(PRRS); - TCVN 8400-22 : 2014 phần 22: Bệnh giả dại ở l ợ n; - TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán; - TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm; - TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm l ợ n; - TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1; - TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh s á n l á gan; - TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại t ử do Clostri d ium per f ringens; - TCVN 8400-29 : 2015, ph ầ n 29: Bệnh Lympho leuko ở gà; - TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà; - TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm; - TCVN 8400-32 : 2015, ph ầ n 32: Bệnh gumboro ở gia cầm; - TCVN 8400-33 : 2015, ph ầ n 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở tr â u bò; - TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh theileria ở trâu bò; - TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2; - TCVN 8400-37 : 2015, ph ầ n 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn; - TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus. BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 29: BỆNH LYMPHO LEUKO Ở GÀ Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 29: Lymphoid leukosis of chicken CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các v ậ t liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không th ể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này ph ả i tự thiết lập các thao tác an toàn sức kh ỏ e thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh Lympho leuko do virus thuộc nhóm Leukovirus gây ra ở gà. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: 2.1. Bệnh Lympho leuko (Lymphoid leukosis of chicken) Bệnh do virus thuộc nhóm Leukovir u s , giống Alpharetrovirus , họ Retroviridae gây ra ở gà, đặc trưng của bệnh là tăng sinh cao độ tế bào lympho non, hình thành các khối u n ằ m rải rác hoặc tràn lan trong các cơ quan nội tạng. CHÚ THÍCH: Virus gây bệnh Lympho leuko được chia thành các ph â n nh ó m A, B, C, D và J dựa tr ê n sự khác biệt đặc tính kháng nguyên glyc o protein. Virus g â y bệnh Lympho leuko nhân l ê n ở hầu hết các mô, cơ quan trong cơ thể. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Ch ỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước c ấ t, nước khử khoáng hoặc nước c ó độ tinh khiết tương đ ương, trừ khi có quy định khác. 3.1. Thuốc thử và vật liệu thử d ùng cho phương pháp para f in 3.1.1. Formalin , dung dịch 10 % (thể tích) Chuẩn bị từ d ung dịch f ormaldehyde 38 % và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (xem Phụ lục A) với tỷ lệ 1:9 (thể tích). 3.1.2. Etanol 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối. 3.1.3. Xylen. 3.1.4. Haematoxylin. 3.1.5. Eosin. 3.1.6. Parafin , có độ nóng ch ả y từ 56 o C đến 60 o C. 3.1.7. Keo dán lamen. 3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp realtime RT-PCR (phản ứng phiên mã ngược chuỗi polymerase theo thời gian thực) 3.2.1. Dung dịch PBS , pH 7,0 (xem Phụ lục A). 3.2.2. Etanol tuyệt đối. 3.2.3. M ẫ u ARN (axit ribonucleic) kiểm chứng dương , chiết tách từ virus gây bệnh Lympho leuko, có giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) đã biết trước. 3.2.4. Kít tách chiết ARN. 3.2.5. Kít nhân gen. 3.2.6. Bộ mồi và mẫu dò (primers và probe). 3.2.7. Dung d ịch đệm TE (Tris-axit etylen d iamintetraaxetic). 3.2.8. Nước, tinh khiết không có nuclease. 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau: 4.1. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp parafin 4.1.1. Khuôn nhựa , loại chuyên dụng cho l à m tiêu b ả n vi thể. 4.1.2. Máy xử lý mẫu mô tự động. 4.1.3. Nồi đun parafin , có thể duy trì ở nhiệt độ từ 56 o C đến 65 o C. 4.1.4. Khay sắt , loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi th ể . 4.1.5. Máy làm lạnh , có thể duy trì ở nhiệt độ từ âm 10 o C đến 4 o C. 4.1.6. Máy cắt tiêu bản , cắt ở độ mỏng từ 3 m m đến 5 m m. 4.1.7. Nồi dãn tiêu bản , có thể làm nóng nước ở nhiệt độ từ 35 o C đến 65 o C. 4.1.8. Phiến kính , vô trùng. 4.1.9. Lamen , vô trùng. 4.1.10. Bộ cốc nhuộm tiêu bản. 4.1.11. Kính hi ể n vi quang học , vật kính 4 X, 10 X, 20 X, 40 X, 60 X. 4.2. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp realtime RT-PCR 4.2.1. Máy nhân gen (realtime PCR). 4.2.2. Máy spindo w n. 4.2.3. T ủ lạnh âm sâu , có thể duy trì nhiệt độ từ âm 20 o C đến âm 80 o C. 4.2.4. Máy ly tâm , có thể tạo gia tốc ly tâm 3 000 g , 6000 g và 20 000 g . 4.2.5. Máy lắc , có thể hoạt động với tốc độ 200 r/min đến 2 500 r/min. 4.2.6. Cối chày sứ , vô trùng. 5. Chẩn đoán lâm sàng 5.1. Đặc điểm d ị ch tễ - Gà con từ 1 ngày tuổi đến 10 ngày tuổi dễ nhiễm bệnh, nhưng không có biểu hiện lâm sàng. - Thường gà trên 16 tuần tuổi các triệu chứng của bệnh mới th ể hiện rõ; - T ỷ lệ ốm và chết cao nhất thường ở gà từ tuần tu ổ i thứ 24 đến tuần tuổi thứ 26; - Virus thường gây bệnh phổ biến ở các đàn gà công nghiệp; - Virus gây bệnh Lympho leuko lan truyền chủ yếu qua trứng. Có thể lây lan qua tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp. 5.2. Triệu chứng lâm sàng Triệu chứng bệnh Lympho leuko thường không điển hình: - Gà thường ủ rũ, mệt mỏi, kém ăn, gầy và ỉa ch ả y; - Mào yếm nhợt nhạt, thiếu máu; - Xoang bụng căng phồng; - Ở gà đẻ giảm s ả n lượng trứng. 5.3. Bệnh tích đại thể - Bệnh tích đặc trưng của bệnh Lympho leuko là sự hình thành các khối u: khối u thường mềm, nhẵn và bóng, mặt cắt có màu xám nhạt đến màu trắng kem, hiếm khi có vùng hoại tử. Khối u có thể là dạng u cục, dạng hạt kê, dạng lan tràn hoặc hỗn hợp các dạng này; - Dạng u cục thường có đường kính từ 0,5 cm đến 5 cm, thường dạng hình cầu hoặc dạng phẳng trên bề mặt tổ chức; - Dạng hạt kê gồm các u nh ỏ có đường kính dưới 2 mm, đồng đều và phân bố ở khắp nhu mô; - Dạng lan tràn: các cơ quan sưng to, màu xám nhạt, dễ nát; - Gan, lách, thận: sưng to, có các khối u; - Có khối u ở túi Fabricius, đ ô i khi thấy ở tủy xương; - Gan: thường b ở , nhạt màu; trên bề mặt có các u cục màu trắng xám, nhỏ bằng đầu đinh ghim hoặc to n ổ i ghồ lên bề mặt. 5.4. Chẩn đoán phân biệt về lâm sàng Chẩn đoán phân biệt về lâm sàng g iữa bệnh Lympho leuko và bệnh Marek theo Bảng 1. B ả ng 1 - So sánh triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể trên gà nhiễm bệnh Đặc điểm Bệnh Lympho leuko Bệnh Marek L ứ a tu ổ i mắc bệnh Từ 16 tuần tuổi tr ở lên Từ vài ngày tuổi tr ở lên Triệu chứng Triệu chứng thường không đặc trưng Gà thường bị liệt chân, s ã cánh Bệnh tích đại thể Dây thần kinh ngoại vi sưng to Không có Thường xuyên Túi Fabricius Có các u cục Teo nhỏ hoặc sưng to U ở dạ dày tuyến, da, cơ Không có Có thể có 6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1. Phương pháp parafin phát hiện bệnh Lympho leuko 6.1.1. Lấy mẫu Chọn từ 3 con g à đến 5 con gà c ó triệu chứng điển hình mổ l ấ y các bệnh ph ẩ m sau: - Dây thần kinh: lấy hai dây thần kinh đùi và hai đây thần kinh cánh, độ dài khoảng 2 cm; - Gan: lấy phần gan nghi có bệnh tích với độ dày khoảng 0,5 cm; - Lách, thận: cắt một miếng với độ dày khoảng 0,5 cm; - Túi Fabricius: cắt ngang túi Fabricius; - N ã o: m ở hộp sọ, lấy phần đại n ã o và tiểu não; - Bệnh ph ẩ m d a: lấy phần da có các nang lông sưng t o. Các mẫu bệnh phẩm trên cho vào lọ chứa f ormalin (3.1.1) sao cho th ể tích mẫu bệnh ph ẩ m và f ormalin có tỷ lệ khoảng 1:10, ghi k ý hiệu mẫu trên lọ. CHÚ THÍCH: Đ ồ ng th ờ i kèm theo Phi ế u gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu c ầ u x ét nghiệm và những th ô ng tin về dịch t ễ , các biểu hiện triệu chứng, bệnh t ích của bệnh. 6.1.2. Bảo quản mẫu Mẫu bệnh ph ẩ m (6.1.1) được đảm bảo ngập trong f ormalin (3.1.1), tránh đổ vỡ, rơi vãi f ormalin (3.1.1) ra ngoài môi trường; khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, bao gói l ọ chứa mẫu bằng t ú i nilon, miệng túi được dán kín. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bổ sung hoặc thay mới formalin (3.1.1), đảm bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin đạt tỷ lệ khoảng 1:10. 6.1.3. Chuẩn bị mẫu - M ẫ u bệnh phẩm được cố định trong d ung d ịch formalin (3.1.1) trong 24 h; - Cắt các bệnh phẩm đ ã cố định trên thành miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm rồi đặt vào khu ô n nhựa (4.1.1). 6.1.4. Cách tiến hành 6.1.4.1. Đúc khuôn - Rửa khuôn nhựa (6.1.3) dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % ( thể tích) (3.1.2) thời gian t ừ 2 đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa v à o cốc etanol tuyệt đ ố i (3.1.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào c ố c parafin (3.1.6) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; CHÚ THÍCH: N ế u sử dụng máy xử lý m ẫ u mô tự độ n g (4.1.2) thì tiến hành tiếp theo từ bước ng â m eta n ol. - Đúc khuôn: rót parafin (3.1.6) nóng chảy từ nồi đun parafin (4.1.3) vào khay sắt (4.1.4), gắp bệnh phẩm từ khuôn nhựa đặt vào khay sắt, đặt khuôn nhựa (4.1.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối parafin. 6.1.4.2. Cắt tiêu bản - Cắt gọt khối paraffin (6.1.4.1) cho b ằ ng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh tiêu bản (4.1.5); - Đặt khối para fi n lên máy cắt tiêu bản (4.1.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lư ỡ i dao, cắt b ỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các bệnh phẩm, điều ch ỉ nh độ dày của lát cắt từ 3 m m đến 5 m m, cắt một vài lát; - Chọn lát cắt phẳng th ả vào nồi dãn tiêu bản (4.1.7) với nhiệt độ nước từ 35 o C đến 40 o C. Dùng phiến kính (4.1.8) vớt lát cắt. Dựng nghiêng tiêu bản và để khô. 6.1.4.3. Nhuộm tiêu bản - Ngâm tiêu bản (6.1.4.2) vào cốc xylen (3.1.3) 3 lần, thời gian mỗi l ầ n từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản v à o cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ng â m tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Rửa tiêu bản dưới vòi nước ch ả y, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.1.4), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ng â m tiêu bản vào c ố c thuốc nhuộm eosin (3.1.5), thời gian từ 60 s đến 90 s; - Rửa dưới vòi nước ch ả y, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Loại bỏ nước còn bám trên ti ê u b ả n b ằ ng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đ ối (3.1.2) 3 lần, thời gi a n mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.1.3) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 m in đến 3 min; gắn lamen (4.1.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.1.7). Để kh ô , soi tiêu bản dưới k í nh hiển vi quang học (4.1.11). 6.1.5. Đọc kết quả [ 1 ] U lympho thường có ở các cơ quan nội tạng như gan, lách, thận, túi Fabricius: - Các u lympho ở gan: gồm các nguyên bào lympho tràn lan hoặc thành đám tập trung trong nhu mô gan; các tế bào này có kích thước và màu sắc đồng nhất, nhân to bắt màu haematoxylin đậm; - Các u lympho ở lách: r ả i rác tăng sinh các tế bào lympho m à u sắc và kích thước đồng nhất; - Túi Fabricius: tăng sinh các nguyên bào lympho trong các nang lympho; - Dây th ầ n kinh, não, da, nang l ô ng: khôn g có các tế b ào viêm xâm nhập. 6.1.6. Chẩn đoán phân biệt về bệnh tích vi th ể Ch ẩ n đoán phân biệt về bệnh tích vi thể giữa bệnh Lympho leuko và bệnh Marek t heo Bảng 2. B ả ng 2 - So sánh bệnh tích vi thể Đặc điểm Bệnh Lympho leuko Bệnh Marek Bệnh tích ở d â y thần kinh ngoại biên Không có Thường xuyên có tế bào viêm xâm nhập U cục ở gan Các tế bào tăng sinh rải rác hoặc tràn lan Các tế bào tăng sinh thường ở ngoại vi mạch quản U cục ở lách Các tế bào tăng sinh rải rác Các tế bào tăng sinh tràn lan Túi Fabricius Các tế bào tăng sinh rải rác trong các nang Các tế bào t ă ng sinh ở giữa các nang và/hoặc nang bị teo giảm Tế bào lympho tăng sinh ở da, nang lông Không có Thường xuyên Bệnh tích ở hệ thần kinh trung ương Không có Có thể có Tế bào ở các u cục Các nguyên bào lympho đồng đều về kích thước, màu sắc Các tế bào lympho không đồng nhất gồm: các nguyên bào lympho, tế bào lympho lớn, trung b ì nh, nh ỏ và tế bào lưới 6.2. Phương pháp realtime RT-PCR phát hiện virus gây bệnh Lympho leuko 6.2.1. Lấy mẫu Chọn từ 3 con gà đến 5 con gà c ó triệu chứng điển hình m ổ lấy gan, lách, túi Fabricius (khối lượng t ổ ng các loại từ 3 g đến 5 g) cho vào t úi hoặc lọ đựng mẫu vô trùng, ghi ký hiệu mẫu trên túi. 6.2.2. Bảo qu ả n m ẫ u Mẫu bệnh phẩm (6.2.1) đựng trong túi hoặc lọ và bảo quản trong thùng lạnh (có nhiệt độ từ 2 o C đến 8 o C) và gửi đến phòng thí nghiệm không quá 48 h. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa tiến hành xét nghiệm ngay, mẫu phải được bảo quản trong tủ lạnh âm 20 o C (4.2.3). CHÚ THÍCH: Đ ồ ng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ y ê u c ầ u xét nghiệm và những thông tin v ề dịch t ễ , các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh. 6.2.3. Chuẩn bị m ẫ u Lấy 1 g mẫu bệnh phẩm gồm gan, lách, túi Fabricicus (6.2.1 ) cắ t nhỏ rồi nghiền với dung dịch PBS theo tỉ lệ 1 : 10 thành huyễn dịch trong cối chày sứ (4.2.6). Ly tâm (4.2.4) huyễn dịch ở gia tốc 3 000 g trong thời gian 5 min rồi hút lấy dịch n ổ i đ ể tách chiết ARN để thực hiện phản ứng realtime RT- PCR. 6.2.4. Cách tiến hành 6.2.4.1. Tách chiết ARN Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.4) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất . VÍ DỤ: sử dụng Kit tách chiết ARN (Qiagen RNeasy mini kit, Cat. No. 74104) 1) (xem Phụ lục B). 6.2.4.2. Chuẩn bị mồi Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.2.1) theo phương pháp realtime RT- PCR khuếch đại đoạn gen đ ặc hiệu của virus gây bệnh Lympho leuko sử dụng cặp mồi và mẫu dò (primers và probe) (3.2.6) được nêu trong Bảng 3. Bảng 3 - Cặp mồi, mẫu d ò [ 4 ] Mẫu dò, mồi Trình tự từ 5’ đến 3’ Mẫu dò FAM -CCTGGGAAGGTGAGCAAGAAG- BHQ1 Mồi xuôi TTGCAGGCATTTCTGACTGG Mồi ngược ACACGTTTCCTGGTTGTTGC Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau: - Chuẩn bị mồi g ố c và mẫu dò gốc: mồi v à mẫu dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.2) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s đ ể mồi lắng xuống đáy ống trước khi m ở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng d ung dịch đệm TE (3.2.7) để hoàn nguyên mồi và mẫu dò ở nồng độ 100 m M làm mồi gốc và mẫu dò gốc; - Chuẩn b ị mồi sử dụng ở nồng độ 20 m M: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (20 m l m ồ i gốc và 80 m l nước (3.2.8)); - Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 6 pM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (6 m l mồi gốc và 94 m l nước (3.2.8)). 6.2.4.3. Tiến hành ph ả n ứng realtime PCR Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đ ã được chuẩn bị (6.2.4.2). Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. VÍ DỤ: Dùng k í t nhân gen của Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR system (Cat # 11732 - 020) 2) . Thành ph ầ n cho 1 ph ả n ứng được nêu trong bảng 4. B ả ng 4 - Thành phần phản ứng Thành phần Thể tích, m l Reaction Mix 2X 12,5 Hỗn hợp Enzym (Enzyme mix) 0,5 Mồi/mẫu dò 1 , 5 Nước tinh khiết không có nuclease 5 , 5 Tổng thể tích 20,0 Chuyển 20 m l hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng: - M ẫ u ki ể m chứng dương: cho 5 m l mẫu ARN có giá trị Ct đã biết trước vào ống phản ứng. - Mẫu kiểm chứng âm: cho 5 m l nước (3.2.8) vào ố ng phản ứng. - M ẫ u bệnh phẩm: cho 5 m l mẫu ARN (phụ lục B ) vào ống phản ứng. CHÚ Ý: - Phản ứng realtime RT- PCR phải bao g ồ m: mẫu bệnh p hẩ m, m ẫ u kiểm chứng dương, mẫu kiểm chứng âm. - M ẫ u v à nguy ê n v ậ t liệu cho phản ứng realtime RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng. Tiến hành phản ứng b ằ ng máy realtime PCR (4.2.1) đã đ ược cài đặt chu trình nhiệt nêu trong bảng 5. B ả ng 5 - Chu trình nhiệt phản ứng Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 50 o C 15 min 1 95 o C 5 min 1 95 o C 10 s 40 60 o C 40s 40 6.2.5. Đọc kết quả Đọc kết quả b ằ ng máy reatime PCR (4.2.1) dựa trên giá trị Ct (Ct là thời điểm máy đ ọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền) Điều kiện phản ứng được công nhận: mẫu kiểm chứng dương t í nh có giá trị Ct biết trước ( ± 2 Ct), mẫu kiểm chứng âm tính không có Ct; V ớ i điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct £ 35 được coi là dương t í nh; mẫu không có Ct được coi l à âm tính; mẫu có giá trị 35 < Ct £ 40 được coi là nghi ngờ; Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại theo quy trình hoặc bằng phương pháp khác để khẳng định. 7. Kết luận Gà đư ợ c xác định mắc bệnh Lympho leuko khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu ch ứ ng lâm sàng, bệnh tích đại thể đặc trưng của bệnh và d ương tính với một trong hai phương pháp xét nghiệm quy định trong tiêu chuẩn này. PHỤ LỤC A (Quy định) CHUẨN BỊ DUNG DỊCH MUỐI ĐỆM PHOSPHAT (PBS) A.1 . Thành ph ầ n Natri hydrophosphat (Na 2 HP O 4 ) 9,47 gm Kali dihydrophosphat (KH 2 PO 4 ) 9,08 gm Nước cất 900 ml A.2 . Chuẩn bị Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Ch ỉ nh pH đến 7,0 bằng axit clohydric. CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương m ạ i và pha theo hướng d ẫ n của nhà s ả n xu ấ t. PHỤ LỤC B (Tham khảo) QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ARN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ARN có sử dụng h óa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các h óa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này. Qui trình tách chiết ARN sử dụng k í t QIAGEN RNeasy miniKit (CAT. No. 74104) như sau: - Lấy 600 m l dung dịch RLT (lysis buffer) cho vào ống 1,5 ml; - Lấy 200 m l mẫu (dịch nổi) (6.2.3) vào ống có chứa dung dịch RLT. Lắc ống bằng máy lắc (4.2.5) trong 15 s; - Cho 400 m l etanol tuyệt đối. Lắc ống bằng máy lắc trong 15 s; - Chuyển 600 m l dung dịch sang cột lọc (dùng cho tách chiết ARN) đựng trong ống thu; ly tâm (4.2.4) với gia tốc 6 000 g trong 15 s; - Đổ bỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống thu và lặp lại bước trên với 600 m l dung dịch còn lại; - Lấy 700 m l dung dịch RW1 nhỏ vào cột lọc, ly tâm với với gia tốc 6 000 g trong 15 s. Đổ b ỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống; - Lấy 500 m l RPE nh ỏ vào cột lọc , ly tâm v ới gia tốc 6 000 g trong 15 s: Đổ b ỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống. Lặp lại bước n à y 1 l ầ n nữa; - Chuyển cột lọc sang ống thu mới. Ly tâm cột lọc với gia tốc 12 000 g trong 2 min; - Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml Free-RNase; - Nh ỏ 50 m l nước sạch Rnase vào cột lọc, ủ trong 1 min ở nhiệt độ phòng; - Ly tâm với gia tốc 10 000 g trong 2 min; - B ỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml có chứa ARN; - Giữ mẫu ARN ở 4 o C trong ngày nếu chạy phản ứng realtime RT-PCR ngay và giữ ở âm 20 o C để lưu mẫu trong thời gian dài. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Aly M. Fadly, Laurence N. Payne, 2008, Disease o f poultry , p.449 - p.616. [2] Laurence N. Payne, 2008, Poultry disease , 6 th Edition. Saunders Elsevier, p.276 - p.293. [3] Nguyễn Vĩnh Phước, 1978, Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc [4] Liting Qin, Yulong Gao, Wei Ni, Meiyu Sun, Yongqiang Wang, Chunhong Yin, Xiaole Qi, Honglei Gao, and Xiaomei Wang (2013), “Development and Application of Real-Time PCR for Detection of Subgroup J Avian Leukosis Virus ” , J. Clin Microbiol . 2013 Jan; 51(1): 149-154 [5] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, L ê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thuý, 2012. Gi á o trình bệnh truyền nhiễm thú y . NXB Đại học Nông nghiệp. [6] L.N. Payne & K. Venugopal, “Neoplastic diseases: Marek ’ s disease, avian leukosis and reticuloendotheliosis ” , Rev. sci. tech. Off. int. cpiz ., 2000,19 (2), 544-564 Available at: http://wvw.oie.in t/ doc/ged/D9316.PDF [7] Wang et al., “Avian leukosis virus subgroup J associated with the outbreak of erythroblastosis in chickens in China”. Virology Journal , 2013 10:92. Available at: http://www.virologyj.com/conten t/ pdf/1743-422X-10-92.pdf . [8] Lymphoid Leukosis in Poultry . Available at: http://www.merckmanuals.com/ve t/ poultry/neoplasms/lympho i d _l eukosis _i n_poultry.html [9] Lymphoid Leukosis . Available at: http:// w ww.thepoultrysite.com/publications/6/diseases-of-poultry/202/lymphoid-leukosis 1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng ti ê u chu ẩ n và kh ô ng ấn đ ị nh sử dụng s ả n phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự n ế u cho các k ế t qu ả tư ơ ng đương. 2) Th ô ng t in này đ ưa ra tạo đ iề u kiện thu ậ n tiện cho ng ườ i sử dụ n g ti ê u chuẩn và không ấ n đị nh sử dụng sản phẩm của nh à cung c ấ p này. Có thể sử dụng các s ả n ph ẩ m tương tự nếu cho các kết quả tươn g đương.