TCVN8179:2009

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8179:2009 (ISO/TS 17837 : 2008) về Sản phẩm phomat chế biến - Xác định hàm lượng nitơ và tính hàm lượng protein thô - Phương pháp Kjeldahl TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8179 : 2009 ISO/TS 17837 : 2008 SẢN PHẨM PHOMAT CHẾ BIẾN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ VÀ TÍNH HÀM LƯỢNG PROTEIN THÔ - PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL Processed cheese products - Determination of nitrogen content and crude protein calculation - Kjeldahl method Lời nói đầu TCVN 8179 : 2009 ho à n toàn tương đương với ISO/TS 17837 : 2008; TCVN 8179 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản ph ẩ m sữa bi ê n soạn, Tổng cục Ti ê u chuẩn Đo lường Ch ấ t lượng đ ề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ c ô ng bố. SẢN PHẨM PHOMAT CH Ế BIẾN - X Á C ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ VÀ TÍNH HÀM LƯỢNG PROTEIN THÔ - PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL Processed cheese products - Determination of nitrogen content and crude protein calculation - Kjeldahl method CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn qui định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Ti ê u chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng nitơ theo nguy ê n tắc Kjeldahl và t í nh hàm lượng protein thô trong sản phẩm phomat chế biến , có sử dụng cả hai phương pháp t ruyền thống v à ph â n hủy kín CHÚ TH Í CH : Các kết quả protein thô sẽ không chính xác nếu nguồn nitơ không phải từ sữa c ó trong sản phẩm phomat chế bi ế n qui đ ị nh. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau r ấ t cần thi ế t cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đ ố i với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phi ê n bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phi ê n bản mới nh ấ t, bao gồm c ả các sửa đổi, b ổ sung (nếu c ó ). TCVN 7149 (ISO 385), Dụng cụ thí nghiệm b ằ ng thuỷ tinh - Buret. TCVN 7153 : 2002 (ISO 1042 : 1998), Dụng cụ thí nghiệm bằng thuỷ tinh - B ì nh định mức. ISO 4788, Laboratory glassware - Graduated measuring cylinders. 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chu ẩ n này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 3.1 . Hàm lượng nitơ (nitrogen content) Ph ầ n khối lượng của nitơ xác định được b ằ ng phương pháp qui định trong tiêu chu ẩ n này . CHÚ TH Í CH : Hàm lượng nitơ được tính bằng phần tr ă m khối l ượ ng. 3.2 . Hàm lượng protein thô (crude protein content) Phần khối lượng của protein th ô t í nh được theo qui định trong tiêu chuẩn n à y CHÚ TH Í CH : Hàm lượng protein thô được t í nh b ằ ng ph ầ n trăm khối lượng 4. Nguyên tắc Phần mẫu th ử được phân hủy bằng hỗn hợp axi t sulfuric đậm đặc và kali sulfat. Dùng đồng (II) sulfat làm ch ấ t xúc tác đ ể chuy ể n nitơ h ữ u cơ thành amoni su l fat. Kali sulfat được dùng để nâng điểm sôi của axit sulfuric và cung cấp hỗn hợp oxi hóa mạnh hơn đ ể phân hủy. Bổ sung một lượng natri hydroxit dư v à o dịch phân hủy nguội đ ể giải ph ó ng amoniac. Amoniac giải ph ó ng được chưng c ấ t b ằ ng hơi nước vào dung dịch axit clohydric dư v à được chu ẩ n độ b ằ ng dung dịch axit clohydric thể tích chu ẩ n. Hàm lượng nitơ được t í nh từ lượng amoniac tạo thành và hàm lượng protein th ô từ hàm lượng nitơ thu được. 5. Thuốc thử Ch ỉ sử dụng các thuốc thử l oại tinh khi ế t phân tích và nước c ấ t hoặc nước đ ã loại ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có qui định khác. 5.1. Kali sulfat (K 2 S O 4 ), không chứa nitơ. 5.2. Đ ồ ng (II) sulfat ngậm n ă m phân tử nước , r (CuS O 4 .5H 2 O ) = 5,0 g/100 ml. Dùng nước hòa tan 5,0 g đồng (II) sulfat ngậm năm ph â n tử nước trong b ì nh định mức một vạch 100 ml (6.8). Thêm nước đ ế n vạch và trộn. 5.3. Axit sulfuric (H 2 SO 4 ), từ 95 % đến 98 % khối lượng, không chứa nitơ, [ r 20 (H 2 SO 4 ) ≈ 1,84 g/ml]. 5.4. Dung dịch n a tr i hydroxit , không chứa nitơ, có chứ a 50 g natri hydroxit (NaOH) trên 100 g (khối lượng natri hydroxit, W NaOH = 50 %). Nếu việc bịt kín hệ thống thổi trong thiết bị chưng c ấ t tự động gặp phải vấn đề th ì sử dụng dung dịch có W NaOH = 40 %. 5.5. Dung d ị ch ch ấ t ch ỉ thị 5.5.1. H òa tan 0,1 g đỏ metyl trong etanol 95 % (th ể t í ch) trong bình định mức một v ạ ch 50 ml (6.8). Thêm etanol đến vạch 50 ml và trộn. 5.5.2. Hòa tan 0,5 g xanh bromocresol trong etanol 95 % ( thể tích ) trong bình đ ị nh mức một vạch 250 ml (6.8). Thêm etanol tương tự đến vạch 50 ml và t rộn. 5.5.3. Trộn một thể tích metyl đỏ (5.5.1) và năm thể tích xanh bromocresol (5.5.2) hoặc kết hợp v à trộn lẫn cả hai dung dịch. 5.6. Dung dịch axit boric , r ( H 3 BO 3 ) = 40,0 g/l Hòa tan 40 g axit boric (H 3 BO 3 ) trong 1 l n ướ c nóng trong bình định mức một vạch 1 000 ml (6.8). Để cho bình và lượng ch ứ a b ê n trong nguội đến 20 o C . Thêm nước đến vạch, sau đó thêm 3 ml dung dịch chỉ thị (5.5.3) và trộn. Bảo qu ả n dung dịch có màu v à ng cam nhạt này trong chai thủy tinh bo silicat. Bảo vệ dung dịch tránh ánh sáng mặt trời vả các nguồn amoniac trong suốt quá trình bảo quản. CHÚ TH Í CH : Nếu dùng m á y đo pH điện t ử chu ẩ n độ đi ể m cu ố i, thì có thể bỏ qua việc b ổ sung dung d ị ch chị thị (5 . 5 . 3) v à o dung dịch axit boric. M ặ t khác, việc đổi màu cũng c ó th ể được sử dụng để kiểm tra các qui trình chu ẩ n độ đúng . 5.7. Dung dịch chuẩn axit clohydric , c (HCI) = (0,1 ± 0,000 5) mol/l N ê n mua dung dịch chuẩn axit clohydric đ ã chuẩn hóa trước từ nhà sản xuất có uy t í n. Sử dụng các dung dịch đã chuẩn hóa t rước tránh đưa vào sai s ố hệ th ố ng khi pha lo ã ng dung dịch axit clohydric gốc đậm đặc và khi xác định nồng độ phân tử gam của axit, quá trình n à y c ó thể làm k é m đi hiệu năng tái lập của phương pháp. Điều này cũng tránh phải sử dụng dung dịch chuẩn để chu ẩ n độ có các n ồ ng độ cao h ơ n giới hạn tr ê n đã đ ề cập (0,1 ± 0,000 5 mol/l), vì nó sẽ giảm tổng th ể tích chuẩn độ trên một mẫu. Trong trường hợp này, sẽ có ph ầ n trăm l ớ n hơn v ề sai số trong khi đọc buret. Các vấn đề tương tự và các nguồn sai số nảy sinh khi dùng axit khác thay cho axit clohydric ( ví dụ : axit sulfuric). Do đó, không khuyến cáo các thay thế như vậy. 5.8. Amoni sulfat [( NH 4 ) 2 .SO 4 ], tối thi ể u 99 % khối lượng t í nh theo ch ấ t khô Ngay t rước khi sử dụng, s ấ y khô amoni su l fat ở 102 o C ± 2 o C trong 2 h r ồ i để nguội đến nhi ệ t độ phòng trong bình hút ẩ m. 5.9. Tryptophan (C 11 H 12 N 2 O 2 ) hoặc lysin hydroclorua (C 6 H 14 N 2 O 2 . HCI), tối thiểu 99 % khối lượng. Khi được bảo quản trong bình hút ẩ m, th ì không cần sấy khô các thuốc thử này trong tủ trước khi sử dụng . 5.10. Sacaroza (C 12 H 22 O 11 ) , có phần khối lượng nitơ nhỏ h ơ n 0,002 %. Không sấy khô sacaroza trong tủ trước khi sử dụng. 6. Thiết bị, dụng cụ S ử dụng các thiết b ị c ủ a phòng th ử nghiệm th ô ng thường và cụ thể như sau: 6.1. Bình Kj e ldahl , dung tích 500 ml hoặc 800 ml. 6.2. Cân ph â n tích , có thể c â n ch í nh xác đến 0,1 mg 6.3. Buret ho ặ c pipet tự động , có thể phân phối các phần 1,0 ml dung dịch đồng (II) sulfat (5.2). 6.4. Ố ng đong ch ia độ , dung tích 50 ml, 100 ml và 500 ml, phù hợp với các yêu c ầ u loại A của ISO 4788. 6.5. Bình nón , dung tích 500 ml, được chia vạch 200 ml. 6.6. Buret, dung tích 50 ml được chia vạch ít nh ấ t tại mỗi 0,1 ml, phù hợp với yêu cầu loại A của TCVN 7149 (ISO 385). Cách khác, có th ể sử dụng buret tự động đáp ứng đầy đủ các yêu cầu. 6.7. M á y nghi ề n 6.8. Bình đ ị nh mức một vạch , dung t ích 50 ml, 100 ml, 250 ml, 1 000 ml, phù hợp với yêu cầu loại A của TCVN 7153 (ISO 1042). 6.9. Chất trợ s ô i , ví dụ: đá bọt, bụi k ẽ m, các mảnh sứ hoặc các hạt alundum lưỡng t í nh (nghĩa là carborundum) có độ tinh khiết cao, nhẵn trơn, cỡ mesh 10. Không s ử dụng lại các hạt trợ sôi. CHÚ TH Í CH : Có thể s ử dụng hạt th ủy tinh đường k í nh kh oảng 5 mm, nhưng chúng c ó thể không nâng nhiệt hiệu qu ả như alundum lưỡng tính . Với hạt thủy tinh thì có th ể có sủi bọt nhi ề u trong suốt quá trình phân hu ỷ . 6.10. Thiết bị phân hủy, giữ được bình Kjeldahl (6.1) ở tư th ế nghiêng (khoảng 45 °), có bếp điện hoặc đ ầ u đốt bằng khí sao cho không đốt nóng bình Kjeldahl ở mức cao hơn lượng chứa bên trong, c ó hệ thống hút khói. Nguồn nhiệt phải có thể đ iều chỉnh được đ ể kiểm soát việc c à i đ ặ t bộ phận gia nhiệt tối đa được sử dụng trong quá trình phân hủy. L à m nóng sơ bộ nguồn c ấ p nhiệt khi cài đặt để đánh giá. Trong trường hợp dùng đầu đốt khí, thì quá trình l à m n ó ng sơ bộ phải 10 min và đối với bếp điện phải 30 min. Đối với mỗi bộ phận gia nhiệt, xác định việc cài đặt đ ể đưa 250 ml nước v ớ i 5 đến 10 vi ê n trợ sôi có nhiệt độ ban đầu ở 25 o C đến đi ể m s ô i trong 5 min đến 6 min. Đây là việc cài đặt bộ phận gia nhiệt tối đa cần sử dụng trong suốt quá trình phân hủy. 6.11. Thiết bị chưng cất , (phương pháp truyền th ố ng), bằng thủy tinh b o silicat hoặc vật liệu th í ch hợp khác có thể phù hợp cho bình Kjeldahl (6.1) gồm có đầu phun có hiệu quả được nối với bình ngưng c ó ống lồng thẳng bên trong và ống đầu ra được gắn với đầu ra thấp của bình . Ố ng nối và nắp phải khít và tốt nhất được làm bằng cao su tổng hợp. CHÚ THÍCH : Thiết b ị c hưng cất được đề cập trên đây có thể được thay bằng thiết bị chưng cất Pamas-Wagner hoàn chỉnh, (xem [4]) hoặc thiết bị thích hợp khác. 6.12. Bu ồ ng phân hủy kín , bu ồ ng hợp kim nhôm hoặc buồng tương đương, được gắn với bộ phận ki ể m soát nhiệt độ c ó thể đi ề u chỉnh được và dụng cụ đo nhiệt độ buồng. 6.13. Ố ng phân hủy , dung tích 250 ml, thích hợp đ ể sử dụng với buồng phân hủy kín (6 . 12). 6.14. Ống xả , th í ch hợp để s ử dụng cho các ống phân hủy (6.13). 6.15. Thiết bị tháp lọc khí ly tâm hoặc bơm lọc hoặc máy hút , bền với axit, đ ể sử dụng v ới nguồn nước ch í nh. 6.16. Thiết bị chưng cất (phương pháp phân hủy k í n), có thể chưng c ấ t hơi nước , thủ c ô ng hoặc b án tự động, thích hợp cho các ống phân hủy (6.13) v à các bình nón (6.5). 6.17. Máy chuẩn độ tự động , có kèm theo máy đo pH Máy đo pH phải được đ iều chỉnh trong phạm vi pH 4 đến pH 7 theo phương pháp điều chỉnh pH của ph ò ng thí nghiệm thông thường. 6.18. Dao trộn hoặc dụng cụ thích hợp. 6.19. Giấy lọc , không chứa nitơ có kích thước và độ xốp thích hợp để giữ lại mẫu thử phomat. 6.20. Nồi cách thủy , có thể duy tr ì nhiệt độ từ 38 o C đ ế n 40 o C . 7. Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng th ử nghiệm phải là mẫu đại diện . Mẫu kh ô ng bị hư h ỏ ng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Phương pháp l ấ y mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. N ê n l ấ y mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) 8. Chuẩn bị mẫu thử Loại b ỏ cùi, các vết hoặc lớp b ề mặt mốc của phomat sao cho thu được mẫu đại diện của phomat. Nghiền m ẫ u đại diện bằng máy nghi ề n (6.7). Trộn nhanh mẫu đ ã nghiền và tốt nh ấ t nghi ề n nhanh lại. Ph â n tích ngay m ẫ u sau khi nghiền. C â n 1 g mẫu phomat nghiền, d ù ng dao trộn (6.18) chuyển sang giấy lọc (6.19) gấp nếp. Cuộn mẫu thử trong gi ấ y lọc v à cho t ấ t c ả vào vào đáy bình Kjeldahl (6.1) hoặc ống phân hủy (6.13) như trong 9.1 1 hoặc 9.12. 9. Cách tiến hành 9.1. Phương pháp truyền thống 9.1.1. Phần mẫu thử và xử lý sơ bộ Cho vào bình Kjeldahl (6.1) khô và sạch từ 5 đến 10 hạt trợ s ô i (6 . 9), 15,0 g kali sulfat (5 . 1). 1,0 ml dung dịch đồng (II) sulfat (5.2). Sau đó th ê m mẫu th ử đã chu ẩ n bị như trong Đi ề u 8 v à 25 ml axit sulfuric (5.3) dùng axit sulfuric đề rửa luôn dung dịch đồng (II) sulfat, kali sulfat hoặc phần m ẫ u thử còn sót lại tr ê n cổ bình. Trộn nhẹ lượng chứa trong bình Kjeldahl. 9.1.2. X á c định 9.1.2. 1 . Ph â n hủy Bật hệ thống hút khói của thiế t bị phân hu ỷ (6.10) trước khi bắt đ ầ u phân hủy. Làm nóng bình Kjeldahl và lượng chứa bên trong (9.1.1) trên thiết bị phân hủy dùng bộ phận gia nhiệt cài đặt đủ th ấ p sao cho dịch ph â n hủy cháy kh ô ng tạo b ọ t dâng đến cổ bình Kjeldahl. Phân hủy ở giai đoạn c à i đặt này cho đ ế n khi xu ấ t hiện khói trắng trong bình sau khoảng 20 min. Tăng nhiệt độ đến một nửa mức cài đặt tối đa trong 6.10 và tiếp tục đun t rong 15 min. Sau 15 min, tăng nhiệt đến mức cài đặt tối đa trong 6.10. Sau khi d ị ch phân hủy trong (có màu xanh nh ẹ ) tiếp tục đun sôi từ 1 h đến 1,5 h ở mức cài đặt tối đa . Nếu ch ấ t lỏng này không sôi , th ì có thể do nhiệt độ cài đặt sau n à y quá th ấ p. Tổng thời gian ph â n hủy sẽ từ 1,8 h đến 2,25 h. N ế u dịch phân hủy cháy vẫn còn sót lại tr ê n cổ bình th ì tráng b ằ ng vài mililit nước Đ ể xác đ ị nh th ờ i gian sôi cụ thể cần cho ph é p phân t í ch trong phòng thử nghiệm cụ thể sử dụng loạt thiết bị cụ thể, th ì chọn các mẫu sữa chứa ch ấ t b é o cao, protein cao và xác định hàm lượng protein sử d ụ ng các thời gian s ô i khác nhau (1 h đến 1,5 h) sau khi đ ã trong. Kết quả protein trung bình tăng khi thời gian sỏi tăng và giảm khi thời gian sôi k é o dài. Chọn thờ i gian sôi cho kết quả protein tối đa. Tại đi ể m cuối quá trình phân hủy, dịch ph â n hủy phải trong v à không chứa ch ấ t chưa phân hủy . Đ ể dịch phân hủy nguội đến nhiệt độ phòng trong bình mở nắp đ ể dưới tủ hút ri ê ng rẽ trong khoảng 25 min. Nếu bình được để trên bếp đến nguội th ì thời gian làm nguội đến nhiệt độ phòng bị k é o dài hơn. Dịch phân hủy nguội cần có dạng lỏng hoặc chất lỏng có vài ch ất kết tinh trên đáy bình khi kết thúc 25 min làm nguội. Việc kết tinh nhi ề u sau 25 min này là do th ấ t thoát quá mức ax it trong quá trình phân hủy và làm cho kết quả có giá trị th ấ p. CHÚ TH Í CH : Việc th ấ t tho á t quá mức axit l à do hút khói quá mạnh hoặc thời gian phân h ủ y k é o dài do phân h ủ y trong một thời gian d à i ở nhiệt độ th ấ p hơn nhiệt độ tối đa của ph é p phân tích. Đ ể gi ả m th ấ t thoát axit, c ầ n giảm tốc độ hút kh ó i. Không để dịch phân hủy chưa pha lo ã ng trong các ố ng nghiệm qua đêm. Dịch phân hủy chưa pha lo ã ng có thể kết tinh trong giai đoạn này và sẽ r ấ t khó khăn để đưa dịch đ ã kết tinh tr ở lại dạng dung dịch lỏng. Cho 300 ml nước vào bình Kjeldahl 500 ml hoặc 400 ml nước khi sử dụng bình Kjeldahl 800 ml. Dùng nước để rửa cổ bình. Trộn kỹ để đảm bảo rằng mọi ch ấ t k ế t tinh đ ã được hòa tan. Thêm 5 đến 10 hạt trợ sôi (6.9). Đ ể h ỗ n hợp nguội trở lại nhiệt độ ph ò ng trước khi chưng c ấ t. Dịch phân hủy đ ã pha lo ã ng có thể được đậy lại và giữ để chưng c ấ t sau này. 9.1.2.2. Chưng cất Bật bộ ngưng nước của thiết bị chưng c ấ t (6.11). Thêm 75 ml dung dịch natri hydrox i t (5.4) vào dịch ph â n hủy đ ã pha lo ã ng (9.1.2.1) bằng cách rót c ẩ n thận dung dịch xuống theo cổ bình nghiêng của bình Kjeldahl đ ể tạo thành một lớp tr ê n đáy bầu của bình, cần có lớp phân cách r õ giữa hai dung dịch này. Đ ể gi ả m khả năng th ấ t thoát amoniac, ngay sau khi th ê m dung dịch natri hydroxit vào bình Kjeldahl, n ố i ngay bình vào thiết bị chưng c ấ t (6.11). Nhúng đầu tip ống ra của bình ngưng trong 50 ml dung dịch axit boric (5.6) được chứa trong bình nón (6.5). Xoay mạnh bình Kjeldahl đ ể trộn lượng chứa trong bình cho đến khi không còn th ấ y các l ớ p của d ung dịch tách ri ê ng trong bình. Đặt bình l ê n bếp . Bật bếp cho đến nhiệt độ cài đặt đ ủ cao đ ể làm sôi lượng chứa trong bình Kjeldahl . Tiếp tục ch ư ng c ấ t cho đến khi sôi mạnh và sau đó tháo bình Kjeldahl ra và tắt nguồn nhiệt. Tắt bộ ngưng tụ nước. Tráng phía trong v à ph í a ngoài đ ầ u tip của ống đầu ra bằng nước tráng rửa trong bình nón v à trộn. Tốc độ chưng c ấ t phải sao cho thu được khoảng 150 ml dịch chưng c ấ t trước khi bắt đầu s ô i mạnh. Tổng thể tích của lượng chứa trong bình nón phải ở khoảng 200 ml. Nếu thể tích dịch chưng c ấ t thu được í t hơn 150 ml th ì có thể bổ sung ít hơn 300 ml n ướ c đ ể pha lo ã ng dịch phân hủy. Hiệu qu ả của bình ngưng phải sao cho nhiệt độ của lượng chứa trong bình n ó n không vượt quá 35 o C trong quá trình chưng c ấ t khi sử dụng điểm kết thúc so màu. 9.1.2.3. Chuẩn độ Dùng buret (6.6) chu ẩ n độ lượng chứa trong bình nón (9.1.2.2) dựa vào axit clohydric (5.7) Đ iể m kết thúc chuẩn độ đạt được khi có vết màu hồng đầu tiên. L ấ y số đọc của buret ít nhất đến 0,05 ml. Có thể dùng bản khu ấ y từ rọi sáng để nhìn đ iể m kết thúc. Cách khác, chu ẩ n độ lượng chứa trong bình nón (9.1.2.2) dựa v à o axit clohydric (5.7) sử dụng máy chu ẩ n độ tự động đã hiệu chu ẩ n có máy đo pH (6.17). Đi ể m cuối pH của chu ẩ n độ đạt được ở pH 4,6, là đi ể m tăng trong đường chu ẩ n độ (điểm uốn). Đọc lượng ch ấ t chu ẩ n độ đ ã dùng trên máy chuẩn độ tự động. CHÚ TH Í CH 1 : V ết m à u h ồ ng đ ầ u tiên quan sát được giữa pH 4,6 và pH 4,3 đối với hệ th ố ng chất chỉ thị (5.5) v à d ung d ịch axit boric (5.6) được qui định trong phương ph á p này. Trong thực tế, t ố c độ thay đ ổ i pH phụ thuộc v à o axit clohydric (5.7) được b ổ sung là r ấ t nhanh trong d ả i pH này. Trong hệ thống n à y , kho ả ng 0 , 05 ml d ung dịch axi t clohydric 0 , 1 mol/l thay đ ổ i 0 , 3 đơn vị pH trong dải pH từ 4 , 6 đến pH 4 , 3 CHÚ TH Í CH 2 : Các th ố ng k ê về hiệu năng phương pháp trong phòng thử nghiệm và giữa các phòng thử nghiệm đối với phương pháp này đã được xác định sử dụng điểm kết thúc chuẩn độ màu. So sánh các phép thử cuối cùng, bao gồm cả các kết quả của phép thử trắng, thu được với điểm kết thúc pH 4,6 với việc chuẩn độ điểm kết thúc màu cho thấy rằng giữa chúng có sự chênh lệch không đáng kể. 9.2. Phương pháp phân hủy kín 9.2.1. Phần mẫu thử và xử lý sơ bộ Cho vào ống phân hủy (6.13) khô và sạch 12,0 g kali sulfat (5.1), 1,0 ml dung dịch đồng (II) sulfat (5.2) và xử lý mẫu th ử đ ã chuẩn bị theo Điều 8, th ê m 20 ml axit sulfuric (5.3) dùng luôn axit sulfuric đ ể rửa luôn dung dịch đ ồ ng (II) sulfat, kali su l fat hoặc ph ầ n mẫu thử còn sót lại tr ê n cổ ống ph â n hu ỷ . Trộn nhẹ l ượ ng chứa trong ống. Các thể tích axit lớn h ơ n 20 ml trong các hệ thống phân hủy kín cho các v ấ n đ ề về tạo bọt quá mức trong quá trình ph â n hủy v à cho các kết quả khác nhau. Người sử dụng phương pháp ph â n hủy kín c ầ n chú ý r ằ ng lượng axit sulfuric đủ dư trong ống t ại điểm kết thúc ph â n hủy cần được người phân tích lưu ý hơn so với phương pháp truy ề n thống. Việc th ấ t thoát axit quá mức do tủ hút khói hút quá mạnh liên quan nhiều đến bộ phân hủy k í n hơn so với các hệ th ố ng truyền thống. 9.2.2. Xác định 9.2.2.1. Ph â n hủy Cài đặt bộ phân hủy k í n (6.12) ở nhiệt độ ban đầu thấp đ ể khống chế bọt ( từ 180 o C đến 230 °C). Chuy ể n ống sang bình hủy k í n v à ống xả (6.14) mà được nối với thiết bị tháp lọc khí ly tâm (6.15) trên đ ỉ nh ống. Tốc độ hút của thiết bị tháp lọc khí ly tâm phải được điều chỉnh đủ đ ể loại b ỏ khói. Thiết bị phân h ủy hoàn chỉnh có thể cần đ ược giữ trong t ủ hút khói. Phân hủy phần mẫu thử trong 30 min hoặc cho đến khi có kh ó i trắng. Sau đó tăng nhiệt độ của bình phân hủy kín đến kho ả ng từ 410 o C đến 430 o C . Tiếp tục phân hủy phần mẫu thử cho đến khi thu được dịch ph â n hủy trong. Cũng có thể c ầ n phải t ă ng d ầ n nhiệt độ trong khoảng quá 20 min đ ể khống chế việc tạo bọt. Trong m ọ i t ì nh huống, không đ ể bọt d â ng cao quá 40 mm đến 50 mm dưới b ề mặt của ống xả đ ã chèn v à o đ ỉ nh ống phân hủy. Sau khi dịch phân hủy trong (trong có màu xanh nhẹ) tiếp tục phân hủy ở khoảng t ừ 410 o C đến 430 o C trong ít nh ấ t 1 h. Trong suốt quá trình n à y axit sulfuric phải sôi. Nếu không thấy dịch trong sôi v ì có bọt khí trên b ề mặt dịch lỏng nóng xung quanh ống, thì nhiệt độ của bình ph â n hủy có thể quá th ấ p. Tổng thời gian phân hủy sẽ từ 1,75 h đến 2,5 h. Đ ể xác định thời gian sôi cụ thể c ầ n cho ph é p phân tích trong phòng thử nghiệm cụ th ể sử dụng loạt thiết bị cụ thể, th ì chọn các mẫu sữa chứa chất b é o cao, protein cao và xác định hàm lượng protein sử dụng các thời gian s ô i khác nhau (1 h đến 1,5 h) sau khi đ ã trong . Kết qu ả protein trung bình t ă ng khi thời gian sôi tăng và giảm khi thời gian s ô i ké o dài. Chọn thời gian sôi cho kết quả protein tối đa. Tại đ iể m cuối quá trình phân hủy, dịch phân hủy phải trong và kh ô ng ch ứ a ch ấ t chưa ph â n hủy. Lấy ống ra khỏi bình phân hủy cùng với ống xả. Để dịch ph â n hủy nguội đến nhiệt độ phòng trong khoảng quá 25 min. Dịch phân hủy nguội c ầ n có d ạ ng lỏng hoặc ch ấ t lỏng có vài ch ấ t kết tinh trên đáy ống. Việc kết tinh nhi ề u sau 25 min này l à do th ấ t thoát quá mức axit trong quá trình phân hủy và làm cho kết quả c ó giá trị th ấ p. CH Ú TH Í CH : Việc th ấ t thoát quá mức axit là do hút khói qu á mạnh hoặc thời gian ph â n hủy k é o dài do ph â n hủy trong một thời gian d à i ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối đa của ph é p phân t ích. Đ ể giảm thất thoát axit, cần giảm tốc độ hút khói. Không đ ể dịch phân hủy chưa pha lo ã ng trong các ống nghiệm qua đêm. Dịch phân hủy chưa pha loãng c ó thể kết tinh trong giai đoạn n à y v à s ẽ r ấ t khó khăn đ ể đưa dịch đ ã kết tinh trở lại dạng dung d ị ch lỏng. Sau khi dịch phân hủy nguội đến nhiệt độ phòng trong khoảng 25 min, tháo ố ng xả ra và c ẩ n thận th ê m 85 ml nước vào mỗi ống. Xoay ống để trộn lượng chứa b ê n trong để đ ả m bảo r ằ ng mọi chất kết tinh đ ã được hòa tan. Đ ể lượng chứa trong ố ng nguội trở lại nhiệt độ phòng 9.2.2.2. Chưng c ấ t B ậ t bộ ngưng nước của thiết bị chưng c ấ t. G ắ n ống phân hủy chứa dịch ph â n hủy đ ã pha lo ã ng vào thiết bị chưng c ấ t (6.16). Đặt bình nón (6.5) ch ứ a 50 ml axit boric (5.6) dưới đầu ra của bộ ngưng, sao cho đầu ra n à y ngập trong dung dịch axit boric. Ch ỉ nh thiết b ị chưng c ấ t đ ể ph â n phối đ ược 55 ml dung dịch natri hydroxit (5.4). Khi sử dụng dung dịch natri hydroxit 40 % khối lượng thì chỉnh thể tích ph â n phối đến 65 ml. Nếu dung dịch natri hydroxit được phân phối tự động th ì lượng này sẽ b ị dao động nhi ề u v ì ống phân phối dung dịch natri hydroxit bị ngh ẽ n từng phần, do đó s ẽ có khác nhau nhi ề u giữa các k ế t quả riêng lẻ. Vận hành thi ế t bị chưng c ấ t theo hướng dẫn của nhà sản xuất để chưng cất hơi amoniac đã giải phóng b ằ ng cách bổ sung dung dịch natri hydroxit, thu l ấ y dịch chưng c ấ t vào dung dịch axit boric. Tiếp tục quá trình chưng c ấ t cho đến khi thu được ít nh ấ t 150 ml dịch chưng c ấ t. L ấ y bình nón ra khỏi thiết b ị chưng cất và làm ráo hẳn đ ầ u tip chưng cất. Tráng ph í a trong và ngoài đầu t ip b ằ ng nước tráng rửa và cho vào bình nón. Lu ô n tráng rửa đầu tip giữa các mẫu. Hiệu quả của bình ngưng phải sao cho nhiệt độ của lượng chứa trong bình nón không vượt quá 35 o C trong quá trình chưng cất khi sử dụng đi ể m kết thúc b ằ ng so màu. 9.2.2.3. Chu ẩn độ Dùng buret (6.6) chuẩn độ lượng chứa trong bình nón (9.2.2.2) bằng axit clohydric (5.7). Điểm kết thúc chuẩn độ đạt được khi có vết màu hồng đầu tiên. Lấy số đọc của buret ít nhất đến 0 , 05 ml. Có thể dùng bản khu ấ y t ừ rọi sáng đ ể nh ì n đi ể m kết thúc. Cách khác, chu ẩ n độ lượng ch ứ a trong bình nón (9 .2.2.2 ) b ằ ng axit clohydric (5.7) sử dụng máy chuẩn độ tự động đ ã hiệu chuẩn c ó máy đo pH (6.17). Điểm cuối pH của chu ẩ n độ đạt được ở pH 4,6, l à đi ể m uốn nhất trên đường chuẩn độ (đi ể m uốn). Đọc lượng ch ấ t chuẩn độ đã dùng trên máy chu ẩ n độ tự động. CHÚ TH Í CH 1 : V ết màu h ồ ng đ ầ u ti ê n quan sát được giữa pH 4,6 v à pH 4,3 đối v ớ i hệ t hống ch ấ t ch ỉ th ị (5 5) v à dung dịch axit boric (5 6) được qui định trong phương pháp này . Trong thực tế, t ốc độ thay đổi pH phụ thuộc v à o axit clohydric (5 . 7) được b ổ sung là rất nhanh trong d ải pH này. Trong hệ th ố ng này, khoảng 0 , 05 ml dung dịch axit clohydric 0,1 mol/l thay đ ổ i 0 , 3 đơn vị pH trong d ả i pH t ừ 4 , 6 đến pH 4 , 3. CHÚ TH Í CH 2 : Các thống kê về hiệu năng phương pháp trong phò ng thử nghiệm và giữa các ph ò ng thử nghiệm đối với phương pháp n à y đã được xác định sử dụng đi ể m kết thúc chu ẩ n độ màu. So sánh các ph é p th ử cuối c ù ng, bao gồm c ả các kết quả của ph é p thử trắng , thu được với điểm kết thúc pH 4,6 với vi ệ c chuẩn độ đi ể m kết thúc màu cho th ấ y r ằ ng giữa ch ú ng có sự chênh l ệ ch kh ô ng đáng k ể 9.3. Phép thử trắng Luôn chuẩn độ mẫu trắng dựa vào cùng loại axit clohydric (5.7) và sử dụng cùng loại buret (6.6) hoặc máy chuẩn độ tự động có kèm theo máy đo pH (6.17) như đã sử dụng đối với mẫu thử. Thực hiện phép thử trắng theo 9.1 hoặc 9.2. Thay phần mẫu thử bằng 5 ml nước và khoảng 0,85 g sacaroza (5.10) Ghi lại các giá tr ị mẫu trắng đi ể n h ì nh. Nếu các giá t rị n à y thay đổi th ì phải t ì m nguyên nhân. CHÚ TH Í CH 1 : Mục đích của sa caroza trong ph é p thử tr ắ ng hoặc chu ẩ n thu h ồ i th ự c hiện như ch ấ t hữu c ơ tiêu t ố n một lượng axi t sulfuric trong qu á trình ph â n hủy m à tương đương với phần mẫu thử . Nếu lượng axit sulfuric d ư tại cuối giai đoạn ph â n h ủ y quá th ấ p th ì đ ộ thu hồi nitơ của cả hai ph é p thử thu hồi trong 9.4.2 và 9.4 3 s ẽ th ấ p. Tuy nhi ê n , nếu lượng axit dư có mặt tại cuối giai đoạn phân hủy đủ để giữ t ất cả nitơ nhưng các điều kiện nhiệt độ và th ờ i gian trong quá trình phân hủy không đủ đ ể giải phóng tấ t cả các n i tơ ra khỏi m ẫ u, th ì độ thu hồi nitơ trong 9.4.2 c ó thể chấp nhận được và độ thu h ồ i nitơ trong 9.4. 3 s ẽ th ấ p. CH Ú TH Í CH 2 : Lượng ch ấ t chu ẩ n độ được dùng trong m ẫ u trắng luôn lớn hơn 0,00 ml. C á c giá tr ị th ử tr ắ ng trong c ù ng một phòng th ử nghiệm phải luôn ổn định. N ế u mẫu trắng đã có màu h ồ ng t rước khi bắt đầu ch uẩn độ thì đã có sai sót. Thông thường trong các trường hợp này, thì do bình nón không sạch hoặc nước từ độ ẩm không khí có thể ngưng tụ trên mặt ngoài của bộ ngưng tụ đã chảy vào bình thu nhận làm nhiễm bẩn. Các giá trị mẫu trắng điển hình thường ít hơn hoặc bằng 0,2 ml. 9.4. Phép thử độ thu hồi 9.4.1. Định kỳ kiểm tra độ đúng của qui trình bằng cách thực hiện các ph é p thử độ thu hồi sau đ â y, thực hiện theo 9.1 và 9.2. 9.4.2. Kiểm tra đ ể đảm bảo r ằ ng k hông có sự th ấ t thoát nitơ b ằ ng cách sử dụng phần mẫu thử 0,12 g amoni sulfat (5.8) cùng với 0,85 sacaroza (5.10). CHÚ TH Í CH : Việc ki ể m tra độ thu hồi của amoni sulfat không cho th ô ng tin về kh ả n ă ng của các điều kiện phân hủy đ ể giải ph ó ng nitơ li ê n kết trong các c ấ u trúc protein. Phần trăm nitơ thu h ồ i phải lớn hơn 99 % khối lượng đối với t ấ t cả các vị trí trên thiết b ị. Đối với c á c độ thu hồi nhỏ hơn 99 %, thì nồng độ đương lượng của chất chu ẩ n độ cao hơn giá trị đã nêu hoặc có thể nitơ bị th ấ t thoát trong quá trình phân hủy hoặc chưng cất. Có thể sử dụng hỗn hợp amoni sulfat và một lượng nhỏ axit sulfuric (lượng dư c ò n lại tại điểm k ết thúc ph â n hủy) trong bình Kjeldahl. Pha lo ã ng với một lượng chu ẩ n của n ướ c và thêm nốt lượng chuẩn natri hydroxit và chưng cất. Nếu độ thu hồi nitơ vẫn còn th ấ p với cùng một lượng tương tự, thì đã có th ấ t thoát nitơ trong thiết bị chưng cất mà không phải trong quá trình chưng cất. Các nguy ê n nh â n có khả n ă ng là rò r ỉ đường ống trong hệ thống truy ề n thống hoặc sai lỗi khi ngâm đ ầ u tip của bộ ngưng trong dung dịch axit boric sớm trong khi chưng cất. Thiết bị phải được qua phép thử này trước khi kiểm tra độ thu hồi theo qui trình trong 9.4.3. Nếu các độ thu h ồ i nitơ vượt quá 100 % và không có sự th ấ t thoát nitơ có thể nh ậ n thấy, th ì một số nguyên nh â n c ó thể là: a) amoni sulfat bị nhiễm bẩn; b) n ồ ng độ đương lượng thực của chốt chuẩn độ thấp hơn giá trị đã nêu; c) việc hiệu chuẩn buret đối với chất chuẩn độ bị sai; d) nhiệt độ của chất chuẩn độ quá cao so với nhiệt độ chuẩn độ buret; e) t ố c độ dòng của chất chuẩn độ từ buret vượt quá tốc độ tối đa chu ẩ n độ c ó hiệu lực của buret. CHÚ TH Í CH : Cho dù độ thu hồi t ối đa theo lý thuyết kh ô ng vượt quá 100 %, nhưng trong thực t ế có th ể thu được c á c độ thu h ồ i cao hơn do độ không đảm bảo của ph é p đo. 9.4.3. Kiểm tra hiệu quả của qui trình ph â n hủy sử dụng 0,16 g lysin hydroclorua hoặc 0,18 g tryptophan (5.9) cùng với 0,67 g sacaroza (5.10). Độ thu hồi của nitơ phải í t nh ấ t l à 98 % khối lượng. Nếu độ thu hồi th ấ p hơn 98 %, th ì sau khi có độ thu h ồ i từ 99 % đến 100 % khối lượng đối với a moni sulfat, th ì thời gian hoặc nhiệt độ phân hủy l à không đ ủ hoặc có vật liệu của mẫu chưa được phân hủy (nghĩa l à chưa cháy) trong bình Kjeldahl. Đánh giá cuối cùng về hiệu năng được thực hiện tốt nh ấ t với sự tham gia vào chương trình th ử nghiệm thành thạo, khi trong và giữa các phòng thử nghiệm các thông số thống kê được tính toán dựa tr ê n các mẫu sữa. 9.4.4. Các giá trị th ấ p hơn trong các ph é p thử độ thu h ồ i (hoặc cao hơn 100 % trong 9.4.2) cho th ấ y có sai sót trong qui trình v à /hoặc nồng độ không đúng của dung dịch axit clohydric (5.7). 10. Tính và biểu thị kết quả 10.1. Phương pháp tính 10.1.1. H à m l ượng nit ơ H à m lượng nit ơ của mẫu thử, W N . t í nh bằng phần tr ă m khối lượng, được tính đến bốn chữ số thập ph â n, theo c ô ng thức (1) sau đây: W N = (1) trong đó c t l à nồng độ của dung dịch axit clohydric (5.7). t í nh đến bốn chữ s ố thập phân, bi ể u thị b ằ ng mol trên lit (mol/l); V b , là thể tích dung dịch axit c l ohydric (5.7), t í nh ch í nh xác đ ế n 0,05 ml, đ ã dùng cho ph é p th ử tr ắ ng (9 . 3), tính b ằ ng mililít (ml); m là khối lượng phần m ẫ u thử (9.1), chính xác đến miligam, tính bằng gam (g); V s là thể tích d ung dịch axit clohydric (5.7), tính ch í nh xác đến 0,05 ml, đ ã dùng cho ph é p xác định (9.2.2 3), tính bằng mililit (ml). 10.1.2. Hàm lượng protein th ô T í nh hàm lượng protein thô, W p, bằng ph ầ n trăm kh ố i lượng, theo công thức (2) sau đây: W p = 6,38 W N trong đó 6,38 là hệ s ố thường được ch ấ p nhận đ ể chuy ể n đổi hàm lượng nitơ v ề h à m lượng protein thô 10.2. Biểu thị kết quả Kh ô ng làm tròn các kết quả tiếp cho đến khi tính kết quả thử nghiệm cuối cùng. ĐIỀU QUAN TRỌNG – Điều này đặc biệt đúng khi c á c giá trị được sử dụng đ ể tính toán ti ế p. Một v í dụ là khi các giá trị th ử nghiệm riêng lẻ thu được từ phép phân tích của nhi ề u vật liệu m ẫ u được dùng đ ể t í nh toán thống k ê v ề hiệu n ă ng của phương pháp v ề sai lệch trong hoặc giữa các phòng th ử nghiệm. Một ví dụ khác, là khi các giá trị được sử dụng làm chuẩn cho hiệu chuẩn thiết bị ( ví dụ : máy phân tích sữa bằng hồng ngoại ) mà các gíá trị thu được từ nhi ề u m ẫ u sẽ được dùng để tính hồi qui đơn giản hoặc hồi qui phức tạp. Trong các trường hợp này, các giá trị thu được không được làm tròn trước khi chúng được dùng để tính toán tiếp. 10.2.1. Hàm lượng nitơ Biểu thị các kết quả đến bốn chữ số thập phân, nếu cần để tính toán tiếp. Cách khác, biểu thị các kết quả thử nghiệm cuối cùng đến ba chữ số thập phân. 10.2.2. Hàm lượng protein thô Biểu thị các kết quả đến ba chữ số thập phân, nếu cần để tính toán tiếp. Cách khác, biểu thị các kết quả thử nghiệm cuối cùng đến hai chữ số thập phân. 11. Độ chụm 11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm Một ph é p thử liên phòng đã được thực hiện theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) [2] v à TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) [3]. Các giá trị v ề độ lặp lại v à độ tái lập đối với các loại phomat khác nhau, gồm phomat chế biến lại đ ã được công bố (xem [5]). Các kết quả đối với phomat chế biến trong ph é p thử được đưa ra trong Phụ lục A. CH Ú TH Í CH : Ph é p thử cộng tác không đưa ra dải rộng v ề hàm l ượ ng protein tim th ấ y trong một số các sản phẩm phomat chế biến có bán s ẵ n. Các giá trị thu được từ ph é p thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các d ả i nồng độ v ề các ch ấ t nền khác v ớ i các giá tr ị đã n ê u. Ch ê nh lệch tối đa giữa các ph é p xác định lặp lại không được vượt quá 0,4 % khối lượng protein thô. 12. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghi ệ m phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết đ ể nhận biết đầy đ ủ v ề mẫu thử; b) phương pháp l ấ y mẫu đ ã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử nghiệm đ ã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi chi tiết thao tác kh ô ng được quy định trong tiêu chu ẩ n này hoặc những đi ề u được coi l à tuỳ ý cũng như các sự cố b ấ t k ỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử; e) kết qu ả thử nghiệm thu được và nếu thỏa m ã n yếu cầu v ề độ lặp lại th ì nêu kết qu ả cuối cùng thu đ ược. Phụ lục A (Tham khảo) Kết quả phép thử liên phòng thử nghiệm Để thử li ê n phòng thử nghiệm, gồm 18 loại phomat có hàm lượng protein th ô dao động từ 18,41 % đến 36,01 % đ ã được 15 phòng thử nghiệm tham gia phân tích. Tám phòng trong số đó có tám phòng tham gia thử nghiệm sử dụng thiết bị Kjeldahl như qui định trong tiêu chuẩn này và bảy phòng sử dụng thiết bị thủy phân k í n và thiết bị chưng c ấ t hơi (xem [5]). B ả ng A.1 - Tổng hợp cá c thông s ố ph â n tích thống kê l iên phòng thử nghiệm đối với phần trăm protein thô (6,38W N ) trong phomat chế biến được xác định bằng phương pháp Kjeldahl, đã trừ các trường hợp ngoại lệ (xem [5]) Phomat Số phòng thử nghiệm Số phép thử Trung bình % Độ lệch chuẩn lặp lại S r Độ lệch chuẩn tái lập S R Hệ số biến thiên lặp lại CV(r) % Hệ số biến thiên tái lập CV(R) % Giới hạn lặp lại r = 2,8s r Giới hạn tái lập R = 2,8 S R Phomat chế biến , từ sữa nguyên ch ấ t 14 28 18,41 0,065 0,103 0,354 0, 5 61 0,182 0 , 289 Phomat chế b i ến, ch ấ t b é o giảm 15 30 19,57 0,068 0,111 0,348 0,570 0 , 191 0 , 312 Phomat chế bi ế n, không chứa ch ấ t b é o, nh à sản xuất số 3 14 28 22,69 0,084 0,094 0,369 0,415 0,235 0,263 Phomat chế biến, k hông chứa chất béo, nh à sản xuất số 3 13 26 22,76 0,047 0,080 0,207 0,351 0,132 0,223 Phomat chế biến, không chứa ch ấ t b é o , nhà sản xuất số 1 14 28 23,94 0,129 0,153 0,537 0,638 0 , 360 0,428 Thư mục t à i liệu tham kh ả o [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa v à s ả n ph ẩ m sữa – Hướng dẫn lấy mẫu . [2] TCVN 6910-1 : 2001 (ISO 5725-1 : 1994), Độ ch í nh xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Các định nghĩa và nguyên tắc chung. [3] TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2 : 1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Ph ầ n 2: Phương pháp cơ b ả n đ ể xác đ ị nh độ lặp lại và độ tái lặp của phương pháp đo ti ê u chuẩn. [4] PAHNAS, J.K.. WAGNER . R Gber die Ausfuhrung von Bestimmungen kleiner Stickstoffmengen n a ch Kjeldahl [On the determination of low nitrogen quantities after KjeldahlJ Biochem Z 1921 125. pp 253-256. [5] LV NGII J M. BARBANO. DM .. F LEMING . J. R Determination of the total nitrogen content of hard, semihard and processed cheese by the Kjeldahl method: Collaborative study. } AOAC Int . 2002, 85, pp 445-455.