TCVN9513:2012

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9513:2012 (EN 14663:2005) về Thực phẩm - Xác định vitamin B6 (bao gồm các dạng glycosyl) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9513:2012 EN 14663:2005 THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH VITAMIN B6 (BAO GỒM CÁC DẠNG GLYCOSYL) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Foodstuffs - Determination o f vitamin B 6 (including its glycosylated f orms) by HPLC Lời nói đầu TCVN 9513:2012 hoàn toàn tươ n g đương với EN 14663:2005; TCVN 9513:2012 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH VITAMIN B6 (BAO GỒM CÁC DẠNG GLYCOSYL) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Foodstuffs - Determination o f vitamin B 6 (including its glycosylated f orms) by HPLC 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định vitamin B6 trong thực phẩm bằng sắc k í lỏng hiệu năng cao (HPLC). Hàm lượng vitamin B 6 là tổng của pyridoxin, pyridoxal và pyridoxamin, bao gồm các dẫn xuất phosphoryl cũng như các dạng b -glycosyl của chúng, được tính theo pyridoxin. Phương pháp này được đánh giá xác nhận trên bột tấm lõi có chứa sữa (thức ăn cho trẻ sơ sinh), khoai tây nghiền, rau trộn dăm bông (các sản phẩm ăn liền) và các loại đồ u ố ng bổ sung multivitamin ở các mức từ 0,034 mg/100 g đến 1,21 mg/100 g. 2. Tài liệu viện dẫn Các t à i liệu viện dẫn sau l à rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các t à i liệu viện dẫn ghi năm c ô ng bố thì áp dụng phiên b ả n được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhẩt, bao gồm c ả các sửa đổi. TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng đ ể phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử. 3. Nguyên tắc Pyridoxin, pyridoxamin và pyridoxal được chiết ra khỏi thực ph ẩ m bằng thủy phân axit và tách phospho và glycosyl bằng enzym sử dụng phosphataza và b -glycosidaza trong axit. Các dẫn xuất khác nhau của vitamin B 6 (pyridoxin. pyridoxamin và pyridoxal) được tách bằng HPLC vá định l ượ ng bằng detector huỳnh quang [1]. [2] 4. Thuốc thử 4.1. Yêu cầu chung Trong quá tr ì nh phân tích, ch ỉ sử dụng các thu ố c thử loại tinh khiết phân tích và nước sử dụng là nước cất hai lần hoặc loại 1 được quy định trong TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác. 4.2. Dikali hydro phosphat, w (K 2 HP O 4 . 3H 2 O ) ≥ 99,9 % khối lượng. 4.3. Natri axetat, không chứa tinh thể nước, w (CH 3 COONa) ≥ 99,0 % khối lượng. 4.4. Axit tricloaxetic (TCA), w (CI 3 CCOOH) ≥ 99,0 % khối lượng. 4.5. Dung dịch natri axetat, nồng độ chất c (CH 3 COONa) = 2,5 mol/l. Hòa tan 205 g natri axetat (4.3) trong 1 lít nước. 4.6. Thuốc thử sau cột (tùy chọn) , d ung dịch K 2 HPO 4 , C (K 2 HP O 4 ) = 0,15 mol/l. Hòa tan 34,2 g dikali hydro phosphat (4.2) trong nước, pha loãng bằng nước đến 1 000 ml, trộn và loại khí. 4.7. Axit clohydric , c (HCI) = 1 mol/l. 4.8. Axit clohydric , c (HCI) = 0,1 mol/l. 4.9. Axit clohy d ric , c (HCI) = 0,2 mol/l. 4.10. Axit sul f uric , c (H 2 S O 4 ) = 1 mol/l. 4.11. Dầu nhẹ , dải sôi từ 40 o C đến 60 o C . 4.12. Phosphataza trong axít , từ khoai tây, có hoạt độ enzym khoảng 5,3 U /mg 1) Enzym được sử dụng cần có hoạt độ phù hợp khi được kiểm tra theo 4.13.2, chi tiết xem [2], [7]. 4.13. Dung dịch phosphataza trong ax i t 4.13.1. Yêu cầu chung Hòa tan 60 mg phosphataza trong axit (4.12) vào 10 ml nước trong cốc có m ỏ , bằng cách khuấy trong 2 min. Chuẩn bị dung dịch n à y trong ngày phân tích. 4.13.2. Kiểm tra hoạt độ của phosphataza trong axit C â n 10 g thịt lợn, 5 g khoai tây nghiền ho ặ c 5 g bột cho v à o cốc có m ỏ rồi chiết bằng axit như trong 6.2.1. Thêm 1 ml dung dịch phosphataza trong axit (4.13.1) và 1 ml dung dịch b -glucosidaza (4 . 15) (tùy chọn) v à o 12,5 ml dung dịch mẫu chiết được và trộn . Ủ dung dịch í t nhất 12 h hoặc qua đêm ở 37 o C trong khi vẫn khuấy liên tục. Lặp l ại bước này với lượng dung dịch phosphataza trong axit l ớ n gấp đôi. Xác định nồng độ khối lượng của các vitamin theo 6.6. Hoạt độ của enzym được sử dụng l à đủ, nếu các nồng độ khối lượng của các hợp chất vitamin B6 tạo thành trong các dung dịch mẫu là tương đương . S ắc đồ không được c ó pic từ pyridoxamin phosphat. CHÚ TH Í CH: Trong phép thử liên phòng th ử nghiệm, đã sử dụng phosphataza trong axit của h ã ng Sigma Nr p 3752 1) . 4.14. b -glucosidaza , từ qu ả hạnh. Hoạt độ enzym khoảng 3,2 U /mg. Enzym được sử dụng cần có hoạt độ phù hợp khi được kiểm tra theo 4.15.2, chi tiết xem [ 2], [7]. 4.15. Dung dịch b -glucosidaza 4.15.1. Yêu c ầ u chung Hòa tan 100 mg b -glucosidaza (4.14) vào 10 ml nước trong cốc có m ỏ , bằng cách khuấy trong 2 min. Chuẩn bị dung dịch này trong ngày phân tích. 4.15.2. Kiểm tra hoạt độ của b -glucosidaza Cân 10 g thịt lợn, 5 g khoai tây nghiền hoặc 5 g bột cho vào cốc có mỏ rồi chiết bằng axit như trong 6.2.1. Thêm 1 ml dung dịch phosphataza trong axit (4.13.1) và 1 ml dung dịch b -glucosidaza (4.15.1) vào 12,5 ml dung dịch mẫu chiết được và trộn . Ủ dung dịch ít nhất 12 h hoặc qua đêm ở 37 o C trong khi vẫn khuấy liên tục. Lặp lại bước này với lượng dung dịch b -glucosidaza lớn gấp đôi. Xác định nồng độ khối lượng của các hợp chất vitamin B 6 theo 6.6. Hoạt độ của enzym được sử dụng l à đủ, nếu các nồng độ khối lượng của các hợp chất vitamin B 6 tạo thành trong các d ung dịch mẫu là tương đương . S ắc đồ không được có pic pyridoxamin phosphat. CH Ú THÍCH: Trong phép thử liên phòng thử nghiệm, đ ã sử dụng b -glucosidaza của h ã ng Sigma Nr G-0395 1) 4.16. Pha động dùng cho HPLC [axit sul f uric, c(H 2 S O 4 ) = 0,015 mol/l có chứa 0,005 mol/l TCA] Hòa tan 817 mg ± 5 mg axit tricloaxetic (4.4) trong 15 ml axit sul f uric 1 mol/l (4.10), chuyển sang bình định m ứ c 1 000 ml, pha loãng bằng nước đến vạch, trộn và khử kh í . 4.17. Dầu Silicon , để khử bọt. 4.18. Chất chuẩn 4.18.1. Yêu cầu chung Pyridoxamin (PM). pyridoxal (PL) và pyridoxin (PN) có thể có được từ nhiều nh à cung cấp khác nhau . Đ ộ tinh khiết của các chất này có thể khác nhau, do đó cần xác định nồng độ và độ tinh khiết của chúng (xem 4.19.4 và 4.20.7). 4.18.2. Pyridoxamin (PM) dihydro clorua , w (C 8 H 12 N 2 O 2 .2HCl) ≥ 98 %. 4.18.3. Pyridoxal (PL) hydro clorua, w (C 8 H 9 N O 3 . HCI) ≥ 98 %. 4.18.4. Pyridoxin (PN) hydro clorua , w (C 8 H 11 N O 3 . HCI) ≥ 98 %. 4.19. Dung dịch gốc 4.19.1. Dung dịch gốc pyridoxamin (PM), nồng độ khối lượng r ( PM) khoảng 500 m g/ml H òa tan 71,7 mg pyridoxamin dihydro clorua (4.18.2) trong axit clohydric 0 , 1 mol/l (4.8) đựng trong b ì nh định mức 100 ml và thêm axit clohydric 0,1 mol/l đến vạch. Dung dịch này khi được bảo quản ở 4 o C có thể bền đến một tuần hoặc ở - 18 o C có thể bền được hai tháng. 4.19.2. Dung dịch gốc pyridoxal (PL), nồng độ khối lượng r (PL) khoảng 500 m g/ml Hòa tan 60,9 mg pyridoxal hydro clorua (4.18.3) trong axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đựng trong bình định mức 100 ml và thêm axit clohydric 0,1 mol/l đến vạch. Dung dịch này khi được bảo quản ở 4 o C c ó thể bền đến một tuần hoặc ở - 18 o C có thể bền được hai tháng. 4.19.3. Dung dịch gốc pyridoxin (PN) , nồng độ khối lượng r (PN) khoảng 500 m g/ml Hòa tan 60,8 mg pyridoxin hydro clorua (4.18.4) trong axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đựng trong b ì nh định mức 100 ml và thêm axit clohydric 0,1 mol/l đến vạch. Dung dịch này khi được bảo quản ở 4 o C có thể bền đến một tuần hoặc ở - 18 o C có thể bền được hai tháng. 4 . 19.4 Phép kiểm tra nồng độ D ù ng pipet lấy các d ung dịch gốc pyridoxamin (4.19.1), pyridoxal (4.19.2) và pyridoxin (4.19.3) tương ứng cho v à o b ì nh định mức 50 ml và thêm dung dịch axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đến vạch. Đo độ hấp thụ của các dung dịch trong cuvet thạch anh 1 cm dựa vào axit clohydric 0,1 mol/l ở bước s ó ng cực đại sử dụng máy đo ph ổ UV (xem Bảng 1). T í nh nồng độ khối lượng của từng hợp chất vitamin B 6 , p i , sử dụng hệ số tắt phân tử như trong Công thức (1): (1) Trong đó p i l à nồng độ khối lượng của pyridoxamin, pyridoxal và pyridoxin tương ứng, t í nh bằng microgam trên mililit dung dịch gốc; A là độ hấp thụ của các dung dịch pyridoxamin , pyridoxal và pyridoxin ở bước sóng cực đại l max (xem B ả ng 1); ε i l à hệ số hấp thụ phân tử của PM, PL hoặc PN ở pH thích hợp được xác định trong Bảng 1; M i là khối lượng phân t ử của các chất chuẩn PM, PL hoặc PN tương ứng được xác định trong Bảng 1; V là hệ số pha loãng, trong trường hợp này V = 50; F là hệ số đ ể tính các hợp chất vitamin B 6 không chứa HCI. Sử dụng các nồng độ khối lượng này để tính các nồng độ chính xác của 4.19.1 đến 4.19.3 và 4.20.1 đến 4.20.6. Bảng 1 - Các ví dụ về hệ s ố tắt phân tử của các hợp ch ấ t v i tamin B 6 Hợp chất Dung môi ε i mmol -1 .cm -1 M i g mo l -1 F PM.2HCI a 0,1 mol/l HCI, pH ~1 292 8 , 2 241 , 1 0,698 PL.HCI b 0,1 mol/1 HCI, pH ~1 288 9,0 203,6 0,821 PN.HCI c 0,1 mol/lHCI. pH ~1 291 8,6 205,6 0,823 a PM • 2HCI l à pyridoxamin dihydro clorua (4.18.2); b PL • HCI là pyridoxal hydro clorua (4.18.3); c PN • HCI lả pyri d oxin hydro c l orua (4.18.4). 4.20. Dung dịch chuẩn 4.20.1. Dung dịch chuẩn pyridoxamin (PM) I , r (PM) khoảng 10 m g/ml Pha lo ã ng 2 ml dung dịch gốc pyridoxamin (4.19.1) bằng axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đến 100 ml. Chuẩn bị dung dịch ngay trong ngày sử dụng. 4.20.2. Dung dịch chuẩn pyridoxal (PL) I , r (PL) khoảng 10 m g/ml Pha loãng 2 ml dung dịch gốc pyridoxal (4.19.2) bằng axit clohy d ric 0,1 mol/l (4.8) đến 100 ml. Chuẩn bị dung dịch ngay trong ngày sử dụng. 4.20.3 Dung dịch chuẩn pyridoxin (PN) I , r (PL) khoảng 10 m g/ml Pha lo ã ng 2 ml dung d ị ch gốc pyridoxin (4.19.3) bằng axit clohydric 0 , 1 mol/l (4.8) đến 100 ml. Chu ẩ n b ị dung dich ngay trong ngày sử dụng. 4.20.4 Dung dịch chuẩn pyridoxamin (PM) II , r (PM) khoảng 1 m g/ml Pha loãng 10 ml dung dịch chu ẩ n PM I (4.20.1) bằng axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đến 100 ml. Chu ẩ n bị dung dịch ngay trong ngày sử dụng. 4.20.5. Dung dịch chuẩn pyridoxal (PL) II , p (PL) kho ả ng 1 m g/ml Pha lo ã ng 10 ml dung dịch chuẩn PL I (4.20.2) bằng axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đến 100 ml. Chuẩn bị dung dịch ngay trong ngày sử dụng. 4 . 20.6 Dung dịch chuẩn pyridox i n (PN) II , p (PN) khoảng 1 m g/ml Pha loãng 10 ml dung dịch chuẩn PN I (4.20.3) bằng axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đến 100 ml. Chuẩn bị dung dịch ngay trong ngày sử dụng. 4.20.7. Ki ể m tra độ tinh khiết sắc kí bằng HPLC Độ tinh khiết của các chất chu ẩ n cỏ thể kiểm tra bằng HPLC như sau: Bơm các thể tích th í ch hợp của các dung dịch chuẩn I của PM, PL và PN (4.20.1, 4.20.2 và 4.20.3) vào hệ thống HPLC và phân tích theo 6.4. Tính độ tinh khiết của các ch ấ t chuẩn theo Công thức (2): R i = (2) Trong đó: R i l à độ tinh khiết của chất chuẩn i t í nh bằng phần trăm (%); x i là diện tích pic của ch ấ t chuẩn i ; B là tổng các diện tích pic của các chất nhiễm bẩn (không có pic của d ung môi). Độ tinh khiết sắc kí của các chất chuẩn cần ≥ 98 %, nếu không th ì sử dụng các chất chu ẩ n mới hoặc chuẩn bị các dung dịch chuẩn mới. 4.21. Dung dịch hiệu chu ẩ n hỗn hợp , ví dụ r ( PM , PL , PN) = 0,1 m g/ml đ ế n 10 m g/ml D ù ng pipet l ấ y các thể tích thích hợp của các dung dịch gốc của PM, PL và PN (4 .19. 1 đến 4 19.3) ho ặ c các dung dịch chuẩn (4.20 1 đến 4.20.6) cho vào b ì nh định m ứ c 20 ml, pha loãng bằng axit clohydric 0,1 mol/l (4 8) đến 6,5 ml, nếu cần . Ch ỉ nh pH đến 4,8 bằng dung dịch natri axetat 2,5 mol/l (4.5) và sau đó ch ỉ nh pH đến 3,0 bằng axit sul f uric (4.10), pha loãng bằng nước đến vạch và trộn (dung dịch hiệu chuẩn). Nên sử dụng í t nhất ba điểm hiệu chuẩn. Các dung dịch hiệu chuẩn hỗn hợp có th ể cần được pha loãng bằng pha động trước khi bơm vào HPLC, nếu cần. 5. Thiết bị, dụng cụ 5.1. Yêu cầu chung Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thủy tinh của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau: 5 . 2 Máy đo phổ UV, có thể đo độ hấp thụ ở các bước sóng xác định. 5 . 3 Thiết b ị gia nhiệt Thiết bị hấp áp lực và tủ sấy hoặc nồi cách thủy kèm theo bộ phận khuấy, của phòng thử nghiệm, có thể kiểm soát được nhiệt độ ở 37 o C . 5.4. Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao Gồm có bơm, bộ bơm mẫu, detector huỳnh quang c ó bước sóng kích thích ở 290 nm và bước sóng phát xạ ở 390 nm và có hệ thống đánh giá như bộ tích phân và thiết bị tạo dẫn xuất sau cột, tùy chọn. 5.5. Cột HPLC , ví dụ: cột pha đảo như: Luna™ RP C 1 8 , 5 m m 1) , cỡ hạt 5 m m, đường k í nh 4,0 mm, dài 250 mm 2) . Các ví dụ thích hợp khác được nêu trong Phụ lục B. 5.6. Dụng cụ lọc Lọc pha động cũng như dung dịch mẫu thử qua bộ lọc màng, ví dụ c ỡ lỗ 0,45 m m, trước khi sử dụng hoặc trước khi bơm sẽ kéo dài thời gian sử dụng của cột. 6. Cách tiến hành 6.1. Chu ẩ n bị mẫu thử Cắt nhỏ và đồng hoá mẫu thử . Nghiền thô nguyên liệu trong máy nghiền th í ch hợp và trộn lại. C ần làm lạnh sơ bộ để tránh mẫu tiếp x ú c với nhiệt độ cao trong thời gian dài. Tiến hành phân tích ngay sau khi mẫu được đ ồ ng hóa. 6.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu th ử 6 . 2.1 Chiết mẫu 6.2 . 1.1 Yêu cầu chung Đối với các mẫu chứa hàm lượng chất béo cao (> 25 %) thì cần loại bớt chất béo, ví dụ: xử lý nhiều lần với dầu nhẹ trước khi phân h ủ y bằng axit. Để xử lý các mẫu c ó tạo bọt, nên sử dụng vài giọt dầu Silicon (4.17). Độ pH của dung dịch chiết được cần xấp x ỉ 1. Nếu không th ì gi ả m khối lượng mẫu hoặc dùng axit clohydric có nồng độ cao hơn [ví dụ: 0,2 mol/l (4.9) hoặc 1 mol/l (4.7)]. 6.2 . 1.2 Chiết các sản phẩm khô (hàm lượng nước nhỏ hơn 20 %, ví dụ: ngũ cốc, sữa bột, rau khô) Cân t ừ 1 g đến 10 g mẫu thử đồng nhất (6.1), chính xác đ ế n miligam, cho vào bình nón 150 ml, thêm 50 ml axit clohydric 0,1 mol/l (4.8), trộn và kiểm tra để chắc chắn pH xấp xỉ 1. Làm nóng trong thiết bị áp lực (5.3) trong 30 min ở nhiệt độ 120 o C , làm nguội đến nhiệt độ ph ò ng, chuyển sang b ì nh định mức 100 ml và pha loãng bằng nước đến 100 ml (với lớp s ilicon cao hơn vạch) và tr ộn. Lọc hoặc li tâm một lượng ( k hoảng 50 ml) dung dịch mẫu đã xử lý bằng axit ở gia t ố c 3 000 g và chuyển lớp n ổ i ph í a trên sang chai thủy tinh có thể đậy k í n (đây là dung dịch chiết mẫu). 6.2.1. 3 Chiết các mẫu dạng lỏng và ướt (hàm lượng nước lớn hơn 20 %, ví dụ: thịt, rau. nước quả) Cân từ 2 g đến 40 g mẫu thử đồng nhất (6.1), chính xác đ ế n miligam, cho vào b ì nh nón 150 ml, thêm 10 ml axit clohydric 1 mol/ l (4.7) , pha loãng bằng nước đến kho ả ng 50 ml, trộn và kiểm tra để chắc chắn pH xấp xỉ 1. Làm n ó ng trong thiết bị á p lực (5.3) trong 30 min ở nhiệt độ 120 o C , làm nguội đến nhiệt độ phòng, chuyển sang b ì nh định mức 100 ml và pha loãng bằng nước đến 100 ml (với lớp s ilicon cao hơn vạch) và trộn. Lọc hoặc li tâm một lượng (khoảng 50 ml) dung dịch mẫu đã xử lý bằng axit ở gia tốc 3 000 g và chuyển lớp nổi ph í a trên sang chai thủy tinh có thể đậy k í n (đây là dung dịch chiết mẫu). CH Ú THÍCH Trong quá tr ì nh hấp áp lực có thể có sự thay đổi c á c d ạ ng khác nhau của vitamin , ví dụ: chuy ể n hóa vitamin. Điều này quan sát được đối với các mẫ u th ịt đã làm chín ho ặ c các mẫu có chứa cac nhóm amin tự do cao. xem t ừ [2] đ ế n [7] 6.2.2. Xử lý enzym và c á c bước chuyển hóa Đối với c ác mẫu thực phẩm c ó nguồn gốc động vật (thịt lợn, sữa , cá...) không ch ứ a pyridoxin liên kết b -glucosidaza, th ì không cần xử lý bằng enzym v ớ i b -glucosidaza. Kinh nghiệm cho thấy rằng các kết quả t ổ ng hàm lượng vitamin B 6 của các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật được phân tích có s ử dụng hoặc không sử dụng b -glucosidaza để xử lý enzym là như nhau [2], [ 7]. D ùn g pipet lấy 12,5 ml dung dịch chiết mẫu từ 6.2.1.2 và 6.2.1.3 cho vào bình nón 20 ml và ch ỉ nh pH đến 4,8 ± 0,1 bằng dung dịch natri axetat (4.5). Thêm 1 ml dung d ịch phosphataza trong axit (4.13) và 1 ml dung dịch b -glucosi d aza (4.15) và trộn. Đậy nắp b ì nh nón và ủ dung dịch ở 37 o C ít nhất 12 h hoặc đ ể qua đêm trong khi vẫn khuấy liên tục. Sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng, chỉnh pH đến xấp xỉ 3 bằng axit su nf uric (4.10), chuyển định lượng dung dịch đã chỉnh này sang b ì nh định mức 20 ml và pha lo ã ng b ằ ng nước đến vạch. Lắc và lọc qua giấy lọc gấp nếp khô, loại bỏ 5 ml dịch lọc đầu tiên. Dung dịch mẫu thử này khi được bảo quản trong tủ lạnh ở khoảng 4 o C có thể bền được 3 ngày. Để phân t í ch HPLC, chuyển một lượng (khoảng 2 ml) qua bộ lọc màng (5.6) và pha loãng bằng pha động, nếu cần. 6.3. Chuẩn bị dung dịch mù thu ố c thử Dùng pipet l ấ y 12,5 ml dung dịch axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) cho vào bình nón 20 ml và chỉnh pH đến 4,8 ± 0,1 bằng dung dịch natri axetat 2,5 mol/l (4.5). Thêm 1 ml dung dịch phosphataza trong axit (4.13) và 1 ml dung dịch b -glucosidaza (4.15) và trộn . Ủ dung dịch ở 37 o C ít nhất 12 h hoặc đ ể qua đêm trong khi vẫn khuấy liên tục. Sau khi để nguội đến nhiệt độ ph ò ng, chỉnh pH đến khoảng 3 bằng axit sul f uric (4.10), chuyển dung dịch n à y sang bình định mức 20 ml và pha loãng bằng nước đến vạch, l ắ c và lọc qua giấy lọc gấp nếp khô, loại b ỏ 5 ml dịch lọc đầu tiên. Để phân tích HPLC, chuyển một lượng (khoảng 2 ml) qua bộ lọc màng (5.6) và pha loãng bằng pha động, nếu cần. 6.4. Điều kiện HPLC Thực hiện tách bằng hệ thống HPLC phải sao cho tách được đường nền của các pic thu được đối với PM, PL và PN ra khỏi tất cả các chất khác có trong mẫu thử. Việc tách và định lượng đã ch ứ ng minh l à thoả mãn khi áp dụng c á c điều kiện thực nghi ệ m sau đây (xem H ì nh trong Phụ l ụ c B): Cột HPLC theo 5.5 ; Pha động theo 4.16; Tốc độ dò ng: 1,5 ml/min; Thể tích bơm: từ 1 m l đến 50 m l; Detector: huỳnh quang; bước sóng kích thích: 290 nm; bước sóng phát xạ: 390 nm. 6.5. Nhận biết Bơm các thể t í ch thích hợp của dung dịch mẫu thử (6.2.2), các dung dịch mù thu ố c thử (6.3) và các dung dịch hiệu chuẩn hỗn hợp (4.21) vào hệ thống HPLC với các điều kiện quy định trong 6.4. Nhận biết PM, PL và PN bằng cách so sánh thời gian l ưu của các pic riêng rẽ trong sắc phổ thu được với dung dịch mẫu thử và với dung dịch thử chuẩn. Việc nhận bi ế t pic cũng c ó thể thực hiện b ằ ng cách thay đổi pH sau cột đến các giá trị lớn hơn, ví dụ: pH = 6,6 sử dụng thiết bị tạo dẫn xuất sau cột (5.4) với tốc độ dòng của thuốc thử sau cột (4.6) là 0,1 ml/min. Việc phát hiện được thực hiện ở bước sóng kích thích 330 n m và bước sóng phát xạ 390 nm [2], [4], [5]. CH Ú THÍCH: Việc t ă ng giá trị pH bằng thu ố c thử sau cột (4.6) dẫn đ ế n trượt bước sóng k í ch thích đ ế n 330 nm. Ngo à i ra , độ chọn lọc của một số chất nền được cải thiện do giảm một số pic nền [ 2], [4], [5]. 6.6. Phép xác định Bơm các thể tích thích hợp của dung dịch chu ẩ n và dung dịch mẫu thử vào hệ thống HPLC với các điều kiện quy định trong 6.4. Tiến hành phép xác định ngoại chuẩn, tích phân các diện t í ch pic hoặc chiều cao pic, so sánh kết quả với các giá trị tương ứng của chất chu ẩ n. 7. Tính kết quả 7.1. Dựa vào đường chuẩn, các chương trình thích hợp của bộ tích phân để tính hoặc sử dụng các công thức từ (3) đến (6) dưới đây. (3) (4) (5) (6) Trong đó y i l à khối lượng của PM, PL hoặc PN, t í nh bằng microgam trên 20 ml dung dịch mẫu thử (6.2.2) xác định được bằng diện tích pic hoặc chiều cao pic sử dụng h ồ i quy tuyến tính hoặc đường chuẩn; m là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g); b i , a i , là các hệ số hồi quy đối với PM, PL hoặc PN tính được từ hồi quy tuyến tính theo nồng độ và diện t í ch pic trong các dung dịch hiệu chuẩn; a i là giá tr ị y của đường chuẩn đối với PM, PL và PN; b i là gradient của đường chuẩn; x i l à diện tích pic PM, PL hoặc PN đã hiệu chính của dung dịch mẫu thử; P i là các diện tích pic PM, PL và PN của dung d ịch mẫu thử; B i l à các diện tích pic PM, PL hoặc PN của dung dịch thử trắng thuốc thử; F là thương số tính được trong Công thức (6); w là phần khối lượng pyridoxamin (PM), pyridoxal (PL) hoặc pyridoxin (PN), t í nh bằng miligam trên 100 g mẫu; V là tổng thể tích dung dịch mẫu chiết bằng axit (6.2.1.2); (6.2.1.3), tính bằng mililit (ml); V 1 l à thể tích dung dịch chiết bằng axit dùng để xử lý enzym (6.2.2), tính bằng mililit (ml). 7.2. T í nh phần khối lượng của vitamin B 6 , w , biểu thị theo pyridoxin bằng mg/100 g mẫu, theo Công thức (7): (7) Trong đó: W PM là hàm lượng pyridoxamin, tính bằng mg/100 g mẫu; W PL là hàm lượng pyridoxal, t í nh bằng mg/100 g mẫu; W P N là hàm lượng pyridoxin , tính bằng mg/100 g mẫu; 1,006 l à hệ số đổi với PM đ ể t í nh theo PN; 1,012 là hệ số đối với PL để t í nh theo PN. 7.3. Báo cáo kết quả đối với vitamin B 6 được tính theo pyridoxin bằng mg/100 g CHÚ THÍCH : Nếu cần tính kết qu ả theo pyridoxin hydro clorua th ì sử dụng hệ s ố chuyển đổi là 1,216 . Việc chuyển đổi này phải đ ược ghi rõ t rong báo cáo thí nghiệm 8. Độ chụm 8.1. Yêu cầu chung Dữ liệu về độ chụm của phép xác định vitamin B 6 được thiết lập từ phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725 do Bg VV (Bundesinstitut fur gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinarmedizin, German Federal Institute for Consumer protection and veterinary medicine) trước đây thực hiện. Các chi tiết của phép thử cộng tác về độ chụm của phương pháp nêu trong Phụ lục A. Các giá tr ị thu được từ phép thử liên ph ò ng này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ phân tích và chất nền khác với d ả i nồng độ và chất nền nêu trong Phụ lục A. Khả năng áp dụng và độ tin cậy của phương pháp này đã được thử nghiệm bằng các nghiên cứu khác trên các loại thực phẩm khác nhau như thịt, cá, sữa, rau, quả và ngũ c ố c [2], [3]. Các kết quả phân tích n à y có độ tái lập tốt và chỉ có một vài pic gây nhiễu từ chất nền thực phẩm, mà có thể tách được dễ dàng. Có mối tương quan tốt và hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của PM, PL và PN trong dung dịch hiệu chuẩn. Các độ lệch chuẩn tương đối của tổng hàm lượng vitamin B 6 trong dãy từ ba đến năm phép xác định thông thường trong các loại thực phẩm khác nhau dao động từ 2 % đến 6 %. Độ thu hồi của PM, PL và PN được bổ sung vào thực phẩm dao động từ 85 % đến 105 % [2], [3]. Xác định t ổ ng vitamin B 6 bằng phương pháp này cho các giá trị cao hơn rõ rệt trong các loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật (c ó ch ứ a pyridoxin đã glycosyl hóa) so với các phương pháp khác không xử lý bằng b -glucosidaza [ 2], [3], [7]. 8.2. Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử thử riêng rẽ, thu được khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r . Các giá trị đó là: Đối với bột tấm lõi (semolina) chứa sữa: Pyridoxamin = 0,065 mg/100 g r = 0,008 Pyridoxal = 0,080 mg/100 g r = 0,022 Pyridoxin = 0,523 mg/100 g r = 0,067 Vitamin B 6 = 0,667 mg/100 g r = 0,084 Đối với bột khoai tây nghiền: Pyridoxamin = 0,163 mg/100 g r = 0,016 Pyridoxal = 0,032 mg/100 g r = 0,012 Pyridoxin = 1,008 mg/100 g r = 0,080 Vitamin B 6 = 1,204 mg/100 g r = 0,089 Đối với rau trộn thịt xông khói (thức ăn cho trẻ nhỏ) Pyridoxamin = 0,043 mg/100 g r = 0,005 Pyridoxal = 0,009 mg/100 g r = 0,004 Pyridoxin = 0,047 mg/100 g r = 0,010 Vitamin B 6 = 0,107 mg/100 g r = 0,011 Đối với đồ uống chứa nhiều loại vitamin: Pyridoxamin = 0,004 mg/100 g r = 0,003 Pyridoxal = 0,004 mg/100 g r = 0,003 Pyridoxin = 0,374 mg/100 g r = 0,056 Vitamin B 6 = 0,380 mg/100 g r = 0,056 8.3. Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử riêng rẽ, thu được bởi hai phòng thử nghiệm khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R . Các giá trị đó là: Đối với bột tấm lõi (semolina) chứa sữa Pyridoxamin = 0,065 mg/100 g R = 0,035 Pyridoxal = 0,080 mg/100 g R = 0,071 Pyridoxin = 0,523 mg/100 g R = 0,151 Vitamin B 6 = 0,667 mg/100 g R = 0,193 Đối với bột khoai tây nghiền: Pyridoxamin = 0,163 mg/100 g R = 0,089 Pyridoxal = 0,032 mg/100 g R = 0,022 Pyridoxin = 1,008 mg/100 g R = 0,314 Vitamin B 6 = 1,204 mg/100 g R = 0,369 Đối với rau trộn thịt xông khói (thức ăn cho trẻ nhỏ) Pyridoxamin = 0,043 mg/100 g R = 0,013 Pyridoxal = 0,009 mg/100 g R = 0,013 Pyridoxin = 0,047 mg/100 g R = 0,021 Vitamin B 6 = 0,107 mg/100 g R = 0,039 Đối với đồ uống chứa nhiều loại vitamin: Pyridoxamin = 0,004 mg/100 g R = 0,005 Pyridoxal = 0,004 mg/100 g R = 0,005 Pyridoxin = 0,373 mg/100 g R = 0,086 Vitamin B 6 = 0,380 mg/100 g R = 0,095 9. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm ít nhất ph ả i bao gồm các thông tin sau đây: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp thử đã sử dụng; c) ngày và loại quy trình lấy mẫu (n ế u biết); d) ngày nhận mẫu; e) ngày thử nghiệm; f) các kết qu ả và các đơn vị biểu thị kết qu ả ; g) các điểm đặc biệt quan sát được trong khi tiến hành thử nghiệm; h) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là t ùy chọn có thể ảnh hư ở ng đến kết quả. Phụ lục A (Tham khảo) Dữ liệu về độ chụm Các dữ liệu hiện hành thu được bằng các phương pháp HPLC được nêu trong Phụ lục C . Dữ liệu về độ chụm đối với phương pháp xác định vitamin B6 đã được thiết lập b ở i phép thử liên phòng theo ISO 5725 do Bg VV (Bundesinstitut fur gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinarmedizin, German Federa l Institute for Consumer protection and veterinary medicine) tr ước đây thực hiện. Bảng A.1 - Dữ liệu về độ chụm đối với bột t ấ m lõi chứa sữa M ẫ u Bột t ấ m lõi chứa sữa Chất phân tích Pyridoxamin Pyridoxal Pyridoxin Vitamin B 6 a N ă m thử nghiệm 2000 2000 2000 2000 Số lượng phòng thử nghiệm 11 11 11 11 Số lượng mẫu thử 5 5 5 5 Số lượng phòng thử nghiệm c ò n lại sau khi tr ừ ngoại lệ 10 10 10 10 S ố lượng kết quả được giữ lại 53 53 53 53 Giá trị trung b ì nh, , mg/100 g 0,065 0,080 0 , 523 0,667 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , mg/100g 0,003 0,008 0 , 024 0,030 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSD r , % 4,6 10,0 4,6 4,5 Giới hạn lặp lại r(2,8 x s r ), mg/100 g 0,008 0,022 0,067 0,084 Độ lệch chuẩn tái lập, s R , mg/100 g 0 , 013 0,025 0,053 0,068 Độ lệch chu ẩ n tương đối tái lập RSD R , % 20,5 31,3 10,1 10,2 Giới hạn tái lập R (2,8 X s R ), mg/100 g 0,035 0 , 071 0 , 151 0,193 Giá trị trung b ì nh độ thu hồi, % 97,2 94,7 93,9 Độ lệch chuẩn thu hồi , % 9 8,2 9,7 Số lượng kết quả sử dụng đ ể t í nh độ thu hồi 23 20 23 a Vitamin B 6 = 1 , 006 pyridoxamin + 1,012 pyridoxal + pyridoxin. B ả ng A.2 - Dữ liệu về độ chụm đối với bột khoai tây nghiền M ẫ u Bột khoai tây nghiền Chất phân tích Pyridoxamin Pyridoxal Pyridoxin Vitamin B N ă m thử nghiệm 2000 2000 2000 2000 Số lượng phòng thử nghiệm 10 10 10 10 Số lượng mẫu thử 5(9) 5(9) 5(9} 5(9) S ố lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 9 9 9 9 Số lượng kết quả được giữ lại 49 49 49 49 Giá trị trung bình , , mg/100 g 0,163 0,032 1,008 1,204 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , mg/100g 0,006 0 , 004 0,028 0,032 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSD r , % 3,7 12,3 2,8 2,7 Giới hạn lặp lạ i r (2,8 x s r ), mg/100 g 0,016 0,012 0,080 0,089 Độ lệch chuẩn tái lập, s R , mg/100 g 0,031 0,008 0,111 0,131 Độ lệch chuẩn tương đ ố i tái lập RSD R , % 19,0 25,0 11 , 0 10,9 Giới hạn tái lập R (2,8 x s R ), mg/100 g 0,089 0,022 0,314 0,369 Giá trị trung bình độ thu hồi, % 97 , 7 85,2 90,8 Độ lệch chuẩn thu hồi, % 9,4 7,4 9 , 9 Số lượng kết quả sử dụng để t í nh độ thu hồi 19 20 20 a Vitamin B 6 = 1 , 006 pyridoxamin + 1,012 pyridoxal + pyridoxin. Bảng A.3 - Dữ liệu về độ chụm đối với rau trộn dăm bông (thức ăn cho trẻ nhỏ) Mẫu Rau trộn dăm b ô ng (thức ăn cho tr ẻ nhỏ) Ch ấ t phân tích Pyr i doxam i n Pyridoxal Pyridoxin V i tamin B 6 N ă m thử nghiệm 2000 2000 2000 2000 Số lượng phòng thử nghiệm 9 9 9 9 Số lượng mẫu thử 5(2) 5(2) 5(2) 5(2) Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 8 8 8 8 Số lượng kết quả được giữ lại 37 37 37 37 Giá trị trung bình , , (mg/100 g) 0,043 0,009 0,047 0,107 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , mg/100g 0,002 0,001 0 , 003 0,004 Độ lệch chuẩn tương đ ố i lặp lại RSD r , % 4,4 15,4 7,2 3,6 Gi ớ i hạn lặp lại r ( 2 , 8 x s r ), mg/100 g 0,005 0,004 0,010 0,011 Độ lệch chu ẩ n tái lập, s R , mg/100 g 0,005 0,005 0,007 0,014 Độ lệch chuẩn tương đối tái lặp RSD R , % 11,0 50,5 15,7 12 , 8 Giới hạn tái lập R (2,8 X s R ), mg/100 g 0,013 0,013 0,021 0,039 Giá trị trung bình độ thu hồi, % 95,1 90,6 88,9 Độ lệch chuẩn thu hồi, % 4,5 12,0 10,2 Số lượng kết quả sử dụng để tính độ thu hồi 18 16 19 a Vitamin B 6 = 1 , 006 pyridoxamin + 1,012 pyridoxal + pyridoxin. B ả ng A.4 – D ữ liệu về độ chụm đối với đồ uống ch ứ a nhi ề u loại vitamin Mẫu Đồ uống ch ứ a nhiều loại vitamin Chất phân tích Pyridoxamin Pyridoxal Pyridoxin Vitamin B 6 Năm thử nghiệm 2000 2000 2000 2000 Số lượng phòng th ử nghiệm 11 11 11 11 S ố lượng mẫu thử 5 5 5 5 S ố lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 10 10 10 10 Số lượng kết quả được giữ lại 53 53 53 53 Giá trị trung b ì nh, , mg/100 g 0 , 004 0,004 0,373 0,380 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , mg/100g 0,001 0,001 0,020 0,020 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSD r , % 25,0 25,0 5,4 5,3 Giới hạn lặp lại r (2,8 x s r ), mg/100 g 0,003 0,003 0,056 0,056 Độ lệch chuẩn tái lập, s R , mg/100 g 0,002 0,002 0,030 0,034 Độ lệch chu ẩ n tương đối tái lập RSD R , % 38,6 49 8 , 0 8,8 Giới hạn tái lập R (2,8 X s R ), mg/100 g 0,005 0,005 0,086 0,095 Giá trị trung b ì nh độ thu hồi, % 98,1 94,5 98,2 Độ lệch chuẩn thu hồi, % 11 , 4 6 , 2 8,4 Số lượng kết quả sử dụng đ ể t í nh độ thu h ồ i 23 23 23 a Vitamin B 6 = 1 , 006 pyridoxamin + 1,012 pyridoxal + pyridoxin. Phụ lục B (tham khảo) B ả ng B.1 - V í dụ về các điều kiện HPLC thích hợp để xác định c á c h ợ p chất vitam i n B 6 PTN Cột phân tích Kích thước, mm x mm Nhiệt độ, o C Pha động Tốc độ, dòng, ml/min Bước sóng, nm Thời gian lưu, min EX EM PM b PL c PN d 1a LUNA RP C 18 , 5 m m 250 x 4,0 30 H 2 SO 4 ( c = 0,015 mol/l) chứa TCA ( c = 0,005 mol/l) 1,5 290 390 ~3 ~7 ~11,4 1b LUNA RP C 18 , 5 m m 250 x 4,0 30 H 2 SO 4 ( c = 0,015 mol/l) chứa TCA ( c = 0,005 mol/l) và thuốc thử sau cột: K 2 HPO 4 ( c = 0,005 mol/l) 1,5 0,5 330 390 ~ 2,4 ~ 6,9 ~ 11,2 2 LUNA RP C 18 , 5 m m 250 x 4,0 30 H 2 SO 4 ( c = 0,015 mol/l) chứa TCA ( c = 0,005 mol/l) 1,5 290 390 ~ 3 ~ 7,9 ~ 13,0 3 AQUA C 18 , 5 m m a Tiền cột: RP C 18 , 5 m m 250 x 4,6 4,0 x 3,0 30 H 2 SO 4 ( c = 0,015 mol/l) chứa TCA ( c = 0,005 mol/l) 2,0 1,5 290 390 ~ 2,2 ~ 2,7 ~ 4,7 ~ 5,4 ~ 6,4 ~ 6,9 4 LiChrospher 60 RP C 8 , Chọn B, 5 m m 250 x 4,0 30 H 2 SO 4 ( c = 0,03 mol/l) chứa TCA ( c = 0,05 mol/l), từ 0 min đến 14 min B : metanol, từ 14 min đến 21 min 3,0 290 390 ~ 2,5 ~ 4,8 ~ 6,1 5 Nucleosil 120 C 18 , 5 m m Tiền cột: RP C 18 250 x 4,0 ~20 H 2 SO 4 ( c = 0,015 mol/l) chứa TCA ( c = 0,005 mol/l) 2,0 290 390 ~ 2,0 ~ 4,9 ~ 7,0 6 LUNA RP C 18 , 5 m m 250 x 4,0 30 H 2 SO 4 ( c = 0,015 mol/l) chứa TCA ( c = 0,005 mol/l) 2,0 290 390 ~ 2,5 ~ 6,3 ~ 9,2 7 LUNA RP C 18 , 5 m m 250 x 4,0 30 H 2 SO 4 ( c = 0,015 mol/l) chứa TCA ( c = 0,005 mol/l) 2,0 290 390 ~ 2,8 ~ 6,5 ~ 11,8 8 LUNA RP C 18 , 5 m m 250 x 4,0 30 H 2 SO 4 ( c = 0,015 mol/l) chứa TCA ( c = 0,005 mol/l) 2,0 290 390 ~ 2,8 ~ 6,9 ~ 11,4 9 Spherisorb 80 ODS-2, 5 m m 250 x 4,6 30 H 2 SO 4 ( c = 0,015 mol/l) chứa TCA ( c = 0,005 mol/l) 2,0 290 390 ~ 5,5 ~ 10,4 ~ 16,1 10 LUNA RP C 18 , 5 m m 250 x 4,0 30 H 2 SO 4 ( c = 0,015 mol/l) chứa TCA ( c = 0,005 mol/l) và thuốc thử sau cột: K 2 HPO 4 ( c = 0,015 mol/l) 1,0 0,5 330 390 ~ 6,9 ~ 17,9 ~ 28,4 a Phenomenex, 125 A; b PM = Pyridoxamin; c PL = Pyridoxal; d PN = Pyridoxin Phụ lục C (Tham khảo) Các ví dụ về các hệ số tắt phân tử B ả ng C.1 - Các ví dụ về hệ số tắt phân tử (E) của các hợp chất vitamin B 6 [3], [4] Hợp chất Dung môi l max E M w nm mmol -1 , cm -1 g mol -1 Pyridoxin hydro clorua HCI 0,1 mol/l, pH xấp x ỉ 1 290 8,6 205,6 Pyridoxin hydro clorua đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 7 323,8 7,3 205,6 Pyridoxal hydro clorua HCI 0,1 mol/l, pH x ấ p xỉ 1 288 8,96 (9,0) 203,6 Pyridoxal-5'-phosphat đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 7 388 5,02 247,1 Pyridoxamin dihydro clorua HCI 0,1 mol/l, pH x ấ p xỉ 1 292 8,2 241,1 Pyridoxamin dihydro clorua đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 7 253 4,6 241,1 Pyridoxamin-5'-phosphat h y dro clorua đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 7 326 8,37 241,1 Phụ lục D (Tham khảo) Hình vẽ CHÚ DẪN LU là c ườ ng độ huỳnh quang Hình D.1 - Các chất chuẩn và mẫu khoai tây nghiền Điều kiện vận hành: Cột HPLC: theo 5.5 Pha động: theo 4.16 Tốc độ dòng: 1,5 ml/min Detector: huỳnh quang, bước sóng kích thích: 290 nm; bước sóng phát xạ: 390 nm. Th ư mục tài liệu tham khảo [1] Bognár. A Bestimmung von Vitamin B 6 in Lebensmitteln mit Hilfe der Hochdruck f lussig- Chromatographie (HPLC). Z Lebensm Unters Forsch A. 1985, 181: 200 - 205 [2] Bognár A., Ollilainen, V.: In f luence of Extraction on the Determination of Vitamin B 6 in Food by HPLC . Z Lebensm Unters Forsch A, 1S97. 204: 327 - 335 [3] Melzler, O . E., and Snelt, E.E: Spectra and lonisation Constants of the Vitamin 86- Group and Related 3-Hydroxypyridine Dehvatos . Jou rn al of the American Chemical Society. 1955, 77: 2431 - 2437 [4] Bilsch. R., Moller. X., J Chromatogr., 1989. 463: 207-211 [5] Ollilainen, V.: HPLC Analysis of Vitamin 86 in Agr i cultural and Food Science in F inland . Department of Applied Chemistry and Microbiology University of Helsinki 1999. Vol. 8: No. 5: 515-619 [6] Bergaentzle. M., Arella. F., Bourguignon, J.B., Hasselmann, C .: Determination of vitamin B 6 in foods by HPLC; A collaborative study . Food Chemistry, 1995, 52: 81-86 [7] Ndaw. S ., Bergaentzle, M., Aoude-Wemer, D., Hasselmann. C .: Extraction procedures tor the liquid chromatographic determination of thiamin Ribo f lavin and vitamin B 6 in foodstuffs . Food Chemistry 2000, 71, 129-136 [8] ISO 5725, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a s tandard test method by intor-laboratory tests 6) 1) U là đơn vị (thường được gọi là đơn vị quốc tế hoặc đơn vị chuẩn) được xác định là số lượng enzym xúc tác chuyển hóa 1 m mol cơ chất trong một phút trong các điều kiện chuẩn. 1) Thông tin n à y đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chu ẩ n v à kh ô ng ấ n định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu chúng cho kết quả tương đương. 1) Luna TM là ví dụ về sản phẩm có bán sẵn, do Phenomenex cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng sản phẩm tương tự nếu chúng cho kết quả tương đương. 2) Có thể sử dụng kích cỡ hạt hoặc đường kính cột khác với quy định trong tiêu chuẩn. Các thông số tách biệt được cập nhật để đảm bảo các kết quả tương đương. Tiêu chí về hiệu năng đối với các cột phân tích thích hợp được dựa trên độ phân giải của các chất phân tích có liên quan. 6) ISO 5725:1986 đã hủy và được thay thế bằng ISO 5725-1:1994, ISO 5725-2:1994, ISO 5725-3:1994, ISO 5725-4:1994, ISO 5725-5:1998 và ISO 5725-6:1994. Tất cả các phần của ISO 5725 đã được chấp nhận thành TCVN 6910-1:2001; TCVN 6910-2:2001; TCVN 6910-3:2001; TCVN 6910-4:2001; TCVN 6910-5:2002 và TCVN 6910-6:2002.