TCVN8400-33:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-33:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-33:2015 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 33: BỆNH LÊ DẠNG TRÙNG Ở TRÂU BÒ Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 33: Bovine babesiosis Lời nói đầu TCVN 8400-33 : 2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo OIE (2010), Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals , Chapter 2.4.2 Bovine babesiosis; TCVN 8400-33 : 2015 do Trung tâm Ch ẩ n đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm 38 phần: - TCVN 8400-1 : 2010, phần 1: Bệnh lở mồm long móng; - TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn; - TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn; - TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn; - TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng; - TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ; - TCVN 8400-7 : 2011, ph ầ n 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê; - TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm; - TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt type I; - TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò; - TCVN 8400-11 : 2011, ph ầ n 11: Bệnh dịch tả vịt; - TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà; - TCVN 8400-13 : 2011, phần 13: Bệnh s ẩ y thai truyền nhiễm do brucela; - TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-15 : 2011, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira; - TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli; - TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh do vi khuẩn Staphylococcus aureus g â y ra ở gà; - TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đ ầ u gà (coryza); - TCVN 8400-19 : 2014, ph ầ n 19: Bệnh phó thương hàn lợn; - TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đ óng dấu lợn; - TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS); - TCVN 8400-22 : 2014, phần 22: Bệnh giả dại ở lợn; - TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí th á n; - TCVN 8400-24 : 2014, ph ầ n 24: Bệnh viêm phế quản truy ền nhiễm; - TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn; - TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia c ầ m H5N1; - TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh s á n lá gan; - TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại t ử d o vi khuẩn Clostr i dium per f ringens ; - TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà; - TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà; - TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh Tụ huyết trùng gia cầm; - TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm; - TCVN 8400-33 : 2015, ph ầ n 33: Bệnh Lê dạng trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-34 : 2015, ph ầ n 34: Bệnh Biên trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh Theiler i a ở tr â u bò; - TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2; - TCVN 8400-37 : 2015, ph ầ n 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn; - TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus. BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 33: BỆNH LÊ DẠNG TRÙNG Ở TRÂU BÒ Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 33: Bovine babesiosis CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết b ị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không th ể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng c h úng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy tr ì nh chẩn đoán bệnh lê dạng trùng ở trâu bò do một số loài Babesia spp. gây ra. Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng để chẩn đoán bệnh lê dạng trùng cho các gia súc khác như dê, c ừ u, lợn, hươu, chó... 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: 2.1 . Bệnh lê dạng trùng (Babesiosis) Bệnh do một số loài Babesia spp. như Babesia divergens, Babesia bovis, Babesia bigemina ký sinh trong hồng cầu gây ra. CHÚ THÍCH: Khi con v ậ t mắc bệnh có biểu hiện đặc trưng như: sốt cao, thiếu máu, nước tiểu màu đ ỏ có l ẫ n máu. M ầ m bệnh Babesia spp. đ ư ợc truyền từ con vật bệnh sang con vật khỏe qua một số lo à i ve như Rhipicephalusspp., Ixodes r i cinus... 3. Thuốc thử và vật liệu thử Ch ỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước c ấ t, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 3.1 . Nguyên liệu và vật liệu thử dùng cho phương pháp nhuộm Giemsa 3.1.1 . Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,0 (xem A.1). 3.1.2 . Dung dịch Giemsa, 10% ( xem A.2). 3.1.3 . Metanol tuyệt đối 3.2 . Nguyên liệu và vật liệu thử dùng cho phương pháp realt i me PCR 3.2.1 . K í t tách chiết ADN (axit deoxyribonucleic), d ùng cho mẫu máu chống đông (xem Phụ lục B). 3.2.2 . Kít nhân gen. 3.2.3 . Cặp mồi (primers) và mẫu dò. 3.2.4 . Nước tinh khiết, không có nuclease. 3.2.5 . Etanol, từ 96% đến 100% (thể tích). 3.2.6 . Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic). 3.3 . Nguyên liệu và vật liệu thử dùng cho phư ơ ng pháp ELISA (phép thử miễn d ị ch liên kết enzym) Hiện nay các kít ELISA thương mại có sẵn trên thị trường dùng để phát hiện kháng thể lê dạng trùng. Khi sử dụng phương pháp EL I SA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xu ấ t. 3.4 . Thuốc thử và vật liệu th ử dùng cho phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFAT) 3.4.1 . Dung dịch PBS. 3.4.2 . Albumin huyết thanh bò (BSA). 3.4.3 . Glyxerol. 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau: 4.1 . Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung 4.1.1 . T ủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C. 4.1.2 . T ủ lạnh , có thể duy trì nhiệt độ 2 °C đến 8 °C. 4.1.3 . Máy lắc trộn vortex. 4.2 . Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp nhuộm Giemsa 4.2.1 . Phiến kính, v ô trùng. 4.2.2 . Lamen, v ô trùng. 4.2.3 . Kính hiển vi quang học, vật kính d ầu 100 X. 4.3 . Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp realtime PCR 4.3.1 . Máy ly tâm, c ó thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g. 4.3.2 . Máy nh â n gen (realtime PCR). 4.3.3 . Máy spindo w n, có thể ly t â m với gia tốc 6 000 g. 4.4 . Thiết b ị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA 4.4.1 . Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 37 °C. 4.4.2 . Máy đọc ELISA, có thể đọc ở bước sóng 405 nm. 4.5 . Kính hiển vi huỳnh quang, dùng cho phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFAT). 5. Chẩn đoán lâm sàng 5.1 . Đặc điểm dịch t ễ - Mầm bệnh Babesia spp. được truyền từ con vật bệnh sang con vật khỏe qua một số loài ve như Ixodes ricinus, Haemaphysalis spp. và Rhipicephalus spp; - Bệnh gặp ở trâu bò mọi lứa tuổi, giống và không phân biệt giới tính; - Ở những vùng dịch mang t í nh chất địa phương, bệnh thường gặp ở trâu bò non; - Bệnh phổ bi ế n ở trâu bò ở những vùng nóng, ẩm; - Bệnh thư ờ ng gặp ở trâu bò ở vùng đồng bằng và mi ề n núi, nơi có nhiều loài ve truyền bệnh. 5.2 . Triệu chứng lâm sàng 5.2.1 . Thể c ấ p tính - Nước tiểu lúc đầu trắng đục sau chuyển sang màu đỏ nâu hoặc có máu tươi; - Niêm mạc nhợt nhạt do thiếu máu; - Trâu bò sốt cao từ 40 °C đến 42 °C, sốt cao kéo dài trong vòng từ 2 ngày đến 4 ng à y. Nhịp th ở nhanh và khó khăn. Đôi khi có triệu chứng thần kinh; - Trâu bò chửa dễ s ả y thai; - Trâu bò y ế u thường chết sau 1 tuần khi nhiệt độ hạ, huyết áp hạ và trụy tim mạch. 5.2.2 . Thể mạn tính - Nước tiểu có màu nâu đỏ; - Có hiện tượng hoàng đản ở vùng da và niêm mạc nhất là vùng mắt, tai, âm đạo; - Trâu bò sốt nhẹ (từ 39 °C đến 40 °C) sau đó lại giảm, ít lâu sau lại sốt tr ở lại; - Trâu bò ăn uống bình thường nhưng mệt mỏi, gầy xơ x á c, không linh hoạt, ít hoạt động, lông rụng dần và suy nhược; - Nếu kh ô ng điều trị kịp thời sẽ chết v ì kiệt sức và thiếu máu nặng. 5.3 . Bệnh tích - Bọng đái thường có nước tiểu vàng th ẫ m hoặc đỏ; - Niêm mạc dưới da nhợt nhạt; - Các bắp thịt tái nhợt, nhũn, ứ nước; - Lớp mỡ dưới d a vàng nhợt, ứ nước; - Xoang ngực chứa nước vàng hoặc hồng nhạt, loãng, khó đông; - Tim sưng to, c ó khi nhũn, nhạt màu, màng bao tim xu ấ t huyết điểm hoặc lan tràn; - Gan sưng, mép gan dày, có vùng cứng vùng nát; - Túi mật sưng to; - Lách sưng dày lên, nhũn, mủn như bùn. 5.4 . Chẩn đoán phân biệt Chẩn đoán phân biệt về lâm sàng giữa bệnh l ê dạng trùng và một số bệnh khác trên gia súc theo Bảng 1. Bảng 1 - Chẩn đoán phân biệt Bệnh Biểu hiện Biên trùng Triệu chứng và bệnh tích nh ẹ hơn bệnh lê dạng trùng. Nước tiểu không có màu đ ỏ . Tiên mao trùng (Trypanosomosis) Con vật sốt cao, theo chu kỳ. Theileriosis Hạch, lách sưng to. Eperythrozoonosis Máu khó đông. Gan và các cơ quan nội tạng màu vàng. Nhiệt thán Nước tiểu có màu đ ỏ nhưng để lâu th ì lắng cặn. Bệnh l ê dạng trùng: nước tiểu có màu đ ỏ nhưng để lâu không lắng cặn. Niệu huyết Gan hoại tử. 6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1. Phương pháp nhuộm Giemsa kiểm tra hình thái lê dạng trùng 6.1.1 . Lấy m ẫ u Dùng xylanh 5 ml và kim tiêm 20 G (hoặc 18 G) vô trùng, l ấ y từ 1,5 ml đến 2 ml máu ở tĩnh mạch cổ hoặc động mạch đuôi của trâu bò nghi ngờ bệnh cho vào ống có chất chống đông (EDTA, natri xitrat hoặc heparin), ghi ký hiệu mẫu l ê n thành ống. CHÚ TH Í CH: Đồng thời K èm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi r õ y ê u cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch t ễ , các biểu hiện triệu chứng, bệnh t í ch của bệnh. 6.1.2 . Bảo quản mẫu T ấ t c ả các mẫu bệnh phẩm đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp chưa xét nghiệm ngay mẫu máu chống đông, bảo quản trong tủ lạnh (4.1.2). 6.1.3 . Chuẩn b ị mẫu Mẫu bệnh ph ẩ m là mẫu máu (6.1.1). 6.1.4 . Cách tiến hành 6.1.4.1 . Chuẩn bị tiêu bản - Nhỏ 1 giọt máu (6.1.1) (tương đương từ 5 m l đến 10 m l) lên một dầu của phiến k í nh (4.2.1); - Dàn mỏng giọt máu bằng lamen (4.2.2) hoặc một phiến kính khác (4.2.1); - Tiêu bản để khô tự nhiên sau đó cố định bằng cách nhỏ metanol tuyệt đối (3.1.3) trong 1 min. Để khô. 6.1.4.2 . Nhuộm tiêu bản - Đặt tiêu bản (6.1.4.1) vào cốc đựng dung dịch Giemsa 10 % (xem điều A.2 phụ lục A) trong 1 min; - Rửa tiêu bản bằng nước sạch từ 3 lần đến 4 l ầ n; - Để khô tiêu bản ở nhiệt độ phòng. 6.1.5 . Xem hình thái l ê dạng trùng Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản (6.1.4.2) và xem bằng kính hiển vi quang học (4.2.3), quan sát th ấ y lê dạng trùng nằm trong hồng cầu và mang đặc điểm riêng cho từng loài như sau: - Babesia bovis: hình dạng giống 2 quả l ê chụm vào nhau tạo góc tù, nằm ở giữa hồng cầu. Kích thước chiều dài từ 1 m m đến 1,5 m m, chiều rộng từ 0,5 m m đến 1,0 m m; - Babesia divergens: có h ì nh dạng g ầ n giống Babesia bovis nhưng n ằ m ở mép hồng cầu; - Babesia bigemina: hình dạng quả l ê đơn hoặc đ ô i chụm vào nhau tạo góc nhọn. Kích thước to hơn các loài khác, chiều dài từ 3 m m đến 3,5 m m, chi ề u rộng từ 1 m m đến 1,5 m m. 6.2. Phương pháp realtime PCR phát hiện kháng nguyên lê dạng trùng 6.2.1 . L ấ y mẫu Xem 6.1.1. 6.2.2 . Bảo quản mẫu Xem 6.1.2. 6.2.3 . Chuẩn bị mẫu Xem 6.1.3. 6.2.4 . Cách tiến hành 6.2.4.1 . Tách chiết ADN Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.1) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. VÍ DỤ: dùng kít tách chiết DNeasy Ò Blood & Tissue Kit (250) ( Cat No. 69506) 1) (xem Phụ lục B). 6.2.4.2 . Chuẩn bị m ồ i Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.3.2) theo phương pháp realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu 18S rADN của B. bovis hoặc B. bigemina sử dụng cặp mồi và m ẫ u dò (3.2.3) được nêu trong Bảng 2. Bảng 2 - Trình tự cặp mồi và mẫu dò phát hiện B. bovis hoặc B. b igemina [1] Gen đích Loài Cặp mồi Trình tự 5’-3’ 18S rADN B. bovis Mồi xuôi (forward primer) AGCAGGTTTCGCCTGTATAATG Mồi ngược (reverse primer) AGTCGTGCGTCATCGACAAA M ẫ u dò (FAM) CCTTGTATGACCCTGTCGTACCGTTGG 18S rADN B. bigemina Mồi xuôi (forward primer) AATAACAATACAGGGCTTTCGTCT Mồi ngược (reverse primer) AACGCGAGGCTGAAATACAACT Mẫu dò (VIC) TTGGAATGATGGTGATGTACAACCTCA Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau: - Chuẩn bị mồi gốc và mẫu dò gốc: mồi và m ẫ u dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.3.3) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi và mẫu dò lắng xuống đáy ống trước khi m ở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi, mẫu dò ở nồng độ 100 m M làm mồi gốc và mẫu dò gốc; - Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 m M, pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.4) (20 m l mồi gốc và 80 m l nước); - Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 10 m M, pha loãng mẫu dò gốc bằng nước (3.2.4) (10 m l mẫu dò gốc và 90 m l nước). 6.2.4.3 . Tiến hành phản ứng Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đ ã được chuẩn bị (6.2.4.2). Sử dụng k í t nhân gen (3.2.2) theo hướng dẫn của nhà sản xu ấ t. VÍ DỤ: dùng kít nh â n gen c ủ a QuantiTect Probe PCR, Qiagen (Cat No. 204341) 2) Thành phần cho một phản ứng được nêu trong Bảng 3. Bảng 3 - Thành phần phản ứng realtime PCR Thành phần Thể tích ( m l ) QuantiTect Probe PCR master mix 12 Mồi xuôi, 20 m M 1 Mồi ngược, 20 m M 1 M ẫ u dò, 10 m M 0,5 Nước tinh khiết không có nuclease 5,5 Tổng thể tích 20 Chuyển 20 m l hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng: - Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 m l mẫu ADN có giá tr ị chu kỳ ngưỡng (C t ) đ ã biết trước vào ống phản ứng; - M ẫ u kiểm chứng âm: cho 5 m l nước (3.2.4) vào ống phản ứng; - Mẫu bệnh ph ẩ m: cho 5 m l mẫu ADN bệnh ph ẩ m (6.2.4.1) vào ống phản ứng. CHÚ THÍCH: Phản ứng realtime PCR ph ả i bao gồm: mẫu bệnh phẩm, mẫu ki ể m chứng dương v à mẫu ki ể m chứng âm; Mẫu và nguyên li ệu cho phản ứng Realtime PCR cần đặt trong khay đ á lạnh trong su ố t quá tr ì nh chu ẩ n bị hỗn hợp phản ứng. Tiến hành phản ứng Realtime PCR bằng máy nhân gen (Realtime PCR) (4.3.2) đã được cài đặt chu tr ì nh nhiệt được nêu trong Bảng 4. Bảng 4 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 50 °C 2 min 1 95 °C 10 min 95 °C 20 s 45 55 °C 1 min 45 6.2.5 . Đọc kết quả Đọc kết quả b ằ ng máy nhân gen (realtime PCR) (4.3.2) dựa trên giá trị C t (C t là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống ph ả n ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền). Điều kiện ph ả n ứng được công nhận: mẫu kiểm chứng dương tính có giá trị C t biết trước, mẫu kiểm chứng âm t í nh không c ó C t ; Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị C t £ 35 được coi là dương tính; mẫu không c ó C t được coi l à âm tính; mẫu có giá trị 35 < C t £ 40 được coi là nghi ngờ; Những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại quy trình xét nghiệm hoặc xét nghiệm b ằ ng phương pháp khác để khẳng định. 6.3. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể lê dạng trùng 6.3.1 . Lấy mẫu Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 20G (hoặc 18G) vô trùng, lấy t ừ 1,5 ml đến 2 ml máu ở tĩnh m ạ ch cổ hoặc động mạch đuôi của trâu bò nghi m ắ c bệnh lê dạng trùng. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp. 6.3.2 . Bảo quản m ẫ u Tất c ả các mẫu bệnh ph ẩ m đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng th í nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp chưa xét nghiệm ngay, mẫu huy ế t thanh phải được ly tâm, chắt l ấ y phần huyết thanh sang ống khác, bảo quản trong t ủ lạnh âm sâu (4.1.1). 6.3.3 . Chuẩn bị mẫu Chắt huy ế t thanh từ xylanh (6.3.1) sang ống nghiệm vô trùng, kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống ch ứ a huyết thanh. 6.3.4 . Cách tiến hành VÍ DỤ: dùng bộ k í t phát hiện kháng thể l ê dạng trùng ở trâu bò của h ã ng SVANOVA 3) . 6.3.4.1 . Chu ẩ n bị nguyên liệu - Dung dịch đệm: pha loãng dung dịch PBS-Tween 20 X với nước c ấ t theo t ỷ lệ 1/20 (cho 25 ml dung dịch PBS Tween 20 X vào 475 ml nước c ấ t), lắc đều. Bảo quản dung dịch đệm ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C; - Dung dịch kháng kháng thể bò: pha loãng kháng kháng thể bò với 11,5 ml dung dịch đệm (pha xong dùng ngay). Sau khi pha loãng bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C. Dung dịch kháng kháng thể bò đông tan tối đa 3 lần; - Pha loãng mẫu kiểm chứng ( âm, dương) và mẫu bệnh ph ẩ m (6.3.3) với dung dịch đệm theo t ỷ lệ 1/100 (cho 5 m l mẫu kiểm chứng hoặc mẫu bệnh phẩm vào 495 m l dung dịch đệm). 6.3.4.2 . Tiến hành ph ả n ứng - Các thuốc thử để ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng; - Nhỏ 100 m l mẫu kiểm chứng (âm, dương) đ ã pha loãng (6.3.4.1) vào các giếng được chọn (mỗi mẫu thực hiện trên 2 giếng, v ị trí của mẫu kiểm chứng đã được đánh dấu trong đĩa); - Nhỏ 100 m l mẫu bệnh ph ẩ m đã pha loãng (6.3.4.1) vào gi ế ng được chọn (mỗi mẫu có thể làm 1 giếng hoặc 2 giếng, tuy nhiên trong trường hợp xác định lại mỗi mẫu nên làm 2 giếng); - Phủ kín đĩa và ủ ở t ủ ấ m 37°C (4.4.1) trong 30 min; - Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch đệm; - Nhỏ 100 m l dung dịch kh á ng kháng thể bò đ ã pha loãng (6.3.4.1) vào từng giếng; - Phủ kín đĩa và ủ ở tủ ấm 37°C (4.4.1) trong 30 min; - Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch đệm; - Nhỏ 100 m l dung dịch cơ ch ấ t vào mỗi gi ế ng; - Phủ kín đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 18 °C đến 25 °C trong 30 min; - Nh ỏ 100 m l dung dịch dừng phản ứng vào mỗi gi ế ng; - Phủ k í n đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 18 °C đến 25 °C trong 30 min; - Đọc đĩa ở bước sóng 405 nm bằng máy đọc ELISA (4.4.2) trong vòng 15 min. 6.3.5 . Đọc kết qu ả - Tính giá trị mật độ quang học (OD) của mẫu kiểm chứng âm, m ẫ u kiểm chứng dương và m ẫ u bệnh phẩm. - Tính tỷ lệ giá trị OD giữa mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu kiểm chứng âm với mẫu kiểm chứng dương (PP) theo công thức sau: PP = OD mẫu bệnh ph ẩ m ho ặ c mẫu ki ể m ch ứ ng â m x 100 OD m ẫ u ki ể m chứng dương - Giá trị mẫu kiểm chứng nằm trong khoảng giới hạn sau: 1) OD của m ẫ u kiểm chứng dương: trong khoảng 1,0 đến 2,3 2) PP của mẫu kiểm chứng âm: nh ỏ hơn 20 - Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh phẩm: 1) PP nhỏ hơn hoặc bằng 25: mẫu âm tính; 2) PP trong khoảng 26 đ ế n 39: mẫu nghi ngờ; 3) PP lớn hơn hoặc bằng 40: mẫu dương tính. CHÚ TH Í CH: K í t phát hiện kh á ng thể lê dạng tr ù ng không thể phân biệt được kháng thể do nhiễm tự nhiên hay kháng thể do ti ê m v ắ c xin. 6.4. Phương pháp IFAT phát hiện kháng thể lê dạng trùng 6.4.1 . Lấy mẫu Xem 6.3.1. 6.4.2 . Bảo quản mẫu Xem 6.3.2. 6.4.3 . Chuẩn bị mẫu Xem 6.3.3. 6.4.4 . Cách tiến hành 6.4.4.1 . Chuẩn bị kháng nguyên - Lấy máu con vật nhiễm lê dạng trùng ở mật độ từ 2 % đến 5 % cho vào ống có ch ứ a chất chống đông; - Rửa 3 l ầ n với dung dịch PBS (3.4.1) theo tỷ lệ 1/5 (hoặc 1/10) để loại bỏ huyết tương; - Sau khi rửa, hồng cầu được tái hòa tan bằng 2 lần thể t í ch PBS đã cho thêm 1 % albumin huyết thanh b ò (3.4.2); - Nhỏ 1 giọt máu đã pha loãng ở trên vào một phiến kính (4.2.1) và dùng một phiến kính khác dàn mỏng; - Để phiến kính khô ở nhiệt độ phòng và cố định 5 min ở nhiệt độ 80 °C. Bọc kín tiêu bản máu đ ã cố định và bảo qu ả n ở âm 70 °C, thời gian bảo quản tiêu bản tối đa 5 năm. 6.4.4.2 . Tiến hành phản ứng - M ẫ u bệnh ph ẩ m (6.4.3) pha loãng với dung dịch PBS ( 3.4.1) theo tỷ lệ 1 : 30; - Chia nh ỏ phiến k í nh chứa kháng nguyên (được chuẩn bị ở (6.4.4.1)) từ 8 ô đến 10 ô bằng bút dầu; - Nhỏ từ 5 m l đến 10 m l mẫu bệnh phẩm đã pha lo ã ng và mẫu kiểm chứng (âm, dương) vào các ô đã chia ở tr ê n qua miếng giấy lọc; - Đặt phiến kính trong hộp ẩ m và ủ ở tủ ấm (4.4.1) trong 30 min; - Rửa phiến kính bằng dung dịch PBS để loại bỏ miếng gi ấ y lọc; - Rửa lại phiến kính bằng dung dịch PBS và nước. Mỗi lần rửa cho phiến kính vào máy lắc trộn vortex (4.1.3) trong 10 min; - Nhỏ kháng kháng thể có gắn chất màu huỳnh quang (fluorescein isothiocyanate - FITC) đ ã pha loãng ở nồng độ từ 1/400 đến 1/1200 vào mỗi ô; - Ủ phiến k í nh ở nhiệt độ phòng trong 30 min; - Rửa phiến kính bằng dung dịch PBS và nước. Mỗi lần rửa cho phiến kính vào máy lắc trộn vortex (4.1.3) trong 10 min; - Gắn lamen (4.2.2) lên trên phiến kính sau khi làm ẩm phiến kính bằng dung dịch glyxerol (3.4.3) và PBS theo tỷ lệ 1/1. 6.4.5 . Đọc kết quả Kiểm tra phiến kính (6.4.4.2) bằng kính hiển vi huỳnh quang (4.5): - M ẫ u dương tính đối với l ê dạng trùng khi có màu huỳnh quan g giống với màu của mẫu kiểm chứng dương; - Mẫu âm tính đối v ớ i l ê dạng trùng khi không có màu huỳnh quang giống với màu của mẫu kiểm chứng âm. 7. Kết luận Trâu bò được kết luận là mắc bệnh lê dạng trùng khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm s à ng, bệnh t í ch đại thể của bệnh và có kết quả xét nghiệm kháng nguyên hoặc kháng thể dương tính b ằ ng một trong những phương pháp quy định trong tiêu chu ẩ n này. Phụ lục A ( Quy định) Thành phần và chuẩn bị thuốc thử cho phương pháp nhuộm Giemsa A.1 . Dung d ị ch muối đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,0 A.1.1 . Thành phần Na t ri hydrophosphat (Na 2 HP O 4 ) Kali dihydrophosphat (KH 2 PO 4 ) Nước c ấ t 9,47 g 9,08 g 900 ml A.1.2 . Chu ẩ n bị Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước c ấ t. Ch ỉ nh pH đến 7,0 b ằ ng axit clohydric. CHÚ TH Í CH: Có thể sử dụng PBS thương mại và chu ẩ n bị theo h ướ ng dẫn của nhà s ả n xu ấ t A.2 . Dung dịch Giemsa, 10 % Dung dịch Giemsa (azur-eosin-methylen blue) Dung d ị ch PBS 0,01 M, pH 7,0 ( A.1) 1 phần 9 phần CHÚ TH Í CH: N ồ ng độ dung d ị ch Giemsa c ó th ể thay đổi theo các phòng th í nghiệm. Phụ lục B (Tham khảo) Quy trình tách chiết ADN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng g â y hại nếu thao tác không c ẩ n thận. Do vậy, n ê n tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải h ơ i của các hóa ch ấ t này. Luôn luôn đeo găng tay, kh ẩ u trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này. Quy tr ì nh tách chiết ADN sử dụng kít DNeasy ® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) như sau: B.1 . Pha dung dịch - Dung dịch AW 1 (Wash buffer 1): thêm 125 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào 95 ml dung dịch AW1 đậm đặc; - Dung dịch AW 2 (Wash buffer 2): thêm 160 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào 66 ml dung dịch AW2 đậm đặc. B.1 . Cách tiến hành - Bước 1: nhỏ 20 m l proteinase K vào ống 1,5 ml; nhỏ thêm 100 m l mẫu máu (6.2.3); và th ê m dung dịch PBS để được thể tích 220 m l . Tiến hành tiếp bước 2; - Bước 2: nhỏ 200 m l dung dịch AL (Lysis buffer) vào ống; trộn đều bằng máy lắc tr ộn vortex (4.1.3) trong 15 s. Ủ mẫu ở 56 °C tr ong 15 min; - Bước 3: nhỏ 200 m l etanol từ 96 % đến 100 % (thể t í ch) (3.2.5) vào ống, trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.1.3). - Bước 4: chuyển toàn bộ dung dịch trong ống vào cột lọc có ống thu; ly tâm cột lọc và ống thu ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.1) trong 1 min, loại bỏ ống thu; - Bước 5: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 m l dung dịch AW 1, ly tâm ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.1) trong 1 min, loại b ỏ ống thu; - Bước 6: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 m l dung dịch AW 2, ly tâm ở gia tốc 20 000 g bằng máy ly tâm (4.3.1) trong 3 min, loại bỏ ống thu; - Bước 7: chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml hoặc 2 ml sạch; - Bước 8: nhỏ 50 m l dung dịch AE (Elution buffer) vào giữa màng cột lọc, ủ 1 min ở nhiệt độ phòng (từ 15 °C đến 25 °C); ly tâm cột lọc và ống 1,5 ml hoặc 2 ml ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly t â m (4.3.1) trong 1 min; - Bước 9: b ỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml hoặc 2 ml có chứa ADN; B ả o quản ADN ở tủ lạnh (4.1.2) nếu thực hiện phản ứng realtime PCR ngay hoặc ở tủ lạnh âm s â u (4.1.1) nếu thực hiện phản ứng realtime PCR sau 24 h. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] K i m C, Iseki H, Herbas MS, Yokoyama N, Suzuki H, Xuan X, Fujisaki K, Igarashi I. Development of TaqMan-based r ea l-ti me PCR assays for d iagnost i c dete ctio n of Babesia bovis and Babesia bigemina. Am J Trop Med Hyg. 2007 Nov;77(5):837-41. [2] Buling A., Cria d o-Fornelio A., Asenzo G., Benitez D., Barba-Carret e ro J.C. & Florin-Christensen M., 2002. A quantitative PCR assay for the detection and quantification of Babesia bovis and B. bigem i na. Vet. Parasitol. 147,16-25. [3] Babesia bigemina Antibody Test. Available at: http://www.svanova.com/conten /d am/inte rn et/ah/svanova/dk_EN/documents/Kit%20inserts/lnsert%20B%20Bigenima-Ab%2019-2970-00_05.pdf [4] Phạm Văn Khuê và Phan Lục, 1996, Giáo tr ì nh ký sinh trùng thú y. NXB Đại học Nông Nghiệp I. 235-240. [5] Edouard Vannier., Peter J. Krause, Update on babesiosis, Interdisdp Perspect In f ect Dis. 2009; 2009: 984568. [6] Moses Sibusiso Mtshali., Phillip Senzo Mtshali, Molecular diagnosis and phylogenetic analysis of Babesia bigemina and Babesia bovis hemoparasites from cattle in South Africa, BMC Vet Res. 2013; 9: 154. 1) Th ô ng tin này đưa ra tạo đi ề u kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chu ẩ n và kh ô ng ấn định s ử dụng sản ph ẩ m của nhà cung c ấ p này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. 2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng ti ê u chu ẩ n v à kh ô ng ấ n đ ị nh sử dụng sản phẩm của nh à cung c ấ p này. Có thể s ử dụng các s ả n ph ẩ m tương tự n ế u cho các k ế t quả tương đương. Tuy nhiên, thành phần và thể tích của phản ứng realtime PCR có thể thay đ ổ i phù hợp với t ừ ng phòng th í nghiệm . 3 ) Thông tin này đưa ra tạo đi ề u kiện thuận tiệ n cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn đ ị nh sử dụng sản phẩm của nh à cung c ấ p n à y. Có thể sử dụng các s ả n phẩm tương tự n ế u cho các kết qu ả tương đương.