TCVN6554:1999

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6554:1999 (ISO 7698:1990) về Ngũ cốc đậu đỗ và các sản phẩm từ ngũ cốc và đậu đỗ - Đếm vi khuẩn nấm men và nấm mốc TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6554 : 1999 ISO 7698 : 1990 NGŨ CỐC ĐẬU ĐỖ VÀ CÁC SẢN PHẨM TỪ NGŨ CỐC VÀ ĐẬU ĐỖ - ĐẾM VI KHUẨN, NẤM MEN VÀ NẤM MỐC Cereals, pulses and derived p roducts - Enumeration of bacteria, yeasts and moulds L ời nól đ ầ u TCVN 6554 :1999 hoàn toàn tương đương với ISO 7698 :1990 TCVN 6554 :1999 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F1 Ngũ cốc và đậu đỗ biên soạn, Tổng cục Ti ê u chuẩn - Đo l ườ ng - Chất lượng đ ề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường ban hành. NGŨ CỐC ĐẬU ĐỖ VÀ CÁC SẢN PHẨM TỪ NGŨ CỐC VÀ ĐẬU Đ Ỗ - Đ Ế M VI KHU Ẩ N, NẤM MEN VÀ NẤM M ỐC Cereals, pulses and derived p roducts - Enumeration of bacteria, yeasts and moulds 1 Phạm vi áp dụng Ti ê u chuẩn này quy định ph ươn g ph á p đ ế m vi khuẩn, nấm men , nấm mốc trong ngũ cốc, đậu đỗ và c á c sản phẩm nhận được tr ự c tiếp từ chúng (bột mì, các hạt, cám , v. . v.) C ầ n áp dụng các tiêu chuẩn h ướ ng dẫn chung đặc biệt là ISO 7954 1 do tiểu ban kỹ thuật 9, vi s i nh vật biên soạn thuộc ISO /TC 34, Nông s ả n th ự c phẩm. C ầ n tham khảo ISO 7218 2 v ề th ự c hành phòng thí nghiệm tốt đ ố i với việc kiểm tra vi sinh vật. Chú thích 1 - Do bản ch ấ t của nấm men và nấm mốc, việc đếm s ố lượng chúng có những sai lệch nhất định. 2 Tiêu chuẩn trích dẫn TCVN 5451:91 (ISO 950), Ngũ cốc - L ấ y mẫu (dạng hạt) ISO 2170:1980, Ngũ cốc và đậu đỗ - Lấy mẫu sản phẩm dạng nghi ề n TCVN:1999 ISO 6887:1983, Vi sinh vật học - H ướ ng d ẫ n chung v ề chuẩn b ị dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh. 3 Định nghĩa Với mục đích của tiêu chuẩn này áp dụng các định ngh ĩ a sau 3.1 V i khuẩn: Các vi sinh vật ư a ấ m, hiếu khí hoặc kị kh í không b ắ t buộc ở 30 ° C ph át triển trong và tr ê n b ề mặt m ô i tr ư ờng thạch với các điều kiện mô tả của ti ê u chuẩn này. 3.2 Nấm men: Vi sinh vật hiếu khí ư a ấ m, ở 25 o C khi sử d ụng môi trường thạch nấm với các đi ề u ki ệ n của tiêu chuẩn này, sẽ: a) trên bề mặt của môi trường, phát triển thành các khuẩn lạc tròn sáng hoặc khuẩn lạc nh ẵ n mọng có mép vi ề n đ ề u đặn và b ề mặt khuẩn lạc l ồ i nhi ề u hoặc ít , hoặc b) trong môi trường nuôi cấy phát triển thành các kh uẩn lạc h ì nh hạt đậu hay hình tròn. 3.3 Mốc: Vi sinh vật thể sợi, hiếu khí, ưa ấ m trên b ề mặt môi trường thạch với các đ iề u kiện m ô tả của tiêu chuẩn này , thường phá t triển thành các khu ẩ n lạc dẹ t hoặc khối sợi nhỏ lan tỏa , thông thư ờ ng ở dạng quả có màu hoặc có cấu trúc bào tử. 4 Nguyên tắc 4.1 Chuẩn bị các cặp đĩa rót có chứa một lượng xác đ ị nh huy ề n phù ban đ ầ u mỗi một trong 2 môi trường nuôi cấy (5.3.1 và 5.3.2). Chuẩn bị các đĩa khác theo cùng một đ iều kiện, sử dụng các dung dịch pha lo ã ng một ph ầ n mười từ huy ề n phù ban đ ầ u. 4.2 Nuôi hiếu khí các đĩa chứa môi trường thạch để đếm vi khuẩn (5.3.1) ở 30 °C trong 3 ngày. Nuôi hi ế u khí các đ ĩ a chứa môi trường thạch để đếm n ấ m men và nấm mốc (5.3.2) ở 25 °C trong 3 ngày , 4 ngày, hoặc 5 ngày. 4.3 T í nh số vi khuẩn từ số khuẩn lạc mọc trên các đĩa môi trường thạch nuôi cấy được (5.3.1) Tính s ố nấm men và/hoặc mốc từ số khuẩn lạc mọc trên các đ ĩa thạch nuôi c ấ y đã được chọn (5.3.2) 5 Nước pha loãng, môi trường nuôi cấy và các vật liệu khác 5.1 C á c nguy ê n l iệ u cơ bản Để t ă ng độ tái lập của k ế t quả, tốt nhất n ê n dùng môi trường khô hoàn chỉnh hoặc các thành ph ầ n cơ bản khô để chuẩn bị môi trường nuôi cấy và môi trường pha loãng. Đ ồ ng thời có thể sử dụng các thu ố c thử pha s ẵ n bán trên thị trường. C ầ n phải tuân theo một cách ngh iêm ngặt các h ướ ng dẫn của nhà sản xuất. Các hóa ch ấ t sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích. N ướ c sử d ụ ng phải là nước c ất hoặc nước đ ã khử ion và không chứa các chất có thể gây ứ c chế sự phát triển vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, n ấ m mốc) theo đi ề u kiện thử ở đây. N ế u môi trường nuôi cấy và n ướ c pha lo ã ng không sử dụng ngay thì phải bảo quản trong chỗ t ối ở nhiệt độ từ 0°C đến +5°C không quá một tháng trong đi ề u ki ệ n sao cho thành ph ầ n của nó không bị thay đổi. 5.2 Chất pha loãn g Dung d ịch p e pton - natr i clorua, x e m TCVN : 1999 (ISO 6887) Chú thích 2- Đ ể t ă ng tính đ ồ ng nhất của huy ề n phù bào tử, có thể th ê m tác nhân hoạt động b ề m ặ t như este oleic sor bitol (Tween 80) với n ồ ng độ 0,033 g trên m ỗi lít dung dịch pha loãng. 5.3 Môi trường nuôi cấy 5.3.1 M ôi t rường thạch đ ể đếm v i khuẩn Thành phần trypton 1 ) 1) 5,0 g cao men khô 2,5g dextro khan 1 , 0 g thạch 9 đến 18 g 2) nước 1000 ml Chú thích 3 - Nếu c ầ n có thể th ê m chất ức chế như actidion (xycloheximit) natamyxin (pimarixin) vào m ôi trường nuôi c ấ y này với hàm lượng 0,1g/l để ngăn nấm men phát triển. chuẩn bị H òa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô vào nước b ằ ng cách đun nóng. Nếu c ầ n điều chỉnh pH sao cho sau khi thanh trùng có pH b ằ ng 7 ở 25 o C. Phân phối môi trường vào các ống nghiệm (6.9) mỗi ống 15ml hoặc vào các bình, hoặc chai (6.9) có dung tích thích hợp, dung tích của b ì nh hoặc chai phải gấp đôi lượng cho vào. Khử trùng trong n ồ i hấp áp l ự c (6.1) ở 121 °C ± 1°C trong 20 phút. N ế u sử dụng môi trường ngay th ì làm nguội tr ướ c khi sử dụng trong n ồ i cách thủy ở nhiệt độ 45 ± 0,5 °C. Nếu không, trước khi b ắ t đ ầ u kiểm tra vi sinh vật, để tránh bị chậm khi rót thạch, c ầ n làm nóng chảy hoàn toàn môi trư ờ ng trong n ồ i cách thủy đang sôi, sau đó làm nguội trong n ồ i cách thủy ở 45 ± 0,5°C trước khi sử dụng. 5.3.2 M ôi tr ườ ng thạch để đếm nấm men nấm mốc (mô i trường thạch - cloramphen i col - dextro - cao men) Thành phần Cao men dextro (C 6 H 1 2 O 6 ) cloramphenicol (C 11 H 1 2 C l 2 N 2 O 5 ) thạch nước 5 g 20 g 0,1 g 9 đ ế n 18 g 2 ) 1000ml Chuẩn bị Hoà tan các thành phần trong nước b ằ ng cách đun sôi. Nếu c ầ n đi ề u ch ỉ nh pH sao cho sau khi khử trùng c ó pH bằng 6,6 ở 25°C Phân phối môi trường vào các dụng cụ chứa (6.9) có dung tích thích hợp. Khử trùng môi trường trong n ồ i hấp áp l ự c (6.1) ở 121°C ± 1°C trong 15 phút. Nếu môi tr ườ ng được sử dụng ngay th ì làm nguội tr ướ c khi sử dụng trong n ồ i cách thủy (6.7) ở nhiệt độ 45°C ± 0,5°C. Nếu không, trước khi b ắ t đ ầ u kiểm tra vi sinh vậ t để tránh bị chậm khi rót thạch c ầ n làm tan chảy hoàn toàn môi trường trong n ồ i cách thủy đang sôi, sau đ ó làm nguội trong n ồ i cách thủy ở 45 ± 0,5°C tr ướ c khi sử dụng. Ch ú thích 4 - Có thể thay cloramphenicol b ằ ng oxytetraxylin (C 2 2 H 3 0 N 2 O 11 ). Trong trường hợp này chuẩn b ị môi trường cơ bản như mô tả ở trên nhưng bỏ qua cloramphenicol. Phân ra từng l ượng 100 ml và khử trùng. Chuẩn bị dung dịch nước 0,1%(m/m) hydroclorua oxytetraxylin và thanh trùng b ằ ng cách lọ c. Ngay trước khi sử dụng, thêm 10 ml dung dịch vô khuẩn này vào 10 0 ml môi trường cơ bản đã được làm tan chảy và giữ ở 45°C ± 0,5°C. 6 Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Chú thích 5 - Có thể sử dụng dụng cụ thủy tinh dùng một l ầ n thay cho đ ồ thủy tinh dùng lại được, n ế u nó đáp ứng được yêu c ầ u. Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh vật và đặc biệt là: 6.1 Thiết bị dùng để khử trùng khô ( tủ sấy ) hoặc khử trùng ướt ( Nồi hấp) (N ồ i h ấ p có thể hoạt động riêng hoặc có thể là một ph ầ n của thiết bị dùng để chuẩn bị và phân phối môi trường.) Khử trùng mọi thiết bị dụng cụ tiếp xúc với chất pha lo ã ng, môi trường nuôi cấy hoặc với mẫu, đặc biệt đối với dụng cụ b ằ ng ch ất dẻo, ch ỉ trừ các dụng cụ đã được khử trùng , bằng một trong các phương pháp sau đây: a) trong tủ sấy (6.1) ở nhiệt độ 170°C đến 175°C ít nhất 1 giờ, b) trong n ồ i hấp (6.1) ở 121°C ± 1°C ít nh ấ t 20 phút. 6.2 Thiết bị ngh iề n trộn Theo ISO 6887, sử dụng một trong các thiết bị sau: a) Máy nghiền trộn quay, tốt nhất nên dùng loại c ó bộ điều khi ể n ở phía trên có số vòng quay trong khoảng 8000 đến 45000 vòng / phút có c ố c chứa mẫu b ằ ng kim loại hoặc b ằ ng thủy tinh có n ắ p đậy kín, b ề n với đi ề u kiện khử trùng. b) M á y nghiền trộn kiểu nhu động (Stomacher), có túi ch ấ t dẻo thanh trùng Chú thích 6 - Dung tích của cốc hoặc túi chất dẻo phải đủ lớn để mẫu được trộn đ ề u với l ượ ng dịch pha loãng tương ứng . Nói chung dung tích của nó c ầ n phải b ằ ng 2 l ầ n thể tích của m ẫ u và thể tích của dịch pha loãng. 6.3 Máy trộn kiểu vortex để trộn chất chứa trong ống nghiệm, bình hoặc chai (các dịch pha loãng từ huy ề n phù ban đ ầ u). 6.4 Tủ ấ m có th ể giữ được nhiệt độ 30°C ± 1°C và 25°C ± 1°C. 6.5 Đĩa petr i , đ ườ ng kính 90mm đến 100 mm. 6.6 P i pet chia độ, đ ược hiệu chuẩn dùng cho mục đích kiểm tra vi sinh, dung tích danh nghĩa 10 ml và 1 ml được chia độ đến 0,5 ml và 0,1 ml, có lỗ thoát 2 mm đến 3 mm. 6.7 N ồi cách thủy hoặc thiết bị tương tự c ó thể duy trì được nhiệt độ 45 ± 0,5°C. 6.8 pH m e t chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25°C. 6.9 Ố ng ngh iệ m đư ờ ng kính 20mm x 200mm hoặc b ì nh hoặc chai dung tích 0,5 và 1lít 7 Lấy mẫu Tiến hành lấy mẫu theo TCVN 5451:91 (ISO 950) hoặc ISO 2170 tùy t ừ ng tr ườ ng hợp Lượng mẫu phòng thí nghiệm phải lớn hơn khối lượng của ph ầ n mẫu thử c ầ n thiết để phân tích theo bảng 1 (9.1) và để có thể phân tích lại khi c ầ n thi ế t. Nếu mẫu không thể phân tích ngay sau khi đưa đến phòng thí nghiệm thì phải bảo quản ở 10 o C t ố i đa 48 giờ. Đi ề u này phải ghi vào trong biên bản thử. M ẫ u không phải bảo quản ở đi ề u kiện đông lạnh. 8 Chuẩn bị mẫu thử Lắc kỹ mẫu thí nghiệm trước khi lấy mẫu để thử Chú thích 7 - Do bản chất của sản phẩm thuộc đối tượng tiêu chuẩn này vi sinh vật thường phân b ố không đ ồ ng đ ề u trong mẫu thử do đ ó khi c ầ n đánh giá ch í nh xác n ê n ti ế n hành xác định tr ê n các mẫu riêng biệt ít nhất là tr ê n 3 mẫu và tốt nh ấ t là tr ê n 5 mẫu thử. 9 Cách tiến hành 9.1 Phần mẫu thử Cân chính xác đến 0,1g lượng mẫu thử quy định trong bảng 1 vào a) Cốc của máy trộn quay (6.2 a) đối với sản phẩm loại 1 hoặc b) Túi chất dẻo của máy Stomacher (6.2 b) đối với sản phẩm loại 2. B ả ng 1 Loại Sản phẩm Kh ố i lượng phần mẫu thử , g Thể tích d ịch pha loãng,ml 1 2 Các loại hạt Các sản phẩm ngh iề n nhỏ (bột, cám, bột nghi ề n...) 40 20 360 180 9.2 Chuẩn bị dung d ị ch huyền phù ban đầu Th ê m lượng thể tích dung dịch pha loãng tương ứng theo bảng 1 vào phần mẫu thử (9.1) Để ph ầ n mẫu thử tiếp xúc với dịch pha lo ã ng trong 30 phút. Sau đ ó hoặc a) cho máy trộn quay (6.2 a) chạy với thời gian sao cho tổng số vòng quay từ 15000 đốn 20000 vòng (ngay cả đối với máy quay chậm nhất thời gian này cũng không được vượt quá 2,5 phút), hoặc b) Vận hành máy Stomacher (6.2 b) trong 2 phút. 9.3 Chuẩn bị các dung dịch pha loãng Chuẩn bị các dung dịch pha lo ã ng theo ISO 6887. Tr ướ c mỗi lần lấy phần mẫu thử để nuôi cấy, nên dùng máy trộn kiểu vortex (6.3) để khuấy kỹ chất chứa trong ống thử. 9.4 Cấy 9.4.1 Lấy 4 đĩa Petri vô trùng (6.5). Dùng pipet vô trùng lấy vào mỗi đĩa 1 ml huyền phù ban đ ầ u (có độ pha lo ã ng 10 - 1 ) (9.2). 9.4.2 Lấy 4 đĩa Petri vô trùng khác. Dùng 1 pipet mới vô trùng cho vào mỗi đ ĩa 1 ml dung dịch 10 - 2 (9.3). Lặp lại quy trình này sử dụng các dịch pha lo ã ng tiếp theo tùy theo yêu cầu (xem 9.6.1 và 9.6.2). 9.4.3 Cho vào mỗi nhóm 4 đĩa , 2 đĩa thứ nhất mỗi đĩa 15 ml môi trường thạch 5.3.1, 2 đĩa thứ 2 mỗi đĩa 15 ml môi trường thạch 5.3.2. Trộn kỹ một cách cẩn thận môi trường với các dịch nuôi cấy và để đĩa ở vị trí mặt phẳng n ằ m ngang ở chỗ mát cho đông đ ặc. Đ ồ ng thời chuẩn bị 2 đĩa đối ch ứ ng ,đĩa thứ nhất chứa khoảng 15 ml môi trường thạch 5.3.1 và đĩa còn lại chứa khoảng 15 ml môi trường thạch 5.3.2,để kiểm tra độ vô trùng củ a chúng. 9.5 Nuôi ấm 9.5.1 Vi khuẩn Lật ngược các đĩa chứa môi trường thạch 5.3.1 và đặt vào trong tủ ấm (6.4) đ ã chỉnh nhiệt độ ở 30°C ± 1°C trong 3 ngày. 9.5.2 Nấm men v à nấm mốc Đặt các đĩa với phần n ắ p ở trên hoặc lật ng ượ c đĩa chứa môi trường thạch 5.3.2 trong tủ ấm (6.4) được ch ỉ nh nhiệt độ ở 25°C ± 1°C trong 5 ngày. 9.6 B i ểu th ị 9.6.1 Đếm số khuẩn lạc vi khuẩn Kiểm tra các đĩa sau khi nuôi ấm theo thời gian quy định (9.5.1). Tiến hành đếm s ố khuẩn lạc ở mỗi đĩa chứa môi trường thạch 5.3.1, chứa không quá 300 khuẩn lạc. Đi ề u c ầ n thiết là một trong các đĩa này chứa ít nhất 15 khuẩn lạc. 9.6.2 Đếm số bào tử nấm men và/hoặc nấm mốc Tính số khuẩn lạc trên mỗi đĩa sau 3 ngày, 4 ngày và 5 ngày ủ ấm. Sau 5 ngày giữ lại các đĩa có ít hơn 150 khuẩn lạc. Nếu đĩa có nhi ề u nấm mốc mọc, hoặc khó đếm các khuẩn lạc phân tách tốt thì giữ lại số đếm sau 4 ngày thậm chí sau 3 ngày nuôi cấy. Trong trường hợp này thời gian ủ 3 hoặc 4 ngày c ầ n phải công bố trong báo cáo thử. Phân biệt khuẩn lạc nấm men và nấm mốc nhờ kiểm tra đại thể. Tuy nhiên trong những trư ờ ng hợp không r õ ràng thì tiến hành kiểm tra d ướ i kính hiển vi "các khuẩn lạc": khuẩn lạc nấm men nói chung g ồ m có tế bào dạng trứng hoặc dạng tròn, trong đó thấy có các dạng sợi. Nếu c ầ n, tiến hành phân tích hiển vi để phân biệt các khuẩn lạc nấm men nấm mốc với các khuẩn lạc vi khuẩn theo tính chất sinh thái học của chúng. 10 Biểu thị kết quả 10.1 Tính toán 10.1.1 Tính s ố vi sinh vật, tức là số vi khuẩn nấm men và/hoặc nấm mốc trên 1 gam sản phẩm theo công thức trong đó Σ C là tổng các khuẩn lạc trên tất c ả các đ ĩa được đếm và giữ lại ở 2 n ồ ng độ kế tiếp nhau d là dịch pha lo ã ng mà từ đó nhận được số đếm thứ nhất (ví dụ 10 - 2 ); n 1 là số đĩa được đ ế m và giữ lại ở dịch pha loãng t hứ nhất; n 2 là số đĩa được đếm và giữ lại ở dịch pha loãng thứ hai; 10.1.2 Làm tròn kết quả nhận được ở 10.1.1 đến 2 chữ số có nghĩa. Khi s ố làm tròn là 5 và không có số có nghĩa tiếp theo thì làm tròn ngay đến số b ê n trái: thí dụ 28500 th ì làm tròn đến 28000; 11500 thì làm tròn đến 12000. 10.1.3 Biểu thị kết quả d ướ i dạng từ 1,0 và 9,9 nhân với 10 x , trong đó x là luỹ thừa của 10. Nếu không có khuẩn lạc nào trên đĩa cấy từ hu yề n phù đầu ti ê n (9.4.1), số vi sinh v ậ t, t ứ c là vi khuẩn, nấm men và/ hoặc n ấ m mốc trên một gam sản phẩm được báo cáo là nhỏ hơn 10. 10.2 Thí dụ tính toán Đếm nấm men nấm mốc cho kết quả sau: (hai đĩa Petri cho mỗi độ pha lo ã ng đ ã được nuôi ấm) Dịch pha loãng 10 - 2 : 105 khuẩn lạc và 97 khuẩn lạc Dịch pha l oãng 10 - 3 : 18 và 23 khuẩn lạc Làm tròn k ế t quả theo quy định ở 10.1.2 thành 11000. Từ đó số nấm men và nấm mốc tr ê n một gam sản phẩm được định lượng là 1,1x1 0 4 . 10.3 Độ chính xác V ì lý do thống kê, trong 95% các trư ờ ng hợp độ tin cậy của phương pháp này dao động từ ± 16 % đến ± 52%. Trên th ự c t ế thậm chí có sự chênh lệch lớn hơn đặc biệt k ế t quả thu được từ các nhà sinh vật học khác nhau. 11 Báo cáo kết quả Báo cáo kết quả c ầ n chỉ ra phương pháp đã sử dụng, thời gian ủ ấm, c ũ ng như ph ươ ng pháp biểu thị kết quả. Báo cáo cũng cần đ ề cập đ ế n bất kỳ thao tác nào không quy định trong tiêu chuẩn này cũng như các thao tác được coi là tùy ý hoặc các sự cố có thể ảnh hưởng đ ế n kết quả. Báo cáo c ầ n bao g ồ m các thông tin cần thiết để nhận bi ế t mẫu một cách đầy đ ủ . Phụ lục A (tham khảo) Thư mục [1] ISO 7954:1987, Vi sinh vật học - H ướ ng d ẫ n chung đ ế m nấm men nấm mốc - Kỹ thuật đ ế m khuẩn lạc ở 25°C. [2] TCVN 6404 :1998 (ISO 7218:1996), Vi sinh vật học - H ướ ng dẫn chung v ề kiểm tra vi sinh vật [3] CO W ELL và MORISETTI,J. Sci Food agric, 1969 (Vol . 20), p.573. [4] TCVN 4884 - 89 (ISO 4833) , Vi sinh vật học - Hướng dẫn chung đếm vi sinh vật - Kỹ thuật đ ế m khuẩn lạc ở 30°C. 1) Thuật ngữ này hi ệ n nay ch ỉ một số nhà sản xuất môi trường sử dụng. Có thể sử d ụng b ấ t kỳ sự phân hủy nào của casein nào cho kết quả so sánh. 2) Theo hướng dẫn của nhà sản xuất.