TCVN10809:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10809:2015 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng methyl benzoquate - Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10809:2015 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG METHYL BENZOQUATE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal f eeding stuffs - Determination of methyl benzoquate content - High per f ormance liquid chromatographic method Lời nói đầu TCVN 10809:2015 được xây dựng dựa theo Commission Regulation (EC) No. 152/2009; TCVN 10809:2015 do Trung tâm Khảo, kiểm nghiệm và kiểm định giống vật nuôi, thức ăn c hăn n u ôi bi ê n soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát tri ể n nông thôn đ ề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo l ư ờng Ch ấ t lư ợ ng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG METHYL BENZOQUATE - PHƯ Ơ NG PHÁP S Ắ C KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal f eeding stuffs - Determination of methyl benzoquate content - High per f ormance liquid chromatographic method 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy đ ị nh phương pháp xác định hàm lượng methyl benzoquate (7-benzyloxy-6-butyl-3 - methoxycarbonyl-4-quinolone) trong thức ăn chăn nuôi bằng sắc k í lỏng hiệu năng cao. Giới hạn định lượng của phương pháp là 1 mg/kg. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu vi ệ n dẫn sau r ấ t cần thiết cho vi ệ c áp dụng tiêu chuẩn n à y. Đ ối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phi ê n b ả n được n ê u. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi n ă m công bố th ì áp dụng phiên bản mới nh ấ t, bao g ồ m c ả các sửa đổi, bổ sung (n ế u có). TCVN 6952 (ISO 9498) Thức ăn chăn nuôi- Chu ẩ n bị mẫu th ử 3. Nguyên tắc Methyl benzoquate được chi ế t ra khỏi mẫu bằng dung dịch axit methanesul f onic trong metanol. Dịch chi ế t được tinh sạch b ằ ng diclometan, sắc k í trao đ ổ i ion và sau đó tinh sạch lạ i bằng diclometan. Hàm lượng methyl benzoquate được xác đ ị nh bằng cách sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo v ớ i detector UV . 4. Thuốc thử Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nư ớ c cất hoặc nước đ ã loại khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy đ ị nh khác. 4.1 . D i clometan. 4.2 . Metanol, loại dùng cho HPLC. 4.3 . Pha động dùng cho HPLC Hỗn hợp của metanol (4.2) và nước (loại dùng cho HPLC) với tỉ lệ 75 : 25 (thể tích). Lọc qua bộ lọc màng c ỡ l ỗ 0,22 m m (5.5) và đuổi k h í dung dịch (v í dụ bằng si ê u âm trong 10 min). 4.4 . Dung dịch axit metha n esul f on i c , c = 2 % Pha loãng 20,0 ml axit methanesul f onic bằng metanol (4.2) đ ế n 1000 ml. 4.5 . Dung d ị ch axit c l ohydric , c = 10 % Pha loãng 100 ml axit clohydric ( r 20 = 1,18 g/ml) bằng nước đ ế n 1000 ml. 4.6 . Nhựa trao đ ổ i cation amber l ite CG-120 (Na), c ỡ 100 mesh đ ế n 200 mesh Nhựa được xử lý trước khi sử d ụ ng. Trộn 100 g nhựa với 500 ml dung dịch axit clohydric (4.5) và đun sôi trên b ế p điện, khuấy li ê n tục. Để nguội và gạn bỏ axit. Lọc qua gi ấ y lọc trong điều kiện chân không. Rửa nhựa hai lần mỗi lần 500 ml nước và sau đó rửa bằng 250 ml metanol (4.2). Rửa tiếp bằ ng 250 ml metanol và làm khô bằng cách cho không khí đi qua phần nhựa thu được. Bảo quản nhựa khô trong chai đậy kín. 4.7 . Ch ấ t chuẩn: methyl benzoquate (7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarbonyl-4-quinolone) tinh khi ế t 4.7.1 . Dung d ị ch chuẩn gốc methyl be nz oquate, 500 m g/ml Cân 50 mg ch ấ t chu ẩ n (4.7), ch í nh xác đ ế n 0,1 mg, hòa tan trong dung dịch axit methanesul f onic (4.4) trong b ì nh định mức 100 ml, thêm dung dịch ax i t me th anesul f onic đến vạch và trộn đều. 4.7.2 . Dung d ị ch chuẩn trung gian methyl benzoquate , 50 m g/ml Chuyển 5,0 ml dung d ị ch chu ẩ n gốc methyl benzoquate (4.7.1) vào b ì nh đ ị nh mức 50 ml, thêm metanol (4.2) đến vạch và trộn đều. 4.7.3 . Dung d ị ch hiệu chuẩn Chuyển 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml và 5,0 ml dung dịch chu ẩ n trung gian methyl be nz oquate (4.7.2) vào một loạt các b ì nh định mức 25 ml. Th ê m pha động (4 . 3) đ ế n vạch và trộn. Các dung dịch này có n ồ ng độ methyl benzoquate tương ứng 2,0 m g/ml, 4,0 m g/ml, 6,0 m g/ml, 8,0 m g/ml và 10,0 m g/ml. Các dung dịch này cần được chu ẩ n b ị mới trước khi sử dụng. 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thi ế t b ị , dụng c ụ thông thư ờ ng của ph ò ng thử nghiệm và các thi ế t b ị , dụng c ụ sau: 5.1 . Máy lắc phòng th ử nghiệm. 5.2 . Bộ c ô quay. 5.3 . Cột th ủ y tinh , k í ch thước 250 mm x 15 mm, có khóa vòi và dung tích cột khoảng 200 ml. 5.4 . Thiết b ị HPLC , có detector UV có th ể thay đổi bước sóng hoặc detector mảng diot. 5.4.1 . Cột sắc k í lỏng , kích thước 300 mm x 4 mm, C18, c ỡ hạt nhồi 10 m m hoặc loại tương đương. 5.5 . Bộ lọc màng, c ỡ lỗ 0,22 m m. 5.6 . Bộ lọc màng , c ỡ l ỗ 0,45 m m. 5.7 . B ì nh đ ị nh mức , dung tích 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml và 1000 ml. 5.8 . Phễu chiết , dung t í ch 500 ml và 1 lít. 5.9 . Bình cầu đáy tròn , dung tích 500 ml. 5.10 . B ì nh nón , dung tích 250 ml. 5.11 . Cân , có thể cân được 50 mg, chính xác đ ế n 0,1 mg. 5.12 . Cân , có th ể cân được 20 g, chính xác đ ế n 0,01 g. 5.13 . Cân , có th ể cân được 100 g, chính xác đ ế n 0,1 g. 5.14 . Pipet , c ó thể phân phối các thể tích thích hợp. 6. Lấy mẫu Mẫu phải đại diện và không b ị hư h ỏ ng hoặc b ị biến đổi chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản. Ti ê u chu ẩ n này không quy định việc lấy mẫu. N ê n l ấ y mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn ch ă n nuôi - Lấy m ẫ u. 7. Chuẩn bị mẫu thử Chu ẩ n b ị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498). 8. Cách tiến hành 8.1 . Y ê u c ầ u chung 8.1.1 . M ẫ u trắng Cần phân tích mẫu trắng đ ể chắc ch ắ n rằng kh ô ng có mặt methyl benzoquate hoặc chất gây nhiễu. 8.1.2 . Ki ể m tr a độ thu hồ i Kiểm tra độ thu hồi bằng cách phân tích mẫu trắng được bổ sung một lượng methyl benzoquate tương tự lượng dự ki ế n đó c ó mặt trong mẫu. Để bổ sung ở mức 15 mg/kg, chuyển 600 m l dung dịch chu ẩ n gốc (4.7.1) vào 20 g mẫu tr ắ ng, trộn và đợi 10 min trước khi tiếp tục quá tr ì nh chiết (8.2). Mẫu trắng phải cùng loại với mẫu thử và kh ô ng phát hiện được sự c ó mặt của methyl benzoquate. 8.2 . Chiết Cân khoảng 20 g m ẫ u đ ã chu ẩ n b ị , chính xác đến 0,01 g và chuy ể n sang b ì nh nón (5.10). Th ê m 100 , 0 ml d ung d ị ch axit methanesul f onic (4.4) và l ắ c bằng máy lắc (5.1) trong 30 min. Lọc dung dịch qua gi ấ y lọc và giữ lại ph ầ n d ị ch lọc cho bước tách pha lỏng-lỏng (8.3). 8.3 . Tách pha l ỏ ng-lỏng Chuyển 25,0 ml dịch lọc thu được trong (8.2) v à o phễu chiết 500 ml (5.8) có chứa 100 ml dung dịch axit clohydric (4.5). Thêm 100 ml diclometan (4.1) vào phễu chiết và lắc trong 1 min. Đ ể cho tách lớp và tháo lớp ph í a dưới (diclometan) vào b ì nh cầu đáy tr ò n 500 m l (5.9). Lặp lại việc chiết pha nước hai lần mỗi lần 40 m l diclometan và gộp lại với phần chiết đầu tiên vào bình cầu đáy tròn. Cho bay hơi ch ấ t chiết diclometan đến khô tr ê n thiết bị cô quay (5.2) dưới áp suất giảm ở 40° C. H òa tan cặn trong 20 ml đến 25 ml metanol (4.2), đậy b ì nh cầu và giữ lạ i toàn bộ phần dịch chiết để ph â n tích sắc kí trao đổi ion (8.4). 8.4 . S ắ c k í trao đ ổ i i on 8.4.1 . Chu ẩ n b ị cột trao đổi cat i on Chèn một nút bông th ủy tinh vào đầu dưới của cột thủy tinh (5.3). Chuẩn bị hồ nh ã o c ủ a 5,0 g nhựa trao đổi cation đã được xử l ý trước (4.6) với 50 ml dung d ịch axit clohydric (4.5), đ ổ vào cột thủy tinh và đ ể cho lắng xuống. Tháo b ớ t axit thừa, ch ỉ để cho axit đủ ngập tr ê n b ề mặt nhựa và rửa cột với nước cho đ ế n khi nước rửa trung tính v ớ i quỳ. Chuyển 50 ml metanol (4.2) vào cột và tháo metanol rút xuống b ề mặt nhựa. 8.4.2 . Sắc kí cột Dùng pipet chuy ể n c ẩ n thận d ị ch chiết thu được trong (8.3) vào cột. Rửa sạch b ì nh cầu đáy tròn hai lần mỗi lần dùng 5 ml đ ế n 10 ml metanol ( 4.2) và chuy ể n nước rửa vào cột. Cho dịch chiết chảy xuống bề mặt nhựa và rửa cột bằng 50 ml metanol, đảm bảo tốc độ dòng không vượt quá 5 ml/min. Loại bỏ nước rửa.. Rửa giải methyl benzoquate ra khỏi cột bằng 150 ml dung dịch axit methanesulfonic (4.4) và thu l ấ y dịch rửa giải cột vào b ì nh nón 250 ml (5.9). 8.5 . Tách pha lỏng - lỏng Chuyển d ịch rửa giải th u được (8.4.2) vào phễu chiết 1 lít (5.8). Rửa sạch b ì nh nón bằng 5 ml đến 10 ml metanol (4.2) và gộp nước rửa vào lượng chứa tr o ng phễu chiết. Thêm 300 ml dung dịch axit clohydric (4.5) và 130 ml diclometan (4.1). Lắc 1 min và để yên cho tách pha. Tháo lớp phía dưới (di cl ometan) cho chảy vào b ì nh cầu đáy tròn 500 ml. Lặp lại việc chiết pha nước hai lần mỗi lần 70 ml dicloromethan và gộp các dịch chiết này với phần dịch chi ế t đầu ti ê n trong b ì nh cầu đáy tròn. Cho bay hơi d ịch chiết d iclometan đến khô tr ê n bộ cô quay (4.2) dưới áp suất gi ả m ở 40° C . H òa tan cặn trong bình cầu bằng khoảng 5 ml metanol (4.2) và chuy ể n định lượng dung d ịch này sang bình định m ứ c 10 ml. Rửa bình cầu đáy tròn hai lần mỗi lần 1 ml đ ế n 2 ml metanol và chuy ể n sang b ì nh định mức. Th ê m metanol đến vạch và trộn. Ph ầ n dịch nước được lọc qua bộ lọc màng (5.6). Dung dịch này dùng để xác định bằng HPLC (8.6). 8.6 . Xác đ ị nh bằng HPLC 8.6.1 . Th ô ng s ố Nên sử dụng các đi ề u kiện sau đây, có thể s ử dụng các điều kiện khác nếu cho kế t qu ả tương đương: - Cột sắc kí lỏng (5.4.1); - Pha động HPLC: hỗn hợp metanol-nước (4.3); - Tốc độ dòng: từ 1 ml/min đ ế n 1,5 ml/min; - Thể tích bơm: 20 m l đ ế n 50 m l, - Bước sóng phát hiện: 265 nm; Kiểm tra sự ổn định của h ệ thống sắc kí bằng cách bơm vài lần dung dịch hiệu chu ẩ n (4.7.3) c ó nồng độ 4 m g/ml, cho đ ế n khi đạt đư ợ c chiều cao (di ệ n tích) p i c và thời gian lưu ổ n định. 8 . 6.2 . Dựng đường chuẩn Bơm mỗi dung dịch hiệu chu ẩ n (4.7.3) vài l ầ n và xác định chiều cao (diện tích) pic đối với mỗi nồng độ. Dựng đường chu ẩ n bằng cách sử dụng chiều cao (diện t í ch) pic trung bình của dung dịch hiệu chu ẩ n tr ê n trục tung v à nồng độ tương ứng tính b ằ ng m g/ml tr ê n trục hoành. 8.6.3 . Dung d ị ch m ẫ u Bơm vài lần dịch chiết mẫu thu được trong 8.5, sử d ụ ng cùng một thể tích như đ ã dùng đối với dung dịch hiệu chu ẩ n và xác định chi ề u cao (diện tích) trung bình của pic methyl benzoquate. Xác định nồng độ methyl benzoquate có trong dung dịch mẫu từ chi ề u cao (diện tích) pic trung bình có trong dung dịch mẫu, sử dụng đường chuẩn (8.6.2). 9. Tính kết quả Tính hàm lượng methyl benzoquate trong mẫu, w(mg/kg), theo công thức sau: w = Trong đó: c là nồng độ methyl benzoquate trong dung dịch mẫu, tính bằng microgam tr ê n mililit ( m g/ml); 40 là thể tích dung d ị ch thu đượ c từ 8.5 tương ứng với phần mẫu th ử ban đ ầ u ( m ), tính bằng mililit (ml); m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g). 10. Đánh giá xác nhận kết quả 10.1 . Nh ậ n biết Việc nhận biết chất phân t í ch có th ể được khẳng đ ị nh bằng đồng sắc kí hoặc sử dụng detector mảng diot để so sánh phổ đ ồ của d ị ch chi ế t mẫu (8.2) và của dung dịch hiệu chu ẩ n (4.7.3) có n ồ ng độ 10 m g/ml. 10.1.1 . Đ ồ ng sắc k í Bổ sung một thể tích th í ch hợp dung dịch chuẩn trung gian (4.7.2) vào d ị ch chiết mẫu. Lượng methyl benzoquate bổ sung phải x ấ p xỉ hàm lượng methyl benzoquate dự ki ế n t ì m th ấ y trong dịch chiết mẫu. Chỉ c ó chiều cao pic methyl benzoquate tăng sau khi t í nh cả lượng bổ sung và độ pha lo ã ng c ủ a dịch chiết. Sai khác v à chiều rộng pic tại điểm giữa chiều cao phải nằm trong phạm vi ± 10 % chiều rộng gốc. 10.1.2 . Detector mảng diot Các k ế t quả được đánh giá theo các ti ê u ch í sau: a) tại bước sóng tương ứng v ớ i độ hấp t hụ cực đại, phổ đ ồ c ủ a mẫu v à của chất chu ẩ n, được ghi lại ở đ ỉ nh cao nhất trên s ắ c k í đồ, phải giống nhau trong một biên độ được xác định bằng khả năng phân gi ả i của hệ thống detector. Đối với detector mảng diot, biên độ đặc trưng là ± 2 nm; b) tại bước s ó ng từ 220 nm đến 350 nm, phổ đ ồ của mẫu và của ch ấ t chu ẩ n được ghi lại ở đỉnh cao nh ấ t trên sắc kí đồ không được khác với các phần phổ đ ồ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này đáp ứng khi có cùng phổ cực đại và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ của ch ấ t phân tích chuẩn; c) tại bước sóng từ 220 nm đ ế n 350 nm, ph ổ đồ của điểm uốn lên, đỉnh cao nh ấ t và điểm uốn xuống của pic ch ấ t phân t ích k h ông được khác với các phần phổ đ ồ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này đáp ứng khi có cùng phổ cực đại và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ hấp th ụ tương ứng với phổ đồ c ủ a đỉnh cao nhất. Nếu một trong các tiêu ch í này không đáp ứng th ì không xác nhận được sự có mặt của chất phân tích trong mẫu. 11. Độ lặp lại và độ thu hồi 11.1 . Độ lặp lại Chênh lệch giữa kết quả của hai ph é p xác đ ị nh song song, thực hiện trên cùng một mẫu không được vượt quá 10 % giá tr ị cao hơn khi hàm lượng methyl benzoquate trong khoảng từ 4 mg/kg đ ế n 20 mg/kg. 11.2 . Độ thu hồ i Đối với các mẫu thức ăn chăn nuôi (mẫu trắng) được thêm chuẩn, độ thu h ồ i í t nh ấ t là 90 %. 12. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi r õ : a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đ ầ y đủ v ề mẫu thử; b) phương pháp l ấ y mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đ ã d ù ng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chu ẩ n này, hoặc được coi là t ùy chọn, cùng với mọi t ì nh huống bất thường có th ể ảnh hưởng đến k ế t quả; e) kết qu ả thử nghiệm thu được hoặc n ế u đáp ứng y ê u cầu về độ lặp lại th ì ghi kết quả cu ố i cùng thu được. PHỤ LỤC A (Tham khảo) KẾT QUẢ CỦA PHÉP THỬ NGHIỆM CỘNG TÁC Một nghiên cứu cộng tác đã được tổ chức thực hiện trên năm mẫu. Mỗi mẫu đã thực hiện hai phép phân tích lặp lại. Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác được nêu trong Bảng A.1. Bảng A.1 - Kết quả của phép thử nghi ệ m cộng tác M ẫ u trắng Dạng bột 1 Dạng v iê n 1 Dạng bột 2 Dạng v iê n 2 Gi á trị trung bình [mg/kg] Không ph á t hiện 4,50 4,50 8,90 8,70 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , [mg/kg] - 0,30 0,20 0,60 0,50 Hệ số biến thi ê n lặp lại, CV r , [% ] - 6,70 4,40 6,70 5,70 Độ lệch chu ẩ n tái lập, s R , [mg/kg] - 0,40 0,50 0,90 1,00 Hệ s ố bi ế n thiên tái lập, CV R [%] - 8,90 11,10 10,10 11,50 Độ thu hồi [%] - 92,00 93,00 92,00 89,00