TCVN8400-38:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-38:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do coronavirus TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-38:2015 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 38: BỆNH TIÊU CHẢY Ở LỢN DO CORONAVIRUS Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 38: Porcine epidemic diarrhea Lời nói đầu TCVN 8400-38:2015 do Trung tâm Ch ẩ n đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ ti ê u chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình ch ẩ n đoán g ồ m 38 phần: - TCVN 8400-1 : 2010, ph ầ n 1: Bệnh l ở mồm long móng; - TCVN 8400-2 : 2010, ph ầ n 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis g â y ra trên lợn; - TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: B ệ nh giun xoắn; - TCVN 8400-4 : 2010, ph ầ n 4: Bệnh Niu Cát Xơn; - TCVN 8400-5 : 2011, ph ầ n 5: Bệnh tiên mao trùng; - TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xu ấ t huyết thỏ; - TCVN 8400-7 : 2011, ph ầ n 7: Bệnh đậu c ừu và đậu dê; - TCVN 8400-8 : 2011, ph ầ n 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia c ầ m; - TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt type I; - TCVN 8400-10 : 2011, ph ầ n 10: Bệnh lao bò; - TCVN 8400-11 : 2011 , ph ầ n 11: Bệnh dịch t ả vịt; - TCVN 8400-12 : 2011 , phần 12: Bệnh bạch lị và thương hàn ở gà; - TCVN 8400-13 : 2011, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhi ễ m do brucela; - TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huy ế t trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-15 : 2011, ph ầ n 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira; - TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli; - TCVN 8400-17 : 2011, ph ầ n 17: Bệnh do vi khuẩn staphylococcus aureus g â y ra ở gà; - TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza); - TCVN 8400-19 : 2014, ph ầ n 19: Bệnh phó thương hàn lợn; - TCVN 8400-20 : 2014, ph ầ n 20: Bệnh đóng d ấ u lợn; - TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS); - TCVN 8400-22 : 2014, phần 22: Bệnh giả dại ở lợn; - TCVN 8400-23 : 2014, ph ầ n 23: Bệnh ung khí th á n; - TCVN 8400-24 : 2014, ph ầ n 24: Bệnh viêm phế qu ả n truyền nhiễm; - TCVN 8400-25 : 2014, ph ầ n 25: Bệnh cúm lợn; - TCVN 8400-26 : 2014, ph ầ n 26: Bệnh cúm gia c ầ m H5N1; - TCVN 8400-27 : 2014, ph ầ n 27: Bệnh s á n lá gan; - TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn Clostridium per f ringens; - TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà; - TCVN 8400-30 : 2015, ph ầ n 30: Bệnh Marek ở gà; - TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh Tụ huyết trùng gia cầm; - TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh Gumboro ở gia c ầ m; - TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh L ê dạng trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh Biên trùng ở tr â u bò; - TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh Theiler i a ở trâu bò; - TCVN 8400-36 : 2015, ph ầ n 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2; - TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn; - TCVN 8400-38 : 2015, ph ầ n 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus. BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 38: BỆNH TIÊU CHẢY Ở LỢN DO CORONAVIRUS Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 38: Porcine epidemic diarrhea C Ả NH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết b ị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đ ư a ra được hết t ấ t c ả các vấn để an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các gi ớ i hạn quy định trư ớc khi sử dụng tiêu chuẩn. 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định cho quy trình chẩn đoán bệnh tiêu chảy ở lợn do coronavirus gây ra. 2 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: Bệnh tiêu chảy ở lợn do coronavirus (Porcine epidemic diarrhea) PED Bệnh truyền nhiễm đường ruột do coronavirus gây ra, được phân loại là ARN virus, có tính l â y lan mạnh, biểu hiện đặc trưng là triệu chứng nôn mửa và tiêu chảy cấp tính dẫn đến mất nước nặng và tử vong. CHÚ TH Í CH: Bệnh tiêu chảy ở lợn do coronavirrus còn được gọi là dịch tiêu chảy ở lợn con hay ở lợn. 3 Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết để phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 3.1 Nguyên liệu sử dụng chung 3.1.1 Etanol, từ 70 % (thể tích) đến etanol tuyệt đối. 3.1.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) , pH 7,2 ± 0,2 (xem A.2). 3.1.3 Dung dịch kháng khuẩn, bao gồm các loại penicillin, kanamycin, streptomycin. 3.2 Thuốc thử và vật liệu th ử dùng cho Realtime - RT PCR 3.2.1 Kit tách chiết RNA , ví dụ: Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104. 3.2.2 Kit nhân gen , ví dụ: Superscript 3 platinum one-step qRT-PCR kit cat # 11732-020 3.2.3 Mồi xuôi, m ồ i ngược và mẫu dò. 3.2.4 Dung d ị ch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic). 3.2.5 Nước tinh khiết , không có nuclease 3.3 Nguyên liệu và vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA (phép thử miễn dịch liên kết enzym) Hiện nay các kit ELISA thương mại có sẵn trên thị trường dùng để phát hiện kháng thể PED khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. 4 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau: 4.1 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp realtime RT-PCR 4.1.1 Máy nghi ề n m ẫ u hoặc cối chày sứ. 4.1.2 T ủ lạnh âm sâu , có thể duy tr ì nhiệt độ từ âm 20 ° C đến âm 80 ° C . 4.1.3 T ủ lạnh , có thể duy tr ì nhiệt độ từ 2 ° C đến 8 ° C . 4.1.4 Máy nhân gen (realtime- PCR). 4.1.5 Máy ly tâm , c ó thể đạt gia tốc ly tâm 900 g ; 6 000 g và 20 000 g . 4.1.6 Máy lắc trộn vortex. 4.1.7 Máy spindo w n. 4.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phư ơ ng pháp ELISA 4.2.1 Máy đọc ELISA , c ó thể đọc đ ĩ a ở bước sóng 650 nm. 4.2.2 T ủ ấ m hoặc bàn s ấ y mẫu , có thể duy trì nhiệt độ ở 37 ° C . 5 Chẩn đoán lâm sàng 5.1 Đặc điểm dịch tễ - Bệnh tiêu ch ả y ở lợn do virus corona xảy ra quanh năm đối với lợn ở tất cả các lứa tuổi, tuy nhiên trên 90 % ca bệnh xảy ra ở lợn con 1 đến 2 tuần tuổi và thường xảy ra vào mùa đông; - Tỷ lệ chết của lợn mắc bệnh tùy thuộc vào lứa tuổi mắc bệnh của lợn: + Lợn con mắc bệnh ở độ tuổi từ 1 ngày tuổi đến 5 ngày tuổi t ỷ lệ ch ế t 100 %; + Lợn con mắc bệnh ở độ tuổi từ 6 ngày tuổi đến 7 ngày tuổi tỷ lệ chết khoảng 50 %; + Lợn con mắc bệnh ở độ tuổi lớn hơn 7 ngày tuổi tỷ lệ chết khoảng 30 %. - Nguồn lây nhiễm: lợn khỏe tiếp xúc với virus PED trong phân, dụng cụ chăn nuôi, xe vận chuyển hoặc do việc nhập đàn (lợn mang trùng, lợn nhiễm bệnh); - Thời gian ủ bệnh từ 1 ngày đến 14 ngày. 5.2 Triệu chứng lâm sàng - Triệu chứng tiêu chảy xuất hiện sau 18 h đ ế n 24 h khi mầm bệnh xâm nhập, bệnh lây nhanh đến tất cả các đàn lợn trong trại; - Vào đầu ổ dịch lợn nái ốm trước, sau đến lợn con, sốt từ 40 ° C đến 40,7 ° C . Lợn con nôn dữ dội, kèm theo tiêu ch ả y phân toàn nước và bọt tr ắ ng, sau đó chuy ể n dần sang màu tro xám, sền sệt như bùn đất, mùi hôi rất khó chịu; - Lợn con theo mẹ: lười bú, ói mửa, ỉa ch ả y có sữa không tiêu. Lợn con sụt cân nhanh do mất nước, nằm chồng đ ố ng lên nhau và thích nằm lên bụng mẹ (triệu chứng điển hình). 5.3 Triệu chứng bệnh t í ch - Lợn b ị tiêu chảy do virus corona có bệnh tích ruột non trương phồng, màu vàng, niêm mạc bong tróc, thành ruột m ỏ ng, tích nhiều nước. - Dạ dày chứa nhiều thức ăn không tiêu, tá tràng tích nước, không tràng xuất huyết, hồi tràng sưng to. - Virus corona nhân lên trong tế bào thượng b ì của ru ột non lợn làm tuy ế n hạch bẹn sưng, hạch lympho màng treo ruột sung huyết, viêm nặng. 6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1 Phương pháp realtime RT-PCR 6.1.1 Lấy mẫu Lấy 5 g đến 10 g ruột non, hạch lâm ba của lợn nghi mắc bệnh cho vào ống vô trùng có thể tích 15 ml. CHÚ TH Í CH: không l ấ y m ẫ u t ừ lợn đã được tiêm phòng vắc xin nhược độc PED tro ng thời gian từ 3 tháng đến 6 tháng đề xét nghiệm bệnh. 6.1.2 Bảo qu ả n mẫu Tất c ả các mẫu bệnh phẩm xét nghiệm đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 ° C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp không tiến hành xét nghiệm mẫu ngay thì mẫu phải được bảo qu ả n trong t ủ âm sâu 80 ° C (4.1.2). CHÚ THÍCH: Mẫu được gửi tới ph ò ng t hí nghiệm có kèm theo phiếu gửi bệnh ph ẩ m ghi r õ yêu c ầ u xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu ch ứ ng, bệnh tích của ca bệnh. 6.1.3 Chuẩn b ị mẫu Ruột non, hạch lâm ba được cắt nhỏ và nghiền nát bằng máy nghiền mẫu hoặc c ố i chày sứ (4.1.1), bổ sung dung dịch PBS (3.1.2), để thu được huyễn dịch 1/10 (1g phủ tạng + 900 ml dung dịch PBS). Cho huyễn dịch vào ống, ly tâm ở gia tốc 900 g (4.1.5) trong thời gian 10 min. Thu phần dịch nổi phía trên ch ẩ n đoán virus PED bằng phương pháp realtime RT-PCR. 6.1.4 Cách tiến hành 6.1.4.1 Tách chiết ARN Sử dụng bộ kít thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất (3.2.1). Ví dụ: sử dụng quy trình tách chiết ARN bằng kít Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104 (xem Phụ lục B) 1) . 6.1.4.2 Chu ẩ n bị mồi Ph ả n ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.1.4) theo phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của virus gây PED sử dụng mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò (3.2.3). Chu ẩ n bị mồi như sau: Chuẩn bị mồi gốc: - Mồi gốc và mẫu dò gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.1.7) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi m ở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên dùng dung dịch đệm TE (3.2.4) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 m M làm mồi gốc và mẫu dò gốc. Chuẩn bị mồi sử dụng: - Mồi sử dụng ở nồng độ 20 m M: mồi gốc được pha với nước (3.2.5) (20 m l mồi gốc và 80 m l nước (3.2.5)). - M ẫ u dò được sử dụng ở nồng độ 6 m M: 6 m l mẫu dò gốc pha với 94 m l nước (3.2.5). - Trộn cùng 1 thể tích mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò sau khi pha th à nh hỗn hợp để tiện khi sử dụng. Trình tự cặp mồi được nêu trong Bảng 1. Bảng 1 - Trình tự mẫu dò và cặp mồi [ 5 ] Cặp mồi/ M ẫ u dò Trình tự gen (5'-3’) Mẫu dò - JVM (146/08) FAM - TGTTGCCATTGCCACGACTCCTGC - BHQ1 Mồi xuôi - JVM (146/08) CGCAAAGAGAACCCACTAATTT Mồi ngược - JVM (146/08) TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT 6.1.4.3 Tiến hành ph ả n ứng realtime RT- PCR Ví dụ: sử dụng phương pháp realtime RT- PCR với cặp mồi đã chuẩn bị (6.1.4.2) và kit Superscript 3 platinum one-step qRT-PCR k i t cat # 11732-020 (3.2.2). Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml, và có đầy đủ đối chứng âm và đối chứng dương trong mỗi lần chạy phản ứng realtime PCR. + Thành phần cho một phản ứng realtime PCR (theo hướng dẫn của kít thương mại) Bảng 2. + Đối chứng dương: Là mẫu ARN được tách chiết từ mẫu virus R ED chu ẩ n. + Đối ch ứ ng âm: sử dụng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.5). Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp nguyên liệu: - Chuyển 20 m l hỗn hợp thành phần phản ứng realtime PCR (B ả ng 2) vào ống ph ả n ứng (ống PCR 0,2 ml) - Cho 5 m l mẫu ARN vào ống phản ứng. - Đặt ống phản ứng vào máy realtime PCR (4.1.4). Bảng 2 - Thành ph ầ n ph ả n ứng realtime RT-PCR Thành ph ầ n Thể tích, m l Nước tinh khiết không có nuclease 4,5 Dung dịch nhân gen 2x 12,5 Magie clorua (MgC l 2 ), 50 mM 1,0 Hỗn hợp mồi ngược, mồi xuôi và mẫu dò 1 , 5 Enzym 0,5 Tổng thể tích 20 Chu kỳ nhiệt chạy phản ứng được cài đặt theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit sử dụng cho phản ứng. Đối với kít kit Superscript 3 platinum one-step qRT-PCR kit cat # 11732-020, chu kỳ nhiệt được nêu trong B ả ng 3. Bảng 3 - Chu tr ình nhiệt của phản ứng realtime RT - PCR Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 50 ° C 15 min 1 vòng 95 ° C 2 min 95 ° C 10 s 40 vòng 60 ° C 50 s CHÚ THÍCH: - Phản ứng realtime RT - PCR phải bao g ồ m: mẫu thử, mẫu kiểm chứng dương và m ẫ u kiểm ch ứ ng â m. Mẫu và nguyên liệu cho ph ả n ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng. 6.1.4.4 Đọc kết quả Phản ứng được công nhận: mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị C t ≤ 35 (± 2 C t ), mẫu đ ố i chứng âm không có C t . Với điều kiện phản ứng trên: 1) Mẫu có giá tr ị chu kỳ ngưỡng C t ≤ 35 được coi là dương t í nh, 2) Mẫu không có giá trị chu kỳ ngưỡng C t = 0 là âm tính. 3) M ẫ u có giá trị chu kỳ ngưỡng C t ≤ 40 và >35 được coi là nghi ngờ. Những mẫu nghi ngờ này cần được xét nghiệm lại lần 2 đề khẳng định và kết luận cuối cùng. 6.2 Phát hiện kháng thể bằng phương pháp ELISA 6.2.1 L ấ y mẫu Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 22 G vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu ở vịnh t ĩ nh mạch cổ lợn nghi mắc bệnh PED. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp. 6.2.2 Bảo quản mẫu M ẫ u được bảo quản theo mục 6.1.2. 6.2.3 Chuẩn b ị mẫu Tất cả các mẫu m á u được chắt huyết thanh từ xylanh (6.2.1) sang ống nghiệm vô trùng khác. Thời gian kể từ lúc l ấ y máu cho đến lúc ch ắ t huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh. 6.2.4 Cách tiến hành Hiện nay, có nhiều bộ kít ELISA phát hiện kháng thể PED bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng d ẫn của nhà sản xuất [2] . CHÚ TH Í CH: Phương pháp này nhanh và dễ thực hiện. Tuy nhiên, không phân biệt được kháng thể do tiêm phòng vắc xin PED hay kháng th ể d o nhiễm thực địa. Ví dụ: sử dụng phương pháp ELISA phát hiện kháng thể PED theo quy trình của kit PED Ab hãng IDEXX thì các bước tiến hành được thực hiện như sau: a) Chuẩn bị nguyên liệu - Nguyên liệu của bộ kít (3.4.1) để ở nhiệt độ phòng từ 20 đến 30 phút trước khi làm ph ả n ứng. - Pha loãng dung dịch rửa 1X: 10 ml dung dịch nước r ử a đặc 10X với 90 ml nước cất khử ion (3.4.2). - Pha loãng mẫu với tỷ lệ 1/40: 10 m l mẫu kiểm tra với 390 m l dung dịch pha loãng mẫu trong ống pha loãng. Sau đó 100 m l dung dịch mẫu kiểm tra đã pha loãng sang đĩa ELISA với bố tr í mẫu tương ứng. b) Các bước tiến hành Bố trí sơ đồ đĩa ELISA phản ứng (tham khảo Phụ lục C). - Chuẩn bị bộ kit: Xác định số mẫu kiểm tra, 01 đối chứng dương, 01 đối chứng âm; - Nhỏ 100 m l đối chứng âm và đối chứng dương (không pha loãng) vào đĩa ELISA theo v ị trí bố trí; - Vỗ nhẹ đĩa, đậy nắp. Ủ ở nhiệt độ 37° C (4.2.2) trong 30 min; - Sau 30 min ủ đĩa, đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rửa đĩa 3 lần với lượng 300 m l/ giếng bằng dung dịch rửa đĩa 1X; - Nhỏ 100 m l chất gắn kết (co nj ugate) vào tất cả các giếng. Ủ tiếp ở nhiệt độ 37° C (4.2.2) trong 30 min; - Sau đó đỗ bỏ dung dịch trong đĩa, rửa đĩa 3 lần với các lượng 300 m l/giếng bằng dung dịch rửa đĩa 1X; - Nhỏ 100 m l cơ chất v à o các giếng, ủ đĩa trong 15 min ở nhiệt độ phòng; - Nhỏ 100 m l dung dịch dừng phản ứng vào các giếng. 6.2.5 Đọc kết quả - Đọc đĩa ở bư ớ c sóng 650 nm bằng máy đọc ELISA (4.2.1) và tính kết quả. - Phản ứng được công nhận khi: + mật độ quang học (OD) của đối chứng âm ≤ 0,15 + OD của đối chứng dương - OD của đối chứng âm ≥ 0,15 - Đánh giá kết quả: S/P = (OD của mẫu - OD của đối chứng âm) (OD của đối chứng d ương - OD của đối chứng âm) + Mẫu dương tính: S/P ≥ 0,4 + Mẫu âm tính: S/P < 0,4 CHÚ THÍCH: Đối với những mẫu nghi ngờ phải làm lại để khẳng định, nếu v ẫ n nghi ngờ thì dựa v à o dịch t ễ học để kết luận bệnh. 7 Kết luận Lợn được kết luận mắc bệnh tiêu chảy ở lợn do virus corona (PED) khi có c á c đặc điểm về triệu chứng, bệnh tích điển hình và có kết quả xét nghiệm dương t í nh với virus PED hoặc dương tính kháng thể PED bằng các phương pháp trong tiêu chu ẩ n này. Phụ lục A (Quy định) Thành phần và chuẩn bị dung dịch thử A.1 Dung dịch kháng khuẩn A.1.1 Thành ph ầ n Penicillin 1 000 000 UI Mycostatin 250 000 UI Streptomycin 200 mg Kanamycin 1 000 000 UI Nước cất 10 ml A.1.2 Chuẩn bị Hòa tan kháng sinh bằng nước cất rồi lọ c bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 m m. Bảo qu ả n ở âm 20 ° C (4.1.2). A.2 Dung dịch mu ố i đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,2 A.2.1 Thành ph ầ n Natri clorua (NaCI) 8 g Kali clorua (KCI) 0,2 g Dinatri hidrophosphat (Na 2 HP O 4 ) 1,15 g Kali dihidrophosphat (KH 2 PO 4 ) 0,2 g Nước cất 1 000 ml A.2.2 Chuẩn b ị Hòa tan các thành phần trong nước, chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1 N hoặc dung dịch axit clohydric (HC l ) 1 N. Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp, chia nhỏ và bảo quản ở 4 ° C (4.1.3). Phụ lục B (Tham khảo) Chuẩn bị tách chiết ARN C Ả NH BÁO: Việc tách chiết ARN có sử dụng hóa ch ấ t nguy hiểm và có khả năng gây tạp chéo và ảnh hưởng đến cơ thể nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này. Tách chiết ARN theo qu y trình của kit Invitrogen (Cat No. 74106): thực hiện như sau: B.1 Chuẩn bị Chuẩn bị dung dịch RLT (600 m l/mẫu) vào ống ly tâm 50 ml. Thêm 1/100 β-mercaptoetanol (β-ME) vào dung dịch RLT (dung d ịch này có thể bảo quản 1 tháng ở nhiệt đ ộ phòng). B.2 Cách tiến hành Dùng huyễn dịch đã xử lý (6.1.3) để tách chiết ARN. Có thể sử dụng bộ kít Qiagen® Rneasy Extraction (cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep) theo quy trình dưới đây. - Nhỏ 200 m l huyễn dịch (6.1.3) vào ống ly tâm (4.1.5) loại 1,5ml cùng với 600 m l Qiagen® buffer RLT có 1 % β-ME, lắc đều trên máy lắc trộn Vortex (4.1.6). - Thêm 500 m l etanol 70 % thể tích (3.1.1) vào ống, lắc mạnh bằng máy lắc trộn Vortex (4.1.6). - Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với gia tốc ≥ 8 000 g bằng máy ly tâm (4.1.5) ở nhiệt độ phòng. - Bổ sung 700 m l dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s ở gia tốc ≥ 8 000 g bằng máy ly tâm lạnh (4.1.5), thay ống thu mới vào cột lọc. - Nhỏ 500 m l dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy® và ly tâm trong 15 s ở gia tốc ≥ 8 000 g bằng máy ly tâm (4.1.5), thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. - Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở gia tốc tối đa, b ỏ ống thu. - Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nh ỏ 50 m l nước sạch nuclease vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 min. Tách ARN bằng cách ly tâm trong 1 min ở gia tốc ≥ 8 000 g bằng máy ly tâm (4.1.5), bỏ cột lọc, giữ lại dung d ịch trong ống thu ARN. - B ả o quản mẫu ARN thu được ở 4 ° C trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR, nếu sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở âm 70 ° C b ằ ng t ủ lạnh âm sâu (4.1.2) hoặc nhiệt độ thấp hơn. Phụ lục C (Tham khảo) Sơ đồ bố trí mẫu trong đĩa ELISA xét nghiệm kháng thể virus corona (PED) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A NC S5 S13 S21 S29 S37 S45 S53 S61 S69 S77 S85 B NC S6 S14 S22 S30 S38 S46 S54 S62 S70 S78 S86 C PC S7 S15 S23 S31 S39 S47 S55 S63 S71 S79 S87 D PC S8 S16 S24 S32 S40 S48 S56 S64 S72 S80 S88 E S1 S9 S17 S25 S33 S41 S49 S57 S65 S73 S81 S89 F S2 S10 S18 S26 S34 S42 S50 S58 S66 S74 S82 S90 G S3 S11 S19 S27 S35 S43 S51 S59 S67 S75 S83 S91 H S4 S12 S20 S28 S36 S44 S52 S60 S68 S76 S84 S92 CHÚ TH Í CH: NC: đối chứng âm PC: đối ch ứ ng dương S1 đến S92: mẫu kiểm tra THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] O . Kim, C . Chae (1999) Application of reverse transcrption polymerase chian reaction to detect porcine epidemic dianrhea vi ru s in Vero cell culture , J Vet Diagn Invest 11:537-538 (1999) [2] F. Guscetti (1998), Immunohistochemical Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Compare to O ther Methods , Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998, 5(3):412. [3] Pan et al (2012), Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China , Virology Jounal 2012, 9:195. [4] Faculty of Veterinary Medicine, Kasetsart University, Kamphangsaen campus, Nakornphathom: Recurrent of Porcine Epidemic Diarrhea Outbreak in a Pig Farm: A case Report Pari w at Poolperm, Preeda Lertwatcharasarakul, Sakuna Phattanakunanan, Kitcha Urairong, THAILAND 73140 , Pariwat.P@ku.ac.th [5] Leyi Wang, Yan Zhang: Bever l y By ru m : Devel o pment and evaluation of a duplex real-time RT- PCR for detection and differentiation of virulent and var i ant strains of porcine epidemic d ia rr hea viruses from the United States . Animal Disease Diagnostic Laboratory, Ohio Department of Agriculture, 8995 East Main Street, Building No. 6, Reynoldsburg, OH 43068, United States 1) Thông tin này đưa ra tạo điều k iệ n thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn v à không ấn đị nh sử dụng s ả n ph ẩ m của nhà cung c ấ p này. C ó thể sử dụng các s ả n ph ẩ m tương tự nếu cho các kết quả tương đ ươ ng.