TCVN8685-11:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-11:2014 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin-Phần 11: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh phù đầu gà (CORYZA) TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8685-11: 2014 QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 11: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH PHÙ ĐẦU GÀ (CORYZA) Vaccine testing procedure - Part 11: Haemophilus paragallinarum vaccine, inactevated Lời nói đầu TCVN 8685-11:2014 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 11: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH PHÙ ĐẦU GÀ (CORYZA) Vaccine testing procedure - Part 11: Haemophilus paragallinarum vaccine, inactevated 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định yêu cầu kỹ thuật để kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt phòng bệnh phù đầu ở gà. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau r ấ t cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phi ê n bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phi ê n bản mới nhất, bao g ồ m c ả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 8684:2011, Vắc xin và chế ph ẩ m sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết. 3. Lấy mẫu sản phẩm và chuẩn bị động vật 3.1 . Lấy m ẫ u sản phẩm: Lấy mẫu sản phẩm theo qui đ ịnh trong bảng như sau: Số lượng mẫu vắc xin và ch ế phẩm si nh học cần l ấ y Quy cách đóng gói (ml ) Số lượng mẫu lấy (sản ph ẩ m) Cho tới 100 Từ 7 đến 10 Trên 100 T ừ 5 đến 7 3.2 . Chuẩn b ị động vật - 10 con gà từ 5 đến 6 tuần tuổi, khỏe mạnh, âm t í nh với kháng thể kháng vi khuẩn Haemophilus paragallinarum. - 40 con gà từ 3 đến 6 tuần tuổi, khỏe mạnh, âm t í nh với kháng thể kháng vi khuẩn Haemophilus paragallinarum . 4. Cách tiến hành 4.1 . Kiểm tra cảm quan Vắc xin phải đồng nh ấ t, không đông vón, không l ắ ng cặn. 4.2 . Kiểm tra độ thuần khiết theo TCVN 8684:2011. 4.3 . Kiểm tra an toàn Tiêm cho ít nhất 10 con gà từ 5 đến 6 tuần tuổi, mỗi con 2 liều vắc xin ghi tr ê n nhãn. Theo d õ i gà trong th ờ i gian từ 14 ngày đến 21 ngày. Vắc xin được coi là đạt nếu tất cả gà sống khỏe mạnh, không có b ấ t kỳ các phản ứng cục bộ hay toàn thân liên quan đến vắc xin trong thời gian theo dõi. 4.4 . Kiểm tra hiệu lực 4.4.1 . Phương pháp trọng tài - Tiêm cho ít nhất 20 con gà từ 3 đến 6 tuần tuổi, mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn. 20 gà đối chứng không tiêm vắc xin. - Sau 14 ngày toàn bộ gà được tiêm một mũi thứ 2 với liều lượng như trên. - Từ 14 đến 21 ngày sau mũi tiêm lần 2, gà được tiêm và g à đối chứng được thử thách với vi khuẩn cường độc tương ứng. - Theo dõi trong thời gian 7 đến 10 ngày. - Vắc xin được coi là đạt nếu: + Ít nhất 70 % gà đối chứng có triệu chứng bệnh tích của bệnh phù đầu; + Ít nhất 70 % gà được tiêm không có b ấ t kỳ các triệu chứng bệnh tích của bệnh phù đ ầ u. 4.4.2 . Phương pháp thay thế - Tiêm í t nhất 20 con gà từ 3 đến 6 tuần tuổi, khỏe mạnh, mỗi con 1 liều vắc xin ghi tr ê n nhãn. 20 gà đối chứng không tiêm vắc xin. - 14 ngày sau, toàn bộ gà được tiêm một mũi thứ 2 với liều lượng như trên. - Từ 14 đến 21 ngày sau mũi tiêm l ầ n 2, gà mi ễ n dịch được l ấ y máu, ch ấ t huyết thanh làm phản ứng huyết thanh học (theo Phụ lục A). - Vắc xin được coi là đạt n ế u: + Í t nhất 70 % gà được tiêm có hiệu giá kháng th ể H. paragallinarum ≥ 4log2; + Ít nh ấ t 70 % gà đối chứng có hiệu giá kháng th ể H. paragallinarum âm tính. PHỤ LỤC A (Quy định) Kiểm tra hiệu giá kháng thể Coryza bằng phương pháp HI A.1 . Chuẩn b ị A.1.1 . Chuẩn b ị kháng nguyên - Cấy vi khuẩn Hpg vào mô i trường thạch CMI, nuôi cấy trong tủ ấ m có 5 % CO 2 ở 37 °C trong 24 h. - Thu hoạch kháng nguy ê n: Cho 1 lượng 0,5 ml dung dịch PBS (Phosphate buffered saline) vào đĩa thạch. Dùng pipet Pasteur được uốn cong đ ể thu hoạch kháng nguy ê n. Dùng pipet hút kháng nguyên vào ống. - Ly tâm với tốc độ 4 000 vòng/min trong 10 min. - Hút bỏ phần nước trong. Cho thêm PBS vào ống h òa tan cặn để rửa kháng nguy ê n. Làm 3 lần (lần thứ 3 ly tâm 13 000 vòng/ min trong 2 min). - Lấy cặn và cho thêm 0,5 ml PBS đ ể đạt độ đậm đặc ống số 5 Mac f aland. - Cho th ê m 0,01 % (khối lượng/thể t í ch) thimerosal. - Ủ ở 4 °C trong 3 ngày t rướ c khi sử dụng. A.1.2 . Chuẩn b ị hồng cầu - Hồng cầu gà được l ấ y vào ống f ancol có chất chống đông. - Ly tâm rửa hồng cầu 3 lần bằng dung dịch PBS. - Pha h ồ ng cầu thành 1 %. Cho thêm 0,01 (khối lượng/thể tích) thimerosal, 0,001 % gelatin. - Khi sử dụng pha h ồ ng cầu thành 0,05 %. A.1.3 . Chuẩn bị hồng cầu cố đ ị nh bằng f ormalin - Hồng cầu đ ã được rửa 3 l ầ n được pha thành n ồ ng độ 1 %. - Cho một lượng tương đương dung d ị ch f ormalin 8,3 % vào hồng cầu. Cho vào từ từ và lắc nh ẹ trên máy lắc ở 37 °C trong 3 h. - Th ê m f ormalin 8,3 % vào hỗn hợp trên theo tỷ lệ 1:5 , ủ ở 37 °C l ắ c nhẹ trong 20 h. - Rửa hồng cầu đã cố định 10 lần bằng dung dịch PBS (ly t â m 200 vòng/min trong 5-10 min). - Cặn được h òa tan thành 10 % trong PBS. - Th ê m 0,05 % albumin huyết thanh bò (BSA). - Th ê m 0,01 % thimerosal, bảo quản ở 4 °C. Sử dụng trong vòng 2 tháng. A.1.4 . Chuẩn b ị huyết thanh chẩn đoán - Ly tâm máu và chất lấy huyết thanh. - Cho hồng cầu đã cố định vào huyết thanh chẩn đoán theo tỷ lệ (1 phần huyết thanh với 5 phần hồng cầu đ ã cố định 1 %), ủ hỗn hợp ở 37 °C trong 2 h ở điều kiện l ắ c nh ẹ trên máy l ắ c. - Ly tâm chất lấy huyết thanh. - Khi sử dụng th ì lúc này huyết thanh ch ẩ n đoán đang ở nồng độ 1/5. A.2 . Cách ti ế n hành A.2.1 . Với kháng nguyên Hpg A A.2.1.1 . Quy trình cho phản ứng HA cho kháng nguy ê n Hpg A (xem Bảng A.1) Dung dịch Thí nghiệm Đ ố i chứng PBS Hồng c ầ u + kh á ng nguyên Thứ tự 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PBS 25 μ l 25 μ l 25 μ l 25 μ l 25 μ l 25 μ l 25 μ l 25 μ l 25 μ l 25 μ l 25 μ l 25 μ l Kháng nguy ê n 25 μ l 25 μ l 25 μ l Hồng cầu 0,5% 50 μ l 50 μ l 50 μ l 50 μ l 50 μ l 50 μ l 50 μ l 50 μ l 50 μ l 50 μ l 50 μ l 50 μ l Bảng A.1 - Sơ đ ồ phản ứng HA cho kháng nguy ê n Hpg A a) Cho dung dịch PBS vào các dây gi ế ng (25 μl/giếng). b) Thêm vào giếng đ ầ u tiên 25 μl kháng nguyên và pha loãng kháng nguyên theo cơ số 2. c) Nhỏ vào các giếng 50 μl hồng cầu 0,5 %. d) Các giếng đối chứng: + Đối chứng hồng cầu: 25 μl dung dịch PBS + 50 μl hồng cầu 0,5 %; + Đối chứng kháng nguyên: 25 μl dung dịch PBS + 25 μl kháng nguyên + 50 μl hồng cầu 0,5 %. Lắc nhẹ trong 20 s, đ ể y ê n 40 min r ồ i đọc kết quả. * Đọc kết quả: + Phản ứng âm t í nh: Hồng cầu lắng đ ề u ở dưới đáy giếng thành ch ấ m tròn. + Phản ứng d ương tính: Xảy ra hiện tượng ngưng kết , hồng cầu ngưng kết thành cụm l ấ m t ấ m xung quanh giếng. + Đọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá ngưng kết kháng nguyên được đánh giá ở độ pha loãng cao nh ấ t còn có phản ứng ngưng kết x ả y ra. A.2.1.2 . Phản ứng HI cho kháng nguy ê n Hpg A (xem Bảng A.2) Nguyên liệu L ô thí nghiệm Đ ối chứng Huyết thanh chuẩn Kháng nguy ê n PBS 1 2 ... 10 11 12 PBS 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl Huyết thanh đ ã được xử lý hồng cầu (1:5) 25 μl 25 μl 25 μl Kháng nguyên 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl Hồng cầu 0,5 % 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl Bảng A.2 - Sơ đ ồ phản ứng HI cho kháng nguy ê n Hpg A a) Cho dung dịch PBS vào các dãy giếng (25 μl /giếng). b) Nhỏ vào giếng đầu tiên 25 μl huyết thanh đã được xử lý hồng cầu. c) Pha lo ã ng huyết thanh theo cơ số 2. d) Nhỏ vào các giếng 25 μl kháng nguyên (kháng nguyên ở 4 đơn v ị HA). e) Lắc nhẹ 20 s, đ ể y ê n 20 min. f) Nhỏ vào các giếng 50 μl hồng cầu 0,5 %. * Đọc kết quả - Phản ứng âm tính: C ó hạt ngưng kết bông lởn vởn. - Ph ả n ứng d ương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy tạo chấm tròn, g) Lắc nh ẹ , để yên 40 min rồi đọc kết quả. A.2.2 . Với kháng nguy ê n Hpg C A.2.2.1 . Phản ứng HA cho kháng nguy ê n Hpg C (xem Bảng A.3) Dung dịch Thí nghiệm Đ ố i chứng PBS Hồng cầu + kháng nguy ê n Thứ tự 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PBS 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl Kháng nguyên 25 μl 25 μl 25 μl Hồng cầu cố định 1 % 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl Bảng A.3 - Sơ đ ồ phản ứng HA cho kháng nguy ê n Hpg C a) Cho dung d ị ch PBS vào các dãy giếng (25 μl /giếng). b) Thêm vào giếng đầu tiên 25 μl kháng nguyên và pha loãng kháng nguyên theo cơ số 2. c) Nhỏ vào các giếng 50 μl hồng cầu cố định 1 %. d) Các giếng đối chứng: + Đối chứng hồng cầu: 25 μl dung dịch PBS + 50 μl hồng cầu cố định 1 %; + Đối chứng kháng nguyên: 25 μl dung dịch PBS + 25 μl kháng nguyên + 50 μl hồng cầu cố định 1 %. Lắc nhẹ trong 20 s, để yên 40 min rồi đọc kết quả. * Đọc kết quả: + Phản ứng â m tính: Hồng cầu lắng đ ề u ở dưới đáy giếng thành ch ấ m tròn. + Phản ứng dương tính: Xảy ra hiện tượng ngưng kết , hồng cầu ngưng kết thành cụm lấm t ấ m xung quanh giếng. + Đọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá ngưng kết kháng nguyên được đánh giá ở đ ộ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết x ả y ra. A.2.2.2 . Phản ứng HI cho kháng nguy ê n Hpg C Nguy ê n liệu Lô thí nghiệm Đối chứng Huyết thanh chu ẩ n Kháng nguy ê n PBS 1 2... 10 11 12 PBS 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl Huyết thanh đ ã được xử lý hồng cầu (1:5) 25 μl 25 μl 25 μl Kháng nguyên 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl Hồng cầu cố định 1 % 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl Bảng A.4 - Sơ đồ phản ứ ng HI cho kháng nguy ê n Hpg C a) Cho dung dịch PBS vào các dãy giếng (25 μl /giếng). b) Nhỏ vào giếng đầu tiên 25 μl huyết thanh đã được xử l ý hồng cầu. c) Pha lo ã ng huy ế t thanh theo c ơ số 2. d) Nhỏ vào các giếng 25 μl kháng nguyên (kháng nguy ê n ở 4 đơn vị HA). e) Lắc nh ẹ 20 s, để y ê n 20 m i n. f) Nhỏ vào các giếng 50 μl hồng cầu cố định 1 %. g) Lắc nh ẹ , đ ể y ê n 40 min rồi đ ọ c kết quả. * Đọc kết quả - Phản ứng âm tính: C ó hạt ngưng kết b ô ng l ở n vởn. - Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xu ố ng đáy tạo ch ấ m t r òn. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] ASEAN Standards for Aniamal Vaccines (Second Edition): Requirements for Haemophilus Paragallinarum Bacterin (Coryza)