TCVN5273:2010

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5273:2010 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả lợn TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 5273:2010 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ LỢN Animal disease - Diagnostic procedure for classical swine fever disease Lời nói đầu TCVN 5273:2010 thay thế TCVN 5273:1990; TCVN 5273:2010 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục đo lường chất lượng thẩm định, Bộ khoa học và Công nghệ công bố. BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ LỢN Animal disease - Diagnostic procedure for classical s w ine fever disease CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức k hỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả lợn. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: Bệnh dịch tả lợn (diagnostic procedure for classical swine fever disease) Bệnh truyền nhiễm gây ra bởi một loại virus cấu trúc ARN thuộc giống Pestivirus, họ Flaviridae. Virus dịch tả lợn chỉ có một serotyp duy nhất. Bệnh chỉ xảy ra ở loài lợn các mức độ khác nhau tùy thuộc vào độc lực virus, tuổi động vật mẫn cảm và thời gian nhiễm bệnh. Lợn có thể bị mắc bệnh ở mọi lứa tuổi. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ khi có quy định khác. - Axeton đậm đặc. - Metanol - Natri clorua (NaCI). - Natri phosphat (Na 2 HPO 4 ). - Natri hydroxit (NaOH) 1 N. - Dung dịch axit chlohydric (HCl) 1N. - Dung dịch đệm phosphat glyxerin - Các loại thuốc kháng sinh: penixillin, streptomycxin, polymixin. - Cồn 96%, 70%. - Phoócmôn (CH 2 O). - Kháng thể dịch tả lợn. - Kit chiết tách ARN. - Kit nhân gen. - Nước tinh khiết không có Rnase. - Mồi và probe. - Kháng sinh. - Môi trường nuôi cấy tế bào: Hank's MEM, Eagle's MEM, Hank's BSS. - Huyết thanh thai bê. - Tế bào thận lợn sơ cấp, tế bào dòng PK 15, SK 6. - Chất gắn kết dịch tả lợn (Kháng thể huỳnh quang dịch tả lợn) - Chất gắn kết globulin thể kháng lợn - Virus cường độc dịch tả lợn gây bệnh trên lợn - Virus cường độc dịch tả lợn chủng thuần hóa trên tế bào 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau: - Tủ lạnh. - Tủ ấm. - Cân điện tử có mức cân nhỏ nhất là 1/10000 g. - Tủ sấy. - Nồi hấp. - Buồng cấy. - Máy ly tâm lạnh. - Máy khuấy từ. - Kính hiển vi đảo ngược (dùng soi tế bào). - Máy đọc ELISA. - Máy Realtime RT-PCR. - Hệ thống chiết tách. - Bộ đồ mổ tiểu gia súc. - Ống nghiệm vô trùng, dung tích 10 ml. - Giá đựng ống nghiệm. - Ống effendorf chắt huyết thanh. - Ống effendorf, dung tích 0,2 ml. - Pipet khắc độ 1 ml, 5 ml, 10 ml. - Bơm tiêm loại 5 ml và kim tiêm 22G. - Lọ đựng bệnh phẩm, dung tích 20 ml. - Bộ cối chày sứ. - Panh, kéo cắt tổ chức bệnh phẩm. - Đèn cồn hoặc đèn ga. - Hộp nhuộm tiêu bản. - Hộp giữ ẩm cho lam kính. - Bình nón, dung tích 1 lít. - Giấy nhôm bao gói. - Bộ micropipet và đầu hút. - Khay chứa các dung dịch làm ELISA. - Bông cồn. - Ống Leighton. - Lọ nuôi tế bào loại T25, T75. - Đĩa nuôi tế bào loại 6 giếng. - Lam kính. - Giấy dán nhãn. 5. Cách tiến hành 5.1. Chẩn đoán lâm sàng 5.1.1. Dịch tễ học Bệnh chỉ xảy ra ở lợn. Bệnh dịch tả lợn có tính chất lưu hành mạnh, lây lan nhanh và lợn mắc ở mọi lứa tuổi, tỷ lệ ốm, chết cao và mắc mạnh nhất là lợn con, nó không có vùng dịch rõ rệt về mặt địa lý và bệnh mắc quanh năm không theo mùa vụ. Lợn thường nhiễm virus dịch tả lợn ngoài tự nhiên qua đường mũi, miệng. Thời gian ủ bệnh từ 7 đến 10 ngày, sau đó xuất hiện các triệu chứng như sốt cao 41 °C, suy nhược cơ thể, chán ăn, hay nghiến răng hoặc kêu rên khẽ, viêm kết mạc mắt có dử, giảm số lượng bạch cầu trong máu, lợn bị táo bón sau đó ỉa chảy phân thối khắm. 5.1.2. Triệu chứng lâm sàng Thời gian ủ bệnh từ 3 ngày đến 8 ngày, bệnh xuất hiện với các thể như sau: - Thể quá cấp tính Bệnh xảy ra rất nhanh. Con vật đang khỏe mạnh tự nhiên giảm ăn hoặc bỏ ăn, ủ rũ, sốt cao từ 40 °C đến 42 °C. Da mỏng phía trong đùi và dưới bụng có chỗ đỏ ứng lên rồi tím lại. Lợn giẫy dụa một lúc rồi chết, con vật chết khi chưa có biểu hiện đặc trưng của bệnh đó là ỉa chảy. Bệnh tiến triển trong vòng từ 1 ngày đến 2 ngày tỷ lệ chết có thể lên đến 100 %. - Thể cấp tính Lợn ốm ủ rũ, buồn bã, biếng ăn hoặc bỏ ăn, chui ẩn dưới rơm hoặc tìm nơi tối để nằm. Hai ba ngày sau lợn bị sốt cao, thân nhiệt lên tới 41 °C đến 42 °C, sốt trong vòng 4 ngày đến 5 ngày liền, trong thời gian sốt con vật bị táo bón và sau đó thân nhiệt bị hạ xuống và lúc này lợn bị ỉa chảy, phân con vật có mùi thối khắm cũng là khi con vật bị kiệt sức. Con vật thở mạnh thở hồng hộc, khát nước nhiều, bỏ ăn, ở những phần da mỏng xuất hiện những nốt đỏ như muỗi đốt Mắt có rử trắng như mủ che lấp làm cho con vật không trông thấy được, con vật bị viêm kết mạc và giác mạc mắt và từ mắt có nước nhờn chảy ra. Con vật có hiện tượng nôn mửa. Niêm mạc miệng, chân răng gốc lưỡi có mụn loét phủ bựa màu váng trắng. Khi s ờ bụng có cục sưng. Lợn bị viêm niêm mạc mũi, con vật chảy nước mũi, nước mũi lúc đầu trong loãng sau đó đục và đặc dần, con vật bị ho và khó thở nhịp thở bị rối loạn, đuôi rủ lưng cong, con vật ngồi như chó ngồi, thở khò khè và ngáp. Con vật có những cơn co giật thân thể nhất là khi bị s ờ mó đến, bại liệt chân nhất là hai chân sau làm cho con vật đi xiêu vẹo. Lợn nái sắp đẻ thường hay bị sẩy thai. - Thể mãn tính Nếu thể cấp tính kéo dài con vật chuyển sang thể mãn tính. Con vật gầy còm lúc đi táo lúc ỉa chảy, ho khó thở, da lưng sườn có những vết đỏ có khi loét ra từng mảng. Bệnh tiến triển từ 1 tháng đến 2 tháng lợn chết do kiệt sức hoặc có thể khỏi nhưng gầy còm khó vỗbéo. Những con khỏi bệnh có thể miễn dịch nhưng nó là nguồn gieo rắc virus. 5.1.3. Giải phẫu bệnh học - Thể quá cấp tính Bệnh tích không rõ, chỉ thấy niêm mạc viêm đỏ, thận xuất huyết, vùng vỏ hạch lâm ba sưng đỏ. - Thể cấp tính Có nhiều điểm xuất huyết ở niêm mạc, niêm mạc miệng lở viêm xuất huyết, có khi có mụn loét nông hay sâu, phủ chất bựa màu vàng trắng. Niêm mạc dạ dày sưng màu đỏ gạch, niêm mạc ruột nhất là van hồi manh tràng có những nốt loét, hạch lâm ba sưng tụ máu có màu đỏ sẫm. Lách không sưng hoặc ít sưng nhưng có hiện tượng nhồi huyết, xuất huyết ở viền lách. Thận xuất huyết ở lớp vỏ. Phổi viêm tụ máu có nhiều vùng bị gan hóa , hoại tử cứng lại. Màng phổi có những chỗ chấm đỏ xuất huyết. - Thể mãn tính Ruột viêm có mụn loét tròn. Có khi thấy thành ruột già dày cứng lên, niêm mạc trở nên sần sùi. Phổi dính vào lồng ngực bằng tổ chức liên kết chứa những cục hoại tử có vỏ liên kết cứng. 5.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm 5.2.1. Lấy mẫu - Bệnh phẩm: Hạch amidan, hạch lympho, lách, thận, van hồi manh tràng, máu (huyết thanh). Mẫu bệnh phẩm được lấy ngay sau khi mổ khám. - Bảo quản mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C và gửi ngay đến phòng thí nghiệm trong 24h, nếu quá thời gian đó, bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ đông băng. Huyết thanh hoặc huyết tương bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C tối đa trong 7 ngày. Lưu mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ-20 °C đến -80 °C. 5.2.2. Phát hiện kháng nguyên 5.2.2.1. Xử lý bệnh phẩm Cắt nhỏ 1g đến 2 g hạch amidan, lách, thận, hạch lympho, nghiền trong cối chày sứ vô trùng với dung dịch BSS hoặc Hank's MEM thành (Phụ lục A) huyễn dịch 10 %. Bổ sung vào huyễn dịch 10 % kháng sinh/Glutamin đậm đặc (1 ml kháng sinh trong 10 ml huyễn dịch), sau đó ly tâm 380g trong 15 min, thu dịch nổi. Dịch nổi được dùng để phát hiện virus bằng các phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên, Realtime RT-PCR (rRT-PCR) hoặc phân lập virus trên tế bào. 5.2.2.2. Phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên Có thể sử dụng mẫu bệnh phẩm là huyễn dịch nghiền bệnh phẩm hoặc huyết thanh/huyết tương lợn ốm. Khi sử dụng kit ELISA, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất 5.2.2.3. Phương pháp Realtime RT-PCR phát hiện kháng nguyên Mẫu bệnh phẩm giống như mẫu bệnh phẩm để thực hiện phản ứng ELISA. Tiến hành chiết tách ARN của virus dịch tả lợn: theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit và tiến hành phản ứng realtime RT-PCR (Phụ lục B). 5.2.2.4. Phân lập virus 5.2.2.4.1. Chuẩn bị tế bào Tách tế bào (thận lợn sơ cấp, PK 15, SK 6,...) bằng trypsin 5 % ở 37 °C trong khoảng từ 5 min đến 10 min. Cho dung dịch Eagle’s MEM 5 % FSC vào đánh đều, ly tâm 60 g trong 10 min. Bỏ dịch nổi, hòa tan tế bào với dung dịch Eagle’ MEM 5 % FCS theo tỷ lệ 2x10 6 tế bào/ml và bổ sung 0,2 ml dung dịch kháng sinh/Glutamin đậm đặc trong 10 ml dung dịch tế bào. 5.2.2 .4 .2 . G â y nhiễm tế bào Trộn huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý với huyễn dịch tế bào theo tỷ lệ 1/10, rồi nuôi cấy trong ống Leighton có sẵn lamen hoặc trong các chai nuôi tế bào hay đĩa nuôi tế bào giếng. Giữ các môi trường tế bào đã phân lập virus ở tủ ấm 37 °C trong vòng 7 ngày. Thu hoạch huyễn dịch tế bào sau 24 h và 72 h, giám định virus. 5.2.2.4.3. Giám định virus Giám định virus bằng phản ứng ELISA hoặc phản ứng rRT-PCR 5.2.3. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp 5.2.3.1. Chuẩn bị mẫu Dùng máy cắt lạnh cắt các tổ chức bệnh phẩm (amiđan, lách, hạch...) thành những lát mỏng từ 5 mm đến 7 mm đặt lên phiến kính, mỗi phiến từ 2 lát đến 3 lát. Dùng bút kim cương đánh dấu ký hiệu số của bệnh phẩm, chủng loại tổ chức lên phía góc trái của phiến kính. Để tiêu bản khô tự nhiên Nếu không có máy cắt lạnh thì dùng phương pháp in tổ chức: dùng dao sắc mỏng cắt dứt khoát một nhát trên miếng tổ chức (amiđan, lách...) dùng panh nhọn gắp miếng tổ chức thấm trên giấy lọc cho đến hết máu, ấn nhẹ mặt cắt tổ chức lên phiến kính, dùng bút đánh dấu, để khô tự nhiên. 5.2.3.2. Chuẩn bị mẫu thử trên môi trường tế bào - Bệnh phẩm là gan, nghiền trong chày cối, xử lý bằng dung dịch kháng sinh, pha với môi trường tế bào thành dịch huyền phù 10 - 1 ly tâm 2000 r/min trong 15 min lấy nước nổi. - Cấy mẫu bệnh phẩm lên tế bào thận lợn đã chuẩn bị sẵn trong ống nghiệm laighton có lá kính, mỗi mẫu bệnh phẩm cấy 2 ống đến 4 ống. Sau khi cấy bệnh phẩm 24h đến 48 h, lấy lá kính ra, để khô tự nhiên và chờ tiến hành các bước sau. CHÚ Ý: Khi cấy bệnh phẩm lên tế bào cần có 2 ống đối chứng tế bào khỏe, 2 ống đối chứng nhiễm virus dịch tả lợn. Đánh dấu các ống tế bào. 2.2.3.3. Cố định tiêu bản Các tiêu bản đã được chuẩn bịở 5.2.3.1 sau khi đã đánh dấu đem cố định bằng axeton. Các lam kính đã chuẩn bị ở trên đặt vào cốc nhuộm, đổ axeton vào. Các lá kính chuẩn bị ở5.2.3.2 thì để nguyên trong ống Leighton đổ bỏ môi trường đi, cho axeton vào cố định, để ở -20 °C trong một giờ hoặc ở nhiệt độ phòng trong 30 min. Sau đó nhấc tiêu bản ra để khô tự nhiên. Axeton được đổ vào bình sạch tái sử dụng cho việc khác. 5.2.3.4. Nhuộm mẫu thử Dùng chất gắn kết đã pha loãng ở nồng độ sử dụng nhỏ lên các phiến kính hoặc lá kính đã gắn bệnh phẩm sao cho thuốc nhuộm phủ kín tổ chức. Đặt các phiến kính, lá kính này vào khay ấm (giữ cho bề mặt luôn ướt trong suốt quá trình nhuộm) để vào tủ ấm 37 °C trong 30 min. Rửa bỏ chất gắn kết Sau khi lấy ở tủ ấm ra, đổ bỏ chất gắn kết đi, dùng bình có vòi bơm nhẹ dung dịch đệm (PBS) pH = 7,2 vào tiêu bản cho sạch chất gắn kết, đặt tiêu bản vào cốc có rãnh, đổ ngập PBS vào ngâm rửa 2 lần đến 3 lần, mỗi lần thay PBS vào ngâm 5 min. Sau lần cuối cùng tráng lại bằng Nước cất hai lần. Đặt nghiêng tiêu bản trên giấy lọc hoặc thấm nhẹ cho khô Nhỏ một giọt dung dịch đệm glyxerin lên phiến kính tiêu bản rồi đậy lá kính lên hoặc nhỏ 1 giọt dung dịch đó lên phiến kính sạch rồi đậy lá kính lên. 5.2.3.5. Đọc kết quả Dùng kính hiển vi huỳnh quang lần lượt đọc các mẫu từ đối chứng trước, các mẫu bệnh phẩm sau. Lúc đầu sử dụng vật kính 10 để tìm vi trùng, sau đó dùng vật kính 40. CHÚ Ý: Kháng nguyên virus dịch tả lợn không có cấu trúc rõ ràng, huỳnh quang dương tính (+) là những đám phát quang màu xanh lá cây (nhuộm bằng FITC) ở nguyên sinh chất. Khi sử dụng phương pháp nhuộm huỳnh quang nhất thiết phải có đối chứng. 5.2.3.6. Các đối chứng trong phương pháp huỳnh quang trực tiếp - Đối chứng âm tính (-): tiêu bản tế bào thận lợn hoặc hạch, lách lợn khỏe mạnh nhuộm chất gắn kết. Kết quả không phát quang. - Đối chứng dương tính (+): tiêu bản dịch tả lợn dương tính nhuộm chất gắn kết. Kết quả có phát quang sáng rõ từng đám ở những nguyên sinh chất có virus dịch tả lợn. - Đối chứng miễn dịch đặc hiệu: tiêu bản bệnh phẩm sau khi cố định axeton được nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh dịch tả lợn đặc hiệu, để ở 37 °C trong 30 min. Đổ bỏ huyết thanh, rửa bằng PBS trước khi gắn chất gắn kết. Kết quả tiêu bản không phát quang hoặc phát quang yếu hơn. Đọc và trả lời kết quả theo Bảng 1. Bảng 1 - Cách đọc kết quả Các tiêu bản Kết quả huỳnh quang Kết luận Bệnh phẩm Có Có virus dịch tả lợn Bệnh phẩm Không Không có virus dịch tả lợn 5.2.4. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp 5.2.4.1. Chuẩn bị mẫu, xem 5.2.3.1. 5.2.4.2. Cố định tiêu bản , xem 5.2.3.3. 5.2.4.3. Gắn kháng huyết thanh dịch tả lợn lên tiêu bản Nhỏ từ 0,1 ml đến 0,2 ml kháng thể dịch tả lợn lên mỗi tiêu bản đặt trong khay ấm để ở nhiệt độ 37 °C trong 30 min (tiêu bản luôn luôn ướt trong suốt quá trình ủ). Đổ bỏ huyết thanh, dùng bình có vòi bơm nhẹ dung dịch đệm (PBS) lên phiến kính tiêu bản trong cốc dung dịch đệm 10 min, thay PBS nhiều lần và liên tục lắc nhẹ phiến kính. Lấy ra để tiêu bản khô, nhỏ chất gắn kết globulin thỏ kháng lợn lên các tiêu bản, đặt vào khay ẩm ở 37 °C trong 30 min. Sau đó thực hiện các bước như 5.2.3.4. 5.2.4.4. Đọc kết quả - Tiêu bản kháng nguyên dương tính gắn với chất gắn kết: Kết quả (+) - Tiêu bản tổ chức khỏe gắn chất gắn kết: kết quả (-) - Tiêu bản bệnh phẩm cần kiểm tra nhỏ globulin miễn dịch không gắn FITC sau đó nhỏ tiếp chất gắn kết:kết quả đọc huỳnh quang giảm nhiều - Đọc kết quả theo Bảng 1. 5.2.5. Phương pháp tiêm truyền qua th ỏ 5.2.5.1. Chuẩn bị mẫu Chọn 6 thỏ mạnh khỏe từ 1,8 kg/con đến 2 kg/con. Chia thỏ làm 2 lô: - Lô 1: tiêm dịch huyết phù bệnh phẩm nghi dịch tả lợn (máu của lợn bệnh đã khử fibrin hoặc hạch lách lợn bệnh pha loãng 10 - 1 đã xử lý kháng sinh) 1 ml vào t ĩnh mạch tai 3 thỏ. Theo dõi nhiệt độ ngày 2 lần trong 7 ngày (thỏ phải không sốt). - Lô 2: sau 7 ngày lấy thêm 3 thỏ mạnh khỏe lô 2 cùng với 3 thỏ lô 1 được tiêm thử thách bằng vắc xin nhược độc dịch tả lợn chủng C pha loãng 10 - 1 , 1 ml vào t ĩnh mạch tai. 5.2.5.2. Đọc kết quả - Lô 2 (đối chứng): thỏ sốt có nhiệt độ điển hình (đặc điểm của chủng vắc xin nhược độc dịch tả lợn qua thử) - Lô 1: nếu có sốt, bệnh phẩm âm tính; nếu không sốt, bệnh phẩm dương tính (+) 5.2.6. Phát hiện kháng thể Phát hiện kháng thể dịch tả lợn có ý nghĩa chẩn đoán đối với lợn ốm có triệu chứng của bệnh dịch lợn và chưa bao giờ tiêm phòng, hoặc nhiễm virus dịch tả lợn từ trước. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể: khi sử dụng kitELISA phát hiện kháng thể, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất . Phương pháp trung hòa trên tế bào (NPLA - Neutralising Peroxidase - Linked Assay). Ngoài việc sử dụng với mục đích chẩn đoán bệnh, phương pháp phát hiện kháng thể bằng phương pháp trung hòa trên tế bào còn có ý nghĩa đánh giá hiệu giá kháng thể khi tiêm phòng vắc xin dịch tả lợn. Phương pháp này để xác định hàm lượng kháng thể có trong huyết thanh nhờ sự ức chế của kháng thể đối với virus dịch tả lợn được gây nhiễm trên tế bào. Các bước tiến hành: xem Phụ lục C. 7. Kết luận Lợn được xác định mắc bệnh dịch tả lợn khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng của bệnh dịch tả lợn và kết quả dương tính với một trong những phương pháp xét nghiệm sau: - Phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên dương tính. - Phản ứng rRT-PCR phát hiện virus dương tính. - Phân lập được virus trên môi trường tế bào, và giám định virus dịch tả lợn dương tính. - Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp dương tính - Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp - Phản ứng tiêm truyền qua thỏ dương tính - Phản ứng ELISA phát hiện kháng thể dương tính ở gia súc chưa tiêm phòng. - Phản ứng trung hòa kháng thể trên tế bào dương tính (chỉ áp dụng đối với lợn chưa tiêm phòngtrong trường hợp chẩn đoán). PHỤ LỤC A ( Quy định ) Chuẩn bị dung dịch để chẩn đoán bệnh dịch tả lợn A.1 . Dung dịch Glutamin/kháng sinh đậm đặc 100 lần (100x) - Dung dịch A: Glutamin 2,92 g Nước cất hai lần 50 ml Hòa tan các thành phần trên rồi lọc qua lưới lọc cỡ lỗ 0,45 m m. - Dung dịch B: Penicillin 1.000.000 U Steptomycin 1g Mycostatin 500.000 U Polymixin 150.000 U Kanamycin 1 g Nước cất hai lần 10 ml. Hòa tan các thành phần trên bằng cách lắc đều. - Dung dịch C: Hòa tan 50 ml dung dịch A, 10 ml dung dịch B và 40 ml nước cất hai lần và bảo quản ở âm 20 °C. A.2. Dung dịch muối đệm Hank's (BSS) hoặc môi trường Hank’s MEM Pha theo chỉ dẫn của hãng sản xuất. Hấp vô trùng. Bảo quản 4 °C. A.3 . Môi trường Eagle’s MEM Môi trường Eagle’s MEM 9,4 g Canh thang TPB (Tryptose Phosphat Broth) 2,95 g Nước cất hai lần 1000 ml. Hòa tan các thành phần trên. Hấp vô trùng 121 °C trong 15 min. Bảo quản 4 °C. A.4 . Pha dung dịch Trypsin 5 % (10x) Trypsin 1:250 5g Nước cất hai lần 100 ml. Khuấy bằng que khuấy từ, để qua đêm ở 4 °C. Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 m m. Bảo quản ở âm 20 °C. A.5 . Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) pH 7,2 NaCl8,5 g Na 2 HPO 4 1,07 g NaH 2 PO 4 0,39 g Nước cất hai lần 1 000 ml Hòa tan các thành phần trên. Chỉnh pH đến 7,2 bằng NaOH 1 N và HCl 1 N, hấp vô trùng 121 ° C trong30 min. A. 6 . Dung dịch đệm glyxerin pH = 8,3 Natri dihydrocacbonat (NaHCO 3 ) 0,0715 g Dinatri cacbonat (Na 2 CO 3 ) 0,00160g Nước cất vô trùng 10 ml Glyxerin vừa đủ 100 ml Hòa tan các thành phần trên. Bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, dùng khi đọc huỳnh quang. A. 7 . Dung dịch kháng khuẩn Penixillin bột Streptomyxin Polymixin bột Nước cất vô trùng Hòa tan các thành phần trên. Bảo quản ở nhiệt độ 4 °C hoặc -20 °C. PHỤ LỤC B ( Quy định ) Quy trình phản ứng rRT-PCR B. 1 . Cách tiến hành Pha master mix (hỗn hợp phản ứng) Qiagen RT-PCR kit Invitrogen SS3 qRT-PCR kit Nguyên liệu Lượng m l Nguyên liệu Lượng m l DW 10,5 DW 5,5 Hỗn hợp đệm phản ứng 5x 5,0 Dung dịch đệm phản ứng 2x 1,5 MgCI 2 (25 mM) 1,2 PPP 1,5 dNTP 0,8 Hỗn hợp enzym 0,5 PPP 1,5 Hỗn hợp enzym 1,0 20,0 20,0 Cho 20 ul master mix và cho 5 ul mẫu ARN vào ống PCR (hoặc ống Smart); Ly tâm nhanh; Đặt ống PCR (hoặc ống Smart) vào máy real-time PCR; Chọn chương trình chạy; Chọn màu đọc (tùy theo probe); Lựa chọn các giếng cần chạy; Chạy phản ứng: Qiagen one-step RT-PCR Kit Invitrogen SS3 qRT-PCR Kit RT PCR RT PCR 50 °C-30 min, 95 °C-15 min 40 x (95 °C-10s + 60 °C-50s) 50 °C-15 min, 95 °C-2 min 40 x (95 °C-10 s + 6 0°C-50 s) B. 2 . Đọc kết quả - Mẫu được coi là dương tính khi có Ct £ 35. - Mẫu được coi là âm tính nếu không có Ct. - Mẫu được coi là nghi ngờ nếu Ct >35. Danh mục và trình tự mồi và probe dùng cho phương pháp RRT/PCR Mồi/ Probe Trình tự nucleotide (5'-3') Modi f ication 5' 3 ' Probe TGATGG GGGTAC GAC CTGATA GGG T HEX BHQ1 Mồi xuôi ATGCCCWTAGTAGGACTAGCA None None Mồi ngược TCAACTCCATGTGCCATGTAC None None PHỤ LỤC C ( Quy định ) Phản ứng trung hòa kháng thể dịch tả lợn trên môi trường tế bào C.1 . Chuẩn bị Pha loãng huyết thanh cần chẩn đoán với môi trường MEM có chứa 5 % huyết thanh thai bê (không có kháng thể bệnh dịch tả lợn vì kháng thể này có thể trung hòa với virus dịch tả lợn). Cho một lượng không đổi virus dịch tả lợn (100 TCID50) vào tất cả các giếng (trừ giếng đối chứng). Cho tế bào PK15 hoặc CPK hoặc SK6 vào tất cả các giếng. Ủ đĩa 2 ngày đến 3 ngày ở 37 °C. Kháng nguyên virus được phát hiện bằng phương pháp nhuộm miễn dịch. Chuẩn bị nguyên liệu: - Kháng thể 1: Pig polyclonal antibody pha loãng 1/200 trong dung dịch PBS pH = 7,2. - Kháng thể 2: Anti-pig IgG peroxidase conjugate (DAKO P0164) pha loãng 1/600 trong dung dịch PBS pH = 7,2 .(nếu sử dụng chất gắn kết khác cần chuẩn độ lại). C. 2 . Tiến hành phản ứng C .2.1 . Chuẩn bị virus cho phản ứng NPLA Chuẩn bị tế bào PK15 hoặc CPK hoặc SK6 vào chai nuôi cấy với lượng 5 x 10 4 tế bào/ml trong 15 ml môi trường (EMEM 5 % FCS). Ủ đĩa ở 37 °C/CO 2 trong 24 h. Nhiễm virus (100TCID50) vào chai. Ủ đĩa ở 37 °C trong 3 ngày đến 4 ngày. Lưu giữ trong tủ -80 °C. Làm rã đông và thu lấy môi trường vào ống 15 ml. Ly tâm 3000 g trong vòng 20 min ở 4 °C. Thu lấy môi trường bên trên vào ống 50 ml. Chia vào các ống nhỏ (200 ml/týp). Lưu giữ ở -80 °C. Chuẩn độ virus trong đĩa 96 giếng. Chuẩn độ kháng thể dịch tả lợn bằng phản ứng NPLA. Dùng đĩa 96 giếng. Nhỏ 100 m l môi trường vào hàng đầu tiên của đĩa. Nhỏ 50 m l môi trường vào giếng kế tiếp. CHÚ Ý:Bớt lại một hàng để chuẩn độ ngược virus và làm đối chứng tế bào. Pha loãng huyết thanh: Cho 10 m l huyết thanh vào hàng đầu tiên. Trộn đều và chuyển 50 m l sang hàng bên cạnh. Nhỏ dung dịch virus 50 m l/giếng vào tất cả các giếng (trừ hàng cuối cùng). Nhỏ 100 m l đối chứng virus pha loãng 1,1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000. Lắc đĩa. Ủ đĩa ở 37 °C có 4 đến 5 % CO 2 trong 24 h. Nhỏ 100 m l tế bào PK15 hoặc CPK hoặc SK6 vào tất cả các giếng. Ủ đĩa ở 37 °C có 4 % đến 5 % CO 2 trong 2 ngày đến 3 ngày. Nhuộm NPLA Cố định tế bào: Đổ bỏ môi trường trong đĩa đi và rửa bằng dung dịch PBS 1 % tween 80 từ 2 lần đến 3 lần (200 m l/ giếng). Dùng dung dịch cố định PBS 1 % tween 20, 10 % formaline, 1 % NP 40, cho vào mỗi giếng 100 m l. Ủở nhiệt độ phòng 30 min. Rửa đĩa 3 lần bằng PBS 1 % tween 80. Cho 50 m l kháng thể 1vào mỗi giếng, để tủ ấm 37 °C trong 30 min. Rửa đĩa 3 lần bằng PBS 1 % tween 80. Cho 50 m l kháng thể 2vào mỗi giếng, để tủ ấm 37 °C trong 30 min. Cho 50 m l cơ chất ACEvào mỗi giếng, để tủ ấm 37 °C từ 10 đến 20 min. CHÚ THÍCH: Cơ chất phải sử dụng ngay sau khi pha. C. 3 . Đọc kết quả - Quan sát đĩa bằng kính hiển vi soi ngược. - Nguyên sinh chất của tế bào bắt phần đỏ đậm (màu của ACE), kết luận không có kháng thể. - Nguyên sinh chất của tế bào không bắt màu (màu hồng), kết luận có kháng thể. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 5273:1990 Bệnh dịch tả lợn . [2] 10 TCN 716-2006 Qui trình chẩn đoán bệnh Dịch tả lợn . Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn - Cục Thú y 2006. [3] O.I.E., 2009. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Classical s w ine f ever , chapter 2.8.3 [4] Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam, in lần thứ nhất, Bệnh dịch tả lợn , trang 104-105. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn - Viện Thú y, 2002.