TCVN10479:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10479:2014 (ISO 16931:2009) Dầu mỡ động vật và thực vật - Xác định các traiacylglycerol đã polyme hóa bằng sắc kí rây phân tử hiệu năng cao (HPSEC) TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10479:2014 ISO 16931:2009 DẦU MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT - XÁC ĐỊNH CÁC TRIACYLGLYCERON ĐÃ POLYME HÓA BẰNG SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬ HIỆU NĂNG CAO (HPSEC) Animal and vegetable fats and oils - Determination of polymerized triacylglycerons by high-per f ormance size-exclusion chromatography (HPSEC) Lời nói đầu TCVN 10479:2014 hoàn toàn tương đương với ISO 16931:2009; TCVN 10479:2014 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật và thực vật biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. DẦU MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT - XÁC ĐỊNH CÁC TRIACYLGLYCERON ĐÃ POLYME HÓA BẰNG SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬ HIỆU NĂNG CAO (HPSEC) Animal and vegetable fats and oils - Determination of polymerized triacylglycerons by high-per f ormance size-exclusion chromatography (HPSEC) 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc kí rây phân tử hiệu năng cao (HPSEC) để xác định hàm lượng các triacylglycerol đ ã polyme hóa (PTAG) trong các loại dầu mỡ có chứa ít nhất 3 % (tính theo diện tích pic) các polyme này, tính bằng phần khối lượng. Các PTAG (gọi đúng là dimeric triacylglycerol và oligomeric triacylglycerol) có dạng rắn được h ì nh thành trong suốt quá trình đun nóng dầu mỡ và vì vậy phương pháp này dùng để đánh giá quá trình suy giảm chất lượng do nhiệt của chất béo chiên rán sau khi sử dụng . Phương pháp này áp dụng cho m ỡ rán, dầu mỡ đã qua xử lý nhiệt có hàm lượng các PTAG ít nhất 3 %. Ph ư ơng pháp này cũng có thể áp dụng để xác định các polyme có trong chất béo dùng làm thức ăn chăn nuôi, mặc dù trong trường hợp này sử dụng phương pháp chiết có thể ảnh hưởng đến kết quả. CHÚ THÍCH: Đ ể biết thêm chi tiết, xem TCVN 4331 (ISO 6492) [4] . 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phiên b ả n được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 6128 (ISO 661), Dầu mỡ động vật và thực vật - Chuẩn bị mẫu thử. 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 3.1. Các triacylg l ycerol đã polyme hóa (polymerized tr i acylglycerols) PTAGs Thành phần dầu mỡ gia nhiệt được xác định bằng ph ươ ng pháp HPSEC theo các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn này. CHÚ THÍCH: Hàm lượng các PTAG của t ấ t cả các pic từ các triacylglycerol đ ã polyme hóa đ ã được rửa giải, các mono-triacylglycerol, các di-triacylglycerol và các triacylglycerol (PTAG, MAG, DAG và TAG) đ ã rửa giải được biểu th ị bằng phần trăm khối lượng . Tí nh b ằ ng gam tr ê n 100 gam. 4. Nguyên tắc Trộn kỹ mẫu với tetrahydrofuran (THF) và tách các PTAG bằng phương pháp sắc kí th ẩ m thấu gel theo kích thước phân tử. Các hợp chất được phát hiện bằng detector chỉ số khúc xạ. CHÚ THÍCH : Đ ể khả năng tách tốt hơn th ì sử dụng hai cột n ố i tiếp (2 x 300 mm). 5. Thuốc thử Ch ỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích tr ừ khi có quy định khác. CẢNH BÁO - C ầ n chú ý các quy định v ề việc xử lý các chất gây nguy hiểm . Cần tuân thủ các biện pháp an toàn kỹ thuật, an toàn đối với tổ chức và cá nhân. 5.1 . Tetrahydro f uran (THF) , dùng cho HPLC, có thể được ổn định bằng butylhydroxytoluen (BHT), đ ã khử khí, không chứa nước. Đảm bảo rằng THF sử dụng làm dịch pha loãng mẫu có cùng hàm lượng nước với chất rửa giải; nếu không có thể quan sát thấy pic âm. 5.2 . Toluen , dùng cho HPLC. 5.3 . D ầ u oliu nguyên chất hạng đặc biệt , d ùng làm chất chuẩn: thêm từ 100 mg đến 300 mg dầu vào 10 ml THF và đồng hóa hỗn h ợ p. CHÚ THÍCH: Dầu ol iu nguyên chất hạng đặc biệt không chứa các PTAG và có thể được sử dụng đ ể xác định thời gian lưu của các monome TAG. 6. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của thử nghiệm và cụ thể như sau: 6.1 . Bình chứa dung môi , dung tích từ 500 ml đến 1 000 ml, có bộ lọc dòng pha động polytetra f loetylen. 6.2 . Bơm HPLC , không xung, có tốc độ dòng thể tích từ 0,5 ml/min đến 1,5 ml/min. 6.3 . Van bom , có vòng bơm 20 m l và xyranh thích hợp có thể tích từ 50 m l đến 100 m l hoặc có bộ b ơ m m ẫ u tự động thích hợp. 6.4 . Cột bằng thép không g ỉ , dài 2 x 300 mm, đường k í nh trong từ 7,5 mm đến 7,8 mm, được nhồi gel co-polyme styren-divinylbezen hiệu năng cao; hình cầu, đường kính 5 m m, cỡ lỗ 10 nm hoặc 50 nm 1) . CHÚ THÍCH: Sắc kí đồ t rong Phụ lục A cho độ phân giải cần thiết đối với hai cột. Nên sử dụng cột bảo vệ. Hiệu suất cột được xác định bằng số đĩa lý thuyết, n , đối với các monone TAG phải í t nhất là 6 000. Duy trì nhiệt độ cột từ 30 °C đến 35 °C bằng thiết bị kiểm soát. Cột có thể được b ả o quản trong toluen (5.2), nếu cần, mặc dù kinh nghiệm cho thấy giữ hệ thống chạy bằng THF là tốt hơn. 6.5 . Detector , detector ch ỉ số khúc xạ kiểm soát được nhiệt độ. Nhiệt độ l í t ưở ng đối với detector là trên nhiệt độ cột (từ 30 °C đến 35 °C). 6.6 . Hệ thống dữ liệu sắc kí (CDS) , cho phép hiển thị và định lượng chính xác diện tích pic. 6.7 . Xyranh dùng 1 lần , dung tích 1 ml 6.8 . Bộ lọc nilon , cỡ lỗ 0,45 m m 2) . 6.9 . Xyranh HPLC , dung tích từ 50 m l đến 100 m l. 7. Lấy mẫu M ẫ u gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo qu ả n hoặc vận chuyển. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 2625 (ISO 5555) [1] . 8. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6128 (ISO 661). 9. Cách tiến hành 9.1 . Khởi động thiết bị HPLC Cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bật hệ thống và bơm THF ở tốc độ dòng từ 0,5 ml/min đến 1 ml/min để làm sạch toàn bộ hệ thống đến van bơm. Nối cột vào van bơm và rửa cột bằng khoảng 30 ml THF. Nối cột với cuvet đựng mẫu của detector. Rót THF đầy cuvet chuẩn. Chỉnh tốc độ dòng pha động từ 0,5 ml/min đến 1,0 ml/min. Đợi đến khi hệ thống đạt đến độ ổn định thích hợp (độ sai lệch của đường nền không đáng kể). Nếu sử dụng cột đưa ra dưới đây th ì hệ thống có thể ổn định trong khoảng 15 min. Đối với các cột nhồi khác, hệ thống khó ổn đ ị nh hơn. Ví dụ nên thực hiện từng bước việc thay đổi pha động từ to l uen sang THF, bằng các hỗn hợp có t ỉ lệ THF khác nhau, mỗi hỗn hợp chứa ít nhất là 25 % THF. Thông thường hệ thống ổn định trong khoảng 12 h. Các điều kiện sau được cho là thích hợp: Cột: PLgel 3) kích thước 10 nm, 2 x 300 mmx 7,6 mm, cỡ hạt 5 m m; Chất rửa giải: THF; Tốc độ dòng: 0,8 ml/min; Lò cột: 35 °C; Detector: RI cài đặt ở 35 °C; Thể tích bơm: 20 m l. 9.2 . Chuẩn b ị phần mẫu thử và mẫu phân tích Thêm khoảng 100 mg đến 300 mg mẫu thử (Điều 8) vào 10 ml THF và đồng hóa. Lọc qua bộ lọc nilon (6.8), nếu cần. Dùng xyranh HPLC bơm từ 20 m l đến 40 m l dung dịch. 10. Biểu thị kết quả 10.1 . Phân tích định tính Sắc k í đồ của phép xác định cho thấy pic chính th ể hiện các monome TAG (khối lượng phân tử tương đối khoảng 900) và một hoặc một vài các pic nhỏ hơn cùng với thời gian lưu ngắn hơn thể hiện các PTAG (dime và cao hơn oligome). Trong điều kiện thích hợp, các TAG và các PTAG có thể được tách riêng ở độ phân giải tốt (Xem Hình A.1 và H ì nh A.2) ngay c ả ở mức các PTAG thấp. Tuy nhiên trong một số trường hợp (có thể liên quan đến hiện tượng hư h ỏ ng phức hợp), hình dạng pic có trước các pic triacylglycerol có thể không rõ ràng gây khó khăn cho việc tính toán (Hình 2). 10.2 . Phân tích định lượng Thực hiện phép tính theo phương pháp nội chuẩn , giả sử tất cả các thành phần có trong mẫu được rửa giải có cùng hệ số đáp ứng. Điều quan trọng là phải có đường nền thẳng. Phần khối lượng của các PTAG, W PTAG , tính bằng gam trên 100 g, được tính bằng công thức sau: Trong đó là tổng diện tích pic của tất cả các PTAG; là tổng diện tích pic của tất cả các acylglycerol (PTAG, TAG, DAG và MAG). Biểu thị kết quả đến một chữ số thập phân. 11. Độ chụm 11.1 . Phép thử liên phòng thử nghiệm Chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục B. Các giá trị thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và ch ấ t nền mẫu khác với các giá trị đã nêu. 11.2 . Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên cùng một loại vật liệu thử , trong cùng một phòng thử ngh i ệm, do một người thực hiện, sử dụng c ù ng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, nằm trong dải các giá trị trung bình nêu trong Bảng B.1 không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại, r , thường được suy ra bằng phương pháp nội suy tuyến tính từ các giá trị nêu trong B ả ng B.1. 11.3 . Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên cùng một vật liệu thử, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập, R , thường được suy ra bằng phương pháp nội suy tuyến tính từ các giá trị nêu trong Bảng B.1. 12. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đ ủ về mẫu thử ; b) phương pháp l ấ y mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d ) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này cùng với mọi t ì nh huống b ấ t thường khác có thể ảnh hưởng đến kết quả; e) các kết quả thử nghiệm thu được, hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được. PHỤ LỤC A (Tham khảo) Sắc kí đồ CHÚ D Ẫ N: 1a/1 b poly-/oligomeric TAG 1b dime TAG 2 TAG 3 DAG 4 MAG 5 axit béo t thời gian V tín hiệu đáp ứng CHÚ THÍCH: Các đ iều kiện nêu trong 9 1. H ì nh A.1 - HPSEC hỗn hợp thử nghiệm của các TAG, DAG, MAG và các axit béo tự do CH Ú D Ẫ N: 1a/1b poly-/oligomeric TAG 1b d i meTAG 2 TAG 3 DAG 4 MAG 5 axit béo t thời gian V tín hiệu đáp ứng CHÚ TH Í CH 1: Các điều kiện được n ê u trong 9.1 CH Ú THÍCH 2: Thứ tự rửa giải được quy định theo c ỡ ph â n t ử và khối lượng ph â n tử tương đối. Trong quá trình chi ê n rán, không tạo thành các DAG. Tuy nhiên, pic từ các DAG tăng do quá trình oxy hóa b ở i sự giảm nhiệt của c á c TAG thành các TAG có hai đoạn C 7 hoặc C 8 và một axit béo C 1 8 . Kh ố i lượng phân tử tương đối bằng khối l ượ ng phân tử tương đối của các DAG. Hình A.2 - HPSEC của các TAG và PTAG: sắc kí đồ của d ầu rán có phần khối lượng các PTAG khác nhau PHỤ LỤC B (Tham khảo) Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm Một phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành ở cấp quốc tế do DIN và DGF tổ chức năm 2007, gồm 15 phòng thử nghiệm tham gia, mỗi phòng thu được hai kết quả thử đối với từng mẫu thử, cho các kết quả thống kê [được đánh giá theo TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) [2] và TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) [3] ] được nêu trong Bảng B.1. B ả ng B.1 - Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm Các mẫu dầu chiên rán được sử dụng A B C D E S ố lượng ph ò ng thử nghiệm 15 15 15 15 15 Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 14 15 13 15 14 Số lượng các kết quả trong tất cả các phòng thử nghiệm 28 30 26 30 28 Giá trị trung bình , , % 5,23 11,95 12,81 15,78 20,42 Đ ộ lệch chuẩn lặp lại ( s r ) 0,10 0,12 0 , 11 0,13 0,14 Đ ộ lệch chuẩn tương đối lặp lại, CV( r ) % 1 , 9 1,0 0,8 0 , 8 0 , 7 Giới hạn lặp lại , r ( 2,8 s r ) 0,28 0,32 0,30 0,37 0,39 Độ lệch chu ẩ n tái lập, s R 0,22 0 , 20 0 , 19 0,26 0,15 Độ lệch chuẩn tương đối tái l ậ p , CV( R ) % 4 , 1 1,7 1 , 4 1,6 0,7 Giới hạn tái lập , R (2,8 s R ) 0,61 0,57 0,52 0,72 0,42 CHÚ THÍCH: Các kết quả và các thống kê được t í nh bằng gam tr ê n 100 gam (phần trăm khối lượng). THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 2625 (ISO 5555), Dầu mỡ động vật và th ự c vật - Lấy mẫu. [2] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994), Độ ch í nh xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung. [3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ t á i lập của phương pháp đo tiêu chuẩn. [4] TCVN 4331:2001 (ISO 6492:1999), Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng ch ấ t béo . [5] IUPAC Method 2.508 , Determination of polymerized triglycerides in oils and fats by hight per f ormance liquid chromatography. Pure Appl. Chem. 1991, 63 , pp. 1168-1171. Available (2008- 10-16) at: http://www.iupac.org/pubications /pac/1991/pdf/6308x1163.pdf 1) 1 nm = 10 Å 2) Bộ lọc xyranh Nalgene 4mm l à v í dụ v ề sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra đ ể tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấ n định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các k ế t quả tương đương . 3) Plgel là ví dụ v ề s ả n phẩm thích hợp có bán sẵn. Th ô ng tin này đưa ra đ ể tạo thu ậ n tiện cho người s ử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản ph ẩ m này. Có th ể sử dụng c á c sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương .