TCVN9591:2013

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9591:2013 (ISO 17372:2008) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định zearalenon bằng sắc ký cột miễn nhiễm và sắc ký lỏng hiệu năng cao TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9591:2013 ISO 17372:2008 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH ZEARALENON BẰNG SẮC KÝ CỘT MIỄN NHIỄM VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuffs - Determination of zearalenone by immunoaffinity column chromatography and high performance liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 9591:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 17372:2008; TCVN 9591:2013 do Cục Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH ZEARALENON BẰNG SẮC KÝ CỘT MIỄN NHIỄM VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuffs - Determination of zearalenone by immunoaffinity column chromatography and high performance liquid chromatography 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này dùng để phân tích zearalenon trong thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, bao gồm lúa mạch, ngô, yến mạch, lúa mạch đen, bột mì, bột đậu tương, bột hạt canola ép lấy dầu (hạt cải dầu), gluten ngô, bã rượu khô, hạt đậu lăng và bã củ cải đường. Giới hạn định lượng là 0,05 mg/kg (50 m g/kg). Giới hạn định lượng thấp hơn có thể có được tùy thuộc vào việc thực hiện đánh giá thích hợp của người sử dụng phòng thử nghiệm. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 2230 (ISO 565), Sàng thử nghiệm - Lưới kim loại đan, tấm kim loại đột lỗ và lưới đột lỗ bằng điện - Kích thước lỗ danh nghĩa. TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử. TCVN 6952 (ISO 6498), Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử. TCVN 7151 (ISO 648), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Pipet một mức. TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức. TCVN 8488 (ISO 4788), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Ống đong chia độ. 3 Nguyên tắc Mẫu được chiết bằng axetonitril loãng và được lọc để làm sạch. Sau đó dịch chiết lỏng được pha loãng bằng nước hoặc bằng muối đệm phosphat (PBS) và được tinh sạch bằng sắc ký cột miễn nhiễm (IAC). Dịch chiết đã tinh sạch được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC) pha đảo có detector huỳnh quang. Các mẫu nghi ngờ dương tính có thể được khẳng định bằng cách tính tỷ số bước sóng, dùng phép phân tích HPLC pha chuẩn, hoặc bằng cách dùng detector mảng diot. 4 Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác. CẢNH BÁO - Xử lý các dung môi và dung dịch trong tủ hút. Đeo kính an toàn, mặc quần áo bảo vệ và tránh để tiếp xúc với da. 4.1 Nước , loại 1 phù hợp với quy định trong TCVN 4851 (ISO 3696). 4.2 Axetonitril (CH 3 CN), loại dùng cho HPLC. 4.3 Metanol (CH 3 OH), loại dùng cho HPLC. 4.4 Natri clorua (NaCL), có độ tinh khiết không nhỏ hơn 99% khối lượng. 4.5 Dung môi chiết , f (CH 3 CN) = 90% thể tích. Trộn 900 ml axetonitril (4.2) với 100 ml nước (4.1). Trộn đều. 4.6 Axetonitril loãng , f (CH 3 CN) = 50% thể tích. Trộn 1 phần thể tích axetonitril (4.2) với 1 phần thể tích nước (4.1). Trộn đều. Dung dịch này được dùng cho xyranh lấy mẫu tự động, nếu có thể. 4.7 Metanol loãng , f (CH 3 OH) = 30% thể tích. Trộn 75 ml methanol (4.3) với 175 ml nước (4.1). Trộn đều. 4.8 Dinatri hydrophosphat (Na 2 HPO 4 ), độ tinh khiết không nhỏ hơn 99 % khối lượng. 4.9 Kali dihydrophosphat (KH 2 PO 4 ), độ tinh khiết không nhỏ hơn 99 % khối lượng. 4.10 Kali clorua (KCl), độ tinh khiết không nhỏ hơn 99 % khối lượng. 4.11 Natri hydroxit (NaOH), độ tinh khiết không nhỏ hơn 99 % khối lượng. 4.12 Muối đệm phosphat (PBS) Hòa tan 8 g natri clorua (4.4), 1,16 g dinatri hydrophosphat (4.8), 0,2 g kali hydrophosphat (4.9) và 0,2 g kali clorua (4.10) trong 1 lít nước (4.1). Chỉnh pH đến 7,4 bằng dung dịch natri hydroxit (4.13). Ngoài ra, có thể mua PBS đậm đặc đã được chuẩn bị rồi pha loãng để sử dụng. 4.13 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,2 mol/l. Hòa tan 8 g natri hydroxit (4.11) trong 1 lít nước (4.1). 4.14 Pha động HPLC Cho 460 ml axetonitril (4.2) vào bình đựng thuốc thử dung tích 1 lít, thêm 460 ml nước (4.1) và 80 ml metanol (4.3). Trộn đều rồi lọc qua bộ lọc có cỡ lỗ 0,45 m m (5.14). 4.15 Dung dịch chuẩn gốc zearalenon , r (C 18 H 22 O 5 ) 50 m g/ml. CẢNH BÁO - Zearalenon là một oestrogen. Việc xử lý có ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của thuốc thử này. Cân 5,0 mg zearalenon, chính xác đến 0,1 mg. Chuyển vào bình định mức một vạch 100 ml (5.1.2). Hòa tan trong axetonitril (4.2) và thêm axetonitril đến vạch. Hiệu chuẩn dung dịch chuẩn như sau: dùng pipet (5.1.3) lấy 4,0 ml chất chuẩn gốc cho vào bình định mức một vạch 25 ml (5.1.2) và thêm axetonitril đến vạch (khoảng 8 m g zearalenon trên mililit). Đo độ hấp thụ tia cực tím (UV), dùng cuvet thạch anh có chiều dài đường quang 10 mm. Xác định nồng độ, r (C 18 H 22 O 5 ) , tính bằng miligam trên mililit, theo Công thức (1): (1) trong đó M r là khối lượng phân tử tương đối của zearalenon bằng 318,4; A là độ hấp thụ UV; e là độ phát xạ, ở bước sóng 274 nm, bằng 12 623 ± 111. Báo cáo kết quả đến ba chữ số có nghĩa. Dung dịch chuẩn gốc bền trong ít nhất 1 năm nếu được bảo quản ở điều kiện lạnh và kín khí. Hiệu chỉnh lại khi chuẩn bị các dung dịch chuẩn pha loãng mới (4.16 và 4.17). 4.16 Dung dịch thêm chuẩn , r (C 18 H 22 O 5 ) = 5,0 m g/ml. Pha loãng 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.15) đến 100 ml bằng dung môi chiết (4.5). Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh. Chuẩn bị dung dịch mới 6 tháng một lần. 4.17 Dung dịch chuẩn HPLC Chuẩn bị năm dung dịch chuẩn zearalenon có nồng độ cho trong Bảng 1 bằng cách pha loãng dung dịch thêm chuẩn (4.16) hoặc dung dịch chuẩn HPLC (4.17.1) có pha động HPLC (4.14) Bảng 1 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn HPLC Dung dịch chuẩn HPLC Dung dịch chuẩn để pha loãng Thể tích để pha loãng (ml) Thể tích cuối cùng (ml) Nồng độ zearalenon m g/ml 4.17.1 4.16 2,0 50 0,20 4.17.2 4.16 1,5 50 0,15 4.17.3 4.16 1,0 50 0,10 4.17.4 4.16 1,0 100 0,050 4.17.5 4.17.1 5,0 50 0,020 Bảo quản tất cả dung dịch chuẩn HPLC trong tủ lạnh. Chuẩn bị dung dịch mới 6 tháng một lần. 5 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể sau: 5.1 Dụng cụ thủy tinh thông thường của phòng thí nghiệm. 5.1.1 Ống đong , phù hợp với loại A quy định trong TCVN 8488 (ISO 4788). 5.1.2 Bình định mức một vạch , phù hợp với loại A quy định trong TCVN 7153 (ISO 1042). 5.1.3 Pipet , phù hợp với loại A quy định trong TCVN 7151 (ISO 648). 5.2 Máy đo quang phổ UV . 5.3 Ống hút chân không , phù hợp với IAC. 5.4 Bình nón , dung tích 125 ml và 500 ml. 5.5 Giấy lọc , đường kính 185 mm, ví dụ Whatman No. 41 1) . 5.6 Ống thủy tinh , đáy tròn, dung tích 5 ml (kích thước 13 mm x 100 mm) hoặc loại tương đương. 5.7 Ống ly tâm , dung tích 50 ml, bằng polypropylen hoặc loại tương đương. 5.8 Phễu thủy tinh , đường kính trong tối đa 60 mm và 90 mm. 5.9 Giấy lọc vi sợi thủy tinh , kích thước 125 mm, Whatman 934AH 1) 5.10 Cột miễn nhiễm , dung tích nạp ³ 2 m g zearalenon và độ thu hồi ³ 85 %, ZearalaTest 1) [loại chuẩn hoặc WB (tốt nhất là loại lỗ rộng, vì ít bị tắc nghẽn)] và EASI-EXTRACT 1) . 5.11 Máy lắc , lắc vòng, hoặc loại tương đương. 5.12 Xyranh bằng chất dẻo , dung tích 5 ml. 5.13 Bộ lọc xyranh dùng một lần , bằng polyvinyldiflorua (PVDF), cỡ lỗ 0,45 m m và đường kính 13 mm. 5.14 Hệ thống lọc dung môi : tất cả các dụng cụ lọc bằng thủy tinh thích hợp cho bộ lọc đường kính 47 mm (5.15) và nylon (polyamid) hoặc bộ lọc PTFE đường kính 47 mm và cỡ lỗ 0,45 m m. 5.15 Hệ thống HPLC gồm có: 5.15.1 Bơm , loại không xung, lưu lượng 0,5 ml/min đến 1,5 ml/min. 5.15.2 Hệ thống bơm mẫu , lấy mẫu bằng tay hoặc tự động, có vòng thích hợp cho việc bơm 100 m l. 5.15.3 Cột phân tích , cột C 18 4 m m và 5 m m, kích thước 150 mm x 4 mm, ví dụ Waters Nova-Pak C 18 1) , Inertsil ODS-3 1) , Lichrospher 100-RP-18 1) , ACE 3 C 18 1) , Waters Symmetry Shield RP18 1) và Hypersil ODS/BDS 1) . 5.15.4 Detector huỳnh quang , thích hợp để đo bước sóng kích thích ở 236 nm và 274 nm và đo bước sóng phát xạ ở 440 nm (detector có bước sóng biến thiên) hoặc ở 418 nm (detector có bộ lọc phát xạ). 5.15.5 Bộ tích phân hoặc bộ xử lý PC. 5.15.6 Detector mảng diot , tùy chọn. 5.16 Bộ lọc vi sợi thủy tinh , đường kính 21 mm, ví dụ Whatman GF/D 1) . 5.17 Bình hứng , bằng polypropylen, thích hợp để gắn vào đỉnh của IAC, dung tích 20 ml và đường kính trong 20 mm. Có thể cần bộ nối. 5.18 Thủy tinh frit , dùng cho bình hứng (5.17), đường kính 20 mm và cỡ lỗ 20 m m. 5.19 Sàng , phù hợp với quy định trong TCVN 2230 (ISO 565). 5.20 Bộ cô mẫu bằng nitơ , có nồi cách thủy có khả năng duy trì được nhiệt độ ở 50 o C ± 5 0 C. 5.21 Máy trộn Vortex. 6 Lấy mẫu Mẫu được gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản hoặc vận chuyển. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) [1] . Các mẫu cần được bảo quản đông lạnh để tránh làm thay đổi các mức độc tố vi nấm do sự phát triển của nấm mốc. 7 Chuẩn bị mẫu thử. Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498). Nghiền toàn bộ mẫu phòng thử nghiệm sao cho lọt hết qua sàng có cỡ lỗ danh nghĩa 1 mm (5.19). Trộn kỹ. Các nghiên cứu đối với các độc tố vi nấm khác cho thấy các mẫu nghiền lọt qua sàng lỗ tròn cỡ lỗ 0,5 mm và sàng cỡ lỗ 1,0 mm làm giảm độ biến thiên của phép phân tích lặp lại và làm tăng hiệu quả chiết. Nên sử dụng thiết bị nghiền tạo cỡ hạt nhỏ hơn 1 mm; tuy nhiên, cần cẩn thận tránh làm mẫu bị quá nhiệt vì lỗ sàng tròn quá nhỏ. Nên dùng sàng lỗ tròn cỡ lỗ 0,75 mm; hầu hết mẫu nghiền lọt qua sàng có cỡ lỗ danh định 0,5 mm. 8 Cách tiến hành 8.1 Chuẩn bị mẫu kiểm soát chất lượng Nên dùng mẫu kiểm soát chất lượng; các kết quả phân tích phải đáp ứng yêu cầu về độ thu hồi, nghĩa là ³ 85 %. Phân tích mẫu kiểm soát đã thêm chuẩn (0,10 mg/kg) theo từng nhóm mẫu. Chuẩn bị mẫu bằng cách dùng pipet lấy 1,0 ml dung dịch thêm chuẩn (4.16) cho vào 50 g phần mẫu thử trắng là lúa mì hoặc ngô và trộn đều. Phân tích thêm mẫu trắng. 8.2 Chiết Tiến hành từng phần mẫu thử như sau: Cân 50,00 g mẫu thử, chính xác đến 0,01g, cho vào bình nón 500 ml (5.4). Cân và thêm 5 g natri clorua (4.4). Thêm 150 ml dung môi chiết (4.5). Lắc trong 1 h. Tiến hành qui trình làm sạch IAC (8.3). Các chất nền như thức ăn gia súc ủ xilô khô có thể hấp thụ gần hết 150 ml dung môi chiết. Trong trường hợp đó, tăng thể tích dung môi chiết đến 200 ml hoặc 250 ml. Bước lắc có thể được bắt đầu vào cuối ngày, dùng máy lắc (5.11) có thiết bị hẹn giờ, nếu cần, lắc đến đầu buổi sáng của ngày hôm sau, rồi tiến hành bước 8.3. 8.3 Làm sạch cột miễn nhiễm Tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất IAC, nhưng dùng bình hứng (5.17) có thủy tinh frit (5.18), bộ lọc GF/D (5.16) dùng cho cột ZearalaTest 1) (8.3.1) và dùng cho cột EASI-EXTRACT 1) (8.3.2), rửa giải bằng 2,0 ml chất rửa giải. Đối với các loại cột khác, tiến hành theo 8.3.1 hoặc 8.3.2. Đối với phép phân tích các nền mẫu được nhuộm màu ở mức cao và các chất nền có mặt gây nhiễu sắc đồ, thì tùy chọn phương án. Dùng methanol 30 % thể tích (4.7) rửa giải các chất gây nhiễu mà không làm biến tính kháng thể; methanol không vượt quá 35% thể tích. Đối với tất cả các loại IAC, để đạt được giới hạn định lượng 0,05 mg/kg, để giảm sự biến thiên và tăng sắc ký HPLC, thì làm bay hơi các chất rửa giải cột rồi hòa tan trong một thể tích tối thiểu (2,0 ml) của pha động (4.14). CHÚ THÍCH 1: Có thể bổ sung nhiều hơn 10 ml dịch lọc pha loãng vào cột trong các bước 8.3.1.4 và 8.3.2.5 với điều kiện không được vượt quá khả năng nạp của cột. Khi sử dụng thể tích lớn hơn có thể gây tắc thủy tinh frit và cột; lúa mạch được biết đến là nguyên nhân gây tắc, mặc dù sử dụng hai bộ lọc trên thủy tinh frit để tránh hiện tượng này. Cột có lỗ rộng ít gây tắc hơn. CHÚ THÍCH 2: Việc tinh sạch dịch lọc dùng cho IAC ảnh hưởng đến hiệu suất của cột. Ngoài nguyên nhân gây tắc cột, các hạt có thể ngăn cản sự hấp thụ zearalenon vào các kháng thể, dẫn đến độ thu hồi không ổn định và thấp. 8.3.1 Cột miễn nhiễm ZearalaTest 1) [dạng chuẩn và lỗ rộng (WB)] 8.3.1.1 Lọc nhiều hơn 10 ml dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp (5.5) vào trong bình nón 125 ml (5.4). 8.3.1.2 Dùng pipet (5.1.3) lấy 10 ml dịch chiết đã lọc cho vào bình định mức một vạch 50 ml (5.1.2) và thêm nước đến vạch. Trộn đều. Lọc dịch chiết đã pha loãng (khoảng 25 ml) qua giấy lọc vi sợi thủy tinh (5.9) vào ống ly tâm 50 ml (5.7). 8.3.1.3 Nối IAC vào ống hút chân không (5.3). Lắp bình hứng (5.17) có thủy tinh frit (5.18) lên đỉnh cột. Cần một ống nối cho cột WB. Gắn bộ lọc vi sợi thủy tinh (5.16). Đối với cột dạng chuẩn thì cần đến hai bộ lọc vi sợi thủy tinh cho một số chất nền, ví dụ lúa mạch. Nếu dung dịch đã lọc (8.3.1.2) sạch thì không cần thủy tinh frit hoặc bộ lọc. 8.3.1.4 Dùng pipet (5.1.3) lấy 10 ml dịch lọc (8.3.1.2) cho vào bình hứng. Rót dịch chiết qua cột ở tốc độ dòng cố định cho đến khi không khí đi qua cột; tốc độ dòng phải tạo thành các giọt nhỏ (từ 1 giọt đến 2 giọt mỗi giây). 8.3.1.5 Đối với các sản phẩm có chất nhuộm màu và các mẫu có các pic gây nhiễu thì rửa cột bằng 15 ml metanol 30 % 0 (4.7) ở tốc độ 1 giọt đến 2 giọt mỗi giây cho đến khi không khí đi qua cột. Đối với tất cả các loại mẫu khác, rửa cột bằng 10 ml nước (4.1) ở tốc độ 1 giọt đến 2 giọt mỗi giây cho đến khi không khí đi qua cột. 8.3.1.6 Tháo bình hứng rồi lắp bình không có thủy tinh frit (không yêu cầu đối với cột WB) và rửa giải zearalenon bằng cách cho 2,0 ml metanol (4.3) đi qua cột ở tốc độ khoảng 1 giọt mỗi giây, thu lấy dịch rửa giải vào trong ống nghiệm 5 ml (5.6). CHÚ THÍCH: Có thể loại bỏ thủy tinh frit ra khỏi bình hứng đã sử dụng bằng cách dùng que khuấy hoặc đũa khuấy cho qua đáy của bình hứng, bình hứng có thể được làm sạch và được dùng lại. 8.3.1.7 Làm bay hơi dung dịch rửa giải đến khô, dùng bộ cô mẫu bằng nitơ với nhiệt độ nồi cách thủy 50 0 C ± 5 0 C (5.20). Bổ sung 2,0 ml pha động HPLC (4.14). Trộn đều bằng máy trộn vortex (5.21), rồi tiếp tục tiến hành theo 8.4. 8.3.1.8 Có thể lọc dung dịch thử qua bộ lọc PVDF (5.13), dùng xyranh bằng chất dẻo. Dãy dịch lọc phải được kiểm tra để xác nhận không có mặt các pic gây nhiễu. Với việc sử dụng thủy tinh frit (5.18) và bộ lọc trong bình hứng (5.17), dung dịch thử phải trong và không cần phải lọc. 8.3.2 Cột miễn nhiễm EASI-EXTRACT Ò 8.3.2.1 Lọc nhiều hơn 10 ml dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp (5.5) vào bình nón 125 ml (5.4). 8.3.2.2 Dùng pipet (5.1.3) lấy 10 ml dịch chiết đã lọc cho vào trong bình định mức một vạch dung tích 50 ml (5.1.2) và thêm dung dịch đệm PBS (4.12) đến vạch. Trộn đều. 8.3.2.3 Lọc dịch chiết đã pha loãng (khoảng 25 ml) qua giấy lọc vi sợi thủy tinh (5.9) vào ống ly tâm 50 ml (5.7). 8.3.2.4 Nối IAC vào ống hút chân không (5.3). Lắp bình hứng (5.17) có thủy tinh frit lên đỉnh của cột, dùng ống nối. Gắn bộ lọc vi sợi thủy tinh (5.16). Rửa cột bằng 10 ml đến 20 ml dung dịch đệm PBS. Nếu dung dịch lọc (8.3.2.3) đã trong thì không cần thủy tinh frit hoặc bộ lọc. 8.3.2.5 Dùng pipet (5.1.3) lấy 10 ml dịch lọc (8.3.2.3) cho vào bình hứng. Rót dịch chiết qua cột với tốc độ dòng cố định cho đến khi không khí đi qua cột; tốc độ dòng phải tạo thành các giọt nhỏ (1 giọt đến 2 giọt mỗi giây). 8.3.2.6 Đối với các sản phẩm có chất nhuộm màu và các mẫu có các pic gây nhiễu, rửa cột bằng 15 ml metanol 30 % thể tích (4.7) ở tốc độ 1 giọt đến 2 giọt mỗi giây cho đến khi không khí đi qua cột. Đối với tất cả các loại mẫu khác thì rửa cột bằng 20 ml nước (4.1) ở tốc độ 1 giọt đến 2 giọt mỗi giây cho đến khi không khí đi qua cột. 8.3.2.7 Tháo bình hứng và rửa giải zearalenon bằng cách cho 2,0 ml axetonitril (4.2) đi qua cột ở tốc độ khoảng 1 giọt mỗi giây, thu lấy dịch rửa giải vào trong ống nghiệm 5 ml (5.6). 8.3.2.8 Làm bay hơi dịch rửa giải đến khô, dùng bộ cô mẫu bằng nitơ với nhiệt độ nồi cách thủy 50 0 C ± 5 0 C (5.20). Bổ sung 2,0 ml pha động HPLC (4.14). Trộn bằng máy trộn vortex (5.21). 8.3.2.9 Có thể lọc dung dịch thử qua bộ lọc PVDF (5.13), dùng xyranh bằng chất dẻo. Lô dịch lọc cần được kiểm tra để xác nhận không có mặt các pic gây nhiễu. Với việc sử dụng thủy tinh frit và bộ lọc trong bình hứng dung dịch thử phải trong và không cần lọc. 8.4 Phân tích HPLC 8.4.1 Các điều kiện vận hành HPLC Pha động xem 4.14 Tốc độ dòng 1,0 ml/min Thể tích bơm 100 m l Cột xem 5.15.3, có cột bảo vệ C 18 Bước sóng detector Bước sóng kích thước: 274 nm Bước sóng phát xạ: 440 nm (đối với detector có bước sóng biến thiên) 418 nm (đối với detetor có bộ lọc phát xạ) 8.4.2 Sự tương thích của hệ thống 8.4.2.1 Quá trình phân giải Bơm dung dịch chuẩn HPLC nồng độ 0,050 m g/ml (4.17.4). Phải quan sát được pic đơn lẻ; tuy nhiên có có pic khác kèm theo thì pic zearaleon phải phân giải được trên đường nền. 8.4.2.2 Hệ số không đối xứng Hệ số không đối xứng theo dược điển Hoa Kỳ, tương đương hệ số đối xứng theo dược điển châu Âu, F, phải nhỏ hơn 1,6. 8.4.3 Xác định 8.4.3.1 Bơm 100 m l (đủ vòng) dung dịch chuẩn HPLC 0,020 m g/ml (4.17.5). Thực hiện bơm dung dịch chuẩn hai lần hoặc nhiều hơn để đảm bảo độ lập lại của diện tích pic là ~2 %. Xác định độ tuyến tính bằng cách bơm 100 m l (đủ vòng) từng dung dịch chuẩn HPLC (4.17). Dựng đồ thị diện tích pic theo nồng độ zearalenon, tính bằng microgam trên mililit. Hệ số tương quan phải ³ 0,999 và độ tin cậy 95% của giá trị chắn y phải gồm cả zero (bằng phép phân tích phần còn lại). 8.4.3.2 Bơm 100 m l dung dịch thử. Bơm năm dung dịch chuẩn HPLC (4.17) ở cuối dãy phép phân tích dung dịch thử và tính giá trị trung bình diện tích pic thu được từ 8.4.3.1 để dựng đường chuẩn. Xếp mỗi nhóm từ năm đến tám lần bơm dung dịch thử nghiệm với một lần bơm 100 m l dung dịch chuẩn, để kiểm tra độ dội. Pha loãng dung dịch thử nếu diện tích pic nằm ngoài phạm vi đường chuẩn. 8.4.3.3 Nếu nồng độ khối lượng của zearalenon trong mẫu thử vượt quá 3 mg/kg, để đảm bảo rằng IAC không bị quá tải, thì pha loãng dịch chiết (8.2) 10 lần bằng dung môi chiết (4.5), rồi lặp lại qui trình quy định trong 8.3. 8.4.3.4 Có thể khẳng định các mẫu dương tính nghi ngờ sử dụng bước sóng phát xạ 236 nm (quan sát được độ nhạy tăng lên) hoặc dùng detector mảng diot. Sử dụng bất kỳ kỹ thuật nào được nêu trong 8.4.3.4.1, 8.4.3.4.2 hoặc 8.4.3.4.3. 8.4.3.4.1 Nếu dùng detector huỳnh quang có đèn derteri, thì sử dụng dung dịch thử 8.3.1.7 hoặc 8.3.2.8. Chỉnh dải detector hoặc tắt dần máy tích phân để thu được pic tương tự như trong 8.4.3.1. Sự đồng nhất của các pic được khẳng định nếu tỷ lệ diện tích pic của dung dịch chuẩn và dung dịch thử ở bước sóng 236 nm và 274 nm không đổi. Đối với diện tích pic của dung dịch chuẩn tương ứng, tỷ lệ diện tích pic của dung dịch mẫu thử phải trong phạm vi 5%. 8.4.3.4.2 Nếu dùng detector huỳnh quang có đèn flash xenon thì việc xác định tỷ lệ pic sử dụng sắc ký pha đảo có thể không khả thi, vì cường độ của đèn quá thấp ở 236 nm. Xác nhận lại nếu áp dụng 8.4.3.4.1 cho detector này; còn nếu không thì sử dụng các điều kiện pha chuẩn (xem Phụ lục A) để khẳng định các mẫu nghi ngờ dương tính. Thực hiện lại 8.3 đối với mẫu thử và mẫu kiểm soát nhưng ở giai đoạn bay hơi (8.3.1.7 hoặc 8.3.2.8), thêm 2,0 ml hỗn hợp chloroform,hexan và propan-2-ol, tỷ lệ thể tích tương ứng là 50+50+3 (A.1.2). Tiến hành theo Điều A.3, dùng cột silica LC (Điều A.2). 8.4.3.4.3 Nếu dùng detector mảng diot thì sử dụng dung dịch thử 8.3.1.7 hoặc 8.3.2.8. Ghi lại phổ (bước sóng từ 200 nm đến 400 nm) của pic tại thời gian lưu zearalenon và so sánh với phổ của dung dịch chuẩn tương tự. Đối với mẫu và dung dịch chuẩn, phải quan sát được ba độ hấp thụ tối đa (236 nm, 274 nm và 316 nm) và cường độ tương đối phải như nhau. Bước sóng hấp thụ tối đa của mẫu phải trong phạm vi ± 2nm của bước sóng hấp thụ tối đa của chất chuẩn. Đối với phổ pic tương tự có giá trị giới hạn > 950 nằm ngoài 1 000 cũng khẳng định sự có mặt của zearalenon. CHÚ THÍCH: Có thể detector mảng diot không đủ nhạy đối với các mức gần giới hạn của phép định lượng. Có thể cần thêm thời gian chạy, để tránh các pic rửa giải chậm và có thể cần điều chỉnh pha động (4.14) để thu được độ chọn lọc thích hợp vì các pic bổ sung có thể xuất hiện cùng với phép xác định UV. 9 Tính kết quả Tính phần khối lượng của mẫu zearalezone, w s , bằng miligam trên kilogam, dùng Công thức (1) hoặc Công thức (2): (1) (2) Trong đó: là nồng độ zearalenon, trong dung dịch thử xác định được từ đường chuẩn, tính bằng microgam trên mililit ( m g/ml); A t là diện tích pic của zearalenon trong dung dịch thử; A st là diện tích pic của zearalenon trong dung dịch chuẩn HPLC (trung bình của dãy chất chuẩn); r st là nồng độ zearalenon trong dung dịch chuẩn HPLC, tính bằng microgam trên mililit ( m g/ml); m là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g); V là thể tích của dịch lọc trong 8.3.1.4 hoặc 8.3.2.5, tính bằng mililit (ml); f d là hệ số pha loãng (bằng 1, trừ khi thể tích cuối cùng khác 2 ml). Báo cáo kết quả đến 3 chữ số có nghĩa. VÍ DỤ A t 65 224 A st 72 578 r st 0,051 0 m g/ml m 50,10 g Thể tích cuối cùng 2,0 ml V (8.3.1.4) 10 ml f d 1 (3) 10 Độ chụm 10.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm Các giá trị độ lặp lại và độ tái lập thu được từ kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm thực hiện năm 2005 được tiến hành theo các Tài liệu tham khảo [6] và [7] (xem Phụ lục B). Việc kiểm tra xác nhận phòng thử nghiệm đơn lẻ cho thấy rằng phương pháp có thể áp dụng cho tất cả các loại thức ăn chăn nuôi và các loại hạt ngũ cốc, bột đậu tương, bột hạt của cây có dầu (cây dải dầu), gluten ngô, các loại bã rượu khô, đậu lăng và củ cải đường. 10.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử nghiệm độc lập, riêng lẻ, được biểu thị theo phần trăm giá trị trung bình xác định được, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại tương đối, r rel , được tính bằng Công thức (4): (4) trong đó CV(r) là hệ số biến thiên lặp lại. 10.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng lẽ, được biểu thị theo phần trăm giá trị trung bình xác định được, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, trên vật liệu giống thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không vượt quá 5% các trường hợp vượt quá giá trị giới hạn tái lập tương đối, R rel , được tính bằng công thức (5): R rel = 2,8 x CV(R) (5) Trong đó CV(R) là hệ số biến thiên tái lập. Tiêu chí về độ lặp lại và độ tái lặp được lấy từ Bảng B.2 cho trong Bảng 2. Bảng 2 - Tiêu chí về độ lặp lại và độ tái lập Thông số Giá trị (%) CV(r), tối đa 12,1 CV(r), giá trị trung bình a 9,25 r rel , tối đa 34,0 r rel , trung bình a 25,9 CV(R), tối đa 19,7 CV (R), giá trị trung bình a 15,4 R rel , tối đa 55,3 R rel , trung bình a 43,1 a Được xác định bằng phép phân tích phương sai. Các nghiên cứu cho thấy rằng độ biến thiên của phép phân tích phụ thuộc vào nồng độ của chất nền và nồng độ của zearalenon. 10.4 Giới hạn của phép định lượng Giới hạn của phép định lượng là 0,05 mg/kg (50 m g/kg). 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm; e) kết quả thử nghiệm thu được và nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được. Phụ lục A (Quy định) Khẳng định bằng cách dùng sắc ký pha chuẩn A.1 Thuốc thử A.1.1 Pha động HPLC Chuẩn bị bằng cách bổ sung các thể tích của diclorometan, hexan, propan-2-ol và axit axetic với tỷ lệ tương ứng 485+484+50+1 rồi trộn đề m A.1.2 Dung môi dùng cho các chất chuẩn HPLC Chuẩn bị bằng cách bổ sung các thể tích của cloroform, hexan và propan-2-ol với tỷ lệ tương ứng 50+50+3 rồi trộn đều. A.1.3 Các dung dịch chuẩn HPLC để khẳng định Chuẩn bị năm dung dịch chuẩn zearalenon có nồng độ nêu trong Bảng A.1 bằng cách pha loãng dung dịch thêm chuẩn (4.16) hoặc dung dịch chuẩn (A.1.3.1) với dung môi (A.1.2). Bảng A.1 - Chuẩn bị các dung dịch chuẩn HPLC Chất chuẩn HPLC Dung dịch chuẩn để pha loãng Thể tích để pha loãng ml Thể tích cuối cùng ml Nồng độ zearalenon m g/ml A.1.3.1 4.16 2,0 50 0,20 A.1.3.2 4.16 1,5 50 0,15 A.1.3.3 4.16 1,0 50 0,10 A.1.3.4 4.16 1,0 100 0,050 A.1.3.5 A.1.3.1 5,0 50 0,020 Bảo quản tất cả các chất chuẩn HPLC trong tủ lạnh. Chuẩn bị chất chuẩn mới sáu tháng một lần. A.2 Cột Ngoài thiết bị HPLC được quy định trong 5.15, thì dùng cột Zorbax SIL 2) 5 m m, dài 250 mm và đường kính 4,6 mm, hoặc loại tương đương. A.3 Phân tích HPLC A.3.1 Các điều kiện vận hành HPLC Pha động xem A.1.1 Tốc độ dòng 1,0 ml/min Thể tích bơm 100 m l Cột bảo vệ silica Bước sóng của detector (dùng cho detector của máy đơn sắc đôi) bước sóng kích thích 236 nm bước sóng phát xạ 440 nm A.3.2 Sự phù hợp của hệ thống Bơm 100 m l dung dịch chuẩn 0,050 m g/ml (A.1.3.4; 100 m l chứa 5,0 ng zearalenon). Cải tiến pha động (bằng cách chỉnh hàm lượng propan-2-ol) để thu được hệ số lưu k ³ 2,0, nếu cần. Bơm hai lần hoặc nhiều hơn dung dịch chuẩn để đảm bảo độ lặp lại của diện tích pic là ~2%. Xác định độ tuyến tính bằng cách bơm 100 m l từng dung dịch chuẩn HPLC (A.1.3). Dựng đồ thị diện tích pic của zearalenon theo khối lượng, tính bằng nanogam. Hệ số tương quan phải ³ 0,999 và độ tin cậy 95% cả giá trị chắn y phải gồm cả zero. A.3.3 Xác định Bơm 100 m l dung dịch thử nghiệm (đã pha loãng theo nồng độ được xác định bằng pha đảo, nếu cần). So sánh mỗi lần bơm hai dung dịch thử nghiệm với lần bơm 100 m l dung dịch chuẩn thích hợp. Sự đồng nhất của các pic được khẳng định nếu tỷ lệ diện tích pic của dung dịch chuẩn và dung dịch thử ở bước sóng 236 nm và 274 nm không đổi. Đối với diện tích pic của dung dịch chuẩn tương ứng, thì tỷ lệ diện tích pic của dung mẫu thử phải trong phạm vi 5 %. Phụ lục B (tham khảo) Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm B.1 Cách tiến hành và các mẫu Một phép thử liên phòng thử nghiệm đã được tổ chức thực hiện theo Tài liệu tham khảo [6] và [7], trong đó chín vật liệu được chọn làm mẫu thử. Mỗi vật liệu từ 2,5 kg đến 5 kg đã được nghiền, dùng máy nghiền Retsch SR3 3) được trang bị sàng cỡ lỗ 1,0 mm (từ 60 % đến 80 % vật liệu nghiền lọt qua sàng cỡ lỗ 0,5 mm). Vật liệu nghiền được trộn vectơ trong 2 h, rồi chia thành 50 g đến 60 g mẫu phòng thử nghiệm, dùng máy chia Retsch rotary PTZ 3) . Độ đồng nhất của mẫu phòng thử nghiệm được kiểm tra xác nhận bằng cách phân tích năm hoặc nhiều hơn mẫu phòng thử nghiệm được chọn ngẫu nhiên. Việc mô tả và các kết quả thử độ đồng nhất đối với từng vật liệu được nêu trong Bảng B.1. Tổng số 20 phòng thử nghiệm từ 13 nước châu Âu, Canada, Mỹ, Nhật và Uruguay được mời tham gia vào phép thử liên phòng thử nghiệm. Việc nghiên cứu đã được tiến hành trong hai giai đoạn: một giai đoạn nghiên cứu phổ biến gồm có phép phân tích, phép khẳng định mẫu thêm chuẩn và hai mẫu bị nhiễm và một giai đoạn nghiên cứu cộng tác gồm có phép phân tích mẫu kép mù. Tổng số 13 phòng thử nghiệm đã được chọn cho nghiên cứu cộng tác trên cơ sở các kết quả từ phép nghiên cứu phổ biến. Trong tổng số 20 mẫu phòng thử nghiệm đã được cung cấp thì chín mẫu trong Bảng B.1 là mẫu mù hai lần, một mẫu ngô trắng mù và một mẫu bột mì trắng mù. Mẫu bột mì trắng được cung cấp để chuẩn bị mẫu kiểm soát. Tất cả các phòng thử nghiệm đã gửi trả lại dữ liệu có thể chấp nhận được trong khoảng thời gian được yêu cầu. Hai phòng thử nghiệm đã có kinh nghiệm về các pic nhiễu trong sắc đồ, nhận biết các chất nhiễm bẩn. Không thể nhận biết được nguồn gây nhiễu, nhưng sự thay đổi pha động hoặc sự thay đổi cột HPLC được đề cập trong báo cáo kết quả. Vì vậy một số dữ liệu từ các phòng thử nghiệm này đã bị loại bỏ trong đánh giá thống kê. Đối với tất cả các phòng thử nghiệm, hai mẫu trắng được báo cáo là "không phát hiện được zearalenon" hoặc ở mức vết (<0,01 mg/kg).="" đối="" với="" hai="" mẫu="" kiểm="" soát="" bột="" mì="" thêm="" chuẩn="" (89="" %="" đến="" 116="" %="" khối="" lượng),="" tất="" cả="" các="" phòng="" thử="" nghiệm="" đã="" báo="" về="" độ="" thu="" hồi="" có="" thể="" chấp="" nhận="" được="" (độ="" thu="" hồi="" trung="" bình="" 102,6%;=""> rel , 6,88 %). Bảng B.1 - Các mẫu Số lượng và loại mẫu Các kết quả thử nghiệm đồng nhất Dung môi rửa IAC n Trung bình cộng s mg/kg % 1. Lúa mạch 5 0,111 6,72 Nước (4.1) 2. Lúa mạch 5 0,161 1,58 Nước (4.1) 3. Ngô 5 0,076 5 6,50 Nước (4.1) 4. Ngô 6 0,120 6,74 Nước (4.1) 5. Ngô 5 0,281 3,66 Nước (4.1) 6. Thức ăn ngô 5 0,142 5,60 Metanol, 30% thể tích (4.7) 7. Bã rượu khô 5 0,279 2,09 Metanol, 30% thể tích (4.7) 8. Thức ăn cho lợn 5 0,115 2,57 Nước (4.1) 9. Bột mì 5 0,202 5,74 Nước (4.1) B.2 Phân tích thống kê các kết quả Các kết quả của phép phân tích mẫu kép mù đã được kiểm tra về dấu hiệu lỗi hệ thống riêng rẽ bằng quy trình mô tả trong Tài liệu tham khảo [6] và [7], dùng phép thử tịnh tiến Cochran và Grubbs, sử dụng chương trình thống kê AOAC năm 2001 đối với Bảng tính phân tích lặp lại mẫu mù. Phép tính về độ lặp lại, r, và độ tái lập R được tiến hành sau khi loại trừ ngoại lệ như đã xác định theo các hướng dẫn. Các giá trị HorRat, tỷ lệ của hệ số biến thiên về độ tái lập với hệ số của độ biến thiên tái lập được dự đoán, đã được tính toán. Các giá trị HorRat từ 0,5 đến 1,5 là các giới hạn chấp nhận được (Tài liệu tham khảo [6] và [7]). Dữ liệu tính được về hiệu năng của phương pháp (độ lặp lại, độ tái lập, các giá trị HorRat) được nêu trong Bảng B.2. Bảng B.2 - Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm Thông số Số mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Lúa mạch Lúa mạch Ngô Ngô Ngô Thức ăn có sữa Bã rượu khô (ngô) Thức ăn cho lợn Bột mì Số lượng các phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ ngoại lệ 13 13 13 13 12 13 12 12 13 Phần khối lượng zearalenon đích, m g/kg 111 161 76,5 120 281 142 279 115 202 Phần khối lượng zearalenon trung bình, m g/kg 115 166 79,6 122 273 134 250 120 189 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , m g/kg 14,0 12,1 9,13 10,2 18,2 13,2 14,6 11,9 18,4 Hệ số biến thiên lặp lại, CV(r), % 12,1 7,28 11,5 8,36 6,67 9,84 5,84 9,92 9,72 Giới hạn lặp lại, r, m g/kg 39,1 33,8 25,6 28,5 51,0 37,0 40,9 33,4 51,5 Giới hạn lặp lại tương đối, r rel của hàm lượng trung bình đã xác định được, % 34,0 20,4 32,2 23,4 18,7 27,6 16,4 27,8 27,2 Độ lệch chuẩn tái lập, s­ R , m g/kg 20,4 22,1 11,9 18,4 37,5 22,3 33,4 23,7 23,6 Hệ số biến thiên tái lập, CV(R), % 17,7 13,3 14,9 15,1 13,8 16,6 13,4 19,7 12,5 Giới hạn tái lập, R, m g/kg 57,1 61,8 33,2 51,6 105 62,4 93,6 66,4 66,1 Giới hạn tái lập tương đối của hàm lượng đã xác định được, R rel , % 49,7 37,2 41,7 42,3 38,5 46,6 37,4 55,3 35,0 Giá trị HorRat 0,80 0,63 0,64 0,69 0,71 0,77 0,68 0,90 0,61 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002), Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu. [2] JOSEPHS, R.D., KRSKA, R., MACDONAL, S., WILON, P., PETTERSSON. H, preparation of a caliabarant as certified reference material for determination of the Fusarium mycotoxin zearaloeone j. AOAC int 2003, 86, p. 50-60. [3] VICAM, Zearala Test TM Instruction manual, p. 31, p.34. Vicam watertown, MA, 1998 [4] KRUGER, S.C., KOHN, B., RAMSEY.CS., PRIOLI, RA. Rapid immunoaffinity-based method for the determination of zearaleone in corn by fluorometry and liquid chromatography . J. AOAC int. 1999, 82, p. 1964-1368 [5] R-BIOPHARM RHONE, EASI-EXTRACT ® ZEARALEONE instructions for use (supplied with the immunoaffinity columns). R-Biopharm Rhone Ltd. Glasgow, 2003. [6] FAZEKAS, B. TAR, A. Determination of zearaleone content in cereals and feedstuff by immunoaffinity column couples with chromatography., J. AOAC int. 2001, 84, p. 1453-1459. [7] AOAC. Collaborative study guidelien. J..AOAC Int., 1995, 78, p 143A-160A. [8] AOAC, Apendix D: Guideline for collaborative study procedure to validate characteristics of a method of analysis. In: Offcial methods analaysis of AOAC international, 17 th edition. Association of Official analyutical chemists. Gaitherburg, MD, 2000 12 p Available (2008-01014) at: http://www.aoac.org/vmeth/manual_part_6.pdf 1) Ví dụ về sản phẩm phù hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu chúng cho kết quả tương đương. 2) Ví dụ về sản phẩm phù hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn này không ấn định phải sử dụng sản phẩm này. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho kết quả tương đương. 3) Ví dụ về sản phẩm phù hợp có bán sẳn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và tiêu chuẩn không ấn định phải sử dụng sản phẩm này.