TCVN6831-2:2010

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6831-2:2010 (ISO 11348-2:2007) về Chất lượng nước - Xác định ảnh hưởng ức chế của mẫu nước đến sự phát quang của vi khuẩn Vibrio fischeri (phép thử vi khuẩn phát quang) - Phần 2: Phương pháp sử dụng vi khuẩn khô - lỏng TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6831-2:2010 ISO 11348-2:2007 CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG) - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN KHÔ-LỎNG Water quality - Determination of the in hibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio f ischeri (Luminescent bacteria test)- Part 2 : Metho d using liquid-dried b a cteria Lời nói đầu TCVN 6831-2:2010 thay thế TCVN 6831-2:2001 (ISO 11348-2:1998). TCVN 6831-2:2010 hoàn toàn tương đương ISO 11348-2:2007. TCVN 6831-2:2010 do Ban kỹ thuật Tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 146 Chất lượng nước biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ tiêu chuẩn TCVN 6831 Chất lượng nước - Xác định ảnh hưởng ức chế của mẫu nước đến sự phát quang của vi khuẩn Vibrio f ischeri (phép thử vi khuẩn phát quang) gồm các tiêu chu ẩ n sau: - TCVN 6831-1:2010 (ISO 11348-1:2007), Phần 1: Phương pháp sử dụng vi khuẩn mới nuôi cấy; - TCVN 6831-2:2010 (ISO 11348-2:2007), Phần 2: Phương pháp sử dụng vi khuẩn khô l ỏ ng; - TCVN 6831-3:2010 (ISO 11348-3:2007), Phần 3: Phương pháp sử dụng vi khuẩn đông kh ô . Lời giới thiệu Phép đo quy định trong bộ TCVN 6831 (ISO 11348) có thể tiến hành sử dụng vi khuẩn mới nuôi cấy, cũng như vi khu ẩ n đông khô hoặc khô lỏ ng. Công việc tiêu chuẩn hóa do DIN Normenausschuss Wasserwesen và ISO/TC 147/SC 5/WG 1 tiến hành đã cho thấy, trong trường hợp đặc biệt, các kỹ thuật khác nhau này có thể cho kết quả khác nhau, đặc biệt khi có mặt kim loại nặng. Độ nhạy thay đổi là do sự khác nhau trong thành phần m ô i trường sử dụng đ ể chuẩn bị vi khuẩn đông khô hoặc khô lỏng. Các môi trường bảo vệ này ảnh hưởng đến t í nh có sẵn sinh học của các chất độc và/hoặc sự phát quang của vi khu ẩ n phát quang. Điều này có nghĩa là nguồn gốc và phương pháp chuẩn bị vi khuẩn cần được xem xét khi biểu thị kết quả. Đôi khi, việc này có thể khó khăn, v ì vi khuẩn đông khô và khô lỏng có thể do các nhà cung cấp khác nhau. Do vậy, việc này có nghĩa là thành phần chi tiết không được biết và do vậy người sử dụng không thể diễn giải được. Vì lý do này, ngoài phép đo độc t í nh dùng vi khuẩn mới nuôi cấy TCVN 6831-1 (ISO 11348-1) và vi khuẩn đông khô TCVN 6831-3 (ISO 11348-3), quy trình dùng vi khuẩn khô lỏng được mô tả trong tiêu chuẩn này, tính năng thực hiện của quy trình có thể do người sử dụng diễn giải trong từng chi tiết. Phòng th í nghiệm chịu trách nhiệm về kết quả có cơ hội để lựa chọn kỹ thuật phù hợp nhất dựa trên các lời khuyên của chuyên gia và thông tin về mẫu nước thử nghiệm . CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG) - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN KHÔ-LỎNG Water quality - Determination of the in hibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio f ischeri (Luminescent bacteria test)- Part 2: Metho d using liquid-dried b a cteria CẢNH BÁO - Người sử dụng tiêu chuẩn này cần phải thành thạo với các thực hành trong phòng thí nghiệm thông thường. Tiêu chuẩn này không đề cập tới mọi vấ n đ ề an toàn liên quan đến người sử dụng. Trách nhiệm của người sử dụng là phải xác lập độ an toàn, bảo đ ả m sức khỏe phù hợp với các quy định của quốc gia. QUAN TRỌNG - Điều chủ y ế u là phép thử theo tiêu chuẩn này cần được tiến hành b ở i những nhân viên đư ợc đào tạo ph ù hợp. 1. Phạm vi áp dụng TCVN 6831:2010 (ISO 11348:2007) quy định ba phương pháp xác định sự ức chế phát quang của vi khuẩn biển Vibrio f ischeri (NRRL B-11177). TCVN 6831-2:2010 (ISO 11348-2) quy định phương pháp sử dụng vi khuẩn khô-lỏng. Tiêu chuẩn này áp dụng cho: - Nước thải; - Dịch chiết và dịch ngâm chiết bằng nước; - Nước sạch (nước mặt và nước ngầm); - Nước mặn và nước lợ; - Dịch rửa giải của trầm t í ch (nước ngọt, nước lợ và nước biển) ; - Nước giếng khoan; - Các chất ô nhiễm đơn, được pha loãng trong nước. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối vớ i các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 7325 (ISO 5814), Chất lượng nư ớ c - Xác định oxy hòa tan - Phương pháp đầu đo điện hóa . ISO 5667-16, Water quality - Sampling - Part 16: Guidance on biotesting of samples (Chất lượng nước - Hướng dẫn th ử sinh học các mẫu). 3. Nguyên tắc Sự ức chế phát quang do cấy vi khuẩn Vibrio f ischeri được xác định bằng cách thử nghiệm theo từng mẻ. Điều đó được thực hiện bằng việc kết hợp các thể tích quy định của mẫu thử hoặc mẫu thử đã pha loãng với huyền phù vi khuẩn phát quang đựng trong ống thử. Chuẩn cứ của phép thử l à sự giảm độ phát quang mẫu thử trong suốt thời gian tiếp xúc, cường độ phát quang trong mẫu sẽ được đo sau thời gian ph ả n ứng là 15 min và 30 min hoặc có thể đo thêm sa u 5 min, tùy chọn, có tính đến hệ số hiệu ch í nh ( ¦ kt ). Ảnh hưởng ức chế của mẫu nước có thể được xác định bằng LID (xem Phụ lục B) hoặc l à các giá trị-EC 20 và/hoặc giá trị-EC 20 thông qua các dãy pha lo ãng (EC là nồng độ ảnh hưởng ). 4. Các chất gây nhiễu Các chất không tan, ít tan hoặc dễ bay hơi hoặc các chất có phản ứng với nước pha loãng hoặc với huyền phù, hoặc làm thay đổi trạng thái của chúng trong quá trình thử, có thể ảnh hưởng đến kết quả hoặc làm giảm độ tái lập của kết quả thử. Trong trường hợp nước quá đục hoặc đậm màu, có thể xảy ra sự mất phát quang do việc hấp thụ ánh sáng hoặc tán xạ ánh sáng gây ra. Sự gây nhiễu này đôi khi có th ể khắc phục được bằng cách xử lý độ đục của mẫu (7.2) hoặc, v í dụ, bằng cách sử dụng cuvet hiệu chính hấp thụ hai ngăn (xem Phụ lục A). V ì sự phát quang sinh học [6] cần đến oxy, nên các mẫu có nhu cầu oxy cao (và/hoặc có nồng độ oxy thấp) có thể sẽ gây ra sự thiếu hụt oxy và mẫu sẽ bị ức chế. Các chất dinh dưỡng dễ phân hủy sinh học trong mẫu có thể làm giảm sự tự ô nhiễm trong việc phát quang sinh học [1] . M ẫ u có pH nằ m ngoài khoảng từ 6,0 đến 8,5 sẽ ảnh hưởng đến sự phát quang của vi khuẩn [6], [7] . Cần phải điều chỉnh pH của mẫu nếu ảnh hưởng độc của pH là không mong muốn. V ì vi khuẩn thử nghiệm Vibr i o f ishcheri là vi khuẩn biển, nên việc thử nghi ệ m các mẫu nước mặn theo quy trình chuẩn thường dẫn đến các hiệu ứng kích t hí ch phát quang sinh học mà có thể che hiệu ứng ứ c chế (xem Phụ lục D). Nồng độ muối trong mẫu ban đầu vượt quá 30 g/l NaCI, hoặc hàm lượng các thành phần khác có độ thẩm thấu tương đương, cùng với lượng muối cần phải th ê m vào khi thử có thể gây ra các hiệu ứng siêu thẩm th ấ u. Để tránh ảnh hưởng này, nồng độ muối cuối cùng có trong mẫu thử sẽ không được vượt quá độ thẩm thấu của dung dịch NaCI là 35 g/l. 5. Thuốc thử và các vật liệu Sử dụng các hóa chất đạt chất lượng tinh khiết phân tích. Dùng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. 5.1. Vi khuẩn thử Sử dụng chủng vi khuẩn phát quang thuộc loại Vibrio fischeri NRRL B- 11177. Huyền phù vi khuẩn được dùng cho các phép đo độc tính được chuẩn bị từ các thuốc th ử khô-lỏng có sẵn ngo ài thị trường. Bảo qu ả n vi khuẩn khô-l ỏ ng ở nhiệt độ ≤ -18 °C và xem xét các khuyến nghị của nhà cung cấp. Vi khuẩn bắt đ ầ u phát triển ngay sau khi khôi phục và sẵn sàng để sử dụng cho phép thử. 5.2. Dung dịch natri clorua , làm chất pha loãng Hoà tan 20 g natri clorua (NaCI) trong nước và thêm nước đến 1 lít. 5.3. Dung dịch natri hydroxit , ví dụ c (NaOH) = ví dụ 1 mol/l 5.4. Axit clohydric , ví dụ c (HCI) = ví dụ 1 mol/l. Để điều chỉnh pH có th ể cần sử dụng các axit hoặc các bazơ nồng độ th ấ p hơn hoặc cao hơn. 5.5. Dung dịch dùng cho vi khuẩn khô-l ỏ ng 8,0 g D(+)- Glucoza ngậm nước (C 6 H 12 O 6 . H 2 O) 20,0 g Natri clorua (NaCI) 2,035 g Magie clorua ngậm sáu nước (MgCI 2 .6H 2 O) 0 , 30 g Kali clorua (KCI) 11,9 g N- (2- Hydroxyetyl) piperazin- N - (2- axit etanesun fo nic) (HEPES) H ò a tan các thành phần trên trong nước, khuấy đều trong 30 min và điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 b ằ ng dung dịch natri hydroxit (5.3) hoặc bằng axit clohydric (5.4) . Th ê m nước đến 1 lít Dung dịch này có thể bảo qu ả n từng phần và ở nhiệt độ -18 °C tới - 20 °C. 5.6. Ch ấ t chuẩn Chuẩn bị riêng rẽ các dung dịch chuẩn gốc, pha lo ã ng bằng dung d ịch natri clorua (5.2) mà không cần điều chỉnh pH: 219,8 mg/l Kẽm sunfat ngậm bảy nước (ZnS O 4 .7H 2 O) 9 mg/l 3,5-dichlorophenol (C 6 H 4 OC l 2 ) (Độ tinh khiết ≥ 99 %) 22,6 mg/l Kali dicromat (K 2 Cr 2 O 7 ) Các nồng độ này xấp x ỉ gấp hai lần giá trị EC 50 mong đợi đối với các chất chuẩn tương ứng trong tiêu chuẩn này. Thể tích yêu cầu phụ thuộc vào yêu cầu thử nghiệm. CHÚ TH Í CH Có th ể sử dụng các dung dịch c ó sẵn ngoài thị trường c ó nồng độ ZnS O 4 và K 2 Cr 2 O 7 (titrisol) xác định để chuẩn bị dung dịch gốc của các chất chuẩn. 6. Thiết bị, dụng cụ 6.1. Tủ lạnh sâu , để bảo quản các vi khuẩn cần bảo qu ả n. 6.2. Hộp kiểm soát nhiệt độ , để duy trì mẫu thử ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C. Trong mỗi lần thử nghiệm nhiệt độ ch ỉ được d ao động tối đa ± 0,3 °C. 6.3. Máy đo độ phát quang , ngăn đo đ o được duy tr ì ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C , có trang bị các cuvet phù hợp . 6.4. Cuvet th ử , l à m bằng chất liệu trơ về hóa học , thích hợp đ ể sử dụng với ngăn đo độ phát quang đã chọn và có dung tích tạo thuận lợi để đọc hết bề mặt lớn nhất có th ể và phù hợp với hộp kiểm soát nhiệt độ(6.2) 6.6. Đ ồ ng hồ tính giờ. 6.7. Pipet pittông hoặc bơm tiêm nhựa , 100 m l, 500 m l và 1 000 m l. 6.8. Pipet pitt ô ng , có dung tích có thể thay đổi , từ 10 ml đến 200 ml và 200 m l đến 5 000 m l. 6.9. B ể điều nhiệt , có khả năng duy trì nhiệt độ ở 20 °C ± 2 °C. 6.10. Nồi cách thủy hoặc hộp ổn định nhiệt, để duy tr ì dung dịch có thể t í ch 12 ml được chuẩn bị trong 5.5 (ví dụ b ì nh thuốc thử) í t nhất ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C 6.11. Máy đo độ d ẫ n. 6.12. Đầu đo oxy , Theo TCVN 7325 (ISO 5814). 7. Lấy mẫu và xử lý sơ bộ mẫu 7.1. Lấy m ẫ u M ẫ u phải được đ ự ng trong các vật chứa sạch, trơ về hóa học như quy định trong ISO 5667-16 . Nạp đầy m ẫ u vào vật chứa và gắn k í n. Thử nghiệm mẫu càng sớm càng tốt ngay sau khi l ấ y mẫu. Nếu cần , b ả o quản mẫu ở nhiệt độ từ 2 °C đến 5 °C trong vật chứa ở nơi tối không quá 48 h. Nếu phải bảo quản mẫu đến hai tháng th ì để mẫu ở nhiệt độ ≤ -18 °C. Không được sử dụng hóa chất để bảo quản mẫu. Cần ch ỉ nh-pH v à th ê m muối trước khi thử . 7.2. Chuẩn bị mẫu Đo nồng độ oxy trong tất cả các mẫu. Nồng độ oxy cần phải > 3 mg/l đối với thử nghiệm này . Nếu nồng độ oxy của mẫu chưa pha loãng nhỏ hơn 3 mg/l, thì phải sử dụng phương pháp làm đ ủ oxy cho mẫu, ví dụ sục khí hoặc khuấy. Đo pH của tất cả các mẫu. Nếu pH n ằ m trong khoảng 6,0 đến 8,5 thì không cần phải điều chỉnh. Tuy nhiên, việc ch ỉ nh giá trị-pH có thể làm biến đổi bản chất của mẫu. Mặt khác , pH của mẫu và pH của mẻ thử có thể khác nhau do khả năng đệm của môi trường thử. Có thể cần phải thực hiện thử nghiệm trên cả hai mẫu: mẫu đã điều ch ỉ nh pH và mẫu chưa điều ch ỉ nh-pH. Nếu cần, điều chỉnh-pH của mẫu bằng cách thêm axit clohydric (5.4) hoặc dung dịch natri hydroxit (5.3). Tùy thuộc vào mục đích của phép thử có thể điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 hoặc giới hạn trên (8,5 ± 0,2) và giới hạn dưới (6,0 ± 0,2). Lựa chọn nồng độ của axit clohydric hoặc dung dịch natri hydroxit sao cho thể tích thêm vào không lớn hơn 5 % t ổ ng thể tích. Cho thêm 20 g natri clorua tr ê n lít vào mẫu nước hoặc vào mẫu nước đã trung hòa . Đối với mẫu có nồng độ muối cao th ì đo độ muối và nếu cần thêm lượng muối để điều chỉnh độ thẩm th ấ u tới NaCI 20 g/l. Nếu mẫu chứa từ 20 g/l đến 50 g/l NaCI tương đương, không cần thêm muối. Nồng độ muối tạo nên trong mẫu thử không được vượt quá độ thẩm thấu 35 g/l dung d ịch natri clorua Phụ lục D cung cấp thêm các thông tin đối với những mẫu nước mặn Các mẫu quá đục cần đục để lắng trong 1 h hoặc cho ly tâm, ví dụ trong 10 min ở 5000 g hoặc lọc. Sử dụng chất nổi hoặc cái lọc cho phép thử. 8. Cách tiến hành Chuẩn bị các mẫu chuẩn theo 5.6. Thử mỗi mẻ vi khuẩn sau khi tiến hành với cả ba mẫu chuẩn. Thử í t nhất một trong ba mẫu chuẩn song song với mỗi cuvet dung dịch huyền phù gốc đã hoàn nguyên cho mỗi phép thử. Chuẩn bị mẫu theo 7.2. Làm tan bằng vi khuẩn khô-lỏng (huyền phù gốc) trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 20 °C ± 2 °C. Các huyền phù gốc đã làm lạnh có thể ch ỉ sử dụng cho thử nghiệm ban đầu. Chuẩn bị huyền phù thử từ huyền phù gốc theo hai bước: - Thêm 0,5ml dung dịch (5.5) (cho từng 100 m l huyền phù gốc vào cuvet thử), duy tr ì ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C và làm đồng nhất bằng cách lắc nhẹ cuvet thử. - Chờ khoảng 15 min. Dùng pipet hút dung dịch huyền phù này rồi cho vào bình định mức (dung tích khoảng 20 ml) và thêm 11,5 ml dung dịch (5.5), duy trì ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C, và làm đồng nhất bằng cách lắc nhẹ b ì nh thuốc thử. Chờ khoảng 15 min. Chuẩn bị v à o một bộ cuvet thử đầu tiên (6 . 4) dãy dung dịch pha loãng mẫu, mẫu chuẩn (5.6) và mẫu kiểm tra (5.2) yêu cầu. Quy trình thông thường để chuẩn bị dãy pha loãng được mô tả trong Phụ lục B. Tùy thuộc v à o mục đích của thử nghiệm và các yêu cầu thống kê liên quan đến kết quả phép thử, các thiết kế d ã y pha lo ã ng có nồng độ dãy hình học hoặc logarit có thể cũng phù hợp. V ì hỗn hợp các thể tích bằng nhau của mẫu/mẫu đã pha loãng và huyền phù thử nghiệm, nên nồng độ mẫu cao nhất trong phép thử chiếm 50% mẫu thử như là một qu y luật. Đối với phép thử m ẫ u nước gần như không pha loãng (80 % mẫu), thì cần thêm mẻ kiểm tra (xem B.2 và Bảng 1). Duy trì các cuvet thử có chứa dung dịch natri clorua (5.2) đ ể ki ể m soát, mẫu chuẩn (5.6), mẫu (7.2) v à các mẫu của dãy pha lo ã ng (Bảng B.1) ở 15 °C ± 1 °C. Chọn điều kiện th ử nghiệm đảm bảo độ lệch nhiệt độ tối đa trong bể điều nhiệt trong một phép thử là không quá ± 0,3 °C. Đối với các phép thử có thể tích huyền phù cần thử và mẫu thử b ằ ng nhau, dùng pipet hút vào ống đo thứ hai, tương ứng với cuvet thử (6.4) 500 m l huyền phù cần thử, duy trì ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C trong tủ ấm, trong các khoảng th ời gian bằng nhau (từ 5 s đến 20 s) như đối với các phép đo cường độ sau này. Tiến hành phép xác định song song đối với mỗi mức pha loãng ở nhiệt độ thử 15 °C ± 1 °C. Điều ch ỉ nh dụng cụ đo huỳnh quang sao cho thuận tiện và gần với mức cực đại. Xác định và ghi cường độ phát quang, I 0 , của các huyền phù thử bằng máy đo phát quang. V ì thời gian tiếp xúc đối với tất c ả các mẫu phải bằng nhau, nên sử dụng đồng hồ tính giờ (6.6) để đo cường độ phát quang ở các khoảng thời gian đo bằng nhau. Khoảng thời gian đo thích hợp là 5 s đến 20 s. Đo tất cả các huyền phù thử, b ở i vì độ phát quang có thể khác nhau do huyền phù thử kh ô ng được đồng nhất. Ngay sau khi đo độ phát quang của huyền phù thử ban đầu, làm đầy huyền phù thử này tới 1 ml bằng mẫu (7.2), mẫu đã pha loãng (Phụ lục B), mẫu chuẩn (5.6) hoặc dung dịch natri clorua (5.2), nếu th í ch hợp. Việc này được thực hiện bằng cách dùng pipet lấy 500 m l mỗi dung dịch mẫu (7.2), mẫu đã pha loãng (Phụ lục B), mẫu chuẩn (5.6) hoặc dung dịch natri clorua (5.2), đã được chuẩn bị trong d ã y cuvet thử thứ nhất, cho vào huyền phù thử cần thử trong mỗi cuvet thử của dãy ống đo thứ hai tương ứng. Trộn đều bằng tay , bắt đầu bấm giờ v à đặt các ống nghiệm trở lại hộp ổn nhiệt tại nhiệt độ 15 °C ± 1 °C. Lặp lại với tất c ả các cuvet thử khác, để cùng khoảng thời gian giữa những lần thêm vào. Đo và ghi cường độ phát quang trong tất cả các cuvet , kể cả mẫu kiểm soát, cứ sau 15min và sau 30min ( I 15 , I 30 ) , có thể đo sau 5 min ( I 5 ), tùy chọn, để khoảng thời gian đo từ 5 s đến 20 s. Ghi lại sự điều ch ỉ nh dụng cụ. 9. Đánh giá 9.1. Ảnh hưởng ức chế lên vi khuẩn phát quang Sử dụng Công thức (1) để tính hệ số hiệu chính (giá trị ¦ kt ) từ cường độ phát quang đo được. Hệ số này dùng để hiệu chính giá trị ban đầu I 0 của tất cả các mẫu thử trước khi chúng được dùng làm giá trị chuẩn để xác định độ giảm phát quang do nước. ¦ kt = I kt / I 0 ( t = 5 min, 15 min, 30 min) (1) Trong đó ¦ kt là hệ số hiệu chính đối với thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min, 30 min; I kt là cường độ phát quang trong mẫu kiểm tra sau thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min hoặc 30 min, tính bằng đơn vị phát quang tương ứng; I 0 là cường độ phát quang của huyền phù thử kiểm tra ngay trước khi cho th ê m chất pha loãng (5.2), t í nh bằng đơn vị phát quang tương ứng; Tính hệ số hiệu chính trung b ì nh và độ lệch của các giá trị riêng từ giá trị trung b ì nh tính bằng phần trăm, (lấy một chữ số có nghĩa): (2) Trong đó: ¦ kti là giá trị riêng của một trong hai hệ số hiệu chính và là giá trị trung b ì nh. Dùng Công thức (3) để tính I ct : I ct = I 0 x (3) Trong đó là giá trị trung b ì nh của ¦ kti ; I 0 là cường độ phát quang của huyền phù mẫu thử , ngay trước khi thêm vào mẫu (7.2) hoặc mẫu đ ã pha lo ã ng (Phụ lục B), t í nh bằng đơn vị phát quang tương ứng; I ct là giá trị đ ã hiệu ch í nh của I 0 đối với các cuvet đựng mẫu thử ngay trước khi cho mẫu thử vào. Dùng công thức (4) để tính ảnh hưởng ức chế của mẫu thử: H t = [( I ct - I t ) / I ct x 100] (4) Trong đó H t là ảnh hưởng ứ c chế của mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min hoặc 30 min, t í nh bằng phần trăm; I ct xem Công thức (3); I t là cường độ phát quang của mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min hoặc 30 min, tính bằng đơn vị phát quang tương ứng. Tính giá trị trung b ìn h của ảnh hưởng ức chế H t cho mỗi mức pha loãng, t í nh bằng phần trăm. T í nh chênh lệch số học của phép xác định song song của H ti từ trung bình tương ứng , tính b ằ ng điểm phần trăm (một chữ số c ó nghĩa): (%) - H ti (%) Trong đó: H ti là một trong hai giá trị hiệu ứng ức chế của mẫu thử là giá trị trung bình. 9.2. Xác định các giá trị-EC T í nh toán mối tương quan ảnh hư ở ng của nồng độ đối với từng thời gian tiếp xúc sử dụng tuyến tính chuẩn thích hợp hoặc ph â n tích hồi qui phi tuyến t í nh [8] . Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ sử dụng kỹ thuật hồi quy tuyến t í nh, ước lượng giá trị gamma cho từng mức pha loãng (tỷ lệ của độ giảm phát quang với tổng lượng ánh sáng còn lại tại thời điểm t ) sử dụng Công thức (5): G t = [ / (100 - )] (5) Trong đó G t là giá trị gamma của mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 5 min , 15 min hoặc 30 min; là giá trị trung b ì nh của H t xem Công th ứ c (4). CH Ú THÍCH Khi một nồng độ thử nh ấ t định cho 0 % hoặc 100 % độ ức ch ế phát quang sinh học , thì không thể tí nh được giá trị gamma . Do đó , ch ỉ c ó những gi á trị H t nằm trong khoảng 10 % v à 90 % được dùng để t í nh tương quan của nồng độ Mối tương quan về ảnh hưởng nồng độ tại thời điểm tiếp xúc đã cho thường có thể được mô tả bằng phương trình tuyến t í nh sau: lg c t = b LG G t + lg a (6) Trong đó c t là phần mẫu nước có trong mẫu thử , tính bằng phần tr ă m; G t xem Công thức (5); b là giá trị của độ dốc của đường tuyến tính; lg a là giá trị của phần bị chắn/giao cắt của đường tuyến tính. Bằng phương pháp thống kê hồi qui bình phương tối thiểu chuẩn, tính các giá trị EC 20 và EC 50 với các giới hạn tin cậy tương ứng, trong đó: c t = EC 20,t ở G t = 0,25; c t = EC 50,t ở G t = 1,00. Đối với ph â n tích hồi qui phi tuyến t í nh, các mô hình khác nhau có sẵn trong phần mềm đồ h ọ a chuẩn hoặc phần mềm thống kê. Các phần mềm này được dựa trên hàm phân bố chuẩn (nghĩa là ph â n tích Probit) , phân bố logistic (nghĩa là phân tích Logit), hoặc phân bố W eibull (nghĩa là phân tích Weibull). Ảnh hưởng ức chế đã tính ( H t ) có thể được dùng trực tiếp để ước lượng thông số ảnh hưởng nồng độ phi tuyến tính, từ đó, giá trị EC đối với từng mức có thể tính được tiếp sau [8] . Nếu khoảng của cặp giá trị không khớp v ớ i đường cong, thì các gi á trị EC có thể được ước lượng theo h ì nh học sử dụng hệ thống tọa độ logarit kép. 10. Biểu thị kết quả Báo cáo kết quả theo mẫu trong Bảng 1. Báo cáo khoảng thời gian thử (5 min, 15 min hoặc 30 min). Nếu xác định được, báo cáo giá trị LID lb , (xem trong Phụ lục B). Nếu xác định được, báo cáo giá trị EC 20 và EC 50 và phương pháp để t í nh độ lệch của các giá trị này. Báo cáo cách chuẩn bị vi khuẩn đã sử dụng. Bảng 1 - Ví dụ v ề đánh giá thử nghiệm - M ẫ u: nước thải sau xử lý của trạm xử lý nước thải Thí nghiệm đối chứng Số mẻ kiểm tra Mức pha lo ã ng D Giá trị đ o được I k30 / I 0 Thí nghiệm tính đúng đắn Độ lệch từ giá trị trung bình , t í nh b ằ ng % b I 0 I k30 1 2 1 a 93 91 76 74 0,8172 0,8132 0,8152 ± 0 , 3 3 4 ≥ 2 92 95 79 80 0 , 8587 0 , 8421 0 , 8504 ± 1 , 0 Thí nghiệm thử Số mẻ thử Mức pha lo ã ng D Giá trị đo được I c 30 H 30 % % Th í nghiệm t í nh đúng đ ắ n. Độ lệch so với giá trị trung bì nh, tính b ằ ng % c G 30 I 0 I k30 1 2 1 92 93 25 27 75,0 75 , 8 66 , 7 64,4 65,53 ± 1 , 1 1 , 901 3 4 2 86 90 43 43 73,1 76 , 5 41,2 43 , 8 42,51 ± 1 , 3 0 , 740 5 6 3 91 89 60 58 77,4 75 , 7 22 , 5 23 , 4 22,92 ± 0 , 5 0 , 297 7 8 4 95 94 72 70 80 , 8 79 , 9 12,4 10,9 11 , 65 ± 0 , 8 0,132 Chất chuẩn 9 3,4 mg/l DCP, hoặc 2,2 mg/l Zn, hoặc 18,7 mg/l Cr 91 32 77 , 4 58,7 57,85 ± 0 , 9 1,372 10 93 34 79,1 57,0 a Xem Phụ lục B. b Đối với mẻ ki ể m tra, độ lệch so với giá trị trung b ì nh được t í nh bằng chênh lệch số học của các lần x á c định song song so với giá trị trung b ì nh của chúng, tính bằng phần trăm [Công thức (2) trong 9.1 ]. c Đối với mẻ thử , độ lệch của giá trị H 30 (tính b ằ ng phần trăm) của các l ầ n xác định song song so với giá trị trung bình của chúng được tính như chênh lệch số học của từng gi á trị H 30 (t í nh b ằn g phần tr ă m) so với gi á trị trung b ì nh (t í nh bằng phần trăm) (được gọi là điểm phần trăm) . Giá trị LID trong ví dụ này LID lb = 4 Giá trị -EC 20 trong v í dụ này = 31,9 %, Gi á trị-EC 50 = 58,8 % (thống kê b ì nh phương tối thiểu chuẩn). 11. Chuẩn cứ về tính đúng đắn của phép thử Phép thử được coi là đúng nếu - Giá trị khi ủ trong 15 min hoặc 30 min nằm trong phạm vi từ 0,6 đến 1,3; - Kết quả của các phép xác định song song không chênh lệch so với giá trị trung bình của chúng quá 3 % đối với các mẫu kiểm tra; - Đối với các mẫu thử mà xác định giá trị-LID lb hoặc giá trị EC 20 /EC 50 tương ứng, độ lệch so với giá trị trung bình của chúng “điểm phần trăm” không quá 3 % (xem Chú thích c trong B ả ng 1). - Đối với m ẻ vi khuẩn đã làm tan, cả ba chất chuẩn (5.6) (các dung dịch không được trung hòa, kiểm tra riêng rẽ) g â y ức chế từ 20 % đến 80 % sau thời gian tiếp xúc 30 min ở các nồng độ sau trong huyền phù thử cuối cùng: 4,5 mg/l 3,5-diclorophenol 25 mg/l Zn(ll) (tương đương 109,9 mg/l kẽm sun f at ngậm b ẩ y nước) 4 mg/l Cr(VI) (tương đương 11,3 mg/l kali dicromat) - Một trong ba mẫu chuẩn (5.6) (các dung dịch không được trung hòa), được thử trong phép thử song song từng ống thử dung dịch huyền phù gốc đã rã đông cho phép thử thực sự (xem Điều 8) gây ra ức chế 20 % đến 80 % sau thời tiếp xúc 30 min. 12. Độ chính xác Trong chương trình thử nghiệm liên phòng cấp quốc gia có 22 phòng t hí nghiệm tham gia, được tiến hành trong suốt mùa thu năm 1991 đã xác định các số liệu về độ chính xác. Các kết quả được tóm tắt trong Phụ lục C. 13. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải viện dẫn tiêu chuẩn này TCVN 6831-2:2010 (ISO 11348-2). Tài liệu cần phải bao gồm các thông tin sau: a) Nhận dạng mẫu nước, kể c ả việc lấy mẫu, thời gian lưu giữ và điều kiện bảo quản; b) pH và nồng độ oxy của mẫu nước gốc, tính bằng mg/l hoặc % sự bão hòa; c) Ngày thử nghiệm; d ) Phương pháp xử lý sơ bộ mẫu, nếu cần, ví dụ pH sau khi hiệu ch í nh; e) Nguồn gốc vi khuẩn, số m ẻ ; ngày bắt đầu và kết thúc; f) Nhiệt độ bảo quản vi khuẩn; g) Biểu thị kết quả theo Điều 10 và B ả ng 1 ; h) Mọi sai lệch so với phương pháp này và thông tin về các t ì nh huống c ó thể ảnh hưởng đến kết quả; i) Kết quả thử so với các chất chuẩn đối với mẻ vi khuẩn và phép thử thực tế. Phụ lục A (tham khảo) Phương pháp hiệu chính màu A.1. Phạm vi áp dụng Việc gi ả m độ phát quang do hấp thụ ánh sáng có thể xảy ra khi mẫu trong các dãy pha lo ã ng quan sát thấy rõ màu, đặc biệt những m à u từ đỏ đến nâu. Nếu quan sát thấy màu ở n ồ ng độ EC 20 , th ì nên thực hiện quy trình sau đây để kiểm tra nếu cần phải hiệu chính màu. Trong mọi trường hợp, khi nồng độ của mẫu thử gần với giá trị-EC 50 th ì nên hiệu chính màu. A. 2 . Dụng cụ bổ sung A. 2.1 . Cuvet hiệu chính-màu: cuvet-hai lớp, lắp vừa với máy đo độ phát quang. A. 2.2 . Pipet Pasteur. A. 3 . Cách tiến hành Thực hiện to à n bộ quy trình hiệu chính màu ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C trong t ủ ủ kiểm soát được nhiệt độ . Chuẩn bị một dung dịch pha loãng mẫu thử (5.2) có nồng độ gần giá trị EC 20, t ( C k ). Nếu giá tr ị -EC 20 t chênh lệch nhiều thì C k phải gần với giá trị EC 20 ,t thấp hơn. CHÚ TH Í CH - Không cần phải chọn C k khác nhau cho mỗi khoảng thời gian tiếp xúc (5 min , 15 min, 30 min). Cho 2,0 ml dung dịch natri clorua 2 % (5.2) vào khoang ngoài của ống hiệu chính-màu. Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn đặc biệt. Với vi khuẩn khô-l ỏ ng, thì dùng 1,0 ml huyền phù vi khuẩn gốc. Trộn kỹ huyền phù trước khi dùng pipet Paster để chuyển vào khoang trong của ống hiệu chính m à u . Thêm huyền ph ù cho bằng với mức dung dịch có trong khoang ngoài của cuvet hiệu chính màu. Đo mức ánh sáng ( B 0 ) sau ít nhất 15 min , và bật đồng hồ bấm giờ . Từ thời điểm n à y t rở đi, vị trí của cuvet hiệu chính màu trong khoảng đo phải được giữ nguyên cho tất cả các số đ ọc . Dùng pipet lấy hết dung dịch natri clorua từ khoang ngoài và thay vào đó bằng 2,0 ml mẫu thử đã pha loãng (Phụ lục B) v à làm lạnh trước đến 15 °C ± 1 °C. Đo mức ánh sáng ( I 5 )5 min sau lần đo đầu. Dùng pipet lấy hết mẫu thử đã pha lo ã ng từ khoang ngoài và thay vào đó bằng 2,0 ml dung d ịch natri clorua. Đo mức ánh sáng ( B 10 ) 1 0 min sau lần đo đầu. CHÚ THÍCH 2 Quy trình này có th ể đơn giản hóa b ằ ng cách dùng hai ố ng hiệu chính màu giống hệt nhau. Khoang ngoài của ống thứ nh ấ t chứa đầy nước, khoang ngo à i của cuvet thứ hai chứa đầy m ẫ u đã pha lo ã ng. Sau 15 min , có th ể đo m ứ c ánh sáng B 0 và I 0 . Những giá trị này khi đ ó có thể thay cho những giá trị B 5 và I 5 để tính toán trong A.4. A. 4 . Tính toán kết quả Các tính toán thừa nhận rằng cường độ màu của mẫu phù hợp với định luật Beer-Lambert , đó là trường hợp thông thường. Tí nh B 5 theo Công thức (A. 1): (A.1) T í nh độ hấp thụ ( A t ) của nồng độ EC 20 ,t chưa hiệu chính với thời điểm tiếp xúc ( t ) theo công thức (A.2): (A.2) Trong đó C k là nồng độ của mẫu hoặc của hóa chất có trong nồng độ thử (m à u); k l à hằng số hệ thống thu được theo thực nghiệm. là độ hấp thụ của dịch pha loãng cần thử trong cuvet hiệu chính màu. Tính độ truyền qua tương ứng ( T t ) theo Công thức (A.3): (A.3) Tính những giá trị gamma đ ã hiệu chính ( G c ) theo Công thức (A.4): c G t = (5T t ) - 4 (A.4) Và theo Công thức (A.5): G c = c G t x G 0 (A.5) Trong đó c G t là h ệ số hiệu chính cho giá trị gamma ở thời điểm tiếp xúc đã định ( t ) ; G 0 là giá trị gamma gốc. Tiến hành t í nh lai kết quả thử với giá trị đ ã được hiệu chính. Với thời gian tiếp xúc đ ã định, có thể tính được độ hấp thụ ( A t ) và độ truyền qua ( T t ) đối với mỗi nồng độ thử, và từ đó tính được giá trị gamma chưa hiệu chính theo Công thức (A.6): G c = T t (1 + G 0 ) - 1 (A.6) Hệ số hiệu chính là giống nhau đối với mỗi giá trị gamma, khi thừa nhận độ dốc của đồ thị gốc l à đúng. Do đó, điều này đ ủ để t í nh hệ số hiệu chính chỉ đối với một giá trị gamma. Trong phép xác định này, áp dụng giá trị gamma tương ứng với nồng độ EC 20,t chưa hiệu chính ( G = 0,25). Công thức (A.7) tính hệ số hiệu chính được rút gọn như sau: (A.7) Trong đó T t l à giá trị phát quang sinh học đo được ở thời điểm tiếp xúc đã định ( t ) ; c G t là hệ số hiệu chính cho các giá trị gamma ở thời điểm tiếp xúc đã định ( t ); G 0 là giá trị gamma gốc; G c l à giá trị gamma đ ã được hiệu chính. A.5 . Ví dụ Bảng A.1 - Ví dụ S ố liệu hiệu chính màu C k = 10,0 % phần th ể tích B 5 = 81 I 0 = 78 k = 3 , 1 T í nh hiệu chính màu C = phần th ể tích 5 min 15 min 30 min c G 5 = 0 , 708 C G 15 = 0,670 c G 30 = 0,657 I 0 I 5 G 0 G c I 15 G 0 G c I 30 G 0 G c Mẫu trắng 100 90 80 70 5,625 98 82 0,076 0,054 74 0,059 0,040 65 0,055 0,036 11,250 94 63 0,343 0,243 60 0,253 0,170 53 0,242 0,159 22,500 96 45 0,920 0,651 42 0,829 0,556 38 0,768 0,505 45,000 97 15 4,820 3,412 17 3,565 2,389 17 2,994 1,967 Công thức gốc: ln G = 1,96 x In C - 5 , 96 ln G = 1,95 x In C - 6,16 ln G = 1,90 x In C - 6,12 Công thức đ ã hiệu chính: In G = 1,96 x In C - 6,30 ln G = 1,95 x In C - 6,56 ln G = 1,90 x In C - 6,53 EC 20 ,t gốc 10,3 11,6 12,1 EC 20 ,t đã hiệu chính 12,3 14,3 15,1 Phụ lục B (tham khảo) Mức pha loãng D - Chuẩn bị các dãy pha loãng B. 1 . Nguyên tắc Khi thử nước thải b ằ ng cách pha loãng dần (D) mẻ thử có nồng độ đậm đặc nhất mà ở nồng độ này không có ức chế, hoặc ch ỉ có í t ảnh hưởng ứ c chế mà không vượt quá độ biến đổi đặc trưng thử nghiệm, được gọi l à “ Độ pha loãng không ảnh hưởng thấp nhất (LID)”. Độ pha lo ã ng này được biểu thị bằng giá tr ị nghịch đảo của phần thể tích nước thải trong mẻ thử [ví dụ , nếu hàm lượng nước th ả i là 1 trong 4 (25 % phần thể tích) th ì mức pha loãng là D = 4]. Trong phép thử vi khuẩn phát quang, thường trộn các thể tích huyền phù thử đúng bằng với thể tích của mẫu nước hoặc thể tích của mẫu đã pha loãng. Do đó, các mức pha loãng trong các dãy pha loãng theo thông lệ là D ≥ 2 (nồng độ mẫu cao nhất trong phép th ử : 50 % mẫu). B. 2 . Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu theo 7.2 Mẫu nước thải phải làm đồng nhất bằng cách lắc bằng tay hoặc trộn bằng khuấy từ . Thêm 20 g dung dịch natri clorua vào mỗi lít mẫu nước hoặc mẫu nước đã điều chỉnh-pH. Đối với mẫu nước có nồng độ muối cao, đo độ muối và tính lượng NaCI (nếu cần) cần để điều chỉnh độ thẩm thấu. Nồng độ muối thu được trong mẫu thử không được vượt quá độ thẩm thấu của dung dịch natri clorua 35 g/ l . Chuẩn bị dãy pha loãng trong dãy cuvet thử thứ nhất. Nên dùng dãy pha loãng theo Bảng B.1. Dãy pha loãng được chuẩn bị bằng cách pha loãng dần và kết hợp hai pha loãng h ì nh học (D = 2, 4, 8, 16,... và D = 3, 6, 12, 24,...). Đối với các phép xác định song song, thể tích mẫu hoặc mẫu đã pha loãng hoặc mẫu kiểm tra bằng 1 500 m l là đủ. Bảng B.1 - Chuẩn bị dãy pha loãng Mức pha loãng D Thành ph ầ n của dãy pha lo ã ng mẫu (Th ể tích tổng của phép xác định song song: 1 500 m l) M ẫ u nước (7.2) m l Nước pha lo ã ng (5.2) m l Đối với D = 1 Mẻ ki ể m tra 0 1 500 Mẻ thử 1 1 500 0 Đ ố i với D ≥ 2 Mẻ ki ể m tra 0 1 500 Mẻ thử 2 1 500 0 3 1 000 500 4 750 750 6 500 1 000 8 375 1 125 12 250 1 250 16 187 , 5 1 312 , 5 24 125 1 375 32 93,75 1 406 , 25 Mẻ chuẩn (Nồng độ xem trong 5.6) 1 500 0 Cách dễ nhất để chuẩn bị dãy pha loãng này là tạo hai dung dịch pha loãng gốc trong các ống nghiệm ri ê ng rẽ (xem H ì nh B.1) CHÚ DẪN 1 mẫu a M ẫ u pha lo ã ng để tạo d ã y thử thứ nh ấ t. b Mức pha lo ã ng cuối cùng D sau khi thêm huyền ph ù thử. Hình B.1 - Sơ đ ồ pha loãng Pha loãng 1 trong 1, 3 000 m l mẫu chưa pha loãng (độ pha loãng cuối cùng trong phép thử sau khi trộn với các thể tích bằng nhau huyền phù thử sẽ là 1 trong 2). Pha lo ã ng 2 trong 3, ví dụ 2 000 m l mẫu + 1 000 m l dung dịch 5.2 (độ pha lo ã ng cuối cùng trong phép thử sau khi trộn với các thể tích huyền phù thử bằng nhau sẽ là 1 trong 3). Đối với những chuẩn bị pha loãng hơn nữa, chuyển 1 500 m l mẫu /mẫu đã pha loãng vào 1 500 m l d ung dịch 5.2 trong các ống thử, trộn đều sau từng lần chuyển. Trong phép thử vi khuẩn phát quang, thường 500 m l mẫu nư ớ c hoặc mẫu đã pha loãng được chuẩn b ị trong dãy thử thứ nhất được trộn với 500 m l huyền phù thử (xem Điều 8) được chuẩn bị trong dãy ống thử thứ hai, sau khi đo cường độ ánh sáng ban đầu của huyền phù thử. Do vậy, mức pha loãng thu được D trong mẻ thử đối với phép đo sự ức chế phát quang l à gấp đ ô i độ pha loãng của mẫu hoặc mẫu đã pha loãng. Nếu cần thử mẫu nước gần như chưa pha loãng, có thể thêm 800 m l mẫu nước chưa pha loãng (7.2) vào 200 m l huyền phù thử. Độ pha loãng của mẫu là 1 trong 1,25 (nồng độ mẫu cuối cùng trong phép thử: 80 % mẫu). Giá trị D tương ứng có thể được coi như D = 1. Huyền phù thử đối với D = 1 được chuẩn bị bằng cách thêm 4,5 ml dung dịch (5.5) vào vi khuẩn đã được tạo huyền phù lại , thay cho 11,5ml. Đối với giá trị này, cần có một mẻ kiểm tra thêm để t í nh toán hệ s ố hiệu chính phục vụ cho việc hiệu chính giá trị ban đầu. Mẻ kiểm tra được l à m bằng cách thêm 800 m l dung dịch natri clorua (5.2) vào 200 m l huyền phù thử. B.3. Cách tiến hành Thực hiện phép thử theo Điều 8. Thực hiện phép xác định kép đối với từng mức pha loãng. Xác định v à ghi lại cường độ phát quang trong tất cả các ống th ử, kể cả ống thử kiểm tra, sau 15 min và 30 min( I 30 ), tùy chọn. B. 4 . Đánh giá T í nh giá trị trung bình của ảnh hưởng ức chế đối với từng mức pha loãng, tính bằng phầ n trăm (xem 9.1). T í nh độ lệch của phép xác định song song H 30 so với giá trị trung b ì nh của ch ú ng tương ứng cho phép xác định kép H 30 (%) (trung bình) - H 30 (%) tính bằng điểm phần trăm, (một chữ số c ó nghĩa) và theo phần trăm của trung bình cho kiểm tra. (hệ số hiệu chính, xem 9.1). B.5. Biểu thị kết quả Biểu thị kết quả theo Điều 10 G iá tr ị D thấp nhất được thử tại mức mà hiệu ứng ức chế trung bình là < 20="" %,="" được="" gọi="" là=""> LID lb . B. 6 . Báo cáo thử nghiệm Xem Điều 13. Ngoài các số liệu được yêu cầu trong tiêu chuẩn này, báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin về độ trong của nước thải, điều chỉnh độ muối và phương pháp xử lý sơ bộ (lắng, lọc , ly tâm, sục kh í ). Phụ lục C (tham khảo) Số liệu độ đúng Đối với chương trình thử nghiệm liên phòng, dung dịch chưa trung hòa gồm 3,5-diclorophenol, kẽm sunfat ngậm bảy nước, kali dicromat và xetyltrimethyammonium bromua được pha bằng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. Những giá trị EC được xác định như nêu trong 9.2, và các kết quả được đưa ra trong Bảng C.1. CH Ú THÍCH Do một số phòng th í nghiệm cho kết quả ức chế lớn hơn 20 % ở n ồ ng độ thử th ấ p nhất hoặc kết quả ức chế nh ỏ hơn 50 % ở nồng độ thử cao nhất nên các giá tr ị l đôi khi có sự khác nhau đối với EC 20 v à EC 50 . Bảng C.1 - Số liệu độ chính xác đối với vi khuẩn khô-lỏng l = n n AP % mg/l s R mg/l CV R % 1 3,5-diclorophenol EC 20 EC 50 20 20 4,8 4,8 4,69 7,61 1,03 1,31 22,0 17,2 2 Kẽm sunfat ngậm 7 nước a EC 20 EC 50 19 20 5,0 0,0 15,0 26,3 3,6 6,1 23,8 23,2 3 Kali dicromat a EC 20 EC 50 18 19 0,0 0,5 1,22 3,50 0,5 1,15 46,2 32,8 4 Cetyltrimethylamoni EC 20 EC 50 14 16 0,0 5,9 0,745 1,199 0,416 0,346 55,9 28,9 Các chữ viết tắt trong các bảng C.1 biểu thị: l : Số lượng phòng thí nghiệm tham gia ; n : Số lượng các bộ dữ liệu; n AP : Số lượng ngoại lệ; : Gi á tr ị trung bình; s R : Độ lệch chuẩn của độ tái lập; CV R : Hệ s ố biến thiên của độ tái lập; EC 20 : Nồng độ ảnh hưởng gây ra ức chế ph á t quang 20 %; EC 50 : Nồng độ ảnh hưởng g â y ra ức chế phát quang 50 % a Nồng độ Zn(ll) hoặc Cr(VI) tương ứ ng Phụ lục D (Tham khảo) Thử mẫu nước mặn với phép thử vi khuẩn phát quang dùng vi khuẩn khô-lỏng D.1 . Thông tin chung Sinh vật thử Vibrio f ischeri là vi khuẩn bi ể n. Thử mẫu nước mặn bằng quy trình chuẩn thường d ẫ n tới những ảnh hưởng kích thích mà có thể gây cản tr ở những hiệu ứn g ức ch ế [2] . Sự k í ch thích đó có thể do các ion của kim loại kiềm và kim loại ki ề m thổ [2], [3] . Với những c ả i tiến này của quy trình thử, sự phát quang sinh học trong kiểm tra được tối ưu hóa bằng cách sử dụng nước biển nhân tạo hoặc nước lợ nhân tạo khi kiểm tra v à pha lo ã ng. Do vậy, những hiệu ứng kích th í ch được giảm bớt và phương pháp này có thể áp dụng cho mẫu nước biển, nước lợ và nước lọc tương ứng. D.2 . Định nghĩa D.2.1 . Độ mu ố i (Salinity) Độ muối thực tế (practical sanility) S Đại lượng không thứ nguyên, d ùng để kiểm tra chất lượng nước, được xem như sự ước lượng về nồng độ của muối hòa tan trong nước biển, tính bằng gam trên kilogram; Nó cũng được định nghĩa theo toán học, là tỷ số ( K 15 ) giữa độ dẫn điện của mẫu nước, tại 15 °C và 1 atm * , và độ dẫn điện của dung dịch kali clorua xác định (32,4366 g/kg mẫu) ở cùng nhiệt độ và áp suất. CHÚ THÍCH Ch ấ p nhận từ TCVN 8184-2:2009 (ISO 6107-2:2006), định nghĩa 85. D.2.2 . M ẫ u n ư ớc mặn (salt water sample) Mẫu nước mặn hoặc lợ có độ muối trong khoảng từ 5 đến 35. D.2.3 . Nước chiết của tr ầ m tích biển hoặc lợ (Eluates of marine or brackish sediments). Dịch chiết lỏng của trầm tích biển hoặc nước lợ có nước lợ/bi ể n nhân tạo hoặc tự nhiên như môi trường rửa giải. D.2.4 . Trầm tích nướ c biển hoặc nư ớ c lợ (Pore water of marine or brackish sediment particles) Nước nằm giữa các hạt trầm tích biển và trầm t í ch lợ. D.3 . Vật liệu D.3.1 . Chất chuẩn - 3,5-dichlorophenol; - Kẽm sun f at ngậm bảy nước (ZnS O 4 .7H 2 O). D.3.2 . Nước biển nhân tạo (ASW) và nước l ợ nhân tạo (ABW) Sử dụng nước đ ã loại ion để chuẩn bị nước biển nhân tạo (ASW) v à nước lợ nhân tạo (ABW) với các thành phần được nêu trong B ả ng D 1. Tất cả thuốc thử phải ở cấp độ tinh khiết. Bảng D.1 - Nước mặn nh â n tạo (ASW) (như quy định trong ISO 10253 [5] ) và nước l ợ nhân tạo (ABW) Nước mặn nhân tạo (ASW) Nước lợ nh â n tạo (ABW) Độ muối (g/l) NaCI 22,0 14,19 MgCI 2 .6H 2 O 9,7 6,26 Na 2 S O 4 (anhydris) 3,7 2,39 CaC l 2 (anhydris) 1,0 0,65 KCI 0,65 0,42 NaHCO 3 0,20 0,13 H 3 BO 3 0,023 0,015 Độ dẫn đ iện ( m S/cm) (20 °C) 47,000 ± 1,000 31,000 ± 1,000 Độ muối nhân tạo (20 °C) 31 ± 1 20 ±1 Giá trị pH 7,5 ± 0,2 7,5 ± 0,2 D.4 . Cách tiến hành D.4.1 . Khái quát Hoàn nguyên vi khuẩn theo một quy trình chuẩn. Tùy thuộc vào độ muối của mẫu, sử dụng nước biển nhân tạo (ASW) hoặc nước lợ nhân tạo (ABW) làm mẫu kiểm tra âm, nước pha loãng cho dãy pha loãng mẫu và nước pha loãng cho chất chuẩn thay cho dung dịch natri clorua 2 % (S 20) (xem tóm tắt trong Bảng D.2). B ả ng - D.2 - So sánh quy trình chuẩn v à quy trình cải biến Quy trình chu ẩ n TCVN 6831-2:2010 (ISO 11348-2) Nước l ợ c ả i biến N ướ c mặn c ả i biến Độ muối của mẫu (S) X <> 5 ≤ x ≤ 20 20 ≤ x ≤ 35 Chất chuẩn hòa tan trong Dung dịch NaCI (S 20) ABW (s 20) ASW (s 20) M ẫ u kiểm tra Dung dịch NaCI (S 20) ABW (s 20) ASW (s 20) Nước pha loãng Dung dịch NaCI (S 20) ABW (s 20) ASW (s 20) D.4.2 . M ẫ u với độ muối 5 ≤ x ≤ 20 (Nước lợ cải biến) Đo và lập tài liệu về độ muối của mẫu. M ẫu có độ muối S < 20=""> ì cần phải tăng độ muối lên S = 20 b ằ ng natri clorua. Đo giá trị pH của mẫu. Nếu pH nằm trong khoảng 7,0 đến 8,5, thì sự điều chỉnh là không cần thiết. Nếu cần, điều chỉnh pH của mẫu tới 7,5 ± 0,2 bằng cách thêm axit clohydric hoặc dung dịch natri hydroxit; Chọn nồng độ của axit clohydric hoặc dung d ịch natri hydroxit để hạn chế thể tích thêm vào không quá 5 % tổng thể tích. Sử dụng nước lợ nhân tạo (ABW) (D.3.2) - Làm mẫu kiểm tra, - Dùng cho dãy pha loãng của mẫu, - Dùng cho dung dịch gốc của chất chuẩn cũng và cho dãy pha loãng của dung dịch gốc. D.4.3 . M ẫ u với độ muối 20 < x=""> 35 (Nước biển cải biến) Đo và lập tài liệu về độ muối của mẫu. Đo giá trị pH của mẫu. Nếu pH nằm trong khoảng từ 7,0 đến 8,5 thì sự điều chỉnh thường l à không cần thiết. Nếu cần, điều chỉnh pH của mẫu tới 7,4 ± 0,2 bằng cách thêm axit clohydric hoặc dung dịch natri hydroxit; chọn nồng độ của axit clohydric hoặc dung dịch natri hydroxit để hạn chế thể tích thêm vào không quá 5 % tổng thể tích. Sử dụng nước biển nhân tạo (ASW)(D.3.2) Đo và lập tài liệu về độ muối của mẫu. Đo giá trị pH của mẫu. Nếu pH nằm trong khoảng từ 7,0 đến 8,5 thì sự điều chỉnh thường là không cần thiết. Nếu cần , điều chỉnh pH của mẫu tới 7,4 ± 0,2 bằng cách thêm axit clohydric hoặc dung dịch natri hydroxit; chọn nồng độ của axit clohydric hoặc d ung dịch natri hydroxit để hạn chế thể tí ch thêm và o không quá 5 % tổng thể tích. D.5 . Số liệu độ đúng Giá trị-EC 50 trong Bảng D.3 xác định được trong phòng th í nghiệm đối với chất chuẩn 3,5- dichlorophenol (D.3.1). Các tài liệu liên quan tới Kẽm sun f at ngậm bảy nước thì bị giới hạn và không thu được kết quả trong các thử nghiệm tại phòng thí nghiệm. Ch ỉ được thể hiện dưới dạng thông tin bắt buộc. CH Ú THÍCH Ngoại lệ không tính đến độ lệch của giá trị trung b ì nh v à nhược điểm dữ liệu của quy trình chuẩn trong quy trình chuyển đổi. Bảng D.3 - Số liệu đúng đối với vi khuẩn khô-lỏng (TCVN 6831-2 (ISO 11348-2)) Ch ấ t chuẩn Phép thử l n n AP % mg/l s R mg CV R % 3.5-dichlorophenol Tiêu chuẩn 15 17 23,5 4,67 0,37 7,9 Nước lợ 11 13 0,0 4,83 0,42 8,7 Nước biển 11 13 0,0 4,02 0,16 3,9 Zn(ll) Tiêu chuẩn 1 2 - 24,78 2,28 9,2 Nước lợ 2 3 - 35,96 1,27 22,1 Nước biển 2 2 - 43,65 9,66 3,6 Giải thích các ký hiệu: l Số phòng thí nghiệm tham gia; n Số bộ dữ liệu; n AP Số lượng ngoại lệ; Giá trị trung bình (giá trị-EC 50 ) phòng thí nghiệm một); s R Độ lệch chuẩn của độ tái lập; CV R Hệ số phương sai của độ tái lập. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 8184-2:2009 (ISO 6107-2:2006), Chất lượng nước-Thuật ngữ-Phần 2 [2] ISO/TS 20281, Water quality - Guidance on statistical interpretation of ecotoxicity data [3] ISO 10253, Water quality - Mar i ne algal gro wt h inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum ( Ch ấ t lượng nước - Thử ức chế phát triển của t ả o biển bằng Skeletonema costatum và Phaeodactylum tricomutum) [4] GRABERT, E., KOSSLER, F. About the nutrients on the luminescent bacteria test ( Về ch ấ t dinh dư ỡ ng trong phép thử vi khuẩn phát quang). In: Hastings J.W., Kricka L.J., Stanley P.E., editors. Bioluminescence and Chemiluminescence, Molecular Reporting with Photons. Chichester: John Wiley & Sons Ltd, 1996, pp. 291-294 [5] KLEIN, B. (1992): Die Rolle des Kaliums bei Toxizitatstests mit Leuchtbakterien (incl. abstract in English: The role of potassium in toxicity tests using luminescent bacteria). Z.f.Angew.Zool., Vol.4, pp. 199-219 [6] KREBS, F. (1992): Gewasseruntersuchung m i t durch Alkali- und Erdalkalionen-Zugabe optimierten D IN-Leuchtbakterientest, dargestellt am Beispiel der Saar (incl. abstract in English: River water analysis with luminescent bacteria test according to DIN, op t imi z e d by the addition of alkaline and alkaline-earth ions, with the River Saar as an exsample (Phân t í ch nước sông bằng phép thử vi khuẩn phát quang theo DIN, bằng cách thêm các ion kiềm và kiềm thổ, lấy ví dụ nước sông Saar) ) In: Steinhauser, K.G & Hansen, P. D. (Eds.). Biologische Testver f ahren. Stuttgart. Germany. Gustav Fischer Verlag. Schr.-Reihe Verein WaBolu. Pp. 657-673 [7] POSTMA, J.F. et al (2002). Con f ounding f actors in bioassays w ith freshwater and marine organisms. Ecotoxicol . Environ . Sa f ety, 53 (2), pp. 226-237 [8] KREBS, F. (1993). Toxizitatstest mit ge f riergetrockneten Leuchtbakterien. Gewasserschutz, Water, Ab w asser , 63 , pp. 173-230 . * Theo quy định hợp pháp, atm được chuyển thành Pa: 1 atm = 101 325 Pa.