28TCN197:2004

Tiêu chuẩn ngành 28 TCN 197:2004 về penicillin trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao do Bộ Thuỷ sản ban hành TIÊU CHUẨN NGÀNH 28 TCN 197:2004 PENICILLIN TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Penicillins in fishery products - Method for quantitative analysis by High Performance Liquid Chromatography 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng các chất thuộc nhóm penicilin (gồm penicilin G, penicilin V, amoxicilin, ampicilin, oxacilin, cloxacilin, dicloxacilin và nafcilin) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp: penicilin G là 3 μg/kg; penicilin V là 3 μg/kg; amoxicilin là 10 μg/kg; ampicilin là 4 μg/kg; oxacilin là 3 μg/kg; cloxacilin là 5 μg/kg; dicloxacilin là 11μg/kg và nafcilin là 7μg/kg. 2. Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp xác định hàm lượng các chất thuộc nhóm penicilin trong sản phẩm thuỷ sản của Phòng Kiểm nghiệm AFSSA (Pháp). 3. Nguyên tắc Quá trình thử nghiệm gồm 4 giai đoạn sau: a. Chiết các chất thuộc nhóm penicilin ra khỏi mẫu sản phẩm thủy sản bằng dung dịch đệm photphat pH = 9. b. Làm sạch và cô đặc dịch chiết trên cột chiết pha rắn C18. c. Tạo dẫn xuất với anhyđrit benzoic ở nhiệt độ 50 0 C, sau đó với 1,2,4-triazole và clorua thuỷ ngân ở nhiệt độ 65 0 C. d. Định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò UV ở bước sóng 325 nm theo phương pháp ngoại chuẩn. 4. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử 4.1 Thiết bị, dụng cụ 4.1.1 Hệ thống HPLC gồm: a. Bơm HPLC; b. Đầu dò UV; c. Bộ phận tiêm mẫu tự động; d. Cột pha đảo C 8 dài 150 mm, đường kính 3,9 mm, kích thước hạt 5 μm; đ. Tiền cột C 8 dài 4 mm, đường kính 4 mm, kích thước hạt 5 μm và e. Hệ thống xử lý số liệu (Thermo Separation Products) gồm giao diện (loại SN4000), máy tính, phần mềm điều khiển thiết bị và xử lý sắc ký (loại PC1000 phiên bản 3.03). 4.1.2 Máy lắc ống nghiệm (Vortex). 4.1.3 Máy khuấy từ (NUOVA7). 4.1.4 Máy khuấy quay (Rheax). 4.1.5 Máy ly tâm lạnh (GR 4.11). 4.1.6 Máy đo pH (Accumet 10). 4.1.7 Máy ly tâm siêu tốc lạnh (MR 1822). 4.1.8 Máy nghiền đồng thể (Siemens) 4.1.9 Bể siêu âm (Bransonic 220). 4.1.10 Bể điều nhiệt hoạt động ở nhiệt độ 50 và 65 0 C (Polytest). 4.1.11 Bơm chân không cho hệ chiết pha rắn (N79KN18). 4.1.12 Thiết bị lọc với màng lọc HVLP 0,45 μm. 4.1.13 Cân phân tích, d = 0,1mg (A 120S). 4.1.14 Cột chiết pha rắn Bond Elut C18, dung tích 6 ml, 500 mg. 4.1.15 Hệ chiết pha rắn (VACELUT). 4.1.16 Dụng cụ phân phối dung môi loại 10 và 20 ml. 4.1.17 Cốc có mỏ các loại dung tích: 50, 100, 250, 500 và 1000 ml. 4.1.18 Bình định mức thuỷ tinh các loại dung tích: 10 ml, 30 ml, 1 lít và 2 lít. 4.1.19 Bình định mức thuỷ tinh màu nâu các loại dung tích: 25, 50 và 100 ml. 4.1.20 Ống nghiệm thuỷ tinh các loại. 4.1.21 Pipet tự động các loại: 100, 200, 1000 và 5000 μl và đầu hút pipetman. 4.1.22 Ống ly tâm có nút dung tích: 5 và 50 ml. Chú thích: có thể dùng các loại thiết bị, dụng cụ tương đương khác. 4.2 Hoá chất 4.2.1 Chuẩn natri penicilin G dạng axit 93,4%, (SIGMA Chemical). 4.2.2 Chuẩn penicilin V dạng axit 89,8%, (SIGMA Chemical). 4.2.3 Chuẩn amoxicilin trihyđrat 86,3% dạng axit, (SIGMA Chemical). 4.2.4 Chuẩn ampicilin natri 92,2% dạng axit, (SIGMA Chemical). 4.2.5 Chuẩn oxacilin natri 85,5% dạng axit, (SIGMA Chemical). 4.2.6 Chuẩn nafcilin natri 82,8% dạng axit, (SIGMA Chemical). 4.2.7 Chuẩn cloxacilin natri 87,8% dạng axit, (SIGMA Chemical). 4.2.8 Chuẩn dicloxacilin natri 95,3% dạng axit, (SIGMA Chemical). 4.2.9 Nước cất loại dùng cho HPLC (Alpha - Q Millipore). 4.2.10 Axetonitril. 4.2.11 Metanol. 4.2.12 Isooctan. 4.2.13 Anhyđrit benzoic ((C 6 H 5 CO) 2 O). 4.2.14 Hyđrophotphat đinatri khan (Na 2 HPO 4 ). 4.2.15 Hyđrophotphat mononatri đihyđrat (NaH 2 PO 4 .2H 2 O). 4.2.16 Thiosulfat natri pentahyđrat (Na 2 ­S 2 O 3 .5H 2 O). 4.2.17 Clorua natri (NaCl). 4.2.18 Tetrabutylammonium hyđrosulfat (C 16 H 37 NO 4 S). 4.2.19 1,2,4-triazole (C 2 H 3 N 3 ). 4.2.20 Clorua thuỷ ngân (HgCl 2 ). 4.2.21 Natri hydroxit (NaOH). 4.3 Dung dịch thử và dung dịch chuẩn 4.3.1 Chuẩn bị dung dịch đệm photphat 0,1 mol/l pH = 6,0 Hoà tan các chất gồm: 9,938 g Na 2 HPO 4 (4.2.14); 20,278 g NaH 2 PO 4 .2H 2 O (4.2.15); 7,788 g Na 2 S 2 O 3 .5H 2 O (4.2.16); 13,582 g C 16 H 37 NO 4 S (4.2.18) trong 800 ml nước cất (4.2.9) rồi định mức đến vạch để có 2 lit. Sau đó, lọc dung dịch qua màng lọc Milipore 0,45 μm (4.1.12). Chú thích: dung dịch có thể bảo quản được trong 5 ngày ở nhiệt độ từ +2 0 C đến +8 0 C. 4.3.2 Chuẩn bị 1 lit pha động (tỷ lệ 65:35): t rộn 350 ml axetonitril (4.2.10) trong 650 ml dung dịch đệm photphat 0,1 mol/l pH = 6,0 (4.3.1). Chú thích: chuẩn bị pha động hàng ngày hoặc phối trộn qua bơm HPLC. 4.3.3 Chuẩn bị dung dịch NaOH 5 mol/l: hoà tan 20,0 g NaOH (4.2.21) trong 100 ml nước cất (4.2.9). 4.3.4 Chuẩn bị dung dịch NaOH 2 mol/l: hoà tan 4,0 g NaOH (4.2.21) trong 50 ml nước cất (4.2.9). 4.3.5 Chuẩn bị dung dịch chiết (đệm photphat 0,1 mol/l pH = 9): hòa tan 14,196 g Na 2 HPO 4 khan (4.2.14) trong nước cất (4.2.9) rồi định mức để có 1 lit dung dịch. Chú thích: chuẩn bị dung dịch chiết hàng tuần và giữ ở nhiệt độ trong phòng. 4.3.6 Chuẩn bị dung dịch NaCl 2%: hoà tan 20,0 g NaCl (4.2.17) trong nước cất (4.2.9) để có 1 lít dung dịch. 4.3.7 Chuẩn bị dung dịch rửa giải (tỷ lệ 50:50) trên cột C ­ 18: trộn 50 ml nước cất (4.2.9) và 50 ml axetonitril (4.2.10). Chú thích: chuẩn bị dung dịch hàng ngày 4.3.8 Chuẩn bị dung dịch đệm pH = 8 để pha chất chuẩn: dùng dung dịch NaOH 5 mol/l (4.3.3) chỉnh 250 ml dung dịch đệm photphat 0,1 mol/l pH = 6 (4.3.1) tới pH = 8. Chú thích: chuẩn bị dung dịch hàng tuần 4.3.9 Chuẩn bị dung dịch (tỷ lệ 50:50) để hoà tan các chất chuẩn: trộn 50 ml dung dịch đệm photphat 0,1 mol/l pH = 8 (4.3.8) trong 50 ml axetonitril (4.2.10) Chú thích: chuẩn bị dung dịch hàng ngày 4.3.10 Chuẩn bị dung dịch anhyđrit benzoic 0,2 mol/l: hoà tan 2,262 g anhyđrit benzoic (4.2.13) vào 50 ml axetonitril (4.2.10) rồi định mức tới vạch trong bình thuỷ tinh màu. Chú thích: dung dịch bảo quản trong chai màu nâu, tránh ánh sáng 4.2.11 Chuẩn bị dung dịch clorua thuỷ ngân 0,1 mol/l: hoà tan 0,2715 g HgCl 2­ (4.2.20) trong 10 ml nước cất (4.2.9). Chú thích: dung dịch rất độc, tránh để da tiếp xúc trực tiếp với clorua thuỷ ngân HgCl 2 4.2.12 Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng tạo dẫn xuất Hoà tan 13,78 g 1,2,4-triazol (4.2.19) với 60 ml nước cất (4.2.9) trong cốc 100 ml (4.1.17), thêm 10 ml HgCl 2 0,1 mol/l (4.3.11). Dùng NaOH 0,5 mol/l (4.3.3) chỉnh pH = 9,0 + 0,5. Sau đó, chuyển toàn bộ sang bình định mức màu nâu (4.1.19) rồi định mức đến 100 ml bằng nước cất (4.2.9). Chú thích: - Dung dịch thu được bão hoà HgCl 2 và có màu trắng đục, để tối ưu quá trình tạo dẫn xuất dung dịch phải được điều chế trước khi sử dụng ít nhất 24 giờ và phải khuấy mạnh trước mỗi lần sử dụng. - Bảo quản dung dịch phản ứng tạo dẫn xuất ở nhiệt độ +4 0 C, nơi tránh ánh sáng. Dung dịch bền trong 3 tháng. 4.3.13 Chuẩn bị dung dịch gốc amoxicillin 0,5 g/l (SM1) Cân chính xác 0,0579 g chuẩn amoxicilin trihyđrat (4.2.3) có 86,3% hoạt tính vào cốc có mỏ (4.1.17), hoà tan bằng nước cất (4.2.9). Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu (4.1.19) rồi định mức bằng nước cất (4.2.9) để có 100 ml. 4.3.14 Chuẩn bị dung dịch gốc penicilin G 0,5 g/l (SM2) Cân chính xác 0,0535 g chuẩn penicilin G axit có 93,4% hoạt tính (4.2.1) vào cốc có mỏ (4.1.17), hoà tan bằng nước cất (4.2.9). Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu (4.1.19) rồi định mức bằng nước cất (4.2.9) để có 100 ml. 4.3.15 Chuẩn bị dung dịch gốc penicilin V 0,5 g/l (SM3) Cân chính xác 0,0557 g chuẩn penicilin V có 89,8% hoạt tính (4.2.2), hoà tan bằng nước cất (4.2.9). Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu (4.1.19) rồi định mức bằng nước cất (4.2.9) để có 100 ml. 4.3.16 Chuẩn bị dung dịch gốc ampicilin 0,5 g/l (SM4) Cân chính xác 0,0542 g chuẩn ampicilin natri có 92,2% hoạt tính (4.2.4), hoà tan bằng nước cất (4.2.9). Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu (4.1.19) rồi định mức bằng nước cất (4.2.9) để có 100 ml. 4.3.17 Chuẩn bị dung dịch gốc oxacilin 0,5 g/l (SM5) Cân chính xác 0,0585 g chuẩn oxacilin natri có 85,5% hoạt tính (4.2.5), hoà tan bằng nước cất (4.2.9). Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu (4.1.19) rồi định mức bằng nước cất (4.2.9) để có 100 ml. 4.3.18 Chuẩn bị dung dịch gốc nafcilin 0,5 g/l (SM6) Cân chính xác 0,0604 g chuẩn nafcilin có 82,8% hoạt tính (4.2.6), hoà tan bằng nước cất (4.2.9). Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu (4.1.19) rồi định mức bằng nước cất (4.2.9) để có 100 ml. 4.3.19 Chuẩn bị dung dịch gốc cloxacilin 0,5 g/l (SM7) Cân chính xác 0,0569 g chuẩn cloxacilin natri có 87,8% hoạt tính (4.2.7), hoà tan bằng nước cất (4.2.9). Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu (4.1.19) rồi định mức bằng nước cất (4.2.9) để có 100 ml. 4.3.20 Chuẩn bị dung dịch gốc dicloxacilin 0,5 g/l (SM8) Cân chính xác 0,0525 g chuẩn dicloxacilin natri có 95,3% hoạt tính (4.2.8), hoà tan bằng nước cất (4.2.9). sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức màu nâu rồi định mức bằng nước cất (4.2.9) để có 100 ml. 4.3.21 Dung dịch chuẩn hỗn hợp các chất thuộc nhóm penicilin để thêm vào mẫu xác định độ thu hồi Hút chính xác 50 μl các dung dịch chuẩn SM1, SM2, SM3, SM4 và 300 μl các dung dịch chuẩn SM5, SM6, SM7, SM8 vào các bình định mức màu nâu 10 ml (4.1.18) rồi định mức tới vạch bằng nước cất (4.2.9). 4.3.22 Các dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc của 8 loại thuốc thuộc nhóm penicilin Dùng các dung dịch gốc 0,5 g/l của các loại thuốc thuộc nhóm penicilin (từ SM1 đến SM8) và các bình định mức thuỷ tinh màu nâu 50 ml (4.1.19). 4.3.22.1 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 1 (ST1): hút chính xác 125 μl mỗi dung dịch từ SM1 đến SM4 và 375 μl mỗi dung dịch từ SM5 đến SM8 vào các bình rồi thêm nước cất (4.2.9) để có 50 ml. 4.3.22.2 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 2 (ST2): hút chính xác 250 μl mỗi dung dịch từ SM1 đến SM4 và 750 μl mỗi dung dịch từ SM5 đến SM8 vào các bình rồi thêm nước cất (4.2.9) để có 50 ml. 4.3.22.3 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 3 (ST3): hút chính xác 500 μl mỗi dung dịch từ SM1 đến SM4 và 1,5 ml mỗi dung dịch từ SM5 đến SM8 vào các bình rồi thêm nước cất (4.2.9) để có 50 ml. 4.3.22.4 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 4 (ST4): hút chính xác 1 ml mỗi dung dịch từ SM1 đến SM4 và 3 ml mỗi dung dịch từ SM5 đến SM8 vào các bình rồi thêm nước cất (4.2.9) để có 50 ml. Chú thích: các dung dịch từ ST1 đến ST4 được chuẩn bị hàng tháng và phải bảo quản trong buồng lạnh (nhiệt độ từ +2 0 C đến +4 0 C) và tối. 5 Phương pháp tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.1.1 Nghiền 200 g mẫu sản phẩm thủy sản bằng máy nghiền đồng thể (4.1.8). Cân chính xác 5.0 g mẫu đã được nghiền cho vào ống ly tâm 50 ml (4.1.22). 5.1.2 Dùng thiết bị phân phối dung môi (4.1.16) cho 30 ml dung dịch đệm photphat pH = 9 (4.3.5) vào ống ly tâm 50 ml chứa 5 g mẫu thử đã được nghiền rồi lắc trên máy lắc ống nghiệm (4.1.2) trong 1 phút. 5.1.3 Thêm 20 ml isooctan (4.2.12) vào ống nghiệm, tiếp tục lắc trong 1 phút. Sau đó, đồng nhất toàn bộ trên máy khuấy quay (4.1.4) trong 10 phút. 5.1.4 Ly tâm dung dịch trong 10 phút ở 2200 RCF (g), tốc độ 3500 vòng/phút ở nhiệt độ 10 0 C rồi hút bỏ phần dịch isooctan phía trên. Sau đó, chuyển toàn bộ pha nước sang ống nghiệm sạch 50 ml (4.1.20) và chỉnh pH về khoảng 8 - 9 bằng NaOH 5 mol/l (4.3.3). 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng là mẫu sản phẩm thủy sản đã được xác định không có penicilin. Tiến hành chuẩn bị và làm sạch mẫu trắng như đối với mẫu thử theo qui định tại Điều 5.1 và Điều 5.5. 5.3 Chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi 50 μ g/kg và 300 μ g/kg Thêm chính xác 100 μ l dung dịch chuẩn hỗn hợp các chất thuộc nhóm penicilin (4.3.21) vào 5 g mẫu trắng (5.2). Tiến hành chuẩn bị và làm sạch 2 mẫu xác định độ thu hồi (50 μ g/kg và 300 μ g/kg) như đối với mẫu thử theo qui định tại Điều 5.1 và Điều 5.5. 5.4 Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp các penicillin STD dùng để dựng đường chuẩn 5.4.1 Dung dịch chuẩn được chuẩn bị hàng ngày mỗi khi tiến hành phân tích bằng cách pha loãng các dung dịch ST1, ST2, ST3, ST4 trong ống nghiệm với 5 ml dung dịch pha loãng (4.3.9). Tiến hành như sau: STD0 : 100 μ l dung dịch hoà loãng chất chuẩn (4.3.9). STD1 : 100 μl ST1 và thêm 900 μl dung dịch hoà tan chất chuẩn (4.3.9). STD2 : 100 μl ST2 và thêm 900 μl dung dịch hoà tan chất chuẩn (4.3.9). STD3 : 100 μl ST3 và thêm 900 μl dung dịch hoà tan chất chuẩn (4.3.9). STD4 : 100 μl ST4 và thêm 900 μl dung dịch hòa tan chất chuẩn (4.3.9). 5.4.2 Tiếp tục thực hiện bước tạo dẫn xuất như theo qui đinh tại Điều 5.6. 5.5 Làm sạch mẫu 5.5.1 Hoạt hoá cột Gắn cột chiết pha rắn loại Bond Elut C18 lên giá đỡ, sau đó gắn bình chứa 50 ml lên cột. Thêm lần lượt 10 ml metanol (4.2.11), 10 ml nước cất (4.2.9), 5 ml dung dịch NaCl 2% (4.3.6) và 5 ml dung dịch đệm chiết pH = 9 (4.3.5). Cho ngay dịch chiết thu được (5.1.4) lên bình chiết trên cột đã được hoạt hoá. Chú thích: không để cột bị khô trong quá trình hoạt hoá cột. Thêm dung dịch cần làm sạch ngay khi hết dịch đệm chiết hoặc khi còn một chút dung dịch đệm chiết. 5.5.2 Hút hỗn hợp với lưu lượng 3 ml/phút rồi thêm 2 ml dung dịch NaCl 2% (4.3.6) 2 ml nước cất (4.2.9). Tiến hành hút kiệt trong vòng 5 phút, ngừng hút chân không. 5.5.3 Đặt ống ly tâm 5 ml (4.1.22) dưới cột rồi rót 1 ml dung dịch rửa giải (4.3.7) lên cột. Để ngấm pha rắn khoảng 1 phút trước khi hút chân không dịch rửa giải với lưu tốc 3 ml/phút. 5.5.4 Sau khi rửa giải xong, thể tích dịch rửa giải khoảng 900 μl, chỉnh đến 1ml bằng dung dịch rửa giải (4.3.7) trong bình tam giác nút mài. 5.6 Tạo dẫn xuất