TCVN10330:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10330:2014 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng Halofuginone - Phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10330:201 4 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HALOFUGINONE - PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal f eeding stuffs - Determination of halo f uginone content - Method using high-performance liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 10330:2014 được xây dựng dựa theo Commission regulation (EC) No. 152/2009; TCVN 10330:2014 do Trung tâm Khảo, kiểm nghiệm và kiểm định giống vật nuôi, thức ăn chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển n ông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG HALOFUGINONE - PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal f eeding stuffs - Determination of halo f uginone content - Method using high-performance liquid chromatography 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng halofuginone (DL-trans-7-bromo-6-chloro- 3- [3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-quinazolin-4-(3H)-one hydrobromide) trong thức ăn chăn nuôi sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Giới hạn định lượng của phương pháp là 1 mg/kg. 2. Tài liệu viện dẫn Các t à i liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nh ấ t, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 6952 (ISO 9498) Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử . 3. Nguyên tắc Sau khi xử lý mẫu bằng nước nóng, halo f uginone được tách ra dưới dạng bazơ tự do vào ethyl axetat và sau đó tách phân đoạn dưới dạng hydroclorua vào dung dịch axit. Chất chiết được tinh sạch bằng sắc k ý trao đổi ion. Hàm lượng halo f uginone được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với detector UV. 4. Thuốc thử Chỉ sử dụng các thuốc th ử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác. 4.1 . Axetonitril , loại dùng cho HPLC. 4.2 . Nhựa Amberlite XAD-2. 4.3 . Amoni axetat. 4.4 . Etyl axetat. 4.5 . Axit axet i c băng . 4.6 . Chất chuẩn halo f uginone (DL-trans-7-brome-6-chloro-3-[3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl] quinazoline-4- ( 3H)-one hydrobromide, E 764). 4.6.1 . Dung dịch chu ẩ n gốc halo f uginone , 100 m g/ml Cân 50 mg chất chuẩn halofuginone, chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 500 ml, hòa tan trong dung dịch đệm amoni axetat (4.18), thêm dung dịch đệm đến vạch và trộn. Dung dịch này nếu được bảo quản nơi tối ở 5 ° C có thể bền được ba tuần. 4.6.2 . Dung dịch hiệu chuẩn Chuyển 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml và 6,0 ml dung dịch chuẩn gốc (4.6.1) vào một loạt các b ì nh định mức 100 ml. Thêm pha động (4.21) đến vạch và trộn. Các dung dịch này có nồng độ halo f uginone tương ứng là 1,0 m g/ml, 2,0 m g/ml, 3,0 m g/ml, 4,0 m g/ml và 6,0 m g/ml. C ần chuẩn b ị các dung dịch này ngay trước khi sử dụng. 4.7 . Axit clohydric ( r 20 xấp xỉ 1,16 g/ml). 4.8 . Metanol. 4.9 . Bạc nitrat. 4.10 . Natri ascorbat. 4.11 . Natr i cacbonat. 4.12 . Natri clorua. 4.13 . EDTA (muối dinatri c ủ a axit ethylenediaminetetraacetic). 4.14 . Nước , loại dùng cho HPLC. 4.15 . Dung dịch natri cacbonat , c = 10 g/100 ml. 4.16 . Dung dịch natri cacbonat bão hòa natri clorua , c = 5 g/100 m l . Hòa tan 50 g natri cacbonat (4.11) trong nước, thêm nước đến 1 lít và thêm natri clorua (4.12) cho đến khi dung dịch bão hòa. 4.17 . Dung dịch a xit clohydric , xấp xỉ 0,1 mol/l. Pha lo ã ng 10 ml axit clohydric (4.7) trong nước đến 1 lít. 4.18 . Dung dịch đệm amoni axetat , xấp xỉ 0,25 mol/l. Hòa tan 19,3 g amoni axetat (4.3) và 30 ml axit axetic (4.5) trong nước (4.14) và pha loãng đến 1 lít. 4.19 . Chuẩn bị nhựa amberlite XAD-2 Rửa một lượng th í ch hợp Amberlite (4.2) bằng nước cho đến khi loại hết t ấ t cả các ion clorua, được kiểm tra bằng phép thử bạc nitrat (4.20) đối với nước rửa. Sau đó rửa nhựa với 50 ml metanol (4.8), lo ạ i bỏ metanol và bảo quản nhựa trong metanol mới. 4.20 . Dung d ị ch bạc nitrat , xấp xỉ 0,1 mol/l. Hòa tan 0,17 g bạc nitrat (4.9) trong 10 ml nư ớ c. 4.21 . Pha động dùng cho HPLC Trộn 500 ml axetonitril (4.1) với 300 ml dung dịch đệm amoni axetat (4.18) và 1200 ml nước (4.14). Chỉn h pH đến 4,3 bằng axit axetic băng (4.5). Lọc qua màng lọc 0,22 m m (5.8) và đuổi kh í dung dịch (ví dụ bằng siêu âm 10 min). Dung dịch n à y nếu đ ược bảo quản trong lọ kín để ở nơi tối có thể bền được 1 tháng. 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng c á c thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như s au: 5.1 . Bể siêu âm. 5.2 . Bộ cô quay. 5.3 . Máy ly tâm. 5.4 . Thiết b ị HPLC , có detector UV bước sóng thay đổi hoặc detector m ả ng diod và có cột sắc ký lỏng, C18, pha đảo, kích thước 300 mm x 4 mm, cỡ hạt 10 m m hoặc loại tương đương. 5.5 . Cột thủy tinh , kích thước 300 mm x 10 mm, được trang bị bộ lọc thủy tinh thiêu kết và có kh ó a. 5.6 . Bộ lọc sợi thủy tinh , đường k í nh 150 mm. 5.7 . Màng lọc , cỡ lỗ 0,45 m m. 5.8 . Màng lọc , c ỡ lỗ 0,22 m m. 5.9 . Phễu chiết , dung tích 250 ml v à 500 ml. 5.10 . Cân , có thể cân chính xác đến 0,1 g. 5.11 . Cân phân tích , có thể cân chính xác đến 0,1 mg. 5.12 . B ì nh cầu đáy tròn , dung tích 250 ml. 5.13 . Bình định mức , dung tích 10 ml, 100 ml và 500 ml. 6. Lấy mẫu M ẫ u gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không b ị hư hỏng hoặc thay đ ổ i trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chu ẩ n này, nên l ấ y mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu . 7. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498). 8. Cách tiến hành CH Ú TH Í CH: Ha l o f uginone dạng bazơ tự do không b ề n trong dung dịch kiềm và dung dịch etyl axetat. Do đó, không để halo f uginone trong ethyl axetat quá 30 min. 8.1 . Yêu c ầ u chung 8.1.1 . M ẫ u thử trắng cần được kiểm tra để chắc chắn r ằ ng không có mặt halo f uginone cũng như ch ấ t gây nhiễu. 8.1.2 . Cần kiểm tra độ thu hồi bằng cách phân tích mẫu thử trắng đã bổ sung halo f uginone, với lư ợn g tương tự dự ki ế n có trong mẫu. Bổ sung ở mức 3 mg/kg bằng cách thêm 300 m l dung d ị ch chuẩn gốc (4.6.1) vào 10 g mẫu thử trắng, trộn và đợi 10 min tr ướ c khi tiếp tục chiết (8.2). CHÚ TH Í CH: Mẫu thử trắng phải tương tự loại mẫu cần phân tích nhưng không phát hiện được halo f uginone. 8.2 . Chiết mẫu Cân 10 g mẫu đã chuẩn bị, ch í nh x á c đến 0,1 g, cho vào ống ly tâm 200 ml, thêm 0,5 g natri ascorbat (4.10), 0,5 g EDTA (4.13), 20 ml nước và trộn. Đặt ống ly tâm vào nồi cách thủy (80 °C) trong 5 min. Sau khi l à m nguội đến nhiệt độ phòng, thêm 20 ml dung dịch natri cacbonat (4.15) và trộn. Thêm ngay 100 ml etyl axetat (4.4) và lắc mạnh bằng tay trong 15 s. Sau đó, đặt ống trong bể siêu âm (5.1) 3 min và nới lỏng nắp. Cho ly tâm trong 2 min và gạn pha etyl axetat qua bộ lọc sợi thủy tinh (5.6) vào phễu chiết 500 ml (5.9). Lặp lại việc chiết mẫu bằng 100 ml etyl axetat lần thứ hai. Rửa sạch phần dịch chiết đ ã gộp lại trong 1 min bằng 50 ml dung dịch natri cacbonat đã bão hòa natri clorua (4.16) và loại bỏ lớp nước. Chiết lớp hữu cơ trong 1 min bằng 50 ml dung dịch axit clohydric (4.17). Cho lớp axit phía dưới chảy vào phễu chiết 250 ml (5.9). Chiết lại lớp hữu cơ trong 1,5 min bằng 50 ml axit clohydric tiếp theo (4.17) và gộp lại với dị c h chiết thứ nhất. Rửa phần chiết đã gộp bằng cách xoay mạnh khoảng 10 s với 10 ml etyl axetat (4.4). Chuyển định lượng lớp nước v à o b ì nh cầu đáy tròn 250 ml (5.12) và loại bỏ pha hữu cơ. Cho bay hơi hết etyl axetat còn lại ra khỏi dung dịch axit bằng bộ c ô quay (5.2). Nhiệt độ của nồi cách thủy không được vượt quá 40 ° C . Trong điều kiện chân không khoảng 25 mbar, tất cả etyl axetat còn lại sẽ đư ợ c loại ra trong vòng 5 min ở 38 ° C . 8.3 . Làm sạch 8.3.1 . Chuẩn bị cột Amberlite Chu ẩ n bị cột XAD-2 cho mỗi lần chiết mẫu. Chuyển 10 g Amberlite đã chuẩn b ị (4.19) vào cột thủy tinh (5.5) với metanol (4.8). Chèn một nút nhỏ bông thủy tinh lên trên lớp nhựa (resin). Xả metanol từ cột và rửa nhựa với 100 ml nước, ngắt dòng chảy khi chất lỏng đạt đến đỉnh c ủ a lớp nhựa. Để cột cân bằng trong 10 min trước khi sử dụng. Không để cột b ị khô. 8.3.2 . Làm sạch mẫu Chuyển định lượng dịch chiết mẫu (8.2) lên cột Amberlite đã chuẩn b ị (8.3.1) và rửa giải, gạn lấy chất rửa giải. Tốc độ rửa giải không được vượt quá 20 ml/min. Tráng bình cầu đáy tròn b ằ ng 20 ml dung dịch axit clohydric (4.17) và sử dụng dung dịch axit clohydric này để rửa cột resin. Dùng dòng không khí để thổi hết dung dịch axit còn lại. Loại bỏ nước r ử a. Thêm 100 ml metanol (4.8) vào cột và cho rửa giải từ 5 ml đến 10 ml, thu lấy dịch rửa vào bình cầu đáy tròn 250 ml (5.12). Để cho metanol còn lại cân bằng với resin trong 10 min và tiếp tục rửa giải với tốc độ không quá 20 ml/min. Thu lấy dịch rửa giải vào b ì nh cầu đáy tròn tr ê n. Cho bay hơi metanol trên thiết b ị cô quay (5.2), nhiệt độ của nồi cách thủy không được vượt quá 40 ° C . Chuyển định lượng phần còn lại bằng pha động (4.21) vào bình định mức 10 ml (5.13) đã được hiệu chuẩn. Thêm pha động đến vạch và trộn. Lọc một phần qua bộ lọc màng (5.7). Dùng dung dịch này cho phép xác định HPLC (8.4). 8.4 . Phép xác định b ằ ng HPLC 8.4.1 . Các thông số Các điều kiện sau được cung cấp để hướng dẫn, điều kiện khác có thể được sử dụng cung c ấ p mang lại kết quả tương đương. - Cột sắc ký l ỏ ng (5.4); - Pha động dùng cho HPLC (4.21); - Tốc độ dòng: từ 1,5 ml/min đến 2 ml/min; - Bước sóng phát hiện: 243 nm; - Lượng mẫu bơm: từ 40 đến 100 m l. Kiểm tra sự ổn định của hệ thống sắc ký, bơm v ài lần dung dịch hiệu chuẩn (4.6.2) có ch ứ a 3,0 mg/ml, cho đến khi đạt được chiều cao pic (hoặc diện tích) và thời gian lưu ổn định. 8.4.2 . Đường chuẩn Bơm mỗi dung dịch hiệu chu ẩ n (4.6.2) vài lần và đo chiều cao hoặc diện tích pic đối với mỗi nồng độ. Dựng đường chuẩn từ chiều cao hoặc diện tích pic trung bình của các dung dịch hiệu chuẩn trên trục tung v à nồng độ tương ứng t í nh bằng microgam tr ê n trục hoành. 8.4.3 . Dung dịch m ẫ u Bơm dịch chiết mẫu (8.2) v à i lần, sử dụng cùng một th ể tích như đ ã thực hiện đối với các dung dịch hiệu chuẩn và xác định chiều cao (diện tích) trung bình của pic halo f uginone. 9. Tính kết quả Từ đường chuẩn (8.4.2), xác định n ồ ng độ của dung dịch mẫu bằng microgam trên mililit theo chiều cao hoặc diện t í ch trung b ì nh của các pic halo f uginone của dung dịch mẫu thử. Hàm lượng halo f uginone có trong mẫu thử, w , tính bằng m i ligam trên kilogam (mg/kg) được t í nh bằng công thức sau: Trong đó: c là nồng độ halofuginone trong dung dịch mẫu, tính bằng microgam trên mililit ( m g/ml); 10 là giá trị dung tích bì n h định mức, bằng thể tích dung dịch mẫu cuối cùng thu được sau khi làm sạch (xem 8.3.2), tính bằng mililit (ml); m l à khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g). 10. Đánh giá xác nhận kết quả 10.1 . Nhận biết Có thể nhận biết chất phân tích bằng đồng sắc ký hoặc sử dụng detector mảng diod trong đó so sánh sắc phổ của dịch chiết mẫu và của dung dịch hiệu chuẩn (4.6.2) c ó nồng độ 6,0 m g/ml. 10.1.1 . Đ ồ ng sắc ký Chất chiết mẫu được b ổ sung một lượng th í ch hợp dung dịch hiệu chuẩn (4.6.2). Lượng halo f uginone được bổ sung phải tương tự với lượng halo f uginone dự kiến t ì m thấy trong chất chiết mẫu. Chiều cao pic halo f uginone phải tăng sau khi bổ sung chất chuẩn và cần tính đến độ pha loãng c ủ a dịch chiết. Chiều rộng pic tại điểm giữa chiều cao tối đa chỉ được dao động trong phạm vi ± 10 % chiều rộng tương ứng trước khi bổ sung. 10.1.2 . Detector m ả ng diod Các kết quả được đánh giá theo các tiêu chí sau: a) bước sóng hấp thụ cực đại c ủ a mẫu và của phổ chuẩn, được ghi lại ở đ ỉ nh pic trên sắc ký đồ, phải giống nhau trong một biên độ phụ thuộc vào khả năng phân giải của hệ thống detector. Đối với detector mảng diod, thường là trong vòng ± 2 nm; (b) trong d ả i bước sóng từ 225 nm đến 300 nm, sắc k ý đồ của mẫu và của chất chuẩn được ghi lại ở đỉnh pic trên sắc ký đồ, không được khác với những phần của phổ trong dải từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đối. Tiêu chí này được đáp ứng khi cùng có các cực đại như nhau và độ lệch giữa hai phổ không vượt quá 15 % độ h ấ p thụ của chất phân tích; (c) trong dải bước sóng từ 225 nm đến 300 nm, phổ của đỉnh pic và độ dốc hai phía của pic thu được từ dịch chiết mẫu không được khác so v ớ i các phần quang phổ trong khoảng từ 10 % đến 100 % độ hấp thụ tương đ ố i. Tiêu chí n à y được đáp ứng khi cùng một cực đ ại c ó mặt và khi tất cả các điểm quan sát được có độ lệch giữa các phổ không vượt quá 15 % độ hấp thụ của phổ cao nhất. Nếu một trong các tiêu chí này không đáp ứng th ì sự có mặt của chất phân tích không được xác nhận. 10.2 . Độ lặp lại Chênh lệch giữa kết quả c ủ a hai phép xác định song song, thực hiện trên cùng một mẫu không được vượt qu á 0,5 mg/kg đối v ớ i hàm lượng halo f uginone đến 3 mg/kg. 10.3 . Độ thu hồi Đối với các mẫu trắng thêm chuẩn, độ thu hồi ít nhất là 80 %. 11. Phép thử liên phòng thử nghiệm Một nghiên cứu cộng tác [ 2 ] đã được tổ chức thực hiện trên ba mẫu, do tám phòng thử nghiệm tham gia. Kết quả nghiên cứu cộng tác được nêu trong Bảng 1. Bảng 1 - Kết quả của phép thử nghiệm cộng tác M ẫ u A (trắng) khi mới nhận M ẫ u B (dạng bột) M ẫ u C (dạng viên) Mới nhận Sau hai tháng Mới nhận Sau hai tháng Giá trị trung b ì nh [mg/kg] Không phát hiện 2,80 2,42 2,89 2,45 Độ lệch chuẩn tái lập, S R [mg/kg] - 0,45 0,43 0,40 0,42 Hệ số biến thiên tái lập, CV R [%] - 16 18 14 17 Độ thu hồi [%] 86 74 88 75 12. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo th ử nghiệm phải ghi r õ : a) tất c ả các thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu th ử ; b) phương pháp lấy m ẫ u đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là t ùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hư ở ng đến kết quả thử. e) kết qu ả thử nghiệm thu được. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu [2] Analyt i cal Methods Committee (1983), Determination of halo f uginone hydrobromide in medicated animal f eed . Analyst, Vol. 108: 1252-1256