TCVN6189-1:2009

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6189-1:2009 (ISO 7899-1 : 1998) về Chất lượng nước - Phát hiện và đếm khuẩn đường ruột - Phần 1: Phương pháp thu nhỏ (Số có xác suất lớn nhất) đối với nước mặt và nước thải TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6189-1 : 2009 ISO 7899-1 : 1998 CHẤT LƯỢNG NƯỚC - PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP THU NHỎ (SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT) ĐỐI VỚI NƯỚC MẶT VÀ NƯỚC THẢI Water quality - Detection and enumeration of intestinal enterococci - Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) for surface and waste water Lời nói đầu TCVN 6189-1 : 2009 thay thế TCVN 6189-1 : 1996. TCVN 6189-1 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 7899-1 : 1998/Cor 1 : 2000. TCVN 6189-1 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn Quốc gia TCVN/TC 147 Chất lượng nước biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ cộng bố. TCVN 6189 (ISO 7899) Chất lượng nước - Phát hiện và đếm khuẩn đường ruột gồm hai phần sau đây: - TCVN 6189-1 : 2009 (ISO 7899-1 : 1998/Cor 1 : 2000) Phần 1: Phương pháp thu nhỏ (số có xác suất lớn nhất) đối với nước mặt và nước thải; - TCVN 6189-2 : 2009 (ISO 7899-1 : 2000) Phần 2: Phương pháp lọc màng. Lời giới thiệu Mục đích của tiêu chuẩn này là để đếm số vi khuẩn đường ruột chính E.faecalis , Ε.faecium , Ε.durans và Ε.hirae thường xuất hiện trong phân người và động vật. Một số loài vi khuẩn Entorococcus như Ε.avium , Ε.columbae và Ε.gallinarum và đặc biệt chủng Streptococcus bovist/equinus có thể xuất hiện nhưng rất ít khi gặp trong mẫu môi trường. Độ phát hiện các vi khuẩn này là thấp. Enterococcus casseliflavus và Ε.mundtii là loài không có nguồn gốc từ phân nhưng khi xuất hiện trong mẫu nước (ví dụ do ảnh hưởng của vật liệu và một số loại nước thải công nghiệp) thì được đếm như vi khuẩn đường ruột có nguồn gốc từ phân. Các loài này và số ít các loài khác không có nguồn gốc từ phân có xu hướng sinh ra sắc tố màu vàng trên môi trường nuôi cấy không chọn lọc. Do vậy, phải xét đến cản trở của các loài Enterococcus không có nguồn gốc từ phân khi diễn giải kết quả. CHẤT LƯỢNG NƯỚC - PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP THU NHỎ (SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT) ĐỐI VỚI NƯỚC MẶT VÀ NƯỚC THẢI Water quality - Detection and enumeration of intestinal enterococci - Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) for surface and waste water 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp thu nhỏ để phát hiện và đếm khuẩn đường ruột chính trong nước mặt và nước thải bằng cách nuôi cấy trong môi trường lỏng. Phương pháp này có thể áp dụng cho tất cá các loại nước mặt và nước thải, đặc biệt là nước có chứa một lượng lớn các chất lơ lửng. Phương pháp này không thích hợp cho nước uống và các loại nước có số đếm theo hướng dẫn nhỏ hơn 15 trên 100 ml. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 5992 : 1995 (ISO 5667-2 : 1991 1) ) Chất lượng nước - Lấy mẫu - Phần 2: Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu; TCVN 6663-1 : 2002 (ISO 5667-1 : 1980 2) ) Chất lượng nước - Lấy mẫu - Phần 1: Hướng dẫn lập chương trình lấy mẫu; TCVN 6450 : 2007 (ISO/IEC Guide 2 : 2004) Tiêu chuẩn hóa và các hoạt động có liên quan - Thuật ngữ chung và định nghĩa; TCVN 6663-3 : 2008 (ISO 5667-3 : 2003) Chất lượng nước - Lấy mẫu - Phần 3: Hướng dẫn bảo quản và xử lý mẫu; ISO 8199 : 1988 3) Water quality - General guide to the enumeration of microorganism by culture (Chất lượng nước - Hướng dẫn chung để đếm vi sinh vật bằng nuôi cấy); ISO 3951 : 1989 Sampling procedures and charts for inspection by variables for percent nonconforming (Qui trình lấy mẫu và biểu đồ để thanh tra dùng biến thiên theo phần trăm không phù hợp). 3 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này, áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa trong TCVN 6450 (ISO/IEC Hướng dẫn 2) và các thuật ngữ sau: 3.1 Khuẩn đường ruột (Intestinal enterococci) Vi khuẩn có khả năng phát triển hiếu khí ở 44 o C và thủy ngân 4-metylbeliferyl- -D-glucosi (MUD) khi có tali axetat, axit nalidic và 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua (TTC) trong môi trường lỏng xác định. 4 Nguyên tắc Mẫu đã pha loãng được nuôi cấy trong các giếng cấy của đĩa microtit có chứa môi trường cấy đã loại nước. Phiến giếng cấy được kiểm tra trong tối có ánh sáng cực tím ở 366 nm sau khi ủ trong khoảng thời gian từ 36 h đến 72 h tại 44 o C ± 0,5 o C. Sự có mặt của khuẩn đường ruột được chỉ thị bằng huỳnh quang là kết quả của sự thủy phân MUD. Kết quả được đưa ra là số có xác suất lớn nhất trên 100 ml (MNP). 5 Thiết bị, dụng cụ Ngoại trừ các dụng cụ, thiết bị vô khuẩn được cấp, tất cả các dụng cụ thủy tinh phải được khử khuẩn theo ISO 8199. Các thiết bị của phòng thí nghiệm phân tích vi sinh thông thường và cụ thể: 5.1 Thiết bị để khử khuẩn bằng sấy nhiệt (lò) hoặc bằng hơi (nồi hấp). 5.2 Tủ ủ có nhiệt độ ổn định, đặt ở nhiệt độ 44 o C ± 0,5 o C. 5.3 Hầm sấy (lò sấy kiểu hầm) hoặc phòng sấy bằng luồng khí (nên dùng loại II). 5.4 Buồng quan sát lắp đèn UV (Đèn Wood 366 nm). CẢNH BÁO - Ánh sáng UV có thể gây kích ứng da và mắt. Sử dụng găng và kính bảo vệ. 5.5 Máy đo khúc xạ cầm tay (tùy chọn). 5.6 pH mét, với độ chính xác = 0,1. 5.7 Ống nghiệm, 16 mm x 160 mm và 20 mm x 200 mm, hoặc bình có dung tích tương tự. 5.8 Pipet nhiều đầu điều chỉnh được hoặc pipet có sẵn 8 đầu điều chỉnh được, hoặc hệ thống phù hợp để đo và phân chia 200 l trên một giếng cấy. 5.9 Ống chóp vô khuẩn lắp vào đầu pipet dùng cho multipipet. 5.10 Thiết bị lọc màng, phù hợp với ISO 8199, kể cả cái lọc màng có cỡ lỗ danh nghĩa 0,2 m, để khử khuẩn môi trường lỏng. 5.11 Phiến giếng cấy vô khuẩn, 96 giếng cấy, 350 l, đáy phẳng, không cản ánh sáng huỳnh quang. 5.12 Băng dính vô khuẩn để bọc kín đĩa cấy microtit. 5.13 Đĩa Petri vô khuẩn, đường kính 90 mm. 6 Lấy mẫu Lấy mẫu và đưa đến phòng thí nghiệm theo TCVN 6663-1 (ISO 5667-1), TCVN 5992 (ISO 5667-2) và TCVN 6663-3 (ISO 5667-3). 7 Môi trường nuôi cấy và dung dịch pha loãng 7.1 Hướng dẫn chung Để đảm bảo có kết quả, chuẩn bị môi trường nuôi cấy và dung dịch pha loãng, sử dụng các thành phần có chất lượng đồng nhất và hóa chất phân tích hoặc dung dịch pha loãng đã loại nước hoặc môi trường hoàn chỉnh được chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chuẩn bị các chất này với nước cất hoặc nước đã loại khoáng, không chứa các chất có khả năng gây ức chế hoặc thúc đẩy sự phát triển vi khuẩn trong các điều kiện thử nghiệm. Nếu chưa sử dụng môi trường ngay, có thể lưu giữ môi trường này đến một tháng trong tối ở (5 ± 3) o C và trong các điều kiện tránh mọi sự thay đổi thành phần của chúng. CHÚ THÍCH Có thể sử dụng các hóa chất có chất lượng khác nếu các hóa chất này cho tính năng như nhau trong phép thử. 7.2 Dung dịch pha loãng 7.2.1 Dung dịch pha loãng đặc biệt (SD) Muối biển tổng hợp 4) 22,5 g Dung dịch bromophenol xanh (tùy chọn) 10 ml Nước đã loại khoáng hoặc nước cất (7.2.2) 1000 ml Tiệt trùng trong nồi hấp (5.1) ở 121 o C ± 3 o C trong 15 min đến 20 min. Dung dịch bromophenol xanh được chuẩn bị bằng cách thêm 0,04 g vào 100 ml etanol 50 %. Dung dịch này chỉ dùng để tạo màu xanh cho SD và để tránh nhầm lẫn với nước đã loại khoáng hoặc nước cất. 7.2.2 Nước đã loại khoáng hoặc nước cất Nước được dùng để pha loãng cần được loại khoáng hoặc nước cất không chứa các chất gây ức chế sự phát triển dưới các điều kiện thử nghiệm. Tiệt trùng trong nồi hấp (5.1) trước khi dùng ở 121 o C ± 3 o C trong 15 min đến 20 min. 7.3 Môi trường nuôi cấy: Môi trường MUD/SF 7.3.1 Thành phần 7.3.1.1 Dung dịch A Tryptoza 40 g KH 2 PO 4 10 g D(+)-galactoza 2 g Polyoxyetylensorbitan moncoleat (Tween® 80 5) ) 1,5 ml Nước đã loại khoáng hoặc nước cất (7.2.2) 900 ml Cho tryptoza, KH 2 PO 4 , galactoza, và Tween® 80 vào 900 ml nước, trong khi làm nóng nhẹ và khuấy bằng khuấy từ, sau đó đun sôi đến khi tan hoàn toàn. Để nguội. 7.3.1.2 Dung dịch B NaHCO 3 4 g Axit nalidixic 250 mg Nước đã loại khoáng hoặc nước cất (7.2.2) 50 ml Cho cả hai hóa chất trên vào 50 ml nước trong khi đun nóng nhẹ và khuấy bằng khuấy từ. Để nguội. 7.3.1.3 Dung dịch C Thalium axetat 2 g 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua 0,1 g Nước đã loại khoáng hoặc nước cất (7.2.2) 50 ml Cho cả hai hóa chất trên vào 50 ml nước trong khi đun nóng nhẹ và khuấy bằng khuấy từ. Để nguội. 7.3.1.4 Dung dịch D MUD (4-metylbeliferyl- -D-glucosi) 150 mg N,N-dimetylfomamid 2 ml CẢNH BÁO - Talium axetat và N,N-dimetylfomamid là các chất độc. Sử dụng các hóa chất này trong tủ hút. 7.3.2 Chuẩn bị Trộn các dung dịch A + B + C + D với nhau. Điều chỉnh pH đến 7,5 ± 0,2. Tiệt trùng bằng cách lọc qua màng có cỡ lỗ trung bình 0,2 m (5.10). Phân bổ dung dịch vào đĩa microtit 96 giếng cấy (5.11) với thể tích 100 l môi trường cho mỗi giếng cấy (dung tích giếng cấy tối thiểu là 350 l) và loại nước ngay trong tủ sấy kiểu hầm hoặc hộp sấy bằng dòng khí (5.3). Sản xuất môi trường nuôi cấy cần đáp ứng được các tiêu chí về chất lượng đưa ra ở Phụ lục Ε. 8 Cách tiến hành 8.1 Lựa chọn số lần pha loãng Số lần pha loãng để cấy thay đổi theo mức nhiễm bẩn dự kiến của nước được thử. Bảng 1 đưa ra một số ví dụ. Bảng 1 Nguồn gốc mẫu Số lần pha loãng Số giếng cấy/lần pha loãng Giới hạn đo của vi khuẩn/ 100 ml Nước bể bơi 2 64 giếng pha loãng đến 1/2 32 giếng pha loãng đến 1/20 15 đến 3,5 x 10 4 Nước mặt khác 4 24 giếng pha loãng đến 1/2 24 giếng pha loãng đến 1/20 24 giếng pha loãng đến 1/200 24 giếng pha loãng đến 1/2 000 40 đến 3,2 x 10 6 Nước thải và nước của trạm xử lý nước thải 6 16 giếng pha loãng đến 1/2 Giếng thứ 17 trở lên pha loãng đến 1/200 000 60 đến 6,7 x 10 4 8.2 Chuẩn bị sự pha loãng CHÚ THÍCH Qui trình này phải được thực hiện trong tủ an toàn sinh học về pha loãng và hút bằng pipet, do sợi khí có thể tạo ra. 8.2.1 Nước ngọt và nước lợ (thải) [độ muối < 30="" g/kg,="" đo="" bằng="" máy="" đo="" khúc="" xạ="" (5.5)="" hoặc="" phương="" pháp="" tương=""> Chuẩn bị số lượng ống nghiệm vô khuẩn (5.7) tương ứng theo số lần pha loãng đã chọn, đặt trên một cái giá, cho 9 ml dung dịch pha loãng đặc biệt (7.2.1) vào mỗi ống. Khấy nhẹ mẫu (xem điều 6) để thu được sự phân bổ các loài vi sinh vật đồng nhất và sử dụng pipet vô khuẩn, chuyển ngay 9 ml dung dịch mẫu đồng nhất này vào ống thứ nhất có chứa 9 ml dung dịch pha loãng (7.2.1) (Pha loãng 1/2). Dùng pipet mới, chuyển 1 ml dung dịch này (đã đồng nhất) vào ống thứ hai (pha loãng 1/20). Từ ống thứ hai (đã được đồng nhất và pha loãng 1/20) nếu cần, pha loãng tiếp 1/10 để đạt độ pha loãng 1/200. Tiếp tục như trên tới khi tất cả pha loãng đã được chuẩn bị. 8.2.2 Nước biển (độ muối 30 g/kg) Chuẩn bị số lượng ống nghiệm vô khuẩn (5.7) đặt lên giá, theo số lần pha loãng đã chọn, cho 9 ml nước đã loại khoáng hoặc nước cất (7.2.2) vào ống đầu tiên và 9 ml dung dịch pha loãng đặc biệt (7.2.1) vào các ống khác. Khấy nhẹ mẫu (xem điều 6) để thu được sự phân bổ các loài vi sinh vật đồng nhất và sử dụng pipet vô trùng, chuyển ngay 9 ml dung dịch mẫu đồng nhất này vào ống thứ nhất có chứa 9 ml nước cất (7.2.2) (Pha loãng 1/2). Dùng pipet mới, chuyển 1 ml dung dịch này (đã đồng nhất) vào ống thứ hai (pha loãng 1/20). Từ ống thứ hai (đã đồng nhất và pha loãng 1/20) nếu cần, pha loãng tiếp 1/10 để đạt độ pha loãng 1/200. Tiếp tục như trên tới khi tất cả dung dịch pha loãng đã được chuẩn bị. 8.3 Nuôi cấy và ủ phiến giếng cấy 8.3.1 Nuôi cấy Chuyển toàn bộ các thành phần trong ống thứ nhất vào đĩa Petri đã khử khuẩn có đường kính tối thiểu 90 mm. Dùng pipet nhiều đầu hút (5.8) với 8 ống chóp đã khử khuẩn (5.9), phân phối 200 l vào mỗi giếng của phiến giếng cấy (5.11) tương ứng với sự pha loãng thứ nhất này. Các lần pha loãng sau đó (1/20, 1/200, …) tiến hành như trên nhưng thay đĩa petri và đầu 8 ống chóp pipet giữa mỗi lần pha loãng. Cách khác, có thể dùng hệ thống phù hợp khác để (5.8) để phân chia 200 l của từng dung dịch pha loãng vào giếng cấy theo bảng 1. CHÚ Ý - Cần chú ý sự nhiễm bẩn do tràn từ giếng cấy này sang giếng cấy khác. 8.3.2 Ủ Mỗi lần đem phiến giếng cấy để ủ phải bọc lại bằng băng dính vô trùng dùng một lần dùng cho mục đích nuôi cấy. Ủ phiến giếng cấy (5.2) ở 44 o C ± 0,5 o C ít nhất là 36 h và tối đa là 72 h. CHÚ THÍCH Phiến giếng cấy cần được giữ cẩn thận để không bị nghiêng. 8.4 Đọc kết quả Đặt từng phiến giếng cấy, kể cả băng dính, vào buồng quan sát có lắp đèn UV (5.4). Tất cả các giếng quan sát thấy màu xanh huỳnh quang được coi là dương tính. CHÚ THÍCH Việc đọc có thể tiến hành bất cứ lúc nào sau 36 h, vì ánh sáng huỳnh quang không làm biến đổi kết quả theo thời gian. 9 Thể hiện kết quả 9.1 Xác định số lượng đặc tính Đối với mỗi lần pha loãng đã chọn, ghi lại số lượng giếng cấy dương tính (+). VÍ DỤ 1: Nước bể bơi 1/2 32 + của 64 1/20 5 + của 32 Ghi 32/5 là số lượng đặc tính. VÍ DỤ 2: Nước mặt khác 1/2 24 + của 24 1/20 18 + của 24 1/200 5 + của 24 1/2 000 1 + của 24 Ghi 18/5/1 là số lượng đặc tính VÍ DỤ 3: Nước thải 1/2 16 + của 16 1/20 16 + của 16 1/200 12 + của 16 1/2 000 5 + của 16 1/20 000 0 + của 16 1/200 000 0 + của 16 Ghi 12/5/0 là số lượng đặc tính Khi ba hoặc nhiều dung dịch pha loãng đã được cấy, cần phải ghi lại số lượng đặc tính bằng ba chữ số, kết thúc 0 nếu có thể theo ISO 8199. 9.2 Tính toán MPN và khoảng tin cậy của chúng MPN là ước lượng thống kê của mật độ vi sinh vật, coi là tương ứng với sự phân bố Poisson trong thể tích đã cấy. Khoảng tin cậy được kèm với MPN này. Phần mềm đưa ra ở Phụ lục A hoặc B có thể tính toán MPN của khuẩn đường ruột trên mililit nước đối với từng cấu hình nuôi cấy và khoảng tin cậy 95 %. VÍ DỤ 1: Cho rằng CN là số đặc tính, LO giới hạn dưới và UP giới hạn trên: Nếu CN = 32/5, phần mềm trong Phụ lục A sẽ cho 7,56 khuẩn đường ruột trên mililit. [LO = 5,42 - UP = 10,54], nghĩa là 756/100 ml (542 đến 1054) VÍ DỤ 2: Nếu CN = 18/5/1, phần mềm trong Phụ lục A sẽ cho 159,08/ml. [LO = 101,99 - UP = 248,11] VÍ DỤ 3: Nếu CN = 12/5/0, phần mềm trong Phụ lục A sẽ cho 1 724,61/ml. [LO = 1 003,98 - UP = 2962,50] Nếu không có giếng cấy nào cho kết quả dương tính, thể hiện kết quả như sau: < n/100=""> Trong đó n là MPN đối với 1 giếng cấy dương tính trong điều kiện pha loãng đã dùng. 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm cần bao gồm tất cả chi tiết cần thiết để nhận dạng đầy đủ mẫu, viện dẫn đến phương pháp đã dùng và kết quả. Báo cáo thử nghiệm cũng cần đề cập đến mọi hiện tượng đặc biệt quan sát được trong thử nghiệm và mọi thao tác không qui định hoặc tùy chọn trong phương pháp mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm. 11 Dữ liệu đặc tính của phương pháp Thông tin liên quan đến độ lặp lại và độ tái lập của qui trình, thu được từ phép thử liên phòng thí nghiệm được đưa ra ở Phụ lục D. Phụ lục A (tham khảo) Ví dụ về phần mềm phân tích thống kê MPN 10 REM************************************************************************** 20 REM GENERAL PURPOSE PROGRAM FOR MPN, ITS S.E., C.I. 30 REM AND HOMOGENEITY TEST STATISTICS 40 REM************************************************************************** 50 REM 60 DIM A(10,6),X2(3,9) 70 REM SET PROGRAM LIMITS 80 D9=10 90 U9=50 100 L9=0 110 A1=.0005 120 E1=85 130 REM SET CHI-SQUARED SIGNIFICANCE LEVELS 140 GOSUB 1000 150 REM READ IN RESULTS OF A DILUTION SERIES 160 GOSUB 2000 170 REM CALC AND PRINT THE MPN 180 GOSUB 3000 190 REM CALC AND PRINT S.E. OF LOG10(MPN) 200 GOSUB 4000 210 REM CALC AND PRINT 95 PERCENT C.I. FOR MPN 220 GOSUB 5000 230 REM CALC AND PRINT DEVIANCE 240 GOSUB 6000 250 STOP 1000 REM SET CHI-SQUARE SIGNIFICANCE LEVELS 1010 FOR I=1 TO 3 1020 FOR J=1 TO 9 1030 READ X2(I.J) 1040 NEXT J 1050 NEXT I 1060 REM 5 PERCENT LEVELS DF=1…9 1070 DATA 3.84, 5.99, 7.81, 9.49, 11.07 1080 DATA 12.59, 14.07, 15.51, 16.92 1090 REM 1 PERCENT LEVELS 1100 DATA 6.63, 9.21, 11.34, 13.28, 15.09 1110 DATA 16.81, 18.48, 20.09, 21.67 1120 REM .1 PERCENT LEVELS 1130 DATA 10.83, 13.81, 16.27, 18.47, 20.52 1140 DATA 22.46, 24.32, 26.12, 27.88 1150 RETURN 2000 REM READ IN RESULTS OF A DILUTION SERIES 2010 PRINT "MPN GENERAL PURPOSE PROGRAM" 2020 PRINT "*******************************************" 2030 PRINT " " 2040 PRINT "M.A. HURLEY AND M.E. ROSCOE" 2050 PRINT " " 2060 PRINT "NUMBER OF DILUTION LEVELS……K=": 2070 INPUT N 2080 IF N<1 then="" goto=""> 2090 IF N<=d9 then="" goto=""> 2100 PRINT "ERROR *** LEVELS EXCEED MAXIMUM" 2110 STOP 2120 S1=0 2130 FOR I=1 TO N 2140 PRINT " " 2150 PRINT "LEVEL NUMBER………………………I=":| 2160 PRINT "DILUTION FACTOR………………….D=": 2170 INPUT A(I,2) 2180 PRINT "SUBSAMPLE VOLUME……………...V=": 2190 INPUT A(I,1) 2200 PRINT "NUMBER OF SUBSAMPLES………..N=": 2210 INPUT A(I,3) 2220 PRINT "NUMBER OF POSITIVE SUBSAMPLES..P=": 2230 INPUT A(I,4) 2240 PRINT "IS THE DATA CORRECT FOR LEVEL":|:"(Y OR N)": 2250 INPUT R$ 2260 IF R$="Y" THEN 2280 2270 GOTO 2140 2280 A(I,5)=A(I,1)*A(I,2) 2290 A(I,6)=A(I,5)*A(I,4) 2300 S1=S1+A(I,5)*A(I,3) 2310 NEXT I 2320 RETURN 3000 REM CALCULATES AND PRINTS MPN 3010 B1=0 3020 S3=0 3030 FOR J=1 TO N 3040 E2=A(J,5)*U9 3050 IF E2 3060 E2=0 3070 GOTO 3090 3080 E2=EXP(-E2) 3090 S3=S3+A(J,6)/(1-E2) 3100 NEXT J 3110 IF S3-S1>=0 THEN 3130 3120 GOTO 3200 3130 FOR I=1 TO N 3140 A(I,5)=A(I,5)*2 3150 A(I,6)=A(I,6)*2 3160 NEXT I 3170 S1=S1*2 3180 B1=B1+1 3190 GOTO 3020 3200 X3=L9 3210 X4=U9 3220 X=(X3+X4)/2 3230 S=0 3240 FOR I=1 TO N 3250 E2=A(I,5)*X 3260 IF E2 3270 E2=0 3280 GOTO 3300 3290 E2=EXP(-E2) 3300 S=S+A(I,6)/(1-E2) 3310 NEXT I 3320 IF ABS(S-S1) 3330 IF S-S1>0 THEN 3360 3340 X4=X 3350 GOTO 3220 3360 X3=X 3370 GOTO 3220 3380 X5=X*(2^B1) 3390 PRINT " " 4000 REM CALCS AND PRINTS S.E OF LOG10 (MPN) 4010 S2=0 4020 FOR I=1 TO N 4030 X3=A(I,5) 4040 E2=X3*X 4050 IF E2 4060 X4=0 4070 GOTO 4090 4080 X4=EXP(-E2) 4090 S3=X3*X3*A(I,3)*X4 4100 S3=S3/(1-X4) 4110 S2=S2+S3 4120 NEXT I 4130 V=1/(X*X*S2) 4140 S1=SQR(V)/LOG(10) 4150 PRINT " " 4160 PRINT "S.E. OF LOG10 (MPN)=":S1 4170 RETURN 5000 REM CALCS 95 PERCENT C.I. FOR MPN 5010 X3=LOG(X)+B1*LOG(2) 5020 S2=SQR(V) 5030 U=EXP(X3+1.96*S2) 5040 L=EXP(X3-1.96*S2) 5050 PRINT " " 5060 PRINT "95 PERCENT C.I. =":L:"TO":U 5070 RETURN 6000 REM CALCS. AND PRINTS DEVIANCE 6010 S3=0 6020 FOR I=1 TO N 6030 S4=0 6040 IF A(I,4)<=0 goto=""> 6050 E2=A(I,5)*X 6060 IF E2 6070 E2=0 6080 GOTO 6100 6090 E2=EXP(-E2) 6100 S4=A(I,4)*LOG(A(I,4)/(A(I,3)*(1-E2))) 6110 S3=S3+S4 6120 S4=0 6130 IF A(I,4)>=A(I,3) GOTO 6160 6140 S4=A(I,3)-A(I,4) 6150 S4=S4*(LOG(S4/A(I,3))+A(I,5)*X) 6160 S3=S3+S4 6170 NEXT I 6180 D=2*S3 6190 REM CHI-SQUARED TEST OF DEVIANCE 6200 V=N-1 6210 PRINT " " 6220 PRINT "DEFIANCE =":D:"ON":V:"D.F." 6230 PRINT " " 6240 PRINT "CHI-SQUARED SIGNIFICANCE LEVELS FOR":V:"D.F." 6250 PRINT " 5 PERCENT ":X2(1,V) 6260 PRINT " 1 PERCENT ":X2(2,V) 6270 PRINT " .1 PERCENT ":X2(3,V) 6280 RETURN 7000 END Phụ lục B (tham khảo) Ví dụ về phần mềm ước tính MPN 10 DIM T (20) 20 DIM M (20) 30 DIM P (20) 40 L = 0 45 CLS : L = L + 1 50 PRINT "CALCULATION OF MPN N ":L 60 PRINT "………………………………." 70 A = 1 80 PRINT 90 INPUT "NB OF DILUTIONS":DI:PRINT : PRINT 110 PRINT 120 P = 0; S = : U = 0 130 FOR I = 1 TO DI 140 PRINT "DILUTION":I 150 INPUT "NB OF POSITIVE WELLS..": P(I) 155 INPUT "NB OF WELLS………………": T(I) 160 INPUT "WATER VOLUME/WELL (ML)…":M(I):PRINT 170 P = P(I) + P 180 S = ((T(I) - P(I))*M(I)) + S 190 U = (M(I) * T(I)) + U 200 NEXT I 280 K = 1 290 NP = (P/U) * 2 ^ (K + K/2 + K/4 + K/8 + K/16 + K/32 + K/64 + K/128 + K/256 + K/512) 300 PM = 0 310 FOR I = 1 TO DI 320 PM = PM + ((P(I) * M(I) * EXP (-M(I) * NP)) / (1 - EXP(-M(I) * NP))) 330 NEXT I 340 IF PM < s="" then=""> 350 K = K + A 360 GOTO 290 370 DT= S - PM 380 IF ABS (DT) <= .000005="" goto=""> 390 K = K - A 400 A = A / 10 410 GOTO 290 702 FOR I = 1 TO DI:ES = ES + P(I):NEXT I 710 FOR I = 1 TO DI 720 K(I) = (T(I) * (M(I)^2)) 730 NEXT I 740 FOR I = 1 TO DI 745 IF (NP * M(I) > 88 THEN E(I) = 1.65E38:GOTO 760 750 E(I) = (EXP (M(I) * NP) -1) 760 NEXT I 770 LL = 0 780 FOR I = 1 TO DI 790 LL = LL + (K(I) / E(I)) 800 NEXT I 810 CL = (LOG (NP) - (1.96 * (1 / (NP * SQR (LL))))) 817 CU = (LOG (NP) + (1.96 * (1 / (NP * SQR (LL))))) 840 NP = INT (NP * 100 + .5) / 100 850 PRINT : PRINT " NPP = ":NP:"/ ML" 860 PRINT : PRINT 870 PRINT "LIMITS INF=":INT (EXP (CL)*100 + .5)/100:" / ML SUP=":INT (EXP (CU)*100 + .5)/100:" / ML" 880 PRINT : PRINT : INPUT "DO YOU WANT ANOTHER MPN (Y/N)?":RE$ 890 IF RE$ = "N" THEN END 900 GOTO 45 Lệnh Sau khi hiển thị số chạy (L, dòng 50) Nhập số pha loãng (dòng 90) Đối với mỗi dung dịch pha loãng - hiển thị số lần pha loãng (dòng 140), - nhập số giếng hoặc ống phản ứng dương tính (dòng 150), - nhập số giếng cấy dung dịch pha loãng (dòng 155), - nhập thể tích nước đã cấy trên một giếng, tính bằng mililit (dòng 160). Tính toán MPN theo De Man [2] (dòng 280-410). Tính toán giới hạn dưới và giới hạn trên của khoảng tin cậy theo De Man [2] (dòng 770-817). Hiển thị - MPN (trên ml) (dòng 850), - giới hạn dưới (trên ml) (dòng 870), - giới hạn (trên ml) (dòng 870). Câu hỏi: "Có chạy tiếp không?:" Nếu không: END. Phụ lục C (tham khảo) Muối biển tổng hợp C.1 Thành phần ion chính của muối biển tổng hợp Ion chính % khối lượng tổng Nồng độ ion ở độ muối 34 g/kg (mg/l) Clorua (Cl - ) 47,470 18 740 Natri (Na + ) 26,280 10 454 Sunphat (SO 4 -2 ) 6,602 2 631 Magiê (Mg + ) 3,230 1 256 Canxi (Ca +2 ) 1,013 400 Kali (K + ) 1,015 401 Bicacbonat (HCO 3- ) 0,491 194 Bo (B) 0,015 6,0 Strontri (Sr +2 ) 0,001 7,5 TỔNG CHẤT RẮN 86,11 34 089,50 Nước (H 2 O) 13,88 TỔNG SỐ 99,99 C.2 Ví dụ về chuẩn bị các dung dịch từ các chất đã định Ba dung dịch cơ bản được làm như sau: Dung dịch A CaCl 2 .2H 2 O 83,6 g KCl 43,5 g SrCl 2 .6H 2 O 0,07 g Nước cất đến 1 000 ml Dung dịch B NaHCO 3 15,15 g Na 2 B 4 O 2 3,0 g Nước cất đến 1 000 ml Dung dịch C MgSO 4 .7H 2 O 190,0 g MgCl 2 .6H 2 O 147,0 g Nước cất đến 1 000 ml Pha loãng dung dịch được pha bằng cách thêm đến 960 ml nước cất, 10 ml dung dịch A, 10 ml dung dịch B, 20 ml dung dịch C và 14,9 g natri clorua, trộn đều đến khi tan hoàn toàn và điều chỉnh pH đến 7,5 ± 0,2. Dung dịch pha loãng được chia vào các bình chứa có thể tích yêu cầu và khử khuẩn bằng nồi hấp ở (121 ± 3) o C trong 15 min. Phụ lục D (tham khảo) Đặc tính của phương pháp Độ lặp lại (r) và độ tái lập (R) được tính theo TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) đã nêu dưới đây là phần của phép thử liên phòng thí nghiệm: Nước bể bơi (mẫu thêm, 100 phòng thí nghiệm ở Pháp, làm 3 đợt vào năm 1995 và 1996) (một nước biển và hai nước ngọt, không có sự sai khác đáng kể): i) Tại mức 100 khuẩn đường ruột/100 ml r = 1,5 R = 2,7 ii) Tại mức 400 khuẩn đường ruột/100 ml r = 2,1 R = 3,7 Và thời gian thử nghiệm (trong 1993 và 1994) của chín phòng thí nghiệm và bốn mẫu (nhiễm bẩn tự nhiên): b) Nước sông có chứa từ 2,2 x 10 3 đến 1,5 x 10 4 khuẩn đường ruột/100 ml r = 1,5 R = 2,7 c) Nước cống có chứa từ 1,9 x 10 4 đến 5,1 x 10 5 khuẩn đường ruột/100 ml r = 2,6 R = 3,9 Phụ lục E (tham khảo) Chuẩn cứ chất lượng để sản xuất môi trường trong phiến giếng cấy Ε.1 Khái quát Đối với mỗi chuẩn cứ sau đây, kiểm soát chất lượng cần phải được thực hiện trên từng mẻ phiến giếng cấy được sản xuất. Phiến giếng cấy được thử nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên hoặc hệ thống để cấu thành nên mẫu theo ISO 3951, tương ứng với mức kiểm soát chung No.II của kiểm soát thông thường. Ngưỡng dương tính của phiến giếng cấy được định rõ do bị mức huỳnh quang dẫn đến kết quả đọc dương tính không bị mờ, tới mắt nhìn, dưới ánh sáng Wood (366 nm). Mức này được đo khi áp dụng điều khoản của phụ lục F. Chuẩn cứ chất lượng chú ý được đưa ra từ Ε.2 đến Ε.5. Mẻ cần được loại bỏ nếu bất cứ chuẩn cứ nào không được đáp ứng. Ε.2 Ngưỡng Không có giếng cấy dương tính trong mỗi phiến giếng cấy mẫu, sau khi cấy dung dịch pha loãng tiệt trùng đặc biệt và ủ trong 48 h ở (44 ± 0,5) o C. Số giếng cấy chứa môi trường nuôi cấy có phản ứng dương tính phải dưới 25 % ngưỡng dương tính đã quy định ở trên và hệ số phương sai phải dưới 10 %. Ε.3 Mức huỳnh quang trung bình Đây là trung bình hình học của dấu hiệu huỳnh quang thu được từ 96 giếng của phiến giếng cấy đã cấy đồng nhất 200 l cho mỗi giếng huyền phù Ε. faecalis CCM 2541 chứa 500 vi sinh vật trên ml. Dung dịch pha loãng đặc biệt (7.2.1), và ủ ở 48 h tại (44 ± 0,5) o C. Dấu hiệu trung bình thu được như vậy cần phải ít nhất là hai lần ngưỡng dương tính và hệ số phương sai phải dưới 10 %. Ε.4 Độ sinh sản Độ sinh sản được tính là tỉ số của số lượng các loài quan sát được với mẻ của phiến giếng cấy thử nghiệm với số vi sinh vật dự đoán với vật liệu chuẩn bền vững (giá trị mục tiêu). Mức nồng độ cần phải xung quanh độ chính xác tối đa của phương pháp, nghĩa là khoảng một vi sinh vật trên giếng (500/100 ml). Độ bền và độ đồng nhất (giá trị mục tiêu và khoảng tin cậy) của mẫu chuẩn cần phải được xác định với một (hoặc một vài) mẻ phiến giếng cấy đã chấp nhận. Ngưỡng chấp nhận của phiến giếng cấy được thử ở 0,66 đến 1,5 giá trị quan tâm. Hệ số phương sai cần phải thấp hơn 10 %. Các chủng được thử nghiệm là: Ε.faecium WR63 Có thể lấy từ RIVM, Bilthoven, Hà Lan Có thể lấy từ Bộ sưu tập vi sinh vật của Séc, Brno, Cộng hòa Séc Thời gian ủ là 48 h ở (44 ± 0,5) o C. Ε.5 Cản trở Khả năng chọn lọc của phiến giếng cấy được thử nghiệm bằng cách cấy vi sinh vật giống với các loại mục tiêu: Có thể lấy từ Viện Pasteur, Pari, Pháp Huyền phù có chứa từ 10 4 đến 10 5 các vi sinh vật này trên 100 ml được cấy vào từng phiến giếng cấy thử nghiệm dựa trên 32 giếng trên một chủng. Sau khi ủ khoảng 48 h tại (44 ± 0,5) o C, không giếng nào cho thấy huỳnh quang rõ ràng hơn chuẩn cứ đã qui định về ngưỡng nền (25 % của ngưỡng phản ứng dương tính) hoặc kết tủa formazan. Phụ lục F (qui định) Chuẩn bị phiến giếng cấy hiệu chuẩn F.1 Vật liệu và thuốc thử Thiết bị phòng thí nghiệm hiện có (cân chính xác, pH mét, dụng cụ thủy tinh) và: F.1.1 4-metylumbeliferon. F.1.2 Etanol. F.1.3 0,8 % dung dịch natri clorua. F.1.4 Glyxin. F.1.5 Natri hydroxyt. F.1.6 Phiến giếng cấy 96 giếng. F.2 Chuẩn bị dung dịch gốc Chuẩn bị dung dịch gốc 4-metylumbeliferon trong etanol bằng cách hỗn hợp như sau: 4-metylumbeliferon 0,044 g Etanol 10 ml F.3 Chuẩn bị dung dịch đệm F.3.1 Chuẩn bị các dung dịch sau Dung dịch glyxin: Hòa tan 7,507 g glyxin và 5,84 g natri clorua trong 1000 ml nước cất. Dung dịch natri hydroxit: Hòa tan 4 g natri hydroxit trong 1000 ml nước cất. F.3.2 Cho 56,5 ml dung dịch glyxin [F.e.1a)] vào 43,5 ml dung dịch natri hydroxit [F.3.1 b)] vào cốc mỏ và máy khuấy. Kiểm tra giá trị pH là 10,3 bằng pH mét. F.4 Chuẩn bị bản hiệu chuẩn Tất cả các thao tác sau cần phải tiến hành ở nhiệt độ phòng. Tất cả các dung dịch pha loãng cần được chuẩn bị sử dụng dung dịch natri clorua 0,8 % (F.1.3). Chuẩn bị ngay dung dịch 1/100 dung dịch gốc (F.2). Từ dung dịch thu được này, hàng ngày chuẩn bị các dung dịch sau. ST 1: 100 l dung dịch vừa chuẩn bị + 0,9 ml dung dịch NaCl 0,8 %. ST2: 0,5 ml dung dịch ST1 + 0,5 ml dung dịch NaCl 0,8 %. ST3: 0,5 ml dung dịch ST2 + 0,5 ml dung dịch NaCl 0,8 %. ST4: 0,5 ml dung dịch ST3 + 0,5 ml dung dịch NaCl 0,8 %. ST5: 0,5 ml dung dịch ST4 + 0,5 ml dung dịch NaCl 0,8 %. Hiển thị các dung dịch khác nhau trong các cột lẻ của phiến giếng cấy (F.1.6), như trong hình F.1 dưới đây (các cột chẵn không sử dụng). Hình F.1 Cho vào từng giếng 100 l dung dịch đệm có pH 10,3 (F.3.2). Do vậy thu được trong khoảng từ 0 pg đến 1 500 pg 4-metylumbeliferon trên microlit. CHÚ THÍCH - Thực nghiệm cho thấy ngưỡng có phản ứng dương tính với 4-metylumbeliferon SIGMA (mẻ số M-1381) và phiến giếng cấy trong suốt có đáy bằng NUNC (ref. 1352) là 367 pg/ l nếu phiến giếng cấy được đổ đầy dung dịch ST3 như mô tả trong phụ lục này. Phụ lục G (tham khảo) Thư mục tài liệu tham khảo [1] TCVN 6910-1 (ISO 5725-2 : 1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập lại của phương pháp đo tiêu chuẩn. [2] DE MAN J.C. The probability of most probable numbers. Eur. J. Appl. Microbiol., 1. 1975, pp. 67-78. [3] DEVRIESE L.A., COLLINS M.D. and WIRTH R. The Genus Enterococcus. In : A. Balows et al. (Ed.) The Prokaryotes. 2nd edn., Vol. ii. 1992, pp. 1485-1481, Springer, NY. [4] HURLEY M. A. and ROSCOE M.E. Automated statistical analysis f microbial enumeration by dilution series. [5] KLEE A.J. A computer program for the determination of most probable numbers and its confidence limits, Microbiol. Methods, 18, 1993, pp. 91-98. 1) ISO 5667-2 : 1991 đã bị hủy và được thay bằng ISO 5667-1 : 2006 2) ISO 5667-1 đã có phiên bản năm 2006 3) ISO 8199 đã có phiên bản năm 2005 4) Phân tích điển hình của sản phẩm có sẵn trên thị trường và muối biển tổng hợp phù hợp được đưa ra ở Phụ lục C. Dung dịch NaCl tinh khiết không phù hợp vì chúng có ảnh hưởng ức chế đáng kể. 5) Tween® 80 là một ví dụ về sản phẩm phù hợp có sẵn ngoài thị trường. Thông tin này được đưa ra chỉ tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn này mà không phải là xác nhận của ISO về sản phẩm này.