TCVN9781:2013

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9781:2013 (ISO 834-3:1994) về Mật ong - Xác định dư lượng các chất chuyển hóa của nitrofuran (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS-MS TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9781 : 201 3 ISO 834-3:1994 MẬT ONG - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NITROFURAN (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC-MS-MS Honey - Determination o f residues of nitro f uran metabolites (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) by liquid chromatography mass - Spectrometry LC-MS-MS Lời nói đ ầ u TCVN 9781 : 2013 do Trung tâm kiểm tra vệ sinh Thú y TƯ1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. MẬT ONG - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NITROFURAN (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC-MS-MS Honey - Determination o f residues of nitro f uran metabolites (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) by liquid chromatography mass - Spectrometry LC-MS-MS 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng các chất chuyển hóa của nitro f uran gồm furazolidone (AOZ), f uraltadone (AMOZ), ni t ro f urantoin (AH D ) và nitrofurazone (SEM) trong mật ong bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS-MS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,3 m g / kg. 2. Nguyên tắc Dư lượng các chất chuyển hóa nhóm nitro f uran trong mật ong được th ủy phân bằng axit clohydric loãng để thu được mạch nhánh của các chất chuyển hóa nhóm nitro f uran gồm AOZ, AMOZ, AHD, SEM. Các mạch nhánh này được dẫn xuất hóa bằng 2-nitrobenzaldehyt để tạo thành NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM. Xác định và định lượng các chất dẫn xuất này bằng kỹ thuật sắc ký l ỏ ng ghép khối ph ổ LC-MS-MS. 3. Thuốc thử Trong tiêu chuẩn này, chỉ sử dụng thuốc th ử có cấp độ tinh khiết, phân tích và nước cất hai lần đã loại ion. 3.1 . Chuẩn 3-amino-2-oxazolidinon (AOZ), 99,0 %; 3.2 . Chuẩn 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon (AMOZ) , 99,0 %; 3.3 . Chuẩn 1-amino-hydantoin hydroclorit (AHD) , 99,0 %; 3.4 . Chuẩn Semicarbazit (SEM) hy d roclorit ; 3.5 . Chuẩn nội 1-amino-hydantoin-d 2 hydroclorid (AHD-d 2 ); 3.6 . Chuẩn nội Semicarbazit - 13 C 14 N 2 (SEM- 1 3 C 14 N 2 ) ; 3.7 . Chuẩn nội 3-amino-2-oxazolidinon-d 4 hydroclorit (AOZ- d 4 ); 3.8 . Chu ẩ n nội 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon-d 5 (AMOZ-d 5 ); 3.9. 2-nitrobenzaldehyt (C 7 H 5 NO 3 ) , loại dùng cho phân tích; 3.10. Dimethyl sul f oxit , loại dùng cho phân tích; 3.11. Acetonitril , loại dùng cho LC/MS; 3.12. Methanol , loại dùng cho LC/MS; 3.13. Nước , loại dùng cho LC/MS; 3.14. Ethyl acetate , loại dùng cho phân tích; 3.15. Axit HCl 37 % , loại dùng cho phân tích; 3.16. NaOH , loại dùng cho phân tích; 3.17. K 2 HPO 4 , loại dùng cho phân tích; 3.18. N-hexan , loại dùng cho phân tích; 3.19. Ammonium f ormate , loại dùng cho phân tích. 3.20. Dung dịch HC l 1 N trong nước: H òa tan 83,4 ml axít HCI 37 % (3.1 5 ) với nước cất hai lần đã loại ion, định mức trong bình định mức 1000 ml. Bảo quản ờ nhiệt độ phòng trong 6 tháng. 3.21. Dung dịch 2-nitrobenzaldehyt 0,05 M trong dimethylsulfoxit: H òa tan 0,19 g 2-nitrobenzaldehyt (3.9) vào 25 ml dimethylsul f oxit (3.10). Dung dịch này chuẩn bị hàng ngày. 3.22. Dung dịch K 2 HP O 4 0,1 M trong nước: Cân 1,78 g K 2 HPO 4 (3.17) vào cốc có mỏ, hòa tan trong 80 ml nước cất hai lần đã loại ion. Ch ỉ nh pH tới 7,4 và chuyển vào bình định mức 100 ml, sau đó thêm nước cất hai lần đã loại ion cho tới vạch. B ả o quản ở nhiệt độ phòng trong 01 tháng. 3.23. Dung dịch NaOH 1 N trong nước: Cân 4 g NaOH khan (3.16) vào cốc có mỏ, hòa tan bằng nước cất hai l ầ n đã loại ion và chuyển vào b ì nh định mức 100 ml, định mức bằng nước cất hai lần đã loại ion đến vạch. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 02 tháng. 3.24. Dung dịch chuẩn gốc AOZ, AMOZ, AHD, SEM, AOZ-d 4 , AMOZ-d 5 , SEM- 1 3 C 14 N 2 , AHD-d 2 1000 m g / ml trong methanol: Cân 50 mg mỗi loại chuẩn vào các bình định mức dung tích 50 ml riêng biệt (4.11). H òa tan và định mức đến vạch bằng methanol (3.12) để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 m g / ml. Dung d ịch chuẩn gốc được bảo qu ả n ở -20 ° C trong 6 tháng. Hò a tan mỗi loại nội chuẩn đóng trong ampul bằng một thể tích methanol thích hợp để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 m g / ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở -20 ° C trong 6 tháng. LƯU Ý: - Lượng chuẩn mỗi loại phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn gốc 1000 m g / ml sau khi tính toán và hiệu ch ỉ nh theo giấy chứng nhận độ tinh khiết của nhà sản xuất. - Thể tích methanol thích hợp phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn nội gốc 1000 m g / ml tùy theo quy cách đóng gói của nhà sản xuất. 3.25. Dung dịch chu ẩ n hỗn hợp trung gian AOZ, AMOZ, AHD, SEM, 1000 m g / I trong methanol: Lấy 100 m l từ mỗi dung dịch chuẩn gốc (3.24) cho vào b ì nh định mức 100 ml, định mức đến vạch với methanol (3.12). Dung dịch chuẩn n à y được bảo quản ở -20 ° C trong 3 tháng. 3.26. Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc AOZ, AMOZ, AHD, SEM, 100 m g / l trong methanol: Từ dung dịch chuẩn trung gian (3.25) lấy 1000 m L cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch với methanol (3.12). Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở 4 ° C trong 1 tuần. 3.27. Dung dịch chu ẩ n nội hỗn h ợ p trung gian AOZ-d 4 , AMOZ-d 5 , SEM- 13 C 14 N 2 , AHD- d 2 1000 m g /l trong methanol: Từ dung dịch nội chuẩn gốc (3.24), lấy 100 m L cho vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch với methanol. Dung dịch chuẩn này được b ả o quản ở -20 ° C trong 3 tháng. 3.28. Dung dịch chu ẩ n nội hỗn hợp làm việc AOZ- d 4 , AMOZ-d 5 , SEM- 13 C 14 N 2 , AHD- d 2 , nồng độ 100 m g / l trong methanol: Lấy 1000 m l dung dịch nội chuẩn hỗn hợp trung gian (3.27) cho v à o b ì nh định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng methanol. Dung dịch chuẩn này được bảo qu ả n ở 4 o C trong 1 tuần. 3.29. Dung dịch pha động: Pha động A: Methanol (3.12); Pha động B: Dung dịch ammonium f ormate 1 mM Cân 0,0315 g ammonium f ormate (3.19) v à o cốc có mỏ, h òa tan và chuyển vào b ì nh định mức 1000 ml bằng nước (3.13). Dung d ị ch này chu ẩ n bị h à ng ngày. 3.30. Dung d ịch hòa tan mẫu : Hòa tan dung dịch pha động B và methanol theo tỉ lệ 1:1. 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau: 4.1. Hệ thống máy sắc ký l ỏ ng khối phổ LC/MS/MS - Bơm 2 kênh dung môi biến đổi dòng; - Detector MS / MS; - Máy tính và phần mềm phân tích; - Cột sắc ký RP C18, đường kính trong là 2,1 cm, kích thước hạt nhồi là 1,7 m m, độ dài của cột là 50 mm; 4.2 . Ố ng ly tâm polypropylene , dung tích 50 ml có nắp; 4.3 . Máy ly tâm lạnh , tốc độ 4000 r / min; 4.4 . Máy lắc ngang , 400 r / min; 4.5 . Máy lắc vortex , tốc độ 400 r / min; 4.6 . Bộ cô quay chân không , có điều ch ỉ nh nhiệt độ; 4.7 . Bình quả lê , dung tích 50 ml; 4.8 . Máy đo pH , độ chính xác đến 0,01; 4.9 . Tủ ấm , c ó điều ch ỉ nh nhiệt độ; 4.10 . Cân phân tích , có độ chính xác đến 0,1 mg; 4.11 . Bình định mức , dung tích 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml và 1000 ml; 4.12 . Pipet tự động , d ung tích 50 m l, 100 m l, 250 m l; 1000 m l; 5000 m l; 4.13 . Ố ng th ủy tinh , dung tích 10 ml; 4.14 . Lọ đựng mẫu , dung tích 1,5 ml; 4.15 . Đầu lọc nylon , đường kính lỗ 45 m m. 5. Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này nhưng mẫu phân tích tại phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư h ỏ ng hoặc bị biến đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. 6. Chuẩn bị mẫu 6.1. Chuẩn bị mẫu thử Cân 5,0 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm (4.2). Cho vào 50 m l hỗn hợp chuẩn nội nitro f uran 100 m g / l (3.28). 6.2. Chuẩn bị mẫu trắng M ẫ u trắng là mẫu mật ong đã được xác định không nhiễm chất chuyển hóa của nitro f uran. M ẫ u trắng được chuẩn bị như mẫu thử. 6.3. Chuẩn bị mẫu kiểm soát M ẫ u kiểm soát được chuẩn bị từ mẫu trắng như mẫu thử nhưng sau khi cân có bổ sung 50 m L hỗn hợp chuẩn nitro f uran 100 m g / l (3.26) vào mẫu. Lắc 30 giây (4.5), sau đó đ ể yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo. 6.4. Chu ẩ n b ị mẫu xây dựng đường chu ẩ n M ẫ u thêm chuẩn được chuẩn bị từ mẫu trắng. Cân 5,0 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml (4.2); cho dung dịch chuẩn hỗn hợp nitro f uran 100 m g / l (3.26) và hỗn hợp chu ẩ n nội nitro f uran 100 m g / l (3.28) vào các ống nghiệm có chứa mẫu trắng theo bảng 1. Tiến hành lắc 15 giây (4.5), sau đó để yên 15 min trước khi thực hiện các bước tiếp theo. Bảng 1 - Xây dựng đường chuẩn STT Nồng độ chu ẩ n thêm vào ( m g / l ) Thể tích chu ẩ n thêm vào ( m l ) N ồ ng độ chu ẩ n lý thuyết ( m g / kg) N ồ ng độ nội chuẩn thêm vào ( m g / l ) Thể tích chuẩn nội thêm vào ( m l) Nồng độ chuẩn nội ( m g / kg) 1 100 5 0,1 100 50 1 2 100 10 0,2 100 50 1 3 100 50 1 100 50 1 4 100 100 2 100 50 1 5 100 250 5 100 50 1 7. Tiến hành thử nghiệm 7.1. Chiết mẫu và làm sạch mẫu Thêm 10 ml nước (3.13), 1 ml HC l 1 N (3.20) vào từng lọ mẫu. Lắc trong 15 giây (4.5), sau đó lắc 15 min trên máy lắc mẫu (4.4) ở tốc độ 300 r / min. Tiếp theo, thêm cho 400 m L 2-nitrobenzaldehyt 0 , 05 M (3.21) v à o tất cả các mẫu. Lắc 15 giây (4.5), sau đó ủ bằng tủ ấm (4.9) ở 60 ° C trong 3 h hoặc ở 37 ° C trong 16 h. Sau khi ủ, lấy ra để cho mẫu tr ở về nhiệt độ phòng. Sau khi mẫu đã tr ở về nhiệt độ phòng, cho vào mỗi mẫu 10 m l n-Hexan (3.18). Lắc 15 giây ở (4.5). Ly tâm mẫu ở 3000 vòng trong 5 min (4.3). Loại bỏ lớp trên và lập lại bước này lần 2. Tiếp theo cho vào mỗi mẫu 1 ml NaOH 1 N (3.23), 2 ml K 2 HP O 4 0,1 M (pH = 7,4) (3.22) và lắc đều. Tiếp theo, thêm 20 ml ethyl acetate (3.14). Lắc trong 5 giây ở (4.5), sau đó lắc đảo lộn 20 lần. Ly tâm mẫu ở 3000 vòng trong 5 min (4.3). Hút lớp trên vào bình quả lê 50 ml (4.7). Sau đó cho 10 ml ethyl acetate (3.14) vào và lập lại bước này. Thu lớp ethyl acetate gộp v à o bình quả lê (4.7), sau đ ó làm khô bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 45 ° C (4.6). Hòa tan phần cặn bằng 0,5 ml dung dịch hòa tan mẫu methanol: Amonium f ormate (3.30). Lắc trong 30 giây ở (4.5). Dịch thu được lọc qua đầu lọc 0,45 m m (4.15) vào lọ đựng mẫu (4.14) để phân tích sắc ký. 7.2. Tiến hành thử nghiệm trên LC-MS-MS 7.2.1. Điều kiện HPLC - Cột sắc ký RP C18, đường kính trong là 2,1 cm, kích thước hạt nhồi l à 1,7 m m, độ dài của cột là 50 mm; - Nhiệt độ cột theo nhiệt độ phòng; - Thể tích bơm mẫu: 10 m l; - Thời gian phân tích: 4 min; - Tốc độ dòng: 0,4 ml / min; Pha động: chương trình gradient thể hiện theo bảng 2. Bảng 2 - Chương trình pha động Thời gian (min) A % (Methanol LC/MS) B % (Dung dịch ammonium f ormate 1 mM) 0 55 45 2,0 55 45 2,1 90 10 3,5 90 10 3,6 55 45 7.2.2. Điều kiện trên MS Điều kiện trên MS như sau: Kiểu ion hóa: ESI (+); Nhiệt độ nguồn ion hóa: 150 o C; Nhiệt độ hóa hơi dung môi: 400 o C; Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi: 600 l / h; Tốc độ dòng khí qua khối nón: 30 l / h; Các điều kiện phân ly MS/MS như sau: B ả ng 3 - Điều kiện phân ly MS/MS Thành phần l on sơ cấp (m/z) lon thứ c ấ p (m/z) Năng lượng mặt nón (V) Năng lượng va chạm (eV) NPAMOZ 335 262 291 (*) 24 24 16 11 NPAMOZ-d 5 340 296 24 11 NPAOZ 236 104(*) 134 24 24 20 12 NPAOZ-d 4 240 104 24 20 NPSEM 209 166 (*) 192 20 20 9 12 NP IS-SEM 212 169 20 9 NPAHD 249 194 178 (*) 20 20 11 16 NP-AHD-d 2 251 180 20 16 GHI CHÚ: ion có kí hiệu (*) là ion dùng để định l ượ ng; 7.3. Trình tự bơm mẫu 7.3.1. Bơm dung môi kiểm tra máy , dung dịch hòa tan mẫu (3.201); 7.3.2. Bơm các dung dịch lập đường chuẩn; 7.3.3. Bơm mẫu trắng; 7.3.4. Bơm mẫu kiểm soát; 7.3.5. Bơm mẫu thử. 8. Tính toán và biểu thị kết quả 8.1. Tính hệ số tín hiệu Tính cho từng chất cần phân tích theo phương trình : Trong đó: RF: hệ số tín hiệu; Sp: tổng diện tích pic của các ion thứ cấp của chất cần phân tích; Sp IS : diện tích pic của ion thứ cấp của chất chuẩn nội tương ứng. 8.2. Xây dựng đường chuẩn Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu với nồng độ chất chuẩn cho vào mẫu thực được chuẩn bị mẫu theo mục 6.4. Phương trình có dạng: RF = ax + b. Trong đó: - RF: Hệ số tín hiệu, t í nh theo mục 8.1; - x: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu, chuẩn bị theo mục 6.4; - b: điểm cắt của đường chuẩn với trục tung; - a: hệ số góc của đường chuẩn. Phương trình đạt yêu cầu khi hệ số hồi quy R 2 ≥ 0,99. 8.3. Hàm lượng ch ấ t phân tích trong mẫu Dư lượng chất cần phân tích trong mẫu được tính theo phương pháp đường chuẩn xây dựng theo mục 8.2. Nồng độ trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau: Trong đó: C: là nồng độ chất phân tích có trong mẫu, tính bằng m g / kg; C x : là nồng độ chất phân tích đo được suy ra từ đường chuẩn, m g / l ; V: là thể tích định mức cuối cùng, tính bằng ml; F: là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1); a: là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g); 8.4. Biểu thị kết quả Kết quả được biểu thị bằng đơn vị m g / kg (ppb), hai số sau dấu phẩy. 9. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: - Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đ ủ mẫu thử; - Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; - Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm; - Độ lập l ạ i của phương pháp; - Kết quả thử nghiệm thu được. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Quy trình chuyển giao phương pháp phân tích chất chuyển hóa của nitro f uran trong mật ong của Cơ quan dịch vụ phân tích quốc tế (QSI) - Cộng hòa liên bang Đức; [2] Nitro f uran metabolites in Honey. Standard Operating Proc e dure, # M-H220. JR laboratories Inc. [3] Decision 2002/657/ CE.