TCVN11517:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11517:2016 về Dầu mỡ động vật và thực vật - Xác định monoglycerid và diglycerid - Phương pháp sắc ký khí TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11517:2016 DẦU MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT - XÁC ĐỊNH MONOGLYCERID VÀ DIGLYCERID - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ Animal and vegetable fats and oils - Determination of mono-and diglecerides - Gas chromatographic method Lời nói đầu TCVN 11517:2016 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 993.18, Mono- and Diglycerides in Fats and Oils, Gas Chromatographic Method ; TCVN 11517:2016 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật và th ự c vật biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. DẦU MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT - XÁC ĐỊNH MONOGLYCERID VÀ DIGLYCERID - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ Animal and vegetable fats and oils - Determination of mono-and digl y cerides - Gas chromatographic method 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định monoglycerid và diglycerid ở dạng đậm đặc và trong dầu mỡ động vật và thực vật. Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng cho các dạng nhũ tương khác và các thành phần của dầu mỡ (glycerol, axit béo, sterol, v . v . ) được chuyển hóa thành dẫn xuất trimethylsilylether. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công b ố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 6128 (ISO 661) Dầu mỡ động vật và thực vật - Chuẩn bị mẫu thử . 3 Nguyên tắc Monoglycerid và diglycerid được phản ứng với bis(trimethylsilyl)trifluoro axetamid (BSTFA) và trimethylchlorsilan (TMCS) trong pyridin tạo thành các dẫn xuất trimethylsilylether dễ bay hơi. Tách các dẫn xuất bằng s ắ c ký khí (GC) và phát hiện bằng ion hóa ngọn lửa. Có thể sử dụng n -tetradecan làm chất chuẩn nội. 4 Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác. 4.1 Thuốc thử silyl hóa 4.1.1 Bis(trimethylsilyl)trifluoro acetamid (BSTFA). 4.1.2 Trimethylchlorsilan (TMCS). 4.2 Pyridin , bảo quản bằng kali hydroxit. 4.3 n -Hexan. 4.4 Chất chuẩn nội , n -tetradecan, độ tinh khiết tối thiểu đạt 99 %. 4.5 Dung dịch chu ẩ n nội Cân khoảng 100 mg n -tetradecan (4.4), chính xác đến 0,2 mg, cho vào bình định mức 10 ml và pha loãng bằng pyrindin đến vạch. 4.6 Chất chuẩn Glycerol, axit palmitic, 1-palmitoyl glycerol, 1-stearoyl glycerol, 1,2-dipalmitoyl glycerol; 1,3-dipalmitoyl glycerol, 1,2-distearoyl glycerol. Tất cả chất chuẩn phải có độ tinh khiết ≥ 99 % 1) . 4.7 Dung dịch chuẩn Cân khoảng 100 mg mỗi chất chuẩn (4.6) và khoảng 100 mg n -tetradecan (4.4), chính xác đến 0,2 mg, cho vào bình định mức 10 ml và pha loãng bằng pyridin đến vạch. Cách khác, cân khoảng 100 mg hỗn hợp chứa một vài chất chuẩn (ví dụ: 5), mỗi thành phần có mặt với cùng một lượng như nhau, và 100 mg n -tetradecan cho vào bình định mức 2 ml và pha loãng bằng pyridin đến vạch. CHÚ THÍCH: Cũng có thể chuẩn bị một hoặc nhiều dung dịch chuẩn không có n -tetradecan. Tiến hành quá trình silyl hóa dung dịch chuẩn như đối với dung dịch mẫu nêu trong Mục 7, sau khi thêm dung dịch chuẩn nội và thuốc thử silyl hóa. 5 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị và dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau: 5.1 Hệ thống sắc ký khí , có gắn bơm chia dòng hoặc bơm trực tiếp lên cột, cài đặt chương trình nhiệt độ lò và detetor ion hóa ngọn lửa. Các điều kiện vận hành: - bơm chia dòng (t ỷ lệ chia dòng 1:10 đến 1:50) ; - bơm trực tiếp (không chia dòng, giữ trong 1 min); - nhiệt độ buồng bơm mẫu: 320 ° C (hoặc 60 ° C nếu bơm trực tiếp lên cột); - nhiệt độ ban đầu của cột: 80 °C (hoặc 60 ° C nếu bơm trực tiếp lên cột); - tốc độ chương trình: 10 ° C /min - nhiệt độ cuối cùng: 360 ° C , giữ trong 15 min; - nhiệt độ detector: 350 °C; - dòng khí mang: He, tốc độ 5 ml/min (ở 80 °C); - thể tích bơm: 1 µl đến 5 µl. CHÚ THÍCH: Nếu bơm lên cột (hoặc bơm trực tiếp) thì pha loãng 50 µl hỗn hợp phản ứng với 1 ml hexan và bơm 1 µl. Khi dùng bơm l ê n cột th ì có thể dùng tiền cột đ ể kéo dài thời hạn sử dụng của cột. Bơm lên cột cho nhiều hệ số đáp ứng ổn định hơn. 5.2 Bộ ghi điện thế và/hoặc máy tích phân điện tử. 5.3 Cột sắc ký , bằng thủy tinh hoặc silica nóng chảy, dài 15 m đến 25 m, đường kính trong 0,25 mm đến 0,35 mm, toàn bộ bề mặt được làm bất hoạt bởi thuốc th ử silyl hóa, dimethylsilicon (SP-2100) hoặc phenylmethyldimethylsilicon, ph ủ phenyl (OV-3) 10 % (hoặc pha khác c ó cùng độ phân cực), độ dày màng từ 0,1 µm đến 0,2 µm. CHÚ THÍCH: Nên sử dụng cột dài để tách các monoglycerid hoặc diglycerid. Không thể tách riêng monoglycerid và diglycerid không bão hòa khỏi monoglycerid và diglycerid bão hòa hoặc ít bão hòa. Có thể sử dụng sắc ký lớp mỏng phủ silica gel nhúng trong axit boric, ngay trước khi tạo dẫn xuất, để tách glycerol-2-monoeste ra khỏi glycerol-1-monoeste. 5.4 Bộ lấy mẫu tự động , tùy chọn. CHÚ THÍCH: Bộ lấy mẫu tự động có lọ với dung tích 2 ml để lấy mẫu kép và thuốc thử. 5.5 Lọ nhỏ có nắp vặn , dung tích 2,5 m l (hoặc lọ có dung tích 2,0 ml dùng cho bộ lấy mẫu tự động) có vách ngăn phủ Teflon. 5.6 Dụng cụ gia nhiệt cho lọ nh ỏ , có thể duy trì nhiệt độ 70 ° C ± 0,5 ° C . 5.7 Pipet. 5.8 Cân phân tích , có thể cân chính xác đến 0,2 mg. 6 Lấy mẫu M ẫ u gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu c huẩn này. Nên l ấ y mẫu theo TCVN 2625 (ISO 5555) [1] . 7 Chuẩn bị mẫu thử Đồng nhất mẫu thử theo TCVN 6128 (ISO 661). Dùng cân (5.8) cân khoảng 10 mg mẫu sản phẩm đậm đặc của chất nhũ hóa đã được đồng nhất, chính xác đến 0,2 mg, hoặc cân khoảng 50 mg d ầ u mỡ chứa chất nhũ hóa, cho vào lọ (5.5). Thêm 0,2 ml BSTFA (4.1.1) và 0,1 ml TMCS (4.1.2), sau đó thêm 0,1 ml dung dịch chuẩn nội (4.5) vào mẫu. Đậy nắp chai và lắc mạnh. Gia nhiệt hỗn hợp phản ứng 30 min trên dụng cụ gia nhiệt ở 70 ° C (5.6). Tiếp tục bơm ngay 1 µl đến 5 µl hỗn hợp phản ứng lên GC (đã cân bằng trước để tạo đường nền ổn định). Tiến hành hai phản ứng song song, mỗi phản ứng bơm hai lần. 8 Cách tiến hành 8.1 Dựng đường chuẩn Dùng pipet (5.7) lấy 0,10 ml dung dịch chuẩn (4.7) cho vào lọ (5.5), thêm 0,2 ml BSTFA (4.1.1) và 0,1 ml TMCS (4.1.2). Gia nhiệt hỗn hợp phản ứng và bơm lên cột GC như trong Điều 7. Sử dụng dải nồng độ chất chuẩn giống với d ả i nồng độ của các thành phần cần định lượng trong dung dịch mẫu. Kiểm tra độ tuyến tính bằng cách dựng đồ thị hệ số đáp ứng dựa theo nồng độ của dung dịch chuẩn. 8.2 Nhận biết monoglycerid và diglycerid Phân tích dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện vận hành như đối với dung dịch thử. Nhận biết pic bằng cách so sánh thời gian lưu với thời gian lưu của chất đã biết (hoặc chạy hai lần GC/MS). (Xem Phụ lục A, Hình 1). 9 Tính kết quả 9.1 Tính hệ số đáp ứng Sử dụng sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, tính hệ số đáp ứng, R x của chất chuẩn so với chất chuẩn nội, theo Công thức (1) như sau: (1) Trong đó: R x là hệ số đáp ứng của chất chuẩn x ; m i s là khối lượng chất chuẩn nội, tính bằng milig a m (mg); m x là khối lượng chất chuẩn x , tính bằng miligam (mg); A x là diện tích pic của chất chuẩn x ; A i s là diện tích pic của chất chuẩn nội. Định kỳ kiểm tra hệ số đáp ứng. Hệ số đáp ứng phải lớn hơn 0,5. Nếu hệ số đáp ứng thấp hơn chứng tỏ có một số sai lỗi hoặc có sự phân giải. Sử dụng 0,5 mg/ml đến 10 mg/ml các thành phần trong cả dung dịch chuẩn và dung dịch m ẫ u. 9.2 Tính hàm lượng các thành phần trong mẫu thử Tính hàm lượng của thành phần x trong mẫu thử, m ’ x , biểu thị bằng phần trăm khối lượng, theo Công thức (2) như sau: (2) Trong đó: R x là hệ số đáp ứng của thành phần x trong mẫu; m ' is là khối lượng chất chuẩn nội trong mẫu, tính bằng miligam (mg); m ' i là khối lượng mẫu, tính bằng miligam (mg); A x là diện tích pic của thành phần x trong mẫu; A' is là diện tích pic của chất chuẩn nội trong mẫu thử. 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết qu ả thử nghiệm; e) kết quả thử thu được; f) nếu kiể m tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được. Phụ lục A (Tham khảo) Sắc ký đồ CHÚ DẪN A: ch ấ t chuẩn B: monoglycerid và diglycerid Hình A.1- Sắc ký đồ điển hình của dẫn xuất trimethylsilylether của monoglycerid và diglycerid Cần phải tuân thủ các điều kiện vận hành, các quy định đối với cột để nhận bi ế t pic trên sắc ký đồ trong qu y tr ì nh sily l h ó a: a) Quá trình silyl hóa gồm các điều kiện: - lượng mẫu: 10 mg: - thuốc thử: 0,1 ml pyridin chứa 1,0 n -tetradecan, 0,2 ml BSTFA, 0,1 ml TMCS; - thời gian phản ứng: 30 min; - nhiệt độ phản ứng: 70 ° C . b) Cột phản ứng - được làm bằng silia nóng chảy; - độ dài: 25 m; - đường kính trong: 0,31 mm; - độ dày màng: 0,17 µm (5 % phenylmethyl s ilicon). c) Điều kiện vận hành - nhiệt độ buồng bơm mẫu: 320 °C; - khí mang: He; - tốc độ dòng: 5 ml/min; - nhiệt độ: 80 ° C . d) Nhận biết pic n -tetradecan (chuẩn nội); 11: glycerol 1-docosanoat 1: glycerol 12: glycerol 1-tetradecanoate-3-hexadecanoat 2: diglycerol 13: glycerol 1,2-dihexadecanoat 3: axit hexadecanoic 14: glycerol 1,3-dihexadecanoat 4: axit octadecanoic 15: glycerol 1-hexadecanoate-2-octadecanoat 5: glycerol 1-tetradecanoat 16: glycerol 1-hexadecanoate-3-octadecanoat 6: glycerol 2-hexadecanoat 17: glycerol 1,2-dioctadecanoat 7: glycerol 1-hexadecanoat 18: glycerol, 1,3-dioctadecanoat 8: glycerol 2-octadecanoat 19: triglycerit C48 9: glycerol 1-octadecanoat 20: triglycerit C50 10: glycerol 1-icosanoat 21: triglycerit C52 22: triglycerit C54 Phụ lục B (Tham khảo) Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm Phép thử liên phòng thử nghiệm được cung cấp từ các phòng thử nghiệm chấp nhận phương pháp. Bảng B.1 - Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm xác định monoglycerid và diglycerid trong 2 mẫu monoglycerid và diglycerid đậm đặc (biểu thị bằng phần trăm khối lượng mẫu thử) Giá trị trung bình, % Độ lệch chuẩn lặp lại s r Độ lệch chuẩn tái lập, s R Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSD r , % Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD R , % 1-Myristat 0,5 0,04 0,04 8,9 9,2 1,7 0,05 0,1 3,0 5,7 17,1 0,7 1,9 4,1 10,9 1-Palmitat 27,2 0,9 2,4 3,3 8,9 23,6 0,8 3,3 3,4 14,1 1-Stearat 60,1 2,1 6,4 3,5 10,7 6,2 0,3 1,0 4,8 15,8 1,3-Dipalmitat-3-stearat 0,2 0,01 0,06 4,5 30,0 17,4 0,6 4,1 3,4 24,2 1-Palmitat-3-stearat 0,8 0,05 0,1 6,0 17,8 13,0 0,4 3,0 3,1 23,2 1,3-Distearat 1,1 0,07 0,3 6,8 24,8 Bảng B.2 - Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm xác định monoglycerid và diglycerid trong 2 mẫu dầu thêm chuẩn (biểu thị bằng phần trăm khối lượng mẫu thử) Thêm chuẩn, % Giá trị trung bình % Độ lệch chuẩn lặp lại s r Độ lệch chuẩn tái lập, s R Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSD r , % Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD R , % 1-Palmitat 1,00 0,96 (96,0) 0,03 0,12 3,3 12,0 1,77 1,72 (97,2) 0,08 0,23 4,8 13,4 1-Stearat 1,00 0,98 (98,0) 0,03 0,14 3,4 13,8 2,85 2,78 (97,5) 0,14 0,40 4,9 14,5 1,2-Dipalmitat 1,00 0,97 (97,0) 0,04 0,24 4,0 24,4 2,06 1,98 (96,1) 0,06 0,53 2,8 26,9 1,3-Dipalmitat 1,00 0,93 (93,0) 0,02 0,19 2,5 20,2 1,2-Distearat 1,00 0,97 (97,0) 0,06 0,19 6,2 19,8 0,68 0,76 (112) 0,06 0,20 8,0 26,2 Bảng B.3 - Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm xác định monoglycerid v à diglycerid trong cặp mẫu mù của dầu hướng dương thêm chuẩn ( biểu thị bằng phần trăm khối lượng mẫu thử) Thêm chuẩn, % Giá trị trung bình % Độ lệch chuẩn lặp lại s r Độ lệch chuẩn tái lập, s R Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSD r , % Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD R , % 1-Palmitat 0,80 0,74 (91,9) 0,07 0,14 10,0 18,5 1-Stearat 1,54 1,44 (93,2) 0,24 0,33 17,0 23,4 1, 2-Dipalmitat 1,09 1,02 (93,6) 0,09 0,11 8,4 10,4 1, 3-Dipalmitat 1,39 1,36 (97,5) 0,07 0,12 5,3 9,2 1, 2-Distearat 2,18 2,38 (114) 0,30 0,94 11,8 36,3 Thư mục tài liệu tham khảo [1] TCVN 2625 (ISO 5555) Dầu mỡ động vật và thực vật - Lấy mẫu . 1) C ó th ể sử dụng sản phẩm của Nu Chek Prep, Inc., Elysian, MN, Mỹ. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn, có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.