TCVN8400-31:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-31:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-31:2015 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 31: BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG GIA CẦM Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 31: Fowl cholera Lời nói đầu TCVN 8400-31:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo OIE (2015), Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals , Chapter 2.3.9 Fowl cholera; TCVN 8400-31:2015 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình ch ẩ n đoán g ồ m 38 phần: - TCVN 8400-1 : 2010, phần 1: Bệnh lở mồm long móng; - TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn; - TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn; - TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn; - TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng; - TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ; - TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu d ê ; - TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm; - TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I; - TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò; - TCVN 8400-11 : 2011, ph ầ n 11: Bệnh dịch tả vịt; - TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà; - TCVN 8400-13 : 2011, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucela; - TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-15 : 2011, phần 15: Bệnh xoắn khu ẩ n do Leptospira; - TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli; - TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà; - TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đ ầ u gà (coryza); - TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn; - TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn; - TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS); - TCVN 8400-22 : 2014 , phần 22: Bệnh giả dại ở lợn; - TCVN 8400-23 : 2014, p hần 23: Bệnh ung khí thán; - TCVN 8400-24 : 2014, ph ần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm; - TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn; - TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1; - TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh sá n l á gan; - TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại t ử do Clostridium per f r i ngens; - TCVN 8400-29 : 2015, ph ầ n 29: Bệnh Lympho leuko ở gà; - TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà; - TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm; - TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm; - TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-34 : 2015 , phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh theileria ở trâu bò; - TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2; - TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở l ợ n; - TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus. BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 31: BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG GIA CẦM Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 31: Fowl cholera CẢNH BÁO - Việc áp d ụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm cho người xét nghiệm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Khi áp dụng tiêu chuẩn người sử dụng tiêu chuẩn ph ả i tự thiết lập các thao tác phù h ợ p để đảm b ả o an toàn sức khỏe và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm do Pasteurella multocida gây ra. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: 2.1. Bệnh tụ huyết trùng gia cầm (Fowl cholera) Bệnh truyền nhiễm phổ biến ở gia cầm, do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra, thường ở thể nhiễm trùng máu với đặc trưng của bệnh là gia cầm chết nhanh, tỷ lệ chết cao. CHÚ THÍCH: Pasteurella multocida là vi khuẩn Gram âm, yếm kh í tùy tiện, có k í ch thước (t ừ 0,2 µm đến 0,4 µm) x (từ 0,6 µm đến 2 , 5 µm). 3. Thuốc thử và vật liệu thử Ch ỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết để phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi c ó quy định khác. 3.1 . Môi trường nư ớ c thịt. 3.2 . Thạch máu , là thạch máu cơ bản (pha thạch theo hướng d ẫ n của nhà sản xuất) được bổ sung từ 5 % đ ế n 7 % máu cừu, máu bê, hoặc máu th ỏ . 3.3 . Thạch MacConkey. 3.4 . Động vật thí nghiệm , chuột nhắt trắng khỏe mạnh có trọng lượng từ 18 g đến 20 g hoặc th ỏ khỏe mạnh có trọng lượng từ 2 kg đến 2,5 kg. 3.5 . Nước muối sinh lý (nước muối 0,9 %) Hòa tan 0,9 g muối natri clorua (NaC l ) tinh khiết trong 100 ml nước c ấ t và được vô trùng. 3.6 . Bộ thuốc nhuộm Gram (xem Phụ lục A). 3.7 . Bộ thuốc nhuộm Giemsa (xem Phụ lục B). 3.8 . Nguyên liệu cho xác định các đặc tính sinh hóa (xem Phụ lục C). 3.9 . Cồ n etanol 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết b ị , dụng cụ thông thường của phòng th ử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau: 4.1 . Tủ ấ m , có thể duy tr ì nhiệt độ 37 °C. 4.2 . Kính hiển vi quang học , vật kính có độ phóng đại 10X, 40X, 100X. 4.3 . Nồi hấp , c ó thể duy tr ì nhiệt độ 110°C, 121 °C. 4.4 . Phiến kính , vô trùng. 4.5 . Que cấy , vô trùng. 4.6 . Que c ấ y chích s â u, vô trùng. 4.7 . Ống nghiệm , vô trùng. 4.8 . Bể ủ nhiệt , có thể duy tr ì nhiệt độ từ 55 °C đến 60 °C. 4.9 . Đ è n c ồ n. 4.10 . Panh, kéo , vô trùng. 5. Chẩn đoán lâm sàng 5.1 . Đặc điểm dịch tễ - Bệnh tụ huyết trùng gia cầm xảy ra ở tất cả các loài gia cầm như: gà, vịt, ngan, ngỗng... - Gia cầm ở mọi lứa tuổi đều có thể nhiễm bệnh. Gia cầm từ 3 tháng tuổi đến 4 tháng tuổi bị bệnh nặng nhất; - Bệnh xuất hiện quanh năm nhưng hay gặp nhất là lúc thời tiết giao mùa, ở miền Bắc là chuyển từ mùa xuân sang mùa hè và mùa thu sang mùa đông; ở miền Nam là từ mùa mưa sang mùa khô và ngược lại; - Bệnh lây nhiễm trực tiếp từ gia cầm ốm sang gia cầm khỏe hoặc lây gián tiếp qua thức ăn, nước uống, các dụng cụ chăn nuôi, người chăn nuôi , … - Gia cầm mắc bệnh có tỷ lệ chết rất cao c ó thể lên tới từ 80 % đến 90 %. 5.2 . Triệu chứng lâm sàng a) Thể quá cấp t í nh: gia cầm chết đột ngột khi chưa có triệu chứng lâm sàng. b) Thể cấp tính: - Gia cầm chết nhanh sau vài giờ đến hai ngày nhiễm bệnh; - Gia cầm ủ rũ, vận động chậm, bỏ ăn, khát nước, khó th ở ; - Gia cầm chảy nhiều nước mũi, nước dãi, liệt chân hoặc liệt cánh; - Mào và tích tím tái ( ở gà); - Phân thường có màu trắng loãng hoặc xanh trắng, đôi khi có máu tươi. c) Thể mạn t í nh: - Gia cầm có thể có các ổ viêm cục bộ ở mào, tích ( ở gà), chân, khớp xương cánh, đệm chân, túi xương ức; - Kết mạc mắt viêm, có dịch r ỉ ; - Mũi tiết ra chất dịch d í nh; - Gia cầm ngoẹo cổ, khó th ở , có tiếng khò khè ở khí qu ả n; - Vùng đầu có thủy thũng rắn, sau đó các mô thủy thũng bị thoái hóa thành thể bã đậu, khi m ổ ra có mùi thối. 5.3 . Bệnh tích đại thể a) Thể quá cấp t í nh: gia cầm thường chưa biểu hiện bệnh tích. b) Thể cấp tính: - Xuất huyết vệt hoặc lấm tấm bằng đầu đinh ghim ở m ỡ vành tim, cơ tim; - Dạ dày tuyến xuất huyết lấm tấm; - Xoang bao tim có dịch vàng; - Phổi xuất huyết; - Gan sưng, trên bề mặt có điểm hoại tử lấm tấm; - Buồng trứng xuất huyết; - Ruột xuất huyết từng mảng lớn hay lấm tấm. Chất chứa trong ruột có lẫn máu. c) Thể mạn tính: - Nhiễm trùng cục bộ, có các ổ m ủ rải rác trong toàn cơ thể; - Phù phổi, viêm phổi và rìa gan sưng; - Viêm kết mạc mắt mạn tính, phù mặt; - Các khớp chân, túi xương ức, các đệm chân, xoang bụng, vòi trứng có dịch bã đậu. 6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1 . Lấy mẫu Bệnh phẩm bao gồm: máu tim, phổi, gan, lách, xương ống chân. - Máu tim: dùng bơm, kim tiêm hoặc pipet vô trùng lấy máu tim; - Mẫu gan, lách, phổi: lấy mẫu vô trùng từ 10 g đến 100 g mỗi loại bệnh phẩm, cho vào từng lọ hay túi ni lon vô trùng riêng biệt, đậy kín; - Xương ống chân: l ấy dao cắt hai đầu khớp, róc sạch thịt. CH Ú THÍCH: C á c dụng cụ lấy m ẫ u như dao, kéo, panh kẹp phải được sát trùng b ằ ng etanol 70 % (3.9) trước và sau khi lấy mẫu. Bệnh ph ẩ m phải lấy vô trùng ngay sau khi gia cầm ch ế t càng nhanh càng tốt. Bệnh phẩm phải được b ả o quản trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C và gửi về phòng thí nghiệm trong vòng 24 h sau khi lấy mẫu kèm theo giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích và các thông tin về dịch tễ. 6.2 . Kiểm tra hình thái vi khuẩn từ bệnh phẩm 6.2.1 . Cách làm tiêu bản Bệnh phẩm máu: lấy một giọt máu nh ỏ lên một phiến kính (4.4), sau đó dàn m ỏ ng giọt máu bằng một phiến kính (4.4) khác, để khô; Bệnh phẩm tổ chức: cắt một miếng nh ỏ phủ tạng (phổi, gan, lách) phết lên phiến k í nh (4.4), để khô; Bệnh phẩm t ủ y xương: bộc lộ t ủ y xương ống chân, dùng que cấy (4.5) lấy tủy xương phết lên phi ế n kính (4.4), để khô. 6.2.2 . Cố định tiêu b ả n Tiêu bản đ ã để khô, nhỏ cồn etanol (3.9) ngập tiêu bản, để khô. Nhuộm Gram theo Phụ lục A. Nhuộm Giemsa theo Phụ lục B. 6.2.3 . Đọc kết quả Nhuộm Gram: vi khuẩn bắt màu hồng (màu của vi khuẩn Gram âm), lưỡng cực (hai đầu đậm hơn), đa h ì nh thái (cầu khuẩn, cầu trực khuẩn, trực khuẩn). Nhuộm Giemsa: vi khu ẩ n bắt màu xanh tím, có h ì nh bầu dục, lưỡng cực. 6.3 . Tiêm động vật thí nghiệm Động vật thí nghiệm (3.4): chuột nhắt trắng hoặc th ỏ . Tiêm động vật thí nghiệm: bệnh phẩm là máu, tủy xương, phủ tạng (phổi, gan, lách) được nghiền nát, hòa với nước muối sinh lý (3.5) theo tỷ lệ 1 : 10 (thể tích). Tiêm huyễn dịch bệnh phẩm vào dưới da, xoang phúc mạc hoặc tĩnh mạch cho 1 con chuột nhắt trắng (từ 0,1 ml đến 0,2 ml) hoặc cho 1 con thỏ (từ 1 ml đến 2 ml) theo dõi trong thời gian 7 ngày. Pasteurella multocida thường gây chết động vật thí nghiệm sau từ 24 h đến 36 h tiêm bệnh phẩm. Máu và phủ tạng của động vật thí nghiệm chết được lấy để phết kính làm tiêu bản kiểm tra trực tiếp dưới kính hiển vi quang học (4.2) và tiến hành phân lập, xác định vi khuẩn. 6.4 . Phân lập vi khuẩn Bệnh ph ẩ m được vô trùng bên ngoài, dùng kéo (4.10) cắt để bộc lộ t ổ chức bên trong. Sau đó dùng que cấy (4.5) lấy bệnh phẩm nuôi cấy vào môi trường nước thịt (3.1), thạch máu (3.2), thạch MacConkey (3.3), nuôi trong tủ ấm (4.1). Sau 24 h, kiểm tra kết quả nuôi cấy: - Môi trường nước thịt: môi trường đục, không có cặn ở đáy, lắc ống nghiệm có vẩn nhẹ; - Trên thạch máu: Pasteurella multocida không gây dung huyết, có 3 dạng khuẩn lạc: dạng M (Mucoid) c ó kích thước to nhất, màu trắng hơi xám, nhầy, hơi ướt; dạng S (Smooth) là khuẩn lạc nhẵn, bề mặt láng bóng, rìa nhẵn; dạng R (Rough) l à khuẩn lạc xù xì, bề mặt không nhẵn bóng, rìa nhăn; - Trên thạch MacConkey: Pasteurella multocida không mọc. Chọn khuẩn lạc nghi ngờ trên thạch máu đ ã nuôi cấy vi khuẩn cấy vào môi trường nước thịt (3.1) và thạch máu (3.2), nuôi trong tủ ấm (4.1) để kiểm tra hình thái và xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn. 6.5 . Xác định vi khuẩn 6.5.1 . Ki ể m tra hình thái - Làm tiêu bản: + Từ khuẩn lạc: nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý (3.5) lên phiến kính (4.4), dùng que cấy (4.5) lấy khuẩn lạc hòa đều vào giọt nước muối sinh lý (3.5). + Từ canh khuẩn (nước thịt đã nuôi cấy vi khuẩn): lấy một vòng que cấy canh khuẩn dàn m ỏ ng lên trên phiến kính (4.4). - Tiêu bản được để khô và cố định trên ngọn lửa của đèn cồn (4.9); - Tiêu b ả n được nhuộm bằng phương pháp Gram (xem Phụ lục A); - Pasteurella multocida bắt màu hồng (Gram âm), đa hình thái (hình cầu, h ì nh cầu trực khuẩn, h ì nh trực khuẩn ngắn), thường đứng riêng lẻ hay thành cặp. 6.5.2 . Xác định các đặc t í nh sinh hóa Xác định Pasteurella multocida dựa vào một số đặc tính sinh hóa được nêu trong B ả ng 1. Bảng 1 - Một số đặc tính sinh h óa đặc trưng của vi khuẩn Pasteurella multocida Tính ch ấ t Pasteurella multocida Sinh indol + Lên men glucose + Lên men lactose - Lên men sucrose + Lên men mannitol + Sử dụng urê - Khả năng di động - Phân hủy ornithine + Phản ứng catalase + Phản ứng oxidase + Xác định đặc tính sinh hóa theo quy định tại Phụ lục C. 6.5.3 . Thử độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng hoặc thỏ (3.4). Huyễn dịch tiêm: lấy khuẩn lạc phân lập được từ bệnh phẩm (sau khi đã được kiểm tra hình thái, tính chất mọc trên các môi trường và đặc t í nh sinh h óa ) cấy vào môi trường nư ớ c thịt (3.1), nuôi cấy tĩnh (không lắc) ở tủ ấm (4.1). Sau 24 h nuôi cấy, lấy 0,2 ml canh trùng tiêm vào dưới da, xoang phúc mạc hoặc tĩnh mạch cho hai con chuột nhắt trắng (3.4) hoặc lấy 2 ml tiêm cho hai con thỏ (3.4) và theo dõi trong thời gian 7 ngày. Đọc kết quả: - Nếu 2 con chết: vi khuẩn Pasteurella multocida có độc lực cao; - Nếu 1 con chết, 1 con không chết: vi khuẩn Pasteurella multocida có độc lực yếu; - Nếu không có con nào chết: vi khuẩn Pasteurella multocida không có độc lực. CH Ú THÍCH : V i khu ẩ n Pasteurella multoci d a phân lập được t ừ động vật thí nghiệm ch ế t sau khi tiêm bệnh phẩm không cần ki ể m tra lại độc lực trên động vật thí nghiệm. 7. Kết luận Gia cầm được xác định mắc bệnh tụ huyết trùng khi c ó đặc điểm d ịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh và phân lập được vi khuẩn Pasteurella multocida có độc lực trong phòng th í nghiệm. Phụ lục A (Quy định) Phương pháp nhuộm Gram A.1 . Thuốc thử A.1.1 . Dung dịch tím tinh th ể Tím tinh thể (C 25 H 30 N 3 C l ) 2,0 g Etanol 95 % (thể tích) 20,0 ml Amoni oxalat [(NH 4 ) 2 C 2 O 4 .2H 2 O ] 0,8 g Nước cất 80,0 ml H òa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxa l at trong nước. Sau đ ó , trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết. A.1.2 . Dung dịch f uchsin đậm đặc Fuchsin basic (C 20 H 20 CIN 3 ) 1 g Etanol 95 % (thể t í ch) 10 ml Phenol (C 6 H 6 O ) 5 g Nước c ấ t 100 ml Khi dùng, pha loãng dung dịch f uchsin đậm đặc v ớ i nước theo t ỉ lệ 1 : 10 (thể tích). A.1.3 . Dung dịch lugol Kali iodua (KI) 2 g I ốt ( I 2 ) tinh thể 1 g Nước c ấ t 200 ml Nghiền kali iodua và i ố t tinh thể, cho nư ớ c vào từ từ và lắc cho tan. A.1.4 . Cồn axeton Etanol 95 % (thể tích) 3 phần Axeton (C 2 H 6 O ) 1 phần A.2 . Cách tiến hành Nh ỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu b ả n, để từ 1 min đến 2 min sau đ ó rửa nước nhanh và để khô. Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô. Nhỏ cồn axeton, rửa nước thật nhanh và để khô. Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi thấm khô hoặc để khô. A.3 . Xem tiêu bản Nhỏ 1 giọt d ầu v à o tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (4.2). Phụ lục B (Quy định) Phương pháp nhuộm Giemsa B.1 . Thuốc thử B.1.1 . Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) , 0,01 M, pH 7,0 Thành phần Natri hydrophosphat (Na 2 HP O 4 ) 9,47 g Kali dihydrophosphat (KH 2 PO 4 ) 9,08 g Nước cất 900 ml Chuẩn b ị Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric. CHÚ TH Í CH: C ó thể sử dụng P B S thương mại v à chuẩn bị theo h ư ớng dẫn của nhà sản xuất. B.1.2 . Dung d ịch Giemsa , 10 % Dung dịch Giemsa (azur-eosin-methylen blue) 1 phần Dung dịch PBS 0,01 M, pH 7,0 (A.1) 9 phần CH Ú THÍCH: Nồng độ dung dịch Giemsa có thể thay đ ổ i theo các phòng th í nghiệm. B.2 . Cách tiến hành Tiêu bản máu, tiêu bản bệnh phẩm phủ tạng, tiêu b ả n bệnh phẩm tủy xương (xem 6.2.1) được cố định bằng metanol nguyên chất trong 10 min, rồi rửa bằng nước. Nh ỏ dung dịch Giemsa ngập tiêu bản, để từ 20 min đến 30 min, rồi rửa nhanh bằng nước và sấy khô. B.3 . Xem tiêu bản Nhỏ 1 giọt dầu lên tiêu b ả n và xem tiêu bản bằng k í nh hiển vi quang học (4.2). Phụ lục C (Quy định) Các phản ứng sinh hóa của Pasteurella multocida C.1 . Môi trường và thuốc th ử C.1.1 . Môi trường nước pepton Chuẩn bị môi trường nước pepton theo hướng dẫn của nhà sản xuất. C.1.2 . Thuốc th ử Kovac’s C.1.2.1 . Thành ph ầ n Paradimetyl aminobenzal d ehyt 5 g Cồn amyl (2-Metylbutan-2-ol) 75 ml Axit clohydric đặc 25 ml C.1.2.2 . Chuẩn b ị Trộn dung dịch paradimetyl aminobenzaldehyt vào cồn amyl cho tan hết và để trong tủ lạnh 4 °C. Thêm từ từ 5 ml đến 10 ml axit clohydric đặc, trộn đều rồi để tủ lạnh, sau đó tiếp tục bổ sung axit clohydric. B ả o quản thuốc thử trong lọ tối màu, ở 4 °C. CHÚ TH Í CH: Có thể sử dụng thuốc thử Kovac's thương mại và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất. C.1.3 . Thuốc thử H 2 O 2 , 3 % (thể tích) C.1.4 . Thuốc thử Tetrammethyl-P. phenylene diamin hydrochloride , 1 % (thể tích). C.1.5 . Môi trường nước pepton - đường C.1.5.1 . Thành ph ầ n - Nước pepton. - Dung dịch chỉ thị màu bromocrezol: cho 0,2 g bromocrezol vào 100 ml etanol 90 % (thể tích) và lắc cho tan h ế t. - Dung d ịch đường: glucose, sucrose, lactose, mannitol. Pha glucose (hoặc sucrose, lactose, mannitol) thành dung dịch 10 % (thể tích) trong nước, hấp tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp (4.3) ở 110 °C trong 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng 3 lần ở 100 °C trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm. C.1.5.2 . Chuẩn bị Cho 1 ml chỉ th ị màu bromocrezol vào 100 ml môi trường nước pepton, chia ra các ống (4 ml mỗi ống). Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp (4.3) ở 120 °C trong 30 min. Chỉnh pH môi trường ở 6,8 ± 0,2. Thêm 0,4 ml dung dịch glucose 10 % (thể tích) hoặc sucrose 10 % (thể tích) hoặc lactose 10 % (thể tích) hoặc mannitol 10 % (thể tích) vào ống chứa 4 ml môi trường pepton đã có chất chỉ thị. C.1.6 . Môi trường thạch urê Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (urea agar base - Christensen). Pha chế môi trường và bổ sung urê theo hướng dẫn của nhà sản xuất. C.1.7 . Môi trường thạch lỏng kiểm tra khả năng di động C.1.7.1 . Thành ph ầ n Pepton 10 g Chất chiết thịt 3g Natri clorua (NaC l ) 5g Thạch 4g Gelatin 80 g Nước cất 1000 ml C.1.7.2 . Chuẩn b ị Hòa gelatin vào nước để 30 min, bổ sung các thành phần khác, đun cho tan hoàn toàn. Chia ra các ống nghiệm (4.7), khoảng 6 ml cho mỗi ống nghiệm. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (4.3) ở 115 °C trong 20 min. C.1.8 . Môi trường ornithine decacbolxy l ase C.1.8.1 . Thành ph ầ n Pepton 0,5 g Chất chiết n ấ m men 0,3 g Glucose 0,1 g Ch ỉ thị màu bromocresol purple 0,2 % 0,1 ml L-ornithine hydrochloride 0,5 g Nước cất 100 ml C.1.8.2 . Chuẩn bị Hòa tan pepton, chất chiết nấm men, glucose trong nước, chỉnh môi trường về pH = 6,7 ± 0,2 và thêm chất chỉ thị màu bromocresol purple 0,2 %. Hấp môi trường trong nồi h ấ p (4.3) ở 115 °C trong 20 min. Bổ sung thêm L-ornithine hydrochloride 0,5 %. Chỉnh lại pH môi trường về 6,7 ± 0,2. Chia môi trư ờ ng ra các ống nghiệm (4.7), mỗi ống nghiệm khoảng 2 ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (4.3) ở 115 °C trong 10 min. C.2 . Cách tiến hành C.2.1 . Phản ứng sinh indol Dùng que cấy (4.5) lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường nước pepton (C.1.1). Nuôi trong tủ ấm (4.1). Sau 24 h nuôi cấy, nh ỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s (C.1.2) vào môi trường, lắc nhẹ. Đọc kết quả: - Phản ứng dương t í nh (sinh indol): xuất hiện vòng màu đ ỏ ph í a trên môi trường. - Ph ả n ứng âm t í nh (không sinh indol): không xuất hiện vòng màu đ ỏ . C.2.2 . Phản ứng catalase Nh ỏ một giọt dung dịch H 2 O 2 3 % (thể tích) (C.1.3) lên phiến kính (4.4). Dùng que cấy (4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cho vào gi ọ t dung dịch H 2 O 2 3 % (thể tích). Đọc kết quả sau 5 s: - Ph ả n ứng dương tính: có hiện tượng sủi bọt; - Ph ả n ứng âm tính: không có hiện tượng s ủ i bọt. C.2.3 . Phản ứng oxidase Tiến hành trên giấy có tẩm dung dịch 1% Tetrammethyl-P. phenylene diamin hydrochloride. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc nghi ngờ phết lên mặt giấy đã thấm thuốc th ử . Đọc kết quả sau 30 s như sau: - Dương tính: tại chỗ phết khuẩn lạc có xuất hiện màu tím; - Âm tính: không xuất hiện màu t í m. C.2.4 . Kiểm tr a đặc tính lên men đường Dùng que cấy (4.5) lấy khu ẩ n lạc c ấ y vào ống môi trường nước pepton có đường glucose (hoặc sucrose, lactose, mannitol) (xem C.1.5). Nuôi trong tủ ấm (4.1), đọc kết quả sau 24 h. - Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu vàng; - Phản ứng âm tính: môi trường không thay đ ổ i màu. C.2.5 . Kiểm tr a khả năng phân giải urê Dùng que cấy (4.5) lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường thạch urê (C.1.6). Nuôi trong tủ ấm (4.1), đọc kết quả sau 24 h. - Ph ả n ứng dương tính: môi trường chuyển sang màu hồng; - Phản ứng âm tính: môi trường không chuyển màu. C.2.6 . Kiểm tra khả năng d i động của vi khuẩn bằng môi trường thạch l ỏ ng Dùng que cấy chích sâu (4.6) lấy khuẩn lạc cấy thẳng xuống gần đáy của ống nghiệm có môi trường thạch l ỏ ng (C.1.7). Nuôi trong tủ ấm (4.1), đọc kết quả sau 24 h. - Ph ả n ứng dương tính (có khả năng di động): môi trường đục, không nhìn rõ đường cấy chích sâu; - Ph ả n ứng âm tính: môi trường trong và nhìn thấy đường cấy chích sâu. C.2.7 . Kiểm tra khả năng phân hủy ornithine Dùng que cấy (4.5) lấy khuẩn lạc c ấ y vào môi trường có chứa ornithine decarboxylase (C.1.8). Nuôi trong t ủ ấm (4.1), sau 24 h đọc kết quả. - Dương tính: môi trường chuyển màu tím; - Âm tính: môi trường có màu vàng (không chuyển màu). THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] JICA, 2003. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand . Third edition. p.110 - 111. [2] John R. Glisson, Charles L.Ho f acre, Jens P. Christense, 2008. Diseases of poultry, Chapter 19: Pasteurollosis and other Respiratory Bacterial In f ection . 12th Edition, Blackwell Publishing, p. 739-758. [3] Quinn J, Carter M.E, Markey B, Carter G.R, 2004. Veterinary Clinical Microbiology . 6th Edition. Printed in Spain, p.254 - 260. [4] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đ ỗ Ngọc Thúy, 2011. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y.