10/2002/QĐ-BTS

Quyết định 10/2002/QĐ-BTS về tiêu chuẩn cấp ngành do Bộ trưởng Bộ Thủy sản ban hành BỘ THUỶ SẢN ------- CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc --------- Số: 10/2002/QÐ- BTS Hà Nội, ngày 8 tháng 4 năm 2002 QUYẾT ĐỊNH VỀ VIỆC BAN HÀNH TIÊU CHUẨN CẤP NGÀNH BỘ TRƯỞNG BỘ THUỶ SẢN - Căn cứ Nghị định số 50/CP ngày 21 tháng 6 năm 1994 của Chính phủ về nhiệm vụ quyền hạn và tổ chức bộ máy của Bộ Thuỷ sản; - Theo đề nghị của Ông Vụ trưởng Vụ Khoa học Công nghệ; QUYẾT ĐỊNH : Ðiều 1: Ban hành kèm theo Quyết định này 04 Tiêu chuẩn cấp Ngành sau đây : 1. 28 TCN 177 : 2002 : hàm Lượng kháng sinh nhóm tetracyclin trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. 1. 28 TCN 178 : 2002 : Hàm lượng axits axolinic trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. 3. 28 TCN 179 : 2002 : Hàm lượng aflatoxin trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. 4. 28 TCN 180 : 2002 : Hàm lượng thuốc trừ sâu gốc clo hữu vơ và poly clorua biphenyl trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký khí. Ðiều 2: Các tiêu chuẩn trên đây được khuyến khích áp dụng cho các phòng kiểm nghiệm khi tiến hành kiểm tra chất lượng hàng thuỷ sản và có hiệu lực thực hiện sau 15 ngày kể từ ngày ký. Ðiều 3: Chánh Văn phòng Bộ; Thủ trưởng các Vụ, Cục; Chánh Thanh tra Bộ; Giám đốc các Sở Thuỷ sản, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn có quản lý thuỷ sản; Giám đốc Trung tâm Kiểm tra Chất lượng và Vệ sinh thuỷ sản; Thủ trưởng các đơn vị các phòng kiểm nghiệm nói tại Ðiều 2 và các cơ sở chế biến thuỷ sản chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này. KT. BỘ TRƯỞNG BỘ THUỶ SẢN THỨ TRƯỞNG Nguyễn Việt Thắng 28 TCN 177 : 2002 HÀM LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLIN TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Tetracyclines group in fishery products - Method for quantitative analysis by high performance liquid chromatography 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh nhóm tetracyclin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10 µg/kg. 2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp số 995.09 Chlortetracyclin, Oxytetracycline, and Tetracycline trong phần ăn được của động vật, quyển I, chương 23, trang 19 - 23 (23.1.17), phương pháp chuẩn của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC) ban hành năm 1997. 3 Nguyên tắc 3.1 Kháng sinh nhóm tetracyclin bao gồm 3 kháng sinh chính sau: tetracyclin (gọi tắt là TC), oxytetracyclin (gọi tắt là OTC) và clortetracyclin (gọi tắt là CTC). 3.2 Các kháng sinh này trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng dung dịch đệm (pH 4). Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột tách chiết pha đảo Sep - Pak Cartrige C18. Hàm lượng TC, OTC, CTC có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò UV tại bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn. 4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử 4.1 Thiết bị, dụng cụ 4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò UV. 4.1.2 Cột sắc ký pha đảo gồm có: a. Cột sắc ký pha đảo C8, kích thước cột L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm. b. Cột sắc ký pha đảo C18, kích thước cột L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5µm. 4.1.3 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/phút. 4.1.4 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g. 4.1.5 Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút (sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml). 4.1.6 pH kế 4.1.7 ống ly tâm thủy tinh dung tích 50 ml. 4.1.8 Bình định mức dung tích 10 ml, 100 ml và 1 000 ml. 4.1.9 Cột Sep-Pak C18, dung tích 10 ml. 4.1.10 Phễu Buch-ner đường kính 5,5 cm. 4.1.11 Pipet tự động điều chỉnh được từ 2 đến10 ml. 4.1.12 Bể siêu âm. 4.2 Hoá chất 4.2.1 Ðinatri photphat khan (Na2HPO4) tinh khiết, loại dùng cho phân tích. 4.2.2 Nước cất loại dùng cho HPLC. 4.2.3 Axit xitric ngậm 1 phân tử nước, tinh khiết, loại dùng cho phân tích. 4.2.4 Ethylenđinitrilotetraaxêtat đinatri (sau đây viết tắt là EDTA) ngậm 2 phân tử nước tinh khiết, loại dùng cho phân tích. 4.2.5 Axít oxalic ngậm 2 phân tử nước, tinh khiết, loại dùng cho phân tích. 4.2.6 Metanol loại dùng cho HPLC. 4.2.7 Axetonitril loại dùng cho HPLC. 4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử 4.3.1 Dung dịch đệm McIlvaine (pH 4,0 +/- 0,05) gồm: a. Dung dịch A: hoà tan 28,4 g Na 2 HPO 4 khan (4.2.1) bằng nước cất (4.2.2) trong bình định mức dung tích 1 000 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch. b. Dung dịch B: hoà tan 21,0 g axít xitric (4.2.3) bằng nước cất (4.2.2) trong bình định mức (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch. Cho từ từ 625 ml dung dịch A vào 1 000 ml dung dịch B. Chỉnh pH tới 4,0 (+/- 0,05) bằng cách cho từng giọt dung dịch HCl nồng độ 0,1M hoặc dung dịch NaOH nồng độ 0,1M (sử dụng pH kế để xác định pH). Chú thích: Dung dịch bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ trong phòng. 4.3.2 Dung dịch đệm McIlvaine - EDTA Hoà tan 60,5 g EDTA (4.2.4) vào 1 625 ml dung dịch đệm McIlvaine (4.3.1). Chú thích: Dung dịch bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ trong phòng. 4.3.3 Dung dịch axit oxalic-metanol: hoà tan 1,26 g axít oxalic (4.2.5) bằng metanol (4.2.6) trong bình định mức 1 000 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch. Chú thích: Dung dịch chiết không bền, chỉ pha trước khi sử dụng. 4.3.4 Pha động cho HPLC: hoà tan 1,26 g axít oxalíc (4.2.5) bằng nước cất (4.2.2) trong bình định mức 1 000 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch. Thêm vào dung dịch 500 ml axetonitril (4.2.7) và 166 ml metanol (4.2.6). Lọc và đuổi khí. Chú thích: Dung dịch pha động không bền, chỉ pha trước khi sử dụng. 4.3.5 Dung dịch chuẩn gốc 1 000 µg/ml: cân 108 mg (+/- 0,1) mỗi loại kháng sinh chuẩn (TC, OTC và CTC) loại có giấy chứng nhận hàm lượng (lượng cân được điều chỉnh theo hàm lượng kháng sinh ghi trong giấy chứng nhận) vào 3 bình định mức dung tích 100 ml (4.1.8) riêng biệt. Hòa tan và định mức tới vạch 100 ml bằng metanol (4.2.6). Chú thích : Bảo quản dung dịch tại nhiệt độ -20 0 C. Dung dịch bền trong vòng 3 tháng. 4.3.6 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml: hút chính xác 10 ml các dung dịch chuẩn gốc (4.3.5) vào bình định mức 100 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch bằng metanol (4.2.6). 4.3.7 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml: hút chính xác 2,5 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 µg/ml (4.3.6) vào bình định mức 10 ml (4.1.8). Ðịnh mức tới vạch bằng metanol (4.2.6). Chú thích: Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 đến 5oC. Dung dịch bền trong vòng 1 tuần. 4.3.8 Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,05; 0,10; 0,25; 0,50 và 1,00 µg/ml: hút chính xác 20, 40, 100, 200, 400 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml (4.3.7) vào các bình định mức 10 ml (4.1.8). Thêm 6 ml dung dịch axít oxalic-metanol (4.3.3) vào mỗi bình. Ðịnh mức tới vạch bằng nước cất (4.2.2). Chú thích: Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0 đến 5oC. Dung dịch bền trong vòng 1 tuần. 5 Phương pháp tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.1.1 Cân 5,00 g (+/- 0,05) mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh (4.1.7) thứ 1. Thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA (4.3.2) vào ống rồi nghiền trong 30 giây bằng máy nghiền đồng thể (4.1.3). Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm (4.1.5) trong 10 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút. 5.1.2 Gạn dịch trong của ống thứ 1 vào ống ly tâm thủy tinh (4.1.7) thứ 2. Cho thêm 20 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ 1. Trộn đều, ly tâm ống trong 10 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút rồi lại gạn dịch trong vào ống ly tâm thủy tinh thứ 2. 5.1.3 Cho thêm 10 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA vào ống ly tâm thuỷ tinh thứ 1. Trộn đều rồi ly tâm ống trong 10 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút. Tiếp tục gạn dịch trong vào ống ly tâm thủy tinh thứ 2. 5.1.4 Ly tâm ống thủy tinh thứ 2 trong 20 phút ở tốc độ 3 000 vòng/phút. Sau đó, lọc dịch trong qua giấy lọc trên phễu Buch-ner. Rửa ống ly tâm 2 lần, mỗi lần rửa sử dụng 2 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA. 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có các kháng sinh thuộc nhóm TC. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1. 5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 100 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 µg/ml (4.3.7) vào 5,00 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy nghiền đồng thể (4.1.3). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1. 5.4 Làm sạch dịch chiết 5.4.1 Chuẩn bị cột Nối cột Sep - Pak C18 vào đầu ra của một xi lanh thủy tinh dung tích 100 ml. Thêm lần lượt 20 ml metanol (4.2.6), 20 ml nước cất (4.2.2) vào xi lanh thủy tinh. Loại bỏ dung dịch chảy qua cột. 5.4.2 Làm sạch dịch chiết 5.4.2.1 Cho lần lượt các dịch chiết trong ống ly tâm thu được tại các Ðiều 5.1.4, 5.2 và 5.3 vào các cột Sep - Pak đã được chuẩn bị ở Ðiều 5.4.1. Tráng rửa bình chứa bằng 2,0 ml dung dịch đệm McIlvaine - EDTA (4.3.2). Trong giai đoạn này, các kháng sinh nhóm tetracyclin sẽ được hấp phụ lên bề mặt các hạt rắn chứa trong cột. Chú thích: Không được để cho cột Sep - Pak khô ở giữa hai giai đoạn chuẩn bị cột và làm sạch dịch chiết. Ðiều chỉnh cho dịch chảy ra khỏi cột từng giọt. 5.4.2.2 Cho 20 ml nước cất (4.2.2) vào xi lanh thủy tinh và cho chảy qua cột. Loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột. Làm khô cột bằng dòng không khí sạch trong 2 phút. 5.4.2.3 Giải hấp các kháng sinh nhóm tetracyclin bằng cách cho 6,0 ml dung dịch axít oxalic-metanol (4.3.3) chảy qua cột với tốc độ 1,5 ml/phút. Thu dịch ra khỏi cột vào bình định mức 10 ml. Ðịnh mức tới vạch (thể tích V) bằng nước cất (4.2.2). Tiến hành phân tích dịch thu được trên HPLC theo qui định tại Ðiều 5.5. 5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC 5.5.1 Ðiều kiện phân tích a. Cột sắc ký : Cột pha đảo C8, L x ID : 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm. b. Nhiệt độ cột: Nhiệt độ trong phòng. c. Pha động: Hỗn hợp dung dịch axit oxalic-metanol-axetonitrile (4.3.4). d. Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút. đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò UV là 350 nm. e. Thể tích tiêm: 60 µl. 5.5.2 ổn định cột sắc ký trong 30 phút bằng pha động (4.3.4). 5.5.3 Tiêm các dung dịch chuẩn (4.3.8) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính chiều cao pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các chiều cao pic thu được và nồng độ (µg/ml) từng loại kháng sinh theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b). 5.5.4 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi theo qui định tại Ðiều 5.4.2.3 vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình. Chú thích: Sau khi phân tích xong, làm sạch hệ thống HPLC (bao gồm cả cột sắc ký) bằng hỗn hợp: nước cất (4.2.2) - metanol (4.2.6) - axetonitrile (4.2.7) theo tỷ lệ về thể tích là 7-1-2 trong 30 phút. 5.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích 5.6.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo chiều cao pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %. 5.6.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu phải lớn hơn 80 %. 5.6.3 Ðường chuẩn đối với mỗi kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,995. 5.6.4 Ðối với các mẫu chứa ít hơn 0,5 µg/g kháng sinh nhóm TC, phải kiểm tra xác nhận kết quả bằng cách tiêm lại dịch chiết mẫu và dung dịch chuẩn trên cột C18 (4.1.2.b) chạy cùng chế độ như cột C8 (4.1.2.a) và so sánh thời gian lưu của píc mẫu và píc chuẩn. 6 Tính kết quả Hàm lượng các kháng sinh có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được (5.5.3). Với đường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm lượng các kháng sinh có trong mẫu được tính theo công thức sau: C (µg/kg) = (Y - b) x F x 1 000 a Trong đó: - C là nồng độ các kháng sinh có trong mẫu, tính theo µg/kg. - Y là hiệu số giữa chiều cao pic của dịch chiết và chiều cao pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị độ dài. - a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b, được xác định theo Ðiều 5.5.3. - F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V ( 5.4.2.3) và khối lượng mẫu m ( 5.1.1) sử dụng. 28 TCN 178 : 2002 HÀM LƯỢNG AXIT OXOLINIC TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Oxolinic acid in fishery products - Method for quantitative analysis by High Performance Liquid Chromatography 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng axit oxolinic trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,5 mg/kg. 2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp do Trung tâm Phát triển Thuỷ sản Ðông Nam á (SEAFDEC) biên soạn. 3 Nguyên tắc Axit oxolinic - kháng sinh thuộc nhóm Quinolon - trong mẫu thủy sản được chiết tách bằng axetonitril. Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng với n-hexan bão hoà axetonitril. Hàm lượng axit oxolinic trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn. 4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử 4.1 Thiết bị, dụng cụ 4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang. 4.1.2 Cột sắc ký TSK - GEL ODS - 80 TM, L x ID : 150 x 4,6mm, kích thước hạt 5µm. 4.1.3 Màng lọc mao quản kích thước 0,4 µm. 4.1.4 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/ phút. 4.1.5 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001g. 4.1.6 Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút. 4.1.7 Bể siêu âm. 4.1.8 Hệ thống cô quay chân không. 4.1.9 ống ly tâm thuỷ tinh, dung tích 150 ml, 15ml. 4.1.10 Bình chiết dung tích 125 ml. 4.1.11 Bình cầu thủy tinh dung tích 100 ml. 4.1.12 Bình định mức dung tích 10 ml và 100 ml. 4.2 Hóa chất 4.2.1 Nước cất loại dùng cho HPLC. 4.2.2 Axetonitril loại dùng cho HPLC. 4.2.3 Metanol loại dùng cho HPLC. 4.2.4 1 - propanol tinh khiết, loại dùng cho phân tích. 4.2.5 n - hexan tinh khiết, loại dùng cho phân tích. 4.2.6 Sulfat natri khan. 4.2.7 Clorua natri tinh khiết, loại dùng cho phân tích. 4.2.8. Axit xitric loại dùng cho HPLC. 4.2.9. Axit oxolinic loại dùng cho HPLC. 4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử 4.3.1 Axit xitric 0,1 M: hòa tan 21,01 g axit xitric (4.2.8) trong 1 lít nước cất (4.2.1). 4.3.2 Dung môi pha động: pha động cho tiến trình chạy HPLC là hỗn hợp của axetonitril, metanol và dung dịch axit xitric 0,1 M theo tỉ lệ về thể tích là 2 : 2 : 3. 4.3.3 Dung dịch chuẩn gốc 100 µg/ml: cân chính xác 10,0 mg axit oxolinic trên cân phân tích (4.1.5), hòa tan và định mức tới 100 ml bằng hỗn hợp axetonitril và nước cất (4.2.1) theo tỉ lệ về thể tích là 1 :1. 4.3.4 Dung dịch chuẩn trung gian 10 µg/ml: hút chính xác 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc 100 µg/ml (4.3.3) vào bình định mức 100 ml. Ðịnh mức tới vạch bằng hỗn hợp axetonitril và nước cất (4.2.1) theo tỉ lệ về thể tích là 1 :1. 4.3.5 Dung dịch chuẩn làm việc: hút chính xác lần lượt 0,2 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 5,0 ml và 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.3.4) vào bình định mức 10 ml. Ðịnh mức tới vạch bằng hỗn hợp axetonitril và nước cất (4.2.1) theo tỉ lệ về thể tích là 1 :1 để được các chuẩn có hàm lượng axit oxolinic lần lượt là: 0,2 µg/ml, 0,5 µg/ml, 1,0 µg/ml, 2,0 µg/ml, 5,0 µg/ml và 10,0 µg/ml. 5 Phương pháp tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.1.1 Cân chính xác 5,0 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thủy tinh dung tích 150 ml (4.1.9). Thêm 25,0 ml axetonitril (4.2.2) và 10,0 g sulfat natri khan (4.2.6) rồi nghiền trong 30 giây bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Ly tâm trong vòng 5 phút ở tốc độ 2 500 vòng/phút. 5.1.2 Lọc lấy phần dịch cho vào bình chiết 125 ml (4.1.10) chứa sẵn 25,0 ml n-hexan bão hòa axetonitril. 5.1.3 Thêm 25,0 ml axetonitril vào phần bã trong ống ly tâm rồi nghiền trong 30 giây bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Ly tâm trong vòng 5 phút ở tốc độ 2 500 vòng/phút và lọc lấy phần dịch cho vào bình chiết ở trên (5.1.2). 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có axit oxolinic. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1. 5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 2ml dung dịch chuẩn có hàm lượng 5 µg/ml vào 10,0 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1. 5.4 Làm sạch dịch chiết 5.4.1 Lắc mạnh bình chiết thu được ở các Ðiều 5.1, 5.2 và 5.3 trong vòng 10 phút rồi để yên cho tách lớp. Mở khoá để chuyển lớp axetonitril ở dưới vào bình cầu thủy tinh 100 ml (4.1.11). Thêm 5,0 ml 1-propanol (4.2.4) vào trong bình rồi cô cạn trên máy cô quay chân không (4.1.8) ở nhiệt độ 40oC. 5.4.2 Thêm 2,0 ml (V) hỗn hợp axetonitril và nước cất (4.2.1) theo tỷ lệ 3:7 về thể tích. Ðể bình vào trong bể điều nhiệt của bể siêu âm (4.1.7) cho đến khi hoà tan cặn hoàn toàn. 5.4.3 Chuyển dung dịch vào ống ly tâm dung tích 15 ml (4.1.9). Thêm 100,0 mg clorua natri tinh khiết và 1,0 ml dung dịch n-hexan bão hòa axetonitril. Trộn đều trong bể siêu âm (4.1.7) và ly tâm trong vòng 5 phút ở tốc độ 2 500 vòng/phút. 5.4.4 Ðể yên cho tách lớp, sau đó dùng pipet cẩn thẩn hút lớp axetonitril ở dưới cho vào xilanh nhựa đã gắn sẵn màng lọc mao quản (4.1.3). Tiến hành phân tích dịch lọc thu được trên HPLC theo qui định tại Ðiều 5.5. 5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC 5.5.1 Ðiều kiện phân tích a. Cột sắc ký : TSK - GEL ODS 80 TM, L x ID:150 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm. b. Nhiệt độ cột : 35oC. c. Pha động : Hỗn hợp axetonitril, metanol và axit xitric 0,1 M (4.3.2). d. Tốc độ dòng : 0,5 ml/phút. đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang: (kích hoạt) E x 337nm, (phát xạ) Em 365nm. e. Thể tích tiêm : 20 µl. 5.5.2 Tiêm các dung dịch chuẩn (4.3.5) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ axit oxolinic theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b). 5.5.3 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi theo qui định tại Ðiều 5.4.4 vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình. 5.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích 5.6.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %. 5.6.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 5 mẫu đã cho vào một lượng dung dịch axit oxolinic chuẩn đã biết hàm lượng chính xác. Ðộ thu hồi tính được phải trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %. 5.6.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R 2 ) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99. 6 Tính kết quả Hàm lượng axit oxolinic có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được (5.5.2). Với đường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm lượng axit oxolinic có trong mẫu được tính theo công thức sau: C (µg/kg) = (Y - b) x F x 1 000 a Trong đó: - C là nồng độ axit oxolinic có trong mẫu, tính theo µgkg. - Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích - a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b, được xác định theo Ðiều 5.5.2. - F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V (5.4.2) và khối lượng mẫu m (5.1.1) sử dụng. 28 TCN 179 : 2002 HÀM LƯỢNG AFLATOXIN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Aflatoxin in fishery products - Method for quantitative analysis by High Performance Liquid Chromatography 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng độc tố aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1,5 µg/kg. 2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp chuẩn số 49.2.05 của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC) công bố năm 1997. 3 Nguyên tắc Aflatoxin có trong mẫu thủy sản bao gồm các nhóm B1, B2, G1 và G2 được chiết tách ra bằng clorofom. Dịch chiết đựơc làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên silicagel. Hàm lượng aflatoxin có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn. 4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, chất chuẩn và dung dịch thử 4.1 Thiết bị, dụng cụ 4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang. 4.1.2 Cột sắc ký pha đảo LC18 kích thước L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt từ 5 đến 10 TCN/2002/TCN179.htm#_msocom_1"> [NAD1] µm. 4.1.3 Màng lọc mao quản kích thước 0,4 µm. 4.1.4 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/ phút. 4.1.5 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g. 4.1.6 Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút. 4.1.7 Bể siêu âm. 4.1.8 Hệ thống cô quay chân không. 4.1.9 Cột thủy tinh có khóa teflon, kích thước L x ID là 500 x 20 mm và 500 x 8 mm. 4.1.10 ống ly tâm thủy tinh dung tích 250 ml. 4.1.11 Bình cầu thủy tinh dung tích 100 ml và 250 ml. 4.1.12 Bình định mức dung tích 5 ml và 10 ml. 4.2 Hóa chất 4.2.1 Nước cất loại dùng cho HPLC. 4.2.2 Metanol loại dùng cho HPLC. 4.2.3 Clorofom loại dùng cho HPLC. 4.2.4 Axetonitril loại dùng cho HPLC. 4.2.5 n-hexan tinh khiết loại dùng cho phân tích. 4.2.6 Ete etylic tinh khiết. 4.2.7 Sulfat natri khan. 4.2.8 Silicagel cỡ hạt từ 60 đến 200 mesh. 4.2.9 Silicagel đã được hoạt hóa: cân 50,0 g silicagel tinh khiết (4.2.8) để vào tủ sấy trong 2 giờ ở nhiệt độ 110oC. Sau đó để nguội về nhiệt độ của phòng trong bình hút ẩm và ngâm trong clorofom 15 phút trước khi nhồi cột. 4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử 4.3.1 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100,0 µg/l), B2 (nồng độ 20,0 µg/l), G1 (nồng độ 100 µg/l) và G2 (nồng độ 20 µg/l). 4.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp aflatoxin có nồng độ (như Ðiều 4.3.1) trong metanol từ các ống chuẩn. Tùy theo nồng độ các aflatoxin có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng metanol thích hợp. 4.3.3 Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ là B1 (10,0 µg/l), B2 (2,0 µg/l), G1 (10,0 µg/l) và G2 (2,0 µg/l): hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp (4.3.1) vào bình định mức 10 ml (4.1.12) rồi định mức tới vạch bằng metanol (4.2.2). 4.3.4 Dung dịch chuẩn: hút chính xác lần lượt 0,0 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0 ml và 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.3.3) vào các bình định mức 10 ml (4.1.12) rồi định mức tới vạch bằng metanol. Các dung dịch chuẩn thu được có nồng độ aflatoxin lần lượt như sau: a. Chuẩn 1 : B1 (0,0 µg/l), B2 (0,0 µg/l), G1 (0,0 µg/l), G2 (0,0 µg/l). b. Chuẩn 2 : B1 (1,0 µg/l), B2 (0,2 µg/l), G1 (1,0 µg/l), G2 (0,2 µg/l). c. Chuẩn 3 : B1 (2,0 µg/l), B2 (0,4 µg/l), G1 (2,0 µg/l), G2 (0,4 µg/l). d. Chuẩn 4 : B1 (4,0 µg/l), B2 (0,8 µg/l), G1 (4,0 µg/l), G2 (0,8 µg/l). đ. Chuẩn 5 : B1 (8,0 µg/l), B2 (1,6 µg/l), G1 (8,0 µg/l), G2 (1,6 µg/l). e. Chuẩn 6 : B1 (10,0 µg/l), B2 (2,0 µg/l), G1 (10,0 µg/l), G2 (2,0 µg/l). 4.3.5 Dung dịch pha động: pha hỗn hợp các dung môi axetonitril, metanol và nước cất loại dùng cho HPLC theo tỉ lệ về thể tích là 2 : 2 : 6. 5 Phương pháp tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.1.1 Dùng cân phân tích (4.1.5) cân chính xác 50,0 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.1.10). 5.1.2 Thêm 100,0 ml clorofom (4.2.3) vào ống rồi trộn đều trong khoảng 2 phút bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm (4.1.6) trong khoảng 5 phút ở tốc độ 5 000 vòng/phút. Tiến hành lọc dịch chiết và rửa phần bã bằng clorofom rồi cho tất cả dịch thu được vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml (4.1.11). 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có aflatoxin. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1. 5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn 3 (4.3.4.c) vào 10,0 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.1. Phải chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi đồng thời với chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng. 5.4 Làm sạch dịch chiết 5.4.1 Chuẩn bị cột Ðặt 1 lớp bông thủy tinh vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon (4.1.9). Ðóng khóa và cho clorofom tới khoảng 2/3 cột rồi thêm lần lượt 5,0 g sulfat natri khan (4.2.7), 20,0g silicagel đã hoạt hóa (4.2.8), 15 g sulfat natri khan (4.2.7). Chú thích: để tránh khô cột luôn giữ mực clorofom cao hơn lớp sulfat natri khan trên cùng khoảng 1,5 cm. 5.4.2 Làm sạch dịch chiết 5.4.2.1 Cô dịch chiết thu được (5.1.2) trên hệ thống cô quay chân không (4.1.8) còn khoảng 5,0 ml ở nhiệt độ 40 oC. Dùng pipet chuyển dung dịch từ bình cầu (5.1.2) vào cột làm sạch đã chuẩn bị (5.4.1) và tráng rửa bình cầu bằng clorofom. Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy của dung dịch ra khỏi cột khoảng từ 1,0 đến 1,5 ml/phút. Trong giai đoạn này, aflatoxin sẽ hấp phụ lên các hạt silicagel. 5.4.2.2 Thêm vào cột lần lượt 50,0 ml n-hexan (4.2.5), 50,0 ml ete etylic (4.2.6). Ðiều chỉnh tốc độ dung môi chảy qua cột ở 1,0 ml/phút. Sau đó loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột. 5.4.2.3 Giải hấp các aflatoxin khỏi cột làm sạch bằng 50,0 ml hỗn hợp clorofom và metanol theo tỉ lệ về thể tích là 97: 3 với tốc dộ 1,0 ml/phút. Hứng dung dịch chảy ra khỏi cột vào bình cầu dung tích 100 ml (4.1.11). Cô dịch thu được trên hệ thống cô quay chân không (4.1.8) ở nhiệt độ 40 o C cho đến khô hoàn toàn. Hoà tan cặn bằng 5,0 ml (V) dung dịch pha động (4.3.5) trong bình định mức 5 ml (4.1.12). Tiến hành phân tích hàm lượng các aflatoxin trên HPLC theo qui định tại Ðiều 5.5. 5.4.2.4 Tiến hành làm sạch mẫu trắng (5.2) và mẫu để xác định độ thu hồi (5.3) giống như với mẫu thử (5.1) theo qui định tại Ðiều 5.4.2.1, Ðiều 5.4.2.2 và Ðiều 5.4.2.3. 5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC 5.5.1 Ðiều kiện phân tích a. Cột sắc ký : RP-LC 18, kích thước L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt 5 -10 [NAD2] µm. b. Nhiệt độ cột : 35 o C. c. Pha động : Hỗn hợp gồm: axetonitril, metanol và nước cất (4.3.5. d. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang là: (kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm. e. Thể tích tiêm : 20 µl. 5.5.2 Tiêm các dung dịch chuẩn (4.3.4) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại aflatoxin theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b). 5.5.3 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng và dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình. 5.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích 5.6.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %. 5.6.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu trắng đã cho vào một lượng dung dịch aflatoxin chuẩn đã biết hàm lượng chính xác (5.3). Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %. 5.6.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99. 6 Tính kết quả Hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được (5.5.2). Với đường chuẩn ở dạng y = ax +b, hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính theo công thức sau: C (µg/kg) = (Y - b) x F a Trong đó: - C là nồng độ aflatoxin có trong mẫu, tính theo µg/kg - Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích - a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b, được xác định theo Ðiều 5.5.2. - F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V (5.4.2) và khối lượng mẫu m (5.1.1) sử dụng. 28 TCN 180 : 2002 HÀM LƯỢNG THUỐC TRỪ SÂU GỐC CLO HỮU CƠ VÀ POLY CLORUA BIPHENYL TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN - PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ KHÍ Organochlorine pesticides and PCB-congeners in fish and fishery products - Method for quantitative analysis by Gas Chromatography 1 Phạm vi áp dụng 1.1 Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng các thuốc trừ sâu gốc Clo hữu cơ và Poly Clorua Biphenyl (sau đây gọi tắt là PCBs) trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản bằng hệ thống sắc ký khí (sau đây gọi tắt là GC). 1.2 Giới hạn phát hiện của phương pháp đối với: α-BHC là 1,0 µg/kg; β-BHC là 4,5 µg/kg; γ-BHC là 0,7 µg/kg; heptaclo là 1,0 µg/kg; alđrin là 1,5 µg/kg; đielđrin là 2,5 µg/kg; enđrin là 5,0 µg/kg; DDT là 1,5 µg/kg và clođan là 1,0µg/kg. 2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp 'Rapid determination of chlorinated pesticides, polychlorinated biphenyls', Mitt.Lebendsmittelunters. Hyg. 65:131-150 (1974) và phương pháp số S9 nêu trong Sổ tay hướng dẫn phân tích dư lượng thuốc trừ sâu của Cộng hoà liên bang Ðức (năm 1987). 3 Nguyên tắc 3.1 Thuốc trừ sâu nhóm clo hữu cơ bao gồm các hợp chất chính hay đồng phân của chúng như sau: alđrin; α-clođan; γ-clođan; oxi-clođan; p,p' DDD; p,p' DDE; o,p' DDT; p,p' DDT; đielđrin; α-endosulfan; enđrin; heptaclo, heptaclo epoxit; hexaclobenzen (HCB); α-hexacloxyclohexan (α-HCH); β-hexacloroxyclohexan (β-HCH); δ-hexacloxyclohexan (δ-HCH); isođrin, trans-nonaclo; γ-hexachlorocyclohexan (γ-HCH). 3.2 Các hợp chất nhóm PCBs bao gồm: 4-PCB (CB3); 2,4,4'-PCB (CB28); 2,2',4,4'-PCB (CB47); 2,2',5,5'-PCB (CB52); 2,2',5,6'-PCB (CB53); 2,2',4,5,5'-PCB (CB101); 2,3,4,4',5'-PCB (CB114); 2,3',4,4',5'-PCB (CB118); 2,3,3',4,5'-PCB (CB122); 2,2',3,3',4,4'-PCB (CB128); 2,2',3,4,4',5'-PCB (CB138); 2,3,3,4',5',6'-PCB (CB149); 2,2',4,4',5,5'-PCB (CB153); 2,2',4,4',6,6'-PCB (CB155); 2,3,3',4,4',5'-PCB (CB156); 2,3,3',4,4',5'-PCB (CB157); 2,3',4,4',5'-PCB (CB167); 2,2',3,3',4,4',5'-PCB (CB170); 2,2',3,4,4',5,5'-PCB (CB180); 2,2',3,3',4,5,5',6-PCB (CB198). 3.3 Trong mẫu thủy sản các hợp chất trên được chiết tách ra bằng dung môi pentan. Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên florisil sau đó được tách làm 2 phân đoạn trên cột silicagel. Phân đoạn A chứa các PCB (trừ CB3), HCB, alđrin, isođrine, heptaclo và p,p' DDE. Phân đoạn B chứa CB3, p,p' DDE và các thuốc trừ sâu gốc clo còn lại. Hàm lượng các thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ và PCBs trong các phân đoạn chiết được xác định trên máy sắc ký khí với đầu dò bắt giữ điện tử (sau đây gọi tắt là ECD). 4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử 4.1 Thiết bị và dụng cụ 4.1.1 Cột sắc ký thủy tinh (có van khoá), kích thước L x ID là 500 x 20 mm và 500 x 8mm. 4.1.2 Hệ thống cô quay chân không. 4.1.3 Hệ thống chiết mẫu soxhlet. 4.1.4 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/phút. 4.1.5 Máy lắc 4.1.6 Tủ sấy 4.1.7 Lò nung 4.1.8 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g. 4.1.9 Cột mao quản (cho máy GC): loại SPBTM - SUPELCO, kích thước L x ID = 30 m x 0,32 mm hoặc tương đương. 4.1.10 Máy sắc ký khí với đầu dò ECD. 4.1.11 Hệ ống soxhlet: các ống soxhlet được làm sạch bằng cách chưng cất với pentan hay diclormetan trên hệ thống soxhlet trong 4 giờ. 4.1.12 Cối sứ. 4.1.13 Bể siêu âm 4.1.14 Bình thuỷ tinh, bình tam giác dung tích 50 ml. 4.2 Hoá chất 4.2.1 Ete đietyl loại dùng cho HPLC. 4.2.2 Pentan loại dùng cho HPLC. 4.2.3 Sulfat natri khan tinh khiết được làm sạch bằng điclometan trên hệ thống soxhlet, sau đó nung ở nhiệt độ 5000C trong 4 giờ và giữ trong chai thuỷ tinh. 4.2.4 Isooctan loại dùng cho HPLC. 4.2.5 Khí mang: Heli (loại dùng cho GC). 4.2.6 Florisil cỡ hạt từ 60 đến100 mesh được làm sạch bằng hệ thống soxhlet và nung ở nhiệt độ 4500C trong 18 giờ, sau đó cho vào chai thuỷ tinh được phủ bằng giấy nhôm và được giữ ở nhiệt độ 1200C trong tủ sấy. 4.2.7 Florisil được hoạt hoá: lấy một lượng florisil (4.2.6) từ tủ sấy đổ trực tiếp qua phễu vào một bình đáy tròn (erlenmeye) có nút nhám. Thêm vào bình 3 % nước theo tỷ lệ trọng lượng (w/w), sau đó lắc hỗn hợp khoảng 30 phút bằng máy lắc và để yên khoảng 1 giờ trước khi sử dụng. 4.2.8 Bông thuỷ tinh được làm sạch bằng pentan hay điclometan trên hệ thống soxhlet và để khô trên miếng giấy nhôm đặt trong tủ hút. 4.2.9 Cát sạch được nung ở nhiệt độ 5000C trong 3 giờ, để cho nguội trên giấy nhôm sau đó giữ trong chai có nắp vặn. 4.2.10 Silicagel cỡ hạt từ 70 đến 140 mesh. 4.2.11 Silicagel đã được hoạt hoá: lấy silicagel (4.2.10), rửa sạch bằng điclometan rồi cho vào trong chén sứ và để trong tủ sấy ở nhiệt độ 1200C trong vòng 12 giờ. Sau đó, dùng giấy thiếc bọc kín mệng chén sứ và để lại vào tủ sấy ở nhiệt độ 1200C trước khi sử dụng. 4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử 4.3.1 Dung dịch rửa giải: hỗn hợp dung dịch điclometan và pentan (4.2.2) theo tỷ lệ về thể tích là 2 : 8, được pha trước khi sử dụng. 4.3.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn thuốc trừ sâu gốc clo và PCBs trong isooctan có nồng độ: 0,0 µg/l, 2,5µg/l , 5µg/l, 10,0 µg/l, 20,0 µg/l từ các ống chuẩn. Tuỳ theo nồng độ thuốc trừ sâu có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng isooctan thích hợp. 4.3.3 Dung dịch chuẩn thu hồi: pha -HCH trong dung môi isooctan để có hàm lượng là:  các chuẩn của CB3, CB198 và -HCH/g isooctan.  2,0 µg CB3/g isooctan; 0,2µg CB198/g isooctan và 0,2 µg 4.3.4 Dung dịch chuẩn kiểm tra: pha chính xác hỗn hợp dung dịch chuẩn kiểm tra gồm p,p DDE và ppDDT trong isooctan với hàm lượng của mỗi chất trong khoảng từ 5 đến 20 ng/ml isooctan. 5 Phương pháp tiến hành 5.1 Xác định hàm lượng chất béo trong mẫu thử 5.1.1 Nghiền đều 250,0 g mẫu thủy sản trên máy nghiền đồng thể (4.1.4). Dùng cân phân tích (4.1.8) cân chính xác 10,0 g mẫu (m) đã nghiền cho vào trong ống soxhlet sạch (4.1.11) được phủ bằng bông thuỷ tinh (4.2.8). Chiết mẫu với 150,0 ml pentan trong 3 giờ trên hệ thống chiết mẫu soxhlet (4.1.3). 5.1.2 Cô đặc dịch chiết trên máy cô quay chân không (4.1.2) đến khoảng 20 ml. Sau đó, cô tiếp ở chế độ chân không cho đến khi chỉ còn khoảng 1,0 ml. 5.1.3 Chuyển dịch đã cô vào một chén cân đã biết trước khối lượng, dùng giấy nhôm phủ lên chén cân rồi để qua đêm trong tủ hút. Sau đó, chén cân được làm khô đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 700C trong tủ sấy (sự thay đổi của chén cân không vượt quá 0,0005 g) rồi để nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm. Phần thu được đem cân là lượng chất béo có trong mẫu. 5.2 Chuẩn bị mẫu thử 5.2.1 Cân chính xác 10,0 g mẫu (m) đã nghiền cho vào cối sứ (nếu lượng chất béo trong 10,0 g mẫu lớn hơn 0,8 g thì giảm lượng mẫu để đảm bảo có tối đa 0,8 g chất béo trong lượng mẫu đem thử nghiệm). Thêm 10,0 g cát sạch (4.2.9) và 4,0 g sunfat natri khan (4.2.3) rồi nghiền đều bằng cối sứ (4.1.12). Hỗn hợp được đưa vào trong ống soxhlet sạch (4.1.11), được phủ bằng bông thuỷ tinh (4.2.8). Sau đó, hỗn hợp được chiết với 150,0 ml pentan trong 3 giờ trên hệ thống chiết mẫu soxhlet (4.1.3). 5.2.2 Nếu mẫu chứa nước, sản phẩm chiết phải được lọc qua sunfat natri khan rồi được rửa lại bằng 25,0 ml pentan. Sản phẩm chiết được cô đặc trên máy cô quay chân không (4.1.2) đến khoảng 20 ml. Sau đó, cô tiếp với chế độ chân không ở nhiệt độ 40oC cho đến khi chỉ còn khoảng 1,0 ml. Thêm vào dịch thu được 2,0 ml isooctane rồi làm sạch dịch chiết theo qui định tại Ðiều 5.5. 5.3 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ và PCBs. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.2. 5.4 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn có hàm lượng 5,0 µg/l (4.3.2) vào 10,0 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy nghiền đồng thể (4.1.4). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại Ðiều 5.2. 5.5 Làm sạch dịch chiết 5.5.1 Chuẩn bị cột 5.5.1.1 Cân 25,0 g florisil đã hoạt hoá rồi cho vào cốc thuỷ tinh có mỏ chứa 50,0 ml dung môi pentan (4.2.2). Sau đó rót từ từ dung dịch vào trong cột sắc ký thuỷ tinh (4.1.1) đã khoá van và nhồi một ít bông thuỷ tinh (4.2.8) dưới đáy cột. 5.5.1.2 Ðể yên cột cho lắng, sau đó tháo van để rút dung môi pentan ra khỏi cột cho đến khi mức dung môi trong cột cao hơn mức florisil khoảng 1,0 cm. Thêm một ít bông thủy tinh lên phía trên lớp florisil để tránh xáo trộn tinh thể khi có dòng dung dịch đổ vào. 5.5.2 Làm sạch dịch chiết 5.5.2.1 Chuyển các dung dịch thu được ở Ðiều 5.2.2, Ðiều 5.3 và Ðiều 5.4 vào các cột sắc ký đã chuẩn bị (5.5.1). 5.5.2.2 Cho tiếp 3 lần, mỗi lần 3,0 ml dung dịch rửa giải (4.3.1). Ðiều chỉnh khoá để tốc độ rửa giải đạt từ 4 đến 5 ml/phút. Chú thích: không được để khô cột trong tất cả các bước của qui trình. 5.5.2.3 Thu toàn bộ dịch chiết đi qua cột vào một bình thuỷ tinh đáy tròn của máy cô quay chân không (4.1.2). Tiến hành cô dung dịch thu được cho đến khi chỉ còn khoảng 1,0 ml. Bổ sung thêm 1,0 ml isooctan vào trong bình rồi lắc đều để hoà tan hết cặn bám trên thành bình. Làm bay hơi từ từ bằng dòng khí nitơ cho tới khi dịch khô hoàn toàn. 5.5.2.4 Thêm chính xác 2,0 ml isooctan rồi lắc đều để hoà tan cặn. 5.6 Phân tách thuốc trừ sâu gốc clo và PCBs 5.6.1 Chuẩn bị cột 5.6.1.1 Cân chính xác 7,0 g silicagel đã được hoạt hoá (4.2.11) vào trong bình định mức tam giác dung tích 50 ml (4.1.14). Sau đó, cho thêm khoảng 25,0 ml pentan, lắc đều rồi để cho lắng. Ðổ hỗn hợp này vào trong cột sắc ký thuỷ tinh kích thước L x ID là 500 x 8 mm (4.1.1) đã nhồi một ít bông thuỷ tinh (4.2.8) dưới đáy cột. Chú thích: trong quá trình nhồi cột phải luôn giữ mức pentan trong cột cao hơn phần silicagel trong cột. 5.6.1.2 Ðể yên cho silicagel lắng xuống rồi bổ sung một lượng tinh thể sulfat natri (4.2.3) vào trong cột với chiều cao khoảng 2 cm. Mở khoá để tháo bớt pentan trong cột đến khi mức pentan ngang bằng với mặt trên của phần tinh thể sulfat natri. 5.6.2 Kiểm tra cột tách chiết silicagel và dung môi pentan 5.6.2.1 Lấy chính xác 2,0 ml dung dịch chuẩn kiểm tra (4.3.4) cho qua cột silicagel đã chuẩn bị (5.6.1). Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy khoảng 40 giọt/giây. Sau đó, cho từ từ 100,0 ml pentan qua cột. Thu lần lượt các dung dịch chiết chảy qua cột vào trong 9 bình thuỷ tinh (4.1.14). Bình thứ nhất (ký hiệu là E 1 ) thu 60,0 ml đầu, các bình tiếp theo (ký hiệu từ E 2 đến E 9 ) mỗi bình thu lần lượt khoảng 5,0 ml dịch chiết. 5.6.2.2 Cô quay các dung dịch trong 9 bình nói trên bằng máy cô quay chân không (4.1.2) cho đến khi còn khoảng 1,0 ml. Tiến hành phân tích trên máy sắc ký khí (GC-ECD) theo qui định tại Ðiều 5.6.3.2, Ðiều 5.6.3.3 và Ðiều 5.7. Tính hàm lượng của p,p'-DDE và p,p'-DDT tương ứng của mỗi bình theo công thức nêu tại Ðiều 6. 5.6.2.3 Xác định thể tích pentan cần thiết để thu được dung dịch rửa giải A (ký hiệu là X), bằng công thức sau: X (ml) = E 1 + E 2 ... + E n-1 Trong đó: - E là thể tích dung dịch rửa giải thu vào bình có số thứ tự tương ứng, tính bằng ml. - n là số thứ tự của bình mà tại đó không còn phát hiện p,p'-DDE 5.6.2.4 Giá trị X chỉ đúng với cùng một lô silicagel và pentan. Thông thường giá trị X nằm trong khoảng từ 60 đến 90 ml. Nếu hai hợp chất trong mẫu kiểm tra không thể phân tách được thì bổ sung thêm nước khoảng từ 1 đến 2 % về khối lượng vào silicagel trong cột rồi tiến hành lặp lại các bước kiểm tra qui định tại Ðiều 5.6.2. 5.6.3 Phân tách các dẫn xuất của PCB và thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ 5.6.3.1 Cho toàn bộ dịch chiết đã làm sạch (5.5.2) qua cột silicagel đã chuẩn bị (5.6.1). Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy khoảng 40 giọt/giây. Cho từ từ X ml pentan (xác định tại Ðiều 5.6.2) qua cột thu được dung dịch rửa giải A. Sau đó, cho tiếp 100,0 ml hỗn hợp ete đietyl và pentan theo tỉ lệ về thể tích là 1 : 9 đi qua cột thu được dung dịch rửa giải B. Sử dụng 2 bình chứa khàc nhau để hứng riêng 2 dung dịch A và B. 5.6.3.2 Thêm 1,0 ml isooctan vào các dung dịch rửa giải A, B. Dung dịch thu được được cô quay bằng máy cô quay chân không (4.1.2) cho đến khi còn khoảng 25,0 ml. Sau đó tiếp tục được cô cho đến dung dịch khô hoàn toàn. 5.6.3.3 Thêm chính xác 2ml isooctan (v) và đem phân tích trên máy GC. Chú thích: không được để khô cột trong tất cả các bước của qui trình. 5.7 Tiến hành phân tích trên GC 5.7.1 Ðiều kiện phân tích a. Máy sắc ký khí sử dụng đầu dò ECD, có khả năng chia dòng, có thể tuỳ chọn chế độ bơm tự động. b. Chế độ nhiệt của hệ thống GC: Nhiệt độ của buồng tiêm là 250 0 C; nhiệt độ đầu dò là 300 0 C. Chương trình nhiệt độ (mô tả chi tiết trong Biểu đồ 1) cụ thể là: - Duy trì ở nhiệt độ 150 0 C trong 1 phút. - Tăng nhiệt độ 2 0 C/phút lên tới nhiệt độ 220 0 C. - Tăng nhiệt độ 20 0 C/phút lên tới nhiệt độ 240 0 C. - Duy trì ở nhiệt độ 240 0 C trong 13phút. - Tổng thời gian là 51 phút. c. Cột sắc ký Cột mao quản không phân cực trung bình SPB -1 TM - SUPELCO (cột methylsilicon có khả năng tách thuốc trừ sâu theo nhiệt độ sôi), nhiệt độ tối đa 360 0 C, chiều dài 30 m, bán kính trong 0,32 mm, bán kính ngoài 0,50 mm, chiều dài lớp phủ 0,25 µm. d. Khí - Khí mang: Heliáp suất khí 70kpa. - Khí làm sạch: Nitơ 99, 9999 %. - Chế độ chia dòng: 1 :10. 5.7.2 Tiến hành phân tích 5.7.2.1 Tiêm các dung dịch chuẩn (4.3.2) vào máy GC theo thứ tự từ nồng độ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại thuốc trừ sâu theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b). 5.7.2.2 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch mẫu để xác định độ thu vào hệ thống GC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình. 5.8 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích 5.8.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm Ðộ lệch chuẩn (CV S ) tính theo diện tích píc sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %. 5.8.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu có cùng một lượng dung dịch chuẩn đã biết hàm lượng chính xác. Ðộ thu hồi tính được phải trong khoảng từ 85% đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %. 5.8.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R 2 ) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99. 6 Tính kết quả Hàm lượng từng loại thuốc trừ sâu có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được ở (5.7.2.1). Với đường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm lượng từng loại thuốc trừ sâu có trong mẫu được tính theo công thức sau: C (µg/kg) = (Y - b) x F a Trong đó: - C là nồng độ từng loại thuốc trừ sâu có trong mẫu, tính theo µg/kg. - Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào GC, tính theo đơn vị diện tích. - a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b, được xác định theo Ðiều 5.7.2.1. - F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch (5.6.3.3) và khối lượng mẫu m (5.2.1) sử dụng.