TCVN5961:1995

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5961:1995 (ISO 11268/1:1993) về chất lượng đất - ảnh hưởng của các chất ô nhiễm lên giun đất (Eisenia tetida) - xác định độ độc cấp tính bằng cách sử dụng nền đất nhân tạo TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5961 : 1995 ( ISO 11268-1:1993 ) CHẤT LƯỢNG ĐẤT - ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT Ô NHIỄM LÊN GIUN ĐẤT (EISENIA FETIDA) - XÁC ĐỊNH ĐỘ ĐỘC CẤP TÍNH BẰNG CÁCH SỬ DỤNG NỀN ĐẤT NHÂN TẠO Lời nói đầu TCVN 5961 - 1995 hoàn toàn tương đương với ISO 11268/1 - 1993 TCVN 5961 - 1995 do Ban Kĩ thuật Chất lượng đất TCVN/TC 190 biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng trình duyệt, Bộ Khoa học - Công nghệ và Môi trường ban hành. CHẤT LƯỢNG ĐẤT - ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT Ô NHIỄM LÊN GIUN ĐẤT (EISENIA FETIDA) - XÁC ĐỊNH ĐỘ ĐỘC CẤP TÍNH BẰNG CÁCH SỬ DỤNG NỀN ĐẤT NHÂN TẠO. Soil quality - Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Determination of acute toxicity using artificial substrate. 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định độ độc tối đa của các chất đối với giun đất-(Eisinia fetida) qua da và qua chất dinh dưỡng bằng cách sử dụng một chất nền nhân tạo. Phương pháp này không áp dụng cho các chất dễ bay hơi tức là những chất mà giá trị H (hằng số Henry) hoặc hệ số riêng phần không khí nước lớn hơn 1 hoặc cho các chất có áp suất hơn lớn hơn 0,0133 Pa ở 250C. Phương pháp này không tính đến khả năng phân huỷ của chất thử. 2 Tiêu chuẩn trích dẫn Những tiêu chuẩn sau đây sử dụng cùng với tiêu chuẩn này. Vì các tiêu chuẩn được soát xét lại một cách thường xuyên, nên khuyến khích sử dụng những tiêu chuẩn mới nhất. ISO 11274 - Chất lượng đất - Xác định đặc tính giữ nước - Phương pháp phòng thí nghiệm. ISO 11461 - Chất lượng đất - Xác định hàm lượng nước của đất trên cơ sở thể tích - Phương pháp khối lượng. 3 Định nghĩa Tiêu chuẩn này sử dụng các định nghĩa sau đây: 3.1 LC 50: Nồng độ gây chết trung bình: là nồng độ ban đầu của chất thử giết chết 50% số súc vật đem thử trong quá trình thử. 3.2 NOEC (nồng độ không quan sát thấy hiệu ứng): Nồng độ cao nhất của chất thử mà tại đó không quan sát thấy hiệu ứng làm chết hoặc các hiệu ứng khác (như làm giảm trọng lượng). Chú thích 1: Cả hai đại lượng LC 50 và NOEC đều được biểu hiện bằng miligam của chất thử trên kilogam (khối lượng khô) của chất nên đem thử (5.2) 4 Nguyên tắc Xác định số phần trăm tử vong của giun đất đã trưởng thành (loài Eisenia fetida) trong mẫu đất xác định chứa thử ở các nồng độ khác nhau sau 7 ngày và 14 ngày. Chất thử được đưa vào một lần và quá trình thử nghiệm được hoàn thành không cần phải bổ sung chất thử. Nồng độ chất thử được tính bằng miligam chất thử trên 1 kilogam chất nền khô đem thử. Những kết quả thu được từ những phép thử được so sánh với mẫu chuẩn và được dùng để đánh giá nồng độ gây nên số tử vong 50% giun đất (LC 50, 14 ngày). Chú thích 2: Cloaxetamit là một chất so sánh thích hợp. Quá trình thử trải qua hai bước: - Phép thử sơ bộ: Phép thử này cho giá trị gần đúng về nồng độ tương ứng với sự tiêu diệt hoàn toàn và sự không gây tử vong. Những kết quả này được dùng để xác định khoảng nồng độ cho phép thử cuối. - Phép thử cuối xác định những nồng độ gây tử vong giữa 10% và 90%: những số liệu này cho kết quả cuối cùng. Không thử các chất ở nồng độ cao hơn 1000mg cho 1 kg chất nền khô. Nếu phép thử sơ bộ chỉ rõ không có tử vong thì không cần thực hiện phép thử cuối cùng. 5 Thuốc thử 5.1 Nguyên liệu sinh vật Nguyên liệu sinh vật là giun đất trưởng thành thuộc loài Eisenia fetida ít nhất hai tháng tuổi và có khối lượng ướt giữa 300mg và 600mg. Chú thích 3: Loài Eisenia fetida hiện có 2 phân loài mà một số nhà phân loại xem như là loài riêng biệt Eisenia fetida và Eisenia andrei. Chúng giống nhau về hình thái học nhưng một loài E fetida fetida (E fetida) có sọc ngang hoặc dải đặc trưng trên các phần đốt còn loài kia E fetida andrei (E andrei) lại không có đặc điểm này nhưng lại có đốm màu đỏ nhạt. Có thể sử dụng được cả hai phân loài (loại). Các con giun đất được chọn cho thử nghiệm phải đạt đến một chừng mực đồng đều về kích thước và trọng lượng. Trước khi thử cần phải rửa chúng bằng nước uống. Chú thích 4: Kỹ thuật về nuôi dưỡng Eisenia fetida được chỉ ra ở phụ lục A. 5.2 Chất nền thử Mỗi chậu thuỷ tinh (6.1) dùng một lượng chất nền là 500g (khối lượng khô). Chất nền được gọi là "đất nhân tạo" có các thành phần như sau: Phần trăm tính theo khối lượng khô Than bùn xay mịn và không thấy vết tích thực vật 10% Đất sét Caolinit chứa không ít hơn 30% caolinit 20% Cát thạch anh công nghiệp (cát mịn là chủ yếu với trên 50% các hạt có kích thước 0,05 mm đến 0,2 mm) 70% Thêm một lượng đủ canxi cacbonat đã được nghiền nhỏ và có độ tinh khiết phân tích để đưa pH của chất nền đã được làm ẩm đến bằng 6,0 ± 0,5 (thường khoảng 0,5% khối lượng của thành phần khô). Chất nền sẽ được làm ẩm bằng nước đã được loại ion hoặc bằng nước cất để đạt được 40% - 60% khả năng giữ nước toàn phần của đất xác định theo ISO 11274. Xác định hàm lượng nước chứa trong chất nền theo ISO 11461. Chú thích 5: Cho phép dùng bất kỳ loại nước nào để đưa chất thử vào đất. 6 Thiết bị Thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm và 6.1 Chậu thuỷ tinh mỗi chậu cho mỗi thử nghiệm, dung tích khoảng 1 lít đến 2 lít, đậy không kín để đảm bảo sự trao đổi giữa môi trường thử và không khí. 6.2 Thiết bị để xác định khối lượng khô của chất nên theo ISO 11641. 7 Môi trường thử 7.1 Khu đất có hàng rào vây quanh có thể kiểm soát nhiệt độ ở 20 ± 20C. 7.2 Nguồn sáng (đèn ống phát huỳnh quang trắng) có khả năng cung cấp một cường độ sáng hằng định từ 400 Lx đến 800 Lx trên các chậu và kiểm tra chu kỳ sáng tối giữa 12 giờ: 12 giờ và 16 giờ, 18 giờ. 8 Qui trình 8.1 Chuẩn bị cho phép thử Nồng độ chất thử được biểu diễn bằng khối lượng chất thử trên khối lượng khô của chất nền (mg/kg) (xem 5.2). 8.1.1 Giới thiệu các chất thử 8.1.1.1 Các chất tan trong nước Ngay trước khi bắt đầu phép thử, hoà tan một lượng chất thử cần thiết để tạo một nồng độ trong nước (hoặc lượng cần thiết để làm ẩm đất để đạt được những yêu cầu của 5.2) và trộn kỹ nó với chất nền (5.2) đã nói trên trước khi đưa vào chậu thuỷ tinh (6.1). Tiếp tục như mô tả trong 8.1.2. 8.1.1.2 Các chất không tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ Hoà tan một lượng chất thử cần thiết để thu được nồng độ mong muốn trong dung môi bay hơi (như là axêtôn hoặc hexan). Cho chất thử vào chậu thuỷ tinh (6.1) với chất nền (5.2). Trộn cẩn thận và làm bay hơi dung môi bằng cách đặt chậu thuỷ tinh vào tủ hút. Sau đó thêm nước theo 5.2. Trộn cẩn thận và tiếp tục như mô tả trong 8.1.2. Chú ý: Cần phải cẩn thận khi tiếp xúc với hơi dung môi để tránh nguy hiểm do bị hít phải hoặc do nổ và tránh thiệt hại cho thiết bị chiết, bơm ... 8.1.1.3 Các chất không tan trong nước hoặc trong dung môi hữu cơ Đối với các chất không tan trong dung môi hữu cơ thì điều chế một hỗn hợp gồm 10 g cát thạch anh (xem 5.2) đã được nghiền nhỏ và một lượng cần thiết chất thử để thu được nồng độ mong muốn. Chuyển hỗn hợp phần còn lại của chất nền (5.2) và nước (xem 5.2) vào chậu thuỷ tinh (6.1). Trộn kỹ và tiếp tục như trình bày trong 8.1.2. 8.1.2 Giới thiệu vật liệu sinh vật Xác định hàm lượng nước và pH của đất nhân tạo ở đầu và cuối phép thử (khi chất thử là axit hoặc bazơ thì không cần điều chỉnh pH). Lấy 10 con giun đất đã được chuẩn bị như trong 5.1, thấm khô chúng bằng giấy hút nước, cân và cho chúng vào chậu chứa mẫu thử. Che chậu chứa mẫu thử như đã nói ở 6.1 và đặt nó vào mảnh đất thử có rào xung quanh (7.1). 8.1.3 Chậu đối chứng Chuẩn bị chậu đối chứng giống như đối với chậu thử. Nếu quá trình thử đòi hỏi dùng dung môi (xem 8.1.1.2) thì cần chuẩn bị chậu đối chứng có dung môi nhưng không có chất thử. Đậy chậu này như đã nói trong 6.1. 8.2 Thử sơ bộ Thực hiện phép thử sơ bộ với nồng độ chất thử khác nhau (ví dụ: 0,1 mg/kg; 1mg/kg; 10 mg/kg; 100 mg/kg và 1,000 mg/kg, các nồng độ được biểu diễn bằng miligam chất thử trên kilôgam chất nền khô (5.2) và mỗi phép kiểm tra dùng 10 con giun cho mỗi nồng độ và mỗi chậu thử. Chuẩn bị chậu thử như đã nói trong 8.1.1 và 8.1.2. Đặt chậu thử vào môi trường như đã mô tả ở điều 7. Sau 7 ngày đêm những con giun sống và lấy ra những chọn giun chết nếu nhìn thấy. Sau 14 ngày đêm những con giun sống và những con giun chết trong chậu (một con giun được coi là chết nếu nó không có phản ứng khi bị gim châm từ phía trước). Tính phần trăm tử vong đối với mỗi chậu chứa và ở nồng độ. Ghi chép các triệu chứng quan sát thấy trên con giun. 8.3 Phép thử cuối cùng Dựa trên kết quả của phép thử sơ bộ, thực hiện phép thử cuối cùng ở 5 nồng độ chất thử theo cấp số nhân giữa nồng độ cao nhất không gây tử vong và nồng độ thấp nhất gây tử vong hoàn toàn. Đồng thời lặp lại 4 mẫu theo nồng độ và một phép kiểm tra không có chất thử (xem 8.1.3) và nếu cần thiết, một phép kiểm tra khác có dung môi, đặt mỗi chậu chứa mẫu vào môi trường thử (điều 7). Trong thời gian thử và sau 14 ngày thực hiện như chỉ dẫn trong 8.2. Khi kết thúc phép thử, xác định tổng số và khối lượng giun sống trong mỗi chậu kiểm tra, giá trị pH trong mỗi chậu về nồng độ thử. 8.4 Chất chuẩn Thực hiện phép thử với cloaxetamit tinh khiết phân tích theo qui trình được mô tả trong 8.1.1.1. Chú thích 6: Đại lượng LC 50 (3.1) cần phải ở trong khoảng giữa 20 mg/kg và 80mg/kg. 9 Tính toán và thể hiện kết quả 9.1 Tính toán Xác định phần trăm tử vong thu được từ phép thử cuối cùng đối với mỗi nồng độ. Chú thích 7: Khi số liệu đầy đủ thì giá trị LC 50 - 14d (14 ngày) và độ tin cậy (T = 0,95) được xác định bằng cách sử dụng các phương pháp tiêu chuẩn (Litch field and Wilcoxon hoặc các phương pháp tương đương). Khi hai nồng độ liên tiếp ở tỉ lệ bé hơn hoặc bằng 1.8 (ví dụ 10;18) chỉ cho duy nhất 0% và 100% tử vong thì hai giá này là đủ để chỉ khoảng trong đó LC 50. 9.2 Thể hiện kết quả Kết quả được tính bằng miligam trên kilogam chất nên khô, đại lượng LC 50 - 14d (hoặc lâu hơn nếu phép thử được kéo dài hơn qui trình này, xem điều 9), nồng độ thử cao nhất gây tử vong 0% và nồng độ thử thấp nhất gây tử vong 100%. 10 Giá trị pháp lý của phép thử Tất cả các kết quả được xem là có hiệu lực nếu phần trăm tử vong quan sát được trong phép kiểm tra < 10%, sự hao hụt trung bình sinh khôi của giun trong phép kiểm tra không vượt quá 20%. 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm bao gồm các thông tin sau: a) Trích dẫn tiêu chuẩn này; b) Các kết quả được trình bày như trong 9.2; c) Mô tả đầy đủ nguyên liệu sinh vật được dùng (loài, tuổi, khoảng khối lượng, điều kiện nuôi, người cung cấp); d) Phương pháp điều chế chất nên thử bao gồm cả dung môi dùng cho chất không tan trong nước; e) Chỉ rõ chất chuẩn và các kết quả thu được khi sử dụng nó; f) Các điều kiện của môi trường thử; g) Phương pháp được dùng để chuẩn hoá giá trị LC 50; h) Bảng thống kê phần trăm tử vong của mỗi chậu, mỗi nồng độ và phép kiểm tra; i) Khối lượng giun còn sống vào cuối phép thử; j) Nếu các số liệu có sẵn, nồng độ cao nhất không quan sát thấy hiệu ứng (NOEC); k) Mô tả về các triệu chứng bệnh lý hoặc các thay đổi rõ rệt được nhận thấy ở các sinh vật thử; l) Hàm lượng nước và pH của "đất nhân tạo" ở điểm xuất phát và điểm cuối của phép thử; m) Tất cả các chi tiết tiến hành không ghi trong tiêu chuẩn này và bất kỳ quá trình tương tự nào xẩy ra có ảnh hưởng đến các kết quả; n) Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và tác dụng. Phụ lục A Ví dụ về kỹ thuật nuôi dưỡng Eisenia fetida Phụ lục này cho những chỉ dẫn về nuôi dưỡng những sinh vật thí nghiệm được dùng để xác định độc tính tối đa. Có thể nuôi Eisenia fetida trong đủ loại chất thải động vật. Môi trường nuôi dưỡng thích hợp là hỗn hợp 50:50 phân ngựa hoặc phân trâu bò và than bùn. Môi trường cần có pH khoảng từ 5 đên 7 (điều chỉnh bằng canxi cacbonat), độ dẫn điện thấp (nhỏ hơn 6mS) hoặc nồng độ muối nhỏ hơn 0,5% và không bị quá nhiễm bẩn amoniac hoặc nước giải gia súc. Chất nền phải ẩm nhưng không quá ướt. Có thể dùng những hộp nuôi dưỡng bằng gỗ hoặc những chậu thấp bất kỳ có thể tích từ 10 đến 50 lít. Để có được những con giun đất đạt tiêu chuẩn về tuổi và khối lượng, tốt nhất là nuôi từ trứng. Đặt giun đã trưởng thành vào hộp nuôi dưỡng chứa chất nền mới để sản xuất trứng và lấy chúng ra sau 14 đến 21 ngày. Có thể dùng các con giun này cho đợt sinh sản tiếp. Các con giun đất nở ra từ trứng được dùng cho phép thử khi đã trưởng thành. Thực hiện nuôi dưỡng trong phòng điều hoà nhiệt độ ở 20 ± 2oC là thích hợp nhất. ở nhiệt độ này giun sẽ trưởng thành sau 2 đến 3 tháng.