TCVN10638:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10638:2014 (EN 14123:2003) về Thực phẩm - Xác định hàm lượng AFLATOXIN B1 và tổng AFLATOXIN B1, B2, G1, G2 trong lạc, quả hồ trăn, quả vả và bột ớt - Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao có tạo dẫn xuất sau cột và làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10638:2014 EN 14123:2003 THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN B 1 VÀ TỔNG AFLATOXIN B 1 , B 2 , G 1 , G 2 TRONG LẠC, QUẢ HỒ TRĂN, QUẢ VẢ VÀ BỘT ỚT - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO CÓ TẠO DẪN XUẤT SAU CỘT VÀ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM Foodstuffs - Determination of a f latoxin B 1 , and the sum of a f latoxin B 1 , B 2 , G 1 and G 2 in peanuts, pistachios, figs, and paprika powder- High per f ormance liquid chromatographic method w ith post-column derivatization and immunoaffiity column clean-up Lời nói đầu TCVN 10638:2014 hoàn toàn tương đương với EN 14123:2003; TCVN 10638:2014 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu bi ê n soạn. Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN B 1 VÀ TỔNG AFLATOXIN B 1 , B 2 , G 1 , G 2 TRONG LẠC, QUẢ HỒ TRĂN, QUẢ VẢ VÀ BỘT ỚT - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO CÓ TẠO DẪN XUẤT SAU CỘT VÀ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM Foodstuffs - Determination of a f latoxin B 1 , and the sum of a f latoxin B 1 , B 2 , G 1 and G 2 in peanuts, pistachios, figs, and paprika powder- High per f ormance liquid chromatographic method w ith post-column derivatization and immunoaffiity column clean-up C Ả NH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết b ị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không th ể đưa ra được tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người s ử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích h ợ p và xác định khả năng áp d ụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này áp dụng để xác định các a f latoxin B 1 , B 2 , G 1 và G 2 trong quả vả, quả hồ trăn, quả lạc v à bột ớ t. Giới hạn định lượng của phương pháp là 0,8 ng/g đối với từng loại a f latoxin hoặc tốt hơn (các giá trị nhận được từ nghiên cứu liên phòng và nội phòng th í nghiệm), tùy thuộc vào thiết bị sử dụng. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài li ệ u viện dẫn sau r ấ t cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện d ẫn ghi năm công b ố th ì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) Nước dùng để phân t í ch trong phòng th í nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương ph á p th ử . 3. Nguyên tắc Phần mẫu thử được chiết b ằ ng d ung môi (metanol/nước) hoặc dung môi có thêm hexan (hoặc xyclohexan). Dịch chi ế t mẫu được lọc, pha loãng với dung dịch nước muối đệm phosphat (PBS) rồi đưa lên cột ái lực miễn nhiễm (IAC) chứa các kháng thể đặc hiệu đối với từng loại a f latoxin B 1 , B 2 , G 1 và G 2 . Các a f latoxin được rửa giải ra khỏi cột ái lực miễn nhiễm bằng metanol. Định lượng các a f latoxin b ằ ng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) có tạo dẫn xuất sau cột (PCD) bằng brom hóa sau đó b ằ ng detector huỳnh quang. Cũng có thể tạo dẫn xuất sau cột b ằ ng brom được t ổ ng hợp bằng phương pháp điện h ó a hoặc b ằ ng pyridini hydrobromua perbromua (PBP B ) 4. Thuốc thử 4.1 . Y ê u cầu chung Ch ỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước loại 3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) trừ khi có quy đ ị nh khác. 4.2 . Dung dịch nước muối đệm phosphat (PBS) Hòa tan 0,20 g kali clorua, 0,20 g kali dihydro phosphat, 1,16 g dinatri hydro ortophosphat (hoặc 2,92 g hydrophosphat ngậm 12 phân tử H 2 O ) và 8,00 g natri clorua trong 0,9 lít nước. Sau khi hòa tan, ch ỉ nh pH đến 7,4 bằng HC l (0,1 mo l /l) hoặc NaOH (0,1 mol/l) một cách thích hợp. Thêm nước đến 1 lít. Có thể sử dụng các viên muối đệm phosphat c ó bán sẵn trên th ị trường có các đặc tính tương tự. 4.3 . Natri clorua 4.4 . Pyridini hydrobromua perbromua (PBPB), [CAS:39416-48-3]. 4.5 . Kali bromua 4.6 . Axetonitril, loại dùng cho HPLC. 4.7 . Metanol, loại dùng cho HPLC. 4.8 . Metano l , loại kỹ thuật. 4.9 . Toluen. 4.10 . Hỗn hợp d ung môi metanol và nước Trộn 8 thể tích metanol (4.8) với 2 thể t í ch nước. 4.11 . n-Hexan, xyclohexan, loại kỹ thuật. 4.12 . Axit nitric, c (HN O 3 ) = 4 mol/l 4.13 . Cột ái lực miễn nhi ễ m Cột ái lực chứa các kháng th ể có thể hấp thu các a f latoxin B 1 , B 2 , G 1 v à G 2 . Cột có khả năng tách tối đa không nh ỏ hơn 100 ng v à có độ thu hồi không nhỏ hơn 80 % đối với các a f latoxin B 1 , B 2 , G 1 và không nhỏ hơn 60 % đ ố i với a f latoxin G 2 khi sử dụng dung dịch chu ẩ n nước (10 % metano l ) chứa 5 ng mỗi loại độc tố. Nồng độ dung môi tối đa của các dung dịch đưa lên cột không được quá 12 % metanol. 4.14 . Dung môi pha động HPLC (A), sử dụng với PBPB Trộn 6 thể tích nước với 2 thể tích axetonitril (4.6) v à 3 thể tích metanol (4.7). Kh ử kh í của dung dịch trước khi sử dụng. Pha động không được ch ứ a hạt và ph ải được lọc trước khi sử dụng. 4.15 . Dung m ô i pha động HPLC (B), sử dụng với brom được tổng hợp b ằ ng phương pháp điện hóa Trộn 6 thể tích nước với 2 thể tích axetonitril (4.6) và 3 thể tích metanol (4.7). Thêm 120 mg kali bromua (4 5) và 350 μ l axit nitric (4.12) trên lít pha động. Khử khí của dung dịch trước khi sử dụng. 4.16 . Thuốc thử sau cột Hòa tan 50 mg PBP B (4.4) trong 1 lít nước. Dung dịch này có thể sử dụng trong 4 ngày nếu được b ả o qu ả n ở nhiệt độ phòng để ở nơi tối. 4.17 . Hỗn hợp toluen và axetonitril Trộn 98 thể tích toluen (4.9) với 2 thể tích axetonitril (4.6). 4.18 . A f latoxin, dạng tinh thể hoặc dạng màng m ỏ ng trong ampun hoặc ở dạng dung dịch afl atoxin bán sẵn tr ê n thị trường. C Ả NH BÁO 1 - Các quy tr ì nh khử nhiễm đối với chất th ả i a f latoxin phòng thử nghiệm do Cơ quan nghiên cứu quốc tế về ung t hư (IRAC) [1], [2] xây dựng. CẢNH BÁO 2 - Các aflatoxin dễ b ị phân h ủy b ởi ánh sáng. Nơi phân tích a f latoxin trong phòng th ử nghiệm ph ả i tránh ánh sáng ban ngày. Có thể s ử dụng màng m ỏ ng hấp thụ tia cực tím (UV) để che c á c cửa sổ kết hợp với ánh sáng dịu (không phải ánh s á ng trực tiếp mặt trời) hoặc dùng rèm cửa hoặc mành che kết h ợ p v ới ánh sáng nhân tạo (có th ể sử dụng đèn ống huỳnh quang). Bảo vệ các dung dịch chứa a f latoxin càng tránh ánh s á ng càng tốt (giữ ở nơi tối, sử dụng màng nhôm hoặc thủy tinh màu hổ phách) và bảo quản ở nhiệt độ theo khuyến cáo của nhà sản xuất (ví dụ - 18 °C). 4. 1 9 . Dung dịch gốc a f latoxin H ò a tan từng a fl atoxin B 1 , B 2 , G 1 v à G 2 trong hỗn hợp toluen và ax e tonitril (4.17) để thu được các dung dịch có nồng độ 10 μ g/ml đối với từng loại aflatoxin. B ọc các bình kín trong màng nhôm và bảo quản ở nhiệt đ ộ nh ỏ hơn 4 ° C . Để x á c định nồng độ chính xác các a f latoxin trong từng dung dịch gốc, ghi lại đường hấp thụ c ủ a các dung dịch ở bư ớ c sóng từ 330 n m đến 370 nm trong cuvet thủy tinh thạch anh 1 cm của máy đo phổ, dùng hỗn hợp toluen và axetonitril (4.17) trong cuvet so sánh. T í nh nồng độ khối lượng c ủ a từng a f latoxin, ρ i , bằng microgam trên mililit, sử dụng công thức (1): ρ i = (1) Trong đó: A max là độ hấp thụ xác định được ở điểm hấp thụ cực đại trên đường hấp thụ; M i l à khối lượng phân tử c ủ a từng a f latoxin, tính bằng gam trên mol (g/mol); ε i là khả năng hấp thụ phân tử c ủ a từng aflatoxin trong hỗn hợp của toluen và axetonitril (4.17), tính bằng mét vuông trên mol (m 2 /mol); d là chiều dài đường quang c ủ a cuvet, tính bằng xentimet (cm). M i v à ε i của a f latoxin B 1 , B 2 , G 1 và G 2 được nêu trong Bảng 1. B ản g 1 - Khối lượng phân tử và độ hấp thụ phân t ử c ủ a các a f latoxin B 1 , B 2 , G 1 và G 2 [trong hỗn hợp c ủ a toluen và axetonitril (4.17)] A fl atoxin M i (g/mol) ε I (m 2 /mol) B 1 312 1930 B 2 314 2040 G 1 328 1660 G 2 330 1790 4.20 . Dung dịch g ố c aflatoxin hỗn hợp Chu ẩ n bị dung dịch gốc các a f latoxin hỗn hợp chứa nồng độ aflatoxin B 1 v à G 1 1 000 ng/ml, a f latoxin B 2 và G 2 200 ng/ml trong hỗn hợp của toluen và axetonitril (4.17) bằng cách pha loãng các dung dịch gốc a f latoxin ( B 1 , B 2 , G 1 và G 2 ) (4.19). Dùng pipet l ấy ch í nh xác 2,0 ml dung dịch này cho vào b ì nh định mức 20 ml (5.10) đã hiệu chuẩn, thêm hỗn hợp toluen và axetonitril (4.17) đến vạch, trộn kỹ để thu được dung dịch gốc aflatoxin hỗn hợp đã pha loãng ch ứ a nồng độ a f latoxin B 1 và G 1 100 ng/ml, a f latoxin B 2 và G 2 20 ng/ml. Bọc k í n b ì nh trong màng nhôm và bảo quản ở nhiệt độ nhỏ hơn 4 ° C . Trư ớ c khi sử dụng, không m ở bình cho đến khi lượng chứa trong b ì nh đạt đến nhiệt độ phòng đ ể tránh hấp thụ nước do ngưng tụ. 4.21 . Dung dịch chuẩn aflatoxin hỗn hợp Dùng pipet lấy các thể tích nêu trong Bảng 2 dung dịch gốc a f latoxin hỗn hợp đ ã pha loãng chứa 100 ng/ml a f latoxin B 1 và G 1 , 20 ng/ml aflatoxin B 2 v à G 2 (xem 4.20) cho vào một dãy các b ì nh định mức 10 ml (5.10). L à m bay hơi dung dịch toluen/axetonitri l đến khô bằng dòng khí nitơ ở nhiệt độ phòng. Thêm 4 ml metanol vào từng bình để các a f latoxin hòa tan, thêm nước đến 10 ml và lắc kỹ. Khi trộn metanol và nước dễ bị ngót thể tích, v ì vậy điều ch ỉ nh lại thể tích đến thể tích quy định. Bảng 2 - Chuẩn bị các dung dịch chuẩn aflatoxin hỗn hợp Dung dịch chuẩn Lấy từ dung dịch gốc đã pha loãng (4.20) ( μ l) Nồng độ khối lượng c ủ a du ng dịch chu ẩn (ng/ml) B 1 B 2 G 1 G 2 1 40 0,400 0,080 0,400 0,080 2 120 1 , 200 0,240 1 , 200 0 , 240 3 200 2,000 0,400 2,000 0,400 4 280 2,800 0,560 2,800 0,560 5 360 3,600 0,720 3,600 0 , 720 4.22 . Dung dịch thêm chuẩn Chuẩn bị dung dịch thêm chuẩn bằng cách dùng pipet lấy 2 ml dung dịch gốc a f latoxin hỗn hợp (chứa nồng độ a f latoxin B 1 và G 1 1000 ng/ml, a f latoxin B 2 và G 2 200 ng/ml, xem 4.20) cho vào bình định mức 10 ml đã hiệu chu ẩ n. Làm bay hơi dung dịch toluen/axetonitril đến khô bằng dòng khí nitơ ở nhiệt độ phòng. Thêm metanol đến vạch và trộn kỹ. Nồng độ của dung dịch thêm chuẩn là: a f latoxin B 1 v à G 1 200 ng/ml, a f latoxin B 2 và G 2 40 ng/ml. Bọc kín bình trong màng nhôm và b ả o quản ở nhiệt độ nh ỏ hơn 4 ° C . Trước khi sử dụng, không m ở bình cho đến khi lượng chứa trong b ì nh đạt đến nhiệt độ phòng để tránh hấp thụ nước do ngưng tụ. 5. Thiết bị, dụng cụ 5.1 . Yêu c ầ u chung Tất c ả các dụng cụ thủy tinh tiếp xúc với các d ung dịch aflatoxin phải được rửa sạch bằng dung dịch axit trước khi sử dụng. Có nhiều máy rửa phòng thí nghiệm có cài đặt chương trình này . Nếu không, ng â m dụng cụ th ủ y tinh trong axit sul f uric (2 mol/l) trong một thời gian (ví dụ: 15 h qua đêm), sau đó rửa s ạ ch (ví dụ: ba lần) với nước để loại b ỏ hết axit. Kiểm tra b ằ ng gi ấ y pH để chắc chắn đã hết axit. Việc xử lý này l à cần thiết, v ì khi s ử dụng các dụng cụ thủy tinh không được r ử a b ằ ng axit có thể gây thất thoát a fl atoxin, cụ th ể với c á c b ì nh cầu đáy tròn, bình định mức, ống đong, lọ hoặc ống nghiệm được sử dụng cho các dung dịch hiệu chuẩn và các dịch chiết cuối c ù ng (đặc biệt là lọ l ấy mẫu tự động) và pipet Pasteur, được dùng để chuyển các dung d ị ch hiệu chu ẩ n ho ặ c dịch chiết. 5.2 . Các thiết bị phòng thử nghiệm thông thường v à cụ thể như sau: 5.3 . Máy nghiền phòng thử nghiệm Hoặc máy nghiền tốc độ cao chống cháy nổ, để tạo và chiết hồ nhão từ lạc, quả h ồ t ră n và quả vả, có bình trộn thích hợp. 5.4 . Máy lắc ngang hoặc máy lắc đứng có thể điều chỉnh được, để phân tích bột ớ t 5.5 . Gi ấ y lọc g ấ p nếp, v í d ụ đường kính 24 cm. 5.6 . B ì nh nón, có nắp th ủ y tinh hoặc n ắ p vặn. 5.7 . Giấy lọc thủy tinh mịn, giữ được cỡ hạt 1,6 μ m hoặc nhỏ hơn. 5.8 . B ầ u chứa, dung tích 75 ml có đầu nối với cột ái lực miễn nhiễm (IAC). 5.9 . B ơ m tay, dạng xyranh 20 ml có khóa hoặc nắp cao su dùng cho cột ái lực mi ễ n nhiễm (IAC). 5.10 . B ì nh định mức th ủ y tinh, ví dụ các b ì nh dung tích 5 ml, 10 ml và 20 ml, có độ chính xác ít nhất là 0,5 %. 5.11 . Hệ thống HPLC, gồm có: 5.11.1 . Bơm HPLC, thích hợp v ớ i tốc độ dòng là 1,0 ml/min. 5.11.2 . Hệ thống bơm, có thể bơm một vòng đầy. Nên dùng vòng bơm 200 μ l. Trong trường hợp dùng vòng bơm có kích c ỡ khác với khuyến cáo thì phải đảm bảo rằng giới h ạ n phát hiện c ủ a hệ thống (LOD) ≤ 0,2 ng/g (tỷ lệ tín hiệu/nhiễu = 3) và giới hạn đ ị nh lượng (LOQ) ≤ 0,5 ng/g (tỷ lệ tín hiệu/nhiễu = 6) đối với từng aflatoxin (s ử dụng các dung dịch chu ẩ n). 5.11.3 . Cột HPLC pha đ ả o, ví dụ C 18 hoặc ODS-2 (dài 25 cm, đường kính trong 4,6 mm , cỡ hạt 5 μ m), đ ả m bảo phân giải đường nền của các pic a f latoxin B 1 , B 2 , G 1 và G 2 ra khỏi các pic khác. Sự chồng lấn tối đa c ủ a các pic phải nhỏ hơn 10 % (có thể cần điều ch ỉ nh pha đ ộ ng để có độ phân giải đường nền tốt). Nên sử d ụ ng tiền cột thích hợp. 5.11.4 . Hệ th ố ng tạo dẫn xu ấ t sau cột, với PBP B (chỉ sử dụng với pha động A (4.14)). Gồm có bơm kh ô ng xung dùng cho HPLC , chi tiết chữ T thể tích chết b ằ ng zero, ống nối ph ả n ứng bằng PTFE kích thước tối thiểu 45 cm x 0,5 mm đường kí nh trong. 5.11.5 . Hệ thống tạo dẫn xuất với brom tổng hợp bằng phương pháp đ iện hóa, v í dụ: cuvet KOBRA 1) (chỉ sử dụng với pha động B (4.15)). 5.11.6 . Detector huỳnh quang, với bước sóng kích thích λ = 360 nm và bước sóng phát xạ λ > 420 nm hoặc tương đương (v í dụ: detector với bộ đơn sắc có thể điều chỉnh được). Nên cài đặt detector có thể điều chỉnh được ở bước sóng 365 nm (bước sóng kích thích), 435 nm (bước sóng phát xạ) và chiều rộng băng l à 18 nm. 5.12 . Dụng cụ lọc dùng một l ầ n, cỡ lỗ 0,45 μ m. Trước khi sử dụng, kiểm t ra để chắc chắn r ằ ng a f latoxin không bị thất thoát trong quá trình lọc (phép thử độ thu h ồ i). CHÚ THÍCH Các vật liệu lọc c ó khả năng giữ lại a fl atoxin. 5.13 . Pipet, dung tích 2 ml và 10 ml, với độ chính xác tối thiểu 0,5 %. 5.14 . Cân ph â n tích, có thể c â n đến 0,1 mg. 5.15 . Cân kỹ thuật, có thể cân đến 0,01 g. 5.16 . Xyranh microlit hoặc pipet microlit đ ã hiệu chuẩn, dung tích từ 25 μ l đến 500 μ l. 5.17 . Bộ phân ph ố i chân không, tùy chọn. 6. Cách tiến hành 6.1 . Chuẩn b ị mẫu th ử Đồng hóa một lượng thích hợp (v í dụ 10 kg, [3]) quả hồ trăn, lạc và quả vả để thu được h ồ nhão, ví dụ: dùng máy nghiền tốc độ cao (5.3). Thông tin về c ỡ mẫu và cách l ấ y mẫu có thể xem trong [3]. 6.2 . Ổ n định cột ái lực miễn nhiễm Để cột ái lực miễn nhiễm (4.13) đạt đ ế n nhiệt độ phòng trước khi ổn định. Nối cột ái lực miễn nhiễm với bộ phân phối chân không (5.17) và gắn bầu chứa (5.8) vào cột ái lực miễn nhiễm. Để ổn định, chuyển 10 ml PBS (4.2) sang đ ỉ nh cột và để ch ả y qua với tốc độ 2 ml/min đến 3 ml/min qua cột (v í dụ: bằng trọng lực). Đảm bảo rằng một phần nhỏ (0,5 ml) PBS được giữ lại trên cột cho đến khi dung dịch mẫu được sử dụng. Thực hiện các quy tr ì nh ổn định theo hướng dẫn của nhà sản xu ấ t. 6.3 . Chiết 6.3.1 . Yêu c ầ u chung Sử dụng máy nghiền tốc độ cao cho quá trình chiết hồ nhão qu ả vả, bơ lạc và hồ nhão qu ả hồ trăn, v ì các sản phẩm giàu béo (bơ lạc v à hồ nhão quả hồ trăn) cần tạo dạng nhũ tư ơ ng đ ể phá vỡ lớp chất béo và để chiết được h ế t. Ngoài ra, hồ nhão qu ả vả cần được phá vỡ trong dung môi, v ì nếu sử dụng máy lắc thì sẽ không thực hiện được do h ồ nhão rất sánh. Bột ớt có thể chiết được bằng cách lắc (với điều kiện là bột nghiền có cỡ hạt đến 500 μ m) để xử lý một số m ẫ u cùng một lúc và giảm nguy cơ lây nhiễm chéo. 6.3.2 . Quả vả Cân khoảng 50 g phần mẫu thử đồng nhất (6.1) , chính xác đến 0,1 g, cho vào bình nón 500 ml (5.6) hoặc bình trộn. Thêm 5 g natri clorua (4.3) và 300 ml dung môi chi ế t (4.10). Trộn trong 3 min bằng máy nghiền tốc độ cao (5.3). Lọc dịch chiết qua giấy lọc (5.5). Dùng pipet l ấ y 10,0 ml dịch lọc trong cho vào cốc thủy tinh có mỏ 100 ml (hoặc tương tự) và pha loãng bằng 60 ml PBS (4.2). Cho dịch chiết mẫu đã pha loãng vào bầu ch ứ a được nối với cột ái lực miễn nhiễm đã ổn định (4.13) và tiến hành như trong 6.4. Có th ể sử dụng khối hồ nhão hoặc các phần mẫu thử lớn hơn, với điều kiện là duy trì đúng tỉ lệ (mẫu- dung môi cũng như thành phần dung môi đối với khối hồ nhão). 6.3.3 . Lạc Cân khoảng 50 g phần mẫu thử đ ồ ng nhất (6.1), ch í nh xác đến 0,1 g, cho vào b ì nh nón 500 ml (5.6) hoặc b ì nh trộn. Thêm 5 g natri clorua (4.3) v à 200 ml dung môi chiết (4.10) và 100 ml n-hexan hoặc xyclohexan (4.11). Trộn trong 3 min bằng máy nghiền tốc độ cao (5.3). Lọc dịch chiết qua giấy lọc (5.5). Trong trường hợp tách lớp dung môi thì tiến hành lọc pha dưới. Dùng pipet l ấ y 10,0 ml d ịch lọc trong cho vào cốc thủy tinh có mỏ 100 ml (hoặc tương tự) v à pha loãng bằng 60 ml PBS (4.2). Cho dịch chiết mẫu đã pha loãng vào bầu chứa được nối với cột ái l ự c miễn nhiễm đã ổn định (4.13) và tiến hành như trong 6.4. Việc tách lớp dung môi không xảy ra nếu lọc ngay sau khi nghiền trộn v à n-hexan/xyclohexan sẽ được giữ lại trong bộ lọc. Có thể sử dụng bộ tách pha, nếu cần. C ó thể sử dụng phần m ẫ u thử lớn hơn với đi ề u kiện duy tr ì được tỷ lệ dịch chi ế t mẫu - dung môi. 6.3.4 . Qu ả hồ trăn C â n khoảng 50 g phần mẫu thử đồng nhất (6.1), ch í nh xác đến 0,1 g , cho vào bình nón 500 ml (5.6) ho ặ c b ì nh trộn. Thêm 5 g natri clorua (4.3), 200 ml dung môi chiết (4.10) v à 100 ml n-hexan hoặc xyclohexan (4.11). Trộn trong 3 min bằng máy nghiền tốc độ cao (5.3). Lọc dịch chiết qua gi ấ y lọc (5.5). Trong trường hợp tách lớp dung môi th ì lọc pha dưới. Dùng p i pet lấy 10,0 ml dịch lọc trong cho vào cốc th ủ y tinh có mỏ 100 ml (hoặc tương tự) và pha loãng bằng 60 ml PBS (4.2). Cho dịch chiết mẫu đ ã pha lo ã ng vào bầu chứa được nối với cột ái lực miễn nhiễm đ ã ổn định (4.13) và tiến hành như trong 6.4. Nếu xuất hiện lượng kết tủa đáng kể khi pha loãng với PBS, dùng pipet lấy 20 ml dịch lọc mẫu cho vào cốc thủy tinh có mỏ 250 ml (hoặc tương tự) và pha lo ã ng với 140 ml PBS (4.2), sau đó lọc qua giấy lọc (5.7). Trong trường hợp này cho 70 ml dịch chiết mẫu đ ã lọc vào bầu chứa nối với cột ái lực miễn nhiễm đã ổn định (4.13) và tiến hành như trong 6.4. Sự phân tách lớp dung môi không xảy ra nếu lọc ngay sau khi nghiền và n-hexan/xyclohexan được giữ lại trong bộ lọc. Sử dụng bộ tách pha lọc, nếu cần. Có thể dùng phần mẫu thử lớn hơn nếu duy trì được tỷ lệ dịch chi ế t mẫu-dung môi. 6.3.5 . Bột ớt Cân khoảng 50 g phần mẫu thử đồng nhất (6.1), ch í nh xác đến 0,1 g, cho vào bình nón 500 ml (5.6) hoặc b ì nh trộn. Thêm 5 g natri clorua (4.3) và 300 ml dung môi chiết (4.10). Lắc kỹ bằng tay 15 s đến 30 s , sau đó lắc 30 min b ằ ng máy lắc (5.4). Đối với các loại máy lắc khác nhau (v í dụ: máy lắc ngang hoặc máy lắc đứng), cần điều ch ỉ nh tốc độ để đạt được việc khuấy trộn tối đa hỗn hợp dịch chiết. Lọc dịch chiết qua giấy lọc (5.5). Dùng pipet lấy 10,0 ml dịch lọc trong cho v à o cốc thủy tinh có mỏ 100 ml và pha lo ã ng bằng 60 ml PBS (4.2). Cho dịch chiết mẫu đ ã pha lo ã ng vào bầu chứa được n ố i với cột ái lực miễn nhiễm đã ổn đ ị nh (4.13) và tiến hành như trong 6.4. Có thể sử dụng các phần mẫu thử lớn hơn nếu duy trì được tỷ lệ dịch chiết-dung môi. 6.4 . Làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm Cho dịch lọc đi qua cột với t ố c độ dòng khoảng 3 ml/min (khoảng một giọt trên mỗi giây). Không vượt quá tốc độ 5 ml/min. Rửa cột với khoảng 15 ml nước, mỗi phần khoảng 5 ml ở tốc độ tối đa 5 ml/min và làm khô bằng chân không khoảng 5 s đến 10 s hoặc dùng xyranh cho không kh í qua cột ái lực miễn nhiễm trong khoảng 10 s. Rửa giải các a f latoxin b ằ ng quy t rì nh hai bước. Cho 0,50 ml metanol (4.7) l ê n cột và cho đi qua cột. Thu dịch rửa giải v à o b ì nh định mức đ ã hiệu chuẩn 5 ml (5.10). Đợi 1 min và đưa phần thứ hai 0,75 ml metanol lên cột. Thu phần lớn phần dung môi rửa giải đã dùng b ằ ng cách nén không kh í đi qua cột. Thêm nước vào b ì nh đến v ạ ch, lắc kỹ và ch ỉ nh lại để thu được thể tích quy định. Nếu dung dịch trong th ì có th ể sử dụng t rực tiếp để phân t í ch HPLC. Nếu dung dịch không trong, lọc qua bỏ lọc dùng một lần (5.12) trước khi bơm v à o HPLC. CHÚ THÍCH : Các phương pháp nạp mẫu lên cột ái lực miễn nhiễm, rửa cột và r ử a giải có thể hơi kh á c nhau giữa c á c hãng sản xuất cột . C ầ n tuân theo c á c hướng dẫn cụ thể của nhà cung cấp cột. 6.5 . Sắc ký l ỏ ng hiệu năng cao (HPLC) Đ ể đảm bảo độ chụm tối đa, việc b ơ m dung dịch chuẩn a f latoxin (thể tích bơm 200 μ l) v à các dịch chi ế t mẫu đã tinh sạch được thực hiện bằng phương thức lấy đầy vòng mẫu theo hướng dẫn của nh à s ả n xu ấ t cổng bơm hoặc van bơm. Các a f latoxin được phân tách bằng HPLC pha đảo (RP-HPLC) ở nhiệt độ phòng với cột pha đ ả o (5.11.3) và pha động thích hợp (4.14) hoặc (4.15). Tốc độ dòng khuyến cáo nên là 1 ml/min với cột có đường kính trong là 4,6 mm. Do đó, tốc độ d ò ng c ó thể được điều chỉnh theo kích thước cột. Các a f latoxin rửa giải theo thứ tự G 2 , G 1 , B 2 và B 1 với th ờ i gian lưu khoảng 6 min, 8 min, 9 min và 11 min tương ứng và độ phân giải đường nền tốt. Pha động có thể được điều ch ỉ nh bằng cách thêm nước, metanol hoặc axetonit r il để có được độ phân giải pic và hiệu suất qu ả sắc ký tối đa (sắc ký đồ đi ể n hình được nêu trong Phụ lục A). 6.6 . Tạo dẫn xuất sau cột Khi sử dụng PBPB, gắn chi tiết chữ T và ống phản ứng (xem 5.11.4), sau đ ó vận hành với các thông số sau: - tốc độ dòng 1,00 ml/min đối với pha động (xem 6.5); - tốc độ dòng 0,30 ml/min đối với thuốc thử (tốc độ dòng có thể điều chỉnh đến tốc độ dòng của pha động). Khi sử dụng brom tổng hợp bằng phương pháp điện hóa (cuvet KOBRA ® ) thực hiện theo các hướng dẫn lắp đặt cuvet của các nhà sản xuất và vận hành với các thông số sau: - tốc độ dòng 1,00 ml/min đối với pha động (xem 6.5); - dòng điện 100 μ A. 6.7 . Đường chu ẩ n Chuẩn bị đường chuẩn, sử dụng các dung d ịch chu ẩ n a fl atoxin hỗn hợp như trong (4.21). Các dung dịch này bao trùm dải từ 0,5 ng/g đến 4,5 ng/g đối v ớ i a f latoxin B 1 và G 1 và dài t ừ 0,1 ng/g đến 0,9 ng/g đối v ớ i B 2 và G 2 . Dựng đường chuẩn trước khi phân tích theo Bảng 2 và kiểm tra độ tuyến tính của đường chu ẩ n. Nếu các hàm lượng aflatoxin trong mẫu n ằ m ngoài dải đường chuẩn, dung dịch bơm để phân tích HPLC có thể cần được pha loãng để có hàm lượng a f latoxin thích hợp với đường chuẩn 6.8 . Quy tr ì nh thêm chuẩn Để xác định độ thu hồi có thể sử dụng quy tr ì nh thêm chuẩn, dùng dung dịch metanol (4.2.2) th ê m chuẩn. Mức thêm chu ẩ n phải nằm trong d ả i hiệu chuẩn (tốt nhất là giá trị trung b ì nh). Lấy c ẩ n thận không nhiều hơn 2 ml dung d ịch thêm chu ẩ n sau đó để cho bay hơi ở nơi tối và trong khoảng từ 30 min đến 2 h. 6.9 . Tính kết quả Đối với các quy trình chuẩn bị mẫu sử dụng n-hexan ho ặ c xyclohexan, th ì thể tích c ủ a các dung môi này không đưa v à o để tính toán kết quả. Việc bổ sung n-hexan hoặc xyclohexan vào hỗn hợp dung môi chiết ch ỉ cần để có th ể phá vỡ lớp ch ấ t béo (a f latoxin b ị bao trong m à ng). A f latoxin không hòa tan trong n-hexan hoặc xycl o hexan. Dựng đường chuẩn sử dụng đường hồi quy tuyến t í nh và tính n ồ ng độ a f latoxin trong dung dịch bơm từ mỗi mẫu, tính bằng nanogam trên mililit. Tính phần khối lượng c ủ a các aflatoxin, w, bằng nanogam tr ê n gam mẫu theo công thức (2): (2) Trong đó: ρ smp là nồng độ khối lượng của a f latoxin trong dung dịch bơm t í nh được từ đường hồi quy tuyến tính, tính b ằ ng nanogam trên mililit (ng/ml); V e là thể tích của dung môi chiết, tính b ằ ng mililit (ml) ( V e = 200 ml đối với bơ lạc và hồ nhão quả hồ trăn và V e = 300 ml đối với hồ nh ã o quả vả và bột ớt); V final là thể tích cuối cùng thu được sau khi rửa giải từ IAC, tính bằng mililit (ml) (trong trường hợp này là 5 ml); m s là khối lượng mẫu đưa vào tính toán, tính bằng gam (g), (trong trường hợp này l à 50 g); V iac l à thể tích mẫu chiết được lấy để l à m sạch cột ái lực miễn nhiễm, tính b ằ ng mililit (ml) (trong trường hợp n à y là 10 m l ). 6.10 . Khẳng định các a f latoxin B 1 và G 1 Đ ể khẳng định sự có mặt các a f la t oxin B 1 và G 1 , tháo cột HPLC ra khỏi thi ế t bị brom hóa v à nối trực tiếp với detector huỳnh quang. Các t í n hiệu a f latoxin B 1 và G 1 thấp hơn đáng kể (10 l ầ n hoặc nhiều hơn) khi hệ thống tạo dẫn suất b ị ngắt. Không tắt dòng điện với các thiết bị brom hóa khi đang hoạt động vì brom có thể vẫn còn giữ lại trong mảng cuvet của thiết b ị . 7. Độ chụm 7.1. Yêu c ầ u chung Chi tiết của phép thử nghiệm liên phòng về độ chụm c ủ a phương pháp nêu trong Phụ lục B . Các giá trị nhận đư ợ c từ các th ử nghiệm liên phòng có thể kh ô ng áp dụng đối với d ả i nồng độ và nền mẫu khác với dải nồng độ và nền mẫu nêu trong Phụ lục B. 7.2 . Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ thu được được tìm thấy trên vật liệu thử gi ố ng hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn độ lặp lại r. Các giá trị đ ố i với bơ lạc: A f latoxin B 1 : = 0,9 ng/g r = 0,25 ng/g (được thêm vào) A f latoxin tổng số: = 1,9 ng/g r = 0,73 ng/g (được thêm vào) A f latoxin B 1 : = 3,6 ng/g r = 0,31 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 7,9 ng/g r = 1,88 ng/g (được thêm vào) A f latoxin B 1 : = 0,8 ng/g r = 0,14 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 1,3 ng/g r = 0,22 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 1,5 ng/g r = 0,28 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 2,2 ng/g r = 0,45 ng/g (nhiễm tự nhi ê n) A f latoxin B 1 : = 3,4 ng/g r = 0,36 ng/g (nhiễm tự nhi ê n) A f latoxin t ổ ng số: = 5,0 ng/g r = 0,64 ng/g (nhiễm tự nhiên) Các giá tr ị đối với hồ nhão quả h ồ trăn: A f latoxin B 1 : = 0,9 ng/g r = 0,36 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 2,0 ng/g r = 0,67 ng/g (được thêm vào) A f latoxin B 1 : = 3,3 ng/g r = 0,36 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 7,8 ng/g r = 5,10 ng/g (được thêm v à o) A f latoxin B 1 : = 0,7 ng/g r = 0,22 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 0,8 ng/g r = 0,28 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 1,5 ng/g r = 0,76 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 1 , 7 ng/g r = 0,87 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 2,9 ng/g r = 1,65 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 3,3 ng/g r = 1,85 ng/g (nhiễm tự nh iê n) Các giá trị đ ối với hồ nhão qu ả v ả : A f latoxin B 1 : = 1,1 ng/g r = 0,50 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 2 , 2 ng/g r = 1,12 ng/g (được thêm vào) A f latoxin B 1 : = 3,6 ng/g r = 1,09 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 7,8 ng/g r = 2,83 ng/g (được thêm v à o) A f latoxin B 1 : = 1,3 ng/g r = 0,34 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 2 , 8 ng/g r = 0 , 70 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 2,1 ng/g r = 0,34 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 3,8 ng/g r = 1,23 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 2,6 ng/g r = 1 , 15 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 5,2 ng/g r = 2,52 ng/g (nhiễm tự nh iê n) Các giá trị đ ố i với bột ớt: A f latoxin B 1 : = 0 , 9 ng/g r = 0,14 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 1,7 ng/g r = 0,31 ng / g (được thêm vào) A f latoxin B 1 : = 3,4 ng/g r = 0,50 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 7,1 ng/g r = 2,02 ng/g (được thêm v à o) A f latoxin B 1 : = 0,8 ng/g r = 0,34 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 0,9 ng/g r = 0,45 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 1,4 ng/g r = 0,39 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 2 , 0 ng/g r = 0,64 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 3,0 ng/g r = 0,36 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 4,5 ng/g r = 0,62 ng/g (nhiễm tự nh iê n) 7.3 . Độ tái lập Ch ê nh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi s ử dụng tr ên vật liệu giống thử hệt nhau b ở i hai phòng thử nghiệm không được qu á 5 % các trường hợp l ớ n hơn đ ộ tái lập R. Các giá trị đối với bơ lạc: A f latoxin B 1 : = 0,9 ng/g R = 0,45 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 1 , 9 ng/g R = 0,98 ng/g (được thêm vào) A f latoxin B 1 : = 3,6 ng/g R = 1 , 85 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 7,9 ng/g R = 4,93 ng/g (được thêm v à o) A f latoxin B 1 : = 0,8 ng/g R = 0,73 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 1,3 ng/g R = 1,29 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 1,5 ng/g R = 0,62 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 2,2 ng/g R = 0,90 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 3,4 ng/g R = 1,82 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 5,0 ng/g R = 2,69 ng/g (nhiễm tự nh iê n) Các giá trị đối với hồ nhã o qu ả h ồ trăn: A f latoxin B 1 : = 0,9 ng/g R = 0,42 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 2,0 ng/g R = 1,01 ng/g (được thêm vào) A f latoxin B 1 : = 3,3 ng/g R = 2,86 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 7,8 ng/g R = 5,1 ng/g (được thêm v à o) A f latoxin B 1 : = 0,7 ng/g R = 0,34 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 0,8 ng/g R = 0,48 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 1,5 ng/g R = 1,01 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 1,7 ng/g R = 1 , 18 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 2,9 ng/g R = 1,71 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 3,3 ng/g R = 2,02 ng/g (nhiễm tự nh iê n) Các giá trị đ ố i với h ồ nhão quả vả : A f latoxin B 1 : = 1,1 ng/g R = 0,59 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 2,2 ng/g R = 2,04 ng/g (được thêm vào) A f latoxin B 1 : = 3,6 ng/g R = 1,29 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 7 , 8 ng/g R = 3,58 ng/g (được thêm v à o) A f latoxin B 1 : = 1,3 ng/g R = 0,84 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 2,8 ng/g R = 2,24 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 2,1 ng/g R = 0,87 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 3,8 ng/g R = 2 , 88 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 2,6 ng/g R = 2,04 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 5,2 ng/g R = 4,37 ng/g (nhiễm tự nh iê n) Các giá trị đ ố i với bột ớt: A f latoxin B 1 : = 0,9 ng/g R = 0,25 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 1,7 ng/g R = 0,95 ng/g (được thêm vào) A f latoxin B 1 : = 3,4 ng/g R = 0,98 ng/g (được thêm vào) A f latoxin t ổ ng số: = 7,1 ng/g R = 2,83 ng/g (được thêm v à o) A f latoxin B 1 : = 0,8 ng/g R = 0,45 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 0,9 ng/g R = 0,87 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 1,4 ng/g R = 0,67 n g/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 2,0 ng/g R = 1,54 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin B 1 : = 3,0 ng/g R = 0,78 ng/g (nhiễm tự nhiên) A f latoxin t ổ ng số: = 4,5 ng/g R = 1,85 ng/g (nhiễm tự nh iê n) 8. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ: - m ọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, tên gọi); - phương pháp lấy mẫu đ ã sử dụng, nếu biết; - viện dẫn tiêu chuẩn n à y; - ngày và quy trình l ấ y mẫu (nếu biết); - ngày nhận mẫu; - ngày th ử nghiệm; - kết quả thử nghi ệ m thu được và các đơn vị biểu thị kết quả; - các điểm đặc trưng quan sát được trong quá tr ì nh thử nghiệm; - mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chu ẩ n này hoặc được xem là tùy chọn, có thể ảnh hư ở ng đến kết quả. PHỤ LỤC A (tham khảo) Sắc ký đồ điển hình Các điều kiện vận hành để c ó được các Hình A.1 đến A.4: Thể tích bơm: 200 μl Cột C-18 (dài 25 cm, đường k í nh trong 4,6 mm v à cỡ hạt 5 μ m) Tốc độ dòng 1 ml/min Pha động nước-metanol-axetonitril (6:3:2 [thể t í ch]) chứa 120 mg KBr và 350 μl HN O 3 (c(HN O­ 3 ) = 4 mol/l) D ẫ n xuất brom được tổng hợp bằng phương pháp điện hóa (cuvet KOBRA ® ) Detector huỳnh quang (bước s ó ng kích thích : 365 nm, bước sóng phát xạ: 435 nm) CHÚ DẪN 1 Huỳnh quang t í nh bằng milivon (mV) 2 Thời gian tính bằng phút (min) H ì nh A.1 - Sắc ký đồ điển hình c ủ a a fl atoxin trong hồ nhão quả và nhi ễ m tự nhiên sau khi làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm (mức nhiễm a f latoxin B 1 1 ng/g) CHÚ DẪN 1 Huỳnh quang t í nh bằng milivon (mV) 2 Thời gian tính bằng phút (min) H ì nh A.2 - S ắc ký đồ đi ể n hình của a f latoxin trong bột ớt nhiễm tự nhiên sau khi làm sạch b ằ ng cột ái lực miễn nhiễm (mức nhiễm a fl atoxin B 1 1 ng/g) CHÚ DẪN 1 Huỳnh quang tính bằng milivon (mV) 2 Thời gian t í nh bằng phút (min) Hình A.3 - Sắc ký đồ điển hình của a f latoxin trong bơ lạc nhiễm tự nhiên sau khi làm sạch bằng ái lực miễn nhiễm (mức nhiễm a f latoxin B 1 1 ng/g) CHÚ D Ẫ N 1 Huỳnh quang tính bằng milivon (mV) 2 Thời gian t í nh bằng phút (min) Hình A.4 - Sắc ký đ ồ điển hình của a f latoxin trong khối nhão qu ả h ồ trăn nhiễm tự nhiên sau khi làm sạch bằng ái lực miễn nhiễm (mức nh iễ m a f latoxin B 1 1 ng/g) PHỤ LỤC B (tham kh ả o) Dữ liệu về độ chụm Dữ liệu sau đây thu được trong các phép thử nghiệm liên phòng do Cộng đồng ch â u Âu tổ chức thực hiện theo TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), TCVN 6910-4 (ISO 5725-4) và TCVN 6910-6 (ISO 5725-6). Phép thử liên phòng đ ã nghiên cứu trên các mẫu bơ lạc, khối nh ã o qu ả hồ t ră n, khối nhão quả vả v à bột ớt nhiễm tự nhiên và thêm chu ẩ n a f latoxin [4]. Bảng B.1 - Dữ liệu v ề độ chụm đối với bơ lạc Thông số A f latoxin B 1 Aflatoxin tổng số S ố lượng mẫu 1 a 2 a 3 b 4 b 5 b 1 a 2 a 3 b 4 b 5 b N ă m thử nghiệm liên phòng 1998 1998 Số lượng ph ò ng thử nghiệm 16 16 Số lượng của m ẫ u (kép) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Số lượng phòng thử nghiệm được giữ l ạ i sau khi trừ ngoại lệ 15 13 15 14 14 15 15 15 13 14 Số ngoại lệ 1 3 1 2 2 1 1 1 3 2 Số kết quả được chấp nhận 15 13 15 14 14 15 15 15 13 14 Giá trị trung bình , ng/g 0,87 3,65 0,80 1 , 52 3,40 1 , 9 7 , 9 1,3 2 , 2 5 , 0 Độ lệch chu ẩ n lặp lại s r , ng/g 0,09 0,11 0,05 0,10 0,13 0,26 0,67 0 , 08 0,16 0 , 23 Độ lệch chu ẩ n tương đối lặp lại RSD r , % 10 3 6 6 4 13 9 6 7 5 Giới hạn lặp lại r [ r = 2,8 x s r ], ng/g 0 , 25 0 , 31 0,14 0,28 0 , 36 0,73 1,88 0,22 0 , 45 0,64 Độ lệch chuẩn tái lập s R , ng/g 0,16 0,66 0 , 26 0,22 0,65 0,35 1 , 76 0,46 0,32 0 , 96 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD R , % 19 18 32 14 19 18 22 34 14 19 Giới hạn tái lập R [ R = 2 , 8 x s R ], ng/g 0,45 1 , 85 0 , 73 0,62 1,82 0,98 4 , 93 1,29 0,90 2 , 69 Độ thu hồi , % 87 91 - - - 81 82 - - - a mẫu thêm chuẩn b mẫu nhiễm tự nhi ê n B ả ng B.2 - Dữ liệu về độ chụm đối với khối nhão quả hồ trăn Thông số A f latoxin B 1 A f latoxin t ổ ng số S ố lượng mẫu 1 a 2 a 3 b 4 b 5 b 1 a 2 a 3 b 4 b 5 b N ă m thử nghiệm liên phòng 1998 1998 Số lượng ph ò ng thử nghiệm 16 16 Số lượng của m ẫ u (kép) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Số lượng phòng thử nghiệm được giữ l ạ i sau khi trừ ngoại lệ 15 12 13 15 14 14 14 13 15 14 Số ngoại lệ 1 4 3 1 2 2 2 3 1 2 Số kết quả được chấp nhận 15 12 13 15 14 14 14 13 15 14 Giá trị trung bình , ng/g 0,94 3,29 0,74 1,54 2,93 2,0 7 , 8 0,8 1,7 3,3 Độ lệch chu ẩ n lặp lại s r , ng/g 0,13 0,13 0,08 0,27 0 , 59 0,24 1,82 0 , 10 0,31 0,66 Độ lệch chu ẩ n tương đối lặp lại RSD r , % 14 4 11 18 20 12 23 12 18 20 Giới hạn lặp lại r [ r = 2,8 x s r ], ng/g 0,36 0,36 0,22 0,76 1,65 0,67 5,10 0,28 0 , 87 1,85 Độ lệch chuẩn tái lập s R , ng/g 0,15 1,02 0,12 0,36 0,61 0,36 1,82 0 , 17 0,42 0,72 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD R , % 16 31 17 23 21 18 23 21 24 22 Giới hạn tái lập R [ R = 2 , 8 x s R ], ng/g 0,42 2,86 0,34 1,01 1,71 1,01 5,1 0,48 1,18 2,02 Độ thu hồi , % 94 82 - - - 83 81 - - - a mẫu thêm chuẩn b mẫu nhiễm tự nhi ê n Bảng B.3 - Dữ liệu về độ chụm đ ố i với kh ố i nhão quả vả Th ô ng số Aflatoxin B 1 Afl atoxin t ổ ng số S ố lượng mẫu 1 a 2 a 3 b 4 b 5 b 1 a 2 a 3 b 4 b 5 b N ă m thử nghiệm liên phòng 1998 1998 Số lượng ph ò ng thử nghiệm 16 16 Số lượng của m ẫ u (kép) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Số lượng phòng thử nghiệm được giữ l ạ i sau khi trừ ngoại lệ 15 15 16 14 16 15 15 16 16 16 Số ngoại lệ 1 1 0 2 0 1 1 0 0 0 Số kết quả được chấp nhận 15 15 16 14 16 15 15 16 16 16 Giá trị trung bình , ng/g 1 , 10 3,60 1,32 2,07 2 , 55 2 , 2 7 , 8 2,8 3,8 5,2 Độ lệch chu ẩ n lặp lại s r , ng/g 0,18 0,39 0,12 0 , 12 0,41 0,40 1,01 0 , 25 0,44 0 , 90 Độ lệch chu ẩ n tương đối lặp lại RSD r , % 17 11 10 6 16 18 13 9 12 17 Giới hạn lặp lại r [ r = 2,8 x s r ], ng/g 0,5 1,09 0,34 0,34 1,15 1,12 2 , 83 0,7 1 , 23 2,52 Độ lệch chuẩn tái lập s R , ng/g 0,21 0,46 0,30 0,31 0,73 0,73 1,28 0,80 1,03 1,56 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD R , % 19 13 23 15 29 32 17 28 29 30 Giới hạn tái lập R [ R = 2 , 8 x s R ], ng/g 0,59 1,29 0,84 0,87 2,04 2,04 3,58 2,24 2,88 4,37 Độ thu hồi , % 109 90 - - - 92 81 - - a mẫu thêm chuẩn b mẫu nhiễm tự nhi ê n Bảng B.4 - Dữ liệu về độ chụm đối với bột ớt Thông số A f latoxin B 1 A f latoxin tổng số S ố lượng mẫu 1 a 2 a 3 b 4 b 5 b 1 a 2 a 3 b 4 b 5 b N ă m thử nghiệm liên phòng 1998 1998 Số lượng ph ò ng thử nghiệm 16 16 Số lượng của m ẫ u (kép) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Số lượng phòng thử nghiệm được giữ l ạ i sau khi trừ ngoại lệ 14 15 15 15 14 13 15 16 16 14 Số ngoại lệ 2 1 1 1 2 3 1 0 0 2 Số kết quả được chấp nhận 14 15 15 15 14 13 15 16 16 14 Giá trị trung bình , ng/g 0 , 86 3 , 41 0,84 1,39 3,02 1 , 7 7 , 1 0 , 9 2 , 0 4 , 5 Độ lệch chu ẩ n lặp lại s r , ng/g 0,05 0,18 0 , 12 0,14 0,13 0,11 0 , 72 0,16 0,23 0,22 Độ lệch chu ẩ n tương đối lặp lại RSD r , % 6 5 14 10 4 6 10 17 12 5 Giới hạn lặp lại r [ r = 2,8 x s r ], ng/g 0,14 0,5 0 , 34 0,39 0,36 0,31 2,02 0 , 45 0,64 0 , 62 Độ lệch chuẩn tái lập s R , ng/g 0,09 0,35 0,16 0,24 0,28 0,34 1,01 0,31 0 , 55 0 , 66 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSD R , % 10 10 19 17 9 20 14 34 28 15 Giới hạn tái lập R [ R = 2 , 8 x s R ], ng/g 0,25 0,98 0,45 0,67 0,78 0 , 95 2,83 0,87 1,54 1,85 Độ thu hồi , % 86 85 - - 71 74 - - - a mẫu thêm chuẩn b mẫu nhiễm tự nhi ê n THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung. [2] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn. [3] TCVN 6910-4:2001 (ISO 5725-4:1994 ) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 4: Các phương pháp cơ bản xác định độ đúng của phương pháp đo tiêu chuẩn. [4] TCVN 6910-6:2002 (ISO 5725-6:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 6: Sử dụng các giá trị độ chính xác trong thực tế. [5] Laboratory decontamination and destruction of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in laboratory wastes. Castegnaro, M., Hunt D.C., Sansone E.B., Schuller P.L., Siriwardana M.G., Telling G.M., van Egmond H.P. and Walker E.A. IARC Scientific publication no. 37, International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon (France), 1980, 59 p. [6] Laboratory decontamination and destruction of carcinogens in laboratory wastes: some mycotoxins. Castegnaro M., Barek J., Fremy J.M., Lafontaine M., Miraglia M., Sansone E.B. and Telling G.M. IARC publication no. 113, International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon (France), 1991, 63 p. [7] Commission Directive 98/53/EC of 16 July 1998 laying down the sampling methods and the methods of analysis for the official control of the levels for certain contaminants in foodstuffs, Official Journal L 201, 17/07/1998, 93-101 [8] Stroka J, Anklam E, Joerissen U, Gilbert J (2000) lmmunoaffinity cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxins in peanut butter, pistachio paste, fig paste, and paprika powder: collaborative study, Journal of the AOAC International 83: 320-340 1) Cuvet KOBRA l à v í dụ về sản phẩm thích hợp c ó bán sẵn trên thị trường . Thông tin này đưa ra tạo thu ậ n tiện cho ngư ờ i sử dụng tiêu chu ẩ n và không ấn định phải sử dụng các sản phẩm này . Các sản ph ẩ m tương tự có th ể được sử dụng nếu cho kết quả tương đương .