TCVN8400-30:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-30:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 30: Bệnh Marek ở gà TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-30:2015 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 30: BỆNH MAREK Ở GÀ Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 30: Mareks disease Lời nói đầu TCVN 8400-30:2015 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, T ổ ng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm 38 phần: - TCVN 8400-1 : 2010, phần 1: Bệnh l ở mồm long móng; - TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn; - TCVN 8400-3 : 2010, ph ầ n 3: Bệnh giun xoắn; - TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn; - TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng; - TCVN 8400-6: 2011 , phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ; - TCVN 8400-7: 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê; - TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi d o Aspergillus ở gia cầm; - TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I ; - TCVN 8400-10 : 2011, ph ầ n 10: Bệnh lao bò; - TCVN 8400-11 : 2011, ph ầ n 11: Bệnh dịch tả vịt; - TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà; - TCVN 8400-13 : 2011, ph ầ n 13: Bệnh s ả y thai truyền nhiễm do Brucela; - TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-15 : 2011, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira; - TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khu ẩ n E.coli; - TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà; - TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza); - TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn; - TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đ ó ng dấu l ợ n; - TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản v à h ô hấp ở lợn (PRRS); - TCVN 8400-22 : 2014 ph ầ n 22: Bệnh giả dại ở lợn; - TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí th á n; - TCVN 8400-24 : 2014, ph ầ n 24: Bệnh viêm phế qu ả n truyền nhiễm; - TCVN 8400-25 : 2014, ph ầ n 25: Bệnh cúm lợn; - TCVN 8400-26 : 2014, ph ầ n 26: Bệnh cúm gia c ầ m H5N1; - TCVN 8400-27: 2014, ph ầ n 27: Bệnh sán lá gan; - TCVN 8400-28: 2014, ph ầ n 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium per f ringens; - TCVN 8400-29 : 2015, ph ầ n 29: Bệnh Lympho leuko ở gà; - TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà; - TCVN 8400-31 : 2015, ph ầ n 31: Bệnh tụ huyết trùng gia c ầ m; - TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm; - TCVN 8400-33 : 2015, ph ầ n 33: Bệnh lê dạng trùng ở tr â u bò; - TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-35 : 2015, ph ầ n 35: Bệnh theileria ở trâu b ò ; - TCVN 8400-36 : 2015, ph ầ n 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2; - TCVN 8400-37 : 2015, ph ầ n 37: Bệnh viêm phổi đ ị a phương ở lợn; - TCVN 8400-38 : 2015, ph ầ n 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus. BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 30: BỆNH MAREK Ở GÀ Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 30: Marek’s disease CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không th ể đưa ra đư ợ c hết tất c ả các v ấ n đề an toàn li ê n quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chu ẩ n này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Ti ê u chuẩn này quy định quy trình ch ẩ n đoán bệnh Marek do virus thuộc nhóm Herpesvirus gây ra ở gà. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: 2.1. Bệnh Marek (Marek’s disease) Bệnh do virus thuộc nhóm Herpesvirus , họ Herpesviri d ae, là virus hư ớ ng tế bào lympho, gây suy giảm hệ thống miễn dịch của gà. CHÚ THÍCH: Virus này gồm 3 kiểu huy ế t thanh (serotype), trong đó serotype 1 g ồ m những dò ng virus có độc lực cao và những dòng c ó đ ộ c lực thấp; serotype 2 không có độc lực; serotype 3 liên quan đến gà t â y. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước c ấ t, nước khử khoáng hoặc nước c ó độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 3.1 . Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp parafin 3.1.1 . Formalin , dung dịch 10 % (thể tích) Chuẩn bị từ dung dịch f ormaldehyde 38 % và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (xem Phụ lục A) với t ỷ lệ 1 : 9 (thể tích). 3.1.2 . Etanol 70 % (thể tích), 90 % (th ể tích) và etanol tuyệt đối. 3.1.3 . Xylen. 3.1.4 . Haematoxylin. 3.1.5 . Eosin. 3.1.6 . Parafin , có độ nóng chảy từ 56 °C đến 60 °C. 3.1.7 . Keo dán lamen. 3.2 . Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp realtime PCR 3.2.1 . Dung dịch PBS , pH 7,0 (xem Phụ lục A) 3.2.2 . Etanol tuyệt đối , dùng cho tách chiết mẫu ADN (axit deoxyribonucleic). 3.2.3 . M ẫ u ADN kiểm chứng dương , tách chiết từ virus gây bệnh Marek, có giá trị C t (chu kỳ ngưỡng) đã biết trước. 3.2.4 . Kít tách chiết ADN. 3.2.5 . K í t nhân gen. 3.2.6 . Bộ mồi và mẫu d ò (primers và probe). 3.2.7 . Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic). 3.2.8 . Nước , tinh khiết không có nuclease. 4. Thiết bị và dụng cụ S ử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của ph ò ng thí nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau: 4.1 . Thiết bị và dụng cụ d ùng cho phương pháp parafin 4.1.1 . Khuôn nhựa , loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể. 4.1.2 . Máy xử lý mẫu mô tự động. 4.1.3 . Nồi đun parafin , có thể duy tr ì ở nhiệt độ từ 56 °C đến 65 °C. 4.1.4 . Khay sắt , loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể. 4.1.5 . Máy làm lạnh , có th ể duy trì ở nhiệt độ từ âm 10 °C đến 4 °C. 4.1.6 . Máy cắt tiêu b ả n , cắt ở độ m ỏ ng từ 3 m m đến 5 m m. 4.1.7 . Nồi dãn tiêu bản , có thể làm nóng nước ở nhiệt đ ộ từ 35 °C đ ế n 65 °C. 4.1.8 . Phiến kính, v ô trùng. 4.1.9 . Lamen, vô trùng. 4.1.10 . Bộ c ố c nhuộm tiêu b ả n. 4.1.11 . K í nh hiển vi quang học , v ậ t kính 4 X, 10 X, 20 X, 40 X, 60 X. 4.2 . Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp realtime PCR 4.2.1 . Máy nhân gen , (realtime PCR). 4.2.2 . Máy spindo w n. 4.2.3 . Tủ lạnh âm sâu , có thể duy tr ì nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C. 4.2.4 . Máy ly tâm , c ó thể tạo gia tốc ly tâm 3 000 g, 6000 g và 20 000 g. 4.2.5 . Máy lắc , có thể hoạt động với tốc độ 200 r/min đến 2 500 r/min. 4.2.6 . Cối chày sứ , vô trùng. 5. Chẩn đoán lâm sàng 5.1 . Đặc điểm dịch tễ - Bệnh thường xảy ra ở gà từ 3 tu ầ n tuổi đến 4 tuần tuổi tr ở lên, phổ biến nhất ở giữa 12 tuần tu ổ i và 30 tuần tuổi; - Giai đoạn ủ bệnh biến đ ổ i từ 1 vài tuần đến lâu hơn; - Đối với thể cấp tính tỷ lệ mắc bệnh từ 10 % đến 30 %, trong các ổ dịch có thể lên tới 70 %, tỷ lệ chết tăng nhanh trong vài tu ầ n, sau đó có thể giữ nguyên hoặc giảm trong vài tháng; đ ố i với thể c ổ điển (thể mãn tính) tỷ lệ chết không vượt quá 10 % đến 15 %; - Virus Marek gây bệnh ch ủ yếu ở gà, đ ôi khi gà tây và chim cút cũng bị nhiễm bệnh, các loài gia cầm, thủy cầm khác hiếm gặp; - Virus l â y lan trực tiếp qua tiếp xúc giữa con bệnh và con khỏe trong đàn hoặc gián tiếp qua không khí. 5.2 . Triệu chứng lâm sàng 5.2.1 . Thể cấp tính - Đặc điểm của thể này là có các u lympho ở các cơ quan nội tạng nên ít có triệu chứng điển h ì nh ngoài hiện tượng chết đột ngột; - Gà có triệu chứng bỏ ăn, phân loãng; - Đi lại khó khăn, bại liệt, sã một bên cánh. 5.2.2 . Thể mạn tính Thể mạn tính thường diễn ra ở hai loại là thể thần kinh và thể mắt. a) Th ể thần kinh - G à thường có triệu chứng liệt một bên hoặc c ả hai bên chân và cánh; - G à bị ngoẹo c ổ sang một bên do thần kinh điều khiển cơ c ổ bị ảnh hư ở ng; - Gà có thể có triệu chứng th ở g ấ p. b) Thể mắt - Giai đoạn đ ầ u có hiện tượng viêm m ắ t nhẹ, con vật rất mẫn cảm với ánh sáng, ch ả y nước m ắ t trong; - Giai đoạn sau viêm mống mắt thể mi gây hiện tượng “mắt nâu”: viêm màng tiếp hợp rồi viêm m ố ng mắt. Mủ tr ắ ng đóng đ ầ y khóe mắt, con vật nh ì n kém, kh ô ng mổ trúng thức ă n, cuối cùng con v ậ t có thể bị mù. 5.3 . Bệnh tích đại thể 5.3.1 . Thể cấp tính - Các cơ quan nội tạng như gan, lách, buồng trứng, thận, tim và dạ dày tuyến: có các u lympho tràn lan; - Ở gà con: gan sưng ở mức độ trung bình; ở gà trư ở ng thành: gan sưng to; - Các u lympho c ó thể th ấ y trên da xung quanh các nang lông và ở trong cơ lườn; - Dây thần kinh vùng đ ùi, cánh sưng to. 5.3.2 . Thể mạn tính - Một hoặc nhiều dây th ầ n kinh ngoại bi ê n như dây thần kinh và đám rối thần kinh hông, cánh, đám rối thần kinh bụng; thần kinh gian sườn sưng to g ấ p 2 đến 3 lần bình thường, phù và có màu vàng nhạt hoặc nâu nhạt, mất các vạch sáng, sợi ngang và dọc; - Đôi khi có các u lympho ở buồng trứng, thận, tim, gan v à các mô khác. Các u thường nhỏ, mềm, màu nâu; - Viêm mống mắt th ể mi gây hiện tượng “mắt nâu”: đồng tử bị biến dạng, hiện tượng n à y ph ổ biến ở gà lứa tuổi từ 16 tuần tu ổ i đến 18 tuần tuổi. 5.4 . Chẩn đoán phân biệt về lâm sàng Ch ẩ n đoán phân biệt về lâm sàng giữa bệnh Marek và bệnh Lympho leuko theo Bảng 1. Bảng 1 - So sánh triệu chứng lâm sàng và bệnh t í ch đại thể tr ê n gà nhiễm bệnh Đặc điểm Bệnh Marek Bệnh Lympho leuko Lứa tuổi mắc bệnh Từ vài ngày tuổi tr ở l ê n Từ 16 tuần tuổi tr ở lên Triệu chứng Gà thường bị liệt chân, s ã cánh Thường không đặc trưng Bệnh tích đại thể D â y thần kinh ngoại vi sưng to Thường xuyên Không có Túi Fabricius Teo nh ỏ hoặc sưng to Có các u cục U ở dạ dày tuyến, da, cơ C ó thể c ó Không có 6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1. Phương pháp parafin phát hiện bệnh Marek 6.1.1 . Lấy mẫu Chọn t ừ 3 con gà đến 5 con gà có triệu chứng điển hình m ổ lấy các mẫu bệnh phẩm sau: - Dây thần kinh: l ấ y hai dây th ầ n kinh đùi và hai d â y thần kinh cánh, độ dài khoảng 2 cm; - Gan: l ấ y phần gan nghi có bệnh tích với độ d ày khoảng 0,5 cm; - Lách: cắt một miếng với độ dày khoảng 0,5 cm; - Túi Fabricius: cắt ngang túi Fabricius; - Tuyến ức: lấy toàn bộ tuyến; - N ã o: m ở hộp sọ, lấy phần đại não và tiểu n ã o; - Mắt: cắt đứt phần da xung quanh h ố mắt và các d ây thần kinh; - Bệnh phẩm da: lấy phần da có các nang l ô ng sưng to. Các mẫu bệnh ph ẩ m trên cho vào lọ chứa f o r malin (3.1.1) sao cho thể tích mẫu bệnh ph ẩ m v à f ormalin có tỷ lệ khoảng 1 : 10, ghi ký hiệu mẫu trên lọ. 6.1.2 . B ả o qu ả n mẫu Mẫu bệnh phẩm (6.1.1) được đảm bảo ngập trong formalin (3.1.1), tránh đổ vỡ, rơi vãi formalin ra ngoài môi tr ư ờng; khi gửi mẫu đến ph ò ng thí nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu bằng túi nilon, miệng túi được dán kín. Trong ph ò ng th í nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được b ổ sung hoặc thay mới f o r malin, đ ả m bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin đạt tỷ lệ khoảng 1 : 10. CH Ú TH Í CH: Đ ồ ng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh ph ẩ m ghi r õ y ê u cầu xét nghiệm v à những thông tin v ề dịch t ễ , c á c biểu hiện triệu chứng, bệnh t ích của bệnh. 6.1.3 . Chuẩn bị m ẫ u - Mẫu bệnh phẩm (6.1.1) được cố định trong dung d ịch formalin (3.1.1) trong 24 h; - Cắt các bệnh phẩm đã cố định trên thành miếng nh ỏ d à y khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm rồi đặt vào khuôn nhựa (4.1.1). 6.1.4 . Cách tiến hành 6.1.4.1 . Đúc khuôn - Rửa khuôn nhựa (6.1.3) dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào c ố c etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) thời gian từ 2 đ ế n 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc para fi n (3.1.6) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đ ến 3 h; CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy xử lý m ẫ u m ô tự động (4.1.2) th ì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etano l . - Đ úc khu ô n: rót parafin (3.1.6) được nóng chảy từ n ồ i đun parafin (4.1.3) vào khay sắt (4.1.4), g ắ p bệnh phẩm từ khuôn nhựa vào khay sắt, đặt khuôn nhựa (4.1.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối parafin. 6.1.4.2 . Cắt tiêu bản - Cắ t g ọ t khối parafin (6.1.4.2) cho b ằ ng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh tiêu bản (4.1.5); - Đặt kh ố i parafin lên máy cắt tiêu bản (4.1.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lư ỡ i dao, cắt b ỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đ ủ các bệnh phẩm, điều ch ỉ nh độ dày của lát cắt từ 3 m m đến 5 m m, cắt một vài lát; - Chọn lát cắt ph ẳ ng th ả vào nồi dãn tiêu bản (4.1.7) với nhiệt độ nước từ 35 °C đ ế n 40 °C; dùng phi ế n kính (4.1.8) vớt lát cắt. Dựng nghiêng tiêu bản và để kh ô . 6.1.4.3 . Nhuộm tiêu bản - Ngâm ti ê u bản (6.1.4.2) vào cốc xylen (3.1.3) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu b ả n vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min; - Ng â m tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.1.4), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Rửa tiêu bản dưới v ò i nước ch ả y, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.1.5), th ờ i gian từ 60 s đến 90 s; - Rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Loại b ỏ nước còn bám tr ê n tiêu b ả n b ằ ng cách ngâm tiêu b ả n vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào c ố c etanol tuyệt đ ố i (3.1.2) 3 lần, thời gian mỗi l ầ n từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.1.3) 2 lần, thời gian mỗi l ầ n từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.1.9) vào tiêu bản b ằ ng keo dán lamen (3.1.7). Để kh ô , soi tiêu b ả n dưới kính hiển vi quang học (4.1.11). 6.1.5 . Đọc kết quả [1 ] - Ở cả hai thể cấp tính và th ể mạn tính, bệnh kh ở i đầu b ằ ng việc tăng sinh các tế bào lymph o đa hình thái. Đặc điểm tế bào ở u lympho trong bệnh Marek là các tế bào lympho không đ ồ ng nhất v ề kích thước v à độ bắt màu. Các nguyên bào lympho, tế bào lympho to, nh ỏ , trung bình và các đại thực b à o xâm nhập, trong đó ưu thế l à tế bào lympho nh ỏ và vừa không đều nhau, nguyên sinh chất bắt màu hồng; - D â y thần kinh ngoại bi ê n có biểu hiện t ă ng sinh, vi ê m, hoặc c ó các biến đổi nhẹ. Cụ th ể l à sự tăng sinh của các nguyên bào lympho, các t ế bào lympho to, nh ỏ , đại thực bào v à các tế b à o plasma cùng với sự tăng sinh của các tế bào sch w ann tạo thành viêm; - Tại gan phát hiện các đám tế bào lympho nằm ở ngoại vi mạch qu ả n; - Tại lách phát hiện các đám tế bào lympho phân bố tràn lan; - Tại tuyến ức và túi Fabricius số lượng các tế bào lympho giảm; - Mạch ở tiểu não, đại n ã o và th ù y mắt bị viêm, có các tế b à o viêm xâm nhập, chủ yếu lo ạ i tế b à o l ympho. 6.1.6 . Ch ẩ n đoán ph â n biệt về bệnh tích vi th ể giữa bệnh Marek và bệnh Lympho leuko Ch ẩ n đoán phân biệt về bệnh tích vi thể giữa bệnh Marek và bệnh Lympho leuko theo Bảng 2. B ả ng 2 - So sánh bệnh tích vi thể Đặc đi ể m Bệnh Marek Bệnh Lymphp leuko Bệnh tích ở d ây thần kinh ngoại biên Thường xuy ê n có tế bào vi ê m Không có U cục ở gan Các đám tế bào tăng sinh thường ở ngoại vi mạch qu ả n Các đám tế bào t ă ng sinh thường dạng điểm hoặc tràn lan U cục ở lách Các đám tế bào tăng sinh trong kh ố i u thường tràn lan Các đám tế bào t ă ng sinh trong khối u thường dạng điểm Túi F abricius Các đám tế b à o tăng sinh trong các u nằm ở giữa các nang v à /hoặc nang bị teo giảm Các đám tế bào tăng sinh trong các u cục nằm r ả i rác trong các nang Tế bào lympho tăng sinh ở da, nang lông Thường xuyên Không có Bệnh tích ở hệ th ầ n kinh trung ương Có thể có Không có Tế bào ở các u cục C á c tế bào lympho không đồng nhất gồm: các nguyên b à o lympho, t ế bào lympho l ớ n, trung b ì nh, nh ỏ và tế bào plasma. Các nguyên bào ly m pho đồng đều về kích thước, màu sắc 6.2. Phương pháp realtime PCR phát hiện virus gây bệnh Marek 6.2.1 . Lấy mẫu Ch ọ n từ 3 con gà đến 5 con gà có triệu chứng điển h ì nh mổ lấy dây thần kinh, gan, lách, nang lô ng (khối lượng tổng các loại từ 3 g đến 5 g) cho vào túi hoặc lọ đ ựng mẫu vô trùng, ghi ký hiệu mẫu tr ê n thành lọ. 6.2.2 . B ả o qu ả n mẫu M ẫ u bệnh phẩm (6.2.1) đựng trong túi kín và được bảo quản trong thùng lạnh (có nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C và gửi đ ế n phòng th í nghiệm không quá 48 h. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bảo qu ả n trong tủ lạnh âm 20 °C (4.2.3). CH Ú THÍCH: Đồng thời kèm the o Phi ế u g ử i bệnh ph ẩ m ghi rõ yêu c ầ u x é t n ghi ệ m và nh ữn g th ô ng tin v ề d ịch t ễ, c á c biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh. 6.2.3 . Chuẩn bị mẫu Lấy 1 g mẫu bệnh phẩm (6.2.1) gồm dây thần kinh, gan, lách, nang lông cắ t nh ỏ , rồi nghiền với du ng dịch PBS (3.2.1) theo t ỉ lệ 1 : 10 thành huyễn dịch trong cối chày sứ (4.2.6). Ly tâm (4.2.4) huyễn d ị ch ở gia tốc 3 000 g trong thời gian 5 min rồi hút lấy dịch nổi để tách chiết ADN cho phản ứng real time PCR. 6.2.4 . Cách tiến hành 6.2.4.1 . Tách chiết ADN S ử dụng bộ kít tách chiết (3.2.4) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà s ả n xu ấ t. VÍ D Ụ : sử d ụ ng kít t á ch chiết QIAGEN RNeasy Bl o od tissue (Cat. No. 69506) 1) (xem Phụ lục B). 6.2.4.2 . Chuẩn bị mồi Ph ả n ứng khuếch đại được thực hiện trong m á y nhân gen (4.2.1) theo phương pháp realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của virus gây bệnh Marek sử dụng cặp mồi và mẫu dò (primers và probe) (3.2.6) được nêu trong B ả ng 3. Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau: - Chuẩn bị m ồ i gốc và mẫu d ò gốc: mồi và mẫu d ò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.2.2) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi m ở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên n ê n dùng dung dịch đệm TE (3.2.7) đ ể hoàn nguyên mồi và mẫu dò ở nồng độ 100 m M làm mồi gốc và mẫu dò gốc; - Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 m M: pha lo ã ng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (20 m l mồi g ố c v à 80 m l nước (3.2.8)). - Chuẩn bị mẫu dò s ử dụng ở nồng độ 6 m M: pha loãng mẫu dò gốc bằng nước (3.2.8) (6 m l m ồ i gốc và 94 m l nước (3.2.8)). Bảng 3 - Trình tự cặp mồi và mẫu dò [2] M ẫ u d ò, mồi Trình tự từ 5’ đến 3’ M ẫ u d ò FAM-AGACCCTGATGATCCG C ATTGCGACT-TAMRA Mồi xuôi GGTCTGGTGGTTTCCAGGTGA Mồi ngược GCATAGACGATGTGCTGCTGA 6.2.4.3 . Tiến hành phản ứng S ử dụng cặp mồi v à mẫu dò đã được chuẩn bị (6.2.4.2). Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xu ấ t. VÍ DỤ: dù ng kít nh â n gen của h ã ng Invitrogen Platinum One - step qPCR SuperMix - UDG (Cat. No. 11730-017) 2) , thà n h phần cho 1 ph ả n ứng được n ê u trong b ả ng 4. B ả ng 4 - Thành ph ầ n ph ả n ứng Thành phần Thể tích, m l Dung dịch đệm 2 X (2 X Reaction buffer) 12,5 M ồ i/ mẫu dò 1,5 Nước tinh khiết không có nuclease 6,0 T ổ ng thể tích 20,0 Chuyển 20 m l hỗn hợp nhân gen vào mỗi ố ng phản ứng. - M ẫ u ki ể m chứng dương: cho 5 m l mẫu ADN có giá trị C t đ ã biết trước vào ống phản ứng. - M ẫ u ki ể m chứng âm: cho 5 m l nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng. - Mẫu bệnh phẩm: cho 5 m l m ẫ u ADN (phụ lục B) vào ống phản ứng. CHÚ Ý : - Phản ứng realtime PCR phải bao gồm : mẫu bệnh ph ẩ m, mẫu kiểm chứng dương, mẫu kiểm ch ứ ng âm. - Mẫu và nguyên vật liệu cho ph ả n ứ ng realtime PCR c ầ n đặt trong khay đá lạnh t rong suốt quá tr ì nh chu ẩ n bị hỗn hợp phản ứng. Tiến hành phản ứng b ằ ng máy realtime PCR (4.2.1) đã được cài đặt chu tr ì nh nhiệt nêu trong bảng 5. B ả ng 5 - Chu trình nhiệt phản ứng Nhiệt độ Thời gian S ố chu kỳ 95 °C 2 min 1 95 °C 10 s 40 60 °C 30 s 40 6.2.5 . Đọc kết qu ả Đọc kết quả bằng máy reatime PCR (4.2.1) dựa tr ê n giá trị C t (Ct là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ốn g phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền) Điều kiện phản ứng được công nh ậ n: mẫu kiểm chứng dương t í nh có giá trị Ct biết trước (± 2 Ct), mẫu kiểm chứng âm t í nh không có C t; Với điều kiện như trên, mẫu c ó giá trị C t ≤ 35 được coi l à dương tính; mẫu không có C t được coi là âm tính; mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi l à nghi ngờ; Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại theo quy trình hoặc bằng phương pháp khác để khẳng định. 7. Kết luận Gà được xác định mắc bệnh Marek khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng l â m sàng, bệnh t ích đại thể đặc trưng của bệnh v à dương tính với một trong hai phương pháp xét nghiệm quy định trong tiêu chuẩn này. Phụ lục A (Quy định) Chuẩn bị dung dịch muối đệm phosphat (PBS) A.1 . Thành phần Natri hydrophosphat (Na 2 HP O 4 ) 9,47 gm Kali dihydrophosphat (KH 2 PO 4 ) 9,08 gm Nước c ấ t 900 ml A.2 . Chuẩn bị Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước c ấ t. Ch ỉ nh pH đến 7,0 b ằ ng axit clohydric. CHÚ THÍCH: Có thể sử d ụ ng P B S thương mại và pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phụ lục B (Tham khảo) Quy trình tách chiết ADN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng h óa chất nguy hi ể m và c ó khả năng gây hại nếu thao tác không c ẩ n thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các h óa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, kh ẩ u trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này. Qui trình tách chiết ADN sử dụng kít QIAGEN RNeasy Blood & Tissue kit (Cat. No. 69506) như sau: B.1. Pha dung dịch - Dung dịch AW1: thêm 125 ml etano l tuyệt đối (3.2.2) vào 95 ml dung dịch AW1 đậm đặc; - Dung dịch AW2: thêm 160 ml etanol tuyệt đối (3.2.2) vào 66 ml dung dịch AW2 đ ậ m đặc. B.2. Cách tiến hành - Cho 20 m l protease vào ống 1,5 ml; - Chuyển 200 m l dịch mẫu (dịch nổi x ử lý ở 6.2.3) vào ống 1,5 ml; - Thêm 200 m l dung dịch AL (lysis buffer) vào ống. Lắc bằng máy lắc (4.2.5) trong 15 s, sau đ ó ly t â m (4.2.4) với gia tốc 3 000 g trong 1 min; - Ủ ở nhiệt độ 56 °C trong 10 min, sau đó ly t â m (4.2.4) với gia tốc 3 000 g trong 1 min; - Cho 200 m l etanol tuyệt đối (3.2.2) vào ống. L ắ c bằng máy l ắ c (4.2.5) trong 15 s, sau đ ó ly t â m với gia tốc 3 000 g trong 1 min; - Chuyển 620 m l dung dịch mẫu đã tách chiết vào cốc lọc (spin column) với ống thu (collection tube); - Ly tâm (4.2.4) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng; - Thêm 500 m l dung dịch AW1 vào cột lọc có ống thu ở dưới; - Ly t â m (4.2.4) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng; - Cho cột lọc vào ống thu mới; - Thêm 500 m l dung dịch AW2 vào cột lọc có ống t hu ở dưới; - Ly tâm (4.2.4) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng; - Chuyển cột lọc sang ống ly tâm 1,5 ml; - Nhỏ 200 m l dung dịch AE vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min; - Ly tâm (4.2.4) với gia tốc 6 000 g trong 1 min; - Chuyển ADN đã thu sang ống 1,5 ml mới; - Bảo quản mẫu ADN ở 4 °C trong ngày nếu chạy ph ả n ứng realtime PCR ngay và giữ ở â m 20 °C để lưu mẫu trong th ờ i gi an dài. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Aly M.Fadly, 2008, Disease of poultry , 12th, Black w ell Publishing, p.449 - p.616. [2] Butter C ., Staines K., Baaten B., Smith L., Davison F. T. (2007) Route of challenge is critical in determining the clinical outcome of in f ection with a very virulent oncogenic herpesvi ru s , Marek’s disease virus, Avian Pathology (April 2007) 36(2), 9399. [3] Manua l of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals , 2010, OIE, Chapter 2.3.13. Marek’s disease. [4] Venugopal Nair, Richard C . Jones, R.E. Gough, 2008, Poultry disease , 6 th Edition, Saunders E l serier, p.258 - p.267. [5] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn L ã nh, Đỗ Ngọc Th úy , 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y . NXB Đại học Nông nghiệp. [6] L.N. Payne & K. Venugopal, “Neoplastic diseases: Marek ’ s disease, avian leukosis and reticuloendotheliosis ” , Rev. sci. tech. Off. int. cpiz., 2000,19 (2), 544-564. Available at: http://www .oie.int/doc/ged/D9316.PDF [7] Marek ’ s Disease in Poultry . Available at: http://www.merckmanuals.com/ve t/ pourtry/neoplasms/mareks_ d isease _ in_poultry.html [8] Marek ’ s disease . Available at: http://www.thepoultrysite.com/diseaseinfo/90/mareks-disease 1) Th ô ng ti n này đ ưa ra t ạ o đ iề u kiện thuận tiện cho người sử d ụng tiêu chu ẩ n và kh ôn g ấn định sử dụng s ả n phẩm của nhà cung c ấ p này. Có t hể s ử d ụ ng các s ả n phẩm tương tự n ế u cho các k ế t quả tương đươ n g. 2) Thông tin n à y đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho n gười s ử dụ ng ti ê u chu ẩ n v à không ấn định sử dụng s ả n ph ẩ m của nhà cung c ấ p này . Có thể s ử dụn g c á c sản ph ẩ m tươn g t ự n ếu cho các kế t qu ả tương đương.