TCVN8106:2009

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8106:2009 (ISO/TS 26844 : 2006) về Sữa và sản phẩm sữa - Xác định dư lượng kháng sinh - Phép thử phân tán trong ống nghiệm TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8106 : 2009 ISO/TS 26844 : 2006 SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH - PHÉP THỬ PHÂN TÁN TRONG ỐNG NGHIỆM Milk and milk products - Determination of antimicrobial residues - Tube diffusion test Lời nói đầu TCVN 8106 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO/TS 26844 : 2006. TCVN 8106 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH - PHÉP THỬ PHÂN TÁN TRONG ỐNG NGHIỆM Milk and milk products - Determination of antimicrobial residues - Tube diffusion test 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phép thử tác nhân ức chế vi sinh vật để phát hiện các loại kháng sinh trong sữa và các sản phẩm sữa. Phương pháp này có thể áp dụng cho sữa nguyên liệu, sữa đã xử lý nhiệt và sữa bột hoàn nguyên. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 4884 (ISO 4833), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 độ C. TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật. ISO 13969, Milk and milk products - Guidelines for a standardized description of microbial inhibitor test (Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn mô tả chuẩn phép thử nghiệm tác nhân ức chế vi khuẩn). ISO 18330, Milk and milk products - Guidelines for the standardized description of immunoassays or receptor assays for the detection of antimicrobial residues (Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn mô tả chuẩn thử nghiệm miễn dịch hoặc thử nghiệm thụ cảm để phát hiện dư lượng kháng sinh). 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 3.1. Chất kháng sinh (antimicrobial substances) Các chất thấy ức chế khi thử nghiệm theo quy trình quy định trong tiêu chuẩn này. 3.2. Giới hạn phát hiện (limits of detection) Mức nồng độ mà tại đó số phần trăm xác định mẫu dương tính được phát hiện. VÍ DỤ 95 %. 4. Nguyên tắc Mẫu sữa được cho vào 2 ống nghiệm đựng môi trường thạch có chứa Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149 (tương tự chủng C953 của NIZO). Các ống nghiệm này khác nhau về pH, chất bổ sung và kháng sinh bổ trợ. Các vi sinh vật sinh trưởng bình thường khi được ủ ấm sẽ làm thay đổi chất chỉ thị pH, làm đổi màu thạch từ đỏ tía sang vàng. Nếu trong sữa có chứa các chất làm ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật thì chất chỉ thị pH sẽ giữ nguyên màu đỏ tía. Ống nghiệm A (pH 7,0; chứa chloramphenicol) có độ nhạy được tăng rõ rệt với dư lượng tetracycline, còn ống nghiệm B (pH 8,0, chứa trimethoprim) nhạy với dư lượng beta-lactam, macrolide, aminoglycoside, sulfonamide và trimethoprim. 5. Vi sinh vật thử nghiệm, môi trường nuôi cấy, dung dịch chuẩn và mẫu kiểm chứng Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 5.1. Vi sinh vật thử nghiệm Dùng huyền phù Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149 (tương tự chủng C953 của NIZO) 1) , đã điều chỉnh để có thể đếm được khoảng 5 000 000 đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mililit (xem Phụ lục B về cách chuẩn bị). Kiểm tra chất lượng của mỗi mẻ mới của huyền phù vi sinh vật bằng cách xác định độ nhạy đối với các dung dịch chuẩn nêu trong Bảng 1. Bảng 1 - Các dung dịch chuẩn dùng để thử độ nhạy của huyền phù vi sinh vật thử nghiệm Dung dịch chuẩn Hàm lượng sữa µg/kg Benzylpenicillin (Xenixillin-G) 2 Sulfadiazine 150 Neomycin 30 Erythromycin 10 Oxytetracycline 100 Tiến hành kiểm tra với các dung dịch chuẩn và sữa kiểm chứng trong 5 lần theo quy trình mô tả trong Điều 9. Xác định độ nhạy của huyền phù vi sinh vật thử nghiệm đối với benzylpenicillin và oxytetracycline với ống A (5.2.5) và độ nhạy đối với sulfadiazine, neomycin và erythromycin với ống B (5.2.6). Tất cả các ống nghiệm trên phải thu được kết quả dương tính. 5.2. Môi trường nuôi cấy Để tăng độ tái lập của phương pháp, nên sử dụng các thành phần cơ bản khô hoặc môi trường hoàn chỉnh khô khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 5.2.1. Môi trường cơ bản 5.2.1.1. Thành phần Casein tryton 5,0 g Chất chiết nấm men 2,5 g Gluccoza khan 1,0 g Thạch 10 g đến 15 g Nước 1 000 ml CHÚ THÍCH: Môi trường cơ bản khô có bán sẵn, chẳng hạn Thạch Đếm Đĩa. 5.2.1.2. Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước và đun nóng. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2. Khử trùng trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 120 o C ± 1 o C trong 15 min. Môi trường cơ bản đã chuẩn bị có thể lưu giữ tối đa được 3 tháng khi được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ 0 o C đến +5 o C. 5.2.2. Dung dịch bromocrezol tía 5.2.2.1. Thành phần Bromocrezol tía 250 g Etanol, 96% 5 ml Nước 100 ml 5.2.2.2. Chuẩn bị Hòa tan bromocrezol tía trong etanol. Thêm nước đến 100 ml. Dung dịch bromocrezol tía có thể lưu giữ tối đa được 6 tháng khi được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ từ 0 o C đến +5 o C. 5.2.3. Dung dịch chloramphenicol (CAP) 5.2.3.1. Thành phần Chloramphenicol 20,0 mg Metanol 5 ml Nước 100 ml 5.2.3.2. Chuẩn bị Hòa tan chloramphenicol trong metanol. Thêm nước đến 100 ml. Dung dịch chloramphenicol có thể lưu giữ tối đa được 1 tháng khi được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ từ 0 o C đến +5 o C. 5.2.4. Dung dịch trimethoprim (TMP) 5.2.4.1. Thành phần Trimethoprim 25,0 mg Etanol, 96% 5 ml Nước 1 000 ml 5.2.4.2. Chuẩn bị Hòa tan trimethoprim trong etanol. Thêm nước đến 1 000 ml. Dung dịch TMP có thể lưu giữ tối đa được 1 tháng khi được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ từ 0 o C đến +5 o C. 5.2.5. Ống nghiệm A (pH = 7) Làm tan chảy môi trường cơ bản (5.2.1). Để nguội môi trường trên nồi cách thủy (6.3) tới nhiệt độ 63 o C ± 1 o C . Thêm 1,5 ml dung dịch CAP (5.2.3) và 2 ml dung dịch bromocrezol tía (5.2.2) vào 100 ml môi trường cơ bản đã gia nhiệt, đồng thời giữ môi trường này trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 63 o C. Trộn kỹ môi trường. Tiếp tục giữ môi trường trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 63 o C, dùng dung dịch NaOH 1 mol/l hoặc HCl 1 mol/l để chỉnh pH (xem 6.5) đến 7,0 ± 0,1 ở nhiệt độ nói trên. Sau đó, thêm một thể tích (khoảng 2 ml) huyền phù vi sinh vật thử nghiệm (5.1) vào mỗi 100 ml môi trường, sau khi ủ trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 63 o C trong 4 h 15 min ± 30 min mà không đổi màu chứng tỏ không có chất kháng sinh. Trộn và phân phối vào các ống nghiệm (6.4) mỗi ống 1 ml môi trường thử nghiệm và để cho môi trường đông đặc. Các ống A có thể được bảo quản tối đa 3 ngày ở nhiệt độ từ từ 0 o C đến +5 o C, với điều kiện các ống được giữ kín để không làm bay hơi (ví dụ dùng parafilm). 5.2.6. Ống nghiệm B (pH = 8) Làm tan chảy môi trường cơ bản (5.2.1). Để nguội môi trường trên nồi cách thủy (6.3) tới nhiệt độ 63 o C ± 1 o C . Thêm 0,6 ml dung dịch TMP (5.2.4) và 2 ml dung dịch bromocrezol tía (5.2.2) vào 100 ml môi trường cơ bản đã gia nhiệt trước, đồng thời giữ môi trường này trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 63 o C. Trộn kỹ môi trường. Tiếp tục giữ môi trường trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 63 o C, dùng dung dịch NaOH 1 mol/l hoặc HCl 1 mol/l để chỉnh pH (xem 6.5) đến 8,00 ± 0,02 ở nhiệt độ nói trên. Trong khi chỉnh, chú ý không để pH của môi trường vượt quá 8,05. Sau đó, thêm một thể tích (khoảng 2 ml) huyền phù vi sinh vật thử nghiệm (5.1) vào mỗi 100 ml môi trường, sau khi ủ trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 63 o C trong 4 h 15 min ± 30 min mà không đổi màu chứng tỏ không có chất kháng sinh. Trộn và phân phối vào các ống nghiệm (6.4) mỗi ống 1 ml môi trường thử nghiệm và để cho môi trường đông đặc. Các ống B có thể được bảo quản tối đa 3 ngày ở nhiệt độ từ 0 o C đến +5 o C, với điều kiện các ống được giữ kín để tránh bị bay hơi (ví dụ dùng parafilm). 5.3. Dung dịch chuẩn và mẫu kiểm chứng Chỉnh các khối lượng cân sao để có độ tinh khiết và hàm lượng muối phù hợp với ISO 13969. Để chuẩn bị các dung dịch chuẩn và mẫu kiểm chứng, giả sử 1 ml dung dịch tương đương với 1 g dung dịch. 5.3.1. Dung dịch chuẩn và mẫu kiểm chứng benzylpenicillin Để benzylpenixillin đạt được độ bền giới hạn, cần chuẩn bị các dung dịch chuẩn benzylpenixillin trước khi sử dụng và làm lạnh đông các mẫu sữa kiểm chứng trong ngày sử dụng ở nhiệt độ dưới -18 o C. 5.3.1.1. Dung dịch gốc chuẩn benzylpenicillin Hòa tan 20,0 mg ± 0,1 mg benzylpenixillin trong 1 000 ml nước và trộn. Dung dịch gốc chuẩn này chứa benzylpenixillin 20 mg/l. Dung dịch gốc chuẩn benzylpenixillin có thể lưu giữ tối đa 2 ngày khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 o C đến +5 o C. 5.3.1.2. Dung dịch làm việc chuẩn benzylpenicillin Pha loãng 10 ml dung dịch gốc chuẩn benzylpenixillin (5.3.1.1) bằng nước đến 1 000 ml và trộn. Dung dịch gốc làm việc này chứa benzylpenixillin 200 µg/l. 5.3.1.3. Mẫu sữa kiểm chứng Benzylpenicillin Pha loãng 1 ml dung dịch làm việc chuẩn benzylpenixillin (5.3.1.2) bằng mẫu sữa âm tính với chất kháng sinh (5.4) đến 100 ml và trộn. Mẫu sữa kiểm chứng này chứa benzylpenixillin 2 µg/l. Mẫu sữa kiểm chứng benzylpenicillin có thể lưu giữ tối đa được 2 tháng khi được bảo quản trong các ống nghiệm (6.4) ở nhiệt độ dưới -18 o C. CHÚ THÍCH: 1 mg muối kali penixillin-G tinh khiết tương đương với 1 595 UI (đơn vị quốc tế) penixillin G. 1 mg muối natri penixillin-G tinh khiết tương đương với 1 670 UI penixillin G. 5.3.2. Dung dịch chuẩn oxytetracycline và mẫu kiểm chứng oxytetracycline 5.3.2.1. Dung dịch gốc chuẩn oxytetracycline Hòa tan 5,0 mg ± 0,1 mg oxytetracycline trong 10 ml dung dịch HCl 0,1 mol/l. Pha loãng bằng nước đến 100 ml và trộn. Dung dịch gốc chuẩn này chứa oxytetracycline 50 mg/l. Dung dịch gốc chuẩn oxytetracycline có thể lưu giữ tối đa được 1 tuần khi được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ từ 0 o C đến +5 o C. 5.3.2.2. Dung dịch làm việc chuẩn oxytetracycline Pha loãng 10 ml dung dịch gốc chuẩn oxytetracycline (5.3.2.1) bằng nước đến 100 ml và trộn. Dung dịch gốc làm việc này chứa oxytetracycline 5 000 µg/l. 5.3.2.3. Mẫu sữa kiểm chứng oxytetracycline Pha loãng 2 ml dung dịch làm việc chuẩn oxytetracycline (5.3.2.2) với mẫu sữa âm tính (5.4) đến 100 ml và trộn. Mẫu sữa kiểm chứng này chứa oxytetracycline 100 µg/l. Mẫu sữa kiểm chứng oxytetracycline có thể lưu giữ tối đa được 3 tháng khi được bảo quản trong các ống nghiệm (6.4) ở nhiệt độ dưới -18 o C. 5.3.3. Dung dịch chuẩn sulfadiazine và mẫu kiểm chứng sulfadiazine 5.3.3.1. Dung dịch gốc chuẩn sulfadiazine Hòa tan 15,0 mg ± 0,1 mg sulfadiazine trong 100 ml nước và trộn. Dung dịch gốc chuẩn này chứa sulfadiazine 150 mg/l. Dung dịch gốc chuẩn sulfadiazine có thể lưu giữ tối đa được 2 tuần khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 o C đến +5 o C. 5.3.3.2. Dung dịch làm việc chuẩn sulfadiazine Pha loãng 10 ml dung dịch gốc chuẩn sulfadiazine (5.3.3.1) bằng nước đến 100 ml nước và trộn. Dung dịch gốc làm việc này chứa sulfadiazine 15 000 µg/l. 5.3.3.3. Mẫu sữa kiểm chứng sulfadiazine Pha loãng 1 ml dung dịch làm việc chuẩn sulfadiazine (5.3.3.2) bằng mẫu sữa âm tính (5.4) đến 100 ml và trộn. Mẫu sữa kiểm chứng này chứa sulfadiazine 150 µg/l. Mẫu sữa kiểm chứng sulfadiazine có thể lưu giữ tối đa được 2 tháng khi được bảo quản trong các ống nghiệm (6.4) ở nhiệt độ dưới -18 o C. 5.3.4. Dung dịch chuẩn neomycin và mẫu kiểm chứng neomycin 5.3.4.1. Dung dịch gốc chuẩn neomycin Hòa tan 30,0 mg ± 0,1 mg neomycin trong 5 ml đệm phosphat 0,1 mol/l (pH = 8,0 ± 0,1) và trộn. Pha loãng bằng nước đến 1 000 ml và trộn. Dung dịch gốc chuẩn này chứa neomycin 30 mg/l. Dung dịch gốc chuẩn neomycin có thể lưu giữ tối đa được 2 tuần khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 o C đến +5 o C. 5.3.4.2. Dung dịch làm việc chuẩn neomycin Pha loãng 10 ml dung dịch gốc chuẩn neomycin (5.3.4.1) bằng nước đến 100 ml nước và trộn. Dung dịch gốc làm việc này chứa neomycin 3 000 µg/l. 5.3.4.3. Mẫu sữa kiểm chứng neomycin Pha loãng 1 ml dung dịch làm việc chuẩn neomycin (5.3.4.2) bằng sữa âm tính (5.4) đến 100 ml và trộn. Mẫu sữa kiểm chứng này chứa neomycin 30 µg/l. Mẫu sữa kiểm chứng neomycin có thể lưu giữ tối đa được 2 tháng khi được bảo quản trong các ống nghiệm (6.4) ở nhiệt độ dưới -18 o C. 5.3.5. Dung dịch chuẩn erythromycin và mẫu kiểm chứng erythromycin 5.3.5.1. Dung dịch gốc chuẩn erythromycin Hòa tan 20,0 mg ± 0,1 mg erythromycin trong 5 ml metanol. Pha loãng bằng nước đến 1 000 ml và trộn. Dung dịch gốc chuẩn này chứa erythromycin 20 mg/l. Dung dịch gốc chuẩn erythromycin có thể lưu giữ tối đa được 2 tuần khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 o C đến +5 o C. 5.3.5.2. Dung dịch làm việc chuẩn erythromycin Pha loãng 5 ml dung dịch gốc chuẩn erythromycin (5.3.5.1) bằng nước đến 100 ml và trộn. Dung dịch gốc làm việc này chứa erythromycin 1 000 µg/l. 5.3.5.3. Mẫu sữa kiểm chứng erythromycin Pha loãng 1 ml dung dịch làm việc chuẩn erythromycin (5.3.5.2) bằng sữa âm tính (5.4) đến 100 ml và trộn. Mẫu sữa kiểm chứng này chứa erythromycin 10 µg/l. Mẫu sữa kiểm chứng Sulfadiazine có thể lưu giữ tối đa được 2 tháng khi được bảo quản trong các ống nghiệm (6.4) ở nhiệt độ dưới -18 o C. 5.4. Mẫu sữa âm tính (sữa không chứa chất kháng sinh) Xem phương pháp thu được sữa kiểm chứng trong ISO 13969, hoặc sử dụng sữa nguyên chất tiệt trùng UHT không chứa các chất ức chế vi sinh vật. 6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Có thể dùng dụng cụ thủy tinh sử dụng một lần thay cho dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu đáp ứng được các yêu cầu quy định. Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh vật thông thường và cụ thể như sau: 6.1. Thiết bị hấp áp lực , dùng để khử trùng ẩm Xem TCVN 6404 (ISO 7218). 6.2. Micropipet , dung tích 1 000 µl. 6.3. Nồi cách thủy , có nắp kín, được khống chế nhiệt ổn định, có thể tuần hoàn nước và duy trì nhiệt độ ổn định ở 63 o C ± 1 o C, 70 o C ± 1 o C và 80 o C ± 1 o C. 6.4. Ống nghiệm , đường kính khoảng 16 mm và dài khoảng 80 cm. 6.5. Máy đo pH , có độ chính xác ± 0,01 đơn vị pH, được trang bị bộ điều chỉnh nhiệt độ tự động và điện cực thích hợp cho các phép đo trong chất lỏng ở 63 o C (ví dụ điện cực Ag/AgCl). 6.6. Cân phân tích , có thể cân chính xác đến 0,1 mg và có thể đọc đến 0,01 mg. 6.7. Giá đựng ống nghiệm , thích hợp để giữ ống nghiệm (6.4). 7. Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc không bị biến đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển hay bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707). 8. Chuẩn bị mẫu thử Điều quan trọng là mẫu thử sữa dạng lỏng cần được thử nghiệm ngay. Hoàn nguyên mẫu sữa bột với nước cất trước khi thử nghiệm. 9. Cách tiến hành 9.1. Mẫu kiểm chứng Trên mỗi giá đựng ống nghiệm (6.7) đặt các ống nghiệm sau đây và thêm vào mỗi ống 0,3 ml sữa kiểm chứng dương tính hoặc mẫu sữa âm tính: a) ống A (5.2.5) chứa mẫu sữa kiểm chứng benzylpenicillin (5.3.1.3); b) ống A (5.2.5) chứa mẫu sữa kiểm chứng oxytetracycline (5.3.2.3); c) ống A (5.2.5) chứa mẫu sữa âm tính (5.4); d) ống B (5.2.6) chứa mẫu sữa kiểm chứng benzylpenicillin (5.3.1.3); e) ống B (5.2.6) chứa mẫu sữa kiểm chứng sulfadiazine (5.3.3.3); f) ống B (5.2.6) chứa mẫu sữa âm tính (5.4). Khi thử nghiệm một lượng lớn mẫu thử cho thấy phần lớn số mẫu thử không chứa chất kháng sinh thì cấc mẫu thử này được coi là mẫu âm tính. 9.2. Chuẩn bị ống nghiệm 9.2.1. Dùng pipet lấy 10 ml mẫu thử vào ống nghiệm thủy tinh. Gia nhiệt trên nồi cách thủy (6.3), giữ ở nhiệt độ 80 o C trong 10 min để bất hoạt các chất ức chế tự nhiên không bền nhiệt. Làm nguội nhanh về nhiệt độ phòng. 9.2.2. Dùng pipet lấy 0,3 ml phần mẫu thử (9.2.1) cho vào các ống A và B tương ứng (5.2.5) đã dán nhãn. 9.2.3. Giữ các ống A và B trên giá (6.7) ở nhiệt độ phòng trong 1 h để sữa được khuếch tán. 9.2.4. Rót một lớp sữa lên trên thạch. Bọc các ống bằng giấy nhôm hoặc đậy nắp để tránh làm bay hơi nước. Sau khi phân tán, đặt các ống vào nồi cách thủy (6.3) ở 70 o C trong 10 min để hoạt hóa các bào tử bằng sốc nhiệt. 9.3. Ủ Đặt các ống nghiệm (9.2.4) vào nồi cách thủy (6.3) ở nhiệt độ 63 o C. Ủ nhiệt độ này trong 4 h 15 min ± 30 min cho đến khi màu của các ống nghiệm liên quan (A hoặc B) với sữa âm tính chuyển hoàn toàn từ màu đỏ tía sang màu vàng. Màu của các ống nghiệm liên quan (A hoặc B) với các mẫu sữa kiểm chứng ít nhất phải giữ được màu đỏ tươi khi lấy các ống nghiệm ra ngoài. Ngay sau đó, lấy tất cả các ống nghiệm (A hoặc B) ra khỏi nồi cách thủy và để nhiệt độ giảm xuống nhiệt độ phòng trong 10 min. 9.4. Diễn giải Quan sát và ghi nhận lại màu của các ống chứa các mẫu thử và mẫu kiểm chứng như sau: a) Toàn bộ hoặc một phần môi trường thử nghiệm rắn có màu đỏ tía trong bất kỳ ống nghiệm nào chứa mẫu thử hoặc mẫu kiểm chứng chứng tỏ có mặt của các chất ức chế vi sinh vật thử nghiệm và chứng tỏ phép thử là dương tính. b) Toàn bộ môi trường thử nghiệm rắn có màu vàng trong bất kỳ ống nghiệm nào chứa mẫu thử hoặc mẫu kiểm chứng chứng tỏ không phát hiện có các chất ức chế vi sinh vật thử nghiệm và chứng tỏ phép thử là âm tính Màu của các ống nghiệm chứa mẫu sữa âm tính phải là màu vàng, trong khi các ống nghiệm chứa mẫu sữa kiểm chứng phải giữ màu đỏ tía. Nếu không thì phải lặp lại phép thử nghiệm. Nếu các mẫu sữa kiểm chứng và/hoặc sữa âm tính phát triển màu khác nhau trong các lần lặp lại thì phải tìm ra nguyên nhân. 10. Khẳng định (tùy chọn) 10.1. Yêu cầu chung Quy trình thử khẳng định dư lượng beta-lactam và sulfonamide được mô tả trong [4]. Hướng dẫn tiếp theo được nêu trong 10.2 và 10.3 CHÚ THÍCH: Sự có mặt của các chất kháng sinh lẫn chất ức chế trong mẫu thử có thể gây khó khăn trong việc khẳng định này. 10.2. Khẳng định beta-lactam Có thể dùng beta-lactam để kiểm tra sự có mặt của dư lượng penixillin và cephalosporin trong các mẫu thử dương tính với ống A (5.2.5) và ống B (5.2.6). Nếu hoạt tính ức chế trong mẫu xử lý với beta-lactamaza bị mất tác dụng thì có thể coi như có mặt dư lượng beta-lactam. Có thể phân biệt hai dạng enzym beta-lactamaza: - penixillinaxa (hoạt tính beta I), hoạt động mạnh hơn trong sự suy giảm penixillin, và - cephalosporinaza (hoạt tính beta II), hoạt động mạnh hơn trong sự suy giảm cephalosporin. VÍ DỤ: Sau đây là quy trình thử nghiệm sử dụng penixillinaza. Thêm 2 ml penaza đậm đặc chứa 10 000 000 UI penaza/ml (có sẵn của hãng Becton, Dickinson and Company 2) vào 100 ml môi trường thử nghiệm trong ống A (5.2.5) trước khi chỉnh pH. Trộn và phân phối vào mỗi ống 1 ml môi trường thử nghiệm và để cho môi trường đông đặc lại. Sau đó thực hiện quy trình thử nghiệm theo mô tả trong Điều 9. Một số loại beta-lactam (ví dụ cephalexin) ít nhạy hơn với beta-lactamaza. Đối với các trường hợp này, nên xử lý trước mẫu sữa (dùng 0,3 ml penaza đậm đặc cho 1ml mẫu thử ở nhiệt độ 37 o C trong 2 h). 10.3. Khẳng định sulfonamide Các mẫu thử dương tính trong ống B (5.2.6) có thể được kiểm tra về sự có mặt của dư lượng sulfonamide dùng dung dịch p-amino axit benzoic (PABA). Nếu hoạt tính của chất ức chế bị mất tác dụng trong mẫu xử lý với PABA, thì có thể coi như có dư lượng sulfonamide. VÍ DỤ: Thêm 2 ml dung dịch p-amino axit benzoic (5 g/kg nước) vào 100 ml môi trường thử nghiệm trong ống B (5.2.6) sau khi đã bổ sung vi sinh vật thử nghiệm và trước khi chỉnh pH. Trộn và phân phối vào các ống mỗi ống 1 ml môi trường thử nghiệm và để cho môi trường đông đặc lại. Sau đó thực hiện quy trình thử nghiệm theo mô tả trong Điều 9. 10.4. Khẳng định đối với các chất ức chế khác Nếu các chất ức chế khác không nhận dạng được như beta-lactam và sulfonamide thì cần tiếp tục nhận diện bằng các phép thử nghiệm khác, như hệ thống thử nghiệm vi sinh vật nhiều đĩa, thử nghiệm miễn dịch hay các phương pháp hóa học (HPLC, LC-MS) (xem ISO 18330). 11. Biểu thị kết quả Biểu thị kết quả bằng cách chỉ ra sự có mặt hay không có mặt của các chất kháng sinh. 12. Độ chụm Xem Phụ lục A về giới hạn phát hiện của một số chất kháng sinh có trong sữa đối với phương pháp phân tán trong ống nghiệm. 13. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng; c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được. Phụ lục A (Tham khảo) Dữ liệu thu được từ các nghiên cứu cộng tác Giới hạn phát hiện đối với phương pháp hai ống nghiệm, ống A (pH = 7) và ống B (pH = 8), tính bằng microgam trong một kilôgam sữa, thu được từ một số nghiên cứu cộng tác [3] với sự tham gia của ba phòng thử nghiệm có kinh nghiệm của Hà Lan. Kết quả được đưa ra trong các Bảng A.1 đến A.5 Bảng A.1 - Beta-lactam Beta-lactam Ống nghiệm A m g/kg Ống nghiệm B m g/kg Benzylpenicillin 2 3 Amoxycillin 3 Cloxacillin 20 Ceftiofur 50 Cephalexin 80 Bảng A.2 - Macrolide Macrolide Ống nghiệm A m g/kg Ống nghiệm B m g/kg Erythromycin 10 Spiramycin 200 Tylosin 20 Bảng A.3 - Aminoglycoside Aminoglycoside Ống nghiệm A m g/kg Ống nghiệm B m g/kg Dihydrostreptomycin 70 Neomycin 30 Kanamycin 500 Getamicin 20 Bảng A.4 - Tetacycline Tetracycline Ống nghiệm A m g/kg Ống nghiệm B m g/kg Oxytetracyline 100 400 Tetracycline 100 300 Doxycycline 100 Clotetracycline 200 >800 Bảng A.5 - Sulfonamide Sulfonamide Ống nghiệm A m g/kg Ống nghiệm B m g/kg Dapsone 2 Sulphamethazine 400 Sulfadiazine 150 Phụ lục B (Tham khảo) Chuẩn bị huyền phù vi sinh vật thử nghiệm B.1. Vi sinh vật thử nghiệm Thu lấy chủng Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149 (tương tự chủng C953 của NIZO), ví dụ từ ATCC (http://www.atcc.org/) 3 ) hoặc từ các nguồn khác. B.2. Chủng gốc B.2.1. Thạch nghiêng B.2.1.1. Thành phần Chất chiết nấm men 2 g Pepton 5 g Chất chiết thịt 1 g Natri clorua (NaCl) 5 g Mangan sulfat (MnSO 4 .H 2 O) 35 mg Thạch 15 g Nước cất 1 000 ml CHÚ THÍCH: Hỗn hợp thành phần cơ bản khô ngoài mangan sulfat có bán sẵn trên thị trường, ví dụ như Thạch Dinh dưỡng. B.2.1.2. Chuẩn bị Hòa tan các thành phần vào nước bằng cách đun nóng. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,4 ± 0,1. Khử trùng môi trường bằng hấp áp lực 15 min ở nhiệt độ 121 o C ± 1 o C. Trước khi đông đặc, chuyển môi trường vào các ống nghiệm thủy tinh vô trùng và có nắp đậy (dung tích khoảng 10 ml) và để cho thạch đông đặc theo tư thế nằm nghiêng. B.2.2. Duy trì chủng thử nghiệm Ủ ống thạch nghiêng (B.2.1), dùng vòng cấy để cấy vạch chủng cấy thử nghiệm ATCC và để 48 h trong tủ ấm ở nhiệt độ 63 o C ± 1 o C. Sau khi ủ, hơ đầu ống nghiệm trên ngọn lửa rồi mở một đường nhỏ vào trong ống nghiệm và đậy bằng nút cao su vô trùng. Ống nghiệm chứa chủng gốc thu được như vậy có thể giữ trong vài tháng trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 o C hoặc có thể được giữ như huyền phù vi sinh vật thử nghiệm trong tủ lạnh đông sau ở nhiệt độ dưới -20 o C. B.3. Nhân chủng vi sinh vật thử nghiệm B.3.1. Chuyển nhanh 20 ml thạch nghiêng (B.2.1) đã tan chảy vào một đĩa Petri vô trùng đường kính 140 mm và làm nguội đến nhiệt độ phòng. B.3.2. Dùng pipet vô trùng lấy 5 ml nước cất cho vào ống nghiệm chứa chủng gốc (B.2.2). Chuẩn bị huyền phù vi sinh vật thử nghiệm bằng cách dùng vòng cấy nhúng nhẹ vào chủng cấy từ thạch nghiêng và cấy vào ống chủng gốc. B.3.3. Dùng piper vô trùng để lấy 0,5 ml huyền phù vi sinh vật thử nghiệm (B.3.2) cho vào các đĩa Petri chứa thạch đã đông đặc (B.3.1). Cấy đầu lên khắp bề mặt thạch bằng que cấy thủy tinh. B.3.4. Ủ 72 h trong tủ ấm ở nhiệt độ 63 o C ± 1 o C. B.3.5. Dùng pipet vô trùng lấy dung dịch nước muối sinh lí/pepton vô trùng (8,5 g NaCl và 1,0 g pepton/kg nước) vào đĩa Petri đã cấy (B.3.4). Dàn đều lên khắp bề mặt bằng que cấy thủy tinh. Thu lấy huyền phù vi sinh vật thử nghiệm vào chai vô trùng. Đậy nút chai và lắc kỹ. B.3.6. Làm sạch huyền phù vi sinh vật thử nghiệm bằng cách ly tâm với gia tốc 2 000 g trong 5 min. Gạn phần nổi phía trên và hòa lại các tế bào này vào dung dịch nước muối sinh lý/pepton vô trùng. Thực hiện bước này hai lần. B.3.7. Hòa các tế bào này vào dung dịch nước muối sinh lý/pepton vô trùng. Đun nóng trong 10 min ở nhiệt độ 80 o C để thúc đẩy sự hình thành các bào tử. B.4. Chỉnh nồng độ vi sinh vật thử nghiệm Chỉnh nồng độ của huyền phù vi sinh vật thử nghiệm sao cho đạt khoảng 5 000 000 đơn vị hình thành khuẩn lạc trong một mililit, xác định được trên thạch đếm đĩa khi ủ ở nhiệt độ 63 o C trong khoảng từ 18 h đến 24 h [Xem TCVN 4884 (ISO 4833)]. B.5. Bảo quản huyền phù vi sinh vật thử nghiệm Chia thành từng lượng nhỏ và bảo quản ở nhiệt độ dưới - 20 o C trong tối đa 1 năm. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu [2] Nouws, J.F.M L OEFFEN; G. SCHOUTEN.J.,VAN EGMOND, H., KEUKENS, H. and STEGEMAN, H. Improvement of the tube diffusion test with respect to detection of antibiotic residues and sulphonamides in raw milk. Archiv ful Lebensmittelhygiene, 46, 1995, pp.140-141 [3] Instruction manual for the testing of herd bulk milk samples. Netherlands Milk Control Station (MCS Nederland), Zutphen, 2003 (in Dutch) [4] Detection and confirmation of inhibitors in milk and milk products. IDF Bulletin, 258, 1991 [5] SUHREN, G. and BEUKERS, R. Delvotest S.P for the detection of cloxacillin and sulfamathoxazole in milk. IDF interlaboratory study, J. AOAC Int. 81, 1998, pp. 978-990. 1) Huyền phù Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149 hoặc chủng C953 của NIZO là ví dụ về một sản phẩm có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này, ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm trên. 2) Penaza đậm đặc do Becton, Dickinson and Company sản xuất là ví dụ về một sản phẩm có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này, ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm trên. 3) Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này, ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm trên (xem chú thích 1).