TCVN8710-12:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12: Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon Hepatopenaei ở tôm TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-12:2015 BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 12: BỆNH VI BÀO TỬ DO ENTEROCYTOZOON HEPATOPENAEI Ở TÔM Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 12: Microsporida diseases by enterocytozoon hepatopenaei in shrimp Lời nói đầu TCVN 8710-12 : 2015 do Trung tâm Ch ẩ n đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ TCVN 8710 Bệnh thủy sản - quy trình ch ẩ n đoán gồm 15 phần: - TCVN 8710-01 : 2011 , phần 1 : Bệnh Còi d o vi rút ở tôm; - TCVN 8710-02 : 2011, phần 2: Bệnh Hoại t ử th ầ n kinh ở cá biển; - TCVN 8710-03 : 2011 , ph ầ n 3: Bệnh Đốm trắng ở tôm; - TCVN 8710-04 : 2011, phần 4 Bệnh Đằu vàng ở tôm; - TCVN 8710-05 : 2011 , phần 5: Bệnh Taura ở tôm He; - TCVN 8710-06 : 2012 , phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép; - TCVN 8710-07 : 2012, phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép; - TCVN 8710-08 : 2012, ph ầ n 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm; - TCVN 8710-09 : 2012, ph ầ n 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm; - TCVN 8710-10 : 2015, phần 10: Bệnh do Perkinsus mar i nus ở nhuyễn thể hai m ả nh v ỏ ; - TCVN 8710-11 : 2015 , phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh v ỏ ; - TCVN 8710-12 : 2015, ph ầ n 12: Bệnh d o Vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm; - TCVN 8710-13 : 2015, phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm - TCVN 8710-14 : 2015, ph ần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá; - TCVN 8710-15 : 2015, ph ần 15: Bệnh nhiễm tr ù ng do Aeromonas ở cá. BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 12: BỆNH VI BÀO TỬ DO ENTEROCYTOZOON HEPATOPENAEI Ở TÔM Aquatic animal diseases - Diagnostic procedure - Part 12: Microsporida diseases by Enterocytozoon hepatopenaei in shrimp C Ả NH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn n à y có th ể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn n à y không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người s ử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi s ử dụng tiêu chu ẩ n. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh vi bào t ử do Enterocytozoon hepatopenaei gây ra ở tôm. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chu ẩ n này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau: 2.1. Bệnh vi bào t ử (microsporida disease) Bệnh do Enterocytozoon hepatopenaei và một số kí sinh trùng thu ộ c giống Thelohania (Agmasoma) ký sinh trong các tế b à o gan tụy, cơ lưng và cơ bụng của các loài tôm. CHÚ THÍCH: Các kí sinh trùng gây bệnh vi bào tử có kích thước nhỏ và cấu tạo phức tạp, mỗi bào tử trùng có hình bầu dục, kích t hước 0 , 7 µ m x 1 , 1 µ m v à đơn nh â n , p h ía trước cực nang có t ừ 5 v ò ng đến 6 vòng sợi t ơ, có không b à o phía sau, có đĩa bám gắn với sợi tơ ở đầ u cực nang, vách tế b à o đậm đặc m ỏ ng. Vách tế b à o c ấ u tạo gồm m à ng sinh ch ấ t, lớp nội b à o sáng dầy khoảng 10 nm v à lớp đậm đặc ở ngoại b à o d ầ y khoảng 2 nm . B à o tử trùng có màng tế bào 2 lớp bọc ng o ài v à có hệ cơ quan đ ỉ nh đặc trưng giúp cho chúng chui vào tế bào v ậ t chủ. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, s ử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác. 3.1. Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung 3.1.1. Etanol, 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối. 3.2. Thuốc th ử và vật liệu th ử dùng cho phương pháp ch ẩ n đoán bằng PCR 3.2.1. Cặp m ồ i (primes), gồm mồi xuôi v à mồi ngược. 3.2.2. Agarose. 3.2.3. Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris-acetate - EDTA) (xem A.1). 3.2.4. Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe 3.2.5. Ch ấ t đệm t ả i m ẫ u (Loading dye 6X). 3.2.6. Dung d ịch đ ệm TE (Tr i s- a xi t etylendiamintetraaxetic ). 3.2.7. Thang chu ẩ n AND (Marker) 3.2.8. Nước tinh khiết, không có nuclease. 3.2.9. Kít tách chiết ADN (acid d eoxyribo nucleic), protein K. 3.2.10. Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit) 3.3. Thuốc th ử và vật liệu dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể b ằ ng para f in 3.3.1. Formalin 10 %, được chuẩn bị từ dung dịch f ormaldehyde 38 % và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (t ỷ lệ thể tích 1 : 9). 3.3.2. Xylen. 3.3.3. Dung dịch Davidson (xem A.2). 3.3.4. Thuốc nhuộm Haematoxylin ( xem A.3). 3.3.5. Thuốc nhuộm Eosin (xem A.4). 3.3.6. Para f in , c ó độ nón g ch ả y từ 56 °C đến 60 °C 3.3.7. Keo dán lamen. 3.4 . Thuốc thử và vật liệu d ù ng cho phương pháp nhuộm tiêu bản tươi 3.4.1. Thuốc nhuộm lugol iodine (xem A.5). 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường c ủ a phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau: 4.1. Thiết bị dụng cụ d ùng chung 4.1.1. Lam k í nh, vô trùng. 4.1.2. Lamen, vô trùng. 4.1.3. Kính hiển vi quang học, vật kính 10 X, 20X, 40 X và 100 X. 4.2. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ch ẩ n đoán bằng PCR 4.2.1. Máy nh â n gen (PCR). 4.2.2. Máy ly tâ m, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g . 4.2.3. Máy lắc trộn vortex. 4.2.4. Máy spindown . 4.2.5. Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di. 4.2.6. Máy đọc gel. 4.3. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng parafin 4.3.1. Khuôn nhựa, loại chuyên dụng cho làm tiêu b ả n vi thể. 4.3.2. Máy x ử lý mẫu m ô tự động. 4.3.3. Nồi đun parafin, có thể duy tr ì nhiệt độ từ 56 °C đến 65 °C. 4.3.4. Khay sắt, loại chuyên dụng cho l à m tiêu bản vi thể 4.3.5. Máy làm lạnh tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 10 °C đến 4 °C. 4.3.6. Máy cắt tiêu bản, cắt ở độ m ỏ ng từ 3 µm đến 5 µm. 4.3.7. Nồi d ã n tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ 35 °C đến 65 °C. 5. Chẩn đoán lâm sàng 5.1. Đặc đi ể m d ịch tễ - Bệnh thường xảy ra trên các loài tôm thuộc họ tôm he (Penaeidae) như tôm sú (Penaeus monodon) , tôm he (P. merguensis) , tôm chân trắng (P. vannamei) , tôm nâu (P. aztecus), P. setiferus... Ngoài ra, bệnh còn gặp trên một số loài như tôm đất, tôm càng xanh, cua, ghẹ, giáp xác phù du Artemia, Copepoda; - Tôm thường nhiễm bệnh ở giai đoạn rất sớm, từ 10 ngày đến 15 ngày sau khi th ả giống và ở các giai đoạn c ủ a tôm nuôi; - Tỷ lệ chết có thể từ 7 % đến 80 % số tôm trong ao nuôi; - Ký sinh trùng ký sinh trong các tế bào gan tụy, cơ lưng và cơ bụng của các loài tôm; - Bệnh có thể lây nhiễm trực ti ế p theo trục ngang từ các loài c á trong ao nuôi, gián tiếp từ cá tạp dùng l à m thức ăn cho tôm hoặc lây nhiễm theo trục dọc qua tôm bố mẹ nhiễm vi bào tử tham gia sinh s ả n; - Bệnh có th ể x ả y ra quanh năm và phân bố hầu khắp các vùng nuôi tôm. 5.2. Triệu chứng lâm sàng - Tôm bị bệnh cơ thể yếu, kém ăn, hoạt động chậm chạp và sinh trư ở ng chậm; - Xu ấ t hiện các đám màu trắng đục hoặc trắng sữa trên vùng cơ lưng, cơ bụng và khối gan tụy. Ở tôm lớn, các đám màu trắng thể hiện rõ hơn ở phần lưng từ gan tụy đến phần giữa thân; - Trên tôm bệnh nặng, những đám màu trắng d ần chiếm chỗ các vùng cơ lưng, cơ bụng v à khối gan tụy. 5.3. Bệnh tích - Gan tụy tôm bệnh nặng hoại tử (dịch hóa), tôm nhẹ không có dấu hiệu rõ ràng; - Tôm bệnh nặng yếu và chết, gan t ụy thối r ữ a rất nhanh; - Dấu hiệu m ô bệnh học: mô hình ống g an tụy hầu hết hoại tử (rỗng) và có chứa nhiều giọt mỡ . Một số tế bào trên mô h ì nh ống trương to chứa đầy các hạt nh ỏ , nhân phân hóa; - Trên các lát cắt mô học cũng cho th ấ y s ự chiếm chỗ của các vi bào tử trong mô cơ, mô của khối gan tụy . 6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 6.1.1. Lấy mẫu Số lượng tôm trên mỗi mẫu phụ thuộc vào kích cỡ c ủ a tôm: - Tôm giống: lấy từ 5 con/mẫu đến 10 con/mẫu; - T ô m trư ở ng thành, tôm bố mẹ: lấy từ 3 con/mẫu đến 5 con/mẫu. 6.1.2. B ả o quản mẫu Trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo qu ả n ở nhiệt độ từ 2°C đến 8 °C không quá 24 h hoặc bảo qu ả n trong etanol tuyệt đối (3.1.1); Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa ph â n tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong etanol tuyệt đ ố i (3.1.1). 6.1.3. Chuẩn bị mẫu Đối với tôm giống và hậu ấu trùng: sử dụng nguyên con; Đối với tôm bố mẹ, tôm thương ph ẩ m : cắt lấy một phần khối gan tụy; Lượng mẫu cần chuẩn bị: khoảng 30 mg. 6.1.4. Cách tiến hành 6.1.4.1. Tách chiết ADN Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.9) thích hợp v à an toàn theo hướng dẫn của nhà s ả n xuất . VÍ DỤ: S ử dụng kit tách chiết ADN: DNeasy Ò Blood & T i ssue Kit (250) (Cat No. 69506) 1) (xem phụ lục B). 6.1.4.2. Chu ẩ n bị mồi Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.2.1) theo phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của Enterocytozoon hepatopenaei sử d ụng cặp mồi MF1/ MR1(3.2.1). Trình tự cặp mồi được nêu trong b ả ng 1. B ả ng 1: Trình tự cặp mồi [ 1 ] Mồi Trình tự Cặp mồi MF1 5’-CCG-GAG-AGG-GAG-CCT-GAG-A-3’ MR1 5 ’ -GAC-GGG-CGG-TGT-GTA-CAA-A-3’ Cặp mồi MF1/ MR 1 dùng để khuếch đại đoạn gen của Enterocytozoon hepatopenaei có k í ch thước 951 bp. Mồi được chuẩn bị như sau: Chuẩn bị mồi gốc: - Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindo wn (4.2.4) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi m ở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 µM làm mồi gốc. Chuẩn bị mồi sử dụng - Mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (10 µl mồi gốc v à 90 µl nước). 6.1.4.3. Tiến hành phản ứng PCR Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (6.2.4.2) sử dụng kít nhân gen (3.2.10) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. VÍ DỤ: Sử dụng kit nhân gen c ủ a Thermo S ci enti fi c Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lo t : 00316656) 2) Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 2 Bảng 2: Thành ph ầ n phản ứng PCR Thành phần Thể tích Taq PCR Master Mix Kit 12,5 µl Mồi xuôi 20 µM 1,25 µ l Mồi ngược 20 µM 1,25 µl Nước không có nuclease 7,5 µl Tổng thể tích 22,5 µl Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng: M ẫ u kiểm chứng dương : Cho 2,5 µ l mẫu ADN đã được g iám định hoặc sử dụng các chủng Enterocytozoon hepatopenaei chuẩn. M ẫ u kiểm chứng âm: Cho 2 , 5 µ l nước (3.2.8). Mẫu thử : Cho 2,5 µ l mẫu ADN kiểm tra v à o ống phản ứng. Tiến hành ph ả n ứng PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt được nêu trong b ả ng 3. B ả ng 3: Chu trình nhiệt của ph ả n ứng PCR [ 1 ] Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 94 °C 30 s 35 55 °C 30 s 72 °C 90 s 72 °C 5 min 1 CHÚ THÍCH: - Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu ki ể m chứng dương và m ẫ u ki ể m chứng â m: - M ẫ u v à nguyên liệu cho ph ả n ứ ng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong su ốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứ ng. 6.1.4.4. Điện di 6.1.4.4.1. Chuẩn b ị bản ge l Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.2) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.3) v à o chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi; Khi nhiệt độ gi ả m xuống khoảng 40 °C đến 50 °C th ì bổ sung 10 µ l chất nhuộm màu (3.2.4) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tr án h tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều. Tiến hành đ ổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đ ổ b ả n thạch dày quá 0,8 cm. Khi b ả n thạch đông lại th ì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch. Chuyển bản gel vào bể điện di (4.2.5), đổ dung dịch đệm (3.2.3) cùng loại với dung d ịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch. CHÚ THÍCH : Có th ể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (v í dụ: Sybr safe ADN gel stain 3) ) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất . 6.1.4.4.2. Chạy điện di Hút 2 µ l ch ấ t đệm t ả i mẫu (3.2.5) v à o 8 µ l sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên b ả n thạch. Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.2.5), chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.2.7) đ ể dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µ l thang chuẩn ADN (3.2.7) v à o một giếng trên bản thạch. Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min. 6.1.4.5. Đọc kết quả Sau khi điện di, đọc kết quả tr ê n máy đ ọ c gel (4.2.6) theo bảng 4. B ả ng 4: Kết quả điện di Giếng Sản phẩm có kích thước 951 bp Kết qu ả Thang chu ẩ n ADN Sáng v à chia vạch rõ ràng Điện di tốt M ẫ u kiểm chứng dương tính Có Hỗn hợp ph ản ứ ng PCR tốt Không M ẫ u kiểm chứng dương tính h ỏ ng hoặc enzym h ỏ ng Mẫu kiểm chứng âm tí nh Không Không bị tạp nhiễm Có Bị tạp nhiễm M ẫ u thử Có Dương t í nh với vi bào t ử Không Âm t ín h với vi bào tử Đánh giá kết qu ả : Kết quả mẫu thử dư ơ ng tính khi: tại giếng mẫu thử xu ấ t hiện vạch sáng có kích thước 951 bp. Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, mẫu kiểm chứng dương có kích thước 951 bp, mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng. Kết qu ả mẫu thử âm t ín h khi: tại gi ế ng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng. Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, mẫu ki ể m chứng dương có kích thước 951 bp, mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng. 6.2. Kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp parafin 6.2.1. Lấy mẫu Xem 6.1.1. 6.2.2. B ả o quản m ẫ u M ẫ u bệnh phẩm được đảm b ả o ngập trong Davidson (3.3.3) đ ả m bảo thể tích mẫu bệnh ph ẩm và Davidson (3.3 . 3) đạt tỷ l ệ khoảng 1 : 10, tránh đổ vỡ, rơi vãi Davidson (3.3.3) ra ngoài môi trường ; khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu bằng túi nilon, miệng túi được dán kín. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bổ sung Davidson (3.3.3) hoặc thay mới bằng f ormalin (3.3.1), đ ả m bảo thể tích mẫu bệnh phẩm v à f ormalin (3.3.1) đạt t ỷ lệ khoảng 1 : 10. 6.2.3. Chu ẩ n bị mẫu Đối với t ô m giống và hậu ấu trùng lấy nguyên con; Đối với tôm bố mẹ hoặc tôm thương phẩm cắt toàn bộ phận giáp đầu ngực (< 1 c m 3 ); Mẫu bệnh ph ẩ m cố định trong Davidson (3.3.3) khoảng từ 24 h đến 72 h tùy thuộc vào kích thước mẫu; M ẫ u bệnh ph ẩ m được chuyển sang cố định trong f ormalin 10 % (3.3.1) không quá 24 h. Lấy mẫu bệnh ph ẩ m cố định trong f ormalin 10% ra, cắt miếng nh ỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm cho vào khuôn nhựa (4.3.1). 6.2.4. Cách tiến hành 6.2.4.1. Đúc khuôn Đặt khuôn nhựa (4.3.1) rửa dưới vòi nư ớ c chảy, thời gian từ 2 h đ ế n 3 h; Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể t í ch) (3.1.1), thời gian từ 2 h đến 3 h; Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 2 đến 3 h; Ngâm khuôn nhựa v à o cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) l ầ n thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.3.2) l ầ n thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; Ngâm khuôn nhựa vào cốc para f in (3.3.6) l ầ n thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; Ng â m khuôn nhựa vào cốc para fi n (3.3.6) lần th ứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; CHÚ THÍCH: Nếu sử d ụ ng m á y xử lý m ẫ u mô tự động (4.3.2) th ì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etanol. Đúc khuôn: rót para f in (3.3.6) nóng ch ả y từ nồi đun para f in (4.3.3) vào khay sắt (4.3.4), gắp bệnh ph ẩ m từ khuôn nhựa đặt vào khay sắt, đặt khuôn nhựa (4.3.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối para f in. 6.2.4.2. Cắt tiêu bản - Cắt gọt khối para f in cho bằng ph ẳ ng, đặt trên mặt máy làm lạnh (4.3.5); - Đặt khối parafin lên máy cắt ti ê u bản (4.3.6) sao cho mặt khối para f in song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đ ủ các tổ chức; - Cắt l ấ y tiêu bản, độ dày lát cắt từ 3 µm đến 5 µm; - Chọn lát cắt tiêu bản phẳng và lấy được hết các mô cần lấy, th ả vào nồi dãn tiêu b ả n (4.3.7) c ó nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C; - Dùng phiến kính (4.1.1) vớt dán lát cắt bằng, dựng nghiêng v à để khô. 6.2.4.3. Nhuộm tiêu bản - Ngâm tiêu b ả n (6.2.4.2) vào cốc xylen (3.3.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu b ả n v à o cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) 2 l ầ n, thời gian mỗi l ầ n từ 3 min đến 5 min; - Ng â m tiêu b ả n vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu b ả n v à o cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.1), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Rửa tiêu bản dưới vòi nước ch ả y, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.3.4), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu b ả n vào c ố c thuốc nhuộm eosin (3.3.5), thời gian từ 60 s đến 90 s; - Rửa dưới vòi nước ch ả y, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Loại bỏ nước còn bám trên tiêu b ả n bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu b ả n v à o cốc etanol tuyệt đối (3.1.1) 3 l ầ n, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong c ố c xylen (3.3.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.1.2) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.3.7). Để khô, soi tiêu b ả n dưới kính hiển vi quan g học (4 . 1.3). 6.2.5. Đọc kết qu ả M ẫ u dương tính khi thấy sự hiện diện c ủ a các vi bào t ử trong tế b à o chất c ủ a tế bào biểu mô gan tụy với các dấu hiệu mô học: - Tế b à o biểu mô ốn g g an tụy trương to , nhân bị phân hóa v à chứa đầy các hạt ưa acid, tạo thành đám được bao quanh bởi lớp màng không bào và bắt màu hồng đỏ của eosin; - Ống gan tụy c ủ a những con tôm bị nhiễm bệnh nặng bị giãn rộng, hoại tử (rỗng) và có thể chứa các giọt dầu; Quan sát mô bệnh học cho thấy các đám màu trắng lớn của vi bào tử dần thay thế ống gan tụy, dạ dày và phần cơ bụng 6.3. Phương pháp nhuộm tiêu bản tươi 6.3.1. Lấy mẫu Xem 6.1.1. 6.3.2. Bảo quản mẫu Mẫu tôm được vận chuyển đến phòng thí nghiệm ph ả i còn sống và được bảo qu ả n ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C: Tôm còn sống có những dấu hiệu lâm sàng đặc trưng của bệnh vi b à o tử, được chuyển đến phòng thí nghiệm đựng trong túi nilon (chứa không quá 1/3 nước) có bơm oxy. 6.3.3. Chuẩn bị mẫu M ẫ u sử dụng nhuộm tiêu bản tươi phải còn sống hoặc vừa mới chết. Tách phần giáp đầu ngực và lấy khối gan tụy bên trong rồi đặt lên lam k í nh (4.1.1) sạch. 6.3.4. Cách tiến hành Dùng lamen tán nh ỏ khối gan tụy, dàn mỏng khối gan tụy trên lam k í nh, nhỏ từ 2 giọt đến 3 giọt thuốc nhuộm lugol odine (3.4.1) và đậy lamen lên rồi quan sát dưới kính hiển vi; Quan sát với vật kính 10 X, 40 X v à 100 X. 6.3.5. Đọc kết qu ả M ẫ u tôm dương tính nếu quan sát dưới kính hiển vi (4.1.3) cho thấy sự xuất hiện của các vi b à o t ử c ó hình giọt nước, đứng thành từng đám một và bắt màu nâu xám của thuốc nhuộm lugol iodine; Nếu quan sát ở vật kính 100 X cho thấy rõ hơn cấu tạo các bào tử: - Các bào tử chưa trư ở ng thành được bao bọc b ở i một lớp m à ng plasma bên trong và bên ngoài l à lớp màng ngoại bào tử là protein; - Ở bào t ử trưởng thành có thể quan sát thấy nhân nằm sâu b ê n trong các sợi cực, đĩa bám và đĩa cực gồm nhiều phiến mỏn g của nó . 7. Kết luận M ẫ u tôm được xác định nhiễm bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh t í ch đặc trưng của bệnh và: có kết quả dương tính một trong hai phương pháp sau: - Phương pháp PCR có kết quả dương tính với Enterocytozoon hepatopenaei ; - M ẫ u cắt mô thể hiện những dấu hiệu bệnh t í ch vi thể đặc trưng cho bệnh vi bào tử. PHỤ LỤC A (Quy định) Thành phần và chuẩn bị thuốc thử A.1 . Dung dịch đệm TAE hoặc TBE A.1.1 . Thành phần Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml Nước khử ion: 900 ml Tổng: 1000 ml d ung dịch TAE (TBE) 1X A.1.2 . Chuẩn bị Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X h òa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. A.2 . Dung dịch Davidson A.2.1 . Thành phần Etanol tuyệt đ ố i: 330 ml Formalin: 220 ml (dung dịch nước bão hòa khí f ormaldehyde là dung dịch từ 36 % đến 38 %) Axit acetic: 115 ml Nước cất: 355 ml A.2.2 . Chuẩn bị Hòa tan axit acetic, f ormalin và etanol trong 355 ml nước cất, khuấy và lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. A.3 . Thuốc nhuộm Hematoxylin (dung dịch Hematoxylin - Mayer) A.3.1 . Thành phần Hematoxylin dạng tinh thể: 1 g Natri iodat: 0,2 g Amoni alum sulphate: 50 g (hoặc Postasium alum sulphate) Axit citric: 1 g Chloral hydrate: 50 g Nước: 1000 ml A.3.2 . Chuẩn bị Hòa tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni alum sulphate hoặc postasium alum sulphate , h òa tan, tiếp tục cho axit citric và chloral hydrate rồi lọc qua giấy lọc. B ả o qu ả n dung dịch đã pha trong chai tối màu. A.4 . Thuốc nhuộm Eosin A.4.1 . Thành ph ầ n Eosin Y: 1 g Etanol 70 % (thể t í ch) 1 lít Axit axetic: 5 ml A.4.2 . Chuẩn bị Thêm từ 2 giọt đến 3 g iọt axit axetic vào etanol 70 % (thể tích) (3.1.1). H òa tan eosin trong etanol, sau đó thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc . B ả o quản d ung dịch đã chu ẩ n bị trong chai tối m à u. A.5 . Thuốc nhuộm lugol iodine A.5.1 . Thành ph ầ n Kali iodua: 6 g I -ốt: 4 g Nước cất: 100 ml A.5.2 . Chuẩn bị Trộn 6 g Kali iodua và 4 g i-ốt vào 100 ml cho nước cất, lắc cho tan. Để yên trong 24 h sau đó được lọc qua g iấ y lọc. Dung dịch được giữ trong chai màu nâu ở nhiệt độ phòng để tránh sự kết tủa. Dung dịch có thể được giữ trong nhiều tuần nhưng nên thỉnh thoảng lọc để loại b ỏ các hạt kết tủa có thể xuất hiện. PHỤ LỤC B (Tham khảo) Quy trình tách chiết ADN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có s ử dụng h óa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các h óa ch ấ t này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo b ả o hộ khi thực hiện các thao tác này. Quy tr ì nh tách chiết ADN sử dụng k ít tách chiết DNeasy ® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506): - Nhỏ 20 µ l protease K vào ống ly tâm 1,5 ml; - Chuyển 30 mg mẫu bệnh phẩm (6.1.3) vào ống ly tâm đã có protease K; - Thêm 200 µ l dung dịch AL (Lysis buffer); - Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.2.4); - Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.2.4); - Thêm 200 µ l etanol tuyệt đối vào ống ly tâm; - Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4); - Hút 420 µ l huyễn dịch trong ống ly t â m trên, chuyển sang cột ly tâm có ố ng thu ở dưới; - Ly t â m bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng; - Th ê m 500 µ l dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới; - Ly tâm b ằ ng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng; - Thay ống thu ở dưới cột ly tâm; - Thêm 500 µ l dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới; - Ly t â m bằng m á y ly tâm (4.2.2) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng; - Chuyển cột ly tâm sang ống ly tâm 1,5 ml, - Nhỏ 2 00 µ l dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min; - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia t ố c 6 000 g trong 1 min; - Chuyển ADN đã thu được sang ống 1,5 ml khác. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Somjintana Tourtip, Somjai W ongtripop, Grant D. Stenti f ord, Kelly S. Bateman, Siriporn Sriurairatana, Jittipan Chavadej, Kallaya Sritunyalucksana, Boonsirm WithyachumnADNkul. September 2009. Enterocytozoon hepatopenaei sp. nov. (Microspor i da: Enterocytozoonidae), a parasite of the black tiger shrimp Penaeus monodon (Decapo d a: Penaeidae): Fine structure and phylogenetic relationships . Journal of Invertebrate PathologySydney M. Finegold, Ellen Jo Baron, 1986. Bailey diagnostic and scott's microbiology. Seventh edition. [2] Amornrat Tangprasittipap, Jiraporn Srisala, Saisunee Chouwdee, Montagan Somboon, Niti Chuchird, Chalor Limsuwan, Thinnarat Srisuvan, Timothy W Flegel and Kallaya Sritunyalucksana. 15 July 2013. The microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei is not the cause of white feces syndrome in w hiteleg shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei . http://www.biomedcentral.com/1746-6148/9/139. [3] FAO and NACA, Asia Diagnosstic Guide to Aquatic Animal Diseases , Fisheries technical paper 402/2 , Page 160. [4] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004, Bệnh học thủy s ả n, NXB Nông nghiệp. [5] Bùi Quang Tề, Lê Ngọc Quân, Nguyễn Thị Biên Th ù y, Bùi Quang Tâm, Hoàng Thị Yến, Nguyễn Thị Niên, Nguyễn Văn Thành, Phan Thị Hường. 2010. Kết quả nghiên cứu bệnh gan tụy trên tôm sú (Penaeus monodon) nuôi ở Việt Nam và biện pháp ph ò ng ngừa. 1) Thông tin n à y đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. 2) Thông tin n à y đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. 3) Sản phẩm do hãng Invitrogen cung c ấ p. Thông tin n ày đ ưa ra tạo điều kiện thu ậ n tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấ n định sử dụng sản phẩm này . Có thể sử dụng các sản ph ẩ m tương tự nếu cho các kết quả tương đương .