TCVN8400-37:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-37:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-37:2015 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 36: BỆNH VIÊM PHỔI ĐỊA PHƯƠNG Ở LỢN Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 37: Enzootic pneumonia in pigs Lời nói đầu TCVN 8400-37 : 2015 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm 38 phần: - TCVN 8400-1 : 2010, ph ầ n 1: Bệnh lở mồm long móng; - TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn ; - TCVN 8400-3 : 2010, ph ầ n 3: Bệnh giun xoắn; - TCVN 8400-4 : 2010, ph ầ n 4: Bệnh Niu C á t Xơn; - TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng; - TCVN 8400-6 : 2011, ph ầ n 6: Bệnh xuất huyết th ỏ ; - TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh đ ậu cừu và đậu dê ; - TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia c ầ m ; - TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I; - TCVN 8400-10 : 2011, ph ầ n 10: Bệnh lao bò ; - TCVN 8400-11 : 2011, ph ầ n 11: Bệnh dịch tả vịt ; - TCVN 8400-12 : 2011 , phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà ; - TCVN 8400-13 : 2011 , ph ầ n 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucela; - TCVN 8400-14 : 2011, ph ầ n 14: Bệnh tụ huy ế t trùng ở tr â u bò ; - TCVN 8400-15 : 2011, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira ; - TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli ; - TCVN 8400-17: 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà; - TCVN 8400-18 : 2014, ph ầ n 18: Bệnh phù đầu gà (coryza); - TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn ; - TCVN 8400-20 : 2014, ph ầ n 20: Bệnh đóng d ấ u lợn; - TCVN 8400-21 : 2014, ph ầ n 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS); - TCVN 8400-22 : 2014 , phần 22: Bệnh giả dại ở lợn; - TCVN 8400-23 : 2014, ph ầ n 23: Bệnh ung khí thán; - TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế qu ả n truyền nhiễm; - TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn; - TCVN 8400-26 : 2014, ph ầ n 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1; - TCVN 8400-27 : 2014, ph ầ n 27: Bệnh sán l á gan; - TCVN 8400-28 : 2014, ph ầ n 28: Bệnh viêm ruột hoại t ử do Clostr i dium per f r i ngens; - TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà; - TCVN 8400-30 : 2015, ph ầ n 30: Bệnh Marek ở gà; - TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia c ầ m; - TCVN 8400-32 : 2015, ph ầ n 32: Bệnh gumboro ở gia cầm; - TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh theileria ở trâu bò; - TCVN 8400-36 : 2015, ph ầ n 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2; - TCVN 8400-37 : 2015, ph ầ n 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn; - TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu ch ả y ở lợn do Corona virus. BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 37: BỆNH VIÊM PHỔI ĐỊA PHƯƠNG Ở LỢN Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 37: Enzootic pneumonia in pigs CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không th ể đưa ra được hết tất cả các v ấ n đề an toàn liên quan đến việc sử dụng ch ú ng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn n à y quy định quy trình chẩn đoán bệnh viêm ph ổ i địa phương do Mycoplasma hyopneumoniae gây ra ở lợn. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: 2.1. Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn (Enzootic pneumonia in pigs) Bệnh suyễn ở lợn Bệnh do vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae gây ra, tác động ch ủ yếu lên đường hô hấp, gây viêm phế quản, viêm phổi. CHÚ THÍCH: Mycoplasma hyopneumoniae (M . hyopneumoniae) : là vi khuẩn hiếu khí , không di động, kh ô ng sinh nha bào, Gram dương nhưng không b ắ t màu thu ố c nhuộm gram và dễ biến đổi qua từng bước nhu ộ m. Vi khuẩn có hình thái rất đa dạng (hình thoi, hình g ậ y ngắn hoặc h ì nh cầu), phụ thuộc vào tuổi của canh trùng nuôi c ấ y và các yếu tố môi trường. Việc nuôi cấy vi khuẩn này khó, mất nhiều thời gian (t ừ 3 ngày đến 30 ngày) và ít thành công. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 3.1. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp para f in 3.1.1. Formalin , dung dịch 10 % (thể tích) Chuẩn bị từ dung dịch f ormaldehyde 38 % (thể tích) và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (xem Phụ lục A) với t ỷ lệ 1 : 9. 3.1.2. Etanol 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối. 3.1.3. Xylen. 3.1.4. Haematoxylin. 3.1.5. Eosin. 3.1.6. Parafin, có độ nóng chảy từ 56 °C đến 60 °C. 3.1.7. Keo dán lamen. 3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho cho phương pháp realtime PCR (phản ứng chuỗi polymerase theo thời gian thực) 3.2.1. K í t tách chiết ADN (axit deoxyribonucleic). 3.2.2. Kít nhân gen. 3.2.3. Cặp mồi và mẫu dò (primers và probe). 3.2.4. Etanol tuyệt đối , dùng cho tách chiết mẫu ADN. 3.2.5. Dung dị c h PBS , pH 7,0 (xem Phụ lục A). 3.2.6. M ẫ u ADN kiểm chứng dương , tách chiết từ Mycoplasma hyopneumoniae , có giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng đã biết trước). 3.2.7. Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic). 3.2.8. Nước , tinh khiết không c ó nuclease. 3.3. Thuốc thử và vật liệu th ử dùng cho phương pháp ELISA ( phép thử miễn dịch liên kết enzym) Hiện nay các kít ELISA thương mại có sẵn trên thị trường dung để phát hiện kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae . Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hư ớ ng dẫn của nhà s ả n xuất 4. Thiết bị và dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ th ô ng thường của phòng thí nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau: 4.1. Thiết bị và dụng cụ sử dụng chung 4.1.1. Tủ lạnh âm sâu , có thể duy trì nhiệt độ từ â m 20 °C đến âm 80 °C. 4.1.2. T ủ lạnh , có thể duy trì nhiệt độ t ừ 2 °C đến 8 °C. 4.1.3. Máy lắc trộn vortex , có thể hoạt động với tốc độ 200 r/min đến 2 500 r/min. 4.2. Thiết b ị và dụng cụ dùng cho phương pháp parafin 4.2.1. Khuôn nhựa , loại chuyên dụng cho l à m tiêu bản vi thể. 4.2.2. Máy x ử lý mẫu mô tự động. 4.2.3. Nồi đun parafin , có th ể duy trì nhiệt độ từ 56 °C đến 65 °C. 4.2.4. Khay sắt , loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể. 4.2.5. Máy làm lạnh , có thể duy trì nhiệt độ từ âm 10 °C đến 4 °C. 4.2.6. Máy cắt tiêu bản , cắt ở độ m ỏ ng t ừ 3 µm đến 5 µm. 4.2.7 . N ồ i dãn tiêu bản , có thể duy trì nước ở nhiệt độ từ 35 °C đến 65 °C. 4.2.8 . Phiến kính , vô trùng. 4.2.9 . Lamen , vô trùng. 4.2.10 . Bộ cốc nhuộm tiêu bản. 4.2.11 . K í nh hiển vi quang học , v ậ t k í nh 4 X, 10 X , 20 X , 40 X, 60 X. 4.3 . Thiết bị và dụng cụ dùng cho phương pháp realtime PCR. 4.3.1. Máy nh â n gen , (realtime PCR). 4.3.2. Máy ly t â m , có thể tạo gia tốc ly tâm 3 000 g , 6 000 g và 20 000 g . 4.3.3. Cối chày sứ , vô trùng. 4.3.4. Máy spindown. 4.4 . Thiết bị, dụng cụ d ù ng cho phương pháp ELISA 4.4.1. Máy đọc ELISA , có th ể đọc được bước sóng 650 nm. 5. Chẩn đoán lâm sàng 5.1 . Đặc điểm dịch tễ - Lợn ở t ấ t cả các lứa tuổi đều mẫn c ả m nhưng triệu chứng vi ê m phổi thường thấy ở lợn trên 6 tuần tuổi. Lợn nái mang thai ở kỳ 2, l ợ n mẹ nu ô i con. Lợn nuôi trong đ iều kiện vệ sinh chuồng trại v à dinh dư ỡ ng kém rất mẫn c ả m với bệnh; - Bệnh thường xảy ra trong những điều kiện sức đề kháng của lợn giảm sút; - Bệnh xảy ra quanh năm nhưng trầm trọng nhất là trời lạnh và ẩ m. Mùa xuân và mùa đông dễ mắc bệnh hơn các mùa khác; - Tỷ lệ mắc bệnh cao, tỷ lệ chết thấp khoảng 10 %; - Đường lây lan: chủ yếu qua đường hô h ấ p, ngoài ra bệnh có thể truyền qua bào thai. Việc lây truyền vi khu ẩ n chủ yếu trực tiếp từ lợn ố m, l ợ n mang trùng sang lợn khỏe, từ lợn mẹ sang lợn con; - Thời gian ủ bệnh từ 7 ngày đến 14 ngày; - Thường kế phát các vi khuẩn khác như Pasteurella multoci d a, Streptococcus pyogenes, Diploccoccus pneumoniae, Salmonella... 5.2 . Triệu chứng lâm sàng 5.2.1 . Thể á c ấ p tính - Lúc đầu triệu chứng rất nhẹ, khó phát hiện; - Lợn bệnh thường tách đàn nằm ở góc chuồng, ăn ít, da nhợt nhạt, sốt nhẹ (từ 39 °C đến 39,5 °C); - Lúc đ ầu hắt hơi từng hồi, chảy nước mũi, vài ngày sau con vật ho, ho liên tiếp từ 1 tuần đến 3 tuần. Bệnh thường chuyển sang thể mạn t í nh. 5.2.2 . Th ể mạn tính - L ợn ho dai dẳng, ho khan, thư ờ ng lúc sáng sớm, bu ổ i tối, hay sau khi ăn xong. Con v ậ t khó th ở , th ở nhanh, há mồm ra để thở, tư thế ngồi thở như chó ngồi để thở , đặc biệt là sau khi bị xua đuổi; - Lợn chậm lớn, còi cọc; lông xù, cứng; - Bệnh kéo d ài trong vài tháng đến nửa năm, thỉnh thoảng có con chết. 5.3 . Bệnh tích đại thể - Phổi viêm, thường quan sát thấy ở thùy đ ỉ nh, thùy tim , thùy hoành hai bên phổi. Bệnh tích có tí nh chất đối xứng, giới hạn r õ rệt giữa vùng phổi viêm và vùng ph ổ i lành . Ở những ca bệnh nặng, bệnh tích có thể lan tràn khắp ph ổ i. Màu sắc phổi tiến triển d ầ n từ màu tím rồi chuyển màu xám nhạt, phổi cứng dần: bị gan hóa, nhục hóa. Khi c ắ t miếng phổi th ả vào nước, miếng phổi ch ì m xuống; - Trong các phế quản thường c ó dịch r ỉ viêm; - Hạch l â m ba phổi sưng r ấ t to (từ 2 l ầ n đến 5 l ầ n so với b ì nh thường). Nếu có vi khu ẩ n kế phát, bệnh tích trầm trọng hơn. 5.4 . Ch ẩ n đoán phân biệt về lâm sàng Ch ẩ n đoán phân biệt bệnh viêm phổi địa phương với một số bệnh khác trên lợn theo B ả ng 1. B ả ng 1 - Chẩn đoán phân biệt Bệnh Biểu hiện Viêm phổi địa phương lợn Phổi viêm, thường quan sát thấy ở th ù y đ ỉ nh, thùy tim, thùy hoành hai bên phổi. Bệnh tích c ó tính chất đối xứng, giới hạn rõ rệt giữa vùng phổi viêm và vùng phổi lành . Ở những ca bệnh nặng, bệnh tích có thể lan tràn khắp phổi. Màu sắc phổi tiến triển dần từ màu t í m rồi chuyển m à u xám nhạt, phổi cứng dần: bị gan hóa, nhục hóa. Tụ huyết trùng Bệnh diễn biến rất nhanh trong vòng 12 h đến 24 h, lợn sốt cao 41 °C, n ằ m yên một chỗ, b ỏ ăn, thở khó có thể sưng ở hầu và xuất hiện những vết đỏ (nâu, tím) ở cuống tai, c ổ , da bụng, lưng... Chảy nhiều nước mũi, lúc đ ầ u lo ã ng, sau đặc dần, có thể có mủ hoặc đ ôi khi có máu, r ấ t khó th ở . Mổ khám thấy phổi viêm, xuất huyết hoặc phổi cứng như gan (gan hóa). Viêm phổi, màng phổi (APP) Biểu hiện như sốt, bỏ ăn: có trường hợp chết đột ngột v ớ i dấu hiệu ch ả y máu có bọt khí ở mũi; thở khó, thở thể bụng; ngồi ki ể u chó ngồi; tai t í m tái (tai xanh); l ợn thường chết do suy tim, viêm phổi hoại t ử và do đ ộc tố của vi khuẩn. Có khi cũng có các triệu chứng như suy nhược cơ th ể , gầy còm, lông xù; đau đớn khi th ở ; ho ngắn (3 tiếng ho), đ â y là đặc đi ể m phân biệt với các bệnh khác. Viêm phổi v à màng phổi hóa sợi, d í nh sườn; Áp xe phổi, phổi bị hoại t ử với những vùng bị hoại t ử xanh đỏ rất đặc trưng. Xoang ngực chứa đầ y dịch. 6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1. Phương pháp parafin phát hiện bệnh viêm phổi địa phương ở lợn 6.1.1 . Lấy mẫu Chọn lợn nghi bệnh mổ lấy các mẫu bệnh phẩm sau: - Phổi: lấy phần phổi nghi có bệnh tích ở thùy tim, thùy đ ỉ nh, thùy hoành hai bên với độ dày lát c ắt khoảng 0,5 cm và độ rộng khoảng 1 cm đến 2 cm, độ d à i khoảng 1 cm đến 2 cm; - Hạch phổi: cắt một miếng với độ dày khoảng 0,5 cm. Các mẫu bệnh phẩm trên cho vào lọ chứa formalin (3.1.1) sao cho thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin có tỷ lệ khoảng 1 : 10, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ. CHÚ TH Í CH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh ph ẩ m gh i r õ yêu c ầ u xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ các b i ểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh. 6.1.2 . Bảo quản mẫu M ẫ u bệnh phẩm đảm bảo ngập trong formalin (3.1.1), tránh đổ v ỡ , rơi v ã i formalin ra ngo à i môi trường; khi gửi mẫu đến phòng th í nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu bằng túi nilon dán kín. Trong trường hợp mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm chưa được xét nghiệm ngay, phải được bổ sung hoặc thay mới formalin đảm b ả o thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin đạt tỷ lệ khoảng 1 : 10. 6.1.3 . Chuẩn bị mẫu - Mẫu bệnh phẩm được cố định trong dung dịch formalin (3.1.1) thời gian 24 h; - Cắt các bệnh phẩm đã cố định trên thành miếng nh ỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm rồi đặt vào khu ô n nhựa (4.2.1). 6.1.4 . Cách tiến hành 6.1.4.1 . Đúc khuôn - Rửa khuôn nhựa (6.1.3) dưới v ò i nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) thời gian từ 2 đ ế n 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần th ứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) l ầ n thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa v à o c ố c parafin (3.1.6) l ầ n thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h; - Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đ ế n 3 h; CHÚ THÍCH: N ế u sử dụng máy chuyển mẫu mô t ự động (4.1.2) th ì tiến hành tiếp theo t ừ b ướ c ng â m etanol. - Đúc khuôn: rót parafin (3.1.6) nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4), gắp bệnh ph ẩ m từ khuôn nhựa vào khay s ắ t, đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối para f in. 6.1.4.2 . Cắt tiêu bản - Cắt gọt khối parafin (6.1.4.2) cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh ti ê u b ả n (4.2.5); - Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối parafin song song v ớ i mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đ ầu đến khi lát c ắ t có đủ các bệnh phẩm, điều chỉnh độ dày của lát cắt từ 3 µm đến 5 µm, cắt một vài lát; - Chọn lát cắt phẳng thả vào nồi d ã n tiêu bản (4.2.7) với nhiệt độ nước từ 35 °C đ ến 40 °C. Dùng phiến kính (4.2.8) vớt lát cắt. Dựng nghiêng tiêu bản và đ ể khô. 6.1.4.3 . Nhuộm tiêu bản - Ngâm tiêu bản (6.1.4.2) vào cốc xylen (3.1.3) 3 lần, thời gian mỗi lần t ừ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 2 l ầ n, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (th ể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.1.4), thời gian từ 3 min đến 5 min; - Rửa tiêu bản dưới với nước chảy, thời gian t ừ 3 min đến 5 min; - Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.1.5), thời gian từ 60 s đ ến 90 s; - R ử a dưới v ò i nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min; - Loại b ỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào c ố c etanol 90 % (thể t í ch) (3.1.2) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đ ến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.1.3) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đ ến 3 min; g ắ n lamen (4.2.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.1.7). Đ ể kh ô , soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (4.2.11). 6.1.5 . Đọc kết quả [3] Đặc điểm bệnh tích vi thể của bệnh l à viêm ph ổ i ở thể mạn tính với đặc trưng các tế bào lympho, bạch cầu đơn nh â n xâm nhập vùng xung quanh phế quản, tiểu phế quản v à mạch quản. Bệnh tích lan rộng tới c ả các nang lympho xung quanh phế quản. Các nang lympho có dạng trung tâm sinh trư ở ng. - Giai đoạn đ ầu của bệnh: thường thấy các tế bào bạch cầu đơn nhân lớn t ậ p trung trong lòng phế qu ả n; - Có thể quan sát thấy viêm kẽ phổi, vách phế nang dày do xâm lấn của số lượng lớn các tế bào đơn nhân và đa nh â n; - Trong lòng phế nang có chứa các m ả nh tế bào; - Các phế nang có thể chứa dịch phù màu hồng, hoặc xẹp xuống hoặc khí thũng. 6.2. Phương pháp realtime PCR phát hiện Mycoplasma hyopneumoniae 6.2.1 . L ấ y mẫu Chọn lợn nghi bệnh mổ lấy từ 3 g đến 5 g ph ổ i cho vào túi hoặc lọ đựng mẫu vô trùng, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ. CH Ú TH Í CH: Đ ồ ng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm v à những th ô ng tin về d ịch tễ, các biểu hi ệ n triệu chứng, bệnh tích của bệnh. 6.2.2 . Bảo quản mẫu M ẫ u bệnh phẩm (6.2.1) được b ả o quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đ ế n 8 °C). M ẫ u được gửi đến phòng th í nghiệm không quá 48 h. Trong phòng thí nghiệm, nếu mẫu chưa xét nghiệm ngay phải được bảo quản trong t ủ â m 20 °C (4.1.1). 6.2.3 . Chuẩn bị mẫu Mẫu bệnh phẩm phổi: lấy khoảng 1 g ph ổ i (6.2.1), c ắ t nhỏ rồi nghiền thành huyễn dịch với dung dịch PBS (3.2.5) theo tỉ lệ 1 : 10 (thể tích) trong cối chày sứ (4.3.3). Ly tâm huyễn dịch b ằ ng máy ly tâm (4.3.2) ở gia tốc 3 000 g trong 5 min. Hút l ấ y dịch nổi để tiến hành tách chiết A D N cho ph ả n ứng realtime PCR. 6.2.4 . Cách tiến hành 6.2.4.1 . Tách chiết ADN Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.1) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. VÍ DỤ : sử dụng kít tách chiết QIAGEN RNeasy Blood tissue (Cat. No. 69506) [1] ) (xem Ph ụ lục B). 6.2.4.2 . Chu ẩ n bị m ồ i Phản ứ ng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.3.1) theo phương pháp realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của Mycoplasma hyopneumoniae sử dụng cặp mồi và mẫu dò (primers và probe) (3.2.3) được nêu trong Bảng 2. B ả ng 2 - Cặp mồi, m ẫ u dò [4] M ẫ u dò, mồi Trình tự từ 5’ đến 3' M ẫ u dò FAM - CCGGAATTGATAGCTCAAATTACGAA - BHQ1 Mồi xuôi TGCCGGTGAATGTTTCTG Mồi ngược CCGGCGAGAAACTGGATA Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau: - Chuẩn bị mồi gốc và mẫu dò gốc: mồi và mẫu dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.3.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi m ở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.7) để hoàn nguyên mồi và m ẫ u dò ở nồng độ 100 µM làm mồi gốc v à mẫu dò gốc; - Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (20 µl mồi gốc và 80 µl nước (3.2.8)); - Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 6 µM: pha loãng mẫu dò gốc b ằ ng nước (3.2.8) (6 µl mẫu dò gốc và 94 µl nước (3.2.8)). 6.2.4.3 . Tiến hành phản ứng realtime PCR Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (6.2.4.2). Sử dụng k í t nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất . VÍ DỤ: dùng k í t nhân gen của Bảng Invitrogen Platinum One - Step qPCR SuperMix - UDG (Cat. No. 11730-017) [2] ) thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 3. Bảng 3 - Thành phần phản ứng realtime PCR Thành phần Thể tích µl Nước tinh khiết không có nuclease 6,0 PCR SuperMix 12,5 Mồi xuôi (20 µ M) 0,5 Mồi ngược (20 µ M) 0,5 Mẫu dò (6 µ M) 0,5 Tổng thể tích 20,0 Chuyển 20 µ l hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng. - Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 µ l mẫu ADN có giá trị Ct đ ã biết trước vào ống phản ứng. - Mẫu kiểm chứng âm: cho 5 µ l nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng. - Mẫu bệnh ph ẩ m: cho 5 µ l m ẫ u ADN (phụ lục B) vào ống ph ả n ứng. CHÚ Ý: - Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: m ẫ u bệnh phẩm, mẫu kiểm chứng dương, m ẫ u kiểm chứng âm. - Mẫu và nguyên v ậ t liệu cho phản ứng realtime PCR c ầ n đặt trong khay đá lạnh trong suốt qu á trình chu ẩ n bị hỗn h ợ p phản ứng. Tiến hành phản ứng bằng máy realtime PCR (4.3.1) đ ã được cài đặt chu trình nhiệt nêu trong Bảng 4. Bảng 4 - Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 50 °C 2 min 1 vòng 95 °C 5 min 95 °C 10 s 40 vòng 60 °C 50 s 40 v ò ng 6.2.5 . Đọc kết quả Đọc kết quả bằng máy reatime PCR (4.3.1) dựa trên giá trị Ct (Ct là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nh ậ n tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cư ờ ng độ huỳnh quang nền) Điều kiện phản ứng đ ược công nhận: mẫu kiểm chứng dương t í nh có gi á trị Ct biết trước (± 2 Ct), mẫu kiểm chứng âm tính không có Ct; Với đ iều kiện như trên, mẫu có gi á trị Ct ≤ 35 đ ược coi là dương tính; mẫu không có Ct được coi l à âm t í nh; mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ; Những mẫu nghi ngờ c ầ n được xét nghiệm lại theo quy trình hoặc b ằ ng phương pháp khác để khẳng định. 6.3. Phát hiện kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae bằng phương pháp ELISA 6.3.1 . Lấy m ẫ u Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 22G (hoặc 20G) v ô trùng, l ấ y từ 1,5 ml đến 2 ml máu của lợn nghi mắc bệnh viêm phổi địa phương nhưng chưa tiêm phòng vắc xin. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra đ ể tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm v ô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ b ì nh thường, tránh ánh nắng trực tiếp. CH Ú THÍCH: Không lấy mẫu huyết thanh lợn đ ã được ti ê m vắc xin Mycoplasma hyopneumoniae đ ể xét nghiệm kháng thể v ì phương ph á p trong ti ê u chuẩn này không ph â n biệt được kháng thể nhiễm t ự nhi ê n và kháng thể do tiêm vắc xin. 6.3.2 . Bảo quản mẫu Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh của lợn nghi mắc bệnh (6.3.1) được b ảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) và gửi đến phòng thí nghiệm không quá 48 h. Trong trường hợp mẫu đến phòng thí nghiệm chưa được xét nghiệm ngay, phải được ly tâm bằng máy ly tâm (4.3.2), chắt lấy ph ầ n huyết thanh sang ống khác, b ả o quản trong tủ lạnh (4.1.2). 6.3.3 . Chuẩn bị mẫu Chắt huyết thanh từ xy lanh (6.3.1) sang ống nghiệm vô trùng, k ể t ừ l ú c lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h , ghi ký hiệu của mẫu l ê n ống chứa huyết thanh. 6.3.4 . Cách tiến hành VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae ở lợn của h ã ng I D EXX [3] ) 6.3.4.1 . Chu ẩ n bị nguyên liệu - Nguyên liệu: các nguyên liệu của bộ k i t được bảo quản ở nhiệt đ ộ 4 °C, trước khi ti ế n hành phản ứng phải đ ược đem ra để cân bằng với nhiệt độ phòng (từ 18 °C đ ến 26 °C); - Mẫu huyết thanh (6.3.3): được pha loãng thành 1/40 với Sample Dilution (dung dịch pha loãng mẫu). (Lấy 10 µ l huyết thanh pha với 390 µ l dung dịch pha lo ã ng mẫu); - Pha lo ã ng dung dịch Wash Concentrate 10 X (dung dịch rửa): lấy 1 phần dung dịch rửa 10 X pha với 9 phần nước cất; - Tính thể tích dung dịch nước r ử a cần pha: 300 µ l/giếng x 3 lần rửa x 2 bước rửa x số giếng sử dụng; - Sơ đồ bố trí mẫu : trong sơ đồ bố tr í mẫu phải có mẫu trắng (Blank), kiểm chứng âm (Negative Control - NC), kiểm chứng dương (Positive Control - PC). 6.3.4.2 . Tiến hành phản ứng ELISA Bước 1: Nh ỏ huyết thanh - Nh ỏ 100 µ l dung d ị ch pha loãng mẫu vào giếng mẫu trắng; - Nh ỏ 100 µ l mẫu kiểm chứng âm vào giếng kiểm chứng âm; - Nh ỏ 100 µ l mẫu kiểm chứng dương vào giếng kiểm chứng dương; - Nh ỏ 100 µ l mẫu huyết thanh (6.3.4.1) đã pha loãng 1/40 v à o các giếng thích hợp; - Để dĩa ở nhiệt đ ộ phòng trong 30 min; - Đổ bỏ dung dịch trong đĩa; - Nhỏ 300 µ l dung dịch r ử a vào các giếng, rồi đổ b ỏ đi. Lặp lại 3 lần. Bước 2: Nhỏ kháng kháng thể - Nh ỏ 100 µ l dung dịch kết hợp vào các giếng; - Đ ể đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min; - Đổ bỏ dung dịch trong đĩa; - Nh ỏ 300 µ l dung dịch r ử a vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại 3 lần. Bước 3: Nh ỏ cơ chất - Nh ỏ 100 µ l dung dịch cơ chất TMB (Tetramethylbenzidine) vào các giếng; - Đ ể đĩa ở nhiệt đ ộ phòng trong 15 min. Bước 4: Dừng phản ứng - Nhỏ 100 µ l dung dịch dừng phản ứng (Stop solution) vào các giếng; - Đo giá trị mật độ quang học ( OD ) b ằ ng máy đọc ELISA (4.4.1) ở bước sóng 650 nm. 6.3.5 . Đọc kết qu ả Điều kiện phản ứng được công nhận khi: - Giá trị OD của kiểm chứng dương tr ừ giá trị OD của kiểm chứng âm phải lớn hơn hoặc bằng 0 , 15; - Giá tr ị OD của kiểm chứng âm lớn hơn hoặc bằng 0,15. Tính kết quả: - Trung bình của kiểm chứng âm: (NC1 + NC2) / 2= NCx tb - Trung bình của kiểm chứng dương: (PC1 + PC2) / 2 = PCx tb - T ỷ lệ S/P = (giá trị OD của m ẫ u – NCx tb) / (PCx tb – NCx tb) - Hiệu giá của m ẫ u: Log 1 0 Titer = 1.09 (log 1 0 S/P) + 3.36 CH Ú TH Í CH: S/P là tỉ lệ được tính toán gi ữ a giá trị OD của mẫu bệnh ph ẩ m so với giá trị OD của mẫu kiểm chứng d ương. Đánh giá kết quả đ ố i với mẫu bệnh ph ẩ m: - M ẫ u huyết thanh dương t í nh với kháng th ể Mycoplasma hyopneumoniae có S/P lớn hơn 0,40; - Mẫu huyết thanh âm t í nh với kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae có S/P nhỏ hơn 0,30; - Mẫu huyết thanh nghi ngờ có kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae có S/P trong khoảng từ 0 , 30 đến 0,40 và phải được kiểm tra lại. 7. Kết luận L ợ n được xác định mắc bệnh viêm phổi địa phương khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng , triệu chứng bệnh tích đặc trưng của bệnh và dương tính với một trong các phương pháp xét nghiệm quy định trong tiêu chu ẩ n này. Phụ lục A (Quy định) Chuẩn bị dung dịch muối đệm phosphat (PBS) A.1 . Thành phần Natri hydrophosphat (Na 2 HP O 4 ) 9,47 gm Kali dihydrophosphat (KH 2 P O 4 ) 9,08 gm Nước c ấ t 900 ml A.2 . Chuẩn bị Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric. CHÚ TH Í CH: Có thể sử dụng PBS thương mại v à pha theo hướng dẫn của nhà s ả n xuất. Phụ lục B (Tham khảo) Quy trình tách chiết ADN C Ả NH BÁO: Việc tách chiết A D N có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không c ẩ n thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, kh ẩ u trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này. Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít QIAGEN RNeasy Blood & Tissue kit (Cat. No. 69506) như sau: B.1. Pha dung dịch - Dung dịch AW1: thêm 125 ml etanol tuyệt đối (3.2.4) vào 95 ml dung dịch AW1 đậm đặc; - Dung dịch AW2: thêm 160 ml etanol tuyệt đối (3.2.4) vào 66 ml dung dịch AW2 đ ậm đ ặc. B.2. Cách tiến hành - Cho 20 µ l protease vào ống 1,5 ml; - Chuyển 200 µ l dịch mẫu (dịch n ổ i xử lý ở 6.2.3) vào ố ng 1,5 ml; - Th ê m 200 pl dung dịch AL (lysis buffer) vào ống. L ắ c bằng máy lắc (4.1.3) trong 15 s, sau đó ly tâm (4.3.2) v ớ i gia tốc 3 000 g trong 1 min; - Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm (4.3.2) với gia t ố c 3 000 g trong 1 min; - Cho 200 µ l etanol tuyệt đ ố i (3.2.4) v à o ống. Lắc bằng máy lắc (4.1.3) trong 15 s, sau đó ly t â m (4.3.2) với gia tốc 3 000 g trong 1 min; - Chuyển 620 µ l dung dịch mẫu đ ã tách chiết vào cột lọc (spin column) với ống thu (collection tube); - Ly tâm (4.3.2.) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ ph ò ng; - Thêm 500 µ l dung dịch AW1 vào cột lọc có ống thu ở dưới; - Ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng; - Cho cột lọc vào ống thu mới; - Thêm 500 µl dung dịch AW2 vào cột lọc có ống thu ở dưới; - Ly tâm (4.3.2) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng; - Chuyển cột lọc sang ống ly tâm 1,5 ml; - Nh ỏ 200 µ l dung dịch AE vào cột ly t â m và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min; - Ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min; - Chuyển ADN đ ã thu được sang ố ng 1,5 ml mới - B ả o quản mẫu A D N ở 4 °C trong ngày nếu chạy phản ứng realtime PCR ngay và giữ ở â m 20 °C để lưu mẫu trong th ờ i gian dài. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] JICA, 2003. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand . Third edition, p.110 - 111 [2] J.Quinn, M.E.Carter, B.Markey, G.R.Carter, 2004. Veterinary Clinical Microbiology . 6th Edition. Printed in Spain, p.320-326. [3] Eileen L. Thacker, 2006. Chapter 42: Mycoplasmal Disease. Diseases of Swine . 9th Edition. Blackwell Publishing, p.701-707. [4] Steven B. Kleiboeker, 2004. Development of Real-time, multiplex PCR/RT-PCR assays for improved PRDC pathogen detection - NPB. Available at: http://www.pork.org/FileLibrary/ResearchDocuments/03-114-KLEIBOEKER.6-28-04.pdf. [5] IDEXX Laboratories, Herd Chek ® Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit. [6] Nguyễn Vinh Phước, 1978. Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc. [7] L ê Văn Lãnh và cs, 2012. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y . [8] Barbara E. Straw và cs, 2006. Diseases of swine . [9] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Th úy , 2012. Giáo trình bệnh truy ề n nhiễm thú y . NXB Đại Học Nông Nghiệp. [10] Paula R. Almeida et al, “Nested-PCR for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae in bronchial alveolar swabs, frozen tissues and formalin-fixed paraffin-embedded swine lung samples: comparative evaluation with immunohistochemical findings and histological features ” , Pesq. Vet. Bras, vol.32 no.8 Rio de Janeiro Aug. 2012. Available at: http://www.merckmanuals.com/vet/respiratory_system/respiratory_diseases_of_pigs/mycoplasmal_pneumonia_in_pigs.html. [11] Mycoplasmal Pneumonia in Pigs . Available at: http://www.thepigsite.com/pighealth/article/323/enzootic-pneumonia-ep-or-mycoplasma-hyopneumoniae-infection. [12] M. Kobisch and N.F. Friis, “Swine mycoplasmoses”, Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1996, 15 (4), 1569-1605. Available at: http://www.oie.in t/ doc/ged/D9110.PDF. [1] Th ô ng tin này đưa ra tạo đi ề u kiện thuận ti ệ n cho người s ử dụng ti ê u chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung c ấ p này. Có th ể sử dụng các sản phẩm tương tự n ế u cho các kết quả tương đư ơn g. [2] Th ô ng tin này đưa ra tạo điều kiện thuận ti ệ n cho ngư ờ i sử dụng tiêu chuẩn v à kh ô ng ấn định s ử dụng s ả n ph ẩ m của nhà cung cấp này. Có thể s ử dụng các s ả n phẩm tương t ự nếu cho các kết qu ả tương đương. [3] ) Thông tin n à y đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấ n định sử dụng sản phẩm của nhà cung c ấ p n à y. Có thể sử dụng các sản phẩm tương t ự nếu cho các kết quả tương đương