TCVN11039-1:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11039-1:2015 về Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật - Phần 1: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật đếm đĩa TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 11039-1:2015 PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 1: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM ĐĨA Food aditive - Microbiological analyses - Part 1: Determination of total aerobic count by plate count technique Lời nói đầu TCVN 11039-1:2015 được xây dựng trên cơ s ở tham khảo JECFA 2006, Combined compen d ium of food additive speci f ications, Volume 4: Analytical methods, t e st procedures and laboratory solutions used by and re f erence d in the food additive specif i cations ; TCVN 11039-1:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F4 Gia vị và phụ gia thực ph ẩ m biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Ch ấ t lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công b ố ; Bộ tiêu chuẩn TCVN 11039 Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật gồm các ph ầ n sau: - TCVN 11039-1:2015, Phần 1: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu kh í bằng kỹ thuật đếm đĩa; - TCVN 11039-2:2015, Phần 2: Xác định t ổ ng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật đếm đĩa xoắn; - TCVN 11039-3:2015, Phần 3: Phát hiện và định lượng coli f orm và E. co l i bằng kỹ thuật đếm số có x á c suất lớn nhất (Phương pháp chu ẩ n); - TCVN 11039-4.2015, Phần 4: Phát hiện và định l ượ ng co lif orm và E. coli bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (Phương ph á p thông dụng); - TCVN 11039-5:2015, Phần 5: Phát hiện Salmonella; - TCVN 11039-6:2015, Phần 6: Ph á t hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm khu ẩ n lạc; - TCVN 11039-7:2015, Phần 7: Phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm số có x á c suất lớn nh ấ t (MPN); - TCVN 11039-8:2015, Phần 8: Định lượng nấm men và n ấ m mốc. PHỤ GIA THỰC PH Ẩ M - PHƯƠNG PHÁP PH Â N TÍCH VI SINH VẬT - PH Ầ N 1: XÁC ĐỊNH T Ổ NG SỐ VI SINH VẬT HI Ế U KHÍ B Ằ NG KỸ THUẬT Đ Ế M ĐĨA Food ad d itive s - Microbiological analyses - Part 1: Determination of total aerobic count by plate count technique 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong phụ gia thực phẩm bằng kỹ thuật đếm đĩa. 2 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 2.1 Vi sinh vật hiếu khí (aerobic micro-organisms) Vi khuẩn, nấm men và nấm mốc hình thành khuẩn lạc có thể đếm được, phát triển trong điều kiện hiếu khí theo quy định trong tiêu chuẩn này. 3 Nguyên tắc 3.1 Chuẩn b ị hai đĩa rót sử dụng môi trường cấy quy định và một lượng dung dịch pha loãng thập ph â n của mẫu thử. 3.2 Ủ các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở 35 ° C ± 1 ° C trong 48 h. 3.3 Tính số lượng vi sinh vật trong một gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc thu được trên các đĩa đã chọn (xem Điều 9). 4 Môi trường nuôi cấy và dịch pha loãng Các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích và nước được sử dụng phải là nước cất hoặc nước c ó chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác. 4.1 Dung dịch đệm phosphat Butterfield 4.1.1 Thành ph ầ n Kali dihydrophosphat (KH 2 PO 4 ) 34g Nước 500 ml 4.1 .2 Chuẩn bị 4.1.2.1 Dung dịch gốc Hòa tan kali dihydrophosphat trong nước. Chỉnh pH đến 7,2 bằng dung d ị ch natri hydroxit 1 M. Thêm nước đến 1 lít. Khử trùng 15 min ở 121 °C. B ả o quản trong t ủ lạnh. 4.1.2.2 Dung dịch pha loãng Lấy 1,25 ml dung d ị ch gốc (4.1.2.1), thêm nước đến 1 lít. Phân phối vào các chai 90 ml hoặc 99 ml (5.9). Khử trùng 15 min ở 121 ° C . 4.2 Môi trường thạch đếm đĩa (PCA) 4.2.1 Thành ph ầ n Trypton 5,0 g Chất chiết nấm men 2,5 g D extrose 1,0 g Thạch 15,0 g Nước 1 000 ml 4.2.2 Chuẩn bị H òa tan các thành phần trên trong nước. Có thể đun nóng nước để h òa tan các thành phần. Thêm thạch và đun đến sôi, thỉnh thoảng khuấy cho đến khi tan hết thạch. Ph â n phối môi trường vào các ống hoặc bình thủy tinh có dung tích th í ch hợp. Kh ử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (5.1) ở 121 ° C . Ch ỉ nh pH sao cho sau khi khử trùng, pH đạt 7,0 ± 0,2, nếu cần. 5 Thiết bị, dụng cụ Có thể dùng dụng cụ th ủy tinh s ử dụng một lần thay thế cho các dụng cụ th ủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp. Sử dụng các thiết bị, dụng cụ c ủ a phòng thử nghiệm vi sinh và các thiết bị, dụng cụ cụ thể như sau: 5.1 Thiết bị đ ể kh ử trùng khô (tủ s ấ y) hoặc đ ể kh ử trùng ướ t (n ồ i h ấ p áp lực). 5.2 T ủ ấ m , có khả năng duy trì nhiệt độ ở 35 ° C ± 1 °C. 5.3 Đĩa Petri , bằng thủy tinh có chiều cao 15 mm, đư ờ ng kính 100 mm hoặc bằng chất dẻo có chiều cao 15 mm, đường kính 90 mm. 5.4 Pipet vô tr ùng , có dung tích danh nghĩa 1 m l , 5 ml và 10 ml, được chia vạch đến 0,1 ml. 5.5 Nồi cách thủy , c ó thể kiểm soát nhiệt độ ổn định ở 45 ° C ± 1 °C. 5.6 Th iế t bị đ ế m khuẩn lạc , loại cơ học hoặc điện tử, có nguồn sáng thích hợp, đĩa lưới và bộ đếm. 5.7 Máy đo pH , có độ chính xác ± 0,1 đơn v ị pH, ở 25 °C. 5.8 Nhiệt kế , có thể đo với khoảng nhiệt độ thích hợp. 5.9 Chai pha loãng , dung tích 90 ml hoặc 99 ml. 5.10 Chai pha lo ã ng , dung tích 160 ml, bằng th ủ y tinh bosilicat chịu nhiệt, c ó nút cao su hoặc nắp vặn bằng chất dẻo. 6 Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc b ả o quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chu ẩ n cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm th ì các bên có liên quan nên th ỏa thuận với nhau về vấn đề này. 7 Chuẩn bị mẫu thử M ẫ u được trộn đều để thu được các phần mẫu th ử đồng nh ấ t. 8 Cách tiến hành 8.1 Cấy và ủ 8.1.1 Dùng các pipet vô trùng (5.4) để chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân 10 - 2 , 10 -3 , 10 -4 và các dung dịch pha lo ã ng thập phân thích hợp khác, từ mẫu đ ã đồng nhất b ằ ng cách chuyển 10 ml dung dịch đ ã được pha lo ã ng vào 90 ml chất pha lo ã ng. Tránh tạo bọt. Lắc các dung dịch pha loãng 25 lần với biên độ 30 cm t rong 7 s. 8.1.2 Dùng pipet lấy 1 ml mỗi dung dịch pha loãng cho vào từng cặp đĩa Petri (5.3) riêng r ẽ, được đánh dấu thích hợp. Nếu sau 3 min mới cấy mẫu th ì lắc lại các chai pha loãng (5.10) 25 lần v ớ i bi ê n độ 30 cm trong 7 s trước khi dùng pipet chuy ể n phần mẫu thử sang đĩa Petri. 8.1.3 Cho v à o mỗi đĩa từ 12 ml đến 15 ml môi trường PCA (4.2), đ ã làm nguội trước về nhiệt độ 44 ° C đến 46 ° C , trong vòng 15 min sau l ầ n pha lo ã ng đầu tiên. Cho ngay thạch vào các đĩa Petri nếu ch ấ t pha lo ã ng có chứa chất hút ẩm. Rót thạch và nước pha loãng (4.1) vào đĩa kiểm chứng cho mỗi d ã y mẫu. Trộn ngay các dung dịch pha loãng mẫu với môi trường thạch, trộn kỹ và trộn đều bằng cách xoay đĩa v à di chuyển đ ĩa tới lui trên bề mặt phẳng. 8.1.4 Khi thạch đông đặc, lật ngược đĩa Petri và ủ ngay trong 48 h ± 2 h ở 35 ° C . 8.2 Đếm khuẩn lạc Sau khi ủ (8.1.4), dùng thiết bị đếm khuẩn lạc (5.6) để đếm các đĩa kép trong dải thích hợp (từ 25 đến 250 khuẩn lạc), ghi kết quả trên đĩa pha lo ã ng đã đếm. Trong 3 độ pha loãng phải có ít nhất một độ pha loãng có 2 đĩa cho kết qu ả n ằ m trong dải từ 25 đ ế n 250 khuẩn lạc. 9 Biểu thị kết quả 9.1 Nếu ch ỉ có 1 độ pha loãng cho kết qu ả nằm trong dải từ 25 đến 250 khuẩn lạc thì t í nh số đếm trung b ì nh trên gam cho mỗi độ pha loãng và nhân với hệ số pha lo ã ng để có tổng số vi sinh vật hiếu khí trên gam (xem Bảng 1, mẫu số 1). 9.2 Nếu có 2 độ pha loãng cho kết quả nằm trong dải phù hợp th ì tính số đ ế m trung b ì nh c ủ a mỗi độ pha loãng sau đó tính số đếm trung bình của 2 độ pha loãng và nhân với hệ số pha lo ã ng để có tổng số vi sinh vật hiếu khí trên gam (xem Bảng 1, mẫu số 2). 9.3 Nếu không có đĩa n à o hoặc chỉ có một trong hai đĩa kép có từ 25 đ ế n 250 khuẩn lạc th ì thực hiện như sau: a) Nếu tất c ả các đĩa đều có í t hơn 25 khuẩn lạc: khi 2 đĩa c ủ a độ pha lo ã ng thấp nh ấ t c ó í t hơn 25 khuẩn lạc, đếm s ố khuẩn lạc trên mỗi đĩa c ủ a độ pha loãng đó, tính số đếm trung bình và nhân với hệ số pha loãng để c ó tổng số vi sinh vật hiếu khí ước tính. Đánh dấu kết quả này để lưu ý rằng đ â y là kết qu ả ước tính từ số đếm đĩa nằm ngoài dải từ 25 đến 250 khuẩn lạc (xem B ả ng 1, mẫu số 3). b) Nếu tất cả các đĩa đều có nhiều hơn 250 khuẩn lạc: đếm số khuẩn lạc tại các phần của đĩa sao cho đại diện cho sự phân bố khu ẩ n lạc. Đánh dấu t ổ ng số đếm đĩa này đ ể lưu ý rằng đây là kết quả ước tính từ số đếm đĩa nằm ngo à i dải từ 25 đến 250 khu ẩn lạc (xem Bảng 1, mẫu số 4). c) Trư ờ ng hợp khuẩn lạc mọc lan rộng: thư ờ ng có 3 dạng đặc trưng; i) t ạ o th à nh chuỗi các khu ẩ n lạc, không tách biệt rõ ràng, do sự tan r ã của một cụm vi sinh vật; ii) khuẩn lạc phát triển trong lớp màng nước giữa thạch và đáy đĩa; iii) khuẩn lạc hình thành trong lớp màng nước ở cạnh hoặc trên bề mặt thạch. Nếu các đĩa được chu ẩ n bị từ mẫu có khuẩn lạc lan rộng quá mức, diện tích lan rộng bao trùm trên 50 % diện tích đĩa hoặc diện tích mọc chồng lên đến 25 % diện tích đĩa thì đĩa được coi là bị khu ẩ n lạc mọc lan rộng. Xác đị nh số đếm trung b ì nh c ủ a mỗi độ pha loãng, tổng số đ ế m đĩa được t í nh theo trung b ì nh của các giá trị này (xem Bảng 1, mẫu số 5). Khi cần đếm các đĩa chứa khuẩn lạc lan rộng không nằm trong 2 trường hợp nêu tr ê n thì đếm từng dạng khuẩn l ạc lan rộng đặc trưng nêu trên. Đối với dạng thứ nh ấ t (i), nếu ch ỉ c ó một chuỗi lan rộng thì tính là một khuẩn lạc. Nếu có một hoặc nhiều chuỗi riêng rẽ th ì đếm mỗi chuỗi là một khuẩn lạc. Không đếm từng thành phần đơn lẻ trong chuỗi như là khu ẩ n lạc riêng. Đối với dạng thứ hai (ii) và dạng thứ ba (iii), thường là các khuẩn lạc đặc trưng và được đếm b ì nh thường. Gộp số đếm khuẩn lạc lan rộng v à số đếm khuẩn lạc để c ó tổng số đếm đ ĩa. d) Đối với các cặp đĩa có một đĩa ch ứ a từ 25 đến 250 khuẩn lạc và đĩa còn lại chứa nhiều hơn 250 khuẩn lạc: đếm cả hai đĩa và tính tổng số đếm từ hai số đếm này (xem Bảng 1, mẫu số 6). e) Đối với các cặp đĩa m à một đĩa c ủ a mỗi độ pha loãng chứa từ 25 đến 250 khu ẩ n lạc và đĩa còn lại ch ứ a nhiều hơn 250 khu ẩ n lạc hoặc í t hơn 25 khu ẩ n lạc: đếm c ả bốn đ ĩ a và lấy các số đếm này để tính tổng số đếm đĩa (xem Bảng 1, mẫu số 7). f) Đối với các cặp đĩa mà cả hai đĩa c ủ a một độ pha loãng chứa từ 25 đến 250 khuẩn lạc và trong cặp đĩa còn lại chỉ có một đ ĩa chứa từ 25 đến 250 khuẩn lạc: đếm cả bốn đĩa và lấy các số đếm này để tính tổng số đếm đ ĩ a (xem B ả ng 1, mẫu số 8). g) Đối với các đĩa không chứa các đơn vị hình thành khuẩn lạc: báo cáo k ế t qu ả t ổ ng số đếm đĩa hiếu kh í ít h ơ n 1 lần tương ứng với độ pha loãng thấp nhất đã sử dụng. Đánh dấ u kết quả này để lưu ý rằng đây l à số ước t í nh từ số đếm n ằ m ngoài dải từ 25 đến 250 khu ẩ n lạc. Khi đ ĩa chứa mẫu đã biết l à bị nhiễm hoặc mặt khác không thỏa mãn thì báo cáo kết quả là có sai sót c ủ a phòng th ử nghiệm. 9.4 Làm tròn số đếm đến hai chữ s ố c ó nghĩa, ch ỉ thực hiện làm tròn một lần khi tính tổng số đếm đĩa. Khi l à m tròn, tăng chữ số có nghĩa thứ hai t í nh từ trái sang phải lên một đơn vị nếu ch ữ số có nghĩa thứ ba bằng hoặc lớn hơn 5; giảm chữ số có nghĩa th ứ hai xuống một đơn vị nếu chữ số có nghĩa thứ ba nhỏ hơn 5. Bảng 1 - Ví dụ về việc tính tổng số đ ế m đĩa (2 đ ĩ a cho mỗi độ pha loãng) S ố thứ tự c ủ a mẫu Số khuẩn lạc đếm được Tổng s ố đếm đĩa/g 1 : 100 1 : 1 000 1 : 1 0000 1 TNTC a) 175 b) 16 190 000 TNTC 208 17 2 TNTC 224 25 250 000 TNTC 245 30 3 18 2 0 1 600 c) 14 0 0 4 TNTC TNTC 523 5 200 000 c) TNTC TNTC 487 5 TNTC 245 35 290 000 TNTC 230 mọc lan rộng 6 TNTC 245 23 260 000 TNTC 278 20 7 TNTC 225 21 270 000 TNTC 255 40 8 TNTC 210 18 230 000 TNTC 240 28 TNTC 260 30 270 000 TNTC 230 28 CHÚ TH Í CH: a) Số đếm khu ẩ n l ạc > 250. b ) Các số có gạch dưới là số đếm được dùng để t í nh k ết quả. c ) Số đ ế m ước tính 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ch ỉ rõ: a) mọi thông tin cần thiết để nhận bi ế t đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp l ấ y mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là t ùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [ 1 ] TCVN 4884:2005 (ISO 4833:2003) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đ ĩ a thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 độ C [2] TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp định lượng vi sinh vật - Phần 1: Đếm khuẩn lạc ở 30 ° C bằng kỹ thuật đ ổ đĩa