TCVN10991:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10991:2015 (CEN/TS 14537:2003) về Thực phẩm - Xác định Neohesperidin-dihydrochalcon TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10991:2015 CEN/TS 14537:2003 THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH NEOHESPERIDIN-DIHYDROCHALCON Foodstuffs - Determination of neohesperidin-dihydrochalcon Lời nói đầu TCVN 10991:2015 hoàn toàn tương đương với CEN/TS 14537:2003; TCVN 10991:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu bi ê n soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Ch ấ t lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH NEO HESPERIDIN-DIHYDROCHALCON Foodstuffs - Determination of neohesper i din-dihydrochalcon 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy đ ị nh phương pháp xác định neohesperidin-dihydrochalcon (NHDC) trong thực phẩm bằng sắc kí l ỏ ng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp này đ ã được đánh giá xác nhận trong các phép thử cộng tác thử nghiệm trên mẫu yogurt trái cây chứa hàm lượng NHDC 42,7 mg/kg và trên mẫu đồ uống multi vitamin chứa 35,6 mg/ l [1 ] . Phương pháp được áp dụng thành công với phạm vi của các thực phẩm khác bao gồm bánh hạnh nhân, các s ả n ph ẩ m bánh mì, cream, bột trứng sữa, socola, kem thực ph ẩ m. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp d ụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên b ả n được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên b ả n mới nh ấ t, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có). TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp th ử . 3. Nguyên tắc Mẫu được pha lo ã ng bằng metanol hoặc được chiết bằng hỗn hợp metanol/nước và có thể lọc. NHDC được tách b ằ ng HPLC pha đ ả o, được phát hiện bằng đo phổ và được xác định bằng phương pháp ngoại chuẩn [1] . 4. Thuốc thử 4.1. Yêu c ầ u chung Trong quá trình phân tích, chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc ít nhất là nước loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696), tr ừ khi có quy định khác. 4.2. Dung dịch tetra- n -butyl amoni hydro sul f at (pha động A) , c =0,01 mol/l, dùng cho HPLC. 4.3. Metanol (pha động B) 4.4. Pha động HPLC Đối với pha động, sử dụng dung dịch tetra- n -butyl amoni hydro sultat (4.2) và metanol (4.3) với tỷ lệ thích hợp (gradient, ví dụ như trong 6.3.1). Lọc qua bộ I ọ c màng (5.2) trước khi s ử dụng. 4.5. Chất chuẩn Có th ể sử dụng NHDC chứa 4 mol nước bán sẵn trên thị trường. Nếu sử dụng NHDC bán sẵn, th ì cần đưa hàm lượng nước vào phần tính kết quả. Khối lượng mol của NHDC khô là 612,6 g/mol. 4.6. Dung dịch chuẩn Hòa tan một lượng thích hợp của NHDC với hỗn hợp metanol/nước (50 + 50 phần thể tích) và hòa lại dung dịch này với hỗn hợp metanol/nước (50 + 50 phần thể tích) để thu được các dung dịch chuẩn cho các pic có thể so sánh được với các pic thu được của dung dịch mẫu. 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau: 5.1. Dụng cụ lọc, ví dụ: bộ lọc chân không bằng th ủ y tinh, có tấm thủy tinh nung ch ả y D2 (đường kính 50 mm), phễu 250 ml và bình nón 1 lít, có khớp nối mài. 5.2. Bộ lọc màng, để lọc pha động, có c ỡ lỗ nhỏ 0,45 m m (hoặc nhỏ hơn). CHÚ THÍCH: Việc lọc pha động cũng nh ư dung dịch m ẫ u qua bộ I ọ c màng trước khi sử dụng hoặc bơm là để tăng thời gian sử dụng cột. 5.3. B ể siêu âm. 5.4. Túi nhu động , tùy chọn, ví dụ: để chiết hoặc chuẩn bị các mẫu dạng rắn. 5.5. Hệ thống HPLC , gồm có: - bơm; - bộ phận bơm mẫu; - detetor UV c ó cài đặt các bước sóng khác nhau; - hệ thống đánh giá dữ liệu. 5.6. Cột HPLC Cột phân tích pha đảo, bền với axit, đường k í nh 4 mm, dài 250 mm, nhồi các hạt cỡ 5 m m, ví dụ: LiChrospher ® 60 RP-select B [1] ) hoặc pha đ ả o RP khác bền với axit. Đ ể b ả o vệ cột phân tích, nên sử d ụng tiền cột có các đặc t í nh tương tự. Có thể sử dụng cột có các kích thước khác với quy định trên (ví dụ: đường kính từ 3,0 mm đến 4,6 mm, dài từ 100 mm đến 250 mm). Các thông số tách (dòng chảy, th ể tích bơm) phải phù hợp với vật liệu sử dụng để đ ả m bảo các kết quả tương đương. 6. Cách tiến hành 6.1. Chuẩn bị mẫu thử Đồng h óa mẫu thử. Lắc các mẫu dạng l ỏ ng, đồng hóa các mẫu bán rắn và nhớt bằng cách khuấy, nghiền các mẫu dạng rắn bằng máy nghiền th í ch hợp và trộn kỹ. 6.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 6.2.1. M ẫ u dạng l ỏ ng Pha loãng 50 ml mẫu trong b ì nh định mức 100 ml bằng metanol, th ê m metanol đến vạch, trộn đều và đặt b ì nh 10 min trong bể si ê u âm. Lọc huyền phù thu được qua giấy lọc gấp nếp và lọc tiếp qua bộ lọc mảng (5.2). 6.2.2. M ẫ u dạng nhớt và dạng bán rắn Cân 10 g mẫu thử đã đồng nhất, cho vào b ì nh định mức 100 ml và th ê m 50 ml metanol. Lắc đều và đặt bình 10 min trong bể siêu âm. Để yên bình có chứa dung dịch này khi đạt đến nhiệt độ phòng và pha loãng bằng nước đến vạch. Đặt lại huyền phù vào bể siêu âm trong 10 min, lọc huyền phù qua giấy lọc gấp nếp và lọc tiếp qua bộ lọc màng (5.2). CHÚ THÍCH: Trong phép thử cộng tác tr ê n yoghurt trái cây, cho th ấ y kh ô ng chắc chắn r ằ ng thể tích của chất kh ô ng tan vượt quá 1 % thể t í ch huyền phù cuối cùng. Trong trường hợp này, mọi hiệu ch ỉ nh bằng cách tính sự sụt gi ả m th ể tích của d ịch chiết là không cần thiết. 6.2.3. M ẫ u dạng rắn Cân 10 g mẫu đã đồng nhất cho vào túi nhu động, thêm 50 ml metanol và khoảng 50 ml nước í t hơn phần nước c ó sẵn trong mẫu thử. Lắc túi nhu động trong 10 min. Lọc huyền phù qua giấy lọc gấp nếp và lọc tiếp qua bộ lọc màng (5.2). 6.3. Xác định bằng HPLC 6.3.1. Các điều kiện HPLC Việc tách và định lượng đã được chứng minh phù hợp nếu tuân th ủ các điều kiện thử nghiệm sau đây: Pha tĩnh: theo 5.6; Pha động: áp dụng gradient theo Bảng 1: Bảng 1 - Gradient của pha động Thời gian, m i n Ch ấ t rửa giải A, % Ch ấ t rửa giải B, % 0 85 15 4 85 15 10 70 30 25 40 60 30 5 95 40 5 95 Tốc độ dòng: 1,2 ml/min; Thể tích bơm: 20 m l; Detector: UV, bước sóng 285 nm. 6.3.2. Nhận biết Bơm các thể tích thích hợp bằng nhau, v í dụ: 20 m l dung dịch th ử chuẩn (4.6) cũng như dung dịch mẫu th ử (6.2) vào hệ thống HPLC (5.5). Nhận biết NHDC bằng cách so sánh thời gian lưu của pic trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử mẫu với dung dịch chuẩn. Việc nhận biết pic có thể được thực hiện bằng cách th ê m các lượng nh ỏ của các dung dịch chu ẩ n thích hợp vào dung dịch thử mẫu và kiểm tra độ tinh khiết của pic bằng phổ UV- VIS, ví dụ: sử dụng máy đo phổ màng diot. 6.3.3. Xác định Tiến hành xác định bằng hiệu chuẩn bên ngoài, tích ph â n các diện tích pic hoặc xác định các chiều cao pic của mẫu và so sánh các kết quả với các giá trị tương ứng của chất chuẩn hoặc sử dụng đồ thị hiệu chuẩn. Kiểm tra độ tuyến tính của đồ thị hiệu chuẩn. 7. Tính kết quả 7.1. Tính kết quả Tính nồng độ khối lượng, r , của NHDC bằng miligam trên lít hoặc phần khối lượng, w , bằng miligam trên kilogam mẫu, theo Công thức (1) sau đây: w hoặc r = (1) Trong đó: A 1 l à diện tích pic của NHDC thu được trong dung dịch thử (6.2), t í nh bằng đơn vị diện tích; A 2 là diện t í ch pic của NHDC thu được trong dung dịch chu ẩ n (4.6), tính b ằ ng đơn vị diện tích; V 1 là thể tích dung dịch m ẫ u thử tổng số (6.2), tính bằng mililit (ml); V 2 là thể tích dung dịch chuẩn tổng số (4.6), tính bằng mililit (ml); m 1 là khối lượng NHDC (khô) ch ứ a trong V 2 , tính bằng miligam (mg); m 0 l à khối lượng mẫu thử, tính bằng mililit (ml) hoặc gam (g). Báo cáo kết qu ả đến số nguyên. 8. Độ chụm 8.1. Yêu cầu chung Dữ liệu về độ chụm của phương pháp HPLC này đối với phép xác định NHDC được xây dựng năm 1999 b ở i nghiên cứu cộng tác trên yoghurt trái cây và trên đ ồ u ố ng multi vitamin nêu trong Phụ lục A. Các dữ liệu thu được từ phép nghiên cứu cộng tác này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ chất phân tích và các n ề n mẫu khác với các dải nồng độ chất phân tích và các nền mẫu nêu trong Phụ lục A. 8.2. Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ, thu được khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn như nhau, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r . Độ lặp lại phụ thuộc vào mức nồng độ chất phân tích trong mẫu. Các giá trị đối với NHDC là: yoghurt trái cây = 42,7 mg/kg r = 2,6 mg/ kg đồ uống multi vitamin = 35,6 mg/l r = 1,8 mg/l 8.3. Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng r ẽ , thu được bởi hai ph ò ng th ử nghiệm khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R. Các giá trị đối với NHDC là : yoghurt trái cây = 42,7 mg/kg R = 9,8 mg/kg đồ uống multi vitamin = 35,6 mg/l R = 5,4 mg/l 9. Báo cáo thử nghiệm Báo c á o thử nghiệm phải nêu r õ các thông tin sau: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp đ ã sử dụng; c) ngày v à phương pháp l ấ y mẫu đã sử dụng (n ế u biết); d) ngày nhận mẫu; e) ngày th ử nghiệm; f) kết quả thu được và đơn vị biểu thị; g) các đi ể m cụ thể quan sát được trong khi thử nghiệm; h) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chu ẩ n này hoặc được xem là tùy chọn, có thể ảnh hư ở ng đến kết quả. PHỤ LỤC A (Tham khảo) Dữ liệu về độ chụm Dữ liệu về độ chụm sau đ â y đã được xác định trong phép thử cộng tác quốc tế phù hợp với TCVN 6910 (ISO 5725) [3] do Viện nghiên cứu Thuốc thú y và Sức khỏe người tiêu d ùng của Đức [ 1 ] thực hiện. Bảng A.1 - Dữ liệu về độ chụm M ẫ u Yoghurt trái cây Đồ uống multi vitamin Năm thử nghiệm cộng tác quốc tế 1998 1998 Số lượng phòng thử nghiệm 8 8 S ố lượng mẫu 1 1 Số lượng phòng thử nghiệm c ò n lại sau khi loại trừ các ngoại lệ 8 8 Số ph ò ng thử nghiệm ngoại lệ 0 0 Số l ư ợng bộ dữ liệu 40 40 Giá trị NHDC trung b ì nh, mg/kg hoặc mg/l 42,7 35,6 Độ lệch chu ẩ n lặp lại s r , mg/kg hoặc mg/l 0,9 0 , 6 Độ lệch chu ẩ n tương đối lặp lại, RSD r % 2,1 1 , 7 Giới hạn l ặ p lại, r (2,83 x s r ), mg/kg hoặc mg/l 2,6 1 , 8 Độ lệch chuẩn tái lập s R , mg/kg hoặc mg/l 3,5 1 , 9 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R , % 8,2 5,3 Giới hạn tái lập, R (2,83 x s R ), mg/kg hoặc mg/ l 9,8 5 , 4 Giá trị Horwitz, tính được (H) 9,1 9,3 Tỷ số Horwitz (RSD R /H) 1,1 0,6 PHỤ LỤC B (Tham khảo) Các hệ thống HPLC thay thế Việc tách và định lượng đã được chứng minh phù hợp nếu áp dụng các điều kiện sắc ký sau đây [ 1 ] : Bảng B.1 - Các điều kiện sắc ký Pha tĩnh Kích th ư ớc cột (mm x mm) Tốc độ đòng (ml/min) LiChrospher ® 60 RP-select B (RP 8) 250 x 4 1,2 LiChrospher ® 100 RP-18 250 x 4 0,8 PHỤ LỤC C (Tham khảo) Ví dụ về sắc kí đồ Hình C.1 - Sắc ký đ ồ của dung dịch chuẩn hỗn h ợ p CHÚ D Ẫ N: 1 L - phenylalanine 4 Aspartame 7 Vanilin 10 Axit sorbic 2 ASP-PHE 5 Diketopiperazine 8 Acesulfame-K 11 Axit benzoic 3 Theobromine 6 Caffeine 9 Na-saccharin 12 Neohesperidin-dihydrochalcon Các điều kiện thực nghiệm đã được dùng để thu được sắc ký đồ trên như sau: Cột: LiChrospher ® 100 RP-18 (250 mm x 4 mm), c ỡ hạt 5 m m, Merck, với ti ề n cột. Pha động A: Tetrabutyl amoni hydro sulfat, c = 0,01 mol/l; Pha động B: Metanol; Tốc độ dòng: 0,8 ml/min (gradient) như trong Bảng 1. Thể tích bơm: 20 m l Detector: DAD (HP 1050) Bước sóng : 217,4 nm. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Untersuchung von Lebensmittein: Bestimmung von Neohesperidin-Dihydrochalcon in Lebensmittein (L 00.00-44), Food analysis - Determination of neohesperidine DHC in foodstuffs. In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG; Vertahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmittein, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenstanden/BgW (In: Official Collection of methods under article 35 of the German Federal Food Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/BgW). Loseblattausgabe, Stand Nov. 1999 Bd. 1 (loose leaf edition, as of 1999- 11 Vol. 1) Berlin, Koln: Beuth Verlag GmbH. [2] COMMISSION DIRECTIVE 95/31/EC of 5. July 1995, laying down speci f ic criteria of purity conce rn ing sweeteners for use in foodstuffs. [3] ISO 5725:1986 Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests . [1] LiChrospher ® 60 RP-select B là v í dụ v ề sản ph ẩ m th í c h hợp có bán sẵn. Thông tin này được đưa ra để thuận tiện cho người sử dụng ti ê u chu ẩ n m à không ấn định s ử dụng sản phẩm này.