TCVN11039-6:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11039-6:2015 về Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật - Phần 6: Phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 11039-6:2015 PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 6: PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Food a d ditive - Microbiological analyses - Part 6: Detection and enumeration of staphylococcus aureus by colony count technique Lời nói đầu TCVN 11039-6:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo JECFA 2006, Combined compendium o f food additive speci f ications, Volume 4: Analytical methods, test procedures and laboratory solutions used by and re f erence d in the food additive spec ifi cations ; TCVN 11039-6:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F4 Gia vị và phụ gia thực phẩm bi ê n soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố; Bộ tiêu chu ẩ n TCVN 11039 Phụ gia thực ph ẩ m - Phương pháp phân tích vi sinh vật gồm các phần sau: - TCVN 11039-1:2015, Phần 1: X á c định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật đ ế m đ ĩ a ; - TCVN 11039-2:2015, Phần 2: X á c định tổng số vi sinh vật hiếu kh í bằng kỹ thuật đếm đ ĩ a xo ắ n; - TCVN 11039-3:2015, Phần 3: Phát hiện và định lượng coli form và E. co li b ằ ng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (Phương pháp chuẩn) ; - TCVN 11039-4:2015, Phần 4: Phát hiện và định lượng co lif orm v à E. coli bằng kỹ thuật đếm số có x á c suất lớn nh ấ t (Phương pháp thông dụng) ; - TCVN 11039-5:2015, Ph ầ n 5: Phát hiện Salmonella; - TCVN 11039-6:2015, Phần 6: Phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm khu ẩ n lạc; - TCVN 11039-7 : 2015, Phần 7: Phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (MPN) ; - TCVN 11039-8:2015, Phần 8: Định lượng nấm men và n ấ m mốc . PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 6: PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Food a d ditive - Microbiological analyses - Part 6: Detection and enumeration of Staphylococcus aureus by colony count technique 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus trong phụ gia thực phẩm bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc. Phương pháp này thích hợp để ph â n tích mẫu dự kiến chứa trên 100 tế bào S . aureus trên gam. Nếu nghi ngờ số lượng tế bào thấp hơn giới hạn nêu trên thì nên sử dụng phương pháp đếm số có xác suất lớn nhất theo TCVN 11039-7:2015. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn . Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên b ả n mới nh ấ t, bao gồm cả các sửa đổi. TCVN 11039-7:2015, Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật - Phần 7: Xác định Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 3.1. Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) Vi khu ẩ n h ì nh thành khu ẩ n lạc điển hình và/hoặc không điển hình trên bề mặt của môi trường cấy chọn lọc và cho phản ứng coagulase dương tính khi tiến hành thử nghiệm theo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này. 4. Nguyên tắc 4.1 . Cấy lên bề mặt của môi trường chọn lọc một lượng huyền ph ù ban đầu quy định. Trong cùng một điều kiện, cấy các dung dịch pha loãng thập phân của huyền phù ban đầu. 4.2 . Ủ các đ ĩ a trong điều kiện hiếu khí ở 35 ° C v à kiểm tra sau thời gian từ 18 h đến 24 h. 4.3 . Tính số lượng Staphylococcus có phản ứng coagulase dương tính trong một gam mẫu từ số lượng khu ẩ n lạc điển hình và/ hoặc không điển hình trên các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn sao cho kết quả cố ý nghĩa và được khẳng định bằng kết quả thử coagulase dương tính. 5. Môi trường cấy, dịch pha loãng và thuốc thử 5.1 . M ô i tr ườ ng Baird-Parker (xem A.1). 5.2 . Canh thang trypticase (trypt i c) đậu tương (TSB) , chứa natri clorua 10 % và natri pyruvat 1 % (xem A.2). 5.3 . Thạch t rypticase (trypton) đậu t ương (TSA) (xem A.3). 5.4 . Thạch toluidin xanh-ax i t deoxyribonucleic (ADN) (xem A.4). 5.5 . Canh thang phenol đỏ cacbohydrat (xem A.5). 5.6 . Coagulase plasma (từ thỏ) chứa EDTA , vô trùng (có bán sẵn). 5.7 . Dung dịch lysostaphin (xem A.6). 5.8 . Dung dịch hydro peroxit , 3 % thể tích (xem A.7). 5.9 . Dung d ịch đệm muối phosphat , 0,02 M, chứa natri clorua 1 %. 5.10 . D ầ u parafin , vô trùng. 6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Có th ể d ùng dụng cụ th ủy tinh sử dụng một lần thay thế cho các dụng cụ th ủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp. Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh và cụ thể là: 6.1 . Buồng s ấ y , có d òng kh í m ỏ ng hoặc phòng được thông khí tốt, không có bụi và dự kiến mật độ vi sinh vật trong không khí ở khu vực làm việc không lớn hơn 15 khuẩn lạc trên mỗi đ ĩ a sau 15 min phơi nhiễm. 6.2 . Đĩa Petri , bằng chất dẻo (15 mm x 90 mm) hoặc thủy tinh (15 mm x 100 mm). 6.3 . Pipet , có thể phân phối 1, 5 và 10 ml, chia vạch đến 0,1 ml. 6.4 . Tủ ấ m , có thể duy trì nhiệt độ 35 ° C ± 1 ° C . 6.5 . Que cấy gạt , bằng th ủy tinh, đường kính từ 3 mm đến 4 m m , dài từ 15 cm đ ế n 20 cm, c ó một đầu được uốn cong một đoạn dài từ 45 mm đến 55 mm. 6.6 . Thiết bị đếm khuẩn lạc , loại cơ học hoặc điện tử, có nguồn s á ng thích hợp, đĩa lưới và bộ đếm. 6.7 . Ố ng nghiệm vô trùng , kích thước 13 mm x 100 mm. 6.8 . N ồ i c á ch thủy , có th ể đun đến sôi. 7. Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc b ả o qu ả n. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chu ẩ n cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến s ả n phẩm thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này. 8. Chuẩn bị mẫu thử Mẫu được trộn đều để thu được các phần mẫu th ử đồng nhất. 9. Cách tiến hành 9.1. Chuẩn bị dung dịch pha loãng Trong các điều kiện vô trùng, chuẩn b ị dãy dung dịch pha loãng thập phân bằng cách chuyển 10 ml dung dịch mẫu thử đã pha loãng trước đó vào 90 ml dung d ịch pha loãng (5.9), sử dụng các p i pet (6.3) riêng cho từng nồng độ. Không làm mẫu n ổ i bọt. Lắc tất c ả các dung d ị ch pha loãng 25 lần với biên độ 30 cm trong vòng 7 s. 9.2. Phân lập Đối với mỗi dung dịch pha loãng để đ ổ đĩa, chuyển v ô trùng 1 ml vào 3 đĩa thạch Baird-Parker (5.1), phân phối 1 ml dung dịch mẫu thử vào ba đĩa (ví dụ 0,4 ml, 0,3 ml và 0,3 ml). Sử dụng que cấy vô trùng (6.5) dàn đều dung dịch mẫu thử tr ê n bề mặt thạch. Để yên đĩa trên mặt ph ẳ ng ngang cho đến khi mẫu h ấ p thụ hoàn toàn (Khoảng 10 min cho đĩa vừa khô). Nếu dung dịch mẫu thử không hấp thụ hoàn toàn th ì đặt đĩa trong tủ ấm trong 1 h , nắp đĩa h ướ ng lên trên. Sau đó, lật ngược các đ ĩa và ủ từ 45 h đến 48 h ở 35 ° C trong tủ ấm (6.4). Lựa chọn các đ ĩa có từ 20 đến 200 khu ẩ n lạc S . aureus điển hình, trừ khi chỉ có các đĩa ở độ pha loãng thấp hơn (> khu ẩn lạc) xuất hiện khu ẩ n lạc S . aureus điển hình. Các khu ẩ n lạc S . aureus có hình tròn, nhẵn, lồi, ẩm ướt, đường kính từ 2 mm đến 3 mm trên các đĩa mọc thưa, màu xám đến đen, bao quanh bởi một quầng đục và thường có một vòng trong bên ngoài; các khuẩn lạc keo dính như bơ hoặc gôm khi chạm kim cấy vào. 9.3. Định lượng Đếm và ghi lại số khuẩn lạc. Nếu trên một đĩa có nhiều kiểu khuẩn lạc thì đếm và ghi lại số lượng của từng kiểu. Có thể sử dụng các đĩa của độ pha loãng th ấ p nhất chứa ít hơn 20 khuẩn lạc. Nếu các đĩa có nhiều hơn 200 khuẩn lạc, gồm các khuẩn lạc S . aureus điển h ì nh v à các khu ẩ n lạc điển hình không xuất hiện tại các độ pha loãng cao hơn th ì sử dụng các đĩa này để đ ế m S . aureus nhưng không đếm các khuẩn lạc không điển h ì nh. Chọn nhiều hơn một khuẩn lạc của mỗi kiểu đ ã đếm v à thực hiện phép thử coagulase (9.4.1). Cộng tất cả khuẩn lạc có phản ứng coagulase dương t í nh trên ba đĩa của cùng độ pha loãng và nhân với hệ số pha loãng. Báo cáo kết quả theo số S . aureus trên một gam mẫu thử. 9.4. Nhận biết S. aureus 9.4.1 . Phép thử coagulase Chuyển c á c khuẩn lạc S . aureus nghi ngờ vào các ố ng nhỏ có từ 0,2 ml đến 0,3 ml canh thang TSB chứa natri clorua 10 % v à natri pyruvat 1 % (5.2), nghiền cho đến khi đục đều. C ấy một vòng đầy huyền phù TSB lên ống môi trường thạch nghiêng thích hợp, ví dụ TSA (5.3). Ủ ống huyền phù nuôi cấy trong TS B và ống thạch nghiêng đ ã cấy trong thời gian từ 18 h đến 24 h ở 35 ° C . Giữ các ch ủ ng cấy trên bề mặt nghiêng ở nhiệt độ phòng, thực hiện các phép thử lặp lại trong trường hợp nghi ngờ kết quả của phép th ử coagulase. Th ê m 0,5 ml plasma coagulase hoàn nguyên với EDTA (5.6) v à o ống huyền phù nuôi cấy trong TSB v à trộn đều. Ủ ở 35 ° C và kiểm tra định kì sự đông tụ sau mỗi 6 h. Phản ứng coagulase ch ỉ được coi là dương tính khi đông tụ hoàn toàn và khối đông tụ không di chuyển khi nghiêng hoặc úp ngược ống. Trong trường hợp đ ô ng tụ một phần, trước đây đánh giá là phản ứng coagulase dương tính 2+ và 3+, cần được phân tích tiếp (xem Tài liệu tham khảo [4]). Thử nghiệm đồng thời các ch ủ ng cấy đ ã biết là dương tính và âm tính với các chủng cấy nghi ngờ, chưa rõ về hoạt tính coagulase. Nhuộm Gram tất c ả ch ủ ng cấy nghi ngờ và quan sát h ì nh thể. Phép thử ngưng kết latex có t hể thay thế cho phép thử coagulase nếu cần thử nhanh. 9.4.2 . Các phản ứng sinh hóa nhận biết bổ sung 9.4.2.1 . Phản ứng catalase Nhỏ một giọt hydro peroxit 3 % (5.8) lên phiến kính sạch. L ấ y một ít sinh khối nuôi cấy trong ống thạch nghiêng TSA nghiền đều vào giọt hydro peroxit 3 %. Nếu sinh bọt kh í thì phản ứng catalase dương tí nh. Ph ả n ứng tiến hành đồng thời với chủng cấy â m tính và dương tính. 9.4.2.2 . Sử dụng glucose trong đi ề u kiện k ị khí Cho vòng cấy đ ầ y vào đáy ống canh thang phenol đ ỏ cacbohydrat chứa glucose (0,5 %) (5.5). Đ ể cho chất cấy chạm đến đáy ống. Ph ủ bề mặt canh thang bằng l ớ p dầu para f in vô trùng (5.10) với chiều dày ít nhất 25 mm. Ủ 5 ngày ở 35 ° C trong tủ ấm (6.4). Nếu chất ch ỉ thị đổi sang màu vàng trên toàn bộ ống th ì có axit sinh ra trong điều kiện kị khí, nghĩa là có mặt S . aureus . Thực hiện phép th ử kiểm chứng đồng thời (kiểm chứng chủng c ấy dương t í nh, âm t í nh và môi trường). 9.4.2.3 . Sử dụng o f mannitol trong điều kiện k ị khí Tiến hành theo 9.4.2.2, sử dụng mannitol làm cacbohydrat trong mỗi trường, S . aureus thường dương t í nh nhưng một số ch ủ ng âm tính. Thực hiện phép th ử kiểm chứng đồng thời. 9.4.2.4 . Nhạy cảm với lysostaphin Dùng que cấy l ấ y khuẩn lạc được phân l ập từ đĩa thạch vào 0,2 ml dung dịch đệm muối phosphat (5.9) và nghiền đ ề u. Chuyển một nửa huyền phù vào ống thứ hai (13 mm x 100 mm) và trộn với 0,1 ml d ung d ị ch đệm muối phosphat (5.9) làm đối chứng. Thêm vào ống ban đầu 0,1 ml dung dịch lysostaphin (5.7) (đã hòa tan trong 100 ml dung dịch đệm muối phosphat 0,02 M chứa natri clorua 1 % để có n ồ ng độ lysostaphin cuối cùng là 25 µ g/ml). Ủ cả hai ống ở 35 ° C không quá 2 h. Nếu ống thử nghiệm trong th ì phép thử được coi là dương tính. Phép thử âm tính nếu ống th ử nghiệm đục. S . aureus thường cho kết quả dương t í nh. 9.4.2.5 . Sinh nuclease bền nhiệt Khi phản ứng coagulase không cho kết quả r õ ràng th ì cần thực hiện phép thử sinh nuclease bền nhiệt đ ể quan sát sự đ ổ i màu từ xanh lam sang hồng tươi. Đây kh ô ng phải l à phép thử thay thế cho ph ả n ứng coagulase mà là phép th ử b ổ trợ, đặc biệt đối với các phản ứng dương tính 2+. Chuẩn b ị các lam k í nh bằng cách dàn 3 ml thạch toluidin xanh-axit deoxyribonucleic (5.6) tr ê n bề mặt lam kính. Khi thạch đông đặc th ì khoan các giếng đường kính 2 mm (từ 10 đến 12 giếng trên mỗi lam kinh) trên bề mặt v à loại b ỏ các n ú t thạch. Nh ỏ khoảng 0,01 ml huy ề n phù vi khu ẩ n đã gia nhiệt (đun sôi cách thủy 15 min) sử dụng cho phản ứng coagulase vào giếng trên mặt thạch . Ủ các lam kính trong tủ ấm 4 h ở 35 ° C . Nếu xuất hiện quầng màu h ồ ng tươi rộng ít nh ấ t 1 mm bao quanh giếng thì phản ứng dương t í nh. 9.4.3 . Các đặc tính Một số đặc t í nh đi ể n h ì nh của hai loài Staphylococcus và các loài Micrococcus được nêu trong Bảng 1. B ả ng 1 - Các đặc tính điển hình của S . aureus, S . epidermidis và Micrococcus Đặc tinh S . aureus S . epidermid i s M i crococcus Hoạt t í nh catalase + + + Sinh coagulase + - - Sinh thermonuclease + + - Nhạy cảm với lysostaphin + + - Sử dụng glucose trong điều kiện kị khí + + - Sử dụng mannitol trong điều kiện kị khí + - - (+) Hầu hết ( ≥ 90%) các ch ủ ng d ương t í nh; (-) Hầu hết ( ≥ 90%) các chủng âm t í nh. 10. Biểu thị kết quả Kết quả đ ị nh lượng theo 9.3 được báo cáo theo số S . aureus trên một gam mẫu thử. 11. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo th ử nghiệm phải chỉ r õ : a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đ ủ về mẫu th ử ; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn cũng như các sự cố b ấ t kỳ có th ể ảnh hưởng đến kết quả ; e) kết quả thử nghiệm thu được. Phụ lục A ( Quy định) Thành phần và chuẩn bị môi trường và thuốc thử A.1 . Môi trường Ba i rd-Parker A.1.1 . Môi tr ườ ng cơ bản A.1.1.1 . Thành phần Trypton 10 g Chết chiết thịt bò 5 g Chất chiết nấm men 1 g Natri pyruvat 10 g Glycin 12 g Liti clorua ngậm sáu phân tử n ướ c (LiC l· 6H 2 O ) 5 g Thạch 20 g Nước cất 1 lít A.1.1.2 . Chuẩn bị Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 7,0 ± 0,2. Nếu cần sử dụng ngay thì duy trì môi trường đã tan chảy ở nhiệt độ từ 48 ° C đến 50 ° C trước khi bổ sung tăng sinh. Nếu không cần sử dụng ngay thì bảo quản môi trường đông đặc ở 4 ° C ± 1 ° C đến 1 tháng. Làm tan chảy môi trường trước khi sử dụng. A.1.2 . Dung d ị ch kali telurit A.1.2.1 . Thành ph ầ n Kali telurit 1) (K 2 Te O 3 ) 1,0 g Nước cất 100 ml 1) Ch ỉ sử dụng kali telurit sẵn c ó phù hợp đối với phép thử này (xem A.1.2.2). A.1.2.2 . Chuẩn bị H òa tan hoàn toàn kali telurit trong nước bằng cách đun nóng rất nhẹ. Bột kali telurit phải dễ tan. Nếu có mặt chất không h òa tan màu trắng trong nước th ì loại b ỏ bột đó. Lọc qua m à ng lọc cỡ lỗ 0,22 µ m để khử trùng. Dung dịch có thể được bảo qu ả n tối đa một tháng ở nhiệt độ + 3 ° C ± 2 ° C . Loại bỏ dung dịch nếu có kết t ủ a màu trắng. A.1.3 . Dung dịch nhũ t ươ ng lòng đ ỏ trứng (nồng độ khoảng 20 % hoặc theo chỉ dẫn của nhà sản xuất). A.1.4 . Môi trường hoàn chỉnh A.1.4.1 . Thành phần M ô i trường cơ b ả n (A.1.1) 100 ml Dung dịch kali telurit (A.1.2) 1,0 ml Nhũ tương l ò ng đ ỏ trứng (A.1.3) 5,0 ml A.1.4.2 . Chuẩn bị Làm tan chảy môi trường cơ b ả n, sau đó làm nguội trong nồi cách th ủy đến khoảng 47 ° C . Dưới các điều kiện vô trùng, thêm dung dịch kali telurit và nhũ tương lòng đỏ trứng, c ả hai đã được làm ấm trước trong nồi cách th ủy ở 47 ° C , lắc kỹ sau khi thêm từng dung dịch. A.1.5 . Chuẩn b ị các đĩa thạch Đổ một lượng th í ch h ợ p môi trường hoàn ch ỉ nh (A.1.4) vào đĩa Petri vô trùng để thu được môi trường thạch dày khoảng 4 mm và để cho đặc lại. Trước khi làm kh ô , các đĩa có thể được bảo qu ả n đến 24 h ở nhiệt độ + 3 ° C ± 2 ° C . CH Ú THÍCH: Đối với các đĩa sản xuất công nghiệp, cần t uân thủ các chỉ dẫn của nhà sản xuất v ề thời gian bảo quản. Trước khi sử dụng, làm khô các đĩa, t ố t nhất là mở nắp ra và úp b ề mặt thạch xuống dưới, đặt vào t ủ ấm ở nhiệt độ từ 25 ° C đến 50 ° C , cho đến khi các giọt nước biến mất trên bề mặt của môi tr ườ ng. A.2 . Canh thang trypticase (tryptic) đậu tương chứa natri clorua 10 % và natri pyruvat 1 % A.2.1 . Thành phần Trypticase hoặc tryptose 17 g Phyton pepton 3 g Natri clorua 100 g Kali hy d ro phosphat ( K 2 HPO 4 ) 2,5 g Dextrose 2,5 g Natri pyruvat 10 g Nước cất 1 lít A.2.2 . Chuẩn bị Chỉnh đến pH 7,3. Đun nhẹ nếu cần. Phân phối 10 ml vào các ống nghiệm 16 mm x 150 mm. Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 7,3 ± 0,2. Bảo quản trong một tháng ở 4 ° C ± 1 ° C. A.3 . Thạch trypticase (tryptic) đậu tương A.3.1 . Thành ph ầ n Trypticase pepton 15 g Phyton pepton 5 g Natri clorua 5 g Thạch 15 g Nước cất 1 lít A.3.2 . Chuẩn bị Gia nhiệt có khuấy để hòa tan thạch. Đun sôi 1 min. Phân phối vào các ống hoặc b ì nh thích hợp. Hấp áp lực 15 min ở 121 ° C . pH cuối cùng đạt 7,3 ± 0,2. A.4 . Thạch toluidin xanh-ADN A.4.1 . Thành ph ầ n Axit deoxyribonucleic (AON) 0,3 g Thạch 10 g Canxi clo rua (dạng khan) 1,1 mg Natri clo rua 10 g Toluidin xanh O 83 mg Tris(hydroxymethyl)aminometan 6,1 g Nước c ấ t 1 lít A.4.2 . Chuẩn bị Hòa tan tris(hydroxymethyl)aminometan trong 1 lít nước c ấ t. Chỉnh pH đến 9,0. Bổ sung c á c thành phần còn lại, trừ toluidin xanh O và đun đến sôi đ ể hòa tan. Hòa tan toluidin xanh O vào môi trường. Phân phối vào các bình nón có nút cao su. Nếu sử dụng ngay th ì không cần kh ử tr ù ng. Môi trường vô trùng bền ở nhiệt độ phòng trong 4 tháng. A.5 . Canh thang phenol đ ỏ cacbohydrat A.5.1 . Thành ph ầ n Trypticase hoặc proteose pepton No. 3 10 g Natri clorua 5 g Ch ấ t chiết thịt bò (tùy chọn) 1 g Phenol đ ỏ (7,2 ml dung dịch phenol đ ỏ 0,25 % ) 0,018 g Glucose 5 g Nước cất 1 lít A.5.2 . Chu ẩ n bị Hòa tan glucose vào canh thang cơ bản này. Phân phối các phần 2,5 ml vào các ống nghiệm 13 mm x 100 mm chứa các ống lên men 6 mm x 50 mm đã lật ngược. Hấp áp lực 10 min ở 118 °C . pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2. Cách khác, hòa tan các thành phần tr ê n, trừ glucose, trong 800 ml nước cất có đun và th ỉ nh tho ả ng khuấy. Phân phối các ph ầ n 2,0 ml vào các ống nghiệm 13 mm x 100 mm chứa các ống lên men đã lật ngược. Hấp áp lực 15 min ở 118 ° C và đ ể nguội. Hòa tan glucose trong 200 ml nước c ấ t và khử trùng b ằ ng cách cho dung dịch qua bộ lọc giữ vi khuẩn. Thêm vô trùng 0,5 ml dịch lọc vào mỗi ống canh thang đã khử trùng sau khi làm nguội đến 45 ° C . Lắc nhẹ để trộn. pH cuối cùng đạt 7,4 ± 0,2. A.6 . Dung d ị ch lysostaphin Hòa tan 2,5 mg lysostaphin trong dung d ị ch muối đệm phosphat 0,02 M chứa natri clorua 1 %. A.7 . Thuốc thử hydro peroxit Dung dịch chứa khoảng 2,5 g đến 3,5 g hydro peroxit (H 2 O 2 ) trong mỗi 100 ml. Dung dịch này c ó thể chứa các ch ấ t bảo quản thích hợp nhưng tổng nồng độ không quá 0,05 %. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1 ] TCVN 4830-1:2005 (ISO 6888-1:1999, With Amd. 1:2003), Vi sinh vật trong thực ph ẩ m và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng staphylococci có ph ả n ứ ng dương t í nh coagulase (Staphy l ococcus aureus và các loài khác) trên đ ĩ a thạch - Phần 1: Kỹ thuật sử dụng môi trường thạch Baird-Parker [2] TCVN 4830-2:2005 (ISO 6888-2:1999, With Amd. 1:2003), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp đ ị nh lượng Staphylococci có phản ứ ng dương tính coagulase (Staphylococcus aureus và các loài khác) trên đ ĩ a thạch - Phần 2: Kỹ thuật sử dụng môi trường thạch fi br i nogen huyết tương th ỏ [3] AOAC 987.09, Staphylococcus aureus in Foods. Most Probable Number Method f or I solation and Enumeration [4] Sperber, W.H. and Tatini, S.R. 1975. Interpretation of the tube coagulase test for identi f ication of Staphylococcus aureus . Appl. Microbiol. 29:502-505