TCVN10640:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10640:2014 (EN 15850:2010) về Thực phẩm - Xác định zearalenon trong thực phẩm chứa ngô, bột đại mạch, bột ngô, bột ngô dạng nhuyễn, bột mì và ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ - Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm và sử dụng detector huỳnh quang TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10640:2014 EN 15850:2010 THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH ZEARALENON TRONG THỰC PHẨM CHỨA NGÔ, BỘT ĐẠI MẠCH, BỘT NGÔ, BỘT NGÔ DẠNG NHUYỄN, BỘT MÌ VÀ NGŨ CỐC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM VÀ SỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANG Foodstuffs - Determination of zearanlenone in maize based baby food, barley flour, maize flour, polenta, wheat flour and cereal based foods for in f ants and young children - HPLC method with immunoaffinity column cleanup and f luorescence detection Lời nói đầu TCVN 10640:2014 hoàn toàn tương đương với EN 15850:2010; TCVN 10640:2014 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH ZEARALENON TRONG THỰC PHẨM CHỨA NGÔ, BỘT ĐẠI MẠCH, BỘT NGÔ, BỘT NGÔ DẠNG NHUYỄN, BỘT M Ì VÀ NGŨ CỐC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM VÀ SỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANG Foodstuffs - Determination of zearanlenone in maize based baby food, barley flour, maize flour, polenta, wheat flour and cereal based foods for in f ants and young children - HPLC method with immunoaffinity column cleanup and f luorescence detection CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này kh ô ng thể đưa ra tất cả các v ấ n đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn . 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định zearalenon trong ngô, b ộ t đại mạch, bột ngô, bột ngô dạng nhuyễn, bột mì và ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ bằng sắc ký l ỏ ng hiệu năng cao (HPLC) có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm và sử dụng detector huỳnh quang. Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong hai nghiên cứu liên phòng. Nghiên cứu đầu tiên phân tích các mẫu thức ă n cho trẻ nhỏ chứa ngô, bột đại mạch, bột ngô, bột ngô dạng nhuyễn, bột m ì chứa zearalenon trong dải t ừ 10 m g/kg đến 335 m g/kg và nghiên cứu thứ hai đối với các mẫu ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ chứa zearalenon trong d ả i từ 9 m g/kg đến 44 m g/kg. Thông tin th ê m về đánh giá xác nhận, xem Điều 9 và Phụ lục B. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất c ầ n thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn n à y. Đối với các t à i liệu viện dẫn ghi năm c ô ng bố th ì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (n ế u có). TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng th í nghiệm - Yêu c ầ u kỹ thuật và phương pháp thử. 3. Nguyên tắc Phần mẫu thử được chiết bằng dung dịch metan o l hoặc axetonitril tùy thu ộ c và o s ả n phẩm được phân tích. Dịch chiết thu được sau đó được pha loãng bằng dung dịch nước muối đệm phosphat (PBS) và được đưa lên cột ái lực miễn nhiễm chứa các kháng thể đặc thù đối với zearalenon. Zearalenon được tinh sạch và là m giàu trên cột và được tách ra khỏi các kháng thể sử dụng axetonitril hoặc metanol làm dung môi rửa giải. Zearalenon được định lượng bằng sắc ký l ỏ ng hiệu năng cao pha đ ả o (RP-HPLC) với detector huỳnh quang. 4. Thuốc thử 4.1 . Yêu c ầ u chung Ch ỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước phù hợp với loại 1 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), trừ khi có quy định khác. Dung môi phải đạt chất lượng để phân tích HPLC , trừ khi có quy định khác. Có thể sử dụng các dung dịch bán sẵn có đặc tính tương đương với các dung dịch đã được liệt kê dưới đ â y 4.2 . Dinatri hydro phosphat , Na 2 HP O 4 khan hoặc Na 2 HP O 4 .12H 2 O . 4.3 . Kali clorua (KCI). 4.4 . Kali dihydro phosphat , KH 2 P O 4 . 4.5 . Natri clorua (NaCI). 4.6 . Natri hydroxit (NaOH). 4.7 . Dung dịch axit clohydric , w (HCI) = 37 % khối lượng trong nước. 4.8 . Dung dịch axit clohydric , c(HCI) = 0,1 mol/l. Pha loãng 8,28 ml dung dịch axit clohydric (4.7) trong nước đến 1 lít. 4.9 . Dung dịch natri hydroxit , c(NaOH) = 0,1 mol/l. Hòa tan 4 g natri hydroxit (4.6) trong 1 lít nước. 4.10 . Dung dịch nước muối đệm phosphat (PBS), c(NaCI) = 120 mmol/l, c(KCI) = 2,7 mmol /l, c(đ ệ m phosphat) = 10 mmol/l, pH = 7,4. Hòa tan 8,0 g natri clorua (4.5), 1,2 g dinatri hydro phosphat khan hoặc 2,9 g Na 2 HP O 4 .12H 2 O (4.2), 0,2 g kali dihydro phosphat (4.4) và 0,2 g kali clorua (4.3) trong 900 ml nước. Sau khi hòa tan, chỉnh pH đến 7.4 bằng dung dịch axit clohydric (4.8) hoặc dung dịch natri hydroxit (4.9), sau đó pha loãng bằng nước đ ế n 1 l í t. Ngo à i ra, có th ể chuẩn bị dung dịch PBS có các đặc tính tương đương từ PBS bán sẵn trên thị trường. 4.11 . Axetonitril Cảnh b á o - Axetonitril là ch ấ t độc hại và các mẫu phả i được pha trộn bằng máy trộn chống n ổ trong t ủ hút. Sau khi trộn, mẫu phải được lọc trong t ủ hút. 4.12 . Metanol , loại dùng cho HPLC. 4.13 . Metanol , loại kỹ thuật. 4.14 . Dung môi chiết A Trộn 75 thể tích axetonitri l (4.11) với 25 thể tích nước. 4.15 . Dung môi A dùng cho phân tích HPLC Trộn 4 thể tích axetonitril (4.11) với 6 thể tích nước. 4.16 . Pha động A dùng cho HPLC Trộn 53 thể tích axetonitril (4.11) v ới 47 thể tích nước. Lọc và khử khí pha động HPLC trước khi sử dụng. 4.17 . Dung môi chiết B Trộn 75 thể tích metanol (4.13) với 25 thể tích nước. 4.18 . Dung môi rửa Trộn 15 thể tích metanol (4.12) với 85 thể tích PBS (4.10). 4.19 . Dung môi bơm B dùng cho phân tích HPLC Trộn 5 thể tích metanol (4.12) v ớ i 5 th ể tích nước. 4.20 . Pha động B dùng cho HPLC Trộn 75 thể tích metanol (4.12) với 25 thể tích nước. Lọc và khử khí pha động HPLC trước khi sử d ụng. 4.21 . Cột ái lực miễn nhiễm Cột ái lực miễn nhiễm chứa các kháng thể hấp thu zearalenon. Cột có khả năng tách được không nhỏ hơn 1 500 ng zearalenon và có độ thu hồi không nhỏ hơn 80 % khi dùng 10 m l dịch chiết chứa 75 ng zearalenon trong hỗn hợp của 15 thể tích metanol và 85 thể tích PBS. 4.22 . Zearalenon , dạng tinh thể hoặc dạng màng trong ampun, độ tinh khiết không nhỏ hơn 98 % phần kh ố i lượng hoặc ở dạng dung dịch zearlenon có bán sẵn trên thị trường. Cảnh báo - Zearalenon là hợp chất oestrogen và c ầ n được xử lý đặc biệt cẩn thận. Luôn phải mang găng tay và kính bảo hộ, giai đoạn chuẩn bị mẫu và chất chuẩn phải được thực hiện trong t ủ hút. 4.23 . Dung dịch gốc zearalenon , c » 200 m g/ml. Cho 4,0 ml axetonitril (4.11) vào 5 mg zearalenon (4.22) để tạo thành dung dịch có nồng độ khối lượng khoảng 1,25 mg/ml. Pha loãng 800 m l dung dịch này đến 5 ml bằng axetonitril (4.11) đ ể tạo thành dung dịch gốc có nồng độ khoảng 200 m g/ml. Bảo quản dung dịch này trong t ủ lạnh đ ô ng ở - 18 °C đến - 20 °C. Để dung dịch đạt đến nhiệt độ phòng trước khi m ở . Dung dịch được bảo qu ả n theo cách này bền được 12 tháng. Xác nhận lại nồng độ khối lượng của dung dịch nếu để l âu hơn sáu tháng. 4.24 . Dung d ịch thêm chuẩn zearalenon , c » 10 m g/ml Pha loãng 250 m l dung dịch gốc (4.23) với 4,75 ml axetonitril (4.11) để tạo thành dung dịch có nồng độ khối lượng khoảng 10 m g/ml. Để xác định nồng độ chính xác, ghi lại đường hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng trong khoảng từ 200 nm tới 300 nm trong c u v et thạch anh 1 cm của máy đo phổ (5.25) với axetonitril (4.11) là m dung dịch so sánh. Xác định bước sóng cho độ hấp thụ cực đại (A khoảng 274 nm). Tính nồng độ khối lượng của zearalenon, r zon , tính bằng microgam trên mililit sử dụng công thức (1): r zon = (1) Trong đó: A m a x là độ hấp thụ xác định được tại điểm cực đại của đường hấp thụ (274 nm); M là khối lượng phân tử của zearalenon, tính bằng gam trên mo l (M = 318,4 g/mol); e là hệ số hấp thụ phân tử của zearalenon trong axetronitril (4.11), tính bằng mét vuông trên mol, (1 262 m 2 /mol, xem [1]); b l à chiều dài đường quang của c u v et thạch anh, t í nh bằng xentimet (cm). Bảo qu ả n dung dịch n à y trong tủ lạnh đông ở - 18 °C đ ế n - 20 °C. Đ ể dung dịch đạt đến nhi ệ t độ phòng trước khi m ở . Dung dịch được bảo qu ả n theo cách này bền được 12 tháng. Xác nhận lại nồng độ khối lượng của dung dịch nếu để lâu hơn sáu tháng. 4.25 . Dung dịch chuẩn zeara l enon A , r = 2 m g/ml, để phân tích mẫu thức ăn dành cho trẻ nhỏ có chứa ngô, bột đại mạch, bột ngô, bột ngô dạng nhuyễn và bột mì. Chuyển một lượng dung dịch thêm chuẩn (4.24) chứa tương ứng với 10 m g zearalenon sang một lọ (5 9 ) khác hoặc b ì nh định mức đã hiệu chuẩn (5.10). Thêm axetonitril (4.11) để thu được tổng thể tích là 5 ml. B ả o qu ả n dung dịch n à y trong tủ lạnh đông ở - 18 °C đến - 20 °C. Để đạt đến nhiệt độ phòng trước khi m ở . Dung dịch được bảo quản theo cách này có thể bền được 12 tháng. Xác nhận lại nồng độ khối lượng của dung dịch nếu để quá sáu tháng. 4.26 . Dung dịch chuẩn zearalenon B , r = 0,4 m g/ml, để phân tích mẫu ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ Chuyển một lượng dung dịch thêm chuẩn (4.24) chứa tương ứng với 2 m g zeara l enon sang một lọ (5.9) khác hoặc b ì nh định mức đã hiệu chuẩn (5.10). Thêm axetonitril (4.11) với tổng thể tích là 5 ml. Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh đông ở - 18 °C đến - 20 °C. Để dung dịch đạt đến nhiệt độ phòng trước khi m ở . Dung dịch được bảo quản theo cách này có thể bền được 12 tháng. Xác nhận l ại nồng độ khối lượng của dung dịch nếu để quá sáu tháng. 5. Thiết bị, dụng cụ 5.1 . Yêu c ầ u chung Sử dụng dụng cụ thủy tinh thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau: 5.2 . Máy nghiền tốc độ cao hoặc máy đông hóa. 5.3 . Cân phân tích , có thể cân đến 0,000 1 g. 5.4 . Cân kỹ thuật , có thể cân đến 0,1 g. 5.5 . Máy lắc ngang hoặc máy lắc đứng có thể điều chỉnh được tốc độ . 5.6 . Máy trộn Vortex , hoặc loại tương đương. 5.7 . Máy xay , có các loại rây khác nhau. 5.8 . Máy trộn. 5.9 . Lọ thủy tinh , có các kích cỡ khác nhau. 5.10 . B ì nh định mức , dung tích 3 ml, 5 ml và 10 ml. 5.11 . Cốc có m ỏ , dung t íc h 250 ml. 5.12 . Bình nón , có nắp vặn hoặc nắp bằng thủy tinh dung tích 100 ml, 250 ml và 500 ml. 5.13 . Giấy lọc , định tính, dai, chảy nhanh, đường kính 24 cm, c ỡ lỗ 30 m m, được gấp nếp trước hoặc loại tương đương. 5.14 . Bộ lọc vi sợi thủy tinh , v í dụ, c ỡ lỗ 1,6 m m hoặc tương đương. 5.15 . Pipet , ví dụ, dung tích 25 m l đến 250 m l, 1 ml, 5 ml và 10 ml. 5.16 . Xyranh hoặc micropipet , k ín khí, ví dụ dung tích 100 m l, 500 m l, 1 000 m l. 5.17 . Hệ thống tự động hoặc hệ th ố ng chân không , thích hợp với các cột ái lực miễn nhiễm . 5.18 . Bầu chứa , dung tích từ 50 ml đến 75 ml và các bộ phận để gắn với cột ái lực miễn nhiễm. 5.19 . Xyranh bằng ch ấ t dẻo , dung tích 5 ml. 5.20 . Bơm chân không , ví dụ có thể hút ch â n không 1 kPa và/hoặc bơm 18 l/min. 5.21 . Hệ thống lọc chân không để lọc dung môi , được gắn với bộ lọc vi sợi thủy tinh 47 mm. 5.22 . Bộ lọc xyranh dùng một l ầ n , bằng nylon có cỡ lỗ 0,45 m m. Trước khi sử dụng, kiểm tra zearalenon có bị th ấ t thoát trong quá trình lọc hay không (phép thử độ thu hồi). CHÚ THÍCH Các v ậ t liệu lọc khác dù ng đ ể có th ể giữ l ạ i zearalenon. 5.23 . B ể siêu â m. 5.24 . Thiết bị HPLC , bao gồm thiết bị như sau: 5.24.1 . Hệ thống bơm , có khả năng bơm ví dụ từ 100 m l đến 300 m l. 5.24.2 . Bơm pha dộng , không xung, có khả năng duy tr ì tốc độ dòng từ 0,5 ml/min đến 1,5 ml/min. 5.24.3 . Cột phân tách HPLC pha đảo , cho phép tách zeara l enon ra khỏi và các thành phần gây nhiễu khác. Phần chồng lấn lên nhau tối đa phải nhỏ hơn 10 % chiều cao pic. Cột Phenomenex Prodigy ® ODS 3 1) (150 mm x 4,6 mm đường kính trong, cỡ hạt 5 m m, cỡ lỗ 25 m m) hoặc Spherisorb ® 1) ODS-2 Excel (250 mm x 4,6 mm đường k í nh trong, cỡ hạt 5 m m, cỡ lỗ 25 m m) cho th ấ y phù hợp khi sử dụng pha động A (4.16). Cột Supelcosil ® 1) (C 18 ), (kích thước 250 mm x 4,6 mm đường kính trong, cỡ hạt 5 m m, cỡ lỗ 18 m m) được nhồi 12 % cacbon hoặc loại tương tự cho th ấ y phù hợp khi được sử dụng với pha động B (4.20). 5.24.4 . Tiền cột , tốt nhất là có vật liệu pha t ĩ nh giống với vật liệu pha t ĩ nh của cột ph â n tích, đường kính trong 4 mm, cỡ hạt 5 m m. 5.24.5 . Detector huỳnh quang , lắp được c u v et d ò ng chảy và thích hợp để đo ở bước sóng kích thích 274 nm hoặc 275 nm và bước sóng phát xạ ở 446 m m hoặc 450 m m. 5.24.6 . Bộ ghi , bộ tích ph â n hoặc máy tính dựa vào hệ thống phân tích dữ liệu. 5.24.7 . Bộ khử kh í (tùy chọn). 5.25 . Máy đo phổ UV , có các c u v et thạch anh thích hợp. 6. Cách tiến hành 6.1 . Chiết 6.1.1 . Chiết bột đại mạch, bột ngô, bột ngô nhuyễn, bột mì và thức ă n chứa ngô dành cho tr ẻ nhỏ Cân 25 g phần mẫu thử đã nghiền, ch í nh xác đến 0,1 g, cho vào cốc có mỏ (5.11). Thêm 100 ml dung môi chiết A (4.14). Đồng hóa 3 min trong máy đồng hóa (5.2) ở tốc độ cao. Lọc dịch chiết qua giấy lọc (5.13). Chuyển 88 ml PBS (4.10) vào bình nón (5.12). Dùng pipet (5.15) cho 12 ml dịch lọc và lắc để trộn kỹ bằng tay. Nếu khi thêm phần dịch lọc vào PBS mà mẫu tr ở nên v ẩ n đục thì lọc qua giấy lọc vi sợi thủy tinh (5.14) trước khi làm sạch. 6.1.2 . Chiết ngũ cốc dành cho tr ẻ sơ sinh và tr ẻ nhỏ Cân 20 g phần mẫu thử, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình nón có nắp vặn (5.12). Thêm 150 ml dịch chiết dung môi B (4.17). Lắc nhanh bằng tay trong vài gi â y để thu được huyền phù đồng nhất, sau đó lắc thêm 1 h trong máy lắc (5.5) hoặc cho vào b ể siêu âm (5.23) 15 min và lắc tiếp trên máy lắc (5.5) 15 min. Lọc dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp (5.13) và thu lấy dịch chiết vào bình nón dung tích 100 ml (5.12). Chuyển chính xác 30 ml phần dịch chiết đã lọc vào ống đong dung tích 150 ml có nắp đậy. Pha loãng dịch chiết trong ống đong bằng PBS (4.10) đến thể tích cuối cùng 150 ml. Lắc và lọc khoảng 20 ml dịch chiết này qua màng lọc vi s ợ i thủy tinh (5.14) cho vào cốc có mỏ bằng thủy tinh bằng cách sử dụng chân không nhẹ (5.21). Loại b ỏ 20 ml này và lọc tiếp thêm khoảng 70 ml để phân tích. CHÚ TH Í CH Không sử dụng ch â n không mạnh khi bắt đ ầ u quá trình lọc, c ó th ể làm d ịch chiết bị đục sau khi lọc Thực hiện ngay quy trình làm sạch trên cột ái lực miễn nhiễm (6.2). 6.2 . Làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm Để cột ái lực miễn nhiễm đến nhiệt độ phòng trước khi làm ổ n định . Nối cột ái lực miễn nhiễm (4.21) với hệ thống chân không (5.17) và gắn bầu chứa (5.18) lên đ ỉ nh cột ái lực miễn nhiễm . Ổ n định sơ bộ cột ái lực miễn nhiễm bằng 20 ml PBS (4.10) sử dụng tốc độ dòng 3 ml/min đ ế n 5 ml/min. Chuyển 50 ml dung dịch chiết mẫu pha loãng (và có thể đã lọc) (xem 6.1.1 hoặc 6.1.2) vào bầu chứa. Rút dịch chiết qua cột bằng trọng lực với tốc độ dòng ổn định cho đ ế n khi tất c ả dịch chiết đ ã qua cột và ph ầ n dung mô i cu ố i cùng qua cột. C ần có tốc độ dòng ch ả y là một giọt tr ê n gi â y đến hai giọt tr ê n gi â y . Sau khi dịch chiết qua cột, rửa cột d ùng 20 ml nước hoặc đối với thức ăn cho trẻ nhỏ dùng 5 ml dung m ô i rửa (4.18) sau đó dùng 15 ml nước ở tốc độ một giây trên gi â y đến hai giọt trên gi â y . Loại b ỏ nước còn dư ra khỏi cột ái lực miễn nhiễm ví dụ bằng 3 ml khí hoặc cho kh í nitơ qua cột. Loại bỏ h ế t dịch rửa giải ở giai đoạn này của quá trình làm sạch. CHÚ THÍCH 1 Các điều kiện trên đây để ổn định sơ bộ cột và rửa giải có thể thay đổi theo hướng dẫn của nhà sản xuất cột. CHÚ THÍCH 2 Cần cẩn thận để không vượt quá khả năng của cột ái lực miễn nhiễm. 6.3 . Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 6.3.1 . Chuẩn bị mẫu bột đại mạch, bột ngô, bột mì, bột ngô dạng nhuyễn, thức ăn có ch ứ a ngô dành cho trẻ nhỏ Đ ặ t lọ (5.9) dưới từng cột ái lực miễn nhiễm. Dùng p i pet lấy 1,5 ml axetonitril (4.11) cho vào b ầ u ch ứ a của cột (5.18). Đ ể cho dung môi tiếp xúc với cột ái lực miễn nhiễm 1 min sau đó rửa giải zearalenon ra khỏi cột ái l ự c miễn nhiễm bằng cách đ ể dung môi qua cột ở tốc độ một giọt trên gi â y đến hai giọt trên gi â y . Đảm b ả o đã thu nhận được t ấ t c ả dung môi, ví dụ cho 5 ml không khí đi qua cột. Làm bay hơi dịch rửa giải thu được đến khô bằng dòng khí nitơ. Hòa tan phần còn lại thu được trong 1 ml dung môi bơm dùng cho HPLC A (4.15). Trộn kỹ trên máy trộn vortex (5.6). Chuyển vào lọ nhỏ (5.9). Ngoài ra , dịch rửa giải có th ể được pha loãng đến thể tích xác định (v í dụ 3 ml) bằng cách thêm nước và sau đ ó được ph â n tích bằng HPLC. 6.3.2 . Chuẩn bị mẫu ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và tr ẻ nhỏ Đặt bình định mức dung tích 3,0 ml (5.10) dưới cột và cho 0,75 ml metanol (4.12) đi qua cột , thu lấy dịch rửa giải. Sau khi những giọt metanol cuối cùng chảy qua cột , để metanol còn gi ữ trên c ộ t khoảng 1 min . Sau đó thêm tiếp 0,75 ml metanol và tiếp tục thu lấy dịch rửa giải . Cẩ n th ậ n cho không kh í đi qua cột để thu được những giọt cuối cùng. Đổ đầy nước đến vạch của bình định mức và lắc. Trong trường hợp mẫu đục, lọc dung dịch thử qua bộ lọc xyranh HPLC (5.22) với xyranh bằng chất d ẻ o (5.19). CHÚ THÍCH 1 Khi trộn, metanol v à nước b ị co ngót th ể tích. Điều chỉnh th ể tích sau khi l ắ c, n ế u c ầ n. CHÚ THÍCH 2 Ngo à i quy trình làm sạch và rửa giải ái lực miễn nhiễm thủ công (xem 6.3.1 v à 6.3.2) còn có thể t hực hiện với bộ chuẩn bị mẫu tự dộng, với đ iều kiện là khối lượng và tốc độ rửa giải không thay đ ổ i. 6.4 . Quy trình thêm chuẩn Sử dụng dung dịch chuẩn (4.25) để xác định độ thu hồi theo quy trình thêm chuẩn. Mức th ê m chuẩn phải nằm trong dải hiệu chuẩn (tốt nhất là giữa dải nồng độ). Để yên mẫu thêm chuẩn tối thiểu 30 min cho bay hết dung môi. 7. Phân tích HPLC 7.1 . Các điều kiện v ậ n hành HPLC Khi sử dụng cột quy định trong 5.24.3 và pha động quy định trong 4.16 hoặc 4.20, việc cài đặt sau đây cho thấy phù hợp, xem Hình A.1 và Hình A.2: - tốc đ ộ dòng pha động (cột): 0,7 ml/min đến 1,0 ml/min; - detector huỳnh quang, bước sóng phát xạ: 446 nm đến 450 nm; - detector huỳnh quang, bước sóng kích thích: 274 nm đến 275 nm; - thể tích bơm 100 m l đến 300 m l. 7.2 . Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn cho HPLC Dùng pipet (5.15) hoặc xyranh (5.16) để chuẩn bị năm dung dịch hiệu chuẩn HPLC trong các bình định mức dung tích 10 ml riêng rẽ, chuyển các thể tích nêu trong B ả ng 1 và Bảng 2 thích h ợ p đối với các mẫu. Pha loãng đến vạch từng dung dịch bằng dung môi bơm thích hợp cho HPLC (4.15 đối với B ả ng 1 hoặc 4 . 19 đối với Bảng 2). B ả ng 1 - Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn HPLC đối với thức ăn dành cho tr ẻ nhỏ có chứa ngô, bột đại mạch, bột ngô, bột mì, bột ngô dạng nhuyễn Dung dịch hiệu chuẩn HPLC Th ể tích dung d ịch chuẩn zearalenon A (xem 4.25) m l Nồng độ khối l ượ ng zearalenon cuối cùng trong dung dịch chuẩn ng/ml 1 25 5 2 175 35 3 375 75 4 550 110 5 750 150 Bảng 2 - Chuẩn bị d ung dịch hiệu chuẩn HPLC đối với ngũ cốc dành cho t rẻ sơ sinh và trẻ nhỏ Dung dịch hiệu chuẩn HPLC Thể tích dung dịch chuẩn zearalenon B (xem 4.26) m l Nồng độ khối lượng zearalenon cuối c ù ng trong dung dịch chuẩn ng/ml 1 50 2 2 200 8 3 350 14 4 500 20 5 650 26 Việc chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các pipet khác nhau hoặc bằng các lọ thủy tinh đã hiệu chuẩn. 7.3 . Đường chuẩn Chuẩn bị đường chuẩn ngay khi bắt đầu ngày phân tích bằng cách bơm dung dịch hiệu chuẩn thích hợp đối với mẫu thử (xem Bảng 1 hoặc Bảng 2) vào hệ thống HPLC. Thiết lập đường chuẩn trước để phân tích mẫu thử bằng cách dựng đồ thị nồng độ khối lượng zearalenon, tính bằng nanogam trên mililit, trên tr ụ c x dựa vào dấu hiệu pic như diện tích hoặc chiều cao trên trục y, kiểm tra độ tuyến tính sử dụng hồi quy tuyến tính (r 2 ³ 0,998). 7.4 . Xác định zearalenon trong dung dịch m ẫ u thử Bơm các lượng dịch d ung dịch mẫu thử (6.3.1 hoặc 6.3.2) vào hệ thống HPLC sử dụng các điều kiện như đã dùng để chuẩn bị đường chuẩn. 7.5 . Nhận biết pic Nhận biết các pic zearalenon trong dung dịch mẫu thử bằng cách so sánh thời gian lưu của dung dịch mẫu với thời gian lưu gần giống nhất của chất chuẩn được bơm vào HPLC. Nồng độ khối lượng của zearalenon trong dung dịch m ẫ u thử phải nằm trong dải hiệu chuẩn. Nếu mức zearalenon trong dung dịch mẫu thử vượt quá nồng độ khối lượng chuẩn lớn nhất thì pha loãng mẫu với pha động HPLC , để đưa nồng độ về trong d ả i hiệu chuẩn và phân tích lại. Hệ số pha loãng phải được đưa vào tất cả các phép t í nh tiếp theo. 8. Tính kết quả Xác định nồng độ khối lượng zearalenon trong dung dịch mẫu thử (6.3.1 hoặc 6.3.2) trực tiếp từ đường chuẩn (7.3), t í nh bằng nanogam trên mililit. T í nh khối lượng của zearalenon, w zon , t í nh bằng nanogam trên gam, sử dụng công thức (2): w zon = (2) Trong đó: r a là nồng độ khối lượng của zearalenon trong phần dung dịch thử được bơm và được xác định từ đường chuẩn, tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml); V 1 là thể tích của dung m ô i chiết (100 ml đối với 6.1.1 hoặc 150 ml đối với 6.1.2) , tính b ằ ng mililit (ml); V 2 là thể tích thu được sau rửa giải khỏi cột ái lực miễn nhiễm và sau khi hòa tan lại với pha động (1,0 ml hoặc 3,0 ml), tính bằng mililit (ml); V 3 thể tích của phần dịch chiết được sử dụng đ ể làm sạch cột ái lực miễn nhiễm (6 ml đối với 6.1.1 và 10 ml đối với 6.1.2), t í nh bằng mililit (ml); m s là khối lượng mẫu thử được lấy để phân tích (25 g đối với 6.1.1 và 20 g đối với 6.1.2). Các kết quả này được t í nh bằng công thức đơn giản sau: w zon = r a x 0,667 (đối với các mẫu được chuẩn bị theo 6.1.1. thể tích cuối cùng là 1 ml); w zon = r a x 2,0 (đối với các mầu được chuẩn bị theo 6.1.1, thể tích cuối cùng là 3 ml); w zon = r a x 2,25 (đối với các mẫu được chuẩn bị theo 6.1.2, thể tích cuối cùng l à 3 ml). 9. Độ chụm 9.1 . Yêu cầu chung Chi tiết của phép thử nghiệm liên phòng về độ chụm của phương pháp đ ố i với bột đại mạch, bột ngô, bột m ì , bột ng ô dạng nhuyễn, ng ô dành cho trẻ nhỏ được đưa ra trong Bảng B.1. Chi tiết của phép thử nghiệm liên phòng về độ chính xác của phương pháp đối với ngũ cốc cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ được đưa ra trong Bảng B.2. Các giá trị nhận được từ các thử nghiệm liên phòng có thể không áp dụng được đối với d ả i nồng độ và/ hoặc nền m ẫ u khác với dải nồng độ và nền mẫu đã n ê u trong Phụ lục B 9.2 . Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành tr ê n vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn độ lặp lại r. Đối với mẫu được chuẩn bị sử dụng quy trình 6.1.1: Các giá trị đối với thức ăn có chứa ngô dành cho trẻ nhỏ : = 10,9 m g/kg r = 11,0 m g/kg (được thêm và o) Các giá trị đối với bột đại mạch: = 143 m g/kg r = 27,5 m g/kg (được thêm vào) Các giá trị đối với bột ngô: = 87,2 m g/kg r = 34,8 m g/kg (nhiễm tự nhiên) Các giá trị đối với bột ngô: = 335 m g/kg r = 82,9 m g/kg (nhiễm tự nhiên) Các giá trị đối với bột ngô dạng nhuyễn = 66,5 m g/kg r = 16,6 m g/kg (được thêm vào) Các giá trị đối với bột m ì = 227 m g/kg r = 52,9 m g/kg (được thêm vào) Đối với các mẫu được chuẩn bị sử dụng quy trình 6.1.2: Các giá trị đối với ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ: = 9,1 m g/kg r= 1,5 m g/kg (nhiễm tự nhiên) = 17,1 m g/kg r= 2,5 m g/kg (nhiễm tự nhiên) = 44,0 m g/kg r = 3,4 m g/kg (nhiễm tự nhiên) = 18,4 m g/kg r= 4,5 m g/kg (được thêm và o) = 26,6 m g/kg r= 4,2 m g/kg (được thêm vào) 9.3 . Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng trên vật liệu thử giống hệt nhau b ở i hai ph ò ng thử nghiệm không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn độ tái lập R. Đối với các mẫ u được chuẩn bị sử dụng quy trình 6.1.1: Các giá trị đối với thức ă n có chứa ngô dành cho trẻ nhỏ : = 10,9 m g/kg r = 11, 7 m g/kg (được thêm và o) Các giá trị đối với bột đại mạch: = 143 m g/kg r = 71 , 8 m g/kg (được thêm vào) Các giá trị đối với bột ngô: = 87,2 m g/kg r = 50 , 4 m g/kg (nhiễm tự nhiên) Các giá trị đối với bột ngô: = 335 m g/kg r = 343,7 m g/kg (nhiễm tự nhiên) Các giá trị đối với bột ngô dạng nhuyễn = 66,5 m g/kg r = 30 ,6 m g/kg (được thêm vào) Các giá trị đối với bột m ì = 227 m g/kg r = 107,9 m g/kg (được thêm vào) Đối với các mẫu được chuẩn bị sử dụng quy trình 6.1.2: Các giá trị đối với ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ: = 9,1 m g/kg R = 3,3 m g/kg (nhiễm tự nhiên) = 17,1 m g/kg R = 6,2 m g/kg (nhiễm tự nhiên) = 44,0 m g/kg R = 12,5 m g/kg (nhiễm tự nhiên) = 18,4 m g/kg R = 6,6 m g/kg (được thêm và o) = 26,6 m g/kg R = 6,1 m g/kg (được thêm vào) 10. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệ m phải nêu rõ: a) mọi thông tin cần thi ế t đ ể nhận biết đầy đủ về mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc mẫu , tên); b) vi ệ n dẫn ti ê u chuẩn này; c) ngày v à phương pháp lấy mẫu (nếu biết); d) ngày nhận mẫu ; e) ngày thử nghiệm; f) kết quả thử nghiệm và các đơn vị biểu thị; g) mọi chi tiết quan sát được trong quá trình thử nghiệm; h) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, có th ể ảnh hưởng đến kết quả. PHỤ LỤC A (tham kh ả o) SẮC KÝ ĐỒ ĐIỂN HÌNH CHÚ DẪN X thời gian (min) Y t í n hiệu (mV) 1 zearalenon Hình A.1 - Sắc ký đồ điển h ì nh, mẫu lúa mì bị nhiễm zearalenon tự nhiên 190 m g/kg, được phân tích sử dụng các điều kiện HPLC nêu trong 7.1 CHÚ DẪN X thời gian (min) Y tín hiệu (mV) 1 zearalenone Hình A.2 - Sắc ký đồ đi ể n hình, mẫu lúa m ì bị nhiễm zeara l enone tự nhiên 36 m g/kg, được ph â n tích sử dụng các điều kiện HPLC nêu trong 7.1 PHỤ LỤC B (tham khảo) DỮ LIỆU VỀ ĐỘ CHỤM Dữ liệu n êu trong Bảng B.1 thu được trong các phép thử nghiệm li ê n phòng [2 ] , [3] theo hướng dẫn của AOAC v ề quy trình nghiên cứu cộng tác để đánh giá các đặc t í nh của phương pháp phân tích (4). Bảng B.1 – D ữ liệu v ề độ chụm đối với các mẫu được chuẩn bị sử dụng quy trình 6.1.1 Mẫu Thức ăn dành cho trẻ nhỏ có chứa ngô ( được thêm vào) Bột đại mạch ( được th ê m vào) Bột ngô (nhiễm tự nhiên ) Bột dạng nhuyễn ( được thêm vào) Bột m ì (được th ê m vào) Bột ngô (nhiễm tự nhi ê n) N ă m thử nghiệm liên phòng 2002 2002 2002 2002 2002 2002 S ố phòng thử nghi ệ m 29 29 29 29 29 28 S ố phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi đ ã trừ ngoại l ệ 28 28 29 29 29 27 S ố ngo ạ i lệ (phòng thử nghiệm) 1 1 0 0 0 1 Số kết quả được chấp nhận 23 25 27 27 27 27 Giá tr ị trung bình, , m g/kg 10 , 9 143 87,2 66,5 227 335 Đ ộ lệch chuẩn l ặ p lại, s r , m g/kg 3 , 9 9 , 8 12 , 4 5,9 18 , 9 29 , 6 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, R SD r , % 35 , 8 6 , 9 14,2 8,9 8,3 8 , 8 Giới hạn đ ộ lặp lại r [r = 2,8 xs r ], m g/kg 11 , 0 27,5 34,8 16 , 6 52,9 82,9 Độ lệch chu ẩ n tái l ậ p , s R , m g/kg 4,2 25 , 6 18 , 0 10,9 38,6 123 Độ lệch chuẩn tương đ ố i tái lập, R SD R , % 38,2 17,9 20,6 16,4 17 36 , 6 Giới hạn độ tái lập R [R = 2,8 x s R ], m g/kg 11,7 71,8 50,4 30 , 6 108 344 Đ ộ thu hồi, % a 100 92 91 91 95 98 Giá trị HorRa t, được t í nh toán sử dụng đ ộ l ệ ch chuẩn dự đoán (PSRD R ) từ Thompson, xem [5] và [6] 1 , 7 0 , 8 0,9 0,7 0,9 1,9 a Các giá trị thu hồi nhận được độc lập từ các mẫu thêm chuẩn đơn lẻ của từng nền mẫu (100 m g/kg ) của từng phòng thử nghiệm tham gia nghiên cứu cộng tác B ả ng B.2 - Dữ liệu về độ chụm đối với mẫu được chuẩn bị sử dụng quy trình 6.1.2 M ẫ u Ngũ c ố c dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ (được thêm vào) ( bị nhiễm tự nhiên ) N ă m thử nghiệm liên phòng 2005 2005 2005 2005 2005 2005 S ố lượng phòng thử nghi ệ m 17 17 19 19 19 19 S ố lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi đ ã trừ ngoại l ệ 17 17 19 17 18 17 S ố phòng thử ngo ạ i lệ 0 0 0 2 1 2 Số kết quả được chấp nhận 17 17 19 17 18 17 Giá tr ị trung bình, , m g/kg 18 , 4 26,6 2 9,1 17 , 1 44 Đ ộ lệch chuẩn l ặ p lại, s r , m g/kg 1,6 1,5 n.a . 0,5 0,9 1,2 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, R SD r , % 8,7 5,7 n.a. 5,9 5,3 2 , 8 Giới hạn đ ộ lặp lại r [r = 2,8 xs r ], m g/kg 4,5 4,2 n.a. 1,5 2,5 3,4 Độ lệch chu ẩ n tái l ậ p , s R , m g/kg 2,4 2,2 n.a. 1,2 2,2 4 , 5 Độ lệch chuẩn tương đ ố i tái lập, R SD R , % 12,9 8,2 na. 13,0 13 , 0 10 , 1 Giới hạn độ tái lập R [R = 2,8 x s­ R ], m g/kg 6,7 6,1 n.a. 3 , 3 6 , 2 12 , 5 Đ ộ thu hồi, % a 92 91 n.a. n.a. n.a . n.a . Giá trị HorRa t, được t í nh toán sử dụng đ ộ l ệ ch chuẩn dự đoán (PSRD R ) từ Thompson, xem [5] và [6] 0,4 0 , 3 n.a. 0,4 0,4 0,4 a Các giá trị thu hồi nhận được từ phép phân tích các cặp mẫu mù. Mỗi phòng thử nghiệm tham gia nghiên cứu hợp tác thực hiện hai mẫu mù thêm chuẩn ở các mức 20 m g/kg và 30 m g/kg THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Josephs, R.D., Krska, R , MacDonald, S., W ilson, P. , Pettersson, H., Preparation of a calibrant as certi f ied re f erence material for determination of the Fusarium mycotoxin zearalenone. Journal of AOAC International, 2003, 86(1), 50-60 [2] MacDonald S ., Anderson, S., Brereton, P ., Wood, R. and Damant, A.„ Determination of zeara l enone in barley, maize and wheat flour, polenta and maize based baby food by immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography: Interlaboratory Study. Journal of AOAC International, 2005, 88, 1733-1740 [3] Arranz, I., Mischke, C ., Ambrosio, K., Kroeger, K., Derbyshire, M., Stroka, J., van Egmond. H. and Sizoo, E., Validation of an Analytical Method to Determine the Content of Zearalenone in Baby Food and Animal Feed, Report of the Final Trial, 2006 [4] AOAC International 1995, AOAC Official Methods Program, Associate Referee's Manual on Development, S tudy, Review, and Approval Process. Part IV AOAC Guidelines for Collaborative Studies, p. 23-51 [5] Horwitz. W . and Albert, R., The Horwitz Ratio (HorRat): A Useful Index of Method Per f ormance with Respect to Precision. Journal of AOAC International, 2006, 89, 1095-1109 [6] Thompson, M„ Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to f itness for purpose criteria in pro f iciency testing. Analyst, 2000, 125, 385-386 1) Phen o menex Prodigy ® , Spherisorb ® , Supelcosil ® là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn trên thị trường. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Các sản phẩm tương tự có thể được sử dụng nếu cho kết quả tương đương.