TCVN9127:2011

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9127:2011 (ISO 14797:1999) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng furazolidon – Phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9127:2011 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FURAZOLIDON - PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuffs - Determination of furazolidone content - Method using high-performance liquid chromatography 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định hàm lượng furazolidon của các premix và thức ăn chăn nuôi. Phương pháp này có thể áp dụng cho các loại thức ăn chăn nuôi có chứa hàm lượng furazolidon từ 25 mg/kg đến 5 000 mg/kg và các loại premix có chứa furazolidon lên đến 20 % khối lượng. CHÚ THÍCH 1: Đối với thức ăn chăn nuôi, hàm lượng furazolidon được biểu thị bằng miligam trên kilogam; đối với các premix, tính bằng phần trăm khối lượng [% (m/m)]. CHÚ THÍCH 2: Furazolidon là một chất hóa học trị liệu thuộc nhóm nitrofuran. Nitrofuran là chất kháng khuẩn hoặc diệt vi khuẩn kháng các loại vi sinh vật Gram dương, Gram âm và kháng một số nấm mốc và động vật nguyên sinh (protozoa). 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 6952:2001 (ISO 6498:1998), Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử. 3. Nguyên tắc Furazolidon được chiết ra khỏi mẫu bằng hỗn hợp của axetonitril và metanol. Mẫu được làm ẩm sơ bộ bằng nước. Dịch chiết của mẫu được tinh sạch qua cột nhôm oxit ngắn và sau đó pha loãng bằng nước. Dịch chiết của premix được pha loãng trực tiếp bằng hỗn hợp của nước, axetonitril và metanol. Dịch chiết cuối cùng được phân tích bằng HPLC pha đảo với detector UV ở bước sóng 365 nm (xem Tài liệu tham khảo [1] đến [3]). 4. Thuốc thử Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có các quy định khác. 4.1. Nước , đã khử khoáng hoặc đã khử ion, có điện trở ít nhất 10 MΩ.cm. hoặc nước ít nhất có độ tinh khiết tương đương. 4.2. Dung môi chiết : hỗn hợp của axetonitril và metanol tỷ lệ 1:1 (thể tích) Trộn các thể tích bằng nhau của axetonitril và metanol. Trộn kỹ và đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. 4.3. Dung môi loãng : hỗn hợp của dung môi chiết (4.2) và nước (4.1) tỷ lệ 35:65 (thể tích). Trộn 350 ml dung môi chiết (4.2) với 650 ml nước (4.1). 4.4. Axit axetic (CH 3 CO 2 H), 10 % thể tích [10 % (thể tích)]. Pha loãng 10 ml axit axetic băng bằng nước (4.1) đến 100 ml. 4.5. Dung dịch đệm natri axetat, c (CH 3 CO 2 Na) = 0,01 mol/l, pH = 6,0. Cân 0,82 g natri axetat vào bình định mức 1 000 ml. Pha loãng trong 700 ml nước. Chỉ pH đến 6 bằng axit axetic (4.4). Pha loãng đến vạch bằng nước và trộn. 4.6. Pha động dùng cho HPLC Trộn đều 800 ml dung dịch đệm natri axetat (4.5) với 200 ml axetonitril. Lọc dung môi rửa giải qua bộ lọc cỡ lỗ 0,22 m m dùng hệ thống lọc dung môi (5.2) và khử khí 10 min trong bể siêu âm (5.3) trước khi sử dụng. 4.7. Chất chuẩn furazolidon: N- (5-nitro-2-furfuryliden)-3-amino-2-oxazolidon, số CAS 67-45-8 theo số đăng ký hóa chất quốc tế. CẢNH BÁO - Do furazolidon nhạy với ánh sáng nên cần tiến hành các thao tác tránh ánh sáng ban ngày hoặc ánh sáng trắng nhân tạo. Tránh hít và tiếp xúc với chất chuẩn furazolidon cũng như các dung dịch của chúng. Làm việc trong tủ hốt khi xử lý các dung môi và dung dịch. Đeo kính an toàn và mặc quần áo bảo vệ. 4.8. Dung dịch gốc furazolidon (khoảng 250 m g/ml). Cân 25 mg ± 1 mg furazolidon (4.7), chính xác đến 0,1 mg vào bình định mức một vạch 100 ml. Hòa tan trong dung môi chất (4.2), pha loãng đến vạch và trộn đều. Tính nồng độ của dung dịch có tính đến độ tinh khiết của chất chuẩn. Chuẩn bị dung dịch mới hàng tháng. Bảo quản nơi tối ở 0 o C đến 8 o C. 49. Dung dịch làm việc furazolidon (khoảng 5 m g/ml đến 12,5 m g/ml). Dùng pipet lấy 2,0 ml và 5,0 ml dung dịch gốc furazolidon (4.8) cho vào các bình định mức một vạch 100 ml riêng rẽ. Thêm 65 ml nước, pha loãng đến vạch bằng dung môi chiết (4.2) và trộn. Chuẩn bị các dung dịch mới đối với từng dãy mẫu. 4.10. Nhôm oxit trung tính, hoạt độ bằng 1. CHÚ THÍCH Cần khoảng từ 0% đến 1 % nước để khử toàn bộ hoạt tính. 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau đây: 5.1. Máy đo pH. 5.2. Hệ thống lọc dung môi, tất cả đều bằng thủy tinh thích hợp dùng cho bộ lọc cỡ lỗ 0,22 m m. 5.3. Bể siêu âm. 5.4 Máy lắc quay, quay ngang, tốc độ quay từ 250 lần/phút đến 300 lần/phút. 5.5 Bộ lọc sợi thủy tinh nhỏ, đường kính 15 cm. 5.6. Bông thủy tinh. 5.7. Cột thủy tinh dùng cho sắc ký , dài 30 cm, đường kính trong 10 mm, bịt một đầu và được nhồi bằng bông thủy tinh (5.6). 5.8. Hệ thống lọc, được trang bị bộ lọc poly (vinyliden difluorua) (PVDF) hoặc bộ lọc polytetrafloretylen (PTFE) có cỡ lỗ 0,45 m m. 5.9. Hệ thống HPLC , bao gồm các bộ phận sau đây: 5.9.1. Bơm , không xung, có khả năng duy trì tốc độ dòng thể tích 0,1 ml/min đến 2,0 ml/min. 5.9.2. Hệ thống bơm, có vòng bơm thích hợp từ 20 m l đến 50 m l. 5.9.3. Detector UV , thích hợp để đo ở bước sóng 365 nm. Có thể sử dụng detector mảng diot để khẳng định, nếu sẵn có. 5.9.4. Máy ghi 5.9.5. Cột bảo vệ : Cột C 18 được nhồi silica liên kết có cỡ hạt từ 37 m m đến 100 m m dài 20 mm, đường kính trong 3,9 mm, hoặc cột bảo vệ có chất lượng tương đương. 5.9.6. Cột phân tích: Cột C 18 được nhồi silica liên kết có cỡ hạt từ 5 m m đến 200 m mm đường kính trong 3,0 mm, hoặc cột phân tích có chất lượng tương đương. Đối với furazolidon, phải thu được thừa số dung tích ( K) ít nhất là 1,0. CHÚ THÍCH Thừa số dung tích được xác định như sau: Trong đó K là thừa số dung tích; t R là thời gian lưu của furazolidon, tính bằng phút (min); t 0 là thời gian lưu của pic furazolidon chưa giữ lại, tính bằng phút (min); 5.10. Xyranh dùng một lần, dung tích 5 ml. 6. Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo phương pháp trong TCVN 4325 (ISO 6497) [1]). Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. 7. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498). Nghiền mẫu phòng thử nghiệm (thường là 500 g) sao cho lọt hết qua sàng cỡ lỗ 1 mm. Trộn kỹ. 8. Cách tiến hành 8.1. Yêu cầu chung Cùng với phép phân tích mẫu thử (hoặc dãy mẫu thử), thực hiện phân tích mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu đối chứng, nếu có. CHÚ THÍCH Các mẫu trắng là hỗn hợp đồng nhất của các mẫu thức ăn chăn nuôi tương đồng có hàm lượng furazolidon nhỏ hơn 10 mg/kg. Các mẫu trắng thêm chuẩn là các mẫu trắng được bổ sung furazolidon. Các mẫu trắng và các mẫu đối chứng có thể bền được trong một năm, nếu được bảo quản ở nhiệt độ 0 o C đến 8 o C. Cần lặp lại phép phân tích nếu độ thu hồi thấp hơn 94 % hoặc cao hơn 106 %. 8.2. Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn Hàm lượng furazolidon của mẫu thêm chuẩn nên xấp xỉ bằng hàm lượng furazolidon dự kiến có trong mẫu được dự kiến. Đối với mẫu thêm chuẩn có hàm lượng furazolidon 250 mg/kg, sử dụng quy trình dưới đây. Dùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch gốc furazolidon (4.8) cho vào bình nón 250 ml. Làm bay hơi đến thể tích xấp xỉ 0,5 ml dưới dòng nitơ và bổ sung 5 g mẫu trắng. Trộn kỹ và để yên ít nhất 10 min trước khi tiến hành chiết (8.3). 8.3. Chiết tách 8.3.1. Thức ăn chăn nuôi có hàm lượng furazolidon từ 25 mg/kg đến 2 500 mg/kg Cân 5,0 g mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 0,05 g cho vào bình nón 250 ml. Thêm 15,0 ml nước, trộn đều và để yên 5 min. Thêm 35,0 ml dung môi chiết (4.2), đậy nắp và lắc mạnh trong 30 min trên máy lắc quay (5.4). Lọc dung dịch qua bộ lọc sợi thủy tinh nhỏ (5.5) và sử dụng dịch lọc cho cột sắc ký theo 8.4. 8.3.2. Thức ăn chăn nuôi có hàm lượng furazolidon từ 2 500 mg/kg đến 5 000 mg/kg Cân 5,0 g mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 0,1 g cho vào bình nón 250 ml. Thêm 30,0 ml nước, trộn đều và để yên 5 min. Thêm 70,0 ml dung môi chiết (4.2), đậy nắp và lắc mạnh trong 30 min trên máy lắc quay (5.4). Lọc dung dịch qua bộ lọc sợi thủy tinh nhỏ (5.5) và sử dụng dịch lọc đưa lên cột sắc ký theo 8.4. 8.3.3. Premix có chứa furazolidon từ 0,5 % đến 7 % khối lượng Cân 1,0g mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 0,01 g cho vào bình nón 250 ml. Thêm 100,0 ml dung môi chiết (4.2), đậy nắp và lắc kỹ trong 30 min trên máy lắc quay (5.4). Lọc dung dịch qua bộ lọc sợi thủy tinh nhỏ (5.5). Pha loãng dịch lọc bằng dung môi pha loãng (4.3) để thu được dung dịch cuối cùng có chứa hàm lượng furazolidon từ 5 m g/ml đến 10 m g/ml. Hệ số pha loãng là f. Trộn kỹ và lọc dung dịch qua hệ thống lọc (5.8). Dùng dịch lọc để phân tích HPLC theo 8.5. CHÚ THÍCH Hệ số pha loãng cần thiết ( f ) có thể ước tính bằng công thức sau: Trong đó f e là hệ số pha loãng cần thiết dự kiến của dịch chiết mẫu; m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g); w exp là hàm lượng furazolidon dự kiến của mẫu, tính bằng miligam trên kilôgam (mg/kg); r r là hàm lượng furazolidon cần có trong dung dịch cuối cùng, tính bằng microgam trên kilôgam ( m g/kg); V là tổng thể tích của dung môi chiết được bổ sung vào phần mẫu thử (xem thêm chú thích trong 8.5.2), tính bằng mililit (ml). 8.3.4. Premix có chứa furazolidon từ 7% đến 10 % khối lượng Cân 1,0 g mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 0,01 g cho vào bình nón 500 ml. Thêm 200,0 ml dung môi chiết (4.2), đậy nắp và lắc mạnh trong 30 min trên máy lắc quay (5.4). Lọc dung dịch qua bộ lọc sợi thủy tinh nhỏ (5.5). Pha loãng dịch lọc bằng dung môi pha loãng (4.3) để thu được dung dịch cuối cùng có chứa hàm lượng furazolidon từ 5 m l/ml đến 10 m l/ml. Hệ số pha loãng là f. Trộn đều và lọc dung dịch cuối qua hệ thống lọc (5.8). Sử dụng dịch lọc dùng để phân tích HPLC theo 8.5. CHÚ THÍCH Xem chú thích trong 8.3.3 để tính hệ số pha loãng. 8.3.5. Premix có chứa furazolidon từ 10 % đến 20 % [khối lượng] Cân 0,5 g mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 5 mg cho vào bình nón 500 ml. Thêm 200,0 ml dung môi chiết (4.2), đậy nắp và lắc mạnh trong 30 min trên máy lắc quay (5.4). Lọc dung dịch qua bộ lọc sợi thủy tinh nhỏ (5.5). Pha loãng dịch lọc bằng dung môi pha loãng (4.3) để thu được dung dịch cuối cùng có chứa hàm lượng furazolidon từ 5 m l/ml đến 10 m l/ml. Hệ số pha loãng là f. Trộn đều và lọc dung dịch cuối qua hệ thống lọc (5.8). Sử dụng dịch lọc dùng để phân tích HPLC theo 8.5. CHÚ THÍCH Xem chú thích trong 8.3.3 để tính hệ số pha loãng. 8.4. Sắc ký cột Đối với từng dịch chiết mẫu, nhồi khô cột thủy tinh (5.7), đã được lắp nút bông thủy tinh (5.6) ở đáy cột, với 4 g nhôm oxit (4.10). Đưa 20 ml dịch chiết, đã chuẩn bị theo 8.3.1 hoặc 8.3.2, lên cột và loại bỏ 4 ml dịch rửa giải đầu tiên. Thu lấy 8 ml dịch rửa giải sau đó vào ống đong chia độ nhỏ. Dùng pipet lấy 5,0 ml dịch rửa giải vào bình định mức một vạch 5 ml và pha loãng đến vạch bằng nước. Trộn đều. Pha loãng dung dịch lọc bằng dung môi pha loãng (4.3), nếu cần, để thu được dung dịch cuối cùng có chứa hàm lượng furazolidon từ 5 m l/ml đến 10 m l/ml. Hệ số pha loãng là f. Lọc dung dịch đã được pha loãng qua hệ thống lọc (5.8) và sử dụng dịch pha loãng để phân tích HPLC theo 8.5. 8.5. Phân tích HPLC 8.5.1. Điều kiện HPLC Sử dụng các điều kiện sau: - tốc độ dòng thể tích của pha động (4.6): 0,6 ml/min; - thể tích bơm: 20 m l; - bước sóng: 365 nm; - máy ghi: 10 mV; - tốc độ vẽ đồ thị 0,5 cm/min. 8.5.2. Cách tiến hành 8.5.2.1. Bơm dung dịch làm việc furazolidon (4.9) cho đến khi thu được đường nền ổn định, chiều cao hoặc diện tích tái lập. Đối với chiều cao pic hoặc diện tích pic, thì chênh lệch giữa kết quả cao nhất và thấp nhất cần nhỏ hơn 5 % kết quả trung bình của ba lần bơm kế tiếp. Pic furazolidon phải đối xứng ( f as­ <> CHÚ THÍCH f as là chiều rộng ở phía cuối đường vuông góc của pic, chia cho chiều rộng phía trước đường vuông góc của pic, cả hai được đo ở vị trí 10 % chiều cao pic. Cần phải có mối tương quan tỷ lệ giữa nồng độ và chiều cao pic của hai dung dịch làm việc furazolidon (trong phạm vi 5 %). Nếu có lệch hơn 5 % thì cần chuẩn bị dung dịch làm việc furazolidon mới. Bơm các dịch tiết của mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn. Nếu pic của furazolidon không đối xứng hoặc không tách hoàn toàn ra khỏi pic nền mẫu, thì cần sử dụng cột HPLC khác hoặc chỉnh các điều kiện sắc ký bằng cách tăng hoặc giảm hàm lượng pha nước của pha động (4.6). Tiếp theo bơm dung dịch làm việc furazolidon (4.9), năm dịch chiết mẫu và dung dịch làm việc furazolidon (4.9). Lặp lại trình tự này đối với các dịch chiết mẫu khác trong dãy, nếu cần. Diện tích pic hoặc chiều cao pic quan sát được của các dung dịch làm việc furazolidon nằm trong giới hạn 5 % các kết quả của dung dịch làm việc furazolidon đã được bơm trước đó. Một ví dụ về sắc đồ được nêu trong Phụ lục A. Từ sắc đồ của furazolidon, có thể tính được các giá trị K 2.1 (xem thêm chú thích trong 5.9.6). 8.5.2.2. Nếu hàm lượng furazolidon của premix thấp hơn rõ rệt so với hàm lượng dự kiến (có tính đến dung sai), thì cần lặp lại phép phân tích với 50 ml dung môi chiết (4.2) bổ sung được áp dụng trong 8.3.3, 8.3.4 hoặc 8.3.5. Nếu kết quả này lớn hơn 15 % (khối lượng) cao hơn giá trị ban đầu, thì cần lặp lại phép phân tích với một lượng bổ sung 50 ml dung môi chiết (4.2). Việc bổ sung này cần được lặp lại cho đến khi chênh lệch các kết quả của các phép xác định kế tiếp nhỏ hơn 15 % (khối lượng). 9. Khẳng định 9.1. Yêu cầu chung Nếu nghi ngờ việc nhận dạng pic trong sắc đồ, thì dựa vào hình dạng của pic hoặc kết quả thu được, mà có thể khẳng định việc nhận dạng chất phân tích xác định được bằng cách sử dụng sắc ký đồng thời hoặc detector mảng diot. Trong trường hợp sắc ký đồng thời, thì tiến hành theo 9.2; trong trường hợp dùng detector mảng diot, thì tiến hành theo 9.3. 9.2. Sắc ký đồng thời Chuẩn bị dịch chiết mẫu thêm chuẩn bằng cách bổ sung một lượng thích hợp dung dịch làm việc furazolidon (4.9) vào dịch chiết mẫu. Lượng furazolidon được bổ sung phải xấp xỉ bằng lượng furazolidon dự kiến có trong dịch chiết mẫu. Bơm vào máy sắc ký dịch chiết mẫu, dung dịch làm việc furazolidon (4.9) và dịch chiết mẫu thêm chuẩn. Chỉ có một pic được coi là pic của furazolidon trong dịch chiết mẫu thêm chuẩn tăng về chiều cao tương ứng với lượng bổ sung và tăng về chiều rộng pic tính tại một nửa chiều cao không quá ± 10 % chiều rộng. Thực hiện tiếp theo Điều 10. 9.3. Detector mảng diot 9.3.1. Điều kiện Các điều kiện như quy định trong 8.5.1 nhưng dùng detector mảng diot thay cho detector UV với các thông số sau đây: Thông số Cài đặt Bước sóng mẫu thử 365 nm Chiều rộng dải phổ của mẫu thử 4 nm (nghĩa là bước sóng 365 nm ± 2 nm) Bước sóng đối chứng 450 nm Chiều rộng dải phổ đối chứng 100 nm Dải phổ 225 nm đến 400 nm Phổ Đường nền, đỉnh, các điểm uốn lên và điểm uốn xuống 9.3.2. Cách tiến hành Ổn định hệ thống. Bơm dung dịch làm việc furazolidon 5 m g/ml (4.9), dịch chiết mẫu nghi ngờ và lại bơm dung dịch làm việc furazolidon 5 m g/ml (4.9). Ghi lại phổ tại đường nền, điểm uốn trên, điểm uốn dưới và đỉnh pic. Lưu giữ tất cả các dữ liệu. 9.3.3. Đánh giá Vẽ trong một hình các phổ khác nhau đã chuẩn hóa (mẫu - đường nền) của pic mẫu, đã ghi lại ở đỉnh và ở điểm uốn lên và điểm uốn xuống. Vẽ trong một hình các phổ đã chuẩn hóa của pic mẫu và của pic dung dịch làm việc carbadox được ghi lại ở đỉnh. 9.3.4. Tiêu chí khẳng định Việc nhận biết chất phân tích được khẳng định nếu đáp ứng được các tiêu chí sau đây: a) Thời gian lưu của pic mẫu phải bằng (± 5 %) thời gian lưu của pic chuẩn. Trong trường hợp nghi ngờ, phải tiến hành thêm chuẩn (chất chuẩn được bổ sung vào mẫu). b) Đánh giá độ tinh khiết của pic mẫu dựa trên sự phù hợp của phổ chênh lệch, được ghi lại đỉnh và tại điểm uốn lên và điểm uốn xuống. Tại mỗi bước sóng, độ hấp thụ tương đối phải bằng nhau (trong phạm vi 15 %) đối với tất cả các phổ. c) Tại bước sóng lớn hơn 220 nm, chênh lệch phổ của pic mẫu và pic chuẩn được ghi tại đỉnh pic không được có sự chênh lệch nhìn thấy so với các phần khác phổ có độ hấp thụ tương đối ít nhất 10 %. Tiêu chí này đáp ứng khi có mặt cùng mức tối đa có mặt trong phạm vi được xác định bằng sự phân giải của hệ thống phát hiện (thường từ 2 nm đến 4 nm). Tại điểm không quan sát được, độ lệch giữa hai phổ của độ hấp thụ của chất phân tích chuẩn tại bước sóng cụ thể đó phải vượt quá 15 %. 10. Tính kết quả 10.1. Yêu cầu chung Tính hàm lượng furazolidon của dịch chiết mẫu bằng cách so sánh chiều cao pic hoặc diện tích pic của sắc phổ của dịch chiết mẫu với trung bình chiều cao pic hoặc diện tích pic của dung dịch làm việc furazolidon được bơm trước và sau dịch chiết mẫu. Dùng các kết quả thu được với dung dịch làm việc furazolidon có hàm lượng furazolidon phù hợp nhất. 10.2. Thức ăn chăn nuôi có hàm lượng furazolidon từ 25 mg/kg đến 5000 mg/kg Tính hàm lượng furazolidon trong mẫu thức ăn chăn nuôi ( w f ) bằng công thức sau: Trong đó W f­ là hàm lượng furazolidon của mẫu thử, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg); h là chiều cao pic thu được từ dịch chiết mẫu, tính bằng đơn vị đo chiều dài; h s là chiều cao pic thu được từ dung dịch làm việc furazolidon, tính bằng đơn vị đo chiều dài; r s là hàm lượng furazolidon của dung dịch làm việc furazolidon, tính bằng microgam trên mililit ( m g/ml); V là tổng thể tích của dung môi chiết được bổ sung vào phần thử, tính bằng mililit (ml); m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g); f là hệ số pha loãng của dịch chiết mẫu (xem 8.4). CHÚ THÍCH Cách khác, có thể sử dụng diện tích pic thay cho chiều cao pic trong phần tính toán. Làm tròn kết quả đến 1 mg/kg. 10.3. Premix có chứa furazolidon đến 20% phần khối lượng Tính phần khối lượng furazolidon trong premix ( w fp ) bằng công thức sau: Trong đó W f­p là phần khối lượng của furazolidon trong mẫu thử, tính bằng phần trăm [%(m/m)]; h là chiều cao pic thu được từ dịch chiết mẫu, tính bằng đơn vị đo chiều dài; h s là chiều cao pic thu được từ dung dịch làm việc furazolidon, tính bằng đơn vị đo chiều dài; r s là hàm lượng furazolidon của dung dịch làm việc furazolidon, tính bằng microgam trên mililit ( m g/ml); V là tổng thể tích của dung môi chiết được bổ sung vào phần thử, tính bằng mililit (ml); m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g); f là hệ số pha loãng của dịch chiết mẫu (xem 8.3.3, 8.3.4 hoặc 8.3.5); f u là hệ số hiệu chỉnh các đơn vị, tính bằng kg.mg -1 .% ( f u =1 kg.mg -1 .%). CHÚ THÍCH Cách khác, có thể sử dụng diện tích pic thay cho chiều cao pic trong phần tính toán. Làm tròn kết quả đến 0,01 % (khối lượng) 11. Độ chụm 11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm Các chi tiết của phép thử nghiên cứu phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục B. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu. 11.2. Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn: - 8 % trung bình của hai kết quả thử nghiệm đối với hàm lượng furazolidon từ 80 mg/kg đến 300 mg/kg. - 10 % trung bình của hai kết quả thử nghiệm đối với phần khối lượng furazolidon từ 4 % đến 6 % [4 % (khối lượng) đến 6 % khối lượng)]. 11.3. Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử nghiệm đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau do hai phòng thử nghiệm khác nhau thực hiện, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn: - 17 % trung bình của hai kết quả thử nghiệm đối với hàm lượng furazolidon từ 80 mg/kg đến 300 mg/kg. - 20 % trung bình của hai kết quả thử nghiệm đối với phần khối lượng furazolidon từ 4 % đến 6 % [4 % (khối lượng) đến 6 % (khối lượng)]. 12. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra được: - mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu; - phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; - phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả; - kết quả thử nghiệm thu được, hoặc - nếu độ lặp lại được kiểm tra thì hai kết quả cuối cùng thu được. PHỤ LỤC A (tham khảo) VÍ DỤ VỀ SẮC ĐỒ CHÚ DẪN A Mẫu chuẩn, 12,1 m g/ml B Mẫu trắng C Thức ăn trắng đã thêm chuẩn, 242 mg/kg S Mẫu (thực tế) Hình A.1 PHỤ LỤC B (tham khảo) CÁC KẾT QUẢ CỦA PHÉP THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM Độ chụm của phương pháp thiết lập bởi một phép thử liên phòng thử nghiệm được tiến hành theo ISO 5725 [2]. Trong phép thử này, có 30 phòng thử nghiệm từ 7 nước Châu Âu đã tham gia; thực hiện trên 14 mẫu (gồm cả 3 mẫu trắng). Các mẫu được lựa chọn dựa trên thông tin về việc sử dụng chúng trong một số nước. Các kết quả được nêu trong Bảng B.1 và B.2. Bảng B.1 - Các kết quả thống kê của phép thử liên phòng thử nghiệm trên thức ăn chăn nuôi Thông số Mẫu [1] ) Pi6 Pi7 Ra9 Ch11 Ch12 Ca13 Fi14 Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi loại trừ ngoại lệ 27 29 28 29 28 29 28 Hàm lượng furazolidon trung bình, mg/kg 199 274 89 92 189 190 2853 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , mg/kg 2,8 3,9 2,4 2,8 3,6 5,9 57,6 Hệ số biến thiên của độ lặp lại, % 1,4 1,4 2,7 3,0 1,9 3,1 2,0 Giới hạn lặp lại, r ( r = 2,8 s r ), mg/kg 7,9 8,5 6,8 7,9 10,2 16,7 163,0 Độ lệch chuẩn tái lập, S R , mg/kg 9,9 12,1 6,9 7,4 10,6 13,6 173,4 Hệ số biến thiên của độ tái lập, % 5,0 4,4 7,7 8,0 5,6 7,1 6,1 Giới hạn tái lập, R ( R = 2,8 r r ), mg/kg 28,0 34,2 19,5 22,4 28,9 47,3 490,7 Pi6: thức ăn cho lợn có chứa hàm lượng natri sulfadimidin 400 mg/kg; Pi7: thức ăn cho lợn; Ra9: thức ăn cho thỏ có chứa hàm lượng robenidin 66 mg/kg và hàm lượng flavophospholipol 4 mg/kg; Ch11: thức ăn chăn nuôi cho gà broiler có hàm lượng chất béo trung bình; hàm lượng avoparcin 15 mg/kg và hàm lượng natri salinomycin 60 mg/kg; Ch12: thức ăn chăn nuôi cho gà broiler có hàm lượng chất béo cao; hàm lượng avoparcin 15 mg/kg và hàm lượng natri salinomycin 60 mg/kg; Ca13: thức ăn thay thế sữa dùng cho bê có hàm lượng clotetraxylin 200 mg/kg; Fi14: thức ăn cho cá. Bảng 2 - Các kết quả thống kê của phép thử liên phòng thử nghiệm với premix Thông số Mẫu 1) P1 P2 P3 P4 Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi đã loại trừ 29 29 29 29 Hàm lượng furazolidon trung bình, mg/kg 3,89 6,21 3,72 19,9 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r , mg/kg 0,14 0,20 0,22 0,38 Hệ số biến thiên của độ lặp lại, % 3,6 3,2 5,9 1,9 Giới hạn lặp lại, r ( r = 2,8 s r ), mg/kg 0,40 0,57 0,62 1,08 Độ lệch chuẩn tái lập, S R , mg/kg 0,26 0,45 0,30 0,82 Hệ số biến thiên của độ tái lập, % 6,58 7,23 8,05 4,13 Giới hạn tái lập, R ( R = 2,8 r r ), mg/kg 0,74 1,27 1,75 2,32 1) P1 và P2: premix dùng bột ngô làm chất mang; P3: Premix có bột ngô làm chất mang và hàm lượng natri sulfadimidin 8 % (khối lượng); P4: Premix dùng canxi carbonat làm chất mang. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Keukes, H.J., Aerts, M.M.L.and Strating, K. (1994) (inpress). [2] Sop A0520, state institute for quality control of agricultural products (RIKILT-DLO), agricultural reseach deparment, the netherlands. [3] Lowie, Jr., D.M., Teague, Jr., R.T., Quick, F.E. and Foster, C.L. J.AOAC, 66, 1983, pp.602-605. [4] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu [5] ISO 5725:1986 Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests. [6] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung. [7] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn. [1] ) ISO 5725:1986 (hiện nay đã hủy) được dùng để thu dữ liệu về độ chụm.