TCVN5283:1990

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5283:1990 về thức ăn chăn nuôi - phương pháp xác định hàm lượng triptophan TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5283:1990 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TRIPTOPHAN Animal feeding stuffs - Methods for determination of triptophan content 1. Nguyên tắc của phương pháp Cắt liên kết peptit của protein bằng kiềm khi đun nóng và tách triptophan trên cột sắc ký trao đổi ion của máy phân tích axit amin. Phức tạo thành trong phản ứng với thuốc thử ninhydrin có cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng axit amin trong dung dịch 2. Lấy mẫu Lấy mẫu để thử theo TCVN 4325-86 3. Dụng cụ và hóa chất 3.1. Dụng cụ - Máy phân tích axit amin; - Máy nghiền mẫu; - Máy cắt mẫu thực vật; - Rây với đường kính lỗ 1mm theo TCVN 2230 - 77; - Nồi hấp; - Tủ sấy tự ngắt có nhiệt độ 110 ± 2 0 C; - Cân phân tích có độ chính xác đến 0,0002 g; - Máy đo pH; - Ampun thủy tinh có chỗ thắt, dung tích 20ml; - Bình định mức dung tích 50; 100; 1000 ml; - Phễu lọc thủy tinh đường kính 2 - 3 cm; - Pipét chia độ dung tích 1, 2, 5, 10 ml; - Đũa thủy tinh; - Giấy lọc không tro, băng xanh đường kính 6 - 8 cm. 3.2. Hóa chất - Bộ thuốc thử cho máy phân tích axit amin; - Axit amin chuẩn (triptophan); - Axit clohydric đặc (d = 1,19 g/ml), TKHH; - Cồn etylic; - Natri xitrat, TKHH hay TKPT; - Phenol, TKPT; - Natri hydroxit, TKHH; - Bary hydroxit ngậm 8 phân tử nước Ba(OH) 2 .8H 2 O; TKHH; - Natricacbonat (khan), TKHH; - Propanol - 2 (rượu izo propylic); - Nước cất hay nước có độ tinh khiết tương đương. 4. Chuẩn bị thử 4.1. Chuẩn bị mẫu để thử Mẫu cỏ khô, thức ăn ủ, thức ăn xanh được cắt thành từng đoạn dài 1 - 3cm. Thức ăn củ quả được cắt thành lát mỏng có độ dày 0,8 cm. Đảo đều mẫu đã cắt trên mảnh nilon và từ những chỗ khác nhau lấy một lượng mẫu để sao cho sau khi sấy có khoảng 100 g mẫu. Sấy mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ 60-65 0 C đến khối lượng không đổi (trạng thái khô không khí). Sau khi sấy, nghiền mẫu và sàng qua rây có đường kính lỗ rây 1 mm. Phần còn lại không lọt qua rây được cắt nhỏ bằng kéo hay nghiền trong cối sứ, sau đó đem trộn đều với phần đã lọt qua rây. Mẫu thức ăn hỗn hợp, thức ăn hạt, khô dầu, bột từ thân lá cây xanh được nghiền nhỏ không cần sấy trước và sau đó sàng qua rây. Những mẫu đã chuẩn bị được bảo quản trong bình thủy tinh hay bình polyetylen có nút đậy kín, để ở nơi khô ráo. 4.2. Chuẩn bị dung dịch và thuốc thử 4.2.1. Chuẩn bị dung dịch đệm với pH = 2,2 Hòa tan 19,6 natri xitrat trong 200 - 300 ml nước cất, thêm vào đó 16,6 ml axit clohydric đặc, 1g phenol và đưa thể tích đến 1000 ml bằng nước cất. Nồng độ ion hydro được kiểm tra trên máy đo pH và khi cần thiết, điều chỉnh pH bằng dung dịch natri hydroxit 50% hay bằng axit clohydric đặc. 4.2.2. Chuẩn bị dung dịch natri cacbonat 10%. Hòa tan 100 g natri cacbonat khan trong 900 ml nước cất và trộn đều. 4.3.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn triptophan Cân 125 mg triptophan với độ chính xác đến 0,0002g, hòa tan bằng dung dịch rượu izopropylic trong nước (tỷ lệ 1:9) và đưa thể tích bình định mức đến 50 ml. 1 ml dung dịch này chứa 2,5 mg triptophan. 5. Tiến hành thử 5.1. Thủy phân mẫu Cân 200 mg mẫu đã chuẩn bị theo mục 4.1 với độ chính xác đến 0,0002g, cẩn thận đổ vào đáy ampun có chỗ thắt, nhỏ thêm 2-3 giọt cồn etylic và cho vào đó 1,6 g bari hydroxit mới tán trong cối sứ. Sau đó thêm vào 5 ml nước cất. Ampun được hàn lại tại chỗ thắt trên ngọn lửa ga và đặt vào tủ sấy đã được sấy nóng trước đó có nhiệt 110 0 C. Tiến hành thủy phân trong 16 giờ. Kết thúc quá trình thủy phân, cẩn thận lắc đều ampun làm lạnh đến nhiệt độ phòng, sau đó đặt vào tủ lạnh trong khoảng 1,5 - 2 giờ. Lọc dịch thủy phân qua phễu thủy tinh với giấy lọc không tro. Dùng pipet hút 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm nhỏ và cho vào đó 1ml dung dịch natri cacbonat 10% để kết tủa ion bari còn lại. Đậy nắp ống nghiệm và bảo quản trong tủ lạnh. Trước khi nhỏ lên cột sắc ký cần chỉnh pH của dịch thủy phân đến 2,2 bằng cách nhỏ vào dịch thủy phân một vài giọt axit clohydric đặc đến pH bằng 2,2 và rót vào đó một lượng dung dịch đệm pH bằng 2,2 đúng bằng thể tích dịch thủy phân. Khi tính toán kết quả phải kể tới yếu tố pha loãng này. 5.2. Tiến hành phân tích trên máy Đưa dịch thủy phân vào cột sắc ký của máy phân tích axit amin, để xây dựng sắc ký đồ chuẩn cần nhỏ lên cột dung dịch chuẩn triptophan với một lượng đúng bằng thể tích dịch thủy phân của mẫu thử. Việc phân tích thực hiện theo chương trình ngắn với việc sử dụng dịch đệm để tách các axit amin cơ bản theo quy trình trên máy phân tích axit amin. Kết quả nhận được sắc ký đồ với các píc có diện tích tỷ lệ với nồng độ axit amin. Diện tích píc (S) được tính như diện tích hình tam giác - bằng chiều cao của píc x 1/2 chiều rộng và tính hàm lượng triptophan dựa vào kết quả so sánh diện tích píc của dung dịch chuẩn triptophan với diện tích píc của mẫu phân tích. 6. Tính toán kết quả 6.1. Hàm lượng axit amin - triptophan (X 1 ) biểu thị bằng g/1kg mẫu thử ở dạng khô không khí được tính theo công thức: Trong đó: C - nồng độ triptophan trong dung dịch chuẩn, tính bằng mg/ml; S tp - diện tích pic triptophan của mẫu phân tích, tính bằng mm 2 ; V - Thể tích cuối cùng của dịch thủy phân, tính bằng ml; n - hệ số pha loãng S te - diện tích pic triptophan của dung dịch chuẩn, tính bằng mm 2 ; m - khối lượng của mẫu thử lấy để thủy phân, tính bằng mg. Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của hai lần xác định song song. Sự sai thác cho phép giữa hai lần xác định song song này ở xác suất tin cậy P =0,95 không được vượt quá 10% giá trị trung bình. 6.2. Hàm lượng triptophan (X 2 ) biểu thị bằng gam trên 1kg vật chất khô của mẫu thử được tính theo công thức: Trong đó: X 1 - lượng triptophan trong mẫu thử ở dạng khô không khí, tính bằng g/kg; W - độ ẩm của mẫu thử, tính bằng %.