TCVN11203:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11203:2016 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng oxytetracyclin/oxytetracyclin hydrochloride bằng phương pháp sắc kí lỏng TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 11203:2016 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG OXYTETRACYLIN/OXYTETRACYCLIN HYDROCHLORIDE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG Animal feeding stuffs - Determination of oxytetracyline/oxytetracycline hydrochloride content by liquid chromatographic method L ờ i nói đầu TCVN 11203:2016 được xây dựng dựa theo AOAC 2008.09 Oxytetracycline/Oxytetracycline Hydrochloride in Animal Feed, Fish Feed and Animal Remedies. Liquid Chromatography; TCVN 11203:2016 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG OXYTETRACYLIN/OXYTETRACYCLIN HYDROCHLORIDE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG Animal feeding stuffs - Determination of oxytetracyline/oxytetracycline hydrochloride content by liquid chromatographic method CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác g â y nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đ ưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này cần thiết lập các thao tác an toàn thích hợp v à xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước kh i sử dụng tiêu chuẩn. 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký l ỏ ng để xác định hàm lượng oxytetracyclin/oxytetracyclin hydrochloride có trong thức ăn chăn nuôi và premix khoáng với hàm lượng bằng hoặc l ớ n hơn 2 mg/kg và trong thức ăn cho thủy sản với hàm lượng bằng hoặc lớn hơn 10 mg/kg. Các kết quả của phép th ử liên phòng th ử nghiệm được n ê u trong Phụ lục B. 2 Tài liệu viện dẫn Các t à i liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài li ệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có). TCVN 6952 (ISO 9498) Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử. 3 Nguyên tắc Chiết oxytetracyclin hydrochloride (OTC.HC l ) ra khỏi các mẫu đ ã nghiền bằng dung dịch metanol trong môi trường axit, sử dụng máy khuấy cơ học. Sau đó ly tâm 5 min ở lực ly tâm 1230g (khoảng 2 000 r/min với bán kính quay 275 mm) và một phần dịch chiết được pha loãng bằng nước (4.4) và/hoặc bằng dung dịch metanol trong môi trường axit sao cho nồng độ OTC.HC l x ấ p x ỉ với nồng độ của dung dịch chuẩn làm việc các dung dịch thu được chứa í t nhất 50 % nước. ( Các dung dịch mẫu th ử pha loãng cuối cùng trong một mẻ c ầ n chứa cùng một tỷ lệ phần trăm nước phù hợp với các dung dịch hiệu chuẩn. Hình dạng của pic được cải thiện khi tăng hàm lượng nước). Dịch chiết được lọc và phân tích bằng sắc kí lỏng (LC) pha đảo có detector huỳnh quang. Việc phát hiện dựa vào đặc tính tạo chelat của oxytetracyclin (OTC) với các ion kim loại hóa tr ị hai tạo thành các hợp chất chelat phát huỳnh quang. Gradient pha động gồm có dung dịch đệm chứa natri a xetat, axit dinatri etylend i amin tetraaxetat (EDTA) ngậm hai phân t ử nước và canxi clorua dùng metanol làm pha hữu cơ. Natri axetat và EDTA được dùng làm dung dịch đ ệm, EDTA và canxi clorua kết hợp với OTC.HC l tạo thành phức chất có kh ả năng phát huỳnh quang. 4 Thuốc thử 4.1 Canxi clorua ngậm hai phân tử nước. 4.2 Metanol , loại dùng cho LC hoặc loại tương đương. 4.3 Dung dịch axit clohydric (HC l ), 12 M. 4.4 Nước , đ ã loại khoáng dùng cho LC hoặc loại tương đương. 4.5 Natri hydroxit (NaOH), dạng viên. 4.6 Dinatri EDTA. 4.7 Natri axetat ngậm ba ph ầ n t ử nước (CH 3 C OO Na.3H 2 O ). 4.8 Dung dịch natri hydroxit , 40 % (khối lượng/thể tích) Hòa tan 40 g natri hydroxit (4.5) vào 100 ml nước (4.4). 4.9 Dung dịch gradient pha động : natri axetat 0,1 M, canxi clorua 0,055 M và dinatri EDTA 0,020 M Hòa tan 7,44 g dinatri EDTA ngậm hai phân tử nước (4.6) trong khoảng 600 m l nước (4.4) và 7 ml dung dịch natri hydroxit 40 % (4.8). Sau đó, hòa tan 8,08 g canxi clorua ngậm hai phân tử nước (4.1) và 13,6 g natri axetat ngậm ba phân t ử nước (4.7). Chỉnh pH đến 6,5 bằng dung dịch axit clohydric (4.11) và thêm nước (4.4) đến 1 lít. Lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45 µm (5.5) bằng chân không. Dung dịch n à y được chuẩn bị trong ngày sử dụng hoặc được bảo quản lạnh để ngăn vi khuẩn phát triển. Pha động được loại khí bằng cách thổi khí heli hoặc dùng bộ khử khí chân không (xem 5.8). 4.10 Dung dịch chiết , metanol trong môi trường axit (tỷ lệ 1:50). Cho 20 m l dung dịch axit clohydric (4.3) vào 1 lít metanol (4.2). 4.11 Dung dịch axit clohydric (HC l ) , 1 M Thêm từ từ 83 ml dung dịch axit clohydric (4.3) vào 800 ml nước (4.4) đựng trong b ì nh định mức 1 lít , vừa thêm vừa khuấy, đ ể nguội đến nhiệt độ phòng rồi thêm nước đến vạch. 4.12 Dung dịch axit clohydric(HC l ) , 0,01 M Pha loãng dung dịch axit clohydric 1 M (4.11) bằng nước (4.4) với tỷ lệ 1/100. 4.13 Chất chuẩn OTC. 4.14 Dung dịch chuẩn gốc, 1000 µg/ml C â n 25 mg chất chuẩn OTC (4.14), chính xác đến ba chữ số thập phân cho vào bình định mức 25 ml, thêm 3 ml metanol (4.2), hòa tan và thêm dung dịch axit clohydric 0,01 M (4.12) đến vạch. Bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch này có thể bền trong ba tuần. Nồng độ OTC có trong dung dịch gốc, C s , tính bằng microgam trên mililit (µg/ml) theo công thức sau: Trong đó: w s là kh ố i lượng của chất chuẩn, tính bằng miligam (mg); P là độ tinh khiết của chất chuẩn, được ghi trên nhãn (ví dụ: 919 µg OTC/mg); 1,08 là s ố microgam OTC.HC l tươ n g ứng với 1 µg OTC; V s là dung tích bình định mức, tính b ằ ng mililit ( ở đây V s = 25 ml). 4.15 Dung dịch chuẩn trung gian A , 100 µg/ml Dùng pipet lấy 10,0 m l dung dịch chuẩn gốc (4.14) cho vào bình định mức 100 ml, th ê m dung dịch metanol trong môi trường axit (4.10) đến vạch. Bảo quản trong tủ lạnh đông hoặc trong t ủ lạnh. Dung dịch này có thể bền trong ba tuần. 4.16 Dung dịch chuẩn trung gian B , 10 µg/ml Dùng pipet lấy 5 , 0 ml dung dịch chuẩn trung gian A (4.15) cho vào bình định m ứ c 50 ml thêm dung dịch metanol trong môi trường ax i t (4.10) đến vạch. Bảo quản trong tủ lạnh đông hoặc trong t ủ lạnh. Dung dịch n à y có thể bền trong ba tuần. 4.17 Các dung dịch chu ẩ n LC , 0,2 µg/ml, 0,6 µg/ml, 1,2 µg/ml, 2,4 µg/ml, 4,0 µg/ml và 5,0 µg/ml Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn LC như trong Bảng 1, tùy thuộc vào nồng độ của mẫu cần phân tích. Đối với các mẫu bổ sung thuốc, bỏ qua dung dịch chuẩn LC 1 và đối với mẫu dạng vết th ì bỏ qua dung dịch chuẩn LC 6. Pha loãng dung dịch chuẩn trung gian A (4.15) và B (4.16) bằng nước đã loại khoáng (4.4) và/hoặc dung dịch metanol trong môi trường axit (4.10), sao cho dung dịch này chứa ít nh ấ t 50 % nước. VÍ DỤ: Đ ể chu ẩ n bị dung dịch chuẩn OTC 5 µg/ml, cho 5 ml dung dịch chuẩn trung gian A (100 µg/ml) (4.15) vào bình định mức 100 ml , thêm từ từ 45 ml dung dịch metanol trong môi trường axit (4.10), thêm nước đã loại ion (4.4), trộn kỹ và thêm nước đến vạch. Bảo quản dung dịch này trong tủ đá hoặc tủ lạnh. Dung dịch này có thể bền trong ba tuần. 4.18 Dung dịch chu ẩ n làm việc , chuẩn bị theo Bảng 1. Bảng 1 - Chuẩn b ị dung dịch chuẩn làm việc Dung dịch chuẩn trung gian Dung tích b ì nh định mức, ml Dung dịch chuẩn LC Dung dịch s ử dụng Th ể tích, ml Nồng độ, µg/ml Dung dịch sử dụng 4.16 1,0 50 0,20 Dung dịch chuẩn LC 1 4.16 3,0 50 0,60 Dung dịch chuẩn LC 2 4.16 3,0 25 1,2 Dung dịch chuẩn LC 3 4.16 6,0 25 2,4 Dung dịch chuẩn LC 4 4.16 10,0 25 4,0 Dung dịch chuẩn LC 5 4.15 5,0 100 5,0 Dung dịch chuẩn LC 6 5 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thủy tinh của phòng thử nghiệm thông thường và cụ th ể như sau: 5.1 B ì nh nón , dung tích 250 ml. 5.2 Pipet, ống đong chia độ, bình định mức , dung tích 50 ml, 100 ml 5.3 Chai và ống ly tâm bằng polyproetylen, dung tích 50 m l và 250 ml. 5.4 Bộ lọc dung dịch thử b ằ ng nylon , đường k í nh 25 mm, cỡ l ỗ 0,45 µm. 5.5 Bộ lọc b ằ ng thủy tinh , để lọc dung môi và bộ lọc b ằ ng nylon đường kính 47 mm, cỡ lỗ 0,45 µm hoặc loại t ư ơng đương. 5.6 Máy lắc. 5.7 Cân phân tích , có thể đọc đến 0,0001 g. 5.8 Hệ thống sắc kí lỏng , gồm có các bộ phận sau: - Bơm có độ xung thấp hoặc bơm được trang bị bộ giảm xung, duy trì tốc độ dòng từ 0,5 ml/min đến 1,5 ml/min; - Bộ lấy mẫu tự động, có vòng bơm để bơm các thể t í ch 20 µl; - Cột phân tích C18, kích thước 4,6 mm x 150 mm, cỡ hạt 5 µm hoặc loại tương đương có cột bảo vệ C18. - Detector huỳnh quang, l à m việc ở bước sóng k í ch thích 390 nm và bước sóng phát xạ 512 nm; - Hệ thống tích phân hoặc hệ thống ph â n tích dữ liệu LC; - Bộ khử khí (tùy chọn). 5.9 Máy ly tâm , có th ể vận hành ở lực ly tâm 1230g. 6 Lấy mẫu M ẫ u gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. M ẫ u không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu. 7 Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498). Mẫu thức ă n khô được nghiền cho đến khi lọt hết qua sàng cỡ lỗ 1 mm, không làm nóng mẫu. 8 Cách tiến hành 8.1 Chiết mẫu Cân một lượng mẫu thử thích hợp, lấy đến hai chữ số thập phân, cho vào ống ly t â m 250 ml (5.3). Cân 20 g phần mẫu thử đối với các mẫu bị nhiễm OTC ở mức nh ỏ hơn 10 mg/kg, c â n 10 g mẫu th ử đối với mẫu chứa hàm lượng OTC từ 10 mg/kg đến 1 000 mg/kg v à cân 2 g mẫu th ử đối với mẫu chứa hàm lượng OTC trên 1 000 mg/kg. Đối v ớ i các mẫu có thuốc, chuẩn bị mẫu ki ể m soát (50 mg/kg) bằng cách bổ sung 5 ml dung dịch chuẩn trung gian A [100 µg/ml (4.15)] vào 10 g mẫu trắng, cần phân tích mẫu kiểm soát với mỗi dãy mẫu bổ sung thuốc khi có thể. Đối với các mẫu bị nhiễm, chuẩn bị mẫu kiểm soát b ằ ng cách bổ sung 4 ml dung dịch chuẩn trung gian B [10 µg/ml] (4.16) vào 20 g mẫu trắng. Mẫu trắng cần được phân tích mỗi khi bắt đầu phương pháp để kiểm tra các chất gây nhiễu. Bổ sung 100 ml dung m ô i chiết (3.10), lắc trên máy lắc (5.6) trong 45 min đến 60 min. Ly tâm 5 min ở lực ly tâm 1230g hoặc cho đến khi phần phía trên trong suốt. Pha loãng phần dịch chiết bằng nước (4.4) và/hoặc dung môi chiết sao cho nồng độ OTC trong dung dịch th ử xấp xỉ như trong dung dịch chuẩn LC v à dung dịch pha lo ã ng cuối cùng của dịch chiết chứa ít nhất 50 % nước. CHÚ THÍCH: Các dung dịch thử pha lo ã ng cuối cùng trong một mẻ cần chứa cùng một t ỷ lệ nước v à phải phù hợp với các dung dịch hiệu chu ẩ n. Khi t ỷ lệ nước tăng thì h ì nh dạng pic được cải thiện. Cần chuẩn bị các dãy pha loãng bằng cách pha loãng các lượng nh ỏ (< 4="" ml).="" các="" bảng="" so="" sánh=""> trăm sai số tương đối đối với các sơ đồ pha loãng khác nhau là có sẵn. V í dụ: lấy 5 ml dịch chiết c ủ a mẫu chứa 100 mg/kg cho vào bình định mức 100 ml (5.2) và thêm nước (4.4) đến vạch. Đ ể dung dịch nguội đến nhiệt độ phòng, sau đó thêm nước đến vạch, nếu cần. Đối với m ẫ u có hàm lượng OTC nhỏ hơn hoặc bằng 110 mg/kg thì pha loãng 5 ml dịch chiết bằng nước (4.4) đến 10 ml. So sánh với dung dịch chuẩn làm việc LC thích hợp có nồng độ gần giống nồng độ dịch pha loãng nhất. Đối với các mẫu có hàm lượng OTC lớn hơn 110 mg/kg th ì xác định độ pha loãng, DF , t h eo công thức sau: Trong đó: C 1 là h à m lượng chất phân tích có trong mẫu, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg); C 2 l à nồng độ chất chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml); w là khối lượng phần mẫu th ử , tính bằng gam (g); V là th ể tích dịch chiết, t í nh bằng mililit (ml). Sử dụng giá trị 4 µg/ml làm nồng độ chu ẩ n, nồng độ dung dịch thử cuối cùng không lớn hơn 5 µg/ml vì nếu không sẽ nằm ngoài dải đường chuẩn (đối với các mẫu chứa hàm lượng vượt qu á lượng dự kiến), tuy nhiên, trong phép phân tích c ầ n sử dụng dung dịch chuẩn LC phù hợp nhất (4,0 µg/ml hoặc 5,0 µg/ml). V Í DỤ: N ế u C 1 = 440 mg/kg, C 2 = 4 µg/ml, w = 10 g và V = 100 ml thì độ pha loãng là: Chọn thể tích cuối cùng thích hợp, ví dụ: 50 ml (dung t í ch bình định mức) thì th ể tích dịch chiết, V 1 , t í nh theo mililit (ml) bằng: (có thể làm tròn đến 5) Cho 5,0 ml dịch chiết vào bình định mức 50 ml (5.2), thêm 20 ml dung môi chiết (4.10) và thêm nước (4.4) đến vạch. Hệ số pha loãng (DF) = 50/5. Lọc các dung dịch thử qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45 µm (5.4). Tốt nhất là chuẩn bị dịch chiết và phân tích trong ngày, nếu không, dịch chiết và dung dịch chuẩn l à m việc cần được bảo quản trong t ủ tạnh để phân tích vào ngày hôm sau. 8.2 Phép xác định LC 8.2.1 Điều kiện LC như sau: - Tốc độ dòng: 1,5m l /min; - Thể tích bơm: 20 µl; - Thông số detector: bước sóng kích thích 390 nm và bước sóng phát xạ 512 nm; - Điều kiện gradient pha động: xem Bảng 2. B ả ng 2 - Điều kiện gradient pha động Thời gian , min Metanol (4.2) , phần th ể t í ch Dung d ị ch gradient pha động (4.9), phần th ể tích 0 15 85 1 15 85 9 35 65 16 35 65 16,1 15 85 25 15 85 8.2.2 Yêu cầu về sự phù hợp của hệ thống như sau: - Thời gian lưu: từ 6 min đến 8 min; - Độ tuyến tính của đường chuẩn cần có hệ số tương quan ≥ 0,999 với giới hạn tin cậy 95 % của giao đi ể m trục y bao gồm điểm zero v à sai số chuẩn nhỏ hơn 0,1; - Hệ số kéo đuôi, T f (hệ số kéo đuôi USP hoặc hệ số đối xứng EP) phải nhỏ hơn hoặc bằng 1,5. Tính T f theo công thức sau: Trong đó: t là thời gian lưu, bằng thời gian tối đa của đường Gauss; t 1 là thời gian tương ứng với điểm 5 % phía trước pic cực đại (điểm 5 % là vị trí mà đáp ứng của một bên pic đạt đến chiều cao bằng 5 % so với chiều cao pic cực đại); t 2 là thời gian tương ứng với điểm 5 % phía sau pic cực đại. CHÚ THÍCH: Hệ thống d ữ liệu sắc k í đ ồ sẽ tính như trên cùng với các thông số pic khác. Ổ n định cột bằng pha động [hỗn hợp metanol (4.2) và dung dịch gradient pha động (4.9) với t ỉ lệ th ể tích 15 : 85] trong 60 min ở tốc độ 1,5 ml/min trước khi bơm dung dịch chuẩn và dung dịch th ử . Kiểm tra xác nhận các thông số thích hợp của hệ thống. Điều chỉnh các điều kiện gradient pha động để đạt được các thông số phù hợp của hệ thống, nếu cần. Nếu gặp phải các vấn đề về áp suất hoặc kết tủa thì có thể giảm lượng EDTA trong dung dịch pha động, cần xem xét về khả năng mất t í n hiệu và c ó thể làm cho pic OTC rộng ra. Tốc độ dòng cũng có thể phải giảm để giảm thi ể u áp suất cao. Bơm 20 µl mỗi dung dịch th ử . Pha loãng nếu cần, để có diện tích pic OTC tương tự diện tích pic của chất chuẩn. Bơm 20 µl dung dịch chuẩn LC sau 3 hoặc 4 lần bơm dung dịch mẫu thử. Đ ể sử dụng hiệu chuẩn một điểm, dựa vào diện tích pic trung bình của các chất chuẩn trong từng mẫu để tính nồng độ của mẫu thử. Đối với các mẫu dạng vết, sử dụng các dung dịch chuẩn LC 1, dung dịch chuẩn LC 2 hoặc dung dịch chu ẩ n LC 3 (4.17). Cách khác, có thể sử dụng đường chuẩn 5 điểm để định lượng các dung dịch mẫu thử nếu không có độ lệch trong quá trình vận hành. Bơm 5 dung dịch chuẩn LC (4.17) thích hợp khi bắt đầu và cuối mỗi dãy mẫu, t í nh trung bình các diện tích pic của từng dung dịch chuẩn và dựng đường chuẩn. Từng dung dịch chuẩn (4,0 µg/ml hoặc 5,0 µg/ml) cần bơm định kỳ đ ể kiểm tra độ trôi. Các v í dụ về sắc k í đồ đối với dung dịch chuẩn hiệu chuẩn OTC 2,4 µg/ml nêu trong Hình A.1; sắc k í đồ c ủ a mẫu thức ăn cho g à giò chứa hàm lượng OTC 49 mg/kg n ê u trong Hình A.2; sắc kí đồ của mẫu thức ăn cho trâu bò chứa 430 mg/kg nêu trong Hình A.3 và sắc kí đồ của chất thay thế sữa chứa 310 mg/kg nêu trong H ì nh A.4. Khi kết thúc một dãy mẫu thử, rửa hệ thống LC bằng hỗn hợp metanol trong nước (t ỉ lệ th ể tích 15 : 85) ít nhất 1 h rồi bằng metanol 70 % trong 30 min, sau đó tắt hệ thống. Đối với bơm có khóa th ổ i ngược, rửa pittong bằng nước sau mỗi dãy mẫu. CHÚ THÍCH: Pic của epi-OTC tách tốt trước pic OTC, pic ở khoảng th ờ i gian lưu 4,8 min có th ể có mặt của epi-OTC. 8.3 Dựng đ ường chuẩn Kiểm tra độ tuyến tính của hệ thống, sử dụng ít nhất 5 dung dịch chuẩn LC (4.17). Dựng đường chuẩn diện tích pic th e o nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml). Độ tuyến t í nh của đường chuẩn cần có hệ số tương quan ≥ 0,999 với giới hạn tin cậy 95 % của giao điểm trục y bao gồm điểm 0 và sai số chu ẩ n nhỏ hơn 0,1: hệ số kéo đuôi T f (hệ số kéo đuôi USP hoặc hệ số đối xứng EP) phải nhỏ hơn hoặc b ằ ng 1,5. 9 Tính và biểu thị kết quả 9.1 Tính kết qu ả Hàm lượng OTC.HC l trong mẫu th ử dạng rắn, X 1 , t í nh bằng mi l igam trên kilogam (mg/kg) theo công thức sau: H à m lượng OTC trong mẫu thử dạng lỏng, X 2 , tính bằng microgam trên mililit (µg/ml) theo công thức sau: Trong đó: A là diện tích pic của chất phân tích; A s là diện tích pic của chất chuẩn; C s là nồng độ của chất chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml); w là khối lượng mẫu thử dạng rắn, tính b ằ ng gam (g); V l à th ể tích của dung dịch mẫu thử dạng lỏng, t í nh bằng mililit (ml); 1,08 là hệ số chuy ể n đổi OTC.HC l sang OTC; V E là th ể tích của dung môi chiết dùng cho các mẫu thêm chuẩn, tính bằng mililit (trong trường hợp này V E = 100 ml); DF là hệ số pha loãng. VÍ DỤ: M ẫ u dạng rắn c ó hàm lượng OTC 220 mg/kg cần được pha loãng bốn lần để phù hợp với dung dịch chu ẩ n làm việc. Diện t í ch pic của mẫu = 19 626; diện t í ch pic của dung dịch chuẩn = 21 598; nồng độ của dung dịch chu ẩ n = 5,00 µg/ml; t ổ ng thể tích = 100 ml; D F = 25/6, khối lượng phần mẫu thử = 10,01 g thì hàm lượng OTC.HC l tính được như sau: Các phép tính có thể được thực hiện sử dụng giá trị trung bình của các lần bơm dung dịch chuẩn riêng rẽ như trên hoặc sử dụng đường hồi quy tuyến tính. 9.2 Biểu thị kết quả Báo cáo kết quả đến ba chữ số sau dấu phẩy đối với hàm lượng OTC.HC l bằng hoặc lớn hơn 10 mg/kg v à đến hai chữ số có nghĩa đối với hàm lượng OTC.HC l nhỏ hơn 10 mg/kg. 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo th ử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đ ủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp th ử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết qu ả ; e) kết quả th ử nghiệm thu được. Phụ lục A (Tham khảo) Các ví dụ về sắc kí đồ đặc trưng Hình A.1 - V í dụ về sắc k í đồ của dung dịch chuẩn hiệu chuẩn OTC 2,4 µg/ml Hình A.2 - Ví dụ về sắc kí đ ồ của mẫu thức ăn cho gà giò chứa hàm lượng OTC 49 mg/kg Hình A.3 - Ví dụ về sắc kí đ ồ của mẫu thức ăn cho trâu bò chứa hàm lượng OTC 430 mg/kg Hình A.4 - Ví dụ về sắc kí đồ của chất thay thế sữa chứa hàm lượng OTC 310 mg/kg Phụ lục B (Tham khảo) Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm Bảng B.1 - Kết qu ả thử nghiệm liên phòng về x á c định oxytetracyclin trong thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản Thức ăn cho cá hồi Thức ăn cho bê AAFCO-200425 Thức ăn cho cá da trơn AAFCO Thức ăn thay thế sữa AAFCO30 Thức ăn cho lợn Thức ăn cho gà thịt AAFCO-200331 Thức ăn cho lợn AAFCO H à m lượng trung bình, mg/kg 11 600 293 1070 215 4,82 14,2 46,2 Số lượ ng ph ò ng thử nghiệm 10 11 10 9 8 10 9 Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ 1 0 1 2 3 1 2 Độ lệch chuẩn lặp lại, S r , mg/kg 181 9,04 42,5 7,98 0,44 1,31 2,3 Độ l ệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r , % 1,56 3,08 3,96 3,71 9,2 9,21 4,98 Độ lệch chuẩn tái lập, S R , mg/kg 570 13,6 42,5 8,31 0,59 1,84 3,3 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R , % 4,92 4,65 3,96 3,87 12,3 12,9 7,16 C hỉ số HorRat 1,26 0,68 0,71 0,54 0,97 1,2 0,8 Hàm lượng công bố trên nhãn, mg/kg 11 000 440 1250 220 - - 55 Độ thu hồi, % 105,5 66,6 85,6 97,7 - - 84,0