TCVN8400-28:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-28:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn clostridium perfringens TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8 400 - 28 :201 4 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 28: BỆNH VIÊM RUỘT HOẠI TỬ DO VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 28: Necrotic enteritis cause by clostridium pe rf ringens L ờ i nói đầu TCVN 8400-28:2014 do Trung tâm Ch ẩ n đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y b i ên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, T ổ ng cục Tiêu chu ẩ n Đo lư ờ ng Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CH Ẩ N ĐOÁN - PH Ầ N 28: BỆNH VIÊM RUỘT HOẠI TỬ DO VI KHU Ẩ N CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 28: Necrotic Enteritis cause by Clostridium pe rf ringens CẢNH BÁO - Việc áp dụng ti ê u chuẩn này có th ể li ê n quan đến các vật liệu, thiết b ị và các thao tác gây nguy hiểm cho ngư ờ i xét nghiệm. Tiêu chuẩn này không th ể đ ư a ra được t ấ t cả các vấn đề an toàn li ê n quan đến việc sử dụng chúng. Khi áp dụng t i êu chuẩn người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thi ế t lập các thao tác phù hợp để đảm bảo an toàn sức khỏe và xác đ ị nh khả năng áp dụng các giới hạn quy đ ị nh. 1. Phạm vi áp dụng Ti ê u chu ẩ n này quy định quy trình ch ẩ n đoán bệnh viêm ruột hoại tử ở gà và lợn do vi khuẩn Clostr i dium per f r i ngens gây ra. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chu ẩ n này sử dụng thuật ngữ và đ ị nh nghĩa sau: Bệnh v i ê m ruột hoại tử ở gà, ở lợn Là bệnh truyền nhiễm, do vi khuẩn Clostr i dium per f r i ngens typ A và/hoặc typ C. Bệnh xảy ra chủ yếu ở gà ít ng à y tuổi, ở l ợn con theo mẹ. Clostridium perfringens (C. per f r i ngens) là vi khu ẩ n Gram dương, yếm khí có khả năng gây bệnh ở vật nuôi, động vật hoang dã và ở ngư ờ i. Vi khuẩn C . per fr ingens có kh ả năng sản sinh 16 loại độc tố. Dựa v à o khả năng s ả n sinh 4 loại độc tố chính là độc tố alpha ( a ), beta ( β ), epsilon ( ε ), lota (ι), vi khuẩn được chia thành 5 typ A, B, C , D, E (typ độc tố) (xem bảng 1). Bảng 1 - Các typ đ ộc t ố chính của vi khuẩn C . per f r i ngens Typ độc tố a β ε ι A + - - - B + + + - C + + - - D + - + - E + - - + CH Ú TH Í CH: có sản sinh độc tố (+); không sản sinh độc t ố (-) C . per f ringens typ A thư ờ ng có ở trong đư ờ ng ruột của gà, lợn khoẻ v ớ i số lượng nhỏ, khi gặp những điều kiện bất lợi như thay đ ổ i chế độ chăm sóc nuôi dưỡng, mật độ chăn nuôi cao hoặc nhiễm cầu trùng, vi khuẩn nhân lên nhanh chóng và sản sinh độc t ố (chủ y ế u là độc tố α) gây viêm ruột hoại t ử . C . per f ringens typ C hiếm khi phân lập được từ gà khỏe, lợn khỏe và độc tố α và β được xác định là yếu tố độc lực chủ y ế u trong quá trình sinh bệnh của C . per f ringens typ C . 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích; sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ các trường hợp có quy định khác. 3.1 . Môi trường nước thịt 3.2 . Thạch máu, thạch cơ bản được bổ sung từ 5 % đến 7 % máu cừu hoặc máu bê, hoặc máu thỏ (pha chế thạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất). 3.3 . Thạch máu Schaedler, thạch Schaedler được b ổ sung từ 5 % đến 7 % máu cừu hoặc máu bê, hoặc máu thỏ (pha chế thạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất). 3.4 . Túi tạo khí C O 2 , đảm bảo từ 5 % đến 10 % C O 2 trong dụng cụ nuôi cấy yếm khí. 3.5 . Môi trường Th i oglycolate. 3.6 . Bộ thuốc nhuộm Gram (xem phụ lục A). 3.7 . Nguy ê n liệu hóa ch ấ t cho các phản ứng sinh hóa (xem phụ lục B). 3.8 . Nguyên liệu cho PCR (Polymerase Chain Reaction) (xem điều C.1 phụ lục C). 3.9 . Môi tr ư ờng TSC (tryptose sulfite cycloserine). 3.10 . Thạch máu cơ bản hay thạch thư ờ ng. 3.11 . Môi trường nước pepton. 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thi ế t b ị , dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học và cụ thể như sau: 4.1 . Tủ ấ m, có thể duy trì nhiệt độ 37 °C và bổ sung từ 5 % đến 10 % C O 2 . 4.2 . Kính h iể n v i quang học, có vật kính với độ phóng đại 10 lần, 40 lần, 100 l ầ n. 4.3 . Bình nuôi cấy vi khuẩn y ế m kh í và túi nu ô i c ấ y vi khuẩn yếm khí. 4.4 . Máy li tâm, có thể li tâm với gia tốc 12 000 g. 4.5 . Máy nhân gen (máy PCR). 4.6 . Nồ i hấp, có th ể duy tr ì ở nhiệt độ 115 °C, 121 °C. 4.7 . Que cấy, vô trùng. 4.8 . Que c ấ y chích s â u, v ô trùng. 4.9 . Phi ế n k í nh, sạch. 4.10 . Ố ng nghiệm, sạch, v ô trùng. 4.11 . Đ è n cồn. 4.12 . Màng lọc, có kích thước lỗ lọc 0,45 µ m. 5. Cách tiến hành 5.1 . Chẩn đoán l â m sàng 5.1 . 1 . Bệnh vi ê m ruột hoại tử ở gà 5.1.1.1 . Đặc điểm dịch t ễ - Bệnh viêm ruột hoại tử thư ờ ng xảy ra ở gà ít ngày tuổi từ 2 tu ầ n đến 5 tuần tuổi, gà tây từ 7 tuần đến 12 tuần tuổi nh ư ng cũng có thể xảy ra ở gà hậu b ị và gà đẻ. - Bệnh lây lan qua đường thức ăn, nước uống do vi khuẩn C. perfringens có nhiều trong m ôi trường đất, thức ăn, phân, chất độn chuồng, rác, ch ấ t chứa đường ruột,... - Tỷ lệ nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử ở gà con có thể lên t ớ i 50 %, ở gà thịt khoảng từ 13 % đến 37,3 %. 5.1.1.2 . Triệu chứng lâm sàng - Trong trường hợp cấp tính gà chết nhanh (từ 1 h đến 2 h) khi chưa b i ểu hiện triệu ch ứ ng của bệnh. T ỷ lệ chết cao, có thể lên tới 50 %. - Gà thường chết đột ngột, các triệu chứng lâm sàng th ấ y được trong th ờ i gian ngắn. - Triệu chứng thường thấy của bệnh là gà bị tiêu chảy, phân nhiều nước, có màu đ ỏ , nâu đỏ, màu vàng hoặc lẫn thức ăn. - Gà có b i ểu hiện ủ rũ, ăn ít, giảm tăng trọng, xác chết gầy và ướt. 5.1.1.3 . Bệnh tích đại thể - Bệnh tích thường quan sát thấy ở phần ruột non chủ yếu là ở không tràng và h ồ i tràng. Niêm mạc ruột bị xuất huyết, hoại tử. Lớp chất nhày ở ruột có màu xám nâu đến vàng xanh lá cây ho ặ c có màng giả. - Thành ruột non và thỉnh thoảng ở đoạn manh tràng mỏng, dễ nát, giãn to và tích khí. - Gan không to nhưng màu sắc thay đổi, có màu thẫm hoặc vàng hơn b ì nh thường. Trên bề mặt gan có lấm tấm điểm hoại tử màu vàng. - Lách có thể sư n g to, sưng huyết hoặc xu ấ t huyết, có các điểm hoại tử. - Thận có thể sưng to, b i ến màu c ó thể có các điểm hoại tử. 5.1.2 . B ệ nh viêm ruột hoại tử ở lợn 5.1.2.1 . Đặc đi ể m dịch t ễ - Bệnh thường xảy ra ở lợn con dưới 7 ngày tuổi (t ỷ lệ mắc cao ở lợn 3 ngày tuổi). - Bệnh có thể xuất hiện kế phát sau các nguyên nhân nguyên phát hoặc khi có yếu tố b ấ t lợi xảy ra. - Mầm bệnh có th ể l â y truyền cho lợn con từ phân của lợn nái c ó chứa vi khuẩn. - Tùy thuộc vào trạng thái miễn dịch của lợn v à thể bệnh tỉ lệ chết có thể thay đổi, c ó thể từ 50 % đến 60 % có khi đến 100 %. 5.1.2.2 . Triệu chứng lâm sàng Th ể cấp tính - Lợn có thể mắc bệnh ngay từ ngày tuổi đầu tiên. - Lợn tiêu ch ả y phân lẫn máu hoặc phân màu đỏ nâu lẫn các mảng niêm mạc ruột b ị hoại tử màu xám. - Lợn con yếu, đi lại khập khiễng hay nằm một chỗ. - Những con gần chết da bụng chuyển màu xanh, thân nhiệt hạ xuống 35 °C, vùng da bụng phù nề. - Con vật gầy c ò m và thường chết từ 12 h đến 48 h sau khi xuất hiện triệu ch ứ ng tiêu chảy. Tỷ lệ chết cao từ 50 % đến 100 %. - Có trường hợp lợn có thể chết không có triệu chứng tiêu chảy. - Ruột non xu ấ t huyết, sinh hơi thường ở vùng không tràng và hồi tràng, chất chứa có thể lẫn máu và các mảng hoại tử màu xám. Ni ê m mạc ruột màu đỏ hay đen. - Dịch xoang bụng có màu đỏ. Thể á c ấ p tính - Thường xảy ra ở lợn từ 5 ngày đến 7 ngày tuổi. - Lợn tiêu chảy phân vàng không lẫn máu. - B ỏ ăn, gầy còm và ch ế t do m ấ t nước. Thể mạn tính - Lợn tiêu chảy dai dẳng khoảng hơn một tuần. - Phân nhiều nước, màu vàng xám có lẫn chất nhày. - Con vật gầy c ò m nhợt nhạt, không chết hoặc ch ế t sau vài tuần, còi cọc sau khi khỏi triệu chứng. 5.1.2.3 . Bệnh tích đại th ể - Ruột non xuất huyết, thành ruột non mỏng, chứa đ ầ y khí, sinh hơi thường ở vùng không tràng và hồi tràng, ch ấ t chứa có thể lẫn máu và các m ả ng hoại tử màu xám. Niêm mạc ruột màu đỏ hay đen. - Ruột già giãn, nhợt nhạt, chất chứa nh ã o. - Dịch xoang bụng có màu đỏ. 5.2 . Ch ẩ n đoán phòng th í nghiệm 5.2.1 . Lấy mẫu Bệnh phẩm bao gồm: ruột non, phân. Bệnh phẩm ruột: lấy từ 10 cm đến 15 cm vùng một non (hồi tràng) có bệnh tích. Bệnh ph ẩ m phân: l ấ y phân trực tiếp từ trực tràng (l ấ y khoảng 10 g). Cho mỗi loại bệnh phẩm vào từng lọ hay túi ni lon vô trùng riêng biệt, đậy kín, bảo quản trong đi ề u kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C và gửi về phòng thí nghiệm chậm nhất 24 h sau khi l ấ y mẫu. Gửi kèm theo bệnh ph ẩ m giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi r õ triệu chứng, bệnh t í ch và đặc điểm dịch tễ. 5.2.2 . Kiểm tra trực tiếp vi khuẩn từ mẫu b ệ nh phẩm Sử dụng phương pháp nhuộm Gram để kiểm tra hình thái vi khuẩn. 5.2.2.1 . Cách làm tiêu bản Dùng que cấy (4.7) lấy niêm mạc ruột (vùng niêm mạc ruột có bệnh tích của bệnh), phết lên phiến kính (4.9), để khô. 5 .2.2.2 . C ố đ ị nh tiêu bản Nhỏ cồn methanol ngập tiêu bản (xem 5.2.2.1), để khô. Nhuộm Gram theo quy định của phụ lục A. 5.2.2.3 . Quan sát h ì nh thái vi khuẩn Vi khuẩn bắt màu tím (màu Gram dương), trực khuẩn to, thẳng, hai đầu tròn, có kích thước từ (từ 0,6 µ m đến 0,8 µ m) x (từ 2 µ m đến 4 µ m), thường đứng riêng lẻ hay thành chu ỗ i ngắn. Bệnh phẩm nghi nhiễm bệnh khi có nhiều vi khu ẩ n có hình thái đặc tr ư ng của C. perfringens trên vi trường. 5.2.3 . Phân lập v i khuẩn Bệnh phẩm được nuôi c ấ y trên m ôi trường thạch máu (3.2) hoặc thạch máu Schaedler (3.3), nuôi ở t ủ ấ m (4.1) trong điều kiện yếm khí (4.3) có b ổ sung C O 2 (3.4) từ 24 h đ ế n 48 h. (CHÚ THÍCH: các dụng cụ nuôi c ấ y vi khu ẩ n y ế m kh í , phương pháp bổ sung kh í C O 2 đ ược thực hiện theo hướng dẫn của nh à sản xu ấ t). Với bệnh ph ẩ m phân, ngoài nuôi cấy vào các m ôi trường trên, nuôi cấy thêm vào m ôi trường chọn lọc như m ôi trường TSC (3.9). Sau từ 24 h đến 48 h nuôi cấy, khu ẩ n lạc trên m ôi trường thạch máu (3.2) và thạch máu Schaedler (3.3) có màu trắng xám đường kính từ 2 mm đến 4 mm, hơi vồng, tròn, bóng và có 2 vòng dung huyết (dung huyết kép). Vòng dung huyết phía trong rõ (dung huyết beta - β ), vòng dung huyết ph í a ngoài mở (dung huyết alpha - a ). Trên môi trường TSC (3.9) khuẩn lạc C . per f ringens có màu đen. Dùng que cấy (4.7) l ấ y khuẩn lạc nghi ng ờ cấy vào môi trường nước thịt (3.1) hoặc môi trường Thioglycolate (3.5) trong điều kiện yếm khí (4.3) có bổ sung C O 2 (3.4), nuôi ở tủ ấm (4.1), từ 24 h đến 48 h để kiểm tra hình thái và đặc tính sinh hóa. 5.2.4 . Xác đ ị nh vi khuẩn 5.2.4.1 . Quan sát hình thái v i khuẩn - Dùng que cấy (4.7) lấy khu ẩ n lạc hòa đều vào giọt nước sinh lý trên phiến kính (4.9) hoặc lấy một vòng que cấy (4.7) canh trùng đ ã nuôi cấy vi khu ẩ n dàn mỏng lên trên phiến k í nh (4.9), để khô và c ố định tiêu bản trên ngọn l ử a đèn cồn (4.11). - Tiêu bản sau khi đã được c ố định, nhuộm bằng phương pháp Gram (xem Phụ lục A). - Vi khu ẩ n bắt màu tím (màu Gram dương), trực khuẩn to, thẳng, hai đầu tròn, có kích thước (từ 0,6 µ m đến 0,8 µ m) x (từ 2 µ m đến 4 µ m), thường đứng riêng lẻ hay thành chuỗi ngắn. 5 .2.4.2 . Ki ể m tra đặc tính sinh hóa Xác định vi khuẩn C. perfringens dựa vào một số đặc tính sinh hóa được nêu trong bảng 2. B ả ng 2 (tiếp theo) - Một s ố đặc tính sinh h ó a của vi khuẩn C. perfringens T í nh chất C. perfringens Lecithinase + Lipase - Phân giải casein + Indole - Di động - Glucose + Lactose + Sucrose + Maltose + Salicin - Phản ứng CAMP* ngược + *CAMP: Christie - Atkins - Munch - Petersen Tiến hành các phản ứng sinh hóa theo quy định tại Phụ lục B. GHI CHÚ: Có thể sử dụng ki t sinh hóa thương mại đ ể ki ể m tra đặc t í nh của vi khu ẩ n C. perfringens 5.2.4.3 . Định typ và xác đ ị nh độc t ố của vi khuẩn C. perfringens Sử dụng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt được nêu trong bảng 3. Bảng 3 - Các cặp mồi và chu trình nhiệt cho PCR xác định độc t ố a , β , ε , ι Độc t ố Tên mồi Trình tự từ đ ầ u 5’ tới 3’ Kích th ước sản phẩm (bp) Chu trình nhiệt a CPA Fw GCTAATGTTACTGCCGTTGA 324 95 °C, 10 min; 40 chu trình: (94 °C, 30 s; 53 °C, 90 s; 72 °C, 90 s) 72 °C, 10 min. CPA Rv CCTCTGATACATCGTGTAAG β Cpb Fw GCGAATATGCTGAATCATCTA 196 Cpb Rv GCAGGAACATTAGTATATCTTC ε Etx Fw GCGGTGATATCCATCTATTC 655 Etx Rw CCACTTACTTGTCCTACTAAC ι lap Fw ACTACTCTCAGACAAGACAG 446 lap Rw CTTTCCTTCTATTACTATACG - Tiến hành phản ứng PCR theo quy định tại Phụ lục C . - Vi khuẩn C . per f ringens được xác định l à typ A khi PCR dương tính với độc tố a ; âm tính v ớ i độc tố β , ε , ι . - Vi khuẩn C . per f r i ngens được xác định là typ C khi PCR dương tính với độc tố a và β ; âm tính với độc tố ε . 6. Kết luận Gà, lợn được xác định là mắc bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn C. perfringens khi có đủ các điều kiện sau: - Có đặc điểm dịch tễ, triệu ch ứ ng lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh; - Nhuộm tiêu bản niêm mạc ruột thấy nhiều vi khu ẩ n có hình thái đặc trưng của vi khuẩn C . perfr i ngens ; - Phân lập và giám định được vi khuẩn C . per f r i ngens thuộc typ A hoặc typ C . Phụ lục A (Quy định) Phương pháp nhuộm Gram A.1 Thuốc thử A.1.1 Dung dịch t í m tinh thể Tím tinh thể (C 25 H 30 N 3 CI) Etanol 95 % Amoni oxalat [(NH 4 ) 2 C 2 O 4 .2H 2 O ] Nước 2,0 g 20,0 ml 0,8 g 80,0 ml Hòa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan h ế t. A.1.2 Dung dịch f uchsin đậm đặc Fuchsin basic (C 20 H 20 CIN 3 ) Etanol 95 % Phenol (C 6 H 6 O ) Nước 1 g 10 ml 5 g 100 ml Khi dùng, pha loãng dung dịch f uchsin đậm đặc với nước theo tỉ lệ 1:10 (thể tích). A.1.3 Dung dịch lugol Kali iodua (KI) lôt (l 2 ) tinh thể Nước 2 g 1 g 200 ml Nghiền kali iodua và iôt tinh thể, cho nước vào từ từ và l ắ c cho tan. A.1.4 Cồ n axeton Etanol 95 % Axeton (C 2 H 6 O) 3 ph ầ n 1 phần A.2 . Cách tiến hành Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản (đã c ố định), để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô. Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô. Nh ỏ cồn axeton, rửa nước thật nhanh và để khô. Nh ỏ dung dịch f uchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi th ấ m khô hoặc sấy khô. A.3 Xem tiêu bản Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi (4.2) với vật kính độ phóng đại 100 lần. Phụ lục B (Quy định) Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hóa B.1 Kiểm tra đặc tính sinh l ecithinase và lipase B.1.1 Môi trường thạch lòng đỏ trứng Chuẩn bị môi trường thạch lòng đỏ trứng: sử dụng môi trường thạch máu cơ bản (3.10) có b ổ sung huyễn dịch lỏng đỏ trứng (thương mại). Pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất. B.1.2 Cách tiến hành Dùng que cấy (4.7) lấy khu ẩ n lạc nghi ng ờ cấy vào môi trường thạch lòng đỏ trứng (xem mục B.1.1), nuôi ở tủ ấm (4.1) trong điều kiện yếm khí (4.3) có bổ sung C O 2 (3.4) và kiểm tra sau từ 24 h đến 48 h. B.1.3 Đọc k ế t quả B.1.3.1 Khả năng sinh lecithinase - Dương tính: Có quầng m ờ đục ở môi trường xung quanh khuẩn lạc; - Âm tính: Không có quầng m ờ đục ở môi trường xung quanh khuẩn lạc. B.1.3.2 Khả năng sinh lipase - Dương t í nh: Có lớp như ngọc trai hay vảy cá bao phủ khu ẩ n lạc (có thể lan ra thạch xung quanh khu ẩ n lạc); - Âm tính: Không có lớp như ngọc trai hay vảy cá bao phủ khu ẩ n lạc. B.2 Phản ứng phân giải casein B.2.1 Môi trường thạch casein Thành ph ầ n môi trường: - Sữa tách bơ (skim milk) 100 g - Nước cất 1000 ml Chỉnh pH môi trường ở 6,8 ± 0,2. Hòa các thành phần trên với nhau, lắc đều. Chia ra các ống nghiệm (4.10), 10ml /1 ống nghiệm. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (4.6) ở 121 °C trong 5 min. B.2.2 Cách ti ế n hành Dùng que c ấ y lấy khuẩn lạc nghi ng ờ cấy v à o môi trường thạch casein (xem mục B.2.1), nuôi ở t ủ ấm (4.1) trong điều kiện yếm khí (4.3) có bổ sung CO 2 (3.4) đọc k ế t quả hàng ngày trong 5 ngày. B.2.3 Đọc k ế t quả - Phản ứng dương tính: s ữ a đông vón có v ẩ n như mây (stormy clot). - Ph ả n ứng âm tính: sữa không đông vón. Ghi chú: Kiểm tra phản ứng phân giải casein có thể sử dụng môi trường thương mại sữa Litmus ( Litmus milk ). B.3 Phản ứng sinh hóa đ ườ ng B.3.1 Môi trường Sử dụng môi trường nước pepton có đường gồm các thành ph ầ n: - Nước pepton (3.11). - Dung dịch chỉ thị màu bromocrezol. Cho 0,2 g bromocrezol vào 100 ml etanol 90 % và lắc cho tan hết. - Dung dịch đường Pha đường với nước thành dung dịch 10 %, tiệt trùng môi trường bằng n ồ i h ấ p (4.6) ở 110 °C trong 15 min đến 20 min hoặc h ấ p cách qu ã ng 3 lần ở 100 °C trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc (4.12) Chu ẩ n b ị môi trường: Cho 0,1 ml chỉ thị màu bromocrezol vào 100 ml môi trường nước pepton, chia 4 ml vào mỗi ống nghiệm (4.10). Tiệt trùng bằng nồi hấp (4.6) ở 120 °C trong 30 min. Ch ỉ nh pH môi trường ở 6,8 ± 0,2. Pha môi trường nước pepton-đường: cho 0,4 ml dung dịch đường 10% v à o ống nghiệm chứa 4ml nước pepton đã được h ấ p tiệt trùng B.3.2 Cách tiến hành Dùng que cấy (4.7) lấy khu ẩ n lạc nghi ng ờ cấy vào các ống môi trường nước pepton - đường (xem mục B.3.1), để vào t ủ ấm (4.1) trong điều kiện yếm khí (4.3) có bổ sung C O 2 (3.4), đọc kết quả sau từ 24 h đến 48 h. B.3.3 Đọc kết quả - Phản ứng dương tính: Môi trường chuyển màu vàng; - Phản ứng âm tính: Môi trường không thay đổi màu. B.4 Ki ể m tra khả năng sinh Indol B.4.1 Thuốc thử Kovac’s Paradimetyl aminobenzaldehyt 5 g Cồn amylic (C 6 H 11 OH) 75 ml Axit clohydric đặc 25 ml Trộn dung dịch paradimetyl aminobenzaldehyt vào c ồ n amylic cho tan hết và để trong tủ lạnh 4 °C. Thêm từ từ 5 ml đến 10 ml HCI, trộn đều rồi để tủ lạnh, sau đ ó lại tiếp tục bổ sung HCI. Bảo qu ả n thuốc thử trong lọ màu, ở 4 °C. B.4.2 Cách ti ế n hành Dùng que cấy (4.7) lấy khuẩn lạc nghi ng ờ cấy vào môi trường nước peptone (3.11) hoặc môi trường nước peptone (3.11) có bổ sung tryptophan, nuôi ở tủ ấ m (4.1) trong điều kiện yếm khí (4.3). Sau 24 h nuôi cấy, nhỏ từ 0,2 ml đ ế n 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ. B.4.3 Đọc k ế t quả Phản ứng dương tính (sinh indol): xu ấ t hiện vòng màu đỏ phía trên môi trường. Phản ứng âm tính (không sinh indol): không xuất hiện v ò ng màu đỏ. B.5 Kiểm tra khả năng di động B. 5 .1 Môi trường thạch lỏng Thành phần môi trường: Peptone 10 g Meat extract 3 g NaCI 5 g Agar 4 g Gelatin 80 g Nước cất 1000 ml Hòa gelatine vào nước để 30 min, bổ sung các t hành phần khác, đun cho tan hoàn toàn. Chia 6ml vào mỗi ống nghiệm (4.10). Hấp tiệt trùng trong nồi h ấ p (4.6) ở 115 °C trong 20 min. GHI CHÚ: Kiểm tra khả năng di động và sinh indol có th ể sử d ụng môi trường SIM (Sulfide Indole Motility) thương mại. B.5.2 Cách tiến hành - Dùng que c ấ y chích sâu l ấ y khuẩn lạc cần kiểm tra, ch í ch thẳng xuống gần đáy của ống nghiệm có môi trường thạch lỏng (xem mục B.5.1). - Nuôi cấy ở tủ ấm (4.1) trong điều kiện yếm khí (4.3) có bổ sung C O 2 (3.4), đọc kết quả sau từ 24 h đến 48 h. B.5.3 Đọc kết quả - Ph ả n ứng dương tính (có khả năng di động): môi trường đục, không nh ì n r õ đường cấy chích sâu; - Phản ứng âm tính: môi trường trong và nhìn thấy đường cấy chích sâu. B.6 Phản ứng CAMP ng ượ c B.6.1 Chuẩn bị - Thạch máu cừu. - Chủng vi khuẩn: Streptococcus agalactiae , vi khuẩn Clostridium pe rf ringens nghi ng ờ . B.6.2 Tiến hành phản ứng - Dùng que cấy (4.7) lấy khu ẩ n lạc nghi ng ờ Clostridium per f ringens cấy thành 1 đường thẳng ngang mặt đĩa thạch. - Dùng que c ấ y (4.7) lấy khu ẩ n lạc Streptococcus agalactiae cấy vuông góc nhưng không tiếp xúc (cách khoảng 2 mm) v ớ i đường c ấ y khuẩn lạc nghi ng ờ Clostr i dium per f ringens . - Nuôi cấy ở t ủ ấm (4.1) trong điều kiện yếm kh í (4.3) có b ổ sung C O 2 (3.4), đọc kết qu ả sau 24 h. B.6.3 Đọc kết quả - Ph ả n ứng dương t í nh: xu ấ t hiện mũi tên hướng về phía đường cấy Clostridium per f r i ngen nghi ng ờ . - Phản ứng âm tính: không xuất hiện mũi tên hướng về phía đường cấy Clostridium per f ringen nghi ngờ. Phụ lục C (Quy định) Phương pháp PCR kiểm tra các yếu tố độc lực C.1 Nguyên liệu PCR C .1.1 Taq PCR Master Mix Kit C .1.2 Cặp mồi (primers): m ồ i xuôi và mồi ngược (xem bảng 3) C.1.3 Nước tinh khi ế t không có nuclease C . 1.4 Dung dịch đệm TAE hoặc TBE C .1.5 Ethidi bromua hoặc ch ấ t nhuộm màu SYBR green C .1.6 Loading dye C .1.7 ADN (Acid Deoxyribo Nucleic) chuẩn (Ladder, marker) C.2 Chuẩn bị mẫu Mẫu kiểm tra là vi khuẩn Clostri d ium per f r i ngens đã nuôi cấy thu ầ n khi ế t tr ê n thạch máu (3.2) ở tủ ấm (4.1) trong điều kiện y ế m kh í (4.3) có b ổ sung C O 2 (3.4), từ 24 h đ ế n 48 h. Đối chứng dương: chủng vi khu ẩ n đã được giám định là Clostridium per f r i ngens hoặc sử dụng các chủng Clos tr idium per f r i ngens chuẩn. C.3 Tách chiết ADN Các vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh ph ẩ m và các mẫu đối chứng dương được tách chiết ADN b ằ ng các kit thương mại hoặc bằng phương pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit th ì các bước ti ế n hành theo chỉ dẫn của nhà s ả n xuất. Tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 μl nước v ô trùng không chứa các enzym Rnase và se (nuclease free w ater). Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch bằng máy ly tâm (4.4) với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần trong phía tr ê n để thực hiện phản ứng PCR. C.4 Tiến hành Có th ể sử dụng các kit thương mại theo hư ớ ng dẫn của nhà s ả n xuất. Nên sử dụng Multiplex PCR kit. Sử dụng cặp mồi và chu tr ì nh nhiệt trong Bảng 3. Đối chứng dương: tách chi ế t từ vi khuẩn Clostr i dium per f r i ngens (xem mục C.3). Đối chứng âm: gồm đầy đủ thành ph ầ n của một phản ứng PCR, nhưng không có ADN của vi khu ẩ n. Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.5). C.5 Chạy điện di Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE. Cho 2 µ l dung dịch loading dye vào 8 µ l sản ph ẩ m PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 µ l thang chu ẩ n (marker) vào một giếng. Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại dung dịch đệm sử dụng khi pha thạch), trong th ờ i gian 30 min đến 40 min, ở 100 V. Sau đó nhuộm bằng dung dịch ethidi bromua 0,2 mg / 100ml. Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (ví dụ như SYBR safe ADN gel stain của hãng Invitrogen) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất. C.6 Đọc kết quả Phản ứng dương tính khi: - Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng k í ch c ỡ của sản ph ẩ m. - Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch. - Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương. Phản ứng âm t í nh khi: - Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm. - Mẫu đ ố i chứng âm: không xu ấ t hiện vạch. - M ẫ u kiểm tra không có vạch giống m ẫ u đối chứng dương. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm Thú y. Nhà xu ấ t bản Đại học Nông nghiệp, trang 431 - 434. [2] A. Heikinheimo, H. Korkeala, 2005. Multiplex PCR assay for toxinotyping Clostr i dium perfringens isolates obtained from Finnish broiler chickens. Article first published o nline: 13 APR 2005; Volume 40, Issue 6, pages 407-411. [3] Ahsani MR, Mohammadabadi MR, Shamsaddini MB (2010). Clostridium per f ringens isolate typing by multiplex PCR . The Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases ISSN 1678-9199, volume 16, issue 4, p. 573-578. [4] Arunava Das, Yahya Mazumder, B i man Kumar Dutta (2008). Clostridium perfringens Type A from Broiler Chicken with Necrotic Enteritis. International Journal of Poultry Science 7 (6), p. 601 - 609. [5] Farzan A, Kircanski J, DeLay J, Soltes G, Songer JG, Friendship R, Prescott JF. 2013. An investigation into the association bet w een cpb2-encoding Clostridium per f ringens type A and diarrhea in neonatal piglets. Can J Vet Res. 77 ( 1):45-53. [6] JICA. Third edition, 2003. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand. p. 118 - 119; 181 - 182. [7] J.Quinn, M.E.Carter, B.Markey, G.R.Carter, 2004. Chapter 17: Clostridium species. Veterinary Clinical Microb i ology . 6th Edition. Printed in Spain, p.191 - 208. [8] Kenneth Opengart, 2008. Chapter 22: Necrotic Enteritis. Clostridial Diseases. Diseases o f Poultry . 12th Edition. Blackwell Publishing, p.872 - 879. [9] Richard L. W ood, Louis M.Henderson, 2006. Chapter 36: Clostri d ial ilnfection. Diseases of Swine. 9th Edit i on. Blackwell Publishing, p. 613 - 619. [10] Songer JG, Glock RD. 1998. Enteric intection of swine with Clostridium per f ringens types A and C . Diagnostic Notes. Swine Health and Production 6 (5). p. 223-225. [11] Van Asten AJAM, van der Wiel CW, Nikolaou G, Houwers DJ, Grone A (2009). A multiplex PCR for toxin typing of Clostr i dium pertringens. Vet Microb i ol. 136 (1), p.411 - 412.