TCVN8400-18:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-18:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 18: Bệnh phù đầu gà (Coryza) TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-18 : 2014 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 18: BỆNH PHÙ ĐẦU GÀ (CORYZA) Animal disease - Diagnostic procedure - Part 18: In f ectious Coryza CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể li ê n quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn n à y không thể đưa ra đ ượ c hết t ấ t cả các v ấ n đ ề an toàn li ên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác đ ị nh khả năng áp dụng các giới hạn quy đ ị nh t rước kh i sử dụng t iê u chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy tr ì nh ch ẩ n đoán bệnh phù đầu gà do vi khu ẩ n Avibacter i um paragallinarum (trước đây tên vi khuẩn là Haemophilus paragallinarum ) gây ra. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau: Bệnh phù đầu gà ( I n f ectious coryza) Bệnh phù đầu gà là bệnh truyền nhiễm đường hô hấp c ấ p t í nh ở gà với các đặc trưng là ch ả y nước mũi, mặt sưng. Bệnh do vi khuẩn Avibacterium paragallinarum gây ra. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước c ó chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác. 3.1 . Thạch máu, thạch máu cơ bản được bổ sung từ 5 % đến 7 % máu cừu, máu bê, hoặc máu th ỏ (pha chế thạch theo hướng d ẫ n của nh à sản xuất). 3.2 . Thạch sô-cô-la Pha môi trường thạch máu cơ bản (4 g thạch máu cơ bản trong 90 ml nước), h ấ p tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.2) ở 121 °C trong 15 min. Để môi trường nguội đến 75 °C, r ồ i bổ sung từ 5% đến 10% máu cừu, máu b ê , hoặc máu thỏ và đặt trong bể ủ nhiệt (xem 4.9) trong từ 15 min đến 30 min. Đ ể môi trư ờ ng nguội đến 45 °C, rồi bổ sung 1% b -NAD (25 m g trong 100 ml nước), 5% chất chiết nấm men. Chia đều môi trường ra các đĩa Petri (xem 4.3), mỗi đĩa khoảng 20 ml. 3.3 . M ô i trường TSB. 3.4 . Môi trường urê cơ bản. 3.5 . Nguyên liệu, hóa ch ấ t cho phương pháp nhuộm Gram (xem Phụ lục A). 3.6 . Nguyên liệu, hóa chất cho các phản ứng sinh hóa (xem Phụ lục B). 4. Thiết bị, dụng cụ. Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường, cụ thể như sau: 4.1 . Tủ ấ m, duy tr ì ở nhiệt độ 37 °C, có 5% C O 2 . 4.2 . Nồi h ấ p, duy trì ở nhiệt độ 100 °C, 110 °C, 121 °C. 4.3 . Đĩa Petr i . 4.4 . Phiến k í nh, sạch. 4.5 . Que cấy, vô trùng. 4.6 . Kính hiển vi quang học, có độ phóng đại 1000 lần. 4.7 . Đèn c ồ n. 4.8 . Màng lọc, có kích thước lỗ lọc 0,45 m m. 4.9 . B ể ủ nhiệt, duy trì ở 75 °C. 4.10 . Ố ng nghiệm, sạch, vô trùng. 4.11 . Máy ổn nhiệt khô, duy tr ì 100 °C. 5. Cách tiến hành 5.1 . Chẩn đoán lâm sàng 5.1.1 . Đặc điểm dịch tễ - Gà ở tất cả các lứa tuổi đ ề u có thể mắc bệnh, chủ yếu trên gà trư ở ng thành và gà đẻ, gà con mắc ít hơn và nếu mắc cũng ít trầm trọng hơn. - Bệnh thường xảy ra vào mùa thu, đông. - Bệnh lây truyền qua đường hô hấp và không lây truyền qua trứng. - T ỷ lệ mắc bệnh cao, tỷ lệ chết thấp (khoảng 10 %). 5.1.2 . Triệu chứng lâm sàng - Có nhiều dịch mũi; mặt sưng, tích b ị sưng; ch ả y nước mắt, viêm kết mạc mắt. - Gà giảm ăn, uống và có thể bị ỉ a ch ả y. - Giảm tăng trọng ở gà nuôi thịt và giảm sản lượng trứng ở gà đẻ (tới 40%). 5.1.3 . Bệnh tích - M à ng nhày xoang mũi, kết mạc mắt bị viêm cata, túi kh í viêm. - Mặt, t í ch bị phù dưới da. 5.2 . Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 5.2.1 . L ấ y mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm Bệnh phẩm: Dịch xoang mũi, dịch từ khí qu ả n, dịch lấy từ các túi khí. Bệnh phẩm phải được bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C và gửi về phòng thí nghiệm chậm nhất 24 h sau khi lấy mẫu kèm theo gi ấ y yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh t í ch và những thông tin về dịch tễ . 5.2.2 . Nuôi cấy, phản lập vi khu ẩ n Bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường thạch máu (xem 3.1) có cấy kèm vi khuẩn Staphylococcus aureus hoặc thạch sô-cô-la (xem 3.2). Nuôi vi khuẩn trong tủ ấm (xem 4.1) trong 24 h. N ế u trong mẫu bệnh phẩm c ó vi khuẩn, các khuẩn lạc sẽ được hình thành với hình thái như sau: a) Trên môi trường thạch máu (xem 3.1) có cấy kèm vi khuẩn Staphylococcus aureus có các khu ẩ n lạc tròn, trong suốt, kích thước nh ỏ (khoảng 0,3 mm), không gây dung huyết, mọc xung quanh đường cấy vi khuẩn Staphylococcus aureus. b) Tr ên môi trường thạch sô-cô-la (xem 3.2) có các khuẩn lạc nhỏ (khoảng 0,3 mm), trong suốt. Chọn khuẩn lạc có hình thái đặc trưng cấy vào môi trường thạch sô-cô- l a (xem 3.2) nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) trong thời gian 24 h đ ể tiến hành quan sát h ì nh thái và kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn hoặc xác định vi khuẩn bằng PCR. 5.2.3 . Xác định vi khuẩn 5.2.3.1 . Quan sát hình th á i vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy Làm tiêu bản và cố định tiêu bản: Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khu ẩ n lạc nghi ngờ thu được trong mục 5.2.2 hòa đều vào giọt nước sinh lý trên phiến kính (xem 4.4). C ố định tiêu bản bằng cách để khô hoặc làm khô tiêu bản trên ngọn lửa của đèn cồn (xem 4.7). Nhuộm tiêu bản: Tiêu bản sau khi cố đ ị nh được nhuộm bằng phương pháp nhuộm Gram (Phụ lục A). H ì nh thái vi khuẩn: Vi khuẩn bắt màu đỏ (gram âm), đa hình thái với dạng trực khu ẩ n ngắn, cầu trực khuẩn hay dạng sợi, kích thước từ 1 m m đến 3 m m x từ 0,4 m m đến 0,8 m m. 5.2.3.2 . Ki ể m tra các đặc tính sinh hóa Kiểm tra các đặc tính sinh hóa theo Bảng 1 sau: Bảng 1 - Đặc t í nh sinh hóa của vi khuẩn Avibacter i um paragallinarum Ur ê Catalase Oxi d ase Manitol Glucose Sucrose D-Xylose - - - + + + + Phương pháp ti ế n hành, theo Phụ lục B. 5.2.3.3 . Xác định v i khuẩn bằng phư ơn g pháp PCR Sử dụng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu và chu tr ì nh nhiệt được n ê u trong Bảng 2. Bảng 2 - Cặp m ồ i đặc hiệu cho Av i bacterium paragall i narum Tên mồi Trình tự từ đầu 5’ tới 3’ Kích thước sản phẩm Chu t rì nh nhiệt N1 TgA ggg TAg TCT TgC ACg CgA AT 500 bp 94 °C, 10 min; Chu tr ì nh 30 vòng: (94 °C, 25 s; 55 °C , 50 s; 72 °C, 40 s) 72 °C trong 7 min. Giữ ở 4 °C R1 CAA ggT ATC gAT CgT CTC TCT ACT Ti ế n hành phản ứng PCR theo Phụ lục C . 6. Kết luận Gà được xác định là mắc bệnh phù đầu khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh và phân lập được vi khuẩn Avibacter i um paragallinarum trong phòng th í nghiệm. Phụ lục A (Qui định) Phương pháp nhuộm gram A.1 . Thuốc nhuộm A.1.1 . Dung d ị ch tím tinh thể Tím tinh thể Etanol 95 % Amoni oxalat Nước 2 , 0 g 20 , 0 ml 0,8 g 80 , 0 ml H òa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết. A.1.2 . Dung d ị ch f ush c in gốc Basic f uchsin Etanol 95 % Phenol Nước 1 g 1 0 ml 5 g 10 0 ml Khi dùng, pha loãng dung dịch gốc theo t ỷ lệ 1:10 (phần thể tích) với nước. A.1.3 . Dung dịch l ugol Kali iodua I od tinh thể Nước 2 g 1 g 20 0 ml Nghiền kali iodua và iodua tinh thể, cho nước cất vào từ từ và lắc cho tan. A.1.4 . Cồn 95 % A.2 . Cách tiến hành - Nh ỏ dung dịch tím tinh thể lên ti ê u bản: từ 1 min đến 2 min - Rửa nước nhanh, để khô - Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min - Rửa nước nhanh, để khô - Nhỏ c ồ n 95 % - Rửa nước thật nhanh, đ ể khô - Nh ỏ dung dịch f uchsin loãng, để 1 min - Rửa nước - Th ấ m khô hoặc sấy khô A.3 . Xem ti ê u bản Nh ỏ 1 giọt dầu soi kính vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (xem 4.6). Phụ lục B (Qui định) Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Avibacterium paragallinarum B.1 . Khả năng ph â n giải urê - Sử dụng môi trường urê cơ bản (xem 3.4) (pha theo hướng d ẫ n của nhà sản xuất) có bổ sung thêm 1% huyết thanh gà, b -NAD n ồ ng độ cuối cùng là 5 m M và ur ê nồng độ cuối cùng là 20%. - Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khu ẩ n lạc từ thạch máu hoặc thạch sô-cô-la trong mục 5.2.2 cấy vào môi trường có urê, n uôi trong tủ ấm (xem 4.1), đọc kết quả sau 24 h. + Ph ả n ứng dương tính: Môi trư ờ ng có màu hồng. + Phản ứng âm tính: Môi trư ờ ng không thay đổi màu. B.2 . Phản ứng oxidaza Ph ả n ứng được tiến hành trên giấy có tẩm dung dịch 1 % Tetrammethyl-P. phenylene diamin hydrochloride. Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch máu hoặc thạch sô-cô-la trong mục 5.2.2 ch à sát lên trên mặt giấy. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đen tím sau 30 s. Phản ứng âm tính khi giấy tẩm giữ nguyên màu. B.3 . Phản ứng catalaza Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch máu hoặc thạch sô-cô-la trong mục 5.2.2 đặt lên một điểm trên phiến k í nh (xem 4.4). Nhỏ một giọt dung dịch H 2 O 2 3 % lên khuẩn lạc trên phiến k í nh (xem 4.4). Phản ứng dương tính khi thấy có hiện tượng sủi bọt sau vài giây. Ph ả n ứng âm tính khi không có hiện tượng s ủ i bọt. B.4 . Lên men đường - Chuẩn bị môi trường TSB-đư ờ ng: Pha môi trường TSB ( xem 3.3) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Bổ sung 1% chỉ thị màu phenol red 0,2%, 1% NaC l (g/v). Ch ỉ nh pH môi trường ở 6,8 ± 0,2, hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.2) ở 121 °C trong 15 min. Để nguội đến 45 °C, rồi bổ sung 1 % b -NAD, 1 % huyết thanh gà. Chia môi trường ra các ống nghiệm (xem 4.10), mỗi ống nghiệm khoảng 4 ml. Chu ẩ n bị đường: Pha các loại đường thành dung dịch 10 %, hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.2) ở 110 °C trong từ 15 min đến 20 min hoặc hấp cách qu ã ng 3 lần ở 100 °C trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc (xem 4.8). Thêm 0,4 ml dung dịch đường 10% vào ống chứa 4 ml môi trường TSB. - Ti ế n hành: Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc từ thạch máu hoặc thạch sô-c ô -la trong mục 5.2.2 c ấ y v à o các ống môi trường TSB-đường ở phần trên, nuôi t rong tủ ấm (xem 4.1) sau 24 h đọc kết quả. + Ph ả n ứng âm tính: môi trường không thay đổi màu. + Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu vàng. Phụ lục C (Qui định) Phát hiện vi khuẩn Avibacterium paragallinarum bằng phương pháp PCR C.1 . Nguyên liệu PC R C.1.1 . Taq PCR Master Mix Kit C.1.2 . Cặp mồi (primers); mồi xuôi và mồi ngược (Bảng 2). C.1.3 . Nước tinh khiết không có nuclease C.1.4 . Dung dịch đệm TAE hoặc TBE C.1.5 . Chất nhuộm màu Ethidi bromua hoặc SYBR green C.1.6 . Loading dye C.1.7 . DNA chuẩn (Ladder, marker) C.2 . Chuẩn bị mẫu M ẫ u kiểm tra là vi khuẩn nghi là Avibacterium paragallinarum đ ã nuôi cấy thu ầ n khiết trên thạch máu (xem 3.1) có cấy kèm vi khuẩn Staphylococcus aureus hay thạch sô-cô-la (xem 3.2) được để ở tủ ấm (xem 4.1) trong 24 h. Đ ố i chứng dương: Chủng vi khuẩn đã được giám định l à Avibacterium paragallinarum hoặc sử dụng các chủng Avibacterium paragallinarum chuẩn. C.3 . Tách chiết DNA Các vi khuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm v à các mẫu đối chứng dương được tách chiết DNA bằng các kít thương mại hay b ằ ng phương pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit th ì các bước ti ế n hành theo chỉ d ẫ n của nhà sản xuất. Tách chi ế t b ằ ng phương pháp sốc nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 m l nước. Đun huyễn dịch trong máy ổn nhiệt khô (xem 4.11) trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá lạ nh trong 5 min. Ly tâm huyễn dịch v ớ i gia tốc 12000 g trong 4 min. Thu hoạch phần nước trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR. C.4 . Phản ứng PCR Sử dụng cặp mồi và chu trình nhiệt được nêu trong Bảng 2, chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 m M. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml. Thành phần cho 1 ph ả n ứng (theo hướng d ẫ n của Kit Taq PCR master mix Kit-Qiagen) như sau: - Taq PCR Master Mix Kit - Mồi xuôi 20 m M - Mồi ngược 20 m M - Nước không có nuclease - Mẫu DNA T ổ ng thể t í ch 12,5 m l 1 m l 1 m l 8,5 m l 2 m l 25 m l Đối chứng dương: DNA tách chiết từ vi khuẩn Avibacter i um paragallinarum (xem C.2). Đ ố i chứng âm: Gồm đầy đủ các th à nh phần của một ph ả n ứ ng PCR, nhưng không c ó DNA c ủ a vi khuẩn. C.5 . Chạy điện di S ả n ph ẩ m PCR được chạy điện di trên thạch agarose từ 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE. Cho 2 m l dung dịch loading dye vào 8 m l sản phẩm PCR, trộn đều cho v à o từng giếng trên bản thạch. Cho 10 m l thang chuẩn (marker) vào một gi ế ng. Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian từ 30 min đến 40 min, ở 100 V, sau đó nhuộm bản thạch (sản ph ẩ m PCR) bằng dung dịch ethidium bromide 0,2 mg/100 ml. Có th ể dùng ch ấ t nhuộm màu khác như SYBR green để nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) v à sử dụng theo qu y định c ủ a nh à sản xuất (ví dụ: SYBR safe DNA gel stain của Invitrogen). C.6 . Đọc kết quả - Phản ứng dương tính khi: + M ẫ u đối chứng dương: Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ c ủ a sản ph ẩ m; + Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch; + M ẫ u kiểm tra: Có vạch giống mẫu đối chứng dương. - Phản ứng âm tính khi : + Mẫu đối chứng dương: Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm; + Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch; + M ẫ u kiểm tra: Không xuất hiện vạch; THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Y.M. Saif, H.J. Barnes, J.R. Glisson, A.M. Fadly, L.R. McDouglad, D.E. S w ayne, L.K. NoLan, 2008. Diseases of poultry, 789-803. [2]. Chen, X., Mi f lin, J. K., Zhang, P. & Blackall, P. J. (1996). Development and application of DNA probes and PCR tests for Haemophilus paragallinarum. Avian Dis 40, 398-407 . [3]. X. Chen, Q. Chen, P. Zhang, W. Feng, P.J. Blackall. Evaluation of a PCR test f or the detection of Haemophilus paragallinarum in China. Avian Pathology Volume 27 , Issue 3, 1998 [4]. Chen X, Song C , Gong Y, Blackall PJ. Further studies on the use of a polymerase c hain reaction test f or the diagnosis o f in f ectious coryza. Avian Pathol. 1998;27(6):618-24. [5]. Blackal l PJ. In f ectious coryza: overvie w of the disease and new diagnostic options. Clin Microbiol Rev. 1999 Oct;12(4):627-32. Review. [6]. P.J.Quin, M.E.Cater, B. Markey, G.R.Cater, 1994. Clinical veterinary microbiology, 273-277. [7]. D de B W elchman, S A King, P Wragg, A M Wood, R M Irvine, W J Pepper, R Dijkman, J J d e Wit. In f ectious coryza in chickens in Great Britain. The Veterinary record 12/2010; 167(23):912-3 [8]. Viện Thú y quốc gia - Jica, 2002. C ẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam, 182-183.