TCVN8400-22:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-22:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 22: Bệnh giả dại ở lợn TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-22 : 2014 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 22: BỆNH GIẢ DẠI Ở LỢN Animal disease - Diagnostic procedure - Part 22: Aujeszky’s disease Lời nó i đầu TCVN 8400-22:2014 do Trung tâm Ch ẩ n đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 22: BỆNH GIẢ DẠI Ở LỢN Animal disease - Diagnostic procedure - Part 22: Aujeszky’s disease CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình ch ẩ n đo á n bệnh giả dại đối với lợn. 2. Thuật ngữ và định nghĩa 2.1 . Bệnh gi ả dại là một bệnh truyền nhiễm gia súc do vi rút Pseudorabies gây ra (phần lớn do Suid herpesvirus 1 , họ Herpesviridae , phân họ Alphaherpesvir i dae , giống Alphagerpesvirus ). Vi rút gây bệnh chủ y ế u ở hệ thần kinh trung ương và đường hô hấp của lợn. 2.2 . CPE (Cytopathic e ff ect): biến đổi bệnh lý tế bào 2.3 . FCS (Fetal calf serum): huy ế t thanh thai bê 2.4 . PK15 (pig kidney 15): tế bào thận lợn 15 2.5 . OD (optical density): mật độ quang 2.6 . ADN (Acid deoxyribonucleic) axid deoxyribonucleic 2.7 . EMEM (Eagle’s minimum essential medium): môi trường t ế bào Eagle 2.8 . DMSO (dimethyl sul f oxide): dung môi hữu cơ dimetyl sulfoxid 2.9 . PBS (phosphate bu ff ered saline) : dung dịch đệm phosphat 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. 3.1 . Môi trường nuôi cấy t ế b à o Minimum essential medium (MEM). 3.2 . Môi trư ờ ng nuôi dưỡng Eagle (EMEM) 3.3 . Trypsin/ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) 0,25 % 3.4 . Huyết thanh thai bê (FCS) 5 % và FCS 10 % 3.5 . Cặp mồi (xuôi và ngược) , dùng đ ể phát hiện vi rút PCV2. 4. Thiết bị, dụng cụ S ử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm sinh học và cụ thể như sau: 4.1 . Máy ly tâm , có thể tạo gia tốc ly tâm 900g, 1000g, 6800g và 14000g 4.2 . Micropipet , có dung tích thích hợp. 4.3 . Chai nuôi tế bào , 25 cm 2 , 75 cm 2 4.4 . Tủ âm , có thể duy trì nhiệt độ ở 37 ° C có chứa 5 % C O 2 4.5 . T ủ lạnh đông , có thể duy trì nhiệt độ -20 ° C , -70 ° C và -90 ° C . 4.6 . N ồ i h ấ p tiệt trùng , có thể duy trì ở 121 ° C . 4.7 . Máy đọc ELISA. 4.8 . M á y Realtime RT-PCR. 4.9 . Máy PCR. 4.10 . Bộ điện di sản phẩm PCR. 5. Cách tiến hành 5.1 . Chẩn đoán lâm sàng 5.1.1 . Đặc điểm dịch tễ Vi rút giả dại gây bệnh chủ yếu ở lợn sơ sinh với những biểu hiện rối loạn thần kinh, t ỷ lệ chết gần 100%. Lợn ở lứa tuổi lớn hơn chủ yếu mắc bệnh với triệu chứng hô hấp và không chết kể cả khi nhiễm bệnh cấp tính, bệnh thường dẫn đến s ẩ y thai đối với lợn nái. Lợn nhiễm bệnh không chết sẽ mang trùng cả đời. 5.1.2 . Triệu chứng lâm sàng L ợ n nhiễm bệnh có những triệu chứng rối loạn hô hấp và thần kinh. Lợn con chưa cai sữa có biểu hiện giảm cân, bỏ ăn, sốt (41 ° C đến 42 °C), run r ẩ y, ch ả y nhiều nước dãi, giật cầu mắt. Triệu chứng thần kinh xuất hiện sau 24 h và chết sau 24 h đến 36 h, t ỷ lệ chết gần 100%. Lợn sau cai sữa (từ 3 đến 4 tuần tuổi) có biểu hiện nhẹ hơn so với lợn con đang bú và ít bị mắc triệu chứng thần kinh, t ỷ lệ chết giảm, tuy nhiên cũng c ó thể lên đến 50 % trong một sổ ổ dịch. Lợn lứa tuổi này có các triệu chứng hô hấp như: hắt hơi, chảy nước mũi, khó thở và ho nặng. Lợn choai có biểu hiện sốt (từ 41 đến 42 °C) mệt mỏi, kém ăn, có triệu chứng hô hấp như hắt hơi, chảy nước mũi, ho nặng, thở khó, giảm cân. Bệnh kéo dài từ 6 ngày đến 10 ngày. Tỷ lệ mắc có thể đến 100 %, tỷ lệ chết từ 1 % đến 2 %. Lợn trư ở ng thành chủ yếu có biểu hiện hô hấp như lợn choai, lợn nái có thể s ả y thai. Tỷ lệ chết hiếm khi vượt quá 2%. 5.1.3 . Bệnh tích Bệnh t í ch của bệnh giả dại thường ít hoặc không phát hiện được, đôi khi có một số đặc điểm sau: - Xung huyết màng não kèm theo tăng sinh dịch n ã o t ủy . - Xung huyết niêm mạc vùng mũi và hầu họng. - Viêm hoại tử ở hạch amidan, hầu họng, kh í quản và thực quản. - Có các điểm hoại t ử ở gan, lách, hạch, thận. - Xuất huyết điểm lấm tấm ở cầu thận và vỏ não. 5.1.4 . Bệnh tích vi th ể - Viêm não, màng não không mủ và viêm hạch thần kinh lan tràn. - Xuất hiện bạch cầu thẩm nhập quanh thành mạch, viêm tế bào đệm thần kinh lan tràn kèm theo hoại t ử tế bào thần kinh và tế bào đệm thần kinh. - Các thể vùi trong nhân ở tế bào kẽ của hạch amidan, lớp nội mô của phế nang, tế bào thần kinh và các tế bào đệm trong não. 5.2 . Chẩn đoán phòng th í nghiệm 5.2.1 . Lấy mẫu 5.2.1.1 . M ẫ u cho xét nghiệm vi rút Đối với lợn bệnh còn s ố ng: Lấy tăm bông để ngoáy dịch miệng hầu hoặc mũi hoặc amidan cho vào môi trường bảo quản có kháng sinh (xem A.1 phụ lục A). Đối với lợn bệnh được mổ khám: Lấy 3 gam đến 5 gam não, amidan, phổi, lách, hạch. 5.2.1.2 . M ẫ u cho xét ng hi ệm kháng th ể : sử dụng xy lanh 5 ml để lấy 2 ml máu của lợn bị mắc bệnh chưa tiêm vắc xin phòng bệnh Aujeszky. Sau khi lấy, rút cán xy lanh tới mức cao nhất đ ể tạo nhiều khoảng trống bên trong, đặt xy lanh nằm nghiêng 5° ở nhiệt độ từ 20 đến 30 ° C trong thời gian 30 min để máu tự đông lại và tiết ra huyết thanh. Chắt huyết thanh sang ống 1,5 ml mới để dùng cho xét nghiệm trong 5.2.4.3 5.2.1.3 . Bảo qu ả n mẫu: trong quá tr ì nh vận chuyển phải bảo quản mẫu trong thùng bảo ôn (nhiệt độ từ 2 ° C đến 4 °C) không quá 48 h. Ở phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, phải được giữ trong tủ lạnh đông -70 ° C (xem 4.5) đối với mẫu xét nghiệm vi rút, - 20 ° C đối với mẫu xét nghiệm kháng thể. CHÚ TH Í CH 1: Trong chăn nu ô i, việc sử dụng vắc xin giả dại có thể làm ảnh h ưở ng đến k ế t qu ả của các phương pháp xét nghiệm. Do vậy, đối với lợn được tiêm vắc xin s ố ng nhược độc, không l ấ y mẫu trong thời gian 4 tuần sau khi tiêm (thời gian vắc xin tồn t ạ i trong cơ thể lợn) để xét nghiệm vi rút giả dại v ì các phương pháp trong tiêu chuẩn này không phân biệt được vi rút vắc xin nhược độc và vi rút thực địa. Đ ối với lợn được tiêm vắc xin đánh d ấ u nhược độc (x óa gen gE), có thể l ấ y mẫu đ ể xét nghiệm v i rút b ằ ng phương pháp Nested PCR hoặc Realtime-RT PCR phát hiện gen gE mà không bị ảnh hưởng của vi rút vắc xin. CHÚ TH Í CH 2: Không lấy mẫu huyết thanh ở lợn đã được tiêm vắc xin giả dại để xét nghiệm kháng thể v ì các phương pháp trong tiêu chuẩn này không phân biệt được kháng th ể nhiễm tự nhiên và kháng thể do tiêm vắc xin. Đối với lợn được tiêm vắc xin đánh dấu nhược độc (x óa gen gE), có thể lấy mẫu để xét nghiệm kháng thể gE bằng phương pháp ELISA mà không bị ảnh hưởng b ở i vi rút vắc xin. 5.2.2 . Ph ả n ứng Nested PCR (PCR lồng) xét nghiệm vi rút 5.2.2.1 . Xử lý m ẫ u Nghiền mẫu phủ tạng với dung dịch PBS (xem A.2 phụ lục A) có kháng sinh [hoặc môi trường nuôi cấy tế bào (xem 3.1) có kháng sinh (chất kháng sinh và kháng nấm)], ly tâm ở gia tốc 900 g (xem 4.1) trong 10 min, thu phần dịch nổi đ ể xét nghiệm PCR. Đối với dịch ngoáy miệng hầu (mũi hoặc amidan) trong dung dịch b ả o quản có kháng sinh, có thể sử dụng ngay để xét nghiệm. 5.2 . 2.2 . Chiết tách ADN Dùng kít chiết tách thương mại đ ể chiết tách ADN của vi rút và theo hư ớ ng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục B). 5.2.2.3 . Tiến hành phản ứng Nested PCR Phương pháp Nested PCR ba o gồm 2 lần thực hiện PCR thường với 2 cặp mồi khác nhau để phát hiện 1 đoạn gen đích. Trong đ ó sản ph ẩ m PCR của lần thực hiện PCR th ứ nhất dùng để làm khuôn mẫu cho lần thực hiện PCR thứ hai. Mục đích của sử dụng Nested PCR (2 lần thực hiện PCR) l à để làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng hơn so với PCR thường (1 lần thực hiện PCR). Phản ứng Nested PCR xét nghiệm vi rút gi ả dại trong qu y tr ì nh này sử dụng các cặp mồi (xem 3.5) để phát hiện các đoạn gen đích thuộc gen B hoặc gen E trong Bảng 1. Bảng 1 - Trình tự các cặp m ồ i Gen đích L ầ n chạy PCR Cặp m ồ i Trình tự 5’-3’ Kích thước sản phẩm (bp) gB Lần 1 Mồi xuôi 1 gB Mồi ngược 1 gB ATG GCC ATC TCG CGG TGC ACT CGC GGT CCT CCA GCA 334 Lần 2 Mồi xuôi 2 gB M ồ i ngược 2 gB ACG GCA CGG GCG TGA TC GGT TCA GGG TCA CCC GC 195 gE Lần 1 Mồi xuôi 1 gE Mồi ngược 1 gE TCG TGA TGA CGT GCG TCG TCG GGG TCC ATT CGT CAC TTC CGG 377 Lần 2 Mồi xuôi 2 gE Mồi ngược 2 gE CCC ACG CAC GAG GAC TAC TAC CGC GGA ACC AGT CGT CGA AGC 211 Phương pháp Nested PCR sử dụng các cặp mồi phát hiện gen gE có thể phân biệt được vi rút thực địa và vi rút của vắc xin nhược độc được đánh dấu bằng x óa gen gE. 5.2.2.3.1 . Hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt trong máy PCR (xem 4.9) có thể được thực hiện theo hướng dẫn kèm theo bộ kit sử dụng (xem C.1 phụ lục C). 5.2.2.3.2 . Điện di sản phẩm PCR Pha 1,5 g bột agarose với 100 ml 1xTAE, rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn. Khi hỗn hợp nguội bớt (khoảng 50 ° C đến 60 °C), cho tiếp 2 m l etidi bromua (10 mg/ml) vào. Sau đó đổ vào khay và cắm lược. Để gel cứng lại trong khoảng 1 h, rồi rút lược ra. Đổ đầy dung dịch 1xTAE vào bộ điện di (xem 4.10) đến vạch full level, đặt khay gel vào vị trí trong bể điện di. Pha 2 m l dung dịch đệm tải mẫu (loading dye) với 4 m l dung dịch thang chuẩn (100 bp ladder) rồi đưa vào giếng đầu tiên của miếng gel. Pha 2 m l dung dịch đệm tải mẫu v ớ i 8 m l mẫu (đối ch ứ ng âm và dương) rồi dùng micropipet (xem 4.2) đưa vào các giếng còn lại của miếng gel. Điện di gel ở 80 V đến 100 V trong 30 min đến 40 min. 5 .2.2.3.3 . Đọc k ế t quả Đặt gel đã điện di vào máy chi ế u tử ngoại (UV transilluminator) có bước sóng 590 nm. Nếu sử dụng các cặp mồi phát hiện gen B, mẫu dương tính có hiển thị vạch s ả n phẩm giống như đối chứng dương và có kích thước 334 bp (lần PCR 1) và 195 bp (lần PCR 2), với điều kiện đối chứng âm không có vạch s ả n phẩm xuất hiện. Tương tự, nếu sử dụng các cặp m ồ i phát hiện gen E, mẫu dương tính có hiển thị vạch sản phẩm giống như đối ch ứ ng dương và c ó trọng lượng 377 bp (lần PCR 1) và 211 bp (lần PCR 2). Mẫu âm tính giống đối ch ứ ng âm và không có vạch sản phẩm xuất hiện. Mẫu ngh i ngờ hiển thị vạch sản ph ẩ m không r õ nét hoặc hiển thị nhiều hơn 1 vạch sản phẩm. Trường hợp này cần xét nghiệm lại hoặc sử dụng các phương pháp khác để khẳng định. 5.2.3 . Phản ứng Realtime RT-PCR xét nghiệm vi rút 5.2.3.1 . Xử lý m ẫ u (xem 5.2.2.1) 5.2.3.2 . Chiết tách ADN (xem 5.2.2 . 2) 5.2.3.3 . Tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR Phản ứng này không cần bước điện di để đọc kết quả nhưng cần sử dụng thêm mẫu dò (probe) có đánh dấu huỳnh quang và thực hiện trên máy Realtime RT-PCR. Ph ả n ứng Realtime RT-PCR xét nghiệm vi rút gi ả dại trong qu y trình này sử dụng các cặp mồi và mẫu dò để phát hiện các đoạn gen đích thuộc gen gB hoặc gen gE. Tr ì nh tự các cặp mồi và mẫu dò được nêu trong Bảng 2. Bảng 2 - Cặp mồi và mẫu dò Gen đích Cặp mồi Tr ì nh tự 5 ’ -3 ’ gB Mồi xuôi Mồi ngược M ẫ u dò (TaqMan Probe) ACGGCACGGGCGTGATC ACTCGCGGTCCTCCAG CA TET-CTCGCGCGACCT C ATCGAGCCCTGCAC-TAMARA gE Mồi xuôi Mồi ngược Mẫu dò (TaqMan Probe) TCGTGATGACGTGCGTCGTCG CGCGGAACCAGTCGTCGAAGC FAM-CTACGAGGGGCCGTACGCGAGCCTGGA-TAMARA Phản ứng Realtime RT-PCR sử dụng cặp m ồ i và mẫu dò để phát hiện gen gE có thể phân biệt được vi rút thực địa và vi rút của vắc xin nhược độc được đánh dấu bằng x óa gen gE. 5.2.3.3.1 . Hỗn hợp phản ứng và chu tr ì nh nhiệt Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt PCR trong máy realtime RT-PCR (xem 4.8) có thể được thực hiện theo hướng dẫn kèm theo bộ kit được sử dụng (xem C2 phụ lục C). 5.2.3.3.2 . Đọc k ế t quả Mẫu dương tính kh i kết quả xét nghiệm PCR có giá trị C t ≤ 35 và đư ờ ng khuếch đại có dạng cong chuẩn (xem H ì nh 1). Mẫu âm t í nh không có giá trị C t hoặc có giá trị Ct > 40 và đường khuyếch đại nằm dưới đường nền (xem H ì nh 1). Mẫu nghi ngờ khi có giá trị Ct nằm trong khoảng > 35 và ≤ 40. Trường hợp này cần xét nghiệm lại hoặc sử dụng các phương pháp khác đ ể hỗ trợ. H ì nh 1 - V í dụ về kết quả Realtime RT-PCR 5.2.4 . Phương pháp ph â n lập vi rút Phương pháp này dùng trong trường hợp mẫu xét nghiệm bằng phản ứng Nested PCR hoặc realtime RT-PCR cho kết quả nghi ngờ. 5.2.4.1 . X ử lý mẫu (x e m 5.2.2.1) Các dịch bệnh phẩm thu được sau quá tr ì nh xử lý mẫu nên được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 m m trước khi tiến hành phân lập. 5.2.4.2 . Tiến hành phân lập Sử dụng 200 m l dịch ngoáy (gồm cả môi trường bảo quản) hoặc dịch nghiền phủ tạng (dịch nổi thu được sau ly tâm) ch o nhiễm vào tế bào PK15 (xem phụ lục D). Theo dõi trong 7 ngày. 5.2.4.3 . Đọc kết quả M ẫ u dương tính khi tế bào có xuất hiện biến đ ổ i bệnh lý, thường xuất hiện trong vòng từ 24 h đến 72 h. Biến đổi bệnh lý tế bào (CPE) bao gồm: trên mặt tế bào đơn l ớ p hình thành các đám tế bào lưỡng chiết, sau đó bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy, sự hợp bào cũng xuất hiện với các kích thước khác nhau. Trong trường hợp không xuất hiện CPE, th ì tiến hành chuyển dịch nuôi tế bào (200 m l) sang môi trường nuôi cấy tế bào (xem 3.1) m ớ i thêm một lần nữa và theo dõi trong 7 ngày. Để khẳng định những biến đổi tế bào là do vi rút giả dại gây ra, lấy dịch nuôi tế bào xét nghiệm vi rút bằng ph ả n ứng Nested PCR (xem 5.2.2) hoặc Realtime RT-PCR (xem 5.2.3). 5.2.4.4 . Phát hiện kháng th ể b ằ ng phản ứng ELISA Hiện nay các kít ELISA thương mại đ ã có sẵn trên th ị trường dùng để phát hiện kháng thể gB và kháng thể gE trên lợn bị nhiễm vi rút bệnh giả dại (xem phụ lục E). Kít phát hiện kháng thể gE c ó thể phân biệt được kháng thể do nhiễm tự nhiên và kháng thể do tiêm vắc xin được đánh dấu bằng x óa gen gE. 6. Báo cáo kết quả Lợn được kết luận là mắc bệnh gi ả dại khi có các đặc điểm dịch tễ và triệu ch ứ ng điển h ì nh và có kết quả xét nghiệm vi rút hoặc kháng thể dương tính bằng một trong những phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này. Phụ lục A (Quy định) Pha môi trường bảo quản mẫu và dung dịch PBS A.1 . Dung dịch bảo quản mẫu Trộn dung dịch PBS với glycerol theo t ỷ lệ 1:1 và bổ sung kháng sinh theo tỷ lệ như sau: Penicillin G 2.000.000U/lít Streptomycin 200 mg/lít Polymyxin B 2.000.000 U /lít Gentamicin 250 mg/lít Nystatin 500.000 U /lít O f loxacin HC l 6 0 mg/lít Sul f methoxasole 200 mg/l í t A.2 . Pha dung dịch PBS NaC l 8 g KC l 0,2 g Na 2 HP O 4 1,15 g KH 2 PO 4 0,2 g Nước cất 1000 ml Khuấy đều cho đến khi các thành phần tan hoàn toàn trong nước rồi hấp tiệt trùng bằng nồi hấp (xem 4.6) trong 15 min. Phụ lục B (Tham khảo) Quy trình chiết tách ADN của vi rút bệnh giả dại từ mẫu bệnh phẩm Chiết tách ADN của vi rút theo hướng dẫn của bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Kit (Cat. No. 12280-050), như sau: - Nhỏ 25 m l protease K vào ống 1,5 ml. - Nhỏ 200 m l huyễn dịch bệnh phẩm vào ống. - Nhỏ 200 m l dung dịch Lysis Buffer vào ống. - Lắc ống trong 15 s và ly tâm nhẹ. Ủ ở 56 ° C trong 15 min rồi ly tâm nhẹ. - Nhỏ 250 m l Ethanol có nồng độ 100 % vào ống, lắc đều trong 15 s rồi ly tâm nhẹ. - Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 min. - Chuyển toàn bộ dịch trong ống (675 m l) vào cột lọc có ống thu. - Ly tâm cột lọc và ống thu ở gia tốc 6800 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng. - Chuyển cột lọc sang ống thu mới. - Nhỏ 500 m l dung dịch Wash Buffer, ly tâm ở gia tốc 6800 g (xem 4.1) trong 1 min ở nhiệt độ phòng. - Chuyển cột lọc sang ống thu mới. - Nhỏ 500 m l dung dịch Wash Buffer, ly tâm ở gia tốc 6800 g (xem 4.1) trong 1 min ở nhiệt độ phòng. - Chuyển cột lọc sang ống thu mới, ly tâm ở gia tốc 14000 g (xem 4.1) trong 1 min. - Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml sạch Dnase/Rnase. - Nhỏ 50 m l nước sạch Dnase/Rnase vào cột lọc, ủ 1 min ở nhiệt độ phòng - Ly tâm cột lọc và ống 1,5 ml ở gia tốc 14000 g (xem 4.1) trong 1 min ở nhiệt độ phòng. - Bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml chứa 50 m l ADN. Bảo quản ADN ở 4 ° C nếu thực hiện PCR ngay hoặc ở âm 20 ° C n ế u thực hiện PCR sau 24 h. Phụ lục C (Tham khảo) Công thức chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt PCR C.1 . Công thức chuẩn bị hỗn h ợ p phản ứng cho phản ứng PCR (lồng) Theo hướng dẫn của bộ kít GoTaq Green Master Mix (Promega - Part. 9PIM712, Cat. M7122) TT Thành phần hỗn hợp phản ứng S ố lượng (tổng lượng 25 m l ) Chu trình nhiệt 1 GoTaq Green Master Mix (Promega, Madison, W I , USA) 12,5 m l 1 vòng: 94 ° C , 5 min 40 vòng: [94 ° C , 20 s (biến tính ADN) 55 ° C , 30 s (gắn mồi) 72 ° C , 60 s (tổng hợp mạch ADN)] 1 vòng: 72 ° C , 7 min (tổng hợp m ạ ch ADN lần cuối) 2 Mồi xuôi a (forward primer), 10 m M 0,5 m l 3 Mồi ngược a (reverse primer), 10 m M 0,5 m l 1 Mẫu ADN 2,5 m l 2 Nước sạch Rnase 9 m l CHÚ TH Í CH: Tr ì nh tự các đoạn mồi: xem Bảng 1. C.2 . Chuẩn bị hỗn h ợ p phản ứng cho phản ứng Realtime RT-PCR Theo hướng dẫn của bộ kít Platium Quantitative PCR Supermix-UDG (Invitrogen - Cat 11730-017) Thành phần hỗn hợp phản ứng Thể tích (tổng thể tích 50 m l) Chu trình nhiệt Nước sạch nuclease 12 m l Platium Quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Cat no. 11730-025) 25 m l 1 vòng: 50 °C, 120 s, 95 °C, 120 s 40 vòng: 95 ° C , 10s, 63 ° C , 30 s Mồi xuôi a ) , 20 m M 1 m l Mồi ngược a) , 20 m M 1 m l Mẫu dò (TaqMan probe), 6 m M 1 m I Mẫu ADN, từ 100 pg đến 1 m g 10 m l CHÚ THÍCH: Trình tự các đoạn mồi và mẫu dò theo quy định tại Bảng 2. Phụ lục D (Tham khảo) Chuẩn bị tế bào PK15 để phân lập vi rút D.1. Khôi phục tế bào - Lấy ống tế bào được bảo quản đông lạnh trong nitơ lỏng ra và rã đông nhanh chóng bằng cách đặt vào nước ấm 35 °C đến 39 °C trong 1 min. - Chuẩn bị chai nuôi cấy với 10 ml môi trường nuôi dưỡng (EMEM + FCS 10 % (xem 3.4) + kháng sinh 100 IU/ml penicillin và 100 m g/ml hoặc 50 m g/ml gentamycin). - Khi tế bào đã rã đông, nhanh chóng dùng pipet hút dung dịch tế bào sang ống ly tâm 15 ml và cho tiếp vào 10 ml môi trường nuôi dưỡng, trộn đều bằng pipet hút nhả nhẹ nhàng để tránh bọt. - Ly tâm ở 1000 g (xem 4.1) trong 5 min. - Hút bỏ phần dịch nổi. Giữ lại phần tế bào lắng cặn ở dưới. Cho tiếp 2 ml môi trường nuôi dưỡng tế bào EMEM + FCS 10 % (xem 3.4). Trộn đều bằng cách dùng pipet hút nhả. - Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào này vào chai nuôi tế bào (25 cm 2 ) (xem 4.3) đã có 15 ml môi trường nuôi dưỡng FCS 10 % (xem 3.4). Ủ chai nuôi cấy ở tủ ấm 37 °C có 5 % CO 2 (xem 4.4). - Qua 1 ngày, loại bỏ môi trường nuôi dưỡng cũ để loại bỏ DMSO, rửa lớp tế bào bằng dung dịch PBS rồi cho môi trường nuôi dưỡng mới có FCS 10 % (xem 3.4). Ủ chai nuôi tế bào ở tủ ấm 37 °C có CO 2 5 % (xem 4.4) để tế bào phát triển. D.2. Chuyển đời tế bào - Hút bỏ môi trường nuôi dưỡng (xem 3.2) cũ trong chai 25 cm 2 , cho 10 ml dung dịch PBS vào để rửa sạch lớp tế bào sau đó hút bỏ dung dịch rửa này đi. - Cho 2 ml đến 3 ml dung dịch Trypsin/ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) 0,25 % (xem 3.3) vào và ủ ở 37 °C từ 5 min đến 10 min để cho tế bào bong ra khỏi bề mặt chai nuôi cấy. Có thể vỗ nhẹ vào thành chai nuôi c ấ y để tế bào bong ra. - Cho thêm 5 ml môi trường nuôi dưỡng EMEM + FCS 5 % (xem 3.4) (huyết thanh trong môi trường tăng trưởng sẽ vô hoạt trypsin), rồi hút toàn bộ dung dịch này sang ống ly tâm 50 ml. Ly tâm bằng máy (xem 4.1) ở 1000 g trong 5 min. - Hút bỏ phần dịch nổi. Giữ lại phần tế bào lắng cặn ở dưới. Cho tiếp 10 ml môi trường nuôi dưỡng tế bào EMEM + FCS 5 % (xem 3.4). Trộn đều bằng cách dùng pipet hút nhả nhiều lần. - Chia đều dung dịch tế bào này sang các chai nuôi cấy có chứa môi trường nuôi dưỡng mới với lượng 5 x 10 4 tế bào/ml. Ủ đĩa ở tủ ấm 37 °C có 5 % CO 2 (xem 4.4) từ 5 ngày đến 7 ngày. Theo dõi tế bào phát triển hàng ngày và loại bỏ ngay những chai tế bào bị nhiễm khuẩn. - Chuyển đời tế bào theo tỷ lệ 1:5. Lượng tế bào từ 01 chai 25 cm 2 (xem 4.3) đạt 100 % diện tích nuôi cấy có thể chuyển đời sang 5 chai 25 cm 2 (xem 4.3) khác. - Nếu tế bào phát triển kém, hút bỏ môi trường nuôi dưỡng cũ, rửa thảm tế bào bằng dung dịch đệm PBS rồi đưa môi trường nuôi dưỡng mới vào. - Tế bào phát triển tốt sau khi được chuyển đời và đạt khoảng 90 % diện tích nuôi cấy thì đem sử dụng để lây nhiễm vi rút (phân lập vi rút). D.3. Đông lạnh tế bào - Đối với tế bào được nuôi trong chai 25 cm 2 , hút bỏ môi trường cũ, cho 10 ml dung dịch PBS vào để rửa lớp tế bào, sau đỏ hút bỏ dung dịch rửa này đi. - Cho 2 ml đến 3 ml dung dịch Trypsin/ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) 0,25 % (xem 3.3) vào và ủ ở 37 °C từ 5 min đến 10 min để cho tế bào bong ra khỏi bề mặt chai nuôi cấy. Có thể vỗ nhẹ vào thành chai nuôi cấy để tế b à o bong ra. - Cho thêm 10 ml môi trường nuôi dưỡng EMEM + FCS 5 % (xem 3.4) (huyết thanh trong môi trường tăng trưởng sẽ vô hoạt trypsin), rồi hút toàn bộ dung dịch này sang ống ly tâm 50 ml. - Ly tâm bằng máy (xem 4.1) ở 1000 g trong 5 min. - Đổ bỏ phần dung dịch nổi, hòa phần tế bào lắng cặn trong 1 ml môi trường không có huyết thanh (Glasgow Eagle’s) và dùng pipet hút nhả nhiều lần để trộn đều. - Cho 3 ml chất bảo vệ đông lạnh (huyết thanh bò 90 % + DMSO 10 %) vào trộn đều, nhẹ bằng pipet để tránh bọt. - Chuyển 4 ml dung dịch tế bào vào ống đông lạnh cryotube (4,5 ml). Bọc ống đông lạnh trong bông vô trùng hoặc giấy vệ sinh vô trùng để làm chậm quá trình đông lạnh. Đặt ống đông lạnh vào tủ lạnh đông (xem 4.5) -50 °C đến -80 °C qua đêm, sau đó chuyển vào giữ ở nitơ lỏng. Phụ lục E (Tham khảo) Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể gB và kháng thể gE E.1 . Phương pháp phát hiện kháng thể gB (sử dụng k i t PrioCheck PRV gB của hãng Prionics) Bước 1: Nhỏ 100 m l huyết thanh tham chiếu 1 vào các giếng A1 và B1 trong đĩa ELISA (xem sơ đồ đĩa ELISA). Sơ đồ vị trí mẫu trong đĩa ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A TC 1 M2 M4 M8 M12 M16 M20 M24 M28 M32 M36 M40 B TC 1 M2 M4 M8 M12 M16 M20 M24 M28 M32 M36 M40 C TC 2 M3 M5 M9 M13 M17 M21 M25 M29 M33 M37 M41 D TC 2 M3 M5 M9 M13 M17 M21 M25 M29 M33 M37 M41 E TC 3 M4 M6 M10 M14 M18 M22 M26 M30 M34 M38 M42 F TC 3 M4 M6 M10 M14 M18 M22 M26 M30 M34 M38 M42 G M1 M5 M7 M11 M15 M19 M23 M27 M31 M35 M39 M43 H M1 M5 M7 M11 M15 M19 M23 M27 M31 M35 M39 M43 CHÚ THÍCH: TC: mẫu tham chiếu; M: mẫu Bước 2: Nhỏ 100 m l huyết thanh tham chiếu 2 vào các giếng C1 và D1. Bước 3: Nhỏ 100 m l huyết thanh tham chiếu 3 vào các giếng E1 và F1. Bước 4: Nhỏ 100 m l mẫu huyết thanh kiểm tra vào các giếng còn lại (mỗi mẫu làm hai giếng). Đậy nắp đĩa và lắc đĩa nhẹ trong 15 s. Bước 5: Ủ đĩa trong hộp giữ ẩm, ở nhiệt độ 37 °C trong 60 min. Bước 6: Sau khi ủ, đổ hết dung dịch trong đĩa ra và rửa đĩa 6 lần bằng dung dịch rửa, từ 200 m l đến 300 m l dung dịch rửa cho mỗi giếng. Sau lần rửa cuối cùng, đập nhẹ đĩa vài lần xuống mặt bàn có lót khăn bông để làm sạch các dung dịch bên trong đĩa. Bước 7: Nhỏ 100 m l conjugate vào các giếng. Đậy nắp đĩa. Bước 8. Ủ đĩa trong hộp giữ ẩm, ở nhiệt độ 37 °C trong 60 min. Bước 9: Rửa đĩa như trên. Bước 10: Nhỏ 100 m l cơ chất Chromogen (TMB) vào tất cả các giếng. Bước 11: Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng (22 °C ± 3 °C) trong thời gian 20 min. Bước 12: Nhỏ 100 m l dung dịch dừng phản ứng và lắc đĩa nhẹ. Bước 13: Đo giá trị OD của các giếng ở bước sóng 450 nm trong 15 min sau khi dừng phản ứng và đọc kết quả. Điều kiện để phản ứng ELISA được công nhận là: Giá trị OD 45 0 max phải ít nhất bằng 1,00 P I của mẫu tham chiếu 1 phải lớn hơn 50 % P I của mẫu tham chiếu 2 phải nhỏ hơn 50 % Tính phần trăm ức chế PI , theo công thức sau: CHÚ THÍCH: OD 450 sample là giá trị OD đo được ở mỗi giếng mẫu hoặc giá trị OD trung bình của mẫu tham chiếu 1 (giếng A1 và B1) hoặc tham chiếu 2 (giếng C1 và D1). OD 450 max là giá trị OD trung bình của mẫu tham chiếu 3 (giếng E1 và F1); Đánh giá kết quả: Mẫu dương tính kháng thể gB của vi rút bệnh giả dại nếu có P I bằng hoặc lớn hơn 50 %. Mẫu âm tính kháng thể gB của vi rút bệnh giả dại nếu có P I nhỏ hơn 50 %. E.2. Phương pháp phát hiện kháng thể gE (sử dụng kít PrioCheck PRV gE 2.0 của hãng Prionics) Bước 1: Nhỏ 50 m l dung dịch đệm ELISA vào tất cả các giếng cần dùng trong đĩa ELISA Bước 2: Nhỏ 50 m l đối chứng dương vào 2 giếng A1 và B1 trong đĩa ELISA (xem sơ đồ đĩa ELISA) Bước 3: Nhỏ 50 m l đối chứng âm vào 2 giếng C1 và D1 Bước 4: Nhỏ 50 m l đối chứng hợp lệ vào 2 giếng E1 và F1 (t ùy chọn) Bước 5: Nhỏ 50 m l mỗi mẫu huyết thanh vào một giếng (hoặc 2 giếng gần nhau trong đĩa). Đậy nắp đĩa và lắc đĩa nhẹ trong 15 s Bước 6: Ủ đĩa trong hộp giữ ẩm (90 %) ở nhiệt độ 37 °C trong 60 min hoặc ủ qua đêm ở 5 °C Bước 7: Sau khi ủ, đổ hết dung dịch trong đĩa ra và rửa đ ĩ a 6 lần bằng dung dịch rửa, từ 200 m l đến 300 m l cho mỗi giếng. Sau lần rửa cuối cùng, đập nhẹ đĩa vài lần xuống mặt bàn có lót khăn bông để làm sạch các dung dịch bên trong đĩa. Bước 8: Nhỏ 100 m l cộng hợp (conjugate) vào các giếng. Đậy nắp dĩa. Bước 9: Ủ đĩa trong hộp giữ ẩm (90 %) ở nhiệt độ 37 °C trong 60 min. Bước 10: Rửa đĩa như trên. Bước 11: Nhỏ 100 m l cơ chất Chromogen (TMB) vào tất cả các giếng. Bước 12: Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng (22 °C ± 3 °C) trong thời gian 20 min. Bước 13: Nhỏ 100 m l dung dịch dừng phản ứng. Bước 14: Đo giá trị OD bằng máy Elisa (xem 4.7) trong vòng 15 min sau khi dừng phản ứng và đ ọ c kết quả. Điều kiện để phản ứng ELISA được công nhận là: Giá trị OD 450 max lớn hơn 0,9 P I của đối chứng dương phải lớn hơn 65 % P I của đối ch ứ ng hợp lệ phải nhỏ hơn 45 %. Tính phần trăm ức chế, P I , theo công thức sau: CHÚ THÍCH: OD 450 max là giá trị OD trung bình đo được ở 2 giếng C1 và D1 đối chứng âm; OD 450 sample là giá trị OD đo được ở mỗi giếng mẫu (tính trung bình nếu làm 2 giếng) hoặc giá trị OD trung bình của đối chứng dương (giếng A1 và B1) hoặc đối chứng hợp lệ (E1 và F1). Đánh giá kết quả Mẫu dương tính kháng thể gE của vi rút bệnh giả dại nếu có P I bằng hoặc lớn hơn 35 %. Mẫu âm tính kháng thể gE của vi rút bệnh giả dại nếu có P I nhỏ hơn 35 %. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] O.I.E. (2008). Aujeszky's Disease. In Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (P145-157) . [2] Bộ Nông nghiệp và PTNT - Viện Thú y Quốc gia - Tổ chức hợp tác quốc tế Nhật Bản JICA (2002). Bệnh Aujeszky's (Bệnh Giả dại). Trong Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam (trang 94-95).