TCVN9660:2013

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9660:2013 (ISO 13875 : 2005) về Sữa dạng lỏng - Xác định hàm lượng β-lactoglobulin tan trong axit -Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9660 : 2013 ISO 13875 : 2005 SỮA DẠNG LỎNG - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG b - LACTOGLOBULIN TAN TRONG AXIT - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO Liquid milk - Determination of acid-soluble b -lactoglobulin content - Reverse-phase HPLC method Lời nói đầu TCVN 9660 : 2013 hoàn toàn tương đương với ISO 13875:2005; TCVN 9660 : 2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. SỮA DẠNG LỎNG - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG b - LACTOGLOBULIN TAN TRONG AXIT - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO Liquid milk - Determination of acid-soluble b -lactoglobulin content - Reverse-phase HPLC method 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng b -lactoglobulin có thể hòa tan ở pH 4,6 có trong sữa dạng lỏng. Phương pháp này đã được thử nghiệm trên dải hàm lượng từ 0 mg đến 3 500 mg b -lactoglobulin trên một lít sữa. Phương pháp này dùng để phân biệt các loại sữa dạng lỏng đã xử lý nhiệt khác nhau. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 8099-1 (ISO 8968-1), Sữa - Xác định hàm lượng nitơ - Phần 1: Phương pháp Kjeldahl ; TCVN 8099-2 (ISO 8968-2), Sữa - Xác định hàm lượng nitơ - Phần 2: Phương pháp phân hủy kín (Phương pháp Macro) . 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: 2.1. Hàm lượng b -lactoglobulin ( b -lactoglobulin content) Hàm lượng b - LG ( b - LG content) Phần khối lượng của chất xác định được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này. CHÚ THÍCH: Hàm lượng b -lactoglobulin được biểu thị bằng miligam trên lít mẫu thử. 4. Nguyên tắc Casein và whey protein biến tính được kết tủa đẳng điện từ sữa ở pH 4,6. Whey axit được tách bằng ly tâm và lọc. Hàm lượng b - LG tan trong axit có trong whey axit được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo. Hàm lượng b - LG hòa tan có trong mẫu thử được xác định bằng hiệu chuẩn một điểm hoặc nhiều điểm sử dụng mẫu đối chứng. 5. Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 5.1. Mẫu chuẩn, b -lactoglobulin tinh khiết (dạng gen A+B). Kiểm tra độ tinh khiết sắc ký của mẫu chuẩn b - LG bằng phương pháp HPLC nêu trong Điều 10. Xác định nồng độ chính xác như trong 10.2. 5.2. Mẫu đối chứng Mẫu đối chứng được hoàn nguyên từ mẫu sữa nguyên liệu đông khô đã được chuẩn bị từ mẫu sữa gầy nguyên liệu. Mẫu đối chứng chứa một lượng b -LG (A+B) có thể hòa tan đã biết trước, được xác định bằng phương pháp HPLC nêu trong Điều 10. Mẫu đối chứng đông khô khi được bảo quản ở 4 o C, tránh hấp thụ nước sẽ bền được 6 tháng. 5.3. Thuốc thử dùng để chuẩn bị mẫu 5.3.1. Axit clohydric, loãng, c (HCl) = 2 mol/l. 5.3.2. Dung dịch đệm phosphat, pH 6,7 (nồng độ cuối cùng là 0,1 mol/l) Cho 57 ml dung dịch natri dihydro octophosphat (NaH 2 PO 4 ) 0,2 mol/l vào bình định mức 200 ml (6.10). Thêm 43 ml dung dịch dinatri hydro octophosphat (Na 2 HPO 4 ) 0,2 mol/l và trộn. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn lại. 5.4. Dung môi rửa giải HPLC Sử dụng các dung môi rửa giải được chuẩn bị từ thuốc thử loại dùng cho HPLC. CẢNH BÁO AN TOÀN - Sử dụng các biện pháp phòng ngừa an toàn khi xử lý các dung môi rửa giải vì các hóa chất này có thể gây ung thư. 5.4.1. Nước, loại dùng cho phân tích HPLC. Nước được phòng thử nghiệm chuẩn bị có thể không đủ tinh khiết. Nước không tinh khiết sẽ làm nhiễm bẩn cột và giảm độ phân giải. Nếu sử dụng axit trofloaxetic không tinh khiết hoặc được bảo quản không đúng cách thì các pic có thể không phân giải được hoặc không có mặt trong sắc đồ. 5.4.2. Axetonitril (CH 3 CN) 5.4.3. Axit trifloaxetic (CF ­3 COOH) có độ tinh khiết cao 6. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau: 6.1. Máy đo pH, được hiệu chuẩn trong dải pH từ 4,0 đến 7,0 và chính xác đến 0,1 đơn vị pH. 6.2. Máy ly tâm, có thể vận hành ở gia tốc 2000 g . 6.3. Ống ly tâm bằng thủy tinh, dung tích khoảng 30 ml. 6.4. Lọ thủy tinh, dung tích khoảng 5 ml 6.5. Phễu thủy tinh, đường kính khoảng 7 cm. 6.6. Giấy lọc, loại nhanh, đường kính khoảng 11 cm. 6.7. Ống nghiệm thủy tinh, dung tích khoảng 30 ml. 6.8. Pipet một vạch, có thể phân phối các lượng 1 ml, 2 ml và 5 ml. 6.9. Cốc có mỏ, dung tích 50 ml và 100 ml. 6.10. Bình định mức một vạch, dung tích 10 ml, 20 ml, 25 ml, 50 ml và 200 ml. 6.11. Dụng cụ lọc micro. 6.11.1. Xyranh thủy tinh, dung tích 5 ml. 6.11.2. Bộ phận lọc xyranh dùng một lần, cỡ lỗ 0,22 m m, dùng cho dung dịch lỏng. 6.12. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 1 mg và có thể đọc đến 0,1 mg. 6.13. Máy khuấy từ. 6.14. Thiết bị HPLC 6.14.1. Hệ thống bơm rửa giải gradient, có thể hoạt động ở tốc độ 1,0 ml/min ở 200 bar. 6.14.2. Bộ bơm thủ công hoặc tự động , có thể bơm được 20 m l. 6.14.3. Buồng cột, có thể duy trì cột ở 40 o C ± 1 o C. 6.14.4. Detector UV, có thể vận hành ở bước sóng 205 nm hoặc ở 280 nm và 0,1 AUFS. 6.14.5. Bộ tích phân hoặc phần mềm xử lý dữ liệu, có thể đo được các diện tích pic. 6.14.6. Cột PLRP-S 1) , dài 150 mm, đường kính trong 4,6 mm, cỡ hạt 5 m m hoặc 8 m m và cỡ lỗ 30 nm; hoặc cột được nhồi bằng benzen divinyl polystyren chưa dẫn xuất, cho mẫu sắc ký tương đương. 7. Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707). 8. Cách tiến hành 8.1. Chuẩn bị phần mẫu thử 8.1.1. Kiểm tra để biết chắc mẫu thử vẫn còn hạn sử dụng. Đưa nhiệt độ của mẫu thử trong bao gói kín đến 20 o C ± 2 o C. Ngay trước khi mở bao gói, lắc kỹ mẫu bằng cách đảo chiều bao gói. Mở bao gói và chuyển khoảng 50 ml mẫu thử sang cốc có mỏ dung tích 100 ml (6.9). Chỉ mở bao gói đựng mẫu thử ngay trước khi bắt đầu chuẩn bị mẫu. 8.1.2. Chỉnh pH của mẫu thử đến 4,6 bằng cách cho thêm từng giọt dung dịch axit clohydric loãng (5.3.1) trong khi vẫn khuấy liên tục. Để yên mẫu thử 20 min ở nhiệt độ phòng. Chuyển mẫu thử đã chuẩn bị sang ống ly tâm (6.3) và cho ly tâm ở gia tốc 2000 g trong 20 min. Lọc phần nổi phía trên qua giấy lọc (6.6), thu lấy whey axit không chứa casein vào ống nghiệm (6.7). Phần mẫu thử whey axit chưa pha loãng khi được bảo quản ở nhiệt độ 4 o C có thể bền được 24 h hoặc ở - 18 o C có thể bền được 2 tuần. Khi đã rã đông thì mẫu thử whey axit không được cấp đông lại. 8.2. Chuẩn bị dung dịch thử Sau khi rã đông, trộn cẩn thận phần mẫu thử whey axit. Dùng pipet (6.8), chuyển các lượng thích hợp của mẫu thử whey axit, tùy thuộc vào loại mẫu thử, cho vào bình định mức 10 ml (6.10) các lượng sau: a) 1ml, nếu mẫu thử là sữa nguyên liệu hoặc sữa thanh trùng hoặc sữa thanh trùng ở nhiệt độ cao (độ pha loãng cuối cùng là 1:10); b) 2 ml, nếu mẫu thử là sữa tiệt trùng UHT (độ pha loãng cuối cùng là 1:5); c) 5 ml, nếu mẫu thử là sữa tiệt trùng đóng chai (độ pha loãng cuối cùng là 1:2) Pha loãng phần mẫu thử đến vạch bằng dung dịch đệm phosphat (5.3.2). Trộn kỹ bằng cách đảo chiều để yên trong 1 h. Trộn kỹ lại và lọc qua dụng cụ lọc micro (6.11). Loại bỏ vài mililit dịch lọc đầu tiên. Thu lấy phần dịch lọc còn lại vào lọ thủy tinh (6.4). Dung dịch whey axit pha loãng khi được bảo quản ở 4 o C nhưng phải được phân tích trong vòng 24 h. 8.3. Chuẩn bị dung dịch đối chứng Cân 2,50 g mẫu đối chứng (5.2), chính xác đến 0,01 g cho vào cốc có mỏ 30 ml (6.9). Thêm 10 ml nước cất ở 40 o C. Dùng đũa thủy tinh (6.13) khuấy cho tan hết. Chuyển định lượng mẫu đối chứng đã hoàn nguyên sang bình định mức 25 ml (6.10). Pha loãng bằng nước cất đến vạch và trộn kỹ. Chuyển định lượng 25 ml dung dịch đối chứng sang cốc có mỏ 50 ml (6.9). Chuẩn bị phần mẫu đối chứng whey axit theo 8.1.2 đối với phần mẫu thử. Định kỳ chuẩn hóa mẫu đối chứng theo Điều 10. 8.4. Chuẩn bị dung dịch đối chứng cho quy trình hiệu chuẩn nhiều điểm Sau khi rã đông, trộn cẩn thận phần mẫu đối chứng whey axit. Dùng pipet lấy 2 ml phần mẫu đối chứng cho vào bình định mức 20 ml (6.10) (đánh dấu là D). Pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat (5.3.2) đến vạch và trộn. Dùng pipet lấy ngay 1 ml, 2 ml và 5 ml dung dịch này cho vào ba bình định mức 10 ml (6.10) khác nhau (đánh dấu là A, B và C). Pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat (5.3.2) đến vạch. Đậy nắp bình và trộn kỹ. Lọc từng dung dịch đối chứng (A, B, C và D) sử dụng dụng cụ lọc micro (6.11). Loại bỏ vài mililit dịch lọc đầu tiên của từng dung dịch và thu lấy phần dịch lọc còn lại. Dùng quy trình này để thu được bốn dung dịch đối chứng pha loãng sau đây: - dung dịch đối chứng A có tỷ lệ pha loãng 1:100; - dung dịch đối chứng B có tỷ lệ pha loãng 1:50; - dung dịch đối chứng C có tỷ lệ pha loãng 1:20; - dung dịch đối chứng D có tỷ lệ pha loãng 1:10. Các dung dịch đối chứng pha loãng có thể được bảo quản ở 4 o C nhưng phải được phân tích trong vòng 24 h. 8.5. Chuẩn bị dung dịch đối chứng cho quy trình hiệu chuẩn một điểm Chuẩn bị dung dịch đối chứng để có diện tích pic của b -LG gần bằng diện tích pic của dung dịch thử (nghĩa là ± 20 %). Không sử dụng các dung dịch đối chứng có chứa hàm lượng b -LG nhỏ hơn 50 mg/l. Thông thường dung dịch đối chứng B (8.4) được sử dụng để định lượng b -LG trong sữa tiệt trùng đóng chai và sữa UHT. Sử dụng dung dịch mẫu đối chứng D (8.4) để định lượng b -LG trong sữa nguyên liệu, sữa thanh trùng và sữa thanh trùng nhiệt độ cao. 8.6. Xác định bằng HPLC 8.6.1. Dung môi rửa giải Sử dụng các dung môi rửa giải sau: a) dung môi rửa giải X1: phần thể tích axit trifloaxetic 0,1 % (5.4.3) trong nước (5.4.1); b) dung môi rửa giải Y: phần thể tích axit trifloaxetic 0,1 % (5.4.3) trong axetonitril (5.4.2); c) dung môi rửa giải X2: trộn các thể tích của nước (5.4.1), axetonitril (5.4.2) và axit trifloaxetic (5.4.3) theo tỷ lệ : 65:35:0,1. Hệ thống gradient áp suất thấp có thể tạo ra nhiễu đường nền do trộn không đều các dung môi rửa giải X1 và Y. Khi đó, thay dung môi rửa giải X1 bằng dung môi X2. Giữ nguyên dung môi rửa giải Y. Lập chương trình gradient rửa giải mới theo Bảng 1, có tính đến dung môi X2 chứa sẵn 35 % axetonitril. 8.6.2. Gradient rửa giải Bảng 1 - Gradient rửa giải khuyến cáo Thời gian min Dung môi rửa giải X1 % Dung môi rửa giải Y % Bắt đầu 65 35 1,0 65 35 8,0 62 38 16,0 58 42 22,0 54 46 22,5 0 100 23,0 0 100 23,5 65 35 CHÚ THÍCH: Gradient rửa giải có thể cần điều chỉnh đôi chút để thu được độ phân giải như trong Hình 1. Cài đặt tốc độ dòng của hệ thống bơm gradient rửa giải (6.14.1) của hệ thống HPCL (6.14) ở tốc độ 1,00 ml/min. Cài đặt nhiệt độ của buồng cột (6.14.3) ở 40 o C. Xác định thời gian cân bằng bằng cách kiểm tra độ rửa giải của cột. Tín hiệu detector ở lần chạy cuối (đường nền) cần bằng với giá trị ban đầu của nó. Rửa đẳng dòng 15 min là đủ. 8.6.3. Thể tích bơm Sử dụng bơm tự động hoặc thủ công (6.14.2) để bơm 20 m l các dung dịch vào cột. 8.4.6. Cân bằng cột Khi bắt đầu hệ thống trong mỗi ngày, cho 100 % dung môi rửa giải Y (8.6.1) đi qua cột trong 5 min đến 10 min. Sau đó cài đặt các điều kiện ban đầu (8.6.2) và cân bằng trong 15 min. Tiến hành chạy mẫu trắng bằng cách bơm dung dịch đệm phosphat (5.3.2). Đối với cột bảo quản lâu, thì rửa cột bằng axetonitril (5.4.2) và nước (5.4.1) với tỷ lệ 70:30. 8.6.5. Xác định hàm lượng b -LG trong mẫu thử Tiến hành dãy các phép phân tích sắc ký trong khi giữ ổn định thời gian chạy giữa các lần để thu được đường nền không bị trôi và thời gian lưu ổn định. Luôn tiến hành quy trình hiệu chuẩn một điểm hoặc nhiều điểm trong mỗi dãy của các phép phân tích. Cứ 10 đến 15 mẫu thử lại bơm một dung dịch đối chứng để đánh giá hệ số đáp ứng. Nếu cần, hiệu chuẩn lại hệ thống. Có thể sử dụng quy trình hiệu chuẩn một điểm hoặc nhiều điểm. Định kỳ thực hiện hiệu chuẩn nhiều điểm để kiểm tra độ tuyến tính của hệ thống HPLC. Nếu mẫu thử chứa hàm lượng b -LG rất thấp (ví dụ: sữa tiệt trùng, thì luôn chạy mẫu trắng (8.6.4) trước khi bơm các mẫu đó để giảm thiểu khả năng "ảnh hưởng chéo" của hệ thống. Cứ 20 đến 25 lần chạy thì làm sạch cột bằng cách cho 100 % dung môi rửa giải Y (8.6.1) đi qua cột ít nhất 30 min. 8.7. Phương pháp tích phân Trong các điều kiện quy định, thu được ba pic b -LG không phân giải được hoàn toàn. Tích phân ba pic này theo một nhóm (Xem Hình 1). Xác định toàn bộ diện tích của các pic b -LG như sau: Lập đường nền từ điểm bắt đầu của pic b -LG thứ nhất đến điểm cuối cùng của pic b -LG sau cùng. Tích phân diện tích của nhóm pic trong dải thời gian này (xem Hình 1 và Hình 2). Khi các điểm bắt đầu và/hoặc kết thúc không thể nhận biết được rõ ràng vì có độ trôi đường nền hoặc hình dạng của pic không tốt, thì chấp nhận tích phân khoảng thời gian của mẫu đối chứng (xem Hình 2). CHÚ DẪN: X là thời gian, tính bằng phút; Y là sự đáp ứng tương đối ở bước sóng 205 nm; A và B là các pic của hai dạng b -LG T là dung dịch thử với tỷ lệ pha loãng 1:5, thu được từ mẫu sữa UHT chứa 500 mg/l b -LG R là dung dịch đối chứng với tỷ lệ pha loãng 1:50, thu được từ mẫu sữa đông khô hoàn nguyên chứa 3470 mg/l b -LG Hình 1 - Sắc đồ HPLC của dung dịch thử sữa UHT và của dung dịch đối chứng CHÚ DẪN: X là thời gian, tính bằng phút; Y là sự đáp ứng tương đối ở bước sóng 205 nm; T là dung dịch thử với tỷ lệ pha loãng 1:2, thu được từ mẫu sữa tiệt trùng chứa 24 mg/l b -LG R là dung dịch đối chứng với tỷ lệ pha loãng 1:100, thu được từ mẫu sữa đông khô hoàn nguyên chứa 3470 mg/l b -LG Hình 2 - Sắc đồ HPLC của dung dịch thử sữa tiệt trùng và của dung dịch đối chứng 9. Tính và biểu thị kết quả 9.1. Hiệu chuẩn nhiều điểm 9.1.1. Tính hàm lượng b -LG, w ­x , bằng miligam trên lít có trong mỗi dung dịch đối chứng x, trong đó x = A, B, C hoặc D (8.4), theo công thức sau: Trong đó: m là khối lượng của b -LG, tính bằng miligam, có trong 2,5 g mẫu đối chứng (5.2). 9.1.2. Dùng phép phân tích hồi quy tuyến tính bình phương nhỏ nhất đối với các cặp A A - w A ; A B - w B ; A C - w C ; A D - w D dùng w A , w B , w C , w D làm các biến số độc lập, cho các hệ số hồi quy b o và b ­1 bằng công thức sau đây: A x = (b o x w x ) + b 1 Trong đó: A x là diện tích pic của b -LG của dung dịch x (x là các dung dịch từ A đến D); b o là hệ số hồi quy thứ nhất (độ dốc); b 1 là hệ số hồi quy thứ hai (điểm cắt). 9.1.3. Tính hàm lượng b -LG, w t của mẫu thử bằng miligam trên lít, theo công thức sau: Trong đó: A t là diện tích pic của b -LG của dung dịch thử (8.2); V t là thể tích của phần mẫu thử whey axit (8.1) đã dùng để chuẩn bị dung dịch thử (8.2), tính bằng mililit (ml). 9.2. Hiệu chuẩn một điểm Tính hàm lượng b -LG, w t , của mẫu thử bằng miligam trên lít, theo công thức sau: Trong đó: w r là hàm lượng b -LG trong mẫu đối chứng hoàn nguyên (8.3), tính bằng miligam trên lít; A r là diện tích pic b -LG của dung dịch đối chứng (8.5); A t là diện tích pic b -LG của dung dịch mẫu thử (8.2); V r là thể tích của whey axit của mẫu đối chứng hoàn nguyên (8.3) có trong 1 ml dung dịch đối chứng (8.5), tính bằng mililit; V t là thể tích của phần mẫu thử whey axit (8.1) đã dùng để chuẩn bị dung dịch thử (8.2), tính bằng mililit. 9.3. Biểu thị kết quả Biểu thị kết quả tính đến hai chữ số thập phân, hoặc "nhỏ hơn 15 mg/l" (xem 11.1). 10. Chuẩn hóa mẫu đối chứng 10.1. Yêu cầu chung Định kỳ chuẩn hóa mẫu đối chứng để kiểm tra hiệu quả thực hiện của phòng thử nghiệm. 10.2. Chuẩn bị mẫu chuẩn Cân khoảng 20 mg mẫu chuẩn b -LG (5.1), chính xác đến 1 mg, cho vào bình định mức 50 ml (6.10). Hòa tan mẫu chuẩn trong dung dịch đệm phosphat (5.3.2). Pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat (5.3.2) đến vạch và trộn. Lọc dung dịch chuẩn bằng dụng cụ lọc micro (6.11). Loại bỏ vài mililit dịch lọc đầu tiên. Thu lấy phần dịch lọc còn lại vào lọ thủy tinh (6.4). 10.3. Xác định hàm lượng protein Xác định hàm lượng nitơ, w N , của mẫu chuẩn theo phương pháp mô tả trong TCVN 8099-1 (ISO 8968-1) hoặc TCVN 8099-2 (ISO 8968-2). Tính hàm lượng protein, w P , bằng miligam trên 100 mg mẫu chuẩn, theo công thức sau: w P = w N x 6,38 Trong đó: w N là hàm lượng nitơ của mẫu, tính bằng phần trăm khối lượng; 6,38 là hệ số được chấp nhận để chuyển đổi hàm lượng nitơ thành hàm lượng protein thô. 10.4. Xác định hàm lượng b -LG trong mẫu đối chứng Chạy sắc ký cả hai dung dịch chuẩn (10.2) và dung dịch đối chứng D với tỷ lệ pha loãng 1:10 (8.4). 10.5. Tính hàm lượng b -LG Tính hàm lượng b -LG, w r , của mẫu đối chứng hoàn nguyên (8.3), bằng miligam trên lít, theo công thức sau: Trong đó: m là khối lượng mẫu chuẩn (10.2), tính bằng miligam (mg); w p ­ là hàm lượng protein tính trên 100 mg mẫu chuẩn, tính bằng miligam (mg); A s là diện tích pic b -LG của dung dịch chuẩn (10.2); A r là diện tích pic b -LG của dung dịch đối chứng (8.4). Khi hệ thống làm việc tốt, thì chênh lệch giữa giá trị w r thu được bằng quy trình này với lượng công bố trong mẫu đối chứng phải nằm trong dải quy định về độ tái lập. Những chênh lệch nhỏ có thể do nồng độ b -LG của mẫu chuẩn không tương ứng với độ tinh khiết công bố. 10.6. Biểu thị kết quả Biểu thị kết quả chính xác đến hai chữ số thập phân. 11. Độ chụm 11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và các chất nền khác với các dải nồng độ và các chất nền đã nêu. Giới hạn thấp nhất của phép định lượng b -LG là 15 mg/l. Dưới giới hạn đó thì biểu thị kết quả thu được là "nhỏ hơn 15 mg/l". 11.2. Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ độc lập, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau trong một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn: - đối với các giá trị b -LG từ 15 mg/l đến 500 mg/l: 16 % giá trị trung bình; - đối với các giá trị b -LG từ 1 300 mg/l đến 3 600 mg/l: 4 % giá trị trung bình. Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, biểu thị độ biến thiên các kết quả phân tích độc lập thu được trong các điều kiện nói trên, không được quá 5 % trường hợp lớn hơn: - đối với các giá trị b -LG từ 15 mg/l đến 500 mg/l: 6 %; - đối với các giá trị b -LG từ 1 300 mg/l đến 3 600 mg/l: 1,4 %. 11.3. Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả thử nghiệm riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống hệt nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn: - đối với các giá trị b -LG từ 15 mg/l đến 500 mg/l: 31 % giá trị trung bình; - đối với các giá trị b -LG từ 1 300 mg/l đến 3 600 mg/l: 13 % giá trị trung bình. Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, biểu thị độ biến thiên các kết quả phân tích độc lập thu được trong các điều kiện nói trên, không được quá 5 % trường hợp lớn hơn: - đối với các giá trị b -LG từ 15 mg/l đến 500 mg/l: 11 %; - đối với các giá trị b -LG từ 1 300 mg/l đến 3 600 mg/l: 5 %. 12. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường có thể ảnh hưởng tới kết quả. e) kết quả thử nghiệm thu được và nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được. Phụ lục A (Tham khảo) Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm Các giá trị giới hạn lặp lại và tái lập, thu được từ các kết quả của hai phép thử liên phòng thử nghiệm do Nhóm chuyên gia về sữa của Cộng đồng Châu Âu tổ chức thực hiện. Các kết quả thu được đã được phân tích thống kê phù hợp với TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) để cho dữ liệu về độ chụm nêu trong Bảng A.1 và A.2. Phiếu thử thứ nhất gồm có 10 phòng thử nghiệm tham gia thực hiện trên 9 mẫu sữa UHT và sữa tiệt trùng đóng chai chứa hàm lượng b -LG từ 0 mg/l đến 500 mg/l. Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm thứ nhất được nêu trong Bảng A.1. Bảng A.1 - Mẫu sữa chứa hàm lượng b -LG từ 0 mg/l đến 500 mg/l Loại sữa Giá trị trung bình mg/l Giới hạn lặp lại, r mg/l s r Giới hạn tái lập, R mg/l s R Tiệt trùng đóng chai 19,30 2,64 0,94 4,82 1,72 Tiệt trùng đóng chai 24,80 3,56 1,27 9,19 3,28 UHT 54,30 16,01 5,72 12,72 4,54 UHT 64,90 13,89 0,50 20,78 7,42 UHT 80,00 32,50 11,59 36,91 13,18 UHT 86,10 10,07 3,60 18,57 6,63 UHT 133,70 12,04 4,22 67,03 23,94 UHT 240,40 31,53 11,26 57,68 20,60 UHT 424,40 38,92 13,90 89,49 31,96 Phép thử thứ hai gồm có 14 phòng thử nghiệm tham gia thực hiện trên 9 mẫu sữa nguyên liệu, sữa thanh trùng, sữa thanh trùng nhiệt độ cao và sữa UHT có chứa hàm lượng b -LG từ 1 300 mg/l đến 3 600 mg/l. Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm thứ hai được nêu trong Bảng A.2. Bảng A.2 - Mẫu sữa chứa hàm lượng b -LG từ 1 300 mg/l đến 3 600 mg/l Loại sữa Giá trị trung bình mg/l Giới hạn lặp lại, r mg/l s r Giới hạn tái lập, R mg/l s R UHT 1337 95,12 33,97 222,52 79,47 UHT 1429 69,61 22,72 239,90 85,68 Thanh trùng ở nhiệt độ cao 2021 79,55 28,41 240,79 86,00 Thanh trùng 2557 105,15 37,55 335,80 119,93 Thanh trùng 2777 123,95 44,27 421,76 150,63 Thanh trùng 2920 81,51 29,11 366,35 130,84 Nguyên liệu 3449 79,17 28,27 474,27 169,38 Nguyên liệu 3544 87,30 31,18 361,43 129,08 Nguyên liệu 3565 141,90 50,68 268,85 96,02 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu 2) . [2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung . [3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn . [4] RESMINI, P., PELLEGRINO, L.ANDREINI R. and PRATI F. Determinazione delle sieroproteine solubii del latte per HPLC (cromatografia liquida ad alta prestazione) in fase inversa. Sci. Tecn. Latt. Cas., 40, 1989, pp. 7-23 [5] RESMINI, P., PELLEGRINO, L.HOGENBOOM J.A. ANDRENIN R. Thermal denaturation of whey protein in pasteurizes milk. Fast evaluation by HPLC. Ital. J. Food Sci., 2, 1989, pp. 51-62 1) Cột PLRP-S là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Polymer laboratories Ltd, Church Stretton, Vương quốc Anh. Thông tin đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương. 2) Tương đương với IDF 50.