TCVN11292:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11292:2016 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng taurine - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11292:2016 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TAUR I NE - PHƯƠNG PHÁP S Ắ C KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO Animal f eeding stu ff s - Determination o f taurine content - Reverse-phase higt per f ormance liquid chromatographic method L ờ i nói đầu TCVN 11292:2016 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 999 : 12 Taurine in pet foo d ; TCVN 11292:2016 do viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đ ề ngh ị , Tổng c ụ c Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TAUR I NE - PHƯƠNG PHÁP S Ắ C KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO PHA ĐẢO Animal f eeding stu ff s - Determination o f taurine content - Reverse-phase higt per f ormance liquid chromatographic method 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chu ẩ n này quy định phương pháp sắc ký l ỏ ng hiệu năng cao pha đảo để xác định hàm lượng taurine trong thức ăn chăn nuôi. CHÚ THÍCH: Đối với thức ăn dạng khô hoặc d ạ ng ướt dành cho ch ó v à mèo, kho ả ng định lượng của phương ph á p là từ 150 mg/kg đến 2 000 mg/kg. Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm được n ê u trong Phụ lục A. 2 Tài liệu viện dẫn Các t à i liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các t à i liệu viện dẫn ghi năm c ô ng bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối vớ i các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 6952 (ISO 9498), T hức ăn chăn nuôi - Chu ẩ n bị mẫu thử. 3 Nguyên tắc Phần m ẫ u thử được thủy phân bằng axit clohydric, taurine đã chiết được cho ph ầ n ứng với dansyl clo ru a đ ể tạo dẫn xuất phát huỳnh quang, dẫn xu ấ t này được xác định bằng HPLC pha đảo. 4 Thuốc th ử và vật liệu thử Ch ỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân t í ch và nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, tr ừ khi có quy định khác. 4.1 Axit clohydric loãng, 6 M Thêm từ từ 500 ml axit clohydric (HCI) đặc ( nồng độ từ 36,5 đến 38,0%) vào 500 ml nước. 4.2 Dung d ịch natri cacbonat, 0,2 M, pH 9,7 Hòa tan 21,2 g natri cacbonat (Na 2 C O 3 ) trong 800 ml nước. Chỉnh pH đ ế n 9,7 bằng dung d ị ch axit clohydric 6 M (4.1), sử dụng máy đo pH và pha lo ã ng đến 1 000 ml. Dung d ịch này b ề n được 6 tháng khi bảo quản ở nhiệt độ phòng. 4.3 Axetonitri l (C 2 H 3 N), loại dùng cho HPLC. 4.4 Dung dịch axetonitril- nước , 70 : 30 (phần thể tích) 4.5 Axeton (C 3 H 6 O ), tối thiểu 99,5 %. 4.6 Dung dịch dansyl c l orua (C 12 H 12 C l N O 2 S) 4.6.1 Dung d ịch chuẩn gốc, 100 m g/m l Hòa tan 1,000 g dansyl clorua (tối thi ể u 95 %) bằng axeton (4.5) đựng trong bình định mức 10 ml và thêm axeton đến vạch. Khi được b ả o qu ả n ở nơ i tối, dung dịch này c ó thể bền được một tháng. 4.6.2 Dung dịch chuẩn làm vi ệ c Pha lo ã ng 1 ml dung dịch chu ẩ n g ố c (4.6.1) đến 10 ml bằng dung dịch axetonitril-nước (4.4). Chuẩn bị dung dịch này ngay trước khi sử dụng. 4.7 Dung dịch axit orthophosphor i c (H 3 P O 4 ), 2 % th ể t í ch Pha loãng 2,35 ml axit phosphoric 85 % b ằ ng nước đến 100 ml. 4.8 Dung dịch đệm phosphat, 0,5 M, pH 6,2 Hò a tan 30,6 g kali dihydrophosphat (KH 2 P O 4 ) và 4,36 g d i kali hydrophosphat (K 2 HPO 4 ) trong khoảng 400 ml nước và chỉnh pH đến 6,2 b ằ ng axit phosphoric (H 3 PO 4 ). Th ê m nước đến 500 ml. 4.9 D ung dịch chuẩn taurine (C 2 H 7 NO 3 S) 4.9.1 Dung d ị ch chuẩn g ố c, 1 mg/ml Hòa tan 100,0 mg taurine (tối thi ể u 99 %) trong nước và pha lo ã ng đến 100 m l. Khi được bảo qu ả n ở 4 0 C dung dịch này có thể b ề n được một tu ầ n. 4.9.2 Dung d ị ch chuẩn l àm việc Pha lo ã ng các lượng dung dịch chuẩn gốc (4.9.1) với nước đ ể chu ẩ n bị các dung dịch chuẩn làm việc c ó chứa 0 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml, 50 µg/ml, 80 µg/ml vá 100 µg/ml. Khi được bảo qu ả n ở 4 °C c á c dung dịch này có th ể bền được một tuần. 4.10 Pha động 4.10.1 Dung môi A, dung dịch đệm phosphat 0,02 M, pH 3,0 Hòa tan 2,72 g kali dihydrophosphat trong khoảng 800 ml nước và chỉnh pH đ ế n 3,0 b ằ ng axit phosphoric. Th ê m nước đến 1 000 ml. Lọc qua bộ lọc màng (5.5). 4.10.2 Dung môi B Trộn 600 ml axetonitril với 400 ml pha động A (4.10.1). 5 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm t h ô ng thường v à cụ thể như sau: 5.1 Cân phân tích, c ó th ể cân chính x á c đến 0,1 mg. 5.2 Máy sắc ký lỏng, có hệ thống rửa giải grad i ent, bộ lấy mẫu tự động với v ò ng bơm m ẫ u 20 µl. 5.3 Detec t or huỳnh quang, với bước sóng k í ch thích 298 nm v à bước sóng phát xạ 550 nm. 5.4 Cột HPLC, cột pha đảo, C8 hoặc C18, hạt nhồi silica c ỡ 4 µm hoặc 5 µm. 5.5 Bộ lọc, dùng một lần, dạng xyranh có đ ầ u lọc bằng polyvinyliden f lorua (PVDF), cỡ 0,2 µm, v í dụ: Gelman Acrod i sc hoặc loại tương đương. 5.6 Máy trộn vortex. 5.7 Bình định mức, dung tích 10 ml, 25 ml, 100 m l , 500 ml và 1 000 ml. 5.8 T ủ sấy, có th ể duy trì ở 110 ° C . 5.9 T ủ s ấ y hoặc bộ gia nhiệt, có thể duy tr ì ở 65 ° C . 5.10 P i pet. 5.11 Chai đựng thuốc thử, có n ú t v ặn d u ng tích 25 ml. 5.12 Lọ đựng mẫu (v i al), dung tí ch 2 ml. 5.13 Xyranh, có th ể ph â n ph ố i th ể tích 2 ml. 6 Lấy m ẫu Mẫu gửi đến ph ò ng thử nghiệm ph ải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không b ị hư hỏng hoặc thay đ ổi trong su ố t quá trình vận ch uyển hoặc bảo quản. Việc l ấ y mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 ( ISO 6497) Thức ăn ch ă n nuôi - L ấ y mẫu. 7 Chuẩn bị mẫu th ử Chuẩn b ị mẫu th ử theo TCVN 6952 (ISO 9498). Nếu mẫu thử dạng khô t hì nghiền l ượng mẫu thử thích hợp thành dạng bột mịn. Đồng nh ấ t mẫu thử đã nghiền bằng máy đồng h ó a. 8 Cách tiến hành 8.1 Tách và tạo dẫn xuất 8.1.1 Thủy phân Cân 400 mg mẫu kh ô đ ã nghi ề n hoặc 800 mg mẫu ư ớ t đã trộn kỹ, ch í nh xác đến 0,1 mg cho vào chai đựng thuốc thử có nút vặn dung tích 25 ml (5.11). Thêm 10 ml axit clohydric 6 M (4.1). Vặn nút chai và thủy phân hỗn hợp 16 h trong tủ s ấ y 110 ° C (5.8). Làm nguội đến nh i ệt độ phò n g, chuyển định lượng phần đã th ủ y phân sang b ì nh định mức 25 ml (5.7) và th ê m nước đến vạch. Lọc khoảng 2 ml dịch thủy phân đã pha lo ã ng bằng bộ lọc 0,2 m m dạng xyranh (5.5). Dùng pipet (5.10) chuyển 250 µm dịch thủy phân đã lọc sang l ọ phản ứng 2 ml (5.12) và cho bay hơi đến khô dưới dòng nitơ. Giữ ở nhiệt độ nhỏ h ơ n 70 ° C để tránh th ấ t thoát taurine. 8.1.2 Tạo d ẫ n xuất Hòa tan phần cặn c ò n lại thu được ở 8.1.1 trong 100 µl nước và trộn tr ê n m á y trộn vortex (5.6). Thêm 0,5 ml dung dịch natr i cacbonat (4.2) và trộn trong 10 s. Thêm 0,5 ml dung dịch chuẩn làm việc dansyl clorua (4.6.2) và trộn trong 10 s. Đậy nút lọ và đặt trong t ủ s ấ y hoặc bộ gia nhiệt duy trì ở 65 ° C (5.9) trong 30 min. Làm nguội đến nhiệt độ phòng và th ê m 100 µ l dung dịch ax i t phosphoric 2 % (4.7) và trộn trong 10 s. Thêm 0,5 ml d ung d ị ch đệm phosphat 0,5 M (4.8) và 0,3 ml nước, trộn trong 10 s. Các bư ớ c trộn đều thực hiện trên máy trộn vortex (5.6). Dùng xyranh 2 m l ( 5.13) chuy ể n hỗn hợp phản ứng qua bộ lọc 0,2 µm dạng xyranh (5.5) v à o lọ lấy mẫu tự động HPLC (dung dịch có thể bền đến 2 ngày khi bảo quản ở -20 ° C cho đến khi phân t í ch). Xử lý 100 µl của từng dung dịch chu ẩ n làm việc (4.9.2) tương tự như trên. 8.2 Xác định bằng HPLC C à i đặt thiết bị với t ố c độ d ò ng 1,5 ml/m i n, chương trình grad i ent, t ỉ lệ dung mô i A (4.10.1) và B (4.10.2) theo Bảng 1. Tối ưu hóa các đi ề u kiện tách để thu đư ợ c pic của taurine tốt nh ấ t. Đ ể ổ n định HPLC, bơm lặp lại nhiều lần các th ể tích 20 µl dung dịch m ẫ u chu ẩ n và mẫu th ử đã tạo d ẫ n xu ấ t, sử d ụ ng chương trình gradient trong Bảng 1, c á c giá tr ị trong bảng có th ể thay đổi để phù hợp v ớ i các đặc tính của cột phân tích. B ả ng 1 - Chương t rì nh grad i ent Thời gian, m i n Ph ầ n trăm Dung m ô i A Dung m ô i B 0 80 20 21 71 29 25 20 80 40 20 80 42 80 20 47 80 20 Bơm các thể tíc h 20 µl dung dịch mẫu chuẩn và mẫu th ử đã tạo dẫn xu ấ t v à dựng đường chu ẩ n theo diện tích hoặc chiều cao của pic, s ử dụng bộ t í ch phân điện tử hoặc máy tính. Đường chuẩn đ i qua gốc tọa độ và tuy ế n t í nh. 9 T í nh kết quả Hàm lượng taurine trong m ẫ u th ử , X , biểu thị bằng mi li gam trên kilogam (mg/kg), được t í nh t heo công thức sau: Trong đó: R test là đáp ứng pic (chiều cao hoặc diện t í ch) của taurine trong dịch chiết mẫu; S là độ dốc của đường chu ẩ n, tính bằng mililit trên micr o gam (ml/µg); V 1 là th ể tích d ị ch chiết được hoàn nguyên, tính bằng microlit ( V 1 = 1 00 µl); V 2 là thể tích d ị ch ch iế t đượ c l ấ y đ ể tạo d ẫ n xu ấ t, t í nh bằng microlit ( V 2 = 250 µ l) ; V 3 là thể tích cuối cùng của d ị ch chi ế t mẫu, tính bằng mililit ( V 3 = 25 m l ); w l à kh ối lượng phần mẫu thử, tính b ằ ng gam (g). 10 Báo cáo th ử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) Mọi th ô ng tin c ầ n th iế t để nhận biết đ ầ y đủ về mẫu thử; b) Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu b iế t; c) Phương pháp thử đ ã dùng, viện d ẫ n ti ê u chu ẩ n này; d) Tất cả các chi tiết thao tác kh ô ng quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tù y chọn cùng với các chi t iết bất thường nào khác có th ể ả nh hư ở ng đến k ế t quả; e) Kết quả thử nghiệm th u được. Phụ lục A (Tham khảo) Độ chụm của phương pháp C á c phép phân t í ch kiểm tra độ chụm của phương pháp do một số phòng thử nghiệm thực hiện trên sáu mẫu, cho kết quả nh ư sau: Thức ăn dạng ướ t cho m è o 1 Th ứ c ăn dạng ướt cho m è o 2 Th ứ c ăn dạng ướt cho chó 3 Th ứ c ăn dạng ướt cho chó 4 Thức ă n dạng kh ô cho m è o 5 Th ức ăn dạng kh ô cho m è o 6 Số lượng phòng thử ngh iệ m 8 7 9 9 7 8 Số lượng phòng thử nghiệm ngoại l ệ 1 2 0 0 2 0 Gi á tr ị trung b ì nh, mg/kg 526 514 167 333 936 2256 Độ lệch c huẩ n lặp lại tương đ ố i, RSD r , % 4,1 3,9 10,0 7,4 3,2 5 , 7 Giới hạn lặp lại, r , mg/kg 61 56 47 69 84 361 Độ lệch chuẩn tái lập tương đ ố i, RSD R , % 6 , 1 6 , 6 10,2 16,1 8 , 9 13 , 3 Giới hạn tái lập, R , mg/kg 90 94 48 150 233 839