TCVN5162:2008

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5162 : 2008 về thực phẩm – Xác định Vitamin B1 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5162 : 2008 THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B 1 BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Foodstuffs – Determination fo vitamin B 1 by high performance liquid chromatography (HPLC) CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể cần phải sử dụng các vật liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đề cập đến các vấn đề an toàn khi sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn qui định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định vitamin B 1 trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Hàm lượng vitamin B 1 là khối lượng thiamin tổng số bao gồm các dẫn xuất đã tách phospho. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi. TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử. 3. Nguyên tắc Thiamin được chiết ra khỏi thực phẩm sau khi thủy phân bằng axit rồi tách phospho sử dụng cách xử lý bằng enzym và định lượng bằng HPLC có dẫn xuất sau cột hoặc trước cột với thiocrom [1] đến [6]. 4. Thuốc thử 4.1. Yêu cầu chung Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước ít nhất là loại 1 của TCVN 4851 : 1989 (ISO 3696:1987) hoặc nước cất hai lần, trừ khi có qui định khác. 4.2. Hóa chất và các dung dịch 4.2.1. Metanol, loại dùng cho HPLC, w (CH 3 OH) ≥ 99,8 % (khối lượng). 4.2.2. Dung dịch axit acetic, c (CH 3 COOH) = 0,02 mol/l. 4.2.3. Isobutanol, w (C 4 H 10 O) ≥ 98 %. 4.2.4. Natri dihydro phosphat, w (NaH 2 PO 4 ) ≥ 99,8 %. 4.2.5. Axit clohydric, w (HCl) = 36 %. 4.2.6. Axit clohydric, c (HCl) = 0,1 mol/l. 4.2.7. Axit sulfuric, c (H 2 SO 4 ) = 0,05 mol/l. 4.2.8. Natri hydroxit, w (NaOH) ≥ 99 %. 4.2.9. Dung dịch natri hydroxit, nồng độ khối lượng p (NaOH) = 150 g/l. 4.2.10. Dung dịch natri hydroxit, p (NaOH) = 200 g/l 4.2.11. Kali hexaxyanoferat III, w {K 3 [Fe(CN) 6 ]} ≥ 99 %. 4.2.12. Dung dịch kali hexaxyanoferat III, p {K 3 [Fe(CN) 6 ]} = 10 g/l. 4.2.13. Dung dịch kali hexaxyanoferat III kiềm (dẫn xuất trước cột), p {K 3 [Fe(CN) 6 ]} = 0,4 g/l. Pha loãng 2,0 ml dung dịch hexaxyanoferat (4.2.12) bằng dung dịch natri hydroxit (4.2.9) đến 50 ml. Chuẩn bị dung dịch này trong ngày phân tích. 4.2.14. Dung dịch kali hexaxyanoferat III kiềm (dẫn xuất sau cột), p {K 3 [Fe(CN) 6 ]} = 0,5 g/l. Pha loãng 2,5 ml dung dịch hexaxyanoferat (4.2.12) bằng dung dịch natri hydroxit (4.2.10) đến 50 ml. 4.2.15. Enzym tách phospho, có khả năng thủy phân thiamin liên kết từ thực phẩm. CHÚ THÍCH: Taka-Diataza 1) đã được sử dụng để xác định các dữ liệu về độ chụm. 4.2.16. Dung dịch natri axetat, c (CH 3 COONa.3H 2 O) = 2,5 mol/l. 4.2.17. Dung dịch natri axetat, c (CH 3 COONa.3H 2 O) = 0,5 mol/l. 4.2.18. Pha động HPLC Các ví dụ về các hỗn hợp thích hợp với các phần thể tích ví dụ như từ 10 % đến 50 % metanol (4.2.1) trong nước hoặc sử dụng phosphat hoặc dung dịch đệm axetat được nêu trong Phụ lục C. Khả năng sử dụng các tác nhân kết cặp ion cũng được nêu trong Phụ lục C. 4.2.19. Dung dịch đệm phosphat (pH = 3,5), c (KH 2 PO 4 ) = 9,0 mmol/l. 4.2.20. Tetraetylamoniclorua, w (C 8 H 20 NCl) ≥ 98%. 4.2.21. Natri heptansulfonat, w (C 7 H 15 NaO 3 S) ≥ 98%. 4.2.22. Dung dịch đệm axatat (pH = 4,0), c (CH 3 COOH) = 50 mmol/l. 4.3. Chất chuẩn 4.3.1. Yêu cầu chung Thiamin clorua hydroclorua có thể lấy được từ nhiều nhà cung cấp. Độ tinh khiết của các chất chuẩn thiamin có thể khác nhau, do đó có thể cần phải xác định nồng độ của dung dịch hiệu chuẩn bằng đo phổ UV (xem 4.4.4). 4.3.2. Thiamin clorua hydroclorua, w (C 12 H 17 CIN 4 OS.HCl) ≥ 99%. 4.3.3. Thiamin monophosphat clorua, w (C 12 H 17 CIN 4 O 4 PS) ≥ 98%. 4.3.4. Thiamin pyrophosphat clorua (cocarboxylaza), w (C 12 H 19 CIN 4 O 7 P 2 S) ≥ 98%. 4.4. Dung dịch gốc 4.4.1. Thiamin clorua hydroclorua, p (C 12 H 17 CIN 4 OS.HCl) ≈ 0,1 mg/ml Hòa tan một lượng chính xác của chất chuẩn thiamin clorua hydroclorua (4.3.2) trong một thể tích xác định của dung môi thích hợp, ví dụ như 10 mg chất chuẩn vitamin B 1 trong 100 ml axit clohydric (4.2.6). Dung dịch này có thể ổn định được bốn tuần ở nhiệt độ +4 o C. 4.4.2. Thiamin monophosphat, p (C 12 H 17 CIN 4 O 4 PS) ≈ 0,1 mg/ml Hòa tan một lượng chính xác của chất chuẩn monophosphat (4.3.3) trong một thể tích xác định của dung môi thích hợp, ví dụ như 10 mg chất chuẩn monophosphat trong 100 ml axit clohydric (4.2.6). Dung dịch này có thể ổn định được bốn tuần ở nhiệt độ - 20 o C. 4.4.3. Thiamin pyrophosphat p (C 12 H 19 CIN 4 O 7 P 2 S) ≈ 0,1 mg/ml Hòa tan một lượng chính xác của chất chuẩn pyrophosphat (4.3.4) trong một thể tích xác định của dung môi thích hợp, ví dụ như 10 mg chất chuẩn pyrophosphat trong 100 ml axit clohydric (4.2.6). 4.4.4. Kiểm tra nồng độ Pha loãng 10 ml dung dịch gốc thiamin clorua hydroclorua (4.4.1) bằng dung dịch axit clohydric (4.2.6) trong bình định mức 100 ml đến vạch. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 247 nm trong cuvet 1 cm dựa vào dung dịch axit clohydric (4.2.6) trong cuvet đối chứng sử dụng máy đo phổ UV (5.2). Tính nồng độ khối lượng, p , bằng microgram trên mililit dung dịch gốc, sử dụng công thức (1): P = (1) trong đó là giá trị hấp thụ của dung dịch ở bước sóng cực đại khoảng 247 nm; 421 là hệ số hấp thụ của thiamin clorua hydroclorua trong axit clohydric 0,1 mol/l (xem [7]); 10 là hệ số pha loãng. 4.5. Dung dịch chuẩn 4.5.1. Thiamin clorua hydroclorua, p (C 12 H 17 CIN 4 OS.HCl) ≈ 0,1 đến 10 Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml dung dịch gốc thiamin clorua hydroclorua (4.4.1) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ như axit clohydric (4.2.6). Dung dịch này có thể ổn định được 1 tháng ở nhiệt độ 4 o C, nơi tối. 4.5.2. Thiamin monophosphat, p (C 12 H 17 CIN 4 O 4 PS) ≈ 0,1 đến 10 Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml dung dịch gốc monophosphat (4.4.2) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ như axit clohydric (4.2.6). Dung dịch này có thể ổn định được 1 tháng ở nhiệt độ 4 o C ở nơi tối. 4.5.3. Thiamin pyrophosphat. p (C 12 H 19 CIN 4 O 7 P 2 S) ≈ 0,1 đến 10 Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml dung dịch gốc pyrophosphat (4.4.2) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ như axit clohydric (4.2.6). Dung dịch này có thể ổn định được 1 tháng ở nhiệt độ 4 o C ở nơi tối. 5. Thiết bị, dụng cụ 5.1. Yêu cầu chung Sử dụng các thiết bị phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau: 5.2. Máy đo phổ UV Có thể đo các độ hấp thụ ở các bước sóng xác định. 5.3. Thiết bị hấp áp lực hoặc làm nóng Dùng thiết bị áp lực cho mục đích tách chiết, ví dụ như kiểu nồi hấp áp lực, có bộ phận ghi nhiệt độ và áp suất, bộ phận đốt nóng bằng điện hoặc nồi cách thủy. 5.4. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Gồm có bơm, bộ phận bơm mẫu, detector huỳnh quang có các bước sóng phát xạ và kích thích đã cài đặt, ví dụ như 420 nm và 366 nm, tương ứng (xem Phụ lục C) và hệ thống đánh giá như bộ tích phân. 5.5. Cột HPLC 5.5.1. Yêu cầu chung Có thể sử dụng các cột hoặc cỡ hạt có kích cỡ khác với quy định trong tiêu chuẩn này. Các thông số riêng cần phù hợp với vật liệu sử dụng để đảm bảo các kết quả tương đương. Chuẩn mực thực hiện đối với các cột phân tích thích hợp là độ phân giải đường nền của các chất phân tích có liên quan 2) . 5.5.2. Ôxy hóa trước cột Cột phân tích, ví dụ như Lichropher ® 60 RP Select B 2) , cỡ hạt 5 , đường kính từ 4,0 mm đến 4,6 mm, dài từ 100 mm đến 250 mm. 1) Taka-Diastase Nr. T00040 là tên thương mại của sản phẩm được cung cấp bởi Pfaltz & Bauer, Waterbury, CT 06708, Mỹ. Thông tin này đưa ra tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn này và CEN không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. 2) Cột sillica bao gói vật liệu thích hợp có bán sẵn là Lichrosorb ® Si 60, Spherisorb ® Si, Hypersil ® Si và Lichrospher ® 100 DIOL. Các cột RP bao gói vật liệu thích hợp như Spherisorb ® ODS, -Bondapak ® radial C18, Supelco ® LC-18-DB và Hypersil ® ODS. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và CEN không ấn định phải sử dụng chúng.