TCVN9887:2013

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9887:2013 về Thực phẩm - Xác định dư lượng etyl carbamat - Phương pháp sắc ký khí - Phổ khối lượng TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9887:2013 THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG ETYL CARBAMAT - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ-PHỔ KHỐI LƯỢNG Foodstuf f s - Determination ethyl carbamate - G as chromatography-mass spectrometry method L ờ i nói đầu TCVN 9887:2013 được xây dựng dựa trên cơ sở AOAC 994.07 Ethyl Carbamate in Alcoholic Beverages and Soy Sauce. Gas Chromatography/Mass Selective Detection Method; TCVN 9887:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG ETYL CARBAMAT - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ-PHỔ KHỐI LƯỢNG Foodstuf f s - Determination ethyl carbamate - G as chromatography-mass spectrometry method 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng etyl carbamat (EC) trong đồ uống có cồn và nước tương bằng sắc ký kh í -ph ổ khối lượng. Tiêu chuẩn này có thể áp dụng để xác định mức etyl carbamat từ 50 m g/kg đến 350 m g/kg trong rượu chưng cất, từ 40 m g/kg đến 160 m g/kg trong rượu vang nâng độ ( f orti f ied wine), từ 10 m g/kg đến 50 m g/kg trong rượu vang và từ 15 m g/kg đến 70 m g/kg trong nước tương. 2. Nguyên tắc n -Propyl carbamat được thêm vào phần mẫu thử làm chất chuẩn nội, dung dịch được pha loãng với nước, sau đó cho vào cột chiết pha rắn dung tích 50 ml. Etyl carbamat và n-propyl carbamat được rửa giải bằng diclometan. Dịch rửa giải được cô đặc trên bộ cô quay. Dịch cô đặc được phân tích bằng sắc ký khí-phổ khối lượng trong chế độ kiểm soát ion chọn lọc. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc th ử loại tinh khiết phân tích và ch ỉ sử dụng nước đã loại khoáng, trừ khi có quy định khác. 3.1. Axeton , loại dùng cho sắc ký lỏng. CHÚ THÍCH : Kiểm tra từng lô trước khi sử dụng bằng phương pháp GC-MS đ ể đảm bảo không chứa m/z 62, m/z 74 và m/z 89. 3.2. Diclometan CHÚ THÍCH : Kiểm tra từng l ô trước khi sử dụng b ằ ng phương pháp GC-MS để đảm bảo không chứa m/z 62 , m/z 74 và m/2 89. 3.3. Etanol , dạng khan. 3.4. Dung dịch chuẩn etyl carbamat (EC) 3.4.1. Dung dịch gốc , 1,00 mg/ml Cân 100 mg EC (độ tinh khiết ít nhất 99 %) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng axeton. 3.4.2. Dung d ị ch chuẩn làm việc , 10,0 m g /ml Chuyển 1 ml dung dịch gốc EC (3.4.1) vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng axeton. 3.5. Dung dịch chuẩn n -propyl carbamat 3.5.1. Dung d ịch chuẩn gốc n -propyl carbamat , 1,00 mg/ml Cân 100 mg chất chuẩn n -propyl carbamat (nPC) 1) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng axeton. 3.5.2. Dung dịch chuẩn làm việc n -propyl carbamat , 10,0 m g/ml Chuyển 1 ml dung dịch gốc nPC (3.5.1) vào bình đị nh mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng axeton. 3.5.3. Dung dịch chuẩn nội nPC , 400 ng/ml Chuyển 4 ml dung dịch chuẩn làm việc nPC (3.5.2) vào bình định mức 100 ml và pha lo ã ng đến vạch bằng nước. 3.6. Dung dịch hiệu chuẩn EC-nPC Pha loãng các dung dịch chuẩn làm việc EC (3.4.2) và nPC (3.5.2) với diclometan đ ể có được: - dung dịch (100 ng EC và 400 ng nPC)/ml, - dung dịch (200 ng EC và 400 ng nPC)/ml, - dung dịch (400 ng EC và 400 ng nPC)/ml, - dung dịch (800 ng EC và 400 ng nPC)/ml, - dung dịch (1600 ng EC + 400 ng nPC)/ml. 3.7. M ẫu kiểm soát , nồng độ EC 100 ng/g trong etanol 40 % Chuyển 1 ml dung dịch chuẩn làm việc EC (3.4.2) vào bình định mức 200 ml và pha loãng bằng etanol 40 % cho đến khi tổng khối lượng là 100 g. CHÚ THÍCH : Độ thu hồi etyl carbamat t ừ mẫu kiểm soát (3.7) phải từ 90 % đến 110 %. 4. Thiết b ị , dụng cụ Sử dụng các thiết bị, d ụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ th ể như sau: 4.1. Máy sắc ký kh í /phổ khối lượng (GC-MS) GC-MS có kiểm soát ion chọn lọc (SIM), được trang bị bộ lấy mẫu tự động, hệ thống xử lý dữ liệu Chemstation hoặc loại tương đương; Cột mao quản silica nung chảy, chiều dài 30 m, đường k í nh trong 0,25 mm, chiều dày màng film 0,25 m m DB- W AX 2) hoặc silica nung chảy chiều dày màng film 0,25 m m Supelcowax 10 3) . Các điều kiện vận hành sau đây cho thấy thích hợp: - Nhiệt độ của bộ bơm: 180 °C; - Tốc độ khí mang heli: 1 ml/min ở 25 °C; - Chế độ bơm: bơm không chia dòng; - Chương tr ì nh nhiệt độ: 40 °C trong 0,75 min, tốc độ tăng 10 °C/min đến 60 °C, sau đó 3 °C/min đến 150 °C rồi tăng đến 220 °C và sau đó giữ trong 4,25 min ở 220 °C; - Thời gian lưu điển hình : đối với etyl carbamat là từ 23 min đến 27 min đối với n -propyl carbamat là 27 min đến 31 min; - Giao diện (inter f ace) GC-MS: 220 o C ; - Các thông số MS: sử dụng per f luorotributylamin để tối ưu hóa độ nhạy ở khối lượng thấp hơn, chế độ SIM, độ trễ dung môi và thời gian bắt đầu 22 min, thời gian dừng/ion 100 ms. 4.2 . Bộ cô quay , ví dụ: Buchi Rotovapor Model RE-120 4) . 4.3. Bình , hình quả lê, dung tích 300 ml, có cổ mài chuẩn 24/40. 4.4. Ố ng nghiệm c ô đặc , dung tích 4 ml, được chia vạch, có khớp nối mài chuẩn 19/22 và có nắp đậy với c ổ mài chuẩn 19/22. 4.5. Cốc có mỏ , dung tích 100 ml. 4.6. Cân , có thể cân chính xác đến 0,01 g. 4.7. Nồi cách thủy , có thể duy tr ì ở 30 °C. 4.8. Pipet Pasteur , có thể phân phối thể tích thích hợp. 4.9. Pipet, có th ể phân phối các thể tích thích hợp. 4.10. Cột chiết pha rắn Sử dụng cột chiết pha r ắ n loại dùng một l ầ n, dung tích 50 ml, được nh ồ i bằng diatomit, ví dụ: cột Chem Elut 5) hoặc Extrelut QE Celite 6) . CHÚ THÍCH: Trước khi phân tích , kiểm tra từng lô cột chiết về độ thu hồi tương đối EC-nPC và đ ể chắc chắn không chứa m/z 62, m/z 74 v à m/z 89. Chuẩn bị EC trong mẫu kiểm soát (3.7) với nồng độ 100 ng/g. Phân t í ch 5,00 g mẫu kiểm soát như đối với mẫu rượu chưng cất, tiến hành theo 6.1.1, 6.2 và 6.3. Độ thu hồi EC từ 90 ng/g đến 110 ng/g là thỏa mãn. Sự thay đổi độ mịn của chất hấp thụ có th ể làm cho tốc độ dòng r ấ t chậm, ảnh hưởng đến độ thu hồi tương đối EC-nPC. Nếu sau một vài th ử nghiệm, mẫu kiểm soát không đạt được độ thu hồi từ 90 % đến 110 % thì thay cột hoặc sử dụng đường chuẩn đã hiệu chỉnh độ thu hồi về định lượng EC. Để dựng đường chuẩn, chuẩn bị các dung dịch chuẩn như trong (3.6), sử dụng etanol 40 % thay cho diclometan. Phân tích 1 ml dung dịch hiệu chuẩn như đối với mẫu rượu chưng cất, tiến hành theo 6.1.1, 6.2 và 6.3, nhưng không bổ sung dung dịch nPC thay thế. Dựng đường chuẩn mới, sử dụng các tỷ lệ EC/nPC từ các chất chuẩn chiết được. 5. Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. M ẫ u gửi đến ph ò ng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. M ẫ u không được hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển. 6. Cách tiến hành 6.1. Chuẩn b ị mẫu th ử 6.1.1. Rượu chưng cất và rượu vang nâng độ (độ cồn trên 14 %) C â n 5,00 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g, cho vào cốc có m ỏ 100 ml (4.5) rồi thêm 1 ml dung dịch chuẩn nội nPC (3.5.3), thêm nước để có được tổng khối lượng 40,00 g. 6.1.2. Rượu vang (độ cồn ít hơn 14 %) Cân 20,00 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g, cho vào cốc có m ỏ 100 ml (4.5) rồi thêm 1 ml dung dịch chuẩn nội nPC (3.5.3), thêm nước để có được tổng khối lượng 40,00 g. 6.1.3. Nước tương Cân 10,00 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g, cho vào cốc có m ỏ 100 ml (4.5) rồi thêm 1 ml dung dịch chuẩn nội nPC (3.5.3), thêm nước để có được tổng khối lượng 40,00 g. 6.2. Chiết CHÚ TH Í CH: Ti ế n hành chiết mẫu trong tủ hút có thông gió. Chuyển phần mẫu thử đã pha loãng tương ứng trong 6.1 sang cột chiết. Rửa cốc có mỏ bằng 10 ml nước và chuyển nước rửa sang cột. Để cho chất l ỏ ng hấp thụ vào cột trong 4 min. Rửa giải hai lần, mỗi lần dùng 80 ml di cl ometan. Thu lấy dịch rửa giải vào bình hình quả lê 300 ml (4.3). Làm bay hơi dịch rửa giải đến khoảng từ 2 ml đến 3 ml, sử dụng bộ cô quay (4.2) đ ể trong nồi cách thủy ở 30 °C. Không để dịch chiết bay hơi đến khô. Chuyển phần dịch chiết đã cô đặc vào ống cô đặc chia vạch 4 ml, sử dụng pipet Pasteur (4.8). Tr á ng bình bằng 1 ml diclometan và chuyển nước tráng rửa vào ống nghiệm. Cô đặc dịch chiết đến 1 ml dưới dòng khí nitơ. Chuyển dịch cô đặc sang lọ lấy mẫu tự động để phân tích GC-MS. 6.3. Phân tích GC-MS 6.3.1. Dựng đường chuẩn Bơm các thể tích 1 m l của các dung dịch hiệu chuẩn EC-nPC trong 3.6 vào máy GC-MS. Dựng đồ thị của các tỷ lệ diện tích đối với m/z 62 trên trục y với nồng độ EC (ng/ml) trên trục x (100 ng/ml, 200 ng/ml, 400 ng/ml, 800 ng/ml và 1600 ng/ml). 6.3.2. Định lượng EC Bơm 1 m l dịch chiết cô đặc thu được trong 6.2 vào máy GC-MS và tính t ỷ lệ diện t í ch EC-NPC đối với m/z 62. Xác định nồng độ EC bằng nanogam trên mililit trong dịch chiết, sử dụng đường chu ẩ n nội. 6.3.3. Phép thử khẳng định EC Xác định các độ đáp ứng đối với các ion m/z 62, m/z 74 và m/z 89 có mặt ở thời gian lưu của EC. Các đáp ứng này l à ch ẩ n đoán các mảnh v ỡ chính (M - C 2 H 3 •) + và (M - CH 3 •) + và ion phân tử (M) tương ứng. Sự có mặt EC được khẳng định nếu tỷ lệ tương đối của các ion này nằm trong dải 20 % các t ỷ lệ của dung dịch chuẩn EC. Dịch chiết có thể cần được cô đặc tiếp để thu được độ đáp ứng đủ đối với m/z 89. 7. Tính kết quả Hàm lượng EC c ó trong phần mẫu thử, X , biểu thị bằng nanogam trên gam (ng/g), tí nh theo công thức sau: X = C x Trong đó: C là nồng độ EC trong dịch chiết cuối cùng, xác định từ đường chuẩn (xem 6.3.2), tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml); V là thể tích dịch chiết sau khi cô cạn (xem 6.2), t í nh bằng mililit ( V = 1 ml); w là khối lượng phần mẫu thử đã lấy, tính bằng gam (g). 8. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn, cùng với mọi t ì nh huống b ấ t thường khác có th ể ảnh hưởng đến kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được. Phụ lục A (Tham khảo) Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm Kết quả của p hép thử liên ph ò ng về xác định etyl carbamat (EC) trong đồ uống có c ồ n và nước tương bằng phương pháp GC-MS được nêu trong B ả ng A.1. Bảng A.1 - Kết quả của phép thử li ê n phòng thử nghiệm M ẫ u EC bổ sung EC trung bình Độ thu hồi của EC bổ sung Độ lệch chuẩn lặp lại, s r Độ l ệ ch chuẩn tái lập , s R H ệ số bi ế n thiên lặp lại, RSD r H ệ s ố biến thiên tái lập, RSD R ng/g ng/g % ng/g ng/g % % Rượu chưng cất 0 50 2,25 4,78 4 , 47 9,49 70 112 89 7 , 43 10,38 6,63 9,26 320 329 87 13 , 24 28 , 03 4,03 8,53 Rượu vang nâng độ 0 40 1,59 4 , 77 4,01 12,02 45 80 89 3,32 7,00 4,14 8,74 135 162 90 8,20 11,11 5,05 6,84 Rượu vang 0 11 0,43 2,03 3,94 18,47 15 25 93 1,67 2,67 6,73 10,73 40 48 93 1,97 4,25 4,10 8,86 Nước tương 0 18 1,49 4,82 8,43 27,37 20 36 90 3,08 8,22 8,49 22,63 60 70 87 3,29 9,70 4,70 13,87 1) Có th ể sử dụng sản phẩm của Biomedicals ICN, Irvine, CA 92.713, USA. Thông tin này đưa ra đ ể thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấ n định phải sử dụng sản phẩm đ ó . Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự n ế u cho kết quả tương đương. 2) S ản ph ẩ m của h ã ng J & W Scienti f ic, F olsom, CA 95630, USA. 3) S ả n ph ẩ m của h ã ng Supelco, Inc., Belle f onte , PA 16823, USA. Các thông tin này đưa ra để thuận tiện cho người sử dụ ng tiêu chuẩn và không ấn đ ị nh phải sử dụng sản ph ẩ m đó . C ó th ể sử dụng các sản ph ẩ m tương tự nếu cho kết quả tương đương. 4) Sản ph ẩ m của Kuderna Danish 5) Sản phẩm của hãng Varian Sample Preparation Products, Sunnyvale, CA 94089, USA 6) S ả n ph ẩ m của hãng EM Science, Gibbstown, NJ 08027, USA Các thông tin này đưa ra để thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm đó. Có th ể sử dụng các sản ph ẩ m tương tự n ế u cho kết quả tương đương .