TCVN8710-11:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-11:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-11:2015 BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 11: BỆNH DO PERKINSUS OLSENI Ở NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 11: Perkinsus olseni disease in bivalve molluscs C Ả NH BÁO - Việc áp dụng tiêu chu ẩ n này có thể liên quan đến các v ậ t liệu, thiết bị và c á c thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chu ẩ n này không thể đưa ra đ ược hết t ấ t c ả các v ấ n đề an toàn liên quan đến việc s ử dụng ch ú ng. Người sử dụng tiêu chu ẩ n n à y phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích h ợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng ti ê u chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh gây ra do Perkinsus olseni ở nhuyễn th ể hai mảnh vỏ . 2. Thuật ngữ và định nghĩa Tr o ng tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau. 2.1. Perkinsus olseni (Perkinsus o l seni) Sinh vật đ ơn bào t huộc ngành bào tử Apicomp l exa (Levine , 1978), ký sinh tr ê n mang, màng áo, tế bào biểu m ô ruột, các tổ chức m ô liên kết của tuyến tiêu hóa và tuyến sinh dục của nhuyễn th ể hai m ả nh vỏ. Chu kỳ sống c ủ a Perkinsus olseni gồm ba giai đoạn ch í nh: Giai đoạn dinh dưỡng (trophozoite), giai đoạn t ă ng trư ở ng (hypnospore), giai đoạn bào tử động (zoospores). 2.1.1 . Giai đoạn dinh dưỡng (trophozoite) Giai đoạn nhân Giai đoạn xảy ra trong các mô của vật chủ trực tiếp. Trong giai đoạn này Perkinsus olseni có dạng tế b à o hì nh cầu với sự xuất hiện c ủ a không bào l ớ n, hơi lệch tâm và có nhân ở ngoại biên. 2.1.2 . Giai đoạn tăng trư ở ng (hypnospore) Giai đoạn này quan sát được khi ủ mô ký chủ bị nhiễm Perkinsus olseni trong Fluid Thioglycollate Medium (FTM), th ể dinh dưỡng được phóng lớn (dạng hình cầu) và lớp vỏ của ký sinh trùng được phát triển dày hơn. Sau khi hypnospores được nuôi trong FTM bị cô lập và chuyển vào nước biển , hypnospores bắt đầu sự ph â n chia nhân tế bào và sự phân bào chu kỳ liên tiếp. 2.1.3 . Giai đoạn bào tử động (zoospores) Giai đoạn t ă ng sinh Giai đoạn này hàng trăm bào tử động được hình thành trong màng tế bào gốc. Bào t ử động ch ỉ có một nhân với kh ô ng bào trong tế bào chất và di động hơn do hai roi chèn ở bên. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nư ớ c khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trư ờ ng hợp có quy định khác. 3.1 . Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp nuôi cấy. 3.1.1 . Môi trường l ỏ ng thioglycollat (FTM - f l uid thioglyco ll ate medium) (xem A.1). 3.1.2 . Dung dịch penicilin-streptomycin (xem A.2). 3.1.3 . Thuốc nhuộm lugol’s iodine (xem A.3). 3.1.4 . Nystatin . 3.2 . Thuốc th ử và vật liệu thử dùng cho phương pháp ch ẩ n đoán b ằ ng PCR 3.2.1 . Etanol, 70 % (thể t í ch) , 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối. 3.2.2 . Kít tách chiết ADN (acid deoxyribo nucleic), protein K. 3.2.3 . Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit). 3.2.4 . Cặp mồi (primers) , gồm mồi xuôi và mồi ngược. 3.2.5 . Nước tinh khiết, không có nuclease. 3.2.6 . Agarose 3.2.7 . Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris -acetate- EDTA) ( xem A.4). 3.2.8 . Chất nhuộm màu , v í dụ: Sybr safe. 3.2.9 . Chất đệm t ả i mẫu (Loading dye 6X). 3.2.10 . Dung d ịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic). 3.2.11 . Thang chu ẩ n ADN (Marker) 4. Thiết bị, dụng cụ S ử d ụ ng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học v à những thiết bị, dụng cụ sau: 4.1 . Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp nuôi c ấ y Perkinsus olseni. 4.1.1 . Nồi hấp vô trùng, có thể duy trì ở nhiệt độ 115°C. 4.1.2 . K í nh hiển vi quang học, vật k í nh 10 X, 20 X, 40 X v à 100 X. 4.1.3 . Ố ng nghiệm vô trùng, dung t í ch 15 ml. 4.1.4 . Phiến k í nh v ô trùng. 4.1.5 . Lamen vô trùng. 4.1.6 . Dao mổ, panh, k é o vô trùng. 4.1.7 . Pipet pasteur. 4.2 . Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ch ẩ n đoán b ằ ng PCR. 4.2.1 . Máy nhân gen (PCR). 4.2.2 . Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g . 4.2.3 . Máy lắc trộn vortex. 4.2.4 . Máy spindo w n. 4.2.5 . Bể ủ nhiệt, duy trì nhiệt độ từ 55 ° C đến 60 ° C . 4.2.6 . Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di. 4.2.7 . Máy đọc gel. 4.2.8. Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml. 5. Chẩn đoán lâm sàng 5.1 . Đặc đi ể m dịch tễ - Bệnh xảy ra ở đối tượng nhuyễn thể hai mảnh vỏ như hàu, vẹm, ngh ê u, trai ngọc, trai tai tượng, bào ngư...; - Bệnh xảy ra quanh năm nhưng tập trung vào mùa hè và đầu mùa thu khi nhiệt độ tăng cao trên 15 o C . Sau đ ó giảm dần vào mùa đông và đầu mùa xuân khi nhiệt độ từ 9 o C đến 10 o C . Vì vậy tỷ lệ nhiễm bệnh và tỷ lệ chết cao nhất thường xảy ra v à o đ ầ u mùa thu; - Perkinsus olseni phát triển mạnh ở độ mặn 25 ‰ và không chịu được độ mặn thấp hơn 15 ‰; - Cơ chế lây truyền Perkinsus olseni xảy ra trực ti ế p giữa động vật thân mềm mà không cần vật chủ trung gian; - Giai đoạn l â y nhiễm là lúc bào tử động c ó 2 roi chuyển sang giai đoạn cơ th ể dinh dưỡng sau khi xâm nhập vào các mô của v ậ t chủ; - Nhuyễn thể hai mảnh v ỏ có tỷ lệ nhiễm bệnh cao, với t ỷ lệ chết l ê n đến 95 % khi điều kiện môi trường bất lợi đối với vật chủ. Perkinsus olseni có thể tồn tại dai dẳng suốt vòng đời vật ch ủ . 5.1 . Triệu chứng lâm sàng - Biểu hiện chủ yếu c ủ a bệnh là nhuyễn thể hai mảnh v ỏ sinh trư ở ng chậm; - Tuyến sinh dục của nhuyễn th ể hai mảnh vỏ chậm phát triển, giảm sức sinh s ả n và làm chậm chu kỳ sinh sản: - Nhuyễn thể hai mảnh v ỏ có hiện tượng n ổ i lên cát, m ở v ỏ v à chết hàng loạt. 5.2 . Bệnh tích - nhuyễn thể hai mảnh v ỏ g ầ y rạc, mô ch ả y nước, co m à ng áo , tuyến tiêu hóa nhợt màu; - Đôi khi có t ổ n thương tạo th à nh áp xe ở tuyến sinh dục; - Sự tăng s i nh c ủ a Perkinsus olseni gây ra phá v ỡ các mô liên kết và biểu mô, trên một số vật chủ có tạo thành áp xe ngẫu nhiên, các mụn mủ đường kính cỡ 8 mm; - Bào tử Perkinsus olseni xuất hiện từng đám trên màng áo, mang, mô liên kết tuyến tiêu hóa và tuyến sinh dục biểu hiện là những nốt sần màu nâu trắng hoặc những cái nang trên mặt của màng áo, mang, chân, ruột tuyến tiêu hóa, thận, tuyến sinh dục. 6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1. Phương pháp nuôi cấy 6.1.1 . Lấy mẫu Số lượng nhuyễn thể hai mảnh vỏ trên mỗi mẫu tùy thuộc vào kích c ỡ của nhuyễn thể hai m ả nh vỏ: - Nhuyễn th ể hai mảnh vỏ giống: lấy từ 10 con/ mẫu đến 15 con/ mẫu; - Nhuyễn thể hai mảnh vỏ trư ở ng thành: lấy từ 5 con/ mẫu đến 10 con/ mẫu. 6.1.2 . Bảo quản mẫu Trong quá trình vận chuyển từ nơi thu mẫu về đến phòng thử nghiệm mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2° C đến 8 ° C không quá 24 h. Mẫu chuyển đến phòng th í nghiệm phải được phân t í ch ngay. 6.1.3 . Chu ẩ n bị m ẫ u - Nhuyễn thể hai mảnh vỏ còn sống hoặc vừa mới chết chưa tách vỏ; - Dùng dao mổ vô trùng cắt cơ m ở v ỏ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và tách ra làm hai; - Dùng panh, kéo vô trùng c ắ t 1 mẫu bệnh ph ẩ m từ 5 mm đến 10 mm c ủ a phần mô áo , mang , ruột, phần cơ bị tổn thương; CHÚ THÍCH: Phải dùng các d ụng cụ v ô tr ù ng khi lấy mô ở các mẫu kh á c nhau để tránh lây nhiễm. 6.1.4 . Cách tiến hành Bước 1: Cho mẫu bệnh phẩm đã chuẩn bị (6.1.3) vào các ống nghiệm (4.1.3) chứa 9.5 ml FTM (3.1.1) có bổ sung thêm 0,5 ml d ung dịch penicilin-streptomycin (3.1.2) và 50 m l nystatin (3.1.4). Ố ng nghiệm được đóng k í n và lắc để mẫu bệnh ph ẩ m được chìm t rong môi trư ờn g; Bước 2: Ủ ống nghiệm chứa mẫu bệnh ph ẩ m trong điều kiện không có ánh sáng, ở nhiệt độ từ 22 ° C đến 25 ° C từ 5 ngày đến 7 ngày: Bước 3: Dùng panh v ô trùng l ấ y mẫu bệnh phẩm được ủ ra khỏi m ô i trường FTM đặt lên phiến k í nh (4.1.4 ): Bước 4: Dùng đầu c ô n vô trùng xé nh ỏ mẫu bệnh phẩm đ ể nhuộm l ugol iodine; Bước 5: Nh ỏ 1 hoặc 2 giọt l u g o l io d ine (3.1.3) vào mẫu bệnh phẩm bằng pipe t pasteur (4.1.7), đặt lamen lên mẫu bệnh ph ẩ m và kiểm tra dưới kính hiển vi quang học (4.1.2) sử dụng vật kính 10 X , 40 X v à 100 X ; CHÚ TH ÍCH: Nếu không ti ế n hành c á c bước tiếp theo để đọc kết quả sau 7 ngày ủ, các ống nghi ệ m chứa m ẫu được b ả o quản ở nhiệt độ từ 2° C đ ế n 8 ° C trong khoảng 3 tuần ở điều kiện không c ó ánh s á ng. 6.1.5 . Đọc kết quả M ẫ u dương t í nh với Perkinsus sp. khi quan sát dưới kính hiển vi thấy thể bào tử dinh dư ỡ ng có vách tế bào nhuộm h ì nh cầu tròn có màu xanh hoặc xanh đen, kích thước (từ 5 m m đến 15 m m) x (từ 50 m m đến 70 m m). M ẫ u âm tính với Perkinsus sp. khi quan sát dưới kính hiển vi không thấy thể bào tử dinh dưỡng có đặc đi ể m như trên. 6.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 6.2.1 . Lấy mẫu Xem 6.1.1. 6.2.2 . B ả o quản mẫu Trong quá trình vận chuy ể n, m ẫ u được b ả o quản ở nhiệt đ ộ từ 2° C đến 8 ° C không quá 48 h hoặc bảo qu ả n trong etanol tuyệt đối (3.2.1); M ẫ u chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa ph â n tích ngay phải b ả o quản mẫu ở nhiệt độ âm 20 ° C đến âm 80 ° C hoặc trong etanol tuyệt đối (3.2.1); 6.2.3 . Chuẩn bị mẫu Lượng mẫu c ầ n chuẩn bị: khoảng 30 mg. a) M ẫ u trực tiếp Thực hiện chuẩn bị mẫu như mô tả tại 6.1.3; Bảo quản mẫu trong etanol tuy ệ t đối (3.2.1); Trư ớ c khi t á ch chiết, lấy mẫu ra kh ỏ i etanol và làm khô b ằ ng giấy th ấ m . b) Mẫu tăng sinh Thực hiện n h ư mô t ả tại bước 1 và bước 2 của 6.1.4; D ù ng pan h vô trùng l ấ y miếng mẫu bệnh phẩm ra khỏi môi trường FTM và đ ặ t v à o ống eppen dorf 1 , 5 ml (4.2.8) đ ể tách chiết A D N. 6.2.4 . Cách tiến hành 6.2.4.1 . Tách chiết ADN Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.2) thích hợp và an toàn theo hướng d ẫn của nhà sản xuất . VÍ D Ụ: S ử dụng k í t tách chiết ADN: DNeas y ® Blood & Tissue K i t (250) (Ca t No. 69506) 1) (xem phụ lục B) . 6.2.4.2 . Chuẩn bị mồi Ph ả n ứ ng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.2.1) theo phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu c ủ a Perkinsus olseni sử dụng cặp m ồ i Po l s I TS-140F và Po l s I TS-600R (3.2.4). Trình tự cặp mồi được nêu trong Bảng 1. Bảng 1 : Trình tự cặp mồi Mồi Trình tự cặp mồi Po l s I TS-140F 5’-GAC-CGC-CTT-AAC-GGG-CCG-TGT-T-3’ Po l s I TS-600R 5’-GGR-CTT-GCG-AGC-ATC-CAA-AG-3' Cặp mồi Po l s I TS-140F và Po l s I TS-600R dùng để khuếch đ ại đoạn gen c ủ a Perkinsus olseni có kích thước 450 bp. Mồi được chu ẩ n bị như sau: Chuẩn bị mồi gốc: - Mồi gốc ở trạn g thái đôn g khô phải được ly tâm nhanh b ằ ng máy spindown (4.2.4) trong 30 s để mồi l ắ ng xuống đáy ống trư ớ c khi m ở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, n ê n dùng dung dịch đệm TE (3.2.10) được mồi ở nồng độ 200 m M làm mồi gốc; Chu ẩ n bị mồi sử dụng: - M ồ i sử dụng ở nồng độ 20 m M: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.5) (10 m l m ồ i gốc và 90 m l nước (3.2.5)). 6.2.4.3 . Tiến hành ph ả n ứng PCR Sử dụng cặp mồi đ ã được chuẩn bị (6.2 . 4.2) sử dụng k í t nhân gen (3.2.3) theo hướng dẫn c ủ a nhà sản xu ất . VÍ DỤ : Sử dụng kít nhân gen c ủ a Thermo S ci enti f ic Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656) 2) Thành phần cho 1 ph ả n ứng được nêu trong bảng 2 B ả ng 2: Thành phần phản ứng PCR Thành phần Th ể tích Taq PCR Master Mix (2X) 12 , 5 m l Mồi xuôi 20 m M 1 m l Mồi ngược 20 m M 1 m l Nước không có nuclease 8 m l Tổng thể tích 22,5 m l Chuyển 22 , 5 m l hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng : - M ẫ u kiểm chứng dương: Cho 2,5 m l mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các ch ủ ng Perkinsus marinus chuẩn vào ống phản ứng; - Mẫu kiểm chứng âm: Cho 2,5 m l nước (3.2.5) v à o ống phản ứng: - M ẫ u thử: Cho 2,5 m l mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng. Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đ ã cài đặt chu tr ì nh nhiệt được nêu trong bảng 3. Bảng 3 : Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 94 ° C 4 min 1 94 ° C 1 min 40 62 ° C 1 min 65 ° C 3 min 65 ° C 10 min 1 CHÚ THÍCH - Phả n ứ ng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm; - Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng. 6.2.4.4 . Điện d i 6.2.4.4.1 . Chuẩn bị bản gel Pha thạch với n ồ ng độ agarose (3.2.6) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X ho ặ c TAE 1X (3.2.7) vào b ì nh thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi; Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 ° C đến 50 ° C thì bổ sung 10 m l chất nhuộm màu (3.2.8) v à o mỗi 100 ml th ạ ch. L ắ c nhẹ tr á nh t ạ o bọt để chất nhuộm màu tan đều; Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược v à o khuôn rồi đổ thạch vào khuôn, không nên đổ bản thạch dày quá 0 , 8 cm; Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch; Chuy ể n bản thạch vào bể ch ạ y điện di (4.2.6), đ ổ dung dịch đệm (3.2.7) cùng loại với dun g dịch pha thạch agarose đ ã đun v à o bể điện di cho tới khi ngập bản thạch; CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có s ẵ n ch ấ t nhuộm ADN đ ể pha chế thạch agarose (v í dụ: Sy br safe A D N gel stain 3) ) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất. 6.2.4.4.2 . Chạy điện di H út 2 m l chất đệm tải mẫu (3.2.9) vào 8 m l sản phẩm PCR trộn đều và cho v à o các giếng trên bản thạch. Thực hiện đ iện di trong bộ điện di (4.2.6), chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.2.11) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 m l thang chuẩn ADN (3.2.11) vào một giếng trên bản thạch. Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min. 6 .2. 4 .5 . Đọc kết quả Sau khi điện di, đ ọc kết qu ả ở máy đọc ge l (4.2.7) theo Bảng 4. B ả ng 4 : Kết quả điện di Giếng Vạch 450 bp Kết quả Thang chuẩn ADN ADN Các vạch sáng r õ ràng Điện d i tốt M ẫ u kiểm chứng dương tính Có Hỗn hợp ph ả n ứng PCR tốt Không M ẫ u đối chứng dương tính hỏng hoặc enzym hỏng M ẫ u kiểm chứng âm tính Có Bị tạp nhiễm Không Không tạp nhiễm M ẫ u thử Có Dương tính với Perkinsus olseni Không Âm tính với Perkinsus olseni Đánh giá kết quả: - Kết quả mẫu thử dương tính khi: Tại giếng mẫu thử xu ấ t hiện vạch sáng có kích thước 450 bp. Thang chu ẩ n ADN phân vạch r õ ràng, mẫu kiểm chứng dương có k í ch thước 450 bp, mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng. - K ế t quả mẫu thử âm tính khi: Tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng. Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng, mẫu ki ể m chứng dương có kích thước 450 bp, mẫu kiểm chứng âm không có vạch sáng. 7. Kết luận Mẫu được xác định nhiễm bệnh do Perkinsus olseni khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển h ì nh của bệnh và có kết quả dương tính với Perkinsus olseni bằng phương pháp PCR trong phòng thí nghiệm. Phụ lục A (Quy định) Thành phần và chuẩn bị môi trường, thuốc thử A.1 . Môi trường l ỏ ng thioglycollat (FTM) A.1.1 . Thành phần Môi trường FTM: 29,3 g Natri clorua: 22 g Nước c ấ t: 1 000 ml A.1.2 . Chuẩn b ị Trộn 22 g natri clorua v à 29,3 g FTM vào 1 000 ml nước c ấ t. Đun cho tan hoàn toàn đến khi dung dịch có màu v à ng trong. Chia ra các ống nghiệm vô trùng, mỗi ống khoảng 9,5 ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (4.1.1) ở 115 ° C trong 20 min. Các ống nghiệm này được giữ nơi tối và bảo quản ở nhiệt độ 4 ° C . A.2 . Môi trường l ỏ ng thioglycollat (FTM) A.2.1 . Thành phần S treptomycin su lf at (500 IU/ml): 3,13 g Penicilin G (500 IU/ml) : 6,55 g Nước khử ion: 500 ml A.2.2 . Chuẩn bị Trộn 3,13 g streptomycin sul f at và 6,55 g penicillin G vào 500 ml nước khử ion và lắc đến khi các kháng sinh tan hoàn toàn. Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ 4 o C . A.3 . Thuốc nhuộm Lugol iodine A.3.1 . Thành phần Kali iodua: 6 g l -ố t: 4 g N ước cất: 100 ml A.3.2 . Chuẩn bị Trộn 6 g Kali iodua và 4 g l ố t vào 100 ml cho nước cất, lắc cho tan. Đ ể yên trong 24 h sau đó được lọc qua giấy lọc. Dung dịch đư ợ c giữ trong chai màu nâu ở nhiệt độ phòng để tránh sự kết tủa. Dung dịch có thể được giữ trong nhiều tuần nhưng nên th ỉ nh thoảng lọc để loại b ỏ các hạt kết t ủ a có thể xuất hiện. A.4 . Dung dịch đệm TAE hoặc TBE A.4.1 . Thành phần Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml Nước khử ion: 900 ml Tổng: 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X A.4.2 . Chu ẩ n bị Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X h òa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều. B ả o quản ở nhiệt độ phòng. Phụ lục B (Tham khảo) Quy trình tách chiết ADN C Ả NH BÁO: Việc tách chiết ADN có s ử dụng h óa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác kh ô ng c ẩ n thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với d a và hít ph ả i hơi của các h óa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, kh ẩ u trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này. Quy trình tách chiết A D N sử dụng kít tách chiết DNeasy ® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506): và protein K ủ qua đêm ở 56 ° C như sau: - Nhỏ 20 m l protein K vào ống ly tâm 1,5 ml; - Chuy ể n 30 mg mẫu bệnh ph ẩ m (6 . 2.3) vào ống ly tâm đ ã có protein K; - Thêm 200 m l dung dịch AL (Lysis buffer); - Trộn kỹ huy ễ n dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh b ằ ng m á y spindo w n (4.2.4); - Ủ qua đ ê m ở 56 ° C trong bể ủ nhiệt (4.2.5), sau đó l y t â m nhanh bằng máy spindown (4.2.4) - Thêm 200 m l ethanol tuyệ t đối (3.2.1) vào ống ly tâm; - Trộn kỹ huyễn dịch trong 15 s, sau đó ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.2.4); - Hút 420 m l huyễn dịch trong ống ly tâm trên, chuyển san g cột ly tâm có ống thu ở dưới; - Ly tâm b ằ ng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g (8 000 r/min) trong 1 min ở nhiệt độ ph ò ng: - Thêm 500 m l dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột ly tâm có ống thu ở dưới; - Ly t âm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g (8 000 r/min) trong 1 min ở nhiệt độ phòng; - Thay ống thu ở dưới cột ly tâm; - Thêm 500 m l dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cộ t ly tâm có ống thu ở dưới; - Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 20 000 g (14 000 r/min) tr o ng 3 min ở nhiệt độ phòng: - Chuyển cột ly tâm sang ống ly tâm 1,5 ml; - Nhỏ 200 m l dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min ; - Ly t âm bằng máy ly tâm (4.2.2) với gia tốc 6 000 g (8 000 r/min) trong 1 min; - Chuyển 200 m l ADN đã thu được sang ống eppendor f 1,5 ml khác. Bảo qu ả n ADN ở nhiệt độ từ 2 ° C đến 8 ° C nếu thực hiện phản ứng PCR ngay hoặc ở nhiệt độ âm 20 ° C đến âm 80 ° C nếu thực hiện phản ứng PCR sau 24 h. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] FAO/NACA, Asia diagnostic guide to Aquatic animal diseases, FAO Fish. Pap. No.402/2 , 2001 , M5. P 133-137 [2] Antonio Vil l aiba. Kimber l y S . Reece, M. Camino Ordás, Sandra M. Cas a s and Antonio F igueras , Perkinsosis in mo l luscs , Aquat. Living Resour, 2004, 17 , p 411- 432 [3] Choi K. S , Park K.l, Review on the protozoan parasite Perkinsus olseni (Lester an d Davis 1981) i n f ection in Asi a n waters. Coastal Environmental a nd Ecosystem Issues of the East China Sea, 2010, p 227-237 [4] C é line Garcia, Ricardo Leite, Isabelle Arzul, Parasites of the genus Perkinsus, W orkshop f or t he analysis of the impact of Perkinsosis to the European shell f ish industry session [5] Nguyễn V ă n H ả o và CS , Sự hiện diện của Perkinsus sp trên nghêu (Meretrix Lyrata) tại vùng biển Cần Giờ - Thành Phố Hồ Chí Minh, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy s ả n II, Chi cục Thú y TP. H ồ Ch í Minh (2010) [6] Nguyễn Thị Thu Hiền, Tr ầ n Thị Nguyệt Minh, Kết quả nghiên cứu một số tác nh â n gây bệnh thường gặp trên ngao Meretrix sp tại vùng ven bi ể n H ả i Phòng, B ả n tin Viện Nghiên cứu Nuô i trồng Thủy s ả n I, S ố 6 (Quý II năm 2012) [7] Sheppard B. J. and Phillips A. C , Perkinsus olseni detected in Vietnamese aquacultured reef clam s, Tri d acna crocea, importe d to the U.S.A, following a mortality event. Disease of aquat i c organism, 2008. 79 p 229-235 [8] Bùi Quang Tề , Bệnh do ngành bào t ử Apicomplexa (Levine 1978) Perkinsiosis , phần 3 , Bệnh ký sinh tr ù ng của động vật thủy s ả n, Bệnh học thủy sản , 2008, trang 259-266 [9] Ng ô Thị Thu Th ả o, Một số đặc đi ể m của ký sinh trùng Perkinsus sp. Lây nhiễm trên ngao l ụ a Paphia un d ulata ở Kiên Giang và Bà Rịa-Vũn g Tàu. Tạp ch í Khoa học , Trường Đại học C ần Thơ , 2008, trang 222-230 . 1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. 2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. 3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.