10TCN348:1999

Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 348:1999 về bảo quản ngắn hạn nguồn gien vi sinh vật nông nghiệp do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 348:1999 BẢO QUẢN NGẮN HẠN NGUỒN GIEN VI SINH VẬT NÔNG NGHIỆP 1. Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc bảo quản ngắn hạn nguồn gien vi sinh vật dị dưỡng hiếu khí sử dụng trong nông nghiệp với nguồn vật liệu di truyền là tế bào sinh dưỡng, bào tử trong điều kiện vô trùng bằng phương pháp bảo quản trên môi trường thạch nghiêng và dưới lớp dầu khoáng. 2. Thuật ngữ, định nghĩa: 2.1. Nguồn gien vi sinh vật nông nghiệp được hiểu là nguồn tài nguyên di truyền công nghệ bao gồm các nhóm chủng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn lam đang là đối tượng được nghiên cứu và sử dụng trong nông nghiệp (trừ vi sinh vật trong lĩnh vực thú y, bao gồm cả các chủng đang được khai thác để lai tạo và các chủng có tiềm năng đã được kiểm định, được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho phép sử dụng. 2.2. Bảo quản nguồn gien vi sinh vật là bảo quản các mẫu giống thuần khiết sau khi đã chọn lọc, trong điều kiện phù hợp bảo đảm độ sống sót cao và bảo tồn các tính trạng ban đầu để sử dụng trong các trường hợp cần thiết. 2.3. Bảo quản ngắn hạn là bảo quản các mẫu giống trong thời gian dưới 2 năm. Trong đó áp dụng một số yếu tố làm giảm tốc độ sinh trưởng của nguồn vật liệu di truyền như hạ thấp nhiệt độ nuôi cấy, đưa thêm các chất ức chế sinh trưởng v.v… 2.4. Đặc tính sinh học là khả năng của vi sinh vật thông qua hoạt động sống của chúng có tác dụng đến quá trình sinh trưởng, phát triển của cây trồng, vật nuôi, kiểm soát sinh học và sinh thái môi trường. 2.5. Môi trường nuôi cấy chọn lọc là môi trường phù hợp cho sự phát triển của một loài hay một nhóm vi sinh vật nào đó nhưng ít thuận lợi hay hoàn toàn bất lợi đối với sự phát triển của loài hay nhóm vi sinh vật khác. 2.6. Môi trường chẩn đoán phân biệt (môi trường chỉ thị) là môi trường cho phép phân biệt nhanh chóng một loài vi sinh vật này với một loài vi sinh vật khác. 2.7. Mẫu giống: Mẫu giống là giống do tác giả chọn lọc, lai tạo hay lấy từ quĩ gien có tính di truyền ổn định. - Một mẫu giống vật liệu cần giữ một lượng mẫu lặp lại ít nhất ba lần. - Không được chọn những khuẩn lạc riêng biệt trong các lần cấy chuyển để làm giống (tránh đột biến sinh trưởng). - Việc lấy mẫu được tiến hành sao cho mẫu kiểm tra phải là mẫu thuần. Người lấy mẫu phải được huấn luyện và có kinh nghiệm trong việc lấy mẫu. - Trong quá trình lấy mẫu, vận chuyển và xử lý mẫu phải đảm bảo tránh sự tạp nhiễm từ bên ngoài và đảm bảo được tính nguyên trạng ban đầu. 2.8. Thời gian cấy chuyển là khoảng thời gian các mẫu giống được lưu giữ trước khi cần cấy chuyển, phụ thuộc vào đặc điểm sinh học mẫu vật liệu, phương tiện và kinh nghiệm người giữ mẫu giống. 2.9. Độ phần trăm sống sót của mẫu giống là tỷ lệ phần trăm giữa lượng tế bào sống sót trong các mẫu giống bảo quản và mẫu giống gốc mới được nuôi cấy và phát triển ổn định. Độ phần trăm sống sót của mẫu giống cho phép định thời gian cấy chuyển mẫu giống. 2.10. Hồi phục là quá trình cấy chuyển mẫu bảo quản trên môi trường dinh dưỡng chọn lọc sau khi đã loại bỏ chất ức chế sinh trưởng (dầu parafin). 3. Nội dung: 3.1. Phương pháp bảo quản trên môi trường thạch nghiêng: 3.1.1. Chuẩn bị: 3.1.1.1. Trang thiết bị: - Tủ sấy (thiết bị tiệt trùng khô) và nồi hấp (thiết bị tiệt trùng ướt) - Tủ ấm. - Cân kỹ thuật có độ chính xác tới 0,01g. - Que cấy. - Que gạt thủy tinh. - Ống nghiệm thủy tinh. - Ống đong: 100ml, 500ml, 1000ml. - Bình tam giác: 250ml, 500ml. - Đĩa petri (hộp lồng). - Pipet chia độ: chuyên dùng cho vi sinh có dung tích 1ml; 5ml; 10ml. - Đèn cồn hoặc đèn gas. 3.1.1.2. Chuẩn bị dụng cụ: Các dụng cụ dùng trong xác định vi sinh vật phải tiệt trùng bằng một trong các phương pháp dưới đây: - Trong tủ sấy ở nhiệt độ từ 160-175 o C trong ít nhất 2 giờ. - Trong nồi hấp 121 o C (1 atmotphe) không ít hơn 20 phút. 3.1.1.3. Môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy là môi trường nuôi cấy chọn lọc (xem mục 3.6). Cân và hòa tan các thành phần môi trường trong nước cất theo thứ tự đã cho. Phân môi trường vào các ống nghiệm (5-6ml/ống nghiệm). Đậy nút bông, tiệt trùng ở 121 o C trong 30 phút. Để nguội môi trường đến 45-50 o C, đặt nghiêng ống nghiệm khoảng 45 o . Đợi bề mặt thạch khô tiến hành cấy giống. 3.1.2. Tiến hành: Cấy giống: Từ các mẫu giống gốc, bằng thao tác vô trùng cấy ria trên môi trường nuôi cấy thích hợp. Sau khi tế bào đã phát triển ổn định, tiến hành cất giữ trong tủ lạnh hay phòng (có thể dùng giấy bạc hoặc túi plastic bao đầu ống giống để tránh sự mất nước của môi trường) Nhiệt độ cất giữ 4-10 o C. Định kỳ cấy chuyển. Tùy từng loại giống mà quy định thời gian phải cấy chuyển lại có thể sau 5-7 ngày, 2-4 tuần hay 3-4 tháng. 3.1.3. Kiểm tra mẫu giống: Định kỳ sau 12 tháng kiểm tra độ phần trăm sống sót và đặc tính sinh học của mẫu giống. 3.1.3.1. Độ phần trăm sống sót của mẫu giống: - Môi trường để kiểm tra: Môi trường để kiểm tra được sử dụng là môi trường nuôi cấy chọn lọc. Môi trường được pha chế theo thứ tự các hóa chất trong thành phần đã cho, sau đó phân phối vào các dụng cụ thủy tinh đã chuẩn bị trước rồi khử trùng ở 121 o C trong 30 phút. Để nguội môi trường đến 45-50 o C, phân phối môi trường vào các đĩa petri đã khử trùng ở điều kiện vô trùng. - Dịch pha loãng là dung dịch muối sinh lý (NaCl 0,85%), không chứa các hợp chất nitơ, có độ pH là 7,0 sau khi khử trùng ở 121 o C trong 30 phút. Phân phối dịch pha loãng vào các ống nghiệm hoặc các hình tam giác có dung tích thích hợp với một lượng sao cho sau khi khử trùng, mỗi ống nghiệm chứa 9ml và mỗi bình tam giác chứa 90ml. Làm nút bông và khử trùng ở 121 o C trong 30 phút. Nếu chưa sử dụng ngay, dịch pha loãng cần được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-10 o C, thời gian bảo quản không quá 1 tháng kể từ ngày chuẩn bị. Ghi chú: Để tránh làm ảnh hưởng đến các vi sinh vật do thay đổi nhiệt độ đột ngột, nên điều chỉnh nhiệt độ của dịch pha loãng đến nhiệt độ phòng thử nghiệm. - Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn (suspension): Lấy ống giống bảo quản cần kiểm tra ra khỏi nhiệt độ bảo quản, để nhiệt độ của ống giống bảo quản bằng nhiệt độ phòng thí nghiệm bắt đầu tiến hành kiểm tra. Lấy sinh khối vi sinh từ một ống giống đưa vào bình tam giác chứa 90ml dịch pha loãng, trộn đều bằng lắc tay hay thiết bị lắc cơ học để đảm bảo các vi sinh vật được phân bố đồng đều. Dung dịch tạo ra được gọi là dịch huyền phù vi khuẩn ban đầu. Dùng pipet đã vô trùng lấy 1ml dịch huyền phù ban đầu cho vào 9 ml dịch pha loãng, tránh chạm pipet vào dịch pha loãng. Trộn kỹ bằng cách dùng một pipet vô trùng khác hút lên xuống 10 lần hoặc bằng dụng cụ trộn cơ học trong 5-10 giây, tần số quay của dụng cụ này sẽ được chọn sao cho chất lỏng khi cuộn xoáy dâng lên cách mép lọ chứa khoảng 2-3 cm để có được dung dịch pha loãng 10 -2 . Lặp lại các thao tác này để thu được dịch pha loãng 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 , 10 -8 Cấy mẫu: dùng pipet vô trùng riêng cho từng độ pha loãng, lấy ra từ dịch mẫu một lượng mẫu dịch 0,05 ml (1 giọt) cấy vào 1 đĩa petri chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn (xem 3.1.3.1). Mỗi mẫu được cấy lặp lại 3 đĩa petri. Dùng que gạt vô trùng gạt đều để dịch mẫu dàn trải trên bề mặt thạch, đợi khô bề mặt thạch, úp ngược đĩa petri, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng của mẫu giống các chủng giống vi sinh vật trên mỗi đĩa petri. Mật độ vi sinh vật trên một đơn vị kiểm tra (gam hay ml) được tính theo công thức sau: A = a x 20 d Trong đó: A: số khuẩn lạc/ml dịch a: số khuẩn lạc trung bình có trong đĩa petri d: nồng độ dịch pha loãng 20: số giọt dịch trong 1 ml dịch Ghi chú: Số lượng khuẩn lạc trung bình được tính là trung bình cộng số khuẩn lạc của các đĩa petri được cấy từ cùng một độ pha loãng, trong đó chỉ tính các đĩa petri chứa 30-300 khuẩn lạc. Số lượng khuẩn lạc trung bình cũng có thể được tính là trung bình cộng số lượng khuẩn lạc của các đĩa petri được cấy từ hai độ pha loãng kế tiếp nhau bằng cách tính số khuẩn lạc trung bình cộng ở mỗi độ pha loãng, trong đó số khuẩn lạc ở độ pha loãng cao hơn được nhân với 10, sau đó lấy trung bình cộng của hai giá trị trên nếu tỷ số giữa giá trị lớn và giá trị nhỏ không lớn hơn 2. Nếu tỷ số này lớn hơn 2 thì lấy giá trị nhỏ làm kết quả. Mật độ vi sinh vật trên một đơn vị kiểm tra được biểu thị bằng một số giữa 1,00 và 9,99 nhân với 10 n , n là số mũ thích hợp. % độ sống sót = Số lượng tế bào mẫu giống bảo quản x 100 Số lượng tế bào mẫu giống gốc 3.1.3.2. Xác định đặc tính sinh học: Tiến hành theo những phương pháp cụ thể (phụ thuộc vào khả năng sinh hoạt tính của từng nhóm các chủng vi sinh vật) 3.2. Phương pháp bảo quản dưới lớp dầu khoáng 3.2.1. Chuẩn bị: 3.2.1.1. Trang thiết bị, dụng cụ: xem 3.1.1.1 3.2.1.2. Chuẩn bị dụng cụ: xem 3.1.1.2 3.2.1.3. Môi trường nuôi cấy: - Chuẩn bị môi trường: xem 3.1.1.3 - Dầu parafin có tỷ trọng 0,865-0,890 được khử trùng ở 121 o C trong 30 phút, sau đó để nhiệt độ phòng cho bay hết nước lẫn trong dầu. 3.2.2. Tiến hành: Cấy giống: xem 3.1.2 Khi tế bào đã phát triển ổn định, bằng thao tác vô trùng đổ parafin đã chuẩn bị ở 3.2.1.3 lên bề mặt thạch nghiêng đã cấy giống sao cho khi dựng đứng ống thạch lên thì bề mặt lớp dầu khoáng cách mép trên của lớp thạch khoảng 1 cm. Ống giống khi đưa vào bảo quản phải đạt độ thuần khiết 100%. Nhiệt độ cất giữ 4-10 o C, định kỳ cấy chuyển sau 12 tháng. 3.2.3. Kiểm tra mẫu giống: Định kỳ sau 12 tháng kiểm tra độ phần trăm sống sót và đặc tính sinh học của mẫu giống. 3.2.3.1. Độ phần trăm sống sót của mẫu giống: xem 3.1.3.1 Trước khi lấy sinh khối vi sinh vật để chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn cần loại bỏ toàn bộ lớp dầu khoáng bằng cách dùng pipet hút hết dầu khoáng, sau đó dùng giấy lọc thấm khô hết dầu khoáng dính trên bề mặt ống giống. 3.2.3.2. Xác định đặc tính sinh học của mẫu giống: xem 3.1.3.2 Ghi chú: Chỉ cho phép giữ lại các mẫu giống có phần trăm độ sống sót cao, có hoạt tính sinh học ổn định như mẫu giống gốc. Các mẫu giống này sẽ được cấy chuyển lại trên môi trường nuôi cấy và tiếp tục bảo quản.