TCVN8400-35:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-35:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-35:2015 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 35: BỆNH THEILERIA Ở TRÂU BÒ Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 35: Bovine theileriosis Lời nói đầu TCVN 8400-35:2015 được xây dựng trên cơ s ở tham khảo OIE (2010), Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals , Chapter 2.4.16 Theiler i osis ; TCVN 8400-35:2015 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ ti ê u chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình ch ẩ n đoán g ồ m 38 phần: - TCVN 8400-1 : 2010, ph ầ n 1: Bệnh l ở mồm long móng; - TCVN 8400-2 : 2010, ph ầ n 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis g â y ra trên lợn; - TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: B ệ nh giun xoắn; - TCVN 8400-4 : 2010, ph ầ n 4: Bệnh Niu Cát Xơn; - TCVN 8400-5 : 2011, ph ầ n 5: Bệnh tiên mao trùng; - TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xu ấ t huyết thỏ; - TCVN 8400-7 : 2011, ph ầ n 7: Bệnh đậu c ừu và đậu dê; - TCVN 8400-8 : 2011, ph ầ n 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia c ầ m; - TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt type I; - TCVN 8400-10 : 2011, ph ầ n 10: Bệnh lao bò; - TCVN 8400-11 : 2011 , ph ầ n 11: Bệnh dịch t ả vịt; - TCVN 8400-12 : 2011 , phần 12: Bệnh bạch lị và thương hàn ở gà; - TCVN 8400-13 : 2011, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhi ễ m do brucela; - TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huy ế t trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-15 : 2011, ph ầ n 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira; - TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli; - TCVN 8400-17 : 2011, ph ầ n 17: Bệnh do vi khuẩn staphylococcus aureus g â y ra ở gà; - TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza); - TCVN 8400-19 : 2014, ph ầ n 19: Bệnh phó thương hàn lợn; - TCVN 8400-20 : 2014, ph ầ n 20: Bệnh đóng d ấ u lợn; - TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS); - TCVN 8400-22 : 2014, phần 22: Bệnh giả dại ở lợn; - TCVN 8400-23 : 2014, ph ầ n 23: Bệnh ung khí th á n; - TCVN 8400-24 : 2014, ph ầ n 24: Bệnh viêm phế qu ả n truyền nhiễm; - TCVN 8400-25 : 2014, ph ầ n 25: Bệnh cúm lợn; - TCVN 8400-26 : 2014, ph ầ n 26: Bệnh cúm gia c ầ m H5N1; - TCVN 8400-27 : 2014, ph ầ n 27: Bệnh s á n lá gan; - TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn Clostridium per f ringens; - TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà; - TCVN 8400-30 : 2015, ph ầ n 30: Bệnh Marek ở gà; - TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh Tụ huyết trùng gia cầm; - TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh Gumboro ở gia c ầ m; - TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh L ê dạng trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh Biên trùng ở tr â u bò; - TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh Theiler i a ở trâu bò; - TCVN 8400-36 : 2015, ph ầ n 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2; - TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn; - TCVN 8400-38 : 2015, ph ầ n 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus. BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CH Ẩ N ĐOÁN - PH Ầ N 35: BỆNH THEILERIA Ở TRÂU BÒ Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 35: Bovine theileriosis C Ả NH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết b ị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất c ả các vấn đề an toàn li ên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng ti ê u chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích h ợ p và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh Theileria ở trâu bò do một số loài Theileria spp . gây ra. Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng để chẩn đoán bệnh Theileria cho các gia súc khác như dê, cừu. 2 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: 2.1 Bệnh Theileria (Theileriosis) Bệnh do một số loài đơn bào Theiler i a spp. như Theileria parva, Theileria annulata, Theileria taurotragi , gây ra. CH Ú THÍCH: Khi con vật m ắ c bệnh, có bi ể u hiện đặc trưng nh ư: sốt cao, lách và hạch lympho sưng to. M ầ m bệnh Theileria spp. được truyền từ con vật bệnh sang con vật khỏe qua một số l o ài ve Rhipicephalus spp., Hyalomma spp... 3 Thuốc thử và vật liệu thử Ch ỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước c ấ t, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp nhuộm Giemsa 3.1.1 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,0 (xem A.1). 3.1.2 Dung dịch Giemsa , 10 % (xem A.2). 3.1.3 Metanol tuyệt đối 3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phư ơ ng pháp PCR 3.2.1 Kít tách chiết ADN (axit deoxyribonucleic), dùng cho mẫu máu hoặc mẫu mô. 3.2.2 Kít nhân gen. 3.2.3 Cặp mồi (primers). 3.2.4 Agarose. 3.2.5 Dung dịch đệm TAE (tris axetat EDTA) hoặc TBE (tris borat EDTA) (xem A.3) 3.2.6 Chất nhuộm màu , v í dụ: Sybr sa f e hoặc etidi bromua. 3.2.7 Loading dye 6X (chất đệm tải mẫu). 3.2.8 Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic). 3.2.9 Thang chuẩn ADN (Ladder, marker). 3.2.10 Nước tinh kh i ết , không có nuclease. 3.3 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA (phép thử mi ễ n dịch li ên kết enzym) Hiện nay các kít ELISA thương mại có sẵn trên thị trường dùng để phát hiện kháng thể The i leria. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. 3.4 Thuốc thử và vật liệu th ử dùng cho phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFAT) 3.4.1 Dung dịch PBS , pH 7,2 (xem A.4). 3.4.2 Axeton. 3.4.3 Formaldehyd. 3.4.4 Natri azide. 3.4.5 Eosin hoặc trypan blue. 3.4.6 G l yxerol. 3.4.7 Lymphocyte lysate. 4 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau: 4.1 Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung 4.1.1 T ủ lạnh âm sâu , có thể duy trì nhiệt độ từ â m 20 °C đến âm 80 °C. 4.1.2 T ủ lạnh , c ó thể duy trì nhiệt độ 2 °C đến 8 °C. 4.2 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phư ơn g pháp nhuộm Giemsa 4.2.1 Phiến k í nh, vô trùng. 4.2.2 Lamen , vô trùng. 4.2.3 K í nh hiển vi quang học , vật kính dầu 100 X. 4.3 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp PCR 4.3.1 Máy nh â n gen (PCR). 4.3.2 Máy ly tâm , c ó thể đạt gia tốc ly tâm 900 g , 6 000 g và 20 000 g. 4.3.3 Máy lắc trộn vortex. 4.3.4 Máy spindown. 4.3.5 Bộ điện di , gồm bộ nguồn và bể chạy điện di. 4.3.6 . Máy đọc gel (blue light transilluminator). 4.4 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA 4.4.1 T ủ ấm , có thể duy tr ì nhiệt độ ở 37 °C. 4.4.2 Máy đọc E LI SA , có thể đọc ở bước sóng 405 nm. 4.5 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp IFAT 4.5.1 Máy ly tâm lạnh , có thể ly tâm với gia tốc 200 g, 500 g. 4.5.2 K í nh hi ể n vi huỳnh quang. 5 Chẩn đoán lâm sàng 5.1 Đặc điểm dịch tễ - Bệnh Theileria thường gặp ở trâu bò ở những vùng có khí hậu nóng, ẩ m; - Trâu bò sau khi khỏi bệnh Theileria thường là những con mang trùng; - Bệnh lây lan mạnh vào các tháng nóng ẩ m khi ve phát triển, đặc biệt từ tháng 5 đến tháng 8. 5.2 Triệu chứng lâm sàng 5.2.1 Th ể c ấ p tính - Sốt cao 42 °C, mất điều hòa thân nhiệt; - Trâu bò chảy nước mắt, có d ử mắt; - Viêm hạch; - Ỉ a chảy; - Nước tiểu không có huyết sắc tố, không có hiện tượng hoàng đản; - Niêm mạc mắt, miệng xuất huyết điểm và sung huyết; - Trước khi chết thân nhiệt giảm nhanh, khó thở do phổi tích d ịch; - T ỷ lệ chết có thể đến 90% tùy thuộc vào giống, tuổi, và các yếu tố dịch tễ khác; - Trâu bò thường chết sau 15 ngày tới 25 ngày mắc bệnh. 5.2.2 Thể mãn tính - Trâu bò gầy, sức sản xuất v ề mặt sinh sản, thịt, sữa... kém ở giai đoạn trư ở ng thành; - Có dấu hiệu thần kinh nhẹ; - Vàng da và niêm mạc. 5.3 Bệnh tích - Ni ê m mạc mắt, mũi chứa nhiều dịch; - Hạch lympho sưng to, xuất huyết và phù nề. Trong giai đoạn bệnh c ấ p tính hạch l ympho phù nề và sung huyết; giai đoạn bệnh mãn tính hạch lympho b ị teo và hoại tử; - Phổi, kh í quản phù nề, tích dịch; - Xoang ngực, bụng ch ứ a nhiều d ịch; - T ủ y xương đóng thành chất keo, màu tro vàng nhạt; - Lách, thận có điểm hoại tử màu trắng; - Gan, lách sưng to; - Đường tiêu hóa bị loét và xu ấ t huyết, đặc biệt phần dạ múi khế. 6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1 Phương pháp nhuộm Giemsa kiểm tra hình thái Theileria 6.1.1 Lấy mẫu Dùng xylanh 5 ml v à kim tiêm 20 G (hoặc 18 G) vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu ở tĩnh mạch cổ hoặc động mạch đuôi của trâu bò nghi ngờ bệnh cho vào ống có ch ấ t chống đông (EDTA, natri xitrat hoặc heparin), ghi ký hiệu mẫu lên thành ống. Đối với trâu bò bệnh được mổ khám: l ấ y 3 gam đến 5 gam hạch lympho, phổi, thận, gan, lách cho vào túi vô trùng, d án k í n ghi kí hiệu mẫu. 6.1.2 Bảo quản mẫu Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp chưa xét nghiệm ngay mẫu máu chống đông và ph ủ tạng bảo quản trong tủ lạnh (4.1.2). CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi r õ yêu c ầ u xét nghiệm và những thông tin v ề dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh. 6.1.3 Chuẩn b ị mẫu Mẫu bệnh phẩm là mẫu máu, phủ tạng. 6.1.4 Cách tiến hành 6.1.4.1 Chuẩn b ị t iê u bản a) Đối với mẫu máu (6.1.1) - Nhỏ 1 giọt máu (6.1.1) (tương đương 5 m l đến 10 m l) lên một đ ầ u của phiến k í nh (4.2.1); - D à n mỏng giọt máu bằng lamen (4.2.2) hoặc một phiến kính khác (4.2.1); - Tiêu bản để khô tự nhi ê n sau đó cố định bằng metanol tuyệt đối (3.1.3) trong 1 min. Đ ể khô. b) Đối với mẫu phủ tạng (hạch lympho, phổi, thận, gan, lách); - Phết nhẹ mẫu phủ tạng (6.1.1) lên phiến kính (4.2.1). - Tiêu bản để khô tự nhiên sau đó cố định bằng metanol tuyệt đối (3.1.3) trong 1 min. Để khô. 6.1.4.2 Nhuộm tiêu bản - Đặt tiêu bản (6.1.4.1) vào cốc đựng dung dịch giemsa 10 % (3.1.2) trong 30 min; - Rửa tiêu bản bằng nước sạch từ 3 lần đến 4 lần; - Để khô tiêu bản ở nhiệt độ phòng. 6.1.5 Xem hình thái Theileria Nhò 1 giọt dầu vào tiêu bản (6.1.4.2) và xem b ằ ng kính hiển vi quang học (4.2.3), quan sát Theileria có hình thái sau: - Theileria thể hạt lựu có m à u xanh lam nhạt, nh â n tế b à o bắt màu tím đối với mẫu phủ tạng; - Theileria có hình cầu, hình gậy hoặc dấu phẩy bắt màu xanh nằm bên trong hồng cầu. 6.2 Phương pháp PCR phát hiện kháng nguyên Theileria 6.2.1 Lấy mẫu Xem 6.1.1. 6.2.2 Bảo quản mẫu Xem 6.1.2. 6.2.3 Chuẩn bị mẫu Mẫu bệnh phẩm là máu hoặc phủ tạng (6.2.1) - Đối với mẫu phủ tạng (6.2.1): lấy kho ả ng 5 g mẫu, nghiền m ẫ u phủ tạng với dung dịch PBS (xem A.1) bằng cối chày sứ vô trùng. Ly tâm ở gia tốc 900 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 10 min, thu phần dịch n ổ i để xét nghiệm PCR; - Đối với mẫu máu (6.2.1): không cần xử lý mẫu. 6.2.4 Cách tiến hành 6.2.4.1 Tách chiết ADN Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.1) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xu ấ t. VÍ D Ụ : dùng k í t tách chiết DNeasy ® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) 1) (xem Phụ lục B). 6.2.4.2 Chuẩn bị m ồ i Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.3.1) theo phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu Tams 1 của T. annulata sử dụng cặp mồi (3.2.3) được nêu trong Bảng 1. Bảng 1 - Trình tự cặp mồi [1] Gen đích Cặp mồi Trình tự 5’-3’ T. annulata Kích thước sản ph ẩ m Tams 1 Mồi xuôi (forward primer) ATGCTGCAAATGAGGAT 785 bp Mồi ngược (reverse primer) GGACTGATGAGAAGACGATGAG Cặp mồi dùng đ ể khuếch đại đoạn gen của T. annulata có kích thước sản phẩm 785 bp Mồi được chuẩn bị như sau: - Chuẩn bị mồi gốc: mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.3.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ố ng trước khi m ở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 m M làm mồi gốc. - Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 m M, pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.10) (20 m l mồi gốc và 80 m l nước). 6.2.4.3 Tiến hành phản ứng Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (6.2.4.2). Sử dụng kít nhân gen (3.2.2) theo hướng dẫn của nhà s ả n xu ấ t. VÍ D Ụ : dùng bộ kít Taq PCR master mix, Qiagen (Cat. No. 201443) 2) Thành phần cho một phản ứng được nêu trong Bảng 2. Bảng 2 - Thành phần ph ả n ứng PCR Thành phần Thể tích ( m l) Taq PCR Master Mix kít 12,5 Mồi xuôi , 20 m M 0,5 Mồi ngược, 20 m M 0,5 Nước tinh khiết không có nuclease 6,5 Tổng thể tích 20 Chuyển 20 m l hỗn hợp nhân gen v à o mỗi ống phản ứng: - Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 m l mẫu ADN c ó kích cỡ sản ph ẩ m đã biết vào ống phản ứng; - M ẫ u kiểm chứng âm: cho 5 m l nước (3.2.10) vào ống ph ả n ứng; - M ẫ u bệnh phẩm: cho 5 m l mẫu ADN bệnh phẩm (6.2.4.1) vào ống ph ả n ứng. CHÚ THÍCH: - Phản ứng PCR phải bao gồm: m ẫ u bệnh phẩm, m ẫ u ki ể m chứng dương và mẫu kiểm chứng âm; - Mẫu và nguyên liệu cho phản ứn g PCR c ầ n đặt trong khay đá lạnh trong suốt qu á tr ì nh chu ẩ n bị hỗn hợp phản ứ ng. Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (PCR) (4.3.1) đã được c à i đặt chu trình nhiệt được nêu trong Bảng 3. Bảng 3 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 94 °C 3 min 1 94 °C 1 min 40 60 °C 1 min 72 °C 1 min 40 72 °C 10 min 1 6.2.4.4 Điện di 6.2.4.4.1 Chuẩn bị bản gel Pha agarose (3.2.4) với nồng độ agarose từ 1,5 % đến 2 % b ằ ng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.5) (từ 1,5 gram đến 2 gram agarose với 100ml TAE 1X hoặc TBE 1X) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc cho tan. Sau đó đun dung dịch agarose sôi, để nguội đến khoảng 40 °C đến 50 °C th ì b ổ sung 10 m l ch ấ t nhuộm m à u (3.2.6) cho 100 ml thạch. Lắc nhẹ để chất nhuộm màu tan đều, tránh tạo b ọ t. Tiến hành đổ dung dịch agarose vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản gel dày quá 0,8 cm. Khi bản agarose đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel. Chuyển bản gel vào bể điện di (4.3.5), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) (3.2.5) ( cùng loại với dung dịch agarose đã đun) vào bể điện di cho tới khi ngập b ả n gel. Có thể dùng các sản ph ẩ m c ó s ẵ n chất nhuộm ADN đ ể pha agarose (v í dụ: Sybr safe ADN gel stain 3) ) và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 6.2.4.4.2 Chạy điện di Chuyển 2 m l Loading dye 6X (3.2.7) vào 8 m l mỗi loại mẫu (kiểm chứng â m, dương) (6.2.4.3) và sản phẩm PCR (6.2.4.3) ra trộn đều và cho vào các giếng trên bản gel (6.2.4.4.1). Đưa gel vào chạy điện di trong bộ điện di (4.3.5) với thang chuẩn ADN (marker) (3.2.9) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Chuyển 10 m l thang chuẩn ADN (marker) (3.2.9) vào một giếng trên b ả n gel. Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min. Bản gel sau khi điện di xong đ ư ợc lấy ra và đọc kết qu ả trên máy đọc gel (blue light transilluminator) (4.3.6). 6.2.5 Đọc kết quả Đặt bản gen lên trên máy đọc gel (4.3.6): - Mẫu dương tính có hiển thị vạch sản phẩm giống như mẫu kiểm chứng dương và có kích thước 785 bp với điều kiện mẫu kiểm chứng âm không có vạch sản phẩm xuất hiện; - Mẫu âm tính giống mẫu ki ể m chứng âm và không có vạch sản ph ẩ m xuất hiện; - M ẫ u nghi ngờ hiển thị vạch sản phẩm không rõ nét hoặc hiển thị nhiều hơn 1 vạch sản ph ẩ m. Trường hợp này c ầ n xét nghiệm lại hoặc sử dụng các phương pháp khác để khẳng định. 6.3 Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể Theileria 6.3.1 L ấ y mẫu Sử d ụng xy l anh 5 ml v à kim ti ê m 20 G (hoặc 18 G) vô trùng, l ấ y từ 1,5 ml đến 2 ml máu ở tĩnh mạch cổ hoặc động mạch đu ô i của trâu bò nghi mắc bệnh Theileria. Sau khi l ấ y, rút pittong l ù i ra để tạo khoảng trống (hoặc b ơ m máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ b ì nh thường, tránh ánh nắng trực tiếp. 6.3.2 Bảo quản mẫu Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được bảo qu ả n trong th ù ng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp chưa xét nghi ệm ngay, mẫu huyết thanh phải được ly tâm, ch ắ t lấy phần huyết thanh sang ống khác, bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1) 6.3.3 Chuẩn bị mẫu Chắt huyết thanh từ xylanh (6.3.1) sang ống nghiệm vô trùng, kể từ lúc l ấ y máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống ch ứ a huyết thanh. 6.3.4 Cách tiến hành VÍ DỤ: d ùng bộ kit phát hiện kháng thể Theileria ở trâu bò của h ã ng SVANOVA 4) 6.3.4.1 Chuẩn bị nguyên liệu - Dung dịch đệm: pha lo ã ng dung dịch PBS - T w een 20 X với nước cất theo t ỷ lệ 1/20 (cho 25 ml PBS T w een 20 X vào 475 ml nước cất), lắc đều. Bảo quản dung dịch đệm ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C; - Dung dịch kháng kháng thể bò: pha lo ã ng dung dịch kháng kháng thể bò với 11,5 ml dung dịch đệm (pha xong dùng ngay). Sau khi pha lo ã ng b ả o qu ả n ở âm 20 °C. Dung dịch kháng kháng thể bò đông tan tối đa 3 lần; - Pha lo ã ng mẫu kiểm chứng (âm, dương) và mẫu bệnh phẩm (6.3.3) với dung dịch đệm theo tỷ lệ 1/100 (cho 5 m l mẫu kiểm chứng hoặc mẫu bệnh phẩm vào 495 m l dung dịch đệm). 6.3.4.2 Tiến hành phản ứng - Các thuốc thử đ ể ở nhiệt độ phòng từ 18 °C đến 25 °C trước khi sử dụng; - Nhỏ 100 m l mẫu ki ể m chứng (âm, dương) đã pha loãng (6.3.4.1) vào các giếng được chọn (mỗi mẫu thực hiện trên 2 giếng, vị trí của mẫu kiểm chứng đã được đánh d ấu trong đĩa); - Nhỏ 100 m l mẫu bệnh phẩm đã pha loãng ( 6.3.4.1) vào giếng được chọn (mỗi mẫu có thể l à m 1 giếng hoặc 2 giếng, tuy nhiên trong trường hợp xác định lại mỗi mẫu nên làm 2 giếng); - Phủ kín đĩa và ủ ở t ủ ấm (4.4.1) trong vòng 30 min; - Rửa đĩa 4 lần b ằ ng dung dịch đệm (6.3.4.1); - Nhỏ 100 m l dung dịch kháng kháng thể bò đã pha loãng (6.3.4.1) vào từng giếng; - Phủ kín đĩa và ủ trong t ủ ấm (4.4.1) trong 30 min; - Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch đệm (6.3.4.1); - Nhỏ 100 m l dung dịch cơ chất vào mỗi giếng; - Phủ kín đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 min; - Nhỏ 100 m l dung d ịch dừng phản ứng vào mỗi giếng; - Ph ủ kín đ ĩ a và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 min; - Đọc đĩa ở bước sóng 405 nm bằng máy đọc ELISA (4.4.2) trong vòng 15 min. 6.3.5 Đọc kết qu ả - Tính giá trị mật độ quang học (OD) của mẫu kiểm chứng (âm, dương) và mẫu bệnh phẩm. - Tính tỷ lệ giá trị OD giữa mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu kiểm chứng âm với mẫu ki ể m chứng dương (PP) theo công thức sau: PP = OD mẫu b ệ nh phẩm hoặc mẫu kiểm chứng â m x 100 OD mẫu kiểm ch ứ ng dương Giá trị mẫu kiểm chứng nằm trong khoảng giới hạn sau: 1) OD của mẫu kiểm chứng dương: trong khoảng từ 1,1 đến 2,3 2) PP của mẫu kiểm chứng âm: nhỏ hơn 15 - Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh phẩm: 1) PP nh ỏ hơn 20: mẫu âm tính 2) PP lớn hơn hoặc bằng 20: mẫu dương t í nh CHÚ THÍCH: Kít phát hiện kháng thể Theileria kh ô ng thể phân biệt được kháng thể do nhiễm tự nh iê n hay kháng thể do tiêm vắc xin. 6.4 Phương pháp IFAT phát hiện kháng thể Theileria 6.4.1 Lấy mẫu Xem 6.3.1. 6.4.2 Bảo quản mẫu Xem 6.3.2. 6.4.3 Chuẩn bị mẫu Xem 6.3.3. 6.4.4 Cách tiến hành 6.4.4.1 Chuẩn bị kháng nguyên schizont 6.4.4.1.1 Kháng nguyên schizont trên phiến kính - Sử dụng kháng nguyên schizont được l ấ y t ừ dòng tế bào lympho khi gây nhiễm với T. parva hoặc dòng tế bào đại thực bào khi gây nhiễm với T. annulata ; - Nuôi c ấ y 200 ml đến 1 lít tế bào nhiễm schizont của loài T. parva hoặc T. annulata ở nồng độ 10 6 tế bào/ml. Kiểm tra khi thấy 90 % tế bào bị nhiễm là đạt yêu cầu; - Ly t â m d ung dịch nuôi c ấ y ở gia t ố c 200 g bằng máy ly tâm lạnh (4.5.1) trong 20 min ở 4 °C. Bỏ dung dịch phía trên. Thu lấy phần cặn và hòa trong 100 ml dung d ịch PBS lạnh (4 °C), pH 7,2 (3.4.1). Sau đ ó lặp lại bước này 3 lần; - Thu phần cặn, hòa tan với dung dịch PBS (x ấ p x ỉ 100 ml) để c ó nồng độ 10 7 tế bào/ml; - Nhỏ dung dịch pha loãng ở trên thành lớp tế bào mỏng l ê n phiến kính đã chia thành nhiều ô nh ỏ . Khi kiểm tra ở vật kính 40X th ấ y mỗi ô ch ứ a kho ả ng 50 t ế b à o đến 80 tế bào; - Để khô phiến kính trong không khí, cố định b ằ ng axeton (3.4.2) trong 10 min. Bao gói và bảo quản phiến kính trong t ủ lạnh âm sâu (4.1.1), được ít nhất 1 năm. 6.4.4.1.2 Kháng nguyên schizont huyền ph ù - Lấy khoảng 500 ml tế b à o nhiễm T. parva, T. annulata hoặc T. taurotragi ở n ồ ng độ 10 6 t ế bào/ml đem ly tâm ở gia tốc 200 g b ằ ng máy ly tâm lạnh (4.5.1) trong 10 min ở 4 °C, phần cặn thu được rửa 2 lần trong 100 ml dung dịch PBS lạnh. Có thể kiểm tra các t ế bào bằng thuốc nhuộm eosin hoặc trypan blue (3.4.5); - Phần cặn được hòa tan b ằ ng cách nhỏ từng giọt dung dịch pha lo ã ng (axeton và formaldehyd 0,1 % (3.4.3) theo t ỷ lệ 4/1). Đảo nhẹ nhàng và liên tục đến khi đạt huyền phù. Để ổn định các tế b à o dạng huyền phù trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1) trong 24 h; - Rửa, ly tâm ở gia tốc 200 g bằng máy ly tâm lạnh (4.5.1) trong 20 min ở 4 °C các tế bào trên 3 lần với dung dịch nước muối sinh lý 0,9 % lạnh. Phần cặn cuối cùng được pha với dung dịch nước muối sinh lý 0,9 % để đạt dạng huyền phù với nồng độ 10 7 tế bào/ml; - Kháng nguyên được bảo quản trong dung dịch natri azide 0,2 % (3.4.4) (dung dịch chống phân hủy) ở tủ lạnh (4.1.2) trong 2 tuần hoặc ở t ủ lạnh âm s â u (4.1.1) nếu lưu giữ trong thời gian dài. 6.4.4.2 Chuẩn bị kháng nguyên piroplasm 6.4.4.2.1 Kh á ng nguyên piroplasm trên phiến kính - Kiểm tra máu của con vật gây nhi ễ m, khi lượng piroplasm trong máu đạt khoảng 10 % thì l ấ y 100 m l máu từ tĩnh mạch cổ vào ống chống đông chứa heparine hoặc EDTA, lắc nhẹ nhàng; - Cho thêm 2 lít dung dịch PBS. Ly t â m dung dịch ở gia tốc 500 g bằng máy ly tâm lạnh (4.5.1) trong 10 min ở 4 °C. Bỏ phần dung dịch phía tr ê n thu l ấ y phần cặn (hồng cầu). Lặp lại bước này 3 lần; - Sau khi rửa xong, pha loãng hồng cầu trong PBS theo tỷ lệ 1/2. Nhỏ 5 m l dung dịch pha lo ã ng l ê n từng điểm trên phiến kính; - Phiến kính được làm khô ở nhiệt độ phòng; - Cố định phiến kính trong aceton lạnh 4 °C trong 10 min. Bao gói và bảo quản phiến kính ở tủ lạnh âm sâu (4.1.1) ít nhất 1 năm. CHÚ THÍCH: Do không th ể nu ô i c ấ y giai đoạn piroplas m của Theileria spp . nên kháng nguyên piroplasm đ ược l ấ y từ máu của con vật nhiễm bệnh. Đối với loài T. parva, T. annulata hoặc T. taurotragi , gây nhiễm thực nghiệm trên bê cắt lách bằng cách tiêm dưới da hoặc g â y nhiễm trên ve. Đối với loài T. sergenti, T. buffeli, T. oriental i s , T. mutan hoặc T. veli f era thường gây nhi ễ m trên bê cắt lách qua đường t ĩ nh mạch hoặc ve. 6.4.4.2.2 Kháng nguyên piroplasm huyền phù - Phương pháp này áp dụng cho T. parva ; - L ấ y 100 ml máu của con vật gây nhiễm T. parva ở mức cao và làm tương tự như kháng nguyên schizont huyền phù. 6.4.4.3 Chuẩn hóa kháng nguyên - Pha loãng kháng nguyên schizont (6.4.4.1.2) hoặc piroplasm ở dạng huyền phù (6.4.4.2.2) trong dung dịch PBS theo nồng độ từ 1/2 đến 1/16. Ở n ồ ng độ pha loãng nào mà có khoảng 50 tế bào đến 80 tế bào nhiễm schizont hoặc 150 đến 200 hồng c ầ u nhiễm được nhìn thấy dưới vật k í nh 40 X thì dùng nồng độ đó để chuẩn hóa kháng nguyên; - Kiểm tra kháng nguyên với huyết thanh kiểm chứng âm và huyết thanh kiểm chứng dương tính để xác định mức độ dương tính mạnh, trung bình và yếu. - Đánh giá kết quả: 1) Huyết thanh kiểm chứng dương: có màu huỳnh quang; 2) Huyết thanh kiểm chứng âm: kh ô ng có màu huỳnh quang. 6.4.4.4 Ti ến hành phản ứ ng IFAT 6.4.4.4.1 Đ ố i với kháng nguyên schizont hoặc piroplasm trên phiến kính - Bước 1: giải đông phiến kính phủ kháng nguyên ở 4 °C trong 30 min và sau đó để tiếp 30 min ở nhiệt độ phòng; - Bước 2: vô hoạt mẫu bệnh phẩm trong 30 min trong nồi hấp ướt ở 56 °C; - Bước 3: pha loãng m ẫ u bệnh phẩm, huyết thanh kiểm chứng (âm, dương) ở nồng độ 1/40 và 1/80 (có thể pha loãng ở các n ồ ng độ cao hơn); - Bước 4: nhỏ 25 m l của mỗi huy ế t thanh pha lo ã ng vào từng điểm kháng nguyên; - Bư ớ c 5: ủ phiến kính trong hộp ẩ m ở nhiệt độ phòng trong 30 min; - Bước 6: r ử a b ỏ huyết thanh thừa từ phức hợp kháng nguyên - kháng thể ở trên bằng cách nhúng phiến kính liên tiếp trong 2 lọ dung dịch PBS, mỗi lần 10 min; - Bước 7: cho vào mỗi giếng 20 m l dung dịch kháng kháng thể bò được gắn chất màu huỳnh quang ( f luorescein isothiocyanat - FITC) ở độ pha loãng thích hợp (n ồ ng độ pha loãng phụ thuộc vào từng ph ò ng thí nghiệm); - Bước 8: để phiến kính trong hộp ẩ m ở nhiệt độ phòng trong 30 min; - Bước 9: gắn lamen lên trên phiến kính bằng một giọt dung dịch chứa PBS và glycerol (3.4.6) (t ỷ lệ PBS/glycerol là 1/1); - Bước 10: đọc phiến kính b ằ ng k í nh hiển vi huỳnh quang (4.5.2). 6.4.4.4.2 Đối với kháng nguyên schizont huyền phù - Bước 1: giải đông kháng nguyên ở nhiệt độ phòng; - Bước 2: nhỏ kháng nguyên huyền phù vào các điểm đ ã chia sẵn trên phiến kính; - Bước 3: để kh ô phiến kính ở nhiệt độ phòng hoặc 37 °C; - Bước 4: pha loãng huyết thanh kiểm chứng (âm, dương) và mẫu bệnh phẩm ở nồng độ 1/40 trong dung dịch lymphocyte lysate (3.4.7) (195 m l lymphocyte lysate với 5 m l huyết thanh); - Bước 5: giống từ bước 4 đến bước 10 trong mục 6.4.4.4.1. 6.4.4.4.3 Đối với kháng nguyên piroplasm huyền phù - Bước 1: đánh tan kháng nguyên piroplasm huyền phù. Pha loãng kháng nguyên theo các bước đã chuẩn hóa ở trên (6.4.4.3); - Bước 2: để phiến kính khô ở nhiệt độ phòng hoặc 37 °C (4.4.1); - Bước 3: pha lo ã ng huyết thanh kiểm chứng (âm, dương) và mẫu bệnh ph ẩ m ở nồng độ 1/40 trong dung dịch lymphocyte lysate (3.4.7) (195 m l lymphocyte lysate với 5 m l huyết thanh); - Bước 4: giống từ bước 4 đến bước 10 trong mục 6.4.4.4.1. 6.4.5 Đọc kết quả Kiểm tra phiến kính bằng kính hiển vi huỳnh quang (4.5.2) - Mẫu dương tính đ ố i với Theileria khi có màu huỳnh quanh giống với màu của đ ố i chứng dương; - Mẫu âm tính đối với Theileria khi không có màu huỳnh quang giống với màu của đối chứng âm. 7 Kết luận Trâu bò được kết luận là mắc bệnh Theileria khi có các đ ặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh và c ó kết quả xét nghiệm kháng nguyên hoặc kháng thể dương t í nh b ằ ng một trong những phương pháp quy định trong ti ê u chuẩn này. Phụ lục A (Quy định) Thành phần và chuẩn bị thuốc thử A.1 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) , 0,01 M, pH 7,0 A.1.1 Thành phần Natri hydrophosphat (Na 2 HP O 4 ) 9,47 g Kali dihydrophosphat ( KH 2 P O 4 ) 9,08 g Nước cất 900 ml A.1.2 Chuẩn bị Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Ch ỉ nh pH đến 7,0 bằng axit clohydric. CHÚ THÍCH: C ó thể sử dụng PBS thương mại v à chuẩn bị theo hướng d ẫ n c ủ a nhà sản xuất. A.2 Dung dịch Giemsa , 10 % Dung dịch Giemsa (azur-eosin-methylen blue) 1 phần Dung dịch PBS 0,01 M, pH 7,0 (A.1) 9 phần CH Ú THÍCH: N ồ ng độ dung dịch Giemsa có thể thay đổi theo các phòng thí nghiệm. A.3 Dung dịch đệm TAE hoặc TBE A.3.1 Thành phần Dung dịch TBE 10X 100 m l Nước khử ion 900 ml A.3.2 Chuẩn bị L ấ y 100 ml dung dịch TBE 10X h òa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng. A.4 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) , pH 7,2 A.4.1 Thành phần Natri clorua (NaCI) 8 g Kali clorua (KCI) 0,2 g Dinatri hidrophosphat (Na 2 HP O 4 ) 1,15 g Kali dihidrophosphat (KH 2 P O 4 ) 0,2 g Nước cất 1 000 ml A.4.2 Chuẩn b ị Hòa tan các thành phần trong nước. Chỉnh pH đến 7,2 bằng axit clohydric. Bảo quản ở 4 °C. Phụ lục B (Tham khảo) Quy trình tách chiết ADN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng h óa chất nguy hiểm và có khả năng g â y hại nếu thao tác không c ẩ n thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít ph ả i hơi của các h óa ch ấ t này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ kh i thực hiện các thao tác này. Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít DNeasy ® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) như sau: B.1 Pha dung dịch - Dung dịch AW 1 (Wash buffer 1): thêm 125 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào 95 ml dung dịch AW1 đậm đặc; - Dung dịch AW 2 (Wash buffer 2): thêm 160 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào 66 ml d ung dịch AW2 đậm đặc. B.2 Cách tiến hành - Bước 1 : ly giải mẫu • Với mẫu phủ tạng (6.2.3): nhỏ 180 ml dung dịch ATL vào ố ng 1.5 ml ch ứ a phần dịch n ổ i sau khi được xử lý (6.1.4.1); nhỏ 20 m l protease K vào ống. Trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3), ủ ở 56 °C đến khi kết thúc quá tr ì nh ly giải, và trộn lại bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3) 15 s trước khi chuyển sang bước 2; • Với mẫu máu (6.2.3): nh ỏ 20 m l proteinase K vào ống 1.5 ml; thêm vào đó 50 m l đến 100 m l mẫu máu chống đông vào ống; th ê m dung dịch PBS để được 220 m l. Tiến hành tiếp bước 2; - Bước 2: nhỏ 200 m l dung dịch AL vào ống; trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3) trong 15 s. Ủ mẫu ở 56 °C trong 15 min; - Bước 3: nhỏ 200 m l etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) vào ống, trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3). - Bước 4: chuyển toàn bộ dung dịch trong ống vào cột lọc có ống thu; ly tâm cột lọc và ống thu ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 1 min, loại b ỏ ống thu; - Bước 5: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 m l dung dịch AW 1, ly t â m ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 1 min, loại bỏ ố ng thu; - Bước 6: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nh ỏ 500 m l d ung dịch AW 2, ly tâm ở gia tốc 20 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 3 min, loại bỏ ống thu; - Bước 7: chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml hoặc 2 ml sạch; - Bước 8: nhỏ 50 m l dung dịch AE vào giữa màng cột lọc, ủ 1 min ở nhiệt độ ph ò ng (từ 15 °C đến 25 °C); ly tâm cột lọc và ống 1,5 ml hoặc 2 ml ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 1 min; - Bước 9: bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml hoặc 2 ml có chứa ADN; Bảo quản ADN trong t ủ lạnh (4.1.2) nếu thực hiện phản ứng PCR ngay hoặc trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1) nếu thực hiện phản ứng PCR sau 24 h. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Kirvar E, llhan T, Katzer F, Hooshmand Ra d P , Zweygarth E, Gerstenberg C , Phipps P , Brown CG. Detection of Theileria annulata in cattle and vector ticks by PCR using the Tams 1 gene sequences . Parasitology. 2000 Mar, 120(Pt3):245-54. [2] Theileria parva (T.parva-Ab). Available at: http://www.veritastk.co.jp/attached/853/lnsert_T_parva_19-2990-00-03.pdf [3] Phạm Văn Khuê v à Phan Lục, 1996, Giáo trình ký sinh trùng thú y . NXB Đại học Nông nghiệp I. 240-242. [4] Carina M Hall., Joseph D Busch., Glen A Scoles., Kristina A Palma-Cagle., Massaro W Ueti., Lowell S Kappmeyer and David M Wagner, Genetic characterization of Theileria equi in f ecting horses in North America: evidence for a limited source of U.S. introductions. Parasites & Vectors 2013, 6:35 [5] Doliveira C ., Vandermerve M., Habela M. , Jacquiet P . & Jongejan F., 1995. Detection of Theileria annulata in blood samples of carr i er cattle by PCR . J. Clin. Microbiol. 33, 2665-2669. [6] Identi fi cation of Theileria species and characterization of Theileria parva stocks . Available at: http://www.fao.org/wairdocs/ilri/x5549e/x5549e0t.htm 1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương. 2) Thông tin này đưa ra t ạ o đi ề u kiện thuận ti ệ n cho người sử d ụng tiêu chu ẩ n và không ấ n định sử dụng sản ph ẩ m của nhà cung c ấ p này. Có th ể sử dụng các s ả n phẩm tương tự nếu cho c á c k ết quả tương đư ơ ng. Tuy nhi ê n, thành phần và thể t í ch của phản ứ ng PCR có thể thay đổi phù hợp với từng phòng thí nghiệm. 3) Thông t i n này đưa ra t ạo đ iề u kiện thuận tiện cho người s ử dụng tiêu chuẩn và không ấ n định sử dụng sản phẩm n à y. Có th ể sử dụng các sản phẩm tương tự n ế u cho các k ế t quả tư ơng đương. 4) Thông tin n à y đưa ra tạo điều ki ệ n thuận tiện cho người sử dụng ti ê u chu ẩ n và không ấ n định sử dụng sản phẩm c ủ a nhà cung cấp n à y. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.