TCVN11219:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11219:2015 về Sữa bò tươi nguyên liệu - Xác định dư lượng nhóm sulfonamide - Phương pháp sắc kí lỏng TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11219:2015 SỮA BÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NHÓM SULFONAMIDE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG Raw bovine milk - Determination of multiple sul f onamide residues - Liquid chromatographic method Lời nói đầu TCVN 11219:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 993.32 Multiple Su lf onamide Residues in Raw Bovine Milk. Liquid Chromatographic Method; TCVN 11219:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chu ẩ n qu ố c gia TCVN/TC/F12 Sữa và s ả n phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. SỮA BÒ TƯƠI NGUYÊN LIỆU - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NHÓM SULFONAMIDE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG Raw bovine milk - Determination of multiple sul f onamide residues - Liquid chromatographic method 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng để xác định dư lượng bảy loại sulfonamide trong sữa bò tươi nguyên liệu, bao gồm sulfadiazine, sulfathiazo l e, sul f apyridine, sulfachloropyridazine, sulfamerazine, su l fadimethoxine và sul f aquinoxaline Khoảng định lượng của phương pháp là từ 5 ng/ml đến 20 ng/ml. 2 Nguyên tắc Sulfonamide trong các phần mẫu thử được chiết bằng cl oro f orm-axeton. Sau khi làm bay hơi dung môi, phần còn lại được hòa tan trong dung dịch kali phosphat. Phần chất béo còn lại được chiết bằng hexan. Phần nước được lọc và phân tích bằng sắc ký lỏng (LC). Sulfonamide được xác định bằng đo độ hấp thụ UV ở bước sóng 265 nm. Bảy loại sulfonamide có thể được định lượng gồm bốn sulfonamide sử d ụng 12% metanol và ba sulfonamide sử dụng 30% metanol trong pha động. 3 Thuốc thử Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích LC, trừ khi c ó quy định khác. Tất cả các dung dịch LC có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng (24 °C ± 3 °C) đến 3 tháng, trừ khi có quy định khác. 3.1 Nước, đã được chưng c ấ t và loại ion, có điện tr ở suất nhỏ hơn hoặc bằng 17 MΩ cm. 3.2 Dung dịch kali dihydro phosphat (KH 2 P O 4 ), 0,1 M Hòa tan 27,2 g kali dihydro phosphat vào nước đựng trong b ì nh định mức 2 lít, thêm nước đến vạch, trộn và lọc qua bộ lọc nylon cỡ lỗ 0,45 μm. 3.3 Dung m ô i, không có lẫn etanol đã được chưng cất bằng dụng cụ thủy tinh. 3.3.1 Metanol. 3.3.2 Hexan. 3.3.3 Axeton. 3.3.4 Cloro f orm. C Ả NH BÁO: Sử dụng cloro f orm trong tủ hút có thông gió. Tránh hít phải hoặc để tiếp xúc với mắt, da và áo quần. Cloroform có thể gây ung th ư . 3.4 Dung môi pha động 3.4.1 Hệ dung mô i pha động 12%, chuẩn bị từ metanol (3.3.1) và dung dịch kali dihydr o phosphat 0,1 M (3.2) theo tỷ lệ 12 : 88 (th ể tích). 3.4.2 Hệ dung môi pha động 30%, chuẩn bị từ metanol (3.3.1) và dung dịch kali dihydro phosphat 0,1 M (3.2) theo tỷ lệ 30 : 70 (thể tích). Lọc metanol (3.3.1) qua bộ lọc nylon cỡ lỗ 0,45 μm (4.6) trước khi trộn với dung dịch kali dihydro phosphat 0,1 M (3.2). Nếu thiết bị LC đ ượ c trang b ị từ 2 bể trở lên thì bơm metanol và dung dịch kali dihydro phosphat tương ứng với các tỷ lệ phần trăm từ các bể riêng đ ố i với hai điều kiện, nếu không, trộn trước các pha động. 3.5 Dung dịch rửa 3.5.1 Dung dịch metanol trong nước, 12% (thể tích). 3.5.2 Dung dịch metanol trong nước, 30% (thể tích). 3.5.3 Dung dịch metanol trong nước, 60% (thể tích). Lọc metanol (3.3.1) qua bộ lọc nylon cỡ lỗ 0,45 μm (4.6) trước khi trộn với nước. 3.6 Dung dịch chiết, hỗn hợp cloroform và axeton, theo t ỷ lệ 2 : 1 (thể tích) Chu ẩ n bị tr o ng ngày sử dụng khoảng 100 ml cho mỗi mẫu. Đong lượng cloro f orm (3.3.4) v à axeton (3.3.3) trong các ống đong chia vạch riêng rẽ, cho axeton vào cloro f orm v à trộn đều. Để hỗn hợp cân bằng (từ 10 min đến 15 min) đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. 3.7 Dung dịch axit clohydric (HC l ), 1 M. 3.8 Chất chuẩn sulfonamide 3.8.1 Su l fadiazine (SDZ). 3.8.2 Sulfathiazole (STZ). 3.8.3 Su l fapyridine (SPD). 3.8.4 Sulfachloropyridazine (SCP). 3.8.5 Sulfamerazine (SMR). 3.8.6 Sul f adimethoxine (SDM). 3.8.7 Sulfaqu i noxa l ine (SQX). 3.9 Các dung dịch chuẩn 3.9.1 Yêu cầu chung Bảo quản các dung dịch chuẩn ở nhiệt độ nh ỏ hơn 10 °C không quá 6 tháng. Sử dụng nước c ấ t đã loại ion và lọc qua bộ lọc nylon cỡ l ỗ 0,45 μm để chuẩn b ị dung dịch chuẩn sulfonamide. Để giảm thi ể u nhiễm b ẩ n chéo, r ử a dụng cụ thủy tinh trước khi sử dụng đầu tiên với dung dịch axit clohydric 1 M (3.7), sau đó tráng bằng nước cất đ ã loại ion (3.1) v à sau đó bằng metanol (3.3.1). Tháo nắp phễu chiết để đ ả m b ả o rửa kỹ. 3.9.2 Dung dịch chuẩn g ố c Cân khoảng 100 mg các chất chuẩn SDZ (3.8.1), ST Z (3.8.2), SPD (3.8.3), SCP (3.8.4), SMR (3.8.5), SDM (3.8.6) và 10 mg chất chuẩn SQX (3.8.7) ở nhiệt độ phòng, chính xác đến 0,1 mg, chuyển định l ượng sang các b ì nh định mức 100 ml (4.14) riêng rẽ. Hòa tan trong metanol (3.3.1), siêu âm nếu cần, sau đó để dung dịch cân bằng đến nhiệt độ phòng và pha loãng bằng metanol đến vạch rồi trộn kỹ. Dung dịch gốc SQX chứa 100 μg/m l (vì í t hòa tan hơn trong metanol), các d ung dịch gốc khác là 1 mg/ml. 3.9.3 Dung dịch chuẩn trung gian , 10 μg/ml Dùng các pipet riêng rẽ (4.4) chuyển 10,0 ml dung dịch chuẩn gốc SQX và 1,0 ml từng dung dịch chuẩn gốc còn lại (3.9.2) vào các b ì nh định mức 100 ml (4.14) riêng rẽ, thêm nước (3.1) đến vạch rồi trộn kỹ. 3.9.4 Dung dịch thêm chuẩn, 1 μg/ml đ ố i với mỗi sulfonamide Dùng các pipet riêng rẽ (4.4) chuyển 10,0 ml mỗi d ung dịch chuẩn trung gian (3.9.3) vào các bình định mức 100 ml riêng rẽ (4.14), thêm nước (3.1) đến vạch rồi trộn kỹ. 3.9.5 Dung dịch chuẩn sulfonamide 3.9.5.1 Dung dịch chuẩn su lf onamide, 200 n g/ml Pha loãng 10,0 ml dung dịch thêm chu ẩ n (3.9.4) đựng trong bình định mức 50 ml (4.14) bằng nước (3.1) đến vạch và trộn kỹ. 3.9.5.2 Dung dịch chuẩn sulfonamide, 100 n g/ml Pha loãng 10,0 ml dung dịch thêm chuẩn (3.9.4) đựng trong bình định mức 100 ml (4.14) bằng nước (3.1) đến vạch v à trộn kỹ. 3.9.5.3 Dung dịch chuẩn sul f onam id e, 50 n g/ml Pha loãng 5,0 ml dung dịch thêm chuẩn (3.9 . 4) đựng trong bình định mức 100 ml (4.14) bằng nước (3.1) đến vạch và trộn kỹ. 4 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng c ụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau: 4.1 Máy sắc ký l ỏ ng (LC) Gồm bộ bơm mẫu tự động, detector cố định bước sóng hoặc detector UV. Cột pha đảo C18 kí ch thước 250 mm x 4,6 mm với các pha đã khử hoạt tính (octadecyldimethylsilyl, đường kính lỗ 10 nm), cỡ hạt 5 μm, cột bảo vệ 2 cm được nhồi tương tự và bộ lọc tiền cột 0,5 μm. Các điều kiện vận hành: - nhiệt độ lò cột (cột C18 và cột bảo vệ): 35 °C ± 0,2 °C - tốc độ dòng: 1,5 ml/min; - thể tích bơm mẫu và chuẩn: 100 μl; - thời gian chạy: 40 min; - tốc độ ghi: 0,5 cm/min; - bước sóng detecto r 265 nm. CHÚ THÍCH: Nếu nhiệt độ phòng không ổn định th ì làm ấm pha động bằng cách cho đi qua ống nối LC của bộ bơm trước qua bộ gia nhiệt cột để thu được th ờ i gian lưu ổn định. Làm sạch hệ thống và cột LC bằng dung dịch rửa (3.5) dùng cho pha động. Rửa cột trên 15 min với t ố c độ 1,5 ml/min hoặc với tốc độ dòng thấp đ ể qua đêm. N ế u hệ thống không sử dụng trong 1 tuần th ì rửa cột bằng dung dịch metanol trong nước (3.5.3). Để phân tích tốt hơn với hệ thống sử dụng d ung dịch r ử a metanol trong nước, có th ể để cân bằng qua đêm, nếu c ầ n. 4.2 Bộ cô quay. 4.3 Ố ng nghiệm polypropylen, dung tích 50 ml, có nắp đậy kín. 4.4 Pipet, dung tích 10 ml, 1 ml và 100 μl. 4.5 G i ấy lọc g ấ p nếp, đường kính 12,5 cm, đã được gấp nếp, loại 588, bề mặt trơn, giữ được các hạt thô, bề dày 0,215 mm, với tốc độ ch ả y nhanh. 4.6 Bộ lọc nylon , cỡ lỗ 0,45 μm, 47 mm và các bộ lọc đầu pipet 2 μm. 4.7 Máy trộn vortex. 4.8 Tủ lạnh đông, duy trì được nhiệt độ - 80 °C + 2°C. 4.9 Ph ễ u cân nh ỏ , khớp với bình định mức 100 ml. 4.10 Pipet định mức, dung tích 1 ml, 2 ml, 5 ml và 10 ml. 4.11 Phễu chiết, dung tích 125 ml, có nắp đậy bằng thủy tinh mài. 4.12 Phễu, cuống ngắn, đường kính 75 mm. 4.13 B ì nh quả lê, d ung tích 100 ml, bằng thủy tinh có cổ hình côn chuẩn 24/40, có nắp. 4.14 Bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml và 2 lít, loại A. [2] 5 Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) [1] . Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư h ỏ ng hoặc thay đổi trong suốt quá tr ì nh vận chuyển hoặc bảo quản. Mẫu thử được bảo qu ả n lạnh ở nhiệt độ dưới 10 °C. Nếu mẫu chưa được phân tích trong vòng 2 ngày đến 3 ngày thì b ả o qu ả n đông lạnh ở - 80 °C trong các ống nghiệm polypropylen (4.3) với các lượng nhỏ. N ế u không, b ả o quản các phần mẫu thử đông lạnh trong t ủ lạnh đông (4.8) ở nhiệt độ càng thấp c à ng tốt. Rã đông mẫu dưới vòi nước ấm trong ngày phân tích và lắc trộn kỹ m ẫ u sữa trước khi lấy để phân tích. Khi b ả o qu ả n ở - 80°C, sữa và các dư lượng sulfonamide có thể bền được khoảng 12 tháng khi được bảo quản ở - 15°C có thể bền được khoảng 3 tháng đến 4 tháng. 6 Cách tiến hành 6.1 Chiết Đặt giấy lọc g ấ p nếp (4.5 ) vào phễu (4.12), d ùng 5 ml dung dịch chiết (3.6) để rửa bộ lọc và loại b ỏ nước rửa. Dùng pipet lấy 10 m l (4.10) mẫu thử cho vào phễu chiết (4.11). CHÚ TH Í CH: Khi cần thực hiện phép thử độ thu h ồ i , thêm chu ẩ n vào các ph ầ n thử trắng bằng cách thêm 50 μl, 100 μl , hoặc 200 μl dung dịch th ê m chuẩn vào 10 ml sữa đựng trong phễu chiết (4.11) ( thu được các mẫu trắng thêm chuẩn chứa 5 ng/ml, 10 ng/ml hoặc 20 ng/ml). B ổ sung 50 ml dung dịch chiết vào phần mẫu thử đựng trong phễu chiết (4.11), đậy nắp, lắc mạnh 1 min , m ở hé nắp c ẩ n thận. Không m ở van khóa vì chất k hô sữa có thể làm tắc nghẽn khóa dẫn đến việc mất mẫu. Lắc thêm 1 min, mở hé nắp và để tách pha 1 min. Lặp lại thao tác lắc liên tục và để tách pha trong 5 min. Tháo dung dịch chiết, lọc qua giấy lọc gấp nếp (4.5) và thu vào bình quả lê (4.13). CHÚ Ý : C ẩ n thận không để sữa đi và o van khóa. Cho 25 ml dung dịch chiết vào phễu chiết (4.11) và lặp lại chính xác như trên. Sau khi lọc dịch chiết lần thứ hai vào cùng một b ì nh quả lê (4.13), rửa sạch bộ lọc hai lần bằng 5 ml dung dịch chiết, thu lấy nước r ử a vào cùng một bình qu ả lê nêu trên. 6.2 Chuẩn bị phần mẫu thử Cẩn thận làm bay hơi dung dịch chiết vừa đến khô trên bộ cô quay (4.2) ở 32 °C ± 2 °C. Trong vài phút đầu tiên, điều tiết chân không để tránh tạo bọt. Hòa tan phần còn lại trong 1 ml dung dịch kali dihydro phosphat 0,1 M (3.2), b ằ ng cách lắc trộn mạnh 1 min trên máy trộn Vortex (4.7). Thêm ngay 5 ml hexan (3.3.2) và trộn 1 min trên máy Vortex (4.7). Để tách pha trong 2 min, sau đó trộn ngay thêm 1 min trên máy Vortex (4.7). Để tách pha ít nhất 15 min trước khi lấy lớp nước (phía dưới) ra. Sử dụng pipet 1 ml (4.10), tháo ngay lớp nước và đặt ngay bộ lọc đầu tip pipet nylon lên đầu tip pipet. CHÚ THÍCH: Lớp nước sẽ đồng nhất, v ì vậy không cần thiết loại b ỏ 100%, ch ỉ c ầ n 50% đến 75% lớp nước là đ ủ cho 2 hai l ầ n bom. Lọc lớp nước vào ố ng nghiệm thủy tinh hoặc lọ bơm m ẫ u tự động (hoặc chia nh ỏ thành 2 lọ n ế u sử dụng 2 hệ thống sắc ký l ỏ ng). Các phần mẫu thử đã chuẩn bị có thể được bảo quản trong lọ bơm mẫu tự động ở nhiệt độ phòng qua đ ê m hoặc đựng trong các lọ bơm kín giữ ở nhiệt độ nh ỏ hơn 10 ° C đến 24 h t rước khi bơm. 6.3 Hệ thống sắc ký Sử dụng hai hệ thống pha động để phân gi ả i bảy loại sulfonamide: - Hệ dung môi pha động 12% (3.4.1) đối với SDZ, STZ, SPD, SMR. - Hệ dung môi pha động 30% (3 4.2) đối với SCP, SDM và SQX. Thiết lập 2 hệ thống LC riêng biệt cho 2 pha động hoặc nếu chỉ có sẵn một hệ thống LC thì phân t í ch các dịch mẫu d ịch chiết sử dụng hệ d ung môi pha động 12% đầu tiên, sau đó c â n bằng 1 h với hệ dung môi pha động 30% và phâ n tí ch các ph ầ n mẫu thử chiết c ò n lại. Cân bằng lại hệ dung môi pha động 12% trong vài giờ hoặc qua đêm với tốc độ dòng giảm. Để tối ưu h ó a độ phân giải cho các cột LC v à máy bơm khác nhau, thay đổi nồng độ metanol trong pha động trong khoảng từ 10% đến 30%. CH Ú THÍCH: Việc sử dụng các hệ dung m ôi pha động 12% và 30% làm giảm thiểu ảnh hưởng n ề n và cung c ấ p độ phân giải đầy đ ủ cho tất cả b ả y sulfonamide, nhưng không nhất thiết phải phản ánh độ phân giải tốt nhất cho t ừng sul f onamide. 6.4 Đường chuẩn Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống trước khi xác định b ằ ng cách bơm 100 μl các dung dịch chu ẩ n sul f onami d e nồng độ 5, 10 và 20 ng/ml lặp lại theo cả hai điều kiện LC. Chuẩn bị b ả y đường chuẩn sử dụng chiều cao pic. 6.5 Xác định mẫu Bơm lặp lại hai lần 100 μl dịch chiết phần mẫu thử đã hòa tan lại (5.3) vào hệ thống LC. 7 Tính kết quả Tính hệ số hồi quy tuy ế n tính, sử dụng hồi quy bình phương nhỏ nhất cho mỗi sulfonamide cần xác định (nồng độ với chiều cao pic) sử dụng công thức sau: Y = mX + b Sau đó, xác định nồng độ mỗi sulfonamide có trong mẫu thử, X , từ phương tr ì nh, trong đ ó Y là chiều cao pic tại thời gian lưu sul f onamide của dịch chiết mẫu tương ứng. CH Ú THÍCH: Phần cặn khô chiết được từ 10 ml các phần mẫu thử được hòa tan lại trong thể t í ch cuối cùng 1 ml, d o đó, việc phân tích dịch chiết cuối cùng 100 ng/ml là tương đương v ớ i ch ấ t ph â n tích n ồ ng độ 10 ng/ml. 8 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấ y mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi thao tác không quy định trong tiêu chu ẩ n này, hoặc tùy chọn và các chi tiết bất thường khác có ảnh hư ở ng tới kết quả; e) kết qu ả thử nghiệm thu được. Phụ lục A (Tham khảo) Phép thử liên phòng thử nghiệm B ả ng A.1 đưa ra các kết quả của phép thử liên ph ò ng thử nghiệm về chấp nhận phương pháp. Bảng A.1 - Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm Sulfonamide Độ thu hồi trung bình Độ l ệ ch chuẩn lặp lại Độ lệch chu ẩ n tái lập Độ lệch chu ẩ n tương đối lặp lại Độ lệch chuẩn tương đối tái lập % S r S R RSD r , % RSD R , % Thêm chuẩn 5 ng/ml SDZ 74,09 6,00 11,55 8,09 15,58 STZ 54,64 8,30 14,15 15,20 25,90 SPD 80,46 7,48 12,66 9,29 15,74 SMR 87,06 10,19 12,63 11,70 14,50 SCP 79,08 11,35 12,18 14,35 15,40 SDM 68,03 12,08 13,13 17,76 19,30 SQX 59,11 9,14 14,03 15,46 23,74 Thêm chuẩn 10 ng/ml SDZ 75,36 5,37 7,81 7,13 10,36 STZ 57,19 4,99 11,56 8,73 20,22 SPD 76,73 5,82 9,54 7,58 12 , 43 SMR 82,46 6,69 8,36 8,11 10,14 SCP 71,22 6,11 7,81 8,58 10,97 SDM 66,54 4,23 6,85 6,35 10,29 SQX 5 6,15 3,20 8,94 5,71 15,92 Thêm chuẩn 20 ng/ml SDZ 75,01 5,14 6,91 6,85 9,21 STZ 56,14 6,23 9,70 11,10 17,28 SPD 76,23 5 , 47 7,93 7,18 10,41 SMR 82,44 5,77 8,17 7,00 9,91 SCP 67,88 3,82 5,13 5,56 7,46 SDM 67,05 3,18 5,57 4,74 8,31 SQX 52,55 2,82 6,60 5,37 12,56 Dự lượng b ị nhiễm, ng/ml (mẫu mù) SDZ 11,32 0,50 1,25 4,46 11,08 ST Z 13,95 0,48 2,50 3,46 17,90 SPD 14,60 0,66 1,53 4,54 10,44 SMR 14,27 0,71 1,14 4,95 8,02 SCP 12,83 2,62 2,72 20,45 21,23 SDM 13,60 1,08 1,82 7,93 13,38 SQX 7,41 1,73 1,84 23,30 24,80 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn l ấ y mẫu [2] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức