TCVN5517:1991

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5517:1991 về thực phẩm - phương pháp xác định phẩm màu hữu cơ tổng hợp tan trong nước TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5517:1991 THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PHẨM MÀU HỮU CƠ TỔNG HỢP TAN TRONG NƯỚC Foodstufes - Method for determination of water-Soluble Synthetic organic Colouring matter Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính phẩm màu hữu cơ tổng hợp tan trong nước, có trong thực phẩm được nhuộm màu. 1. Lấy mẫu Theo quy định đối với từng loại sản phẩm cụ thể. 2. Chuẩn bị mẫu 2.1. Đồ nóng và đồ hộp rau quả (Đồ uống có cácbon dioxit, rượu mùi, rượu quả, xi rô, nước ép hoa qua, mứt hoa quả…). 2.1.1. Dụng cụ - Cốc thủy tinh - Ống đong chia độ - Phễu thủy tinh - Bếp cách thủy - Bông 2.1.2. Cách chuẩn bị: Pha loãng 5 - 10ml mẫu thử với 5 - 20 ml nước cất (khi cần thiết có thể lấy nhiều hơn). Lọc qua bông nếu cần, rửa bông bằng nước cất. Tập trung dịch lọc để chiết phẩm màu theo phương pháp nêu ở phần 3. Chú thích: khi chiết phẩm màu trong các đồ uống có cacbon dioxit hoặc có cồn, cần phải đuổi hết cacbon dioxit và cồn ra khỏi mẫu bằng đun cách thủy. 2.2. Kẹo 2.2.1. Dụng cụ, hóa chất: - Cốc thủy tinh - Ống đong chia độ - Bếp cách thủy - Cân kỹ thuật - Bông - Amoniac, dung dịch 1%. 2.2.2. Cách chuẩn bị Chọn kẹo riêng theo từng mẫu. Đối với kẹo không nhân hòa tan khoảng 5 - 10g kẹo bằng nước cất nóng cho đến khi tan hết. Đối với kẹo có nhân hòa tan như trên, nếu hòa tan không hết, thì lọc qua bông và chất còn lại được rửa bằng dung dịch amoniac 1% và hứng vào bình riêng, sau đó đuổi hết amoniac trên bếp cách thủy. Tập trung tất cả dịch lọc để chiết phẩm màu theo phương pháp nêu ở phần 3. 3.3. Sản phẩm chứa tinh bột (Các sản phẩm kẹo bột chứa ít chất béo, bánh ngọt, bột puding, mì sợi khô). 2.3.1. Dụng cụ, hóa chất - bát sứ - cối chày sứ - ống đong chia độ - phễu thủy tinh - bếp cách thủy - cối xay cà phê - cân kỹ thuật - bông - ete dầu hỏa có điểm sôi 40 - 70 0 C - amoniac, dung dịch 1%. 2.3.2. Cách chuẩn bị: Cân khoảng 5 - 10g mẫu được sấy khô tự nhiên trước vào bát sứ, nghiền với 10ml ete dầu hỏa, sau đó chắt loại bỏ lớp ete dầu hỏa. Phần còn lại tiếp tục đuổi hết ete dầu hỏa trên bếp cách thủy. Sau đó nghiền nhỏ mẫu đã thu được trong cối xay cà phê. Cân khoảng 5 - 10g mẫu đã nghiền, dùng 30 - 50ml dung dịch amoniac 1% hòa dần từng ít một vào mẫu. Lọc qua bông. Đun cách thủy để loại amoniac. Dung dịch này dùng để chiết phẩm màu theo phương pháp nêu ở phần 3. 2.4. Sản phẩm chứa đường và nhiều chất béo (Gatô có kem, bánh hạnh nhân….). Phương pháp dùng dung môi. 2.4.1. Thiết bị, dụng cụ hóa chất - Cối chày sứ - Ống đong chia độ - Bếp cách thủy - Cân kỹ thuật - Bộ chiết soóc - Lét - Bông - Ete dầu hỏa có điểm sôi 40 - 70 0 C - Cát trắng tinh chế - Amoniac, dung dịch 1%. 2.4.2. Cách chuẩn bị Nghiền khoảng 10g mẫu với cát tinh chế. Sấy khô ở 60 0 C. Dùng ete dầu hỏa loại hóa chất béo bằng máy Sooc let. Chuyền phần còn lại ra cốc tiếp tục đuổi hết ete dầu hỏa trên bếp cách thủy. Sau đó hòa vào khoảng 20 - 30 ml dung dịch amoniac 1%, đun nhẹ trên bếp cách thủy để chiết phần màu, rồi lọc qua bông. Đun cách thủy để loại hết amoniac hoặc axit hóa dịch lọc. Dung dịch này dùng để chiết phẩm màu theo phương pháp nêu ở phần 3. 2.5. Sản phẩm chứa protit Thịt và sản phẩm chế biến từ thịt (giờ, lạp xưởng…). Phương pháp dùng dung môi. 2.5.1. Dụng cụ, hóa chất - cối chày sứ - ống đong chia độ - phễu thủy tinh - bộ chiết soóc - Lét. - cân kỹ thuật - bông thủy tinh - Pepsin bột hoặc dung dịch đậm đặc. - ete dầu hỏa có điểm sôi 40 - 70 0 C - axit clohydric, dung dịch 0,05N. 2.5.2. Cách chuẩn bị Trước khi tách phẩm màu khỏi protit của thịt, cần phải loại chất béo bằng cách sau: mẫu được nghiền nhỏ đều. Dùng ete dầu hỏa loại chất béo bằng máy chiết Soóc - lét; hoặc đun mẫu với nước cho đến khi mỡ nóng chảy hết, sau đó làm lạnh đột ngột dung dịch, tách lớp mỡ đóng băng khỏi lớp nước. Axit hóa dung dịch đã được tách mỡ bằng axit clohydric, protit kết tủa kéo theo cả phẩm màu. Cho 1g pepsin đã hòa sẵn trong 10 - 20ml axit clohydric 0,05N vào chất kết tủa màu và để ở nhiệt độ 45 - 50 0 C trong 2 giờ. Sau đó lọc và rửa bằng nước cất nóng. Nếu chất còn lại trên phễu lọc vẫn còn màu thì phải cho pepsin lần thứ hai và tiến hành như trên. Gộp tất cả dịch lọc có màu lại để chiết phẩm màu theo phương pháp nêu ở phần 3. 3. Chiết phẩm màu 3.1. Phương pháp nhuộm len 3.1.1. Nguyên lý Trong môi trường axit yếu (p H = 6) phẩm màu hữu cơ tổng hợp có tính axit sẽ được hấp thụ vào sợi len lông cừu trắng đã khử chất béo, sau đó chiết phẩm màu từ sợi len bằng dung dịch amoniac. 3.1.2. Phương tiện - hóa chất - Sợi len lông cừu trắng đã được khử chất béo - Axit axetic, dung dịch 10%. - Amoniac, dung dịch 5%. 3.1.3. Cách tiến hành Dung dịch mẫu thử đã được chuẩn bị theo phần 2 được pha loãng hai lần bằng dung dịch axit axetic 20% phẩm màu từ dung dịch này bằng sợi len lông cừu trắng đã khử chất béo bằng cách đun cách thủy. Lấy sợi len ra và rửa bằng nước cất nóng. Sau đó tách phẩm màu từ sợi len bằng dung dịch amoniac 5% trên bếp cách thủy. Tiếp tục tách cho tới khi dung dịch amoniac mới không còn màu nữa. Tập trung tất cả dung dịch amoniac có màu trong một bát sứ, làm bay hơi đến khô, chất cặn được hòa tan với nước cất nóng và lặp lại phương pháp nhuộm len. Nếu sau khi lặp lại phương pháp nhuộm len hai lần mà dung dịch amoniac đã được chiết vẫn có màu, thì chứng tỏ sự có mặt của phẩm màu tổng hợp. Dung dịch này dùng để định tính phẩm màu. 3.2. Phương pháp chiết bằng dung môi 3.2.1. Nguyên lý Chiết phẩm màu hữu cơ tổng hợp có tính axit bằng iso - butanol ở môi trường axit. Sau đó chiết lại phẩm màu đó bằng dung dịch kiềm nhẹ. Đối với phẩm màu erythrosin dùng ete-etylic làm dung môi. 3.2.2. Chiết bằng iso-butanol 3.2.2.1. Dụng cụ - hóa chất - Phễu chiết: 250ml - Iso - butanol - Axit sunfuric, dung dịch 25% - Amoniac, dung dịch 1%. 3.2.2.2. Cách tiến hành Axit hóa mẫu thử đã được chuẩn bị trước, theo phần 2 bằng dunng dịch axit sunfuric 25% theo tỷ lệ 1/10. Chiết suất phẩm màu bằng iso-butanol 2 - 3 lần mỗi lần 15 ml. Lắc kỹ đến khi iso-butanol không còn màu, tập trung dịch chiết iso-butanol. Sau đó dùng dung dịch amoniac 1% chiết phẩm màu, mỗi lần 5ml. Lắc kỹ đến khi dung dịch amoniac không còn màu. Tập trung dung dịch màu amoniac lại, đuổi hết amoniac bằng cách đun cách thủy. Cô đặc đến thể tích cần thiết. Dung dịch này dùng để định tính phẩm màu. 3.2.3. Chiết Erythrosin bằng ete-etylic 3.2.3.1. Dụng cụ - hóa chất - Phễu chiết 500ml - Ete-etylic - Axit sunfuric, dung dịch 25%. 3.2.3.2. Cách tiến hành Từ dung dịch mẫu thử đã được axit hóa bằng axit sunfuric như trên. Chiết suất Erythrosin bằng ete-etylic hai lần, mỗi lần 10ml. Tập trung dịch chiết ete-etylic lại, lắc với nước máy. Phẩm màu sẽ tạo thành muối với các ion kiềm và kiềm thô trong nước máy và tan được trong nước. Lắc 3 lần với nước máy. Tập trung các dung dịch màu chiết bằng nước máy lại. Cô cách thủy đến thể tích cần thiết (khoảng 1 ml). Dung dịch này dùng để định tính phẩm màu. 4. Định tính phẩm màu bằng phương pháp sắc ký giấy. 4.1. Nguyên lý Từ dung dịch phẩm màu chiết suất được từ mẫu thử theo phần 3. Dùng phương pháp sắc ký giầy tách các phẩm màu và so sánh với các sản phẩm màu chuẩn đã biết, thì ta có thể định tính được chúng. 4.2. Dụng cụ - Hóa chất 4.2.1. Dụng cụ (ngoài các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm). - Micrôpipet chia đến M1 hoặc ống mao quản - Bình chạy sắc ký - Giấy sắc ký (ví dụ loại whatan 1 hoặc Schleichersohull 2043/b hoặc FN 4 , FN 6 ). 4.2.2. Hóa chất - Các dung dịch phẩm màu chuẩn để so sánh (đã biết hàm lượng màu). - Các hệ dung môi chạy sắc ký: tùy theo từng loại phẩm màu chọn hệ dung môi phù hợp (Xem phụ lục 1). + Hệ dung môi 1: trinatri xitrat-amoniac-nước (2:5:93) + Hệ dung môi 2: etanol-amoniac-nước (12;5;2,5;85) + Hệ dung môi 3: n.butanol-etanol-nước (2; 1; 1) + Hệ dung môi 4: phenol-etanol-nước (8; 5; 8) + Hệ dung môi 5: phenol-nước-amoniac (8; 2; 1) + Hệ dung môi 6: piridin-ibutanol-nước (4; 6; 3) + Hệ dung môi 7: etyl axetat-piridin-nước (50; 25; 20) 4.3. Tiến hành thử 4.3.1. Chuẩn bị giấy sắc ký Cần phải chọn kích thước của giấy sắc ký sao cho đường kính (sau khi cuộn thành hình trụ) nhỏ hơn từ 2 - 3cm so với đường kính của bình chứa dung môi chạy sắc ký, chiều cao của cuộn giấy thấp hơn chiều cao của bình ít nhất là 5cm, nhưng không thấp hơn 35cm. Phía cuối của giấy sắc ký, cách mép giấy khoảng 3cm, kẻ 1 đường thẳng bút chì, chia đường thẳng đó thành những đoạn bằng nhau, cách nhau 2 - 3cm, hai đầu cách mép giấy 2 - 3cm. 4.3.2. Chuẩn bị bình sắc ký Bình thủy tinh có nắp đậy kín được, kích thước của bình phụ thuộc vào kích thước của giấy. Nếu các chất giá trị Rf gần bằng nhau thì cần giấy dài hơn nên bình phải cao. Chiều cao của bình thường là 40 - 50cm, còn chiều ngang của bình thường là 20cm để có thể làm nhiều mẫu cùng một lúc. Đổ dung môi vào bình sắc ký một lớp dày 15mm, sau đó đậy nắp bình. Sau 2 giờ tạo được trạng thái bão hòa hơi dung môi trong bình. 4.3.3. Chấm chất thử lên giấy Chấm trên cùng đường thẳng đã chia ở trên 2 chấm dung dịch cần thử, xen vào giữa là những chấm dung dịch phẩm màu chuẩn. Lượng dung dịch hút để chấm lên giấy sao cho xuất hiện những vết có đường kính 2 - 4 mm. Chú ý chấm những chấm nhỏ để khô, rồi mới chấm tiếp giọt sau để đảm bảo vết chấm cuối cùng có đường kính nhỏ nhưng chứa được đủ thể tích yêu cầu và chú ý lượng dung dịch mẫu thử và lượng dung dịch phẩm màu chuẩn phải gần tương đương nhau. Sau khi các vết chấm đã khô, cố định giấy sắc ký (cuộn lại thành hình trụ) sao cho 2 mép giấy còn cách nhau một khoảng là 1cm. Trường hợp các vết chấm trên giấy chưa khô hoàn toàn, thì có thể dùng máy sấy tóc hoặc để ra ngoài không khí 1 giờ để độ ẩm ở các điểm trên giấy trở lên như nhau. 4.3.4. Cho chạy dung môi và phát hiện vết Đặt cuộn giấy vào bình sắc ký đã chuẩn bị trước chú ý đừng để chạm vào thành bình. Trong thời gian này dung môi lan truyền từ từ trên giấy. Việc chạy sắc ký hoàn toàn khi đường mức của dung môi đã truyền gần tới đầu phía đối lập của tờ giấy khoảng 25cm. Thời gian cần thiết khoảng từ 1 - 12 giờ phụ thuộc vào từng loại phẩm màu và từng loại hệ dung môi. Kết thúc quá trình sắc ký lấy cuộn giấy ra. Vạch vị trí của đường mức dung môi và làm khô trong tủ hốt. Sau khi giấy khô có thể đọc kết quả bằng mắt hoặc soi ở ánh sáng đèn tử ngoại. Để tính giá trị Rf của các phẩm màu đã được phân chia, đánh dấu vị trí trung bình của các vết và đường mức của dung môi, rồi đo khoảng cách từ đó tới đường xuất phát. Nếu ký hiệu a bằng khoảng cách từ đường xuất phát tới tâm của vết chấm đã được phân chia b bằng khoảng cách từ đường xuất phát tới mức của dung môi thì giá trị của Rf được tính theo công thức sau: 4.4. Đánh giá kết quả sắc ký đồ Giá trị tuyệt đối của Rf rất khó xác định vì phải làm trong những điều kiện thật giống nhau. Tuy vậy có thể định tính bằng cách làm sắc ký so sánh với một chất phẩm màu chuẩn. Sau khi chạy sắc ký ta so sánh vị trí của các vết (mẫu thử và phẩm màu chuẩn). Nếu ta thu được: - Màu của các vết giống nhau - Giá trị Rf gần giống nhau Sau khi làm sắc ký ít nhất với hai hệ dung môi thì có kết luận là hai chất như nhau. PHỤ LỤC CÁC HỆ DUNG MÔI Phẩm màu và hỗn hợp phẩm màu để so sánh Nồng độ Phẩm màu Phù hợp Có thể được Hệ dung môi - Phẩm vàng: Tartrazine CI.19140 0,2 1,2,3,6 - Phẩm vàng axit: Fast yellow AB CI.13015 0,3 1,2,3,6 - Phẩm đỏ: Fonceou 4R CI.16255 0,2 1,2,3 6 - Phẩm đỏ: Amoranth CI.16185 0,2 1 2,6 - Phẩm đỏ: Eritrosine CI.45430 0,1 3,4 6 - Phẩm xanh: Indigocarmine CI.73015 0,1 3,5,7,6 - Phẩm đen: Brillant black CI.28440 0,2 3,6 - Tartrazine ponceau 4R 0,4 1 2,3,6 - Tartrazine Indigocarmine 0,4 5 3,4,6 - Tartrazine + ponceau 4 + Brillant black 0,6 1,2,3,6 - Tartrazine + Amaranth + Indigocarmine 0,6 3,4,6 - Tartrazine + Amaranth + Brillant black 0,6 1,2,6 - Phẩm vàng mặt trời: sunset yellow FCH CI.15985 0,2 1,2,3,6