TCVN8400-36:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-36:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do circovirus typ 2 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-36:2015 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 36: HỘI CHỨNG SUY MÒN Ở LỢN SAU CAI SỮA DO CIRCOVIRUS TYP 2 A ni mal diseases - Diagnostic procedure - Part 36: W asting syndrome piglet weaning by circo type 2 virus Lời nói đầu TCVN 8400-36:2015 do Trung tâm Ch ẩ n đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm 38 phần: - TCVN 8400-1 : 2010, phần 1: Bệnh l ở mồm long móng; - TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn; - TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn; - TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn; - TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng; - TCVN 8400-6 : 2011 , ph ầ n 6: Bệnh xuất huyết thỏ; - TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê; - TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm; - TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I; - TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò; - TCVN 8400-11 : 2011, phần 11: Bệnh dịch t ả vịt; - TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà; - TCVN 8400-13 : 2011, phần 13: Bệnh sẩy thai truyền nhiễm do Brucela; - TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở tr â u bò; - TCVN 8400-15 : 2011, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira; - TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli; - TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà; - TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza); - TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thư ơ ng hàn lợn; - TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn; - TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS); - TCVN 8400-22 : 2014 , phần 22: Bệnh gi ả dại ở l ợ n; - TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán; - TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm; - TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn; - TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1; - TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh s á n lá gan; - TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại t ử do Clostridium per f r i ngens; - TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà; - TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà; - TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm; - TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm; - TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu b ò ; - TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò; - TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh theileria ở trâu bò; - TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2; - TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn; - TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus. BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 36: HỘI CHỨNG SUY MÒN Ở LỢN SAU CAI SỮA DO CIRCOVIRUS TYP 2 A ni mal diseases - Diagnostic procedure - Part 36: W asting syndrome piglet weaning by Circo type 2 virus CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết t ấ t c ả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích h ợ p và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi s ử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy đ ị nh quy trình ch ẩ n đoán hội chứng suy mòn, còi cọc ở lợn sau cai sữa do circovirus typ 2 gây ra. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: Hội chứng suy mòn ở lợn con sau cai sữa do circovirus typ 2 (Wasting syndrome piglet weaning by Circo type 2 virus) Hội chứng gây ra bởi virus Circo type 2 (PCV 2), là virus thuộc giống Circovirus h ọ Circovi rid ae được phân loại là ADN virus. CHÚ TH Í CH: Hội chứng này còn được gọi là hội ch ứ ng còi cọc, giảm cân, chậm lớn , giảm sức đề kháng ở lợn con sau cai sữa . 3. Thuốc thử và vật liệu thử Ch ỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết để phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 3.1 . Nguyên liệu cho l ấ y mẫu và xử lý mẫu. 3.1.1 . Etanol, từ 70% (thể tích) đến etanol tuyệt đối. 3.1.2 . Dung dịch mu ố i đệm phosphat (PBS), pH 7,2 ± 0,2 (xem A.2). 3.1.3 . Dung dịch kháng khuẩn, bao gồm các loại penicillin, kanamycin, streptomycin. 3.2 . Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho Realtime PCR 3.2.1 . Kit tách chiết AND, (Cat No. 69506) 3.2.2 . K i t nhân gen (Cat. 11730-017) 3.2.3 . Mồi xuôi, môi ngược và m ẫ u dò. 3.2.5 . Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic). 3.2.5 . Nước tinh khiết, không có nuclease. 3.3 . Nguyên liệu và vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA (phép thử miễn dịch liên kết enzym) Hiện nay các kit ELISA thương mại c ó sẵn trên thị trường dùng để phát hiện kháng thể PCV 2 khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau: 4.1 . Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp realtime RT-PCR 4.1.1 Máy nghi ề n m ẫ u hoặc cối chày sứ. 4.1.2 T ủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C. 4.1.3 . T ủ lạnh, c ó thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C. 4.1.4 . Máy nhân gen (realtime-PCR). 4.1.5 . Máy ly tâm, có thể đạt gia tốc ly tâm 900 g; 6 000 g và 20 000 g. 4.1.6 . Máy lắc. 4.1.7 . Máy spindo w n. 4.2 . Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA 4.2.1 . Máy đọc ELISA, có thể đọc đĩa ở bước sóng 630 nm. 4.2.2 . Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu, có thể duy tr ì nhiệt độ ở 37 °C. 5. Chẩn đoán lâm sàng 5.1 . Đặc điểm dịch tễ - Hội chứng suy mòn ở lợn con sau cai sữa do PCV 2 xảy ra trên lợn thường vào khoảng 4 đến 15 tuần tuổi (phổ biến từ 6 đến 12 tuần tuổi). - Tỷ lệ mắc bệnh tùy theo trại và theo loại lợn, biến động từ 1 % đến 60 % với t ỷ lệ chết từ 50% đến 100%. - Bệnh lây truyền qua đường hô hấp, tiêu hóa con vật h í t phải không khí, ăn phải thức ăn, nước u ố ng có nhiễm mầm bệnh PCV 2 hoặc lợn mẹ truyền bệnh cho con qua nhau thai và qua bú sữa mẹ. 5.2 . Triệu chứng tâm sàng - Hội chứng suy mòn ở lợn con sau cai sữa do PCV 2 có triệu chứng đặc trưng l à còi cọc , da nhợt nhạt, th ở khó, đôi khi bị tiêu chảy (phân sẫm màu) và có chứng hoàng đả n (triệu chứng điển hình của bệnh); - Giai đoạn đầu bệnh các hạch lâm ba dưới da đều bị sưng to. - Lợn sau cai sữa có hiện tượng còi cọc nên được gọi là: “Hội chứng 30 kg ” . 5.3 . Triệu chứng bệnh tích - Các hạch lâm ba sưng to trong giai đoạn đầu của bệnh. Bệnh tiến triển, hạch lâm ba trở lại kích thước bình thường và thậm chí b ị teo nh ỏ , tuyến ức bị teo. - Phổi sưng dai chắc như cao su. Gan bị sưng to hoặc teo nhỏ, nhạt màu, cứng, bề mặt có các hạt nhỏ. Thận có nốt hoại tử màu trắng. 6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 6.1 . Phương pháp Realtime PCR 6.1.1 . L ấ y mẫu - M ẫ u bệnh phẩm xét nghiệm vi rút: lấy 5 g đến 10 g hạch lâm ba (hạch bẹn nông, amidan) của lợn nghi mắc bệnh cho v à o ống 15 ml hoặc lấy 1 ml đến 2 ml máu của lợn đang sốt nghi mắc bệnh vào x y lanh 5 m l . - Mẫu bệnh phẩm xét nghiệm kháng thể: lấy 0,2 ml huyết thanh của lợn nghi mắc bệnh cho vào ống 1,5 ml. 6.1.2 . Bảo quản mẫu Mẫu bệnh phẩm phải bao gói, b ả o quản trong tủ lạnh có nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C, vận chuyển đến phòng thí nghiệm không quá 24 h. LƯU Ý : + Không lấy mẫu máu của lợn đã tiêm phòng vắc xin PCV 2 để xét nghiệm kháng thể cho mục đích chẩn đoán bệnh. + Tất cả các mẫu phải được dán nhãn và kèm theo các thông tin dịch tễ, triệu chứng lâm s à ng và bệnh tích (nếu mổ khám). + Trong trường hợp không tiến hành xét nghiệm mẫu ngay thì mẫu xét nghiệm kháng nguyên phải được b ả o qu ả n trong tủ âm 80 °C (4.1.2) và mẫu xét nghiệm kháng thể phải được bảo quản ở tủ âm 20 °C (4.1.2). 6.1.3 . Chuẩn bị mẫu Mẫu bệnh phẩm là phủ tạng (hạch, lách, phổi...): lấy từ 1 g đến 2 g, cắt nhỏ r ồ i nghiền trong cối chày sứ (4.1.1) vô trùng với dung dịch PBS (3.1.2) để thu được huyễn dịch 1 : 10 (1 g phủ tạng + 900 ml dung dịch PBS). Cho huyễn dịch vào ống ly tâm, ly tâm (4.1.5) ở gia tốc 900 g trong 10 min, rồi thu lấy d ịch nổi để xét nghiệm virus bằng phương pháp realt i me PCR. Bệnh ph ẩ m là máu lợn đang sốt: ly tâm chắt lấy huyết thanh đ ể xét nghiệm virus bằng phương pháp realtime PCR. 6.1.4 . Cách tiến hành 6.1.4.1 . Tách chiết ADN Sử dụng bộ kit thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. V í dụ: sử dụng quy tr ì nh tách chiết ADN (3.2.1) bằng protein K và kít tách chiết bằng cột lọc của kit Invitrogen (Cat No. 69506) (xem Phụ lục B). 1) 6.1.4.2 . Chu ẩ n bị m ồi Phản ứng khuếch đ ại được thực hiện trong máy nhân g en (4.1.4 ) theo phươn g pháp realt i me PCR khuếch đại đoạn g en đặc hiệu của PCV 2 sử dụng cặp mồi xuôi và mồi n gư ợc (3.2.3). Trình tự cặp m ồ i được nêu tron g B ản g 1. B ả ng 1 - Cặp mồi Mồi (primers) Trình tự (5’-3’) Mồi xuôi (forward primer) TGGCCCGCAGTATTCTGATT Mồi ngược (reverse primer) CAGCTGGGACAGCAGTTGAG Mẫu d ò (probe) FAM-CCAGCAATCAGACCCCGTTGGAATG-BHQ1 Chuẩn bị mồi như sau: - Chuẩn bị mồi gốc: mồi gốc và mẫu dò gốc ở trạng thái đ ô ng khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindo w n (4.1.7) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xu ố ng đáy ống trước khi m ở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên dùng dung dịch đệm TE (3.2.4) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 m M làm mồi gốc v à mẫu dò g ố c. - Chuẩn bị mồi sử dụng: mồi sử dụng ở nồng độ 20 m M (20 m l mồi gốc được pha với 80 m l nước (3.2.5)). M ẫ u dò được sử dụng ở nồng độ 6 m M (6 m l mẫu dò gốc được pha với 94 m l nước (3.2.5)). Trộn cùng 1 th ể t í ch mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò sau khi pha th à nh hỗn hợp để tiện khi s ử d ụng. 6.1.4.3 . Tiến hành phản ứng PCR Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (6.1.4.2). Đối với kít Invitrogen (Cat. 11730-017) (3.2.2) thành phần của m ộ t phản ứng được trình bày ở B ả ng 2. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ố ng 0,2 ml, có đầy đ ủ đối chứng âm và đối chứng dương. Bảng 2 - Thành ph ầ n phản ứng realtime PCR Thành ph ầ n Thể tích Nước tinh khiết không có nuclease 6,0 Platinum SuperMix UDG 12,5 Mồi xuôi 0,5 Mồi ngược 0,5 Probe 0,5 Tổn g thể tích 20 Th à nh phần cho một phản ứng realtime PCR (theo hướng dẫn của kít t hương mại được sử dụng). Đối chứng dương: L à mẫu ADN được tách chiết từ mẫu PCV 2 chuẩn. Đối chứng âm : sử dụng nước tinh khiết không có nuclease (3,2,5). Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp nguyên liệu: - Cho 20 m l hỗn hợp nguyên liệu vào ống PCR 0,2 ml. - Cho 5 m l mẫu ARN vào ống PCR. - Đặt ống PCR vào máy realtime PCR (4.1.4). LƯU Ý: Ph ả n ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu nghi ngờ, mẫu đ ố i chứng dương và mẫu đối chứng âm. - Chu t rì nh nhiệt chạy phản ứng được cài đặt theo hướng d ẫ n của nhà s ả n xuất kit sử dụng cho phản ứng. Đối với kit Invitrogen Platinum qPCR SuperMix-UDG (Cat.11730-017) (3.2.2), chu kỳ nhiệt được nêu trong Bảng 3. Bảng 3 - Chu tr ì nh nhiệt của phản ứng rea l time PCR Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 50 °C 2 min 1 vòng 95 °C 2 min 95 °C 10 s 40 vòng 60 °C 40 s CHÚ THÍCH: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng. 6.1.4.4 . Đọc kết quả Phản ứng được công nhận: mẫu đ ố i chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị C t £ 35 (± 2 C t ), mẫu đối chứng âm không có C t . Với điều kiện ph ả n ứng trên: 1) M ẫ u c ó giá trị C t £ 35 được coi là dương tính, 2) Mẫ u không c ó giá trị C t là âm tính. 3) M ẫu có giá trị C t £ 40 và > 35 được coi là nghi ngờ. Những mẫu nghi ngờ này cần được xét nghiệm lại lần 2 để khẳng định và kết luận cuối cùng. 6.2 . Phương pháp ELISA 6.2.1 . Lấy mẫu S ủ dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 22 G vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu ở vịnh tĩnh mạch c ổ lợn nghi mắc bệnh PCV 2. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để t ạ o khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp. 6.2.2 . Bảo qu ả n mẫu Mẫu được bảo quản theo mục 6.1.2. 6.2.3 . Chu ẩ n bị mẫu Tất c ả các mẫu máu được chắt huyết thanh từ xylanh (6.2.1) sang ống nghiệm vô trùng. Thời gian kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh. 6.2.4 . Cách tiến hành Hiện nay, có nhiều bộ kít ELISA (3.4.1) phát hiện kháng thể PCV 2 bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. [2] CHÚ THÍCH: Phương pháp n à y nhanh và dễ thực hiện. Tuy nhiên, không phân biệt được kháng thể d o ti êm ph ò ng vắc xin PCV 2 hay kháng thể do nhiễm thực địa. Ví dụ: sử dụng phương pháp ELISA phát hiện kháng thể PCV 2 theo quy trình của kít GreenSpring® Ab Test thì bước tiến hành được thực hiện như sau: a) Chuẩn bị - Nguyên liệu trong bộ kít (3.4.1) để ở nhiệt độ phòng 30 min trước khi l à m phản ứng. - Pha loãng dung dịch rửa 1X: 10 ml dung dịch nước rửa đặc 10X với 90 ml nước cất khử ion (3.4.2). - Pha loãn g mẫu với tỷ lệ 1/40: 10 m l mẫu kiểm tra với 390 m l dun g dịch pha loãn g mẫu trong ố ng pha loãng. Sau đó 100 m l dung dịch mẫu ki ể m tra đã pha loãng sang đĩa ELISA với bố trí mẫu tương ứng. b) Tiến hành phản ứng ELISA Bố trí s ơ đồ đĩa ELISA phản ứng (tham khảo Phụ l ục C). 1. Nh ỏ 100 m l đối chứn g âm chuẩn v à o g iến g A1 và A2; 2. Nhỏ 100 m l đối c h ứng d ương chuẩn vào giếng B1 và B2; 3. Để trống 2 giếng C1 và C2 (Blank control well); 4. Nhỏ 100 m l huyết thanh cần kiểm tra được pha loãng vào giếng D1 và D2, E1 và E2 nhỏ lần lượt cho đến hết các mẫu cần kiểm tra (mỗi mẫu làm 2 giếng); 5. Lắc đĩa nhẹ nh à ng, ủ đĩa ở 37 °C (4.2.2) trong 30 min; 6. Rửa đĩa từ 3 lần đến 5 lần với lượng 300 m l cho mỗi giếng bằng nước rửa đã pha loãng; 7. Nhỏ 100 m l chất gắn kết (co nj ugate) vào tất cả các giếng; 8. Đậy nắp đ ĩa và ủ ở 37 °C (4.2.2) trong 30 min; 9. Lặp lại bước 5; 10. Nhỏ 1 giọt (khoảng 50 m l ) cơ ch ấ t A và 1 giọt (kho ả ng 50 m l) cơ chất B vào tất cả các giếng; 11. Lắc nhẹ đĩa, đậy nắp và ủ đĩa ở 25 °C trong 10 min để tránh ánh sáng; 12. Nh ỏ 50 m l dung d ịch dừng phản ứng vào tất cả các giếng; 13. Đưa vào máy đọc ELISA (4.2.1) để đo mật độ quang học (OD) ở bước sóng 650 nm. CH Ú T HÍCH : Kết quả được đọc trong khoảng 10 min sau khi nhỏ dung dịch dừng phản ứng. 6.2.5 . Đọc kết quả + mật độ quang học (OD) của đối chứng âm £ 0,2 + OD của đối chứng dương - OD của đối chứng âm ³ 0,2 - Đánh giá kết quả: S/P = (OD của m ẫ u - OD của đối chứng âm) (OD của đối chứng dương - OD của đối chứng âm) + Mẫu dươn g tính: S/P ³ 0,4 + M ẫ u âm tính: S/P < 0,4 Trong đó OD TB650 l à mật độ quang học trung bình đo ở bư ớ c sóng 650 nm. CHÚ THÍCH : Đ ối với n hững mẫu nghi ngờ phải làm l ại để khẳng đ ị nh, nếu vẫn ng h i ng ờ thì dựa v à o dịch tễ học đ ể kế t luận bệnh. 7. Kết luận Lợn được cho là dương tính v ớ i hội chứng suy mòn ở lợn con sau cai sữa do virus circo type 2 khi có các đặc điểm về triệu ch ứ ng, bệnh tích điển h ì nh và c ó kết quả xét nghiệm dương tính với PCV 2 hoặc dương tính kháng thể PCV 2 bằng các phương pháp trong tiêu chuẩn này. Phụ lục A (Quy định) Thành phần và chuẩn bị dung dịch thử A.1 . Dung dịch kháng khuẩn A.1.1 . Thành phần Penicillin Mycostatin Streptomycin Kanamycin Nước cất 1 000 000 UI 250 000 UI 200 mg 1 000 000 UI 10 ml A.1.2 . Chuẩn b ị Hòa tan kháng sinh bằng nước cất rồi lọc bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 m m. B ảo quản ở âm 20 °C (4.1.2). A.2 . Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,2 A.2.1 . Thành phần Natri c l orua (NaC l ) Kali clorua (KC l ) Dinatri hidrophosphat (Na 2 HP O 4 ) Kali dihidrophosphat (KH 2 P O 4 ) Nước cất 8 g 0,2 g 1,15 g 0,2 g 1 000 ml A.2.2 . Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước, chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1 N hoặc d ung dịch axi t c l ohydric (HC l ) 1 N. Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp, c h ia nh ỏ v à bảo quản ở 4 o C (4.1.3). Phụ lục B (Tham khảo) Quy trình tách chiết ADN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, kh ẩ u trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này. Tách chiết ADN theo quy trình của kít Invitrogen (Cat No. 69506): thực hiện như sau: - Nh ỏ 200 m l huyễn dịch bệnh phẩm (6.1.3) vào ố ng 1,5 ml cùng với 200 m I Lysis buffer c ó 25 m l proteinase K, lắc đều trên máy lắc trộn Vortex (4.1.6) trong 15 s rồi ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.5) ở 8 000 g trong 1 min; - Ủ hỗn hợp này ở 56 °C trong 15 min; - Ly tâm (4.1.5) ở 8 000 g trong 1 min, thêm 250 m l etanol tuyệt đối vào ố ng, lắc mạnh bằng máy lắc trộn Vortex trong 15s rồi ủ 5 min; - Ly tâm (4.1.5) ở 10 000 g trong 1 min; - Chuyển toàn bộ hỗn hợp (675 m l) sang cột lọc có ống thu; - Ly tâm (4.1.5) ở 8 000 g trong 1 min. Thay cột thu mới; - Cho 500 m l nước rửa ( w ashing buffer) vào cột lọc. Ủ 1 min, ly tâm bằng (4.1.5) 8 000 g trong 1 min. Đ ổ b ỏ nước trong ống thu đ i ; - Cho 500 m l nước rửa ( w ashing buffer) vào cột lọc. Ly tâm bằng (4.1.5) 13 000 g trong 1 min; - Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở tốc độ tối đa, bỏ ống thu; - Đặt cột lọc vào ốn g thu ADN , nh ỏ 50 m l nước khôn g ch ứ a men DNase vào cột lọc , ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 min. Tách ADN bằng cách ly tâm (4.1.5) ở 13 000 g trong 1 min, bỏ cột lọc, giữ lại dịch trong ống thu AND; Bảo quản mẫu ADN thu được ở 4 °C (4.1.3) trong thời gian ngắn trước khi tiến hành chạy realtime PCR. Nếu thực hiện sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở nhiệt độ không lớn hơn âm 20 °C (4.1.2). Phụ lục C (Tham khảo) Sơ đồ bố trí mẫu trong đĩa ELISA xét nghiệm kháng thể PCV 2 Bảng C.1 - Sơ đồ đĩa ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A NC (-) NC(-) S6 S6 S14 S14 S22 S22 S30 S30 S38 S38 B PC (+) PC (+) S7 S7 S15 S15 S23 S23 S31 S31 S39 S39 C Blank Blank S8 S8 S16 S16 S24 S24 S32 S32 S40 S40 D S1 S1 S9 S9 S17 S17 S25 S25 S33 S33 S41 S41 E S2 S2 S10 S10 S18 S18 S26 S26 S34 S34 S42 S42 F S3 S3 S11 S11 S19 S19 S27 S27 S35 S35 S43 S43 G S4 S4 S12 S12 S20 S20 S28 S28 S36 S36 S44 S44 H S5 S5 S13 S13 S21 S21 S29 S29 S37 S37 S45 S45 CHÚ THÍCH: PC (positive control): đối chứng dương NC (negative control): đ ố i chứng âm S1 đến S45 (sample): mẫu xét nghiệm Blank: ô để trống (không nh ỏ mẫu huyết thanh ki ể m tra) THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Chang et al (2010), Fast d iagnosis and Quanti f ication of Porcine Circovirus type 2 (PCV-2) using Realtime polymerase Chain reaction, J Microbiol Immunol Intect 2010; 43(2):85-92 [2] C. C h ae (2004) Post w eaning mu l tisystemic wasting syndrome: a review of aetiology, diagnosis and pathology, The Veterinary Jounal 168 (2004) 41-49 [3] T. Opriessnig et al (2007), Porcine Circovirus type 2 - associated disease: Update on current te rmi nology, clinacal manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies, J Vet Diagn Invest 19:591-615 (2007) 1) S ả n ph ẩ m do hãng Invi t roge n cung c ấ p. T hông tin n à y đưa ra tạo điều k iện thuận tiện cho người sử dụng tiêu c huẩn v à không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.