TCVN10993:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10993:2015 (EN 15911:2010) về Thực phẩm - Xác định đồng thời chín chất tạo ngọt bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector tán xạ bay hơi TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10993: 2015 EN 15911:2010 THỰC PHẨM-XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI CHÍN CHẤT TẠO NGỘT BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO SỬ DỤNG DETECTOR TÁN XẠ BAY HƠI Foodstuffs-Simultaneous determination o f nine s w eeteners by high pe rf ormance liquid chromatography and evaporative light scattering detection Lời nói đầu TCVN 10993:2015 hoàn toàn tương đương với EN 15911:2010; TCVN 10993:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công b ố . THỰC PHẨM-XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI CHÍN CHẤT TẠO NGỌT BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO SỬ DỤNG DETECTOR TÁN XẠ BAY HƠI Foodstuffs-Simultaneous determination o f nine s w eeteners by high pe rf ormance liquid chromatography and evaporative light scattering detection 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định đồng thời chín chất tạo ngọt trong đồ uống và nước trái cây đóng hộp hoặc đóng chai bằng sắc k ý l ỏ ng hiệu năng cao (HPLC) với detector tán xạ bay hơi (HPLC-ELSD). Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong nghiên cứu liên phòng phân tích các mẫu thêm chuẩn trên các nền mẫu sau đây: - acesulfame-K (ACS-K) (từ 38,3 mg/ l đến 383,5 mg/l) trong đồ uống và (từ 38,4 mg/kg đến 391,3 mg/kg) trong nước trái cây đóng hộp; - alitame (ALI) (từ 31,1 mg/l đến 114,5 mg/l) trong đồ uống và (từ 36 mg/kg đến 175,2 mg/kg) trong nước trái cây đóng hộp; - aspartame (ASP) (từ 38,1 mg/l đến 702 mg/l) trong đồ uống và (từ 37,2 mg/kg đến 1 120,2 mg/kg) trong nước trái cây đóng hộp; - axit cyclamic (CYC) (từ 28,3 mg/l đến 307,2 mg/l) trong đồ uống và (từ 27,5 mg/kg đến 1 100,6 mg/kg) trong nước trái cây đóng hộp; - dulcin (DUL) (từ 55,0 mg/l đến 115,1 mg/l) trong đồ uống và (từ 49,8 mg/kg đến 172,6 mg/kg) trong nước trái cây đóng hộp; - neotame (NEO) (từ 37,6 mg/l đến 115,3 mg/l) trong đồ uống và (từ 37,3 mg/kg đến 173,7 mg/kg) trong nước trái cây đóng hộp; - neohesperidine-dihydrochalcone (NHDC) (từ 31,4 mg/l đến 59,3 mg/l) trong đồ uống và (từ 35,3 mg/kg đến 59,3 mg/kg) trong nước trái cây đóng hộp; - saccharin (SAC) (từ 36,2 mg/l đến 87,6 mg/l) trong đồ uống và (từ 44,3 mg/kg đến 235,3 mg/kg) trong nước trái cây đ ó ng hộp; - sucralose (SCL) (từ 36,8 mg/l đến 346,8 mg/l) trong đồ u ố ng và (từ 35,3 mg/kg đến 462,4 mg/kg) trong nước trái cây đóng hộp. Thông tin chi tiết về đánh giá xác nhận xem Điều 8 và Phụ lục C . CHÚ THÍCH: Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận đầy đủ [1 ] qua phép thử cộng tác theo quy tr ì nh của IUPAC [ 2 ] , tr ê n các hỗn hợp nền mẫu phân tích cho tất c ả ch í n chất tạo ngọt có trong đồ uống v à nước trái cây đóng h ộ p hoặc đóng chai. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có). TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm-Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử . 3. Nguyên tắc Quy trình này bao gồm việc chiết chín chất tạo ngọt bằng dung dịch đệm, mẫu được làm sạch bằng cột chiết pha rắn sau đó phân tích bằng HPLC-ELSD. 4. Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước ít nhất là loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác. Khi chuẩn bị các dung dịch, cần tính đến độ tinh khiết của các chất. 4.1 . Acesulfame-K 1 phần khối lượng w ít nhất là 99,0 %. 4.2 . Alitame , w ≥ 99,0 %. 4.3 . Aspartame , w ≥ 99,0 %. 4.4 . Dulcin , loại dùng cho HPLC. 4.5 . Neotame , w ≥ 99,0 %. 4.6 . Neohesperidine-dihydrochalcone , w ≥ 95,0 %. 4.7 . Saccharin, muối natri dihydrat , w ≥ 98,0 %. 4.8 . Natri cyclamat , w ≥ 99,0 %. 4.9 . Sucralose , w ≥ 99,0 %. 4.10 . Axit formic , HCOOH loại dùng cho HPLC. 4.11 . Triethyla mine , (C 2 H 5 ) 3 N, w ≥ 99,5 %. 4.12 . Metanol , loại dùng cho HPLC. 4.13 . Axeton , loại dùng cho HPLC. 4.14 . Dung dịch đệm (pH = 4,5). Hòa tan 4 ml axit f ormic (4.10) trong 5 lít nước. Chỉnh đến pH 4,5 bằng khoảng 12,5 ml triethyla mine (4.11). 4.15 . Pha động HPLC A , metanol/dung dịch đệm/axeton, với tỷ lệ 69:24:7 (thể tích). Trộn 690 ml metanol (4.12) với 240 ml dung dịch đệm (4.14) và 70 ml axeton (4.13). Khử khí bằng siêu âm trong 10 min. 4.16 . Pha động HPLC B , metanol/ dung dịch đệm/axeton, với t ỷ lệ 11:82:7 (thể tích). Trộn 110 ml metanol (4.12) với 820 ml dung dịch đệm (4.14) và 70 ml axeton (4.13). Khử khí b ằ ng siêu âm trong 10 min. 4.17 . Dung dịch gốc hỗn hợp , chứa ACS-K, ALI, ASP, CYC-Na, DUL, NEO, NHDC, SAC-Na và SCL; có nồng độ khối lượng ρ (chất tạo ngọt i ) = 30 μ g/ml đến 250 μ g/ml. Chuẩn bị dung dịch gốc hỗn hợp của tất cả chín chất tạo ngọt bằng cách cân các lượng quy định của từng chất chuẩn riêng rẽ (B ả ng 1) đầu tiên cho vào cốc có m ỏ 100 ml và hòa tan chúng trong 50 ml hỗn hợp metanol/nước (1:1) cho đến khi tan hoàn toàn. Sau đ ó chuyển định lượng dung dịch sang b ì nh định mức 500 ml và thêm dung dịch đệm (4.14) đến vạch. Trộn kỹ bằng siêu â m cho đến khi tan hết. Bảng 1-Lượng chất chuẩn riêng rẽ dùng để chuẩn bị dung dịch gốc hỗn hợp Ch ấ t chu ẩ n Lượng chất chu ẩ n cho vào bình định mức 500 ml c mg Nồng độ cuối cùng c ủ a ch ấ t tạo ngọt thứ i trong ch ấ t chuẩn gốc hỗn hợp μ g/ml Acesulfame-K (ACS-K) 45 90 Alitame (ALI) 25 50 Aspartame (ASP) 125 250 Natri cyclamat (CYC-Na) 140 a - Axit cyclamic (CYC) (axit tự do) - 249,42 Dulcin (DUL) 25 50 Neotame (NEO) 25 50 Neohesperidine-dihydrochalcone (NHDC) 15 30 Saccharin, muối natri dihydrat (SAC- Na · 2H 2 O ) 35 b - Saccharin (SAC) (imit tự do) - 53,17 Sucralose (SCL) 50 100 a tương đương với 124,71 mg axit cyclamic tự do; hệ số chuy ể n đổi đ ể tính khối lượng axit cyclamic tự do = 0,890 8; m C YC = 0,890 8 x m C Y C -Na b tương đương với 26,58 mg saccharin tự do; hệ số chuyển đổi đ ể tính khối lượng saccharin tự do = 0,759 5; m S AC = 0,759 5 x m S AC-Na·2H2 O c lượng đầu tiên cho vào cốc có mỏ 100 ml, hòa tan trong 50 ml hỗn hợp metanol/nước (tỷ lệ 1:1) và chuyển định lượng sang bình định mức 500 ml. CHÚ THÍCH: Trong trường hợp đối với axit cyclamic và saccharin, sử dụng các muối natri của chúng, vì không sẵn có ở dạng tự do và ít tan. Nồng độ cuối cùng của các chất tạo ngọt riêng rẽ tính bằng microgam trên millilit trong dung dịch gốc hỗn hợp phải tính được bằng cách sử dụng các khối lượng thực tế chính xác. 4.18 . Dung dịch chuẩn Từ dung dịch gốc hỗn hợp (4.17), chuẩn bị các dãy dung dịch chuẩn của các chất tạo ngọt ở các mức giới hạn phù hợp, ví dụ: nồng độ cao nhất của dung dịch hiệu chuẩn phải ít nhất bằng 125 % giới hạn quy định hiện hành (theo Commission Directives [3], [4], [5] (xem Bảng D.1), có tính đến các bước pha loãng (xem Bảng 2). Đối với các chất tạo ngọt chưa có quy định hiện hành (ví dụ: ALI, DUL và NEO) th ì liều dùng tối đa giả định là xấp xỉ 200 mg/l hoặc 200 mg/kg. Người sử dụng tiêu chuẩn cần kiểm tra các giới hạn trong Bảng D.1 về hiệu lực của các giá trị giới hạn. Nếu không, nồng độ khối lượng của chất chuẩn trong dung dịch hiệu chuẩn phải được điều chỉnh phù hợp với mức liều dùng tối đa giả định. CHÚ TH Í CH: Quy trình này có thể đơn giản hóa bằng cách chu ẩ n bị một d ã y dung dịch hiệu chu ẩ n đ ố i với cả hai nền mẫu thực ph ẩ m. D ã y hiệu chuẩn quy định l à phù h ợ p với nước tr á i cây đóng hộp v ì mức liều dùng t ố i đa gi ả định đối v ớ i nước trái c â y đóng hộp trong một số trường hợp l à cao hơn đối với các loại đồ uống gi ả i khát khác. Trong trướng hợp ch ỉ ph â n t í ch nền mẫu nước trái c â y, th ì d ã y d ung dịch hiệu chuẩn có th ể phù hợp cho c ả mức liều dùng tối đa gi ả định của n ướ c gi ả i khát. Dùng pipet lấy các thể t í ch (xem B ả ng 2) dung dịch gốc hỗn hợp (4.17) cho vào c ác bình định mức thích hợp (10 ml đến 50 ml) và thêm dung dịch đệm (4.14) đến vạch và lắc kỹ. Bảng 2-Chuẩn b ị dãy dung dịch chuẩn Dung d ị ch hiệu chu ẩ n Dung tích b ì nh định mức, ml Th ể t í ch cần l ấ y từ dung dịch gốc hỗn hợp (4.17), ml Th ể tích cần lấy t ừ dung dịch đệm (4.14), ml 1 a 10 10 0 2 10 8 2 3 10 6 4 4 10 4 6 5 10 2 8 6 25 3 22 7 50 3 47 8 50 1,5 48,5 a l à dung dịch gốc hỗn hợp không pha lo ã ng (4.17). Bảng 3 nêu chi tiết nồng độ chất tạo ngọt thứ i trong mỗi chất chuẩn hiệu chuẩn được chuẩn bị theo B ả ng 2. Nếu không cần thiết phải phân tích tất c ả các chất tạo ngọt nêu trong tiêu chuẩn này, thì sử dụng bộ mẫu cụ thể để giảm các mức của dung dịch hiệu chuẩn đối với các mẫu đó. B ả ng 3-N ồ ng độ ch ấ t tạo ngọt thứ i tr ong từng dung dịch chuẩn Ch ấ t tạo ngọt Dung d ị ch hiệu chuẩn mg/ml 1 2 3 4 5 6 7 8 ACS-K 90,0 72,0 54,0 36,0 18,0 10,8 5,4 2 , 7 a A LI 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 6,0 3 , 0 a 1 , 5 a ASP 250,0 200,0 150,0 100,0 50,0 30,0 15,0 7,5 CYC 249,4 199,5 149,7 99,8 49,9 29,9 15,0 7,5 DU L 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 6,0 a 3 , 0 a 1 , 5 a NEO 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 6,0 3,0 a 1,5 a NHDC 30,0 24,0 18,0 12,0 6,0 3,6 a 1,8 a 0,9 a SAC 53,2 42,5 31,9 21,3 10,6 6,4 3,2 a 1 , 6 a SC L 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 12,0 6.0 3,0 a a Gi ớ i hạn nồng độ có thể thấp hơn giới hạn định lượng (LOQ). Nếu đúng th ì kết quả thu được bằng phân tích HPLC có th ể không được đưa vào để dựng đường chuẩn, ví dụ: đối với ACS-K thực hiện hiệu chu ẩ n bảy đ iểm, b ỏ qua kết quả thu được với dung dịch hiệu chu ẩ n số 8. 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau: 5.1 . Dụng cụ thủy tinh thông thường của phòng th ử nghiệm , như ố ng đong chia vạch, pipet tính mức, cốc thủy tinh có mỏ. 5.2 . Cân phân tích , có thể cân chính xác đến 0,01 mg. 5.3 . C â n phòng th ử nghiệm , có thể cân chính xác đến 0,01 g. 5.4 . Pipet , có thể phân phối từ 1 ml đến 10 m l (dung tích khác nhau). 5.5 . B ì nh định mức , có dung tích thích hợp, ví dụ: 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml và 500 ml. 5.6 . Ố ng ly tâm bằng polypropylene , có dung tích thích hợp, ví dụ: 50 ml. 5.7 . Ố ng nghiệm chia vạch , có dung tích thích hợp, ví dụ: 5 ml. 5.8 . Máy nghiền trộn thực phẩm , thích hợp để đồng hóa mẫu thực phẩm. 5.9 . Bể siêu âm. 5.10 . Máy ly tâm , có thể duy trì tốc độ 4 000 min - 1 . 5.11 . Hệ thống chân không SPE hoặc loại tương đương. 5.12 . Dụng cụ làm bay hơi dung môi. 5.13 . Máy đo pH. 5.14 . Cột C18-SPE. 5.15 . Cột phân tích pha đảo , có khóa đuôi, cho phép tách được tất cả chín chất tạo ngọt. Ví dụ, cột c ó : - pha tĩnh RP-C18 cỡ hạt 5 μ m; - chiều dài 250 mm; - đường kính trong 3 mm. 5.16 . Hệ thống HPLC , được trang bị bơm hai kênh c ó thể duy trì tốc độ dòng 0,5 ml/ min, tốt nhất là có hệ thống bơm mẫu tự động và có detector tán xạ bay hơi. Có thể sử dụng các hệ thống detector khác như MS để thay thế ELSD hoặc UV và DAD khi các chất hấp thụ trong vùng UV với điều kiện là thu được các đặc tính tương tự. 5.17 . Bộ thu thập dữ liệu và phần mềm ph â n tích. 6. Cách tiến hành 6.1 . Yêu cầu chung Sử dụng máy nghiền trộn (5.8) để nghiền toàn bộ mẫu thử để thu được huyền phù đồng nhất. Các mẫu dạng lỏng có thể thực hiện luôn quy trình chiết. 6.2 . Chuẩn bị mẫu thử 6.2.1 . Bước 1 Cân khoảng 5 g ( M 1 , lấy đến hai chữ số thập phân) mẫu th ử đồng nhất (6.1) cho vào bình định mức 50 ml ( V 1 ). Thêm dung dịch đệm (4.14) đến vạch, lắc trộn kỹ bằng tay để thu được huyền phù đồng nhất và cho siêu âm 15 min trong bể siêu âm (5.9). 6.2.2 . Bước 2 Chuyển huyền phù thu được sang ống ly tâm 50 ml. Ly tâm 10 min ở tốc độ 4 000 min - 1 . CHÚ TH Í CH: Đối với trường hợp mẫu là dung dịch trong suốt (ví dụ: một v à i loại nước giải khát), th ì có th ể b ỏ qua bước n à y. 6.3 . Chiết pha rắn 6.3.1 . Bước 1 Ổn định cột (5.14) bằng cách cho 3 ml metanol (4.12) đi qua cột sử dụng chân không nhẹ để có tốc độ rửa giải từ 1 ml/ min đến 2 ml/ min. Đảm bảo một lượng nhỏ metanol còn lại trên đáy cột hấp phụ (1 mm). 6.3.2 . Bước 2 C â n bằng cột (5.14) bằng cách cho 2 ml dung dịch đệm (4.14) đi qua cột sử dụng chân không nhẹ để có tốc độ rửa giải từ 1 ml/ min đến 2 ml/ min. Đảm bảo một lượng nhỏ metanol còn lại trên đáy cột hấp phụ (1 mm). Lặp lại quy trình này hai lần. 6.3.3 . Bước 3 Cho 5 ml ( V 2 ) dịch chiết lên cột (5.14), nghĩa là cho phần nổi phía trên thu được trong 6.2.2, sử dụng chân không nhẹ để có tốc độ rửa giải từ 1 ml/ min đến 2 ml/ min. Đ ả m bảo rằng một lượng nh ỏ còn lại trên đáy cột hấp phụ (1 mm). Lặp lại quy trình này hai lần (tổng V 2 là 10 ml). 6.3.4 . Bước 4 Rửa cột (5.14) bằng 3 ml dung dịch đệm (4.14), sử dụng chân không nhẹ để có tốc độ rửa gi ả i từ 1 ml/ min đến 2 ml/ min. Đảm bảo rằng một lượng nhỏ còn lại trên đáy cột hấp phụ (1 mm). 6.3.5 . Bước 5 Rửa giải các chất tạo ngọt ra khỏi cột (5.14) bằng cách sử dụng 2 ml metanol (4.12) và thu lấy dịch rửa giải vào ống chia vạch 5 ml. Sử dụng chân không nhẹ để có tốc độ rửa giải từ 1 ml/ min. Đảm bảo rằng một lượng nh ỏ metanol còn lại trên đáy cột hấp phụ (1 mm). Đ ợ i 10 min trước khi nạp phần thứ hai của 2 ml metanol và thu lấy dịch rửa giải này vào cùng ố ng nghiệm 5 ml, sử dụng cùng điều kiện chân không nhưng thời gian này để cho cột (5.14) chảy đến khô. Không để cho các bước từ 6.2.1 đến 6.3.5 có chất hấp phụ chảy đến khô, trừ lần rửa giải thứ hai của bước cuối cùng 6.3.5. 6.3.6 . Bước 6 Cho dung môi bay hơi ra khỏi dịch chiết SPE trong metanol đến khi còn 3 ml, dùng dòng khí nitơ ở nhiệt độ phòng. Tránh để nhiệt độ vượt quá 40 ° C , vì aspartame có thể bị phân hủy. 6.3.7 . Bước 7 Cho dung dịch đệm (4.14) vào ống chia vạch có chứa dịch chiết SPE (6.3.6) đầy đến vạch 5 ml ( V 3 ). Trộn kỹ và chuyển lượng ch ứ a sang lọ HPLC thích hợp và phân tích bằng HPLC. 6.4 . Điều kiện của HPLC Cài đặt các điều kiện của HPLC để đáp ứng được các tiêu chí thực hiện đã được định nghĩa trước trong 6.5. Việc tách và định lượng cho thấy tốt khi áp dụng các điều kiện thực nghiệm sau đây và các điều kiện gradient HPLC nêu trong Bảng 4. - Cột: xem 5.15; - Nhiệt độ cột: nhiệt độ môi trường; - Thể tích bơm: 10 μ l; - Pha động: xem 4.15 và 4.16; - Kiểu phân tách: gradient; - Detector: detector tán xạ bay hơi (ELSD); - Nhiệt độ ống kéo ELSD: 85 °C; - Tốc độ dòng nitơ ELSD: 2,5 l/ min; - Độ khuếch đại ELSD: 1 - Chế độ ELSD: tắt. Bảng 4-Phân tích gradient HPLC, tốc độ dòng 0,5 ml/ min Thời gian, min Pha động A, % Pha động B, % 0 0 100 4 0 100 11 53 47 23 100 0 24 100 0 26 0 100 36 0 100 CHÚ THÍCH: Các thông số detector c ó th ể áp dụng cho hệ thống Alltech ELSD 2000ES 1 ) . Các hệ thống thay thế ELSD và các điều kiện thực nghiệm được s ử dụng trong nghiên cứu liên phòng được nêu trong Phụ lục A. Các điều kiện vận hành HPLC và ELSD có th ể được thay đ ổ i để thu được việc tách tối ưu. 6.5 . Phép th ử sự phù hợp của hệ thống-Độ phân giải của hệ thống tách Các chi tiết của quy trình sắc ký phụ thuộc vào nhiều yếu tố, thiết bị, kiểu, tuổi thọ, nhà cung cấp cột, kích cỡ mẫu và detector. Có thể sử dụng các cột khác nhau và các thể tích bơm khác, nếu đáp ứng được các phép thử sự phù hợp của hệ thống. Hệ thống HPLC-ELSD có thể tách được tất cả chín chất tạo ngọt ra với sự phân tách các đường nên l à rõ nhất. Yêu cầu này c ó thể được chứng minh bằng cách sử dụng dung dịch hiệu chuẩn 1 (4.18) nêu trong Hình B.1. Ngoài ra hệ thống này có thể tách được tất cả chín chất tạo ngọt ra khỏi các thành phần khác của nền mẫu. Nhiều thành phần nền mẫu như natri benzoat, axit sorbic, axit xitric, axit phosphoric, axit malic, axit ascorbic, axit glutamic, sucrose, glucose, f ructose, lactose, caffeine, taurine, D-glucurono-γ-lactone và sorbitol, v.v..., được tách bằng làm sạch trên cột SPE. Cặp tới hạn thường gặp nhất là alitame và quinine, không tách được bằng SPE [7 ] . Khi không tách được thì cần tối ưu các điều kiện sắc ký (ví dụ: th ể tích mẫu bơm, tốc độ pha động, chương trình gradient, v.v...) hoặc các điều kiện ELSD (ví dụ: nhiệt độ ống trôi, tốc độ dòng khí nitơ/không khí). 6.6 . Dựng đường chuẩn Phân tích tất c ả các dung dịch chuẩn (4.18, Bảng 2) sử dụng các điều kiện HPLC (6.4) giống hệt nhau như đã dùng cho các mẫu thử, nghĩa là bơm 10 μ l mỗi dung dịch vào hệ thống HPLC. Dựng đường chuẩn cho mỗi chất tạo ngọt thứ i từ các kết quả thu được qua việc phân tích các dung dịch chuẩn. Dựng đồ thị các diện tích pic thu được là Iog10 (diện tích pic thứ i) (trục y) với Iog10 (nồng độ chất thứ i) (trục x). Vẽ đường th ẳ ng (y = a + bx) đ ể thu được các kết quả, trong đó b là giá trị độ dốc của hàm tuyến tính và a là giá trị của điểm cắt của đường chuẩn với trục tung y. Nếu các kết quả phân tích các dung dịch chuẩn là đường thẳng thì các đường hiệu chuẩn có thể sử dụng để tính nồng độ chất tạo ngọt thứ i của dịch chiết mẫu. Nếu sử dụng detector khác không phải là ELSD, th ì có thể sử dụng các hàm hiệu chuẩn khác. 6.7 . Phân tích dung dịch mẫu bằng HPLC Phân tích 10 μ l dung dịch mẫu thử thu được trong 6.3.7. 6.8 . Diễn giải dữ liệu sắc k ý Nhận biết các chất tạo ngọt riêng rẽ trong mẫu thử bằng cách so sánh thời gian lưu của các chất tạo ngọt quan sát được trong quá trình phân tích dung dịch chuẩn được phân tích đồng thời với mẻ mẫu với thời gian lưu của các hợp chất rửa giải trong quá trình phân tích các mẫu thử. Thứ tự rửa giải của các chất tạo ngọt riêng rẽ cùng với thời gian lưu được nêu trong sắc ký đồ ở Hình B.1. Đo diện tích pic đặc trưng ( R i ) quan sát được của chất tạo ngọt thứ i trong từng dung dịch. Trong trường hợp diện tích của chất tạo ngọt thứ i trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử v ượ t quá diện tích pic của chất tạo ngọt tương ứng thu được trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn có nồng độ cao nhất thì cần pha loãng dung dịch mẫu thử bằng dung dịch đệm (4.14) và phân tích lại dung dịch đã pha loãng. 7. Tính kết quả Xác định hàm lượng chất tạo ngọt thử i bằng cách tích phân diện tích pic thứ i ( R i ) thu được từ phép phân tích dịch chiết SPE được bơm vào . S ử dụng hàm hiệu chuẩn, nghĩa là y = a + bx (6.6) để tính nồng độ khối lượng chất tạo ngọt thứ i ( ρ 1 i ) trong dung dịch chất chiết mẫu đo được, sử dụng Công thức (1) v à (2) sau đây: (1) (2) Trong đó: R i l à diện tích pic đặc trưng (6.8) đối với chất tạo ngọt thứ i ; a i là giao điểm của đường chuẩn (6.6) đối với chất tạo ngọt thứ i ; b i là độ dốc của đường chuẩn (6.6) đối với chất tạo ngọt thứ i ; ρ 1i là nồng độ khối lượng của chất tạo ngọt thứ i c ó trong dịch chiết SPE tính bằng microgam trên mililit; Tính tỷ lệ phần khối lượng trên nồng độ khối lượng wl ρ 2i của chất tạo ngọt thứ i có trong mẫu thử theo Công thức (3) sau đây: (3) Trong đó: ρ 1i là nồng độ khối lượng của chất tạo ngọt thứ i có trong dịch chiết SPE t í nh bằng microgam trên mililit ( μ g/ml) (xác định được theo Công thức 2); M 1 l à khối lượng mẫu th ử được lấy để chiết, tính bằng gam (g), trong trường hợp này là 5 g (6.2.1); V 1 là t ổ ng thể tích dung dịch mẫu, tính bằng mililit, trong trường hợp này là 50 ml (6.2.1); V 2 là thể tích dung dịch mẫu đưa lên cột SPE, tính bằng mililit (ml), trong trường hợp này là 10 ml (6.3.3); V 2 là thể tích cuối cùng của dịch chiết SPE, tính bằng mililit (ml), trong trường hợp này là 5 ml (6.3.7). 8. Độ chụm 8.1 . Yêu cầu chung Chi tiết về các phương pháp được các phòng thử nghiệm riêng rẽ sử dụng trong phép thử liên phòng được nêu trong Bảng A.1. Các chi tiết của phép thử liên phòng về độ chụm được nêu trong Phụ lục C . Các dữ liệu thu được từ phép nghiên cứu cộng tác này có thể không áp dụng được cho các dài nồng độ chất phân tích và các nền mẫu khác với các dải nồng độ chất phân tích và nền mẫu nêu trong Phụ lục C. 8.2 . Độ lặp lại và độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả th ử riêng rẽ, thu được khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn như nhau, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r . Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ, thu được b ở i hai phòng thử nghiệm khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R . Các giá trị r và R được nêu trong Bảng 5 và Bảng 6, còn các dữ liệu về đánh giá xác nhận phương pháp được nêu trong Phụ lục C và tài liệu tham khảo [1]. Bảng 5-Các giá trị của chín chất tạo ngọt trong nước giải khát theo các Bảng C.1 đến C.9 M ẫ u 2 mg/l M ẫ u 3 mg/l M ẫ u 4 mg/l M ẫ u 5 mg/l acesulfame-K 38,3 266,6 324,1 383,5 r 7,4 16,9 29,7 25 , 7 R 11,6 43,8 56,2 54,0 alitame 31,1 69,1 96,4 114,5 r 6,2 7,7 6,3 4,3 R 8,3 21,1 7,2 11,0 aspartame 38,1 485,1 584,8 702 r 5,2 26,5 14,1 16,2 R 17,1 93,3 86,6 65,9 cyclamate 28 , 3 248,9 256,8 307,2 r 3,5 18,4 10,2 16,5 R 16,3 43,1 392 43,4 dulc i n 55 , 0 79,6 95,7 115,1 r 3,8 8,2 2,8 4,3 R 9,4 10,9 14,7 14,7 neotame 37,6 77,9 97,2 115,3 r 2,4 5,2 6,7 7,7 R 6,8 12,9 13,5 14,4 neohesperidine- dihydrochalcone 31,4 42,8 51 , 0 59,3 r 9,3 4,7 4,9 7,3 R 25,1 18,7 12,4 14,5 saccharin 36 , 2 60,1 74,1 87,6 r 3,9 4,7 8,3 2,7 R 11,3 7,7 13,6 14,5 sucralose 36,8 245,1 282,9 346,8 r 3,8 10,6 7,4 22,9 R 14,7 28,2 45,3 374 B ả ng 6-Các giá trị của chín ch ấ t tạo ngọt trong nước trái cây theo các Bảng C.1 đến C.9 M ẫ u 7 , mg/kg M ẫ u 8 mg/kg M ẫ u 9 mg/kg M ẫ u 10 mg/kg acesu l fame-K 38,4 259,2 323 391,3 r 7,4 25,6 11,5 32 R 15,9 35,5 44,8 49,1 alitame 36 113,7 142,5 175,2 r 9,7 6,9 8,8 18 R 9,7 10,6 12,3 21,1 aspartame 37,2 739,8 951,9 1 120,2 r 10,1 46,3 12,5 37,8 R 10 , 1 82 , 0 77,1 88,8 cyclamate 27,5 749,7 924,7 1 100,6 r 12,4 19,6 40,5 35,6 R 13,7 86 5 124,2 104,3 dulcin 49,8 111 141,7 172,6 r 10,3 8,4 10,1 8,6 R 12,0 13,4 13,1 15,2 neotame 37,3 116,2 140,6 173,7 r 3,6 10,1 6,2 13,5 R 6 , 2 17,6 21,1 21,7 neohesperidine- dihydrochalcone 35,3 40,5 49,8 59,3 r 6,1 2,8 5,6 6,5 R 12,2 13,0 9,2 15,3 saccharin 44 , 3 151,9 193,4 235,3 r 6,8 11,3 12,0 18,8 R 23,6 29,6 37,7 42,0 sucralose 35,3 306,1 380,2 462,4 r 6,3 20,6 23,8 27,1 R 10,8 24 , 4 29,1 27,1 9. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo th ử nghiệm phải nêu rõ các thông tin sau: - mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; - viện dẫn tiêu chuẩn này và phương pháp đã sử dụng; - ngày và phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu biết); - ngày nhận mẫu; - ngày thử nghiệm; - kết quả thu được và đơn vị biểu thị; - các điểm cụ thể quan sát được trong khi thử nghiệm; - mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, có thể ảnh hư ở ng đến kết quả. Phụ lục A (Tham khảo) Các điều kiện thích hợp của phương pháp Bảng A.1-Các điều kiện thích hợp của hệ thống Các đặc trưng của SPE Tên hãng Chromabond® Chromabond® Bak er bond spe® Chromaband® Chromabond® Chromabond® Chromabond® - Pha tĩ nh C18ec C18ec C18 C18ec C18ec C18ec C18ec - D un g l ượ ng(m l/m g) 6/1000 6/1000 3/500 6/1000 6/1000 6/1000 6/1000 Đặc tính cột HPLC - Tên hãng Purophe r ® S tar Purophe r ® S tar Puroph er ® S tar Nu cl eodu r ® Puropher® Star Puropher® Star Purophe r ® S tar - Pha tĩnh RP-C18 endcapped RP-C18 endcapped RP-C18 endcapped C-18ec Pyramid RP-C18 endcapped RP-C18 endcapped RP-C18 endcapped - Chiều dài 250 250 250 250 250 250 250 - Đ ường kính trong (mm) 3 3 3 3 3 3 3 - Cỡ hạt (μm) 5 5 5 5 5 5 5 Pha động HPLC - Th à nh phần pha độ ng A (thể t ích) Metano l: dung d ị ch đ ệm : axeton: 69 : 24:7 Metano l: dung d ị ch đệm: axet o n: 69 : 24:7 Metano l: dung dị ch đ ệm axet o n: 69 : 24:7 Metano l: dung dị ch đ ệm : axeton: 69 : 24:7 Metano l: dung dị ch đ ệm : axeton: 69 : 24:7 Metano l: dung dị ch đ ệm : axeton: 69 : 24:7 Metano l: dung dị ch đ ệm : axeton: 69 : 24:7 - Th à nh phần pha động B (thể tích) Metano l: dung dị ch đ ệm : axeton: 11:82 :7 Metano l: dung dị ch đ ệm : axeton: 11:82 :7 Metano l: dung dị ch đ ệm : axeton: 11:82 :7 Metano l: dung dị ch đ ệm : axeton: 11:82 :7 Metano l: dung dị ch đ ệm : axeton: 11:82 :7 Metano l: dung dị ch đ ệm : axeton: 11:82 :7 Metano l: dung dị ch đ ệm : axeton: 11:82 :7 -Tốc độ dòn g (m l/ min ) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,6 0 , 55 0,5 Phương thức tách bằng HPLC - Ch ươ ng tr ì nh gra d ient ( min-% pha độ ng A) 0 min - 100%A ; 0 min-5%A ; 0 min-0%A 0 min - 0%A 0 min - 0%A ; 0 min-0%A ; 4 min - 100%A ; 10 min - 60%A ; 0 min - 0%A ; 4 min - 0%A ; 4 min-0%A ; 4 min-0%A ; 4 min-0%A ; 11 min - 47%A ; 30 min - 95%A ; 15 min-100%A ; 11 min - 53%A ; 11 min -53%A ; 11 min-53%A ; 11 min-53%A ; 23 min- 2%A ; 31 min - 95%A ; 18 min-100%A ; 23 min-100%A ; 21 min-100%A ; 23 min-100%A ; 23 min-100%A ; 24 min - 2 %A ; 32 min - 5%A ; 20 min - 0%A ; 24 min-100%A ; 23 min-100%A ; 24 min-100%A ; 24 min-100%A ; 26 min-100%A ; 45 min - 5%A ; 35 min - 0%A ; 26 min - 0%A ; 25 min-0%A ; 26 min-0%A ; 26 min-0%A ; 36 min - 0%A ; 31 min-0%A ; 36 min-0%A ; 36 min-0%A ; Phương thức bơm HPLC - Th ủ công-t ự độ ng Tự đ ộ ng Tự đ ộ ng Tự đ ộ ng Tự đ ộ ng Tự đ ộ ng Tự đ ộ ng Tự đ ộ ng Điều kiện ELSD - Nh à sản xuấ t Sedex 85, Sedere Varex MKlll , A l ltech ELSD-LT II, Sh im ad z u Sedex, Sedere Sedex 75, Sedere ELSD 2000ES, Altech ELSD 2000ES, Atech - Nh iệt độ ống kéo (oC) 40 90 50 43 45 85 85 - N i t ơ/ không kh í (áp lực/ tốc độ dòng) Nitơ 3 , 2 bar N it ơ 2 , 5 l/ min Không khí 3 bar Nitơ 3,5 ba r Không k hí 2 , 5bar Nitơ 2 , 5bar N i tơ 2 , 5 l/ min - độ khuếch đại 7 1 9 10 2 1 1 Phụ lục B (Tham khảo) Ví dụ về sắc ký đồ CHÚ D Ẫ N 1 Zorbax Extend-C18 2) 2 Nucleodur® C18 Pyramid 2 ) 3 Nucleodu r ® C18 Gravity 2 ) 4 Purospher® S tar RP-18, 5 μm 3) X Thời gian ( min) Y Tín hiệu ELSD Hình B.1-Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn các chất tạo ngọt thu được sử dụng các cột HPLC khác nhau CHÚ D Ẫ N: 1 M ẫ u trắng đồ uống cung cấp n ă ng lượng; 2 Đồ uống cung cấp năng lượng có bổ sung chất chuẩn ở mức xấp xỉ giới hạn định lượng; 3 Đồ uống không chứa cacbonat có bổ sung ch ấ t chuẩn ở mức xấp xỉ 80 % liều dùng tối đa; 4 Đồ uống chứa cacbonat có bổ sung ch ấ t chuẩn ở mức xấp x ỉ 100 % liều dùng tối đa; 5 Đồ uống ch ứ a cacbonat có bổ sung chất chuẩn ở mức xấp xỉ 120 % li ề u dùng tối đa. X Thời gian ( min); Y T í n hiệu ELSD. Cột tách Purospher ® S tar RP-18, 5 μm 4) Đường kính 3 mm; Chiều dài cột 250 mm. Các điều kiện đ ể th í nghiệm được nêu trong tiêu chuẩn này. Hình B.2-Sắc k ý đồ của các loại đồ u ố ng khác nhau bổ sung các chất tạo ngọt thu được sử dụng cột HPLC pha đảo PHỤ LỤC C (Tham khảo) Dữ liệu về độ chụm Có bảy phòng thử nghiệm đã tham gia phép thử liên phòng. Các đơn vị tham gia vào phép thử sơ bộ để đánh giá mọi tr ở ngại c ó thể xảy ra trước khi tham gia xác định chính thức. Trong suốt quá trình đánh giá sơ bộ, các đơn vị tham gia được giao hai mẫu th ử với thành phần đã cho của tất cả chín chất tạo ngọt, nghĩa là một mẫu nước giải khát với nồng độ thấp và một mẫu với nồng độ cao của t ấ t cả chín ch ấ t tạo ngọt. Hai mẫu thử đã được sử dụng cho mục đích tối ưu hóa và chứng minh tính chính xác hệ thống sắc ký. Trong quá trình thử nghiệm liên phòng, các đơn vị tham gia đ ượ c nhận hai mươi mẫu thử (mười mẫu kép mù) của nước giải khát, cụ thể như sau: - M ẫ u 1: Đồ uống cung cấp năng lượng mẫu trắng; - Mẫu 2: Đồ uống cung cấp năng lượng c ó bổ sung chất chuẩn ở mức nồng độ xấp xỉ giới hạn định lượng (LOQ); - Mẫu 3: Đồ uống không ch ứ a cacbonat có b ổ sung chất chuẩn ở mức nồng độ xấp xỉ 80 % liều dùng tối đa (MUDs); - M ẫ u 4: Đồ uống chứa cacbonat có bổ sung chất chuẩn ở mức nồng độ xấp xỉ 100 % liều dùng tối đa; - M ẫ u 5: Đồ uống chứa cacbonat có bổ sung chất chuẩn ở mức nồng độ xấp xỉ 120 % liều dùng tối đa Và nước trái cây đóng hộp: - Mẫu 6: Nước cocktail trái cây đóng hộp-mẫu trắng; - M ẫ u 7: Nước cocktail trái cây đ ó ng hộp thêm chuẩn ở mức nồng độ xấp xỉ giới hạn định lượng (LOQ); - M ẫ u 8: Nước lê đóng hộp thêm chuẩn ở mức nồng độ xấp xỉ 75 % liều dùng tối đa (MUD); - M ẫ u 9: Nước lê đóng hộp thêm chuẩn ở mức nồng độ xấp xỉ 100 % liều dùng tối đa (MUD); - Mẫu 10: Nước l ê đóng hộp thêm chuẩn ở mức nồng độ xấp xỉ 115 % liều dùng tối đa (MUD). với các lượng nồng độ thêm chuẩn khác nhau của chín chất tạo ngọt để phân tích. Chi tiết của phương pháp được áp dụng tại các phòng thử nghiệm khác nhau nêu trong Bảng A.1. Các dữ liệu sau đây thu được trong các phép thử liên phòng theo quy định của IUPAC Harmonised Protocol [2] do Viện Nghiên cứu vật liệu và phép đo chuẩn của Trung tâm nghiên cứu hỗn hợp Châu Âu (Institute for Re f erence Materials and Measurements of the European Commission’s Directorate General Joint Research Centre) tổ chức thực hiện. Bảng C.1 - Acesulfame-K Nước gi ả i khát M ẫ u số 2 3 4 5 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 Số phòng th ử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 Số phòng th ử nghiệm ngoại l ệ 0 0 0 0 Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi loại trừ các ngoại lệ 7 7 7 7 S ố lượng kết qu ả được chấp nhận 14 14 14 14 Giá trị trung b ì nh , [mg/l] 38,3 266,6 324,1 383,5 Giá trị đúng (mg/l) 42,1 282,5 354,2 421,7 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , mg/l 2,6 6,0 10,6 9,2 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r % 6,9 2,3 3,3 2,4 Giới hạn lặp lại, r [mg/l] 7,4 16,9 29,7 25,7 Độ lệch chuẩn tái lập s R , mg/l 4,2 15,6 20,1 19,3 Độ lệch chuẩn tương đối t á i l ậ p, RSD r % 10,9 5,9 6,2 5,0 Giới hạn tái lập, R , mg/l 11,6 43,8 56,2 54,0 Giá trị Horrat 1,2 0,9 0,9 0,8 Nước trái cây đóng hộp M ẫ u số 7 8 9 10 Năm th ử nghiệm 2007 2007 2007 2007 Số phòng thử nghi ệ m 7 7 7 7 Số lượng mẫu th ử 2 2 2 2 Số phòng th ử nghiệm ngoại lệ 0 0 0 0 Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi loại trừ các ngoại lệ 7 7 7 7 S ố lượng kết quả được chấp nhận 14 14 14 14 Giá trị trung bình , [mg/kg] 38,4 259,2 323,0 391,3 Giá trị đúng (mg/kg) 36,5 265,6 338,8 410,0 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/kg] 2,7 9,1 4,1 11,4 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r % 6,9 3,5 1,3 2,9 Giới hạn lặp lại, r [mg/kg] 7,4 25,6 11,5 32,0 Độ lệch chuẩn tái lập s R [mg/kg] 5,7 12,7 16,0 17,5 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R , [%] 14,8 4,9 4,9 4,5 Giới hạn tái lập, R , [mg/kg] 15,9 35,5 44,8 49,1 Giá trị Horrat 1,6 0,7 0,7 0,7 Bảng C.2 - Alitame Nước giải khát M ẫ u số 2 3 4 5 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 S ố phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 S ố ph ò ng thử nghiệm ngoại lệ 0 0 0 0 S ố phòng th ử nghiệm còn lại sau khi loại trừ các ngoại lệ 7 7 7 7 Số lượng kết quả được chấp nhận 14 14 14 14 Giá trị trung b ì nh , mg/l 31,1 69,1 96,4 114,5 Giá trị đúng (mg/l) 36,5 80,5 102,6 122,2 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/l] 2,2 2,8 2,3 1,5 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 7,1 4,0 2,3 1,3 Giới hạn lặp lại, r [mg/l] 6,2 7,7 6,3 4,3 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/l] 3,0 7,5 2,6 3,9 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 9,5 10,9 2,7 3,4 Giới hạn tái lập, R , mg/l 8,3 21,1 7,2 11,0 Giá trị Horrat 1,0 1,3 0,3 0,4 Nước trái cây đóng hộp M ẫ u số 7 8 9 10 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 Số phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 Số phòng thử nghi ệ m ngoại lệ 0 0 1 0 S ố phòng thử nghiệm c ò n lại sa u khi loại trừ các ngoại lệ 7 7 6 7 Số lượng kết quả được chấp nhận 14 14 12 14 Giá trị trung b ì nh , [mg/kg] 36,0 113,7 142,5 175,2 Giá trị đúng [ mg/ kg] 34,6 116,1 145,1 175,5 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/ kg ] 3,5 2,5 3,1 6,4 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 9,7 2,2 2,2 3,7 Giới hạn lặp lại, r [mg/ kg ] 9,7 6,9 8,8 18,0 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/ kg ] 3,5 3,8 4,4 7,5 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 9,7 3,3 3,1 4,3 Giới hạn tái lập, R , [ mg/ kg] 9,7 10,6 12,3 21,1 Giá trị Horrat 1,0 0,4 0,4 0,6 Bảng C.3 - Aspartame Nước giải khát M ẫ u s ố 2 3 4 5 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 S ố phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 S ố ph ò ng thử nghiệm ngoại lệ 1 0 0 1 S ố phòng th ử nghiệm còn lại sau khi loại trừ các ngoại lệ 6 7 7 6 Số lượng kết quả được chấp nhận 12 14 14 12 Giá trị trung b ì nh , [ mg/l ] 38,1 485,1 584,8 702,0 Giá trị đúng [ mg/l ] 42,0 485,0 605,0 720,3 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/l] 1,9 9,5 5,0 5,8 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 4,9 1,9 0,9 0,8 Giới hạn lặp lại, r [mg/l] 5,2 26,5 14,1 16,2 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/l] 6,1 33,3 30,9 23,5 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 16,0 6,9 5,3 3,4 Giới hạn tái lập, R , mg/l 17,1 93,3 86,6 65,9 Giá trị Horrat 1 , 7 1,1 0,9 0,6 Nước trái cây đóng hộp M ẫ u số 7 8 9 10 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 Số phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 Số phòng thử nghi ệ m ngoại lệ 1 0 2 1 S ố phòng thử nghiệm c ò n lại sa u khi loại trừ các ngoại lệ 6 7 5 6 Số lượng kết quả được chấp nhận 12 14 10 12 Giá trị trung b ì nh , [mg/l] 37,2 739,8 951,9 1 120,2 Giá trị đúng [ mg/ l] 37,3 752,1 967,8 1 171,1 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/ kg ] 3,6 16,5 4,5 13,5 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 9,7 2,2 0,5 1,2 Giới hạn lặp lại, r [mg/ kg ] 10,1 46,3 12,5 37,8 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/ kg ] 3,6 29,3 27,5 31,7 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 9,7 4,0 2,9 2,8 Giới hạn tái lập, R , [ mg/ kg] 10,1 82,0 77,1 88,8 Giá trị Horrat 1,0 0,7 0,5 0,5 Bảng C.4 - Cyclamate Nước giải khát M ẫ u s ố 2 3 4 5 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 S ố phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 S ố ph ò ng thử nghiệm ngoại lệ 0 0 0 0 S ố phòng th ử nghiệm còn lại sau khi loại trừ các ngoại lệ 7 7 7 7 Số lượng kết quả được chấp nhận 14 14 14 14 Giá trị trung b ì nh , [ mg/l ] 28,3 248,9 256,8 307,2 Giá trị đúng [ mg/l ] 36,9 239,0 252,7 300,8 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/l] 1,2 6,6 3,6 5,9 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 4,4 2,6 1,4 1,9 Giới hạn lặp lại, r [mg/l] 3,5 18,4 10,2 16,5 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/l] 5,8 15,4 14,0 15,5 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 20,6 6,2 5,5 5,0 Giới hạn tái lập, R , mg/l 16,3 43,1 39,2 43,4 Giá trị Horrat 2,1 0,9 0,8 0,7 Nước trái cây đóng hộp M ẫ u số 7 8 9 10 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 Số phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 Số phòng thử nghi ệ m ngoại lệ 0 1 0 1 S ố phòng thử nghiệm c ò n lại sa u khi loại trừ các ngoại lệ 7 6 7 6 Số lượng kết quả được chấp nhận 14 12 14 12 Giá trị trung b ì nh , [mg/l] 27,5 749,7 924,7 1 100,6 Giá trị đúng [ mg/ kg] 32,2 752,6 968,8 1172,3 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/ kg ] 4,4 7,0 14,5 12,7 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 16,1 0,9 1,6 1,2 Giới hạn lặp lại, r [mg/ kg ] 12,4 19,6 40,5 35,6 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/ kg ] 4,9 30,9 44,4 37,2 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 17,9 4,1 4,8 3,4 Giới hạn tái lập, R , [ mg/ kg] 13,7 86,5 124,2 104,3 Giá trị Horrat 1,8 0,7 0,8 0,6 Bảng C.5 - Dulcin Nước giải khát M ẫ u s ố 2 3 4 5 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 S ố phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 S ố ph ò ng thử nghiệm ngoại lệ 0 0 0 0 S ố phòng th ử nghiệm còn lại sau khi loại trừ các ngoại lệ 7 7 7 7 Số lượng kết quả được chấp nhận 14 14 14 14 Giá trị trung b ì nh , [ mg/l ] 55,0 79,6 95,7 115,1 Giá trị đúng [ mg/l ] 60,7 81,3 101,8 121,1 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/l] 1,4 2,9 1,0 1,5 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 2,5 3,7 1,0 1,3 Giới hạn lặp lại, r [mg/l] 3,8 8,2 2,8 4,3 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/l] 3,3 3,9 5,2 5,2 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 6,1 4,9 5,5 4,6 Giới hạn tái lập, R , mg/l 9,4 10,9 14,7 14,7 Giá trị Horrat 0,7 0,6 0,7 0,6 Nước trái cây đóng hộp M ẫ u số 7 8 9 10 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 Số phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 Số phòng thử nghi ệ m ngoại lệ 1 0 0 0 S ố phòng thử nghiệm c ò n lại sa u khi loại trừ các ngoại lệ 6 7 7 7 Số lượng kết quả được chấp nhận 12 12 14 14 Giá trị trung b ì nh , [mg/l] 49,8 111,0 141,7 172,6 Giá trị đúng [ mg/ kg] 50,2 114,3 145,7 176,3 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/ kg ] 3,7 3,0 3,6 3,1 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 7,4 2,7 2,5 1,8 Giới hạn lặp lại, r [mg/ kg ] 10,3 8,4 10,1 8,6 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/ kg ] 4,3 4,8 4,7 5,4 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 8,6 4,3 3,3 3,1 Giới hạn tái lập, R (R = 2,8 x s R ) , [ mg/ kg] 12,0 13,4 13,1 15,2 Giá trị Horrat 1,0 0,5 0,4 0,4 Bảng C.6 - Neotame Nước giải khát M ẫ u s ố 2 3 4 5 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 S ố phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 S ố ph ò ng thử nghiệm ngoại lệ 0 0 0 0 S ố phòng th ử nghiệm còn lại sau khi loại trừ các ngoại lệ 7 7 7 7 Số lượng kết quả được chấp nhận 14 14 14 14 Giá trị trung b ì nh , [ mg/l ] 37,6 77,9 97,2 115,3 Giá trị đúng [ mg/l ] 37,5 80,5 102,2 121,7 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/l] 0,9 1,9 2,4 2,8 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 2,3 2,4 2,4 2,4 Giới hạn lặp lại, r [mg/l] 2,4 5,2 6,7 7,7 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/l] 2,4 4,6 4,8 5,2 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 6,4 5,9 5,0 4,5 Giới hạn tái lập, R , mg/l 6,8 12,9 13,5 14,4 Giá trị Horrat 0,7 0,7 0,6 0,6 Nước trái cây đóng hộp M ẫ u số 7 8 9 10 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 Số phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 Số phòng thử nghi ệ m ngoại lệ 0 0 0 0 S ố phòng thử nghiệm c ò n lại sa u khi loại trừ các ngoại lệ 7 7 7 7 Số lượng kết quả được chấp nhận 14 14 14 14 Giá trị trung b ì nh , [mg/l] 37,3 116,2 140,6 173,7 Giá trị đúng [ mg/ kg] 36,2 118,3 145,4 175,9 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/ kg ] 1,3 3,6 2,2 4,8 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 3,5 3,1 1,6 2,8 Giới hạn lặp lại, r [mg/ kg ] 3,6 10,1 6,2 13,5 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/ kg ] 2,2 6,3 7,5 7,7 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 5,9 5,4 5,3 4,5 Giới hạn tái lập, R , [ mg/ kg] 6,2 17,6 21,1 21,7 Giá trị Horrat 0,6 0,7 0,7 0,6 Bảng C.7 - Neohesperidine dihydrochalcone Nước giải khát M ẫ u s ố 2 3 4 5 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 S ố phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 S ố ph ò ng thử nghiệm ngoại lệ 0 0 0 0 S ố phòng th ử nghiệm còn lại sau khi loại trừ các ngoại lệ 7 7 7 7 Số lượng kết quả được chấp nhận 14 14 14 14 Giá trị trung b ì nh , [ mg/l ] 31,4 42,8 51,0 59,3 Giá trị đúng [ mg/l ] 36,7 40,2 50,7 60,4 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/l] 3,3 1,7 1,8 2,6 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 10,6 3,9 3,5 4,4 Giới hạn lặp lại, r [mg/l] 9,3 4,7 4,9 7,3 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/l] 9,0 6,7 4,4 5,2 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 28,5 15,6 8,7 8,8 Giới hạn tái lập, R , mg/l 25,1 18,7 12,4 14,5 Giá trị Horrat 3,0 1,7 1,0 1,0 Nước trái cây đóng hộp M ẫ u số 7 8 9 10 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 Số phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 Số phòng thử nghi ệ m ngoại lệ 0 1 0 0 S ố phòng thử nghiệm c ò n lại sa u khi loại trừ các ngoại lệ 7 6 7 7 Số lượng kết quả được chấp nhận 14 12 14 14 Giá trị trung b ì nh , [mg/l] 35,3 40,5 49,8 59,3 Giá trị đúng [ mg/ l] 33,4 37,5 48,9 59,1 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/ kg ] 105,6 108,0 102,0 100,4 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 6,1 2,5 4,0 3,9 Giới hạn lặp lại, r [mg/ kg ] 6,1 2,8 5,6 6,5 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/ kg ] 4,4 4,6 3,3 5,5 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 12,4 11,5 6,6 9,2 Giới hạn tái lập, R (R = 2,8 x s R ) , [ mg/ kg] 12,2 13,0 9,2 15,3 Giá trị Horrat 1,3 1,3 0,7 1,1 Bảng C.8 - Saccarin Nước gi ả i khát M ẫ u s ố 2 3 4 5 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 S ố phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 S ố ph ò ng thử nghiệm ngoại lệ 0 1 0 1 S ố phòng th ử nghiệm còn lại sau khi loại trừ các ngoại lệ 7 6 7 6 Số lượng kết quả được chấp nhận 14 12 14 12 Giá trị trung b ì nh , [ mg/l ] 36,2 60,1 74,1 87,6 Giá trị đúng [ mg/l ] 40,3 65,2 80,9 96,3 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/l] 1,4 1,7 3 , 0 1,0 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 3,8 2,8 4,0 1,1 Giới hạn lặp lại, r [mg/l] 3,9 4,7 8,3 2,7 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/l] 4,0 2,8 4,9 5,2 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 11,1 4,6 6,6 5,9 Giới hạn tái lập, R (R = 2,8 x s R ), mg/l 11,3 7,7 13,6 14,5 Giá trị Horrat 1,2 0,5 0,8 0,7 Nước trái cây đóng hộp M ẫ u số 7 8 9 10 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 Số phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 Số phòng thử nghi ệ m ngoại lệ 0 0 0 0 S ố phòng thử nghiệm c ò n lại sa u khi loại trừ các ngoại lệ 7 7 7 7 Số lượng kết quả được chấp nhận 14 14 14 14 Giá trị trung b ì nh , [mg/kg] 44,3 151,9 193,4 235,3 Giá trị đúng [ mg/ kg] 38,0 150,0 194,0 234,8 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/ kg ] 2,4 4,0 4,3 6,7 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 5,5 2,7 2,2 2,9 Giới hạn lặp lại, r [mg/ kg ] 6,8 11,3 12,0 18,8 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/ kg ] 8,4 10,6 13,5 15,0 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 19,0 7,0 7,0 6,4 Giới hạn tái lập, R (R = 2,8 x s R ) , [ mg/ kg] 23,6 29,6 37,7 42,0 Giá trị Horrat 2,1 0,9 1,0 0,9 Bảng C.9 - Sucralose Nước giải khát M ẫ u s ố 2 3 4 5 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 S ố phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 S ố ph ò ng thử nghiệm ngoại lệ 0 0 0 0 S ố phòng th ử nghiệm còn lại sau khi loại trừ các ngoại lệ 7 7 7 7 Số lượng kết quả được chấp nhận 14 14 14 14 Giá trị trung b ì nh , [ mg/l ] 36,8 245,1 282,9 346,8 Giá trị đúng [ mg/l ] 38,9 251,8 302,6 360,3 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/l] 1,4 3,8 2,7 8,2 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 3,7 1,5 0,9 2,4 Giới hạn lặp lại, r [mg/l] 3,8 10,6 7,4 22,9 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/l] 5,2 10,1 16,2 13,3 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 14,2 4,1 5,7 3,8 Giới hạn tái lập, R , [ mg/l ] 14,7 28,2 45,3 37,4 Giá trị Horrat 1,5 0,6 0,8 0,6 Nước trái cây đóng hộp M ẫ u số 7 8 9 10 Năm thử nghiệm 2007 2007 2007 2007 Số phòng thử nghiệm 7 7 7 7 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 Số phòng thử nghi ệ m ngoại lệ 0 0 0 0 S ố phòng thử nghiệm c ò n lại sa u khi loại trừ các ngoại lệ 7 7 7 7 Số lượng kết quả được chấp nhận 14 14 14 14 Giá trị trung b ì nh , [mg/kg] 35,3 306,1 350,2 462,4 Giá trị đúng [ mg/ kg] 34,6 313,1 388,2 469,7 Độ lệch chuẩn lặp lại s r , [mg/ kg ] 2,2 7,4 8,5 9,7 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r [%] 6,3 2,4 2,2 2,1 Giới hạn lặp lại, r [mg/ kg ] 6,3 20,6 23,8 27,1 Độ lệch chuẩn tái lập s R , [mg/ kg ] 3,8 8,7 10,4 9 , 7 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R [%] 10,9 2,8 2,7 2,1 Giới hạn tái lập, R , [ mg/ kg] 10,8 24,4 29,1 27,1 Giá trị Horrat 1,2 0,4 0,4 0,3 PHỤ LỤC D (Tham khảo) Các giới hạn hiện hành của EU về chín chất tạo ngọt Bảng D.1-Các giới hạn hiện hành của EU về chín chất tạo ngọt trong nước giải khát và nước trái cây đóng hộp Chất tạo ngọt MUD a đối với nước giải khát, mg/l MUD a đối với nước trái cây đóng hộp, mg/kg ACS-K 350 350 ALI b - - ASP 600 1000 CYC 250 1000 DUL b - - NEO 20 - NHDC 30 50 SAC 80 200 SCL 300 400 a MUD = liều dùng tối đa theo giới hạn của EU [3] đến [6]. b Chất tạo ngọt chưa có quy định giới hạn của EU. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Buchgraber M. and W asik, A.: Validation of an analytical method for the simu l taneous determination of nine intense s w eeteners by HPLC-ELSD-Report on the collaborative trial. EUR 22726 EN, 2007 [2] IUPAC Harmonised Protocol for the Design, Conduct and Interpretaticn of meth o d-Per f ormance Studies. Pure & Appl Chem, 19 9 5, 67, 331-343 [3] Directive 94 / 35/EC of European Parliament and of the Council of 30 June 1994 on s w eeteners for use in f oodstu ff s. Official Journal of European Communities 1994, L237/13 [4] Directive 96/83/EC of the European Parliament and of the Council of 19 December 1996 amending Directive 94/35/EC on sweeteners for use in foodstuffs. O ffi cial J ourna l of European Union 1997, L048, 16-19 [5] Directive 2003/115/EC of the European Parliament and of the Council of 22 December 2003 amending Directive 94/35/EC on sweeteners for use in foodstuffs. Official Jou rn al of European Union 2004, L024, 65-71 [6] Commission D i rective 2009/163/EU of 22 December 2009 amending Directive 94/35/EC of the European Parliament and of the Council on sweeteners for u se in f o odstuffs w i th regard to neotame. Official Journal of European Union 2009, L344, 37-40 [7] W asik, A., McCourt, J. and Buchgraber, M.: Simultaneous determination of nine s w eeteners in foodstuffs by high per f ormance liquid chromatography and evaporative light scattering detection-Single-laborat o r y validation. J Chromat A, 2007, 1157, 187-196 2) Đây là ví dụ về sản phẩm thích hợp c ó bán sẵn. Th ô ng tin n à y được đưa ra đ ể thuận tiện cho người sử dụng ti ê u chuẩn m à không ấn định s ử dụng s ả n ph ẩ m này. 3) Purospher® Star RP-18, 5 μm là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin này được đưa ra để thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn mà không ấn định sử dụng sản phẩm này. 4) Purospher ® S tar RP-18, 5 μm là v í dụ về s ả n ph ẩ m thích hợp có bán sẵn. Thông tin này được đưa ra để thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn mà không ấn định sử dụng sản phẩm này.