TCVN11131:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11131:2015 (ISO/TS 20836:2005) về Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Phép thử hiệu năng đối với máy chu trình nhiệt TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11131:2015 ISO/TS 20836:2005 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM - PHÉP THỬ HIỆU NĂNG ĐỐI VỚI MÁY CHU TRÌNH NHIỆT Microbiology of food and animal f eeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Per f ormance testing for thermal cyclers Lời nói đầu TCVN 11131:2015 hoàn toàn tương đương với ISO/TS 20836:2005; TCVN 11131:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương ph á p phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm đ ị nh, Bộ Khoa học và C ô ng nghệ công b ố . Lời giới thiệu Tiêu chuẩn này n ằ m trong bộ tiêu chuẩn với tên chung là Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm: TCVN 7682 (ISO 20838), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp đ ị nh tính TCVN 10781 (ISO/TS 13136) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phản ứng chuỗi pol y merase (PCR) thời gian thực - Phát hiện Escherichia coli sinh độc tố Shiga (STEC) và x á c định các nhóm huyết thanh O 157, O 111, O 26, O 103 và O 145 TCVN 11131 (ISO/TS 20836), Vi sinh vật trong thực ph ẩ m và thức ăn chăn nuôi - Phản ứ ng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật g â y bệnh từ thực phẩm - Phép thử hiệu năng đối với m á y chu trình nhiệt TCVN 11132 (ISO 22118) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứ ng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện và định lượng vi sinh vật gây bệnh từ thực ph ẩ m - Đặc tính hiệu năng TCVN 11133 (ISO 22119), Vi sinh vật tr o ng thực ph ẩ m và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase real-time (PCR real-time) đ ể phát hiện và định lượng vi sinh vật gây bệnh từ th ự c phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung TCVN 11134 (ISO 22174), Vi sinh vật trong thực ph ẩ m và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa v à yêu c ầ u chung ISO 20837, M i crobiology of food and animal f eeding stu ff s - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food - borne pathogens - Requirements for sample preparation for qualitative detect i on [Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đ ể phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về chuẩn bị mẫu để phát hiện định t í nh]. VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHẢN ỨNG CHU Ỗ I POLYMERASE (PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT G Â Y BỆNH TỪ THỰC PHẨM - PHÉP THỬ HIỆU NĂNG ĐỐI VỚI MÁY CHU TRÌNH NHIỆT Microbiology of food and animal f eeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Per f ormance testing for thermal cyclers CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có th ể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. T i êu chuẩn này không đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc s ử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng hoặc các gi ớ i hạn quy định trư ớ c khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này đưa ra các yêu cầu cơ b ả n đ ố i với việc lắp đặt, vận hành và bảo dư ỡ ng máy chu trình nhiệt. Máy chu trình nhiệt là thiết bị có độ bền cao, nhưng vẫn cần được bảo dưỡng định kì. Những bộ phận làm lạnh/nóng, sử dụng công nghệ Pe l tier hay công nghệ khác, đều có thời hạn sử dụng nhất định. Việc vận hành tốt các yếu tố gia nhiệt/làm nguội phụ thuộc đồng thời vào chất lượng của thiết bị gia nhiệt/làm nguội và cách sử dụng và b ả o trì hợp lý. Ngoài ra, để đưa ra yêu cầu cho một chương trình bảo dưỡng rõ ràng, xem Phụ lục A và B về các quy trình xác định hiệu năng của máy chu trình nhiệt bằng các phương pháp sinh hóa và vật lý. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau l à rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đ ố i với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đ ố i với các t à i liệu viện dẫn không ghi năm công b ố thì áp dụng phiên b ả n mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi ( nếu c ó ). TCVN 11134 (ISO 22174), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để p h át hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực ph ẩ m - Định nghĩa và yêu cầu chung. TCVN ISO/IEC 17025, Yêu cầu chung về năng lực của phòng thử nghiệm và hiệu chu ẩ n. 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 3.1 . Nắp nóng (Heate d lid) Tính năng tùy chọn của máy chu trình nhiệt, được sử dụng để ngăn chặn mẫu bay hơi. 3.2 . Độ ổn đồng đều nhiệt ( temperature uniformity) Sự đồng đều nhiệt độ trong bộ phận ki ể m soát nhiệt (ví dụ: hộp làm nóng). 3.3 . Kiểm tr a hiệu năng sinh hóa (biochemical per f ormance test) Quy trình kiểm tra xác định hiệu năng của máy chu trình nhiệt bằng các biện pháp sinh hóa (ví dụ: PCR nhạy nhiệt). 3.4. Kiểm tra hiệu năng vật lý (physical performance test) Quy trình kiểm tra xác định hiệu năng của máy chu trình nhiệt bằng các các biện pháp vật lý. 3.5 . Hệ thống PCR không ổn định ( non-robust PCR system) Hệ thống PCR, trong đó có một vài sai lệch nhỏ về hóa chất chạy PCR hoặc nhiệt đ ộ PCR so với quy định dẫn đến việc khuếch đại kém hiệu qu ả . 3.6. Vị tr í tới hạn (critical positions) Vị trí hay khu vực m à sai lệch nhiệt độ mẫu thử so với nhiệt độ hiển thị dễ x ả y ra hơn so với những khu vực khác trong giá đỡ mẫu của máy chu trình nhiệt. 4. Lắp đặt máy chu trình nhiệt Tuân thủ hướng dẫn của nh à sản xu ấ t. Những nội d ung dưới đây cần được xem xét: a) Máy chu trình nhiệt phải được lắp đặt và sử dụng ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp; b) Máy chu trình nhiệt phải được đặt ở nơi: - Có thể nhìn đ ể kiểm tra được; - Cho phép trao đổi nhiệt ổn đ ị nh với môi trường xung quanh và không khí lưu th ô ng tự do; - Có môi trường ổn định. 5. Bảo dưỡng máy chu trình nhiệt Phòng thử nghiệm cần thiết lập và thực hiện chương trình bảo dư ỡ ng cụ thể cho từng máy chu trình nhiệt, dựa trên nhật k í sử dụng hoặc số lần chạy. 6. Kiểm tra hiệu năng 6.1 . Yêu cầu chung Kiểm tra hiệu năng của t ừ ng máy chu trình nhiệt phải được thực hiện v à ghi chép lại sử dụng gián t iếp phương pháp kiểm tra hiệu năng sinh hóa hay trực tiếp phương pháp ki ể m tra hiệu năng vật lý. 6.2 . Ki ể m tra hiệu năng bằng sinh hóa Cần thực hiện quy trình sinh hóa để kiểm tra hiệu n ă ng má y chu trình nhiệt, có thể sử dụng phương pháp PCR không ổ n định nhạy nhiệt. V í dụ về phương pháp thích hợp được nêu trong Phụ lục A. Có thể sử dụng phương pháp PCR bất kỳ khác nếu đáp ứng được tất cả các yêu cầu. Tần suất kiểm tra hiệu năng phải dựa trên số giờ sử dụng hoặc số lần chạy của từng máy chu trình nhiệt. 6.3 . Kiểm tra hiệu năng vật lý Cần thực hiện quy trình vật lý đ ể kiểm tra hiệu năng đ ể đo nhiệt độ thực của mẫu tại mỗi giếng trong chu trình nhiệt độ và để so sánh với nhiệt độ hiển thị. Ví dụ về phương pháp thích hợp được nêu trong Phụ lục B. Cần kiểm tra hiệu năng vật lý nếu việc kiểm tra hiệu năng sinh hóa trước đó chưa thực hiện hoặc việc kiểm tra hiệu năng sinh hóa cho thấy khuếch đại kém hiệu qu ả . Tần suất kiểm tra hiệu năng phải được dựa trên số giờ sử dụng hoặc số lần chạy của từng máy chu trình nhiệt. 7. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm ít nhất ph ả i bao gồm các thông tin sau đây: - số nhận biết máy chu trình nhiệt; - viện dẫn tiêu chuẩn này và Phụ lục được sử dụng cho thử nghiệm; - ngày thử nghiệm; - người chịu trách nhiệm phân tích; - kết quả th ử nghiệm; - tất cả nh ữ ng điểm cần lưu ý trong quá trình thử nghiệm; - mọi sai lệch, thêm vào hay lược bớt so với quy định của phép thử; - tất cả những thông tin có liên quan đến thử nghiệm cụ th ể . Phòng thử nghiệm ph ả i lưu giữ hồ sơ quy trình tại chỗ để có thể nhận d iện và ghi lại những bất thường liên quan đến hiệu năng máy chu trình nhiệt (xem thêm TCVN ISO/IEC 17205). PHỤ LỤC A (Tham khảo) KIỂM TRA HIỆU NĂNG SINH HÓA - PHƯƠNG PHÁP PCR KIỂM TRA ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA NHIỆT ĐỘ A.1 . Yêu cầu chung Phương pháp này k i ể m tra xác nhận độ chính xá c nhiệt độ gắn mồi của máy chu trình nhiệt. Phép kiểm tra này nhạy với sự tăng nhiệt độ gắn mồi thật tương quan với nhiệt độ hiển thị trong một chu trình nhiệt độ xác định. A.2 . Nguyên tắc Độ chính xác của nhiệt độ đặt sẵn/hi ể n thị được kiểm tra bằng PCR được thiết kế riêng. Các mẫu PCR rất nhạy với nhiệt độ gắn mồi vượt quá mức trong chu trình nhiệt độ. Một trình tự ADN 362 cặp base , trong đó có vị trí đích cho PCR, được tạo ra bằng việc khuếch đại vùng biên của vị trí trong véc tơ pGEM với cặp mồi giải mã M13 chuẩn. Đoạn gen nhân b ả n được nêu trong Hình A.1. Hình A.1. - M ẫ u và trình tự m ồ i đư ợ c dùng tr ong kiểm tra hiệu năng của máy chu trình nhiệt Trình tự của sản phẩm PCR được tạo ra bằng việc dùng các mồi M13 (gạch chân 2 lần) trong quá trình khuếch đại trình tự đích từ plasmid pGEM (pSC17 1) ) sửa đổi. Các mồi được dùng trong hệ thống th ử nghiệm để đánh giá máy chu trình nhiệt được tô đậm và trình bày riêng (VAL1 và VAL2, xem A.3.5.3 và A.3.5.4). Trình tự sản phẩm PCR được tạo ra trong quá trình kiểm tra hiệu năng chu trình nhiệt được gạch chân. Những chỗ không phù hợp được in đậm. Các mồi VAL1 và VAL2 cho ra sản phẩm PCR có độ dài 116 cặp base và được nhận bi ế t bằng điện di gel agarose. Do sự không phù hợp tại đầu 3’ của mồi VAL1, mà PCR nhạy với nhiệt độ gắn mồi vượt quá b ì nh thường so với nhiệt độ xác định. Khi vượt quá dải từ 63 o C đến 66 o C có thể dẫn tới việc khuếch đại kém hiệu quả và không thể phát hiện sản phẩm PCR 116 cặp base. Các mẫu phải được đặt tại các vị trí đại d iện cho vùng nhiệt độ có thể kiểm soát được, bao gồm các vị trí tới hạn. Trong trường hợp không biết vị trí tới hạn, các mẫu phải được để ở vị trí trung tâm v à các góc [1] . Ví dụ về máy chu trình nhiệt có 96 giếng được nêu trong Hình A.2. A.3 . Chất phản ứng Ch ỉ dùng các ch ấ t phản ứng tinh khiết phân tích để dùng cho với các phương pháp xác định sinh học phân tử. A.3.1 . Nước Đối với các phản ứng khuếch đại, luôn sử dụng nước không có ADNse và RNase. Những loại nước siêu tinh khiết thích hợp có bán sẵn trên thị trường. A.3.2 . Dung dịch đệm PCR (không có MgCI 2 ), 10x (150 mmol/l TRIS, pH 8; 500 mmol/ l KCI). A.3.3 . Dung dịch MgCl 2 , c(MgCI 2 ) = 25 mmol/l. A.3.4 . Dung d ị ch dNTP, c(dNTP) = 10 mmol/l (cho mỗi nucletotide). A.3.5 . Oligonucleotide Oligonucleotide cần phải t i nh sạch sau khi t ổ ng hợp. A.3.5.1 . Mồi xuôi đ ể thiết lập trình tự đích 362 cặp base Véc tơ nhân bản thực khuẩn M13mp8 (GenBank No. M77826.1). Mồi M13(-26): 5 ’ -CAg gAA ACA gCT ATg AC-3 ’ . A.3.5.2 . Mồi ngược để thiết lập trình tự đích 362 cặp base Véc tơ nhân b ả n thực khuẩn M13mp8 (GenBank No. M77826.1). Mồi M13(-20): 5’-gTA A AA CgA Cgg CCA gT-3 ’ A.3.5.3 . M ồ i xuôi đ ể kiểm tra nhiệt độ gắn mồi của máy chu trình nhiệt Cấu trúc tổng hợp: Mồi VAL1: 5’-gAT ACA gAA ACA TCg gTT ggC-3 ’ A.3.5.4 . Mồi ngược để ki ể m tra nhiệt độ gắn mồi của máy chu trình nhiệt Cấ u trúc tổng hợp: Mồi VAL2: 5 ’ -gTg TAA CTT gAT gCC ATC Agg-3’ A.3.6 . Plasmid pSC17 1) A.3.7 . ADN-polymerase ổ n định nhiệt (dành cho PCR kh ở i động nóng), 5U/ m l. A.3.8 . Agarose, phù hợp cho việc điện di v à chia tách ADN theo kích c ỡ mong muốn. A.3.9 . Axit boric (H 3 BO 3 ), chỉ dùng cho dung dịch đệm T B E. A.3.10 . Bromophenol xanh (C 1 9 H 9 Br 4 O 5 SNa) và/hoặc xylen cyanole FF (C 25 H 27 N 2 O 6 S 2 Na). A.3.11 . Axit axetic băng (CH 3 COOH), ch ỉ dùng cho dung dịch đệm TAE. A.3.12 . Muối axit etylen diamin tetraaxetic dinatri (Na 2 -EDTA) (C 10 H 1 4 N 2 O 8 Na 2 ). A.3.13 . Et i d i bromua (EtBr) (C 21 H 2 0 N 3 Br). A.3.14 . Glyxerol (C 3 H 8 O 3 ). A.3.15 . Natri axetat (CH 3 COONa), chỉ dùng cho dung dịch đệm TAE. A.3.16 . Axit clohydric (HCI). A.3.17 . Natri hydroxit (NaOH). A.3.18 . Tris (hydroxymethyl) aminometan (TRIS) [NH 2 C ( CH 2 OH) 3 ]. A.3.19 . Dung dịch đệm TAE , 1x, c (TRIS) = 0,050 mol/l, c ( CH 3 COONa) = 0,020 mol/l, c (Na 2 -EDTA) = 0,001 mol/ l . Chỉnh pH đến 8,0 bằng axit axetic băng hoặc natri hydroxit. Dung dịch đệm TAE có thể được chuẩn bị dưới dạng dung dịch gốc đậm đặc 10x. Nếu dung dịch xuất hiện dạng kết tủa, thì không tiếp tục sử dụng. Dung dịch đậm đặc phải được pha loãng với nước (A.3.1). A.3.20 . Dung dịch đệm TRIS/borat (TBE), 0,5x, c (TRIS) = 0,055 mol/l, c (H 3 B O 3 ) = 0,055 mol/l , c (Na 2 -EDTA) = 0,001 mol/l. Chỉnh pH đến 8,0 bằng axit clohydric hoặc natri hydroxit. Dung dịch đệm TBE có th ể được chuẩn b ị dưới dạng dung dịch gốc đậm đặc 10x. Nếu dung dịch xuất hiện dạng kết tủa thì không tiếp tục sử dụng. Dung dịch đậm đặc phải được pha loãng với nước (A.3.1). A.3.21 . Dung dịch đệm đ ể chạy m ẫ u, 5x, f ( glycerol) = 50 %, r (xanh bromopheno l ) = 2,5 g/l và/hoặc r (xylen cyanole FF) = 2,5 g/l, hòa tan vào dung dịch đệm điện di (A.3.19 hoặc A.3.20). A.3.22 . Dung dịch etidi bromua , r ( EtBr) = 0,5 mg/l. Dung dịch etidi bromua phải được bảo quản ở nồng độ đậm đặc (ví dụ 10 mg/ml) ở 5 o C ở nơi tối. LƯU Ý: EtBr là chất có khả năng gây bi ế n đổi gen, ung thư và gây quái thai. Sử dụng găng tay và mặt nạ khi sử dụng EtBr. N ế u đ ượ c, phải làm việc trong t ủ hốt . EtBr phải được xử lí đúng cách dưới dạng chất th ả i hóa học. Dung dịch gốc phải được chuẩn bị bằng cách cho một lượng nước vừa đủ vào lọ chứa EtBr bột, hoặc EtBr viên có khối lượng phù hợp. Bảo quản dung dịch EtBr tránh ánh sáng trong quá trình hòa tan. Hòa tan chậm ở nhiệt độ phòng bằng cách t rộn đều t ừ từ. Không được đun nóng. A.3.23 . Ch ấ t chuẩn khối l ượ ng phân tử ADN , ví dụ chế phẩm thương mại có các đoạn ADN có độ dài từ 100 cặp base đến 200 cặp base. A.4 . Thiết bị, dụng cụ A.4.1 . Máy chu trình nh iệ t A.4.2 . Lò vi sóng hoặc n ồ i cách thủy đun sôi. A.4.3 . Thiết bị điện di gel thạch agarose , với các phụ kiện và nguồn điện. A.4.4 . Đèn cực tím hoặc đèn điện , làm việc ở bước sóng 312 nm. A.4.5 . Bộ phận ghi , v í dụ như hệ thống chụp ảnh v ớ i film ASA 3000 hay bộ lọc UV phù hợp với huỳnh quang của EtBr, hoặc hệ thống quay phim với m á y quay CC D , bộ lọc UV và ph ầ n mềm phân tích định lượng (tùy chọn). A.5 . Cách tiến hành A.5.1 . Chuẩn bị trình tự đích 362 cặp base A.5.1.1 . Cà i đặt PCR Nồng độ cuối cùng thích hợp của các chất phản ứng được nêu trong B ả ng A.1. Phương pháp này sử dụng thể t í ch PCR cuối cùng là 50 m l cho một phản ứng. Bảng A.1 - Thành phần của Mastermix (PCR-mix) Chất phản ứng Nồng độ cu ối c ù ng Th ể tích từng m ẫ u ( m l) Plasmit pSC17 10 000 bản sao ~ 6 pg 2,0 Nước 31,8 Dung dịch đệm PCR 10x (không có MgCI 2 ) 1x 5,0 Dung dịch MgCI 2 a , 25 mmol/l 2,5 mmol/l 5,0 Dung dịch dNTP, 10 mmol/l 0,2 mmol/l 1,0 Mồi M13 (-26), 5 m mol/l 0,25 m mol/l 2,5 Mồi M13 (-20), 5 m mol/l 0,25 m mol/l 2,5 Taq-ADN-polymerase, 5 U/ m l 1 đơn vị cho một phản ứng 0,2 a Nếu dung dịch đệm PCR chứa sẵn MgC l 2 , thì n ồ ng độ cuối c ù ng của MgC l 2 trong hỗn hợp phản ứng phải được điều ch ỉ nh cho đúng 2,5 mmol/l. A.5.1.2 . Chương trình thời gian nhiệt độ Chương trình thời gian nhiệt độ được nêu trong Bảng A.2. Chương trình này có th ể được thay đổi theo kiểu loại máy chu trình và/hoặc enzym sử dụng. Bảng A.2 - Chương trình thời gian nhiệt độ Biến tính ban đ ầ u 2 min/95 o C Khuếch đại 10 s/95 o C 30 s / 45 o C 20 s/72 o C Số chu trình 40 Kéo dài cuối cùng 2 min/72 o C A.5.1.3 . T i nh sạch sản phẩm PCR và xác định kết quả Một lượng 5 m l của sản ph ẩ m PCR được tách bằng điện di trên gel agarose và được nhuộm với etidi bromua để hiển thị sản ph ẩ m PCR. Số thể tích sản phẩm còn lại sẽ được tinh sạch và kết quả được xác định bằng đo quang phổ hoặc phương pháp phù hợp bất kỳ [2] . A.5.1.4 . Chuẩn b ị các nồng độ khuôn mẫu Từ k ế t quả sản phẩm PCR, số b ả n sao đoạn gene 362 cặp base được tinh bằng các quy trình chuyển đổi tiêu chuẩn. Các sản phẩm PCR được chuẩn bị trong nước ở 3 dung dịch có nồng độ khác nhau: 1 000 bản sao/ m l , 100 bản sao/ m l và 10 bản sao/ m l. Các nồng độ ADN đích được mã h ó a như sau: - a = 1 000 bản sao/ m l (tương ứng với 5 000 bản sao cho một PCR); - b = 100 bản sao/ m l (tương ứng với 500 bản sao cho một PCR); - c = 10 bản sao/ m l (tương ứng với 50 bản sao cho một PCR). A.5.2 . Kiểm tra máy chu trình nhiệt A.5.2.1 . Cài đặt PCR Phương pháp này sử dụng thể tích PCR cuối cùng là 50 m l cho một phản ứng. Chất phản ứng và nồng độ cuối được nêu trong B ả ng A.3. Sử dụng ít nhất 16 phản ứng PCR cho máy chu trình nhiệt 96 giếng. Cài đặt PCR như sau: - chuẩn bị hỗn hợp PCR; - chia hỗn hợp PCR ra làm 3 phần và 1 kiểm soát âm t í nh; - thêm ADN đích ở 3 nồng độ khác nhau vào 3 phần để tạo hỗn hợp đích PCR. - chia mỗi hỗn hợp đích PCR ra làm 5 phần sao chép và đưa tất c ả v à o đĩa đựng mẫu trong máy chu trình nhiệt ở những vị trí xác định. B ả ng A.3 - Ch ấ t phản ứng b ổ sung Thuốc th ử Nồng độ cu ố i cùng Thể tích cho một mẫu ( m l ) Th ể tích khuy ế n cáo cho 16 mẫu ( m l) Nước 24,78 401,48 b Dung d ịch đệm PCR 10x (không ch ứ a MgCl 2 ) 1x 5,0 80,0 Dung dịch MgCI 2 a , 25 mmol/l 3 mmol/l 6,0 96,0 Dung dịch dNTP, 10 mm o l/l 0,2 mmol/l 1 , 0 16 , 0 Mồ i VAL1, 5 m mol / l 0,4 m mol / l 4,0 64,0 Mồi VAL2, 5 m mol / l 0 , 4 m mol / l 4 , 0 64 , 0 Taq-ADN-polymerase, 5 U/ m l 1,1 đơn vị cho một phản ứng 0,22 3 , 52 a Nếu dung dịch đệm PCR đ ã chứa MgCl 2 , th ì nồng độ cuối cùng của MgCl 2 trong h ỗ n hợp ph ả n ứn g phải đ ược đi ề u ch ỉ nh đến 3 mmol/I. b Thay nước cho 16 ph ả n ứng và 5 m l cho kiểm chứng dương (5 m l khuôn mẫu được thay thế bởi 5 m l nước). Chia hỗn hợp PCR vào 3 phần, mỗi phần 225 m l và 1 mẫu 50 m l k i ể m soát âm t í nh (NTC). Thêm vào phần thứ nhất 25 m l ADN đích ở nồng độ “a ” chứa 1 000 bản sao/ m l, phần thứ hai thêm 25 m l ADN đích ở nồng độ “b ” chứa 100 b ả n sao/ m l, và cho phần thứ ba thêm 25 m l ADN đích ở nồng độ “c” chứa 10 bản sao/ m l và trộn cẩn thậ n . Chuẩn bị 5 phản ứng 50 m l cho từng hỗn hợp và đặt vào trong máy chu trình nhiệt theo sơ đồ ở Hình A.2. Hình A.2 - Sơ đồ các ống PCR để kiểm tra máy chu trình nhiệt 96 giếng A.5.2.2 . Chương trình thời gian nhiệt độ Chương trình thời gian nhiệt độ nêu trong Bảng A.4. Bảng A.4 - Chương trình thời gian nhiệt độ Biến tính ban đầu 2 min/95 o C Khuếch đại 10 s/95 o C 20 s/63 o C 20 s/72 o C Số chu trình 40 Kéo dài cuối cùng 5 min/72 o C A.5.3 . Phát hiện A.5.3.1 . Yêu cầu chung Các s ả n ph ẩ m PCR được nhận biết bằng điện di. Sử dụng d ung dịch đệm TAE hoặc TBE cho chạy điện di. S ử d ụng cùng một loại dung dịch đệm để hòa tan agarose v à đ ổ vào giá điện di. A.5.3.2 . Chuẩn bị thạch agarose, điện di và nhuộm C â n một lượng agarose thích hợp (A.3.8) trộn với dung dịch đệm điện di (A.3.19 hoặc A.3.20) để có được nồng độ cuối cùng ρ = 20 g/l. Lớp gel không được dày quá 1cm. Trộn 5 m l từng s ả n phẩm PCR với khoảng 1 m l d u ng dịch đệm để chạy mẫu (A.3.21) và cho vào gel. Cho marker khối lượng phân tử vào một giếng riêng. Tiến hành điện di ở nhiệt độ phòng. Sử dụng điện thế phù hợp để giữ điện thế ổn định tối đa l à 5 V/cm giữa cá c điện cực. Sau khi điện di hoàn tất, ủ gel ít nh ấ t 30 min trong dung dịch etidi bromua (A.3.22) ở nhiệt độ phòng , ở nơi tối. Có thể sử d ụ ng các phương pháp nhuộm gel agarose khác nếu cho kết quả tương đương. Chuyển thạch gel vào để soi bằng đèn cực tím (A.4.4). Bật đèn cực tím và ghi lại huỳnh quang của ADN bằng việc chụp ảnh hoặc quay phim. A.6 . Diễn giải kết qu ả Kích thước của sản phẩm PCR được xác định bằng cách so sánh với các đoạn trong ch ấ t chuẩn khối lượng phân tử ADN (A.3.23) Nếu trong tất cả các mẫu thử phát hiện được sản phẩm khuếch đại là các cặp base 116, th ì sai số nhiệt độ gắn mồi ở 63 o C là nhỏ hơn 3 o C. Nếu không thấy sản phẩm nào, th ì hoặc là có sự vư ợ t quá nhiệt độ hoặc biến tính không đ ủ . Cả hai trường hợp này là do việc kiểm soát chương trình nhiệt độ trong máy chu trình nhiệt không được t ố t. Việc diễn giải kết quả được nêu trong Bảng A.5. Bảng A.5 - Diễn giải kết quả Số lượng b ả n sao Hiệu n ă ng ch ấ p nhận được: s ả n ph ẩ m phát hiện thấy Hiệu năng không chấp nhận đ ược: sản phẩm không phát hiện 5 000 5 trên 5 < 5=""> ê n 5 500 5 trê n 5 < 5="" trên=""> 50 £ 5 trên 5 a a Các phản ứng với 50 bản sao cho 1 phản ứng c ó thể cho ra các dải ADN nhạt Trong trường hợp kết quả hiệu năng không chấp nhận được (xem b ả ng A.5), thì cần kiểm tra lại. Nếu kết quả được xác nhận, th ì hiệu năng của máy chu trình nhiệt l à c ó vấn đề và thiết bị phải được kiểm tra hiệu năng vật lý. PHỤ LỤC B (Tham khảo) KIỂM TRA HIỆU NĂNG VẬT LÝ B.1 . Yêu c ầ u chung Đây là phương pháp để kiểm tra chính xác nhiệt độ máy chu trình nhiệt trong các điều kiện hoạt động. Việc kiểm tra này ghi lại nhiệt độ chất lỏng trong ống mẫu. B.2 . Nguyên tắc Nhiệt độ được đo bằng cặp nhiệt điện hay thiết bị khác có khả năng đo được nhiệt độ ở trong lọ có chứa nước. Quy trình kiểm tra vật lý được tiến hành trong các điều kiện đang chạy PCR. Theo đó thì quá trình kiểm tra sẽ bao gồm loạt 3 cấp độ nhiệt độ được s ử d ụng để biến t í nh, g ắ n mồi và kéo d ài mồi. Nếu như máy chu trình nhiệt có nắp đậy, th ì việc đo phải tiến hành khi nắp được đậy. B.3 . Chất phản ứng B.3.1 . Nước B.4 . Thiết bị, dụng cụ B.4.1 . Máy chu trình nhiệt B.4.2 . Thiết bị ghi nhiệt độ : đầu dò ghi nhiệt độ, dây dẫn v à các thiết bị đo nhiệt độ. Định kỳ hiệu chuẩn bộ phận đo nhiệt độ đ ố i với dải nhiệt độ sử dụng. B.5 . Cách tiến hành B.5.1 . Bố trí phép thử Đặt đầu dò nhiệt độ tại các vị trí đại diện cho dải kiểm soát nhiệt độ. Việc chọn v ị trí t ớ i hạn phải được cân nhắc c ẩ n thận. Khi không xác định được vị trí tới hạn thì đặt ngẫu nhiên các cảm biến trong các giếng. V í dụ : Đối với máy chu trình 96 giếng, chia số giếng thành 6 vùng bằng nhau. Đặt í t nh ấ t 2 đ ầ u d ò nhiệt đ ộ t ại mỗi vùng. Do đ ó có ít nh ấ t 12 điểm nhiệt độ được ghi [ 1 ] . B. 6. Ghi các giá trị nhiệt độ C ầ n cài đặt tần suất ghi nhiệt độ sao cho ít nhất 1 giá trị nhiệt độ được g h i lại cho một vị trí trong một giây [1] . Tối thiểu, thực hiện đo trong ba lần chạy máy liên tục, mỗi l ầ n í t nhất 30 chu trình. Cho mỗi vị trí kiểm tra, tính trung bình giữa điểm nhiệt độ cao nh ấ t và thấp nhất ở điểm thời gian t o ( điểm thời gian khi chương trình nhiệt độ bắt đ ầ u) và t x (điểm thời gian lúc chương trình nhiệt độ kết thúc) cho các bước biến tính, gắn mồi và kéo d ài [ 1 ] . B.7 . Giải th í ch kết qu ả Khảo sát nghiên cứu nhiệt độ ở vị trí cao nhất và thấp nhất. Cả 2 nhiệt độ này phải hoặc nằm trong dải nhiệt độ ghi của máy hoặc nếu không có quy định về độ ch í nh xác của nhiệt độ, thì không được sai lệch l ớ n hơn 0,5 o C so với nhiệt độ chương trình. Nhiệt độ phải nằm trong d ả i quy định đ ố i với mỗi bước trong chu trình và trong quá trình chạy. Không sử dụng các máy chu trình nhiệt không đảm bảo được các đi ề u kiện trên. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] SCHODER D., SCHMAL W IESER A., SCHAUBERGER G ., KUHN M., HOORFAR J. and WAGNER M. Physical characteristics of six new thermocyclers. Clin. Chem., 49 , 6, 2003, pp. 960-963 [2] HEATON P.A. Quantification of total DNA by spectroscopy. In: Analytical Molecular Biology: Quality and Validation , ed. Sauders G. S and Parker H.C., RCS publications, 1999, UK 1) Đây là v í d ụ v ề s ả n ph ẩ m thich hợp có bán s ẵn . Thông tin này đ ược đưa ra để t hu ậ n tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn m à không ấn định sử dụng sản ph ẩ m n à y. Các sản ph ẩ m tương tự có thể được sử dụng nếu cho kết qu ả tương đương.