TCVN11133:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11133:2015 (ISO 22119:2011) về Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase real-time (pcr real-time) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi. Phản ứng chuỗi polymerase real-time (pcr real-time) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm. Định nghĩa và yêu cầu chung TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11133:2015 ISO 22119:2011 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE REAL-TIME (PCR REAL-TIME) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM - ĐỊNH NGHĨA VÀ YÊU CẦU CHUNG Microbiology of food and animal f eeding stuffs - Real-time polymerase c hain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - General requirements and de f initions Lời nói đầu TCVN 11133:2015 hoàn to à n tương đương với ISO 22119:2011; TCVN 11133:2015 d o Ban kỹ thuật tiêu chu ẩ n quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và l ấ y mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và C ô ng nghệ công bố. Lời giới thiệu PCR là phương pháp nhanh, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm . Những tiến bộ về kỹ thuật của phương pháp PCR cho phép phát hiện các sản phẩm PCR đặc hiệu thông qua quá trình khuếch đại. Nguyên lý chủ yếu dựa vào sự kích th í ch huỳnh quang trong quá trình PCR. Tiêu chuẩn này nằm trong bộ tiêu chuẩn với tên chung là Vi sinh vật trong thực ph ẩ m và thức ăn chăn nuôi - Phản ứ ng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm: TCVN 7682 ( I SO 20838), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp định tính TCVN 10781 (ISO/TS 13136) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện vi sinh vật g â y bệnh trong thực phẩm bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thời gian thực - Phát hiện Escherichia coli sinh độc tố Sh i ga (STEC) và xác định c á c nhóm huyết thanh O 157, O 111, O 26, O 103 và O 145 TCVN 11131 (ISO/TS 20836), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Phép thử hiệu năng đối với máy chu trình nhiệt TCVN 11132 (ISO 22118) Vi sinh vật trong thực phẩm và th ứ c ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện và định lượng vi sinh vật g â y bệnh từ thực phẩm - Đặc tính hiệu năng TCVN 11133 (ISO 22119), Vi sinh vật trong thực ph ẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase real-time (PCR real-time) đ ể phát hiện và định lượng vi sinh v ật g â y bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung TCVN 11134 (ISO 22174), Vi sinh vật trong th ự c phẩm và thức ă n chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung ISO 20837, Microbiology of food and animal f eeding stuffs - Polymerase c hain reaction (PCR) for the detection of food-bo rn e pathogens - Requirements for sample preparation for qualitative detection [Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về chu ẩ n bị mẫu để phát hiện định tính]. VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE REAL-TIME (PCR REAL-TIME) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM - ĐỊNH NGHĨA VÀ YÊU CẦU CHUNG Microbiology of food and animal f eeding stuffs - Real-time polymerase c hain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - General requirements and de f initions 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này đưa ra các thuật ngữ về việc phát hiện c á c vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm v à các ch ủ ng phân lập được từ thực phẩm bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Tiêu chuẩn này cũng quy định các yêu cầu đối với việc khuếch đại và phát hiện các tr ì nh tự nucleotide (ADN và ARN sau khi phiên mã ngược) bằng phản ứng PCR real-time. Những yêu cầu tối thiểu trong tiêu chuẩn này đưa ra các kết quả mang tính so sánh và lặp lại trong các phòng thử nghiệm riêng lẻ và giữa các phòng thử nghiệm khác nhau. Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng để phát hiện các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm trong mẫu môi trường và mẫu thức ăn chăn nuôi. CHÚ THÍCH: C á c v í dụ đưa ra ở đây được dùng thường xuyên tại thời điểm xây dựng tiêu chuẩn này. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm c ả các sửa đổi (nếu có). TCVN 7682 (ISO 20838) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu c ầ u về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp đ ị nh tính TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), Vi sinh v ật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứ ng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung. 3 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chu ẩ n này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau: 3.1 Phản ứng chuỗi polymerase real-time (Real-time polymerase c hain reaction) Quá trình enzym kết h ợ p phản ứng khuếch đại in v i tro của các đoạn ADN đặc hiệu thông qua quá trình biến tính, bắt cặp của các mồi đặc hiệu và t ổ ng hợp ADN bằng việc phát hiện các sản phẩm PCR đặc hiệu trong quá trình khuếch đại. CH Ú THÍCH 1: Nh ì n chung hỗn hợp phản ứng khuếch đại ch ứ a một hay nhiều m ẫ u d ò ADN đặc hiệu cùng với một hoặc nhiều màu huỳnh quang. B ằ ng kỹ thuật này , tín hiệu được tạo ra sau quá trình lai đặc hiệu của các mẫu dò với trình tự nucleotide đích và phát huỳnh quang ở các bước sóng xác định. CHÚ THÍCH 2: Việc sử dụng các ch ấ t hu ỳ nh quang có gắn ADN kh ô ng đặc hiệu có thể được dùng nếu các kết quả dương tính được kiểm tra theo TCVN 7682 (ISO 20838). 3.2 S ả n phẩm PCR (PCR pro d uct) ADN được khuếch đại bằng PCR. [ TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), 3.4.5] 3.3 Chuy ể n năng lượng cộng hưởng huỳnh quang ( f luorescence resonance energy trans f er) â y bệnh từ thực phẩm bằng PCR> Việc chuyển năng lượng phụ thuộc vào khoảng cách từ phân tử cho sang phân tử nhận khiến cho lượng huỳnh quang của phân t ử nhận tăng lên sau khi p hát ra bức xạ điện t ừ có bước sóng xác định. CHÚ THÍCH: Có đ ư ợ c từ Tài liệu tham kh ả o [2]. 3.4 Phân tử phát (Reporter) 3.5 Phân tử dập tắt (Quencher) 3.6 Phân tử dập tắt không có chất huỳnh quang (dark quencher) Phân t ử được coi là nhận, không phát ra năng lượng trong dải quang phổ được phát hiện bằng quang học của máy real-time PCR. 3.7 Hoạt tính enzym 5’-3’exonuclease (enzym 5’-3’exonuclease activity) Khả năng một enzym có thể tách phân tử axit nucleic lai theo hướng 5’-3’, ví dụ polymerase axit nucleic. CHÚ THÍCH: Hoạt t í nh của enzym 5’-3’exonuclease là ADN sợi đôi đặc hiệu, phụ thuộc vào loại enzym và có thể c ó mặt trong Taq-, T t h- và T fl -polymerase. 3.8 M ẫ u dò huỳnh quang ( f luorescent probe) Các olinucleoitide hoặc analogon oligonucleotide của một trình tự xác định bắt cặp với một hoặc nhiều phân tử huỳnh quang. CHÚ THÍCH: B ấ t cứ hệ thống phát tín hiệu huỳnh quang nào sau khi lai đặc hiệu v ớ i trình tự axit nucleic đ í ch có th ể được phát hiện bằng thiết b ị đặc hiệu được dùng như một mẫu dò huỳnh quang. 3.9 M ẫ u d ò thủy giải (hydrolysis probe) Mẫu dò huỳnh quang bắt cặp với hai phân tử huỳnh quang được chia tách trong không gian bởi hoạt tính của enzym 5’-3’exonuclease trong quá trình khuếch đại. CHÚ TH Í CH: Nguyên lý của mẫu d ò th ủ y gi ả i được minh họa ở Hình 1. a) Mẫu dò chưa được lai trong dung dịch b) Sự phân tách của mẫu dò đã được lai c) M ẫ u dò đ ã tách (cleaved probe) tạo thành trong phân tử phát huỳnh quang sau khi k í ch thích CHÚ D Ẫ N: 1 Cơ ch ấ t ADN 3 Phân t ử dập tắt 2 Phân tử huỳnh quang (phân tử phát) 4 Enzym Hình 1 - Nguyên tắc của mẫu dò thủy giải 3.10 M ẫ u d ò lai (hybridization probe) Hệ thống gồm hai mẫu dò huỳnh q u ang bắt cặp với một phân t ử huỳnh quang, trong đó một phân tử là huỳnh quang cho và một phân tử làm huỳnh quang nhận. CHÚ THÍCH: Nguy ê n tắc của m ẫ u dò lai được minh họa trong H ì nh 2. a) M ẫ u dò ch ư a được lai trong dung d ị ch b) M ẫ u dò đã được lai tạo thành trong huỳnh quang nhận CH Ú D Ẫ N: 1 Cơ ch ấ t ADN 2 Phân t ử nhận 3 Phân tử cho H ì nh 2 - Nguyên tắc của m ẫ u dò lai 3.11 M ẫ u dò dạng kẹp tóc (molecular beacon) M ẫ u dò huỳnh quang bao gồm ba phần khác nhau: phần trung tâm b ổ sung trình tự acid nucleic đích, cộng với đầu 5’ và đầu 3’ là bổ sung, phân tử phát và phân t ử dập tắt được gắn vào hai đầu mút của mẫu d ò . CHÚ THÍCH: Nguyên lý của tín hiệu phân tử được minh họa ở Hình 3. a) M ẫ u dò dạng kẹp tóc không lai trong dung dịch b) M ẫ u d ò dạng kẹp tóc tạo thành trong phân tử phát huỳnh quang CHÚ D Ẫ N: 1 Cơ chất A D N 2 Phân tử huỳnh quang (phân tử phát) 3 Phân tử dập tắt H ì nh 3 - Nguyên tắc của mẫu dò dạng kẹp tóc 3.12 M ẫ u dò phát hiện trình tự ADN vi sinh vật gây bệnh đặc hiệu ( probe for detection of a specitic pathogen DNA sequence) M ẫ u dò với một trình tự bổ sung vào ADN vi sinh vật gây bệnh có phân tử phát ra tín hiệ u với bư ớ c sóng xác đ ị nh và được phát hiện bằng hệ thống phát hiện quang học. 3.13 M ẫ u dò phát hiện tr ì nh tự axit nucleic kiểm soát bên trong (probe for detection of an inte rn al control nucleic acid sequence) Mẫu dò với phân tử phát huỳnh quang được thiết kế để xác nhận quá trình khuếch đại CHÚ THÍCH 1: M ẫ u dò phát ra tín hiệu sẽ phân biệt được rõ với tín hiệu của mẫu dò được thiết k ế cho việc phát hiện vi sinh v ậ t gây bệnh cụ thể. CHÚ TH Í CH 2: Việc áp dụng nội kiểm cần ph ả i sử dụng một thiết bị c ó t hể phát hiện được tín hiệu có bước sóng khác nhau. 3.14 Chu ẩ n tham chiếu (passive re f erence) Các phân tử huỳnh quang có mặt trong hỗn hợp phản ứng được dùng để chuẩn hóa t í n hiệu CH Ú TH Í CH: L à khi các phân tử huỳnh quang bắt cặp với các trình tự acid nucleic hoặc các phân tử khác không tham gia vào phản ứng. 3.15 Mức độ phát hiện huỳnh quang nền (baseline fluorescence detection level) Đường n ề n “ baseline ” Điểm mà phản ứng đạt được mức độ huỳnh quang tr ê n mức nền. 3.16 Huỳnh quang nền (background f luorescence) N ề n “backgroun d” Mức độ huỳnh quang nội tại được tạo ra từ thuốc thử và vật liệu phụ đang dùng. 3.17 Điểm cắt của chu kỳ ngưỡng (threshold cycle c rossing point) Điểm trên đường cong khuếch đại khi tín hiệu huỳnh quang tăng lên cao hơn mức ban đầu hoặc cắt tại một ngưỡng đ ã xác định trước. 4 Nguyên tắc 4.1 Yêu cầu chung Phân tích real-time PCR nhìn chung bao gồm: a) Khuếch đại trình tự đích đặc hiệu bằng PCR với sự có mặt của mẫu dò huỳnh quang b) Gắn mẫu dò hu ỳ nh quang trong mỗi chu trình khuếch đại c) Tạo ra tín hiệu huỳnh quang bằng sự kích thích trong mỗi chu trình d) Phát hiện tín hiệu huỳnh quang bằng hệ thống phát hiện huỳnh quang e) Phân tích số liệu CHÚ TH Í CH: Đối v ớ i mục đích sàng lọc, c ó th ể dùng tín hiệu huỳnh quang từ cơ chất gắn v ớ i A D N sợi đôi. 4.2 M ẫ u dò dùng cho real-time PCR 4.2.1 Sử dụng mẫu dò thủy giải Mẫu dò thủy giải là một oligonucleotide đặc hiệu có mặt trong ph ả n ứng PCR cùng với các cặp mồi PCR. Một đầu của mẫu dò này mang phân tử phát huỳnh quang (reporter) với phổ phát xạ mà bị dập tắt b ằ ng phân tử thứ hai (quencher) nằm tại một đầu còn lại. M ẫ u dò này lai với trình tự acid nucleic đích. Trong bước kéo dài, enzym polymerase có hoạt tính 5 ’ -3’ exonuclease bám kết mẫu dò lai. Sau khi gắn kết, reporter sẽ tách ra kh ỏ i quencher, làm tăng cường độ huỳnh quang của reporter. Tín hiệu huỳnh quang tạo thành t ỷ lệ thuận với việc tạo thành s ả n phẩm PCR đặc hiệu. Đầu 3’ của mẫu dò cần đóng để tránh bị kéo dài trong quá trình chạy PCR. 4.2.2 Sử dụng mẫu dò lai Người ta dùng 2 mẫu dò lai có mặt trong phản ứng PCR theo các oligonu cl eotide đặc hiệu thêm vào các mồi PCR. Mỗi mẫu dò này chứa một phân t ử huỳnh quang, một làm phát huỳnh quang (donor) và một làm chất nhận huỳnh quang (acceptor) lai với các trình tự axit nucleic đích. Sau khi lai, cả hai chất ở trong một khoảng cách gần sao cho việc truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang xảy ra trên bước sóng kích thích và chất nhận huỳnh quang phát hiện được tín hiệu. Tín hiệu huỳnh quang tạo ra tỷ lệ thuận với sản phẩm PCR đặc hiệu. Đầu 3’ của các mẫu dò cần đóng để tránh bị kéo dài trong quá trình chạy PCR. 4.2.3 Sử dụng m ẫ u dò dạng kẹp tóc M ẫ u dò dạng kẹp tóc là một oligonucleotide đặc hiệu có mặt trong phản ứng PCR cùng với các cặp mồi PCR. Khi các mẫu dò dạng kẹp tóc liên kết với trình tự đích bổ sung tại nhiệt độ lai, chúng trải qua quá trình chuyển đ ổ i thích nghi l à m tách ra xa. Điều này dẫn đến quá trình lai-đ í ch-mẫu dò dài hơn và ổ n định hơn so với thân. Sự phân tách reporter và quencher làm cho reporter phát tín hiệu (xem Tài liệu tham khảo [3]). Tín hiệu huỳnh quang tạo ra t ỷ lệ thu ậ n v ớ i sản phẩm PCR đặc hiệu. 5 Yêu cầu chung trong phòng thử nghiệm Y ê u cầu chung đối với phòng t hử nghiệm được quy định trong TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005). 6 Thuốc thử và vật liệu thử 6.1 Yêu cầu chung Trong quá trình phân tích, chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước tinh khiết tương đương không c ó axit nucleic và nuclease thích hợp cho phân tích sinh học phân tử. Không sử dụng các thuốc thử, ví dụ các thành phần của can h thang tăng sinh, những chất này có th ể ảnh hưởng đến việc phát hiện tín hiệu huỳnh quang của máy. Những yêu cầu cụ thể áp dụng cho từng loại th u ốc thử cụ thể đư ợ c nêu trong 6.2 đến 6.6. 6.2 ADN polymerase và chất đệm cho phản ứng 6.2.1 ADN polymerase Sử d ụng polymerase chịu nhiệt (có thể có hoạt tính phiên mã ngược) cho PCR. Enzym này nên được dùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. CHÚ TH Í CH: Enzym n à y c ó thể là t ự nhiên hoặc là enzym tái tổ hợp v ề mặt di truy ề n, đ ã được tinh sạc h . Nếu dùng mẫu dò thủy giải, thì ADN polymerase cần có hoạt t í nh exonuclease 5 ’ -3’. Trong phân tích ARN, cần sử dụng hỗn hợp phiên mã ngược và enzym ADN polymerase hoặc ADN polymerase với hoạt t í nh phiên mã ngược. Mỗi ADN polymerase cần có những điều kiện thực nghiệm khác nhau. 6.2.2 Ch ấ t đệm ph ả n ứng Chất đệm ph ả n ứng phải phù hợp với TCVN 7682:2007 (ISO 20838:2006). 6.3 Deoxyr i bonucleotide triphosphat (dNTP) dùng cho phản ứng PCR Các dNTP được sử dụng phải phù hợp với TCVN 7682:2007 (ISO 20838:2006). 6.4 M ồ i Các cặp mồi được dùng phải phù hợp với TCVN 7682:2007 (ISO 20838:2006). 6.5 M ẫ u dò huỳnh quang dùng cho real - time PCR Các oligonucleotide phải có chất lượng phù hợp, được thiết kế để phát hiện trình tự có mặt trong sản phẩm PCR đặc hiệu. Trình tự mẫu dò cần được bổ sung phù hợp với trình tự của ADN đích. 6.6 Kiểm soát khuếch đại bên trong Hiệu quả khuếch đại của mẫ u thử sẽ được kiểm tra bằng đoạn ADN kiểm chứng được bổ sung vào bình phản ứng như phần chiết ADN của mẫu th ử . Có thể dùng cùng một cặp mồi đ ể khuếch đại của đoạn ADN kiểm chứng và khuếch đại của đ í ch ADN (kiểm soát khuếch đại bên trong đồng đẳng) hoặc một cặp mồi khác (kiểm soát khuếch đại bên trong không đồng đẳng). Hệ thống đích và hệ thống kiểm soát khuếch đại bên trong cần có hiệu quả khuếch đại giống nhau. Nồng độ đoạn ADN kiểm chứng được bổ sung nên càng thấp càng tốt để có thể phát hiện được hàm lượng chất ức chế nhỏ nhất và cho kết qu ả dương tính tương tự. Ngoài ra, cần biết chắc rằng kiểm soát khuếch đại bên trong không ảnh hư ở ng đến mức phát hiện của đoạn gen đích. Những lý do sau làm giảm những tương tác không tốt đến mức độ phát hiện - Hiệu quả khuếch đại của đối chứng khuếch đại bên trong đồng đẳng hơi th ấ p hơn ADN đích; - Nồng độ mồi đối với kiểm soát khuếch đại bên trong kh ô ng đồng đẳng được giảm. Ch ất ki ể m soát khuếch đại b ê n trong có thể được đưa v à o mẫu ở giai đoạn đầu của phép phân tích và ở cùng thời gian hoạt động để kiểm soát quy trình tách chiết. 6.7 Thuốc thử để ngăn ngừa lây nhiễm chéo Ngăn ngừa nhiễm chéo theo TCVN 7682 (ISO 20838). 7 Thiết bị, dụng cụ 7.1 Yêu cầu chung Trang thiết bị phần cứng được dùng theo TCVN 11134 (ISO 22174). Phòng thử nghiệm cần sử dụng trang thiết bị phù hợp với các phương pháp sử dụng. 7.2 Các thi ế t b ị , dụng cụ cụ thể Ngoài các trang thiết bị của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ nêu trong TCVN 11134 ( ISO 22174), cần sử d ụ ng các thiết bị cụ thể như sau: 7.2.1 Máy chu trình nhiệt , được trang bị a) nguồn năng lượng phù hợp để giải phóng các phân tử huỳnh quang b) hệ thống phát hiện thích hợp để phát hiện tín hiệu huỳnh quang được sinh ra trong quá trình PCR Việc s ử dụng các kiểm chứng bên trong cần phải có những thiết bị có thể phát hiện được những tín hiệu với bước sóng khác nhau. 7.2.2 B ì nh phản ứng , nắp đậy phải chịu được việc gia nhiệt lặp lại ở nhiệt độ 100 ° C sau đó làm lạnh xuống 4 ° C m à không ảnh hư ở ng đến tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong quá trình khuếch đại. 8 Mẫu phòng thử nghiệm Chất chiết có chứa các axit nucleic tách được từ nền mẫu thích hợp v ớ i phạm vi áp dụng phù h ợ p với mẫu phòng th ử nghiệm với điều kiện đảm bảo không gây ức chế phản ứng PCR hay ảnh hư ở ng đến việc phát ra tín hiệu huỳnh quang. 9 Cách tiến hành 9.1 Chuẩn bị mẫu Việc tách chiết và/hoặc tinh sạch axit nucleic của mẫu thử cần thực hiện theo các phương pháp th í ch hợp, ví dụ ISO 20837. Dung dịch axit nucleic được tạo ra cần có đủ lượng axit nucleic đích cho phân tích định lượng và có thể phát hiện được từ 1 đến 10 vi sinh vật đích hoặc đương lượng d i truyền virus trong mẫu th ử . Phương pháp làm giàu hoặc phương pháp cô đặc virus hoặc vi sinh vật đích dùng cho phương pháp định lượng ch ỉ cần một lượng nh ỏ các đích trong mẫu thử. Dung dịch axit nucleic được tạo nên chứa ít chất ức chế mà ảnh hư ở ng đến ph ả n ứng PCR và các chất này không ảnh hưởng đến sự phát ra của tín hiệu huỳnh quang CHÚ TH Í CH: Hu ỳ nh quang thư ờ ng được giữ trong bình phản ứng tối màu cùng với một số chất phù hợp. Phân tích đ ị nh lượng cần có quy trình chu ẩ n b ị mẫu để đ ả m b ả o đủ số lượng axit nucleic của virus hoặc vi sinh vật đích có trong dung dịch axit nucleic được tạo ra được sao chép cao. 9.2 Khuếch đại 9.2.1 Yêu cầu chung Việc khuếch đại axit nucleic đặc hiệu được thực hiện in vitro trong phòng thí nghiệm thông qua phản ứng chuỗi trùng hợp ADN polymerase với sự có mặt của các cặp mồi, oligonucleotide, chất đệm phản ứng và mẫu dò huỳnh quang trong chất đệm ph ả n ứng xác đ ị nh. Đối với phương pháp PCR c ổ điển, không cần thiết phải dùng đầu côn và ống phản ứng có màu đối với các hỗn hợp phản ứng, chỉ cần tránh nhiễm chéo do các hạt bên ngoài các b ì nh phản ứng. Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong quá trình khuếch đại. ARN có thể được phát hiện khi dùng kỹ thuật real-time PCR nếu trình tự được chuyển thành trình tự ADN bổ sung bằng phương pháp phiên mã ngược. 9.2.2 Các tham s ố của chu trình 9.2.2.1 M ẫ u dò thủy giải Về cơ b ả n, quá trình khuếch đại sử dụng chu trình 2 bước bao gồm bước biến t í nh, gắn mồi, bắt cặp với mẫu dò và bước kéo dài. Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong bước bắt cặp và kéo dài 9.2.2.2 M ẫ u dò lai Quá trình khuếch đại sử dụng chu trình 3 bước bao gồm bước biến tính, bắt cặp m ồ i và mẫu dò và bước kéo dài. Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong bước bắt cặp 9.2.2.3 M ẫ u dò dạng kẹp tóc V ề cơ b ả n, quá trình khuếch đại sử dụng chu trình 3 bước bao gồm bước biến tính, gắn mồi và mẫu dò dạng kẹp tóc và bước kéo dài. Tín hiệu huỳnh quang được tạo ra t rong bước bắt cặp. 9.3 M ẫ u k iểm chứng Các mẫu kiểm chứng được nêu trong TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005). Real-time PCR cho phép phát hiện cùng một lúc tín hiệu huỳnh quang của vi sinh vật gây bệnh cụ thể và của mẫu kiểm soát khuếch đại bên trong. Do đó, khi thực hiện phương pháp này cần có mẫu kiểm soát khuếch đại bên trong. 9.4 Phân tích số liệu huỳnh quang 9.4.1 Đư ờ ng khuếch đại 9.4.1.1 Yêu cầu chung Trong quá trình khuếch đại, s ố sản phẩm PCR ph á t hiện được tăng l ê n. Việc tăng tín hiệu huỳnh quang liên quan đến tăng các s ả n phẩm PCR. Điều này được hiển thị trên đường cong khuếch đại (xem Hình 4). Đường cong khuếch đại điển hình gồm ba giai đoạn đặc trưng cho quy trình PCR. CHÚ DẪN: N c số phân tử được khuếch đạ i v s ố lượng chu trình khu ế ch đạ i 1 Pha hàm số mũ 2 Pha t u yến t í nh 3 Pha ổ n đ ị nh Hình 4 - Đường khuếch đạ i 9.4.1.2 Pha 1: Pha hàm mũ Pha hàm mũ có dải chu trình độ chụm cao đặc trưng b ở i hiệu quả khuếch đại cao và không đổi. Trong pha hàm mũ, mối tương quan giữa sản ph ẩ m PCR với nhiệt độ ban đầu được thể hiện theo Công thức (1): N c = N ( 1 + η ) v (1) Trong đ ó : N c là số phân tử được khuếch đại N là số phân tử đ í ch ban đầu η là hiệu quả của hệ thống v là số chu trình khuếch đại. 9.4.1.3 Pha 2: Pha tuyến tính Pha tuyến tính đặc trưng b ở i mức độ ảnh hưởng mà độ dốc của đường khuếch đại giảm đến độ ổn định . Ở thời điểm này một hoặc nhiều th à nh phần giảm xuống dưới nồng độ t ớ i hạn và hiệu quả khuếch đại bắt đầu gi ả m. Pha được gọi là tuyến tính vì khuếch đại xấp x ỉ cấp số cộng chứ không phải là cấp số nhân. 9.4.1.4 Pha 3: Pha ổn định Ở giai đoạn này, việc khuếch đại PCR sẽ không còn và tín hiệu huỳnh quang duy trì ở trạng thái ổ n định ( xem Tài liệu tham khảo [4]). 9.4.2 Đánh giá dữ liệu huỳnh quang M ẫ u phân tích tạo ra đồ thị kh u ếch đại với ít nhất pha 1 của đường cong khuếch đại điển hình. Đường cong khu ế ch đại của các mẫu cắt ngang một ngưỡng xác đ ị nh được thiết lập sau số chu tr ì nh nhất định. M ẫ u với t í nh hiệu huỳnh quang trên ngưỡng được coi là d ương tính. 9.4.3 Phân tích định lư ợ ng 9.4.3.1 Yêu cầu chung Phương pháp định lượng xác định tín hiệu huỳnh quang tương ứng với số lượng trình tự axit nucleic đích được tạo ra tr ong pha khuếch đại của phản ứng PCR. Phương pháp này được dùng đ ể xác đ ị nh lượng hoặc axit nucleic đích ban đầu trong mẫu Axit nucleic đích được định l ượng dựa trên đường chuẩn (stADNard curve) Có thể dùng các phương pháp định lượng khác nếu giá trị của chúng được xác đ ị nh. 9.4.3.2 Phương pháp đường chuẩn dùng cho định lượng Có thể sử dụng g ố c ADN hoặc ARN đích tinh sạch và ổn đ ị nh với nồng độ đã biết để chu ẩ n bị đường chuẩn bằng một d ãy pha loãng. Hiệu quả khuếch đại của đường cong chuẩn và axit nucleic đích phải gần giống nhau. ADN plasmi d và ARN sao chép in vitro được dùng ph ổ biến khi xây d ựng đường chuẩn. Nồng độ đích cần nằm trong dải đường chuẩn. Có th ể áp d ụng một s ố điểm hiệu chu ẩ n thích hợp và lặp lại bao trùm d ả i định lượng [ v í dụ: có ít nhất b ố n điểm với hai điểm lặp lại (tổng của các giá trị 4x2) hoặc sáu đi ể m hiệu chuẩn với một phép đo t ạ i mỗi điểm (tổng là sáu giá trị)]. 10 Đánh giá và tài liệu Việc đánh giá dựa vào các kết qu ả thu được cùng với các mẫu chứng được quy định trong 9.3 phải ch í nh xác. Các kết quả PCR được liệt kê trong Bảng 2 của TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005). THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] ISO 20837, Microbiology of food and animal f eeding stuffs - Polymerase c hain reaction (PCR) for the detection of food-bo rn e pathogens - Requirements for sample preparation for qualitative detection [Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Ph ả n ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về chuẩn bị mẫu để phát hiện đị nh tính ] [2] Forster, T. Intermolecular energy migration and fl uorescence. Ann. Phys . 1948, 2, p.55 - 75 [3] Bustin, S.A. Quanti f ication of mARN using rea l -time RT-PCR: Trends and problems. J. Mol. Endocrinol . 2002,29, p.23-39 [4] APPLIED BIOSYSTEMS, ABI Prism® 7900HT Sequence Detection System use ’ s manual. Applied Biosystems, Foster City, CA, 2001.