TCVN7136:2002

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7136:2002 (ISO 5552 : 1997) về thịt và sản phẩm thịt - phát hiện và định lượng Entero - bacteriaceae không qua quá trình phục hồi - kỹ thuật MPN và kỹ thuật đếm khuẩn lạc do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7136:2002 THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT – PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG ENTEROBACTERIACEAE KHÔNG QUA QUÁ TRÌNH PHỤC HỒI – KỸ THUẬT MPN VÀ KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Meat and meat products – Detection and enumeration of Enterobacteriaceae without resuscitation – MPN technique and colony-count technique Lời nói đầu TCVN 7136 : 2002 hoàn toàn tương đương với ISO 5552 : 1997; TCVN 7136 : 2002 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F 8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn – Đo lường – Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện và định lượng Enterobacteriaceae có trong tất cả các loại thịt và sản phẩm thịt, kể cả thịt gia cầm. Việc định lượng được tiến hành như sau: - bằng cách tính số có xác suất lớn nhất (MPN) sau khi nuôi cấy ở 35 0 C hoặc 37 0 C trong môi trường lỏng; hoặc - bằng cách đếm số khuẩn lạc trong môi trường đặc sau khi nuôi cấy ở 35 0 C hoặc 37 0 C. Nhiệt độ sử dụng để nuôi cấy cần được thỏa thuận giữa các bên có liên quan và phải được ghi vào báo cáo thử nghiệm. Chú thích – Đối với thực phẩm đông lạnh, nhiệt độ nuôi cấy ở 30 0 C là thích hợp khi mục đích định lượng mang tính chất công nghệ. Khi số lượng vi khuẩn ít thì phương pháp MPN là thích hợp, còn đối với các trường hợp khác thì phương pháp đếm khuẩn lạc là thích hợp hơn. Tiêu chuẩn này không bao gồm các quy trình phục hồi, do đó kết quả không cần phải liên hệ đến các chuẩn cứ hoặc các quy định kỹ thuật dựa trên giả định là quá trình phục hồi đã được thực hiện. Điểm hạn chế khi áp dụng tiêu chuẩn này là kết quả có độ dao động lớn. Vì vậy, cần sử dụng phương pháp này và đọc kết quả theo các thông tin nêu trong 10.3. 2. Tiêu chuẩn viện dẫn TCVN 4833 – 2 : 2002 (ISO 3100 – 2 : 1988) Thịt và sản phẩm thịt – Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử - Phần 2: Chuẩn bị mẫu thử để kiểm tra vi sinh vật. TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887 : 1983) Vi sinh vật học – Hướng dẫn chung về cách pha chế các dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh vật. TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996) Vi sinh vật trong thực phẩm và trong thức ăn gia súc – Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật. TCVN 6847 : 2001 (ISO 7402 : 1993) Vi sinh vật học – Hướng dẫn chung về định lượng Enterobacteriaceae không qua quá trình phục hồi – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc và kỹ thuật MPN. 3. Định nghĩa Trong tiêu chuẩn này áp dụng các định nghĩa sau đây: 3.1. Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae): Các vi sinh vật lên men glucoza và cho phản ứng oxidaza âm tính khi tiến hành phép thử theo phương pháp quy định. 3.2. Phát hiện Enterobacteriaceae (detection of Enterobacteriaceae): Việc xác định sự có mặt hay không có mặt của các vi khuẩn này, trong một khối lượng sản phẩm cụ thể, khi thực hiện phép thử theo tiêu chuẩn này. 3.3. Số đếm Enterobacteriaceae (count of Enterobacteriaceae) : Số Enterobacteriaceae tìm thấy trong một mililit hoặc trong một gam mẫu thử khi thực hiện phép thử theo phương pháp quy định. 4. Nguyên tắc 4.1. Chuẩn bị dịch pha loãng Chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân từ mẫu thử. 4.2. Phát hiện Enterobacteriaceae trong một lượng quy định của mẫu thử Cho vào ống nghiệm chứa môi trường canh thang tăng sinh chọn lọc 1 ml mẫu thử, nếu sản phẩm dạng lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu (hoặc các dung dịch pha loãng thập phân của chúng), nếu các sản phẩm ở dạng khác). Ủ các ống nghiệm này ở 35 0 C hoặc 37 0 C trong 24 h, sau đó ria cấy các dịch nuôi cấy lên thạch mật glucoza đỏ tím. Sau khi ủ các đĩa thạch đã ria cấy ở 35 0 C hoặc 37 0 C trong 24 h, lấy các khuẩn lạc nghi ngờ để thử khẳng định bằng đặc tính sinh hoá. 4.3. Định lượng Enterobacteriaceae 4.3.1. Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (MPN) Chú thích – Nên dùng kỹ thuật này khi số lượng Enterobacteriaceae trong một mililit hoặc trong một gam mẫu thử được dự kiến nằm trong khoảng từ 1 đến 100. Cấy vào ba ống nghiệm chứa môi trường nồng độ kép mỗi ống một lượng mẫu thử quy định, nếu sản phẩm dạng lỏng, hoặc một lượng quy định của huyền phù ban đầu, nếu các sản phẩm ở dạng khác. Cấy vào ba ống nghiệm chứa môi trường nồng độ đơn mỗi ống một lượng mẫu thử quy định, nếu sản phẩm dạng lỏng, hoặc một lượng quy định của huyền phù ban đầu, nếu các sản phẩm ở dạng khác. Sau đó trong cùng một điều kiện, cấy vào ba ống nghiệm chứa môi trường nồng độ đơn mỗi ống một lượng quy định dịch pha loãng thập phân thứ nhất chuẩn bị từ mẫu thử hoặc từ huyền phù ban đầu. Ủ ấm các ống nghiệm ở 35 0 C hoặc 37 0 C (theo thỏa thuận) trong 24 h. Từ số lượng các ống được thử khẳng định dương tính, tính số có xác suất lớn nhất của Enterobacteriaceae trong một mililit hoặc một gam mẫu thử bằng cách tra bảng MPN (xem phụ lục A). 4.3.2. Kỹ thuật đếm khuẩn lạc Chú thích – Nên dùng kỹ thuật này khi số lượng Enterobacteriaceae trong một mililit hoặc trong một gam mẫu thử được dự kiến lớn hơn 100. Cấy vào hai đĩa Petri chứa môi trường thạch mật glucoza đỏ tím (kỹ thuật ổ đĩa) mỗi đĩa một lượng mẫu thử quy định, nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng, hoặc một lượng quy định của huyền phù ban đầu, nếu sản phẩm ở dạng khác. Phủ lên bề mặt thạch đã cấy một lớp môi trường cùng loại. Chuẩn bị các cặp đĩa khác trong cùng điều kiện thử nghiệm và cấy các dịch pha loãng thập phân chuẩn bị từ mẫu thử hoặc từ huyền phù ban đầu. Ủ ấm các đĩa ở 35 0 C hoặc 37 0 C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 2h. Từ số các khuẩn lạc điển hình đã được thử khẳng định trên mỗi đĩa, tính số Enterobacteriaceae có trong một mililit hoặc trong một gam mẫu thử. 5. Dịch pha loãng, các môi trường nuôi cấy và thuốc thử 5.1. Khái quát Đối với thực hành phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218). 5.2. Dịch pha loãng Xem TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887 : 1983). 5.3. Môi trường nuôi cấy 5.3.1. Canh thang glucoza mật lục sáng có đệm (canh thang EE). 5.3.1.1. Thành phần a) Môi trường nồng độ kép b) Môi trường nồng độ đơn Pepton 20,0g 10,0g Glucoza 10,0g 5,0g Dinatri hydro phosphat (Na 2 HPO 4 ) 12,90g 6,45 g Kali dihydro phosphat (KH 2 HPO 4 ) 4,0g 2,0g Mật bò khô 40,0g 20,0g Lục sáng 0,027g 0,0135 g Nước 1 000 ml 1 000 ml 5.3.1.2. Chuẩn bị Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh đã được làm khô trong nước cất bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho giá trị pH sau khi đun sôi là 7,2 ở 25 0 C nếu cần. Không đun nóng môi trường quá 30 phút. Làm nguội nhanh môi trường. Chuyển vào mỗi ống nghiệm, bình hoặc chai vô trùng (6,8) 10 ml môi trường trong điều kiện vô trùng. Không hấp môi trường bằng nồi hấp áp lực. Môi trường này có thể bảo quản trong vòng một tuần ở nhiệt độ từ 0 0 C đến 5 0 C. 5.3.2. Thạch glucoza mật đỏ tím (VRBG) 5.3.2.1. Thành phần Pepton 7,0 g Cao nấm men 3,0 g Muối mật 1,5 g Glucoza 10,0 g Natri clorua 5,0 g Đỏ trung tính 0,03 g Tím tinh thể 0,002 g Thạch ở dạng bột hoặc ở dạng vẩy 8g đến 18 g 1) Nước 1 000ml 1) Phụ thuộc sức đông của thạch 5.3.2.2. Chuẩn bị Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh đã được làm khô trong nước bằng cách đun sôi. Không đun sôi môi trường quá 2 phút. Chỉnh pH sao cho giá trị pH sau khi đun sôi là 7,4 ở 25 0 C, nếu cần. Chuyển môi trường nuôi cấy này vào các ống nghiệm, bình hoặc lọ vô trùng (6.8) có dung tích không lớn hơn 500 ml. Không hấp môi trường bằng nồi hấp áp lực. Chuẩn bị môi trường này ngay trước khi sử dụng (xem 9.3.2 và 9.4.1). 5.3.2.3. Chuẩn bị các đĩa thạch (chỉ yêu cầu đối với việc phát hiện và kỹ thuật MPN, xem 9.3.2) Chuyển ngay khoảng 15 ml môi trường nuôi cấy, đã được làm nguội đến khoảng 47 0 C trong nồi cách thủy (6.5), vào các đĩa Petri (6.6) và để cho đông đặc. Ngay trước khi sử dụng, sấy các đĩa trong tủ sấy (6.3) cho đến khi bề mặt của thạch khô, tốt nhất là mở nắp và để bề mặt thạch úp xuống. Nếu được chuẩn bị trước, các đĩa chưa khô này không nên giữ quá 4 ngày ở nhiệt độ từ 0 0 C đến 5 0 C. 5.3.3. Thạch glucoza 5.3.3.1. Thành phần Trypton 10,0 g Cao nấm men 1,5 g Glucoza 10,0 g Natri clorua 5,0 g Bromcresol tía 0,015 g Thạch ở dạng bột hoặc vẩy 8g đến 18 g 1) Nước 1 000ml 1) Phụ thuộc sức đông của thạch 5.3.3.2 Chuẩn bị Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh đã được làm khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho giá trị pH sau khi khử trùng là 7,0 ở 25 0 C, nếu cần. Chuyển vào mỗi ống nghiệm hoặc bình (6.8) 15 ml môi trường nuôi cấy. Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 0 C. Để các ống nghiệm hoặc các bình ở vị trí thẳng đứng. Môi trường này có thể bảo quản trong vòng một tuần ở 0 0 C đến 5 0 C. Ngay trước khi sử dụng, hâm nóng môi trường bằng cách ngâm nước sôi hoặc bằng luồng hơi nước trong 15 phút, sau đó làm nguội nhanh đến nhiệt độ nuôi cấy. 5.3.4. Thạch dinh dưỡng 5.3.4.1. Thành phần Cao thịt bò 3,0 g Pepton 0,5 g Thạch ở dạng bột hoặc vẩy 8g đến 18 g 1) Nước 1 000ml 1) Phụ thuộc sức đông của thạch 5.3.4.2. Chuẩn bị Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh đã được làm khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho giá trị pH sau khi khử trùng là 7,0 ở 25 0 C, nếu cần. Chuyển môi trường nuôi cấy vào các ống nghiệm, chai hoặc bình (6.8) có dung tích không lớn hơn 500 ml. Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 0 C. 5.3.4.3. Chuẩn bị các đĩa thạch (xem 9.4.1) Chuyển ngay khoảng 15 ml môi trường nuôi cấy, đã được làm tan chảy và làm nguội đến khoảng 47 0 C vào các đĩa Petri (6.6) và để cho đông đặc. Ngay trước khi sử dụng, sấy các đĩa trong tủ sấy (6.3) cho đến khi bề mặt của thạch khô, tốt nhất là mở nắp và để bề mặt thạch úp xuống. Nếu được chuẩn bị trước, các đĩa thạch chưa khô này có thể bảo quản trong vòng 2 tuần ở nhiệt độ từ 0 0 C đến 5 0 C. 5.4. Thuốc thử oxidaza 5.4.1. Thành phần N, N, N’N’ – Tetrametyl – ρ -phenylendiamin dihydro clorua Nước 1,0 g 100 ml 5.4.2. Chuẩn bị Hòa tan thuốc thử trong nước lạnh. Chuẩn bị thuốc thử ngay trước khi sử dụng 6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm phân tích vi sinh thông thường và đặc biệt là: 6.1. Thiết bị khử trùng khô (tủ sấy) hoặc khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) Xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218) 6.2. Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 35 0 C ± 1 0 C hoặc 37 0 C ± 1 0 C. 6.3. Tủ sấy hoặc tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 35 0 C ± 1 0 C và 55 0 C ± 1 0 C. 6.4. pH-met, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 0 C. 6.5. Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự, có khả năng hoạt động ở 47 0 C ± 2 0 C. 6.6. Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm. 6.7. Que cấy vòng, bằng platin/iridi, niken/crom hoặc bằng chất dẻo sử dụng một lần có đường kính khoảng 3 mm, que cấy đầu thẳng làm bằng vật liệu cùng loại hoặc đũa thủy tinh. Chú thích – Que cấy vòng niken/ crom không thích hợp cho phép thử oxidaza (xem 9.5.2.1) 6.8. Ống nghiệm, có kích thước khoảng 16 mm x 160 mm và 20 mm x 200 mm và các bình hoặc chai có dung tích từ 150 ml đến 500 ml. 6.9. Pipet chia độ xả hết, dung tích danh định từ 1 ml và 10 ml, được chia độ tương ứng đến 0,1 ml và 0,5 ml. 7. Lấy mẫu Phương pháp lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 4833 – 1 : 2002 (ISO 3100 – 1) [1] . Điều quan trọng là phòng thí nghiệm nhận được mẫu thực sự đại diện và không bị hư hỏng hay biến đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. 8. Chuẩn bị mẫu thử Lấy mẫu đại diện theo phương pháp quy định trong TCVN 4833 – 2 : 2002 (ISO 3100 – 2). Tiến hành thử nghiệm mẫu đã xử lý càng nhanh càng tốt. Nếu cần, bảo quản thì phải giữ ở nhiệt độ từ 0 0 C đến +2 0 C nhưng không quá 24h. 9. Cách tiến hành 9.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng Xem TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887). Chuẩn bị các loạt dung dịch pha loãng thập phân riêng lẻ từ mẫu thử, nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc từ huyền phù ban đầu, nếu các sản phẩm ở dạng khác. 9.2. Phát hiện Chú thích – Phép thử kiểm tra sự có/không có này thường được tiến hành ba lần. 9.2.1. Cấy và ủ Dùng pipet vô trùng (6.9) chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường canh thang glucoza mật lục sáng có đệm (5.3.1) 1 ml phần mẫu thử, nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc huyền phù ban đầu, nếu sản phẩm ở dạng khác (9.1), hoặc 1 ml phần mẫu thử của một trong hai độ pha loãng 10 -2 hoặc 10 -3 từ hai loạt dung dịch pha loãng. Ủ ống nghiệm này ở nhiệt độ từ 35 0 C hoặc 37 0 C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 4h. 9.2.2. Phân lập Ria cấy một que cấy vòng (6.7) dịch nuôi cấy đã ủ (xem 9.2.1) lên đĩa thạch glucoza mật đỏ tím (xem 5.3.2.3) và ủ đĩa này ở nhiệt độ từ 35 0 C hoặc 37 0 C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 4h. 9.2.3. Chọn khuẩn lạc để thử khẳng định Từ đĩa đã được ủ theo 9.2.2 mà trên đó có các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ đặc trưng (có hoặc không có quầng tủa) hoặc có các khuẩn lạc có màng nhầy không màu phát triển, chọn một cách ngẫu nhiên năm khuẩn lạc như vậy để thử khẳng định đặc tính sinh hoá (xem 9.5.2) sau khi cấy truyền (xem 9.5.1) 9.3. Kỹ thuật MPN 9.3.1. Cấy và ủ Lấy ba ống nghiệm chứa môi trường canh thang EE nồng độ kép [5.3.1.1 a)]. Dùng pipet (6.9) chuyển vào mỗi ống 10 ml mẫu thử, nếu sản phẩm dạng lỏng, hoặc 10 ml huyền phù ban đầu, nếu các sản phẩm ở dạng khác. Lấy ba ống nghiệm chứa môi trường canh thang EE nồng độ đơn [5.3.1.1 b)]. Dùng pipet (6.9) khác cho vào mỗi ống 1 ml mẫu thử, nếu sản phẩm dạng lỏng, hoặc 1ml huyền phù ban đầu, nếu các sản phẩm ở dạng khác. Lấy thêm ba ống nghiệm chứa môi trường canh thang EE nồng độ đơn [5.3.1.1 b)]. Dùng Pipet (6.9) khác cho vào mỗi ống 1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10 -1 ) của mẫu thử, nếu sản phẩm dạng lỏng, hoặc 1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất của huyền phù ban đầu (10 -2 ), nếu sản phẩm ở dạng khác. Ủ chín ống này ở nhiệt độ 35 0 C hoặc 37 0 C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 4h. 9.3.2. Phân lập Ria cấy một que cấy vòng (6.7) dịch nuôi cấy từ mỗi ống trong chín ống đã ủ (xem 9.3.1) lên các đĩa thạch glucoza mật đỏ tím (xem 5.3.2.3) và ủ các đĩa này ở nhiệt độ 35 0 C hoặc 37 0 C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 4h. 9.3.3. Chọn các khuẩn lạc để thử khẳng định Từ mỗi đĩa đã được ủ ấm theo 9.3.2 mà trên đó có các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ đặc trưng (có hoặc không có quầng tủa) hoặc có các khuẩn lạc có màng nhầy không màu phát triển, chọn một cách ngẫu nhiên năm khuẩn lạc như vậy để thử khẳng định đặc tính sinh hóa (xem 9.5.2) sau khi cấy truyền (xem 9.5.1). 9.4. Kỹ thuật đếm khuẩn lạc 9.4.1. Cấy và ủ 9.4.1.1. Lấy hai đĩa petri vô trùng (6.6). Dùng pipet vô trùng (6.9) chuyển vào mỗi đĩa 1ml mẫu thử, nếu sản phẩm dạng lỏng, hoặc 1 ml huyền phù ban đầu, nếu sản phẩm ở dạng khác. Lấy hai đĩa petri vô trùng khác. Dùng một pipet mới vô trùng chuyển vào mỗi đĩa 1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10 -1 ) của mẫu thử, nếu sản phẩm dạng chất lỏng, hoặc 1 ml dịch pha loãng thập phân thứ nhất của huyện phù ban đầu (10 -2 ), nếu sản phẩm ở dạng khác. Lặp lại trình tự trên với các độ pha loãng tiếp theo và dùng các pipet vô trùng mới cho mỗi độ pha loãng thập phân. 9.4.1.2. Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15 ml môi trường VRBG (5.3.2) đã chuẩn bị và được làm nguội đến khoảng 47 0 C trong nồi cách thủy (6.5). Thời gian tính từ khi chuẩn bị xong huyền phù ban đầu (hoặc độ pha loãng 10 -1 nếu sản phẩm dạng lỏng) đến khi môi trường (5.3.2) được rót vào các đĩa không được vượt quá 15 phút. Trộn cẩn thận mẫu cấy vào môi trường bằng cách lắc ngang và để cho hỗn hợp đông đặc lại, đặt các đĩa petri ở chỗ mát, trên mặt phẳng nằm ngang. 9.4.1.3. Sau khi hỗn hợp đông đặc hoàn toàn, phủ lên bề mặt một lớp từ 6 ml đến 10 ml môi trường VRBG (5.3.2) đã được chuẩn bị và làm nguội như mô tả trong 9.4.1.2, để tránh vi khuẩn mọc lan và có được điều kiện bán yếm khí. Để cho lớp bề mặt đông đặc như mô tả ở trên. 9.4.1.4. Lật ngược các đĩa đã chuẩn bị và ủ ấm ở 35 0 C hoặc 37 0 C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 4h. 9.4.2. Chọn và đếm các khuẩn lạc Chọn các đĩa (9.4.1.4) có chứa ít hơn 150 khuẩn lạc đặc trưng (xem 9.3.3) có đường kính 0,5mm hoặc lớn hơn; đếm các khuẩn lạc nghi ngờ này. Chọn ngẫu nhiên năm khuẩn lạc như vậy từ mỗi đĩa để thử khẳng định đặc tính sinh hóa (xem 9.5.2) sau khi cấy truyền (xem 9.5.1) Loại bỏ phép xác định nếu một nửa hoặc trên một nửa diện tích bề mặt của đĩa có khuẩn lạc mọc quá dày. Nếu diện tích vùng có khuẩn lạc mọc quá dày nhỏ hơn một nửa diện tích bề mặt của đĩa, thì đếm các khuẩn lạc trên phần nhìn rõ và ngoại suy để có được số lượng tương ứng với tổng diện tích bề mặt của đĩa. 9.5. Thử khẳng định 9.5.1. Cấy truyền Ria cấy lên các đĩa thạch dinh dưỡng (5.3.4) từng khuẩn lạc đã được chọn để thử khẳng định (xem 9.2.3, 9.3.3 và 9.4.2). Ủ các đĩa này ở nhiệt độ 35 0 C hoặc 37 0 C (theo thỏa thuận) trong 24h ± 4h. Chọn khuẩn lạc tách biệt từ các đĩa đã ủ để thử khẳng định đặc tính sinh hoá (xem 9.5.2). 9.5.2. Thử khẳng định đặc tính sinh hoá 9.5.2.1. Phản ứng oxidaza Dùng que cấy vòng hoặc que cấy đầu thẳng bằng platin/iridi hoặc đũa thủy tinh (6.7), lấy một phần từ mỗi khuẩn lạc tách biệt (9.5.1) và ria cấy lên giấy lọc đã được tẩm thuốc thử oxidaza (5.4) hoặc ria lên các đĩa chứa môi trường chỉ thị bán sẵn. Không dùng que cấy vòng hoặc que cấy đầu thẳng bằng niken/crom. Phép thử được coi là âm tính khi màu của tấm giấy lọc đó không chuyển sang màu tối trong vòng 10 giây. Đối với các đĩa chứa môi trường chỉ thị bán sẵn, cần theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 9.5.2.2. Phép thử lên men Dùng que cấy đầu thẳng (6.7) cấy các khuẩn lạc đã được chọn ở 9.5.1 vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch glucoza (5.3.3). Ủ các ống này ở nhiệt độ 35 0 C hoặc 37 0 C trong 24h ± 2h (theo thỏa thuận). Phản ứng được coi là dương tính nếu màu vàng lan khắp ống thạch. Hầu hết các chủng Enterobacteriaceae đều sinh khí. 10. Biểu thị kết quả 10.1. Phát hiện Enterobacteriaceae trong một lượng mẫu quy định 10.1.1 Nếu các ống chứa các khuẩn lạc được thử khẳng định là Enterobacteriaceae (xem 10.2.2), thì báo cáo kết quả như sau: “ Enterobacteriaceae được phát hiện trong lượng mẫu quy định” 10.1.2. Nếu các ống (9.2) không chứa các khuẩn lạc Enterobacteriaceae (xem 10.2.2) thì báo cáo kết quả như sau: “ không phát hiện thấy Enterobacteriaceae trong lượng mẫu quy định”. 10.2. Tính số xác suất lớn nhất (MPN) 10.2.1. Đếm số ống cho phản ứng dương tính đối với mỗi độ pha loãng. 10.2.2. Nếu một trong những khuẩn lạc đặc trưng được chọn (9.3.3) từ đĩa cấy truyền (xem 9.5.1) có phản ứng oxidaza âm tính và glucoza dương tính, thì ống nghiệm chứa mẫu cấy truyền đó được coi là dương tính. 10.2.3. Từ số ống dương tính của các độ pha loãng khác nhau, tra bảng MPN (xem phụ lục A) để xác định chỉ số xác suất lớn nhất (MPN). 10.2.4. Đối với các sản phẩm dạng lỏng, số Enterobacteriaceae trong một mililit được tính bằng cách chia chỉ số MPN cho 10. Đối với các sản phẩm ở dạng khác mà từ đó huyền phù ban đầu được chuẩn bị, thì số khuẩn lạc trong một gam sẽ bằng chỉ số MPN. 10.3. Tính số đếm khuẩn lạc 10.3.1. Khái quát Nếu có ít nhất 80% các khuẩn lạc đặc trưng được chọn (xem 9.4.2) có phản ứng oxidaza âm tính và glucoza dương tính và được thử khẳng định là Enterobacteriaceae , thì số vi sinh vật có mặt sẽ bằng số đếm như ở 9.4.2. Trong tất cả các trường hợp khác, số khuẩn lạc được tính từ tỷ lệ phần trăm số khuẩn lạc oxidaza âm tính và glucoza dương tính của tổng số các khuẩn lạc được chọn (xem 9.4.2). Làm tròn kết quả số khuẩn lạc tính toán thành số nguyên. 10.3.2. Trường hợp chung Tính số Enterobacteriaceae, N, trong một mililit hoặc trong một gam sản phẩm bằng công thức sau: Trong đó: Σa là tổng số khuẩn lạc đếm được sau khi nhận dạng ở tất cả các đĩa giữ lại; n 1 là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất; n 2 là số đĩa được giữ lại độ pha loãng thứ hai; d là hệ số pha loãng ứng với dịch pha loãng thứ nhất. Làm tròn kết quả đến hai chữ số có nghĩa. Lấy kết quả là số vi sinh vật trong một mililit hoặc trong một gam sản phẩm, được biểu thị bằng tích của một số nằm trong khoảng từ 1,0 đến 9,9 với lũy thừa của cơ số 10 có số mũ thích hợp. THÍ DỤ Đếm trực tiếp các vi sinh vật cho kết quả sau: - ở dịch pha loãng thứ nhất được giữa lại (10 -3 ): 66 và 80 khuẩn lạc; - ở dịch pha loãng thứ hai (10 -4 ): 4 và 7 khuẩn lạc; Các số sau đây được xem xét: - đối với 66 khuẩn lạc: 5 khuẩn lạc, có 4 trong số này phù hợp với chuẩn cứ, a = 53; - đối với 80 khuẩn lạc: 5 khuẩn lạc, có 3 trong số này phù hợp với chuẩn cứ, a = 48; - đối với 7 khuẩn lạc: 5 khuẩn lạc, có 4 trong số này phù hợp với chuẩn cứ, a = 6; - đối với 4 khuẩn lạc: tất cả 4 được tìm thấy cũng là số vi sinh vật cần tìm. Do đó Làm tròn kết quả theo quy định ở trên và kết quả là 50 000 hoặc 5,0 x 10 4 Enterobacteriaceae trong một mililit hoặc một gam sản phẩm. 10.3.3. Ước tính đối với số lượng nhỏ Nếu hai đĩa ứng với mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (các sản phẩm ở dạng khác) đều chứa ít hơn 15 khuẩn lạc thì tính giá trị trung bình số học, y, từ các khuẩn lạc đếm được trên cả hai đĩa. Biểu thị kết quả như sau: - sản phẩm dạng lỏng: số ước tính Enterobacteriaceae trong một mililit, N E = y - các sản phẩm ở dạng khác: số ước tính Enterobacteriaceae trong một gam, N E = y/d Trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu. 10.3.4. Trường hợp không có khuẩn lạc đặc trưng Nếu hai đĩa ứng với mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (các sản phẩm ở dạng khác) không có các khuẩn lạc đặc trưng, biểu thị kết quả như sau: - nhỏ hơn 1 vi sinh vật trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng); - nhỏ hơn 1 x d -1 vi sinh vật trong một gam (các sản phẩm ở dạng khác), trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu. 10.4. Độ chụm 10.4.1. Kỹ thuật MPN Thực tế cho thấy, kỹ thuật MPN có kết quả dao động rất lớn. Vì vậy sử dụng kết quả theo phương pháp này phải hết sức cẩn thận. Giới hạn tin cậy được nêu ở phụ lục A. 10.4.2. Kỹ thuật đếm khuẩn lạc Xét riêng về mặt thống kê, trong 95% các trường hợp giới hạn tin cậy của kỹ thuật đếm khuẩn lạc dao động từ ± 16% đến ±52% (xem tài liệu tham khảo [2]), đối với số đếm ít hơn 15 khuẩn lạc trong một đĩa, giới hạn tin cậy cho ở phụ lục B. Trên thực tế, có thể gặp phải dao động thậm chí còn lớn hơn, đặc biệt giữa các kết quả nhận được từ các nhân viên thử nghiệm khác nhau. 11. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm cần nêu rõ phương pháp đã sử dụng, nhiệt độ ủ và kết quả nhận được. Báo cáo thử nghiệm cũng cần phải đề cập đến mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này và các điều được coi là không bắt buộc cũng như các sự cố có thể ảnh hưởng đến kết quả. Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử. PHỤ LỤC A (Quy định) XÁC ĐỊNH SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT Xem bảng A.1 và bảng A.2 Bảng A.1 – Chỉ số MPN và giới hạn tin cậy Số kết quả dương tính Chỉ số 1) MPN Cấp hạng 2) khi số mẫu được thử Giới hạn tin cậy 1)3) 1 2 3 5 10 ≥ 95% ≥ 99% 0 0 0 <> 0,00 0,94 0,00 1,40 0 0 1 0,30 3 2 2 2 1 0,01 0,95 0,00 1,40 0 1 0 0,30 2 1 1 1 1 0,01 1,00 0,00 1,60 0 1 1 0,61 0 3 3 3 3 0,12 1,70 0,05 2,50 0 2 0 0,62 3 2 2 2 1 0,12 1,70 0,05 2,50 0 3 0 0,94 0 0 0 0 3 0,35 3,50 0,18 4,60 1 0 0 0,36 1 1 1 1 1 0,02 1,70 0,01 2,50 1 0 1 0,72 2 2 1 1 1 0,12 1,70 0,05 2,50 1 0 2 1,1 0 0 0 3 3 0,4 3,5 0,2 4,6 1 1 0 0,74 1 1 1 1 1 0,13 2,00 0,06 2,70 1 1 1 1,1 3 3 2 2 2 0,4 3,5 0,2 4,6 1 2 0 1,1 2 2 1 1 1 0,4 3,5 0,2 4,6 1 2 1 1,5 3 3 3 3 2 0,5 3,8 0,2 5,2 1 3 0 1,6 3 3 3 3 2 0,5 3,8 0,2 5,2 2 0 0 0,92 1 1 1 1 1 0,15 3,50 0,07 4,60 2 0 1 1,4 2 1 1 1 1 0,4 3,5 0,2 4,6 2 0 2 2,0 0 3 3 3 3 0,5 3,8 0,2 5,2 2 1 0 1,5 1 1 1 1 1 0,4 3,8 0,2 5,2 2 1 1 2,0 2 2 1 1 1 0,5 3,8 0,2 5,2 2 1 2 2,7 0 3 3 3 3 0,9 9,4 0,5 14,2 2 2 0 2,1 1 1 1 1 1 0,5 4,0 0,2 5,6 2 2 1 2,8 3 2 2 2 1 0,9 9,4 0,5 14,2 2 2 2 3,5 0 0 0 0 3 0,9 9,4 0,5 14,2 2 3 0 2,9 3 2 2 2 1 0,9 9,4 0,5 14,2 2 3 1 3,6 0 3 3 3 3 0,9 9,4 0,5 14,2 3 0 0 2,3 1 1 1 1 1 0,5 9,4 0,3 14,2 3 0 1 3,8 1 1 1 1 1 0,9 10,4 0,5 15,7 3 0 2 6,4 3 3 2 2 2 1,6 18,1 1,0 25,0 3 1 0 4,3 1 1 1 1 1 0,9 18,1 0,5 25,0 3 1 1 7,5 1 1 1 1 1 1,7 19,9 1,1 27,0 3 1 2 12 3 2 2 2 1 3 36 2 44 3 1 3 16 0 0 0 3 3 3 38 2 52 3 2 0 9,3 1 1 1 1 1 1,8 36,0 1,2 43,0 3 2 1 15 1 1 1 1 1 3 38 2 52 3 2 2 21 2 1 1 1 1 3 40 2 56 3 2 3 29 3 3 3 2 2 9 99 5 152 3 3 0 24 1 1 1 1 1 4 99 3 152 3 3 1 46 1 1 1 1 1 9 198 5 283 3 3 2 110 1 1 1 1 1 20 400 10 570 3 3 3 > 110 1) Xem tài liệu tham khảo [3] 2) Xem bảng A.2 3) Giới hạn tin cậy cho trong bảng này chỉ là giá trị trung bình nhằm cung cấp một số ý tưởng về ảnh hưởng của sai lệch thống kê đối với các kết quả, ngoài ra còn có những nguồn sai lệch khác mà đôi khi còn quan trọng hơn. Bảng A.2 – Các cấp hạng Cấp hạng 1) Định nghĩa 1 Khi số lượng vi khuẩn trong mẫu bằng số MPN được tìm thấy, thì kết quả nằm trong số có khả năng cao nhất thu được. Hầu như chỉ có 5% khả năng thu được kết quả nhỏ hơn giá trị nhỏ nhất ở cấp hạng này. 2 Khi số lượng vi khuẩn trong mẫu thử bằng số MPN tìm được, thì kết quả là một trong số khả năng thu được ít hơn cả số có khả năng xẩy ra nhỏ nhất trong cấp hạng 1, nhưng tối đa chỉ có 1% khả năng thu được một kết quả có thể thấp hơn kết quả nhỏ nhất có thể xảy ra ở cấp hạng này. 3 Khi số lượng vi khuẩn trong mẫu thử bằng số MPN tìm được, thì kết quả là một trong số có khả năng thu được ít hơn cả giá trị nhỏ nhất trong cấp hạng 2, nhưng tối đa chỉ có 0,1% khả năng thu được một kết quả có thể nhỏ hơn giá trị nhỏ nhất ở cấp hạng này. 0 Khi số lượng vi khuẩn trong mẫu thử bằng số MPN tìm được, thì kết quả là một trong số có khả năng thu được ít hơn cả giá trị nhỏ nhất trong cấp hạng 3. Chỉ có 0,1% khả năng thu được một kết quả ở cấp hạng này, nếu như không có một sai sót nào. 1) Trước khi bắt đầu thử cần phải quyết định chọn cấp hạng nào, tức là chỉ có cấp hạng 1, 1 và 2 hoặc thậm chí 1, 2 và 3. Việc quyết định cơ sở để chọn kết quả là rất quan trọng, chỉ kết quả cấp hạng 1 hoặc hầu hết cấp hạng 1 và 2 được chấp nhận. Kết quả cấp hạng 0 được coi là đáng nghi ngờ nhất. PHỤ LỤC B (Quy định) GIỚI HẠN TIN CẬY ĐỐI VỚI ƯỚC TÍNH SỐ LƯỢNG NHỎ KHUẨN LẠC Giới hạn tin cậy ở mức 95% đối với số khuẩn lạc được giữ lại ước tính nhỏ hơn 15 được cho ở bảng B.1 Bảng B.1 – Các giới hạn tin cậy Số lượng vi sinh vật Giới hạn tin cậy ở mức 95% Dưới Trên 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 <> <> <> 1 2 2 2 3 4 4 5 6 7 7 8 2 4 5 6 9 10 12 13 14 16 18 19 20 21 23 PHỤ LỤC C (tham khảo) TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 4833-1 : 2002 (ISO 3100-1:1991), Thịt và sản phẩm thịt – Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử - Phần 1: Lấy mẫu. [2] Cowell N.D and Moriseti M.D., J.Sci. Fd. Fd Agric., 20, 1969, p. 573 [3] De Man, J.C., J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 17, 1983, pp. 301 – 305.