TCVN8685-9:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-9:2014 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 9: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8685-9:2014 QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 9: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1 Vaccine testing procedure - Part 9: Avian infuenza A/H5N1 vaccine Lời nói đầu TCVN 8685-9:2014 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất l ượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 9: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1 Vaccine testing procedure - Part 9: Avian infuenza A/H5N1 vaccine 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định yêu cầu kỹ thuật để kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 cho gà, vịt , ngan. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau r ấ t c ầ n th iế t cho việc áp d ụng tiêu chuẩn này. Đối với các tà i liệu viện dẫ n ghi năm công bố th ì áp dụng phi ê n bản được n ê u. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên b ả n mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 8684:2011, V ắc xin và chế ph ẩ m sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thu ầ n khi ế t. 3. Lấy mẫu sản phẩm và chuẩn bị động vật thí nghiệm 3.1. Lấy mẫu sản phẩm: Lấy mẫu sản ph ẩ m theo qui định trong bảng như sau: S ố l ượn g mẫu vắc xin và ch ế phẩm sinh học cần l ấ y Quy cách đóng gói (ml) Số lượng mẫu l ấ y (sản ph ẩ m) Cho tới 100 Từ 7 đ ế n 10 Trên 100 Từ 5 đ ế n 7 3.2 . Chu ẩ n b ị động vật th í nghi ệ m Tùy theo yêu cầu của vắc xin, chuẩn b ị động vật sau: - 10 con gà từ 2 đ ế n 3 tu ầ n tuổi, khỏe mạnh, âm tính với kháng th ể kháng vi rút cúm gia cầ m. - 30 con g à từ 4 đ ế n 5 tuần tuổi, mẫn cảm, khỏe mạnh, âm t í nh với kháng thể kháng vi rút cúm gia cầm. - 45 con vịt hoặc ngan t ừ 2 đ ế n 3 tuần tuổi, mẫn cảm, khỏe mạnh, âm t í nh với kháng th ể kháng vi rút cúm gia c ầ m. 4. Cách tiến hành 4.1. Kiểm tra cảm quan Kiểm tra bằng mắt thường: V ắc xin đồng nh ấ t, không đông vón, không lắng cặn. 4.2. Kiểm tra độ thuần khiết Kiểm tra các chỉ ti ê u tạp nhiễm vi khu ẩ n, tạp nhiễm n ấ m mốc, tạp nhi ễ m Salmonella và tạp nhiễm Mycoplasma theo TCVN 8684:2011. 4.3. Kiểm tra tính an toàn - Trên gà: tiêm cho 10 con gà từ 2 đ ế n 3 tuần tuổi, mỗi con 2 li ề u vắc xin ghi trên nhãn. - Trên vịt hoặc ngan: tiêm cho 10 con vịt hoặc ngan từ 2 đến 3 tuần tuổi, mỗi con 2 liều vắc xin ghi t r ên nhãn. Theo d õ i động vật th í nghiệm trong 14 ngày. Vắc xin được coi là an toàn nếu t ấ t cả gà/vịt/ngan sống khỏe mạnh, phát tri ể n b ì nh thường và kh ô ng c ó biến đổi b ấ t thường v ề cục bộ hay triệu chứng toàn thân. 4.4. Kiểm tra hi ệ u lực 4.4.1. Phương pháp trọng tài Sử dụng 15 con gà khỏe từ 4 đ ế n 5 tuần tuổi, chia làm 2 nhóm: + Nhóm 1: gồm 10 con gà, mỗi con được tiêm 1 l iề u vắc xin ghi tr ê n nhãn, theo đường dưới da cổ; + Nhóm 2: gồm 5 con gà làm đối chứng, không tiêm v ắ c xin. Sử dụng 15 vịt hoặc ngan khỏe từ 2 đ ế n 3 tuần tuổi, chia làm 2 nhóm: + Nhóm 1: gồm 10 con vịt hoặc ngan, tiêm dưới da 2 liều vắc xin (0,5 ml/con vào ngày tuổi thứ 14 và 1 ml vào ngày tu ổ i thứ 35); + Nhóm 2: gồm 5 con vịt hoặc ngan làm đối chứng, không tiêm v ắ c xin. Sau khi tiêm 21 ngày đối với gà, 14 ngày sau mũi ti ê m cuối cùng đối với vịt hoặc ngan, động vật ở l ô được ti ê m và lô đối chứng được th ử thách với ch ủ ng vi rút cúm gia cầm cường độc H5N1 hiện hành bằng phương pháp nhỏ mũi, liều 10 6 TCID 5 0 / con (theo Phụ lục A). Theo dõi động vật thí nghiệm trong 10 ngày. Vắc xin được coi là đạt n ế u: + Í t nh ấ t 80 % động vật ở lô được tiêm sống, không có b ấ t kỳ biểu hiện nào c ủ a bệnh cúm gia cầm; + Í t nhất 80 % động vật ở lô đ ố i ch ứ ng chết. 4.4.2. Phư ơ ng pháp thay thế Sau khi tiêm 21 ngày đối với gà, 14 ngày sau mũi thứ 2 đối với vị t/ ngan, t ấ t cả động vật được l ấ y máu, thu huyết thanh làm phản ứng HI (theo Phụ lục B và Phụ lục C). V ắc xin đạt ti ê u chu ẩ n khi hiệu giá kháng thể trung b ì nh (GMT) của lô miễn dịch phải ≥ 4log2, trong khi đó lô đối chứng âm tính. PHỤ LỤC A (Quy định) Phương pháp chuẩn độ vi rút A.1 . Chuẩn b ị - Chu ẩ n b ị đĩa 96 giếng có 1 lớp t ế bào. - Pha lo ã ng vi rút trong môi trường t ế bào có tolylsul f onyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK) trypsin. - Pha lo ã ng vi rút theo tỷ l ệ 1:10, pha lo ã ng 7 nồng độ. A.2 . Cách t i ến hành - Đánh dấu thứ tự các n ồ ng độ gây nhiễm tr ê n đĩa t ế bào. - Mỗi đĩa cố 4 giếng d ùng làm đối chứng. - Loại bỏ m ô i trư ờ ng nuôi c ấ y trong đ ĩ a t ế bào, rửa t ế bào 1 l ầ n bằng dung d ị ch muối đệm phosphat (PBS) trước khi gây nhi ễ m 0,1 ml dung dịch pha loãng vi rút. - Bắt đầu t ừ n ồ ng độ pha loãng cao nh ấ t, mỗi nồng độ gây nhiễm cho 4 gi ế ng. - Tiếp tục gây nhiễm các giếng ti ế p theo, ngược trở lại đến n ồ ng độ pha l oãng thấp nh ấ t. - Thay đổi đầu pipet khi cần thiết. - Đặt đ ĩ a vào trong tủ ấ m 37 ° C trong môi trư ờ ng c ó 5 % C O 2 trong 1 h. - Rửa bỏ những vi rút không bám tr ê n b ề mặt t ế bào bằng dung dịch PBS. - Thêm 0,5 ml môi trường có chứa dung dịch albumin huy ế t thanh bò (BSA), TPCK trypsin và kháng sinh. - Đặt đĩa vào tủ ấ m 37 ° C trong môi trường c ó 5 % CO 2 và giám sát CPE (cytopathic effect) trong thời gian từ 1 ngày đến 4 ngày. - Ghi lại số lượng gi ế ng d ương tính và âm tính. - T í nh TCID 50 (li ề u xâm nhiễm của virus gây hủy hoại 50 % số giếng t ế bào) theo công thức spearman - Kaber. λ . TCID 50 (0,1 ml) = X + 1/2 - ( N x / n ) trong đó: X là logarit cơ số 10 của độ pha lo ã ng vi rút có 100 % gi ế ng xu ấ t hiện bệnh tích tế bào; N x là tổng số giếng có bệnh tích tế bào trong thí nghiệm; n là số giếng c ủ a mỗi độ pha l o ã ng; λ là độ pha lo ã ng vi rút. PHỤ LỤC B (Quy định) Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà B.1 . Thu ố c thử và v ậ t liệu thử - Dung dịch natri ci tr at 4 %. - Nước muối sinh lý (dung d ị ch NaCI 0,85 %). - Máu gà trống khoẻ mạnh đ ã trưởng thành, không có kháng th ể cúm và Newcast l e. - Đĩa 96 giếng ch ữ U . B.2 . Thiết b ị , dụng cụ - Máy ly tâm, c ó th ể quay với tốc độ từ 1000 r/min đ ế n 1500 r/min. - Ố ng ly tâm. - Xyranh, dung tích 5 ml. - Máy l ắ c (tùy chọn). B.3 . Chuẩn b ị h ồ ng cầu gà 1 % - Dùng xyranh dung t í ch 5 ml hoặc 10 ml đ ể hút 1 ml (10 % th ể t í ch) dung d ị ch ch ố ng đông (natri citrat 4 %) cho vào ống ly tâm, th ê m 9 ml máu gà trống. - Ly tâm với tốc độ từ 1000 r/min đ ế n 1500 r/min trong 15 min, đ ổ bỏ huy ế t tương, cho th ê m nước muối sinh lý vào hồng c ầ u, lắc đ ề u. Ly tâm như trên từ 3 l ầ n đến 4 lần đ ể rửa hồng cầu, hút bỏ nước ở tr ê n sau lần ly tâm cuối. - Chu ẩ n bị huyễn dịch 1 % b ằ ng cách pha 1 ml hồng cầu với 99 ml nước muối sinh l ý . - Bảo quản huy ễ n dịch h ồ ng cầu ở nhiệt độ từ 4 ° C đ ế n 8 ° C . Hồng c ầ u sau khi pha có thể dùng trong 4 ngày đ ế n 5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết th ì loại bỏ, kh ô ng nên dùng). B.4 . Cách tiến hành - Nh ỏ 50 m l nước mu ố i sinh lý vô trùng vào đĩa 96 giếng chữ U từ gi ế ng thứ 1 đ ế n gi ế ng 12 của mỗi h à ng. - Nhỏ 50 m l kháng nguyên vi rút vào cột đầu tiên c ủ a đĩa. - Tiếp tục pha lo ã ng kháng nguyên kiểm tra theo cơ số 2 bằng cách chuy ể n 50 m l từ gi ế ng 1 đ ế n giếng thứ 2 và tuần tự đ ế n gi ế ng 11 rồi bỏ đi 50 m l. - Gi ế ng 12 dùng đối chứng chứa: 50 m l nước muối sinh lý và 50 m l hồng cầu gà 1%. - Nhỏ 50 m l h ồ ng cầu gà 1% vào các gi ế ng của đ ĩ a phản ứng. - Lắc nhẹ bằng tay hoặc b ằ ng máy. Ủ đĩa ph ả n ứng ở nhiệt độ phòng tr ong thời gian khoảng 30 min,sau đ ó đọc kết quả. B.5 . Di ễ n giải k ế t quả - Phản ứng â m tính: Hồng cầu lắng đ ề u ở dưới đ á y giếng thành ch ấ m tròn. - Phản ứng d ương tính: Xảy ra hiện tượng ngưng kết, h ồ ng cầu ngưng k ế t t h à nh cụm l ấ m t ấ m xung quanh gi ế ng. - Đọc hiệu giá ngưng k ế t: Hiệu g i á ngưng k ế t kháng nguy ê n được đánh giá ở độ pha loãng cao nh ấ t còn có phản ứng ngưng k ế t xảy ra. PHỤ LỤC C (Quy định) Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà C.1 . Thuốc th ử và vật l iệ u thử - Hồng cầu gà, nồng độ từ 0,8 % đ ế n 1 %. - Kháng nguyên (nước trứng). - Nước muối sinh lý ( d ung dịch NaC l 0,85 %). - Đ ĩ a ngưng k ế t 96 gi ế ng đáy chữ V. C.2 . Cách tiến hành - Đánh d ấ u mẫu huyết thanh c ầ n ki ể m tra l ê n đĩa 96 gi ế ng đáy chữ V. - Nhỏ 25 m l nước muối sinh l ý v ô trùng vào các giếng của đĩa 96 gi ế ng. - Nhỏ 25 m l huyết thanh c ầ n kiểm tra vào d ã y 1, pha loãng bậc 2. - Dùng micropipet trộn đ ề u gi ế ng 1, chuy ể n 25 m l gi ế ng 1 sang gi ế ng 2. Tương tự đ ế n nồng độ th í ch hợp. D ã y đối chứng dương nước muối sinh lý + hồng cầu, đối chứng âm kh á ng nguyên + h ồ ng cầu. - Cho vào t ấ t cả các gi ế ng mỗi giếng 25 m l dung dịch kháng nguy ê n 4HA, lắc nhẹ trong v ò ng 1 min. Để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 min. - Hút 50 m l dung dịch h ồ ng cầu cho vào các giếng, lắc nh ẹ trong vòng 1 min. Đ ể ở nhiệt độ phòng trong 30 min (khi nào đối chứng lắng hoàn toàn) và đọc kết quả. C.3 . Di ễ n gi ả i kết qu ả - Phản ứ ng âm t í nh: Có hạt ngưng k ế t bông lởn vởn. - Phản ứng dương tính: H ồ ng cầu l ắ ng xuống đáy tạo chấm tròn. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] ASEAN Standard Requ i rements for Avian lnf l uenza Vacc i ne [2] Chapter 2.3.4: Avian lnfluenza, OIE Terrestrial Manual 2009