TCVN4328:2001

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4328:2001 về thức ăn chăn nuôi - xác định hàm lượng nitơ và tính hàm lượng protein thô - phương pháp Kjeldahl do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 4328:2001 THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ VÀ TÍNH HÀM LƯỢNG PROTEIN THÔ – PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL Aniaml feeding stuffs – Determination of nitrogen content and calculation of crude protein content – Kjeldahl method 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng nitơ trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp Kjeldahl, và phương pháp tính hàm lượng protein thô. Phương pháp này không phân biệt giữa nitơ protein và nitơ phi protein. Nếu cần phải xác định hàm lượng nitơ phi protein thì có thể áp dụng phương pháp thích hợp khác. Chú thích – Trong một số trường hợp, nitơ ở dạng nitrat và nitrit không thể thu hồi hoàn toàn bằng phương pháp này. 2. Tiêu chuẩn viện dẫn TCVN 6952 : 2001 (ISO 6498 : 1998) Thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử. 3. Nguyên tắc Vô cơ hóa chất hữu cơ bằng axit sunfuric với sự có mặt của chất xúc tác. Kiểm hóa sản phẩm phản ứng, sau đó đem cất và chuẩn độ lượng amoniac giải phóng ra. Tính hàm lượng nitơ. Nhân kết quả với hệ số qui ước 6,25 để có hàm lượng protein thô. 4. Thuốc thử và hóa chất Chỉ sử dụng những thuốc thử phân tích và nước cất hoặc nước đã loại ion hoặc ít nhất nước có độ khiết tương đương. Những thuốc thử [trừ những chất chuẩn ở (4.6)] phải không được có hợp chất nitơ. 4.1 Kali sunfat. 4.2 Chất xúc tác: dùng 4.2.1 hoặc 4.2.2. 4.2.1 Đồng (II) oxit (CuO). 4.2.2 Đồng (II) pentahydrate sunfat (CuSO 4 .5H 2 O). 4.3 Axit sunfuric: c(H 2 SO 4 ) = 18 mol/l, r 20 (H 2 SO 4 ) = 1,84 g/ml. 4.4 Sáp parafin. 4.5 Đường sacaroza. 4.6 Chất chuẩn, dùng 4.6.1 hoặc 4.6.2. 4.6.1 Acetanilit: điểm nóng chảy 114 0 C, hàm lượng nitơ (N) 103,6 g/kg. 4.6.2 Tryptophan: điểm nóng chảy 282 0 C, hàm lượng nitơ (N) 137,2 g/kg. Trước khi sử dụng sấy khô tryptophan. 4.7 Dung dịch hydroxit natri: w(NaOH) = 33% (m/m). 4.8 Axit dùng ở bình hứng: theo 4.8.1 hoặc 4.8.2. 4.8.1 Axit sunfuric: pha loãng trong bình có dung tích chuẩn, c(H 2 SO 4 ) = 0,05 mol/l hoặc c(H 2 SO 4 ) = 0,125 mol/l. 4.8.2 Axit boric: r (H 3 BO 3 ) = 40 g/l. 4.9 Dung dịch chuẩn độ: dùng 4.9.1 hoặc 4.9.2. 4.9.1 Hydroxit natri: pha loãng trong bình có dung tích chuẩn, c(NaOH) = 0,1 mol/l hoặc c(NaOH) = 0,25 mol/l. 4.9.2 Axit sunfuric, pha loãng trong bình có dung tích chuẩn, c(H 2 SO 4 ) = 0,05 mol/l hoặc c(H 2 SO 4 ) = 0,125 mol/l. 4.10 Chất chỉ thị hỗn hợp, điểm trung tính tại pH = 4,4 – 5,8. Hòa tan 2g metyl đỏ và 1g metylen xanh trong 1000 ml etanol [w(C 2 H 5 OH) = 95% (v/v)] 4.11 Giấy quỳ. 4.12 Chất trợ sôi: đá bọt hạt, hoặc viên bi thủy tinh đường kính 5 mm đến 7 mm, hoặc tinh thể silic cacbua đã được rửa bằng axit clohydric và nước cất và được tro hóa. 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị dùng trong phòng thí nghiệm, cụ thể những thiết bị sau: 5.1 Cân phân tích. 5.2 Thiết bị vô cơ hóa, chưng cất và chuẩn độ. 6. Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thí nghiệm phải là mẫu trung thực và có tính đại diện, không bị hư hại hoặc biến đổi thành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Phương pháp lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo ISO 6497 [5]. Trong quá trình bảo quản mẫu, phải giảm thiểu sự hư hại và sự biến đổi thành phần của mẫu. 7. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952:2001 (ISO 6498). 8. Cách tiến hành Chú thích – Hướng dẫn chung khi áp dụng phương pháp Kjeldahl, đề nghị xem ISO 1871 [1]. 8.1 Phần mẫu thử Cân mẫu thử, chính xác đến 1mg, tùy thuộc vào hàm lượng nitơ sao cho phần mẫu thử chứa khoảng 0,005g đến 0,2 g nitơ, tốt nhất là trên 0,02g nitơ. Chú thích 1 – Khối lượng phần mẫu thử khô và đồng nhất nằm trong khoảng 0,5g đến 2,0g. Khối lượng phần mẫu thử ướt và/hoặc không đồng nhất nằm trong khoảng 2,5g đến 5,0g. 8.2 Xác định Cảnh báo – Những thao tác dưới đây phải được thực hiện trong tủ hốt có hệ thống thông gió tốt hoặc trong tủ hốt chịu được axit sunfuric. 8.2.1 Vô cơ hóa chất hữu cơ Chuyển phần mẫu thử vào bình Kjeldahl có dung tích phù hợp (thường là 800 ml). Thêm 15g kali sunfat (4.1). Thêm một lượng chất xúc tác phù hợp gồm: 0,3g đồng (II) oxit (4.2.1) hoặc 0,9 g đến 1,2g đồng (II) pentahydrat sunfat (4.2.2). Thêm 25 ml axit sunfuric (4.3) đối với gam chất khô đầu tiên của mẫu thử và thêm 6 ml đến 12 ml cho mỗi gam chất khô tiếp theo. Trộn đều, đảm bảo đã làm ướt toàn bộ phần mẫu thử. Đặt bình Kjeldahl nghiêng một góc 30 0 – 45 0 , giữ bình ở vị trí này trong suốt quá trình vô cơ hóa mẫu. Đầu tiên đun nhẹ để tránh bọt trào lên cổ bình hoặc trào ra ngoài. Chú thích: 1. Có thể thêm chất chống tạo bọt như sáp parafin (4.4). 2. Sử dụng bộ thiết bị thích hợp để đảm bảo hỗn hợp vô cơ hóa được xử lý nhiệt tốt. Đun sôi nhẹ và thỉnh thoảng lắc đến khi toàn bộ hỗn hợp bị cacbon hóa và hết bọt. Sau đó tiếp tục đun đến khi chất lỏng sôi đều. Chú thích 3 – Nếu thấy axit sôi ngưng tụ ở phía giữa cổ bình Kjeldahl có nghĩa là quá trình vô cơ hóa đã hoàn tất. Tránh để thành bình không tiếp xúc với dịch lỏng bị quá nóng Chú thích 4 – Nếu dùng ngọn lửa thường, có thể tránh hiện tượng quá nhiệt bằng cách đặt bình trên lưới làm bằng vật liệu chịu nhiệt có đường kính lỗ lưới hơi nhỏ hơn đường kính phần chất lỏng ở trong bình. Sau khi chất lỏng trong bình trong và có mầu xanh da trời nhạt, tiếp tục đun thêm 2 giờ. Để nguội. Nếu quá trình vô cơ hóa thấy xuất hiện cặn rắn thì cho một ít nước rồi lắc đều. 8.2.2 Chưng cất amoniac 8.2.2.1 Cho từ từ 250 ml đến 350 ml nước để hòa tan hoàn toàn sunfat. Nếu cần hòa tan dễ dàng hơn, làm nóng bình trong nước ấm. Lắc đều và để nguội. Thêm chất trợ sôi (4.12). Chú thích – Đối với một số mẫu đặc biệt, sunfat có thể không hòa tan hoàn toàn trong nước. Trong trường hợp này phải lặp lại quá trình vô cơ hóa với lượng kali sunfat nhỏ hơn (4.1). 8.2.2.2 Dùng pipet hút 25 ml axit sunfuric (4.8.1) cho vào bình hứng của thiết bị cất, có nồng độ axit chọn phụ thuộc vào lượng nitơ của phần mẫu thử. Thêm 100 ml đến 150 ml nước. Thêm vài giọt chất chỉ thị hỗn hợp (4.10). Làm tiếp theo 8.2.2.4. 8.2.2.3 Cách khác, cho vào bình hứng 100 ml đến 250 ml axit boric (4.8.2). Thêm vài giọt chất chỉ thị hỗn hợp (4.10). Chú thích – Đồng thời với việc chuẩn độ amoniac (xem 8.2.3.2) khi cất điều này giúp cho việc xác định thời điểm kết thúc quá trình cất được dễ dàng. 8.2.2.4 Nhúng đầu ra của phần ngưng tụ trong chất lỏng của bình hứng sâu ít nhất 1 cm. Rót từ từ 100 ml dung dịch hydroxit natri (4.7) theo thành bình vào bình chưng cất. Lắp ngay bình vào bộ cất. Đun bình cất sao cho trong 30 phút thu được khoảng 150 ml dịch cất. Khi gần kết thúc thời gian cất, dùng giấy quỳ (4.11) kiểm tra độ pH của dịch cất ở đầu ống ngưng bằng giấy quỳ. Nếu phản ứng vẫn kiềm, tiếp tục cất. Chú ý – Lấy bình ngưng ra khỏi chất lỏng ngay trước khi kết thúc quá trình cất để tránh hiện tượng sục ngược trở lại của dịch cất. Nếu dùng axit sunfuric trong quá trình cất, thì dung dịch trong bình hứng sẽ chuyển sang môi trường kiềm, do vậy nên có sự điều chỉnh thích hợp khi bắt đầu xác định. 8.2.3 Chuẩn độ Chú thích – Nên dùng máy đo pH để xác định bước nhảy trong chuẩn độ tự động. Hoặc xác định bước nhảy căn cứ vào sự chuyển mầu của chỉ thị hỗn hợp (4.10) thêm vào ở 8.2.2. 8.2.3.1 Nếu dùng axit sunfuric ở bình hứng, chuẩn độ lượng axit sunfuric dư bằng dung dịch hydroxit natri (4.9.1), nồng độ c(NaOH) = 0,1 mol/l hoặc c(NaOH) = 0,25 mol/l, đến khi máy đo pH chỉ ra bước nhảy của phản ứng hoặc đến khi xuất hiện sự thay đổi mầu từ tím sang xanh lá cây. 8.2.3.2 Nếu dùng axit boric ở bình hứng, chuẩn độ amoniac bằng axit sunfuric (4.9.2) nồng độ c(H 2 SO 4 ) = 0,05 mol/l hoặc c(H 2 SO 4 ) = 0,125 mol/l, đến khi máy đo pH chỉ ra bước nhảy của phản ứng hoặc đến khi xuất hiện sự thay đổi mầu từ xanh lá cây sang tím. Nếu chuẩn độ không tiến hành được đồng thời (xem chú thích ở 8.2.2.3), thì nên chuẩn độ ngay sau khi quá trình cất hoàn thành và đảm bảo nhiệt độ dịch cất không vượt quá 25 0 C. Ở điều kiện này sẽ tránh được sự tổn thất amoniac. 8.3 Mẫu trắng Dùng 1g đường sacaroza (4.5) thay thế phần mẫu thử để làm mẫu trắng. 8.4 Phép thử kiểm tra Tiến hành phép thử kiểm tra bằng cách xác định lượng nitơ trong acetanilit (4.6.1) hoặc tryptophan (4.6.2) sau khi đã thêm 1g sacaroza (4.5). Việc chọn chất dùng cho phép thử kiểm tra phải tương đương với khả năng vô cơ hóa của mẫu phân tích. Acetanilit dễ bị thủy phân trong khi đó tryptophan khó bị thủy phân hơn. Thu hồi nitơ từ acetanilit hoặc từ tryptophan ít nhất phải là 99,5% đối với acetanilit hoặc 99,0% đối với tryptophan. Sự khác nhau tối đa giữa các lần xác định được tiến hành đồng thời không được vượt quá 3 gam trên kilôgam hàm lượng chất khô. 9. Tính toán và biểu thị kết quả 9.1 Tính hàm lượng nitơ 9.1.1 Trường hợp thu dịch chưng cất trong axit sunfuric Khi thể tích axit sunfuric sử dụng để thu hồi amoniac trong mẫu thử xác định ở (8.2) và trong mẫu thử ở (8.3) là như nhau, hàm lượng nitơ của mẫu thử được xác định theo công thức dưới đây: trong đó W N1 là lượng nitơ của mẫu thử, tính bằng gam trên kilôgam; V 0 là thể tích dung dịch hydroxit natri (4.9.1) dùng cho mẫu trắng, tính bằng mililit; V 1 là thể tích dung dịch hydroxit natri (4.9.1) dùng cho mẫu thử, tính bằng mililit; c 1 là nồng độ dung dịch hydroxit natri (4.9.1) dùng để chuẩn độ, tính bằng mol trên lít; M là khối lượng phân tử gam của nitơ, (M=14g/mol) tính bằng gam trên mol; m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam. Báo cáo kết quả chính xác đến 0,01 g/kg. 9.1.2 Trường hợp thu dịch cất trong axit boric Hàm lượng nitơ của mẫu thử được tính theo công thức: trong đó W N2 là lượng nitơ của mẫu thử, tính bằng gam trên kilôgam; V 2 là thể tích axit sunfuric (4.9.2) dùng cho mẫu trắng, tính bằng mililit; V 3 là thể tích axit sunfuric (4.9.2) dùng cho mẫu thử, tính bằng mililit; c 2 là nồng độ axit sunfuric (4.9.2) dùng để chuẩn độ, tính bằng mol trên lít; M là khối lượng phân tử gam của nitơ, (M=14g/mol) tính bằng gam trên mol; m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam. Báo cáo kết quả chính xác đến 0,01 g/kg. 9.2 Tính hàm lượng protein thô Hàm lượng protein thô của mẫu thử được tính theo công thức: W P = 6,25 W N Trong đó W P là hàm lượng protein thô của mẫu thử, tính bằng gam trên kilogam; W N là hàm lượng nitơ của mẫu thử (W N1 hoặc W N2 ), tính bằng gam trên kilogam. Báo cáo kết quả chính xác đến 1g/kg. 10. Độ chụm 10.1 Thử nghiệm liên phòng thí nghiệm Những chi tiết của thử nghiệm liên phòng thí nghiệm về độ chụm của phương pháp được tóm tắt trong phụ lục A. Những giá trị này không áp dụng với những dải nồng độ và các thành phân khác với những dải nồng độ và thành phần đã cho. 10.2 Độ lặp lại Sự chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn, do cùng một kiểm nghiệm viên thực hiện khi áp dụng cùng một phương pháp, cùng thiết bị kiểm tra, cùng một phòng thí nghiệm ở một khoảng thời gian ngắn, sẽ không có trên 5% các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại (r), được tính theo công thức sau: Trong đó r là giới hạn lặp lại, tính bằng gam trên kilôgam; là giá trị trung bình của hai kết quả xác định lượng protein thô, tính bằng gam trên kilôgam. 10.3 Độ tái lập Sự chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn trên cùng một phương pháp, đối với cùng mẫu kiểm tra nhưng do các kỹ thuật viên khác nhau tiến hành trên những thiết bị khác nhau ở các phòng thử nghiệm khác nhau sẽ không có trên 5% các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R được tính theo công thức sau: Trong đó R là giới hạn tái lặp, tính bằng gam trên kilôgam; là giá trị trung bình của hai kết quả xác định lượng protein thô, tính bằng gam trên kilôgam. 11. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải thể hiện: - tất cả những thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu; - phương pháp lấy mẫu, nếu biết; - phương pháp thử đã áp dụng; - kết quả thử hoặc về hàm lượng nitơ hoặc về lượng protein thô cùng với hệ số chuyển đổi (ví dụ 6,25); - nếu đã kiểm tra độ lặp lại, đưa ra kết quả nhận xét cuối cùng; - các thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tự chọn cùng với các chi tiết của bất kỳ yếu tố nào có thể ảnh hưởng đến kết quả; PHỤ LỤC A (tham khảo) KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM LIÊN PHÒNG THÍ NGHIỆM ISO/TC 34/SC 10 đã tổ chức một cuộc thử nghiệm liên phòng thí nghiệm về Thức ăn chăn nuôi vào năm 1987 theo ISO 5725 : 1986 [2]. Kết quả phân tích thống kê cuối cùng thực hiện theo TCVN 6910-2: 2001 (ISO 5725-2) [4]. Có 25 phòng thí nghiệm tham gia. Các mẫu thí nghiệm gồm thức ăn có chứa gluten ngô, bột cá, thức ăn đậm đặc (2 loại), premix và nấm men. Bảng A.1 – Kết quả thống kê của thử nghiệm liên phòng thí nghiệm Thông số Mẫu 1) 1 2 3 4 5 6 7 Số phòng thí nghiệm được chọn *) 25 25 25 25 25 25 25 Hàm lượng protein thô trung bình, g/kg 2) 704 810 456 29,8 394 474 252 Độ lệch chuẩn lặp lại (s r ), g/kg 4,6 4,5 3,2 0,85 2,9 2,3 3,2 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, % 0,65 0,55 0,71 2,85 0,75 0,50 1,26 Giới hạn lặp lại (r) [r=2,8 x sr], g/kg 12,88 12,60 8,96 2,38 8,12 6,44 8,96 Độ lệch chuẩn tái lập (s R ), g/kg 10,6 12,9 12,5 4,3 12,4 10,3 8,2 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, % 1,51 1,59 2,75 14,5 3,16 2,17 3,24 Giới hạn tái lập (R) [R = 2,8 x s R ], g/kg 29,68 36,12 35,00 12,04 34,72 28,84 22,96 1) Mẫu 1: bột cá; Mẫu 2: thức ăn chứa gluten ngô; Mẫu 3: nấm men; Mẫu 4: premix Mẫu 5: thức ăn chăn nuôi đậm đặc; Mẫu 6: thức ăn chăn nuôi đậm đặc; Mẫu 7: thức ăn hỗn hợp (giai đoạn kết thúc). 2) Dựa trên chất khô. *) Số phòng thử nghiệm được chọn, không tính phòng thử nghiệm đã bị loại.