TCVN12195-2-6:2018

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12195-2-6:2018 về Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Phytophthora boehmeriae Sawada TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12195-2-6:2018 QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT PHẦN 2-6: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI PHYTOPHTHORA BOEHMERIAE SAWADA Procedure for identification of plant disease caused by fungi Part 2-6: Particular requirements for Phytophthora boehmeriae Sawada L ờ i nói đầu TCVN 12195-2-6: 2018 do Trung tâm Giám định Kiểm dịch thực vật - Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ TCVN 12195 Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật gồm các phần sau đây: - Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Guignardia bidwellii (Ellis) Viala & Ravaz - Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr - Ph ầ n 2-3: Y ê u cầu cụ thể đối v ớ i n ấ m Claviceps africana Frederickson, Man t l e & De Milliano - Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Ciborinia camelliae Kohn - Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Boeremia foveata (Foister) Aveskamp, Gruyter & Verkley - Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Phytophthora boehmeriae Sawada QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT PHẦN 2-6: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI PHYTOPHTHORA BOEHMERIAE SAWADA Procedure for identification of plant disease caused by fungi Part 2-6: Particular requirements for Phytophthora boehmeriae Sawada 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình giám định Phytophthora boehmeriea Sawada gây bệnh thực vật. 2 Tài liệu viện dẫn Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 8597: 2010, Kiểm dịch thực vật - Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng. 3 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị sau: 3.1 Túi lấy mẫu: sạch 3.2 Tủ lạnh: nhiệt độ từ 4 ̊C đến 8 ̊C 3.3 Giấy bản: thấm nước, sạch 3.4 Kẹp ép mẫu thực vật: gồm 2 cặp mắt cáo (thường là bằng gỗ), dây buộc 3.5 Lọ đựng mẫu: Tre với hóa chất, có nắp 3.6 Tủ lưu trữ mẫu 3.7 Hộp lưu trữ mẫu 3.8 Kim khêu nấm 3.9 Dao cắt mẫu 3.10 Bình tam giác 3.11 Thẩu thủy tinh 3.12 Đĩa petri 3.13 Lam kính 3.14 Lam e n 3.15 Đ è n cồn 3.16 Bàn gia nhiệt 3.17 Ống ly tâm 1,5 ml: bằng nhựa, có nắp. 3.18 Chày nhựa 3.19 Ch à y cối sứ 3.20 Máy chu trình nhiệt (PCR) 3.21 Kính hiển vi: có độ phóng đại 40x đến 100x 4. Hóa chất Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác. 4.1 Hóa chất điều chế môi trường: LBA, CA, V8, Oatmeal Agar, 4.2 Cồn (C 2 H 5 OH): 70 %, 90% 4.3 Nước cất 1 lần, nước cất vô trùng 4.4 S ili cag e l 4.5 Parafin 4.7 Axít Sunfuric (H 2 SO 4 ) 10 % 4.8 Hóa chất cố định mẫu : chất kết dính, keo Bôm Canada, Xylene. 4.9 Hóa chất PCR: Natri clorit (NaC l ) khan, Kali clorit (KC l ), Natri hydro phosphat (Na 2 HPO 4 ), Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ), Tris- HC l 1M, EDTA 0,5M, Natri clorit (NaC l ) 5M, PVP 40, 2- mercaptoethanol, phenol: chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), isopropanol, dry milk solution, SDS, ammonium acetate 7,5M, PCR Buffer 10x, dNTPs 2.0nM, Primers, Taq polymerase, agarose, loading dye. 5 Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu 5.1 Lấy mẫu 5.1.1 Đối với hàng hóa xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước Lấy mẫu theo TCVN 8597:2010 5.1.2 Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng - Diện tích điều tra: phụ thuộc vào loại cây trồng, điều kiện cụ thể tại vùng điều tra và mục đích điều tra. - Chọn điểm điều tra: Có thể chọn điểm điều tra theo một trong số các phương pháp sau + Chọn điểm theo đương chéo góc (hình 1) Hình 1- Điểm điều tra lấy theo đường chéo góc (NGUỒN: Viện Bảo vệ thực vật, 1997) + Chọn điểm theo ô bàn cờ (hình 2) Hình 2 - Điểm điều tra lấy theo ô bàn cờ (NGUỒN: Viện Bảo vệ thực vật, 1997) + Chọn điểm hình rẻ quạt (hình 3) Hình 3 - Điểm điều tra lấy theo hình rẻ quạt (NGUỒN: Viện Bảo vệ thực vật, 1997) + Chọn điểm ngẫu nhi ê n (hình 4) Hình 4 - Điểm điều tra lấy theo ngẫu nhiên (NGUỒN: Viện Bảo vệ thực vật, 1997) + Điều tra toàn bộ ruộng theo băng (hình 5). Tại ruộng điều tra, điều tra toàn bộ ruộng theo phương pháp cuốn chiếu theo băng. Mỗi ruộng được chia ra làm các băng nhỏ, mỗi băng có chiều rộng 2 m, điều tra lần lượt từ đầu tới cuối băng và kiểm tra toàn bộ cây trồng trong mỗi băng điều tra. Hình 5 - Điều tra toàn bộ ruộng theo băng - Số lượng mẫu: s ố lượng mẫu phụ thuộc vào mục đích điều tra và phương pháp lấy mẫu. + Cây ăn quả, cây lâu năm, cây công nghiệp: số lượng cây điều tra tại một điểm tối thiểu từ 3 cây đến 5 cây. + Cây hàng năm, rau màu, cây ngắn ngày: mỗi điểm có diện tích tối thiểu là 1 m 2 . Thu toàn bộ các bông có triệu chứng nghi bị nhiễm nấm P. boehmeriae Sawada. Mẫu rễ và đất được lấy của 4 cây mỗi điểm. Mẫu đất: Lấy mẫu đất có độ sâu 5 cm đến 25cm 5.2 Bảo quản mẫu Các bộ phận tươi khi thu được chứa trong các túi lấy mẫu (3.1) và bảo quản trong tủ lạnh (3.2) ở nhiệt độ 4 ̊C đến 5 ̊C. Các mẫu tươi sau khi giám định hoặc gửi đi giám định có thể xử lý bằng phương pháp: Ép khô Bộ phận nhiễm bệnh (quả) được ép khô bằng cách đặt giữa các lớp giấy bản (3.3) thường là từ 4 đến 5 tờ. Các lớp giấy bản (có chứa mẫu) được đặt giữa 2 miếng bìa các tông và đặt vào kẹp ép mẫu thực vật (3.4) sau đó nén chặt bằng dây hoặc vật nặng. Trong quá trình làm khô mẫu giấy bản nên thay thường xuyên khoảng 1 lần/ngày. Kẹp ép mẫu thực vật (có chứa mẫu) có thể phơi nắng, để trong phòng có điều hòa hoặc máy sưởi để tăng hiệu quả làm khô mẫu. Thời gian làm khô mẫu hoàn toàn thông thường là từ 5 đến 10 ngày. Mẫu đạt tiêu chuẩn là các mẫu không bị mốc, khô hoàn toàn, không bị gập gãy hoặc nhăn nheo. Các mẫu vật sau khi ép khô được đặt trong các túi lấy mẫu vô trùng, bên ngoài đề rõ các thông tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu; thông tin kí chủ; thông tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại); địa điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu). Các túi chứa mẫu bằng giấy được lưu trữ trong các tủ lưu trữ mẫu (3.6) (hoặc các hộp lưu trữ mẫu (3.7)) cố độ ẩm thấp (có thể sử dụng các vật liệu chống ẩm như silicagel...) Ngâm mẫu: Bộ phận nhiễm bệnh (cành, lá, quả tươi) được rửa nhẹ dưới vòi nước chảy sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng. Mẫu được để chỗ thoáng để bề mặt khô hoàn toàn. Có thể ngâm mẫu vào dung dịch H 2 SO 4 10 % bổ sung thêm glycerol 0,01 % và cồn 90 % 0,01 % trong vòng 24 giờ. Vớt mẫu vật ra, rửa trong nước lạnh. Chuyển mẫu vào dung dịch bảo quản (Xem phụ lục C) và đậy chặt nắp. Thay dung dịch bảo tồn khi thấy hiện tượng dung dịch bị vẩn đục (hoặc 6 tháng 1 lần) cho đến khi dung dịch bảo tồn không bị vẩn đục nữa thì gắn chặt lọ mẫu bằng parafin. Dán nhãn bên ngoài hộp ngâm mẫu ghi rõ các thông tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu; thông tin kí chủ; thông tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại); địa điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu). Các tiêu bản lam của nấm được dán nhãn, để trong hộp lưu trữ mẫu (3.7) và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Ảnh chụp của mẫu vật (ảnh mẫu vật, ảnh cấu trúc nấm...) được ghi rõ các thông tin và lưu lại trong máy tính hoặc ảnh rửa. 6 Phát hiện bệnh Nấm gây hại trên cây con và quả bông, lá và thân cây gai, lá cây dướng, quả cây họ cam quýt, rễ thông. Trên mỗi bộ phận và loại cây nấm thể hiện các triệu chứng khác nhau: 6.1 Triệu chứng trên chi bông ( Gossypium sp .) Giai đoạn cây con: Trên lá mần hoặc lá thật nấm gây ra các vết bệnh có màu xanh đen, hình dạng bất định, sũng nước. Lá mầm hoặc lá thật nhiễm bệnh thường rụng đi hoặc bị héo khi gặp thời tiết lạnh và ẩm ướt. Phần cổ rễ thường có các sọc màu nâu sau đó thối đi cây con sau đó bị héo và chết. Trên quả: Các vết bệnh thường xuất hiện ở các vết nứt dưới đáy quả hoặc trên đầu quả. Vết bệnh có dạng sũng nước màu xanh đậm, mô nhiễm bệnh sau đó bị thối. Trong điều kiện thời tiết ẩm có thể quan sát thấy một lớp "sương mai" mỏng trên bề mặt vết bệnh. Bông bị bệnh thường bị thối hỏng. 6.2 Triệu chứng trên cây gai ( Boehmeria nivea ) Bệnh gây hại trên lá và thân. Trên lá vết bệnh đầu tiên có màu xanh nhạt sau đó chuyển thành nâu đen hoặc xanh đen. Vết bệnh có dạng tròn hoặc bất định, hơi sũng nước. Trong giai đoạn nhiễm nặng tâm vết bệnh chuyển màu nâu vàng hoặc xám, rìa màu nâu. Lá nhiễm bệnh thường rụng sớm. Vết bệnh thường ở phần gốc thân, vết bệnh màu nâu đen hình ellip. Khi nhiễm bệnh ở phần thân cây thường bị thối phần gốc thân. 6.3 Triệu chứng trên cây Dướng ( Broussonetia papyrifera ) và cây cơi ( Pterocarya stenoptera C . DC.) Triệu chứng nấm gây hại trên cây dướng và cây cơi tương tự như triệu chứng của nấm trên lá và lá mầm của bông 6.4 Triệu chứng trên cây có múi ( Citrus spp.): Nấm gây thối nâu quả và chảy mủ phần gốc ghép. 6.6 Triệu chứng trên chi thông ( Pinus sp.) Nấm gây hiện tượng thối rễ trên cây thông. Như vậy các dấu hiệu cơ bản để nhận biết nhanh bệnh trên các loài cây kí chủ như sau: Cây: héo hoặc chết (chi bông) Lá: Đốm trên lá (cây dướng, cây cơi), vết bệnh tròn sũng nước lá rụng (chi bông) Thân: Chảy mủ (Cây có múi) Rễ: thối rễ (cây có múi, chi thông, chi bông) Khi kiểm tra lô hàng cần chú ý các quốc gia mà nấm có phân bố (xem phụ lục A) và các loài kí chủ mà nấm gây hại (xem phụ lục A). 7 Giám định bệnh 7.1 Giám định bằng đặc điểm hình thái 7.1.1 Kiểm tra trực tiếp 7.1.1.1 Soi tươi Dùng kim khêu nấm (3.8) hoặc dao cắt mẫu (3.9) thu nấm trực tiếp từ các phần nghi ngờ nhiễm bệnh hoặc có triệu chứng điển hình, đặt lên lam kính (3.13) đã có một giọt lactophenol (xem phụ lục C). Đặt lam lên kính hiển vi (3.21), quan sát đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm trong khóa phân loại hiện có. Đặc biệt chú ý thu nấm từ những bộ phận có triệu chứng bệnh điển hình. 7.1.1.2 Cố định tiêu bản lam - Nấm được làm tiêu bản lam cố định trước khi quan sát, đo đếm hình thái. - Cách làm tiêu bản lam: có thể sử dụng một trong hai phương pháp sau: Phương Pháp 1: cố định lam sử dụng chất kết dính: Nhỏ 1 giọt dung dịch soi kính (có thể sử dụng một trong hai loại dung dịch soi kính: axit lactic 85 %, lactoglycerol (Xem phụ lục C) hoặc lactophenol (Xem phụ lục C)) lên một lam kính (3.13) sạch. Dùng kim khêu nấm (3.8) hoặc dao cắt mẫu (3.9) lấy nấm trên bề mặt vết bệnh hoặc các lát cắt mỏng của mẫu bệnh đặt vào giọt dung dịch soi kính. Đặt lamen (3.14) lên giọt dung dịch soi kính có chứa mẫu nấm. Hơ nhanh qua ngọn lửa đèn cồn (3.15) để đuổi bọt khí. Nếu dịch soi kính tràn ra phía ngoài lamen (3.14) quá nhiều sử dụng giấy thấm lau khô trước khi gắn cố định mẫu. Dùng chất kết dính gắn chặt viền lamen (3.14) và lam kính (3.1). Đặt lam kính đã cố định ở nơi khô ráo. CHÚ THÍCH: phương pháp này có thể lưu trữ tiêu bản lam trong vòng vài năm. Phương pháp 2: sử dụng keo Bôm Canada (Canada balsam) Nhỏ 1 giọt dung dịch keo Bôm Canada-Xylene (Xem phụ lục C) lên một lam kính sạch. Dùng kim khêu nấm (3.11) hoặc dao cắt mẫu (3.12) lấy nấm trên bề mặt vết bệnh hoặc các lát cắt mỏng của mẫu bệnh đặt vào giọt dung dịch keo Bôm Canada-Xylene. Đặt lamen (3.15) lên giọt dung dịch keo Bôm Canada-Xylene có chứa mẫu nấm. Nếu trong lam có bọt khí có thể đuổi bọt khí bằng cách đặt lam lên một bàn gia nhiệt. CHÚ THÍCH: Đây là phương pháp cố định lam lâu dài, thời gian lưu trữ có thể lên tới vài chục năm. - Đặt tiêu bản lam lên kính hiển vi (3.14), quan sát đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm trong khóa phân loại hiện có. 7.1.2 Lắc rửa ly tâm 7.1.2.1 Cách làm Biện pháp lắc rửa ly tâm thường áp dụng đối với các hạt nghi ngờ nhiễm bệnh mà chủ yếu là hạt cây bông. Các bước tiến hành như sau: Bước 1: cân 5 g hạt Bước 2: Cho hạt vào bình tam giác (3.10) có sẵn 150 ml nước cất vô trùng. Lắc mạnh trong 5 phút Bước 3: Lọc dung dịch nước và hạt qua vải lọc (chessedoth) Bước 4: Ly tâm dịch thu được trong 5 phút ở tốc độ 3.000 vòng/phút Bước 5: Thu cặn ly tâm hòa tan vào 0,5 ml nước cất vô trùng 7.1.2.2 Quan sát đặc điểm hình thái của nấm 7.1.12.1 Soi tư ơ i - Quan sát hình thái sợi nấm: Dùng kim khêu nấm (3.8) thu nấm trên mẫu đã để ẩm đặt lên lam trong có một giọt lactophenol rồi đậy lamen (3.14) lên. Đặt lam lên kính hiển vi tìm và quan sát, đo đếm các đặc điểm hình thái của nấm (bào tử, sợi nấm, tản nấm...) và so sánh với đặc điểm hình thái nấm trong khóa phân loại. 7.1.2.2.2 Cố định tiêu bản lam - Thu mẫu nấm hoặc mẫu cắt lát mỏng tiêu bản nấm từ mẫu để ẩm để làm tiêu bản lam cố định. - Làm tiêu bản lam cố định như mục 7.1.1.2 - Đặt tiêu bản lam lên kính hiển vi (3.21), quan sát đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm trong khóa phân loại hiện có. 7.1.3 Phương pháp để ẩm 7.1.3.1 Cách làm Biện pháp để ẩm sử dụng khi đối tượng nghi ngờ nhiễm bệnh là mô cây tươi. Các bước tiến hành như sau: Bước 1: Phần mô cây nghi nhiễm bệnh (cành, thân, lá, quả...) được rửa sạch dưới vòi nước chảy Bước 2: Để phần mô cây này vào buồng để ẩm (thường là các thẩu thủy tinh (3.11) đã được khử trùng bằng cồn, kín hơi) Bước 3: Để ẩm trong điều kiện 25 ̊C ẩm độ 95 % đến 100 % trong điều kiện sáng 7.13.2 Quan sát đặc điểm hình thái của nấm 7.1.3.2.1 Soi tươi - Quan sát hình thái sợi nấm: Dùng kim khêu nấm (3.8) thu nấm trên mẫu đã để ẩm đặt lên lam trong có một giọt lactophenol rồi đậy lamen (3.14) lên. Đặt lam lên kính hiển vi tìm và quan sát, đo đếm các đặc điểm hình thái của nấm (bào tử, sợi nấm, tản nấm...) và so sánh với đặc điểm hình thái nấm trong khóa phân loại. 7.13.2.2 Cố định tiêu bản lam - Thu mẫu nấm hoặc mẫu cắt lát mỏng tiêu bản nấm từ mẫu để ẩm để làm tiêu bản lam cố định. - Làm tiêu bản lam cố định như mục 7.1.12 - Đặt tiêu bản lam lên kính hiển vi (3.21), quan sát đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm trong khóa phân loại hiện có. 7.1.4 Phân lập và nuôi cấy trên môi trường nhân tạo 7.1.4.1 Cách làm 7.4.1 Phân lập nấm từ các mô cây nghi ngờ nhiễm bệnh. Bước 1: Phần mô cây nghi nhiễm bệnh (cành, thân, lá...) được rửa sạch dưới vòi nước chảy Bước 2: Khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong cồn 70 % trong 30 giây, rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng Bước 3: Đặt 1 mẫu nhỏ (5x5) mm phần mô nghi ngờ nhiễm bệnh lên đĩa petri (3.12) có chứa môi trường LBA hoặc V8 có bổ sung thêm chất kháng sinh (Xem phụ lục B). Bước 4: Đặt các đĩa petri môi trường có chứa nấm ở điều kiện phòng trong 3 ngày Bước 5: Cấy chuyển nấm lên các môi trường LBA, V8, CA (Xem phụ lục B) nuôi cấy ở 25 ̊C trong điều kiện tối trong 1 đến 3 ngày. 7.4.2 Nuôi cấy để quan sát bọc bào tử (sporangium) Bước 1: Cấy chuyển 1 mẩu thạch nhỏ có chứa nấm (đường kính 3 đến 5mm) thu được từ bước phân lập (xem 7.1.4.1) vào một đĩa petri (3.12) có chứa môi trường V8 (Xem phụ lục B) đặt đĩa petri trong bóng tối ở nhiệt độ 25 ̊C. Bước 2: Khi nấm phủ kính 1/2 đường kính của đĩa petri chuyển 10 mẩu thạch nhỏ (đường kính 3 đến 5mm) lên 1 đĩa petri sạch. Bước 3: Rót nước cất vô trùng vào đĩa petri ở bước 2 sao cho nước cất hoặc dung dịch phủ kín các mẩu thạch (thông thường là từ 7 ml đến 10 ml nước cất hoặc dung dịch). Bước 4: Đặt các đĩa petri ở bước 3 trong điều kiện chiếu sáng liên tục ở nhiệt độ phòng (22 ̊C đến 25 ̊C) Bước 5: Kiểm tra sau mỗi 12 đến 24 giờ trong khoảng 3 ngày. 7.4.3 Nuôi cấy để quan sát bao trứng (Oospore) Bước 1: Cấy chuyển 1 mẩu thạch nhỏ có chứa nấm thu được ở bước phân lập (xem 7.1.4.1) vào một đĩa petri (3.12) có chứa môi trường V8 hoặc CA (Xem phụ lục B) Bước 2: Đặt đĩa petri ở bước 1 trong điều kiện tối hoàn toàn nhiệt độ 20 ̊C khoảng 6 tuần. Bước 3: Kiểm tra sự có mặt của giao tử đực (sau 1 tuần), giao tử cái (2 tuần) và bào tử trứng (2 đến 6 tuần) 7.4.4 Nuôi cấy để quan sát bào tử hậu (Chlamydospore) Bước 1: Chuyển 1 mẩu thạch nhỏ nuôi cấy trên môi trường CA vào bình thủy tinh có chứa 25ml dịch chiết cà rốt (Xem phụ lục B) nuôi cấy trong bóng tối nhiệt độ 25 °C trong 24 giờ Bước 2: Lắc bình trong 5 phút, nuôi cấy tiếp tục trong điều kiện tối, nhiệt độ 25 ̊C trong 5 ngày. Bước 3: Loại bỏ phần dịch chiết cà rốt, bổ sung thêm 50ml nước cất vô trùng, nuôi cấy trong điều kiện tối, nhiệt độ 18 °C trong 21 ngày. Bước 4: Theo dõi sự hình thành bào tử hậu 7.1.4.2 Quan sát đặc điểm hình thái của nấm 7.1.4.2.1 Soi tươi - Quan sát hình thái sợi nấm: Dùng kim khêu nấm (3.8) thu nấm trên mẫu đã để ẩm đặt lên lam trong có một giọt lactophenol rồi đậy lamen (3.14) lên. Đặt lam lên kính hiển vi tìm và quan sát, đo đếm các đặc điểm hình thái của nấm (bào tử, sợi nấm, tản nấm…) và so sánh với đặc điểm hình thái nấm trong khóa phân loại. 7.1.4.2.2 Cố định tiêu bản lam - Thu mẫu nấm hoặc mẫu cắt lát mỏng tiêu bản nấm từ mẫu để ẩm để làm tiêu bản lam cố định. - Làm tiêu bản lam cố định như mục 7.1.1.2 - Đặt tiêu bản lam lên kính hiển vi (3.21), quan sát đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm trong khóa phân loại hiện có. 7.1.5 Bẫy bào tử trong đất 7.1.5.1 Cách làm Nấm P. boehmeriae có tồn tại trong đất, để xác định sự tồn tại của nấm này trong đất chúng ta có thể kiểm chứng bằng cách bẫy bào tử như sau: Bước 1: Hòa tan 10 g đất vào 1 lít nước cất Bước 2: Rót dung dịch đất qua phễu làm bằng giấy lọc. Dung dịch này có thể bảo quản trong tủ lạnh Bước 3: Rót dung dịch đất thu được ở bước 2 vào đĩa petri (3.12) có chứa đĩa lá của cây họ cam chanh (đĩa lá được tạo ra bằng cách đục lá bằng các ống kim loại tròn hoặc cắt nhỏ lá bằng kéo) đến khi đĩa lá nổi trên mặt dịch. Bước 4: Đậy nắp đĩa và theo dõi trong 24 giờ 7.1.5.2 Quan sát đặc điểm hình thái của nấm 7.1.5.2.1 Soi tươi - Quan sát hình thái sợi nấm: Dùng kim khêu nấm (3.8) thu nấm trên mẫu đã để ẩm đặt lên lam trong có một giọt lactophenol rồi đậy lamen (3.14) lên. Đặt lam lên kính hiển vi tìm và quan sát, đo đếm các đặc điểm hình thái của nấm (bào tử, sợi nấm, tản nấm...) và so sánh với đặc điểm hình thái nấm trong khóa phân loại. 7.1.5.2.2 Cố định tiêu bản lam - Thu mẫu nấm hoặc mẫu cắt lát mỏng tiêu bản nấm từ mẫu để ẩm để làm tiêu bản lam cố định. - Làm tiêu bản lam cố định như mục 7.1.1.2 - Đặt tiêu bản lam lên kính hiển vi (3.21), quan sát đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm trong khóa phân loại hiện có. 7.1.6 Đặc điểm hình thái giám định của nấm Đặc điểm hình thái Bọc bào tử (hình 6) hình trứng tới hình tròn, có núm nhỏ trên đầu. Bào tử dễ rụng ra khỏi cuống. Kích thước bào tử (35x30) µm, núm cao khoảng 4,83 µm. Kích thước cành bào tử (2 đến 5) µm, không phân nhánh. Giao tử cái (Oogonia) hình cầu, màu nâu, đường kính 23 µm đến 38 µm, vách bào tử nhẵn. Giao tử đực (Antheridia) (hùng cơ) có hình phễu nằm phía dưới của giao tử cái, đơn bào, hình trụ tròn, kích thước (10 đến 18) µm x(10 đến 14) µm. Bào tử trứng (Oospores) (hình 7) hình cầu, đường kính (19 đến 31) µm. Bào tử hậu (không phổ biến) đường kính thường (17 đến 51) µm vách tế bào khoảng 2 µm. 7.2 Giám định bằng phương pháp sinh học phân tử 7.2.1 Tích chiết DNA Có nhiều phương pháp tách chiết DNA khác nhau, tùy vào điều kiện của phòng thí nghiệm có thể áp dụng cách tách chiết khác nhau. Sau đây là một số cách tách chiết phổ biến có thể áp dụng cho nấm. Tách chiết bằng CTAB (với nấm nuôi cấy trên môi trường) Bước 1: Nuối cấy nấm trong dịch chiết đậu hà lan (Xem phụ lục B) trong 7 ngày Bước 2: Thu màng nấm thu được từ môi trường dịch chiết đặt trong ống ly tâm 1,5 ml (3.17) để ở nhiệt độ âm 20 ̊C Bước 3: Thêm 150 µl dịch chiết CTAB (Xem phụ lục D) bổ sung 2 % 2 mercaptoethanol ống ly tâm (3.17) và lắc. Nghiền nát nấm bằng chày nhựa (3.18). Bước 4: Ủ ở 85 ̊C trong 15 đến 30 phút. Bước 5: Thêm khoảng 300 µl phenol:chloroform(CHC l 3 ); isoamyl alcohol (25:24:1) lắc đều. Bước 6: Ly tâm 15 phút tốc độ 12.000 vòng/phút. Bước 7: Chuyển phần dịch trên sang ống ly tâm (3.17) khác, thêm isopropanol lượng gấp 2 lần dịch chiết thu được. Bước 8: Để tủa DNA qua đêm Bước 9: Ly tâm tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phần dịch phía trên Bước 10: Rửa tủa 2 lần bằng cồn 70 % Bước 11: Hòa tan tủa bằng TE, pH 8.0 (Xem phụ lục D) Tách chiết bằng CTAB (với mô cây nghi nhiễm bệnh) Bước 1: Nghiền nhỏ 200 mg mô cây nghi nhiễm bệnh bằng chày cối sứ (3.19) Bước 2: Chuyển phần mô đã nghiền vào ống tuýp 1,5 ml (3.17) thêm vào 500 µl dịch chiết CTAB (Xem phụ lục D) bổ sung 2 % 2 mercaptoethanol Bước 3: Ủ ở 65 ̊ C trong 30 phút Bước 4: Ly tâm 10 phút tốc độ 12.000 vòng/phút Bước 5: Thu dịch phía trên sang ống mới đo lượng dịch Bước 6: thêm vào ống lượng dịch chloroform(CHC l 3 ); isoamyl alcohol(24: 1 ) gấp đôi lượng dịch thu được ở bước 4, lắc đều Bước 7: Ly tâm 10 phút tốc độ 12.000 vòng/phút. Bước 8: Thu dịch phía trên sang ống mới, đo lượng dịch Bước 9: Thêm vào ống lượng dịch isopropanol bằng 2/3 dịch thu được ở bước 8. Lắc nhẹ, để tủa trong vòng 1 giờ (nhiệt độ âm 20 ̊C) Bước 10: Ly tâm tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phần dịch phía trên Bước 11: Rửa tủa 2 lần bằng cồn 70 % Bước 12: Hòa tan tủa bằng TE, pH 8.0 (Xem phụ lục D) Tách chiết bằng TENP (với mẫu đất) Bước 1: Cân 0,25 g đất, làm khô lạnh (lyophillzed) bằng ni tơ lỏng Bước 2: Thêm vào 0,5 ml dung dịch sữa 0,4 %(dry milk solution) và 500 µl dịch chiết TENP (xem phụ lục D) Lắc đều Bước 3: Ủ ở 6 5 ̊C trong 30 phút Bước 4: thêm 10 µl SDS 20 % lắc đều Bước 5: Ủ ở 65 ° C trong 30 phút Bước 6: Ly tâm tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút loại bỏ phần cặn đất Bước 7: Thu dịch phía trên, đo lượng dịch Bước 8: Thêm vào ống ly tâm (3.17) 7,5 M ammonium acetate và cồn 100 % với lượng gấp đôi dịch thu được ở bước 7, lắc nhẹ, để tủa trong vòng 2 giờ hoặc qua đêm (nhiệt độ âm 20 ̊C) Bước 9: Ly tâm tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phần dịch phía trên Bước 10: Rửa tủa 2 lần bằng cồn 70 % Bước 11: Hòa tan tủa bằng TE, pH 8.0 (Xem phụ lục D) 7.2.2 Nhân gen (PCR) và đọc kết quả DNA thu được tiến hành nhân gen trong máy chu trình nhiệt (3.20) (PCR) với quy trình như sau: Bước 1: Pha dung dịch nhân gen (master mix) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sử dụng cặp mồi đặc hiệu (nguồn Shen et al., 2005) PB1 (5' - CGGCTTTCGGGCTGCTGC-3') PB2 (5' - ATACCCGAA GGCAAAGCGC-3') Bước 2: nhân gen trong máy với chu trình nhiệt như sau: 94 ̊ C trong 5 phút 94 °C trong 30 giây Chu trình lặp lại 35 lần 62 ° C trong 40 giây 72 ° C trong 1 phút 72 ̊C trong 8 phút 7.2.3 Đọc kết quả Gen sau khi nhân được nhuộm bằng chất nhuộm (thường là Loading dye) sau đó được chạy điện di trong gel agarose 2 %. Mẫu dương tính cho đoạn gen có kích thước 752 kb 8 Báo cáo kết quả Mẫu giám định được kết luận là loài Phytophthora boehmeriae Sawada khi: - Mẫu có đặc điểm hình thái phù hợp với các đặc điểm đã nêu ở mục 7.1.6. hoặc - Phương pháp PCR cho kết quả là dương tính. Sau khi khẳng định kết quả giám định, người giám định hoặc cơ quan giám định trả lời kết quả bằng phiếu. Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin sau: - Thông tin về mẫu giám định. - Tên loài - Phương pháp giám định - Người giám định/cơ quan giám định Phiếu giám định chi tiết có thể tham khảo phụ lục E. Phụ lục A (Tham khảo) Thông tin chung A.1 Tên khoa học và vị trí phân loại Tên tiếng Việt: Bệnh thối quả bông Tên khoa học: Phytophthor a boehmeria e Sawada Vị trí phân loại Gi ớ i: Chromista Ngành: Oomycota Lớp: Oomyce t es Bộ: Peronosporales Họ: Peronosporaceae Giống: Phytophthora A.2 Phân bố Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam Trên thế giới: Châu Á : Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan; Châu Mỹ: Mê-xi-cô, Argentina, Brazil; Châu Âu : Hy Lạp; Châu Đại Dương: Australia, Papua New Guinea A.3 Ký chủ Kí chủ chính: Boehmeria nivea (Gai), Gossypium (Chi Bông) Kí chủ khác: Broussonetia papyrifera (Dướng), Chamelaucium uncinatum , Citrus (Chi cây có múi), Pinus (Chi Thông), Pterocarya stenoptera (Cơi) A.4 Đặc điểm sinh học Khi các mô nhiễm bệnh (lá, quả..) bị phân hủy, các bào tử trứng được hình thành trong các mô bệnh và được giải phóng vào trong đất. Trong điều kiện thích hợp, các bào tử này nảy mầm tạo ra ống mầm hình thành bọc bào tử hoặc sợi nấm. Các sợi nấm có thể sinh ra bọc bào tử. Sự nảy mầm của bọc bào tử thường phụ thuộc vào nhiệt độ. Ở nhiệt độ 18 đến 20 ̊C tất cả các bọc bào tử nảy mầm trực tiếp và giải phóng du động bào tử, trong khi đó ở 22 đến 24 ̊C phần lớn bọc bào tử nảy mầm trực tiếp thành bọc bào tử thứ cấp và giải phóng du động bào tử. Tất cả các dạng bào tử đều có khả năng lan truyền với khoảng cách lớn nhờ nước hoặc đất và tất cả bào tử đều nảy mầm trong nước. Khi bào tử (chủ yếu là du động bào tử) bám dính trên thân hoặc rễ của kí chủ nhất định, ví dụ cây Bông, chúng nảy mầm và hình thành các sợi nấm và xâm nhiễm vào cây. Bào tử trứng xâm nhiễm vào cây thông qua cả tầng cutin hay qua lỗ khí khổng hoặc vết thương. Thời kỳ ủ bệnh khác nhau tùy theo kí chủ và nhiệt độ: từ 24h trên lá bông ở 20 đến 22 ̊C đến 2 đến 3 ngày trên quả bông ở nhiệt độ 22 đến 24 ̊C. Khi trời ấm và ẩm, bào tử trứng có thể hình thành trên bề mặt đất hoặc trên lá, thân quả nhiễm bệnh. Trong điều kiện này, du động bào tử nảy mầm tạo thành sợi nấm với các bọc bào tử và du động bào tử. Việc này sẽ nhanh chóng nhân lên lượng nguồn nhiễm bệnh và dẫn đến bùng phát dịch bệnh ở một số vùng đất thấp của Trung Quốc vào mùa mưa. Trong các mô nhiễm bệnh (lá, thân, Bông..), có lượng lớn bào tử trứng được hình thành. Các mô nhiễm bệnh vẫn dính trên cây tạo thành các nguồn nhiễm bệnh chủ yếu cho các vụ và năm sau. Vai trò của bào tử hậu trong vòng đời của nấm vẫn được nghiên cứu. Zhang và Ma cho biết, bào tử hậu có thể tồn tại trong cuticle của quả bông nhiễm bệnh và trong đất là nguồn lây nhiễm và qua đông quan trọng của nấm; tuy vậy, một số nghiên cứu khác gợi ý rằng bào tử hậu rất ít khi xuất hiện với loài nấm này và bào tử trứng có thể qua đông và tồn tại trong đất trong khi sợi nấm không có khả năng này. Bọc bào tử có thể tồn tại trong tàn dư quả bông trong khoảng 3 đến 4 tháng với tỉ lệ sống sót là 58 % nhưng không có khả năng qua đông vì khả năng lây nhiễm của chúng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ thấp. Không có bọc bào tử nào có khả năng hoạt động ở 0 ̊C trong tháng 1. Đây là loài nấm trứng bán thủy sinh, hoại sinh không bắt buộc. Nấm thích hợp với điều kiện ẩm cao và nhiệt độ ẩm; chính vì vậy, bệnh thường xuất hiện ở các vùng trũng, ẩm ướt trong các năm mưa nhiều. Nhiệt độ thích hợp nhất để sợi nấm phát triển trên môi trường là 25 °C đến 30 °C, thấp nhất là 9 ̊C, cao nhất là 35 ̊C. Nhiệt độ thấp nhất để hình thành bọc bào tử và bào tử trứng tương ứng là 25 °C và 25 °C đến 28 °C. Nhiệt độ thấp nhất để bào tử trứng qua đông có thể nảy mầm là 18 °C đến 20 °C. Bóng tối kích thích sự phát triển của sợi nấm và sự hình thành bào tử trứng, trong khi ánh sáng có tác dụng ngược lại. Tuy vậy, ánh sáng kích thích sự nảy mầm của bào tử trứng và hình thành bọc bào tử. Sự nảy mầm của bào tử trứng cũng có thể kích thích bằng cách xử lý 0,1 % potassium permanganate hoặc 0,3 % hydrogen peroxide. Điều kiện pH thích hợp nhất cho sự phát triển của sợi nấm và sự hình thành bào tử trứng là 5,5 đến 6,5, thấp nhất là 5 và cao nhất là 9. Phụ lục B (Quy định) Phương pháp chuẩn bị và điều chế môi trường nhân tạo B.1 Cách hấp, sấy khử trùng 6.1.1 Sấy khử trùng Dùng phương pháp này để khử trùng hộp lồng và dụng cụ thủy tinh. Dụng cụ phải được rửa sạch và gói riêng rẽ bằng giấy nhôm rồi đặt vào hộp bằng chất liệu phù hợp để có thể sấy được. Tránh không nên sử dụng giấy để gói vì sẽ làm dính kết vào dụng cụ và có thể gây cháy trong quá trình sấy. Dụng cụ thủy tinh có thể được sấy trong tủ sấy bằng không khí nóng, các đồ sấy không nên xếp quá chật để đảm bảo không khí nóng đối lưu, khí nóng phải đảm bảo tiếp xúc đều tất cả các phần của dụng cụ để quá trình sấy đạt hiệu quả tốt. Có thể sử dụng các nhiệt độ và cách sấy sau: Nhiệt độ Thời gian 120 ° C 8 giờ 140 ° C 3 giờ 160 ° C 1 giờ 180 ° C 20 phút CHÚ THÍCH: thời gian được tính từ khi nhiệt độ lên tới nhiệt độ yêu cầu B.1.2 Hấp khử trùng bằng nồi hấp Dùng phương pháp này để khử trùng môi trường nhân tạo. Các nồi hấp vô trùng tự động kiểu mới (autoclave) hoặc các nồi áp suất kiểu cũ đều có thể sử dụng để hấp vô trùng. Các môi trường nhân tạo sau khi điều chế được dựng trong các bình thủy tinh có nắp. Các bình này được đặt trong các lồng, hộp của nồi hấp vô trùng và đặt vào nồi hấp. Không nên để nghiêng hay rót môi trường quá đầy tránh làm trào môi trường trong quá trình khử trùng. Không nên xếp chồng chéo hoặc quá đầy ảnh hưởng tới luồng không khí đối lưu trong nồi hấp. Hấp khử trùng thường ở nhiệt độ 121°C trong thời gian 30 phút. Khi vận hành nồi hấp vô trùng kiểu mới (autoclave) hay kiểu cũ đều cần sự giám sát cẩn thận và tuân thủ hướng dẫn sử dụng máy. B.2 Phương pháp điều chế môi trường nhân tạo B.2.1 Môi trường V8 Th à nh phần V8 juice 50 ml Agar 15g Nước 950 m l Cách điều chế: Hòa tan các thành phần, đun tới khi hòa tan hoàn toàn Bổ sung kháng sinh sau khi hấp khử trùng. Thành phần kháng sinh Piramicin 50 % 10 mg Sodium ampicillin 250 mg Rifamycin-SV (sodium salt) 10 mg Terrador (75 % PCNB) 66 , 7 mg Hymexazol 50 mg B.2.2. M ô i trường Lima bean agar (LBA) Thành phần Đậu Lima 200 g Agar 20g Nước 1.000 ml Cách điều chế: cho phần đậu vào nước, đun tới khi đậu mềm. Xay hỗn hợp nước và đậu tới khi mịn. Hòa tan agar vào hỗn hợp. B.2.3 M ô i trường Carrot agar Th à nh ph ầ n Cà rốt 200g Agar 15g Nước 1.000ml Cách điều chế: Cho phần cà rốt vào nước đun tới mềm. Xay hỗn hợp tới min, hòa tan agar vào hỗn hợp. B.2.4. Dịch Chiết đậu hà lan Thành phần Đậu hà lan 200g Nước 1.000ml Cách điều ch ế : Cho phần đậu hà lan vào nước đun tới mềm. Xay hỗn hợp tới min lọc qua vài lọc lấy nước trong CHÚ THÍCH: Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại môi trường nhân tạo để nuôi cấy nấm như: PDA, CMA, NA, V8 agar… có thể mua các loại môi trường này sau đó điều chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc tự điều chế theo phương pháp trên đây. Phụ lục C (Quy định) Dung dịch bảo quản mẫu và dung dịch cố định tiêu bản C.1 Dung dịch bảo quản Có thể sử dụng một trong những dung dịch bảo quản sau Dung dịch 1 CuS O 4 85 g H 2 SO 3 28,4 ml Nước 2.485 ml Dung d ị ch 2 H 2 S O 3 284 ml Nước 3.785 ml Dung dịch 3 Muối bão hòa 1.000 ml Fomalin 500 ml Nước 870 ml Dung d ị ch 4 Fomal i n 450 ml Cồn 540 ml Nư ớc 1.810ml Cách pha dung dịch muối bão hòa: Hòa tan muối trong nước nóng đến mức độ bão hòa. Đ ể dung d ị ch nguội trong 3 tiếng. Lọc bỏ phần không tan hết C.2 Dung dịch keo B ô m Canada-Xylene Tùy theo độ đặc của của keo Bôm Canada mà tỉ lệ pha có thể khác nhau, thường tỉ lệ như sau: Keo B ô m Canada 100 ml Xylene 100 ml đến 200 ml C.3 Dung dịch Lactoglycerol Axi t lactic 10 ml Glycerol 20 ml Nước 10m l C.4 Dung dịch Lactophenol Dung dịch lactophenol có thể mua dưới dạng pha chế sẵn hoặc có thể tự pha chế theo tỉ lệ sau: Axit lactic 10 ml Glycerol 10 ml Phenol 10 ml Nước 10 ml CHÚ THÍCH : Xylene, phenol là các chất độc hại, tránh tiếp xúc trực tiếp với da trần, sử dụng găng tay, khẩu trang và dụng cụ bảo hộ lao động trong thời gian tiếp xúc với các hóa chất này Phụ lục D (Quy định) Các dịch chiết mẫu D.1 PBS Thành phần NaCI 8g KC l 0,2 g Na 2 HPO 4 2,9 g KH 2 PO 4 0,2 g Nước 1.000 ml Hòa tan hoàn toàn các thành phần chuẩn độ tới pH 7,2 D.2 CTAB Thành phần CTAB 2g Tris HC l 1M 10 ml EDTA 0,5M 4 ml NaC l 5M 28 ml PVP 40 1 g Nước 100 ml Hòa tan hoàn toàn các thành phần. D.3 TE Th à nh phần Tris HC l 1M 1 ml EDTA 0,5M 0,2 ml Nước 100 ml Hòa tan hoàn toàn các thành phần. D.4 TENP Thành phần Tris HC l 1M 5 ml NaC l 5M 20 ml EDTA 0,5M 4 ml PVP 40 1 g Phụ lục E (Tham khảo) Mẫu phiếu kết quả giám định Cơ quan Bảo vệ và Kiểm dịch thực vật ………………….................. CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc --------------- …………., ngày … tháng … năm 20… PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH 1. T ê n hàng h óa : 2. Nước xuất khẩu: 3. Xuất xứ: Kh ố i lượng: 4. Phương tiện vận chuyển: 5. Địa điểm lấy mẫu: 6. Ngày lấy mẫu: 7. Người lấy mẫu: 8. Tình trạng mẫu: 9. Ký hiệu mẫu: 10. Số mẫu lưu: 11. Người giám định: 12. Phương pháp giám định: Theo TCVN 12195-2-6:2018, Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật. Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Phytophthora boehmeriae Sawada. 13. Kết quả giám định: Tên tiếng Việt: Bệnh thối quả bông Tên khoa học: Phytophthora boehmeriae Sawada Vị trí phân loại Giới: Chromista Ngành: Oomycota Lớp: Oomycetes Bộ: Peronosporales Họ: Peronosporaceae Gi ố ng: Phytophthora TRƯỞNG PH Ò NG KỸ THUẬT (hoặc người giám định) (ký, ghi rõ họ và tên) THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ (ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu) THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KH Ả O [1] CABI, (2017), Crop Protection Compe d ium. [2] Commonwealth Mycologycal Institute, (1983) , Plant Pathologist's Pocketbook. [3] Donald C. Erwin, Olaf K. Ribeiro, (1996), Phytophthora diseases Worldwide , APS Press, 562. [4] IPPC, (2006), ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests. [5] Sh e n, G., Wang, Y. C., Zhang, W. L, and Zheng, X. B, (2005), Development of a PCR assay for the molecular detection of Phytophthora boehmeriae in infected cotton , J. Phytopathol, 153:2 9 1- 296. [6] Viện Bảo vệ thực vật, (1997), Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật. NXB Nông nghiệp. [7] Viện Nấm học quốc tế IMI, (1994), Kỹ thuật chẩn đoán và giám định bệnh hại cây trồng. Lớp tập huấn 08-15/12/1994, tại Viện Bảo vệ thực vật, Hà Nội.