TCVN12560-1:2018

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12560-1:2018 về Phân bón vi sinh vật - Xác định mật độ nấm rễ nội cộng sinh - Phần 1: Đếm số lượng bào tử nấm nội cộng sinh bằng kỹ thuật sàng ướt, ly tâm nổi TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12560-1:2018 PHÂN BÓN VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ NẤM RỄ NỘI CỘNG SINH - PHẦN 1: ĐẾM SỐ LƯỢNG BÀO TỬ NẤM NỘI CỘNG SINH BẰNG KỸ THUẬT SÀNG ƯỚT, LY TÂM NỔI Biofertilizers - The determination of endomycorrhizae density - Part 1: Counting the number of endomycorrhizae spores with the wet sieving technique in combination with flotation centrifugation Lời nói đầu TCVN 12560-1:2018 d o Viện Thổ như ỡ ng Nông hóa biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công b ố . PHÂN BÓN VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ N Ấ M R Ễ NỘI CỘNG SINH - PH Ầ N 1: ĐẾM S Ố LƯỢNG BÀO TỬ N Ấ M NỘI CỘNG SINH BẰNG KỸ THUẬT SÀNG ƯỚT, LY TÂM NỔI Biofertilizers - The determination of endomycorrhizae density - Part 1: Counting the number of endomycorrhizae spores with the wet sieving technique in combination with flotation centrifugation 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy đ ị nh phương pháp xác định mật độ b à o tử nấm rễ nội cộng sinh c ó hoạt t í nh (IP) trong phân bón vi sinh vật bằng kỹ thuật sàng ướt, ly tâm nổi trong d ị ch chứa sucroza. 2 Tài liệu viện dẫn Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phiên b ả n được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, b ổ sung (nếu có). TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng cho phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử. 3 Thuật ngữ, định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau: 3.1 Nấm rễ nội cộng sinh (endomycorrhizae hoặc arbuscular mycorrhiza fungi) Loại nấm cộng sinh với rễ cây tr ồ ng, không làm thay đổi h ì nh thái bên ngoài của rễ nhưng giúp tăng cường vận chuyển, hấp thụ các chất dinh dư ỡ ng và nước, kích thích tạo thành nốt sần, cải thiện cấu trúc đất và là một tác nhân trong kiểm soát sinh học. 3.2 Bào tử n ấ m rễ nộ i cộng sinh có hoạt tính (viable endomycorrhiza spores) H ì nh cầu, hình thoi hoặc dạng khác, k íc h thước 50 - 500 μ m, bắt màu h ồ ng hoặc đỏ khi nhuộm với thuốc nhuộm 2,5-diphenyl-2N-tetrazolium bromide (MTT), được tạo thành từ s ợ i n ấ m trong đất hoặc ngoài rễ, mọc đơn lẻ hoặc thành chùm, có khả năng nảy mầm ở điều kiện thích hợp, xâm nhiễm vào rễ cây k ý chủ tạo th à nh các c ấ u trúc chùm (arbuscular), túi bọt (vesicles), sợi nấm gian bào (intercellular hyphae), sợi nấm nội bào (intracellular hyphae). 4 Nguyên tắc Khi sàng ướt qua rây, các bào tử nấm rễ nội cộng sinh và lượng rất nh ỏ của m ả nh vụn hữu cơ được giữ lại trên b ề mặt rây. Ly tâm trong dịch sucroza 50 %, bào tử nấm sẽ nổi lên tr ê n, các mảnh vụn hữu cơ chìm xuống dưới. Cho d ị ch chứa bào tử qua phễu lọc h ú t chân không, các bào tử sẽ bị giữ lại trên bề mặt gi ấ y lọc. Nhuộm b à o tử thu được với thuốc nhuộm 2,5-diphenyl-2N-tetrazolium bromide (MTT) 0,25 %, các bào tử c ó hoạt t í nh (IP) bắt màu h ồ ng hoặc đ ỏ . Đếm s ố lượng b à o tử c ó hoạt tính dưới kính hiển vi nổi hoặc hi ể n vi thường 5 Thuốc thử Sử dụng các loại h ó a chất tinh khiết phân tích để pha các loại dung dịch, thuốc th ử , chất chuẩn. 5.1 Nước, đáp ứ ng các yêu cầu của nước loại 3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3969:1987). 5.2 Dung dịch sucroza 50 % Cân 500 g sucroza trên cân phân tích (6.2), ch í nh xác đến 0,001 g, cho vào b ì nh định mức dung tích 1000 mL (6.10), thêm nước (5.1) đến vạch đ ị nh mức, lắc đều. 5.3 Dung d ị ch 2,5-diphenyl-2N-tetrazolium bromide 0,25 % (MTT 0,25 %) Cân 0,25 g 2,5-diphenyl-2N-tetrazolium bromide (MTT) trên cân phân tích (6.2), chính xác đến 0,001 g, cho vào b ì nh định mức dung tích 100 mL (6.10), thêm nước (5.1) đến vạch đ ị nh mức, lắc đều. CH Ú TH Í CH 1: Dung dịch MTT 0,25 % cần được bảo quản trong lọ tối màu, tránh ánh sáng; thời gian bảo quản kh ô ng nhi ề u hơn 2 tuần ở nhiệt độ từ 2 đến 8 ° C . Kh ô ng để dung dịch MTT 0,25 % tiếp xúc với da và mắt. 6 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng th í nghiệm và cụ thể như sau: 6.1 Máy lắc ổn nhiệt, tốc độ đạt 150 r/m i n, nhiệt độ từ 20 ° C đến 40 ° C . 6.2 Cân phân t í ch, có độ chính xác đến 0,001 g. 6.3 Máy ly t â m, ly tâm được tốc độ 2 000 r/min, có khả năng sử dụng được các ống phancon c ó nắp, dung t í ch 10 mL, 25 mL hoặc 50 mL. 6.4 Bơm hút chân không, độ chân không không ít hơn 100 mbar, tốc độ dòng chảy không ít hơn 20 L/ m i n. 6.5 Kính hiển vi soi n ổ i hoặc k í nh hiển vi thường, có trư ờ ng sáng, độ khuếch đại không ít hơn 70 lần. 6.6 Nồi hấp áp lực, áp suất t ối thi ể u 101,3 kPa, nhiệt độ 121 ° C . 6.7 T ủ sấy, có thể kiểm soát nhiệt độ từ 40 ° C đến 260 ° C . 6.8 Bình tam giác, dung tích 500 mL. 6.9 Cốc, dung tích 50 mL, 250 mL, 1000 mL. 6.10 B ì nh định mức, dung tích 100 mL, 1000 mL. 6.11 Ố ng phancon, có nắp, dung tích 25 mL hoặc 50 mL. 6.12 Bộ rây, với kích thước 50 μ m, 100 μ m, 250 μ m, 500 μ m, 750 μ m, 1 000 μ m. 6.13 Pipet (Micropipet), dung tích 1 mL, 5 m L . 6.14 Bình tia, dung t í ch 500 mL. 6.15 Bộ lọc h ú t chân không, gồm có phễu và bình hút chân không 6.16 Giấy lọc Whatman số 2, hoặc màng lọc Cellulose nitrat có chia ô với đường k í nh lỗ 0,45 μ m 6.17 Ố ng eppendorf, bằng nhựa, có nắp, thể tích 2 mL 7 Chuẩn bị 7.1 Chuẩn b ị dụng cụ Các dụng cụ sử dụng trong đếm số lượng b à o tử nấm nội cộng sinh Mycorrhiza phải được khử trùng bằng 1 trong 2 cách sau: - giữ ở nhiệt độ 121 ° C không ít hơn 30 min trong nồi hấp áp lực (6.6) sau đ ó sấy khô trong tủ sấy (6.7) hoặc; - giữ ở nhiệt độ 180 ° C không ít hơn 2 h trong tủ s ấ y (6.7). 7.2 Chuẩn bị mẫu C â n 10 g mẫu trên cân phân tích (6.2), ch í nh xác đến 0,001 g, cho vào b ì nh tam giác dung tích 500 mL (6.8). Bổ sung 250 mL nước (5.1); Để y ê n trong 15 min; Lắc trên máy lắc ổn nhiệt (6.1) trong 15 min, tốc độ 150 r/min; Để lắng trong 5 min, gạn dịch trong lần lượt qua các rây cổ kích thước 1 000 μ m, 750 μ m (6.12). Các bào tử nấm rễ được qua rây (trên mặt rây còn lại là các mảnh vụn hữu cơ có k í ch thước lớn); Cho tiếp dịch trong qua rây có kích thước 500 μ m, 250 μ m, 100 μ m, 50 μ m (6.12). Các bào tử nấm rễ nội cộng sinh tùy kích c ỡ khác nhau được giữ lại trên mặt rây cùng với những mảnh vụn hữu cơ; Dùng bình tia (6.14) chứa nước (5.1), tia nhẹ từ 3 đến 5 lần lên bề mặt rây nhằm loại bỏ những mảnh vụn hữu cơ nhỏ bám vào bào tử n ấ m rễ nội cộng sinh; Lật ngược từng rây, sử dụng bình tia (6.14) chứa nước (5.1) tia nhẹ đ ể tách bào tử nấm rễ nội cộng sinh ra khỏi mặt rây; CHÚ THÍCH 2: Mỗi c ỡ r â y n ê n sử dụng một cốc (6.9) để đựng d ị ch bào tử n ấ m rễ nội cộng sinh sau khi ti ế n h à nh tia ngược các rây. Lấy pipet (6.13) hút to à n bộ hỗn hợp dịch chứa bào tử nấm rễ nội cộng sinh và các mảnh vụn hữu cơ nh ỏ vào các ống phancon (6.11); Ly tâm dịch trong bằng m á y ly tâm (6.3) ở tốc độ 2 000 r/min trong 5 min; Loại b ỏ các mảnh vụn hữu cơ nhỏ n ổ i trên bề mặt ống phancon bằng cách sử dụng pipet hút b ỏ 1/2 dịch ph ía trên, phần dịch còn lại ph ía dưới của ống phancon chứa bào tử gọi là dịch bào tử nấm rễ nội cộng sinh. 8 Cách tiến hành Chuyển toàn bộ dịch bào tử nấm rễ nội cộng sinh (7.2) vào các ống phancon (6.11); Bổ sung dung dịch sucroza 50 % (5.2) theo tỷ lệ dung dịch sucroza 50 % : dịch chứa bào tử (7.2) là 1:1 (v/v). Lắc nhẹ bằng tay để dung dịch sucroza 50 % trộn đều với dịch bào tử nấm rễ nội cộng sinh. Ly tâm với tốc độ 2 000 r/min trong 10 min, các bào tử nấm rễ nội cộng sinh sẽ nổi lên trên bề mặt ố ng phancon; CH Ú TH Í CH 3: Có thể dùng nhiều ố ng phancon đ ể chứa h ế t lượng dịch bào t ử nấm r ễ nộ i cộng sinh của một c ỡ rây. Sử dụng pipet (6.13) h ú t toàn bộ dịch nổi trên bề mặt ống phancon cho vào phễu lọc hút chân không (6.15) có đặt giấy lọc hoặc màng lọc chia ô (6.16); Dùng bơm hút chân không (6.4) hút chân kh ô ng cho đến hết dịch tr ê n phễu lọc hút chân kh ô ng; Quan sát các màng lọc dưới kính hiển vi nổi hoặc hiển vi thường (6.5) ở độ phóng đại phù hợp; Đếm số bào tử trong 5 ô ngẫu nhiên đ ể xác định số lượng bào tử nấm rễ nội cộng sinh có trong từng cỡ rây; CHÚ TH Í CH 4: M ỗi cỡ s à ng sử dụng một m à ng lọc. Lấy ngẫu nhiên một lượng bào tử nấm rễ nội cộng sinh nhất định (khoảng 100 bào tử) trong mỗi c ỡ rây cho vào ống eppendorf vô trùng (6.17); Bổ sung 1,5 mL dung dịch MTT 0,25 % (5.3) và ủ ở 27 ° C , giữ trong tối; Sau 72 h, quan sát bào tử nấm rễ nội cộng sinh dưới kính hiển vi soi nổi hoặc kính hiển vi thư ờ ng (6.5). Những b à o tử bắt màu đỏ hoặc h ồ ng là những b à o tử n ấ m rễ nội cộng sinh có hoạt t í nh (IP). 9 Tính kết quả Số lượng bào tử nấm rễ nội cộng sinh có hoạt tính (A) trong 1 gram mẫu thử nghiệm được tính theo công thức sau: (9.1) Trong đó: B i là s ố bào tử nấm rễ nội cộng sinh trong 5 ô ngẫu nhiên ở mỗi cỡ r â y (50 μm , 100 μm , 250 μm , 500 μm ), tính bằng bào tử (bt); n là tổng số ô trong 1 t ờ giấy lọc hoặc màng lọc, tính bằng ô; U l à số bào tử nấm rễ nội cộng sinh bắt màu h ồ ng hoặc đ ỏ khi nhuộm, tính b ằ ng b à o tử (bt); V là số bào tử nấm rễ nội cộng sinh khi nhuộm, tính bằng bào tử (bt); 2 là hệ số (b ằ ng 100 bào tử lấy ngẫu nhiên trong mỗi c ỡ rây : (5 ô ngẫu nhiên ở mỗi cỡ rây x 10 g mẫu thử)). Nếu độ lặp lại được kiểm tra, thì nêu kết quả cuối cùng thu được. 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau: - Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; - Phương pháp thử đã sử dụng: viện dẫn tiêu chuẩn nảy; - Tất cả các thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có th ể ảnh hưởng đến kết quả; - Các kết quả thử nghiệm thu được. Thư mục tài liệu tham khảo [1] National Centre of Organic Farming Department of Agriculture and Cooperation, Ministry of Agriculture, Govt of India, CGO-II, Kamla Nehru Nagar Ghaziabad, 201 001, Uttar Pradesh. 1985. Biofertilizers and Organic Fertilizers in Fertilizer (Control) Order, pp. 34 - 38. [2 ] Brundrett. Mark et. Al. 1996. Working with Mycorrhiza in Forestry and Agriculture. Canberra, Australia, pp. 141 - 252. [3 ] Carter M. R. 1993. Soil sampling and methds of analysis. Canadian society of soil scien. Lewis publishers. [4] Trần V ă n Mão, 2002. Sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích. Tập 2: Sử dụng vi sinh vật có ích. Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 247 - 276.