TCVN11492:2016

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11492:2016 về Thực phẩm có nguồn gốc thực vật - Xác định glyphosate và axit aminomethylphosphonic (AMPA) - Phương pháp sắc ký khí TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11492:2016 THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC THỰC VẬT - XÁC ĐỊNH GLYPHOSATE VÀ AXIT AMINOMETHYLPHOSPHONIC (AMPA) - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ Foods of plant origin - Determination of glyphosate and aminomethylphosphonic (AMPA) - Gas chromatographic method Lời nói đầu TCVN 11492:2016 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2000.05 Determination of glyphosate and aminomethylphosphonic acid (AMPA) in crops. Gas chromatography with mass-selective; TCVN 11492:2016 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC THỰC VẬT - XÁC ĐỊNH GL Y PHOSATE VÀ AXIT AMINOMETHYLPHOSPHONIC (AMPA) - PHƯƠNG PHÁP S Ắ C KÝ KHÍ Foods of plant origin - Determination of glyphosate and aminomethylphosphonic (AMPA) - Gas chromatographic method 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc kí khí để xác định glyphosate và axit aminomethyl phosphonic (AMPA) trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật có hàm lượng từ 0,050 mg/kg đến 2,0 mg/kg. 2 Nguyên tắc Dư lượng glyphosate và AMPA được chiết ra khỏi thực phẩm bằng cách ngâm với nước. Dịch chiết thô được làm sạch tiếp bằng metylen clorua để tách các hợp chất khác sau đó phần dung dịch nước tiến hành quá trình trao đổi cation (CAX). Chất phân tích trong dịch chiết đã tinh sạch được tạo dẫn xuất trực tiếp bằng hỗn hợp của trifluoroaxetic anhydrid và heptafluorobutanol. Các nhóm chức amin được tạo dẫn xuất để hình thành các dẫn xuất tri f luoroacetyl tương ứng. Các nhóm chức axit carboxylic và axit phosphonic được tạo dẫn xuất để hình thành heptafluorobutyl este tương ứng. Sau quá trình tạo dẫn xuất, các thuốc thử dư được làm bay hơi và cặn được h òa tan trong etyl axetat. Nồng độ của các chất phân tích trong dịch chiết cuối cùng được xác định bằng sắc ký khí mao quản có detector phổ khối lượng (GC/MSD). Tiến hành định lượng bằng phương pháp ngoại chuẩn với các dung dịch hiệu chuẩn được tạo dẫn xuất đồng thời với dịch chiết. Trong phương pháp này, hệ thống detector có độ nhạy cao cho phép sử dụng một lượng nhỏ dịch chiết được tạo dẫn xuất mà không làm bay hơi, vì vậy sẽ khắc phục được các khó khăn liên quan đến quá trình tạo dẫn xuất của dịch chiết và sự hấp thụ chất phân tích. 3 Thuốc thử Trong suốt quá trình phân tích, chỉ sử dụng các loại thuốc thử đạt chất lượng phân tích và chỉ sử dụng nước ít nhất là loại 3 quy định trong TCVN 4851:1999 (ISO 3696:1987 ) Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử, trừ khi có quy định khác. 3.1 Dung môi, có độ tinh khiết cao, thích hợp cho phép phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật. 3.1.1 Etyl axetat (CH 3 COOC 2 H 5 ). 3.1.2 Metanol (CH 3 OH). 3.1.3 Metylen clorua (CH 2 CI 2 ). 3.2 Dung dịch pha động CAX Phối trộn 160 ml nước, 2,7 ml axit clohydric đặc (nồng độ 36,5 % đến 38 %) và 40 ml metanol. 3.3 Dung dịch điều chỉnh axit Phối trộn 16 g kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ), 160 ml nước, 40 ml metanol và 13,4 ml axit clohydric đặc. 3.4 2,2,3,3,4,4,4-Heptafluoro-1-butanol, 98 %. 3.5 Trifluoroaxetic anhydrit, 99 %. 3.6 Xitral (3,7-Dimethyl-2,6-octadienal), 95 % Xitral bền trong 6 tháng khi bảo quản ở nơi lạnh. S ả n phẩm màu vàng cho thấy có thể bị polyme hóa; cần thay thuốc thử khi đã biến màu. 3.7 Xitral, 0,2 % trong etyl axetat Phối trộn 200 µl xitral với 100 ml etyl axetat (3.6). Dung dịch bền trong một tháng. 3.8 Các dung dịch chuẩn. 3.8.1 Dung dịch chuẩn gốc glyphosate, 1000 µg/ml. Cân khoảng 50 mg glyphosate chính xác đến ± 0,1 mg, cho vào ống polyet y len miệng hẹp hoặc lọ polypropylen dung tích khoảng 118 ml. Thêm vào lọ một lượng nước thích hợp để tạo được dung dịch chứa glyphosate nồng độ 1000 µg/ml. Tính khối lượng nước cần bổ sung, W w , được biểu thị bằng gam (g), bằng Công thức (1): (1) Trong đó: C s là nồng độ chất phân tích trong dung dịch cuối cùng (1,0 mg/ml); W s là khối lượng của chất chuẩn chính, tính bằng miligam (mg); P s là độ tinh khiết của chất chuẩn (100 % = 1,00); D w là tỷ trọng của nước (giả định là 1,00 g/ml). 3.8.2 Dung dịch chuẩn gốc AMPA Chuẩn bị như trong 3.8.1 nhưng sử dụng chất chuẩn chính (reference s tandard) AMPA. 3.8.3 Dung dịch chuẩn trung gian, nồng độ từng chất phân tích 100 µg/ml, 10,0 µg/ml và 1,0 µg/ml. Chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian đơn lẻ chứa cả hai chất phân tích, mỗi chất ở nồng độ 100 µg/ml. Dùng pipet tự động (4.3), chuyển 5,0 g dịch lỏng của từng dung dịch chuẩn gốc (3.8.1) và (3.8.2) vào ống polypropylen miệng hẹp dung tích khoảng 118 ml (4.16). Thêm nước để được tổng khối lượng là 50,0 g. Bằng cách tương tự, pha loãng chất chuẩn trung gian 100 µg/ml để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ 10,0 µl/ml và 1,0 µg/ml. Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit clohydric đậm đặc làm chất diệt khuẩn để bảo quản vào tất cả dung dịch chuẩn gốc (3.8.1), (3.8.2) và dung dịch chuẩn trung gian (3.8.3). Dung dịch bền trong 6 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ dưới 5 °C. 3.8.4 Dung dịch chuẩn làm việc, nồng độ của từng chất phân tích 225 ng/ml, 36 ng/ml và 4,5 ng/ml. Chuẩn bị dãy pha loãng bằng cách sử dụng pipet tự động (4.3). Dùng dung dịch pha động CAX (3.2) làm dịch pha loãng cho tất cả dung dịch chuẩn làm việc. Chuẩn bị dung dịch chuẩn 225 ng/ml bằng cách phối trộn 1,8 ml dung dịch chuẩn trung gian 1,0 µg/ml (3.8.3) và 6,2 ml dịch pha loãng. Phối trộn 0,80 ml dung dịch chuẩn làm việc 225 ng/ml với 4,20 ml dịch pha loãng để có dung dịch chuẩn nồng độ 36 ng/ml. Phối trộn 1,0 ml dung dịch chuẩn nồng độ 36 ng/ml với 7,0 ml dịch pha loãng để có dung dịch chuẩn nồng độ 4,5 ng/ml. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày. 3.8.5 Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn, nồng độ 50 ng/ml, 8,0 ng/ml và 1,0 ng/ml. Chuẩ n bị các dung dịch chu ẩ n hiệu chuẩn bằng cách tạo dẫn xuất (xem 6.1.5) các dung dịch chuẩn làm việc (3 . 8.4). 4 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau: 4.1 Máy sắc ký khí, có chương trình nhiệt độ phù hợp cho việc sử dụng cột mao quản; có hệ thống phân tích dữ liệu để xác định phép đo pic và bộ bơm mẫu/lấy mẫu tự động để phân tích tự động. Cột phân tích: cột mao quản đường kính trong 0,25 mm, dài 30 m được tráng 0,50 µ m pha tĩnh chứa 95 % metyl-5 % phenyl s ilicon . Ống lót đơn hoặc đôi (1 hoặc 2 mảnh) đường kính trong 4 mm, được nhồi nút bông thủy tinh đã silan hóa hoặc bông silica nóng chảy dày 1 cm ở giữa ống lót. Đặt ống lót vào đáy cột, ống cách đáy từ 6 mm đến 8 mm. 4.2 Detector phổ khối lượng Thiết bị tứ cực có khả năng cung cấp phổ khối lượng bắn phá electron (El) dương có chế độ chọn lọc ion (SIM) trên dải amu (đơn vị khối lượng nguyên tử) đến 650 m/z , hoạt động trong chế độ SIM có độ phân giải thấp; thực hiện bằng tay, đối với m/z 414, m/z 502 và m/z 614 thì sử dụng perfluorotributylamine (PFTBA). Theo dõi dẫn xuất AMPA ở m/z 446; dẫn xuất glyphosphat ở m/z 611.5. Thời gian dừng (dwell time) 100 ms. 4.3 Pipet tự động, loại đơn kênh, có đầu tip bằng chất dẻo, dùng một lần, dải dung tích từ 10 µl đến 100 µl, 200 µl đến 1 000 µ l và 500 µl đến 2 500 µl. 4.4 Cột CAX, đã được nhồi trước, dùng một lần, được làm đầy bằng 2 ml chất trao đổi cation axit mạnh, nhựa styren divinylbenzen (AG 50W-X8), dạng H+, 200 mesh đến 400 mesh. 4.5 Nắp và lọ tạo dẫn xuất, bằng chất dẻo chứa phenol, được lót polytetrafluoroethylen (PTFE). Nắp bằng chất dẻo không chứa phenol như polypropylen sẽ mềm hơn và có thể bị nới lỏng trong quá trình tạo dẫn xuất. 4.6 Lọ nhỏ, dung tích 4,0 ml và 8,0 ml bằng thủy tinh, có nắp xoáy. 4.7 Bộ bay hơi, có gia nhiệt, có khả năng phân phối dòng nitơ nhẹ vào các lọ 4 ml (4.6) được duy trì ở 40 °C đến 50 °C. 4.8 Máy đồng hóa phòng th ử nghiệm (ki ể u rôto/stator), có lưỡi dao có thể tháo rời để làm sạch hoặc máy trộn phòng th ử nghiệm, dung tích khoảng 1 lit. 4.9 Ố ng ly tâm bằng polypropylen dùng một lần, dung tích 50 ml, được chia vạch, có nắp vặn, đường kính trong 28 mm, dài 115 mm. 4.10 Máy ly tâm, có thể hoạt động với gia tốc 2 000 g. 4.11 Máy cô quay chân không kiểu vortex. 4.12 Pipet, bằng thủy tinh, dùng một lần, có các dung tích thích hợp. 4.13 Bộ làm nóng/làm mát, bằng nhôm có đường kính lỗ 15 mm hoặc 16 mm. 4.14 Bộ cô quay, có nồi cách thủy có khả năng duy trì nhiệt độ tối đa 40 °C. 4.15 Ống polypropylen miệng rộng, dung tích khoảng 236 ml. CHÚ THÍCH Glyphosate hấp thụ lên bề mặt thủy tinh (AMPA hấp thụ một lượng nhỏ hơn). Hiện tượng này đặc biệt rõ ràng với các dung dịch chu ẩ n, nhưng ít rõ ràng khi có mặt n ề n mẫu và sau khi tạo dẫn xuất. Không sử dụng b ì nh định mức bằng thủy tinh để chuẩn bị các dung dịch chuẩn vì dụng cụ thủy tinh có thể không được rửa sạch hoàn toàn. Dùng cân phân tích để chuẩn bị các dung dịch chuẩn dựa vào khối lượng. Dùng pipet tự động (4.3) để xử lý hầu hết các mẫu thử và dung dịch chuẩn. Hiệu chuẩn pipet (4.3) theo ch ỉ dẫn của nhà sản xuất. 4.16 Ống polypropylen miệng hẹp, dung tích khoảng 118 ml. 5 Lấy mẫu M ẫ u gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. M ẫ u không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan nên th ỏa thuận với nhau về vấn đề này. 6 Cách tiến hành 6.1 Chuẩn bị dung dịch thử 6.1.1 Chiết mẫu Cho 25 g mẫu thử đã được đồng nhất vào ống polypropylen miệng rộng (4.15). Ước tính độ ẩ m từ 10 % đến 20 % (có thể chấp nhận các giá trị từ Bảng thành phần dinh dưỡng trên sản phẩm). Sau khi có tính đến lượng nước trong nền mẫu thử, thêm nước để có tổng thể tích nước bằng 125 ml. Ví dụ với loại quả chứa 80 % nước thì cần bổ sung 105 ml nước. Sử dụng máy đồng hóa (4.8) nghiền ở tốc độ cao trong 3 min đến 5 min. Ly tâm ở gia tốc khoảng 2000 g trong 10 min. Sử dụng pipet thủy tinh dùng một lần (4.12) chuyển 20 ml lớp dịch lỏng nổi phía trên vào ống ly tâm polypropylen dùng một lần dung tích 50 ml (4.9). Thêm 15 ml metylen clorua (3.1.3) vào ống và lắc từ 2 min đến 3 min. Ly tâm trong 10 min ở gia tốc 2000 g . Dùng pipet thủy tinh dùng một lần dung tích 5 ml (4.12) chuyển 4,5 ml lớp dịch lỏng phía trên vào lọ thủy tinh 8 ml (4.6). Thêm 0,50 ml dung dịch điều chỉnh axit (3.3), đậy nắp và lắc lọ. Ly tâm trong 10 min ở gia tốc 2000 g . Cách khác, cho phần mẫu thử vào bình của máy đồng hóa phòng thử nghiệm (4.8), thêm nước như trên và trộn ở tốc độ cao trong 3 min đến 5 min. Chuyển khoảng 40 ml dịch chiết thô vào ống ly tâm polypropylen dùng một lần dung tích 50 ml (4.9). Ly tâm trong 10 min ở gia tốc khoảng 2000 g (4.10). Chuyển 20 ml dịch lỏng nổi phía trên vào ống polypropylen và tiếp tục bước phân đoạn bằng metyl clorua như mô tả ở trên. 6.1.2 Điều chỉnh đối với nền mẫu cụ thể a) Mẫu khô Đối với các mẫu khô hấp thụ một lượng nước lớn thì giảm cỡ phần mẫu thử xuống 12,5 g để cho thể tích dịch chiết không thay đổi. Chỉnh thể tích dịch lỏng khác như trong Bảng 1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc (3.8.4) ở nồng độ 150 ng/ml, 24 ng/ml, và 3,0 ng/ml. Chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn được tạo dẫn xuất trong 6.1.5 ở các nồng độ 37,5 ng/ml; 6,0 ng/ml và 0,75 ng/ml. Bảng 1 - Các thông số để tính tỷ lệ dung môi với mẫu cuối cùng Thông số Điều mục M ẫ u thông thường M ẫ u khô C CS = tỷ lệ mẫu cuối cùng: dung môi, tính bằng gam trên mi l ilít (g/ml) 7.1 0,02 0,015 W test = khối lượng của mẫu chiết được, tính bằng gam (g) 6.1.1, 6.1.2 25 12,5 V so l vent = Tổng thể tích của dịch chiết mẫu, tính bằng mililít (ml) 6.1.1 125 125 V crude = Thể tích dịch chiết thô kết hợp với dung dịch điều chỉnh axit, tính bằng mililít (ml) 6.1.1 4,5 4,5 V mod = Thể tích của dung dịch điều chỉnh axit được bổ sung vào dịch chiết thô, tính bằng mililít (ml) 6.1.1 0,50 0,50 V cax-a l iquot = Thể tích dịch chiết đưa lên cột làm sạch CAX, tính bằng mililít (ml) 6.1.3 1,0 1,0 V cax-fina l = Thể tích được sử dụng để hòa tan phần còn lại sau khi bay hơi, tính bằng mililít (ml) 6.1.3 2,0 1,5 V deriv = Thể tích của dịch chiết được tinh sạch dùng cho quá trình tạo dẫn xuất, tính bằng mililít (ml) 6.1.5 0,050 0,050 V final = Thể tích cuối cùng trước khi phân tích, tính bằng mililít (ml) 6.1.5 0,225 0,200 b) M ẫ u có hàm lượng protein cao Đối với các loại mẫu như các loại đậu đỗ khô, cho 100 µ l axit clohydric đặc vào 20 ml dịch chiết thô vào lọ; vặn nắp và lắc. Ly tâm ở khoảng 2000 g trong 10 min. Chuyển 15 ml dịch nổi phía trên vào ống ly tâm sạch, dung tích 50 ml và tiếp tục bước phân đoạn với metylen clorua c) M ẫ u có hàm lượng dầu cao Đối với các mẫu như các loại hạt có dầu, dùng pipet thủy tinh dùng một lần (4.12) để loại bỏ lớp hữu cơ sau khi phân đoạn với metylen clorua (3.1.3). Lần hai thêm 15 ml dịch lòng metylen clorua (3 1 3) rồi lặp lại quá trình phân đoạn. 6.1.3 Làm sạch cột CAX Chuẩn b ị c ộ t làm sạch CAX dùng một lần (4.4) bằng cách lắc cột đã được đậy nắp và để nhựa lắng xuống đáy . Để rửa giải, dùng trọng lực ở bước này và cho tất cả các bước rửa giải khác. Khi r ử a gi ả i bằng trong lực , dòng chảy phải dừng lại ngay khi chất lỏng đạt đến đ ỉ nh cột nhưng không để cột khô. Tiến hành với mẫu thử một cách kịp thời, không đ ể nhựa kh ô . Có thể chuẩn bị nhiều dung dịch thử nghiệm bằng cách sử dụng bộ chiết pha rắn thích hợp (SPE), nhưng không sử dụng chân không. Rửa nhựa hai lần mỗi lần dùng 5 ml nước. Dùng pipet tự động (4.3) chuyển 1,0 ml dịch chiết (tương ứng 0 , 18 g đối với mẫu thông thường và 0,09 g đối với mẫu khô) vào bình chứa của cột. Sử dụng cẩn thận để giảm thiểu gián đoạn việc đưa dịch chiết lên cột và khi bổ sung vào bình chứa của cột. Rửa giải đầu cột; loai bỏ d ị ch rửa giải. Thêm 0,70 ml dung dịch pha động CAX (3.2) vào bình chứa và rửa giải; tiếp t ụ c lo ạ i bỏ d ị ch rửa giải. Lặp lại quá trình này lần hai với 0,70 ml dung dịch pha động CAX (3.2). Rửa giải chất phân tích với 12,0 ml dung dịch pha động CAX (3.2). Thu lấy dịch r ử a giải vào bình cầu đáy tròn 50 ml . Làm bay hơi vừa đến khô, dùng bộ cô quay (4.14). Cách khác, thu lấy dịch rửa giải vào ống ly tâm 50 ml và cho bay hơi, dùng bộ cô quay chân không kiểu vortex (4.11). Hòa tan phần còn lại trong 2 , 0 ml dung dịch pha động CAX (3.2) (đối với mẫu khô, dùng 1,5 ml). Hòa tan phần còn lại bằng cách xoay bình để tráng hết dịch trên thành bình (chỉ đến c ổ bình) sau đó đậy nắp bình và lắc kỹ. CHÚ THÍCH 1 Phương pháp này có thể bị gián đoạn trước khi làm bay hơi dịch rửa giải CAX. Dịch chiết có th ể được bảo qu ả n lạnh đến 7 ngày trước khi tiến hành tiếp. Dịch chiết của quá trình tạo dẫn xuất sơ bộ (sau khi làm bay hơi dịch rửa giải và hòa tan lại phần cặn) cũng có th ể được bảo quản lại tương tự. Không được bảo quản cặn khô mà không thêm dung môi. CHÚ THÍCH 2 Độ thu hồi thấp có thể được cải thiện hoặc hiện tượng gây nhiễu có th ể giảm bằng cách thay đ ổ i chế độ rửa giải CAX . Thêm dịch lỏng của dịch chiết từ nền mẫu ki ể m soát được bổ sung nồng độ chất phân tích khoảng 2,0 mg/kg vào cột CAX ; rửa giải với 15 ml dung dịch pha động CAX (3.2). Thu lấy 3 ml đến 4 ml dịch rửa giải đầu tiên vào mỗi phân đoạn 0 , 5 ml đến 1 , 0 ml . Tăng th ể tích từ 1 ml đến 2 ml trên mỗi phân đoạn đối với dịch rửa giải còn lại. Tạo dẫn xuất dung dịch từ mỗi phân đoạn và phân tích để xác định mô hình rửa giải chất phân tích và chất gây nhiễu. 6.1.4 Chuẩn bị thuốc thử dẫn xuất đã được làm lạnh Chuẩn bị thuốc thử dẫn xuất trong vật chứa bằng thủy tinh với kích cỡ phù hợp có nắp được lót PTFE (4.5) bằng cách thêm một thể tích của 2,2,3,3,4,4,4-heptafluoro-1-butanol (3.4) vào hai thể tích trifluoroacetic anhydrit (3.5). Không đổ đầy vật chứa quá 75 % dung tích. Đậy nắp và đảo chiều vật chứa nhẹ nhàng từ 3 đến 4 lần. Nới lỏng nắp c ẩ n thận để xả áp suất. Chuẩn bị hỗn hợp thuốc thử mới trong ngày. Dùng pipet thủy tinh dùng một lần dung tích 2 ml (4.12) thêm 1,6 ml phần hỗn hợp của thuốc thử dẫn xuất vào lọ 4,0 ml (4.6). Vặn nắp lọ, sử dụng nắp bằng chất dẻo có lớp lót PTFE (4.5). Đặt lọ lên bộ làm nóng/làm mát bằng nhôm (4.13). Cho bộ làm nóng/làm mát lên tấm cacbondioxit hoặc cho vào chảo chứa cacbondioxit xay nhỏ. Làm nguội lọ xuống từ - 40 °C đến - 60 °C, dùng nhiệt kế để đo. 6.1.5 Tạo dẫn xuất chất phân tích CHÚ Ý Đeo găng tay khi xử lý lọ đã làm lạnh. Dùng pipet (4.3), thêm 50 µl dịch chiết hoặc dung dịch chuẩn làm việc (3.8.4) vào thuốc thử tạo dẫn xuất đã được làm lạnh trước (6.1.4), bằng phương pháp sau: Dùng đầu tip pipet (4.3) lấy 50 µl dịch chiết hoặc dung dịch chuẩn. Đặt đầu tip pipet dưới bề mặt của thuốc thử và xả lượng chứa từ từ. Tráng ngay đầu tip pipet bằng cách lặp lại quá trình rút thuốc thử (3 đến 4 lần) vào đầu tip pipet và xả vào lọ nhỏ; luôn giữ đầu tip của piet dưới bề mặt của thuốc thử CHÚ THÍCH: Thể tích của dịch chiết hoặc dung dịch chuẩn làm việc được bổ sung vào hỗn hợp thuốc th ử phải không đổi trong mọi quá trình tạo dẫn xuất. Vặn nắp lọ và cho trở lại vào bộ làm nóng/làm mát (4.13). Sau khi tất cả các dịch chiết đã được xử lý, lấy tất cả các lọ ra và để cân bằng với nhiệt độ phòng (25 °C), kiểm tra để đảm bảo rằng nắp lọ được đóng kín. Đặt lọ vào bộ làm nóng/làm mát (4.13) trong 1 h được duy trì ở 85 °C đến 90 °C. Sau khi làm nóng 5 min, kiểm tra để đảm bảo rằng tất cả các nắp vẫn được đóng kín. Cứ 15 min lắc lọ một lần; đảm bảo rằng thuốc thử không bị bay hơi bằng cách ki ể m tra mức thuốc thử trong lọ. Sau khi làm nóng, lấy lọ ra khỏi bộ gia nhiệt và để lọ nguội đến nhiệt độ phòng (25 °C). Làm bay hơi thuốc thử dẫn xuất dư dưới dòng nitơ, sử dụng bộ bay hơi (4.7) để thuận tiện cho việc xử lý nhiều lọ. Ống phân phối nitơ phải đặt vừa trong cổ của mỗi lọ. Trong quá trình làm bay hơi, các lọ cần được duy trì ở 40 °C đến 50 °C. Khi thấy lọ đã khô thì giữ lọ thêm 30 min dưới dòng nitơ ở 40 °C đến 50 °C, vì thuốc thử dẫn xuất hoặc sản phẩm phụ còn lại có thể ảnh hưởng đến sắc ký đồ của các chất phân tích. Sau khi làm bay hơi, đậy nắp lọ và để nguội đến nhiệt độ phòng (25 °C). Sử dụng xyranh thủy tinh dung tích 250 µl, thêm ngay 225 µl (200 µl đối với thực phẩm khô) etyl axetat (3.1.1) có chứa xitral 0,2 % (3.7). Hạn chế phần còn lại tiếp xúc với không khí. Đậy nắp lọ và trộn vortex trong 20 s để hòa tan lượng chứa bên trong. Sử dụng pipet tự động (4.3) (10 µl đến 100 µl) để chuyển lượng chứa vào lọ của bộ lấy mẫu tự động có th ể tích nhất định (250 µl). 6.2 Xác định 6.2.1 Quy trình điều chỉnh detector phổ khối lượng CHÚ THÍCH Thay vì sử dụng quy trình điều chỉnh chu ẩ n, thì sử dụng quy trình dưới đây để t ă ng độ nhạy của detector. Ngoài ra, có thể phát hiện tối ưu các mảnh có khối lượng cao bằng bộ nguồn điện tử MSD sạch. Sử dụng perfluorotributylamin (PFTBA) làm dung dịch chuẩn hiệu chuẩn và thực hiện quy trình điều chỉnh theo khuyến cáo của nhà sản xuất thiết bị để đảm bảo detector hoạt động đúng. Sau khi điều chỉnh quy trình chuẩn thành công thì thực hiện quy trình điều chỉnh bằng tay như sau. Chọn khối lượng điều ch ỉ nh m/z 414, m/z 502, và m/z 614, với phạm vi quét m/z 350 đến m/z 650. Ch ỉ nh bằng tay các thông số sau đây: Giảm việc cài đặt hệ số nhân tín hiệu (gain) amu, làm tăng độ rộng cửa sổ khối (bandwith) khoảng 3 lần từ 0,5 amu đến dải từ 1,5 amu đến 2,0 amu. Việc tăng độ rộng cửa sổ khối sẽ tăng khả năng phát hiện. Ch ỉ nh hệ số nhân tín hiệu khối và hệ số bù khối lượng để đánh giá được khối lượng đúng. Mặc dù độ rộng cửa sổ khối tăng lên sẽ không cần phải điều chỉnh khối lượng chính xác. Vận hành detector phổ khối lượng trong chế độ SIM, sử dụng m/z 446 đối với dẫn xuất AMPA và m/z 611,5 đối với dẫn xuất glyphosate. Chương trình detector để chuyển đ ổ i từ m/z 446 sang m/z 611,5 tính từ khi rửa giải dẫn xuất AMPA và glyphosate. Chỉ theo dõi một ion ở thời điểm này, trừ khi cần thực hiện phép phân tích khẳng định (6.2.5). Việc điều chỉnh điện áp nhân điện tử là cần thiết để thu được tỷ số tín hiệu/nhiễu tối ưu, trong khi duy trì độ đáp ứng tuyến tính trên dải hiệu chuẩn. 6.2.2 Cân bằng hệ thống sắc ký Cần tiến hành kết hợp nền mẫu/chất phân tích đã được tạo dẫn xuất thông qua sự cân bằng hệ thống đầu vào sắc ký khí (GC) trước khi phân tích sao cho các vị trí hấp thụ bị bất hoạt. Xitral trong dung môi được bơm vào cũng giúp duy trì hệ thống đầu vào bất hoạt. Việc bơm dịch chiết đã tạo dẫn xuất chứa các chất phân tích ở mức cao cũng có hiệu quả. Để cân bằng hệ thống, tiến hành bơm lặp lại xen kẽ giữa hai lần bơm dịch chiết dẫn xuất và một lần bơm dung dịch chuẩn hiệu chuẩn 50 ng/ml (3.8.5), cho đến khi chất chuẩn cho độ đáp ứng tái lập. Phụ thuộc vào nền mẫu để cân bằng hệ thống. Vì vậy khi tiến hành cân bằng, sử dụng dịch chiết đã dẫn xuất của cùng một nền mẫu cần phân tích trong quá trình chạy phân tích. Nếu các nền mẫu khác được phân tích sau đó thì cân bằng lại với dịch chiết đã tạo dẫn xuất của nền mẫu đó. Không phân tích nền mẫu khác trong cùng thời điểm chạy phân tích này. 6.2.3 Hiệu năng của hệ thống Tỷ số tín hiệu/nhiễu đối với dung dịch chuẩn 1,0 ng/ml phải ít nhất là 10:1. Rửa giải dẫn xuất AMPA khoảng từ 4 min đến 7 min, dẫn xuất glyphosate rửa giải sau khoảng từ 0,5 min đến 1,0 min so với xuất AMPA. Chiều rộng pic (tại nửa chiều cao) của các pic chất phân tích phải từ 0,6 s đến 2,0 s. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của độ đáp ứng từ việc bơm lặp lại của dung dịch chuẩn 1,0 ng/ml phải nhỏ hơn 10 %. 6.2.4 Phân tích GC Sau khi cân bằng thiết bị, tiến hành bơm riêng lẻ từng dung dịch chuẩn hiệu chuẩn: 50 ng/ml, 8,0 ng/ml và 1,0 ng/ml (3.8.5). Bơm riêng lẻ từng dịch chiết phân tích. Bơm lại dung dịch chuẩn sau 4 đến 8 lần bơm dịch chiết. Sau khi bơm tất cả các dịch chiết, bơm từng dung dịch chuẩn hiệu chuẩn. 6.2.5 Phân tích khẳng định Ba mảnh chính có thể được sử dụng để x á c định dẫn xuất AMPA là m/z 372, m/z 446, và m/z 502. Ba mảnh chính để xác định dẫn xuất glyphosate là: m/z 611,5, m/z 584 và m/z 460. Mặc dù m/z 446 và m/z 611,5 cho độ đáp ứng đối với dẫn xuất AMPA và glyphosate lớn nhất tương ứng, các ion thay thế có thể được sử dụng cho phép phân tích khẳng định. Các ion thay thế có thể cũng có hiệu quả để loại trừ hoặc giảm khả năng gây nhiễu. 6.3 Điều kiện vận hành máy sắc ký khí Các điều kiện vận hành sau đây cho thấy thích hợp : - Tốc độ dòng khí heli: khoảng 30 cm/s ở 180 °C; bằng khoảng 40 kPa đến 50 kPa (6 psi đến 7 psi) ở đầu cột. - Chương trình nhiệt độ: nhiệt độ ban đầu, giữ ở 90 °C trong 1,5 min, tăng lên 300 °C với tốc độ 30 °C/min (tốc độ 20 °C/min nếu tính năng của máy bị hạn chế) và giữ ở 300 °C trong 4 min. - Chương trình thay thế để tăng sự phân giải là: Nhiệt độ ban đầu, giữ ở 60 °C trong 1,5 min, tăng lên 120 °C với tốc độ 10 °C/min, giữ ở 120 °C trong 1.0 min, tăng lên 300 °C với tốc độ 30 °C/min và giữ ở 300 °C trong 4 min. - Nhiệt độ cổng bơm: 200 °C. - Nhiệt độ giao diện của detector phổ khối lượng (MSD): 280°C. - Thể tích bơm: 2 µl đến 5 µl, tùy thuộc vào khả năng phát hiện chất phân tích. - Đầu vào của hệ thống: hoạt động ở chế độ không chia dòng, có đầu vào được làm sạch trong 1.0 min sau khi bơm. CHÚ THÍCH Độ nhạy có thể được tối ưu hóa bằng cách chỉ nh nhiệt độ lò cột ban đầu từ 60 °C đến 90 °C. Thay đổi chương trình nhiệt độ để thu được các điều kiện tối ưu. 7 Tính kết quả 7.1 Tính lượng mẫu thử trong dung dịch Dùng các thông số trong Bảng 1, lượng mẫu thử trong dịch chiết cuối cùng, C CS , biểu thị bằng gam trên mililít (g/ml) được tính bằng Công thức (2): (2) Trong đó W test là khối lượng mẫu chiết được, tính bằng gam (g); V so l ven là tổng thể tích của dịch chiết mẫu, tính bằng mililít (ml); V crude là thể tích dịch chiết thô kết hợp với dung dịch điều chỉnh axit, tính bằng mililít (ml); V mod là thể tích của dung dịch điều chỉnh axit được bổ sung vào dịch chiết thô, tính bằng mililít (ml); V cax - a l iquot là thể tích dịch chiết đưa lên cột làm sạch CAX, tính bằng mililít (ml); V cax - fina l là thể tích được sử dụng để hòa tan phần còn lại sau khi bay hơi, tính bằng mililít (ml); V der i v là thể tích của dịch chiết được tinh sạch dùng cho quá trình tạo dẫn xuất, tính bằng mililít (ml); V final là thể tích cuối cùng trước khi phân tích, tính bằng mililít (ml). 7.2 Tính hàm lượng của từng dư lượng trong mẫu thử 7.2.1 Đối với hiệu chuẩn tuyến tính a) Hệ số đáp ứng, RF 1-3 , tại từng mức hiệu ch uẩ n, C 1-3 , được tính bằng Công thức (3): (3) Trong đó R 1-3 là độ đáp ứng trung bình của ba nồng độ (3.8.5) từ các lần bơm dung dịch hiệu chuẩn. b) Độ lệch, D 1 -3 , tính bằng phần trăm (%), của hệ số đáp ứng đơn lẻ từ hệ số đáp ứng trung bình, được tính bằng Công thức (4): (4) Trong đó RF 1-3 là hệ số đáp ứng trung bình của ba nồng độ (3.8.5) từ các lần bơm dung dịch hiệu chuẩn; RF avg là hệ số đáp ứng trung bình. Nếu độ lệch của hệ số đáp ứng ở mức bất kỳ lớn hơn 20 %, thì hiệu chuẩn lại (7.4). c) Nồng độ của chất phân tích trong dịch chiết cuối cùng, C E , tính bằng nanogam trên mililít (ng/ml) dùng hiệu chuẩn điểm riêng lẻ, được tính bằng Công thức (5). C E = RF x R s (5) Trong đó, R s là độ đáp ứng của mẫu thử. Sử dụng RF của dung dịch chuẩn với độ đáp ứng gần nhất với mẫu thử, R s , trong khoảng 50 % đến 200 % độ đáp ứng chuẩn. Nếu độ đáp ứng của mẫu thử không nằm trong phạm vi 50 % đến 200 % độ đáp ứng chuẩn trung bình ở bất kỳ mức hiệu chuẩn nào, thì sử dụng RF trung bình từ 2 dung dịch chuẩn có độ đáp ứng phù hợp với độ đáp ứng của mẫu. Sử dụng RF của dung dịch hiệu chuẩn ở mức thấp, tương đương với LOQ (giới hạn định lượng), để xác định nồng độ chất nền trong mẫu kiểm soát. d) Hàm lượng của mỗi dư lượng trong mẫu thử ban đầu, C R , tính bằng nanogam trên mililít (ng/ml) được tính bằng Công thức (6): (6) Trong đó C E là nồng độ của chất phân tích trong dịch chiết cuối cùng, tính bằng nanogam trên gam (ng/g); C CS là lượng mẫu thử trong dung dịch (7.1), tính bằng gam trên mililít (g/ml). 7.2.2 Đối với hiệu chuẩn không tuyến tính Dải đáp ứng tuyến tính có th ể thay đổi theo thiết bị. Việc lệch ra khỏi tuyến tính phổ biến hơn khi mở rộng dải hiệu chuẩn. Đối với độ đáp ứng không tuyến tính, nên sử dụng đường đa thức bậc hai thay cho phép hiệu chuẩn để tính C E . Khi sử dụng phương pháp hiệu chuẩn không tuyến tính, sử dụng giao đi ể m với trục y tại gốc tọa độ. 8 Hiệu chuẩn lại Nếu cần hiệu chuẩn lại thì quy trình được đưa ra sau đây đề cân bằng hệ thống GC (6.2.2). Nếu việc hiệu chuẩn sau đó không được cải thiện thì chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc (3.8) mới và tạo dẫn xuất lại các dung dịch chuẩn đó để tạo dung dịch hiệu chuẩn dẫn xuất mới (6.1.5). Đồng thời, tạo dẫn xuất lại dịch chiết, lấy dịch l ỏ ng từ dịch chiết đã tinh sạch được giữ lại (6.1.3). Tính lại các giá trị D 1-3 , (7.2.1). Nếu các giá trị vẫn lớn hơn 20 % thì sử dụng hiệu chuẩn không tuyến tính (7.2.2). 9 Kiểm soát chất lượng Các yêu cầu kiểm soát chất lượng tối thiểu bao gồm việc chứng minh ban đầu về khả năng của phòng thử nghiệm và việc phân tích chất chuẩn hiệu chu ẩ n, thuốc thử trắng, mẫu kiểm soát và kiểm soát mẫu thêm chuẩn như mô tả dưới đây: 9.1 Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn Ban đầu xác định hiệu năng của thiết bị bao gồm việc chuẩn bị và phân tích dung dịch chuẩn hiệu chuẩn bao trùm dải dự kiến sử dụng. Xem xét chủ yếu là khả năng phát hiện chất phân tích. Tỷ số tín hiệu/nhiễu thu được từ việc bơm dung dịch chuẩn hiệu chuẩn ở nồng độ tương đương với nồng độ của chất phân tích trong mẫu thử ở LOQ phải lớn hơn 10:1. Bơm lặp lại dung dịch chuẩn này sẽ cho độ đáp ứng với RSD nhỏ hơn 10 %. 9.2 Thuốc thử trắng và nền mẫu kiểm soát Ban đầu thuốc thử trắng phải được chạy phân tích để chứng minh rằng tất cả các thuốc thử và dụng cụ thủy tinh không chứa chất gây nhiễu. CHÚ THÍCH Điều này r ấ t quan trọng b ở i v ì tính chất hấp thụ của chất phân tích. Chạy ít nhất một nền mẫu kiểm soát không thêm chu ẩ n với từng bộ mẫu thử. Nền mẫu kiểm soát được yêu cầu khi phải hiệu ch ỉ nh phép xác định đối với hàm lượng chất phân tích hoặc sự có mặt của mẫu trong nền mẫu, hoặc khi dữ liệu về độ thu hồi được yêu cầu. Đối với phép xác định độ thu hồi ở mức 1 đến 2 lần LOQ, thì nồng độ của nền mẫu tính được phải nh ỏ hơn LOQ. 9.3 Kiểm soát mẫu thêm chuẩn Cần ít nhất một mẫu thêm chuẩn cho mỗi lô mẫu thử để chứng minh độ thu hồi của phương pháp. Bổ sung hàm lượng nền mẫu trắng đã biết ở mức tương đương 1 đến 2 lần LOQ, dùng dung dịch chuẩn trung gian (6.1.3). Nếu sử dụng nhiều nền mẫu th ử nghiệm thì chạy phân tích một mẫu thêm chuẩn đối với mỗi nền mẫu. Tính phần trăm độ thu hồi đối với mỗi chất phân tích, hiệu chỉnh nồng độ của nền mẫu được tìm thấy trong mẫu kiểm soát. Độ thu hồi phải từ 70 % đến 130 % mức thêm chuẩn. 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp l ấ y mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được. Phụ lục A (Tham khảo) Kết quả nghiên cứu Bảng A.1 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm để xác định glyphosphat trong thực phẩm bằng GC/MSD Ký hiệu cặp mẫu Giá trị trung bình ( ), mg/kg a Số lượng phòng thử nghiệm b Độ lệch chuẩn lặp lại ( s r ) Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại ( RSD r ) % Độ lệch chuẩn tái lập ( s R ) Độ lệch chuẩn tương đ ố i tái lập ( RSD R ) % Chỉ s ố HORRAT c Độ thu hồi, % a C1 0,045 11 (1) 0,0067 15,0 0,0067 15,0 1,1 84,5 C2 0,368 12 (0) 0,0413 11,2 0,0680 18,5 1,0 87,5 C3 1,706 12 (0) 0,1809 10,6 0,3716 21,8 1,5 89,7 S1 0,046 12 (0) 0,0079 17,0 0,0091 19,7 0,8 88,1 S2 0,407 12 (0) 0,0427 10,5 0,0617 15,2 0,8 96,6 S3 1,774 12 (0) 0,1451 8,2 0,2905 16,4 1,1 93,3 W1 0,051 10 (1) 0,0046 9,0 0,0046 9,0 0,7 97,3 W2 0,386 10 (1) 0,0235 6,1 0,0441 11,5 1,3 91,7 W3 1,767 9 (0) 0,1970 11,2 0,3519 19,9 1,4 93,1 a Được hiệu chỉnh bằng cách trừ nồng độ được tìm thấy trong phép kiểm soát. b Số lượng của phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ ngoại lệ; giá trị trong ngoặc là số lượng phòng thử nghiệm bị loại bỏ vì ngoại lệ. c HORRAT = RSD R (tìm thấy được)/RSD R (tính được từ công thức Horwitz). B ả ng A.2 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng th ử nghiệm đ ể xác định AMPA trong thực phẩm bằng GC/MSD Ký hiệu cặp mẫu Giá trị trung bình ( ), mg/kg a Số lượng phòng thử nghiệm b Độ lệch chuẩn lặp lại ( s r ) Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại ( RSD r ) % Độ lệch chuẩn tái lập ( s R ) Độ lệch chuẩn tương đ ố i tái lập ( RSD R ) % Chỉ s ố HORRAT c Độ thu hồi, % a C1 0,046 11 (0) 0,0111 24,1 0,0111 24,1 1,0 87,5 C2 0,374 11 (0) 0,0413 11,1 0,0874 23,4 1,3 88,9 C3 1,699 11 (0) 0,2469 14,5 0,4215 24,8 1,7 89,4 S1 0,041 12 (0) 0,0097 23,7 0,0175 42,9 1,7 77,7 S2 0,364 12 (0) 0,0729 20,0 0,0872 24,0 1,3 86,6 S3 1,649 12 (0) 0,2501 15,2 0,3340 20,3 1,4 86,8 W1 0,048 11 (0) 0,0077 15,9 0,0135 27,9 1,1 92,4 W2 0,354 11 (1) 0,0400 11,3 0,0541 15,3 1,6 84,2 W3 1,671 9 (0) 0,1801 10,8 0,3883 23,2 1,6 88,0 a Được hiệu chỉnh bằng cách trừ nồng độ được tìm thấy trong phép kiểm soát. b Số lượng của phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ ngoại lệ; giá trị trong ngoặc là số lượng phòng thử nghiệm bị loại bỏ vì ngoại lệ. c HORRAT = RSD R (tìm thấy được)/RSD R (tính được từ công thức Horwitz).