TCVN8102:2009

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8102:2009 (ISO 9231 : 2008) về Sữa và sản phẩm sữa - Xác định hàm lượng axit benzoic và axit sorbic TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8102 : 2009 ISO 9231 : 2008 SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BENZOIC VÀ AXIT SORBIC Milk and milk products - Determination of the benzoic and sorbic acid contents Lời nói đầu TCVN 8102 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 9231 : 2008; TCVN 8102 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BENZOIC VÀ AXIT SORBIC Milk and milk products - Determination of the benzoic and sorbic acid contents 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng axit benzoic và axit sorbic trong sữa và các sản phẩm sữa. Phương pháp này có thể áp dụng cho sữa, sữa bột, sữa chua và các sản phẩm sữa lên men khác, phomat và các sản phẩm phomat chế biến, thích hợp để xác định hàm lượng cả hai hợp chất ở mức lớn hơn 5 mg/kg . 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thuỷ tinh - Bình định mức. 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này áp dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 3.1 Hàm lượng axit benzoic và axit sorbic (benzoic and sorbic acid contents) Phần khối lượng của axit benzoic và axit sorbic xác định được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này. CHÚ THÍCH Hàm lượng axit benzoic và axit sorbic được biểu thị bằng miligam trên kilogam sản phẩm 4. Nguyên tắc Chất béo và protein được tách khỏi dung dịch kiềm nhẹ của sản phẩm bằng kết tủa Carrez. Sau đó pha loãng phần dung dịch còn lại với metanol, lọc phần chất lỏng phía trên Axit benzoic và axit sorbic được tách bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) với cột pha đ ả o C 18 , đo độ hấp thụ ở bước sóng 227 nm và 250 nm. 5. Thuốc thử Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. 5.1. Metanol (CH 3 OH). 5.2. Thuốc thử tạo kết tủa , chuẩn bị như sau: 5.2.1. Dung dịch kali hexaxyanoferat (II) Hoà tan 10,6 g kali hexaxyanoferat (II) ngậm ba phân tử nước (K 4 [Fe(CN) 6 ].3H 2 O) với nước trong bình định mức một vạch dung tích 100 ml (6.3). Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn. CHÚ THÍCH 100 ml dung dịch này đủ cho 40 lần chạy sắc ký. 5.2.2. Dung dịch kẽm axetat H òa tan 21,9 g kẽm axetat ngậm hai phân tử nước [(CH 3 COO) 2 Zn.2H 2 O] và 32 ml axit axetic (CH 3 COOH) với nước trong bình định mức một vạch dung tích 100 ml (6.3). Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn. Nếu kẽm axetat ngậm hai phân tử nước không hoà tan hoàn toàn, thì đun nóng bình định mức 100 ml với dung dịch chứa trong bình trên nồi cách thuỷ (6.2), duy trì nhiệt độ 70 o C trong khi vẫn xoay bình. Khi kẽm axetat ngậm hai phân tử nước đã hoà tan hoàn toàn, thì làm nguội dung dịch về nhiệt độ phòng. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn. CHÚ THÍCH 100 ml dung dịch này đủ cho 40 lần chạy sắc ký 5.3. Dung dịch đệm phosphat , pH 6,7 Hoà tan 2,5 g kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ) và 2,5 g kali hydro phosphat ngậm ba phân tử nước (K 2 HPO 4 .3H 2 O) trong 1 I nước và trộn. Lọc dung dịch thu được qua hệ thống lọc dung môi (6 . 8). 5.4. Pha động , dùng cho HPLC Trộn 10 thể tích metanol (5.1) với 90 thể tích dung dịch đệm phosphat (5.3). Tách khí hoà tan trong dung dịch bằng cách sử dụng chân không nhẹ. 5.5. Dung dịch natri hydroxit , c (NaOH) = 0,1 mol/l Hoà tan 4,0 g natri hydroxit dạng hạt bằng nước trong bình định mức một vạch dung tích 1 000 ml (6 . 3). Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn. 5.6. Axit sulfuric , c (H 2 SO 4 ) = 0,5 mol/l Rót cẩn thận 15 ml axit sulfuric đậm đặc, nồng độ ít nhất 95 % đến 98 % khối lượng vào 250 ml nước trong bình định mức một vạch dung tích 500 ml (6.3) và làm nguội. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn. 5.7. Dung dịch axit sorbic và axit benzoic chuẩn , chuẩn bị như sau: 5.7.1. Dung dịch chuẩn gốc Hoà tan 50 mg axit sorbic và 50 mg axit benzoic bằng metanol (5.1) trong bình định mức một vạch dung tích 100 ml (6.3). Pha loãng bằng metanol (5.1) đến vạch và trộn. Dung dịch chuẩn gốc có thể bền ít nhất ba tuần nếu bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 o C đến 7 o C. 5.7.2. Dung dịch chuẩn làm việc Trộn 500 ml metanol (5.1) với 500 ml nước để thu được dung dịch nước-metanol 50 % thể tích. Trong ngày sử dụng, dùng pipet lấy 5 ml dung dịch chuẩn gốc (5.7.1) cho vào bình định mức một vạch dung tích 250 ml (6.3). Pha loãng bằng dung dịch nước-metanol 50 % tới vạch và trộn. Dung dịch chuẩn làm việc thu được chứa 10 m g/ml tổng hàm lượng axit sorbic và axit benzoic . 6. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau: 6.1. Cân phân tích , có thể cân chính xác đến 1 mg, có khả năng đọc đến 0,1 mg. 6.2. Nồi cách thuỷ , có thể duy trì nhiệt độ 70 o C ± 2 o C. 6.3. Bình định mức một vạch , dung tích 100 ml, 250 ml, 500 ml và 1 000 ml, phù hợp với cấp A của TCVN 7153 (ISO 1042). 6.4. Sắc kí lỏng , được gắn với bơm có thể tạo áp suất lên đến 4,37 MPa (6 000 psi), bộ bơm mẫu, detector UV bước sóng kép hoặc lưỡng cực, và máy ghi hoặc bộ tích phân. Detector bước sóng kép có cuvet 1 cm và có thể đo độ hấp thụ ở bước sóng 227 nm (đối với axit benzoic) và 250 nm (đối với axit sorbic). 6.5. Cột HPLC , làm bằng thép không gỉ, dài 250 mm, đường kính trong 4 mm, chứa pha đảo, octađexyl (ODC) xử lí với chất hấp thụ silic, ví dụ Micro-Bondapak C 18 1) hoặc loại tương tự. 6.6. Xyranh dùng cho HPLC . 6.7. Bộ lọc trong máu , có màng Iọc với cỡ lỗ 0,45 μm sử dụng với dung dịch nước. 6.8. Hệ thống lọc dung môi , có màng lọc với c ỡ lỗ 0,45 μm sử dụng với dung dịch nước. 6.9. Thiết bị siêu âm. 6.10. Máy đo pH. 7. Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc không bị biến đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707). Mẫu thử được bảo quản sao cho tránh hư hỏng hoặc biến đổi thành phần. 8. Chuẩn bị mẫu thử 8.1. Sữa chua và các sản phẩm sữa lên men khác Trước khi bắt đ ầ u tiến hành thử, đồng hoá mẫu bằng cách làm ấm từ từ tới 40 o C trong khi khuấy. Cân, 20 g mẫu thử đã đồng hoá, chính xác đến 0,1 g, vào bình định mức một vạch (6.3). 8.2. Các sản phẩm sữa khác Cân 3 g mẫu, chính xác đến 0,1 g, vào cốc thuỷ tinh có mỏ dung tích 20 ml. Hoà tan hoàn toàn mẫu thử trong 10 ml nước, thêm từng lượng nhỏ trong khi khuấy bằng đũa thuỷ tinh. Chuyển hết dung dịch này vào bình định mức một vạch dung tích 100 ml (6.3), tráng cốc có mỏ hai lần mỗi lần dùng 5 ml nước. 9. Cách tiến hành 9.1. K ế t tủa chất béo, protein và làm trong Thêm 25 ml dung dịch natri hydroxit (5.5) vào mẫu thử (xem 8.1 hoặc 8.2) và trộn. Có thể đặt bình cùng với dung dịch vào trong thiết bị siêu âm (6.9) trong 15 min hoặc đặt trên nồi cách thuỷ (6.2) duy trì ở nhiệt độ 70 o C và gia nhiệt trong 15 min, sau đó để dung dịch nguội tới nhiệt độ phòng. Chỉnh pH đến 8 ± 1 bằng cách thêm dung dịch axit sulfuric (5.6) trong khi trộn. Sau đó thêm 2 ml dung dịch kali hexaxyanoferat (II) (5.2.1) và 2 ml dung dịch kẽm axetat (5.2.2) để làm kết tủa chất béo và protein. Lắc mạnh rồi để yên huyền phù thu được trong 15 min. Sau đó thêm khoảng 40 ml metanol (5.1) và trộn. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Pha loãng bằng metanol (5.1) đến vạch và tiếp tục trộn. Giữ yên hỗn hợp thêm 15 min. Lọc phần chất lỏng nổi lên bằng bộ lọc trong mẫu (6.7). 9.2 Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Tiến hành phân tích HPLC ở nhiệt độ phòng, dùng pha động (5.4) với tốc độ dòng khoảng 1,2 ml/min. Để cho hệ thống cân bằng trong ít nhất 30 min trước khi bơm các dung dịch. Sau đó bơm 5 μl đến 20 μl dung dịch đã lọc trong trong 9.1 và một thể tích tương đương dung dịch chuẩn làm việc (5 . 7.2). Kiểm tra dòng chảy của cột bằng detector UV ở bước sóng 227 nm và 250 nm, dùng detector liên tiếp ở hai bước sóng cài đặt hoặc dùng đồng thời bước sóng kép. CHÚ THÍCH Đường chuẩn phải tuyến tính, do vậy chỉ cần một điểm hiệu chuẩn là đủ. Lượng metanol trong dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử cao hơn nhiều trong pha động, điều này có thể ảnh hư ở ng đến h ì nh dạng pic và sự phân tách pic ở một số trường hợp . Khi đó. cần kiểm tra hình dạng pic và sự phân tách pic bằng cách so sánh với pic thu được khi bơm dung dịch chuẩn làm việc (5.7.1) trong đó metanol (5.1) được thay bằng pha động (5.4) với thể tích tương đương. Thời gian lưu của axit benzoic và axit sorbic trong các điều kiện nêu trên tương ứng khoảng 5,5 min và 7 min. Nếu các pic được tạo thành bị ảnh hư ở ng bởi các chất gây nhiễu khác, thì chuẩn bị độ pha loãng thích hợp trong nước-metanol 50 % và bơm 5 μl đến 20 μl dung dịch đã pha loãng để thu được chiều cao pic thích hợp. Để phát hiện xem có bất kỳ hợp chất gây nhiễu nào bị phân giải cùng với axit sorbic hay không, cần kiểm tra tỉ lệ các tín hiệu UV ở cả bước sóng 250 nm và 227 nm. Khi phân tích sữa hoặc sữa bột, sẽ quan sát được pic thứ ba sau khi rửa giải 8 min. Pic này được tạo thành bởi axit hippuric, một thành phần tự nhiên của sữa. Pic của axit hippuric có thể chồng một phần lên pic của axit sorbic. Độ phân giải cột giữa axit sorbic và axit hippuric tốt nhất là > 1. 10. Tính toán và biểu thị kết qu ả 10.1. Tính toán Tính hàm lượng axit sorbic, ws , và/hoặc hàm lượng axit benzoic, wb , bằng miligam trên kilogam, theo công thức sau: trong đó H ts là chiều cao hoặc diện tích của pic thu được từ dung dịch mẫu thử (xem 9.2), tính theo đơn vị thích hợp; H st là chiều cao hoặc diện tích của pic thu được từ dung dịch chuẩn làm việc (xem 9.2), tính theo cùng đơn vị; m s là khối lượng chuẩn làm việc (5.7.2) đã bơm, tính bằng microgam (μg); m là khối lượng của mẫu thử (xem 8.1 hoặc 8.2), tính bằng gam (g); V 1 là thể tích dịch chiết được chuẩn bị trong 9.1 (= 100 ml), tính bằng mililit (ml); V 2 là thể tích dung dịch mẫu thử (xem 9.2) đã bơm, tính bằng microlit (μl). 10.2. Biểu thị kết quả Biểu thị k ế t quả đến số nguyên gần nhất. 11. Độ chụm 11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm Các giá trị nhận được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu. Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập thu được từ các kết quả của hai phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành năm 1984 và 2004 (xem Phụ lục A). Các phép thử được tiến hành trên mẫu có hàm lượng axit benzoic và axit sorbic dao động từ 6 mg/kg đến 920 mg/kg. 11.2. Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một loại vật liệu thử, trong cùng phòng thử nghiệm, do cùng một người thao tác và sử dụng cùng một thiết bị trong cùng một khoảng thời gian ngắn như nhau, không quá 5 % trường hợp lớn hơn 2,235 + 0,031 x ϖ s ,(hoặc ϖ b ) mg/kg. 11.3. Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một loại vật liệu thử, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người thao tác khác nhau thực hiện và sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn 8,987 + 0,130 x ϖ s ,(hoặc ϖ b ) mg/kg. 12. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được, và nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được. Phụ lục A (Tham khảo) Các phép thử liên phòng thử nghiệm Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập thu được từ các kết quả của hai phép thử liên phòng thử nghiệm quốc tế tiến hành vào các năm 1984 [4] và 2004 [6] . Các kết quả thu được trong hai phép thử liên phòng thử nghiệm đã được phân tích thống kê theo TCVN 4550 : 1988 (ISO 5725 : 1981) và TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2 : 1994) cho các số liệu về độ chụm như trong Bảng A.1. Bảng A.1 - Kết quả thử nghiệm liên phòng thử nghiệm Thông số Axit benzoic Axit sorbic 1984 [4] 1984 [4] 2004 [6] 2004 [6] 1984 [4] 2004 [6] 2004 [6] M ẫ u A a B a C b D b B+ c C b D b Số phòng thử nghiệm tham gia 14 14 9 14 14 14 14 Số phòng thử nghiệm ngoại lệ 2 2 1 1 3 1 0 Số phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ 12 12 8 13 11 13 14 Giá trị trung bình, mg/kg 26 , 4 40,6 7 , 61 35 , 0 36 , 1 920 57 , 0 Độ lặp lại, r , mg/kg 2,0 3,8 1 , 6 4,4 3 , 4 30,5 4 , 5 Độ lặp lại theo giá trị trung bình, r rel , % 7 , 7 9 , 4 20,5 12,7 9 , 4 3,3 7 , 8 Độ lệch chuẩn lặp lại, s r, % 0 , 7 1 , 3 0,6 1 , 6 1 , 2 10,8 1,6 RSD r, % 2 , 7 3 , 3 7 , 2 4,5 3 , 3 1 , 2 2 , 8 Độ tái lập, R , mg/kg 13 , 5 15 , 3 11,0 9,9 12,1 128,9 18,6 Độ tái lập theo giá trị trung bình, R rel , % 51 , 1 37 , 7 144 28,4 33 , 5 14,0 32,6 Độ lệch chuẩn tái lập , S R , mg/kg 4 , 8 5,4 3,9 3 , 5 4 , 3 45 , 6 6,6 RSD R , % 18 , 1 13 , 3 50 , 9 10,0 11 , 9 5,0 11 , 5 a Mẫu A v à m ẫ u B: Sữa chua có hương liệu. b Mẫu C và mẫu D: Phomat chế biến (xem thông tin bổ sung trong Tài liệu tham khảo [6]) c Spiked với 40 mg/kg axi t sorbic trong quá trình chuẩn bị Sử dụng phân tích hồi quy tuyến tính với phương trình hồi quy x = b + ay, thu được hệ số tương quan 0,9973486, với n = 7, s = 0,8249 và t 0,95 = 2,57 (xem Hình A.1): đối với axit sorbic, r = 2 , 2354088 + 0,0307787 ϖ s , và đối với axit benzoic, r = 2,2354088 + 0,0307787 ϖ b Sử dụng phân tích hồi quy tuyến tính với phương trình hồi quy x = b + ay, thu được hệ số tương quan 0,9989653, với n = 7, s = 2,1815 và t 0,95 = 2,57 đối với độ tái lập (xem Hình A.2): đối với axit sorbic, R = 8,9874965 + 0,1304663 ϖ s , và đối với axit benzoic, R = 8,9874965 + 0,1304663 ϖ b . CH Ú D Ẫ N X giá trị trung bình (mg/kg) Y độ lặp lại, r ( mg/kg) H ì nh A.1 - Độ lặp lại theo hàm số của giá trị trung bình X CH Ú D Ẫ N X giá trị trung bình (mg/kg) Y độ tái lập, R (mg/kg) Hình A.2 - Độ tái l ập theo hàm số của giá trị trung bình THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu. [2] TCVN 4550 : 1988 (ISO 5725 : 1981), Thống kê ứng dụng - Độ lặp lại và độ tái lập của các phương pháp thử (đã huỷ). [3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn. [4] S tijve, T., and Hischenhuber, C: High performance liquid chromatographic determination of low levels of benzoic acid and sorbic acid in yoghurts, Deutsche Lebensmittel-Rundschau, 80 (1984), pp. 81-84. [5] B I TIKOFER, H., Baumann, E., and Bosset, F.O.: Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg., 79 (1988), pp. 392-405 [6] Carl, M., and BlTIKOFER, U .: Bulletin of the International Dairy Federation, publication in preparation. 1) Micro-Bondapak C 18 ® là tên của sản phầm có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng, ISO không ấn định phải sử dụng chúng.