TCVN7748:2007

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7748:2007 (EN 13783:2002) về thực phẩm - Phát hiện chiếu xạ bằng kỹ thuật lọc huỳnh quang bề mặt trực tiếp/đếm đĩa vi sinh vật hiếu khí (DEFT/APAC) - Phương pháp sàng lọc TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7748 : 2007 THỰC PHẨM – PHÁT HIỆN CHIẾU XẠ BẰNG KỸ THUẬT LỌC HUỲNH QUANG BỀ MẶT TRỰC TIẾP/ ĐẾM ĐĨA VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (DEFT/APAC) – PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC Foodstuffs – Detection of irradiated food using direct epifluorescent filter technique/Aerobic plate count (DEFT/APC) – Screening method Lời nói đầu TCVN 7748:2007 hoàn toàn tương đương với EN 13783:2002; TCVN 7748:2007 do Tiểu ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F5/SC1 Thực phẩm chiếu xạ biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỰC PHẨM – PHÁT HIỆN CHIẾU XẠ BẰNG KỸ THUẬT LỌC HUỲNH QUANG BỀ MẶT TRỰC TIẾP/ ĐẾM ĐĨA VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (DEFT/APAC) – PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC Foodstuffs – Detection of irradiated food using direct epifluorescent filter technique/Aerobic plate count (DEFT/APC) – Screening method CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định các khả năng áp dụng các giới hạn qui định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sàng lọc vi sinh vật để phát hiện chiếu xạ đối với thảo mộc và gia vị bằng cách sử dụng kết hợp kỹ thuật lọc huỳnh quang bề mặt trực tiếp (DEFT) với đếm đĩa vi sinh vật hiếu khí (APC). Kỹ thuật kết hợp DEFT/APC không đặc thù cho xử lý chiếu xạ, do đó kết quả dương tính thu được từ phương pháp này cần được kiểm tra và khẳng định lại bằng các phương pháp đã được chuẩn hóa [ví dụ TCVN 7412 (EN 1788), TCVN 7746 (EN 13751) để xác nhận việc xử lý chiếu xạ các mẫu thực phẩm nghi ngờ. Phương pháp này đã được thử nghiệm thành công trong các phép thử liên phòng thử nghiệm thực hiện trên một số loại thảo mộc và gia vị [1] đến [5]. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi. TCVN 4884 (ISO 4833), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 o C. TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và trong thức ăn chăn nuôi – Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật. 3. Nguyên tắc Phương pháp này dựa vào sự so sánh số đếm vi sinh vật hiếu khí (APC) với số đếm thu được từ kỹ thuật DEFT. Kỹ thuật APC cho biết số lượng vi sinh vật còn sống trong mẫu sau khi chiếu xạ, còn số đếm thu được từ kỹ thuật DEFT cho tổng số vi sinh vật có trong mẫu, kể cả những tế bào không còn sống. Sự khác nhau về kết quả đếm tổng số vi sinh vật giữa APC và DEFT trên các mẫu gia vị chiếu xạ ở các liều 5 kGy và 10 kGy nằm trong khoảng 3 đến 4 đơn vị log. Những sai lệch tương tự giữa hai kỹ thuật xác định này cũng có thể xảy ra do một số phương pháp xử lý thực phẩm khác, ví dụ xử lý nhiệt làm cho vi sinh vật bị chết dẫn đến kết quả xác nhận là dương tính. Một lượng mẫu nhất định được lọc qua màng lọc có sự hỗ trợ của áp suất giảm nhằm tập trung các vi sinh vật trên bộ lọc. Các vi sinh vật sẽ được nhuộm màu bằng chất tạo huỳnh quang, phẩm da cam acridin (AO) để tạo huỳnh quang màu cam hoặc cam-vàng khi chiếu sáng với ánh sáng xanh da trời tại bước sóng 450 nm đến 490 nm. Những vi sinh vật này sẽ được đếm dưới kính hiển vi huỳnh quang bề mặt để cho số đếm DEFT. Tuy nhiên, những vi sinh vật đã bị chết trước khi chiếu xạ chỉ phát huỳnh quang xanh lá cây nên không đếm được bằng phương pháp này. Bằng cách tiến hành song song, kỹ thuật đếm APC cũng được thực hiện từ một phần khác của cùng một mẫu thử nghiệm [6] đến [10]. 4. Thuốc thử 4.1. Yêu cầu chung Trong quá trình phân tích chỉ sử dụng những loại thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích. Tất cả các loại thuốc thử phải được khử trùng bằng cách lọc qua bộ lọc có cỡ lỗ 0,2 m m hoặc được hấp áp lực. 4.2. Dung dịch muối pepton 4.2.1. Thành phần Natri clorua 8,5 g Pepton 1,0 g Nước cất hoặc nước đã khử khoáng 1000 ml 4.2.2. Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trên trong nước. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH cuối cùng là 7,2 ± 0,2 ở 20 o C đến 25 o C, nếu cần. Khử trùng dung dịch 15 phút trong nồi hấp áp lực (5.13) ở nhiệt độ 121 o C ± 1 o C. Dịch pha loãng này có thể bền đến 2 tuần khi bảo quản trong lọ thủy tinh ở nhiệt độ từ 4 o C đến 6 o C. 4.3. Dung dịch đệm, pH 3,0 4.3.1. Dung dịch axit xitric, nồng độ c (C 6 H 8 O 7 .H 2 O) = 0,1 mol/l 4.3.1.1. Thành phần Axit xitric ngậm một phân tử nước 21 g Nước cất hoặc nước đã khử khoáng 1000 ml 4.3.1.2. Chuẩn bị Hòa tan axit xitric ngậm một phân tử nước trong nước. Dung dịch này có thể bền đến ba tháng khi được bảo quản trong bình thủy tinh vô trùng ở nhiệt độ từ 4 o C đến 6 o C. 4.3.2. Dung dịch natri hydroxit, c (NaOH) = 0,1 mol/l 4.3.2.1. Thành phần Natri hydroxit 4,0 g hoặc Dung dịch natri hydroxit, 1 mol/l 100 ml Nước cất hoặc nước đã khử khoáng 900 ml 4.3.2.2. Chuẩn bị Hòa tan natri hydroxit hoặc dung dịch natri hydroxit loãng trong nước. Dung dịch này có thể bền đến ba tháng khi bảo quản trong lọ thủy tinh ở nhiệt độ từ 4 o C đến 6 o C. 4.3.3. Dung dịch đệm hoàn chỉnh, pH 3,0 4.3.3.1. Thành phần Dung dịch axit xitric (4.3.1) 100 ml Dung dịch natri hydroxit (4.3.2) 54 ml 4.3.3.2. Chuẩn bị Trộn đều dung dịch axit xitric và natri hydroxit. Chỉnh pH đến 3,0 ± 0,2 bằng dung dịch axit xitric hoặc dung dịch natri hydroxit. Trước khi sử dụng, khử trùng dung dịch đệm qua màng lọc cỡ lỗ là 0,2 m m (5.3). Dung dịch này có thể bền đến 3 tuần khi bảo quản trong lọ thủy tinh ở nhiệt độ từ 4 o C đến 6 o C. 4.4. Dung dịch da cam acridin 4.4.1. Dung dịch đệm, pH 6,6 4.4.1.1. Thành phần Dung dịch axit xitric (4.3.1) 35,5 ml Dung dịch natri hydroxit (4.3.2) 100 ml 4.4.1.2. Chuẩn bị Trộn đều dung dịch axit xitric và dung dịch natri hydroxit. Chỉnh pH đến 6,6 ± 0,2 bằng dung dịch axit xitric hoặc dung dịch natri hydroxit. Trước khi sử dụng, khử trùng dung dịch đệm này bằng cách lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,2 m m (5.3). Dung dịch đệm này có thể bền đến 3 tuần khi bảo quản trong lọ thủy tinh ở nhiệt độ từ 4 o C đến 6 o C. 4.4.2. Dung dịch da cam acridin hoàn chỉnh 4.4.2.1. Thành phần Phẩm da cam acridin 0,025 g Dung dịch đệm, pH 6,6 (4.4.1) 100 ml 4.4.2.2. Chuẩn bị Hòa tan phẩm da cam acridin trong dung dịch đệm (4.4.1). Trước khi sử dụng, khử trùng dung dịch da cam acridin qua màng có cỡ lỗ 0,2 m m (5.3). Dung dịch này có thể bền đến 1 tuần khi bảo quản trong lọ thủy tinh màu nâu ở nhiệt độ từ 4 o C đến 6 o C. CHÚ THÍCH 1 Dung dịch da cam acridin đậm đặc có bán sẵn và được khuyến cáo về sự an toàn. CHÚ THÍCH 2 Vì phẩm da cam acridin là chất gây đột biến, cần đeo găng tay và mặt nạ sử dụng một lần khi cân phẩm màu này. 4.5. 2-Propanol 4.6. Triton® X-100 1 , dung dịch rửa 1% 4.6.1. Thành phần Triton® X-100 10 ml Nước cất hoặc nước đã khử khoáng 1000 ml 4.6.2. Chuẩn bị Trộn Triton X-100 với nước ấm (80 o C). Khử trùng dung dịch qua màng lọc cỡ lỗ 0,2 m m (5.3). Dung dịch này có thể bền đến 3 tuần khi bảo quản trong lọ thủy tinh ở nhiệt độ từ 4 o C đến 6 o C. 4.7. Tripton-Dịch chiết nấm men-Glucoza-Thạch (Thạch đếm đĩa) 4.7.1. Thành phần Tripton 5,0 g Dịch chiết nấm men 2,5 g Dextroza (Glucoza) 1,0 g Thạch (phụ thuộc vào sức đông của thạch 12 g đến 18 g Nước cất hoặc nước đã khử khoáng 1000 ml 4.7.2. Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô vào trong nước và đun đến sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH cuối cùng là 7,2 ± 0,2 ở 20 o C đến 25 o C, nếu cần. Khử trùng dung dịch 15 phút trong nồi hấp áp lực (5.13) ở nhiệt độ 121 o C ± 1 o C. 5. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm theo TCVN 6404 (ISO 7218) và các thiết bị, dụng cụ sau đây: 5.1. Dụng cụ lọc dịch mẫu qua màng Sử dụng dụng cụ lọc được làm bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Đáy bộ lọc cần phải làm bằng thủy tinh thiêu kết hoặc thép không gỉ có nhiều lỗ nhỏ dùng cho các bộ lọc có đường kính 25 mm (5.5). Thể tích thân bộ lọc tối thiểu là 10 ml. Dụng cụ lọc này được đặt thẳng đứng trên miệng bình tam giác có hút hoặc một ống góp manifold được nối với bơm nước hoặc bơm chân không có gắn kèm bộ phận điều áp. Trong quá trình lọc chân không khoảng 70 kPa. CHÚ THÍCH Việc sử dụng bơm nước sẽ không phù hợp nếu không điều chỉnh được áp suất dòng nước. 5.2. Phễu lọc, và bình hút thích hợp bằng thủy tinh để lọc khử trùng thuốc thử và dịch pha loãng. 5.3. Màng lọc, làm bằng este xenlulo hoặc tương đương, cỡ lỗ 0,2 m m, đường kính 30 và 47 mm để lọc khử trùng thuốc thử. 5.4. Màng lọc, bằng polypropylen, đường kính 25 mm, kích thước lỗ 10 m m, để lọc mẫu sơ bộ. 5.5. Màng lọc, bằng polycacbonat trắng, đường kính 25 mm, kích thước lỗ 0,6 m m để lọc dung dịch mẫu thử. 5.6. Giấy lọc nhanh vô trùng, để lọc mẫu gia vị. 5.7. Kính hiển vi huỳnh quang bề mặt Với ánh sáng thích hợp và có bộ lọc (450 nm đến 490 nm). 5.8. Bộ phận quang học, vật kính chìm độ phóng đại 100 lần, thị kính có độ khuyếch đại 10 lần (sử dụng ống khuyếch đại 1,25 lần sẽ có tổng độ khuyếch đại là 1250 lần). 5.9. Phiến kính hiển vi, ví dụ 76 mm x 26 mm. 5.10. Lamen, ví dụ 25 mm x 50 mm, có độ dày tùy thuộc vào yêu cầu của vật kính. 5.11. Dầu soi kính, không phát huỳnh quang, chỉ số khúc xạ từ 1,515 đến 1,518. 5.12. Thước đo giá kính hiển vi, có thang chia 0,01 mm, dùng để đo đường kính vi trường. 5.13. Nồi hấp áp lực, để khử trùng dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy. 5.14. Tủ sấy, để sấy khử trùng các dụng cụ thủy tinh. 5.15. Máy trộn, để trộn mẫu và dịch pha loãng. 5.16. Nồi cách thủy, để duy trì nhiệt độ thích hợp cho môi trường nuôi cấy. 5.17. Tủ ấm, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 30 o C ± 1 o C. 5.18. Lọ thủy tinh, có nắp vặn, dùng để bảo quản thuốc thử (DEFT). 5.19. Ống nghiệm, để chuẩn bị dãy pha loãng dung dịch mẫu thử (APC). 5.20. Pipet, dung tích 1 ml, 2 ml, 5 ml và 20 ml. 5.21. Đĩa petri, đường kính 90 mm (APC). 5.22. Máy đếm khuẩn lạc (APC). 5.23. Kẹp fooc-xep. 5.24. Thiết bị/dụng cụ tùy chọn dùng cho máy đếm DEFT bán tự động hoặc tự động Bao gồm bộ phận phân tích hình ảnh, máy quay video loại dành cho kính hiển vi, màn hình TV, bàn phím và máy in, kính hiển vi chỉnh tiêu cự (tự động), giá kính hiển vi nâng hạ (tự động). 6. Kỹ thuật lấy mẫu Lấy 200 g mẫu trong điều kiện vô trùng, đại diện cho sản phẩm cần thử nghiệm. 7. Cách tiến hành 7.1. Xử lý sơ bộ Hòa 5 g mẫu thử trong bình nón có chứa 45 ml dung dịch muối pepton (4.2) và khuấy trộn bằng cách lắc mạnh bình nón trong khoảng 30 giây. Lọc từng mẫu huyền phù qua giấy lọc nhanh vô trùng (5.6). Dịch lọc này là dung dịch mẫu thử cho các phép kiểm tra tiếp theo (dịch lọc này có độ pha loãng khoảng 10 -1 ). Sau khi lọc, xác định đếm DEFT và APC. Sử dụng muối pepton loãng phụ thuộc vào số lượng vi sinh vật ước tính có trong mẫu gia vị để chuẩn bị các phiến kính DEFT có độ pha loãng 10 -1 và/hoặc 10 -2 từ dung dịch mẫu thử nghiệm. Chuẩn bị dãy pha loãng dung dịch mẫu thử từ dịch lọc gia vị bằng cách sử dụng dung dịch pepton để xác định APC (7.5). 7.2. Màng lọc để chuẩn bị phiến kính cho DEFT Trước khi dùng, làm sạch màng lọc (5.1.) bằng cách lọc ba lần sử dụng Triton X-100 1% nóng (80 o C) đã được lọc khử trùng và tráng tháp lọc ba lần bằng nước sôi trước khi cho polycacbonat trắng vào trong tháp. Đặt giấy lọc polycacbonat (5.5) cỡ lỗ 0,6 m m vào thiết bị màng lọc (5.1) với mặt bóng hướng lên trên và đặt giấy lọc thô (5.4) cỡ lỗ 10 m m lên trên giấy lọc polycacbonat. Lọc 2 ml dịch mẫu thử qua bộ lọc trong tháp lọc. Lấy ra và loại bỏ giấy lọc thô cỡ lỗ 10 m m đặt ở bên trên giấy màng lọc polycacbonat trắng (5.5) trong khi máy bơm chân không vẫn chạy. Trong giai đoạn lọc này chỉ bật máy bơm chân không sau khi đã cho dịch lỏng lên tháp. Kiểm tra thêm, sử dụng 2 ml dung dịch muối pepton loãng (4.2) thay cho mẫu, dùng tháp lọc khác. Dịch lọc này sẽ được sử dụng làm mẫu đối chứng. Tráng cột lọc chứa các mẫu bằng cách lọc ba lần bằng nước sôi như mô tả ở trên. 7.3. Nhuộm màu và tráng màng lọc DEFT Chuyển 2,5 ml dung dịch da cam acridin (4.4) vào tháp lọc và để cho thấm đều vào màng lọc. Sau 2 phút bật máy bơm chân không và hút hết toàn bộ dung dịch nhuộm màu. Vẫn bật máy bơm chân không và tráng ngay màng lọc bằng 2,5 ml dung dịch đệm pH 3,0 (4.3). Cuối cùng tráng màng lọc bằng cách lọc nhanh với 2,5 ml 2-propanol (4.5). CHÚ THÍCH Điều quan trọng là cần tráng bằng isopropanol càng nhanh càng tốt để tránh làm mất màu các vi sinh vật đã được nhuộm. 7.4. Lắp ráp các phiến kính DEFT Tắt bơm chân không, dùng kẹp fooc-xep cẩn thận lấy giấy lọc polycacbonat ra để đến khô trong không khí. Nhỏ một giọt dầu soi kính (5.11) lên giữa tấm phiến kính hiển vi (5.9) và đặt giấy lọc polycacbonat hướng mặt bóng lên trên vào chính giữa giọt dầu. Nhỏ tiếp một giọt dầu soi kính nhỏ nữa vào chính giữa màng lọc. Đậy lamen (5.10) lên trên màng và giảm bớt lượng dầu bằng cách ép cẩn thận lamen vào phiến kính. Phiến kính DEFT đã sẵn sàng để kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang. CHÚ THÍCH Phiến kính này được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ khoảng 5 o C nhưng có giá trị đọc được trong khoảng thời gian không quá hai tháng. 7.5. Kỹ thuật đổ đĩa để xác định vi sinh vật hiếu khí còn sống (APC) Sau khi lọc và pha loãng (7.1), xác định APC trong vòng 15 phút bằng kỹ thuật đổ đĩa theo TCVN 4884 (ISO 4833). Cho 1 ml dung dịch mẫu thử có độ pha loãng thích hợp vào đĩa petri rỗng và trộn với khoảng 15 ml môi trường thạch đếm đĩa (4.7) (đã được làm nguội trước đến 47 o C ± 2 o C). Để yên và ủ các đĩa thạch với tư thế lật ngược ở nhiệt độ 30 o C ± 1 o C trong 72 giờ. 7.6. Đếm Kiểm tra các phiến kính DEFT dưới kính hiển vi huỳnh quang bề mặt (5.7) và đếm các đơn vị DEFT bằng mắt thường hoặc nếu có thể thì sử dụng máy phân tích hình ảnh để đếm tự động hoặc bán tự động (5.24). Nếu sử dụng máy đếm tự động thì máy phải được đặt chương trình để đếm được các tế bào phát quang màu da cam và màu vàng cam. Các kết quả sẽ được quy đổi về số vi sinh vật trên một gam mẫu gia vị ban đầu được mô tả trong điều 8. Nhỏ một giọt dầu soi kính (5.11) lên lamen. Đặt phiến kính DEFT dưới kính hiển vi huỳnh quang. Kiểm tra việc chuẩn bị bằng vật kính dầu 100 x (5,8). Đếm các đơn vị DEFT các vi sinh vật phát huỳnh quang màu cam hoặc vàng cam trong vi trường chọn ngẫu nhiên theo bảng 1: Bảng 1 Số đơn vị DEFT trong một vi trường Số lượng vi trường (n) < 1="" đến=""> 20 21 đến 100 10 > 100 a a Pha loãng thêm dịch mẫu đã qua lọc sơ bộ và lặp lại cách tiến hành. Đếm một đơn vị DEFT những vi sinh vật riêng rẽ hoặc cả nhóm vi sinh vật (từng đốm hoặc từng chuỗi) xuất hiện cách nhau ít hơn hoặc tương đương với hai lần đường kính nhỏ nhất của vi sinh vật. Những đốm, chuỗi và những vi sinh vật riêng rẽ có cấu trúc khác đi và xuất hiện cách nhau ít hơn hai lần đường kính thì được tính thành hai đơn vị DEFT. Áp dụng những tiêu chí sau để đếm khuẩn lạc: - Khi đếm khuẩn lạc bằng mắt thường nên sử dụng thị kính có thước đo vuông góc hoặc thị kính được chia thành các ô vuông; - Những hạt phát huỳnh quang màu cam hoặc vàng cam nhưng nhìn không giống vi sinh vật thì không được đếm. - Nếu vi trường có những đơn vị DEFT màu xanh lá cây trong một phiến kính mà không phải là màu cam và vàng cam thì những đơn vị này không được đếm (nhưng lưu ý các vi sinh vật đã chết trước khi chiếu xạ). - Không nên đặt vật kính quá gần cạnh của phiến kính, vì việc đếm chỉ được thực hiện trong phạm vi diện tích màng lọc. - Lựa chọn vi trường một cách ngẫu nhiên, nhưng chú ý cho chúng nằm trên khắp bề mặt màng lọc. - Những vi sinh vật/đơn vị DEFT xuất hiện ở ngoài rìa vi trường chỉ được tính khi nhìn thấy toàn bộ vi sinh vật hoặc ít nhất nhìn thấy một vi sinh vật trong một đốm hay một chuỗi. - Để tránh phiến kính bị mất màu, chú ý rằng chứng chỉ được chiếu sáng trong thời gian cần để đếm. CHÚ THÍCH Thao tác đếm có thể thực hiện bán tự động sử dụng máy quay video, màn hình TV và bộ phận phân tích hình ảnh, hoặc tự động hoàn toàn sử dụng kính hiển vi lấy tiêu điểm tự động và có giá nâng hạ tự động (5.24). Việc chuẩn bị DEFT phải không có nhiều đáng kể (kết quả dương tính giả là kết quả tính cả những hạt, mảnh nhỏ mẫu, v.v..). 8. Đánh giá 8.1. Tính DEFT Tính số đếm DEFT, x , trên một gam mẫu gia vị, bằng công thức (1) và (2): (1) Với (2) Trong đó N là tổng số đơn vị DEFT đếm được trong n vi trường; n là số vi trường đếm được; M là hệ số tính được của kính hiển vi (xem phụ lục B); D là hệ số pha loãng mẫu ví dụ 5 g mẫu trong 45 ml muối pepton loãng tương đương với 10ml/g; F là diện tích tính bằng mm 2 ( p r 1 2 ) của màng lọc, được tính bằng cách đo đường kính ( r 1 = radian) của phần đáy tháp lọc; A là diện tích vi trường tính bằng mm 2 ( p r 2 2 ) được tính bằng cách đo đường kính ( r 2 = radian) của vi trường sử dụng thước đo giá kính có thang chia 0,01 mm (5.12). Đường kính của vi trường cũng có được tính theo tỷ lệ giữa số lượng vi trường và số lần khuyếch đại vật kính nhân (x) với độ khuyếch đại ống; V là thể tích mẫu, tính bằng mililit. Tổng số đếm DEFT trên gam mẫu gia vị được đưa ra với hai chữ số có nghĩa. Số đếm DEFT được quy đổi về giá trị logarit với hai chữ số có nghĩa. 8.2. Tính APC Đếm vi sinh vật hiếu khí còn sống (số đếm APC) trong đĩa petri sau khi đã qua ủ theo phương pháp đếm nêu trong TCVN 4884 (ISO 4833). Tính số lượng vi sinh vật trên gam mẫu gia vị sử dụng số lượng khuẩn lạc (cfu) thu từ các đĩa petri được chia bởi hệ số pha loãng và thể tích mẫu đã dùng. Số đếm APC trên gam mẫu gia vị được đưa ra với hai chữ số có nghĩa và được quy về giá trị logarit với hai chữ số có nghĩa. 8.3. Tính DEFT/APC Kết quả được biểu thị theo sự chênh lệch ( Dc ) giữa số đếm DEFT và số đếm APC sử dụng giá trị logarit. D c = A – B Trong đó A là số đếm log DEFT; B là số đếm log APC. Chênh lệch ³ 4,0 cho thấy mẫu đã qua xử lý chiếu xạ. 9. Hạn chế Hạn chế của phương pháp là khi có quá ít vi sinh vật trong mẫu thử (APC <> 3 cfu/g). Nếu mẫu đã xử lý phun xông hoặc xử lý nhiệt để khử nhiễm thì sự chênh lệch giữa số đếm DEFT/APC có thể tương tự như sự chênh lệch của các số đếm thu được sau khi chiếu xạ. Tuy nhiên, có thể phát hiện mẫu đã qua xử lý phun xông. Một số loại gia vị như đinh hương, quế, tỏi, mù tạt có chứa những thành phần ức chế vi sinh vật có thể làm giảm APC (kết quả dương tính giả). 10. Thẩm định Phương pháp kết hợp DEFT/APC được áp dụng cho các mẫu thảo mộc và gia vị, [2], [3]. Khi các mẫu hạt tiêu Gia-mai-ca, hạt tiêu, hạt bạch đậu khấu được chiếu xạ với liều tối thiểu là 10 kGy thì sự chênh lệch giữa DEFT và APC thường lớn hơn 6 đơn vị log đối với hạt tiêu Gia mai ca và hạt tiêu trắng, lớn hơn 4,5 đơn vị log đối với hạt tiêu đen và lớn hơn 7 đơn vị log đối với hạt bạch đậu khấu [2]. Khi các mẫu gia vị như hạt tiêu, ớt, bạch đậu khấu, quế, gừng và các mẫu thảo mộc như húng tây, kinh giới, húng quế và kinh giới ô (oregano) được đem phân tích sau khi chiếu xạ ở liều 5 kGy và 10 kGy, sự chênh lệch giữa DEFT và APC biến động tương ứng từ 3,9 đến 6,8 đơn vị log và từ 5,7 đến 7,5 đơn vị log [3]. Một cuộc nghiên cứu liên phòng thử nghiệm BCR [1] đã được tiến hành trên 192 mẫu bao gồm hạt tiêu Gia-mai-ca nguyên hạt, hạt tiêu đen nguyên hạt và bột hạt tiêu đen, hạt tiêu trắng nguyên hạt, bột ớt, húng quế thái nhỏ, kinh giới thái nhỏ, hạt bạch đậu khấu nghiền vỡ chưa qua chiếu xạ hoặc đã chiếu xạ ở liều 5 kGy và 10 kGy, và do tám phòng thử nghiệm phân tích. Giá trị chênh lệch trung bình giữa số đếm DEFT và APC chiếu xạ với liều 5 kGy và 10 kGy lần lượt tương ứng là 5,1 đơn vị log và 6,1 đơn vị log. Đối với tất cả các mẫu phân tích đã chiếu xạ, sự chênh lệch giữa số đếm DEFT và APC thường tăng lên ít nhất 3,5 đơn vị log trong khi đó đối với những mẫu chưa qua chiếu xạ sự chênh lệch này là không có ý nghĩa. Độ lệch chuẩn tương đối tái lập đối với sự chênh lệch này là 12,3 %, 19,9 % và 20,7 % tương ứng với liều chiếu xạ 10kGy, 5kGy và đối với các mẫu chưa chiếu xạ cho thấy sự biến động giữa các phòng thử nghiệm là chấp nhận được. Khả năng kết luận nhẩm những mẫu chưa chiếu xạ là đã qua chiếu xạ (kết quả dương tính giả) sử dụng giới hạn 4,0 đơn vị log là thấp [1]. Mặt khác, giới hạn 4,0 đơn vị log đôi khi cho những kết quả âm tính giả. Điều này đã xảy ra đối với mẫu húng quế [1] và [11]. 11. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất những thông tin sau đây: a) Thông tin cần thiết để nhận dạng mẫu; b) Viện dẫn tiêu chuẩn này; c) Ngày lấy mẫu và qui trình lấy mẫu (nếu biết); d) Ngày nhận mẫu; e) Ngày thử nghiệm; f) Kết quả; g) Những điểm cụ thể quan sát được trong quá trình thử nghiệm; h) Những thao tác không được quy định trong phương pháp này hoặc những điều được coi là tùy ý có thể ảnh hưởng đến kết quả; i) Những khuyến cáo kiểm tra thêm đối với mẫu, nghĩa là khẳng định kết quả sàng lọc sử dụng phương pháp cụ thể trong trường hợp kết quả DEFT/APC dương tính. PHỤ LỤC A (tham khảo) THÔNG TIN THÊM VỀ VIỆC ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP Phương pháp này đã được thử nghiệm các loại thực phẩm khác nhau như thịt, sữa, hải sản và gia cầm [4], [6], [7], [8], và [10]. PHỤ LỤC B (Tham khảo) VÍ DỤ THỰC NGHIỆM VỀ CÁCH TÍNH HỆ SỐ KÍNH HIỂN VI Hệ số kính hiển vi M được tính theo công thức (2), xem điều 8. M được quy định đối với từng phòng thử nghiệm và phụ thuộc vào thiết bị lọc (5.1) và thiết bị dùng cho kính hiển vi (5.7 và 5.8). Ví dụ, nếu như: F là 201 mm 2 A là 0,0201 mm 2 , và V là 2,0 ml Thì: PHỤ LỤC C (Tham khảo) SƠ ĐỒ CÁCH TIẾN HÀNH THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO TCVN 7412 (EN 1788), Thực phẩm – Phát hiện thực phẩm chiếu xạ bằng phương pháp nhiệt phát quang đối với loại có thể tách khoáng silicat. TCVN 7746:2007 (EN 13751:2002) Thực phẩm – Phát hiện chiếu xạ bằng phương pháp đo cường độ phát quang do kích thích ánh sáng [1] Wirtanen, G., Sjửberg, A-M., Boisen, F, and Alanko, T.: Microbiological Screening method for Indication of Irradiation of Spices and Herbs: A BCR Collaborative Study. Journal of AOAC International, 1993, 76, 674-681. [2] Sjoberg, A-M., Manninen, M., Pinnioja, S. and Họrmọlọ, P.Z.: Methods for detection of irradiation of spices. Zeitsch. Lebensm. Unters. Forsch., 1990, 190, 99-103. [3] Manninen, M. and Sjoberg, A.-M.: Evaluation of a microbiological method for detection of irradiation of spices. Zeitsch. Lebensm. Unters. Forsch., 1991, 192, 226-229. [4] Wirtanen, G. and Sjoberg, A-M.: A microbiological method (DEFT/APC) for the identification of irradiation of spices and seafood.: Recent Advances on detection of irradiated food. Edited by LeonardĂ, M., Raffi, J.J., and Belliardo, J.-J. BCR-Information. 1993, Luxembourg: Commission of the European Communities, 1993, (Report EUR/14315/en), 25-34. [5] Boisen, F. and Leth, T.: Screening of imported spices for irradiation using the combined DEFT/APC method. Internal report CLA 1993.2. (Danish version). Published by the Danish National Food Agency, 1993. [6] Betts, R. P., Farr, L., Bankes, P. and Stringer, M.F.: Detection of irradiated foods using the Direct Epifluorescent Filter Technique. Journal of Applied Bacteriology, 1988, 64, 329-335. [7] Boisen, F., Skovgaard, N., Ewald, S., Olsson, G. and Wirtanen, G.: Quantitation of Microorganisms in Raw Minced Meat using the Direct Epifluorescent Filter Technique: NMKL Collaborative Study. Journal of AOAC International, 1992, 75, 465-473. [8] Boisen, F.: Nordic Committee on Food Analysis (NMKL) standard, no. 137. Bacterial count. Determination by Direct Epifluorescent Filter Technique (DEFT) in raw minced meat, 1990. [9] Pettipher, G.L.: The direct epifluorescent filter technique for the rapid enumeration of micro-organisms.Research Studies Press LTD. 1983. [10] Copin, M-P., Jehanno, D. and Bourgeois C.M.: Detection of irradiated deepfrozen foodstuffs by comparison of DEFT and APC counts. Journal of Applied Bacteriology, 1993, 75, 254-258. [11] Hammerton, K.M. and Banos. C.: Detection of irradiated spices with a microbiological method, DEFT/APC method: Detection Methods for Irradiated Foods – Current Status. Edited by McMurray, C.H., Stewart, E.M., Gray, R., and Pearce, J. Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, 1996, 392-396. 1 Trixon® X-100 là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin đưa ra để thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và CEN không ấn định phải sử dụng sản phẩm này.