TCVN189:1993

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 189:1993 về tinh dầu - phương pháp thử TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 189:1993 Soát xét lần 1 TINH DẦU - PHƯƠNG PHÁP THỬ Essential oil - Method of test 1. LẤY MẪU THỬ VÀ CHUẨN BỊ MẪU 1.1 Khái niệm 1.1.1 Chất lượng tinh dầu được xác định trên cơ sở chất lượng mẫu trung bình của lô hàng 1.1.2 Lô hàng đồng nhất là một lượng sản phẩm cùng loại, cùng hạng chất lượng, sản xuất ở cùng thiết bị lắng, đựng trong cùng một loại bao bì, được giao nhận cùng một lần và không lớn hơn 500 đơn vị bao gói. 1.1.3 Mẫu ban đầu là lượng mẫu lấy ở một đơn vị bao gói (ở mỗi thùng, can hoặc ở mỗi chai trong một kiện). 1.1.4 Mẫu chung là lượng mẫu tập hợp từ tất cả các mẫu ban đầu được lấy từ lô hàng tinh dầu. 1.1.5 Mẫu trung bình được thành lập từ mẫu chung để xác định các chỉ tiêu chất lượng của lô hàng tinh dầu hoặc để lưu 1.2 Tiến hành lấy mẫu 1.2.1 Dụng cụ lấy mẫu và đựng mẫu - Đũa thủy tinh; - Ống hút; - Cốc đong (với các cỡ dung tích phù hợp); - Lọ đựng mẫu dung tích 500 ml, nút lie hoặc nút thủy tinh được bọc bằng plastic. 1.2.2 Lấy ngẫu nhiên các đơn vị bao gói được chỉ định lấy mẫu ở các vị trí khác nhau trong lô, số đơn vị bao gói được chỉ định lấy mẫu theo quy định trong bảng 1. Số lượng đơn vị bao gói của lô hàng Số lượng đơn vị bao gói lấy mẫu Từ 1 đến 5 Từ 6 đến 100 Từ 101 đến 300 Từ 301 đến 500 Lấy tất cả Lấy 5 đơn vị và 5% số đơn vị trong lô Lấy 8 đơn vị và 3% số đơn vị trong lô Lấy 15 đơn vị và 1% số đơn vị trong lô 1.2.3 Lấy mẫu ban đầu a) Lấy ở thùng hoặc can: Mở thùng hoặc can, quan sát mức độ lắng cặn hoặc tạp chất, dùng đũa thủy tinh khuấy đều và dùng ống hút lấy 100 ml ở vị trí giữa của mỗi thùng chứa. Trong trường hợp lô hàng quá nhỏ, cần tăng khối lượng mẫu ban đầu sao cho khối lượng mẫu chung không nhỏ hơn 2000 ml. b) Lấy mẫu ở các hòm hoặc kiện: Mở hòm, quan sát dạng bên ngoài của các chai có trong hòm, tùy theo số lượng chai đóng trong hòm để quyết định số lượng chai lấy mẫu nhưng không ít hơn 2 chai. Lắc đều tinh dầu chứa trong chai, dùng ống hút lấy 50 ml tinh dầu ở mỗi chai. Trong trường hợp lô hàng quá nhỏ, cần tăng khối lượng mẫu ban đầu sao cho khối lượng mẫu chung không nhỏ hơn 2000 ml. Chú thích: Nếu tinh dầu bị đông đặc cần hóa lỏng bằng phương pháp gia nhiệt ở nhiệt độ thích hợp với từng loại tinh dầu cụ thể. (Không lớn hơn mẫu 25 0 C). 1.2.4 Lập mẫu chung Tập trung tất cả các mẫu ban đầu lấy được từ các đơn vị bao gói vào cốc đong có dung tích phù hợp, dùng đũa thủy tinh trộn đều, ta được mẫu chung của lô hàng có khối lượng không nhỏ hơn 2000 ml. Cần xem xét độ đồng nhất của tất cả các mẫu ban đầu trước khi lập mẫu chung. 1.2.5 Lập mẫu trung bình Lập 2 mẫu trung bình từ mẫu chung đã trộn kỹ bằng cách rót vào hai chai chứa mẫu dung tích mỗi chai 500 ml, nút kín và dán nhãn với nội dung: - Tên cơ sở có lô hàng; - Tên sản phẩm và hạng chất lượng; - Số ký hiệu và khối lượng lô hàng; - Địa điểm và thời gian lấy mẫu; - Người lấy mẫu. Một mẫu trung bình được gửi tới phòng thí nghiệm để đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của lô hàng. Một mẫu được lưu tại cơ quan lấy mẫu, thời gian lưu mẫu theo sự thỏa thuận của các bên hữu quan. Mẫu trung bình phải được lưu giữ hoặc vận chuyển trong các điều kiện sao cho không ảnh hưởng tới chất lượng của mẫu. 1.3 Chuẩn bị mẫu 1.3.1 Dụng cụ thiết bị và hóa chất - Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ gần với điểm đông đặc của một số tinh dầu; - Natri hoặc magie sunphat khan, trung tính đã sấy khô tới khối lượng không đổi, nghiền nhỏ và đựng trong lọ nút mài; - Bình tam giác, cốc lọc có dung tích phù hợp 1.3.2 Nếu mẫu ở trạng thái lỏng ở nhiệt độ bình thường, rót mẫu vào các bình tam giác khô, sạch sao cho lượng tinh dầu không vượt quá 2/3 dung tích bình. Cho thêm bột natri hoặc magie sunphat khan với khối lượng tương ứng 15% khối lượng tinh dầu và thỉnh thoảng lắc đều trong khoảng 2h. 1.3.3 Nếu mẫu ở trạng thái đặc hoặc đông đặc một phần ở nhiệt độ thường, cần hóa lỏng mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ thích hợp. Khi sấy cần nới lỏng nhưng không mở nút, mẫu có thể được lọc trong tủ sấy, sau đó rót mẫu vào các bình tam giác khô sạch và đã sấy ở nhiệt độ cần thiết với lượng mẫu không vượt quá 8 dung tích bình cho thêm bột natri hoặc magie sunphat khan với một lượng bằng khoảng 15% khối lượng mẫu, thỉnh thoảng lắc đều trong khoảng 2h. Trong quá trình bảo quản để phân tích, mẫu cần được giữ ở nhiệt độ thấp nhất mà vẫn duy trì mẫu ở trạng thái lỏng. 1.3.4 Mẫu đã được chuẩn bị, cần được phân tích ngay hoặc bảo quản trong các bình kín, khô sạch ở nơi thoáng mát. 1.3.5 Các phép xác định ở 20 0 C như tỷ trọng, chỉ số khúc xạ, độ hòa tan trong etanol… phải được tiến hành trong môi trường không khí có nhiệt độ gần với nhiệt độ xác định. 2. XÁC ĐỊNH ĐỘ TRONG, MÀU SẮC VÀ MÙI VỊ CỦA TINH DẦU 2.1 Dụng cụ và điều kiện thử - Điều kiện và dụng cụ cảm quan theo TCVN; - Ống nghiệm thủy tinh trong suốt đường kính 20 - 25 mm dung tích khoảng 30ml; - Cân kỹ thuật; - Ống hút; - Giấy thấm; - Đường kính. 2.2 Xác định độ trong và màu sắc Dùng ống hút lấy 20 ml mẫu cho vào ống nghiệm khô, sạch, trong suốt (2.1). Dùng mắt quan sát độ trong và màu sắc của tinh dầu. 2.3 Xác định vị Cân khoảng 1g đường kính cho vào chén thử khô, sạch. Nhỏ vài giọt nước tinh dầu vào chén, trộn đều, dùng lưỡi xác định vị của hỗn hợp đó. 2.4 Xác định mùi Nhỏ vài giọt tinh dầu lên giấy thấm khô, sạch. Dùng mũi xác định mùi của tinh dầu, cứ 15 phút xác định một lần, khoảng 4-5 lần. 3. XÁC ĐỊNH TỈ TRỌNG 3.1 Tỉ trọng của tinh dầu là tỉ số của khối lượng tinh dầu ở 20 0 C với khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 20 0 C. 3.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất - Bỉnh tỉ trọng dung tích 50 ml; - Nhiệt kế bách phân, bầu thủy ngân và vạch chia tới 0,1 0 C; - Cân phân tích, chính xác đến 0,2mg; - Phễu thủy tinh có cuống phễu nhỏ; - Giấy lọc định tính, một số được cắt thành giải có thể cho vào cổ bình tỉ trọng; - Tủ sấy; - Môi trường điều nhiệt có thể duy trì nhiệt độ nước ở 20± 0,5 0 C; - Nước cất TCVN; - Axeton, ete hoặc etanol, TKPT; - Hỗn hợp sunfocromic, chuẩn bị như sau: Hòa tan 60g kalibicromat trong 100ml axit sunfuric đậm đặc (H 2 SO 4 ). 3.3 Tiến hành thử 3.3.1 Chuẩn bị bình tỉ trọng Bình tỉ trọng được rửa sạch bằng hỗn hợp sunfocromic, tráng kỹ bằng nước cất và súc lại bằng axeton, ete hặc etanol, làm khô bằng cách thổi vào bình một luồng không khí khô, nóng hoặc sấy nhẹ ở 70 - 80 0 C tới khối lượng không đổi. Cân khối lượng của bình và nút chính xác tới 0,0002g. 3.3.2 Xác định khối lượng của nước cất Rót nhẹ nước vào bình cao hơn vạch mức một chút, tránh không tạo bọt khi rót. Ngâm bình vào môi trường điều nhiệt đã duy trì ở 20 0 ± 0,5 0 C ngập tới cổ lọ trong 30 phút tới khi nhiệt độ của nước trong bình đạt 20 0 ± 0,5 0 C. Dùng các giải giấy thấm hút bớt nước trong bình tới đúng vạch mức và thấm khô các giọt nước bám ở thành trong cổ bình, lau khô cổ bình và đậy nút. Lấy bình ra khỏi môi trường điều nhiệt, lau khô và cân nhanh chính xác đến 0,0002g. Sau đó đổ nước và làm khô bình tỉ trọng như 3.3.1. 3.3.3 Xác định khối lượng của tinh dầu Tiến hành như 3.3.2 nhưng thay nước cất bằng tinh dầu ta xác định được khối lượng của bình và tinh dầu ở 20 0 ± 0,5 0 C. 3.4 Tính kết quả Tỉ trọng của tinh dầu ở 20 0 C ( ) được tính theo công thức: = Trong đó: m - khối lượng bình tỉ trọng, g; m 1 - khối lượng bình tỉ trọng và nước ở 20 0 C, g; m 2 - khối lượng bình tỉ trọng và tinh dầu ở 20 0 C, g. Kết quả là trung bình cộng của hai lần xác định liên tiếp có sai lệch giá trị không lớn hơn 0,001 và được làm tròn tới số thập phân thứ tư. 4. XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ KHÚC XẠ 4.1 Chỉ số khúc xạ được xác định ở 20 0 C theo phương pháp đo góc giới hạn bằng khúc xạ kế. 4.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất - Khúc xạ kế kiểu Abbe hoặc kiểu khác có đèn natri hay các bộ phân bổ chính triệt tiêu hiện tượng tán sắc và cho phép đọc được chỉ số khúc xạ từ 1,3000 đến 1,7000 với độ chính xác ± 0,0002; - Bông hút nước hay vải mầu sạch, khô; - Ete hoặc axeton TKPT; - Nước cất. 4.3 Tiến hành xác định Cho dòng nước chảy qua máy để duy trì máy ở 20 0 C. Tiến hành hiệu chỉnh máy trước khi đo theo hướng dẫn cụ thể của từng loại máy. Mở hộp lăng kính, dùng bông tẩm axeton hoặc exton lau kỹ lăng kính và thấm khô bằng vải mềm hoặc bông thấm nước. Nhỏ 2 - 3 giọt tinh dầu lên mặt lăng kính mờ phía dưới và áp vào lăng kính bên trên. Khi nhiệt kế của khúc xạ kế chỉ 20 0 C, nhìn vào thị kính, chỉnh hiện tượng tán sắc nếu có rồi từ từ xoay bộ lăng kính đưa ranh giới giữa hai miền sáng và tối cắt đúng giao điểm của vạch. Đọc chỉ số khúc xạ ở ngang vạch chuẩn. Xác định lại vị trí và đọc chỉ số ba lần. Chỉ đọc chỉ số khúc xạ khi nhiệt độ đã ổn định. Kết quả là trung bình cộng của ba giá trị đọc được và làm tròn tới số thập phân thứ tư. Khi đo chỉ số khúc xạ của tinh dầu ở nhiệt độ khác và cần tính chuyển về chỉ số khúc xạ ở nhiệt độ nhất định, dùng công thức sau: N t D = N t’ D + 0,0004 (t ’ – t) Trong đó: N t D - là chỉ số đọc được ở nhiệt độ “t”; t – nhiệt độ cần tính chuyển. 5. XÁC ĐỊNH GÓC QUAY CỰC 5.1 Góc quay cực được xác định ở nhiệt độ phòng. 5.2 Dụng cụ và vật liệu: - Phân cực kế với độ chính xác ± 0,03 0 và được hiệu chỉnh để cho giá trị 0 0 và 110 0 với nước cất; - Nguồn sóng đèn natri hoặc thiết bị cho ánh sáng với bước sóng 589,3 ± 0,3 mm; - Ống đo hình trụ dài 100 ± 0,5 mm, đối với các loại tinh dầu sáng mầu và có góc quay cực thấp có thể dùng ống dài 200 ± 0,5mm. Đối với các loại tinh dầu sẫm mầu có thể dùng ống dài 50 ± 0,05mm hoặc 10 ± 0,05mm; - Nước cất. 5.3 Tiến hành xác định 5.3.1 Điều chỉnh máy: Đổ nước cất vào đầy ống của phân cực kế, chú ý tránh có bọt khí ở bên trong. Vặn chặt nắp đậy của ống. Đặt ống vào máng của phân cực kế đã bật đèn sáng, xác định sai lệch của điểm 0 0 so với điểm 0 của du xích. 5.3.2 Đo góc quay cực: Lấy ống trong máy ra, tháo nước đi và lau ống cho thật khô. Đổ tinh dầu vào đầy ống và tiếp tục đo như khi điều chỉnh máy. Kết quả thu được cần hiệu chỉnh với độ sai lệch của điểm 0 0 so với điểm 0 của du xích để được giá trị đúng của góc quay cực. Tiến hành đo ít nhất 3 lần với cùng mẫu thử, kết quả là trung bình cộng của ba lần xác định liên tiếp có sai lệch giá trị không vượt quá 0,08 0 . Sai số của phép đo không được vượt quá ± 0,17 0 . Chú thích: 1) Khi đo bằng ống có kích thước khác 100mm thì tính góc quay cực theo công thức: Trong đó: a - giá trị của góc quay cực đo được; l – chiều dài của ống đo đã sử dụng, dm. 2) Trong trường hợp không có ống đo với kích thước thích hợp với mẫu của tinh dầu thì dùng rượu 90% pha loãng và đo góc quay cực của dung dịch đã pha loãng rồi tính góc quay cực của tinh dầu theo công thức: Trong đó: a 1 - góc quay cực của dung dịch; p – nồng độ của dung dịch tính bằng mililit tinh dầu chứa trong 100 ml dung dịch; l – chiều dài của ống, dm. 3) Sau khi đo được góc a , để xác định hướng quay cực là phải hay trái, dùng một ống đo khác có chiều dài bằng nửa chiều dài ống cũ và đo góc a với tinh dầu như trước hoặc dùng ống cũ nhưng đo với tính dầu có độ pha loãng gấp đôi bằng rượu 90 – 95% góc quay cực a ’ đo được phải bằng . Hướng của góc đó là hướng quay cực cần xác định. 6. XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐÔNG 6.1 Nguyên tắc: làm lạnh sâu từ từ tinh dầu, quan sát sự biến đổi của nhiệt độ khi tinh dầu chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn. 6.2 Dụng cụ và vật liệu - Băng điểm kế gồm các bộ phận sau: (hình 1); . Ống thử (a) đường kính 15 - 20 mm – dài 150 – 180 mm với nút có 2 lỗ để luồn nhiệt kế và que khuấy. . 2 nhiệt kế (t và t ’ ) chia độ đến 0,1 0 C; . Que khuấy (k) . Ống thử (b) đường kính 30 – 40 mm – dài 130 - 150 mm có nút mềm; . Cốc đong dung tích 1000 ml – cao 150 mm (c) - Hỗn hợp làm lạnh: nước, đá hoặc nước đá muối. 6.3 Tiến hành xác định 6.3.1 Xác định sơ bộ (nếu cần) - Làm nóng chảy tinh dầu trên bếp cách thủy, lấy khoảng 10 ml vào ống thử. Làm lạnh và khuấy nhẹ tinh dầu bằng nhiệt kế - ghi nhiệt độ khi tinh dầu đã đông đặc. Ta có điểm đông dự kiến. 6.3.2 Xác định điểm đông Lấy khoảng 10 ml tinh dầu (nếu đặc thì phải làm nóng chảy trên bếp cách thủy cho vào ống thử (a) đã khô sạch cho nhiệt kế (t) và que khuấy (k) vào ống nút đậy sao cho bầu thủy ngân ở giữa khối tinh dầu và cách đáy ống ít nhất 5cm. Đặt ống (a) vào ống (b) qua nút của ống (b) sao cho 2 ống không chạm nhau. Muốn truyền nhiệt nhanh có thể đổ vào ống (b) một ít cồn 90%. Đặt tất cả vào cốc vại (c) chứa hỗn hợp làm lạnh có nhiệt độ thấp hơn 5 0 C so với nhiệt độ đông đặc dự kiến. Theo dõi nhiệt kế (t), nhiệt độ hạ từ từ và xuống thấp quá điểm đông dự kiến 2-3 0 C, thì bắt đầu khuấy liên tục và cọ que khuấy vào thành ống để kích thích sự đông. Cách 30 giây lại đọc nhiệt độ một lần, lúc đầu nhiệt độ hạ thấp dần sau đó tăng lên nhanh đạt tới cực đại, giữ nguyên một lúc rồi hạ xuống từ từ. Nhiệt độ cực đại đó là điểm đông đặc. Có thể cho một vài tinh thể nhỏ tinh dầu vào để tránh hiện tượng chậm đông. Hình 1 - Băng điểm kế Sau khi xác định được điểm đông, làm tinh dầu chảy ra và xác định tại điểm đông lần thứ 2. Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 lần xác định có sai lệch giá trị không lớn hơn 0,2 0 C. 7. XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN SÔI 7.1 Nguyên tắc: dùng phương pháp cất để xác định nhiệt độ sôi của chất lỏng là khoảng từ nhiệt độ bắt đầu sôi đến nhiệt độ kết thúc sôi. 7.2 Dụng cụ và vật liệu cần dùng (hình 2) - Bình cầu dung tích khoảng 50 ml, cổ bình dài 125 mm, đường kính trong của cổ là 16 ± 1mm, bình có một ống ngang dài khoảng 100mm ở lưng chừng cổ bình và chúc xuống theo một góc 75 ± 2 0 so với cổ bình; - Ống đo dung tích 50 ml, có khắc vạch; - Nút của bình cầu có lỗ để cắm nhiệt kế; - Ống làm lạnh thẳng dài khoảng 600 mm, đầu cuối bẻ theo một góc 105 0 ; - Tấm amiăng vuông mỗi cạnh dài 12cm, dày 0,3cm, giữa có một lỗ thủng tròn đường kính 2 – 3cm; - Bếp điện điều khiển được nhiệt độ; - Giá đỡ 02 cái; - Đá bọt sạch hay ống mao quản bằng thủy tinh hàn kín một đầu; - Nhiệt kế chia tới 0,5 0 C. Hình 2 - Dụng cụ để xác định giới hạn sôi 7.3 Tiến hành thử Lắp dụng cụ cất theo hình 2, rót 50 ml tinh dầu vào bình cầu, tránh để tinh dầu dính vào cổ bình và ống của bình. Nút bình cầu bằng nút có nhiệt kế sao cho bầu thủy ngân của nhiệt kế ở dưới miệng ống ngang 1cm. Để tránh sôi đột ngột, cho thêm vào bình cầu vài mảnh đá bọt sạch hay ống mao quản thủy tinh. Cho nước vào ống làm lạnh và tiến hành đun sôi tinh dầu. Sau khi cất được 5 giọt, đọc, ghi nhiệt độ sôi đầu của tinh dầu. Điều chỉnh nhiệt sao cho mỗi phút cất chúng 4 – 5ml tinh dầu. Tiếp tục đun cho đến khi cất được 95% lượng tinh dầu. Đọc và ghi nhiệt độ sôi cuối của tinh dầu. 8. XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ AXIT VÀ HÀM LƯỢNG AXIT 8.1 Nguyên tắc: dựa trên sự trung hòa axit tự do trong tinh dầu bằng dung dịch kiềm chuẩn. lượng kiềm đã dùng biết khối lượng phân tử của axit, tính ra được hàm lượng axit. Chỉ số axit là lượng mg kali hydroxit cần để trung hòa axit trong 1g tinh dầu. 8.2 Dụng cụ và thuốc thử - Bình cầu để xà phòng hóa dung tích 100 - 200 ml, có ống làm lạnh bằng không khí dài 1m, đường kính 1 cm (ống này chỉ dùng để xác định chỉ số este); - Pipet 5 ml; - Buret hoặc microburet; - Cân phân tích; - Phenolphtalein dung dịch 0,2% trong etanol (hoặc đỏ phenol khi tinh dầu có chứa nhiều phenol); - Kali hydroxit dung dịch 0,1N và 0,5N trong etanol (chuẩn bị trước khi dùng 24 giờ); - Etanol 95% thể tích ở 20 0 C, đã được trung hòa bằng KOH 0,1N trong etanol. 8.3 Tiến hành thử Cân 2g tinh dầu (chính xác đến 0,005g) vào bình cầu xà phòng hóa. Thêm vào đó 10 ml etanol và 5 giọt chỉ thị phenolphtalein (hoặc đỏ phenol) chuẩn độ bằng dung dịch kali kydroxit 0,1N trong etanol cho đến khi xuất hiện màu hồng vững bền trong khoảng 30 giây. Ghi số ml kali hydroxit tiêu tốn và giữ bình lại để xác định chỉ số este (theo 9). 8.4 Tính kết quả Chỉ số axit (X 1 ) được tính theo công thức: Trong đó: V – lượng dung dịch kali hydroxit 0,1N đã dùng để chuẩn độ, ml; M – khối lượng mẫu thử, g; 5,61 – lượng kali hydroxit có trong etanol, tính bằng mg. Hàm lượng axit theo phần trăm (X 2 ) tính bằng công thức: Trong đó: M - khối lượng phân tử axit; V,m – giống như trên. Chú thích: Nếu phải dùng quá 10 ml dung dịch rượu kali hydroxit 0,1N để chuẩn độ thì phải làm lại. Cân 1g tinh dầu hòa tan trong 10 ml etanol trung tính 95% ở 20 0 C và chuẩn độ bằng dung dịch kali hydroxit 0,5N trong rượu X 1­ và X 2 theo phần trăm tính bằng các công thức: ; Trong đó: 28 – lượng kali hydroxit có trong 1 ml dung dịch kali hydroxit đúng 0,5N trong rượu, tính bằng mg; V, M, m – xem ở trên. 9. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ESTE VÀ CHỈ SỐ ESTE 9.1 Nguyên tắc Xà phòng hóa este bằng dung dịch kali hydroxit trong etanol. Từ lượng kali hydroxit đã dùng, biết khối lượng phân tử của este, tính ra được lượng este. - Hàm lượng este tính theo phần trăm còn chỉ số este biểu thị số mg kali hydroxit cần để xà phòng hóa 1g tinh dầu. 9.2 Dụng cụ và thuốc thử. - Bình cầu để xà phòng hóa dung tích 100 – 200 ml có ống sinh hàn khí dài 1m, đường kính 1 cm (như bình ở phần xác định axit); - Buret; - Bếp cách thủy; - Kali hydroxit, dung dịch 0,1N và 0,5N trong etanol; - Axit sunfuric dung dịch 0,5N hay axit clohydric dung dịch 0,5N; - Etanol 95% ở 20 0 C đã được trung hòa bằng kali hydroxit trong cồn; - Phenol phtalein dung dịch 2% trong etanol; - Đỏ phenol (dùng khi tinh dầu có nhiều phenol). 9.3 Tiến hành thử: - Dùng buret cho 20 ml dung dịch kali hydroxit 0,5N vào bình cầu để xà phòng hóa có chứa lượng mẫu đã xác định chỉ số axit (theo 8) lắp ống sinh hàn khí và đun sôi nhẹ trong 1 giờ. - Cùng một lúc trong bình cầu khác kiểm tra song song một mẫu trắng gồm 10ml etanol và 20 ml dung dịch kali hydroxit 0,5N trong cồn. Đun xong, để nguội cho cả 2 bình mỗi bình 5 giọt chỉ thị mầu phenol phetalein 2% (hoặc đỏ phenol). Chuẩn độ bằng dung dịch axit sunfuric hay axit clohydric 0,5N. 9.4 Tính kết quả Chỉ số este (X 3 ) được tính bằng công thức: Trong đó: V – lượng dung dịch axit sunfuaric hay clohydric 0,5N đã dùng để chuẩn độ mẫu trắng, tính bằng ml; V 1 - lượng dung dịch axit sunfuaric hay clohydric 0,5N đã dùng để chuẩn độ mẫu thử, tính bằng ml; m – khối lượng mẫu, g; 28,05 – lượng kali hydroxit trong 1 ml dung dịch kali hydroxit đúng 0,5N. Hàm lượng este theo % (X 4 ) tính bằng công thức: Trong đó: M – khối lượng phân tử của este; V, V 1 , m – giống như trên. 10. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG RƯỢU TỰ DO 10.1 Nguyên tắc Dựa trên sự chuyển hóa rượu thành axetic este bằng cách đun nóng với anhydric axetic tách và xà phòng hóa este, rồi xác định phần trăm của rượu. 1. 2. Phương pháp này dùng cho rượu bậc 1 và bậc 2. 10.2 Dụng cụ và hóa chất - Bình axetyl hóa hình trái xoan 100 ml có ống làm lạnh khí dài 100 - 110 cm- có nút mài; - Bếp cách thủy; - Bếp cách cát- bếp điện; - Phễu chiết 250 ml; - Anhydric axetic 98 - 100%, TKPT; - Natri axetat, mới nung chảy và nghiền thành bột, TKPT; - Natri clorua, dung dịch bão hòa, TKPT; - Natrisunfat khan, TKPT; - Cacbon disunfua, TKPT; - Phenol phtalein dung dịch 2% etanol và các dụng cụ thuốc thử cần xác định chỉ số este (theo mục 9). 10.3 Tiến hành xác định 10.3.1 Axetyl hóa: Cho khoảng 10 ml tinh dầu đã được chuẩn bị (1.3), 15 ml anhydric axetic và 2g natri axetat vào bình axetyl hóa đun sôi nhẹ trong 2 giờ trên bếp cách cát, để nguội, qua làm lạnh khí, thêm vào đó 50 ml nước để phân hủy anhydric dư. Đun cách thủy trong 15 phút, lắc bình luôn trong khi đun. Để nguội, đổ dung dịch vào phễu chiết 250 ml. Tráng rửa bình axetyl hóa 2 lần bằng nước cất mỗi lần 10 ml và dồn tất cả nước vào phễu chiết để yên cho chất lỏng phân thành lớp. Gạn bỏ lớp axit ở dưới, rửa lớp dầu còn lại bằng 50 ml dung dịch natri clorua bão hòa và sau đó là bằng dung dịch natri cacbonat 2% trong nước muối bão hòa có chỉ thị là phenol phtalein cho đến khi màu hồng không mất đi. Cuối cùng rửa bằng 20 ml nước cất. Trong khoảng 15 phút, lắc nhiều lần tinh dầu đã axetyl hóa với mỗi lần là 3g natrisunfat khan để hút nước của tinh dầu. Thử lại bằng cách lấy một giọt tinh dầu nhỏ vào 10 giọt cacbon disunfua, không có vẩn đục chứng tỏ tinh dầu đã hết nước. Cuối cùng đem lọc. 10.3.2 Xà phòng hóa Cân chính xác đến 0,0005g, 2g tinh dầu đã axetyl hóa ở trên tiến hành xà phòng hóa và xác định chỉ số este như đã chỉ dẫn ở phần xác định chỉ số este (9) (dùng 40 ml dung dịch kali hydroxit 0,5N trong cồn để xà phòng hóa). 10.3.3 Tính kết quả Hàm lượng rượu tự do (X 5 ), tính theo phần trăm bằng công thức: Trong đó: E 1 – chỉ số este trước khi axetyl hóa (xác định ở mục 9); E - chỉ số este sau khi axetyl hóa n – số nhóm hydroxy của rượu 11. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG RƯỢU BẬC 3 (LINALOOL) BẰNG CLORUA AXETYL VÀ DIMETYLANILIN 11.1 Nguyên tắc Dùng clorua axetyl và dimetylanilin tác dụng với rượu bậc 3 (linalool) ở nhiệt độ thấp để este hóa hoàn toàn rượu một cách nhẹ nhàng, tránh mất nước của rượu bậc 3 như khi axetyl hóa bằng ahydric axetic. 11.2 Dụng cụ thiết bị và hóa chất. - Bình nón dung tích 100 ml có nút mài; - Phễu chiết 250 ml; - Tủ sấy hoặc bể điều nhiệt; - Dimetylanilin khan, TKPT (không lẫn monometylanilin); - Clorua axetyl, TKPT; - Anhydric axetic, dung dịch 5%; - Natri cacbonat, dung dịch 10%; - Nước đá và nước muối bão hòa; - Các dụng cụ và thuốc thử cần để xác định chỉ số este (9). 11.3 Tiến hành xác định Cho 10 ml tinh dầu vào bình nón 100 ml nút mài, làm lạnh bằng nước đá trong 10 phút. Cho thêm 20 ml dimetylanilin vào bình. Lắc đều, làm sạch bằng nước đá trong 15 phút. Sau đó thêm vào 8 ml clorua axetyl và anhydric axetic. Tiếp tục làm lạnh trong 10 phút. Để yên ở nhiệt độ phòng trong nửa giờ rồi để tủ sấy hoặc bể điều nhiệt ở 40± 1 0 C trong 16 giờ. Chuyển sang phễu chiết. Rửa 3 lần mỗi lần 75 ml nước ướp đá. Và 3 lần mỗi lần 25 ml axit sunfuric 5% để loại hết dimetylanilin tự do. Rửa tiếp bằng 10 ml dung dịch natri cacbonat 10% và 2 lần 50ml nước muối bão hòa và cuối cùng là 2 lần, mỗi lần 50 ml nước cất. Làm khô tinh dầu bằng cách lắc với natrisunfat khan, lọc. Cân 2g tinh dầu đã axetyl hóa như trên tiến hành xà phòng hóa và xác định chỉ số este (9). 11.4 Tính kết quả Hàm lượng rượu bậc 3 (linalool) (X 6­ ) tính bằng phần trăm theo công thức: Trong đó: m - lượng tinh dầu đã axetyl hóa, g; V - thể tích dung dịch axit sunfuaric hay axit clohydric 0,5N dùng để chuẩn độ mẫu trắng, ml; V 1 - thể tích dung dịch axit sunfuric hay axit clohydric 0,5N dùng để chuẩn độ mẫu thử đã cân, ml. Nếu tinh dầu có lẫn este linalyl axetat, hàm lượng linalool (X 7 ) tính theo phần trăm bằng công thức: Trong đó: E – hàm lượng este trong tinh dầu ban đầu, (%); m, V, V 1 – xem ở trên. Hoặc có thể tính theo công thức như xác định hàm lượng rượu tự do (10). 12. XÁC ĐỊNH ĐỘ HÒA TAN TRONG ETANOL. 12.1 Nguyên tắc Dùng etanol ở các nồng độ khác nhau để hòa tan tinh dầu. Ghi lượng etanol tối thiểu cần để hòa tan 1 ml tinh dầu ở 20 ± 0,5 0 C. 12.2 Dụng cụ và hóa chất: - Ống nghiệm so màu 20 ml có nút mài; - Pipet có chia vạch; - Buret 25 ml; - Etanol ở các nồng độ, 95% - 90% - 80% và 70% (bảng 3); - Natri clorua, dung dịch 0,0002N; - Bạc nitrat, dung dịch 0,1N; - Axit nitơric đậm đặc, TKPT; - Nước cất ở 20 0 C. Bảng 3 Etanol, % thể tích Thể tích nước cất ở 20% được thêm vào 100ml etanol 95% thể tích Tỷ trọng ở 20/20 70 39,1 0,8869 đến 0,8874 80 20,9 0,8605 – 0,8611 90 6,4 0,8303 – 0,8310 95 0 0,8124 – 0,8132 - Dung dịch trắng đục tiêu chuẩn được pha như sau: Lấy 50 ml dung dịch natri clorua 0,0002N thêm vào đó 0,5 ml dung dịch bạc nitrat (AgNO 3 ) 0,1N và 1 giọt axit nitric đậm đặc. Trộn đều hỗn hợp trong 5 phút và bảo quản ở nơi tránh ánh sáng. 12.3 Tiến hành xác định Dung môi và các dụng cụ thí nghiệm phải duy trì ở 20 ± 0,5 0 C. Hút 1ml tinh dầu cho vào ống nghiệm, từ buret nhỏ dần etanol có nồng độ xác định vào ống đựng tinh dầu được ngâm trong nước ở 20± 0,5 0 C, mỗi lần khoảng 0,5 ml. Đậy nút lại lắc nhẹ cho tan hết tinh dầu rồi lại tiếp tục ngâm vào nước 20± 0,5 0 C và nhỏ như trên cho đến khi thu được một dung dịch trong suốt. Ghi lượng etanol đã dùng. Lặp lại thí nghiệm với mỗi lần nhỏ là 0,2 ml etanol để có được thể tích etanol tiêu tốn chính xác. Nếu dung dịch thu được không trong suốt và đục trắng thì đem so sánh với dung dịch tiêu chuẩn. 13. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PHENOL 13.1 Phương pháp dựa trên phản ứng của phenol với kiềm để tạo thành phenolat hòa tan trong nước. 13.2 Dụng cụ và hóa chất - Bình cầu dung tích 100 hoặc 150 ml có cổ cao 150 mm đường kính 8 mm, có thang đo chia tới 0,1 ml; - Bình tam giác; - Pipet; - Bếp cách thủy; - Natri hydroxit, dung dịch 3% trong nước; - Axit tactric, dạng bột, TKPT; - Natri sunfat hoặc magie sunfat khan, TKPT. 13.3 Tiến hành xác định Lấy khoảng 10 g tinh dầu cho vào bình tam giác, dung tích 100 ml, thêm vào 0,2 ml axit tactric lắc kỹ. Sau đó thêm vào 2g magie sunfat hoặc natri sunfat đã sấy kiệt nước ở 180 0 C và nghiền nhỏ thỉnh thoảng lắc trong khoảng 2 giờ để làm mất nước. Để lắng trong hoặc lọc nếu cần thiết. Dùng pipet lấy 5ml tinh dầu trên cho vào bình cầu, thêm vào 50 ml dung dịch natri hydroxit 3%, để bình lên bếp cách thủy nóng trong 15 phút, thỉnh thoảng lắc đều, sau đó để nguội, cho thêm dung dịch natri hydroxit để đưa phần đầu không phản ứng lên phần cổ bình có chia độ. Gõ nhẹ vào cổ bình cho các hạt dầu còn lại nổi lên cổ bình. 13.4 Tính kết quả: Hàm lượng phenol (X 8 ) tính theo phần trăm thể tích theo công thức: Trong đó: V – thể tích tinh dầu không phản ứng, ml. 14. XÁC ĐỊNH PHẦN CÒN LẠI KHÔNG BAY HƠI 14.1 Dụng cụ: - Cân phân tích, chính xác đến 0,2 mg; - Cốc thủy tinh dung tích 50 ml; - Bếp cách thủy; - Bình hút ẩm. 14.2 Cách xác định Cân 5g tinh dầu chính xác đến 0,001 g trong một cốc thủy tinh dung tích 50 ml đã biết trước khối lượng. Làm bay hơi tinh dầu trên bếp cách thủy sôi cho đến khối lượng không đổi. Sau đó lau khô cốc và đặt trong bình hút ẩm cho nguội rồi đem cân với độ chính xác như trên. 14.3 Tính kết quả Hàm lượng phần còn lại không bay hơi (X 9 ) tính theo phần trăm khối lượng theo công thức: Trong đó: m – khối lượng tinh dầu dùng để xác định, g; m 0 – khối lượng cốc, g; m 1 – khối lượng cốc và phần còn lại không bay hơi, g. 15. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ALDEHYT VÀ XETON 15.1 Phương pháp natri sunfat (aldehyt cinnamic) Phương pháp này dựa trên phản ứng cộng giữa aldehyt hay xeton của tinh dầu với natri sunfat trung tính để cho một hợp chất cộng tan trong nước và trong dung dịch natri sunfit. Phần không phải aldehyt trong dầu tách riêng ra. Từ đó tính ra được lượng aldehyt hay xeton có trong dầu. 15.1.1 Dụng cụ và thuốc thử cần dùng - Pipet; - Bếp cách thủy; - Bình dung tích 150 ml, cổ bình có ghi từ 0 đến 6 ml và chia tới 0,1 ml; - Natri sunfit, dung tích bão hòa 40% mới pha; - Natri hydro sunfit, tinh khiết loại 1, dung dịch 30%, mới pha hay axit, dung dịch 1/2. - Phenolphthalein, dung dịch 1% trong rượu 95% ở 20 0 C. 15.1.2 Cách xác định Hút 10 ml tinh dầu cho vào bình dung tích 150 ml. Cho thêm vào bình 50 ml dung dịch bão hòa natri sunfit và 2 giọt chỉ thị màu phenolphtalein 1%. Để bình trên bếp cách thủy sôi và lắc. Khi xuất hiện màu hồng, nhỏ dung dịch natri hydro sunfit từng giọt một cho đến khi mất màu. Cứ để bình trên bếp cách thủy sôi và thỉnh thoảng lại lắc. Nếu không thấy xuất hiện màu hồng cho thêm vài giọt chỉ thị màu phenolphtalein và nếu vẫn không thấy xuất hiện màu hồng thì coi như được. Nếu còn thấy xuất hiện màu hồng lại cho thêm natri hydro sunfit cho đến khi mất màu hồng thì thôi. Lại tiếp tục làm như trên cho đến khi dù cho thêm vài giọt chỉ thị màu phenolphtalein dung dịch vẫn không có màu hồng trở lại. Để đảm bảo cho phản ứng thật hoàn toàn tiếp tục đun cách thủy trong 15 phút nữa. Sau đó đem bình ra và để nguội. Sau khi lớp dầu không phản ứng phân ly hoàn toàn với dung dịch cho dung dịch natri sunfit vào để lớp dầu nổi hoàn toàn lên cổ bình. 15.1.3 Tính kết quả Hàm lượng aldehyt hay xeton theo phần trăm (X 10 ) tính bằng công thức Trong đó: 10 – lượng tinh dầu lấy để xác định tính bằng ml; v – lượng tinh dầu không phản ứng tính bằng ml; Chú thích: Đối với tinh dầu có dưới 40% aldehyt hay xeton thỉ dùng bình nhỏ dung tích 100ml. 15.2 Phương pháp Oxim hóa bằng hydroxylamin clohydrat Phương pháp này dựa trên sự tạo thành oxim do tác dụng của hydroxylamin clohydrat với các hợp chất có nhóm cacbonyl, đồng thời có giải phóng ra một lượng tương đương axit clohydric theo phản ứng. Aldehyt và xeton tham gia trong phản ứng oxim hóa với những tốc độ khác nhau và trong những đều kiện khác nhau. 15.2.1 Dụng cụ và thuốc thử cần dùng Bình cầu để xà phòng hóa dung tích từ 100 đến 150 ml có ống làm lạnh bằng không khí dài 1m, đường kính 1 cm; Cân phân tích, chính xác đến 0,2 mg; Ống đo; Buret; Bếp cách thủy; Hydroxylamin clohydrat, dung dịch 0,5N trong etanol 60%, không có aldehyt. 15.2.2 Cách xác định và tính kết quả a) Xác định hàm lượng aldehyt (citral, citronnellel v..v..) Cân một lượng tinh dầu khan nước chính xác đến 0,0005g có chứa khoảng 0,4 – 0,8g aldehyt cho vào bình cầu để xà phòng hóa. Dùng ống đo rót vào bình 15 ml dung dịch hydroxylamin clohydrat 0,5N, đối với aldehyt có khối lượng phân tử thấp thì rót vào khoảng 20 - 25ml. Sau đó cho vào bình 8 – 10 giọt bromophenol xanh. Chuẩn độ ngay lượng axit clohydric thoát ra bằng dung dịch kali hydroxit 0,5N trong rượu cho đến khi dung dịch có màu trung tính của bromophenol (lục vàng). Sau đó để yên bình trong 1 giờ, nếu lại xuất hiện màu vàng thì phải chuẩn độ lại. Kiểm nghiệm đồng thời một mẫu trắng. Hàm lượng aldehyt theo phần trăm (X 11 ) tính bằng công thức: Trong đó: v – lượng dung dịch kali hydroxy 0,5N trong rượu dùng để chuẩn độ mẫu thử tính bằng ml; v 1 – lượng dung dịch kali hydroxit 0,5N trong rượu dùng để chuẩn độ mẫu trắng tính bằng ml; M – khối lượng phân tử của aldehyt cần xác định; m – lượng tinh dầu đã cân tính bằng g. b) Xác định hàm lượng xeton (menion, cacvon, tuyon) Cân một lượng tinh dầu khan nước chính xác đến 0,0005 g có chứa khoảng 0,5 - 0,6g xeton đem cho vào bình cầu để xà phòng hóa. Dùng ống đong rót vào bình 20ml dung dịch hydroxylamin clohydrat 0,5N. Cho 8 -10 giọt bromophenol xanh. Để yên trong 10 phút. Chuẩn độ lượng axit clohydric thoát ra bằng dung dịch kali hydroxit 0,5N trong rượu cho đến khi dung dịch có màu trung tính của bromophenol (lục vàng). Lắp ống làm lạnh vào bình và đun cách thủy trong 10 phút. Để nguội rồi lại chuẩn độ lần thứ hai bằng dung dịch kali hydroxit 0,5N. Làm như trên nhiều lần cho đến khi dung dịch giữ được màu cố định lục vàng mà không chuyển lại thành màu vàng. Kiểm nghiệm đồng thời một mẫu trắng. Hàm lượng xeton theo phần trăm (X 12 ) tính bằng công thức: Trong đó: v – lượng dung dịch kali hydroxit 0,5N trong rượu dùng để chuẩn độ mẫu thử tính bằng ml; v 1 – lượng dung dịch kali hydroxit 0,5N trong rượu dùng để chuẩn độ mẫu trắng tính bằng ml; M – khối lượng phân tử của xeton cần xác định; m – lượng tinh dầu đã cân tính bằng g.