10TCN349:1999

Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 349:1999 về bảo quản dài hạn nguồn gien vi sinh vật nông nghiệp bằng phương pháp đông khô do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 349:1999 BẢO QUẢN DÀI HẠN NGUỒN GIEN VI SINH VẬT NÔNG NGHIỆP BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ 1. Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc bảo quản dài hạn nguồn gien vi sinh vật dị dưỡng hiếu khí và vi hiếu khí sử dụng trong nông nghiệp với nguồn vật liệu di truyền là tế bào sinh dưỡng, bào tử trong điều kiện vô trùng bằng phương pháp đông khô. 2. Thuật ngữ, định nghĩa: 2.1. Nguồn gien vi sinh vật nông nghiệp được hiểu là nguồn tài nguyên di truyền công nghệ bao gồm các nhóm chủng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn lam khác đang là đối tượng được nghiên cứu và sử dụng trong nông nghiệp (trừ vi sinh vật trong lĩnh vực thú y), bao gồm cả các chủng đang được khai thác để lai tạo và các chủng có tiềm năng đã được kiểm định, được Bộ Nông nghiệp - PTNT cho phép sử dụng. 2.2. Bảo quản nguồn gien vi sinh vật là bảo quản các mẫu giống thuần khiết sau khi đã chọn lọc, trong điều kiện phù hợp bảo đảm độ sống sót cao và bảo tồn các tính trạng ban đầu để sử dụng trong các trường hợp cần thiết. 2.3. Bảo quản dài hạn là bảo quản các mẫu giống trong thời gian trên 2 năm. 2.4. Đặc tính sinh học là khả năng của vi sinh vật thông qua hoạt động sống của chúng có tác dụng đến quá trình sinh trưởng, phát triển của cây trồng, vật nuôi, kiểm soát sinh học và sinh thái môi trường. 2.5. Môi trường nuôi cấy chọn lọc là môi trường phù hợp cho sự phát triển của một loài hay một nhóm vi sinh vật nào đó nhưng ít thuận lợi hay hoàn toàn bất lợi đối với sự phát triển của loài hay nhóm vi sinh vật khác. 2.6. Môi trường chẩn đoán phân biệt (môi trường chỉ thị) là môi trường cho phép phân biệt nhanh chóng một loài vi sinh vật này với một loài vi sinh vật khác. 2.7. Mẫu giống: - Mẫu giống là giống do tác giả chọn lọc, lai tạo hay lấy từ quĩ gien có tính di truyền ổn định. - Một mẫu giống vật liệu cần giữ một lượng mẫu lặp lại ít nhất ba lần. - Không được chọn những vi khuẩn lạc riêng biệt trong các lần cấy chuyển làm giống (tránh đột biến sinh trưởng). - Việc lấy mẫu được tiến hành sao cho mẫu kiểm tra phải là mẫu thuần. - Người lấy mẫu phải được huấn luyện và có kinh nghiệm trong việc lấy mẫu. - Trong quá trình lấy mẫu, vận chuyển và xử lý mẫu phải đảm bảo tránh sự tạp nhiễm từ bên ngoài và đảm bảo được tính nguyên trạng ban đầu. 2.8. Thời gian cấy chuyển là khoảng thời gian các mẫu giống được lưu giữ trước khi cần cấy chuyển, phụ thuộc vào đặc điểm sinh học mẫu vật liệu, phương tiện và kinh nghiệm người giữ mẫu giống. 2.9. Độ phần trăm sống sót của mẫu giống là tỷ lệ phần trăm giữa lượng tế bào sống sót trong các mẫu giống bảo quản và mẫu giống gốc mới được nuôi cấy và phát triển ổn định. Độ phần trăm sống sót của mẫu giống cho phép định thời gian cấy chuyển mẫu giống. 2.10. Hồi phục là quá trình cấy chuyển mẫu đông khô trên môi trường dinh dưỡng chọn lọc. 3. Nội dung: 3.1. Chuẩn bị: 3.1.1. Trang thiết bị: - Tủ sấy (thiết bị tiệt trùng khô) và nồi hấp (thiết bị tiệt trùng ướt) - Tủ ấm - Máy đông khô - Cân kỹ thuật có độ chính xác tới 0,01g. - Que cấy - Que gạt thủy tinh - Lọ đông khô (có nút cao su) hoặc ampul bằng thủy tinh trung tính - Ống nghiệm thủy tinh - Ống đong: 100ml, 500ml, 1000ml - Bình tam giác: 250ml, 500ml - Đĩa petri (hộp lồng) - Pipet chia độ: chuyên dùng cho vi sinh có dung tích 1ml, 5ml, 10ml - Đèn cồn hoặc đèn gas 3.1.2. Chuẩn bị dụng cụ: - Các dụng cụ dùng trong xác định vi sinh vật phải tiệt trùng bằng một trong các phương pháp dưới đây: + Trong tủ sấy ở nhiệt độ từ 160-175 o C trong ít nhất 2 giờ. + Trong nồi hấp 121 o C (1 atmotphe) không ít hơn 20 phút. - Chuẩn bị lọ đông khô (hoặc ampul): ngâm trong HCl 2% trong 12 giờ. Sau đó rửa lại bằng nước máy 3-4 lần và tráng lại bằng nước cất vô trùng. 3.1.3. Chuẩn bị môi trường: - Môi trường nuôi cấy sinh khối và kiểm tra độ phần trăm sống sót của mẫu giống là môi trường nuôi cấy chọn lọc (xem mục 2.5). Cân và hòa tan các thành phần môi trường trong nước cất theo thứ tự đã cho. Phân phối môi trường vào các bình tam giác. Đậy nút bông, tiệt trùng ở 121 o C trong 30 phút. - Môi trường bảo vệ: có thành phần như sau: sữa tách bơ 20%, hoặc Saccharoza 10%, hoặc Gelalin 1%. Môi trường bảo vệ cần được tiệt trùng bằng phương pháp Pasteur, hoặc màng lọc vi khuẩn hoặc ở 121 o C trong 15 phút. 3.2. Tiến hành: 3.2.1. Tạo sinh khối vi sinh vật: Các mẫu giống được nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy thích hợp (dạng dịch thể hay thạch nghiêng). Sau khi tế bào phát triển tốt, ổn định, thu sinh khối vi sinh vật để tiến hành đông khô. 3.2.2. Chuẩn bị dịch huyền phù cho đông khô: - Cho sinh khối vi sinh vật vào môi trường bảo vệ. Trộn đều để thu được dịch huyền phù đồng nhất, đảm bảo ít nhất là 10 8 tế bào/ml. - Dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch huyền phù nhỏ dưới đáy lọ đông khô (hoặc ampul). Tiến hành thao tác trong điều kiện vô trùng, không để rây vi sinh vật lên mép hoặc thành lọ đông khô (hoặc ampul). 3.2.3. Quá trình đông khô: được tiến hành như sau: - Pha 1: Hạ băng: Từ 20 o C xuống -35 o C trong 3 giờ. - Pha 2: Đông khô: Từ -35 o C đến -10 o C trong 18 giờ. Từ -10 o C đến 25 o C trong 4 giờ. - Pha 1: Làm kiệt: Duy trì ở 25 o C trong 4 giờ. 3.2.4. Quy định chất lượng đông khô: - Vùng nhiệt sử dụng (từ -35 o C đến -25 o C): nằm trong vùng cho phép, các vi sinh vật không bị tổn thương. Sau mỗi mẻ đông khô cần kiểm tra độ sống sót của vi sinh vật, độ tạp nhiễm trước và sau khi đông khô. - Ống đông khô có độ chân không gần tuyệt đối (kiểm tra bằng đèn cực tím) - Ẩm độ của sản phẩm sau đông khô nhỏ hơn 4%. - Cấu trúc vật lý: xốp, không vỡ. - Tan ngay khi cho dung môi vào sản phẩm đã đông khô. - Không bị biến màu. 3.2.5. Bảo quản: Mẫu đông khô được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-10 o C hoặc ở chỗ tối và mát. 3.3. Kiểm tra mẫu giống: Định kỳ sau 1-5 năm kiểm tra độ phần trăm sống sót và đặc tính sinh học của mẫu giống. 3.3.1. Độ phần trăm sống sót của mẫu giống: 3.3.1.1. Môi trường để kiểm tra: Môi trường để kiểm tra được sử dụng là môi trường nuôi cấy chọn lọc. Môi trường được pha chế theo thứ tự các hóa chất trong thành phần đã cho. Sau đó được phân phối vào các dụng cụ thủy tinh đã chuẩn bị trước rồi khử trùng ở 121 o C trong 30 phút. Để nguội môi trường đến 45-50 o C, phân phối môi trường vào các đĩa petri đã khử trùng ở điều kiện vô trùng. 3.3.1.2. Dịch pha loãng, dung dịch muối sinh lý (NaCl 0,85%), không chứa các hợp chất nitơ, có độ pH là 7,0 sau khi khử trùng ở 121 o C trong 30 phút. Phân phối dịch pha loãng vào các ống nghiệm có dung tích thích hợp với một lượng sao cho sau khi khử trùng, mỗi ống nghiệm chứa 9ml. Làm nút bông và khử trùng ở 121 o C trong 30 phút. Nếu chưa sử dụng ngay, dịch pha loãng cần được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-10 o C, thời gian bảo quản không quá 1 tháng kể từ ngày chuẩn bị. Ghi chú: Để tránh làm ảnh hưởng đến các vi sinh vật do thay đổi nhiệt độ đột ngột, nên điều chỉnh nhiệt độ của dịch pha loãng đến nhiệt độ phòng thử nghiệm. 3.3.1.3. Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn (suspension): Lấy ống giống bảo quản cần kiểm tra ra khỏi nhiệt độ bảo quản, tiến hành kiểm tra khi nhiệt độ của ống giống bảo quản bằng nhiệt độ phòng thí nghiệm. + Từ ống nghiệm đông khô dạng ampul: - Sát trùng ampul bằng gạc tẩm cồn - Cưa ngang ampul vào chỗ giữa nút bên trong - Dùng đầu đũa thủy tinh nóng đỏ để bẻ ampul, hoặc bọc cái gạc quanh ampul giống và bẻ gãy ở vị trí đã cưa. Phải cẩn thận tránh gạc quá ướt, cồn có thể bị sộc vào chủng giống khi ống chân không bị bẻ ra. - Cho phép không khí vào ống nghiệm từ chỗ bẻ. Nếu mở không tốt, cái nút có thể bị đẩy sát vào đáy ống giống và phần tinh khiết của dịch đông khô bị lộ ra không khí. - Bỏ đầu ampul giống và cái nút bằng kẹp vô trùng. Nếu không lấy cẩn thận, cái nút có thể gây nhiễm trùng ống giống đông khô. - Đốt nóng đầu mở của ampul. - Dùng bơm tiêm vô trùng thêm 1 ml môi trường dinh dưỡng dịch thể tương ứng vào ampul giống để hydrat hóa chủng giống. Lắc kỹ trong 20 phút để đảm bảo các tế bào được phân bố đồng đều. Dung dịch được tạo ra gọi là dịch huyền phù ban đầu. + Từ ống đông khô dạng lọ có nút cao su: - Sát trùng lọ bằng gạc tẩm cồn. - Dùng bơm tiêm vô trùng thêm 1 ml môi trường dinh dưỡng dịch thể tương ứng vào lọ giống (qua nút cao su) để hydrat hóa chủng giống. Lắc kỹ trong 20 phút để đảm bảo các tế bào được phân bố đồng đều. Dung dịch được tạo ra gọi là dịch huyền phù ban đầu. - Dùng bơm tiêm đã vô trùng hút toàn bộ dịch huyền phù ban đầu (1ml) cho vào 9ml dịch pha loãng, tránh chạm bơm tiêm vào dịch pha loãng. Trộn kỹ bằng cách dùng một pipet vô trùng khác hút lên xuống 10 lần hoặc bằng dụng cụ trộn cơ học trong 5-10 giây, tần số quay của dụng cụ này sẽ được chọn sao cho chất lỏng khi cuộn xoáy dâng lên cách mép lọ chứa khoảng 2-3 cm để có được dung dịch pha loãng 10 -2 . Lặp lại các thao tác này để thu được dịch pha loãng 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 . Cấy mẫu: dùng pipet vô trùng riêng cho từng độ pha loãng, lấy ra từ dịch mẫu một lượng mẫu dịch 0,05 ml (1 giọt) cấy vào 1 đĩa petri chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn (xem 3.3.1). Mỗi mẫu được cấy lặp lại 3 đĩa petri. Dùng que gạt vô trùng gạt đều để dịch mẫu dàn trải trên bề mặt thạch, đợi khô bề mặt thạch, úp ngược đĩa petri, nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp. Đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng của mẫu giống các chủng giống vi sinh vật trên mỗi đĩa petri. Mật độ vi sinh vật trên một đơn vị kiểm tra (gam hay ml) được tính theo công thức sau: A = a x 20 d Trong đó: A: số khuẩn lạc/ml dịch a: số khuẩn lạc trung bình có trong đĩa petri d: nồng độ dịch pha loãng 20: số giọt dịch trong 1 ml dịch Ghi chú: Số lượng khuẩn lạc trung bình được tính là trung bình cộng số khuẩn lạc của các đĩa petri được cấy từ cùng một độ pha loãng, trong đó chỉ tính các đĩa petri chứa từ 30-300 khuẩn lạc. Số lượng khuẩn lạc trung bình cũng có thể được tính là trung bình cộng số lượng khuẩn lạc của các đĩa petri được cấy từ hai độ pha loãng kế tiếp nhau bằng cách tính số khuẩn lạc trung bình cộng ở mỗi độ pha loãng, trong đó số khuẩn lạc ở độ pha loãng cao hơn được nhân với 10, sau đó lấy trung bình cộng của hai giá trị trên nếu tỷ số giữa giá trị lớn và giá trị nhỏ không lớn hơn 2. Nếu tỷ số này lớn hơn 2 thì lấy giá trị nhỏ làm kết quả. Mật độ vi sinh vật trên mỗi đơn vị kiểm tra được biểu thị bằng một số giữa 1,00 và 9,99 nhân với 10 n , n là số mũ thích hợp. % độ sống sót = Số lượng tế bào mẫu giống bảo quản x 100 Số lượng tế bào mẫu giống gốc 3.3.2. Xác định đặc tính sinh học: Tiến hành theo những phương pháp cụ thể (phụ thuộc vào khả năng sinh hoạt tính của từng nhóm các chủng vi sinh vật) Ghi chú: Chỉ cho phép giữ lại các mẫu giống có phần trăm độ sống sót cao, có hoạt tính sinh học ổn định như mẫu giống gốc. Các mẫu giống này sẽ được cấy chuyển lại trên môi trường nuôi cấy và tiếp tục bảo quản.