TCVN10785:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10785:2015 về Vi sinh vật - Xác định khả năng hòa tan kali TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10785:2015 VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG HÒA TAN KALI Microorganisms - Determination of potassium solubilization capability Lời nói đầu TCVN 10785:2015 do Viện Thổ như ỡ ng Nông hóa biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, T ổ ng cục Ti ê u chu ẩ n Đo lư ờ ng Ch ấ t lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. VI SINH VẬT - XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG HÒA TAN KALI Microorganisms - Determination of potassium solubilization capability 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chu ẩ n này quy định phương pháp đ ị nh tính và đ ị nh lượng khả năng hòa tan kali từ những hợp ch ấ t v ô cơ ch ứ a kali khó tan của vi sinh vật. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau đây l à cần thiết để áp dụng tiêu chuẩn này. Đối v ớ i các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (n ế u có). TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng cho phân tích trong phòng thí nghiệm - Y êu cầu kỹ thuật và ph ươ ng pháp thử . 3 Thuật ngữ, định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau: 3.1 Vi sinh vật hòa tan kali (potassium solubili zing microorganisms) Các vi sinh vật có khả năng hòa tan, giải phóng kali từ những hợp chất vô cơ chứa kali khó tan . 4 Nguyên tắc 4.1 Nguyên tắc đ ị nh tính Vi sinh vật dùng để xác đ ị nh khả năng sinh tổng hợp axit 3-indol axetic (IAA) là vi sinh vật thuần. Tạo vòng trong bao quanh khuẩn lạc/ cụm khu ẩ n lạc khi nuôi cấy tr ê n m ô i trường thạch. 4.2 Nguyên tắc định l ượ ng Sử dụng phương pháp quang kế ngọn lửa để xác đ ị nh lượng ion K + hòa tan được giải phóng ra trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật. 5 Thuốc thử, dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy H óa chất sử dụng để pha các chất chuẩn đạt loại tinh khiết hóa học, hóa chất sử dụng để phân tích đạt loại tinh khiết phân tích. 5.1 Nước cất , đáp ứng các yêu cầu nước loại 3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987). 5.2 Dung dịch axit clohydric (HCI) 0,1 N (pha từ dung dịch tiêu chu ẩ n HCI 1 N). 5.3 D ung dịch chu ẩ n 5.3.1 Dung d ị ch chuẩn g ố c kali clorua 1000 mg K/l Sử dụng dung dịch chuẩn gốc kali clorua 1000 mg K/l có sẵn trên th ị trường hoặc pha chế như sau: C ầ n 1,9067g kali clorua (KCI) tinh khiết (99%) đ ã sấy khô ở 105 ° C đến khối lượng không đổi, để nguội trong b ì nh hút ẩ m cho vào cốc và th ê m 100 ml dung dịch HCI 0,1 N, khu ấ y tan, chuyển vào bình định mức dung t í ch 1000 ml, thêm nước đến vạch định mức, trộn đều. 5.3.2 Dung dịch chuẩn l à m việc kali clorua 100 mg K/l Dùng pipet lấy 25,0 ml dung dịch chuẩn gốc kali clorua 1000 mg K/l (5.3.1) cho vào bình định mức dung tích 250 ml (6.2.3), thêm 2,5 ml dung dịch HCI 0,1 N. Thêm nước đến vạch định mức, trộn đều. 5.3.3 Thang chuẩn kali Ch uẩn b ị 7 bình định m ứ c dung tích 100 ml, đánh số thứ tự từ 1 đến 7. Dùng pipet lần lượt hút dung dịch chuẩn làm việc kali clorua 100 mg K/l (5.3.2) vào các b ì nh định mức theo thể tích ghi trong bảng 1. Thêm dung dịch HCI 0,1 N đến vạch định mức, trộn đều. Bảng 1 - Hướng dẫn pha thang chuẩn kal i STT Nồng độ dung d ị ch kali clorua (mg K/l) Thể t í ch dung d ị ch chuẩn làm việc kali clorua 100 mg K/l (ml) cho vào mỗi bình định mức dung tích 100 ml 1 00,0 0,0 2 05,0 5,0 3 10,0 10,0 4 20,0 20,0 5 40,0 40,0 6 60,0 60,0 7 80,0 80,0 5.3.4 Đường chuẩn kali Đo thang chuẩn kali trên máy quang kế ngọn lửa với k í nh lọc kali, hiệu chỉnh máy sao cho đường chuẩn có dạng y=ax + b (với R 2 lớn hơn 0,95); Lập đồ thị đường chuẩn (hoặc phương tr ì nh tương đương) biểu diễn tương quan giữa số đo tr ê n máy v à nồng độ dung dịch chu ẩ n kali. CH Ú THÍCH 1: Tùy theo hàm lượng kali hòa tan do vi sinh vật giải phóng ra trong dung dịch, có th ể pha dung dịch chuẩn làm việc và thang chuẩn c ó n ồ ng độ kali clorua th ấ p hơn hoặc cao hơn. 5.4 D ị ch pha lo ã ng Dùng dịch pha loãng là nước muối sinh lý (NaCI 0,85 %), vô trùng, pH = 7, không ch ứa c á c hợp ch ấ t kal i; Lấy 9 ml dịch pha loãng cho vào các ố ng nghi ệm (6.2.5), đậy nút bông và khử trùng ở 121 ° C k hông ít hơn 20 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2); 5.5 Môi trường nuôi cấy 5.5.1 Thành ph ầ n Môi trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa hợp chất kali khó tan, v í dụ như môi trường Aleksandrov (cải tiến) có thành phần như sau: Tinh bột tan ( C 6 H 10 O 5 ) n ) 20,0 g Magie sulphat ngậm bảy phân tử nước (MgS O 4 .7 H 2 O ) 0,5 g Sắt (III) clorua (FeCI 3 ) 0,005 g Canxi cacbonat (CaC O 3 ) 0,1 g Canxi (II) phosphat (Ca 3 (P O 4 ) 2 ) 2,0 Khoáng vật chứa kali ( f enspat (KAIS i 3 O 8 )), qua rây 0,2 mm 5,0 g Nước c ấ t vừa đủ 1000 ml pH 6,5 CHÚ THÍCH 2: Nếu m ôi trường thạch đĩa th ì bổ sung 20,0 g thạch. 5.5.2 Cách chuẩn b ị Cân và hòa tan các thành phần môi trường trong nước cất theo thứ tự đã liệt kê tại (5.5.1). 5.5.2.1 Môi trường dịch thể Phân phối 100 ml môi trường (5.5.2) vào bình tam giác dung tích 250 ml (6.2.1), đậy nút bông, kh ử trùng 30 min ở 121 ° C trong nồi hấp áp lực (6.1.2). 5.5.2.2 Môi trường thạch đ ĩa Phân phối 200 ml môi trường (5.5.2) vào b ì nh tam giác dung t í ch 500 ml (6.2.1), đậy nút bông, khử trùng 30 min ở 121 ° C trong nồi hấp áp lực (6.1.2), làm nguội đến 50 ° C , phân phối lượng từ 15 ml đến 20 ml môi trường vào các đĩa Petri (6.2.4) đã chu ẩ n bị s ẵn (6.3); các thao tác tiến hành trong tủ cấy vô trùng (6.1.1). 6 Thiết bị, dụng cụ S ử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và cụ thể như sau: 6.1 Thiết bị 6.1.1 T ủ cấy vô trùng (Box cấy ), vận tốc dòng kh í trung b ì nh 0,79 m/s, lưu lượng khí 1204 m 3 /h, màng lọc ULPA với k ích th ướ c hạt từ 0,1 μm đến 0,3 μm. 6.1.2 Nồi hấp áp lực, áp su ấ t tối thiểu 101,3 kPa, có khả năng duy tr ì nhiệt độ ở 121 ° C . 6.1.3 T ủ s ấ y , có khả năng duy tr ì nhiệt độ từ 40 ° C đến 260 ° C . 6.1.4 T ủ ấm, có khả năng duy tr ì nhiệt độ từ 20 ° C đ ến 60 ° C. 6.1.5 Máy lắc ổn nhiệt, tốc độ 150 r/min, có khả năng duy tr ì nhiệt độ từ 20 ° C đến 40 ° C . 6.1.6 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,0001 g. 6.1.7 Cân kỹ thuật, có độ chính xác đến 0,01 g. 6.1.8 Máy trộn Vortex, tốc độ 1000 r/min. 6.1.9 Máy ly tâm, tốc độ 6000 r/min. 6.1.10 Máy đo pH, có độ chính xác đ ế n 0,1 đơn vị pH ở 25 ° C . 6.1.11 Máy quang kế ngọn lửa, đánh lửa điện tử, s ử dụng các loại kh í prôpan, butan, kh í tự nhiên, hoặc khí hóa lỏng; Thang đo từ 0 ppm đến 199,9 ppm; Ngư ỡ ng phát hiện: K ≤ 2 ppm. 6.2 Dụng cụ 6.2.1 Bình tam giác, dung t í ch 250 ml, 500 ml. 6.2.2 Cốc t huỷ tinh, dung tích 100 ml và 1000 ml. 6.2.3 Bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml, 250 m l , 1000 ml. 6.2.4 Đĩa Petri, đường kính 90 mm. 6.2.5 Ố ng nghiệm, kích thước 18 mm x 180 mm. 6.2.6 Que cấy vòng . 6.2.7 Que gạt mẫu (bàn trang) 6.2.8 P i pet (Micropipet), có thể lấy các thể tích 0,1 ml và 1 ml. 6.3 Chuẩn bị dụng cụ - Dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật phải được rửa sạch, tiệt trùng bằng một trong các phương pháp dưới đây: + Khử tr ù ng khô: Giữ ở nhiệt độ 180 ° C không ít hơn 1 h trong tủ sấy (6.1.3) hoặc; + Khử trùng ướt: Giữ ở nhiệt độ 121 ° C không ít hơn 30 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2). - Dụng cụ sử dụng trong định l ượng kali hòa tan phải được rửa sạch, tráng lại bằng nước cất. 7 Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu 7.1 Lấy mẫu Việc l ấ y mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Điều quan trọng là mẫu gửi đến ph ò ng thí nghiệm phải l à đại diện và mẫu không b ị hư hỏng hoặc suy giảm chất lượng trong quá tr ì nh bảo qu ả n và vận chuyển. 7.2 Chuẩn bị mẫu L ấ y một vòng que cấy vi sinh vật cấy vào b ì nh tam giác chứa môi trường dịch thể đã chuẩn bị sẵn ( 5.5.2.1). Nuôi lắc ở tốc độ 150 r/min, trong thời gian từ 2 ngày đến 3 ngày, nhiệt độ từ 28 ° C đến 30 °C; đảm b ả o mật độ tế bào vi sinh vật không nhỏ hơn 1 0 8 CFU/ml (dung dịch mẫu ban đầu). 8 Định tính khả năng hòa tan kali của vi sinh vật 8.1 Cách tiến hành Dùng một pipet vô trùng lấy 1 ml dung dịch mẫu ban đầu (7.2) cho vào ống nghiệm có chứa 9 ml d ung dịch pha loãng đã chu ẩ n bị sẵn (5.4), tránh chạm pipet vào dịch pha loãng, trộn đều bằng máy trộn Vortex (6.1.8) đ ể có dung dịch mẫu có nồng độ pha loãng là 10 - 1 . Tiếp tục pha loãng để đạt được độ pha lo ã ng 10 -5 , 10 -6 ; Dùng một pipet vô trùng khác lấy 0,1 m l d ung dịch mẫu pha loãng cấy vào đĩa Petri chứa môi trường đ ã chuẩn b ị sẵn (5.5.2.2) . Mỗi nồng độ pha loãng được cấy lặp lại không í t hơn 2 đĩa Petri; Dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dung dịch mẫu thấm đều trên bề mặt thạch, đợi bề mặt thạch khô, úp ngược đĩa Petri, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28 ° C đến 30 ° C trong thời gian từ 5 đến 7 ngày; Quan sát vòng trong bao quanh khuẩn lạc. CHÚ THÍCH 3 : Sau khi nuôi cấy, c ác đĩa Petri c ó thể được để lạnh ở 4 ° C trong thời gian 24 h để vòng phân giải hiện r õ . 8.2 Khẳng đ ị nh Vi sinh vật có khả năng hòa tan kali là vi sinh vật tạo được vòng trong suốt bao quanh khuẩn lạc/cụm khuẩn lạc. 9 Định lượng khả năng hòa tan kali của vi sinh vật 9.1 Cách ti ế n hành 9.1.1 Mẫu thử Lấy 1 ml dung dịch mẫu ban đầu (7.2) cho vào b ì nh tam giác chứa 100 ml môi trường dịch thể đã chuẩn bị sẵn (5.5.2.1). Nuôi lắc ở tốc độ 150 r/min, trong thời gian từ 5 ngày đến 7 ngày, nhiệt độ từ 28 ° C đến 30 °C; đ ả m b ả o mật độ t ế bào vi sinh vật không nhỏ hơn 10 8 CFU/ml (dung dịch mẫu thử). Mỗi mẫu được c ấ y lặp lại kh ô ng ít hơn 3 lần; Ly tâm không ít hơn 1,5 ml dung dịch mẫu thử bằng máy ly tâm (6.1.9) với tốc độ 6 00 0 r/min, trong thời gian 10 min; Lấy 1,0 ml phần dung dịch tr ê n bề mặt (phần dung dịch trong) cho vào b ì nh định mức dung t í ch 50 ml. Thêm nước cất đến vạch định mức, trộn đều; Xác định lượng kali hòa tan trong m ẫu t hử bằng máy quang kế ngọn lửa. 9.1.2 Mẫu trắng Ly tâm không ít hơn 1,5 ml môi trường dịch thể đ ã chuẩn b ị s ẵn (5.5.2.1) bằng máy ly tâm (6.1.9) với tốc độ 6000 r/min, trong thời gian 10 min; Lấy 1,0 m l phần dung dịch trên bề mặt (ph ầ n nước trong) cho v à o bình định mức dung t í ch 50 ml. Th ê m nư ớ c cất đến vạch định mức, trộn đều; Xác định lượng kali hòa tan trong mẫu trắng bằng máy quang kế ngọn lửa. CHÚ TH Í CH 4: T iế n hành đo dung d ị ch mẫu thử v à mẫu đối chứng đồng nh ấ t với đi ề u kiện đo dung dịch chuẩn. Sau khi đo khoảng 10 mẫu phải ki ể m tra lại thang chuẩn. Nếu sai lệch phải hiệu chỉnh máy, lập lại đường chuẩn và đo lại mẫu. 9.2 Tính và biểu th ị kế t quả Hàm lượng K 2 O h ò a tan do vi sinh vật giải phóng ra được tính theo công thức: (mg/l) Trong đ ó: M Hàm lư ợng K 2 O hòa tan do vi sinh vật giải ph ó ng ra, t í nh bằng miligam/lít (mg/l); a Hàm lượng K + trong mẫu thử, tính bằng miligam/lít (mg/l); ao Hàm lượng K + trong mẫ u trắng, tính b ằ ng miligam/l í t (mg/l); 50 Thể t í ch b ì nh định mức, tính bằng mililit (ml); 1 Lượng mẫu thử, tính bằng mililit (ml); 1000 Hệ số quy đổi từ l í t sang mililít; 1,205 Hệ số quy đổi từ K + sang K 2 O . 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau: - Mọi thông tin c ầ n thiết đ ể nhận biết đầy đủ về mẫu thử; - Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu bi ế t; - Tất cả các thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết qu ả ; - Các kết quả thử nghiệm thu được; - Nếu độ lặp lại được kiểm tra, th ì nêu kết quả cuối cùng thu được. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Archana D. S . 2007. Studies on potassium so lubili z ing bacteria. Master of Science (agriculture). University of Agricultural Sciences, Dhar w ad [2 ] Sugumaran, P . and Janarthanam, B., 2007, Solubilization of potassium containing minerals by bacteria and their effect on plant growth. World J. Agric. Sci., 3(3): 350-355. [3] TCVN 8560:2010. Phân bón - Phương pháp xác định kali h ữ u hiệu.