TCVN10642:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10642:2014 (AOAC 997.13) về Thực phẩm - Xác định hàm lượng GLYCOALKALOID (α-Solanin và α-Chaconin) trong của khoai tây - Phương pháp sắc ký lỏng TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10642:2014 THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLYCOALKALOID (-SOLANIN VÀ -CHACONIN) TRONG CỦ KHOAI TÂY - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG Foodstuffs - Determination of glycoalkaloids ( a -solanine and a -chaconine) in potato tubers - Liquid chromatographic method Lời nói đ ầ u TCVN 10642:2014 được xây dựng dựa trên cơ s ở AOAC 997.13 Glycoalkaloids ( a -solanine and a -chaconine) in potato tubers. Liquid chromatographic metho d; TCVN 10642:2014 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, T ổ ng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLYCOALKALOID ( a -SOLANIN VÀ a -CHACONIN) TRONG CỦ KHOAI TÂY - PHƯƠNG PHÁP S Ắ C KÝ LỎNG Foodstuffs - Determination of glycoalkaloids ( a -solanine and a -chaconine) in potato tubers - Liquid chromatographic method CẢNH BÁO: a -solanin và a -chaconin là các chất độc, c ầ n chú ý đến an toàn khi xử lý các hóa chất đặc biệt nguy hại này. Không đư ợ c hít hoặc nuốt vào. Tránh tiếp xúc với da. C ần xử lý nitơ lỏng một cách c ẩ n thận . Ở nhiệt độ rất th ấ p (- 196 °C) có thể làm tổn thương da, tổn thương do đông lạnh hoặc b ỏ ng. Mang găng tay và kính bảo hộ cùng với tấm chắn hoặc mặt nạ. Khi rót đ ầ y vào vật chứa hoặc khi cho các chất vào nitơ lỏng luôn xảy ra sôi và bắn tung tóe, do đó cần thực hiện các thao tác này thật chậm. Bảo quản và sử dụng nitơ lỏng ở nơi thông gió tốt. Do t ỷ lệ giãn n ở l ớ n t ừ thể lỏng sang thể khí (từ 1 lần đến 700 lần) nên nế u nit ơ l ỏ ng được b ả o qu ả n trong vật chứa k í n sẽ rất nguy hiểm. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng một số glycoalkaloid (bao gồm a -solanin và a -chaconin) trong c ủ khoai tây bằng sắc ký lỏng. Giới hạn định lương đ ố i với a -solanin là từ 10 mg/kg đến 200 mg/kg, đối với a -chaconin là từ 20 mg/kg đến 250 mg/kg. 2. Nguyên tắc Các glycoalkaloid được chiết ra khỏi ph ầ n mẫu thử (mô củ tươi) bằng axit axetic loãng. Dịch chiết được cô đặc và làm sạch trên cột chiết pha rắn dùng một lần. Cuối cùng tách và đo a -solanin và a - chaconin b ằ ng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo với detector UV ở bước sóng 202 nm. 3. Thuốc thử Ch ỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân t í ch. 3.1. Axetonitril, loại dùng cho sắc ký lỏng với độ truyền qua ≥ 80 % ở bước sóng 200 nm. 3.2. Dung dịch chiết, nước-axit axetic-natri hydro sul f at (100 : 5 : 0,5 thể tích/thể tích/khối lượng). Cho 1,0 l í t nước với 50 ml axit axetic băng và thêm 5,0 g NaHS O 3 vào rồi trộn để hòa tan. 3.3. Dung d ịch r ử a SPE, axetonitril 15 %. Trộn 150 ml axetonitril (3.1) với 850 ml nước. 3.4. Kali monohydro phosphat (K 2 HPO 4 ), 0,1 M. Cân chính xác 17,4 g K 2 HP O 4 khan, chuyển định lượng vào bình định mức dung tích 1 lít (4.9), hòa tan trong nước và thêm nước đến vạch. 3.5. Kali dihydro phosphat (KH 2 PO 4 ), 0,1 M. Cân chính xác 13,6 g KH 2 P O 4 , chuyển định lượng vào bình định mức dung tích 1 lít (4.9), hòa tan trong nước và thêm nước đến vạch. 3.6. Dung d ị ch đệm kali phosphat, 0,1 M, pH 7,6. Chuyển 100 ml dung dịch K 2 HP O 4 (3.4) vào cốc có m ỏ có que khuấy từ và điện cực pH. Cho dung dịch KH 2 PO 4 (3.5) đến khi pH đạt 7,6 ± 0,01 [khoảng 19 ml dung dịch KH 2 P O 4 (3.5) trên 100 ml K 2 HPO 4 (3.4)]. Lọc qua màng lọc có cỡ lỗ 0,45 m m. 3.7. Pha động LC, axetonitril 60 % trong dung dịch đệm phosphat 0,01 M. Trộn 100 ml dung dịch đệm phosphat (3.6) với 300 ml nước và thêm 600 ml axetonitril (3.1). Khử khí. 3.8. Dung dịch rửa LC, axetonitril 60 % . Trộn 600 ml axetonitril (3.1) với 400 ml nước. Khử kh í . 3.9. Dung dịch chuẩn glycoalkaloid 3.9.1. Dung dịch chuẩn gốc glycoalkaloid Cân khoảng 25 mg a -solanin và khoảng 25 mg a -chaconin 1) , chính xác đến 0,05 mg . Chuyển định lượng vào bình định mức dung tích 100 ml (4.9) bằng dung dịch KH 2 P O 4 (3.5). Trộn để hòa tan và pha loãng bằng dung d ịc h KH 2 P O 4 0,1 M (3.5) đến vạch. 3.9.2 Dung dịch chuẩn làm việc glycoalkaloid Pha lo ã ng dung dịch chu ẩ n gốc glycoalkaloid (3.9.1) với dung dịch KH 2 PO 4 (3.5) để thu được các dung dịch c ó nồng độ tương ứng 5,0 m g/ml; 10,0 m g/ml; 25,0 m g/ml; 50,0 m g/ml; 100 m g/ml và 150 m g/ml. Các dung dịch chuẩn glycoalkaloid ổn định ít nhất 3 tháng khi được b ả o qu ả n ở 4 ° C . 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ th ô ng thường c ủ a phòng thử nghiệm và cụ thể như sau: 4.1. Máy đồng hóa 4.1.1. M á y đồng hóa để ph â n hủy mô khoai tây trong nitơ lỏng: Ví dụ. Ultra-Turrax 2) . T 45 với trục 45-N (đệm Te f lon) máy phát TP45/26 và kiểm soát tốc độ thích hợp. Đậy nắp Plexiglass trượt trên trục để tránh bị bắn. 4.1.2. Máy đồng hóa đ ể chiết: Ví dụ Ultra-Turrax 2) TP 18-10 với trục 18-N và bộ kiểm soát tốc độ thích hợp. 4.2. Cột chiết pha rắn ( SPE ): Ví dụ cột chiết pha rắn Sep-Pak C 1 8 3) dùng một lần với 360 mg vật liệu nhồi . Kiểm tra độ thu hồi trong quá tr ì nh thực hiện phương pháp và kiểm soát chất lượng thường xuy ê n, đặc biệt là khi sử dụng các cột SPE khác với cột nêu trên. Sử dụng các dịch chiết đã thêm chuẩn để xác định độ thu hồi vì dung dịch chuẩn tinh khiết c ó thể cho độ thu hồi thấp từ cột SPE, có thể v ì bazơ ancaloid hấp thụ mạnh vào pha tĩnh. Độ hấp thụ có thể được chặn b ở i các hợp chất khác có mặt trong dịch chiết từ củ. Độ thu hồi dự kiến lớn hơn 90 %. 4.3. Bộ phân phối chân không, dùng cho bộ chiết pha r ắ n. 4.4. Hệ thống sắc ký lỏng (LC): bơm cao áp đẳng dòng sử dụng van bơm vòng, bộ ổn nhiệt cột, detector có bước sóng thay đổi, bộ tích phân điện tử và máy ghi. CHÚ THÍCH Ki ể m tra hiệu quả v ề t í nh chọn lọc sắc ký khi bắt đầu thực hiện quy tr ì nh . S ắc ký đồ của một số gi ố ng khoai t â y có các pic với thời gian lưu g ầ n với thời gian lưu của a -solanin và a -chaconin (xem H ì nh A.1). Thời gian lưu của các glycoalkaloid có th ể khác nhau rất nhi ề u khi sử dụng các v ậ t liệu pha tĩnh khác nhau v à ngay cả khi sử dụng cùng một cột, v í dụ d o sự khác nhau v ề hiệu quả của các thiết bị ổ n nhiệt cột. Ph â n tích khoai tây có hàm lượng alkaloid k hông đáng k ể , thu được từ c á c m ô của c ủ có kích cỡ lớn hoặc b ằ ng cách thay đ ổ i các th ô ng số chiết. Nhiệt độ có ảnh hư ở ng đáng k ể đ ế n t í nh chọn l ọ c gi ữ a các pic của glycoalkaloid và pic của các ch ấ t gây nhiễu. T ă ng nhiệt độ sẽ tăng thời gian lưu của glycoalkaloid , trong khi đó t h ờ i gian lưu các p i c nhiễu lại giảm. 4.5. Cột sắc ký lỏng, kích thước 250 mm x 4,6 mm đường kính trong, cột bằng thép không gỉ , được nhồi Hypersil ODS 4) , cỡ hạt 5 m m, pha C 1 8 , hoặc tương đương. Các điều kiện vận hành: - tốc độ dòng: 1,5 ml/min; - thể tích bơm: 20 m l; - nhiệt độ cột: 40 °C; - bước sóng cài đặt detector: 202 nm. 4.6. Máy li tâm, gia tốc 40 000 m/s 2 (khoảng 4000g). 4.7. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,05 g. 4.8. Cân phân tích, có thể cân ch í nh xác đến 0,05 mg. 4.9. Bình định mức, dung t í ch 100 ml và 1 lít. 4.10. Cốc có mỏ, bằng thép không g ỉ , dung tích 2 lít. 4.11. Hộp chứa bằng nhựa. 4.12. Máy cắt thực phẩm hoặc dao thái. 4.13. Máy đo pH. 5. Chuẩn bị mẫu thử Cắt nhỏ khoảng 10 đến 20 c ủ khoai tây trong máy cắt thực ph ẩ m (4.12). Trộn kỹ và chuyển ngay khoảng 200 g vào cốc có mỏ 2 lít (4.10) chứa đầy nitơ lỏng. Cho các miếng khoai tây cắt nhỏ còn lại vào v à khuấy để tách các miếng bị dính. Trong khi ngâm trong nitơ lỏng, làm nhỏ khoai t â y bằng máy đồng hóa (4.1.1). Chuyển hỗn hợp đồng nhất vào hộp ch ứ a bằng nhựa (4.11) và đặt ở nơi lạnh để nitơ bay hơi. Trước khi m ô khoai tây bắt đầu bị phá vỡ hoàn toàn, đậy kín hộp ch ứ a và bảo quản ở - 18 ° C hoặc th ấ p hơn. Phần mẫu thử có thể bảo quản được ít nhất 6 tháng trước khi xử lý tiếp. C Ả NH BÁO: Áp lực quá cao có thể x ả y ra nếu nitơ không bay hơi hết trước khi vật chứa được đóng lại. CHÚ THÍCH: Việc đ ồ ng hóa trong nitơ lỏng sẽ thu được bột có hạt mịn đ ể dễ l ấ y mẫu t hử và có th ể dễ chi ế t glycoalkaloid. N ế u các q u y tr ì nh chu ẩ n bị mẫu th ử khác được ưu tiên hơn v ì sự thu ậ n tiện, ví dụ nghiền củ tươi trong máy ch ế biến thực ph ẩ m hoặc l à m đông khô , th ì kiểm tra t í nh đồng nh ấ t. Ngo à i ra, c ầ n đảm bảo kh ô ng xảy ra sự phá v ỡ các glycoalkaloid trong quá tr ì nh chu ẩ n b ị. 6. Cách tiến hành 6.1. Chiết Loại bỏ lớp tr ê n của mẫu thử khoai tây đông lạnh, v ì có thể chứa nước ngưng t ụ . Cân khoảng 10 g mẫu đông lạnh, chính xác đến 0,01 g v à bổ sung ngay 40 ml ± 0,1 ml dung dịch chiết (3.2). Trộn khoảng 2 min b ằ ng máy đồng hóa (4.1.2) (kiểm soát tốc độ để tránh tạo b ọ t). Lọc b ằ ng cách ly tâm 30 min ở gia tốc lớn hơn 40 000 m/s 2 b ằ ng máy ly tâm (4.6). Thu lấy phần dịch lỏng phía trên. Dịch chiết ổn định ít nhất trong một tuần khi được bảo qu ả n ở 4 ° C . 6.2. Làm sạch dịch chiết Đặt cột SPE (4.2) vào bộ ph â n phối chân không (4.3) và ổn định cột bằng 5,0 ml axetonitril (3.1), tiếp theo l à 5,0 ml dung dịch chiết (3.2). Cho 10 m l ± 0,05 ml dịch chiết mẫu đi qua cột. Rửa cột bằng 4,0 ml dung dịch rửa SPE (3.3). Rửa giải với 4,0 ml pha động LC (3.7) (tốc độ rửa giải: 1 đến 2 giọ t/ s) và điều ch ỉ nh thể tích đến 5,0 ml ± 0,05 ml bằng pha động LC (3.7). Dịch chiết mẫu có thể ổn định ít nhất một tuần khi được bảo quản ở 4 ° C . 6.3. Chạy sắc ký C à i đặt các điều kiện vận hành theo 4.5 với dung môi pha động LC (3.7) và để cho hệ thống cân bằng. Bơm các dung dịch chuẩn làm việc (3.9.2) và các dịch chiết mẫu. Thể tích bơm ít nhất bằng 2 lần thể tích của vòng bơm. Xem Hình A.1 về sắc ký đồ của dịch chiết từ c ủ khoai tây. Trong các điều kiện quy định đối với LC, các pic a -solanin và a -chaconin xuất hiện trong khoảng 10 min. C ó thể xuất hiện mono- và di-glycoside, nhưng không có aglycon của a -solanin v à a -chaconin nếu thời gian ch ạ y kéo dài đến khoảng 20 min. Các pic gây nhiễu từ chất nền có thể xuất hiện với một số giống khoai tây. Sự có mặt của b -chaconin có thể coi như ch ỉ số bi ế n ch ấ t của nền mẫu, v ì chúng được h ì nh thành nhanh trong các mô củ khoai tây bị hư h ỏ ng do kết quả của quá trì n h thủy ph â n a -chaco ni n bằng enzym. Thời gian lưu trong các điều kiện sắc ký đối với b 1 - chaconin, b 2 -chaconin và g -chaconin l à kho ả ng 10 min, 13 min và 18 min, tương ứng, còn với b 2 -solanin và g -solanin l à 9 min và 17 min, tương ứ ng. Sau khi chạy sắc ký xong, rửa bơm và cột (4.5) ít nhất 30 min với dung dịch LC (3.8). Trước khi lấy cột ra sau một khoảng thời gian dài, rửa tiếp bằng axetonitril (3.1). 6.4. Đường chuẩn Dựng đường chuẩn hồi quy tuyến tính của a -solanin và a -chaconin dựa v à o diện tích pic (trục y) trên nồng độ ch ấ t chuẩn được biểu thị bằng microgam trên mililit ( m g/ml) (trục x). 7. Tính kết quả T í nh hàm lượng a -solanin và a -chaconin tương ứng trong mẫu thử, X, khi dung dịch thử và dung dịch chu ẩ n làm việc được bơm vào với thể tích bằng nhau, bằng miligam trên kilogam (mg/kg), theo công thức sau: Trong đó: P s là diện tích pic phân tích; a là phần bị chặn của đường chu ẩ n, tính bằng đơn vị diện tích; b là độ d ố c của đường chuẩn, tính bằng đơn vị diện tích pic/( m g/ml); F là hệ số pha loãng, tính bằng mililit trên gam (ml/g). Tính hệ số pha loãng, F, như sau: Trong đ ó : w p là khối lượng của phần mẫu thử (thường l à 10 g), tính bằng gam (g); V 1 là thể t í ch của dịch chiết, t í nh bằng mililit (trong trường hợp này V 1 = 40 ml); V 2 là thể tích của dịch chiết sử dụng trên cột SPE, tính bằng mililit (trong trường hợp này V 2 = 10 ml); V 3 là thể t í ch cuối cùng của dịch chiết mẫu được pha loãng từ cột SPE, t í nh bằng mililit (trong trường hợp n à y V 3 = 5 ml), C w là h à m lượng nước của khoai tây, tính bằng mililit trên gam (giả định C w = 0,8 ml/g nếu không biết trước); F = 2,4 ml/g khi sử dụng 10,0 g phần thử và các điều kiện khác tiếp theo như quy định. 8. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ: a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) kết quả thử nghiệm thu được; e) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy ch ọ n, cùng với mọi tình huống b ấ t thường có thể ảnh hư ở ng đến kết qu ả . PHỤ LỤC A (tham khảo) VÍ DỤ VỀ SẮC KÝ ĐỒ CHÚ D Ẫ N A là pic của a -solanin (thời gian lưu là 5,9 min) tương ứng với nồng độ 22 mg/kg. B là pic của a -chaconin (thời gian lưu là 7,3 min) tương ứng với nồng độ 46 mg/kg. Hình A.1 - Ví dụ về sắc ký đồ của d ịch chiết từ c ủ khoai tây Điều kiện vận hành: Cài đặt chế độ ghi: đơn vị hấp thụ 0,01 trên toàn thang đo. Cột: Shandon ODS (C 18 ) Hypersil 5 m m, 250 mm x 4,6 mm đường k í nh trong. Nhiệt độ cột: 40 ° C . Pha động: 60 % axetonitril 0,01 M; pH = 7,6 đệm phosphat. Tốc độ dòng: 1,5 ml/min. PHỤ LỤC B (Tham khảo) KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM LIÊN PHÒNG Bảng A.1 - Kết qu ả thử nghiệm liên phòng đối với phép xác định glycoalkaloid ( a -solanin và a -chaconin) trong củ khoai tây bằng phương pháp sắc ký lỏng Giá trị trung b ì nh, mg/kg Độ lệch chuẩn lặp lại, s r Độ lệch chuẩn tái tập, s R Độ lệch chu ẩ n tương đối lặp lại, RSD r , % Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD R , % Giới hạn lặp lại, r Giới hạn tái lập, R a -solanin 11,5 1 , 4 1,5 12,3 13,1 4,0 4 , 2 15,4 1 , 3 1,9 8,5 12,1 3,7 5,2 32,1 1,9 4,2 6 , 1 13,0 5,5 11,6 35 , 9 2,1 3,2 5,9 9,0 5,9 9,1 103,1 3,5 8,1 3,4 7,9 9,9 22,8 218,1 11,4 21,6 5,2 9 , 9 32,0 60,6 a -chaconin 17,2 1 , 0 1 , 7 6,0 9,7 2 , 9 4,6 37,2 1 , 9 3 , 4 5,1 9,1 5,3 9,5 48,8 3,1 6,3 6,3 12 , 8 8 , 6 17,5 67,2 3,3 6,6 4,8 9 , 8 9,1 18,5 162,3 6,6 13,8 4,1 8,5 18,5 38,7 260,8 13,8 28,7 5,3 11,0 38,8 80,2 1) Sigma Chemical Co. , PO Box 14508 , S t. Louis , MO 63103-2564, USA là v í dụ về nhà cung c ấ p s ả n ph ẩ m b á n sẵn trê n th ị trường . Th ô ng tin này đưa ra t ạo thuận tiện cho người sử d ụ ng ti ê u chu ẩ n và không ấn định phải sử d ụng các sản ph ẩ m n à y. Có th ể s ử d ụ ng các s ả n ph ẩ m tương tự nếu cho k ế t qu ả tương đương. 2) Jank e & Kunkel GmbH & Co KG , D79219 S taufen, Đức là v í dụ v ề sản ph ẩ m bán s ẵ n tr ê n th ị trư ờ ng. 3) Wa t ers Corp. 34 Maple S t. Mil f ord. MA 01.757-3.696, Mỹ l à v í dụ v ề sản phẩm bán sẵn tr ê n thị t rư ờ ng. C á c th ô ng tin n ê u tr ê n đưa ra t ạ o thu ậ n tiện cho ng ườ i s ử dụng tiêu chu ẩ n v à không ấn đ ịn h phải s ử dụ ng các s ả n phẩm n à y . Có thể sử dụng các sản ph ẩ m tương tự nếu cho kết quả tương đương. 4) Shandon Southern Products Ltd. , Astmoor, UK Supelco , Inc. , Be l lefonte , PA 16823 - 0048 , USA , Cat. No. Z22 , 634-3 l à v í dụ v ề s ả n ph ẩ m có bán s ẵ n trên thị trường. Th ô ng tin n à y đưa ra t ạ o thuận tiện cho người s ử d ụng tiêu chu ẩ n và không ấ n đ ị nh ph ả i s ử dụng các sản ph ẩ m n à y. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả lương đương