TCVN10992:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10992:2015 (CEN/TS 15606:2009) về Thực phẩm - Xác định acesulfame-K, Aspartame, Neohesperidine-dihydrochalcone và Saccharin - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10992:2015 CEN/TS 15606:2009 THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH ACESULFAME-K, ASPARTAME, NEOHESPERIDIDINE-DIHYDROCHALCONE VÀ SACCHARIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Foodstuffs - Determination of acesulfame-K, aspartame, neohesperidine-dihydrochalcone and saccharin - High per f ormance liquid chromatographic method Lời nói đầu TCVN 10992:2015 hoàn toàn tương đương với CEN/TS 15606:2009; TCVN 10992:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH ACESULFAME-K, ASPARTAME, NEOHESPERIDIDINE-DIHYDROCHALCONE VÀ SACCHARIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Foodstuffs - Determination of acesulfame-K, aspartame, neohesperidine-dihydrochalcone and saccharin - High per f ormance liquid chromatographic method 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác đ ị nh acesul f ame-K, aspartame, neohesperidine-dihydrochalcone và saccharin trong thực phẩm bằng sắc kí l ỏ ng hiệu năng cao (HPLC) v ớ i detector UV. Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận đầy đủ về quy trình th ẩ m tách thông qua phép thử cộng tác [1] (xem 8.2, 8.3 và Phụ lục C), theo quy trình IUPAC [2] trên các hỗn hợp nền mẫu phân tích sau đây: - acesulfame-K (từ 86 mg/l đến 331 mg/ l ) và aspartame (từ 97 mg/kg đến 610 mg/l) trong đồ uống pha từ nước, đồ uống từ trái cây, bánh quy có phomat, súp đóng hộp và đồ uống socola. - saccarin (từ 70 mg/ l đến 97 mg/kg) trong đồ uống pha từ nước, đồ uống từ trái cây, bánh quy có phomat, súp đóng hộp; - neohesperidine-dihydrochalcone (từ 27 mg/ l đến 57 mg/kg) trong đồ uống pha từ nước, đồ uống từ trái cây, b á nh quy có phomat, súp đ ó ng hộp. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là r ấ t cần thiết cho việc áp dụng tiêu chu ẩ n. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên b ả n được nêu. Đ ố i với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có). TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng đ ể phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp th ử . 3. Nguyên tắc M ẫ u được pha lo ã ng hoặc được chiết bằng nước. Nếu cần, dung d ịch mẫu có ch ứ a các chất tạo ngọt mạnh được tinh sạch bằng thuốc thử Carrez. Cách khác, các mẫu dạng rắn được hồ hóa trong dung dịch NaC l /HC l và chất tạo ngọt được chiết b ằ ng thẩm tách sử dụng cellulose axetat (ngưỡng khối lượng phân t ử xấp xỉ 12 000). Dịch chiết đã tinh sạch được phân tích bằng HPLC pha đảo cặp ion với detector UV . 4. Thuốc thử 4.1. Yêu c ầ u chung Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc ít nhất là nước loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác. Khi chuẩn bị các dung dịch, cần tính đến độ tinh khiết của các ch ấ t. 4.2. Metanol, loại dùng cho HPLC. 4.3. Axit clohydric, w (HC l ) » 36 % 1) . 4.4. Axit phosphoric, c (H 3 P O 4 ) = 5 mo l / l 2) . 4.5. Natri hydroxit, c (NaOH) = 5 mol/l. 4.6. Saccharin, w ( C 7 H 5 NO 3 S): 98,0 % đ ế n 101,0 % hoặc w ( C 7 H 4 NNa O 3 S.2H 2 O ): 99,0 % đến 101,0 %. 4.7. Neohesperidine-dihydrocha l cone, w (C 28 H 3 4 O 15 ) ≥ 99,0 %. 4.8. Acesulfame-K, w ( C 4 H 4 K NO 4 S) ≥ 99,0 %. 4.9. Aspartame, w ( C 14 H 18 N 2 O 5 ) ≥ 98 %. 4.10. Natri clorua. 4.11. Tetrapropylamoni hydro sul f at (TPrA-HSO 4 ) 4.12. Pha động HPLC 4.12.1. Pha động 1 (5 % metanol trong nước) Dùng pipet (5.4) lấy 50 ml metanol (4.2) cho vào bình đ ị nh mức 1 lít (5.2), thêm nước đến vạch. Thêm 0,24 g ± 0,01 g TPrA-HS O 4 (4.11) và lắc. Chỉnh đến pH 3,5 bằng cách thêm từng giọt natri hydroxit 5 mol/l (4.5) hoặc axit phosphoric 5 mol/l (4.4). 4.12.2. Pha động 2 (75 % metanol trong nước) Chuyển 750 ml metanol (4.2) từ ố ng đong sang b ì nh định mức 1 lít (5.2) thêm nước đến vạch. Thêm 0,24 g ± 0,01 g TPrA-HS O 4 (4.11) và lắc. Chỉnh đến pH 3,5 bằng cách thêm từng giọt natri hydroxit 5 mol/l (4.5) hoặc axit phosphoric 5 mol/l (4.4). 4.12.3. Pha động rửa giải đ ẳ ng dòng (15 % metanol trong nước) Chuyển 150 ml metanol (4.2) từ ố ng đong vào bình định mức 1 lít (5.2) và thêm nước đến vạch. Thêm 0,24 g ± 0,01 g TPrA-HSO 4 (4.11) và lắc. Ch ỉ nh đến pH 3,5 bằng cách thêm từng giọt natri hydroxit 5 mol/l (4.5) hoặc axit phosphoric 5 mol/l (4.4). Lọc các dung dịch qua bộ lọc (5.5) và siêu âm trong bể siêu âm (5.9) trong 30 min. 4.13. Dung dịch dùng để th ẩ m tách, 1,71 mol/l NaC l và 0,01 mo l / l HC l , tùy chọn. Hòa tan 100 g NaC l (4.10) và 1 ml axit HC l đặc (4.3) trong nước đựng trong bình định mức 1 lít (5.2). 4.14. Dung dịch ch ấ t thẩm tách, 0,01 mol/ l HC l , tùy chọn. Hòa tan 1 m l axit HC l đặc (4.3) trong nước đựng trong bình định mức 1 lít (5.2). 4.15. Dung dịch gốc acesulfame-K, aspartame, saccharin và neohesperidine-dihydrochalcone Chuẩn bị các dung dịch 1 000 mg/l c ủ a acesulfame-K (4.8) và aspartame (4.9) trong nước. Chuẩn bị dung dịch saccharin (4.6) tương ứng với imit tự do 1 000 mg/l (v í dụ: muối natri khan 1126 mg/l) trong nước và neohesperidine-dihydrochalcone 1 000 mg/l (4.7) trong hỗn hợp 50 % metanol (4.2) và 50 % nước. 4.16. Các dung dịch hiệu chuẩn hỗn hợp có chứa acesulfame-K, aspartame, saccharin và neohesperidine-dihydrochalcone Từ các dung dịch gốc (4.15) chu ẩ n b ị một dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp c ó chứa các chất tạo ngọt ở các nồng độ tương ứng với mức tối đa 150 % của giới hạn thích hợp (ví dụ: các mức tối đa theo quy định hiện hành) trong khi đó đ ã tính đến các bước pha loãng. VÍ DỤ: Các ch ấ t chu ẩ n hiệu chu ẩ n phép đo các ch ấ t tạo ngọt trong sản ph ẩ m tráng miệng từ sữa. Các giới hạn hiện hành của EU đối với bốn chất tạo ngọt trong các sản phẩm tráng miệng chứa sữa là: - acesulfame-K: 350 mg/kg; - saccharin: 100 mg/kg (imit tự do); - aspartame: 1 000 mg/kg; - neohesperidine-dihydrochalcone 50 mg/kg. 15 0 % của các giới hạn trên là: - acesulfame-K: 525 mg/kg; - saccharin: 1 5 0 mg/kg (imit tự do); - aspartame: 1 5 00 mg/kg; - neohesperidine-dihydrochalcone 75 mg/kg. Các chất tạo ng ọ t từ 20 g mẫu được chiết trong 200 m l chất thẩm tách (độ pha loãng 10:1). Do đó, việc hiệu chuẩn cần được thực hiện đối với các dịch chiết có chứa các nồng độ chất tạo ngọt sau đây: - acesulfame-K: 50 mg/ l ; - saccharin: 1 5 mg/ l (imit tự do); - aspartame: 1 50 mg/ l ; - neohesperidine-dihydrochalcone 7 mg/ l . Để hiệu chuẩn bảy điểm, lấy các thể tích từ các dung dịch gốc 1 000 mg/l (4.15) như trong Bảng 1 và thêm nước đến vạch 50 ml trong bình định mức (5.2). Bảng 1 - Chuẩn b ị đường chuẩn Acesulfame-K ml Saccharin m l Aspartame ml Neohesper i dine-dihydrochalcone m l 1 0,25 75 0,75 50 2 0,50 150 1,50 100 3 0,75 225 2,25 150 4 1,00 300 3,00 200 5 1,50 450 4,50 250 6 2,00 600 6,00 300 7 2,50 750 7,50 350 B ả ng 2 đưa ra nồng độ chất tạo ngọt trong mỗi dung dịch hiệu chuẩn pha loãng sau: Bảng 2 - Nồng độ chất tạo ngọt trong mỗi dung dịch hiệu chuẩn Acesulfame-K mg/l Saccarin (imit tự do) mg/l Aspartame mg/ l Neohesperidine-dihydrochalcone mg/l 1 5 1,5 15 1 2 10 3 30 2 3 15 4,5 45 3 4 20 6 60 4 5 30 9 90 5 6 40 12 120 6 7 50 15 150 7 4.17. Mẫu trắng và m ẫ u thêm chuẩn để xác định độ thu hồi Nếu thực hiện chuẩn bị mẫu bằng th ẩ m tách thì cần chuẩn bị mẫu đồng nhất của cùng loại mẫu thử. Chia mẫu thử thành hai phần. Bổ sung một lượng đã biết các chất tạo ngọt vào một phần (tính theo khối lượng với chất rắn hoặc thể tích với dung dịch là phù hợp). 4.18. Dung dịch Carrez số 1 Hòa tan 15 g kali hexacyano f erat (II) (K 4 [ Fe ( CN) 6 ] × 3H 2 O ) trong nước và pha lo ã ng đến 100 ml. 4.19. Dung dịch Carrez s ố 2 Hòa tan 30 g kẽm sul f at (ZnS O 4 × 7H 2 O ) trong nước và pha loãng đến 100 ml. 5. Thiết bị, dụng cụ 5.1. Yêu cầu chung Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thủy tinh của phòng thử nghiệm thông thường và cụ th ể như sau: 5.2. Bình định mức, d ung tích 50 ml và nhỏ hơn. 5.3. Lọ đựng mẫu dùng cho HPLC, trong suốt, dung tích 2 ml. 5.4. Pipet, dung tích 50 ml và nhỏ hơn. 5.5. Bộ lọc thủy tinh dùng cho pha động. 5.6. Chai có nắp vặn, dung tích 250 ml. 5.7. Phễu thủy tinh. 5.8. Bộ đồng hóa, Ultra Turrax® hoặc loại tương đương. 5.9. Bể siêu â m. 5.10. Bộ khuấy từ thích hợp để khuấy (hoặc máy trộn trục lăn hoặc một vài dụng cụ khác thích hợp cho việc khuấy trộn chất thẩm tách). 5.11. Thanh nam châm mini. 5.12. Bộ lọc màng xyranh, 13 mm, cỡ lỗ 0,45 m m (PVDF hoặc tương đương). 5.13. Bộ lọc pha động, đường kính 4,8 cm, c ỡ lỗ 0,45 m m. 5.14. Ố ng thẩm tách, bằng cellulose axetat, chiều rộng cắt ngang 4,8 cm; ngư ỡ ng khối lượng phân tử xấp xỉ 12 000, tùy chọn. 5.15. Máy đo pH. 5.16. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), được trang bị cột phân tích (5.17), hệ thống bơm gradient, bộ lấy mẫu tự động, detector (UV) (có thể phát hiện ở bước sóng 220 nm đến 280 nm, tốt nhất là detector mảng diot) và được trang b ị máy ghi và/hoặc máy tích phân để có thể đo chi ề u cao và diện t í ch pic. 5.17. Cột HPLC pha đảo, ví dụ: ODS3 10 m m; 250 mm x 3,2 mm hoặc loại tương tự (cỡ hạt 10 m m, kích thước 250 mm x 3,2 mm). CHÚ TH Í CH: Có thể sử dụng cột có các kích thước khác với quy định nêu trên (v í d ụ: đường k í nh 3,0 mm đến 4,6 mm, dài từ 100 mm đến 250 mm). Các thông số tách (tốc độ dòng, th ể tích bơm) cần đ ả m bảo cho k ế t quả t ương tự. 5.18. S ự phù hợp của hệ thống HPLC Các chất tạo ngọt acesulfame-K, saccharin, aspartame và neohesperidine-dihydrochalcone cần được phân giải (Rs = 1,3) ra khỏi nhau và ra khỏi các thành phần khác của nền mẫu. Hai thành phần thường gặp phải là các cặp tới hạn: (a) acesu l fame-K với theobromine và (b) aspartame với caffeine. 6. Cách tiến hành 6.1. Chuẩn bị mẫu th ử không thẩm tách 6.1.1. Các s ả n ph ẩ m dạng lỏng trong suốt như nước chanh, nước cola hoặc đ ồ u ố ng Pha lo ã ng 20 ml mẫu thử bằng nước đựng trong bình định mức 100 ml. Lọc dung dịch qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,45 m m trước khi bơm. 6.1.2. Các sản phẩm dạng l ỏ ng màu đục nh ư nước trái cây hoặc đ ồ u ố ng từ sữa có bổ sung hương liệu Pha loãng 20 ml mẫu thử đã đồng nh ấ t trong 50 ml nước đựng trong bình đ ị nh mức 100 ml, th ê m 2 ml dung dịch thuốc th ử Carrez số 1 (4.18), trộn và thêm 2 ml dung dịch thuốc thử Carrez số 2 (4.19). L ắ c mạnh và để yên dung dịch 10 min ở nhiệt độ phòng . Pha loãng bằng nước đến vạch. Lọc dung dịch qua gi ấ y lọc gấp nếp, loại b ỏ 10 ml dịch lọc đ ầ u tiên. Cho dịch lọc đi qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,45 m m trước khi bơm dung dịch mẫu thử vào hệ thống HPLC. Để yên cho d ung dịch kết tủa hết, nếu chất không tan không chứa chất béo có trong thể tích mẫu (trường hợp này là 20 ml) vượt quá khoảng 3 g, thì nên ly tâm hỗn hợp mẫu đã lọc 10 min ở ít nhất 1 400g trước khi lọc dung dịch sang bình định mức 100 ml. Rửa phần kết tủa hai lần với nước và ly tâm lại, mỗi lần thu lấy phần nổi phía trên cho vào b ì nh đ ị nh mức 100 ml và pha loãng dung dịch bằng nước đến vạch. Quy tr ì nh này cũng c ó thể thực hiện khi lượng chất không tan ít hơn 3 g. 6.1.3. Mứt nhuyễn, mứt, mứt quả nghi ề n và các sản phẩm có liên quan, trừ trái cây đông lạnh Cân khoảng 20 g mẫu đồng nhất, chính xác đến 1 mg, cho vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 60 ml nước và đặt bình cầu vào bể siêu âm ở 40 ° C trong 20 min. Nhiệt độ không được vượt quá 40 ° C vì aspartame có thể bị phân hủy. Làm nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng. Thêm 2 ml dung dịch Carrez số 1 (4.18), trộn và thêm 2 ml dung dịch Carrez số 2 (4.19). Lắc mạnh và để yên dung dịch ở nhiệt độ phòng 10 min. Pha loãng bằng nước đến vạch. Lọc dung d ịch qua giấy lọc gấp nếp và loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu tiên. Cho dịch lọc đi qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,45 m m trước khi bơm dung dịch mẫu v à o hệ th ố ng HPLC. Đ ể yên cho dung dịch kết t ủ a hết, nếu chất không tan không chứa chất béo có trong khối lượng mẫu ban đầu vượt quá khoảng 3 g, thì nên ly tâm hỗn hợp mẫu 10 min ở ít nhất 1 400g trước khi lọc dung dịch sang bình định mức 100 ml. Rửa phần kết tủa hai lần với nước và ly tâm lại, mỗi lần thu l ấ y phần nổi phía trên cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng dung dịch b ằ ng nước đến vạch. Quy tr ì nh này cũng có thể thực hiện khi lượng chất không tan ít hơn 3 g. 6.1.4. Sản phẩm bán đặc và sản phẩm đặc như món tr áng miệng chứa phomat, sữa chua yoghurt hoặc salad, trừ bột custard Cân từ 10 g đến 20 g, chính xác đến 1 mg, mẫu th ử đã đồng hóa kỹ, cho vào b ì nh định mức 100 ml. Thêm khoảng 50 ml nước và đặt b ì nh vào bể siêu âm ở 40 ° C trong 20 min. Không để nhiệt độ vượt quá 40 ° C v ì aspartame có thể bị phân hủy. Làm nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng. Thêm 2 ml dung dịch Carrez số 1 (4.18), trộn, thêm tiếp 2 ml dung dịch Carrez số 2 (4.19). Lắc mạnh và để yên dung dịch ở nhiệt độ phòng trong 10 min. Pha loãng b ằ ng nước đến vạch. Lọc dung dịch qua giấy lọc gấp nếp và loại bỏ 10 ml dịch lọc đ ầ u tiên. Trong trường hợp nền mẫu phức hợp, dùng cột chiết pha rắn (ví dụ: cột C18-SPE) tinh sạch thêm dung dịch để bảo vệ cột chiết, v ì các chất màu, hương liệu và chất béo không thể tách được bằng thuốc th ử Carrez. Trong trường hợp này, cho 2 ml dịch lọc đã làm trong vào cột, đã được hoạt hóa bằng 3 ml metanol (4.2) và 20 ml nước, rửa giải b ằ ng khoảng 20 ml pha động (4.12). Cho dịch lọc đi qua bộ lọc màng c ỡ lỗ 0,45 m m trước khi bơm dung dịch mẫu th ử vào hệ thống HPLC. Để yên cho dung dịch kết tủa hết, n ế u chất không tan không chứa chất béo có trong khối lượng mẫu ban đầu vượt quá khoảng 3 g, thì nên ly tâm hỗn hợp mẫu 10 min ở ít nh ấ t 1 400g trước khi lọc dung dịch sang bình định mức 100 ml. R ử a phần kết tủa hai lần với nước và ly tâm lại, mỗi lần thu lấy phần nổi phía tr ê n cho vào b ì nh định mức 100 ml và pha lo ã ng dung dịch bằng nước đến vạch. Quy trình này cũng có thể thực hiện khi lượng chất không tan ít hơn 3 g. 6.1.5. Bột custard Cân khoảng 10 g mẫu thử, ch í nh xác đến 1 mg, cho vào b ì nh định mức 500 ml. Thêm khoảng 400 ml nước và thực hiện như trên, nghĩa là th ê m 6 ml dung dịch thuốc th ử Carrez số 1 (4.18), trộn, thêm 6 ml dung dịch thuốc thử Carrez số 2 (4.19) để làm trong. Để yên cho dung dịch kết tủa hết, nếu chất không tan không chứa ch ấ t béo c ó trong khối lượng mẫu ban đầu vượt quá khoảng 3 g, th ì nên ly tâm hỗn hợp mẫu 10 min ở ít nh ấ t 1 400g trước khi lọc dung dịch sang bình đ ị nh mức 500 ml. Rửa phần kết tủa hai lần với nước và ly tâm lại, mỗi lần thu lấy phần n ổ i phía trên cho vào b ì nh định mức 500 m l và pha loãng dung dịch bằng nước đến vạch. Quy trình này cũng có thể thực hiện khi lượng chất không tan ít hơn 3 g. 6.2. Chuẩn bị mẫu thử có thẩm tách 6.2.1. M ẫ u dạng bán rắn và mẫu dạng rắn Cân 20 g mẫu đồng nhất cho v à o cốc mỏ 100 ml. Thêm 20 g dung dịch thẩm tách (4.13) và trộn kỹ để tạo hồ nhão . Cắt một đoạn 25 cm chiều dài ống thẩm tách (5.14) và đặt vào nước lạnh 20 min để mềm ra. Chuẩn bị ống th ẩ m tách bằng cách thắt nút một đầu. Nạp mẫu vào ống th ẩ m tách , nếu cần , sử dụng dung dịch thẩm tách (4.13) để chuyển mẫu vào. Thắt nút đầu còn lại càng sát với mẫu càng tốt. Cắt b ỏ phần ống thừa. Đặt túi đựng mẫu vào chai có nắp vặn (5.6) và thêm 200 ml (V 1 ) dung dịch chất thẩm tách (4.14). Đặt thêm thanh nam châm (5.11) vào. Đặt chai này lên bộ khuấy từ (5.10) đảm bảo rằng tất cả mẫu ngập trong dung dịch thẩm tách và để cho thẩm tách trong 40 h. Cách khác, có thể đặt chai lên máy tr ộ n lăn (hoặc thiết bị khuấy trộn khác) và th ẩ m tách trong 40 h. Lọc dịch th ẩ m tách qua bộ lọc màng xyranh (5.12). 6.2.2. Nước qu ả Đong 20 ml mẫu đã lắc trộn kỹ cho vào cốc có mỏ , thêm 20 ml dung dịch th ẩ m tách (4.13). Lắc kỹ. Cho vào ống th ẩ m tách (5.14) và để cho thẩm tách 24 h như trên. Lọc dịch thẩm tách qua bộ lọc màng xyranh (5.12). 6.3. Phân tích bằng HPLC Bơm dung dịch mẫu thử đã chuẩn bị trong 6.1 hoặc 6.2 vào hệ thống HPLC (5.16). Các gradient HPLC sau đây đã chứng minh là phù hợp. Bảng 3 - Gradient HPLC I , tốc độ dòng 0,8 ml/min Thời gian (min) Pha động 1 (%) Pha động 2 (%) 0 100 0 30 0 100 35 0 100 40 100 0 Sử dụng các điều kiện trong Bảng 3, cần cài đặt bước sóng ở 220 nm từ 0 min đến 25 min để th ẩ m tách acesulfame-K, aspartame và saccharin . C ần cài đặt lại bước sóng ở 280 nm để phân tích neohesperidine-dihydrochalcone. Gradient có thể dài hơn để tách tốt hơn. Bảng 4 - Gradient HPLC II, tốc độ dòng 0,8 ml/min Thời gian (min) Pha động 1 (%) Pha động 2 (%) 0 100 0 25 50 50 30 0 100 35 0 100 40 100 0 Nếu chỉ phân t í ch acesulfame-K, aspartame và saccharin th ì có thể áp dụng các điều kiện đẳng dòng (4.12.3). 6.4. Diễn giả i dữ liệu sắc k ý Nhận biết acesulfame-K, aspartame, saccharin và neohesperidine-dihydrochalcone trong mẫu bằng cách so sánh thời gian lưu của các chất tạo ngọt quan sát được khi phép phân tích dung dịch chuẩn (4.16) được phân tích trong cùng mẻ mẫu với thời gian lưu của hợp chất rửa giả i trong phép phân tích mẫu. Đo diện tích pic quan sát được của từng chất tạo ngọt trong mỗi dung dịch. Nếu diện tích pic của chất phân tích bất kỳ trong dịch chiết mẫu lớn hơn đặc trưng diện tích pic của dung dịch chuẩn có nồng độ cao nh ấ t thì cần pha lo ã ng dịch chiết mẫu bằng dung dịch th ẩ m tách (4.14) và phân tích lại dịch chiết đ ã pha loãng. Dựng đường chuẩn đối với từng chất tạo ngọt từ các kết quả phân tích các dung dịch chuẩn (4.16). Nồng độ của dung dịch chuẩn được thể hiện trên trục x và đặc trưng diện tích pic thể hiện trên trục y. Nếu các kết quả thu được của các dung d ị ch chuẩn l à tuyến tính và nồng độ của chất tạo ngọt nằm giữa nồng độ cao nhất và thấp nhất của các dung dịch chuẩn thì đường chuẩn có thể được dùng để tính nồng độ chất tạo ngọt trong dịch chiết mẫu. Xác định độ dốc (g) và giao điểm (I) của đường chu ẩ n. 7. Tính kết quả 7.1. Tính hàm lượng chất tạo ngọt có trong mẫu Tính phần khối lượng, w , bằng miligam trên kilogam (mg/kg) hoặc nồng độ kh ố i lượng, p , bằng miligam trên lít mẫu (mg/l), của chất tạo ngọt theo Công thức (1) sau đây: w hoặc p = (1) Trong đó: A là đặc trưng diện tích pic; I l à giao điểm của đường chuẩn; g l à độ d ố c của đường chuẩn; m 0 là khối lượng mẫu thử, tính bằng mililit (ml) hoặc gam (g); F là hệ số pha loãng. 7.2. Độ thu h ồ i ch ấ t tạo ngọt Tính độ thu hồi chất tạo ng ọ t từ mẫu thêm chu ẩ n theo Công thức (2) và C ô ng thức (3): (2) Nếu cần, hiệu ch í nh các kết quả đo độ thu hồi sử dụng Công thức (3): (3) Trong đó: C là kết quả chưa hiệu chính của phép đo nồng độ chất tạo ngọt; C F là kết quả đo nồng độ chất tạo ngọt trong mẫu thêm chuẩn; C B là kết quả đo nồng độ chất tạo ngọt trong mẫu trắng được dùng để tạo mẫu thêm chuẩn; C S là nồng độ chất tạo ngọt đã b ổ sung trong mẫu thêm chuẩn; R là độ thu hồi chất tạo ngọt từ mẫu thêm chuẩn được biểu thị theo tỷ lệ phần trăm; C R là kết quả đo độ thu hồi đã hiệu chính 7.3. Biểu thị kết quả Đối với các mẫu được chuẩn bị bằng thẩm tách thì dữ liệu của mẫu l à độ thu hồi đã hiệu chính sử dụng giá trị độ thu hồi thu được bằng cách đo các chất tạo ngọt trong mẫu thêm chu ẩ n được phân tích cùng thời điểm với mẫu thử. 8. Độ chụm 8.1. Yêu cầu chung Chi tiết của ph é p thử liên phòng về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục C . Các dữ liệu thu được từ phép nghiên cứu cộng tác này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ chất phân tích và các nền mẫu khác với các d ả i nồng độ chất phân tích và các nền mẫu nêu trong Phụ lục C . 8.2. Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ, thu được khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, s ử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn như nhau, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r. Các giá trị đối với acesulfame-K là: Đồ uống từ nước = 331 mg/l r = 21,8 mg/l Đồ uống từ trái cây = 219 mg/l r = 15,3 mg/l Bánh quy chứa phomat = 239 mg/kg r = 6,2 mg/kg Súp đóng hộp = 95,9 mg/kg r = 7,9 mg/kg Đồ uống chứa socola uống liền = 85,6 mg/l r = 20,8 mg/ l Các giá trị đối với aspartame là: Đồ uống từ nước = 567 mg/l r = 43,5 mg/l Đồ uống từ trái cây = 610 mg/l r = 47,4 mg/l Bánh quy chứa phomat = 501 mg/kg r = 22,1 mg/kg Súp đóng hộp = 96,9 mg/kg r = 11,8 mg/kg Đồ uống chứa socola uống liền = 153 mg/l r = 43,4 mg/l Các giá tr ị đối với saccharin là: Đồ uống từ nước = 69,6 mg/ l r = 5,4 mg/l Đồ uống từ trái cây = 91,4 mg/l r = 14 mg/ l Bánh quy chứa phomat = 83,1 mg / kg r = 7,4 mg/kg Súp đóng hộp = 96,7 mg/kg r = 4,5 mg/kg Các giá trị đối v ớ i neohesperidine-dihydrochalcone là: Đồ uống từ nước = 27,3 mg/ l r = 3,8 mg/l Đồ uống từ trái cây = 34,1 mg/l r = 5,2 mg/ l Súp đóng hộp = 56,5 mg/kg r = 23 ,5 mg/kg 8.3. Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa hai k ế t quả thử riêng rẽ, thu được b ở i hai phòng thử nghiệm khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, không quá 5 % các trường hợp vư ợt quá giới hạn tái lập R. Các giá trị đối với acesulfame-K là: Đồ uống từ nước = 331 mg/ l R = 56,9 mg/l Đồ uống từ trái cây = 219 mg/l R = 46,4 mg/l Bánh quy chứa phomat = 239 mg/kg R = 103 mg/kg Súp đóng hộp = 95,9 mg/kg R = 18,2 mg/kg Đồ u ố ng ch ứ a socola uống liền = 85,6 mg/l R = 40,0 mg/l Các giá trị đối với aspartame là: Đồ uống từ nước = 567 mg/l R = 161 mg/ l Đồ uống từ trái cây = 610 mg/l R = 207 mg/l Bánh quy chứa phomat = 501 mg/kg R = 217 mg/kg Súp đóng hộp = 96,9 mg/kg R = 37,4 mg/kg Đ ồ uống chứa socola uống liền = 153 mg/l R = 106 mg/l Các giá trị đối với saccharin là: Đồ uống từ nước = 69,6 mg/l R = 17,5 mg/ l Đồ uống từ trái cây = 91,4 mg/l R = 31,2 mg/l Bánh quy chứa phomat = 83,1 mg/kg R = 44,4 mg/kg Súp đ ó ng hộp = 96,7 mg/kg R = 16,9 mg/kg Các giá trị đ ố i với neohesperidine-dihydrochalcone là: Đồ uống từ nước = 27,3 mg/ l R = 9,9 mg/ l Đồ uống từ trái cây = 34,1 mg/l R = 20,0 mg/l Súp đóng hộp = 56,5 mg/kg R = 34,9 mg/kg 9. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ các thông tin sau: - mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; - viện dẫn ti ê u chuẩn này và phương pháp đ ã sử dụng; - ngày và phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu biết); - ngày nhận mẫu; - ngày th ử nghiệm; - kết qu ả thu được và đơn vị biểu thị; - các điểm cụ thể quan sát được trong khi thử nghiệm; - mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, có thể ảnh hư ở ng đến kết quả. Ghi lại tất cả các dữ liệu định tính và định lượng. Trừ khi có các yêu cầu khác, tất cả các kết quả phải được hiệu chính để phục hồi. Báo cáo phải tr ì nh bày các kết quả đã được hiệu chính để phục hồi và cung cấp các giá trị của dữ liệu này. Phụ lục A (Quy định) Ví dụ về các điều kiện sắc ký cho kết quả thỏa đáng A.1 . Cột sắc ký Kiểu: Pha đảo (RP) Pha tĩnh v à chiều dài cột: cỡ hạt h ì nh cầu 10 m m dùng cho cột dài 250 mm (phù hợp với các tiêu chí thực hành đã quy định) Đường kính trong: Cột bảo vệ: Ví dụ: 3,2 mm nên dùng (tùy chọn) Partisil ODS 3 3) A.2 . Tốc độ dòng: 0,8 ml/min A.3 . Thể tích bơm: từ 10 m l đến 20 m l A.4 . Detector: UV phát hiện ở bước sóng 220 nm từ 0 min đến 25 min để phân tích acesulfame-K, aspartame, saccharin và ở bước sóng 280 nm để phân tích neohesperidine dihydrochalcone. A.5 . Pha động Phân tích gradient như 6.3. Phụ lục B (Tham khảo) Sắc ký đồ CHÚ D Ẫ N 1. Acesulfeme-K 2. Saccharin 3. Aspartame 4. Neohesperidine-dihydrochalcone Hình B.1 - Sắc ký đồ của dung dịch chu ẩ n các ch ất tạo ngọt CHÚ D Ẫ N 1. Acesulfame-K 2. Saccharin 3. Caffeine 4. Aspartame 5. Neohesperidine-dihydrochalcone Hình B.2 - Sắc ký đồ của các chất tạo ngọt trong đồ uống có chứa ca ff eine Phụ lục C (Tham khảo) Dữ liệu về độ chụm Các dữ liệu trong Bảng C.1, C.2 và C.3 thu được từ phép thử liên phòng thực hiện theo quy định của IUPAC Harmonised Protocol [2] do Vụ Môi trường, Thực phẩm và Nông nghiệp (DEFRA), Phòng thí nghiệm Khoa học Trung tâm (CSL) thực hiện trên nước uống, nước trái cây, bánh quy ch ứ a phomat, súp đóng hộp và đồ uống chứa socola uống liền. Mười bảy phòng thử nghiệm tham gia trong các phép thử liên phòng. Các đơn vị tham gia vào phép thử sơ bộ để đánh giá mọi trở ngại c ó thể xảy ra trước khi tham gia xác định chính thức. Trong suốt quá trình đánh giá sơ bộ, các đơn vị tham gia được giao ba loại mẫu thử: a) mẫu thử của hỗn hợp sản phẩm sữa hoặc sản phẩm bánh có chứa chất béo; b) các mẫu kép được bổ sung các chất tạo ngọt và c) mẫu trắng. Mẫu trắng được chia thành hai phần cho các đơn vị tham gia và một phần được dùng làm mẫu trắng. Một phần mẫu trắng còn lại được thêm các chất tạo ngọt để đánh giá độ thu hồi. Trong quá trình đánh giá thử nghiệm ch í nh thức, các đơn vị tham gia được nh ậ n mười mẫu thử (năm mẫu kép mù) từ nước uống, nước trái cây, bánh quy chứa phomat, súp và bột socola nóng để phân t í ch s ử dụng phương pháp nêu trong Điều 6. Bảng C.1 - Acesulfame-K N ướ c uống N ướ c trái cây Bánh quy chứa phomat Súp đóng hộp Đ ồ uống chứa socola uống liền N ă m thử nghiệm 2003 2003 2003 2003 2003 Số phòng thử nghiệm 17 17 17 17 17 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 2 S ố phòng thử nghiệm còn lại sau khi loại trừ các ngoại l ệ 15 15 13 14 13 Số phòng thử nghiệm ngoại lệ 2 0 2 3 1 S ố lượng kết quả được ch ấ p nhận 30 30 26 28 26 Giá trị trung b ì nh , mg/kg hoặc mg/l 331 219 239 95,9 85,6 Độ lệch chu ẩ n lặp lại s r , mg/kg hoặc mg/l 7,8 5,5 2,2 2,8 7,4 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r % 2,4 2,5 0,9 3,0 8,7 Giới hạn lặp lại, r [mg/kg hoặc mg/l] 21,8 15,3 6,2 7,9 20,8 Độ l ệ ch chuẩn tái lập s R , mg/kg hoặc mg/l 20,3 16,6 36,9 6,4 14,3 Độ lệch chu ẩ n tương đối tái lập, RSD R , % 6,1 7 , 1 15,5 6,8 16,7 Giới hạn tái lập, R ( R = 2,8 x s R ), mg/kg hoặc mg/l 56,9 46,4 103 18,2 40,0 Giá trị Horrat 0,9 1,1 2,2 0 , 8 2,0 Bảng C.2 - Aspartame N ước uống Nước trái cây Bánh quy chứa phomat Súp đóng hộp Đ ồ u ố ng chứa socola uống liền N ă m thử nghiệm 2003 2003 2003 2003 2003 Số phòng thử nghiệm 17 17 17 17 17 Số lượng mẫu thử 2 2 2 3 2 S ố phòng thử nghiệm còn lại sau khi loại trừ các ngoại l ệ 16 16 11 13 12 Số phòng thử nghiệm ngoại lệ 1 1 2 3 3 S ố lượng kết quả được ch ấ p nhận 32 32 22 26 24 Giá trị trung b ì nh , mg/kg hoặc mg/l 567 610 501 96,9 153 Độ lệch chu ẩ n lặp lại s r , mg/kg hoặc mg/l 15,5 16,9 7,9 4 , 2 15,5 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r % 2,73 2,8 1,6 4 , 4 10,1 Giới hạn lặp lại, r [mg/kg hoặc mg/l] 43 , 5 47,4 22,1 11 , 8 43,4 Độ l ệ ch chuẩn tái lập s R , mg/kg hoặc mg/l 57,6 74,1 77,6 13,4 37,8 Độ lệch chu ẩ n tương đối tái lập, RSD R , % 10,2 12,1 15,5 14,1 24,7 Giới hạn tái lập, R ( R = 2,8 x s R ), mg/kg hoặc mg/l 161 207 217 37,4 106 Giá trị Horrat 1 , 7 2,0 2,5 1,7 3 , 3 Bảng C.3 - Saccharin Nước uống Nước trái cây Bánh quy chứa ph o mat Súp đóng hộp Năm thử nghiệm 2003 2003 2003 2003 Số phòng thử nghiệm 17 17 17 17 Số lượng mẫu thử 2 2 2 2 S ố phòng thử nghiệm còn lại sau khi loại trừ các ngoại l ệ 15 14 8 12 Số phòng thử nghiệm ngoại lệ 2 1 1 3 S ố lượng kết quả được ch ấ p nhận 30 28 16 24 Giá trị trung b ì nh , mg/kg hoặc mg/l 69,6 91,4 83 , 1 96 , 7 Độ lệch chu ẩ n lặp lại s r , mg/kg hoặc mg/l 1 , 9 1 , 4 2,6 1,6 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r % 2 , 8 1 , 5 3 , 2 1 , 7 Giới hạn lặp lại, r [mg/kg hoặc mg/l] 5,4 3,9 7,4 4 , 5 Độ l ệ ch chuẩn tái lập s R , mg/kg hoặc mg/l 6,2 11,1 15,9 6 , 0 Độ lệch chu ẩ n tương đối tái lập, RSD R , % 9,0 12,2 19,1 6,2 Giới hạn tái lập, R ( R = 2,8 x s R ), mg/kg hoặc mg/l 17 , 5 31,2 44,4 16,9 Giá trị Horrat 1 , 1 1,5 2,3 0,8 Bảng C.4 - Neohesperidine-dihydrochalcone N ướ c uống N ư ớc trái cây Súp đóng hộp N ă m thử nghiệm 2003 2003 2003 Số phòng thử nghiệm 17 17 17 Số lượng mẫu thử 2 2 2 S ố phòng thử nghiệm còn lại sau khi loại trừ các ngoại l ệ 16 15 14 Số phòng thử nghiệm ngoại lệ 1 0 0 S ố lượng kết quả được ch ấ p nhận 32 30 28 Giá trị trung b ì nh , mg/kg hoặc mg/l 27,3 34,1 56,5 Độ lệch chu ẩ n lặp lại s r , mg/kg hoặc mg/l 1 , 4 1,8 8,4 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD r % 5 , 0 5,4 14,9 Giới hạn lặp lại, r [mg/kg hoặc mg/l] 3,8 5,2 23,5 Độ l ệ ch chuẩn tái lập s R , mg/kg hoặc mg/l 3,6 7 , 1 12,5 Độ lệch chu ẩ n tương đối tái lập, RSD R , % 5,0 20,9 22,0 Giới hạn tái lập, R ( R = 2,8 x s R ), mg/kg hoặc mg/l 9,9 20,0 34,9 Giá trị Horrat 1,3 2 , 2 2,5 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] W illetts, P ., Anderson, S ., Brereton, P ., and Wood, R.: Determination of intense s w eeteners in foodstuffs. Collaborative trial, J Assoc Publ Analysts, 1996, 32, 53 - 97 [2] IUPAC Harmonised Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of method-Performance Studies. Pure & Appl. Chem., Vol. 67, No., 2, pp.331-343 1) w là khối lượng. 2) c là nồng độ chất. 3) Partisil ODS 3 l à ví dụ về s ả n ph ẩ m thích hợp c ó bán sẵn. Thông tin n à y được đưa ra để thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn mà không ấn định sử dụng s ả n ph ẩ m này.