TCVN11039-2:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11039-2:2015 về Phụ gia thực phẩm - Phương pháp phân tích vi sinh vật - Phần 2: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật đếm đĩa xoắn TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 11039-2:2015 PHỤ GIA THỰC PHẨM- PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 2: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM ĐĨA XOẮN Food aditive - Microbiological analyses - Part 2: Determination of total aerobic count by spiral p l ate count technique Lời nói đầu TCVN 11039-2:2015 được xây dựng trên cơ s ở tham khảo JECFA 2006, Combined compendium of f oo d a d ditive speci fi cations, Volume 4: Analytical me t hods, test procedures and laboratory solutions used by and r ef erenced in the food additive speci f ications ; TCVN 11039-2:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F4 Gia vị và phụ gia thực phẩm biên soạn , Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố; Bộ tiêu chuẩn TCVN 11039 Phụ gia thực ph ẩ m - Phương pháp phân tích vi sinh vật gồm các ph ầ n sau: - TCVN 11039-1:2015, Phần 1: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật đếm đĩa; - TCVN 11039-2:2015, Phần 2: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật đếm đ ĩ a xoắn; - TCVN 11039-3:2015, Phần 3: Phát hiện và định lượng coli f orm và E. coli bằng kỹ thuật đếm số có xác suất l ớ n nhất (Phương ph á p chuẩn); - TCVN 11039-4:2015, Phần 4: Phát hiện và đị nh lượng coli f orm và E. coli bằng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (Phương pháp thông dụng); - TCVN 11039-5:2015 , Phần 5: Phát hiện Salmonella; - TCVN 11039-6:2015, Phần 6: Phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc; - TCVN 11039-7:2015, Phần 7: Phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật đếm số có xác su ấ t lớn nhất (MPN); - TCVN 11039-8:2015, Phần 8: Định lượng nấm men và n ấ m mốc. PHỤ GIA THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT - PHẦN 2: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM ĐĨA XOẮN Food additives - Microbiologica l analyses - Part 2: Determination of total aerobic count by spiral plate count technique 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng vi sinh vật hiếu khí có trong phụ gia thực phẩm bằng kỹ thuật đếm đĩa xoắn (SPLC). 2 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây: 2.1 Vi sinh vật hiếu khí (aerobic micro-organisms) Vi khu ẩ n, nấm men và nấm mốc h ì nh thành khuẩn lạc có thể đếm được, phát triển trong điều kiện hiếu khí theo quy định trong tiêu chuẩn này. 3 Nguyên tắc Phương pháp này sử dụng đĩa cơ học để cấy mẫu dạng lỏng vào đĩa thạch xoay. Thể tích mẫu được phân phối giảm khi kim cấy di chuyển từ tâm đĩa ra mép đĩa đang xoay. Nồng độ vi sinh vật được xác định bằng cách đếm các khu ẩ n lạc tại một phần của đĩa Petri, là phần có thể đếm được và chia số đếm này cho thể tích th í ch hợp. Một lần cấy xác định mật độ vi sinh vật từ 500 đến 500 000 trên mỗi mililit. Đối với các mật độ vi sinh vật cao hơn, có thể pha loãng tiếp. 4 Môi trường cấy và dịch pha loãng 4.1 Dung dịch natri hypoclorit (NaOC l ) thương mại, nồng độ khoảng 5 %. 4.2 Dung d ị ch natri hypoclorit (NaOC l ) thương mại , n ồ ng độ 5,25 %. 4.3 Nư ớ c pha loãng vô trùng. 4.4 Môi trường thạch để đếm đ ĩa (PCA) 4.4.1 Thành ph ầ n Trypton 5,0 g Chất chiết n ấ m men 2,5 g Dextrose 1,0 g Thạch 15g Nước 1 000 ml 4.4.2 Chuẩn bị H òa tan các thành phần trên trong nước. Có thể đun nóng nước để h òa tan các thành phần. Thêm thạch và đun đến sôi, th ỉ nh thoảng khu ấ y cho đến khi tan hết thạch. Ph â n phối môi trường vào các ống hoặc b ì nh thủy tinh có d ung tích thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (5.1) ở 121 ° C . Ch ỉ nh pH sao cho sau khi khử trùng, pH đạt 7,0 ± 0,2, n ế u cần. 5 Thiết bị, dụng cụ Có thể dùng dụng cụ th ủy tinh sử dụng một lần thay thế cho các dụng cụ th ủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp. Sử dụng các thi ế t bị c ủ a phòng thử nghiệm vi sinh và cụ thể là: 5.1 Thiết b ị đ ể khử trùng kh ô (t ủ sấy) hoặc để khử trùng ướt (n ồ i hấp áp lực). 5.2 Tủ ấm, có khả n ă ng hoạt động ở 35 ° C ± 1 ° C . 5.3 Đĩa Petri, b ằ ng nhựa hoặc thủy tinh, có chiều cao 15 mm, đư ờ ng kính 100 mm hoặc 150 mm. 5.4 Pipet, có dung t í ch danh đ ị nh 1 ml, 5 ml và 10 ml, được chia vạch đến 0,1 ml. 5.5 pH mét, có độ chính xác ± 0,1 đơn vị pH ở 25 ° C . 5.6 Nhiệt kế, c ó thể đo với khoảng nhiệt độ thích hợp. 5.7 Thiết bị c ấ y xoắn. 5.8 Lưới đ ế m (xem H ì nh 1) Sử dụng cùng lưới đếm cho cả đĩa Petri 100 mm và đĩa Petri 150 mm. Sử d ụng màn chắn đối với đĩa 100 mm. Lưới đếm được chia thành tám phần hình quạt b ằ ng nhau; mỗi hình quạt được chia b ở i bốn dây cung đánh số 1, 2, 3 v à 4 t ừ mép ngoài của lưới đếm. Các đường kẻ b ê n trong các h ì nh cung được bổ sung để thuận tiện cho việc đếm. Hình vành khăn là vùng n ằ m giữa hai d â y cung bên trong h ì nh quạt, số lượng vùng đã đ ếm (ví dụ: 3) là số hình vành khăn được đếm bên trong một hình quạt. Thiết bị cấy đĩa xoắn s ẽ c ấ y mẫu lên đĩa thạch theo cùng cách thức giữa các lần. CH Ú THÍCH: Khi các khu ẩ n lạc được đ ế m b ằ ng lưới, thể tích mẫu sẽ lớ n hơn v ì đ ế m từ mép ngoài v ề phía tâm đ ĩ a. Hình 1 - Lưới đ ế m 5.9 B ẫ y chân không, để rút bỏ chất lỏng, gồm chai chân không từ 2 lít đến 4 lít , hoạt động như bầu chứa và nguồn chân không từ 66,7 kPa đến 80,0 kPa (từ 500 mmHg đến 600 mmHg). 5.10 Cốc có mỏ loại nh ỏ dùng một lần, dung tích 5 ml. 5.11 Túi polyetylen, dùng để bảo quản các đĩa đ ã chuẩn bị. 5.12 Xyran h , v ớ i đầu tip Luer để chống tắc nghẽn kim. 6 Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng th ử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư h ỏ ng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chu ẩ n này. Xem tiêu chu ẩ n cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan n ê n th ỏa thuận với nhau về v ấ n đề n à y. 7 Chuẩn bị mẫu thử M ẫ u được trộn đều để thu được các phần mẫu thử đồng nh ấ t. 8 Cách tiến hành 8.1 Chuẩn bị đĩa thạch Sử dụng bộ phân phối vô trùng tự động khi chuẩn bị các đ ĩ a thạch. Thể tích thạch được phân ph ố i vào các đĩa cần giống nhau v ì t ỉ lệ nhiễm tạp là thấp so với việc rót thạch thủ công trong phòng thử nghiệm. Khi dùng tủ cấy, sử d ụng bộ phân phối tự động. Rót các lượng thạch giống nhau vào tất cả các đĩa sao cho thạch có cùng độ dày, để đầu kim của thiết b ị cấy xoắn duy tr ì góc tiếp xúc như nhau. Các đĩa thạch phải b ằ ng phẳng trong quá tr ì nh để nguội. Trước khi đổ đĩa, nên sử dụng phương pháp sau đây: dùng bộ phân phối tự động hoặc rót một lượng thạch cố định (khoảng 15 ml cho đĩa 100 mm; 50 m l cho đĩa 150 mm) đã kh ử trùng ở nhiệt độ từ 60 ° C đến 70 ° C vào từng đĩa Petri (5.3). Để cho thạch đông đặc trên bề mặt ph ẳ ng và đặt các đ ĩ a đ ã rót thành từng ch ồ ng không nhiều hơn 10 đĩa. Đặt các đ ĩa thạch đã đặc vào các túi polyetylen (5.12), làm kín túi bằng nhiệt và úp ngược, ở nhiệt độ từ 0 ° C đ ế n 4,4 ° C . Giữ các đ ĩ a thạch đã rót ở nhiệt độ phòng trước khi cấy. 8.2 Quy trình cấy S ử dụng thiết bị cấy xoắn (5.7) cấy lên bề mặt đĩa thạch đã chuẩn bị (8.1) để đếm vi sinh vật trong các dung dịch ch ứ a từ 500 đến 500 000 vi sinh vật trên mililit. Trong dải đếm được quy định, không cần sử d ụng các chai pha loãng hoặc pipet và các thiết bị phụ trợ khác. Khoảng cách giữa các mẻ l à tối thiểu v à thời gian để kiểm tra thiết bị là ít hơn 2 min. Thiết bị cấy giảm dần lượng mẫu theo đường xoắn Acsimet lên bề mặt đĩa thạch. Thể tích mẫu của bất k ì phần nào c ủ a đ ĩ a đều biết trước. Sau khi c ấ y, các khuẩn lạc mọc dọc theo đường xoắn. Nếu các khuẩn lạc trên một phần của đĩa có khoảng cách thích hợp so với phần khác thì đếm chúng trên lưới đếm (5.8) đ ã hiệu chuẩn thể tích với diện tích c ủ a phần đĩa. Kiểm tra hàng ngày góc nghiêng của đầu tip và chỉnh lại nếu cần (sử dụng chân không để giữ n ắ p trên bề mặt đầu tip; đầu típ ở vị trí đúng hư ớ ng nếu mặt ph ẳ ng của nắp song song và cách bề mặt nền khoảng 1 mm). Cho chất lỏng di chuyển qua hệ thống bằng chân không. Trước khi đưa mẫu vào, làm sạch đầu tip b ằ ng cách tráng bằng dung dịch natri hypoc l orit (4.1) trong 1 s, sau đó tráng tiếp b ằ ng nước pha loãng vô trùng (4.3) trong 1 s. Thực hiện bư ớ c tráng giữa các lần thực hiện mẫu để giảm thiểu nhiễm chéo. Sau khi tráng, đưa mẫu vào đầu tip c ủ a ống teflon bằng chân không, sử dụng van hai chiều. Khi ống tef l on và xyranh (5.13) đã chứa đầy m ẫ u thì đóng van g ắ n với xyranh. Đặt đĩa thạch lên mặt phẳng, đặt đầu tip lên bề mặt thạch và kh ở i động motor của thiết b ị cấy xoắn (5.7). Trong quá tr ì nh cấy, ghi nhãn các n ắ p đ ĩa Petri. Sau khi c ấ y xong, nhấc đầu c ấ y ra khỏi bề mặt thạch và dừng thiết b ị . Lấy đĩa thạch đã cấy ra và đậy nắp. Di chuyển đầu cấy về vị tr í kh ở i động. Tráng hệ thống bằng hypoclorit (4.1) và nước, sử dụng chân không, sau đó đưa mẫu mới v à o. Lật ngược các đĩa và đặt ngay đĩa vào tủ ấm (5.2) trong 48 h ± 3 h ở 35 ° C ± 1 ° C . 8.3 Kiểm soát vô trùng Kiểm soát sự vô trùng của thiết b ị cấy đĩa xoắn sau mỗi dãy mẫu, dùng nước pha loãng v ô trùng (4.3) để đổ đĩa. CHÚ Ý : Các đĩa thạch rót sẵn không được nhiễm khu ẩ n bề mặt và giữ nhiệt độ của đĩa không th ấ p hơn nhiệt độ phòng (nếu không, nước có thể tích tụ trên bề mặt thạch). Không được để đĩa quá khô, biểu hiện qua b ề mặt thạch óng ánh hoặc có các nếp nh ă n lớn. Đĩa thạch không được đọng các giọt nước trên bề mặt hoặc các đĩa thạch có độ d à y chênh l ệch quá 2 mm, cũng không nên bảo quản đĩa thạch ở nhiệt độ từ 0 ° C đến 4,4 ° C quá một tháng. Tốc độ dòng bị giảm qua ống cho thấy có sự t ắ c nghẽn hoặc có vật cản trong hệ thống. Để làm hết tắc nghẽn, tháo van ra kh ỏ i xyranh (5.13), lắp xyranh bơm tay cố ống nối chứa nước và bơm áp suất vào. Dùng etanol để tráng nhằm loại bỏ các chất b ẩ n bám trên thành của hệ thống. Hòa tan các chấ t bẩn còn sót bằng axit cromic. Tráng kỹ bằng nư ớ c sau khi làm sạch, 8.4 Hiệu chuẩn lưới đếm Lượng mẫu tương ứng trong các phần khác nhau của lưới đếm (5.8), như trong sổ tay kèm theo thiết bị c ấ y. Diện tích lưới chính xác được kiểm tra b ở i nhà sản xuất. Để xác nhận các giá trị này, chuẩn bị 11 nồng độ vi sinh vật trong dải từ 10 6 đến 10 3 tế bào/ml bằng cách pha loãng huyền phù với tỉ lệ 1:1 (không dùng dụng cụ dàn mẫu) rồi đổ đĩa. Ủ cả hai nhóm đĩa trong 48 h ± 3 h ở 35 ° C ± 1 ° C . Tính các nồng độ của mỗi độ pha loãng. Đếm các đĩa xoắn theo bề mặt lư ớ i, dùng nguyên tắc đ ế m 20 (xem 8.5) và ghi lại số đ ế m khuẩn lạc cùng v ớ i diện tích lưới đếm. Mỗi số đếm khuẩn lạc xoắn của diện tích lưới cụ thể được chia cho số vi sinh vật hiếu khí trong 1 m l để có nồng độ vi sinh vật trên đĩa xo ắ n tương ứng, nêu rõ thể t í ch mẫu đã đưa vào từng diện tích lư ớ i cụ thể. Thể t í ch được đưa vào mỗi diện tích lưới, V, tính bằng mililit (ml) theo công thức sau: Trong đó: C 1 là số khuẩn lạc đếm được trong một diện tích lưới; C 2 là số đếm vi sinh vật trên mililit. VÍ DỤ: C 1 = 31 + 30 ( khuẩn lạc), C 2 = 4,1 x 10 4 vi sinh vật/ml 8.5 Kiểm tra số đếm đĩa xoắn Sau khi ủ, đặt đ ĩ a xoắn vào giữa lưới đếm bằng cách điều ch ỉ nh giá đỡ. Chọn hình quạt bất kì và bắt đầu đếm các khuẩn lạc từ mép ngoài của h ì nh vành khăn thứ nh ấ t về phía tâm, đến khi đếm được 20 khu ẩ n lạc. Kết thúc việc đếm khuẩn lạc còn lại trong hình v à nh kh ă n tại điểm đếm đến khu ẩ n l ạc thứ 20. Bất k ì khuẩn lạc mọc không đều trong m ẫ u đều được kiểm soát bằng cách đ ế m các hình vành khăn tương ứng của h ì nh quạt đối diện và ghi lại kết quả. 9 Tính và biểu thị kết quả Để ước t í nh số vi sinh vật, chia số đếm cho thể tích của tất cả hình vành khăn đã đếm. VÍ DỤ: Hai h ì nh vành khăn c ủ a mỗi hình quạt đ ã đếm đối diện nhau c ủ a đĩa tương ứ ng 31 và 30 khu ẩ n lạc. Thể tích m ẫ u ch ứ a trong các h ì nh vành kh ă n sẫm màu l à 0,0015 ml Số vi sinh vật = vi sinh vật/ml Nếu 4 h ì nh vành kh ă n của hình quạt chứa ít hơn 20 đơn v ị h ì nh thành khuẩn l ạc (CFU) thì đếm số CFU trên toàn bộ đĩa. Nếu số khuẩn lạc vượt quá 75 trong h ì nh vành kh ă n thứ hai, thứ ba hoặc thứ tư là hình vành khăn chứa khu ẩ n lạc thứ 20 th ì số vi sinh vật ước tính sẽ thấp vì lỗi trùng lặp d o các khuẩn lạc chồng l ê n nhau. Trong trường hợp này, đếm mỗi hình vành khăn gần kề theo chu vi trong tất c ả 8 hình quạt, đếm ít nhất 50 khuẩn lạc, v í dụ nếu 2 hình vành khăn đầu tiên của hình quạt chứa 19 khu ẩ n lạc và hình vành khăn thứ ba chứa khuẩn lạc thứ 20 và thứ 76 (hoặc lớn hơn) thì đ ế m các khuẩn lạc trong hình v à nh khăn thứ nhất và thứ hai liền kề theo chu vi, tại tất c ả 8 hình quạt. Tính thể tích chứa trong các hình vành khăn đã đếm của các hình quạt và chia thành số khu ẩ n lạc. Khi có ít h ơ n 20 CFU đ ế m được trên toàn bộ đĩa thì báo cáo kết quả là “ít hơn 500 số đếm khu ẩ n lạc ước t í nh trên mililit". Nếu số khuẩn lạc đếm được lớn hơn 75 ở h ì nh vành khăn thứ nhất của hình quạt thì báo cáo kết qu ả là “lớn hơn 500 000 s ố đ ế m Khuẩn lạc ước tính trên mililit”. Không đếm các đĩa xoắn ph â n bố khu ẩ n lạc không đều do lỗi phân phối. Báo cáo các kết qu ả của các đĩa này là “sự cố của phòng th ử nghiệm”. Nếu khuẩn lạc mọc lan rộng trên toàn bộ đ ĩ a th ì bỏ đĩa này. N ế u khuẩn lọc mọc lan rộng trên một nửa diện tích đĩa thì chỉ đếm các khuẩn lạc phân bố tốt trên diện tích không mọc l an rộng. T í nh số đếm khu ẩ n lạc trừ khi phát hiện có mặt các chất ức chế trong mẫu, khuẩn lạc mọc lan rộng quá mức hoặc sự cố của phòng th ử nghiệm. Làm tròn số đếm như trên. Báo cáo các số đếm theo số đếm khuẩn lạc hoặc số đếm khu ẩ n lạc ước tính trên mililit. 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ch ỉ r õ : a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; đ) mọi chi tiết thao tác không được quy đị nh trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ c ó thể ảnh hư ở ng đến kết quả; e) kết quả thử nghiệm thu được. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 4884:2005 (ISO 4833:2003) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch - Kỹ thuật đ ế m khu ẩ n lạc ở 30 độ C [2] TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương ph á p định lượng vi sinh vật - Phần 1: Đếm khuẩn lạc ở 30 °C bằng kỹ thuật đổ đĩa [3] TCVN 4884-2:2015 (ISO 4833-2:2013) Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp định lượng vi sinh vật - Phần 2: Đếm khu ẩ n lạc ở 30 °C bằng kỹ thuật cấy bề mặt