TCVN8685-10:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-10:2014 về Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 10: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh lở mồm long móng (FMD) A/H5N1 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8685-10:2014 QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 10: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG (FMD) A/H5N1 Vaccine testing procedure - Part 10: Foot and mouth disease vaccine, inactivated Lời nói đầu TCVN 8685-10:2013 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát tri ể n nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 10: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG (FMD) A/H5N1 Vaccine testing procedure - Part 10: Foot and mouth disease vaccine, inactivated 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định y ê u c ầ u kỹ thuật để kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt phòng bệnh lở mồm long móng dạng nhũ dầu hoặc keo phèn cho lợn và động vật nhai lại (các serotype O , A, Asia 1 đơn hoặc đa giá). 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho vi ệ c áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được n ê u. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên b ả n mới nh ấ t, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 8684:2011, V ắc xin và chế ph ẩ m sinh học dùng trong th ú y - Phép thử độ thuần khiết. 3. Lấy mẫu sản phẩm và chuẩn bị động vật thí nghiệm 3.1. L ấ y mẫu sản phẩm: Láy mẫu sản ph ẩ m theo quy định trong bảng như sau: S ố l ư ợng mẫu vắc xin và ch ế phẩm sinh học c ầ n l ấ y Quy cách đóng g ó i (ml) Số lượng mẫu l ấ y (sản ph ẩ m) Cho t ớ i 100 Từ 7 đến 10 Tr ê n 100 Từ 5 đến 7 3.2 . Chuẩn b ị động vật th í nghiệm Tùy theo yêu cầu của vắc xin, chu ẩ n bị động vật sau: - 8 con lợn từ 3 đến 4 tu ầ n tuổi, khỏe mạnh, âm t í nh với kháng thể kháng vi rút gây bệnh l ở mồm long móng. - 8 con bê 6 tháng tuổi, khỏe mạnh, âm tính với kháng th ể kháng vi rút gây bệnh l ở mồm long móng. 4. Cách tiến hành 4.1. Kiểm tra cảm quan Vắc xin nhũ dầu đồng nh ấ t, không đông vón, không lắng cặn. V ắc xin keo phèn c ó lắng cặn ở đáy chai. 4.2. Ki ể m tra độ thuần khiết Kiểm tra các chỉ tiêu tạp nhi ễ m vi khu ẩ n và tạp nhiễm nấm mốc theo TCVN 8684:2011. 4.3. Kiểm tra tính an toàn 4.3.1. Tr ê n lợn Tiêm theo một trong hai đường sau: a) Tiêm bắp cho 2 con lợn, mỗi con 2 liều v ắ c xin ghi trên nh ã n. b) Tiêm vào vành móng bàn chân trước bên trái tại 2 v ị trí cho 2 con lợn, mỗi v ị trí 1 liều. - Quan sát lợn được tiêm và 2 con lợn đối chứng trong 14 ngày. - Vắc xin đạt tiêu chuẩn an toàn: Lợn sống khỏe, không có biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng của bệnh lở mồm long móng ở lư ỡ i, chân hoặc m õ m. 4.3.2. Tr ê n b ê Tiêm theo một trong hai đường sau: a) Tiêm bắp cho 2 con b ê với 2 li ề u vắc xin ghi tr ê n nhãn. Theo dõi trong 14 ngày. Vắc xin đạt tiêu chuẩn k hi không có b ấ t kỳ triệu chứng cục bộ hay toàn thân nào trong thời gian theo d õ i. Bê sống khỏe mạnh, không có triệu chứng bệnh tích điển h ì nh của bệnh lở m ồ m long móng. b) Tiêm vào nội b ì lưỡi cho 2 con bê, ở 20 vị trí với liều 0,1 m l/ vị trí. Sau 4 ngày quan sát, nếu không có các triệu chứng bệnh tích điển h ì nh của bệnh th ì tiêm nhắc lại theo cách trên cho mỗi con 3 liều quy đị nh. Theo dõi ti ế p 6 ngày sau tiêm lần 2. Vắc xin đạt tiêu chuẩn khi không có b ấ t kỳ triệu chứng cục bộ hay toàn thân nào trong thời gian theo d õ i. 4.4. Kiểm tra hiệu lực 4.4.1. Tr ê n lợn Tiêm cho 3 con lợn, m ỗ i con 1 liều vắc xin ghi tr ê n nhãn. 28 ngày sau ti ê m lần 1, ti ê m mũi 2 với liều tương tự. 28 ngày sau khi tiêm lần hai, 3 con lợn được tiêm và 3 con l ợn đối chứng được lấy máu để kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phương pháp trung h ò a vi rút (theo Phụ lục B) hoặc phương pháp ELISA (theo Phụ lục A). Vắc xin đạt tiêu chuẩn khi hiệu giá kh á ng thể trung hòa vi rút (viral neutralization - VN) ³ 1/100 hoặc hiệu gi á kháng thể E LI SA ³ 1/128 (khi vắc xin có t í nh tương đồng kháng nguyên). 4.4.2. Trên b ê Tiêm cho 3 con bê 6 tháng tu ổ i, khỏe mạnh, mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn. Bốn tuần sau khi tiêm vắc xin 3 con b ê được ti ê m và 3 con bê đ ố i chứng được l ấ y máu. Kiểm tra hàm lượng kháng thể trong máu bằng ph ư ơng pháp trung hòa vi rút trên t ế bào (theo Phụ lục B) hoặc phương pháp ELISA (theo Phụ lục A) với chủng tương ứng có trong vắc xin. Vắc xin đạt tiêu chuẩn khi hiệu giá kháng th ể trung hòa vi rút ³ 1/100 hoặc hiệu giá kháng thể ELISA ³ 1/128 (khi vắc xin có t í nh tương đồng kháng nguyên). PHỤ LỤC A (Quy định) Định lượng kháng thể kháng vi rút lở mồm long móng bằng phản ứng ELISA A.1 . Cách tiến hành A.1.1 . Phủ đĩa - L ấ y “rabbit antiserum” từ ngăn mát tủ lạnh, sau đó lắc đều và nhẹ nhàng để bảo đảm tính đồng nhất của nguyên liệu trước khi sử dụng. - Chuẩn bị pha loãng 1/1000 cho mỗi rabbit antiserum serotype A trong dung dịch coating buffer (dung d ịch đệm gắn đĩa) pH 9,6 - Cho 50 μl của rabbit antiserum đã pha loãng vào đĩa phản ứng (Maxisorp-NUNC) theo sơ đ ồ đã bố tr í xét nghiệm. - Đậy đ ĩ a và ủ ở nhiệt độ từ 1 ° C đến 8 ° C qua đêm (18 h) trong hộp nhựa ẩ m ướt. A.1.2 . Ủ mẫu xét nghiệm và đ ố i chứng kháng nguy ê n A.1.2.1 . Pha loãng mẫu xét nghi ệ m trong trường hợp đ ị nh t í nh - Lắc đ ề u mẫu đối chứng và mẫu xét nghiệm trước kh i sử dụng. - Mẫu xét nghiệm và các mẫu đ ố i chứng được pha loãng 1/16 trong đĩa polypropylen đáy chữ U . - Đầu tiên, chuẩn bị pha loãng 1/16 cho mỗi mẫu đối chứng và mẫu xét nghiệm trong Buffer A V í DỤ: Lấy 15 μl mỗi huyết thanh đ ố i chứng (C++, C+, C-) cho vào 225 μl Buffer A và l ấ y 10 μl huy ế t thanh của mỗi mẫu xét nghiệm cho vào 150 μ l Buffer A . - Cho 50 μ l mẫu đối chứng và mẫu xét nghiệm đ ã pha lo ã ng vào các giếng tương ứng trong đĩa nhựa đáy chữ U . Cho 50 μl Buffer A vào các gi ế ng kháng nguyên đối chứng (Ca) theo sơ đồ trong H ì nh A.1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 9 9 17 17 25 25 33 33 B C++ C++ 2 2 10 10 18 18 26 26 34 34 C C + C + 3 3 11 11 19 19 27 27 35 35 D C + C + 4 4 12 12 20 20 28 28 36 36 E C - C - 5 5 13 13 21 21 29 29 37 37 F C - C - 6 6 14 14 22 22 30 30 38 38 G Ca Ca 7 7 15 15 23 23 31 31 39 39 H Ca Ca 8 8 16 16 24 24 32 32 40 40 H ì nh A.1 - Sơ đồ các giếng trong trường hợp phát h iệ n kháng th ể A.1.2.2 . Pha loãng mẫu x é t nghiệm trong tr ư ờng h ợ p định lượng A.1.2.2.1 . Pha loãng bậc 2 - Chuẩn b ị pha lo ã ng 1/16 cho các mẫu đối chứng theo A.1.2.1. - Tiếp theo, chuẩn bị pha lo ã ng 1/8 cho m ỗ i mẫu xét nghiệm trong đĩa nhựa hoặc trong tube. (ví dụ lấy 20 μl mẫu xét nghiệm cho vào 140 μ l Buffer A). - Cho 50 μ l đệm A vào t ấ t cả các gi ế ng từ cột 3 đ ế n cột 12 trong đĩa polypropylen đáy chữ U . Cho 50 μl mẫ u đối chứng đ ã pha loãng vào các gi ế ng tương ứ ng như trong sơ đ ồ . Các giếng kháng nguyên đối chứng (Ca) cho vào 50 μl Buffer A. - Cho 50 μl mẫu xét nghiệm đã pha loãng 1/8 đến c á c giếng tương ứng của hàng A hoặc E, cột 3-12. Trộn đ ề u 100 μl trong các gi ế ng này. Đây là thể t í ch 100 μl của mẫu pha loãng 1/16. Sau đó, chuyển 50 μl huy ế t thanh từ hàng A đến hàng B, trộn đ ề u và chuyển đến hàng D và loại bỏ 50 μ l từ hàng D. Nồng độ pha lo ã ng mẫu lúc này là 1/16 đến 1/128. Tiếp tục cho các mẫu khác th ì lặp lại như trên bắt đầu từ hàng E đến hàng H và loại bỏ 50 μl từ hàng H. Xem sơ đồ trong Hình A.2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 3 3 5 5 7 7 9 9 B C++ C++ 1 1 3 3 5 5 7 7 9 9 C C + C + 1 1 3 3 5 5 7 7 9 9 D C + C + 1 1 3 3 5 5 7 7 9 9 E C - C - 2 2 4 4 6 6 8 8 10 10 F C - C - 2 2 4 4 6 6 8 8 10 10 G Ca Ca 2 2 4 4 6 6 8 8 10 10 H Ca Ca 2 2 4 4 6 6 8 8 10 10 H ì nh A.2 - Sơ đồ các giống trong trường hợp đ ị nh lượng kháng th ể A.1.2.2.2 . Pha loãng bậc 5 - Chuẩn bị pha lo ã ng 1/16 của mẫu đối chứng giống như trong A.1.2.1, nhưng mỗi mẫu đ ố i chứng lấy 20 μ l cho vào 300 μ l đệm A. Cho 60 μl mẫu đối chứng đã pha loãng vào các gi ế ng tương ứng trong đ ĩ a polypropylen đáy chữ U như trong sơ đ ồ . Gi ế ng đối chứng kháng nguyên (Ca) cho vào 60 μl Buffer A. - Chuẩn b ị pha lo ã ng 1/5 cho mỗi huyết thanh xét nghiệm bằng cách lấy 20 μ l huyết thanh cho vào 80 μ l Buffer A. - Tiếp theo, cho 60 μ l Bu ff er A vào tất cả các các giếng từ cột 3 đến cột 12 trong đĩa polypropylen, lấy 15 μ l huyết thanh xét nghiệm đ ã pha loãng 1/5 cho vào các giếng tương ứng của hàng A hoặc hàng E của cột 3-12. Đây là kết quả của pha loãng bậc 5. Trộn đều 75 μ l trong c á c giếng này, đây l à thể tích 75 μ l của nồng độ pha loãng 1/25. Chuyển 15 μ l của nồng độ này từ h à ng A đến hàng B và trộn đều ở hàng B và ti ế p tục tương tự cho đến hàng D và loại bỏ 15 μ l từ hàng D. Các mẫu tiếp theo lặp lại như trên và bắt đầu từ hàng E đến hàng H và loại bỏ 15 μ l từ hàng H. Xem sơ đ ồ trong H ì nh A.2. A.1.2.3 . Th ê m kháng nguy ê n - Chuẩn bị pha loãng 1/100 kháng nguyên lở mồm long móng serotype A22 IRAQ 24/64 trong Buffer A. - Với đ ĩ a định lượng pha loãng bậc 2, cho 50 μ l kháng nguyên đ ã pha loãng 1/100 đến tất cả 96 giếng trong đĩa polypropylen đáy chữ U . Đây là n ồ ng độ pha loãng mẫu xét nghiệm, lúc n à y đạt nồng độ từ 1/32 đến 1/256 của phương pháp chuẩn độ. - Với đĩa định lượng pha loãng bậc 5, cho 60 μ l kháng nguy ê n đã pha loãng 1/100 đến tất cả 96 giếng trong đĩa polypropylen đáy chữ U . Đây là nồng độ pha loãng mẫu xét nghiệm, lúc này đạt nồng độ từ 1/50 đến 1/6250 của phương pháp chuẩn độ. - Lắc đ ề u hỗn hợp huy ế t thanh xét nghiệm và kháng nguyên bằng tay hoặc bằng máy, dán kín đĩa. Ủ ở nhiệt độ từ 1 ° C đến 8 ° C qua đêm. A.1.3 . Chuyển hỗn hợp kháng nguy ê n và mẫu xét nghi ệ m L ấ y đĩa ph ả n ứng (đĩa đã ph ủ rabbit antibody) và đĩa polypropylen đáy chữ U có chứa hỗn hợp mẫu xét nghiệm và kháng nguyên để ở nhiệt độ phòng. Rửa đ ĩ a phủ rabbit antibody 5 lần với nước rửa PBS 0,002 M, sau đó đập làm sạch đ ĩ a trên khăn vải mềm. Lắc đều hỗn hợp mẫu xét nghiệm - kháng nguyên, sau đó chuyển 50 μ l hỗn hợp này vào đĩa phản ứng tương ứng với sơ đồ bố tr í xét nghiệm. Đậy nắp và ủ lắc liên tục ở nhiệt độ +35 ° C đến +39 ° C trong 1 h. A.1.4 . Chuẩn b ị dung d ị ch đ ệ m B Thêm PBST (Phosphate Buffered Saline with T w een 20) 0,01 M (Buffer A) vào sữa bột gầy (skim milk) sao cho nồng độ sữa gầy l à 5 %. Lắc đ ề u v à điều chỉnh pH ở d ã y pH 7,4 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH 0,1 M. VÍ DỤ: Để chuẩn bị 100 ml dung dịch đệm B thì cân 5 g sữa gầy cho vào 100 ml dung dịch Buffer A. A.1.5 . Thêm kháng thể phát h iệ n (Guinea Pig antiserum) Trước khi kết thúc giai đoạn ủ hỗn hợp kháng nguyên và huyết thanh xét nghiệm, chuẩn bị pha loãng guinea pig serotype A nồng độ 1/100 trong Buffer B. Sau khi ủ 1 h, l ấ y đĩa phản ứng từ tủ ấ m ra ngoài và rửa 5 lần vớ i dung dịch nước rửa PBS, pH 7,4 ± 0,2 Cho 50 μ l Guinea pig đ ã pha loãng 1/100 vào tất cả 96 giếng tr ê n đĩa phản ứng. Đậy n ắ p và ủ lắc li ê n tục ở nhiệt độ từ 35 ° C đến 39 ° C trong 1 h. A.1.6 . Thêm con j ugate Trước khi kết thúc giai đoạn ủ Guinea pig, chuẩn b ị pha loãn g conjugate 1/200 trong đệm B. Sau 1 h ủ guinea pig, lấy đ ĩ a phản ứng từ tủ ấm ra ngoài và rửa 5 lần v ớ i dung dịch nước rửa PBS, pH 7,4 ± 0,2. Cho 50 μ l dung dịch conjugate đã pha loãng vào t ấ t cả các giếng trên đĩa phản ứng. Đậy đĩa và ủ lắc liên tục ở nhiệt độ 35 ° C đến 39 ° C trong 1 h. A.1.7 . Thêm dung d ị ch ch ấ t phát màu Substrate Chromogen và dung d ị ch stop Trước khi kết thúc giai đoạn ủ conjugate, chuẩn bị dung dịch ch ấ t phát màu OPD ( Ortho-Phenylendiamine). Dung dịch này phải được giữ trong tối và nếu đ ã chuyển sang màu vàng th ì nên loại bỏ. Chuẩn bị một đĩa sạch (blanking plate). Đĩa này sau khi dùng xong có thể r ử a sạch và dán kín nh ữ ng giếng chưa sử dụng cho những lần x é t nghiệm k ế ti ế p. Sau ủ conjugate trong 1 h, lấy đĩa phản ứng từ tủ ấm ra ngoài và rửa 5 lần với dung dịch nước rửa PBS, pH 7,4 ± 0,2. Chuẩn bị chất phát màu cho một đĩa phản ứng như sau: l ấ y 30 μ l của Substrate - H 2 O 2 3 % pha trong 6 ml dung dịch ch ấ t phát màu OPD. Như vậy H 2 O 2 3 % sử dụng là 1/200. Sau khi rửa, đầu ti ê n cho 50 μ l của substrate/chromogen v à o cột bank của đĩa “blanking plate” và sau đó là tất c ả các giếng của đ ĩ a phản ứng, đậy nắp để ở nhiệt độ phòng trong tối. Thời gian được tính bắt đầu từ giếng đầu tiên sau khi cho ch ấ t phát màu. Sau 15 min ủ substrate/chromogen, đầu tiên cho 50 μ l dung dịch S top (axit sul f uric 1,25 M) vào cột blank của đĩa “blanking plate”, sau đó là tất cả các giếng của đĩa phản ứng. Lắc đều bằng máy lắc (hoặc dùng tay vỗ nh ẹ vào các thành giếng) để bảo đảm rằng hỗn h ợ p này đã được trộn đều. Tất c ả các giếng lúc này chứa 50 μ l dung dịch substrate/chromogen và 50 μ l dung dịch S top. A.1.8 . Đọc đĩa phản ứng Mật độ quang (OD) của từng giếng trong đ ĩ a được đo bằng quang k ế . Trước khi đọc đ ĩ a, cần phải đảm bảo rằng không có bong bóng trong bất kỳ giếng nào, vì điều này sẽ gây ra sai s ố quang học và đảm bảo rằng kh ô ng có dấu (v í dụ: dấu vân tay) hoặc ngưng tụ trên thành của đ ĩ a phản ứng. Nếu cần thi ế t, làm v ỡ bong bóng b ấ t kỳ bằng một tip sạch. Lau sạch phía dư ớ i đáy đĩa bằng vải m ề m. Đĩa “banking plate” được đưa vào máy đọc trước, kế tiếp là các đ ĩ a phản ứng. Kiểm tra xem k í nh lọc 492 nm của máy đọc đã được cài đặt, các đĩa phản ứng sẵn sàng đưa vào máy đọc. A.2 . Diễn giải kết quả Đĩa đọc được phân tích cho hai nhóm: A.2.1 . Phân tích c á c giá tr ị đ ố i ch ứ ng Giá tr ị phần trăm giá tr ị ứ c chế (percent inhibition) của mẫu đối chứng được dùng để chấp nhận kết quả. Tính phần trăm ức ch ế của mẫu đối ch ứ ng, P l R , theo công thức sau: Trong đó: OD R là mật độ quang của mẫu đối chứng; OD Ca là mật độ quang trung b ì nh của đối chứng kháng nguyên. Tính phần trăm giá trị ức ch ế của mẫu xét nghiệm, P l s , theo công thức sau: Trong đ ó : OD s là mật độ quang của mẫu xét nghiệm; OD C a là mật độ quang trung b ì nh của đ ố i chứng kháng nguyên. A.2.2 . T í nh toán và ch ấ p nh ậ n các giá trị đối chứng Các giá trị OD và P I của đối chứng kháng nguyên và các giá tr ị P I của ba đ ố i chứng khác (C++, C + và C-) được sử dụng để chấp nhận hoặc không chấp nhận kết quả khi so với bảng giới hạn bắt buộc của bảng dữ liệu, từ đó đưa ra kết luận chấp nhận cho từng đĩa phản ứng theo Bảng A.1. Bảng A.1 - Các đối chứng Ca, C++, C + và C- G i á trị P I K ế t luận Trong a Ngoài b 4 0 Chấp nhận 3 1 Chấp nhận 2 2 Làm lại 1 3 L à m lại 0 4 L à m lại a Nằm trong khoảng giới hạn trên (UCL) và giới hạn dưới (LCL); b Nằm ngoài khoảng giới hạn trên (UCL) và giới hạn dưới (LCL). Với sự bi ế n đổi trong giá trị OD và các giá tr ị Pl của các đối chứng được so sánh với giới hạn trên và giới hạn dưới về t í nh ổn đ ị nh của các giá trị đối chứng theo Bảng A.2. Bảng A.2 - Giới hạn tr ê n và gi ới hạn dưới của các giá tr ị OD và Pl Giá tr ị Giới hạn tr ê n (UCL) Giới hạn dưới (LCL) Ca (OD) a 1 , 9 0,8 Ca (Pl) a 25 - 25 C++ (Pl) b 100 85 C+ (Pl) c 85 50 C-(PI) d 49 0 a Ca là đối ch ứ ng kháng nguyên; b C++ là dương t í nh mạnh; c C + là d ương t í nh y ế u; d C- là â m t í nh. Các giá trị đối chứng được xem xét một cách trình tự như sau: a) Điều kiện đầu ti ê n đ ể chấp nhận đĩa phản ứng Đ ố i chứng kháng nguyên (Ca) Đầu tiên tính giá tr ị Pl, so sánh các giá tr ị OD của đối chứng kháng nguyên trong bảng giới hạn trên và gi ớ i hạn dưới. Cả hai giá trị OD trung gian (tức là hai giá trị còn lại sau khi loại bỏ các giá trị thấp nhất và cao nhất) phải nằm trong những dãy giới hạn này. Nếu hai giá trị trung gian không đạt th ì đ ĩa ph ả n ứng phải được làm lại. Khi đó, chỉ có hai giá tr ị OD trung gian này được sử dụng để tính toán giá trị trung b ì nh OD Ca và được sử dụng đ ể tính toán cho các giá tr ị Pl tiếp theo. b) Điều kiện tiếp theo để chấp nhận đĩa phản ứng Đối chứng kháng nguyên (Ca), mẫu dương tính mạnh ( C++) , mẫu dươn g t í nh y ếu (C+) và đối chứng âm (C-). - Đ ố i chứng kháng nguy ê n (Ca) So sánh giá trị Pl của đối chứng kháng nguyên trong bảng giới hạn UCL và LCL và sử dụng Bảng A.1 để chấp nhận hoặc kh ô ng chấp nhận kết quả cho từng đĩa phản ứng. - Đối chứng C++, C + và C- So sánh giá trị Pl của các đối chứng C +, C + và C- trong b ả ng giới hạn UCL và LCL và sử dụng Bảng A.1 để ch ấ p nhận hoặc không ch ấ p nhập kết quả cho từng đĩa phản ứng. Phải làm lại đĩa phản ứng n ế u có một vài giá tr ị đối chứng của Ca, C++, C + và C- không đạt được các điều kiện của Pl. A.2.3 . Giải thích kết quả mẫu huyết thanh xét nghi ệ m Ngư ỡ ng đánh giá cho phương pháp này là phần trăm giá tr ị ức chế 50 % (Pl = 50). A.2.3.1 . Trong trường h ợ p phát hi ệ n kháng thể - Nếu giá tr ị Pl của mẫu xét nghiệm dưới 50 % (Pl < 50="" %)=""> ì mẫu huy ế t thanh đó được xem là không có kháng th ể (mẫu âm tính). - N ế u giá trị Pl của mẫu xét nghiệm lớn hơn hoặc bằng 50 % (Pl ³ 50) th ì mẫu huyết thanh đó được xem là c ó kháng thể (mẫu dương tính). Và mẫu huyết thanh dương tính này được đem ra chuẩn độ (xem sơ đ ồ 2 v à 3) để bi ế t được hiệu giá kháng th ể . A.2.3.2 . Trong trường hợp chuẩn độ a) Chuẩn độ pha loãng bậc 2 - Nếu tất cả giá tr ị Pl trong 2 giếng của mẫu huy ế t thanh xét nghiệm nhỏ hơn 50 (Pl<50),> ì mẫu này được xem là không có kháng th ể (mẫu âm tính). - Nếu có một trong 2 giếng đó có giá trị Pl lớn h ơn 50 (Pl >50) ở độ pha loãng 1/32 nhưng t ấ t cả các giá trị Pl ở độ pha loãng k ế tiếp có Pl < 50=""> ì mẫu xét nghiệm này có hiệu giá kháng thể là 1/32 . - N ế u cả hai gi ế ng c ó giá tr ị Pl l ớ n hơn 50 (Pl >50) ở độ pha loãng 1/32 và t ấ t cả các giá trị Pl ở độ pha loãng kế ti ế p có Pl < 50=""> ì mẫu này có hiệu giá kháng th ể là 1/45 và mẫu xét nghiệm này được xem là mẫu c ó kháng thể (mẫu dương t í nh). - Hiệu giá kháng thể của các mẫu xét nghiệm có giá trị Pl lớn hơn 50 (Pl > 50) ở độ pha loãng 1/32 có thể tham khảo ở Bảng A.3. Nếu hiệu giá kháng thể lớn hơn 90 (> 90) cho bi ế t rằng con vật này có khả năng bảo hộ với serotype vi rút l ở mồm long móng tương đồng v ớ i kháng nguy ê n sử dụng trong phản ứng. Bảng A.3 - Bảng tính hiệu gi á kháng th ể ở độ pha loãng b ậ c 2 Huyết thanh pha loãng Mẫu huy ế t thanh với những giá tr ị Pl k hác nhau > 50 % 1 2 3 4 5 6 7 8 32 +- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 64 - - - - +- ++ ++ ++ ++ ++ 128 - - - - -- -- +- ++ ++ ++ 256 - - - - - - - - - - -- +- ++ Hiệu giá kháng th ể 32 45 64 90 128 181 256 >256 b) Chuẩn độ pha loãng bậc 5 Hiệu giá kháng thể của huyết thanh xét nghiệm có giá tr ị Pl trên 50 c ó th ể xem ở Bảng A.4. Hiệu giá kháng th ể ³ 112 cho bi ế t rằng con vật này có khả năng bảo hộ với serotype vi rút lở mồm long móng tương đ ồ ng với kháng nguyên sử dụng trong phản ứng. Bảng A.4 - Bảng t í nh hi ệ u g i á kháng thể ở đ ộ pha loãng bậc 5 Huy ế t thanh pha loãng Mẫu huy ế t thanh với những giá trị Pl khác nhau > 50 % 1 2 3 4 5 6 7 8 50 +- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 250 - - -- +- ++ ++ ++ ++ ++ 1250 - - - - - - - - +- ++ ++ ++ 6250 - - - - - - - - - - - - +- ++ Hi ệ u giá kháng th ể 50 112 250 560 1250 2800 6250 >6250 PHỤ LỤC B (Quy định) Định lượng kháng thể kháng vi rút lở mồm long móng bằng kỹ thuật trung hòa vi rút trên tế bào B.1 . Cách tiến hành B.1.1 . Chuẩn đ ộ hiệu giá vi rút Hình B.1 - B ố trí s ơ đồ đĩa chuẩn độ hi ệ u giá vi rút B.1.1.1 . Cho 200 μ l môi trường EMEM vào mỗi giếng trên hàng A từ 1 đến 10 và hàng H từ 1 đến 10. B.1.1.2 . Cho 22 μ l mẫu vi rút 01 vào giếng A1 và ti ế n h à nh pha loãng bậc 10 đến giếng A10, loại bỏ 22 μ l . Tương t ự với mẫu vi rút 02 trên hàng H. B.1.1.3 . Pha loãng mẫu v i rút (pha loãng bậc 10): Dùng pipet đa kênh chuyển 50 μ l từ hàng A đến hàng B, C và D. Tương tự cũng chuyển 50 μ l từ hàng H đến hàng G, F và E. B.1.1.4 . Cho 50 μ l môi trường EMEM huy ế t thanh vào t ấ t c ả các giếng từ A1 đến H10. B.1.1.5 . Cho 100 μ l môi trư ờ ng EMEM huy ế t thanh vào t ấ t cả các giếng A11 đến H12 B.1.1.6 . Ủ đĩa ở 37 °C/3 - 5 % C O 2 /45 - 60 min. B.1.1.7 . Cho 50 μ l EMEM chứa tế b à o BHK-21 vào t ấ t cả các giếng B.1.1.8 . Ủ đ ĩ a ở 37 °C/3 - 5 % C O 2 / 24 - 48 h B.1.1.9 . Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới kính hiển vi soi ngược. B.1.1.10 . Nhuộm: a). Loại bỏ môi trường từ đĩa phản ứng cho vào lọ chứa ch ấ t khử trùng. b) Cố định t ế bào bằng 100 μ l formal 10 %. c) Ủ đ ĩ a ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 min. d) Loại bỏ dung dịch cố định và rửa đĩa 3 l ầ n 300 μ l PBS. e) Cho vào 50 μ l xanh methylen 0,05 %. f) Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 min. g) Loại bỏ xanh methylen và rửa đĩa 3 lần với 300 μ l PBS. h . Quan sát dưới k í nh hiển vi soi ngược đ ể đọc và ghi nhận bệnh tích tế bào. B.1.1.11 . Đọc kết quả Ghi nhận bệnh lý tế bào vào phi ế u quản l ý x é t nghiệm (TYV6-BM-VR-09.01C) và tính n ồ ng độ vi rút (liều gây nhiễm t ế bào: TCID 50 /ml) bằng công thức Karber (1931). Dữ liệu được tính trên phần mềm Excel hoặc theo công thức sau: TCID50 = x + 0,5 - ∑ r l /n Trong đó: x là độ pha loãng cao nh ấ t có bệnh tích t ế bào; r l là số giếng không có bệnh tích t ế bào ở từng độ pha loãng; n là số giếng sử dụng cho một độ pha loãng. B.1.2 . Thực hiện phản ứng VNT B.1.2.1 . Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng với 100 TCID 50 trong môi trường EMEM. VÍ DỤ: Lượng dung dịch vi rút với 100 TCID 50 c ầ n cho một đĩa phản ứng là 6 ml. B.1.2.2 . Thực hiện trên đ ĩ a phản ứng: huy ế t thanh pha loãng bắt đầu từ 1/4 đến 1/512. CHÚ D Ẫ N: Cột: từ cột 1 đến cột 12 Hàng: từ hàng A đến hàng H Hình B.2 - Sơ đồ đĩa phản ứ ng - Cho 150 μ l môi trường EMEM vào các giếng A1, A3, A5, A7, A9 và A11. - Cho 100 μ l môi trường EMEM vào các giếng từ B1 đến H1, từ B3 đến H3, từ B5 đến H5, từ B7 đến H7, từ B9 đến H9 và từ B11 đến H11. - Cho 50 μ l mẫu huyết thanh 01 vào giếng A1. - Cho 50 μ l mẫu huyết thanh 02 vào giếng A3. - Cho 50 μ l mẫu huyết thanh 03 vào giếng A5. - Cho 50 μ l mẫu huy ế t thanh 04 vào gi ế ng A7. - Cho 50 μ l mẫu huyết thanh 05 vào giếng A9. - Cho 50 μ l mẫu huy ế t thanh 06 vào giếng A11. - Sử dụng pipet 12 kênh pha loãng bậc 2 mẫu huy ế t thanh từ A1 đến H1, t ừ A3 đến H3, từ A5 đến H5, từ A7 đến H7, từ A9 đến H9 và từ A11 đến H11 và loại bỏ 100 μ l . Sau khi pha loãng xong, sử dụng pipet 8 kênh chuyển 50 μ l mẫu huyết thanh đã pha loãng từ cột 1 sang cột 2, từ cột 3 sang cột 4, từ cột 5 sang cột 6, từ cột 7 sang cột 8, từ cột 9 sang cột 10 và từ cột 11 sang cột 12. a) Cho 50 μ l dung dịch vi rút với 100 TCID 50 vào các giếng. b) Ủ đĩa ở 37°C/3 - 5% CO 2 /45 - 60 min. c) Sau khi ủ xong, cho 50 μ l EMEM chứa tế bào BHK-21 vào tất cả các giếng. d) Ủ đĩa ở 37°C/3 - 5% CO 2 /24 - 48 h e) Kiểm tra tế bào hằng ngày dưới k í nh hiển vi soi ngược để xem t ế bào có ả nh hưởng b ở i độc tố không (tế bào ch ế t nhiều). B.1.2.3 . Thực hiện trên đĩa đối chứng: a) Đối chứng huyết thanh - Cho 150 μ l môi trường EMEM vào giếng A1. - Cho 100 μ l môi trường EMEM vào các giếng từ B1 đến H1. - Cho 50 μ l huyết thanh đối chứng vào giếng A1. Ti ế n hành pha loãng bậc hai từ A1 đến H1 và loại bỏ 100 μ l ở giếng H1. - Sau khi pha loãng xong, sử dụng pipet 8 kênh chuyển 50 μ l mẫu huyết thanh đã pha loãng từ cột 1 sang cột 2. - Cho 50 μ l dung dịch vi rút với 100 TCID 50 vào các giếng từ A1 đến H2. - Ủ đĩa ở 37°C/3 - 5% C O 2 /45 - 60 min b) Đ ố i chứng t ế bào - Cho 100 μ l môi trường EMEM vào giếng A4 đến H5. - Ủ đĩa ở 37°C/3 - 5% CO 2 /45 - 60 min. c) Đối chứng môi trường - Cho 150 μ l môi trường EMEM vào giếng A6 đến H7. - Ủ đĩa ở 37°C/3 - 5% CO 2 /45 - 60 min. d) Chuẩn độ lại vi rút sử dụng - Pha loãng dung dịch vi rút sử dụng: từ 10 - 1 đ ế n 10 -8 - Cho 50 μ l môi trường EMEM vào các giếng từ A9 đến H12. - Cho 50 μ l dung dịch vi rút pha loãng 10 -1 và các giếng từ A9 đến A12. - Cho 50 μ l dung dịch vi rút pha loãng 10 - 2 và các giếng từ B9 đ ế n B12. - Cho 50 μ l dung dịch vi rút pha loãng 10 - 3 và các giếng từ C9 đến C12. - Cho 50 μ l dung dịch vi rút pha loãng 10 -4 v à các giếng từ D9 đến D12. - Cho 50 μ l dung dịch vi rút pha loãng 10 -5 và các giếng từ E9 đến E12. - Cho 50 μ l dung dịch vi rút pha loãng 10 -6 và các giếng từ F9 đến F12. - Cho 50 μ l dung d ịch vi rút pha loãng 10 -7 và các giếng từ G9 đến G12. - Cho 50 μ l dung dịch vi rút pha loãng 10 - 8 và các giếng từ H9 đến H12. - Cho 50 μ l môi tr ườ ng EMEM vào các giếng từ G9 đến H12. - Ủ đ ĩ a ở 37°C/3 - 5% CO 2 /45 - 60 min. e) Sau khi ủ xong, cho 50 μ l EMEM chứa t ế bào BHK-21 vào t ấ t cả các giếng từ A1 đến H2, từ A4 đến H5 và từ A9 đến H12. - Ủ đ ĩ a ở 37°C/3 - 5% C O 2 /24 - 48 h. - Kiểm tra t ế bào h ằ ng ngày dưới kính hiển vi soi ngược đ ể xem t ế bào c ó ảnh hưởng bởi độc t ố kh ô ng (tế bào chết nhiều). B.1.3 . Nhuộm B.1.3.1 . Loại b ỏ môi trường từ đ ĩ a phản ứng cho vào lọ chứa ch ấ t khử trùng. B.1.3.2 . C ố định t ế bào bằng 100 μ l f ormal 10% B.1.3.3 . Ủ đĩa ở nhiệt độ ph ò ng trong vòng 30 min. B.1.3.4 . Loại bỏ dung dịch c ố định và rửa đĩa 3 l ầ n 300 μ l PBS. B.1.3.5 . Cho vào 50 μ l xanh methylen 0.05% B.1.3.6 . Ủ đ ĩ a ở nhiệt độ ph ò ng trong vòng 30 min. B.1.3.7 . Loại b ỏ xanh methylen và rửa đ ĩ a 3 lần với 300 μ l PBS. B.1.3.8 . Quan sát dưới kính hi ể n vi soi ngược đ ể đọc và ghi nhận bệnh tích t ế bào. B.2 . Đọc và diễn giải kết quả B.2.1 . Đọc kết quả Đọc kết quả sau khi nhuộm, bằng cách quan sát dưới k í nh hiển vi soi ngược để ghi nhận bệnh lý tế bào trên từng giếng. Kết quả dương tính là những giếng khi xem dưới k í nh hiển vi soi ngược không có bệnh tích tế bào (không có CPE). N ế u sau khi nhuộm thì các giếng dương t í nh có màu xanh (v ì những giếng đó vi rút đ ã được trung hòa với kháng thể trong huyết thanh nên tế bào vẫn phát triển b ì nh thường). Kết quả âm t í nh là những g iế ng khi xem dưới k í nh hiển vi soi ngược có bệnh tích tế bào (có CPE), sau khi nhuộm thì các giếng âm tính sẽ trống (không có màu). Bệnh tích tế bào được ghi nhận vào phiếu kết quả (TYV6-BM-VR-09.01A). Kết quả được tính bằng công thức Karber (1931). TCID50 = a + 0,5 - 1/ n x ∑ r l Trong đó: a là độ pha loãng cao nh ấ t có bệnh tích t ế bào; r l l à số giếng không có bệnh tích t ế bào ở từng độ pha loãng; n là số giếng sử dụng cho một độ pha lo ã ng. B.2.2 . Diễn giải kết quả a) Phản ứng có giá tr ị khi: - Đ ố i chứng t ế bào: b ì nh thường; - Đối chứng môi trường: bình thường; - Hiệu giá của mẫu đ ố i chứng huyết thanh dương chuẩn ch ỉ ch ê nh lệch ± 2 độ pha loãng; - Hiệu giá chuẩn độ lại vi rút (100 TCID 50 ) phải nằm trong khoảng log 1 0 1,5 đến log 10 2,5. b) Kết quả: Hiệu giá kháng thể có trong mẫu huyết thanh được tính ở nồng độ pha loãng cuối cùng của huyết thanh có trong hỗn hợp huyết thanh/vi rút là nơi 50 % số giếng được bảo hộ. - Mẫu huyết thanh được xem là không có kháng thể (mẫu âm tính) nếu c ó hiệu giá kháng thể £ 1:16. - Mẫu huyết thanh được xem là có kháng th ể (mẫu dương tính) nếu có hiệu giá kháng thể ³ 1: 45. - Mẫu huyết thanh được xem là nghi ngờ n ế u có hiệu giá khá n g thể từ 1:16 đến 1:32 CHÚ TH Í CH: Sự chứng nhận cho từng cá th ể động vật v ớ i mục đ í ch thương mại, nồng độ t ừ 1/16 đến 1/32 được xem là giới hạn nghi ngờ, và cần phải l ấ y th ê m mẫu huyết thanh để kiểm tra; kết quả được xem là dương t í nh n ế u mẫu kiểm tra lần 2 hiệu gi á là 1/16 hoặc cao hơn. Với mục đ í ch thống k ê trên cơ sở dữ liệu huyết thanh là một ph ầ n của khảo sát thống k ê v ề hiệu lực huyết thanh, ngưỡng 1/45 có th ể xem là thích hợp. Ngư ỡ ng hiệu giá để đánh giá kh ả n ă ng bảo hộ mi ễ n dịch của vacxin phải được thi ế t lập từ các thí nghiệm v ề kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin liên quan và động vật mục tiêu. Kết quả kiểm tra c ó th ể k hác nhau giữa các phòng thí nghiệm có liên quan đến ngưỡng giới hạn âm t í nh và dư ơ ng t í nh. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Chapter 2.1.5: Foot and Mouth Disease, OIE Terrestrial Manual 2009