TCVN8710-3:2011

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8710-3:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 3: bệnh đốm trắng ở tôm TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-3:2011 BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 3: BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 3: White spot syndrome virus Lời nói đầu TCVN 8710-3:2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Pháttriển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượngthẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. TCVN 8710-3:2011 BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 3: BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 3: White spot syndrome virus CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn, sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh đốm trắng do vi rút ở tôm. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 8377:2010, Tôm và sản phẩm tôm - Phát hiện virut gây bệnh đốm trắng (WSSV) bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR). 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa nêu trong TCVN 8377:2010. 4. Phương pháp chẩn đoán 4.1 Chẩn đoán lâm sàng 4.1.1 Dịch tễ học Bệnh xảy ra thành dịch chủ yếu trên các loài tôm thuộc họ Penaeidae như Peneus monodon, P. vannamei, P.stylirostris, P. setiferus… Ngoài tôm he (các loài tôm thuộc họ trên), một số loài tôm đất, tôm càngxanh, cua, ghẹ, đến tôm có kích thước nhỏ như Acets sp, giáp xác phù du như Artemia, Copepodađều mang mầm bệnh. Bệnh lây lan từ tôm bố mẹ truyền sang con cái trong quá trình sinh sản, từ cá thể bị nhiễm trong ao, bể do tôm ăn thức ăn có mầm bệnh hoặc do dụng cụ nhiễm mầm bệnh hoặc do các vật chủ trung gian như copepoda, tôm tự nhiên, cua, ghẹ... hoặc chim mang mầm bệnh vào khu vực nuôi tôm. Vi rút có thể cảm nhiễm hầu hết các giai đoạn phát triển của tôm: giai đoạn ấu trùng biến thái, tôm giống, tôm trưởng thành cả tôm nước mặn, lợ và nước ngọt. Bệnh xuất hiện quanh năm, đặc biệt là mùa xuân và đầu hè khi thời tiết biến đổi nhiều như biên độ nhiệt độ trong ngày biến thiên quá lớn, thay đổi độ mặn gây sốc cho tôm. 4.1.2 Triệu chứng lâm sàng Tôm bị bệnh thường thể hiện dấu hiệu giảm ăn rõ rệt, đôi khi có trường hợp tăng cường sự bắt mồihơn bình thường, sau vài ngày bỏ ăn, tôm dạt bờ, lờ đờ với dấu hiệu xuất hiện các đốm trắng tròn dưới lớp vỏ kitin đặc biệt là vùng đầu ngực và đốt bụng cuối cùng. Trong trường hợp cấp tính, tômbệnh có thể chuyển sang màu hồng đỏ. Hiện tượng chết có thể xảy ra ngay sau đó, tỉ lệ chết có thể lên đến khoảng từ 90 % đến 100 % trong vòng 3 ngày đến 7 ngày. 4.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 4.2.1 Phương pháp PCR, theo TCVN 8377:2010. 4.2.2 Phương pháp mô học 4.2.2.1 Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước cóđộ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác. - Dung dịch Davidson (xem A.1). - Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2). - Thuốc nhuộm eosin (xem A.3). - Cồn 70 %, 90 %, 95 % và cồn tuyệt đối. - Parafin. - Xylen. - Keo dán, ví dụ Bom Canada. 4.2.2.2 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh. - Kính giải phẫu; - Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen - Lọ nhỏ cố định mẫu; - Bình rót parafin; - Bộ phận làm lạnh mẫu; - Máy cắt mẫu microtome; - Nồi nước có chỉnh nhiệt độ; - Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu; - Kính hiển vi quang học; - Cassete; - Khung đúc mẫu. 4.2.2.3 Lấy mẫu Thu mẫu tôm giống (từ postlavare 5 trở lên). Mẫu tôm phải còn sống hoặc đang trong tình trạng hấp hối. Không dùng tôm đông lạnh, tôm bảo quản đá để cắt mô. 4.2.2.4 Các bước tiến hành 4.2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu - Cố định mẫu trong dung dịch Davidson. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10. - Đối với tôm ấu trùng hoặc tôm postlavare (hậu ấu trùng) có thể cố định cả con trong dung dịch từ 12 h đến 24 h. Thu lấy khoảng từ 30 con đến 50 con trên bể. Sau đó cố định trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng. - Đối với tôm lớn lấy mang, dạ dày và biểu mô dưới vỏ cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Thu lấy khoảng từ 5 con đến 10 con trên một ao. Ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước củamẫu, sau đó bảo quản ngay trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng. 4.2.2.4.2 Khử mẫu cố định - Ngâm trong cồn 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. - Sau đó ngâm trong cồn tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. 4.2.2.4.3 Làm trong mẫu - Ngâm sang xylen 1 để trong 30 min đến 60 min - Ngâm sang xylen 2 để trong 30 min đến 60 min. - Ngâm tẩm parafin 2 lần, mỗi lần 56 ºC đến 58 ºC trong 1 h. - Đúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắt được tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh. 4.2.2.4.4 Cắt mẫu - Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá. - Đặt mặt khối block nến song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 µm đến 5 µm. - Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước từ 30 ºC đến 35 ºC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô. 4.2.2.4.5 Nhuộm tiêu bản H&E - Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượttrong cồn tuyệt đối, cồn 90 % và cồn 70%, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min. - Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min. - Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ cồn 75 %, cồn 90 % và cồn tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, ví dụ Bom Canada. Để khô và soi kính. 4.2.2.4.6 Đọc kết quả - Soi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật kính có độ phóng đại cao. - Khi tôm bị bệnh WSSV, trong mô của một số cơ quan như mang, dạ dày, biểu mô dưới vỏ kitin, cơquan tạo máu… có những biến đổi đặc thù. Những tế bào bị nhiễm vi rút thể hiện sự hơi phình to củanhân tế bào, trong đó chứa duy nhất một thể vùi hình cầu hoặc hình trứng bắt màu tím hồng củahematoxylin. Khi bệnh nặng các thể vùi thường chiếm hết thể tích của nhân tế bào phình to. 5. Kết luận Tôm được xác định nhiễm bệnh vi rút đốm trắng khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng và kết quả dương tính thu được từ một trong hai phương pháp sau: - Phản ứng PCR phát hiện vi rút dương tính; - Mẫu cắt mô có bệnh tích của vi rút đốm trắng (WSSV). PHỤ LỤC A (Quy định) THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH THUỐC THỬ A.1 Dung dịch Davidson Cồn 95 %: 330 ml Formalin (formaldehyd 37 %): 220 ml Axit axetic đậm đặc: 115 ml Nước: 335 ml A.2 Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin - Mayer) Hematoxylin dạng tinh thể: 1 g Natri iodat: 0,2 g Amoni alum [NH4Al(SO4)2] hoặc kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g Axit xitric: 1 g Cloral hydrat: 50 g Nước: 1000 ml Hoà tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni alum hoặc kali alum, hoà tan, tiếp tục cho axit xitric và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc. Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu. A.3 Thuốc nhuộm eosin Eosin Y: 1 g Cồn 70 %: 1 lít Axit axetic băng: 5 ml Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào cồn 70 %. Hoà tan eosin trong cồn, sau đó cho thêm axitaxetic rồi lọc qua giấy lọc. Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bùi Quang Tề. 2008, Bệnh truyền nhiễm của động vật thủy sản. p. 122-128. [2] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội. 2004. Bệnh học thủy sản. p. 184-189. [3] Flegel, T.W. 1997. Special topic review: major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus monodon) in Thailand. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 13 : p. 442. [4] Hameed, A.S., Balasubramanian. G., Musthaq, S.S., Yoganandhan. K. 2003. Experimental infection of twenty species of Indian marine crabs with white spot syndrome virus (WSSV). 57: p. 157-161. [5] Lightner, D.V. 1996. A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp. Baton Rouge, Louisiana, USA: World Aquaculture Society. [6] Li, Q., Zhange, Z., Chen, Y., Yang, F. 2003. White spot syndrome virus (WSSV) infectivity for Artemia at different developmental stages.. Diease of Aquatic Organism. 57: p. 261-264. [7] Lo, C.F., Ho, C.H., Peng, S.E., Chen, C.H., Hsu, H.E., Chiu, Y.L., Chang, C.F., Liu, K.F., Su, M.S., Wang, C.H. and Kou, G.H. 1996a. White spot syndrome associated virus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods. Diseases of Aquatic Organisms.27: p. 215-225. [8] Lo, C.F., Leu, J.H., Ho, C.H., Chen, C.H., Peng, S.E., Chen, Y.T., Chou, C.M., Yeh, P.Y., Huang, C.J., Chou, H.Y., Wang, C.H., Kou, G.H. 1996b. Detection of baculovirus associated with whitespot syndrome (WSBV) in penaeid shrimps using polymerase chain reaction. Diseases of Aquatic Organisms. 25: p. 133-141. [9] Lo C.F., Ho C.H., Chen C.H., Liu K.F., Chiu Y.L., Yeh P.Y., Peng S.E., Hsu H.C., Liu H.C., Chang C.F., Su M.S., Wang C.H. & Kou G.H. 1997. Detection and tissue tropism of white spot syndrome baculovirus (WSBV) in captured brooders of Penaeus monodon with a special emphasis on reproductive organs. Dis. Aquat. Org., 30: p. 53-72. [10] Lo C.F. & Kou G.H. 1998. Virus-associated white spot syndrome of shrimp in Taiwan: a review. Fish Pathol.,33: p. 365-371. [11] Maeda M., Itami T., Mizuki E., Tanaka R., Yoshizu Y., Doi K., Yasunaga-Aoki C., Takahashi Y. & Kawarabata T. 2000. Red swamp crawfish (Procambarus clarkii): an alternative experimental host in the study of white spot syndrome virus. Acta Virol., 44: p. 371-374. [12] OIE. 2009. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. Chapter 2.3.2. [13] Peng, S.E., Lo, C.F., Ho, C.H., Chang, C.F. and Kou, G.H. 1998. Detection of white spot baculovirus (WSBV) in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, using polymerase chain reaction. Aquaculture. 164: p. 253-262 [14] Wang, Y.-C. 1998. Experimental infection of white spot baculovirus in some cultured and wild decapods in Taiwan. Aquaculture. 164: p. 221 - 231. [15] Vlak J.M., Bonami J.R., Flegel T.W., Kou G.H., Lightner D.V., Lo C.F., Loh P.C. & Walker P.J. 2004. Nimaviridae. In C. M. Fauquet, M. A.