TCVN7605-3:2017

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7605-3:2017 (ISO/TS 21569-3:2015) về Phương pháp phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phần 3: Phương pháp real-time PCR đặc hiệu cấu trúc để phát hiện trình tự P35S-Pat trong sàng lọc sinh vật biến đổi gen TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7605-3:2017 ISO/TS 21569-3:2015 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DẤU ẤN SINH HỌC PHÂN TỬ - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN - PHẦN 3: PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR ĐẶC HIỆU CẤU TRÚC ĐỂ PHÁT HIỆN TRÌNH TỰ P35S-PAT TRONG SÀNG LỌC SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN Horizontal methods for molecular biomarker analysis - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Part 3: Construct-specific real-time PCR method for detection of P35S-pat-sequence for screening genetically modified organisms Lời nói đầu TCVN 7605- 5 :2017 hoàn toàn tương đương với ISO/TS 21569- 3 :201 5 ; TCVN 7605- 3 :2017 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, T ổ ng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. TCVN 7605 (ISO 21569) Phương pháp phân tích dấu ấ n sinh học phân tử - Phương pháp ph â n tích đ ể phát hiện sinh vật biến đổi gen và s ả n phẩm có nguồn gốc biến đ ổ i gen gồm có các tiêu chuẩn sau: - TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005) *) Thực phẩm - Phương pháp phân tích đ ể phát hiện sinh vật bi ế n đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa trên định tính axit nucleic - TCVN 7605-2:2017 (ISO 21569-2:2012) Phương pháp phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Phương pháp phân t í ch để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản ph ẩ m có nguồn g ố c biến đổi gen - Phần 2: Phương pháp real-time PCR đặc hiệu cấu trúc để phát hiện sự kiện FP967 của dòng hạt lanh và sản phẩm từ hạt lanh. - TCVN 7605-3:2017 (ISO 21569-3:2015) Phương pháp phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phần 3: Phương pháp real-time PCR đặc hiệu cấu trúc để phát hiện trình tự P35S-Pat trong sàng lọc sinh vật biến đổi gen Bộ tiêu chuẩn ISO 21569 Horizontal methods for molecular biomarker analysis - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products còn có các tiêu chuẩn sau: - ISO/TS 21569-4:2016 Horizontal methods for molecular biomarker analysis - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Part 4: Real-time PCR based screening methods for the detection of the P-nos and P-nos-nptll DNA sequences - ISO/TS 21569-5:2016 Horizontal methods for molecular biomarker analysis - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Part 5: Real-time PCR based screening method for the detection of the FMV promoter (P-FMV) DNA sequence - ISO/TS 21569-6:2016 Horizontal methods for molecular biomarker analysis - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Part 6: Real-time PCR based screening methods for the detection of cry1Ab/Ac and Pubi-cry DNA sequences PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DẤU ẤN SINH HỌC PHÂN TỬ - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NG UỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN - PHẦN 3: PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR ĐẶC HIỆU CẤU TR Ú C ĐỂ PHÁT HIỆN TRÌNH TỰ P35S-PAT TRONG SÀNG LỌC SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN Horizontal methods for molecular biomarker analysis - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Part 3: Construct-specific real-time PCR method for detection of P35S-pat-sequence for screening genetically modified organisms 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy trình phát hiện trình tự chuyển đổi ADN giữa promotor 35S ( P35s ) từ virut Cauliflower mosaic và gen phoshinothricin-acetyltransferase đã biến đổi ( pat ) từ vi khuẩn Streptomyces viridochromogene . C ấu trúc P35S-pat thường thấy trong thực vật biến đổi gen chịu được thuốc diệt cỏ có chứa phosphinothricin. Phương pháp đặc hiệu cấu trúc P35S-pat dựa trên real-time PCR và có thể được sử dụng cho mục đích sàng lọc định tính và định lượng. Đ ể nhận biết và định lượng một sự kiện đặc hiệu, phải thực hiện phân tích tiếp theo. Tiêu chuẩn này có th ể áp dụng để phân tích ADN chiết từ thực phẩm. Cũng có thể thích hợp để phân tích ADN chiết từ các sản phẩm khác như thức ăn chăn nuôi và các loại hạt. Việc áp dụng phương pháp này đòi hỏi phải chiết đủ số lượng và chất lượng của ADN có thể khuếch đại từ nền mẫu có liên quan. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chu ẩ n này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 7605 (ISO 21569) Thực phẩm - Phương pháp phân t í ch để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa trên định tính axit nucleic TCVN 7606:2007 (ISO 21571:2005) Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Tách chiết axit nucleic TCVN 7608 (ISO 24276) Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và s ả n phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Yêu cầu chung và định nghĩa 3 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa trong TCVN 7608 (ISO 24276). 4 Nguyên tắc ADN được chiết ra khỏi phần mẫu thử bằng phương pháp thích hợp. Phân tích ADN gồm có hai phần: 1) xác định lượng ADN và khả năng khuếch đại của ADN chiết được, ví dụ bằng phương pháp real-time PCR taxon đích đặc hiệu (xem ISO 21570 [10 ] ), và 2) phát hiện cấu trúc P35S-pat bằng real-time PCR. [ 1,2 ] 5 Thuốc thử và vật liệu thử 5.1 Yêu cầu chung Sử dụng các hóa chất loại phân tích đã được công nhận, phù hợp với phân tích sinh học phân tử. Nước được sử dụng phải được cất hai lần hoặc có chất lượng dùng cho PCR (không chứa nuclease và axit nucleic). Tất cả các thao tác có sử dụng găng tay c ầ n đảm bảo rằng găng tay không có bột. Nên sử dụng đầu typ pipet bảo vệ sol khí để tránh lây nhiễm chéo. 5.2 Thuốc thử PCR 5.2.1 ADN polymerase chịu nhiệt , dùng cho hot-start PCR. 5.2.2 Dung dịch đệm PCR , chứa magie clorua và các deoxyribonucleoside triphosphate (dATP, dCTP, dGTP và dUTP). Có thể sử dụng các hỗn hợp thuốc thử đã chuẩn bị sẵn hoặc trộn các thành phần riêng lẻ. Có thể sử dụng các thuốc thử và polymerase cho kết quả tương đương hoặc tốt hơn. 5.2.3 Oligonucleotid (xem Bảng 1). Bảng 1 - Oligonucleotid Tên Trình tự ADN của oligonucleotid Nồng độ cuối trong PCR Cấu trúc P35S-pat l à trình tự đích: [1,2 ] Đoạn mồi 35SP03. f 5'-AAg TTC ATT TCA TTT ggA gAg gAC A-3’ 200 nmol/1 Đoạn mồi pat-7.r S'-Cgg CCA TAT CAg CTg CTg TAg-3’ 200 nmol/l Đoạn dò GSS01. s 5 ' -(FAM)-CCg gAg Agg AgA CCA gTT gAg ATT C- (TAMRA)-3' a 100 nmol/l a FAM:6-Cirboxyfluorescein,TAMRA:6-Carboxytetramethylrhodamine; CHÚ THÍCH Có thể sử dụng các loại thuốc nhuộm reporter và/hoặc thuốc nhuộm quencher tương đương cho đoạn dò nếu chúng cho kết quả tương tự hoặc tốt hơn. 5.2.4 ADN chuẩn dùng cho hiệu chu ẩ n Dung dịch ADN chuẩn với nồng độ đã biết (ng/μl) có th ể được sử dụng để tính số lượng bản sao của trình tự đích P35s-pa t. Khi sử dụng hệ gen ADN thực vật làm ADN chuẩn, th ì số lượng gen đơn bội tương ứng cần được tính theo khối lượng phân tử của gen đơn bội thực vật bằng Công thức (1) sau đây: (1) Trong đ ó : n hgeq l à số lượng gen đơn bội tương ứng trên microlit [ADN] là nồng độ ADN tính bằng nanogam trên microlit, (ng/μl); m hg là khối lượng hệ gen đơn bội, tính bằng picogam (pg). Dựa theo lượng gen đơn bội, có thể tính được số bản sao tương ứng với trình tự P35S-pat . Khi tính số bản sao, c ầ n tính đến số lượng tích hợp vào gen thực vật cũng như mức độ tiếp nhận gen vào thực vật được sử dụng. 6 Thiết bị, dụng cụ Đối với thiết bị và vật liệu, xem TCVN 7605 (ISO 21569). Ngoài các thiết bị ph ò ng thử nghiệm thông thường cần có các thiết bị sau: 6.1 Thiết bị real-time PCR Thiết bị real-time PCR thích hợp cho việc kích thích các phân tử huỳnh quang v à phát hiện các tín hiệu huỳnh quang tạo ra trong quá trình PCR. 7 Cách tiến hành 7.1 Chuẩn bị mẫu thử C ầ n đảm bảo rằng mẫu thử được sử dụng đ ể chiết ADN là mẫu đại diện của phòng thử nghiệm, ví dụ bằng cách nghiền hoặc đồng h ó a mẫu. Lưu ý đến các bước đo và thực hiện theo quy định trong TCVN 7606 (ISO 21571) và TCVN 7608 (ISO 24276). 7.2 Chuẩn bị chiết ADN Việc chuẩn bị ADN từ phần mẫu thử, phải tuân thủ các hướng dẫn chung và các phép đo được nêu trong TCVN 7606 (ISO 21571). Nên chọn phương pháp chiết ADN được mô tả trong Phụ lục A, TCVN 7606 (ISO 21571). 7.3 Cài đặt PCR Phương pháp quy định tổng thể tích là 25 μl cho mỗi ống phản ứng PCR. Chuẩn bị phản ứng theo Bảng 2. Rã đông hoàn toàn thuốc thử ở nhiệt độ phòng. Mỗi loại thuốc thử phải được trộn cẩn thận và cho ly tâm nhanh trước khi được lấy bằng pipet. Chu ẩ n bị hỗn hợp thuốc thử c ó chứa tất cả các thành phần trừ mẫu ADN. Lượng hỗn hợp thuốc thử PCR yêu cầu phụ thuộc vào số lượng phản ứng cần được thực hiện, bao gồm ít nhất một phản ứng bổ sung để dự phòng. Với mỗi phản ứng sử dụng 5 μl ADN mẫu. Bảng 2 - Chuẩn bị phản ứng để khuếch đại Tổng thể tích phản ứng 25 μl M ẫ u ADN (đến 200 ng) hoặc mẫu kiểm soát 5 μl Dung dịch đệm PCR a (bao gồm MgCI 2 , dNTP và polymerase ADN hot-start 12,5 μl Đoạn mồi 35SP03. f và pat-7.r Xem B ả ng 1 Đoạn dò GSSO 1 .s Xem Bảng 1 Nước Đến 25 μl a Trong nghiên cứu cộng tác, tùy thuộc vào thiết bị real-time PCR mà các dung dịch đệm PCR khác nhau đã được sử dụng [TaqM.in Universal PCR Mastermix (Life Technologies. Darmstadt), QuantiTeci Multiplex PCR NoROX hoặc QuantiTect Probe PCR Master/mix (O i agen GmbH, Hilden)]. Thông tin này đ ưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấ n định phải sử dụng chúng. Các sản ph ẩ m tương ứng từ các nhà sản xuất khác có thể được sử dụng nếu chúng cho kết quả tương tự hoặc tốt hơn. Nếu c ầ n, điều chỉnh các lượng thuốc th ử v à chương trình nhiệt độ-thời gian cho phù hợp. Trộn hỗn hợp thuốc thử, ly tâm nhanh và dùng pipet lấy 20 μl hỗn hợp này vào từng ống phản ứng. Đối với việc kiểm soát thuốc th ử PCR, thêm 5 μl nước để thiết lập phản ứng. Dùng pipet lấy 5 μl mẫu ADN hoặc 5 μl dung dịch kiểm soát tương ứng (kiểm soát chiết mẫu trắng, kiểm soát đích ADN dương tính). Nếu cần, chuẩn bị kiểm soát ức chế PCR như nêu trong TCVN 7608 (ISO 24276). Chuyển các ống phản ứng vào máy chu trình nhiệt và khởi động chương trình nhiệt độ-thời gian. 7.4 Chương trình nhiệt độ-thời gian Chương trình nhiệt độ-thời gian, nêu trong Bảng 3, đã được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá xác nhận. Cần phải tối ưu hóa khi sử dụng các điều kiện phản ứng và các máy chu trình real-time PCR khác. Thời gian biến tính ban đầu phụ thuộc vào hỗn hợp ban đầu được sử dụng. Bảng 3 - Chương trình nhiệt độ-thời gian Bước Thông số Nhiệt độ Thời gian Đo huỳnh quang Số chu trình 1 Hoạt hóa UNG (tùy chọn) 50 ° C 2 min Không 1 2 Bi ế n tính ban đầu 95 ° C 10 min Không 1 3 Khuếch đại Biến tính 95 ° C 15 s Không 45 Gắn mồi và kéo dài 60 ° C 60 s Có 8 Tiêu chí chấp nhận/từ chối 8.1 Yêu cầu chung Chương trình phân tích dữ liệu thiết bị đặc hiệu real-time PCR tương ứng được sử dụng để nhận biết các sản phẩm PCR. Các kết quả khuếch đại có thể được đưa ra theo cách khác nhau, tùy thuộc vào thiết bị được sử dụng. Trong trường hợp không có sản phẩm PCR được phát hiện (kiểm soát âm tính), thì kết quả có thể được biểu thị là "không xác định được", "không khuếch đại được" hoặc số chu trình tối đa. Nếu việc khuếch đ ại của trình tự A D N đích x ả y ra trong mẫu (kiểm soát dương tính), thì có thể quan sát được đường khuếch đại hình chữ S và số chu trình được tính mà tại đ ó giá trị huỳnh quang xác định trước bị vượt quá ngưỡng (giá trị C t hoặc giá trị C p ). Nếu số liệu tín hiệu đo huỳnh quang không điển hình, thì việc giải thích tự động không mang lại kết quả có nghĩa, cần phải thiết lập thủ công đường nền và ngưỡng trước khi gi ả i thích dữ liệu. Trong trường hợp này, áp dụng các hướng dẫn cho thiết bị cụ thể nêu trong sổ tay dùng phần mềm giải thích. 8.2 Nhận biết Trình tự đích phát hiện được, nếu: - sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu P35S-pat của 35SP03.C và pat-7.r và đoạn dò GSS01.S, có thể quan sát được đường khuếch đại hình chữ S v à giá trị huỳnh quang xác định trước đã bị vượt quá ngưỡng, - việc thiết lập kiểm soát PCR không bổ sung ADN (kiểm soát thuốc th ử PCR, kiểm soát chiết âm tính), không quan sát thấy đường cong khuếch đại hình chữ S và giá trị huỳnh quang xác định trước không bị vượt quá ngưỡng, và - việc thiết lập kiểm soát khuếch đại (kiểm soát đích ADN dương tính, kiểm soát ức chế PCR) các giá trị C t dự kiến (hoặc giá trị C p ) đạt được. 8.3 Tính số lượng bản sao P35S-pat Với các chuẩn ADN có chứa các lượng xác định số bản sao P35S-pat (xem 5.2.4, 9.3), c ó thể dựng đường chuẩn v à được sử dụng để tính số lượng bản sao P35S-pat trong các mẫu chưa biết. 9 Thực trạng xác định giá trị sử dụng và tiêu chí hiệu năng 9.1 Độ chắc chắn của phương pháp Độ chắc chắn của phương pháp chưa được kiểm tra với những thay đổi nhỏ các yếu tố như nồng độ thuốc thử (ví dụ đoạn m ồ i, đoạn dò) hoặc các điều kiện phản ứng (ví dụ: nhiệt độ gắn mồi). CHÚ THÍCH Trong phép thử nghiệm cộng t á c, độ chắc chắn của phương pháp đ ã được kiểm tra b ằ ng các máy real-time PCR khác nhau (ABI 7500, ABI 7700, ABI 7900, RotorGene 3000, RotorGene 6000, LightCycler 480). Máy real-time PCR không ả nh h ưở ng đến hiệu năng của phương ph á p. 9.2 Phép thử cộng tác để xác định LOD LOD của phương pháp được thử nghiệm trong nghiên cứu cộng tác được tổ chức Bảo vệ Người tiêu dùng và An toàn Thực phẩm Liên bang Đức (BVL) thực hiện năm 2011 với t ổ ng cộng 10 phòng thử nghiệm tham gia. Các phòng thử nghiệm tham gia đã nhận được 4 mẫu ADN từ thực vật biến đổi gen dương tính có chứa trình tự đích P35S-pat . Để chuẩn bị mẫu, các mẫu chuẩn đã được chứng nhận của Hiệp hội các nhà Hóa học về d ầ u của Mỹ (AOCS Urbana USA) và Viện Chất chuẩn và Đo lường (IRMM, Geel Belgium) đã được sử dụng. Các vật liệu được sử dụng là ADN từ lá cây hạt cải dầu T45 (AOCS 0208-A2), đậu tương A2704-12 (AOCS, 0707-B2), ngô T25 (AOCS, 0306-H) và ADN chiết được từ bột ngô 1507 (IRMM ERM- BF418d). Nồng độ ADN được xác định bằng quang phổ. S ố lượng gen trên mỗi μl được tính theo Công thức (1). Trên cơ sở số lượng gen t í nh được số bản sao tương ứng với trình tự P35S-pat dựa trên số tích hợp của trình tự P35S-pat vào hệ gen thực vật cũng như mức độ tiếp nhận gen vào thực vật được sử dụng (xem Bảng 4). S ố lượng bản sao của mẫu ADN được điều chỉnh đến khoảng 100 bản sao của trình tự P35S-pat trên mỗi μl. Bảng 4 - Đặc tính của mẫu chuẩn để xác định LOD Sự kiện biến đổi gen Nguồn m ẫ u chu ẩ n Vật liệu/% (m/m) biến đ ổ i gen Khối lượng gen đơn bội (pg) [3] Tình trạng tiếp hợp giao t ử Số bản sao P35S-pat trên gen đơn bội Chiều d à i của sản phẩm PCR P35S-pat (bp) Hạt cải dầu T45 AOCS ADN/99,99 % 1,3 Đồng hợp t ử 1 [ 4 ] 111 Đậu tương A2704-12 AOCS ADN/99,99 % 1,13 Đồng hợp tử 2 [5] 102 Ngô T25 AOCS ADN/99,99 % 2,7 Đồng hợp tử 1 [6] 111 Ngô TC1507 IRMM B ột/ 10 % 2,7 Dị hợp tử 1 [7] 102 Trên cơ sở của bốn dung dịch ADN chuẩn, các phòng thử nghiệm chuẩn bị dãy pha loãng để thu được các dung dịch ADN với 50 số bản sao từ 0,1/25 μl phản ứng PCR, tương ứng. Các thành viên tham gia đã phân tích từng dung dịch ADN pha lo ã ng bằng phương pháp real-time PCR P35S-pat sáu lần phép xác định theo các điều kiện được nêu trong Bảng 1 đến Bảng 3. Kết quả của nghiên cứu thử nghiệm cộng tác này được liệt kê trong Bảng 5. Bảng 5 - Các kết quả phép thử cộng tác để xác định LOD Số bản sao P35S- pat trên PCR Số kết quả dương tính ( C t < 45) trong số 60 kết quả Hạt cải dầu T45 Ngô TC1507 Ngô T25 Đậu tương A2704-12 50 60 60 60 60 20 60 60 60 60 10 59 60 60 60 5 46 59 56 55 2 26 52 41 36 1 11 42 21 24 0,1 3 8 3 2 9.3 Phép thử cộng tác để định lượng cấu trúc P35S-pat trong hạt cải dầu Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong nghiên cứu cộng tác được Tiểu ban về xây dựng Phương pháp của Ủy ban Hợp tác Quốc gia và Liên bang Đức về Kỹ thuật di truyền (LAG) thực hiện vào năm 2014 với t ổ ng 14 phòng thử nghiệp tham gia. Những bên tham gia đ ã nhận được 5 mẫu hạt và 5 mẫu ADN tương ứng. Để chuẩn bị mẫu hạt, hạt cải dầu không biến đổi gien được trộn với hạt cải dầu GS 40/90 biến đổi gen với tỷ lệ 980 g/20 g (2 % biến đổi gen), 990 g/10 g (1 % biến đổi gen), 995 g/5 g (0,5 % biến đổi gen), 999 g/1 g (0,1 % biến đổi gen) và 1 000 g/0 g (0 % biến đổi gen), sử dụng bộ chia mẫu để đồng hóa và chia nh ỏ th à nh các mẫu 30 g. Các bên tham gia phải nghiền các mẫu hạt và phân lập ADN. Để chuẩn bị mẫu ADN cung cấp cho các bên tham gia, trộn hệ gen ADN được phân lập từ cây cải dầu GS 40/90 với hệ gen ADN được phân lập từ cây cải dầu không biến đổi gen để thu được các dung dịch chứa 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % và 0 % ADN GS 40/90 hạt cải dầu. Nồng độ các mẫu ADN được điều chỉnh đến 20 ng/μl. Các phòng thử nghiệm tham gia thực hiện ba lần phép xác định với mỗi mẫu bằng phương pháp real - time PCR P35S-pat với các điều kiện được nêu trong Bảng 1 đến Bảng 3. Để hiệu chuẩn, 6 ADN chuẩn (100, 300, 900, 2 700, 8 100, 100 000 bản sao đã được cung cấp) được đo hai lần trong cùng một lần phân tích PCR. Ngoài ra, thực hiện cùng số phép đo sử dụng phương pháp real-time PCR taxon đích đặc hiệu gen pepC của hạt cải dầu. [ 1 ] Dựng đường chuẩn bằng cách dựng các giá trị C t theo lôgarit của số bản sao trình tự đích được cung cấp cho các dung dịch hiệu chuẩn, số lượng bản sao tương ứng với các mẫu được tính bằng nội suy từ đường chuẩn. Trong Bảng 6 đưa ra tóm tắt các kết quả. Bảng 7 cho thấy các kết quả định lượng. Trước khi tính các hàm lượng biến đổi gen trung bình và dữ liệu độ chụm sử dụng phép kiểm tra thống kê theo TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) [8 ] , các số lạc Gruhbs và Cochran được xác định và loại bỏ nếu có. V ì không biết được số lượng alen pepC trong các giống cải dầu khác nhau, nên không thể sử dụng các kết quả của PCR taxon đặc hiệu để tính số bản sao gen của cây cải dầu. Do đó, độ chính xác của phương pháp này không thể xác định được. Ngoài ra, giả định rằng hàm lượng biến đổi gen đúng trong mẫu hạt có thể sai lệch so với hàm lượng dự kiến. Không thể ước lượng được độ sai lệch. Bảng 6 - Kết qu ả phép thử cộng tác để định lượng cấu trúc P35S-pat trong hạt cải dầu Năm thực hiện phép th ử cộng tác 2 0 04 Số lượng ph ò ng th ử nghiệm tham gia 14 Số lượng phòng th ử nghiệm báo cáo kết quả 14 Số lượng mẫu hạt cho mỗi phòng thử nghiệm 5 Số lượng mẫu ADN cho mỗi phòng thử nghiệm 5 Số lượng kết quả được chấp nhận 140 Số lượng mẫu được chấp nhận chứa trình tự đích P3SS-pat 112 S ố lượng mẫu được chấp nhận không chứa trình tự đích P3SS-pat 28 Kết quả dương tính gi ả 0 (0 %) Kết quả âm tính giả 0 (0 %) Bảng 7 - Kết quả định lượng thu được trong phép thử cộng tác P35S-pat Hàm lượng biến đổi gen tương đối của m ẫ u tính bằng % khối lượng (w/w) Hàm lượng biến đổ i gen tính được, % (số bản sao P35S-pat/ số bản sao pepC ) MW a RSD R b (%) 0,1 % (hạt cải dầu) 0,19 52,0 0,5 % (hạt cải dầu) 0,88 29,5 1 % (hạt cải dầu) 1,78 42,1 2 % (hạt cải dầu) 3,91 32,5 0,1 % (ADN) 0,14 32,2 0,5 % (ADN) 0,54 34,5 1 % (ADN) 1,08 21,8 2 % (ADN) 2,26 17,3 a Giá trị trung b ì nh sau khi trừ số lạc Grubbs và Cochran b Độ lệch chuẩn tương đối (trong điều kiện tái lập) sau khi trừ số lạc Grubbs v à Cochran 9.4 Độ nhạy Trong Bảng 5, các kết quả phép thử cộng tác với các mẫu ADN cho thấy số lượng thấp về bản sao của trình tự đích P35S-pat . ADN chuẩn, thiết lập nồng độ 10 bản sao cho mỗi phản ứng PCR, dẫn đến sự khuếch đại ở hầu hết các phòng thử nghiệm ch ỉ loại một trong 60 phản ứng đối với cây cải dầu T45. Dựa trên những kết quả này, giới hạn phát hiện đối với sự kiện biến đổi gen đã kiểm tra nhỏ hơn hoặc bằng 10 bản sao. 9.5 Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu của đoạn mồi và đoạn dò đã được đánh gi á xác nhận in silico sử dụng các liên kết trình tự có dữ liệu trong ngân hàng gen GenBank/EMB L/ DDBJ (ngày tìm kiếm: 2011-06-16). Với mục đích này, bằng cách sử dụng chương trình BLASTN và trình tự của sản phẩm PCR của ngô từ sự kiện FP967 (Tài liệu tham khảo [2]), đ ể so sánh với các trình tự nucleotid trong GenBank (cơ sở dữ liệu "non-redundant" với tất cả GenBank, RefSeq, EMBL, DDBJ và PDB) và cơ sở dữ liệu về các trình tự nucleotid đã có bản quyền được cấp bằng sáng chế. Kết quả t ì m kiếm cho thấy không hoàn toàn giống với các trình tự khác trong cơ sở dữ liệu ngoại trừ các oligonucleotid đích. Tính đồng nhất của trình tự amplicon ch ỉ tìm thấy đối với các trình tự nucleotid rõ ràng của DAS 59122-7, DAS-59132, TC I 507 và A5547-127, cũng như đối với các trình tự nucleotid rõ ràng khác của thực vật biến đổi gen không đặc hiệu hoặc vector được sử dụng để chuyển hóa cây trồng. Tìm kiếm BLASTN (ngày tìm kiếm: ngày 15 tháng 11 năm 2011) xác nhận tính đồng nhất hoàn toàn của trình tự P35S-pat với tr ì nh tự nucleotid của thực vật biến đ ổ i gen hoặc vectơ được sử dụng để chuyển hóa cây trồng. Khi th ử nghiệm xác định tính đồng nhất của phương pháp P35S-pat , không phát hiện sự khuếch đại ADN từ thực vật biến đ ổ i gen sau đây: - Gạo biến đổi gen: LL62 (ACS-OSØØ2-5), LL601 (BCS-OSØØ3-7) ; - Hạt cải biến đ ổ i gen: GT73 (MON-ØØØ73-7), Laurat (pCGN3828) (CGN-89465-2), MS1xRF1 (ACS- BNØØ4-7xACS-BNØØ1-4), MS8 (ACS-BNØØ5-8); - Ngô biến đổi gen: 3272 (SYN-E3272-5), Btl76 (SYN-EV176-9), CBH-351 (ACS-ZMØØ4-3), M 0 N809 (PH-MON8Ø9-2), MON810 (MON-ØØ81Ø-6), GA21 (MON-ØØØ21-9), MIR604 (SYN-1R6Ø4-5), MONB63 (MON-ØØ863-5). M 0 N88017 (MON-88Ø17-3), NK603 (MON-ØØ6Ø3-6); - Đậu tương biến đổi gen: 305423 (DP-3Ø5423-1), 356043 (DP-356Ø43-5), MON40-3-2 (MON-Ø4Ø32-6); - Khoai tây biến đ ổ i gen: EH92-527-1 (BPS-25271-9); - Củ cải đường biến đ ổ i gen : GTSB77 , H7-1 (KM-ØØØ71-4); - Đu đ ủ biến đổi gen: 55-1 (CUH-CP551-8). Đối với thực vật biến đổi gen sau đây, thực nghiệm cho thấy rằng phương phá p phát hiện P35S-pat là phương pháp s à ng lọc thích hợp: - Hạt c ả i dầu biến đổi gen: Falcon GS40/90 (ACS-BNØ1Ø-4), Topas 19/2 (ACS-BNØØ7-1), T45 (ACS-BNØØ8-2), Liberator (ACS-BNØØ9-3); - Ngô biến đổi gen: T14 (ACS-ZMØØ2-1), T25 (ACS-ZMØØ3-2), TC-1507 (DAS-Ø15Ø7-1), DAS- 59122 (DAS-59122-7); - Đậu tương biến đổi gen: A2704-12 (ACSGMØØ5-3), A5547-127 (ACS-GMØØ6-4). Đối với các sự kiện Topas 19/2, T45, TC-1507. DAS-59122-7, DAS-59123, A2704-12 và A5547-127, đã xác định được các chiều dài lý thuyết của amplicon P35S-pat từ 102 bp đến 111 bp (xem Bảng 4). CHÚ THÍCH Trong ngô Bt11, chiều dài amplicon P35S-pat là 410 bp và ch ỉ phát hiện được trong nh ữ ng trường hợp đặc biệt (ví dụ số lượng bản sao cao, một vài dung dịch đệm PCR). 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải được thực hiện theo TCVN 7068 (ISO 24276) và các tiêu chuẩn áp dụng khác (ví dụ TCVN/ISO/IEC 17025 [ 9 ] ). Thư mục tài liệu tham khảo [1] SUB-COMMITTEE FOR METHOD DEVELOPMENT OF THE GERMAN NATIONAL AND FEDERAL JOINT COMMITTEE ON GENETIC ENGINEERING (LAG) Real-Time PCR zur quantitativen Bestimmung gentechnisch veränderter Rapslinien mit dem 35S/pat-Genkonstrukt. J. Verbr. Lebensm. 2008, 3 pp.111-114 [2] H.-U. Waiblinger, L. Grohmann, J. Mankertz, D. Engelbert, K. Pietsch A practical approach to screen for authorised and unauthorised genetically modified plants. Anal. Bioanal. Chem. 2010, 396 (6) pp. 2065-2072 [3] K. Arumuganathan, E.D. Earle Nuclear content of some important plant species. Plant Mol. Biol. Rep. 1991, 9 pp. 208-218 [4] Part I . I . Summary of the request for Authorization of GM Food and GM Feed in Accordance with Articles 5 and 17 of Regulation (EC) No. 1829/2003 Glufosinate Ammonium-Tolerant Oilseed Rape Transformation Event T45. Available (viewed 2014-04-08) at: http://registerofquestions.efsa.europa.eu/roqFrontend/?wicket:inter$2margin-top:6.0pt'> [5] Part I . I . Summary of the request for Authorization of GM Food and Feed in Accordance with Articles 5 and 17 of Regulation (EC) No. 1829/2003 Glufosinate Ammonium-Tolerant Soybean Transformation Event A2704-12. Available (viewed 2014-04-08) at: http://registerofquestions.efsa.europa.eu/roqFrontend/?wicket:inter$2margin-top:6.0pt'> [6] Scientific opinion on applications EFSA-GMO-RX-T25 and EFSA-GMO-NL-2007-46 for the renewal of authorisation of maize T25,1 and for the placing on the market of herbicide-tolerant genetically modified maize T25,2 both for food and feed uses, import and processing under Regulation (E C) No 1829/2003 from Bayer CropScience AG. EFSA Journal 2013, 11 3356 pp. 1-30 [7] Opinion of the Scientific Panel on Genetically Modified Organisms on a request from th e Commission related to the notification (Reference C/ES/01/01) for the placing on the market of insect-tolerant genetically modified maize 1507 for import, feed and industrial processing an d cultivation, under Part C of Directive 2001/18/EC from Pioneer Hi-Bred lnternational/Mycoge n Seeds. EFSA Journal. 2005, 181 pp. 1-33 [8] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết qu ả đo - Phần 2: Phương pháp cơ b ả n xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn [9] TCVN ISO/IEC 17025 (ISO/IEC 17025), Y ê u cầu chung về năng lực của phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn [10] ISO 21570, Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Quantitative nucleic acid based methods *) ISO 21569:2005 đang được soát xét để tr ở th à nh ISO 21569-1