TCVN10807-1:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10807-1:2015 (ISO 13641-1:2003) về Chất lượng nước - Xác định sự ức chế quá trình tạo khí của vi khuẩn kỵ khí - Phần 1: Phép thử chung TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10807-1:2015 ISO 13641-1:2003 CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH SỰ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH TẠO KHÍ CỦA VI KHUẨN KỴ KHÍ - PHẦN 1: PHÉP THỬ CHUNG W ater quality - Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacter i a - Part 1: General t e st Lời nói đầu TCVN 10807-1:2015 hoàn toàn tương đương với ISO 13641-1:2003 TCVN 10807-1:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 147 Chất lượng n ướ c biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ tiêu chuẩn TCVN 10807 (ISO 13641) , Chất lượng nước - Xác định sự ức chế quá trình tạo khí của vi khuẩn kỵ khí gồm các phần sau: - TCVN 10807-1:2015 ( ISO 13641-1:2003), Phần 1: Phép thử chung; - TCVN 10807-2:2015 (ISO 13641-2:2003), Phần 2: Phép thử đối với nồng độ sinh khối thấp. CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH SỰ ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH TẠO KHÍ CỦA VI KHUẨN KỴ KHÍ - PHẦN 1: PHÉP THỬ CHUNG W ater quality - Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacter i a - Part 1: General t e st CẢNH BÁO - M ẫ u b ù n thải có thể chứa chất nguy hại và dễ cháy. Mẫu b ù n chứa các vi sinh vật gây bệnh và có khả năng tạo ra các tác động sinh học. Do đó, khuyến nghị xử lý mẫu đặc biệt cẩ n thận. Hoạt tính sinh học của vi sinh vật có thể tạo ra các l oại khí d ễ cháy tiềm ẩ n và tăng áp suất trong chai kín. Việc nổ các bình đựng mẫu thường kéo theo sự phát t á n các mảnh nhiễm khuẩn hoặc các hạt chất lỏng mang mầm bệnh. Nên tránh sử dụng chai thủy tinh. Việc l ấ y mẫu, vận chuyển và sử dụng mẫu b ù n và dùng các ố ng tiêm nhỏ và các kim tiêm đo á p suất phải hết sức cẩn trọng. Phải tuân th ủ các quy định quốc gia đối với các mối nguy hại từ vi sinh vật liên quan đến phương pháp này. C ầ n thao tác thận trọng với các vật liệu thử độc hại và các vật l i ệu không rõ đặc tính. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp s à ng lọc để đánh giá độc t ính tiềm ẩn của các chất, hỗn hợp, nước mặt, nước ng ầ m, nước thải, nước thải đã qua xử lý, bùn thải hoặc các mẫu môi trường khác bằng cách xác định sự tạo khí sinh học (cacbon đioxit và metan) từ quá trình phân hủy kỵ khí của bùn thải trong khoảng thời gian tới 3 ngày. Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn kỵ khí thấp h ơ n nhiều so với tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật hiếu kh í . Vì lý do này, khoảng thời gian thử đối với phương pháp kỵ khí dài hơn so với phương pháp được sử dụng cho vi khuẩn hiếu khí. Phương pháp này có thể áp dụng cho c á c chất, tan hoặc không tan trong nước, bao gồm cả hóa chất dễ bay hơi (xem trong tài liệu tham khảo [1] trong thư mục tài liệu tham khảo). CHÚ THÍCH: Cần đặc biệt c ẩ n trọng với các hợp chất í t hòa tan trong nước, và trong trường hợp này, xem ví dụ, TCVN 6918 (ISO 10634). Đối với các thông tin chung về phép thử sinh học xem ISO 5667-16 [ 2 ] . Phương pháp n à y cung cấp thông tin hữu ích trong việc dự báo t á c động có thể có của vật liệu thử đến sự tạo khí sinh học trong hệ thống phân hủy kỵ khí. Ví dụ, chỉ những phép thử dài hơn, mô phỏng gần hơn với hệ thống phân hủy đang hoạt động có thể cho biết liệu có xảy ra sự thích nghi của vi sinh vật với vật liệu thử hoặc liệu c á c hợp chất có khả năng hấp thụ vào bùn có thể tích lũy thành một nồng độ độc hại sau một thời gian dài hơn thời gian cho phép trong phép thử này không. Thông tin thu được từ tiêu chuẩn này có thể cũng hữu ích trong việc ch ọ n nồng độ khối lượng ban đầu phù hợp cho phép thử phân hủy sinh học kỵ khí (ví dụ TCVN 6825 (ISO 11734)). Tuy nhiên, tiêu chuẩn này sử dụng bùn không pha loãng nên ít phù hợp cho việc thử với bùn đang phân hủy pha loãng hơn s o với phương pháp m ô tả trong TCVN 10807-2 (ISO 13641-2) có sử dụng nồng độ khối lượng pha loãng gấp trăm lần. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đ ố i với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 6918 (ISO 10634), Ch ấ t lượng nước - Hướng dẫn chuẩn bị và xử lý hợp chất hữu cơ ít tan trong nước để đánh giá sự phân h ủy sinh học trong môi trường nước. 3. Nguyên tắc Các lượng nhỏ của hỗn hợp bùn đang phân hủy kỵ khí không pha loãng (20 g/l đến 40 g/l t ổ ng chất rắn khô) và chất nền có thể phân hủy được ủ riêng và ủ đồng thời với một dãy các nồng độ khối lượng của vật liệu thử trong các chai kín từ 2 ngày đến 3 ngày. Lượng khí sinh học (metan và cacbon đioxit) tạo ra được đo bằng sự gia tăng về áp suất trong chai. Phần trăm ức chế của quá trình tạo khí sinh học ở các nồng độ khối lượng khác nhau của vật liệu thử được tính bằng lượng khí tạo ra trong phép thử tương ứng và trong chai đối chứng. Ch ỉ số EC 50 và nồng độ khối lượng hiệu quả khác được t í nh từ đồ thị phần trăm ức chế đối với logarit của nồng độ khối lượng của vật liệu thử. 4. Thuốc thử và môi trường nuôi cấy 4.1 . Thuốc thử 4.1.1 . Nước pha loãng, đã được loại khí và loại ion Các kiểm soát về phân tích của nước này là không cần thiết, nhưng phải đảm bảo rằng hệ thống loại ion được bảo trì thường xuy ê n. Trước khi thêm chất cấy kỵ khí vào bất kỳ dung dịch hoặc dịch pha loãng nào của vật liệu thử, cần đảm bảo dịch này không chứa oxy. Vì thế, cần sục khí nitơ (4.1.2) qua nước pha loãng hoặc qua dịch pha loãng trong 1 h trước khi thêm chất cấy, hoặc thay thế bằng cách đun sôi nước pha loãng và để nguội ở nhiệt độ phòng trong môi trường không có oxy. 4.1.2 . Khí nitơ, độ tinh khiết cao chứa hàm lượng oxy nh ỏ hơn 5 µ l/l. 4.2 . Môi trường nuôi c ấ y 4.2.1 . Chất cấy (bùn đang ph â n hủy) Thu thập bùn kỵ khí đang phân hủy mạnh từ hệ thống phân hủy tại nhà máy xử lý nước thải, hoặc từ hệ thống phân hủy của phòng thí nghiệm đang xử lý bùn chủ yếu từ nước thải sinh hoạt vào chai thu mẫu (5.1). Thêm bùn vào chai này tới cách miệng chai khoảng 1 cm, đ ó ng chặt và đặt vào thùng bảo ôn (5.2) để giảm tối đa sự sốc nhiệt, cho đến khi được chuyển vào tủ ủ (5.12) ổn nhiệt ở 35 °C ± 2 °C. Khi m ở chai, c ẩ n trọng x ả á p suất khí bằng cách nới lỏng gioăng từ từ hoặc lắp van xả áp suất chạc ba (5.3) vào nắp chai. Tốt nhất là sử dụng bùn trong vài giờ sau khi lấy mẫu, hoặc bảo quản chai ở nhiệt độ 35 °C ± 2 °C mà phần trống của chai có chứa nitơ tối đa là 3 ngày vì trong khoảng thời gian này việc mất hoạt tính thường xảy ra ở mức độ thấp. Ngay trước khi sử dụng, trộn bùn bằng cách khuấy nhẹ và lọc qua rây (5.5) vào bể chứa thích hợp (5.6) có dòng kh í nitơ đi qua ở phần tr ố ng của bể. Đặt riêng một mẫu để xác định nồng độ khối lượng của tổng chất rắn khô (ví dụ xem TCVN 6625 (ISO 11923)). Nói chung, sử dụng bùn không pha loãng. Nồng độ khối lượng chất rắn ph ả i trong khoảng từ 20 g/ l đến 40 g/ l chất rắn khô. Kiểm tra giá trị pH của bùn, điều chỉnh về 7 ± 0,5, nếu cần. 4.2.2 . Chất nền H òa tan 10 g canh dinh dưỡng, 10 g chiết nấm men và 10 g D-glucoza trong nước loại ion (4.1.1) và pha loãng đến 100 ml. Lọc qua màng lọc khử khuẩn (0,2 µ m) (5.7) và dùng ngay hoặc bảo quản ở nhiệt độ 4 °C không quá 1 ngày. 5. Thiết bị, dụng cụ 5.1 . Chai thu chất cấy , có gioăng kín khi được làm bằng polyetylen tỷ trọng cao hoặc vật liệu tương đương, có thể dãn n ở . Khuyến nghị không sử dụng chai thủy tinh vì chai có thể nổ. 5.2 . Thùng bảo ôn , để vận chuyển bùn. 5.3 . Van xả áp chạc ba , có thể g ắ n vừa khít với nắp chai thu mẫu cấy. 5.4 . Máy ly tâm , để xác định nồng độ khối lượng của chất rắn đem cấy. 5.5 . Rây , c ó k í ch thước lỗ 1 mm 2 . 5.6 . B ể chứa bùn phân hủy , bao gồm một chai nhựa hoặc thủy tinh ( d ung tích khoảng 5 I) gắn với một máy khuấy và thiết bị dẫn chuyển dòng khí nitơ đi qua ph ầ n trống phía trên của chai. 5.7 . Bộ lọc màng , có kích thước lỗ là 0,2 µ m để khử khuẩn môi trường nền. 5.8 . Micro xyranh , để nối kín khí giữa máy đo áp suất với phần tr ố ng của chai; đồng thời để thêm vật liệu thử thể lỏng không tan vào chai. 5.9 . Chai thử thủy tinh đã kín khí chịu áp suất , kích thước danh định thích hợp (từ 0,1 I đến 1 I). Ví dụ, sử dụng chai huyết thanh dung tích danh định 125 ml có tổng thể tích thực tế là 160 ml, được gioăng kín khí bằng đệm nắp và các vòng nhôm khía rãnh. Tốt nhất là sử dụng đệm nắp làm bằng silicon hoặc cao su butyl phủ polyte tr a f loroeten có khả năng chịu áp suất khoảng 2 x 10 5 Pa. Sử dụng độ kín khí của nắp, đặc biệt đệm nắp bằng cao su b u tyl, nên được kiểm tra trước vì nhiều đệm nắp có s ẵ n trên thị trường không đủ k í n đối với metan, và một số loại đệm nắp khác khi bị kim xuyên qua thì không còn kín như yêu cầu về điều kiện của phép thử này. 5.10 . Máy đo áp suất chính xác để đo tổng lượng khí sinh học (metan cộng với cacbon đ i oxit). Kim được g ắ n vào nh ằ m thực hiện phép đo và xả khí sinh học tạo ra. Ví dụ về thiết bị thích hợp là máy đo áp su ấ t chính xác cầm tay được nối với kim tiêm; một van kín khí chạc ba dùng để xả áp khí quá mức. Hiệu chuẩn máy đo (xem Phụ lục A) để cho phép chuyển đổi đại lượng đo áp suất sang thể tích khí, nếu cần. Th ể tích bên trong của hệ thống ống đo áp suất và van phải giữ thấp tới mức có thể, sao cho sai số do b ỏ qua thể tích thiết bị là không đáng kể. Nếu sử dụng máy đo áp suất có chất lượng như đã mô tả (ví dụ đóng nắp bằng màng thép), thì không cần hiệu chuẩn trong phòng thí nghiệm. Máy đo áp suất này phải do một đơn vị được cấp phép hiệu chuẩn trong khoảng thời gian như khuyến nghị của nhà sản xuất. Độ chính xác của hiệu chuẩn có thể được kiểm tra trong phòng thí nghiệm bằng phép đo một điểm ở 1x1 0 5 Pa so với máy đo áp suất có bộ hiển thị cơ học. Khi điểm đo này được đo đúng cách thức, thì độ tuy ế n tính cũng sẽ không bị thay đổi. Nếu sử dụng thiết bị đo khác (mà không c ó hiệu chuẩn được xác nhận bởi nhà sản xuất), thì nên tiến hành hiệu chuẩn trên toàn thang đo tại những khoảng thời gian qui định. 5.11 . Hộp găng tay (tùy chọn), có áp suất dương nitơ thấp. 5.12 . T ủ nuôi ủ chống cháy , tốt nhất là được trang b ị thiết bị lắc, và có khả năng duy trì nhiệt độ ở 35 °C ± 1 °C. 6. Môi trường thử và cản trở 6.1 . M ô i trường thử Tiến hành phép thử bằng cách ủ chai thử đã gioăng kín ở nhiệt độ ổn định 35 °C ± 1 ° C trong điều kiện không có oxy, ban đầu trong khí nitơ, trong tối hoặc trong ánh sáng khuyếch tán. Sử dụng nitơ có độ tinh khiết cao (4.1.2). Trong trường hợp đặc biệt, phép thử c ó thể được tiến hành ở nhiệt độ khác. 6.2 . Cản trở 6.2.1 . Độ ẩ m trong kim tiêm của xyranh Độ ẩm trong kim tiêm và ống nối của máy đo áp suất có thể dẫn đến số đọc áp suất không chính xác ( xem 7.5). 6.2.2 . Nhi ễ m oxy Phương pháp kỵ khí thường bị sai số t ừ việc nhiễm oxy. Trong phương pháp n à y, chất gây cản trở được giảm thiểu bằng sử dụng kỹ thuật xử lý kỵ khí nghiêm ngặt. 6.2.3 . pH của môi trường nuôi c ấ y Hoạt tính của vi sinh vật nuôi cấy kỵ khí rất nhạy cảm với giá trị pH. Phải đảm bảo pH của hỗn hợp phản ứng được điều chỉnh về pH 7 ± 0,5 và duy trì trong khoảng từ pH 6,2 đến pH 7,5 cho đến khi kết thúc quá trình ủ (xem 7.5). 6.2.4 . Ch ấ t l ượ ng nắp chai Các loại đệm nắp khác nhau có sẵn trên thị trường. Nhiều loại trong số đ ó không giữ k í n được khí sau khi bị xuyên kim trong điều kiện phép thử. Đôi khi áp suất gi ả m rất chậm khi đệm nắp bị xuyên bởi kim tiêm. 6.2.5 . Tồn dư ch ấ t nền t rong bùn Quá trình tạo khí sinh học kỵ khí và độ nhạy của bùn bị ảnh hưởng bởi chất n ề n được chuyển từ dịch cấy vào trong chai thử. Bùn bị phân hủy trong hệ thống phân hủy kỵ khí quy mô gia đình thường chứa vật liệu như cát, tóc hoặc chất bã xeluloza từ thực vật. S à ng lọc bùn bằng rây để loại bỏ các chất thô không tan để thu được mẫu đại diện. 6.2.6 . H ó a chất d ễ bay hơi Hóa chất dễ bay hơi được giải phóng vào trong phần trống của chai huyết thanh. Việc này có thể dẫn đến thất thoát một số vật liệu thử từ hệ thống trong quá trình sục khí sau khi đo áp su ấ t, làm cho giá trị EC 50 cao giả. Chi tiết xem tài liệu tham khảo [1] trong thư mục tài liệu tham khảo. 7. Cách tiến hành 7.1 . Thiết lập phép thử và phép thử sơ bộ 7.1.1 . Thiết lập phép thử Số lượng các lần lặp lại cần thiết phụ thuộc vào mức độ chính xác cần có để thu được chỉ số ức chế có thể chấp nhận được. Nếu gioăng của chai đủ chặt trong suốt quá trình thử, chỉ cần thiết lập một mẻ thử tốt nhất là với ba lần lặp lại của chai thử cho mỗi nồng độ khối lượng. Tương tự thiết lập một mẻ chai cho chất chuẩn và một mẻ cho chất đối chứng. Tuy nhiên, nếu gioăng của chai ch ỉ đáng tin cậy cho một hoặc vài l ầ n xuyên kim , nên thiết lập một mẻ chai thử với ba lần lặp lại cho mỗi khoảng thời gian ( t ) và thiết l ậ p này phải tiến hành thử cho tất cả các nồng độ khối lượng vật liệu thử. Tương t ự thiết lập thời gian “ t ” cho mẻ chai chất chuẩn v à đối chứng. Nên sử dụng hộp găng tay (5.11). Ít nhất 30 min trước khi bắt đầu phép thử, cho khí nitơ chảy vào hộp găng tay chứa t ấ t cả các thiết bị thử cần thiết. Nếu không sử dụng hộp găng tay, loại khí trong chai bằng cách sử dụng nitơ để thay thế không khí. Phải đảm bảo nhiệt độ của bùn trong khoảng 35 °C ± 1 °C trong suốt khoảng thời gian xử lý và làm kín chai. 7.1.2 . Phép thử sơ bộ Nếu chưa biết hoạt tính của chất cấy (4.2.1), nên tiến hành phép thử sơ bộ. V í dụ, thiết lập mẫu đối chứng với n ồ ng độ khối lượng của chất rắn là 10 g/I, 20 g/l và 40 g/l được thêm vào chất nền mà không sử dụng vật liệu thử. Đồng thời sử dụng các chai có thể tích khác nhau để có 3 hoặc 4 tỷ lệ khác nhau giữa thể tích của phần tr ố ng của chai và thể tích của chát lỏng. Từ thể tích khí sinh học tạo ra trong các khoảng thời gian khác nhau có thể suy ra điều kiện thích hợp nhất cho phép thực hiện hai phép đo hàng ngày để thu được các thể tích khí sinh học đáng kể và xả áp suất hàng ngày cho độ nhạy tối ưu mà không sợ nổ. 7.2 . Vật liệu thử và đ ố i chứng 7.2.1 . V ậ t liệu thử 7.2.1.1 . Dung dịch hợp ch ấ t thử Chuẩn bị dung dịch gốc ri ê ng biệt cho mỗi hợp chất thử tan trong nước bằng nước pha loãng không ch ứ a oxy (4.1.1) để thu được, v í dụ như, 10 g/l vật liệu thử. Sử dụng các thể tích dung dịch gốc thích hợp để chuẩn bị các h ỗ n hợp ph ả n ứng có chứa các nồng độ khối lượng đạt mức. Phương pháp thay thế có thể tiến hành bằng cách chuẩn bị một dãy pha loãng của t ừng dung dịch gốc để thể t í ch được thêm vào các chai thử là như nhau cho mỗi nồng độ khối lượng cuối cùng đ ã yêu cầu. Thêm các chất ít hoặc không tan trong nước, ví dụ, như các dung dịch trong dung môi bay hơi. Chuẩn bị dung dịch ở nồng độ khối lượng thích hợp trong dung môi phù hợp, ví dụ, axeton hoặc dietyl ete (nhưng không sử dụng dung môi ức chế như tri cl orometan hoặc tetraclorometan). Thêm dung dịch vào chai thử rỗng (5.9) và làm bay hơi dung môi trước khi thêm bùn. Vật liệu thử thể lỏng không tan trong nước có thể được bơm trực tiếp vào chai huyết thanh bằng micro xyranh (5.8). Sử dụng TCVN 6918 (ISO 10634), nhưng cần hiểu rằng mọi chất hoạt động bề mặt được sử dụng đều tạo ra dịch nhũ tương có thể ức chế quá trình tạo khí sinh học kỵ khí. Thêm vật liệu thử vào chai (5.9) để tạo ra d ã y các n ồ ng độ khối lượng theo c ấ p số nhân, ví dụ, 500 mg/l, 250 mg/l, 125 mg/l, 62,5 mg/l, 31,2 mg/1 và 15,6 mg/l. Nếu chưa biết dãy độc t í nh của các hợp chất tương t ự, phải tiến hành phép thử để t ì m khoảng nồng độ sơ bộ với các nồng độ khối lượng, ví dụ như, 1000 mg/l, 100 mg/l và 10 mg/l từ đ ó xác định khoảng nồng độ th í ch hợp. 7.2.1.2 . M ẫ u nư ớ c và nước thải Sử dụng m ẫ u nước và nước thải ban đầu làm dung dịch gốc, và, nếu cần, điều chỉnh pH về 7 ± 0,5 nếu chưa xác định được ức chế là do mẫu có tính axít hoặc tính kiềm. Thêm nước và nước thải vào chai (5.9) để tạo ra dãy dung dịch pha loãng cuối cùng theo cấp số nhân: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 và v.v.. trong đó các tỷ lệ pha loãng được tính bằng tương quan giữa thể tích của nước hoặc nước th ả i với thể tích tổng cuối cùng. Khi thử nước th ả i, nồng độ khối lượng phép thử lớn nhất có thể có là tương ứng với 50 % mẫu nước thải. Đ ó là kết quả của việc thêm nước thải ban đầu vào chai thử (5.9) và một thể tích tương đương huyền phù chất cấy. Phải bảo đảm nước thải hoặc nước thử khác là hoàn toàn không chứa oxy. Ví dụ, sục bột khí nitơ (4.1.2) qua các dịch pha loãng í t nhất 1 h hoặc sử dụng nước pha loãng không có khí oxy (4.1.1) 7.2.2 . H ợ p ch ấ t chuẩn và đối chứng Chuẩn bị dung dịch gốc thể l ỏ ng của hợp chất chuẩn, 3,5-diclorophenol (10 g/l), bằng cách vừa thêm từ từ dung dịch natri hydroxit (250 g/l) vào chất rắn, vừa lắc liên tục cho đến khi chất rắn được hòa tan. Sau đó thêm nước pha loãng đã loại oxy (4.1.1) tới thể tích yêu cầu. c ó thể sử dụng rung siêu âm để hỗ trợ việc hòa tan. Có thể sử dụng chất chuẩn khác khi d ãy giá trị trung bình của EC 50 đã được thử. Trong trường hợp này, thêm số liệu vào Điều 9 cho chuẩn cứ đánh giá giá trị sử dụng. Thiết lập mẻ chai với ít nhất ba lần lặp lại (5.9), chỉ chứa bùn (4.2.1) và chất nền (4.2.2), để làm đối chứng. Thiết lập thêm các chai lặp lại (5.9), ch ứ a bùn (4.2.1) và chất nền (4.2.2). Thêm lượng vừa đủ dung dịch gốc của chất chuẩn (3,5-diclorophenol) vào các chai này để thu được nồng độ khối lượng cuối cùng là 150 mg/l. Nồng độ khối lượng này của 3,5-diclorophenol sẽ ức chế việc tạo khí sinh học khoảng 50 %. Cách khác, có thể thiết lập một dãy nồng độ khối lượng thích hợp với cùng chất chuẩn. Ngoài ra, thiết lập thêm 4 chai (5.9) sử dụng để đo pH có chứa bùn (4.2.1), nước pha loãng đã loại oxy và chất nền. Thêm vật liệu thử (7.2.1) vào 2 chai có nồng độ khối lượng lớn nhất được thử và thêm nước pha l o ã ng đã loại oxy vào 2 chai còn lại. 7.3 . Thêm vật liệu thử Thêm vật liệu thử tan trong nước (7.2.1) vào chai thử rỗng (5.9) ở thể dung dịch nước (7.2.1.1). Sử dụng micro xyranh thêm vào các chai thử rỗng vật liệu thử không tan hoặc kém tan trong nước, ví dụ, như dung dịch trong dung môi dễ bay hơi để thu được các bộ lặp lại của mỗi bộ năm nồng độ khối lượng của vật liệu thử. Làm bay hơi dung môi bằng cách cho dòng khí nitơ đi qua (4.1.2) bề mặt của dung dịch trong chai thử. Nếu vật liệu thử không tan hoặc ít tan trong nước không được thêm vào chai bằng cách sử dụng dung môi, thì thêm trực tiếp vật liệu này sau khi cấy. Xem Phụ lục B về thêm chất thải hoặc bùn để thử. 7.4 . Thêm dịch cấy và môi trường thử Khuấy một thể tích thích hợp chất bùn đang phân hủy đã qua sàng l ọ c (4.2.1) trong chai 5 I (5.6), đồng thời cho dòng khí nitơ đi qua phần trống của chai. Phun một dòng khí nitơ vào chai thử (5.9), có chứa dung dịch lỏng hoặc dung dịch dung môi đã bay h ơ i của vật liệu thử (7.2.1), trong khoảng 2 min để loại b ỏ không khí. Phân phối các lượng nh ỏ chất bùn đã trộn kỹ (xem 4.2.1), ví dụ 100 ml, vào chai thử bằng cách sử dụng ống hút (pipet) có đầu tuýp rộng, hoặc sử dụng xyranh định lượng. Hút dung dịch bùn vào ống pipet ch ỉ với một l ầ n đến đúng thể tích cần thiết. N ế u cần lấy nhiều hơn, nhả hết dung dịch trong pipet và hút lại như trên. Sau đó thêm vừa đủ dung dịch ch ấ t nền (4.2.2) để thu được nồng độ khối lượng trong hỗn hợp là 2 g/l cho mỗi th à nh phần canh dinh dưỡng, chiết n ấ m men và đường D-glucoza, trong khi vẫn giữ chai dưới dòng khí nitơ. Ví dụ về thiết lập phép thử cho mẻ thử được nêu trong Bảng 1. Phải bảo đảm thể tích phần trống của chai trong khoảng từ 10 % đến 40 % toàn bộ thể tích chai và tất cả các chai (ch ấ t đối chứng, chất thử và chất chuẩn) chứa cùng một thể tích chất l ỏ ng; nếu cần, thêm nước pha loãng đã loại oxy (4.1.1) để thu được thể tích cần. Ví dụ chọn tỷ lệ giữa khí sinh học với thể tích chất l ỏ ng từ các các kết quả của các phép thử sơ bộ (7.1.2). Sau khi mỗi chai đã định lượng xong, rút kim cung cấp khí nitơ và gioăng kín chai b ằ ng nút cao su và nắp nhôm, làm ẩm nút bằng vài giọt nước đ ã loại ion để hỗ trợ việc đóng nắp. Trộn đều các chất trong mỗi chai bằng lắc và ủ . B ả ng 1 - Ví dụ về thiết lập phép thử cho mẻ thử N ồ ng độ khối lượng cuối cùng của vật liệu thử trong chai th ử mg/l Th ể tích dung dịch g ố c của vật liệu thử (7.2.1) ml Thuốc thử và môi t rườ ng N ướ c pha loãng (4.1.1) ml Ch ấ t cấy (4.2.1) ml Ch ấ t nền (4.2.2) ml Dung dịch gốc a) 10 g/l Dung dịch gốc b) 1 g/ l 0 - 0 1,0 100 2 1 - 0,1 0 , 9 100 2 3 , 3 - 0,33 0,67 100 2 10 0,1 - 0,9 100 2 33 0 , 33 - 0 , 67 100 2 100 1,0 - 0 100 2 7.5 . Ủ chai và đo áp suất Chuyển chai vào tủ ủ ổn nhiệt (5.12) duy trì ở 35 °C ± 1 °C. Sau khoảng 1 h, cân b ằ ng áp suất trong chai với áp suất khí quyển bằng cách lần lượt xuyên kim xyranh gắn với máy đo áp suất (5.10) qua gioăng của mỗi chai, m ở van đến khi máy đo áp suất đọc “không”, và cuối cùng đóng van. Tốt nhất nên xuyên kim tạo góc khoảng 45° để ngăn khí thoát ra từ chai. Nếu ủ chai không có phương tiện lắc (xem 5.12), thì lắc chai đều đặn hai lần mỗi ngày trong toàn bộ thời gian ủ để cân bằng hệ thống, úp ngược chai có thể giúp ngăn ngừa việc th ấ t thoát khí sinh học qua đệm nắp. Tuy nhiên, úp ngược không thích hợp trong trường hợp chất không tan có thể dính chặt vào đáy của chai. Khi chai đạt tới nhiệt độ 35 °C ± 1 °C, đo và ghi lại pH của dịch chứa của 2 trong số 4 chai thiết lập cho mục đ í ch này và thải bỏ dịch chứa đi. Tiếp tục ủ và những chai còn lại trong tối. Trong vòng 48 h đến 72 h, đo và ghi lại áp suất trong chai hai lần một ngày bằng cách xuyên kim của máy đo áp suất lần lượt qua g i oăng của từng chai. Để máy đọc áp suất đến ổn định, ghi lại kết quả. Sau đó m ở van thông Khí. Đ ó ng van khi áp suất đọc giá trị là “không”. Nếu chỉ số áp suất có giá trị âm, không mở van. Đôi khi hơi nước tích tụ trong kim xyranh và ống dẫn. Việc tích tụ của hơi nước được chỉ thị bằng chỉ số áp suất hơi âm. Trong trường hợp này loại bỏ kim, lắc ống dẫn, làm khô bằng giấy và lắp một kim mới. T ừ thời gian c â n bằng áp suất đầu tiên, ghi thời gian là “ 0”, tiếp tục thử, thường là 48 h. 7.6 . Đo pH Đo pH của dịch chứa trong mỗi chai sau khi đo áp suất lần cuối. 8. Tính toán Tính tổng, và giá trị trung bình, giá trị áp suất ghi tại từng kho ả ng thời gian của từng mẻ chai l ặ p lại và tính giá trị trung bình của áp suất tích lũy khí sinh học. Vẽ đường cong biểu diễn sự tạo khí sinh học tích lũy trung bình ( p , tính theo Pa) theo thời gian của chai đối chứng, chai thử và chai chuẩn. Chọn một mốc thời gian ở phần tuy ế n tính của đường cong, thường là 48 h, và tính phần trăm ức chế ( l ) đối với từng nồng độ khối lượng của vật liệu thử theo c ô ng thức (1). (1) Trong đó: I là phần trăm ức chế; p t là áp suất khí sinh học tạo ra từ vật liệu thử trong thời gian đã chọn, tính bằng pascals (Pa); p c là áp suất khí sinh học tạo ra trong bình đối chứng ở cùng thời gian, tính bằng pascals (Pa); Vẽ đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế I dựa vào logarit của nồng độ khối lượng của vật liệu thử. Ước tính giá trị EC 50 (mg/l) bằng mắt hoặc b ằ ng phân tích hồi quy. Thể hiện nồng độ khối lượng của chất theo phần khối lượng (mg/g) của chất rắn khô t ổ ng đôi khi trợ giúp tốt hơn cho mục đích so sánh. Để có được phần khối lượng này, chia nồng độ thể tích ( mg/l) với nồng độ khối lượng của chất rắn bùn khô (g/l) (xem 4.2.1). Tính phần trăm ức chế thu được từ nồng độ khối lượng đơn của chất chuẩn hoặc EC 50 , nếu c ó đ ủ số lượng nồng độ khối lượng được điều tra nghiên cứu. Trong phép thử ức chế vi khuẩn hiếu khí, I thư ờ ng được vẽ đồ thị dựa vào hàm logarit của nồng độ khối lượng của vật liệu thử. Trong phép thử ức chế ch ấ t bùn kỵ khí với một số chất, đồ thị tuyến tính của I dựa vào nồng độ khối lượng sẽ thích hợp để chỉ sự phụ thuộc giữa nồng độ kh ố i lượng và sự ức chế hơn là so với đồ thị của hàm bán logarit. Sử dụng l oại đồ thị này cho thấy đường cong gần tuyến t í nh ở dải nồng độ rộng hơn. Chuyển đổi áp suất trung bình của khí sinh học tạo ra trong mẫu đối chứng sang thể t í ch bằng cách tham chiếu đường cong hiệu chuẩn của máy đo áp suất và từ đó tính sản lượng khí sinh học, t í nh bằng thể tích khí sinh ra trong 48 h t ừ 100 ml chất bùn kh ô ng pha loãng ở phần khối lượng chất rắn từ 2 % đến 4 % hoặc nồng độ khối lượng là 20 g/l đến 40 g/l. Trong phép thử nước thải, mức pha loãng thấp nh ấ t không g â y ảnh hưởng (giá trị LID), được quan sát trong phép thử, có thể được nêu như kết quả của phép thử. Xem Phụ lục C để biết thêm chi tiết. 9. Tiêu chí đánh giá xác nhận Các giá trị từ phép thử l iên phòng thí nghiệm (1999) cho thấy chất chuẩn 3,5-diclorophenol gây ra ức chế 50 % hoạt tính của vi khuẩn kỵ khí trong khoảng nồng độ khối lượng từ 32 mg/l đến 510 mg/l (trung bình 153 mg/l). Thể tích kh í sinh học tạo ra trong chai đối chứng vào giai đoạn cuối thay đổi từ 21 ml/g chất khô đến 149 ml/g chất khô ( trung bình 72 mg/g). Không c ó mối liên hệ r õ ràng nào giữa thể tích khí sinh học tạo ra và giá trị EC 50 tương ứng. Ch ỉ số pH cuối cùng thay đổi trong khoảng 6,1 và 7,5. Phép thử có giá trị khi sự ức chế lớn hơn 20 % thu được trong mẫu đối chứng chứa 150 mg/I 3,5-diclorophenol, c ó hơn 50 ml kh í sinh h ọ c tr ê n gram chất khô được tạo ra từ mẫu đối chứng và giá trị pH trong khoảng từ 6,2 đến 7,5 khi kết thúc phép thử. 10. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau: a) Viện dẫn tiêu chuẩn này; b) Tên, yêu cầu kỹ thuật và đặc tính của vật liệu thử; c) Nguồn bùn kỵ khí đang phân hủy mạnh; d) Nhiệt độ và khoảng nhiệt độ thử; e) Hợp ch ấ t chuẩn và kết qu ả của sự ức chế (tại nồng độ khối lượng sử dụng hoặc EC 50 ); f) Thể tích chất lỏng trong hệ thống phân hủy và phần trống của chai thử; g) Nồng độ khối lượng của vật liệu thử và phương thức thêm chất; h) Đặc tính tính năng cơ bản của phép đo khí sinh học và loại máy đo áp suất; i) Tất cả số liệu được đo trong các chai đựng chất thử, đối chứng và chuẩn (v í dụ áp suất p t í nh b ằ ng pascals) j) Các k ế t quả của phép thử, đặc biệt là EC 50 (tính bằng mg/g của chất khô) và đư ờ ng cong ức chế. Phụ lục A (Tham khảo) Hiệu chuẩn máy đo áp suất Máy đo phải được hiệu chuẩn tại các khoảng thời gian đều đặn. S ố đọc áp suất có thể liên quan đến các thể tích kh í sinh học qua một đường chuẩn được tạo ra khi bơm các thể tích khí đã biết ở nhiệt độ 35 °C ± 1 °C vào các chai huyết thanh có chứa lượng nước bằng với lượng hỗn hợp phản ứng, V R . - Phân phối V R ml dung dịch nước vào năm chai huyết thanh, giữ ở 35 °C ± 1 °C. Gioăng các chai và đặt vào bể nước ổn nhiệt ở 35 °C trong 1 h để cân bằng nhiệt. - Bật máy đo áp suất, để ổn định, và điều chỉnh về “không”. - Xuyên kim xyranh qua gioăng của một trong số các chai, mở van cho đến khi máy đo áp suất chỉ “không” và đóng van. - Lặp lại quy trình với các chai còn lại. - Bơm 1 ml khí tại nhiệt độ 35 °C ± 1 °C vào mỗi chai. Xuyên kim xyranh (gắn với máy đo) xuyên qua gioăng của một trong các chai và để cho máy đo áp suất đến ổn định. Ghi lại áp suất, mở van đến khi áp suất đọc về “không” và sau đó đóng van. - Lặp lại quy trình với các chai còn lại. - Lặp lại toàn bộ quy trình trên sử dụng 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 16 ml, 20 ml và 50 ml khí. - Vẽ đường cong hiệu chuẩn của áp suất (Pa) theo thể tích khí được bơm V b (ml). Ph ả n hồi của máy đo là tuyến tính trong khoảng từ 0 Pa đến 70 000 Pa, và 0 ml đến 50 ml khí. Phụ lục B (Tham khảo) Phép thử mẫu chất lỏng và bùn B.1 . Yêu c ầ u chung Lấy các mẫu nước thải, bùn,.v.v... vừa thu được t ừ các nguồn. Tùy thuộc vào mục đích phép thử, lấy các mẫu ngẫu nhiên theo trọng số thời gian trong 24 h. C ần tiến hành thử nghiệm các mẫu càng s ớ m càng tốt, tốt nhất là ngay trong ngày lấy mẫu hoặc bảo quản đúng cách để giảm tối thi ể u các thay đổi có thể xảy ra. Đối với phép thử không xử l ý mẫu. Trong trường hợp mẫu có tính axit hoặc bazơ làm thay đổi đáng kể pH của chất cấy bùn nuôi ủ thì cần ph ả i trung hòa (pH 7 ± 0,5) tr ước khi thử. Nếu cần, nêu rõ đ iề u kiện trung hòa trong báo cáo thử. Mẫu có chứa chất thể huyền phù n ê n được thử mà không cần xử lý tiếp. Tuy nhiên, nếu mẫu chứa các hạt thô, cần phải lọc để loại bỏ các hạt. Có thể phải có những thay đổi trong quy trình để th í ch ứng với khoảng độc tính rộng của các mẫu này. Đặc biệt, nồng độ khối lượng của chất cấy ( bùn đang phân hủy) trong hỗn hợp phản ứng cuối có thể được giảm thấp, và thay vì thêm các chất nền tổng hợp có thể thêm bùn thô. B.2 . M ẫ u chất l ỏ ng B.2.1 . Ví d ụ, đối với hỗn hợp phản ứng có thể tích cuối cùng là 100 ml. chuyển các thể tích (1 ml đến 50 m l ) của mẫu thử vào năm m ẻ chai thử có lặp lại 3 lần trong khi đang được sục khí bằng nitơ và thêm nước pha l oã ng đã loại oxy để điều chỉnh thể tích lên đến 50 ml (xem Bảng B.1). Thêm 50 ml nước pha loãng đ ã loại oxy vào chai đối chứng. Thêm một lượng dung dịch gốc chất nền vào tất cả các chai để có được nồng độ khối lượng cuối cùng l à 2 g/l cho từng thành phần của canh dinh dưỡng, chiết n ấ m men và đường D-glucoza. Cuối cùng, chuyển các lượng 50-ml bùn đang phân hủy vào tất cả các chai. Quá trình thử được tiến hành sau khi gioăng kín các chai. B.2.2 . Cách khác chuẩn bị bùn (không phân hủy) từ nước thải trộn với bùn cống thô. Trộn một thể tích thích hợp vật liệu thử với bùn cống thô lấy từ nhà máy xử lý chủ yếu là nước thải sinh hoạt. Tốt nhất là, tỷ lệ thể tích giữa vật liệu thử và bùn thô nên ph ả n ánh t ì nh huống thực tế. Nếu không có thông tin về điều kiện thực tế, nên chọn một vài tỷ lệ có thể c ó . Để hỗn hợp lắng xuống, hút ra và thải b ỏ một lượng chất hoạt động bề mặt lỏng phía trên b ằ ng với lượng v ậ t li ệu thử đã thêm vào. Sử dụng bùn thô đã được cải tạo theo cách sau. B ả ng B.1 - Ví dụ v ề mẫu thử thể lỏng M ẫ u thử Nước pha loãng đã loại ion B ù n đang ph â n hủy Dung dịch g ố c dinh dưỡng a ml ml ml ml 0 (đối chứng) 50 50 2 1 49 50 2 5 45 50 2 10 40 50 2 20 30 50 2 50 0 50 2 a Xem 4.2.2 - Canh dinh dư ỡ ng, chiết nấm men và D-glucoza. B.3 . Mẫu bùn Nếu không biết rõ thể tích bùn thử thải ra, sử dụng kiến thức này để chuẩn bị hỗn hợp phản ứng với bùn thô và bùn đang phân hủy trong các chai thử, theo tỷ lệ (các tỷ lệ) thường thấy trong thực tế. Ngoài ra, chuẩn b ị các hỗn hợp với các tỷ lệ tùy ý theo quy trình trong 7.2.1. Ví dụ, chuyển chất bùn thử (2 ml đến 20 ml) vào chai thử, được làm sạch bằng nitơ, thêm nước pha l oãng đã loại oxy đến thể tích tổng là 20 ml. Thêm 20 ml nước pha loãng đã l oại oxy vào các chai đối chứng. Chuẩn bị hỗn h ợ p gồm bùn đang phân hủy và bùn thô chuẩn ( từ nhà m á y xử lý nước thải sinh hoạt) theo tỷ lệ 3:1 và thêm 80 ml vào tất cả các chai thử (xem B ả ng B.2). Đóng chai và t iến hành như trong 7.4. Nếu bùn thử chứa nhiều hợp chất dễ phân hủy, bùn nên được điều chỉnh có nồng độ khối lượng của chất rắn khô tổng s ố xấp xỉ bằng với bùn thô chuẩn, bằng cách để lắng hoặc ly tâm, hoặc pha loãng. Sơ đồ thêm các chất bùn này nên theo ví dụ trong Bảng B.3, ở đây thể tích t ổ ng của bùn và bùn thử phải như nhau trong tất cả các chai, khác với trường hợp theo B ả ng B.2. Bảng B.2 - Ví dụ về mẫu bùn M ẫ u thử nghiệm Nước pha loãng đã loại ion Bùn a đang phân hủy B ù n thô chuẩn a ml ml ml ml 0 (đối chứng) 20 60 20 2 18 60 20 5 15 60 20 10 10 60 20 15 5 60 20 20 0 60 20 a Theo cách khác, các chất bùn này có thể được trộn theo t ỷ lệ 3:1 (bùn đang phân hủy: bùn thô) ngay trước khi sử dụng và phân chia thành các lượng 80 ml. Bảng B.3 - Ví dụ thay thế về mẫu bùn chứa ch ấ t có nhiều ch ấ t phân hủy Mẫu thử Nước pha loãng đ ã loại ion B ù n a đang phân hủy Bùn thô chuẩn a ml m l ml ml 0 (đối chứng) 20 60 20 2 20 60 18 5 20 60 15 10 20 60 10 15 20 60 5 20 20 60 0 a Ch ỉ nh trước n ồ ng độ kh ố i lượng của ch ấ t rắn khô t ổ ng số x ấ p xỉ bằng với bùn th ô chuẩn. Phụ lục C (Tham kh ảo ) Thể hiện kết quả trong các phép thử với nước thải Trong phép thử nước thải, mức pha loãng thấp nhất không có hiệu ứng được t ì m ra trong quá trình thử (giá trị LID) có thể được dùng để thay thế hoặc thêm vào cùng với giá trị EC. Giá trị LID là mức pha loãng thấp nhất không gây ảnh hưởng (nồng độ khối của nước thải cao nhất) thể hiện ở mức ức chế dưới 20 % tr ong phép thử. Việc xác định giá trị LID trong nhiều trường hợp là đủ cho mục đích kiểm soát nước thải tại các khoảng thời gian đều đặn. Nếu khoảng giá trị LID nh ỏ , thì giá trị này thậm chí có thể được xác định trong các phép thử giới hạn với hai hoặc bốn mức pha loãng. Đánh giá ước lượng giá trị EC là thích hợp hơn để xác định tác động độc của các hợp chất trong các phép thử riêng lẻ. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] W OODS V., PAINTER H.A. and BATTERSBY N. S . A creening method for assessing the inhibition of the anaerob i c gas production from s ew age sl u dge. Eds. S teinberg, C . and Kettup, Proc. Int. Symp. om Ecotoxicology: Ecotoxilogical Re l evance of Test Method . A. GSF Forschungszen t rum, Neuherberg, Germany, 1992, pp. 117 - 132. [2] ISO 5667-16:1998, Water quality - Sampling - Part 16: Guidance on biotesting of samples. [3] TCVN 6825:2001 (ISO 11734:1995), Chất lượng nước - Đ á nh giá sự phân h ủy sinh học kỵ khí “ hoàn toàn ” các hợp chất hữu cơ tr ong bùn phân h ủy - Phương ph á p đo sự sinh khí sinh học.' [4] TCVN 6625:2000 (ISO 11923:1997), Chất lượng nước. Xác định chất rắn lơ l ử ng bằng cách lọc qua cái lọc sợi th ủy tinh.