TCVN6831-1:2010

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6831-1:2010 (ISO 11348-1:2007) về Chất lượng nước - Xác định ảnh hưởng ức chế của mẫu nước đến sự phát quang của vi khuẩn Vibrio Fischeri (phép thử vi khuẩn phát quang) - Phần 1: Phương pháp sử dụng vi khuẩn mới nuôi cấy TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6831-1:2010 ISO 11348-1:2007 CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG) - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN MỚI NUÔI CẤY W ater quality - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fi scheri (Luminescent bacteria test) - Part 1: Method using f reshly prepared bacteria Lời nói đầu TCVN 6831-1:2010 thay thế TCVN 6831-1:2001 (ISO 11348-1:1998). TCVN 6831-1:2010 hoàn toàn tương đương ISO 11348-1:2007. TCVN 6831-1:2010 do Ban kỹ thuật Tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 146 Ch ấ t lượng nước biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Bộ tiêu chuẩn TCVN 6831 Chất lượng nước - Xác định ảnh hư ở ng ức chế của mẫu nước đến sự phát quang của vi khu ẩ n Vibrio f ischeri (phép th ử vi khuẩn phát quang) gồm các ti êu chu ẩ n sau: - TCVN 6831-1:2010 (ISO 11348-1:2007), Phần 1: Phương pháp sử dụng vi khuẩn mới nuôi cấy; - TCVN 6831-2:2010 (ISO 11348-2:2007), Phần 2: Phương pháp sử dụng vi khuẩn khô lỏng; - TCVN 6831-3:2010 (ISO 11348-3:2007), Phần 3: Phương pháp sử dụng vi khuẩn đông khô. Lời giới thiệu Phép đo quy định trong bộ TCVN 6831 (ISO 11348) có thể tiến hành sử dụng vi khuẩn mới nuôi cấy, cũng như vi khuẩn đông khô hoặc khô lỏng. Công việc tiêu chuẩn hóa do DIN Normenausschuss Wasserwesen và ISO/TC 147/SC 5/WG 1 tiến hành đã cho thấy, trong trường hợp đặc biệt, các kỹ thuật khác nhau n à y có thể cho kết qu ả khác nhau, đặc biệt khi có mặt kim loại nặng. Độ nhạy thay đổi là do sự khác nhau trong thành phần môi trường sử dụng để chuẩn bị vi khu ẩ n đông khô hoặc khô lỏng. Các môi trường bảo vệ này ảnh hưởng đến tính có sẵn sinh học của các ch ấ t độc và/hoặc sự phát quang của vi khuẩn phát quang. Điều này có nghĩa là nguồn gốc và phương pháp chuẩn bị vi khuẩn cần được xem xét khi biểu thị kết quả. Đôi khi, việc này có thể khó khăn, vì vi khuẩn đông khô và khô lỏng có thể do các nhà cung cấp khác nhau. Do vậy , việc này có nghĩa là thành phần chi tiết không được biết và do vậy người sử dụng không thể diễn giải được. V ì lý do này, ngoài phép đo độc tính dùng vi khuẩn khô lỏng TCVN 6831-2 (ISO 11348-2) và vi khuẩn đông kh ô TCVN 6831-3 (ISO 11348-3), quy trình dùng vi khu ẩ n mới nuôi cấy được mô t ả trong tiêu chuẩn này, tính năng thực hiện của quy trình có thể do người sử dụng diễn giải trong từng chi tiết. Phòng thí nghiệm chịu trách nhiệm về kết quả có cơ hội để lựa chọn kỹ thuật phù hợp nh ấ t dựa tr ê n các lời khuyên của chuyên gia và thông tin về mẫu nước thử nghiệm. CH Ấ T LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH Ả NH HƯỞNG ỨC CH Ế C ỦA M Ẫ U NƯỚC Đ Ế N SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHU Ẩ N VIBRIO FISCHERI (PHÉP TH Ử VI KHU Ẩ N PHÁT QUANG) - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP S Ử DỤNG VI KHU Ẩ N MỚI NUÔI C Ấ Y W ater quality - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fi scheri (Luminescent bacteria test) - Part 1: Method using f reshly prepared bacteria CẢNH BÁO - Người sử dụng tiêu chuẩn này cần phải thành thạo với các thực hành trong phòng thí nghiệm thông thường. Tiêu chuẩn này không đề cập tới mọi v ấ n đ ề an toàn liên quan đến người sử dụng. Trách nhiệm của người sử dụng là phải xác lập độ an toàn, bảo đảm sức khỏe phù hợp với các quy định của quốc gia. QUAN TRỌNG - Điều ch ủ yếu là phép thử theo tiêu chuẩn này cần được tiến hành b ở i những nhân viên đư ợ c đào tạo phù hợp. 1. Phạm vi áp dụng TCVN 6831:2010 (ISO 11348:2007) quy định ba phương pháp xác định sự ức chế phát quang của vi khuẩn biển Vibrio f ischeri (NRRL B-11177). TCVN 6831-1:2010 (ISO 11348-1) quy định phương pháp sử dụng vi khu ẩ n mới nuôi cấy. Tiêu chuẩn này áp dụng cho: - Nước th ả i; - Dịch chi ế t và dịch ngâm chiết bằng nước; - Nước sạch (nước mặt và nước ngầm); - Nước mặn và nước lợ; - Dịch rửa giải của trầm tích (nước ngọt, nước lợ và nước biển); - Nước giếng khoan; - Chất ô nhiễm đơn, được pha loãng trong nước. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn n à y. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các t à i liệu viện dẫn không ghi năm công bố th ì áp dụng phiên bản mới nhất bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có). TCVN 7325 (ISO 5814), Chất lượng nước - Xác định oxy hòa tan - Phương pháp đầu đo điện hoá. TCVN 6184 (ISO 7027), Chất lượng nước - Xác định độ đục. ISO 5667-16, Water quality - Sampling - Part 16: Guidance on biotesting of samples ( Chất lượng nước - Hướng dẫn thử sinh học các mẫu ). 3. Nguyên tắc Sự ứ c chế phát quang do cấy vi khuẩn Vibrio f ischeri được xác định bằng cách thử nghiệm theo từng mẻ. Điều đó được thực hiện bằng việc kết hợp các thể tích quy định của mẫu thử hoặc mẫu đã pha loãng với huyền phù vi khuẩn phát quang đựng trong ống thử. Chuẩn cứ của phép th ử là sự giảm độ phát quang mẫu thử trong suốt thời gian tiếp xúc , cường độ phát quang trong mẫu sẽ được đo sau thời gian phản ứng là 15 min và 30 min hoặc có thể đo thêm sau 5 min, tùy chọn, có tính đến hệ số hiệu chính ( f kt ). Ảnh hưởng ức chế của mẫu nước có thể được xác định bằng LID (xem Phụ lục B) hoặc là các giá trị EC 20 và/hoặc giá trị EC 50 thông qua các dãy pha loãng (EC là nồng độ ảnh hưởng). 4. Các chất gây nhiễu Các chất không tan, ít tan hoặc dễ bay hơi hoặc các chất có phản ứng với nước pha loãng hoặc với huyền phù, hoặc làm thay đổi trạng thái của chúng trong quá trình thử, có thể ảnh hưởng đến kết quả hoặc làm giảm độ tái lập của kết quả thử. Trong trường hợp nước quá đục hoặc đậm màu, có thể xảy ra sự mất phát quang do việc hấp thụ ánh sáng hoặc tán xạ ánh sáng gây ra. Sự gây nhiễu này đôi khi có thể khắc phục được bằng cách xử lý độ đục của mẫu (7.2) hoặc, ví dụ , bằng cách sử dụng cuvet hiệu ch í nh hấp thụ hai ngăn (xem Phụ lục A). V ì sự phát quang sinh h ọ c [6] cần đến oxy, nên các mẫu có nhu cầu oxy cao (và/hoặc có nồng độ oxy thấp) có thể sẽ gây ra sự thiếu hụt oxy và mẫu sẽ bị ức chế. Các chất dinh dưỡng dễ phân hủy sinh h ọ c trong mẫu có thể làm giảm sự tự ô nhiễm trong việc phát quang sinh học [ 1 ] . Mẫu có pH nằm ngoài khoảng từ 6,0 đến 8,5 sẽ ảnh hưởng đến sự phát quang của vi khuẩn [ 6],[ 7 ] . C ần phải điều chỉnh pH của mẫu nếu ảnh hưởng độc của pH là không mong muốn. Vì vi khuẩn thử nghiệm Vibrio fishcher i là vi khuẩn biển, nên việc thử nghiệm các mẫu nước mặn theo quy trình chuẩn thường dẫn đến các hiệu ứng k í ch thích phát quang sinh học mà có thể che hiệu ứng ức chế (xem Phụ lục D). Nồng độ muối trong mẫu ban đầu vượt quá 30 g/l NaCI, hoặc hàm lượng các thành phần khác có độ th ẩ m thấu tương đương, cùng với lượng muối cần phải thêm vào khi thử có thể gây ra các hiệu ứng siêu th ẩ m th ấ u. Để tránh ảnh hưởng này, nồng độ muối cuối cùng có trong mẫu thử sẽ không được vượt quá độ th ẩ m thấu của dung dịch NaCI là 35 g/l. 5. Thuốc thử và các vật liệu Sử dụng các hóa chất đạt chất lượng tinh khiết phân tích. Dùng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. 5.1. Vi khuẩn th ử Sử dụng chủng vi khu ẩ n phát quang thuộc loại Vibrio f ischeri NRRL B - 11177. Ch ủ ng vi khuẩn có thể được mua ngoài th ị trường ở dạng thuốc thử đông-khô hoặc khô-lỏng hoặc từ bộ ch ủ ng nuôi cấy, ví dụ Deutsche Sammlung fur Mikroganis und Zellkuturen Gmbh, Mascheroder Weg 10, D-38124 Braunschweug, Germany, hoặc NRRL, ARS culture collection NCAUR, 1815 N, University Street, Peoria, Illinois 61604, USA. Các huyền phù vi khuẩn dùng để xác định độc tính cần phải mới được nu ô i cấy. 5.2. Dung dịch natri clorua, làm chất pha loãng Hòa tan 20 g natri clorua (NaCI) trong nước và thêm nước đến 1 l í t. 5.3. Dung dịch natri hydroxit , ví dụ c(NaOH) = 1 mol/l. 5.4. Axit clohydric , ví dụ c (HCI) = 1 mol/l. Để điều chỉnh pH có th ể sử dụng các axit hoặc các bazơ nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn. 5.5. Dung dịch dùng cho vi khuẩn mới nuôi cấy 8,0 g D(+)- Glucoza ngậm nước (C 6 H 1 2 O 6 .H 2 O) 20,0 g Natri clorua (NaCI) 2,035 g Magie clorua ngậm sáu nước (MgCI 2 . 6 H 2 O ) 0 , 30 g Kali clorua (KCI) 11 , 9 g N - (2- Hydroxyetyl) piperazin- N - (2- axit etanesun f onic) (HEPES) Hòa tan các thành phần trên trong nước, khuấy đều trong 30 min và điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0 , 2 bằng dung dịch natri hydroxit (5.3) hoặc bằng axit clohydric (5.4) . Thêm nước đến 1 l í t. Dung dịch này có thể bảo quản từng phần và ở nhiệt độ -18 °C tới -20 °C. 5.6. Chất chuẩn Chuẩn bị riêng rẽ các dung dịch chuẩn gốc, pha lo ã ng bằng dung dịch natri clorua (5.2) mà không cần điều chỉnh pH: 219,8 mg/l Kẽm sun f at ngậm bảy nước (ZnS O 4 .7H 2 O ) 9 mg/l 3,5-dichlorophenol (C 6 H 4 OCI 2 ) (Độ tinh khiết ≥ 99%) 22,6 mg/l Kali dicromat (K 2 Cr 2 O 7 ) Các nồng độ này xấp xỉ gấp hai lần giá trị các EC 50 mong đợi đối với các chất chuẩn tương ứng trong tiêu chuẩn này. Thể tích yêu cầu phụ thuộc vào yêu cầu thử nghiệm. CH Ú THÍCH : Có thể sử dụng các dung dịch có sẵn ngoài thị trường có nồng độ ZnS O 4 và K 2 Cr 2 O 7 (titrisol) xác định để chuẩn bị dung dịch gốc của các ch ất chu ẩ n. 5.7. Dịch l ỏ ng dùng để cấy s ơ bộ và c ấ y chính 30 g Natri clorua (NaCI) 6,10 g Natri dihydrophosphat ngậm nước (NaH 2 P O 4 . H 2 O) 2,75 g Kali hydrophosphat ngậm ba nước (K 2 HPO 4 .3H 2 O) 0,204 g Magie sun f at ngậm bảy nước (MgS O 4 .7H 2 O ) 0,500 g Hydrophosphat diammoni [(NH 4 ) 2 .HPO 4 ] 3 ml Glyxerol 5 , 00 g Caso- pepton 0,50 g Dịch chiết nấm men Hòa tan các thành phần trên trong nước và điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch natri hydroxit (5.3) hoặc bằng axit clohydric (5.4). Thêm nước đến 1 lít. Chuyển mỗi lần 50 ml vào b ì nh Erlenmeyer (ví dụ dung tích 250 ml) và khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 121 °C trong 20 min. Caso-pepton và cao men do nhiều hãng cung cấp nên có thể có chất lượng khác nhau. Trong trường hợp có tr ở ngại (ví dụ: ức chế phát triển), th ì cần mua sản ph ẩ m của hãng khác. 5.8. Môi trường thạch để cấy vi khuẩn g ốc Điều chỉnh dịch l ỏ ng cấy (5.7) đến pH 7,0 ± 0,2. Thêm và hòa tan 12 g thạch cho mỗi lít bằng cách làm ấm nhẹ; khử trùng và chuyển sang các đĩa Petri vô khuẩn. 5.9. Môi trường bảo vệ 66 g D(+)-Glucoza ngậm nước (C 6 H 12 O 6 .H 2 O ) 4 g Natri clorua (NaCI) 2 g L-histidin 0,5 g Albumin huyết thanh bò, BSA Hòa tan hoàn toàn các thành phần trên trong nước ở 37 °C, nếu cần dùng natri hydroxit (5.3) hoặc axit clohydric (5.4) để chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ở nhiệt độ phòng. Thêm nước đến 100 ml. Sử dụng môi trường bảo vệ để không gây ảnh hưởng đến các tế bào vi khuẩn trong quá trình làm lạnh. BSA do nhiều hãng cung cấp có thể có chất lượng khác nhau. Trong trường hợp có trở ngại thì cần mua sản phẩm của hãng khác. Chuẩn bị môi trường bảo vệ ngay trước khi sử dụng. 6. Thiết bị, dụng cụ 6.1. Hộp kiểm soát nhiệt độ , để duy trì mẫu thử ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C. Trong mỗi lần thử nghiệm nhiệt độ chỉ được dao động tối đa ± 0,3 °C. 6.2. B ể điều nhiệt hoặc hộp kiểm soát nhiệt độ , để duy tr ì dung dịch có thể tích ít nhất 12 ml được chuẩn bị trong 5.5 (ví dụ b ì nh thuốc thử) ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C. 6.3. Máy đo độ phát quang , ngăn đo mẫu được duy tr ì ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C , có trang bị các cuvet phù hợp. 6.4. Cuvet th ử , làm bằng chất liệu trơ về hóa học, th í ch hợp để sử dụng với ngăn đo độ phát quang đã chọn và có dung tích tạo thuận lợi để đọc hết bề mặt lớn nhất có thể và phù hợp với hộp kiểm soát nhiệt độ (6.1). 6.5. pH-mét. 6.6. Đồng hồ tính giờ. 6.7. Pipet pittông hoặc bơm tiêm nhựa, 10 m l , 500 m l và 1000 m l . 6.8. Pipet pittông có dung tích có thể thay đổi, từ 10 ml đến 200 ml và 200 m l đến 5000 m l . 6.9. Máy li tâm lạnh. 6.10. Máy khuấy từ và que khu ấ y từ. 6.11. Tủ ấm lắc rung , để ủ các bình Erlenmeyer. 6.12. N ồ i hấp. 6.13. Tủ ủ. 6.14. Máy đo phổ hoặc máy đo quang kính lọc và cuvet, có chiều dài quang học 1 cm. 6.15. Vòng cấy (hoặc kim cấy). 6.16. Máy đo độ dẫn. 6.17. T ủ lạnh sâu , để bảo quản dung dịch và huyền phù. 6.18. Đ ầ u đo oxy , Theo TCVN 7325 (ISO 5814). 7. Lấy mẫu và xử lý sơ bộ mẫu 7.1. L ấ y m ẫ u Mẫu phải được đựng trong các vật chứa sạch, trơ về hóa học như quy định tại ISO 5667-16. Nạp đầy mẫu vào vật chứa và gắn kín. Thử nghiệm mẫu càng sớm càng tốt ngay sau khi lấy mẫu. Nếu cần, bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 2 °C đến 5 °C trong vật chứa ở nơi tối không quá 48 h. Nếu phải bảo qu ả n mẫu đến hai tháng thì để mẫu ở nhiệt độ ≤ -18 °C. Không được sử dụng hóa chất để bảo quản mẫu. C ần chỉnh -pH và thêm muối trước khi thử. 7.2. Chuẩn bị mẫu Đo nồng độ oxy trong tất cả các mẫu. Nồng độ oxy cần phải > 3 mg/l đối với thử nghiệm này. Nếu nồng độ oxy của mẫu chưa pha loãng nhỏ hơn 3 mg/l, thì phải sử dụng phương pháp làm đủ oxy cho mẫu, ví dụ sục khí hoặc khuấy. Đo pH của tất cả các mẫu. Nếu pH trong khoảng từ 6,0 đến 8,5 thì không cần phải điều chỉnh. Tuy nhiên, việc chỉnh giá trị pH có thể làm biến đổi b ả n chất của mẫu. Mặt khác, pH của mẫu và pH của mẻ thử có thể khác nhau do khả năng đệm của môi trường thử. Có thể cần phải thực hiện thử nghiệm trên cả hai mẫu: mẫu đã điều chỉnh - pH và mẫu chưa điều chỉnh-pH. Nếu cần , điều chỉnh - pH của mẫu bằng cách thêm axit clohydric (5 . 4) hoặc dung dịch natri hydroxit (5 . 3) . Tùy thuộc vào mục đích của phép thử có thể điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0 , 2 hoặc giới hạn trên (8,5 ± 0,2) và giới hạn dưới (6,0 ± 0,2). Lựa chọn nồng độ của axit clohydric hoặc dung dịch natri hydroxit sao cho thể tích thêm vào không lớn hơn 5 % tổng thể tích. Cho thêm 20 g natri clorua cho mỗi lít vào mẫu nước hoặc vào mẫu nước đ ã trung h òa . Đối với mẫu có nồng độ muối cao thì đo độ muối và nếu cần thêm lượng muối để điều chỉnh độ thẩm thấu tới NaCI 20 g/l. Nếu mẫu chứa từ 20 g/l đến 50 g/l NaCI tương đương, không cần thêm muối. Nồng độ muối tạo nên trong mẫu thử không được vượt quá độ thẩm thấu 35 g/l dung dịch natri clorua. Phụ lục D cung cấp thêm các thông tin đối với những mẫu nước mặn. Các mẫu quá đục cần được để lắng trong 1 h hoặc cho ly tâm , ví dụ trong 10 min ở 5000 g hoặc lọc. Sử dụng chất nổi hoặc cái lọc cho phép thử. 8. Cấy vi khuẩn phát quang 8.1. Cấy vi khuẩn gốc Chuyển vi khuẩn phát quang ch ủ ng Vibrio fischeri NRRL B-11177 (5.1), trong các điều kiện vô khuẩn sang các đĩa Petri chứa môi trường thạch dùng nuôi cấy vi khuẩn gốc (5.8). Ủ trong tủ ấm từ 2 ngày đến 3 ngày ở nhiệt độ 20 °C ± 1 °C. Đánh dấu các khuẩn lạc riêng lẻ phát quang bằng cách quan sát bằng mắt trong bóng tối, và bảo quản các đĩa trong tủ lạnh. Chuyển các khuẩn lạc đã đánh dấu trong điều kiện vô khuẩn sang các đĩa mới sau thời gian bảo quản mỗi tuần và tối đa là hai tuần. Các lọ vi khuẩn được bảo quản có bán sẵn thường không được phân phối dưới các điều kiện vô khuẩn. Để nuôi cấy vi khuẩn tinh khiết nên dùng một vài ch ủ ng khu ẩ n lạc đơn. Đ ể tránh biến đổi tính di truyền, có thể m ở và sử dụng lọ vi khuẩn đã được bảo quản 6 tháng một lần. CHÚ THÍCH : Đ ộ phát quang của các k huẩn lạc phát quang có th ể bị giảm trong quá trình bảo quản. 8.2. Chuẩn bị nuôi cấy sơ bộ Dưới các điều k iện vô trùng, cho 50 ml dịch lỏng nuôi cấy sơ bộ (5.7) vào các b ìn h tam giác (dung tích khoảng 250 ml) đã có một khuẩn lạc đơn lẻ phát quang của chất cấy gốc đã ủ từ 2 ngày đến 3 ngày. Lắc trong 21 h ± 1 h ở 20 °C ± 1 °C với ít nhất 180 r.min - 1 . Xác định độ đục của dịch pha loãng 1 phần 10 chất cấy trong dung dịch natri clorua (5.2), ví dụ, ở 578 nm, tính bằng đơn vị hấp thụ formazin (FAU), như quy định tại TCVN 6184 (ISO 7027). 8.3. Chuẩn bị nuôi cấy chính Cho 50 ml dịch lỏng nuôi cấy chính (5.7) với một thể tích thích hợp chất cấy sơ bộ (8.2) vào các b ì nh tam giác 250 ml sao cho có được độ đục ước tính ban đầu là 10 đơn vị FAU. Lắc trong 20 h ± 1 h ở 20 °C ± 1 °C với ít nhất là 180 r.mi n - 1 . Xác định độ đục, tính bằng FAU, của dịch pha loãng 1 phần 10 trong dung dịch natri clorua (5.2) bằng đo quang ở 578 nm. CHÚ THÍCH : Khi tuân thủ các điều kiện nêu trên, chất cấy chính không pha lo ã ng thường cho độ đục từ 700 FAU đến 1 800 FAU. 8.4. Chuẩn bị huyền phù gốc Làm lạnh sơ bộ dung dịch natri clorua (5.2) và môi trường bảo vệ (5.9) trong đá. Ly tâm huyền phù vi khuẩn thu được từ dung dịch cấy chính (8.3) ở nhiệt độ 4 °C ± 2 °C b ằ ng m áy ly tâm đã được làm lạnh trước, từ 15 min đến 20 min ở 6000 g ± 2000 g. Đối với mỗi 50 ml chất cấy chính, gạn b ỏ phần nổi ở trên và h òa ph ầ n cặn trong 5 ml đến 10 ml dung dịch natri clorua đã làm lạnh trước (5.2). Ly tâm lại như điề u kiện ở trên. Đối với 50 ml chất cấy chính, gạn b ỏ phần nổi ở trên và hòa phần cặn trong 0,5 ml dung dịch natri clorua đ ã làm lạnh trước (5.2). Chuyển huyền phù vi khuẩn vào cốc thí nghiệm (ví dụ. dung tích 100 ml) đã làm lạnh trước và đặt cốc lên đá lạnh. Th ê m từ từ khoảng 4 ml cho mỗi 50 ml chất c ấ y chính môi trường bảo vệ (5.9) dưới điều kiện làm lạnh liên tục bằng nước đá và khuấy đều. Tiến hành xác định độ đục của dịch pha loãng 1 phần 100 với dung dịch natri clorua (5.2) bằng phương pháp đo quang. Thêm thật nhanh môi trường bảo vệ đã làm lạnh trước (5.9) cho đến khi đạt độ đục ước tính 2 500 FAU ± 500 FAU hoặc tương đương (xem Chú thích tại 8.1). Để chuẩn bị huyền phù gốc thích hợp, cứ mỗi mililit huyền phù trong dung dịch natri clorua nên cho thêm ít nhất 10 ml môi trường bảo vệ. Khi cho thêm môi trường bảo vệ thì độ phát quang sinh học sẽ bị giảm rõ rệt, nhưng nó sẽ xuất hiện lại sau khi thêm dung dịch pha l oãn g. Tiếp tục khuấy trong 15 min để thu được hỗn hợp đồng nhất. Cho hỗn hợp này vào các cuvet thử thích hợp (6.4), mỗi cuvet 100 m l. Đ ể thuận tiện nên dùng loại cuvet được sử dụng trong quy trình tiếp sau (Điều 9). Để sử dụng sau này, b ả o quản huyền phù gốc trong tủ đá ở ≤ -20 °C. CHÚ THÍCH : Huyền phù gốc có thể được sử dụng trong vài tháng. Huy ề n phù c ó th ể được bảo q uản lâu hơn ở nhiệt độ -70 °C. Các huyền phù gốc được rã đông ch ỉ có thể dùng cho các thử nghiệm sơ bộ. Có thể sử dụng huyền phù gốc vào mục đích thử nghiệm miễn là t hỏa mãn các chuẩn cứ về tính đúng đắn (xem Điều 12). 9. Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu chuẩn theo 5.6. Thử nghiệm mỗi mẻ vi khuẩn vớ i cả ba mẫu chuẩn. Thử ít nhất một trong ba mẫu chuẩn song song với mỗi cuvet dung dịch huyền phù gốc cho mỗi phép thử. Chu ẩ n bị mẫu theo 7.2. Lấy ố ng có chứa huyền phù gốc (8.4) ra ngoài tủ lạnh sâu và đặt v à o bể điều nhiệt ở 20 °C ± 2 °C để làm tan huyền phù. Chuẩn bị huyền phù thử theo hai bước: - Thêm 0,5 ml dung dịch (5.5) cho từng 100 m l huyền phù gốc vào cuvet thử, duy tr ì ở nhiệt độ 15°C ± 1 °C và làm đồng nhất bằng cách lắc nhẹ cuvet thử. - Chờ khoảng 15 min. Dùng pipet hút dung dịch huyền phù này rồi cho vào bình định mức, ví dụ dung tích 20 ml, và thêm 11,5 ml dung dịch (5.5), duy tr ì ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C, và làm đồng nhất bằng cách lắc nhẹ b ì nh thuốc thử. Chờ khoảng 15 min. Chuẩn bị d ã y dung dịch pha loãng mẫu, mẫu chuẩn (5.6) và mẫu kiểm soát (5.2) vào một bộ cuvet thử thứ nhất ( 6.4). Quy trình thông thường để chuẩn bị dãy pha loãng được mô tả trong Phụ lục B. Tùy thuộc vào mục đích của thử nghiệm và các yêu cầu thống kê liên quan đến kết quả phép thử, th ì các thiết k ế d ã y pha loãng có nồng độ dãy h ì nh học hoặc logarit có thể cũng phù hợp . Vì hỗn hợp các thể t í ch b ằ n g nhau của mẫu/mẫu đ ã pha loãng và huyền phù thử nghiệm, nên nồng độ mẫu cao nhất trong phép thử chiếm 50% mẫu thử như là một quy luật. Đối với phép thử mẫu nước gần như không pha loãng (80 % mẫu), t hì cần thêm mẻ kiểm tra (xem B.2 và B ả ng 1). Duy tr ì các cuvet thử có chứa dung dịch natri clorua (5.2) để kiểm soát, mẫu chuẩn (5.6), mẫu (7.2) và các mẫu của d ãy pha loãng (Bảng B . 1) ở 15 °C ± 1 °C. Chọn điều kiện thử nghiệm đảm bảo độ lệch nhiệt độ tối đa trong bể điều nhiệt trong một phép thử là không quá ± 0,3 °C. Đối với các phép thử có thể tích huyền phù cần thử và mẫu thử bằng nhau, dùng pipet hút vào ống đo thứ hai, tương ứng với cuvet thử (6.4) 500 m l huyền phù cần t hử, duy trì ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C trong tủ ấm , trong các khoảng thời gian b ằ ng nhau (từ 5 s đến 20 s) nh ư đối với các phép đo cường đ ộ sau này . Tiến hành phép xác định song song đối với mỗi mức pha loãng ở nhiệt độ thử 15 °C ± 1 °C. Điều chỉnh dụng cụ đo huỳnh quang sao cho thuận tiện và gần với mức cực đại. Xác định và ghi cườ ng độ phát quang, I 0 , của các huyền phù thử bằng máy đo phát quang. V ì thời gian tiếp xúc đối với tất cả các mẫu phải bằng nhau, nên sử dụng đồng h ồ tính gi ờ (6.6) để đo cường độ phát quang ở các khoảng thời gian đo bằng nhau. Khoảng thời gian đo thích hợp là 5 s đến 20 s. Đo tất cả các huyền phù thử, b ở i vì độ phát quang có thể khác nhau do huyền phù thử không đư ợ c đồng nhất. Ngay sau khi đo độ phát quang của huyền phù thử ban đầu, làm đ ầ y huyền phù thử này tới 1 ml b ằ ng mẫu (7.2), mẫu đã pha loãng (Phụ lục B) , mẫu chuẩn (5 6) hoặc dung dịch natri clorua (5.2) , nếu thích hợp. Việc này được thực hiện bằng cách dùng pipet lấy 500 m l mỗi dung dịch mẫu (7.2), mẫu đã pha loãng (Phụ lục B), mẫu chuẩn (5.6) hoặc dung dịch natri clorua (5.2) , đã được chuẩn bị trong dãy cuvet thử th ứ nhất, cho v à o huyền phù thử cần thử trong mỗi cuvet thử của dãy ống đo thứ hai tương ứ ng. Lắc đều bằng tay, bắt đầu bấm giờ và đặt các cuvet thử tr ở lại b ể điều nhiệt tại nhiệt độ 15 °C ± 1 °C. Lặp lại với tất c ả các cuvet thử khác, để cùng khoảng thời gian giữa những lần thêm vào. Đo và ghi cường độ phát quang trong tất cả các cuvet, kể cả mẫu kiểm soát, cứ sau 15 min và sau 30 min ( I 15 , I 30 ) , c ó thể đo sau 5 min ( I 5 ), tùy chọn, để khoảng thời gian đo từ 5 s đến 20 s. Ghi lại sự điều chỉnh dụng cụ. 10. Đánh giá 10.1. Ả nh hưởng ức chế lên vi khuẩn phát quang Sử dụng công thức (1) để tính hệ s ố hiệu chính (giá trị ) từ cường độ phát quang đo được. Hệ số này dùng để hiệu chính giá tr ị ban đầu I 0 của t ấ t cả các mẫu thử trước khi chúng được dùng làm giá trị chuẩn cho việc xác định độ giảm phát quang do nước. (t = 5 min, 15 min, 30 min) (1) Trong đó là hệ số hiệu chính đối với thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min, 30 min; I kt là cường độ phát quang trong mẫu kiểm tra sau thời gian tiếp xúc 5 m in , 15 min hoặc 30 min, tính b ằ ng đơn vị phát quang tương ứng; I 0 là cường độ phát quang của huyền phù thử kiểm tra ngay trước khi cho thêm chất pha loãng (5.2), tính bằng đơn v ị phát quang tương ứng; Tính hệ số hiệu chính trung bình và độ lệch của các giá trị riêng t ừ giá trị trung bình tính bằng phần trăm (lấy một chữ số có nghĩa) (2) Trong đó: là giá trị riêng của một trong hai hệ số điề u chỉnh và là giá trị trung bình Dùng công thức (3) để tính I ct : (3) Trong đó: là giá trị trung bình của ; I 0 là cường độ phát quang của huyền phù mẫu thử, ngay trước khi thêm của mẫu (7.2) hoặc mẫu pha loãng (Phụ lục B), tính b ằ ng đơn vị phát quang tương ứ ng; I ct là giá trị đã hiệu chính của I 0 đối với các cuvet đựng mẫu thử ngay trước khi cho mẫu thử vào. Dùng công thức (4) để tính ảnh hưởng ức chế của mẫu thử: (4) Trong đó: H t là ảnh hưởng ức chế của mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min hoặc 30 min, tính bằng phần trăm; I ct xem Công thức (3); I t là cường độ phát quang của mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min hoặc 30 min, tính bằng phát quang tương ứng; Tính giá trị trung bình của ảnh hưởng ức chế H t cho mỗi mức pha loãng, tính bằng phần trăm. Tính chênh lệch số học của phép xác định song song H ti từ trung bình tương ứng , tính bằng điểm phần trăm (một chữ số có nghĩa): Trong đó H ti là một trong hai giá trị hiệu ứng ức chế của mẫu thử và là giá trị trung bình. 10.2. Xác định các giá trị EC Tính toán mối tương quan ảnh hưởng của nồng độ đối với từng thời gian tiếp xúc sử dụng tuyến tính chuẩn thích hợp hoặc phân tích hồi quy phi tuyến tính [8] . Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ sử dụng kỹ thuật hồi quy tuyến tính, ước lượng giá trị gamma cho từng mức pha loãng (tỷ lệ của độ giảm phát quang với tổng lượng ánh sáng còn lại tại thời điểm t) sử dụng Công thức (5): (5) Trong đó: là giá trị gamma của mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min hoặc 30 min; là giá trị trung bình của H t x em Công thức (4). CHÚ THÍCH : Khi một nồng độ thử nhất định cho độ ức chế phát quang sinh học 0 % hoặc 100 %, thì kh ô ng thể t í nh được giá trị gamma. Do đ ó , ch ỉ c ó những giá trị H t n ằ m trong khoảng 10 % và 90 % được dùng để t ín h tư ơ ng quan của nồng độ. Mối tương quan về ảnh hưởng nồng độ tại thời điểm tiếp xúc đã cho thường có thể được mô tả bằng phương trình tuyến tính sau: (6) Trong đó: c t là phần mẫu nước có trong mẫu thử, t í nh bằng phần tr ă m; xem Công thức (5); b là giá trị của độ dốc của đường tuyến t í nh; Ig α là giá trị của phần bị chắn của đường tuy ế n tính. Bằng phương pháp thống kê hồi quy bình phương tối thiểu chuẩn, t í nh các giá trị EC 20 và EC 50 với các giới hạn tin cậy tương ứng, trong đó: c t = EC 20, t ở = 0 , 25; c t = EC 50, t ở = 1,00; Đối với phân tích hồi quy phi tuyến t í nh, các mô hình khác nhau c ó sẵn trong phần mềm đồ họ a chuẩn hoặc phần mềm thống kê. Các phần mềm n à y được dựa trên hàm phân bố chuẩn (nghĩa là ph ân tí ch Probit), phân bố logistic (nghĩa là phân tích Logit), hoặc phân bố Weibull (nghĩa là phân tích We ibull). Ảnh hưởng ức ch ế đã tính ( H t ) có thể được dùng trực tiếp để ước lượng thông số ảnh hưởng nồng độ phi tuyến tính, từ đó, giá trị EC đối với từng mức có thể tính được tiếp sau [ 8 ] . Nếu kho ản g của cặp giá trị không khớp với đường cong, thì các giá trị EC có thể được ước lượng theo hình học sử dụng hệ thống t ọa độ logarit kép. 11. Biểu thị kết quả Báo cáo kết quả theo ví dụ trong Bảng 1. Báo cáo khoảng thời gian thử (5 min, 15 min hoặc 30 min) Nếu xác định được, báo cáo giá trị LID l b (xem Phụ lục B). Nếu xác định được, báo cáo giá trị EC 20 và EC 50 và phư ơn g pháp để t í nh độ l ệ ch của các giá trị này. Báo cáo cách chuẩn bị vi khuẩn đã sử dụng. Bảng 1 - Ví dụ v ề đánh giá thử nghiệm – Mẫu: nước thải sau xử lý của trạm xử lý nước thải Thí nghiệm đối chứng Số mẻ ki ể m tra Mức pha loãng D Giá trị đo được I k30 /I 0 Thử nghiệm t í nh đ ú ng đắn Độ lệch so với giá trị trung bình , tính b ằ ng % b I 0 I k30 1 1 a 93 76 0 , 817 2 0,815 2 ± 0 , 3 2 91 74 0,813 2 3 ≥ 2 a 92 79 0 , 858 7 0 , 850 4 ± 1 , 0 4 95 80 0,842 1 Thí nghiệm thử Số mẻ thử Mức pha loãng D Giá trị đo được I c30 H 30 Thử nghiệm tính đúng đắn Độ lệch so với giá trị trung b ì nh, tính bằng % theo điểm c I 0 I 30 % % 1 2 1 92 93 25 27 75 , 0 75,8 66 , 7 64,4 65 , 53 ± 1 , 1 1 ,9 01 3 4 2 86 90 43 43 73 , 1 76 , 5 41 , 2 43 , 8 42 , 51 ± 1 , 3 0 , 740 5 6 3 91 89 60 5 8 77,4 75,7 22,5 23,4 22 , 92 ± 0,5 0,297 7 8 4 95 94 72 70 80 , 8 79 , 9 12,4 10,9 11 , 65 ± 0,8 0 , 132 Ch ấ t chuẩn 9 3 , 4 mg/l DCP , hoặc 2,2 mg/l Zn, hoặc 18,7 mg/l Cr 91 32 77 , 4 58 , 7 57 , 85 ± 0,9 1 , 372 10 93 34 79,1 57 , 0 a Xem Ph ụ lục B. b Đối với mẻ ki ể m tra, đ ộ lệch so với giá trị trung bì nh đư ợ c t í nh bằng ch ê nh lệch to á n học của các l ầ n xác định song song so với giá trị trung bình của chúng, t í nh bằng ph ầ n trăm [ Công thức (2) trong 10.1 ] c Đối với mẻ thử, độ lệch của giá trị H 30 (t í nh b ằ ng phần tr ă m) của các l ầ n xác định song song so với gi á trị trung bì nh của chúng được t í nh như chênh lệch t oán học của từng giá trị H 30 (t í nh bằng ph ầ n tr ă m) so với giá trị trung b ì nh (tính bằng phần trăm) (được gọi là đi ể m ph ầ n tr ă m). Giá trị LID lb trong ví dụ n à y LID l b = 4. Gi á trị EC 20 trong ví dụ này = 31,9 % , Giá trị EC 50 = 58 , 8 %. (thống kê b ìn h phương tối thi ể u chu ẩ n) 12. Chuẩn cứ về tính đúng đắn của phép thử Phép thử được coi là đúng nếu - Giá trị- khi ủ trong 15 min hoặc 30 min n ằ m trong khoảng từ 0,6 đến 1,3; - Kết quả của các phép xác định song song không chênh lệch so với giá trị trung bình của chúng quá 3% so với các mẫu kiểm tra; - Đối với các mẫu thử mà xác định giá trị LID l b hoặc giá trị EC 20 /EC 50 tương ứng, độ lệch so với giá trị trung bình của chúng “điểm phần trăm ” không quá 3 %. - Đối với mẻ nuôi cấy huyền phù gốc theo 8.4, c ả ba chất chuẩn (5.6) (các dung dịch không được trung hòa , kiểm tra riêng rẽ) gây ức chế từ 20 % đến 80 % sau thời gian tiếp xúc 30 min ở các nồng độ sau trong huyền phù thử cuối cùng. 4,5 mg/l 3,5-diclorophenol 25 mg/l Zn(ll) (tương đương 109,9 mg/l kẽm sun f at ngậm bảy nước) 4 mg/l Cr(VI) (tương đương 11,3 mg/l kali dicromat); - Một trong ba chất chuẩn (5.6) (các dung dịch không được trung hò a ), được thử trong phép thử tiến hành song song từng dung dịch huyền phù gốc được r ã đông cho phép thử thực sự (Điều 9) g â y ra ức chế 20 % đến 80 % sau thời tiếp xúc 30 min. 13. Độ chính xác Trong chương trình thử nghiệm liên phòng cấp quốc gia có 22 phòng thí nghiệm tham gia, được tiến hành trong suốt mùa thu năm 1991 đã xác định các số liệu về độ ch í nh xác. Các kết quả được tóm tắt trong Phụ lục C . 14. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải viện dẫn tiêu chuẩn này TCVN 6831-1:2010 (ISO 11348-1). Tài liệu cần phải bao gồm các thông tin sau: a) Nhận dạng mẫu nước, kể cả việc lấy mẫu, thời gian lưu giữ và điều kiện bảo quản; b) pH v à nồng độ oxy của mẫu nước gốc, t í nh bằng mg/l hoặc % sự bão hòa ; c) Ngày thử nghiệm; d) Phương pháp xử lý sơ bộ mẫu, nếu cần, ví dụ pH sau khi đi ề u chỉnh; e) Nguồn gốc vi khuẩn, số mẻ; f) Ngày chuẩn b ị vi khuẩn; g) Nhiệt độ bảo quản vi khuẩn; h) Biểu thị kết qu ả theo Điều 11 và Bảng 1; i) Mọi sai lệch so với phương pháp này và thông tin về các tình huống có thể ảnh hưởng đến kết quả; j ) Kết quả thử với các chất chuẩn đối với mẻ vi khuẩn và thử nghiệm thực tế. Phụ lục A (Tham khảo) Phương pháp hiệu chính màu A.1 Phạm vi áp dụng Việc giảm độ phát quang do h ấ p thụ ánh sáng có thể xảy ra khi mẫu trong các dãy pha loãng quan sát thấy rõ màu, đặc biệt những màu từ đỏ đến nâu. Nếu quan sát thấy màu ở nồng độ EC 20 , thì nên thực hiện quy trình sau đây để kiểm tra nếu th ấ y cầ n thiết phải hiệu chính màu. Trong mọi trường hợp, khi nồng độ của mẫu thử gần với giá trị EC 50 thì nên hiệu chính màu. Α. 2 Dụng cụ b ổ sung Α. 2.1 Cuvet hiệu chính-màu: cuvet-hai lớp, lắp vừa với máy đo độ phát quang Α. 2.2 Pipet Pasteur. Α. 3 Cách tiến hành Thực hiện toàn bộ quy trình hiệu chính màu ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C trong tủ ủ kiểm soát được nhiệt độ. Chuẩn bị một dung dịch pha loãng mẫu thử (5.2) có nồng độ gần giá trị EC 20 , t (C k ). Nếu giá trị EC 20 ,t chênh lệch nhiều thì C k phải gần với giá trị EC 20 ,t thấp hơn. CHÚ THÍCH 1 : Không cần phải chọn C k khác nhau cho mỗi khoảng thời gian ti ế p xúc (5 min, 15 min , 30 min). Cho 2,0 ml dung dịch natri clorua 2 % (5.2) vào kho ả ng ngoài của cuvet hiệu chính màu. Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn đặc biệt. Đối với vi khuẩn tươi được chuẩn bị theo 8.4, nên sử dụng 1,0 ml huyền phù vi khuẩn gốc. Trộn kỹ huyền phù trước khi dùng pipet Paster để chuyển vào khoang trong của cuvet hiệu chính màu. Thêm huyền phù cho bằng với mức dung dịch có trong khoang ngoài của cuvet hiệu chính màu. Đo mức ánh sáng ( B 0 ) sau ít nhất 15 min, và bật đồng hồ bấm giờ. Từ thời điểm này tr ở đi, vị tr í của cuvet hiệu chính màu trong khoảng đo phải được giữ nguyên cho tất cả các số đọc. Dùng pipet lấy hết dung dịch natri clorua từ khoang ngoài và thay vào đó bằng 2,0 ml mẫu thử đã pha loãng (Phụ lục B) và làm lạnh trước đến 15 °C ± 1 °C. Đo mức ánh sáng ( I 5 ) 5 min sau lần đo đầu. Dùng pipet lấy hết mẫu thử đã pha loãng từ khoang ngoài và thay vào đó bằng 2,0 ml dung dịch natri clorua. Đo mức ánh sáng ( B 10 ) 10 min sau lần đo đầu. CHÚ THÍCH 2 : Quy trình n ày có th ể đơn giản hóa bằng cách dùng hai cuvet hiệu chính màu giống hệt nhau. Kho a ng ngoài của cuvet thứ nh ấ t chứa đầy nước, khoang ngo à i của cuvet thứ hai ch ứa đầy mẫu đ ã pha lo ã ng. Sau 15 min, có th ể đo mức ánh sáng B 0 và I 0 . Những giá trị này khi đó c ó th ể thay cho những giá trị B 5 và I 5 để t í nh toán ở A.4. Α. 4 Tính toán kết quả Các t í nh toán thừa nhận rằng cường độ màu của mẫu phù hợp với đ ị nh luật Beer-Lambert, đó là trường hợp thông thường. Tính B 5 theo công thức (A.1): (Α.1) Tính độ hấp thụ ( A t ) của nồng độ EC 20 , t chưa hiệu chính với thời điểm tiếp xúc ( t ) theo c ô ng thức (A.2): (Α.2) Trong đó C k là nồng độ của mẫu hoặc của h óa chất có trong nồng độ thử (màu); k là hằng số hệ thống thu được theo thực nghiệm; là độ hấp thụ của dịch pha loãng cần thử trong cuvet hiệu chính m à u. T í nh độ truyền qua tư ơn g ứng T t theo công thức (A.3): (Α.3) Tính giá trị gamma đã hiệu chính ( ) theo công thức (A.4): (A.4) và theo Công thức (A.5): (A.5) Trong đó c là hệ số hiệu chính cho giá trị gamma ở thời điểm tiếp xúc đã định ( t ); là giá trị gamma gốc. Tiến hành tí nh lại kết quả thử với giá trị gamma đã được hiệu chính. Với thời gian tiếp xúc đã định, có thể tính được độ hấp thụ ( A t ) và độ truyền qua ( T t ) đối với mỗi nồng độ thử, và từ đó tính được giá trị gamma chưa hiệu chính theo Công thức (A.6): (A.6) Hệ s ố hiệu chính là giống nhau đối với mỗi gi á trị gamma, khi thừa nhận độ dốc của đồ thị gốc là đúng. Do đó, điều này đủ để tính hệ số hiệu chính ch ỉ đối với một giá trị gamma. Trong phép xác định này , áp dụng giá trị gamma tương ứng với nồng độ EC 2 0,t chưa hiệu chính ( = 0,25). Công thức (A.7) tính hệ số hiệu chính được rút gọn như sau: (A.7) Trong đó T t l à giá trị phát quang sinh học đo được ở thời điểm tiếp xúc đã định ( t ); c là hệ số hiệu chính cho các giá trị gamma ở thời điểm tiếp xúc đã định ( t ) ; l à giá trị gamma gốc; l à giá trị gamma đã được hiệu chính. Α. 5 Ví dụ Bảng A.1 – V í dụ S ố liệu về hiệu chính màu C k = 10,0 % ph ầ n thể t í ch B 5 = 81 I 0 = 78 k = 3 , 1 Tính hiệu chính màu C = phần th ể tích 5 min 15 min 30 min = 0,708 = 0,670 = 0,657 I 0 I 5 I 15 I 30 M ẫu tr ắ ng 100 90 80 70 5 , 625 98 82 0,076 0 , 054 74 0 , 059 0 , 040 65 0 , 055 0,036 11,250 94 63 0,343 0,243 60 0,253 0,170 53 0,242 0,159 22,500 96 45 0,920 0,651 42 0,829 0,556 38 0,768 0,505 45,000 97 15 4,820 3,412 17 3,565 2,389 17 2,994 1,967 Công thức gốc: ln = 1,96 x In C - 5 , 96 ln = 1,9 5 x In C - 6,1 6 ln = 1,9 0 x In C - 6,12 Công thức đã hiệu chính: ln = 1 , 96 x In C - 6 , 30 ln = 1,9 5 x In C - 6,56 ln = 1,9 0 x In C - 6,53 EC 20 ,t gốc 10,3 11 , 6 12,1 EC 20 , t đã hiệu chính 12 , 3 14,3 15 , 1 Phụ lục B (Tham khảo) Mức pha loãng D - Chuẩn bị các dãy pha loãng B. 1 Nguyên tắc Khi thử nước thải bằng cách pha loãng dần (D) mẻ thử có nồng độ đậm đặc nhất mà ở nồng độ này không có ức chế, hoặc ch ỉ có ít ả nh hưởng ức chế mà không vượt quá độ biến đổi đặc trưng thử nghiệm, được gọi là “ Độ pha loãng không ảnh hưởng thấp nhất (LID) ” . Độ pha loãng này được biểu thị bằng giá trị nghịch đảo của phần thể tích nước th ả i trong mẻ thử [ví dụ , nếu hàm lượng nước th ả i là 1 trong 4 (25 % phần th ể tích) thì mức pha loãng là D = 4]. Trong phép thử vi khuẩn phát quang, thường trộn các thể t í ch huyền phù thử đúng bằng với thể tích của mẫu nước hoặc thể t í ch của mẫu đã pha loãng. Do đó, các mức pha loãng trong các dãy pha loãng theo thông lệ là D ≥ 2 (nồng độ mẫu cao nhất trong phép thử: 50 % mẫu). B. 2 Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu theo 7.2. Mẫu nước thải phải làm đồng nhất bằng cách lắc bằng tay hoặc trộn bằng khuấy từ. Thêm 20 g dung dịch natri clorua vào mỗi lít mẫu nước hoặc mẫu nước đã điều chỉnh-pH. Đối với mẫu nước có nồng độ muối cao, đo độ muối và tính lượng NaCI (nếu cần) cần để điều ch ỉ nh độ thẩm thấu. Nồng độ muối thu được trong mẫu thử không được vượt quá độ thẩm thấu của dung dịch natri clorua 35 g/l. Chuẩn bị dãy pha loãng trong dãy cuvet thử th ứ nh ấ t. N ên dùng dãy pha loãng theo Bảng B.1. Dãy pha loãng được chuẩn bị bằng cách pha loãng dần và kết hợp hai pha lo ã ng hình học (D = 2 , 4, 8, 16.... và D = 3, 6, 12, 24,...). Đối với các phép xác định song song, thể tích mẫu hoặc mẫu đã pha loãng hoặc mẫu kiểm tra bằng 1 500 m l là đ ủ . Bảng B.1 - Chuẩn bị dãy pha loãng Mức pha loãng D Thành phần của dãy pha loãng mẫu (T ổ ng th ể tích cho phép xác định song song : 1 500 m l ) Mẫu nước (7.2) m l Nước pha loãng (5.2) m l Đối với D = 1 Mẻ ki ể m tra 0 1 500 M ẻ thử 1 1 500 0 Đối với D ≥ 2 Mẻ kiểm tra 0 1 500 Mẻ thử 2 1 500 0 3 1 000 500 4 750 750 6 500 1 000 8 375 1 125 12 250 1 250 16 187,5 1 312 , 5 24 125 1 375 32 93,75 1 406,25 Mẻ chuẩn (Nồng độ xem trong 5.6) 1 500 0 Cách dễ nhất để chuẩn bị dãy pha loãng này là tạo hai dung dịch pha loãng gốc trong các ống nghiệm riêng rẽ (xem Hình B.1) CHÚ DẪN 1 Mẫu a Mẫu pha loãng để tạo d ã y thử thứ nhất b Mức pha loãng cuối cùng D sau khi thêm huyền phù thử Hình B.1 - Sơ đồ pha loãng Pha loãng 1 trong 1, 3 000 m l mẫu chưa pha loãng (độ pha loãng cuối cùng trong phép thử sau khi trộn với các thể tích bằng nhau huyền phù thử sẽ là 1 trong 2). Pha loãng 2 trong 3, ví dụ 2 000 m l mẫu + 1 000 m l dung dịch 5.2 (độ pha loãng cuối cùng trong phép thử sau khi trộn với các thể tích huyền phù thử bằng nhau sẽ là 1 trong 3). Đối với những chuẩn bị pha loãng hơn nữa , chuyển 1 500 m l mẫu /mẫu đã pha loãng vào 1 500 m l dung dịch 5.2 trong các ống thử , trộn đều sau từng lần chuyển. Trong phép thử vi khuẩn phát quang, thường 500 m l mẫu nước hoặc mẫu đã pha loãng được chuẩn bị trong dãy thử thứ nhất được trộn với 500 m l huyền phù thử (xem Điều 9) được chuẩn bị trong dãy ống thử thứ hai, sau khi đo cường độ ánh sáng ban đầu của huyền phù thử. Do vậy, mức pha loãng thu được D trong mẻ thử đối với phép đo sự ức chế phát quang là gấp đôi độ pha loãng của mẫu hoặc mẫu đã pha loãng. Nếu cần thử mẫu nước gần như chưa pha loãng, có thể thêm 800 m l mẫu nước chưa pha loãng (7.2) vào 200 m l huyền ph ù thử. Độ pha loãng của mẫu là 1 trong 1,25 (nồng độ mẫu cuối cùng trong phép thử: 80 % mẫu). Giá trị D tương ứ ng có thể được coi như D = 1. Huyền phù thử đối với D = 1 được chuẩn bị bằng cách thêm 4,5 ml dung dịch (5.5) vào vi khuẩn đã được tạo huyền ph ù lại, thay cho 11 , 5 ml . Đối với giá trị này, cần có một mẻ kiểm tra thêm để tính toán hệ số hiệu chính phục vụ cho việc hiệu chính giá trị ban đầu. Mẻ kiểm tra được làm bằng cách thêm 800 m l dung dịch natri clorua (5.2) vào 200 m l huyền phù thử. B. 3 Cách tiến hành T iến hành phép thử theo Điều 9. Thực hiện phép xác định kép đối với từng mức pha loãng. Xác định và ghi lại cường độ phát quang trong tất cả các ống thử , kể cả ống kiểm tra, sau 15 min và 30 min( I 30 ) , tùy chọn. B. 4 Đánh giá T í nh giá trị trung bình của ảnh hưởng ức chế đối với từng mức pha loãng, t í nh bằng phần tr ă m (xem 10.1). T í nh độ lệch của phép xác định song song H 3 0 so với giá trị trung b ì nh của chúng tương ứng cho phép xác định kép H 30 (%) (trung bình) – H 3 0 (%) tính bằng điểm phần trăm, (một chữ số có nghĩa) và theo phần trăm của trung bình cho kiểm tra. (hệ số hiệu chính, xem 10.1). B.5 Bi ể u thị kết quả Thể hiện kết quả theo Điều 11. Giá trị D thấp nhất được thử tại mức mà hiệu ứng ức chế trung bình là < 20="" %,="" được="" gọi="" là=""> l b . B. 6 Báo cáo thử nghiệm Xem Điều 14. Ngoài các số liệu được yêu cầu trong tiêu chuẩn này , báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin về độ trong của nước thải, điều chỉnh độ muối và phương pháp xử lý sơ bộ (lắng, lọc, ly tâm, sục khí). Phụ lục C (Tham khảo) Số liệu độ đúng Đối với chương trình thử nghiệm liên phòng, dung dịch chưa trung hòa gồm 3,5-diclorophenol, kẽm sunfat ngậm bảy nước, kali dicromat và xetyltrimethyammonium bromua được pha bằng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương. Những giá trị EC được xác định như nêu trong 10.2, và các kết quả được đưa ra trong Bả ng C.1. CHÚ THÍCH : Do một số phòng thí nghiệm cho k ế t quả ức chế lớn hơn 20 % ở nồng độ thử th ấ p nh ấ t hoặc kết quả ức chế nhỏ hơn 50 % ở nồng độ thử cao nh ấ t nên các giá trị đô i khi c ó sự khác nhau đối với EC 20 và EC 50. Bảng C.1 - S ố liệu độ đúng đối với vi khuẩn tươi được bảo qu ả n trong tủ lạnh sâu = n n AP % mg/l S R mg/l CV R % 1 3,5-diclorophenol EC 20 EC 50 15 15 0,0 0,0 3,31 5,80 0,75 1,28 22,6 22 , 1 2 Kẽm sulfat heptahydrat a EC 20 EC 50 13 13 13,3 13,3 14 , 6 26 , 0 2 , 4 3,3 16 , 6 12 , 8 3 Kali dicromat a EC 2 0 EC 50 11 10 15,3 28,6 0,717 2,726 0,283 0,947 39 , 5 34,8 4 Cetyltrimethylammonium bromua EC 2 0 11 8,3 0 , 229 0,105 45.6 EC 50 13 7 , 1 0,476 0 , 152 31,8 Giải thích các ký hiệu I : số lượng phòng thí nghiệm tham gia; n : Số lượng các bộ dữ liệu; n AP : Số lượng ngoại lệ; : Giá trị trung b ìn h; S R : Độ lệch chu ẩ n của độ tái lập; CV R : Hệ số bi ế n thiên của độ tái lập, EC 20 : Nồng độ hữu ích gây ra ứ c chế phát quang 20 %. EC 50 : Nồng độ hữu ích gây ra ức chế phát quang 50 % a Nồng độ của Zn(ll) hoặc Cr(VI) tương ứng Phụ lục D (tham khảo) Thử mẫu nước mặn với phép thử vi khuẩn phát quang dùng vi khuẩn mới nuôi cấy D.1 Thông tin chung Sinh vật thử Vibrio f ischeri là vi khuẩn biển. Thử mẫu nước mặn bằng quy trình chuẩn thường dẫn tới những ảnh hưởng kích thích mà có thể gây cản trở những hiệu ứng ức chế [ 2 ] . Sự kích thích đó có thể do các ion của kim loại ki ề m và kim loại kiểm thổ [ 2 ],[ 3 ] . Với những cải tiến này của quy trình thử, sự phát quang sinh học trong kiểm tra được tối ưu hóa bằng cách sử dụng nước biển nhân tạo hoặc nước lợ nhân tạo khi kiểm tra và pha loãng. Do vậy, những hiệu ứng kích thích được giảm bớt và phương pháp n à y có thể á p dụng cho mẫu nước biển, nước lợ và nước lọc tương ứng. D.2 Định nghĩa D.2.1 Độ mu ố i (Salinity) Độ mu ố i thực tế (practical sanility) S Đại lượng không thứ nguyên, dùng để kiểm tra chất lượng nước, được xem như sự ước lượng về nồng đ ộ của muối hòa tan trong nước biển, tính bằng gam trên kilogram; Nó cũng được định nghĩa theo toán học, là tỷ số ( K 1 5 ) giữa độ dẫn điện của mẫu nước, tại 15 °C và 1 atm * , và độ dẫn điện của dung dịch kali clorua xác định (32,4366 g/kg mẫu) ở cùng nhiệt độ và áp suất. CHÚ THÍCH : Ch ấ p nhận t ừ TCVN 8184-2:2009 (ISO 6107-2:2006), định nghĩa 85. D.2.2 M ẫ u nước mặn (salt w ater sample) Mẫu nước mặn hoặc lợ có độ muối trong khoảng từ 5 đến 35. D.2.3 Nước chiết của tr ầm tích bi ể n hoặc l ợ (Eluates of marine or brackish sediments). Dịch chiết lỏng của trầm tích biển hoặc nước lợ có nước lợ/biển nhân tạo hoặc tự nhiên như môi trường rửa giải. D.2.4 Tr ầ m t í ch nước bi ể n hoặc n ướ c lợ (Pore water of marine or brackish sediment particles) Nước n ằ m giữa các hạt trầm tích biển và trầm tích lợ D.3 Vật liệu D .3.1 Ch ấ t chuẩn - 3,5-dichlorophenol; - Kẽm sun f at ngậm bảy nước (ZnS O 4 .7H 2 O ). D.3.2 Nước biển nhân tạo (ASW) và nước l ợ nhân tạo (ABW) Sử dụng nước đã loại ion đ ể chuẩn bị nước biển nhân tạo (ASW) và nước lợ nhân tạo (ABW) với các thành phần được nêu trong Bảng D.1. Tất cả thuốc thử phải ở cấp độ tinh khiết. Bảng D.1 - Nước biển nh â n tạo (ASW) (như quy định trong ISO 10253 [ 5 ] ) và n ướ c l ợ nh â n tạo (ABW) Nước biển nh â n tạo (ASW) Nước lợ nhân tạo (ABW) Độ muối (g/l) NaCI 22 , 0 14 , 19 MgC l 2 .6H 2 O 9,7 6 , 26 Na 2 S O 4 (anhydris) 3 , 7 2 , 39 CaCI 2 (anhydris) 1 , 0 0, 65 KCI 0 , 65 0 , 42 NaHCO 3 0 , 20 0 , 13 H 3 BO 3 0,023 0 , 015 Độ dẫn điện ( µ S/cm) (20 °C) 47,000 ± 1,000 31 , 000 ± 1 , 000 Độ muối nhân tạo (20 °C) 31 ± 1 20 ± 1 Giá trị pH 7 , 5 ± 0,2 7 , 5 ± 0 , 2 D.4 Cách tiến hành D.4.1 Khái quát Chuẩn bị và làm tan vi khuẩn theo một quy trình tiêu chuẩn. Tùy thuộc vào độ muối của mẫu, sử dụng nước biển nhân tạo (ASW) hoặc nước lợ nhân tạo (ABW) làm mẫu kiểm tra âm, nước pha loãng cho dãy pha loãng mẫu và nước pha loãng cho ch ấ t chuẩn thay cho dung dịch natri clorua 2 % (S 20) (xem tóm tắt trong Bảng D.2) Bảng D.2 - So sánh quy trình chuẩn và quy trình cải biến Quy trình chuẩn TCVN 6831-1 (ISO 11348-1) Nước lợ cải biến Nước mặn cải biến Độ muối của mẫu (S) X <> 5 ≤ x ≤ 20 20 ≤ x ≤ 35 Chất chuẩn hòa tan trong Dung dịch NaCI (S 20) ABW (s 20) ASW (s 20) M ẫ u kiểm tra Dung dịch NaCI (S 20) ABW (s 20) ASW (s 20) Nước pha loãng Dung dịch NaCI (S 20) ABW (s 20) ASW (s 20) D.4.2 M ẫ u với độ muối 5 ≤ x ≤ 20 (Nước lợ cải biến) Đo và lập tài liệu về độ muối của mẫu. Mẫu có độ muối S < 20="" thì="" cần="" phải="" tăng="" độ="" muối="" lên=""> S = 20 bằng natri clorua. Đo giá trị pH của mẫu. Nếu pH nằm trong khoảng 7,0 đến 8,5, th ì sự điều ch ỉ nh là không cần thiết. Nếu cần, điều chỉnh pH của mẫu tới 7,5 ± 0,2 bằng cách thêm axit clohydric hoặc dung dịch natri hydroxit; chọn nồng độ của axit clohydric hoặc dung dịch natri hydroxit để hạn chế thể tích thêm vào không quá 5 % tổng thể tích. Sử dụng nước lợ nhân tạo (ABW) (D.3.2) - Làm mẫu kiểm tra, - Dùng cho d ã y pha loãng của mẫu, - Dùng cho dung dịch gốc của chất chuẩn cũng và cho dãy pha loãng của dung dịch gốc. D.4.3 M ẫ u có độ muối 20 x ≤ 35 (Nước biển cải biến) Đo và lập tài liệu về độ muối của mẫu. Đo giá trị pH của mẫu. Nếu pH nằm trong khoảng từ 7,0 đến 8,5 thì sự điều chỉnh thường là không cần thiết. Nếu cần, điều chỉnh pH của mẫu tới 7,4 ± 0,2 bằng cách thêm axit clohydric hoặc dung dịch natri hydroxit; chọn nồng độ của axit clohydric hoặc dung dịch natri hydroxit để hạn chế thể tích thêm vào không quá 5 % tổng thể tích. Sử dụng nước biển nhân tạo (ASW) (D.3.2) - Làm mẫu kiểm tra, - Dùng cho dãy pha loãng mẫu, - Dùng cho dung dịch gốc của chất chuẩn và cho dãy pha loãng của dung dịch gốc. D.5 Số liệu độ đúng Đối với các chất chuẩn 3,5-dichlorophenol và kẽm sunfat ngậm bảy nước (D.3.1) giá trị EC 50 được nêu trong Bảng D.3 có thể thu được do một phòng thí nghiệm và chỉ dùng cho mục đích tham khảo. Bảng D.3 – S ố liệu độ đúng đ ố i v ớ i vi khuẩn mới nuôi cấy được bảo quản trong tủ lạnh sâu Chất chuẩn Phép th ử n mg/l s mg CV % 3,5-dichlorophenol Tiêu chuẩn 1 5 3,87 0,32 8 , 2 Nước lợ 1 2 3,46 0,09 2,7 Nước biển 1 3 3,23 0,19 5,8 Zn(ll) Tiêu chuẩn 1 3 20,70 2 , 39 11 , 6 Nước lợ 1 2 31,43 2,63 8,4 Nước biển 1 6 36,73 3,66 10 , 0 Giải th í ch các ký hiệu: là số lượng phòng thí nghiệm tham gia ; n là số lượng các bộ số liệu; là giá trị trung bình (giá trị EC 50 ) (một phòng thí nghiệm); s là độ lệch chuẩn (một phòng thí nghiệm) ; CV là hệ số bi ế n thiên (một phòng th í nghiệm). THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 8184-2:2009 (ISO 6107-2:2006), Ch ất lượng nước - Thuật ngữ - Phần 2 [2] ISO/TS 20281, Water quality - Guidance on statistical interpretation of ecotoxicity data [3] ISO 10253, Water quality - Mar ine algal gro w th inhibitio n test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum (Chất lượng nước - T hử ức chế phát triển của tảo biển bằng Skeletonema costatum và Phaeodactylum tricomutum ) [4] GRABERT, E., KOSSLER, F. About the nutrients on the luminescent bacteria test (Về chất dinh dưỡng trong phép thử vi khuẩn phát quang ). In: Hastings J.W., Kricka L.J., Stanley P.E., editors. Bioluminescence and Chemiluminescence, Molecular Reporting with Photons. Chichester: John Wiley & Sons Ltd, 1996, pp. 291-294 [5] KLEIN. B. (1992): Die Rolle des Kaliums bei Toxizitatstests mit Leuchtbakterien (incl. abstract in English: The role of potassium in toxicity tests using luminescent bacteria). Z.f.Angew.Zool. , Vol.4. pp 199-219 [6] KREBS , F. (1992): Gewasseruntersuchung m i t durch Alkali- und Erdalkalionen-Zugabe optimierten DIN-Leuchtbakterientest, dargestellt am Beispiel der Saar (incl. abstract in English: River water analysis with luminescent bacteria test according to DIN, optimize d by the addition of alkaline and alkaline-earth ions, with the River Saar as an exsample (Phân tích nước sông bằng phép thử vi khuẩn ph á t quang theo DIN , bằng cách thêm các ion ki ề m và ki ề m thổ, lấy ví dụ nước sông Saar )) In: Steinhauser, K.G. & Hansen, P . D. (Eds.). Biologische Testver f ahren. Stuttgart. Germany. Gustav Fischer Verlag. Schr.-Reihe Verein WaBolu. P p. 657-673 [7] POSTMA, J.F. et al (2002). Con f ounding f actors in bioassays with freshwater and marine organisms. Ecotoxicol. Environ . Sa f ety, 53 (2), pp. 226-237 [8] KREBS. F (1993). Toxizitatste s t mit ge f riergetrockneten Leuchtbakterien . Gewasserschutz , Water. A bw ass e r , 63, pp. 173-230 * Theo quy định hợp pháp, atm được chuyển thành Pa: 1 atm = 101 325 Pa.