TCVN8128:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014) về Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8128:2015 ISO 11133:2014 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM, THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ NƯỚC - CHUẨN BỊ, SẢN XUẤT, BẢO QUẢN VÀ THỬ HIỆU NĂNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Microbiology of food, animal feed and w ater - Preparation, production, storage and per f ormance testing of culture media Lời nói đầu TCVN 8128:2015 thay thế TCVN 8128-1:2009 v à TCVN 8128-2:2009; TCVN 8128:2015 hoàn toàn tương đương với ISO 11133:2014; TCVN 8 128:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công b ố . Lời giới thiệu Tại tất c ả các phòng thử nghiệm thực hiện kiểm tra vi sinh, các mục tiêu chính là để duy trì, hồi sinh, phát triển, phát hiện và/hoặc định lượng các gi ố ng vi sinh vật. Môi trường nuôi cấy được sử dụng trong tất cả các kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật truyền thống và cũng dùng cho nhi ề u kỹ thuật thay thế khác. Nhiều công thức môi trường nuôi cấy có bán sẵn trên thị trường và được dùng cho c á c mục đích tăng trưởng đặc biệt, được mô t ả trong các tài liệu. Nhiều phép thử và nhiều quy trình phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy có thể cho các kết qu ả hợp lý và tái lập. Các yêu cầu về môi trường nuôi cấy có thể đặc thù đối với mẫu và các sinh vật cần phát hiện. Do đó, môi trường nuôi cấy đáp ứ ng các tiêu chí quy định là điều kiện tiên quyết đối với mọi công việc v ề vi sinh. Thử nghiệm thích đáng phải được thực hiện đ ể chứng minh: a) sự chấp nhận của từng mẻ môi trường: b) môi trường là “phù hợp cho mục đích”; và c) môi trường có thể cho các kết quả phù hợp. Ba tiêu chí trên là một phần thiết yếu của các quy trình kiểm soát chất lượng nội bộ, với các tài liệu thích hợp, sẽ cho phép giám sát hiệu qu ả môi trường nuôi cấy và góp phần vào việc cung cấp dữ liệu chính xác và đáng tin cậy. Đối với phép phân tích vi sinh vật đáng tin cậy thì điều cơ bản l à sử dụng môi trường nuôi cấy có chất lượng đã được chứng minh. Đối với tất cả các môi trường quy định trong các phương pháp chuẩn, cần xác định các tiêu chí chấp nhận yêu cầu tối thiểu để đảm bảo độ tin cậy của môi trường. Khuyến cáo rằng trong phép xác định các đặc tính hiệu suất của môi trường nuôi cấy cần thực hiện các phép thử theo tiêu chuẩn này. Việc thiết lập các tiê u chí hiệu suất tối thiểu được chấp nhận rộng rãi đối với môi trường nuôi cấy có thể dẫn đ ế n sản phẩm có ch ấ t lượng phù hợp hơn và do đó làm giảm mức độ thử nghiệm cần thiết trong phòng thử nghiệm. Ngoài ra , các tiêu chí chấp nhận bằng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này có thể được tất cả các phòng thử nghiệm vi sinh sử dụng để đánh giá tính hiệu quả, chọn lọc và/hoặc đặc tính chọn lọc của môi trường nuôi cấy. Phân tích vi sinh vật trong thực phẩm, thức ă n chăn nuôi và nước, các yêu cầu của tiêu chuẩn n à y phải được ưu tiên trong việc đánh giá chất lượng của môi trường nuôi cấy. VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM, THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ NƯỚC - CHUẨN BỊ, SẢN XUẤT, BẢO QUẢN VÀ THỬ HIỆU NĂNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Microbiology of food, animal feed and w ater - Preparation, production, storage and per f ormance testing of culture media 1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này đưa ra các định nghĩa liên quan đến việc đảm bảo chất lượng của môi trường nuôi cấy và quy định các yêu cầu đối với việc chuẩn bị các môi trường nuôi cấy dùng để phân tích vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và các mẫu từ các môi trường sản xuất thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi cũng như tất cả các loại nước sinh hoạt hoặc được sử dụng trong chế biến thực phẩm. Các yêu cầu này có thể áp dụng để chuẩn bị tất cả các loại môi trường nuôi cấy sử dụng trong các ph ò ng thử nghiệm thực hiện phân tích vi sinh vật. Tiêu chuẩn này cũng đưa ra các tiêu ch í và quy định các phương pháp để thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy. Ti ê u chuẩn này áp dụng cho các nhà sản xu ấ t như: - Các t ổ chức thương mại sản xuất và/hoặc phân phối môi trường pha chế sẵn để sử dụng, môi trường hoàn ch ỉ nh khô hoặc môi trường bán hoàn chỉnh; - Các tổ chức phi thương mại cung cấp môi trường cho các bên thứ ba; - Các phòng thử nghiệm vi sinh tự chuẩn bị môi trường nuôi cấy đ ể sử dụng. 2 Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên b ả n được nêu. Đối với các tài liệu viện d ẫ n không ghi năm công b ố th ì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, b ổ sung (nếu có). TCVN 6404 ( ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung v à hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật. TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), Vi sinh v ậ t trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầ u và các dung dịch pha loãng thập phân đ ã ki ể m tra vi sinh vật - Phần 1: Các nguyên tắc chung đ ể chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân. TCVN 6507-2 (ISO 6887-2), V i sinh vật trong thực phẩm v à th ức ă n ch ă n nuôi - Chuẩn b ị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm t ra vi sinh vật - Ph ầ n 2: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các m ẫ u thịt và sản phẩm thịt. TCVN 6507-3 (ISO 6887-3), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ă n c hă n nuôi - C h u ẩ n bị mẫu thử, huy ề n phù ban đ ầ u và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra v i sinh vậ t - Ph ầ n 3: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các mẫu thủy sản và sản ph ẩ m thủy sản. TCVN 6507-4 ( I SO 6887-4), Vi sinh vật trong thực phẩm v ề thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đ ầu và các dung dịch pha loãng thập phân để k iểm tr a vi sinh v ậ t - P hần 4: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các sản phẩm khác với sữa và sản phẩm sữa, t hịt và s ả n phẩm thịt thủy sản và sản phẩm th ủy sản. TCVN 6507-5 ( ISO 6887-5), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ă n chăn nuôi - Chu ẩ n b ị mẫu thử, huyền ph ù ban đầu và dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi s i nh vật - Phần 5: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị mẫu sữa và sản phẩm sữa. TCVN 6507-6 (ISO 6887-6), Vi sinh vật trong thực phẩm và th ứ c ăn c hă n nuôi - Chuẩn bị mẫu th ử , huyền phù ban đầu và dịch pha loãng thập phân để kiểm t ra vi sinh vật - Phần 6 : Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị mẫu được lấy từ giai đoạn sản xuất ban đầu. TCVN 9716 (ISO 8199), Chất lượng nước - Hướng dẫn chun g về đếm vi sinh vật bằng nuôi c ấ y. ISO 7704, Water quality - Evaluat i on of membrane filters used for mic ro biological analyses (Chất lượng nước - Đánh giá bộ lọc màng được sử dụng trong phân tích vi sinh). 3 Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây: CHÚ THÍCH 1: Đi ề u này cung c ấ p các định nghĩa chung liên quan đến đảm bả o ch ất lư ợ ng của m ô i trường nu ô i c ấ y và cung c ấ p các thu ậ t ngữ liên quan đến thực hiện th ử nghiệm, môi trường nu ô i c ấ y và vi sinh v ật thử nghiệm. CHÚ TH Í CH 2 : Các Bảng E.2 v à F.2 đưa ra các giải th í ch về c á c thuật ngữ viết t ắ t tên g ọ i m ô i trường. 3.1 Thuật ngữ chung và định nghĩa 3.1.1 K i ểm soát chất l ượ ng (quality control) Một phần của quản lý chất lượng tập trung vào thực hiện cá c yêu cầu chất lượng. CHÚ TH Í CH 1: Xem Tài liệu tham khảo [1]. 3.1.2 M ẻ môi trường nuôi cấy (batch of culture medium) Lô môi trường nuôi cấy (lot of culture medium) Đơn v ị môi trường đồng nhất và hoàn toàn có thể truy xuất liên quan đến một lượng xác định của nguyên liệu, bán thành phẩm hoặc thành phẩm, đồng nh ấ t về kiểu loại và chất lượng và được sản xuất trong một giai đoạn xác định, có cùng s ố mẻ (hoặc s ố lô) sản xuất. 3.1.3 C ơ chất tạo màu (chromogenic substrate) Cơ chất phát huỳnh quang ( f luorogenic substrate) Cơ chất có chứa một nhóm chất màu/nhóm chất huỳnh quang và cơ chất để nuôi cấy được bởi vi khuẩn hoặc nấm. CHÚ TH Í CH 1: Sau khi tách cơ chất tạo màu/cơ chất phát huỳnh quang, chất màu/huỳnh quang được giải phóng và sản phẩm cuối cùng có màu/h u ỳnh quang có thể nh ì n thấy được/có t hể được phát hiện bằng cách sử dụng đèn cực tím (UV). 3.2 Thuật ngữ thử hiệu năng 3.2.1 Hiệu năng môi trường nuôi cấy (performance of culture media) Sự đáp ứng của môi trường nuôi cấy đối với các vi sinh vật thử nghiệm trong các điều kiện xác định. 3.2.2 Vi sinh vật đích (target microorgan i sm) Vi sinh vật hoặc nhóm vi sinh vật cần được phát hiện hoặc định lượng. 3.2.3 Vi sinh vật không phải đích (non-target microorganism) Vi sinh vật b ị ức chế bởi môi trường v à /hoặc điều kiện ủ hoặc không hiển th ị các đặc trưng mong muốn của các vi sinh vật đích. 3.2.4 Hiệu suất của môi trường nuôi cấy (productivity of culture medium) Mức thu hồi vi sinh vật đích từ môi trường nuôi cấy t rong các điều kiện xác định. 3.2.5 Tính chọn lọc của môi trường nuôi c ấ y (selectivity of cu l ture medium) Mức độ ức chế các vi sinh vật không phải đích trên hoặc trong một môi trường nuôi cấy chọn lọc trong các điều kiện quy định. 3.2.6 T í nh đặc thù của môi trường nuôi cấy (electivity of culture medi u m) T ính đặc hiệu của môi trường nuôi cấy (specitic i ty of culture medium) Trong các điều kiện xác đị nh, các vi sinh vật không phải đích không hiển thị các đặc tính tương tự như vi sinh vật đ í ch. 3.3 Thuật ngữ về môi trường nuôi cấy 3.3.1 M ôi trường nuôi c ấ y (culture medium) S ự tạo thà nh của các ch ất ở dạng lỏng, bán đặc hoặc dạng đặc, có chứa các thành phần tự nhiên và ho ặ c t ổ n g h ợ p để giúp cho việc nhân lên ( c ó hoặc không có sự ức chế một số vi sinh vật nhất định), nhận bi ết hoặc duy tr ì sự s ố ng của các vi sinh vật. CH Ú TH Í CH : Khi được sử dụ ng cùng với các cụm từ k hác th ì thuật ngữ này thường gọi tắt là “môi trường ” (ví dụ: m ô i trường tăng sinh). 3.3. 2 M ô i trường nu ô i cấy phân loại theo thành phần 3.3.2.1 Môi trường xác định v ề h ó a học (chemically de f ined med i um) M ô i trường nu ô i c ấ y ch ỉ bao g ồ m các thành phần hóa học xác định đã biết về cấu trúc phân t ử và độ tinh khi ế t. 3.3 . 2 . 2 Môi trường không xác định hoặc môi trường không xác định một ph ầ n v ề hóa học (chemically undefined or p ar tia l ly unde fi ned me d ium) Môi trường nuôi cấy bao gồm toàn bộ hoặc một phần của nguyên liệu tự nhiên, đã chế biến hoặc cách khác, có thành phần hóa học chưa được xác định hoàn toàn. CHÚ TH Í CH 1: Các tên gọi đ ố i v ớ i các t hà nh ph ầ n không xác định về mặt hóa học được sử dụng trong môi trường nuôi cấy được quy định tron g P hụ lục A. 3.3.2.3 Môi trường nuôi c ấ y sinh m àu ( chromogenic culture medium) Mô i trường nuôi cấy phát huỳnh quang (fluorogenic culture medium) Môi trường n uô i cấy có chứa một hoặc nhiều cơ chất tạo màu/cơ chất phát huỳnh quang. CH Ú THÍCH 1: M ôi trường nuôi cấy sinh màu tạo thuận tiện cho việc nhận bi ế t các vi khuẩn hoặc n ấ m bởi màu sắc xác định hoặc các đặc điểm h ì nh thái (môi trường nuôi cấy phát triển đi ể n h ì nh). Môi trường nuôi cấy phát huỳnh quang yêu cầu quan sát dưới đèn UV . Các sản phẩm phản ứng sinh hóa c ầ n thiết cho việc đánh giá môi trường nuôi cấy sinh màu/phát huỳnh quang, th ư ờng là kết quả hoạt động enzym của các sinh vật nhất đị nh, phụ thuộc r ấ t nhiều vào việc duy trì ch í nh xác các điều kiện cụ thể (v í dụ như nhiệt độ, độ pH, n ồ ng độ cơ chất). 3.3.2 Môi trường nuôi cấy đ ượ c phân loại theo trạng thái vật lý 3.3.3.1 Môi trường lỏng (liquid medium) Môi trường nuôi cấy bao gồm dung dịch hòa tan của một hoặc nhiều thành phầ n như nước pepton và canh thang dinh dư ỡ ng. CHÚ TH Í CH 1: Trong một s ố trường h ợ p, các hạt rắn được cho vào môi trường nuôi cấy l ỏ ng, như nước th ịt. CHÚ THÍCH 2: Môi trường dạng lỏng đựng trong các ố ng, b ì nh hoặc chai thường được gọi là “canh t h ang”. 3.3.3.2 Môi trường đặc (solid medium) Môi trường bán đặc (semi-solid medium) Môi trường lỏng chứa các chất làm đông đặc (ví dụ: thạch, gelatin) ở các n ồ ng độ khác nhau. CHÚ THÍCH 1: Do môi trường agar-agar đông đặc được sử dụng rộng r ã i, n ê n thu ậ t ngữ rút ngắn “ aga r” ( “t hạch”) th ườn g đư ợc sử dụng đồng nghĩa với môi trường đặc và li ê n quan đ ế n “thạch đếm đ ĩ a”. CH Ú THÍCH 2: Môi trường đặc được rót vào các đĩa Petri thường được gọi là “thạch đ ế m đĩa”. M ôi trường đặc được rót vào các ống hoặc chai nhỏ được giữ theo vị trí nghiêng để cho m ô i trường đông đặc lại đ ư ợc gọi là “thạch nghiêng” hoặc “ dốc ” . N ế u môi trường được phân phối vào đáy vật chứa, tạo thành “ thạch đ ứng”. 3.3.3 Môi trường nuôi cấy được phân loại theo mục đích sử dụng 3.3.4.1 Môi trường vận chuyển (transport medium) Môi trường được thiết kế để b ả o tồn và duy trì khả năng sống của vi sinh vật trong kh i vẫ n giảm thi ể u th ờ i gian tính từ lúc thu thập mẫu đến khi xử lý mẫu trong phòng thử nghiệm. VÍ DỤ : Môi trường vận chuyển S tua r t hoặc Amies. 3.3.4.2 Môi trường bảo quản (preservation medium) Môi trường được thiết kế để bảo tồn và duy trì sự tồn tại của các vi sinh vật trong một thời gian d ài, nh ằ m b ả o vệ các vi sinh vật chống lại những ảnh hưởng bất lợi c ó thể xảy ra trong thời gian bảo qu ản dài và cho phép phục hồi sau giai đoạn bảo quản. VÍ DỤ : Môi trường trứng Dorset, thạch d inh dư ỡ ng nghiêng. 3.3.4.3 Môi trường pha loãng (diluent medium) Môi trường huyền phù (suspension medium) Môi trường được thiết kế để tách các vi sinh vật từ sản ph ẩ m thử nghiệm dạng đặc thành dạng lỏng và/hoặc làm giảm nồng độ bằng cách pha loãng mà không l àm tăng hoặc làm ức chế vi sinh vật trong thời gian tiếp xúc. VÍ DỤ : Dung dịch muối pepton . 3.3.4.4 Môi trường phục hồi (resuscitation medium) Môi trường tạo điều kiện cho các vi sinh vật bị ức chế và bị hư hỏng c ó thể phục hồi và phát triển b ì nh thường mà không cần thiết phải nhân lên. VÍ DỤ : Nước đệm pepton. CHÚ THÍCH 1: M ô i trường phục hồi cũng có thể được sử dụng làm môi trường tăng sinh sơ bộ , ví dụ: nước đệm pepton. 3.3.4.5 Môi trường tăng sinh sơ bộ (pre-enrichment medium) Môi trường tăng sinh (enrichment medium) Môi trường dạng lỏng, c ó thành ph ầ n tạo điều kiện thuận lợi cho việc nhân lên các vi sinh vật. VÍ DỤ: Canh thang trypton đậu tương. 3.3.4.5.1 Môi trường tăng sinh chọn lọc (selective enrichment medium) Môi trường tăng sinh cho phép một số vi sinh vật nhân lên trong khi lại ức chế một phần hoặc hoàn toàn sự tăng trư ở ng của các vi sinh vật khác. VÍ DỤ: Môi trường Rappaport-Vassiliadis pepton đậu tương (RVS). 3.3.4.5.2 Môi trường t ă ng sinh không chọn lọc (non-selective enrichment medium) Môi trường t ă ng sinh cho phép nhiều loại vi sinh vật phát triển . VÍ DỤ: Canh thang tim não. 3.3 .4. 6 Môi trường phân lập (isolation medium) Môi trường đặc hoặc bán đặc cho phép các vi sinh vật phát triển. 3.3.4.6.1 Môi trường phân lập chọn lọc (selective isolation medium) Môi trường phân lập cho phép phát triển các vi sinh vật đích cụ thể, trong khi lại ức chế hoàn toàn hoặc một phần các vi sinh vật khác. VÍ DỤ: Thạch deoxycholat cefoperazon than cải biến (Thạch mCCD). 3.3.4.6.2 M ôi trường phân lập không chọn lọc (non-selective isolation medium) Môi trường phân lập không ức chế chọn lọc các vi sinh vật. VÍ D Ụ : Thạch dinh d ưỡ ng. 3.3.4.6.3 Môi trường nuôi cấy chọn lọc sinh màu (chromogenic se l ective culture medium) Môi trường nuôi cấy chọn lọc phát huỳnh quang (fluorogenic selective culture medium) Môi trường nuôi cấy sinh màu/phát huỳnh quang cũng chứa các chất chọn lọc để ức chế hoàn toàn hoặc một phần đi kèm với hệ vi sinh vật có trong mẫu thử, do đó hỗ trợ cho việc phát hiện chính xác các vi sinh vật đích. VÍ DỤ: Thạch TBX, môi trường MU G/ EC. 3.3.4.7 Môi trường phân biệt (differen ti a l me d ium) Môi trường đặc trưng (c h arac te riza t ion me dium ) Môi trường cho phép thử nghiệ m một hoặc nhiều đặc tính sinh l ý /sinh hóa của các vi sinh vật để nhận biết chúng . VÍ DỤ: Thạch TBX, thạch La ct ose v ớ i t ergitol 7 và TTC. CHÚ TH Í CH 1: Các môi trường phân biệt có thể được sử dụng như môi trường phân lập được gọi l à môi trường phân lập/phân biệt , v í dụ như thạch deoxyc h otat l ysin xytose (XLD), thạch TTC lactose. 3.3.4. 8 Môi trường nhận biết ( identification medium) Môi trường được thiết kế đ ể tạo ra phản ứ ng nhận biết cụ thể mà thường không yêu cầu thêm bất kỳ phép thử khẳng định nào. VÍ DỤ: Thạch mật azid aesculin. 3.3.4.9 Môi trường định l ượ ng (enumeration med i um) Môi trường nuôi cấy chọn lọc hoặc không chọn lọc, cho phép định lượng các vi sinh vật. VÍ D Ụ : Thạch Baird-Parker, chất ch iế t n ấ m men. CH Ú THÍCH 1: Môi trường định lượng có t h ể bao gồm các thuộc t í nh của môi trường tăng sinh và/hoặc phục hồi. 3.3.4.10 M ôi trường khẳng định (con f irmation medium) Môi trường góp phần vào việc nhận bi ế t hoặc xác định đặc trưng của vi sinh vật sau khi phục hồi sơ bộ và/hoặc tăng sinh và/hoặc phân lập. VÍ DỤ: Thạch sắt Kligter. 3.3.4.11 M ôi trường có chứa các ch ấ t trung hòa (medium containing neutralisers) Môi trường vận chuyển, môi trường pha loãng hoặc môi trường nuôi cấy có chứa các chất trung hòa để làm bất hoạt chất t ẩ y rửa/ chất khử trùng hoặc các chất diệt sinh vật khác. 3.3.4.12 Môi trường sử dụng cho nhiều mục đích (medium having multiple uses) Môi trường được phân vào một số mục khác nhau. VÍ DỤ: Thạch máu là môi trường phục hồi theo 3.3.4 4, môi trường phân lập theo 3.4.4.6 và môi trường ph â n biệt theo 3 . 3.4.7 sử dụng để ph á t hiện tan máu. Nư ớ c đệm pepton là chất pha loãng theo 3.3.4.3 và m ô i trường tăng sinh sơ bộ theo 3.3 4.5. 3.3.4.13 Môi trường đối chứng (reference medium) Môi trường, thường là không chọn lọc, đ ể đánh giá so sánh về hiệu suất độc lập của môi trường cần thử nghiệm và được chứng minh là phù hợp cho việc sử dụng để kiểm soát. VÍ DỤ: Thạch trypton đậu tương (TSA). 3.3. 5 Môi trường nuôi cấy đư ợ c phân loại theo phư ơ ng pháp chuẩn bị 3.3.5.1 Môi trường để sử dụng ngay (ready-to-use medium) Môi trường lỏng, đặc hoặc bán đặc được cung cấp trong các đĩa, chai lọ, ống nghiệm hoặc vật chứa khác, ở dạng để sử dụng ngay hoặc để sử dụng sau khi làm tan ch ả y hoặc đ ể sử dụng ngay sau khi làm tan chảy và bổ sung. 3.3.5.1.1 Môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh ( f inished culture medium) M ô i trường ở sẵn sàng để nuôi cấy. 3.3.5.1.2 Môi trường sử dụng ngay sau khi làm tan chảy lại (rea d y-to-use medium after remelting) Môi trường cần làm tan chảy lại, ví dụ để sử dụng trong kỹ thuật đ ổ đĩa hoặc đ ể rót vào các đĩa Pe tr i. 3.3.5.1.3 Môi trường sử dụng ngay sau khi làm tan ch ả y lại và bổ sung (ready-to-use medium after reme l t i ng and supplementing) Môi trường cần làm tan chảy lại, bổ sung và phân ph ố i trước khi sử dụng (trước đó môi trường chưa s ẵ n sàng để sử dụng). VÍ D Ụ : Thạch su lfit xy cl oserin tryptose (TSC), thạch Baird-Parter hoặc thạch Fibrinogen huyết tương thỏ (RPF). 3.3.5.2 Môi trường được chuẩn b ị từ các ch ế phẩm khô bán sẵn (medium prepared from commercially dehydrated f ormulations) Môi trường ở dạng khô yêu cầu bù nước và xử lý trước khi sử dụng, ở một trong hai dạng sau: - môi trường hoàn chỉnh; - môi trường không hoàn chỉnh cần bổ sung trước khi sử dụng . VÍ DỤ: Dạng bột, dạng hạt, sản phẩm đông khô. 3.3.5.3 Môi trường đ ượ c chuẩn b ị t ừ các thành phần riêng l ẻ (medium prepared from individual component) Môi trường được s ả n xuất bởi một phòng thử nghiệm vi sinh hoàn toàn từ các thành phần riêng l ẻ . 3.4 Thuật ngữ về vi sinh vật thử nghiệm 3.4.1 Sinh vật thử nghi ệ m (test organism) Vi sinh vật thư ờ ng được sử dụng để thử hiệu năng của môi trường nu ô i cấy. CHÚ THÍCH 1: Sinh vật thử nghiệm được xác đị nh ti ế p theo nguồn của chúng (xem 3.4.2 đến 3.4.7). 3.4.2 Chủng đ ối chứng ( reference strain) Vi sinh vật thu được trực tiếp từ một bộ sưu tập chủng đối chứng, từ bộ sưu tập ch ủ ng của Liên đoàn thế giới các Bảo tàng giống vi sinh vật (WFCC) hoặc T ổ chức Bảo tàng giống vi sinh vật châu Âu (ECCO) và được xác định í t nhất đến mức ch i và loài, được phân loại và mô tả theo đặc điểm của chúng và tốt nhất là có nguồn gốc từ thực phẩm, thức ăn chăn nuôi hoặc môi trường sản xuất thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi hoặc nư ớ c. 3.4.3 Gốc đối chứng (reference stock) Các gi ố ng riêng biệt giống hệt nhau thu được bằng c ấ y chuyền riêng rẽ từ chủng đối chứng trong phòng thử nghiệm hoặc có được từ một nhà cung cấp. 3.4.4 Giống gốc (stock culture) Cấy chuyền từ gốc đối chứng. 3.4.5 Gi ố ng làm vi ệ c (working culture) Cấy chuyền từ gốc đối chứng hoặc giống gốc hoặc ch ấ t đối chứng, đ ã được chứng nhận hoặc không. 3.4.6 Chất chuẩn (reference mate ri al) RM Vật liệu có chứa một lượng vi sinh vật có thể sống lại, đồng nhất và ổn định đối với số lượng vi sinh vật sống, đã được thiết lập là để phù hợp v ớ i mục đích sử dụng trong quá trình định lượng. CHÚ THÍCH 1: Xem T à i liệu tham kh ảo [3]. 3.4.7 Chất chuẩn đã đ ược chứng nhận (certified reference material) CRM Chất chuẩn được định rõ đặc đi ể m b ằ ng quy trình có hiệu lực về đo lường đ ể định lượng các vi sinh vật sống, đi kèm gi ấ y chứng nhận ghi rõ số lượn g quy định của các vi sinh vật sống, với độ không đảm bảo đo và liên kết chuẩn đo l ường. CHÚ THÍCH 1: Xem Tài liệu t ham k hả o [3 ] . 4 Quản lý đảm bảo chất lượng 4.1 Hệ thống tài liệu 4.1.1 Tài liệu từ nhà s ả n xu ấ t hoặc người sản xuất Nhà sản xuất (các tổ chức thương mại hoặc phi thương mại cung c ấ p môi trường cho bên thứ ba) cần có sẵn các tài liệu sau đây: - tên môi trường, các th ành phần riêng lẻ và các thành phần bổ sung bất k ỳ, nếu có và các m ã số sản phẩm; - b ả ng dữ liệu kỹ thuật, v í dụ: công thức, mục đích sử dụng, lượng đổ đầy, nếu có; - dữ liệu an toàn và/hoặc mối nguy khi c ầ n. - số m ẻ ; - pH đích của môi trường hoàn chỉnh; - thông tin b ả o qu ả n và hạn sử d ụ ng; - hạn sử dụng dự định; - giấy chứng nhận kiểm soát chất lượng, các vi sinh vật thử nghiệm được sử dụng và các kết quả phép thử hiệu năng theo các tiêu ch í chấp nhận. 4.1.2 Chấp nhận giao sản phẩm Đối với mỗi mẻ sản phẩm ( thành phần hoặc môi trường nuôi cấy), kiểm tra như sau: - nhận biết s ả n phẩm; - t í nh nguyên vẹn của bao gói; - hạn dùng của sản phẩm; - tài liệu được cung cấp. - số lượng đơn vị nhận được Ghi lại ngày nhận sản phẩm. 4.2 Bảo quản 4.2.1 Y ê u c ầ u chung Trong mọi trường hợp, ph ả i tuân thủ các hướng dẫn của nhà sản xuất. 4.2.2 Quản lý chất lượng và kiểm soát sản phẩm môi trường khô và các thành phần b ổ sung Môi trường dạng bột khô hoặc dạng hạt đựng trong vật chứa có nắp đậy k í n. Các chất b ổ sung chọn lọc khác nhau hoặc các chất ch ẩ n đoán được cung cấp ở trạng thái l ỏ ng, bột hoặc đông khô. Việc đặt mua môi trường c ầ n lập kế hoạch quay vòng định kỳ trong kho (nghĩa là vào trước-ra trước). Khi mở vật chứa mới cần: - kiểm tra niêm phong; - ghi ngày mở lần đầu tiên; - nh ì n để đánh giá lượng chứa trong hộp đ ã mở. Sau khi mở hộp chứa m ớ i, chất lượng của môi trường có thể phụ thuộc vào điều kiện bảo quản. Chất lượng môi trường khô bị gi ả m khi th ấ y có sự thay đổi đặc tính chảy của bột, tính đồng nhất, vón cục, đ ổ i màu v . v ... Môi trường khô đã hút ẩm hoặc thấy thay đổi nhiều về h ì nh thức bên ngoài th ì phải loại b ỏ . Khi m ở chai đựng môi trường khô, ghi lại ngày tháng và nêu rõ thời gian bảo quản t ố i đa. 4.3 Chuẩn bị môi trường trong phòng thử nghiệm 4.3.1 Yêu c ầ u chung Chuẩn b ị chính xác môi trường nuôi cấy là một trong các bước cơ bản để đ ả m bảo tính toàn d iện trong kiểm tra vi sinh vật và được chú ý đặc biệt. Chú ý v ề thực hành tốt phòng thử nghiệm và các hướng dẫn của nhà sản xuất liên quan đến xử lý môi trường kh ô và các thành phần khác, đặc biệt các thành phần có ch ứ a các vật liệu độc hại, nghĩa là muối mật, natri azid, chất kháng sinh hoặc các chất chọn lọc khác. Khi môi trường được chuẩn bị từ các chế phẩm khô có bán sẵn, thì tuân th ủ chính xác các hướng dẫn của nhà sản xuất. Ghi lại tất cả các dữ liệu liên quan, như khối lượng/thể tích, mã s ả n phẩm, số hiệu lô hàng, pH, ngày chuẩn bị, điều kiện khử trùng, người thực hiện. Đối với môi trường được chuẩn bị từ các thành phần riêng lẻ, thực hiện chính xác theo công thức. Ghi lại tất cả mọi chi tiết và nhận biết đầy đ ủ (nghĩa là mã sản phẩm, số hiệu lô hàng và hạn sử dụng, nếu có sẵn) của tất cả các thành phần được sử dụng. Phụ lục D nêu ví dụ về thông tin này. 4.3.2 Chất lượng của các thành phần môi trường cơ bản Công thức của các thành phần môi trường cơ bản được quy định trong các tiêu chu ẩ n cụ thể (xem Thư mục tài liệu tham khảo). Khi sẵn có, nêu r õ khối lượng phân tử và số CAS 1) của hóa chất trong công thức. Trong một số trường hợp, thành phần cụ thể (ví dụ nêu dưới đây) được quy định trong công thức cần được điều ch ỉ nh đ ể có được môi trường ổn định và ph ù hợp. - pepton và nước thịt hoặc chất chi ế t n ấ m men có thể thay đổi các đặc tính dinh dư ỡ ng của chúng; - thạch có thể thay đổi sức đông; - các chất đệm; - muối mật, chất chiết mật và deoxycolat, chất màu kháng khuẩn, phụ thuộc vào các đặc tính chọn lọc của chúng; - chất ch ỉ thị màu; - các chất kháng sinh, phụ thuộc vào hoạt tính và tương tác với các th à nh phần khác. CHÚ THÍCH: Ở quy mô công nghiệp, các nhà sản xuất thường đưa ra c ô ng thức đ ã được tối ưu hóa để đáp ứng các tiêu chí thực hiện. Th ô ng thường trước tiên l à chọn c á c thành phần, sau đó điều ch ỉ nh nồng độ giữa các sản phẩm để thu được cùng hiệu năng và giảm thiểu bi ế n động giữa các mẻ. 4.3.3 N ướ c Để ch uẩ n bị môi trường nuôi cấy, chỉ sử dụng nước tinh khiết như nước cất, đã khử khoáng, đã loại ion hoặc được sản xuất bằng thẩm thấu ngược hoặc nước có chất lượng tương đương không chứa các chất gây ứ c chế hoặc ả nh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật trong các điều kiện thử nghiệm, ví dụ: các vết clo, vết amoniac và các vết ion kim loại. Nước tinh khiết phải được bảo quản trong vật chứa có nắp đậy kín làm bằng vật liệu trơ (thủy tinh trung tính, polyetylen v.v...) không chứa các chất gây ức chế. Tuy nhiên, sử dụng nước mới được chung cất. Số lượng vi khuẩn không được vượt quá 10 3 đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu)/ml và tốt nh ấ t là dưới 10 2 cf u /ml. Sự nhiễm khuẩn cần được kiểm soát định kỳ theo ISO 6222 [4] , ủ ấm ở 22 °C ± 1 °C trong 68 h ± 4 h hoặc sử dụng phương pháp tương đư ơn g. CHÚ THÍCH : N ư ớc đã loại ion (đã khử khoáng) có thể c hứ a lượng vi si nh vật r ất cao, do đ ó , c hỉ sử dụng loại nư ớc n à y khi kiểm t ra hàm lượng vi sinh vật . Tham khảo tư v ấ n của nhà s ả n xu ất để t ì m biện pháp t ố t nhất nhằm giảm thiểu nhiễm khuẩn. Nước đã kh ử khoáng b ị nhiễm b ẩ n cao, thậm ch í đ ã khử t rùng bằng cách lọc, th ì vẫn có thể còn chứa các chất mà có thể gây ức ch ế sự phát triển của các vi sinh vật nhất định. Độ dẫn điện của nước được sử dụng trong p h òng thử nghiệm kh ô ng được lớn hơn 25 μS.cm -1 (tương đương với điện tr ở ≥ 0,04 MΩ.cm) và tốt nh ấ t là d ưới 5 μS .cm -1 [n ư ớc đạt ch ấ t lượng loại 3 quy định trong TCVN 4851 (ISO 3696) [ 5 ] ] ở 25 °C, tr ừ khi có quy định kh á c. Đ ộ dẫn điện của nước cần được kiểm tra trước khi sử dụng. 4.3.4 Cân và hoàn nư ớ c Tuân th ủ các c ả nh báo về an toàn, c â n c ẩ n thận một l ượ ng c ầ n thiết của môi trường khô hoặc các thành phần riêng l ẻ và khu ấ y trộn với một lượng nước cần thiết để tránh v ó n cục. Dùng cân chính xác có sai số tối đa cho phép nhỏ hơn hoặc bằng 1 % như trong TCVN 6404 (ISO 7218) và TCVN 9716 (ISO 8199). Các thành phần phải được cho vào một lượng nước quy định, trừ khi có quy định khác. 4.3.5 Hòa tan và phân tán Môi trường khô cần được phân tán nhanh bằng cách khu ấ y ngay và khuấy liên tục sau đó đun nóng để hòa tan, nếu cần. Môi trường chứa thạch cần được ng â m trong nước vài phút trước khi làm nóng, khuấy để h òa tan và sau đó phân phối vào vật c h ứ a , nếu c ầ n, trước khi hấp áp lực. Tránh để môi trường b ị quá nhiệt. 4.3.6 Đo và chỉnh pH Dùng máy đo pH để đo độ pH và chỉnh trước khi khử trùng, nếu cần, sao cho sau khi khử trùng và làm nguội đến 25 °C, môi trường có pH đạt yêu cầu ± 0,2 đơn vị pH, tr ừ khi có quy định khác. Thông thường sử dụng dung dịch natri hydroxit khoảng 40 g/l [ c (NaOH) = 1 mol/ l ] hoặc axit clohydric lo ã ng khoảng 36,5 g/l [ c (HCI) = 1 mol/l] để điều chỉnh pH. Việc điều ch ỉ n h n ày được thực hiện sau khi khử trùng, sử dụng dung dịch đ ã khử trùng. Việc chỉnh pH được nêu trong TCVN 6404 (ISO 7218) và TCVN 9716 (ISO 8199). CHÚ THÍCH : Môi trường có bán sẵn thường cho thấy thay đổi pH trước v à sau khi hấp á p lực khác nhau đáng kể. Tuy nhi ê n, nếu sử dụng nước c ấ t hoặc nước đ ã khử khoáng, th ì việc ch ỉ nh pH t r ư ớc khi hấp áp lực là kh ô ng cần thiết. 4.3.7 Phân phối Phân phối m ô i trường vào các vật chứa thích hợp, đảm bảo có khoảng trống phía trên để tránh quá sôi trong quá trình làm nguội sau khi xử lý nhiệt bằng hấp áp lực hoặc l àm tan chảy lại hoặc làm tràn sau khi th ê m các thành phần khác. CHÚ THÍCH: Khoảng trống này có thể không cần thiết nếu áp lực trong nồi hấp được duy trì trong suốt quá trình làm nguội. 4.3.8 Kh ử trùng 4.3.8.1 Y ê u cầu chung Kh ử trùng môi trường nuôi cấy đã chuẩn bị trong ngày sử dụng. Khử trùng môi trường nuôi cấy và thuốc thử bằng khử trùng ướt bằng nhiệt (4.3.7.2) hoặc bằng cách lọc (4.3.7.3). Một số môi trường nhất định không cần hấp áp lực nhưng có thể được sử dụng sau khi đun sôi. Ví dụ: môi trường Enterobacteriaceae chứa xanh br ili ant thường đặc biệt nhạy với nhiệt và ánh sáng và cần được làm nguội nhanh sau khi đun sôi và b ả o vệ tránh ánh sáng mạnh. Cũng tương tự, một số thuốc thử có thể được sử dụng mà không cần phải khử tr ù ng. Trong mọi trường hợp, xem tiêu chuẩn thích hợp cụ thể hoặc hướng dẫn của nhà sản xuất. 4.3.8.2 Khử trùng bằng nhiệt ẩm Việc khử trùng bằng nhiệt ẩm được thực hiện trong nồi hấp áp lực hoặc máy chuẩn bị môi trường. Đối với các vật chứa môi trường với thể tích lớn hơn 1 000 ml, chấp nhận chu kỳ khử trùng của nồi hấp áp lực để đảm bảo xử lý nhiệt đầy đủ. Trong mọi trường hợp, tuân thủ các h ư ớng dẫn nêu trong tiêu chu ẩ n cụ th ể hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất. CHÚ THÍCH : Việc qu á nhiệt cục bộ c ó th ể xuất hiện khi hấp áp lực môi trường với thể tích lớn (> 1 000 ml). Sau khi gia nhiệt cần làm nguội môi trường tránh để trào. Điều này đặc biệt quan trọng đối với môi trường có thể tích lớ n và đối với các môi trường có các thành phần nhạy cảm v ớ i nhiệt, ví dụ: môi trường chứa lục sáng. Thông tin bổ sung về khử trùng bằng nhiệt ẩ m được nêu trong TCVN 6404 (ISO 7218) [11]. Việc khử trùng bằng nhiệt cần được đánh giá sử dụng các giá trị F 0 , có tính đến việc xử lý nhiệt trong suốt quá trình gia nhiệt và làm nguội. Việc xử lý nhiệt cần được xác định cho từng mẻ cụ thể, để đảm bảo xử lý thích hợp các vật chứa ở bất kỳ v ị trí nào trong nồi hấp áp lực. 4.3.8.3 Khử trùng bằng cách lọc Khử trùng bằng cách lọc có thể được thực hiện trong các điều kiện chân không hoặc giảm áp suất. Sử dụng thiết bị và các màng lọc vô trùng có cỡ lỗ 0,2 μm. Khử trùng các bộ phận khác nhau của thiết b ị lọc theo TCVN 6404 (ISO 7218) hoặc TCVN 9716 (ISO 8199) hoặc sử dụng dụng cụ đã khử trùng trước. Một số màng lọc có thể giữ lại các protein hoặc các chất khác (như kháng sinh). Để thu được nồng độ đúng , ngư ờ i sử dụng cần chọn kiểu màng lọc thích hợp, ví dụ: màng li ê n kết protein th ấ p và bộ lọc đã đượ c l àm ướ t sơ bộ. 4.3.8.4 Chuẩn bị các chất bổ sung CẢNH B Á O - Các chất bổ sung có chứa các chất độc, đặc biệt là các chất kháng sinh, c ầ n đư ợ c xử lý cẩn thận đ ể tránh phân tán vào bột có th ể gây d ị ứng hoặc các phản ứng cho nhân viên phòng thử nghiệm. Thực h iệ n các bi ệ n pháp phòng ngừa thích h ợ p và tuân thủ các hướng dẫn của nhà s ả n x u ấ t kh i pha ch ế các dung dịch. Không sử dụng các chất bổ sung được pha chế đã hết hạn sử dụng, đối với các dung dịch làm việc của các chất kháng sinh chỉ sử dụng trong ngày chuẩn bị. Trong những tình huống nhất đ ị nh, các dung dịch kháng sinh có thể được bảo quản đông lạnh với các lượng thích hợp nhưng không c ấ p đông lại sau khi rã đông. Khả năng giảm hoạt tính do đông lạnh cần được nhà sản xuất thiết lập hoặc được người sử dụng kiểm tra. 4.4 Bảo quản và hạn sử dụng môi trường đã chuẩn bị 4.4.1 Môi trường sử dụng ngay có bán sẵn tr ên thị trường Tuân thủ các hướng dẫn của nhà sản xuất về các điều kiện bảo quản, hạn sử dụng và cách sử dụng. 4.4.2 M ô i trường đư ợ c chuẩn bị trong phòng thử nghiệm 4.4.2.1 Y ê u cầu chung Nh ậ n biết t ấ t cả các môi trường để đảm bảo truy xuất được nguồn gốc. Các môi trường có thời hạn sử dụng là khác nhau. Trong các tiêu chuẩn riêng sẽ quy định các điều kiện cụ thể và t hời hạn sử dụng của từng loại môi trường nhưng phòng thử nghiệm phải thẩm đ ị nh các đề u kiện đ ó . Phòng thử nghiệm phải quy định tần suất kiểm tra xác nhận. Bảo quản môi trường ở các điều kiện không làm thay đổi thành phần môi trường, tránh ánh sáng và tránh bị kh ô . Bảo quản ở 5 °C ± 3 °C, nếu không sử dụng ngay hoặc theo quy định khác trong tiêu chuẩn cụ th ể. Nếu được bảo quản lạnh, thì không nên bảo quản quá 2 tuần đến 4 tuần đối với đĩa và đối với các ống hoặc lọ nh ỏ thì không quá 3 tháng đến 6 tháng, trừ khi có quy định trong các tiêu chuẩn cụ thể hoặc các kết quả kiểm tra xác nhận thời hạn sử dụng của phòng thử nghiệm cho thấy lâu hơn. Thông tin bổ sung về thời hạn b ả o quản tối đa đối với môi trường pha chế sẵn được nêu trong TCVN 9716 (ISO 8199), Tài liệu tham kh ả o [17] và [21]. Khuyến cáo, môi trường được bổ sung các thành phần không ổn định thì cần được sử dụng trong ngày, trừ khi có quy định trong các tiêu chuẩn cụ thể hoặc các kết qu ả kiểm tra xác nhận thời hạn sử dụng của phòng thử nghiệm cho thấy l â u hơn (4.4.2.2). Môi trường đặc có chứa các chất không ổn định và/hoặc các chất hoạt hóa để tan chảy lại không nên b ả o qu ả n với lượ ng l ớ n. Trước khi sử dụng hoặc trước khi làm nóng tiếp, nên cân b ằn g nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến nhiệt độ môi trường xung quanh. 4.4.2.2 Đánh giá hạn sử dụng Hạn sử dụng đối với môi trường nuôi cấy đã được bảo qu ả n phải được thiết lập bằng cách kiểm tra môi trường sau khoảng thời gian bảo quản xác định về các đặc tính vật lý, hóa học và vi sinh vật theo quy định trong tiêu chuẩn này. Phòng thử nghiệm phải quy định t ầ n xu ấ t kiểm tra xác nhận. Kiểm tra sự thay đổi bất kỳ về màu sắc, dấu hiệu bay h ơ i/m ấ t nước, thay đổi pH hoặc hiệu suất hoặc t í nh chọn lọc và tính đặc hiệu khi có thể. Hạn sử dụng phải dựa vào thời gian bảo quản mà môi trường vẫn giữ được các tính năng quy định. CHÚ THÍCH: Việc kiểm tra này cũng thích hợp khi thử ki ể m tra các môi trường b á n s ẵ n. 4.4.2.3 Bảo quản môi trường trong đĩa Petri Sử dụng ngay môi trường đông đặc hoặc bảo quản trong các điều kiện không làm thành phần của môi trường bị biến đổ i và m ấ t nước, nghĩa là để ở n ơi tối v à / h oặc t rong t ủ l ạnh ở 5 °C ± 3 °C. Dán nh ã n trên đáy hoặc mặt bên của đĩa điền ngày tháng chuẩn bị và/hoặc hạn sử dụng và cách nhận biết. Cách khác, có thể sử dụng các hệ thống m ã hóa đáp ứng được các yêu cầu n à y. Hạn sử dụng của các đĩa thạch sẽ tăng lên nếu đ ược bảo quản trong các túi bằng chất dẻo hoặc cellophan hàn kín. Để giảm thi ể u ngưng tụ nước, thì cần làm mát các đĩa trước khi cho vào túi. Không làm khô bề mặt các đĩa thạch trước khi bảo quản lạnh. 4.5 Chuẩn bị để sử dụng 4.5.1 Làm tan chảy môi trường thạch nuôi cấy Làm tan chảy môi trường nuôi cấy bằng cách đặt trong nồi cách thủy hoặc b ằ ng cách khác cho kết quả tương tự [ví dụ: dòng hơi qua hấp áp l ực như quy định trong TCVN 6404 (ISO 7218) hoặc TCVN 9716 (ISO 8199)]. Môi trường trước đó đ ã được hấp áp lực cần được làm nóng lại trong một thời gian tối thiểu để duy trì chất lượng môi trường. Tránh quá nhiệt và khi đã tan chảy thì l ấ y môi trường ra. Để ở nhiệt độ ph ò ng trong khoảng thời gian ngắn, ví d ụ : 2 min, trước khi đặt vào nồi cách thủy để làm ngu ộ i, không l à m thủy tinh bị v ỡ . C ần nới lỏng nắp đậy trước khi gia nhiệt và vặn chặt trước khi đưa ra khỏi nguồn nhiệt. Làm nguội môi trường tan chảy duy trì từ 47 °C đến 50 °C trong nồi cách th ủy kiểm soát được nhiệt độ. Thời gian thực tế cần thiết để đạt được 47 °C đến 50 °C phụ thuộc vào loại môi trường, thể tích và s ố lượng đơn vị để trong n ồ i cách th ủy . Môi trường đã tan chảy thì sử dụng càng sớm càng tốt, nhưng không nên để quá 4 h. Trường hợp môi trường đặc biệt nhạy c ả m, thì thời gian giữ mô i trường tan chảy ph ả i ngắn hơn, theo quy định trong tiêu chuẩn cụ th ể liên quan. Môi trường tan chảy chưa sử dụng không được làm đông đặc lại để sử dụng cho lần sau. Thiết lập và ghi th à nh văn bản ch ế độ điều chỉnh thạch bằng cách cài đặt nhiệt kế trong môi trường thạch trong hộp ch ứ a riêng tương tự như được sử dụng cho môi trường thử nghiệm. Điều này phụ thuộc vào số lượng và kích thước vật chứa đặt vào nồi cách thủy. CH Ú TH Í CH: Môi trường được sử dụng trong phương pháp đ ổ đĩa, đ ược b ổ sung vào m ẫ u c ầ n được ch ỉ nh đến 44 °C đến 47 °C, hoặc theo quy định trong tiêu chuẩn l iê n quan. Sử dụng n ồ i cách thủy cài đặt ở 44 °C đến 47 °C. Thông tin b ổ sung v ề sử dụng và kiểm tra nồi cách thủy được nêu trong TCVN 6404 (ISO 7218). 4.5.2 Loại kh í m ô i trường nuôi cấy Để có hàm lượng chính xác không khí/oxy, nếu cần, ngay trước khi sử dụng, làm n ó ng môi trường trong nồi cách th ủy đun sôi hoặc dưới dòng hơi nước 15 min, nới lỏng nắp; sau khi làm nóng, vặn chặt nắp và làm nguội nhanh đến nhiệt độ làm việc. 4.5.3 Thêm chất bổ sung Các th à nh phầ n không bền nhiệt cần được bổ sung vào môi trường sau khi đã làm nguội đến dưới 50 °C. Nếu môi trường chứa thạch, để cho chất b ổ sung vô trùng cân bằng đến nhiệt độ phòng trước khi bổ sung vào môi trường thạch. Việc thêm các chất b ổ sung lạnh dạng lỏng có thể làm cho thạch đông lại hoặc tạo thành các l ớ p vảy trong suốt làm cho phân bố không đúng . Cần thực hiện theo đúng hướng dẫn của nhà sản xu ấ t. Nhẹ nhàng trộn kỹ t ấ t c ả các thành phần vào môi trường và phân phối vào các hộp chứa cuối cùng càng nhanh c à ng tốt. 4.5.4 Chuẩn bị môi trường đặc trong các đĩa Pe t ri Rót môi trường thạch nuôi cấy đã tan chảy vào các đĩa Petri sao cho thu được một lớp dày ít nhất là 3 mm (đối với các đĩa có đường k í nh 90 m m , 18 ml đến 20 ml thạch thường l à đủ) hoặc theo quy định trong tiêu chuẩn liên quan. Nếu các đĩa được bảo qu ả n hoặc nếu ủ ẩ m quá 72 h, hoặc nhiệt độ ủ trên 40 °C, th ì cần đến một lượng môi trường nuôi cấy lớn hơn. Để thạch nguội và đông đặc lại bằng cách đặt các đĩa cùng với nắp trên mặt phẳng nằm ngang, ở nơi mát. Các đĩa môi trường nuôi cấy đã chuẩn b ị sẵn để sử dụng ngay cần được bảo quản và sử dụng theo hướng dẫn của nh à sản x u ất. 4.5.5 Chuẩn bị môi trường đổ đĩa để nuôi cấy Để nuôi cấy bề mặt môi trường đặc, th ì cần làm khô nhanh các đĩa ngay trước khi sử dụng, cho đến khi không còn các giọt nước trên bề mặt môi trường. Không làm quá khô bề mặt thạch. Đ ể là m khô các đĩa, các điểm sau đây rất quan trọng; - Độ ẩ m của môi trường nuôi cấy là quan trọng v ì việc phát tri ể n tối ưu vi khuẩn phụ thuộc vào các điề u kiện ẩ m t rong và trên môi trường. Ví dụ việc thất thoát quá nhiều nước có thể dẫn đến tăng nồng độ các chất gâ y ức chế trong môi trường nuôi cấy chọn lọc và giảm hoạt độ nước trên bề mặt môi trường. - Khi vi k h u ẩ n được nuôi cấy không lan nhanh và các đĩa khô do thời tiết th ì không cần phải làm khô. Trong trường hợp này, có thể b ỏ qua quy trình sấ y vì chỉ làm tăng khả năng nhiễm b ẩ n và thất thoát nước không cần thiết. - Chọn nhiệt độ và thời gian làm khô sao cho môi trường càng ít b ị nhiễm bẩn càng tốt và việc gia nhiệt không ảnh hư ở ng đến chất lượng môi trường nuôi cấy. Thời gian làm khô phụ thuộc vào mức độ ngưng tụ nước trong đĩa Petri, nhưng phải càng ngắn càng tốt. - Để tránh nhiễm bẩn và nếu các đĩa không làm khô trong tủ sấy thì các đĩa phải được làm khô bằng cách úp ngược đ ĩa với b ề mặt môi trường nuôi cấy l ật úp. Trong thực tế, các đĩa có thể được làm khô bằng cách đặt đ ĩ a với b ề mặt thạch lật úp và mở nắp một nửa và để trong t ủ ở nhiệt độ từ 25 °C đến 50 °C. Làm khô các đĩa cho đến khi hết hẳn các giọt nước trên bề mặt n ắ p. Không làm khô thêm. Các đĩa thạch cũng có thể được làm khô với bề mặt thạch hư ớ ng lên trên đ ể trong t ủ cấy ( ở nh i ệt độ phòng) từ 30 min đến 60 min hoặc đậy nắp để qua đêm ở nhiệt độ phòng. 4.6 Ủ ấm môi trường đặc trong các đĩa Petri Trong quá trình ủ ấm, môi trường thạch sẽ mất nước. Trong một số trường hợp, điều này có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của các vi sinh vật. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự mất nước l à thành phần m ôi trường , lượn g môi trường trong đĩa, kiểu tủ ấm có quạt hoặc kiểu khác, độ ẩ m của không khí trong t ủ ấ m , vị trí và s ố lượng đĩa trong tủ ấm và nhiệt độ ủ. Có thể gi ả m thiểu việc mất nước bằng cách c h ồng sáu đĩa đ ặt vào túi ch ấ t dẻo m ở miệng phía trên (để tránh ngưng tụ nhiều nước). Cách khác, có thể làm tăng đ ộ ẩ m của không khí trong tủ ấm b ằ ng cách đặt hộp đựng nước ở phía dưới. Thường xuyên thay nước đ ể tránh nhiễm nấm m ố c. 4.7 Thải bỏ môi trường Thải bỏ môi trường bị nhiễm b ẩ n và không sử dụng theo cách an toàn và đáp ứng được các quy định hiện hành. 5 Vi sinh vật thử nghiệm để thử hiệu năng 5.1 Yêu cầu chung Các tiêu chuẩn mới hoặc đã được soát xét ph ả i quy định r õ phép thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy, bao gồm quy định về các chủng kiểm chứng và các tiêu chí chấp nhận, theo Phụ lục J. 5.2 Chọn vi sinh vật thử nghiệm Bộ vi sinh vật thử nghiệm cần c ó các vi sinh vật có các đặc tính ổn định đại diện cho các loài và có thể tin cậy đối vớ i việc thể hiện hiệu năng tối ưu của môi trường được phòng thử nghiệm chu ẩn bị cụ thể. Các vi sinh vật thử nghiệm gồm các chủng có sẵn trong các bộ sưu tập g iốn g đố i c hứ ng, nhưng cũng có thể bao gồm các chủng đặc trưng do phòng thử nghiệm phân lập. Các đặ c trưng nuôi c ấy liên quan của chủng gốc đối chứng cần được kiểm tra và được phòng thử nghi ệm ghi lại hoặc chọn ch ủ ng mới nếu xuất hiện các đặc trưng không đ iể n hình. Tốt nhất là sử dụng các ch ủ ng c ó nguồn g ố c từ thực phẩm hoặc từ nước cho dù không phải tất c ả các bộ sưu tập các ch ủ ng nuôi cấy đều cung cấp các dữ liệu đó về nguồn gốc xuất xứ của chúng. Các đặc trưng về giống của gốc đối chứng liên quan phải được phòng thử nghiệm kiểm tra và ghi lại. Nếu có sự biến đổi về ch ủ ng, thì nghiên cứu các kh ả năng ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy bằng cách thu thập cùng một môi trường từ các nhà sản xuất khác nhau và thu l ấ y các giống đối chứng bổ sung từ bộ sưu tập giống. LƯU Ý: Người sử dụng cần phản h ồ i thông t i n liên quan đến các biến đổi v ề chủng và hiệu năng. Các vi sinh vật thử nghiệm đối với mỗi môi trường có thể bao gồm: - các ch ủ ng dương tính mạnh với các đặc trưng điển h ì nh của vi sinh vật đích; - các chủng dương tính yếu; - các ch ủ ng âm tính không cho thấy các đặc tính mong đợi của vi sinh vật đích (các đặc trưng â m tính); - các chủng bị ức chế một phần hoặc hoàn toàn. Phụ lục E đưa ra các vi sinh vật thử nghiệm được sử dụng trong các tiêu chuẩn vi sinh vật trong thực phẩm và Phụ lục F đưa ra các vi sinh vật thử nghiệm được sử dụng trong các tiêu chuẩn vi sinh vật trong nước. CHÚ THÍCH : Một v à i hạn chế của quốc gia và một v à i hướng dẫ n yêu c ầ u sử dụng các typ huyết thanh khác với các typ huyết thanh quy định trong các Bảng này. Nêu rõ các y ê u cầu của quốc gia liên quan đến việc chọn các typ huyết thanh Salmonella . 5.3 Bảo quản và duy trì các vi sinh vật thử nghiệm 5.3.1 Yêu c ầ u chung Hiện nay có sẵn một vài phương pháp bảo quản và duy trì thành công t ấ t cả các vi sinh vật liên quan đến vi sinh vật trong thực phẩm và trong nư ớc , ví dụ: đông khô, bảo quản các hạt ở □ 70 °C, hoặc sử dụng nitơ lỏng. Một phương pháp có thể không thích hợp cho tất cả các chủng. Các phương pháp bổ sung để b ả o qu ả n các vi sinh vật nêu trong [14], [15], [ 36], [ 37] và [38]. Số lượng vi sinh vật thử nghiệm được cấy chuyền cần được lập thành văn bản đ ể ngăn ngừa cấy chuyền quá nhiều làm tăng nguy cơ biến đổi kiểu hình. Một lần cấy chuyền được xác định là chuyển từ giống vi sinh vật sống sang môi trường mới với sự phát triển của các vi sinh vật. Mọi kiểu cấy chuyền được coi là dạng cấy chuy ể n/chuyển sang. Thông tin bổ sung có trong [27], [28], [35], [38]. Xem sơ đồ trong B.1, B.2 và Phụ lục B về thông tin bổ sung để duy trì và chuẩn bị. 5.3.2 Vi s i nh vật thử nghiệm t ừ các ngu ồ n th ư ơng mại Nếu các vi sinh vật thử nghiệm thu được từ các bộ sưu tập chuẩn hoặc các nh à cung cấp được cấp chứng ch ỉ ISO 9001 [2] hoặc chứng nhận thích hợp khác và được giữ trong các hộp đựng gốc, thì ph ả i sử dụng và nuôi cấy theo hướng d ẫn của nhà sản xuất. Phòng thử nghiệm cần chắc chắn rằng chủng được cung cấp là ch ủ ng đối chứng hoặc gốc đối chứng và bao nhiêu lần cấy chuyền đã được thực hiện trước khi nhận và tài liệu về thông tin liên quan. Phòng thử nghiệm cần kiểm tra sự có mặt các đặc tính mong đợi. 5.3.3 Ch ủ ng gốc đối chứng được chuẩn bị trong phòng thử nghiệm Các giống gốc của các chủng đối chứng (xem Hình B.1) dùng cho các mục đích thử hiệu năng phải được duy trì và xử lý theo cách sao cho giảm thiểu khả năng nhiễm ch é o, biến đ ổ i hoặc thay đ ổ i các tính chất điển hình. Các gốc đối chứng cần được bảo quản với các lượng nhỏ, thường được duy trì ở nhiệt độ đông lạnh sâu (ví dụ, dưới - 70 °C) hoặc đông khô. Ở nhiệt độ cao hơn th ì thời gian sống có thể giảm và có sự biến đổi về di truyền. Các đặc trưng phát triển của chúng cần được lập thành văn bản đầy đ ủ cho từng môi trường mà trên/trong đó các chủng này được sử dụng làm sinh vật thử nghiệm. Các gốc đối chứng không được dùng để chuẩn bị các chủng đối chứng. 5.3.4 Giống g ố c Cấy giống g ố c thư ờ ng được chuẩn bị từ gốc đối chứng đông sâu hoặc đông khô (xem H ì nh B.2). Các lượng nhỏ phải được xử lý theo cách sao cho tránh được nhiễm b ẩ n ch é o gốc đối ch ứ ng và/hoặc suy giảm chất lượng của chúng. Các giống gốc c ầ n được chuẩn b ị bằng cách h òa lại một lượng gốc đối chứng trong hoặc trên môi trường phát triển không chọn lọc và ủ để tạo ra giống pha tĩnh. Xem 5.3.3 v ề các yêu cầu bảo qu ả n và hồ sơ lưu trữ. Đ ố i với các hệ th ố ng b ả o qu ả n có bán sẵn, cần tuân th ủ nghiêm ngặt các hướng dẫn của nhà s ả n xuất. Các giống gốc không được dùng để chuẩn b ị các chủng đối chứng hoặc gốc đối chứng. 5.3.5 Giống làm việc Các giống làm việc p hải được chuẩn bị từ giống gốc hoặc gốc đối chứng v à được sử dụng để chuẩn bị giống thử nghiệm. Các giống làm việc kh ông đượ c dùng để chuẩn bị các ch ủ ng đối chứng, gốc đối chứng hoặc giống gốc hoặc tạo ra giống làm việc tiếp theo. 5.4 Vi sinh vật để thử hiệu năng 5.4.1 Yêu c ầ u chung Các vi sinh vật thích hợp để thử hiệu năng thông thường được nêu trong các Phụ lục E và F. Các thể tích dịch cấy và s ố lư ợn g vi sinh vật được sử dụng, xem 5.4.2.4 và 5 .4 .2.5. Hướng dẫn dưới đ â y là một ví dụ về quy trình thích hợp để tạo ra dịch cấy tiêu chuẩn để kiểm soát chất lượng môi trường. Các q uy trình n à y được áp dụng trong trường hợp chung nhưng một s ố sinh vật có thể y ê u cầu các đ iề u kiện chuẩn bị đặc biệt, ví dụ: các sinh vật kị khí, ưa mặn, ưa th ẩ m thấu và các v i sinh vật có yê u cầu phát triển hoặc dinh dưỡng đặc biệt. 5.4.2 Chuẩn b ị 5.4.2.1 Chuẩn bị gi ố ng g ố c Khi yêu cầu cấy gốc đối chứng vào môi trường đặc, ví dụ thạch trypton đậu tương ( TSA) hoặc TSA máu, cấy s a o cho thu được các khuẩn lạc mọc đơn lẻ. Ủ trong các điều kiện thích hợp, v í d ụ: các vi khuẩn hiếu khí ở 37 °C trong khoảng t ừ 18 h đến 24 h. Kiểm tra giống gốc trên môi trường đ ặc về độ thuần khiết và sử dụng trong khoảng thời gian quy định (ví dụ: 14 ngày ở nhiệt độ thích hợp để tránh làm thay đổi đáng kể vi sinh vật). 5.4.2.2 Chuẩn bị giống làm việc Các giống làm việc phải được chuẩn bị từ gốc đối chứng (hoặc khi cần thì từ giống gốc) như giống pha tĩnh thuần k h iết trong môi trường canh thang không chọn lọc. Đối với nhiều vi khuẩn hiếu khí thường thu được b ằ ng cách ủ ấm 18 h đến 24 h. Giống làm việc có thể được chuẩn bị từ chất chuẩn thương mại RM hoặc CRM hoặc được chuẩn bị trong phòng thử nghiệm. Nồng độ của huyền phù được chuẩn bị phải ổ n định v à đồ ng nh ất t rong suốt quá trình sử dụng [7 ] , [ 10] , [11], [21], [29 ] và [30]. C ó th ể sử dụng các kỹ thuật khác nhau, nhưng ph ả i đảm bảo độ thuần của d ị ch cấy, cũng như sự chuẩn hóa để cho phép sử dụng về sau. Tùy thuộc vào kích thước khuẩn lạc, lấy một đến hai khu ẩ n lạc từ môi trường giống g ố c b ằ ng vòng cấy. Nên sử dụng v ò ng cấy 1 μl để tránh lấy quá nhiều dịch cấy. Chuy ể n dịch cấy lên môi trường lỏng không chọn lọc, ví dụ: canh thang trypton đậu tương (TSB) và trộn kỹ trên máy trộn vortex. Ủ ấm trong các điều kiện và thời gian thích hợp (ví dụ: đối với ph ầ n lớn các vi khuẩn hi ếu khí thường ủ ở 37 °C trong 18 h đến 24 h). Sử dụng gi ố ng làm việc này trong khoảng thời gian quy định (ví dụ: tối đa ba ngày ở nhiệt độ thích hợp để tránh làm thay đổi đ á ng kể vi sinh vật). Chuẩn bị và bảo quản các bào tử nấm và vi khuẩn dùng làm giống làm việc, xem [10], [11], [24], [25] và [30]. 5.4.2.3 Chuẩn bị các huyền phù (dịch cấy) để thử nghi ệ m Chuẩn bị các dãy dung dịch pha loãng trong các dịch pha loãng thích hợp (v í dụ: dung dịch Ringer nồng độ ¼, dung dịch m u ối pepton) và s ử dụng bước pha loãng thích hợp nhất đối với số lượng vi sinh vật mong muốn (cfu) trong một thể tích quy định. Dung dịch pha loãng thích hợp được sử dụng làm dịch cấy thử nghiệm cần được xác định từ các phép thử trư ớ c đó trong các điều kiện chuẩn hóa nghi ê m ngặt đối với tất cả các bước. Sử dụng các huyền phù (dịch cấy) trong thời gian quy định (v í dụ: đ ế n 2 h ở nhiệt độ phòng hoặc trong 24 h nếu được bảo qu ả n ở 5 °C ± 3 °C hoặc thời gian bảo quản lâu hơn nếu đã được đánh gi á hiệu lực [10] , [21]). Có th ể sử dụng dịch cấy đông lạnh nếu cho thấy vi sinh vật có thể sống trong th ờ i gian được chọn. 5.4.2.4 Th ể tích dịch cấy Thể tích dịch cấy đư ợ c sử dụng cho phép thử hiệu năng định lượng phải phản ánh được các dịch cấy sử dụng trong các điều kiện thử nghiệm đối với môi trường liên quan. Đối với d ịch pha loãng và môi trường lỏng được sử dụng cho phép thử định lượng, thì th ể tích dịch c ấ y phải có cùng t ỷ lệ với thể t í ch dịch cấy được sử dụng trong tiêu chuẩn liên quan, thường là 10 % môi trường cần thử. 5.4.2.5 M ức d ịc h cấy 5.4.2.5.1 Mức dịch cấy đ ể th ử hiệu suất 5.4.2.5.1.1 Phép thử định lượng Đối với phép thử định lượng, thì mức ở khoảng 10 2 cfu là cần thiết để đạt được độ chụm đầy đủ (xem Bảng 1). Phép thử này có thể cần sử dụng nhiều hơn một đĩa kép. Cần sử dụng dải thực t ế từ 80 cfu đến 120 cfu trên đĩa với số đếm t ố i thi ể u 50 cfu trên đĩa. Đối với các bộ lọc, số đếm cfu tương tự cần đến việc sử dụng một hoặc nhiều màng lọc. B ả ng 1 cho thấy mức tin cậy 95 % liên quan đến số đếm khuẩn lạc. Đối với các phép thử định lượng c ủ a dịch pha loãng và môi trường vận chuyển lỏng, thì mức d ịch cấy ở khoảng 10 3 đến 10 4 cfu là cần thiết để đạt được dịch cấy ở khoảng 100 cfu trong thể tích được dàn trên đĩa. Bảng 1 - Mức tin cậy 95 % đối với số lượng khuẩn lạc giả định thống nhất với phân bố Po i sson [21] , [26] Số lượng khuẩn lạc đếm đ ượ c Giới hạn độ chụm (chính x á c đ ế n ph ầ n trăm) % Gi ới hạn t i n cậy x ấ p x ỉ 95 % 500 ± 9 455 đến 545 400 ± 10 360 đến 440 320 ± 11 284 đến 356 200 ± 14 172 đến 228 100 ± 20 80 đến 120 80 ± 22 62 đến 98 50 ± 28 36 đến 64 30 ± 37 19 đến 41 20 ± 47 11 đến 29 16 ± 50 8 đ ế n 24 10 ± 60 4 đ ế n 16 6 ± 83 1 đ ế n 11 5.4.2.5.1.2 Phép thử định tính Thể tích được sử dụng cho phép thử c ầ n chứa: - 10 3 cfu đến 10 4 cfu cho các phép thử định tính môi trường đổ đĩa; - ≤ 100 cfu cho các phép thử hiệu suất của các môi trường tăng sinh và tăng sinh sơ bộ; - 10 4 cfu đến 1 0 6 cfu cho các ph é p thử định t í nh môi trường vận chuyển đặc. 5.4.2.5.2 Mức vi sinh vậ t trong dịch c ấ y đ ố i v ớ i phép thử tính chọn lọc Đối với các phép thử tính chọn lọc của m ô i trường nuôi cấy, nuôi cấy huyền phù vi sinh vật không phải đích có chứa t ừ 10 4 cfu đến 1 0 6 cfu l ê n đĩa thạch hoặc vào ố ng đựng m ô i trường. 5.4.2.5.3 Mức vi sinh vật trong dịch cấy đối với phép thử tính đặc hiệu Đối với các ph é p thử định tính của môi trường đổ đĩa, về tính đặc hiệu cần đến 10 3 cfu đến 10 4 cfu. 5.4.2.6 Ủ Ủ môi trường đã cấy theo các điều kiện quy định trong các tiêu chuẩn liên quan. Phụ lục E nêu các điều kiện ủ được sử dụng trong các tiêu chuẩn quy định đối với vi sinh vật trong thực phẩm và Phụ lục F nêu các điều kiện ủ được sử dụng trong các tiêu chuẩn quy định đối với vi sinh vật trong nước. Tránh th ấ t thoát nước trong môi trường thạch trong quá trình ủ , xem 4.6. Cần sử dụng thời gian ủ ngắn nhất trong tiêu chuẩn được dùng đối với vi sinh vật đích, trong khi thời gian ủ cho phép lâu nhất cần được sử dụng khi xác định t í nh chọn lọc [10]. 6 Kiểm soát chất lượng và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy 6.1 Yêu cầu chung Các điều sau đây mô tả các yêu cầu đối với tất cả các môi trường nuôi c ấ y. Các yêu cầu này có thể áp dụng cho mọi c ỡ mẻ môi trường nuôi cấy. Thực tế, các mẫu có thể chứa các vi sinh vật bị ức chế. Tính phù hợp của môi trường liên quan đến độ phục hồi của các t ế bào bị ức chế cầ n được tính đến [21] , [31], [32], [33]. Chất lượng của môi trường nuôi cấy phụ t h u ộc vào ch ấ t lượng của các thành phần cơ bản, công thức đúng, chất lượng của quy trình chuẩn bị, v iệ c loại trừ nhiễm khuẩn và c á c điều kiện bao gói và bảo qu ả n. Kiểm soát chất lượng môi trường nuôi cấy phải phù hợp với việc sử dụng của môi trường (ví dụ: định tính hoặc định lượng). Trước khi sử dụng, hiệu năng của từng mẻ môi trường nuôi cấy phải được thử nghiệm phân loại môi trường trong 6.4. Nếu không thể thực hiện phép thử trước khi sử dụng do tính không ổ n định của môi trường hoặc bổ sung, thì phải thực hiện phép thử hiệu n ă ng song song với việc thử nghiệm mẫu. 6.2 Kiểm soát chất lượng lý - hóa Môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh phải phù hợp về các tính chất lý-hóa như quy định trong ti ê u c h u ẩ n tương ứng. Ngoài ra, việc đánh giá chất lượng bằng ki ể m tra cảm quan phải đảm bảo từng môi trường nuôi cấy đều đáp ứng được các yêu cầu quy định, ví dụ: - lượng phân ph ố i và/hoặc độ d ày; - bề ngoài, màu sắc và tính đồng nh ấ t; - độ đông đặc; - độ ẩ m; Ngoài ra, phải xác định trị s ố pH. Các thành phần ri ê ng lẻ và mọi thành phần bổ sung chọn lọc hoặc thành phần dinh dưỡng ph ả i được đánh giá chất lượng bằng các quy trình thích hợp. 6.3 Kiểm soát chất lượng vi sinh vật 6.3.1 Yêu cầu chung Việc thực hiện các phép thử hiệu năng về vi sinh phải được tiến hành trên m ẫ u đại diện của m ẻ s ả n phẩm cuối cùng [6], [8 ] , [9 ] , [21]. 6.3.2 Môi trường đối chứng Đ ể có được độ tin cậy của các kết quả phép thử hiệu năng, thì ph ả i sử dụng môi trường đối chứng có chất lượng phù hợp cao. Các ví dụ cần được người sử dụng xem xét như sau: - sử dụng RM định lượng (xem 3.4.6) có chứa một lượng xác định các vi sinh vật khi đánh giá môi trường đối chứng; - sử dụng quá trình sản xuất xác định kể cả việc làm tan chảy, nếu có thể; - sử dụng cùng một cơ s ở sản xuất/nguồn gốc môi trường/các thành phần; - sử dụng một lượng lớn vi sinh vật khi thử kiểm tra (để bao trùm dải vi sinh vật cần tìm); - chọn “ môi trường đối chứng” cho mục đ í ch đánh giá; - các quy trình th í ch hợp để đảm bảo chất lượng khi sử dụng môi trường đối chứng. Có thể không cần thiết phải bao g ồ m t ấ t cả các nội dung trên khi đánh giá sự phù hợp của môi trường đối chứng. Phòng thử nghiệm phải tự chọn quy trình phù hợp cho m ì nh. Các vi sinh vật thử nghiệm phù hợp, phương pháp kiểm soát và các tiêu chí chấp nhận đối với môi trường đối chứng thạch trypton đậu tương (TSA) được nêu trong các Phụ lục E và F. Có thể sử dụng các môi trường đối chứng không chọn lọc khác nếu đáp ứng được các tiêu ch í trên. 6.3.3 Ki ể m tra mức độ nhiễm vi khuẩn (kiểm tr a độ vô trùng) Cần phải kiểm tra mức độ nhiễm vi khuẩn (độ vô trùng) của một lượng m ô i trường nuôi cấy thích hợp, tùy thuộc vào cỡ của mẻ b ằ ng cách ủ ấm ở các điều kiện thích hợp. Các m ẫ u thử nghiệm phải ít nhất là một đĩa hoặc một ống cho các mẻ nhỏ (< 100 đơn vị). Đối với các mẻ lớn hơn, người sản xuất phải l ấ y theo quy định, ví dụ: dựa vào các thành phần môi trường, thông số quá trình, các giới hạn và kiểu bao gói, sử dụng các giới hạn chất lượng được chấp nhận. Thông tin bổ sung được nêu trong TCVN 7790-1 (ISO 2859-1) [6] ngoài các tiêu chuẩn quốc gia kh á c và các nguồn khác [9], [21]. Các tiêu chí chấp nhận phải được thiết lập và điều chỉnh đối với từng môi trường. 6.4 Yêu cầu chung đối với phép thử hiệu năng vi sinh vật 6.4.1 Yêu cầu chung Để đánh giá mẻ môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh, thành phần dinh dưỡng hoặc các chất bổ sung, sự phát triển phải được đánh giá thích hợp bằng các phương pháp định tính hoặc định lượng nêu trong tiêu chuẩn này. Sử dụng thiết bị thích hợp và thực hiện kỹ thuật nuôi cấy nêu trong các tiêu chuẩn liên quan, nuôi cấy các môi trường nuôi cấy lỏng hoặc bán đặc với một lượng thích hợp (5.4.2.4) giống làm việc của mỗi vi sinh vật thử nghiệm xác định, xem Phụ lục E và Phụ lục F. Các ví dụ v ề phương pháp thử định tính và định lượng đối với môi trường nuôi cấy đặc và lỏng được nêu trong tiêu chuẩn này. Có thể chọn phương pháp bất kỳ khác và không phải sử dụng tất cả các phương pháp. Khi môi trường nuôi cấy được sử dụng để đếm vi sinh vật, phải th ự c hiện các phương pháp thử đ ị nh lượng. Khi cần đánh giá môi trường nuôi cấy mới hoặc nhà sản xu ấ t mới, nên thực hiện các phương pháp thử đ ị nh lượng để cung cấp thông tin bổ sung về sự thay đổi. Trong môi trường lỏng, các tương t á c d ẫ n đến sự phát triển các vi sinh vật rất phức tạp, do đó, các phương pháp thử hiệu năng cũng phức tạp hơn Đối với phép thử nghiệm các hỗn hợp môi trường đặc bằng các bộ lọc màng, sử dụng ISO 7704. Thông th ư ờng các kỹ thuật vi sinh là gi ả định và do đó, các phương pháp không đưa ra chi tiết cụ thể. Các vi sinh vật thử nghiệm thích hợp, các phương pháp kiểm soát và các tiêu chí chấp nhận được liệt kê tr ong Phụ lục E và Phụ lục F. Tần suất thử nghiệm phải d o người sử dụ ng đi ều chỉnh, có t í nh đến phạm vi chuẩn bị trong ph ò ng thử nghiệm của người sử dụng cuối cùng và mức đ ảm bảo ch ấ t lượng tại đó. 6.4.2 Môi trường sử dụng ngay Các nhà s ả n xu ấ t môi trường s ử d ụng ngay có bán s ẵ n trên thị trường, đặc biệt nếu đã được chứng nhận phù hợp với TCVN ISO 9001, ph ải có s ẵ n chương t r ình chất lượng và có thể k è m theo chứng c hỉ về chất lượng của môi trường mà họ cung cấp. Trong các điều kiện này, người sử dụng có thể không cần phải thử nghiệm thêm về môi trường đó nhưng cần đảm bảo rằng các điều kiện b ả o qu ả n được duy trì theo hướng d ẫ n của nh à sản xuất . Đối với môi trường hoàn chỉnh sử dụng ngay có ch ấ t bổ sung, chất lượng đã được nhà sản xuất kiểm soát phù hợp với tiêu chuẩn quy định, thì ít nhất nên có phép thử định tính. Người sử dụng phải chắc chắn rằng nhà sản xu ấ t các môi trường đ ể sử dụng ngay có bán sẵn trên thị trường đều có chương trình chất lượng đối với các sản phẩm này và các chứng chỉ kiểm soát chất lượng đáp ứng các yêu cầu của tiêu chuẩn này, th ỏ a mãn cá c k ế t qu ả d ự kiến và kết quả thu được. Phòng thử nghiệm sử dụng cũng phải kiểm tra các tài liệu bằng ch ứ ng để đảm bảo rằng các tiêu chí chấp nhận của nhà sản xuất về phép thử hiệu năng đáp ứng c ác yêu cầu nội bộ của phòng thử nghiệm. Phải định kỳ kiểm tra để chứng minh chất lượng của môi trường được duy trì trong quá trình vận chuyển. Cũng cần phải kiểm tra sau bảo quản và xử lý tiếp trong phòng thử nghiệm, ví dụ: sự tan chảy của môi trường. Điều ch ỉ nh tần xuất kiểm tra. Đối với môi trường không hoàn chỉnh cần được phòng thử nghiệm thêm các chất bổ sung (xem 3.3.5.1), thì kiểm tra việc bổ sung bằng các hồ sơ hoặc thực hiện các phép thử đ ị nh t í nh để đảm bảo rằng chất bổ sung được thêm đúng. 6.4.3 Môi trường đư ợ c chuẩn bị từ các công thức thành phần khô bán sẵn tr ê n thị trường Đối với môi trường đ ể đếm vi sinh vật, th ì phải thực hiện ph é p thử định lượng. Đối với các môi trường khác thì chỉ c ầ n phép thử định t í nh là đ ủ . Các phép thử định lượng cho độ đảm bảo chất lượng môi trường cao hơn. Đối với các môi trường không quy định trong Phụ lục E và Phụ lục F th ì việc kiểm soát chất lượng cần quy định theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Đối với các môi trường không chứa các chất ch ỉ thị hoặc các chất ch ọ n lọc, th ì sử dụng một s ố lư ợ ng hạn chế ch ủ ng thử nghiệm. Đối với các môi trường có chứa các chất chỉ thị hoặc chất chọn lọc, th ì sử dụng các ch ủ ng chỉ thị hoặc chọn lọc. Đối với môi trường phức hợp, nghĩa l à có chất b ổ sung th ì m ỗi mẻ c ầ n được kiểm tra với các ch ủ ng có các đặc trưng được liệt kê trong 5.2. 6.4.4 Môi trường được chuẩn bị từ các thành phần cơ b ả n ri ê n g rẽ Ngoài các yêu cầu nêu trong 6.4.3, th ì cần ti ế n hành phép thử định lượng để kiểm tra chiều hướng chất lượng của vật liệu cơ bản, hiệu su ấ t của môi trường và các quy trình chu ẩ n bị sản xuất trong phòng thử nghiệm. 6.5 Đánh giá hiệu năng và diễn giải các kết quả M ẻ môi trường nuôi cấy cho thấy đáp ứng nếu tất cả các vi sinh vật thử nghiệm được sử dụng thực hiện theo các quy định kỹ thuật. Môi trường được chấp nhận nếu cả tiêu chí chung lẫn các tiêu ch í chất lượng được đáp ứng. Nếu không đáp ứng yêu cầu về hiệu năng, xem Phụ lục H. 6.6 Môi trường khẳng định và thuốc thử 6.6.1 Môi trường khẳng định Hiệu năng của môi trường nuôi cấy được sử dụng cho các phép thử khẳng định phải được xác nhận trước khi sử dụng. Các vi sinh vật thử nghiệm âm t í nh và dương tính thích hợp phải được sử dụng để xác nhận theo cách tương tự trong các tiêu chuẩn cụ thể [9], [16]. 6.6.2 Thu ố c thử kh ẳ ng định Hiệu năng của các d u ng d ịch nhuộm Gram, các thuốc thử như Kovac, VP, nitrit, oxydase, catalase và các thuốc thử khác được sử dụng để chứng minh các đặc tính sinh hóa phải được kiểm tra xác nhận hiệu năng trước khi sử dụng. Các chủng âm tính, dương tính phải được sử dụng để đánh giá xác nhận và hạn sử dụng phải được thiết lập. C ần sử dụng các thuốc thử thuộc loại tinh khiết phân tích cho các phép thử khẳng định. N ế u sử dụng các loại thuốc thử thương mại, thì tuân thủ các hướng dẫn của nhà sản xuất về bảo qu ản và sử dụng [18], [ 19]. 7 Phương pháp thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy đặc 7.1 Yêu cầu chung Đ iề u này mô tả phép thử hiệu năng định tính và định lượng đối v ớ i môi trường nuôi cấy đặc được quy định trong các tiêu chuẩn cụ th ể áp dụng cho thực phẩm và nước. Đây là các phương pháp chung đối với hầu hết các môi trường nuôi cấy. Các phương pháp này có thể không thích h ợ p cho phép thử một s ố kiểu môi trường về độ thu hồi nấm mốc. Sơ đồ tóm tắt của phương pháp có trong Phụ lục C . 7.2 Phương pháp thử định lượng 7.2.1 Phương pháp thử định lượng - Các định nghĩa 7.2.1.1 Hiệu suất Hiệu suất phải đạt được gi ớ i hạn xác đ ị nh tối thiểu (xem tiêu chuẩn cụ thể li ê n quan hoặc các Phụ lục E và Phụ lục F). Xem Phụ lục G về sử dụng sơ đồ kiểm soát để thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy đặc bằng quy trình quy định dưới đây. Đối với các phương pháp định lượng, hệ số hiệu suất P R [21] được xác định theo Công thức (1): (1) Trong đó N s là số đếm khuẩn lạc tổng số thu được trên hoặc trong môi trường nuôi cấy c ầ n thử, nghĩa là số đếm khuẩn lạc trên các đĩa; N 0 là số đếm khuẩn lạc t ổ ng số thu được trên môi trường nuôi cấy đối chứng thu được từ một hoặc nhiều đĩa và phải ≥ 100 cfu, xem 5.4.2.5.1. Diễn g i ải các kết quả, xem 7.2.2.1.2. 7.2.1.2 Tính chọn lọc Môi trường nuôi cấy chọn lọc và môi trường đối chứng không chọn lọc được cấy cùng các vi sinh vật không phải đích ở các độ pha loãng khác nhau. Hệ số chọn lọc, S F [ 22 ] , được t í nh bằng Công thức (2): S F = D 0 - D s (2) Trong đó D 0 là độ pha loãng cao nh ấ t có vi sinh vật phát triển trên m ô i trường đối chứng không chọn lọc; D s là độ pha lo ã ng cao nhất có vi sinh vật p há t t riển tốt trên môi trường thử nghiệm chọn lọc; S F , D 0 và D s được biểu thị bằng đơn vị log 1 0 . CHÚ THÍCH: V í dụ , n ế u D 0 10 -4 = Iog 10 4 , 0 và D s 10 - 3 = l og 10 3,0 th ì hệ số ch ọ n lọc S F = 1 , 0. Diễn giải kết quả, xem 7.2.2.1.2. 7.2.2 Phương pháp thử định lượng đố i với môi trường nu ôi cấy đặc 7.2.2.1 Y ê u c ầ u chung Quy trình này cần sử dụng huyền phù vi k huẩ n đ ã được đị nh lượng (có thể là huyền phù mẫu th ử /vật liệu chuẩn định lượng đ ược) có nồng độ t hí ch hợp với ch ủ ng đích. Độ thu hồi của mẻ môi trường nu ô i cấy mới được so sánh với độ thu hồi của môi trường nuôi cấy không chọn lọc (m ô i trường đối chứng) hoặc trong các trường hợp đặc biệt, được so sánh v ớ i m ẻ đã được chấp nhận trước đ ó của thành phần môi trường tương tự. 7.2.2.1.1 Cách tiến hành a) Sử dụng các giống làm việc và dịch cấy có nồng độ thích hợp biết trước của ch ủ ng đích và chủng cấy không phải đích trong 5.3.2 hoặc RM thích h ợ p. b) Cần sử dụng một hoặc nhiều đĩa cho mỗi vi sinh vật. Số đếm được sử dụng phụ thuộc vào c ỡ của mẻ, độ tin cậy trong quy trình s ả n x u ất đả m b ả o chất lượng độ tin cậy và mức vi sinh vật trong huyền phù mẫu thử. c) Đảm bảo rằng bề mặt các đĩa là khô hoàn toàn, xem 4.5.5. d) Nuôi cấy bằng cách d àn dịch cấy trên môi trường hoặc bằng phương pháp lọc màng đ ể cho các số đếm nằm trong các giới hạn khuyến cáo nêu trong 5.4.2.5.1 đ ố i với phép thử định lượng. Phương pháp nhỏ giọt b ề mặt Miles-Misra cải bi ế n, các h ệ thống nh ỏ giọt khác hoặc đổ đ ĩ a xoắn cũng có thể được sử dụng đ ể c ó được các khuẩn lạc có thể đếm đư ợ c trên đ ĩ a. - Đối với các môi trường nuôi cấy thường được sử dụng để định lượng theo cách này thì ph ả i sử dụng phương pháp đổ đĩa. - Nuôi cấy môi trường đối chứng hoặc các đĩa từ các mẻ được chấp nhận trước đó theo cách tương tự. - Ủ ấm các đĩa với các điều kiện quy định trong các tiêu chuẩn cụ th ể . - Đếm các khu ẩ n lạc có mặt trên mỗi đĩa. Đ á nh giá kích thước và hình thái của các khuẩn lạc trên hoặc trong môi trường thử nghiệm bằng cách so sánh với độ thu hồi trên môi trường nuôi c ấ y k hông chọn lọc (môi trường đối chứng) hoặc m ẻ đã được chấp nhận trước đó của thành phần môi trường tương tự. 7.2.2.1.2 T í nh kết quả và diễn g iải kết quả Đối với phép thử định lượng, khoảng 100 cfu l à cần thiết để đ ả m b ả o độ chụm (xem Bảng 1). Có thể c ầ n phải sử dụng nhiều đĩa cho mỗi lần lặp lại. Các kết quả được chấp nhận c ó hiệu lực nếu đáp ứng các đ iề u kiện sau đây: - Mỗi lặp lại phải cho kết quả dương tính (có phát triển vi khuẩn đích); - Mỗi kết quả báo cáo riêng lẻ bao gồm trong d ả i phân tích chu ẩn (đến 100 khuẩn lạc đối với các phương pháp lọc và đến 150 khu ẩ n lạc đối với các phương pháp bề mặt). Diễn giải các kết quả, tính hệ số hiệu suất P R (xem 7.2.1.1) và khi thích hợp, hệ số chọn lọc, S F (xem 7.2.1.2). a) P R phải ≥ 0,50 để so sánh môi trường chọn lọc với môi trường đối chứng không chọn l ọc quy định trong Phụ lục E và Phụ lục F. P R phải ≥ 0,70 để so sánh m ô i trường không chọn lọc với môi trường đ ối chứng không chọn lọc hoặc như quy định trong Phụ lục E và Phụ l ục F. Điều này có thể áp dụng cho các trường hợp đặc biệt khi so sánh với mẻ trước đó. b) Nếu P R vượt quá 1,4 thì phải t ì m ra nguyên nhân. c) S F của các vi sinh vật không phải đích ít nhất phải bằng 2. Đối với các trường hợp đặc biệt, xem các Phụ lục S , F và I. Các tiêu chí này có thể không thích hợp cho các môi trường không được quy đ ị nh trong các Phụ lục E và F ví dụ như các tiêu chí này quy định trong các tiêu chuẩn cụ thể. 7.2.2.2 Sử dụng h ệ s ố thu h ồ i từ ch ấ t chuẩn Nguyên tắc này sử dụng các chất chuẩn RM, CRM hoặc các CRM nội bộ để cung cấp huyền phù vi khuẩn c ó chứa một lượng đ ơ n vị hình thành khuẩn lạc đích đã biết hoặc các ch ủ ng không mong mu ố n. Hệ số thu hồi từ mẻ mới của môi trường nuôi cấy có thể được so sánh với s ố lượng cfu dự kiến từ RM, CRM hoặc RM nội bộ. Có thể sử dụng chênh lệch tới hạn để tính giới hạn dung sai (xem TCVN 6910-6 (ISO 5725-6) [34 ] ). Xem Bảng 1. Đối với việc chuẩn bị và đánh giá các RM nội bộ, xem [21] và [29]. Chất lượng của RM phải được kiểm tra xác nhận trên môi trường đối chứng. 7.3 Thử nghiệm môi trường nuôi cấy sử dụng cho lọc màng Chất lượng của các bộ l ọ c màng được sử dụng phải được đánh giá trước đó để chứng minh tính phù hợp của chúng về việc sử dụng, xem ISO 7704. Để thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy sử dụng trong lọc màng, sử dụng giống làm việc và dịch cấy trong 5.4.2. Nuôi cấy môi trường huyền phù, ví dụ: chất lỏng pha loãng, nước vô trùng với mức dịch c ấ y thích hợp nêu trong 5.4.2.5. Lọc chất lỏng theo các yêu cầu của tiêu chuẩn cụ thể. Đặt màng lọc lên bề mặt thạch cần thử. Nuôi cấy một lượng đủ các màng/đĩa đ ể thu được khoảng 100 cfu cho thử nghiệm hiệu suất. Lặp lại với màng lọc mới và đặt màng thứ hai l ê n bề mặt môi trường đối chứng, sử dụng các độ pha loãng nếu cần cho phép thử t í nh chọn lọc. Nuôi ấm các đĩa theo tiêu chuẩn cụ thể. Lặp lại quy trình mỗi lần khi thay đổi mẻ màng lọc mới cũng như m ẻ môi trường mới. Nếu c ầ n, đánh giá ảnh hưởng của màng lọc đến kết qu ả sao cho dàn đều dịch cấy thử nghiệm l ê n môi trường thử nghiệm và môi trường đối chứng mà không có màng lọc. 7.4 Phương pháp thử định tính 7.4.1 Phương pháp cấy vạch định tính 7.4.1.1 Cách tiến hành Sử dụng các giống l à m việc và dịch cấy trong 5.4.2. Đối với các phép thử hiệu suất và tính đặc hiệu, sử dụng đĩa môi trường thử nghiệm và cấy vạch t ừ ng vi sinh vật thử nghiệm sao cho thu được các khuẩn lạc mọc riêng rẽ. Đối với các phép thử tính chọn lọc, sử dụng đĩa môi trường thử nghiệm và cấy vạch từng vi sinh vật thử nghiệm thành từng vạch thẳng sử dụng vòng cấy 1 μl lên b ề mặt môi trường thử nghiệm. Vài vi sinh vật thử nghiệm có thể được cấy vạch trên cùng một đĩa thành các đường song song không giao n hau, các vạch cần phân biệt rõ để cho phép quan sát h ì nh thái điển hình. Có thể sử dụng các phương ph á p cấy vạch đã chuẩn h ó a khác. Ủ ấ m các đĩa ở các điều kiện xác định trong các ti ê u chuẩn cụ thể. 7.4.1.2 Di ễ n giải các kết quả Đánh giá sự phát triển trên các đĩa thạch sau khi ủ như sau: - 0 tương ứng với không phát triển; - 1 tương ứng với phát tri ể n yếu; - 2 tương ứng với phát triển tốt; Các vi sinh vật đích phải bằng 2 và có v ẻ bề ngoài, kích thước v à h ì nh thái của khuẩn lạc đi ể n hình. Đối với các phép thử tính chọn lọc, mức độ ức chế phụ thuộc vào kiểu môi trường. Sự phát triển của các vi sinh vật không phải đích phải b ị ức ch ế toàn ph ầ n hoặc một p hầ n. 7.4.2 Xác đị nh t í nh đặc hiệu Định nghĩa về tính đặc hiệu được nêu trong 3.2.6. T í nh đ ặ c hiệu của m ô i trường nuôi cấy là ch ỉ thị về các đặc tính vật lý để phân biệt các vi sinh vật liên quan đến sự có mặt không có mặt và/hoặc cấp độ thể hiện các phản ứng sinh hóa và kích thước khuẩn lạc v à hình thái khuẩn lạc. Đối với các yêu cầu của giống làm việc và dịch cấy, xem 5.4.2. 7.4.3 Các phư ơn g pháp định tính khác đối với môi trường đặc Có thể sử dụng các phương pháp định tính khác [9], [21]. 8 Phương pháp thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy lỏng 8.1 Yêu cầu chung Điều này mô tả các phương pháp định tính và định lượng để thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy lỏng. Sơ đồ tóm tắt cho từng phương pháp được nêu trong Ph ụ l ục C . 8.2 Phương pháp định lượng trong ống nghiệm để thử hiệu năng của môi trường tăng sinh lỏng (phương pháp pha loãng để phân biệt) 8.2.1 Y ê u c ầ u chung Phương pháp n à y là phương pháp chung có thể được sử dụng đối với môi trường lỏng chọn lọc hoặc không chọn lọc. Phương pháp này cũng có thể thích hợp để thử hiệu năng của m ôi trường lỏng dùng để định lượng, ví dụ: trong các phương pháp đếm s ố có xác suất lớn nhất. 8.2.2 Chuẩn b ị dãy pha l o ãng - Chọn số ống đại diện, xem 6.3.1. - Chuẩn bị các dãy pha loãng thích hợp từ giống làm việc của vi sinh vật đích hoặc không phải đích trong các dịch pha loãng quy định trong TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và TCVN 9716 (ISO 8199) sao cho không có mặt các vi sinh vật trong dung dịch pha loãng nhất, ví dụ: từ 10 - 1 đến 10 - 10 . Thư ờ ng sử dụng các d ã y pha loãng thập phân, nhưng các độ pha loãng 1/5 ho ặ c 1/2 cũng thích h ợ p. - Sử dụng các dãy pha loãng trong khoảng thời gian quy định, xem 5.4.2.3. - Tại thời đi ể m sử dụng, chuyển một lượng đ ã biết, v í dụ: 0,1 ml mỗi dung dịch pha loãng sang bề mặt của đ ĩ a thạch môi trường không chọn lọc và d à n đều. - Ủ ấ m trong các điều kiện thích hợp đối với vi sinh vật li ê n quan. - Đếm số khu ẩ n lạc trên các đĩa thạch ở nồng độ pha loãng th ấ p nhất có chứa đến 150 khuẩn lạc và số khuẩn lạc có độ pha loãng cao hơn độ pha loãng n à y và ghi lại kết quả. 8.2.3 Quy trình thử nghiệm mô i trường lỏng - Chọn số lượng ống môi trường cần thử tương ứng với số ống trong dãy pha loãng. - Sử dụng các dung dịch pha loãng đã chuẩn bị theo 8.2.2 và bắt đầu với dung dịch pha loãng nhất, nuôi cấy một lượng đã biết của huyền phù vi sinh vật thử nghiệm, ví dụ: 0,1 ml vào ống môi trường tương ứ ng. - Ủ ấm các ống thử nghiệm trong các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn liên quan, xem 5.4.2.6. - Sau khi ủ ấ m, sử dụng vòng cấy riêng rẽ 10 μ l cho mỗi ống môi trường đã ủ ấm để c ấ y chuyền sang môi trường thạch không chọn lọc. - Ủ ấm các đĩa đã cấy ở các điều kiện thích h ợ p đối với vi sinh vật. - Sau khi ủ ấm, kiểm tra từng đĩa về sự phát triển hoặc không phát triển của vi sinh vật. CHÚ THÍCH: Đối với vi sinh vật đích, thư ờ ng sử dụng các dung dịch pha lo ã ng t ừ 10 - 5 đến 10 -8 . Đối với các vi sinh vật không phải đích, thường sử dụng các dung dịch pha lo ã ng từ 10 -1 đến 10 - 4 . 8.2.4 Tính và diễn giải k ế t quả Hiệu suất của môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc được đáp ứng nếu có phát triển tốt ( í t nhất 10 cfu từ vòng cấy đầy 10 μ l ) của vi sinh vật đích thu được từ dung dịch pha loãng tạo ra ít hơn 100 cfu (trong 0,1 ml) trên đĩa. Đối với môi trường lỏng chọn lọc, xác định hệ số chọn lọc S F , từ dung dịch pha loãng nhất của giống làm việc cho th ấ y phát triển tốt (ít nhất 10 cfu) trên đĩa thạch và dung dịch pha loãng nh ấ t của môi trường lỏng ch ọ n lọc cho th ấ y không phát triển (hoặc ít hơn 10 cfu) của vi sinh vật không ph ả i đích trên đĩa thạch không chọn lọc. Hệ số S F ít nhất phải bằng 2. CHÚ THÍCH: C á c phương pháp bổ sung cho phép thử đ ị nh lượng của môi trường lỏng dùng để đánh giá môi trường đang được nghiên cứu hoặc trong các nghiên cứu so s á nh được nêu trong Phụ lục I. 8.3 Phương pháp định tính trong ống nghiệm để thử hiệu năng của môi trường lỏng chọn lọc 8.3.1 Yêu cầu chung Phương pháp này sử dụng vi sinh vật đích, không phải đích hoặc hỗn hợp vi sinh vật đích và không phải đích trong cùng ống nghiệm. 8.3.2 Các h ti ế n hành - Chọn một lượng các ống, mỗi ống chứa 10 ml môi trường hoặc các phần 10 ml của mỗi m ẻ c ầ n thử nghiệm (xem 3.1 . 2 và 6.3.1). Tiế n hành tiếp theo mô tả sau đ â y theo các yêu cầu quy định trong các Phụ lục E và Phụ lục F. - Chuẩn bị dịch cấy: xem 5.4.2.3. - Nuôi cấy các vi sinh vật đích: Nuôi cấy một ống canh thang thử nghiệm bằng cách cho một lượng d ịch cấy chứa ≤ 100 cfu vi sinh vật đích rồi trộn. - Nuôi cấy các v i sinh vật không phải đích: Nuôi cấy một ống canh thang thử nghiệm của một vi sinh vật bằng cách cho một lượng dịch cấy chứa lượng vi sinh vật cao hơn (> 1000 cf u ) rồi trộn. - Nu ôi cấy các vi sinh vật đích và không phải đích trong cùng ố ng nghiệm khi yêu cầu trong Phụ lục E và Phụ lục F hoặc khi đánh giá môi trường mới hoặc đánh giá nhà sản xuất mới. Nuôi cấy một ống canh thang chứa ≤ 100 t ế bào vi sinh vật đích và một lượng lớn hơn các vi sinh vật không phải đích (> 1 000 tế b à o cho mỗi ống) trong cùng ố ng nghiệm và trộn. - Ủ ấ m các ống nghiệm ở các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn cụ thể, xem 5.4.2.6. - Lấy một vòng cấy (10 μ l ) từ ống nghiệm chứa vi sinh vật đích và cấy vạch lên đĩa môi trường không chọn lọc (v í dụ: TSA). - Nếu sử dụng h ỗ n hợp môi trường nuôi cấy vi sinh vật đích và kh ô ng phải đích th ì lấy một vòng cấy (10 μl) và cấy vạch lên đĩa môi trường xác định đối với vi sinh vật đích. - Lấy một vòng cấy (10 μ l ) từ giống vi sinh vật không phải đích và cấy vạch l ê n đĩa môi trường chọn lọc (v í dụ: XLD). - Ủ ấm các đ ĩa đã cấy ở các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn cụ thể. Nếu sử dụng thể tích môi trường l ớ n hơn thì người sử dụng có thể chọn cách để chỉnh tỷ lệ dịch cấy sao cho thu được các kết quả tương đương. 8.3.3 T í nh và diễn giải kết quả Hiệu suất của canh thang thử nghiệm lỏng là đáp ứng nếu có phát triển tốt (ít nhất 10 cfu hoặc đường cấy phát triển tốt) của vi sinh vật đích thu được trên môi trường đặc thù đ ố i với vi sinh vật đó. Tính chọn lọc của canh thang thử nghiệm được đáp ứng nếu kh ô ng c ó sự phát triển (hoặc ít hơn 10 cfu) của vi sinh vật không phải trên môi trường thạch không chọn lọc. 8.4 Phương pháp định tính trong ống nghiệm đơn (độ đục) để thử hiệu năng của môi trường lỏng 8.4.1 Yêu c ầ u chung Phương pháp này thích hợp đ ể thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy lỏng không chọn lọc và môi trường chọn lọc để thử khẳng định, ví dụ canh thang lactose mật lục sáng (BGBLB) [41]. Phương pháp n à y ch ỉ định tính và kết quả ch ỉ là chỉ thị. Môi trường đục chỉ có thể đư ợ c thử nghiệm bằng phương pháp này nếu được cấy chuyền sang môi trường đặc cho th ấ y có ph át triể n . Đối với các môi trường trong, đánh giá như sau: - 0 tương ứng với không đục; - 1 tương ứng với hơi đục; - 2 tương ứng với khá đục; 8.4.2 Cách tiến hành 8.4.2.1 Môi trường tăng sinh sơ bộ - Chọn một số ống, mỗi ống chứa 10 ml môi trường hoặc các phần 10 ml của mỗi mẻ cần thử nghiệm (xem 3.1.2 và 6.3.1). - Đối với phép thử hiệu năng của môi trường tăng sinh sơ bộ; ví dụ : nước đệ m pepton (BPW), nuôi cấy m ô i trường với một lượng d ịch cấy th í ch hợp (xem tiêu chuẩn cụ thể) có chứa ≤ 100 cfu trực tiếp vào môi trường thử nghiệm. - Chuẩn bị dịch cấy: xem 5.4.2.3. - Ủ ấm các ống trong các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn cụ thể, xem 5.4.2.6. - Ki ể m tra môi trường về sự phát triển. 8.4.2.2 M ô i trường khẳng định - Đối với phép thử hiệu năng của môi trường khẳng định dạng lỏng, nuôi cấy môi trường thử nghiệm với huyền phù giống làm việc (có chứa > 10 6 cfu/ml) sử dụng vòng cấy 1 μl. - Ủ ấm ống nghiệm ở các điều kiện quy định trong ti ê u chuẩn cụ thể, xem 5.4.2.6. - Nếu môi trường chưa nuôi cấy bị đục th ì cấy chuyền sang môi trường đặc, ủ ấm các đĩa ở các điều kiện quy định tr ong các tiêu chu ẩ n cụ thể và kiểm tra sự phát triển. 8.4.3 Tính và diễn giải kết quả Thực hiện đánh giá định tính trực quan b ằ ng cách quan sát độ đục (nghĩa là 2) cho thấy phát triển tốt, xem 8.4.1. Đánh giá định tính môi trường mờ đục là chỉ thị có sự phát triển trên môi trường đặc. CHÚ THÍCH 1: Đôi khi sự phát triển của vi sinh vật có thể quan sát được khi có ngưng kế t/l ắng ở đáy ống nghiệm hoặc chai. Trong trường hợp n à y, lắc c ẩ n t hận th ì có thể cải thiện việc đánh gi á và giải thích kết quả. CHÚ TH Í CH 2: Các đặc tính khác, như sinh kh í và đ ổ i m à u cũng có th ể đánh giá bằng phương pháp này. 9 Phương pháp thử hiệu năng của chất pha loãng và môi trường vận chuyển 9.1 Yêu cầu chung Các phép thử hiệu năng vi sinh vật phải được thực hiện trên mẫu đại diện cho mẻ sản phẩm cuối cùng, xem 6.3.1. 9.2 Phương pháp thử nghiệm dịch pha loãng 9.2.1 Phư ơn g pháp thử đ ị nh lượng dịch pha loãng 9.2.1.1 Yêu cầu chung Phương pháp xác định hiệu n ă ng của dịch pha loãng để duy trì sự sống của các vi sinh vật mà không có sự tăng hoặc giảm quá mức vi sinh vật trong suốt quá trình tiếp xúc trước khi đổ thạch lên đĩa hoặc nuôi cấy trong môi trường lỏng. 9.2.1.2 Cách tiến hành Nuôi cấy phần thử nghiệm (ví dụ 9 ml) dịch pha loãng với 1 ml huyền phù vi sinh vật ch ứ a khoảng 10 4 cfu/ml và trộn, để chuẩn bị dịch cấy, xem 5.4.2. Lấy ngay 0,1 ml dịch đã cấy và dàn đều trên bề mặt thạch không chọn lọc (môi trường đối chứng) như TSA ( t 0 ). Giữ dịch nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian quy định trong phần thích hợp của bộ TCVN 6507 (ISO 6887) hoặc TCVN 9716 (ISO 8199) tính từ thời điểm kết thúc chuẩn bị huyền phù ban đầu đến khi lấy dịch cấy ra cho tiếp xúc với môi trường nuôi cấy (thường là 45 min). Trộn và lấy ra một lượng tương tự (0,1 ml) và cấy đĩa lại trên môi trường đối chứng ( t 1 ). Ủ ấm môi trường đối chứng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, ví dụ: 30 ° C /72 h. 9.2.1.3 Đọc và diễn giải kết quả Sau khi ủ ấm, đếm các khu ẩ n lạc trên các đĩa t 0 và t 1 . Số lượng vi sinh vật, t 1 , sau khi ủ ấm dịch pha loãng đã cấy ph ả i trong phạm vi ± 30 % số đếm ban đầu ( t 0 ). 9.3 Phương pháp thử môi trường vận chuyển 9.3.1 Yêu cầu chung Phương pháp xác định h iệu năng của môi trường vận chuyển để duy trì sự sống của các vi sinh vật trong quá trình vận chuyển m à không làm tăng hoặc gi ả m mức vi sinh vật đã cấy. Nếu các hệ thống vận chuyển phù hợp với thi ế t bị l ấ y mẫu, th ì phải được sử dụng để cấy môi trường vận chuy ể n . Mặt khá c, việc nuôi cấy phải được thực hiện trong các điều kiện tương ứng với các điều kiện thực tế. Ủ ấm môi trường vận chuyển đã cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp theo thực tế hoặc nêu quy định trong tiêu chu ẩ n cụ thể [12], [13]. VÍ DỤ: Các hệ thống v ậ n chuy ể n để vận chuyển mẫu trong các điều kiện lạnh được thử nghiệm ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C đối với qu á tr ì nh v ậ n chuy ể n thông thường, ví dụ: 24 h trước kh i l ặ p lại đ ổ đĩa. 9.3.2 Ph ư ơng pháp thử định lượng môi trường vận chuyển lỏng 9.3.2.1 Cách tiến hành Nuôi cấy phần mẫu thử (ví dụ 10 ml) môi trường vận chuyển lỏng với một lượng vi sinh vật thử nghiệm thích hợp cần sử dụng. Sử dụng mức dịch c ấ y chứa khoảng 10 3 đến 10 4 tế bào cho mỗi ống 10 ml, để chuẩn bị d ị ch cấy, xem 5.4 . 2. L ấ y ngay 0,1 ml môi trường đã cấy và dàn đều trên bề mặt thạch không chọn lọc (môi trường đối chứng) như TSA ( t 0 ). Để nuôi cấy tro n g các hệ thống vận chuyển bằng các dụng cụ lấy mẫu, đặt d ụng cụ lấy mẫu trong một lượng dung dịch giống làm việc th í ch hợp (ví dụ 0,1 ml đối với tăm bông) (chứa khoảng 10 3 đến 1 0 4 tế bào) trong kho ả ng 10 s, sau đó nuôi cấy môi trường vận chuyển bằng dụng cụ lấy mẫu. L ấ y ngay 0,1 ml môi trường vận chuyển l ỏ ng đã cấy và dàn đều trên bề mặt thạch không chọn lọc (môi trường đối chứng) như TSA ( t 0 ). Ủ ấm môi trường vận chuyển đã cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp theo thực tế hoặc nêu trong tiêu chu ẩ n cụ thể, ví dụ: 25 °C/5 ngày đối với môi trường v ậ n chuyển và 30 °C/3 ngày đối với môi trường đối chứng, sau đ ó lặp lại việc đ ổ đĩa trên môi trường đối chứng ( t 1 ). 9.3.2.2 Đọc và diễn giải kết quả Sau khi ủ ấm, đếm các khuẩn lạc trên các đĩa t 0 và t 1 . Số lượng v i sinh vật, t 1 , sau khi ủ ấm môi trường vận chuyển phải trong phạm vi ± 30 % số đếm ban đầu ( t 0 ). 9.3.3 Phương pháp thử định tính môi trường vận chuy ể n rắn 9.3.3.1 Cách tiến hành Nuôi cấy phần mẫu thử (ví d ụ 10 ml) môi trường vận chuyển rắn với một l ượng vi sinh vật thử nghiệm thích hợp cần sử dụng. Sử dụng mức dịch cấy chứa khoảng 10 4 đến 1 0 6 , để chuẩn bị dịch cấy, xem 5.4.2 Để nuôi cấy các hệ th ố ng vận chuyển bằng các dụng cụ lấy mẫu, đặt dụng cụ lấy mẫu trong một lượng dung dịch giống làm việc th í ch hợp (ví dụ 100 μl đối với tăm bông) (chứa khoảng 10 4 đến 1 0 6 t ế bào) trong khoảng 10 s, sau đó nuôi cấy môi trường vận chuyển bằng dụng cụ lấy mẫu. Ủ ấm môi trường vận chuyển đã nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp theo thực tế hoặc nêu trong tiêu chuẩn qu y định cụ thể. C ấy chuyền lên môi trường thạch không chọn lọc (môi trường đối chứng), nh ư thạch TSA và ủ ấm theo thực tế hoặc nêu trong tiêu chuẩn cụ thể. 9.3.3.2 Đọc và giải thích kết qu ả Sau khi ủ ấ m, kiểm tra sự phát triển của khuẩn lạc trên thạch không chọn lọc. Phải quan sát thấy sự phát triển của các vi sinh vật sau khi ủ ấm. 10 Hệ thống tài liệu về các kết quả thử nghiệm 10.1 Thông tin từ nhà sản xuất Nhà sản xuất hoặc nhà cung cấp môi trường nuôi cấy phải cung cấp, khi có yêu cầu, v ề c á c đặc tính phát triển của vi sinh vật cụ thể và các thông tin chung liên quan đến mẻ môi trường nuôi cấy cụ thể. 10.2 Truy xuất nguồn gốc Tất cả các s ố liệu từ phép thử hiệu năng thông thư ờ ng cần được lập văn bản theo cách thích hợp và được giữ trong khoảng thời gian thích hợp theo hệ thống chất lượng được sử dụng . Cần sử dụng các biểu mẫu kiểm soát đối với tài liệu và biểu mẫu để đánh giá các kết quả thử nghiệm (xem Phụ lục D). Phụ lục A (Tham khảo) Tên gọi các thành phần môi trường nuôi cấy sử dụng trong phân tích vi sinh vật thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước A.1 Yêu cầu chung Các t ê n gọi sau đây đã được thống nhất để h à i hòa tên gọi của các thành phần khác nhau của môi trường nuôi cấy trong các tiêu chuẩn phương pháp phân tích vi sinh vật. A.2 Pepton - S ản phẩm thủy phân casein bằng enzym; CHÚ THÍCH 1: S ản phẩm này bao g ồ m c ả sản phẩm thủy phân casein bằng ch ấ t phân h ủ y tuyến tụy hoặc pepxin, sản phẩm thủy phân casein và trypton b ằ ng trypsin. - Sản phẩm thủy phân đậu tương hoặc bột đậu tương bằng enzym; - Sản phẩm thủy phân m ô động vật bằng enzym; CHÚ THÍCH 2: Sản phẩm này bao gồm cả pepton thịt, sản phẩm thủy phân thịt bằng pepxin, sản phẩm th ủ y phân thịt b ằ ng chất phân h ủ y tuyến tụy. - Sản phẩm thủy phân tim bằng enzym; - Sản phẩm thủy phân gelatin b ằ ng enzym; - Sản phẩm thủy phân mô động vật và thực vật bằng enzym; CHÚ THÍCH 3: Sản phẩm này bao gồm cả trypton. - Sản phẩm thủy phân casein b ằ ng axit. A.3 Các chất chiết và chất để pha - Chất chiết thịt và canh thang thịt; - Chất chiết tim-não và canh thang tim-não; - Chất chiết nấm men. A. 4 Thạch Thạch d ùng cho vi khuẩn. A. 5 Các loại khác - Nhũ tương l ò ng đ ỏ trứng; - Sữa bột gầy; - Huyết, huyết đã tách fi br i n hoặc huyết đã dung giải, bột máu, plasma, sợi huyết, haemin từ các động vật xác đ ị nh; - Mật bò dùng cho vi khuẩn; - Các muối mặt. CHÚ TH Í CH: Các loại này bao gồm các m uối mậ t số 3. Phụ lục B (Quy định) Chuẩn bị gốc đối chứng và giống làm việc B. 1 Chuẩn bị gốc đối chứng từ chủng đối chứng a Nh ì n chung, hoàn nguyên trong canh thang dinh dưỡng và cần thời gian để h ồ i phục. b Kiểm tra xác nhận h ì nh thái các khuẩn lạc và nhuộm Gram hoặc nh ậ n biết sử dụng phép thử sinh hóa c Ví d ụ môi trường b ả o vệ cryo, như TSB được bổ sung từ 10 % glyxerol đến 15 % glyxerol (thể tích). d Các ố ng cryo có thể chứa các hạt. e L à m đông lạnh ở nhiệt độ d ư ới - 70 ° C có thể kéo dài thời gian bảo quản. Nên hạn chế thời gian bảo quản ở nhiệt độ cao hơn [36]. f Có thể sử dụng trực tiếp giống làm việc. Hình B.1 - Sơ đ ồ chuẩn bị g ố c đối chứng từ chủng đ ố i chứng B. 2 Chuẩn bị giống làm việc từ ch ủ ng đối chứng a Kiểm tra các t à i liệu, kể c ả liên kết đến chủng đối chứng và các đặc tính liên quan, nếu gốc đối chứng thu được từ nguồn khác. b Quy trình này là th í ch hợp. c Quy trình này có thể cần thiết đối với một vài chủng, v í dụ: cho các phép định lượng. M ọ i giai đoạn phải được ghi lại. d Ví dụ: nuôi cấy trên thạch nghiêng TSA hoặc TSA huyết cừu hoặc môi trường thích hợp khác, ủ ấm 24 h và bảo quản ở nhiệt độ thích hợp (18 °C đến 25 °C hoặc 2 °C đến 8 °C tùy thuộc vào vi sinh vật) đến 4 tuần [36]. e Ví dụ môi trường bảo vệ cryo, như TSB được bổ sung từ 10 % glyxerol đến 15 % glyxerol ( th ể tích). Làm đông lạnh ở nhiệt độ dưới - 70 °C có thể kéo dài th ờ i gian bảo quản. N ê n hạn chế thời gian bảo qu ả n ở nhiệt độ cao h ơ n [36]. Hình B.2 - Sơ đồ chuẩn bị gi ố ng làm việc từ g ố c đối chứng Phụ lục C (Quy định) Sơ đồ của các phương pháp thử hiệu năng C.1 Yêu cầu chung Xem Điều 7. C.2 Phương pháp định lượng đối với môi trường đặc: hiệu suất và tính chọn lọc (xem 7.2.2 và Hình C.1). CHÚ DẪN P R Hệ số hiệu su ấ t. S F Hệ số chọn lọc. Hệ số hiệu su ấ t P R có thể được dùng để so sánh: a) môi trường không chọn lọc với môi trường đối chứng kh ô ng chọn lọc. b) môi trường chọn lọc với môi trường đ ố i chứng không chọn lọc. c) môi trường chọn l ọc với môi trường đối chứng chọn lọc. Đ ể ủ ấm (hộp thứ ba của Hình này), xem 5.4.2.6. Hình C.1 - Sơ đồ phép thử định lư ợng môi trường nuôi cấy đặc C.3 Phương pháp định lượng trong ống nghiệm để thử hiệu năng của môi trường tăng sinh lỏng (xem 8.2 và Hình C.2) CHÚ THÍCH: Để ủ ấ m (hộp thứ năm của h ì nh này), xem 5.4.2.6. Hình C.2 - Sơ đ ồ phép thử hiệu năng môi trường tăng sinh lỏng (phương pháp độ pha loãng giảm dần) C. 4 Phương pháp định tính trong ống nghiệm đ ơ n đối với môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc (với vi sinh vật đích, không phải đích, hoặc hỗn hợp của vi sinh vật đích và không phải đích trong cùng một ố ng) (xem 8.3 và Hình C.3) CHÚ THÍCH: Đ ể ủ ấ m (hộp thứ năm của mỗi cột trong hình này), xem 5.4.2.6. Hình C.3 - Sơ đ ồ của phư ơ ng pháp định tính trong ống nghiệm đơn đối với m ô i trường tăng sinh lỏng chọn l ọc C. 5 Phương pháp định tính trong ống nghiệm đơn đối với môi trường không chọn lọc và môi trường l ỏ ng chọn lọc: Độ đục (xem 8.4 và H ì nh C.4) Nhìn chung, cần kiểm tra các đặc tính phát triển vi khuẩn đối với từng môi trường lỏng, ví dụ: sinh khí, đổi màu, n ế u có thể. CHÚ THÍCH: Đ ể ủ ấ m (hộp thứ ba của hình này), xem 5.4.2.6. Hình C.4 - Sơ đồ thử định tính môi trường lỏng tr ong ống nghiệm đơn (độ đục) Phụ lục D (Tham khảo) Ví dụ về phiếu ghi các kết quả thử nghiệm môi trường nuôi cấy Bảng D.1 - Ví dụ về phiếu Phi ế u k iể m soát thử nghiệm chất lượng nộ i bộ của môi trường nuôi cấy Môi trường nu ô i cấy Lượng được chuẩn bị Ngày r ó t Số mẻ nội bộ M ô i trường khô (v à m ã số): Người cung cấp M ẻ Lượng: Ngày/chữ ký Chất b ổ sung Người cung cấp M ẻ Lượng: Ngày/chữ ký Chi ti ế t quy trình: Ki ể m soát chất lượng vật lý Vẻ bên ngoài dự kiến của môi trường nuôi cấy khô Màu b ì nh thư ờ ng, không bị chảy Chất lượng được kh ẳ ng định: Có Không: Các khuyết tật: Ngày/chữ ký Gi á trị pH dự kiến: pH đo được: Chất lượng được kh ẳ ng định: Có : Không: Các khuyết t ậ t: Ng à y/chữ ký Lượng điền đầy và/ho ặ c độ dày dự kiến Quan sát được: Chất lượng được kh ẳ ng định: Có : Không: Các khuyết tật: Ngày/chữ ký Màu sắc dự kiến Quan sát được: Chất lượng được kh ẳ ng định: Có : Không: Các khuyết tật: Ngày/chữ ký Độ nét/sự có mặt của các vật phát quang dự kiến Quan sát được: Chất lượng được kh ẳ ng định: Có : Không: Các khuyết tật: Ngày/chữ ký Đ ộ ổn định gel/độ đặc/độ ẩm Quan sát được: Chất lượng được kh ẳ ng định: Có : Không: Các khuyết tật: Ngày/chữ ký Nh iễ m khuẩn Số lượng đĩa hoặc ống được thử nghiệm: Ủ ấm: Kết quả Chất lượng được kh ẳ ng định: Có : Không: Số lượng đĩa hoặc ống bị nhiễm: Ngày/chữ ký Phát triển vi khuẩn - Hi ệ u suất Phương pháp ki ể m chứng: Định lượng: Định t í nh: Chủng Ủ ấm: Môi trường đối chứng: Tiêu chí: Kết quả: Chất lượng được kh ẳ ng định: Có : Không: Ngày/ch ữ ký Phát tri ể n v i khuẩn - Tính chọn lọc Phương pháp ki ể m soát: Đ ị nh lượng: Định t í nh: Chủng Ủ ấm: Môi trường đối chứng: Tiêu chí: Kết quả: Chất lượng được kh ẳ ng định: Có : Không: Ng à y/ch ữ ký Phát triển vi khuẩn - Tính đặc hiệu Phương pháp ki ể m chứng: Định lượng: Định t í nh: Chủng Ủ ấ m: Môi trường đối chứng: Tiêu chí: Kết quả: Chất lượng được kh ẳ ng định: Có : Không: Ngày/chữ k ý Đánh giá mẻ m ô i trường Chi tiết b ả o quản: Biên lai của m ẻ hàng: có: không: Ngày/chữ ký Phụ lục E (Quy định) Các vi sinh vật thử nghiệm và các tiêu chí hiệu năng đối với môi trường nuôi cấy khuẩn lạc được sử dụng cho vi sinh vật trong thực phẩm Phụ lục này cung cấp thông tin về môi trường nuôi cấy, các điều kiện nuôi cấy, các vi sinh vật thử nghiệm, s ố bộ sưu tập giống vi sinh vật thử nghiệm và các phản ứng dự kiến khi thực hiện thử nghiệm môi trường nuôi cấy. Các chủng đặc thù được chọn để thử nghiệm nhằm đ ả m bảo sự nhất quán giữa các phòng thử nghiệm và để chứng minh sự khác nhau giữa các môi trường (giữa các mẻ, giữa các nhà sản xuất). Các ch ủ ng này đã được đ á nh giá đầy đủ để đảm bảo sự phù hợp và thống nh ấ t về hiệu năng. Khi có nhiều hơn một ch ủ ng được liệt kê cho mỗ i lĩnh vực thử hiệu năng (hiệu suất, t í nh chọn lọc, t í nh đặc hiệu), th ì ít nhất các ch ủ ng được sử dụng phải được viết rõ bằng chữ b. Các nhà cung cấp môi trường thương mại hoặc phi thương mại dự kiến sử dụng các ch ủ ng bổ sung, ví dụ: các chủng nêu trong Bảng E.1 để đảm bảo thêm về chất lượng của môi trường nuôi cấy mà họ áp dụng. Bảng E.1 được thiết lập c ó tính đến các chủng kiểm soát được sử dụng trong Dược điển châu Âu (EP) và các khuyến ngh ị đối với môi trường nuôi cấy vi sinh vật trong thực phẩm từ Nhóm làm việc của Ủ y ban qu ố c tế về Vi sinh vật thực phẩm và Vệ sinh thực phẩm (ICFMH). Các tiêu chí này phải được đưa vào trong các tiêu chuẩn cụ thể khi được xây dựng và soát xét. Mẻ môi trường nuôi cấy đã được đánh giá xác nhận l à mẻ môi trường đáp ứng được hiệu năng, số lượng chủng được quy định trong Bảng E.1 là số lượng từ b ả ng kê của các bộ định danh chủng phổ biến do Trung tâm Dữ liệu Thế giới về Vi sinh vật (WDCM) cung c ấ p. [ 20 ] Bảng kê này có chứa chi tiết các chủng đối chứng được thể hiện bằng mỗi số WDCM và các chi tiết liên l ạc của các bộ sưu tập giống. T ấ t cả các môi trường trích dẫn được quy định trong các tiêu chuẩn quốc tế (ISO) và tiêu chuẩn quốc gia (TCVN). Nếu gặp ph ả i sự biến đổi về chủng thì nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (ví dụ: thu lấy cùng môi trường từ các nhà sản xuất khác nhau), thu lấy giống đối chứng b ổ sung từ bộ sưu tập giống g ố c. Người sử dụng phải phản h ồ i về sự biến đổi về chủng cho WG5 Môi trường nuôi cấy của ISO/TC34/SC9. Các chú thích được sử dụng trong Bảng E.1 như sau: a Tên gọi đầy đ ủ của các thuật ngữ môi trường viết tắt nêu trong B ả ng E.2. b Các chủng được sử dụng ít nhất; c Tham khảo đến b ả ng k ê chủng đối chứng có sẵn t rên http://www.wfcc.info v ề thông tin số lượng chủng của bộ sưu tập giống và các chi tiết liên lạc. d Chủng được chọn tự do, một trong các chủng được sử dụng ít nhất. e L: môi trường lỏng; S: môi trường đặc; SS: môi trường bán đặc f Phát triển/độ đục được phân loại như sau: 0 - kh ô ng phát t ri ển/kh ô ng đục; 1 - phát triển yếu/hơi đục và 2 - phát triển/có đục (xem 7.4.2.1, 8.4.1). g Esch e r i chia coli WDCM 00013 được nêu trong tiêu chuẩn cụ thể. h Escher i chia coli WDCM 00013 l à chất sản xuất ra β-d-gluconidase mạnh và WDCM 00202 chất sản xuất ra β-d-g l uconidase yếu. i Một số quy định và hạn chế của quốc gia về sử dụng typ huyết thanh khác. Xem các yêu cầu hiện hành về việc chọn typ huyết thanh Salmonella . j Trong trường hợp sử dụng phép thử định tính và định lượng đối với môi trường thì ch ỉ cần các kết quả định lượng (xem Bảng E.1). k Các chi tiết về kiểm soát chất lượng môi trường MSRV kể cả nồng độ cuối cùng của dịch cấy và các tiêu chí được nêu trong TCVN 4829 (ISO 6579). l Nếu môi trường dinh dưỡng được sử dụng ch o hai h oặc ba ứng d ụ ng khác nhau: ít nhất là thực hiện phép thử phát triển Salmonella (nếu phòng thử nghiệm thực hiện thử vi sinh vật này). m Nếu môi trường BPW được sử dụng cho hai hoặc ba ứng d ụng khác nhau: ít nh ấ t là thực hiện phép thử phát triển Salmonella (nếu phòng thử nghiệm thực hiện thử vi sinh vật này). n Chọn các chủng theo phương pháp sử dụng trong đó TSA được dùng làm môi trường đối chứng. Bảng E.1 - Các vi sinh vật thử nghi ệ m và các tiêu chí hiệu năng của môi trường nuôi cấy thường dùng trong vi sinh vật thực phẩm M ô i trường chọn lọc đ ể đếm v i sinh vật M ôi trường a Typ Vi sinh vật Tiêu chuẩn Chức năng Ủ Chủng đối chứng Số W DCM c M ô i trường đối chứng Ph ư ơng pháp kiểm chứng Chuẩn cứ Các phản ứng đ ặc trưng Thạch Listeria theo Ottaviani và Agosti S Lister i a monocytognes TCVN 7700-2 (ISO 11290-2) Hiệu suất (44 ± 4) h/ (37 ± 1)°C Li steria monocytogn e s 4b Li ster i a monocytognes 1/2a 00021 b 00109 TSA Định lượng P R ≥ 0 , 5 Khuẩn lạc màu xanh lục lam có qu ầ ng đục T í nh chọn lọc Escherich i a coli d Enterococus taecalis d 00012 hoặc 00013 00009 hoặc 00087 - Định t í nh Ứ c chế to à n phần (0) - Độ đ ặc hiệu Lister i a innocua 00017 - Định t í nh - Khuẩn lạc m à u xanh lục lam có qu ầ ng đục Baird -Parker S S taphylococ ci dương t í nh coagulase TCVN 4830-1 (ISO 6888-1) Hiệu s uất (24 ± 2) h đến (48 ± 2) h/ ( 37 ± 1) °C Staphylococus aur e us 00034 b 00032 TSA Định lượng P R > 0,5 Khuẩn lạc màu đen hoặc xám có quầng trong (phản ứng làm trong l ò ng đ ỏ tr ứ ng) T í nh chọn lọc (48 ± 2) h/ (37 ± 1)°C E. coli d 00012 00013 - Định t í nh Ứ c chế to à n phần (0) - Độ đặc hiệu ( 24 ± 2) h đ ế n (48 ± 2) h / ( 37 ± 1) °C Staphytococus sap ro phyticus Staphylococus epidermidis 00159 b 00036 - Định tính - Khuẩn lạc màu đen hoặc xám không có phản ứng l à m trong l ò ng đỏ trứng BGBLB L Coli f orm TCVN 4882 (ISO 4831) Hiệu suất (24 ± 2) h đ ế n ( 48 ± 2) h/ (30 ± 1)°C E. coli Cit ro bacter f reundii 00012 b 00013 00006 - Định tính Đục (2) f và c ó kh í trong ố ng Dur h am Có sinh kh í và có đục Độ đặc hiệu Enterococcus faecalis d 00009 00087 - Định t í nh Ức ch ế từng ph ầ n kh ô ng sinh kh í - CFC S Pseudomonas spp. TCVN 7138 (ISO 13720) Hiệu su ấ t (44 ± 4) h/ (25 ± 1) ° C Pseudomonas f uorescens Pseudomonas f ra g i 00115 b 001 16 TSA Đ ị nh lượng P R ≥ 0 , 5 - Tính chọn lọc E co li d 00012 00013 - Đ ị nh tí nh Ứ c chế to à n phần (0) - DG18 S Nấm men và nấm mốc TCVN 8275-2 (ISO 21527-2) Hiệu suất 5 ngày/ (25 ± 1) ° C Sacchammyces cerevisiae 00058 b SDA Định lượng P R ≥ 0,5 Khuẩn lạc/chồi đặc t rư ng theo từng loài Wallemi a sebi 00182 b Aspergillus restrict u s 00183 Eurotium rub ru m 00184 T í nh chọn lọc E. coli 00012 hoặc 00013 g - Định tính Kh ông phát triển - Bacillus subt il is subsp. spizizenii 00003 DRBC S Nấm men và n ấ m mốc TCVN 8275-1 (ISO 21527-1) Hiệu suất 5 ngày/ (25 ± 1) ° C Saccharomyces cerevisiae 00058 b SDA Đ ị nh lượng P R ≥ 0 , 5 Khuẩn lạc/chồ i đặc trưng th e o từng loài Asperg ill us bra siliensis 00053 b Candi d a albicans 00054 Mucor racemosus 00181 Tính chọn lọc E. coli 00012 hoặc 00013 g - Định tính Không phát triển - Bacillus subtilis subsp. sp i zizenii 00003 EC L E. coli TCVN 6846 (ISO 7251) Hiệu suất (24 ± 2) h đến (48 ± 2) h/ (44 ± 1)°C E. coli 00012 b 00013 - Định tính Độ đục (2) f và kh í trong ống Dur ham Có sinh kh í và có đục T í nh ch ọ n lọc Pseudomonas ae ru ginosa 00025 - Định tính Không phát triển - IS (“ TS”) S Vi khuẩn tạo sul f it TCVN 7902 (ISO 15213) Hiệu suất (24 ± 3) h đến (48 ± 2) h/ (37 ± 1)°C môi trường kị khí Closstr i dium per f ringens 0000 7 b 00080 TSA hoặc môi trường không ch ọ n lọc khác đối với vi khuẩn k ị kh í Định lượng P R ≥ 0,5 Khuẩn lạc m à u đen T í nh chọn lọc E. co li d 00012 00013 - Định tính - Khuẩn lạc không c ó màu đen LST L Coli f orm TCVN 4882 (ISO 4831) Hiệu su ấ t ( 24 ± 2) h đến ( 48 ± 2) h/ (30 ± 1)°C E col i Citrobacter f reundii 00012 b 00013 00006 - Định tính Độ đục (2) f và kh í trong ống Durham Có sinh khí và có đục Tính chọn lọc Ente ro coccus f aecalis d 00009 00087 - Định tính Kh ô ng phát triển - E. coli TCVN 6846 (ISO 7251) Hiệu suất (24 ± 2) h đ ế n (48 ± 2) h/ (37 ± 1)°C E. coli 00012 b 00013 - Định tính Độ đục (2) f và kh í trong ống Dur ham Có sinh khí và có đục Tính chọn lọc Ente ro coccus f aecalis d 00009 00087 - Định tính Không phát triển - mCCDA S Campylobacter TCVN 7715-2 (ISO 10272-2) Hiệu suất (44 ± 4) h / (41.5 ± 1) °C môi trường hiếu kh í C a mpylobacter jejun i d Campylobacter co li d 00156 00005 00004 Thạch máu Định lượng P R ≥ 0,5 Khuẩn lạc m à u xám nhạt, ph ẳ ng v à ẩm, đôi khi có ánh màu kim loại T í nh chọn l ọ c E. co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính - - Staphylococcus aur e us 00034 - Định tính - - MRS S Vi khuẩn sinh ax i t lactic TCVN 7906 (ISO 15214) Hiệu suất (72 ± 3) h/ (30 ± 1) °C Lactoba ci llus sakei 00015 b Mẻ môi trường MRS đã được đánh g i á Định lượng P R ≥ 0, 7 Khuẩn lạc đặc trưng theo từng loài Lactococcus lact i s 00016 b Pediococcus pentosaceus 00158 Tính chọn lọc E. col i d Ba ci llu s ce reu s 00012 ho ặc 00013 00001 - Định tính Ức ch ế to à n p hần (0) - MYP S Baclllus cereus TCVN 4902 (ISO 7932) Hiệu suất (24 ± 3) h đ ế n (44 ± 4) h/ (30 ± 1) °C Ba ci llu s ce reu s 00001 TSA Định lượng P R ≥ 0, 5 Khuẩn lạc màu hồng có quầng kết tủa Tính chọn lọc (44 ± 4) h/ (30 ± 1) °C E. co li d 00012 h o ặc 0001 3 - Đ ị nh t í nh Ức ch ế to à n p hần (0) - Độ đặc hiệu Ba ci llus subt i l i s su b sp. spi ziz eni i 00003 - Định tính - Khuẩn lạc màu vàng kh ô ng có quầng kết tủa RPFA S Staphylococci dương t í nh coagulase TCVN 4830-2 (ISO 6888-2) Hiệu suất (24 ± 2) h đến (48 ± 2) h/ (37 ± 1) °C Staphylococcus aureus 00034 b 00032 TAS Định l ư ợng P R ≥ 0,5 Khuẩn lạc màu đen hoặc xám c ó quầng mờ đục Tính chọn lọc (48 ± 2) h/ (37 ± 1) °C E.co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính Ức ch ế to à n p hần (0) - Độ đặc hiệu ( 24 ± 2) h đến ( 48 ± 2) h/ (37 ± 1)°C Staphylococ c us sap ro phyticus Staphytococcus epidermidis 00159 b 00036 - Định tính - Khuẩn lạc màu đen hoặc xám có qu ầ ng m ờ đục PPA S Pseudomonas spp. TCVN 8899 (ISO/TS 11059) Hiệu suất ( 48 ± 2) h/ ( 25 ± 1) °C Pseudomonas f luor e scens Pseu d omonas aeruginosa 00115 b 00025 TSA Định lượng P R ≥ 0,5 - Tính chọn lọc E. col i d 00012 hoặc 00013 - Định tính Ức ch ế to à n p hần (0) - TBX S E. co l i dương tính β-D-glucuronidase TCVN 7924-1 (ISO 16649-1) v à TCVN 7924-2 (ISO 16649-2) Hiệu suất (21 ± 3) h/ (44 ± 1) °C E.co li h 00012 d 00013 d 00202 b TSA Định lượng P R ≥ 0,5 Khuẩn lạc màu xanh lam Tính chọn lọc Enterococcus faecalis d 00009 00087 Định tính Ức ch ế to à n p hần (0) - Độ đặc hiệu Citrobacter f reundii Pseudomonas aeruginosa 00006 b 00025 Định tính - Khuẩn lạc m à u trắng đến xanh lục-xanh be TSC (SC) S Clostr id ium per fin gens TCVN 4991 (ISO 7937) Hiệu suất (21 ± 2) h/ (37 ± 1) °C môi trường k ị kh í Clostridium per f ingens 00007 00080 TSA hoặc môi trường không chọn lọc khác đối với vi khu ẩ n kị khí Định lượng P R ≥ 0,5 Khuẩn lạc màu đen Tính chọn lọc E. co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính Ức ch ế to à n p hần (0) - Pseudom o nas ae ru ginosa 00025 VRBG S Ente ro bacter i aceae TCVN 5518-2 (ISO 21528-2) Hiệu suấ t (24 ± 2) h/ (37 ± 1) °C E coli Salmonella Typhymuri u m d ,l Sa l monel l a En t er itidis d,l 00012 b 00013 00031 00030 TSA Định lượng P R ≥ 0,5 Khuẩn lạc màu h ồ ng đ ế n đ ỏ , có hoặc không c ó qu ầ ng kết t ủ a b ê n ngoài T í nh ch ọ n lọc Ente ro coccu s faec alis d 00009 00087 - Đ ị nh tính Ức ch ế to à n p hần (0) - VR B L S Coli f orm TCVN 6 848 (ISO 4832) Hiệu suất (24 ± 2) h/ (30 ± 1) °C E.col i 00012 b 00013 TSA Đị nh lượng P R ≥ 0,5 Khuẩn lạc màu đỏ t í a, c ó hoặc không có quầng kết tủa Tính chọn lọc Ente ro coccus faecal i s d 00009 00087 - Định tính Ức ch ế to à n p hần (0) - Độ đặc hiệu Pseudomonas aeruginosa 00025 Định tính - Khuẩn lạc không màu đến màu be M ôi trường không chọn lọc đ ể đếm vi sinh vật M ôi trường Typ V i sinh v ậ t T iêu chuẩn Chức năng Ủ Chủng đ ối chứng S ố W DCM c M ôi trường đ ố i chứng Ph ươ ng pháp kiểm ch ứng Chuẩn cứ Các phản ứng đặc trưng PCA MPCA S Đ ế m khuẩn lạc ISO 4833 Hiệu suất (72 ± 3) h/ (30 ± 1) °C Bacillus subtilis subsp. spizizenii E. coli S . aureus 00003 b 00012 b 00013 00034 TSA Định lượng P R ≥ 0, 7 - M ô i trường tăng s i nh chọn lọc M ôi trường Typ V i sinh v ậ t T iêu chuẩn Chức năng Ủ Chủng đ ối chứng S ố W DCM c M ôi trường đ ố i chứng Ph ươ ng pháp kiểm ch ứng Chuẩn cứ Các phản ứng đặc trưng Bolton L Campylobacter TCVN 771 5 -1 (ISO 10272-1) Hiệu suất (5 ± 1) h/ (37 ± 1) °C sau đó (44 ± 4) h/ (41,5 ± 1) °C môi trường hi ế u kh í Campylobacter j e j un i d Campylobacter co li + E . Col i d + Proteus mirabilis 000156 hoặc 00005 00004 00012 00013 00023 - Định tính >10 khuẩn lạc trên mCCDA Khuẩn lạc màu xám nhạ t , phẳng và ẩm đôi khi có ánh màu kim loại T í nh chọn lọc E. co li d Proteus mirabilis 00012 00013 00023 - Định t í nh Ức chế toàn phần ( 0 ) trên TSA - EE L En t erobacter i aceae TCVN 5518-1 (ISO 21528-1 ) Hiệu su ấ t (24 ± 2) h/ (37 ± 1) °C E . coli + Enterococcus f aecalis d 00012 b 00013 00009 hoặc 00087 - Định tính >10 khuẩn lạc trên VRBG Khuẩn lạc màu hồng đến đỏ có hoặc không có quầng kết t ủ a b ê n ngo à i Salmonella Typhimurium i Salmonella Enteritidis i + Enterococcus f aececalis d 00031 hoặc 00030 00009 hoặc 00087 Tính chọn lọc Enterococcus faececalis d 00009 hoặc 000 8 7 - Định tính Ứ c chế toàn phần (0) trên TSA - Fraser L Li ster i a monocytogenes TCVN 7700-1 (ISO 11290-1) Hiệu suất (48 ± 2) h/ (37 ± 1) °C Li ster i a monocytogenes 4b 00021 b - Đ ị nh tính >10 khuẩn lạc tr ê n thạch Listeria theo O t tavian i và Agos ti Khuẩn lạc màu xanh lục lam có quầng m à u đục + E. col i d 00012 hoặc 00013 + Ente ro cocc u s fa ec a li s d 00009 hoặc 00087 Listeria monocy t ogenes 1/2a 00109 + E . co li d 00012 hoặc 00013 + Enterococc u s fa e calis d 0000 9 hoặc 00087 Tính chọn lọc E.co li d 00012 h oặ c 00013 - Đị nh tí nh Ứ c ch ế to à n ph ầ n (0) tr ê n TSA - Enter o coccus faecalis d 00009 hoặc 00087 - Định tính < 100 khuẩn lạc tr ê n TSA - Giolitti Cantoni L S taphy l ococc i dương tính c oagulase TCVN 4830-3 (ISO 6888-3) Hiệu suất (24 ± 2) h đến (48 ± 2) h / (37 ± 1) °C S. aureus + E . co li d 00034 b 00012 hoặc 00013 - Định tính >10 khuẩn lạc t r ê n Baird Parker hoặc RPFA Khuẩn l ạc đặc trưng theo từng môi trường (xem TCVN 4830-1 (ISO 6888-1) đối với Baird Parker và TCVN 4830-2 (ISO 6888-2) đ ố i v ớ i RPFA) S. aureus + E . Colid 00032 0001 2 hoặc 00013 Tính chọn lọc (48 ± 2) h / (37 ± 1) °C E . co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính Ức ch ế to à n p hần (0) t rê n TSA - Half-Fraser L Listeria monocytogenes TCVN 7700-1 (ISO 11290-1) Hiệu su ấ t (24 ± 2) h / (30 ± 1) °C L . monocytogenes 4b 00021 b - Định tính >10 k huẩn lạc tr ê n Agar Listeria theo O ttaviani và Agosti Khuẩn lạc màu xanh lục lam có quầng màu đục + E . co li d 00012 hoặc 00013 + Ente ro coccus faecalis d 00009 hoặc 00087 L. monocytogenes 1/2a 00109 + E . co li d 00012 hoặc 00013 + Enterococcus f ae calis d 00009 hoặc 00087 Tính chọn lọc E . co li 00012 hoặc 00013 - Định tính Ứ c chế toàn phần (0) tr ê n TSA - + En t erococcus faecal is d 00009 hoặc 00087 - Định tính <100 khu ẩ n lạc trên TSA - ITC L Yersinia ente r ocolitica TCVN 8127 (ISO 10273) Hiệu suất (44 ± 4) h / (25 ± 1) °C Yersinia ente r ocolitica 00038 b - Định tính >10 khuẩn lạc tr ê n CIN hoặc SSDC Khuẩn l ạc đặc t rưng theo từng môi trường [xem TCVN 8127 (ISO 10273)] + E Co li d 00012 hoặc 00013 + Pseudomonas ae ru ginosa 00025 Tính chọn lọc Pseudomonas ae ru ginosa Proteus mirab il is 00025 00023 - Định tính Ứ c ch ế toàn ph ầ n (0) trên TSA - MKTTn L Salmonella TCVN 4829 (ISO 6579) Hiệu suất (24 ± 3) h / (37 ± 1) °C Salmonella Enteritidis d,i 00030 - Định tính >10 khuẩn I ạ c tr ê n XID hoặc môi trường chọn l ọ c khá c Khuẩn lạc đặc trưng t heo từng môi trường [xem TCVN 48 29 (ISO 6579)] Salmonella Typhimurium d,i 00031 + E. coli d 0 0012 hoặc 0001 3 + Pseudomona s aerug i nosa 00025 Tính chọn lọc E. co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính Ứ c chế t ừng phần < 100 khuẩn lạc trên TSA - Enterococcus faecalis d 00009 hoặc 00087 - Định tính < 10 khuẩn lạc trên TSA - MSRV k SS Salmonella TCVN 4829 (ISO 6579) Hiệu suất 2 x (24 ± 3) h / (41,5 ± 1) °C Salmonella Enteritidis d ,i Salmonel l a Typhimurium d , i 00030 00031 - Định tính Giọt mẫu được ủ có v ù ng bao quanh màu trắng xám, đục sau 24 h đế n 48 h vùng có màu đục sẽ trải rộng trên toàn đĩa Khả năng cao: khuẩn lạc đặc trưng sau khi nuôi cấy lại trên XLD k Tính chọn lọc E. co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính Có thể phát triển ở vị trí gi ọ t m ẫ u được ủ , không có vùng bị đục - Enterococcus faecal i s d 00009 hoặc 00087 - Định tính Không phát triển - MMG L E. coli dương tính β-D-glucuronidase TCVN 7924-3 (ISO 16649-3) Hiệu suất ( 24 ± 3) h / (37 ± 1) °C E. coli 00012 b 00013 - Định tính Sinh axit Khuẩn lạc thay đổi thành m à u vàng Tính chọn lọc Enterococcus faeca l is d 00009 hoặc 00087 - Đ ị nh t ị nh Không phát triển - PSB L Yersinia enteroco l it i ca TCVN 8 127 (ISO 10273) Hiệu su ấ t 3 ngày đế n 5 ngày (24 ± 3) h/ (25 ± 1) ° C Yersinia enterocolit i ca 0003 8 b - Định tính > 10 huẩn lạc trên CIN hoặc SSDC Khuẩn lạc đặc trưng theo từng môi trường [xem TCVN 8127 (ISO 10273)] + E.C oli d 00012 hoặc 00013 + Pseudomonas aeruginosa 00025 Yersinia enteroco li t i ca 00160 + E.Co li d 00012 hoặc 00013 + Pseudomonas aeruginosa 00025 Tính chọn lọc Pseudomonas aeruginosa Prot e us mirab ili s 00025 00023 - Định tính Ứ c chế toàn phần (0) trên TS A - RVS L Salmonella TCVN 4829 (ISO 6579) Hiệu suất ( 24 ± 3) h/ (41,5 ± 1) °C Salmone ll a En r eritidis d ,i 00030 - Định tính > 10 khuẩn lạc tr ê n XLD hoặc môi trường chọn lọc khác Khuẩn lạc đặc t rưn g theo từng môi trường [xem TCVN 4829 (ISO 6579)] Salmone l la Typhimurium d,i 00031 + E . co li d 00012 hoặc 00013 + Pseudomonas aeruginosa 00025 Tính chọn lọc E. co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính Ứ c chế từng phần < 100 khuẩn lạc trên TSA - Ente ro coccus faecalis d 00009 h oặc 00087 - Định tính > 10 khuẩn lạc trên TSA - TSP B L Baci ll us cereus TCVN 7903 (ISO 21871) Hiệu suất (48 ± 4) h/ (30 ± 1) °C Ba cil lus cereus 00001 - Định tính > 10 khuẩn lạc trên FEMBA hoặc MYP Khuẩn lạc đặc trưng theo từng môi trường [xem TCVN 7903 (ISO 21871)] T í nh chọn lọc E. co li d 00012 hoặc 00013 - Đ ị nh t í nh Ứ c chế toàn phần (0) trên TSA - Môi trường lỏng không chọn lọc Môi trường a Typ e Vi sinh vật Tiêu chuẩn Chức năng Ủ Ch ủ ng đ ố i chứng Số WDCM c Môi trường đố i chứng Phư ơn g pháp kiểm soát Chuẩn cứ Các phản ứng đặc trưng BHI L S taphy l ococci dương tính coagulase T CVN 4830-1 (ISO 6888-1) T CVN 4830- 2 (I SO 688 8 -2) Hiệu suất (24 ± 2) h / (37 ± 1) °C Staphylococcus aureus 00034 - Định tính Độ đục (1-2) f - Brucella L Campylobacter TCVN 7715 ( ISO 10272) (tất cả các phần) Hiệu suất 2 ngày đ ế n 5 ngày/ (41,5 ± 1) °C môi trường hiếu k h í Campylobacter jejun i d 000156 hoặc 00005 - Định tính Độ đục (1-2) f - Campylobacter col i d 00004 Pha loãng với mục đ ích đặc biệt, v í dụ BPW có bromo-cresol- purpre L Chất lỏng pha loãng TCVN 6507 (ISO 6887) (t ấ t c ả các phần) Pha loãng 45 min - 1 h/ 20 °C đến 25 °C E col i d Staphylococcus aureus 00012 hoặc 00013 00034 b TSA Định lượng ± 30% khuẩn lạc/T 0 (± 30 % s ố đếm) - Ringer dài một ph ầ n tư Dung dịch Pepton Muối pepton Dung dịch đệm phosphat L Chất lỏng pha loãng TCVN 6507 (ISO 6887) (t ấ t cả các phần) Pha loãng 45 min - 1 h/ 20 °C đến E. co li d Staphylococcus aureus 00012 hoặc 00013 00034 b TSA Định lượng ± 30% khuẩn lạc/ T 0 (± 30 % số đ ế m gốc) - Thioglyco ll at L Clostridium perfringens TCVN 4991 (ISO 7937) Hiệu suất ( 21 ± 3) h / (37 ± 1) °C Clostridium pe rf r i ngens 00007 - Định tính Độ đục (1-2 ) f - TSYEB L Listeria monocytogenes TCVN 7700-1 (ISO 11290) (tất cả các phần) Hiệu suất (21 ± 3) h/ (25 ± 1) °C Listeria monocytogenes 4b Listeria monocytog e nes 1/2a 00021 b 00109 - Định tính Độ đục (1-2 ) f - M ô i trường phân lập chọn lọc Môi trường a Typ e Vi sinh vật Tiêu chuẩn Chức năng Ủ Ch ủ ng đ ố i chứng Số WDCM c Môi trường đố i chứng Phư ơn g pháp kiểm chứng Chuẩn cứ Các phản ứng đặc trưng Thạch Listeria theo O ttaviani và Agosti i S Listeria monocytogenes TCVN 7700 (ISO 11290) Hiệu suất (44 ± 4) h / (37 ± 1) °C Listeria monocytogenes 4b 00021 b - Định tính Ph á t triển tốt Khu ẩn lạc xanh lục lam có quầng đụ c Listeria monocytogenes 1/2a 00109 Tính chọn lọc Escheric h ia col i d Enterococus faecal i s d 00012 hoặc 00013 00009 h oặ c 00087 - Đ ị nh tính Ứ c chế toàn phần (0) - Độ đặc hiệu Listeria i nnocua 000 17 - Định tí nh Phát triển tốt Khuẩn lạc xanh lục lam không có quầng đục mCCDA j S Campylobacter TCVN 7715 ( ISO 10272) ( tấ t cả các phần) Hiệu suất ( 44 ± 4) h / (41,5 ± 1 ) °C m ôi trường hiếu k h í Campylobacter j e j un i d Campylobacter co li 000156 00005 00004 - Đ ị nh tính >10 khuẩn lạc tr ê n mCCDA Khuẩn lạc màu xám nhạt, phẳng và ẩ m đôi khi có ánh màu kim loại Tính chọn lọc E. co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính Ứ c chế to à n phần hoặc từng phần (0-1) Khuẩn lạc không đặc trưng Staphylococcus aureus 00034 - Định tính Ức chế toàn phần (0) - CT-SMAC S Escherichia coli O 157 TCVN 7686 (ISO 16654) Hiệu suất (21 ± 3) h / (37 ± 1) °C E coli O 157:H7 00014 (chu ỗ i không sinh độc tố) - Định tính Phát triển tốt (2) Khuẩn lạc t r ong suốt, dạng đĩa màu nâu vàng và đ ư ờng k í nh ~ 1 mm Tính chọn lọc Staphylococcus aureus d 00032 hoặc 00034 - Định tính Ứ c chế toàn phần (0) - E. co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính Ứ c chế từng phần (0) Một s ố khuẩn lạc màu hồng phát tr iển CIN SSDC S Yersinia ent e rocolitica TCVN 8127 (ISO 10273) Hiệu suất (21 ± 3) h / (30 ± 1) °C Yersinia ent e rocolitica 00038 b 00160 - Định tính Phát triển t ốt (2) Khu ẩ n lạc đặc trưng theo từng môi trường [xem TCVN 8127 (ISO 10273)] Tính chọn lọc E.co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính Ứ c chế t o à n phần hoặc từng phần (0- 1 ) Khuẩn lạc không đặc trưng Staphylococcus aureus d 00034 - Định tính Ứ c chế toàn phần (0) - CPC mCPC S Vibr i o spp. ngoại trừ Vibrio parahaemolyticus/ V. cholerae TCVN 7905-2 ( ISO/TS 21872-2) Hiệu suất (24 ± 3) h / (37 ± 1) °C Vibrio vulni f icus 0018 7 b - Định tính Ph á t triển tốt (2) Khu ẩ n lạc màu vàng được bao quanh do nhuộm màu vàng môi trường Vibr i o chole ra e non- 01/non-0139 00203 b - Định tính Ph á t triển tố t (2) Khuẩn lạc đỏ tía đ ượ c bao quanh do nhuộm m à u đ ỏ t í a môi trường Tính chọn lọc E.co li d 00012 hoặc 00013 hoặc 00090 - Định tính Ứ c chế toàn phần (0) - MYP j S Bacillus cereus TCVN 7903 (ISO 21871) Hiệu suất (21 ± 3) h đến 4 8 h/ (30 ± 1) °C Bacillus cereus 00001 - Định tính Ph á t triển tốt (2) Khuẩn lạc màu hồng có quầng kết tủa Tính chọn lọc (44 ± 4) h/ ( 30 ± 1) °C E. co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính Ức chế to àn ph ầ n (0) - Độ đặc hiệu Bacillus subti l is subsp. sp iziz enii 00003 - Định tính - K h u ẩ n lạc màu vàng không có qu ầ ng kết tủa PEMBA S Bacillus cereus TCVN 7903 (ISO 21871) Hiệu suất ( 21 ± 3) h đến (44 ± 4) h / (37 ± 1) °C Bacillus cereus 00001 - Định tính Phát triển tố t (2) Khuẩn lạc màu ngọc lam có qu ầ ng k ế t tủa Tính chọn lọc (44 ± 4) h/ ( 37 ± 1) °C E. co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính Ứ c chế toàn phần (0) - Độ đặc hi ệ u Bacillus subt i l i s subsp. sp iziz enii 00003 - Định tính - Khuẩn lạc màu trắng không có quầng kết tủa SDS S V i brio spp. ngoại trừ Vibrio parahaemolyticus/ V .cholerae TCVN 7905-2 (ISO/TS 21872-2) Hiệu suất (24 ± 3) h / (37 ± 1) °C Vibr i o vu l ni fi cus 00187 b - Định tính Phát triển tốt (2) Khu ẩ n lạc màu xanh lục/đ ỏ tía có quầng kết tủa Vibrio cho l era e non-01/non-0139 00203 b - Định tính Phát triển tốt (2) Khuẩn lạc màu vàng có quầng k ết tủa Tính chọn lọc E.co li d 00012 hoặc 00013 hoặc 00090 - Định tính Ứ c chế toàn phần (0) - TBX j S E coli dương tính β-D-glucur o nidase TCVN 7924-3 (ISO 16649-3) Hiệu suất (21 ± 3) h/ (44 ± 1) °C E. co li h 00012 d 00013 d 00202 b - Định tính Phát triển tốt (2) Khuẩn lạc màu xanh lam Tính chọn lọc Enterococcus f aecalis d 00009 hoặc 00087 - Định tính Phát tri ể n tốt (2) - Độ đặc hiệu Citrobac t er fre undii Pseu d omonas aeruginosa 00006 b 00025 - Đ ị nh t í nh - Khuẩn lạc màu trắng đ ế n xanh lục-xanh b e VRB G j S Ente ro bacteriaceae TCVN 5518-1 (ISO 21528-1 Hiệu suất (24 ± 2 )h/ (37 ± 1) °C E. co li Salmonella Typhimuriu m i Salmonella Typhimurium i 00012 b 00013 00031 hoặc 00032 - Định tính Phát triển tốt (2) Khuẩn lạc màu hồng đến đỏ, có hoặc kh ô ng có quầng kết tủa bên ngo à i Tính chọn lọc Enterococcus faecalis d 00009 hoặc 00087 - Định tính Ứ c chế toàn phần (0) - XLD S Salmon ell a TCVN 4 8 29 (ISO 6579) Hiệu suất (24 ± 3) h / (37 ± 1) °C Salmonella Typhimurium d,i Salmonella En t eriti di s d,i 00031 00030 - Định tính Khuẩn lạc có tâm m à u đen và vi ề n trong, m à u đ ỏ nhạt do sự thay đổi màu của môi trường Tính chọn lọc E. col i d 00012 hoặc 00013 - Định tính Phát triển hoặc ức chế từng phần (0-1) Khuẩn lạc màu v à ng Ente ro coccus fa e calis d 00009 hoặc 0008 7 - Định tính Ứ c chế toàn phần (0) - Môi trường phân lập không chọn lọc Môi trường a Typ e Vi sinh vật Tiêu chuẩn Chức năng Ủ Ch ủ ng đ ố i chứng Số WDCM c Môi trường đố i chứng Phư ơn g pháp kiểm chứng Chuẩn cứ Các phản ứng đặc trưng Thạch d inh dưỡng S Enterobacteriaceae TCVN 5518 (ISO 21528 (tất cả cá c phần) Hiệu suất ( 24 ± 3 ) h/ (37 ± 1) °C E. co li 0001 2 b 00013 - Đị nh tính Phát triển tốt (2) - Salmonella TCVN 4829 (ISO 6579) (24 ± 3) h / (37 ± 1) °C Salmonella Typhimurium d,i Salmonella Enteritidis d,i 00030 00031 Yersinia e nte r ocolitica TCVN 8127 ( ISO 10273) (24 ± 2) h / (30 ± 1) °C Yersinia e nte r ocolitica 0003 8 h 0001 6 0 TSYEA S Li ster i a monocytogenes TCVN 7700 (ISO 11290) (t ấ t cả c á c phần) Hiệu suất (21 ± 3) h/ (37 ± 1) °C Li ster i a monocytogenes 4 b Li ster i a monocytogenes 1/2a 00021 b 00109 - Định tính Phát triển tốt (2) - Môi trường dùng cho nh iề u mục đích Môi trường a Typ e Vi sinh vật Tiêu chuẩn Chức năng Ủ Ch ủ ng đ ố i chứng Số WDCM c Môi trường đố i chứng Phư ơn g pháp kiểm chứng Chuẩn cứ Các phản ứng đặc trưng BPW m L Pha loãng để đếm tất cả vi sinh vật TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần) TCVN 6 5 07-5 (ISO 6887-5 ) Pha loãng 45 min đế n 1 h / 20 °C đến 25 °C E. coli Staphylococcus aureus 00012 b 00013 00034 b TSA Đ ịnh lượng ± 30 % khuẩn lạc/ T 0 (± 30 % số đếm gốc) - BP W m Pha lo ã ng để đếm Li steria monocytogenes TCVN 7700-2 (ISO 11290-2) Pha loãng (1 h ± 5 min) / (20 ± 2) °C Li steria monocytogenes 4 b Li steria monocytogenes 1/2a 00021 b 00109 TSA Định lượng ± 30 % khuẩn lạc/ T 0 (± 30 % số đếm gốc) - Tăng sinh sơ bộ đ ể phát hiện Salmon e lla TCVN 4829 (ISO 6579) Hiệu suất (18 ± 2) h/ (37 ± 1) °C Salmonella Typhimurium d,i Salmonella Enteritidis d,i 00031 00030 - Định tính Độ đục ( 1-2 ) f - Tăng sinh sơ bộ để phát hiện Enterobacteri- aceae TCVN 5518-1 (ISO 21528-1) Hiệu suất ( 18 ± 2) h/ (37 ± 1) °C E. coli Salmonella Typhimurium d,i Salmonella Enteritidis d,i 00012 b 00013 00031 hoặc 00032 - Định tính Độ đục (1-2) f - Môi trường đ ối chứng đối với số đ ế m vi sinh vật Môi trường a Typ e Vi sinh vật Tiêu chuẩn Chức năng Ủ Ch ủ ng đ ố i chứng Số WDCM c Môi trường đố i chứng Phư ơn g pháp kiểm soát Chuẩn cứ Các phản ứng đặc trưng Thạch m á u S Campylobacter TCVN 7715-2 (ISO 10272-2) Hiệu suất (44 ± 4) h/ (41,5 ± 1) °C Campylobacter jejun i d Campylobacter coli 000156 00005 00004 M ẻ m ô i trường thạch m á u đã được đánh giá Định l ượ ng P R ≥ 0,7 - TSA n S Đếm khuẩn lạc - Hiệu suất Theo qui định trong phương pháp mà TSA được dùng làm môi trường đối chứng Bacillus cereus B a cillus subti l is supsp. spizizenii E. coli E. coli O 157:H7 List er ia m o nocytogenes 4b Staphy l oco cc us a u r eus 00001 00003 00012 00014 (chủng không sinh độc tố) 00021 00034 Mẻ môi trường TSA đã đ ư ợc đánh giá Đ ị nh lượng P R ≥ 0,7 Khuẩn lạc đặc trưng theo từng loài SDA S Đếm khuẩn lạc - Hiệu suất Theo qui định trong phương pháp mà SDA được dùng làm môi trường đối chứng Saccharomyces cerevisiae Aspergillus brasiliensis 00058 b Mẻ môi trường SDA đã được đánh giá Định lượng P R ≥ 0,7 Khuẩn lạc/chồi/mầm đặc trưng theo từng loài a Tên gọi đầy đủ của cá c môi trường vi ế t tắt nêu t rong Bảng E.2. b Các chủng được thử nghiệm í t nhất c Tham khảo bảng k ê chủng đối chứng có sẵn trên http://w ww .wfcc.info về thông tin số lượng chủng của bộ sưu tập giống và các chi tiết liên lạc; d Chủng được chọn tự d o, một trong các chủng được sử dụng ít nhất. e L: môi trường lỏng; S: môi trường đặc; SS: môi trường bán đặc f Ph á t triển/độ đục được phân loại nh ư sau: 0 - không phát triển/k hô ng đục; 1 - phát triển yếu/hơi đục và 2 - phát triển/c ó đục (xem 7.4.2.1,8.4.1). g Escherichia co l i W DCM 00013 được nêu trong ti ê u chuẩn cụ th ể . h Escherichia co li W D CM 00013 là chất s ả n xuất ra β-d-g l uconidase mạnh và W DCM 00202 chất sản xuất ra β-d-gluconidase yếu i Một số quy định và hạn chế của quốc gia về sử dụng typ huyết thanh khác. Xem các yêu cầu hiện hành v ề việc chọn typ huyết thanh Salmonella . j Trong trường hợp sử dụng ph é p thử định tính và định lượng đối với môi trường thì chỉ cần các kết quả định lượng ( xem B ả ng E.1). k Các chi tiết về kiểm soát chất lượng môi trường MSRV kể cả nồng độ cuối cùng của chất cấy v à các ti ê u chí được nêu t rong TCVN 4829 (ISO 6579). l Nếu môi trường dinh dưỡng được sử dụng cho h ai hoặc ba ứng d ụng khá c nhau: ít nhất là thực hiện phép thử ph át triển Salmonella (nếu phòng thử nghiệm thực hiện thử vi sinh vật này). m Nếu môi trường BPW được sử dụng cho hai hoặc ba ứng dụng khác nhau: ít nhất là thực hiện phép thử phát triển Salmonella (nếu phòng thử nghiệm thực hiện thử vi sinh vật này). n Ch ọ n các chủng theo ph ươn g pháp có sử dụng TSA làm m ô i trường đối chứng. Bảng E.2 - Các thuật ngữ vi ế t tắt v ề môi trường được sử dụng trong Bảng E.1 Thuật ngữ môi trường viết tắt Tên đ ầy đủ của môi trường Ti ê u chuẩn Baird-Parker Thạch Baird-Parker TCVN 4830-1 (ISO 6888-1) BGBLB Canh thang lactose mật lục sáng TCVN 4882 (ISO 4831) BHI Canh thang tim não TCVN 4830-1 (ISO 6888-1) và TCVN 4830-3 (ISO 6888-3) Bolton Canh thang Bolton TCVN 7715-1 (ISO 10272-1) BPW Nước đệm pepton TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần), TCVN 4829 (ISO 6579), TCVN 7700-2 (ISO 11290-2) , TCVN 551 8 -1 (ISO 21528-1) Brucella Canh thang Brucella TCVN 7715 (ISO 10272) (t ất cả các phần) CFC Thạch xetrimit, f uxidin và xephacloridin TCVN 7138 (ISO 13720) CIN Thạch ce f sulodin, Irgasan novobiocin TCVN 8127 (ISO 10273) CPC Thạch xenlulose polymixin B colistin TCVN 7905-2 (ISO/TS 21872-2) CT-SMAC Thạch MacConkey sorbitol telurit xefixim TCVN 7686 (ISO 16654) DG18 Thạch Dichloran glycero l TCVN 8275-2 (ISO 21527-2) DRBC Thạch Dichloran-rose bengal chloramphenicol TCVN 8275-1 (ISO 21527-1) EC Canh thang EC TCVN 6846 (ISO 7251) EE Canh thang glucose mật lục s á ng, có đệm TCVN 5518-1 (ISO 21528-1) Fraser Canh thang Fraser TCVN 7700-1 (ISO 11290-1) Half-Fraser Canh thang nửa F raser TCVN 8127 (ISO 10273) IS (“TS”) Thạch sắt sulf i t (Thạch tryptose su l fit) TCVN 7902 (ISO 15213) ITC Canh thang Irgasan, ticarcillin chlorat TCVN 8127 (ISO 10273) LST Canh thang Lauryl sul f at, triptose lauryl TCVN 4882 (ISO 4831) và TCVN 6846 (ISO 7251) mCCDA Thạch deoxycholat cefoperazon than cải biến TCVN 7715 (ISO 10272) (t ấ t cả các phần) mCPC Thạch colistin B polymyxin xellobiose cải biến TCVN 7905-2 ( ISO/TS 21872-2) MKTTn M ô i trường novobiocin tetrathionate Muller- Kauffmann TCVN 4829 (ISO 6579) MMG Môi trường glutamate khoáng cải biến TCVN 7924-3 (ISO 16649-3) MPCA Thạch đ ế m đ ĩ a có sữa gầy/thạch đếm đĩa có sữa TCVN 4884 (ISO 4833) MRS Môi trường MRS (de Man, Rogosa và Sharpe) TCVN 7906 (ISO 15214) MSRV Môi trường rappaport-Vassiliadis bán đặc cải biến TCVN 4829 (ISO 6579) MYP Thạch mannitol lòng đỏ trứng polymyxin TCVN 4992 (ISO 7932) PCA Thạch đếm đĩa TCVN 4884 (ISO 4833) PEMBA Thạch bromothymol mannitol l ò ng đ ỏ trứng pyruvat polymyxin TCVN 7903 (ISO 21871) PPA Thạch penicillin và pimaricin TCVN 8 8 99 ( ISO/TS 11059) PSB Canh thang sorbitol và pepton muối mật TCVN 8127 (ISO 10273) RPFA Thạch f ibrinogen huyết tương thỏ TCVN 4830-2 (ISO 6888-2) RVS Canh thang Rappaport-Vassiliadis pepton đậu tương TCVN 4829 (ISO 6579) SDA Thạch Sabouraud dextrose - SDS Thạch natri dodecyl sul f at polymyxin sucarose TCVN 7905-2 (ISO/TS 21872-2) SSDC Thạch Salmonella Shigella deoxychotate và canxi TCVN 8127 ( ISO 10273) TBX Thạch trypton mật X-glucuronit TCVN 7924 (ISO 16649) (tất cả các phần) TCBS Thạch sucarose, muối mật, xitrat và thiosu l fat TCVN 7905-1 (ISO/TS 21872-1) Thioglycollate Môi trường thioglycolat lỏng TCVN 4991 (ISO 7937) TSA Thạch trypton đậu tương - TSC/SC Thạch sulfit xycloserin/thạch sulfit xycloserin không chứa lòng đỏ trứng TCVN 4991 (ISO 7937) TSPB Thạch polymyxin t rypton đậu tương TCVN 7903 (ISO 21871) TSYEA Thạch chất chiết nấm men trypton đậu tương TCVN 7700 (ISO 11290) (t ấ t cả các phần) TSYEB Canh thang chất chiết nấm men trypton đậu tương TCVN 7700 (ISO 11290) (tất cả các phần) VRBG Thạch glucose mật đ ỏ t í m TCVN 5518 (ISO 21528) (tất cả các ph ầ n) VRBL Thạch lactose mật đ ỏ t í m TCVN 6848 (ISO 4832) XLD Thạch deox y cholate lysin xylose TCVN 4829 (ISO 6579) Phụ lục F (Quy định) Các vi sinh vật thử nghiệm và các tiêu chí hiệu năng đối với môi trường nuôi cấy khuẩn lạc được sử dụng cho vi sinh vật trong nước Các ch ủ ng đặc thù đư ợ c chọn để thử nghiệm để đảm bảo sự nhất quán giữa các phòng thử nghiệm và để chứng minh sự khác nhau giữa các môi trường (giữa các mẻ, giữa các nhà sản xuất). Các chủng nêu trong Bảng F.1 đã được đánh giá đầy đủ để đảm bảo sự phù hợp và thống nhất về hiệu năng. Khi có nhiều h ơn một chủng được liệt kê cho mỗi khía cạnh của phép thử hiệu năng (hiệu suất, tính chọn lọc, tính đặc hiệu) thì ít nhất các chủng được sử dụng phải được viết rõ. Các nhà cung cấp môi trường thươn g mại hoặc phi thương mại dự kiến sử dụng các chủng bổ sung, ví dụ: các chủng nêu trong B ả ng F.1 để đảm bảo thêm v ề chất lượng của môi trường nuôi cấy mà họ áp dụng. Các tiêu chí n à y phải bao gồm trong các tiêu chuẩn cụ thể khi được xây dựng và soát xét. M ẻ môi trường nu ô i cấy đã được đánh giá hiệu lực là mẻ môi trường đáp ứng được hiệu năng, số lượng chủng được q u y định trong Bảng F.1 là s ố lượng từ bảng kê của các bộ định danh chủng phổ biến do Trung tâm Dữ liệu Thế giới về Vi sinh vật (WDCM) cung cấp. [20] B ả ng kê này có chứa chi tiết các chủng đối chứng được thể hiện bằng mỗi số WDCM và các chi tiết l iê n lạc của các bộ sưu tập giống. T ấ t c ả các môi trường trích d ẫn được quy định trong các tiêu chuẩn qu ố c tế (ISO) và tiêu chuẩn quốc gia (TCVN). Nếu gặp phải sự biến đổi về chủng, th ì nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (ví dụ: thu lấy cùng môi trường từ các nhà sản xuất khác nhau), thu lấy giống đối chứng bổ sung từ bộ sư u tập gi ố ng gốc. Người sử dụng phải phản hồi về sự biến đổi về chủng cho WG5 Môi trường nuôi cấy của I SO/TC34 /S C 9 . Các Chú thích được sử dụng trong B ả ng F.1 như sau: a Tên gọi đầy đủ của c á c thuật ngữ môi trường viết tắt nêu trong Bảng F.2. b Các chủng được sử dụng ít nhất; c Tham kh ả o đến b ả ng kê chủng đối chứng có sẵn tr ê n http://www.wfcc.info về th ô ng tin số lượng chủng của bộ sưu tập giống và các chi tiết liên lạc. d Chủng được chọn tự do, một trong các chủng được sử dụng ít nhất. e L: môi trường lỏng; S: môi trường đặc; SS: môi trường bán đặc f Các chi tiết v ề môi trường Legionella , kể c ả bảo qu ả n các chủng đối chứng, được nêu trong ISO 11731. g Các chi tiết về kiểm soát chất lượng và các tiêu chí chất lượng môi trường MUG/EC được nêu trong ISO 9308, Phụ lục E, còn tính chọn lọc không được quy định trong tiêu chuẩn n à y. h Các chi tiết về kiểm soát chất lượng và các tiêu chí chất lượng môi trường MUD/EC được nêu trong ISO 7899-1:1998, Phụ lục E. i Một số quy định và hạn chế của quốc gia về sử dụng typ huyết thanh khác. Xem các yêu cầu hiện hành về việc chọn typ huyết thanh Salmonella . j Phát triển/độ đục được phân loại như sau: 0 - không phát triển/không đục; 1 - phát triển yếu/hơi đục và 2 - phát triển/có đục (xem 7.4.2.1, 8.4.1). k Nếu môi trường dinh dưỡng được sử dụng cho hai hoặc ba ứng dụng khác nhau: ít nhất là thực hiện phép thử phát triển Salmonella (nếu phòng thử nghiệm thực hiện thử vi sinh vật này). l Ch ọ n các chủng theo phương pháp sử dụng trong đó TSA được dùng làm môi trường đối chứng. Bảng F.1 - Các v i sinh vật thử nghiệm và các t iê u chí hiệu năng của môi trường nuôi cấy th ư ờng dùng t rong vi sinh vật nước M ôi trường chọn l ọc đ ể đ ế m v i sinh vật bằng cách so sánh v ớ i môi trường đ ố i chứng không chọn lọc Môi trường a Typ e Vi sinh vật Tiêu chuẩn Chức năng Ủ Ch ủ ng đ ố i chứng Số WDCM c Môi trường đố i chứng Phư ơn g pháp kiểm chứng Chuẩn cứ Các phản ứng đặc trưng Colilert L E. co li /vi khuẩn Coli f orm TCVN 6187-2 (ISO 9308-2) Hiệu suất (20 ± 2) h/ (36 ± 2) °C E . coli 00013 b 00090 TSA Định lượng P R ≥ 0 , 5 Khuẩn lạc màu v à ng và có huỳnh quang đ ố i với E. coli Klebsiella pneumoniae 00206 TSA Đ ị nh lượng P R ≥ 0 , 5 Khuẩn lạc màu vàng không nhạt hơn màu của mẫu ki ể m chứng đối với vi khuẩn coliform T í nh chọn lọ c Pseu d omonas aeruginosa d 00027 hoặc 00025 - Định tính Ứ c chế toàn phần (0) Khuẩn lạc màu vàng nhạt hơn màu của mẫu k iể m chứng GVPC f S Legione l la ISO 11731 v à 11721-2 Hiệu suất 2 ngày đ ế n 5 ngày/ (36 ± 2) °C Legione l la pneumophila 00107 b 00180 BCYE Định lượng P R ≥ 0 , 5 K h u ẩ n lạc màu trắng-xám-xanh tam-đỏ tí a có g ờ và tròn b ó ng đặc tr ư ng 5 ng à y đến 10 ngày/ (36 ± 2) °C Legionella anisa 00106 Tí nh ch ọ n lọc 3 ngày/ (36 ± 2) °C Ente ro coccus faecalis d 00009 hoặc 00087 - Định tính Ứ c c hế toàn phần (0) - Pseudomonas aer u ginosa d 00026 hoặc 00025 - Định tính Ứ c chế toàn phần hoặc từng phần (0) - E. co li d 00012 hoặc 00013 Lactose TTC S E. coli /v i khuẩn Coli f o rm TCVN 6187-1 ( ISO 9308-1) Hiệu suất (21 ± 3) h/ (44 ± 1) °C E. col i Ente ro coccus ae r ogenes Ci tr obacter f reun d ii 00179 b 00012 00013 00175 00006 TSA Định lượng P R ≥ 0 , 5 Khuẩn lạc m à u vàng trong môi trường có màng Tính chọn lọc Enterococcus faecalis d 00009 hoặc 00087 - Định tính Ức chế toàn phần (0) - Độ đặc hiệu Pseudomonas ae ru ginosa d 00025 hoặc 00026 - Định tính - Khuẩn lạc màu đỏ, xanh t rong môi trường mCP S Clost r i d ium per f ingens 98/83/EC Hiệu suất (21 ± 3) h/ (44 ± 1) °C môi trường kị kh í Clost r i d ium per f ingens 00007 b 00080 0017 4 ISA hoặc môi trường không chọn lọc khác đối v ớ i vi khuẩn kị kh í Định lượng P R ≥ 0,5 Khuẩn lạc màu vàng; dương tính v ớ i phép thử phosphatase Tính chọn lọc Clostri d ium bi f ermentans 00079 - Định tính - Khuẩn lạc màu xanh lam; â m t í nh với phép thử phosphatase Độ đặc hiệu E. co li 00012 hoặc 00013 - Định tính Ứ c ch ế toàn phần (0) - Pseudomonas CN S Pseudomonas aeruginosa TCVN 8881 ( ISO 16266) Hiệu suất (44 ± 4) h/ (36 ± 2) °C Pseudomonas aeruginosa 00024 b 00025 00026 TSA Định lượng P R ≥ 0,5 Khuẩn lạc màu lục lam có huỳnh quang trong d ả i UV (360 ± 20 n m ) Tính chọn lọc E. co li d Enterococcus faecalis d 00012 hoặc 00 0 13 00009 hoặc 00087 - Định tính Ứ c ch ế toàn phần (0) - S l anetz và Bartley S Enterococci đường ruột TCVN 6189-2 (ISO 7899-2) Hiệu suất (44 ± 4) h/ (36 ± 2) °C Enter o coccus f aecalis d Enterococcus faecium d 00009 b 00087 00176 00177 00178 TSA Định lượng P R ≥ 0,5 Khuẩn lạc màu đỏ-nâu sẫm-h ồ ng T í nh chọn lọc E. co li d Staphylococcus aureus d 00012 hoặc 00013 00032 hoặc 00034 - Định tính - - S ắt sul f it Trypose su lf it ( TS) S Vi khuẩn k ị kh í khử sul fi t (clostridia) TCVN 6191-2 ( ISO 6461-2) Hiệu suất (44 ± 4) h/ (37 ± 1)°C m ô i trường yếm kh í Clostridium per f ingens 00007 b 00080 TSA ho ặ c m ô i trường thạch m á u hoặc môi trường chọn lọc khác đối với vi k huẩn kị khí Định lượng P R ≥ 0,5 Khuẩn lạc m à u đen Tính chọn lọc E co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính - Khuẩn lạc k hô ng có màu đen TSC S Clostridium per f ingens IS O 14189 Hiệu suất (21 ± 3) h/ (44 ± 1) °C môi trường kị kh í Clostridium per f ingens 00007 b 00080 00174 TSA hoặc môi trường thạch m á u hoặc môi trường ch ọ n l ọ c khác đố i với vi khuẩn kị kh í Định lư ợng P R ≥ 0,5 Khuẩn lạc màu đen T í nh ch ọ n lọc Bacillus subt i lis subsp . spizizenii 00003 - Định tính Ức ch ế toàn phần (0) - Môi trường chọn lọc đ ể đếm v i sinh vật bằng cách so sánh v ới m ẻ đã đ ượ c ch ấ p nhận trước đó (sử dụng trong trường h ợ p đặc biệt) Môi trường a Typ e Vi sinh vật Tiêu chuẩn Chức năng Ủ Ch ủ ng đ ố i chứng Số WDCM c Môi trường đố i chứng Phư ơn g pháp kiểm chứng Chuẩn cứ Các phản ứng đặc trưng Colile r t L E. coli /vi k h u ẩ n coli f o rm TCVN 6187-2 (ISO 9308-2) Hiệu suất (20 ± 2) h/ (36 ± 2) °C E. co li 00013 b 00090 Mẻ Colilert được đánh g i á trước đó Định lượng P R ≥ 0 , 7 Khuẩn lạc màu vàng và c ó huỳnh quang đối với E. co li Kl e bs ie lla pneumoniae 00206 Mẻ Colilert được đánh giá trướ c đ ó Định lượng P R ≥ 0 , 7 Khuẩn lạc màu vàng không nhạt hơn màu của mẫu ki ể m chứng đối với v i khuẩn co i l f orm T í nh chọn lọ c Pseudomona s ae ru g i no s a d 00027 hoặc 0 0 025 - Định tí nh Ứ c ch ế toàn phần (0) Khuẩn lạc màu v à ng nhạt hơn màu của mẫu kiểm chứng GVPC f S Legionella ISO 11731 và 11721-2 Hiệu suất 2 ngày đến 5 ngày/ (36 ± 2)°C Legionella pneumophila 00107 b 00180 Mè môi trường GVPC đã đ ược đánh giá Định lượng P R ≥ 0 ,5 Khuẩn lạc màu trắng- xám-xanh lam-đ ỏ t í a có gờ và tr ò n b ó ng đặc tr ư ng 5 ngày đến 10 ngày/ (36 ± 2)°C Legionella an i sa 00106 Tính chọn lọc 3 ngày/ (36 ± 2) ° C Enterococcus fa e calis d 00009 hoặc 00087 - Định tính Ức c hế to à n phần (0) - Pseudo m onas ae ru ginosa d E. co li d 00026 hoặc 00025 00012 hoặc 00013 - Định tính Ứ c chế to à n phần hoặc từng phần (0-1) - Lactose TTC S E. coli /vi khuẩn Coliform TCVN 6187-1 (ISO 9308-1) Hiệu suất (21 ± 3) h/ (36 ± 2)°C E. coli E n te ro coccus aerogenes Citrobacter fre undii 00179 b 00012 00013 00175 00006 Mẻ môi trường lactose TTC đã được đánh gi á Định lượng P R ≥ 0 , 7 Khuẩn lạc màu vàng trong môi trường có m à ng Tính chọn lọc E n te ro coccus f aeca l i s d Pseudomonas aerug i nosa d 00009 hoặc 00087 - Định tính Ứ c chế toàn phần (0) - Độ đặc hi ệ u 00025 hoặc 00026 - Định tính - Khuẩn lạc màu đỏ, xanh trong môi trường mCP S Clostridi u m per fi ngens 98/83/EC Hiệu suất (21 ± 3) h/ ( 44 ± 1)°C môi trường k ị khí Clostridium per fin gens 00007 b 00080 00174 Mẻ môi trường mCP đã đ ư ợc đánh giá Định lượng P R ≥ 0 , 7 Khuẩn lạc màu vàng; dương tính vớ i phép thử phosphatase Độ đặc hiệu Cl ostri d ium bifermentans 00079 - Định tính - Khuẩn lạc màu xanh lam; âm t ính với phép thử phosphatase Tính ch ọ n lọc E col i d 00012 hoặc 00013 - Định tính Ứ c c hế to à n phần (0) - Pseudomonas CN S Pseudomonas aer u ginosa TCVN 8881 (ISO 16266) Hiệu suất (44 ± 4) h/ (36 ± 2)°C Pseudomonas aeruginosa 00024 b 00025 00026 Mẻ môi trường pseudo- monas CN đ ã được đánh giá Định lượng P R ≥ 0 , 7 Khuẩn lạc m à u lục lam có huỳnh quang trong dải UV (360 ± 20 nm) T í nh ch ọ n lọc E. co li Enterococcus faecal i s d 00012 hoặc 00013 00009 hoặc 00087 - Định t í nh Ứ c c hế to à n phần (0) - Slanetz và Bartley S E n terococc i ruột TCVN 6189-2 (ISO 7899-2) Hiệu su ấ t (44 ± 4) h/ (36 ± 2) °C Enterococcus faeca li s Enterococcus faec ium d 0000 9 b 00087 0017 6 00177 00178 M ẻ m ô i trường Sla r net z v à Bartley đã đ á nh giá Đ ị nh lượng P R ≥ 0 , 7 Khuẩn lạc m à u đỏ-nâu sẫm-hồng Tính chọn lọc E. col i d Staphylococcus aureus d 00012 hoặc 00013 00032 hoặc 00034 - Định tính Ứ c c hế to à n phần (0) - Sắ t sul fi t Trypose sulfit (TS) S Vi khuẩn kị kh í khử sul f it ( cl ostridia) TCVN 6191-2 (ISO 6461-2) Hiệu suất (44 ± 4) h/ (37 ± 1)°C môi trường yếm kh í Clostridium per f ingens 0000 7 b 00080 M ẻ m ô i trường s ắ t sulf il hoặc TS đã được đánh giá Định lượng P R ≥ 0 , 7 Khuẩn lạc màu đen Tính chọn lọc E. co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính - Khuẩn lạc không có màu đen TSC S Clostridium per f ingens ISO 14189 Hiệu suất (21 ± 3) h/ (44 ± 1) °C môi trường k ị kh í Clostridium per f ingens 00007 b 00080 00174 Mẻ môi trường TSC đã được đ á nh giá Định lượng P R ≥ 0 , 7 Khuẩn lạc màu đen T í nh ch ọ n l ọ c Bacillus sub til is subsp . sp izizenii 00003 - Định tính Ứ c c hế to à n phần (0) - Môi trường không chọn lọc đối với số đếm vi sinh vật YEA S Flora t ổ ng số ISO 6222 Hiệu suất (44 ± 4) h/ (36 ± 2) °C E. co li d Bacillus subti l is subsp . spizizenii 00012 hoặc 00013 00003 M ẻ môi trường YEA đã được đánh giá Định lư ợng P R ≥ 0 , 7 - Môi trường tăng sinh chọn lọc Môi trường a Typ e Vi sinh vật Tiêu chu ẩ n Chức năng Ủ Ch ủ ng đ ố i chứng Số WDCM c Môi trường đố i chứng Phư ơn g pháp kiểm chứng Chuẩn cứ Các phản ứng đặc trưng Bolton preston L Campylobacter ISO 17995 Hiệu suất (44 ± 4) h/ (37 ± 1) °C môi trường hi ế u khí Campylobacter j e j un i d Campylobacter co li d + E . coli + Proteus mirabilis 000156 00005 00004 00012 hoặc 00013 00023 - Định tính > 10 khuẩn lạc trên mCCDA Khuẩn lạc nh ỏ , phẳng hoặc l ồ i, bề mặt bóng Tính chọn lọc E. co li d Proteus mirabilis 00012 hoặc 00013 00023 - Định tính Ứ c chế toàn phần (0) trên TSA - MUG/EV g L E. coli /v i khuẩn coliform ISO 9308-3 Hiệu s uất 48 h/ (44 ± 0,5) °C E . coli 00179 Chi tiết về phương pháp kiểm soát và t iêu chí chất lượng của môi trường MUG/EC nêu trong Phụ lục E của ISO 9308-3:1998. MUD/SF h L Enterococ ci ruột TCVN 6189-1 (ISO 7899-1) Hiệu suất (44 ± 4) h/ (44 ± 0,5) °C Enter u coccus f aecalis Enterococcus h i rae Enterococcus f aecium 00176 00177 00178 Chi ti ế t về phương pháp ki ể m soát và tiêu chí chất lượng của môi trường MUD/SF nêu trong Phụ lục E của TCVN 6189-2:2009 (ISO 7899-2:2000) T í nh ch ọ n lọc Aerococc u s vir i dans Lactococcus lact i s Staphylococcus epi d e rmid is 00061 00016 00132 RVS L S a lmonella TCVN 9717 (ISO 19250) Hiệu suất (24 ± 3) h/ (41,5 ± 1) °C Salmonella Enteritidis d,i Salmonel l a Typhimurium d ,i + E. co li d + Ps e udomonas aeruginosa 00030 00031 00012 hoặc 00013 00025 - Định tính > 10 khuẩn lạc tr ê n XLD hoặc môi trường chọn lọc khác Khuẩn lạc đặc trưng theo từng môi trường ( xem tiêu chuẩn) Tính chọn lọc E. col i d 00012 hoặc 00013 - Định tính Ứ c ch ế từng phần ≤ 100 khuẩn lạc trên TSA - Enterococcus faeca li s d 00009 hoặc 00087 - Định tính < 10 khuẩn l ạc trên TSA - M ôi trường chất lỏng không chọn lọc Môi trường a Typ e Vi sinh vật Tiêu chuẩn Chức năng Ủ Ch ủ ng đ ố i chứng Số WDCM c Môi trường đố i chứng Phư ơn g pháp kiểm chứng Chuẩn cứ Các phản ứng đặc trưng DRCM L V i khuẩn kị khí khử sul f it (cl ostridia) TCVN 6191-1 ( ISO 6461-1) Hiệu suất (44 ± 4) h/ (36 ± 1) °C môi trường yếm kh í Clostridium p e r f ing e ns 00007 b 00080 - Định tính Độ đục ( 1 -2) j Khuẩn lạc màu đen Độ đặc hiệu E. co li d 00012 hoặc 00013 - Định tính Độ đục ( 0 - 1 ) j Khuẩn lạc không có m à u đen Nước muối L Các dịch lỏng pha loãng TCVN 9716 ( ISO 8199) Dịch pha loãng 45 min đến 1 h/ (20 đến 25) °C E.co li d S t aphy l ococcus aureus 00012 hoặc 00013 00034 TSA Định lượng ± 30 % kh uẩ n lạc/ T 0 (± 30 % số đếm ban đầu) - Dịch pha loãng pepton Dung dịch muối pepton Dung dịch Ringer (nồng độ 1/4) Dung dịch đệm phosphat Môi trường phân lập chọn lọc Môi trường a Typ e Vi sinh vật Tiêu chuẩn Chức năng Ủ Ch ủ ng đ ố i chứng Số WDCM c Môi trường đố i chứng Phư ơn g pháp kiểm chứng Chuẩn cứ Các phản ứng đặc trưng mCCDA S Campylobacter ISO 17995 Hiệu suất (44 ± 4) h / (41,5 ± 1) °C môi trường hi ế u khí Campylobacter j e j uni d Campylobacter co li d 000156 hoặc 00005 00004 - Định tính Phát triển tốt (2) Khuẩn lạc nhỏ, ph ẳ ng hoặc lồi có bề mặt bóng Tính chọn lọc + E coli d 00012 hoặc 00013 h oặc 00179 hoặc 00090 - Định tính Ứ c chế t oàn phần hoặc từng ph ầ n (0-1) Khu ẩ n lạc không đặc trưng Staphylococcus au re us d 00032 hoặc 00034 - Định tính Ứ c chế toà n ph ần (0) - XLD S Salmon e lla TCVN 9717 (ISO 19250) Hiệu suất (24 ± 3) h/ (36 ± 2) °C Salmonella typhimurium d,i Salmonel l a Enteriti d is d,i 00031 00030 - Định tính Phá t triển b ình t hường (2) Khuẩn lạc có t â m màu đen và vi ề n trong, màu đỏ nhạt do sự thay đổi màu của môi trường T í nh chọn lọ c E. co li d 00012 hoặc 00013 - Định t ính Phát tri ể n hoặc ứ c chế từng phần (0-1) Khuẩn lạc màu vàng E n terococcus f aecalis d 00009 hoặc 00087 - Định tính Ứ c chế toàn ph ầ n (0) - M ô i trường dùng cho nh iề u mục đí ch Môi trường a Typ e Vi sinh vật Tiêu chuẩn Chức năng Ủ Ch ủ ng đ ố i chứng Số WDCM c Môi trường đố i chứng Phư ơn g pháp kiểm chứng Chuẩn cứ Các phản ứng đặc trưng BPW k L Pha loãng để đếm t ấ t cả vi sinh vật TCVN 6507 (ISO 6 887) Pha loãng 45 min đến 1 h/ 20 °C đến 25 °C E co li d Staph y lococcus aureus 00012 hoặc 00013 00034 TSA Đ ị nh lượng ± 30% k huẩn lạc/ T 0 (± 30 % s ố đếm ban đầu ) - Tăng sinh sơ bộ đ ể phát hiện Salmonella TCVN 9717 (ISO 19250) Hiệu suất (18 ± 2) h/ (36 ± 2) °C Salmonel l a typhimur i um d,i Salmonella Enteri ti dis d 00031 00030 - Định tí nh Độ đục ( 1 -2 ) j - Mô i trường đối ch ứ ng đố i với số đế m v i sinh vật Môi trường a Typ e Vi sinh vật Tiêu chuẩn Chức năng Ủ Ch ủ ng đ ố i chứng Số WDCM c Môi trường đố i chứng Phư ơn g pháp kiểm chứng Chuẩn cứ Các phản ứng đặc trưng BCYE S Đếm khuẩn lạc ISO 11731 và ISO 111731-2 Hiệu su ấ t 2 ngày đến 5 ngày/ (36 ± 2) °C Legionella p neu mophil l a 001 0 7 b Mẻ môi trường BCYE đã được đánh giá Định lượng P R ≥ 0 , 7 Khuẩn lạc màu trắng-xám-xanh lam-đỏ tía có g ờ và tròn bóng đặc trưng TSA l S Đếm khuẩn lạc - Hiệu suất Theo qui định trong phương ph á p mà TS A được dùng làm môi trường đối chứng E. co li d Clos t ridium per f r i ngens Pseu d omonas aeruginaso Enterococcus faecalis 00012 00013 00090 00179 00007 00024 00087 Mẻ môi trường TSA đã được đánh giá Định lượng P R ≥ 0 , 7 Khuẩn lạc đặc trưng theo từng lo à i a T ê n gọi đ ầ y đủ của cá c môi trường viết tắt nêu trong Bảng E.2. b Các chủng được thử nghiệm í t nhất c Tham khảo bảng k ê chủng đối chứng c ó sẵn trên http://www.wfcc.info về thông tin số lượng chủng của bộ sưu tập giống và các chi tiết liên lạc; d Chủng được chọn tự do, một trong cá c chủng được sử dụng í t nhất. e L: môi trường lỏng; S: môi trường đặc; SS: môi trường bán đặc f Ph á t triển/độ đục được phân loại nh ư sau: 0 - không phát triển/không đục; 1 - phát triển yếu/hơi đụ c và 2 - phát triển/có đụ c (xem 7.4.2.1, 8.4.1). g Escher i ch i a coli WDCM 00013 đ ư ợc nêu trong t iêu chuẩn cụ th ể . h Escherichia coli WDCM 00013 sinh β-d-glucon i dase mạnh và WDCM 00202 sinh β-d-gluconidase yếu i M ột số quy định và hạn chế của quốc gia về sử dụng typ huyết thanh khác. Xem các yêu cầu hiện hành về việc chọn typ huyết thanh Salmone l la . j Phát triển/đ ộ đục được xếp loại là: 0 - không phát triển/độ đục; 1 - phát triển yếu/độ đục; 2 - phát triển tốt/độ đục (xem 7.4.1.2 ; 8.4.1). k N ế u môi trường BPW được sử dụng cho hai hoặc b a ứng dụng khác nhau: í t nh ấ t là thực hiện phép thử phát triển Salmonella (n ế u phòng thử nghiệm thực hiện thử vi sinh vật này). l Chọn các chủng theo phương pháp c ó sử dụng TSA làm môi trường đối chứng. B ả ng F.2 - Các thuật ngữ viết tắt về môi trường được sử dụng trong Bảng F.1 Thuật ngữ môi trường viết tắt T ê n đ ầ y đủ của môi trường Tiêu chuẩn BCYE Môi trường chất chiết nấm men đệm than ISO 11731 và ISO 11731-2 Bolton Canh thang Bolton ISO 17995 BPW Nước đệm pepton TCVN 6507 (ISO 6887), TCVN 9717 (ISO 19250) DRCM Môi trường phân biệt b ổ sung clostridium TCVN 6191-1 (ISO 6461-1) GVPC Thạch đ ệm than chất chiết n ấ m men bổ sung glycin, vancomycin, polymyxin B, cycloheximid ISO 11731 và ISO 11731-2 Lactose TTC Thạch clorua tripheny l tetrazolium lactose bổ sung natri heptadecylsulfat TCVN 6187-1 ( ISO 9308-1) mCCDA Thạch deoxycho l a t cefoperazon than c ả i biến ISO 17995 mCP Thạch per t ringen Clostri d ium dùng cho phương pháp lọc 98/83/EC MUD/S F Môi trường 4-metylumbelliferyl-α-D glucoside /SF TCVN 6189-1 (ISO 7899-1) MUG/EC Môi trường 4-metylumbelliferyl-β-D glucuronide /EC ISO 9308-3 Preston Canh thang Preston ISO 17995 Pseu d omonas CN Thạch axit nalidixic xetrimid Pseudomonas TCVN 8881 (ISO 16266) RVS Canh thang Rappaport-Vassiliadis pepton đậu tương TCVN 9717 (ISO 19250) S l anetz và Bartley Môi trường Slanet z và Bartley TCVN 6189-2 (ISO 7899-2) Sắt su lfil Thạch s ắt su lfil TCVN 6191-2 (ISO 6461-2) Tryptose sulf i t (TS) Thạch tryptose sulfit TCVN 6191-2 (ISO 6461-2) TSA Thạch trypton đậu tương - TSC Thạch sulfit xycloserin tryptose (kh ô ng chứa l ò ng đỏ tr ứ ng) ISO 14189 XLD Thạch deoxycholat lysin xylose TCVN 9717 (ISO 19250) YEA Chất chiết nấm men ISO 6222 Phụ lục G (Quy định) Sử dụng các biểu đồ kiểm chứng để kiểm soát phép thử định lượng môi trường nuôi cấy đặc G.1 Yêu cầu chung Phụ lục này mô tả việc sử dụng biểu đồ ki ể m chứng để theo d õ i các kết quả, đặc biệt là kết quả biểu thị tỷ lệ hiệu suất, P R , như chi tiết trong 7.2, khi thử nghiệm thạch chọn lọc hoặc k hông chọn lọc dựa vào thạch đối chứng không chọn lọc hoặc các m ẻ thạch chọn lọc tương tự đã được chấp nhận. Cần chú ý khi sử dụng biểu đồ kiểm chứng để thử nghiệm giữa các mẻ của cùng loại thạch, như bất k ỳ sự suy gi ả m chất lượng nào của các m ẻ liên tiếp có th ể kh ô ng được rõ ràng, trừ khi các d ung dịch huyền phù thử nghiệm được kiểm chứng cẩn thận để c h o s ố l ư ợ ng sinh vật thích hợp, hoặc sử dụng RM (xem 3.4.6). Bất kỳ hệ thống kiểm soát chất lượng môi trường nào dựa vào việc kiểm tr a giữa các mẻ phải được xác nhận là phù hợp với mục đích trước khi đưa vào sử dụng. Mỗi nguồn gốc và mẻ thạch thử nghiệm đều cho th ấ y mức độ khác nhau về hiệu suất và các phòng thử nghiệm riêng rẽ có thể sử dụng các thạch đối chứng khác nhau để so sánh với thạch thử nghiệm. Do đó, các phòng thử nghiệm riêng rẽ phải thiết lập và chứng minh các giới hạn của m ì nh và/hoặc khoảng hệ số hiệu suất có thể được chấp nhận đối với mỗi loại thạch thử nghiệm s ử d ụng thường xuyên trong khoảng giá trị hệ số hiệu suất quy định trong 7.2.2.1.2. Các biểu đồ kiểm chứng được chuẩn b ị từ các dữ liệu đánh giá xác nhận ban đầu, thi ế t lập các giới hạn chấp nhận sử dụng phân tích thống kê và sau đó các biểu đồ này được sử dụng để theo dõi các m ẻ thạch tiếp theo. Thường xuyên đánh giá các giới hạn (ví dụ cứ sau mỗi 30 phép thử) và điều chỉnh khi cần (thông tin bổ sung được đưa ra trong G.2.6). Các quy trình yêu cầu sử dụng dung dịch huyền phù vi sinh vật có nồng độ đã biết của chủng đích quy định cho môi trường thử nghiệm nêu trong Phụ lục E hoặc Phụ lục F; đây là giá tr ị đích đối với phép thử. Huyền phù thử nghiệm l à RM thương mại (xem 3.4.6) hoặc được phòng thử nghiệm chuẩn bị từ các giống làm việc đã chuẩn hóa kỹ của các chủng đối chứng. Nồng độ vi sinh vật trong huyền phù phòng thử nghiệm ( giá trị đích) phải cho thấy ổ n định và đồng nhất trong suốt thời gian sử dụng. Để tối ưu hóa việc kiểm soát, các huy ề n phù ph ả i ch ứ a x ấ p xỉ 100 cfu (khoảng 80 cfu tới 120 cfu) trong một thể t í ch dịch cấy được đưa lên đ ĩ a thạch và thường thực hiện các phép thử ít nhất hai lần lặp lại. B ả ng 1 (xem 5.4.2.5.1) cung cấp các giá trị về độ chụm ở các n ồ ng độ dịch cấy khác nhau cho thấy tầm quan trọng của việc duy trì dịch cấy tối ưu này. Các đĩa thạch phải được cấy bằng các kỹ thuật d àn bề mặt, đổ đĩa hoặc lọc màng, thích hợp với phương pháp chuẩn đối chứng mà thạch được sử dụng và được ủ trong các điều kiện quy định tại các tiêu chuẩn cụ thể đó. Các khuẩn lạc có mặt trên hoặc trong mỗi đĩa phải được đếm phù hợp với các phương pháp chuẩn đối chứng và các hệ số hiệu suất tính được trong 7.2.1.1. G.2 Sử dụng biểu đồ kiểm chứng G.2.1 Yêu cầu chung Đ ể thiết lập một biểu đồ ki ể m chứng mới, cần thực hiện ít nhất 10 phép thử trên các mẻ khác nhau của cùng loại thạch thử nghiệm, tốt nhất là thực hiện lặp lại hai lần và vào những ngày khác nhau d o các người khác nhau thực hiện (các điều kiện tái lập nội phòng thử nghiệm). Sử dụng 20 phép thử (như trong G.2.2) sẽ cho giới hạn đáng tin cậy hơn so với biểu đồ được chuẩn bị từ 10 phép thử ban đầu (số lượng tối thiểu) phải được tính lại khi có sẵn 20 kết quả. Phải duy trì các biểu đồ riêng rẽ theo một dãy ít nhất 30 phép thử được giữ lại cho mỗi đánh giá chất lượng môi trường (xem G.2.6). G.2.2 Dựng biểu đ ồ kiểm chứng Quy trình này d ựa trên dịch cấy chuẩn có chứa ( 100 ± 20) cfu trong 0,1 ml dịch cấy được sử dụng đối với phép thử sử dụng kỹ thuật dàn đ ĩ a quy trình này. Cũng thích hợp khi sử dụng các th ể tích khác của dịch cấy đối với các kỹ thuật khác như đổ đĩa hoặc lọc màng, v ớ i điều kiện là dịch cấy có chứa số lượng khuẩn lạc nằm trong dải chấp nhận (100 ± 20) cfu. Trung bình của hai dãy số đếm lặp lại tr ê n phép thử thứ i là x i cfu/0,1 ml đối với môi trường thử nghiệm và y i cfu/0,1 ml đối với môi trường đối chứng. Khi đó, hệ số hiệu suất của phép thử thứ i l à x i / y i = r i . Đối với các dãy phép thử từ i = 1, 2, ... n , trong đó n là số tối thiểu 10 và tốt nhất là 20, sử dụng Công thức (G.1) để tính giá trị trung bình, của P R : (G.1) Sử dụng Công thức (G.2) để xác định các giá trị trung bình, của P R : (G.2) Trong đó: i l à số phép thử; n là tổng số các phép thử; r i là giá trị P R thứ i . X á c định các độ lệch chuẩn (s) như sau: (G.3) CHÚ TH Í CH: H ằ ng s ố 0,8865 (hoặc nghịch đảo của 1,128) là chuẩn được ASTM khuyến cáo để xác định độ lệch chuẩn từ dải trung bình các giá trị thử nghiệm lặp lại hai lần. Tính các giá trị giới hạn 95 % (± 2 s ) và 99 % (± 3 s ) của sự phân bố các kết quả. Trên trục Y của biểu đồ ki ể m chứng, đánh dấu các vị trí của giá trị trung bình t ổ ng th ể P R , , từng giá trị của hai giá trị trên (+2 s và +3 s ) và hai giá trị dưới (-2 s và -3 s ), sau đó vẽ các đường song song với trục X. Dựng các gi á trị P R thứ 1, 2, … n trên trục X (xem ví dụ). Mỗi khi chuẩn bị m ẻ môi trường mới, cần thử nghi ệ m sử dụng huyền phù dịch cấy chuẩn và P R tính được từ tỷ số của số cfu đếm được sau khi ủ ấ m trên môi trường thử nghiệm và môi trường đối chứng như trên. G i á trị này được vẽ tr ên biểu đồ kiểm chứng và được kiểm tra lại dựa vào các giới hạn thu được. G.2.3 Ví dụ về dựng biểu đ ồ kiểm chứng sử dụng 20 kết quả Bảng G.1 cho các kết quả từ 20 lần kiểm tra hệ số hiệu suất liên tiếp trên các mẻ của c hủ ng loại thạch thử nghiệm không chọn lọc sử dụng dịch cấy chuẩn 110 cfu/0,1 m l đếm được trên môi trường đối chứng không chọn lọc (số đếm chính xác trên môi trường đối chứng sẽ khác so với số đếm được trong thực tế, nhưng số liệu được dùng để đưa ra nguyên tắc của biểu đồ kiểm chứng là chỉ từ các hệ số hiệu suất tính được). Bảng G.1 - Báo cáo kiểm tra h ệ s ố hiệu suất của 20 l ầ n liên tiếp trên thạch không chọn lọc dùng để xây dựng biểu đồ kiểm chứng (cho các số đếm thực ch ỉ trên môi trường thạch thử nghiệm, các số đếm trên môi trường đối chứng y i là 110 cfu) Kết quả số phép thử nghiệm ( i ) i = 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Cfu (thạch thử nghiệm - x i ) 95 102 94 97 105 68 98 105 103 116 r i 0,86 0,93 0,85 0,88 0,95 0,62 0,89 0,95 0,95 1,05 - 0,07 0,08 0,03 0,07 - 0,06 0,06 0,01 0,11 i = 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Cfu (thạch thử nghiệm - x i ) 95 90 89 116 114 110 114 98 88 102 r i 0,86 0,82 0,81 1,05 1,04 1,00 1,04 0,89 0 , 80 0,93 0,19 0,04 0,01 0,24 0,01 0,04 0,04 0,15 0,09 0,13 Cần lưu ý rằng kết quả dưới của phép thử số 6 trong ví dụ này của thạch không chọn lọc thấp hơn khoảng cho phép đối với giá trị chấp nhận P R từ 0,70 đến 1,40 của thạch không chọn lọc (xem 7.2.2.1.2) và tất cả các k ế t quả như thế được coi l à ngoại lệ trong việc th u lấy độ lệch chuẩn và giá trị trung bình đối với biểu đồ kiểm chứng. Các lý do kết quả thử nghiệm PR nằm ngoài dải cho phép cần được nghiên cứu v ì chúng thư ờ ng liên quan đến việc thực hiện không tốt quy trình thử nghiệm chứ không phải do chất lượng môi trường kém và thường tìm được khi dịch cấy được sử dụng nằm ngoài khoảng độ chụm quy định từ 80 cfu đến 120 cfu. Giá trị P R trung bình bằng với: (G.4) (thể hiện bằng đường kẻ đậm trên Hình G.1) Khoảng các giá trị ( R = | r i - r i-1 |) được xác định là chênh lệch tuyệt đối của các giá trị liên ti ế p, ngoại trừ giá trị bị loại (ví dụ: phép thử số 6 trong B ả ng G.1 ở trên), nghĩa là: 0,93 - 0,86 = 0,07; 0,93 - 0,85 = 0,08; 0,88 - 0,85 = 0,03 v.v... Giá trị trung bình bằng: (0,07 + 0,08 + 0,03 + ... + 0,09 + 0,13)/18 = 1,43/18 = 0,08 (G.5) Do đó, độ lệch chuẩn, s = 0,8865 x 0,08 = 0,071 Các giới hạn tin cậy 95 % (thể hiện bằng đường kẻ chấm nhạt trong Hình G.1) là: 0,92 ± 2 x 0,071 = 0,92 ± 0,14 = 0,78 đến 1,06 (G.6) Các giới hạn tin cậy 99 % (thể hiện bằng đường kẻ chấm đậm trong Hình G.1) là: 0,92 ± 3 x 0,071 = 0,92 ± 0,21 = 0,78 đến 1,13 (G.7) CHÚ DẪN: Y hệ số hiệu suất, P R X số phép thử Hình G.1 - Biểu đồ ki ể m chứng được xây dựng từ các hệ số hiệu suất thu đư ợ c từ 20 lần kiểm tra đ ầ u tiên nêu trong Bảng G.1 (đ ã loại trừ kết quả ngoại lệ s ố 6) G.2.4 Đánh giá hiệu năng và giải th í ch kết quả Mẻ môi trường nuôi cấy sẽ được chấp nhận nếu các tiêu chí chất lượng vi sinh lẫn tiêu chí chung (xem 6.2) đầu đáp ứng. Mẻ môi trường mới bị loại b ỏ nếu các kết quả sau đây xuất phát từ các phép thử định lượng nói trên không kiểm soát được như sau: - vi phạm giới hạn ± 3 s ; - hai trong ba quan sát trong hàng ngang vượt quá giới hạn cảnh báo ± 2 s ; - sáu quan sát trong hàng ngang là tăng đều hoặc giảm đều; - chín quan sát trong hàng ngang trên cùng một bên của giá trị trung bình. CHÚ THÍCH: Ti ê u ch í của bốn quan sát trong hàng ngang vượt quá mức ± 1 s cũng cho thấy có v ấ n đề. G.2 . 5 Các cách tiếp cận khác để thử hiệu năng của môi trường Quy trình sử dụng biểu đ ồ kiểm chứng để thử hiệu năng của môi trường nêu trên thu được để dựng đồ thị các giá trị P R m à không cần chuyển log 10 của số đếm khuẩn lạc. Những phương pháp thay được chấp nhận dựa trên đồ th ị trực tiếp các số đếm khuẩn lạc hoặc số đếm khuẩn lạc chuyển về log 10 , nếu cho thấy thích hợp . Các phương pháp kiểm tra xem sự phân bố dữ liệu số đếm khuẩn lạc có phù hợp với phân bố chuẩn hay không khi không chuyền về log 1 0 sử dụng phép thử Kolmogorov-Smimov hoặc phép thử khi-bình phương, các ví dụ được đưa ra trong NEN 6603. [39] Tuy nhiên, cần lưu ý r ằ ng nếu các số đếm không bao gồm hệ số pha loãng, khi đó không chắc biến đổi v ề log 10 sẽ là thích hợp. Việc chuyển đổi trực tiếp số đếm (ví dụ 100 cfu/đĩa) cần gi ả định phân bố Poisson để chuy ể n đổi số đếm x là . Ngoài ra, trong tình huống bất kỳ khi số đếm khuẩn lạc được dựng đồ thị trực tiếp thì cần đảm bảo rằng mức dịch cấy thử nghiệm là không đổi giữa các phép thử, n ế u kh ô ng kết quả thu được sẽ bị sai. G.2.6 Xem xét định kỳ các biểu đồ kiểm chứng Các biểu đồ kiểm chứng đầu tiên và t iế p theo đối với một môi trường thử nghiệm phải được xem xét định kỳ đ ể đảm bảo rằng các giới hạn thiết lập vẫn còn chấp nhận được. Biểu đồ đầu tiên chứa tối thiểu là 20 điểm dữ liệu được xem xét để thiết lập giới hạn ban đầu và sau đó các biểu đồ tiếp theo có thể được xem xét tại các tần suất dự kiến cho mỗi 30 điểm dữ liệu bằng các quy trình dưới đây. Một khi biểu đồ kiểm chứng được hoàn tất, tính lại giá trị trung bình và độ lệch chuẩn s , b ỏ qua mọi kết quả nằm ngoài d ả i chấp nhận hoặc giới hạn thiết lập. Trường hợp sử dụng việc chuyển đổi về log 10 , th ì thực hiện tất cả các phép tính sử dụng kết quả chuyển đổi log 10 . So s á nh độ l ệch chuẩn của biểu đồ hiện hành với độ lệch chuẩn của t ấ t cả các kết quả trước đ ó , s t ot , và kiểm tra bi ế n thiên sử dụng các tiêu chí sau đây: (G.8) Trong đó: F (0975; n - 1, n tot - 1) là giá trị của thử nghiệm F ở xác suất α = 0,025 tại quan sát thứ n của s và quan sát n tot của s to t . Biến thiên đã tăng đ á ng kể khi s không đáp ứng được tiêu chí này và cần tìm nguyên nh â n. Trường hợp độ lệch chuẩn của biểu đồ kiểm chứng đáp ứng được các tiêu chí, th ì kết hợp với biểu đồ kiểm chứng tiếp theo [xem công thức (G.9) l à ví dụ để tính toán]. Đồng thời so sánh giá trị trung bình, của biểu đồ hiện hành với trung bình của tất cả các quan sát trước đó, và thử nghiệm sử dụng tiêu chí sau: (G.9) Trong đó: là giá trị trung bình của biểu đồ kiểm chứng hiện hành; là giá trị trung bình của tất cả các biểu đồ kiểm chứng trước đó; s là độ lệch chuẩn của biểu đồ kiểm chứng; s tot là độ lệch chuẩn của t ấ t cả các biểu đồ kiểm chứng trước đó; n là t ổ ng số quan sát của bi ể u đồ kiểm chứng hiện hành; n tot là tổng số quan sát của tất cả các biểu đồ kiểm chứng trước đó. Nếu trung bình của biểu đồ kiểm chứng hiện hành đáp ứ ng các tiêu ch í thì kết hợp dữ liệu với các quan sát trước đối với cho bi ể u đồ ki ể m chứng tiếp theo. Bắt đầu điều tra về nguyên nhân có thể xảy ra nếu các tiêu chí không được đáp ứng. Nếu không t ì m ra nguyên nhân, thì bắt đ ầ u dựng biểu đồ kiểm chứng mới và thiết lập các giới hạn mới dựa trên những quan sát trước đ â y bằng cách tính toán lại các giới hạn từ giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của tất cả các quan sát. VÍ DỤ: Ví dụ về tính toán: Các ví dụ v ề dữ liệu nêu trong Bảng G2, dựa vào ba biểu đồ kiểm chứng, mỗi bi ể u đồ có 3 0 q u an sát x tot , s tot và liên quan đến số liệu tổng hợp từ biểu đồ 1 và biểu đồ 2. Một trong những quan sát trong biểu đồ thứ hai (số 22 được đánh dấu bằng chữ in nghiêng) vượt quá giới hạn ch ấ p nhận được phòng thử nghiệm thiết lập từ dữ liệu của m ì nh v à quan sát này là do đó không được sử dụng trong việc t í nh toán. Bảng G.2 - Dữ liệu đ ố i với 3 biểu đ ồ kiểm chứng để đánh giá dựa vào các giới hạn đ ã thiết lập bởi phòng thử nghiệm (từ NEN 6603[39]) Phép đo Kết quả thử nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Biểu đồ 1 100 77 108 75 83 92 70 81 90 88 Biểu đồ 2 74 81 60 66 109 83 73 82 74 89 Biểu đồ 3 89 75 67 63 90 77 90 75 53 91 Phép đo 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Bi ể u đồ 1 78 82 90 95 75 86 100 98 75 92 Biểu đ ồ 2 80 83 95 71 98 74 76 92 84 88 Biểu đ ồ 3 99 74 88 68 100 81 97 89 80 71 Phép đo 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Bi ể u đồ 1 74 80 98 79 82 91 78 90 65 60 Biểu đ ồ 2 67 130 97 98 64 85 101 73 67 82 Biểu đ ồ 3 63 84 82 84 99 79 86 70 72 98 Tính các s ố liệu b iể u đồ ri ê ng rẽ s s 2 x tot s t ot Từ các số liệu tổng hợp của biểu đ ồ 1 và bi ể u đ ồ 2 Biểu đồ 1 84,4 11,1 122,7 83,0 11,7 136 , 1 Biểu đồ 2 81,6 12,3 150,8 - - - Biểu đ ồ 3 81,1 12,1 147,5 - - - Kiểm tra về biến thiên trong độ lệch chuẩn bằng cách so sánh độ lệch chuẩn, s, của biểu đồ cuối cùng (biểu đồ 3) với độ lệch chuẩn của hai biểu đồ đầu tiên ( s to t ) như quy định trên đây để cho kết q u ả sau: (G.10) Giá trị tới hạn là F ( 0,975; 29,58) = 1,83. Gi á trị quan sát được này l à nh ỏ hơn giá trị tới hạn cho nên không có sự chênh lệch đáng kể giữa độ lệch chuẩn từ Biểu đồ 3 với hai biểu đồ trước đó (Biểu đồ 1 và Biểu đồ 2). Sau đó kiểm tra nếu giá trị trung bình đã thay đổi như mô t ả ở trên đối với các dữ liệu cho các kết quả như sau: Dữ liệu đối với Biểu đồ 3 cho |81,1 - 83,0| = 1,9 và giá trị tới hạn cho: (G.11) Giá trị tính được đối với Biểu đồ 3 là nh ỏ hơn giá trị tới hạn do đó không có sự chênh lệch đáng kể giữa trung bình của Biểu đồ 3 với các biểu đ ồ trước đó (Bi ể u đồ 1 và Biểu đồ 2). Khi thử nghiệm về biến thiên có hiệu lực, thì các dữ liệu từ Biểu đồ 3 được kết hợp v ớ i dữ liệu của các biểu đồ trước đ ó để tính các giới hạn mới. Như vậy, các biểu đồ mới được thực hiện trên cơ s ở của giá trị trung bình 82,4 và độ lệch chuẩn 11,80. Phụ lục H (Tham khảo) Đảm bảo chất lượng của môi trường nuôi cấy - Xử lý sự cố B ả ng H.1 Bất thư ờ ng Lý do có thể Môi trường thạch không đông đặc Quá nhiệt trong quá trình chuẩn b ị môi trường Độ pH th ấ p gây ra th ủ y phân axit Sử dụng khối l ượng thạch không đúng Agar không hòa trộn kỹ Trộn các thành phần không k ỹ Độ pH không đúng Qu á nhiệt trong quá trình chuẩn bị m ô i trường Chất lượng nước kém Nhiễm b ẩ n hóa chất t ừ bên ngoài pH được đo tại nhiệt độ không ch í nh xác Máy đo pH được hiệu chuẩn kh ô ng đúng Chất lượng môi trường khô không tốt Màu s ắ c khác thường Quá nhiệt trong quá trình chuẩn bị môi trường Chất lượng nước k ém Chất lượng môi trường khô không tốt Thi ế u một hay nh iề u thành phần Các th à nh phần được sử dụng không chính xác Độ pH không ch í nh xác Nhiễm bẩn từ bên ngoài H ì nh thành kết tủa Quá nhiệt trong quá trình chuẩn bị môi trường Chất lượng nước kém Ch ấ t lượng môi trường khô không t ố t Ki ể m soát pH kém N ế u môi trường được chuẩn bị từ các th à nh phần riêng lẻ, th ì có thể c ó tạp chất trong nguyên liệu Môi trường b ị ứ c c hế/Hiệu suất th ấ p Quá nhiệt trong quá trình chuẩn bị m ô i trường Chất lượng môi trường kh ô không tốt Chất lượng nước kém Công thức được sử dụng không đúng, ví dụ: các thành phần được cân không ch í nh xác, ch ấ t b ổ sung có nồng độ không đúng Có dư lượng chất độc hại trong b ì nh chuẩn bị hoặc trong nước Chuẩn bị các vi sinh vật kiểm soát sinh vật không đúng cách Tính chọn lọc/t í nh đặc hiệu kém Quá nhiệt tr ong quá trình chuẩn bị môi trường Chất lượng môi trường khô không tốt Sử dụng công thức không đúng Chất bổ sung được thêm vào không đúng cách, ví dụ: cho vào khi môi trường quá nóng hoặc với nồng độ không đúng Chất bổ sung b ị nhiễm bẩn Chuẩn bị các vi sinh vật kiểm soát sinh vật không đúng cách Nhiễm b ẩ n Khử trùng không đúng cách Kỹ thuật vô trùng kém Chất b ổ sung bị nhiễm b ẩ n Phụ lục I (Tham khảo) Phép thử định lượng môi trường nuôi cấy lỏng I.1 Yêu cầu chung Phụ lục này đưa ra các ph ư ơng pháp thử định lượng môi trường lỏng, có thể cung cấp thêm thông tin so với các phương pháp thông thường quy định trong Điều 8. Các phương pháp này ch ủ yếu được áp dụng để đánh giá môi trường đang được nghiên cứu và so sánh. Chất lượng của môi trường lỏng với khía cạnh tối ưu hóa đặc tính phát triển được thể hiện rõ nhất trong giai đoạn đầu. Nhìn vào độ dài của pha trễ và tăng trư ở ng trong pha đầu cung cấp th ô ng tin nhạy cảm nhất về hiệu suất và tính chọn lọc của các vi sinh vật đích và không phải đích tương ứ ng trong canh thang thử nghiệm và canh thang đối chứng. Do đó, nếu ch ỉ có khác biệt nhỏ về chất lượng, th ì cấy vạch từ môi trường l ỏ ng vào các đĩa sau thời gian ủ ngắn hơn, ví dụ: 6 h hoặc 12 h. I.2 Phương pháp thử định lượng môi trường nuôi cấy lỏng không chọn lọc sử dụng các vi sinh vật đích I.2.1 Cách tiến hành - Chọn một lượng các ống, mỗi ố ng chứa ít nhất 10 ml m ô i trường hoặc các phần 10 ml từ mỗi mẻ cần thử nghiệm (xem 3.1.2). - Sử dụng giống làm việc nêu trong 5.4.2.2. - Nuôi cấy các vi sinh vật đích: Cấy canh thang thử nghiệm và môi trường đối chứng đặc cho mỗi vi sinh vật thử nghiệm ≤ 100 tế bào. - Ủ các môi trường đã cấy theo các điều kiện quy định trong các tiêu chuẩn cụ thể. - Chuẩn bị đủ các độ pha loãng từ môi trường đã ủ ấm để thu được số đếm khuẩn lạc (xem 5.4 . 2.5). - Dàn đều thể tích đã đong, ví dụ 10 μ l , trên một đĩa thạch không có chất ức chế như trong 7.2.2.1.1. I.2.2 Đ ế m và diễn giải kết quả Sau khi ủ, đếm số khuẩn lạc trên các đĩa (xem 7.2.2.1.1 và 7.2.2.1.2). Việc diễn giải các kết quả sẽ phụ thuộc vào mục tiêu của phép thử, ví dụ: so với mẻ trước đó, môi trường đối chứng hoặc RM. Vi sinh vật đích cần đạt được 10 6 cfu/ml đến 10 8 cfu/ml. I.2.3 Sơ đồ ph ư ơng pháp định l ượ ng đ ố i v ớ i môi trường nuôi cấy lỏng không chọn lọc sử dụng vi sinh vật đích Hình 1.1 là sơ đồ phương pháp đ ị nh lượng đối với môi trường nuôi cấy lỏng không chọn lọc sử dụng các vi sinh vật đích. Hình I .1 - Sơ đồ phép thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy lỏng không chọn lọc s ử d ụ ng các vi s i nh vật đ í ch (xem I .2.1 và I .2.2) I.3 Phương pháp thử định lượng môi trường nuôi cấy lỏng chọn lọc sử dụng vi sinh vật đích và không phải đích I. 3.1 Cách tiến hành - Chọn một lượng các ống, mỗi ố ng chứa ít nhất 10 ml môi trường hoặc các phần 10 m l từ mỗi mẻ c ầ n thử nghiệm (xem 3.2.2). - Sử dụng giống làm việc nêu trong 5.4.2. - Nuôi cấy các vi sinh vật đích: cấy canh thang thử nghiệm, canh thang đối chứng và môi trường đối chứng đặc cho m ỗ i vi sinh vật thử nghiệm ≤ 100 tế bào. Môi trường đối chứng đặc được dùng để đếm cfu trong d ịch cấy. - Nuôi cấy các vi sinh vật không phải đích: C ấy canh thang thử nghiệm, canh thang đối chứng và môi trường đối chứng đặc cho mỗi vi sinh vật thử nghiệm ≥ 1 000 tế bào. - Nuôi cấy hỗn hợp của các vi sinh vật đích và các vi sinh vật không phải đích: Đ ể thử nghiệm các giống hỗn hợp trong canh thang thử nghiệm nuôi cấy m ô i trường chọn lọc, môi trường đối chứng và môi trường đối chứng đặc có ≤ 100 tế bào vi sinh vật đích và ≥ 1 000 tế bào của vi sinh vật không phải đích trong cùng một ống/trên cùng một đĩa thạch. Để thử nghiệm các giống hỗn hợp, dãn đều khi có thể trên các đĩa thạch không chọn lọc thạch cho phép phân biệt các vi sinh vật trong giống hỗn hợp (ví dụ: đ ĩa đếm thạch có MUG để đếm Escherichia coli và Salmonella spp.). Khi không thể phân biệt được giống cấy hỗn hợp trên môi trường thạch không chọn lọc, th ì cần sử dụng môi trường thạch chọn l ọc đã được thử hiệu năng. - Ủ các môi trường đã cấy theo các điều kiện quy định trong các tiêu chuẩn cụ th ể . Lấy một lượng đã biết hoặc nếu cần, lấy một lượng sau khi pha loãng từ mỗi canh thang và dàn đều lên đĩa thạch không có chất ức chế đối với các ống ch ỉ chứa các vi sinh vật đích hoặc ch ỉ chứa các vi sinh vật không phải đích nêu trong 8.2.2. Đối với các ổng chứa c ả vi sinh vật đích lẫn vi sinh vật không phải đích, d à n đều trên mỗi đĩa chứa cùng môi trường chọn lọc như đã sử dụng ở trên. Phương pháp nhỏ giọt bề mặt Miles-Misra, các hệ thống nh ỏ giọt khác hoặc đĩa xoắn cũng có thể được sử dụng để thu được số đếm khuẩn lạc trên các đĩa. I.3.2 Đọc, tính và diễn giải kết quả Đếm các khuẩn lạc của vi sinh vật đích và không phải đích trên từng đĩa và tính toán độ thu hồ i so với canh thang đối chứng, có t í nh đến độ pha lo ã ng được dùng để đếm (nếu cần). Trong trường hợp các giống cấy hỗn hợp, cần phân biệt các loại khác nhau. Việc t í nh toán và d i ễ n giải kết quả phụ thuộc v à o mục đích của phép thử. Việc diễn giải các kết quả phụ thuộc vào mục đích của phép thử, ví dụ: so sánh với mẻ trư ớ c đó, môi trường đối chứng hoặc RM. Vi s i nh vật đích cần đạt được 10 6 cfu/ml đến 10 8 cfu/ml và cần có mặt vi sinh vật ư thế trong môi trường chọn lọc. Đối với các giống cấy hỗn hợp, độ thu hồi vi sinh vật đích không được th ấ p hơn so với độ thu hồi của giống thuần của sinh vật đích. I.3.3 Sơ đồ phương pháp định lư ợn g đối với môi trường nuôi cấy lỏng có chọn lọc bằng cách sử dụng vi sinh vật đích và vi sinh vật không phải đích Hình I .2 là sơ đồ phương pháp đ ị nh lượng đối với môi trường nuôi cấy l ỏ ng chọn lọc sử dụng vi sinh vật đích và vi sinh vật không phải đích. H ì nh I .2 - Sơ đồ phư ơ ng pháp định lượng đối với môi trường nuôi cấy l ỏng chọn lọc sử dụng vi sinh vật đích và vi sinh vật không phải đích (xem I .3.1 và I.3.2) Phụ lục J (Quy định) Xác định các phép thử hiệu năng vi sinh vật đối với môi trường nuôi cấy chuẩn hóa J.1 Khái quát Phụ lục n à y đưa ra các hướng dẫn cho các nhà lãnh đạo nhóm công tác tiêu chuẩn hóa để họ xác định các tiêu chí hiệu năng vi sinh, các phương pháp và các chủng kiểm chứng, khi xây dựng hoặc soát xét các tiêu chuẩn về phân tích vi sinh vật (vi sinh vật trong thực phẩm hoặc vi sinh vật trong nước). J.2 Yêu cầu chung Các yêu cầu về hiệu năng vi sinh vật (tiêu ch í hiệu năng, phương pháp kiểm chứng và các mục đích) có thể áp dụng cho các môi trường nuôi cấy chuẩn hóa phải bao gồm trong mỗi tiêu chuẩn phân tích vi sinh. Các yêu cầu về hiệu năng có thể là: - được sử dụng và được c ả i biến nếu cần, theo tiêu chuẩn này đối với các môi trường nuôi cấy có quy định trong tiêu chuẩn; - hoặc tạo ra môi trường nuôi cấy mới bất kỳ, phù hợp với các nguyên tắc quy định tr ong phụ lục này. CHÚ THÍCH: Việc xác định các yêu cầu hiệu năng của vi sinh vật này không đề cập đến thuốc thử hoặc môi trường để khẳng định. J.3 Tiêu chí hiệu năng, phương pháp và các mục đích Các ti ê u ch í được đánh giá (hiệu suất, tính chọn lọc, tính đặc hiệu), các phương pháp thử được sử dụng (phương pháp định lượng và định tính) và các mục đích cần đáp ứng ph ả i được xác định theo các đặc trưng của từng môi trường nuôi cấy, như trong Bảng J.1 dưới đây: - dạng môi trường (canh thang, thạch); - thành phần môi trường (môi trường chọn lọc, môi trường không chọn lọc); - chức năng của mô i trường trong phương pháp chuẩn hóa (tăng sinh, pha loãng, phát hiện, định lượng). Bảng J.1 - Tiêu chí, phương pháp thử và mục đích Môi trường T iê u ch í và phương pháp thử Canh thang định lượng chọn lọc Hiệu suất (phương pháp: định lượng) e Tính chọn lọc (định tính) f Thạch định lượng chọn lọc Hiệu suất (phương pháp: đ ị nh lượng) b Tính chọn lọc (định tính) g Tính đ ặ c hiệu (định tính) i Canh thang tăng s i nh chọn lọc Hiệu suất ( phương pháp: định lượng) c Tính chọn lọc (định tính) h Thạch phát hiện chọn lọc Hiệu suất (phương pháp: định tính ) d Tính chọn lọc (định tính) g Tính đặc hiệu (định tính) i Thạch định lượng không chọn lọc Hiệu suất (phương pháp: định lượng) b Canh thang tăng sinh không chọn lọc Hiệu suất (phương pháp: định tính) a Canh thang pha loãng không chọn lọc Hiệu suất (phương pháp: định lượng) e Thạch phát hiện không chọn lọc Hiệu suất (phương pháp: định tính) d 1. Hiệu suất: mục đích của ti ê u chí hi ệ u năng này là để ki ể m tra xác nh ậ n sự phát triển của các chủng đích (và h ì nh th á i khuẩn lạc) trên đĩa thạch. a Hiệu suất định tính (môi trường lỏng): xem 8.4. Mục đích: kết quả phải là 2 (tăng trưởng khả quan) đối v ớ i một dịch cấy ≤ 100 cfu các vi sinh vật đích (8.4.1). b Hiệu suất định lượng (môi trường thạch): xem 7.2.1.1. - Mục đ í ch: P R phải ≥ 0,50 đ ể so sánh môi trường chọn lọc với môi trường đối chứng không chọn lọc quy định trong các Phụ lục F v à E. Các P R phải ≥ 0,70 để so sánh môi trường không chọn lọc vớ i môi trường đối chứng không chọn lọc hoặc theo quy đị nh trong tiêu chuẩn hoặc các Phụ lục F và E. Điều này cũng áp dụng cho các trường hợp đặc biệt, nếu thực hiện so sánh với mẻ trước đó. Các khuẩn lạc vi sinh vậ t đ í ch phải có vẻ bên ngoài đặc trưng. c Định tính (môi trường lỏng): xem 8.3. Mục đích: Ít nhất 10 khuẩn lạc của vi sinh vật đích quan sát th ấ y tr ê n môi trường phân lập chọn lọc được sử dụng đ ể phát hi ệ n sau khi cấy ≤ 100 cfu. d Hiệu suất định tính (môi trường thạch): xem 7.4. Mục đích: kết quả phải l à 2 (tăng trưởng khả quan) các vi sinh vật đích. Các khuẩn lạc vi sinh vật đích phải có vẻ bên ngoài đặc trưng. e Hiệu suất định lượng (môi trường lỏng): xem 8.2. Mục đích: Đối vối các chất pha loãng, số lư ợ ng vi sinh vật sau thời gian tiếp xúc, phải nằm trong kho ả ng ± 30 % số lượng ban đ ầ u. 2. Tính chọn lọc: mục đích của ti ê u ch í hiệu năng này l à để xác minh rằng các chủng g â y nhiễu ( k hông p hả i đ í ch) b ị ức chế một ph ầ n hoặc ho à n toàn b ở i môi trường chọn lọc. f Tính chọn lọc định tính (môi trường lỏng ) : xem 8.3. Mục đ í ch: các vi sinh vật thử nghiệm (kh ô ng mong muốn) bị ức chế ho à n toàn. g Tính chọn lọc định tính (môi trường thạch): xem 7.4. Mục ti ê u: Các vi sinh vật thử nghiệm (không mong muốn) bị ức chế một phần hoặc ho à n to à n. h Tính chọn lọc định tính (môi trường lỏng): xem 8.3. Mục ti ê u: Không phát tri ể n (hoặc <10 cfu) các vi sinh vật (không mong muốn) trên môi trường thạch không chọn lọc được sử dụng đ ể phát hiện. 3. T í nh đặc hiệu: Mục đích của tiêu chí hiệu năng này l à đ ể xác minh r ằ ng các chủng gây nhiễu (kh ô ng ph ả i đ í ch) kh ô ng bị ức chế không tạo ra các khuẩn lạc đặc t rư ng. ii T í nh đặc hiệu định tính (môi trường thạch): xem 7.4. Mục đích: các khuẩn lạc của các chủng kh ô ng phải đích thử nghiệm không được có vẻ bên ngoài của các vi sinh vật đ íc h trong các ph ươ ng pháp đã chu ẩ n hóa. Các tiêu ch í này ph ả i được kiểm tra xác nhận với thời gian v à nhiệt độ ủ đã chuẩn h ó a. J.4 Chọn các chủng kiểm chứng hiệu năng J.4.1 Yêu cầu chung Mục đích của các tiêu chí hiệu năng khác nhau và phạm vi của phương pháp tiêu chuẩn hóa ph ả i xác định việc chọn các chủng kiểm chứng, nghĩa là: - Các chủng đích (hiệu suất) được phát hiện hoặc được đ ị nh lượng trong phương pháp, và - Các chủng không phải đích (tính chọn lọc, tính đặc hiệu) thuộc hệ thực vật gây nhiễu thường gặp trong các nền mẫu được phân t í ch. Các chủng kiểm chứng được mô tả trong Phụ lục E và Phụ lục F, đã được thử nghiệm trên môi trường xác định, phải được sử dụng, nếu có thể. Nếu chứng minh được (tính không ổ n định di truyền, không đủ khả năng tái sinh của các chủng QC đã xác định trước đó v.v...), thì ch ủ tr ì dự án có thể đề xuất thay đổi các chủng yêu cầu, theo các hướng dẫn trong điều này. J.4.2 Đánh giá sự phù h ợ p của các chủng kiểm chứng mới Trước khi giới thiệu một chủng mới, th ì sự phù hợp để sử dụng trong phép thử hiệu năng phải được đánh giá xác nhận và lập thành văn bản. Điều này đòi hỏi việc chứng minh khả năng lặp lại của phép kiểm soát hiệu năng ít nhất hai (tốt nhất l à ba) phòng thử nghiệm độc lập, sử dụng hai hoặc ba lô hàng khác nhau của các công thức đã tiêu chuẩn hóa hoặc t ừ các nh à sản xu ấ t thương mại khác nhau trong từng phòng thử nghiệm. J.4.3 M ô i trường mới Đối với môi trường mới bất kỳ, các chủng kiểm chứng phải: - được chọn ưu tiên từ các chủng được mô tả trong Phụ lục E hoặc Phụ lục F; - được đánh giá trước đó và được chứng minh là phù hợp ( xem J.4.2); - hoặc mới được giới thiệu trong các điều kiện sau đây: - tốt nhất là chúng có nguồn gốc từ thực phẩm hoặc từ các mẫu nước; - chúng phải sẵn có trong í t nhất hai bộ sưu tập chủng quốc tế, với mức giá chấp nhận được; - đã được đánh giá trước đó và được chứng minh là phù hợp (xem J.4.2). J.4.4 S ố l ượ ng các chủng cho mỗi tiêu chí Chú thích a của B ả ng: hiệu suất định tính (môi trường lỏng): xem 8.4. Hai chủng đích: chủng typ A và chủng typ B Typ A: chủng được thử nghiệm trong kiểm soát chất lượng hiệu năng của nhà sản xuất môi trường và người sử dụng cuối cùng. Typ B: chủng ch ỉ yêu c ầ u nhà sản xuất môi trường thử nghiệm. Chú thích b của Bảng: hiệu su ấ t định lượng (môi trường thạch): xem 7.2.1.1. Hai chủng đích: chủng A và chủng B Chú th í ch c của Bảng: hiệu suất định tính (môi trường lỏng): xem 8.3. Hai chủng đ í ch: chủng A và chủng B mỗi chủng liên quan đến hai chủng không phải đích. Chú thích d của B ả ng: hiệu suất định t í nh (môi trường thạch): xem 7.4. Hai chủng đích: chủng A và chủng B. Ch ú thích e của Bảng: hiệu suất định lượng (môi trường lỏng): xem 8.2 Hai chủng đích: chủng A và chủng B. Chú thích f của Bảng: tính chọn lọc định tính (môi trường lỏng): xem 8.3 Hai chủng không ph ả i đích: chủng A và chủng B Chú thích g của B ả ng: tính chọn lọc định tính (m ô i trường th ạ ch): xem 7.4 Hai chủng không phải đích: chủng A và chủng B Chú thích h của Bảng: tính chọn lọc định tính (môi trường lỏng): 8.3 Hai chủng không phải đích: chủng A và chủng B Chú thích i của Bảng: tính chọn lọc định tính ( môi trường thạch): 7.4 Một chủng không ph ả i đích: chủng A THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN ISO 9000, Hệ thống qu ả n lý ch ấ t lượng - Cơ sở và từ vựng [ 2 ] TCVN ISO 9001, Hệ thống quản lý chất lượng - Các yêu cầu [ 3 ] TCVN 8890:2011 (ISO Guide 30:1992 with A. m endment 1:2008), Thuật ngữ và định nghĩa sử dụng cho mẫu chuẩn [ 4 ] ISO 6222, Water quality - Enumeration of culturable micro-organisms - Colony count by inoculation in a nutr i ent agar culture medium [ 5 ] TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử [ 6 ] TCVN 7790-1 (ISO 2859-1), Quy trình lấy mẫu đ ể kiểm tra định tính - Phần 1: Chương trình lấy mẫu được xác định theo giới hạn chất l ượ ng chấp nhận (AQL) để ki ể m tra từng lô [ 7 ] TCVN 9331 (ISO/TS 22117), Vi sinh vật thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn và các yêu cầu cụ thể về thử nghiệm thành thạo thông qua so sánh liên phòng thử nghiệm [ 8 ] Nordic Committee on Food Analysis (NMKL) Procedure no 10, 2002, Control of microbiological media [ 9 ] AUSTRALIAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY Guidelines for assuring quality of food and w ater microbiological culture media. Second Edition, 2014 [1 0 ] EUROPEAN PHARMACOPOEIA 2010 7th ed, Council of Europe, France. Chapters 2.6.12 and 2.6.13 [ 1 1] UNITED STATES PHARMACOPOEIA 2011, 35th ed, The United States Pharmacopoeial Convention, USA. Chapter 1117. Microbiological Best Laboratory Practice [1 2 ] DIN 58942-4:2003, Medical Microbiology - Culture media - Transport systems for specimen containing bacteria [1 3 ] DIN 58942-4, Suppl. 1:2003, Medical Microbiology - Culture media - Systems, media and conditions for the transport of selected pathogens in clinical specimens [1 4 ] DIN 58959-6, Suppl. 1:1997, Quality management in medical microbiology - Requirements for control strains - Examples for production and preservation of bacteria used as stock cultures and working cultures [1 5 ] DIN 58959-6, Suppl. 2:1997, Quality management in medical microbiology - Requirements for control strains - Examples for production and preservation of fungi used as stock cultures and working cultures [1 6 ] DIN 58959-9, Suppl. 1:1997, Quality management in medical microbiology - Requirements for the use o f control strains for testing culture media - Control strains for commonly used culture media [1 7 ] DIN 58959-9, Suppl. 2:1997, Quality management in m e dical microbiology - Requirements for the use of control strains for testing culture media - Maximum storage times for rea d y-to-use culture media [1 8 ] DIN 58959-10:1997, Quality management in medical microbiology - Requiremen t s for the use of control strains for testing reagents, dyes and biological materials [1 9 ] DIN 58959-10, Suppl. 1:1997, Quality management in medical microbiology - Requirements for the use of control strains for testing reagents, dyes and biological mater ia ls - Control strains for commonly used materials [ 20 ] WORLD DATA CENTRE FOR MICROORGANISMS R ef erence Strain Catalogue per t aining to organisms for per f ormance testing of culture media . Available (viewed 2013-10-14) at http://www.wfcc.info [ 21 ] J.E.L. Corry, G.D.W. Curtis, R.M. Baird eds. Handbook of Culture Media for Food and W ater Microbiology. Royal Society of Chemistry, UK, Third Edition, 2012 [ 22 ] G.D.W. Curtis, R.M. Baird, N. P . Skovgaard, J.E.L. Corr y Int. J. Food Microbio l . 1998, 45 p. 65 [A statement from the IUMS-ICFMH w orking party on culture media II] [ 23 ] C . Bell, P . Neaves, A. P . W illiams Food Microbiology and Laboratory Practice. Blackwell Science, Ox f ord, 2005 [ 24 ] J.H. Hagemann Single, chemically defined sporulation medium for Bacil l us subtilis . J. Bacteriol. 1984, 160 pp. 438-441 [ 25 ] V.K. Sharma, P.N. Hobson A spo ru lation medium for strict anaerobes. Lett. Appl. Microbiol. 1985, 1 pp. 31-32 [ 26 ] B. Jarvis Statistical aspects of the microbiological examination of foods. Academic Press, London, Second Edition, 2008 [ 27 ] A.M. Cundell, S . Chatellier, P . Schumann, R. Lilischkis Equivalence of quality control strains of microorganisms used in the compendial microbiological tests: are national culture collection strains identical? PDA J. Pharm. Sci. Technol. 2010, 64 pp. 137-155 [ 28 ] L.J. Cross, J.E. Russell, M. Desai Examining the genetic variation of reference microbial cultures used within food and environmental laboratories us i ng fl uorescent ampli f ied f ragment length polymorphism analysis. FEMS Microb i ol. Lett. 2011, 321 (2) pp. 100-106 [ 29 ] J.F. Schijven, A.H. Havelaar, M. Bahar A simple and widely applicable method for preparing homogeneous and stable quality control samples in w ater microbiology. Appl. Environ. Microbiol. 1994, 60 (11) pp. 4160 - 4162 [ 30 ] R. Araujo, A.G. Rodrigues, C . Pina-Vaz A fast practicable and reproducib l e procedure for standardization of the cell density of an Aspergillus inoculums. J. Med. Microbiol. 2004, 53 pp. 783-786 [ 31 ] M. Wesche Stress, sublethal injury, resuscitation, and virulence of bacterial foodbo rn e pathogens. J. Food Prot. 2009, 72 (5) pp. 1121-1138 [ 32 ] DB Kell 1998, Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical issues . A v Leeuwenhoek 73 pp. 169-187 [ 33 ] N.J. Ro w an Viable but non-culturable forms of food and waterbome bacteria: Quo Vadis? Trend Food Sciences. 2004,15 pp. 462-467 [ 34 ] TCVN 6910-6 (ISO 5725-6), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương ph á p đo và kết quả đo - Phần 6: Sử dụng các giá trị độ chính xác trong thực tế [ 35 ] G.M. Garrity ed. et al. Bergey ’ s Manual of Systematic Ba c teriology . 2nd ed. Springer, New York, NY, USA, 2001-2012 [ 36 ] AMERICAN TYPE CU L TURE COLLECTION Bacterial Culture Guide. Manassas, VA, USA, 2012 [ 37 ] AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION Preservation and recovery of f ilamentous fungi. Tech.Bu ll . No 2 Manassas, VA, USA, 2011 [ 38 ] AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION Reference strains - How many passages are too many? Tech. Bull, No 6 Manassas, VA, USA, 2011 [ 39 ] NEN 6603, Environmental and Food - Inte rn al qu a lity control by the use of control charts with chemical and microbiological ana l ysis [ 40 ] TCVN 4882 (ISO 4831), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương ph á p ph át hiện v à định lượng coli f orm - Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất [ 41 ] TCVN 6848 (ISO 4832), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp đ ị nh l ượ ng co lif orm - Kỹ thuật đếm khu ẩ n lạc [ 42 ] TCVN 4884 (ISO 4833), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương ph á p định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 độ C [ 43 ] TCVN 6191-1 (ISO 6461-1), Chất lượng nước - Phát hiện và đếm số bào tử vi khuẩn kị khí khử sun f it (clostr i dia) - Phần 1: Phương pháp tăng sinh trong môi trường cấy lỏng [ 44 ] TCVN 6191-2 (ISO 6461-2), Ch ấ t lượng nước - Phát hiện và đếm số bào tử vi khuẩn kị khí khử sun fi t (clostridia) - Phần 2: Phương pháp màng lọc [ 45 ] TCVN 4829 (ISO 6579), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phư ơ ng pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch [ 46 ] Sửa đổi 1:2008 TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Am d . 1:2007), Vi sinh vật trong th ự c phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Salmonella spp. trên đĩa thạch - Sửa đổi 1: Phụ lục D: Phát hiện Salmonella spp. trong phân động vật và trong mẫu môi trường từ giai đoạn sản xu ấ t ban đầu [ 47 ] TCVN 4830-1 (ISO 6888-1), Vi sinh vật trong thục phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng staphylococci c ó ph ả n ứ ng dương tính coagulase (Staphylococcus aureus và các loài khác) trên đĩa thạch - Phần 1: Kỹ thuật sử dụng môi trường thạch Bair d -Parker [ 48 ] TCVN 4830-2 (ISO 6888-2), Vi sinh vật trong thực ph ẩ m và thức ăn chăn nuôi - Phương ph á p định lượng staphylococci có ph ả n ứng d ương tính coagulase (Staphylococcus aureus và các loài khác) trên đĩa thạch - Phần 2: Kỹ thuật sử dụng môi trường thạch f ibrinogen huyết tương thỏ [ 49 ] TCVN 4830-3 (ISO 6888-3), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Staphylococci có ph ả n ứ ng d ương tính với coagulase (Staphylococcus aureus và các loài kh á c) trên đĩa thạch - Phần 3: Phát hiện và dùng kỹ thuật đếm số có xác suất l ớn nhất (MPN) để đếm số lượng nhỏ [ 50 ] TCVN 6846 (ISO 7251), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Escherichia coli gi ả định - Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất [ 51 ] TCVN 6189-1:2009 ( ISO 7899-1:1998 with Cor 1:2000), Chất lượng nước - Ph á t hiện và đếm khu ẩ n đường ruột - Phần 1: Phương pháp thu nhỏ (số có xác suất lớn nhất) đ ố i với nước mặt và nước thải [ 52 ] TCVN 6189-2:2009 (ISO 7899-2:2000) , Chất lượng n ư ớc - Phát hi ệ n và đếm khuẩn đ ư ờng ruột - Phần 2: Phương pháp lọc màng [ 53 ] TCVN 4992 ( ISO 7932), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 độ C [ 54 ] TCVN 4991 (ISO 7937), V i sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi- Phương pháp định lượng Clostri d ium pertringens trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc [ 55 ] TCVN 6187-1 (ISO 9308-1), Chất lượng nước - Phát hiện và đếm Escher i chia coli và vi khuẩn coliform - Phần 1: Phương pháp lọc màng [ 56 ] TCVN 6187-2 (ISO 9308-2), Chất l ượng nước - Phát hiện và đếm Escher i chia coli và vi khuẩn coli f orm - Phần 2: Phương pháp nhiều ống (số có x á c suất cao nhất) [ 57 ] ISO 9308-3:1998, Water quality- Detection and enumeration of Escher i chia coli and co lif orm bacter i a - Part 3: Miniatur i zed method (Most Probable Number) for the detection and enumeration of E. coli in sur f ace and w aste water [ 58 ] TCVN 7715-1 (ISO 10272-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn ch ă n nuôi - Phư ơ ng pháp phát hiện và định lượng Campylobacter spp. - Phần 1: Phương ph á p phát hiện [ 59 ] TCVN 7715-2 (ISO/TS 10272-2), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn ch ă n nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Campylobacter spp. - Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc [ 60 ] TCVN 7715-3 (ISO/TS 10272-3), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Campylobacter spp. - Phần 3: Phương pháp bán định lượng [ 61 ] TCVN 8127 (ISO 10273), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phát hiện Yersinia enterocolitica gây bệnh giả định [ 62 ] TCVN 8899 (ISO/TS 11059), Sữa và sản phẩm sữa - Phương pháp định lượng Pseu d omonas spp. [ 63 ] TCVN 7700-1 (ISO 11290-1), Vi sinh vật trong th ự c phẩm và thức ăn ch ă n nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Lister i a monocytogenes - Phần 1: Phương pháp phát hiện [ 64 ] TCVN 7700-2 (ISO 11290-2), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ă n chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Lister i a monocytogenes - Phần 2: Phương pháp định lượng [ 65 ] ISO 11731, Water quality - Enumeration of Legionella [ 66 ] ISO 11731-2, Water quality- Detection and enumeration of Legionella - Part 2: Direct membrane fi l tration method for waters with low bacter i al counts [ 67 ] TCVN 7138 (ISO 13720), Thịt v à sản phẩm thịt - Định lượng Pseudomonas spp. giả định [ 68 ] ISO 14139, Water quality - Enumeration of Clostridium pe rf r i ngens - Method using membrane filt ration [ 69 ] TCVN 7902 (ISO 15213), Vi sinh vật t rong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi khuẩn khử sul f it phát triển trong điều kiện kị khí [ 70 ] TCVN 7 90 6 (ISO 15214), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi khuẩn axit lactic ưa nhiệt trung bình - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 °C [ 71 ] TCVN 8881 (ISO 16266), Chất lượng nước - Phát hiện và đếm Pseudomonas aeruginosa - Phương pháp màng lọc [ 72 ] TCVN 7924-1 (ISO 16649-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và th ứ c ăn chăn nuôi - Phương ph á p định lượng Escher i chia coli dương tính b-glucuronidaza - Phần 1: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44 °C sử dụng màng lọc và 5-bromo-4-clo-3- i ndolyl b-D-g l ucuronid [ 73 ] TCVN 7924-2 (ISO 16649-2), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Escher i chia coli dư ơn g t í nh b-glucuronidaza - Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 44 °C sử dụng 5-bromo-4-clo-3-indolyl b-D-glucu rom id [ 74 ] TCVN 7924-3 (ISO/TS 16649-3), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn ch ă n nuôi - Phương pháp đ ị nh lượng Escherichia coli dương tính b-glucuronidaza - Phần 3: Kỹ thuật tính số c ó xác suất l ớn nhất s ử dụng 5-bromo-4-clo-3-indolyl b-D-glucuroni d [ 75 ] TCVN 7686 (ISO 16654), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Escher i chia coli O 157 [ 76 ] IS O 17995, Water quality - Detection and enumeration of thermotolerant Campylobacter species [ 77 ] TCVN 9717 (ISO 19250), Chất lượng nước - Phát hiện Salmonella spp. [ 78 ] TCVN 8275-1 (ISO 21527-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng nấm men và nấm mốc - Phần 1: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc trong các sản phẩm có hoạt độ nước lớn hơn 0,95 [ 79 ] TCVN 8275-2 (ISO 21527-2), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng nấm men và nấm mốc - Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc trong các sản phẩm có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0,95 [ 80 ] TCVN 5518-1 (ISO 21528-1), Vi sinh vật tron g thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và đ ịnh lượng Enterobacteriaceae - Phần 1: Phát hiện và đ ị nh lượng bằng kỹ thuật MPN c ó tiền tăng sinh [ 81 ] TCVN 5518-2 (ISO 21528-2), Vi sinh vật trong th ực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Enterobacteriaceae - Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc [ 82 ] TCVN 7903 (ISO 21871), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp xác định số lượng nh ỏ Bacillus cereus giả định - Phương pháp phát hiện và kỹ thuật đếm số c ó xác suất lớn nhất [ 83 ] TCVN 7905-1 (ISO/TS 21872-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương ph á p phát hiện Vibrio spp. có khả n ă ng gây bệnh đường ruột - Ph ầ n 1: Phát hiện Vibrio p a rahaemolyticus và Vibrio cholerae [ 84 ] TCVN 7905-2 (ISO/TS 21872-2), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp ph á t hiện Vibrio spp. có khả năng gây bệnh đường ruột - Phần 2: Phát hiện các loài không phải là Vibri o parahaemolyticus và Vibr i o cholerae [ 85 ] European Culture Collections ’ Organisation (ECCO), avai l able at http://www.ecosite.org [ 86 ] Eu ro pean Council Directive 98/83/EC of 3 November 1998 on the quality of wa t er intended for h uman consumptio n . Available (vie w e d 2013-10-14) at http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/ LexUriServ.do?uri=OJ:L:1998:330:0032:0054:EN:PDF [ 87 ] World Federation for Culture Collections (WFCC). Available at htpp:// www.wfcc.info MỤC LỤC Lời nói đầu Lời giới thiệu 1 Phạm vi áp dụng 2 Tài liệu viện dẫn 3 Thuật ngữ và định nghĩa 3.1 Thuật ngữ chung và định nghĩa 3.2 Thuật ngữ thử hiệu năng 3.3 Thuật ngữ về môi trường nuôi cấy. 3.4 Thuật ngữ về vi sinh vật thử nghiệm 4 Quản lý đảm bảo chất lượng 4.1 Hệ th ố ng tài liệu 4.2 Bảo quản 4.3 Chuẩn bị môi trường trong phòng thử nghiệm 4.4 Bảo quản và hạn sử dụng môi trường đã chuẩn bị 4.5 Chuẩn bị để sử dụng 4.6 Ủ ấm môi trường đặc trong các đĩa Petri 4.7 Thải bỏ môi trường 5 Vi sinh vật thử nghiệm để thử hiệu năng 5.1 Yêu c ầ u chung 5.2 Chọn vi sinh vật thử nghiệm 5.3 Bảo quản và duy tr ì các vi sinh vật thử nghiệm 5.4 Vi sinh vật để thử hiệu năng 6 Kiểm soát chất lượng và thử hiệu năng của môi trường nuôi c ấ y 6.1 Yê u cầu chung 6. 2 Kiểm soát chất lượng lý - hóa 6 .3 Kiểm soát chất lượng vi sinh vật 6 .4 Yêu cầu chung đối với phép thử hiệu năng vi sinh vật 6. 5 Đánh giá hiệu năng và diễn giải các kết quả 6 .6 Môi trường khẳng định và thuốc thử 7 Phương pháp thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy đặc 7.1 Yêu cầu chung 7.2 Phương pháp thử định lượng 7.3 Thử nghiệm môi trường nuôi cấy sử dụng cho lọc màng 7.4 Phương pháp thử định t í nh 8 Phương pháp th ử hiệu năng của môi trường nuôi cấy lỏng 8 .1 Yêu cầu chung 8 .2 Phương pháp định lượng trong ống nghiệm đ ể thử hiệu năng của môi trường tăng sinh lỏng (phương pháp pha loãng để phân biệt) 8.3 Phương pháp định tính trong ống nghiệm đ ể thử hiệu năng của môi trường lỏng chọn lọc 8 .4 Phương pháp định tính trong ống nghiệm đơn (độ đục) để thử hiệu năng của môi trường lỏng 9 Phương pháp thử hiệu năng của chất pha loãng và m ô i trường vận chuyển 9.1 Yêu cầu chung 9.2 Phương pháp thử nghiệm dịch pha loãng 9.3 Phương pháp thử môi trường vận chuyển 10 Hệ thống tài liệu về các kết quả thử nghiệm 10.1 Thông tin từ nhà sản xuất 10.2 Truy xuất nguồn gốc Phụ lục A (tham khảo) Tên gọi các các thành phần môi trường nuôi cấy sử dụng trong phân tích vi sinh v ậ t thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước Phụ l ục B (quy định) Chuẩn bị gốc đối chứng và giống làm việc Phụ lục C (quy định) Sơ đồ của các phương pháp thử hiệu năng Phụ lục D (tham khảo) Ví dụ về phiếu ghi các kết quả thử nghiệm môi trường nuôi cấy Ph ụ lục E (quy định) Các vi sinh vật thử nghiệm và các tiêu chí hiệu năng đối với môi trường nuôi cấy khu ẩ n lạc được sử dụng cho vi sinh vật trong thực phẩm Phụ lục F (quy định) Các vi sinh vật thử nghiệm và các tiêu ch í hiệu năng đối với môi trường nuôi cấy khu ẩ n lạc được sử dụng cho vi sinh vật trong nước Phụ lục G (quy định) Sử dụng các biểu đồ kiểm chứng đ ể kiểm soát phép thử định lượng môi trường nuôi cấy đặc Ph ụ l ục H (tham khảo) Đ ả m bảo chất lượng của môi trường nuôi cấy - Xử lý sự cố Phụ l ục I (tham khảo) Phép thử định lượng môi trường nuôi cấy lỏng Ph ụ lụ c J (quy đ ị nh) Xác định các phép thử hiệu năng vi sinh vật đối với môi trường nuôi cấy chu ẩ n hóa Thư mục t à i liệu tham khảo 1) Số CAS là đơn vị nhận dạng đơn nhất của Tổ chức Chemical Abstracts Service (CAS) đối với các nguyên tố, các hợp chất hóa học, polyme, các trình tự sinh học, các hỗn hợp và các hợp kim.