TCVN8400-23:2014

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-23:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 23: Bệnh ung khí thán TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400 -23 : 2014 BỆNH ĐỘNG VẬT-QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN-PHẦN 23: BỆNH UNG KHÍ THÁN Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 23: Blackleg disease Lời nói đầu TCVN 8400-23:2014 do Trung tâm Ch ẩ n đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, T ổ ng cục Tiêu chu ẩ n Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. BỆNH ĐỘNG VẬT-QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN-PHẦN 23: BỆNH UNG KHÍ THÁN Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 23: Blackleg disease CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có th ể li ên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết t ấ t cả các v ấ n đ ề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định quy tr ình ch ẩ n đoán bệnh ung khí thán trên trâu, bò do vi khuẩn Clostridium chauvoie gây ra. 2. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chu ẩ n này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: Bệnh ung khí thán (Blackleg disease) Bệnh ung khí thán là bệnh truyền nhiễm cấp tính ở trâu, bò do vi khu ẩ n yếm kh í Clostr i dium chauvoei gây ra, có đặc trưng là trâu, bò sốt cao, các bắp thịt sưng, kh í thũng. 3. Thuốc thử và vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước đ ã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ khi c ó quy định khác. 3.1 . Thạch máu , thạch máu cơ bản được bổ sung từ 5 % đến 7 % máu cừu, máu bê, hoặc máu th ỏ (pha chế thạch theo hướng d ẫn của nhà s ả n xuất). 3.2 . Thạch thường. 3.3 . Canh thang thịt (cooked meat). 3.4 . Môi trường nước thịt BHI (Brain heart in f us i on broth). 3.5 . Môi trường pepton. 3.6 . Nguyên liệu , hóa chất cho phương pháp nhuộm Gram (xem Phụ lục A) 3.7 . Nguyên liệu , h óa chất cho các ph ả n ứng sinh hóa (xem Phụ lục B). 3.8 . M ôi trường ur ê cơ bản. 4. Thiết bị, dụng cụ Sử dụng các thiết b ị , dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh và các thiết bị, dụng cụ cụ thể như sau: 4.1. T ủ ấm, duy trì nhiệt độ 37 °C. 4.2. Que cấy , vô trùng. 4.3. Đèn cồn. 4.4. Nồi h ấ p , duy trì ở nhiệt độ 115° C , 121 ° C . 4.5. Nồi đun cách thủy , duy trì ở 100 ° C . 4.6. Kính hiển vi quang học , có độ phóng đại 1000 l ầ n. 4.7. Ố ng nghiệm , sạch, v ô trùng. 4.8. Phiến kính , sạch. 5. Cách tiến hành 5.1. Chẩn đoán lâm sàng 5.1.1 . Đặc điểm dịch tễ - Bệnh xảy ra quanh năm nhưng thường tập trung vào những tháng nóng, ẩ m, mưa nhiều. - Bệnh xuất hiện lẻ tẻ. - Vi khuẩn không lây trực tiếp từ con ố m sang con khỏe. Nh a bào từ xác chết, phân, d ịch bài xuất v ào trong đất và sống ở đó. Khi mưa, lũ lụt, nước làm nha bào nổi lên mặt đ ấ t. Gia súc ăn phải nha bào sẽ mắc bệnh. - Bệnh thường xảy ra ở trâu, bò , dê, cừu, lợn, ngựa ít mắc bệnh. Súc vật non từ 6 tháng t uổi đến 3 năm tuổi mắc bệnh nhiều hơn súc vật già. 5.1.2 . Triệu chứng lâm sàng - Thể quá cấp tính: Một vài con trâu, bò chết đột ngột mà không biểu hiện triệu chứng lâm sàng. - Thể cấp tính: Ban đầu sốt cao từ 39 ° C tới 39,5 ° C , kh i các triệu chứng bệnh biểu hiện r õ ràng th ì nhiệt độ giảm xuống bình thường. - Con vật có các khối ung, khí thũng ở vùng cơ mông, chi sau, ngực, vai, lưng. - Khối ung nóng và đau, sau đó trở n ê n lạnh và không đau, ấn tay vào có tiếng kêu lạo xạo. - Khi ung ở đùi, chân, con vật đi lại khó khăn. - Khi ung ở c ổ , con vật thè lưỡi, khó thở. 5.1.3 . Bệnh tích đại thể - Bệnh tích ch ủ yếu là các khối ung. Ở giữa ung, bắp thịt bị thâm tím, đen xạm hoặc nâu xạm, b ị hoại tử, có chất keo, nhầy hoặc như thịt đông, cắt vào sâu th ấ y s ủi bọt và có tiếng lạo xạo, mùi bơ ôi. Phía ngoài bắp thịt có màu nhạt, xung quanh có vùng thủy thũng, xuất huyết. - Hạch ở vùng có ung sưng to, thấm tương dịch. - Nếu ung xuất hiện ở ức và ngực thì tim tụ máu, ngoại tâm mạc có nước vàng, phổi tụ máu, sưng. - Nếu ung xu ấ t hiện ở bụng th ì dạ dày, ruột bị tụ máu, màng bọc gan có các vết trắng hoại tử, trên mặt có vân như đá hoa, mật sưng. - Lách sưng, khi cắt có ch ấ t màu đỏ xám lẫn khí ở bề mặt cắt. - Máu màu sẫm. 5.2 . Chẩn đoán tr ong phòng th í nghiệm 5.2.1 . Lấy mẫu Bệnh phẩm gồm: Các vùng cơ, vùng mô bị phù nề, gan. L ấ y vô trùng từ 50 g đến 100 g mỗi loại bệnh phẩm, cho vào từng lọ hay túi ni lon vô trùng riêng biệt, đậy kín, bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2 ° C đến 8 ° C và gửi v ề phòng thí nghiệm chậm nh ấ t 24 h sau khi l ấ y mẫu. Gửi kèm theo bệnh ph ẩ m giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi r õ triệu ch ứ ng, bệnh tích và đặc điểm dịch tễ. 5.2.2 . Tiêm động vật thí nghiệm Động vật th í nghiệm: Chuột lang khỏe mạnh có trọng lượng từ 200 g tới 250 g. Tiêm động vật thí nghiệm: Mẫu bệnh ph ẩ m được nghiền nát, h òa với nước muối sinh lý 0,9 % theo t ỷ lệ 1/10, tiêm vào bắp thịt cho chuột lang từ 0,1 ml đến 0,2 ml. Vi khuẩn Clostridium chauvoei làm ch ế t chuột lang trong vòng 24 h đến 48 h. Mẫu cơ, mô vùng phù nề, gan được làm tiêu bản để kiểm tra h ình thái vi khuẩn trên kính hiển vi và tiến hành phân lập, giám định vi khuẩn. 5.2.3 . Phân lập vi khuẩn Bệnh ph ẩ m (xem 5.2.1) được cấy vào canh thang thịt (xem 3.3) và đun trong nồi đun cách thủy (xem 4.5) trong 10 min. Chuy ể n 10 μ l canh thang vào thạch máu (xem 3.1), nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) ở điều kiện yếm khí trong 48 h. Trên thạch máu, khuẩn lạc nghi ngờ c ó màu xám, đường kính từ 2 mm đ ế n 3 mm, d ẹ t, tròn, bóng và gây tan huyết. Chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường thạch máu (xem 3.1), môi trường nước thịt BHI (xem 3.4), nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) ở điều kiện yếm khí trong 48 h để kiểm tra các đặc tính sinh hóa. 5.2.4 . Xác đ ịnh vi khuẩn 5.2.4.1 . Quan sát h ì nh thái - Làm tiêu bản và c ố định tiêu bản: Dùng que cấy (xem 4.2) lấy khuẩn lạc hòa đều vào giọt nước muối sinh lý trên phiến kính (xem 4.8) hoặc lấy canh thang đ ã nuôi cấy vi khu ẩ n dàn mỏng lên trên phiến kính (xem 4.8). Cố định tiêu bản bằng cách để khô hoặc làm khô tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn (xem 4.3). - Nhuộm tiêu bản: Tiêu bản sau khi cố định được nhuộm bằng phương pháp nhuộm Gram (xem phụ lục A) - Vi khu ẩ n Clostridium chauvoei dạng trực khu ẩ n ngắn, hai đ ầ u tròn, k ế t thành chuỗi ngắn từ 2 vi khuẩn đến 5 vi khuẩn, có nha bào h ì nh b ầ u dục, chiều ngang c ủ a nha bào có kích thước lớn hơn chi ề u ngang của vi khu ẩ n. 5.2.4.2 . Kiểm tra các đặc tính sinh hóa Xác định vi khuẩn Clostridium chauvoei dựa vào các đặc tính sinh hóa được nêu trong Bảng 1. Bảng 1 - Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Clos tr idium chauvoe i Lecithinase L i pase Thủy phân gelatin Phân giải casein Glucose Lactose Sucrose Maltose Salicin Indol - - + - + + + + - - X ác định đặc tính sinh hóa theo Phụ lục B. 5.2.4.3 . Xác đ ịnh vi khuẩn Clos tr id i um chauvoei bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu và chu tr ình nhiệt ở Bảng 2. Bảng 2 - Cặp m ồi và chu trình nh iệt cho PCR Gene đích Kí hiệu Sequence (5'-3 ' ) Kích c ỡ sản phẩm (bp) Chu trình nhiệt 16S- 23S 1GSC4 GAATTAAAACAACTTTATTAACAAATG 509 94 ° C , 5 min ; Chu tr ình 30 v ò ng: (94 ° C , 1 min; 55 ° C , 1 min; 72 ° C , 1 min) 72 ° C - 7 min. Giữ: 4 ° C r D NA 23UPCH GGATCAGAACTCTAAACCTTTCT Tiến hành phản ứng PCR theo Phụ lục C . 6. Kết luận Trâu, bò được xác định là mắc bệnh ung khí thán khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình c ủa bệnh và phân lập được vi khu ẩ n Clostridium chauvoei trong phòng thí nghiệm. PHỤ LỤC A (Qui định) Phương pháp nhuộm gram A.1 . Thuốc nhuộm A.1.1 . Dung d ịch t ím tinh th ể T ím tinh thể 2,0 g Etanol 95 % 20,0 ml Amoni oxalat 0,8 g Nước 80,0 ml H òa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết. A.1.2 . Dung dịch f ushcin gốc Basic f uchsin 1 g Etanol 95 % 10 ml Phenol 5 g Nước 100 ml Khi d ùng, pha lo ã ng dung dịch gốc theo t ỉ lệ 1:10 (phần thể tích) với nước. A.1.3 . Dung dịch lugol Kali iodua 2 g lodua tinh thể 1 g Nước 200 ml Nghiền kali iodua và iodua tinh thể, cho nước cất vào từ từ và lắc cho tan. A.1.4 . Dung dịch tẩy màu Axeton 1 ph ầ n Etanol 95 % 3 phần A.2 . Cách tiến hành - Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu b ả n, để từ 1 min đến 2 min. - Rửa n ước nhanh, để khô. - Nhỏ dung d ịch lugol, để 1 min. - Rửa nước nhanh, để khô. - Nhỏ etanol 95 %. - Rửa nước thật nhanh, để khô - Nh ỏ dung dịch f uchsin lo ã ng, để 1 min. - Rửa nước. - Thấm khô hoặc sấy khô. A.3 . Xem tiêu bản Nhỏ 1 giọt dầu v à o tiêu bản và xem tiêu bản bằng k í nh hiển vi quang học (xem 4.6). PHỤ LỤC B (Qui đ ịnh ) Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Clostridium chauvoei B.1 . Ki ể m tra đặc t í nh sinh lecithinase và lipase B.1.1 . Môi trường thạch lòng đỏ trứng Sử dụng môi trường thạch lòng đỏ trứng, có thành phần như sau: Thạch thường (xem 3.2) 40 g Nước 900 ml Huyễn dịch lòng đ ỏ trứng 100 ml Chuẩn b ị huyễn dịch lòng đỏ trứng: Trộn 1 lòng đ ỏ trứng với 20 ml nước muối sinh lý 0,9 % vô trùng. Pha thạch theo hướng dẫn c ủa nhà sản xuất. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.4) ở 121 ° C 15 min. Để thạch nguội khoảng từ 45 ° C đến 50 ° C th ì bổ sung thêm huyễn dịch lòng đỏ trứng. Có thể sử dụng các môi trường thương mại. B.1.2 . Cách tiến hành Dùng que cấy (xem 4.2) lấy khu ẩ n lạc từ thạch máu trong mục 5.2.3 cấy vào môi trường thạch lòng đ ỏ trứng, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) ở điều kiện yếm khí, đọc kết quả sau 48 h. B.1.3 . Đọc kết quả B.1.3.1 . Khả năng sinh lecithinase - Dương tính: Có quầng mờ đục ở môi trường xung quanh khuẩn lạc; - Âm tính: Không có quầng mờ đục ở môi trường xung quanh khu ẩ n lạc. B.1.3.2 . Khả năng sinh lipase - Dương tính: Có lớp như ngọc trai hay v ả y cá bao phủ khuẩn lạc (có thể lan ra xung quanh khu ẩ n lạc); - Âm tính: Không có lớp như ngọc trai hay v ả y cá bao phủ khuẩn lạc. B.2 . Ph ả n ứng phân giải casein B.2.1 . M ôi trường sữa Thành phần môi trường: Sữa tách bơ (skim milk) 100 g Nước cất 1000 ml Chỉnh pH môi trường ở 6,8 ± 0,2. Hòa các thành phần trên với nhau, lắc đều và chia ra các ống nghiệm (xem 4.7) (10 ml /1 ống). Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.4) ở 121 ° C trong 5 min. B.2.2 . Cách tiến hành - Dùng que c ấ y (xem 4.2) lấy khuẩn lạc từ thạch máu trong mục 5.2.3 cấy vào môi trường sữa. - Nuôi cấy trong t ủ ấm (xem 4.1) trong điều kiện y ế m khí, đọc kết quả hàng ngày trong 5 ngày. B.2.3 . Đọc kết quả - Dương t í nh: sữa đông vón có vẩn như mây (stormy clot) - Âm tính: sữa không đông vón. - Ghi chú: Kiểm tra phản ứng phân giải casein c ó th ể sử dụng môi tr ường thương mại sữa Litmus (litmus milk ) hoặc môi trường skim milk. B.3 . Ph ả n ứng thủy phân gelatin B.3.1 . M ôi trường gelatin Sử dụng môi tr ường gelatin có thành phần như sau: Môi tr ường nước thịt BHI (xem 3.4) 100 m l Sodium thioglycolate 0,05 g Gelatin 12g Pha 100 ml môi trường nước thịt BHI (xem 3.4) (theo h ướng dẫn của nhà s ả n xuất). Cho thêm gelatin, sodium thioglycolate vào môi trường và đun nóng cho tan. Chỉnh pH 7,0 và chia ra các ống (4 ml mỗi ống). Hấp tiệt trùng môi trường trong nồi hấp (xem 4.4) ở 115° C trong 15 min. B.3.2 . Cách tiến hành Dùng que cấy (xem 4.2) lấy khu ẩ n lạc từ thạch máu trong mục 5.2.3 cấy v à o môi trường gelatin, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) ở điền kiện yếm khí trong thời gian 14 ngày. Cứ từ 2 ngày đến 3 ngày thì để ống vào tủ lạnh 2 h để kiểm tra sự hóa lỏng c ủa môi trường. B.3.3 . Đọc kết quả - Dương tính: Môi trường b ị hóa lỏng; - Âm tính: Môi trường không bị hóa l ỏng . B.4 . Phản ứng sinh hóa đường B.4.1 . Môi trường Sử dụng môi trường pepton - đường gồm các thành ph ầ n: - Môi trường pepton (xem 3.5). - Dung dịch bromocrezol 0,2 %: Cho 0,2 g bromocrezol vào 100 ml etanol 90 % và lắc cho tan hết. - Dung dịch đường Pha đường thành dung dịch 10 %, hấp tiệt tr ùng trong nồi h ấ p (xem 4.4) ở 110 ° C trong từ 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng 3 lần ở 100 ° C trong 30 min hoặc l ọc qua màng lọc 0,45μm. Chuẩn bị môi trường: Cho 0,1 ml dung dịch bromocrezol 0,2% vào 100 ml môi trường pepton (xem 3.5), chia ra các ống (4 ml mỗi ống). Hấp tiệt trùng trong n ồi hấp (xem 4.4) ở 121 ° C trong 30 min. Chỉnh pH môi trường ở 6,8 ± 0,2. Thêm 0,4 ml dung dịch đường 10 %. B.4.2 . Cách tiến hành Dùng que cấy (xem 4.2) lấy khu ẩ n lạc từ thạch máu trong mục 5.2.3 cấy vào môi trường pepton - đường (xem B4.1), nuôi trong tủ ấ m (xem 4.1) ở điều kiện yếm kh í , đọc k ế t quả sau 48 h. B.4.3 . Đọc kết quả - Ph ả n ứng dương tính: Môi trường chuyển sang màu vàng; - Phản ứng âm tính: Môi trường không thay đổi màu. B. 5. Khả năng sinh indol B.5.1 . Thuốc thử Kovac ' s Paradimetyl aminobe n zaldehyt 5 g Cồn amylic 75 ml Axit clohydric 25 ml Trộn dung dịch paradimetyl aminobe nz aldehyt vào cồn amylic cho tan h ế t và để trong tủ lạnh 4 ° C . Thêm từ từ 5 ml đến 10 ml axit clohydric, trộn đều rồi để tủ lạnh, sau đó lại tiếp tục b ổ sung axit clohydric. Bảo quản thuốc thử trong lọ màu, ở 4 ° C . B.5.2 . Cách tiến hành Dùng que cấy (xem 4.2) lấy khu ẩ n lạc từ thạch máu trong mục 5.2.3 cấy vào môi tr ường pepton (xem 3.5) hoặc môi trường peptone (xem 3.5) có bổ sung tryptophan, nuôi trong tủ ấ m (xem 4.1) ở điều kiện yếm khí. Sau 24 h, nhỏ từ 0,2 m l đ ế n 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac ' s vào môi tr ường , lắc nhẹ. Phản ứng dương tính khi có vòng màu đỏ xu ấ t hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường (sinh indol). Ph ả n ứng âm tính khi không có vòng màu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và m ôi trường. B.3 . Phân giải ur ê Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (xem 3.8) (chuẩn bị môi trường và bổ sung urê theo chỉ dẫn của nhà sản xuất). Dùng que cấy (xem 4.2) lấy khu ẩ n lạc từ thạch máu trong mục 5.2.3 cấy vào môi trường có urê, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) ở điều kiện y ế m khí, đọc k ế t quả sau 48 h. - Phản ứng dương tính: Môi trường chuyển màu tím. - Phản ứng âm t í nh: Môi trường không thay đổi màu. PHỤ LỤC C (Qui định) Phát hiện vi khuẩn Clostridium chauvoei bằng phương pháp PCR C.1. Nguyên liệu PCR C.1.1. Taq PCR Master Mix Kit. C.1.2. Cặp mồi (primers): mồi xuôi và mồi ngược (B ảng 2). C.1.3. Nước tinh khiết không có nuclease. C.1.4. Dung dịch đệm TAE hoặc TBE. C.1.5. Chất nhuộm màu Ethidi bromua hoặc SYBR gree n. C.1.6. Loading dye. C.1.7. DNA chuẩn (Ladder, marker). C.2 . Chuẩn b ị mẫu Mẫu kiểm tra là vi khuẩn nghi l à Clostridium chauvoei được cấy trên thạch máu (xem 3.1) và nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) ở điều kiện yếm khí trong 48 h. Đối chứng dương: Ch ủ ng vi khuẩn đã được giám đ ịnh là Clostr i dium chauvoei hoặc sử dụng các ch ủng Clostridium chauvoei chu ẩ n. C.3 . Tách chiết DNA Các vi khu ẩ n phân lập được từ mẫu bệnh ph ẩ m, các mẫu đối chứng dương được tách chiết DNA bằng các kit thương mại và tiến hành các bước theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. C.4 . Phản ứng PCR Sử dụng cặp m ồi (primer) và chu tr ình nhiệt tr ong Bảng 2 và chuẩn b ị mồi ở nồng độ 20 μM. Hỗn hợp ph ản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml. Thành phần cho 1 phản ứng (theo hướng d ẫ n của Kit Taq PCR master mix Kit-Qiagen) như sau: - Taq PCR Master Mix Kit 12,5 μ l - M ồi xuôi 20 μ l 1 μ l - Mồi ngược 20 μ l 1 μ l - Nước không có nuclease 8.5 μ l - Mẫu DNA 2 μ l Tổng thể tích 25 μ l Đối chứng dương: DNA tách chi ế t từ vi khu ẩ n Clostr i dium chauvoei (xem C.2). Đối chứng âm: Gồm đầy đủ thành phần c ủa một phản ứng PCR, nhưng không có DNA của vi khuẩn. C.5 . Chạy điện di Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose từ 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE. Cho 2 μ l dung dịch loading dye vào 8 μ l sản ph ẩ m PCR, trộn đ ề u cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μ l thang chu ẩ n (marker) vào một giếng. Bản thạch được điện di trong môi tr ường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian từ 30 min đến 40 min, ở 100 V, sau đ ó nhuộm bản thạch (sản ph ẩ m PCR) bằng dung dịch ethidium bromide 0,2 mg/100 ml. Có thể dùng chất nhuộm màu khác như SYBR green để nhuộm bản thạch (sản ph ẩ m PCR) và sử dụng theo qui định c ủa nhà sản xu ấ t (v í dụ: SYBR sate DNA gel stain của Invitrogen). C.6 . Đọc kết quả Phản ứng dương tính khi: - Mẫu đ ối chứng dương: Có một vạch duy nhất đúng k ích c ỡ của s ản ph ẩ m; - M ẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch; - Mẫu kiểm tra: Có vạch giống mẫu đ ối chứng dương. Phản ứng âm tính khi: - Mẫu đối chứng d ương: Có một vạch duy nhất đúng k ích c ỡ c ủa sản phẩm; - M ẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch; - Mẫu kiểm tra: Không xuất hiện vạch; THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1 ] G.l. Barrow, R.K.A. Feltham, 1993. Cowan and Steel's Mannual for the ident if ication of media bacteria. Third edition. [2] Sydney M. Fi negold, Ellen Jo Baron, 1986. Bailey diagnostic and scott's microbiology. Seve n th edit i on. [3] E B agge, S S te rn berg Lewerin and K-E Johansson, 2009. Detection and identi fi cation by PCR of Clostr i dium chauvoei in clinical isolates, bovine faeces and substrates from biogas plant. Acta Veterinaria Scandinavica , 51:8 [4] JICA. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand. Third edition, 2003. 110-111. [5] Yoshimasa Sasaki, Kinya Yamamoto, Akemi Kojima, Yukie Tetsuka, Mari Norimatsu, Yutaka Tamura, 2000. Rapid and Direct Detection of Clostridium chauvoei by PCR of the 16S-23S rDNA Spacer Region and Partial 23S rDNA Sequences, J. Vet. Med. S ci . 62 (12):1275-1281. [6] S . Miyashiro, A.F.C. Nassar, M.C.A.M. Souza, J.B. Carvalho, J.E.B. Adegas, 2007. Identi f ication of clostridium chauvoei in clinical samples cultures from blackleg cases by means of pcr. Brazilian Journal of Microbiology 38:491-493. [7] P.J.Quin, M.E.Cater, B. Markey, G.R.Cater, 1994. Clinical veterinary microbiology. [8] Nguyễn V ĩ nh Phước, 1978. Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc.