TCVN10990:2015

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10990:2015 (ISO 13495:2013) về Thực phẩm - Nguyên tắc lựa chọn và tiêu chí đánh giá xác nhận các phương pháp nhận biết giống sử dụng axit nucleic đặc thù TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10990:2015 ISO 13495:2013 THỰC PHẨM - NGUYÊN TẮC LỰA CHỌN VÀ TIÊU CHÍ ĐÁNH GIÁ XÁC NHẬN CÁC PHƯƠNG PHÁP NHẬN BIẾT GIỐNG SỬ DỤNG AXIT NUCLEIC ĐẶC THÙ Foodstuffs - priciples of selection and criteria of validation for varietal identi f ication methods using speci f ic nucleic acid Lời nói đầu TCVN 10990:2015 hoàn toàn tương đương với ISO 13495:2013; TCVN 10990:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương ph á p ph â n tích và lấy mẫu biên soạn, T ổ ng cục Ti ê u chuẩn Đo lường Chất lượng th ẩ m định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Lời giới thiệu Tiêu chuẩn này đưa ra các hướng dẫn được thiết kế để hỗ trợ việc ra quy ế t đ ị nh và đánh giá xác nhận các nguyên tắc được sử dụng đ ể thu được dữ liệu phân tử ch ấ t lượng cao đối với việc nhận biết g iố ng. Phép thử nhận biết giống yêu cầu các marker ch ấ t lượng cao, để có thể cho các dữ liệu giống nhau khi sử d ụng các thiết bị, hóa chất và thuốc thử khác nhau. Do đó, tiêu chuẩn này chỉ đưa ra các phương pháp khuếch đại đặc thù. Mục đích của tiêu chuẩn này là để đảm bảo rằng t ấ t c ả các phương pháp phân tích đề u phù hợp với các yêu cầu của khách hàng, nêu r õ các bước khác nhau đ ể đánh giá xác nhận ph ư ơng pháp và để xác định các tiêu ch í chấp nhận. Và cũng đảm bảo rằng các nguyên tắc chung được áp dụng trong khi thực hiện các phép phân tích này đều giống nhau trong t ấ t cả các phòng thử nghiệm (chất chuẩn, cỡ mẫu, mẫu phòng thử nghiệm, phần mẫu thử, việc chiết, phân tích và giải thích k ế t quả, chứng nhận phân t ích). Tiêu chuẩn n à y có vai trò trong việc chuẩn hóa các kết quả thu được trong các phòng thử nghiệm khác nhau. THỰC PHẨM - NGUYÊN TẮC LỰA CHỌN VÀ TIÊU CHÍ ĐÁNH GIÁ XÁC NHẬN CÁC PHƯƠNG PHÁP NHẬN BIẾT GIỐNG SỬ DỤNG AXIT NUCLEIC ĐẶC THÙ Foodstuffs - Principles of selection and criteria of validation for varietal identi f ication methods using specitic nucleic acid 1. Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy đ ị nh kỹ thuật phân tử đ ể lập các hồ sơ phân tử v ề các giống của các loài thực vật cụ thể, đ ể cho phép nhận biết các giống, nghĩa là khẳng đ ị nh việc nhận bi ế t liên quan đến một hoặc nhiều mẫu đối chứng. Tiêu chuẩn này có th ể áp dụng cho các loại nền mẫu khác nhau, các hạt, lá, củ, các sản phẩm công nghiệp của một giống. Các nền mẫu ở dạng hỗn hợp của các giống (nh ư bột nhuyễn, mứt qu ả , bột) không áp dụng tiêu chuẩn này. Tiêu chuẩn này không liên quan đến độ thuần d i truy ề n. 2. Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thi ế t cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công b ố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có). TCVN ISO/IEC 17025:2005, C á c yêu cầu chung về năng lực của các phòng thí nghiệm và hiệu chuẩn. 3. Thuật ngữ và định nghĩa Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và đ ị nh nghĩa sau: 3.1. Thuật ngữ liê n quan đến giống 3.1.1 . Giống cây trồng (cultivar) Nhóm cây trồng có thể được xác định r õ bởi các đặc tính h ì nh thái, vật lý, t ế bào, hóa học hoặc các đặc tính khác, sau khi sinh sản hữu tính hoặc vô t í nh giữ được tính chất đặc thù của nó. [nguồn: ISO 7563:1998, định nghĩa 1.12] CHÚ THÍCH 1: Khái niệm “ giống cây trồng ” khác v ớ i khái niệm “ th ứ” (varietas) trong thực vật học như sau: - “ giống cây trồng ” là đơn vị phân loại dưới loài, kết quả từ ch ọ n I ọ c có ki ể m so át, k ể cả từ thực nghiệm; - “ thứ ” là đơn v ị phân loại d ưới loài, kết quả từ chọn lọc tự nhi ê n. Các thuật ngữ “giống cây trồng ” và “thứ ” (variety) (theo nghĩa của thứ cây trồng) là tương đương. Khi diễn giải hoặc chấp nhận danh pháp thực vật để sử dụng cụ thể, các thuật ngữ “ giống cây trồng ” hoặc “ thứ ” (hoặc các thuật ngữ tương đương bằng ngôn ngữ khác) có thể được sử dụng trong tiêu chuẩn này. CHÚ THÍCH 2: Tên các thứ và các lo à i thực vật sử dụng là t ê n Latinh và được g ọ i l à danh pháp thực vật. 3.1.2 . Loài (species) Nhóm các sinh vật có mức tương đồng di truyền (ADN) cao và có khả năng lai giống cao: thường chứa các phân loài (subspecies), thứ (variety) hoặc nòi (race). CHÚ THÍCH 1: T ê n lo à i được in nghiêng, gồm tên chi cùng với t ê n cụ th ể , v í dụ: Ananas comosus . 3.1.3 . Thứ (variety) Bộ phận duy nhất và cùng kiểu của các loài thực vật (trừ các loài lai) giữ được các đặc tr ư ng của thực vật từ thế hệ này sang th ế hệ khác qua quá trình nhân giống tự nhiên. [Nguồn: ISO 5527: - định nghĩa 2.1.7, được sửa đ ổ i - thuật ngữ khác thích hợp hơn “giống cây trồng ” đ ã bị xóa]. 3.2. Các thuật ngữ liên quan đến chiết và tinh sạch ADN/ARN 3.2.1. Chiết axit nucleic (nucleic acid extraction) Xử lý mẫu để giải phóng axit nucleic đích. CHÚ THÍCH 1. Quy trình chiết axit nucleic được sử d ụ ng đ ể t á ch các axit nu cl eic ra khỏi các thành phần khác nhau của t ế bào, như protein, lipit, cacbohydrat và các chất nhiễm b ẩ n khác có trong mẫu. [Nguồn: TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), đ ị nh nghĩa 3.2.1, đ ã sửa đ ổ i - Chú th í ch 1 đ ã được bổ sung] 3.2.2 . Tinh sạch axit nuc l e i c (nucleic acid purificat i on) Phương pháp l à m ADN sạch hơn CHÚ THÍCH 1: Quy trình hoặc quá trình g ồ m các bước được sử dụng đ ể tách ADN và/hoặc ARN ra khỏi các thành ph ầ n khác c ó trong mẫu. Mẫu ADN hoặc ARN đ ã tinh sạch cao có các ảnh hư ở ng quan sát được hoặc đo đ ư ợc không đáng kể đến các chất ức ch ế phản ứng chuỗi polymerase. CHÚ THÍCH 2: Trong ti ê u chuẩn này, độ tinh sạch li ê n quan đến việc giảm các ảnh hưởng quan sát được và đo được của các ch ất ức ch ế PCR. [Nguồn: TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), định nghĩa 3.2.2, đ ã sửa đ ổ i - Chú thích 1 đã được b ổ sung; Chú thích 2 đ ã sửa đ ổ i]. 3.3 . Các thuật ngữ liê n quan đến khuếch đại PCR của các axit nucleic 3.3.1 . Amplicon (amplicon) Đoạn ADN cụ th ể tạo ra bởi công nghệ khuếch đại ADN, như phản ứng chuỗi polymerase (PCR). 3.3.2 . Lai giống (hybridization) Sự liê n kết cụ thể của các trình tự axit nucleic bổ sung trong các điều kiện phản ứng thích hợp. [Nguồn: TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), định nghĩa 3.6.3] 3.3.3 . PCR đa thành ph ầ n (Multiplex PCR) PCR sử dụng nhiều cặp mồi trong các locus liên kết khác nhau trong một h ỗ n hợp phản ứng đơn lẻ đồng thời đ ể tạo ra các amplicon. [Nguồn: TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), định nghĩa 3.4.11, đã sửa đổi - đoạn sau “mồi ” đã được bổ sung] 3.3.4 . Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) PCR Quy trình sử dụng enzym để khuếch đại ADN in vitro . [Nguồn: TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), định nghĩa 3.4.1] 3.3.5 . Mồi (primer) Oligonucleotid có chiều dài xác định và trình tự bổ sung cho đoạn ADN cần phân tích. [Nguồn: TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), định nghĩa 3.4.12]. 3.3.6 . M ẫ u dò (probe) Phân tử axit nucleic dán nhãn có trình tự xác định được dùng đ ể phát hi ệ n ADN đích bằng lai giống. [Nguồn: TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), định nghĩa 3.6.1, đ ã sửa đ ổ i - thuật ngữ gốc là “ mẫu dò ADN ” ]. 3.3.7 . T í nh đặc thù (speci f icity) Đặc tính của phương pháp tương thích hoàn toàn v ớ i đặc tính hoặc chất phân t í ch trong quá trình nghiên c ứ u. CHÚ THÍCH 1: Đi ề u này m ô tả khả năng nhận bi ế t cụ thể trình tự axit nu cl e i c đ ể phát hiện b ằ ng cách phân biệt với các trình tự axit nucleic khác và xu hướng đối với mồi hoặc mẫu dò để lai với đích của nó và không la i với các trình tự khác không phải đích. [Nguồn: ISO 24276:2006, định nghĩa 3.1.4, đ ã sửa đổi - Chú thích 1 đ ã được bổ sung]. 3.3.8 . Chu trình nhiệt (thermocycler) Thiết bị tự động của phòng thử nghiệm được dùng để tăng và hạ nhiệt độ nhanh của mẫu theo chu kỳ th ô ng qua một loạt các bước rời rạc và đã được cài đặt chương trình trước. 3.4. Các thuật ng ữ liên quan đ ế n phát h iệ n 3.4.1 . Điện di (electrophoresis) Phương pháp tách các hạt điện tích do dịch chuyển điện tích khác nhau của chúng dưới một điện trường. CHÚ THÍCH: Các s ả n phẩm PCR có thể được tách bằng các kiểu điện di khác nhau. 3.5. Các thuật ngữ li ê n quan đ ế n kiểm soát 3.5.1 . M ẫ u chuẩn (reference material/re f erence sample) Vật liệu hoặc chất c ó một hoặc nhiều đặc tính đồng nh ấ t và được thiết lập tốt dùng để hiệu chuẩn thi ế t bị , đánh giá phương pháp đo hoặc đ ể đánh giá vật liệu. CHÚ THÍCH 1 : Mẫu chuẩn có th ể do khách h à ng cung c ấ p đến ph ò ng thử nghiệm hoặc do cơ quan c ó th ẩ m quy ề n ch ỉ đị nh. [Nguồn: TCVN 8890 (ISO Guide 30)] [Nguồn: TCVN 7608:2007 (ISO 24276:2006), định nghĩa 3.5.1 , đã sửa đ ổ i - Ch ú thích 1 đ ã được b ổ sung]. 3.5.2 . Kiểm so á t thử nghiệm (test control) Một hoặc nhiều mẫu thực hiện tất cả hoặc một phần quá trình phân tích đã được thiết kế đối với các mẫu đích và có thể phát hiện các alen tương ứng của các marker được sử dụng, do đó việc phát tín hiệu sai số quá trình bất kỳ và cung cấp các alen đối chứng có thể tạo thuận tiện cho việc đọc kết quả. 3.6 . Thuật ngữ liên quan đến các marker 3.6.1 . Cạnh tranh alen (allele competition) Việc khuếch đại ưu ti ê n của một alen so với alen khác trong d ị hợp tử hoặc hỗn hợp. 3.6.2 . Tần s ố alen (allele f requency) Đại lượng cho b iế t alen có thông dụng trong quần th ể hay không; tỷ l ệ hoặc phần trăm tất cả số lần xuất hiện một locus được chi ế m bởi alen xác định. 3.6.3 . Marker (marker) Marker gen chỉ dùng cho các đoạn ADN phù hợp với locus đã định đ ể cho thông tin về kiểu gen của chất mang hoặc kiểu gen của các locus bên cạnh. 3.6.4 . Alen b ấ t hoạt (Null allele) ế n đổi ngăn ngừa khu ế ch đại PCR của đ í ch cụ thể, dẫn đến không có mặt sản ph ẩ m PCR c ó thể phát hiện được. 3.6.5 . Vùng lặp (repeat region) Vùng gen trong đó trình tự ADN hoặc ARN cụ thể xu ấ t hiện như nhiều bản sao 3.6.6 . Lặp trình tự đơn (simple sequence repeat/SSR) Vùng ADN bao gồm trình tự ngắn (1 bp đến 6 bp) (đơn v ị lặp lại) được lặp lại nhiều lần liền nhau ( đ iển h ì nh từ 5 đến 50). CHÚ THÍCH 1: Các SSR thư ờ ng được bi ế t là c á c v ệ tinh nhỏ. CHÚ THÍCH 2: S ố lượng các đơn vị lặp lạ i th ì hiện SSR quy định, do đ ó tổng chi ề u dài của SSR thường khác nhau giữa các đ ơ n v ị ri ê ng r ẽ . 3.6.7 . Hiện tượng lặp lại của một nucleotid (single nucleotide polymorphism/SNP) Sự biến đổi của một nucleotid trong trình tự gen mà có thể xuất hiện với tần suất lớn trong quần thể. [Nguồn: ISO 25720:2009, định nghĩa 4.23, sửa đ ổ i]. 4. Đảm bảo chất lượng các kết quả thử nghiệm Các yêu cầu và các hướng dẫn nêu trong Bảng 1 được m ã hóa như sau: - C: bắt buộc; - R: khuyến cáo. Bảng 1 - Các y ê u cầu và h ư ớng dẫn về k ế t quả thử nghi ệ m Nhân viên T ấ t c ả nhân viên thực hiện nhiệm vụ cụ thể phải được đ à o tạo th í ch hợp, có ki ế n th ứ c, có kinh nghiệm và/hoặc c ó kỹ n ă ng thành thạo, phù hợp với yêu cầu Ti ê u chí Y ê u cầu (C hoặc R) Đ à o tạo sử dụng thi ế t bị C Xử lý hóa chất C Nhân vi ê n chịu trách nhiệm đưa ra ý kiến và diễn giải phải hi ể u bi ế t v ề các c ấ u trúc gen khác nhau và các h ệ thống sản xuất hạt đ ể cung c ấ p cho khách hàng lời khuyên và/hoặc gợi ý đ ể diễn giải kết quả C Thiết b ị Thực hiện các thao tác bảo dư ỡ ng thiết bị, dụng cụ theo hướng d ẫn của nhà sản xuất. Các hệ thống hiệu chuẩn thiết bị thích hợp phải luôn s ẵ n sàng. Bảo dưỡng thi ế t b ị ch í nh Thiết bị được sử dụng đ ể chuẩn b ị mẫu C V í dụ: máy xay tr ộn Dụng cụ pipet C Nồi h ấ p áp lực d ù ng đ ể khử trùng dụng cụ phòng thử nghiệm, các dung dịch và các đệm khác nhau được sử dụng C Tủ đông để bảo qu ả n dịch chiết, sản ph ẩ m, hỗn hợp v.v... C Tủ lạnh/bộ phận làm lạnh để giữ mẫu chiết, dung dịch và các hóa chất C Thi ế t b ị được sử dụng để thực hiện chu trình khu ế ch đại ADN (chu trình nhiệt , n ồ i cách thủy v.v...) C H ì nh ảnh amplicon và hệ th ố ng ghi (sao chép h ì nh ảnh, máy quét v.v...) C Hệ thống điện di, máy phân tích gen R Thang đo chính xác C Máy đo pH R Robot R Tiện nghi Các biện pháp c ầ n thiết bảo vệ sức khỏe lao động và m ô i trường c ầ n thực hiện R Dụng cụ pipet thực hiện thủ công hoặc tự động dùng cho từng khu vực C Hai khu vực l à m vi ệ c riêng biệt Trước PCR và sau PCR C Thu ố c thử Các sản ph ẩ m được sử dụng không được c ó các nguồn có khả năng làm suy giảm chất lượng hoặc làm nhiễm b ẩ n ADN. T ấ t cả các thuốc thử phải được bảo quản và sử dụng theo chỉ dẫn của nhà sản xuất C 5. Lựa chọn phương pháp Phương pháp luận và marker được sử dụng để nhận bi ế t giống phải đáng tin cậy và thực tế cho phép mỗi phòng thử nghiệm ghi ch ú l ại các sơ đồ marker đơn giản và có độ tin cậy nhất. Việc lựa chọn này yêu cầu áp dụng các ti ê u chí chất lượng, như trong việc chọn các alen đối ch ứ ng và hệ thống phát hiện/ghi lại alen; hệ thống phát hiện phải thích hợp với kích thước của các sản phẩm PCR. Các phương pháp được sử dụng c ầ n được chọn theo marker sẵn có đối với từng loài được nghiên c ứ u. Dưới đây là danh mục tiêu chí quan trọng nhất đ ể chọn phương pháp luận: a) tính sẵn có; b) độ tái lập của dữ liệu được đưa ra giữa các phòng thử nghiệm và n ề n tảng phát hiện (các loại thiết bị được dùng); c) độ lặp lại; d) khả năng phân biệt 6. Chọn marker 6.1. Tiêu ch í chung Tiêu chí chung để chọn bộ marker là: a) mức độ phân biệt dựa theo các giống đối ch ứ ng; b) biến động về độ lặp lại và độ tái lập của bộ marker trong phòng thử nghiệm (xem 8.2.1 và 8.2.2); c) tránh c à ng xa càng tốt các marker đưa ra các alen b ấ t hoạt; d) sự thuận tiện để ghi (scoring). 6.2. Chọn bộ marker Để khẳng định việc nhận biết khi so sánh với một hoặc nhi ề u đối chứng (dòng b ố m ẹ , lai nhân tạo, vô tính), phòng thử nghiệm phải sử dụng bộ marker tạo ra s ố lượng đủ phân biệt của các alen để đáp ứng yêu cầu của khách hàng. Phòng thử nghiệm phải nêu r õ lý do bộ marker được chọn. Các bộ marker cần được phân bố khắp toàn bộ gen khi sơ đ ồ liên kết sẵn có. Mặc dù đây không phải là điều bắt buộc, nhưng r ấ t bổ í ch để hư ớ ng dẫn tránh việc chọn đối với các marker có khả năng liên quan. 6.3. Marker SSR Phép phân tích SSR đầy đủ và có hiệu quả khi chọn các marker chất lượng cao. Việc chọn marker do đó cần như sau: a) phải ưu tiên cho các marker hi ể n thị ít hoặc không có các băng vạch giả; b) việc chọn các marker phải tính đến hệ thống tách và quan sát; c) phải ưu tiên các marker không có mặt alen cạnh tranh và cần cố gắng để loại bỏ bất kỳ sự cạnh tranh giữa các marker trong các l ầ n chạy PCR đa thành phần. 6.4. Nucleotid lặp lại đơn l ẻ (SNP) Phải tránh các vùng lặp lại. CH Ú TH Í CH: Các vùng lặp lại có th ể dẫn đến các alen SNP chi ế m ưu th ế n ế u xuất hiện vi ệ c phát hiện đồng thời vùng tương đ ồ ng. Bản chất của các SNP là chúng có hai trạng thái alen. Không nên chọn các SNP có nhi ề u hơn hai trạng thái alen. Các SNP có thể được ghi lại đáng tin cậy và không phức tạp. Nên để phân tích một số lượng lớn các marker độc lập hoặc thông qua việc ghép để đạt đ ư ợc khả năng phân biệt tốt giữa các gi ố ng. 7. Mẫu phòng thử nghiệm 7.1. M ẫ u Cỡ mẫu và các điều kiện bảo quản trước khi phân tích phải phù hợp với phép phân tích được yêu c ầ u. Cần chú ý về việc nhận biết mẫu, mẫu con và phần mẫu th ử , theo quy định trong 5.8.2 của TCVN ISO/IEC 17025:2005 để đảm bảo việc truy xuất nguồn gốc. 7.2. C ỡ mẫu Để phân tích chất chuẩn, c ầ n bao gồm một lượng đủ các mẫu riêng lẻ để đặc trưng cho đa hình thái giống nội, có t í nh đến các đặc tính tái lập (xem 7.3) và sự hiểu bi ế t khác của các yếu tố đặc thù của giống và/hoặc trồng trọt. Đối với các mẫu thử, khi có thể, n ê n phân tích vài mẫu riêng lẻ hoặc nhiều mẫu chung. 7.3. Mẫu đố i chứng Phải sử dụng mẫu đối chứng (xem 3.5.1) được xử lý theo cùng một phương pháp như đối với mẫu thử. Nếu mẫu đối chứng là khuôn mẫu ADN, th ì thực hiện các bư ớ c tương tự sau khi tách ADN. Sơ đ ồ phân tử thu được trước trong các đi ề u kiện tương tự như áp dụng cho sơ đồ phân tử đối chứng. Các sơ đ ồ marker của mẫu đối chứng có th ể được sử dụng đ ể xây dựng cơ sở dữ liệu trong mỗi phòng thử nghiệm và sau đ ó được sử dụng cho các phép phân t í ch thông dụng. - Các giống lai tạo thực vật (vegetatively reproducing varieties): nh ì n chung, các phép phân tích trên các giống lai tạo thực vật có thể thực hiện sử dụng chỉ một giống, như nhau cho tất cả các giống riêng lẻ; - Các g iố ng tự giao hoặc tự giao ban đ ầ u (primarily autogamous var i eties or pr i marily autogamous varieties): các giống tự giao hoặc tự giao ban đầu kh ô ng nh ấ t thiết phải đơn hình tại tất cả các locus, kể c ả locus SSR hoặc locus SNP. Thông thường nên phân tích một số hạt hoặc cây riêng lẻ để đặc trưng cho tính đa dạng trong một giống cây trồng. Tuy nhiên, một lượng l ớ n các mẫu riêng lẻ có thể được sử dụng để đại diện cho giống. - Các giống trong một qu ầ n th ể : n ê n phân tích các hạt hoặc các cây riêng r ẽ để xác định sơ đồ tần số alen đặc trưng cho mỗi giống trong qu ầ n thể. Phải sử dụng c ỡ mẫu đại diện cũng như cách tiếp cận thống k ê đ ể xác định mức độ tin cậy của các kết quả phù hợp với 9.4. Trong trường hợp n à y , phải sử dụng mẫu đối chứng cho mỗi giống trong qu ầ n thể. - Lai đơn c ố định b ố m ẹ (F1): v ề nguy ê n tắc, c ó thể phân tích chỉ một cá th ể tương tự cho tất c ả các cá th ể . Có thể không đồng nhất, ví dụ: t ừ dị hợp tử c ò n lại của ít nh ấ t một dòng bố m ẹ , sự thụ phấn chéo hoặc trộn lẫn về vật lý. Do đó, việc hướng dẫn là phân tích vài cá thể để đại diện sơ đồ ADN của giống xác định. - Lai ba (3-way hybrids): C ấ u trúc gen của loại lai này cho thấy ba loài khác nhau lai nhau cần thực hiện các phép phân tích tr ộ n hỗn hợp của một số lượng cá th ể th í ch hợp (ít nh ấ t là 20). - Giao ph ố i c ù ng giống hoặc các giống giao ph ối c ù ng giống chính : Nên phân t í ch một lượng hạt hoặc cây trồng riêng lẻ để đặc trưng cho tính đa h ì nh mà có thể c ó trong giao phối cùng giống hoặc giao phối cùng giống chính. Tuy nhiên, mẫu chung của các cá thể cũng có th ể được sử dụng để đại diện cho giống. 8. Đánh giá xác nhận phòng thử nghiệm 8.1. Yêu cầu chung Mỗi phòng thử nghiệm sử dụng ph ư ơng pháp đ ã được xác nhận bằng nghiên cứu li ê n phòng hoặc không thì bằng nghiên cứu nội bộ phòng thử nghiệm. Trong lĩnh vực nhận biết giống marker phân tử trung gian, việc đánh giá phương pháp tương đương với đánh giá xác nhận bộ marker. Phương pháp được đánh giá xác nhận marker bằng marker đối với một loài xác định. Diễn giải và đánh giá xác nhận các kết quả được thực hiện theo Điều 9. Bộ marker phải cung cấp đủ khả năng phân biệt đáp ứng yêu cầu của khách hàng. Phương pháp được đánh giá xác nhận qua toàn bộ quá trình phân tích (trên từng nền mẫu của mỗi loài). 8.2. Tiêu chí đánh giá xác nhận nộ i bộ phòng thử nghi ệ m Việc đánh giá xác nhận bao trùm bộ marker được chọn bởi phòng thử nghiệm theo các tiêu ch í nêu trong Điều 6. Việc đánh giá xác nhận phải bao gồm một số l ư ợng thích hợp các giống khác nhau (ít nhất là năm, n ế u có thể). Đối với các loài có mặt các giống lai th ì n ê n sàng lọc alen cạnh tranh sử dụng các dị hợp tử (cây lai hoặc hỗn hợp ADN bố mẹ) và các dòng bố mẹ, n ế u có thể. 8.2.1. Độ lặp lại Mỗi marker được sử dụng phải cho độ lặp lại. Mục đích là để kiểm tra độ chụm trong các điều kiện giống nhau. Mỗi marker phải được kiểm tra về độ lặp lại trên một lần chiết axit nucleic cho mỗi giống và ba PCR cho mỗi lần chiết. Marker được coi là lặp lại n ế u ba kết quả giống nhau cho mỗi giống được kiểm tra. 8.2.2. Các điều kiện tái lập (hoặc độ chụm trung gian) Mỗi marker được sử dụng phải cho độ tái lập. Mục đ í ch là đ ể kiểm tra độ chụm trong các điều kiện khác nhau. Mỗi marker được kiểm tra về độ tái lập bằng cách cho chạy ba phép thử không đồng thời cho mỗi giống, với một PCR cho ADN chiết được. Mỗi phép thử c ầ n có một số lượng đ ủ các cá thể riêng lẻ hoặc nhiều cá thể trên mỗi giống để công nhận gi ố ng nội lặp lại. Các giống đã biết có các biến thể không b ì nh thường cần loại ra khỏi các phép thử tái lập. Không đồng thời có nghĩa l à mỗi phép thử phải được thực hiện các đi ề u kiện khác nhau (người thực hiện, thi ế t bị, thời gian, thuốc thử v.v...). Marker được coi là tái lập n ế u cho các kết quả giống nhau cho m ỗ i giống qua ba phép thử. 8.2.3. Ph â n biệt Việc sử dụng bộ marker đã đánh giá xác nhận được giới hạn đến các giống có thể phân biệt được. Có một s ố trư ờ ng hợp các giống thu được từ các nhà sản xu ấ t, như chọn lọc tự nhiên hoặc đột biến gây ra hoặc lai lặp lại thì có th ể kh ô ng phân biệt được từ giống ban đ ầ u khi sử dụng một bộ marker cho tất c ả các mục đích. Trong những trường hợp này có thể cần đến các bộ marker bổ sung đặc hiệu hoặc biện pháp bổ sung khác để nhận bi ế t rõ các giống. Những hạn chế đã bi ế t của bộ marker phải được hiểu rõ. 8.2.4. Đánh giá xác nhận khi thay đổi thiết bị hoặc nền mẫu thực vật CHÚ THÍCH: Thi ế t bị bao gồm chu trình nhiệt, p i pet tự động, hệ thống tách và phát hiện. Trư ờ ng hợp có s ự thay đ ổ i thiết bị định kiểu gen, th ì bộ marker đã được đánh giá phải thể hiện lại các đặc t í nh sử dụng A D N từ các giống đã được sử dụng trước đó để đánh giá. Mỗi marker được thử nghiệm qua 1 PCR tr ê n 1 ADN trên ít nh ấ t năm giống khác nhau, nếu có thể. Cho dù có những khác nhau v ề các thông số, như kích thước alen suy ra được khi xác định bằng các bộ thiết b ị khác nhau, th ì các kết luận được rút ra đối với việc nhận biết giống không được thay đổi. 8.3. Các t iê u ch í đánh gi á liên phòng thử nghi ệ m 8.3.1. Y ê u cầu chung Việc đánh giá xác nhận chỉ liên quan đến kết quả. Mỗi phòng thử nghiệm tham gia tự do lựa chọn quy trình phân tích (chiết ADN, tinh sạch axit nu cl eic, cách thức PCR, thiết bị v.v...) trong quá trình thử nghiệm đánh giá liên phòng. Việc tự do lựa chọn này không áp dụng cho việc s ử dụng marker. 8.3.2. Đánh giá xác nhận bằng phép thử nghi ệm liên phòng 8.3.2.1. Y ê u cầu chung Đánh giá xác nhận b ằ ng phép thử nghiệm liên phòng này ph ả i xác định ti ế p quy trình lựa chọn bộ marker mạnh nhất c ó th ể trong số các marker được đánh giá trong quá trình đánh giá n ội bộ ph ò ng trước đó (xem 8.2). 8.3.2.2. Số l ượ ng tối thiểu các phòng thử nghiệm tham gia Việc đánh giá xác nhận mức quốc gia phải í t nhất bốn phòng tham gia (n ế u có th ể ) hoặc ít nhất tám phòng đối với đánh giá ở mức quốc t ế . 8.3.2.3. Vật liệu sinh học Phép thử phải th ự c hiện trên một l ư ợng đủ các giống ( í t nh ấ t là năm, n ế u có thể) khi thực hiện đánh giá ở mức quốc gia (hoặc quốc t ế ) . Số lượng cá thể hoặc các cá thể tr ê n mỗi giống được kiểm tra trên mỗi phòng thử nghiệm tham gia cần đủ đ ể công nhận sự đa h ì nh của giống nội. Các giống được biết có các biến th ể bất thường không được đưa vào sử dụng trong phép thử đánh giá li ê n phòng. CHÚ THÍCH: Vật liệu sinh học c ó th ể là hạt, t ế b à o thực vật, bột. N ế u sử d ụng bột, th ì bột phải c ó xuất xứ t ừ một gi ố ng. 8.3.2.4. Nguy ê n tắc l à m việc Nguyên tắc làm việc, bao g ồ m cả các yêu cầu cơ b ả n đối với PCR, nh ư mồi và trình tự dò, kể cả chất nhuộm màu huỳnh quang, chất l à m tắt, chất gắn kết r ã nh nhỏ và/hoặc các phần thúc đ ẩ y đặc hiệu khác, cũng như các điều kiện khuếch đại PCR được khuyến cáo, phải được cung c ấ p. Các phòng thử nghiệm tham gia có thể điều chỉnh các điều kiện này cho thích hợp với thi ế t bị được sử dụng. Việc bổ sung hoặc loại bớt sự m ở rộng trình tự mồi 5’ hoặc thay đ ổ i các chất nhuộm màu huỳnh quang là cho phép; tuy nhiên không được thay đ ổ i đoạn trình tự mồi đặc hiệu đối với trình tự đ í ch. 8.3.2.5. Chú thích về các kết quả Xem 9.2. 8.3.2.6. Đánh giá xác nhận các marker riêng r ẽ Marker được đánh giá xác nhận khi t ấ t cả các kết quả giống nhau giữa các phòng thử nghiệm đối với tất cả các giống được thử nghiệm. Đối với các marker vệ tinh nhỏ, các k í ch thước tương đối của alen đối với bộ giống đ ã cho phải thống nhất giữa các phòng thử nghiệm. 8.3.2.7. Đánh giá xác nhận phương pháp của phòng thử nghiệm Phương pháp được đánh giá xác nhận khi một lượng đủ các marker tái lập thu được. Phòng thử nghiệm phải xác đị nh số lượng đ ủ các marker. Số lượng marker phụ thuộc vào kiểu marker được sử dụng, các loài và việc ứng dụng. Cần đ á nh giá phương pháp với hệ thống phát hiện được sử dụng trong mỗi phòng thử nghiệm tham gia. 8.3.3. Chuy ể n đổi ph ươ ng pháp Nếu phòng thử nghiệm muốn sử dụng bộ marker đ ã được phòng thử nghiệm khác đánh giá, th ì phải đăng ký trong quy trình đánh giá nội bộ phòng thử nghiệm (xem 8.2). 8.3.4. Thay đổi n ề n mẫu Mọi thay đổi nền mẫu tiềm năng ch ỉ phải đánh giá nội phòng thử nghiệm. CHÚ THÍCH: Thay đổi n ề n m ẫ u nghĩa l à thay đổi một phần b ấ t kỳ của t ế bào ở giai đoạn b ấ t k ỳ . 9. Diễn giải và biểu thị kết quả 9.1. Y ê u c ầ u chung Nên sử dụng các phép thử kiểm chứng l à để hỗ trợ cho việc phát hiện các sai số đọc hoặc sai số thực nghiệm. 9.2. H ệ th ố ng chú thích dữ liệu Khi làm việc với các marker có k í ch thước cơ bản như SSR, th ì n ê n dùng thang ADN thích hợp (chuẩn khối lượng phân tử) để thuận tiện cho việc chú thích dữ liệu. Không sử dụng thang ADN để thay thế phép thử kiểm chứng (xem 3.5.2). Cần quan sát kiểm tra nếu dữ liệu được đọc bằng hệ thống tự động. Việc chú thích tốt nh ấ t là theo định dạng locus alen. Các alen có thể được chú thích sử dụng mã số thông dụng đối với SSR, v í dụ: A, B, C, D v.v...trong đó A là alen nhỏ nh ấ t v.v... Đối với các marker có kích thước cơ bản, nh ư SSR, th ì các kết quả được báo cáo phải bao gồm kích thước dự kiến của mỗi marker. Khi làm việc với các SNP, th ì các kết quả cần được biểu th ị theo ba định dạng như sau: - đồng hợp tử 1 (huỳnh quang 1 hoặc băng 1), viết là A; - đồng hợp tử 2 (huỳnh quang 2 hoặc băng 2), viết là B; - đồng hợp tử 1 và 2 (huỳnh quang 1 và 2 hoặc b ă ng 1 và 2), viết là AB. Phòng thử nghiệm trả các kết quả theo kiểu huỳnh quang hoặc dải huỳnh quang. 9.3. Phân tích k ế t quả Các kết quả có thể biểu thị theo Bảng 2. Bảng 2 - Ví dụ v ề biểu th ị kết qu ả Marker 1 Marker 2 Marker 3 SSR Kích thước dự ki ế n K í ch thước dự ki ế n K í ch thước dự ki ế n SNP A, B, AB A, B, AB A, B, AB Mẫu 1 - - - Chất chuẩn 1 - - - Mẫu 2 - - - Chất chuẩn 2 - - - 9.4. Biểu thị kết quả 9.5. Kiểm tra v iệ c nhận biết 9.6. Sự t ư ơng h ợ p giữa mẫu cần phân tích và mẫu đ ố i chứng Nếu bộ dữ liệu xác định được đối với mẫu trùng kh ớ p ch í nh xác h ì nh dạng quan sát được sử dụng cùng bộ marker trong mẫu đối chứng, th ì báo cáo phải n ê u r õ : “ M ẫ u X giống hệt mẫu chuẩn Y liên quan đến h ì nh dạng phân tử xác định được s ử dụng các marker ADN Z; trong đó X là ký hiệu nhận dạng mẫu, Y là k ý hiệu nhận dạng mẫu đối chứng và Z là tổng số marker được sử dụng ” . 9.4.1.2. Sự kh ô ng t ươ ng hợp giữa mẫu cần phân t í ch và mẫu đố i chứng N ế u dữ liệu marker xác định được đ ố i với mẫu khác với một hoặc nhiều marker từ hình dạng quan sát được sử dụng cùng bộ marker trong mẫu đối chứng, th ì báo cáo phải nêu r õ : “ M ẫ u X khác với mẫu chuẩn Y tại n marker ngoài các marker ADN được xác định ” ; trong đ ó X l à ký hiệu nhận dạng mẫu, Y là ký hiệu nhận dạng mẫu đối ch ứ ng và n là số lượng marker mà ở đó mẫu X khác với mẫu đối chứng Y và Z là tổng s ố marker được sử dụng ” . 9.4.2. H ì nh dạng ph â n tử của các giống Các kết quả có thể được biểu thị theo Bảng 2 (xem 9.3). 10. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ các thông tin sau: a) mọi th ô ng tin cần thi ế t đ ể nhận bi ế t đầy đủ và mẫu thử; b) phương pháp l ấ y mẫu đã sử dụng (n ế u biết); c) ngày nhận mẫu; d) ngày phân tích mẫu; e) ngày báo cáo kết quả; f) phương pháp sử dụng, viện dẫn ti ê u chuẩn này; g) mọi điều kiện thao tác không quy đ ị nh trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, có thể ảnh hư ở ng đến kết quả; h) kết quả thu được (xem 9.4); i) nếu kiểm tra lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được. THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 4995 (ISO 5527), Ngũ cốc - Thuật ngữ và định nghĩa [2] TCVN 9990:2013 (ISO 7563:1998), Rau quả tư ơ i- Thuật ngữ và định nghĩa [3] TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005), Vi sinh v ậ t trong thực ph ẩ m và thức ăn chăn nuôi - Phản ứ ng chuỗi polymerase (PCR) để ph á t hiện và định lượng sinh vật gây bệnh từ th ự c ph ẩ m - Định nghĩa và yêu cầu chung [4] TCVN 7608 (ISO 24276), Thực phẩm - Phương ph á p ph â n t í ch đ ể phát hiện sinh vật biến đổi gen và s ả n phẩm có nguồn gốc bi ế n đổi gen - Yêu c ầ u chung và định nghĩa [5] ISO 25720:2009, Health in f ormatics - Genomic Sequence Var i ation Markup Language (GSVML) [6] TCVN 8890 (ISO Guide 30), Terms and definitions used in connection with re f erence materials