Bundespatentgericht (Bundesrepublik Deutschland, Ordentliche Gerichtsbarkeit)
Urteil vom 2024-05-07, Aktenzeichen 3 Ni 20/22 (EP)
ECLI: ECLI:DE:BPatG:2024:070524U3Ni20.22EP.0

Tenor:
BPatG München, 07.05.2024, 3 Ni 20/22 (EP)
In der Patentnichtigkeitssache
…
betreffend das europäische Patent 2 794 928
(DE 60 2012 056 947)
hat der 3. Senat (Nichtigkeitssenat) des Bundespatentgerichts aufgrund der mündlichen Verhandlung vom 7. Mai 2024 durch den Vorsitzenden Richter Schramm, den Richter Schwarz, die Richterin Dipl.-Chem. Dr. Münzberg, den Richter Dipl.-Chem. Dr. Jäger und die Richterin Dr.-Ing. Philipps
für Recht erkannt:
I. Das europäische Patent 2 794 928 w-ird mit Wirkung für das Hoheitsgebiet der Bundesrepublik Deutschland für nichtig erklärt.
II. Die Beklagte trägt die Kosten des Rechtsstreits .
III. Das Urteil ist gegen Sicherheitsleistung in Höhe von 120 % des zu vollstreckenden Betrages vorläufig vollstreckbar.

Tatbestand:
Die Beklagte ist eingetragene Inhaberin des aufgrund der als WO 2013/096851 veröffentlichten internationalen Anmeldung vom 21. Dezember 2012 unter Inanspruchnahme der Priorität aus der US-amerikanischen Anmeldung US 201161579265 P vom 22. Dezember 2011 mit Wirkung für das Hoheitsgebiet der Bundesrepublik Deutschland in englischer Verfahrenssprache erteilten europäischen Patents 2 794 928 (Streitpatent) mit der Bezeichnung "COMPOSITIONS AND METHODS FOR ANALYTE DETECTION" (in Deutsch laut Streitpatentschrift: "ZUSAMMENSETZUNGEN UND VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON ANALYTEN").
Das beim Deutschen Patent- und Markenamt unter dem Aktenzeichen DE 60 2012 056 947.6 geführte Streitpatent betrifft ein sog. "Multiplex"-Verfahren, mit dem mehrere Analyten, wie DNA oder RNA, in einer Probe, z.B. Blut, Urin oder Gewebe, nachweisbar sind, und umfasst in der erteilten Fassung den Verfahrensanspruch 1 sowie die auf diesen unmittelbar oder mittelbar zurückbezogenen Patentansprüche 2 bis 17. Patentanspruch 1 lautet in der Verfahrenssprache bzw. in der deutschen Übersetzung der Streitpatentschrift wie folgt:
1. A method for detecting a plurality of analytes in a sample, comprising:
a. contacting the sample with a composition comprising a plurality of detection reagents, wherein each subpopulation of the detection reagents targets at least one different analyte, wherein the analyte is fixed on a solid substrate or support and wherein the solid substrate or support is a chip, a microarray, a blotting membrane or a microscopic slide, and wherein each detection reagent comprises:
at least one probe reagent targeting an analyte and at least one nucleic acid label comprising a plurality of predetermined subsequences, wherein said at least one probe reagent and said at least one nucleic acid label are conjugated together; and wherein at least a portion of said plurality of pre-determined subsequences form an identifier of said at least one probe reagent;
b. removing any unbound detection reagents;
c. detecting in a temporally-sequential manner said plurality of pre-determined subsequences of said detection reagent, wherein said detection of the subsequences comprises:
i) hybridizing a set of decoder probes with a subsequence of the detection reagents, wherein each subpopulation of said decoder probes comprises an optical detectable label, each optical detectable label generating an optical signal signature corresponding to each subsequence;
ii) detecting said optical signal signature produced upon the hybridization of said set of decoder probes and obtaining an image;
iii) removing said optical signal signature produced by the hybridization of said set of decoder probes;
iv) repeating steps (i) through (iii) for other subsequences of said detection reagents, thereby producing a temporal order of optical signal signatures corresponding to the plurality of pre-determined subsequences, wherein the temporal order of the optical signal signatures corresponding to said plurality of pre-determined subsequences of said detection reagent identifies a subpopulation of the detection reagents and is unique for each subpopulation of the detection reagents; and
d. comparing said temporal order of the optical signal signatures with different identifiers of said at least one probe reagent, wherein an agreement between the temporal order of the optical signal signatures and a particular identifier of said at least one probe reagent identifies the analyte in the sample.
1. Verfahren zum Nachweis einer Vielzahl von Analyten in einer Probe, umfassend:
a. Kontaktieren der Probe mit einer Zusammensetzung, die eine Vielzahl von Nachweisreagenzien umfasst, wobei jede Teilpopulation der Nachweisreagenzien auf mindestens einen unterschiedlichen Analyten zielt, wobei der Analyt auf einem festen Substrat oder Träger fixiert ist, und wobei das feste Substrat oder der feste Träger ein Chip, ein Mikroarray, eine Blotting-Membran oder ein Objektträger für die Mikroskopie ist, und wobei jedes Nachweisreagenz umfasst:
mindestens ein Sondenreagenz, das auf einen Analyten zielt, und mindestens eine Nucleinsäuremarkierung, die eine Vielzahl von vorbestimmten Teilsequenzen umfasst, wobei das mindestens eine Sondenreagenz und die mindestens eine Nucleinsäuremarkierung miteinander konjugiert sind; und wobei mindestens ein Anteil der Vielzahl der vorbestimmten Teilsequenzen einen Identifikator des mindestens einen Sondenreagenzes bildet;
b. Entfernen jeglicher ungebundener Nachweisreagenzien;
c. Nachweisen der Vielzahl von vorbestimmten Teilsequenzen des Nachweisreagenzes in einer zeitlich aufeinander folgenden Weise, wobei der Nachweis der Teilsequenz umfasst:
i) Hybridisieren eines Satzes von Decodersonden mit einer Teilsequenz der Nachweisreagenzien, wobei jede Teilpopulation der Decodersonden eine optisch nachweisbare Markierung umfasst, wobei jede optisch nachweisbare Markierung eine optische Signalsignatur generiert, die jeder Teilsequenz entspricht;
ii) Nachweisen der optischen Signalsignatur, die bei der Hybridisierung des Satzes von Decodersonden produziert wurde, und Erhalten eines Bildes;
iii) Entfernen der optischen Signalsignatur, die durch die Hybridisierung des Satzes von Decodersonden produziert wurde;
iv) Wiederholen der Schritte (i) bis (iii) für andere Teilsequenzen der Nachweisreagenzien, wodurch eine zeitliche Reihenfolge von optischen Signalsignaturen produziert wird, die der Vielzahl der vorbestimmten Teilsequenzen entsprechen, wobei die zeitliche Reihenfolge der optischen Signalsignaturen, die der Vielzahl der vorbestimmten Teilsequenzen des Nachweisreagenzes entsprechen, eine Teilpopulation der Nachweisreagenzien identifiziert und für jede Teilpopulation der Nachweisreagenzien eindeutig ist; und
d. Vergleichen der zeitlichen Reihenfolge der optischen Signalsignaturen mit unterschiedlichen Identifikatoren des mindestens einen Sondenreagenzes, wobei eine Übereinstimmung zwischen der zeitlichen Reihenfolge der optischen Signalsignaturen und einem speziellen Identifikator des mindestens einen Sondenreagenzes den Analyten in der Probe identifiziert.
Mit ihrer Nichtigkeitsklage begehrt die Klägerin die vollständige Nichtigerklärung des Streitpatents wegen unzulässiger Erweiterung, nicht ausführbarer Offenbarung und fehlender Patentfähigkeit. Die Beklagte verteidigt ihr Patent in der erteilten Fassung sowie jeweils als geschlossene Anspruchssätze in den Fassungen der Hilfsanträge 1 bis 9. Wegen deren jeweiligen Wortlauts wird auf den Schriftsatz vom 26. April 2024 in Verbindung mit den Schriftsätzen vom 11. November 2022 und vom 10. März 2023 verwiesen.
Die Klägerin hat zur Stützung ihres Vortrags u.a. folgende Druckschriften eingereicht (Nummerierung und Kurzzeichen wie von der Klägerin vergeben):
NK3 EP 2 794 928 B1 (Streitpatent)
NK3a EP 2 794 928 B1 (Deutsche Übersetzung des Streitpatents)
NB3 D.Y. Duose et al., Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 7, 3289 bis 3298
NK11 Auszug aus Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, zweite Auflage, 2006, Stichwort "probe”
NK12 J. Göransson et al., Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, No. 1, S. 1 bis 9
NK14 D.Y. Duose et al., Bioconjugate Chem. 2010, Vol. 21, S. 2327 bis 2331
NK16 O. Söderberg et al., Nature Methods, 2006, Vol. 3, No. 12, S. 995 bis 1000
NK20 NEBinspired-blog von N. Kelesoglu, "Proven tips for PCR primer design”, 2021, S. 1/6 bis 6/6
NK21 J. Olejnik et al., Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, No. 15, S. 3572 bis 3576
NK23 WO 03/003810 A2
NK28 S. Müller et al., Chromosome Research, 2002, Vol. 10, S. 223 bis 232
NK33 R. M. Levenson und J. R. Mansﬁeld, Cytometry Part A 69A, 2006, S. 748 bis 758
NK34 P. Capodieci et al., Nature Methods, 2005, Vol. 2, No. 9, S. 663 bis 665
NK35 Auszug aus Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, zweite Auflage, 2006, Stichwort "fluorescence in situ hybridization”
NK36 D. Kosman et al., Science, 2004, Vol. 305, S. 846
NK40 M. Stougaard et al., BMC Biotechnology, 2007, Vol. 7:69, S. 1 bis 10
NK41 A. Lagunavicius et al., RNA, 2009, Vol. 15, S. 765 bis 771
NK42 X. Bai et al., PNAS, 2003, Vol. 100, No. 2, S. 409 bis 413
NK44 W. Schubert et al., Nature Biotechnology, 2006, S. 1 bis 9
NK45 D. K. Zhen et al., Prenatal Diagnosis, 1998, Vol. 18, S. 1181 bis 1185
NK46 K.L. Gunderson et al., Genome Research, 2004, S. 870 bis 877
NK51 US 2010/0120043 A1
NK55 Uppsala Dissertations from the Faculty of Medicine 656, Autorin Ida Grundberg, Titel: Genotyping and Mutation Detection In Situ, 06. Mai 2011, 59 Seiten
NK62 Anordnung des Bankruptcy Court Delaware (USA) vom 6. Februar 2024, Case No. 24-10160 (CTG)
Die Klägerin ist der Auffassung, dass das Verfahren aufgrund der Anordnung des Insolvenzgerichts des Staates Delaware (USA) unterbrochen sei, mit der dieses am 6. Februar 2024 (vgl. NK62) das Chapter-11-Verfahren für die Klägerin, ihre Konzernmutter und ihr Schwesterunternehmen eröffnet hat.
In der Sache selbst macht sie geltend, dass das Streitpatent wegen des Merkmals, wonach der feste Träger neben einem Chip, einem Mikroarray und einer Blotting-Membran auch ein Objektträger für die Mikroskopie sein könne, sowie des weiteren Merkmals betreffend das "Erhalten eines Bildes" mangels entsprechender Ursprungsoffenbarung unzulässig erweitert sei. Des Weiteren sei das patentgemäße Verfahren nicht ausführbar, weil eine Hybridisierung mit, wie beansprucht, einer Decodersonde aus nur einem Nukleotid nicht möglich sei. Schließlich sei das patentgemäße Verfahren gegenüber der NK12 bzw. der NK51 nicht neu. Des Weiteren beruhe das patentgemäße Verfahren gegenüber der NK12 in Kombination mit der NK14 und/oder der NB3, der NK23, der NK44, NK45 und/oder NK46, der NK51 und/oder der NK55 auch nicht auf einer erfinderischen Tätigkeit. Auch in den Fassungen der Hilfsanträge sei das beanspruchte Verfahren nicht schutzfähig.
Die Klägerin beantragt,
das europäische Patent 2 794 928 mit Wirkung für das Hoheitsgebiet der Bundesrepublik Deutschland für nichtig zu erklären.
Die Beklagte beantragt,
die Klage abzuweisen,
hilfsweise die Klage mit der Maßgabe abzuweisen, dass das Streitpatent die Fassung eines der Hilfsanträge 1 bis 9 gemäß Schriftsatz vom 26. April 2024 (jeweils in der Verfahrenssprache) erhält.
Die Beklagte ist der Auffassung, dass eine Unterbrechung mangels internationaler Zuständigkeit des amerikanischen Insolvenzgerichts für die Klägerin nicht eingetreten sei. In der Sache hält sie den Gegenstand des Streitpatents in wenigstens einer der verteidigten Fassungen für schutzfähig, da die Nichtigkeitsgründe der unzulässigen Erweiterung, der nicht ausführbaren Offenbarung und der fehlenden Patentfähigkeit nicht bestünden.

Entscheidungsgründe:
A.
Die Klage ist zulässig.
1. Soweit die Beklagte meint, die Klage sei wegen der anfänglichen unrichtigen Angabe der im Handelsregister eingetragenen Adresse der Klägerin nicht zulässig, ist eine solche Rechtsfolge in § 81 Abs. 5 PatG, welcher den Mindestinhalt der Klage vorsieht, nicht vorgesehen; denn nach § 81 Abs. 5 S. 3 PatG führen formelle Mängel nur zur Nachbesserungspflicht aufgrund einer entsprechenden fristgebundenen Aufforderung des Vorsitzenden; ob bei fruchtlosem Fristablauf die Klage unzulässig wird, bedarf vorliegend keiner Entscheidung, nachdem die Klägerin ihre Anschrift bereits vor einer entsprechenden Anordnung des Vorsitzenden selbsttätig korrigiert hat.
2. Entgegen der Auffassung der Klägerin ist das Verfahren auch nicht nach § 352 InsO wegen der Anordnung des Insolvenzgerichts des Staates Delaware (USA) vom 6. Februar 2024 unterbrochen. Zwar betrifft diese Anordnung, welche einer Eröffnung des Insolvenzverfahrens nach deutschem Recht grundsätzlich gleichsteht (vgl. BGH, Urteil vom 13. 10. 2009 - X ZR 79/06, GRUR 2010, 861 Rn. 9 ff. - Schnellverschlusskappe), auch die Klägerin, bei der es sich um eine Gesellschaft deutschen Rechts handelt. Allerdings treten die Folgen dieser Insolvenzeröffnung nach amerikanischem Recht gem. § 343 Abs. 1 Nr. 1 InsO vorliegend schon deshalb nicht ein, weil eine Anerkennung der aufgrund dieser Anordnung eintretenden Rechtsfolgen mangels internationaler Zuständigkeit des amerikanischen Insolvenzgerichts für die Klägerin nach Art. 3 Abs. 1 Unterabs. 1 und 2 S. 1 EuInsVO, § 3 InsO ausgeschlossen ist; denn der Sitz der Klägerin befindet sich in Deutschland, so dass nach den vorstehenden Vorschriften für Insolvenzmaßnahmen auch nur deutsche Gerichte zuständig sind, die allerdings bislang solche Maßnahmen, die nach § 99 Abs. 1 PatG i.V.m. § 240 ZPO zur Verfahrensunterbrechung führen könnten, nicht erlassen haben. Eine internationale Zuständigkeit des amerikanischen Gerichts ergibt sich auch nicht aus § 3a InsO, da diese Norm zur Verfahrenskonzentration von Insolvenzen mehrerer Konzernunternehmen ungeachtet der Frage, ob sie neben den Bestimmungen der EuInsVO, welche eine entsprechende Vorschrift nicht kennt, überhaupt anwendbar sind, die internationale Zuständigkeit für jedes einzelne Konzernunternehmen (vorliegend also auch für die Klägerin) nach § 3 InsO voraussetzt (vgl. Thole in: Münchener Kommentar zur InsO, 4. Aufl. 2020, § 343 Rn. 27); daran mangelt es aber nach dem Vorstehenden hier.
Aber selbst bei Vorliegen einer Internationalen Zuständigkeit des amerikanischen Insolvenzgerichts schiede eine Unterbrechung nach § 352 InsO auch deshalb aus, weil die Anordnung des amerikanischen Gerichts nach ihrem eindeutigen Wortlaut eine Unterbrechung nur für gegen die jeweilige Insolvenzschuldnerin gerichtete Gerichtsverfahren, also für Passivprozesse, vorsieht, so dass sie den vorliegenden Aktivprozess der Klägerin nicht betrifft; damit schiede aber selbst bei Anerkennung der Insolvenzfolgen der Entscheidung des Insolvenzgerichts des Staates Delaware (USA) vom 6. Februar 2024 eine Unterbrechung nach § 352 InsO aus (so wohl auch BGH, Urteil vom 13. 10. 2009 - X ZR 79/06, GRUR 2010, 861 Rn. 18 - Schnellverschlusskappe).
B.
Die somit zulässige Klage ist in der Sache begründet. Das Streitpatent ist gemäß Artikel II § 6 Absatz 1 Nr. 1 IntPatÜG, Art. 138 Abs. 1 Buchst. a) EPÜ i.V.m. Art. 52, 56 EPÜ für nichtig zu erklären, da sein Gegenstand sowohl in der erteilten Fassung als auch in den Fassungen der Hilfsanträge, mit denen die Beklagte es verteidigt, nicht patentfähig ist.
I.
1. Wie das Streitpatent in der einleitenden Beschreibung ausführt, war bei optischen Multiplex(= mehrfarbigen)-Verfahren im bisherigen Stand der Technik die Zahl der nachweisbaren Analyten in einer Probe durch die verfügbare Anzahl an fluoreszierenden bzw. anderweitig farbgebenden Stoffen, die mit spezifischen Sonden für die einzelnen Analyten verbunden sind, begrenzt. So hätten in einer Probe z.B. nur etwa 4 oder 5 verschiedene Analyten mittels Fluoreszenzfarbstoffen nachgewiesen werden können. Zur Vermeidung dieses Nachteils sei im Stand der Technik bisher auf verschiedenen Wegen versucht worden, die Zahl der in Multiplex-Verfahren verwendbaren Farbstoffe für den optischen Nachweis zahlreicher, in einer Probe enthaltener Analyten zu erhöhen (vgl. NK3, Abs. [0003 bis 0006]).
2. Ausgehend hiervon besteht die objektive Aufgabe, wie das Streitpatent zutreffend ausführt, darin, den geschilderten Nachteil dadurch zu überwinden, dass genaue und sensitive Verfahren für einen Hochdurchsatz-Nachweis, eine Hochdurchsatz-Identifizierung und/oder eine mengenmäßige Bestimmung von Analyten in einer Probe bereitgestellt werden (vgl. NK3, Abs. [0006], letzter Satz).
3. Diese Aufgabe wird durch das im erteilten Patentanspruch 1 beschriebene Nachweisverfahren gelöst, dessen Merkmale in der Verfahrenssprache sowie in deutscher Übersetzung wie folgt gegliedert werden können:
1 A method for detecting a plurality of analytes in a sample, comprising:
Verfahren zum Nachweis einer Vielzahl von Analyten in einer Probe, umfassend:
2 a. contacting the sample with a composition comprising a plurality of detection reagents, wherein
a. Kontaktieren der Probe mit einer Zusammensetzung, die eine Vielzahl von Nachweisreagenzien umfasst, wobei
2.1 each subpopulation of the detection reagents targets at least one different analyte, wherein
jede Teilpopulation der Nachweisreagenzien auf mindestens einen unterschiedlichen Analyten zielt, wobei
2.2 the analyte is fixed on a solid substrate or support and wherein
der Analyt auf einem festen Substrat oder Träger fixiert ist, und wobei
2.3 the solid substrate or support is a chip, a microarray, a blotting membrane or a microscopic slide, and wherein
das feste Substrat oder der feste Träger ein Chip, ein Mikroarray, eine Blotting-Membran oder ein Objektträger für die Mikroskopie ist, und wobei
2.4 each detection reagent comprises:
jedes Nachweisreagenz umfasst:
2.4.1 at least one probe reagent targeting an analyte and
mindestens ein Sondenreagenz, das auf einen Analyten zielt, und
2.4.2 at least one nucleic acid label comprising a plurality of pre-determined subsequences, wherein
mindestens eine Nucleinsäuremarkierung, die eine Vielzahl von vorbestimmten Teilsequenzen umfasst, wobei
2.4.3 said at least one probe reagent and said at least one nucleic acid label are conjugated together; and wherein
das mindestens eine Sondenreagenz und die mindestens eine Nucleinsäuremarkierung miteinander konjugiert sind; und wobei
2.4.4 at least a portion of said plurality of predetermined subsequences form an identifier of said at least one probe reagent;
mindestens ein Anteil der Vielzahl der vorbestimmten Teilsequenzen einen Identifikator des mindestens einen Sondenreagenzes bildet;
3 b. removing any unbound detection reagents;
4 c. detecting in a temporally-sequential manner said plurality of pre-determined subsequences of said detection reagent, wherein
c. Nachweisen der Vielzahl von vorbestimmten Teilsequenzen des Nachweisreagenzes in einer zeitlich aufeinander folgenden Weise, wobei
4.1 said detection of the subsequences comprises:
der Nachweis der Teilsequenz umfasst:
4.1.1 i) hybridizing a set of decoder probes with a subsequence of the detection reagents,
i) Hybridisieren eines Satzes von Decodersonden mit einer Teilsequenz der Nachweisreagenzien,
4.1.1.1 wherein each subpopulation of said decoder probes comprises an optical detectable label, each optical detectable label generating an optical signal signature corresponding to each subsequence;
wobei jede Teilpopulation der Decodersonden eine optisch nachweisbare Markierung umfasst, wobei jede optisch nachweisbare Markierung eine optische Signalsignatur generiert, die jeder Teilsequenz entspricht;
4.1.2 ii) detecting said optical signal signature produced upon the hybridization of said set of decoder probes and obtaining an image;
4.1.3 iii) removing said optical signal signature produced by the hybridization of said set of decoder probes;
4.1.4 iv) repeating steps (i) through (iii) for other subsequences of said detection reagents, thereby producing a temporal order of optical signal signatures corresponding to the plurality of pre-determined subsequences,
iv) Wiederholen der Schritte (i) bis (iii) für andere Teilsequenzen der Nachweisreagenzien, wodurch eine zeitliche Reihenfolge von optischen Signalsignaturen produziert wird, die der Vielzahl der vorbestimmten Teilsequenzen entsprechen,
4.1.4.1 wherein the temporal order of the optical signal signatures corresponding to said plurality of pre-determined subsequences of said detection reagent identifies a subpopulation of the detection reagents and
wobei die zeitliche Reihenfolge der optischen Signalsignaturen, die der Vielzahl der vorbestimmten Teilsequenzen des Nachweisreagenzes entsprechen, eine Teilpopulation der Nachweisreagenzien identifiziert und
4.1.4.2 is unique for each subpopulation of the detection reagents; and
für jede Teilpopulation der Nachweisreagenzien eindeutig ist; und
5 d. comparing said temporal order of the optical signal signatures with different identifiers of said at least one probe reagent,
d. Vergleichen der zeitlichen Reihenfolge der optischen Signalsignaturen mit unterschiedlichen Identifikatoren des mindestens einen Sondenreagenzes,
5.1 wherein an agreement between the temporal order of the optical signal signatures and a particular identifier of said at least one probe reagent identifies the analyte in the sample.
wobei eine Übereinstimmung zwischen der zeitlichen Reihenfolge der optischen Signalsignaturen und einem speziellen Identifikator des mindestens einen Sondenreagenzes den Analyten in der Probe identifiziert.
4. Zuständiger Fachmann ist ein Chemiker oder Biologe mit einem Hochschulabschluss auf dem Gebiet der Biochemie, der über eine mehrjährige berufliche bzw. wissenschaftliche Erfahrung in der Entwicklung von Multiplex-Nachweisstrategien für Biomoleküle verfügt.
Die Erfahrung mit Multiplex-Verfahren kann dem Fachmann dabei nicht abgesprochen werden, da schon lange vor dem Zeitrang des Streitpatents Multiplex-Nachweisverfahren in der Fachwelt bekannt waren und diese auch bereits praktisch angewendet worden sind (vgl. NK28, Titel i.V.m. S. 224, re. Sp., Abschnitt "Multiplex probe composition", erster Satz bzw. NK33, Titel).
Ein Fachmann mit diesen Kenntnissen versteht die auslegungsbedürftigen Merkmale wie folgt:
4.1 Gemäß Merkmal 2.4.2 weist das patentgemäße Nachweisreagenz neben einem Sondenreagenz auch eine Nukleinsäuremarkierung auf, die wiederum eine "Vielzahl" ("plurality") von vorbestimmten Teilsequenzen umfasst. Im Absatz [0112] gibt das Streitpatent zwar an, dass der Begriff "Vielzahl" jede beliebige Anzahl von 1 bis 100 umfassen und damit auch für eine einzige Teilsequenz stehen kann. Davon, dass die Nukleinsäuremarkierung nur aus einer einzigen Teilsequenz besteht, geht der zuvor definierte Fachmann aber nicht aus. Zum einen weist das Streitpatent in Figur 13 zur graphischen Erläuterung der patentgemäßen Lehre bereits auf eine Nukleinsäuremarkierung mit drei Teilsequenzen hin. Zum anderen ist mit einer einzigen Teilsequenz das Merkmal 4.1.4 nicht realisierbar. Dieses fordert eine Wiederholung der in den Merkmalen 4.1.1 bis 4.1.3 vorgesehenen Verfahrensschritte betreffend das Hybridisieren (Merkmale 4.1.1 und 4.1.1.1.), das Detektieren (Merkmal 4.1.2) sowie das Dehybridisieren (Merkmal 4.1.3) von Decodersonden in Verbindung mit einer anderen Teilsequenz. Eine solche Wiederholung setzt somit das Vorliegen von mindestens zwei Teilsequenzen voraus. Außerdem wäre der Begriff Teilsequenz im Merkmal 2.4.2 bedeutungslos, wenn die Nukleinsäuremarkierung nur aus einer einzigen Nukleinsäuresequenz bestehen würde. Dafür, dass der im Merkmal 2.4.2 verwendete Begriff "Vielzahl" für mindestens zwei Teilsequenzen steht, spricht letztendlich auch die Verwendung dieses Begriffs im allgemeinen Sprachgebrauch, in dem der Begriff "Vielzahl" immer dann verwendet wird, wenn das Gegenteil von Einzahl ausgedrückt werden soll, ohne einen bestimmten Zahlenwert anzugeben. Angaben dazu, dass das Streitpatent bei dem Begriff "Vielzahl" vom allgemeinen Sprachgebrauch abweicht, finden sich im Streitpatent nicht.
4.2 Unter einer "Probe" ("sample"), wie sie in den patentgemäßen Merkmalen 1 und 2 genannt wird, versteht der Fachmann aufgrund der Angaben im Absatz [0008] des Streitpatents u.a. eine Protein-haltige "Probe", die auf einem festen Träger immobilisiert ist, aber auch eine "Probe", die eine oder mehrere Zellen, ein oder mehrere Gewebe und/oder eine bzw. mehrere Flüssigkeiten enthält. Derartige biologische "Proben" müssen nicht, können aber nach der Definition des Streitpatents mechanisch aufbereitet (vgl. NK3, Abs. [0049 und 0050]), aber auch chemisch und/ oder biologisch behandelt werden (vgl. NK3, Abs. [0218 und 0219]). Eine solche Probenverarbeitung im patentgemäßen Sinn dient u.a. dem Schutz und/oder der Stabilisierung der Zielanalyten ("target analytes"), oder aber deren Freisetzung aus anderen Bestandteilen der "Probe" (vgl. NK3, Abs. [0219]). Denn soll, wie beim patentgemäßen Verfahren, eine Vielzahl von Analyten spezifisch bestimmt werden, erfordert dies den direkten Kontakt der Analyten mit den Nachweisreagenzien. Der direkte Kontakt der Nachweisreagenzien mit der nativen "Probe", die keiner Probenverarbeitung unterzogen worden ist, ist dagegen aus zweierlei Gründen nicht sinnvoll: Einerseits soll nicht die "Probe" per se nachgewiesen werden, sondern die in ihr enthaltenen Analyten, und zweitens sind Analyten in der nativen "Probe" ohne vorherige Probenverarbeitung für die Nachweisreagenzien oftmals nicht zugänglich, weshalb z.B. regelmäßig Zellaufschlüsse durchgeführt werden müssen, um Analyten in Form von Chromosomen, mRNA oder intrazellulär vorhandenen Proteinkomplexen nachweisen zu können. Demzufolge wird der Begriff "Probe" im Streitpatent als Überbegriff für alle darin enthaltenen Analyten verwendet.
Der Auffassung der Beklagten, dass das im Merkmal 2 vorgesehene Kontaktieren der "Probe" mit einer Vielzahl von Nachweisreagenzien etwas anderes sei als das Kontaktieren mit den Analyten, kann daher nicht gefolgt werden.
Das Argument der Beklagten, dass das Streitpatent gezielt zwischen Zell- und Gewebeproben mit und ohne strukturelle und morphologische Kontextinformationen in Absatz [0214] unterscheide und Analyt und "Probe" deshalb nicht identisch sein könnten, ändert daran nichts. Denn – wie bereits zuvor ausgeführt – bezeichnet das Streitpatent eine "Probe" auch nach einer chemischen und/oder biologischen Behandlung, bei der u.a. die Zielanalyten freigesetzt werden, weiterhin als biologische "Probe" (vgl. NK3, Abs. [0219]). Daraus folgt, dass für die patentgemäße Lehre nicht der stoffliche Zustand der "Probe" von Bedeutung ist, sondern vielmehr der Umstand, dass die "Probe" die Vielzahl an nachzuweisenden Analyten umfasst, so dass die Analyten sowohl in einer künstlichen Umgebung für einen in vitro Nachweis als auch in ihrem nativen Kontext für einen in situ Nachweis vorliegen können.
4.3 Entgegen der Auffassung der Beklagten, dass die Zugabe der Nachweisreagenzien im patentgemäßen Verfahren aufgrund der Angaben in den Merkmalen 2, 3 und 4.1.3 nur einmalig erfolge, schließt das Streitpatent nicht aus, dass die Nachweisreagenzien während des Verfahrens wieder entfernt und die gleichen Nachweisreagenzien vor einer weiteren Detektionsrunde erneut zugegeben werden können.
Eine dauerhafte Verbindung zwischen Analyten und Nachweisreagenzien ist dem Streitpatent an keiner Stelle zu entnehmen. Aus dem erteilten Patentanspruch 1 geht lediglich vor, dass nach dem Entfernen der optischen Signalsignaturen (Merkmal 4.1.3) im nachfolgenden Merkmal 4.1.4 die Schritte (i) bis (iii) der Merkmale 4.1.1 bis 4.1.3 betreffend die Hybridisierung, Detektierung und Dehybridisierung von Decodersonden, wiederholt werden. Eine gleichzeitige, erneute Zugabe der im Merkmal 2 genannten Nachweisreagenzien wird an dieser Stelle nicht erwähnt. Sie wird aber auch nicht ausgeschlossen. Dafür, dass eine erneute Zugabe der Nachweisreagenzien möglich ist, spricht die Tatsache, dass durch den im Merkmal 1 genannten Begriff "umfassend" ("comprising") das patentgemäße Verfahren außer den in den Merkmalen 2 bis 5.1 genannten Schritten noch weitere Schritte aufweisen kann, was durch die Angaben im Absatz [0278] der Beschreibung des Streitpatents bestätigt wird.
Die Beklagte ist demgegenüber der Auffassung, dass sich der erste Schritt des Entfernens im Merkmal 3 nur auf ungebundene Nachweisreagenzien beziehe und der zweite Schritt des Entfernens im Merkmal 4.1.3 nur die Entfernung der optischen Signalsignaturen betreffe, so dass der erteilte Patentanspruch 1 an keiner Stelle eine Entfernung von Nachweisreagenzien vorsehe, die bereits spezifisch an Zielanalyten gebunden seien. Dies werde aus der Sicht der Beklagten auch durch die Beschreibung des Streitpatents bestätigt, in der selbst in dem mit Nachweisreagenzien befassten Absatz [0052] nicht von einer Entfernung der Nachweisreagenzien die Rede sei. Hinzu komme, dass ein zwischenzeitliches Entfernen der Nachweisreagenzien keinen Vorteil biete, da – wie in Absatz [0046] des Streitpatents angegeben – die Kontaktzeit für eine spezifische Bindung zwischen Analyten und Nachweisreagenzien mitunter bis zu 48 Stunden betragen könne.
Diese Betrachtung vermag eine eingeschränkte Interpretation des Wortlauts von Patentanspruch 1 nach Hauptantrag dahingehend, dass dieser ein zwischenzeitliches Entfernen der Nachweisreagenzien ausschließt, nicht zu stützen. Denn zu dem bereits zuvor angesprochenen, im Merkmal 1 enthaltenen Begriff "umfassend" ("comprising"), der eine Limitierung des erteilten Patentanspruchs 1 auf die darin genannten Verfahrensschritte ausschließt, kommt ein weiterer Aspekt hinzu, der für eine breite Auslegung spricht. Das im Merkmal 4.1.3 genannte "Entfernen der optischen Signalsignatur" kann den Angaben im Absatz [0074] des Streitpatents zufolge durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden. Daraus ergibt sich, dass hierfür auch Bedingungen gewählt werden können, welche dazu geeignet sind, die Bindung zwischen Nachweisreagenz und Analyt wieder aufzuheben. Immerhin erfordert Merkmal 4.1.3 Bedingungen, die dazu geeignet sind, die gesamte optische Signalsignatur zu entfernen, also nicht nur die optisch nachweisbare Markierung oder die Decodersonde per se, sondern das komplette Konstrukt aus Markierung und Decodersonde. Dabei kann aus fachlicher Sicht nicht nur die Bindung zwischen Decodersonde und Teilsequenz der Nukleinsäuremarkierung zerstört werden, sondern auch die ebenfalls auf einer klassischen Hybridisierungsreaktion basierende Verbindung zwischen Sondenreagenz und Analyt. Wird diese Verbindung zerstört, müssen vor einer weiteren Detektionsrunde die gleichen Nachweisreagenzien wie zuvor (siehe Merkmale 2 und 2.1) erneut zugegeben werden. Die von der Beklagten angesprochenen Inkubationszeiten ändern daran nichts, da diese den Angaben in der Beschreibung des Streitpatents zufolge beliebig lang sein können und mit diesen demzufolge keinerlei Beschränkung in Verbindung gebracht werden kann (vgl. NK3, Abs. [0046]). Es bleibt somit dabei, dass das Streitpatent eine wiederholte Zugabe von Nachweisreagenzien nicht ausschließt.
4.4 Das Streitpatent selbst enthält keine Definition für den Begriff "in situ". Demzufolge versteht der Fachmann den Begriff im fachüblichen Sinn. Wie dem Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology NK35 im Zusammenhang mit einer in situ durchgeführten Fluoreszenz-Hybridisierung (kurz FISH) zu entnehmen ist, findet die Reaktion dabei im nativen Kontext und somit im strukturellen Umfeld der Zelle statt. Mit dem Begriff in situ wird in der Fachwelt folglich eine Analyse umschrieben, die am natürlichen Ort des Analyten erfolgt und nicht in künstlicher Umgebung wie bei einer in vitro Analyse üblich. Daraus ergibt sich allerdings nicht, dass sich der Analyt zwingend innerhalb einer Zelle befinden muss. Er kann vielmehr auch extrazellulär verortet sein, da das Streitpatent u.a. auch Zelllysate als geeignete biologische Proben erachtet (vgl. NK3, Abs. [0214], Z. 3).
4.5 Merkmal 4.1.4 sagt aus, dass die Hybridisierung, Dekodierung und Dehybridisierung von Decodersonden an mehreren Teilsequenzen der Nachweisreagenzien wiederholt und somit für jeden Analyten eine zeitliche Reihenfolge optischer Signalsignaturen produziert werden soll. Die Reihenfolge optischer Signalsignaturen wird gemäß Merkmal 5 schließlich zur spezifischen Identifikation eines einzelnen Analyten herangezogen. Damit ist aus technischer Sicht die Zuordnung einer einzelnen optischen Signalsignatur, d.h. einer einzigen optisch nachweisbaren Markierung, zu einem Analyten ausgeschlossen. Eine solche Auslegung der Merkmale 4.1.4 und 5 wird durch Absatz [0044] des Streitpatents gestützt.
Nachdem die patentgemäße Lehre somit ein mehrfarbiges, iterativ durchgeführtes Nachweisverfahren betrifft, geht der Fachmann davon aus, dass auch alle in einer Nukleinsäuremarkierung vorhandenen Teilsequenzen nachzuweisen sind (siehe Merkmal 2.4.2) und demzufolge der Nachweis einer einzigen Nukleinsäuremarkierung pro Analyt keinesfalls ausreichend ist. Das Streitpatent sieht in diesem Zusammenhang lediglich vor, dass der Nachweis einer Teilsequenz nicht zwingend ein Farbsignal erfordert, sondern auch "keine Farbe" (= schwarz) bzw. "kein Signal" eine Signalsignatur im patentgemäßen Sinn sein kann, wobei ausgeschlossen wird, dass alle Auslesezyklen dunkel sind (vgl. NK3, Abs. [0113 und 0114]). Daraus ergibt sich für den Fachmann, dass die zeitliche Reihenfolge der optischen Signalsignaturen für jeden Analyten aus mindestens zwei Signalen bestehen muss, wobei aber nicht alle Signale farbig sein müssen.
4.6 Den Begriff "Sondenreagenz" ("probe reagent") wird der Fachmann nicht mit dem Begriff "Analyt" gleichsetzen.
Für den Begriff "Analyt" ("analyte") findet sich in den Absätzen [0210 und 0212] des Streitpatents eine sehr breite, aber dennoch deutliche Definition. Demnach ist ein "Analyt" – auch bezeichnet als "target analyte" oder "target molecule" – dasjenige Molekül, welches durch Bindung des Nachweisreagenzes nachgewiesen, identifiziert oder gemessen werden soll, wobei der "Analyt" Teil einer Probe oder die einzige bzw. wichtigste Komponente der Probe ist. Demzufolge wird der "Analyt" durch das "Sondenreagenz", welches wiederum Teil des Nachweisreagenzes ist, erkannt und geht mit diesem eine Verbindung ein. In Anbetracht dessen können die Begriffe "Analyt" und "Sondenreagenz" nicht als Synonyme erachtet werden, da mit ihnen zwei unterschiedliche Moleküle beschrieben werden.
II.
In der erteilten Fassung beruht das Streitpatent gegenüber dem Stand der Technik nach NK12 in Verbindung mit dem Fachwissen des Fachmanns nicht auf einer erfinderischen Tätigkeit. Ob die weiteren geltend gemachten Nichtigkeitsgründe der unzulässigen Erweiterung, der nicht ausführbaren Offenbarung sowie der mangelnden Neuheit ebenfalls bestehen, kann bei dieser Sachlage daher dahingestellt bleiben.
1. Der wissenschaftliche Artikel NK12 von Göransson et al. aus dem Jahr 2008 ist ein geeigneter Ausgangspunkt, da die Autoren darin ein kombinatorisches Decodierungsschema für eine zielgerichtete digitale Multiplex-basierte molekulare Analyse beschreiben und damit ein Verfahren, welches aus demjenigen Fachgebiet stammt, aus dem auch die patentgemäße Aufgabenstellung abgeleitet wurde (siehe Punkt B.I.2.) (vgl. NK12, S. 1, Abstract).
Göransson et al. erläutern ihr Verfahren anhand einer genomischen Analyse, mit der 36 verschiedene Gen-loci identifiziert werden (vgl. NK12, S. 8, re. Sp., erster vollständiger Satz und Fig. 3C). Die genomische DNA (Probe/Analyt) wird dabei vorab einem enzymatischen Verdau unterzogen und diese damit in kürzere genomische Fragmente überführt. Die so erhaltenen DNA-Fragmente werden anschließend mit Padlock- bzw. Selector-Sonden kontaktiert und auf diese Weise zirkuläre DNA-Fragmente der genomischen DNA erzeugt. Um eine für den optischen Nachweis ausreichende Menge an Zielmolekülen zu erhalten, werden die zirkulären DNA-Fragmente danach mittels einer sog. Rolling-Circle Amplification (kurz RCA) vervielfacht. Die so gewonnenen, in NK12 als Amplified Single Molecules (kurz ASMs) bezeichneten Zielmoleküle (Analyten) werden schließlich auf einem mit poly-L-Lysin beschichteten Objektträger nach dem Zufallsprinzip ("randomly") immobilisiert (vgl. NK 12, S. 4, re. Sp., letzter Abs. i.V.m. Fig. 1A und 3A, jeweils mit dazugehöriger Legende). Damit beschreibt die NK12 eine Probenverarbeitung, wie sie auch die Merkmale 1, 2.2 und 2.3 unter Berücksichtigung der vorangegangenen Auslegung des Begriffs "Probe" (siehe Punkt B.I.4.2), umfassen.
Zur Identifizierung der einzelnen ASMs (Analyten) setzen Göransson et al. sog. "sandwich probes" (Nachweisreagenzien) i.V.m. sog. "tag probes" (Decodersonden) ein, wobei die "tag probes" (Decodersonden) unterschiedliche Fluorophore tragen. Die "sandwich probes" (Nachweisreagenzien) wiederum bestehen aus zwei Abschnitten: Einer 5`-Region, die jeweils zu einem bestimmten ASM (Analyt) komplementär ist (Sondenreagenz) und einer 3`-Region (Nukleinsäuremarkierung), die aus einer Reihe von sog. "decoding tags" (Teilsequenzen) besteht. In den "decoding tags" (Teilsequenzen) erkennt der Fachmann kurze DNA-Abschnitte, da diese mit den "tag probes" (Decodersonden) hybridisieren. Die von Göransson et al. zur Erläuterung ihrer Lehre ausgewählten "sandwich probes" (Nachweisreagenzien) enthalten zwei "decoding tags" (Teilsequenzen), die in NK12 als "tag 1" und "tag 2" bezeichnet werden (vgl. NK12, S. 5, li. Sp., erster bis dritter Satz i.V.m. Fig. 3B mit dazugehöriger Legende). Die "sandwich probes" (Nachweisreagenzien) werden in einem Hybridisierungsschritt über ihre jeweilige 5`-Region (Sondenreagenz) mit einem spezifischen ASM (Analyt) in direkten Kontakt gebracht (vgl. NK12, S. 3, Abschnitt "Hybridization of ASMs"). In Kenntnis dessen liegen für den Fachmann nicht nur die Merkmale 2 und 2.1, betreffend das spezifische Kontaktieren von Nachweisreagenzien mit den unterschiedlichen Analyten einer Probe auf der Hand, sondern auch der Aufbau der in der Merkmalsgruppe 2.4 beschriebenen Nachweisreagenzien. Denn NK12 lehrt mit den darin genannten "sandwich probes" (Nachweisreagenzien) den Einsatz von zweiteilig aufgebauten Nachweisreagenzien im patentgemäßen Sinn, die an ihrem 5`-Ende ein Sondenreagenz aufweisen, welches auf einen Analyten zielt, und an ihrem 3`-Ende eine Nukleinsäuremarkierung besitzen, die aus mindestens zwei Teilsequenzen besteht, was nach der vorangegangenen Auslegung unter Punkt B.I.4.1 einer Vielzahl von vorbestimmten Teilsequenzen gemäß Merkmal 2.4.2 entspricht. Daraus, dass sich die in den "sandwich probes" (Nachweisreagenzien) der NK12 als Sondenreagenz fungierende Einheit am 5`-Ende befindet und die als Nukleinsäuremarkierung fungierenden "tags 1 und 2" am 3`-Ende liegen, wird außerdem deutlich, dass die beiden Einheiten in einem Molekül liegen und somit im Sinne des patentgemäßen Merkmals 2.4.3 miteinander konjugiert sind. In Figur 3B wird dies graphisch dadurch verdeutlicht, dass die "sandwich probe" (Nachweisreagenz) darin als abgewinkelte, durchgehende graue Linie dargestellt wird. Das Merkmal 2.4.4., welches besagt, dass eine Mehrzahl von Teilsequenzen einen Identifikator für mindestens ein Sondenreagenz bildet, wird durch den zuvor geschilderten Aufbau der "sandwich probes" (Nachweisreagenzien) ebenfalls in das Blickfeld des Fachmanns gerückt.
Kein erfinderisches Zutun erfordert im patentgemäßen Verfahren auch das nach wie vor zur Probenverarbeitung gehörende, im Merkmal 3 genannte "Entfernen jeglicher ungebundener Nachweisreagenzien". Denn bei bekannten Multiplex-Nachweisverfahren, wie dem in der NK51 beschriebenen Verfahren, werden überschüssige Sonden ("target-binding probes"), die nicht an Zielmoleküle gebundenen haben, regelmäßig entfernt, bevor die gebundenen Sonden mit Signal-gebenden Sonden ("signal-generating probes") in Kontakt gebracht werden (vgl. NK51, Patentanspruch 26). Bei der Maßnahme im Merkmal 3 handelt es sich mithin um ein fachübliches Vorgehen.
In Kenntnis der NK12 vermögen auch die Hybridisierungs- und Detektionsschritte der Merkmalsgruppe 4 sowie die in den Merkmalen 5 und 5.1 widergegebenen Schritte der optischen Auswertung keine erfinderische Tätigkeit zu begründen, denn auch im Verfahren der NK12 erfolgt dies in einer zeitlich aufeinanderfolgenden Weise, indem eine wiederholte Abfolge von Sonden-Hybridisierungsschritten ("hybridization"), optischer Erfassung von Daten ("imaging") und Dehybridisierungsschritten ("dehybridization") durchgeführt wird (vgl. NK12, Fig. 1B und 1C sowie Fig. 3B und 3C, jeweils mit dazugehöriger Legende).
Ein solcher Ablauf wird in Figur 3B im Detail anhand von vier als "hyb1, hyb2, hyb3 und hyb4" bezeichneten Hybridisierungsschritten verdeutlicht. Im ersten Schritt bindet eine "tag probe" (Decodersonde) mit roter Markierung an eine als "tag 1" bezeichnete Teilsequenz der 3`-Region (Nukleinsäuremarkierung) in der "sandwich probe" (Nachweisreagenz), die ihrerseits über ihr 5`- Ende mit einem spezifischen Analyten verbunden ist. Im zweiten und dritten Hybridisierungsschritt bindet keine "tag probe" (Decodersonde) an eine der beiden "decoding tags" (Teilsequenzen) in der 3`-Region (Nukleinsäuremarkierung) der "sandwich probe" (Nachweisreagenz). Daraus ergibt sich, dass in diesen Schritten keine Farbmarkierung erhalten wird. Gemäß der vorangegangenen Auslegung unter Punkt B.I.4.5 ist der fehlende Farbnachweis in diesen beiden Hybridisierungsschritten aber dennoch als eine optische Signalsignatur im patentgemäßen Sinn zu werten. Im vierten Hybridisierungsschritt bindet schließlich eine "tag probe" (Decodersonde) mit blauer Markierung an "tag 2" (Teilsequenz) in der 3`-Region (Nukleinsäuremarkierung) der "sandwich probe" (Nachweisreagenz). Dabei wird nach jedem Hybridisierungsschritt ein Bild aufgenommen (vgl. NK12, Fig. 3B mit dazugehöriger Legende). In Anbetracht dessen liegen für den Fachmann die Merkmale 4 bis 4.1.2 auf der Hand.
Naheliegend ist für den Fachmann in Kenntnis der NK12 ferner das in Merkmal 4.1.3 vorgesehene Entfernen der optischen Signalsignaturen, die durch die Hybridisierung der "tag probes" (Decodersonden) mit den "decoding tags" (Teilsequenzen) der "sandwich probe" (Nachweisreagenz) produziert wurden. Denn auch in NK12 werden die "tag probes" (Decodersonden) nach jedem Hybridisierungsschritt entfernt. Dieses Vorgehen beschreiben Göransson et al. im Abschnitt mit der Überschrift "Dehybridization of ASMs" (vgl. NK12, S. 3, re. Sp., zweiter vollständiger Abs.).
Nachdem das in Figur 3B von NK12 gezeigte Verfahren – wie zuvor ausgeführt - von vier, in zeitlicher Reihenfolge durchgeführten und jeweils optisch nachgewiesenen Hybridisierungsschritten ausgeht, ist für den Fachmann des Weiteren das in Merkmal 4.1.4 genannte Wiederholen von Hybridisierung, Nachweisen optischer Markierungen und Dehybridisieren von Decodersonden naheliegend (vgl. NK12, S. 5, re. Sp., letzter Abs., erster Satz).
Auch die Merkmale 4.1.4.1 und 4.1.4.2 können in Kenntnis von NK12 für das im erteilten Patentanspruch 1 nach Hauptantrag beschriebene Verfahren keine erfinderische Tätigkeit begründen. Dies ist darauf zurückzuführen, dass Göransson et al. mit ihrem in Figur 3C gezeigten "Decoding scheme" bereits einen Beleg dafür liefern, dass es ihnen mit der zuvor geschilderten, wiederholten zeitlichen Abfolge von Hybridisierung, Bildgebung und Dehybridisierung gelungen ist, für jede der von ihnen untersuchten 36 genomischen Stellen einen eindeutigen Farbcode zu generieren. So entspricht beispielsweise die Farbfolge "Schwarz-Rot-Grün-Schwarz" dem im "Decoding scheme" der Figur 3C als Nummer 1: aufgeführten Genort mit der Bezeichnung ABCC4 und die Farbfolge "Rot-Schwarz-Schwarz-Blau" dem im Figur 3B beispielhaft nachgewiesenen Genort, der in Figur 3C als Nummer 10: aufgeführt und dort als MC2R1 bezeichnet wird. Nichts anderes als die eindeutige Zuordnung eines Farbcodes zu einem spezifischen Analyten sagen die Merkmale 4.1.4.1 und 4.1.4.2 aus.
Die in den Merkmalen 5 und 5.1 beschriebene optische Auswertung lässt sich in Kenntnis von NK12 ebenfalls nicht auf eine erfinderische Tätigkeit zurückführen. Denn in NK12 findet sich bereits der Hinweis, dass die Muster des kombinatorischen Decodierungsschemas als Vektoren dargestellt und somit die für die Vielzahl von ASMs (Analyten) erhaltenen Muster mit dem hierfür erwarteten Muster verglichen werden können, was exakt der in den Merkmalen 5 und 5.1 vermittelten technischen Lehre entspricht (vgl. NK12, S. 3, re. Sp., letzter Abs., Sätze eins bis vier).
2. Die von der Beklagten hiergegen vorgebrachten Argumente vermögen nicht zu überzeugen:
2.1 Die Beklagte geht davon aus, dass die NK12 keine Hinweise für die in den Merkmalen 2 und 2.2 genannten Verfahrensschritte liefere. Bei deren Berücksichtigung müsste aus der Sicht der Beklagten in der NK12 nämlich die genomische DNA mit den "sandwich probes" in Kontakt gebracht (Merkmal 2) und die genomische DNA auf einem festen Träger fixiert werden (Merkmal 2.2). Dies sei jedoch nicht der Fall, da in NK12 in diesen Schritten an Stelle der genomischen DNA die ASMs und damit keine "Probe" im patentgemäßen Sinn verwendet werde.
Dem kann aufgrund der zuvor unter Punkt B.I.4.2 festgestellten Bedeutung des patentgemäßen Begriffs "Probe" nicht gefolgt werden. Demnach kann die "Probe" aufbereitet und chemisch/biologisch behandelt werden, was dazu führt, dass der patentgemäße Begriff "Probe" als Sammelbegriff für alle darin enthaltenen, nachzuweisenden Analyten steht, und zwar unabhängig davon, ob deren Nachweis in vitro oder in situ durchgeführt wird. Die Merkmale 2 und 2.2 fordern demzufolge nicht, dass die räumlichen Informationen vollumfänglich in einer "Probe" erhalten bleiben müssen, sondern umfassen auch Probenverarbeitungsschritte wie in NK12 und lassen daher eine Aufhebung der räumlichen Strukturen in einer "Probe" zu. Die Merkmale 2 und 2.2 sind mithin so weit gefasst, dass sie sich von der in NK12 vermittelten technischen Lehre nicht abgrenzen; sie beinhalten daher auch keine erfinderische Tätigkeit.
2.2 Die Beklagte beanstandet ferner, dass in NK12 keine Anregung dafür zu finden sei, die 5`-Region (Sondenreagenz) der "sandwich probes" (Nachweisreagenzien) so zu konzipieren, dass sie an spezifische Bereiche der genomischen DNA hybridisiere.
Auch dieses Argument vermag nicht zu überzeugen, da es sich bei den ASMs um spezifische Bereiche der genomischen DNA handelt (siehe Punkt B.II.1 Abs. 2) und die "sandwich probes" (Nachweisreagenzien) in ihrer 5´-Region (Sondenreagenz) jeweils so gestaltet sind, dass diese eine Hybridisierung mit einem spezifischen ASM eingehen können (vgl. NK12, S. 5, li. Sp., Satz in Zeilen 5 bis 7 i.V.m. Fig. 3B mit dazugehöriger Legende). Somit erfordert auch die Einhaltung von Merkmal 2.4.1 keine über die in NK12 enthaltenen Informationen hinausgehenden Erkenntnisse, die mit einer erfinderischen Tätigkeit in Verbindung gebracht werden könnten.
2.3 Seitens der Beklagten wurde des Weiteren vorgetragen, dass das Verfah- ren von Göransson et al. eine Rolling-Circle Amplification (RCA) erfordere, um die vorgesehene Fluoreszenz-basierte Detektion überhaupt durchführen zu können, was einen technischen Unterschied zum patentgemäßen Verfahren darstelle.
Die Notwendigkeit einer RCA im Verfahren der NK12 führt nicht zu einem technischen Unterschied, der das Naheliegen des patentgemäßen Verfahrens in Frage zu stellen vermag. Zum einen handelt es sich bei der Durchführung einer RCA um eine in biochemischen Nachweisverfahren fachübliche Methode (vgl. NK55, S. 29, dritter Abs.), die auch im Streitpatent Berücksichtigung findet (vgl. NK3, Abs. [0127]). Zum anderen schließt der erteilte Patentanspruch 1 gemäß Hauptantrag solche zusätzlichen Verfahrensschritte aufgrund der Formulierung von Merkmal 1 als "Verfahren …umfassend" nicht aus (siehe Punkt B.I.4.3, zweiter Abs.). Infolgedessen kann nicht davon ausgegangen werden, dass das patentgemäße Verfahren ohne eine RCA oder eine andere Form der Amplifizierung von Zielmolekülen auskommt und sich daher auf erfinderische Weise vom Verfahren der NK12 unterscheidet.
2.4 Nach Auffassung der Beklagten forderten die Merkmale 2, 2.1, 2.4.2, 3 sowie die Merkmalsgruppe 4 eine Aufrechterhaltung der Bindung zwischen Nachweisreagenz und Analyt während des gesamten Nachweises der vorbestimmten Teilsequenzen, wofür sich in der NK12 keine Anregung finde.
Auch dieses Argument führt zu keiner anderen Einschätzung der Sachlage. Wie schon zuvor unter Punkt B.I.4.3 erläutert, geht es in diesem Zusammenhang nicht darum festzustellen, ob im Streitpatent an einer Stelle eine erneute Zugabe der gleichen Nachweisreagenzien vorgesehen ist, sondern vielmehr darum, ob das Streitpatent eine solche wiederholte Zugabe ausschließt. Ein solcher Ausschluss ist aus den bereits zuvor ausgeführten Gründen aber nicht feststellbar und die Lehre des Streitpatents somit dahingehend zu interpretieren, dass in einem den Merkmalen 2, 2.1 und 3 nachgeschalteten Schritt die gleichen Nachweisreagenzien im patentgemäßen Verfahren erneut zugegeben werden können.
Hinzu kommt, dass der Fachmann der in NK12 zitierten Stelle betreffend die "Dehybridization of ASMs" nicht eindeutig entnehmen kann, ob mit dem darin beschriebenen Dehybridisierungsschritt nur die mit den "decoding tags" (Teilsequenz) in der 3`-Region (Nukleinsäuremarkierung) der "sandwich probes" (Nachweisreagenz) hybridisierten "tag probes" (Decodersonden) entfernt werden, oder sowohl die "tag probes" (Decodersonden) als auch die "sandwich probes" (Nachweisreagenzien). Da sich hierzu weder im weiteren Text noch in den graphischen Darstellungen der NK12 ergänzende Informationen finden, geht der Fachmann davon aus, dass die genannte Zitatstelle beide Optionen einschließt, also eine Entfernung von "tag probes" (Decodersonden) allein oder i.V.m. den "sandwich probes". Dies führt dazu, dass eine anfängliche und damit einmalige Bindung des Nachweisreagenzes an einen Analyten weder im patentgemäßen Verfahren noch im Verfahren der NK12 vorgeschrieben wird, so dass dem patentgemäßen Verfahren auch unter diesem Gesichtspunkt keine erfinderische Tätigkeit zuerkannt werden kann.
2.5 Die Beklagte vertritt ferner den Standpunkt, dass für den Fachmann keine Veranlassung dafür bestanden habe, die Lehre von NK12 und NK51 zu kombinieren.
Dieser Auffassung kann nicht gefolgt werden. Die Lehre der NK51 geht von derselben Problematik wie das Streitpatent aus, wonach in beiden Fällen für den Nachweis einer Vielzahl von Zielmolekülen in einer biologischen Probe nach wie vor genaue, ausreichend sensitive Multiplex-fähige Detektionsmethoden fehlen (vgl. NK3, Abs. [0006], Z. 41 bis 43; NK51, Abs. [0004 und 0005]). Allein die Tatsache, dass die Lehre der NK51 aus dem Jahr 2009 teilweise ein anderes Konzept verfolgt als die Lehre der NK12 aus dem Jahr 2008, ändert nichts daran, dass beide Druckschriften aus dem gleichen Fachgebiet stammen und es sich bei ihnen somit um Literatur handelt, welche der Fachmann zur Lösung der patentgemäßen Aufgabenstellung heranzieht. Einer speziellen Veranlassung bedarf es hierfür nicht.
III.
Die Beklagte kann das Streitpatent auch nicht in einer der Fassungen nach den Hilfsanträgen erfolgreich verteidigen, weil den Fassungen der Hilfsanträge 1 bis 8 jeweils zumindest der Nichtigkeitsgrund der fehlenden Patentfähigkeit entgegensteht, so dass es einer Erörterung ihrer Zulässigkeit sowie der weiteren gegen sie klägerseits geltend gemachten Nichtigkeitsgründe nicht bedarf, und der lediglich klarstellende Hilfsantrag 9 mangels Beschränkung des Erfindungsgegenstandes unzulässig ist.
1. Hilfsantrag 1 unterscheidet sich von der erteilten Fassung durch folgende Änderung der Merkmale 1 und 2.3 sowie die Hinzufügung der Merkmale 6 und 7 im Patentanspruch 1:
1 A method used in (i) immunohistochemistry and/or (ii) fluorescence in situ hybridization for detecting a plurality of analytes in a sample, comprising:
2.3 the solid substrate or support is a chip, a microarray , a blotting membrane or a microscopic slide, and wherein
6 wherein said sample is a biological sample comprising one or more cells and/or one or more tissues; and wherein
7 said analytes are selected from the group consisting of proteins, peptides and nucleic acids, wherein said nucleic acids are selected from the group consisting of cellular RNA, messenger RNA, microRNA, ribosomal RNA, and any combinations thereof.
1.1 Der Hilfsantrag 1 sieht mithin die Umwandlung des patentgemäßen in vitro Verfahrens in ein in situ-Verfahren vor. Hierfür wurde Merkmal 1 auf immunhistochemische Verfahren und/oder Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungs (kurz FISH)-Verfahren beschränkt. Darauf abgestimmt definiert das neue Merkmal 6 die Probe als biologische Probe aus Zellen und/oder Geweben und mit dem neuen Merkmal 7 werden die darin enthaltenen Analyten auf Proteine, Peptide und Nukleinsäuren in Form von verschiedenen RNAs beschränkt.
1.2 Allerdings kann auch diese Variante des patentgemäßen Verfahrens nicht auf eine erfinderische Tätigkeit zurückgeführt werden.
Dabei ist im rechtlichen Ausgangspunkt darauf hinzuweisen, dass nach der Rechtsprechung des Bundesgerichtshofs, die auch auf den hier zu beurteilenden Fall der Stoffchemie anwendbar ist, eine Veranlassung für den Fachmann zum Rückgriff auf allgemeines Fachwissen nur besteht, wenn es sich bei der heranzuziehenden Maßnahme um ein generelles, für eine Vielzahl von Anwendungsfällen in Betracht zu ziehendes Mittel handelt, das seiner Art nach zum allgemeinen Fachwissen gehört, sich die Nutzung der Funktionalität dieses Mittels in dem zu beurteilenden Zusammenhang als objektiv zweckmäßig darstellt und keine besonderen Umstände feststellbar sind, die eine Anwendung aus fachlicher Sicht als nicht möglich, mit Schwierigkeiten verbunden oder sonst untunlich erscheinen lassen (vgl. BGH, Urteil vom 11. März 2014 - X ZR 139/10, GRUR 2014, 647 Rn. 26 - Farbversorgungssystem; Urteil vom 27. März 2018 - X ZR 59/16, GRUR 2018, 716 Rn. 29 - Kinderbett; Beschluss vom 13. Juli 2020 - X ZR 90/18, GRUR 2020, 1074 Rn. 49 - Signalübertragungssystem; Urteil vom 15. Juni 2021 - X ZR 58/19, GRUR 2021, 1277 Rn. 47 - Führungsschienenanordnung).
Übertragen auf den vorliegenden Fall ist diesbezüglich vorab festzuhalten, dass in Fachkreisen neben in vitro durchgeführten Verfahren zum spezifischen und quantitativen Nachweis von Zielmolekülen in einer biologischen Probe, in situ-Verfahren eine besondere Bedeutung zukommt, da mit ihnen zusätzliche Informationen zum nativen Ort der Zielmoleküle in der Probe erhalten werden (vgl. NK35, Stichwort "fluorescence in situ hybridization"). Ein Detektionsverfahren nicht nur in vitro, sondern auch in situ durchführen zu können ist daher ein generelles Ziel und die hierfür notwendigen technischen Maßnahmen hinreichend bekannt (vgl. NK28, S. 223, Abstract und NK34, S. 663, Abstract).
Im Zusammenhang mit der Frage nach der erfinderischen Tätigkeit des im Patentanspruch 1 nach Hilfsantrag 1 beschriebenen in situ-Verfahrens erweist sich die NK12 nach wie vor als ein geeigneter Ausgangspunkt, da die technischen Merkmale 2 bis 5.1 im Verfahren des Patentanspruchs 1 nach Hilfsantrag 1 gegenüber dem in vitro Verfahren des erteilten Patentanspruchs 1 gemäß Hauptantrag unverändert geblieben sind.
Bei dem von Göransson et al. in NK12 anhand einer genomischen Analyse beschriebenen Multiplex-Verfahren, welches im Array-Format durchgeführt wird, handelt es sich unbestritten um ein in vitro-Verfahren.
In NK12 findet der Fachmann darüber hinaus aber auch Hinweise, welche die Möglichkeit in sein Blickfeld rücken, dieses Verfahren als in situ-Verfahren an Zellen und/oder Geweben zum Nachweis einer Vielzahl von Analyten in Form von mRNA oder Proteinen/Peptiden durchführen zu können. Einen ersten Hinweis hierauf findet der Fachmann im letzten Satz des Abstracts von NK12, der besagt, dass die darin vorgestellte Decodierungsstrategie insofern breit anwendbar ist, als das Zielmolekül hierfür jedes Biomolekül sein kann, welches über eine molekulare Sondenreaktion in zirkuläre DNA überführt werden kann. Im letzten Satz des Abschnitts "Discussion" sprechen die Autoren der NK12 dann gezielt die Analyse der Expression von mRNA und Proteinen an. Bekräftigt wird die Möglichkeit einer in situ-Analyse mit dem Verfahren der NK12 durch den weiteren darin enthaltenen Hinweis, den Göransson et al. mit dem Verweis auf die Literatur-Referenz (33) verbinden. Göransson et al. führen aus, dass die für den Erhalt zirkulärer Nukleinsäuren eingesetzten Padlock Sonden bei der Analyse der "mRNA expression" geeignet sind und Proteine in gleicher Weise mittels sog. "Proximity Ligation Assays" (kurz PLA) nachgewiesen werden können (vgl. NK12, S. 7, li. Sp.). Darauf abgestimmt handelt es sich bei der von ihnen zitierten Literatur-Referenz (33) um den vorliegend als Dokument NK16 bezeichneten wissenschaftlichen Artikel von Söderberg et al., der sich mit der in situ-Untersuchung von endogenen Proteinkomplexen befasst. Diese Arbeitsgruppe führt den von ihnen entwickelten in situ-Nachweis mittels "Proximity Ligation Probes" und RCA durch (vgl. NK16, S. 995, Abstract). Die Anwendung dieser Techniken bei in situ-Verfahren weckt eine angemessene Erfolgserwartung beim Fachmann dafür, dass das Multiplex-Verfahren der NK12, welches die gleichen Techniken anwendet, ebenfalls für eine in situ-Analyse genutzt werden kann.
Eine weitere Anregung, die die Erfolgserwartung des Fachmanns stützt, liefert die Druckschrift NK55. In ihrer Doktorarbeit beschreibt Grundberg auf Seite 46, dass sich Padlock-Sonden und Rolling-Circle Amplification in dem von ihr entwickelten Nachweisverfahren als ausgezeichnete Methoden für die in situ-Detektion von Punktmutationen in Onkogenen erwiesen haben (vgl. NK55, S. 46, erster Abs. letzter Satz). Darin erkennt der Fachmann eine Strategie, wie sie auch im in vitro-Multiplex-Verfahren der NK12 Anwendung findet. Daran anschließend stellt sich die Autorin der NK55 die Frage, was im Zusammenhang mit dem von ihr beschriebenen Nachweisverfahren als nächster Schritt unternommen werden soll (vgl. NK55, S. 46, dritter Abs., erster Satz). Eine Anwendungsgrenze für ihr Verfahren sieht Grundberg insbesondere darin, dass es aufgrund der begrenzten Anzahl von verwendbaren Fluorophoren bisher noch nicht als Multiplex-Verfahren eingesetzt werden kann (vgl. NK55, S. 46, dritter Abs., vorletzter Satz). Um dieses Problem zu beseitigen, weist sie in ihrer Doktorarbeit NK55 auf die frühere Studie NK12 von Göransson et al. hin. In dieser ist aus der Sicht von Grundberg unter Verwendung von Padlock-Sonden, sowie einem auf konsekutiven Hybridisierungsschritten basierenden Decodierungsschema der Multiplex-Nachweis einer Vielzahl von Analyten in biologischen Proben bereits gelungen (vgl. NK55, S. 46, dritter Abs., letzter Satz i.V.m. Literatur-Referenz (113)). In Kenntnis dessen hatte der Fachmann eine angemessene Erfolgserwartung dahingehend, dass das in vitro durchgeführte Multiplex-Verfahren der NK12 auch in situ durchführbar ist.
Darin wird der Fachmann zudem durch die Druckschriften NK34 und NK36 bestärkt, die belegen, dass ein Multiplex-FISH Verfahren zum Nachweis von RNA in Geweben schon Jahre vor dem Prioritätstag des Streitpatents angewendet worden ist, so dass der Fachmann den in situ-Nachweis von RNA mit keinerlei Schwierigkeiten in Verbindung bringt (vgl. NK34, S. 663, Abstract i.V.m. Figur 1 mit dazugehöriger Legende und NK36, S. 846, li. Sp., dritter Satz). Ihm war vielmehr bewusst, dass er bei der Entwicklung eines Multiplex-RNA-FISH-Assays mit einem sequentiellen Nachweis gemäß NK12 auf diesen etablierten Techniken aufbauen kann.
Eine Aufrechterhaltung des Streitpatents mit der Anspruchsfassung des Hilfsan-trags 1 scheidet mangels erfinderischer Tätigkeit daher aus.
1.3 Die hiergegen von der Beklagten vorgebrachten Einwendungen vermögen nicht zu überzeugen.
1.3.1 Der Hinweis der Beklagten, dass für das Verfahren nach Hilfsantrag 1 als Proben nur Zellen oder Gewebe in Frage kämen, die NK12 dagegen aber eine Zusammenstellung von DNA-Molekülen in Form von ASMs lehre und somit weder die Verwendung von Zellen bzw. Geweben als Proben, noch den Nachweis von RNA-Molekülen anrege, steht dem Vorstehenden nicht entgegen.
Der von der Beklagten angedeutete Wechsel von den in NK12 verwendeten flüssigen Proben hin zu den festen Zell- und Gewebeproben des Hilfsantrags 1 ist zutreffend, kann aber keine erfinderische Tätigkeit begründen. Denn Göransson et al. erachten ihr Verfahren in Bezug auf die darin verwendbaren Zielmoleküle als "generic” und damit als breit anwendbar (vgl. NK12, S. 1, Abstract). Aufgrund dessen beziehen die Autoren der NK12 außer den von ihnen exemplarisch verwendeten flüssigen Proben mit DNA-Fragmenten in Form von ASMs auch ausdrücklich den uneingeschränkten Nachweis der Expression von mRNA und Proteinen als Zielmoleküle in ihre Überlegungen mit ein (vgl. NK12, Abschnitt "Discussion”, letzter Satz). Dadurch erweitern sie zugleich die Art der in ihrem Verfahren verwendbaren Proben, da der Nachweis von RNA und Proteinen im Stand der Technik bekanntermaßen häufig in situ und damit in Zellen und/Geweben durchgeführt wird (vgl. NK16, Titel und NK34, S. 663, Abstract). Die neu in den Patentanspruch 1 nach Hilfsantrag 1 aufgenommenen Merkmale 6 und 7 gehen folglich nicht auf erfin-derische Tätigkeit zurück.
1.3.2 Auch der Auffassung der Beklagten, gegen ein Naheliegen des in situ Verfahrens nach Hilfsantrag 1 spreche ferner, dass der Fachmann zahlreiche Probleme im Zusammenhang mit einem Nachweis von RNA erwartet hätte, kann nicht gefolgt werden.
Nachdem der Nachweis von RNA mittels FISH als etabliert anzusehen ist und das patentgemäße Verfahren nach Hilfsantrag 1 keine technischen Schritte umfasst, die etwaige Probleme im Umgang mit RNA beseitigen oder abmildern würden, ist davon auszugehen, das mit der Etablierung der RNA-FISH-Technik Probleme, wie das molecular Crowding, bereits gelöst wurden. Der Umgang mit RNA im Zusammenhang mit einem in situ Verfahren konnte die Erfolgserwartung des Fachmanns daher nicht trüben.
1.3.3 Gleiches gilt für den Einwand der Beklagten, dass bei einer Umwandlung des Verfahrens der NK12 auf Zell- und Gewebeproben die nativen Strukturen der Zellen bzw. Gewebe zerstört bzw. beschädigt würden, da diese mit jedem Zyklus aus Hybridisierung und Dehybridisierung immer wieder beeinträchtigt und abgebaut würden.
Bereits 1998 und damit Jahre vor dem Zeitrang des Streitpatents war es allerdings einschlägig tätigen Fachleuten gelungen, dieses Problem soweit zu lösen, dass sie z.B. mit fötalen Zellen in zeitlicher Reihenfolge eine FISH-Analyse neunmal durchführen konnten, wobei mindestens drei verschiedene Sonden gleichzeitig eingesetzt und somit theoretisch 24 chromosomale Verände-rungen nachgewiesen werden konnten (vgl. NK45, S. 1181, Summary i.V.m. S. 1182, li Sp., erster Abs., letzter Satz und Fig. 2 mit dazugehöriger Legende sowie S. 1184, re. Sp., letzter Abs.). Zudem sind im Verfahren des Patentanspruchs 1 nach Hilfsantrag 1 keine Maßnahmen vorgesehen, um den Abbau von Zellen und/oder Geweben zu minimieren. Daher ist im Verfahren nach Hilfsantrag 1 nach wie vor keine erfinderische Tätigkeit erkennbar.
1.3.4 Auch das weitere Argument der Beklagten, dass Padlock-Sonden, wie sie im Verfahren der NK12 verwendet werden, aus fachlicher Sicht für ein in situ-Verfahren ungeeignet seien, was durch die Druckschriften NK40 und NK41 bestätigt werde, vermag nicht durchzugreifen.
Stougaard et al. führen in NK40 zwar aus, dass sich Padlock-Sonden für einen in situ Nachweis von RNA-Molekülen in Gewebe-Schnitten, die als Formalin-fixiertes Paraffin-eingebettets Gewebe vorliegen, nicht geeignet sind (vgl. NK40, S. 2, re. Sp., Abschnitt "Results and discussion”, erster Abs., Z. 10 ff.). Diese Aussage bezieht sich somit einerseits auf eine ganz spezielle Probenart, was den Fachmann folglich nicht dazu veranlasst die Eignung von Padlock-Sonden für in situ-Verfahren grundsätzlich zu verneinen. Andererseits haben die Autoren der NK40 aufgrund der von ihnen geschilderten Problematik für den Nachweis von nicht polyadenylierten RNA Molekülen ein neues Sondenformat entwickelt, welches in NK40 als "Turtle Probes” bezeichnet wird. Dieses neue Sondenformat haben Stougaard et al. zunächst in einem in vitro-Assay erfolgreich getestet und anschließend in einem in situ-Verfahren ebenfalls mit positivem Ergebnis erprobt (vgl. NK40, S. 1, Abstract – "Results” und "Conclusions” i.V.m. S. 4, li. Sp., letzter Abs., erster Satz und S. 5, re. Sp., erster Satz). Dies liefert dem Fachmann eine Anregung dafür, dass ein in vitro erfolgreich durchgeführtes Verfahren auch auf seine Eignung als in situ-Verfahren getestet werden sollte, selbst wenn hierfür z.B. das Format von Sonden angepasst werden muss.
In der Druckschrift NK41 wird die niedrige Effizienz des Detektionsnachweises von etwa 1% für das darin beschriebene, unter Einsatz von Padlock-Sonden und RCA durchgeführte Verfahren nur im Zusammenhang mit dem Nachweis von RNA-Molekülen festgestellt, die in einer einzelnen Zelle jeweils als einzelnes Molekül vorliegen (vgl. NK41, S. 768, spaltenübergreifender Abs.). Das Fehlen einer grundsätzlichen Eignung von Padlock-Sonden und RCA-Technik bei in situ-Nachweisen vermittelt folglich auch dieses Dokument nicht.
Hiervon geht der einschlägig tätige Fachmann auch deshalb nicht aus, weil im Stand der Technik, wie NK55, zugleich Belege dafür existieren, dass es sich bei Padlock-Sonden und RCA um exzellente Werkzeuge z.B. für den in situ-Nachweis von Punktmutationen in Onkogenen handelt (vgl. NK55, S. 46, erster Abs., letzter Satz). Im Übrigen setzt eine angemessen Erfolgserwartung keine 100 %ige Garantie dafür voraus, dass eine Umwandlung des in vitro-Verfahrens nach NK12 in ein in situ-Verfahren zum Nachweis von RNA und/oder Proteinen von vornherein optimale Ergebnisse liefert.
1.3.5 Der Beklagten kann auch nicht dahingehend gefolgt werden, dass Grundberg in NK55 durch ihre Bezugnahme auf NK12 nicht die Absicht geäußert habe, das Verfahren der NK12 in situ durchzuführen, sondern lediglich das Decodie-rungsschema gemäß NK12 zum Nachweis von Padlock-Sonden in ihrem Genotypisierungs- und Mutationsnachweis-Assay zu verwenden.
Nachdem sich Grundberg in NK55 allerdings ausschließlich mit einer in situ-Detektion befasst (vgl. NK55, Deckblatt, Titel), kann die darin geäußerte Überlegung, das Decodierungsschema der NK12 mit dem Detektionsverfahren der NK55 zu kombinieren, nur so verstanden werden, dass Grundberg das Multiplex-Verfahren der NK12 grundsätzlich für eine in situ-Anwendung als geeignet erachtet. Denn immerhin beabsichtigt Grundberg ihre eigenes in situ-Verfahren mit Hilfe des Decodierungsschemas der NK12 erstmals in ein Multiplex-Verfahren überführen zu können (vgl. NK55, S. 46, dritter Abs.). Eine Kombination von in vitro- und in situ-Techniken kommt für Grundberg daher nicht in Betracht und wird infolgedessen auch an keiner Stelle erwähnt.
1.3.6 Schließlich ändert sich auch nichts durch die Ansicht der Beklagten, dass der Fachmann von einer Umstellung des in vitro Verfahrens nach NK12 in ein in situ-Verfahren auch deshalb abgehalten gewesen sei, weil der erste Schritt dieses Verfahrens, betreffend den enzymatischen Verdau der genomischen DNA, zu einem bei in situ-Verfahren nicht akzeptablen Verlust an struktureller Information führe.
Selbst wenn zugunsten der Beklagten davon auszugehen ist, dass der Fachmann die Fragmentierung der genomischen DNA im in vitro-Verfahren der NK12 als wesentlich erachtet, versteht es sich für den Fachmann dennoch von selbst, dass bei einem in situ-Nachweis von RNA und/oder Proteinen/Peptiden ein solcher enzyma-tischer Verdau weder erforderlich noch sinnvoll ist. Anders ausgedrückt gehört die Anpassung der Probenverarbeitung/Probenvorbereitung bei einer Umstellung des in vitro-Verfahrens der NK12 auf ein in situ-Verfahren zur Routinetätigkeit des Fachmanns. Sie stellt daher keine technische Hürde dar, welche ihn davon abhalten würde, die zuvor angesprochenen, in NK12 und NK55 enthaltenen Anregungen für eine Umstellung auf ein in situ-Verfahren zum Nachweis von RNA, Proteinen und/oder Peptiden zu realisieren.
2. Hilfsantrag 2 unterscheidet sich von Hilfsantrag 1 durch folgende Änderung in den Merkmalen 3 und 4 von Patentanspruch 1:
3 b. removing any unbound detection reagents before the detection step c.;
4 c. detecting in a temporally-sequential manner said plurality of pre-
determined subsequences of said detection reagent bound to the
analyte in the sample, wherein
Den Angaben der Beklagten zufolge soll mit diesen Änderungen hervorgehoben werden, dass die Bindung zwischen den Nachweisreagenzien und ihrem jeweiligen Analyten im patentgemäßen Verfahren einmalig hergestellt werde und die Nachweisreagenzien anschließend in zeitlich sequenzieller Weise nachgewiesen würden, woraus sich ein technischer Unterschied gegenüber NK12 ergebe.
Dem kann nicht gefolgt werden. Zum einen lassen die vorgenommenen Änderungen nach wie vor keine dauerhafte Bindung der Nachweisreagenzien an ihrem jeweiligen Analyten erkennen. Zum anderen wurde bereits zuvor unter Punkt B.I.4.3 im Rahmen der Auslegung festgestellt, dass die Merkmale 2, 3 und 4.1.3 eine wiederholte Zugabe der Nachweisreagenzien nicht ausschließen. Die Änderung in Merkmal 3 zur Entfernung jeglicher ungebundener Nachweisreagenzien vor dem Nachweisschritt c. ändert daran nichts, da es sich hierbei um eine fachübliche Maßnahme handelt, die eine erneute Zugabe der Nachweisreagenzien nicht ausschließt (vgl. NK51, Patentanspruch 26). Eine auf erfinderischer Tätigkeit beruhende Abgrenzung von NK12 ist mit den Änderungen im Hilfsantrag 2 auch deshalb nicht möglich, weil selbst die Lehre der NK12 sowohl eine einmalige als auch eine wiederholte Zugabe von Nachweisreagenzien umfasst. Es wird auf die Ausführungen unter Punkt B.II.2.4 verwiesen.
3. Hilfsantrag 3 unterscheidet sich von Hilfsantrag 1 durch folgende Ände-rungen in den Merkmalen 4 und 6 von Patentanspruch 1.
4 c. detecting directly on the sample in a temporally-sequential manner said plurality of pre-determined subsequences of said detection reagent, wherein
6 said sample is a biological sample comprising one or more fixed cells and/or one or more tissues; and wherein
Die in Hilfsantrag 3 vorgesehene ergänzende Angabe, dass der Nachweis "unmittelbar auf der Probe" erfolgt, bei der sich um Zellen handelt, fügt dem patentgemäßen, in situ durchgeführten Verfahren kein weiteres technisches Merkmal hinzu, welches über das allgemeine Können und Wissen des Fachmanns hinausgeht (vgl. NK35, Stichwort "fluorescence in situ hybridization").
4. Hilfsantrag 4 unterscheidet sich von Hilfsantrag 1 durch folgende Ände-rungen in den Merkmalen 4.1.2 und 4.1.4 von Patentanspruch 1:
4.1.2 ii) detecting said optical signal signature produced upon the hybridization of said set of decoder probes at a special location and obtaining an image;
4.1.4 iv) repeating steps (i) through (iii) for other subsequences of said detection reagents, thereby producing at a special location a temporal order of optical signal signatures corresponding to the plurality of pre-determined subsequences, wherein
Die im Hilfsantrag 4 in den Merkmalen 4.1.2 und 4.1.4 nunmehr hervorgehobene räumliche Positionierung der Decodersonden in der Probe ist ein übliches Merkmal von in situ durchgeführten Verfahren und daher für die Begründung einer erfinde-rischen Tätigkeit ebenfalls nicht geeignet (vgl. NK35, Stichwort "fluorescence in situ hybridization").
5. Hilfsantrag 5 unterscheidet sich von Hilfsantrag 4 durch folgende Änderung im Merkmal 1 von Patentanspruch 1:
Zu Hilfsantrag 5 gelten die Ausführungen zu den Hilfsanträgen 1 und 4 entsprechend.
6. Hilfsantrag 6 unterscheidet sich von Hilfsantrag 1 durch folgende Änderung im Merkmal 4.1.3 von Patentanspruch 1:
4.1.3 iii) removing said optical signal signature produced by the hybridization of said set of decoder probes, wherein said removing is performed by cleavage;
Die im Patentanspruch 1 nach Hilfsantrag 6 vorgesehene Verdeutlichung, dass die farbliche Markierung durch Spaltung wieder entfernt wird, geht nicht über das allgemeine Können und Wissen des Fachmanns hinaus. Denn die Druckschriften NK21 und NK42 belegen, dass dem Fachmann zahlreiche, mittels UV-Licht spaltbare Linker bekannt sind, über die Markierungen, wie Fluorophore, von Nukleinsäuren abgespalten werden können (vgl. NK21 und NK42, jeweiliger Titel)
7. Hilfsantrag 7 unterscheidet sich von Hilfsantrag 1 durch folgendes zusätzliches Merkmal 8 im Patentanspruch 1:
8 and wherein each of the pre-determined subsequences of the nucleic acid label can independently have a length of about from about 5 nucleobases to about 30 nucleobases.
Die Druckschriften NK11 und NK20 liefern den Nachweis dafür, dass die im Patentanspruch 1 von Hilfsantrag 7 beschriebenen Teilsequenzen in der Nukleinsäuremarkierung mit einer Länge von jeweils ca. 5 bis 30 Nukleotiden, eine für Primer und Sonden fachübliche Länge im Bereich der Oligonukleotide aufweisen (vgl. NK11, Stichwort "probe", Punkt 3 und NK20, S.3/6, erster Abs.(gutachtlich)).
8. Hilfsantrag 8 unterscheidet sich von Hilfsantrag 7 durch folgendes zusätzliches Merkmal 9 im Patentanspruch 1:
9 and wherein each decoder probe from the set of decoder probes has a length of about 5 to about 30 nucleotides.
Für das zusätzliche Merkmal 9 gelten die Ausführungen zu Hilfsantrag 8 gleichlautend, da die zuvor im Hilfsantrag 8 genannten Teilsequenzen mit einer Länge von ca. 5 bis 30 Nukleotiden für eine Hybridisierung mit dazu komplementären Decodersonden vorgesehen sind. Hieraus folgt, dass Teilsequenzen und Decodersonden die gleiche Länge aufweisen müssen.
9. Hilfsantrag 9 unterscheidet sich von der erteilten Fassung durch folgende Änderung von Merkmal 2.4.2:
2.4.2 at least one nucleic acid label comprising a plurality of, that is at least two, predetermined subsequences, wherein
Mit der Ergänzung in Merkmal 2.4.2 soll die Bedeutung des Begriffs "plurality" definiert werden. Dessen Bedeutung wurde allerdings bereits unter Punkt B.I.4.1 durch Auslegung ermittelt. Demzufolge handelt es sich bei Merkmal 2.4.2 im Hilfsantrag 9 lediglich um eine Klarstellung, die mangels Beschränkung des Erfindungsgegenstandes (§ 64 PatG analog) nicht zulässig ist und daher eine Schutzfähigkeit des Patentgegenstandes nicht begründen kann.
C.
Die Kostenentscheidung beruht auf § 84 Abs. 2 PatG i. V. m. § 91 Abs. 1 ZPO, die Entscheidung über die vorläufige Vollstreckbarkeit auf § 99 Abs. 1 PatG i. V. m. § 709 ZPO.

Rechtsmittelbelehrung:

Zitierte Normen: § 352 InsO
§ 3 InsO
§ 240 ZPO
§ 3a InsO
§ 64 PatG
§ 709 ZPO
§ 81 Abs. 5 PatG
§ 81 Abs. 5 S. 3 PatG
§ 343 Abs. 1 Nr. 1
    InsO
§ 99 Abs.
    1 PatG
§ 6 Absatz 1 Nr. 1 IntPatÜG
§ 84 Abs. 2 PatG
§ 91 Abs. 1 ZPO
§ 99 Abs. 1 PatG

Zitierte Entscheidungen: GRUR 2010, 861
GRUR 2014, 647
GRUR 2018, 716
GRUR 2020, 1074
GRUR 2021, 1277
3 Ni 20/22
23 WO 03/00
51 US 2010/01
X ZR 79/06
X ZR 139/10
X ZR 59/16
X ZR 90/18
X ZR 58/19