TEK GEN HASTALIĞI VE HLA UYUMUNDA PREİMPLANTASYON GENETİK TANI: TEK MERKEZ DENEYİMİ Single Gene Disorder and HLA Matched Preimplantation Genetic Diagnosis: Single Center Experience
TEK GEN HASTALIĞI VE HLA UYUMUNDA PREİMPLANTASYON GENETİK TANI: TEK MERKEZ DENEYİMİ Single Gene Disorder and HLA Matched Preimplantation Genetic Diagnosis: Single Center Experience
Yazar: Alpaslan Pınarlı, Ferda; Kaplanoğlu, İskender; Kahyaoğlu, İnci; Saat, Hanife; Yıldız, Hilal; Harşıt, Songül; Erdoğan, Kadri Murat; Dilbaz, Serdar
Dergi: Bozok Tıp Dergisi, Vol. 9 No. 2, 2019
Anahtar kelimeler: TEK GEN HASTALIĞI VE HLA UYUMUNDA PREİMPLANTASYON GENETİK TANI: TEK MERKEZ DENEYİMİ Single Gene Disorder and HLA Matched Preimplantation Genetic Diagnosis: Single Center Experience

ÖZETAmaç: Preimplantasyon Genetik Tanı (PGT)’da tek gen hastalıkları taraması ile kombine HLA doku tiplemesi tayini TalasemiMajör gibi yaşamı tehdit eden ve kordon kanı ve /veya kemik iliği nakli ile tam olarak tedavi edilebilen genetik hastalıklarasahip çocuklar için etkin bir yöntemdir. Bu çalışmada, Sağlık Bilimleri Üniversitesi Dışkapı Yıldırım Beyazıt Eğitim AraştırmaHastanesi Genetik Tanı Merkezi Preimplantasyon Genetik Tanı Laboratuvarında 2014-2017 Mayıs döneminde çalışılanvakaların verileri sunulmuştur.Gereç ve Yöntem: Laboratuvarımıza Sağlık Bilimleri Üniversitesi Etlik Zübeyde Hanım Kadın Hastalıkları Tüp BebekMerkezinden gelen 6-8 blastomer aşamasındaki 3. Gün embriyolarından alınan biyopsi örneklerinde preimplantasyongenetik tanı uygulamaları yapılan 91 vakanın genetik analiz sonuçları, mutasyon tipleri, implantasyon ve gebelik başarısı ilecanlı doğum oranları değerlendirildi. Biyopsi örneklerine uygulanan lizis işleminin ardından REPLI-g Advanced DNA SingleCell Kit (Qiagen, USA) ile Whole Genom Amplification (Biorad T100, USA) gerçekleştirildikten sonra mutasyonu taşıyanDNA fragmentlerinin ve HBB geni ile ilişkili 11 markırın belirlenebilir seviyeye kadar multiplex Polimeraz Zincir Reaksiyonu(PZR) ile çoğaltılması yapıldı. Amplifikasyondan sonra DNA, normal DNA fragmentlerini mutasyonu taşıyan fragmentlerdenayırt etmeye olanak sağlayan mini-sekanslama tekniği ile kapiller elektroforez kullanılarak analiz edildi. Seçilmiş LinkedMarkerlar (STR: Short Tandem Repeat/ Kısa tekrar dizileri) mutasyonun tanısı için bir destek oluşturma ve bazı DNAkontaminasyonlarının belirlenmesi amacıyla kullanıldı. HLA tipleme analizlerinde uyumlu HLA genotiplerinin belirlenmesiiçin HLA kompleksi ile ilişkilendirilen 32 markır, multipleks PZR ile çalışılarak DNA fragmentleri kapiller elektroforezkullanılarak analiz edildiBulgular: 86 vaka Beta Talasemi (HBB geni) , bir vaka Orak Hücreli Anemi (HBB geni), bir vaka Blackfan Diamond Anemisi(RPS19 geni), bir vaka akut lenfoblastik lösemi, bir vaka Ağır Konjental Nötropeni (HAX1 geni) ve bir vaka Fankoni AplastikAnemisi (FANCA geni) olmak üzere toplamda 91 vaka çalışıldı. Toplam çalışılan blastomer sayısı 328, transferi yapılan vakasayısı 41, gebelik gerçekleşen vaka sayısı 12, gerçekleşen canlı doğum sayısı 8 ve kemik iliği nakil işlemi yapılan vaka sayısı 6olarak saptandı. Canlı doğumların tümünde gerçekleştirilen ikinci genetik analizde sağlıklı/taşıyıcı gen ve HLA tipinde hastakardeş ile tam uyum görüldü.Sonuç: Sonuçlarımız kemik iliği nakli ile tam kür sağlanan genetik hastalıkların tedavisinde ailede sağlıklı ve HLA uyumluçocuk varlığının önemi açısından anlamlıdır. Diğer preimplantasyon genetik test uygulanan hastalıklarla karşılaştırıldığındatransfer edilebilir blastomer bulma oranının düşük olduğu görülmüş ve bunun blastomerde iki farklı genetik seçilimyapılması gerekliliğinden kaynaklandığı düşünülmüştür.Anahtar Kelimeler: Preimplantasyon genetik tanı; HLA uyumu; Tek gen hastalığı; Multipleks polimeraz zincir reaksiyonu;Kısa tekrar dizileri markırı; DNA sekans analiziABSTRACTPurpose: Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) of single gene disorders combined with HLA typing is an effectivemethod for life-threatening genetic diseases such as Beta thalassemia major which can be treated with bone marrowtransplantation. The aim of this study is to present the data of the cases evaluated between May 2014-May 2017 in the PGDLaboratory of Genetic Diagnosis Center, Dışkapı Yıldırım Beyazıt and Research Hospital, Health Sciences Faculty.Material and Methods: We evaluated the results of genetic analysis, the success of implantation and pregnancy, and therate of live births of 91 cases which was biopsied from blastomeres of 6-8 stage of the 3th day embryos. After the WholeGenome Amplification with REPLI-g Advanced DNA Single Cell Kit (Qiagen, USA) preceded by the lysis of biopsy samples,DNA fragments and HBB related 11 markers were amplified until the predicted level with polymerase chain reaction (PCR).After the amplification, DNA was analyzed with mini-sequencing technique using capillary electrophoresis in order todistinguish normal DNA fragments from the mutated ones. Selected linked markers were used to support the diagnosisof mutation and determinate DNA contaminants. HLA complex related 32 markers were studied with multiplex PCR andDNA fragments were analyzed using capillary electrophoresis in order to determinate compatible HLA genotypes in HLAtyping analyses.Results: We studied a total of 91 cases consisting of 86 cases of beta thalassemia (HBB gene), one case of sickle celldisease (HBB gene), one case of acute lymphoblastic lymphoma, one case of severe congenital neutropenia (HAX1 gene)and one case of Fanconi aplastic anemia (FANCA gene). The total number of blastomeres studied were 328, 41cases weretransferred, and there were 12 successful pregnancies with 8 live births. There were also 6 cases which were treated withbone marrow transplantation. The second genetic analysis of all live births revealed that healthy/carrier gene and HLAtyping of affected sibling was full matched.Conclusion: Our results have significant importance for the treatment of genetic disease which cure is possible with bonemarrow transplantation in the presence of HLA matched sibling. The rate of transferable blastomere were lower than othergenetically tested diseases; however, the reason of this difference was probably the necessity of making two differentgenetic selections.Key words: Preimplantation Genetic Diagnosis, HLA Matching, Single Gene Disorder, Multiplex polimeraz chain reaction,Short Tandem Repeat Marker, Sequence analysis DNA

ÖZETAmaç: Preimplantasyon Genetik Tanı (PGT)’da tek gen hastalıkları taraması ile kombine HLA doku tiplemesi tayini TalasemiMajör gibi yaşamı tehdit eden ve kordon kanı ve /veya kemik iliği nakli ile tam olarak tedavi edilebilen genetik hastalıklarasahip çocuklar için etkin bir yöntemdir. Bu çalışmada, Sağlık Bilimleri Üniversitesi Dışkapı Yıldırım Beyazıt Eğitim AraştırmaHastanesi Genetik Tanı Merkezi Preimplantasyon Genetik Tanı Laboratuvarında 2014-2017 Mayıs döneminde çalışılanvakaların verileri sunulmuştur.Gereç ve Yöntem: Laboratuvarımıza Sağlık Bilimleri Üniversitesi Etlik Zübeyde Hanım Kadın Hastalıkları Tüp BebekMerkezinden gelen 6-8 blastomer aşamasındaki 3. Gün embriyolarından alınan biyopsi örneklerinde preimplantasyongenetik tanı uygulamaları yapılan 91 vakanın genetik analiz sonuçları, mutasyon tipleri, implantasyon ve gebelik başarısı ilecanlı doğum oranları değerlendirildi. Biyopsi örneklerine uygulanan lizis işleminin ardından REPLI-g Advanced DNA SingleCell Kit (Qiagen, USA) ile Whole Genom Amplification (Biorad T100, USA) gerçekleştirildikten sonra mutasyonu taşıyanDNA fragmentlerinin ve HBB geni ile ilişkili 11 markırın belirlenebilir seviyeye kadar multiplex Polimeraz Zincir Reaksiyonu(PZR) ile çoğaltılması yapıldı. Amplifikasyondan sonra DNA, normal DNA fragmentlerini mutasyonu taşıyan fragmentlerdenayırt etmeye olanak sağlayan mini-sekanslama tekniği ile kapiller elektroforez kullanılarak analiz edildi. Seçilmiş LinkedMarkerlar (STR: Short Tandem Repeat/ Kısa tekrar dizileri) mutasyonun tanısı için bir destek oluşturma ve bazı DNAkontaminasyonlarının belirlenmesi amacıyla kullanıldı. HLA tipleme analizlerinde uyumlu HLA genotiplerinin belirlenmesiiçin HLA kompleksi ile ilişkilendirilen 32 markır, multipleks PZR ile çalışılarak DNA fragmentleri kapiller elektroforezkullanılarak analiz edildiBulgular: 86 vaka Beta Talasemi (HBB geni) , bir vaka Orak Hücreli Anemi (HBB geni), bir vaka Blackfan Diamond Anemisi(RPS19 geni), bir vaka akut lenfoblastik lösemi, bir vaka Ağır Konjental Nötropeni (HAX1 geni) ve bir vaka Fankoni AplastikAnemisi (FANCA geni) olmak üzere toplamda 91 vaka çalışıldı. Toplam çalışılan blastomer sayısı 328, transferi yapılan vakasayısı 41, gebelik gerçekleşen vaka sayısı 12, gerçekleşen canlı doğum sayısı 8 ve kemik iliği nakil işlemi yapılan vaka sayısı 6olarak saptandı. Canlı doğumların tümünde gerçekleştirilen ikinci genetik analizde sağlıklı/taşıyıcı gen ve HLA tipinde hastakardeş ile tam uyum görüldü.Sonuç: Sonuçlarımız kemik iliği nakli ile tam kür sağlanan genetik hastalıkların tedavisinde ailede sağlıklı ve HLA uyumluçocuk varlığının önemi açısından anlamlıdır. Diğer preimplantasyon genetik test uygulanan hastalıklarla karşılaştırıldığındatransfer edilebilir blastomer bulma oranının düşük olduğu görülmüş ve bunun blastomerde iki farklı genetik seçilimyapılması gerekliliğinden kaynaklandığı düşünülmüştür.Anahtar Kelimeler: Preimplantasyon genetik tanı; HLA uyumu; Tek gen hastalığı; Multipleks polimeraz zincir reaksiyonu;Kısa tekrar dizileri markırı; DNA sekans analiziABSTRACTPurpose: Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) of single gene disorders combined with HLA typing is an effectivemethod for life-threatening genetic diseases such as Beta thalassemia major which can be treated with bone marrowtransplantation. The aim of this study is to present the data of the cases evaluated between May 2014-May 2017 in the PGDLaboratory of Genetic Diagnosis Center, Dışkapı Yıldırım Beyazıt and Research Hospital, Health Sciences Faculty.Material and Methods: We evaluated the results of genetic analysis, the success of implantation and pregnancy, and therate of live births of 91 cases which was biopsied from blastomeres of 6-8 stage of the 3th day embryos. After the WholeGenome Amplification with REPLI-g Advanced DNA Single Cell Kit (Qiagen, USA) preceded by the lysis of biopsy samples,DNA fragments and HBB related 11 markers were amplified until the predicted level with polymerase chain reaction (PCR).After the amplification, DNA was analyzed with mini-sequencing technique using capillary electrophoresis in order todistinguish normal DNA fragments from the mutated ones. Selected linked markers were used to support the diagnosisof mutation and determinate DNA contaminants. HLA complex related 32 markers were studied with multiplex PCR andDNA fragments were analyzed using capillary electrophoresis in order to determinate compatible HLA genotypes in HLAtyping analyses.Results: We studied a total of 91 cases consisting of 86 cases of beta thalassemia (HBB gene), one case of sickle celldisease (HBB gene), one case of acute lymphoblastic lymphoma, one case of severe congenital neutropenia (HAX1 gene)and one case of Fanconi aplastic anemia (FANCA gene). The total number of blastomeres studied were 328, 41cases weretransferred, and there were 12 successful pregnancies with 8 live births. There were also 6 cases which were treated withbone marrow transplantation. The second genetic analysis of all live births revealed that healthy/carrier gene and HLAtyping of affected sibling was full matched.Conclusion: Our results have significant importance for the treatment of genetic disease which cure is possible with bonemarrow transplantation in the presence of HLA matched sibling. The rate of transferable blastomere were lower than othergenetically tested diseases; however, the reason of this difference was probably the necessity of making two differentgenetic selections.Key words: Preimplantation Genetic Diagnosis, HLA Matching, Single Gene Disorder, Multiplex polimeraz chain reaction,Short Tandem Repeat Marker, Sequence analysis DNA