Escherichia coli Ekspresyon Plazmiti pTolT’nin Nokta Mutasyonu Yöntemiyle Moleküler Modifikasyonu
Molecular Modification of Escherichia coli Expression Plasmid pTolT by Point Mutation Method
Yazar: Ulusu, Yakup
Dergi: Avrupa Bilim ve Teknoloji Dergisi No. 17, 2019
Anahtar kelimeler: Engineering ; Mühendislik ; pTolT,Point Mutation,Escherichia coli,Recombinant Protein ; pTolT,Nokta Mutasyonu,esherichia coli,rekombinant protein

Bakteriler rekombinant protein üretimi için kolay kültür edilmeleri, basit yapıları ve genetik manipülasyonlara açık olmaları nedeniyle en çok tercih edilen konakçılardandır. Özellikle Escherichia coli en yaygın olarak kullanılan prokaryotik konakçı olarak pek çok araştırmada karşımıza çıkmaktadır. Tüm bu avantajlarının yanında, yabancı proteinlerin yüksek miktardaki üretimleri, Escherichia coli’de inklüzyon cisimciklerinin oluşmasına veya toksik etkilere neden olabilmektedir. Bu problemlerin aşılması amacıyla geliştirilen pTolT ekspresyon vektörü heterolog proteinlerin Escherichia coli periplazmik bölge proteini TolAIII ile birlikte üretilmesine imkân sağlamaktadır. Bununla birlikte TolAIII proteininde 31 ve 56. pozisyonda bulunan sisteinler bu sistemle üretilen diğer proteinler ile istenmeyen disülfit köprüleri kurarak rekombinant proteinin aktivitesi üzerine etki etmektedir. Bu çalışmanın amacı TolAIII proteininde bulunan sisteinlerin kaldırılarak yerine serin amino asitlerinin getirilmesidir. In vitro nokta mutasyonu tekniği, gen klonlama ve ekspresyon stratejilerinin düzenlenmesi amacıyla vektör DNA dizilerinin modifiye edilmesinde, protein yapı ve fonksiyon çalışmalarında ve genetik araştırmalarda sıklıkla kullanılan gelişmiş bir tekniktir.  Bu teknikte mutajenik primerler vasıtasıyla polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) işlemi ile kalıp plazmid DNA’nın birçok yeni kopyasını meydana getirilir. Sunulan çalışmada QuikChange site-directed mutagenesis metoduyla TolAIII gen dizisinde C31S ve C56S mutasyonları gerçekleştirilmiştir. DNA sekans analizi sonuçları ile teyit edilen mutasyonun ardından elde edilen yeni plazmid pTolT Delta olarak adlandırılmıştır.  Böylece bu çalışma ile geliştirilen yeni ekspresyon sistemi ile üretilecek rekombinant proteinlerin doğal üç boyutlu konformasyonlarını kazanmaları daha kolay olacaktır.

Bacteria are among the most preferred hosts for their easy culture conditions, simple structure and allowing genetic manipulations for recombinant protein production. Escherichia coli is the most widely used prokaryotic host in many studies. In addition to all these advantages, the high amount production of foreign proteins can cause inclusion bodies or toxic effects in Escherichia coli. The pTolT expression vector developed to overcome these problems allows the production of heterologous proteins with the Escherichia coli periplasmic region protein TolAIII. However, cysteines in positions 31 and 56 of the TolAIII influence the activity of the recombinant protein via unwanted disulfide bridges with other proteins produced by this system. The aim of this study was to remove cysteines in TolAIII protein and replace serine amino acids. The in vitro point mutation technique is an advanced technique that is frequently used for modifying vector DNA sequences, protein structure and function studies, and genetic research to regulate gene cloning and expression strategies. In this technique, polymerase chain reaction (PCR) by mutagenic primers produces many new copies of the template plasmid DNA. In the present study, C31S and C56S mutations in the TolAIII gene sequence have been performed by QuikChange site-directed mutagenesis method. Following the mutation confirmed by DNA sequence analysis results, the obtained new plasmid was called pTolT Delta. Thus, it will be easier for the recombinant proteins to be produced with the new expression system developed by this study to acquire their natural three-dimensional conformation.