Büyük Mikyasta Şap Virusu İstihsalinde BHK-21 (Yavru Hamster Böbreği) Hücre Kültürünün Kullanılması Üzerinde Çalışmalar
Studıes On Bhk-21 Cell Culture For The Large Scale Productıon Of Foot-And-Mouth Dısease Vırus
Yazar: Okay, Güngör; Girard, H.c.; Sütçü, M.; Şentürk, M.; Oral, Macit; Boz, Cemil; Bayramoğlu, Orhan; Yalım, Nejdet; Ünlüleblebici, Necati; Süer, İlhan; Anter, Cumhuriye
Dergi: Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi, Vol. 3 No. 7-8, 1969
Anahtar kelimeler: Veterinary Sciences ; Veteriner Bilimleri ; Şap Virus,Şap,Virus,Hücre Kültürü,Hamster Böbreği

BHK- 21 Hücre Dizisi % O.S Lactalbumin hydrolysate, % 0.01Yeast extr-act ve % 10 Sığır serumu .ihtiva eden Hanks' DengeliTuz Soh.ısyonu (HYL) içinde önce manolayer sabit hücre kültürlerindetiretilmiştir.Vasattan Yeast extract ' çıkarıldığında BHK- 21 · hücresini üretmekmümkün olamamış ve BHK hücresinin HYL ı vasatında üretilmesindeYeast extract ilavesinin şart olduğu anlaşılmıştır.Manolayer üremeye adapte olmuş hücre Bellco cihazı ve NewBrunswick fermentörleri~1de seri pasajlar yapı~arak . suspansiyonkültürüne adapte edilmiştir. Susparisiyon hücre kültürü çalışmalaı·ında, üremenin 24. cü saatinde vasat % 1 Tryptose PhosphateBroth ile takviye edilmiştir.New Brunswick fermentörlernide pH . ayarlaması 24. cü saattenitilxiren 300 cc/ dakika superfisiyal steril· hava verilerek yapılmıştır.Suspansiyon ~ültürü çalışmalarında başlangıç hücre sayısı1.0- 1.2 X lOS /ml olduğu haller de, 48 saate, 2- 3 misli çoğalma eldeeelilmesine rağmen, 5.0 X 104 hücre/ml ile başlandığında ortalama5 misli üreme elde edilmiştir. Başlangıç hücre· sayısının fazla olduğubirinci durumda 24. cü saatten itibaren pH kontrolü ele güçleşmiştir.Halbuki, 5.0 x 104 hücre/ml ile başlandığında superfisiyalhava vermekle pH .7.2 -7.4 arasında tutulabill!lektedir.Rolling sistemde kültür hazırla,nabilmesi için enkubasyonun48. ci saatinde toplanan hÜcre suspansiyonu bir gece + 4 oc de bekletilerekhücreler dibe çöktürülmüş, ertesi günü, üstteki mayiaıılarak, dibe çöken hücreler % 10 sığır -serumlu HYL vasatındaW.OOO hücre/ ml olacak şekilde sulandırılmış, 1 litre kapasiteli yuvarlakşişelere 150 ml tevzi edilerek rolling sistem etüvüne koyulmuştur.Hücrenin üreyip şişe sathını tamamen kaplaması 3 gün içindeolmaktadır. Bunu takiben şişelerdeki vasat boşaltılmış ve 0.1TCDso virus/hücre olacak şekilde (Dana böbreğii1e veya BHK hücresine5-6 pasajcia adapte olmuş virus) virus ilave edilen HYLvasatından herbir şişeye 100 ml konularak enfeksiyonun 30. cusaatinde toplanmıştır. Bu anda hücreler şişe satlımdan tamamenkalkmış bulunmaktadır.Aşı istihsalinde kullanılacak bu virus önce % ı nisbetinde chloroform'lakarıştınlıp bir gece + 4 oc de bekletilerek, ertesi gün,10.000 rpm de santrifüj edilmiş; aynı işlem ikinci defa % 0.6 nisbetindechloroform'la tekrarlanmıştır. Aşı hazırlanmadan evvelayrıca , Seitz K- S klarifiye filtre kağıdından süzülmüştür.Virusun BHK hücresinde enfektivite titresi CPE test'i ile,areton ı B le muamele4en önce, (AT) ve sonra (ATAT) antij~niktitreleri de semi- kantitatif complement- fixation test' i ' ile ' yapılmıştır.5 ml lik sığır aşı dozuna 2 ml virus ilave edilmiştir.Aşılar formulle inaktive olup, adjuvant olarak sapanin kullanılmıştır.Virusun enfektivite ve antijenik titreleri ile eprüvasyon sonuçlarıçok tatminkar olup, (Tablo : ı) de gösterilmiştir

BHK- 21 cell was first grown in manolayer stationary culturesusing Hanks' BSS cont8ining 10% bovine serum, 0.01 % yeastextract, and ·0.5% lactalbumin hydrolysate (HYL).These cells did not grow in Hanks' lactalbuınin medium withoutyeast extract. So yeast extract must be considered as anessential part for BHK cell development in Hanks' lactalbuminmedium.BHK- 21 cell adapted to manolayer culture was then seriallypassed in Bellco apparatus and in New Brunswick fermentors toadapt to suspension culture.HYL medium was supported with 1 % tryptose phosphate1Jroth added at the 24 th hour of culture.The pH of the suspension, in New Brunswick fermentors,was adjusted with sterile air on the surface, after 24 hour of incubation,at the ratio of 300 cc/minute.When the initial cell count was 1.0 to 1.2 X 10'/ml, the cellsincreased only 2- 3 times, but when the initial cell number wasonly 5.0 X HY1 /ml the increase was an average of 5 times. In the first case, when initial cells were more concentrated, the pH wasdifficult to regulate at the second day of incubation, whereas, inthe later case with the addition of air on the surface, the pH between7.2-7.4 was easier.The cell suspension was harvested at the 48 th hour of ineuhationand left overnight at + 4 ·c for sedimentation.To carry out the rolling flask manolayer cell culture, the supernatantof suspended cell culture was decanted, and the cellswere diluted to 50.000/ml in HYL medium containing ıo %' bovineserum, then ıso ml put into each ı litre capacity rolling flask andplaced in the incubator. The confluency ·of the cells was almost100% on the 3 rd day. For virus culture, the growth medium isremoved and replaced with 100 ml of HY~, without serum, containingvirus (either calf kidney virus or virus adapted With 5-6passages to BHK cells) in amount of o.ı TCDso/cell., The virus was harvested at the 30 th hours of infection. Atthis time, there was a nearly complete lysis of cellular monolayer.This vaccine virus was then treated with ı % chloroform andkept overnight at + 4 ·c; the next morning it was centrifuged at10,000 rpm in a Westfalia separator, the same treatment was repeatedwith 0.6% chloroform. The virus was then filtered throughSeitz K- 5 clarifying filter pad.Infectivity titer of the virus was carried out on the BHK cellc.ultures grown in tubes according to the CPE of the ·virus, antigenicitybefore (AT) and after areton 113 treatment (ATAT) weredetermined by semi- quantitative complement- fixation test.S ml cattle dose of vaccine contained 2 ml of virus.The vaccines were formalin inactivated at 26 ·c ·for 48 hoursand contained saponin as adjuvant.The infectivity· and antigenic titers of vaccine viruses and theresults of vaccine challenges were very satisfactory as shown in(Table : 1)