Procion brown MX5-BR and procion green H-4G bağlı pHEMA sorbentlerinin lizozim enziminin saflaştırılmasında kullanımı ve saflık derecesinin YBSK'da tayini
The Use of procion brown MX5-BR and procion green H-4G immobilized pHEMA sorbents in the purification of the lysozyme enzyme and determination of purity degree of the lysozyme by HPLC
Yazar: MELTEM YILMAZ
Danışman: PROF.DR. YAKUP ARICA
Kırıkkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2003
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada, yumurta beyazından doğrudan lizozim enziminin saflaştırılması için, yeni bir boya ligand afinite kromatografisi yöntemi geliştirildi. Destek materyali olarak, pHEMA membranlan kullanıldı. pHEMA destek materyali, y 2-hidroksietilmetakrilat (HEMA) monomerinden, a-a -azoizobütironitril (AIBN) başlatıcısı varlığında, azot ortamında, UV ışığmda fotopolimerizasyon yöntemi ile hazırlandı. Boya ligand olarak, reaktif triazin grubu bir boya olan Procion Brown MX-5BR (Reactive Brown 10) ve Procion Green H-4G (Reactive Green 5) reaktif boyaları, alkali ortamda nükleofilik yer değiştirme reaksiyonuyla, pHEMA üzerine kovalent olarak bağlandı ve afinite sorbent olarak, lizozim enziminin saflaştırılmasında kullamldı. Kesikli sistemde bu afinite adsorbentleri üzerine farklı pH'larda farkb miktarda lizozim içeren sulu ortamdan lizozim adsorpsiyonudavranışı incelendi. Lizozimin afinite adsorbentlerine adsorpsiyonu için optimal pH değeri, 4,0-8,5 değerleri arasında araştırıldı. Sıcaklık ve iyonik şiddetin, adsorbentlerin, adsorpsiyon kapasiteleri üzerindeki etkisi belirlendi. Reactive Brown 10 ve Reactive Green 5 bağlı pHEMA membranlarının lizozimi adsorpsiyon kapasitesi, sırasıyla 60,56 ve 80,21 mg/ml olarak belirlendi. pHEMA membranınuı lizozim adsorpsiyon kapasitesi 1,87 mg/ml olarak bulundu. Reactive Brown 10 ve Reactive Green 5 boya ligandı immobilize edilmiş pHEMA membranlarının lizozim adsorpsiyonunun, pHEMA membranlarından, sırasıyla, yaklaşık 32,4 ve 42,9 kat fazla olduğu görüldü. Lizozim adsorpsiyonu için optimum pH değerinin 7,0 olduğu gözlendi. Yumurta beyazından doğrudan lizozim enziminin saflaştırılması sonuçları YBSK ile tayin edildi. Procion Brown 10 ve Reactive Green 5 ligandı bağlı membranlann, lizozim enziminin yumurta akından saflaştırılmasında kullanılmasından sonra, lizozim erızirninin 0,5 M NaCl ile elüsyonları yapıldı. Lizozimin yumurta akından saflaştırma oranı, Reactive Brown 10 bağlı sorbentler için %63,4 ve Reactive Green 5 bağlı sorbentler için %77,2 olarak bulundu. Anahtar Kelimeler : Boya-ligand, Yumurta beyazı, pHEMA, Membran, Lizozim

Abstract:
In this study, for direct purification of lysozyme enzyme from egg white, a new dye ligand affinity chromatography method was developed. pHEMA membranes were used as support material. It was prepared from 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) via UV initiated photo-polymerization, in the presence of an initiator a-a'-azoisobutyronitrile (AIBN) in the nitrogen atmosphere. Procion Brown MX-5BR (Reactive Brown 10) and Procion Green H-4G (Reactive Green 5) which are reactive triazine dyes, were covalently attached onto pHEMA membrane by nucleophilic substitution reaction in the base medium and were used in the purification of lysozyme enzyme as affinity sorbents. Behaviour of lysozyme adsorption onto these affinity adsorbents, from aqueous solutions containing mdifferent amounts of lysozyme at different pH, was investigated in a batch system. The optimal pH values for adsorption of lysozyme on the affinity adsorbents, were investigated in the pH range of 4,0-8,5. The effects of temperature and ionic strength, on the adsorption capacities of the adsorbents, were determined. The lysozme adsorpsion capacities of the Reactive Brown 10 and Reactive Green 5 immobilized pHEMA membranes, were found as 60,56 and 80,21 mg/ml, respectively. The adsorpstion of the lysozyme on the plain pHEMA membrane, was found as 1,87 mg/ml. Lysozyme adsorptions of Reactive Brown 10 and Reactive Green 5 dye ligands immobilized pHEMA membranes, were greater than the lysozyme adsorption of plain pHEMA membranes about 32,4 and 42,9 times, respectively. The optimum pH value of the lysozyme adsorption, was observed as pH 7,0. The results of direct lysozyme enzyme purification from egg white were determined by HPLC. After usage of Reactive Brown 10 and Reactive Green 5 immobilized membranes in the purification of the lysozyme enzyme from the egg white, lysozyme enzyme was eluted by 0,5 M NaCl solution. The removal ratios for the Reactive Brown 10 and Reactive Green 5 immobilized sorbents, were 63,4% and 77,2%, respectively. Keywords: Dye-ligand, Egg white, pHEMA, Membrane, Lysozyme