Krusifer grubu sebzelerin tohumlarından (karaturp, alabaş ve lahana) sülforafanın yeşil yöntemler kullanılarak ekstraksiyonu ve optimizasyonu
Extraction of sulforaphane with green methods from the seeds of the cruciferous vegetables (blackradish, kohlrabi and cabbage) and optimization
Yazar: RABİA AKÇAY
Danışman: PROF. DR. FİGEN ERTEKİN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Teknolojisi Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Lahana = Cabbage ; Mikrodalgalar = Microwaves ; Sülforafan = Sulforaphane ; Turpgiller = Crucifers ; Ultrases dalgaları = Ultrasound waves ; Özütleme = Extraction

Özet:
Yapılarında doğal olarak bulundurdukları biyoaktif bileşikler sayesinde sağlığın korunmasında büyük bir öneme sahip olan bitkiler, insan beslenmesinde de önemli bir yere sahiptir. Bileşiminde çeşitli biyoaktif bileşikleri ve yüksek miktarda sülforafan içeren Brassica grubu sebzelerin tüketilmesi, kronik hastalık riskinin azalmasıyla ilişkilendirilmiştir. Sülforafan, sağladığı antikanser, antimikrobiyal, antiinflamatuar ve daha birçok etki sayesinde son zamanlarda üzerinde çok fazla çalışılan bitkisel bileşenlerden birisidir. Çalışma kapsamında, sağlık üzerine birçok olumlu etkisi bulunan sülforafan bileşiğinin, krusifer grubu sebze tohumlarından (karaturp, alabaş ve lahana) en yüksek sülforafan içeriğine sahip materyalden ekstraksiyonu hedeflenmiştir. Aynı zamanda, en yüksek sülforafan dönüşümünü sağlayan hidroliz işlem koşulunun (süre ve sıcaklık) ve en yüksek sülforafan miktarını veren çözgen/su konsantrasyonunun belirlenerek, ekstraksiyon yöntemlerine özgü işlem değişkenlerinin (süre, çözgen/katı oranı, genlik ve güç) sülforafan miktarı ve enerji tüketimi üzerindeki etkisini incelemek amacıyla, üç farklı ekstraksiyon yöntemi ile (mikrodalga ekstraksiyon, ultrases ekstraksiyon ve hibrit mikrodalga ve ultrases ekstraksiyon) sülforafan ekstraksiyonu gerçekleştirilmiştir.

Öncelikle krusifer grubu lahana, karaturp ve alabaş tohumlarından en yüksek sülforafan içeriğine sahip materyal incelenmiş ve lahana tohumunun en yüksek sülforafan miktarına sahip olduğu belirlenmiştir. Ayrıca elde edilen ekstraktlarda, düşük pH ve demir iyonları varlığında oluşan ve sağlık üzerine olumlu bir etkisi olmayan sülforafan nitril miktarıları GC/MS cihazı kullanılarak analiz edilmiştir.    Hidroliz işlem koşulu olan süre ve sıcaklığın, mirosinaz enzimini aktive ederek, sülforafan dönüşümünün sağlanması üzerine etkisi incelenmiş ve bu amaçla farklı sıcaklık (20, 25, 35 ve 45 °C) ve süre (30 ve 45 dk, 1, 2 3 4 ve 5 saat) koşulları denenmiş ve hidroliz işlemleri boyunca örneklere 1:2 katı/su (w/v) oranı ve pH:7 sabit olarak uygulanmıştır.  Hidroliz işlem denemeleri sonucunda en yüksek sülforafan dönüşümünün 25 °C sıcaklıkta 1 saat süre boyunca gerçekleştiği saptanmıştır. Ayrıca elde edilen ekstraktlarda sülforafan nitril analizleri gerçekleştirilmiştir. Çözgen konsantrasyonunun sülforafan ekstraksiyonunda etkili bir parametre olması nedeniyle, farklı oranlarda çözgen konsantrasyonları (%80 etil asetat + %20 su, %65 etil asetat +%35 su, %50 etil asetat +%50 su, %35 etil asetat +%65 su ve %20 etil asetat + %80 su) denenmiş ve ve yeşil ekstraksiyon hedeflendiğinden %65 etil asetat+%35 su konsatrasyonu ile maksimum su kullanımında maksimum sülforafan ekstraksiyonu gerçekleştirilmiştir.

Ekstraksiyon işlemlerinin ikinci basamağında ise mikrodalga, ultrases ve hibrit ultrases ve mikrodalga ekstraksiyon yöntemleri çalışılmış, yönteme özgü işlem değişkenlerinin (süre, çözgen/katı oranı, genlik ve güç) maksimum sülforafan konsantrasyonu hedeflenenrek optimizasyonu amaçlanmıştır. Bu amaçla mikrodalga ekstraksiyon yönteminde CCRD, ultrases ekstraksiyon yönteminde Box-Behnken ve hibrit ultrases ve mikrodalga ekstraksiyon yönteminde ise klasik deneme deseni kullanılarak denemeler gerçekleştirilmiştir. Yanıt yüzey yöntemi kullanılarak ekstraksiyon işlem koşulları, maksimum sülforafan konsantrasyonu ve kabul edilebilir enerji tüketim değeri yanıt olarak seçilerek optimize edilmiştir. Modele göre belirlenen optimum işlem koşulları ile optimum noktanın deneysel olarak doğrulanması için üç deneme yapılmıştır. Ayrıca optimizasyon aşamasında elde edilen ekstraktlarda GC/MS cihazı ile sülforafan nitril, ekstraksiyon verimi, toplam fenolik madde miktarı ve antioksidan aktivite (FRAP, DPPH ve IC50) analizleri gerçekleştirilmiştir.

Gerçekleştirilen optimizasyon çalışmalarında maksimum sülforafan miktarı ve kabul edilebilir enerji tüketim değeri, mikrodalga ekstraksiyon yönteminde 100 W güç, 3 dakika süre ve 25.94:1 çözgen/katı oranında; ultrases ekstraksiyon yönteminde %40.24 genlik, 5.21 dakika süre ve 24.02:1 çözgen/katı oranında, hibrit ultrases (%40 genlik) ve mikrodalga (100 W güç) ekstraksiyon da sabit 25:1 çözgen/katı (v/w) oranınında, 2.41 dakika ultrases süresi ve 1 dakika mikrodalga süresinde bulunmuştur. Ekstraksiyon işlemleri sırasında sıcaklıklar kontrol edilmiş ve mikrodalga cihazında maksimum sıcaklık 32 ˚C olarak kaydedilirken, ultrases cihazında ise maksimum sıcaklık değeri 37 ˚C olarak kaydedilmiştir. Ekstraksiyon işlemlerinin ardından en uygun yöntemin belirlenmesi amacıyla tüm sonuçlar incelenmiş ve bu sonuçlar doğrultusunda en yüksek sülforafan miktarını sağlayan, ekstraksiyon işlem süresinin ve enerji tüketim değerinin de kısmen düşük olduğu hibrit ultrases ve mikrodalga ekstraksiyon işleminin en uygun ektraksiyon yöntemi olduğuna karar verilmiştir.

Abstract:
Plants, which have a major role in case of health protection due to the bioactive substances that are found naturally in their structures, also have a major role in terms of human nutrition. The consumption of Brassica group vegetables containing high amounts of bioactive compounds and sulforaphane has been associated with a reduced risk of chronic diseases. Sulforaphane is one of the herbal components that has been studied on due to the several effects that it ensures such as anticancer, antibacterial, anti-inflammatory and some more.  Within the scope of this study, sulforaphane compound, which has several positive effects on health, was extracted from cruciferous group vegetable seeds (black radish, kohlrabi and cabbage) and the aim was to extract it from the material with the highest sulforaphane content. Meanwhile, the condition of hydrolysis process (time and temperature) that provided the highest sulforaphane conversion, and the solvent/water concentration that gave the highest amount of sulforaphane, were determined in order to examine the effect of process variables (time, solvent/solid ratio, amplitude and power) that are all special in case of different extraction methods,  on the amount of sulforaphane and energy consumption;  sulforaphane extraction was performed with three different extraction methods (microwave extraction, ultrasound extraction and hybrid microwave and ultrasound extraction).

First, the material with the highest sulforaphane content from cabbage, black radish and kohlrabi seeds of the cruciferous group was investigated and as a result of that, the cabbage seed had the highest amount of sulforaphane. In addition, the amount of sulforaphane nitrile, which is formed in the presence of low pH and iron ions and has no effect on health, was analyzed by using the GC/MS. The effect of time and temperature on sulforaphane conversion by activating the myrosinase enzyme was investigated during the hydrolysis process and for this purpose, different temperatures (20, 25, 35 and 45 °C) and time (30 and 45 min, 1, 2 3 4 and 5 h) conditions were tested at constant 1:2 solid/water (w/v) ratio and pH: 7.  As a result of the hydrolysis process, it was determined that the highest conversion of sulforaphane took place at 25 °C temperature for 1 hour. Besides that, sulforaphane nitrile analyzes were carried out in the extracts that are obtained. Due to the fact that, solvent concentration is thought to be an important parameter in the effective extraction process of sulforaphane and green extraction is aimed, solvent concentrations at different ratios (80% ethyl acetate + 20% water, 65% ethyl acetate + 35% water, 50% ethyl acetate + 50% water, 35% ethyl acetate + 65% water and 20% ethyl acetate + 80% water) were tried and maximum sulforaphane extraction was achieved with 65% ethyl acetate+35% water concentration.
 	
In the second step of the extraction process, it is aimed to optimize the microwave, ultrasound and hybrid ultrasound and microwave and the process variables (time, solvent/solid ratio, amplitude and power) specific to extraction methods in order to reach maximum sulforaphane concentration. Experiments were carried out by applying CCRD in the microwave extraction method, Box-Behnken in the ultrasound extraction method, and classical experimental design in the hybrid ultrasonic and microwave extraction method in order to achieve this goal. In terms of using the response surface method, the extraction process conditions were optimized by selecting the maximum sulforaphane concentration and acceptable energy consumption value in response. Three validation experiments were carried out under the optimum operating parameters, which are determined according to the model, and the optimum point was also confirmed as a result of experiments. In addition, sulforaphane nitrile, extraction efficiency, total phenolic substance content and antioxidant activity (FRAP, DPPH and IC50) analyzes were performed with the GC/MS device in the extracts that are obtained during the optimization phase.

In the optimization studies, the maximum amount of sulforaphane and acceptable energy consumption value were determined by the microwave extraction method with 100 W power, 3 minutes and 25.94:1 solvent/solid ratio, 40.24% amplitude, 5.21 minutes time and 24.02:1 solvent/solid ratio in ultrasound extraction, hybrid ultrasound (40% amplitude) and microwave (100 W amplitude) extraction at a constant 25:1 solvent/solid (v/w) ratio, 2.41 minutes ultrasound time and 1 minute microwave time. The temperatures were controlled during the extraction processes and the maximum temperature was recorded as 32 ˚C in the microwave device, while the maximum temperature value was recorded as 37 ˚C in the ultrasound device. Following these extraction processes, all results were examined in order to determine the most appropriate method. In terms of these results, it was decided that the hybrid ultrasound and microwave extraction process, which provides the highest amount of sulforaphane while having a partially low extraction time and low energy consumption value, is the most appropriate extraction method.