Kars yöresinde pnömonili koyun akciğerlerinden mycoplasma etkenlerinin kültürel ve moleküler yöntemlerle araştırılması
Investigation of mycoplasma species in pneumonic sheep lungs by cultural and molecular methods in Kars, Turkey
Yazar: OLCAY ÖZTÜRKLER
Danışman: PROF. DR. SALİH OTLU
Kafkas Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Hayvancılık = Animal husbandry ; Kars = Kars ; Koyunlar = Sheep ; Kültür teknikleri = Culture techniques ; Mikoplazma = Mycoplasma ; Pnömoni-mikoplazma = Pneumonia-mycoplasma ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; RNA = RNA ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Bu çalışmada, 2017-2018 yılları arasında Kars yöresinde mezbaha ve kesimevlerinden temin edilen pnömonili 250 koyun akciğeri ile sağlıklı görünümlü 30 koyun akciğer örneğinde Mikoplazma etkenlerinin kültürel ve moleküler yöntemlerle araştırılması amaçlandı. Kültürel analizi Mycoplasma Agar ve Mycoplasma Broth besiyerlerinde yapılan pnömonili 250 koyun akciğerlerinin 26' sından (%10.4) etken izolasyonu gerçekleştirilirken bunların tümü cins spesifik PCR ile Mycoplasma spp. olarak tanımlandı. Sağlıklı görünümlü koyun akciğerlerinden etken izole edilemedi. 16S rRNA gen bölgesinin amplifikasyonunu hedef alan primerlerin kullanıldığı tür spesifik PCR analizi ile örneklerin 12' si (%46.15) Mycoplasma ovipneumoniae ve 4' ü (%15.38) Mycoplasma arginini olarak identifiye edildi. Örneklerin 2' sinde (%7.69) M. ovipneumoniae ve M. arginini eş zamanlı olarak belirlendi. Mycoplasma spp. olarak tanımlanan 8 (%30.76) izolat ise araştırılan türler (M. ovipneumoniae ve M. arginini) yönünden negatif saptandı. Tanımlanan izolatlardan 22' sinin (%84.61) 16S rRNA geninin kısmi dizi analizi başarılı bir şekilde gerçekleştirildi ve sekans sonrası izolatların 11' i M. ovipneumoniae, 4' ü M. arginini olarak tanımlandı. Tür spesifik PCR ile M. ovipneumoniae ve M. arginini' nin eş zamanlı belirlendiği 2 örnek ise sekansı sonrası M. arginini olarak tanımlandı. Cins spesifik PCR ile Mycoplasma spp. olarak tanımlanan 5 izolat ise sekans analizi sonucu Mycoplasma bovigenitalium olarak identifiye edildi. Sonuç olarak, 16S rRNA gen bölgesinin sekans analizi sonrası 22 izolatın 11' i (%50) M. ovipneumoniae, 6' sı (%27.27) M. arginini ve 5' i (%22.72) M. bovigenitalium olarak identifiye edildi ve sekansı yapılan izolatların herbiri kendilerine özgü erişim numaraları ile NCBI veri bankasına kaydedildi. Tür spesifik PCR yöntemiyle identifiye edilen Mycoplasma türleri ile 16S rRNA gen bölgesinin sekansı sonrası elde edilen türler büyük uyum içerisinde saptandı. 16S rRNA sekans analizine göre 22 Mycoplasma izolatı için komşu birleştirme yöntemi ile oluşturulan dendogram ve evrimsel ilişki sonucu izolatların tamamının Hominis filogenetik grubu içerisinde yer aldığı ve M. ovipneumoniae, M. arginini ve M. bovigenitalium olmak üzere üç temel kümede toplandığı görüldü. Bu kümelere bakıldığında M. arginini ve M. bovigenitalium izolatları iki ayrı filogenetik pozisyon almalarına rağmen birbirlerine olan yakınlıkları, M. ovipneumoniae izolatlarına olan filogenetik yakınlıklarından daha fazladır. Sonuç olarak, Kars yöresinde mezbaha ve kesimevlerinden temin edilen pnömonili koyun akciğerlerinde Mikoplazma prevalansı %10.4 olarak saptandı. Mikoplazma kaynaklı solunum sistemi hastalıklarının koyun yetiştiriciliği temelli ekonominin uygulanabilirlik ve sürdürülebilirliği üzerine olumsuz etkileri düşünüldüğünde bu çalışmada elde edilen Mikoplazma pozitifliği önemli ölçüdedir. Çalışmada, M. ovipneumoniae predominant tür olarak saptandı ve bunu M. arginini ve M. bovigenitalium izledi. Bu veriler koyun pnömonilerinde M. bovigenitalium ile ilgili ilk ulusal ve uluslararası bildirimdir. Koyunlara ait çeşitli enfeksiyöz vakalardan M. bovigenitalium' un artan bildirimleri bu etkenin konak spektrumuna koyunların da eklenmesi gerekliliğini ortaya çıkardı. İzolasyon ve moleküler identifikasyon testlerinin beraber yürütüldüğü bu çalışmada bulgular mikrobiyoloji alanında modern teknolojinin son ürünü olan sekans analizi sonuçları ile büyük uyum gösterdi. Kolay ve ucuz erişim imkanı ve ergonomik oluşu ile dizi analizi yönteminin Mikoplazma etkenlerinin teşhisi ve filogenetik analiz çalışmalarında fayda sağlayacağı ve bu yöntemlerin konvansiyonel yöntemlere kolaylıkla entegre edilebileceği öngörülebilir.

Abstract:
In this study, it was aimed to investigate Mycoplasma species by cultural and molecular methods in 250 pneumonic and 30 healthy appearanced sheep lungs obtained from slaughterhouse and butcheries in Kars region between 2017 and 2018. Mycoplasma isolation was achieved in 26 (10.4%) of 250 sheep lungs with pneumonia in Mycoplasma Agar and Mycoplasma Broth media and all isolates were identified as Mycoplasma spp. by genus specific PCR. Mycoplasma spp. could not be isolated from the lungs of healthy-looking sheep. Species-specific PCR analysis using primers targeting the amplification of the 16S rRNA gene region identified 12 (%46.15) of the isolates as Mycoplasma ovipneumoniae and 4 (%15.38) as Mycoplasma arginini. M. ovipneumoniae and M. arginini were determined simultaneously in 2 (7.69%) of the samples. Eight isolates (30.76%) identified as Mycoplasma spp. were found to be negative for the investigated species (M. ovipneumoniae and M. arginini). The partial sequence analysis of the 16S rRNA gene of 22 (84.61%) of the identified isolates was performed successfully and 11 of the isolates were identified as M. ovipneumoniae and 4 as M. arginini. Two samples simultaneously identified as M. ovipneumoniae and M. arginini by species-specific PCR were furthure identified as M. arginini after the sequence analysis. Five isolates, identified as Mycoplasma spp. by genus-specific PCR, were identified as Mycoplasma bovigenitalium as the result of sequence analysis. As a result, after the sequence analysis of the 16S rRNA gene region, 11 (50%) of the 22 isolates were identified as M. ovipneumoniae, 6 (27.27%) as M. arginini and 5 (22.72%) as M. bovigenitalium. Each of the isolates was recorded in the NCBI database with their unique accession numbers. The species obtained after the sequence of the 16S rRNA gene region with Mycoplasma species identified by species-specific PCR are in great agreement. As a result of the dendogram and evolutionary relationship generated by the neighboring joining method for the 22 Mycoplasma isolates by 16S rRNA sequence analysis, all of the isolates were found in the Hominis phylogenetic group and were collected in three main clusters as M. ovipneumoniae, M. arginini and M. bovigenitalium. In these clusters, M. arginini and M. bovigenitalium isolates have two distinct phylogenetic positions, but their proximity to each other is higher than those for M. ovipneumoniae isolates. As a result, the prevalence of Mycoplasma in the pneumonic lungs obtained from slaughterhouse and butcheries in Kars region was found as 10.4%. When considering the material adverse effect of Mycoplasma-induced respiratory system diseases on the feasibility and sustainability of sheep breeding-based economy, the Mycoplasma positivity obtained in this study is not to be underestimated. M. ovipneumoniae was determined as predominant species and followed by M. arginini and M. bovigenitalium. These data are the first national and international reports on M. bovigenitalium in sheep pneumonia. The increased notifications of M. bovigenitalium from various infectious cases of sheep revealed the necessity of adding sheep to the host spectrum of this species. In this study, where isolation and molecular identification tests were carried out together, the findings showed great agreement with the results of sequence analysis which is the final product of modern technology in microbiology. With its ergonomic features and easy and inexpensive accessibility, it can be predicted that the sequence method will be useful in the diagnosis and phylogenetic analysis of Mycoplasma agents and it can be predicted that this method can be easily integrated into conventional techniques.