Yenilikçi bir SMAD bildirici yaklaşımı geliştirilmesi
Developing an innovative SMAD reporter approach
Yazar: NİLAY ÇOLAK
Danışman: PROF. DR. YUSUF ÇETİN KOCAEFE
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Genetik vektörler = Genetic vectors ; Transforme edici büyüme faktörü-beta = Transforming growth factor-beta

Özet:
Dönüştürücü Büyüme Faktörü-β (Transforming growth factor-𝛽/ TGF-β) yara iyileşmesi başta olmak üzere hücre farklılaşması, apoptozis, immün cevabın düzenlenmesi gibi birçok fizyolojik süreçte düzenleyici role sahip olan bir sinyal molekülüdür. İnaktif yapıda sentezlenen TGF-β, yapısında bulunan Gizli TGF-β Bağlayıcı Protein (Latent TGF-β Binding Protein / LTBP) aracılığıyla hücre dışı matriks (Extracellular matrix / ECM) proteinleriyle kovalent bağlar kurarak ECM'de inaktif bir şekilde tutulur. TGF-β çeşitli uyaranlar tarafından uyarılıp aktifleştikten sonra hücre yüzeyinde bulunan reseptör kompleksine bağlanarak sinyal yolağını uyarır. Aktifleşme sürecinin kontrolsüz bir şekilde süreklilik kazanması, ECM elemanlarının geri dönüşümsüz bir şekilde birikmesiyle sonuçlanan "fibrozis" ile ilişkilidir. Ayrıca bu yolak kanser, otoimmün hastalıklar ve ateroskleroz patolojisinde de rol almaktadır. Bu nedenle TGF-β sinyal yolağının, özellikle de molekülün hücrede transkripsiyonu düzenleyen bir yanıtı tetikleyip tetiklemediğinin takip edilebilmesi bu yolağı hedefleyen yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilebilmesi için önemlidir. Bu tez çalışması kapsamında, TGF-β sinyalinin in vitro takibini sağlamak için Salgılanan Alkalen Fosfataz (Secreted Alkaline Phosphatase / SEAP) ve Yeşil Floresan Protein'lerinden (Green Fluorescent Protein /GFP) oluşan bildirici nitelikte bir füzyon proteini geliştirilmiştir. TGF-β etkisi ile bu yapının ifadesini sağlamak amacıyla TGF-β'ya özgü transkripsiyon cevabını oluşturan SMAD (Suppressor of Mothers Against Decapentaplegic) proteinlerinin bağlanma dizisi kullanılmış, yenilikçi bir dual bildirici vektör sistemi geliştirilmesi planlanmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda geliştirilen bildirici vektörün aktarıldığı hücrelerde TGF-β uygulanmayan kontrol grubuna kıyasla TGF-β uygulanan grupta akış sitometri analizi ile artan GFP sinyali gösterilmiştir. Bunun yanı sıra GFP sinyalinin TGF-β konsantrasyonuna bağıntılı ölçüde artışı gözlenmiştir. Çalışma sonucunda, elde edilen bildirici vektör yapısının beklenen işlevsel SEAP aktivitesini sergilemediği gözlemlenmiştir. Bu doğrultuda SEAP işlevselliği için optimizasyon çalışmalarının yapılmasına ihtiyaç vardır.

Abstract:
Transforming growth factor-𝛽 (TGF-β) is a signaling molecule that has a regulatory role in many physiological processes such as cell differentiation, apoptosis, and regulation of immune response, especially wound healing. TGF-β, which is synthesized inactively, is stored inactively in the ECM by establishing covalent bonds with extracellular matrix (ECM) proteins through the Latent TGF-β Binding Protein (LTBP) molecule in its structure. After TGF-β is stimulated and activated by various stimuli, it binds to the receptor complex on the cell surface and stimulates the signaling pathway. The uncontrolled continuity of the activation process is associated with "fibrosis", which results in the irreversible accumulation of ECM elements. In addition, this pathway plays a role in the pathophysiology of cancer, autoimmune diseases and atherosclerosis. Therefore, it is important to monitör the TGF-β signaling pathway, especially whether the molecule triggers a response that regulates transcription in the cell, in order to develop new treatment methods targeting this pathway. Within the scope of this thesis study, a reporter fusion protein consisting of Secreted Alkaline Phosphatase (SEAP) and Green Fluorescent Protein (GFP) proteins was developed to enable in vitro monitoring of the TGF-β signal. In order to ensure the expression of this structure through the effect of TGF-β, the binding sequence of Suppressor of Mothers Against Decapentaplegic (SMAD) proteins that create a TGF-β-specific transcription response was used, and it was planned to develop an innovative dual reporter vector system. As a result of the studies, an increased GFP signal was shown by flow cytometry analysis in the TGF-β applied group, compared to the control group without TGF-β application, in the cells to which the developed reporter vector was transferred. In addition, an increase in the measurable GFP signal relative to the TGF-β concentration was observed. As a result of the study, it was observed that the resulting reporter vector structure did not exhibit the expected functional SEAP activity. In this regard, optimization studies are needed for SEAP functionality.