Kentsel su döngüsünde mikrobiyal kontaminantların sürveyanı: Fırsatçı patojenlerin moleküler karakterizasyonu ve antimikrobiyal direnç profilinin araştırılması
Microbial contaminants surveillence in the urban water cycle: Molecular characterization of oppurtunistic pathogens and antimicrobial resistance profile
Yazar: BİNNUR KIRATLI
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN AKSOY
Sakarya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Sucul ekosistem hizmetlerinin önemli bir unsuru olan içme suyu kaynakları, kentsel su döngüsü içinde yüzey suları, yağmur suları, atık sular ve geri dönüştürülmüş sular gibi farklı habitatların etkisine maruz kalmaktadır. Bu çeşitli habitatlardan gelen girdiler, su kalitesini ve genel ekosistem sağlığını doğrudan etkilemektedir. Çoklu arıtma bariyerlerinden geçerek dağıtım sistemi ile nihai kullanıcıya ulaştırılan suyun doğasında, bazı kimyasal ve biyolojik değişiklikler meydana gelebilir. Bu değişikliklerin başında, abiyotik ve biyotik faktörlerin etkisiyle suyun kimyasal ve biyolojik kararlılığını kaybetmesi ve mikrobiyal yeniden üremenin (bacterial regrowth) oluşması gelir. Mikroorganizmalar, çevresel koşullara hızlı bir şekilde adaptasyon gösterme ve antibiyotiklere karşı direnç geliştirme kabiliyetleriyle bilinir. Bu özellikleri sayesinde, su ekosistemlerinde direnç birikimine yol açarak hem doğal hem de insan yapımı habitatlarda önemli bir çevresel tehdit oluştururlar. Özellikle içme suyu kaynakları, heterojen su kütleleri ve çeşitli ekosistem unsurlarından gelen girdilerle kirlenmeye açıktır. Su döngüsündeki bu farklı girdiler, su kalitesini etkilerken, aynı zamanda su kaynaklarının biyolojik kararlılığını da bozabilir.
Suyun arıtma süreçlerinden geçirilmesine ve dağıtım sistemleri ile son kullanıcıya ulaştırılmasına rağmen, bazı biyolojik ve kimyasal değişiklikler meydana gelebilir. Bu değişiklikler arasında mikrobiyal yeniden üreme, yani dağıtım sisteminde heterotrofik bakterilerin çoğalması ve suyu kolonize etmesi yer alır. Mikroorganizmaların su sistemlerinde çoğalması, suyun biyolojik denge ve kalitesini olumsuz etkiler. Bununla birlikte, bu tür mikroorganizmaların yalnızca heterotrofik bakterilerle sınırlı kalmadığı, aynı zamanda fırsatçı patojenlerin (FP) ve antibiyotik dirençli bakterilerin (ADB) de üreme olasılığını artırır. Heterotrofik bakterilerin ve antibiyotik dirençli bakterilerin su sistemlerinde yeniden üremesi, ekosistemin biyolojik dengesini bozarken, direnç birikimi yoluyla çevresel stres faktörlerine daha dayanıklı mikroorganizma topluluklarının oluşmasına neden olur. Bu durum, içme suyu kaynaklarının güvenliğini tehdit ederken, antibiyotik dirençli enfeksiyonların yayılmasını hızlandırır ve halk sağlığı açısından ciddi sonuçlar doğurur.
Oligotrofik bir habitat olan su dağıtım sistemi, aynı zamanda kalıntı dezenfektanların sürekli bulunduğu bir çevredir. Oligotrofik çevreler, genellikle mikroorganizmaların çoğalmasını daha az destekler, ancak bu ortamlarda hayatta kalmayı başaran bakteriler, düşük besin koşullarına son derece özelleşmiş ve uyum sağlamış olabilirler. Dezenfektanların varlığı, su kalitesini korumak ve mikrobiyal kontaminasyonu önlemek amacıyla kullanılırken, aynı zamanda bir seçici baskı oluşturur. Bu durum, zamanla antimikrobiyal direnç genlerinin (ADG'lerin) gelişimine ve yayılmasına yol açabilir. Bu ortam, çeşitli faktörler ve kalıntı dezenfektanların varlığı nedeniyle ADG'leri için bir rezervuar olma potansiyeli taşımaktadır. Çoklu antibiyotik direncine sahip patojenlerin küresel düzeyde artışı, ciddi bir halk sağlığı tehdidi oluşturmakta ve çevrenin mikrobiyal direnç gelişimine etkisinin araştırılmasının önemini vurgulamaktadır.
İçme suyu dağıtım sisteminde kullanılan dezenfektan türleri ve konsantrasyonları, çevresel koşullar ve mikrobiyal etkileşimler gibi çeşitli faktörler, ADG'lerin dinamiklerini etkiler. Bu karmaşık etkileşimler, su dağıtım sistemini ADG'lerin rezervuarı haline getirerek, önemli halk sağlığı riskleri oluşturabilir. İçme suyu kaynaklarıyla ilgili riskleri kapsamlı bir şekilde anlayabilmek ve bu riskleri etkili bir şekilde azaltabilmek, suyun kaynaktan nihai kullanıcıya ulaşana kadar geçtiği tüm aşamaların mikrobiyal ve kimyasal özelliklerinin detaylı incelenmesini gerektirir. İçme suyu kalitesinin korunması, yalnızca kaynağın temizliğinin sağlanmasıyla sınırlı olmayıp, suyun arıtılması, depolanması ve dağıtımı sürecinde karşılaşılabilecek risklerin de dikkate alınmasını zorunlu kılar. Bu süreçler boyunca suyun maruz kaldığı çeşitli biyolojik ve kimyasal etkiler, suyun nihai güvenliğini ve insan sağlığına olan potansiyel tehditlerini doğrudan etkiler.
Çalışmamız, suyun kaynağından musluğa olan yolculuğunda bazı fırsatçı patojenler (FP'ler), antibiyotik direnç genleri (ADG'ler) ve mikrobiyal aktivite de dahil olmak üzere mikroorganizmaların varlığının ve davranışlarının nasıl değiştiğini ve bu mikroorganizmaların habitatlar arasında yayılmasındaki rolünü incelemeyi amaçlamaktadır. Bu kapsamda, su numunelerinde qPCR, ATP analizi ve hücre membran hasar tespit analizleri yapılmıştır. Su kaynağı olarak kullanılan Sapanca Gölü (Sakarya) ve Akçay'dan gelen ham su, içme suyu arıtma tesisi ve içme suyu dağıtım sisteminden 2 yıllık bir sürede numuneler alınarak incelenmiştir. Mycobacterium spp. gibi su kaynaklı fırsatçı patojenlerin aerosolleşme, biyofilm oluşturma, dezenfektan ve antibiyotik direnci geliştirme kabiliyetleri nedeniyle içme suyu sistemlerinde varlıklarının tespiti büyük önem taşımaktadır. Elde edilen veriler, Mycobacterium spp.'nin zaman içinde değişen konsantrasyonlarını ortaya koymuş ve bu durum çevresel faktörlerle ilişkilendirilmiştir. Pseudomonas aeruginosa'nın virülansla ilgili ecfX geni ve olası çapraz reaksiyon sorunları incelenmiştir. Çalışmada, iki gen hedefli PCR yöntemleri kullanılmış ve bazı kaynaklarda bu genlerin varlığı tespit edilmiştir. Ayrıca, vanA geni gibi klinik öneme sahip antibiyotik direnç genlerinin varlığı, olası gen transferi ve su kaynaklı enfeksiyonlar açısından risk faktörü olarak değerlendirilmiştir. qnrA geni gibi diğer direnç genlerinin tespit edilmesi, antibiyotik tedavisinin yönetiminde önemli bir faktör olarak vurgulanmıştır. intl1 geni, yatay gen transferi göstergesi olarak içme suyu örneklerinde izlenmiş ve direnç seviyelerindeki dalgalanmalar rapor edilmiştir. Mikrobiyal ATP ölçümleri, su kalitesindeki küçük değişiklikleri hızlı bir şekilde tespit etmek için kullanılmış ve bu değerler, özellikle klor dozları ve suyun depolama süresi gibi faktörlerle ilişkilendirilmiştir. Çalışmada, içme suyu sistemlerindeki mikroorganizmaların membran hasarı analizi ile canlı ve ölü bakterilerin varlığı incelenmiştir. Dezenfeksiyona rağmen, bakterilerin içme suyu temin zincirinde hayatta kaldıkları ve hasarlı membranlarla yaşamlarını sürdürdükleri görüntüleme teknikleri ile tespit edilmiştir. Ayrıca, su dağıtım sisteminde biyofilm parçacıkları, filamentli bakteriler ve serbest bakterilerin varlığı gözlenmiştir. Bu sonuçlar, biyofilm oluşumunun yönetimi için entegre bir yaklaşıma ihtiyaç olduğunu ve geleneksel dezenfeksiyon yöntemleriyle ilgili zorlukları ortaya koymaktadır.Mühendislik ürünü içme suyu dağıtım sisteminde antibiyotik direncinin şekillenmesi ile ilgili hipoteze dayalı bu çalışmada, yatay gen transferi, fırsatçı patojen varlığı, canlı ve ölü bakteri bolluğu ile mikrobiyal aktivite düzeyi gibi faktörlerin antibiyotik direncinin oluşumunda etkili olduğu sonucuna varılmıştır. Çalışmanın bulguları, "Tek Sağlık" yaklaşımı ile entegre edilebilecek ve su yönetimi alanında standardizasyon sağlayabilecek potansiyele sahip bir ön çalışma niteliği taşımaktadır.

Abstract:
Drinking water sources, which constitute a critical component of aquatic ecosystem services, are subjected to the influences of various habitats within the urban water cycle, including surface waters, stormwater, wastewater, and reclaimed waters. The inputs from these diverse habitats exert a direct impact on water quality and the overall health of the ecosystem. As water passes through multiple treatment barriers and is ultimately delivered to the end user through the distribution system, a series of chemical and biological transformations may occur. Foremost among these changes are the loss of chemical and biological stability, driven by abiotic and biotic factors, and the occurrence of microbial regrowth. Microorganisms, recognized for their rapid adaptive capabilities and resistance development, contribute to the accumulation of antimicrobial resistance within the ecosystem.
The water distribution system, as an oligotrophic habitat, represents an environment characterized by the persistent presence of residual disinfectants. Oligotrophic environments typically do not favor extensive microbial proliferation; however, bacteria that survive under such conditions are often highly specialized and adapted to thrive in low-nutrient settings. The application of disinfectants, while essential for maintaining water quality and preventing microbial contamination, simultaneously imposes selective pressure. This selective pressure can, over time, facilitate the evolution and dissemination of antimicrobial resistance genes (ARGs). The interplay of various environmental factors and the presence of residual disinfectants within this system suggests its potential to serve as a reservoir for ARGs. The emergence of multi-drug resistant pathogens, catalyzed by the overuse of antibiotics and environmental contamination, constitutes a profound public health challenge. This growing threat accentuates the necessity for rigorous research into environmental antibiotic concentrations and their critical role in fostering and propagating microbial resistance. The proliferation of microorganisms in water systems negatively impacts the biological balance and quality of the water. Moreover, these microorganisms are not limited to heterotrophic bacteria; there is also an increased likelihood of the growth of opportunistic pathogens (OPs) and antibiotic-resistant bacteria (ARBs). The regrowth of heterotrophic bacteria and antibiotic-resistant bacteria in water systems disrupts the ecosystem's biological equilibrium, leading to the formation of microbial communities that are more resilient to environmental stress factors due to the accumulation of resistanceThis situation threatens the safety of drinking water sources and accelerates the spread of antibiotic-resistant infections, with severe consequences for public health. The presence of these resistant microorganisms in water systems highlights the need for effective monitoring and treatment strategies to mitigate the risks they pose.The types and concentrations of disinfectants utilized in drinking water distribution systems, in conjunction with environmental conditions and microbial interactions, significantly influence the dynamics of antimicrobial resistance genes (ARGs). These complex interactions have the potential to transform the water distribution system into a reservoir for ARGs, thereby presenting substantial public health risks. To effectively understand and mitigate the risks associated with drinking water sources, it is imperative to conduct comprehensive analyses of the microbial and chemical properties of water sources, treatment processes, and distribution systems. To comprehensively understand the risks associated with drinking water sources and effectively mitigate these risks, it is essential to thoroughly examine the microbial and chemical properties of water at every stage, from the source to the end user. Protecting drinking water quality is not limited to ensuring the cleanliness of the source but also requires addressing potential risks encountered during water treatment, storage, and distribution. Throughout these processes, various biological and chemical factors can affect the safety of the water and pose direct threats to human health.
By monitoring the microbial and chemical dynamics at each stage, authorities can identify emerging risks and take necessary actions to maintain water quality. This comprehensive approach is crucial for safeguarding public health and ensuring the long-term sustainability of drinking water systems.
This study aims to investigate the changes in the presence and behavior of microorganisms, including opportunistic pathogens (OPs), antibiotic resistance genes (ARGs), and microbial activity, during their journey from the water source to the tap, as well as their role in spreading across different habitats. To achieve this, water samples were analyzed using qPCR, ATP assays, and cell membrane damage detection techniques. Over a two-year period, samples were collected from raw water sources, including Sapanca Lake (Sakarya) and Akçay, as well as from the drinking water treatment plant and the distribution system. The detection of opportunistic pathogens such as Mycobacterium spp., known for their ability to aerosolize, form biofilms, and develop resistance to disinfectants and antibiotics, is of critical importance in drinking water systems. The data reveal temporal fluctuations in the concentrations of Mycobacterium spp., which have been correlated with environmental factors. Moreover, the study examined the virulence-associated ecfX gene of Pseudomonas aeruginosa and potential issues related to cross-reactivity. Two-gene targeted PCR methods were employed, confirming the presence of these genes in certain samples. Additionally, the presence of clinically significant antibiotic resistance genes, such as vanA, was evaluated as a risk factor for potential gene transfer and waterborne infections. The detection of other resistance genes, including qnrA, was emphasized as a critical factor in the management of antibiotic therapy. The intl1 gene, an indicator of horizontal gene transfer, was monitored in drinking water samples, with fluctuations in resistance levels observed. Microbial ATP measurements were conducted to rapidly detect subtle changes in water quality, with these values being particularly linked to factors such as chlorine dosing and water storage duration. The study also analyzed membrane damage in microorganisms within drinking water systems to assess the presence of viable and non-viable bacteria. Despite disinfection efforts, imaging techniques revealed that bacteria persisted within the drinking water supply chain, surviving with damaged membranes. Additionally, biofilm fragments, filamentous bacteria, and free-living bacteria were observed within the distribution system. These findings underscore the necessity of an integrated approach to biofilm management and highlight the challenges associated with traditional disinfection methods.This hypothesis-driven study on the emergence of antibiotic resistance within engineered drinking water distribution systems concludes that critical factors such as horizontal gene transfer, the presence of opportunistic pathogens, the abundance of viable and non-viable bacteria, and microbial activity levels significantly contribute to the development of antibiotic resistance. The findings from this research serve as a preliminary study with the potential to be integrated into the "One Health" framework, offering insights that could inform the standardization of practices in water management systems.