Galium aparine L. bitkisinden peroksidaz ve katalaz enzimlerinin karakterizasyonu
Characterization of peroxidase and catalase enzymes from the plant Galium aparine L.
Yazar: DUYGU YAMAN
Danışman: PROF. DR. GÜLNUR ARABACI
Sakarya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Canlı yaşamı için gerekli olan oksijenin bazı türleri (reaktif oksijen türleri, ROS) insan 
sağlığı için son derece zararlı olabilmektedir. ROS çoğunlukla serbest radikaller 
tarafından oluşturulurlar ve moleküler oksijene kıyasla kimyasal olarak daha 
reaktiftirler. Serbest radikallerin yok edilememesi durumunda; hücre membranında ki 
proteinler ROS'lar tarafından yıkılarak hücrelerin ölümü, DNA'nın kırılarak 
mutasyonlara açık hale gelmesi, kanser, yaşlanma ve bağışıklık sisteminin zayıflaması 
gibi olaylar gözlenebilir. ROS oluşumu ve meydana getirdikleri hasarların önlenmesi 
için vücut savunma mekanizmaları geliştirirmektedir. Bu savunma sistemlerine 
antioksidan savunma sistemleri, yani kısaca antioksidanlar ismi verilmiştir. Bitki 
dokuları ROS'ni ortadan kaldırarak stres koşullarındaki hücreleri korumak için katalaz 
(CAT), peroksidaz (POD), süeroksit dismutaz (SOD) gibi çeşitli enzimler ve fenolik 
bileşikler içermektedir. Bu sayede serbest radikallerden etkilenmezler ve meydana 
getirdikleri hasarı oortadan kaldırmış olurlar. Enzimler, protein yapısında olan ve 
biyokimyasal reaksiyonları gerçekleştiren biyokatalizörlerdir. Peroksidaz enzimi (EC 
1.11.1.7), hidrojen peroksitli ortamda flavonoidler, fenoller, , sülfonoidler, aromatik 
aminler ve pirogallol gibi birçok substratın oksidasyonunu katalize eden bir 
oksidoredüktaz grubu enzimidir. POD bitki, hayvan, bakteri ve mantarlarda bulunan, 
bununla birlikte bitki gelişimi için gerekli olan hücre duvarında da yer alan bir
oksidoredüktaz grubu enzimidir. POD enzimleri, H2O2 kullanarak inorganik ve 
organik substratların oksidasyonunu ve katalize ederler. Katalitik moleküllerin
örnekleri; guaiacol, o-dianisidine, pyrogallol, azo boya türevleri, o-fenilendiamin
sayılabilir. POD'un bitki savunma mekanizmaları, meyve ve sebzelerde indolasetik
asit regülasyonu, hormon aktivitesi ve lignin biyosentezi gibi önemli işlevlerde önemli
bir rol oynadığı bildirilmiştir. POD, bitkisel gıdalarda bol miktarda bulunur. Bitkilerde 
POD çiçeklerde, gövdelerde, yapraklarda, hücre çekirdeklerinde, hücre zarlarında,
ribozomlarda ve hücre duvarlarında bulunur. Katalaz enzimi ((CAT): H2O2
oksidoredüktaz E.C.1.11.1.6 doğada çok yaygındır. Hemen hemen tüm aerobik 
mikroorganizma, bitki ve hayvan hücrelerinde yüksek katalitik aktiviteye sahiptir. Bir
katalaz enzimi, oksidoredüktaz grubu olan hidroperoksidazlar sınıfına aittir.
Hidroperoksidazlar, substrat olarak hidrojen peroksit ve organik peroksitleri kullanır.
Bir katalaz enzim solüsyonu, kontak lens yeniden kullanılmadan önce H2O2'yi
ortamdan güvenilir bir şekilde uzaklaştırır. UV ışınları serbest radikallerin oluşumunu 
hızlandırır. Serbest radikaller ise cilde zarar verir ve cilt kalitesinin bozulmasına neden 
olur. Antioksidan moleküller çeşitli etkiler gösterir ve oksidasyonun neden olduğu cilt
hasarını azaltır. Katalaz enzimi son zamanlarda H2O2 ve enzimlerden oluşan çeşitli yüz
maskesi uygulamalarında ve epidermisin üst katmanlarında hücresel oksidasyonu
artırarak vitiligo tedavisinde kullanılmaktadır. Yoğurt otu (Galium aparine), Kuzey 
Amerika, Avrupa ve Asya'ya da yetişen bir tırmanma bitkisidir. G. aparine'nin aktif 
bileşenleri, alkanlar, flavonoidler, antrakinonlar, polifenolik asitler, tanenler, iridoidler 
ve C vitaminidir. Lenf şişlikleri, bademcik iltihabı, sarılık, kanser, ateş, ve lösemi tedavisinde kullanılmıştır. Bu çalışmada Sakarya bölgesinde yetişen yoğurt out 
(Galium aparine L.) bitkisinden peroksidaz ve katalaz enzimleri saflaştırılarak her iki 
enzimin kinetik özellikleri ve bazı inhibitörlere karşı aktiviteleri tespit edilmiştir. Bu 
amaçla enzim izolasyonu için pH 7,0, 0,1 M fosfat tamponu, askorbik asit, PVP ve 
Triton X-100 kullanılmıştır. Bitki -20 ℃'de depolanmıştır. Enzim izolasyon işlemleri 
+4 ℃'de yapılmıştır. Yoğurt otu bitkisinin izolasyonu gerçekleştirildikten sonra üç 
fazlı ayırma tekniği (TPP) ile saflaştırılmış ve SDS-PAGE metodu ile enzimlerin 
molekül ağırlıkları tayin edilmiştir. Peroksidaz enziminin molekül ağırlığı 65 kDa, 
katalaz enziminin molekül ağırlığı ise 50 kDa olarak bulunmuştur. Peroksidaz enzimi 
aktivitesi, uygun subsratlar ile 60 sn'de 420 nm'deki absorbasın ölçülmesi sonucu
tayin edilmiştir. Katalaz enzimi aktivitesi ise H2O2 substratının 180 sn 240 nm'deki 
absorbans ölçümü ile tayin edilmiştir. Peroksidaz enziminin 4 metil katekol ve sabit 
konsantrasyondaki H2O2 substratı için Vmax ile Km değerleri sırasıyla 0,00238 EÜ/dk 
ve 1,47mM olarak belirlenmiştir. Katalaz enziminin Vmax ile Km değerleri ise 0,0007 
EÜ/dk ve 6,41 mM olarak belirlenmiştir. Peroksidaz enzimi substrat spesifikliği testi 
için H2O2'li ortamda pirogallol, o-fenilendiamin, gallik asit, kafeik asit, 4-metilkatekol 
substratları ile aktivite ölçümü gerçekleştirilmiştir ve G.aparine peroksidaz enziminin 
en ilgili substratı 1,086 mM Km değeri ile pirogallol substratı olarak tesit edilmiştir. 
Optimum pH POD enzimi için 6,5, CAT enzimi için ise 8 olarak belirlenmiştir. G. 
aparine. peroksidazı ve katalazı için farklı sıcaklıklarda (0-90 ℃) optimum sıcaklık 
tayini yapılmıştır. Peroksidaz ve katalaz için optimum sıcaklık 30 ℃ olarak 
bulunmuştur. G. aparine peroksidazı ve katalazı için inhibisyon tayininde inhibitör 
olarak sodyum azid ve tiyoüre kullanılmıştır. Her iki inhibitöründe POD ve CAT 
enzimlerini inhibe ettiği sonucuna varılmıştır. Enzim aktivitelerini yarıya düşüren 
inhibitör miktarını belirlemek için önce % bağıl aktiviteler hesaplanmış ve grafik 
yardımıyla IC50 değerleri belirlenmiştir. Yoğurt otu peroksidazına tiyoüre inhibisyonu 
sonucunda IC50 değeri 1,18 mM, sodyum azid inhibitörü ile ise IC50 değeri 2,05 mM 
olarak hesaplanmıştır. G. aparine katalazına tiyoüre inhibisyonu sonucunda IC50
değeri 0,85 mM ve sodyum azid inhibisyonu sonucunda ise IC50 değeri 0,97 mM 
olarak belirlenmiştir. G.aparine peroksidazı ve katalaz enzim aktivitelerine Fe(III), 
Cu(II), Mn(II), Co(II), Ni(II), Ba(II), Ca(II), Pb(II), Hg(II) ve Cd(II) metallerinin etkisi 
incelenmiştir. 0,5-1 ve 5 mM olarak 3 farklı konsantrasyonda metal çözeltileri 
hazırlanmış ve aktiviteleri ölçülmüştür. Aktivite tayini peroksdiaz için 420nm, katalaz 
için 240 nm'de yapılmıştır. % kalan enzim aktiviteleri hesaplanarak metallerin 
inhibisyon oranları belirlenmiştir. En yüksek oranda POD enzimine inhibisyon etkisi;
0,5 Mm konsantrasyonda Hg(II)'nın % 47,18 oranında, 1 mM Hg (II) de % 84,67 ve 
5 mM Hg (II) de ise % 80 oranında olduğu belirlenmiştir. 0,5 Mm konsantrasyonda 
Pb(II) % 40, 1 Mm konsantrasyonda Cd(II) % 52 ve 5 Mm konsantrasyonda Pb(II) 
ise % 55 oranında ise CAT enzimini inhibe etmiştir. Ayrıca, G. aparine peroksidazı 
ve katalazına solvent etkisi test edilmiştir. Solvent olarak aseton, etanol, DMSO, tbütanol ve DMF seçilmiştir. Bu solventlerin % 5- % 30 (v/v) oranlardaki çözeltileri 
POD ve CAT enzimleri ile inkübe edilmiştir ve enzim aktivite ölçümü uygun 
substratların varlığında peroksidaz için 420 nm, katalaz için 240 nm' de 
gerçekleştirilmiştir. % kalan enzim aktiviteleri hesaplanarak karşılaştırma yapılmıştır. 
POD enzimine solvent etkisi incelendiğinde % 30 oranında etanol ilavesin ve CAT 
enzimine solvent etkisi incelendiğinde ise %30 oranında DMF ilavesinin enzimin 
aktivitesini en fazla inhibe eden solvent olduğu belirlenmitir. Enzimlere tuz toleransı 
testi için 1, 2, 3, 4, 5mM konsantrasyonlarında NaCl çözeltileri hazırlanmıştır. 
Belirtilen knsantrasyonlardaki tuz çözeltileri ile enzimler 2 saat inkübe edildikten 
sonra aktivite tayini yapılmıştır. Artan tuz konsantrasyonunda enzimin aktivitesinin 
düştüğü görülmüştür. G. aparine peroksidazının katalaza göre daha fazla tuztoleransı 
gösterdiği tespit edilmiştir. Peroksidaz ve katalaz enzimlerinin iyonik şiddet etkisi için 
1, 2, 3, 4 ve 5 mM konsantrasyonlu NaCl çözeltileri hazırlanarak aktivite ölçümü 
gerçekleştirilmiştir. G. aparine peroksidaz enziminin 3 mM NaCl çözeltisi ile en 
yüksek aktivite gösterdiği görülmüştür. Enzimin 1 mM tuz konsantrasyonunda ise % 
42 oranında inhibe olduğu görülmüştür. Katalaz enziminin 3 mM tuz
konsantrasyonunda en yüksek aktiviteye sahip olduğu fakat 5 mM konsantrasyonda 
aktivitesinin % 40'a düştüğü görülmüştür.

Abstract:
Some oxygen species (reactive oxygen species, ROS) essential for life can be 
extremely harmful to human health. ROS is mostly produced by free radicals and is 
chemically more reactive than molecular oxygen. In case free radicals cannot be 
destroyed; ROS can cause events such as the death of cells by breaking down proteins 
in the cell membrane, DNA fragmentation and becoming open to mutations, cancer, 
aging and weakening of the immune system. The body develops defense mechanisms 
to prevent the formation of ROS and the damage they cause. These defense systems 
found in all living organisms are called antioxidant defense systems, briefly 
antioxidants. Plant tissues also contain various antioxidant enzymes such as catalase 
(CAT), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD) and phenolic compounds to 
protect their cells under stress conditions by eliminating ROS. All parts of plants 
contain natural antioxidants in the form of carotenoids, phenols, vitamins and 
flavonoids. The antioxidants in plants act as peroxide scavengers, free radical 
scavengers and enzyme inhibitors. In this way, they are not affected by free radicals. 
Enzymes are biocatalysts that are in protein structure and carry out biochemical 
reactions. 
Peroxidase enzyme ((POD) EC 1.11.1.7) is an oxidoreductase group enzyme that 
catalyzes the oxidation of many substrates such as flavonoids, phenols, sulfonoids, 
aromatic amines and pyrogallol in the presence of hydrogen peroxide. POD is an 
enzyme found in the cell wall of plants, animals, bacteria and fungi, and is also 
essential for plant growth. It has been reported that POD plays an important role in 
important functions such as plant defense mechanisms, regulation of indolacetic acid 
in fruits and vegetables, hormone activity and lignin biosynthesis. POD is abundant in 
plant foods. In plants, POD is found in flowers, stems, leaves, cell nuclei, cell 
membranes, ribosomes, and cell walls. POD enzymes catalyze the oxidation of 
inorganic and organic substrates and the dehydrogenation of hydroquinones, phenols, 
hydroquinoid amines and other aromatic compounds using H2O2. Examples of 
catalytic molecules; guaiacol, o-dianisidine, pyrogallol, azo dye derivatives, ophenylenediamine can be counted.
The another antioxidant enzyme catalase ((CAT), H2O2 oxidoreductase, E.C.1.11.1.6) 
is very common in nature. It has high catalytic activity in almost all aerobic 
microorganisms, plant and animal cells. It belongs to the class of hydroperoxidases, a 
catalase oxidoreductase group. Hydroperoxidases use hydrogen peroxide and organic 
peroxides as substrates. It catalyzes cellular hydrogen peroxide to water and oxygen. 
Catalase enzyme is also used in industrial applications sucha as textile, food, medicine, 
etc. For examplei, catalase enzyme is used in contact lens hygiene and lens disinfection 
with H2O2 solutions. A catalase enzyme solution reliably removes H2O2 before contact 
lens reuse. UV rays accelerate the formation of free radicals. Free radicals damage the 
skin and cause deterioration of skin quality. Antioxidant molecules exert a variety of 
effects and reduce skin damage caused by oxidation. 
Yogurt grass (Galium aparine) is a climbing plant that also grows in North America, 
Europe and Asia. Galium aparine is traditionally used to coagulate milk because of its 
chemical composition. Therefore, it is known as "Yogurt grass" in public. 
The active ingredients of G. aparine are alkanes, flavonoids, anthraquinones, 
polyphenolic acids, tannins, iridoids and vitamin C. It has been used in the treatment 
of lymph nodes, tonsil foci, jaundice, cancer, fever and leukemia.
In this study, peroxidase and catalase enzymes from Galium aparine L. (Yogurt grass) 
plant grown in Sakarya, Turkey were purified and their kinetic properties and activities 
against some inhibitors were determined. The collected plant was stored at -20 ℃ until 
extraction. Enzyme isolation procedures were performed at +4 ℃. Enzymes were 
extracted bye using 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing ascorbic acid, PVP 
and Triton X-100. Yogurt grass peroxidase and catalase enzymes were purified by 
three-phase separation technique (TPP) after izolation and molecular weights of 
enzymes were determined by SDS-PAGE method. The molecular weight of 
peroxidase enzyme was found to be 65 kDa, and the molecular weight of catalase 
enzyme was found to be 50 kDa. Peroxidase enzyme activity was determined by 
measuring absorbance at 420 nm for 60 seconds using 4-methyl catechol and H2O2
substrates. Catalase enzyme activity was determined by observing the absorbance 
decrease of the H2O2 substrate for 180 seconds at 240 nm. The Vmax and Km values 
of the peroxidase enzyme were determined as 0.00238 EU/min and 1.47mM, 
respectively. Vmax and Km values of catalase enzyme were determined as 0.0007 
EU/min and 6.41 mM. The peroxidase enzyme substrate specificity was determined 
with pyrogallol, o-phenylenediamine, gallic acid, caffeic acid, 4-methylcatechol 
substrates in the presence of H2O2 and and the most relevant substrate of the G. 
aparine peroxidase enzyme was determined as the pyrogallol substrate with a Km value 
of 1.086 mM. Optimum pH was determined as 6.5 for POD enzyme and 8 for CAT 
enzyme. G. apirine peroxidase and optimum temperature determination was made for 
G. aparine catalase. The optimum temperature for peroxidase and catalase enzymes 
was found to be 30 ℃. Sodium azide and thiourea were used as inhibitors in the 
inhibition experiment for G. aparine peroxidase and catalase. It was concluded that 
both inhibitors inhibited POD and CAT enzymes. In order to determine the amount of 
inhibitor that halves the enzyme activities, firstly the % relative activities of the 
enzymes were calculated and the IC50 values were determined with the help of 
graphics. The IC50 value calculated by the effect of the thiourea inhibitor on the 
peroxidase enzyme activity was calculated as 1.18 mM, and the IC50 value with the 
sodium azide inhibitor was calculated as 2.05 mM. The IC50 value was determined as 
0.85 mM as a result of inhibition of the catalase enzyme by thiourea, and as 0.97 mM 
as a result of sodium azide inhibition. The effects of Fe(III), Cu(II), Mn(II), Co(II), 
Ni(II), Ba(II), Ca(II), Pb(II), Hg(II) ) and Cd(II) metals on G. aparine peroxidase and 
catalase enzymes were also investigated. Metal solutions at 3 different concentrations, 
0.5-1 and 5 mM, were prepared and their effects on the enzymes were measured. 
Inhibition rates of metals were determined by calculating their % residual activity of 
enzymes. The results showed that the peroxidase enzyme was inhibited by 47.18% at 
0.5 mM concentration, 84.67 % at 1 mM concentration and 80 % at 5 mM Hg(II). It 
was measured that the catalase enzyme was inhibited by 40 % with Pb(II) at 0.5 mM 
concentration and 52 % by Cd(II) at 1 mM concentration. Additionally, the solvent 
effects on G. aparine peroxidase and catalase enzyme activities were tested. Acetone,ethanol, DMSO, t-butanol and DMF were chosen as solvents. Solutions of 5 %, 10 %, 
15 %, 20 %, 25 % and 30 % (v/v) of the solvents were incubated with POD and CAT 
enzymes. Activity measurement was performed at 420 nm for peroxidase and at 240 
nm for catalase. Comparison was made by calculating the percentage of remaining 
activity of each enzyme. When the solvent effect on the peroxidase enzyme was 
examined, it was determined that the addition of 30 % ethanol was the solvent that 
inhibited the enzyme activity the most. When the solvent effect on the cayalase enzyme 
was examined, it was determined that the 30 % DMF addition was the solvent that 
inhibited the enzyme activity the most. In both enzymes, 30% was determined as the 
highest inhibitory value for all solvents. In addition to all tests, salt tolerance test was 
applied to the peroxidase and catalase enzymes. For this test, NaCl solutions at 1, 2, 3, 
4, 5 mM concentrations were prepared. First, the enzymes were incubated separately 
for 2 hours with the salt solutions at the specified concentrations, then, the activity of 
the enzymes was determined. According to the results obtained, it was observed that 
the activities of the enzymes decreased with increasing salt concentration. It was 
determined that G. aparine peroxidase showed more salt tolerance than G. aparine 
catalase enzyme. For the ionic strength effect of the peroxidase and catalase enzymes, 
1, 2, 3, 4 and 5 mM concentration NaCl solutions were prepared and the enzyme 
activity measurements were performed. It was observed that the G. aparine peroxidase 
enzyme showed the highest activity with 3 mM NaCl solution. But, the enzyme was 
inhibited by 42% at 1 mM salt concentration. It was observed that the catalase enzyme 
had the highest activity at 3mM salt concentration, but its activity decreased to 40 % 
at 5 mM salt concentration.