İmmünobiyosensörlerde biyomoleküllerin dedeksiyonu için immobilizasyon yöntemlerinin geliştirilmesi
Development of immobilization methods for detection of biomolecules in immunobiosensors
Yazar: SEVECEN TUĞLU GÜRPINAR
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ZEYNEP AKDESTE ; DOÇ. DR. SELMA ÖZTÜRK
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı / Biyomühendislik Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Protein immobilizasyonu = Protein immobilization ; İmmünosensör = Immunosensor

Özet:
Biyosensörler, bir biyolojik algılayıcı ile hedef analitin arasındaki etkileşimin yarattığı değişiklikten sinyal üreten bir transdüserin kombinasyonundan oluşan cihazlardır.  Biyosensörlerin performans parametreleri; hızlı geriye dönme zamanı, dinamik cevap, tekrarlanabilirlik, seçicilik, kantitatif ölçüm sınırı, tespit sınırı, geniş ölçüm aralığı, doğrusallık ve hassasiyetdir. Biyosensörlerin hassasiyetine büyük ölçüde etki eden immobilizasyon etkinlikleri biyoalgılayıcı yüzeyde farklı methodlar ile gerçekleştirilmektedir. Tez kapsamında yapılan çalışmada elektrod yüzeyinde kendiliğinden oluşan tek tabakalar (self assembled monolayer (SAM)) oluşturularak analit immobilizasyonları gerçekleştirilmiştir. 
Tez çalışmasında geliştirilen kuvars kristal mikrobalans (QCM) immünosensöründe immobilizasyon etkinliğinin belirlenmesi çalışmaları için Fumonisin (FUM) biyomolekülü model olarak kullanılmıştır.  FUM, Fusarium Moniliforme ve Fusarium Proliferatum isimli küf mikroorganizmaları tarafından üretilen bir mikotoksin türüdür ve diğer mikotoksinler gibi ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) , Avrupa Komisyonu (E.C.) ve ülkemizde Türk Gıda Kodeksi tarafından getirilen regülasyonlar (düzenlemeler) ile izlenmektedir. FUM kontaminasyonunda laboratuvar odaklı enstrümantal analitik sistemler ile tayinlerin yanısıra yerinde tespit imkanları sunmasına bağlı olarak biyosensörler ile tayin metodları üzerine çalışmalar da geliştirilmektedir. Tez kapsamında FUM'ne karşı üretilen Monoklonal Antikorlar (Mab) kullanılarak FUM dedeksiyonu yapabilen QCM immünosensörü ilk kez geliştirilmiştir. Çalışmada immobilizasyon etkinliğinin önemini ortaya koyan stratejiler sayesinde regülasyonların belirlediği aralıklarda FUM tayini yapılabilen bir sensör geliştirildi. FUM'nin yüzeye immobilizasyonunda SAM ajanı olarak en sık kullanılan 11-merkaptoundekanoik asit'in yanısıra yine lineer ajanlardan 11-merkaptoundekanamid (MUD) ve 11-merkaptoundekanol (MUO) kullanılarak yüzey modifikasyonları yapıldı. İmmobilizasyon etkinliğinin arttırılmasında lineer ajanlara alternatif olarak; kendiliğinden SAM oluşturmaları, farklı topografik yapıları ile analiti sunma/yakalama kabiliyetleri ve yüksek derecede ıslanabilme özelliklerinden dolayı dendronlar kullanıldı. İmmobilize olan analitin elektrodlara ve birbirlerine olan uzaklıklarının ölçümlerdeki hassasiyet üzerine etkisinin belirlenmesi amacıyla 3 farklı nesilden (jenerasyon) dendronlar kullanıldı. Bu amaçla bis-MPA dendron-8-hidroksil-1thiol (G3 DND), bis-MPA dendron-16 hidroksil-1 thiol (G4 DND) ve bis-MPA dendron-32 hidroksil-1 thiol (G5 DND) dendronları ile FUM immobilizasyonları gerçekleştirildi. Yüzeyde dendronların kullanılması ile yüksek sensör yanıtlarının elde edilmesine karşın verilerde güven sınırlamasından dolayı iki katmanlı sensör yüzeyleri oluşturuldu ve MUD ile SAM oluşturulduktan sonra yüzeyde ikinci bir katman olarak dendronlar kullanıldı. Geliştirilen tüm elektrod yüzeyleri ölçümlerde algılama, hassasiyet, doğruluk ve tekrarlanabilirlik parametreleri açısından irdelendi. Biyosensörlerde immobilizasyon etkinliğini ortaya koyan bu çalışmalar sayesinde, 0.008 ppm algılama limitine sahip, güvenilir, tekrarlanabilir, yüksek hassasiyette FUM ölçümü yapabilen QCM immünosensörü geliştirildi.

Abstract:
Biosensors are devices that consist of a combination of a transducer that generates a signal from the change caused by the interaction between a biological sensor and the target analyte. Performance parameters of biosensors are fast response time, dynamic response, reproducibility, selectivity, quantitative measurement limit, detection limit, wide measurement range, linearity and precision. The immobilization activities, which affect sensitivity of the biosensors, are achieved by different methods on the biosensor surface. In this thesis, analyte immobilization was performed by forming single layers (self assembled monolayer (SAM)) on the surface of the electrode. Fumonisin (FUM) biomolecule was used as a model to determine immobilization activity in developed quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor in thesis study.
FUM is a mycotoxin species produced by the fungus microorganisms named Fusarium Moniliforme and Fusarium Proliferatum and it is followed by the US Food and Drug Administration (FDA), European Commission (E.C.), Turkish Food Codex(T.F.C) regulations as other mycotoxins. In addition to laboratory-focused instrumental analytical systems in FUM contamination, biosensors and identification methods have also been developed depending on the availability of on-site detection facilities. In the thesis, for the first time, QCM immunosensor capable of FUM detection was developed by using Monoclonal Antibodies (Mab) produced against FUM. In this study FUM immunosensors were developed that can be identified at intervals determined by the regulation because of strategies that demonstrate the importance of immobilization effectiveness. Surface immobilization was performed by using 11-mercaptoundecanamide (MUD) and 11-mercaptoundecanol (MUO) from linear agents as well as 11-mercaptoundecanoic acid, which is the most commonly used SAM agent in surface immobilization of FUM. Dendrons were used as an alternative to linear agents for enhancing immobilization efficiency due to spontaneous SAM formation, the ability to present / capture analytes with different topographic features, high degree of wettability and conductivity. Three different generations of dendrons were used to determine the effect of the immobilized analyte on the sensitivities of the electrodes and their distances to each other. For this purpose, FUM immobilization was performed with dendrons of bis-MPA dendron-8-hydroxyl-1 thiol (G3 DND), bis-MPA dendron-16 hydroxyl-1 thiol (G4 DND) and bis-MPA dendron-32 hydroxyl-1 thiol (G5 DND). High sensor responses were obtained by using the dendrons on the surface but due to the confidence constraint in the data, two layer sensor surfaces were created and dendrons were used as a second layer on the surface after MUD and SAM were created. All developed electrode surfaces were investigated in terms of perception, precision, accuracy and repeatability parameters in measurements. Through the studies the effect of immobilization on biosensors, QCM immunosensor has been developed for FUM detection, which have 0.008 ppm detection limit, reliable, reproducible, capable of high precision measurement.