Pichia pastoris mayasında rekombinant tibet öküzü kimozini ekspresyonu ve karakterizasyonu
Expression and characterization of recombinant chymosin in Pichia pastoris
Yazar: ÖZGE ADIGÜZEL
Danışman: PROF. DR. MEHMET İNAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Kimozin peynir endüstrisinde kullanılan ve sütün pıhtılaşmasını sağlayan proteolitik bir enzimdir. Kimozin yeni doğmuş geviş getiren memeli hayvanların midesinin dördüncü bölgesi olan şirdenden (abomasum) elde edilir. Ancak bu şekilde elde edilen kimozin, endüstrinin talebini karşılayacak nicelikte ve nitelikte değildir. Bu sebeple rekombinant DNA tekonolojisi kullanılarak üretilen kimozin, süt ürünleri endüstrisi için alternatif bir yöntem olmuştur. Günümüzde, rekombinant olarak daha yüksek miktarlarda kimozin üretilebilmektedir. 

Rekombinant kimozin üretiminde gen kaynağı olarak sığır, deve, keçi, manda gibi hayvanlar kullanılmıştır. Bu projede gen kaynağı olarak ilk kez Tibet öküzü (Bos grunniens) kullanılarak Pichia pastoris mayasında rekombinant kimozin üretimi gerçekleştirilmiştir. α–MF (Saccharomyces cerevisiae α-eşleşmesi faktörü), HSA (İnsan serum albümini), PIR1 (P. pastoris Protein with Internal Repeats) ve PHO1 (P. pastoris asit fosfataz) sekresyon sinyallerini taşıyan ekspresyon kasetleri oluşturulmuş ve farklı sekresyon sinyallerinin üretim üzerindeki etkilerine bakılmıştır.

Engelli erlende yapılan ön çalışmalar sonrasında, α-MF sekresyon sinyali taşıyan ekspresyon kaseti ile fermentör koşullarında AOX1 kullanılarak rekombinant kimozin üretilmiştir. Tibet öküzü kimozinin kısmi karakterizasyonu yapılmıştır. Böylece literatüre, ilk kez Tibet öküzünün gen kaynağı olarak kullanıldığı rekombinant kimozin enzimi ile ilgili katkıda bulunulmuştur.

Abstract:
Chymosin is a proteolytic enzyme that coagulates milk efficiently and widely used in cheese industry. It obtained from fourth stomach of nerwborn ruminants. But its quality and quantitiy can not meet demand of the market. Recombinant chymosin is the best alternative for cheese industry. Present day high quantitiy of chmosin can be produced with recombinant enzyme technology. 

Until now, bovine; camel; goat; buffalo were used as a gene sources for chymosin expression. In the present study, yak (Bos grunnniens) prochymosin gene was used as gene source and recombinant chymosin was expressed in P. pastoris. Expression casettes have Saccharomyces cerevisiae α-mating factor (α-MF), HSA (Human Serum Albumin), PIR1 (P. pastoris Protein with Internal Repeats) ve PHO1 (P. pastoris Acid Phosphatase) signal sequences were constructed to observe impact of secretion signals on expression of enzyme.

Active chymosin expression was achieved into supernatant under the control of methanol-inducible AOX1 promoter. Trials continued in bioreactor only expression casette which have α-MF secterion signal. Recombinant chymosin production was analyzed in flusk cultures then continued with the bioreactor which included basal salt medium. Eznyme characterization was performed with raw supernatant obtained from bioreactor. Present study will contribute to literature about recombinant chmosin which its gene source is yak.