İskemi ve reperfüzyon sonrasi erken dönemde kan beyin bariyerinin zedelenmesinde nitratif ve oksidatif mekanizmalarin farede kranial pencere ve izole retina modellerinde incelenmesi
Effects of nitrative/oxidative stress mechanisms on early blood brain barrier injury after ischemia/ reperfusion studied by cranial window and isolated retina models
Yazar: ATAY VURAL
Danışman: DOÇ. DR. YASEMİN GÜRSOY ÖZDEMİR
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Nörolojik Bilimler Ana Bilim Dalı / Temel Nörolojik Bilimler Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Nöroloji = Neurology
Dizin: Beyin iskemisi = Brain ischemia ; Kan beyin bariyeri = Blood brain barrier ; Matriks metalloproteinaz 9 = Matrix metalloproteinase 9 ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Peroksinitrit = Peroxynitrite ; Reperfüzyon lezyonu = Reperfusion injury ; Retina damarları = Retinal vessels ; Serebrovasküler bozukluklar = Cerebrovascular disorders ; İskemi = Ischemia

Özet:
İskemi/reperfüzyon sırasında, nörovasküler ünitede meydana gelen değişiklikler mikrosirkülasyonun bozulmasına ve enfarkt alanının penumbraya doğru genişlemesine sebep olmaktadır. Trombolitik ve nöroprotektif ajanlar bu durumu düzeltmekte yetersiz kalmaktadır. Önceki çalışmalarda ex vivo histolojik yöntemlerle iskemi/reperfüzyon sonrası mikrodamarlarda boğumlanmalar oluştuğu ve boğumlanmaların arasında eritrositlerin hapsolduğu gösterilmiş, peroksinitritin (oksidatif ve nitratif strese yol açan bir radikal) bu boğumlanmaların oluşumunda rolü olduğu saptanmış ve bu boğumlanmaların perisitlerin kasılmasına bağlı olabileceği önerilmişti. Bu tez çalışmasında ilk olarak önceki bulguların in situ test edilmesi amacıyla iskemi sırasında ve sonrasında mikrodolaşımda meydana gelen değişikliklerin ve ek olarak bu değişikliklerin peroksinitritle olan ilişkisinin intravital görüntüleme yöntemleriyle incelenmesi hedeflendi. Daha sonra perisitlerin bu değişikliklerde oynadıkları rolün direkt gözlenmesi amacıyla retina mikrodamarları izole edilerek, OGD ve peroksinitrit uygulanmasına cevapları mikroskop altında incelendi. Son olarak, peroksinitritin kan beyin bariyeri hasarında rolü olan MMP-2 ve 9 üzerindeki etkisi zimografi yöntemiyle çalışıldı. İntravital görüntüleme için kraniyal pencere açıldıktan sonra farelere FITC-Dekstran verildi ve orta serebral arter tıkanması gerçekleştirildi. Flüoresan görüntülerde 2 saat iskemi sonunda mikrodamarların %56±3'ünde, takip eden 2 saat reperfüzyonun sonunda ise %62±3'ünde kesintiler tespit edildi (n=3). Bu kesintilerin içinde eritrositlerin hapsolduğu saptandı. Reperfüzyondan önce verilen PBN (serbest radikal temizleyicisi) boğumlanmış damar oranını anlamlı derecede azaltarak %30±4'e düşürdü (n=3). Topikal peroksinitrit uygulanması, mikrodamarların %54±4'ünde (n=3) segmental darlıklara yol açarken ebselen (peroksinitrit temizleyici molekül) verilen grupta bu oran %28±3'e (n=3) düştü. İzole retina mikrodamarlarında perisitlerin OGD`ye cevaben kasılarak komşu damar çapını bazalin %62±4'üne indirdikleri gözlendi (n=9). Reoksijenizasyon sıvısına geçilmesi ile bu oran değişmezken (%61±9, n=3) reoksijenizasyon sıvısına PBN eklenen grupta düzelme (%87±4) saptandı (n=5). Zimografi çalışmasının ilk bulguları düşük konsantrasyonlardaki peroksinitritin (1?10 µM) MMP-9 aktivasyonuna yol açabileceğine işaret etmektedir. Bu bulgular iskemi ve reperfüzyonun patofizyolojisinde peroksinitrit aracılı perisit disfonksiyonunun ve buna bağlı mikrodolaşım bozukluğunun rolü olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Ischemia/reperfusion may disrupt microcirculation and promote progression of the infarct to the penumbra. Although there are strategies for opening of occluded artery via thrombolytic agents and protection of cell death with neuroprotective agents, they are yet inadequate in clinical trials. Previously, microvascular constriction after ischemia/reperfusion was demonstrated ex vivo in histological sections through increased peroxynitrite (an oxidative and nitrative radical) production. Pericytes may actively contract and cause these constrictions. First aim of this thesis is to test mentioned findings about vascular constriction and the role of pericytes in these constrictions in situ (live animal model) by investigating microcirculatory changes during and after 2 hours of ischemia/reperfusion and after topical application of peroxynitrite with help of intravital microscopy. Second aim is to directly observe changes in pericytes after OGD or peroxynitrite application in isolated retinal microvessel preparation. Third aim is to study the effect of peroxynitrite on MMP-2 and 9 activation which were shown to play an important role in blood brain barrier damage by gelatin zymography method. For intravital imaging experiments, first a cranial-window was opened and FITC-Dextran was injected to mice and MCA occlusion was induced. Fluorescent images revealed that constrictions were detected on %56±3 of microvessels at the end of 2 hours of ischemia and following 2 hours of reperfusion this ratio was %62±3 (n=3). Entrapped erythrocytes were detected around these constrictions. PBN, a free radical scavenger, given before reperfusion significantly decreased the ratio of capillaries displaying constrictions to 30±4% (n=3). Peroxyitrite caused segmental constrictions on 54±4% of capillaries (n=3) while peroxynitrite scavenger ebselen significantly reduced peroxynitrite-induced capillary constrictions to 28±3% (n=3). During OGD of isolated retinal microvessels, pericyte contraction was observed and neighbouring vessel diameter was reduced to %62±4 of its baseline value (n=9). After reperfusion with normoxic and normoglycemic solution, this ratio was detected %61±9 (n=3). After addition of PBN to reperfusion solution, this ratio increased to %87±4 (n=5). Findings of of the gelatin zymography study were preliminary. Results imply that lower concentrations of peroxynitrite (1?10 µM) may cause MMP-9 activation. The results of this thesis showed that microcirculatory constrictions were also present in in-situ ischemia/reperfusion model and after direct application of peroxynitrite which were resolved with scavenging agent. During direct retinal pericyte examinations pericytes constricted after OGD and peroxynitrite applications.