Günlük hayatta sıklıkla kullanılan fitalatların metabolitleri mono etil hekzil fitalat ((MEHP) ve mono bütil fitalatın (MBP) olası etkilerinin ın vivo ve in vitro yöntemlerle araştırılması
Investigation with in vivo and in vitro methods for possible effects of mono ethyl hexyl phthalate and mono butyl phthalate that are phthalate metabolites frequently used in daily life
Yazar: GÖZDE KARABULUT
Danışman: PROF. DR. NURHAYAT BARLAS
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Endokrin bozucular, endokrin sistem tarafından sentezlenen hormonların etkilerini değiştirerek, engelleyerek ya da taklit ederek, canlı organizma üzerinde önemli etkiler oluşturan kimyasallardır. Fitalatlar, endokrin bozucu kimyasalların başında gelmektedir. Geçtiğimiz 10 yıl içinde diyabet görülme oranı artarak 3 katına yaklaşmıştır. Önümüzdeki 20 yılda ise diyabetli hasta sayısının 300 milyondan fazla olacağı öngörülmektedir. Endokrin bozucuların metabolizma, üreme ve yağ dokusu ile olan ilişkileri göz önüne alındığında diyabetle ilişkili olmaları olası görünmektedir. Di bütil fitalat (DBP) ve Di-etilhekzil fitalat (DEHP) en çok kullanılan fitalatların başında gelmektedir. Fitalatların emilimi ve metabolizması memelilerde oldukça hızlıdır ve yapılan çalışmalarda açığa çıkan metabolitlerin birçoğunun ana maddeye kıyasla daha toksik olduğu gösterilmiştir. Bu yüzden bu çalışmada en çok maruz kalınan fitalatların (DEHP ve DBP) metabolitleri mono 2-etil hekzil fitalat (MEHP) ve monobütil fitalat (MBP)'ın in vivo ve in vitro etkileri araştırılmıştır.
Bu amaçla, INS-1 β hücreleri, 5 farklı konsantrasyonda (0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM, 1 μM or 10 μM olacak şekilde) MEHP ve MBP metabolitlerine maruz bırakılmış ve 24, 48 ve 72. saat sonundaki etkileri MTT sitotoksisite testi ile gösterilmiştir. Ayrıca total oksidan ve antioksidan seviyeleri ölçülmüştür. Beta hücre proliferasyonu ile ilişkili olarak FOXO-1 ve PDX-1 genleri, beta hücre fonksiyonları ile ilgili olarak SIRT-1, İnsulin-1 ve İnsulin-2 genleri, apoptoz ile ilgili olarak da p53, Bcl-2 ve Bcl-XL genlerinin mRNA ifade düzeyleri analiz edilmiştir. INS-1 hücrelerinden insülin salınımı ölçülmüştür. Sonuçlarda MEHP ve MBP için doz artışına bağlı olarak hücre canlılığında istatistiksel olarak azalma görülmüştür. Hücrelerden salgılanan insülin miktarında da, MEHP ve MBP uygulamalarından sonra kontrol grubuna göre azalma gözlenmiştir. Total oksidan seviyelerinde, zamana bağlı olarak hem MEHP hem MBP uygulaması sonucunda artış görülmüştür. Total antioksidan seviyelerinde ise azalmanın olduğu tespit edilmiştir.
İn vivo çalışmada her grupta 6 sıçan olacak şekilde 1 adet yağ kontrol, 5 adet MEHP (mono 2-etilhekzil fitalat) doz uygulama grubu ve 5 adet MBP (mono bütil fitalat) doz uygulama grubu olmak üzere 11 grup yer almıştır. Çalışmada 6 haftalık erkek sıçanlardan oluşan toplam 66 hayvan kullanılmıştır.
MEHP uygulama gruplarından 1. gruba 25 mg/kg/gün, 2. gruba 50 mg/kg/gün, 3. gruba 100 mg/kg/gün, 4. gruba 200 mg/kg/gün ve 5. gruba 400 mg/kg/gün 28 gün boyunca her sabah oral gavaj yoluyla uygulanmıştır. MBP uygulama gruplarından 1. gruba 25 mg/kg/gün, 2. gruba 50 mg/kg/gün, 3. gruba 100 mg/kg/gün, 4. gruba 200 mg/kg/gün ve 5. gruba 400 mg/kg/gün oral gavaj yoluyla 28 gün boyunca her sabah uygulanmıştır. Deney süresince sıçanlarda yem ve su tüketimlerinin yanı sıra vücut ağırlıkları da ölçülmüştür. Deney bitiminde sıçanlardan alınan serum örneklerinde biyokimyasal analizler için aspartat transaminaz (AST), alanin aminotransferaz (ALT), trigliserit, üre, glikoz, kreatinin, total protein miktarları ölçülmüştür. Deney sonunda alınan kanda insülin hormonu ölçülmüş ve hematolojik analizler yapılmıştır. Ayrıca pankreas, karaciğer ve böbrek dokularında histopatolojik incelemeler yapılmıştır. İnsülin hormonu, 200 ve 400 mg/kg/gün MEHP doz grubunda, yağ kontrol, 25 ve 50 mg/kg/gün gruplarına göre azalma göstermiştir. MBP doz gruplarında da yağ kontrol grubuna göre insülin miktarında azalma olmuştur. ALT ve AST enzimleri, trigliserit ile glikoz ölçümleri 100, 200 ve 400 mg/kg/gün MEHP ve MBP doz gruplarında artış göstermiştir. 200 ve 400 mg/kg/gün MEHP doz grubunda karaciğerde sinüzoidal dejenerasyon, böbrekte glomerulus dejenerasyonu, pankreasta langerhans adacıklarında dejenerasyon görülmüştür. 400 mg/kg/gün MBP doz grubunda karaciğerde sinüzoidal dejenerasyon görülmüştür. Elde edilen sonuçlara göre MEHP ve MBP, pankreatik β hücreleri ve pankreas üzerinde negatif etkiye sebep olmuştur.

Abstract:
Endocrine disruptors are chemicals that have significant effects on the living organism by altering, inhibiting, or mimicking the effects of hormones synthesized by the endocrine system Phthalates are one of the main endocrine disrupting chemicals. The incidence of diabetes has almost tripled in the past 10 years. In the following 20 years, the number of patients with diabetes diagnosis is thought to exceed 300 million. It seems likely that endocrine disruptors are associated with diabetes, given their relationship to reproduction, metabolism, and adipose tissue. Di butyl phthalate (DBP) and Di-Ethylhexyl phthalate (DEHP) are the most widely used phthalates. In mammals, the absorption and metabolism of phthalates are quite rapid and conducted studies showed that most of the metabolites formed have been more toxic than the main chemical. Therefore, in vivo and in vitro effects of mono 2-ethyl hexyl phthalate (MEHP) and monobutyl phthalate (MBP), metabolites of the most exposed phthalates (DEHP and DBP) were examined in this study.
For this reason, INS-1 β cells were exposed to MEHP and MBP metabolites at 5 different concentrations (such as 0.001 μM, 0.01 μM, 0.1 μM, 1 μM or 10 μM) and 3 different times like 24h, 48h and 72h. their effect at the end of the hour was demonstrated by the MTT cytotoxicity test. Total oxidant and antioxidant levels were also measured. The mRNA expression levels of FOXO-1 and PDX-1 genes in relation to beta cell proliferation, SIRT-1,Insulin-1 and Insulin-2 genes in relation to Beta cell functions, and p53, Bcl-2 and Bcl-xL genes in relation to apoptosis were analyzed. Insulin released from INS-1 cells was measured. In the results, A statistical decrease in cell viability was observed due to increased dose for MEHP and MBP. The amount of insulin secreted from the cells decreased after MEHP and MBP applications compared to the control group. Total oxidant levels increased as a result of both MEHP and MBP administration depending on time. Total antioxidant levels have been reduced.
In the study, there were 11 groups, including 1 oil control group, 5 MEHP (mono 2-Ethylhexyl phthalate) dose administration groups and 5 MBP (mono butyl phthalate) dose administration groups with 6 rats in each group. A total of 66 animals, consisting of 6-week-old male rats, were used.
As for the MEHP application groups; the first group was received 25 mg/kg/day of MEHP, second group was received 50 mg/kg/day of MEHP, the third group was received 100 mg/kg/day of MEHP, the forth group was received 200 mg/kg/day of MEHP and the fifth group was received 400 mg/kg/day of MEHP through oral gavage every morning for 28 days. As for the MBP application groups; the first group was received 25 mg/kg/day of MBP each morning, second group was received 50 mg/kg/day of MBP each morning, third group was received 100 mg/kg/day of MBP each morning, the forth group was received 200 mg/kg/day of MBP each morning and the fifth group was received 400 mg/kg/day of MBP each morning through oral gavage for 28 days. During the experiment, body weights were measured in addition to feed and water consumption in rats. For biochemical analyses, Alanine aminotransferase (ALT), aspartate transaminase (AST), urea, triglycerides, glucose, creatinine, total protein were measured in serum samples taken from rats at the end of the experiment.
Insulin hormone mesurement and hematologic analyses were performed in the blood at the end of the experiment. In addition, histopathological examinations were carried out on pancreatic, liver and kidney tissues. Insulin hormone was decreased in 200 and 400 mg/kg/day of MEHP dose groups compared to oil control groups of 25 and 50 mg/kg/day of MEHP. There was also a decrease in the amount of insulin in the MBP dose groups compared to the fat control group. ALT and AST enzymes, triglycerides and glucose measurements increased in the 100, 200 and 400 mg / kg / day MEHP and MBP dose groups. In the 200 and 400 mg / kg / day MEHP dose group, sinusoidal degeneration in the liver, glomerulus degeneration in the kidney, degeneration in the islets of langerhans in the pancreas were observed. Sinusoidal degeneration was observed in the liver in the 400 mg / kg / day MBP dose group. According to the results, MEHP and MBP caused a negative effect on pancreatic β cells and pancreas.