Poli(bütilenadipat-ko-tereftalat) (PBAT) bazlı doku iskeleleri: Sentez, karakterizasyon ve osteoblastik aktivite
Poly(butyleneadipate-co-terephthalate) (PBAT) based scaffolds: Synthesis, characterization and osteoblastic activity
Yazar: AYSU ARSLAN
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Bu çalışma, FHD-2015-6667 kodlu "Poli(bütilenadipat-ko-tereftalat) (PBAT) Doku İskeleleri: Fabrikasyon ve in vitro Testler" adlı Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projesi ve 2210-C TÜBİTAK Öncelikli Alanlara Yönelik Yurt İçi Yüksek Lisans Burs Programı desteği ile hazırlanmıştır. Sunulan tez çalışmasının amacı, mevcut biyobozunur sentetik polimerlere alternatif olarak, alifatik-aromatik bir kopoliester olan PBAT'ın kemik doku mühendisliği alanındaki kullanım potansiyellerinin incelenmesidir. 
Tez çalışmasının ilk aşamasında, çözücü buharlaştırma ve elektroeğirme yöntemleri ile 2 boyutlu (2D), çözücü döküm-parçacık uzaklaştırma ve eriyik kalıplama-parçacık uzaklaştırma yöntemleri ile ise 3 boyutlu (3D) PBAT doku iskeleleri üretilmiştir. Doku iskelelerinin en uygun morfolojide üretilebilmeleri için optimum koşullar belirlenmiştir. Parçacık uzaklaştırma yöntemleri ile malzeme üretiminde 200-355 μm boyut aralığında NaCl parçacıkları kullanılmıştır. Çözücü döküm-parçacık uzaklaştırma işlemi ile üretilen doku iskelelerinde %90 oranında gözeneklilik ve 283 ± 61 μm gözenek boyutu; eriyik kalıplama-parçacık uzaklaştırma işlemi ile üretilen doku iskelelerinde ise %62 gözeneklilik ve 236 ± 61 μm gözenek boyutu elde edilmiştir. Elektroeğirme yönteminde seçilen optimum parametreler ile (21 kV gerilim, 1 mL/sa akış hızı ve 20 cm şırınga-toplayıcı arası mesafe) yaklaşık %85 gözenekliliğe, 12 μm gözenek boyutuna ve 569 ± 187 nm çapında fiberlere sahip 2D fibröz matrisler elde edilmiştir. Çözücü buharlaştırma yöntemi ile ise 400 μm kalınlığında, gözeneksiz ince filmler elde edilmiştir. 
Üretilen malzemeler ile yapılan su alım kapasitesi testleri sonucunda, en yüksek su alım kapasitesine sahip olan grup %578 ± 62 ile çözücü döküm-parçacık uzaklaştırma yöntemi ile üretilen doku iskeleleri, en düşük değere sahip olan grup ise %4 ± 3 ile çözücü buharlaştırma işlemi ile üretilen doku iskeleleri olmuştur. Mekanik dayanım testleri sonucu, eriyik kalıplama-parçacık uzaklaştırma işlemi ile üretilen doku iskelelerinin sıkıştırma direncinin (8.80 ± 6.10 MPa), kanselöz kemiğin sıkıştırma direncine benzer olduğu görülmüştür. PBAT ince filmlerin su temas açısı 71°, diğer doku iskelelerinin temas açıları ise gözenekli yapılarından dolayı 0° olarak elde edilmiştir. Lipaz enzimi ile yürütülen in vitro bozunurluk testlerinde, çözücü döküm-parçacık uzaklaştırma ile üretilen doku iskelelerinde 5. hafta sonunda yapısal bozunma gözlenmiştir.
İn vitro hücre kültür çalışmaları, MC3T3-E1 preosteoblastlar ile gerçekleştirilmiştir. SEM analizi ile yapılan morfolojik incelemeler sonucunda, kültürün 11. gününde hücrelerin tüm iskelelerin yüzeyini tamamen kapladığı görülmüş ve en hızlı hücre yayılımının fibröz matrislerin yüzeyinde olduğu gözlenmiştir. 
Çalışmanın ikinci kısmında, daha büyük gözenek boyutuna ve daha yüksek gözenekliliğe sahip 3D fibröz matrislerin üretimi ıslak elektroeğirme ile gerçekleştirilmiş, biyoaktivitenin incelenmesi için insan kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücreler (hBMSC) kullanılmıştır. Osteoindüktif etkinin artırılması amacıyla, mikrodalga destekli biyomimetik çöktürme yöntemi ile üretilen hidroksiapatit (HAp) ve bor katkılı hidroksiapatit (B-HAp) parçacıkları, %5 (w/w) oranında PBAT fiberlerin yapısına eklenmiştir. Üretilen 3D fibröz matrislerin gözenek boyutu 30 ± 22 μm, gözenekliliği ise yaklaşık ~%91 olarak belirlenmiştir.
hBMSC'ler ile yapılan hücre kültür çalışmaları sonucu, hücrelerin 3D fibröz matrislerin iç kısımlarına yayılamayıp tüm yüzeyi kapladığı, mineralize yapıların ise doku iskelesinin iç kısımlara geçebildiği gözlenmiştir. Hücre farklılaşmasının belirlenmesinde, alkalin fosfataz (ALP) aktivitesi, kollajen ve kalsiyum miktarları kolorimetrik yöntemlerle tayin edilmiş ve elde edilen sonuçlar ALP, kollajen tip I (COL-I), osteokalsin (OCN) ve osteopontin (OPN) gibi gen ifadelerinin gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) incelenmesi ile desteklenmiştir. Farklılaşma analizleri sonucu, B-HAp-PBAT doku iskelelerinde osteojenik farklılaşmanın daha belirgin olduğu gözlenmiştir.
Sonuç olarak, PBAT doku iskelelerinin yüzey yapısı, biyobozunurluk ve mekanik özellikler açısından yeterli özellikler gösterdiği, hücre tutunmasını ve çoğalmasını büyük ölçüde desteklediği anlaşılmıştır. Özellikle osteojenik farklılaşmayı iyileştiren B-HAp gibi malzemeler ile desteklendiğinde, PBAT'ın kemik doku mühendisliği uygulamalarında kullanılabilecek alternatif bir biyomalzeme olduğu anlaşılmıştır.

Abstract:
This thesis was prepared with support of FHD-2015-6667 Hacettepe University funding project and TÜBİTAK 2210-C Primary Subject National Scholarship Program for MSc Students. The aim of the present study is to investigate the potential of an aliphatic-aromatic copolyester PBAT as an alternative biomaterial for bone tissue engineering applications.
At the first part of the study, 2 dimensional (2D) PBAT scaffolds were fabricated with solvent evaporation and electrospinning whereas 3 dimensional (3D) PBAT scaffolds were fabricated with solvent casting-particulate leaching and melt molding-particulate leaching techniques. In order to obtain better results in terms of morphology, optimum parameters were determined for scaffold fabrication. The size range of NaCl particles used in the particulate leaching methods were determined as 200-355 μm. Porosity of 90% and pore size 283 ± 61 μm were obtained with solvent casting-particulate leaching technique whereas porosity of 62% and pore size of 236 ± 61 μm were obtained with melt molding-particulate leaching technique. Electrospun fibrous mats have 85% of porosity, 12 μm of pore size and 569 ± 187 nm of fiber diameter under optimized process parameters (21 kV of voltage, 1 mL/h of flow rate and 20 cm of distance between syringe tip-collector). Non-porous thin films with 400 μm thickness were fabricated with solvent evaporation method.
According to water absorption capacity analyses, solvent casting-particulate leaching scaffolds have the highest water uptake of 578 ± 62 % whereas thin films have the least water uptake capacity that is close to zero. According to mechanical tests, melt molding-particulate leaching scaffolds showed a mechanical strength (8.80 ± 6.10 MPa)  similar to cancellous bone. Water contact angle of PBAT thin films were observed as 71°, whereas other scaffolds have contact angle value of zero due to their porous structure. According to in vitro degradation assays, solvent casting-particulate leaching scaffolds were partially degraded within lipase enzyme after 5 weeks.
In vitro cell culture studies were carried out with MC3T3-E1 preostoblastic cell line. According to morphological investigation with SEM analysis, it was observed that cells fully covered the surface of the scaffolds at the end of the 11th day of the culture. The most rapid cell spreading was observed on fibrous mats.
At the second part of the study, 3D fibrous mats that have higher pore size and porosity were fabricated via wet electrospinning method. In order to investigate bioactivity of the scaffolds, human bone marrow derived mesenchymal stem cells (hBMSCs) were used in cell culture studies. In order to enhance osteoinductive effect, hydroxyapatite (HAp) and boron containing hydroxyapatite (B-HAp) particles were fabricated via microwave-assisted biomimetic precipitation method and added into PBAT fibrous mats with ratio of 5% (w/w). Fabricated 3D fibrous mats have pore size of 30 ± 22 μm and porosity of  ~91%.
According to hBMSC culture studies, it was observed that cells could not infiltrated into 3D fibrous mats and covered the surface of scaffolds. However, secreted minerals could penetrate into the scaffolds. In order to determine cell differentiation, alkaline phosphatase (ALP) activity, collagen and calcium amounts were determined via colorimetric assays and also ALP, collagen (COL-I), osteocalcin (OCN) and osteopontin (OPN) gene expressions were investigated via real time-polimerase chain reaction (RT-PCR) analyses. As a result, differentiation of hBMSCs on B-HAp-PBAT fibrous mats were more significant than the other groups.
As a conclusion, it was observed that PBAT scaffolds have adequate properties in terms of surface structure, biodegradability and mechanical properties and they promote cell attachment and proliferation. PBAT can be used as an alternative biomaterial for bone tissue engineering applications particularly with the incorporation of materials like B-HAp, to enhance the osteoinductivity.