"Horseradish" peroksidaz (bayır turpu peroksidazı) (HRP) ve dekstran türevinin çevre kirletici boyalara etkisinin incelenmesi
The effect of horseradish peroxidase (HRP) and its dextran derivative on environment pollutant dyes
Yazar: R. SELVA ÖNDER
Danışman: PROF. DR. HURİYE KUZU
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: FTIR = FTIR ; Horseradish peroxidase = Horseradish peroxidase

Özet:
Özellikle diyagnostik endüstrisinde kullanılan ticari öneme sahip enzimlerden Bayır Turpu Peroksidazı (Horseradısh Peroksidase, HRP, E,C 1.11.1.7) adı geçen bitkinin (Armoracia rusticana) köklerinden ekstre edilmektedir. HRP yaklaşık yüzyıldır üzerinde çalışılan hem içerikli bir peroksidazdır ve çok sayıda izoenzimi bulunmaktadır. HRP'nin enzimatik aktivitesi hem grubunda bulunan demir atomunun oksidasyon ve redüksiyonundan ileri gelmektedir. Hem grubu nedeniyle HRP 403 nm'de de absorpsiyon vermektedir. Peroksidazlar yükseltgeyici olarak hidrojen peroksidi veya organik hidrojen peroksidleri kullanan oksideredüktazlardır. H2O2 ile Bileşik I, II ve III olmak üzere üç farklı yapı oluştururlar.Fenolik bileşikler tıp, gıda endüstrisi atıklarda kirleticilerin başında gelmektedir. Bu nedenle fenolik bileşiklerin hassas ve hızlı bir şekilde saptanması, çevre çalışmaları ve sağlık açısından önemlidir. Horseradısh peroksidaz (HRP) fenollerin, bifenollerin ve bunlar gibi heteroaromatik bileşiklerin oksidasyonlarını katalizleyebilmektedir.HRP geniş bir pH ve sıcaklık aralığında aktivite gösterdiğinden atık suların temizlenmesinde kullanılması uygun görülmektedir. Sulu çözeltilerden fenol ve türevlerinin HRP katalizinde giderilmesini optimize etmek amacıyla son 20 yılda birçok çalışma gerçekleştirilmiştir. HRP, içinde fenol, klorofenol ve diğer sübstitüe fenollerin de bulunduğu birçok aromatik bileşiğin polimerizasyonu öncesinde serbest radikal oluşumunu katalizlediği bilinmektedir.H2O2 + 2 AH2 HRP 2AH + 2H2OToksik özellikte olan bu boyaların giderilmesi amaçlanarak kimyasal yükseltgeme, ters ozmoz, adsorbsiyon gibi çeşitli yöntemler denenmiştir. Son zamanlarda bu konuda çalışan araştırmacıların dikkati enzim etkisi ile gidermeye odaklanmıştır. Özellikle bitki peroksidazlarının üzerinde durulmaktadır.Bu çalışmada HRP-Dekstran kovalent konjugatı sentezlendi. Öncelikle, HRP immobilize Con A kullanılarak affinite kromatografi yöntemi ile saflaştırıldı. Dekstranın (Mw 75.000 Da) aldehid türevi ve saf enzim örnekleri kullanılarak 1/10 mol oranında(mol enzim/mol dekstran) enzim-dekstran konjugatı sentezlendi.Saflaştırılan enzimin ve sentezlenen 1/10 oranlı konjugatın katalizi ile Naphtol Blue Black ve Coomassie Brillant Blue boyalarının giderilmesi 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 oC sıcaklıklarda, pH: 3, 4, 5, 6, 7 ve 8' da incelendi. Bu reaksiyon bir saat süre ile UV-Vis. Spektrofotometre ile izlendi. ?Naphtol Blue Black? ve ?Coomassie Brillant Blue? in parçalanması LC-MS ve FT-IR sonuçlarına göre değerlendirildi.

Abstract:
Horseradish Peroxidase (HRP; E.C 1.11.1.7) notably used in diagnostic industry and having a great commercial importance, is extracted from the roots of Armporacia rusticana. HRP enzyme is a heme containing peroxidase which has been studied for a century and has so many isoenzymes. Enzymatic activity of HRP take its source from the reduction and oxidation of iron atom present in heme group. As a result of having a heme group, HRP has an absorbance at 403 nm . Peroxidases are oxidoreductases which use hidrogen peroxidase or organic hydrogen peroxidases as oxidants. Most of them are glycoprotein structured enzymes having N-linked oligosaccaharides in their compositions. They have three different forms known as Compound I, II and III with H2O2.Fenolic compaunds are major pollutants in medicine, food and local matrixe.Hence, it is important to detect fenolic compounds sensitively. Horseradish peroxidase (HRP) can be catalyse oxidation of heteroaromatic compounds as phenols, biphenols, alinine. Because of HRP shows wide range of pH and temparature, it is seem favor to use processsing to waste water. In recent 20 years in order to optimize the removal of phenol and analogous from waste water, many studies have been performed. It is known that HRP catalyse free radical existion before polymerization of phenol, chlorophenol and other substitue phenols.H2O2 + 2 AH2 HRP 2AH + 2H2OVarious methods were tested such as chemical oxidation, reverse osmos, adsorpsition to remove these toxic dyes. Recently, investigators who work in this area focus on removing these toxic substances by enzyme catalyses. Especially, it is emphasized on plant peroxidases.In this study, Horseradish Peroxidase-Dextran covalent conjugate was synthesized. Thus, firstly HRP was purified by affinity chromatography using immobilized Con A. Enzyme-dextran conjugate with 1/10 molar ratio was synthesized using dextran aldehyde derivative (Dextran Mw 75.000 Da) and purified enzyme.Bleaching of Naphtol Blue Black and Coomassie Brillant Blue dyes were observed with UV-VIS absorbance spectrophotometer for 60 minutes and results are compared. The reactions by using purified enzyme and conjugate were performed at different pHs (pH: 3, 4, 5, 6, 7, 8) in a 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, oC temperatured in UV-VIS quartz cuvette. Degredation of ?Naphtol Blue Black? and ?Coomassie Brillant Blue? were evaluated using LC-MS and FT-IR spectra.