Formalinde tespit edilmiş, parafine gömülü patoloji arşiv materyalinin kantitatif gen ekspresyon analizi için kullanımı
Quantitative gene expression analysis of formalin-fixed paraffin-embedded archieval tissue samples
Yazar: DİCLEHAN ORHAN
Danışman: PROF. DR. MERAL ÖZGÜÇ
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Gen amplifikasyonu = Gene amplification ; Genetik analiz = Genetic analysis ; Gerçek zaman = Real time ; Kantitatif = Quantitative ; Nefrektomi = Nephrectomy ; Parafine gömme-doku kesitleri = Paraffin embedding ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Kanser araştırmalarında normal ve malign dokularda gen ekspresyon profillerinin analizi kanser gelişimi ve ilerlemesi hakkında önemli bilgiler kazandırmaktadır. Bu çalışmada patoloji arşiv materyalini oluşturan parafine gömülü dokularda yeni moleküler teknikler ile parafine gömülü tümör, nefrojenik artık ve normal böbrek dokularından RNA ekstraksiyonu yapılarak cDNA sentezlenmiş ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile gen ekspresyon profilleri değerlendirilmiştir. Kontrol olarak kullanılan dondurulmuş dokular ile kalite ve miktar olarak karşılaştırmaları yapılmıştır. Invitrogen PureLink FFPE Total RNA İzolasyon Kiti kullanıldığında, hem RNA konsantrasyonlarında hem de saflıkta guanidinium isothiocyanate denatürasyon solüsyonu kullanılarak yapılan RNA izolasyonu yöntemine göre artış olduğu saptandı. RNA izolasyon kiti kullanılarak, 1 ? 20 saat süreyle formalinde tespit edilen dokulara ait parafin bloklardan, cDNA?ya çevrilebilen RNA izole edilebildiği ve bu RNA?nın, housekeeping genler açısından gerçek zamanlı PZR ile yeterince iyi sonuç verecek saflıkta olduğu gösterildi. Parafin blok ömrü 5 yıl ve daha fazla olan dokulardan elde edilen RNA?nın gen ifade analizi için uygun olmadığı saptandı. Parafin dokulardan elde edilen RNA?lardan sentezlediğimiz cDNA?ların hem HPRT hem de TBP geni için, ancak 35. döngüden sonra amplifiye olduğu, bu nedenle kantitasyona uygun olmadığı görüldü. Parafin kesitlerden elde edilen RNA?lar dondurulmuş dokulardan elde edilen RNA kalitesinde olmadığı için WT1 (Wilms tümör 1), PAX2 (paired box gene 2), PODXL (podocalyxin-like) genlerinin amplifikasyonunda kantitasyon yapılamadığı gösterildi. Formalinde tespit edilmiş parafine gömülü doku örneklerinden izole edilen RNA?dan sentezlenen cDNA üzerinden konvansiyonal PZR yöntemiyle amplifikasyon varlığının belirlenebileceği, ancak tez kapsamında kullanılan koşullarda kantitasyon yapılamayacağına karar verildi.Anahtar kelimeler: Kantitatif gen ekspresyon analizi, parafine gömülü doku, gerçek zamanlı PZR, Wilms tümörü, nefrojenik artık.

Abstract:
Gene expression profiling in cancer development and progression using normal and malign tissue has great information for cancer research. In this study; using formalin-fixed parafin-embedded archieval tissue samples, RNA isolation and cDNA synthesis from tumour, nephrogenic rest and normal renal tissue and then gene expression profiling were performed using RT-PCR technique. Frozen tissue was used as control in order to do quality and quantity comparison. Invitrogen PureLink FFPE Total RNA Isolation kit gave better results by means of RNA concentration and purity when compared to guanidinium isothiocyanate protocol. Using RNA isolation kit, we demonstrated that; RNA can be isolated from 1-20 hours formalin-fixed samples and this RNA is appropriate for housekeeping genes? PCR. We showed that RNA isolated from 5 years or older paraffin block age can not be used for gene expression analysis. When we used RNA isolated from paraffin-embedded tissues in RT-PCR, housekeeping genes; HPRT and TBP were amplified after 35th cycle which was not acceptable for quantitation. Since the purity of RNA isolated from paraffin-embedded tissues was not as good as frozen tissues, quantitation couldn?t be done after WT1 (Wilms tumour 1), PAX2 (paired box gene 2), PODXL (podocalyxin-like) genes? amplification. We demonstrated that cDNA synthesized using RNA isolated from formalin-fixed parafin-embedded tissue samples can be used in convantional PCR to investigate the presence of a gene but can not be used in quantitation under these conditions.Keywords: Quantitative gene expression analysis, parafin-embedded tissue, Real-time PCR, Wilms tumour, nephrogenic rest.