Badem ağaçlarında sorun olan toprak kökenli fungal hastalık etmenlerine karşı antagonist ve bitki gelişimini teşvik eden bakterilerin İn Vitro etkinliklerinin belirlenmesi
Determination of In Vitro effects of antagonist and plant growth promoting bacteria against soilborne fungal disease agents on almond trees
Yazar: ZEKİYE CEREN AKTAN
Danışman: PROF. DR. SONER SOYLU
Hatay Mustafa Kemal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bitki Koruma Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Badem (Prunus dulcis L.) Güneydoğu Anadolu Bölgesinin önemli ürünlerinden biridir. Sclerotinia sclerotiorum (Ss), Ceratobasidium sp (Cb), Macrophomina phaseolina (Mp), Fusarium oxysporum (Fox) ve Phytophthora chlamydospora  (Pc) bademlerde kök solgunluk, kök ve kökboğazı çürüklüğü hastalıklarına neden olan önemli toprak kökenli hastalık etmenleridir. Toprak kökenli hastalık etmenlerinin gelişimi rizosfer ve filosferde bulunan yararlı mikrobiomlar ile baskılanabilir. Bu çalışmanın amacı sağlıklı badem bitkilerinin farklı kısımlarından endofit ve epifit bakterilerin izolasyonu, teşhisi, Sclerotinia sclerotiorum, Ceratobasidium sp., Macrophomina phaseolina, Fusarium oxysporum  ve Phytophthora chlamydospora etmenlerinin misel gelişimlerinin in vitro koşullarda engellemedeki antagonistik potansiyellerinin ikili kültür testleri ile belirlenmesidir. Bakterilerin protease, amonyak, hydrogen cyanide (HCN), siderophore üretimi gibi antagonistik, indole-3-acetic acid (IAA) üretimi ve fosfor çözme gibi bitki gelişimini teşvik edici özellikleri kalitatif ve kantitatif olarak belirlenmiştir. 
Sağlıklı badem bitkilerinin rizosfer ve endosfer bölgelerinden toplam 97 izolat elde edilmiş olup, 46 izolat MALDI-TOF MS ile teşhisi edilmiş ve fungal etmenlere karşı antagonistik potansiyelleri karakterize edilmiştir. Elde edilen 46 izolatın 19'u Gram-negatif, 27 tanesi Gram-pozitifdir. İkili kültür testlerinde Bacillus spp. den Bacillus subtilis ssp subtilis AEP3 (Pc'ye), AEP116 (Ss'ye), AEP138 (Fox, Mp, Cb'ye), Bacillus mojavensis AEP109 (Fox, Pc'ye) ve AEP4 (Cb'ye), B. vallismortis AEP113 (Mp, Ss'ye), B. cereus AEP2 (Mp, Ss'ye), Serratia marcescens AEN38 (Fox, Cb'ye), Pseudomonas chlororaphis ssp aurantiaca AEP119 (Ss'ye) ve Ochrobactrum anthropi AEP84 (Pc'ye) hastalık etmenlerinin misel gelişimlerini %64-80 gibi yüksek oranlarda engellemek suretiyle güçlü in vitro antagonistik etkinlik göstermiştir. Bacillus spp. izolatlar engelleme bölgesine yakın yerlerdeki fungus hifleri üzerinde vakuolleşme, büzüşme, şişme ve erime şeklinde morfolojik bozulmalara neden olmuştur. Test edilen bakteri izolatları IAA, siderophore, protease, amonyak üretimi ve fosfor çözme bakımından istatistiksel olarak oldukça farklılıklar göstermiştir. Test edilen 46 izolatın, 46 tanesi siderophore, 45 tanesi amonyak, 35 tanesi protease üretiminde pozitif iken, hiçbiri HCN üretmemiştir. Siderofor, protease ve amonyak üretiminin misel gelişimin engellenmesinde (antagonizm) rol oynayan faktörler olabileceği düşünülmektedir. Test edilen tüm bakteriler değişen oranlarda IAA üretmiş olup, 35 izolat fosforu çözebilme yeteneğinde olduğu belirlenmiştir. İzolatlar arasında Enterobacter cloacae ssp dissolvens AEP15 en fazla IAA üreten izolat olmuştur. Antagonistik etkinlik gösteren izolatlar aynı zamanda IAA'de oluşturmuştur.
Sonuç olarak biyokontrol etmeni olarak kullanılan bakteriyel izolatlar entegre mücadele programı kapsamında pestisitlerin çevre üzerindeki olası olumsuzlukların azaltılmasında rol oynayabilirler. Güçlü antagonistik (siderophore, protease, amonyak üretimi) ve PGPB (IAA ve fosfor çözme) etkinlikleri gösteren, özellikle Bacillus spp. ait izolatların pestisitlere alternatif biyokontrol etmeni olarak değerlendirilebileceği, test edilen toprak kökenli hastalık etmenlerinin baskılanmasında biyokontrol ajanı olarak geliştirilebilme potansiyeline sahip olduğu belirlenmiştir. Bu çalışma antagonist bakteri türlerinin bademde sorun olan bazı toprak kökenli hastalık etmenlerine karşı biyokontrol etkinliğinin ve etki mekanizmalarının araştırıldığı ilk çalışma niteliğindedir.

Abstract:
Almond (Prunus dulcis L.) is an important crops grown in the South East Anatolia region of Turkey. Soilborne fungal diseases such as Sclerotinia sclerotiorum (Ss), Ceratobasidium sp (Cb), Macrophomina phaseolina (Mp), Fusarium oxysporum (Fox) and Phytophthora chlamydospora (Pc) are the important pathogens of almond plants, causing plant wilt and/or crown, root rot diseases. The development of soil borne pathogens can be suppressed by beneficial microbioms in the rhizosphere or phyllosphere. The aim of this study was to isolate and identify bacterial epiphytic and endophytic bacteria isolated from different parts of healthy almond plants and also to evaluate their inhibitory potential on mycelial growth of soil borne fungal disease agents Sclerotinia sclerotiorum, Ceratobasidium sp., Macrophomina phaseolina, Fusarium oxysporum and Phytophthora chlamydospora in vitro conditions by using dual culture assay. Antagonistic and Plant Growth-Promoting Bacteria traits such as protease, ammonium, hydrogen cyanide (HCN), siderophore, indole-3-acetic acid (IAA) productionand phosphate solubilization by bacterial isolates were also determined qualitatively and quantitatively. 
A total of 97 bacterial isolates were obtained from the rhizosphere (epiphytic) and endosphere (endophytic) of healthy almond trees, 46 of these isolates were identified by MALDI-TOF MS analysis and selected for antagonistic potential against fungal isolates. Out of the 46 isolates, 19 were Gram-negative while 27 were Gram-positive. In dual culture assay, isolates of different Bacillus spp such as Bacillus subtilis ssp subtilis AEP3 (against Pc), AEP116 (against Ss), AEP138 (against Fox, Mp, Rs), Bacillus mojavensis AEP109 (against Fox, Pc) and AEP4 (against Rs), B. vallismortis AEP113 (against Mp, Ss), B. cereus AEP2 (against Mp, Ss), Serratia marcescens AEN38 (against Fox, Rs), Pseudomonas chlororaphis ssp aurantiaca AEP119 (against Ss) and Ochrobactrum anthropi AEP84 (against Pc) displayed the strong and broad spectrum in vitro antagonistic activities by inhibiting mycelial growth of the fungal disease agents (mycelial inhibition values ranging between 64-80%). Bacterial isolates of Bacillus spp. caused considerably morphological changes such as vacuolation, shriveling, swelling and lysis of hyphae close to inhibition zone. These bacterial isolates significantly varied in the production of siderophores, proteases, IAA and phosphate solubilization. Among the tested bacterial isolates, 46 were positive for siderophore production, 45 for ammonium production, 37 for protease production. Nevertheless, all the isolates were negative for HCN production. The production of siderophore, protease and ammonium by these isolates may be the contributing factor(s) for their antagonistic properties against the suppression of the mycelial growth. All selected bacterial isolates produced IAA in a relatively varying amounts but 35 isolates solubilized the phosphate. Among the isolates, Enterobacter cloacae ssp dissolvens AEP15 produced a relatively large amount of extracellular IAA. Isolates which exhibited strong and broad spectrum in vitro antagonistic activities also produced IAA.
In conclusion, bacterial antagonists used as biocontrol agents represent part of an integrated management program to reduce pesticides in the environment. The strong antagonistic (siderophore, protease, ammonium production) and PGPR traits (IAA and phosphate solubilization potentials) displayed by effective isolates belonging to Bacillus spp may be considered a good alternative as a biocontrol agent and have the potential to be developed as biofungicides for suppressing soil borne plant pathogens tested in this study. This is the first study to investigate the biocontrol effect and mode of action of some of the antagonist bacterial species on soil borne fungal disease agents of almond tested in the present study.