CRISPR-Cas9 Teknolojisi ile in Vitro F8 geninin fonksiyonunun bozulmasının sağlanması
Impairment of F8 Gene function in Vitro with CRISPR-Cas9 technology
Yazar: MAHDI SHEKARI
Danışman: PROF. DR. FERİŞTAH FERDA ÖZKINAY
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Hemofili A = Hemophilia A

Özet:
Hemofili A, F8 eksikliği sonucunda gelişen nadir bir hematolojik kalıtsal hastalıktır. F8'de meydana gelen intron 1 ve intron 22 inversiyonları, nokta mutasyonları, delesyonlar, insersiyonlar ve yeniden düzenlemeler Hemofili A hastalığına neden olan mutasyon tipleridir. Ağır hemofili A tanılı olguların yaklaşık yarısında veya tüm olguların yaklaşık %30 kadarında "F8 intron 22 inversiyon mutasyonu" bulunmaktadır. Nokta mutasyonları (tek nükleotid değişiklikleri) en yaygın gen defekti sayılır ve yaklaşık olarak hemofili hastalarının %90'nında bulunmaktadır. Hemofili "tek gen hastalığı" olması açısından genetik tedavi yaklaşımı için ideal hastalıklardan biri olarak görünmektedir.
 Gen düzenleme teknolojilerle F8 geninde meydana gelen mutasyonların düzeltilmesi Hemofili hastalığın tedavisinde kritik bir yaklaşım olabilir. Bu çalışmada, Karaciğer Stellate hücre (LX-2) hattında CRISPR-Cas9 (Düzenli aralıklarla bölünmüş palindromik tekrar kümeleri) teknolojisiyle F8 genin daha önce belirlenen bölgelerden, çift sarmallı DNA'yı kesip indel (İnversiyon-Delesyon) mutasyon oluşturarak Hemofili A hücre modelin oluşturulması araştırılmıştır. Bu amaç doğrultusunda tasarlanan dört farklı sgRNA, verimlilik testine tabi tutulup yüksek verimliliğe sahip oldukları tespit edildikten sonra, plazmid vektörlerine bağlanıp klonlandılar. Farklı sgRNA'ların klonlama aşamasında düzgün bir şekilde vektörlere bağlanması ve mutasyona uğramadıkları Sanger metoduyla DNA sekansı yapılarak tespit edilmiştir. Transfeksiyon öncesi hedef hücrelerinde (LX-2) ekspresyon testi ve Western blot yöntemiyle sırayla F8 gen ve faktör VIII protein ifadesi kontrol edilip tespit edildi. Ayrıca Karaciğer Stellate (LX-2), THLE-2, HEK 293T ve HEPG2 hücrelerde Kromojenik yöntemiyle faktör VIII protein aktivite tahlili yapılmıştır. LX-2 hücrelerde faktör VIII proteinin sentezi yüksek düzeyde olduğu gösterilmiştir. 
Saflaştırılmış gRNA ve Cas9 içeren plasmid vektörleri nano vezikül üretici HEK-293T hücrelerine transfekte edilmiştir. Hedefe özel 4 farklı sgRNA kompleksini içeren nano veziküller HEK-293T hücrelerinde üretilip transfeksiyonun gerçekleştiği tespit edilmiştir. Elde edilen CRISPR Cas9 sistemi LX-2 sağlıklı karaciğer Stellate hücrelerine (hedef hücrelere) başarıyla transfekte edilmiştir. Böylelikle nano vezikül yüzeyindeki Cherry Picker floresan işaretçisinden kaynaklanan kırmızı floresan sinyali mikroskop altında LX-2 hücrelerinde tespit edilip transfeksiyonun başarıyla gerçekleştiği gösterildi. Gen düzenlemesi Sanger sekansı ile doğrulandı. Sonuç olarak, CRISPR Cas 9 teknolojisi Hemofili hücre modelin oluşturulması ve gelecekte Hemofili hastalığın tedavisi için yeni bir terapötik yaklaşım sunabilir.

Abstract:
Hemophilia A is a rare hereditary disease that develops due to a lack of the F8. Intron 1 and intron 22 inversions, point mutations, deletions, insertions and rearrangements mutations, occurring in F8, cause hemophilia A disease. Approximately half of the cases with severe hemophilia A, or about 30% of all cases, have "F8 intron 22 inversion mutation". Point mutations (single nucleotide changes) are considered to be the most common genetic defect. Hemophilia is a single gene disease that makes it a suitable candidate for genetic therapy. 

Correction of mutations in the F8 gene with gene editing technologies may be a critical approach in the treatment of hemophilia. In this study, the creation of a Hemophilia A cell model by cutting double-stranded DNA from previously determined regions of the F8 gene and creating an indel (Inversion-Deletion) mutation with CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) technology in the Hepatic Stellate cell (LX-2) line has been researched. Four different sgRNAs designed for this purpose were subjected to efficiency testing and determined to have high efficiency, then they were ligated into plasmid vectors and cloned. It was determined that different sgRNAs were properly attached to the vectors during the cloning phase by DNA sequencing using the Sanger method. F8 gene and factor VIII protein expression were checked and detected by expression test and Western blot method in target cells (LX-2) before transfection, respectively. In addition, factor VIII protein activity assay was performed by Chromogenic method in Liver Stellate (LX-2), THLE-2, HEK 293T and HEPG2 cells. Plasmid vectors containing purified gRNA and Cas9 were transfected into nanovesicle producer HEK-293T cells. It was determined that nano vesicles containing 4 different target-specific sgRNA complexes were produced in HEK-293T cells and transfection took place. The resulting CRISPR Cas9 system was successfully transfected into LX-2 healthy liver Stellate cells (target cells). The red fluorescent signal originating from the CherryPicker fluorescent marker on the nano-vesicle surface was detected under the microscope in LX-2 cells and it was shown that the transfection was successful. Gene editing was confirmed by Sanger sequencing. In conclusion, CRISPR Cas9 technology may offer a new therapeutic approach for the establishment of a Hemophilia cell model and for the treatment of Hemophilia in the future.