Optimization of Production Parameters for Single Cell Oil and Metabolite Production from Yarrowia lipolytica Strains
Yarrowia lipolytica Suşlarından Tek Hücre Yağı ve Metabolit Üretim Parametrelerinin Optimizasyonu
Yazar: AYŞE SAYGÜN
Danışman: DOÇ. DR. NEŞE ŞAHİN YEŞİLÇUBUK ; PROF. DR. NECLA ARAN
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Son yıllarda, bitki ve hayvan kaynaklarının öngörülebilir kısıtlılığı nedeniyle, mikrobiyal yağ ve metabolit üretimi, giderek artan önem kazanmaktadır. Mikrobiyal lipitler ve metabolitler gıda, yakıt ve oleo-kimyasal endüstriler için umut verici hammaddelerdir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, mikroorganizmaların, düşük değerli substratları, lipitler, enzimler, sitrik asit, mikrobiyal kütle ve polioller gibi katma değeri yüksek ürünlere dönüştürme potansiyelini göstermektedir. Mikrobiyal yağ üretimi, çeşitli oleosus mikroorganizmaların (bu mikroorganizmalar, kuru maddede ağırlıkça %20'den fazla lipid depolayabilmektedir) lipid depolama kapasiteleriyle endüstriyel açıdan ilgi çekmektedir. Enzimler ve organik asitler mikroorganizmaların başlıca endüstriyel metabolitleridir. Sitrik asit, tüm gıda asitlerinin %60'ını temsil etmektedir. Enzimler arasında lipazlar, lipit teknolojisi, biyo-endüstride önemlidir ve hidroliz (uzun zincirli yağ asitlerinin tri-, di- ve mono-gliseridlerinin ester bağlarını yağ asitleri ve gliserole hidroliz), esterifikasyon, interesterifikasyon, asidoliz, alkoliz ve trans-esterifikasyon gibi reaksiyonları katalize ederler. Lipazlar, enzim pazarının yaklaşık %5'ini oluşturur ve gıda, süt, deterjan ve ilaç endüstrisinde birçok uygulamaları bulunmaktadır. Model oleosus mikroorganizmalar arasında, Yarrowia lipolytica, genetik özellikleri tanımlanmış, metabolit üretme yeteneği yüksek olması nedeniyle biyoteknolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Y. lipolytica, trigliseritler ve yağlar gibi hidrofobik substratları asimile etme ve tek hücre yağları (THY), lipazlar ve organik asitler gibi metabolitleri üretme özelliğine sahiptir. Y. lipolytica, ilaç, gıda ve çevre endüstrilerinde biyokatalizör olarak kullanılabilen hücre içi ve hücre dışı lipazlar üretmektedir. 
Bu doktora tezinin hedefleri; (i) farklı yağ kaynaklarının (hodan, kanola, keten tohumu, susam, Echium ve alabalık yağları) ve yağ endüstrisi atık ve yan ürünlerinin (prina yağı, fındık yağı pres küspesi ve ayçiçek yağı küspesi), Y. lipolytica YB 423-12 maya hücresinin büyüme ve morfolojisine etkilerinin araştırılması; (ii) Y. lipolytica YB 423-12 suşu kullanılarak üretilen mikrobiyal yağların verimi ve yağ aside bileşiminin belirlenmesi; (iii) Y. lipolytica YB 423-12 suşundan sitrik asit ve lipaz üretiminin araştırılıması; (iv) Fındık yağı pres kekinin substrat olarak kullanıldığı fermantasyon koşullarını optimize ederek Y. lipolytica YB 423-12'nin hücre dışı lipaz aktivitesinin arttırılması; (v) mikrobiyal lipaz enziminin saflaştırılması ve karakterize edilmesi; (vi) lipaz enzimi üretimine substratın yağ, protein ve selüloz bileşenlerinin etkilerinin incelenmesi; (vii) büyük ölçekte lipaz enzimi üretiminin maliyet analizinin incelenmesidir.
İlk bölümde, bu doktora tezinin araştırma çerçevesi ve hedefleri verilmiştir. Bundan sonra, Bölüm 2'de, mikrobiyal lipidler ve metabolitler üzerine literatür taraması sunulmaktadır. Aynı bölümde, lipid akümülasyonu, yağ asitleri üzerine ve farklı mikroorganizmalarla yapılan çalışmalar derlenmiştir. Daha sonra optimizasyon çalışmaları, genetik manipülasyon ve metabolik mühendislik çalışmaları tartışılmıştır. Son olarak, sitrik asit ve lipaz enzimi gibi mikrobiyal metabolitler anlatılmıştır. Bölüm 3'te, yapılan analizlerde kullanılan materyaller ve yöntemler açıklanmıştır. 
Tez kapsamında beş farklı deneysel çalışma (Bölüm 4-8) yapılmıştır. Öncelikle Y. lipolytica YB 423-12 suşu, karbon kaynağı olarak glukoz ve farklı yağları (hodan, kanola, keten tohumu, susam, Echium ve alabalık yağları) içeren fermentasyon ortamında geliştirilmiştir. Bu substratlar kullanılarak biyokütle ve hücre morfolojisi analizleri gerçekleştirilmiştir (Bölüm 4). Farklı substratlar üzerinde üretilen mikrobiyal yağın verimi ve yağ asidi profilleri Bölüm 5'te incelenmiştir. Daha sonra, sitrik asit ve lipaz gibi mikrobiyal metabolitlerin üretimi, aynı yağlar ve yağ endüstrisi atık ve yan ürünleri (prina yağı, fındık yağı pres küspesi ve ayçiçek yağı küspesi) kullanılarak araştırılmıştır (Bölüm 6). Çalışmalar Y. lipolytica'nın fındık yağı pres keki substrat olarak kullanıldığında yüksek verimlilikte lipaz enzimi ürettiği göz önüne alınarak, enzim üretimi üzerine yoğunlaştırılmıştır. Bu bağlamda, enzim aktivitesini artırmak için Plackett-Burman deseni ve Tepki Yüzey Metodu (TYM) gibi deneysel tasarımlar yapılmıştır (Bölüm 7). Son olarak lipaz enziminin protein tayini, enzim saflaştırma ve karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca substratın lipid, protein ve selüloz bileşenlerinin enzim aktivitesi üzerine etkileri incelenmiştir. Veriler değerlendirilerek büyük ölçekli üretimde, lipaz enzimi üretiminin maliyet analizi yapılmıştır.
Farklı yağları (hodan, Echium, kanola, keten tohumu, susam, alabalık yağı) substrat olarak içeren fermentasyon ortamlarında misel büyüme gözlemlenmiştir. Ortamlara yağ ilave edilmesi, suşun biyokütlesinde önemli bir artışa neden olmuştur (p <0,05). Maksimum ve minimum biyokütle verimi, sırasıyla, keten tohumu yağı (26,67 ± 0,09 g/L) ve alabalık yağı (20,48±0,03 g / L) ile elde edildi (Bölüm 4).
Hücresel yağ verimi, 31,99 – 61,67 g/100 g biyokütle aralığında hesaplanmıştır. Keten tohumu yağı (%61,67±0,26, g/g) içeren ortamda, lipid içeriğinde kontrole göre % 92,78 artış gözlemlenmiştir. Ayrıca, maksimum lipid akümülasyonu, sırasıyla, keten tohumu ve Echium yağları ile 16,45 ve 14,86 g/L olarak tespit edilmiştir (5 gün inkübasyon süresinin ardından). GLA içeren ortamda, yağın daha yüksek GLA içeriğine sahip oldugu belirlenmiştir. 

Keten tohumu yağının mikrobiyal yağ üretimini arttırdığını göstermiştir. Alabalık yağı için de eikosapentaenoik asit (EPA, 20:5 n-3) ve docosahexaenoic acid (DHA, 22:6 n-3) içeriği ile ilgili benzer sonuç elde edilmiştir (Bölüm 5).
En yüksek sitrik asit konsantrasyonu (5,34±0,938 g/L), hodan yağı içeren ortamda elde edilmiştir. Hodan yağının yanı sıra, Echium (5,19±0.20 g/L), alabalık (4,62±0,14 g/L), kanola (4,61±0,19 g/L), keten tohumu (4,58±0,83 g/L) ve susam (4,49±0,66 g/L) yağları ile ayçiçek yağı küspesi (4,85±0,13 g/L) de sitrik asit üretimi üzerinde istatistiksel olarak önemli etkilere sahiptir (Bölüm 6).
Test edilen yağlar ve yağ endüstrisi yan ürünleri arasında, fındık yağı pres küspesinin, lipaz üretimi için en iyi ortam olduğu belirlenmiştir. Y. lipolytica YB 423-12 suşu, glukoz ilave edilmiş fındık yağı pres küspesi ortamında, 12,32±1,54 U/mL lipaz aktivitesine sahiptir. Oleik asit ilavesinin lipaz üretimi üzerindeki etkisini doğrulamak için, aynı miktarda oleik asit içeren üç farklı substrat (fındık yağı, oleik asit ve fındık yağı pres küspesi), üç farklı Y. lipolytica suşunun fermentasyon ortamından kullanılmıştır. Maksimum lipaz aktivitesi, 3. gün sonunda 15,67 U/mL olarak Y. lipolytica CBS 6303 suşu ile fındık yağı pres küspesinin mevcudiyetinde elde edilmiştir.İki seviyeli Plackett-Burman deney deseni, test edilen parametreler arasında, fermantasyon süresi ve KH2PO4'ün lipaz aktivitesini önemli derecede (p<0,05) etkilediğini ortaya koymuştur. Diğer optimizasyon çalışmalarından Merkezi Kompozit tasarım ve Tepki Yüzey Metodu, birinci dereceden parametrelerin istatistiksel olarak önemli (p <0,05) ve optimum koşulların 22,1 g/L KH2PO4 ve 4,8 gün inkübasyon periyodu olduğunu göstermiştir. Bu optimum koşullar altında, 28°C'de %10 fındık yağı pres küspesi varlığında, en yüksek lipaz aktivitesi (9,18 U/mL) elde edilmiştir (Bölüm 7).
Saflaştırma çalışmaları, en yüksek lipolitik aktivitenin %60 amonyum sülfat çöktürmesiyle 332,55 U/mg olduğunu ve bu aktivitenin 41 kDa büyüklüğünde proteinden kaynaklandığını göstermiştir. Farklı sıcaklıklarda, pH'da ve metal iyonlarında lipaz enziminin karakterizasyon çalışmaları yapıldıktan sonra pH 7,0 ile 9,0 arasında ve 40°C'de optimum enzim aktivitesi gözlemlenmiştir. 100 mM konsantrasyonda test edilen metal iyonları (CaCl2, MgCl2, CuSO4) arasında, lipaz etkinliği Ca2+ ve Mg2+ iyonlarıyla artarken, Cu2+ iyonları enzim aktivitesini düşürmüştür. Daha sonra, lipaz aktivitesi analizi, kontrol (30 g/L glukoz), protein, selüloz, lipid içermeyen substrat, işlem görmemiş fındık yağı pres küspesi ve glukoz içermeyen ortamlarda yapılmıştır. En yüksek lipaz aktivitesi (16,89±0,44 U/mL), işlem görmemiş fındık yağı pres küspesi substrat olarak kullanıldığında elde edilmiştir. Sonuçlar, fındık yağı pres küspesinin, Y. lipolytica mayasının lipaz aktivitesini arttırdığını göstermiştir. Bununla birlikte, bu etki sadece küspenin mevcut olan oleik aside atfedilemez, çünkü lipid içermeyen fındık yağı pres küspesi de lipaz aktivitesini önemli ölçüde arttırmıştır. Son olarak, Y. lipolytica suşu tarafından fındık yağı pres küspesi substratı kullanılarak lipaz enzimi üretmenin maliyet analizi yapılarak fizibilitesi değerlendirilmiştir (Bölüm 8). Maliyet analizinin sonuçlarına göre, fermantasyon ortamında fındık yağı pres küspesinin varlığında mikrobiyal lipaz üretimi, ekonomik açıdan uygulanabilir olmaktadır. Ayrıca, çeşitli düşük maliyetli hammaddelerin, yan ürünlerin, atıkların veya yenilenebilir kaynakların, katma değeri yüksek ürünlerin üretilmesinde substrat olarak kullanımlarına duyulan ilgi giderek artmaktadır.

Abstract:
Nowadays, microbial oil and metabolite production have gained increasing interest due to the foreseeable limitation of plant and animal sources. Microbial lipids and metabolites are promising raw materials for food, fuel and oleo-chemical industries. Many reports of past few years indicated the potential of microorganisms to convert low value substrates to value added products such as microbial lipids, enzymes, citric acid, microbial mass, and polyols. Microbial oil production presents a potential industrial interest due to the capacity of various oleaginous microorganisms (these microorganisms can accumulate more than 20%, wt/wt, of lipid in their dry matter) to store lipids. Enzymes and organic acids are principal industrial metabolites of microorganisms. Citric acid represents 60% of all food acidulates. Among the enzymes, lipases are important in lipid technology, bio-industry, and they catalyze reactions such as hydrolysis (of ester bonds of tri-, di- and mono-glycerides of long-chain fatty acids into fatty acids and glycerol), esterification, interesterification, acidolysis, alcoholysis, and trans-esterification. Lipases constitute about 5% of the enzyme market and they have many applications in the food, dairy, detergent, and pharmaceutical industries. 
The model oleaginous yeast Yarrowia lipolytica has been used in lipid and metabolite production due to its biotechnological ability and intense secretory activity. Yarrowia lipolytica is known to have the ability to assimilate hydrophobic substrates like triglycerides, fats, and oils and produce single cell oils, lipases and organic acids. Non-conventional yeast Y. lipolytica produces intracellular and extracellular lipases which can be utilized as biocatalyst in the pharmaceutical, food and environmental industries. The objectives of this Ph.D. thesis were (i) to investigate the effects of different oil sources (borage, canola, sesame, Echium and trout oils) and oil industry residues (olive pomace oil, hazelnut oil press cake, and sunflower seed oil cake) on the growth and morphology of Yarrowia lipolytica YB 423-12; (ii) to determine lipid accumulation and composition of cellular lipids produced using Y. lipolytica YB 423-12 strain; (iii) to investigate citric  acid and lipase production by Y. lipolytica YB 423-12 strain; (iv) to improve the extracellular lipase activity from Y. lipolytica YB 423-12 by optimizing fermentation conditions using hazelnut oil press cake as a substrate; (v) to characterize and purify microbial lipase enzyme; (vi) to determine the effects of lipid, protein, cellulose on lipase enzyme production; (vii) to evaluate processing costs for lipase enzyme in large scale.
In Chapter 1, research framework and objectives of this Ph.D. thesis are introduced. Following that, in Chapter 2, literature review on microbial lipids and microbial metabolites are presented. Then, studies investigating the lipid accumulation, fatty acids and different microorganisms are reviewed. Afterwards, optimization studies, strain improvement by genetic manipulation and metabolic engineering are discussed. Lastly, microbial metabolites such as citric acid and lipase enzyme are described. In Chapter 3, materials and methods of the analysis are introduced. 
To achieve these goals, five different experiments (Chapters 4-8) were conducted. Firstly, Y. lipolytica YB 423-12 strain was cultivated in media containing glucose and various oils (borage, Echium, linseed, rapeseed, sesame, trout oils) as carbon and energy sources. These substrates were investigated for biomass and morphology of cells (Chapter 4). Lipid accumulation and fatty acid profiles of microbial oil produced using different substrates were investigated in Chapter 5. Following that, microbial metabolites such as citric acid and lipase production were determined using the same oils and oil industry residues such as olive pomace oil, hazelnut oil and sunflower seed oil cakes (Chapter 6). After that, considering the high efficiency of lipase enzyme production by Y. lipolytica using hazelnut oil press cake, studies focused on enzyme production. In this context, experimental designs such as Plackett-Burman design and Response Surface Methodology (RSM) were conducted to improve enzyme activity (Chapter 7). Finally, protein determination, enzyme purification and characterization studies of lipase enzyme were conducted. Also the effects of lipid, protein, and cellulose on lipase enzyme production were determined to increase the enzyme activity.Cost analysis of lipase enzyme production were determined in large-scale production (Chapter 8).
Mycelial growth have been observed in all mediums containing different substrate oils (borage, Echium, linseed, rapeseed, sesame, trout oils). Addition of oils to medium caused a significant increase in dry biomass of the strain (p<0.05). The maximum and minimum dry biomass yields were obtained with linseed oil (26.67±0.09 g/L), and trout oil (20.48±0.03 g/L), respectively (Chapter 4).
It was observed that cellular lipid yields were in the range of 31.99 – 61.67 g/100 g dry biomass. The increase in lipid content compared to the control was 92.78% in linseed oil medium (61.67±0.26%, g/g). Also, maximum lipid accumulation was observed as 16.45 and 14.86 g/L with linseed and Echium oils, respectively (after 5 days of incubation period). The results of fatty acid profiles indicated that GLA containing medium favored the production of microbial oil with GLA content. A similar result was observed for trout oil regarding the eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5 n-3) and docosahexaenoic acid (DHA, 22:6 n-3) content in the accumulated oil (Chapter 5).
The highest citric acid (CA) concentration (5.34±0.938 g/L) was found with borage oil containing medium. Echium seed (5.19±0.20 g/L), trout (4.62±0.14 g/L), rapeseed (4.61±0.19 g/L), linseed (4.58±0.83 g/L) and sesame oils (4.49±0.66 g/L) and sunflower seed oil cake (4.85±0.13 g/L) had also statistically important effects on CA production as well as borage oil (Chapter 6). 
Among the tested oil sources and oil industry residues, hazelnut oil press cake was the best medium for lipase production. The Y. lipolytica YB 423-12 strain produced 12.32±1.54 U/mL (lipase activity) of lipase on hazelnut oil press cake medium supplemented with glucose. In order to verify the efficacy of oleic acid contribution to the lipase production, three different substrates (hazelnut oil, oleic acid and hazelnut oil press cake) containing the same amount of oleic acid were used as substrates for cultivation media for three different Y. lipolytica strains. Maximum lipase activity was obtained in the presence of hazelnut oil press cake with Y. lipolytica CBS 6303 strain on the 3rd day as 15.67 U/mL. 
A two-level Plackett-Burman design revealed that fermentation time and KH2PO4 significantly affected lipase activity (p<0.05) of Y. lipolytica YB 423-12 strain among the parameters tested. Further optimization studies Central Composite Circumscribed Design (CCC) and Response Surface Methodology (RSM) indicated that all first-order parameters were statistically significant (p<0.05) and the optimum conditions were 22.1 g/L of KH2PO4 and 4.8 days of incubation period. Under these optimum conditions,  highest lipase activity (9.18 U/mL) was obtained in the presence of 10% of hazelnut oil press cake at 28 °C (Chapter 7).
Purification studies indicated that maximum lipolytic activity was 332.55 U/mg with 60% ammonium sulfate precipitation and this activity stems from a single 41 kDa protein. After conducting characterization studies of lipase enzyme at different temperatures, pH, and metal ionsoptimum enzyme activity was observed between the pH ranges of 7.0 and 9.0 and at 40°C. Among the tested metal ions (CaCl2, MgCl2, CuSO4) at 100mM concentration, the lipase activity increased with Ca2+ and Mg2+  ions, while Cu2+  ions decreased the enzyme activity. Afterwards, the lipase activity analysis were made with the control (30 g/L glucose), protein, cellulose, lipid freee and untreated hazelnut oil press cake and without glucose mediums. The highest lipase activity (16.89±0.44 U/mL) was achieved for untreated hazelnut oil press cake medium. The results showed that hazelnut oil press cake medium increased the lipase activity of Y. lipolytica. However, this effect cannot only be attributed to oleic acid present in the cake, because lipid-free hazelnut oil press cake also increased lipase activity. Finally, feasibility of producing lipase enzyme using hazelnut oil press cake by Y. lipolytica strain was evaluated (Chapter 8).According to the results of cost analysis, microbial lipase production  is feasible in the presence of hazelnut oil press cake in the fermentation medium. Furthermore, valorization of various low-cost raw materials, residues, wastes and renewable resources as substrates would be of such interest in production of value added products.