Iyon değişim kromatografisi için polimerik ligand içeren yeni dstek materyallerinin sentezi ve karakterizasyonu
Synthesis and characterization of new supports with polymeric ligands for ion-exchange chromatography
Yazar: BERNA SARAÇOĞLU
Danışman: PROF. DR. ALİ TUNCEL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering
Dizin: İyon değişim kromotografisi = Ion exchange chromatography

Özet:
Tez kapsamında, Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) için monodispers ve gözenekli partikül formunda kolon dolgu materyalleri sentezlenmiş ve kolon performansları İyon Değişim Kromatografisi (Ion Exchange Chromatography, IEC) modunda test edilmiştir. Sentezde çıkış materyali olarak kullanılan partiküller ?çok basamaklı mikrosüspansiyon polimerizasyonu? yöntemi ile poli(glisidil metakrilat-co-etilenglikol dimetakrilat) poli(GMA-co-EDM) kopolimeri formunda elde edilmiştir. Partiküllerin yüzeyindeki ?epoksi? grupları asidik ortamda hidrolizlenerek ?diol? formuna dönüştürülmüş ve kromatografik kullanım için uygun yüzey ve gözenek yapısına sahip poli(2,3-dihidroksipropil metakrilat-co-etilen dimetakrilat), poli(DHPM-co-EDM) partiküller elde edilmiştir. Partiküllerin karakterizasyonu Taramalı Elektron Mikroskobu (Scanning Electron Microscopy, SEM), BET yüzey alanı ve gözeneklilik ölçüm sistemi ve FTIR spektroskopi ile yapılmıştır.Monodispers ve gözenekli poli(DHPM-co-EDM) partiküllerin yüzeyinde iyon değişim kromatografisinde kullanılmak üzere zayıf katyon değiştirici karboksil (-COOH) grubu farklı yöntemler kullanılarak oluşturulmuştur. İlk yöntemde partiküller trifloroasetik asit (TFA) ile hidrolize edilerek yüzeylerinde karboksil grubunun oluşumu sağlanmıştır. Alternatif olarak polimerik formda ve karboksil grubu içeren zayıf katyon değiştirici ligandlar ?Serbest Radikal Aşılama Polimerizasyonu? (Free Radical Grafting Polymerization, FRGP), ?Atom Transfer Radikal Polimerizasyonu? (Atom Transfer Radical Polymerization, ATRP) ve ?Tersinir Katılmalı Ayrışmalı Zincir Transfer Polimerizasyonu? (Reversible Addition Fragmentation Chain Transfer Polymerization, RAFT) yöntemleri ile elde edilmiştir. Canlı/kontrollü polimerizasyon teknikleri (Living-controlled polymerization technique) olan ATRP ve RAFT ile polimerik ligand boyunun ?nanometre? ölçeğinde kontrolu hedeflenmiştir. Bu yaklaşım kullanılarak iyon-değişim kromatografisi sırasında kolonda ayrılacak analitler ile sterik ve elektrostatik engeller olmaksızın etkileşebilecek ve uygun akış koşullarını sağlayabilecek moleküler boya sahip iyon-değiştirici ligand taşıyan yeni bir kolon türünün eldesi sağlanmıştır.Bu anlamda kolonların kromatografik performansları incelediğinde, Asidik hidroliz (200-300 µm), FRGP (200-320 µm), ATRP (150-300 µm) ve RAFT (190-260 µm) ile sentezlenen zayıf katyon değiştirici kolonlar için literatürdeki değerlerden daha düşük ve kararlı teorik tabaka yüksekliği değerleri elde edilirken pik çözünürlük değerlerinin de kabul edilen değerlerin üstünde olduğu görülmüştür. Asidik hidroliz (%94-99), FRGP (%95-100), ATRP (%94-100) ve RAFT (%97-100) polimerizasyonu yöntemleri ile üretilen iyon değiştiricilerde ulaşılan protein geri kazanım değerleri ise bütün proteinler için kantitatife yakın değerler olarak belirlenmiştir. Üretilen poli(MAA) kolonlar için analitlerin, analizden analize ve günden güne tekrarlanabilirlik testleri yapılmış, hem ?analizden analize ? hem de ?günden güne? BSS değerleri %1'in altında bulunmuştur. Asidik hidroliz ile elde edilen kolonda ise bu değerler sırasıyla % 2.51 ve % 1.75 olarak elde edilmiştir. Bu sonuçlar sentezlenen bütün kolon dolgu materyallerinin başarılı bir şekilde iyon değişim kromatografisinde kullanılabileceğini göstermiştir. Ligand boyu uzunluğunun ?nano-ölçekte değişimi?, fonksiyon bazında iyon değiştirici sabit fazın kromotografik performansını tayin etmiştir. Yapılan kromatografik çalışmalar, ATRP ve RAFT polimerizasyonu ile kontrol edilen ligand boyunun kolon geri-basınç değeri, kromatografik ayırma yeteneği (pik çözünürlüğü ve tabaka yüksekliği) ve kolondan analit geri-kazanımı üzerinde etkisi dışında alıkonma süresinin düşmesi açısından etkili olduğunu göstermiştir.Tez kapsamında sentezlenen bütün kolonlar, gradyent koşullarda protein ayrımı için ticari olarak kullanılan kolonlara benzer bir kromatografik performans sergilemektedir. Bununla birlikte, pH'a dayanıklı ve yüksek protein geri kazanımı, düşük geri basınç, teorik tabaka yüksekliği ve tekrarlanabilirlik değerlerine sahip olmaları açısından ticari kolonlara üstünlük sağlamaktadır.

Abstract:
In this thesis, the column materials in the form of monodisperse and porous particles were synthesized with regard to test their column performances in Ion Exchange Chromatography (IEC) mode. Particles in the form of poly(glycidil methacrylate-co-ethyleneglycol dimethacrylate) poly(GMA-co-EDM) copolymer used for starting materials in the synthesis, were maintained by ?multi-stage microsuspension polymerization?. ?Epoxy? groups on the surface of particles were converted to ?diol? form by acidic hydrolysis that were then used as poly(2,3-dihyroxypropyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate), poly(DHPM-co-EDM) particles, having appropriate structural properties like surface and porosity for chromatographic applications. Particle characterization was assessed by Scanning Electron Microscopy (SEM), BET surface area and porosity measurement system and FTIR spectroscopy.Weak cation-exchange carboxyl (-COOH) group on monodisperse and porous poly(DHPM-co-EDM) particles, used for ion-exchange chromatography, was synthesized by different methods. In the first method, the particles were hydrolyzed with trifloroacetic acid (TFA) in order to generate carboxyl groups on their surfaces. Alternatively, polymer based weak cation-exchange ligands with carboxyl groups were synthesized by ?Free Radical Grafting Polymerization? (FRGP), ?Atom Transfer Radical Polymerization? (ATRP) and ?Reversible Addition Fragmentation Chain Transfer Polymerization? (RAFT) methods. With living-controlled polymerization techniques like ATRP and RAFT, a controlled length of polymeric ligand in ?nanometer? scale was aimed. By use of this approach, a new column type having ion-exchange ligands having appropriate molecular length that can interact with analytes without any steric and electrostatic barriers during ion-exchange chromatography, are maintained. The investigation of column performances concluded that weak cation-exchanged columns, synthesized by acidic hydrolysis (200-300 µm), FRGP (200-320 µm), ATRP (150-300 µm) and RAFT (190-260 µm), showed low and stable theoretical plate heights and high peak resolution values compared to literature knowledge. Protein recovery data in ion-exchange columns, which are synthesized by acidic hydrolysis (94-99%), FRGP (95-100%), ATRP (94-100%) and RAFT (97-100%) polymerization techniques, were determined as similar as quantitative values for all proteins. Reproducibility tests of analytes of poly(MAA) columns were assessed ?during analysis and day by day?. BSS values were determined under 1%. The BSS values in columns, synthesized by acidic hydrolysis, were determined as 2.51% and 1.75%, respectively. Results showed that all synthesized column materials can be successfully used in ion-exchange chromatography. ?Nano-scale change? of ligand length determined the chromatographic performance of functional based ion-exchanged stable phase. Chromatographic studies demonstrated that the length of polymeric ligand, which can be controlled by ATRP and RAFT polymerization, affected decrease of retention time without any change of column reverse pressure values, chromatographic separation ability (peak resolution and plate height) and analyte recovery from column.The columns synthesized in this thesis exhibited similar chromatographic performance for protein separations in gradient conditions compared to the commercial columns. Moreover, columns exhibited superior properties like pH resistivity, high protein recovery, low reverse pressure and theoretical plate height and reproducibility.