Tekstil atıksularının japon balığı (Carassius auratus L. 1758) üzerindeki genotoksik etkilerinin comet ve difüzyon analiz yöntemleriyle belirlenmesi
Genotoxicity determination of textile wastewater on goldfish (Carassius auratus L. 1758) using the comet and diffusion assay
Yazar: HURİYE DOĞAN
Danışman: PROF. DR. NAGİHAN GÜLSOY
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Zooloji = Zoology

Özet:
Endüstriyel atık su arıtım tesisleri; kaliteli arıtım sağlayamamaları nedeniyle, içerisinde çok sayıda karsinojenik (azo boyalar, hidrojen peroksit) ve mutajenik (potasyum permanganat) kimyasal maddeler ihtiva eden atıksular üretmektedir. Bu tesislerden biri olan tekstil yıkama atık sularının da içinde olduğu bu atık suların akarsulara, göllere ve denizlere deşarj edilmesi sonucunda, sucul ekosistemde yaşayan akuatik organizmalar olumsuz yönde etkilenmektedir. Bu kirletici maddelerin hem suda yaşayan canlılarda biyobirikimi, hem de bu organizmalarla beslenen içinde insanların da yer aldığı çok sayıda tüketiciye ulaşması durumunda, canlı yaşamı olumsuz yönde etkilenmektedir. Üstelik canlılığın devamı için gerekli olan suyun geleceği de bu şekilde tehlike altına girmektedir. Bu çalışmanın hedefi; kanalizasyon sistemine bırakılan tekstil atık sularının (TAS) sucul canlılar arasında önemli bir yeri olan balıklar üzerinde genotoksik etkisinin olup olmadığını saptamaktır. Bu amaçla çeşitli konsantrasyonlarda (% 0.5, 5, 10 v/v TAS) hazırlanmış atık su örneklerine maruz bırakılan balıkların eritrositlerinde muhtemel akut genotoksik etkiler in vivo ortamda gözlendi. Negatif kontrol (boş akvaryum suyu), pozitif kontrol (5 mg/L Etil Metan Sülfonat) ve deney gruplarından (% 0.5, 5, 10 v/v TAS) belirli saatler (24, 48, 72, 96 saat) sonunda heparinize şırınga ile balıklardan kan örnekleri alındı. Kan hücrelerine Comet ve DNA difüzyon testleri uygulandıktan sonra, lamlar CCD kameraya (Canon A640) bağlı floresan mikroskop (BX51TF, Olympus) altında incelendi ve her lamdan 100 adet görüntü fotoğraflandı. 'Kuyruk % DNA ve Olive Kuyruk Momenti' Comet data analizinde parametre olarak kullanıldı ve bu parametrelerin ölçümü Kameram Comet Görüntü İşleme ve Analiz Yazılımı (Mikrosistem, Turkey) ile incelendi. DNA'sı hasarlı ve hasarsız olan hücrelere ait veriler elde edilerek, deney ve kontrol grupları arasında p<0.05 düzeyinde anlamlı bir fark olup olmadığına bakıldı. 'Ölü hücrelerin sayısı' ise DNA difüzyon analizinde parametre olarak kabul edildi. Apoptoz veya nekroza uğramış ölü hücrelerin sayıca yüzdesi hesaplanarak, bu veriler ile Comet sonuçları arasındaki ilişki değerlendirildi. Tüm kontrol ve deney grupları sonuçları karşılaştırıldı ve balık eritrositlerinde TAS'ın neden olduğu genotoksik potansiyel tartışıldı. Comet testi için ölçülen Kuyruk % DNA sonuçları dikkate alındığında; en yüksek ölçüm % 10'luk derişimde ve 96. saatte (Kuyruk % DNA: 84,322) gelişirken, en az ölçüm % 0.5'lik derişimde ve 24. saatte (Kuyruk % DNA: 59,687) meydana geldi. TAS'a maruz bırakılan balık gruplarında görülen DNA hasarının, tüm saat ve konsantrasyonlarda negatif kontrol ile kıyaslandığında, önemli düzeyde (p<0.05) arttığı tespit edildi. Olive Kuyruk Momenti sonuçlarına bakıldığında; yapılan doz ve negatif kontrol grupları karşılaştırmalarında, maksimum DNA hasarı % 10'luk derişimde ve 24 saatlik sürede gerçekleşirken (Olive Kuyruk Momenti: 15,5224), minimum hasar % 0.5'lik derişimde ve 24 saatte (Olive Kuyruk Momenti: 7.48) görüldü. İlk 24 saatte % 10 grubunda belirlenen Olive Kuyruk Momentinin (Olive Kuyruk Momenti: 15.5224) kontrol grubuna (Olive Kuyruk Momenti: 10) kıyasla önemli seviyede arttığı gözlendi. Comet ve Olive Kuyruk Momenti incelemelerinde; hasarlı DNA sayıları, konsantrasyonlara maruz kalma ile arttı ve daha yüksek konsantrasyonlarda doz yanıtı gözlendi. DNA difüzyon testi için ölçülen apoptoz ve/veya nekroz kaynaklı ölü hücre sayısının yüzdece miktarının en fazla % 10'luk derişimde, 24. saatte (% 80,99), en az % 0.5'luk derişimde ve 96. saatin sonunda (% 26.82) olduğu görüldü. Negatif kontrol grubuna göre, tüm atıksu muamelesi görmüş gruplarda, hasarlı nükleotidlerin dağılım yüzdesinde belirgin bir artış kaydedildi. Daha sonraki uygulama saatlerinde ölü hücrelerin sayısı kısmen azalmış olsa da, hala negatif kontrole göre oldukça yüksek olduğu izlendi. Yapılan bu çalışmada, tekstil yıkama atıksuyunun balıkların DNA'sı üzerinde etkili genotoksik ajanlar içerdiği tespit edilmiştir. Genotoksik maddelerle DNA onarım sistemi bozulan eritrositlerde gelişen DNA kırıkları tamir edilemediği için hücre apoptoza yönlendirilmiştir. Elde edilen tüm sonuçlar; belli sürelerde ve farklı konsantrasyonlarda uygulanan atıksu örneklerine maruz bırakılan balıkların, bu riske maruz kalmayan balıklara göre genotoksisite ve kanserojenlik bakımından potansiyel risk taşıdıklarını düşündürmekte ve bu durum yapılan bu ekotoksikolojik çalışma ile doğrulanmaktadır.

Abstract:
Because of inability to provide quality treatment, industrial wastewater treatment plants produce wastewater contain many carcinogenic (azo dyes, hydrogen peroxide) and mutagenic (potassium permanganate) chemicals. A result of the textile washing wastewater is in one of these plants discharge to rivers, lakes and seas, aquatic organisms live in aquatic ecosystems are affected negatively. In case of these contaminants bioaccumulate in aquatic organisms and also reach to people involved in of many consumers who fed by these organisms, live life is affected adversely. Moreover, the future of water is necessary for the continued vitality also thus come under threat. The aim of this study; to determine whether the genotoxic potential of textile waste water (TWW) discharged into the sewage system on the fish that play an important role in aquatic organisms. For this purpose, possible acute genotoxic effects were observed in vivo in erythrocytes of fish exposed to the waste water sample prepared for various concentrations (% 0.5, 5, 10 v/v TWW). Blood samples were taken from fish groups of negative control (only aquarium water), positive control (5 mg/L Ethyl Methane Sulfonate) and experimental (% 0.5, 5, 10 v/v TWW) in the end of specific times (24, 48, 72, 96 hours), with heparinized syringe. After the Comet and DNA diffusion tests are performed to blood cells, slide examined under fluorescence microscope (BX51TF Olympus) connected CCD camera (Canon A640) and 100 images in every slide was photographed. 'Tail DNA % and Olive Tail Moment' was used as a parameter in the Comet data analyzes and these parameters have been investigated by Comet Image Analysis Software (Microsystems, Turkey). The data of cells with damaged and undamaged DNA was obtained, it has been examined whether there is significant difference between experimental and control groups at the level of p<0.05. 'The number of dead cells' was used as a parameter in the DNA diffusion analysis. It was calculated of number % of dead cells underwent apoptosis and necrosis and also evaluated relationship between the results of comet with these data. All the results from experimental and control groups were compared and genotoxic potential in fish erythrocytes caused of TWW were discussed. When considered measured Tail DNA % results for Comet test; the highest measurement was obtained in concentration of 10 % and in 96 hours (Tail DNA %: 84,322), minimum measurement was obtained in 0.5 % concentration and in 24 hours (Tail DNA %: 59,687). When DNA damage is observed in fish groups exposed to the TWW compared with negative control for all the time and concentration, increases were detected significantly (p<0.05). When looked at the Olive Tail Moment results; it was viewed in doses and negative control group comparisons, maximum DNA damage occured in a concentration of 10 % and at the 24 hour period (Olive Tail Moment: 15.5224) minimum damage were observed in a concentration of 0.5 % and in 24 hours (Olive Tail Moment: 7.48). In the first 24 hours, it was observed increase Olive Tail Moment was detected (Olive Tail Moment: 15.5224) in 10 % of group significantly when compared to the control group (Olive Tail Moment: 10). In the investigation of Comet and Olive Tail Moment; number of damaged DNA increased with exposure to concentration and the dose response was observed at the higher doses. It was shown that maximum amount occured in 10 % concentration at 24 hours (80.99 %), least amount occured in % 0.5 concentration and at 96 hours (26.82 %) for dead cell count % induced apoptosis and/or necrosis measured for DNA Diffusion test. Compared to the negative control group, all the groups were treated wastewater, percent increase in the distribution of damaged nucleotides was recorded. At 24 hours and 10 % exposure group the number of apoptotic and necrotic cells was detected very highly. Although the number of dead cells reduced in later exposure times, it was observed that the number is considerably higher than the negative control. In this study, it was found that TWW contain genotoxic agents which is effective on fish DNA. Cell was directed to apoptosis because of damaged DNA repair system in erythrocytes with genotoxic agents and DNA breaks can not be repaired. All results considered that the fish has potential risk in terms of genotoxicity and carcinogenicity that exposed to samples of wastewater exposed in different concentrations and certain periods when compared to the fish was not expose to those risk factors and this situation confirmed by this ecotoxicological study.