Erzurum yöresi koyunlarında piroplasmosisin mikroskobik ve moleküler yöntemlerle incelenmesi
Investigation of sheep piroplasmosis in Erzurum province by microscopic and molecular techniques
Yazar: RIDVAN KİRMAN
Danışman: PROF. DR. ESİN GÜVEN
Atatürk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Babesiosis = Babesiosis ; Erzurum = Erzurum ; Koyunculuk = Sheep farming ; Koyunlar = Sheep ; Mikroskopi = Microscopy ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Erzurum Yöresi Koyunlarında Piroplasmosisin Mikroskobik ve Moleküler Yöntemlerle İncelenmesi
Amaç: Piroplasmosis, Babesia ve Theileria türlerinin neden olduğu, önemli ekonomik kayıplara yol açan kene kaynaklı protozoer bir hastalıktır. Türkiye'nin birçok bölgesinde hastalığın epidemiyolojisine yönelik çeşitli çalışmalar bulunmakla beraber Erzurum ilinde kapsamlı bir çalışma mevcut değildir. Bu çalışmada, Erzurum yöresi koyunlarında piroplasmosise neden olan etkenlerin varlığının ve yaygınlığının saptanması, ayrıca bölge koyunlarının kene profilinin ortaya konması ve bu kenelerin piroplasmosisi nakletmedeki rolünün araştırılması amaçlanmıştır. 
Materyal ve Metot: Örnekleme, Erzurum iline bağlı 20 ilçedeki 41 köy ve 77 farklı işletmede yer alan koyunlardan rast gele seçilerek yapılmıştır. Bu kapsamda, 1621 kan örneği ve enfeste koyunlardan 1696 ixodid kene toplanmıştır. Kan örneklerinden hazırlanan ince yayma frotiler %5'lik Giemsa solüsyonu ile boyanarak ışık mikroskobu ile incelenmiştir. Aynı örnekler, Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile 18S rRNA gen bölgesini amplifiye eden BJ1/BN2, Thei F1/R1 ve Thei F2/R2 primer çiftleri kullanılarak Babesia spp. ve Theileria spp. yönünden analiz edilmiştir. 
Tür tayini yapılan kenelerden doymuş dişiler uygun sıcaklık ve nem koşullarında yumurtlamaya ayrılmıştır. Keneler tür, doyma derecesi ve konak kriterlerine göre ayrılarak 115 havuz oluşturulmuştur. Kenelerden tek tek DNA ekstraksiyonu ve aynı primer çiftleri ile PZR analizi yapılmıştır. 
Moleküler analizler ile Babesia spp. ve Theileria spp. yönünden pozitif bulunan kan ve kene örneklerine ait amplikonlar çift yönlü sekans analizi için ticari firmaya gönderilmiştir. 
Bulgular: Kan örneklerinde mikroskobik bakı ile %0.06 B. ovis ve %2.77 Theileria spp. tespit edildi. Parazitemi oranı, B. ovis için %0.1, Theileria spp. için %0.001-0.003 olarak hesaplanmıştır.  Moleküler analiz ile 307 örnekte Babesia spp. ve Theileria spp. pozitifliği tespit edilmiştir. Sekans verileri incelendiğinde 244 örnekte B. ovis (%0.41), B. crassa (%0.41), B. canis (%0.41), T. ovis (%69.26), Theileria sp. (%26.64) ve Theileria sp. OT3 (%2.87) varlığı belirlenmiştir. Koyunlardan toplanan keneler D. marginatus (%62.55), Hae. parva (%36.14), Hae. punctata (%1.07), Rh. turanicus (%0.12) ve H. marginatum (%0.12) türleri olarak tanımlanmıştır. Kenelerin moleküler analizinde D. marginatus'da T. ovis ve T. annulata, Hae. parva'da B. crassa ve T. ovis ve Hae. punctata'da T. ovis pozitifliği belirlenmiştir.
Sonuç: Erzurum ili koyunlarında ve koyunlardan toplanan kenelerde Babesia/Theileria türleri ve genotiplerinin varlığı ve yaygınlığı ortaya konmuştur. Koyunları enfeste eden kene türleri belirlenmiştir. Bu çalışmanın sonuçları, bölge için ilgili hastalıklara ait güncel verilere ulaşılması sağlanmıştır. Bu bilgilerin koyun yetiştiricileri, saha veteriner hekimleri ve ilgili kurum ve kuruluşlarla paylaşılması ve böylelikle söz konusu hastalıklara yönelik etkili koruma ve kontrol stratejilerinin planlanmasına katkı sunulması öngörülmektedir.
Anahtar Kelimeler: Erzurum, koyun, mikroskobi, piroplasmosis, PZR

Abstract:
Investigation of Sheep Piroplasmosis in Erzurum Province by Microscopic and Molecular Techniques
Aim: Piroplasmosis, caused by Babesia and Theileria species, is a tick-borne protozoan disease and leads to significant economic losses. There are several studies regarding the epidemiology of the disease in many regions of Turkey but there is no comprehensive study in Erzurum province. This study aimed to determine the presence and prevalence of the species causing piroplasmosis in sheep of Erzurum region. In this study, it was aimed to determine the presence and prevalence of the agents causing piroplasmosis in sheep in Erzurum province, also to reveal the tick species infesting the sheep and to investigate the role of these ticks in transmission of piroplasmosis.
Material and Method: Sampling was conducted on randomly selected sheep from 41 villages and 77 different enterprises in 20 districts of Erzurum province. A total of 1621 blood samples and 1696 ixodid ticks from infested sheep were collected. Thin blood smears were prepared, stained with %5 Giemsa and examined under light microscope. Each sample was subjected to Polymerase Chain Reaction for amplification of partial fragments of 18S ribosomal RNA gene of Babesia and Theileria spp with BJ1/BN2, Thei F1/R1 and Thei F2/R2 primers. 
After species identification, engorged female ticks were maintained in an incubator at suitable temperature and humidity conditions until they oviposited. The ticks were grouped according to species, degree of engorgement and host, and 115 tick pools were created. Ticks were screened for the presence of Babesia and Theileria spp with PCR using same primers. 
The selected PCR positive amplicons were sent to a commercial company for bidirectional sequencing.
Results: The microscopic analysis revealed 0.06% B. ovis and 2.77%Theileria spp. positivity in blood smears. Parasitemia was 0.1% for B. ovis and ranging from 0.001% to 0.003% for Theileria spp. A total of 307 blood samples were positive for Babesia spp. and Theileria spp. by molecular analysis. The analysis of the obtained nucleotide sequences revealed presence of B. ovis (0.41%), B. crassa (0.41%), B. canis (0.41%), T. ovis (69.26%), Theileria sp. (26.64%) and Theileria sp. OT3 (2.87%) in 244 samples. Collected ticks were identified as D. marginatus (62.55%), Hae. parva (36.14%), Hae. punctata (1.07%), Rh. turanicus (0.12%) and H. marginatum (0.12%). Molecular analysis of tick samples revealed T. ovis and T. annulata positivity in D. marginatus, B. crassa and T. ovis positivity in Hae. parva and T. ovis positivity in Hae. punctata ticks.
Conclusion: The presence and the prevalence of Babesia/Theileria species and genotypes in sheep and ticks of Erzurum were determined. Tick species infesting sheep were identified. The results of this study were provided up to date data on related diseases for the region. It is envisaged that the obtained data will be shared with the breeders, field veterinarians and relevant institutions and organizations to plan effective protection and control strategies for the mentioned diseases.
Key words: Erzurum, sheep, microscopy, piroplasmosis, PCR