Deneysel spinal kord yaralanmasında mir-20A ve mir-125B ekspresyonlarının apopitoz ve enflamasyon üzerine etkileri
The effects of mir-20A and mir-125B expressions on apoptosis and inflammation in experimental spinal cord injury
Yazar: DİLEK ŞAKER
Danışman: PROF. DR. SAİT POLAT
Çukurova Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Mikro RNA = Micro RNA ; Spinal kord = Spinal cord ; Spinal kord yaralanmaları = Spinal cord injuries ; Yaralar ve yaralanmalar = Wounds and injuries ; İnflamasyon = Inflammation

Özet:
MikroRNA'lar (miRNA'lar), hedef messenger RNA'lara (mRNA) bağlanan ve onların translasyonlarını baskılayan kısa (18-25 nükleotid uzunluğunda), kodlanmayan RNA'lardır. MiRNA'lar hücrede çok sayıda fizyolojik ve patolojik süreçlerde rol alan, post-transkripsiyonel gen regülasyonunda önemli roller üstlenen yapılardır. MiRNA'lar; gen ekspresyonunun post-transkripsiyonel düzenlenmesi, metabolik düzenleme, hafıza ile sinaptik gelişim, organizmada embriyogenez, organogenez, farklılaşma ve büyümenin kontrolü gibi kritik rollere sahiptir. Bunların yanında, son zamanlarda yapılan araştırmalarda, miRNA'ların kanser, metabolik hastalıklar, kardiyovasküler hastalıklar, virüs enfeksiyonları ve travmatik nörolojik yaralanmalarda da önemli rollerinin olduğu gösterilmiştir. Hücrelerde meydana gelen fonksiyonel bozukluğun oluşmasında, en önemli mekanizma, miRNA'ların ifade düzeyinde meydana gelen değişikliklerdir. Bu bağlamda, hücrelerde miRNA'ların değişen ekspresyon düzeyleri ile hastalıkların oluşumu ile teşhis ve terapötik uygulamalar arasında çok yakın ilişkiler ortaya çıkarılmıştır. Günümüzde moleküler tıp uygulamalarında miRNA'lar, hastalıkların gelişiminde yeni bir belirteç olarak kullanılmaktadır.  Spinal kord hasarı (SKH) motor ve duysal fonksiyonların tam veya kısmen kaybına neden olan ciddi bir merkezi sinir sistemi hastalığıdır. Bugüne kadar geliştirilen çeşitli tedavi stratejilerine rağmen, SKH sonrası fonksiyonel iyileşme için etkili bir tedavi henüz tam olarak bulunamamıştır. Son yıllarda yapılan çalışmalar ve biyoinformatik analizler SKH patogenezinde, miRNA'ların ifadelerinde meydana gelen değişimlerin, sekonder doku hasarında etken olabileceğini göstermektedir. Sıçanlarda yapılan deneysel çalışmalarda, microarray analizlerine göre SKH sonrasında 300'e yakın miRNA'nın eksprese olduğu ve 97 miRNA'nın ifadesinde önemli değişikliklerin meydana geldiği rapor edilmiştir. Bu bulgular, SKH tedavisinde, miRNA'ların potansiyel hedefler olabileceğini düşündürmektedir. miRNA'ların SKH patogenezinde çeşitli koruyucu veya zararlı etkilerinin olabileceği ileri sürülmektedir. Bununla birlikte, günümüzde hala SKH patogenezinin altında yatan mekanizmalar tam açık değildir. Bu nedenle çalışmamızda, deneysel olarak yetişkin erkek sıçanlarda oluşturulan SKH'nda miR-20a ve miR-125b ekspresyonları ile apopitoz ve enflamasyon arasındaki ilişkilerin mikroskobik, immünohistokimyasal ve moleküler biyolojik yöntemler ile araştırılması amaçlandı. 
Bu amaçla 42 adet Wistar cinsi erkek sıçan, herhangi bir cerrahi işlem yapılmayan kontrol grubu, spinal kord T2-T7 segmentleri arasında yalnızca laminektomi oluşturulan sham operasyon grubu ve T2-T7 arasında klip kompresyon yöntemi ile SKH oluşturulan deney grubu olmak üzere 3 gruba ayrıldı. SKH'nı takiben deney grubunda yer alan hayvanlar da kendi aralarında; spinal kord hasarı oluşturulduktan sonra yalnızca serum fizyolojik verilen deney kontrol grubu; spinal kord hasarını takiben MP tedavisi uygulanan grup olarak 2 alt gruba ayrıldı. Tüm sham ve deney gruplarından spinal kord doku örnekleri yaralanmayı takiben 1, 3, 7, ve 14. günlerde elde edilerek, ışık ve elektron mikroskobik, immunohistokimyasal ve moleküler biyolojik yöntemlerle değerlendirildi.
TNF-α ve IL-6 ekspresyonunun, deney kontrol grubu 1. ve 3. günlerde yükseldiği, 7. ve 14. günlerde azaldığı, MP tedavisi alan gruplarda ise her iki sitokinin anlamlı olarak azaldığı belirlendi. Kaspaz-3 ekspresyonun, deney kontrol grubu 1. günde yükseldiği, 3, 7 ve 14. günlerde anlamlı olarak azaldığı izlendi. Tedavi gruplarında kaspaz-3 ekspresyonunun azalmış olduğu dikkati çekti. Işık ve elektron mikroskobik incelemelerde, SKH oluşturulan gruplarda, nöronlarda, gliya hücrelerinde ve miyelinli sinir liflerinde yapısal dejenerasyonların meydana geldiği ve bu değişikliklerin, 1. ve 3. günlerde daha belirgin olduğu, 7. ve 14. günlerde azaldığı gözlendi. Tedavi gruplarında hücresel yapının, deney kontrol gruplarına oranla daha iyi korunduğu belirlendi. SKH'ndan sonra deney kontrol grubu 1. ve 3. günlerde ve tedavi grubu 1. günde miR-20a ekspresyonunun upregüle olduğu görüldü. miR-125b ekspresyonunun ise deney kontrol grubu 3.  ve 7. günlerde downregüle olduğu görüldü.
Bütün bulgular birlikte değerlendirildiğinde, deneysel akut spinal kord yaralanmasından sonra miR-20a upregülasyonun proenflamatuvar molekülleri indükleyerek enflamasyonu artırabileceği düşünüldü. Diğer taraftan, miR-125b'nin kaspaz-3 ile ilişkili olabileceği ve hasardan sonra miR-125b downregülasyonunun apopitozu inhibe edebileceği şeklinde yorumlandı. Bu nedenle, miR-20a ve miR-125b'nin SKH'nda biyomarkır ve tedavi ajanı olarak dikkate alınabileceği kanaatine varıldı.

Abstract:
MicroRNAs (miRNAs) are a class of short (18-25 nucleotide), noncodingRNAs that bind to target messenger RNAs, blocking their translation. MiRNAs are involved in many physiological and pathological processes in the cell and play an important role in post-transcriptional gene regulation. Furthermore, miRNAs play critical roles in the organism, such as post-transcriptional regulation of gene expression, metabolic regulation, memory, synaptic development, embryogenesis, organogenesis, differentiation and growth control. Additionally, in recent studies, it has been reported that miRNAs have significant roles in cancer, metabolic disorders, cardiovascular diseases, viral infections and traumatic neurological injuries. Changes in the expression levels of miRNAs is the major cause of functional disorders that occured in the cells. It is revealed that there is a close relationship between varying expression levels of miRNA and formation, diagnosis and treatment of diseases. Nowadays, miRNAs are used as a new biomarker for the development of disease in moleculer medicine. Spinal cord injury (SCI), is a serious central nervous system disorder leads to complete or partial loss of sensory and motor functions. Although various treatment strategies has been developed until today, there is still no effective treatment protocol for functional recovery after spinal cord injury. In recent years, researches and bioinformatic analyses showed that the variations in miRNA expression levels can cause seconder tissue damage in SCI pathogenesis. It has been reported that in experimental SCI model in rats, approximately 300 miRNAs are expressed and significant expression changes occured in 97 of those miRNAs according to the microarray analyses. It is suggested that miRNAs can be potential targets in SCI treatment. On the other hand It is also suggested that miRNAs may have protective and harmful effects in SCI pathogenesis. However, the underlying mechanisms of spinal cord injury pathogenesis is still unclear today. In this study we aimed to investigate the relationship between miR-20a and miR-125b expressions and apoptosis and inflamation in experimental SCI model in rats with using microscopic, immunohistochemical and molecular biological methods.
	Fourty two wistar rats were divided into 3 main groups as intact control group; they did not receive any operation, sham operation group; we created laminectomy on T2-T7 levels of spinal cord, and experimental group received spinal cord compression injury. Following injury the experimental group subdivided into 2 groups as: experimental control group, which did not receive any drug administration, methylprednisolone treatment group; they received MP following injury. Tissue samples were obtained from all groups at 1, 3, 7 and 14. days after injury for light and electron microscopic, immunohistochemical and molecular biological examinations.
	We found an increase in TNF-α and IL-6 levels in experimental control group on 1. and 3. days. We also obtained that there were a significant decrease in both cytokines expressions in experimental control group on 7. and 14. days and MP treatment group. Moreover we observed an increase on kaspaz-3 levels in experimental control group on 1. day. On the other hand, in experimental control group on 3, 7 and 14. days and in the treatment group there were a significant decrease in kaspaz-3 levels. Furthermore we found structural degenerations in neurons, glia cells and axons in the SCI groups of the light and electron microscopic examinations. These degenerations were more prominent in 1 and 3 days injury groups. However, the ultrastructure of the cells were well preserved in MP treatment group when compared with experimental control groups. Also, we obtained that the expression of miR-20a was upregulated in experimental control group on 1 and 3 days and in treatment group on 1 day after injury. In contrast we observed that miR-125b expression was downregulated in experimental control groups on 3 and 7. days.
	When all results are evaluated together, we understood that after experimental SCI, miR-20a upregulation could induce proinflammatory molecules and thus increase inflammation. On the other hand, we understood that miR-125b may be associated with caspase-3 and after injury miR-125b downregulation may inhibit apoptosis. These results suggest that miR-20a and miR-125b could be considered as biomarkers and treatment agents in SCI.