Termofilik bacillus zhangzhounesis 2ÇM4'ten elde edilen β- Galaktosidazın saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of β-Galactosidase from Thermophilic bacillus zhangzhounesis 2ÇM4
Yazar: CEMAL DİRİ
Danışman: DOÇ. DR. FATMA MATPAN BEKLER
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Beta galaktosidaz = Beta galactosidase ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Hücre dışı enzimler = Extracellular ezymes

Özet:
β-Galaktosidaz (E.C. 3.2.1.23), laktoz gibi galaktopiranositleri hidroliz eden ve trans-galaktosilasyon reaksiyonunu katalize ederek galaktooligosakkaritleri üreten glikozid hidrolaz enzimidir. Son yıllarda yapılan çalışmalar özellikle termofillerden elde edilen termostabil β-galaktosidazlar üzerine yoğunlaşmaktadır. Termofilik β-galaktosidazlar, tıpta sütün laktoz toleransını tedavi etmek için, gıda endüstrisinde süt ürünlerinde laktoz kristalleşmesinin önlenmesi ve peynir altı suyunun sebep olduğu su kirliliğinin azaltılması gibi birçok biyoteknolojik alanda kullanılmaktadır. Bu çalışmanın amacı, Çermik (Diyarbakır) kaplıcasından izole edilen termofilik Bacillus zhangzhounesis 2ÇM4'ten β-galaktosidaz üretmek, saflaştırılmak ve karakterize etmektir.  Bunun için, hem intrasellüler hem de ekstrasellüler enzim üretimine zamana bağlı olarak (0-96 saat) bakılmıştır. B. zhangzhounesis 2ÇM4'e ait ekstraselüler β-galaktosidazın optimum zaman, sıcaklık ve pH değerleri sırasıyla 33. saatte (335,5 U/mg), 60 oC ve pH 6.0 olarak bulunmuştur. Enzimin kısmi saflaştırılması için çöktürme ve kromatografi yöntemleri kullanılarak %5,8 verim ile 10,2 kat saflaştırılmıştır. Enzimin karakterizasyonu için farklı konsantrasyonlarda substrat (oNPG ve laktoz) kullanılarak substrat özgünlüğü, farklı konsantrasyonlarda bazı divalent metaller ve kimyasalların etkisi, pH ve sıcaklık stabilitesi ve ayrıca enzimin molekül ağırlığı belirlendi. 1 mM Mg+2 (%154) ve 5 mM Ca+2 (%126) varlığında aktivitenin artırdığı; Mn+2 ve Zn+2'nin artan konsantrasyonda aktivitenin azalttığı, Cd+2, Co+2, Ni+2 ve Cu+2'nin ise aktivitenin inhibe olduğu tespit edildi. Ayrıca, IAA'nın enzim aktivitesini tamamen inhibe ettiği, N-EtM, Phen, PCMB ve EDTA'nın enzim aktivitesinde inhibisyona neden olduğu, β-merkaptoetanolun aktiviteyi arttırdığı belirlenmiştir. oNPG için enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0,112 mM ve 0,712 μmol/dk iken laktoz için Km ve Vmax değerleri sırasıyla 14,20 mM ve 1,596 μmol/dk olarak hesaplandı. Sonuç olarak bu çalışma, elde edilen enzimin kısa sürede ve uygun maliyetli olarak üretilmesi, termostabil olma özelliği ile biyoteknolojik uygulamalar için kullanılabilir olduğunu göstermektedir.

Abstract:
β-Galactosidase (E.C. 3.2.1.23) is a glycoside hydrolase enzyme that hydrolyzes galactopyranosides such as lactose and produces galactooligosaccharides by catalyzing the trans-galactosylation reaction. Recent studies have focused on thermostable b-galactosidases obtained from thermopHiles. ThermopHilic β-galactosidases are used in many biotechnological fields such as in medicine to treat milk lactose tolerance, in food industry to prevent lactose crystallization in dairy products and to reduce water pollution caused by whey. The aim of this study is to produce, purify and characterize β-galactosidase from thermophilic Bacillus zhangzhounesis 2ÇM4 isolated from Çermik (Diyarbakır) thermal spring. For this, both intracellular and extracellular enzyme production were examined depending on time (0-96 hours). The optimum temperature (25-80 oC) and pH (4.0-11.0) values of the enzyme were determined. Optimum time, temperature and pH values of extracellular β-galactosidase of B. zhangzhounesis 2ÇM4 were found at 33h (335,5 U/mg), 60 oC and pH 6.0, respectively. For partial purification of the enzyme, it was purified 10,2 times with 5,8% yield using precipitation and chromatography methods. For the characterization of the partially purified enzyme, substrate specificity using different concentrations of substrate (oNPG and lactose), effect of different concentrations of some divalent metals and chemicals, the effect of pH and thermal stability as well as the molecular weight of the enzyme were determined by SDS-PAGE. It was determined that 1 mM Mg+2 (154%) and 5 mM Ca+2 (126%) increased activity; Mn+2 and Zn+2 decreased enzyme activity with increasing concentration, while Cd+2, Co+2, Ni+2 and Cu+2 inhibited enzyme activity. In addition, it was determined that IAA completely inhibited the enzyme activity, N-EtM, Phen, PCMB and EDTA caused inhibition in enzyme activity, and β-Mer increased the activity. The Km and Vmax values of the enzyme for oNPG were 0,112 mM and 0,712 μmol/min, respectively, while the Km and Vmax values for lactose were 14,20 mM and 1,596 μmol/min, respectively. As a result, this study shows that the obtained enzyme can be used for biotechnological applications with its thermostable feature in a short time and cost-effective production.