Mitokondriyal DNA'nın D-Loop bölgesinin metilasyonunun sperm hareketi üzerine etkisinin araştırılması
Research of the effect of methylation of the D-Loop region of mitochondrial DNA on sperm motility
Yazar: BİRGİ ERCİLİ
Danışman: PROF. DR. KADİR EMRE AKKUŞ
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Cerrahpaşa Tıp Fakültesi / Üroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Üroloji = Urology
Dizin: DNA = DNA ; Metilasyon = Methylation ; Mitokondriler = Mitochondria ; Sperm = Spermatozoa ; Sperm mobilitesi = Sperm mobility

Özet:
Amaç: Sperm motilite bozukluğu erkek infertilitesinin nedenlerinden biridir. Sperm hareketi için gerekli olan adenozin trifosfatın (ATP) bir kısmı spermatozoa mitokondrisinde üretilir. Mitokondriyal genlerin ekspresyonunu düzenlemekte önemli bir rolü olan ve mitokondri genomunda yer alan D-loop bölgesinin CpG bazlarının metile olabildiği ve bunun bazı patolojilerle ilişkili olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmada astenospermik infertil erkek bireylerin spermatozoalarında D-loop bölgesinin metilasyon düzeyleri ile bunun ATP düzeyleri üzerindeki ilişkileri incelemiştir.
Gereç ve Yöntem: Mart 2020 – Şubat 2021 tarihleri arasında kliniğimize başvuran 24 kontrol (normospermik), 25 hasta (astenospermik) olmak üzere toplam 49 olgu çalışmaya dahil edildi. Olgulardan alınan semen örneklerinden elde edilen spermatozoaların mitokondriyal DNA'larından (mtDNA) bisülfit modifikasyon sonrası metilasyon spesifik gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) uygulaması ile D-loop metilasyon oranı ve mtDNA kopya sayıları tespit edildi. D-loop metilasyon oranı ve mtDNA kopya sayısı, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemi ile tespit edildi. Hücre içi ATP seviyeleri ise kemilüminesans yöntemi ile ölçüldü.
Bulgular: Çalışmaya alınan semen örneklerinden elde edilen veriler istatistiksel olarak değerlendirildiğinde, astenospermi grubunun spermatozoalarında kontrol grubuna kıyasla D-loop metilasyon oranı %86 daha fazla saptanmıştır (p<0,05). Yine astenospermi grubunun spermatozoalarında mtDNA kopya sayısı, kontrol grubuna kıyasla %44 fazla bulunmuştur (p<0,05). Ancak her iki grubun spermatozoalarındaki hücre içi ATP düzeyleri arasında belirgin bir farklılık gözlenmemiştir (p>0,05). Aynı zamanda Spearman korelasyon analizleri, ilgili artışların spermatozoa ATP düzeyleri ile ilişkili olmadığını da göstermektedir (p>0,05).
Sonuç: Çalışmamızın sonuçlarına göre, astenospermik vakaların spermatozoalarında D-loop bölgesinde metilasyon artışı ile birlikte mtDNA kopya sayısında artışın da olduğu belirlenmiş, ancak bunun hücre içi ATP düzeyleri ile ilişkili olmadığı gösterilmiştir. Astenospermik vakalarda bu metilasyon artışının nedenleri ve sonuçlarının daha net bir şekilde ortaya konabilmesi için daha ileri çalışmalara gerek duyulmaktadır.

Abstract:
Aim: Sperm motility disorder is a condition that may cause male infertility. Some of the adenosine triphosphate (ATP) required for sperm motility is produced in the mitochondria of the spermatozoa. It has been reported that the CpG bases of the D-loop region in the mitochondrial genome, which have an important role in regulating the expression of mitochondrial genes, can be methylated and this is associated with some pathologies. In this study, the relationship between methylation levels of the D-loop region and ATP levels in the spermatozoa of asthenospermic infertile male individuals was investigated.
Material and Method: A total of 49 cases, including 24 controls (normospermic) and 25 patients (asthenospermic) cases who admitted to our outpatient clinic between March 2020 and February 2021, were included in the study. D-loop methylation rate and mtDNA copy numbers were determined from mitochondrial DNA (mtDNA) of spermatozoa obtained from semen samples taken from the subjects, by methylation-specific real-time polymerase chain reaction (PCR) application after bisulfite modification. Intracellular ATP levels were measured by chemiluminescence method.
Results: When the data obtained from the semen samples included in the study were evaluated statistically, the D-loop methylation rate was 86% higher in the spermatozoa of the asthenospermia group compared to the control group (p<0,05). In addition, the mtDNA copy number in the spermatozoa of the asthenospermia group was 44% higher than the control group. (p<0,05). However, no significant difference was observed between the intracellular ATP levels in the spermatozoa of both groups (p>0,05). At the same time, Spearman correlation analyzes show that the respective increases are not related to spermatozoa ATP levels (p>0.05).
Conclusion: As results of our study, it was determined that there was an increase in mtDNA copy number along with an increase in methylation in the D-loop region in the spermatozoa of asthenospermic cases, but it was shown that this was not related to intracellular ATP levels. Further studies are needed to clearly reveal the causes and consequences of increased methylation in asthenospermic cases.