Düşük vakalarında plasenta ve anne serumunda mikroRNA profilin karşılaştırılması
Comparison of placental and maternal serum microRNA profile in miscarriage
Yazar: MOHAMMADKAZEM HOSSEINI
Danışman: DOÇ. DR. TUBA GÜNEL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Düşük veya abortus, gebeliğin 20. haftasından önce gebeliğin sonlanması olarak tanımlanmıştır. Çocuk sahibi olmayı planlayan çiftlerin yaklaşık %30'u düşük problemiyle karşılaşırlar. Bu vakalarda düşük nedeni olarak genetik, endokrin, enfeksiyon, anatomik, hematolojik, otoimmün ve diğer (sigara, alkol) faktörler bulunmaktadır. Düşüğe neden olan moleküler mekanizmaların tanımlanması ve risk grubunda olan vakaların erken tanısı, canlı doğumların artışına neden olmaktadır. Araştırmalarda hedef olarak alınan üç genom; anne, baba ve fetüs/plasentadır. Fetüsün büyümesi ve gelişmesi plasenta fonksiyonuna ve damar gelişimine bağlı olmaktadır, bu yüzden düşük vakalarında genomik ve epigenetik araştırmalar için plasental örneklerle çalışmak uygundur. 
Plasenta gelişiminde ve fonksiyonunda önemli etkenlerden biri, gen anlatımının kontrolünde görev alan epigenetik düzenlemelerdir. Epigenetik etkenler, DNA metilasyonu (CpG), kromatin histon modifikasyonu ve kodlanmayan düzenleyici RNA'lar olarak tanımlanmıştır.  miRNA'lar (mikroRNA) plasenta gelişiminde ve fonksiyonunda önemli rol oynayan epigenetik düzenlemelerden biridir. Plasentaya özgü miRNAlar plasental bariyeri geçerek maternal kana karışırlar. Bu bulgulardan yola çıkılarak, anneye ait plazmadaki miRNA'ların yeni bir nükleik asit belirteç sınıfı olarak kullanılabileceği önerilmiştir. miRNA'ların anlatım oranı çeşitli yöntemlerle ölçülebilir. Bu yöntemlerin en önemlisi mikroarray tekniğidir. Düşük vakalarında plasenta dokusuna özgü anne dolaşımına katılan miRNA'nın varlığına literatürde rastlanmamıştır. Araştırmamız bu konuda aday miRNA belirtecinin belirlenmesi yolunda öncü bir araştırma niteliğindedir. 
Çalışmamızda düşük ve kontrol (normal) vakalarında plasentayı oluşturacak olan villus materyalinden ve maternal plazmadan miRNA'ların izolasyonu yapılmış, mikroarray yöntemi ile anlatım farklılıkları saptanmıştır. Anlatım farklılığı tespit edilen miRNA'ların gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ("Quantitative RT Real-time PCR") tekniği ile validasyonları gerçekleştirilmiştir. Mikroarray sonuçlarına göre, doku örneklerinden elde edilen 4 miRNA'nın anlatımında artma (p değeri 0.05'den küçük ve anlatım değişme katsayısı 2'den büyük olan) ve maternal plazma örneklerinden elde edilen 3 miRNA'dan 2'sinin anlatımında artma 1'inde azalma (p değeri 0.05'den küçük ve anlatım değişime katsayısı 2'den büyük olan) saptanmıştır. RT-qPCR yöntemiyle miR-125a-3p, miR-3663-3p, miR-575, let-7c, miR-122 ve hsa-miR-135a validasyonu gerçekleşmiş fakat miR-423-5p'nin anlatım analizinde bir farklılık saptanamamıştır. Kantitasyonu yapılan miRNA'ların biyoinformatik olarak hangi gen yolaklarını etkilediği belirlenmiştir. Bu gen yolakları en fazla hücre göçü, çoğalma, adhezyon, implantasyon, anjiyogenez ve farklılaşma da etkili olan genler üzerinedir. Bu araştırma sonucunda validasyonu yapılan 6 miRNA'nın hedeflediği genlerin etkilediği proteinlerle değerlendirilerek kişiye özgü düşük sebepleri ortaya çıkarılabilir.

Abstract:
Spontaneous abortion, also known as miscarriage, is identified as the unintentional expulsion of an embryo or fetus before the 20th week of gestation. About 30% of couples attempting to bear children have come up the occurrence of recurrent miscarriage (RM). In these patients, there are multiple factors associated with miscarriage, including genetic, endocrine, infectious, anatomical, haematological, autoimmune and several behavioral and social risk factors, such as alcohol consumption and smoking. Identification of the underlying molecular causes of biological mechanisms and diagnosis of risk group cases of miscarriage lead to an increase of live births. Three genomes used as a target of studies are mother, father, fetus/placenta. Fetal development and growth is related to placental function and vessel development, so in this context, a placental genome would represent an ideal miscarriage case for (epi)genetic and genomic studies. 
An important factor of placental development and function is epigenetic regulation governing the control of gene expression. Epigenetic factors are identified as CpG methylation in DNA, histon modifications in chromatin, and non-coding regulatory RNAs. miRNAs (microRNAs) are one of the epigenetic regulations which play an important role in placenta  development and function. Placenta-specific miRNAs are capable of crossing the placental barrier and detectable in maternal plasma. According to these findings, maternal plasma miRNAs are suggested to be used for new nucleic acid biomarker class in non-invasive diagnosis. miRNAs expression rate can be measured by various methods, and one of the most important methods is microarray technology. The presence of placental tissue-specific miRNAs passed to maternal circulation in miscarriage cases were not reported in the literature. This study is pioneering research in the determination of miRNA biomarker for non-invasive diagnosis of miscarriage.
In this project, firstly miRNAs were isolated from villus material which produces placenta and maternal plasma samples of miscarriage and control groups and then differences in miRNA expression were detected by microarray technique. The differences in miRNA expression obtained from microarray analysis were validated by quantitative real-time PCR (RT-qPCR) method. According to miRNA microarray results; it was detected that four miRNAs (hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-3663-3p, hsa-miR-423-5p and hsa-miR-575) were up-regulated (p-value less than 0.05 and fold-change more than 2) in tissue sample. It was determined that two of the three differentially expressed miRNAs (hsa-let-7c, hsa-miR-122) are up-regulated and one of them (hsa-miR-135a) is down-regulate in maternal plasma. Validation results by RT-qPCR showed that six of seven miRNAs could be validated by RT-qPCR ("Quantitative reverse transcription PCR") technique except one miRNA (miR-423-5p). The effect of quantifed miRNA on gene pathways have been designated by bioinformatics. The involved pathways of effected genes are mostly about cell migration, proliferation, implantation, adhesion, angiogenesis and differentiation. In the results of this study, personalize reasons of abortion can be found out by evaluation of validated 6 miRNAs' target genes and related proteins of these genes.