Amniotik membran kaynaklı kök hücreleri üzerine trombositten zengin plazmanın etkisi
The effect of platelet rich plasma on amniotic membrane derived stem cells
Yazar: A S M GOLAM KIBRIA
Danışman: PROF. DR. ARTAY YAĞCI ; PROF. DR. JALE ÖNER
Afyon Kocatepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Amnion = Amnion ; Atlar = Horses ; Epidermal büyüme faktörü = Epidermal growth factor ; Kök hücreler = Stem cells ; Trombosit kaynaklı büyüme faktörü = Platelet-derived growth factor ; Trombositten zengin plazma = Platelet rich plasma

Özet:
Kök hücreler gelişen teknoloji ile birlikte biyomedikal alanında oldukça önemli bir tedavi aracı haline gelmiştir. Amniotik membran, kök hücre kaynakları arasında daha az immunojenite ve  multipotentten daha yüksek potansiyelleri ile önemli bir kaynaktır. Bu çalışmada atların amniotik membranından elde edilen kök hücreler izole edilerek, kültüre edildi ve onuncu pasaja kadar çoğaltıldı. Bununla beraber hücreler üzerinde adipojenik, osteojenik, kondrojenik farklılaştırmalar ve nörosfer oluşumu çalışmaları yapıldı.  İki katına çıkma süresi analizi ile üçüncü pasaj ile altıncı pasaj arasında hücre çoğalmalarının daha güçlü olduğu ve dördüncü pasajda hem epitel (AEH) hem de mezenkimal hücrelerde (AMH)  çoğalmanın en yüksek olduğu belirlendi. Büyüme eğrisi analizinde AEH ve AMH'lerde beşinci pasajın en iyi büyüme kinetiği özelliğini sergilediği görüldü. At kanından yüksek konsantrasyonda (717.17±43.34×109 /L) tombosit içeren PRP hazırlanışı için çift santrüfüjlü bir teknik geliştirildi. Çalışmada, taze ve inaktif (PRP-1), taze ve CaCl2 ile aktive edilen (PRP-2), CaCl2 ile aktive edildikten sonra dondurulan (PRP-3) ve dondurma çözdürme işlemi ile aktive edilen (PRP-4) dört grup PRP kullanıldı. Çalışmada PRP grupları arasında belirgin bir fark olmaksızın yüksek konsant- rasyonda Epidermal büyüme faktörü (EGF) gözlendi. PRP-4 grubunda en yüksek konsantrasyonda PDGF saptandı. MTT analizi ile hem AEH hem de AMH'de dondurma çözdürme ile aktive edilen PRP'nin (PRP-4) daha iyi çoğalma sağladığı ortaya kondu. Canlı hücre sayımı da dondurma çözdürme ile aktive edilen PRP'nin daha iyi hücre proliferasyonunu sağladığını gösterdi. Farklı dozlardaki PRP kullanımlarında %5 PRP konsantrasyonunun hem AEC hem de AMC'lerde bütün analizlerde hücre çoğalmasını arttırdığı  belirlendi. %10 ve %15 PRP konsantrasyonları ile de yakın sonuçlar elde edildi. Farklılaştırma çalışmalarında iki tip hücre de başarı ile osteojenik, adipojenik ve kondrojenik hücrelere farklılaştırıldı; bu farklılaşmalar alizarin red boyaması, oil red O boyaması ve alsian mavisi boyaması ile gösterildi. Nörosfer oluşumunda iki tip hücrenin de küre benzeri, üç boyutlu sinir doku progenitör hücreleri oluşturabilme yeteneğinde olduğu gözlendi. PCR analizinde pluripotent hücre belirteçleri olan SOX2 ve OCT4'te oldukça güçlü ekspresyon gözlendi. Hem AMH hem de AEH'lerde P0, P3, P5 ve P7'de multipotent kök hücre belirteçleri CD14, CD44, CD73, CD90 ve CD105 ekspresyonları iyi seviyede gözlendi. Hemotopoetik hücre belirteci CD45 iki tip hücre için de negatif bulundu. Ayrıca MHC-II belirteci (CD74) de her iki hücre tipinde negatifdi. Bu sonuçlar, hem pluriopotent hem de multipotent kök hücre karakterizasyonu gösteren amnion membranından elde edilen kök hücrelerinin, allojenik uygulamalar için  kullanılabilecek  önemli bir kök hücre kaynağı olduklarını göstermektedir.

Anahtar kelimeler: Amniotik Membran Kaynaklı Kök Hücre, PRP, PDGF, EGF, At

Abstract:
Stem cells become very important apparatus in this cutting edge technology in the field of biomedical science. Amniotic membrane is one of the vital sources of stem cells that give the cells with lesser immunogenicity having the strength more than multipotency. Thus equine amniotic membrane derived stem cells were isolated, cultured and propagated till passages ten. Along with these osteogenic, adipogenic, chondrogenic differentiation as well as neurospheres formation were also performed. In proliferative study, doubling time revealed that passage three (P3) to passage six (P6) had the higher growth and passage four (P4) was the highest proliferation in both epithelial (AEC) and mesenchymal stem cells (AMC). In AECs and AMCs, growth curve analysis showed that passage five (P5) was the best for growth kinetics properties. A handy double centrifuged laboratory technique was developed to yield a PRP from horse blood with higher platelets (717.17±43.34×109 /L) concentration. Four types of PRP was made such as fresh and inactivated (PRP-1), fresh and CaCl2 activated (PRP-2), stored and CaCl2 activated (PRP-3) as well as stored and freeze-thaw activated (PRP-4). Epidermal Growth Factor (EGF) concentration was recorded in higher concentration having without any significant difference among different types of PRPs. Platelet-derived growth factor (PDGF)  concentration was the highest in the freeze-thaw activated PRP. MTT procedure showed that PRP activated by freezing-thawing method was related with higher propagation of both AECs and AMCs. Viable cells counting also favoured the freeze-thaw activated PRP in terms of growth of cells. In case of different dosages of PRP, 5% concentration of freeze-thaw PRP had over all improved relation with all cellular growth indexes for both AECs and AMCs although 10% and 15% concentration of PRP had the close results. In differentiation study both types of stem cells were successfully differentiated into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineage that were confirmed by alizarin red stain, oil red O stain and alcian blue stain, respectively. In neurospheres generation, both cells proved their ability to produce progenitor cells for nerve tissue by creating well defined, spheroid, three dimensional structures. In PCR analysis, strong expression of two pluripotent markers (SOX 2 and OCT 4) was recorded. Besides these, multipotent stem cell markers like CD 14, CD 44, CD 73, CD 90 and CD 105 had good expression in this study (P0, P3, P5 and P7) for AECs and AMCs. On the contrary hemopoietic cell marker (CD 45) was negative for both cell types. In addition, MHC-II marker (CD 74) had also negative. These results have shown that the amniotic membrane derived stem cells which have both of multipotent and pluripotent characteristics are an important source of stem cells for allogenic treatments.
Key words: Amniotic membrane derived stem cell, PRP, PDGF, EGF, horse