Candida türlerinin restriksiyon enzim analizi ile identifikasyonu
Identification of candida species by restriction enzyme analysis
Yazar: REYHAN YİŞ
Danışman: PROF.DR. MİNE YÜCESOY
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2007
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
İmmun baskılanmış hastalarda en sık rastlanan ve en önemli fungal patojenler mayalarolup; bunlar arasında da en sık Candida türlerinin izlendiği bildirilmektedir. Klinikörneklerden soyutlanan Candida türünün belirlenmesi, antifungal ilaçlara duyarlılık hakkındabilgi verdiği gibi ampirik sağaltım seçimine de ışık tutabilmektedir. Bu nedenle soyutlanansuşların hızlı, güvenilir ve doğru identifikasyonu büyük önem taşımaktadır. Çalışmamız, ciddiklinik tablolardan soyutlanan ve klasik yöntemler ile tanımlanmış olan Candida albicans venon-albicans Candida türlerinin daha hızlı ve güvenilir identifikasyonu amacıyla restriksiyonenzim analizi yönteminin uygulanması ve sonuçların karşılaştırılması amacıyla planlanmıştır.Araştırmamıza Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi Mikoloji laboratuvarına gönderilensistemik örneklerden soyutlanan toplam 146 Candida suşu (40 C. albicans, 27 C.parapsilosis, 26 C. tropicalis, 25 C. glabrata, 11 C. kefyr, 10 C. krusei, 7 C. guilliermondii)ile birlikte C. albicans ATCC 14053, C. parapsilosis ATCC 90018 ve C. krusei ATCC 6258numaralı kalite kontrol suşları dahil edilmiştir.Çalışmaya alınan tüm Candida suşları %50 gliserol içeren beyin kalp infüzyonbuyyonunda -80°C'de stoklanmıştır. Sabouraud dekstoz agar'a iki kez pasajlanan suşlar37°C'de 24- 48 saat inkübe edilmiştir. Üreyen suşlar çimlenme borusu testi, mısır unu tween80 agar, CHROMagar Candida (CHROMagar, Fransa) besiyerlerindeki morfolojik özelliklerive API 20C AUX (Biomérieux, Fransa) otomatik identifikasyon işlemi sonucuna göretanımlanmıştır.Tüm Candida suşlarının DNA eldesi ?Nucleospin Tissue Kit? (Macherey-Nagel,Almanya) ile EDTA, litikaz ve sorbitol tampon kullanılarak üretici firma önerileridoğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Daha sonra uygulanan polimeraz zincir tepkimesi içinITS1, 5.8S rDNA ve ITS2 bölgelerini hedef alan öncül1 ve öncül3 kullanılmıştır.Amplifikasyon ürünleri ?GeneMark PCR Clean-Up Kit? kullanılarak saflaştırılmış ve takibenMwoI enzimi ile restriksiyon enzim analizi uygulanmıştır. İncelenen C. albicans suşlarının 36tanesinde 141, 184 ve 261 bç `lik üç adet bant saptanırken, dört suşun 184 bç, 141 bç veyaklaşık 165 bç, 95 bç'lik dört adet bant oluşturduğu gözlenmiştir. Çalışmaya alınan C.parapsilosis ve C. tropicalis suşları aynı enzim ile kesim sonucunda sırasıyla 336, 146, 88bç'lik ve 325, 154, 97 bç'lik üçer adet bant oluşturmuştur. Bu iki türün birbirinden ayırtedilebilmesi için ek olarak BslI enzimi ile de kesim yapılmış ve C. parapsilosis suşları 413,94, 63 bç'lik üç bant oluştururken, C. tropicalis suşları için 326, 187 ve 63 bç'lik bantlarizlenmiştir. Araştırmamıza alınan C. glabrata suşları MwoI enzimi ile kesim sonucunda 414,174, 171, 86, 80 bç'lik bantlar oluştururken, C. kefyr suşları için 370, 430 bç'lik iki adet bantve C. krusei suşları için 289, 134, 83, 54 bç'lik dört adet bant elde edilmiştir. MwoI enzimi ilekesilen yedi adet C. guilliermondii suşunun beş tanesi 355 ve 302 bç'lik, kalan iki suş iseyaklaşık olarak 390 ve 300 bç'lik iki adet bant oluşturmuş; BslI enziminin kullanılmasıyla sözkonusu iki suşun diğer beş suştan tamamen farklı bir kesim paterni gösterdiği saptanmıştır.C. albicans suşlarında MwoI enzimi ile uygulanan yöntemin duyarlılık, özgüllük, pozitifve negatif prediktif değerleri sırasıyla %90, %100, %100, %96,4 olarak elde edilmiştir. Aynıyöntemin C. parapsilosis ve C. tropicalis türleri için bu değerler sırasıyla %100, %78,2- 81,5,%49,1- 50,9, %100 olarak saptanmış; BslI enziminin kullanılmasıyla ise tüm değerler %100'eyükselmiştir. C. glabrata, C. kefyr, C. krusei ve C. guilliermondii türleri için MwoI enzimininkullanıldığı restriksiyon enzim analizi duyarlılıkları %100 iken, özgüllükleri %98,6- 100,pozitif prediktif değerleri %71,4- 100 ve negatif prediktif değerleri %100 olarak saptanmıştır.Çalışmada yer alan C. albicans suşlarından MwoI enzimi ile diğerleriyle farklıbölgelerden kesilerek dört bant oluşturan dört ve aynı bölgelerden kesilerek üç bant oluşturaniki adet suş ile farklı ve aynı bölgelerden kesilen ikişer adet C. guilliermondii suşuna çiftyönlü dizi analizi uygulanmış ve sonuçlar Bio-Edit version 7.0 programı iledeğerlendirilmiştir. Dizi analizi sonuçları incelendiğinde, MwoI enzimi ile farklı kesim paternigösteren C. albicans suşlarının üçünde adenin yerine guanin nükleotidinin geldiği noktamutasyonu, bir tanesinde de insersiyon/delesyon tipi mutasyon saptanmıştır. Bu mutasyonlarsonucunda suşlarda MwoI enziminin kesim bölgesine uyan nükleotid dizilimi meydanageldiği ve böylelikle kesim sonucunda diğer suşlardan farklı olarak dört adet bant oluştuğugözlenmiştir. C. guilliermondii suşlarına ait dizi analizi sonuçları değerlendirildiğinde, her ikienzimle de diğer suşlardan farklı bölgelerden kesilen iki adet suşun Gen bankasında DNAdizisi verilen C. guilliermondii var guilliermondii dizilerine göre (% 66,6) C. guilliermondiivar membranaefaciens suşlarına gerek nükleotid dizilimi ( % 91,2) gerekse aminoasit dizilimiaçısından çok daha fazla benzerlik gösterdiği belirlenmiş ve bu suşlar C. guilliermondii varmembranaefaciens olarak kabul edilmiştir.Araştırmamızda, Candida türlerinin identifikasyonu için altın standart olarak kabuledilen klasik yöntemlerle tanımlamada sorun yaşanan Candida türlerinin identifikasyonundaveya hızlı tanımlama gerektiğinde MwoI ve BslI enzimleri ile uygulanan restriksiyon enzimanalizinin kullanabileceği, ancak bu yöntemde de bazı farklılıkların izlenebileceğinin gözönünde bulundurulması gerektiği sonucuna varıldı.Anahtar Sözcükler: Candida türleri, identifikasyon, restriksiyon enzim analizi

Abstract:
Yeasts are the most common and important pathogens in immunosupressive patients and ithas been reported that Candida spp. are the most commonly isolated ones among them.Identification of Candida species isolated from clinical specimens gives information about theantifungal susceptibility as well as sheds light to the choice of ampirical treatment. Because of thisreason, rapid, reliable and accurate identification of the isolates is very important. This study wasplanned to apply restriction enzyme analysis for more rapid and reliable identification of Candidaalbicans and non Candida albicans species isolated from serious clinical cases which had beenpreviously identified by conventional methods and to compare the results.In this study one hundred and fortysix Candida strains (40 C. albicans, 27 C. parapsilosis, 26C. tropicalis, 25 C. glabrata, 11 C. kefyr, 10 C. krusei, and 7 C. guilliermondii) isolated fromsystemical specimens at Dokuz Eylul University Hospital Mycology Laboratory and C. albicansATCC 14053, C. parapsilosis ATCC 90018 and C. krusei ATCC 6258 were included.All Candida isolates were kept at -80°C in 50% glycerol and brain heart infusion broth asstock cultures. The strains which were subcultured onto Sabouraud dextrose agar were incubated at37°C for 24- 48 hours. The strains were identified according to germ tube test, morphology atcornmeal tween 80 agar and CHROMagar Candida (CHROMagar, France) and API 20C AUX(Biomérieux, France) automatized system.DNA extraction of all Candida species was performed with ?Nucleospin Tissue Kit?(Macherey-Nagel, Germany) using EDTA, lyticase and sorbitol buffer according to themanufacturer?s recommendations. For the polymerase chain reaction, primer1 and primer3 whichtargeted ITS1, 5.8S rDNA and ITS2 regions were used. The amplification products were purifiedwith ?GeneMark PCR Clean-Up Kit? and following this restriction enzyme analysis wasperformed with MwoI enzyme. Thirty six of the C. albicans strains produced a restriction enzymeanalysis pattern with three 141, 184 and 261 bp bands while four of them produced four 184 bp,141 bp and approximately 165 bp and 95 bp bands. The restriction of C. parapsilosis and C.tropicalis strains with the same enzyme resulted in three 336, 146, 88 bp and 325, 154, 97 bpfragments, respectively. In order to distinguish these two species, further restriction was performedwith BslI enzyme and the lengths of restriction enzyme analysis products were 413, 94 and 63 bpfor C. parapsilosis, and 326, 187 and 63 bp for C. tropicalis. Restriction of C. glabrata isolateswith MwoI enzyme resulted in five bands of 414, 174, 171, 86, 80 bp. Calculated lengths of5restriction enzyme analysis products were 370 and 430 for C. kefyr; 289, 134, 83 and 54 bp for C.krusei isolates. Restriction of five C. guilliermondii isolates with MwoI enzyme showed two bandsat 355 and 302 bp while the remaining two strains showed a restriction enzyme analysis patternwith two bands at 390 and 300 bp. Additional digestion with BslI enzyme established that thesetwo strains showed totally different restriction patterns from the other five strains.The sensitivity, specifity, positive and negative predictive values of restriction enzymeanalysis performed by MwoI enzyme for C. albicans strains were 90%, 100%, 100%, %96,4,respectively. These values were detected as 100%, 78,2%-81,5%, 49,1%-50,9%, 100%respectively for C. parapsilosis and C. tropicalis isolates. When BslI enzyme was used forrestriction, all values for these two species increased to 100%. The sensitivity, specifity, positiveand negative predictive values of MwoI enzyme restriction for C. glabrata, C. kefyr, C. krusei andC. guilliermondii strains were found to be 100%, 98,6%- 100%, 71,4%- 100%, 100%, respectively.Sequence analysis of both strands of four C. albicans isolates which resulted in differentrestriction patterns and two C. albicans isolates which produced three bands with the same enzymeand two C. guilliermondii isolates showing a different restriction enzyme analysis pattern wereperformed. The evaluation of the sequence analysis results was done by Bio-Edit version 7.0programme. Three C. albicans isolates which produced a different restriction pattern had pointmutations (guanine instead of adenine); one isolate had insertion/deletion type mutation and thesemutations were the reason of a different pattern. In addition, sequence analysis of two C.guilliermondii isolates showing various fragments with different lengths by two enzymes were66.6% similar with GenBank C. guilliermondii var guilliermondii and 91.2% similar with C.guilliermondii var membranaefaciens (nucleotide seqeunce). Because of this high nucleotidesequence similarity, these isolates were accepted as C. guilliermondii var membranaefaciens.As a result, we can conclude that restriction enzyme analysis with MwoI and BslI enzymescan be used for the identification of Candida species which need rapid identification or which areproblematic with conventional methods that are still accepted as gold standard although somevariations can be observed with this method.Key Words: Candida species, identification, restriction enzyme analysis