Transkripsiyon faktörü TFIIB'nin glikozilasyon profilinin biyoinformatik ve deneysel olarak belirlenmesi
Determination of the transcription factor TFIIB glycosylation profile by using bioinformatics and experimental methods
Yazar: MUHAMMET USLUPEHLİVAN
Danışman: PROF. DR. REMZİYE DEVECİ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Transkripsiyon; prokaryotik ve ökaryotik tüm canlılarda gerçekleşen, canlılığın evrensel ve kilit bir mekanizmasıdır. Ökaryotik canlıların tamamında trankripsiyonun gerçekleşmesinde, RNA Polimeraz II enzimi ve onunla etkileşen genel tranksripsiyon faktörleri rol oynamaktadır. Bu proteinlerden TFIIB, transkripsiyonun başlaması aşamasında üç yapı ile etkileşime girer. Bunlar; TATA'ya bağlanan protein'in tek ucu; TATA kutusunu izleyen GC zengin DNA dizisi ve RNA polimeraz II'nin C-terminal domaini kuyruğudur. RNA Polimeraz II'nin bir glikoprotein olduğu ve transkripsiyonun başlama aşaması sırasında C-terminal domaininde O-GlcNAc şekerini taşıdığı bilinmektedir. Fakat, RNA polimeraz II ile etkileşime giren transkripsiyon faktörü TFIIB'nin bir glikoprotein olup olmadığı ve bu etkileşimlerinde glikanların rolü ile ilgili bilinenler oldukça sınırlıdır. Bu nedenle çalışmanın amacı; nukleus proteinlerinden TFIIB transkripsiyon faktörünün olası glikozilasyon (N- ve O-bağlı glikozilasyonlar) noktalarını, çeşitli omurgasız ve omurgalı türlerinde biyoinformatik yöntemlerle belirlemek ve türler arasında korunmuş/farklılaşmış amino asit dizileri ile bunların olası glikozilasyon profilini ortaya koyarak elde edilecek bilgilerden hareketle, model organizma denizkestanesi Paracentrotus lividus'ta TFIIB'nin olası glikozilasyon profillerini (N- ve/veya O-) western blot/lektin blot yöntemleri ve TEM ile deneysel olarak ortaya koymaktır.
   Bu amaçla biyoinformatik çalışmalarda kullanılmak üzere; denizkestanesi Strongylocentrotus purpuratus, balık Oryzias latipes, kurbağa Xenopus laevis, sıçan Rattus norvegicus, fare Mus musculus, sığır Bos taurus, orangutan Pongo pygmaeus abelii ve insan Homo sapiens'e ait TFIIB amino asit dizilerinden yararlanılmıştır. Biyoinformatik veritabanları ve sunucuları kullanılarak her türün TFIIB proteininin sekonder ve üç boyutlu yapı tahminleri oluşturulmuş, potansiyel glikozilasyon pozisyonları belirlenerek doğruluk analizleri yapılmış ve ilgili pozisyonlar proteinin yapısı üzerinde görüntülendirilmiştir. Deneysel çalışmalarda ise denizkestanesi P.lividus'un ergin bireylerinden alınan yumurta hücreleri kullanılmış, elde edilen nuklear ekstrakt kullanılarak western/ lektin blotlama ve TEM ile immün/lektin işaretleme yapılmıştır.
  Biyoinformatik çalışmalar sonucunda, denizkestanesi ve kurbağa türlerine ait TFIIB proteininin N-bağlı glikozilasyon noktalarına sahip olduğu belirlenmiş, ayrıca çalışılan türlerin TFIIB proteininde musin tip O-bağlı glikozilasyon, O-α-GlcNAclasyon, O-β-GlcNAclasyon ve ying-yang pozisyonları da belirlenmiştir. Buna ek olarak, sekonder ve üç boyutlu yapı tahminlerinde, omurgasızlardan omurgalılara gidildikçe proteinin yapısal bir değişim gösterdiği bulunmuştur. Lektin blotlama sonucunda TFIIB proteininde, N-asetilglukozamin, Galaktoz, Mannoz ve α2-3 bağlı Sialik asit uç glikan birimleri olarak belirlenmiştir. TEM'de sialik asitlere yönelik yapılan lektin işaretlemede ise, α2-3 ve α2-6 bağlı sialik asitlerin TFIIB proteininde bulunduğu belirlenmiştir.
Elde edilen bulgularla, TFIIB transkripsiyon faktörünün bir glikoprotein olduğu ilk kez belirlenmiştir. Ayrıca nukleositoplazmik proteinlerin O-GlcNAc modifikasyonunun yanında, O- ve/veya N- bağlı glikozilasyon modifikasyonlarını da gösterdiği/gösterebileceği belirlenmiştir. Bu bulgu ile nukleositoplazmik proteinlerin glikozilasyonuna yeni bir bakış açısı kazandırılmış ve glikobiyoloji alanına yeni bir araştırma sorusu sorulmuştur. Böylece, moleküler biyolojinin klasik bakış açısına farklı bir yaklaşım ile alternatif sunulmuştur. Bütün bunlara ek olarak bu çalışmada, TEM'de kullanılmak üzere, kesit alınmaksızın doğrudan grid üzerine uygulama yapılarak oluşturulan, son derece pratik ve yeni bir yöntem tarafımızca geliştirilmiş ve ilk kez bu tez çalışmasında kullanılmıştır.

Abstract:
Transcription is the universal and key mechanism of life that occurs in all prokaryotes and eukaryotes. RNA polymerase II and transcription factors that interact with it are involved in transcription of all eukaryotic organism. Transcription factor TFIIB interacts with three structures at the initiation stage of transcription: the single end of TATA binding protein, TATA box followed by GC-rich DNA sequence, and C-terminal domain tail of RNA polymerase II. It has been known that RNA polymerase II is a glycoprotein and it contains O-GlcNAc sugar in the C-terminal domain at the initiation stage of transcription. However, it is not clear whether the transcription factor TFIIB interacting with RNA polymerase II is a glycoprotein or not. Also, data concerning the role of glycans in this interaction is quite limited. Thus, the first aim of the study is to determine the potential glycosylation positions (N- and O-linked glycosylation) of transcription factor TFIIB of nucleus proteins in various invertebrate and vertebrate species and to reveal conserved/differentiated amino acid sequences as well as their potential glycosylation profile amongst the species via bioinformatics. Taking into account the data obtained from bioinformatics, the second aim of the study is to determine experimentally of the potential glycosylation profiles (N- and/or O-) of TFIIB in the model organism sea urchin Paracentrotus lividus by using western/lectin blotting methods and TEM.
  For this purpose, TFIIB amino acid sequences of sea urchin Strongylocentrotus purpuratus, fish Oryzias latipes, frog Xenopus laevis, rat Rattusnorvegicus, mouse Mus musculus, bovine Bos taurus, orangutan Pongo pygmaeus abelii, and human Homo sapiens were used in bioinformatic studies. The construction of the secondary and three dimensional structure predictions of TFIIB protein, determination of the potential glycosylation positions and their accuracy analyzes, and the visualization of the relevant positions on the protein structure were performed using bioinformatic databases and servers. In experimental studies, egg cells from mature individuals of sea urchin P. lividus were used and western/lectin blotting and immune/lectin labelling by TEM were performed using the nuclear extract obtained.
  In addition to the determination of mucin type O-linked glycosylation, O-α-GlcNAcylation, O-β-GlcNAcylation, and ying-yang positions in the TFIIB protein of all studied species, N-linked glycosylation positions were also found in the TFIIB protein of sea urchin and frog as a result of bioinformatic studies. Furthermore, in the secondary and three dimensional structure predictions, changing in the protein structure from invertebrates to vertebrates was found. N-acetylglucosamine, Galactose, Mannose, and α2-3 linked Sialic acid were determined as a terminal glycan unit of the TFIIB protein in lectin blotting. The presence of α2-3 and α2-6 linked sialic acids in the TFIIB protein were found by using lectin labelling against sialic acids in TEM.
With the findings obtained, it has been demonstrated for the first time that transcription factor TFIIB is a glycoprotein. It has also been determined that nucleocytoplasmic proteins may exhibit O- and/or N-linked glycosylation modifications as well as O-GlcNAc modification. With this finding, a new approach has been adopted to the glycosylation of nucleocytoplasmic proteins and prompted a new research question in the field of glycobiology. Thus, an alternative approach is presented for the classical viewpoint of molecular biology. Furthermore, a very practical and new method has been developed by us applying directly on the grid without sectioning in order to be used in TEM and used for the first time in this thesis.