İn vitro kültür ortamında kemik iliği nişi modellenmesine yönelik çalışmalar
Studies on modeling of bone marrow niche under in vitro conditions
Yazar: YAĞIZ ANASIZ
Danışman: PROF. DR. RIZA KÖKSAL ÖZGÜL
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kök Hücre Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Hematoloji = Hematology
Dizin: Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Ekstrasellüler matriks = Extracellular matrix ; Kemik iliği = Bone marrow ; Kök hücreler = Stem cells ; Rejeneratif tıp = Regenerative medicine ; İn vitro = In vitro

Özet:
Mezenkimal kök hücreler (MKH), preklinik araştırmalar, klinik çalışmalar ve yeni araştırma ilacı başvurularında en yaygın kullanılan kök hücre tipidir. İnsanlarda MKH izolasyonu başlıca kemik iliği ve adipoz dokudan yapılmakta olup, izole edilebilir MKH miktarı tüm çekirdekli hücrelerin yalnızca %0.001-3'lük kısmını oluşturmaktadır. Bu nedenle yeni izolasyon yöntemleri ve kaynaklarına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu tez kapsamında ilk bölümde, kemik iliği nakli sırasında kullanılan ve sonrasında tıbbi atık olarak uzaklaştırılan filtre ve torba sistemlerinin MKH kaynağı olarak uygunluğu araştırılmıştır. Kök hücre uygulamalarında güncel yaklaşım, sistemik ve/veya bölgesel olarak doğrudan MKH uygulanması yerine "cell-free therapy" olarak adlandırılan MKH kaynaklı biyoaktif bileşenlerin kullanılmasıdır. Çalışmamızın ikinci aşamasında, kök hücre nişinin temelini oluşturan, MKH kaynaklı biyoaktif bileşenlerden olan ekstraselüler matriks yapısının üretimi ve güncel doku mühendisliği uygulaması olan çeşitli deselülerizasyon yöntemleri ile izolasyonu, mikroskobik inceleme çalışmaları, kalıntı DNA miktarı ve glikozaminoglikan içeriği açısından değerlendirilmiş ve proteomik tekniklerle yapısı aydınlatılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, "kullanılmış" filtre ve torba sistemleri, özgül antijen ifadesine sahip, adipojenik, osteojenik ve kondrojenik farklılaşma potansiyeli bulunan MKH izolasyonu için önemli bir kaynak oluşturmaktadır. Osteojenik farklılaşma besiyeri ile EM üretimi sonrasında Triton X-100, NH4OH içeren çözelti ile deselülerizasyon yöntemi ile insan trabeküler kemik morfolojisi benzeri MKH-dEM izole edilmiş ve nLC-MS/MS yöntemi ile MKH-dEM kompozisyonunda yer alan 2005 farklı protein tanımlanmıştır. EM yapısını oluşturan, bağlantılı olan ve düzenlenmesinde rol alan önemli proteinler insan matrizom veritabanı ile karşılaştırılarak analiz edilmiştir.  Anahtar Kelimeler: Rejeneratif tıp, kemik iliği nişi, mezenkimal kök hücre, ekstraselüler matriks, deselülerizasyon, doku mühendisliği (*) Bu çalışma THD-12181 numaralı Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Koordinasyon Birimi projesi tarafından desteklenmiştir.

Abstract:
Mesenchymal stem cells (MSC) are the widely used stem cell type in preclinical research, clinical studies and investigational new drug applications. Isolation of MSC can be provided from bone marrow and adipose tissue, and the total isolated amount of MSC consists of 0.001-3% of nucleated cells. Thus, novel isolation techniques and resources are still needed. In the first section of this thesis, the suitability of the filter and bag systems, which are used during bone marrow transfer, were investigated. Those systems are removed as a medical waste, after the transfer, in routine. The current approach in stem cell-based therapy is using bioactive compounds named as "cell-free therapy" resourced from MSC, instead of applying MSC as systemically or locally. In the second stage of this study, the production of extracellular matrix (ECM) structure, which is constructed as bioactive compounds resourced from MSC, providing the basis of stem cell niche was carried out. The isolation of this structure was performed by using various decellularization techniques, as a current tissue engineering application was evaluated with microscopic studies, residual DNA and glycosaminoglycan content. Afterward, the structure was enlightened by using proteomics techniques. The results demonstrated the used filter and bags systems are an important source for isolation of MSC, which has a specific antigen expression and representing adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation potential. Besides, after producing EM with osteogenic differentiation medium, human trabecular bone morphology-like MSC-dECM was isolated by using solution containing Triton X-100, NH4OH. Then, 2005 different protein structures were demonstrated by using nLC-MS/MS technique. The important proteins, which consist, associate and regulate EM structure, were detected by using Human Matrisome Database. Key Words: Regenerative medicine, bone marrow niche, mesenchymal stem cell, extracellular matrix, decellularization, tissue engineering (*) This work was supported by Scientific Research Coordination Unit of Hacettepe University (Project Number: THD-12181).