Kan bankacılığında iyi laboratuvar uygulamalarına temel oluşturmak üzere hepatit B tarama testleri için iç kalite kontrol serumlarının geliştirilmesi
Development of internal quality control sera for hepatitis B screening in respect of good laboratory practice
Yazar: FAHRİ YÜCE AYHAN
Danışman: PROF. DR. ŞAZİYE RÜÇHAN SERTÖZ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Kan Bankacılığı ve Transfüzyon Tıbbı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Hematoloji = Hematology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Hepatit B = Hepatitis B ; Hepatit B virüsü = Hepatitis B virus ; Hepatit B yüzey antijenleri = Hepatitis B surface antigens ; Kalite kontrol = Quality control ; Kan = Blood ; Kan bankaları = Blood banks ; Kan donörleri = Blood donors ; Laboratuvar yöntemi = Laboratory method ; Laboratuvarlar = Laboratories ; Laboratuvarlar-hastane = Laboratories-hospital

Özet:
Kan bağışçılarının transfüzyonla bulaşan enfeksiyonlar yönünden mikrobiyolojik taramasının yapılması güvenli kan temini açısından önemli ve gereklidir. Bu alana ilişkin ulusal mevzuat ile zorunlu tarama testlerinin kapsamı hepatit B, hepatit C, AIDS ve sifiliz enfeksiyonlarına ilişkin göstergelerin araştırılması olarak belirlenmiştir. Bu testlerin güvenilir ve doğru sonuç vermesi ise iyi laboratuvar uygulamaları çerçevesinde kalite kontrol basamaklarının eksiksiz yerine getirilmesi ile mümkündür. 
Uluslararası kaynaklı ticari tarama kitleriyle birlikte tedarik edilen internal kalite kontrol serumları uluslararası kökenli olup tedarikçilerin ticari yaklaşımı nedeniyle birim test maliyetini arttırmaktadır.
Bu çalışmada kan bağışçılarının hepatit B taramasında kullanılan zorunlu tarama testleri için HBsAg reaktivitesi gösteren bağışçı kanlarından internal kontrol serumlarının hazırlanması amaçlandı.
Bu amaçla Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Kan Merkezine kan bağışında bulunmuş ve zorunlu tarama testlerinde saptanan HBsAg reaktivitesi nedeniyle karantinaya alınmış kanlardan plazmaları ayrıldı ve hazırlık süresince -40oC'de dondurularak saklandı.
HBsAg S/CO değeri yüksek (>1000) ve saptanabilir (>50 IU/ml) HBV DNA kantitasyonu bulunan bağışçılara ait plazmalar internal kalite kontrol örneği hazırlamak üzere havuzlanarak birleştirildi. Kalsiyum klorür ve trombin ile koagulasyonu sağlanan plazmadan elde edilen serum dekstran sülfat ile muamele edildi ve bir dizi santrifügasyon işlemi uygulanarak lipid presipitasyonu sağlandı. Serum havuzundan alınan örnekler farklı sulandırım oranlarında fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) ile sulandırıldı. Farklı sulandırımlar HBsAg reaktivitesi yönünden test edilerek S/CO oranlarına göre düşük reaktif, orta reaktif ve yüksek reaktif olarak üç farklı seri internal kontrol serumu kriyotüplere dağıtıldı ve donduruldu. Dondurulan İKK serumlarından farklı günlerde her seriden birer kriyotüp çözdürülerek HBsAg yönünden test edildi. Bulunan S/CO değerleri Levey-Jennings grafiğine işlendi ve Westgard kurallarına göre değerlendirildi.
Hazırlanan her üç seriden İKK serumlarının HBsAg analizinde elde edilen S/CO değerlerinin % 95 güven aralığında normal dağılım gösterdiği görüldü.
Yüksek, orta ve düşük reaktif İKK serumlarının S/CO değerlerinin istatistik analizinde ortalama sırasıyla 219.57, 1725.57 ve 3323.75 bulunurken ortanca sırasıyla 217.34, 1753.48, 3401.76 olarak; standart sapma ise sırasıyla 14.93, 210.62 ve 271.19 olarak belirlendi. Değişim katsayıları ise yüksek reaktif İKK serumlarında %8.1, orta reaktif İKK serumlarında %12.2 ve düşük reaktif İKK serumlarında %7.6 olarak belirlendi.
Westgard kurallarına göre yapılan incelemede bir kez 12s kuralının ihlal edildiği görülmüştür. Uyarıcı kural olarak tanımlanan bu durum dışında uyumsuzluk saptanmaması ve sistematik hata gözlenmemesi çalışmamız sonucunda hazırlanan İKK örnekleri ile elde edilen sonuçların tutarlı ve uygun olduğuna işaret etmektedir.

Abstract:
Microbiological screening of blood donors for agents of transfusion transmitted infections is important and necessary for ensuring the transfusion safety.
Screening of markers for hepatitis B, hepatitis C,  AIDS and syphilis in blood donors is obligatory in our national legislation.  Quality control (QC) is a crucial step to obtain reliable and accurate results in these assays. Internal quality control sera which are dependent to in vitro diagnostic test kits supplied from international market can lead an extra financial burden for laboratories. Besides the increasing costs, the use of QC material dependent to kit manufacturer would be a problem for quality management of the laboratory. 
Human plasma and cells that would be supplied from blood donors can be a reasonable source of preparation of in house QC materials for blood banks.
In this study, it was aimed to prepare in house QC sera for HBsAg screening of blood donors by using the human plasma collected from blood donors whom had have detectable HBsAg. 
Quarantined fresh plasma separated from whole blood collected from blood donors with repeatedly reactive screening tests for HBsAg in the blood bank of Ege University Medical Faculty Hospital were reserved and stored at -40oC for the preparation of QC material for HBsAg screening tests. 
Reserved plasmas from donors with high S/CO ratio (>1000)  and detectable (>50 IU/ml) HBV DNA were thawed and pooled for the preparation of internal QC sera. In vitro coagulation of pooled plasma was performed by using calcium chloride and bovine thrombin. Following the removal of coagulum dextrane sulphate was added and precipitation of lipids was carried out in a series of sentrifugation processes. Samples from the sera pool were diluted with PBS in different ratio and diluted samples were tested for HBsAg reactivity. Sera from three categories were assigned as high, medium and low reactive HBsAg control samples and transferred to cryotubes and frozen at -40oC.  One cryotube from each category were thawed and control samples were tested for HBsAg reactivity in consecutive days. Recorded S/CO ratio of IQC samples from each category was applied to Levey-jennings control charts and evaluated according to Westgard rules.
S/CO ratio of QC samples obtained from each category represented normal distribution in 95% confidence interval.  
In descriptive analysis of high, medium and low reactive IQC samples the mean was found as 3323.75, 1725.57 and 219.57; the median was determined as 3401.76, 1753.48 and 217.34; the standard deviation was calculated as 271.19, 210.62 and 14.93, respectively. Coefficients of variation for high, medium and low reactive IQC samples were determined as %8.1, %12.2 and %7.6, respectively.
Evaluation according to Westgard rules demonstrated one violation of 12s rule. Except this warning rule no evidence of unconformity or sytematic error. Therefore, it can be stated that IQC samples prepared in our study can be reliable in-house run controls for using in HBsAg immunoassays for screening of blood donors.