Matriks metalloproteinaz -1, -8 ve -13 aktivitelerinin belirlenmesi amacıyla kollajen zimografi yöntemi'nin standardizasyonu
Standardization of collagen zymography to determine the activation of matrix metalloproteinases -1, -8 and -13
Yazar: ŞENİZ İNANÇ
Danışman: PROF. DR. GÜLGÜN OKTAY
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Ekstrasellüler matriks = Extracellular matrix ; Kollajen = Collagen ; Matriks metalloproteinazlar = Matrix metalloproteinases

Özet:
Giriş: Canlı organizmalarda bulunan matriks metalloproteinazlar (MMP'ler), aktif bölgelerinde Zn2+ atomu içeren endopeptidazlardır. MMP'ler başlıca kollajen, laminin gibi ekstrasellüler matriks (ESM) bileşenlerinin yanı sıra, büyüme faktörleri, reseptörler gibi ESM dışı moleküllerin degradasyonundan da sorumludurlar. Kollajenazlar olarak bilinen MMP-1,-8 ve-13; tip I-II-III-V ve IX doğal fibriler kollajeni yıkma yeteneğine sahip proteazlardır. MMP'lerin aynı jel üzerinde pro ve aktif formlarının düzeylerini belirlemede kullanılan Zimografi tekniği, SDS-PAGE tekniğine dayalı elektroforetik bir yöntemdir. Kullanılan substrata göre jelatin, kazein veya kollajen zimografi şeklinde adlandırılmaktadır.Amaç: Bu çalışmada; kollajen zimografi tekniğinin standardizasyonu sağlanarak kollajenazların (MMP-1, -8 ve -13) aktivitelerinin kantitasyonu ve kollajen zimografi tekniğinin laboratuvarımıza kazandırılması amaçlanmıştır.Yöntem: Kollajen zimografi yönteminde substrat olarak kullanılan tip I kollajen sıçan kuyruk tendonlarından ekstrakte edilerek saflaştırıldı. Bununla birlikte substratların spesifikliklerini karşılaştırmak amacıyla tip I ve II kollajen ticari olarak satın alındı. İnsan rekombinant kollajenazları kullanılarak kollajen zimografi tekniği standardize edildi. Her çalışma en az 6 defa tekrar edildi. Yapılan zimografi işleminin ardından jeller ?UVP Gel Logic System? ile görüntülendi, litik bantların yoğunlukları hesaplandı ve standart grafikleri çizildi.Bulgular: Veriler değerlendirildiğinde tüm kollajenazlar için en uygun substratın tip I kollajen olduğu belirlendi ve çalışmaya aynı zamanda düşük maliyeti nedeniyle saflaştırılmış tip I kollajen üzerinden devam edildi. En belirgin litik bantlar 48 saatlik inkübasyon sonucunda görüldü. Yapılan standardizasyon çalışmaları sonucunda kollajen zimografi tekniği ile en az 1 ng kollajenaz aktivitesinin saptanabildiği bulundu. Bu nedenle 1-100 ng aralığında rekombinant kollajenazlar kullanılarak standart grafikleri çizildi.Sonuç: Sonuç olarak; MMP-1, -8, -13'ün aktif ve pro formlarını ayrı ayrı deteksiyonunu sağlayan kollajen zimografi tekniği laboratuvarımıza kazandırılmıştır ve gelecekte yapılacak olan projelerimizde kullanmak üzere standart grafikleri oluşturulmuştur.

Abstract:
Introduction: In living organisms matrix metalloproteinases (MMPs) are endopeptidases which contain Zn2+ atoms at their active site. MMPs are responsible for degradation of extracellular matrix (ECM) components like collagen and laminin as well as non-ECM molecules such as growth factors and reseptors. MMP-1, -8 and -13 which are also known as collagenases are proteases that capable of degradation of natural fibriller collagen type I-II-III-V and IX. Zymography is an electrophoretic technique based on SDS-PAGE prensible in which pro and latent forms of MMPs can be detected in the same gel. According to used substrate, zymograpy is reffered as gelatin, casein and collagen zymography..Objective: In this research we aimed to standardize collagen zymography, detect quantification of activity of collagenases (MMP-1, -8 ve -13) and gain collagen zymography technique to our laboratory.Method: Type I collagen was extracted from rat tail tedons to use as substrate in collagen zymography. In addition type I and type II collagen were bought commercially to compare the spesifities of substrates. Then collagen zymography technique was standardized by using human recombinant collagenases. Each experiment was repeated six times. After collagen zymography, the gels were monitorized by using UVP Gel Logic System, densities of lytic bands were analysed and standart graphs were drawn.Results: When the results were evaulated, type I collagen was determined as the best suitable substrate and extracted type I collagen was used because of its low price. The best clear lytic bands were obtained after 48 hours incubation. In the result of standardization of collagen zymography, it is found that at least 1 ng collagenase activity can be detected. Therefore, the range of 1-100 ng recombinant collagenases are used to draw standart graphs.Conclusion: In conclusion, in our laboratory we standardized collagen zymography which can detect active and pro forms of MMP-1, -8, -13 separately and made standard graphs that can be used in our following projects.