Türkiye'deki hiperkolesterolemi ve propiyonik asidemi hastalıklarına neden olan genetik patolojilerin belirlenmesi ve özgül mutasyon çeşitlerinin gen ifadelerinin araştırılması
Identification of genetic pathologies which cause hyper cholesterolaemia and propionic acidemia diseases in Turkey and investigation of gene expressions of spesific mutation types
Yazar: MUSTAFA MERT SÖZEN
Danışman: PROF.DR. CİHAN ÖNER
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2005
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
TÜRKİYE'DEKİ HİPERKOLESTEROLEMİ ve PROPİYONİK ASİDEMİHASTALIKLARINA NEDEN OLAN GENETİK PATOLOJİLERİN BELİRLENMESİve ÖZGÜL MUTASYON ÇEŞİTLERİNİN GEN İFADELERİNİN ARAŞTIRILMASIMustafa Mert SÖZENÖZGenetik hastalıklar, DNA yapısındaki genlerde meydana gelen bozulmalar(mutasyonlar) sonucunda ortaya çıkan, çoğu zaman ölümcül olan ya da yaşamkalitesini azaltan anormalliklerdir. Bu tip hastalıkların kesin tanılarının konulabilmesive gerekli önlemlerin alınabilmesi için ilk olarak hastalığın moleküler düzeydeaydınlatılması gerekir. Bu tez çalışmasında, Türk toplumunda görülen üç ayrı genetikhastalığın moleküler temelleri üzerine araştırmalar yapılmış ve her bir hastalık ayrıkısımlar halinde ele alınmıştır. Bu hastalıklardan ailesel hiperkolesterolemi vepropiyonik asidemiye neden olan mutasyonlar DNA düzeyinde yapılan taramalarlaaraştırılmıştır. Ayrıca, üçüncü bir hastalık grubuna giren anormal hemoglobinhastalıklarının özgül bir tipine neden olan Hb Volga mutasyonun gen ifadesini neşekilde etkilediği mRNA düzeyindeki çalışmalarla incelenmiştir.Ailesel hiperkolesterolemi (AH, FH-Familial hypercholesterolaemia), lipoproteinmetabolizmasını etkileyen otozomal dominant bir hastalıktır. Hastalığın nedeni,çoğunlukla düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör geninde (LDLR) bulunan çeşitlimutasyonlardır. Bu tez çalışmasının birinci kısmında ailesel hiperkolesterolemihastalarının LDLR genindeki mutasyonları taramak için kapiler elektroforez DNAanaliz sisteminde uygulanabilecek yeni bir yöntem olan floresan-SSCP veheterodupleks tekniği (F-SSCP-HDX) geliştirilmiştir. Geliştirilen bu yöntemkullanılarak, AH klinik tanısı konmuş olan 36 Türk pediatrik hastanın (20 homozigotve 16 heterozigot) LDLR geninde mutasyon taraması yapılmıştır. F-SSCP-HDXanalizlerinde farklı bant profili gösteren bölgelerin DNA dizi analizi yapılmıştır. Buanalizler sonucunda, hasta grubunda daha önceden bildirilmemiş olan on adet yenive daha önce bildirilmiş olan yedi adet bilinen mutasyon bulunmuştur. Çalışılan hastagrubunda ailesel hiperkolesterolemiye neden olduğu tahmin edilen allellerin %66,1'isaptanmıştır. Bu veriler, ailesel hiperkolesteroleminin Türkiye'deki genetikheterojenitesini ortaya koymuş ve F-SSCP-HDX tekniğinin mutasyon saptamak içinkullanışlı bir ön tarama yöntemi olduğunu göstermiştir.Propiyonik asidemi (PA), bazı amino asitlerin, bazı yağ asitlerinin ve kolesterolünkatabolizmasını etkileyen otozomal resesif bir kalıtsal hastalıktır. Propionil-CoAkarboksilaz enzimindeki (PCC, EC 6.4.1.3) bozukluklardan kaynaklanır. PCC'nin Î±ve Î² alt birimlerini kodlayan PCCA ve PCCB genlerindeki mutasyonlar, PAhastalığına neden olur. Bu tez çalışmasının ikinci kısmında 8 adet Türk PAhastasının PCCB geninin ekzonları, ekzon-intron bağlantılarını da kapsayacakşekilde olası mutasyonlara karşı taranmıştır. Ön tarama yöntemi olarak gümüş nitratboyama ile görüntülenen SSCP yöntemi kullanılmış, farklı bant profili gösterenörneklerin DNA dizi analizi yapılmış, ancak bu genin incelemeye alınan bölgelerindehastalığa neden olabilecek her hangi bir nükleotit değişikliği saptanmamıştır.Anormal hemoglobinlere dayalı hastalıklar, globin zincirindeki amino asit değişikliklerisonucu ortaya çıkan bozukluklardır. Bu tez çalışmasının üçüncü kısmında, anormalbir hemoglobin varyantı olan Hb Volga'ya neden olan mutasyonun Î²-globin genininifadesi üzerine olan etkisi mRNA düzeyinde incelenmiştir. Î²Hb Volga allelinden üretilenÎ²-cDNA'sındancDNA, gümüş nitrat ile boyanan poliakrilamid jelde HbAayrıştırılabilmiştir. Î²A/Î²HbVolga mRNA oranında dengesizlik görülmemiştir.Anahtar Kelimeler: Ailesel Hiperkolesterolemi, LDLR, Propiyonik Asidemi, SSCP, F-SSCP, Heterodupleks, Gen İfadesi, RT-PZR, Hb Volga.Danışman: Prof. Dr. Cihan ÖNER, Hacettepe Üniversitesi, Fen Fakültesi, BiyolojiBölümü, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı

Abstract:
IDENTIFICATION OF GENETIC PATHOLOGIES WHICH CAUSE HYPERCHOLESTEROLAEMIA and PROPIONIC ACIDEMIA DISEASES IN TURKEY andINVESTIGATION OF GENE EXPRESSIONS OF SPESIFIC MUTATION TYPESMustafa Mert SÖZENABSTRACTGenetic diseases are abnormalities resulted from defects called mutations occurredin the genes which are specific DNA segments. These abnormalities usually give riseto death or decrease the quality of life. Genetic diseases must be identified atmolecular level for exact diagnosis. In this thesis study, three different geneticdiseases were investigated at molecular level in Turkish Population. The mutationscausing familial hypercholesterolaemia and propionic acidemia which are two ofgenetic diseases concerned in the first two parts were investigated by screening andgenotyping methods at DNA level. In the third part, effect on gene expression of themutation causing Hb Volga which belongs to the third group of genetic disorders(abnormal haemoglobin disorders) has been investigated at the mRNA level.Familial hypercholesterolaemia (FH) is an autosomal dominant disorder of lipoproteinmetabolism. In the majority of patients FH is caused by mutations in the gene for thelow-density lipoprotein receptor (LDLR). In the first part of this thesis study, a highthroughput single strand conformation polymorphism (SSCP) and Heteroduplexmethod (F-SSCP-HDX method) has been developed for detection of mutations in theLDLR gene. This method is appropriate for capillary electrophoresis DNA analysissystems. This method was used for screening of the LDLR gene in a group of 36Turkish paediatric FH patients (20 homozygous and 16 heterozygous) for mutations.DNA sequencing of the patients with different SSCP and/or HDX banding patternsshowed ten novel and seven known mutations in the LDLR gene of different patients.66,1 % of the predicted FH causing alleles in the patient group were detected. Thesedata confirm the genetic heterogeneity of FH in Turkey, and demonstrate theusefulness of F-SSCP for mutation detection.Propionic acidemia (PA) is an autosomal recessive inborn error in the catabolism ofsome amino acids, odd-numbered chain length fatty acids and cholesterol. PA iscaused by a deficiency of propionyl-CoA carboxylase enzyme (PCC, EC 6.4.1.3).Mutations in the PCCA or PCCB genes, encoding Î± and Î² subunits of propionyl-CoAcarboxylase respectively, result in propionic acidemia, a life-threatening inborn errorof metabolism with autosomal recessive inheritance. In the second part of this thesisstudy, the PCCB gene was screened for the mutations in a group of Turkish PApatients. SSCP method was used for pre-screening of each exon of the gene withtheir exon-intron boundaries. The fragments with different SSCP banding patternswere sequenced. No nucleotide changes were detected in this group of patients.Abnormal haemoglobin disorders are results of amino acid changes in the globinchain. In the third part of this thesis study, effect of the mutation causing an abnormalhaemoglobin variant Hb Volga on the Î²-globin gene expression was investigated atthe mRNA level. The cDNA produced from Î²Hb Volga allele could be distinguished fromthe HbA Î²-cDNA on a polyacrylamide gel stained with silver nitrate. The resultsshowed there is no imbalance between Î²A/Î²HbVolga mRNA ratios.Key Words: Familial Hypercholesterolaemia, LDLR, Propionic Acidemia, SSCP, F-SSCP, Heteroduplex, Gene expression, RT-PZR, Hb Volga.Advisor: Prof. Dr. Cihan ÖNER, Hacettepe University, Faculty of Science,Department of Biology, Molecular Biology Section.