Maternal kandan fetal DNA izolasyonu ile rhesus D ve cinsiyet genotiplemesi
Rhesus d and sex genotyping with fetal DNA i̇solation from maternal blood
Yazar: BÜŞRA YAŞA
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ SELÇUK SÖZER TOKDEMİR
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Adrenal hiperplazi-konjenital = Adrenal hyperplasia-congenital ; DNA = DNA ; Eritroblastozis-fetal = Erythroblastosis-fetal ; Genotip = Genotype ; Kan hastalıkları = Hematologic diseases ; Moleküler genetik = Molecular genetic ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Rh Hr kan grup sistemi = Rh Hr blood group system

Özet:
Eritroblastosis Fetalis, gebelerde annenin Rhesus (Rh) faktör negatif (-), fetüsün ise Rh pozitif (+) olmasıyla gerçekleşen ve fetal hidropsa sebebiyet vererek ölüme neden olabilen yenidoğanın hemolitik hastalığıdır. Hamilelik sürecinde, Rh ve cinsiyet tespitinde kullanılan koryon villüs, amniyosentez ve kordosentez örneklemesi gibi invaziv yöntemler düşük riskine neden olmakta ve müdahale zamanı da gebelik haftasına bağlı olarak değişmektedir. Bunların yanında, invaziv olmayan ultrasonografi, indirekt ve direkt coombs testleri gibi yöntemler de kullanılmaktadır. Ancak bu tetkiklerin duyarlılığı invazif yöntemler kadar yüksek olmadığından yeni yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Son yıllarda gelişen maternal kandan elde edilen hücre dışı (hd)fetal DNA'ların tesbitinin yapılması prenatal tanıda önemli tekniklerin geliştirilmesine olanak tanımıştır. Çalışmamızda, invaziv işlem gerektirmeden gebelerden alınan periferik kandan fetüse ait hdDNA izole edilerek, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemiyle RhD genine ait ekzon 5 ve ekzon 7 bölgeleri ve SRY genine özgü tasarlanan primerler yardımıyla Fetal Rh ve cinsiyet belirlenmesi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, toplam 100 Rh (-) gebeden toplanan örneklerde hdDNA'lar izole edilerek Rh D ve SRY analizleri yapıldı. 100 olgunun 54'ü bu süreçte doğum gerçekleştirdi ve elde edilen sonuçlar doğum sonrası bebeğe ait Sağlık Bakanlığı Bebek Takip Sistemi'nde bulunan sonuçlar ile karşılaştırıldı. Analiz sonuçlarımızla Yenidoğan Takip Sisteminden elde edilen sonuçlarla yapılan karşılaştırmada, Rh D geni için 54 vakada 3 uyuşmayan negatif sonuç, SRY için ise 1 uyuşmayan negatif sonuç belirlenmiştir. Kalan 46 olgunun karşılaştırmalı analizi ise doğumlar gerçekleştirdikten sonra yapılacaktır. Bulunan sonuçlar bebek takip sistemi güncellendikçe konfirme edilecektir. Elde edilen sonuçlara göre, bu teknik ile maternal plazmadan yeterli miktarlarda ve kalitede hdDNA elde edilerek genetik tanı amacıyla fetal Rh D ve SRY'nin belirlenebileceği anlaşılmıştır. Bu metod kullanılarak, Rh uyumsuzluğundan kaynaklanan Eritroblastosis Fetalis ve cinsiyetin belirlenmesine katkı sağlayabileciği, Konjenital Adrenal Hiperplazi, Hemofili, Duchenne Muscular Distrofi gibi hastalıkların erken dönemde belirlenmesine imkân sağlayabilecektir. Böylece, bu teknik kullanılarak elde edilen veriler ışığında erken dönemde tedaviye başlanılabilmesi ve gereksiz yapılan tedavi ve maliyetin önüne geçilebilecektir. Anahtar Kelimeler: Hücre dışı DNA, Eritroblastosis Fetalis, Rh D, SRY, Konjenital Adrenal Hiperplasia 

Anahtar Kelimeler: Hücre dışı DNA, Eritroblastosis Fetalis, Rh D, SRY, Konjenital
Adrenal Hiperplasia

Abstract:
Erythroblastosis Fetalis is a condition in which the mother is Rhesus (Rh) factor negative (-)and the fetus is Rh positive (+) and can cause causing fetal hydropsia and death. During pregnancy, invasive methods including corrion villus, amniocentesis and cordocentesis sampling could be used in the detection of Rh and gender, which all might cause miscarriages and the interference time of these procedures varies depending on the gestational week. In addition, non-invasive methods including ultrasonography, indirect and direct coombs tests are also applied. However, the sensitivity of these tests is not as high as the invasive methods. For these reasons, new methods are needed. Detection of cell free fetal DNA derived from maternal blood in recent years has enabled the development of important techniques in prenatal diagnosis. In our study, fetal Rh and gender analysis were performed by utilizing the fetal cell free DNA obtained from pregnant women whole blood with non- invasive procedure with the specific primers of exons 5 and 7 for RhD gene and SRY gene and were analized by real-time polymerase chain reaction (PCR) method. For this purpose, a total of 100 Rh (-) pregnant women were collected and cell free DNAs were isolated and Real Time PCR and Rh D and SRY analyzes were performed. 54 of the 100 cases that we collected were delivered their babies during this process and the analysis results were compared with the Turkish Ministry of Health New Born Follow up System. In the Rh D comparison, there were 3 false negative results in 54 cases and SRY gene there were 1 false negative result. The remaining 46 cases the analysis were completed and will be confirmed when the system is updated with new born babies.
According to these results, the use of this technique could be applied as a genetic diagnostic test to the determinethe fetal RhD and the SRY from maternal plasma. The early diagnosis of erythroblastosisfetalis due to Rh mismatch and Congenital Adrenal Hyperplasia, Hemophilia and Duchenne Muscular Disrophy due to the presence of SRY may lead to apply this technıque as an early diagnostic test and early assessment of the result for the treatment modalities. Therefore, the unnecessary stress, treatment and the cost to the patient could be prevented. Key Words: Cell free DNA, Erythroblastosis Fetalis, Rh D, SRY, Congenital Adrenal Hyperplasia