Pichia pastoris mayasına sığır laktat dehidrogenaz geninin aktarımı ve laktik asit üretimi
Expression of bovine lactate dehydrogenase gene in yeast Pichia pastoris and lactic acid production
Yazar: FIRAT AYAS
Danışman: PROF. DR. MEHMET İNAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Laktik asit gıdadan kozmetiğe, tıptan kimya endüstrisine çok geniş bir alanda kullanım imkanına sahiptir. Laktik asidin, L (+)-laktik asit ve D (-)-laktik asit olmak üzere iki optik izomeri vardır. İzomerlerin saf olarak üretimi sadece fermentasyon yolu ile mümkündür. D (-)-laktik asit insan metabolizmasında asidoz ve kemik erimesine neden olabilmektedir. Ancak L (+)-laktik asit, biyolojik olarak tüketilebilmesi ve ilaç amaçlı kullanılabilmesi bakımından önemlidir. 
Pichia pastoris, biyoteknoloji ve ilaç endüstrisinde rekombinant protein üretimi için ihtiyaç duyulan bir ekspresyon sistemi olmasıyla birlikte araştırmacılar tarafından da sıklıkla kullanılmaktadır. P. pastoris, bakteriler gibi, tek karbon kaynağı olarak metanol, glukoz, gliserol veya etanol içeren ucuz besiyerlerinde hızla gelişim gösterebilmektedir. Bu tez çalışması kapsamında P. pastoris mayasında L (+)-laktik asit üretimi hedeflenmiştir. Bunun sebebi, bu mayanın şimdiye kadar laktik asit üretiminde kullanılan mikroorganizmalardan çok daha düşük pH'larda gelişme gösterebilmesidir. Ayrıca, L(+)-laktik asidin D(-)-laktik aside göre kullanımı daha yaygındır. 
Laktik asit üretimi için gen kaynağı olarak sığır (Bos taurus) genomuna ait L-laktat dehidrogenaz geni kullanılmıştır. Çalışmanın ilk aşamasında P. pastoris ΔPDC (pirüvat dekarboksilaz) geni inaktif hale getirilmiştir. Pirüvatı L-laktik aside yükseltgeyecek olan L-laktat dehidrogenaz geni mayaya gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAP) ve pirüvat dekarboksilaz (PDC) promotorlarına bağlı olarak aktarılmıştır. Üretim ön çalışmaları çalkalamalı inkübatörde erlenler ölçeğinde yapılmıştır. Daha sonra, P. pastoris suşlarının L-laktik asit üretim kapasiteleri, kesikli fermentör koşullarında yapılan çalışmada en yüksek X33 pGAP-LDH ve FA115 pPDC-LDH tek kopya suşları tarafından yaklaşık 9,5 g/L (0,19 g/g) olarak gerçekleştirildiği belirlenmiştir. Kesikli beslemeli fermentör çalışmasında ise, L-laktik asit üretimini en yüksek FA115 pPDC-LDH iki kopya suşu 38,0 g/L (0,27 g/g) ile sağlamıştır.
Bununla birlikte, ileride yapılabilecek; promotorların yeniden tasarımı, yeni promotorların kullanımı, gen kopya sayısının arttırılması, fermentasyon koşulları optimize edilmesi gibi modifikasyonlarla çok daha yüksek L-laktik asit üretim verimleri elde edilebileceği düşünülmektedir. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, yapılacak olan benzer çalışmalara ışık tutacak niteliktedir.

Abstract:
Lactic acid has the possibility to use in a wide range, for example medicine, food, cosmetics, chemical industry, etc. Lactic acid has two optical isomers: L (+)-lactic acid and D (-)-lactic acid. Pure production of these isomers is possible only with fermentation. D (-)-lactic acid can cause acidosis and osteoclasis in human metabolism. However, L (+)-lactic acid is important for its bioavailability and for pharmaceutical use.
Pichia pastoris is an expression system required for recombinant protein production in the biotechnology and pharmaceutical industry, and is frequently used by researchers. P. pastoris, like bacteria, can grow rapidly in cheap media containing methanol, glucose, glycerol or ethanol as a carbon source. In this thesis study, production of L (+)-lactic acid in P. pastoris was aimed. This is why this yeast can exhibit activity at much lower pH than the microorganisms used to produce lactic acid up to now. Furthermore, the use of L (+) - lactic acid compared to D (-) - lactic acid is more common.
The L-lactate dehydrogenase gene from bovine genome was used as a gene source for lactic acid production. In the first step of the study, P. pastoris ΔPDC (pyruvate decarboxylase) gene was inactivated. The L-lactate dehydrogenase gene, which oxidizes pyruvate to L-lactic acid, was expressed under the control of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAP) and pyruvate decarboxylase (PDC) promoters. Preliminary production studies were done in shake flask scale in a shaker incubator. L-lactic acid production was determined to be approximately 9,5 g/L (0,19 g/g) by X33 pGAP-LDH and FA115 pPDC-LDH single copy P. pastoris strains in batch fermentation conditions. In fed-batch fermentation studies, the highest L-lactic acid production was 38,0 g/L (0,27 g/g) by FA115 pPDC-LDH two-copy strain.
However, further studies are expected to yield higher yields with modifications such as optimizing the fermentation conditions, redesigning the promoters, using new promoters and increasing the gene copy number of the LDH. The results obtained from this study will shed light on similar work in the future.