Termofilik bakteri izolatlarından ekzopolisakkarit üretimi ve karakterizasyonu
Production and characterization of exopolysaccharide from thermophilic bacteria
Yazar: MEHMET AYTAR
Danışman: PROF. DR. GAMZE BAŞBÜLBÜL ; PROF. DR. DENİZ AKTAŞ UYGUN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Biyolojik aktivite = Biological activity ; Ekzopolisakkarit = Exopolysaccharide ; Karakterizasyon = Characterization ; Termofilik bakteriler = Thermophilic bacteria ; İzolatlar =

Özet:
Amaç: Bu tez çalışmasında termofilik bakteri izolatlarının ekzopolisakkarit (EPS) üretimlerinin incelenmesi, verimli olan izolatların ürettikleri EPS'lerin saflaştırılması ve biyolojik karakterizasyonlarının yapılması amaçlanmıştır. Ayrıca en iyi üretimi gerçekleştirdiği için seçilen HBB 111 termofilik bakteri izolatının ürettiği EPS'in detaylı kimyasal analizi ve üretim koşullarının optimizasyonu tezin diğer amacını teşkil etmiştir.
Materyal ve Yöntem: Doktora tez çalışmasında Aydın ili ve çevresindeki sıcak su kaynaklarından önceden izole edilmiş olan termofilik bakterilerin ekzopolisakkarit üretimini tespit etmek için EPS ekstraksiyonu ve fenol sülfürik asit yöntemi ile EPS miktar tayini yapılmıştır. On adet termofilik EPS'nin hemolitik potansiyel test ile sitotoksisitesi, agar-well difüzyon yöntemi ve 96'lık mikroplakada spektrofotometrik olarak analiz edilmiştir. Antimikrobiyal aktivitesi, agar-well difüzyon yöntemiyle incelenmiştir. Antioksidan kapasiteleri ve alfa-amilaz enzim inhibisyonu 1 mL küvet ile spektrofotometrik olarak incelenmiştir. Prebiyotik aktiviteleri ise hücre sayma metotu ile araştırılmıştır. Fibrinolitik aktivitesi USP 28-NF 23 pharmacopeia (2005) metodu modifiye edilerek incelenmiştir. Antibiyofilm kapasiteleri için 96'lık mikroplakada kristal viyole ile boyama yöntemi kullanılmıştır. On adet EPS üreticisi arasından HBB 111 izolatı seçilmiş ve üretilen EPS'nin TLC, FTIR-ATR, NMR, GC-MS ve SEM-EDX analizleri kullanılarak karakterizasyonu yapılmıştır. EPS üretim koşullarının optimizasyonunda zaman, sıcaklık, pH, NaCl konsantrasyonu, şeker tipi ve şeker konsantrasyonu parametreleri incelenmiştir.
Bulgular: Bu tez çalışmasında on adet termofilik izolatın ürettiği EPS'lerin anti-sitotoksisite, antimikrobiyal, antioksidan, alfa-amilaz enzim inhibisyonu, prebiyotik, fibrinolitik ve antibiyofilm aktiviteleri olduğu tespit edilmiştir. Çalışmada daha verimli olduğu için seçilen ekzopolisakkarit EPS 111'in denenen tüm biyolojik aktiviteler açısından pozitif sonuçlar verdiği tespit edilmiştir. İlaveten EPS 111'in TLC, FTIR-ATR, NMR, GC-MS ve SEM-EDX analizi sonuçlarına göre glukoz, galaktoz ve fruktoz monosakkaritlerini içeren heteropolisakkarit yapısında, pürüzlü ve tabakalı yüzeye sahip bir polisakkarit olduğu belirlenmiştir. Optimum üretim koşulları ise 26 saat inkübasyon, 55 °C, pH 8.0, NaCl içermeyen ortam ve %2,4 laktoz içeren ortam olarak saptanmıştır.
Sonuç: Son yıllarda ekstremofil bakteriler tarafından üretilen EPS'ler sağlık, gıda, kozmetik alanlarında kullanım potansiyelleri ile göze çarpmaktadır. Bu tez çalışmasında, incelenen HBB 111 izolatının ürettiği EPS'nin antioksidan, antisitotoksik ve prebiyotik özellikleri nedeniyle gıda; antisitotoksik, antimikrobiyal, antibiyofilm, alfa amilaz inhibisyonu, prebiyotik, fibrinolitik özelliklerinden dolayı ise sağlık alanlarında kullanılabileceği düşünülmektedir. Saflaştırılan bu EPS'in literatürde bildirilen termofilik EPS'lerden farklı olarak EPS 111'in çoklu biyolojik aktiviteye sahip olduğu görülmektedir.
Anahtar Kelimeler: Termofilik Bakteri, Ekzopolisakkarit, Biyolojik Aktivite, Kimyasal Karakterizasyon

Abstract:
Objective: In this thesis, it was aimed to examine the exopolysaccharide (EPS) production of thermophilic bacterial isolates, to purify and biological characterization of EPS produced by the productive isolates. In addition, the detailed chemical analysis of EPS produced by the HBB 111 thermophilic bacterial isolate, which was selected for the best production, and the optimization of the production conditions constituted the other objectives of the thesis.
Materials and Methods: In this doctoral thesis study, EPS extraction and phenol sulfuric acid method were used to determine the exopolysaccharide production of thermophilic bacteria that were previously isolated from hot water sources in Aydın and its surroundings. Cytotoxicity by hemolytic potential test of ten thermophilic EPSs was analyzed by agar well diffusion method and spectrophotometrically in 96 microplate. Its antimicrobial activity was investigated by agar-well diffusion method. Antioxidant capacities and inhibition of alpha-amylase enzyme were examined spectrophotometrically with a 1mL cuvette. Prebiotic activities were investigated by cell counting method. Fibrinolytic activity was investigated by modifying the USP 28-NF 23 pharmacopeia (2005) method. For the antibiofilm capacities, staining method with crystal violet on 96 microplate was used. HBB 111 isolate was selected among ten EPS producers and TLC, FTIR-ATR, NMR, GC-MS and SEM-EDX chemical analyzes of the EPS produced were performed. Time, temperature, pH, NaCl concentration, sugar type and sugar concentration parameters were tested in the optimization of EPS production conditions.
Results: In this thesis study, it was determined that EPSs produced by ten thermophilic isolates have anti-cytotoxicity, antimicrobial, antioxidant, alpha-amylase enzyme inhibition, prebiotic, fibrinolytic and antibiofilm activities. It was determined that the exopolysaccharide EPS111, which was chosen because it was more efficient in the study, was positive in terms of all biological activities tested. Additionally, according to TLC, FTIR-ATR, NMR, GC-MS, and SEM-EDX analysis results, EPS 111 was determined to be a heteropolysaccharide containing glucose, galactose and fructose monosaccharides, with a rough and layered surface. Optimum production conditions were determined as 26 hours of incubation, 55 °C, pH 8.0, media free of NaCl, and media containing 2.4% lactose.
Conclusion: In recent years, EPSs produced by extremophilic bacteria stand out with their potential for use in health, food and cosmetics industries. In this thesis study, it is thought that EPS produced by HBB 111 can be used in food areas, due to the antioxidant, anticytotoxic and prebiotic properties and in health areas due to its anticytotoxic, antimicrobial, antibiofilm, alpha amylase inhibition, prebiotic, and fibrinolytic properties. Unlike thermophilic EPSs reported in the literature, EPS 111 appears to have multiple biological activities.
Key Words: Thermophilic Bacteria, Exopolysaccharide, Biological Activity, Chemical Characterization.