Pigmentli ve pigmentsiz pseudomonas aerugınosa suşlarının 
virulans faktörlerinin fenotipik ve genotipik olarak karşılaştırılması
Comparison of virulence factors in pigmented and non-pigmented pseudomonas aeruginosa by using phenotypic and genotypic tests
Yazar: SALİH MAÇİN
Danışman: PROF. DR. YAKUT AKYÖN YILMAZ
Hacettepe Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2014
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Fenotip = Phenotype ; Genotip = Genotype ; Kistik fibroz = Cystic fibrosis ; Pigmentler = Pigments ; Pseudomonas = Pseudomonas ; Pseudomonas aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa ; Virülans = Virulence

Özet:
Pseudomonas aeruginosa aerob, sporsuz, hareketli, düz veya hafif kıvrımlı, 42 C°de üreyebilen Gram negatif basillerdir. P. aeruginosa; son yıllarda artan insidansı, ürettiği virülans faktörlerinin çeşitliliği ve sürekli yükselen antibiyotik direnç oranlarıyla sık rastlanan, mortalite ve morbiditesi yüksek, tedavisi güç enfeksiyonların etkenidir. Bu çalışmadaki amacımız pigment üreten ve pigment üretmeyen P. aeruginosa suşları arasındaki virulans faktörlerinin karşılaştırılmasıdır. Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi, Mikrobiyoloji Laboratuvarı'nda hastalara ait örneklerden izole edilen ve P.aeruginosa olarak tanımlanan suşlar çalışmaya dahil edildi. Hasta suşları (n:100) iki ana gruba ayrıldı. Birinci gruba; kistik fibrozis tanısıyla takip edilen ve P. aeruginosa izole edilen hastaların suşları (n:50) alındı. İkinci gruba ise püy, idrar, yanık yarası, beyin omurilik sıvısı ve balgam gibi çeşitli vücut bölgelerinden izole edilen P. aeruginosa suşları alındı. Her iki ana grupta izole edilen P. aeruginosa suşları pigment üretimlerine göre de kendi içinde eşit sayıda (n:25) iki gruba ayrıldı. Tüm suşların antibiyotik duyarlılık testleri disk difüzyon yöntemiyle ve CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) standartlarına göre yapıldı. Fenotipik testler olarak DNaz, proteaz, elastaz, hemoliz ve hareket testi çalışıldı. Genotipik testler olarak ise "quarum sensing" mediatörleri olan rhlA ve rhlB ve virulans ile ilişkili genleri kodlayan ekzotoksinler olan T (exoT), S (exoS), U (exoU) ve Y (exoY) bölgeleri Real-time PCR yöntemiyle çalışıldı. P. aeruginosa suşlarının pigment üretimlerine göre virulans faktörleri incelendiğinde, elastaz aktivitesi ve mukus üretimi pigment üreten ve üretmeyen suşlarda benzer bulunmuştur. Proteaz aktivitesi ve hemoliz varlığı pigment üreten P. aeruginosa suşlarında pigment üretmeyen suşlara göre daha yüksek bulunmuştur (p≤0.05). Hareket özelliğide pigment üreten suşlarda pigment üretmeyen suşlara kıyasla daha yüksek bulunmuştur. DNaz aktivitesi ise pigment üretmeyen suşlarda pigment üretenlere kıyasla daha yüksek bulunmuştur (p≤0.05). Pigment üretmeyen P. aeruginosa suşlarında pigment üreten suşlara göre daha yüksek antibiyotik direnç oranları saptanmıştır. Pigment üretimlerine göre genotipik virulans faktörleri incelendiğinde; pigment üreten suşların rhlB, exoS ve exoY virulans gen bölgelerine pigment üretimi olmayan suşlara göre daha fazla sahip oldukları görülmüştür (p≤0.05). ExoT gen bölgesi de yine pigment üretimi olan suşlarda daha fazla saptanmıştır. Bu sonuçlar pigment üretimi olan P. aeruginosa suşlarının hem fenotipik virulans faktörlerinin hem de genotipik virulans faktörlerinin pigment üretmeyen suşlara göre daha fazla sahip olduklarını göstermektedir. Edinilen sonuçlara göre pigment üretimi virulansı değerlendirmek açısından önemli bir belirteç olarak kabul edilebilir.

Anahtar Kelimeler: Pseudomonas aeruginosa, virulans, kistik fibrozis, pigment

Abstract:
Pseudomonas aeruginosa is an aerobic, motile, non-spore forming, straight or slightly curved, gram-negative bacilli and it can grow at 42 °C. The incidence of P. aeruginosa has been increased in recent years and its virulence factors are various. It has high morbidity and mortality and its rates of antibiotic resistance is increasing constantly. The aim of this study was to compare the differences in the virulence
factors of pigmented and non-pigmented P. aeruginosa isolates. Isolates of patients that were identified as P. aeruginosa were included into the study. Identification was done in Hacettepe University Medical Faculty Microbiology Laboratory. Strains of patients (n: 100) were divided into two main groups. In the first group, strains were isolated from cystic fibrosis patients (n: 50). In the second group, the strains which were isolated from various body parts (pus, urine, burn wounds, sputum, and cerebrospinal fluid) included (n: 50). The isolated P. aeruginosa strains from both main groups were divided into two subgroups according to their pigment production (n: 25). Antibiotic susceptibility tests of all strains were performed by disk diffusion method according to CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) standards. DNase, protease, elastase, haemolysis and motility tests were performed as phenotypic tests. The presence of several virulence-associated genes encoding exotoxins T (exoT), S (exoS), U (exoU) and Y (exoY) and quorum sensing mediators (rhlA and rhlB) were assessed by Real-time PCR method for genotypic identification. The relationship between pigment production, antibiotic resistance and virulence factors were examined. There was no significant difference between pigmented and non-pigmented isolates when elastolytic activity and mucus production were compared. Pigmented isolates produced significantly more (p≤0.05) protease and haemolysis activity. Motility was present in pigmented isolates more frequently than in non-pigmented isolates. DNase activity was significant in pigmented isolates then non-pigmented isolates (p≤0.05). Antibiotic resistance was present more frequently in non-pigmented isolates than pigmented isolates. Pigmented isolates had more frequently and significant more (p≤0.05) virulence-associated genes rhlB, exoS, exoY (p≤0.05). ExoT was present in pigmented isolates more frequently than in non-pigmented isolates. The results of this study suggest that both phenotypic and genotypic virulence factors are associated with the pigment production in P. aeruginosa. Pigment production is easy to determine, which might be a good starting point to identify the virulence status of an isolate.

Key Words: Pseudomonas aeruginosa, virulence, cystic fibrosis, pigment