Bazı bitkilerde pullulanaz aktivitesinin araştırılması, pullulanazın saflaştırılması ve immobilizasyonu
Determination of pullulanase activity in different plant samples, purification and immobilization of pullulanase
Yazar: NİLAY ALTAŞ KIYMAZ
Danışman: DOÇ. DR. AYŞEGÜL PEKSEL
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Bu çalışmada öncelikle, ülkemizde meyve ve sebze olarak yaygın tüketilen bitkilerde pullulanaz aktivitesi araştırıldı. Yapılan enzim aktivitesi tarama çalışması sonucunda enzim kaynağı olarak enginar yaprağının kullanılmasına karar verildi. Enginar yaprağından pullulanazın saflaştırılması ilk kez gerçekleştirildi ve enzimin kinetik özellikleri incelendi. Saflaştırılan enzim çeşitli taşıyıcılar üzerine adsorpsiyon yöntemi ile immobilize edildi. İmmobilize enzimin karakterizasyonu yapıldı. Sonuçlar serbest enzim ile karşılaştırıldı.
Enginar yaprağı 100 mM sodyum fosfat tamponu (pH 6,5) ile homojenize edildi. Pullulanaz aktivitesi gösteren homojenat ultrafiltrasyon ve diyaliz işlemlerine tabi tutuldu. Elde edilen diyalizata DEAE-selüloz kolon kromatografisi uygulanarak pullulanaz 21,53 kat saflaştırıldı. Enzim aktivitesi Miller?ın indirgen şeker yöntemine göre; protein miktar tayini ise Bradford ve Warburg-Christian yöntemlerine göre gerçekleştirildi. Maksimum enzim aktivitesinin elde edilebilmesi için uygun enzim ve substrat miktarı belirlendi.
Enzimin molekül ağırlığı tayini ve saflık kontrolü amacıyla yapılan SDS-PAGE elektroforezinde enginar yaprağı pullulanazı tek aktivite bandı gösterdi ve molekül ağırlığı 141,37 kDa olarak saptandı. 
Saflaştırılan enzimin pullulan, dekstrin, amilopektin ve nişasta substratlarına karşı ilgisi incelendi. Pullulanazın ilgisinin en çok dekstrine olduğu ve bu substrat için optimum          pH?nın 5, optimum sıcaklığın ise 45°C olduğu tayin edildi. Enzimin aynı substratlara karşı Km değerleri sırasıyla 5,1382X10-5 mg/mL, 5,9093X10-4 mg/mL, 2,0986X10-3 mg/mL ve 3,8726X10-3 mg/mL; Vmaks değerleri ise 0,8037 U/mL, 0,9848 U/mL, 0,8089 U/mL ve 0,7892 U/mL olarak bulundu. Depo kararlılığı ve termal kararlılık çalışmaları gerçekleştirildi. Enginar yaprağı pullulanazı aktivitesine organik ve anorganik bileşiklerin, organik çözücülerin, çeşitli asit ve bazların, deterjanların etkisi araştırıldı. 
Adsorpsiyon yöntemi ile enzimin kitosan boncuk, PEG-6000 kaplı kitosan boncuk ve amberlit XAD-16 üzerine immobilizasyonu gerçekleştirildi. İmmobilize pullulanazların optimum pH, sıcaklık, termal kararlılık, depo kararlılığı, tekrar kullanılabilirlik, çeşitli bileşiklerin immobilize enzim aktivitisine etkisi gibi özellikleri incelendi. Bulunan sonuçlar serbest enzim ile karşılaştırıldı.

Abstract:
In this study, firstly, the pullulanase activity of the extensively consumed vegetables and fruits in our country was determined. According to the enzyme tests on several plants it was decided to use globe artichoke as pullulanase source. Pullulanase was firstly purified from the leaves of globe artichoke and the properties of the enzyme were investigated. Purified pullulanase was immobilized on various supports by adsorption method. Characterization of the immobilizied enzyme was carried out. The results were compared with the free enzyme.
Globe artichoke leaves were homogenized with 100 mM phosphate (pH 6,5) buffer. Ultrafiltration fraction of pullulanase-active homogenate was obtained and the retantate was applied to DEAE-cellulose column and pullulanase was purified 21,53 fold. The enzyme activity was assayed with Miller?s reducing sugar method and the protein content was determined by using Bradford and Warburg-Christian methods.
After SDS-PAGE electrophoresis which was commited due to determine the molecular weight  and  the purity of the globe artichoke pullulanase, it was found that the purified pullulanase showed one activity band and had a moleculer weight of 141,37 kDa.
The affinity of the purified enzyme against pullulan, dextrin, amylopectin and starch was investigated. It was found out that the highest affinity of the enzyme was to dextrin having an optimum pH of 5,0 and an optimum temperature of 45°C. Km values were 5,1382X10-5 mg/mL, 5,9093X10-4 mg/mL, 2,0986X10-3 mg/mL and              3,88726X10-3 mg/mL and Vmax values were 0,8037 U/mL, 0,9848 U/mL, 0,8089 U/mL ve 0,7892 U/mL for the same substrates respectively. Storage stability and thermal stability of globe artichoke pullulanase were also determined. The effects of several organic and inorganic compounds, organic solvents, various acids and bases, detergents were investigated.
The immobilization of globe artichoke pullulanase on chitosan, PEG-chitosan and amberlite XAD-16 by adsorption was held. Properties of the immobilizied enzymes such as optimum pH, temperature, thermal and storage stability and effects of vaious compounds were also examined. The results were compared to the free enzyme.