Agrobacterium tumefaciens enfeksiyonu ile ilişkili konak faktörlerin arpa (Hordeum vulgare L.) bitkilerinde araştırılması
Investigation of host factors associated with Agrobacterium tumefaciens infection in barley (Hordeum vulgare L.) plants
Yazar: NADIA EL SARRAF
Danışman: PROF. DR. AYŞE FİLİZ GÜREL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Genetik = Genetics

Özet:
Bitkide Agrobacterium-aracılı genetik transformasyon hem temel hem de uygulamalı bitki biyolojisi araştırmaları açısından büyük önem taşımaktadır. Model organizma olan Arabidopsis thaliana'da Agrobacterium transformasyonu ile ilişkili birçok konak proteinin olduğu ortaya çıkmıştır. "VirE2-Interacting Protein 1" (VIP1) enfeksiyon sırasındaki antagonistik rolü nedeniyle en önemli faktörlerden biridir. VIP1 proteininin, T-DNA'yı konakçı diziye entegrasyonuna rehberlik ederek bitkide genetik transformasyonu teşvik etmesinde ve konakçı genomu stres sinyalizasyonun düzenlenmesinde rolü vardır. Ancak VIP1'in nasıl bu kadar farklı fonksiyonlarda görev alabildiği hâlâ bilinmemektedir.
Bu tezde Agrobacterium-aracılı genetik transformasyona dirençli olduğu bilinen arpa bitkisinde VIP1 ve T-DNA'nın genomik entegrasyonunda rol oynayan XRCC4 proteinlerinin moleküler karakterizasyonu amaçlanmıştır. Arpadaki VIP1 ve XRCC4 proteinlerini kodlayan cDNA dizileri belirlenmiş (VIP1: NCBI aksesyon no: MG000155) ve VIP1'in dokuya özgü anlatım seviyeleri normal ve stres koşulları altında incelenmiştir. Dizileme sonuçlarına göre proteinin 157. ve 223. amino asit bakiyeleri arasında korunmuş bZIP domeni bulunmaktadır ve bundan dolayı HvVIP1 bZIP transkripsiyon faktör ailesinin altgrup İ'in bir üyesi olarak sınıflandırılmıştır. AtVIP1 ile karşılaştırmalı analizde, HvVIP1 bZIP domen dizisinde 13 sinonim olmayan SNP olduğu belirlenmiştir. Ayrıca Arabidopsis ve 8 monokotil bitki ile yapılan filogenetik analizler ve evrimsel uzaklık hesaplamaları HvVIP1 ve TaVIP1'nin enyakın ortak ataya sahip olduğunu göstermiştir. Yapılan 3D modelleri, yapısal domen tahminleri ve düzensizlik ("disorder") tahmin profil testleri Arabidopsis ve arpa VIP1 proteinleri arasında bZIP lokasyonları ve domen uzunlukları bakımından son derece küçük farklar olduğunu ortaya koymuştur. HvXRCC4'ün, filogenetik olarak TaXRCC4'e çok yakın olduğu gösterilmiştir.
HvVIP1 arpa yapraklarında, köklerinde, kalluslarda, koleoptillerde ve olgunlaşmamış embriyolarda anlatım yapmaktadır. HvVIP1 anlatımının çeşitli biyotik (örn. Agrobacterium tumefaciens ve Fusarium culmorum enfeksiyonu) ve abiyotik (örn. tuzlukluk ve dehidrasyon şoku) stres koşulları altında önemli ölçüde arttığı görülmüştür. Ek olarak, HvVIP1'in zamana bağlı gen anlatımı ile stres bağlantılı (HvBAS1, HvPR1, HvPR4 ve HvPR10 gibi) birçok genin anlatımı arasında güçlü bir ilişki vardır. Arpa filizlerinde, HvVIP1 anlatımının dehidrasyon şoku stres uygulamasından 4 saat sonra kökte önemli ölçüde arttığı gözlenirken, yaprak dokularında gen anlatımının ancak 8. saatten sonra arttığı belirlenmiştir. Diğer yandan, tuz stresi altındaki bitkilerde HvVIP1'in anlatımı oldukça geç (48 ve 60 saat sonra) uyarılmaktadır. Abiyotik strese benzer olarak Agrobacterium enfeksiyonu sonrası, transformasyona farklı duyarlılıktaki çeşitlerde (cv. Martı ile hassas cv. Golden Promise) HvVIP1 geninin anlatımının anlamlı seviyede arttığı belirlenmiştir. Dayanıklı çeşitte (cv. Martı) HvVIP1 ve PR gen anlatımları hassas çeşide göre daha geç gerçekleşmektedir. HvVIP1 cv. Martı köklerinde Fusarium culmorum ile inokülasyonundan 24 saat sonra önemli ölçüde indüklenmiştir.
Agrobacterium ile enfekte edilen cv. Martı'da mitojen ile aktifleşen protein kinase HvMPK3 ile HvVIP1 (r = 0.9) arasında ve HvVIP1 ile HvPR1 (r = 0.98) arasında zamana bağlı transkript birikimi açısından güçlü bir ilişki bulunmuştur. Çalışmamızda ek olarak HvVIP1 gen anlatımının HvPR4 (r = 0.98), ve HvVPR10 (r = 0.97) genlerinin anlatımları ile de korelasyon gösterdiği bulunmuştur. Bunun yanı sıra HvVIP1'deki artış antioksidan sistemin bir bileşeni olan HvBAS1 geninin anlatımı ile de uyumludur (r = 0.9). Sonuçlar HvVIP1 ile Arabidopsis'deki ortolog AtVIP1 arasında benzerlik olduğunu ve VIP1 transkripsiyon faktörünün korunmuş MPK3 transdüksiyon yolağında rolü olduğunu desteklemektedir. Diğer yandan, arpa hücrelerinde enfeksiyon sonrası oluşan güçlü PR- gen anlatımı bu bitkinin Agrobacterium'a dirençliliğinde ("recalcitrance") rol oynuyor olabilir. Bu çalışmanın önemi, HvVIP1 gibi bir efektörün arpanın savunma tepkisindeki rolünü değerlendirmek, daha büyük ölçekte ise, özellikle A. tumefaciens'in doğal konak aralığı dışında sıralanan tarımsal olarak önemli bitki türlerindeki direncin arkasındaki olası nedenler hakkında daha çok bilgi sahibi olmaktır. Tez çalışmasındaki diğer protein, HvXRRC4, transgen entegrasyonundaki rolü nedeniyle önem taşımaktadır.

Abstract:
Agrobacterium-mediated plant genetic transformation is at the base of both fundamental and applied research in plant biology. A number of host proteins involved in Agrobacterium transformation has been revealed in the model organism Arabidopsis thaliana. VirE2-Interacting Protein 1 (VIP1) is one of the most important factors due to its antagonistic roles during infection. VIP1 is recognized for its roles in promoting plant genetic transformation by guiding and integrating the T-DNA inside the host genome, and in regulation of stress signaling. However, it is still unknown how VIP1 is involved in such contrasting functions.
In this thesis, we aimed at the molecular characterization of VIP1 protein and the XRCC4 protein, which play a role in genomic integration of T-DNA, in barley plants known to be resistant to Agrobacterium-mediated genetic transformation. cDNA sequences coding for VIP1 and XRCC4 proteins in barley were determined (HvVIP1: NCBI accession no. MG000155) and the tissue-specific expression levels of HvVIP1 were examined under normal and stress conditions. According to the sequencing results, a conserved bZIP domain was found within VIP1 protein's 157th and 223rd amino acid. Accordingly, HvVIP1 was classified as a member of subgroup I of the bZIP transcription factor family. Comparative analysis with AtVIP1 showed 13 non-synonymous SNPs in the HvVIP1 bZIP domain sequence. In addition, phylogeneticanalyzes and evolutionary distance calculations with Arabidopsis and 8 other monocotyledonous plants have shown that HvVIP1 and TaVIP1 have the closest common ancestor. The 3D models, structural dominance predictions and disorder prediction profiling tests revealed that there are insignificant differences in the bZIP domain locations and lengths when comparing Arabidopsis and barley VIP1 proteins. Whereas XRCC4 protein has been shown to be the closest to TaXRCC4 according to the phylogenetic analysis.
HvVIP1 gene expression was determined in barley leaves, roots, calli, coleoptile and immature embryos. The expression of HvVIP1 has been shown to increase significantly under various biotic (e.g. Agrobacterium tumefaciens and Fusarium culmorum infection) and abiotic (e.g. salinity and shock dehydration) stress conditions. In addition, a time-dependent strong correlation between HvVIP1 gene and the expression of many stress-related genes (i.e. HvBAS1, HvPR1, HvPR4, and HvPR10) was registered. HvVIP1 expression in barley seedlings undergoing shock dehydration stress increased significantly in the root after 4 hours of stress application, whereas gene expression increased in leaf tissues after 8 hours. On the other hand, the expression of HvVIP1 in plants undergoing salt stress is stimulated quite late (48 and 60 hours later). The accumulation of HvVIP1 transcripts was found to be 6 times higher in the roots than in the leaves. Similar to the abiotic stress, after Agrobacterium infection an increase in HvVIP1 expression levels was shown in barley varieties (i.e. cv. Martı, and sensitive cv. Golden Promise) known for their different transformation-susceptibilities. HvVIP1 has been induced significantly 24 hours after inoculating cv. Martı roots with Fusarium culmorum.
In Agrobacterium-infected cv. Martı calli, a strong association was found between the Mitogen-Activated Protein Kinase HvMPK3 and HvVIP1 (r = 0.9) as well as a time-dependent transcript accumulation between HvVIP1 and HvPR1 (r = 0.98) was registered. In our study, HvVIP1 gene expression was also found to correlate with the expression of HvPR4 (r = 0.98), and HvPR10 (r = 0.97) genes. In addition, the increase in HvVIP1 gene expression is compatible with HvBAS1 gene expression, a component of the antioxidant system (r = 0.9).
The results show that there is a similarity between HvVIP1 and its orthologue from Arabidopsis thaliana AtVIP1. Results also support the idea that VIP1's role within the MPK3 signal transduction pathway may be conserved in barley. On the other hand, results show a strong PR gene expression after infection in barley cells which may play a role in Agrobacterium-resistance ("recalcitrance") of this plant. The aim of this study is to assess the role of a host effector protein like HvVIP1 transcription factor in the defense responses in barley plants. On a larger scale, this study aims at providing more information about the possible causes behind the resistance of agriculturally important plant species, particularly those listed outside the natural host range of A. tumefaciens. The importance of the other protein in the thesis study, HvXRRC4, lies in its role in transgene integration in host genome.