Yem değerini artırıcı enzim genlerinin probiyotik etkili laktik asit bakterilerinde klonlanarak üretimi
Cloning and production of feed upgrading enzyme encoding genes in probiotic lactic acid bacteria
Yazar: MELTEM AŞAN ÖZÜSAĞLAM
Danışman: PROF.DR. NUMAN ÖZCAN
Çukurova Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Zootekni Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Ziraat = Agriculture
Dizin: Fitaz = Phytase ; Klonlama = Cloning ; Probiyotikler = Probiotics

Özet:
Fitazlar, bitkilerdeki fosforun ana depo formu olan fitatdan inorganik fosfatın serbest kalmasını sağlayarak gıda ve yemlerin besleyici değerini artıran enzimlerdir. Bu çalışmada, Bacillus subtilis VTT E-68013'den fitaz geni (phyC) PCR tekniği ile çoğaltılmış ve pMK3F'yi oluşturmak için Escherichia coli-Bacillus sp. mekik vektörü pMK3'e yerleştirilmiştir. pMK3F rekombinant vektörü ilk önce sıcaklık şoku yöntemi ile E. coli'ye aktarılmıştır. E. coli'den izole edilen pMK3F plazmidi kullanılarak elektrotransformasyon yöntemi ile Bacillus coagulans'a aktarılmıştır. E. coli ve B. coagulans'dan elde edilen bu rekombinant plazmidlerin HindIII ve BamHI enzimleri ile kesilmesi sonucu agaroz jel'de, phyC'yi kodlayan 1300 bç büyüklüğündeki DNA fragmenti ile 7200 bç büyüklüğündeki pMK3 vektörü gözlenmiştir. pMK3F rekombinant vektörünün fitaz geni PCR ile çoğaltılmış ve agaroz jelde gözlenerek sonuçlar desteklenmiştir. Fitaz geni, B. coagulans'da klonlanmasına rağmen Buğday Kepeği Ekstraktı/Sodyum-fitat/LB/Agar besi yerinde ve Buğday Kepeği Ekstraktı/Na-fitat substratları içeren SDS-PAGE'de fitaz aktivitesi tespit edilememiştir.ß-(1,3-1,4)-glukanazlar (likenazlar), ß-glukanlar ve likenanlar gibi ß-1,3 ve ß-1,4 bağları içeren düz ß-glukanları hidrolize eden enzimlerdir. Streptococcus bovis kökenli likenaz geni pMK3Lik plazmidini oluşturmak için E. coli-Bacillus sp. mekik vektörü pMK3'e yerleştirilmiştir. pMK3Lik rekombinant vektörü ilk önce E. coli'ye daha sonra da B. coagulans'a aktarılmıştır. E. coli ve B. coagulans'dan elde edilen bu rekombinant plazmidlerin SmaI enzimiyle kesilmesi sonucu agaroz jel'de 1800 bç'lik likenaz genine ait bant gözlenmiştir. pMK3Lik plazmidini taşıyan E. coli hücrelerinde hem LB/Likenan/Agar besi yerinde hem de SDS-Likenan-PAGE'de likenaz aktivitesi gözlenirken rekombinant B. coagulans'da enzim aktivitesi tespit edilememiştir.Anahtar kelimeler: Fitaz, likenaz, Bacillus coagulans, probiotik, klonlama

Abstract:
Phytases can increase the nutritional value of food and feed by liberating inorganic phosphate from phytate, the major storage form of phosphorus in plants. In this study, the phytase gene (phyC) from Bacillus subtilis VTT E-68013 was amplified by PCR technique and inserted into pMK3 shuttle vector of Escherichia coli-Bacillus sp. to construct pMK3F. The recombinant vector, pMK3F, was firstly transferred into E. coli by heat-shock method. MK3F plasmid isolated from E. coli was used to introduce into Bacillus coagulans cells by electrotransformation. HindIII and BamHI digestion of the recombinant plasmids from E. coli and B. coagulans yielded 1300 bp fragment of DNA carrying the gene encoding phyC and 7200 bp fragment of pMK3 vector on agarose gel electrophoresis. Phytase gene of recombinant vector pMK3F was also amplified by PCR and visualized by agarose gel electrophoresis to support the results. Although phytase gene was cloned in B. coagulans, phytase enzyme activity was not detected on Wheat Bran Extract/Sodium-phytate/LB/Agar plates and SDS-PAGE gel contains Wheat Bran Extract/Na-phytate as substrats.ß-(1,3-1,4)-glucanases (lichenases) hydrolyse linear ß-glucans containing ß-1,3 and ß-1,4 linkages such as ß-glucans and lichenan. Lichenase gene originated from Streptococcus bovis was ligated with pMK3 shuttle vector of E. coli-Bacillus sp. to construct pMK3Lik. The recombinant vector, pMK3Lik, was firstly introduced into E. coli and then B. coagulans. Digestion of recombinant plasmids from E. coli and B. coagulans by SmaI was showed the 1800 bp lichenase gene band on agarose gel elctrophoresis. Although E. coli cells carrying pMK3Lik was showed lichenase activity, the enzyme activity was not detected from recombinant B. coagulans cells on both LB/Lichenan/Agar plates and SDS-Lichenan-PAGE.Key words: Phytase, lichenase, Bacillus coagulans, probiotic, cloning