Sinkrotron X ışınları yöntemlerinin biyolojik makromolekül yapısı çözümlenmesinde kullanılması
Structural analysis of biological macromolecules by using synchrotron X ray scattering method
Yazar: OYA ORUN
Danışman: PROF. DR. BEKİ KAN
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 1999
Konu: Biyofizik = Biophysics

Özet:
-11- ÖZET Bu çalışmada sinkrotron X-ışm küçük açı saçılması (XSAS) ile çözeltideki proteinlerin yapısal özelliklerinin araştırılması amaçlandı. Deneyler için hücre sinyal ileti sisteminde temel rol oynayan heterotrimerik G-proteinlerinin sinir sisteminde en yaygın bulunan tipi olan G0-proteininin a-altbiriminin (Goo) rekombinant olarak E.coli7 den saflaştırılması denendi. Rekombinant Go«, Kcoli BL21(DE3) hücrelerinde pT7/Ndel/Goa vektörü kullanılarak sentezlendi. Ekspresyon seviyesi Western blot ve GTPyS bağlama yöntemleriyle belirlendi ve IPTG'den bağımsız olduğu saptandı. Protein izolasyonu çalışmalarına indüklenmemiş geniş ölçekli kültürlerde, Lee ve ark. tarafından verilen yöntem izlenerek başlandı. Saflaştırmanın her aşamasında, protein OD ölçümleri ile saptandı ve Goa'nın varlığı SDS-PAGE ve Goa'ya özgû bir antikor kullanılarak (NEN-Dupont) Western blot analizleriyle saptandı. Bazı kesimler GTPyS bağlama testleriyle de denendi. Bu çalışmalarda değişik aşamalarda Lee ve ark.'na uygun sonuçlar alınmadığından ve görülen safsızlıklar nedeniyle bazı değişiklikler yapıldı. Örneğin yüksek molekül ağırlığındaki proteinleri uzaklaştırmak amacıyla Gel Filtrasyon kromatografisi eklendi ve Q-Sefaroz kolonu Mono Q ile değiştirildi. Bu değişimler Goa ile aynı molekül ağırlığına sahip ve Kcoli glisin parçalama enzim sisteminin bir üyesi olan T-proteininin de Goa ile birlikte saflaşmasına yol açtı. Goa saflaştırma çalışmalarına paralel olarak X-ışınları küçük açı saçılma deneyleri için T-protein kullanıldı. Bu deneyler proteinin girasyon yarıçapının 2.58 nm olduğunu ve asimetrik bir yapıya sahip bulunduğunu gösterdi. T-proteini için elde edilen X-ışınlan saçılma deseni G-protein a-altbiriminden beklenilen desen ile m karşılaştırıldı. Analiz sonuçları bu proteinin yapısı ile GDP bağlı, aktif olmayan yapıdaki heterotrimerik bir kimerik G-proteininin a-altbiriminin yapısı arasında yüksek benzerlik olduğunu ortaya koydu. Goa proteininin saflaştırma yöntemini optimize etme ve T-protein şeklinin belirlenmesi çalışmaları sürmektedir.

Abstract:
-111- STRUCTURAL ANALYSIS OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES BY USING SYNCHROTRON X-RAY SCATTERING METHOD SUMMARY Our aim in this study has been to determine structural properties of proteins using synchrotron X-ray small angle scattering (XSAS). Isolation of Goa, the a subunit of a major type of heterotrimeric G-protein in the nervous system was attempted for the measurements. Recombinant Goa was expressed in Kcoli BL21(DE3) cells transformed with pT7/Ndel/Goa plasmid. Expression levels were determined by Western blot analysis and GTPyS binding assays and it was established that the level of expression was not dependent on IPTG concentration. Protein isolation studies were initially carried out according to the method described by Lee et al. using large scale cultures which were not induced. At every step of purification, protein was detected by OD measurements and the presence of Goa was monitored by SDS-PAGE and Western blot analysis using commercial Goa antibody (NEN-Dupont). Some fractions were also assayed for GTPyS binding activity. Due to the inconsistencies with the results of Lee et al. and the presence of impurities in the final product, some modifications were introduced to this procedure. For example, to remove large molecular weight contaminants a gel filtration chromatography step was added and the Q-Sepharose column was replaced with Mono Q. These modifications resulted in co-purification of an Exoli protein of nearly the same molecular weight, the T-protein of glycine cleavage system.-IV- Parallel to Goa purification studies, T-protein was used for XSAS measurements. These measurements yield 2.58 om for the radius of gyration of T- protein and indicate that the protein has an assymetric shape in solution. The scattering pattern of T-protein was compared with that expected from a G-protein a subunit. Analyses indicate a high similarity between T-protein structure and the structure of GDP-bound inactive form of a-subunit of a chimeric heterotrimeric G- protein. Studies to optimize the purification of Goa and to determine the shape of T- protein are in progress.