Pirüvat dehidrojenaz enzim kompleksinin epitelyal mezenkimal dönüşüm ile ilişkisinin in vitro araştırılması
Investigation of the relationship between pyruvate dehydrogenase enzyme complex and epithelial mesenchymal transition in vitro
Yazar: BUSE CEVATEMRE
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ EGEMEN DERE ; PROF. DR. ENGİN ULUKAYA
Uludağ Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Mitokondri son yıllarda, metastatik kanser araştırmalarında çok fazla ilgi çekmektedir. Metastaz kapasitesi yüksek olan kanser hücrelerinin, enerji üretimi için mitokondriyal solunuma kıyasla glikolizi tercih ettiğini gösteren pek çok çalışma bulunmaktadır. Bazı kanserlerde görülen bu değişimin sebebi olarak, mitokondri bekçisi olarak bilinen pirüvat dehidrojenaz enzim kompleksi (PDH) sorumlu tutulmaktadır. Epitelyal mezenkimal dönüşüm (EMD) süreci metastazın itici gücü olduğu ileri sürülmüştür. Bu tez çalışmasında, EMD ile kanser hücre metabolizması arasında bir bağlantının varlığı araştırılmıştır. Bu amaçla, PDH'yı baskılamak için, A-549 hücrelerinde farmakolojik inhibitör Cpi-613 ve RNAi kullanılmıştır. Cpi-613'in antiproliferatif etkisi, xCELLigence sistemi, SRB ve ATP canlılık testleri ile belirlendi. Antiproliferatif dozlar kullanılarak hücrelerde, yara iyileşmesi, invazyon ve ilaç dirençliliği test edildi. Hücrelerde EMD fenotipini göstermek için, EMD ilişkili proteinlerin ifadesi, western blot yöntemi ile analiz edildi. Cpi-613 uyarılmış EMD sürecinin TGF-β sinyal iletimine bağımlı olup olmadığını test etmek için SB-431542 (TGF-β reseptör inhibitörü) kullanıldı. Sonuç olarak, hem PDH'ın Cpi-613 tarafından inhibisyonu hem de PDHA1 ifadesinin baskılanması, EMD sürecine karakteristik morfolojik değişiklikleri uyardığı bulundu. Ayrıca, hızlı bir yara iyileşmesi, artmış invaziv potansiyel ve kemodirenç varlığı gösterildi. Bunun yanı sıra, SB-431542 uygulamasının, EMD sürecini tersine çevirdiği gözlendi. CD133+ (kanser kök hücre belirteci) hücre oranı shPDHA1 hücrelerinde shKontrol hücrelerine kıyasla daha yüksek bulundu. Özetle, PDH inhibisyonunun ve/veya PDHA1 ifadesinin baskılanmasının EMD fenotipini uyardığı ve daha da önemlisi kemoterapötik ilaçlara direnç gelişimi ile sonuçlandığı gösterildi. Bulgular doğrultusunda, Cpi-613 veya PDH inhibitörlerinin antikanser terapide kullanılmasının tartışmalı olduğu düşünüldü.

Abstract:
Recently, mitochondria have attracted much attention in metastatic cancer research. There are several reports showing that highly metastatic cancer cells preferentially use glycolysis over mitochondrial respiration for energy production. Pyruvate dehydrogenase enzyme complex (PDH), the gatekeeper enzyme of mitochondria is shown to be responsible for this switch in some cancers. Epithelial mesenchymal transition (EMT), has been proposed to be a driving force of metastasis. In this study, the existence of a link between EMT and cancer cell metabolism has been investigated. To inhibit PDH activity, pharmacological (PDH inhibitor, Cpi-613) and RNAi (stable cell lines were established by lentivirus) were used in A-549 cells. The antiproliferative effect of Cpi-613 was investigated by xCELLigence System, SRB and ATP viability assays. Wound healing, invasion and drug sensitivity tests were applied at antiproliferative doses. To demonstrate the EMT phenotype in cells, the expression of EMT-related proteins were analyzed via western blotting. Furhermore, SB-431542 (TGF-β receptor inhibitor) was used to test whether Cpi-613 induced EMT depends on TGF-β signalling. As a result both the inhibition of PDH by Cpi-613 and the knockdown of PDHA1 induced morphological changes, which were characteristics of EMT. A more rapid wound healing, increased invasive potential and chemoresistance were also shown. SB-431542 treatment reversed the EMT phenotype. The proportion of CD133+ (a cancer stem cell marker) cells were also higher in shPDHA1 cells than those of shControl cells. In brief, knockdown of PDHA1 expression or inhibition of PDH activity induced the EMT phenotype and more importantly resulted in resistance to chemotherapeutic drugs. Therefore, the use of Cpi-613 or PDH blockers becomes debatable for use in anticancer therapy.