Klinik Acinetobacter baumannii izolatlarında florokinolon direnç mekanizmalarının araştırılması
Investigation of fluoroquinolone resistance mechanisms in clinical Acinetobacter baumannii isolates
Yazar: GÜLŞAH GÜLER
Danışman: DOÇ. DR. BAYRI ERAÇ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Eczacılık Temel Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Acinetobacter baumannii fırsatçı bir patojen olup, nozokomiyal enfeksiyonların en önemli etkenlerinden biridir. Bir çok antibiyotiğe dirençli oluşu, neden olduğu enfeksiyonların tedavisini zorlaştırmaktadır. Florokinolonlar hastane ve toplum kaynaklı birçok enfeksiyonun tedavisinde kullanılan antibiyotikler olup, direnç gelişiminde rol oynayan mekanizmaların belirlenmesi önem taşımaktadır. Bu çalışmada hastane kaynaklı A. baumannii izolatlarının siprofloksasin (CIP) ve levofloksasin (LEV) minimum inhibitör konsantrasyonlarının (MİK) belirlenmesi, klonal ilişkilerinin incelenmesi, florokinolonlara direnç gelişiminden sorumlu olan DNA giraz ve topoizomeraz IV enzimlerini kodlayan genlerdeki mutasyonlar ile efluks pompalarının aşırı ekspresyonunun araştırılması amaçlanmıştır. 

Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı'nda farklı klinik örneklerden izole edilen CIP dirençli 79, aynı antibiyotiğe duyarlı iki izolat olmak üzere toplam 81 A. baumannii kökeni çalışmaya alındı. CIP ve LEV MİK değerleri sıvı mikrodilüsyon yöntemiyle belirlendi. Kökenlerin klonal yakınlıkları ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus) -PZR yöntemi ile araştırıldı. Her farklı klon ve alttipi temsilen seçilen 16 kökende gyr-A ve par-C genlerindeki mutasyonlar dizi analizi ile belirlendi. Seçilen kökenlerde efluks pompalarının aşırı ekspresyonu, pompa inhibitörleri varlığında gerçekleştirilen sıvı mikrodilüsyon ve florometrik akümülasyon deneyleri ile araştırıldı.

İncelenen A. baumannii kökenlerinde MİK50 ve MİK90 değerlerinin CIP için 256 ve ≥256 aynı değerlerin LEV için 32 ve 128 olduğu belirlendi. Genel olarak CIP MİK değerlerinin LEV MİK değerlerine göre yüksek olduğu saptandı. İzolatların 10 farklı klona ayrıldığı, ancak bunların büyük çoğunluğunun klonal olarak ilişkili oldukları gözlendi. Seçilen temsilci kökenlerin gyr-A geninde en sık rastlanan önemli mutasyonlar Ser83Leu ve Asp87Glu, par-C geninde ise Ser80Leu'di. Temsilci kökenlerden yedisinde sadece mikrodilüsyon yöntemiyle, 11 kökende ise sadece florometrik olarak aşırı pompa ekspresyonu gözlenirken, beş kökende her iki yöntemle de olumlu sonuç elde edildi. Mikrodilüsyon yöntemiyle aşırı ekspresyonu saptamada CIP'in LEV'den daha iyi olduğu görüldü. İncelenen hastane kaynaklı ve klonal olarak ilişkili A. baumannii izolatlarında gözlenen yüksek florokinolon MİK değerlerine, hedef bölge mutasyonlarının yanı sıra, efluks pompalarının aşırı ekspresyonunun yol açtığı sonucuna varıldı. 

Anahtar Kelimeler: Acinetobacter baumannii; Florokinolon; QRDR; efluks; ERIC-PZR

Abstract:
Acinetobacter baumannii is an opportunistic pathogen which is one of the most important agents of nosocomial infections. Being resistant to many antibiotics makes difficult to treat the infections it causes. Fluoroquinolones are used in the treatment of nosocomial and community-acquired infections and it is important to determine the mechanisms of resistance to these antibiotics. It is aimed to investigate ciprofloxacin (CIP) and levofloxacin (LEV) minimum inhibitor concentrations (MIC), clonal relationships, mutations that occur in DNA gyrase and topoisomerase IV genes and overexpression of efflux pumps in nosocomial A. baumannii isolates.

79 CIP-resistant and two CIP-susceptible A. baumannii strains isolated from different clinical samples (one per patient) in Ege University Department of Clinical Microbiology were included into the study. CIP and LEV MIC values were determined by broth microdilution method. Clonal relationship among the strains was investigated by ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus) –PCR. Mutations that occur in gyr-A and par-C genes were detected by DNA sequence analysis in 16 strains representing each clone and subtype. Overexpression of efflux pumps was evaluated by the broth microdilution and fluorometric accumulation experiments carried out in the presence of pump inhibitors, in the representative strains.

MIC50 and MIC90 values for CIP were  256 and ≥256, same values for LEV were 32 and 128 respectively. Overall, CIP MIC values were found to be higher than that of LEV in the investigated A. baumannii strains. Isolates were grouped into 10 different clusters, but the vast majority of them were observed to be clonally related. The most common and important mutations detected in the gyr-A and par-C genes of the representative isolates were, Ser83Leu, Asp87Glu and Ser80Leu, respectively. While the overexpression of efflux pumps was observed in seven of the representative strains by microdilution method and in 11 strains by fluorometric assay, the results were positive in five strains by both methods. CIP was found to be better than LEV in detecting the overexpression of pumps by microdilution method. It was concluded that, high fluoroquinolone MIC values of the investigated nosocomial and clonally related A. baumannii strains were derived from target mutations and overexpression of efflux pumps.

Keywords: Acinetobacter baumannii; Fluoroquinolone; QRDR; efflux; ERIC-PCR