Anti kanser ilaç direnç mekanizmasında ısı şoku proteinlerinin şaperon aktivitesinin araştırılması
Investigation of chaperone activity of heat shock proteins in anti-cancer drug resistance mechanism
Yazar: DUDU MELEK GÜRSOY
Danışman: DOÇ. DR. MURAT PEKMEZ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoteknoloji ve Genetik Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics

Özet:
Kanser günümüzde en önemli halk sağlığı sorunlarından biridir. Dünyada her geçen gün yeni
teşhis edilen vakalar ve kanser nedenli ölüm sayıları artmaya devam etmektedir. Kanser
hücrelerin DNA kontrol mekanizmaları dışında kontrolsüz bölünerek çoğalması ile normal
hücrelerden farklılaşarak meydana gelir. Kanser türleri oluştuğu çeşitli doku ve organlara göre
isimlendirilmiştir. Başlıca kanser çeşitleri; Akciğer, lenf, pankreas, meme ve beyin kanseridir.
Çevresel faktörler ve kalıtsal faktörler gibi bazı kronik enfeksiyona neden olan virüsler de
kanser oluşumuna neden olabilir.
Glioblastoma yetişkinlerde en sık rastlanan ve çabuk yayılan agresif primer beyin tümörüdür.
Glioblastoma cerrahi operasyon, radyasyon terapisi ve kemoterapi tedavilerine rağmen 15 aylık
bir sağkalım süresi göstermektedir. Beyinde bulundukları konum nedeniyle cerrahi müdahale
genellikle sınırlıdır.
Temozolomid lipofilik yapısı sayesinde kan beyin bariyerini geçebilen ve Glioblastoma
tedavisinde kullanılan bir DNA alkilleyici ajandır. GBM'lerin oldukça farklı ve mutasyona
yatkın olması nedeniyle TMZ tedavisi yapılan tümör hücrelerin antikanser ilaç direnci ortaya
çıkmaktadır ve bu nedenle hastaların yarısı tedaviye yanıt vermemektedir. Bu sebeple başarılı
tedavi için antikanser ilaç mekanizmasını aşabilen yeni terapötik ajanlara ihtiyaç vardır.
Krisin doğada bazı bitkilerin çiçeklerinde bal ve propoliste yaygın olarak bulunabilen
antikanser özellikleri gösteren aromatik halkaya sahip bileşiklerdir.
 Anti Kanser İlaç Direnç Mekanizmasında Isı Şoku Proteinlerinin Şaperon
Aktivitesinin Araştırılması
xiii
Bu tez kapsamında TMZ tedavisine ilaç direnci gösteren U87MG hücre hattında Krisin ve
TMZ'nin birlikte sinerjistik etki gösterdiği dozlar SynergyFinder ve Compusyn programları ile
belirlenmiş ve seçilen 250 µM TMZ ve 25 µM Krisin dozları tek başına ve kombine olarak
uygulanmıştır. Seçilen dozların kombinasyonu ile yapılan uygulamanın U87MG hücre hattı
üzerindeki migrasyon analizi in vitro çizik deneyi ile yapılmıştır. Kombine terapi
uygulamasının tekli uygulamalara kıyasla migrasyonu önemli ölçüde engellediği görülmüştür.
Kombine terapi uygulamasının apoptik etkilerini belirlemek amacıyla Hoechst33342/Propidium iyodür (HO/PI) floresan boyaması yapıldı. Apoptoz yolağında görev alan
Bax, Bcl2, Cas3 ve PARP1 proteinlerinin anlatımları western blot yöntemi ile incelendi.
Kombine terapi uygulamalarının ilaç direnç mekanizması üzerine etkilerini belirlemek
amacıyla MRP1 ve TAP1 proteinlerinin anlatımları westernblot yöntemi ile incelendi. Son
olarak kombine terapi uygulamalarının şaperon aktivitesi ve ER Stresi üzerine etkilerini
belirlemek amacıyla HSP90, HSP70, HSP60, IRE1α, ATF-6, ve Grf78 proteinlerinin
anlatımları westernblot yöntemi ile incelenmiştir.
Seçilen TMZ ve Krisin dozlarının kombinasyon olarak U87MG hücre hattına uygulanması tek
başına uygulamalara kıyasla apoptoz proteinlerinin anlatımını daha çok arttırmıştır. İlaç direnç
mekanizmasına ve MHC sunum yolağında rol alan TAP1 proteinlerinin anlatımında artma
meydana gelirken, çoklu ilaç direnç proteini olan MRP1 anlatımı tek başına uygulanan TMZ'ye
kıyasla azalmıştır. Tek başına yapılan TMZ uygulaması HSP90, HSP70 ve HSP60
proteinlerinin büyük oranda anlatımını arttırırken, tek başına uygulanan Krisin dozu HSP70 ve
HSP60'ta anlamlı bir değişiklik meydana getirmemiş, HSP90 anlatımında azalma
gerçekleşmiştir. Kombine uygulama ise HSP90, HSP70 ve HSP60 proteini anlatımını
azaltmıştır.
Tek başına uygulanan TMZ ve Krisin dozları Grp78 proteini anlatımında anlamlı bir değişiklik
meydana getirmezken, kombine uygulama Grp78 proteini anlatımını arttırmıştır. Tek başına
uygulanan Krisin ve TMZ dozları IRE1α anlatımını arttırmıştır fakat kombine uygulama tek
başına uygulanan dozlara kıyasla protein anlatımını daha çok arttırmıştır. Tek başına uygulanan
Krisin dozu tek başına uygulanan TMZ dozuna kıyasla ATF p50 proteinlerinin anlatımını
arttırırken kombine uygulama protein anlatımını daha çok arttırmıştır. Bu bilgiler ışığında
kombine terapi uygulaması; TMZ uygulaması sonrası meydana gelen antikanser ilaç direnç
mekanizmasını azaltırken, hücrelerin apoptoz aktivitesini arttırmış ve hücre içerisindeki
şaperon aktivitesini azaltmış ve ER stresini arttırmıştır.

Abstract:
Cancer is one of the most important public health problems today. Newly diagnosed cases and
deaths due to cancer continue to increase every day in the world. It occurs when cancer
differentiates from normal by uncontrolled division and proliferation other than DNA control
proliferation. Cancer types are named according to various tissues and organs. Major types of
cancer; Lung, lymph, pancreas, breast and brain cancer. Like environmental factors and
hereditary factors, some chronic infection-causing viruses can also cause cancer.
Glioblastoma is the most common and rapidly spreading aggressive primary brain tumor in
adults. Glioblastoma shows a survival time of 15 months despite surgery, radiation therapy and
chemotherapy treatments. Because of their location in the brain, surgical intervention is often
limited.
Temozolomide is a DNA alkylating agent that can cross the blood-brain barrier thanks to its
lipophilic structure and is used in the treatment of Glioblastoma. Since GBMs are highly
heterogeneous and prone to mutation, anticancer drug resistance occurs in tumor cells treated
with TMZ, and therefore half of the patients do not respond to treatment. Therefore, new
therapeutic agents that can overcome the anticancer drug mechanism are needed for successful
treatment.
 Investigation of Chaperone Activity of Heat Shock Proteins in Anti-Cancer
Drug Resistance Mechanism
xv
Chrysins are compounds with aromatic rings that show anticancer properties and can be
commonly found in honey and propolis in the flowers of some plants in nature.
Within the scope of this thesis, the doses at which Chrysin and TMZ exert a synergistic effect
on the U87MG cell line, which showed drug resistance to TMZ treatment, were determined
with SynergyFinder and Compusyn programs, and the selected doses of 250 µM TMZ and 25
µM Chrysin were applied alone and in combination. Migration analysis of the treatment
application with the combination of selected doses on the U87MG cell line was performed by
in vitro scratch experiment. It has been observed that combined therapy application
significantly inhibits migration compared to single applications. Hoechst-33342/Propidium
iodide (HO/PI) fluorescent staining was performed to determine the apoptic effects of combined
therapy application. The expressions of Bax, Bcl2, Cas3 and PARP1 proteins, which are
involved in the apoptosis pathway, were examined by western blot method. In order to
determine the effects of combined therapy applications on the drug resistance mechanism, the
expressions of MRP1 and TAP1 proteins were examined by westernblot method. Finally, in
order to determine the effects of combined therapy applications on chaperone activity and ER
Stress, the expressions of HSP90, HSP70, HSP60, IRE1α, ATF-6, and Grf78 proteins were
examined by westernblot method.
Application of selected doses of TMZ and Chrysin in combination to the U87MG cell line
increased the expression of apoptosis proteins more compared to single applications. While
there was an increase in the expression of TAP1 proteins, which are involved in the drug
resistance mechanism and the MHC presentation pathway, the expression of MRP1, a
multidrug resistance protein, decreased compared to TMZ administered alone. While TMZ
application alone significantly increased the expression of HSP90, HSP70 and HSP60 proteins,
the Chrysin dose applied alone did not cause a significant change in HSP70 and HSP60, and
there was a decrease in HSP90 expression. Combined application reduced the expression of
HSP90, HSP70 and HSP60 proteins.
While TMZ and Chrysin doses applied alone did not cause a significant change in Grp78 protein
expression, combined application increased Grp78 protein expression. Chrysin and TMZ doses
applied alone increased IRE1α expression, but combined application increased protein
expression more compared to doses applied alone. While the Chrysin dose applied alone
increased the expression of ATF p50 proteins compared to the dose of TMZ applied alone, the
combined application increased the protein expression even more. In the light of this
information, combined therapy application; While it reduced the anticancer drug resistance
mechanism that occurred after TMZ application, it increased the apoptosis activity of the cells,
decreased the chaperone activity within the cell, and increased ER stress.