İnsan aldehit dehidrogenaz izoenzimlerinin (ALDH1A1, ALDH1A3 ve ALDH2) klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve bazı antibiyotiklerin bu enzimlerin aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi
Cloning, expression, purification, characterization of human aldehyde dehydrogenase isoenzymes (ALDH1A1, ALDH1A3 ve ALDH2) and investigation of some antibiotics effects on enzymes activity
Yazar: YELİZ DEMİR
Danışman: PROF. ŞÜKRÜ BEYDEMİR
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry

Özet:
Bu çalışmada, insan beyin cDNA'sı kullanılarak aldehit dehidrogenaz izoenzimleri (ALDH1A1, ALDH1A3 ve ALDH2) pET SUMO vektörüne klonlandı ve başarılı bir şekilde eksprese edildi. Oluşturulan rekombinant konstraktlar çapraz PCR ile doğrulandı. Elde edilen rekombinant proteinler Escherichia coli BL21 (DE-3)'de eksprese edildi. İzopropil β-D-1-tiyogalaktopiranozit (IPTG) indüksiyonu ile üretilen hekzahistidin (6xHis) kuyruğuna sahip füzyon proteinler anti-his antikoru kullanılarak yapılan western blot yöntemiyle doğrulandı ve yaklaşık 70 kDa'luk füzyon proteinler tespit edildi. ALDH1A1, ALDH1A3 ve ALDH2 enzimleri nikel-nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. Saflaştırılan enziminlerin saflığını kontrol etmek ve molekül kütlesini tespit etmek amacıyla SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı ve tek bant elde edildi. ALDH1A1, ALDH1A3 ve ALDH2 enzimleri mol kütlesi sırasıyla 68,45; 69,31 ve 67,85 kDa olarak belirlendi. Enzimlerin doğal halinin molekül kütlesi ise Sephadex G-100 jel filtrasyon kolonu kullanılarak sırasıyla 277,97; 281,83 ve 275,42 kDa olarak belirlendi. Böylece enzimlerin dört alt birimden oluştuğu tespit edildi. Ayrıca saflaştırılan hALDH1A1, hALDH1A3 ve hALDH2 enzimlerinin karakterizasyonu yapılarak enzimin optimum pH, optimum iyonik şiddet ve optimum sıcaklık değerleri belirlendi. Daha sonra saflaştırılan rekombinant enzimlerin aktivitesi üzerine bazı antibiyotiklerin etkileri araştırıldı. İnhibisyon etkisi gösteren antibiyotikler için Linewear-Burk grafikleri yardımıyla Ki sabitleri ile inhibisyon tipleri tespit edildi.

Abstract:
In this study, aldehyde dehydrogenase isoenzymes (ALDH1A1, ALDH1A3 ve ALDH2) were cloned into pET SUMO vector by using human brain cDNA and expressed successfully. The recombinant constructs created plasmids were confirmed by cross PCR.  This recombinant proteins were over expressed in Escherichia coli BL21 (DE-3). Fusion protein  with hexahistidine (6xHis) tail produced by isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induction were confirmed by western blotting using anti-his antibody and ~70 kDa fusion proteins were detected.  ALDH1A1, ALDH1A3 and ALDH2 enzymes were purified by using nickel-nitrilotriacetic acid affinity chromatography. To check the purity and determine the molecular mass of the purified enzyme SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed and a single band was observed. Molecular mass of SUMO-hALDH1A1, hALDH1A3 and hALDH2 enzymes were determined as 68.45, 69.31 and 67.85 kDa, respectively. The molecular weight of enzymes were estimated to be  277.97, 281.83 and 275,42 kDa by Sephadex G-100 gel filtration chromatography, respectively. Thus, it was determined that the enzymes were composed of four subunits. In addition, optimal pH, optimal ionic strenght and optimal temperature values were determined for characterization of purified hALDH1A1, hALDH1A3 and hALDH2 enzymes. Then, effects of some antibiotics on hALDH1A1, hALDH1A3 and hALDH2 enzymes activity were investigated. For antibiotics that exhibit inhibitory effect Ki constants and inhibition types were calculated by the help of Linewear-Burk curves.