Çilek meyvesinden proteaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve uygulama alanlarının araştırılması
Purification, characterization and investigation of the applications of protease enzyme from strawberry
Yazar: ESMA HANDE ALICI
Danışman: DOÇ. DR. GÜLNUR ARABACI
Sakarya Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya = Chemistry
Dizin: Enzim immobilizasyonu = Enzyme immobilization ; Kalsiyum aljinat = Calcium alginate

Özet:
Bu çalışmada, çilek (Fragaria ananassa) meyvesinden izole edilen proteaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu, immobilizasyonu ve uygulama alanlarının araştırılması amaçlanmıştır. Sefaroz-4B-L-tirozin-p-amino benzoik asit afinite kromatografisi kullanılarak 395,6-kat saflaştırılan proteazın molekül ağırlığı, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ile 65,8 kDa olarak belirlenmiştir. Saf proteaz için optimum pH ve sıcaklık değerleri sırasıyla 6 ve 40 °C olarak bulunmuştur. Saf proteazın, geniş bir sıcaklık ve pH aralığında oldukça kararlı olduğu saptanmıştır. Co2+ iyonları çilek proteazını çok kuvvetli bir şekilde aktive etmiştir. Cu2+, Hg2+, Cd2+ ve Mn2+ iyonları ise proteaz aktivitesini belirgin şekilde inhibe etmiştir. 2-propanol enzimi tamamen inhibe ederken, etanol ve metanol varlığında enzim kararlılığını daha iyi korumuştur. Çilek proteazı, doğal ve modifiye substratlar arasında en yüksek spesifikliği hemoglobine karşı göstermiştir. Enzimin sentetik substratlara karşı spesifikliğinin de araştırılmasının ardından, geniş bir substrat spesifikliğine sahip olduğu sonucuna varılmıştır. İnhibisyon çalışmaları çilek proteazının yüksek ihtimalle serin proteaz olduğunu ve aktivitesinin ortamdaki metal iyonlarından belirgin şekilde etkilendiğini göstermektedir. Bunun yanında, ham çilek proteazının Ca-aljinat küreciklerde immobilizasyonunun ardından, deterjan katkı maddesi ve süt pıhtılaştırıcı ajan olarak kullanımı test edilmiştir. Enzimin Ca-aljinat küreciklerde immobilizasyonu esnasında, aljinat konsantrasyonu %2 ve CaCl2 çözeltisi konsantrasyonu %3'de sabit tutulmuştur. Enzimle beraber immobilize edilen Co2+ iyonlarının (1 mM) enzim etkinliğini 8,4 kat arttırdığı saptanmıştır. İmmobilizasyon verimi sadece ham enzimi içeren kürecikler için %65, Co2+ iyonlarıyla birlikte ham enzimi içeren kürecikler için %69 olarak belirlenmiştir. İmmobilizasyon sonucunda enzimin optimum sıcaklık değeri değişmezken, optimum pH değerinin 6'dan 7'ye kaydığı görülmüştür. İmmobilizasyon sonrasında ham enzimin Vmax değerinde yok denebilecek kadar küçük bir azalma ve Km değerinde belirgin bir artış meydana gelmiştir. Çilek proteazının tekrar kullanılabilirlik özelliği ortalama düzeyde iken, depolanma kararlılığı yüksek bulunmuştur. Test edilen tüm parametreler açısından, çilek proteazının kararlılığının immobilizasyon neticesinde arttığı saptanmıştır. Gerçekleştirilen uygulama çalışmaları, çilek proteazının iyi bir deterjan katkı maddesi olarak değerlendirilebileceğini fakat süt pıhtılaştırıcı enzim alternatifi olarak etkisinin zayıf kaldığını göstermiştir.

Abstract:
The aim of this study was purification, characterization, immobilization and investigating some applications of the protease isolated from strawberry (Fragaria ananassa) fruit. The molecular weight of protease, that was 395.6-fold purified by using Sepharose-4B-L-tyrosine-p-amino benzoic acid affinity chromatography, was determined to be 65.8 kDa by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Optimum pH and temperature for the pure enzyme were 6 and 40 °C, respectively. The pure protease was stable at a wide range of temperature and pH. Co2+ ions stimulated protease activity very strongly. Cu2+, Hg2+, Cd2+ and Mn2+ ions significantly inhibited protease activity. While 2-propanol completely inhibited the enzyme, the enzyme maintained its activity better in the presence of ethanol and methanol. The strawberry protease showed the highest specificity towards hemoglobin among all the natural and modified substrates tested. The specificity of the enzyme towards synthetic substrates was also investigated and it was concluded that it has broad substrate specificity. Inhibition studies indicated that this purified protease was highly-likely a serine protease and its activity was significantly affected by the presence of metal ions. Furthermore, after the immobilization of crude strawberry protease in Ca-alginate beads, the use of crude protease as a detergent additive and milk coagulating agent was tested. During immobilization of the enzyme in Ca-alginate beads, the alginate concentration was kept constant at 2% and the CaCl2 solution concentration at 3%. Co2+ ions (1 mM) immobilized together with the crude enzyme were found to increase the enzyme activity by 8.4 fold. The immobilization yield was determined to be 65% for the beads containing only the crude enzyme and 69% for the beads containing crude enzyme and Co2+ ions together. As a result of the immobilization, the optimum temperature value of the enzyme did not change and the optimum pH value changed from 6 to 7. After immobilization, there was a slight decrease in Vmax and a significant increase in Km of the crude enzyme. While the reusability of the strawberry protease was at an average level, the storage stability was found to be high. In terms of all the parameters tested, the stability of the strawberry protease increased as a result of immobilization. The application studies showed that strawberry protease can be considered as a good detergent additive but a weak milk clotting enzyme alternative.