Bor madenlerinden izole edilmiş bor toleransı yüksek bir pseudomonas izolatının proteomik analizi
Proteomic analysis of highly boron tolerant pseudomomas strain isolated from boron mines
Yazar: BEGÜM HAZAR GÖKCAN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BEKİR ÇÖL
Muğla Sıtkı Koçman Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology

Özet:
Bor, bitkiler, Bacillus boroniphilus, tek hücreli ökaryotlar ve siyanobakterlerin bazı türleri için esansiyel bir mikroelementtir. Insanlar için yararlı etkileri rapor edilmiş olmasına rağmen teknik zorluklardan dolayı bu konuda yeterli bilgi elde edilememiştir. Bu elementin canlılar üzerindeki biyokimyasal fonksiyonu ve bu canlılarla biyolojik olarak ilişkisi araştırılmalıdır. laboratuvarımızda yapılan çalışmalarla Emet, Kütahya bölgesinden izole edilen bakteri şusunun yapılan 16SrRNA gen sekans analizi sonucu Pseudomonas stutzeri ile yakın ilişki gösterdiği görülmüştür. Bu bakterinin, 200 mM borik asit içeren TSB besiyerinde üreyebildiği görülmüştür. 200 mM Bor konsantrasyonu, çoğu bakterinin üreme gösterebilmesi için yüksek bir konsantrasyondur. Bu bakteri ekstramofil bir bakteridir. Bundan dolayı bu tez çalışmasında model organizma olarak seçilmiştir. Bu çalışmada, Bor tarafından indüklenen ya da baskılan gen ekspresyonuna ışık tutması amacıyla,  farklı Bor konsantrasyonlarında yetiştirilerek elde edilen bakterinin protein ekstraktlarının proteomik analizi gerçekleştirilmiştir. Seçilen model bakteri borik asit içermeyen, 50 mM ve 150 mM boric asit içerin TSB besi yerinde büyütülmüştür. Elde edilen hücre pelletleri sonikasyon işlemiyle parçalanmış ve istenmeyen hücre kalıntilarından uzaklaştırılarak protein ekstraktları elde edilmiştir. Proteinlerin kalitatif ve kantitatif analizleri yapıldıktan sonra BioRad IEF sistemi kullanılarak 2D jel elektroforez aşamasına geçilmiştir. Protein spotları, BlooMoose boyası kullanılarak görünür hale getirilmiştir. Ardından, PDQuest (Biorad) programı kullanılarak her bir 2D jeldeki protein spotları eşleştirilmiş ve seçilen spotlar spot cutter ile kesilerek, proteinler tripsinizasyon işlemine tabii tutulmuştur. Protein peptitleri AB SCIEX 5800 MALDI-TOF-TOF kütle spektrometresi ile analiz edilmiştir. Proteinler Mascot programı kullanılarak tanımlanmıştır. Ayrıca Escherichia coli (BW25113) bakterisi de aynı işlemlerden geçirilerek farklı Bor konsantrasyonu içeren ortamlardaki protein profilleri değerlendirilerek çalışmaya eklenmiştir. Bu çalışma sonucunda, model organizma olarak seçilen KE4b (Pseudomonas stutzeri) bakterisinde 5 adet; E. coli BW25113 suşunda da 8 adet protein spotının, Bor'a bağlı regülasyonunda farklılıklar görülmüştür. MALDI TOF-TOF analizi sonucu elde edilen pikler, Mascot ve Swissprot veri tabanlarında araştırılarak protein kimlikleri önerilmiştir. Buna göre, Pseudomonas bakterisinde belirlenen proteinler; ketol-asid redüktoizomeraz, koproporpirinogen-3 oksidaz, uzama faktörü Tu, süksinat dehidrogenaz flavoprotein alt ünitesi, enoyl-redüktaz. E. coli BW25113 suşunda belirlenen proteinler; fosfopentamutaz, izositratdehidrogenaz, 2-dehidro-3-deoksi-D-glukonat-5-dehidrogenaz, 4-deoksi-L-threo-5-hekzosüloz-uronatketol-izomeraz (2 spot), süperoksit dismutaz, D-tagatoz-1,6-bisfosfat aidolaz alt ünitesi, uzama faktörü Tu. Bu çalışmada bu bakteriler için ilk kez, Bor miktarına bağlı olarak değişen gen ekspresyonunu araştırmak için proteomik çalışmalar yapılmıştır. Ayrıca, Pseudomonas bakteri türü için elde edilen 5 farklı protein aktivitesinin; E. coli BW25113 suşu için 7 farklı protein aktivitesinin, stres ve Borla olan muhtemel ilişkileri açısından, literatüre yeni bilgiler sunduğu düşünülmektedir.

Anahtar Kelimeler: Pseudomonas, Escherichia coli, Bor, Proteomik, Protein, 2D-PAGE

Abstract:
Boron is an essential micronutrient for plants and required by Bacillus boroniphilus unicellular eukaryotes, and some species of cyanobacteria. The beneficial effects of this element for Homo sapiens were reported, but its essentiality is debatable due to technical difficulties and insufficient data. Further investigations need to be explored to shed light onto biochemical function and biological relevance of this element on a number of organisms.  Our laboratory isolated a bacterial strain from the boron mine located in Emet, Kütahya and identified this microorganism to be closely related to Pseudomonas mendocina based on 16SrRNA gene sequence analysis. Boron tolerance of this organism, which is 200 mM boric acid in TSB medium, was found to be much higher than most of the bacteria, hence making this bacterium an extremophile that can be used as model organism in boron biology studies. Among other efforts directed to elucidate the role of Boron in this microorganism, we took advantage of the proteomics approach, where some of the proteins that are upregulated in response to increasing level of boric acid were aimed to be identified. Therefore, the bacterium was grown with TSB medium containing none and 150mM boric acid and following sonication, the supernatant containing cell-free protein extract were obtained. Following qualitative and quantitative assessment of the extracts, 2D gel electrophoresis was performed for each extract using BioRad IEF system (IPG pH 3-10, 17 cm strips) and SDS-PAGE. The protein spots were visualized by staining with BlooMoose Staining Solution and a digital camera with 8 Mega Pixel resolution. The spots from each gel were compared and 5 spots that seemed to be upregulated were selected and subject to Maldi-TOF-TOF analysis. The protein spots were first digested with trypsin and the peptides were then analyzed with ABSCIEX5800 MALDI-TOF-TOF. The peptide peaks were analyzed with Mascot Program and Swiss Prot databases. 


In addition, E. coli protein profiles of bacteria grown with TSB media that contain different concentrations of Boron were determined in the experiment. As a result, 8 protein spots for E.coli (BW25113), Phosphopentomutase, isocitrate dehydrogenase, 2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate-5-dehydrogenase, 4-deoxy-L-threo-5-hexosulose-uronatketol-isomerase (2 spots), superokside dismutase, D-tagatose-1,6-bisphosphate aldolase subunit, elongation factor Tu 1. 5 protein spots for Pseudomonas ketol-acid reductoisomerase, coproporphyrinogen-III oksidase, elongation factor Tu, succsinate dehydrogenase flavoprotein subunit, enoyl-redüktaz. These protein activities appear be expressed more under high levels of boron and their potential roles in boron biology were discussed in light of current literature and bioinformatics databases. 
Keywords: Pseudomonas, Escherichia coli, Boron, Proteomics, Protein, 2D-PAGE