Bütil hidroksitolüen konsantrasyonunun saanen teke sperminin donmasına etkisi
Effect of butylated hydroxytoluene concentration on saanen buck sperm freezability
Yazar: AHMED FATHY HASSAN SEIOUDY
Danışman: PROF. DR. NEDİM KOŞUM
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Zootekni Ana Bilim Dalı / Hayvan Yetiştirme Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Bu çalışma, Tris-sitrik asit-glikoz yumurta sarısı gliserol (TCGYG) bazlı sulandırıcıda bütil hidroksitolüen'in (BHT) farklı konsantrasyonlarının (0,6 mM, 2,0 mM ve 5,0 mM) Saanen teke sperminin kryoprezervasyonunun sperma kalitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmeyi amaçlamıştır. Ayrıca, kriyoprezervasyon öncesinde santrifüjleme yoluyla yıkanmış ve yıkanmamış sperm etkisi incelenmiştir. Bununla birlikte, başarılı bir teke spermi kriyoprezervasyonunun geliştirilmesinde optimal bir BHT konsantrasyonu bulunması amaçlanmıştır. Tez çalışması, Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Zootekni Bölümü Küçükbaş Hayvan ünitesinde gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, 1-2 yaş arasında ve 50-60 kg canlı ağırlık aralığındaki 4 baş Saanen ırkı teke kullanılmıştır. Sperma toplama işlemi tekelerden çiftleşme mevsiminde (Kasım-Ocak) haftada 2 kez gerçekleştirilmiştir. Sperma, dişi varlığında yapay vajina yöntemiyle alınmıştır. Alınan sperma test tüplerinde birleştirilerek karışım elde edildikten sonra, 2 eşit ana gruba ayrılarak örnekler oluşturulmuştur. Bir kısım, tris-sitrik asit-glikoz (TCG) solüsyonunda (1:5) oranında seyreltilmiş ve iki kez 600 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edilerek yıkanmış, diğer kısım yıkanmadan tutulmuştur.
Yıkadıktan sonra süpernatan dikkatlice çıkarılmış ve elde edilen tortu dört eşit parçaya bölünmüştür. Yıkanmamış sperma ise iki eşit parçaya bölünmüştür. Yıkanmış ve yıkanmamış sperma, muamelelere göre farklı konsantrasyonlarda BHT takviyesi ile desteklenmiş farklı TCG (%5 gliserol ve %15 yumurta sarısı) birinde yeniden süspanse edilmiştir: 1) yıkanmış sperma; 2) yıkanmış sperma + 0,6 mM BHT; 3) yıkanmış sperma + 2,0 mM BHT; 4) yıkanmış sperma + 5,0 mM BHT; 5) yıkanmamış sperma ve 6) yıkanmamış sperma + 5,0 mM BHT. Sulandırılan sperma 6 farklı 0,25 ml'lik payetlere çekildikten sonra, +4°C'de 2 saat ekilibrasyona bırakılmıştır. Ekilibrasyondan sonra payetler sıvı azot seviyesinin 4 cm üzerinde sıvı azot buharında 15 dakikada dondurulmuş ve sıvı azota daldırılarak saklanmıştır. Dondurma işlemi toplamda 20 kez tekrarlanmıştır. Alınan spermanın elde edilen karışık ejakülat miktarı (ml) ve sperm yoğunluğu (x109/ml) değerlendirilirken dondurma-çözdürme sonrası toplam, progresif, lokal spermatozoa motilitesi (%) ve ölü spermatozoa (%) parametreleri Bilgisayar Destekli Sperma Analizi (CASA) ile belirlenmiştir.
Sperma miktarı en yüksek  miktar 2,5 ml, en düşük miktar 1,0 ml ve ortalama 1,75±0,39 ml olarak kaydedilmiştir. Spermanın yoğunluğu ortalama 2,320x109/ml olarak tespit edilmiştir. Çözündürme sonrası TCGYG sulandırıcısına toplam ve progresif motilitesi bakımından, BHT antioksidan hem yıkanmış sperma hem de yıkanmamış sperma muamelesinde kontrol grubundan farkının önemli olduğu belirlenmiştir (P<0,05). Yıkanmış sperma muamelesinde yalnızca 2,0 mM BHT grupları arasında en yüksek toplam ve progresif motilite oranı sırasıyla; % 71,65 ve % 42,44 ile kaydedilirken en düşük oran kontrol grubunda bulunmuştur. Ayrıca, yıkanmış sperma grubunun yıkanmamış sperma grubundan farkının önemli olduğu belirlenmiştir (P<0,05). BHT ilavesinin yıkanmış sperma grubunda yıkanmamış sperma grubundan önemli bir ölçüde (P<0,05) daha etkili olduğu belirlenmiştir.
Ancak BHT antioksidan ilavesinin, TCGYG sulandırıcısı ile sulandırılan deneme grubunda lokal spermatozoa motilitesi bakımından farkının, hem yıkanmış sperma hem de yıkanmamış sperma muamelesinde kontrol grubundan istatistik bakımından önemli değildir (P>0,05). Ayrıca, lokal motilite bakımından yıkanmış sperma grubu yıkanmamış sperma grubundan fark önemli değildir (P>0,05). Diğer taraftan TCGYG sulandırıcısında, ölü spermatozoa oranı bakımından, BHT antioksidan ilavesinin hem yıkanmış sperma hem de yıkanmamış sperma muamelesinde, kontrol grubundan farkının önemli olduğu belirlenmiştir (P<0,05). Yıkanmış sperma grubunda 2,0 mM BHT grupları arasında en düşük değer olarak % 28,34 ile kaydedilirken genelde en yüksek değer kontrol grubunda bulunmuştur. Ayrıca, ölü spermatozoa oranı bakımından yıkanmış sperma grubunun yıkanmamış sperma grubundan farkının önemli olduğu belirlenmiştir (P<0,05). Buna göre BHT ilavesinin yıkanmış sperma grubunda yıkanmamış sperma grubundan daha etkili olduğu belirlenmiştir.
Sonuç olarak, Saanen tekelerde BHT önemli bir ölçüde hem sperm motilite oranını hem de sperm canlılığı oranını artmıştır. Bu sonuçla Saanen teke spermasının dondurulması için 0,6 ile 2,0 mM/mL arasında değişen BHT konsantrasyonunun optimum olabileceğini göstermektedir. Çözündürme sonrası yıkanmış spermada hem en yüksek motilite oranı hem de en düşük ölü spermatozoa oranı TCGYG sulandırıcısına 2 mM BHT ilavesi içeren grupta kaydedilmiştir. Bunun sonucu olarak, toz yumurta sarısı bazlı ortamda kriyoprezerve edilmiş yıkanmış ve yıkanmamış spermlerin kalite parametrelerinin çoğunu iyileştirmek için 2.0 mM konsantrasyonda BHT ilavesi önerilmiştir. Ayrıca, bu çalışmada hem en yüksek motilite oranı hem de en düşük ölü spermatozoa oranı yıkanmış sperma grubunda kaydedilmiştir. Bununla birlikte, kriyoprezervasyon öncesi spermanın ilk santrifüjlenmesiyle yıkanması ve spermin dondurularak saklanmasında canlılık oranının iyileştirilmesi önerilmiştir.

Abstract:
The main objective of this study was to define the effect of cryopreservation with different concentrations of butyl hydroxytoluene (BHT) at 0.6 mM, 2.0 mM, and 5.0 mM in Tris-citric acid-glucose egg yolk glycerol (TCGYG) based extender on semen quality of Saanen buck. Also, the effect of washed and unwashed sperm by centrifugation before cryopreservation was examined. Therefore, an optimal concentration of BHT could be found to develop a successful cryopreservation of buck sperm. The study was carried out at Ege University, Faculty of Agriculture, Department of Animal Science, Small Animals Unit. A total number of 4 Saanen bucks with 1-2 years old and 50-60 kg body weight were used in this study. Semen was collected twice a week during the mating season (November-January) using an artificial vagina in the presence of female goat. The collected semen was mixed in test tubes and the mixture was divided into two equal main groups. One portion was diluted in tris-citric acid-glucose (TCG) solution (1:5) and washed twice by centrifugation at 600 x g for 10 minutes, while the other portion was kept unwashed.
The supernatant was carefully removed after washing and the residue was divided into four equal parts, while the unwashed semen was divided into two equal parts. Afterwards, washed and unwashed semen were re-suspended in one of the different TCG-based media with 5% glycerol and 15% powdered egg yolk supplemented or not with different concentrations of BHT according to the treatments: 1) washed semen; 2) washed semen + 0.6 mM BHT; 3) washed semen + 2.0 mM BHT; 4) washed semen + 5.0 mM BHT; 5) unwashed semen and 6) unwashed semen + 5.0 mM BHT. Following supplementation or not with BHT, semen treatments were packed into 6 different 0.25 ml straws then were left to equilibrate at +4°C for 2 hours. After equilibration, the straws were kept in liquid nitrogen vapor at 4 cm above the liquid nitrogen level for 15 minutes and frozen by storing in liquid nitrogen. The total number of the freezing process was repeated 20 times. The amount of mixed ejaculate (ml) and spermatozoa concentration (x109/ml) obtained by mixing the collected semen were recorded, while the evaluation of total, progressive, local sperm motility (%) and dead spermatozoa (%) was determined by Computer Assisted Semen Analysis (CASA).
The obtained results showed that the maximum amount of semen was 2.5 ml; the minimum amount was 1.0 ml, and the average was 1.75 ml. The average of sperm concentration was 2,320x109/ml. In terms of total and progressive sperm motility in TCGYG extender after thawing, BHT groups were significantly (P<0.05) different than the control group in both of washed and unwashed semen treatments. The highest percentages of total and progressive sperm motility were recorded with 2.0 mM of BHT with an average of 71.65 and 42.44 %, respectively in washed semen, while the lowest percentages were recorded in the control group. Moreover, the difference between the washed and unwashed semen was significant (P<0.05). The washed semen was significantly (P<0.05) higher in the percentages of total and progressive sperm motility compared to unwashed semen.
In the term of local sperm motility in TCGYG extender, there was no significant (P>0.05) difference between the control group and BHT groups in both of washed and unwashed semen. The difference between the washed and unwashed semen was also insignificant (P>0.05). On the other hand, the percentage of dead spermatozoa in TCGYG extender, was significantly (P<0.05) different in BHT groups than the control group in both of washed and unwashed semen. The lowest percentage of dead spermatozoa was recorded with 2.0 mM of BHT with an average of 28.34 % in washed semen, while the highest percentage was recorded in the control group. Moreover, the difference between the washed and unwashed semen was significant (P<0.05). The washed semen was significantly (P<0.05) lower in the percentage of dead spermatozoa compared to unwashed semen.

In conclusion, BHT increased significantly (P<0.05) both of sperm motility and viability in Saanen bucks. This study showed that BHT concentration ranging from 0.6 to 2.0 mM/mL could be the optimum concentration for freezing semen of Saanen buck. The highest percentages of sperm motility and viability were recorded after thawing of washed semen in TCGYG extender containing 2 mM of BHT. Consequently, the addition of BHT with a concentration of 2.0 mM could be recommended as an optimum concentration to improve many parameters of washed and unwashed sperm cryopreserved in an egg yolk-based medium. Also, both of the highest sperm motility and viability were recorded in washed semen compared to unwashed semen in this study. Therefore, it could be recommended to make sperm washing before cryopreservation by initial centrifugation of the semen to improve sperm cryosurvival.