TTH polimeraz enziminin tıbbi moleküler tanı kitlerinde kullanım amaçlı rekombinant üretimi
Expression of recombinant TTH polymerase enzyme for development of medical molecular diagnostic kits
Yazar: HÜMEYRA AYDIN
Danışman: PROF. DR. İSA GÖKÇE
Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; PCR =   ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Tth polimeraz, 834 aa büyüklüğünde ve 94 kda ağırlığında bir enzimdir. Tth polimeraz; hem PCR hem reverse transkriptaz PCR uygulamalarında ayrıca DNA dizileme çalışmaları ve bunlara bağlı olarak viral ve bakteriyel bulaşıcı veya ölümcül hastalıkların tanısında sıklıkla kullanılmaktadır. Reverse transkripsyon (RT) ve PCR (Reverse Transkriptaz PCR), enfeksiyöz ajanlar ya da genetik hastalıkların teşhisi için kullanılmalarının yanısıra, klonlama ve RNA dizilerinin analizi, gen ekspresyonunun takibi gibi moleküler işlemler için de güçlü birer araç olarak kullanılmaktadırlar. Üretilmesi planlanan rekombinant Tth polimeraz enzimi, sahip olduğu polimeraz aktivitesi ile PCR uygulamalarında, reverse transkriptaz aktivitesi ile de RT-PCR uygulamalarında kullanılabilmektedir. Aynı zamanda DNA dizilemede de kullanılan en güvenilir enzimlerden biridir. Bu tez çalışmasında moleküler biyolojik uygulamalarda kullanılan en önemli enzimlerden biri olan Tth polimerazın, uygun vektör sistemi kullanılarak Escherichia coli ekspresyon sisteminde üretimi planlanmıştır. Tth polimeraz enzimine ait nükleotid dizisi biyoinformatik araçlar kullanılarak oluşturulmuş ve sentezlettirilmiştir. Elde edilen gen dizisine E. coli K12 SUŞU için kodon optimizasyonu yapılmış, pTOLT vektörüne klonlama işlemi gerçekleştirilmiştir. Klonlama işleminin doğrulanmasının ardından protein ekspresyon çalışmaları yapılmıştır. Protein ekspresyonu için E. coli BL21 pLysE hücreleri kullanılmıştır. Ekspresyon çalışmaları sonrası üretilen Tth polimeraz, SDS-PAGE analizi ile görüntülenmiş ve üretiminin gerçekleştiği doğrulanmıştır.

Abstract:
The Tth polymerase is an enzyme with a size of 834 aa and a weight of 94 kDa. Tth polymerase is frequently used in both PCR and reverse transcriptase PCR applications as well as in DNA sequencing studies and  to diagnosis in viral and bacterial infectious or fatal diseases. Reverse transcription (RT) and PCR (Reverse Transcriptase PCR) are used as tools for the diagnosis of infectious agents or genetic diseases, as well as for molecular processes such as cloning, analysis of RNA sequences and gene expression. The recombinant Tth polymerase enzyme that is planned to be produced can be used in PCR applications with polymerase activity and RT-PCR applications with reverse transcriptase activity. It is also one of the most reliable enzymes used in DNA sequencing. In this study, production of Escherichia coli expression system was planned by using appropriate vector system of Tth polymerase which is one of the most important enzymes used in molecular biological researches. The nucleotide sequence of the enzyme Tth polymerase was constructed and synthesized using bioinformatic tools. The obtained gene sequence was codon optimized for E. coli K12 strain and cloned into pET22b and pTOLT vectors. After confirmation of the cloning process, protein expression studies were carried out. E. coli BL21 plyse cells were used for protein expression. The produced Tth polymerase after expression studies was analyzed by SDS-PAGE  and the presence of the enzyme was confirmed.