Arpada Fusarium culmorum enfeksiyonuna dayanıklılığın gen anlatımı düzeyinde analizi
Analysis of the tolerance in barley to Fusarium culmorum infection at gene expression level
Yazar: AYŞE FEYZA TUFAN
Danışman: PROF. DR. AYŞE FİLİZ GÜREL ; PROF. DR. BERNA TUNALI
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Genetik = Genetics
Dizin: Moleküler genetik = Molecular genetic

Özet:
Tahıl yetiştiriciliğinin en önemli sorunlarından biri kök ve kök boğazı çürüklüğü hastalıklarıdır. Ülkemizde yapılan araştırmalarda, bu hastalıklara yol açan patojenler arasında Fusarium culmorum'un yüksek oranda bulunduğu ortaya çıkmıştır. Kök ve kök boğazı çürüklüğü hastalıkları, özellikle arpa ve buğday bitkilerinde önemli ürün kayıplarına yol açmakta ve ürün kalitesini düşürmektedir. Bu tez çalışmasında, Türkiye'de yetiştirilen altı arpa çeşidinde (Hordeum vulgare L. cvs. Erginel 90, Karatay 94, Martı, Tarm 92, Tokak 157/37 ve Yesevi 93) F. culmorum enfeksiyonu sonucu meydana gelen fenotipik ve fizyolojik değişimler incelendi. Enfeksiyondan 7 gün sonra, tüm çeşitlerde kök ve yaprak uzaması anlamlı derecede baskılandı. Enfekte edilen bitkilerin; kök uzunluklarıyla hastalık indeksleri ve yaş ağırlıklarındaki azalmaları arasında anlamlı korelasyon saptandı. Hastalık indeksi açısından, en hafif hastalık belirtileri Martı arpa çeşidinde görülürken (% 46,5) enfeksiyondan en fazla etkilenen Tokak 157/37 arpa çeşidi (% 64,9) oldu. Bu iki çeşit, fizyolojik analizler ve gen anlatımı analizleriyle, 0-96 saatlik zaman aralıklarında karşılaştırmalı olarak incelendi. Fizyolojik analizlerde, her iki çeşitte de mantar enfeksiyonu kök hücrelerinin zar bütünlüğünü etkilemezken 48. saatten sonra ozmolalite anlamlı olarak azaldı ve hidrojen peroksit üretimi anlamlı olarak arttı. 
Gen anlatımı analizleri için aday genler belirlemede, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi'nde bulunan, anlatım yapan işaretlenmiş dizi (EST) veri tabanı kullanılarak F. culmorum ile enfekte edilmiş arpa kök dokularının cDNA'larından oluşturulmuş EST'ler analiz edildi. 2294 EST; 359 kontig ve 1260 singletona gruplandırıldı. Bu dizilerden 674 tanesinde bir ya da daha fazla gen ontolojisi sınıflandırması bulundu. Gen ontolojisi terimleri arasında; 157 dizi strese yanıt (biyolojik süreç), 207 dizi iyon bağlama (moleküler işlev) ve 160 dizi plastid (hücresel bileşen) ile ilişkiliydi. Enzim komisyonu dağılımına göre 94 dizi transferaz ve 70 dizi hidrolazlarla ilişkiliydi. Yolak haritalaması (KEGG) sonucunda ise 369 dizi 83 yolak ve 264 enzim ile ilişkili olarak bulundu. Bu diziler arasından, stresle ilişkili genlerden HvBAS1, HvMT2 ve HvLOX1 gen anlatımı analizlerinde kullanıldı.
Antioksidan ilişkili genler olan HvCu/ZnSOD, HvGST6, HvAPX ve HvBAS1'in her iki çeşitte de konstitütif ve güçlü bir şekilde anlatım yaptığı gözlendi. Buna karşın, HvCAT2 ise enfeksiyondan önce tespit edilemezken enfeksiyonu takiben düşük miktarlarda anlatım yaptı. HvMT2, HvLOX1 ve HvWRKY12 genlerinde her iki çeşitte de enfeksiyonu takiben farklı anlatım şablonları gözlendi. Patogenezle ilişkili genlerden HvPR1, HvPR3, HvPR4, HvPR5 ve HvPR10 enfeksiyonu izleyen farklı zaman aralıklarında indüklenirken en yüksek anlatım seviyeleri 48-96. saatlerde tespit edildi. HvPR1, HvPR3 ve HvPR10 genleri kontrol gruplarında tespit edilemezken bu genlerin enfeksiyona yanıt olarak anlatım yaptığı gözlendi. Analiz edilen genler arasında HvPR4'teki transkript birikimi en yüksek seviyedeyken, HvPR10 anlatımı minimal seviyedeydi. Bu çalışma, Türkiye'de ekilen arpa çeşitlerinin F. culmorum toleransı ile ilgili ilk fizyolojik ve moleküler bulguları vermesi nedeniyle öncül bir çalışma niteliğindedir.

Abstract:
One of the most serious problems in cereal breeding is root and crown rot diseases. In the surveys carried out in our country, Fusarium culmorum was found to be highly prevalent among the fungi that cause these diseases. Root and crown rot diseases cause significant yield losses and reduce yield quality, particularly in barley and wheat plants. In this thesis study, the phenotypic and physiologic changes were examined upon F. culmorum infection in six varieties (Hordeum vulgare L. cvs. Erginel 90, Karatay 94, Martı, Tarm 92, Tokak 157/37, and Yesevi 93) which are bred in Turkey. Elongation of the root and shoot lengths were significantly suppressed at 7 days after infection in all varieties. Significant correlations were found between root length and both disease index and reduction in the fresh weight among infected plants. Based on the disease index values, Martı barley variety showed milder disease symptoms (46.5 %) while Tokak 157/37 barley variety was the most severely affected (64.9 %) upon infection. These two varieties were comparatively assessed at 0-96 hourly time points with physiologic and gene expression analyses. In physiologic analyses, fungal infection did not affect the membrane integrity of root cells whereas osmolality was significantly decreased and hydrogen peroxide production was significantly increased after 48 hours in both varieties. 
In order to identify candidate genes for gene expression analyses, expressed sequence tags (ESTs) derived from F. culmorum infected barley root tissues cDNAs were analyzed by use of the EST database available at National Center for Biotechnology Information. The 2294 ESTs were assembled into 359 contigs and 1260 singletons. 674 of the sequences were assigned to at least one gene ontology classification. Within gene ontology terms, 157 sequences were related with response to stress (biological process), 207 with ion binding (molecular function), and 160 with plastid (cellular component). According to enzyme commission distribution, 94 sequences were transferases and 70 sequences were hydrolases. Based on pathway mapping (KEGG), 369 sequences were assigned to 83 pathways and 264 enzymes. Within these sequences, stress related genes HvBAS1, HvMT2 and HvLOX1 were used in gene expression analyses.
Antioxidant related genes, HvCu/ZnSOD, HvGST6, HvAPX, and HvBAS1 were constitutively and strongly expressed in each variety. However, HvCAT2 transcript accumulation were not detected before infection and was slightly seen upon infection. Different expression patterns of HvMT2, HvLOX1, and HvWRKY12 were observed following the infection in both varieties. Pathogenesis related genes HvPR1, HvPR3, HvPR4, HvPR5, and HvPR10 were induced at different time points of infection and the highest transcript levels were detected at 48-96 hours. HvPR1, HvPR3, and HvPR10 genes were not detected in control groups, whereas these genes were expressed in response to infection. Among the analyzed genes, the transcript accumulation of HvPR4 was the highest while HvPR10 was expressed in minimal levels. This study is a preliminary study that reports first physiologic and molecular results about F. culmorum tolerance of barley breeding varieties in Turkey.