Üriner sistem enfeksiyonlarının hızlı tanısında idrar örneğinin matriks aracılı lazer desorpsiyon iyonizasyon -uçuş zamanlı- kütle spektrometresi (maldi-tof MS) ile incelenmesi
Examination of urine samples by matrix-assisted laser desorption ionization-(time of fliGHT)-mass spectrometry (maldi-tof MS) in the rapid diagnosis of urinary tract infections
Yazar: ÜMMÜHAN SU TOPALCA
Danışman: DOÇ. DR. ELİF AKTAŞ
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / İstanbul Şişli Hamidiye Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Klinik Mikrobiyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Teşhis = Diagnosis ; Teşhis teknikleri-ürolojik = Diagnostic techniques-urological ; Üriner sistem = Urinary tract ; Üriner sistem enfeksiyonları = Urinary tract infections ; İdrar tahlili = Urinalysis

Özet:
Üriner sistem enfeksiyonlarının (ÜSE), önemli oranda morbidite, mortalite ve maliyet ile ilişkili olduğu gözönüne alındığında, laboratuvar tarafından hızlı ve anlamlı sonuçların elde edilmesi, uygun tedaviye erken başlanması ve gereksiz antibiyotik kullanımının önlenmesi için kritik önem taşımaktadır. ÜSE tanısında altın standart olan kültür sonuçlarının raporlanması iki-üç gün sürmektedir. Matriks Aracılı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon –Uçuş Zamanlı –Kütle Spektrometresi (MALDİ-TOF MS) mikroorganizmaların kendilerine özgü proteomik parmak izi pik kalıplarına dayanarak tanımlama yapmakta ve dakikalar içinde sonuç vermektedir. Bu çalışmada amaç, üriner sistem enfeksiyonlarının hızlı tanısı için MALDİ-TOF MS ile direkt idrar örneğinden etken mikroorganizmanın saptanmasını sağlayacak bir yöntem optimize etmek ve optimize edilen yöntemin idrar örneklerinde Gram boyama ile birlikte kullanımının etkinliğini değerlendirmektir. Ayrıca, idrar örneğindeki lökosit yoğunluğu ve bakteri sayısının MALDI-TOF MS ile tanımlamaya etkisi değerlendirilecektir.
Bu çalışmada, T.C. Sağlık Bilimleri Üniversitesi Şişli Hamidiye Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarına Nisan 2016-Aralık 2016 tarihleri arasında rutin kültür için gönderilen 600 idrar örneği prospektif olarak incelenmiştir. Çalışma, iki aşamalı olarak tasarlanmıştır. Birinci aşamada kültürde ≥105 CFU/ml saf üreme gözlenen ve +40C'de saklanmış olan 500 idrar örneği kullanılmış ve literatürde tanımlanmış yöntemlerden yola çıkılarak MALDİ-TOF MS ile direkt idrar örneğinden etken mikroorganizmanın saptanması için bir yöntem optimizasyon çalışması yapılmıştır. Yöntem optimizasyonu için  3 ml idrar örneğinin çeşitli santrifüj basamakları ve  %0.1 sodyum dodezil sülfat (SDS) ile muamelesi sonrası ektraksiyon yapılmadan MALDI-TOF MS ile test edilmesi prensibine dayanan bir protokol esas alınmıştır. Bu aşamada, kullanılan idrar miktarı (1.5, 3 ve 5 ml), SDS konsantrasyonu (%0.1 ve %1), deterjan etkili madde (SDS ve Tween-80), MALDI-TOF MS ile değerlendirme öncesi ekstraksiyon işlemi (ekstraksiyon yapılmadan, formik asit ekstraksiyonu ve etanol-formik asit ekstraksiyonu ile) ve çalışma öncesinde idrar örneğinin inkübe edilmesinin sonuca etkisi araştırılmıştır.İkinci aşamada Gram boyama sonucunda tek morfolojide mikroorganizma görülen 100 idrar örneği kullanılmış ve idrar örnekleri kültürle eş zamanlı olarak ilk basamakta optimize edilen yöntem kullanılarak  MALDİ-TOF MS ile test edilmiştir. Ayrıca, çalışmanın her bir basamağındaki değişkenler için, MALDI-TOF MS kullanılarak kültürle uyumlu mikroorganizma tanımlanması ile lökosit yoğunluğu ve koloni sayısı arasındaki ilişkiler incelenmiştir.
Birinci aşama sonucunda; MALDİ-TOF MS ile mikroorganizma tanımlama oranlarının 3 ml ve 5 ml idrar örneği ile benzer ve 1.5 ml'den daha iyi, %0.1 ve %1 SDS konsantrasyonları ile benzer,  SDS ve Tween-80 için benzer,   formik asit ve etanol formik asit ekstraksiyonu ile ekstraksiyon yapılmadığı durumdan daha iyi, örneğin direkt işleme alınması ile inkübasyon sonrası işleme alınması durumunda benzer olduğu görülmüştür. Üç ml idrar ve %0.1 SDS kullanılarak, örneğin inkübasyonu yapılmadan, formik asit ekstraksiyonu ile gerçekleştirilen ikinci aşamada Gram boyama ile tek tip morfolojide mikroorganizma görülen idrar örneklerinin %75'i MALDİ-TOF MS ile direkt olarak tanımlanmıştır. 1.5 ml idrar örneği kullanıldığında lökosit yoğunluğu azaldıkça, mikroorganizmaların MALDİ-TOF MS ile tanımlanma oranının arttığı, bunun dışında çalışmanın tüm basamaklarında test edilen bütün değişkenler için bol, orta, az ve nadir lökosit içeren örneklerde, tanımlanma oranlarının birbirine yakın olduğu gözlenmiştir. Çalışmanın tüm basamaklarında test edilen bütün değişkenler için idrar örneklerinde, koloni sayısı arttıkça mikroorganizmaların tanımlanma oranının da arttığı belirlenmiştir.
Sonuç olarak; direkt idrar örneğinde Gram boyama ve MALDI-TOF-MS'in birlikte kullanımıyla kültürde ≥105 CFU/ml üreme olan örneklerin %75'inden fazlasında örneğin laboratuvara ulaşmasından sonraki iki saat içerisinde etken bakteri tanımlaması yapmak mümkün olmuştur. MALDI-TOF-MS'in direkt idrar örneğinden mikroorganizma tanımlanması için kullanımı ÜSE tanısına yeni bir perspektif kazandıracaktır.
Anahtar Kelimeler : ÜSE, idrar, Gram boyama, MALDI-TOF-MS

Abstract:
Considering that urinary tract infections (UTIs) are associated with significant morbidity, mortality and cost, it is critical to obtain rapid and meaningful laboratory results to perform early diagnosis of these infections, to initiate the appropriate treatment at earlier stages and to avoid unnecessary antibiotic use, It takes two to three days to report the culture results, which is the gold standard for diagnosis of UTI. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization- Time of Flight –Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) is based on the unique proteomic fingerprin tpeak patterns of microorganisms and gives results within minutes. The aim of this study is to optimize a method to determine the microorganism from direct urine sample with MALDI-TOF MS for the rapid diagnosis of UTI and to evaluate the effectiveness of the optimized method in combination with Gram staining in urine samples. In addition, the leukocyte density and number of bacteria in the urine sample will be evaluated for its effect on the identification by MALDI-TOF MS.
In this study, 600 urinesamples, submittedt oT.C. Sağlık Bilimleri University Sisli Hamidiye Etfal Training and Research Hospital Clinical Microbiology Laboratory for routine culture between April 2016 and December 2016, were analyzed prospectively.The study is designed in two stages. In the first stage, 500 urine samples, that had pure growth of ≥105 CFU / ml microorganisms in culture and stored at + 40C, were used and a method optimization study was conducted by the methods described in the literature to identify the microorganism from the urine sample with MALDI-TOF MS. For the method optimization, a protocol was employed that is based on the principle of testing 3 ml of urine sample with MALDI-TOF MS, without any extraction procedure,  after various centrifugation steps and treatment with 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS). At this stage, the effect of the amount of urine used (1.5, 3 and 5 ml), the concentration of SDS (0.1 and 1%), the detergent active substance (SDS and Tween-80), the extraction before the evaluation with MALDI-TOF MS (without extraction, with formic acid extraction and ethanol-formicacidextraction) and the incubation of the urine sample before testing was investigated. In these condstage, 100 urines samples, having a single morphologic microorganism by Gram staining, were tested with MALDI-TOF MS using the optimized method in the first stage simultaneously with culture. In addition, for the variables in every step of the study, the relationship between culture-compatible detection of microorganisms by MALDI-TOF MS and the leukocyte density and the number of colonies was investigated. 

The results of the first stage indicated that the identification rates of microorganisms by MALDI-TOF MS were similar for 3 ml and 5 ml urine sample while beter than 1.5 ml urine sample, were similar for 0.1% and 1% SDS concentrations, were similar for SDS and Tween-80, were better for formic acid and ethanol formic acid extraction than absence of any extractions, were same for the direct testing of the sample and post-incubation testing. In the second stage, using 3 ml of urine and 0.1% SDS, without incubation of the sample and with formic acid extraction, 75% of the samples with a single type of morphologic microorganism by Gram staining were identified by MALDİ-TOF MS. When 1.5 ml of the urine sample was used, it was observed that the identification rate of microorganisms by MALDİ-TOF MS increased as the leukocyte density decreased. Apart from that, the identification rates were close to each other in samples containing abundant, moderate, low and rare leukocytes for all variables tested in all steps of the study.For all the variables tested in all steps of the study, the identification rate of microorganisms increased as the number of colonies in the urine sample increased. 

In conclusion, by using Gram staining and MALDİ-TOF-MS in combination in direct urine sample, it is possible to identify the microorganism in more than 75% of the samples with a growth of ≥ 105CFU/ml in culture within two hours after the sample reaches the laboratory. The use of MALDI-TOF-MS for the identification of microorganisms in the direct urine sample will gain a new perspective on the diagnosis of UTI.
Keywords: UTI, urine, Gram staining, MALDI-TOF-MS