Pichia pastoris'te rekombinant insan dornaz alfa üretimi
Production of recombinant human dornase alfa in Pichia pastoris
Yazar: AYÇA URAS
Danışman: PROF. DR. MEHMET İNAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Gıda Mühendisliği Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; Deoksiribonükleaz = Deoxyribonuclease ; Fermentasyon = Fermentation ; Kistik fibroz = Cystic fibrosis ; Pichia pastoris = Pichia pastoris

Özet:
Dornaz alfa (rhDNAseI), hücre dışı DNA'nın hidrolizini katalize eden doğada bulunan sayısız nükleazlardan birisidir. Birincil rolü nükleik asitleri parçalamak olan Dornaz alfa pankreas ve tükürük bezleri tarafından salgılanmaktadır. Dornaz alfa ilk olarak 1980'lerin sonunda insan pankreasından klonlanmıştır. DNA'yı seçici bir şekilde parçalayan rekombinant Dornaz alfa, kistik fibrozis (KF) hastalığı tedavisinde kullanılmakta olup viskoz mukusta bulunan DNA'yı hidrolize ederek akciğerlerdeki vizkozitenin azaltılması şeklinde etki mekanizmasını göstermektedir. Bu çalışmada, insan kaynaklı Dornaz alfa enzimi Pichia pastoris mayasında etanol ile indüklenebilen ve güçlü bir ekspresyon seviyesine sahip olan ADH2SNT5 promotoru kontrolü altında rekombinant olarak üreten bir suş geliştirilmiştir. Oluşturulan suşun Dornaz alfa üretim potansiyelinin laboratuvar ölçeğinde araştırılması ve endüstriyel üretime uyarlanabilmesi için ölçek büyütme çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca, P. pastoris ekspresyon sistemi kullanılarak Dornaz alfa enziminin ekspresyonu ilk kez bu çalışma kapsamında gerçekleştirilmiştir.
Çalışma kapsamında öncelikle, Dornaz alfa enzimini kodlayan gen bölgesi,  sentetik ADH2SNT5 promotorunu içeren vektöre klonlanarak pADH2SNT5αDornaz alfa ekspresyon vektörü elde edilmiştir. Hücre dışına sekresyon şeklinde gerçekleştirilen enzim üretiminde konak hücre olarak, PDI şaperon proteinini 4 kopya içeren P. pastoris MK115(PDI) kullanılmıştır. Farklı plazmid kopyası içeren klonlar farklı zeosin (100-1000 µg/mL) içeren plakalardan elde edilmiştir. Seçilen farklı kopya sayısında Dornaz alfa geni içeren klonlar ile üretim koşulları (28 ˚C sıcaklıkta ve pH 6.0, 225 rpm) BMEY besiyerinde erlenmayer ölçeğinde Dornaz alfa ekspresyonu yapılmıştır. Ekspresyon sonunda, üretim suşu olarak protein üretiminin en yüksek olduğu klon tek kopya gen içeren pADH2SNT5αDornaz alfa (MK115 PDI) #10 seçilmiştir. Daha sonrasında üretim miktarının arttırılabilmesi amacıyla erlenmayer koşullarında farklı sıcaklık ve pH (20-28 ˚C ve 3-7 pH aralığı) denemeleri yapılmıştır.  Erlenmayer ölçeğinde gerçekleştirilen 96 saatlik üretim sonunda, tüm üretim şartlarından elde edilen süpernatant örnekleri ile  Dornaz alfa enzim aktivite testi yapılmış ve en yüksek verim pH 7.0 ve üretim sıcaklığı   24 ˚C olarak elde edilmiştir. Çalışmanın son aşamasında ise oluşturulan klon ile, erlenmayer ölçeğinde belirlenen bazı parametreler (sıcaklık 24 ˚C ve pH 7.0) kullanılarak minimal (FM22) ve zengin (BMGY) besiyerinde fermentör ölçeğinde üretimler gerçekleştirilerek hızlı performans sıvı kromotografi (FPLC) yöntemi ile histidin etiketli enzimin saflaştırması yapılmıştır. Saflaştırma sonrası enzim aktivite değerleri, FM22 besiyerinde yapılan biyoreaktör üretimi sonucunda, 3525.42 U/ml (13559.32 U/mg) şeklinde bulunmuşken BMGY besiyerinde yapılan üretimde 3325.42 U/ml (15254.23 U/mg) olarak tespit edilmiştir.
Çalışmanın ana hedefi, ticari olarak satılan Dornaz alfa enzimine muadil bir ürün geliştirilebilme potansiyelinin araştırılmasıdır. Bu bağlamda, yapılan bu çalışma ve ileride yapılacak olan karakterizasyon çalışmaları ile, memeli ekspresyon sistemi yerine maya hücre platformu kullanılarak ticari ürüne eşdeğer veya daha yüksek verimde bir ürün elde edilme potansiyeli mevcuttur. 

ANAHTAR KELİMELER: Dornaz alfa, fermantasyon, kistik fibrozis (KF), Pichia pastoris, rekombinant Dornaz alfa üretimi, rhDNAseI, ADH2SNT5 promotoru

Abstract:
Dornase alfa (rhDNAseI) is one of the numerous nucleases common substance in nature that catalyze the hydrolysis of extracellular DNA. Dornase alfa that primary role is to cleaves nucleic acids and secreted by the pancreas and salivary glands. Dornase alfa was first cloned from the human pancreas in the late 1980s. Recombinant Dornase alfa, which selectively cleaves DNA, is used in the treatment of cystic fibrosis (CF) disease and shows its mechanism of action in the form of reducing viscosity in the lungs by hydrolyzing DNA contained in viscous mucus. In this study, a strain was developed to produces the human Dornase alfa enzyme recombinantly under the control of the ADH2SNT5 promoter which is ethanol-inducible and has a strong expression level in Pichia pastoris yeast. Dornase alfa production potential of the created-strain was studied at laboratory scale and was carried out scale-up studies to adapt it to industrial production. In addition, the expression of the Dornase alfa enzyme was carried out in the P. pastoris expression system for the first time in this study.
In the first part of the study, the gene region encoding the Dornase alfa enzyme was cloned to the expression vector containing the synthetic ADH2SNT5 promoter region and pADH2SNT5αDornase alfa expression vector was obtained. All the production of Dornase alfa carried out as extracellular secretion in this study so P. pastoris MK115(PDI) containing 4 copies of the PDI chaperone protein was used as the host cell. Clones containing different plasmid copies were obtained from plate containing different zeocin ( 100-1000 µg/mL). Dornase alfa expression was performed in BMEY medium as erlenmayer scale with clones containing different copy numbers of Dornase alfa gene under standard production conditions (temperature of 28 ˚C and pH 6.0, 225 rpm). At the end of expression studies, pADH2SNT5αDornase alfa (MK115 PDI) #10 containing the clone single-copy Dornase alfa gene was selected as the production strain with the highest protein production. Later, different temperature and pH (20-28 ˚C and  3-7 pH range) experiments were carried out in order to increase the production amount at erlenmeyer scale. End of 96 hours of the production at erlenmayer scale, Dornase alfa enzyme activity tests were performed with the supernatant samples obtained from all the tested production conditions so production condition was determined pH 7.0 and the production temperature 24 ˚C according to the achieved highest Dornase alfa activity. In the last part of the study, some determined parameters (temperature 24 ˚C and pH 7.0) at the erlenmeyer scale were used to produce Dornase alfa in fermenter scale in minimal (FM22) and rich (BMGY) media by the created clone and the purification of histidine-labeled enzyme was performed by Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC). The enzyme activity values after purification were determined 3525.42 U/ml (13559.32 U/mg) as a result of bioreactor production in FM22 medium while it was determined as 3325.42 U/ml (15254.23 U/mg) as a result of bioreactor production in BMGY medium.
The main target of the study is to investigate potential of developing a product equivalent to the commercially available Dornase alfa enzyme. In this context with this study and future characterization studies, using the yeast cell platform instead of the mammalian expression system can create the potential for a higher yield product or equivalent to commercial product.

KEYWORDS: Dornase alfa, fermentation, cystic fibrosis (CF), Pichia pastoris, production of recombinant Dornase alfa, rhDNAseI, ADH2SNT5 promoter