Sülfoksi radikallerin ve bu radikallerin süpürme esaslı antioksidan aktivitenin kolorimetrik tayini için yöntem geliştirilmesi
Method development for colorimetric determination of sulfoxy radicals and antioxidant activity based on scavenging of these radicals
Yazar: ÇİĞDEM AŞILIOĞLU
Danışman: PROF. DR. SEMA DEMİRCİ ÇEKİÇ
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Kolorimetrik yöntemler = Colorimetric methods ; Sülfoksit = Sulfoxide

Özet:
Bir yandan yaşamımız için vazgeçilmez olan oksijen, bir yandan da solunum zincirinde çeşitli reaktif türlerininin (RS) (hidroksil radikali, süperoksit vb.) oluşumuna neden olabilmektedir. Bu türlerin vücudun savunma mekanizmasına katkıda bulunmak ve hücreler arası sinyal üretimi gibi aslında bir takım önemli işlevleri bulunsa ROS konsantrasyonunun antioksidanlarca (endojen veya eksojen) dengelenmesi zorunludur. Bu dengenin RS lehine bozunması 'oksidatif stres' olarak adlandırılmakta olup bu koşullar altında biyolojik yapıların yıkımına neden olabilecek radikalik zincir reaksiyonları oluşabilmektedir. Antioksidanlar, reaktif türleri giderebilen ve çeşitli insan hastalıklarına yol açabilecek oksidatif stres koşullarını önleyebilen sağlık açısından faydalı bileşiklerdir. Oksidatif stres ile başa çıkmanın yollarından biri antioksidan mitarı yüksek gıdaların tüketilmesidir. Örneğin meyve ve sebzelerin yapılarında antioksidan özelliklere sahip maddelerin (polifenoller ve vitaminler vb.) çok miktarda bulunduğu bilinmektedir. Dolayısıyla, farklı örneklerde antioksidan kapasitenin (veya aktivitenin) gerçekçi olarak belirlenebilmesi için duyarlı, basit ve ekonomik tayin yöntemlerinin geliştirilmesi önemlidir.
Bir yandan yaşamımız için vazgeçilmez olan oksijen, bir yandan da solunum zincirinde çeşitli reaktif türlerininin (RS) (hidroksil radikali, süperoksit vb.) oluşumuna neden olabilmektedir. Bu türlerin vücudun savunma mekanizmasına katkıda bulunmak ve hücreler arası sinyal üretimi gibi aslında bir takım önemli işlevleri bulunsa ROS konsantrasyonunun antioksidanlarca (endojen veya eksojen) dengelenmesi zorunludur. Bu dengenin RS lehine bozunması 'oksidatif stres' olarak adlandırılmakta olup bu koşullar altında biyolojik yapıların yıkımına neden olabilecek radikalik zincir reaksiyonları oluşabilmektedir. Antioksidanlar, reaktif türleri giderebilen ve çeşitli insan hastalıklarına yol açabilecek oksidatif stres koşullarını önleyebilen sağlık açısından faydalı bileşiklerdir. Oksidatif stres ile başa çıkmanın yollarından biri antioksidan mitarı yüksek gıdaların tüketilmesidir. Örneğin meyve ve sebzelerin yapılarında antioksidan özelliklere sahip maddelerin (polifenoller ve vitaminler vb.) çok miktarda bulunduğu bilinmektedir. Dolayısıyla, farklı örneklerde antioksidan kapasitenin (veya aktivitenin) gerçekçi olarak belirlenebilmesi için duyarlı, basit ve ekonomik tayin yöntemlerinin geliştirilmesi önemlidir.
Bu tez çalışmasının amacı, sülfoksi radikallerin ve bu radikallerin süpürme esaslı antioksidan aktivitenin kolorimetrik tayini için, duyarlı, ekonomik ve kolay uygulanabilen bir yöntem geliştirilmesi ve bu yöntemin standart antioksidanların sülfoksi radikallerini süpürme etkinliğinin belirlenmesine uygulanabilmesidir. Geliştirilen yöntemin tayin prensibi, bir geçiş metali olan kobaltın sülfit ile reaksiyonu sonucu ortamda oluşturulan sülfoksi radikalleri ile 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) reaktifi arasındaki reaksiyon sonucu renkli bir katyonik türün oluşturulması ve oluşan rengin şiddetinin 653 nm'de ölçülmesidir. Antioksidanlar varlığında oluşan radikalik türler süpürüleceğinden, TMB'den oluşan katyonik türde azalma olacak ve bu da absorbansta da bir azalma olarak kendini gösterecektir. Antioksidanların süpürme etkinliğinin belirlenebilmesi için denemeler seçilen standart antioksidanlar varlığında ve yokluğunda yapılmış, absorbans farkları (ΔA) hesaplanmıştır. Yapılan deneysel çalışmlar sonucunda denenen antioksidanların molar konsantrasyonları ile A arasında doğrusal bir ilişki olduğu saptanmıştır. Ayrıca referans yöntem olarak daha önce literatürde var olan Rodamin B metodu amaca uygun olarak modifiye edilmiştir. Bu yöntemde oluşan radikallerin rodamin B'nin rengini gidermesinden yararlanılmaktadır. Sentetik antioksidanların tek başlarına ve ikili ve üçlü karışımlar halinde denenmesinin ardından geliştirilrn yöntem gerçek örnek olarak yeşil çay, beyaz çay ve siyah çay örneklerinin sülfoksi radikallerini süpürme etkinliğinin belirlenmesine uygulanmıştır. Yapılan denemeler sonucunda, test edilen bir dizi antioksidan için sülfoksi radikalleri süpürme etkinliklerinin sıralaması geliştirilen metod ile Epikateşin > Kateşin > Kuersetin > Gallik asit > Ferulik asit  > Askorbik asit > L-sistein > Kafeik asit > L-glutatyon > Naringenin > p-kumarik asit  > N-asetil sistein şeklinde bulunurken bu sıralama Rodamin B yöntemi ile Epikateşin = Kateşin > Kafeik asit > Gallik asit = Ferulik asit = Askorbik asit = L-sistein > N-asetil sistein > Kuersetin > Naringenin > L-glutatyon > p-kumarik asit şeklinde belirlenmiştir. Her iki sıralama arasında birtakım farklar olamkla birlikte sonuçların birbiriyle uyumlu olduğu görülmektedir. Yine LOD değerleri karşılaştırıldığında önerilen yöntem için düşük LOD değeri epikateşin için elde edilmiş olup (3,82×10-8M), Rodamin B yöntemiyle hesaplanan LOD değeri yine epikateşin için belirlenmiş olup bu değer 3,48×10-9M şeklinde bulunmuştur.

Abstract:
On the one hand, oxygen, which is indispensable for our life, can also cause the formation of various reactive species (RS) (hydroxyl radical, superoxide, etc.) in the respiratory chain. Although these species actually have some important functions such as contributing to the body's defense mechanism and producing intercellular signals, it is imperative that the ROS concentration be balanced by antioxidants (endogenous or exogenous). The deterioration of this balance in favor of RS is called 'oxidative stress' and under these conditions, radical chain reactions causing destruction of biological structures can occur. Antioxidants have beneficial effects and can remove RS and prevent oxidative stress conditions that can cause various human diseases. One of the ways to cope with oxidative stress is to consume foods having high antioxidant content. As an example, substances having antioxidant properties (polyphenols and vitamins, etc.) are present largely in the structures of fruits and vegetables. Therefore, developing a sensitive, simple and economical determination methods for realistic measurent of antioxidant capacity (or activity) in different samples is important.
In this thesis development of a sensitive, economical and easy-to-apply colorimetric method for determination of sulfoxy radicals and sulfoxy radical scavenging-based antioxidant activity was aimed. The developed method was applied to the determination of the scavenging efficiency of standard antioxidants and real samples. The determination principle of the developed method On the one hand, oxygen, which is indispensable for our life, can also cause the formation of various reactive species (RS) (hydroxyl radical, superoxide, etc.) in the respiratory chain. Although these species actually have some important functions such as contributing to the body's defense mechanism and producing intercellular signals, it is imperative that the ROS concentration be balanced by antioxidants (endogenous or exogenous). The deterioration of this balance in favor of RS is called 'oxidative stress' and under these conditions, radical chain reactions causing destruction of biological structures can occur. Antioxidants have beneficial effects and can remove RS and prevent oxidative stress conditions that can cause various human diseases. One of the ways to cope with oxidative stress is to consume foods having high antioxidant content. As an example, substances having antioxidant properties (polyphenols and vitamins, etc.) are present largely in the structures of fruits and vegetables. Therefore, developing a sensitive, simple and economical determination methods for realistic measurent of antioxidant capacity (or activity) in different samples is important.
In this thesis development of a sensitive, economical and easy-to-apply colorimetric method for determination of sulfoxy radicals and sulfoxy radical scavenging-based antioxidant activity was aimed. The developed method was applied to the determination of the scavenging efficiency of standard antioxidants and real samples. The determination principle of the developed method was the occurrence of colored cationic species as a result of the reaction between the sulfoxy radicals formed in the reaction medium (as a result of the reaction between cobalt, which is a transition metal, and sulfide) and the 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) reagent. Then the intensity of the color formed was measeured at 653 nm. When antioxidants were present in the reaction medium, since the radical species was scavenged, decrease in the cationic species formed from TMB was realized, and it caused a decrease in absorbance. In order to determine the scavenging efficiency of antioxidants, the experiments were carried out with or without selected standard antioxidants, and absorbance differences (ΔA) were determined. In the experiments conducted, a linear relationship between antioxidant concentrations and ΔA was observed. In addition, the Rhodamine B method, which was previously available in the literature, was used as the reference method and it was modified in accordance with the purpose. The radicals formed in this method are used to decolorize Rhodamine B. After testing synthetic antioxidants individually and in combination, the methods were applied to the real samples (green tea, white tea and black tea). As a result of the experiments, the order of sulfoxy radical scavenging activities for tested antioxidants was determined by the developed method as Epicatechin > Catechin > Quercetin > Gallic acid > Ferulic acid > Ascorbic acid > L-cysteine > Caffeic acid > L-glutathione > Naringenin > p-coumaric acid > N-acetyl cysteine. On the other hand, the radical scavenging order determined by Rhodamine B method was Epicatechin = Catechin > Caffeic acid > Gallic acid = Ferulic acid = Ascorbic acid = L-cysteine > N-acetyl cysteine > Quercetin > Naringenin > L-glutathione > p-coumaric acid. Although the rankings obtained by two different methods were not completely the same, the results were highly similar. When the LOD values were compared, the lowest LOD value was obtained for epicatechin (3,82×10-8M) for the proposed method, and the LOD value calculated by the Rhodamine B method was again determined for epicatechin, and this value was found to be 3.48×10-9M.