Hypericum triquetrifolium Turra.'nın kallus ve hücre süspansiyon kültürlerinde total hiperisin içeriğinin belirlenmesi
determination of total hypericin content in callus and cell suspension cultures of Hypericum triquetrifolium Turra
Yazar: ÖZGÜR KARAKAŞ
Danışman: PROF. DR. HASAN ÇETİN ÖZEN
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Botanik = Botany
Dizin: Hypericum triquetrifolium = Hypericum triquetrifolium

Özet:
Bu çalışmanın amacı, Hypericum triquetrifolium Turra.'nın in vitro kallus ve hücre süspansiyon kültürlerinden toplam hiperisin üretimini arttırmak için etkili bir süspansiyon kültürü yöntemi geliştirmektir. Kallus ve süspansiyon kültürlerinin paketlenmiş hücre hacmi, taze ağırlık ve kuru ağırlıkları gibi büyüme parametreleri ölçülmüştür. Süspansiyon kültürlerinin gelişmesi üzerine bitki büyüme düzenleyicilerinin etkileri özellikle çalışılmıştır.İlk olarak kallus kültürü çalışmalarında ana materyal olarak kullanılacak olan en uygun eksplantın (bitki parçası) tespiti için; doğal yetişme ortamından toplanan H. triquetrifolium'un yaprak, çiçek, gövde ve kök kısımlarının total hiperisin içerikleri araştırılmıştır. En yüksek total hiperisin içeriği bitkinin yaprak kısmından elde edilirken (1.95 ± 0.0027 mg/g) en düşük hiperisin içeriği de köklerden elde edilmiştir (0.08 ± 0.0015 mg/g). Daha yüksek total hiperisin içeren yaprak parçalarından kallus oluşturmak için çeşitli hormon kombinasyonları çalışıldı. En uygun kallus oluşum oranı (% 92.3) 1 mg/l BA + 2 mg/l NAA içeren MS besi ortamından elde edildi. Bu ortamdan elde edilen kalluslar, hücre süspansiyon kültürlerinin başlatılmasında ana materyal olarak kullanıldı.Kalluslar, 1 mg/l BA + 2 mg/l NAA içeren sıvı MS ortamına alınarak süspansiyon çalışmaları başlatıldı. Hücrelerin birbirinden ayrılmasının sağlamak için süspansiyon kültürü ortamı sırasıyla 500 µm, 250 µm ve 100 µm por çapındaki süzgeçlerden geçirildi. Süspansiyon kültürlerinin büyüme parametrelerinin araştırılması için iki farklı hormon kombinasyonu kullanıldı. 1 mg/l BA+ 2 mg/l NAA içeren MS besin ortamında gelişen hücreler, kültürün 20. gününde en yüksek büyüme oranı seviyesine ulaştı, paketlenmiş hücre hacmi (PHH) 2.33 kat, yaş ağırlık 5.5 kat ve kuru ağırlık 6.30 kat artış gösterdi. 1 mg/l BA + 0.4 mg/l 2,4-D içeren MS besin ortamında gelişen hücrelerin büyüme parametreleri 1 mg/l BA + 2 mg/l NAA ortamına paralel bir artış gösterdi.H. triquetrifolium'un in vitro kültürlerinden elde edilen total hiperisin içerikleri (0.0018 ± 0.00026 mg/g) doğada yetişen bitkilerin yapraklarından (1.95 ± 0.0027 mg/g) çok daha düşük olmasına rağmen, in vitro adapte edilmiş kültürlerin hiperisin üretmeleri bu tür çalışmaların ümitvar bir sistem olduğunu göstermektedir.Anahtar kelimeler: Hypericum triquetrifolium Turra., Hiperisin, Kallus kültürü, Süspansiyon kültürü, UV -Spektrofotometresi.

Abstract:
The aim of this study was to investigate an efficient suspension culture allowing to improve total hypericin production from calli and cell suspension cultures in Hypericum triquetrifolium Turra. in vitro cultures. Growth parameters such as packed cell volume (PCV), fresh weight and dry weight were determined. The role of plant growth regulator treatments has been particularly studied on suspension culture development.To start with, it was determined that what is the most convenient explant type for the establishment of callogenesis. To do this, total hypericin content of leaves, flowers, stems and root of grown in natural habitat wild H. triquetrifolium was investigated. Among the different parts of H. triquetrifolium, the leaf showed the highest hypericin content with a concentration of 1.95 ± 0.0027 mg/g. The least hypericin content with a concentration of 0.08 ± 0.0015 mg/g was obtained from the roots of H. triquetrifolium. To induce callus formation, leaf explant excised from sterile germinated seedlings were cultured in MS medium containing the following PGR combinations: 1 mg/l BA + 2 mg/l NAA, BA (1 mg/l) + NAA (0.5 mg/l), 1 mg/l BA + 0.4 mg/l 2,4-D, BA (0.06 mg/l) + 2,4-D (0.1 mg/l), Kinetin (0.9 mg/l) + 2,4-D (3 mg/l) and Kinetin (0.4 mg/l) + 2,4-D (2 mg/l) The most suitable rate of calli formation (92.3 %) obtained from MS medium containing 1 mg/l BA + 2 mg/l NAA. Calli obtained from this medium was used as main material for the initiation of cell suspension cultures.After 3-5 subcultures, calli were inoculated into 100 ml flasks containing 25 ml MS medium without agar containing 3% sucrose, 1 mg/l BA + 2 mg/l NAA and they were maintained on a rotary shaker at 100 rpm. After 14 days in liquid culture cell aggregates were separated into three different size groups using the test sieves of mesh sizes 500 µm, 250 µm and 100 µm.Cell growth was measured by date determining, the packed cell volume (PCV-v/v). Two different PGR combination were used to investigate growth parameters at 4, 8, 12, 16 and 20 days. of suspension cultures. Growing cells in MS medium containing 1 mg/l BA + 2 mg/l NAA reached the highest growth rate on 20th day of culture and it was determined that there is an increase approximately 2.33-fold for PCV, 5.5-fold for wet weight and 6.30-fold for dry weight. MS medium containing 1mg/l BA + 0.4 mg/l 2, 4-D showed a similar increase in the growth parameters of cells in MS medium containing 1mg/ BA + 2 mg/g NAA.Although in the in vitro adapted cultures of H. triquetrifolium contain much lower amount of total hypericin (0.0018 ± 0.00026 mg/g) than in vivo grown leaves (1.95 ± 0.0027 mg/g), they appear to be promising system for hypericin production.Key words: Hypericum triquetrifolium Turra., Hypericin, Callus culture, Suspension culture, UV ?Spectrophotometer.