Androctonus crassicauda türü akrep venomundan peptid toksinlerin saflaştırılması, gen klonlanması ve hücre kültüründe biyokimyasal etkilerinin araştırılması
Purification of peptide toxins and gene cloning from the Androctonus crassicauda species scorpion venom and investigation of its biochemical effects on cell culture
Yazar: FİGEN ÇALIŞKAN
Danışman: PROF. DR. GÜNGÖR KANBAK ; PROF. DR. YALÇIN ŞAHİN
Eskişehir Osmangazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Genel Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2008
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Akrepler = Scorpions

Özet:
Androctonus crassicauda Türkiye'de halk sağlığı açısından önemli olan bir Güneydoğu Anadolu akrebidir. Bu çalışma bu türe ait bilginin çok az olması nedeniyle akrep venomunun ana bileşenlerinin tanımlanması üzerine odaklanmıştır.Bu amaçla venom HPLC'de ayrıştırılmıştır. Amino asit sekanslanması, kütle spektrometre ölçümü, cDNA kütüphanesi oluşturulması ve gen klonlanması gerçekleştirilmiştir. Ham venom ve bileşenlerin BC3H1 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisini belirlemek için MTT testi uygulanmıştır. Ham venom ve bileşenler nedeniyle oluşan hücresel ölümünün mekanizması AO boyama, DNA fragmentasyonu, hücrelerden sialik asit ve LDH salınımı yoluyla nekroz ya da apoptozun varlığı araştırılmıştır.Çok sayıda bileşen arasından molekül ağırlığı 7,620.3 Da olan bir peptid izole edilmiş ve Acra3 olarak isimlendirilmiştir. Peptidin 66 amino asit uzunluğunda ve dört disulfit köprüsü ile bağlı sekiz sistein içerdiği belirlenmiştir. Acra3'ün (0.5 ?g/20 gr) farelerdeki beyin içi enjeksiyonu şiddetli nörotoksik etkilere neden olmuş ve ölümle sonuçlanmıştır. Ayrıca ham venomdan yeni sitotoksik peptidler saflaştırılmış ve molekül ağırlıkları sırasıyla 16,356 Da, 7,422 Da ve 16,328 Da olmak üzere Ac8, Ac9 ve Ac10 olarak isimlendirilmiştir.Bu çalışma, Türk akrebi A.crassicauda'dan saflaştırılan memelilere özgün yeni bir peptid olan Acra3 'ün biyokimyasal ve moleküler tanımlanmasını ve ayrıca BC3H1 hücre hattı üzerindeki biyolojik etkisini bildirmektedir.

Abstract:
Androctonus crassicauda is one of the scorpions from the Southeastern Anatolia of Turkey with public health importance. This work is focused on the characterization of the main components of this scorpion venom, because of very little knowledge on this species.In this propose, venom was separated by HPLC. Amino acid sequencing, mass spectrometry measurement, cDNA library construction and gene cloning were performed. In order to determine the cytotoxic effects of the crude venom and fractions, MTT test was applied on BC3H1 cells. The mechanism of cell death caused by the crude venom and fractions were investigated by the occurrence of necrosis or apoptosis using AO staining, DNA fragmentation, release of sialic acids and LDH from the cells.Among the various components, a peptide with a molecular mass of 7,620.3 Da was isolated and named as Acra3. It was determine that the peptide contains 66 amino acid residues and has eight cysteine residues, crosslinked by four disulfide bridges. Intracraneal injection of Acra3 (0.5 ?g/20 g) induced severe neurotoxic events in mice leading to the death. Furthermore, new cytotoxic peptides were purified from the crude venom and named as Ac8, Ac9 and Ac10 with molecular masses of 16,356 Da, 7,422 Da and 16,328 Da respectively.This study reports the biochemical and molecular characterization of a novel mammalian specific peptide Acra3 purified from the Turkish scorpion A.crassicauda and its biological activities on BC3H1 cells.