Akut ishallerde campylobacter jejuni ve diğer etyolojik ajanların hızlı tanısında moleküler yöntemlerin değeri
The value of molecular methods in rapid diagnosis of campylobacter jejuni and the other etiologic agents in acute diarrhea
Yazar: ESRA POLAT
Danışman: PROF. DR. FATİH KÖKSAL
Çukurova Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2008
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Termofilik kampilobakterler, gelişmekte olan ülkelerde özellikle 0-2 yaş arası çocuk ishallerinin en önemli etyolojik ajanlarındandır. Yüksek mortalite ile seyreden çocukluk dönemi ishallerinde; antibiyotik kullanımı için sınırlı endikasyonlar arasında yer alan kampilobakter enfeksiyonlarının mikrobiyolojik tanısı, hasta kayıplarının en aza indirilmesi ve etkili bir tedavi planının oluşturulması açısından önemlidir. İshalli hastaların dışkı örneklerinden kampilobakterlerin tanısında kullanılan klasik kültür bazlı izolasyon ve identifikasyon yöntemleri, uygulanması zor, pahalı, zaman alıcı, düşük duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir. Bu sebeple son yıllarda klinik örneklerden kampilobakter tanısında, klasik kültür bazlı tanı yöntemlerinden daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip olan Nükleik asit amplifikasyonu bazlı moleküler yöntemler kullanılmaya başlanmıştır. Bu çalışmada ishalle seyreden hastalıklarda, dışkı örneklerinden C.jejuni ve diğer termofilik kampilobakter türlerinin tanı ve tiplendirilmesinde, konvansiyonel kültür yöntemleri ile 23S rDNA bazlı PCR-RFLP yönteminin duyarlılığının tespiti amaçlanmıştır.Bu çalışmaya, Haziran-2006 ile Ekim-2007 tarihleri arasında kalan toplam 15 aylık süre içerisinde ishalli hastalardan alınan toplam 434 dışkı örneği dahil edilmiştir.Dışkı örneklerinden kampilobakter izolasyonu için, koyun kanı içeren Skirrow sellektif agar (SSA) besiyeri, Modifiye Kampilobakter Blood- Free Selective Agar (mCCDA agar) ve CAT suplement içeren CCDA besiyeri kullanıldı.Dışkı örneklerinden QIA-Gen dışkı ekstraksiyon kiti ile elde edilen DNA ekstraktı ile seçici besiyerlerinde üreyen, kampilobakter kolonilerinden dondurup çözme? yöntemi kullanılarak elde edilen DNA ekstraktı, termofilik kampilobakter türlerinin 23S rDNA geninde yer alan 491 bp uzunluğundaki dizilerin tespiti amacı ile çoğaltıldı. Amplikonlar Alu I ve Tsp 509I restriksiyon enzimi ile kesildikten sonra, jel elektroforezinde gösterdikleri fragment profil polimorfizmine göre tür düzeyinde tanımlandı.Çalışma sonunda bu yöntemlerden en az birisi ile; 13 (% 59)'ü kadın, 9 (% 41)'u da erkek hastalara ait olmak üzere 22 (% 5,1 ) örnekde kampilobakter pozitifliği tespit edildi. Örneklerin 16 (% 3,7)'sında mCCDA ve CAT besiyerlerinde, 13 (% 3 )'ünde de SSA besiyerinde üreme görüldü. PCR-RFLP ile dışkı örneklerinden 19 (% 4,5)'unda termofilik kampilobakter türleri için spesifik olan hedef dizilerin varlığı tespit edildi.Seçici besiyerlerlerinde izole edilen 17 izolatın hippurat hidroliz testi sonuçlarına göre yapılan tiplendirilmesi sonucunda, ensık tanımlanan türün 13 (% 76,5 ) izolatla C.jejuni olduğu görüldü. Aynı izolatlar PCR-RFLP ile tiplendirildiğinde en sık tanımlanan türün 14 (% 82,4) izolat ile yine C.jejuni olduğu tesbit edildi.Dışkıdan termofilik kampilobakterlerin tanısında ve tür düzeyinde identifikasyonunda moleküler yöntemlerin daha sensitif olduğu belirlendi

Abstract:
Thermophilic Campylobacters are one of the most significant causes of diarrhea especially in children aged 0-2 in developing countries. Microbiological diagnosis of Campylobacter infections which are among limited indications for antibiotics, is important for decreasing the mortality rate and establishing an effective treatment plan against infections in childhood diarrhea with high mortality. The conventional culture based methods for isolation and identification of thermophilic Campylobacter species in patients?s stool specimens are highly difficult, time-consuming, expensive, low sensitive and low specific. For these reasons, in last decade, nucleic acid amplification based methods which are more sensitive and specific than conventional based culture methods, have been using for diagnosis of Campylobacters in clinical specimens.The aim of this study was to determine the sensitivity of selective culture methods and PCR-RFLP based on 23S rDNA for detecting and identifying Campylobacter jejuni and the other thermophilic Campylobacter species in patients with acute diarrhea.In this study, a total of 434 faecal samples obtained from patients with acute diarrhea over a fifteen-month period from June 2006 to October 2007 were investigated by culture and PCR-RFLP.The isolation of Campylobacters from faecal samples was carried out on Skirrow selective agar (SSA), modified Campylobacter blood free selective agar (mCCDA) and CCDA with CAT supplement medium.Extraction of DNA was performed with Qia-Gen stool extraction kit from faecal samples and with freeze-boil method from colonies growth on selective medium. A fragment of 491 bp of the 23s rDNA gene was amplified for identification of thermotolerant Campylobacters and amplicons were digested with restriction enzymes Alu I and Tsp 509I. The restriction fragments were separated by gel electrophoresis giving a specific banding pattern for each one of Camphylobacter species.As a result, 22 (5,1 %) stool specimens (females 13(59 %); males 9(41 %)) were found Campylobacter positive in at least one of these method 16(3,7 %)specimen were positive on mCCDA and CCDA with CAT supplement medium and 13(3 %) specimen on SSA medium. 19(4,5 %) stool specimen were found PCR positive for thermophilic Campylobacter species.The Hippurate hydrolysis test results showed that of 17 isolates growth on selective medium, 13 (76,5 %) were identified as C.jejuni as the most frequent species. 14 (82,4 %) isolates were identified as C.jejuni by PCR-RFLP