Siyatik sinir hasarında borik asit (Sodyum tetraborat) ve mezenkimal kök hücre (MKH) uygulamalarının sinir doku iyileşmesi üzerine etkisi
The effect of boric acid (Sodium tetraborate) and mesenchymal stem cell (MSC) applications on nerve tissue healing in sciatic nerve damage
Yazar: MUHAMMED AKTOPRAK
Danışman: PROF. DR. BEKİR ÇOKSEVİM
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Borik asit = Boric acid ; Elektrofizyoloji = Electrophysiology ; Hayvan deneyleri = Animal experimentation ; Kök hücreler = Stem cells ; Periferik sinir hasarları = Peripheral nerve injuries ; Sinir rejenerasyonu = Nerve regeneration ; Siyatik sinir = Sciatic nerve ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Mevcut çalışmada sıçanlarda oluşturulan deneysel siyatik sinir hasarına karşı borik asit ve mezenkimal kök hücre uygulamalarının terapötik etki potansiyelleri araştırıldı. Erciyes Üniversitesi (ERÜ) Etik Kurul Onayı ve ERÜ Bilimsel Araştırma Projeleri (BAP) Birimi desteği (TDK-2020-10073) alındıktan sonra 2-3 aylık (200-300gr ağırlığında) Erkek Wistar Albino sıçan (36 adet) kullanıldı. Deneklerden rastgele altı grup (n=6) oluşturuldu. Gruplar: (I)-Kontrol (K), (II)-Borik asit İntakt (Bİ), (III)-Borik asit Cerrahi (BC), (IV)-Akut Mezenkimal Kök Hücre (A-MKH), (V)-Geç Mezenkimal Kök Hücre (G-MKH) ve (VI)-Mezenkimal Kök Hücre+Borik Asit (MKH+B) şeklinde belirlendi. Sıçanlarda deneysel siyatik sinir hasarı cerrahi olarak anestezi altında ve siyatik sinirin nörotmezis tipi (oblik kesi) dejenerasyonu ile gerçekleştirildi. Siyatik sinirin serbest sinir uçları (proksimal ve distal) uç-uca getirilerek, epinöral dikiş ile biseps kası ve cilt sütur ile onarıldı. Pansuman sonrası sıçanlar oda sıcaklığında 7 gün süresince iyileşmeye bırakıldı. Borik asit (100 mg/kg) yaralanmadan sonra 0, 24, 48 ve 72. saatlerde intragastrik olarak sıçanlara uygulandı. 14 günlük sıçan yağ dokusundan elde edilen (36 milyon adet) mezenkimal kök hücre (MKH) uygulamaları: IV ve VI. gruplara hasar oluşturulduktan hemen sonra, V. gruba ise 14 gün sonra hasarlı siyatik sinir bölgesine 24 saat arayla ve iki doz (2x106 adet/0,5ml) şeklinde uygulandı. Peryodik aralıklarla sıçanların fiziksel (vücut boyu vücut ağırlığı, beden kitle indeksi), fizyolojik özellikleri (vücut sıcaklığı, kan glukozu ve %oksijen satürasyonu), motor fonksiyon parametreleri (denge testi, kavrama testi ve siyatik fonksiyon indeksi) tespit edildi. Sıçanlarda sinirsel hasar öncesi, sinirsel hasar sonrası ve hasardan 14 gün sonra elektrofizyolojik parametrelerden EMG, EEG, EKG ve gastrocnemius kası izotonik kontraksiyon güçleri ölçülerek değerlendirildi. Deney hayvanlarından alınan venöz kan örneklerinden ELISA yöntemi kullanılarak büyüme faktörlerinden (Nükleer Faktör Kappa B: NF-kB, Beyin Kaynaklı Büyüme Faktörü: BDNF, Nörotrofin-3: NT-3) ve sitokinlerden; İnterferon Gama (IFN-γ), Granülosit Makrofaj Koloni Uyarıcı Faktör (GM-HSF), Interlökin-1Alpha (IL-1α), Interlökin-6 (IL-6), Interlökin-18(IL-18), Interlökin-12p70(IL-12p70), Interlökin-17A (IL-17A) ve Interlökin-33 (IL-33)' in serum düzeyleri belirlendi. Deney süresince elde edilen tüm veriler SPSS 22.0 paket programı ile bilgisayar ortamında değerlendirildi ve istatistiksel anlamlılık düzeyi olarak p<0.05 kabul edildi. Çalışma bulgularımız sıçanlarda deneysel sinir hasarı sonrasında vücut ağırlığı ve BKİ düzeylerinde anlamlı azalma ve kan glukoz düzeylerinde ise belirgin düzeylerde artış tespit edildi. Motor fonksiyon test bulgularında, kavrama gücü ve denge testi bulgularında cerrahi gruplarda cerrahi işlem sonrasında anlamlı azalma tespit edildi. Siyatik fonksiyon indeksi (SFİ) düzeyi cerrahi gruplarda cerrahi işlem sonrasında %93 oranında azalırken, tedavi sonunda %74 oranında yüksek düzeyde anlamlı artış belirlendi (p<0,05). EMG verileri grup içi ve gruplara arasında cerrahi gruplarda cerrahi işlem sonrası anlamlı olarak artan latans, bileşik kas aksiyon potansiyeli (BKAP) toplam yanıt süresi tedavi süreci sonunda düşüşü, cerrahi işlem sonrasında azalan izotonik kasılma gücünün tedavi süreci sonunda artışı anlamlı bulundu (p<0,05). EEG verileri ortalama güç potansiyeli frontal bölgede cerrahi işlem sonrasında BC ve MKH+B gruplarında anlamlı olarak azalırken, A-MKH ve G-MKH gruplarında anlamlı artış, parietal ve oksipital bölgelerde cerrahi gruplarda sinir hasarı öncesine göre tedavi sonunda anlamlı düşüş ve EEG amplitüdlerinde belirgin düzeyde azalma tespit edildi. EKG'de artan taşikardiye bağlı olarak sinir hasarı sonrasında cerrahi gruplarda QT, QTc ve R-R intervalleri sürelerinde anlamlı azalmalar belirlendi. Histopatolojik ve immunofloresan bulgularda cerrahi gruplar arasında aksonal atrofi, demiyelinizasyon, dejenerasyon ve nekroz oluşumunun BC grubunda en yüksek düzeyde, MKH+B grubunda ise en düşük düzeyde olduğu tespit edildi (p<0,05). Deney grupları arasında en yüksek apoptozis düzeyinin tespit edildiği grup BC olurken, en düşük apoptozis MKH+B grubunda tespit edildi (p<0,05). Borik asit uygulanan Bİ ve BC gruplarına kıyasla MKH ile borik asit kombinasyonu uygulanan grupta (MKH+B) serum NF-kB düzeyleri anlamlı düzeyde (p<0,05) artış gösterdi. Sonuç olarak; borik asit ve mezenkimal kök hücre uygulanan gruplarda sinir rejenerasyonu, reinnervasyonu, kasılma performansı ve motor fonksiyonlarda iyileşme ile nörolojik ve histopatolojik açılardan olumlu etkiler gözlendi. Bulgularımız doğrultusunda, MKH uygulamalarının rejenerasyondaki olumlu etkilerinin borik asit desteği ile artırılabileceği değerlendirildi.

Anahtar Kelimeler: Siyatik sinir yaralanması; Borik asit; Mezenkimal kök hücre; Elektrofizyoloji; Apoptozis; Sıçan

Abstract:
In the present study, the potential therapeutic effects of boric acid and mesenchymal stem cell applications against experimental sciatic nerve injury in rats were investigated. After obtaining Erciyes University (ERU) EthiHS Committee Approval and ERU Scientific Research Projects (BAP) Unit support (TDK-2020-10073), 2-3 months old (weighing 200-300 g) male Wistar Albino rats (36) were used. Six groups (n=6) were randomly assigned. The groups were: (I)-Control (C), (II)-Boric acid Intact (BI), (III)-Boric acid Surgical (BC), (IV)-Acute Mesenchymal Stem Cell (MSC-A), (V)-Delayed Mesenchymal Stem Cell (MSC-D) and (VI)-Mesenchymal Stem Cell+Boric Acid (MSC+BA). Experimental sciatic nerve injury in rats was performed surgically under anesthesia and by neurotmesis-type (oblique incision) degeneration of the sciatic nerve. The free nerve endings (proximal and distal) of the sciatic nerve were brought end-to-end and repaired with epineural suture, biceps muscle, and skin suture. After dressing, the rats were allowed to heal at room temperature for seven days. Boric acid (100 mg/kg) was administered intragastrically at 0, 24, 48 and 72 hours after injury. Mesenchymal stem cell (MSC) applications obtained from 14-day-old rat adipose tissue (36 million): Groups IV and VI were administered immediately after the injury and group V was administered two doses (2x106 pieces/0.5ml) to the damaged sciatic nerve area every 24 hours 14 days later. Physical (body length, body weight, body mass index (BMI)), physiologic (body temperature, blood glucose and oxygen saturation) and motor function parameters (balance test, grip test and sciatic function index) were determined periodically. Electrophysiologic parameters EMG, EEG, ECG and gastrocnemius muscle isotonic contraction strength were measured and evaluated before, after and 14 days after neural injury. Venous blood samples obtained from the experimental animals were analyzed for growth factors (Nuclear Factor Kappa B: NF-kB, Brain-Derived Growth Factor: BDNF, Neurotrophin-3: NT-3) and cytokines; Interferon Gamma (IFN-γ), Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-HSF), Interleukin-1Alpha (IL-1α), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-18 (IL-18), Interleukin-12p70 (IL-12p70), Interleukin-17A (IL-17A) and Interleukin-33 (IL-33) were determined. All data obtained during the experiment were evaluated in a computer with SPSS 22.0 package program and p<0.05 was accepted as a statistical significance level. Our study findings showed that body weight and BMI levels decreased significantly and blood glucose levels increased significantly after experimental nerve injury in rats. There was a significant decrease in motor function test findings, grip strength and balance test findings in the operated groups after the surgical procedure. Sciatic function index (SFI) level decreased by 93% in the operated groups after the surgical procedure and increased significantly by 74% at the end of the treatment (p<0.05). According to EMG data, a significant increase in latency in the operated groups after the surgical procedure within and between groups, a significant decrease in the total response time of the compound muscle action potential (CMAP) at the end of the treatment period, and a significant increase in the isotonic contraction strength at the end of the treatment period after the surgical procedure were found to be significant (p<0.05). According to the EEG data, a significant decreased in the BC and MSC+BA groups after the surgical procedure in the frontal region in the mean power potential, a significant increased in the MSC-A and MSC-D groups, a significant decrease in the parietal and occipital regions at the end of the treatment compared to before nerve damage in the operated groups and a significant decrease in the EEG amplitudes has been observed. Significant decreases in QT, QTc and R-R interval were detected durations in the operated groups after nerve injury due to increased tachycardia in the ECG. According to histopathological and immunofluorescent findings, axonal atrophy, demyelination, degeneration and necrosis formation among operated groups were highest in BC group and lowest in MSC+BA group (p<0.05). Among the experimental groups, the highest level of apoptosis was detected in the BC group, while the lowest apoptosis was detected in the MSC+BA group (p<0.05). Serum NF-κB levels in the group treated with the combination of MSC and boric acid (MSC+BA) were significantly (p<0.05) increased compared to the Bİ and BC groups treated with boric acid. In conclusion, positive effects in motor functions in terms of neurological and histopathological and improvement in nerve regeneration, reinnervation, and contraction performance in the groups treated with boric acid and mesenchymal stem cells were observed. In line with our findings, it was evaluated that the positive effects of MSC applications on regeneration could be increased with boric acid supplementation.

KeyworHS: Sciatic nerve injury; Boric acid; Mesenchymal Stem Cell; Electrophysiology; Apoptosis; Rat.