Metilsülfonilmetan, glukozamin ve kondroitin sülfatın LPS/IFN-? ile uyarılmış RAW 264.7 makrofaj hücrelerinde apoptoz üzerine etkileri
Effects of methylsulfonylmethane, glucosamine and chondroitin sulfate on apoptosis in LPS/IFN-? stimulated RAW 264.7 macrophage cells
Yazar: ARZU ZEYNEP KARABAY
Danışman: PROF. DR. ZELİHA BÜYÜKBİNGÖL
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Glükozamin = Glucosamine ; Hücreler = Cells ; Kondroitin = Chondroitin ; Makrofaj aktivasyonu = Macrophage activation ; Makrofajlar = Macrophages ; Nitrik oksit = Nitric oxide ; İnflamasyon = Inflammation

Özet:
Apoptoz, doku homeostazisinin düzenlenmesi gibi normal fizyolojide ve çeşitli hastalıkların patofizyolojisinde önemli rol oynayan, genetik olarak programlanmış bir hücre ölüm mekanizmasıdır. Apoptoz, içsel ve dışsal olmak üzere başlıca iki yolak aracılığı ile gerçekleşir. Birçok hücre tipinde mikrobiyal ve viral patojenlere karşı savunma mekanizması olarak iNOS enziminin aktivasyonu sonucunda sentezlenen nitrik oksit, apoptozun içsel yolak aracılı indükleyicileri arasında yer almaktadır. Nitrik oksitin kontrolsüz üretimi, apoptotik yolakların da etkin olduğu ateroskleroz, romatoid artrit, diyabet, septik şok ve multipl skleroz gibi inflammatuvar ve immün patolojilerde rol oynamaktadır. Son yıllarda, özellikle temelinde inflamatuvar bozuklukların yattığı artrit ve romatoid artrit tedavisinde yarar sağladığı öne sürülen MSM ve MSM ile kombine preparatları bulunan GA ve CS klinikte yaygın olarak kullanılmaktadır. Literatürde MSM' nin apoptotik yolaklar üzerindeki etki mekanizmalarına ilişkin yeterli bilgi bulunmamaktadır. Ayrıca, klinikte bu üç kimyasal maddenin farklı kombine formlarının kullanılıyor oluşu, tek başına sergiledikleri etkilerin yanı sıra kombine olarak uygulanmaları durumunda sergiledikleri etkilerin belirlenmesini önemli kılmaktadır. Bu çalışmada, MSM, GA ve CS' nin farklı konsantrasyonlarda tek başına ve/veya kombine uygulandıklarında LPS/IFN? ile aktive RAW 264.7 makrofajlarda apoptoz üzerine olan etkileri belirlenmiştir. Bu amaçla, nitrit düzeyleri ve hücre canlılığı tayin edilmiş ve apoptozun belirteçleri arasında yer alan kaspaz-3 aktivitesi, mitokondri membran potansiyeli ve Ann V-PI ile akım sitometrik analizler gerçekleştirilmiştir. Kimyasal maddelerin tamamı nitrit düzeyleri üzerinde inhibe edici etki göstermişler, en etkin inhibisyon 100 mM MSM ile gerçekleşmiştir. MSM' nin LPS/IFN? ile aktive RAW 264.7 makrofajlarda doz bağımlı olarak apoptotik ya da antiapoptotik olarak davrandığı, GA' nın ise uygulanan bütün dozlarda mitokondri membran potansiyelini arttırdığı, kaspaz-3 enzim aktivitesini azalttığı ve antiapoptotik etkiler gösterdiği belirlenmiştir. CS, tek başına uygulanması durumunda apoptotik belirteçler üzerine etki göstermezken MSM ve GA ile kombine formları antiapoptotik etkiler göstermiştir. Kombine formlarda gözlenen antiapoptotik etkilerin büyük ölçüde GA' nın etkisinden kaynaklanabileceği düşünülmektedir. GA' nın aktive hücrelerde nitrit düzeylerinde yarattığı inhibisyonun çok güçlü olmaması nedeniyle antiapoptotik etkilerine kısmen nitrit sentezi üzerine olan etkilerinin aracılık ettiği, bununla birlikte nitrik oksit bağımlı olmayan yolakların da görev yaptığı düşünülmektedir. MSM ve GA' nın nitrit üretimi üzerinde inhibitör etkiler sergilerken hücre canlılığı ve apoptoz üzerine birbirinden farklı etkiler göstermeleri ise makrofajlarda LPS/IFN? uyarımı ile aktive olan çok sayıda biyolojik sinyal yolağının bulunması ve sözü geçen kimyasal maddelerin olasılıkla farklı sinyal yolaklarına etkileri ile açıklanabilir. Bu nedenle MSM, GA ve CS' nin spesifik yolaklar üzerine olan etkilerini aydınlatmak üzere mekanizmaya yönelik daha ayrıntılı çalışmaların yapılması gerekmektedir.

Abstract:
Apoptosis is a genetically programmed cell death mechanism which plays important role in normal physiology such as tissue homeostasis regulation and pathophsiology of various diseases. Apoptosis occurs mainly via two pathways, intrinsic and extrinsic. iNOS enzyme activation and nitric oxide synthesis in various cell types as a defense mechanism against microbial and viral pathogens plays important role in inflammatory and immune pathologies such as atherosclerosis, rheumatoid arthritis, diabetes, septic shock and multiple sclerosis, highly and uncontrolled production of nitric oxide leads to cell death. Recently, MSM and GA and CS which are acclaimed to be beneficial for inflammatory disorders arthritis and romatoid arthritis are used widely clinically. There is limited information regarding the effect mechanisms of MSM on apoptotic pathways. Furthermore as these three chemical agents are widely prescript together, it is important to analyse the effects of MSM, GA and CS both alone and in combination. In this study, effects of different concentrations of MSM, GA and CS alone or in combination were tested on LPS/IFN? activated RAW 264.7 macrophages. Fort his purpose nitrite levels, cell viability, caspase-3 activity, mitochondria membran potential and flow cytometric analysis with Annexin V-PI cell staining was performed. All of the compounds tested inhibited nitrite levels, most potent inhibition was achieved with 100 mM MSM. MSM acted as apoptotic or antiapoptotic in LPS/IFN? activated macrophages depending on the dose tested whereas GA increased mitochondrial membrane potential, decreased caspase-3 enzyme activity and exhibited antiapoptotic effects. CS did not effect any apoptotic revealers alone, however its combination with MSM and/or GA showed antiapoptotic effects which might be largely attributed to GA. As the inhibitor effect of GA on activated cells is not potent, the antiapoptotic effects of GA is partly nitric oxide dependent however nitric oxide independent pathways are thought to be responsible. MSM and GA both inhibited NO levels but they showed opposite effects in terms of cell viability and apoptosis. This can be explained with activation of various different biological signal pathways in macrophages with LPS/IFN? and the probable effects of the chemicals on different signaling pathways. In this regard, further elaborate studies are needed to clarify the effects of MSM, GA and CS on mechanisms in specific pathways.