Lipaz enziminin Lactobacillus brevis bakterisinden saflaştırılması, karakterize edilmesi, magnetik florosil nanopartiküller yüzeyine immobilize edilmesi ve deterjan katkı maddesi olarak kullanımının araştırılması
The investigation of purification and characterization of lipase enzyme from lactobacillus brevis bacteria, its immobilization to the surface of magnetic florisil nanoparticles and its usability as detergent additive
Yazar: SEYEDEH SARA SOLEIMANI
Danışman: PROF. DR. HAYRUNNİSA NADAROĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı / Nanoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Lipaz enzimi (EC.3.1.1.3) mono, di-, triaçilgliserol yapısında bulunan hayvan bitki ve mikrobiyal yağların ana bileşen yapısının ester bağlarını hidroliz edilmesini katalizleyen enzimdir ve reaksiyon sonucunda karboksilik asitler ve alkoller oluşmaktadır.
Yaptığımız çalışmada lipaz enzimi amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE-Sefadeks iyon değişim kromatografisi ve Sephakril S 200 jel filtrasyon kromatografisi teknikleri kullanılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırma işleminin ilk basamağında %0-20 aralıklarda amonyum sülfat çöktürmesi yapılarak DEAE-Sefadeks iyon değişim kromatografisine enzim kaynağı tatbik edilmiş ve son adımda Sephakril S 200 jel filtrasyon kolonundan elde edilen lipaz enzimi L.brevis bakterisinden %37.85 verimle 135.2 kat saflaştırılmıştır. Saf lipaz enzimi florisil destek materyali, -Fe3O4 NP'leri ile magnetik hale getirildikten sonra, L-glutaraldehit ara kolu kullanılarak kovalent olarak immobilize edilmiştir. Lipaz enziminin magnetik florisil NP'lere immobilizasyonundan önce ve sonra SEM, XRD ve FTIR analizleri yapılarak immobilizasyonun karakterizasyonu yapılmıştır. Daha sonra, serbest ve immobilize lipaz enzim kinetikleri araştırılmıştır. Serbest ve immobilize lipaz enzimlerinin optimum pH değerleri 9.0, optimum sıcaklık değerleri 60°C olarak belirlenmiştir. Hem serbest hemde immobilize lipaz enzimin 50-70°C aralığında daha stabil olduğu tespit edilmiştir. SDS-PAGE jel elektroforez analizi sonucunda lipaz enziminin tek alt birimden oluştuğu ve jel filtrasyon kromatografisi sonucunda molekül ağırlığının 57 kDa olduğu belirlenmiştir. Serbest ve bağlı enzimin substrat spesifikliğini belirlemek amacıyla p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil palmitat, p-nitrofenil laurat, metil heptanoat ve metil propionat substratları ile ayrı ayrı aktivite ölçümleri yapılmış ve Lineweaver burk grafikleri çizilerek Vmax ve KM değerleri belirlenmiştir. Enzim en yüksek Vmax değerini p-nitro fenil asetat substratına karşı göstermiştir. Serbest ve immobilize lipaz enzimlerinin Vmax değerleri sırasıyla 11.75 mol/L.dak ve 16.28 mol/L.dak olarak bulunmuştur. KM değerleri ise sırasıyla 0.375 mg/mL ve 0.25 mg/mL olarak hesaplanmıştır. Serbest ve bağlı L. brevis lipaz enziminin aktivitesi üzerine CuCl2, HgCl2, FeCl2, MgCl2, ZnCl2, CaCl2 gibi metal iyonlarının etkisi araştırılmış ve bağlı enzimin serbest enzime göre metal iyonlarına karşı daha yüksek aktivite kararlılığına sahip olduğu belirlenmiştir. Serbest ve immobilize enzimin deterjan katkı maddesi olarak kullanılabilirliğinin belirlenmesi için, enzimin optimum pH ve optimum sıcaklığında zeytin yağı adsorbe edilmiş pamuklu bezler serbest lipaz, immobilize lipaz ve bir ticari deterjana (katkı maddesi olarak %0.1 (w/v) oranında) ilave edilmiş ve 60 dakika süreyle, oda sıcaklığında inkübe edilmiştir. Elde edilen bulgulardan L.brevis saflaştırılan ve immobilize edilen lipaz enziminin 45 dak sonunda sırasıyla %65 ve %75 oranlarında pamuklu bezlerden yağ giderimini sağladığı görülmüştür.

Abstract:
Lipase (EC.3.1.1.3) is enzyme that catalyze the hydrolysis s of carboxyl and ester bonds of mono, di-, tri-, and mono acyl glycerol, the main constituent of animal and plant and microbial oils and the carboxylic acids and alcohols are obtained as products from the reaction. In our work, the lipase enzyme was purified using ammonium sulphate precipitation, DEAE-Sephadex ion exchange chromatography and Sephacryl S 200 gel filtration chromatography techniques. In the first step of the purification process, ammonium sulfate precipitation was carried out at 0-20% saturation. Then, obtained product was applied to DEAE-Sephadex ion exchange chromatography and in the last step, the lipase enzyme obtained from the Sephacryl S 200 gel filtration column. Thus, lipase enzyme was purified 135.2 times and a yield of 37.85% from the L.brevis bacteria. Pure lipase enzyme was immobilized as covalently via L-glutaraldehyde arm to florisil which was magnetized using -Fe3O4 (NPs). Characterization of immobilization was performed by analyzing SEM, XRD and FTIR before and after immobilization of lipase enzyme to magnetic fluorisil NPs. Then, free and immobilized lipase enzyme kinetics were investigated. The optimum pH values were determined as 9.0, and the optimum temperature values were determined as 60°C for free and immobilized lipase enzymes, respectively. Both free and immobilized lipase enzymes were found to be more stable at 50-70°C. As a result of SDS-PAGE gel electrophoresis analysis, it was obtained that lipase enzyme was formed from the single subunit. It was determined that the molecular weight was 57 kDa using gel filtration chromatography. The bound enzyme has higher activity stability to metal ions than the free enzyme. In order to determine substrate specificity of free and immobilized enzyme, lipase activity measurements were measured using p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl palmitate, p-nitrophenyl laurate, methyl heptanoate and methyl propionate, separately. Lineweaver burk graphics were drawn and Vmax and KM values were determined using these graphics. The enzyme showed the highest Vmax value against the substrate of p-nitro phenyl acetate.The Vmax  values of the free and immobilized lipase enzymes were found to be 11.75 μmol / L.min and 16.28 μmol/L.min., respectively. KM values were calculated as 0.375 mg/mL and 0.25 mg/mL, respectively. The effects of some metal ions such as CuCl2, HgCl2, FeCl2, MgCl2, ZnCl2 and CaCl2 were determined on the activity of free and bound L. brevis lipase. It was observed that the bound enzyme had a higher activity stability againist metal ions than the free enzyme. To determine the usability of free and immobilized lipase enzyme as a detergent additive at the optimum pH and the optimum temperature of them. The olive oil adsorbed cotton cloths were treated free lipase and immobilized lipase with a commercial detergent (as an additive material at the 0.1% (w/v) rate) at room temperature during 60 minutes. From the results, free lipase and immobilized lipase enzyme were removed cotton cloth oil at rate of 65% and 75%, respectively after 45 min.