Farelerdeki polikistik over sendromu modelinde mir-21 ve mtor ilişkisinin incelenmesi
Investigation of mir-21 and mtor relation in polycystic ovary syndrome model in mice
Yazar: SİBEL DEMİRCİ DELİPINAR
Danışman: PROF. DR. İSMAİL SEÇKİN
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı / Histoloji ve Embriyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology ; Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology ; Morfoloji = Morphology

Özet:
Anovulatuvar infertilitenin en yaygın nedenlerinden biri olan polikistik over sendromu (PKOS), üreme çağındaki kadınlarda görülen kompleks bir endokrinopatidir ve çevresel faktörlerin bu hastalığın kökeni ve gelişiminde rol oynadığı bilinmektedir. Yapılan PKOS çalışmalarında, hücrenin proliferasyonu, büyümesi, metabolizması gibi süreçlerde rol oynayan bir serin/tironin kinaz olan mammalian target of rapamycin (mTOR) ile PKOS arasında bir ilişki olabileceği ortaya konulmuştur. Kodlama yapmayan küçük RNA molekülleri olan mikroRNA (miRNA)'lar da, hücre proliferasyonu, farklılaşması, apoptoz ve hormon biyosentezi gibi çeşitli hücresel, fizyolojik ve patolojik süreçlerin post transkripsiyonel düzenlenmesinden sorumludurlar. Ovaryumda eksprese edilen çok sayıda miRNA, ovaryan bozukluklardaki folikül büyümesi, atrezi, ovulasyon ve steroidogenezin düzenlenmesinde önemli rol oynamaktadırlar ve bunlardan en önemlilerinden biri miRNA-21 (miR-21)'dir. 
	Biz de buradan yola çıkarak, farelerdeki deneysel PKOS modelinde, hücresel fonksiyonlara ortak yolaklar üzerinden etki eden mTOR ve miR-21 arasındaki ilişkiyi incelemeyi hedefledik. Bunun için 42 adet 22-25 günlük dişi Balb/c fareyi 6 deney grubuna ayırdık: Kontrol grubu, PKOS Sham grubu, PKOS grubu, İnhibisyon grubu, PKOS +İnhibisyon grubu, İnhibisyon Sham grubu. Hayvanlarda PKOS oluşturmak için 20 gün boyunca 0,01 ml %95 etanol + 0,09 ml susam yağı (SY)'nda çözünmüş 6mg/100g dehidroepiandrosteron (DHEA) enjeksiyonu subkutan olarak; mTOR inhibisyonu yapmak için 0,1 ml, dimetilsülfoksit (DMSO) içerisinde çözünmüş 1 mg/100g KU-0063794 enjeksiyonu intraperitoneal olarak uygulandı. Deney sonunda hayvanlardan elde edilen serum örneklerinden ELISA (enzym-linked immunsorbent assay) yöntemi ile östrojen (E2) ve progesteron (P4)   hormon seviyeleri ölçüldü.
	Hayvanların ovaryumlarından biri, histomorfolojik incelemeler için rutin doku takibinden geçirildi ve elde edilen kesitlere Hematoksilen-Eosin (H&E) ve Masson trikrom boyaları uygulandı. İmmunohistokimyasal incelemeler için mTOR, P-mTOR (Ser-2448), P-mTOR (Ser-2481), Proliferating Cell Nuclear Protein (PCNA)  ve caspase-3 (Cas-3) primer antikorları uygulandı. RT-PCR (Real time-polymerase chain reaction) analizi için, hayvanların diğer ovaryumlarından total RNA (ribonükleik asit) izolasyonu yapıldı ve gen amplifikasyonu için mir-21 primeri kullanıldı. Çalışmadan elde edilen veriler One-Way ANOVA testi ile uygun istatistiksel metodlar kullanılarak değerlendirildi. 
	PKOS grubundaki hayvanların vücut ağırlıkları, hormon E2 ve P4 seviyeleri, PCNA, Cas-3, mTOR, P-mTOR (Ser-2448) ve P-mTOR (Ser-2481) immünreaktiviteleri kontrol grubuna göre artmıştı. mTOR inhibisyonu yapılan PKOS+İNH grubunda, vücut ağırlıkları artış göstermezken, İNH grubunda azalmıştı. mTOR inhibisyonu, GH hücre proliferasyonu ve apoptozunu da azaltmıştı. Ancak hormon seviyelerinde, kontrole yakın bir iyileşme gözlenmedi. Ayrıca mTOR inhibisyonunun, morfolojik olarak PKOS'ta gördüğümüz dejeneratif bulguları iyileştirmediği gibi, sağlıklı bir ovaryumda da ciddi bozulmalara ve anovulasyona neden olması dikkat çekiciydi.PKOS grubundaki yüksek miR-21 seviyesine, inhibisyon gruplarındaki yüksek miR-21 seviyelerinin eşlik etmesi de, mTOR inhibisyonunu, PKOS tedavisinde kullanılabilecek bir alternatif olmaktan uzaklaştırıyordu.
	Elde ettiğimiz bu verilerin, ileri çalışmalar ile birlikte, PKOS (ön)tanı ve tedavisinde geliştirilecek yöntemler için ışık tutacağını öngörüyoruz.

Abstract:
Polycystic ovary syndrome (PCOS) which is one of the most common causes of anovulatory infertility is a complex endocrinopathy affecting women in the reproductive age group and it is known that environmental factors have a role in the origin and development of this disease. In the PCOS studies, it is revealed that there may be a relation between PCOS and the mammalian target of rapamycin (mTOR) which is a serine/threonine kinase having a role in processes such as proliferation, growth and metabolism of a cell. Also, microRNAs (miRNAs) which are noncoding small RNA molecules are responsible for post-transcriptional regulation of a variety of cellular, physiological and pathological processes such as cellular proliferation, differentiation, apoptosis and hormone biosynthesis. A large number of miRNAs expressed in ovary play a crucial role in regulation of follicular growth, atresia, ovulation and steroidogenesis in ovarian disorders and one of the most important ones is miRNA-21 (miR-21).
	Starting from this point, we aim at investigating the relation between miR-21 and mTOR which affect the cellular functions through common pathways in experimental PCOS model in mice. For this experiment, we divided 42 Balb/c female mice (22-25 weeks of age) into 6 experimental groups: Control group, PCOS Sham group, PCOS group, Inhibition group, PCOS+Inhibition group, Inhibition Sham group. For 20 days, the mice were subcutaneously injected with 6mg/100g of dehydroepiandrosterone (DHEA) dissolved in 0.01 ml of 95% ethanol+0.09 ml of sesame oil (SO) in order to generate PCOS; and were intraperitoneally injected with 1 mg/100g of KU-0063794 dissolved in 0,1 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO) in order to provide mTOR inhibition. At the end of the experiment, estrogen (E2) and progesterone (P4) hormone levels of the serum samples from the mice were measured via ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). One of the ovaries of the mice was subjected to a routine tissue processing for histomorphological investigation and Hematoxylin-Eosin (H&E) and Masson's trichrome stains were applied onto the obtained section. For immunohistochemical investigations, mTOR, P-mTOR (Ser-2448), P-mTOR (Ser-2481), Proliferating Cell Nuclear Protein (PCNA) and caspase-3 (Cas-3) primer antibodies were applied. For RT-PCR (Real time-polymerase chain reaction) analysis, a total RNA (ribonucleic acid) isolation from the other ovary of the mice is performed and mir-21 primer was used for gene amplification. Data obtained from this study were evaluated via One-Way ANOVA test by using convenient statistical methods. 
	The body weights, E2 and P4 hormone levels, PCNA, Cas-3, mTOR, P-mTOR (Ser-2448) and P-mTOR (Ser-2481) immunoreactivities of the mice in PCOS group increased compared to the control group. In the PCOS+INH group performed mTOR inhibition, the body weights did not show any increase, however there was a reduction in INH group. The mTOR inhibition also reduced the GH cellular proliferation and apoptosis. However, a near-control improvement was not observed in hormone levels. Moreover, it was remarkable that the mTOR inhibition did not improve the degenerative findings morphologically seen in PCOS and it caused serious degenerations and anovulation in a healthy ovary. Accompaniment of high levels of miR-21 in inhibition groups to the high level of miR-21 in PCOS group prevented mTOR inhibition from being an alternative to be used in PCOS treatment. 
	We anticipate that these data will shed light on the methods to be developed for pre-diagnosis and treatment of PCOS along with further studies.