UPLC-ESI-MS/MS ile kinolon antibiyotiklerinin ballarda tespitine yönelik analitik yöntem geliştirilmesi
Development of UPLC-ESI-MS/MS analytical method for quinolone antibiotics analysis in honey
Yazar: İSMAİL EMİR AKYILDIZ
Danışman: PROF. DR. ECE KÖK YETİMOĞLU
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Kinolonlar, C9H7N kapalı formülüne sahip heterosiklik aromatik organik yapıda, antibakteriyel etkili bileşiklerdir. Kinolon molekülüne florun eklenmesi ile sentezlenen florokinolonlar, bakterilerin sitoplazmasına girerek DNA replikasyonunu ve DNA transkripsiyonunu bozar. Florokinolon gibi birçok antibiyotik grubunun hayvanlardaki yanlış uygulamaları sonucunda gıda maddelerinde kalıntılar oluşabilmektedir. Ballardaki ilaç kalıntılarının nedeni, arı hastalıklarının azaltılması amacıyla kovanda ilaç uygulanması veya zirai mücadelede kullanılan ilaçlardır. Antibiyotik kalıntıları genelde 'Amerikan ya da Avrupa yavru çürüğü' hastalıklarının tedavilerinde kullanılan antibiyotiklerden kaynaklanmaktadır. Kalıntı barındıran balların tüketilmesi ile halk sağlığı olumsuz yönde etkilenebilmektedir. Antibiyotik kalıntıların, kişilerde alerjik reaksiyonlara yol açmasının yanı sıra patojenik bakterilerde antibiyotik direncinin yükselmesini de teşvik ettiği bilinmektedir. Antibiyotik kalıntı seviyelerinin belirlenmesi için ELISA yöntemleri, Gaz Kromatografi ve HPLC yöntemleri geliştirilmiş ve kullanılmış olup, son senelerde LC-MS/MS teknolojileri daha hassas, özgül ve tekrarlanabilir sonuçlar vermesi dolayısı ile tercih edilmektedir. Literatür taramasında, arıcılıkta kullanılan ve ballarda kalıntısına rastlanan kinolon antibiyotiklerinin analizleri, HPLC-UV ve HPLC-FL yöntemleri ile uzun ve maliyetli saflaştırma ya da ekstraksiyon yöntemleri içerdiği ve verilerin yüksek LOQ değerlerinde, düşük geri kazanımlarda seyrettiği görülmüştür. UPLC-ESI-MS/MS sistemi kullanarak çok daha kısa süreli bir analiz yöntemi geliştirilmiş olup, numune hazırlık süreçleri minimize edilmiştir. Sıklıkla karşılaşılan siprofloksasin ve enrofloksasine ilave 19 farklı florokinolon türünün de görüntülenmesi yapılarak
multifonksiyonel bir tarama metodu 21 parametre üzerinden çok düşük limitlerde, 7 dakikalık görüntüleme süresi ile geliştirilmiştir. Balda florokinolon kalıntılarının tespiti için numune hazırlık yaklaşımı 2 farklı teknik üzerinden geliştirilmiş olup, seyrelt ve enjekte et metodu ile pratik, maliyeti düşük, kısa süreli şekilde analiz imkânı sağlanır iken, alternatif olarak, Quechers metodolojisi ile çok düşük limitlerde görüntüleme imkânı sağlayan, yüksek hassasiyetli bir numune hazırlık prosedürü geliştirilmiştir. Yapılan validasyon çalışmaları seçicilik, doğrusallık, doğruluk, kesinlik, sağlamlık ve LOD & LOQ parametreleri üzerinden değerlendirilmiş olup, seyreltme yöntemi ile 1, 2, 5, 10, 20 μg/kg, Quechers metodunda ise 0,5, 1, 2, 5, 10 μg/kg konsantrasyonlarında doğrusallık çalışmaları yapılmıştır. Geri kazanım değerleri, seyreltme metodu için %85,7 ile %112,86 arasında değişir iken, Quechers metodunda bu değerler %82,8 ile %117,8 aralığında seyretmektedir. Kesinlik çalışmalarında ise % RSD değerleri, tekrarlanabilirlik ve tekrarüretilebilirlik için, her iki metot içinde ortalama olarak %0,7 ile %13,2 aralığında gözlemlenmiştir. LOD ve LOQ değerleri, seyreltme metodu için 1,00 μg/kg iken Quechers metodu için 0,5 μg/kg olarak tespit edilmiştir. Her iki metod için de aynı kromatografik analiz parametreleri uygulanmış olup, analiz edilen toplam 50 adet bal numunesinde, 7 adet numune de enrofloksasin görüntülenmiş olup, lomefloksasin, sinoksasin, siprofloksasin, pipemidik asit ve danofloksasin diğer tespit edilen kinolon antibiyotikleridir.

Abstract:
Quinolones are antibacterial effective compounds in the heterocyclic aromatic organic structure having the closed formula C9H7N. The fluoroquinolones are synthesized by the addition of fluorine to the quinolone molecule and enter the cytoplasm of bacteria and disrupt DNA replication and DNA transcription. Many antibiotic groups, such as fluoroquinolone, are applied incorrectly to animals, which can lead to residues in foodstuffs. Medicines used in agicultural struggle and drugs applied at hives for the purpose of reducing bee diseases are the main reasons for the formation of residues in honey. Antibiotic residues are usually caused by antibiotics used in the treatment of 'american or european foulbrood' diseases in beekeeping. People's health can be affected negatively by the consumption of honeys which contain residues. Antibiotic residues may cause allergic reactions in humans, as well as increased antibiotic resistance in pathogenic bacteria. ELISA methods, gas chromatography and HPLC methods have been developed and used for the determination of antibiotic residue levels and LCMS/ MS technologies in recent years are preferred because they give more sensitive, specific and reproducible results. Research of analysis of quinolone antibiotics used in
beekeeping and honey in the literature, including HPLC-UV and HPLC-FL methods, showed that long and costly purification methods were extensively used and results were observed at low LOQ values and low recoveries. A much shorter analysis method has been developed using the UPLC-ESI-MS/MS system and sample preparation processes have been minimized. A multifunctional screening method was developed on 21 parameters at very low limits with a 7 minutes run time by screening of 19 additional fluoroquinolones in addition to the frequently encountered ciprofloxacin and Enrofloxacin. The sample preparation approach for the detection of fluoroquinolone residues in honey has been developed on two different techniques and provides practical, low cost, short time analysis by means of the dilution and injection method. Alternatively, Quechers methodology provides a high precision the sample preparation procedure has been developed. Validation studies were evaluated on selectivity, linearity, accuracy, precision, robustness/ruggedness and LOD & LOQ parameters. Concentration of 1, 2, 5, 10, 20 μg/kg by the dilution method and 0.5, 1, 2, 5, 10 μg/kg in the Quechers method were used for linearity study. The recovery values ranged from 85.7% to 112.86% for the dilution method, while these values ranged from 82.8% to 117.8% in the Quechers method. For accuracy studies,% RSD values were observed on average between 0.7% and 13.2% in both methods for reproducibility and reproducibility. LOD and LOQ values were 1.00 μg/kg for the dilution method and 0.5 μg/kg for the Quechers method. The same chromatogaphic analysis parameters were applied for both methods. Enrofloxacin was screened in 7 samples on a total of 50 honey samples analyzed, and lomefloxacin, cinoxacin, ciprofloxacin, pipemidic acid and danofloxacin were other detected quinolone antibiotics.