Nanoilaç olarak modifiye edilmiş seramidaz inhibitörlerinin in vitro kanser hücrelerinde toksik etkilerinin ve mekanizmasının araştırılması
Investigation of the toxic effects and mechanism of in vitro cancer cells of nano-drug-modified ceramidase inhibitors.
Yazar: FERDANE DANIŞMAN
Danışman: PROF. HÜSNİYE BİRMAN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Flüorourasil = Fluorouracil ; Karmofur = Carmofur ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Seramidler = Ceramides ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; İlaç formülleri = Formularies ; İlaçlar = Drugs

Özet:
Kanser sağlık alanında en fazla ilaç araştırmalarının yapıldığı ve yeni ilaçların klinik kullanımda hızla yer aldığı bir alandır. Son yıllarda nanopartikül bazlı ilaçların geliştirilmesi ile hem kanser hücrelerinde hedefe yönelik toksik etki sağlanması hem de sağlıklı hücrelerde daha düşük yan etkilerin meydana gelmesi istenmektedir. Bu amaçla hücre çoğalması ve farklılaşmasındaki sinyal iletilerinde çeşitli mekanizmaları ve molekülleri hedefleyen nanopartiküller geliştirilmektedir.
Seramidaz, seramidi sfingozin 1-fosfat ve yağ asitlerine dönüştüren bir enzimdir. Asit seramidaz aktivitesinin tümörlü hücrelerde normal hücrelerle kıyaslandığında artmış olduğu gösterilmiştir. Ayrıca seramidazların aşırı ekspresyonu tümör hücrelerini tümör nekrozis faktör ve radyasyona karşı dirençli hale getirmektedir. Bu nedenlerle seramidaz inhibitörleri antikanser ilaç geliştirilmesinde önemli hedeflerdir.  
Bu çalışmada timidilat sentetaz üzerine etkilerinin yanında, seramidaz inhibitörleri de olan, florourasil (5-FU) ve karmofur nanotaşıyıcı sistemlere yüklenerek meme kanseri hücre serilerinde (MCF-7, MDA-MB-231) ve insan kordon veni endotel hücrelerinde (HUVECs) etkileri incelenmiştir. Bu amaçla biyouyumlu nanotaşıyıcı olan rosin esteri ve Poli-Etilen Glikol (PEG) kullanılmıştır. Nanopartiküllerin karakterizasyonu Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ve Dinamik Işık Saçılımı (DLS) ile yapıldıktan sonra sitotoksik etkileri incelenmiştir. 
Elde edilen sonuçlara göre 10-100 μM konsantrasyon aralığında çalışılan nanopartiküllerin meme kanseri hücreleri üzerinde sitotoksik etkileri tespit edilmiştir. Nano 5-FU'nun ve nano karmofurun sitotoksik aktivitesinin MCF-7 hücre hattında MDA-MB-231 hücre hattına göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. 
Ayrıca çalışmamızda, MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde western blot ile yapılan protein analizinde, S1P, ASAH1 ve Bcl-2 proteinlerinin ekspresyonunda genel olarak kontrole göre azalma görülmektedir, özellikle S1P ve ASAH1 için nano karmofur'da daha yüksek oranda bir azalma söz konusudur. Çalışmamızdaki bu sonuçlara göre 5-FU ve karmofurun ASAH1 ve S1P üzerinden etki ederek hücre ölümünü gerçekleştirdiğini düşünmekteyiz. Ayrıca bu ilaçların nano taşıyıcılara yüklenmesi sonucu ASAH1ve S1P enzimlerinin sitotoksik etkilerinin de artabileceği bulgularımızda görülmektedir. Çalışmamızda sağlıklı HUVEC hücrelerinde ASAH1 ve S1P enzim seviyelerinde önemli bir değişiklik görülmemesi, nano bileşiklerimizin kanser hücreleri üzerinde kullanılabilir olduğunu desteklemektedir.

Abstract:
Cancer is an area where the most drug researches are conducted in the field of health and new drugs are rapidly introduced into clinical use. In recent years, with the development of nanoparticle based drugs, it is aimed to provide targeted toxic effects on cancer cells and lower side effects in healthy cells. For this purpose, nanoparticles targeting various mechanisms and molecules in signaling cell proliferation and differentiation are being developed.
Ceramidase is an enzyme that converts ceramide into sphingosine 1-phosphate and fatty acids. Acid ceramidase activity has been shown to be increased in tumor cells compared to normal cells. In addition, overexpression of ceramidases renders tumor cells resistant to tumor necrosis factor and radiation. For these reasons, ceramidase inhibitors are important targets in the development of anticancer drugs.
In addition to its effects on thymidilate synthetase, fluorouracil and carmofur, which are also inhibitors of ceramidase were loaded into nanotransport systems and their effects on breast cancer cell lines MCF-7, MDA-MB-231 and HUVECs were investigated. For this purpose, Rosin ester, which is a biocompatible nanocarrier, and Poly-Ethylene-Glycol were used. Cytotoxic effects of nanoparticles were investigated by SEM and DLS.
The cytotoxic effects of our nanoparticles in the range of 10-100 concentration μM on breast cancer cells were determined. The cytotoxic activity of nano 5-FU and nano carmofur was found to be higher in the MCF-7 cell line than in the MDA-MB-231 cell line.
           In our study S1P, ASAH1 enzyme levels and Bcl-2 protein expression decreased compared to control cells,  especially for S1P and ASAH1. This result was lower for nano carmofur applied cells. Therefore, we think that 5-FU and carmofur effect cell death by acting on ASAH1 and S1P. ASAH1 and S1P enzymes activity may increase when loading of these drugs into the nano carriers.
            There were no significant changes in ASAH1 and S1P enzyme levels in healthy HUVEC cells, these results suggest that our nano compounds can be used on cancer cells.