Zeferan şeftalisinden (Prunus persica L.) polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve inhibisyonu
Purification, characterization and inhibition of Polyphenol oxidase enzyme from zeferan peach (Prunus persica L.)
Yazar: EDA BECERİKLİ
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ELİF DUYGU KAYA
Iğdır Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Çalışmamızda polifenol oksidaz enzimi (PPO) Iğdır ilinin yerel bir şeftali çeşidi olan Zeferan şeftalisinden (Prunus persica L.) afinite kromatografisi metodu ile sepharose-4B-L-tirozin-p-amino benzoik asit afinite jeli kullanılarak 16,47 kat saflaştırıldı. Enzimin saflığını kontrol etmek ve molekül kütlesini tespit etmek amacı ile Doğal ve SDS poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı. Doğal elekroforez jelinin bir kısmı coomassie brillant blue R-250 ile diğer kısmı L-DOPA ile boyandı ve her ikisinde tek bant gözlendi. SDS-PAGE elektroforezi sonucunda Zeferan Şeftaliden saflaştırılan PPO'nun72,4kDa ve 41,5kDa ağırlığında iki alt birimi olduğu görüldü. Enzimin optimum pH ve sıcaklık değerleri sırası ile 6,0 ve 30oC olarak, Km ve Vmax değerleri sırası ile 13mM ve 10000U/mg protein olarak tespit edildi. Ayrıca enziminpH kararlılığı ve ısıl kararlılığı incelendi. Enzim aktivitesi üzerine gıda endüstrisinde esmerleşme ajanı olarak kullanılan askorbik asit, sodyum metabisülfit ve sitrik asit kimyasallarının inhibisyon etkileri araştırıldı. Polifenol oksidazın katekol substratı varlığında IC50 değerleri sırası ile 0,0104mM, 0,0194mM ve 1,38mM olarak belirlendi. Enzimin aynı inhibitörler için Ki değerleri sırası ile 0,015mM, 0,0142 mM ve 0,451mM olarak bulundu. Enzim aktivitesi üzerine en güçlü inhibitörün askorbik asit olduğu görüldü.

Abstract:
In this study, polyphenol oxidase enzyme obtained from Zeferan peach (Prunus persica L.) which was a local peach cultivar of Iğdır province was purified by affinity chromatography method using sepharose-4B-L-tyrosine-p-amino benzoic acid affinity gel in 16.47 fold. Natural and SDS polyacrylamide gel electrophoresis was performed to check the purity of the enzyme and to determine the molecular mass. One part of the natural electrophoresis gel was stained with coomassie brillant blue R-250 and the other part with L-DOPA and both showed a single band.SDS-PAGE electrophoresis revealed that the PPO purified from Zeferan Peach had two subunits weighing 72.4 kDa and 41.5 kDa.Optimum pH and temperature values of the enzyme were determined as 6.0 and 30 °C, Km and Vmax values were determined as 13mM and 10000U / mg protein, respectively.PH stability and thermal stability of the enzyme were also investigated.Inhibition effects of ascorbic acid, sodium metabisulfite and citric acid chemicals used as browning agents in food industry were investigated on enzyme activity.IC50 values of polyphenol oxidase in the presence of catechol substrate were determined as 0.0104mM, 0.0194mM and 1.38mM, respectively.Ki values for the same inhibitors of the enzyme were found to be 0.0122 mM, 0.0142 mM and 0.451mM, respectively.Ascorbic acid was found to be the most effective inhibitor on enzyme activity.