LipAH02-30'un saflaştırılması, karakterizasyonu ve endüstriyel kullanımı
Purification, characterization and industrial uses of LipAH02-30
Yazar: NURDAN SARAÇ
Danışman: PROF. DR. AYSEL UĞUR
Muğla Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada; yeni bir lipaz enzimi tanımlanmış ve karakterize edilmiştir. Bu enzimi üreten bakteri, toprak ve prina örneklerinden lipolitik aktiviteye sahip bakterilerin taranması sonucu izole edilmiş ve ardından Acinetobacter haemolyticus olarak tanılanmıştır. Bu suşun lipaz aktivitesi 1187 U/ml olarak tespit edilmiştir.LipAH02-30 (A. haemolyticus NS02-30 suşunun ürettiği lipaz enzimi) amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz, ultrafiltrasyon ve Sephacryl S-100 HR jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Saflaştırma katsayısı 6.25 ve verim % 8.4 olarak belirlenmiştir. Proteinin moleküler ağırlığı SDS-PAGE ile yaklaşık 282 kDa olarak tespit edilmiştir.LipAH02-30'un Km ve Vmax değerlerinin belirlenmesi amacıyla p-NPP substrat olarak kullanılmış ve bu değerler sırasıyla 0.8 mM ve 3.833 mmol/ml/dk olarak belirlenmiştir. Enzimin optimum pH değerinin 9.0 ve sıcaklık değerinin 40 ºC olduğu tespit edilmiştir. Enzim pH 5.0-11.0 arasında iyi stabilite göstermiş; 10-30 ºC arası sıcaklıklarda stabil kalmış ve 10 ºC'de 2 saatlik inkübasyon sonunda aktivitesinin % 95.41'ini korumuştur.LipAH02-30, suda faz oluşturan organik solventlerin tümünde ve faz oluşturmayan solventlerin bazılarında aktive olmuş ve stabil kalmıştır. Suda faz oluşturan organik solventler arasında en yüksek aktivite artışı, % 75 (v/v) konsantrasyonda kloroform ile 1 saat ön inkübasyon sonucunda görülmüştür. Kloroform ile muamele edilen enzimde aktivite, kloroform ile muamele edilmeyen enzime göre % 804.77 oranında artmıştır. Suda faz oluşturmayan organik solventler arasında en yüksek aktivite artışı ise % 75 (v/v) konsantrasyonda izopropanol ile 1 saat ön inkübasyonda görülmüş ve enzim aktivitesi, izopropanol ile muamele edilmeyen enzime oranla % 377.77'lik bir artış göstermiştir.Çeşitli metal iyonlarının, borik asidin, sürfaktanların, ticari deterjanların, enzim inhibitörlerinin, ağartıcıların ve proteazın LipAH02-30'un aktivitesi üzerindeki etkisi karakterize edilmiştir. Bu amaçla, enzim bu ajanlarla ön inkübasyona tabi tutulmuş ve inkübasyon sonundaki aktivite ön inkübasyona tabi tutulmayan enzim aktivitesi ile karşılaştırılmıştır. Enzim borik asit, Ni2+, Na2+, Mg2+, Ca2+ ve Fe3+ ile inkübe edildiğinde aktive olurken, Cu2+ ve Zn2+ enzim aktivitesini inhibe etmiştir. Enzim çeşitli sürfaktanlar ve düşük konsantrasyonda ticari deterjanlarla uyumluluk göstermiştir. Tween 40 enzim aktivitesini arttırmıştır. Enzim aktivitesi Triton-X 100, sodyum kolat ve Tween 20 varlığında yaklaşık % 20 oranında azalmıştır. LipAH02-30'un aktivitesi, düşük konsantrasyondaki (0.5 mg/ml veya 0.5 µl/ml) ticari deterjanların varlığında zayıf olarak etkilenmiştir. Fakat yüksek deterjan konsantrasyonları (3.5 mg/ml veya 3.5 µl/ml) enzim aktivitesini güçlü şekilde azaltmıştır. LipAH02-30, EDTA ve iodoasetik asit varlığında % 42.01 ve % 21.42'lik aktivite göstermiştir. PMSF enzim aktivitesini zayıf olarak etkilemiştir. ß- merkaptoetanol enzim aktivitesi üzerinde önemli bir etki göstermemiştir. Enzim aktivitesi SDS varlığında güçlü olarak inhibe olmuştur. LipAH02-30, düşük konsantrasyonda (% 0.1 v/v veya w/v) H2O2, sodyum perborat ve sodyum hipoklorit varlığında zayıf olarak etkilenmiş ve % 76.58, % 95.31 ve % 84.77'lik bir aktivite göstermiştir. Fakat yüksek konsantrasyonda (% 1 v/v veya w/v) ağartıcı varlığında enzim güçlü bir şekilde inhibe olmuştur.LipAH02-30, ticari proteazlara karşı bir derece stabilite göstermiştir. % 5'lik proteaz varlığında, 40 ºC'de 1 saatlik inkübasyon sonunda aktivitesinin % 43.27'sini korumuştur. Enzim +4 ºC'de yüksek derecede stabil kalmış ve 60. güne kadar depolanmada aktivitesinin % 90'ını muhafaza etmiştir. LipAH02-30 gıda kaynaklı ticari yağlara karşı aktivite göstermiştir. Enzim ayrıca yağlı mutfak atıksularındaki yağları hidrolize etme özelliğine sahiptir.LipAH02-30, yağlı atıksuların gideriminde kullanılabilecek özelliklere sahip bir enzimdir. Enzimin geniş pH ve sıcaklık aralıklarında stabilite göstermesi, çeşitli sürfaktanların, ağartıcıların, proteazın ve ticari deterjanların varlığında aktivitesini koruması, bu enzimin lipit içeren atık suların gideriminde etkili bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir. Buna ilaveten, enzimin yüksek spesifik aktiviteye sahip olması, bu enzimin yağ bakımından zengin atık suların gideriminde, düşük miktarlarda etkili ve ekonomik bir şekilde kullanımına olanak vermektedir.

Abstract:
In this study, a novel lipase was identified and characterized. The bacteria producing this enzyme were isolated by screening various soil and prina samples for lipolytic activity, and consequently was identified as Acinetobacter haemolyticus. The lipase activity of this strain was determined as 1187 U/ml.LipAH02-30 (the lipase produced by A. haemolyticus strain) was purified by ammonium sulphate precipitation, dialysis, ultrafiltration and Sephacryl S-100 HR gel filtration chromatography. This purification procedure resulted in 6.25 fold purification of lipase with 8.4% final yield. The molecular weight of the purified lipase was determined to be approximately 282 kDa by SDS-PAGE.The Km and Vmax of the enzyme were measured to be 0.8 mM and 3.833 mmol/ml/min, respectively, using p-NPP as a substrate. The optimal temperature and pH for LipAH02-30 determined as 40 ºC and 9.0, respectively. The lipase exhibited good stability between pH 5.0 and 11.0 and was stable between temperatures 10 and 30 ºC. 95% of the initial activity of the enzyme was preserved after 2 h incubation at 10 ºC.LipAH02-30 was activated by and remained stable in all of the water-immiscible and some water-miscible organic solvents used in this study. Among the water-immiscible solvents tested, the maximum activity was observed when enzyme was pre-incubated with 75% (v/v) chloroform for an hour. The activity of the enzyme treated with chloroform was increased 804.77% compare to the activity of the untreated enzyme. Among the water-miscible solvents tested, the maximum activity was observed when enzyme was pre-incubated with 75% (v/v) isopropanol for an hour and the activity increase was determined to be 377.77% in comparison to the untreated enzyme.LipAH02-30 was further characterized by determining the effects of various metal ions, surfactants, commercial detergents, enzyme inhibitors, oxidizing agents, protease and boric acid on the activity. For this purpose, the enzyme was pre-incubated with above agents and the activity of treated enzyme was compared with untreated enzyme. While pre-incubation with boric acid, Ni2+, Na2+, Mg2+, Ca2+, and Fe3+ resulted in enzyme activation, Cu2+ and Zn2+ inhibited the enzyme activity. The enzyme was compatible with various surfactants as well as commercial detergents at low concentrations. Tween 40 enhanced the enzyme activity. The enzyme activities were reduced by approximately 20% in the presence of Triton-X 100, sodium cholate and Tween 20. The activity of LipAH02-30 was slightly affected by the presence of commercial detergents at low concentrations (0.5 mg/ml or 0.5 µl/ml). However, at higher detergent concentrations (3.5 mg/ml or 3.5 µl/ml), the enzyme activity was strongly reduced. In the presence of EDTA and iodoacetic acid, LipAH02-30 activities were 42.01% and 21.42%, respectively. PMSF slightly inhibited the enzyme activity. The activity of the enzyme was not significantly affected by ß- mercaptoethanol. LipAH02-30 was strongly inhibited by SDS. LipAH02-30 was slightly affected by low concentrations (0.1% v/v or w/v) of H2O2, sodium perborate, and sodium hypochloride and the remaining activities were 76.58%, 95.31% and 84.77%, respectively. However, at higher concentrations (1.0%) these oxidizing agents resulted in strong inhibition of the enzyme.LipAH02-30 was somewhat resistant to commercial protease, retaining 43.27% of its initial activity after 1 h protease (5% v/v) treatment at 40 ºC. The enzyme was highly stable at +4 ºC displaying 90% activity even after stored for 60 days. The enzyme was active towards a number of commercial food grade oils. The enzyme was also able to hydrolyse the oils found in kitchen wastewaters.LipAH02-30 is shown to be usable for lipid-rich wastewater treatment. Since LipAH02-30 displays high stability in a wide pH and temperature ranges, and maintains its activity in the presence of various surfactants, oxidizing agents, protease and commercial detergents, it can be effectively used in treatment of lipid containing wastewaters. In addition, high specific activity of the enzyme makes it possible to use low amounts of it effectively and economically for the treatment of lipid rich wastewaters.