Kekik yağının mide kanserindeki antikanser rolünün epigenetik açıdan değerlendirilmesi
Epigenetic evaluation of thyme oil anticancer effect in gastric cancer
Yazar: FATMA SÖĞÜTLÜ
Danışman: DOÇ. DR. ÇIĞIR BİRAY AVCI
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Antikanser = Anticancer ; Fitoekstraksiyon = Phytoextraction

Özet:
Mide kanseri (MK) lokasyonu ve moleküler altyapısı bakımından heterojen bir hastalık olması sebebiyle, hastalara klinik yaklaşımı ve prognozunu karmaşık bir hale gelmektedir. MK'nın genetik altyapısına ilave olarak her geçen gün yeni prognostik değere sahip yeni epigenetik düzensizlikler keşfedilmektedir. Fakat MK başlangıcını tetikleyen driver epigenetik değişiklikler ya da genetik düzensizliklere katkıda bulunarak tümör progresyonuna katkıda bulunan epigenetik modifikasyonların özellikle sistemik olarak uygulanan kemoterapötiklerin aksine doğal bileşikler ile hedeflenmesi, MK hastaları için tedavinin yan etkisiz ve konforlu bir sürece dönüşmesi ile sonuçlanabilir. 
Origanum onites L.'nin bugüne kadar birçok farklı kanser tipinde antiproliferatif, apoptotik, antianjiyogenik, antimigratif aktivite sergileyerek antikanser etkiye sahip olduğu gösterilmiş fakat herhangi bir kanser tipinde potansiyel epigenetik modifikasyon degiştirici aktivitesi ile ilgili ve özellikle MK'deki etkisi incelenmemiştir. 
Bu çalışmada, Origanum onites L.'nin MK in vitro modeli olan AGS hücreleri ve sağlıklı mide epiteli GES1 hücreleri üzerindeki sitotoksik, apoptotik, sitostatik, DNA çift zincir kırığı üzerine etkilerinin incelenmesi, ayrıca promotör spesifik metilasyon ve histon modifikasyonlarını düzenleyici aktivitesinin ortaya çıkarılması amaçlanmıştır. 
Bu bağlamda öncelikle Ceylan 2002 ve Tayşi 2002 çeşidi olan Origanum onites L.'nin toprak üstü kısımları toplanarak 35°C'de kurutma dolabında kurutulmuş, sonrasında kurutulan yapraklardan Neo-Clavenger apareyi kullanılarak su distilasyonu yöntemi ile Origanum onites L.'nin uçucu yağı (OOEO) elde edilmiştir. Uçucu yağın komponentleri gaz kromotografisi kütle spektrofotometresi (GC-MS) ile analiz edilerek belirlenmiştir. OOEO'nın AGS ve GES1 hücrelerindeki sitotoksik etkisi WST-8 yöntemi, apoptotik etkisi Annexin V yöntemi, hücre döngüsü üzerindeki etkisi hücre döngüsü testi, DNA çift zincir kırığı γ-H2AX testi ile belirlenmiştir. Metilasyon üzerine etkisinin değerlendirilmesi için metil spesifik PCR yapılmıştır. Global histon modifikasyonlarındaki değişiklikler Histone H3 modifikasyon multiplex deney kiti ile belirlenmiştir. MK'nde bugüne kadar en fazla hedef genlerin promotör bölgesindeki aktivitesi incelenmiş iki modifikasyon seçilerek biyobelirteç niteliği taşıyan genlerin promotöründeki etkinliği EpiQuik Kromatin İmmünopresipitasyon kiti kullanılarak ChIP-PCR ile gerçekleştirilmiştir. Epigenetik değişikliklere neden olan modifikatör enzimlerin gen ekspresyonu gerçek zamanlı qRT-PCR ile değerlendirilmiştir. 
GC-MS yöntemine göre OOEO içeriğinde en yüksek orana sahip bileşenlerin Karvakrol, Gamma Terpinen, P-Simen, (+) Borneol ve Alfa Tuhen olduğu saptanmıştır. Sitotoksisite testi sonrasında 24, 48 ve 72. saatlerde AGS hücrelerinde belirlenen IC50 değerlerinin sırasıyla 28,23 μg/ml, 18,51 μg/ml ve 11,18 μg/ml olduğu, GES1 hücrelerinde ise 64,88 μg/ml, 41,36 μg/ml ve 25,92 μg/ml olduğu saptanmıştır. OOEO ile tedavi edilen AGS hücrelerinde 48. saatte tedavi edilmeyen kontrol grubuna göre apoptozda, hücre döngüsünün S ve G2/M fazı arrestinde artış meydana gelmiş ve çift zincir kırığında artış meydana gelmiştir. GES1 hücrelerinde anlamlı bir değişiklik saptanmamıştır. Metil spesifik PCR sonuçlarına göre, kekik yağı LOX, TIMP3, CDH1 ve RARB genlerinde metilasyonunda azalmaya sebep olmuştur. Global histon modifikasyonunda 22 farklı modifikasyondan 10 tanesinde OOEO kaynaklı değişklik meydana gelmiştir. ChIP-PCR sonuçlarına göre OOEO, H3K9as ve H3K27me3 modifikasyonunu tümör süpressörlerin promotör bölgesinde asetilasyonu artırarak ve metilasyonu azaltarak, onkogenlerin promotöründe ise bunun tersi şeklinde aktivite ile modifikasyonların yeniden organizasyonuna katkıda bulunmuştur. OOEO uygulaması sonrasında, histon modifikasyonu ve DNA metilasyonunda değişiklik saptanan genler ve histon modifikatör genlerin ekspresyonları elde edilen verileri destekleyecek şekilde ifadelerinde değişiklik saptanmıştır.
OOEO, neoadjuvan yada kombinatoryal uygulamalar ile mide kanserinde kullanılan geleneksel tedavi yöntemlerinin yükünü epigenetik bakımdan azaltabilir.

Abstract:
Stomach cancer (GC) is highly heterogeneous in terms of location and molecular structure, complicating the clinical management and prognosis of patients. In addition to the genetic makeup of GC, new epigenetic irregularities with predictive value are continuously being discovered. However, unlike systemically applied chemotherapeutics, targeting driver epigenetic changes triggering GC initiation or contributing to tumor progression with natural compounds can result in a less side-effect prone, safe, and more comfortable treatment for GC patients.
The Origanum onites L., which is one of the most widely cultivated species in Turkey, has been demonstrated to exhibit antiproliferative, apoptotic, antiangiogenic, and antimigrative activities in various cancer types, indicating potential anticancer effects. However, its potential epigenetic modification-modulating activity, particularly in gastric cancer, has not been discovered.
This study aims to assess the potential cytotoxic, apoptotic, cytostatic, and DNA double-strand break effects of Origanum onites L. essential oil (OOEO) on AGS cells, an in vitro model of gastric cancer, and on GES1 cells representing healthy gastric epithelium. Additionally, the impact on promoter-specific methylation and histone modifications will be investigated.
Initially, the aerial parts of Origanum onites L. from Ceylan 2002 and Tayşi 2002 varieties were collected, air-dried at 35°C, and subjected to steam distillation using the Neo-Clavenger apparatus to obtain OOEO. The essential oil components were analyzed and identified using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS).
The cytotoxic effect of OOEO on AGS and GES1 cells was determined using the WST-8 method, apoptotic effects using the Annexin V method, and its impact on the cell cycle was assessed using a cell test plus DNA reagent kit. DNA double-strand breaks were evaluated using the γ-H2AX test. Methylation-specific PCR was performed to assess its effect on methylation. Changes in global histone modifications were determined using the Histone H3 modification multiplex assay kit. The activity of biomarker genes' promoters, selected based on the most studied modification sites in GC, was assessed using ChIP-PCR with the EpiQuik Chromatin Immunoprecipitation kit. The gene expression of modifier enzymes causing epigenetic changes was evaluated using real-time qRT-PCR.
According to the GC-MS method, the highest percentage of components in OOEO was found to be Carvacrol, Gamma Terpinene, P-Cymene, (+) Borneol, and Alpha Tujene. After the cytotoxicity test, IC50 values for AGS cells were determined to be 28.23 μg/ml, 18.51 μg/ml, and 11.18 μg/ml at 24, 48, and 72 hours, respectively, and for GES1 cells, 64.88 μg/ml, 41.36 μg/ml, and 25.92 μg/ml, respectively. In OOEO-treated AGS cells, apoptosis increased at 48 hours compared to the untreated control group, and there was an increase in the S and G2/M phase arrest of the cell cycle, as well as an increase in double-strand breaks. no significant changes were observed in GES1 cells.
According to methylation-specific PCR results, thyme oil caused a decrease in methylation in LOX, TIMP3, CDH1 and RARB genes. Changes in global histone modification occurred in 10 out of 22 different modifications in OOEO. According to ChIP-PCR results, OOEO contributed to the reorganization of modifications by increasing acetylation and decreasing methylation in the promoter regions of tumor suppressors and vice versa in the promoters of oncogenes. After OOEO application, changes in the expressions of genes related to histone modification and DNA methylation were observed to support the obtained data.
OOEO, through neoadjuvant or combinatory applications, may alleviate the epigenetic burden of traditional treatment methods used in gastric cancer.