İnsan kronik myeloblastik lösemi hücre dizisi K562'de imatinibin ve silimarinin BCR-ABL1, GRB2, GAB2, AKT ve ERK gen ifadelenmelerine olan etkisinin değerlendirilmesi
The evaluation of effect of imatinib and silimarin on BCR-ABL1, GRB2, GAB2, AKT and ERK gene expression levels in human myeloid leukemia cell line K562
Yazar: BURCU YAZAR ÜNTEKİN
Danışman: DOÇ. DR. ERKAN YURTCU
Başkent Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Gen ifadesi = Gene expression ; Genler-ABL = Genes-ABL ; Lösemi-miyeloid-kronik-BCR-ABL pozitif = Leukemia-myelogenous-chronic-BCR-ABL positive ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Silimarin = Silymarin ; İmatinib mesilat = Imatinib mesilat

Özet:
KML'nin moleküler patogenezinde Philadelphia (Ph) kromozomu üzerindeki BCR-ABL1 füzyon geni rol oynar. Oluşan füzyon protein AKT, ERK ve STAT yolaklarını aktive eden bir tirozin kinaz kodlarken bu proteinin modülatörleri GRB2 (Growth factor receptor-bound protein 2) ve GAB2 (Grb-2-associated binder 2)'dir. KML tedavi protokolünde yer alan STI571 (imatinib mesilat), tirozin kinaz özelliği olan bu enzimin ATP-bağlayıcı bölgesine kompetitif inhibisyonla bağlanır. BCR-ABL1 sinyal iletiminde görevli proteinlerin tirozin fosforilasyonu inhibe olur. 
Bu çalışmada, insan KML hücre dizisi K562 hücrelerinde STI571 uygulaması ile birlikte bitkisel bir flavonoid olan silimarin uygulamasının hücre içi sinyal yolakları üzerine etkisinin belirlenmesi hedeflenmiştir. K562 hücre dizisi RPMI besiyerinde %5'lik CO2, %95 nem içeren 37 0C'lik inkübatörde çoğaltıldı. STI571 sitotoksik dozu MTT testi ile belirlendikten sonra hücrelere STI571, silimarin, STI571 ve silimarin kombinasyonu birlikte uygulandı. Kontrol grubu olarak kullanılacak hücre grubuna hiçbir uygulama yapılmadı. Belirlenen doz ve uygulama süreleri sonunda tüm hücrelerden mRNA izolasyonu yapıldı ve bunu takiben cDNA elde edildi. BCR-ABL1, GRB2, GAB2, AKT ve ERK genlerinin ifadelenme düzeyleri real-time PCR yöntemi ile belirlendi.
Sonuç olarak imatinib ve silimarin kombinasyonu uygulanan K562 hücrelerinde GAB2 ve ERK gen ifadelenme düzeylerinin azaldığı tespit edildi. Diyete ek olarak alınan silimarin aracılığıyla KML hücrelerinde imatinibin etkinliğinin artırılabileceğinin gösterilmesi ilaç dirençliliğinde rol oynayan sinyal moleküllerinin baskılanabileceğini akla getirmektedir. Bunun ileride yapılacak klinik çalışmalara ışık tutabileceğini düşünüyoruz.
Anahtar Kelimeler:  Kronik myeloid lösemi, silimarin, imatinib, BCR-ABL1, GRB2, GAB2, AKT, ERK

Abstract:
BCR-ABL1 fusion gene, located on Philedelphia (Ph) chromosome has a major role in the pathogenesis of CML. Fusion protein, the product of this translocation, encodes a tyrosine kinase that activates AKT, ERK and STAT pathways. The modulators of BCR-ABL1 fusion protein are GRB2 (Growth factor receptor-bound protein 2) and GAB2 (Grb-2-associated binder 2) in the activation of cell signalling pathways. STI571, that is given to patients in CML treatment protocol, binds to the ATP-binding domain of tyrosine kinase enyzme by competative inhibition. The tyrosine phosphorylation of the proteins, responsible of BCR-ABL1 signalling, is inhibited.
The aim of this study is to determine the effect of silimarin, a herbal flavonoid, treatment together with STI571 on human CML cell line K562 signalling pathways. K562 cells were maintained in RPMI 1640 medium, at 37°C in a 95% (v/v) humidified atmosphere of 5% (v/v) CO2. After determining the cytotoxic dose of STI571 by MTT test, cells were treated by STI571, silymarin, and combination of both STI571 and silymarin. Control group was not treated with any of the substances. After the treatment of cells with previously designated doses and times, mRNA were isolated and cDNA were synthesed. BCR-ABL1, GRB2, GAB2, AKT and ERK gene expression levels were analyzed with real-time PCR.
In conclusion, the decrease of GAB2 and ERK gene exression levels was determined in K562 cells that are treated with imatinib and silimarin combination. Silimarin as dietary supplement may increase the effect of imatinib and supress the defined cell signalling pathways on drug resistance on CML cells.
Key words: Chronic myelogenous leukemia, silymarin, imatinib, BCR-ABL1, GRB2, GAB2, AKT, ERK