Farklı frekanslarda elektromanyetik alana maruz kalan ratlarda ginseng uygulamasının kan beyin bariyeri üzerine etkisinin immünohistokimyasal, biyokimyasal, genetik açıdan değerlendirilmesi ve yapay zeka algoritmalarının mikroskop görüntülerine uygulanması
Immunohistochemical, biochemical and genetic evaluation of the effect of ginseng administration on blood brain barrier in rats exposed to different frequencies of electromagnetic field and application of artificial intelligence algorithms to microscope images
Yazar: İREM POSTACI KARAMAN
Danışman: PROF. DR. ÖZLEM COŞKUN
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
İnsan yapımı kaynaklardan gelen radyofrekans radyasyona maruziyet, ileri teknoloji çağıyla birlikte büyük ölçüde artmıştır. İyonlaştırıcı olmayan radyasyonlar, iyonlaştırıcı radyasyonlardan daha az zararlı olsa da, uzun süreli maruziyetle etkisi artmaktadır. Wi-Fi, mikrodalga fırın, TV, cep telefonu gibi rutin hayatımızın vazgeçilmez bir parçası haline gelen cihazların yaydığı elektromanyetik alanın (EMA) canlı organizmalar ve insan sağlığı üzerindeki etkileri son zamanlarda en önemli araştırma konularından biri haline gelmiştir. Dolayısıyla EMA'ya maruz kalma sonucu ortaya çıkabilecek sağlık sorunlarını incelemek ve insanlar üzerindeki etkilerini en aza indirmeye yönelik araştırma çalışmalarına ilgi artmıştır. Cihaz genellikle başa yakın tutulduğu için beyin cep telefonu kullanımından en çok etkilenen organlardan biridir. Kulakları ve başı çevreleyen yapılarda EMA maruziyeti daha yüksektir. Ayrıca beyin, mitokondriyal hasarın diğer organlara göre daha erken ve daha ciddi şekilde meydana geldiği mikrodalga radyasyona en duyarlı hedef organdır. Bu da elektromanyetik alanın beyin üzerindeki etkilerinin araştırılmasının önemini arttırmaktadır. Bu çalışmada 2100 MHz, 2450 MHz ve 2600 MHz EMA'nın kan beyin bariyeri (KBB) üzerindeki immünohistokimyasal, genetik ve biyokimyasal etkilerini ve bu etkiler üzerinde ginsengin (Panax ginseng) koruyucu rolü araştırılmıştır. İmmunohistokimyasal olarak, kan beyin bariyerinde bulunan endotel hücreleri arasındaki bağlantıyı belirlemek için Zonula occludens-1 (ZO-1) ve okludin, astrosit hasarını belirlemek için Glial fibriler asidik protein (GFAP) ve astrosit ayakçıklarında bulunan Aquaporin-4 (AQP-4) antikorları değerlendirildi. Gen ekspresyonu seviyesinde siklooksijenaz-2 (COX-2) geni ve biyokimyasal olarak BCL-2 Associated X (BAX) proteini incelendi. Ayrıca immunohistokimyasal sonuçlardan elde edilen ışık mikroskop görüntülerine önceden eğitilmiş yapay sinir ağı modelleri uygulanıp, görüntülerden hasar skoru sınıflandırması yapıldı. 

72 adet yetişkin erkek Wistar Albino rat rastgele her grupta 8 hayvan olacak şekilde ayrıldı: kontrol, sham, ginseng, 2100 MHz EMA, 2100 MHz EMA + Ginseng, 2450 MHz EMA, 2450 MHz EMA + Ginseng, 2600 MHz EMA, 2600 MHz EMA + Ginseng grubu. EMA'ya maruz kalan gruplarda 30 gün boyunca günde 1 saat maruziyet uygulandı. EMA + Ginseng gruplarında ise 30 gün boyunca EMA maruziyetine ek olarak günde 150 mg/kg Panax Ginseng gavaj yöntemiyle uygulandı. 

2100 MHz, 2450 MHz ve 2600 MHz EMA gruplarında beynin kortikal bölgesi başta olmak üzere nöronlarda dejenerasyon, vakuolizasyon, damarlarda dilatasyon ve minör ödem saptandı, ancak konjesyon gözlenmedi. 2100 MHz + Ginseng, 2450 MHz + Ginseng ve 2600 MHz + Ginseng grupları ile Sham grubunda beynin kortikal bölgesindeki nöronlardaki damarlardaki dejenerasyon, vakuolizasyon ve dilatasyonların daha hafif olduğu belirlendi. Histopatolojik hasar oluşumunda gruplar arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0,05). ZO-1 ve okludin immun pozitif hücre yoğunluğu 2100 MHz, 2450 MHz ve 2600 MHz EMA gruplarında +1 (Az) düzeyde,  2100 MHz + Ginseng, 2450 MHz + Ginseng ve 2600 MHz + Ginseng gruplarında ise immun pozitif boyanmanın +2 (Orta) olduğu belirlendi. Gruplar arasındaki farlılık istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,05). GFAP ve AQP-4 immun pozitif hücre yoğunluğu 2100 MHz, 2450 MHz ve 2600 MHz EMA gruplarında +2 (Orta) düzeyde, 2100 MHz + Ginseng, 2450 MHz + Ginseng ve 2600 MHz + Ginseng gruplarında ise immun pozitif boyanmanın şiddetinin +3 (Şiddetli) olduğu anlamlı bir artış olduğu gözlendi (p<0,05). İmmünohistokimya TUNEL metodu apoptoz değerlendirmesi sonuçlarına göre EMA uygulanan gruplarda orta düzeyde hasar gözlenirken, ginseng uygulanan gruplarda istatistiksel olarak anlamlı bir azalma gözlendi (p<0,05). Sham grubuna göre EMA gruplarının COX-2 ekspresyon seviyelerinde azalma gözlendi ancak bu azalma anlamlı değildi (0,127). 2450 MHz EMA ve 2450 MHz EMA + G grubu değerlendirildiğinde aradaki yüksek fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p=0,05). BAX protein konsantrasyonu sonuçlarına göre 2450 MHz ve 2600 MHz EMA gruplarında sham grubuna göre anlamlı bir artış görüldü (p=0,05). EMA + G uygulanan gruplarla sadece EMA maruziyeti alan gruplar karşılaştırıldığında aralarında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmedi. Ayrıca immunohistokimya TUNEL metodu mikroskop görüntülerine uygulanan konvolüsyonel sinir ağı (CNN) modelleri değerlendirmesine göre en iyi sonuç %80 eğitim + %20 test verisinde, %89,47'lik doğrulukla GoogleNet'ten elde edildi. En yüksek doğruluk değerinin elde edildiği parametreler seçildiğinde GoogleNet algoritması, veri setinde bulunmayan farklı sınıflara ait 10 yeni görüntüden 7'sini doğru sınıflara yerleştirdi. 

Sonuç olarak, EMA'nın beyin dokusunda apoptoza neden olduğu, ginsengin koruyuculuk sağladığı belirlendi. EMA gruplarında apoptoz oluşumunun yanı sıra COX-2 gen ekspresyonunun azaldığı ve BAX proteininin arttığı gözlendi. Ginsengin EMA'nın neden olduğu apoptoz sürecinde COX-2 geninin ekspresyonunu arttırarak ve BAX proteinini azaltarak zararlı etkileri azalttığı sonucuna ulaşıldı. Ginsengin beyin ve KBB üzerindeki antioksidan etkisi kanıtlandı.

Anahtar Kelimeler: Apoptoz, BAX, beyin, COX-2, elektromanyetik alan, ginseng, görüntü sınıflandırma, kan beyin bariyeri, konvolüsyonel sinir ağları, rat, yapay zeka.

Abstract:
Exposure to radiofrequency radiation from man-made sources has increased drastically with the era of advanced technology. Although non-ionizing radiations are less harmful than ionizing radiations, their effect increases with prolonged exposure. The effects of electromagnetic field (EMF) emitted by devices such as Wi-Fi, microwave oven, TV, mobile phone, which have become an indispensable part of our routine life, on living organisms and human health have recently become one of the most important research topics. Therefore, interest in research studies to examine the health problems that may arise as a result of exposure to EMF and to minimize its effects on humans has increased. Since the device is usually held close to the head, the brain is one of the organs most affected by mobile phone use. EMF exposure is higher in the structures surrounding the ears and head. In addition, the brain is the most sensitive target organ to microwave radiation, where mitochondrial damage occurs earlier and more severely than other organs. This increases the importance of investigating the effects of the electromagnetic field on the brain. 

In this study, the immunohistochemical, genetic and biochemical effects of 2100 MHz, 2450 MHz and 2600 MHz EMF on the blood brain barrier (BBB) and the protective role of ginseng (Panax ginseng) on these effects were investigated. Immunohistochemically, Zonula occludens-1 (ZO-1) and okludin were used to determine the connection between endothelial cells in the blood brain barrier. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Aquaporin-4 (AQP-4) antibodies in astrocyte footplates were evaluated to determine astrocyte damage. The cyclooxygenase-2 (COX-2) gene at the gene expression level and the BCL-2 Associated X (BAX) protein biochemically were examined. In addition, pre-trained artificial neural network models were applied to the light microscope images obtained from the immunohistochemical results, and damage score classification was made from the images.

72 adult male Wistar Albino rats were randomly divided into 8 animals in each group: control, sham, ginseng, 2100 MHz EMF, 2100 MHz EMF + Ginseng, 2450 MHz EMF, 2450 MHz EMF + Ginseng, 2600 MHz EMF, 2600 MHz EMF + Ginseng group. The groups exposed to EMF were exposed to 1 hour a day for 30 days. In EMF + Ginseng groups, on the other hand, Panax Ginseng was administered by gavage method at a dose of 150 mg/kg per day for an additional 30 days to EMF exposure.

In the 2100 MHz, 2450 MHz and 2600 MHz EMF groups, neuronal degeneration, vacuolization, dilatation of the vessels and minor edema were detected, especially in the cortical region of the brain, but no congestion was observed. It was determined that the degeneration, vacuolization and dilatation of the vessels in the neurons in the cortical region of the brain were milder in the 2100 MHz + Ginseng, 2450 MHz + Ginseng and 2600 MHz + Ginseng groups and the Sham group. The difference between the groups in the formation of histopathological damage was statistically significant (p<0.05). ZO-1 and okludin immune positive cell density was at +1 (Low) level in 2100 MHz, 2450 MHz and 2600 MHz EMF groups, while immune positive staining was +2 (Moderate) in 2100 MHz + Ginseng, 2450 MHz + Ginseng and 2600 MHz + Ginseng groups. was determined to be. The difference between the groups was statistically significant (p<0.05). GFAP and AQP-4 immune positive cell density is +2 (Moderate) in 2100 MHz, 2450 MHz and 2600 MHz EMF groups. A significant increase was observed in the 2100 MHz + Ginseng, 2450 MHz + Ginseng and 2600 MHz + Ginseng groups, with the intensity of immune positive staining +3 (severe) (p<0.05). According to the results of immunohistochemistry TUNEL method apoptosis evaluation, moderate damage was observed in EMF applied groups, while a statistically significant decrease was observed in ginseng applied groups (p<0.05). A decrease in COX-2 expression levels was observed in the EMF groups compared to the Sham group, but this decrease was not significant (0,127). When the 2450 MHz EMF and 2450 MHz EMF + G groups were evaluated, the high difference was statistically significant (p=0.05). According to the BAX protein concentration results, a significant increase was observed in the 2450 MHz and 2600 MHz EMF groups compared to the sham group (p=0.05). When the groups that received EMF + G were compared with the groups that received only EMF exposure, no statistically significant difference was observed between them. In addition, according to the evaluation of the convolutional neural network (CNN) models applied to the immunohistochemistry TUNEL method microscope images, the best result was obtained from GoogleNet with 80% training + 20% test data, with an accuracy of 89.47%. When the parameters with the highest accuracy value were selected, the GoogleNet algorithm placed 7 out of 10 new images belonging to different classes that were not in the data set into the correct classes. As a result, it was determined that EMF caused apoptosis in brain tissue and ginseng provided protection. In addition to apoptosis formation in EMF groups, COX-2 gene expression decreased and BAX protein increased. It was concluded that ginseng reduces the harmful effects by increasing the expression of the COX-2 and decreasing the BAX in the process of apoptosis caused by EMF. The antioxidant effect of ginseng on the brain and BBB has been proven.

Keywords: Apoptosis, artificial intelligence, BAX, blood brain barrier, brain, convolutional neural networks, COX-2, electromagnetic field, ginseng, image classification, rat.