Antimikrobiyal peptitlerin rekombinant olarak sentezi ve nanotaşıyıcı sistem enkapsülasyonu ile yara iyileştirme özelliklerinin incelenmesi
Synthesis of Antimicrobial Peptides Recombinantly and Investigation of Their Wound Healing Properties through Encapsulation in Nanocarrier Systems
Yazar: BİLGE ÖLÇEROĞLU
Danışman: DOÇ. DR. AHMET KATI ; DOÇ. DR. FIRAT BARIŞ BARLAS
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Hamidiye Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Amaç: Antimikrobiyal peptitler (AMP'ler), kısa yapılı, pozitif yüklü biyomoleküller olup antibiyotik direncine karşı alternatif ajanlar olarak önem kazanmaktadır. Bu çalışmada, Myxinidin peptidinin yeşil floresan protein (GFP) etiketi ile rekombinant olarak üretimi gerçekleştirilmiş ve UiO66-NH₂ MOF yapısı ile niozom yapıları aracılığıyla enkapsülasyonu sağlanmıştır. Sistemlerin karakterizasyonları yapılmış, antimikrobiyal etkileri, sitotoksisite profili ve yara iyileştirici potansiyelleri karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiştir.
Yöntem: His	-tag, sfGFP ve TEV kesim bölgesi içeren GFP-Myx dizisi, pET28(a) vektörüne klonlanarak E. coli Rosetta (DE3) hücrelerinde ekspresse edilmiştir. Ni-NTA afinite kromatografisi ile saflaştırılan protein, SDS-PAGE analiziyle doğrulanmıştır. UiO66-NH₂, 2-aminotereftalik asit ile sentezlenmiş, GFP-Myx ise EDC/NHS kimyasal bağlama yöntemiyle MOF ve niozom sistemlerine yüklenmiştir. Nanotaşıyıcı sistemler DLS, FTIR ve TEM teknikleriyle karakterize edilmiştir. L929 hücreleriyle yapılan MTT ve scratch assay testleriyle biyouyumluluk ve yara iyileşme potansiyeli incelenmiş, hücre içi dağılım floresan mikroskop ile görselleştirilmiştir.
Bulgular: GFP-Myx peptidi hem UiO66-NH₂ MOF yapısına hem de niozom yapısına başarıyla enkapsüle edilmiştir. MOF ve niozom sistemleriyle birlikte kullanılan GFP-Myx, E. coli ve S. aureus suşları üzerinde anlamlı antimikrobiyal etki göstermiştir. Enkapsülasyon sonrası sitotoksisite gözlenmemiş, hücre canlılığı artmıştır. Özellikle MOF-GFP-Myx ve Niozom-GFP-Myx gruplarında fibroblast göçü artmış, yara kapanma süreci hızlanmıştır.
Sonuç: GFP etiketi sayesinde hücre içinde izlenebilirlik kazanmış rekombinant olarak üretilen Myxinidin antimikrobiyal peptidi, hem MOF hem de niozom yapılarıyla yüksek verimle enkapsüle edilmiştir. Enkapsülasyon yapılan bu sistemler biyouyumlu, etkili ve hedefe yönelik taşınım sağlayarak biyolojik etkinliği artırmıştır. Bu sonuçlar, AMP'lerin nanoteknolojik sistemlerle entegrasyonunun yara iyileşmesi ve enfeksiyon kontrolü gibi biyomedikal alanlarda yenilikçi tedavi yaklaşımlarına kapı aralayabileceğini göstermektedir.

Abstract:
Aim: Antimicrobial peptides  are short, positively charged biomolecules that have gained prominence as alternative agents in the fight against antibiotic resistance. In this study, the Myxinidin peptide was recombinantly produced with  green fluorescent protein (GFP) tag and encapsulated using UiO66-NH₂ MOF and niosomal nanocarrier systems. The systems were characterized, and their antimicrobial activity, cytotoxicity profiles, wound healing potentials were comparatively evaluated.
Materials and Methods: The GFP-Myx construct, containing His-tag, sfGFP, and TEV protease cleavage site, was cloned into the pET28(a) expression vector and expressed in E. coli Rosetta (DE3) cells. The recombinant protein was purified using Ni-NTA affinity chromatography and verified by SDS-PAGE analysis. UiO66-NH₂ was synthesized using 2-aminoterephthalic acid, and GFP-Myx was loaded into both MOF and niosome structures via EDC/NHS coupling chemistry. The nanocarrier systems were characterized by DLS, FTIR, and TEM. Cytocompatibility and wound healing assays were performed on L929 fibroblast cells, and intracellular localization was visualized using fluorescence microscopy.
Results: GFP-Myx was successfully encapsulated into both UiO66-NH₂ MOF and niosomal systems. GFP-Myx-loaded nanocarriers exhibited significant antimicrobial activity against E. coli and S. aureus. No cytotoxicity was observed post-encapsulation; on contrary, cell viability increased. Notably, MOF-GFP-Myx and Niosome-GFP-Myx groups enhanced fibroblast migration and accelerated wound closure.
Conclusion: Recombinant GFP-tagged Myxinidin gained intracellular traceability and was efficiently encapsulated within both MOF and niosomal carriers. These nanocarrier systems demonstrated biocompatibility, enhanced bioactivity, and targeted delivery. Results suggest that  integration of AMPs with nanotechnological platforms holds promise for developing innovative therapeutic strategies in wound healing and infection control.