İnsan herpesvirus-6 DNA'sının mutlak kantitasyonunda kullanılmak üzere dijital pcr yöntemine dayalı bir test formatının geliştirilmesi
Development of a digital PCR based assay format for absolute quantification of human herpesvirus-6 DNA
Yazar: AYLİN DAĞ GÜZEL
Danışman: DOÇ. MERT AHMET KUŞKUCU
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Exanthema subitum = Exanthema subitum ; Herpesvirüs 6-insan = Herpesvirus 6-human ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Giriş ve Amaç: Human Herpesvirus-6 (HHV-6), T lenfositleri, monosit-makrofaj sistemi, epitel hücreleri ve santral sinir sistemi hücreleri gibi geniş bir hücre yelpazesini infekte eder. Primer infeksiyondan sonra, T hücreleri ve monositler başta olmak üzere konak hücrelerinin kromozomlarının subtelomerik bölgesinde latent olarak kalırlar. Bu durum aktif viral infeksiyon tanısı zorlaştırmaktadır. Özellikle AIDS, kemik iliği taansplatasyon (KİT) alıcısı veya primer ya da sekonder immün yetmezliği olan hastalarda reaktive olduklarında ensefalit ve intertisyel pnömoni gibi ciddi klinik tablolara yol açabilmektedirler. Bu tür ciddi tablolarda tanı için klinik örneklerde viral DNA'nın gösterilmesi veya virüsün izolasyonu önerilmektedir. HHV-6 ile ilişkili infeksiyonların moleküler tespiti reaktivasyonun saptanması ve tedavinin başlatılması açısından oldukça önemlidir. Yaptığımız bu tez çalışmasında HHV-6'nın tüm tiplerini yüksek duyarlılıkta kantitatif olarak saptayabilecek dijital PCR (dPCR) yöntemine dayalı bir test formatı geliştirilmesi amaçlanmıştır. Geliştirilen bu dPCR formatı ile her bir klinik örneğe uygulanacak test protokolünde dış kontrollere gereksinim olmayacağından, rutin çalışmalarda testlerin zamanında ve daha düşük maliyetle yapılabilmesine olanak sağlanacaktır.
Gereç ve Yöntem: HHV-6A ve B'yi aynı anda saptayabilecek primer serileri nBLAST ile doğrulanarak, BioEdit yazılımında hedef dizisi belirlenmiş ve hem dPCR hem de qPCR analizlerde kullanılmıştır. Geliştirilecek testin ölçüm limitini (limit of quantification, LoQ), dinamik aralığını, saptama sınırını (limit of detection, LoD), doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini belirleyebilmek için ekstrakte edilen HHV-6 DNA'sının 10'ar kat sulandırımlı ardışık 4 adet dilüsyonu herbiri birbirlerinden bağımsız üç farklı seansta üçer kez tekrarlı olarak çalışılmış ve dPCR ile qPCR testlerinin sonuçları karşılaştırılmıştır.
Sonuç: Tasarladığımız testin  kantitasyon sınırı (LoQ), analitik duyayrlılık (LoD) değeriyle aynı olup 0,53 kopya/μl olarak tespit edilmiştir. Çalışmamızın, HHV-6'ya bağlı primer ve latent infeksiyonların kantitatif monitörizasyonunun yüksek duyarlılıkta gerçekleştirilebilmesi ve erken tedavi protokolü hazırlanmasına katkıda bulunabilmesine önemli bir fayda sağlayacağını düşünüyoruz. Ancak bu test formatının rutin kullanıma geçirilebilmesi adına ilerleyen adımlarda özellikle de pediyatrik gruptaki ensefalit vakalarında, BOS gibi hasta örneklerini içeren klinik performansının değerlendirilebileceği geniş kapsamlı çalışmalar ile desteklenmesi gerektiğini düşünmekteyiz.

Abstract:
Introduction and Objective: Human Herpesvirus-6 (HHV-6) infects a wide range of cells including T lymphocytes, monocyte-macrophage system, epithelial cells, and central nervous system cells. After primary infection, they remain latent in the subtelomeric region of the chromosomes of host cells, particularly T cells and monocytes. This makes the diagnosis of active viral infection difficult. When reactivated, especially in patients with AIDS, bone marrow transplantation (BMT) recipients, or primary or secondary immunodeficiency, they can lead to serious clinical pictures such as encephalitis and interstitial pneumonia. In such severe cases, demonstration of viral DNA in clinical samples or isolation of the virus is recommended for diagnosis. Molecular detection of HHV-6-associated infections is very important for the detection of reactivation and initiation of treatment. In this thesis, we aimed to develop a test format based on the digital PCR (dPCR) method that can quantitatively detect all types of HHV-6 with high sensitivity. With this dPCR format, there will be no need for external controls in the test protocol to be applied to each clinical sample, and it will be possible to perform tests in routine studies promptly and at a lower cost.
Materials and Methods: Primer series that could detect HHV-6A and B simultaneously were validated with nBLAST, and the target sequence was determined in BioEdit software and used in both dPCR and qPCR analyses. To determine the limit of quantification (LoQ), dynamic range, the limit of detection (LoD), accuracy and reproducibility of the test to be developed, 4 consecutive 10-fold dilutions of the extracted HHV-6 DNA were run three times each in three different independent sessions and the results of dPCR and qPCR tests were compared.
Conclusion: The limit of quantitation (LoQ) of the assay we designed was 0.53 copies/μl, the same as the analytical sensitivity (LoD). We believe that our study will provide an important benefit for the quantitative monitoring of primary and latent infections due to HHV-6 with high sensitivity and contribute to the preparation of early treatment protocols. However, in order for this test format to be put into routine use, we think that it should be supported by large-scale studies in which its clinical performance can be evaluated, especially in encephalitis cases in the pediatric group, including patient samples such as CSF.