Safranal'ın kanser hücre hatlarında sitotoksik, apoptotik ve genotoksik etkilerinin araştırılması
Investigation of cytotoxic, apoptotic and genotoxic effects of safranal in cancer cell lines
Yazar: ATHOUMANI ALI SOUANDAOU
Danışman: PROF. DR. FATMA GÜL ÖZCAN ; PROF. DR. NİHAL ÖMÜR BULAN
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Genel Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Antikanser = Anticancer ; Bitkisel ilaçlar = Herbal medicine ; Kanser hücreleri =   ; Plantogram = Plants-medicinal ; Tümör hücreleri-kültürü yapılmış = Tumor cells-cultured ; Tıbbi bitkiler = Plants-medicinal

Özet:
Kanser, genetik ve çevresel faktörlerin etkisiyle meydana gelen, hücrelerin kontrolsüz bölünmesi, çoğalması ve yayılması ile ortaya çıkan kompleks bir hastalıktır. Radyoterapi, kemoterapi ve cerrahi standart olarak kabul edilen kanser tedavi yöntemleri birçok yan etkilerin ortaya çıkmasına neden olduğundan, günümüzde kanser hücrelerini tamamen yok eden ve yan etkileri en aza indiren ajanlar geliştirilmesi hedeflenmektedir. Ayrıca kanser hücrelerine karşı duyarlılığı düşük olan kemoterapi ajanlarının yerine antitümör aktivitesi yüksek ve daha dirençli ajanların geliştirilmesine de odaklanılmaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar, kanser tedavisinde kullanılan bitkisel kökenli bileşiklerin umut verici etkilerinden dolayı ilaç olarak kullanımının yaygınlaştığını göstermektedir. Bu kapsamda, çalışmamızda, Crocus sativus'un aroması ve kokusundan sorumlu olan Safranal'ın insan serviks kanseri kökenli HeLa ve C- 4 I hücre hatları üzerindeki sitotoksik, apoptotik ve genotoksik etkileri ile bu etkilerin moleküler mekanizmalarında rol oynayan molekül ya da moleküllerin araştırlması amaçlanmıştır. 
Safranal'ın 6 farklı dozu (25, 50, 100, 200, 400, 800µM) uygulanan insan serviks kanseri kökenli HeLa ve C- 4 I hücre hatlarında meydana gelen sitotoksik etkinin ve IC50 dozunun belirlenmesinde Mitokondriyal Dehidrogenaz Enzim Aktivitesi (MTT) ve Laktat Dehidrogenaz Enzimin Aktivitesi (LDH) analizleri kullanıldı. Bununla birlikte, Safranal'ın sebep olduğu sitotoksisite canlı olarak faz kontrast mikroskobu, Giemsa ile ışık mikroskobu ve 4'-6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile floresan mikroskobunda incelendi. Daha sonra meydana gelen apoptoz oranı, apoptotik indeks (AI) parametresi ile değerlendirildi. Safranal'ın IC50 dozunun (400 µM) 24 saat uygulandığı HeLa ve C- 4 I hücreleri üzerindeki apoptotik etkileri ve DNA hasarı, sırasıyla Annexin V  ve Gamma H2A.X aktivasyonu flow sitometri yöntemi ile belirlendi. Ayrıca, Safranal'ın IC50 dozu uygulanan hücrelerdeki mitokondriyal membran bozulma potansiyeli MitoLight floresan boyama yöntemi ile de belirlendi. Buna ek olarak, meydana gelen bu etkide rol oynayan moleküller ve moleküler mekanizmaları RNA sekanslama biyoinformatik analiz ile belirlendi.
Sonuç olarak çalışmamızda değerlendirilen parametreler ışığında, Safranal'ın farklı dozlarının HeLa ve C-4 I hücre hatları üzerinde istatistiksel olarak anlamlı (p<0.05) sitotoksik bir etkiye sahip olduğu tespit edildi. Bu sitotoksisitenin, apoptoz, nekroptoz ve ferroptoz hücre ölüm yolakları ile meydana geldiği tespit edildi. Buna ilaveten hücre döngüsü durması ve DNA hasarının meydana geldiği de ortaya kondu. Safranal'ın  IC50 dozu uygulanan HeLa hücrelerinde apoptozun, BIM ve CASP 9 molekülleri aracılığı ile teşvik edilen mitokondriyal apoptotik yolak ile, Granzim B yolağının da Lamin ve ɑ-tubilin genlerinin aktivasyonu ile olduğu tespit edildi. Ayrıca, HeLa hücrelerinde meydana gelen nekroptozda STAT, CASP1, IL33 ve STAT 1 genlerinin aktive olduğu, C- 4 I hücrelerinde ise TRIF, FADD, MLKL ve ESCRTII genlerinin aktivasyonu ile gerçekleştiği tespit edildi. C-4 I hücrelerinde Safranal kaynaklı ferroptoz hücre ölüm yolağında ise HO-1, SAT1 ve TFR- 1 genlerinin aktivasyonu saptandı. Elde edilen tüm bu sonuçlar ileride yapılacak in vivo çalışmalar ile, Safranal'ın serviks kanseri için yeni umut verici bir tedavi seçeneği olarak kullanılabileceğini ortaya koymuştur.

Abstract:
Cancer is a complex disease due to the uncontrolled division, proliferation and spread of cells under the influence of genetic and environmental factors. Since radiotherapy, chemotherapy and surgery are accepted as standard cancer treatment methods, it is aimed to develop agents that completely destroy cancer cells and minimize side effects. In addition, instead of chemotherapy agents that are less sensitive to cancer cells, it is also focused on developing more resistant agents with high antitumor activity. In recent years conducted-studies show that the promising effects of plant-based compounds used in cancer treatment have become as widespread as drugs. In this context, our study aimed to investigate the cytotoxic, apoptotic and genotoxic effects of Safranal, which is responsible for the aroma and smell of Crocus sativus, on human cervical cancer-derived HeLa and C-4 I cell lines and the molecule or molecules that play a role in the molecular mechanisms of these effects. 
Mitochondrial Dehydrogenase Activity (MTT) and Lactate Dehydrogenase Activity (LDH) analyses were used to determine the cytotoxic effect and IC50 dose in human cervical cancer-derived HeLa and C-4 I cell lines treated with 6 different doses of safranal (25, 50, 100, 200, 400, 800µM). In addition, cytotoxicity caused by safranal was examined live by phase contrast microscopy, light microscopy with Giemsa and fluorescence microscopy with 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI). Then, the apoptosis rate was evaluated by the apoptotic index (AI) parameter. The apoptotic effects and DNA damage on HeLa and C-4 I cells, to which the IC50 dose of Safranal (400 µM) was applied for 24 hours, were determined by Annexin V and Gamma H2A.X activation flow cytometry method, respectively. In addition, the mitochondrial membrane disruption potential in cells to which the IC50 dose of Safranal was applied was determined by MitoLight fluorescent staining method. In addition, the molecules and molecular mechanisms that play a role in this effect were determined by RNA sequencing bioinformatic analysis. 
As a result, in light of the parameters evaluated in our study, it was determined that different doses of Safranal had a statistically significant (p<0.05) cytotoxic effect on HeLa and C-4 I cell lines. It was determined that this cytotoxicity occurred through apoptosis, necroptosis and ferroptosis cell death pathways. In addition, it was revealed that cell cycle arrest and DNA damage occurred. In HeLa cells treated with IC50 dose of Safranal, apoptosis was detected via mitochondrial apoptotic pathway promoted by BIM and CASP 9 molecules, and Granzyme B pathway was detected via activation of Lamin and ɑ-tubilin genes. In addition, it was detected that STAT, CASP1, IL33 and STAT 1 genes were activated in necroptosis occurring in HeLa cells, and TRIF, FADD, MLKL and ESCRTII genes were activated in C-4 I cells. In C-4 I cells, activation of HO-1, SAT1 and TFR-1 genes was detected in Safranal-induced ferroptosis cell death pathway. All these results have shown that Safranal can be used as a new promising treatment option for cervical cancer with future in vivo studies.