Etanol-metanol karışımının tayini için yüzey baskılı elektrotların modifiye edilmesiyle amperometrik alkol biyosensörünün geliştirilmesi
Development of an amperometric alcohol biosensor with modified screen-printed electrodes for the detection of a mixture of ethanol and methanol
Yazar: MELİKE ŞAHİN
Danışman: PROF. DR. EROL AYRANCI
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Çalışma temel olarak etanol, metanol ve etanol-metanol karışımının tayini için, çeşitli materyallerle modifiye edilmiş, tek kullanımlık, ekonomik, çift enzimli amperometrik enzim biyosensörünün geliştirilmesini amaçlamaktadır. Karbon nanotüp (CNT), altın nanoparçacık (AuNp) ve poli(nötral) kırmızı (PNR) ile farklı türdeki yüzey baskılı elektrotlar (YBE) modifiye edilerek, elektrokimyasal reaktivitesi yüksek tek kullanımlık çeviriciler geliştirilmiştir. Geliştirilen sistemler alkol oksidaz ve alkol dehidrojenaz enzimleri ile modifiye edildikten sonra bu biyosensörlerin etanol, metanol ve etanol-metanol karışımının tayini için optimum çalışma koşulları araştırılmıştır. Optimum koşullardaki alkol biyosensörleri ile gerçek numunelerdeki etanol miktarı ve etanol/metanol karışımındaki etanol ve metanol miktarları belirlenmiştir. Deneysel çalışmalarda döngüsel voltametri ve kronoamperometri gibi voltametrik teknikler kullanılmıştır. 

Çalışmada ilk olarak nikotinamid adenin dinükleotitin (NADH) medyatörsüz, düşük potansiyelde girişimsiz tayini için yeni YBCE/MWCNT/AuNP/PNR formüllü kompozit elektrodu geliştirilmiştir. Geliştirilen amperometrik NADH sensörünün optimum pH'ı 7,5 olarak belirlenmiştir. Analitiksel karakterizasyonlar sonucunda NADH sensörünün tekrarlanabilirliği 100 µM NADH için bağıl standart sapma (R.S.D.) % 2,55 (n=10), duyarlığı 15,82 µA.mM-1, gözlemlenebilme ve tayin sınırları ise sırasıyla 4,82 ve 16,09 µM, doğrusal aralık 16,07 µM – 150 µM olarak bulunmuştur.

NADH sensörleri ve alkol dehidrojenaz (ADH) temelli biyosensörlerde, PNR'nin nanoparçacıklar ile olan sinerjik etkisi incelenmiş, PNR'nin sadece MWCNT veya AuNP ile hazırlanmış sensör ve biyosensörlerin formulasyonuna dahil olduğunda duyarlığı artırdığı gözlenmiştir. MWCNT ve PNR'nin sahip oldukları özellikleri sayesinde yaptıkları - elektronik ve hidrofobik etkileşimlerle, sensör ve biyosensörlerin elektronik iletkenliği, sinerjik bir etkiyle artmıştır. En yüksek elektronik iletkenlik ve elektrokatalitik etki, PNR'nin hem MWCNT hem de AuNP ile oluşturduğu kompozit elektrot olan YBCE/MWCNT/AuNP/PNR ile hazırlanmış sensör ve biyosensörlerde gözlenmiştir. YBCE/MWCNT/AuNP/PNR kompozit elektrodundaki MWCNT ve AuNP'nin miktar optimizasyonları yapılmıştır. YBCE yüzeyinde MWCNT'nin 3 tabaka, AuNP'nin 2 tabaka olduğu miktarlarda en yüksek pik akımları elde edilmiştir. 
ADH temelli biyosensörlerin optimum elektrot türü ve formulasyonu YBCE/MWCNT/AuNP/PNR, optimum pH'sı 7,75, çalışma potansiyeli + 0,2 V, enzim ve koenzim miktarları sırasıyla 150 unit ve 7 mM olarak bulunmuştur. Analitiksel karakterizasyonlar sonucunda ADH temelli biyosensörlerin tekrarlanabilirliği 400 µM etanol için RSD % 1,57 (n=10), duyarlığı 0,49 µA.mM-1, doğrusal aralığı 320,2 µM – 1000 µM, gözlemlenebilme ve tayin sınırları ise sırasıyla 96,1 ve 320,2 µM, olarak bulunmuştur.

ADH temelli biyosensörler ve NADH sensörü için optimum elektrot türü ve formulasyonu olan YBCE/MWCNT/AuNP/PNR kompozit elektrotları ile Alkol oksidaz (AOx) temelli biyosensörler hazırlanmıştır. AOx temelli biyosensörlerin optimum pH'ı 7,0, çalışma potansiyeli - 0,3 V ve enzim miktarı 1,2 unit olarak bulunmuştur. Analitiksel karakterizasyonlar sonucunda AOx temelli biyosensörlerin tekrarlanabilirliği 400 µM metanol ve 400 µM etanol için R.S.D.'ler sırasıyla % 1,65 (n=5) ve % 1,12 (n=5) olarak bulunmuştur. Metanol ve etanol için sırasıyla gözlemlenebilme sınırları, 100,8 µM ve 53,5 µM,  tayin sınırları 335,9 µM ve 178,5 µM, doğrusal aralıkları 335,9 µM - 1000 µM ve 178,5 µM – 1000 µM, duyarlıkları ise 0,509 ve 0,482 µA.mM-1 olarak hesaplanmıştır. AOx temelli biyosensörlerle etanol/metanol karışımının tayini için de analitiksel karakterizasyonlar yapılmıştır.

Etanol/metanol karışımındaki etanol miktarı ADH temelli biyosensörlerle, metanol miktarı ise AOx temelli biyosensörlerle yapılan amperometrik tayin sonucu elde edilen akım değerlerinin, kalibrasyon grafiklerinin doğru denklemlerinde yerine yazılmasıyla bulunmuştur. AOx temelli biyosensörlerin metanole karşı duyarlığının etanole göre daha fazla olduğu sonucuna varılmıştır. AOx temelli biyosensörler, etanol-metanol karışımının tayini için kullanılmış ve etanol varlığında metanolün duyarlığının azaldığı gözlenmiştir. 

Tez kapsamında yeni YBCE/MWCNT/AuNP/PNR kompozit elektrodu, NADH sensörü, etanol, metanol ve etanol/metanol biyosensörleri başarıyla geliştirilmiştir.

ANAHTAR KELİMELER: Alkol biyosensörü, yüzey baskılı elektrotlar, alkol  dehidrojenaz, alkol oksidaz, poli(nötral) kırmızı, karbon nanotüp, altın nanoparçacık

Abstract:
The present work mainly aimed the development of a dual enzymes amperometric enzyme biosensor which is modified with various materials, disposable and low-cost, for detection of methanol, ethanol and methanol-ethanol mixtures. Disposable transducers of high electrochemical reactivity were developed by modifying various types of screen-printed electrodes (SPCE) with carbon nanotubes (CNT), gold nanoparticles (AuNP) and poly (neutral) red (PNR). After modifying the developed systems with alcohol oxidase and alcohol dehydrogenase enzymes, the optimum working conditions of these biosensors were investigated for the analysis of ethanol, methanol and ethanol-methanol mixture. The amount of ethanol in real samples and the amounts of ethanol and methanol in ethanol-methanol mixtures were determined with the alcohol biosensors at optimum conditions. Voltammetric techniques such as cyclic voltammetry and chronoamperometry were used in experimental studies.

In the work, firstly a new composite electrode of SPCE/MWCNT/AuNP/PNR formulation was developed for the determination of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) at low potentials, without any mediator and without any interference. Optimum pH of this biosensor was determined as 7.5. Reproducibility for 100 µM NADH, sensitivity, limit of detection and limit of quantification, linear range of NADH sensor were found to be 2.55 % (n=10) as relative standart deviation (R.S.D.), 15.82 µA.mM-1, 4.82 µM and 16.09 µM, 16.07 µM – 150 µM respectively, after analytical characterizations.

The synergic effect of PNR with nanoparticles in NADH sensors and alcohol dehydrogenase (ADH) based biosensors was investigated and it was observed that PNR increased the sensitivity when it is included in the formulation of sensor or biosensors prepared with only MWCNT or AuNP. Electronic conductivity of sensor and biosensors increased with a synergic effect displayed due to characteristics possessed by PNR and MWCNT. The highest electronic conductivity and electrocatalytic effect were observed in sensors and biosensors prepared with SPCE/MWCNT/AuNP/PNR composite electrode. Quantity optimizations of MWCNT and AuNP were accomplished in SPCE/MWCNT/AuNP/PNR composite electrode. The highest peak currents were obtained when there are 3 layers of MWCNT and 2 layers of AuNP at the SPCE surface.

It was found that optimum electrode type and formulation is SPCE/MWCNT/AuNP/PNR, optimum pH is 7.75, working potential is + 0.2 V, the amounts of enzyme and coenzyme are 150 unit and 7 mM, respectively, for the ADH based biosensors. Sensitivity, linear range, limit of detection and limit of quantification were found to be 0.49 µA.mM-1, 320.2 µM – 1000 µM, 96.1 µM and 320.2 µM, respectively, for the ADH based biosensors after analytical characterizations. Reproducibility of ADH based biosensors for 400 µM ethanol relative standard deviation (R.S.D.) was calculated to be 1.57 % (n=10).

Alcohol oxidase (AOx) based biosensors were prepared with SPCE/MWCNT/AuNP/PNR composite electrodes which is the optimum electrode type and formulation for ADH based biosensors and NADH sensor. The optimum pH, working potential and enzyme amount were found to be 7.0, - 0.3 V and 1.2 unit, respectively. Reproducibility of AOx based biosensors for 400 µM methanol and  400 µM ethanol relative standard deviation (R.S.D.) were calculated to be  1.12 % (n=5) and 1.65 % (n=5), respectively. It was calculated that the limit of detections were 100.8 µM and 53.5 µM, limit of quantification were 335.9 µM and 178.5 µM, linear ranges 335.9 µM - 1000 µM and 178.5 µM – 1000 µM, sensitivities were 0.509 and 0.482 µA.mM-1 for methanol and ethanol, respectively. Analytical characterization for the determination of ethanol/methanol mixture with AOx based biosensors were also made.

The amount of ethanol in ethanol/methanol mixture was determined with ADH biosensors while the amount of methanol was found by substituting the current values obtained by amperometric analysis with AOx based biosensors into the equation of calibration curves. It was concluded that AOx based biosensors were more sensitive for methanol compared to ethanol. The AOx based biosensors were used for ethanol-methanol mixture and the sensitivity for methanol was observed to decrease in the presence of ethanol.

A new SPCE/MWCNT/AuNP/PNR composite electrode, NADH sensor and biosensors for ethanol, methanol and ethanol/methanol were developed successfully within the scope of the thesis.

KEYWORDS: Alcohol biosensor, screen-printed electrodes, alcohol dehydrogenase alcohol oxidase, poly(neutral) red, carbon nanotubes, gold nanoparticles