Geobacillus stearothermophilus AH22 suşundan lipaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of lipase enzyme from Geobacillus stearothermophilus AH22 strain
Yazar: ARİFE PINAR EKİNCİ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. BARBAROS DİNÇER
Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Kimya = Chemistry
Dizin: Enzim saflaştırması = Enzyme purification

Özet:
Bu çalışmada, yeni izole edilmiş ve termofilik bir bakteri olan Geobacillus stearothermophilus AH22 suşundan endüstriyel bir enzim olan lipaz, iyon değişim kromatografisi ve jel filtrasyon kromatografisi kullanılarak kısmi olarak saflaştırıldı ve karakterize edildi. Lipaz enzimi  %19.7 verimle 18.3 kat saflaştırılarak elde edildi. Kısmi saflaştırılmış lipaz enziminin moleküler ağırlığı SDS-PAGE kullanılarak yaklaşık 26 kDa olarak belirlendi. Enzim p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil bütirat, p-nitrofenil oktaonat ve p-nitrofenil laurat substratları varlığında karakterize edildi. Enzimin Km ve Vmaks değerleri p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil bütirat, p- nitrofenil oktaonat ve p- nitrofenil laurat substratları varlığında Lineweaver-Burk eğrisi yardımıyla belirlendi. Enzimin Km değerleri sırasıyla 0.16, 0.02, 0.19 ve 0.55 mM olarak, Vmaks değerleri ise sırasıyla 0.52 EU mg−1, 1.03 EU mg−1, 0.72 EU mg−1 ve 0.15 EU mg−1 olarak hesaplandı. Enzimin kullanılan substratlar varlığında en yüksek aktiviteyi 50 ile 60 oC' de ve pH 8 ile 9' da gösterdiği tespit edildi. Enzimin 50 ile 60 °C arasında termal kararlığının, +4 °C' de pH 8.0-10.0 aralığında ise pH karalılığının oldukça iyi olduğu gözlendi. Lipaz aktivitesine bazı metal tuzlarının ve bileşiklerin etkisi incelendi. Enzim aktivitesini en fazla Hg2+ iyonunun inhibe ettiği tespit edildi. Bununla birlikte orlistat, kateşin, propil paraben, p-kumarik asit ve 3,4- dihidroksi hidrosinamik asit inhibitörlerinin IC50 değerleri sırasıyla 0.0085, 0.06, 0.5, 1.25 ve 1.7 mM olarak belirlendi. Bu sonuçlar, Geobacillus stearothermophilus AH22 lipazının ısıl ve pH kararlılığı ve diğer özellikleri açısından endüstriyel uygulamalar için oldukça elverişli özelliklere sahip olduğunu göstermektedir.



Anahtar kelimeler: Geobacillus stearothermophilus AH22, Lipaz, Saflaştırma,Karekterizasyon

Abstract:
In this study, the lipase, as an industrial enzyme, was partially purified by ion exchange  and gel filtration column chromatographies and was characterised from Geobacillus stearothermophilus AH22 strain. The lipase was purified 18.3-folds with 19.7% recovery. Protein samples obtained from the purification steps were migrated on SDS-PAGE and molecular weight of enzyme was found to be about 26 kDa.  The lipase activity was determined by using p-nitrophenly acetate, p-nitrophenly butyrate, p-nitrophenly octaonate and p-nitrophenly laurate as substrates. The Km values of the enzyme for these substrates were found as 0.16, 0.02, 0.19 and 0.55 mM, respectively. Also Vmax values were found 0.52 EU mg−1, 1.03 EU mg−1, 0.72 EU mg−1and 0.15 EU mg−1. The enzyme showed maximum activity at 50 °C and pH ranging for in 8.0-9.0.  It was observed that the enzyme was quite stable at pH range of 8.0-10.0 at +4 °C and thermal stability between 50 and 60 °C. The effect of some metal salts and compounds were investigated on the lipase activity. It was found that Hg2+ is the best inhibitor for this enzyme activity. The inhibitory effect of some chemicals including as orlistat, catechin, propyl paraben, p-coumaric acid, 3,4-dihydroxy hydro cinnamic acid, PMSF was examined and their IC50 values was calculated as 0.0085, 0.06,  0.5, 1.25, 1.7 and 1.6 mM, respectively. These results suggest that Geobacillus stearothermophilus AH22 lipase presents very suitable proporties for industrial applications.



Keywords: Geobacillus stearothermophilus AH22, Lipase, Purification, Characterization