Anoxybacillus kestanbolensis ac26 sarı l-arabinoz izomeraz geninin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu
Cloning, expression and characteisation of l-arabinoseisomerase from anoxybacillus kestanbolensis ac26 sari
Yazar: NAZAN DALKIRAN
Danışman: DOÇ. DR. SABRİYE ÇANAKÇI
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Ekspresyon = Expression ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification

Özet:
L-arabinoz izomeraz (L-AI; intramoleküler oksidoredüktazlar; EC 5.3.1.4) hücre içi bir enzimdir ve pentoz fosfat yan yolu için L-arabinozun L-ribuloza veya D-galaktozun D-tagatoza geri dönüşümlü izomerizasyonu sağlar. Mikrobiyal L-arabinoz izomerazlar özellikle D-tagatoz sentezlenmesi açısından endüstriyel açıdan oldukça ilgi çekmektedir. Endüstriyel kullanım için özellikle termofilik bakterilerin enzimleri tercih edilmektedir. Yüksek sıcaklıklarda gerçekleşen endüstriyel enzimatik reaksiyonlar, kontaminasyon riskini ve substrat viskositesini azaltmaktadır.Bu çalışma Anoxybacillus kestanbolensis AC26 Sarı L-arabinoz izomeraz geninin klonlanmasını, gen ürününün izolasyonunu ve karakterizasyonunu konu almaktadır. Anoxybacillus kestanbolensis AC26 Sarı L-arabinoz izomerazını kodlayan 1503 nt` lik genin baz dizilimi belirlenerek pET28a+ vektörüne klonlandı. Geni içeren vektör, E.coli BL21(DE3)pLysS hücresine aktarılarak L-arabinoz izomeraz ekspres edildi ve saflaştırıldı. Saflaştırılan L-AI'ın optimum sıcaklığı 65ºC ve optimum pH'ı 8,5 olarak belirlendi. L-arabinoz için Km değeri 6,5 mM olarak belirlendi. Mn+2, Co+2, Mg+2, Fe+2,Ca+2, Cu+2, Li, K ve Zn+2 metal iyonlarının etkisi incelendi. A. kestanbolensis AC26 Sarı L-arabinoz izomeraz moleküler ağırlığı 55,6776 kDa olarak tespit edildi. Elde edilen veriler ışığında, enzimin biyokimyasal özellikleri, enzimin önemli bir endüstriyel enzim olabileceğini göstermektedir.

Abstract:
L-arabinose isomerase (intramolecular oxidoreductases; EC 5.3.1.4) is an intracellular enzyme and provides reversible isomerization of L-arabinose to L-ribulose or D-galactose to D-tagatose for pentose phosphate pathway. Microbial L-arabinose isomerases draw great attention in terms of synthesis of D-tagatose in industry. Particularly, thermophilic enzymes are preferred for industrial use. Industrial enzymatic reactions that occur at high temperatures reduce the risk of contamination and viscosity of substrate.This work describes the cloning, isolation, and characterization of L-arabinose isomerase from Anoxybacillus kestanbolensis AC26 Sari. A 1503 nt L-arabinose isomerase gene coding for L-arabinose isomerase from Anoxybacillus kestanbolensis AC26 SARI sequenced and cloned into pET28a+ vector. Vector encoding this gene was transformed into E.coli BL21(DE3)pLysS, expressed and purified. It was determined that the purified L-arabinose isomerase optimum temperature is 65 °C and optimum pH is 8.5. It was determined that the enzyme had Km (6.5 mM) for L-arabinose. Metal ion effects to L-AI were observed with cloride salts of Mn+2, Co+2, Mg+2, Fe+2, Ca+2, Cu+2, Li, K and Zn+metal ions. The molecular mass of the L-AI was determined to be 55.6776 kDa on SDS-PAGE. In the light of all data it has been suggested that the enzyme?s biocatalytic properties proved to be one of the important industrial enzymes.