On-line HPLC-FRAP antioksidan aktivite tayin yönteminin geliştirilmesi ve bazı doğal ürünlere uygulanması
Development of on-line HPLC-FRAP antioxidant activity determination method and application to some natural products
Yazar: NESİBE ARSLAN BURNAZ
Danışman: PROF. DR. MURAT KÜÇÜK
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Antioksidanlar = Antioxidants ; Fenolik asit = Phenolic acid

Özet:
Çalışmada, literatürdeki on-line HPLC-antioksidan yöntemlerine bir yenisi (on-line HPLC-FRAP) eklenmiş ve yöntem bitki numunelerine uygulanmıştır. Yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğu bilinen bitki ekstraktlarının (bitkisel poşet çayların şekerli/şekersiz sulu, ormangüllerinin metanollü, yaylaçayının farklı çözücülerdeki ekstraktları) spektrofotometrik (off-line) yöntemlerle antioksidan aktiviteleri belirlenmiştir. Sonrasında geliştirdiğimiz on-line HPLC-FRAP antioksidan yönteminde gradient şartlar, gradient pompa ve şırınga pompanın akış hızları, FRAP ile reaksiyon sıcaklığı ve FRAP'ın bekleme süresi, kullanılan 15 standardın ve ekstraktlardaki antioksidan bileşiklerin ve aktivitelerinin eşzamanlı olarak belirlenmesi için uygun hale getirilmiştir. 6 standardın LOD ve LOQ değerlerinin 0,4-14,7 ppm aralığında olduğu belirlenmiştir. Yeni yöntemle bitki ekstraktlarının bileşenlerinin antioksidan aktiviteleri belirlenmiş, sonuçlar spektrofotometrik FRAP verileriyle karşılaştırılmıştır. Ayrıca aynı sistemde (on-line) -ABTS ve -DPPH denenmiş ve -FRAP verileriyle karşılaştırılmıştır. Geliştirilen yöntem tüm standartlar için 0-1000 ?M aralıkta lineerlik göstermiştir. On-line sistemde reaksiyonun gerçekleştiği sarmalda geçen 1,5 dakikalık sürenin yeterli olduğu yapılan kinetik çalışmayla belirlenmiştir. Bitki ekstraktları için belirlenen on-line ve off-line toplam aktivite sonuçları uyum göstermiştir (R2 = 0,89). On-line sistemde bileşenlerin tek tek aktivitelerinin toplanmasıyla elde edilen veriler, ekstraktlarda bir arada bulunan bileşiklerin antagonizm ya da sinerji gösterebileceğini ortaya koymuştur. Bitki çaylarının şekerli/şekersiz ekstraktları arasındaki aktivite değişiminin off-line ve on-line yöntemde benzer ve bitkiden bitkiye farklılık göstermekte olduğu tespit edilmiştir. Geliştirilen on-line HPLC-FRAP yöntemi literatürden adapte edilen DPPH ve ABTS yöntemlerine göre gürültü ve antioksidan cevap açılarından üstünlükler göstermiş, gıda ve bitki numunelerindeki bileşenlerin miktar ve antioksidan aktivitelerinin belirlenmesi için oldukça uygun olduğu görülmüştür.

Abstract:
A new on-line HPLC-antioxidant activity method (on-line HPLC-FRAP) was added to the existing methods in literature, and the method was applied to plant samples. Antioxidant activities of plant extracts (sugar/sugar-free aqueous herbal tea bag extracts, methanolic Rhododendron extracts, Thymus praecox extracts in different solvents) known to have high activity were determined by spectrophotometric (off-line) methods. Then the developed method (on-line HPLC-FRAP) was optimized (gradient conditions, gradient pump and syringe pump flow rates and the reaction temperature and waiting time of FRAP) for the determination of 15 standards, extract components, and their antioxidant activities simultaneously. LOD and LOQ values of six standards were in 0.4 ? 14.7 ppm range. The antioxidant activities of the components of plant extracts were determined with the new method; the results were compared with spectrophotometric FRAP data. On-line -ABTS and -DPPH methods were also tested using the same system, and the results were compared with FRAP data. The developed method showed linearity in 0-1000 ?M range for all the standards. The elapse time (1,5 minutes) in reaction coil in on-line system was found sufficient based on the kinetic study. The on-line and off-line total activities for plant extracts were in agreement (R2 = 0.89). The values obtained by summing the antioxidant activities of individual constituents in on-line system revealed that the compounds in extracts could demonstrate antagonism or synergy. Activity changes between sugar/sugar-free herbal tea extracts were found similar in both methods, with differing behaviour from plant to plant. The developed on-line HPLC-FRAP method was found to be superior to the on-line HPLC-ABTS and -DPPH methods adapted from literature with respect to noise and antioxidant response, and the method appeared to be highly suitable for application to the determination of components and antioxidant activities of food and plants.