Arnebia densiflora Ledeb. Bitkisinde bitki doku kültürü metotları ile şikonin ve türevlerinin üretilmesi
Production of shikonin and derivatives with plant tissue culture methods in Arnebia densiflora Ledeb.
Yazar: TUĞBA ERÇETİN
Danışman: PROF. DR. GÜLNUR TOKER
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid

Özet:
Anadolu ve Yunanistan'da yetişen bir tür olan Arnebia densiflora Ledeb. (Boraginaceae) köklerinden elde edilen ekstreler; yanık, yara, egzama tedavilerinde kulanıldığı gibi, boyar madde olarak gıda, dokumacılık ve kozmetik sanayiinde  de kullanılmaktadır. Köklerden izole edilen alkannin/şikonin türevi naftokinonlar; yara iyileştirici, antitümöral, antimikrobiyal, antienflamatuvar ve antioksidan aktivitelere sahiptir.
Bu çalışmada, A. densiflora bitkisinde, şikonin ve türevlerinin miktarlarının doku kültürü metotları  olan kallus, süspansiyon kültürleri ve biyoreaktörlerde arttırılması amaçlanmıştır. Bitkinin kökleri, genç sürgünleri ve yaprakları eksplant kaynağı olarak kullanılmış ve kallus üretilmesi aşamasında yoğun bir kontaminasyon problemi ortaya çıkmıştır. Bu problemi aşabilmek amacıyla farklı sterilizasyon yöntemleri kullanılmıştır. Eksplantlar NaOCl, PPM ve H2O2 ve antibiyotik-antifungal karışımları ile muamele edildikten sonra çeşitli oranlarda büyüme düzenleyicileri içeren Murashige ve Skoog (MS), Gamborg (B5) ve Schenk ve Hildebrandt (SH) ortamlarına ekilerek karanlıkta inkübe edilmişlerdir. En iyi kallus gelişimi görülen MS ortamı ile hücre hatları oluşturulmuştur ve bu kalluslar şikonin üretimi için özel ortamlar olan M9 ve M10 ortamlarına transfer edilmişlerdir.
Kallus ve süspansiyon kültürleri 50 gün, biyoraktörler 25 gün süre ile izlenmiştir. M9 ve M10 ortamlarında oluşturulan kalluslarda,  süspansiyon kültürlerinde, biyoreaktörlerde gelişen hücrelerde ve sıvı ortamlarda şikonin ve türevlerinin analizleri yapılmıştır. In vitro olarak elde edilen bu hücrelerdeki ve bitkinin kök, kabuk kısımlarındaki şikonin, alkannin ve asetilalkannin değerleri kalitatif ve kantitatif olarak analiz edilerek karşılaştırılmıştır. Kantitatif analizlerde  spektrofotometrik metot ve  ters faz yüksek basınçlı sıvı kromatografisi  kullanılmıştır. Kiral kolon kullanılarak yapılan HPLC analizleri ile de alkannin ve şikonin ayrımı yapılarak miktarları belirlenmiştir.
Şikonin ve türevlerinin analizleri sonucunda, in vitro olarak yapılan tüm çalışmalarda, sekonder metabolit üretimine M10 ortamının, M9 ortamından daha iyi yanıt verdiği tespit edilmiştir. Spektrofotometrik analiz sonucunda  şikonin ve  türevleri M10 ortamında geliştirilen kalluslarda 40. günde (% 2.09), süspansiyon kültürlerinde 50. günde (166.00 mg/l) ve biyoreaktörlerde ise 25. günde (213.42 mg/l)   en yüksek miktarlarda bulunmuştur. Bitkinin köklerinde  % 1.404, kabuklarında ise % 17.276 şikonin ve türevi bulunduğu tespit edilmiştir.
Ters faz HPLC ile analizleri sonucunda  toplam şikonin ve asetilalkannin miktarları  sırasıyla  M10 ortamında geliştirilen kalluslarda 40. günde % 1.646 ve  % 1.227; süspansiyon kültürlerinde 50. günde  54.614 mg/l ve  11.231 mg/l; biyoreaktörlerde ise 25. günde 111.40 mg/l ve 59.475 mg/l  olarak tespit edilmiştir. Bitkinin köklerinde  bulunan  şikonin ve asetilalkannin  miktarları % 0.636 ve 0.030; kabuklarda ise % 13.78 ve  4.707 olarak belirlenmiştir. 
Kiral kolonla yapılan HPLC analizleri sonucunda, bitkinin kök ve kök kabuklarında ve de in vitro olarak elde edilen hücreler ve ortamlarda çoğunlukla alkannin miktarının şikonin miktarından fazla olduğu belirlenmiştir. Şikonin:alkannin oranı kök kabuklarında 2:98 iken, bu değerin kalluslarda 24-65:76-35, süspansiyon kültürlerinde 31-57:69-43, biyoreaktörlerde üretilen hücrelerde ise 1.5-30:98.5-70 oranlarında olduğu tespit edilmiştir.

Abstract:
Arnebia densiflora Ledeb. (Boraginaceae), grown in Anatolia and Greece, the extracts which are obtained from roots not only used for the treatments of burn, wound, eczema but also used for dying food, textile and cosmetology. Naphtoquinones which are shikonin and alkannin derivatives are isolated from the roots that have a wound healing, antitumoral, antimicrobial, antiinflamatory and antioxidant activities.
In this study, the amounts of the shikonin, alkannin and its derivatives in A. densiflora plant  were aimed to increase in callus, suspension cultures and bioreactors which are the tissue culture methods. The parts of the plant's roots, young shoots and leaves were used as explants source and the intense contamination problem came up during the phase of production callus. Different sterilization techniques were used to overcome this problem. After treatment of explants with NaOCl, PPM, H2O2 and antibiotic-antifungal mixture these were sown in MS, B5, LS and SH media containing growth regulators in various proportions and incubated in the dark. The cell line was created with MS medium which has the best callus development and these calluses were transferred to M9 and M10 media which are the special media for the production of shikonin.
Callus and suspension cultures have been observed for 50 days, bioreactors have been observed for 25 days. Shikonin and derivatives which were created by the growing cell with M9 and M10 media on calluses, suspension cultures and bioreactors and also extracellular media in bioreactors have been analyzed. Shikonin, alkannin and acetylalkannin values in these cells which have been obtained from the in vitro and in the root, bark parts of the plant have compared by analyzing qualitatively and quantitatively. Spectrophotometric method and reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) have been used for quantitative analysis. Then the amounts of alkannin and shikonin have been determined with making a distinction by using a chiral colon in an HPLC analysis. 
As a result of analysis of shikonin and its derivatives were detected in M10 medium responded better than M9 medium to the production of secondary metabolites all of the in vitro studies. The highest amounts were obtained from the callus cultures on 40th day (2.09 %), suspension cultures on 50th day (166 mg/l), bioreactors on 25th day (213.42 mg/l) in M10 media for the production of shikonin and derivatives by spectrophotometric method. Shikonin and derivatives determined in the plant roots 1.404 % and the barks 17.276 %.
A result of RP-HPLC analysis, the amount of the total shikonin and acetylalkannin were determined to develop in M10 medium to the callus cultures on 40th day respectively 1.646 % and 1.227 %, suspension cultures on 50th day 54.614 mg/l and 11.231 mg/l, bioreactors on 25th day 111.4 mg/l and 59.475 mg/l. The amount of the shikonin and acetylalkannin determined in the plant roots 0.636 % and 0.03 %, the barks 13.78 % and 4.707 %.
A result of HPLC analysis with chiral column determined the amount of alkannin higher than the amount of shikonin in the root and root bark of the plant and as for that in the cells and media which were obtained from the in vitro mostly. The ratio of shikonin:alkannin were found in the root barks 2:98 while the rates in calluses 24-65:76-35, in suspension cultures 31-57:69-43, the cells produced in bioreactors 1.5-30:98.5-70.