Rekombinant DPP IV enziminin Sf9 hücreleri kullanılarak biyoreaktörde üretimi ve karakterizasyonu
Production and characterization of recombinant DPP IV enzyme in bioreactor by using Sf9 cells
Yazar: ÖZLEM ÜSTÜN
Danışman: DOÇ. DR. GAYE ÖNGEN
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Çalışmamızda eksikliğinde insan vücudunda metabolizmanın normal seyrini etkileyebilecek önemli hastalıkların baş gösterdiği gastrointestinal, nörolojik, endrokrinolojik, immunolojik pek çok işlevi bulunan insan Dipeptidil Peptidaz IV (DPP IV) enzimi Sf9 hücre hattında baculovirus kullanılarak rekombinant olarak üretilmiştir.Rekombinant insan DPP IV enzimi öncelikle Sf9 vektörü olan pFastBac1 plazmidine aktarılmış ve daha sonra DH10Bac hücresi içinde baculoviral DPP IV elde edilmiştir. Sf9 hücrelerinin baculoviral insan DPP IV ile enfeksiyonu sonucunda üretilen DPP IV enzim aktiviteleri karşılaştırılarak transfeksiyon için uygun enfeksiyon katsayısı (MOI) 0,1 ve transfeksiyon zamanı 96 saat olarak belirlenmiştir. Transfeksiyonun 120.saatindeki DPP IV enzim aktivitesi değeri ile aynı saatteki enfekte olmamış Sf9 hücresinin DPP IV enzim aktivitesi değeri arasında 35,2 katlık fark bulunmuştur. Bu enfeksiyon katsayısı kullanılarak yapılan `Virüs replikasyonu ve sitopatik etkisinin incelenmesi' denemesi sonucunda baculovirusun Sf9 hücrelerine litik etkisinin olmadığı gözlenmiştir. Çalışmalarımızda 0.saatte enfekte olmayan ve enfekte olan Sf9 hücrelerinin büyüklükleri arasında anlamlı bir fark bulunmazken 24.saatten sonra bu iki bağımsız örneklem arasında anlamlı bir farklılık olduğu görülmüştür.Büyük ölçekte üretim çalışmalarımız için yapılan çalkalamalı griftli kültür erlenlerinde Sf9 hücrelerinin spesifik büyüme hızı 0,03 h-1 (0,73 gün-1) ve ikilenme süresi 22,5 h olarak hesaplanmıştır. Bu veriler ile beraber üretim ortamının reolojik özelliklerine dayanarak ölçek büyütme prosesinin parametreleri olan biyoreaktör içine verilen kabarcıkların boyutu, havalandırma hızı, spesifik ölüm hızı, Reynolds sayısı, Güç sayısı hesaplanmıştır.Büyük ölçekteki üretimler 1,5 litre ve 3 litre için gerçekletirilmiş ve üretim boyunca izlediğimiz oksijen tüketimlerinin sırası ile enfekte olmamış Sf9 hücre hattı için 1,5 litrelik biyoreaktörde 1,8x10-10 mgO2/hücre.dk, baculovirus inokülasyonundan 72 saat sonra hücre başına düşen spesifik oksijen tüketim hızı miktarı 2,9 x10 -10 mgO2/hücre.dk olarak hesaplanmıştır. Üretimin değeri 0,0133 dk-1 olarak bulunmuştur. Biyoreaktördeki üretim sona erdiğinde Sf9 hücrelerinin % 96'sında DPP IV ekspresyonu tespit edilmiş ve molekül ağırlığı 76 kDa olarak belirlenmiştir. 3 litrelik üretimde enfekte olmamış Sf9 hücre hattı için 3 litrelik biyoreaktörde spesifik oksijen tüketim hızı 7,27x10-11 mgO2/hücre.dk (3,75 x10 -17 mol/hücre.s) baculovirus inokülasyonundan 72 saat sonra hücre başına düşen spesifik oksijen tüketim hızı miktarı 1,12 x10 -10 mgO2/hücre.dk ve üretimin değeri 0,0129 dk-1 olarak hesaplanmıştır. Biyoreaktördeki üretim sona erdiğinde Sf9 hücrelerinin % 90'ında DPP IV ekspresyonu tespit edilmiştir.Üretim sonunda 1,5 litrelik üretim (3,4 mU/ml.saat) ve 3 litrelik üretim (2,98 mU/ml.saat) verimlilik açısından karşılaştırıldıklarında üretim verimliliklerinin yakın olduğu görülmüştür. Üretimler tamamlandıktan sonra DPP IV proteini iyon değiştirici ve moleküler elek kromatografilerinin optimizasyonları sağlandıktan sonra %24,5 `luk bir verim ile 487 kat saflaştırılabilmiştir. Ayrıca moleküler elek kromatografisi sonuçlarına göre denatüre olmamış DPP IV'ün molekül ağırlığı yaklaşık 136 kDa (dimer) olarak hesaplanmıştır.Çalışmamız sonucunda elde edilen DPP IV enzim aktivitesi ve verimlilik değerleri Sf 9 hücre hattı kullanılarak büyük ölçekte rekombinant DPP IV üretiminin başarılı bir şekilde yapıldığını göstermektedir.

Abstract:
The recombinant DNA technology is a groundbreaking theme in industrial area such as productions of biotechnological vaccines, antibiotics, hormones and monoclonal antibodies. Dipeptidyl Peptidase IV (DPP IV) enzyme is in hydrolase class and shows many activities in different parts of human body. Deficiency of DPP IV causes some disorders in gastrointestinal, neurologic, endocrinological and immunological systems.In this study, DPP IV enzyme was produced via recombinant DNA technology using Sf9 cell line in bioreactor. Recombinant human DPP IV gene was transferred to pFastBac1 plasmid and baculoviral DPP IV was then generated in DH10Bac cell. After the infection o Sf9 cell line with baculoviral human DPP IV, enzyme activities were compared for determining the transfection time and amount of virus used for infection. The optimum multiplicity of infection (MOI) and transfection time were determined 0.1 and 96 hours, respectively. The significant difference of DPP IV enzyme activity, 35.2-fold, was observed between infected and uninfected Sf9 cells in 120th hour in transfection. Baculovirus has no lytic activity to Sf9 cell lines, according to virus replication and investigation of cytopathic effect assay based on MOI. Cell size of infected cells was started to increase after 24 hours of infection depend on uninfected cells.Specific growth rate and doubling time of Sf9 cells were calculated as 0.03 h-1 (0.73 day-1) and 22.5 h in shake flasks. These data and characteristic values of medium such as viscosity and density were used in calculation scale-up process in terms of bubble diameter, aeration rate, specific death rate, kLa, Reynolds number and Power number. Large scale productions of Sf9 cell line were performed in 1.5- and 3-L bioreactors. Specific oxygen consumption rate was monitored in uninfected cells and cells at 72nd hour after infection in 1.5-L and 3-L bioreactors. It was increased from 1.8x10-10 mgO2/cell.min in uninfected cells to 2.9x10-10 mgO2/cell.min at 72nd hour after inoculation in 1.5-L bioreactor. Meanwhile, 7.27x10-10 mgO2/cell.min and 1.12x10-10 mgO2/cell.min were determined in 3-L bioreactor, respectively. Oxygen mass transfer coefficient (kLa) was calculated as 0.0133 min-1 and 0.0129 min-1 in 1.5-L and 3-L bioreactors. DPP IV expression was observed in 96% and 90% of total cells after 1.5-L and 3-L productions and molecular-weight of DPP IV was determined 76 kDa with SDS-PAGE method in both productions. Productivity values of 1.5-L and 3-L productions were 3.4 and 3.0 mU/ml.h, respectively.Ion exchange and molecular-size chromatographies were used in purification steps of DPP IV in large scale productions. Purification process was successfully achieved with 24.5% yield and 487-fold purified product based on crude enzyme activity. Molecular-weight of DPP IV was determined 136 kDa (dimer) using molecular-size chromatography.Productivity of processes and activities of DPP IV values after large scale productions showed that recombinant DPP IV was successfully prepared in Sf9 insect cell lines and produced in large scales.