Aloe vera (AV) katkılı poli (bütilen adipat-ko-tereftalat) (PBAT) doku iskelesi ile fotobiyomodüle kalp yaması geliştirilmesi
Development of photobiomodulated cardiac patch with Aloe vera (AV) doped poly (butylene adipate-co-terephthalate) (PBAT) scaffolds
Yazar: TUĞÇE GÜLTAN
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU ; PROF. DR. SULTAN BELGİN İŞGÖR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Miyokardiyal enfarktüs (MI) sonrası hasar gören ve kasılma yeteneğini kaybeden kasın onarımı gerçekleşmez. Kalbin geri kalan kısmının, o bölgedeki kasların da kasılma görevini yerine getirmeye çalışması, kalp yetmezliğine varan hastalıklar ile sonuçlanmaktadır. Bu hastalıkların tedavisinde 'kardiyak doku mühendisliği' çalışmaları yeni bir bakış açısı sunmaktadır. Sunulan tez çalışmasında MI sonrası kardiyak yama olarak kullanılabilecek Aloe vera (AV) katkılı poli(bütilen adipat-ko-tereftalat) (PBAT) nanofibröz matrikslerin üretilmesi ve gerçek ortamı taklit eden hücre kültür koşullarında kızılötesi ışınlar varlığında ve yokluğunda in-vitro kardiyomiyojenik farklılaşmanın araştırılması amaçlanmıştır. 
Tez çalışmasının ilk kısmında PBAT ve Poli(ε-kaprolakton) (PCL) bazal membran destekli rastgele (R-PBAT) ve hizalı (H-PBAT) morfolojide nanofibröz matriksler üretilmiştir. Tepki Yüzey Metodolojisi (Response Surface Methodology-RSM) kullanılarak elektroeğirme koşulları optimize edilmiştir. Bu koşullar, %10 (w/v) polimer çözeltisinin 0.1 mL/sa akış hızıyla 15 kV elektriksel alanda 20 cm iğne ucu – toplayıcı arası mesafeden işletim şeklinde optimize edilmiştir. R-PBAT ve H-PBAT nanofiberler için sırasıyla ortalama 555126 nm ve %91'i hizalı olacak şekilde 417137 nm çap değerleri bulunmuştur. H-PBAT yapısının H9C2 tutunma, yayılma ve çoğalma davranışlarını iyileştirdiği saptanmıştır. Bu nedenle sonraki aşamalarda hizalı nanofibröz matrikslerin kullanımına karar verilmiştir. 
İkinci bölümde H9C2 ve KMEH hücreleri karakterize edilerek özgül üreme hızları ve ikilenme süreleri sırasıyla 0.017 sa-1 – 41 saat ve 0.0454 sa-1 – 22 saat olarak bulunmuştur. PBAT nanofibröz matrikslere katkılanacak AV miktarının belirlenmesi için sitotoksite testi uygulanmış ve katkılanacak AV derişiminin 10 mg/mL olması kararlaştırılmıştır. Bu bölümde, AV ve PBM'nin hücresel cevaplara etkisi de incelenmiştir. Optimize PBM koşulları 20 cm mesafeden 3 dk boyunca gün aşırı uygulama olarak belirlenmiştir. 
Tez çalışmasının son kısmında elektroeğirme işlemi sırasında H-PBAT nanofibröz matriks yapısına AV katkılanarak %85'i hizalı 430116 nm ortalama çap değerinde AV-PBAT nanofibröz matriksler üretilmiştir. Katkılama sonrası matrikslerin çekme dayanımının 8.50.9 MPa'dan 5.90.4 MPa'a, elastik modülünün 29.24.5 MPa'dan 18.40.8 MPa'a, kopmadaki uzama değerlerinin ise %48.010.5'ten %25.72.72'ye düştüğü saptanmıştır. ATR-FTIR, Raman, EDX, EDX haritalama ve XPS gibi yöntemlerle AV'nin nanofiberler içinde kimyasal varlığı ispatlanmaya çalışılmıştır. Biyoreaktörde gerçekleştirilen ön denemeler sonrası elektromekanik uyarım biyoreaktörünün 2 Hz çekme – 10 Hz dinlenme şeklinde %5 gerinim ve 2 ms atım periyodu ile 0.4 V elektrik akımının 7 gün boyunca düzenli olarak hücreli örneklere uygulanması şeklinde çalıştırılmasına karar verilmiştir. RT-qPCR analiz sonuçları Cacnal1c, Cacnal1s, FGF-2, Slc29a1 ve VEGF-A gibi önemli genlerin ekspresyon seviyelerinde özellikle dinamik koşullarda PBM uygulamasının yüksek oranlarda artışa neden olduğunu ortaya koymuştur. 
Tez çalışması sonunda AV-PBAT nanofibröz matrikslerin 20 cm mesafeden 3.5 J/cm2dk enerji yoğunluklu, 600-1200 nm dalga sayısı aralığında polikromatik ışık ve kızılötesi enerji sağlayan plazma ark ışık kaynağı (PAC) ile günde 10.4 J/cm2 enerjili kızılötesi ışınlarla gün aşırı uyarılarak elektromekanik uyarım biyoreaktöründe kullanılmaları durumunda kardiyomiyojenik farklılaşmayı ve vaskülarizasyonu desteklediği ortaya konmuştur.

Abstract:
The damage to the muscle that loses its ability to contract after myocardial infarction (MI) is not repaired. 'Cardiac tissue engineering' studies offer a new perspective on treating diseases that lead to heart failure due to the rest of the heart trying to fulfill the contraction function of the muscles in that area. In this study, it was aimed to produce Aloe vera (AV)-doped poly (butylene adipate-co-terephthalate) (PBAT) nanofibers that can be used as a cardiac patch after MI and to support in-vitro cardiomyogenic differentiation of the H9C2 rat cardiomyoblast cell line-cardiac microvascular endothelial cell (KMEH) co-culture cultured in these matrices under dynamic conditions in the presence and absence of infrared radiation.
In the first part, it was proposed to evaluate basal membrane-supported random (R-PBAT) and aligned (A-PBAT) nanofibrous matrices as a cardiac patch. Using Response Surface Methodology (RSM), electrospinning parameters were optimized to produce nanofibers with the desired average diameter and alignment values at a flow rate of 0.1 mL/hr of 10% (w/v) polymer solution in an electric field of 15 kV at 20 cm between the needle tip and collector. The average diameters were found for R-PBAT and A-PBAT nanofibers as 555126 nm and 417137 nm (91% alignment), respectively. In this section, it was determined that the A-PBAT structure improved H9C2 adhesion, spreading, and proliferation behavior. Therefore, it was decided to use aligned nanofibrous matrices for further studies. 
In the second part, H9C2 and CMEC cells were characterized, and their specific growth rates and doubling times were found as 0.017 hr-1 – 41 hours and 0.0454 hr-1 – 22 hours, respectively. A cytotoxicity test was applied to determine the doping amount of AV in PBAT nanofibrous matrices, and it was decided that the doping concentration of AV as 10 mg/mL. Cell culture studies were performed to determine the effects of AV and PBM on cellular responses. Optimized PBM conditions were application from 20 cm distance for 3 minutes every other day. 
In the last part of the thesis study, AV was doped into the A-PBAT nanofibrous matrix structure during the electrospinning process, and AV-PBAT nanofibers with an average diameter of 430±116 nm, 85% aligned, were produced. The doping process decreased the tensile strength of the matrices from 8.5±0.9 MPa to 5.9±0.4 MPa, the elastic modulus from 29.2±4.5 MPa to 18.4±0.8 MPa, and the elongation at break values from 48.0±10.55% to 25.7±2.72%. ATR-FTIR, Raman, EDX and EDX mapping, elemental analysis, and XPS methods were used to prove the chemical existence of AV in nanofibers. After the preliminary tests, it was decided to operate the electromechanical stimulation bioreactor by applying a 0.4 V electrical current with a 2 Hz stretching – 10 Hz resting pattern, 5% strain, and a 2 msec pulse period to samples regularly for 7 days under aseptic conditions. RT-qPCR analysis results revealed that PBM application, especially under dynamic conditions, caused a high increase in the expression levels of significant genes such as Cacnal1c, Cacnal1s, FGF-2, Slc29a1, and VEGF-A.
In conclusion, the thesis study revealed that AV-PBAT nanofibrous matrices support cardiomyogenic differentiation and vascularization when stimulated every other day with polychromatic light and infrared energy provided by a plasma arc light source (PAC), emitting light in the wavelength range of 600-1200 nm with an energy density of 3.5 J/cm2min from a distance of 20 cm and delivering a daily dose of 10.4 J/cm2 of infrared radiation in an electromechanical stimulation bioreactor.