Yeni doğan buzağılardan patojenik escherichia coli identifikasyonu ve bu etkenlere karşı etkin bakteriyofaj izolasyonu
New born calf pathogenic escherichia coli identification  and isolation of bacteriophage against these agents
Yazar: MUSTAFA REHA COŞKUN
Danışman: PROF. DR. MİTAT ŞAHİN
Kafkas Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Bakteriyofajlar = Bacteriophages ; Buzağılar = Calves ; Diyare = Diarrhea ; Escherichia coli = Escherichia coli ; Genom = Genome

Özet:
Bu çalışmada yenidoğan buzağılarda ishale neden olan Escherichia coli suşları izole edilmiş ve bu suşlara karşı bakteriyofaj izolasyonu gerçekleştirilmiştir. İshalli buzağılardan alınan 115 dışkı sürüntü örneğinin kültürel ve moleküler araştırılması sonucunda virulens gen bölgelerine göre 50 buzağı örneğinde (%43,5) patojen E. coli suşu izole edilmiştir. Patojen E. coli izole edilen 50 buzağının 9'unun farklı E. coli suşu ile miks enfeksiyon geçirdiği belirlenmiştir ve buzağıların 7'sinde 2 farklı virulens profili gösteren E. coli suşu bulunurken geriye kalan 2 buzağıda 3 farklı virulens profili gösteren suş izolasyonu yapılmıştır. Çalışmanın sonunda 50 buzağıdan 61 suş elde edilmiştir. Elde edilen suşların 27'si F17 fimbriası, 26 tanesi K99, 3 tanesi F41, 2 tanesi Stx1, 1 tanesi intimin ve son bir taneside Stx-2+eae gen bölgelerine sahip olarak tanımlanmıştır.  İzole edilen 61 suş O-antijeni serotiplendirmesi için 10 farklı serotipe karşı moleküler ve serolojik olarak incelenmiştir. 32 suş O101 ve 2 suş ise O9 olarak tanımlanmıştır. 
Araştırmada izole edilen E. coli izolatlarına yapılan disk diffüzyon antibiyogram testi ile antibiyotik duyarlılık profili belirlenmiştir. Antibiyogram sonucunda E. coli suşlarının trimethoprim-sulphamethoxazole %91,7 (55/60), ampisiline %86,7 (52/60), enrofloksasine %86,7 (52/60), gentamisine %45 (27/60), tobramisine %41,7 (25/60), cefotaksime %3,3 (2/60) ve ceftazidime %1,7 (1/60) oranında dirençli bulunmuştur. Ertapenem ve meropeneme dirençli suşa rastlanmamıştır. 
Çalışmada buzağı ishaline neden olan E. coli suşlarına karşı 7 bakteriyofaj izolasyonu gerçekleştirilmiştir.  Fajların biribirinden farklılığı RAPD-PCR ile belirlenmiştir. İzole edilen fajların adsorbsiyon zamanı, latent periyodu, burst size ile biyolojik aktivitleri tespit edilmiştir. Fajların izole edilen E. coli suşları üzerine konak spektrumuna bakıldığında %58,3 (35/60) oranında etki ettiği gözlemlenmiştir. İzole edilen fajlardan 3'ü seçilerek tüm genom sekansı gerçekleştirilmiştir. Biyoinformatik analizleri sonucunda fajların ikisi (Eco-ETEC 22-3 ve Eco-STEC 70S) Dhillonvirus cinsinde, diğer faj ise (Eco-ETEC 234) Gamaleyavirus cinsinde olduğu saptanmıştır. Yapılan analizler sonucunda fajlarda hiçbir virulens genine veya antibiyotik direnç 
genine rastlanmamıştır. Üç fajında litik (virulent) yaşam siklusunda olduğu belirlenmiştir.
E. coli infeksiyonları buzağı yaşamını olumsuz etkilemeye devam etmektedir. Bu bakteriler antibiyotiklere hızla direnç kazanmaktadır. Koruyucu ve tedavi amaçlı alternatif metodların geliştirilmesi ihtiyaç vardır. Bu alternatiflerden birisi de fajlar olabileceği öngülmektedir.

Abstract:
In this study, Escherichia coli strains causing diarrhea in newborn calves were isolated and bacteriophage was isolated against these strains. As a result of cultural and molecular investigation of 115 stool swab samples taken from calves with diarrhea, pathogenic E. coli strains were isolated in 50 (43.5%) calf samples according to virulence gene regions. It was determined that 9 of 50 calves isolated from pathogen E. coli had mixed infections with different E. coli strains, and 7 of the calves had E. coli strains showing 2 different virulence profiles, while strains showing 3 different virulence profiles were isolated in the remaining 2 calves. At the end of the study, 61 strains were obtained from 50 calves. Of the strains obtained, 27 were identified as having F17 fimbria, 26 with K99, 3 with F41, 2 with Stx1, 1 with intimin and the last one with Stx-2+eae gene regions. 61 isolated strains were analyzed molecularly and serologically against 10 different serotypes for O-antigen serotyping. 32 strains were defined as O101 and 2 strains as O9.
Antibiotic susceptibility profile was determined by disk diffusion antibiogram test performed on E. coli isolates isolated in the study. As a result of the antibiogram, E. coli strains were found to be trimethoprim-sulphamethoxazole 91.7% (55/60), ampicillin 86.7% (52/60), enrofloxacin 86.7% (52/60), gentamicin 45% (27/60), 41.7% (25/60) to tobramycin, 3.3% (2/60) to cefotaxime and 1.7% (1/60) to ceftazidime were found to be resistant. No strains resistant to ertapenem and meropenem were found.
In the study, 7 bacteriophages were isolated against E. coli strains causing calf diarrhea. The differentiation of phages from each other was determined by RAPD-PCR. Adsorption time, latent period, burst size and biological activities of isolated phages were determined. It was observed that phages had an effect of 58.3% (35/60) on the isolated E. coli strains when looking at the host spectrum. The whole genome sequence was performed by selecting 3 of the isolated phages. As a result of bioinformatics analysis, two of the phages (Eco-ETEC 22-3 and Eco-STEC 70S) were found to be in the genus Dhillonvirus, and the other phage (Eco-ETEC 234) was in the genus Gamaleyavirus. As a result of the analysis, no virulence genes or antibiotic 
resistance genes were found in the phages. It has been determined that three phages are in a virulent life cycle.
E. coli infections continue to negatively affect calf life. These bacteria are rapidly gaining resistance to antibiotics. There is a need to develop alternative methods for preventive and therapeutic purposes. One of these alternatives is predicted to be phages.