Bazı mikroorganizmaların ürettiği lipaz enziminin optimizasyon ve karakterizasyonu
Optimization and characterization of the lipase enzyme produced by some microorganisms
Yazar: EZGİ KESKİN TALDARİ
Danışman: PROF. DR. ŞAHLAN ÖZTÜRK
Nevşehir Hacı Bektaş Veli Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada ekstrem çevre şartlarından alınan yağ ile kontamine olmuş toprak ve kaynak sularından izole edilen 24 tribütrin agar pozitif izolatın lipolitik aktivitesi pNPP lipaz testi ile incelenmiştir. Lipaz aktivitesinin yüksek olduğu izolatlar Aeromonas veronii olarak tanımlanmıştır. En yüksek enzim aktivitesine sahip EK-2 (26 U/ml) izolatı optimizasyon ve karakterizasyon çalışmalarında kullanılmıştır. EK-2 izolatından lipaz üretimi için en iyi koşulları belirlemek üzere, farklı fermentasyon parametreleri optimize edilmiş ve optimum inkübasyon süresi ve sıcaklığı 18 saat ve 30 °C, optimum besiyeri pH'sı 7, en uygun yağ oranı ve kaynağı % 1 hindistancevizi yağı, en uygun inorganik ve organik azot kaynakları sırasıyla amonyum sülfat ve jelatin olarak belirlenmiştir. Optimize edilmiş fermentasyon koşullarında, hücre dışı lipaz üretilmiş ve diyaliz ve ultrafiltrasyon ile kısmen saflaştırılmıştır. Kısmi olarak saflaştırılan enziminin ultrafiltrasyon aşamasında toplam ve spesifik aktivitesinin (39,47 U/ml)  diğer saflaştırma adımlarından daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Kısmi saflaştırılmış lipaz karakterize edilmiş ve optimum çalışma sıcaklığı 40 °C (45,05 U/ml), tampon pH'sı pH 8.0 (45,17 U/ml), tampon konsantrasyonu 50 mM (56,35 U/ml) ve substrat konsantrasyonu 27 mg/ml (48,6 U/ml)  olarak belirlenmiştir. Ayrıca, EK-2 izolatının lipid içeriği, sülfo-fosfo vanilin testi ile 26,08 μg/ml olarak belirlenmiştir. Bu çalışma, fermantasyon koşullarının optimizasyonunun ve enzim karakterizasyonu çalışmalarının EK-2 lipaz aktivitesinde önemli bir artışa yol açtığını göstermiştir. Bu sonuçlara göre, ileriki çalışmalarda yüksek enzimatik aktiviteye sahip EK-2 lipazının biyodizel üretimi gibi biyoteknolojik uygulamalarda kullanılması mümkündür.

Abstract:
In this study lipolitic activity of 24 tributyrin agar positive strains isolated from extreme environmental sources such as oil contaminated soil and spring water were examined with pNPP lipase assay. Isolates having higher lipase activity were identified as Aeromonas veronii.  In the subsequent optimization and characterization studies, EK-2 (26 U/ml) strain possessing higher enzyme activity was used. To determine the best conditions for EK-2 lipase production, different fermentation conditions were performed and optimum incubation time and temperature were determined as 18 hours and 30 °C, optimum media pH as 7, optimum fat content and source was determined as 1% coconut oil, inorganic and organic nitrogen source were determined as ammonium sulfate and gelatin with respectively. At the optimized fermentation conditions, extracellular lipase was produced and partially purified by dialysis and ultrafiltration. It was determined that the total and specific activity of purified enzyme (39,47 U/ml) in the ultrafiltration step was higher than the other purification steps. The partially purified lipase was characterized and the optimum working temperature, buffer pH and concentration, substrate concentration was determined as 40 °C (45,05 U/ml), pH 8.0 (45,17 U/ml), 50 mM (56,35 U/ml) and 27 mg/ml (48,6 U/ml) with respectively. This study revealed that the optimization of fermentation conditions and enzyme characterization studies led to a significant increase in activity of EK-2 lipase. In addition, the lipid content of the EK-2 strain was determined as 26,08 μg/ml by sulfo-phospho vanillin assay. According to these results, it is possible to use EK-2 lipase with high enzymatic activity in biotechnological applications such as biodiesel production in advanced studies.