Meme kanseri ve meme kanser kök hücrelerinde telomeraz inhibitörü bıbr1532 ajanının etkisinin moleküler biyolojik açıdan incelenmesi
Molecular biological investigation of telomerase inhibitor bibr1532 agent effect in breast cancer and breast cancer stem cells
Yazar: FATMA DOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. ÇIĞIR BİRAY AVCI
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Tümör hücrelerinin alt popülasyonunu oluşturan kanser kök hücrelerinin (KKH) tümör büyümesi, metastaz, kanser ilaç direncinden sorumlu olduğu vurgulanmaktadır ve telomeraz inhibitörü BIBR1532 etkeninin KKH tedavisinde etkili olması beklenmektedir.  Meme kanserinde konvansiyonel tedaviden yeterli yanıt alamama durumu araştırmacıları yeni tedavi yöntemleri bulmaya yönlendirmektedir ve literatür araştırmaları KKH çalışmalarını desteklemektedir.
BIBR1532, telomeraz enzimini inhibe eden seçici bir anti-kanser ajanıdır. Klinik çalışmalarda kullanılan genel kemoterapötik ilaçların birçoğu yan etki göstermektedir. Telomeraz inhibitörlerinin avantajı normal dokularda toksik etkisinin az olmasıdır. Bu inhibitör eşliğinde terapötik ilaçların yan etkilerinin en aza indirilmesi beklenmektedir. Meme kanserinde yaygın olan PI3K/Akt/mTOR yolağının KKH'nin yenilenebilmesinde ve anti-kanser ilaç direnç gelişiminde önemli olduğu bilinmektedir. Kanser hücrelerinin hayatta kalması için mTOR ve hTERT yolları arasında etkileşimin gerekli olduğu vurgulanmaktadır. Çalışmamızda MCF-7, meme kanser kök hücresi (MKKH) ve kontrol olan normal meme epitel hücresi MCF10A hücrelerinde BIBR1532 etken maddesinin hücrelerdeki sitotoksisitesi belirlenmiş olup, apoptoz ve hücre döngüsü üzerine etkileri araştırılmıştır. Ayrıca mTOR yolağındaki ilişkili 84 genin ekspresyon değişimleri ve hTERT gen ekspresyon değişimleri gerçek zamanlı RT-qPCR ile analiz edilmiştir. HIF1α (hipoksi ile indüklenebilir faktör alfa) ve PKM2 (Pirüvat kinaz izoenzimleri M/M2) proteinlerindeki ifade değişimleri ELISA (Enzim Bağlantılı İmmünosorbent Assay) yöntemi kullanılarak değerlendirilmiştir.
BIBR1532 etken maddesinin 48. saat için IC50 dozları MCF-7 hücre hattında 34,59 μM, MKKH hattında 29,91 μM ve MCF10A hücre hattında 29,07 μM bulunmuştur. Bu etken maddenin MKKH ve MCF-7 hücre hatlarında kayda değer bir şekilde apoptoz indüklerken, MCF10A kontrol hücresinde apoptozu çok az indüklediği gözlenmiştir. Hücre döngüsü analiz sonuçlarında, MKKH ve MCF-7 hücre hatlarının G2/M fazında hücre arresti görülmüştür. Ayrıca MKKH ve MCF-7 hücre hatlarında BIBR1532 etken maddesinin telomeraz aktivitesini baskıladığı gösterilmiştir. 
BIBR1532'nin sitotoksik aktivitesi MKKH ve MCF10A hücre hatlarında ilk kez araştırılmış ve etken maddenin sitotoksisite değerinin MKKH ve MCF-7 hücre hatları üzerinde etkin bir şekilde apoptozu indüklediği gözlenmiştir. Ayrıca kontrol hücre modeli olan MCF10A hücre hattı üzerinde ise kayda değer bir apoptotik etkiye neden olmadığı saptanmıştır. BIBR1532'nin mTOR sinyal yolağı üzerindeki etkisi ilk kez değerlendirilmiş ve telomeraz inhibitörünün bu sinyal yolağındaki olumlu etkileri göz önünde bulundurulduğunda, meme kanserinde tedaviye yeni bir yaklaşım getirebileceği düşünülmektedir. BIBR1532 uygulamasına bağlı olarak MKKH ve MCF-7 hücre hatlarında HIF-1α/PKM2 protein seviyelerindeki azalmanın, literatür verileri göz önünde bulundurulduğunda, hTERT bağlantılı olarak gerçekleştiğini düşünmekteyiz.

Abstract:
It is emphasized that the cancer stem cells (CSC) forming the subpopulation of tumor cells are responsible for tumor growth, metastasis, cancer drug resistance and telomerase enzyme may be effective in the treatment of CSC. Inadequate response to conventional therapy in breast cancer leads researchers to find new treatment methods and literature surveys which support cancer stem cell studies.
A selective anti-cancer agent BIBR1532 inhibits the telomerase enzyme. Many of the general chemotherapeutic drugs used in clinical trials have harmful effects but the advantage of telomerase-based inhibitors are less toxic to normal tissues. In the presence of this inhibitor, it is planned to minimize the therapeutic drug damage. It is known that PI3K/Akt/mTOR pathway is common in breast cancer and important in regenerating cancer stem cell in anti-cancer drug resistance. It is emphasized that the interaction between the mTOR and hTERT pathways is essential for the survival of cancer cells. In our study, we applied the BIBR1532 inhibitor on MCF-7, breast cancer stem cell (BCSC) and control normal breast epithelial cell MCF10A. Cytotoxic, apoptotic effects in cells were evaluated and cell cycle analysis was performed. In addition, the 84 gene expression changes in the mTOR pathway and hTERT gene expression changes were analyzed by RT-qPCR and the changes in HIF1α/PKM2 proteins were examined by ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). 
The IC50 doses for the 48th hour of the BIBR1532 agent were detected 34,59 μM in the MCF-7 cell line, 29,91 μM in the BCSC line and 29,07 μM in the MCF10A cell line. It has been observed that this agent induces apoptosis in the BCSC and MCF-7 cell lines but no induction of apoptosis has been observed in the MCF10A control cell. According to the results of cell cycle analysis, G2/M phase accumulation was observed in BCSC and MCF-7 cell lines. It has also been shown that the agent BIBR1532 suppresses telomerase activity in BCSC and MCF-7 cell lines.
The cytotoxic activity of BIBR1532 was first investigated in BCSC and MCF10A cell lines and BIBR1532 agent induced apoptosis effectively on BCSC and MCF-7 cell lines. It has been observed that the BIBR1532 agent did not cause a significant apoptotic effect on the MCF10A cell line. The effect of BIBR1532 on the mTOR signaling pathway has been investigated for the first time in this study. It is thought that the telomerase inhibitor may bring a new approach to treatment, since the breast cancer observation's positive effects on mTOR signaling pathway. We observed that HIF-1α/PKM2 protein level decreased in BCSC and MCF-7 cell lines treated with BIBR1532. We think that the decrease in HIF-1α/PKM2 protein levels is related to hTERT when the literature is considered.