Küçük hücreli dışı akciğer kanseri hücrelerinde EGFR' nin PD-L1 üzerine etkisinin ve ilişkili yolakların incelenmesi
Investigation of the effect of EGFR on PD-L1 and related pathways in non-small cell lung cancer cells
Yazar: BÜŞRA ESER ÇAVDARTEPE
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ NADİR KOÇAK
Selçuk Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2018
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; Apoptozis = Apoptosis ; Epidermal büyüme faktörü = Epidermal growth factor ; ErbB reseptörleri = ErbB receptors ; Karsinoma-küçük hücreli olmayan-akciğer = Carcinoma-non small cell-lung ; RNA = RNA ; Reseptörler = Receptors

Özet:
Akciğer kanseri tüm dünyada kansere bağlı mortalitenin önde gelen nedenidir. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) ise tüm akciğer kanserlerinin yaklaşık % 85' ini oluşturur. KHDAK' ta EGFR mutasyonlarına sıklıkla rastlanmaktadır ve bu da EGFR sinyal yolağının aşırı aktivasyonuyla sonuçlanmaktadır. İmmünoterapi, kanserle savaşmak için vücudun doğal savunma sistemini kullanarak çığır açan bir tedavi yöntemidir. İmmünoterapide önemli hedeflerden biri olan programlanmış hücre ölümü ligandı-1 (PD-L1), çeşitli kanser hücrelerinde sıklıkla aşırı eksprese edilen bir transmembran glikozile proteinidir ve tümör hücrelerinin immün sistemden kaçmasını sağlar. PD-L1 ekspresyonu, kanser hücrelerinde tümör mikroçevresi ve konstitütif onkogenik sinyal yolakları yoluyla modüle edilir. KHDAK' ta onkogenik sinyal yolakları ve PD-L1 arasındaki ilişkiyi araştıran çalışmalar olmakla birlikte çelişkili sonuçlar mevcuttur. Bu nedenle, KHDAK' ta PD-L1 ekspresyonunu düzenleyen onkogenik driver yolakların ve PD-1/ PD-L1 eksen blokajına cevabın etkileri hakkında klinik olarak anlamlı sonuçlar çıkarmak için, ileri çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.
Mevcut projede KHDAK' ta EGFR' nin PD-L1 ile arasındaki ilişkinin ve PD-L1 regülasyonundan sorumlu olabilecek potansiyel yolakların araştırılması hedeflenmiştir. Bu amaçla HCC-827 küçük hücreli dışı akciğer kanseri hücrelerine EGFR-siRNA transfekte edilerek EGFR geni baskılanmıştır. Baskılanma düzeyleri RT-qPZR ile gösterilmiştir. Sonrasında EGFR geninin HCC-827 hücreleri üzerinde proliferasyon ve migrasyona olan etkileri MTT ve scatch assay ile analiz edilmiştir. Bu analizlerde EGFR baskılanmasının HCC-827 hücrelerinin proliferasyon ve migrasyonu anlamlı şekilde azalttığı görülmüştür. EGFR ve PD-L1 genleri arasındaki ilişki incelendiğinde, EGFR baskılanan hücrelerde PD-L1 gen ekspresyonununun anlamlı düzeyde azaldığı tespit edilmiştir. Bu ilişkiyi düzenleyen muhtemel yolaklar hakkında ipucu yakalamak amacıyla yapılan fosfokinaz antikor array analizi sonucunda fosforile JNK 1/ 2/ 3, EGFR, GSK-3α/ β, CREB, FAK, PRAS40, c-Jun ve HSP60 proteinlerinin düzeylerinde azalma, fosforile p53 ve β-Catenin proteinlerinin düzeylerinde ise artış gözlenmiştir. 
Sonuç olarak bu çalışmada, HCC-827 hücrelerinde EGFR geni ile PD-L1 ekspresyonu ile arasında anlamlı ilişki olduğu görülmüştür. Array analizi ile bu genler arasındaki ilişkinin PI3K/ AKT/ mTOR, MAPK ve Wnt/ β-katenin yolakları ve proteozomal yıkım aracılığıyla kontrol ediliyor olabileceği sonucuna varılmıştır. Bu yolaklar birarada düşünüldüğünde bu ilişkinin, hepsinin ortak olarak etkileştiği MYC onkogeni üzerinden düzenleniyor olabileceği düşünülmüştür. Ancak daha detaylı analizler ile desteklenmesi gerekmektedir. Çalışma bulgularının ileri analizler ile desteklenmesi halinde kanser immünoterapisinde güncel tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine fayda sağlayabileceği düşünülmektedir.

Anahtar Sözcükler: EGFR; siRNA; Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri; PD-L1

Abstract:
Lung cancer is the leading cause of cancer-related mortality worldwide. Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for approximately 85% of all lung cancers. EGFR mutations are frequently encountered in NSCLC, resulting in overactivation of the EGFR signaling pathway. Immunotherapy is a pioneer treatment method using the body's own natural defense system to fight cancer. Programmed cell death ligand 1 (PD-L1), one of the important targets in immunotherapy, is a transmembrane glycosylated protein that is frequently overexpressed in various cancer cells and allows tumor cells to escape from the immune system. PD-L1 expression is modulated in cancer cells by the tumor microenvironment and constitutive oncogenic signaling pathways. Although there are studies investigating the relationship between oncogenic signaling pathways and PD-L1 in NSCLC, there are conflicting results. Therefore, further studies are needed to produce clinically relevant results about the effects of oncogenic driver pathways regulating PD-L1 expression in NSCLC and the response to PD-1/ PD-L1 axis blockade.
In the present project, it is aimed to investigate the relationship between EGFR and PD-L1 in NSCLC and the potential pathways that may be responsible for PD-L1 regulation. For this purpose, EGFR-siRNA was transfected into HCC-827 non-small cell lung cancer cells and the EGFR gene was suppressed. The suppression levels are demonsrated by RT-qPZR. The effects of EGFR gene on proliferation and migration on HCC-827 cells were then analyzed by MTT and scatch assay. In these analyzes, it was found that EGFR suppression significantly reduced the proliferation and migration of HCC-827 cells. When the relationship between EGFR and PD-L1 genes was examined, it was determined that PD-L1 gene expression was significantly reduced in EGFR suppressed cells. Phosphokinase antibody array analysis was performed to obtain clues about the possible pathways that regulate this relationship. As a result, the levels of phosphorylated JNK 1/ 2/ 3, EGFR, GSK-3α/ β, CREB, FAK, PRAS40, c-Jun and HSP60 proteins were decreased, and the levels of phosphorylated p53 and β-Catenin proteins increased.
In conclusion, this study showed a significant relationship between EGFR gene and PD-L1 expression in HCC-827 cells. As a result of array analysis, it can be concluded that this relationship can be controlled by PI3K / AKT/ mTOR, MAPK and Wnt/ β-catenin pathways and proteosomal degradation. When these pathways are considered together, it is thought that this relationship between these genes could be regulated via the MYC oncogene, where all of them interacted together. However, it should be supported by more detailed analysis. If the findings of the study are supported by further analysis, it is thought that it may benefit the development of current treatment approaches in cancer immunotherapy.

Keywords: EGFR; siRNA; Non Small Cell Lung Cancer; PD-L1