İn vitro ortamda elektriksel stimülasyonun nöral membran lipit plastisitesi üzerine etkileri
Effects of in vitro electrical stimulation on neural membrane lipid plasticity
Yazar: AYTAÇ GÜZEL
Danışman: DOÇ. DR. VEDAT EVREN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Elektrikle uyarma = Electric stimulation ; Epilepsi = Epilepsy ; Membran lipidleri = Membrane lipids ; Nöral yollar = Neural pathways ; Sinir iletimi = Neural conduction ; İn vitro = In vitro

Özet:
Nöronların uyarılabilirliğindeki değişimler birçok nörolojik hastalığın nedenleri arasında gösterilmektedir. Bunlardan en tipik olanı ise epilepsidir. Epileptogenez bugün bile tam olarak anlaşılamayan ve olasılıkla birden çok etkenin rol aldığı mekanizmalar sonucu kendini göstermektedir. Epilepside gözlenen nöron uyarılabilirliğindeki değişimler, nöbet esnasında nöronların ani ve çok hızlı bir şekilde depolarizasyonuna neden olmaktadır. Buna bağlı olarak, elektriksel alandaki yerel ve şiddetli dalgalanmaların nöron hücre membranlarında plastik değişimlere yol açması olasıdır. Nöron uyarılabilirliğindeki değişimleri açıklamaya çalışan çoğu çalışmada protein yapılı iyon kanalları ve sinaptik bağlantılarla ilişkili plastik değişimler sorumlu tutulmuş ancak bu değişimlerin nedeni tam anlamıyla açıklığa kavuşturulamamıştır. Nöron membranının kapasitif özelliği üzerinde etkili olması beklenen plazma mebranının lipit profili ise genellikle araştırmacılar tarafından göz ardı edilmektedir. Dolayısıyla, epileptik nöbet sırasında gözlenen elektriksel alan potansiyel değişimlerinin membran lipit kompozisyonu üzerindeki olası etkilerinin ortaya konulması gerekmektedir. Literatüre bakıldığında, nöronlar üzerinde elektriksel alan oluşturan çalışmalar arasında detaylı lipit analizi gerçekleştiren bir çalışmaya rastlanmamıştır.
Bu bilgiler ve öngörüler ışığında in vitro nöral eksitasyon sırasında oluşan elektriksel alan değişimlerinin, membranın kapasitif özelliğinde belirleyici rol oynayan lipit profilinde değişime neden olacağını hipotez olarak ileri sürmekteyiz. Bu hipotezimiz kapsamında in vitro koşullarda oluşturulan pulsatil akım elektrik alan potansiyellerinin (PCEF) membran lipit kompozisyonu üzerindeki etkisinin belirlendiği bir çalışma gerçekleştirilmiştir. Bu bağlamda; in vitro stimülasyon yapabilecek ve elektrofizyolojik deneylerde kullanılan Biopac sistemiyle uyumlu deney düzenekleri geliştirilmiş, deney düzenekleri aracılığıyla primer nöron ve SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı stimülasyon parametreleri kullanılarak elektriksel stimülasyon uygulanmış ve çalışma sonunda ise yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemiyle bu hücrelerin membran lipit profilleri analiz edilmiştir. Sonuçlar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile incelenmiştir. Farkın anlamlı bulunduğu değişkenlerde gruplar arası varyansın homojen olması durumunda Post-Hoc yöntem olarak Tukey testi, varyansın gruplar arası homojen olmadığı durumlarda Post-Hoc Dunnett T3 testi uygulanmıştır. 
Çalışma sonucunda primer nöronlar ve nöron kökenli SH-SY5Y hücreleri üzerinde oluşturulan elektrik alan potansiyellerinin, her iki hücre tipindeki membran lipit profillerinde değişime yol açtığı gözlenmiştir. Lipit türlerinden özellikle kolesterol ve fosfotidiletanolamin (PE) moleküllerinin elektrik alan stimülasyonuna karşı gösterdikleri yanıtlar önemlidir. Kolesterolün primer nöronlardaki yüksek şiddetli elektrik alan stimülasyonlarında konsantrasyonunun azaldığı, buna karşılık hücre membranındaki PE seviyelerinin arttığı belirlenmiştir. Yüksek elektrik alan şiddetinde uygulanan nöronların membranlarındaki kolesterol seviyelerinin azalması, hücrenin eksitotoksisite gibi hücre canlılığını tehdit eden olaylara karşı geliştirdiği bir tür savunma mekanizması olabilirken, PE seviyelerinin artması hücrenin, kolesterolün membran eğriliğine yaptığı katkıyı kompanze etmek adına gerçekleştirdiği bir düzenleme olabilir. PCEF uygulanan SH-SY5Y hücrelerinde ise hipokampal ve kortikal nöronlarda ortaya çıkan sonuçlara tamamen zıt bir şekilde artan elektrik alan şiddetine bağlı kolesterol seviyelerinde artış görülmüş ve bu da SH-SY5Y hücrelerinin toksisiteden korunma mekanizması olarak kullandığı kolesterolün burada da hücre canlığını koruma amaçlı kullanılabileceğini bizlere düşündürmüştür.
Sonuç olarak çalışma hipotezimin temelini oluşturan elektriksel stimülasyona bağlı membran lipit profilinin plastik bir değişim görülmesi önemli fizyolojik etkiler gösterebilecek bir değişimdir ve özellikle hücre uyarılabilirliği kaynaklı deneysel hastalık modellerinde terapötik bir hedef olarak değerlendirilmesi ve bu konuda detaylı araştırmaların yapılması gerekmektedir.

Abstract:
Changes in the excitability of neurons are among the causes of many neurological diseases. The most typical of these is epilepsy. Epileptogenesis manifests itself as a result of mechanisms that are not fully understood even today and possibly more than one factor having a role in. Changes in neuron excitability observed in epilepsy cause sudden and very rapid depolarization of neurons during seizures Accordingly, local and severe fluctuations in the electrical field are likely to cause plastic changes in neuron cell membranes. In most studies trying to explain changes in neuron excitability, plastic changes associated with protein-structured ion channels and synaptic connections have been blamed, but the reason for these changes has not been fully elucidated. The lipid profile of the plasma membrane, which is expected to have an effect on the capacitive property of the neuron membrane, is generally ignored by researchers. Therefore, the possible effects of electrical field potential changes observed during epileptic seizures on membrane lipid composition should be revealed. When we look at the literature, there is no study that performs detailed lipid analysis among the studies that create an electrical field on neurons.

In the light of this information and predictions, we hypothesize that the electrical field changes that occur during in vitro neural excitation will cause a change in the lipid profile, which plays a decisive role in the capacitive property of the membrane. Within the scope of this hypothesis, a study was conducted to determine the effect of pulsatile current electric field potentials (PCEF) generated in vitro on membrane lipid composition. In this context, experimental setups compatible with the Biopac system used in electrophysiological experiments were developed, electrical stimulation was applied to primary neuron and SH-SY5Y cell cultures using different stimulation parameters, and at the end of the study, membrane lipid profiles of these cells were analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC) method. 
The results were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA).  Tukey test was used as Post-Hoc method in case the variance between groups was homogeneous in the variables where the difference was significant, and Post-Hoc Dunnett T3 test was used in cases where the variance was not homogeneous between groups.
As a result of the study, it was observed that the electric field potentials created on primary neurons and neuron-derived SH-SY5Y cells to which PCEF was applied caused changes in membrane lipid profiles in both cell types. The responses of lipid species, especially cholesterol and phosphatidylethanolamine (PE) molecules to electric field stimulation are important. It was determined that the concentration of cholesterol in primary neurons decreased in high-intensity electric field stimulation, while the PE levels in the cell membrane increased. While the decrease in cholesterol levels in the membranes of neurons applied at high electric field intensity may be a kind of defense mechanism developed by the cell against events that threaten cell viability such as excitotoxicity, the increase in PE levels may be a regulation that the cell performs to compensate for the contribution of cholesterol to the membrane curvature. In contrast to the results in hippocampal and cortical neurons, cholesterol levels increased due to increased electric field intensity in SH-SY5Y cells treated with PCEF, suggesting that cholesterol, which SH-SY5Y cells use as a protection mechanism from toxicity, can also be used to protect cell viability here.
As a result, a plastic change in the membrane lipid profile due to electrical stimulation, which forms the basis of my working hypothesis, is a change that can have important physiological effects, and it should be evaluated as a therapeutic target especially in experimental disease models originating from cell excitability, and detailed studies should be conducted on this subject.