İnterlökin-33'ün makrofajlarda nitrik oksit üretimi ve kutuplaşma üzerine etkileri
Effect of interleukine 33 on nitric oxide production and macrophage polarization
Yazar: HANDAN AKSOY
Danışman: PROF. DR. VEDAT BULUT
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İmmünoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Bilim ve Teknoloji = Science and Technology
Dizin: Fagositoz = Phagocytosis ; Makrofaj aktivasyonu = Macrophage activation ; Makrofajlar = Macrophages ; Nitrik oksit = Nitric oxide ; Nükleer faktör-kappa B = Nuclear factor-kappa B ; Protein kinaz C = Protein kinase C ; İmmün sistem = Immune system ; İnterlökin 33 = Interleukin 33

Özet:
İnterlökin-33, İnterlökin-1 (İL-1) ailesinin yeni üyesi olarak 2005 yılında keşfedilmiştir. Bu ailenin üyelerinden olan İL-1β ve İL-18 Tip I immün yanıt yönünde immün sistem düzenleyicisiyken, İL-33 Tip 2 immün yanıt yönünde kutuplaşmaya yol açmaktadır. Diğer İL-1 ilişkili sitokinlerle aynı sinyal yolağını kullanmasına rağmen bu farklı etkisi açıklanmalıdır. Bu tezde İL-33'ün makrofajlarda NO üretimi ve kutuplaşma üzerine olan etkileri araştırılmıştır. J774.1 makrofaj hücre hattı kullanılmıştır. Makrofajlar öncelikle M1, M2a ve M2c yönüne kutuplaşabilmeleri amacıyla uygun sitokinlerle muamele edilmiş, sonra bu kutuplaşmış makrofajlara İL-33 eklenerek NO üretimi, kemokin ve kemokin reseptörlerindeki değişimler tespit edilmiştir. İL-33'ün kutuplaşmış makrofajın fagositoz kapasitesini nasıl değiştirdiği değerlendirilmiştir. Son olarak İL-33'ün cAMP, PKC ve NFκB ileti yolağı üzerine etkileri incelenmiştir. Makrofajların nitrik oksit üretimleri Griess reaksiyonu ile tespit edilmiştir. Kemokin üretimleri ELISA ile test edilmiştir. Makrofaj yüzeyindeki kemokin reseptörleri İFA yöntemiyle değerlendirilmiştir. Fagositoz deneylerinde ısı ile inaktive edilmiş ve canlı bakteriler ile floresan işaretli antijen kaplı boncuklar kullanılmıştır. İmmünofloresan mikroskop, fluorometri ve akım hücre ölçer kullanarak fagositoz deneyleri gerçekleştirilmiştir. Sinyal ileti yolağı, uyarımlı makrofajlarda sitoplazma ve membran ekstraksiyonu yapıldıktan sonra ELISA ile değerlendirilmiştir. Sonuç olarak İL-33 naif makrofajlarda NO üretimini etkilememiştir. Ancak uyarımlı makrofajlarda NO üretimini değiştirebilmektedir. İL-33 uyarımlı ve uyarımsız makrofajların fagositoz kapasitesini artırmaktadır. İL-33 sinyal ileti sisteminde cAMP, PKC ve NFκB yapılarını etkilemektedir. Genel itibariyle epitel ve endotel hücrelerinden salgılanan bir sitokin olan İL-33 naif hücreyi aktif durumda tutmakta ve uyarıya hemen cevap verebilecek şekilde hazırlamaktadır. Uyarımlı makrofajlarda ise İL-33, inflamasyon şiddetini azaltmaktadır.


Anahtar Kelimeler : Makrofaj, interlökin-33, nitrik oksit, makrofaj kutuplaşması, fagositoz, cAMP, protein kinaz C, NFκB

Abstract:
Interleukin-33 is classified as a new member of interleukin-1 family cytokines in 2005. Whereas IL-1 and IL-18 promote Th1 associated immune response, IL-33 leads to Th2 polarization. Although it works through the same signalling pathways with other IL-1 associated cytokines, this different affect should be explored. Our study was aimed to explore the effect of IL-33 on NO production and polarization in J774.1 macrophages cell line. Macrophages were polarized skewed to M1, M2a and M2c via cytokine cocktails, IL-33 was added. Then, chemokine and chemokine receptors were assessed by IFA staining (direct or indirect) and ELISA. NO was synchronically measured by Griess reaction. In order to enlighten the effect of IL-33 on the phagocytosis capacity in polarized macrophages, phagocytosis experiments was performed by using fluorescent microscopy, fluorometry and flow cytometry by using heat inactivated and live bacteria or beads bearing antigens with fluorescent label. Finally, we were examined effect of İL-33 on cAMP, PKC and NFκB pathways. In conclusion, we found that IL-33 did not affect NO synthesis in unstimulated J774.1 cells, but IL-33 decreased nitrite levels in macrophages pre-treated with IFNγ+LPS (M1) and increased nitrite levels in macrophages stimulated with IL-4+IL-13 (M2a). When added IL-33 alone into macrophages, fluorometric and flow cytometric analysis showed that IL-33 caused to increase in the phagocytosis response of stimulated and unstimulated macrophages. The different inflammatory conditions have modified the effects of IL-33 in macrophages. Protein kinase C activity, levels of cAMP and NF-κB activities were measured by ELISA. The present study establishes for the first time that cAMP, PKC and NFκB are become effective on the IL-33 signalling pathway. Due to the stimulation, IL-33 keeps macrophages in priming state in prior to induction with IFN-γ plus LPS or TNFα and then represses the severe inflammation.

Key words : Macrophage, interleukine-33, nitric oxide, macrophage polarization, phagocytosis, cAMP, protein kinase C, NF-κB