Rasemik 1-feniletanolün biyokatalitik derasemizasyonu ile enantiyomerik saflıkta 1-feniletanol üretimi
Production of enantiomerically pure 1-phenylethanol with biocatalytic deracemization of racemic 1-phenylethanol
Yazar: PINAR AK
Danışman: PROF. DR. ÜLKÜ MEHMETOĞLU
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering

Özet:
Enantiyomerik saflıktaki kiral bileşikler özellikle ilaç sanayinde farmakolojik ürünlerin girdi maddesidir. Biyoloji, biyokimya ve tıptaki gelişmeler, kiral bileşiğin sadece bir enantiyomerinin aktif olduğunu göstermiştir. 1-feniletanol de kiral bir sekonder alkoldür. (R)-1-feniletanol oftalmik (gözle ilgili) koruyucu, kolestrol inhibitörü, solvatokromik boya olarak kullanılırken, (S)-1-feniletanol alzheimer ilaçlarının yapımında kullanılan bir öncü maddedir.
Bu çalışmada derasemizasyon yöntemi ile enantiyomerik saflıkta (S)-1-feniletanol üretimi incelenmiştir. Rac-1-feniletanolün derasemizasyonu, arda arda enantiyoseçimli yükseltgenme ve stereoseçimli indirgenme tepkimeleri ile gerçekleştirilmiştir. Her iki adım için farklı seçimliliğe sahip tüm hücre biyokatalizörleri kullanılmıştır. Birinci adımda R-seçimli Lactobacillus kefir NRRL B-183; (R)-1-feniletanolün asetofenona yükseltgenme tepkimesini katalizlemektedir. İkinci adımda S-seçimli Rhodotorula glutinis DSM 70398; asetofenonun (S)-1-feniletanole indirgeme tepkimesini katalizlemektedir. Tepkimeler 250ml?lik kesikli biyoreaktörlerde 10ml çalışma hacminde, sıcaklık ve karıştırma hızı kontrol edilen çalkalayıcılarda yapılmıştır. Organik ve sulu fazlar ayrıldıktan sonra, ürünler ve girdi yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) ile analiz edilmiştir. 
İlk olarak R-seçimli ADH enzim aktivitesine sahip Lactobacillus kefir kullanılarak yükseltgenme tepkimesi incelenmiştir. Yükseltgenme tepkimesinde; hücre üreme ortamı, pH, tepkime süresi, hücre derişimi parametrelerinin etkisi incelenmiştir. Lactobacillus kefir biyokatalizörlüğünde optimum koşullar Cso= 5 mM, pH= 8, T= 30°C,  L.kefir derişimi= 200 g/L, t= 24 h olarak belirlenmiş ve bu koşullarda % 100 enantiyomerik aşırılık (e.e) ve % 50 dönüşüm elde edilmiştir. İlk basamağın ardından S-seçimli ADH enzim aktivitesine sahip Rhodotorula glutunis kullanılarak ardışık tepkimenin ikinci basamağı olan indirgenme tepkimesi incelenmiştir. İndirgenme tepkimesinde; tepkime süresi, kosubstrat seçimi, kosubstrat miktarı, hücre derişimi parametrelerinin etkisi incelenmiştir. Rhodotorula glutinis biyokatalizörlüğünde optimum koşullar Cso= 5mM, pH = 8, T= 30 °C, R.glutinis derişimi= 150 g/L , kosubstrat derişimi= 30 g/L, t= 24 h olarak belirlenmiş ve bu koşullarda % 100 enantiyomerik aşırılık ve % 98 dönüşüm elde edilmiştir. Daha sonra her iki tepkime adımı için belirlenen optimum koşullarda rasemik 1-feniletanolün derasemizasyon tepkimesi gerçekleştirilmiştir. Derasemizasyon tepkimesinde; tepkime süresi, L. kefir  hücre derişimi, karıştırma hızı, substrat derişimi parametrelerinin etkisi incelenmiştir. Ters seçimliliğe sahip iki farklı mikroorganizma ile gerçekleştirilen derasemizasyon tepkimesi sonucunda Cso= 5mM, pH= 8, T= 30 °C, L.kefir derişimi= 60 g/L, R.glutinis derişimi= 150 g/L, kosubstrat derişimi= 30 g/L, KH= 250 rpm  ve t= 24 h olarak belirlenmiştir. Bu koşullarda % 91 enantiyomerik aşırılık ve % 90 (S)-1-feniletanol elde edilmiştir.

Abstract:
Enantiomerically pure  chiral compounds are input agent of products in the pharmaceutical industry. Advances  in  biology, biochemistry and medicine  showed that only one enantiomer of a chiral compound is biologically active. 1-phenyl ethanol is a chiral secondary alcohol. (R)-1-phenyl ethanol is used ophthalmic (ocular) protective, cholesterol inhibitor, solvatokromik dye; (S)-1-phenyl ethanol is used in making a precursor of alzheimer's drugs. 
İn this study, (S)-1-phenyl ethanol production has been investigated using deracemization method. Deracemization of racemic 1-phenylethanol has been realized via concurrent enantioselective oxidation and stereoselective reduction. For both steps, the whole cell biocatalysts which have different selectivity were used. In a first step, (R)-1-phenyl ethanol   was oxidized to the acetophenone via R- selective Lactobacillus kefir NRRL B-183. In a second step, acetophenone was reduced to the (S)-1-phenyl ethanol via S-selective Rhodotorula glutinis DSM 70398.  Experiments were performed in a 250 ml batch bioreactor using  the temperature and mixing speed controlled orbital shaker.  The products and substrat have been analyzed at high pressure liquid chromatography (HPLC). 
Firstly, oxidation reaction was investigated via (R)-selective L. kefir as an alcohol dehydroganase (ADH) source. At the oxidation reaction, the effects of cell growth medium, pH, reaction time and cell concentration on the enantiomeric excess and conversion were examined.  Optimum conditions were determined as Cso = 5mM, pH= 8, T= 30 °C, L.kefir concentration= 200 g/L, t=24h. 100 % enantiomeric excess (e.e) and 50 % conversion was obtained at this conditions. After the first step; reduction reaction was investigated via (S)-selective R. glutinis as an alcohol dehydroganase (ADH) source. At the reduction reaction, the effects of reaction time, co-substrate type and concentration, cell concentration on the enantiomeric excess and conversion were   examined.  100 % enantiomeric excess  and  98 % conversion were obtained at conditions of Cso = 5 mM, pH= 8, T= 30 °C, R.glutinis concentration= 150 g/L, co-substrate concentration= 30 g/L, t=24h. After that, under these optimum conditions the deracemization reaction of racemic 1-phenyl ethanol was realized in one-pot. İn the deracemization reaction, the effects of  reaction time, L. kefir cell concentration, stirring rate and  substrate concentration on the  enantiomeric excess  and relative amount % of (S)-1- phenyl ethanol were investigated. Optimum conditions determined as Cso = 5mM, pH= 8, T=30 °C, L.kefir concentration= 60 g/L, R.glutinis concentration= 150 g/L, cosubstrate concentration= 30 g/L, KH= 250 rpm , t=24h.  91 % enantiomeric excess and 90 % (S)-1- phenyl ethanol were obtained at these conditions.