Pankreas kanser dokularında ING4 gen ifade seviyesinin ve P53 gen mutasyonlarının araştırılması
The investigation of ING4 gene expression level and p53 gene mutations in pancreatic cancer tissues
Yazar: İBRAHİM HALİL YILDIRIM
Danışman: PROF. DR. CELALETTİN CAMCI ; PROF. DR. ECİR ALİ ÇAKMAK
Gaziantep Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Pankreas neoplazmları = Pancreatic neoplasms

Özet:
Giriş: Pankreas kanseri 5 yıllık sağ kalım süresi %1'in altında olan çok hızlı metastaz gelişmesi ve tıbbi tedavi ve uygulamalara dirençle karakterize oldukça kötü huylu bir kanser türüdür. Bu kanser tipinde tümör baskılayıcı genlerden p53'ün %50'den fazla mutasyona uğradığı sıkça rapor edilmiştir. ING4 ve ING tümör baskılayıcı genler MDM2'ye bağlanarak p53'ün ubikutinasyon yoluyla parçalanmasını önler ve p21'in özendirici bölgesine bağlanarak gen ifadesini düzenlerler. Ayrıca, ING4 Lys-382 asetilasyonunu tetikleyerek p53'ün oligomerizasyonunu sağlar. ING ailesi tümör baskılayıcı genler p53'ün bu yolla kararlılığını sağlayarak hücre döngüsünü ve hücresel çoğalmanın kontrolüne yardımcı olmakla birlikte, ayrıca, liprin ?1 yoluyla hücresel göçü ve NF-?B yoluyla anjiyogenesisi kontrol etmektedir. ING ailesi PHD bölgesi aracılığı ile de kromatin yapısı kararlılığının düzenlenmesinde rol almaktadır. Bu sebeple pankreatik kanserlerde p53 mutasyonları ve ING4 gen ifadesi ve mutasyonları çalışıldı. Materyal ve yöntemler: Pankreas dokularından elde edilen genomik DNA'larda p53 mutasyonları tanımlanmış primerler kullanılarak, elde edilen mRNA kümesinden sağlanılan cDNA'lar üzerinde tanımlanmış ING4 primerleri ile ß-aktin gen ifadesine göre ING4 gen ifade seviyesi ve dizin analizleri çalışıldı. Sonuçlar: p53 mutasyonları örneklerimizde gözlenmedi fakat p53 de görülen farklı bantların mutasyon taşımadıkları nukleotid dizin analizlerinde görülmüştür. Örneklerde ß-aktin gen mutasyonları gözlemlenmiştir. ING4 çeşitlerinden V1, V2 ve V4 çeşitlerinin hakim olduğu ve gen ifade seviyelerinin azaldığı bulunmuştur. Tartışma: Jel yürütmelerinde bulunan farklı p53 bantlarının GC'ce zengin tekrar dizilerinden kaynaklanan saç tokası yapısı oluşturması sebebiyle eksik yapılı işlevsiz p53 proteininin sentezlenmesine yol açmıştır. ß-aktin geninde bulunan mutasyonlar hücre iskeletinde bozulmalara ve bazı pankreatik kanser dokularının metastatik özelliği ile ilişkilendirilebilir. ING4 gen ifade seviyesinin düşüklüğü ile birlikte işlevsiz p53 sebebiyle pankreatik kanser dokularında hücre döngüsü ve çoğalma kontrolünün bozulmasıyla ve neticede apoptozisin çalışmaması ve metastazisin gelişimini engellemeyen hücresel ortam ile kanser gelişiminin ilşkili olabileceği düşünüldü. Bu arada sitoplazmada biriken ING4 çeşitleride ubikuinasyon yoluyla parçalanmaya giderek nisbi derişiklikleri de düşmektedir. Pankreatik kanser hastaları öykülerinde 1-2 yıl önce tip2 şeker hastası olduklarını dolayısı ile histon asetilaz ve histon deasetilaz ve IGF, MAPK ve p38 yoluyla cAMP ve PI-3K yolaklarının etkinliği anlaşılmaktadır. Her tip2 şeker hastası pankreatik kansere yakalanmadığına göre bu hastalarda yatkınlığın genetik ve çevresel alışkanlıkların etkinliği de dikkate alınarak, ING4 çeşitlerinin hücre içi dağılımları ve pankreatik kanserlerde bu çeşitlerin işlevleri hakkındaki bilgilerin ortaya çıkarılması ING4'ün pankreas kanseri gelişimindeki rolünün daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Abstract:
Preamble: Pancreatic cancer is one of the intractable malignant tumors with a 5-year survival rate is under 1% and characterized by rapid metastatic progression and resistant to medical treatments and management. p53 is a tumor suppressor gene and mutated in more than 50% of pancreatic cancers. p53 protein is involved in several central cellular processes and ING family proteins are the proteins involved in the regulation of p53 activity such as the cell cycle control, DNA repair mechanism and programmed cell death. ING proteins sustain the stability by extending the half-life of p53 protein by competing with MDM2 for the same binding site on p53. It also enhance p53 acetylation at Lys-382 is an important processes in p53 protein oligomerization. The ING family proteins stimulates the expression of p21 by binding to p21 promoter. Like other ING family members, ING4 is involved in suppression of cell proliferation and chromosome stability by means of their PHD binding domains and also involved in cell migration through liprin ?1 and angiogenesis by way of NF-?B. Because of high mutation rate of p53 in pancreatic cancers and the role of ING4 on p53 stabilty and importance of cell migration and angiogenesis in metastasis of pancreatic cancer, p53 mutations and ING4 gene expressions and mutations have been studied. Material and methods: The pancreatic cancer tissues obtained were used for DNA and mRNA population extraction. p53 genomic DNA was analysed using appropriate primers for known mutations on the DNA fraction. The mRNA population obtained was converted to cDNA to study for ING4 variants again using appropriate primers. All PCR products were analyzed using agarose and acrylamide gel elctrophoresis followed by nucleotide sequence analysis. Results and Discussion: Our study has shown a decrease in gene expression of ING4 and its three splice variants of ING4 cDNA samples. Expected p53 gene mutations have not been observed as assessed by DNA sequencing analysis. Differing mobilites of p53 banding pattern were attributed to secondary structures that may cause to truncated mRNA synthesis which may results in disregulation of cell cycle and proliferation. Mutation in ß-actin gene may cause the cell cytoskeleton disruption and enhanced mobility in some pancreatic cancer tissues. Decreased expression of ING4 mRNA variants which were resulted due to alternative splincings (_v2 and _v4) involved in limited NLS regions of the gene that which restricts nuclear migration and cytoplasmic accumulation of ING4 proteins without triggering p53 and p21, in turn, disfunction of apoptosis and enhancing metastasis in addition to the loss of NLS accelerates the ubiquitination of ING4 in the cytosol and again uninduction of p53 translation. An initial onset of type2 diabetes mellitus in pancreatic cancer patients suggests the importance of cAMP and PI-3K pathways through histone acetylase, histone deasetylase and IGF, MAPK and p38. Thus, not all type2 diabetes susceptible to pancreatic cancer and along with genetic predisposition and habitual environment, studying the cellular locations and functions of ING4 splicing variants in pancreatic cancer due to different cellular functions of ING4 splicing variants, will explain beter the role of ING4 in pancreatic cancer.