Yaralanmayla aktif olan AoPR1 promotörünün kontrolü altındaki CRY genlerinin protein üretimlerinin patateste sınırlandırılması
Restriction of CRY gene protein production under the control of wound-induced AoPR1 promoter in potato
Yazar: HÜSEYİN ABDULLAH AHMED AHMED
Danışman: PROF. DR. SEBAHATTİN ÖZCAN
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarla Bitkileri Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Bu çalışmada, patatese Agrobacterium.tumefaciens aracılığıyla etkili ve hızlı gen aktarım yönteminin geliştirilmesine çalışılmış ve adventif sürgün rejenerasyonu, Agrobacterium tumefaciens ile gen aktarımının optimizasyonu ile böceklere dayanıklı transgenik bitkilerin elde edilmesine yönelik çalışmalar yürütülmüştür. Öncelikle 14 adet patates çeşit ve hattına ait yaprak ve gövde eksplantlarının adventif sürgün rejenerasyon kabiliyeti, değişik oranlarda bitki büyüme düzenleyicileri kombinasyonlarını içeren MS besin ortamlarında belirlenmiştir. En yüksek adventif sürgün rejenerasyonu Tokat 6/24 ve Tokat 10/1 hatları ile Innovator ve Marabel çeşitlerinin yaprak eksplantlarından ilk önce %3 sukroz, 10 mg/L zeatin ribosid (ZR) ve 10 mg/L -naftalen asetik asit (NAA)  içeren Murashige ve Skoog (MS) besin ortamında ön muamele uygulandıktan sonra, 2.0 mg/L ZR, 0.2 mg/L NAA ve 0.02 mg/L giberellik asit (GA3) içeren MS besin ortamında kallus ve daha sonra 2.00 mg/L ZR ve 0.2 mg/L GA3 içeren MS besin ortamında elde edilmiştir. Patatese gen aktarımını optimize etmek amacıyla pAoPR1-GUS-INT ve p35S-GUS-INT vektörlerini içeren GV2260 A.tumefaciens hatları ile yaprak eksplantları farklı uygulamalarla inoküle ve ko-kültüve edilmiştir.  En uygun inokulasyon süresinin 15 dk ve ko-kültivasyon süresinin karanlık şartlarda 3 gün olduğu bulunmuştur. Çalışmanın ikinci aşamasında ise hem Lepidoptera ve hem de Coleoptera takımındaki böceklere toksik olan ve iki çenekli bitkilerde ekspresyon için optimize edilmiş olan hibrit SN19 (Cry1Ba/Cry1Ia) geni yaralanmayla aktif olan AoPR1 ve CaMV35S promotörlerinin önüne klonlandıktan sonra binari pTF101.1 transformasyon vektörünün T-DNA bölgesine yerleştirilmiştir. Daha sonra elde edilen vektörler elektroparosyon ile A. tumefacines EHA 105 hattına aktarılmış ve farklı patates çeşit ve hatlarına gen aktarımında kullanılmıştır. Gen aktarım sonucunda Tokat 6/24 ve Tokat 10/1 hatları ile innovator çeşidinden SN19 ve BAR genleri taşıyan 42 adet transgenik bitki elde edilmiş ve PCR ile Western Blot analizleriyle teyit edilmiştir. Bu bitkiler üzerinde patates böceğinin (Leptinotarsa decemlineata) larva ve erginleriyle biyoessey çalışmaları yapılmıştır. Bu çalışmalar sonucunda 42 adet bitkinin tamamı patates böceği larvalarının %100 oranında ölümüne neden olmuştur. Ayrıca, bu çalışmalarda larva ve ergin ölümlerinde AoPR1 promotörünün 35S promotöründen daha etkili olduğu gözlenmiştir.

Abstract:
This study reports the optimization of adventitious shoot regeneration and rapid genetic transformation in potato using Agrobacterium tumefaciens and development of insect resistant potato plants. Firstly, adventitious shoot regeneration capacity of 14 potato cultivar and lines were determined using leaf and stem explants on MS medium supplemented with various concentrations of plant growth regulators. The highest adventitious shoot regeneration was achieved from leaf explants of Innovator and Marabel cultivars and Tokat 6/24 and Tokat 10/1 lines on Murashige and Skoog (MS) medium containing 3% sucrose, 10 mg/L zeatin riboside (ZR) and 10 mg/L -naphthaleneacetic acid (NAA) preconditioning followed by culture on 2.0 mg/L ZR and 0.2 mg/L NAA and 0.02 mg/L gibberellic acid (GA3) that induced callus followed by transfer on MS medium containing 2.00 mg/L ZR and 0.2 mg/L GA3. For optimization of gene transfer to potato, leaf explants were inoculated and co-cultivated with A. tumefaciens strain GV2260 bearing pAoPR1 GUS-INT and p35S GUS-INT vectors using different applications. The highest results were obtained from 15 min inoculation period followed by cultivation for 3 days in dark conditions. In the second stage of the experiments, hybrid SN19 gene (Cry1BA/Cry1Ia) which is optimized for expression in dicots and toxic to Lepidoptera and Coleoptera insect species was cloned in front of wound induced AoPR1 and CaMV35S promoters and placed into T-DNA region of binary pTF101.1 transformation vector. Vectors containing AoPR1-SN19 and 35S-SN19 genes were then transferred to A. tumefaciens strain EHA105 by electroporation and used for gene transfer to different potato cultivars and lines. After transformation, 42 plants containing SN19 and BAR genes were generated from Tokat 6/24, Tokat 10/1 and Innovator genotypes and confirmed by PCR and Western Blot analysis. Leaf bioassay test results with Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata) show that all transgenic potato plants killed the 100% of insect larvae. In addition, AoPR1 promoter was found to be more effective than 35S promoter for killing the larvae and adult insects.