İnsanda paternal mitokondriyal DNA geçişinin moleküler temeli ve gelişimsel mitokondri eliminasyonunun izlenmesi
Molecular basis of paternal mitochondrial DNA transmission and monitoring of developmental mitochondria elimination in human
Yazar: CANDAN EKER
Danışman: DOÇ. DR. TUBA GÜNEL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Mitokondri ökaryotik hücrelerin tümüne yakın kısmında yer alan; kendi genomuna, transkripsiyon ve translasyon mekanizmasına sahip semiotonom bir organeldir. Mitokondriler kalsiyum sinyal yolağı, programlı hücre ölümü, hücresel yaşlanma, farklılaşma ve enerji üretimi gibi pek çok hücresel fonksiyonun gerçekleştirilmesinde önemli rol oynar.
İnsanda ve memelilerin çoğunda mitokondri ve mitokondriyal DNA'nın maternal kalıtımı, evrensel olarak kabul edilen bir görüştür. Yüksek düzeydeki mitokondriyal heteroplazmi, sağlıklı yaşam ve hastalık direnci üzerinde zararlı etkilere neden olabileceğinden; fertilizasyona uğramış oositler içindeki sperm-kaynaklı mitokondrilerin ortadan kaldırılmasının normal preimplantasyon embriyo gelişimini sağladığı düşünülmektedir.
Maternal mitokondriyal kalıtım mekanizması tam olarak aydınlatılmamış olmakla birlikte, günümüze kadar yapılan çalışmalar paternal mitokondriyal DNA'nın döldeki eliminasyonunun farklı türlerde farklı mekanizmalarla gerçekleştiğini göstermektedir.
Bu bağlamda bu tez çalışmasının amacı; memelilerde mekanizması henüz tam olarak aydınlatılmamış olan sperm mitokondriyal DNA eliminasyonunun ve paternal mitokondriyal DNA geçişinin insanda moleküler düzeyde çalışılarak yardımcı üreme teknolojileri uygulamalarında paternal mitokondriyal DNA etkisinin araştırılmasıdır.
Erkek infertilitesi sebebiyle yardımcı üreme tekniklerine başvuran ailelerde yeni nesil dizileme teknolojisi kullanılarak mitokondriyal DNA genom dizileme çalışması gerçekleştirilmiştir.
Çalışmamızda; in vitro fertilizasyon yöntemiyle dünyaya gelmiş 15 erkek ve 1 kız çocuk olmak üzere toplam 42 bireye ait periferik / kordon kanı örnekleri kullanılarak total genomik DNA izolasyonu yapılmıştır. İnsan mitokondriyal DNA'sına özgü iki primer çifti kullanılarak, polimeraz zincir reaksiyonu tekniğiyle mitokondriyal DNA'nın tamamını kapsayan genom amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. "Illumina" dizileme platformuna ait insan mitokondriyal DNA genom dizileme prosedürü uygulanarak 42 mitokondriyal DNA kütüphanesinin dizilemesi için "MiSeq" sistemi kullanılmıştır. Dizileme verileri; mitokondriyal DNA veritabanlarında analiz edilerek, sonuçlar aile bazında değerlendirilmiştir.
Mitokondriyal genom dizileme verilerinin analizi; "mtDNA Server", "mtDNA Variant Processor", "mtDNA Variant Analyzer", "Integrative Genomics Viewer" ve "BLASTN" gibi internet erişimli biyoinformatik programlarıyla yapılmıştır. Dizileme sonuçları; "anne-baba-çocuk", "anne-çocuk","baba-çocuk" olarak değerlendirilmiştir. 16 "trio"nun 14'ünde maternal mitokondriyal DNA haplotipi gözlenirken, 2 "trio"da çocuk mitokondriyal DNA'ları anne ve babadan farklı haplotipte saptanmıştır. 16 "trio"dan sekizinde "baba-çocuk" ortak genetik varyantları (SNP ("Single nucleotide polymorphism") / MNP ("Multiple nucleotide polymorphism" / INDEL ("Insertion/Deletion") tespit edilmiştir.

Abstract:
Mitochondrion is a semiautonomous organelle found in allmost all eukaryotic cells, having its own genome, transcription and translation machinery. Mitochondria play an important role in numerous cellular functions including calcium signaling, programmed cell death, cellular aging, differentiation and energy production.
In human and most animals, maternal inheritance of mitochondria and mitochondrial DNA is recognized as universal assumption. As high levels of mitochondrial heteroplasmy might contribute to a detrimental effect on fitness and disease resistance, it is raised that disposal of the sperm-derived mitochondria inside fertilized oocytes assures normal preimplantation embryo development.
Nevertheless, the mechanism underlying the maternal inheritance of mitochondrial DNA is not completely explained. Recently, several lines of evidence suggest that different species seem to employ distinct mechanisms to prevent the inheritance of paternal mitochondrial DNA.
In this context, the aim of this thesis project is to investigate the paternal mitochondrial DNA effect on assisted reproductive technologies applications by working on the molecular basis of sperm mitochondrial DNA elimination which remains unexplained in mammals, and paternal mitochondrial DNA transmission in human. Studies on the next generation sequencing of mitochondrial DNA were carried out in the families that applied to assisted reproductive technologies as a result of male infertility.
Total 42 individuals which contain 16 children (15 boys and 1 daughter) born by in vitro fertilization method were selected in our study. Total genomic DNA was isolated from either peripheral blood lymphocytes or cord blood samples. Mitochondrial DNA genome was amplified using two special primer pairs by polymerase chain reaction method to generate the entire human mitochondrial genome. Human mitochondrial DNA genome sequencing procedure of "Illumina" sequencing platform was applied for 42 mitochondrial DNA libraries which were sequenced on "MiSeq" system. Sequencing reads were analyzed in mitochondrial DNA databases and the results were evaluated within each family.
Mitochondrial DNA genome sequencing data analysis was done by using web-based bioinformatic tools: "mtDNA Server", "mtDNA Variant Processor", "mtDNA Variant Analyzer", "Integrative Genomics Viewer" and "BLASTN". Sequencing results were investigated on the basis of "mother-father-child", "mother-child" and "father-child". In 14 "trios" of 16; maternal mitochondrial DNA haplotype was detected for child, the remaining 2 "trios" had different mitochondrial DNA haplotypes when compared to their mother and fathers. Also; "father-child" sharing same genetic variants (SNP ("Single nucleotide polymorphism") / "Multiple nucleotide polymorphism" / INDEL ("Insertion/Deletion") were detected in 8 "trios".