GLT-1 (Glutamat Transporter 1) promotorunun, SIRT4 (Sirtuin 4) susturulmuş, glia hücrelerinde düzenlenmesi
Regulation of the Glutamate Transporter 1 (GLT-1) promoterin Sirtuin 4 (SIRT4) silenced glial cells
Yazar: ERKAN USLUER
Danışman: PROF. DR. GİZEM DÖNMEZ YALÇIN
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Amaç: Glutamat Taşıyıcı 1 (GLT-1), sinaptik boşlukta bulunan fazla glutamatı toplayan eksitatör amino asit taşıyıcı (EAAT) protein ailesinin bir üyesidir. SIRT4 (Sirtuin 4), beyindeki glia hücrelerinde eksprese olan ve çeşitli proteinleri deasetile ya da ADP-ribozile edebilen mitokondriyal bir sirtuindir. SIRT4, GLT-1 protein ekspresyonunu düzenleyerek eksitotoksisiteye karşı koruma sağlar. Bu nedenle çalışmada SIRT4'ün GLT-1 geninin transkripsiyonel regülasyonunda etkili olup olmadığını araştırmak amaçlandı. 
Gereç ve Yöntem: İlk olarak IHA (Immortalized Human Astrocytes) hücre hattında SIRT4'ü susturmak için dizayn edilmiş olan shRNA genini içeren lentiviral partiküller kullanılarak SIRT4 geni susturulmuş olan IHA hücreleri elde edildi. Kontrol ve SIRT4-susturulmuş IHA hücrelerindeki GLT-1 mRNA seviyeleri qPCR yöntemi kullanılarak belirlendi. SIRT4'ün susturulduğunu göstermek için SIRT4 protein ifadesine Western Blot yöntemi kullanılarak bakıldı. GLT-1 promotoru ve transkripsiyon faktörlerinin (CREB, REST ve YY1) etkileşimi CHIP (Kromatin İmmünopresipitasyon) metodu ile kontrol ve SIRT4-susturulmuş IHA hücrelerinde gösterildi. 
Bulgular: SIRT4, SIRT4'ü susturmak için dizayn edilmiş olan shRNA genini içeren lentiviral partiküller ile IHA hücrelerinde susturulduktan sonra IHA kontrol ve SIRT4 susturulmuş IHA hücreleri olarak iki deney grubu elde edilmiştir. Kontrol ve SIRT4 susturulmuş IHA hücrelerinden protein izole edilerek, SIRT4 protein seviyeleri western blot ile incelenmiş ve SIRT4 geninin susturma işleminin başarılı bir şekilde gerçekleştirildiği gösterilmiştir. Daha sonrasında, her iki hücre grubundan total RNA izole edilmiş, cDNA yapılmış ve GLT-1 mRNA seviyesini belirlemek için qPCR analizi yapılmıştır. Analiz sonucunda, her iki gruptaki GLT-1 mRNA seviyeleri arasında istatiksel olarak anlamlı bir fark görülmediği ortaya çıkmıştır. CREB, REST ve YY1 transkripsiyon faktörlerinin, GLT-1 promotorunda yer aldığı yapılan CHIP deneyleri ile gösterilmiştir. CHIP analizinde, transkripsiyon faktörlerinin bağlandığı DNA bölgeleri qPCR ile çoğaltılmaktadır. SIRT4 susturulmuş hücre grubunda da CREB, REST ve YY1 transkripsiyon faktörleri GLT-1 promotoruna bağlanmıştır. SIRT4'ün susturulması, CHIP analizinde anlamlı bir fark yaratmamıştır. 
Sonuç: Bu çalışmada, SIRT4'ün GLT-1'i trankripsiyonel düzeyde regüle ettiği düşünülerek araştırmalar yapılmış ve çeşitli sonuçlar elde edilmiştir. IHA hücrelerinde, SIRT4 geninin susturulması, GLT-1 mRNA seviyesini değiştirmemiştir. SIRT4 geninin susturulmasının, CREB, REST ve YY1 transkripisyon faktörlerinin, GLT-1 promotoruna bağlanmasına etkisi olmamıştır.

Abstract:
Objective: Glutamate Transporter 1 (GLT-1) is a member of the excitatory amino acid transporter (EAAT) protein family that collects excess glutamate present in the synaptic cleft. SIRT4 (Sirtuin 4) is a mitochondrial sirtuin expressed in glial cells in the brain and can deacetylate or ADP-ribosylate various proteins. SIRT4 protects against excitotoxicity by regulating GLT-1 protein expression. Therefore, the study aimed to determine whether SIRT4 is effective in the transcriptional regulation of the GLT-1 gene.
Material and Methods: First, IHA cells with the SIRT4 gene silenced were obtained by using lentiviral particles containing the shRNA gene designed to silence SIRT4 in the IHA (Immortalized Human Astrocytes) cell line. GLT-1 mRNA levels were determined using the qPCR method. To show that SIRT4 was silenced, SIRT4 protein expression was measured using the Western Blot method. The interaction of GLT-1 promoter and transcription factors (CREB, REST and YY1) was demonstrated in both experimental groups by the CHIP (Chromatın Immunoprecipitation) method.
Results: After SIRT4 was silenced in IHA cells with lentiviral particles containing the shRNA gene designed to silence SIRT4, two experimental groups were obtained: IHA control and SIRT4 silenced IHA cells. By isolating protein from control and SIRT4 silenced IHA cells, SIRT4 protein levels were examined by western blot and it was shown that the silencing of the SIRT4 gene was successfully carried out. Subsequently, total RNA was isolated from both cell groups, cDNA was made and qPCR analysis was performed to determine the GLT-1 mRNA level. As a result of the analysis, it was revealed that there was no statistically significant difference between GLT-1 mRNA levels in both groups. CHIP experiments have shown that CREB, REST and YY1 transcription factors are located in the GLT-1 promoter. In CHIP analysis, DNA regions to which transcription factors bind are amplified by qPCR. In the SIRT4 silenced cell group, CREB, REST and YY1 transcription factors bound to the GLT-1 promoter. Silencing SIRT4 did not make a significant difference in the CHIP analysis.
Conclusion: In this study, research was conducted considering that SIRT4 regulates GLT-1 at the transcriptional level and various results were obtained. In IHA cells, silencing the SIRT4 gene did not alter the GLT-1 mRNA level. Silencing the SIRT4 gene had no effect on the binding of CREB, REST and YY1 transcription factors to the GLT-1 promoter.