AML-12 hücre hattında karmustin hepatotoksisitesi üzerine phyllanthus amarus'un in-vitro etkilerinin araştırılması
Investigation of in-vitro effects of phyllanthus amarus on carmustine hepatotoxicity in AML-12 cell line
Yazar: GÜL ECEM ŞİMŞEK
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ MELEK AKINCI ; DR. ÖĞR. ÜYESİ ÇAĞATAY OLTULU
Trakya Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Eczacılık Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology

Özet:
Giriş ve Amaç: Karmustin, glioma, glioblastoma multiform, medulloblastoma, astrositom, multipl miyelom, Hodgkin ve Hodgkin dışı lenfomanın tedavisinde kullanılan antineoplastik bir ajandır. Karmustin ile tedavi esnasında, serum transaminazlarında geçici yükselme, hepatotoksisite ve hastaların %5-20'sinde hepatik veno-tıkayıcı hastalık görülebilmektedir. Karmustin ile birlikte hepatoprotektif etkiye sahip olduğu bilinen P. amarus'un kullanılması ile sitotoksisitenin azaltılması amaçlanmaktadır. 
Gereç ve Yöntemler: Çalışmamız alpha mouse liver 12 hücre hattında Kontrol, Karmustin, PA, Karmustin+PA olacak şekilde dört grup olarak planlanmıştır. Hücre hatlarına uygulanacak madde konsantrasyonları 3-(4,5-dimetiliazol-2-yl)-2,5 difenil tetrozolyum bromid yöntemi ile belirlenmiştir. Oksidatif stresi belirlemek amacıyla süperoksid dismutaz, katalaz ve glutatyon enzim ekspresyon düzeyleri Gerçek Zamanlı PZR ile ölçülmüştür. Karmustin'in neden olduğu hepatotoksisite ve P. amarus'un bu hasar üzerindeki etkilerinde apoptoz yolaklarının rolünü değerlendirmek amacıyla Gerçek Zamanlı PZR analizi ile kaspaz-3, kazpaz-9, apoptotik proteaz aktive edici faktör-1, Bax, B-cell lymphoma-2, p53, ikincil mitokondri kaynaklı aktivatör/Düşük pI ile doğrudan IAP bağlayıcı protein, apopitoz proteaz aktive edici faktör-1, Topoizomeraz 1 ve Topoizomeraz 2 gen ekspresyonları incelenmiştir.
Bulgular: Kontrole kıyasla Karmustin grubunda, süperoksid dismutaz (p<0,0001), katalaz (p<0,0001) ve glutatyon (p<0,0001) düzeylerinin artması antioksidan savunma sistemlerinin devreye girdiğini gösterdi. Apoptotik preoteaz aktive eden faktör-1 (p<0,0001) ve Bax (p<0,0001) ekspresyonun artması içsel yolaktan, Kaspaz-3'ün artması buna kaspaz-9'un eşlik etmemesi içsel yolaktan da apoptozun tetiklendiğini gösterdi. PA grubunda p53 artışı (p<0,0001) deoksiribonükleik asit hasarının bir göstergesi iken, Topoizomeraz 1 (p<0,0001) ve Topoizomeraz 2 (p<0,0001) artışları bu hasarın giderilmesinde rol oynarken, Bax (p<0,0001), apoptotik preoteaz aktive eden faktör-1 (p<0,0001) ve ikincil mitokontri kaynaklı aktivatör/ Düşük pl ile doğrudan IAP Bağlayıcı Protein (p<0,0001) artışı apoptozun tetiklendiğini göstermekle birlikte kaspaz-9 ve kazpaz-3 aktivasyonu gerçekleşmemiştir. Bu da bize P. amarus'un kısmen koruyucu etkisini ortaya koydu. Karmustin+PA grubunda glutatyon (p<0,0001) ve katalaz (p<0,0001) seviyelerindeki artış antioksidan sistemin aktive olduğunu, Topoizomeraz 1 (p<0,0001) mRNA seviyesinde artış olması deoksiribonükleik asit üzerindeki stresin sonucu olabilir. İkincil mitokontri kaynaklı aktivatör/ Düşük pl ile doğrudan IAP Bağlayıcı Protein (p<0,05), BAX (p<0,0001), kaspaz-3 (p<0,0001) artış ile B-cell lymphoma-2'deki (p<0,001) azalma hücrelerin içsel yolaktan apoptoza gittiği şeklinde yorumlanabilir.
Sonuç: P. amarus'un karmustinin neden olduğu hepatotoksisitede kısmen koruyucu etkiye sahiptir. Ancak P. amarus ile ilgili farklı doz ve uygulama süreleri ile ilgili çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.

Anahtar kelimeler: Apoptoz, hepatotoksik, karmustin, oksidatif stres, P. amarus
Destekleyen Kurum: Bu çalışma, Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: TÜBAP-2022/03.

Abstract:
Background and Aim: Carmustine is an antineoplastic agent used in the treatment of glioma, glioblastoma multiforme, medulloblastoma, astrocytoma, multiple myeloma, Hodgkin and non-Hodgkin lymphoma. During treatment with carmustine, transient elevations in serum transaminases, hepatotoxicity, and hepatic veno-occlusive disease may occur in 5-20% of patients. It is aimed to reduce cytotoxicity by using P. amarus, which is known to have a hepatoprotective effect, together with carmustine.
Material and Methods: Our study was planned as four groups: Control, Carmustine, PA, Carmustine+PA in alpha mouse liver 12 cell line. Substance concentrations to be applied to cell lines were determined by the 3-(4,5-dimethyliazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrozolium bromide method. In order to determine oxidative stress, superoxide dismutase, catalase and glutathione expression levels were measured by Real Time PCR. In order to evaluate the role of apoptosis pathways in the hepatotoxicity caused by carmustine and the effects of P. amarus on this damage, Real-Time PCR analysis used caspase-3, caspase-9, apoptotic protease activating factor 1, Bax, B-cell lymphoma-2, p53, second mitochondria-derived activator of caspases/ direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI and apoptotic protease activating factor 1, topoisomerase 1, topoisomerase 2 gene expressions were examined.
Results: Increased levels of superoxide dismutase (p<0.0001), catalase (p<0.0001) and glutathione (p<0.0001) in the Carmustine group compared to the control showed that antioxidant defense systems were activated. The increase in the expression of apoptosis protease activating factor-1 (p<0.0001) and Bax (p<0.0001) showed that apoptosis was triggered by the intrinsic pathway, and the increase in caspase-3, accompanied by the absence of caspase-9, showed that apoptosis was also triggered by the intrinsic pathway. While p53 increase (p<0.0001) in the PA group is an indicator of DNA damage, Topoisomerase 1 (p<0.0001) and Topoisomerase 2 (p<0.0001) increases are an indicator of this damage. While the increase in Bax (p<0.0001), apoptotic protease activating factor 1 (p<0.0001) and second mitochondria-derived activator of caspases/ direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI (p<0.0001) indicates that apoptosis is triggered, caspase-9 and caspase-3 activation did not occur. This revealed to us the partial protective effect of P. amarus. The increase in glutathione (p<0.0001) and catalase (p<0.0001) levels in the carmustine+Phyllanthus group indicates that the antioxidant system is activated, and Topoisomerase 1 (p<0.0001) mRNA levels are increased. The increase may be the result of stress on DNA. Second mitochondria-derived caspase activator/Low pI (p<0.05), BAX (p<0.0001), caspase-3 (p<0.0001) increased and B-cell lymphoma-2 (p<0.001) The decrease can be interpreted as the cells going to apoptosis via the intrinsic pathway.
Conclusion: It was determined P. amarus had a partially protective effect on hepatotoxicity caused by Carmustine. However, studies on different doses and application times for P. amarus are needed.

Keywords: Apoptosis, carmustine, hepatotoxic, oxidative stress, P. amarus
Financial Support: The present study was supported by the Research Fund of Trakya University. Project No: TUBAP-2022/03