Meme kanseri hücreleri (MDA-MB-231) ve THP-1 orjinli makrofaj hücrelerinin KO-kültürü ile oluşturulacak mikroçevrede kanser hücre lizatı, oleuropein, alum ve QS-21'in etkilerinin araştırılması
Investigation of cancer cell lysate, oleuropein, alum and QS-21 effect on CO-culture microenvironment of THP-1 origin macrophages and breast cancer cells
Yazar: BÜŞRA ÇAKIR
Danışman: PROF. DR. AYŞE NALBANTSOY
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Kanser mikroçevresinde birçok immün hücresi bulunmakta ve bunlardan biri olan makrofaj hücreleri hem doğal immün hem de adaptif immün yanıtı tetiklemektedir. Makrofajlar 2 ana fenotipte olabilmektedir. M1 polarize makrofajlar anti-tümör, pro-enflamatuvar ve sitotoksik etki gösterirken bunun aksine M2 polarize makrofajlar immünosupresifdir, anjiyogenez, doku onarımını desteklemekte ve metastazı teşvik etmektedir. Kanser mikroçevresinde bu iki fenotip birbirine zıt etki göstermektedir ve kanserin ilerleyişinde önemlidir. Yapılan tez çalışmasında kanserin ilerlemesinde kanser mikroçevresinde bulunan makrofajların farklı fenotiplere polarizasyonu ve bu fenotiplerin kanser hücreleri üzerine etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri ile THP-1 orjinli makrofaj hücrelerinin ko-kültürünün transwell sisteminde yapılarak kanser mikroçevresinde makrofaj polarizasyonunun belirlenmesidir. İndüklenmeyen(M0), LPS(M1) ve IL-4(M2) ile indüklenen THP-1 orjinli makrofajların ayrıca QS-21, alum ve oleuropein varlığında MDA-MB-231 hücreleri üzerine apoptotoik etkisi ve makrofaj polarizasyonu araştırılmıştır. Kanser mikroçevresinin makrofaj polarizasyonun meme kanseri tedavisinde katkılarının belirlenmesi, QS-21,  alum adjuvanı ve oleuropeinin kanser tedavisindeki rolünün belirlenmesi ve makrofajlar üzerindeki etkisini bulunması sonucu yeni tedavi yöntemlerinin geliştirmesine katkı sağlaması hedeflenmektedir. 
Yürütülen tez çalışmasında THP-1 monosit hücreleri PMA ile makrofaja farklılaştırılmış ve FITC-CD11b antikoru ile flow sitometre cihazında analiz edilmiştir. Çalışmada kullanılan oleuropein, QS-21 ve alumun sitotoksik potansiyeli MTT yöntemi ile belirlenmiştir. Daha sonra transwell sisteminde üst membrana THP-1 orijinli makrofaj hücreleri, alt tabakasına MDA-MB-231 hücreleri ekilmiştir. İndüklenmeyen(M0), LPS(M1) ve IL-4(M2) ile indüklenen  makrofaj hücrelerine kanser hücre lizatı, oleuropein, QS-21 ve alum eklenerek 24 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonunda makrofaj hücrelerinde FITC-CD86,  FITC-CD11b, FITC-CD163 ve PE-CD80 antikorları ile boyanarak makrofaj polarizasyonuna etkileri flow sitometre cihazında belirlenmiştir. Ayrıca inkübasyon sonrada makrofaj hücrelerindeki GAPDH hedef geni kullanılarak RT-qPCR yöntemi ile CD86, CD11b, CD80 ve CD163 gen ifadeleri saptanmıştır. MDA-MB-231 hücreleri üzerine etkisi ise FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit kullanılarak flow sitometri cihazında analiz edilmiştir. Makrofajların süpernatantlarında IL-6, TNF-α, IL-1α,  IL-1β ve IL-10 sitokin miktarlarını ELISA ile belirlenmiştir. 
Yapılan tez çalışması ile elde edilen veriler ışığında tüm çalışma gruplarında CD11b ekspresyonu %99 oranında olduğu belirlenmiştir. LPS ile indüklenen gruplarda M1 polarize makrofaj belirteci CD86 ve CD80 ekspresyon seviyeleri artmaktadır. Kanser hücre lizatı, oleuropein, QS-21 ve alum eklenen gruplarda ise CD80 ekspresyonu indüklenmeyen ve LPS ile indüklenen gruplarda en yüksek ekspresyon seviyesinde olduğu saptanmıştır. M2 polarize makrofaj belirteci olan CD163 ekspresyon seviyeleri genel olarak tüm gruplarda artmakta olduğu gözlenmiştir. CD11b geni için LPS ile indüklenen makrofajlarda azalma gösterirken IL-4 ile indüklenen makrofajlarda artış olduğu saptanmıştır. LPS ile indüklenen gruplarda CD86 ve CD80 gen ifadelerinde flow sitometri sonuçları ile korele olarak artış olduğu belirlenmiştir. LPS ile indüklenen gruplarda oleuropeinin CD86 geni ifadesini inhibe ettiği ve anti-enflamatuvar etki gösterdiği saptanmıştır.  IL-6, TNF-α, IL-1α, IL-1β ve IL-10 sitokin miktarları LPS ile indüklenen gruplarda arttığı saptanmıştır. Oleuropein anti-enflamatuvar etki gösterirken alum adjuvanı pro-enflamatuvar etki göstermiştir. MDA-MB 231 hücrelerinin üzerine en yüksek apoptotik etkinin ise maddelerin birlikte kullanıldığı grupta belirlenmektedir. Bunun yanında oleuropeinin MDA-MB-231 hücreleri üzerine pre-apoptotik etkisinin olduğu saptanmıştır.
Sonuç olarak QS-21, alum ve anti-enflamatuvar etki gösteren oleuropeinin makrofaj polarizasyonuna etkisinin olduğu ayrıca oleuropeinin kanser hücreleri üzerine apoptotik etkisinin olduğu ileri çalışmaların yapılması bu molekülün kanser tedavisinde etkili olabileceğini vaad etmektedir.

Abstract:
There are many immune cells in the cancer microenvironment, and one of them, macrophage cells response both natural immune and adaptive immune response. Macrophages can be in 2 main phenotypes. While M1 polarized macrophages show anti-tumor, pro-inflammatory and cytotoxic effects, contrarily, M2 polarized macrophages are immunosuppressive, support angiogenesis, tissue repair and promote metastasis. These two phenotypes have opposite effects in cancer microenvironment and are important in the progression of cancer. In the thesis study, it was aimed to polarize the macrophages in the cancer microenvironment into different phenotypes and to investigate the effects of these phenotypes on cancer cells. For this purpose, MDA-MB-231 breast cancer cells and THP-1 origin macrophage cells are co-cultured in the transwell system to determine macrophage polarization in the cancer microenvironment. The apoptotoic effect and macrophage polarization of both non-induced, LPS-induced and IL-4-induced THP-1 origin macrophages on MDA-MB-231 cells were investigated in the presence of QS-21, alum and oleuropein. Determination of the contribution of macrophage polarization of cancer microenvironment in the treatment of breast cancer, determination of the role of QS-21, alum adjuvant and oleuropein in cancer treatment and As a result of its effect on macrophages, it is aimed to contribute to the development of new treatment methods.
In the thesis study, THP-1 monocyte cells were differentiated to macrophage by PMA. It was stained with FITC-CD11b antibody and analyzed in flow cytometer. The cytotoxic potential of oleuropein, QS-21 and alum used in the study was determined by the MTT method. Then, in the transwell system, THP-1 origin macrophage cells were added to the upper membrane, and MDA-MB-231 cells were added to the under layer. Cancer cell lysate, oleuropein, QS-21 and alum were incubated for 24 hours by adding non-induced, LPS-induced and IL-4-induced macrophage cells. After an incubation period macrophage cells with FITC-CD86, CD11b-FITC, CD163-FITC and PE-CD80 antibodies by staining  was determined polarization effects of macrophages in flow cytometry. Also, after incubation, gene expressions of CD86, CD11b, CD80 and CD163 markers were determined by RT-qPCR method using the GAPDH target gene in macrophage cells. The apoptotic effect on MDA-MB-231 cells was analyzed in the flow cytometry device using the FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit. The amounts of IL-6, TNF-α, IL-1α, IL-1β and IL-10 cytokines to the supernatants of macrophages were determined by ELISA.
The data obtained in the thesis study determined that CD11b expression was 99% in all study groups. The expression levels of M1 polarized macrophage marker CD86 and CD80 increase in LPS-induced groups. Cancer cell lysate, oleuropein, QS-21 and alum added in groups were found to have the highest expression level in non-induced and LPS-induced groups. CD163 expression levels, which are M2 polarized macrophage markers, were generally observed to be increasing in all groups. For the CD11b gene, there was a decrease in LPS-induced macrophages while an increase in IL-4-induced macrophages was found. In LPS-induced groups, there was an increase in CD86 and CD80 gene expression correlated with flow cytometry results. In LPS-induced groups, oleuropein has been found to inhibit CD86 gene expression and show anti-inflammatory action. IL-6, TNF-α, IL-1α, IL-1β and IL-10 cytokine levels were found to be increased in LPS-induced groups. Oleuropein exhibited anti-inflammatory effect while alum adjuvant exhibited pro-inflammatory effect. The highest apoptotic effect on MDA-MB 231 cells is determined in the group in which the substances are used together. In addition, oleuropein has been found to have a pre-apoptotic effect on MDA-MB-231 cells. 
As a result, QS-2, anti-inflammatory effects oleuropein and alum has an effect on macrophage polarization also, oleuropein has apoptotic effect on cancer cells and that this molecule can be effective promises in the treatment of cancer.