Mezenkimal kök hücrelerin ın vitro ortamda çoğaltılması ve farklılaştırılması sırasında standart referans genlerin stabilitesinin belirlenmesi
Determination of the stability of standard reference genes of mesenchymal stem cells during in vitro expansion and differentiation
Yazar: FATMA BETÜL AYANOĞLU
Danışman: PROF. DR. AYŞE ESER ELÇİN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Disiplinlerarası Kök Hücre ve Yenileyici Tıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Genler = Genes ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kök hücreler = Stem cells ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Mezenkimal kök hücreler (MKH), yenileyici tıp uygulamalarında yaygın olarak kullanılan hücre kaynaklarındandır. Günümüzde çeşitli kaynaklardan elde edilen MKH'ler, klinik öncesi ve klinik çalışmalarda kullanılmaktadır. Hastalıkların tedavisinde kullanılmak üzere uygun MKH kaynağının seçilebilmesi için, MKH'lerin in vitro şartlarda kendini yenileme, çoğalma ve farklılaşma özelliklerinin kantitatif olarak değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu amaçla MKH'lerin gen ekspresyonlarının belirlenmesinde kantitatif eş zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) yöntemi kullanılmaktadır. qRT-PCR yöntemi ile doğru ve güvenilir sonuçlar elde edilebilmesi için gen ekspresyon seviyelerinin housekeeping/referans genler kullanılarak normalize edilmesi gerekmektedir. Bu nedenle normalizasyon için uygun housekeeping/referans genlerin seçilmesi oldukça önemlidir. MKH çalışmalarında uygun ve güvenilir olan housekeeping/referans genlerin belirlenmesi ve seçimi ile ilgili literatürde sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmaların büyük bir kısmı KİMKH'ler kullanılarak gerçekleştirilmiş, çok küçük bir kısmında ADMKH'ler araştırılmıştır. Yapılan bu çalışmalar sonucunda MKH'lerin kültür ortamında çoğaltılması ve farklılaştırılması deneyleri için ortak bir housekeeping/referans gene rastlanmamıştır. Bu tez çalışmasında insan ADMKH'lerin in vitro kültür ortamında çoğalması, osteojenik, adipojenik ve kondrojenik farklılaşması sırasında yaygın olarak kullanılan housekeeping/referans genlerin ekspresyon kararlılığının incelenmesi ve insan ADMKH araştırmaları için uygun olan housekeeping/referans genlerin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla MKH araştırmalarında yaygın olarak kullanılan 13 housekeeping/referans gen seçilmiştir. 
Tez çalışmasında öncelikle insan ADMKH'leri in vitro kültür ortamında çoğaltıldı. ADMKH'lerin karakterizasyonu üçlü soy farklılaşması, akım sitometri ve CFU analizleri ile doğrulandı. Çoğaltılan hücreler standart farklılaşma protokolleri kullanılarak osteojenik, adipojenik ve kondrojenik hücre soylarına farklılaştırıldı. İnsan ADMKH'lerin farklılaşması histokimya boyamaları ve ışık mikroskobu görüntüleri ile kontrol edildi. Farklılaşmanın sonunda toplanan hücrelerden mRNA izolasyonu gerçekleştirildi. Elde edilen mRNA örnekleri cDNA'ya çevrilerek housekeeping/referans genlerin ekspresyon seviyeleri qRT-PCR yöntemi ile belirlendi. Housekeeping/referans genlerin ekspresyon kararlılıkları karşılaştırmalı delta Ct yöntemi ve NormFinder analizi kullanılarak değerlendirildi. 
Tez çalışmasının sonucunda EF1α, RPLP0 ve RPL13A genlerinin ekspresyon kararlılıklarının yüksek olduğu görülmüş ve insan ADMKH araştırmalarında normalizasyon için housekeeping/referans gen olarak kullanılabilecekleri öngörülmüştür. GAPDH geni ise en düşük kararlılığa sahip gen olarak tanımlanmış ve ADMKH'lerin üçlü soya farklılaşması çalışmaları için uygun bir housekeeping/referans gen olmadığı sonucuna ulaşılmıştır. Elde edilen bu bilgiler ADMKH çalışmalarında uygun housekeeping/referans genlerin seçilmesi ve gen ekspresyonlarının doğru bir şekilde ölçülebilmesi için son derece önemlidir.

Abstract:
Mesenchymal stem cells (MSCs) are one of the most frequently used cell source for regenerative medicine applications. Currently, MSCs from a variety of sources are being used in pre-clinical and clinical studies. The choice of optimal MSC source for the treatment of diseases requires quantitative evaluation of self-renewal, proliferation and differentiation potencies of MSCs. For this purpose, quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) technique is used to determine the expression of genes of MSCs. In the qRT-PCR technique, the gene expression levels must be normalized by the use of housekeeping/reference genes for obtaining accurate and reliable results. Therefore, the choice of appropriate housekeeping/reference genes is critical. There is a limited number of studies in the literature on the selection and/or selection of housekeeping/reference genes that are appropriate and reliable in MSC studies. Almost all of this limited number of studies have been performed using BMMSCs and a very small part has been researched in human ATMSCs. As a result of these studies, no common housekeeping/reference gene has been found for the proliferation and differentiation experiments of MSCs in vitro. In this thesis study, it is aimed to investigate the stability of expression of housekeeping/reference genes widely used during proliferation, osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation of human ATMSCs in vitro and to determine housekeeping/reference genes suitable for human ATMSCs studies. For this purpose, 13 housekeeping/reference genes commonly used in MSC studies were selected.
In the thesis study, firstly human ATMSCs were replicated in vitro culture medium. Characterization of ATMSCs was confirmed by triple lineage differentiation, flow cytometry and CFU analyzes. The replicated cells were differentiated into osteogenic, adipogenic and chondrogenic cell lines using standard differentiation protocols. The differentiation of human ATMSCs was controlled by histochemical staining and light microscope images. At the end of the differentiation mRNA isolation was performed from collected cells. The mRNA samples obtained were converted to cDNA and the expression levels of housekeeping/reference genes were determined by qRT-PCR method. The stability of expression of housekeeping/reference genes was evaluated using the comparative delta Ct method and NormFinder analysis. 
As a result of the thesis study, the expression stability of EF1α, RPLP0 and RPL13A genes was found to be high and these genes were predicted to be used as housekeeping/reference genes for normalization in human ATMSC studies. The GAPDH gene is defined as the gene with the lowest stability and that this gene is not a suitable housekeeping/reference gene for ATMSC triple lineage differentiation studies. This information is crucial for the selection of appropriate housekeeping/reference genes and for accurate measurement of gene expression in ATMSC studies.