Agrobacterium aracılığıyla nohut bitkisi (Cicer arietinum L.)'ne gen aktarımı
Agrobacterium mediated transformation in chickpea (Cicer arietinum l.)
Yazar: RIDVAN TEMİZGÜL
Danışman: Y.DOÇ.DR. MİKAİL AKBULUT
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2006
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
iiiAGROBACTERIUM ARACILIĞIYLA NOHUT BİTKİSİ (CICER ARIETINUML.)'NE GEN AKTARIMIRıdvan TEMİZGÜLErciyes Üniversitesi, Fen Bilimleri EnstitüsüYüksek Lisans Tezi, Temmuz 2006Tez Yöneticisi: Yrd. Doç. Dr. Mikail AKBULUTÖZETBu çalışmanın temel amacı, lokal nohut kültüvarları için güvenilir ve tekrarlanabilir birrejenerasyon ve transformasyon sistemi geliştirmektir. Doku kültürü çalışmalarındafarklı eksplantlar (kotiledon nodları ve embriyo uçları), farklı büyüme düzenleyicileri(BAP ve TDZ) ve bu düzenleyicilerin farklı konsantrasyonları gibi çeşitli parametrelerinrejenerasyon ve transformasyona etkileri araştırılmıştır. En iyi rejenerasyon yanıtı 3mg/L BAP, 1 mg/L Kinetin ve 0.5 mg/L GA3 ile desteklenmiş Modifiye Murashige veSkoog ortamında kültüre alınan kotiledon nodlarından elde edilmiştir. Kotiledonnodlarının Agro-vakum infiltrasyonu, çimlendirilmiş nohut tohumlarınınAgroinokülasyonu, tohumların Agroenjeksiyonu ve yüzey sterilizasyonu yapılmış vekuru nohut tohumlarının imbibisyonu (şişirme, emdirme) olmak üzere dört farklıtransformasyon stratejisi denenmiştir. Agro-vakum infiltrasyonu çalışmaları kotiledonnodları ve embriyo uçlarına uygulanmıştır. 30 dakika süreyle 450 mmHg evaküasyonbasıncında Agrobacterium hücrelerinin vakum infiltrasyonu geçici GUS ekspresyonuiçin optimum olarak bulunmuştur. Agroenjeksiyon, üç gün çimlendirilmiş tohumlarınkotiledon nodları içine steril bir enjektör ile uygulanmıştır. Transformasyon etkinliğineAgrobacterium suşları, enfeksiyon süresi, eksplantın gelişme evresi, yaralama,infiltrasyon ve kültüvarlar gibi çeşitli parametrelerin etkisi araştırılmıştır.Transformasyon etkinliği geçici GUS aktivitesine bakarak veya selektif ortamdayaşayan eksplantlara dayanarak belirlenmiştir. KYRT1/pTJK 136 suşu geçici GUSaktivitesi bakımından C58C1/pTJK 136 suşundan daha etkili olarak bulunmuştur.pDNEM 33 plazmidi uida geni taşımadığı için EHA 101 suşu için geçici GUS aktivitesibelirlenememiştir. Transgenlerin varlığı, ayda bir alt kültüre alınan selektif ortamda 3-4ay seleksiyona tabi tutulmuş bitkilerde PCR analizleri ile belirlenmiştir.Anahtar Kelimeler: Nohut, Agrobacterium, Transformasyon, Enjeksiyon, Infiltrasyon

Abstract:
ivAGROBACTERIUM MEDIATED TRANSFORMATION IN CHICKPEA(CICER ARIETINUM L.)Rıdvan TEMİZGÜLErciyes University, Graduate School of Natural and Applied SciencesM. Sc. Thesis, July 2006Thesis Supervisor: Asist. Prof. Dr. Mikail AKBULUTABSTRACTMain purpose of this study was to develop a reproducible and reliable regeneration andtransformation system for local chickpea cultivars. In tissue culture studies; the effect ofvarious parameters such as different explants (cotyledonary nodes and embryo axes),different growth regulators (Benzylaminopurine and thidiazuron) and their variousconcentrations have been investigated. Best regeneration response was obtained fromcotyledonary nodes cultured on modified Murashige and Skoog medium amended with3 mg/L Benzylaminopurine, 1 mg/L Kinetin and 0.5 mg/L GA3 (2.77 shoot per explant).Four different transformation strategies namely; Agro-vacuum infiltration ofcotyledonary nodes, Agroinoculation of germinating chickpea seedlings, Agro-injectionof seedlings and imbibitions of surface sterilized dry chickpea seeds were investigated.Agro-vacuum infiltration experiments were carried out on cotyledonary nodes, andembryo axes. Vacuum infiltration of Agrobacterium cells at 450 mmHg for 30 minutewas found to be optimum for transient GUS expression. Agroinjection was applied witha sterile injector into cotyledonary node of three days old seedlings. The effect ofvarious parameters; Agrobacterium strains, infection durations, explant developmentalstage, injury, infiltration and cultivars, on transformation efficiency were investigated.Transformation efficiency was determined based on transient GUS activity or survivalon selective media. KYRT1/pTJK 136 strains were more efficient compared toC58C1/pTJK 136 strain based on transient GUS activity. Since pDNEM 33 plasmid wasnot carrying uida gene, transient GUS activity was not determined for EHA 101 strain.The presence of transgene was determined by PCR analysis on green plants subculturemonthly on selective media for 3-4 times.Key Words. Chickpea, Regeneration, Agrobacterium, Transformation, Infiltration