Plasenta kaynaklı mezenkimal kök hücrelerden eksozomların izolasyonu, karakterizasyonu ve ilaç taşıyıcı sistem olarak etkinliğinin araştırılması
Isolation and characterization of exosomes from placenta originating mesenchymal stem cells and investigation of its effectiveness as a drug delivery system
Yazar: BURÇİN İREM ABAS
Danışman: PROF. DR. ÖZGE ÇEVİK
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya (Tıp) Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Dosetaksel = Docetaxel ; Eksozomlar = Exosomes ; Kök hücreler = Stem cells ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Plasenta = Placenta ; Uterin servikal hastalıklar = Uterine cervical diseases ; Uterin servikal neoplazmlar = Uterine cervical neoplasms ; İlaç taşıyıcılar = Drug carriers

Özet:
Amaç: Mezenkimal kök hücreler (MSC), kendi kendini yenileme yeteneğine sahip doku kaynaklı hücrelerdir ve çeşitli hücre soylarına farklılaşabilirler. Plasenta, fetal toleransı koruyan ve zengin bir MSC rezervuarı oluşturan geçici bir organdır. MSC'ler invaziv prosedürler olmaksızın plasentadan kolayca izole edildiğinden, kullanımları etik kaygılara yol açmaz. Büyüme faktörleri, sitokinler, kemokinler, mikroveziküller (200-1000 nm çap) ve eksozomlar (40-200 nm çap) gibi ekstrasellüler vezikül salgı proteinleri dahil olmak üzere MSC'lerin sekretomunun, MSC'lerin terapötik özelliklerinin çoğunu sergilediği gösterilmiştir. Bu çalışmanın amacı, plasenta kaynaklı mezenkimal kök hücrelerden salınan eksozomların, dosetaksel (DOC) ile fonksiyonel hale getirilerek serviks kanseri tedavisinde etkisinin araştırılmasıdır.
Gereç ve Yöntem: Tip I kollajenaz ile doku inkübasyonu sonucu MSC'ler plasentadan izole edildi. İzole MSC'leri tanımlamak için CD44, CD90, CD105 ve CD34 kullanıldı. Eksozomlar, her 48 saatte bir, ultrasantrifüj yöntemi kullanılarak MSC açlık ortamından izole edildi. Santrifüjlemeden sonra, eksozom pelletleri PBS içinde yeniden süspanse edildi ve Exo-Quick eksozom saflaştırma kiti ile saflaştırıldı. Saflaştırılmış eksozomlar, partikül boyutu ve yapısının yanı sıra CD9, CD63 ve CD81 işaretçileri kullanılarak karakterize edildi. MSC'den türetilen eksozomlar, docetaxel (EXO-DOC) ile elektroporasyona tabi tutuldu ve ardından 24 ve 48 saat boyunca HeLa rahim ağzı kanseri hücreleri ile inkübe edilerek sitotoksisite testleri yapıldı.
Bulgular: Taramalı elektron mikroskobu, saf ve docetaxel yüklü eksozomların partikül boyutunu ve yapısını sırasıyla 81 ve 107 nm olarak ortaya koymuştur. Dosetaksel yüklü eksozomlar daha kısa sürede ve daha düşük konsantrasyonlarda etkinlik gösterir. Western blot ve qPCR sonuçlarına göre EXODOC, rahim ağzı kanseri hücrelerinde apoptozu artırır ve epitelyal mezenkimal geçişi(EMT) azaltır.
Sonuç: Plasentanın eksozomları doğumdan sonra izole edilirse ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanılabilirler ve bu eksozomlar ilacın hücrelere girişini kolaylaştırarak ilaçların düşük dozlarda daha etkili olmasını sağlar. Bu çalışmanın bulguları, antikanser tedaviler için yeni ilaç dağıtım sistemlerinin geliştirilmesinde plasenta kaynaklı eksozomların kullanılması potansiyelini arttırmaya yardımcı olacaktır.
Anahtar kelimeler: Dosetaksel, Eksozom, Mezenkimal kök hücre, Plasenta, Servikal kanser.

Abstract:
Aim: Mesenchymal stem cells (MSC) are tissue-derived cells with the self-renewing ability and
can differentiate into various cell lineages. The placenta is a transient organ that maintains
fetal tolerance and constitutes a rich reservoir of MSC. Since MSCs are readily isolated
from the placenta without invasive procedures, their use does not elicit ethical concerns. The
secretome of MSCs, including growth factors, cytokines, chemokines, microvesicles and
exosomes has been shown to exhibit many of the therapeutic properties of MSCs. The
purpose of this study is to look into the effect of exosomes released from placenta-derived
mesenchymal stem cells in the treatment of cervical cancer by making them functional with
docetaxel (DOC).
Material and Method: Following the incubation with type I collagenase, MSCs were
isolated from the placenta. CD44, CD90, CD105 and CD34 were used to identify isolated
MSCs. Exosomes were isolated from the MSC starvation medium using and
ultracentrifugation method every 48 hours. After centrifugation, exosome pellets were
resuspended in PBS and purified by Exo-Quick exosome purification kit. Purified exosomes
were characterized using particle size and structure, as well as CD9, CD63 and CD81
markers. MSC-derived exosomes were electroporated with docetaxel (EXO-DOC) and then
incubated with HeLa cervical cancer cells for 24 and 48 hours. Cytotoxicity tests, western
blotting and qPCR analysis were performed.
Results: Scanning electron microscopy has revealed the particles size and structure of pure and docetaxel-loaded exosomes as 81 and 107 nm respectively. Docetaxel-loaded exosomes show efficacy in a shorter time and at lower concentrations. According to western blotting and qPCR results EXODOC increases apoptosis and decreases epithelial-mesenchymal transition (EMT) in HeLa cells.
Conclusion: If the exosomes of placenta excreted after birth are isolated, they can be used
as a drug delivery system and these exosomes facilitate drug entry into the cells, making
drugs more effective at low doses. The findings of this study will help to increase the
potential for using the placenta-derived exosomes in the development of new drug delivery
systems for anticancer therapies.
Keywords: Docetaxel, Exosome, Mesenchymal stem cell, Placenta, Cervical cancer.