Sığırlardan toplanmış ixodid kenelerde anaplasma phagocytophilum'un real time PCR'la araştırılması ve saptanan izolatların moleküler karakterizasyonu
Investigation of anaplasma phagocytophilum in ixodid ticks collected from cattle by real time PCXR and molecular characterizations of the isolates
Yazar: ÖMER TÜRKMEN
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ÖNDER DÜZLÜ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Patoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Anaplasma = Anaplasma ; Kayseri = Kayseri ; Keneler = Ticks ; Moleküler yapı = Molecular structure ; RNA = RNA ; Sığırlar = Cattles ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Bu çalışma, Kayseri yöresindeki sığırlardan toplanmış ixodid kenelerde Anaplasma phagocytophilum'un Real Time PCR'la araştırılması ve pozitif izolatların 16S rRNA gen bölgesi yönünden karakterize edilmesi amacıyla yapılmıştır. Bu amaçla Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenen TYL-2014-5506 kodlu araştırma projesi kapsamında, Nisan-Eylül 2015 tarihleri arasında araştırma yöresindeki sığırlardan toplanmış toplam 265 ergin ixodid keneden (60 Rhipicephalus (Boophilus) annulatus, 21 Haemaphysalis parva, 53 Hyalomma marginatum, 32 H. anatolicum, 36 H. excavatum, 30 H. detritum, 25 Rh. turanicus, 8 Rh. bursa) genomik DNA ekstrakte edilmiştir. DNA ekstraksiyonunu takiben 16S rRNA gen bölgesinin yaklaşık 641 bp'lik kısmını amplifiye eden Anaplasma phagocytophilum spesifik primerlerle nested PCR analizleri yapılmıştır. Real Time PCR'la bireysel olarak incelemesi yapılan örneklerden bir Hyalomma marginatum ve bir Rhipicephalus turanicus örneğinde pozitiflik saptanmıştır. Pozitif izolatlara (TRAphagHmar ve TRAphagRtur) ait amplikonlar nested PCR primerleri ile klonlanmış ve plasmid pürifikasyonundan sonra sekans analizleri gerçekleştirilmiştir. Elde edilen DNA dizilerinin GenBank kayıtları gerçekleştirilmiş (KU925346-KU925347) ve GenBank'ta kayıtlı mevcut diğer bazı A. phagocytophilum suşları ile ikili analizleri ve çoklu hizalamaları yapılarak filogenisi araştırılmıştır. Filogenetik analiz sonucu Kayseri yöresindeki sığırlardan toplanmış Hyalomma marginatum ve Rhipicephalus turanicus örneklerinde belirlenen A. phagocytophilum izolatları ile Dünya'dan ve Türkiye'den daha önce GenBank'a girilmiş izolatların 3 ana dalda (A, B ve C kümeleri) kümelendikleri belirlenmiştir. A ve B gruplarındaki A. phagocytophilum izolatlarının homolog oldukları, C grubunda yer alan izolatların ise kendi aralarında ortalama %0,2'lik genetik farklılığın bulunduğu belirlenmiştir. Gruplar arasındaki genetik farklılıklara bakıldığında; A grubundaki izolatların B grubundakilerle %10,8±2,0, C grubundakilerle ise %13,0±2,7; B grubundaki izolatların C grubundaki izolatlarla arasındaki ortalama genetik farklılık %13,8±2,8 saptanmıştır. TRAphagHmar ve TRAphagRtur izolatlarının kendi aralarında %100 identik oldukları tespit edilmiştir. TRAphagHmar ve TRAphagRtur izolatlarının, Türkiye'den daha önce girilmiş ve Ixodes ricinus kenelerinden elde edilmiş 9-08 (AB604782), 73-08 (AB604783) ve 208-08 (AB604784) izolatlarıyla (C grubunda) arasındaki genetik farklılığın sırasıyla %0,09, %0,05 ve %0,58 olduğu tespit edilmiştir. Türkiye'den daha önce girilmiş ve koyun ve keçilerden elde edilmiş UK 40 (KJ183079), C139 (KF459965), EKY 144 (JF807995) ve EKY 155 (JF807994) izolatlarıyla (C grubunda) TRAphagHmar ve TRAphagRtur izolatları arasındaki genetik farklılık ise %0,09 saptanmıştır. A grubunda yer alan ve Türkiye'den sığır, köpek ve Haemaphysalis sulcata ile türü belirtilmemiş keneden girilmiş Trbrt45 (KP745629), 10100 (JN656375), H116 (KF034787) ve HS56 (KJ195692) izolatlarıyla TRAphagHmar ve TRAphagRtur arasındaki genetik farklılık da ilk üç izolat için %13,26 ve sonuncu HS56 izolatı için ise %13,66 olarak tespit edilmiştir.
Sonuç olarak bu çalışma ile Kayseri yöresindeki sığırlardan toplanmış kene örneklerinde A. phagocytophilum'un moleküler yaygınlığı ve genetik karakterleri hakkında bilimsel veriler elde edilmiştir.

Abstract:
This study was performed to investigate Anaplasma phagocytophilum in the ixodid ticks collected from cattle in Kayseri province by Real Time PCR and to genotype the positive isolates related to 16S rRNA gene region. For this aim, a total of 265 adult ixodid ticks (60 Rhipicephalus (Boophilus) annulatus, 21 Haemaphysalis parva, 53 Hyalomma marginatum, 32 H. anatolicum, 36 H. excavatum, 30 H. detritum, 25 Rh. turanicus, 8 Rh. bursa) were collected from the study area between April-September 2015 within the scope of research Project (No:TYL-2014-5506) supported by Erciyes University Research Fund and genomic DNA was extracted from the specimens. Following the DNA extraction, nested PCR analyses were individually carried out with Anaplasma phagocytophilum specific primers amplifying an approximately 641 bp region of 16S rRNA gene. Anaplasma phagocytophilum positivity was determined in one Hyalomma marginatum and one Rhipicephalus turanicus samples by Real Time PCR analyses. The amplicons belonging to positive isolates (TRAphagHmar and TRAphagRtur) were cloned and sequenced following the plasmid purification. The obtained DNAs were deposited to GenBank (KU925346-KU925347) and pairwise analyses of the sequences and multiple alignments with some other A. phagocytophilum strains available in the GenBank were performed and phylogenies were investigated. The phylogenetic analyses revealed that the Hyalomma marginatum and Rhipicephalus turanicus isolates clustered in 3 main groups (A, B, and C groups) together with the isolates from Turkey and the world available in GenBank. While A and B groups were found homolog, the isolates in group C showed 0.2% genetic difference amongst themselves. According to the genetic differences in groups, the genetic differences between group A and B, group A and C, and group B and C were found as 10.8±2.0%, 13.0±2.7%, and 13.8±2.8%, respectively. TRAphagHmar and TRAphagRtur isolates were found as 100.0% identical within each other. The genetic differences of TRAphagHmar and TRAphagRtur isolates with the prior Ixodes ricinus tick isolates 9-08 (AB604782), 73-08 (AB604783) and 208-08 (AB604784) in group C from Turkey were determined as 0.09%, 0.05% and 0.58%, respectively. The genetic differences amongst TRAphagHmar and TRAphagRtur isolates and the prior sheep and goat isolates UK 40 (KJ183079), C139 (KF459965), EKY 144 (JF807995) and EKY 155 (JF807994) in group C from Turkey were detected as 0.09%. In addition the genetic differences amongst TRAphagHmar and TRAphagRtur isolates and the prior cattle, dog, Haemaphysalis sulcata and an unremarked tick species isolates Trbrt45 (KP745629), 10100 (JN656375), H116 (KF034787) and HS56 (KJ195692) in group A from Turkey were found as 13.26% for first three isolates and 13.66% fort he last HS56 isolate.
In conclusion, the scientific data were obtained with this study about the molecular prevalence and genetic characters of A. phagocytophilum in tick species in Kayseri province.