Sıcak su kaynaklarından bakteri izolasyonu, tanımlanması ve Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. Rittmanii'nin b-galaktozidaz enziminin saflaştırılması
Identification, isolation of bacteria from the hot spring and the purification of ß-galactosidase in Alicyclobacillus acidocaldarius subspecies Rittmanii
Yazar: REYHAN GÜL GÜVEN
Danışman: PROF. DR. ERHAN ÜNLÜ
Dicle Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2007
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Taşlıdere-Batman ve Kös-Bingöl sıcak su kaplıcalarından izole edilen bakterilerin morfolojik, fizyolojik, biyokimyasal özellikleri, lipit ve yağ asidi içerikleri, kinon tipleri ve 16S rRNA dizi analizleri yapılarak identifikasyonları yapılmıştır. Ayrıca Antartika'dan izole edilmiş diğer bir termofilik basil olan Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmannii'nin biyoteknolojik öneme sahip olan ? -galaktozidaz enzimi saflaştırılmış ve saf enzimin bazı özellikleri çalışılmıştır.Kös-Bingöl kaplıcasından izole edilen ve KG5 olarak adlandırılan izolat, çubuk şekilli, Gram-pozitif, fakültatif anaerob, hareketli ve endosporları oval şekilli sentral konumlu olduğu bulunmuştur. KG5 için üreme sıcaklık aralığı 15-45 ? C (optimum 40 ? C) olarak bulunduğundan mezofilik karakterde bir bakteri olarak tanımlanmıştır. KG5 birçok özellik bakımından Bacillus cereus türüne benzerlik göstermektedir. KG5'in sadece katalaz ve glukoz kullanımının negatif olmasından dolayı Bacillus cereus'un diğer varyetelerinden farklı olduğu tespit edilmiştir.KG5 ile Bacillus cereus türü arasında yağ asidi profili bakımından da benzerlik bulunmuştur. Her iki bakteride de nC16:0 majör yağ asidi, iC15:0 ise ikinci büyük yağ asididir. KG5'te nC18:0 yağ asidinin B.cereus'tan çok daha fazla oranlarda bulunmuştur. Ayrıca, KG5'in 16S rRNA dizisi % 100 oranına yakın B. cereus'a, % 99.9 oranında Bacillus thrungiensis'e ve % 99.8 oranında Bacillus anthracis'e benzediği bulunmuştur.Taşlıdere-Batman kaplıcasından izole edilen ve KG9 olarak adlandırılan izolat çubuk şekilli, Gram-pozitif, fakültatif anaerob ve hareketli, endosporları oval şekilli subterminal konumlu olduğu bulunmuş ve üreme sıcaklık aralığı 30-55 ? C (optimum 50 ? C) olarak bulunduğundan ılımlı termofil karakterde bir bakteri olarak tanımlanmıştır. KG9 birçok özellik bakımından Bacillus licheniformis türüne benzerlik gösterdiği bulunmuştur. % 15 Oranındaki NaCl' de üreyen KG9' un halotolerant olduğu tespit edilmiştir.Yağ asidi profiline göre KG9 ve B.licheniformis'te majör yağ asidi iC15:0'tir. Diğer türlerde tespit edilmeyen yağ asidi nC18:0, KG9'da bulunmuştur. KG9'un 16S rRNA dizisinin % 99 oranında Bacillus licheniformis'e benzediği tespit edilmiştir.Taşlıdere-Batman kaplıcasından izole edilen ve KG8 olarak adlandırılan diğer izolatın çubuk şekilli, Gram-pozitif, fakültatif anaerob, hareketli, endosporları oval şekilli subterminal konumlu olduğu bulunmuş ve üreme sıcaklık aralığı 35-65 ? C (optimum 55 ? C) olarak bulunduğundan ılımlı termofil karakterde bir bakteri olarak tanımlanmıştır.Yağ asidi profilinden KG8 izolatının Anoxybacillus cinsinin üyesi olduğunu ve KG8'in 16S rRNA dizisinin Anoxybacillus kamchatkensis' e % 99, A.flavithermus, A. ayderensis ve A. gonensis' e % 98 ve A. pushchiensis' e ise % 97 oranında benzerliğe sahip olduğu bulunmuştur.KG8 izolatının 16S rRNA dizi analizine göre %99 oranda benzerlik gösterdiği A. kamchatkensis, katalaz negatif, nişasta hidrolizi negatif, optimum üreme sıcaklığı 60 ? C iken, KG8, katalaz (+), nişasta hidrolizi (+), ve optimum üreme sıcaklığı 55 ? C olarak tespit edilmiştir. İki bakteri arasındaki yüksek oranda 16S rRNA dizi benzerliğine rağmen bu gibi farklılıkların görülmesi KG8'in ayrı bir tür olabileceğini göstermektedir. A. kamchatkensis türü ile DNA-DNA hibridizasyonu sonucunda elde edilecek homoloji ile bu izolatın yeni bir tür veya alt tür olup olmadığı ortaya çıkacaktır.Çalışılan bakterilerin lipit analizi yapıldığında ise 3 bakterinin gliko ve fosfolipit ve aminolipitler bakımından basillere benzediği, KG5' in farklı olarak fosfo-gliko lipit içerdiği tespit edilmiştir. Ayrıca tür teşhisinde kullanılan kinon tipleri çalışılmış, tüm çalışılan izolatların menakinon içerdiği ve KG8 için yapılan ileri çalışmada da bu menakinon tipinin MK-7 olduğu bulunmuştur.Ekstrem şartlara dayanıklı türlerin enzim kaynağı olarak kullanılma potansiyelleri nedeniyle, Antartika'dan izole edilen ve tür teşhisi daha önce yapılan Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmanii'nin endüstriyel açıdan öneme sahip intraselüler bir ? -galaktozidaz enzimi saflaştırılmış ve enzimin bazı özellikleri çalışılmıştır.Saf enzim 113 U/mg spesifik aktivite, 163 kat saflaştırma ve % 8'lik bir verimle elde edildi. Km değeri 8.9 mM olarak hesaplandı. Saf enzim için elde edilen optimum pH ve sıcaklık sırasıyla 6.0 ve 65 ?C'dir.FPLC sistemini kullanarak ? -galaktozidazın nativ (non-denatüre) molekül ağırlığı 165 kD, denatüre şartlar altında ise 76 kD olduğu bulunmuştur. Saflaştırılan ? -galaktozidaz ın molekül ağırlığına, izole edildiği organizmaya ve afinite kromatografisine bağlanamama veya zayıf bağlanma yeteneğine bakıldığında GH-42 ailesinin bir üyesi olabileceği düşünülmektedir. Jel filtrasyon ve SDS-PAGE yöntemi ile enzimin benzer veya aynı alt ünitelerden (76 kD) oluşan oligomerik (dimer veya trimer; non-denatüre moleküler ağırlık 165 kD) bir yapıya sahip olduğu bulunmuştur.Bu çalışmada saflaştırılan A. acidocaldarius subsp. rittmannii ? -galaktozidazının optimum pH ve sıcaklığının uygunluğu, hem kendiliğinden sentezlenen hem de sentezi artırılabilen (indüklenebilen) özelliklerinden dolayı süt ve peynir altı suyu laktozunun hidrolizinde uygun bir kullanım alanına sahip olabileceğini göstermektedir. Bu enzimin endüstride kullanılabilirliği ileri seviyede test edilmesi gerekmektedir.KG9'un nişasta ve kazein hidrolizi pozitif, katalaz pozitif, KG5'in kazein ve jelatin pozitif, KG8' in ise nişasta hidrolizi pozitif olması bu bakterilerin endüstriyel açıdan önemli olan enzimlerin (amilaz, proteaz vs.) kaynağı olabileceklerini göstermektedir. Termofilik olmalarından dolayı KG8 ve KG9'un önemi daha da artmaktadır .

Abstract:
The morphological, physiological, biochemical characteristics, as well as lipid and fatty acid composition, quinone types and 16S rRNA sequence analyses of bacteria isolated from Taşlıdere (Batman) and Kös (Bingöl) hot springs were carried out in order to identify the isolates. Moreover, ? -galactosidase enzyme, which has biotechnological importance, of a thermophilic Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmannii isolated from Antarctica was purified and some properties of this enzyme were studied.The isolate named as KG5 isolated from Kös hot spring was rod-shaped, Gram-positive, facultatively anaerobic, motile and endospores are oval and centrally located. KG5 grows at at a temperature of 15-45 ? C (optimum 40 ? C ??? which has been considered as mesophilic strain. KG5 for its catalase and glucose utilisation being negative was found to be different from other Bacillus cereus strains.The fatty acid profiles of KG5 and B. cereus were also found to be similar. In both bacteria, nC16:0 is major fatty acid, while iC15:0 is the second most aboundant fatty acid. However, KG5 was found to possess nC18:0 much more than B.cereus. Moreover, 16S rRNA sequence of KG5 was similar to B. cereus at a ratio of 100 %, Bacillus thrungiensis at 99.9 % and Bacillus anthracis at 99.8 %.The isolate named as KG9 isolated from Taşlıdere hot spring was rod-shaped, Gram-positive, facultatively anaerobic, motile and endospores are oval at subterminal location. KG9 grows at at a temperature of 30-55 ? C (optimum 50 ? C ??? which has been considered as moderatively thermophilic strain. KG9 was found to be very similar to Bacillus licheniformis. KG9 is a halotolerant strain which grows in 15 % salt. The fatty acid profiles of KG9 and B. licheniformis showed that major fatty acid is iC15:0. However, nC18:0 was found in KG9, but not in other B. licheniformis strains. 16S rRNA sequence of KG9 was 99 % similar to B.licheniformis.The isolate named as KG8 also isolated from Taşlıdere hot spring was rod-shaped, Gram-positive, facultatively anaerobic, motile and endospores are oval at subterminal location. KG9 grows at a temperature of 35-65 ? C (optimum 55 ? C ??? which has been considered as moderatively thermophilic strain. The fatty acid profile of KG8 indicated that this strain was a member of Anoxybacillus and 16S rDNA sequence of KG8 was found to be similar to Anoxybacillus kamchatkensis at a ratio of 99 %, A.flavithermus, A. ayderensis and A. gonensi? at 98 % and A. pushchiensis at 97 %.A. kamchatkensis, of which 16S rDNA sequence is 99 % similar to KG8, is catalase-negative, starch hydrolysis-negative and grows at an optimum temperature of 60 ? C, while KG8 is catalase (+), starch hydrolysis (+) and grows at an optimum temperature of 55 ? C. Although the similarity of 16S rRNA sequence is high for both strains, KG8 is probably different species due to the differences mentioned above. The homology obtained by DNA-DNA hybridisation with A. kamchatkensis will reveal whether this isolate is a new species or a subspecies.The lipid analysis showed that three strains resemble bacils for their glicolipid, phospholipid and aminolipid content. KG5 possessed phospho-glicolipid, compared to other two strains. In addition, quinone types were studied for identification, which all had MK types. Further investigation showed quinone type for KG8 to be MK-7.Because of the potantial use of extremophile species as enzyme sources, the industrially important, intracellular ? -galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmanii previously isolated from Antarctica was purified and some properties of this enzyme were studied.The homogenous enzyme had a specific activity of 113 U/mg protein, with a fold purification of 163 and a yield of 8%. The Km value for ONPG were determined as 8.9mM in the purified ? -galactosidase from A. acidocaldarius subsp. rittmannii. The pH and temperature optima for the purified enzyme are 6.0 and 65 ?C, respectivelyThe molecular mass of the purified enzyme determined by gel filtration on FPLC (native) and SDS-PAGE (under denatured conditions) was 165 and 76 kDa, respectively. It is clear that the ? -galactosidase from A. acidocaldarius subsp. rittmannii is very likely to belong to GH-42, according to its molecular weight, the organism isolated from, and its weak or no binding ability to an affinity column. The results of gel filtration and SDS-PAGE demonstrate that A. acidocaldarius subsp. rittmannii ? -galactosidase is oligomeric (dimeric or trimeric; native mass 165 kDa), composed of similar or identical subunits (mass 76 kDa).The optima of pH and temperature, both constitutive synthesis and inducibility of A. acidocaldarius subsp. rittmannii ? -galactosidase indicate that this enzyme may be suitable for hydrolysis of lactose in milk and sweet whey. Further study is needed in order to evaluate A. acidocaldarius subsp. rittmannii ? -galactosidase for use in milk and whey processing.The starch and casein hydrolysis-positive, catalase-positve characteristics of KG9, casein and gelatine hydrolysis positive characteristics of KG5 and starch hydrolysis-positive characteristics of KG8 showed that these strains can be used as sources of industrially important enzymes (amylase, protease etc.). Particularly the thermophilic species, KG8 and KG9 deserve more attention in this regard.