Endokrin bozucu hormonlara özgü gravimetrik nanosensörün hazırlanması ve moleküler modellenmesi
Preparation and molecular modelling of specific gravimetric nanosensor for endocrine disrupting hormones
Yazar: GÜLGÜN AYLAZ
Danışman: PROF. DR. AYŞE MÜGE ANDAÇ
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Endokrin bozucu kimyasallar = Endocrine disrupting chemicals ; Moleküler modelleme = Molecular modeling ; Sensörler = Sensors ; Östrojenler = Estrogens

Özet:
Doğal östrojenik hormonların kadınlarda hormonal tedavilerde doğum kontrol hapı olarak ve veterinerlikte çiftlik hayvanlarının büyüme öncülleri olarak sıklıkla kullanılmaktadırlar. Bu bileşenlerin idrarla atılmalarıyla su kaynaklarına ya da toprağa karışması ile insan sağlığını ve yaban hayatını tehdit etmekte ve ayrıca sucul organizmalar üzerinde ciddi yan etkilerin oluşmasına neden olmaktadırlar. Kadınlar için menopoz sonrası hormon replasman tedavilerinde yaygın olarak kullanılan östrojenik hormonlar, doğal su kaynağı kirleticilerinin başında gelmektedir. ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA) tarafından 2020 yılında düzenlenen Endokrin Bozucu Kimyasal (EBK) kirleticiler listesinde yer alan östrojenik hormonlar, günümüzde kullanılan tespit yöntemleri ile ancak belirli sınırların üzerinde tespit edilebilmektedir. Equilin (Equ), kimyasal kirleticiler listesinde sağlık risk düzeyi 0.35 µg/L olan östrojenik hormonlardan biridir. Bu tez çalışmasında, endokrin bozucu su kirleticilerinden olan Equ'in, hızlı ve etkin bir şekilde gerçek zamanlı kantitatif tayini için yüksek maliyetli cihazlara ve uzman kullanımına ihtiyaç duyulmadan, yüksek hassasiyette ölçüm yapabilen bir kuartz kristal mikro terazi nanosensör hazırlanmıştır. Bu nanosensör sistemi ile hem Equ'in hem de 17β-estradiol, estron, estriol östrojenik hormonların etkileşimleri incelenmiştir. Ayrıca bu östrojenik hormonlar ile nanosensör etkileşimleri bilgisayarlı modelleme çalışmaları ile karşılaştırılmıştır. AutoDock moleküler modelleme programının kullanılması, hedef moleküle yüksek seçicilik ve afinite gösteren biyomimetik ligandların tasarımını kolaylaştıran bir araç olmuştur. Östrojenik hormonları üç boyutlu geometrik yapılarına göre seçici olarak tanıyacak ligand molekülleri olarak Tirozin (Tyr), Triptofan (Trp) ve Fenilalanin (Phe) amino asitleri seçilmiştir. Amino asitler ve östrojenik hormonların moleküller arası etkileşimlerinin serbest bağlanma enerjileri hesaplanarak birbirleriyle en çok etkileşim halinde olan moleküller belirlenmiştir. Moleküler modelleme sonuçları ile Equ ve Tyr, Trp ve Phe arasındaki etkileşimler esas olarak hidrofobik etkileşimlere dayandığı görülmüştür. Tyr, Trp ve Phe moleküllerinin sırasıyla fenil halkası, indol grubu ve fenil kısımları, Equ'in halka yapısına hidrofobik etkileşimlerle yönlenmişlerdir. Tez kapsamında, östrojenik hormonlar, QCM nanosensör sisteminde afiniteye dayalı etkileşimler ile kısa sürede hassas bir şekilde tespit edilmişlerdir. QCM nanosensörü 11-merkaptoundekanoik asit (11-MUA) ile kendiliğinden düzenlenen tek tabaka oluşturularak ve daha sonra Tyr, Trp ve Phe amino asitleri ile modifiye edilerek hazırlanmıştır. Bu tez çalışmasında geleneksel QCM sensör sistemlerinden farklı olarak amino asitlerin desorpsiyon mekanizması araştırılmıştır. Algılama işlemi, kuvars kristal yüzeyine bağlanan moleküllerin neden olduğu kütle artışı yerine yüzeyden uzaklaştırılan kütle miktarına bağlı olarak gerçekleşmiştir. Equ ve amino asitler arasındaki afinite etkileşimleri hem moleküler modelleme ile teorik olarak hem de gerçek zamanlı QCM ölçümleri ile deneysel olarak incelenmiş ve sonuçlar karşılaştırılmıştır. Equ için en düşük tespit limiti, 25-500 nM aralığında lineer dinamik algılama ile Tyr, Trp ve Phe modifiye QCM nanosensör için sırasıyla 4.59, 5.05 ve 6.30 ng/L olarak elde edilmiştir. Hem tespit limiti hem de QCM sensogramlarında meydana gelen rezonans frekansındaki değişimlere göre, Tyr ve Trp modifiye edilmiş QCM nanosensörlerin Phe modifiye edilene kıyasla daha yüksek performansa sahip oldukları bulunmuştur. Tez çalışması kapsamında QCM nanosensör ile ilk kez Equ analizi ve amino asitlerle olan etkileşimleri moleküler modellenmesi yapılarak bu alanda yapılacak olan birçok çalışmaya ışık tutacak niteliktedir.

Abstract:
Natural estrogenic hormones are frequently used as birth control drugs in hormonal treatments for women and as growth precursors of farm animals in veterinary practice. These components threaten human health and wildlife when they are excreted in urine and mixed with water resources or soil, and they also cause serious side effects on aquatic organisms. Estrogenic hormones, which are widely used in postmenopausal hormone replacement therapies for women, are among the leading natural water source pollutants. Estrogenic hormones, which are included in the Endocrine Disrupting Chemical (EDC) pollutants list issued by the US Environmental Protection Agency (EPA) in 2020, can only be detected above certain limits with the detection methods used today. Equilin (Equ) is one of the estrogenic hormones with health risk level 0.35 µg/L in the chemical pollutants list. In this thesis study, a quartz crystal microbalance nanosensor was prepared for the rapid and effective real-time quantitative determination of Equ, which is one of the endocrine disrupting water pollutants, without the need for expensive devices and the use of specialists, which can measure with high precision. The interactions of both Equ and 17β-estradiol, estrone, estriol estrogenic hormones with this nanosensor system were investigated. On the other hand, interactions of these estrogenic hormones and nanosensor were investigated by computer modeling studies. The use of the AutoDock molecular modeling program has been a tool to facilitate the design of biomimetic ligands with high selectivity and affinity for the target molecule. Tyrosine (Tyr), Tryptophan (Trp) and Phenylalanine (Phe) amino acids were chosen as ligand molecules that will selectively recognize estrogenic hormones according to their three-dimensional geometric structures. By calculating the free binding energies of the intermolecular interactions of amino acids and estrogenic hormones, the molecules that interact the most with each other were determined. The molecular modeling results and the interactions between Equ and Tyr, Trp and Phe were mainly based on hydrophobic interactions. The phenyl ring, indole group and phenyl residue of Tyr, Trp and Phe molecules, respectively, were oriented to the ring structure of Equ by hydrophobic interactions. Within the scope of the thesis, estrogenic hormones were detected sensitively in a short time by affinity-based interactions in the QCM nanosensor system. The QCM nanosensor was prepared by forming a self-assembled monolayer with 11-mercaptodecanoic acid (11-MUA) and then modified with the amino acids Tyr, Trp and Phe. In this thesis, the desorption mechanism of amino acids, unlike conventional QCM sensor systems, was investigated. The detection process was based on the amount of mass removed from the surface instead of the mass increase caused by the molecules attached to the quartz crystal surface. Affinity based interactions between Equ and amino acids were investigated both theoretically by molecular modeling and experimentally by real-time QCM measurements, and the results were compared. The lowest detection limit for Equ was obtained as 4.59, 5.05 and 6.30 ng/L for Tyr, Trp and Phe modified QCM nanosensor with linear dynamic detection in the 25-500nM range, respectively. It was found that Tyr and Trp modified QCM nanosensors had higher performance compared to Phe modified one, according to the changes in resonance frequency occurring in both the detection limit and QCM sensograms. Within the scope of the thesis, Equ analysis and molecular modeling of interactions with amino acids for the first time with QCM nanosensor will shed light on many studies to be done in this field.