N-asetil sistein, rifampisin ve ozonun panrezistan Klebsiella pneumoniae izolatlarının oluşturduğu biyofilm üzerine etkinliği
The efficacy of N-acetyl cysteine, rifampicin, and ozone on the biofilm formed by the panresistant Klebsiella pneumoniae isolates
Yazar: GÜLŞAH TUNÇER
Danışman: PROF. DR. ARİF ATAHAN ÇAĞATAY
İstanbul Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2019
Konu: Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases
Dizin: Biyofilmler = Biofilms ; Klebsiella = Klebsiella ; Klebsiella pneumoniae = Klebsiella pneumoniae ; N-asetilsistein = N-acetylcysteine ; Ozon tedavisi = Ozone therapy ; Rifampisin = Rifampicin

Özet:
Amaç ve Giriş: Bu çalışmada giderek çözümü zor hale gelen ve hastanemizde de önemli bir nozokomiyal infeksiyon etkeni olarak karşımıza çıkan panrezistan Klebsiella pneumoniae (PRKp)'nin neden olduğu infeksiyonlar ve direnç sorununa çözüm aranmaya çalışılmıştır. Yeni bir antibiyotikle şimdilik çözüm yolu olmadığı bilindiği için biyofilm tabakası hedef alınarak biyofilm tabakasına etkili olması beklenen N-asetil sistein (NAC), rifampisin ve ozon gibi antibiyofilm etkinlikli ajanların uygulanması ve etkili olmaları durumunda tedavide kullanılabilecek antibiyotiklerin etkili olabilmesi ve infeksiyonun tedavi olabilirliğini sağlaması beklenmektedir.
Gereç ve Yöntemler: İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Hastanesi'nde 15 Haziran 2017- 15 Temmuz 2018 tarihleri arasında yatan, >18 yaş üstü dokuz hastadan alınan örneklerde invazif infeksiyon oluşturmuş K. pneumoniae izolatları klasik biyokimyasal yöntemler kullanılarak tanımlandı. Bu bakterilerin antibiyotiklere duyarlılıklarının belirlenmesinde kullanılan disk difüzyon yöntemi, gradyan testi ve sıvı mikrodilüsyon yöntemleri için European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) tarafından belirlenen zon çapları ve minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri kullanıldı. Bakterilerin biyofilm oluşturma yeteneklerinin gösterilmesi için mikroplakta kristal viyole boyama yöntemi kullanıldı. Kuyucukların optik dansiteleri (OD) ölçülerek biyofilm oluşturma kapasitelerine göre sınıflandırma yapıldı. Tek tabaka hücre kültüründe hücre içi biyofilm oluşturma yeteneği belirlendi. Biyofilm oluşumu ve NAC, rifampisin ve ozonun biyofilm tabakası üzerine etkinliği koloni sayma yöntemi ve lazer taramalı konfokal mikroskopisi yöntemiyle gösterildi.
Bulgular: Çalışmaya dokuz hasta dahil edildi. Bu hastalardan 5 (%55.5)'i Yoğun Bakım Ünitesi'nde yatmaktaydı. Hastaların dördü bakteriyemi, üçü ventilatörle ilişkili pnömoni (VİP), biri protez infeksiyonu, diğeri ise komplike idrar yolu infeksiyonu tanısıyla takip edildi. PRKp infeksiyonu gelişen hastaların altısı meropenem, tigesiklin ve kolistin; ikisi imipenem, tigesiklin ve kolistin; biri ise meropenem, ertapenem ve kolistin kombinasyonuyla tedavi edildi.  Hastanede kalış süresi ortalama 50.4 (4-80) gündü. Tedavi başlandıktan ortalama dokuz gün (4-21) sonra hastalardan 7 (%77.7)'si geniş spektrumlu antibiyotik kullanılmasına karşın kaybedildi. Hayatta kalan hastalardan birisi komplike idrar yolu infeksiyonu tanısıyla meropenem, ertapenem ve kolistin tedavisi alan ve sondası değiştirilen hasta; diğeri ise protez infeksiyonu tanısıyla meropenem, tigesiklin ve kolistin tedavisi alan ve protezi değiştirilen hastaydı. İzolatların tüm antimikrobiyal kategorilerde tüm ajanlara dirençli oldukları gösterildi ve hepsi denenen tüm antibiyotiklere dirençli bakteri (PDR) olarak tanımlandı. Karbapeneme dirençli olan suşların hepsinde (%100) genotipik yöntemlerle karbapenemaz geni saptandı. Tüm suşlarda saptanan karbapenemaz tipi OXA-48 idi, sadece bir suşta (12 no'lu) hem OXA-48 hem de NDM-1 geni birlikte saptandı. Biyofilm oluşumu yönünden tüm K. pneumoniae suşları değerlendirildiğinde biyofilm yapanların oranı %100 olarak saptandı. Pozitif ve negatif kontrole göre yapılan sınıflandırmada izolatların hepsinin (%100) yüksek düzeyde biyofilm oluşturduğu belirlendi. Koloni sayma yöntemiyle, biyofilm oluşturmuş (24 saatlik) bakterilere son konsantrasyon 2 g/ml ve 0.1 g/ml olacak şekilde NAC ve rifampisin uygulanarak 2. saat, 6. saat, 24. saat ve 72. saatlerdeki etkileri incelendi. Kullanılan tüm izolatlarda ortalamalarına bakılarak kendi kontrollerine göre bakteri sayısında anlamlı bir azalma saptanmadı (sırasıyla NAC için p değeri >0.05, >0.05, >0.05, >0.05 ve rifampisin için p değeri >0.05, >0.05, >0.05, >0.05). Son konsantrasyon 0.6 g/ml olacak şekilde ozonlu su uygulandığında belirlenen zamandaki kendi kontrollerinin ortalamalarına göre 6. ve 24. saatte bakteri sayısında istatistiksel olarak anlamlı bir azalma görülmekle (sırasıyla p değeri <0.05, <0.05) birlikte logaritmik olarak 2 log10 veya üzerinde bir azalma saptanmadığı için etkili olmadığı düşünüldü. Bununla birlikte, 2. ve 72. saatteki incelemede biyofilmdeki bakteri sayısında anlamlı bir azalma saptanmadı (sırasıyla p değeri  >0.05, >0.05). Sudaki ozon konsantrasyonu artırılarak son konsantrasyon 4.78 g/ml olacak şekilde ozonlu su uygulandığında 2. ve 24. saatte biyofilmdeki bakteri sayısında istatistiksel olarak anlamlı azalma görülmekle (sırasıyla p değeri <0.05, <0.05) birlikte 2 log10 üzerinde azalma saptanmadığı için etkili olmadığı düşünüldü. Bununla birlikte, aynı konsantrasyonda 6. saatte istatistiksel olarak anlamlı bir azalma görülmedi. Ancak, 72. saatteki incelemede biyofilmdeki bakteri sayısında tüm izolatlarda 2.06-4.08 log10 aralığında azalma saptandığı için etkili olarak değerlendirildi. Lazer taramalı konfokal mikroskopi yöntemiyle, biyofilm oluşturmuş (24 saatlik) bakterilerde son konsantrasyon 2 g/ml, 0.1 g/ml ve 4.78 g/ml olacak şekilde NAC, rifampisin, ozonlu su uygulandığında 2., 6. ve 24. saatlerdeki biyofilm içindeki canlı ve ölü bakteriler üzerine etkileri incelendi. Tüm izolatlarda kendi kontrollerine göre bakteri sayısında 24. saatte ozonlu suda istatistiksel olarak anlamlı azalma (canlı bakteriler için p değeri 0.05 ve ölü bakteriler için p değeri 0.01) dışında canlı ve ölü bakteri sayısında anlamlı bir azalma saptanmadı. Bununla birlikte logaritmik olarak 2 log10 veya üzerinde bir azalma gösterilmediği için ozonlu suyun koloni sayma yöntemiyle belirlendiği gibi 24. saatte de etkili olmadığı düşünüldü.  
Sonuç: PRKp izolatları ülkemizde ve dünya çapında tedavi açısından sorun oluşturan önemli bir patojendir. OXA-48 ve NDM tipi karbapenemaz üreten ve özellikle Yoğun Bakım Ünitesi hastalarında kolonize olan bu bakteriler hastanemizde endemik hale geçmişlerdir. Ancak, bu izolatların biyofilm oluşturma yetenekleri hakkında bir veri yoktur. Bunun dışında, literatür taraması yapıldığında panrezistan suşlarla ilgili bir çalışmaya rastlanmamıştır. PRKp'nin biyofilm oluşturma özelliğini karakterize etmenin yanı sıra, biyofilm oluşturan bu izolatların tedavisinde kullanılacak farklı yaklaşımlara ihtiyaç duyulmaktadır. Böyle dirençli suşların tedavisinde NAC (2 mg/lt), rifampisin (0.1 mg/lt) ve ozon (0.6 mg/lt ve 4.78 mg/lt) gibi diğer ajanların belirli konsantrasyonlarda etkinliği ilk defa bu çalışmada test edilmiştir. Test sonuçlarına göre NAC ve rifampisin etkili bulunmamakla birlikte, ozon 4.78 mg/lt konsantrasyonda bile bakteri sayısında ≥2 log10'luk azalmayı sağlamıştır. Daha yüksek ozon konsantrasyonunun kullanılması durumunda tedavi açısından başarılı sonuçların alınabileceği düşünülmektedir. Daha fazla suşla in vitro testlerin yapılmasının yanı sıra in vivo deneylerle de bu antibiyofilm etkinlikli ajanların etkinliklerinin gösterilmesi gerekmektedir. Ayrıca, bakterilerin hem biyofilm oluşturma kapasiteleri hem de panrezistan olmaları nedeniyle halihazırda kullanılacak tedavi seçeneklerinin bulunmaması, bu infeksiyonların gelişimini önlemenin yani hastane kontrol önlemlerinin önemini iyice vurgulamaktadır.

Anahtar kelimeler: Panrezistan Klebsiella pneumoniae, biyofilm, N-asetil sistein, rifampisin, ozon

Abstract:
Aim and Introduction: In the present study, we searched for a solution for the infections of panresistant Klebsiella pneumoniae (PRKp) and the resistance which is difficult to handle and as a significant nosocomial infection factor in our hospital. We expect to administer the antibiofilm effective agents such as N-acetyl cysteine (NAC), rifampicin, and ozone by targeting the biofilm layer, and if they are found effective, to provide the effective antibiotics to be used in treatment, and to enable the cure of infection because no solution is yet known to be available with a new antibiotic.
Material and Methods: K. pneumoniae isolates which created invasive infections in the samples collected from nine patients aged over 18 years who were hospitalized in Istanbul University Istanbul Faculty of Medicine Hospital between 15 June 2017- 15 July 2018 were identified using the classical biochemical methods. The zone diameters and minimum inhibitory concentration (MIC) values determined by the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) were used for disk diffusion method, gradient test, and broth microdilution methods in determining the sensitivity of these bacteria to antibiotics. The crystal violet staining method was used in demonstrating the biofilm forming capacity of the bacteria. The classification was performed in accordance with the biofilm forming capacities by measuring the optic density (OD) of the wells. Intracellular biofilm forming capability was identified in the single layer cell culture. Biofilm formation and the efficacy of NAC, rifampicin, and ozone on biofilm layer was demonstrated using the colony counting method, and laser screened confocal microscopy method.
Results: Nine patients were included in the study. 5 (55.5%) patients were hospitalized in the Intensive Care Unit. Four patients were followed up with the diagnosis of bacteremia, three were diagnosed with ventilator-associated pneumonia (VAP), one patient had prosthetic infection, and the other one patient was diagnosed with complicated urinary tract infection. Six patients who developed PRKp infection were treated with meropenem, tigecycline, and colistin; two patients were administered imipenem, tigecycline, and colistin; and one patient was administered meropenem, ertapenem, and colistin combination. The mean hospital stay time was 50.4 (4-80 days) days. Although broad spectrum antibiotics were used, 7 (77.7%) patients died in a mean of 9 (4-21 days) days after the initiation of treatment. One of the surviving patients was received meropenem, ertapenem, and colistin treatment and whose catheter was replaced with the new one, the other surviving patient was administered meropenem, tigecycline, and colistin due to prosthetic infection, and the prosthesis was replaced with the new one. The isolates were shown to be resistant against all agents in all antimicrobial categories, and all were described as pan-drug resistant (PDR). Carbapenemase gene was detected in all (100%) strains resistant to carbapenem with the genotypic methods. The detected carbapenemase type was OXA-48 in all strains, and both OXA-48, and NDM-1 gene were detected in only one strain (no. 12). All (100%) the K. pneumoniae strains were detected to form biofilms. All (100%) isolates were found to form biofilms in high levels according to the classification in terms of the positive and negative control. NAC and rifampicin were administered to create a final concentration of 2 g/mL, and 0.1 g/mL to biofilm formed (24 hours) bacteria, and their effects at hour 2, hour 6, hour 24, and hour 72 were investigated using the colony counting method. No significant decrease was detected in the number of bacteria in all isolates compared with their controls (p value >0.05, >0.05, >0.05, >0.05 for NAC, and p value >0.05, >0.05, >0.05, >0.05 for rifampicin, respectively). Although there was a statistically significant decrease in the bacteria count at hour 6, and hour 24 compared with its control in the indicated time when ozone water was applied as to provide a final concentration of 0.6 g/mL (p value 0.05, 0.05, respectively), it was considered ineffective because no decrease was detected logaritmically as 2 log10 or over 2 log10. In addition, no significant decrease was detected in the number of bacteria in the biofilm in the investigation at hour 2 and hour 72 (p value >0.05 and >0.05, respectively). Although there was a statistically significant decrease in the bacterial count at hour 2, and hour 24 compared with its control in the indicated time when ozone water was applied as to provide a final concentration of 4.78 g/mL (p value <0.05, <0.05, respectively) by increasing the ozone amount in water, it was considered ineffective because no decrease was detected logaritmically as 2 log10 or over 2 log10. In addition, no statistically significant decrease was detected in the same concentration at hour 6. However, it was considered effective in detection of a decrease of 2.06-4.08 log10 interval in the bacterial count in the biofilm at hour 72 in all isolates. The effects of NAC, rifampicin, and ozone water on the living and death bacteria in the biofilm at hours 2, 6, and 24 were investigated as to provide the final concentration of 2 g/mL, 0.1 g/mL, and 4.78 g/mL in the biofilm forming (24 hours) bacteria using the laser screening confocal microscopy method. No significant decrease was detected in the living and death bacterial count in all isolates compared with their controls except the statistically significant decrease in the ozone water at hour 24 (p value for living bacteria was 0.05, and p value for death bacteria was 0.01). Ozone water was regarded ineffective at hour 24 as no decrease was determined logaritmically at 2 log10 or over 2 log10.
Conclusion: Panresistant K. pneumoniae isolates are important pathogens that cause therapeutic problems in Turkey and worldwide. These bacteria that produce OXA-48 and NDM-1 type carbapenemase and are particularly colonised in the intensive care unit patients became endemic in our hospital. However, there is no data on the biofilm forming capabilities of these isolates. In addition, there is no study on the panresistant strains in the literature. There is need for different approaches to be used in the treatment of these isolates that form biofilms in addition to characterising the PRKp biofilm forming characteristics. The efficacy of the different concentrations of other agents such as NAC (2 mg/L), rifampicin (0.1 mg/L) and ozone (0.6 mg/L ve 4.78 mg/L) in treatment of such resistant strains was first tested in the present study. In accordance with the test results; NAC and rifampicin were found ineffective, however, ozone in a concentration of 4.78 mg/L enabled a decrease of  ≥2 log10 in the number of bacteria. We suggest that more succesful results may be obtained in treatment with the use of higher ozone concentrations. There is a need for demonstrating the efficacy of these antibiofilm efficient agents with in vivo experiments with more strains and in vitro test. In addition, due to the lack of current treatment options owing to the biofilm forming capacities of bacteria and their being panresistant, emphasizes the prevention of the development of these infections and thus to the importance of the hospital control precautions.

Key words: Panresistant Klebsiella pneumoniae, biofilm, N-acetyl cysteine, rifampicin, ozone