Nörit uzamasında koronin 1A'nın etkisi
The effect of coronin 1A on neurite outgrowth
Yazar: YUNUS KASIM TERZİ
Danışman: PROF. DR. ŞÜKRİYE AYTER
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Hücre iskeleti = Cytoskeleton ; Koronin 1A = Coronin 1A ; Merkez sinir sistemi = Central nervous system ; Nöritler = Neurites ; Sinir rejenerasyonu = Nerve regeneration ; Sinir sistemi = Nervous system ; Sinir sistemi hastalıkları = Nervous system diseases

Özet:
Sinir sistemi hasarları, canlının iç ve dış çevreden gelen uyarıları algılamasını ve bunlara uygun bir cevap oluşturmasını engellemektedir. Memelilerde, merkezi sinir sistemi hasarı sonrasında rejenerasyon, miyelin ile ilişkili baskılayıcı proteinlerin ve kondroitin sülfat proteoglikanlarının oluşturduğu sinyal nedeni ile çok sınırlı olarak gerçekleşebilir. Bu sinyal iletim yolağının önemli iki elemanı olan RhoA ve ROCK'un in vitro ve in vivo'da baskılanmaları durumunda akson rejenerasyonunun gerçekleştiği gösterilmiştir. RhoA ve ROCK'un çok sayıda fizyolojik olayda rol almaları nedeni ile baskılanmalarının hücrenin fizyolojisinde ciddi problemlere neden olabileceği düşünülmekte, bu nedenle özgül olarak nörit uzamasını düzenleyecek yeni hedef moleküllerin tanımlanmasına ihtiyaç duyulmaktadır. Yeni hedef moleküllerin tanımlanması amacı ile yapılan bir oligonükleotid microarray çalışması sonucunda, Koronin 1A proteininin gen ifade düzeyinin, sıçanlarda oluşturulan omurilik hasarı sonrasında önemli artış gösterdiği tespit edilmiştir. Koronin 1A, aktin ağı yapısının oluşumunda etkili olan Arp2/3 ile etkileşen bir proteindir ve bu etkileşimi ile aktin filamentlerinin polimerizasyonunu düzenlemektedir. Aynı zamanda amino ve karboksil uçlarında bulunan fosforilasyon bölgesi ile Arp2/3 ile olan ilişkisi kontrol edilmektedir. Böylece baskılayıcı moleküller tarafından oluşturulan ve RhoA/ROCK yolağı ile iletilen sinyal için bir hedef molekül olmaktadır. Tez çalışmamız kapsamında Koronin 1A'nın nörit uzaması üzerindeki etkisi araştırıldı. Bu amaçla ilk olarak, nöron benzeri hücre hattı PC-12 hücrelerinde Koronin 1A proteininin ifade düzeyi ve hücre içi yerleşimi sırasıyla western blot ve immünfloresan boyama yöntemleri ile analiz edildi. İkinci aşama olarak, PC-12 hücrelerinin, Koronin 1A cDNA'sını içeren ifade vektörü ile transfeksiyonu sağlandı ve Nerve Growth Factor (NGF) uygulanarak farklılaştırıldı. Bu aşamada, Koronin 1A'nın yüksek düzeyde ifade edilmesinin nörit boyu üzerindeki etkisi, transfeksiyonun başka bir gen ile (Green flourescent protein) sağlandığı ve transfeksiyonun yapılmadığı PC-12 hücreleri kontrol olarak kullanılarak analiz edildi. Çalışmamız kapsamında Koronin 1A'nın, PC-12 hücrelerinde kortekste ve büyüme konisinde aktin hücre iskeleti ile birlikte yerleşim gösterdiği immünfloresan boyama yöntemi ile gösterildi. Aynı zamanda, PC-12 hücrelerinin farklılaşmasına parallel olarak Koronin 1A'nın ifadesinde protein düzeyinde değişiklik olmadığı da saptandı. Nörit uzama analizleri sonucunda Koronin1A/pQE-TriSystem-6-pEGFP ifade vektörleri ile birlikte transfeksiyonu sağlanan PC-12 hücrelerinin nörit boylarının, transfeksiyonun yapılmadığı (p<0,001) ve GFP ile transfeksiyonu sağlanan (p=0,002) kontrol PC-12 hücrelerine göre daha kısa olduğu ve bu farkın istatistiksel olarak anlamlı bulunduğu gösterildi. Bu sonuçlar, Koronin 1A'nın nörit uzaması üzerinde in vitro'da baskılayıcı bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir.

Abstract:
Damage to the nervous system hinders recieving sensory inputs from the inside and outside of organisms and initiating appropriate motor outputs. Due to inhibitor signals consist of myelin associated inhibitor proteins and chondroitin sulfate proteoglycans, regeneration after damage of the central nervous system in mammals can only occur in a limited way. Blockade of the RhoA and ROCK, two important members of the inhibitory signaling pathway, promotes axon regeneration both in vitro and in vivo. However, the ability of RhoA and ROCK to affect multiple physiological processes in many cell types highlights the need to identify novel intracellular targets for neurite outgrowth to develop more specific and potent therapeutic avenues. An oligonucleotide microarray study has been done to examine temporal gene profile changes following spinal cord injury in rats with the goal of identifying novel factors involved in neuronal plasticity. The results of this study showed that the expression level of Coronin 1A was significantly upregulated. Coronin 1A binds to the Arp2/3 complex which is a key nucleator of actin polymerization and regulates its activation on actin cytoskeleton. Coronin 1A ? Arp2/3 interaction is regulated by phosphorylation of Coronin 1A from the C and N terminal region. Thus, Coronin1A- Arp2/3 complex is targets of RhoA/ROCK inhibitory signaling cascades. In this study, our aim was to investigate the effect of Coronin 1A on neurite outgrowth. For this purpose, the expression level and localization of Coronin 1A in neuron like cell line, PC-12, was first detected by using western blot analysis and immunofluorescence staining, respectively. Secondly, PC12 cells were transfected with expression vector carrying Coronin 1A cDNA and differentiated by using Nerve Growth Factor. We then analyzed the effect of Coronin 1A overexpression on neurite outgrowth versus nontransfected and the green flourescent protein (GFP) transfected PC-12 cells serving as control. We showed that Coronin 1A protein was expressed in PC-12 cell lines at the cortical cytoskeleton, and growth cones along with the actin cytoskeleton via immunofluorescence staining. It was also shown that Coronin 1A expression has not been changed during differentiation of the PC-12 cells at the protein level. Neurite outgrowth analysis showed that neurite lenghts of the Coronin1A/pQE-TriSystem-6-pEGFP expression vectors cotransfected PC-12 cells were lower than the nontransfected (p<0,001) and GFP transfected (p=0,002) control PC-12 cells and these differences were statistically significant. These results indicate that Coronin 1A has an inhibitory effect on neurite outgrowth in in vitro.