Trombosit aktivasyonunun düzenlenmesinde MRP-1'in fonksiyonunun hastalıklarla olan ilişkisinin araştırılması.
Study of MRP1 function and its association with illnesses in regulation of thrombocyte activation.
Yazar: ÇİĞDEM BAYRAM GÜREL
Danışman: PROF. DR. GÖNÜL KANIGÜR
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
Astımda rölü olduğu bilinen LTC4'ile bu molekülün taşınmasından sorumlu olduğu bilinen MRP1 arasındaki ilişkinin astım hastalarında nasıl olduğu bilinmemektedir. LTC4 seviyeleri yüksek olduğu bilinen astımlı hastalarda MRP1 gen ifade seviyelerinde ve buna bağlı olarak taşıma hızında değişiklikler beklenebilir. Bu nedenle çalışmamızın ilk bölümünde lökositlerde MRP1 gen anlatım seviyeleri gerçek zamanlı kantitatif PZR yöntemiyle, fonksiyonu akan hücre ölçerde CFDA ve Calcein-AM problarıyla ve LTC4 miktarları ELİSA ile bu sorunun cevabı incelendi. Sonuçlarımız astımda MRP1 fonksiyonu ve MRP1 gen anlatım seviyelerinin yüksek olduğunu göstermektedir. Bu hastalarda LTC4 seviyelerinin farksız olması, MRP1'in artarak bir kompansatuar mekanizma gibi LTC4'ün seviyelerini düzenlendiğini düşündürebilir. Çalışmamızda hastalık şiddetiyle doğru orantılı olarak lökositlerde MRP1 gen anlatım düzeylerinin artması, MRP1'in alerjik astımın patolojisinde bir rolü olabileceğini düşündürebilir. Astımda inflamasyonu tetikleyen sebeplerden biri de lökosit ve trombosit aktivasyonları olduğu ve özellikle salgıladıkları maddelerle dolaşımdaki ve solunum yollarındaki hücreleri aktive ederek inflamasyona yol açtıkları bilinmektedir. Ancak trombosit ve lökositlerin membranlarında mevcut MRP-1'in trombosit-lökosit etkileşimindeki rolü halen açık değildir. Aktive trombositlerin belirlenmesinde özgül bir yöntem olarak kabul edilen trombosit lökosit agregatları, trombosit lökosit agregatlarında intrastoplazmik MRP1 protein düzeyleri, trombositlerde MRP1 protein miktarları akan hücre ölçer ile incelenerek böyle bir ilişkinin varlığı değerlendirildi. Aktif trombositlerin belirteci olan CD42b %fluoresans oranı astım hastalarında ve hafif intermitant astımda kontrol grubundan anlamlı olarak daha yüksek bulundu. Astımda trombositlerdeki GpIb reseptörünün diğer aktivasyon belirteçlerine göre kontrolden daha yüksek olarak tespit edilmesi; trombositin; astımın patolojisine GpIb reseptörü aracılığıyla endotele adezyonu arttırarak katıldığını düşündürebilir. Hafif intermitant astımda MRP1 özgül antikoru ile tespit edilen intrastoplazmikMRP1 protein miktarı CD45CD42b antikorları ile monosit-trombosit, lenfosit-trombosit ve granülosit-trombosit agregatlarında kontrolden istatistiksel olarak yüksek bulundu. Alerjik astım hastalarının trombosit lökosit agregatlarında intrastoplazmik MRP1protein miktarlarının arttığını gösteren bulgumuz ilk defa bir hastalık grubunda böyle bir değişimi göstermesi açısından önem teşkil etmektedir. CumOH ile indüklediğimiz oksidatif stres ve probenecid ile yaptığımız MRP1 inhibisyonun etkilerini in vitro trombosit aktivasyonuna olan etkisini ortaya koymak amacıyla trombositleri ADP ile uyararak agregasyonu takip ettik. Astım ve kontrol gruplarının her ikisinde de MRP1 inhibisyonu ve CumOH uygulaması sonucu kontrole göre agregasyonda anlamlı azalma kaydettik. MRP1 inhibisyonu ile trombosit lökosit etkileşiminin önlenmesi ve hücre aktivasyonlarının azaltılması bulgumuz, astım hastalarına yönelik tedavi protokollerine yeni bir bakış açısı kazandırabilir.

Abstract:
The association between LTC4, a lipid mediator playing a role in asthma and MRP1, transporter of this molecule remains still unexplained in asthmatic patients. We can observe changes in the MRP1 expression and thus in the exportation rate in the asthmatic patients whose LTC4levels are high. MRP1, a trans-membrane protein known for its function in exporting LTC4, a major agent in asthma pathology, from thrombocytes and leukocytes and its interference in the compensation mechanism against oxidative stress. In the first part of our study, we have searched for a response to the this question through the PCR quantitive analysis explaining MRP1 expression in leukocytes, CFDA and Calcein-AM probes applied in flow cytometry to define its function and ELISA test for LTC4 quantity/number. Our findings show that in asthma, MRP1 function and the levels of MRP1 expression are high. The LTC4 levels found unvarying in these patients may lead us to think that in fact, MRP1, as a compensator mechanism, can be regulated increasingly in order to hold LTC4 at a certain level. In our study, we may also think that the augmentation of MRP1 expression in leukocytes in parallel to the severity of the illness, indicates that MRP1 may play a role in the pathology of allergic asthma.It is also known that one of the major agents activating inflammation in asthma is the thrombocytes and leukocytes and with the substances they released, they can cause inflammation through the activation of cells found in the circulation and respiratory ways. However, the role of MRP1 present in the membranes of thrombocytes and leukocytes still remains unclear in the thrombocyte-leukocyte association. We have evaluated the existence of possible association through a flow cytometry analysing the thrombocyte-leukocyte aggregates considered as an effective method to define activated thrombocystes, the intrastoplasmic MRP1 protein levels of these aggregates in the cells. The CD42b fluorescent percentage, a major indicator of active thrombocyte, has been found significantly higher in the patients with asthma than the group experiencing mild intermittent asthma. Having found out that in the course of asthma, GpIb receptor in thrombocytes is higher than the controls regarding the other activation indicators, we may consider that thrombocytes contribute to asthma pathology by increasing endothelial adhesion over GpIb receptor. While the amount of intrastoplasmic MRP1 protein detected with MRP1 antibody in mild intermittent asthma, is found statistically higher than the controls in the aggregates of CD45CD42b antibodies, monocyte-thrombocyte, lenfocyte-thrombocyte and granuleocyte-thrombocyte. Our finding unveils that the increase of intrastoplasmic MRP1 proteins in the thrombocytes-leukocyte aggregates of the patients with allergic asthma, carries an importance regarding the change appeared first time in a group of patients. We have observed the course of the aggregation stimulated by ADP thrombocytes in order to demonstrate what impacts the oxidative stress induced with CumOH and the MRP1 inhibition carried out with probenecid can have on the in-vitro thrombocyte activation. We have recorded a significant decrease in the aggregation as a result of MRP1 inhibition and CumOH application in both groups of control and asthma. With the prevention of influence developed between MRP1 inhibition and thrombocyte-leukocyte and the diminution of cell activations, our finding may add a new dimension to the treatment protocols dedicated to asthma patients.