Burun spreylerinde prezervatif olarak kullanılan benzalkonyum klorid ve potasyum sorbatın sıçan burun mukozası üzerine etkilerinin araştırılması
The Side effects of preservatives benzalconium chloride and potassium sorbate contained in nasal spreys on rat nasal mucosa
Yazar: MUSTAFA ERKAN LEBE
Danışman: Y.DOÇ.DR. BÜLENT ŞERBETÇİOĞLU
Dokuz Eylül Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Kulak Burun Boğaz Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2000
Konu: Kulak Burun ve Boğaz = Otorhinolaryngology (Ear-Nose-Throat)

Özet:
ÖZET AMAÇ Bu çalışmada buruna uygulanan topikal formulasyonlarda yaygın olarak kullanılan benzalkonyum klorid ve potasyum sorbatın uzun ve kısa süreli uygulanmaları sonrasında burun içindeki solunum yolu epiteli üzerinde meydana getirebileceği değişiklikleri ışık mikroskobu, transmisyon elektron mikroskobu ve scanning elektron mikroskobu düzeyinde inceleyerek varsa toksik etkilerinin ortaya konması amaçlanmıştır. GEREÇ VE YÖNTEM Benzalkonyum klorid ve potasyum sorbatın uzun ve kısa dönem kullaımlannda olası zararlı etkilerini göstermek için yapılan bu in vivo çalışmada aynı laboratuarda üretilmiş ve aynı jenerasyondan ağırlıkları 350-450 gr arasında olan 56 sıçan beş gruba bölünerek incelendi. l.Grup : Günde iki kez her bir burun deliğine 7 mL olmak üzere mikropipet yardımıyla saat 08:00 ve 20:00 da 4 hafta boyunca intranazal % 0,9 NaCl solüsyonu uygulandı. 2. Grup : Günde iki kez her bir burun deliğine 7 mL olmak üzere mikropipet yardımıyla saat 08:00 ve 20:00 da 1 hafta boyunca intranazal % 0,01 oranında benzalkonyum klorid solüsyonu uygulandı. 3. Grup : Günde iki kez her bir burun deliğine 7 mL olmak üzere mikropipet yardımıyla saat 08:00 ve 20:00 da 1 hafta boyunca intranazal % 0,12 oranında potasyum sorbat solüsyonu uygulandı. 4. Grup : Günde iki kez her bir burun deliğine 7 mL olmak üzere mikropipet yardımıyla saat 08:00 ve 20:00 da 4 hafta boyunca intranazal % 0,01 oranında benzalkonyum klorid solüsyonu uygulandı. 5. Grup : Günde iki kez her bir burun deliğine 7 mL olmak üzere mikropipet yardımıyla saat 08:00 ve 20:00 da 4 hafta boyunca intranazal % 0,12 oranında potasyum sorbat solüsyonu uygulandı. Bir ve dört haftalık uygulamalar sonrasında sıçanlar dekapite edilerek kafa derileri soyuldu ve burun içindeki mukozaya dokunmamaya son derece özen gösterilerek burun boşluğu açığa çıkarıldı. Tüm sıçanlardan standart olarak septumun 1/3 orta ve alt bölgesinden alman örnekler elektron mikroskobu ve ışık mikroskobu düzeyinde incelenmek üzere hazırlandı. 55Işık mikroskobu düzeyinde incelenecek septal mukoza örneğinden hazırlanan preparatlar hematoksilen eozin ile boyandıktan sonra aynı patolog tarafından silia kaybı, inflamatuar hücre infiltrasyonu, skuamöz metaplazi, intraepidermal gland gelişimi, vasküler yapılarda artmanm olup olmaması ve subepiteüal ödem yönünden incelendi (31). Scanning elektron mikroskopik değerlendirmede Zeiss DSM 982 Gemini elektron mikroskobu kullanıldı. Yapılan yüzey taraması ve değerlendirmenin yanı sıra Agfa Pan AXP 25 marka film kullanılarak kayda değer histopatolojik bulguların fotoğrafı çekildi. Transmisyon elektron mikroskobik çalışmada ise Philips CM 12 transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak ultrastrüktürel değişiklikler incelendi ve Kodak SO 163 marka film kullanılarak kayda değer bulgular fotoğraflandı. Işık mikroskobu ile elde edilen bulgular istatistiksel olarak analiz edildi ve sonuçlar elektron mikroskobu ile elde edilen bulgular ile birlikte değerlendirildi. İstatistiksel analizlerde anlamlılık derecesi olarak a = 0.05 kabul edildi. İntraepitelial gland gelişimi ve skuamöz metaplazi gelişimi gruplar arasında -fi ile değerlendirildi. Ayrıca gruplar arasında ödem, enflamatuar hücre infiltrasyonu ve damarsal yapılarda artış skorları kontrol grubu ile Kruskal Wallis metoduyla test edildi. Test sonucunda farkların istatistiksel olarak anlamlı bulunması üzerine gruplar yukarıdaki değişkenler bakımından ikili analizlerinde Bonferroni düzeltmesi yapılarak (p = 0.0063) Mann-Whitney U testine tabii tutuldu. Aynca uzun dönem prezervatif madde uygulanan iki grup arasında Fisher's Exact Test kullanıldı. BULGULAR Prezervatif madde uygulanan tüm grublarda dikkati çeken ilk bulgu ödemdi. Ödem gelişimi kontrol grubu ile karşılaştırıldığında tüm gruplar için istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p= 0.0001). Ancak prezervatif madde uygulanan tüm gruplar arasında ödem yönünden istatistiksel bir anlamlılık saptanmadı (p > 0.0063). Diğer önemli bulgu nazal mukozadaki enflamatuar hücre infiltrasyonuydu. Prezervatif madde uygulanan gruplar ile kontrol grubu karşılaştırıldığında farkın anlamlı olduğu saptandı (p < 0.05). 1 hafta süreyle preservatif madde kullanılan gruplar ve 4 hafta süreyle prezervatif kullanılan gruplar kendi aralarında karşılaştırıldığında gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olmadığı saptandı. Ancak 1 hafta ve 4 hafta benzalkonyum klorid uygulanan gruplar ve 1 hafta ve 4 hafta potasyum sorbat uygulanan gruplar kendi arasında karşılaştırıldığında istatistiksel anlamlılık saptandı (p<0.0063). 56Yapılan ışık mikroskobik incelemede dikkat çeken bir bulgu da prezervatif uygulanan gruplarda nazal mukozada vasküler yapılardaki artışdı. Prezervatif madde uygulanan gruplar kontrol grubu ile karşılaştırıldıklarında aradaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0.05). Gruplar kendi aralarında karşılaştırıldıklarında; tıpkı enflamatuar hücre infiltrasyonunda olduğu gibi prezervatif maddelerin birbirinden 1 haftalık ve 4 haftalık kullanımları sonucunda nazal mukozada meydana getirdikleri damarsal yapılardaki değişikliklerin istatistiksel olarak farklı olmadığı ancak her iki prezervatifin de 4 hafta kullanımı ile 1 hafta kullanılmaları sonucu oluşan vasküler değişiklikler ve derecelerinin istatistiksel olarak anlamlı olduğu saptandı (p<0.0063). İncelemelerde kaydedilen diğer önemli bulgu nazal mukozada skuamöz metaplazi ve intraepitelial gland gelişimiydi. İntraepitelial gland gelişimi skuamöz metaplazinin bir varyasyonu olarak kabul edilebilir. 1 hafta benzalkonyum klorid uygulanan grupta bir olguda izlenen intraepitelial gland gelişimi dışında skuamöz metaplazi ve intraepitelial gland gelişimi yalnızca 4 hafta prezervatif madde uygulanan gruplarda tespit edildi. Yapılan değerlendirmede kısa ve uzun dönem prezervatif uygulamaları arasında skuamöz metaplazi ve intraepitelial gland gelişimi açısmdan farklar istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0.05). 4 haftalık prezervatif uygulanan iki grup arasmda ayrıca yapılan değerlendirmede benzalkonyum klorid ve potasyum sorbat kullanılan gruplar arasmda bu parametreler bakımından farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı saptandı (p>0.05). Transmisyon elektron mikroskobu ile yapılan değerlendirmede nazal respiratuar epitelde hücre düzeyinde ultrastrüktürel olarak nükleus, granüllü endoplazmik retikulum gibi organellerde küçük farklılıklar izlense de bunlar örnekler arasındaki kabul edilebilir küçük farklılıklar olarak değerlendirildi. Gerek potasyum sorbat gerekse benzalkonyum kloridin 1 hafta boyunca uygulandığı gruplarda ultrastrüktürel olarak göze çarpan bir patolojiye rastlanmadı. Ancak özellikle benzalkonyum klorid uygulanan grupta daha fazla olmak üzere her iki prezervatifin de 4 hafta uygulandığı gruplarda benzer şekilde hücrelerde değişik boyutlarda çok sayıda sitoplazmik vakuol ve bazı hücrelerde silialı epitelin hemen altındaki yüzeyel sitoplazmik alanda mitokondrilerde şişme dikkat çekti. Scaring elektron mikroskobu ile yapılan değerlendirmede 1 hafta süreyle benzalkonyum klorid uygulanan grupta burun mukozasmda birkaç örnekte küçük alanlar halinde silia kaybı izlenmekle beraber genelde doku bütünlüğünün korunmuş olduğu gözlendi. Bu grupta göze çarpan en önemli bulgu silialardaki kümeleşme eğilimiydi. Bu kümeleşmeye 57rağmen silialann koordine bir şekilde aynı yöne eğilim gösterdikleri izlendi. 1 hafta potasyum sorbat uygulanan grupta ise örneklerde hiçbir alanda silia kaybı gözlenmedi. Bu grupta silialardaki kümeleşme eğiliminin daha belirgin olduğu dikkat çekti. 4 hafta boyunca benzalkonyum klorid uygulanan grupta silia kaybı izlenen alanlar daha sık karşımıza çıktı ve daha geniş olarak izlendi. Bu alanların ışık mikroskobu ile yapılan incelemede belirtilen skuamöz metaplazi gelişmiş alanlar olduğu düşünüldü. Nadiren de olsa bazı alanlarda goblet hücrelerinin burun boşluğuna bakan duvarlarının patlayarak canlılığını yitirdiği gözlendi. Doku geneline bakıldığında silialı epitelin mevcudiyetini sürdürdüğü ancak silialarda yoğun kümeleşmeler yer yer silialar arasında yapışıklıklar izlendi. Bu değişikliklere rağmen silialar yine koordine bir şekilde aynı yöne eğilim göstermekteydi. 4 hafta süreyle potasyum sorbat uygulanan grupta da benzer şekilde silia kaybı gösteren alanlar, silialarda yoğun kümeleşme ve yapışıklıklar izlendi. Yine silialar koordine bir şekilde aynı yöne eğilim gösteriyordu. Bu grupta denature goblet hücre grupları hiç karşımıza çıkmadı. SONUÇ Gerek benzalkonyum klorid gerekse de potasyum sorbat solunum yolu epiteli için zararlı etkilere sahiptir. Burun içi solunum yolu epiteli in vivo ortamda bu maddelerin zararlı etkilerine karşı yukarıda saydığımız etmenlerden dolayı daha dirençlidir. Bizim araştırmamız 1 ve 4 haftalık uygulamalar sonrasında yaptığımız incelemelerde bütün direnç mekanizmalarına karşın patolojik değişmelerin geliştiğini ve uzamış uygulamalarda bu zararlı etkilerin daha da belirginleştiğini gösterdi. 58

Abstract: