Arpada gen aktarım frekansının artırılmasına yönelik çalışmalar
Studies for enhancing the gene transfer efficiency in barley
Yazar: ÖZGE KARAKAŞ
Danışman: Y.DOÇ.DR. FİLİZ GÜREL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2005
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Arpa (Hordeum vulgare L.) dünyada tahillar arasinda dördüncü sirada, Türkiye'de isebugdaydan sonra ikinci sirada yer almaktadir. Üretilen arpanin büyük bir kismi hayvanyemi kalani maltlik ve insan gidalarinda kullanilmaktadir. Dogrudan (elektroporasyon)ve dolayli (Agrobacterium araciligiyla) gen aktarim tekniklerinin uygulandigi bu tezçalismasinda amaç bazi yerli arpa varyetelerinde transformasyon frekansini artirmaktir.Çalismada ilk olarak arpa (Hordeum vulgare L.)'nin üç ticari varyetesinde (Bornova92, Tokak ve Zafer 160) doku elektroporasyonunda kullanilmak üzere rejenere olabilenkallus olusturma yetenekleri incelendi. Bu amaçla, MS ve N6 tuzlarini içerenbesiyerlerinde 2,4-diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) ve dicamba (3,6-dikloro-o-anisikasit)'nin etkilerine bakildi. 4 mg/L dicamba içeren MS besiyeri, aktif bölünenrejenerasyona egilimli kallus olusumunda en iyi sonucu verdi(Bornova 92 % 98.33(Â± 2.04)). Farkli büyüme düzenleyicilerinin kullanildigi rejenerasyon besiyerleriarasinda her üç varyetede de 0.5mg/L zeatin ribozid ve dicamba, kalluslarda somatikembriyogenez, sürgün ve kök gelisimini tesvik etti. Ancak, elektropore edilenkalluslarin canliliginin indirge nmesi bu eksplantta daha ileri çalismalarinyapilabilmesini sinirladi.Olgun embriyolarla yapilan elektroporasyon çalismalarinda küçük boyuttaki vektörkullanimi (5.2 kb), daha büyük boyuttaki vektöre (12.7 kb) oranla geçici gen anlatiminiartirdi. Tokak'da 12.7 kb boyutundaki plazmid kullanildiginda embriyolarin%69.16'sinda GUS aktivitesi gözlenirken, 5.2 kb boyutundaki vektörde bu oran%81.66 oldu. Transformasyon verimliligi açisindan varyeteler karsilastirildiginda enfazla GUS gen anlatimi Tokak embriyolarinda gözlendi.Agrobacterium tumefaciens ile gen aktariminin frekansini artirmak için embriyolardaçesitli uygulamalar yapildi. Bitki ve bakteri arasindaki etkilesimi artirmak amaciylaasetosiringon kullanimina ek olarak, vakum infiltrasyonu, enzim ve elektroporasyonlayaralama islemleri yapildi. Tüm uygulamalarda en yüksek GUS aktivitesi degerlerivakum (400mmHg) uygulanan Bornova 92 embriyolarinda elde edildi(%66.66(Â±1.5)).Çalismada elektroporasyon ve Agrobacterium uygulanmis embriyolardan seçicibesiyerinde gelisen bitkilerin 20'sinde isaret genlerinin devamliligi arastirildi.Elektroporasyon sonucunda sadece bir bitkide GUS ve NPT II genlerinin varligisaptandi. Agrobacterium uygulamasi yapilan 10 bitkiden 3'ünde GUS-INT; 1'indeNPT II ve 4'ünde her iki gen (GUS-INT ve NPT II) tespit edildi. GenomikDNA'larinda enzim kesimi yapilarak NPT II probuyla melezleme yapilan 4 bitkiden2'si pozitif sonuç verdi.Bu tez çalismasiyla elde edilen bulgular arpaya gen aktarim frekansinin artirilmasindave dengeli transformasyon saglanmasinda önceki çalismalara katkilar saglayacaktir.

Abstract:
Barley (Hordeum vulgare L.) is the fourth crop among cereals in the world and secondafter wheat in Turkey. A large quantity of barley produced is utilized as animal feed andrest is used in malting and human food. The aim of this study in which direct(electroporation) and indirect (Agrobacterium- mediated) gene transfer methods wereapplied in several commercial barley varieties is enhancing the transformationfrequency.In the first part of the study, regenerable callus induction in three commercial barleyvarieties (Bornova 92, Tokak and Zafer 160) were examined in order to use those intissue electroporation. For this purpose, effects of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D) and dicamba (3,6-dichloro-o-anisic acid) were assessed in media including MSand N6 basal salts. Best result was obtained on MS with 4mg/L dicamba in vigorouslygrowing regenerable callus induction(Bornova 92 % 98.33(Â± 2.04)). Among theregeneration media including different growth factors for both three varieties, 0.5mg/Lof zeatin ribosid and dicamba induced somatic embryogenesis, shoot and root formationon calli. However, viability of calli electroporated has been reduced and this effectlimited further studies.In the electroporation studies with mature embryos, use of smaller size vector (5.2 kb)enhanced transient gene expression compared to bigger size vector (12.7 kb). GUSactivity was observed at 69.16% of embryos in the use of vector with the size of 12.7 kbwhereas this ratio was 81.66% in the use of vector with the size of 5.2 kb in Tokak. Incomparison of varieties in respect of transformation efficiency, higher GUS geneexpression was observed on the embryos of Tokak.Several treatments were applied in order to increase the gene transfer frequency withAgrobacterium tumefaciens. In the aim of enhancing the interaction between plant celland bacteria, vacuum infiltration, wounding with enzyme and electroporation wereapplied in addition of acetosiringone usage. In all applications, higher values of GUSactivity were obtained in vacuum (400mmHg) applied embryo s of Bornova 92(%66.66(Â±1.5)).In the study, 20 of plants developing on selective media which were derived from theembryos treated with electroporation and Agrobacterium were evaluated for the stabilityof marker genes. In the result of electroporation, presence of GUS and NPT II geneswere detected in single plant. In 10 plants treated with Agrobacterium, 3 were GUS-INTpositive; 1 was NPT II positive and 4 of them were both GUS-INT and NPT II positive.In the 4 plants of which genomic DNAs cut with enzymes and hibridized with NPT IIprob, 2 of them was positive.Results obtained in this study will contribute to previous works in respect of enhancingthe gene transfer frequency and stable transformation.