Aspergillus Flavipes'in indüklenebilen alfa-galaktozidaz izoenzimleri
Induced alpha-galactosidase isoenzymes of aspergillus flavipes
Yazar: NURTEN ÖZSOY
Danışman: PROF. DR. HAKAN BERKKAN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 1999
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Aspergillus flavus = Aspergillus flavus ; Galaktosidazlar = Galactosidases ; Glikozid hidrolaz = Glycoside hydrolases

Özet:
ÖZET Aspergillus f/av/pes in indüklenebilen a-galaktozidaz izoenzimleri Bu çalışmada, a-galaktozidaz, a-glukozidaz, p-glukozidaz ve a-amilazın Aspergillus f/av/pes'ten elde edilmeleri için optimal üreme koşulları araştırıldı. Bu nedenle besiyeri bileşiminin ve pH'sının, inkübasyon süresinin ve substrat konsantrasyonunun enzim aktivitesi üzerine etkisi incelendi. a-Glukozidaz ve p- glukozidaz indüksiyonu pepton (5g/L), KH2P04 (8g/L), (NH4)2HP04 (2g/L), MgS04-7H20 (0.5g/L) içeren ve pH'sı 6 olan besiyerine sırasıyla %1 oranında maltoz ve %0.4 oranında sellobioz; a-amilaz indüksiyonu pepton (5g/L), KH2PO4 (7g/L), (NH4)2HP04 (3g/L), MgS04.7H20 (0.5 g/L) içeren ve pH'sı 6,5 olan besiyerine %1 oranında nişasta; a-galaktozidaz indüksiyonu ise pepton (15g/L), KH2P04 (15g/L), MgSO^hfeO (5g/L) ve KCI (5g/L) içeren ve pH'sı 5 olan besiyerine %0.2 oranında melibioz ilavesi ile hazırlanan ortamlarda gerçekleştirildi ve a-glukozidazın 11. günde, p-glukozidazın 12. günde, a- amilazın 6. günde ve a-galaktozidazın 13. günde en yüksek enzim aktivitesini gösterdikleri saptandı. Aspergillus ffav/pes'ten a-galaktozidaz izoenzimlerinin elde edilmesi için besiyeri otoklavda steril edildi ve Aspergillus flavipes'm spor süspansiyonu (5x107spor/ml) ile inoküle edilerek 13 gün 30°C de inkübe edildi. Daha sonra santrifüj işlemiyle miselyum uzaklaştırıldı ve elde edilen supematant'tan hidroksilapatit kolon kromatografisi ile Fla, Flb, Fıc olarak adlandırılan a- 47galaktozidaz aktivitesi gösteren fraksiyonlar, daha sonra, adları geçen fraksiyonlara ayrı ayrı DEAE-selüloz kromatografisi uygulanmasıyla, sırasıyla Flla, Fllb, Fllcı ve Fllc2 olarak adlandırılan ve a-galaktozidaz aktivitesi gösteren dört fraksiyon elde edildi ve izoenzimlere ait bazı kinetik özellikler belirlendi. Flla fraksiyonundaki a-galaktozidazın en yüksek aktivitesini pH 4.5-5.0 arasında gösterdiği, optimum temperatürünün 48°C olduğu saptandı. 4- Nitrofenil-a-D-galaktopiranozide karşı gösterdiği en yüksek reaksiyon hızının ve Km değerinin sırasıyla 2.6 mM 4-nittrofenol/dak. ve 3. 16x1 0"3 M olduğu bulundu. a-Galaktozidaz aktivitesi gösteren Fllb fraksiyonu ile yapılan deneyler sonucunda, enzimin optimum pH'sının 4.5-5.0 arasında, optimum temperatürünün 50°C, 4-nitrofenil-a-D-galaktopiranozide karşı Km ve Vmax değerlerinin sırasıyla 4. 17x1 0"3 M ve 2.4 mM nitrofenol/dak. olduğu saptandı. Fllcı fraksiyonundaki a-galaktozidazın optimum pH'sının 4.4-4.8 arasında, optimum temperatürünün 45°C, 4-nitrofenil-a-D-galaktopiranozide karşı Km ve Vmax değerlerinin sırasıyla 1.9x1 0"3 M ve 11.5 mM nitrofenol/dak. olduğu saptandı. FIİC2 fraksiyonundaki a-galaktozidazın optimum pH'sının 4.5-5.0 arasında, optimum temperatürünün 45°C, 4-nitrofenil-a-D-galaktopiranozide karşı Km ve Vmax değerlerinin sırasıyla 1.7x1 0"3 M ve 1.2 mM nitrofenol/dak. olduğu bulundu. 48

Abstract:
SUMMARY Induced a-galactosidase isoenzymes of Aspergillus flavipes In the present study the effect of composition and pH of culture medium, incubation time and substrate concentration was examined so that optimum conditions for mycelial growth of Aspergillus flavipes and induction of a- galactosidase, a-glucosidase, (3-glucosidase and a-amylase from this fungus could be determined, then a-galactosidase was induced and some of its properties were studied. a-Glucosidase and p-glucosidase production were induced by addition of 1% maltose and 0.4% cellobiose, respectively to the medium consisted of peptone (5g/L), KH2P04 (8g/L), (NH4)2HP04 (2g/L), MgS04.7H20 (0.5g/L), at pH 6; a-amylase production was induced by addition of 1% starch to the medium consisted of peptone (5g/L), KH2PO4 (7g/L), (NH4)2HP04 (3g/L), MgSO^FfeO (0.5g/L), at pH 6,5 and a-galactosidase production was induced by addition of 0.2% melibiose to the medium consisted of peptone (15g/L), KH2P04 (15g/L), MgS04.7H20 (5g/L) ve KCI (5g/L) at pH 5. a-Glucosidase, p-glucosidase, a-amylase and a-galactosidase showed maximum activity at 11 th, 12 th, 6 th and 13 th days respectively. The culture medium prepared for induction of a-galactosidase from Aspergillus flavipes was autoclaved, inoculated with spores at concentration of 5x1 07 per ml and incubated at 30°C for 13 days. Culture medium was centrifuged and the supernatant was fractionated on hydroxylapatite column, which resulted in three protein fractions containing a-galactosidase activity, called Fla, Fib and FIc.These fractions were further purified by DEAE-cellulose 49 T.C.V®KSEKÖ?REFtMKSJBBHSJ DOKÜMANTASYON MEB&Echromatography, four a-galactosidase activities Flla, Fllb, Fllci and Fllc2 were separated, some kinetic properties of these isoenzymes were examined. It was determined that optimum pH of a-galactosidase in Flla fraction existed between pH 4.5-5.0 and optimum temperature at 48°C. Km and Vmax values for 4-nitrophenyl-a-D-galactopyranoside were found 3.16x10"^ and 2.6 mM nitrophenol/min., respectively. Experiments on the a-galactosidase of Fllb fraction showed that optimum pH of the enzyme was in the range 4.5-5.0 and optimum temperature at 50°C. Km and Vmax values for 4-nitrophenyl-a-D-galactopyranoside were found 4.1 7x1 0"3 M and 2.4 mM 4-nitrophenol/min., respectively. a-Galactosidase isoenzyme in Fllci fraction exhibited optimum pH between 4.4-4.8, optimum temperature at 45°C, Km and Vmax values 1.9x1ü"3 M and 11.5 mM 4-nitrophenol/min. respectively, if 4-nitrophenyl a-D- galactopyranoside is the substrate. It was found that a-galactosidase isoenzyme in FIİC2 fraction had optimum pH in the range 4.5 - 5.0, optimum temperature at 45°C, Km and Vmax values 1.7X10"3 M and 1.2 mM nitrophenol/min., respectively. 50