İnsan umblikal ven endotel hücresinde kalsitriol ve parikalsitolün oksidatif DNA hasarı ve onarımı üzerine etkilerinin incelenmesi
Investigation of calcitriol and paricalcitol effects on oxidative DNA damage and repair in human umbilical vein endothelial cells
Yazar: MERVE AKIŞ
Danışman: PROF. DR. GÜL HÜRAY İŞLEKEL
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: DNA = DNA ; DNA hasarı = DNA damage ; DNA onarımı = DNA repair ; Endotelinler = Endothelins ; Endotelyum-vasküler = Endothelium-vascular ; Kalsitonin = Calcitonin ; Kalsitriol = Calcitriol ; Oksidanlar = Oxidants ; Umbilikal venler = Umbilical veins ; Vitamin D = Vitamin D

Özet:
Memeli hücresinde, çeşitli endojen ve ekzojen ajanlar ile ortaya çıkan oksidatif stres diğer hücresel makromoleküller yanı sıra DNA yapısında da hasara yol açabilir. Oluşan DNA hasarı onarılmadığı takdirde, çeşitli mutasyonlara ve genomik kararsızlığa neden olur. Oksidatif stres ile ilişkili kronik hastalıkların gelişiminde D vitamini eksikliğinin önemli bir rolü olduğu düşünülmektedir. Aktif D vitamini kalsitriolün, bilinen klasik etkilerinin yanı sıra, son zamanlarda antioksidan, hücre büyümesi ve farklılaşması gibi klasik olmayan etkileri bildirilmiştir. Ancak, kalsitriolün supra-fizyolojik dozlarda gösterdiği hiperkalsemik etki nedeniyle klasik endikasyonu dışında klinik kullanımı sınırlıdır. Sentetik bir D vitamini analoğu olan parikalsitol, kalsitriole benzer fizyolojik özelliklere sahip olup, daha az hiperkalsemik etki göstermektedir. Kalsitriol ve parikalsitol, hücre içindeki etkilerinin çoğunu D vitamini reseptörü (VDR) aracılığıyla gerçekleştirir. D vitamini ve oksidatif DNA hasarı arasındaki ilişki, D vitamini eksikliğinin yüksek prevalansı ve genomik kararsızlığın hayati önemi nedeniyle oldukça önemlidir. Bu çalışmanın amacı, insan umblikal ven endotel hücresinde oluşturulan hidrojen peroksit (H2O2) aracılı oksidatif stres modelinde farklı dozlardaki kalsitriol ve parikalsitolün reaktif oksijen türleri ve hasarlı DNA nükleozidlerinin oluşumu ve DNA onarım enzimi APE1 ekspresyonu üzerine olası etkilerinin incelenmesi; bu olası etkilerde VDR'nin rolünün araştırılmasıdır. HUVE hücreleri, 24 saat fizyolojik (0.1 nM) ve supra-fizyolojik (10 nM ve 100 nM) dozlardaki kalsitriol ve parikalsitol ile muamele edildikten sonra yarım saat 300 µM H2O2'e maruz bırakıldı. VDR'nin rolünü değerlendirmek amacıyla, deneyler 100 nM ZK159222 antagonisti varlığında tekrarlandı. ROT oluşumu diklorofluorescein diasetat (DCFH-DA) probu kullanılarak fluorimetrik olarak değerlendirildi. Hasarlı DNA nükleozidlerinin (8-OH-dG, R-cdA  ve S-cdA) düzeyleri sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometre ile ölçüldü. DNA onarım enzimi APE1 ve VDR'nin mRNA ekspresyonları real-time qPCR yöntemi ile belirlendi. Fluorimetrik ROT ölçüm sonuçlarına göre, kalsitriol ve parikalsitolün çalışılan tüm dozlarında ROT düzeylerini anlamlı olarak azalttığı belirlendi. Tandem kütle spektrometrik yöntem ile hasarlı DNA nükleozid düzeylerinin ölçümünde, hem kalsitriol hem de parikalsitol uygulaması ile R-cdA, S-cdA ve 8-OH-dG düzeylerinin anlamlı olarak azaldığı gözlemlendi; bu etki özellikle supra-fizyolojik dozlarda daha belirgindi. Parikalsitol, ROT oluşumunda ve hasarlı nükleozid S-cdA düzeyinin azalmasında doza bağlı bir etki gösterdi. Kalsitriol ve parikalsitolün bu yararlı etkileri ZK159222 antagonisti varlığında ortadan kalktı. mRNA ekspresyon çalışmaları sonucunda, kalsitriol ve parikalsitolün APE1 mRNA ekspresyonu üzerine etkisi bulunamazken, kalsitriolün fizyolojik dozunun sadece H2O2 uygulanan gruba göre VDR mRNA ekspresyonunu arttırdığı belirlendi, ancak diğer dozlarda bu etki görülmedi. Tez çalışmasının tüm bulguları değerlendirildiğinde, sonuç olarak; farklı dozlardaki kalsitriol ve parikalsitolün, insan umblikal ven endotel hücresini H2O2 aracılı oksidatif stresten koruyabileceği, parikalsitolün oksidatif hasara karşı kalsitriolden daha etkili olduğu, kalsitriol ve parikalsitolün bu yararlı etkilerinin VDR aracılığı ile gerçekleştiği gösterilmiştir. Bulgularımızın oksidatif DNA hasarı - D vitamini ilişkisini araştıran gelecek çalışmalara ışık tutacağı ve oksidatif stres ile ilişkili hastalıkların önlenmesinde ve tedavisinde uygulanacak terapötik yaklaşımlar için temel oluşturacağı düşüncesindeyiz.

Abstract:
Increasing levels of oxidative stress caused by endogenous and exogenous agents may lead to DNA damage, besides other macromolecules in the living cells. In case of unrepaired DNA damage, a variety of mutations and genomic instability might occur. Vitamin D deficiency is thought to play a role in the development of chronic diseases associated with oxidative damage. Active vitamin D calcitriol, besides its known classic effects, is reported recently to have non-classical effects such as antioxidant, regulation of cell growth and differentiation, etc. However, calcitriol has hypercalcemic effects at supra-physiological doses. Paricalcitol, a synthetic vitamin D analog, has physiological properties similar to calcitriol, but shows less hypercalcemic effects. Calcitriol and paricalcitol exerts most of their actions via binding to vitamin D receptor (VDR). The relation between vitamin D and oxidative DNA damage is noteworthy due to the high prevalence of vitamin deficiency and importance of genomic instability. The aim of this study is: to investigate the dose-dependent effects of calcitriol and paricalcitol on the formation of ROS, levels of oxidatively induced DNA damage and expressions of DNA repair enzyme APE1 and VDR in a model of hydrogen peroxide (H2O2)-generated oxidative stress in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). HUVECs were pretreated for 24 h with physiologic (0.1 nM) and supra-physiologic (10 nM and 100 nM) doses of calcitriol and paricalcitol, before exposure to H2O2 (300 µM) for half an hour. Also, to evaluate the role of VDR, experiments were repeated in the presence of 100 nM ZK159222 antagonist. The generation of ROS was assessed fluorometrically using the probe dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA). Damaged DNA nucleosides (8-OH-dG, R-cdA and S-cdA) were measurement using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. mRNA expressions of DNA repair enzymes APE1 and VDR were measured by real-time qPCR. Regarding fluorometric ROS measurement data, we have found that, all doses of calcitriol and paricalcitol significantly reduced ROS formation. Tandem mass spectrometric assay results revealed that, both calcitriol and paricalcitol pretreatments attenuated damaged DNA nucleosides 8-OH-dG, R-cdA and S-cdA in HUVECs, compared to only H2O2 treatment group, especially in supra-physiological doses. Effects of paricalcitol on ROS formation and reduction of damaged nucleoside S-cdA levels, were dose-dependent. These useful effects of calcitriol and paricalcitol were inhibited in the presence of ZK159222. For all doses of calcitriol and paricalcitol no effect on APE1 expression was observed. Physiological dose of calcitriol increased mRNA expression of VDR compared to only H2O2 treatment group, but not other doses. This study demonstrated that, calcitriol and paricalcitol protect from H2O2 generated oxidative stress in human umbilical vein endothelial cells, being paricalcitol more effective. These protective effects of calcitriol and paricalcitol in preventing oxidative DNA damage have been shown to be mediated by VDR. We think that our findings will enlighten further studies investigating oxidative DNA damage-vitamin D relationship and will also create a basis for the therapeutic approaches in the prevention and treatment of oxidative stress related diseases.