Yeni bir antimikrobiyal peptidin A549 hücre soyunda olası etkilerinin araştırılması
Investigation of possible effects of a new antimicrobial peptide on A549 cell line
Yazar: AYAN HUSEYNZADA
Danışman: PROF. DR. ŞEHNAZ BOLKENT ; DR. ÖĞR. ÜYESİ SERAP SANCAR
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Adenokarsinom = Adenocarcinoma ; Akciğer hastalıkları = Lung diseases ; Antimikrobiyal aktivite = Antimicrobial activity ; Hücre ölümü = Cell death ; Reaktif oksijen türleri = Reactive oxygen species ; Sitotoksisite = Cytotoxicity ; İlaçlar = Drugs

Özet:
Antimikrobiyal peptitler (AMP), böceklerden memelilere kadar doğuştan gelen bağışıklık sisteminde önemli roller oynayan moleküllerdir. Bu peptitlerin inflamasyon ve enfeksiyonlarda bağışıklık sistemini düzenlediği, lipopolisakkaritleri nötralize ettiği ve adaptif immün yanıtları düzenleyerek gram pozitif ve gram negatif bakterilere karşı etkili olduğu bilinmektedir. Akciğer kanseri dünya çapında %14'lük bir prevalansa sahip olup, küçük hücreli akciğer kanseri ve küçük hücreli olmayan akciğer kanseri olmak üzere iki alt tipi vardır. Son yıllarda, AMP'ler potansiyel antikanser ilaçlar olarak dikkat çekmektedir. Bu çalışmanın amacı, kriptonin'in A549 hücrelerinde olası antikanser etkilerini araştırmaktı. Bu AMP ilk olarak Cryptotympana dubia'nın hemolenfinde tanımlanmış olup, 24 amino asit uzunluğunda, %50 hidrofobik ve +8 net yüke sahiptir. Bu peptit, gram negatif ve gram pozitif bakteriler üzerinde de etkilidir ve antibakteriyel aktiviteye sahiptir. Kriptonin'in antikanser aktivitesini belirlemek için hücre kültüründe büyütülen A549 ve BEAS-2B hücreleri, bu AMP'ye farklı konsantrasyonlarda maruz bırakıldı. Peptit uygulaması sonrası hücre canlılığı, laktat dehidrogenaz salınımı (LDH), reaktif oksijen türleri (ROS) oluşumu ve morfolojik değişiklikler araştırıldı. Morfolojik değişiklikler invert mikroskop ve akridin oranj/etidyum bromür boyama yöntemi ile incelenmiştir. Kriptonin doza bağlı olarak hücre canlılığını azalttı ve LDH salınımını artırdı. Kriptonin ayrıca yüksek dozlarda ROS'u yükseltti ve şişmiş hücre morfolojisine neden oldu. 24 saat boyunca artan peptit konsantrasyonuna paralel olarak etidyum bromür ile boyanmış çekirdeklere sahip nekrotik hücre sayısında artış gözlendi. A549 hücrelerinde kaspaz-3, Bax, Atg5, Beclin1, LC3B, HMGB1 ekspresyonunu saptamak için kullanılan western blot analizi ile kriptonin'in A549 hücrelerinde bütün bu proteinleri doza bağlı anlamlı olarak azalttığını ve hücre ölümünün apoptoz ve otofaji ile değil, nekroz ile oluştuğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, kriptonin'in doksorubisin ile olası sinerjistik etkileri de araştırılmıştır. 24, 48 ve 72 saat doksorubisin uygulaması doza bağlı olarak hücre canlılığını azaltmıştır. Ayrıca 48 saat 1, 2.5, 5 ve 10 μg/ml kriptonin ile 1μM doksorubisin kombine uygulaması tek başına doksorubisin uygulamasına kıyasla hücre canlılığında anlamlı bir azalmaya yol açarken, 48 saat aynı düşük dozlarda kriptonin ile 5μM doksorubisin kombine uygulaması sonucu sinerjistik etki sadece 5μg/ml kriptonin ve 5μM doksorubisin kombinasyonu dozda gözlenmiştir. 48 saat 1 μM doksorubisin uygulanması ile aktif kaspaz 3 protein seviyesi kontrole göre anlamlı olarak artarken, LC3B protein seviyesi azalmıştır. 1 μM doksorubisin ile 5 μg/ml kriptonin uygulaması ise tek başına 1 μM doksorubisin uygulanmasına göre kaspaz-3 seviyesini anlamlı olarak azaltırken, LC3B seviyelerini anlamlı olarak artırmıştır. 5 μM doksorubisin ile 5 μg/ml kriptonin uygulamasının ise kontrole göre kaspaz-3 ve LC3B seviyelerini anlamlı olarak azaltırken, tek başına 5 μM doksorubisin uygulanmasına göre sadece LC3B seviyelerini anlamlı olarak azaltmıştır. Sonuç olarak, bu bulgular kriptonin'in akciğer kanseri hücreleri üzerinde antikanserojen bir etki gösterdiğini ve kemoterapötik etki potansiyeline sahip olduğunu, ayrıca kriptonin ve doksorubisin kombine uygulamasının ise sinerjistik antikanser etki göstererek daha düşük dozlarda etkili olduğunu göstermiştir.

Abstract:
Antimicrobial peptides (AMP) are molecules that play important roles in the innate immune system from insects to mammals. It is known that these peptides regulate the immune system in inflammation and infections, neutralize lipopolysaccharides, and are effective against gram positive and gram negative bacteria by regulating adaptive immune responses. Lung cancer has a prevalence of 14% worldwide and has two subtypes as small cell lung cancer (SCLC) and non-small cell lung cancer (NSCLC). In recent years, antimicrobial peptides have gained attention as potential anticancer drugs. The aim of this study was to investigate the possible anticancer effects of cryptonin in A549 cells. This AMP is firstly defined in hemolymph of Cicada, Cryptotympana dubia and has 24 amino acids long, 50% hydrophobicity and +8 net charge. This peptide is also effective on gram-negative and gram-positive bacteria and has antibacterial activity. In order to determine the anticancer activity of cryptonin, A549 cells grown in cell culture were exposed to this AMP at different concentrations. Cell viability, LDH release, ROS levels and morphological changes after peptide treatment were investigated. Morphological changes were examined by inverted microscope and acridine orange/ethidium bromide staining method. Cryptonin reduced cell viability and incresead LDH release in dose dependent manner. Cryptonin also rised the reactive oxygen species in high doses and led swollen cell morphology. Increased number of necrotic cells having nuclei stained with ethidium bromide was observed parallel to increasing peptide concentration for 24h. Western blot analysis used to detect the expression of Caspase-3, Bax, Atg5, Beclin1, LC3B, HMGB1 in A549 cells revealed that all these proteins were dose-dependently decreased in A549 cells by cryptonin, and cell death occurred by necrosis, not apoptosis and autophagy. The possible synergistic effects with doxorubicin were also investigated. Doxorubicin administration for 24, 48 and 72 hours decreased cell viability in a dose-dependent manner. In addition, the combined application of 1, 2.5, 5 and 10 μg/ml cryptonin and 1μM doxorubicin for 48 hours caused a significant decrease in cell viability compared to doxorubicin alone, while the synergistic effect as a result of the combined application of 5μM doxorubicin and cryptonin at the same low doses for 48 hours was only observed at the combined application of 5μg/ml cryptonin and 5μM doxorubicin. With the administration of 1 μM doxoribosin for 48 hours, the level of active caspase 3 protein increased significantly compared to the control, while the level of LC3B protein decreased. The combined application of 1 μM doxorubicin and 5 μg/ml cryptonin significantly decreased caspase-3 levels and significantly increased LC3B levels compared to the application of 1 μM doxorubicin alone. Application of 5 μM doxorubicin and 5 μg/ml cryptonin significantly decreased caspase-3 and LC3B levels compared to the control and LC3B levels compared to the application of 5 μM doxorubicin. In conclusion, these findings showed that cryptonin has an anticarcinogenic effect on lung cancer cells and has the potential for chemotherapeutic effects, also showed that the combined application of cryptonin and doxorubicin was effective at lower doses by showing a synergistic anticancer effect.