Farelerde in vitro embriyo kültürü ve embriyo transferinin fötal trakeya dokusunda bazal hücrelerin sayısı üzerine etkisi
Effect of in vitro mouse embryo culture and embryo transfer on the number of basal cells in fetal trachea
Yazar: GÖKSEL DOĞAN
Danışman: DOÇ. DR. LEVENT KARAGENÇ
Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Embriyo = Embryo ; Embriyo nakli = Embryo transfer ; Fareler = Mice ; Fertilizasyon-in vitro = Fertilization-in vitro ; Fetüs = Fetus ; Trakea = Trachea ; İn vitro = In vitro

Özet:
İnsan hekimliğinde çiftlerin bir yıl boyunca düzenli olarak ve korunmaksızın cinsel ilişkiye girmelerine karşın çocuk sahibi olamamaları olarak tanımlanan infertilite, tüm dünya genelinde toplumun %7'sini etkileyen önemli bir sağlık sorunudur. Günümüzde, infertilite tedavisinde başta in vitro fertilizasyon (tüp bebek), in vitro embriyo kültürü ve embriyo transferi olmak üzere çeşitli üremeye yardımcı tedavi (ÜYTE) yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar, infertilite tedavisi sonucunda dünyaya gelen bebeklerin normal bebeklere oranla  enfeksiyonlara ve astım gibi alerjik solunum yolu hastalıklarına daha duyarlı olduklarını göstermektedir. Buna karşın, optimum olmayan koşullarda gerçekleştirilen in vitro embriyo kültürünün fötal trakeya dokusunda bazal hücrelerin sayısı üzerine her hangi bir etkisinin olup olmadığı bilinmemektedir. Trakeyadan başlayarak akciğerlere kadar uzanan solunum yollarının yüzeyini örten epitel dokusu, sürekli olarak kendini yenilemektedir. Solunum sisteminin trakeyadan başlayarak bronşiyollere kadar uzanan kısmında bazal membran ile sıkı bir bağlantı içerisinde olan ve transkripsiyon faktörü transformasyon-ilişkili protein 63 (TRP63)'ü,  sitokeratin 5 ve 14 (KRT 5 ve KRT 14) faktörlerini eksprese etmeleri ile karakterize olan bazal hücreler, bu yenilenme sürecinde rol oynayan en önemli hücre popülasyonunun oluşturmaktadırlar. Bir kök hücre olarak işlev görerek kendilerini yenileme (self-renewal) yeteneğine sahip olan bazal hücreler bu işlevlerini, gerektiğinde Clara hücrelerine ve silli epitel hücrelere farklılaşabilme yetenekleri sayesinde gerçekleştirmektedirler. Sunulan tez çalışmasının amacı, fizyolojik olmayan atmosferik oksijen konsantrasyonunda gerçekleştirilen in vitro fare embriyo kültürü ve embriyo transferinin fötal trakeya dokusunda bazal hücrelerin sayısı üzerine herhangi bir etkisinin olup olmadığını test etmektir. Sunulan tez çalışmasında, bir adet kontrol grubu ve bir adet deney grubu olmak üzere toplam iki grup bulunmaktadır. Kontrol grubu, süperovulasyonu sağlamak amacıyla in vitro fertilizasyon çalışmalarında rutin olarak kullanılan PMSG ve hCG uygulaması yapılmamış olan 8-12 haftalık dişilerin, aynı yaştaki erkeklerle çiftleştirilmelerinden elde edilmiş olan fötuslardan oluşturulmuştur. Deney grubu ise, süperovulasyon uygulanan dişilerden hCG uygulamasından 22 saat sonra oviduktun ampulla kısmından toplanan döllenmiş yumurta hücrelerinin (zigot) atmosferik oksijen konsantrasyonunda 95 saat süreyle büyütülmesiyle elde edilen, dolayısıyla in vitro ortamda gelişen, blastosist aşamasındaki embriyoların yalancı gebe dişilere transferiyle elde edilmiş olan fötuslardan oluşturulmuştur. 	  Embriyo transferi yapılan Deney grubunda, embriyo gelişim oranları belirlenmiştir. Deney grubunu oluşturmak amacıyla, toplam 30 adet blastosist aşamasında bulunan embriyo, üç adet yalancı gebe dişiye transfer edilmiştir. Her iki grupta da, gebeliğin 18. gününde (18.5 d.p.c) servikal dislokasyonla ötenazi edilerek, gebe dişilerden izole edilen fötuslar uzaklaştırılarak, canlı ağırlıkları belirlenmiş ve bireysel olarak trakeya doku örnekleri alınmıştır. Her bir fötusa ait trakeya dokusunda, dokunun genel histolojik görünümünü belirlemek amacıyla üçlü boyama yöntemi uygulanmıştır. Dokuda bulunan bazal hücrelerin sayılarını, belirlemek amacıyla immunoflöresan ve immunohistokimya yöntemleri kullanılmıştır. İmmunohistokimya yöntemi uygulanan kesitlerde ayrıca epitel kalınlıkları ve lümen yüzey alanları da belirlenmiştir. 	Sunulan tez çalışmasından elde edilen bulgular, in vitro embriyo kültürü ve embriyo transferi ile elde edilen ve Deney grubunu oluşturan fötuslarda canlı ağırlığın önemli ölçüde azaldığını göstermektedir. Kontrol grubuna ait fötuslarda lumen yüzey alanının Deney grubuna ait fötuslardan önemli ölçüde yüksek olduğu, epitelyum kalınlığında ise iki grup arasında bir fark olmadığı belirlenmiştir.  Fötal canlı ağırlığın yanısıra, in vitro embriyo kültürü ve embriyo transferine bağlı olarak trakeya dokusunda bazal hücre popülasyonunun da etkilendiği belirlenmiştir. Kontrol grubu ile kıyaslandığında, düşük canlı ağırlığa sahip olan Deney grubunda bazal hücre sayısının önemli ölçüde artmış olması sunulan tez çalışmasından elde edilen en ilginç veri setlerinden birisini oluşturmaktadır. Elde edilen veriler, bu durumun vücut ağırlığı ve lümen yüzey alanından bağımsız olarak ortaya çıktığını göstermektedir.  Elde edilen bulgular doğrultusunda, Deney ve Kontrol grupları arasında bazal hücre sayıları açısından gözlemlenen farklılığın hücre proliferasyonu ve/veya apoptosis ya da bazal hücrelerin silli hücreler ile sekretorik hücrelere farklılaşması ile ilişkili olup olmadığının test edilmesi gerekmektedir. 

Anahtar kelimeler: Fötal trakeya, bazal hücre, p63, in vitro embriyo kültürü ve embriyo transferi

Abstract:
Infertility, defined as the failure to conceive after a year of regular intercourse without contraception, is an important health problem affecting about 7% of the world population.  Today, various assisted reproductive Technologies, including in vitro fertilization, embryo culture and embryo transfer, are commonly used in the treatment of infertility. Recent studies indicate that children born following infertility treatment are more susceptible to infections and allergic respiratory diseases like asthma when compared to naturally conceived children. However, there is no information in the literature concerning the effect of in vitro embryo culture performed under sub-optimal culture conditions on the number of basal cells in fetal tracheal tissue. Epithelial tissue covering the surface of the respiratory tract extending from the trachea to the lungs constantly renews itself. Basal cells that are present in the respiratory tract between the trachea and bronchioles and that are characterized by the expression of TRP63, cytokeratin 5 and 14 constitute the major cell population playing a role in this self-renewal process.  Basal cells that function as stem cells with the ability of self-renewal realize this function by their ability to differentiate to Clara cells as well as to ciliated epithelial cells when necessary. The aim of the present thesis is to test whether or not  in vitro embryo culture and embryo transfer performed under atmospheric concentrations of oxygen affects the number of tracheal basal cells in mouse fetuses.  The present thesis had two study groups in total: One Control group and one Experimental group. Control group consisted of fetuses obtained from the mating of 8-12 weeks-old female mice with male mice of the same age. Female mice in the Control group did not receive PMSG and hCG that are regularly used in in-vitro fertilization studies for super-ovulation and ovulation induction. Experimental group consisted of fetuses that will be generated through embryo transfer of  in vitro-developed blastocysts obtained with the culture of zygotes collected from the ampulla of the oviduct of super-ovulated female mice at 22 hours following the administration of hCG under atmospheric concentrations of oxygen for a period of 95 hours. Embryos scores will be determined in the Experimental group. In order to obtain fetuses for the Experimental group, a total of thirty blastocysts were transferred to three pseudo-pregnant mice. In both groups, pregnant mice were sacrificed on day 18 of gestation (18.5 d.p.c.) and fetuses were weighed individually and tracheal tissue samples were obtained.  Triple-staining procedure was used to reveal general histological structure of the trachea. Immunofluoressence and immunohistochemistry were used to reveal basal cells in the trachea. Surface area of the tracheal lumen along with the thickness of the epithelial layer was also measured in sections stained with immunohistochemistry. Data gathered from the present thesis revealed that fetuses in the Experimental group weighed significantly less compared to those of the Control group. The surface area of the tracheal lumen was significantly higher in the Control group, whereas the thickness of the epithelial layer did not differ between the two groups. The number of basal cells was significantly reduced in the Control group compared to the Experimental group, which constitute the most interesting finding of the present study. Evidence gathered from the present study suggests that this increase in the number of basal cells in the Experimental group is independent of the fetal weight and the surface area of the tracheal lumen.  Further experiments are warranted in the light of the evidence gathered in the present study to determine whether or not the difference observed between the two groups as for the number of basal cells is due to cell proliferation and/or apoptosis or due to the differentiation of basal cells to ciliated as well as to secretoric cells.	

Keywords: Fetal trachea, basal cell, p63, in vitro embryo culture and embryo transfer