Farklı habitatlardan izole edilen Actinomadura, Micromonospora, Nocardia ve Streptomyces suşlarının moleküler taksonomisi
Molecular taxonomy of Actinomadura, Micromonospora, Nocardia and Streptomyces strains isolated from different habitats
Yazar: ELİF ÇİL
Danışman: DOÇ. DR. KAMİL IŞIK
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Nocardia = Nocardia ; RAPD-PCR = RAPD-PCR ; Restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmi = Restriction fragment length polymorphisms ; Streptomyces = Streptomyces

Özet:
Bu çalışmada, değişik habitatlardan üç Actinomadura, yedi Micromonospora, sekiz Nocardia ve on yedi Streptomyces'i içeren toplamda otuz beş aktinomisetin moleküler taksonomisi, PCR-RAPD, PCR-RFLP metotları, 16S rRNA, gyrB ve rpoB gen bölgelerinin nükleotit dizi analizleriyle araştırılmıştır.Test organizmalarının DNA amplifikasyon parmak izleri (RAPD) M13f evrensel primeri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Elde edilen amplifikasyon ürünlerinin fragment uzunlukları 127 ve 2000 bç aralığında çeşitlilik göstermiştir.PCR amplifikasyonları yapılan test organizmalarının 16S rRNA gen bölgeleri ticari olarak temin edilen restriksiyon endonükleaz enzimleriyle kesilerek agaroz jelde görüntülendi. EcoRI, PstI ve HinP1I restriksiyon endonükleaz enzimleri amplifiye edilen 16S rRNA gen bölgesi ürünlerini keserken, NcoI restiriksiyon endonükleaz enziminde kesim gerçekleşmemiştir. EcoRI enzimi aynı sayıda ve eşit büyüklükte restriksiyon fragmentleri oluşturduğundan suşlar arasında herhangi bir farklılaşma oluşmamıştır.Tip örneklerinin NCBI, DDBJ ve EMBL gibi gen bankalarından elde edilen 16S rRNA nükleotit dizileri ile izolatların 16S rRNA nükleotit dizileri MEGA 4.1 programında hizalanmıştır. 16S rRNA gen bölgesi baz dizi analizi filogenetik dendogramları, least-squares, maximum-parsimony ve neighbour-joining algoritmaları ile Mega ve Phylip programlarında oluşturulmuştur.MLST analizleri; protein kodlayan iki gen olan rpoB ve gyrB gen bölgesi dizileri elde edilerek araştırılmıştır. Bu çalışmanın sonucuna göre, rpoB dizilerinden elde edilen filogenetik ağacın yapısı 16S rRNA dizisinden elde edilenle uyumlu olmasına rağmen, Micromonospora izolatlarını sınıflandırmak için kullanılan gyrB gen bölgesinin nükleotit dizisine dayalı metod, bu çalışmada uygulanan diğer moleküler tekniklerden daha kullanışı olduğu belirlenmiştir.Filogenetik analizler sonucu MD16 ve MD40 izolatlarının Streptomyces lusitanus NBRC 13464T ile, G12 ve G36 numaralı suşların Micromonospora lupini Lupac 14NT türü ile MD49 izolatının Actinomadura cremea subsp. cremea' JCM 3308T, M23 nolu izolatın da A. formosensis DSM 43997T ile yakın ilişkili olduklarını göstermiştir.Anahtar Kelimeler: Streptomyces, Nocardia, Micromonospora, Actinomadura, RFLP, RAPD, MLST, 16S rRNA

Abstract:
In this study, molecular taxonomy of the total thity five actinomycetes consisted of three Actinomadura, seven Micromonospora, eight Nocardia, seventeen Streptomyces isolates from different habitats, was examined using PCR-RAPD, PCR-RFLP methods, 16S rRNA, gyrB and rpoB gene regions sequencing analysis.DNA amplification fingerprints (RAPD) of the test organisms were evaluated using the universal primer M13f. The fragment lengths of amplification products varied between 127 and 2000 bp.PCR amplification of 16S rRNA genes from the strains were examined for RFLP profiles. PCR products were digested using commercially avaliable restriction endonuclease enzymes and imaged on agarose gels. EcoRI, PstI and HinP1I restriction endonucleases digested amplified 16S rRNA gene products, but no NcoI did. As the digesting EcoRI enzyme gave same number and size of RFLP restiriction fragments, there was no differentiation among strains.16S rRNA nucleotide sequences of type starins obtained from databanks such as NCBI, DDBJ and EMBL and nucleotide sequences of the isolates were aligned using the MEGA 4.1 program. Phylogenetic dendograms of 16S rRNA sequence analysis were made by MEGA and Phylip programes using the least-squares, maximum-parsimony and neighbour-joining algoritms.The MLST analysis was examined by sequencing two protein-encoding rpoB and gyrB genes. According to the result of these studies, although the topology of phylogenetic tree based on rpoB was similar to that of 16S rRNA, gyrB based method for classifying the Micromonospora starins was more useful than other technicques was already applied in this study.The results of phylogenetic analyses showed that isolates MD16 and MD40 were closely related to Streptomyces lusitanus NBRC 13464T, isolates G12 and G36 to Micromonospora lupini Lupac 14NT, isolate MD49 to Actinomadura cremea subsp. cremea? JCM 3308T and isolate M23 to A. formosensis DSM 43997T.Key Words: Streptomyces, Nocardia, Micromonospora, Actinomadura, RFLP, RAPD, MLST, 16S rRNA