Erken yaşta başlayan alzheimer hastalığı'nda TRPC1'in rolü
The role of TRPC1 on early-onset alzheimer's disease
Yazar: MİNE KOCABIYIK
Danışman: DOÇ. DR. YASEMİN ERAÇ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Nöroloji = Neurology
Dizin: Alzheimer hastalığı = Alzheimer disease ; Demans = Dementia ; Gen ifadesi = Gene expression ; Kalsiyum = Calcium ; Mutasyon = Mutation

Özet:
Tez çalışmasının amacı, Erken yaşta başlayan Alzheimer hastalığına (EBAH) neden olan presenilin-1 (PSEN1) mutasyonunun oluşturulduğu hücrelerde TRPC1 geninin aşırı eksprese edildiği koşullarda depo kontrollü kalsiyum girişinin (SOCE), SOCE ilişkili genlerin (TRPC1, TRPC6, STIM1 ve Orai1) ekspresyon düzeylerinin, Aβ protein seviyelerinin ve hücrelerin proliferasyon hızlarının kontrol grupları ile karşılaştırmalı olarak araştırılmasıdır.
Öncelikle çalışmamızda PSEN1 cDNA'sını içeren plazmid vektörde nokta mutasyonu (I213F) oluşturulmuştur. PSEN1 mutant ve mutant olmayan plazmidler SH-SY5Y insan nöroblastoma hücrelerine geçici ve stabil yöntemle transfekte edilmiştir. Mutant PSEN1 hücreler EBAH modeli olarak kabul edilmiş ve sonuçlar mutasyonu taşımayan kontrol hücreler ile karşılaştırılmıştır. Çalışmamızda aynı zamanda TRPC1 geninin etkilerini araştırmak amacıyla TRPC1 geninin ekspresyonunda artışa neden olan TRPC1 cDNA'sını taşıyan plazmid transfeksiyonu gerçekleştirilmiştir. Aβ düzeyleri ELISA yöntemi ile belirlenmiştir. Ayrıca western blot yöntemi ile de Aβ protein seviyeleri analiz edilmiştir. Ca+2 indikatörü Fura-2 ile yüklenmiş hücrelerde SOCE spektrofluorometre ile gerçek zamanlı olarak izlenmiştir. SOCE ilişkili genlerin (TRPC1, TRPC6, STIM1 ve Orai1) ekspresyon düzeyleri RT-qPCR ile analiz edilmiştir. Hücrelerin proliferasyon hızları gerçek zamanlı hücre analiz sistemi ile izlenmiştir.
Mutant PSEN1 (mtPSEN1) hücrelerde Aβ düzeyleri kontrol hücrelere göre istatistiksel olarak anlamlı derecede artmıştır. Mutant hücrelerde azalan SOCE, TRPC1 transfekte edilen hücrelerde kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı derecede artmaktadır. Mutant hücrelerde TRPC1 ekspresyon düzeyleri kontrole göre herhangi bir değişiklik göstermezken, TRPC6 seviyeleri anlamlı olmamakla birlikte azalmaktadır. mtPSEN1 hücrelerinde STIM1 ekspresyon seviyelerinde kontrol hücrelere göre herhangi bir değişiklik belirlenmemişken Orai1 düzeyleri azalmaktadır. TRPC1 aşırı eksprese eden mtPSEN1 hücrelerde ise TRPC6, STIM1 ve Orai1 mRNA ekspresyon düzeyleri mutant hücrelere benzer şekilde belirlenmiştir. Mutasyon ile artan Aβ protein seviyeleri mtPSEN1+TRPC1 hücrelerinde mutant hücrelere göre istatistiksel olarak anlamlı derecede azalmaktadır. mtPSEN1 ve TRPC1 aşırı ekspresyonuyla proliferasyon hızı azalmıştır. Plazmidlerin her ikisini de içeren hücrelerde proliferasyon hızı kontrol, mtPSEN1 ve TRPC1 hücrelerine göre istatistiksel olarak anlamlı derecede azalmaktadır.
PSEN1 mutasyonu sonucunda SOCE ve ilişkili proteinlerin ekspresyon düzeylerindeki değişim Alzheimer Hastalığı (AH)'nın patolojisinde bu proteinlerin ve aracılık ettikleri depo kontrollü kalsiyum girişinin rolü olabileceğini göstermektedir. Aynı zamanda TRPC1 proteininin ekspresyonundaki artışın Aβ protein düzeylerinde azalmaya neden olması bu proteinin terapötik bir hedef olabileceğini düşündürmüştür. Ancak kompleks bir patolojiye sahip AH'nin tedavisinde sadece Aβ düzeylerindeki azalmanın hastalığı geri çevirmediği de bilinmektedir. Bu nedenle SOCE sinyal yolağını aktive ya da inhibe eden ajanlar ile mekanizmayı aydınlatıcı ve tedavi edici etkilerinin araştırıldığı daha ileri in vitro ve in vivo çalışmaların yapılması gerekmektedir.

Abstract:
Aim of the thesis was to investigate the store-operated calcium entry (SOCE), expression levels of SOCE-associated genes (TRPC1, TRPC6, STIM1, Orai1), Aβ protein levels and proliferation rate on cells that have Early-Onset Alzheimer's Disease (EOAD)-associated presenilin-1 (PSEN1) mutation and overexpress TRPC1 in comparison with the control groups.
First of all, the point mutation (I213F) was generated in the plasmid vector containing PSEN1 cDNA. PSEN1 mutant and non-mutant plasmids were transfected into human neuroblastoma SH-SY5Y cells by a transient and stable method. Mutant PSEN1 (mtPSEN1) cells were accepted as EOAD model and results were compared with control cells. At the same time, TRPC1 cDNA containing overexpression plasmids were transfected to investigate the effects of TRPC1. Aβ levels were determined by ELISA method. Aβ protein levels were also analysed with western blot. SOCE was monitoring on cells that are loaded with Ca2+ indicator Fura-2 by sprectrofluorometry real-timely. SOCE-associated genes (TRPC1, TRPC6, STIM1 and Orai1) expression levels were determined with RT-qPCR. Proliferation rates of cells were monitoring with real-time cell analysis system (RTCA).
Aβ levels increase at mtPSEN1 cells compared to control cells statistically significant. SOCE that decreases at mtPSEN1 cells increases statistically significant at TRPC1 transfected cells compared to control cells. Although TRPC1 expression levels has no alteration compared to control cells, TRPC6 levels decreased statistically insignificant. While STIM1 expression levels  are similar with control cells, Orai1 levels decrease at mtPSEN1 cells. Expression levels of TRPC6, STIM1 and Orai1 genes at TRPC1 overexpress mutant cells are similar to mutant cells. Aβ levels, which increases with mutation, decrease statistically significant in mtPSEN1+TRPC1 cells compared to mutant cells. Reduced proliferation rate was observed with transfection of mtPSEN1 and TRPC1. There was a reduction at proliferation rate of  cells that have both of mtPSEN1 and TRPC1 plazmids (mtPSEN1+TRPC1).
Alterations of SOCE and SOCE-associated genes expression levels demonstrate that these proteins and their mediated SOCE may have a role on AD pathology. At the same time, reduction of Aβ levels with TRPC1 overexpression estimated that TRPC1 may be a new therapeutical target and contribute to the development of new drugs for Alzheimer disease. But reduction of Aβ levels could not treat the AD's complex pathology. As a consequence, further in vitro and in vivo experiments should be achieved with activatory/inhibitory agents of SOCE for illuminating of mechanism and therapeutic effects.