İnsülin ile indüklenen OUMS-27 hücrelerinde adamts, TIMP ve sinyal yolaklarının gen ifadesi ve protein profillerinin araştırılması
The investigation of gene expression and protein profiles of adamts, TIMP and signal pathways in OMS-27 cell lines induced by insulin
Yazar: SÜMEYYA AKYOL
Danışman: DOÇ. DR. HÜSEYİN ÖZYURT
Gaziosmanpaşa Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Diabetes mellitus = Diabetes mellitus ; Hücre dizisi = Cell line ; Kondrosarkom = Chondrosarcoma ; Metalloproteinazlar = Metalloproteinases ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Proteinler = Proteins ; İnsülin = Insulin

Özet:
Diyabet hastalarında görülen sık komplikasyonlardan; yaraların geç iyileşmesi, uzun kemiklerin kırılganlığa karşı direncinde azalma, kırık iyileşmesinde gecikme ve ayrıca diş implant ameliyatlarında ön kemik-hazırlama işlemlerinde yaşanan başarısızlıklar,önemli sorunlar olarak çözülmeyi beklemektedir. Ayrıca iyi kontrol edilmemiş tip 1 diyabetli çocuklarda iskelet büyüme ve gelişmesi ile puberteye adım atılması konularında problemler yaşanmaktadır. Böyle bir olumsuzluğa yüksek kan şekerinin mi yoksa bizzat insülin eksikliğinin/cevapsızlığının mı sebep olduğu henüz net olarak bilinmemektedir. Dolayısıyla konu hem in vitro hem de in vivo çalışmalar açısından bakirdir.
Bu çalışmada OUMS-27 kondrosarkom hücrelerinde insülin indüksiyonunun, kemik matriksinde iyileşme ve gelişmede söz sahibi olan ADAMTS protein/enzimleri ile bunların inhibitörü olan TIMP proteinleri ve ayrıca bunların ilişkili proteinleri kantitafif Real-time PCR (qRT-PCR) ve Western blot tekniği ile araştırılması hedeflendi.Bu amaçla OUMS-27 hücrelerine 11 gün süre ile insülin indüksiyonu (10μmol/mL) yapıldı. İlk grup kontrol olmak üzere 1., 3., 7. ve 11. günlerde hücreler harvest edilerek mRNA ve protein izolasyonu yapıldı. qRT-PCR ile mRNA düzeyleri, bundan hareketle cDNA düzeyleri ve ayrıca Western blot yöntemi ile protein düzeyleri belirlendi.
Yapılan analizlerin sonunda ADAMTS1, ADAMTS5, ADAMTS7 düzeylerinin hem mRNA hem de protein düzeyleri açısından bakıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığı; TIMP-3 düzeylerinin de yine anlamlı bir şekilde arttığı bulundu. OUMS-27 kondrosarkom hücrelerinde insülinin tetiklediği sinyal yolağının tespit edilmesi amacıyla yaptığımız deneylerin sonucunda, STAT-3 ve NFκB proteinlerinin bir saat sonunda yüksek oranda fosfatlanması nedeniyle bunların birisinin veya her ikisinin aday sinyal yolağı olabileceği değerlendirildi.
Diyabetli hastaların özellikle kıkırdak/kemik metabolizmasında görülen, kırık iyileşmelerindeki gecikme başta olmak üzere tespit bütün patolojiler ve zorluk insülin eksikliğinden kaynaklanıyor olabilir. Çünkü iyileşmede söz sahibi ADAMTS genlerinden bazıları insülin yokluğunda artmakta bu da kıkırdak matriksinin parçalanarak iyileşmeye zemin hazırlamasına izin vermemektedir. İnsülin takviyesinin ise bu negatif olayları geri çevireceği değerlendirilmektedir.

Abstract:
Delay in wound healing, decrease in long bones' resistance to fracture, delay infracture healing, and failure in pre-preparation of bone process for dentalimplant surgeries are among common complications in diabetic patients, which remain as challenging issues to be solved. Furthermore, children with poorly controlled type I diabetes are suffering from problems of skeletalgrowth and development, and entering puberty. It has not fully understood yet whether these caused by high blood sugar or directly by insulin deficiency/unresponsiveness. Thus, there is a strong need for both in vitro andin vivostudies.
For this purpose, we aimed to determine healing ofbone matrix, ADAMTSproteins/enzymes playing role in the process, TIMP proteins as inhibitors, and theirs' associated proteins quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) and Western blottechnique in OUMS-27 chondrosarcoma cells induced by insulin. OUMS-27 chondrosarcoma cells were induced by 10μmol/mL insulin for 11 days. The first group was untreated control group, while others were insulin-induced group for 1, 3, 7, and 11 days. After the induction periods, cells were harvested, and mRNA and protein extractions were performed. mRNA levels and cDNA levels were measured using qRT-PCR and individual protein levels were detected by Western blot technique.
ADAMTS1, 5, and 7 levels were found to be significantly decreased whereas TIMP3 levels were detected to be increased, in terms of both mRNA and protein itself. The results were statistically significant. Analyses regarding determination of signal pathway triggered by insulin in OUMS-27 chondrosarcoma cells revealed a high rate ofphosphorylation of STAT-3 and NFκBproteinsfor 60 min, which might indicate one or both of these as possible pathways.
Pathologies and disturbances regarding cartilage/bonemetabolism, delayed fracture healing in particular, of diabetes patients may result from insulin deficiency. Because ADAMTS genes that play role in healing process are increased in insulin deficiency, which consequently interrupts healing process by leading cartilagematrixdegradation. Insulin support is suggested to reverse these undesired negative processes.