İnvertaz enziminin afiniteye dayalı teknikler ile saflaştırılması
Purification of invertase enzyme by affinity techniques
Yazar: İLKE YÜCEKAN
Danışman: DOÇ. DR. SEÇİL ÖNAL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
İnvertazlar (ß-fruktofuranozidaz, E.C 3.2.1.26), (Sükraz), endüstriyel alanda özellikle gıda sanayinde pek çok uygulama alanına sahip enzimlerdir. Proteinler ve enzimlerin saflaştırılmasında kullanılan pek çok biyokimyasal izolasyon ve saflaştırma metodu mevcut olmasına rağmen son yıllarda afiniteye dayalı yeni tekniklerin (afinite çöktürmesi, afinite membranları, sulu ikili ve üçlü faz sistemleri gibi) özellikle enzimlerin saflaştırılmasında kullanılmaya başlanması oldukça dikkat çekicidir.Bu çalışmada, invertaz enzimi domatesten (Lycopersicon esculentum) ekstrakte edilerek PEG/Tuz sulu ikili faz sistemi (ATPS) ile ilk kez tarafımızdan saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Bu çalışmada sulu ikili faz sisteminin optimizasyonu ve enzim aktivitesine etki eden bazı parametrelerin etkisi incelenerek kararlılık testleri (termal, pH, depo) yapılmıştır. Enzim aktivitesi dinitrosalisilik asit (DNS) metodu ile, protein tayini ise Bradford metodu ile gerçekleştirilmiştir.% 15 PEG?3000, % 12 Na2SO4 ve % 5 KCl (pH 4.5, 25oC) kullanılarak hazırlanan sulu ikili-faz sisteminde invertaz enzimi PEG'ce zengin üst fazda toplanmıştır ve yaklaşık 6.7 kat saflaştırma elde edilmiştir. Ayrıca, son adımda uygulanan ultrafiltrasyon işlemi ile enzim homojenata kıyasla 31 kat saflaştırılmıştır. Enzimin molekül kütlesi SDS-PAGE ile yaklaşık 20 kDa olarak, optimum pH ve sıcaklığı ise sırasıyla 5.0 ve 50oC olarak belirlenmiştir. Enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 48 mM ve 31 U olarak belirlenmiştir. Polimer-Tuz tabanlı ATPS ile saflaştırılan domates invertazı geniş bir pH ve sıcaklık aralığında oldukça kararlı bir enzim preparatıdır. Geleneksel metodlara kıyasla, invertazın saflaştırılmasında kullanılan bu tek adımlı ekstraksiyon metodu basit, ekonomik ve etkili bir metod olup hazırlanan enzim preparatı sahip olduğu katalitik özellikleri bakımından gıda sanayinde kullanılabilecek uygun bir enzim preparatıdır.

Abstract:
Invertases (ß-fructofuranosidase, E.C 3.2.1.26), (Sucrase), have many applications in industrial area especially in food industry. In spite of many biochemical isolation and purification methods for purification of proteins and enzymes, new affinity techniques (affinity precipitation, affinity membrane, aqueous two phase and aqueous three phase systems) were begun to use in enzyme purification at last years.The tomato (Lycopersicon esculentum) invertase was purified by using an aqueous two-phase system (ATPS) composed of PEG / Salt for the first time and characterized. In this study, the partitioning behavior of tomato invertase in PEG / Salt aqueous two-phase systems was optimized and several parameters that effect enzymatic activity were investigated. Invertase activity and protein determination was performed by Dinitrosalicylic (DNS) method and Bradford method, respectively.In % 15 PEG?3000, % 12 Na2SO4 ve % 5 KCl (pH 4.5, 25oC) aqueous two-phase system invertase partitioned to the PEG-rich top phase and about 6.7 fold purification was achieved. Ultrafilration was carried out at the last step and 31 fold purification was achieved. The enzyme has apparent molecular mass of 20 kDa by SDS-PAGE and its optimum pH and temperature for sucrose hydrolysis were determined to be 5.0 and 50oC, respectively. The Km ve Vmax values for sucrose were 48 mM and 31 U, respectively. Polymer-Salt based ATPS purified tomato invertase showed very stable characteristic for large pH and temperature range. Compared to multi-step conventional down stream processing, ATPS is a single-step extraction process who has been recognized as a simple, economical and effective method. According to the catalytic properties this enzyme preparation can be used for industrial applications.