Kanser tedavisine yönelik antisens oligonükleotid yüklü polimerik nanopartikül tasarımı ve İn vitro karakterizasyonu
Design and In vitro characterization of antisense oligonucleotide loaded polymeric nanoparticles for cancer therapy
Yazar: PEZHMAN HOSSEİNİAN AHANGARNEZHAD
Danışman: DOÇ. DR. EYLEM GÜVEN ÖZTÜRK
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Genetik = Genetics ; Onkoloji = Oncology ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology
Dizin: Folik asit = Folic acid

Özet:
Antisens oligonükleotitler, plazmit DNA lar veya siRNA lar; enfeksiyonlardan kansere ve genetik rahatsızlıklara kadar birçok hastalığın tedavisinde terapötik ajanlar olarak büyük potansiyele sahiptirler. Antisens oligonükleotitler (ASON) gen ekspresyonunu transkripsiyonel düzeyde inhibe eden oldukça seçimli nükleik asit ilaçlardır. Ancak antisens oligonükleotit tedavisi sahip olduğu düşük hücre içi penetrasyon, zayıf hücre içine alım ve nükleazlara karşı kararsızlık gibi farmakodinamik ve farmakokinetik özelliklerinden dolayı sınırlı bir tedavidir. Bu nedenle antisens ilaçları enzimlerden korumayı ve hücre içi penetrasyonu arttırmayı hedefleyen birçok taşıyıcı sistem geliştirilmiştir. Bu çalışmada folik asit (FA) konjuge edilmiş karboksimetil kitosan (CMC) nanopartiküller sentezlenmiş ve c-myc ASON taşınımı için model vektör olarak kullanılmıştır. CMC nanopartiküller CMC'ın kalsiyum klorur (CaCl2) ile iyonik çapraz bağlanma reaksiyonu kullanılarak oluşturulmuştur. Elde edilen nanopartiküllerin boy-boy dağılımı ve zeta potansiyelleri belirlenmiştir. Boyutları 114nm ve 600nm aralığında, yüzey yükleri ise -15 mV ve -25 mV aralığında gözlenmiştir. Nanopartikül boyutunun polimer konsantrasyonu, karıştırma hızı ve CaCl2 konsantrasyonuna bağlı olarak değişim gösterdiği gözlenmiştir. Nanopartiküllerin morfolojik değerlendirmeleri taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre nanopartiküllerin küresel formda olduğu belirlenmiştir. FA bağlama verimliliği spektrofotometrik olarak incelenmiş olup başlangıç ligand miktarına bağlı olarak % 60 ve %93 aralığında değişim gösterdiği belirlenmiştir. Nanopartiküllerin yapısal karakterizasyonu için FTIR çalışmaları gerçekleştirilmiştir. ASON yükleme ve salım çalışmaları yapılmıştır. Tezin son aşamasında nanopartiküllerin MCF-7 hücrelerine karşı sitotoksisitesi WST-1 metodu kullanılarak incelenmiştir. İkili floresan boyama tekniği kullanılarak apoptosis/nekrosis indeksleri de çalışma kapsamında araştırılmıştır.

Abstract:
Nucleic acids such as antisense oligonucleotides, plasmid DNAs or small interfering RNAs (siRNAs) have great potential as therapeutic agents for treatment of numerous diseases spanning from infections to cancers and genetic anomalies. Antisense oligonucleotides (ASONS) are highly selective nucleic acid drugs to inhibit gene expression at the transcriptional level. Antisense oligonucleotide therapy is however restricted due to unfavourable pharmacokinetic and pharmacodynamic properties such as low intracellular penetration, poor cellular uptake and instability against nucleases. Therefore several delivery systems have been developed to protect the antisense drugs against enzymatic digestion and provide the enhanced intracellular delivery. The aim of this thesis was to prepare and characterize folic acid (FA) conjugated carboxymethyl chitosan (CMC) nanoparticles as a model vector to deliver c-myc antisense ASON. CMC nanoparticles were prepared by the ionic cross-linking reaction of CMC with calcium chloride (CaCl2). Size-size distribution and zeta potential of nanoparticles were determined. The size of nanoparticles obtained ranged from approximately 114 nm to 600 nm and zeta potential was relatively stable from -15 mV to -25 mV. The size of the nanoparticles depended on the polymer concentration, stirring rate and CaCl2 concentration. The morphology of nanoparticles has been assessed by using scanning electron microscope (SEM) and atomic force microscope (AFM). Their results indicate that nanoparticles are of spherical shape. FA binding efficiency was evaluated spectrophotometrically and observed to be between 60 and 93 % depending on initial ligand concentration. The Fourier transform infrared analysis (FTIR) was conducted for the structural characterization of the prepared nanoparticles. ASON loading and release studies were performed. At the last stage of the thesis WST-1 assay was performed to investigate cytotoxicity of nanoparticles towards MCF-7 cells. Apoptosis and necrosis indexes were also evaluated by using double staining method.