IDH mutant olmayan glioblastoma'da LC3 genin ıntegrin β1/fak/SRC yolağı üzerinden otofajiye ve U87 GBM hücre hattında hücre davranışı üzerine etkisi
Effect of LC3 gene on autophagy through integrin β1/fak/SRC pathway in non-IDH mutant glioblastoma and cell behavior in U87 GBM cell line
Yazar: ÖKKEŞ CELİL GÖKÇEK
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ HALİL ULUTABANCA
Erciyes Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Nöroşirürji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2020
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery
Dizin: Genler = Genes ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Hücre dizisi = Cell line ; Hücre çoğalması = Cell proliferation ; Klon = Clon ; Migrasyon = Migration ; Otofaji = Autophagy ; Poli (ADP-riboz) polimerazlar = Poly (ADP-ribose) polymerases ; Sinyal nakli = Signal transduction ; Temozolomid = Temosolomide

Özet:
Glioblastoma (glioblastoma multiform, GBM) insanlarda en sık görülen beyin tümörüdür. Kötü prognozlu tümör olmasına rağmen moleküler patojenezi hala aydınlatılamamıştır. GBM primer (%80) ve sekonder GBM (%20) olarak iki tipe ayrılır. 
GBM morfolojik heterojenite içeren yüksek selülarite, nükleer atipi, artmış anjiogenez ve mitotik aktiviteye sahip tümördür. GBM tedavisinde cerrahi rezeksiyon, kemoterapi ve radyoteropatik tedavi yöntemleri kullanılsa da hastalarda sağ kalım süresi çok düşüktür. Ortalama yaşam ömrü 12-15 aydır.  Bu nedenle, tanı, prognoz ve tedavi açısından GBM patogenezinin altında yatan moleküler mekanizmaların araştırılması ve bu mekanizmaları hedefleyen terapilerin uygulanması gerekmektedir.
Otofaji, uzun ömürlü ve yanlış katlanmış proteinlerin yanı sıra fazla ve hasarlı organellerin, bir çift membran vezikül veya otofagosom kullanılarak uzaklaştırıldığı koruyucu bir hücresel işlemdir. Kanserde ise, otofajinin, sistemik ve aşamalı bir şekilde tümör büyümesini kolaylaştırmada veya önlemede çelişkili bir rol oynadığı bilinmektedir.	
Otofaji sürecinde LC3 proteini, fagoforun uzatılması ve kapanmasının gerçekleşmesinde görevlidir, bu yüzden en yaygın kullanılan otofagosom belirtecidir. LC3 otofajide kritik bir rol oynamasının yanı sıra, otofajiden bağımsız olarak bazı kanser hücrelerinin proliferasyonunda da rol aldığı gösterilmiştir. Bu özelliğinden dolayı LC3'in teröpatik bir hedef olabileceği düşünülmektedir. Ancak glioma hücrelerinde LC3'nin rolü ile ilgili çok az bilgi olup,  bu proteinin kanser hücrelerinde rolünün araştırılması gerektiği önerilmektedir. 
Son zamanlarda, RNA müdahalesi (RNAi) GBM dahil birçok kanserin tedavisi için kullanılan yeni bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Sunulan tezde LC3 genini hedefleyen LC3-siRNA kullanılarak, LC3 geninin GBM hücrelerinin proliferasyon, klon oluşturma, apoptoza direnç ve  migrasyon gibi agresif özellikler kazanmasında ve bu yolaklarda ana medyatör olarak görev yapan CyclınD1/Integrin β1/Src ve apoptozda rol oynayan PARP proteinlerinin ekspresyonlarına etkisi araştırılarak, LC3'ün GBM'de göz önünde bulundurulması gereken teröpatik bir hedef olup olmayacağının  açığa çıkartılması ve LC3'ün bu özelliklerde olası bir rolünün olduğunun bulunması durumunda LC3-siRNA'nın teröpatik bir ajan olarak kullanılıp kullanılmayacağının  gösterilmesi amaçlandı. Bu amaç için GBM hücre hattı olan U-87 MG hücreleri LC3 geninin hedefleyen iki farklı LC3 siRNA'ları ve hiçbir geni hedeflemeyen kontrol siRNA ile transfekte edildi. Transfeksiyon sonrası hücrelerin canlılığı MTS analizi, hücrelerin klon oluşturma özellikleri klonojenik analizi,  hücrelerin migrasyonu yara iyileştirme analizi, CyclınD1/Integrin β1/Src ve PARP proteinlerinin ekspresyonları Western blot analizleri ile test edildi. Analiz sonuçlarımıza göre, kontrol siRNA ile transfekte edilen hücrelerle karşılaştırıldığında, iki farklı LC3 siRNA'larla transfekte edilen hücrelerde, hücre canlılığının, klon oluşumunun ve migrasyonun önemli oranda baskılandığı bulundu (p < 0.001). Ayrıca, LC3'ün siRNA aracılı baskılanmasının CyclınD1/Integrin β1/Src ve PARP içeren birçok proto-onkogenik sinyal yolağının inhibisyonuna yol açtığı bulundu.
Sonuç olarak verilerimiz, in vitro ortamda LC3'ün GBM'de hücre proliferasyonu, canlılığı ve migrasyonu için gerekli olduğunu, yüksek agresiflik gösteren ve metastatik GBM hücrelerinde tümör büyümesi ve progresyonuna katkı sağladığını gösterdi. Bu sebeple otofaji geni olan LC3'ün GBM tedavisi için stratejik teröpatik hedef olma potansiyeline sahip olduğunu ve LC3-siRNA'nın teröpatik bir ajan olarak kullanılabilirliğini gösterdi.

Abstract:
Glioblastoma (glioblastoma multiform, GBM) is the most common brain tumor in humans. Although it is a tumor with poor prognosis, its molecular pathogenesis is still unclear. GBM is divided into two types as primary (80%) and secondary GBM (20%).
GBM is a tumor with morphological heterogeneity, high cellularity, nuclear atypia, increased angiogenesis and mitotic activity. Although surgical resection, chemotherapy and radiotherapy treatment methods are used in GBM treatment, the survival time of patients is very low. Average life expectancy is 12-15 months. Therefore, it is necessary to investigate the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of GBM in terms of diagnosis, prognosis and treatment and to apply therapies targeting these mechanisms.
Autophagy is a protective cellular process in which long-lived and misfolded proteins as well as excess and damaged organelles are removed using a pair of membrane vesicles or autophagosomes. In cancer, autophagy is known to play a contradictory role in facilitating or preventing tumor growth in a systemic and gradual manner.
During the autophagy process, the LC3 protein is involved in the lengthening and closing of the phagophore, so it is the most widely used autophagosome marker. In addition to playing a critical role in LC3 autophagy, it has also been shown to be involved in the proliferation of some cancer cells independent of autophagy. Because of this feature, LC3 is thought to be a therapeutic target. However, there is little information about the role of LC3 in glioma cells, and it is suggested that the role of this protein in cancer cells should be investigated.
Recently, RNA intervention (RNAi) has emerged as a new strategy used for the treatment of many cancers, including GBM. In the presented thesis, using LC3-siRNA targeting the LC3 gene, LC3 gene in GBM cells gaining aggressive properties such as proliferation, clone formation, resistance to apoptosis and migration, and the effects of Cyclin D1 / Integrin β1 / Src, which act as the main mediator in these pathways, and PARP proteins playing a role in apoptosis were investigated. Thus, it was aimed to reveal whether LC3 would be a therapeutic target to be considered in GBM and to show whether LC3-siRNA could be used as a therapeutic agent in case LC3 had a possible role in these features. For this purpose, U-87 MG cells, the GBM cell line, were transfected with two different LC3 siRNAs targeting the LC3 gene and control siRNA targeting no gene. Cell viability after transfection was tested by MTS analysis, clone-forming properties of cells, clonogenic analysis, migration of cells, wound healing analysis, expression of CyclinD1/Integrin β1/Src and PARP proteins by Western blot analysis. According to our analysis results, it was found that cell viability, clone formation and migration were significantly suppressed in cells transfected with two different LC3 siRNAs compared to cells transfected with control siRNA (p <0.001). It was also found that siRNA mediated suppression of LC3 leads to inhibition of many proto-oncogenic signaling pathways including CyclinD1/Integrin β1/Src and PARP.
In conclusion, our data show that LC3 is necessary for GBM cell proliferation, viability and migration, contributes to tumor growth and progression in high aggressiveness and metastatic GBM cells, that the autophagy gene LC3 has strategic therapeutic potency for the treatment of GBM and Demonstrated the usability of LC3-siRNA as a therapeutic agent.