Peptitlerin GA-68 ve lu-177 ile işaretlenmesi üzerine çalışmalar
PeptitlerinGA-68 ve lu-177 ile işaretlenmesi üzerine çalışmalar
Yazar: EMİNE MELTEM OCAK
Danışman: PROF. DR. AHMET ARAMAN
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Peptidler = Peptides ; Pozitron emisyon tomografi = Positron-emission tomography ; Radyonüklid görüntüleme = Radionuclide imaging ; İlaç formülleri = Formularies ; İlaçlar = Drugs ; İlaçlar-araştırma safhasında = Drugs-investigational

Özet:
Tez iki temel çalışma konusu içermektedir. Birinci kısımda 68Ga-DOTA-peptitlerinin farmasötik olarak hazırlanması ve formülasyon haline getirilmesi tartışılmıştır. 68Ge/68Ga jeneratörleri PET uygulamalarında kullanılan 68Ga-bileşiklerini hazırlanmasında yer alan siklotrondan bağımsız pozitron yayıcı 68Ga teminini sağlar. Jeneratörden elde edilen 68Ga in peptit işaretlemelerinde doğrudan kullanımını engelleyen faktörler arasında fazla miktarda elde edilmesi, yüksek konsantrasyonda H+ içermesi, iyonik metal ve 68Ge kontaminasyonları sayılabilmektedir. Bu nedenle tezin ilk kısmında GMP uyumlu tam otomatik bir sistem kullanılarak katyon değiştirici reçine içeren kolon yardımıyla konsantre ve saf halde elde edilen 68Ga ile 68Ga-DOTA peptitlerinin hazırlanması üzerine çalışılmıştır. Radyoişaretleme verimi (RİV) ve radyokimyasal safsızlıklar (RKS) ITLC ve RP-RHPLC kullanılarak saptanmıştır. Elde edilen ürünlerin metal, 68Ge içeriği, radyoaktif parçalanması düzeltilmiş ve düzeltilmemiş % verimleri hesaplanmıştır. Tam otomatik sistem ile başarılı ve tekrar edilebilir bir şekilde yüksek verimde 68Ga-DOTA-TOC formülasyonları kullanıcıya verilen radyasyon dozu düşürülerek hazırlanabilmiştir. Sistemin klinik uygulamalarda farmasötik standartlarda ve GMP kurallarına uygun olacak şekilde 68Ga-DOTA-peptitlerinin hazırlanmasında alternatif yol olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.Tezin ikinci kısmı; radyopeptitlerin deneysel olarak stabilitelerinin incelenmesini kapsamaktadır. Radyopeptitlerin farmasötik formülasyon haline getirilmesinde karşılaşılan en önemli problem in vitro ve in vivo stabiliteleri arasındaki uyuşmazlıktır. Bu sorun özellikle minigastrin (MG) türevlerinin tedavi amaçlı kullanılması üzerine yapılan geliştirme çalışmalarında kendini belirgin bir şekilde göstermektedir. Çalışmamızın ikinci kısmında, model olarak seçtiğimiz bir 177Lu-DOTA-MG analoğunun kararlılığına in vitro stabilite çalışma koşullarının etkileri incelenmiştir. Ayrıca, radyopeptitin farelerdeki in vivo kararlılığı ve serum içerisindeki enzimatik parçalanma ürünleri saptanmıştır. Çalışma kapsamında ilk olarak 177Lu-DOTA-MG türevi peptitin in vitro stabilitesi farklı biyolojik kaynaklardan (insan, fare) elde edilen kan, serum, plazma ve organ (fare böbreği ve karaciğeri) homojenatları ile standart enzimatik karışımlar içerisinde test edilmiştir. Aynı zamanda serum ve peptidaz çözeltisi içerisinde farklı zamanlarda elde edilen radyopeptit metabolitleri RP-RHPLC ile belirlenmiş ve tam olarak MALDI-TOF-MS analizi ile karakterize edilmiştir. Radyopeptit farelere enjekte edildikten 3, 5, 10 ve 15 dakika sonra, elde toplanan idrarlarda RP-RHPLC analizi yapılarak in vivo stabilitesi incelenmiştir. Sonuç olarak aynı radyopeptit için farklı inkübasyon ortamları kullanıldığında farklı stabilite sonuçları bulunmuştur. In vitro serum stabilite testi, stabiliteyi tahmin etmekte kullanılabilir ancak, sadece serum içerisinde yapılan çalışma yetersiz kalabilir. Klinik öncesi çalışmalarda özellikle peptit temelli radyofarmsötiklere alternatif inkübasyon ortamlarında da stabilite testi yapılmasına ihtiyaç olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract:
The thesis has two main points. In the first part, strategies for pharmaceutical preparation and formulation of DOTA-peptides radiolabelled with 68Ga were discussed. 68Ge/68Ga generators provide cyclotron-independent positron emitting 68Ga for synthesis of 68Ga-labelled compounds using in PET applications. The main limitations with all generators preventing the direct use of 68Ga for radiolabelling were described as large volume of 68Ga eluate, a high H+-concentration, contamination with the long lived parent radionuclide (68Ge) and cationic ions. Therefore, a new fully automated approach was described in the thesis for the synthesis of 68Ga-labelled DOTA-peptides with pre-concentrated and purified generator eluate by using a cation exchange-cartridge. Radiochemical purity was determined by ITLC and RP-RHPLC. Metal contents, 68Ge breakthrough of all products, the overall decay and non-decay corrected reaction yields were calculated. The fully automated system described here can be used successfully and reproducibly for GMP compliant preparation of 68Ga- DOTA-peptides in high yields with reduced radiation dose to the operator. The system seems to be a promising way to prepare 68Ga-DOTA peptides for clinical applications meeting current pharmaceutical standards.The second part of the thesis deals with the experimental determination of the stability of radiopeptides used for targeted radionuclide therapy. Lack of correlation between in vitro and in vivo stability is a general problem for the pharmaceutical development of radiopeptides especially in the case of minigastrin derivatives for therapeutic applications. The aim of the second part was the comparison of the influence of experimental conditions on radiopeptide stability results in vitro using a model Minigastrin (MG) analogue labelled with 177Lu. Additionally characterization of the main serum enzymatic cleavage sites was performed. In vitro stability of a 177Lu-DOTA-MG derivative was tested in blood, serum, plasma (from different origin), rat tissue homogenates and two different standardised enzymatic mixtures. Quantification of the metabolised radiopeptides at different time intervals was performed using RP-RHPLC. Metabolites were characterised by MALDI-TOF-MS. Urine was collected after 3,5,10,15 min post injection into the mice and compared with in vitro metabolites by RP-RHPLC. Very variable results may be found when using different kind of incubation media for testing peptide stabilities. Serum incubation studies may overestimate stability, and therefore alternative strategies (blood and tissue homogenates) may be required for the preclinical testing of new peptide based radiopharmaceuticals especially for therapeutic applications.