Rotavirüs NSP4 proteini uygulanan CACO-2 hücre hattında lactobacillus plantarum bakteriyosininin etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of Lactobacillus plantarum Bacteriocin on CACO-2 Cell Line Treated with Rotavirus NSP4 Protein
Yazar: MERVE ŞEN
Danışman: PROF. DR. HÜSEYİN TAŞLI ; PROF. DR. SEFA ÇELİK
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmasötik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı / Farmasötik Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bakteriyosinler = Bacteriocins ; Hücre dizisi = Cell line ; Lactobacillus plantarum = Lactobacillus plantarum ; Plantarisin A = Plantaricin A ; Rotavirüsler = Rotaviruses

Özet:
Rotavirüs, bebeklerde ve küçük çocuklarda  akut gastroenteritin başlıca nedenidir. Rotavirüs öncelikle enterositleri enfekte eder ve rotavirüs yapısal olmayan protein 4 (NSP4) tarafından uyarılan bağırsak hücrelerinde oluşan tahribat ve enterik sinir sisteminin aktivasyonu sebebiyle ishale neden olur. NSP4, rotavirüs ile enfekte hücrelerde gözlenen Ca+2 homeostazındaki değişikliklerden sorumlu ana proteindir. Bu çalışmada, Rotavirüs enfeksiyonlarında çeşitli mekanizmalarla özellikle diyareye ve enterositlerin tahribatına neden olan NSP4 proteini uygulanmış Caco-2 bağırsak hücre hattında Lactobacillus plantarum bakteriyosini olan plantarisin A'nın (PlnA),  hücre içi, hücre dışı kalsiyum miktarları ve antiinflamatuar, proinflamatur sitokin düzeyleri üzerine etkileri araştırılmıştır.

Nsp4 ve PlnA, MTT hücre viabilite testi ile IC50 dozları belirlenerek Caco-2 bağırsak hücre hatlarına uygulandı. 3., 6., 12. ve 24. saatlerde proteinlerin hücre içi ve hücre dışı kalsiyum seviyeleri Kolorimetrik yöntem ile belirlendi. Belirtilen saatlerde proinflamatuar/antiinflamatuar sitokinlerin (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10) düzeyleri ELISA yöntemi ile belirlendi. Ayrıca belirtilen saatlerde sitokinlerin RT-PZR ile gen ekspresyon seviyelerine bakıldı.

Çalışmada elde edilen bulgulara göre, Rotavirüs Nsp4'ün hücre içi ve hücre dışı kalsiyum seviyelerini zamana bağlı olarak arttırdığı, PlnA'nın ise Nsp4 ile birlikte uygulamalarında bu durumu baskıladığı görüldü. Dolayısıyla Plna'nın viral enfeksiyonun erken dönemlerinde virüsün çoğalmak için kullandığı sitozolik kalsiyumu azaltma potansiyeline sahip olabileceği düşünüldü. PlnA'nın etkileri değerlendirildiğinde, proinflamatuar sitokinlerin gen ekspresyon ve protein düzeylerinde artışlar saptandı. Benzer şekilde PlnA'nın  antiinflamatuar sitokin olan IL-10'un hem gen ekspresyon hem de protein düzeyini arttırması, PlnA'nın antiinflamatuar etkisinin olabileceğini göstermiştir. Bu bakımdan in vivo çalışmalar ile desteklendiği takdirde viral enteritlerin tedavisinde terapötik ajan olarak kullanılabilme potansiyeline  sahip olabileceği sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Rotavirus is the main cause of acute gastroenteritis in infants and young children. Rotavirus primarily infects enterocytes and causes diarrhea due to destruction of intestinal cells stimulated by rotavirus nonstructural protein 4 and activation of the enteric nervous system. NSP4 (Rotavirus nonstructural protein 4)  is the main protein responsible for the changes in Ca+2 homeostasis observed in rotavirus-infected cells. In this study, the effects of Lactobacillus plantarum bacteriocin plantaricin A (PlnA) on intracellular and extracellular calcium amounts and anti-inflammatory, proinflammatory cytokine levels in Caco-2 intestinal cell line treated with NSP4 protein, which causes diarrhea and destruction of enterocytes by various mechanisms in rotavirus infections. has been researched.

IC50 doses of Nsp4 and PlnA proteins were determined by MTT cell viability test and applied to Caco-2 intestinal cell lines. Intracellular and extracellular calcium levels of proteins were determined by Colorimetric method at 3.,6.12. and 24 hours. In addition, gene expression levels of proinflammatory / anti-inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10) were measured by RT-PCR and protein levels by ELISA at the indicated hours.

According to the findings obtained in the study, it was thought that Rotavirus Nsp4 protein increased intracellular and extracellular calcium levels depending on time, while PlnA suppressed this situation in its co-administration with Nsp4, therefore it was thought that it might have the potential to reduce the cytosolic calcium used by the virus to multiply in the early stages of viral infection. When the effects of PlnA were evaluated, increases in proinflammatory gene expression levels and protein levels were detected. Similarly, the fact that PlnA increased both gene expression levels and protein levels of the anti-inflammatory cytokine IL-10 showed that PlnA could have an anti-inflammatory effect. In this respect, it has been concluded that if it is supported by in vivo studies, it may have the potential to be used as a therapeutic agent in the treatment of viral enteritis.