Lipopolisakkarit uygulanana sıçanların karaciğerinde tempol'ün rolü
The role of tempol in the liver of rats treated with lipopolysaccharide
Yazar: PERİHAN SİNEM ÖZDEMİR
Danışman: PROF. DR. CİHAN DEMİRCİ TANSEL
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Zooloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Zooloji = Zoology

Özet:
Endotoksemi, kandan kaynaklanan yaygın bakteriyel bir enfeksiyonun, bir dokudan diğer dokuya yayılarak aşırı hasara yol açması olarak tanımlanmaktadır. Endotoksemi, sıvı ve ilaç tedavisine rağmen hipotansiyonun ve sistemik inflamasyonun görüldüğü çoklu organ yetmezliğine neden olan sepsise dönüşmektedir. Sepsis hipotansiyon, damar daraltıcı ajanlara karşı cevabın azalması, miyokardiyal fonksiyon bozukluğu ve organ kanlanmasında bozulma ile de karakterize edilmektedir. 
Deneysel sepsis modelleri oluşturabilmek için kullanılan lipopolisakkarit (LPS), Gram (-) bakterilerin hücre duvarının yapısında bulunan bir endotoksindir. Vaskular sistemde artan LPS miktarı,  sitokinlerin salınmasında ve sistemik inflamatuvar cevabın oluşmasında anahtar role sahiptir. Bunun yanısıra, LPS gibi endotoksinlerin oluşturduğu inflamatuvar yanıt sonucunda serbest radikallerin oluşumu da tetiklenir. Ayrıca serbest radikaller fizyolojik koşullarda gerçekleşen bir çok hücresel olayda da meydana gelmektedir. Bunlar hidroksil, süperoksit, NO ve lipid peroksit radikalleri gibi değişik kimyasal yapılara sahip olabilirler. Normal fizyolojik durumlarda bu serbest radikaller, reaktif nitrojen türleri (RNT) ve reaktif oksijen türleri (ROT) karmaşık bir antioksidan sistem tarafından etkisiz hale getirilmektedir. Serbest radikaller, ROT'ların, özellikle süperoksit anyonunun, RNT'lerin ve antioksidan moleküllerin oluşum hızında artmaya ya da antioksidan savunma sistemi etkinliğinde azalmaya bağlı olarak, oksidan/antioksidan dengenin bozulmasına sebep olur. Bu da oksidatif stresin oluşumuna neden olmaktadır. Doğal antioksidanlar organizmadaki enzimler ile bazı moleküllerden oluşmaktadır. Örneğin; çeşitli reaksiyonlarda rol alan süperoksit dismutaz (SOD), katalaz, glutatyon peroksidaz, hidroperoksidaz, sitokrom C oksidaz gibi enzimler antioksidan özelliğe sahiptir. SOD, süperoksit serbest radikalinin H2O ve moleküler oksijen (O2)'e dönüşümünü katalizleyen hücrelerde antioksidan bir enzimdir. TEMPOL, süperoksit anyonları, hidroksil radikalleri ve peroksinitrit gibi bir çok radikalin oluşumunu ve etkilerini in vivo vein vitro'da ortadan kaldıran bir serbest radikal süpürücüsüdür. Ayrıca tempol, patolojik süreçlerde artan ROT'ların etkilerine karşı deneysel hayvan modellerinde yaygın olarak çalışılmıştır. Tempolün SOD taklitçisi olarak davranması, düşük moleküler ağırlıklı olması, tempolün stabil piperidin nitroksidi grubu taşıyor olması, biyolojik membranlardan kolayca geçebiliyor olması ve ROT'ları temizlemesinden dolayı çalışmamızda tercih edilmiştir.
Bu çalışmada, LPS'in intraperitonal (ip) enjeksiyonu sonrası oluşan karaciğer hasarı üzerine tempolün etkilerini araştırmak amaçlıyla dört grup (200-300 gram ağırlığında erkek Wistar albino sıçanlar) oluşturuldu. (I) FTS uygulanan kontrol grubu, (II) LPS (E.coli, 15 mg/kg, ip, Serotip 026:B6) uygulanangrup, (III) LPS enjeksiyonundan 3 saatsonraTempol (100 mg/kg, ip) uygulanangrup, (IV) Fizyolojiktuzlusu (FTS) verilmesinden 3 saat sonra Tempol enjekte edilen gruptur. Deneyin başlamasından 6 saat sonra deney sonlandırılmış ve biyokimyasal incelemeler için kalpten kan toplanmıştır. Ayrıca, immünohistokimyasal ve biyokimyasal analizler için karaciğer örnekleri alındı. 
Işık mikroskobu incelemeleri sonucunda, LPS uygulanmasının karaciğer dokusunda bazı patolojik değişikliklere neden olduğu görülmüştür. Hepatositlerin hücre sınırlarının belirginliği ve merkezi ven etrafındaki ışınsal düzeni kaybolmuştur. Kupffer hücreleri belirgin ve büyüktü. Düzensiz ve genişlemiş sinüzoidlerin lümeninde lökositler gözlenmiştir. Endotel devamlılığını kaybetmiş olan merkezi ven lümeninde çok fazla sayıda lökositin bulunduğu tespit edilmiştir. Aynı zamanda endotoksemiyle birlikte plazma ve karaciğer dokusundaki aspartataminotransferaz (AST) ve alaninaminotransferaz (ALT) düzeylerinin arttığı gözlenmiştir. LPS grubunda, doku örneklerinde bakılan C-reaktif protein (CRP) düzeyi de artışgöstermiş, süperoksitdismutaz (SOD) düzeyleri ise azalmıştır. LPS grubunda yapılan immünohistokimyasal gözlemler sonucunda, endoteliyal nitrikoksitsentaz (eNOS) immünoreaktivitesi anlamlı olarak azalırken, uyarılabilir nitrikoksit sentaz (iNOS) immünoreaktivitesi ise bir artış sergilemiştir. Aynı grupta, miyeloperoksidaz (MPO) ile işaretli lökositlerin sinüzoidlerin lümeninde biriktiği, damarların endotel tabakasına tutunmuş olduğu ve portal alanlarda yaygın bir dağılım gösterdiği belirlenmiştir. LPS enjeksiyonundan sonra tempol uygulanan grupta, karaciğer morfolojisinin kısmen LPS grubundaki bireylere kısmen de kontrol grubundaki bireylere benzer özellikler sergilediği saptanmıştır. Tempol uygulandığında, plazma ve dokudaki AST ve ALT düzeylerinin azaldığı ancak, plazmadaki azalmanın daha fazla olduğu tespit edilmiştir. LPS enjekte edilen hayvanlara tempol uygulandığı zaman, plazma ve dokuda azalan SOD değerleri arttığı belirlendi. Buna ek olarak, dokudaki SOD değerlerinin kontrole göre fazla olduğu tespit edilmiştir. Tempol uygulaması, LPS grubunun karaciğer dokusunda artan CRP seviyelerini önleyemedi. Dokudaki eNOS ve iNOS reaksiyonu immünohistokimyasal olarak değerlendirildiğinde, LPS grubuna göre eNOS reaksiyonunun arttığı, iNOS reaksiyonunun azaldığı görüldü. MPO ile işaretli lökositlerin LPS grubuna benzer şekilde, aynı alanlarda aynı dağılımda olduğu belirlendi. Tempol uygulaması, LPS enjekte edilen hayvanların karaciğer dokusundaki MPO ile işaretli lökositlerin dağılımını değiştirmedi. Sadece tempol uygulanan kontrol hayvanlarında, karaciğer dokusunun histolojisi kontrol grubuna benzerdi. Ayrıca, eNOS reaksiyonu, AST veSOD'un plasmadaki seviyeleri ile dokudaki CRP seviyeleri de kontrole benzerdi. Ancak, iNOS reaksiyonu, ALT'nin plasma ve dokudaki seviyeleri ile SOD'un dokudaki seviyeleri sadece tempol uygulanan hayvanlarda kontrol grubundan yüksekti.
Bu sonuçlar doğrultusunda, dokudaki CRP düzeyinde düşüş gözlenmemesi, MPO ile işaretli lökositlerin LPS uygulaması sonrası tempol uygulanan grupta halen benzeri yoğunlukta görülmesi tempolün bu doz ve sürede sepsis patogenezinde düzenleyici bir etkisinin var olmadığını göstermektedir. Bunun yanı sıra karaciğer hasarı belirleyici olan ALT ve AST değerlerinden özellikle plazma değerlerindeki düşüşe sebep olması, tek başına uygulandığında doku düzeyinde histopatolojik bulgularda kontrole benzer durumun sağlaması, tempolün, uygulama zamanı ve doz ayarlaması sağlandığında iyi bir antioksidan olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Endotoxemia has been described as causing severe damage of a widespread bacterial infection derived from blood by spreading from a tissue to other  tissue. Endotoxemia has changed to the sepsis causing multiple organ deficiency, systemic inflammation and hypotension despite fluid resuscitation and drugtreatment. Sepsis has been also characterized by hypotension, vascular hyporeactivity to vasoconstrictor agents, myocardial dysfunction, and distribution of organ blood flow.
Lipopolysaccharide (LPS) using to create experimental sepsis models is an endotoxin found in the cellular wall structure of Gram (-) bacteria. The increased level of LPS in the vascular system has a key role in releasing of cytokines and occurrence of systemic inflammatory response. The formation of free radicals can also trigger in the case of the inflammatory response resulting fromthe endotoxins such as LPS. Additionally, they have been formed in various cellular events occurring under certain physiological conditions. They have different chemical structures such as hydroxyl, superoxide, NO and lipid peroxide.
These free radicalsare eliminated by a complex antioxidant systemin normal physiological conditions. The balance of oxidant/antioxidant system is broken down, depending on the increasing of free radical formation rate or the decreasing of antioxidant defense system activity. This causes oxidative stress. Natural and cellular antioxidants consist of enzymes and some molecules in the organisms. For instance, the enzymes such as SOD, catalase, glutathione peroxidase, hydroperoxidase, cytochrome C oxidase playing role in various reactions bear an antioxidant feature. Superoxide dismutase is an antioxidant enzyme which catalysis changing from the superoxide free radical to H2O and molecular oxygen (O2). TEMPOL is a scavenger eliminating the formations and the effects of many free radicals such as superoxide anions, hydroxyl radicals and peroxynitrite. Moreover, tempol has been widely studied to investigate effects of increased ROT level with hypertension and endothelial dysfunction in the experimental animal models. In our study, tempol was chosen because of its SOD mimetic, its low molecular weight, its stabile piperidine nitroxide group and easy passing through biological membranes.
In this study, it is composed of four groups to investigate effects of tempol on liver damage induced by the injection of LPS intraperitoneally (ip) (male Wistar albino rats weighed 200-300 gr). Group I was the animals FTS-injected, group II; LPS-injected (E.coli, 15 mg/kg, ip, Serotype 026:B6), group III; tempol-injected (100 mg/kg, ip) after 3 hours of LPS injection, group IV; tempol-injected after 3 hours of FTS injection. Blood samples were collected from the heart for biochemical analysis and liver tissue samples were taken for immunohistochemical and biochemical analysis after finalization of the experiments.
Light microscopic observations showed that the administration of LPS caused some pathological changes in the liver tissue. The cell borders of hepatocytes were not evident and there was notradial structure around the central veins. Kupffer cells were evident and large. The leukocytes were observed in the enlarged and irregular sinusoids. Many leucocytes were detected in lumen of central veins and endothelial line of the veinlost its continuity. In the same time, the levelsof aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) increased in the plasma and liver tissue in LPS group. The tissue level of C-reactive protein (CRP) also increased butthe levels of SOD decreased in the same group. It was detected strong immunoreactivity of inducible nitric oxide synthase (iNOS) while immunoreactivity of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) was weak in the liver tissue sections of LPS injected animals. Additionally, myeloperoxidase (MPO)-stained leukocytes accumulated in sinusoidal lumen and attached to endothelial layer of the vessels and they widely spread out to portal areas in the liver tissue. In tempol administrated group after LPS injection, the liver morphology exhibited the similar morphology both in partly LPS group and partly control group. It was detected to decrease plasma and tissue levels of AST and ALT. However, plasma levels of AST and ALT were lower than those of tissue levels in this group. The decreased SOD levels weredetected to increase when tempol was injectedtothe endotoxemic animals. In addition to this, the tissue levels of SOD were high when compared to theircontrol levels. Tempol administration did not prevent the increase of CRP levels in the liver tissue of LPS group. Immunoreactivitiy of eNOSin tempol injected group after 3 hours of LPS injection were stronger and the iNOS immunoreactivity were weaker than those of LPS injected animals. The distribution and the location of MPO-stained leukocytes were similar with LPS group.  However, tempol administration did not change the distributions of MPO-stained leukocytes in liver tissues of LPS injected animals. The histology of liver tissue was similar to control groupin tempol given control animals. Moreover, eNOS immunoreactions, plasma levels of AST and SOD, plasma levels of CRP were similar to control groups. However, iNOS immunoreactions, plasma and tissue levels of ALT and tissue levels of SOD were higher than control groupin tempol given animals. 
In conclusion, no changes in the tissue level of increased CRP and the similarity with LPS group in the distribution of MPO-stained leukocytes after tempol injection in the animals given LPS revealed that tempol did not show any kind of regulatory effect on sepsis pathogenesis in the time and dose applied. Besides, decreased levels of AST and ALT, which are markers for liver damage, and especially their decreased plasma levels, and no changings in the liver morphology of the animals given tempol made us think that when application time and dose of tempol were adjusted, itcan be a good antioxidant for treatment of oxidative stress.