C6 glioma hücre hattında cisplatin ve ginkgolid a yüklü nanopartiküllerin biyolojik etkilerinin incelenmesi
Investigation of the biological effects of cisplatin and ginkgolide a-loaded nanoparticles in C6 glioma cells
Yazar: ÜMMÜGÜLSÜM GÜZELSOY
Danışman: PROF. DR. BANU MANSUROĞLU ; DOÇ. DR. MELİKE ERSÖZ
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyokimya ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik  Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Apoptozis = Apoptosis ; Ginkgolid = Ginkgolide ; Glioblastoma = Glioblastoma ; Nanopartiküller = Nanoparticles ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Sisplatin = Cisplatin

Özet:
Glioblastoma, primer beyin tümörleri arasında en sık görülen agresif malign  kanser türüdür. Tedavi yöntemlerinde kemoterapi ve radyoterapi yer almasına  rağmen kısıtlı etkinlik göstermesi ve hastalığın çok hızlı yayılması sonucunda  glioblastoma hastalarında hayatta kalma süresi 15 ayı geçmemektedir. Bu  nedenle, glioblostoma tedavisinde yeni yaklaşımlara ihtiyaç duyulmaktadır. 
Cisplatin, kanser tedavilerinde yaygın kullanılan bir kemoterapi ilacıdır. Cisplatin  DNA'da hasar oluşturarak hücre döngüsünün G1/S fazında kalmasını sağlar ve  apoptoza neden olur. Fakat bu durum aynı zamanda mitokondriyal disfonksiyon  oluşturur. Ginkgo biloba ekstraktı içerisinde bulunan terpenoidler (Ginkgolid A,  Ginkgolid B), anti-kanser ve nöroprotektif etkiler dahil olmak üzere birçok önemli  biyolojik aktiviteye sahip antioksidanlardır. Ginkgolide A, Ginkgo biloba'nın 
yapraklarından izole edilen oldukça aktif bir moleküldür. Ginkgolide A'nın çeşitli hastalıklara karşı koruyucu etkisinin iyi bir antioksidan olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Günümüzde nanopartiküler (NP) sistemler, bir çok tedavide mevcut ilaçların etkinliğini arttırmak ve kontrollü salınım sağlamak amacıyla ilaç taşıyıcı sistemler olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, Cisplatin, Cisplatin yüklü PLGA NP, Ginkgolid A, Ginkgolid A yüklü PLGA NP'nin C6 Glioma hücrelerinde biyolojik etkileri araştırıldı.
Cisplatin yüklü PLGA NP ve Ginkgolid A yüklü PLGA NP tekli emülsiyon (w/o) yöntemiyle sentezlendi. Cisplatin yüklü PLGA NP ve Ginkgolid A yüklü PLGA NP'nin boyut dağılımları, çoklu dağılım indeksleri, zeta potansiyelleri, enkapsülasyon verimleri ve ilaç yükleme kapasitesileri belirlendi. Cisplatin yüklü PLGA NP'nin boyutu 196.5 ± 1.773 nm, Ginkgolid A yüklü PLGA NP'nin boyutu ise 224.5 ± 10.86 nm olarak ölçüldü.  Cisplatin, Cisplatin yüklü PLGA NP, Ginkgolid A ve Ginkgolid A yüklü PLGA NP'nin sitotoksik aktivitesi C6 Glioma hücrelerinde MTT yöntemiyle analiz edildi. Cisplatin ve Cisplatin yüklü PLGA NP ile muamele edilen C6 Glioma hücrelerinin IC50 değerleri 24. saatte sırasıyla; 53 µM ve 24 µM, 48. saatte ise sırasıyla; 12.7 µM ve 4.3 µM olarak belirlendi. Ginkgolid A ve Ginkgolid A yüklü PLGA NP ile muamele edilen C6 Glioma hücrelerinin IC50 değerleri 24. saatte sırasıyla; 175 µM ve 116 µM, 48. saatte ise sırasıyla; 136 µM ve 64 µM olarak tespit edildi. Cisplatin, Cisplatin yüklü PLGA NP, Ginkgolid A ve Ginkgolid A yüklü PLGA NP ile muamele edilen C6 Glioma hücrelerindeki apoptotik etki TUNEL yöntemi ile gösterildi. 24 ve 48 saat Cisplatin, Cisplatin yüklü PLGA NP, Ginkgolid A ve Ginkgolid A yüklü PLGA NP uygulanan C6 Glioma hücrelerindeki apoptotik hücre sayısı kontrol hücrelerine göre istatistiksel olarak anlamlı bir artış gösterdi (p<0.05). Total oksidan seviye (TOS) tayini kit ile, oksidatif stres belirteci olan MDA seviyesi spektrofotometrik olarak belirlendi. Total antioksidan seviye (TAS) tayini kit ile, GSH ve SOD antioksidan düzeyleri spektrofotometrik olarak saptandı. 48 saat Cisplatin yüklü PLGA NP ile muamele edilen C6 Glioma hücrelerinin TOS değerleri kontrol hücrelerine göre istatistiksel olarak anlamlı bir artış gösterdi (p<0.05). 48 saat Ginkgolid A yüklü PLGA NP ile muamele edilen C6 Glioma hücrelerinin TAS değerlerinde kontrol hücrelerine göre istatistiksel olarak anlamlı bir artış kaydedildi (p<0.05). 
Elde edilen sonuçlarla; Cisplatin ve Cisplatin yüklü PLGA NP'nin C6 Glioma hücrelerinde oksidatif stresi arttırarak apoptozu indüklediği, Ginkgolid A ve Ginkgolid A yüklü PLGA NP'nin ise C6 Glioma hücrelerinde antioksidan aktivitesi ile serbest radikallerin ortadan kaldırılmasında etkili olduğu gösterildi. Buna göre; Cisplatin, Cisplatin yüklü PLGA NP, Ginkgolid A ve Ginkgolid A yüklü PLGA NP glioblastoma tedavisine yönetlik olarak geliştirilen etkin tedavi yaklaşımlarında düşünülebilir. Çalışma sonuçları bu alandaki gelecekteki araştırmalara önemli bir katkı sağlayacaktır.

Anahtar Kelimeler: Cisplatin, Ginkgolid A, Nanopartikül, Oksidatif stres, Antioksidan, Apoptoz, Glioblastoma

Abstract:
Glioblastoma is the most common type of aggressive malignant cancer among primary brain tumors. Although chemotherapy and radiotherapy are included in the treatment methods, the survival time in glioblastoma patients does not exceed 15 months as a result of limited effectiveness and the rapid spread of the disease. Therefore, new approaches are needed in the treatment of gliobrostoma. Cisplatin is a chemotherapy drug widely used in cancer treatments. Cisplatin causes DNA damage and keeps the cell cycle in G1/S phase and causes apoptosis. But this also creates mitochondrial dysfunction. Terpenoids (Ginkgolide A, Ginkgolied B) contained in Ginkgo biloba extract are antioxidants with many important biological activities, including anti-cancer and neuroprotective effects. Ginkgolide A is a highly active molecule isolated from the leaves of Ginkgo biloba. It is thought that the protective effect of Ginkgolide A against various diseases is due to its being a good antioxidant. Today, nanoparticular (NP) systems are used as drug delivery systems in many treatments to increase the effectiveness of existing drugs and to provide controlled release. In this study, the biological effects of Cisplatin, PLGA NP loaded with Cisplatin, Ginkgolide A, Ginkgolied A loaded PLGA NP were investigated in C6 Glioma cells.
Cisplatin loaded PLGA NP and Ginkgolid A loaded PLGA NP were synthesized by single emulsion (w/o) method. The size distributions, multiple distribution indices, zeta potentials, encapsulation efficiencies and drug loading capacities of Cisplatin loaded PLGA NP and Ginkgolide A loaded PLGA NP were determined. The size of Cisplatin loaded PLGA NP was measured as 196.5 ± 1.773 nm, and the size of Ginkgolide A loaded PLGA NP was measured as 224.5 ± 10.86 nm. The cytotoxic activity of Cisplatin, Cisplatin loaded PLGA NP, Ginkgolide A and Ginkgolide A loaded PLGA NP were analyzed by MTT method in C6 Glioma cells. IC50 values of C6 Glioma cells treated with Cisplatin and Cisplatin-loaded PLGA NP at 24 hours; 53 µM and 24 µM, respectively, at the 48th hour; It was determined as 12.7 µM and 4.3 µM. IC50 values of C6 Glioma cells treated with Ginkgolide A and Ginkgolide A loaded PLGA NP at 24 hours, respectively; 175 µM and 116 µM, respectively, at the 48th hour; It was detected as 136 µM and 64 µM. The apoptotic effect in C6 Glioma cells treated with Cisplatin, Cisplatin loaded PLGA NP, Ginkgolide A and Ginkgolide loaded PLGA NP A was demonstrated by TUNEL method. The number of apoptotic cells in C6 Glioma cells treated with Cisplatin, Cisplatin loaded PLGA NP, Ginkgolide A and Ginkgolide A loaded PLGA NP for 24 and 48 hours showed a statistically significant increase compared to control cells (p<0.05). Total oxidant level (TOS) was determined with the kit, and MDA level, which is an oxidative stress marker, was determined spectrophotometrically. Total antioxidant level (TAS) was determined with the kit, and GSH and SOD antioxidant levels were determined spectrophotometrically. TOS values of C6 Glioma cells treated with Cisplatin loaded PLGA NP for 48 hours showed a statistically significant increase compared to control cells (p<0.05). A statistically significant increase was observed in TAS values of C6 Glioma cells treated with Ginkgolide A loaded PLGA NP for 48 hours compared to control cells (p<0.05).
With the results obtained; It has been shown that Cisplatin and Cisplatin loaded PLGA NP increase oxidative stress in C6 Glioma cells and induce apoptosis, while Ginkgolide A and Ginkgolide A loaded PLGA NP are effective in eliminating free radicals with their antioxidant activity in C6 Glioma cells. According to this; Cisplatin, Cisplatin loaded PLGA NP, Ginkgolide A and Ginkgolide A loaded PLGA NP can be considered in effective treatment approaches developed for the treatment of glioblastoma. The results of the study will make an important contribution to future research in this area.
Keywords: Cisplatin, Ginkgolide A, Nanoparticle, Oxidative stress, Antioxidant, Apoptosis. Glioblastoma