Bir trimetazidine türevi olan s-15176'nın nöroprotektif etkilerinin deneysel spinal kord travması modelinde incelenmesi
The evaluation of neuroprotective effects of a trimetazidine derivative s-15176 in experimental spinal cord injury model
Yazar: HAKAN ERDOĞAN
Danışman: PROF. DR. AHMET CELAL İPLİKÇİOĞLU
Sağlık Bakanlığı / Taksim Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Beyin ve Sinir Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2009
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery
Dizin: Medulla spinalis =

Özet:
Omurilik yaralanması (SCI), araba kazaları, düşme veya ateşli silah yaralanmaları gibi çeşitli yaralanmaların bir sonucu olarak ortaya çıkabilir. Travmatik SCI, kalıcı nörolojik sorunlara ve sakatlıklara neden olarak ciddi bir tıbbi ve bilimsel zorluk oluşturur. Omurilik hasarı sadece ilk incinmelerle sınırlı değildir, aynı zamanda ikincil hasar ile devam edebilir. Günümüzde, geri döndürülemez yaralanmaya yol açan birincil hasarın tedavisi mümkün görünmemektedir. SCI'nin feci sonuçlarının yüzyıllarca gözlemlenmesinden sonra Allen tarafından tanımlanan ikincil hasar kavramı yeni geliştirilen tıbbi çözümler için umut vermiş gibidir. 
Hücrelerin iki mekanizma ile ölebileceği bilinmektedir: nekroz ve apoptozis. Mekanik doku hasarından kaynaklanan primer hasar, nekrotik hücre ölümüne neden olurken ikincil yaralanma, hücre ölüm mekanizmalarının aktivasyonu ile tetiklenen olayların bir sonucudur. Bu nedenle, deneysel ve klinik çalışmaların çoğunda ikincil hasarın önlenmesine odaklanılmıştır. İkincil yaralanma süreci ödem, kanama, enflamatuar reaksiyon, iskemi, enerji metabolizmasının bozulmasını kapsamaktadır. Apoptozis, çeşitli hücreler harici veya dâhili uyaranlara maruz bırakıldıktan sonra ortaya çıkan, aktif olarak düzenlenmiş bir yanıttır. Uzunca bir süredir omurilik lezyonlarının apoptozis tarafından ağırlıkla ikincil hasarın bir sonucu olarak arttığı gösterilmiştir.
Bu çalışmada sıçan modelinde omurilik hasarına (SCI) bağlı ikincil hasarlarda anti-iskemik, antioksidan ve mitokondriyal membran stabilizatörü olarak difumarat tuz S-15176'nın nöroprotektif ve antiapoptotik etkisini analiz ettik. Çalışma üç grupta, 30 Wistar sıçanı ile gerçekleştirildi; kontrol (1), travma (2) ve bir travma + S-15176 tedavisi (3). Omurilik yaralanması, ağırlık düşürme tekniği kullanılarak torakal düzeyde gerçekleştirildi. Travma sonrasındaki 3. ve 7. günlerde intrakardiyak perfüzyon sonrası spinal kord dokuları toplandı. Histopatoloji için hematoksilen ve eozin boyama, apoptotik hücreler için TUNEL (terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick labeling) incelemesi ve proapoptotik sitokrom-c, Bax ve kaspaz 9 için immünohistokimya tüm gruplara uygulandı. Omurilik yaralanmasını takip eden 3. ve 7. günlerde her gruba fonksiyonel iyileşme testi uygulandı. Travma grubunda daha fazla gri maddede olmak üzere ödemli bölgeler, yaygın kanama, nekroz, lökosit infiltrasyonu ve motor nöronlarda ciddi dejenerasyon gözlendi. Apoptotik hücrelerin sayısı kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksekti (p <0.05). S-15176 ile tedavi edilen gruplarda 3. ve 7. günlerde apoptotik hücre sayısı (p <0.001), sitokrom-c (p <0.001), Bax (p <0.001) ve kaspaz 9 immünoreaktif hücreler (p <0.001) travma gruplarına kıyasla anlamlı oranda azalmıştı. Lokomotor testin sonuçları, tedavi grubunda (p <0.05) travma gruplarına kıyasla belirgin şekilde daha iyiydi.
Difumarat tuzu S-15176'nın, apoptozisin mitokondrial yollarını engellediğini ve omuriliği ikincil yaralanmalardan koruduğunu ve sıçanlarda SCI sonrası motor fonksiyonun korunmasına yardımcı olduğunu ileri sürüyoruz. 
Trimetazidin'in iskemi-reperfüzyonun deneysel modellerinde hücresel yaralanma oranını sınırladığı gösterilmiştir. Bu etkinin, mitokondriyal fonksiyonların korunmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. S-15176'nın mitokondriyal geçirgenliğin geçişini engellediği, mitokondriyal membran boyunca elektrokimyasal eğilimin çökmesini önleyerek apoptozisin erken adımını engellediği düşünülmektedir. Settaf ve arkadaşları, sıçan modelini kullanarak S-15176'nın karaciğer hasarındaki membran stabilize edici potansiyelini ve anti-apoptotik etkilerini göstermişlerdir.
Bu bulgular, S-15176 kullanımının, mitokondriyal apoptozis yolağının erken evrelerinde gelişebilen pro-apoptotik proteinlerin ekspresyonunu önleyebildiği hipotezini desteklemektedir. Morfolojik değerlendirme, travma gruplarında ikincil yaralanmayı önleyeceğini ortaya koymuştur. Burada, S-15176'nın MMP'yi stabilize ederek mitokondriden cyt-c salınmasını önlediğini ve kaspaz-9 ekspresyonunun azaltılması yoluyla apoptotik hücre ölümünü önlediğini ileri sürüyoruz. S-15176'nın nöroprotektif bir ajan olarak kabul edilmesi gerektiği sonucuna vardık.

Abstract:
Spinal cord injury (SCI) can occur as a consequence of various injuries such as car accidents, falls or gunshots. Traumatic SCI represents a serious medical and scientific challenge, being the cause of permanent neurological deficits and disabilities. Damage to the spinal cord is not only limited to the initial inju¬ry but may also continue with the secondary damage. At the present day, it appears to be impossible to treat primary damage leading to irreversible injury. After centuries of observing the catastrophic consequences of SCI, the conception of secondary damage defined by Allen was about to give hope for newly de¬veloped medical solutions. 

It is well known that cells can die in two mechanisms: necro¬sis and apoptosis. Primary injury caused by mechanical tissue damage results in necrotic cell death whereas secondary injury is the termination of a cascade of events triggered by activation of cell death mechanisms. On this account, most of the exper¬imental and clinical studies have focused on preventing secondary damage. Secondary injury process include edema, hemorrhage, inflammatory reaction, ischemia, the disruption of energy metab¬olism. Apoptosis is an actively regulated response that oc¬curs after various cells have been subjected to external or internal stimuli. For quite some time, it has been well demonstrated that spinal cord lesions are greatly exacerbated by apoptosis as a re¬sult of secondary damage.

In the present study we analyzed neuroprotective and antiapoptotic effect of the difumarate salt S-15176, as an anti-ischemic, an anti¬oxidant and a stabilizer of mitochondrial membrane in secondary damage following spinal cord injury (SCI) in a rat model. Three groups were performed with 30 Wistar rats; control (1), trauma (2), and a trauma+S-15176 treatment (3). SCI was performed at the thoracic level using the weight-drop technique. Spinal cord tissues were collected following intracardiac perfusion in 3rd and 7th days of posttrauma. Hematoxylin and eosin staining for histopatology, TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) assay for apoptotic cells and immunohistochemistry for proapoptotic cytochrome-c, Bax and caspase 9 were performed to all groups. Functional recovery test were applied to each group in 3rd and 7th days following SCI. In trauma group, edematous regions, diffuse hemorrhage, necrosis, leukocyte infiltration and severe degeneration in motor neurons were observed prominently in gray matter. The number of apoptotic cells was significantly higher (p<0.05) than control group. In the S-15176-treated groups, apoptotic cell number in 3rd and 7th days (p<0.001), also cytochrome-c (p<0.001), Bax (p<0.001) and caspase 9 immunoreactive cells (p<0.001) were significantly decreased in number compared to trauma groups. Results of the locomotor test were significantly increased in treatment group (p<0.05) when compared to trauma groups.
We suggest that difumarate salt S-15176 prevents mitochondrial pathways of apoptosis and protects spinal cord from secondary in¬jury and helps to preserve motor function following SCI in rats. 
Trimetazidine has been shown to limit the extent of cellular in¬juries in experimental models of ischemia-reperfusion. This effect was thought to be due to the preservation of mitochon¬drial functions. It is thought that S-15176 inhibits mitochondrial permeability transition, prevents the early step in apoptosis by preventing collapse of the electrochemical gradient across the mitochondrial membrane. Settaf et al. have shown its mem¬brane-stabilizing potential and anti-apoptotic effects on liver injury by using a rat model. 
These findings support the hypothesis that use of S-15176 is able to prevent the expres¬sion of pro-apoptotic proteins, which could develop in the early stages of the mitochondrial apoptosis pathway. Morphological evaluation have revealed that it would prevent secondary injury in trauma groups. Here we sug¬gest that S-15176 prevents the release of cyt-c from mitochon¬dria by stabilizing MMP and inhibits apoptotic cell death via knockdown of caspase-9 expression. We have come to the con¬clusion that S-15176 should be considered as a neuroprotective agent.