Tıbbi uygulamalar için bor içeren ftalosiyaninler
Boron substituted phthalocyanines for medicinal applications
Yazar: BAHAR BİRSÖZ
Danışman: PROF. DR. AHMET GÜL
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Ftalosiyaninler = Phthalocyanines ; Karakterizasyon = Characterization ; Sentez = Synthesis

Özet:
Ftalosiyaninler, birbirilerine mezo konumlardaki azot atomlarıyla bağlanan dört adet isoindol ünitesinden oluşan makroheterohalkalı bileşiklerdir. Porfirinlerin sentetik analogları olarak bilinirler. 2-boyutlu 18 adet π-elektronu içeren bu aromatik sistemler periyodik cetveldeki çoğu elementle koordinasyon kompleksi oluşturabilmektedirler. 
Ftalosiyaninler; çok çeşitli uygulama alanında ihtiyaç duyulan spesifik özelliklerin yapıya kazandırılabilmesi için ftalosiyanin halkasının modifikasyonuna olanak sağlayan esnek kimyasal sistemlere sahiptirler. Yüksek termal kararlılık, kimyasal dayanıklılık, yüksek renklendirme özelliği, yarı-iletkenlik, fotoiletkenlik, katalitik aktivite gibi üstün özellikleri nedeniyle ftalosiyanin ve türevleri detaylı bir şekilde incelenmiş ve çok farklı alanlardaki olası uygulamaları tespit edilmiştir. 
Ftalosiyaninlerin tıbbi uygulamalardaki kullanılabilirliği son yıllarda üzerinde önemle durulan noktalardan biri olmuştur. Ftalosiyaninler optik spektrumun kırmızı bölgesindeki (600-800 nm) güçlü absorpsiyonlarından dolayı son yıllarda kanser tedavisinde fotodinamik terapi (PDT) yöntemi olarak kullanılmaktadır. Ancak bu uygulamalar için bileşiklerin polar çözücülerde iyi çözünmesi gerekmektedir. Bunun yanında, porfirin ve ftalosiyaninlerin tümör yapılarında birikebilme kapasitesinden dolayı kanser tedavisi için kullanılan ve BNCT olarak tanımlanan Bor Nötron Yaklama Terapisi uygulamasında da kullanılabilirliği araştırılmaktadır. Ftalosiyanin ve porfirin gibi tetrapirol türevlerine birden fazla sübstitüe grubun bağlanabilmesi nedeniyle bu bileşikler BNCT yöntemi için ilgi çekici bileşikler haline gelmiştir. Böylelikle hedef hücreye yüksek derişimde bor yüklemesi yapılabilmektedir.
Ftalosiyaninler konusunda çok fazla sayıda çalışma bulunmasına rağmen subftalosiyaninler ve karboran sübstitüe ftalosiyaninler dışında bor içeren ftalosiyanin ve türevlerine yoğun bir ilgi gösterilmemiştir. 
Çalışmanın ilk kısmında; öncelikle başlangıç maddeleri sentezlenmiştir. Literatürde yer alan 4-nitroftalimid (1), 4-nitroftalamid (2), 4-nitroftalonitril (3) ve (Bu4N)[B12H11O(CH2CH2)2O] (4) bileşiklerinin sentezi gerçekleştirilmiştir. Daha sonra 4-nitroftalonitril (3) bileşiğinin 3,5-dimetoksifenol bileşiği ile baz-katalizli nükleofilik aromatik yerdeğiştirme reaksiyonu sonucu  literatürde yer almayan 4-(3,5-dimetoksifenoksi)ftalonitril (5) bileşiği elde edilmiştir.  Diğer bir başlangıç maddesi olan ve literatürde yer almayan 5-(3,5-dimetoksifenoksi)izoindol-1,3-diimin (6) bileşiğinin sentezi ise kuru metanol içerisindeki 5 bileşiğinin kuru sodyum metoksit eklenerek amonyak gazı altında önce oda sıcaklığında 2 saat süreyle daha sonra geri soğutucu altında 8 saat süreyle kaynatılarak karıştırılmasıyla elde edilmiştir. 
Dinitril bileşiğinin (5) FT-IR spektrumunda, C≡N gerilim titreşimine ait şiddetli pikin 2226 cm-1 ortaya çıkması hedeflenen yapının oluştuğunu göstermiştir. C-O-C piki 1250 cm-1 civarında gözlenmiştir. Aromatik protonlar 7,74-6,23 ppm arasında ve CH3-O protonları 3,81 ppm'de  gözlenmiştir. 5'ün 13C NMR spektrumunda nitril gruplarının varlığı 115,46 ve 115,03 ppm aralığında rastlanan sinyaller ile metoksi gruplarının varlığı ise 55,65 ppm civarındaki pikler ile kanıtlanmıştır. 6 bileşiğinin yapısı  nitril gruplarına ait absorpsiyon bandının (2226 cm-1) kaybolması ve C=NH grubuna ait şiddetli bir pikin 1593 cm-1 'de ortaya çıkmasıyla kanıtlanmıştır. Diiminoizoindolin grubuna ait imin protonu, 1H-NMR spektrumunda 7,20 ppm'deki pik ile de karakterize edilmiştir. 6'nın 13C NMR spektrumunda nitril gruplarından kaynaklanan 115 ppm civarındaki karbon piklerinin kaybolması ve C=NH karbon piklerinden kaynaklanan 161,48 ve 169,3 ppm'deki sinyallerin varlığı bu yapının doğruluğunu kanıtlamaktadır. 
Çalışmanın ikinci kısmında; tetradimetoksifenoksi sübstitüentler içeren metalsiz (7), çinko (8), kobalt (9) ve platin ftalosiyanin (10) sentezi gerçekleştirilmiştir. 7 bileşiği ftalonitril türevinin (5), 1-pentanol içerisinde azot atmosferi altında çözünmesi, lityum metali ilavesiyle geri soğutucu altında kaynatılması ve ardından asit çözeltisi ile muamele edilerek çöktürülmesi sonucu sentezlenmiştir. 8 bileşiğinin sentezi 5'in DMF, çinko(II)asetat ve DBU ortamında 24 saat süre ile geri soğutucu altında kaynatılmasıyla gerçekleştirilmiştir. Bir başka dimetoksifenoksi sübstitüe ftalosiyanin bileşiği olan kobalt ftalosiyanin (9) bileşiğinin sentezi ise metalsiz ftalosiyanin (7) bileşiğinin CoCl2 ile DMF içerisinde 80 oC'de 18 saat süreyle karıştırılarak muamelesinin ardından gerçekleşmiştir. 5-(3,5-dimetoksifenoksi)izoindol-1,3-diimin (6) bileşiğinin PtCl2 ile DMAE içerisinde geri soğutucu altında kaynatılmasının ardından 9 bileşiği elde edilmiştir. 
7, 8, 9 ve 10 nolu ftalosiyaninlerin IR spektrumlarında C≡N gerilim titreşimine ait 2226 cm-1 frekansında gözlenen pikin kaybolması, 1203-1041 cm-1 civarındaki C-O-C pikinin varlığını koruması bu bileşiklerin sentezini doğrulamaktadır. 7, 8 ve 10 nolu ftalosiyanin bileşiklerinin 1H-NMR spektrumunda, metoksi protonlarına ait pikler 3,83-3,48 ppm civarında kendini gösterirken, sadece 7 ftalosiyaninin spektrumunda gözlenen -2,1 ppm'deki pik metalsiz halka çekirdeğinde bulunan N-H piklerini ifade etmektedir. 7, 8, 9 ftalosiyanin bileşiklerinin 13C-NMR spektrumunda ortaya çıkan 54,40-55,20 ppm civarındaki metoksi gruplarına ait pikin varlığı bileşiklerin yapısını doğrulamaktadır. 7 ftalosiyaninin UV-vis spektrumunda gözlenen yarılmış haldeki Q bandının (667 nm, 701 nm) varlığı metalsiz 7 ftalosiyaninin yapısının bir kanıtıdır. Metalli 8, 9, 10 ftalosiyanin bileşikleri için Q bandına ait absorpsiyon pikleri sırasıyla 680, 671 ve 651 nm civarında gözlenmektedir.
Çalışmanın üçüncü kısmında; tetradimetoksifenoksi sübstitüentler içeren metalsiz (7), çinko (8), kobalt (9) ve platin ftalsoiyanin (10) bileşiklerinin hidroksi türevlerine dönüştürülerek tetradihidroksifenoksi sübstitüe ftalosiyaninler (11, 12, 13, 14) oluşturulmuştur. Bu amaçla diklorometan içinde çözünmüş halde ki 7, 8, 9, 10 bileşiklerine, BBr3 -80 oC'de eklenmiş, karışımın 24 saat süreyle oda sıcaklığında karıştırılmasının ardından 11, 12, 13, 14 bileşikleri elde edilmiştir.
11, 12, 13, 14 bileşiklerinin IR spektrumlarında –OH gruplarına ait gerilme bandı geniş bir pik şeklinde 3226 cm-1 civarında gözlenmiştir.  11, 12, 14 bileşiklerinin 1H-NMR spektrumlarında, fenolik OH proton sinyalleri sırasıyla 4,04 ppm, 4,22 ppm, 4,28 ppm civarında ortaya çıkması metoksi sübstitüe ftalosiyaninlerin hidroksillendiğini kanıtlamaktadır. 11, 12, 14'ün 13C-NMR spektrumlarında O-CH3 gruplarına ait 55 ppm civarındaki piklerin gözlenmemesi bileşiklerin hidroksillenme işleminin gerçekleştiğini ispatlamaktadır. Metalsiz 11 ftalosiyaninin absorpsiyon spektrumunda Q bandı yarılmış halde 663, 699 nm'de gözlenmektedir. 12, 13, 14 ftalosiyanin bileşiklerine ait absorpsiyon spektrumlarında ise Q bandı sırasıyla 677, 669, 606 nm'de ortaya çıkmaktadır. 
Çalışmanın son aşamasında; periferal pozisyonlarda dietilenoksifenoksi gruplarıyla bağlanmış sekiz adet dodekaboran sübstitüenti bulunduran metalsiz (15), çinko (16), kobalt (17), platin (18) ftalosiyaninler sentezlenmiştir. Asetonitril veya aseton içerisinde çözünmüş halde bulunan 11, 12, 13, 14 bileşikleri (Bu4N)[B12H11O(CH2CH2)2O]  (4) ile K2CO3 ve Bu4NBr ilavesiyle birlikte 24 saat süreyle geri soğutucu altında reaksiyona sokulur ve halka açılma reaksiyonu sonucu 15, 16, 17, 18 bileşikleri elde edilir.  
15, 16, 17, 18 bileşiklerinin FT-IR spektrumlarında 3226 cm-1'deki geniş –OH gerilme bandının kaybolması ve B-H gerilme titreşimleri için 2468 cm-1'deki şiddetli pikin varlığı hedeflenen yapıların oluştuğunu açık bir şekilde kanıtlamıştır. 15, 16, ve 18 bileşiklerinin 1H-NMR spektrumlarında, 64 adet butil grubuna ait protonların varlığı ftalosiyanine ait sayıca daha düşük olan aromatik protonların gözlenmesini zorlaştırmaktadır. Ftalosiyanine ait protonlar ancak bu bölgeye ait sinyallerin büyütülmesi durumunda farkedilebilmektedir. 15, 16, 18 bileşikleri için Bu4N+ protonlarına ait pikler 0,93-0,99 ppm, 1,30-1,38 ppm, 1,56-1,62 ppm, 3,16-3,23 ppm aralıklarında gözlenirken, fenoksietoksi gruplarına ait protonların varlığı sırasıyla 3,44, 3,40, 3,42 ppm'de gözlenmektedir. 15, 16 ve 18 nolu ftalosiyanin bileşiklerinde bulunan 16 adet tetrabutilamonyum grupları 13C-NMR spektrumunda ftalosiyanine ait aromatik karbonların ve alifatik karbonların gözlenmesine engel olmaktadır. 16 adet tetrabutilamonyum gruplarında bulunan 256 adet karbon atomu, ftalosiyaninde bulunan 16 adet karbon, benzen gruplarından gelen 24 adet karbon ve CH2-O karbonlarından gelen 32 adet karbon atomuna ait titreşim sinyallerinin gözlenmesini zorlaştırmaktadır. Bu nedenle 15, 16, 18 bileşiklerine ait 13C-NMR spektrumları incelendiğinde sadece bileşik içerisinde yoğun olarak bulunan tetrabutilamonyum gruplarına ait karbon atomlarının titreşim pikleri gözlenmektedir. 15, 16, 18 bileşiklerine ait 11B-NMR spektrumlarında 12 adet bor atomu için dört farklı titreşim sinyali gözlenmektedir. 15 ftalosiyaninin 11B-NMR spektrumunda 6,51 ppm'de singlet, -17,49 ppm'de üst üste çakışmış halde iki dublet ve -22,99 ppm'de dublet olmak üzere dört adet sinyal gözlenmektedir. 
Redoks açısından inaktif bir metal olan Zn(II) içermesi sebebiyle 16 nolu bileşik spektroelektrokimyasal ölçümler boyunca halka temelli karakter sergilemiştir. 17 nolu bileşik için elde edilen  ilk indirgenme çiftinin kobalt(I) türünün oluşumundan kaynaklandığı, -1,4 V potansiyelinde oluşan diğer indirgenme durumu ise halka temelli redoks işlemlerinden dolayı oluştuğu anlaşılmaktadır.
Bu tezin çalışma amacı kapsamında olan bor içeren bileşiklerin tıbbi alanlardaki uygulama çalışmaları dolayısıyla 16 nolu ftalosiyanin bileşiğinin biyolojik moleküllerle olan etkileşimi ve hücre içi birikme seviyesi incelenmiştir. Sonuç olarak; bir hücredeki sitoplazma hacminin ca. 1,210-12 L olduğu düşünülürse, 16'nın hücre başına sağladığı birikme miktarının 2,4107 bor atomu olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Teorik olarak yapılan tahminlere göre etkili bir BNCT uygulaması için bu değer hücre başına 109 bor atomu olarak belirlenmiştir. Yüksek negatif yüke ve düşük hücre içi birikime rağmen 16 bileşiği tümör hücrelerinde yüksek seviyede bor birikimine neden olmuştur ve bu durum yeni bor içeren ftalosiyanin modelleri için umut vericidir.

Abstract:
Phthalocyanines are macroheterocyclic compounds which comprise four isoindole units linked by nitrogen atoms at the meso position. They are known as the synthetic porphyrin analogues. These tetrapyrrolic macrocycles containing, a two-dimensional 18 π- electron aromatic system can form coordination complexes with most elements of the periodic table. 
Phthalocyanines have a versatile chemical system that is necessary to modify the phthalocyanine core for a broad range of applications in order to meet specific qualities suitable for their applications. Phthalocyanines and their derivatives have been extensively studied and found numerous applications in widely different areas due to their distinct properties like high thermal stability, chemical resistance, high colouring property, semiconductivity, photoconductivity, catalytic activity, etc. 
The availability of phthalocyanines in medicinal applications has been one of the most important research subjects in recent years. Phthalocyanines have also been succesfully used in photodynamic therapy of cancer (PDT) due to their intense absorption in the red region (600-800 nm) of the optical spectrum. For such applications a good solubility in polar solvents is preferred. Besides this, the availability of phthalocyanines and porphyrins in Boron Neutron Capture Therapy, known as BNCT, has been studied because of accumulation capacity of porphyrins and phthalocyanines in tumour structures. Because of the reason that more than one substituted groups can be connected to the tetrapirol derivatives such as porphyrin and phthalocyanines, these macrocyclic compounds have become of interest for BNCT method. Thus high concentration of boron can be installed to the target cell.
Although phthalocyanines have been extensively studied, not much attention has been paid to the boron containing phthalocyanine derivatives except for sub-phthalocyanines and carborane substituted ones. 
In the first part of this study; firstly, starting materials were prepared. The synthesis of 4-nitrophthalimide (1), 4-nitrophthalamide (2), 4-nitrophthalonitrile (3) and (Bu4N)[B12H11O(CH2CH2)2O] (4) were done according to the literature. 4-(3,5-dimethoxyphenoxy)phthalonitrile (5), which is not found in literature, was prepared by a base-catalyzed nucleophilic aromatic displacement of 4-nitrophthalonitrile with 3,5-dimethoxyphenol. The other novel starting material, 5-(3,5-dimethoxyphenoxy)isoindol-1,3-diimine (6), was prepared by the reaction of 5 in dry methanol with dry sodium methoxide under ammoniacal atmosphere at room temperature for 2 hours, than for 8 hours at reflux.
The FT-IR spectrum of dinitrile 5 confirmed the proposed structure by the appearance of an intense peak at (2226 cm_1)  for CN stretching vibrations. C-O-C peak came out at 1250 cm_1. The aromatic protons appeared at 7.74-6.23 ppm and CH3-O protons were observed at 3.81 ppm. The presence of nitrile groups was also evidenced by signals at 115.46 and 115.03 ppm, the presence of methoxy groups was identified by the signals at 55.65 ppm in the 13C NMR of 5. The structure of 6 was confirmed by the disapperance of the absorption bands of nitrile groups (2226 cm-1) and appearance of intense band attributed to the C=NH group at 1593 cm-1. The signal at 7.20 ppm in 1H-NMR spectrum of 6 of imine proton belongs to diiminoisoindoline group. The 13C-NMR spectrum proves the structure of 6  by the disappereance of nitrile group signals at around 115 ppm and appearence of C=NH carbon peaks at around 161.48 and 169.3 ppm.
In the second part of this study; the synthesis of metal-free (7), zinc (8), kobalt (9) and platinium (10) phthalocyanines substituted with tetradimethoxyphenoxy groups were done. Phthalocyanine 7 was synthesized by the treatment of phthalonitrile derivative (5) with lithium metal in 1-pentanol under nitrogen atmosphere and by precipitating with addition of acid. The synthesis of 8 was done by refluxing the compound in DMF, zinc(II)acetate and DBU for 24 hours. Another dimethoxyphenoxy substituted phthalocyanine compound, cobalt phthalocyanine (9), was synthesized by the treatment of metal-free phthalocyanine (7) with CoCl2 in DMF at 80 oC for 18 hours. Phthalocyanine 9 was obtained by refluxing 5-(3,5-dimethoxyphenoxy)isoindoline-1,3-diimine (6) with PtCl2 in DMAE.  
The IR spectrums of phthalocyanines 7, 8, 9, 10 confirmed the structures of target compounds by exhibiting the disappearence of  C≡N band at 2226 cm-1 and the presence of C-O-C peak around 1203-1041 cm-1. The 1H-NMR spectrums of 7, 8 and 10 showed the signals of methoxy protons at around 3.83-3.48 ppm, whereas the signal at -2.1 ppm that indicates the N-H peaks in metal-free cyclic core was present in the spectrum of 7. The 13C-NMR spectrums of 7, 8 and 10 demonstrated the formation of complex by the presence of signals belong to methoxy groups at around 54.40-55.20 ppm. The spliting of Q-band (667 nm, 701 nm) in UV-vis spectrum of 7 confirmed the structure of metal-free 7. The absorption peaks belong to Q-band of 8, 9 and 10 observed around 680, 671 and 651 nm.
At the third part of this work, tetradimethoxyphenoxy substituted metal-free (7), zinc (8), cobalt (9) and platinium (10) phthalocyanines were deprotected with BBr3 and tetradihydroxyphenoxy substituted phthalocyanines (11, 12, 13, 14) were obtained.    For this purpose, BBr3 was added at -80 oC  to the solutions of 7, 8, 9, 10 in dichloromethane, after mixing the solutions for 24 hours at room temperature compounds of 11, 12, 13 and 14 were obtained. 
In the FT-IR spectrums of 11, 12, 13, 14 the stretching band for the -OH groups appeared at 3226 cm-1 as a broad peak. According to the 1H-NMR spectrums of 11, 12 and 14 the appearance of phenolic OH proton signals at 4.04 ppm, 4.22 ppm, 4.28 ppm respectively proved deprotection of methoxy substituted phthalocyanines. The hydroxylation process was confirmed by the appearance of O-CH3 peak at around 55 ppm in 13C-NMR spectrums of 11, 12 and 14. The absorption spectrum of metal-free phthalocyanine 11 showed the Q-band splitted as 663 nm, 699 nm. The absorption spectra of 12, 13 and 14 showed the Q bands at 677, 669nm, 606 nm respectively. 
In the last part of this work, metal-free (15), zinc (16), cobalt (17) and platinium (18) phthalocyanines with eight dodecaborate substituents bonded with diethyleneoxyphenoxy groups at peripheral positions were synthesized. The solution of 11, 12, 13, 14 phthalocyanines in acetonitrile or acetone was reacted with (Bu4N)[B12H11O(CH2CH2)2O] (4) and refluxed with addition of K2CO3 and Bu4NBr for 24 hours, as a result of ring opening reaction 15, 16, 17, 18 were obtained.  
The FT-IR spectra of 15, 16, 17 and 18 clearly indicated the formation of proposed structure by the disappearence of broad -OH stretching band at around 3226 cm-1 and the appereance of intense B-H stretching band at around 2468 cm-1.  In the 1H-NMR spectrum of 15, 16, 17, 18 it was hard to observe the aromatic protons of phthalocyanine ring, which was lower in number, because of protons of 64 butyl groups. The protons belong to phthalocyanine ring could be noticed in the case of expansion of the signals in this region. The Bu4N+ protons of 15, 16, 18 observed in the range of 0.93-0.99 ppm, 1.30-1.38 ppm, 1.56-1,62 ppm, 3.16-3.23 ppm, whereas protons of phenoxyethoxy groups observed at 3.44, 3.40, 3.42 ppm, respectively. The presence of 16 tetrabutylammonium groups of 15, 16, 18 prevented the observation of aromatic and aliphatic carbons belong to phthalocyanine also in 13C-NMR spectra. 256 carbon atoms present in 16 tetrabutylammonium groups complicated the observation of the signals of 16 carbon atoms belong to phthalocyanine, 24 carbon atoms belong to benzene groups and 32 carbon atoms belong to CH2-O groups. Because of that reason, the 13C-NMR spectra of 15, 16, 18 showed just the signals came from tetrabutylammonium groups. 11B-NMR data of 15 indicated  the signals at 6.51 ppm (s), -17.49 ppm (two overlapped doublet peak) and -22.99 ppm (d). That of phthalocyanine 16 exhibited the signals at 6.48 ppm (s), -17.24 ppm (two overlapped doublet peak) and 23.04 ppm (d). 11B-NMR data of 18 indicated  four signals at 6.44 ppm (s), -17.20 ppm (two overlapped doublet peak) and -20.29 ppm (d). 
Compound 16 displays ring-based characters during spectroelectrochemical measurements due to the redox inactive metal at the core. the first reduction couple of compound 17 is ascribed to the formation of cobalt (I) species. Further reduction of 17 at -1.4 V indicates a ring based redox process.
In the case of the aim of this study, which is medicinal applications of boron substituted phthalocyanines, interactions of 16 with biological molecules and its intracellular accumulation and distrubition was studied. Consequently, assuming that cytoplasm volume of a cell is ca. 1.2×10-12 L, once can calculate that 16 provides accumulation of 2.4×107 boron atoms per cell. According to a theoretical estimation ca. 109 boron atoms per cell is required for efficient BNCT. Despite very high negative charge and rather low intracellular molar concentration, phthalocyanine 16 provides high level of boron accumulation in the tumor cells and can be considered as promising model for synthesis of new boron-containing phthalocyanines.