İnsan karbonik anhidraz ıı enziminin (hCA II) klonlanması, E. coli'de ekspresyonu, karakterizasyonu, yönlendirilmiş mutagenez ile mutant hCA II genlerinin eldesi ve mutant proteinlerin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması
Cloning, expression in E. coli, characterization of human carbonic anhydrase ii (hCA II) enzyme, production of mutant hCA II genes by site directed mutagenesis and investigation of affinity of mutant proteins to inhibitors
Yazar: DERYANUR KILIÇ
Danışman: PROF. DR. ÖMER İRFAN KÜFREVİOĞLU
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
İnsan karbonik anhidraz II (hCA II) enzimi ilk kez pET SUMO ekspresyon vektörü kullanılarak E. coli'de eksprese edildi ve rekombinant enzim, nikel (Ni+2) afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. hCA II'nin hidrofobik kısmındaki Trp 209 aminoasiti, bölge yönelimli mutagenez yöntemi ile dört farklı amino asit (Val, Leu, Ile ve Pro) ile yer değiştirdi. hCA II varyantlarının p-nitrofenilasetat esteraz aktivitesi, hidrofobiklik ve rezüdü hacmi ile ilişkilidir, bu bilgi Trp 209 rezidüsünün hidrofobikliğinin katalizleme için önem taşıdığını düşündürmektedir. Bu rezidü önemli bir rezidü olarak tahmin edildi ve bu rezidünün hesaplamalı mutagenezi gerçekleştirildi. Bu öngörü, hCAII mutantlarını (W209V, W209L, W209I, W209P) deneysel olarak üreterek ve bazı benzenesülfonamidlere karşı ilgilerini belirleyerek teyit edildi. Dört mutant enzim doğal tip enzimle kıyaslandığında, benzensülfonamidlere karşı daha az ilgi gösterdi. W209V mutantı, doğal tip enzim ile benzer spesifik aktivite değerlerine sahipken; W209P, W209L ve W209I mutantları doğal tip enzime kıyasla p-nitrofenil esteraz aktivitesinde sırasıyla %60, %30 ve %20 oranında daha az aktif olduğu belirlendi. Enzimin aktif bölgesinin hidrofobik kısmındaki bu mutasyonlar, çözünmeyen protein agregatlarının oluşumuna neden olduğundan, E. coli'de hCA II'nin protein ekspresyonunu azalttı. Bu çalışmadaki bulgularımız hCA II'deki Trp 209'un katlanma sürecinde önemli rol oynadığını ve valin rezidüsünün bu izoenzimin aktif boşluğundaki hidrofobik bölge ile çok uyumlu olduğunu gösterdi. Bu mutant proteinler, gelecekte enzimin yapısal fonksiyonlarının ve ilaç temelli çalışmalarının anlaşılmasına yol açacaktır.

Abstract:
Human carbonic anhydrase II (hCA II) enzyme was firstly expressed using pET SUMO expression vector in E. coli and the recombinant enzyme was purified using nickel (Ni2+) affinity chromatography. The substitutions of Trp 209 with four amino acid (Val, Leu, Ile, and Pro) in the hydrophobic pocket of hCA II were made using site-directed mutagenesis. The p-nitrophenyl esterase activity of hCA II variants correlate with the hydrophobicity and size of residue, suggesting that the hydrophobic character of this residue is important for catalysis. The Trp 209 was forecast as an important residue and was exposed to computational mutagenesis. This forecast was confirmed experimentally by producing hCA II mutants (W209V, W209L, W209I, W209P) and determining the resulting affinities towards some benzenesulfonamides. Affinity for benzenesulfonamides was reduced in the four mutants compared to wild type (wt). The W209V mutant showed similar specific activity values with the wt enzyme, whereas the W209P, W209L and W209I mutants were less active around 60%, 30%, 20% in p-nitrophenyl esterase activity compared to the wt, respectively. These mutations in the hydrophobic pocket of the enzyme active site decreased the protein expression of hCA II in E. coli, causing the formation of insoluble protein aggregates in many cases. Our findings demonstrated that the Trp 209 in hCA II plays important role the folding process and the valine residues are very compatible for hydrophobic region in active cavity of this isoenzyme. These mutant proteins will lead to the understanding of structural functions of enzyme and drug-based studies in the future.