N. benthamiana'da P. falciparum Pfs48/45 R0.10C varyantlarının tasarlanması, üretimi ve karakterizasyonu
Design, production and characterization of Pfs48/45 R0.10C variants P. falciparum's in N. benthamiana
Yazar: KADER ÇİÇEK
Danışman: PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics

Özet:
Günümüzde sıtmaya karşı birçok aşı geliştirilme aşamasında olmasına rağmen yeterli derecede koruma sağlayan etkili bir aşı henüz bulunmamaktadır. Doğal Pfs48/45 proteini Nbağlı glikan taşımamaktadır, fakat bitki ekspresyon sistemleri de dahil olmak üzere herhangi bir ökaryotik sistemde anlatımı yapıldığında anormal şekilde glikosilasyona uğrayan yedi potansiyel N-bağlı glikosilasyon bölgesi içermektedir. Anormal glikosilasyon problemini çözmek için geçici gen anlatımı yöntemi aracılığıyla N. benthamiana da ilgili hedef gen ile bakteriyel deglikosilasyon enzimleri olan PNGase F (Mamedov vd. 2012; Mamedov vd. 2013; Mamedov vd. 2016) veya Endo H enzimlerinin (Mamedov vd. 2017) birlikte ekspresyonu stratejisi geliştirildi. Bu çalışmada, geçici gen anlatımı yöntemi ile N. benthamiana bitkisinde Pfs48/45 proteininin 10C domaininin farklı versiyonları (glikosillenmiş ve deglikosillenmiş) başarılı bir şekilde üretildi. Üretilen 10C varyantları saflaştırıldı ve karakterize edildi. Pfs48/45-10C varyantlarının MRA-26 antikorları (iletim bloklama antikoru olarak bilinen bir konformasyonel spesifik antikor) kullanılarak gerçekleştirilen western blot analizleri, indirgenmemiş anormal şekilde glikosilasyona uğramış Pfs48/45-10C proteininin MR-26 antikoru tarafından çok az ya da hiç tanınmadığını; bitkide PNGase F veya Endo H in vivo olarak üretilen indirgenmemiş deglikosile Pfs48/4510C proteininin antikorlar tarafından güçlü bir şekilde tanındığını göstermiştir. Bu sonuçlar bitkide Endo H veya PNGase F aracılığıyla in vivo deglikosilasyona uğramış Pfs48/45-10C proteinlerinin doğru katlandığını ve Pfs48/45-10C proteinlerinin doğal Pfs48/45 proteini üzerinde bulunan epitopları içerdiğini desteklemektedir. Elde edilen sonuçlar, bitkide üretilmiş Endo H in vivo deglikosillenmiş Pfs48/45 ve Pfs48/45-10C antijenlerinin Pfs48/45 tabanlı iletim bloklama sıtma aşısının geliştirilmesi için potansiyele sahip olduğunu desteklemektedir.

Abstract:
Although many efforts have been made toward developing malaria vaccines, however, no vaccine is currently available that provides a satisfactory level of protection against malaria. The native Pfs48/45 protein does not carry N-linked glycans but contains seven potential N-linked glycosylation sites which can be aberrantly glycosylated during expression in any eykaryotic system including plant expression systems. To solve the aberrant glycosylation problem, a strategy was developed by co-expression of the bacterial deglycosylation enzymes, PNGase F (Mamedov et al. 2012; Mamedov et al. 2013; Mamedov et al. 2016) or Endo H enzymes (Mamedov et al. 2017) with target proteins of interest in N. benthamiana plant by transient expression technology. In this study, we successfully produced different versions (glycosylated and deglycosylated) of the 10C domain of the Pfs48/45 protein in Nicotiana benthamiana plant by transient expression. Plant produced 10C-varants were purified and characterized. It should be noted that 10C domain of the Pfs48/45 protein is one of the most important candidates for the development of the transmission blocking vaccine (TB).  Western blot analysis of Pfs48/45-10C variants using MRA-26 antibody (a conformational specific MRA-26 antibody, known as TB antibody), showed that MRA-26 antibody did not recognized or weakly recognized the aberrantly glycosylated Pfs48/45-10 in non-reduced samples, but strongly recognized plant produced Endo H and PNGase F in vivo deglycosylated Pfs48/45-10 proteins in non-reduced samples. These results suggest correct folding of plant produced, in vivo Endo H or PNGase F deglycosylated Pfs48/45-10C proteins, and also suggest that Pfs48/45-10C proteins contain epitopes present on native Pfs48/45. Taken together, our results collectevely support that plant produced Endo H in vivo deglycosylated Pfs48/45 and Pfs48/45-10C antigens have a potential for the development of a Pfs48/45-based TB malaria vaccine.