Biyofiziksel ve biyokimyasal uyaranlarla desteklenmiş doku iskeleleri ile mezenkimal kök hücrelerin osteojenik farklılaşmasının incelenmesi
Investigation of osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells with scaffolds supported by biophysical and biochemical stimulants
Yazar: ANIL SERA ÇAKMAK
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2014
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Sunulan tez çalışması kapsamında, farklı biyomalzemeler kullanılarak biyofiziksel ve biyokimyasal uyaranlar varlığında mezenkimal kök hücrelerin osteojenik farklılaşma potansiyellerinin incelenmesi hedeflenmiştir. Bu amaca yönelik olarak gerçekleştirilen deneysel çalışmalarda, kitosan doku iskeleleri ile fotostimülasyon, ipek biyomalzemeler ile elektrostimülasyon çalışmaları yürütülmüştür.
Fotostimülasyon çalışmalarında kullanılan kitosan doku iskeleleri, liyofilizasyon yöntemi ile üretilmiş ve yapısal özellikleri belirlenmiştir. Sıçandan izole edilen adipoz kökenli kök hücreler (AdMSC) TCPS (hücre kültür kabı) yüzeylerde ve kitosan doku iskelelerinde 28 gün boyunca kültüre edilmiştir. Fotostimülasyon çalışmaları 590-1395 nm dalga boyu aralığındaki ışıkları içeren plazma ark kaynağı kullanılarak yapılmış ve hücreler gün aşırı ışığa maruz bırakılmıştır. TCPS yüzeylerde uygulama mesafesi 10 cm, uygulama süresi 5 dk ve kitosan doku iskeleleri için uygulama mesafesi 10 cm, uygulama süresi 5 dk olarak belirlenmiştir. Işığın her iki koşulda da, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında hücre proliferasyonunu arttırdığı belirlenmiştir. TCPS yüzeylerde,  ışık varlığındaki hücrelerin farklılaşmış morfolojisi, floresan mikroskop görüntüleri ile ortaya koyulmuştur. Ayrıca, optik mikroskop görüntüleri ile fotostimülasyonun uygulanan hücrelerde, hücre canlılığının daha uzun süre korunduğu belirlenmiştir. SEM analizi sonucu, ışık ile muamele edilen kitosan doku iskelelerinde, kontrol grubuna göre, daha yoğun ve homojen bir hücre dağılımına rastlanmıştır. TCPS yüzeylerdeki matris mineralizasyonu Alkalin fosfataz-von Kossa (ALP-VK) boyamalar ile görüntülenmiş ve ışığın mineralize matris üretimini arttırdığı tespit edilmiştir. Kitosan iskeleler ile yapılan von Kossa boyamalarda da, ışık uygulanan doku iskelelerinin daha koyu boyandığı görülmüştür. Hücre farklılaşmasının moleküler düzeyde incelenmesi amacıyla gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yapılmıştır. TCPS yüzeylerde ışığın kollajen tip 1 (Col1a1) ekspresyonunu uyardığı belirlenmiş ancak alkalin fosfataz (Alp), runt-ilişkili transkripsiyon faktör (Runx2) ve osteopontin (Opn) ekspresyon seviyeleri arasında anlamlı bir fark bulunamamıştır. Kitosan doku iskelelerinde ise, belirtilen genler açısından, ışığın gen ekspresyonları seviyesinde bir etkisine rastlanmamıştır.
Elektrostimülasyon çalışmalarında ipek filmler ve ipek doku iskeleleri kullanılarak, elektriksel alanın hem 2-boyutlu hem de 3-boyutlu sistemlerde, insan kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (hMSC) osteojenik farklılaşması üzerindeki etkileri incelenmiştir. Bu amaçla, öncelikle hMSC'lerin kemik iliğinden izolasyonu ve karakterizasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Literatür bilgileri ışığında hücreler üzerine alternatif akım (AC) kullanılmasına karar verilmiştir. İpek filmler ile yürütülen elektrostimülasyon çalışmalarında, platin tel içeren ipek filmler kullanılmıştır. Optimizasyon çalışmaları sonucunda, 2.5 mm elektrot mesafesi ve 60 kHz frekans kullanılmasına karar verilmiştir. Yapılan analizler sonucu düşük voltajın hücre farklılaşması (10 mV), yüksek voltajın (50, 100, 250 ve 500 mV) ise hücre proliferasyonu üzerinde etkisi olduğu belirlenmiştir. Ayrıca elektrostimülasyon çalışmaları, faklılaşma ve büyüme ortamı olmak üzere farklı koşullarda yürütülmüş, elektriksel alanın, büyüme ortamı varlığında hücre proliferasyonunu, farklılaşma ortamı varlığında hücre farklılaşmasını uyardığı tespit edilmiştir. 10 mV ile yapılan çalışmalarda, Alizarin red boyamaları, elektriksel alanın,  hücrelerin erken mineralizasyonunu uyardığını göstermiştir. Kültürün ilerleyen günlerinde, kontrol grubuna göre, elektrik uygulanan gruplarda mineralizasyon önemli derecede artmıştır. SEM analizi ile hücre-malzeme etkileşimleri ve elektriksel alan varlığında oluşan mineralize nodüller gösterilmiştir.  
İpek doku iskeleleri ile yapılan çalışmalarda, kullanılan doku iskeleleri çözücü döküm-partikül uzaklaştırma yöntemi ile üretilmiştir. Üretilen doku iskeleleri, Petri kapları içerisinde, karbon elektrotlar arasına yerleştirilmiş ve kültür ortamı aracılığıyla elektriksel alan ile etkileşime girmeleri sağlanmıştır. 3-boyutlu sistemlerde yapılan elektrostimülasyon çalışmalarında, dışarıdan uygulanan elektriksel alan yanında, hücre içerisinde de elektriksel sinyaller oluşturmak hedeflenmiştir. Bu amaçla, hücre membranındaki iyon kanalları üzerinde etkisi olduğu bilinen, monensin ve glibenklamid adlı kimyasallar kullanılmış ve bu kimyasallar ile elektriksel alanın, osteojenik farklılaşma üzerindeki sinerjik etkisi incelenmiştir. İpek doku iskeleleri ile yapılan çalışmalarda, film çalışmalarında belirlenen 60 kHz frekans değeri olarak kullanılmıştır. Elektrotlar arası mesafe 8 mm ve optimizasyon çalışmaları doğrultusunda, voltaj 200 mV olarak seçilmiştir. 3-boyutlu sistemlerde, elektrostimülasyonun ve biyokimyasalların hücre proliferasyonu üzerinde etkisi gözlenmemiştir. Gruplar arasında karşılaştırılma yapıldığında, monensinin erken dönem osteojenik genler olan ALP ve RUNX2 ekspresyonlarını arttırdığı görülmüştür. Örneklerdeki ALP aktivitesi de bu sonucu desteklemektedir. Monensinin COL1A1, BSP ve OPN ekspresyonlarını ise inhibe ettiği görülmüş, elektriksel alan varlığında bu inhibisyonun ortadan kalktığı belirlenmiştir. Diğer yandan glibenklamidin, özellikle BSP ve OPN gibi geç dönem osteojenik genler üzerinde etkisi olduğu tespit edilmiş, örneklerdeki Ca içeriği de benzer sonuçları vermiştir. Glibenklamid, elektriksel alan ile birlikte hMSC'ler üzerinde sinerjik bir etki oluşturmuş ve osteojenik farklılaşmayı arttırmıştır. SEM analizi ile hücre morfolojisi incelenmiş, hücrelerin gözeneklerin iç kısmına yerleşerek, kollajen fiberler ve mineralize nodüller sentezledikleri belirlenmiştir. Tüm örnekler için, hemotoksilen&eozin boyamaları etkin bir hücre-malzeme etkileşimini işaret etmektedir. Alizarin red ve von Kossa boyamaları da RT-PCR sonuçlarını desteklemektedir. Elektriksel alan varlığında, glibenklamid ile muamele edilen örneklerde, çok daha büyük ve homojen bir mineralizasyona rastlanmıştır. 
Elde edilen veriler, mezenkimal kök hücrelerin metabolik aktivitelerinin düzenlenmesinde, fotostimülasyon ve elektrostimülasyon gibi biyofizksel uyaranların etkin bir rol oynadığını göstermektedir. Meydana gelen hücresel cevap, hücre tipine, mikroçevreye ve uygulama parametrelerine göre değişiklik göstermektedir. Hücre farklılaşmasında rol oynayan bir diğer faktör de biyokimyasal uyaranlardır. Bu amaçla kullanılan monensin ve glibenklamidin, elektrostimülasyon ile sinerjik bir etki oluşturduğu belirlenmiştir.

Abstract:
The aim of this study is to investigate the osteogenic differentiation potential of mesenchymal stem cells in the presence of biophysical and biochemical stimulants by using different biomaterials. For this purpose, photostimulation studies were carried out with chitosan scaffolds, while electrostimulation studies were realized by the use of silk biomaterials.	
Chitosan scaffolds, which were used in photostimulation studies, were fabricated by lyophilization technique. Adipose derived mesenchymal stem cells (AdMSCs), which were isolated from rats, were cultured on TCPS surfaces and chitosan scaffolds for 28 days. Photostimulation studies were carried out by using a plasma arc source including 590-1395 nm wavelengths and cells were exposed to light every other day. For TCPS surfaces, exposure distance was 10 cm and exposure time was 5 min, while exposure distance and time were determined as 10 cm and 5 min, respectively for chitosan scaffolds. In both cases, it was seen that the light increased cell proliferation when compared to control group.
Florescence microscopy images showed the differentiated morphology of the cells on TCPS surfaces in the presence of light exposure. In addition, sustained viability was detected by optical microscopy images for the cells on which photostimulation was applied. SEM analysis showed that photostimulated scaffolds had denser and uniform cell distribution when compared to control groups. Matrix mineralization on TCPS surfaces was visualized by alkaline phosphatase-von Kossa (ALP-VK) staining and it was detected that the light exposure increased mineralized matrix production. Similarly in ALP-VK staining of chitosan scaffolds, darker staining was seen in the scaffolds, which were exposed to light. To analyze cell differentiation in molecular level, real time polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis was done. It was seen that the light stimulated the expression of Col1a1 on TCPS surfaces, whereas no statistical difference was found for the expression levels of alkaline phosphatase (Alp), runt related transcription factor 2 (Runx2) and osteopontin (Opn). In chitosan scaffolds, no effects of light was found on the expression of prementioned genes.
In electrostimulation studies, silk films and silk scaffolds were used and the effects of electrical field on osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs) were investigated in both 2D and 3D systems. For this purpose, hMSCs were isolated from bone marrow and the characterization studies were carried out as a first step. In the light of the related literature, alternative current (AC) was selected for cell stimulation. For the electrostimulation studies carried out in 2D, silk films having platinium wires were used. After optimization studies, electrode distance was selected as 2.5 mm while frequency was selected as 60 kHz. The analysis showed that low voltage (10 mV) had influence on cell differentiation, whereas high voltage (50, 100, 250 and 500 mV) effected cell proliferation. In addition, electrostimulation studies were realized in two different culture conditions by using differentiation medium and growth medium, and the results demonstrated that cell proliferation was stimulated in growth medium, while cell differentiation was stimulated in differentiation medium. In the studies that were carried out with 10 mV, Alizarin red staining showed that the electrical field stimulated early mineralization of cells. In the following days of culture, mineralization was enhanced significantly in the electrostimulated groups when compared to control group. Cell-biomaterial interactions and the mineralized nodules formed in the presence of electrical field were visualized by SEM analysis.
For the electrostimulation studies carried out in 3D, silk scaffolds were fabricated by solvent casting-particulate leaching method. The scaffolds were inserted between carbon electrodes in Petri dishes, so that they could interact with the electrical field via culture medium. In 3D electrostimulation studies, in addition to external electrical field application, it was aimed to produce electrical signals within the cells. Towards this goal, chemicals like monensin and glibenclamide were used, which are known to have effects on ion channels on cell membrane and synergistic effect of these chemicals with the electrical field on osteogenic differentiation was examined. In the studies carried out with silk scaffolds, 60 kHz was used since this frequency value was determined in silk film studies.  The distance between the electrodes was selected to be 8 mm and the voltage value was determined as 200 mV after optimization studies. In 3D systems no effects of electrostimulation and biochemicals were observed on cell proliferation. When the results obtained from different groups were compared, monensin was shown the increase the expression of early osteoblastic genes like ALP and RUNX2. The ALP activity of the samples also supported this finding. While monensin was shown to inhibit the expression of COL1A1, BSP and OPN, it was seen that the inhibition was disappared in the presence of an electric field. On the other hand, it was detected that glibenclamide had effects on the expression of late osteogenic genes, particularly on BSP and OPN, and the Ca contents of the samples gave similar results. When used with electrical field, glibenclamide had a synergistic effect on hMSCs and enhanced osteogenic differentiation. Cell morphology was examined by SEM analysis and it was determined that cells were located at the inner parts of the pores synthesizing collagen fibers and mineralized nodules. For all samples, hematoxylene&eosin staining indicated the presence of active cell-material interactions. Alizarin red and von Kossa staining results supported the findings of RT-PCR analyses. For the samples, which were treated with glibenclamide, much more bigger and homogeneously distributed mineralization was obtained by the presence of electrical field.
The findings of this study showed that biophysical stimulants such as photostimulation and electrostimulation had an effective role on the regulation of metabolic activity of mesenchymal stem cells. However, the cellular response varies depending on the cell type, microenvironment and operational parameters. The other factors which contribute to cell differentiation are the biochemical stimulants. Monensin and glibenclamide, which were used as biochemical stimulants, were found to have a synergistic effect for the differentiation of hMSCs.