Kemik doku onarımı için hidroksiapatit/peptit amfifil bazlı nanokompozit doku iskelelerinin geliştirilmesi
Development of hydroxyapatite/peptide amphiphile based nanocomposite scaffolds for bone tissue repair
Yazar: SONER ÇAKMAK
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Nanoteknoloji ve Nanotıp Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Bu çalışmanın bir bölümü, 112M442 No'lu TÜBİTAK Hızlı Destek Projesi ile desteklenmiştir. Ayrıca, tezin sahibi Soner Çakmak'ın Amerika Birleşik Devletleri'nde gerçekleştirdiği çalışmalar, Hacettepe Üniversitesi Uluslararası İşbirliği Destekleme Projesi altında 13 G 602 003 No'lu proje ile desteklenmiştir. Sunulan tez çalışması kapsamında, kemik ve osteokondral doku mühendisliğinde kullanılabilecek farklı içerikte biyomalzemeler tasarlanmış, üretilmiş ve bu biyomalzemelerin etkinliği in vitro hücre kültürü deneyleriyle incelenmiştir. Bu amaca yönelik olarak üretilen iki-fazlı peptit amfifil (PA)/hidroksiapatit (HA) doku iskelesiyle kemik doku mühendisliği, üç-fazlı ipek-HA/ipe k/PA doku iskelesiyle ise osteokondral doku mühendisliği çalışmaları gerçekleştirilmiştir.
Kemik doku mühendisliği çalışmalarında kullanılan nanofiber yapıda HA matrisler elektroeğirme yöntemiyle, arjinin-glisin-aspartik asit (RGD) taşıyan PA hidrojeller (PA-RGD) ise kendiliğinden düzenlenme yöntemiyle üretilmiştir. Fourier transform kızıl ötesi spektroskopisi (ATR-FTIR) ve X-ışını kırınımı (XRD) analizleriyle HA nanofiber matrisin kimyasal yapısı doğrulanmıştır. Bu yapının yüksek kristaliniteye sahip olduğu görülmüş, ayrıca içeriğinde bulunan CaCO3 nedeniyle saf HA'ya göre daha biyobozunur bir malzeme olabileceği düşünülmektedir. Taramalı ve geçirimli elektron mikroskobu (SEM ve TEM) analizleriyle HA nanofiberlerin 437 ± 64 nm çapa sahip oldukları görülmüştür.  PA-RGD hidrojellerin kendiliğinden düzenlenme ve jelleşme sonrası hücre dışı matris (ECM) yapısına benzer nanofiber düzenlenme gösterdiği AFM analiziyle gösterilmiştir. Peptit nanofiberlerin ortalama çapı, SEM görüntüleri üzerinden 100 ± 64 nm olarak hesaplanmıştır. Dairesel dikroizm ve ATR-FTIR analizleriyle, nanofiber düzenlenmenin β-tabaka ikincil yapı üzerinden gerçekleştiği ve biyoaktif sekans olan RGD'nin fiber yüzeyinde yerleştiği bulunmuştur. İn vitro çalışmalarda, kemik öncülü MC3T3-E1 hücreleri PA-RGD jeller içerisine enkapsüle edildikten sonra HA nanofiber matris bu jel içerisine yerleştirilerek nanokompozit yapı oluşturulmuştur. Hücre proliferasyonu analiziyle, HA, PA-RGD ve PA-RGD/HA doku iskelelerinin üçünde de 7. günden sonra hücre proliferasyonunun arttığı görülmüş ve 18. günde en yüksek proliferasyonun PA-RGD jelde olduğu bulunmuştur. Floresan mikroskobu ve SEM analizleriyle, hücrelerin her üç doku iskelesinde de osteoblastik morfoloji gösterdikleri tespit edilmiştir. Alkalin fosfataz (ALP) aktivitesi analiz sonucuna göre, yapıya HA eklenmesiyle çok daha etkin bir osteojenik farklılaşma gerçekleştiği sonucuna varılmıştır. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yöntemiyle bu malzemelerde bulunan hücrelerin erken dönem gen olan Alp ve geç dönem genler olan osteokalsin (Ocn) ve kemik sialoprotein (Bsp) ekspresyonları incelenmiştir. Alp ve Ocn ekspresyon seviyeleri bakımından kültür boyunca örnekler arasında bir fark görülmemekle birlikte, 18. gündeki Bsp ekspresyon seviyesinin PA-RGD/HA nanokompozit yapıda çok daha yüksek olması bu yapının osteojenik farklılaşmanın en önemli belirteci olan kemik mineralizasyonunu diğer örneklere göre çok daha fazla desteklediğini göstermiştir. Tüm bu sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde, PA-RGD/HA nanokompozit doku iskelesinin kemik doku mühendisliği uygulamalarında başarılı bir şekilde kullanılabileceği görülmüştür. 
Tezin ikinci kısmı olan osteokondral doku mühendisliği çalışmasında ise kemik kısmı %6'lık (w/v) ipek doku iskelesinden, kıkırdak kısmı arjinin-glisin-aspartik asit-serin (RGDS) içeren PA hidrojelden (PA-RGDS) ve kemik-kıkırdak ara yüzeyi olarak ise %4'lük (w/v) ipekten oluşan üç-fazlı doku iskelesi tasarlanmıştır. Bu çalışmada ayrıca, kemik kısmı için insan kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücreler (hBMSC) ve kıkırdak kısmı içinse insan kondrositleri (hAC) kullanılmış ve ikili kültür ortamında bu hücrelerin birbirlerine olan tropik etkileri incelenmiştir. %6'lık (w/v) ve %4'lük (w/v) ipek doku iskelelerinin gözenek çapları sırasıyla 416 ± 87 ve 194 ± 67 µm olarak hesaplanmış ve biyouyumlulukları ve içsel bağlantılı gözenekleriyle kemik ve ara yüzey için uygun yapılar olduğu görülmüştür. hBMSC'ler ipek doku iskelesi içerisinde osteojenik ortamda ve kondrositler PA-RGDS hidrojel içerisinde kondrojenik ortamda iki hafta boyunca kültüre edilmiş ve daha sonra bu iki yapı aralarına %4'lük ipek iskele eklenerek birleştirilmiş ve osteokondral kokteyl ortamında iki hafta daha kültüre edilmiştir. İkili kültür ortamındaki kondrositlerin hBMSC'lere tropik etkisi, yüksek ALP aktivitesi ve runt-ilişkili transkripsiyon faktörü (RUNX2), ALP, tip I kollajen (COLL I), BSP, osteopontin (OPN), OCN ekspresyon seviyeleriyle ve kalsiyum içeriğiyle kendini göstermiştir. SOX9, agregan (AGC) ve tip II kollajen (COLL II) ekspresyon seviyelerine bakıldığında, PA-RGDS hidrojellerde kondrojenik farklılaşmanın pellet kültüre göre çok daha erken bir sürede gerçekleştiği fakat 7.günden sonra gen ekspresyonlarının pellet kültürle benzer olduğu görülmüştür. İkili kültür kondrositler üzerinde herhangi bir tropik etki yaratmamış ve bu da kondrositlerin farklılaşmasında TGF-β1'in ikili kültüre göre çok daha etkin olduğunu göstermiştir. Histolojik boyamalar sonucunda ikili kültürde bulunan hBMSC'lerin doku iskelesi gözeneklerini çok daha yoğun bir şekilde doldurduğu görülmüş ve Alizarin kırmızısı ve von Kossa boyamalarında ikili kültürdeki hBMSC'lerin çok daha fazla ve yoğun mineralize yapılar ürettiği belirlenmiştir. Ayrıca, ikili kültürde bulunan kondrositlerin PA-RGDS hidrojeller içerisinde yoğun bir kıkırdak ECM'si ürettikleri de Alcian mavisi boyamalarıyla gösterilmiştir. Elde edilen veriler, hBMSC'lerin pahalı büyüme faktörleri kullanılmadan ikili kültür yöntemleriyle de çok etkin bir kemik yapı oluşturabileceğini ve ayrıca kondrositlerin TGF-β1 yokluğunda bile kıkırdak matrisi üretebildiğini göstermiştir. Neticede, bu çalışmada tasarlanan üç-fazlı doku iskelesinin, osteokondral doku hasarlarının tedavisi için klinikte kullanılabilir bir malzeme olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract:
A part of this study was supported by 112M442 TÜBİTAK Project and Soner Çakmak was also supported by Hacettepe University Scientific Research Coordination Unit, under The International Cooperation Programme with Project Number of 13 G 602 003 during his studies in USA. In the present study, biomaterials with different contents were designed, fabricated and tested in vitro by cell culture studies for bone and osteochondral tissue engineering. For this purpose bone tissue engineering studies were carried out with biphasic peptide amphiphile (PA)/hydroxyapatite (HA) scaffolds, whereas triphasic silk-HA/silk/PA scaffolds were used for osteochondral tissue engineering studies.
For bone tissue engineering studies, HA matrices in nanofiber form were fabricated by electrospinning method, while arginine-glycine-aspartic acid (RGD) bearing PA hydrogels (PA-RGD) were prepared by self assembling technique. The chemical structure of HA nanofiber matrix was verified by Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) and X-ray diffraction (XRD) analyses and it was determined that this structure had high crystallinity and exhibited better biodegradability when compared to pure HA, depending on its CaCO3 content. Scanning and transmission electron microscopy (SEM and TEM) analyses demonstrated that HA nanofibers had an average diameter of 437 ± 64 nm. AFM analysis showed that PA-RGD hydrogels underwent self assembly and exhibited nanofiber organization similar to extracellular matrix (ECM) structure after gelation. The average diameter of peptide nanofibers was calculated as 100 ± 64 nm by using SEM images. Circular dichroism and ATR-FTIR analyses showed that nanofiber organization occurred via β-sheet secondary structure and RGD was located on the nanofiber surface. For in vitro studies, pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells were encapsulated in PA-RGD gels and following this step; nanocomposite structures were fabricated by embedding HA nanofiber matrix within this gel. It was seen that cell proliferation was increased on all of the three scaffolds; HA, PA-RGD and PA-RGD/ HA scaffolds, after the 7th day and on the 18th day, the highest proliferation was detected in PA-RGD gel by cell proliferation analysis. Fluorescence microscopy and SEM analyses demonstrated that cells exhibited osteoblastic morphology on both scaffolds. Depending on the results of alkaline phosphatase (ALP) activity analysis, it was seen that the osteogenic differentiation was enhanced by the addition of HA to the scaffold structure. By real time polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis, the expression of Alp gene of cells was investigated as an early marker, while osteocalcin (Ocn) and bone sialoprotein (Bsp) gene expressions of cells were analyzed as late markers of osteogenic differentiation. Although no differences in Alp and Ocn expressions were detected among the samples throughout the cell culture period, significantly higher expression of Bsp on PA-RGD/HA nanocomposite on the 18th day showed that bone mineralization, which is an important indication of osteogenic differentiation, was supported more by this scaffold. Consequently, it was evaluated that PA-RGD/HA nanocomposite scaffold could be successfully used in bone tissue engineering applications.
In the osteochondral tissue engineering study as the second part of the present work, silk scaffolds from 6% (w/v) solution was used as the bone part and arginine-glycine-aspartic acid-serine (RGDS) containing PA hydrogel (PA-RGDS) was used as the cartilage part, while silk scaffolds from 4% (w/v) solution was designed as the bone-cartilage interface. In addition to that, for the bone part of the scaffold human bone marrow derived mesenchymal stem cells (hBMSCs) was used, whereas human chondrocytes (hAC) were used as cell source for the cartilage part and the trophic effects of these two cells on each other were investigated under co-culture conditions. The pore sizes of the silk scaffolds with 6% (w/v) and 4% (w/v) silk contents were calculated as 416 ± 87 and 194 ± 67 µm, respectively and it was seen that the silk scaffolds had suitable properties for bone and interface tissues due to their biocompatibility and interconnected pore structures. Human BMSCs were cultured on silk scaffolds in osteogenic medium and chondrocytes were cultured on PA-RGDS in chondrogenic medium for two weeks. Following this culture period, these two cell seeded scaffolds were combined together by placing the 4% (w/v) silk scaffold in between and the resulting structure was cultured for an additional two weeks in the osteochondral cocktail medium. The trophic effects of chondrocytes, which were cultured in the coctail medium, on hBMSCs were revealed as enhanced expression of runt related transcription factor (RUNX2), ALP, collagen type I (COLL I), BSP, osteopontin (OPN) and increased calcium content. When the expression levels of SOX9, agregan (AGC) and collagen type II (COLL II) were evaluated, it was seen that the chondrogenic differentiation of chondrocytes in PA-RGDS hydrogels occurred significantly earlier than pellet cultures. However, gene expressions in hydrogels were found to be similar to that of pellet cultures after the 7th day of incubation. No significant trophic effect of coculture on chondrocytes was determined and this finding showed that TGF-β1 had stronger influence on the chondrocyte differentiation over the co-culture. By histology stainings, it was seen that the hBMSCs in co-culture intensely filled the pores of the scaffold and it was seen that these cells also produced higher amounts of denser mineralized structures detected by Alizarin red and von Kossa stainings. Besides, densely production of cartilage ECM by the chondrocytes in co-culture on PA-RGDS hydrogels was shown by Alcian blue staining. The findings of this study has shown that hBMSCs could able to form an enabled bone structure by co-culture technique without the use of expensive growth factors and chondrocytes could produce cartilage matrix even in the absence of TGF-β1. As a result, it was concluded that the triphasic scaffold designed in this study was a promising biomaterial which could be used for the treatment of osteochondral tissue defects in clinic.