Periodontal apselerden kültür yardımıyla izole edilen bakterilerin 16s PCR ve DNA dizi analizi ile tanılanması
Identification of bacteria isolated from periodontal abscess with culture assay BY 16S PCR and dna sequence analysis
Yazar: KÜBRA KARAÇAM
Danışman: PROF. DR. TURGUT DEMİR
Atatürk Üniversitesi / Diş Hekimliği Fakültesi / Periodontoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Diş Hekimliği Uzmanlık, 2017
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Abseler = Abscess ; Bakteriler = Bacteria ; Bakteriyoloji = Bacteriology ; DNA = DNA ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Dizi analizi-DNA = Sequence analysis-DNA ; Mikrobiyoloji = Microbiology ; Periodontal abse = Periodontal abscess ; Periodontal hastalıklar = Periodontal diseases ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Amaç: Gelişen teknoloji doğrultusunda periodontitis için yeni muhtemel patojenlerin ortaya konduğu bir dönemde, kültüre edilebilen fakat patojen olarak henüz sınıflandırılmamış bakterilerin periodontal apse için etken olmasını beklememek için bir neden yoktur. Periodontal apse mikrobiyolojisi üzerine günümüze kadar yapılan çalışmaların çoğu iyi tanınan bakteri türleri üzerinde yapılmış, hastalığa etken olabilecek bilinmeyen farklı bakteriler üzerine çalışma yapılmamıştır. Bu çalışmada periodontal apse örneklerindeki kültüre edilebilen aerob, fakültatif anaerob bakterilerden besiyerinde en yoğun olarak gelişen koloni örnekleri izole edilip, moleküler yöntemler ile tanımlanması hedeflenmiştir. 
Materyal ve Metot: Sistemik olarak sağlıklı, son 4 hafta içinde herhangi bir antibiyotik kullanmamış, periodontal apse teşhisi konulmuş 20 gönülllü hastadan  periodontal apse örnekleri alındıktan sonra örnekler bekletilmeden mikrobiyoloji laboratuvarına götürülerek kültüre edildi. 2.günün sonunda sayısal olarak fazla olan koloniler saflaştırılarak diğer karakterizasyon işlemlerine kadar %16'lik gliserol içeren NB (Nutrient Broth) içerisinde -86 oC'de saklandı. Daha sonra genomik DNA'nın izolasyonu yapıldı. Her bir izolattan saflaştırılan genomik DNA'dan, 16S rRNA genleri PCR yardımı ile çoğaltıldı. Elde edilen PCR ürünleri jel görüntüleme sistemi ile görüntülendikten sonra hizmet alımı yoluyla DNA dizi analizleri yapıldı. Analizler sonucu düzenlenen nükleotid dizileri NCBI kütüphaneleri (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) ile homolojilerinin belirlenmesi için BLAST işlemi yapıldı. Sonuç olarak değerlendirmelerin sonunda gen dizileri GenBank'a girilerek kabul numaraları alındı.
Bulgular: 20 periodontal apse örneğinden 60 bakteri izole edilerek tanılandı. 33 örnekte Streptococcus türleri (S. pneumoniae, S. mitis, S.gordonii, S.anginosus, S. sanguinis, S. massiliensis, Streptococcus spp., S.cristatus, S.sinensis, S.mutans) 7 örnekte Neisseria türleri ( N. Sicca, N.elongata, N.subflava), 4 örnekte  Actinomyces türleri (A. naeslundii, A. odontolyticus), 3 örnekte Staphylococcus türleri, (S.haemolytıcus, S. equorum, Staphylococcus spp.), 2 örnekte Morococcus cerebrosus ve birer örnekte Moraxella spp., Bacillus spp., Enterococcus casseliflavus türleri tespit edildi.
Sonuç: Çalışmamızda tespit edilen bakteri türleri vücudun farklı bölgelerinde apse ve ciddi enfeksiyonlara neden olan bakteriler oldukları ve yine bu bakteri türlerinin çoğunun periodontal apselerde ilk kez izole edilen türler oldukları literatür taramasında ortaya kondu. Periodontal apse içeriğinden alınan ve aerobik ve fakültatif anaerobik ortamda yoğun üreme gösteren bu bakteriler  apse mikrobiyotasına yönelik ileri çalışmalara ihtiyaç duyulduğunu ortaya koymaktadır.

Abstract:
Aim: At a time when new potential pathogens for periodontitis are emerging in the direction of developing technology, there is no reason not to expect bacteria that are culturally but not yet classified as pathogenic to be causative agents for periodontal abscesses. Many studies on periodontal abscess microbiology have been done on well-known bacterial strains and no study has been done on unknown bacterial strains that may be causative of the disease. In this study, it is aimed to isolate and identify the most intensively growing colony samples from aerobic, facultative anaerobic bacteria cultured on periodontal abscess specimens by using molecular methods.
Material and Method: Periodontal abscess samples were obtained from 20 healthy volunteers who did not use any antibiotics during the last 4 weeks and were diagnosed as periodontal abscesses. The samples were then taken to the microbiology laboratory and were cultured. At the end of the second day, the numerically excess colonies were purified and stored at -86 ° C in NB (Nutrient Broth) containing 16% glycerol until further characterization. Then the genomic DNA was isolated. Each isolate was amplified from purified genomic DNA by 16S rRNA genes using PCR. After the obtained PCR products were visualized with a gel imaging system, DNA sequence analysis was performed through service intake. The BLAST procedure was performed to determine homologs with the nucleotide sequences NCBI libraries (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) that were analyzed. As a result, at the end of the evaluations, the gene sequences were entered into GenBank and the acceptance numbers were obtained.
Results: Sixty bacteria of 20 periodontal abscesses were isolated and diagnosed.  Streptococcus species (S. pneumoniae, S. mitis, S. gordonii, S. anginosus, S. sanguinis, S. massiliensis, Streptococcus spp., S.cristatus, S. sinensis, S. mutans) in 33 samples, Neisseria species (N. Sicca, N. elongata, N.subflava) in 7 samples, Actinomyces species (A. naeslundii, A. odontolyticus) in 4 samples, Staphylococcus species (S. haemolytics, S. equorum, Staphylococcus spp.) , Morococcus cerebrosus in 2 samples and Moraxella spp., Bacillus spp., Enterococcus casseliflavus species in 1 sample.
Conclusion: In our study, bacterial species detected were bacteria that caused abscesses and serious infections in different parts of the body, and these bacteria species were the first species isolated in periodontal apse for the first time. These bacteria, which are taken from the periodontal abscess content and show intense growth in the aerobic and facultative anaerobic environment, suggest that advanced studies for abscess microbiota are needed.