Kolon kanser hücrelerinde RhoC yolakları ile ekstrasellüler proteoliz arasıdaki olası ilişkinin invazyon ve metastaz açısından belirlenmesi
Determination of possible relation between RhoC and extracellular proteolysis in terms of invasion and metastasis in colon cancer cells
Yazar: DİDEM KELEŞ
Danışman: PROF. DR. GÜLGÜN OKTAY
Dokuz Eylül Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Hücre kültürü = Cell culture ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Matriks metalloproteinazlar = Matrix metalloproteinases ; Mikro RNA = Micro RNA ; Neoplazm metastazları = Neoplasm metastasis ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Giriş: Kolorektal kanser kaynaklı ölümlerin çoğu, primer tümörden çok metastatik hastalık sonucu gerçekleşmektedir; bu nedenle akciğer, prostat ve meme kanserinden sonra en sık ölümle sonuçlanan kanser türüdür. Ekstrasellüler alanda yer alan ve primer olarak ekstrasellüler matriksin yıkımından sorumlu olan matriks metalloproteinazların (MMP'ler) kolorektal karsinogenezi ve metastazını desteklediği bilinmektedir. Bununla birlikte küçük GTPaz'lar ailesinden olan RhoC, hücre içi sitoiskelet elemanlarının regülasyonunu sağlayarak hücre migrasyonunda rol almakta ve kanser metastazı ile yüksek korelasyon göstermektedir. 
Amaç: Bu çalışmanın amacı; primer ve metastatik kolon kanser hücrelerinde sitoiskelet elemanların regülasyonunda rol alan RhoC'nin ekstrasellüler proteolizden sorumlu olan MMP'ler arasındaki olası ilişkinin invazyon ve metastaz açısından araştırılmasıdır.
Materyal ve Yöntem: İlk olarak, primer (HT-29, HCT116, SW480) ve metastatik (SW620 ve LoVo) kolon kanser hücrelerinde RhoC gen ekspresyonu siRNA tekniği ile susturuldu. Bu susturum sonucunda ROCK-I, mDia, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-14, TIMP-1 ve TIMP-2 mRNA ekspresyon düzeyleri Real Time PCR; MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-14 ve TIMP-2 protein ekspresyon düzeyleri Western Blot tekniği ile incelendi. Bunun yanı sıra MMP-2 ve MMP-9 salınım ve aktivite düzeyleri Jelatin Zimografi tekniği ile belirlendi. RhoC susturumu sonrası kolon kanser hücrelerinin migrasyon ve invazyon yetenekleri Hücre Migrasyonu ve Matrijel İnvazyon teknikleri ile değerlendirildi.
Bulgular: RhoC'nin baskılanması sonucunda HT-29 hücrelerinde MMP-9 mRNA ekspresyon düzeylerinin azaldığı, TIMP-2 mRNA ve protein ekspresyon düzeylerinin ise anlamlı olarak arttırdığı belirlendi. HCT116 hücrelerinde ise MMP-9 mRNA ekspresyonunun anlamlı olarak azaldığı, TIMP-1 mRNA ekspresyon düzeylerinin ise arttığı belirlendi. Ayrıca RhoC inhibisyonu ile HT-29 hücrelerinde proMMP-2, proMMP-9 ve aktif MMP-9, SW480 hücrelerinde ise proMMP-2 aktivitelerinin azaldığı görüldü. Ek olarak, RhoC susturulan HT-29, SW480, SW620 ve LoVo hücre hatlarında hücre migrasyonunun ve HT-29, HCT116, SW480 SW620 ve LoVo hücre hatlarında hücre invazyonunun baskılandığı belirlendi.
Tartışma: Sonuç olarak elde ettiğimiz verilerin ileride kolorektal kanser metastazının önlenmesi amacıyla; hem MMP aktivitesinin hem de RhoC sinyal yolaklarının baskılanmasını hedef alan, antimetastatik özellikte yeni terapötik ajanların geliştirilmesine katkı sağlayacağını öngörmekteyiz.

Abstract:
Introduction: Most of deaths derived from colorectal cancer are due to metastasis rather than primary tumor; therefore colorectal cancer is the fourth leading cause of cancer death after lung, prostate and breast cancers. It is known that matrix metalloproteinases (MMPs) which are primarily responsible for degradation of extracellular matrix and locate in the extracellular area contribute carcinogenesis and metastasis of colorectal cancer. In addition RhoC, a member of small GTPases family, is involved in cell migration by regulating cytoskeletal components and highly correlated with metastasis.
Aim: The aim of this research is to investigate the possible relation between RhoC that regulates the cytoskeletal components and MMP that is responsible for extracellular proteolysis in terms of invasion and metastasis in primary and metastatic colon cancer cells.
Material and Methods: At first, RhoC gene expression was silenced with siRNA transfection in primary (HT-29, HCT-116 and SW480) and metastatic (SW620 and LoVo) colon cancer cells. After this transfection ROCK-I, mDia, MMP-2, MMP-7, MMP-9,     MMP-14, TIMP-1 and TIMP-2 mRNA expression levels were investigated with Real Time PCR; the protein expression levels of MMP-2, MMP-9, MMP-7, MMP-14 and TIMP-2 were determined with Western Blot. In addition, secretion and activity levels of MMP-2 and   MMP-9 were detected with Gelatin Zymography. After RhoC silencing, migration and invasion capability of colon cancer cells were evaluated with Cell Migration and Matrigel Invasion techniques. 
Results: The knockdown of RhoC resulted in decreased MMP-9 mRNA expression levels and significantly increased TIMP-2 mRNA and protein expression levels in HT-29 cells. In HCT116 cells, MMP-9 mRNA expression levels were significantly decreased and TIMP-1 mRNA expression levels were increased. Furthermore, RhoC inhibition declined proMMP-2, proMMP-9 and active MMP-9 activities in HT-29 cells and also proMMP-2 activity in SW480 cells. In addition, cell migration was inhibited in RhoC silenced HT-29, SW480, SW620 ve LoVo cell lines and cell invasion was decreased in RhoC silenced HT-29, HCT116, SW480 SW620 and LoVo cells.
Conclusion: In conclusion, we predict that our results may contribute for developing new anti-metastatic therapeutic agents that target both RhoC signalling and MMP activity to prevent colorectal cancer metastasis.