Klinik örneklerden mycobacterium tuberculosis tanısında kullanılan moleküler yöntemlerinin karşılaştırılması
Comparision of molecular methods used for diagnosis of mycobacterium tuberculosis in clinical specimens
Yazar: OLKAR ABDULMAJED
Danışman: PROF. DR. A. NEDRET KOÇ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2011
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Mycobacterium = Mycobacterium ; Mycobacterium tuberculosis = Mycobacterium tuberculosis ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Rifampin = Rifampin ; Teşhis = Diagnosis ; Teşhis-ayırıcı = Diagnosis-differential

Özet:
Dünyanın pek çok yerinde Mycobacterium tuberculosis'in neden olduğu enfeksiyonların sıklığındaki artış, tüberkülozun tanısı ve ilaç direncinin kısa sürede gösterilmesini zorunlu hale getirmiştir. Bu amaçla çok sayıda yeni yöntem denenmektedir. Bu çalışmada, Mikobakteriyoloji Laboratuvarı'na gelen klinik örneklerde Mycobacterium tuberculosis'in tanısında kullanılan klasik kültür yöntemleriyle moleküler yöntemlerin karşılaştırılması amaçlanmıştır.Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Mikobakteriyoloji Laboratuvarı'na tüberküloz tanısı amacıyla gönderilen toplam 50 klinik örnek işleme alındı. Bu örnekler; açlık mide suyu (AMS), bronkoalveolar lavaj (BAL), balgam, apse, idrar, steril vücut sıvıları, beyin omurilik sıvısı (BOS), doku, biyopsi örnekleridir. Klinik örneklerin EZN (Erlich- Ziehl Neelsen) boyama ile mikroskobik incelenmesi, L-J (Löwenstein-Jensen), BACTEC MGIT 960 yöntemi ile kültürleri yapıldı. İzole edilen suşların tür düzeyinde tanımlanması BACTEC 460 NAP testi (Becton, Dickinson and Company Sparks, Ireland) ve MGIT 960 TBc ID (Becton, Dickinson and Company Sparks, USA) testi ile çalışıldı. BACTEC MGIT 960 ile duyarlılık testleri çalışıldı. Aynı zamanda 50 klinik örneğin moleküler tanısında RT PCR (QIAGEN GmbH;Hilden,Germany) ve GeneXPERT MTB/RIF (Cepheid, Sunnyvole CA) yöntemi kullanıldı.Çalışmaya alınan 50 tüberküloz şüpheli klinik örneğin EZN boyama yöntemiyle boyanması sonucunda %34'ü ARB pozitif; %66'sı ARB negatif olarak bulundu. L-J ve MGIT yöntemleriyle %64 kültür pozitif, %36 kültür negatif olarak bulundu. Kültür pozitif olan klinik örneklerin %78.1'i M. tuberculosis complex grubu, %21.8'i MOTT basili olarak bulundu.Moleküler tanıda; RT PCR yöntemi uygulanan klinik örneklerin; %58'i Mycobacterium complex grubu olarak bulundu.GeneXPERT MTB/RIF yöntemi ile 50 klinik örneğin; %18'i yüksek düzey pozitif, %16'sı orta düzey pozitif, %16'sı düşük düzey pozitif, %8'i çok düşük düzeyde pozitif olarak bulundu.Çalışmaya alınan 20 solunum yolu örneklerinde; kültür üremeleriyle RT PCR'ın uyumluluğu %75 XPERT MTB/RIF sisteminin uyumluluğu %95 olarak bulundu. Çalışmaya alınan 30 solunum yolu dışı örneklerde; RT PCR'ın kültür üremeleriyle uyumu %56.6 XPERT MTB/RIF testinin kültür üremeleriyle uyumu ise %83,3 olarak bulundu. Kültür yönteminin altın standart kabul edildiği bu çalışmada; ARB mikroskobisinin duyarlılığı %32, özgüllüğü %66 olarak bulundu. Kültür bulguları ile ARB bulguları karşılaştırıldığında istatistiksel açıdan fark yoktu (p>0.05). Uyum düşük düzeyde ama anlamlı bulundu (kapa:0.04; p>0.05). Kültür üremelerinde; RT PCR'ın duyarlılığı %72, özgüllüğü %56 olarak bulundu. Kültür bulguları ile PCR bulguları karşılaştırıldığında istatistiksel açıdan fark yoktu (p>0.05). Uyum düşük düzeyde ama anlamlı bulundu (kapa:0.28; p>0.05). XPERT MTB/RIF testinin duyarlılığı %96, özgüllüğü %80 olarak bulundu. Kültür bulguları ile XPERT bulguları karşılaştırıldığında istatistiksel açıdan fark yoktu (p>0.05). Yüksek düzeyde uyum bulundu (kapa:0.76; p<0.05) RT PCR bulguları ile XPERT MTB/RIF bulguları karşılaştırıldığında istatistiksel açıdan fark yoktu (p>0.05). Yüksek düzeyde uyum bulundu (kapa:0.507; p<0.05).Bu çalışmada; ilaç hassasiyet testinde, klinik örneklerin %60'ı SIRE (Streptomycin, İzoniazid, Rifampin, Etambuthol)'e duyarlı bulundu. Klinik örneklerin %40'ı en az bir ya da daha fazla ilaca karşı direnç bulundu. XPERT MTB/RIF yöntemiyle rifampin direnci belirlenemedi.Sonuç olarak; moleküler yöntemlerlerden biri olan RT PCR; kompleks, yoğun laboratuvar işlemleri, eğitimli personel ve donanımlı alt yapı gerektirmektedir. Tüberkülozun tanı süresini kısaltmak ve kolay uygulanabilirliğini sağlamak amacıyla geliştirilen XPERT MTB/RIF sistemi, doğrudan klinik örneklere uygulanabilen semi-kantitatif, gerçek zamanlı bir nested polimeraz zincir reaksiyon yöntemidir. Bu çalışmanın sonucunda; XPERT MTB/RIF yönteminin duyarlılığının ve özgüllüğünün yüksek düzeyde olması ve kısa sürede sonuç verebilmesi açısından rutin laboratuvarlarda çalışılabileceği kanaatine varıldı.Anahtar kelimeler: Mikobakteri, real-time PCR, XPERT MTB/RIF, rifampin, Ziehl-Neelsen yöntemi, BACTEC MGIT 960.

Abstract:
The detection of early diagnosis and drug resistance in patients with tuberculosis has become a necessity because of increasing prevalence of infections caused by Mycobacterium tuberculosis. Numerous new methods are being tested to this aim. In this study it is aimed to compare conventional culture methods and molecular methods which are used for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples accepted by mycobacteriology laboratory.A total of 50 clinical specimens sent for diagnosis of tuberculosis to Erciyes University, Medical Microbiology Department, Mycobacteriology Laboratory were processed. These samples were gastric lavage fluid, bronchoalveolar lavage, sputum, abscess, urine, sterile body fluids, cerebrospinal fluid, tissue and biopsy samples. Microbiological examining was performed with EZN (Erlich- Ziehl Neelsen) staining and cultured in L-J(Löwenstein-Jensen) med ium by BACTEC MGIT 960 method. Determination of isolated subspecies at species level was studied with BACTEC 460 NAP test (Becton, Dickinson and Company Sparks, Ireland) MGIT 960 TBc ID (Becton, Dickinson and Company Sparks, USA) test. Susceptibility tests were performed with BACTEC MGIT 560. RT PCR (QIAGEN GmbH;Hilden,Germany) and GeneXPERT MTB/RIF (Cepheid, Sunnyvole CA) were studied for the molecular diagnosis of total 50 clinical samples.Smear positive and negative rate of studied 50 tuberculosis suspected clinical specimens were 34% and 66%, respectively, with EZN Dyeing. L-J and MGIT methods also resulted % 64 cultures positive and 36% culture negative. 78.1 % of culture positive samples were found mycobacterium complex group and 21.8 % were MOTT bacilli.In molecular diagnosis; 58% of RT PCR performed clinical samples were found as mycobacterium tuberculosis complex group.18% of 50 clinical samples were highly positive, 16% moderately positive, 16% positive at low level, 8% positive at very low level according to XPERT MTB/RIF results.In studied 20 pulmonary system specimens, agreement between culture and RT PCR; culture and XPERT MTB/RIF was 75% and 95%, respectively. In studied 30 nonpulmonary system specimens, agreement between culture and RT PCR; culture and XPERT MTB/RIF was 56.6% and 83.3%, respectively.In this study that Culture has been considered the gold standard; susceptibility and specificity of smear microscopy were found 32% and 66% respectively. There was no significant statistical difference between Culture and smear findings. (p<0.005). The Compliance was at low level but meaningful. (kapa:0.04; p>0.05). Susceptibility of RT PCR was found 72%, specificity was found 56%. There was no significant statistical difference between Culture and PCR findings. (p>0.05). The compliance was at low level but meaningful. (kapa:0.28; p>0.05). Susceptibility of XPERT MTB/RIF was found 96%, specificity was found 80%. There was no significant statistical difference between culture and XPERT findings. (p>0.05).The compliance was at high level (kapa:0.76; p<0.05). There was no significant statistical difference between XPERT MTB/RIF and RT PCR findings. The compliance was at high level (kapa:0.507; p<0.05).In this study; 60% of clinical samples were found susceptible to SIRE (streptomycin, isoniazide, rifampin, ethambutol) in drug susceptibility test. 40% of clinical samples were found resistant to at least one or more drug. Rifampicin resistant could not be determined by XPERT MTB/RIF.In conclusions; RT PCR which is the one of the molecular methods; is complex and requires intensive laboratory processes, trained staff and equipped infrastructure. XPERT MTB/RIF system which is developed to shorten diagnosis time of tuberculosis and to operate easily is a semi-quantitative, real time nested polymerase chain reaction method that applicable to clinical samples directly. As a result of this study; high level of susceptibility and specificity and ability to give results in short time, XPERT MTB/RIF can be studied in routine laboratories.Key Words: Mycobacterium, real-time PCR, XPERT MTB/RIF, rifampin, Ziehl-Neelsen method, BACTEC MGIT 960.