Solunum yolu viral enfeksiyon etkenlerinin saptanmasında in-house  PCR optimizasyonu
In-house PCR optimization for detection of respiratory viral pathogens
Yazar: MELİS KANTURVARDAR TÜTENYURD
Danışman: PROF. DR. SELİM BADUR
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Temel Tıp Bilimleri Bölümü / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Parainfluenza virüs 2-insan = Parainfluenza virus 2-human ; Parainfluenza virüs 3-insan = Parainfluenza virus 3-human ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Respiratuvar sinsityal virüsleri = Respiratory syncytial viruses ; Solunum yolları enfeksiyonları = Respiratory tract infections ; Solunum yolları hastalıkları = Respiratory tract diseases ; Virüs hastalıkları = Virus diseases

Özet:
Viral solunum yolu enfeksiyonları, görülme sıklığının fazla olması, yayılımlarının kolaylığı, yüksek morbidite ve mortaliteyle sonuçlanmaları nedeniyle tüm dünyada önemli halk sağlığı sorunu oluşturmaktadırlar. Tüm yaş gruplarında sorun yaratan viral solunum yolu enfeksiyonları, komplikasyon sıklığı fazla olan çocuklarda, okul devamsızlığına ve hospitalizasyona; erişkinlerde ise iş gücü kaybına ve dolaylı olarak ekonomik kayba neden olmaktadır.Ülkemizde solunum yoluna yerleşen virüslerin tanısının yaygın biçimde yapılmaması nedeniyle viral kökenli solunum yolu enfeksiyonları, bakteriyel kökenli solunum yolu enfeksiyonlarından ayırt edilememekte ve hastalara kimi zaman gereksiz yere antibiyotik tedavisi uygulanmakta, bu durum ekonomik kayba ve antibiyotiğe dirençli bakterilerin yayılmasına neden olabilmektedir.Bu çalışmada, sıklıkla rastlanan 11 viral etkenin tanısını koymak amacıyla hızlı ve güvenilir sonuç veren Real Time PCR esasına dayanan bir tanı yöntemi geliştirilmiş ve optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Tanıda kullanılan primer ve problar Primer Express (Applied Biosystems, A.B.D.) programı ile seçilmiş; primerlerin özellikleri Power SYBR Green PCR Master Mix Kiti (Applied Biosystems, A.B.D.) ile; primer prob uyumları ise TaqMan Gene Expression Master Mix Kiti (Applied Biosystems, A.B.D.) ile kontrol edilmiştir. Multipleks çalışmalar öncelikle TaqMan Gene Expression Master Mix Kiti (Applied Biosystems, A.B.D.) ile daha sonra tek aşamalı OneStep Superscript qRT-PCR kiti (Applied Biosystems, A.B.D.) ile gerçekleştirilmiştir.Geliştirilen yöntem ile, laboratuarımıza gönderilen ve Real Time RT-PCR ile Influenza virüs negatif bulunan, 200 solunum yolu örneğinde, Adenovirus, Rhinovirus, Respiratory Syncytial Virüs, Parainfluenza virüs 1-2-3, Coronavirus 229E- N63-OC43, Metapneumovirus ve Bocavirus varlığı araştırılmıştır. Onbir örnekte Rhinovirus, 11 örnekte Coronavirus OC43, beş örnekte Parainfluenza virüs 3, dört örnekte Coronavirus NL63, dört örnekte Bocavirus, iki örnekte Parainfluenza virüs 2, iki örnekte Coronavirus 229E, iki örnekte Metapneumovirus pozitifliği saptanmıştır. Ayrıca bir örnekte Rhinovirus ve Parainfluenza virüs 3, bir örnekte Rhinovirus ve Coronavirus 229 E, bir örnekte Rhinovirus ve Coronavirus OC43 çoklu pozitifliği tespit edilmiştir.

Abstract:
Respiratory tract infections are among the most common infectious diseases of humans worldwide, causing significant morbidity and mortality. They are consequently responsible for an enormous economic burden on society in terms of visits to doctors, treatments, hospitalisations and absences from work and school.Nucleic acid amplification methodologies have revolutionised the diagnosis of infectious diseases. They provide timely, accurate and dependable diagnosis, enabling the initiation of appropriate interventions without delay, improving patient care and ultimately reducing costs. The great strength of molecular techniques, especially multiplexed tests, is that they increase sensitivity and create a means to test for numerous pathogens using a common system. Many of these pathogens were previously unable to be detected by techniques such as DFA and culture.The test we designed involves Human Adenovirus, Human Rhinovirus, Human Respiratory Syncytial Virus, Human Parainfluenza virüs 1-2-3, Human Coronavirus 229E-NL63-OC43, Human Metapneumovirus, Human Bocavirus. Primers and probes designed with Primer Express (Applied Biosystems, USA) program, primers checked with Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA), primer prob interraction is controlled with TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, USA) and one step multiplex PCR is optimised with One-Step SuperScript qRT-PCR Kit (Applied Biosystems, USA). All real-time RT-PCR assays were developed for use on the ABI 7500 real-time PCR system. Probes are labelled with the dyes FAM, VIC and NED.Influenza virüs negative 200 samples are investigated and 11 Rhinovirus, 11 Coronavirus OC43, 5 Parainfluenza virüs 3, 4 Coronavirus NL63, 4 Bocavirus, 2 Parainfluenza virüs 2, 2 Coronavirus 229E, 2 Metapneumovirus, 1 Rhinovirus and Parainfluenza virüs 3 mix infection, 1 Rhinovirus and Coronavirus 229E mix infection, 1 Rhinovirus and Coronavirus OC43 mix infection is diagnosed.