SARS-CoV-2 nötralizasyon antikor testlerinde kullanılmak üzere pseudovirüslerin üretimi
Production of pseudovirus for use in SARS-CoV-2 neutralization antibody tests
Yazar: ZEHRA KÖSEOĞLU
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ SEVAL CİNG YILDIRIM
İnönü Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
SARS-CoV-2, nötralize edici antikorların ana hedefi olan Spike proteinini kullanarak hücrelere girmektedir. Bu nedenle, antikorların ve serumların Spike aracılı viral enfeksiyonu nasıl etkilediğini ölçen analizler, bağışıklığı incelemek için önemlidir.
SARS-CoV-2, biyogüvenlik düzeyi 3 olan bir virüs olduğundan, bu tür testleri güvenli bir şekilde yapmanın yolu, biyogüvenlik düzeyi 2 olan viral partikülleri Spike ile pseudotiplendirmektir. Bu tür pseudotiplemeler artık tek döngülü lentiviral, retroviral ve VSV partikülleri için tanımlanmıştır. Ancak bu işlemlerde kullanılan reaktifler ve protokoller geliştirilmelidir.
Bu çalışmada nötralizan antikor testlerinde kullanılmak üzere, BSL-2 laboratuvarlarında gerçekleştirilen, HEK293T hücre hattının transfeksiyon prosedürü kullanılarak, insan bağışıklık yetmezliği virüsü çekirdeği (HIV-1), GFP proteini raportörlü ve SARS-CoV-2'nin spike (S) proteinini içeren pseudovirüsler üretilmiştir. Stab plazmid kültürlerinden plazmidlerinden izolasyonu, kompetent bakteri hücrelere transformasyonu ve izole edilen pDNA'ların transfeksiyon için özelleştirilmiş hücre hattı olan HEK293T'ye transfeksiyonu ile pseudovirüsler oluşturulmuştur. Üçlü plazmid transfeksiyonunda, Plazmid #39196 (pHIV-Luc-ZsGreen), plazmid #12263 (pCMV-delta R8.2) ve plazmid #149543 (pGBW-m4137384) kullanılmıştır.
Pseudotiplemenin başarısı, pHIV-Luc-ZsGreen plazmidinin GFP için gen kodlamasını entegre ettiğinden, GFP ışıması ile değerlendirilmiştir. Transfeksiyonun 48. Saatinde GFP ışımaları hücre hattında tespit edilmiştir. Aşı uygulamalarından sonra yapılan nötralizan antikor testlerinde kullanılmak üzere güvenli ve kolay elde edilebilir bir yöntemle pseudovirüsler üretilebilmiştir.

Anahtar Kelimeler: COVID-19, SARS-CoV-2, pseudovirüs, başak proteini, nötralize edici antikorlar

Abstract:
SARS-CoV-2 enters cells using the Spike protein, which is the target of neutralizing antibodies. Therefore, the assays that measure how antibodies affects Spike-mediated viral infection are important for studying immunity. Since SARS-CoV-2 is a biosafety level 3 virus, the safe way to perform such tests is to Spike pseudotyping biosafety level 2 viral particles. Such pseudo-typing has now been defined for single-cycle lentiviral, retroviral, and VSV particles. However, the reagents and protocols used in these procedures must be developed.
In this study, pseudoviruses containing human immunodeficiency virus core (HIV-1), GFP protein reporter and spike (S) protein of SARS-CoV-2; using the transfection procedure of the HEK293T cell line, were produced in BSL-2 laboratories for use in neutralizing antibody tests. Pseudoviruses were generated by isolation of plasmids from stable plasmid cultures, transformation into competent bacterial cells, and transfection of isolated pDNAs into HEK293T, a specialized cell line for transfection. Plasmid #39196 (pHIV-Luc-ZsGreen), plasmid #12263 (pCMV-delta R8.2) and plasmid #149543 (pGBW-m4137384) were used in triple plasmid transfection.
The success of pseudotyping was assessed by GFP irradiation, as the pHIV-Luc-ZsGreen plasmid integrates the gene coding for GFP. GFP irradiation was detected in the cell line at 48 hours of transfection. Pseudoviruses could be produced with a safe and easily obtainable method to be used in neutralizing antibody tests performed after vaccine administration.

Keywords: COVID-19, SARS-CoV-2, pseudovirus, spike protein, neutralizing antibodies