Primer bronş epitel hücre kültürlerinde progenitör/kök hücre ekspresyonu ve pasajlamanın etkisi
Progenitor/stem cell expression in bronchial epithelial cell cultures and the effect of passaging
Yazar: NURAY BAYAT
Danışman: PROF. DR. HASAN BAYRAM ; YRD. DOÇ. DR. AYHAN ERALP
Gaziantep Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2012
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Bronşlar = Bronchi ; Epitel hücreleri = Epithelial cells ; Hücre kültürü = Cell culture ; Kök hücreler = Stem cells ; Sitokeratinler = Cytokeratins

Özet:
Her ne kadar son yıllarda kök hücrelerdeki değişikliklerin KOAH gibi akciğer hastalıklarının gelişiminde rol oynayabileceği düşünülüyorsa da, hava yolları epitelyumundaki progenitör/kök hücre varlığının ne ölçüde etkilendiği açık değildir. Diğer yandan, doku eksplantlarının hücre kültürü elde etmede kaç kez kullanılabileceklerine dair net bir görüş yoktur ve kök hücre ekspresyonunun buradaki rolü bilinmemektedir. Çalışmamızda, sigara içen, KOAH'ı olmayan (sigaralı) ve KOAH'lı bireylerin akciğer eksplantlarından bronş epitel hücre (BEH) kültürleri elde ederek, eksplant pasaj (P) sayısının BEH sayısına etkisini, iki grupta progenitör/kök hücre ekspresyonu ve pasajlama sayısı ile ilişkisini araştırmayı amaçladık. Bronş epitel eksplantları kültür kaplarına konarak 4. haftanın sonunda çoğalan BEH sayıldı ve eksplantlar her seferinde yeni kültür kaplarına aktarılarak (toplam 3 kez) BEH kültürü elde edildi ve hücre sayısındaki değişim hesaplandı. Paralel deneylerde, kültürde kullanılan eksplantlar ve eksplantlardan üreyen BEH'lerde progenitör/kök hücre varlığı immün boyama yöntemiyle sitokeratin (K) 5, K14 ve p63 belirteçlerinin ekspresyonuna bakılmak suretiyle belirlendi ve P sayısının etkisi değerlendirildi. Sigaralı grupta, P ilerledikçe eksplantlardan çoğalan hücre sayısı azalmasına rağmen, KOAH'lı hücrelerde anlamlı bir değişiklik saptanmadı. Eksplantlarda K5, K14 ve p63 ekspresyonu P sayısı ilerledikçe sigaralı ve KOAH'lı grupta anlamlı olarak azaldı. Sigaralı BEH hücrelerinde P sayısı ilerledikçe K14 ve p63 ekspresyonunda azalma gözlenirken, K5 ekspresyonunda bir değişiklik olmadı. KOAH'lı BEH kültürlerinde K5 ekspresyonu P sayısı ile değişmedi. Bu grupta yeterli BEH elde edilemediği için P2 ve 3'te K14 ve p63 ekspresyonu değerlendirilemedi. Sigaralı ve KOAH'lı gruplarda karşılaştırıldığında, eksplantlardan elde edilen hücre sayısı arasında anlamlı bir fark olmazken, bronş epitel eksplantlarında P0'daki K5 ekspresyonunun KOAH'lı grupta daha yüksek olduğu, 2. pasajda ise tam tersine bu belirtecin ekspresyonunun bu grupta düşük olduğu bulundu. K14 ekspresyonu, her üç pasajda sigaralı eksplantlarda daha yüksekken, p63 ekspresyonu benzerdi. BEH kültürlerindeki K5 ekspresyonu her üç pasajda sigaralı grupta yüksekti. P1'da K14 ve p63 ekspresyonu sigaralı grupta daha yüksekti. Çalışmamızda, pasajlama sayısındaki artış ile birlikte eksplantlardan elde edilen hücre sayısının azalabileceği, bunun hem eksplantlarda hem de üretilen hücrelerde eksprese olan progenitör/kök hücre sayısındaki azalma ile ilişkili olabileceği literatürde ilk kez gösterilmiş oldu. Bundan başka, bulgularımız KOAH'lıların hava yolu epitelinde progenitör/kök ekspresyonun azalmış olabileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
Although it has recently been thought that changes in stem cells may play a role in the progression of lung diseases such as COPD, it is not clear to what extent the presence of progenitor/stem cell in airway epithelium is affected. On the other hand, it is not known how many times to use tissue explants for cell culture, and role of stem cell expression is not known, either. We cultured bronchial epithelial cells (BECs) from lung explants of smokers and COPD patients, and investigated effect of passage (P) numbers on outgrowing BECs, and studied the relation with progenitor/stem cell expression. Explants were put in culture, outgrowing cells were counted after 4wks, each time explants were transferred to new plates (3 times) and cell count difference was calculated. In parallel experiments, expression of progenitor/stem cell markers, cytokeratin (K) 5, K14 and p63 in explants and BEC were determined by immunostaining and the influence of P numbers was assessed. In smokers, number of BEC from explants decreased with increased P numbers, however, there was no significant change in COPD cells. As the P number advanced, K5, K14 and p63 expression was decreased in explants from both smokers and COPDs. Expression of K14 and p63 were decreased in smoker BECs. However, K5 expression was not changed in BECs of either smokers or COPDs. Since, it was not possible to obtain adequate BEC cultures in COPD group, K14 and p63 expression at passages 2 and 3 were not assessed. When smokers and COPD patients were compared, the numbers of outgrowing cells from explants were not different. Although expression of K5 in explants of COPDs was higher in P0, this was lower than smokers at P2. K14 expression was significantly higher in explants of smokers at all three passages, whereas p63 expression was similar with COPDs. In BEC cultures, K5 expression was higher in smokers at three passages, and K14 and p63 expression was higher in smokers at P1. For the first time, our findings have demonstrated that as P numbers increased, number of outgrowing cells from explants can decrease, and that this may be associated with decreases in progenitor/stem cell marker expression in both explants and outgrowing cells. Furthermore, our findings suggest that progenitor/stem cell expression may be reduced in airway epithelium of patients with COPD.