Doğal Streptococcus thermophilus izolatlarında CRISPR sistemlerinin belirlenmesi ve faj konakçı etkileşim analizi
Determination of CRISPR systems in natural Streptococcus thermophilus isolates and analysis of phage host interaction
Yazar: ELİF COŞKUN DAĞGEÇEN
Danışman: PROF. DR. İSMAİL AKYOL ; DR. ÖĞR. ÜYESİ SABAHATTİN CÖMERTPAY
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Streptococcus thermophilus suşları, süt fermantasyonlarında Lactococcus lactis'den sonra ikinci sırada en yaygın kullanılan başlanhıç kültürleridir. Bu türün kapsamlı uygulaması, enfekte olan bakteriyofajların çoğalması için önemli bir fırsat sağlar. S. thermophilus' un fajlar tarafından enfekte olması, düşük ve tutarsız kalitede ürün üretimine neden olan fermantasyon başarısızlığına yol açan bir sorundur. Bu nedenle, dirençli suşların bulunması ve tanımlanması, endüstriyel üretim ortamlarında yaygın olan bakteriyofajların tanımlanması endüstri için önem arzetmektedir. Bu kapsamda, çalışmanın ilk bölümünde yerel suşların izolasyonu,tanımlaması ve faj direnç potansiyellerininin değerlendirilmesi, ikinci bölümde bakteriyofaj izolasyonu, tanımlaması ve konakçı aralığı analizi gerçekleştirilmiştir. 
Çalışmanın birinci bölümünde, yerel S. thermophilus izolatlarının faj direnç potansiyellerini belirlemek amacıyla 19 farklı şehirden toplandan 24 adet yoğurt, 11 adet peynir ve 1 adet kefir örneğinden 36 adet S. thermophilus izolatı 16 S rRNA ile tanımlanmıştır. S. thermophilus suşlarında fajlara karşı, yüzey resepör tanıma, R-M, CRIPSR sistemleri gibi çeşitli direnç mekanizmaları mevcuttur. İlk olarak, izolatların Streptococcus fajları için reseptör görevine sahip ramnoz glukoz polisakkarit grupları mPCR ile belirlenmiştir. 36 izolatın mPCR sonucuna göre 1 rgpA grubuna ait bir izolat, rgpB grubuna ait 16 izolat, rgpC grubuna ait 3 izolat, rgpD grubuna ait 16 izolat belirlenmiştir. 1 adet izolatın ise literatürde tanımlanan hiçbir rgp grubuna uyum göstermediği tespit edilmiştir. Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR), yabancı genetik unsurlara karşı kazanılmış bağışıklık sağlayan hiperdeğişken lokuslar olarak bilinmektedir. Çalışmamızda tanımlanan 36 izolatın faj direnç potansiyellerini ve faj enfeksyon geçmişlerini analiz etmek amazıyla CRISPR lokusları detaylı incelenmiştir. Tüm izolatlarda CRISPR1 lokusu bulunurken, 15 izolatta CRISPR2 lokusu, 16 izolatta CRISPR 3 ve 4 izolatta CRISPR4 lokusu olmak üzere 36 izolata ait toplam 71 CRISPR lokusu tespit edilmiştir. S. thermophilus izolatlarında mevcut olan CRISPR Cas sistemlerinin yapısı ve mekanizmasının detaylı araştırılması amacıyla rgp grupları ve coğrafi konum dikkate alınarak TR6, TR10, TR46, TR58, TR79 ve TR81 izolatlarına ait genom dizileri İllumina Miseq dizileme sistemleri ile elde edilmiştir. Ek olarak, rgp grubu bulunmayan TR6 genomunun daha detaylı ve güvenilir analizi için PacBio teknolojisi ile dizilemesi yapılmıştır. İzolatların kromozom uzunluklarının 1.80 Mbp- 1.98 Mbp arasında değiştiği ve % 38.9 GC içeriği ile tespit edilmiştir. Genomlara ait CRISPR sistemleri incelendiğinde, T10 izolatının sadece tip II-C CRISPR sistemine sahip iken TR6 izolatının tip II-C, tip III-A, tip II-A ve tip I-E olmak üzere 4 farklı CRISPR sistemi içerdiği belirlenmiştir. S. thermophilus genomunda, genom boyutları yaklaşık 4 ile 50 kilobaz ve GC içeriği % 35,48 ile 42,3 arasında değişen 22 profaj benzeri element tespit edilmiştir. Ayrıca, 6 izolatın 13 farklı antibiyotiğe karşı duyarlılıkları analiz edilmiş ve TR 6 izolatının 4, TR79 izolatı 7, TR58 izolatı 9, TR10 izolatı 7, TR46 izolatı 9, TR88 izolatının 10 farklı antibiyotiğe direnç gösterdiği fakat 6 izolatın da genomlarında sadece tet (R) ve van (Z) antibiyotik direnç genleri bulunmuştur. Son olarak, 6 izolatın taramalı elektron mikroskobunda görüntüleri incelenerek, genomlarında bulunan yapısal ilişkili genler, ramnoz glukoz polisakkarit ve eksopolisakkarit gen kümelerinin hücre yapısı üzerinde roller değerlendirilmiş ve eksopolisakkaritlerin hücre yapısında farklılıklara neden olduğu bulunmuştur.
Çalışmanın ikinci aşamasında, ülkemiz endüstriyel fermente ürünlerden izole edilen ve önceden tanımlanmış fajların 36 S. thermophilus izolatları ile interaksiyon ilişkileri araştırılmıştır. Bu kapsamda, endüstriyel olarak üretilmiş boza ve kefir örneklerinden bakteriyofaj izolasyonu yapılmış ve elde edilen 6 faj lizatının mPCR sonucu pac grubuna ait olduğu belirlenmiştir. Faj lizatlarına ait genom dizilimi İllumina Miseq 2000 dizileme teknolojisi ile elde edilmiştir. Faj genomlarına ait nükleotit sayısı 36714 bç ve ortalma GC yüzdesi %39.2 olarak bulunmuştur. Son olarak, 36 S. thermophilus izolatın çalışma kapsamında tanımlanmış (ϕBoza1, ϕBoza4, ϕBoza6, ϕBoza9, ϕKefir1, ϕKefir3) ve önceden tanımlanmış (ϕSW16, ϕSW19, ϕSW8, ϕSW13, ϕSW1151, ϕSTP1) fajlarına karşı direnç durumları spot deneyler ile araştırılmış ve TR108 (rgpC) STP1 fajına duyarlı; TR46 izolatının SW13 ve Boza 6 fajına; TR 6 izolatının Boza 6 fajına; TR10 izolatının Boza1 ve Kefir3 fajlarına duyarlı olduğu tespit edilmiştir.

Abstract:
Streptococcus thermophilus strains are the second most widely used starter cultures in milk fermentation after Lactococcus lactis. The extensive application of this strain provides an important opportunity for the proliferation of infected bacteriophages. Phage invasion of S. thermophilus is a problem leading to fermentation failure resulting in low and inconsistent quality product production. Therefore, the finding and identification of the resistant strain, identification of the bacteriophage common in industrial environments is of great importance to industry. In this regard, in the first part of the study, isolation, identification and evaluation of phage resistance potentials of local strains, in the second part identification and host range analysis were performed. 
In the first part of the study, in order to determine the phage resistance potential of local isolates, 36 S. thermophilus isolates obtained from 24 yoghurt, 11 cheese and 1 kefir samples collected from 19 different cities were identified with 16 S rRNA. There are various resistance mechanisms against phages in S. thermophilus strains such as surface receptor recognition, R-M, CRIPSR systems. Firstly, groups of rhamnose glucose polysaccharides that act as receptors for Streptococcus phages of isolates were determined by mPCR. According to the mPCR results of 36 isolates, 1 isolate belonging to the rgpA group, 16 isolates belonging to the rgpB group, 3 isolates belonging to the rgpC group, and 16 isolates belonging to the rgpD group were determined. It was determined that 1 isolate did not comply with any rgp group defined in the literature. Clustered regularly spaced short palindromic repeats (CRISPR) are known as hypervariable loci that provide acquired immunity against foreign genetic elements. In order to analyze the phage resistance potentials and phage infection histories of 36 isolates identified in our study, the CRISPR loci were examined in detail. A total of 71 CRISPR loci belonging to 36 isolates were identified. While CRISPR1 locus was determined in all isolates, CRISPR2 locus in 15 isolates, CRISPR3 locus in 16 isolates and CRISPR4 locus was were determined in 4 isolates. Genome sequences of TR6, TR10, TR46, TR58, TR79 and TR81 isolates were obtained by Illumina Miseq sequencing systems in order to investigate the structure and mechanism of CRISPR Cas systems in S. thermophilus isolates in detail. In addition, the TR6 genome without rgp group was sequenced with PacBio technology for more detailed and reliable analysis. It was determined that the chromosome lengths of the isolates varied between 1.80 Mbp - 1.98 Mbp and with 38.9% GC content. It was determined that TR10 contains only type II-C CRISPR system, while TR6 contains 4 different CRISPR systems type II-C, type III-A, type II-A and type I-E. In the 6 S. thermophilus genome, 22 prophage-like elements with genome sizes of approximately 4 to 50 kilobases and GC content of 35.48 to 42.3% were detected. In addition, the susceptibility of 6 isolates to 13 different antibiotics was analyzed and it was found that TR 6 isolate 4, TR79 isolate 7, TR58 isolate 9, TR10 isolate 7, TR46 isolate 9, TR88 isolate resisted 10 different antibiotics. Only tet (R) and van (Z) antibiotic resistance genes were found in the genomes of these 6 isolates. Finally, the roles of structural related genes, rhamnose glucose polysaccharide and exopolysaccharide gene clusters in their genomes were evaluated by examining the images of 6 isolates in scanning electron microscopy, and it was found that exopolysaccharides caused differences in the cell structure. 
In the second stage of the study, the identification of phages isolated from industrial fermented products of our country and their interactions with 36 S. thermophilus isolates including some previously defined phages were investigated. In this context, bacteriophage isolation was performed from industrially produced boza and kefir samples and it was determined that the obtained 6 phage lysates belong to the pac group as a result of mPCR. The genome sequence of phage lysates was obtained by Illumina Miseq 2000 sequencing technology. The average DNA length of the phage genomes was 36714 bp and the mean GC percentage was 39.2%. Finally, resistance conditions against phages defined (ϕBoza1, ϕBoza4, ϕBoza6, ϕBoza9, ϕKefir1, ϕKefir3) and previously defined (ϕSW16, ϕSW19, ϕSW8, ϕSW13, ϕSW1151, ϕSTP1) within the scope of the study of 36 S. thermophilus isolate were investigated by spot experiments and TR108 (rgpC) sensitive to STP1 phage; TR46 isolate to SW13 and Boza 6 phage; TR 6 isolate to Boza 6 phage; The TR10 isolate was found to be susceptible to Boza1 and Kefir3 phages.