CHO hücrelerinde monoklonal antikor üretimi sırasında XBP-1(s) aşırı ekspresyonunun er stres ve glikozilasyon arasındaki ilişkiye etkisinin tanımlanması
Identification of effect of overexpression XBP-1(s) on relationship between er stress and glycosylation during monoclonal antibody production in CHO cells
Yazar: PELİN KOLÇAK YAŞLI
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ EVREN DORUK ENGİN
Ankara Üniversitesi / Biyoteknoloji Enstitüsü / Temel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; Endüstriyel üretim = Industrial production

Özet:
Çin hamster over (CHO) hücresi üretici memeli hücre hattı olarak ilaç endüstrisinde ağırlıklı biçimde kullanılan hücre hattıdır (1). Günümüze kadar farklı karyotipe sahip CHO-K1, CHO-DG44 (DHFR-/-), CHO-S (süspanse hücre hattı) gibi metabolik ve fonksiyonel farklılıklara sahip hücreler meydana çıkmıştır (2). Genetik plastisite hücreleri sentetik besiyeri gibi stres altındaki koşullarda genomlarını yeniden düzenleme yoluyla adaptasyon yeteneklerini arttırsa da genomik tutarsızlık yarattığı için gen fonksiyonlarının kaybedilmesine sebep olabilmektedir (3). Bir diğer problem ise ürünün hücre üzerinde meydana getirdiği stres neticesinde üretim veriminde azlık, yeni jenerasyon oluşturma güçlerinde azalma ve üretilen ürünün kalitesinde değişmeler görülmektedir. Bu durum çoğunlukla endoplazmik retikulumda (ER) katlanmamış proteinlerin yarattığı stres neticesinde olmaktadır (4,5)
Çalışmada, CHO hücrelerinde gerçekleşen ER stres kaynaklı fenotipik heterojenitenin adapte edici özelliğinden faydalanarak XBP1(s) geninin kontrollü olarak ifadelenmesi ile stres ile baş edebilecek varyantların hayatta kalması ve verimli – kaliteli bir üretim yapması amaçlanmıştır. Bu amaçla kullanılan TET-ON sistemi yoluyla XBP1(s) ekspresyonu arttırılan anti-PD-1 antikoru üreten CHO kolonilerinde antikorun glikozilasyon örgüsü, miktarı, aktivitesi ve kolonilerin uzun dönem hücre popülasyon ve üretim stabilitesi değerlendirilecektir. Böylece CHO memeli hücresi kullanılarak yapılan üretim sürecinin verimli ve stabil şekilde olabilmesi için süreçte etkin rol oynadığı düşünülen ER stresin protein üretim üzerindeki negatif etkisinin azaltılması planlanmaktadır.
Çalışma sonuçlarına bağlı olarak, transpozon sistemi kullanılarak elde edilen transfeksiyon sonrası seçilim süresinin 44 gibi kısa sürede yapılabildiği ancak rastgele aktarımda seçilim süresinin 100 gün gibi uzun bir sürede gerçekleştiği tespit edilmiştir. Sonrasında devam eden süreçlerde elde edilen koloniler ile yapılan13 günlük beslemeli parti çalışmalarında üretim 1.3 ila 2.6 g/L arasında değişen titrelere sahipken, rastgele transfer sistemi kullanılarak elde edilen kolonide 0,056 g/L üretime ulaşılmıştır. Ancak TET-ON sistemi kontrollü XBP1(s) aşırı ekspresyonu ile yapılan kesikli besleme çalışmalarında transpozon kolonisinde üretim 4.0 g/L ve rastgele sisteminden gelen kolonide üretimin 0.5 g/L'ye kadar yükseldiği ve ilgili kolonilerde XBP1(s) varlığında popülasyon üretim performansını stabil bir glikan profili ile koruduğu tespit edilmiştir.  Sonuç olarak, XBP1(s) ifade seviyeleri, yüksek IgG üretkenliği ve klonal stabilite arasında bir korelasyon gözlenmiştir. Buna bağlı olarak, XBP1(s) aracılı salgı mühendisliği, endüstriyel üretimlerde büyük bir zorluk olan klonal varyasyonu yöneten uygun maliyetli süreçler oluşturmak için umut vaat etmektedir.

Abstract:
The Chinese hamster ovary (CHO) cell line is predominantly used in the pharma industry as a producer of mammalian cell lines (1). To date, cells with different karyotypes and metabolic and functional differences, such as CHO-K1, CHO-DG44 (DHFR-/-), and CHO-S (suspended cell line), have emerged (2). Although genetic plasticity increases the ability of cells to adapt to stressful conditions, such as synthetic media, by reorganizing their genomes, it may cause loss of gene function due to genomic inconsistency (3). Another problem is that because of the stress caused by the product on the cell, there is a decrease in production efficiency, a decrease in the power to form new generations, and changes in the quality of the product produced. This is mostly due to the stress caused by unfolded proteins in the endoplasmic reticulum (ER) (4,5).
In this thesis, by utilizing the adaptive features of ER stress-induced phenotypic heterogeneity in CHO cells, the expression of the XBP1 (s) gene was controlled to ensure the survival of the variants that can cope with stress and ensure efficient and high-quality production. For this purpose, the glycosylation pattern, amount, activity, long-term cell population, and production stability of the antibody will be evaluated in CHO clones producing anti-PD-1 antibody, whose XBP1(s) expression is increased through the TET-ON system. Thus, for efficient and stable production using CHO cells, it is necessary to reduce the negative effect of ER stress on protein production, which is thought to play an active role in this process.
Based on the results of this study, it was determined that the selection period after transfection obtained using the transposon system could be carried out in a short period of 44 days, but the selection period in random was realized over a long period of 100 days. In the 13-day fed-batch studies carried out with the clones obtained in the subsequent processes, production had titers ranging from 1.3 to 2.6 g/L, whereas 0.056 g/L production was reached in the colony obtained using the random system. However, in fed-batch studies with TET-ON controlled XBP1(s) overexpression, production in the transposon colony increased to 4.0 g/L and in the colony from the random system to 0.5 g/L, and it was found that the population maintained its production performance with a stable glycan profile in the presence of XBP1(s) in the respective colonies.  Consequently, a correlation was observed between XBP1(s) expression levels, high IgG productivity, and clonal stability. Accordingly, XBP1(s)-mediated secretion engineering holds promise for creating cost-effective processes that manage clonal variation, which is a major challenge in industrial production.