Dışkı örneklerinden izole edilen Cryptosporidium RNA'sının tespiti için hızlı tanı testinin geliştirilmesi
Development of rapid diagnostic test to detect cryptosporidium rna isolated from stool samples
Yazar: AYGÜL SADİQOVA
Danışman: DOÇ. DR. AYŞE CANER
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı / Parazitoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Cryptosporidium = Cryptosporidium ; Dışkı = Feces ; Gen amplifikasyonu = Gene amplification ; RNA = RNA ; Teşhis teknikleri ve prosedürleri = Diagnostic techniques and procedures ; Teşhis testleri = Diagnostic tests

Özet:
Cryptosporidium spp. insanlarla beraber çok sayıda omurgalıyı da etkileyen gastrointestinal ve solunum sisteminde enfeksiyona neden olabilen hücre içi ve sitoplazma dışı yerleşimi olan bir protozoondur. Konağın bağışıklık sistemine bağlı olarak semptomsuz veya ağır ishallerle seyreden klinik bir tablo ile ortaya çıkabilmektedir. Parazit, özellikle çocuklarda ve immun sistemi baskılanmış kişilerde önemli bir sağlık sorunudur. Cryptosporidium spp. dünyanın çok sayıda ülkesinde yaygın olarak görülmekte, Afrika ve Asya'nın birçok bölgesinde çocuklar arasında ishal etkeni olarak rotavirüsden sonra ikinci sırada yer almaktadır. Özellikle okul öncesi çocuklar arasında yüksek mortalite ve morbiditiye neden olabilmektedir. Cryptosporidiosisin önemli bir toplum sorunu olmasından dolayı hastalığın erken tanısı çok önemli olmakta ve etkenin tanısında farklı laboratuvar yöntemleri uygulanmaktadır. Cryptosporidium ookistlerinin yoğun olarak bulunduğu dışkıda parazitin tanısı direkt yayma ve boyama yöntemleri ile yapılmakta fakat ookist miktarının daha az olduğu ve risk grubu kişilerde daha spesifik ve hassas tanı yöntemlerine ihtiyaç duyulmaktadır. Cryptosporidium spp. tanısında moleküler bir test olan PZR, çok hassas bir tanı yöntemi olması ve az miktarda ookist varlığını gösterebilmesine rağmen yüksek maliyetli olması, iyi yetişmiş personel ve gelişmiş cihaz gerektirmesi her merkezde yaygın olarak kullanımını kısıtlamaktadır. Ayrıca bu testlerde parazitlerin DNA'sı kullanılmaktadır. Yapılan bakteriyel çalışmalar RNA'nın direkt dışkı örneklerinden elde edilebildiğini ve DNA'dan daha üstün bir tanı imkanı sağladığını göstermiştir. Bu çalışma ile PZR cihazlarına ihtiyaç duyulmadan, RLB solüsyonu kullanılarak oda ısısında Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyon (RPA) yöntemi ile nükleik asitlerin izotermal tespiti yapılmıştır. Revers Transkriptaz-RPA (RT-RPA) yöntemi kullanılarak dışkılardan izole edilmiş Cryptosporidium RNA'sını Lateral Flow striplerinde teşhis edebilen yöntem geliştirilmiştir. Aynı zamanda çalışma RNA izolasyon kiti ve RLB kullanılarak elde edilen RNA ve genomik DNA RPA/PZR testi ile karşılaştırılmıştır. Sonuçta RLB solüsyonu ile oluşturulan RT-RPA ve Lateral Flow testinin qPZR'a göre daha yüksek analitik duyarlılığı bulunduğu gösterilmiştir. İlk kez Cryptosporidium RNA'sı kullanılarak yüksek duyarlı ve özgüllüğe sahip bir yöntem ile cryptosporidiosis tanısına yeni bir yaklaşım getirilerek kısıtlı şartları olan laboratuvarlarda ve saha çalışmalarında kullanılabilen hızlı bir tanı testi geliştirilmiştir. Bu metodolojinin diğer intestinal parazitlerin tanısı için de yararlı olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
Cryptosporidium that causes an infection in the gastrointestinal and respiratory system both in humans and other vertebrates is a protozoon established in intracellular and extracytoplasmic area. Infection may occur with asymptomatic or severe diarrhea as clinical depending on the host immune system. Cryptosporidiosis is an important health problem especially in children and immunocompromised individuals. It is known that Cryptosporidiosis widely seen in many countries of the world and is the second leading cause of diarrhea after rotavirus in some countries of Africa and Asia. It can cause high mortality and morbidity, especially among preschool children. As a main public health problem, it is very important to detect and diagnose on time. Therefore, different laboratory methods are used to diagnose the disease and detect parasite. There is a need for more specific and sensitive diagnostic methods in the number of oocysts were lower, and in people within the risk group while diagnosis of the parasite in feces where Cryptosporidium oocysts are dense is made by staining methods. Molecular diagnostic techniques of cryptosporidiosis are sensitive and specific and detect presence of less number of oocysts. However, their widespread use is limited in every center because these methods could only conducted in fully-equipped laboratories with well-trained personnel and high costs. In addition to this, the DNA of the parasites is used in these tests. Bacterial studies have shown that RNA can be obtained directly from stool samples and provides a better diagnosis than DNA. In this study, isothermal detection of nucleic acids by Recombinase Polymerase Amplification (RPA) with RLB was performed at room temperature without the need for PCR devices. We developed Reverse transcriptase-RPA (RT-RPA) and Lateral Flow assay to detect Cryptosporidium RNA isolated from feces. Our results demonstrated that RNA could be amplified under isothermal conditions using nucleic acids extracted directly from stool samples. The study was also compared with RNA and genomic DNA RPA/PZR test obtained using RNA isolation kit and RLB. As a result, RT-RPA and Lateral Flow test created with RLB solution has been shown to have higher analytical sensitivity than qPZR. By using Cryptosporidium RNA for the first time, a new approach to the diagnosis of cryptosporidiosis has been developed which has highly sensitive and specific and is a rapid diagnostic test that can be used in laboratory and field studies with limited conditions. We anticipate that the methodology described here would be useful to conduct diagnosis of other intestinal parasites at low-resource settings.