Polimer/oligonükleotid komplekslerinin karakterizasyonu ve modellenmesi
Characterization and modelling of polymer/olygonucleotide complexes
Yazar: ERAY DALGAKIRAN
Danışman: DOÇ. DR. SEVİL DİNÇER ; PROF. DR. HASAN TATLIPINAR
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Işık saçılması = Light scattering ; Moleküler dinamik benzetimi = Molecular dynamic simulation

Özet:
Bu çalışmada, antisens oligonükleotid (AS ODN) taşıyıcısı olarak daha önce grubumuzda sentezlenmiş olan metoksi poli(etilen glikol)-b-poli(?-kaprolakton)-b-poli(etilen imin) (mPEG-b-PCL-b-PEI) ve metoksi poli(etilen glikol)-b-poli(L-laktat)-b-poli(etilen imin) (mPEG-b-PLL-b-PEI) triblok kopolimerlerin model olarak seçilen c-myc AS ODN ile etkileşimleri, deneysel ve modelleme yoluyla karakterize edilmiştir. C-myc, hücre büyümesinin kontrolünde önemli rol oynayan bir gen türü olup özellikle meme kanserinde tümörlerin çoğunda normal dışı bir c-myc aktivitesi bulunduğundan, kanser tedavisine yönelik çalışmalarda yoğun şekilde hedef alınmaktadır. Kusurlu c-myc genlerinin ekspresyonunu engellemek için, c-myc mRNA?sına karşılık gelen AS ODN?ler kullanılabilir. Bu AS ODN?lerin tümör hücrelerine etkin ve güvenli bir şekilde taşınması amacıyla polikatyonik vektörlerin kullanımı oldukça yaygın bir yaklaşımdır.

DNA aktarım çalışmalarının başarısı; oluşan kompleksin boyutu, molekül ağırlığı ve yükü gibi fizikokimyasal parametrelere bağlı olduğundan, çalışmanın ilk aşamasında taşıyıcı polimerler ve oluşan polimer/ODN komplekslerinin yapısal karakterizasyonları gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla, farklı azot(N)/fosfor(P) oranlarında hazırlanan polimer/ODN kompleksleri, dinamik ışık saçılması ve sedimantasyon denge analizi ile karakterize edilmiştir. Çalışmanın ikinci kısmında ise, polimerler ile ODN arasındaki etkileşimler ve oluşan yapılar ?Amber? moleküler dinamik yazılımı kullanılarak incelenmiştir.

Deneysel sonuçlara göre çok monodispers ve çözelti içinde kararlı kompleks yapıların oluştuğu, komplekslerin boyut ve molekül ağırlıklarının N/P oranına göre ayarlanabildiği ve sentezlenen polikatyonların yüksek taşıma kapasitesine sahip olduğu bulunmuştur. Modelleme sonuçlarına göreyse PEI ve ODN moleküllerinin birbirlerine yaklaşmasıyla kısa sürede komplekslerin oluştuğu, kompleks oluşumuyla ODN?nin bir miktar kompaktlaştığı, kompleks oluşumlarının ODN?nin fosfor atomları etrafındaki Na+ iyonlarının uzaklaşması ve PEI?nin protonlanmış amin gruplarının yaklaşmasıyla gerçekleştiği, ODN?nin fosfat gruplarındaki oksijen atomları ile PEI?nin amin gruplarının hidrojen atomları arasında H-bağlarının oluştuğu ve hesaplanan bağlanma enerjilerine göre incelenen triblok kopolimerlerin gen terapiye yönelik potansiyel polimerik vektör olarak kullanılabileceği bulunmuştur. Ayrıca, hem modelleme hem de deneysel sonuçlara göre polimerlerin omurgalarında yer alan hidrofobik zincirlerin uzunluğu, kompleks oluşumunu etkilemektedir ve PLL?ye kıyasla daha fazla sayıda hidrofobik alkil zincirlerine sahip PCL içeren triblok kopolimerlerin ODN ile oluşturduğu komplekslerin boyutları, molekül ağırlıkları, bağlanan birim sayıları ve bağlanma enerjileri buna bağlı olarak daha düşük çıkmıştır.

Abstract:
In this study, the interactions between triblock copolymers that are synthesized previously by our group as antisense oligonucleotide carriers, methoxy poly(ethylene glycol)-b-poly(?-caprolactone)-b-poly(ethylene imine) (mPEG-b-PCL-b-PEI) and methoxy poly(ethylene glycol)-b-poly(L-lactate)-b-poly(ethylene imine) (mPEG-b-PLL-b-PEI), with c-myc AS ODN were characterized by experimentally and modelling. C-myc is an important gene type which plays important role in controlling cell growth and it is often targeted in cancer treatment studies because abnormal c-myc activities have been observed in especially breast cancer tumors. Corresponding AS ODNs of c-myc mRNAs can be used to inhibit expression of damaged c-myc genes. The use of polycationic vectors for effective and safe transfer of these AS ODNs into tumor cells is quite a common approach.

In the first part of the study, structural characterizations of the polymeric carriers and polycation/ODN complexes were carried out because the achievement of DNA transfer studies is related with physicochemical parameters such as complex?s size, molecular weight and charge. For this purpose, polycation/ODN complexes that were prepared in different nitrogen (N)/phosphor (P) ratios were characterized by using dynamic light scattering and sedimentation equilibrium techniques. In the second part of the study, the interactions between polycations with ODN and formed structures investigated by using Amber molecular dynamics software.
   
According to the experimental results, highly monodisperse and stable complex structures are formed in the solution. Also, it is found out that the size and molecular weight of the complexes can be adjusted by N/P ratio and synthesized polycations have high delivery capacity.  According to the modelling results, complexes are formed by PEI and ODN molecules come closer in a short time, ODN is compacted a little by complexation, complexations occurred by Na+ ions releasing from vicinity of phosphor atoms of ODN and by approaching of protonated amine nitrogen atoms of PEI to vicinity of phosphor atoms of ODN and H-bondings are formed between oxygen atoms of phosphate groups of ODN and protonated amine nitrogen atoms of PEI. Also, according to the calculated binding energies, triblock copolymers can be used as potential polymeric vectors in gene therapy. Furthermore, according to both modelling and experimental results, the length of hydrophobic chains in backbone of polymers affects complexation and it is found out that the sizes, molecular weights, number of binding units and binding energies of complexes between ODN and triblock copolymers containing PCL are less than complexes between ODN and triblock copolymers containing PLL due to the fact that PCL has more hydrophobic alkyl chains than PLL.