Derin ötektik çözücü kullanılarak lignoselülozik biyokütleden inülinaz enzimi üretiminin optimizasyonu
Optimization of inulinase enzyme production from lignocellulosic biomass using a deep eutectic solvent
Yazar: HATİCE GÖZDE HOSTA YAVUZ
Danışman: PROF. DR. İRFAN TURHAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu tez çalışması lignoselülozik biyokütleden derin ötektik çözücü (DES) ile ön işlem sürecinin optimize edilmesi ve elde edilen hidrolizatlardan inülinaz enziminin üretimini ve kısmi saflaştırılmasını kapsamaktadır. Arpa kavuzu (AK), buğday kepeği (BK), çavdar kepeği (ÇK) ve yulaf kavuzunun (YK) ön işleminde kolin klorür: gliserol ve kolin klorür: asetik asitin farklı molar oranları (1:2, 1:4 ve 1:6)  kullanılmıştır.  Bu hammaddelere DES ile su banyosunda bir ön işlem uygulanarak mikrodalga ve YBR destekli ön işlemede kullanılacak DES çeşidi ve molar oranı belirlenmiştir. Cevap yüzey metodu ile AK, BK, ÇK ve YK'nın kolin klorür: gliserol (1:2) ile yüksek basınç reaktörü ve mikrodalga destekli ön işlem süreci optimize edilmiştir. Hidrolizatların şeker profili (glukoz, ksiloz, fruktoz, sakkaroz, maltoz ve arabinoz) ve furan türevlerinin (furfural ve 5-hidroksimetilfurfural (HMF)) miktarları belirlenmiştir. Cevap yüzey metodunda kullanılan değişken parametrelerden YBR sıcaklığı/mikrodalga gücü, uygulama süresi ve sıvı katı oranının fermente edilebilir şeker konsantrasyonu ve fenolik madde konsantrasyonu üzerindeki etkisi incelenmiştir. AK için mikrodalga destekli optimize edilmiş koşullar 460 W, 64,8 saniye, s/k 9.90, YBR destekli ise 110,93°C', 39,98 dakika ve s/k 4 olmuştur. BK için mikrodalga destekli optimize edilmiş koşullar 120 W, 90 saniye, s/k 7,36; YBR destekli ise 130°C, 27 dakika ve s/k 4'tür. ÇK için optimize edilmiş koşulların mikrodalga destekli 460 W, 66,03 saniye, s/k oranı 4,29; YBR'de ise 107,39°C', 39,74 dakika ve s/k 8,51 olduğu belirlenmiştir. YK'nun mikrodalga destekli optimize edilmiş koşulları 350W, 30 saniye ve s/k 4 iken YBR destekli 100,09°C', 30,49 dakika s/k'nın ise 4 olduğu tespit edilmiştir. Lignoselülozik hammaddelere uygulanan bileşen analizleri; derin ötektik çözücü uygulamasının ekstraktif madde, hemiselüloz ve lignin oranlarını azaltırken selüloz oranını arttırdığı göstermiştir. Hidrolizatların organik asit tayini sonuçları DES ile ön işlemin benzoik asit miktarını azalttığını ve fermentasyonu engelleyecek inhibitör oluşmadığını göstermiştir. Hidrolizatlarda ve DES ile ön işlem esasında ayrılan sıvı fazda ksiloooligosakkarit analizleri gerçekleştirilmiştir. Maksimum ksilooligosakkarit içeriği ÇK'nin mikrodalga destekli ön işleminde sıvı fazda tespit edilmiştir.
Çalışmanın devamında AK, BK, ÇK ve YK hidrolizatları kullanılarak inülinaz fermantasyonları gerçekleştirilmiştir. Maksimum  inülinaz aktivitesi kolin klorür: gliserol (1:2) ile su banyosunda ön işlenmiş BK hidrolizatı ile elde edilmiştir (Iase = 416,05 U/ml ve Sase = 486,22 U/ml). Enzim, 50 kDa ayırma sınırındaki membran ile kısmen saflaştırılmış ve retentat kısmından alınan örneklerde inülinaz ve invertaz aktiviteleri sırasıyla 769,93 U/mL ve 566,69 U/mL olarak tespit edilmiştir. Permeatların inülinaz ve invertaz aktiviteleri ise sırasıyla 503,02 U/mL, 244,68 U/mL olarak belirlenmiştir. Saflaştırma katsayısı değerleri ise inülinaz için 1,88; invertaz-tip için ise 0,92 olmuştur.  Katma değeri yüksek bir ürün olan inülinaz enzimi üretimi için çalışılan lignoselülozik hammaddeler içinde BK'nin en iyi kaynak olduğu ve derin ötektik çözücü ile ön işlemin inülinaz aktivitesini arttırdığı belirlenmiştir. Bu çalışmanın asıl amacı inülinaz üretimi olmakla birlikte DES ile ön işlem esnasında prebiyotik olarak oldukça değerli bir ürün olan ksilooligosakkaritlerin üretimi çalışmanın niteliğini arttırmıştır. Bu çalışmada lignoselülozik hammdelerin katma değeri yüksek bir enzim olan inülinaz üretiminde kullanılması döngüsül ekonomi perspektifinde büyük önem taşımaktadır. Lignoselülozik hammdelere uygulanan ön işlemde yeni nesil yeşil çözücü olan derin ötektik çözücülerin kullanılması sürdürülebilir bir yaklaşım ortaya koymuştur.

Abstract:
This thesis study comprises optimizing the pretreatment process with deep eutectic solvent (DES) from lignocellulosic biomass and the production and partial purification of inulinase enzyme from the resulting hydrolysates. Different molar ratios of choline chloride: glycerol and choline chloride: acetic acid (1:2, 1:4 and 1:6) were used in the pretreatment of barley husk (BH), wheat bran (WB), rye bran (RB) and oat husk (OH) used. By pretreating these raw materials with DES in a water bath, DES type and molar ratio to be used in microwave and high pressure reactor (HPR) assisted pretreatment were determined. With the Response Surface Methodology (RSM), the high pressure reactor and microwave assisted pretreatment process of BH, WB, RB, and OH with choline chloride: glycerol (1:2) was optimized. The sugar profile (glucose, xylose, fructose, sucrose, maltose and arabinose) and the amounts of furan derivatives (furfural and 5-hydroxymethylfurfural (HMF)) of the hydrolysates were determined. The effects of HPR temperature/microwave power, application time and liquid solid ratio (LSR), which are among the variable parameters used in the response surface method, on fermentable sugar concentration and phenolic substance concentration were examined. The optimized conditions for BH were found to be 460 W, 64.8 seconds, LSR of 9.90, while HPR assisted conditions were 110.93°C, 39.98 minutes and LSR of 4. Microwave assisted optimized conditions for WB 120 W, 90 seconds, LSR 7.36, while HPR assisted, it is 130°C, 27 minutes and LSR of 4. Optimized conditions for RB were microwave-assisted 460 W, 66.03 seconds, and a LSR of 4.29, while HPR assisted, it was determined to be 107.39°C, 39.74 minutes and LSR of 8.51. While the optimized conditions of OH with microwave assisted pretreatment were 350W, 30 seconds and LSR of 4, it was determined that HPR assisted conditions were 100.09°C, 30.49 minutes LSR was 4. Component analyzes applied to lignocellulosic raw materials have shown that the application of deep eutectic solvent increases the cellulose ratio while decreasing the extractive matter, hemicellulose and lignin ratios. The results of organic acid determination of hydrolysates showed that pretreatment with DES reduced the amount of benzoic acid and no inhibitor was formed that would prevent fermentation. Xyloooligosaccharide analyzes were carried out in hydrolysates and in the liquid phase separated on the basis of pretreatment with DES. The maximum xylooligosaccharide content was determined in the liquid phase during microwave-assisted pretreatment of RB.
In the following stages of the study, inulinase fermentations were carried out using BH, WB, RB, and OH hydrolysates. Maximum inulinase activity was achieved with WB hydrolyzate pretreated with choline chloride:glycerol (1:2) in a water bath (Iase = 416.05 U/ml and Sase = 486.22 U/ml). The enzyme was partially purified with membrane has the cutoff value of 50 kDa, and inulinase and invertase activities in the samples taken from the retentate part were determined as 769.93 U/mL and 566.69 U/mL, respectively. Inulinase and invertase activities of permeates were determined as 503.02 U/mL and 244.68 U/mL, respectively. Purification coefficient values for inulinase and invertase-type was 1.88 and 0.92, respectively. It has been determined that WB is the best source of lignocellulosic raw materials studied for the production of inulinase enzyme, a product with high added value, and pretreatment with a deep eutectic solvent increases inulinase activity. Although the main purpose of this study is the production of inulinase, the production of xylooligosaccharides, which is a very valuable product as a prebiotic, during the pre-treatment with DES has increased the quality of the study. In this study, the use of lignocellulosic raw materials in the production of high value added inulinase enzyme has great importance from a circular economy perspective. The use of deep eutectic solvents, which are new generation green solvents, in the pre-treatment of lignocellulosic raw materials has revealed a sustainable approach.