Toprak bakterilerinden selülaz-free ksilanaz enziminin üretimi, izolasyonu, kısmi karakterizasyonu ve enzimin endüstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğinin araştırılması
Production, isolation, and partial characterization of the cellulase free xylanase enzyme from soil bacteria and determination of usage possibilities in industrial applications
Yazar: SEDAT KÖSTEKCİ
Danışman: DOÇ. DR. ASHABİL AYGAN
Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Van gölünün kıyı sahillerinden alınan toprak örneklerinden Bacillus sp. izole edilen toplam 243 bakteri suşu içerisinde 50 suşun (% 22.6) selülaz free ksilanaz enzimi ürettiği belirlenmiştir. En yüksek ksilanolitik aktivite gösteren ASX42 suşu enzim üretimi ve karakterizasyon çalışmaları için seçilmiştir. Bazı biyokimyasal ve mikroskobik testlere tabi tutulan bu suş Bacillus sp. olarak tanımlanmıştır. Bacillus sp. ASX42 suşu en yüksek ksilanolitik aktivitesini pH: 9.0' de ve 30 °C'de oluşturmuştur.
ASX42 selülaz free ksilanaz enziminin optimum aktivitelerini 60 °C'de ve pH: 9.0'da göstermiştir. Ayrıca izole edilen bu enzimin stabilite pH yelpalzesi çok geniş olup pH: 3.5-9.0 aralığında stabilitesini 15 dakida % 90 oranında 30 dakikada %71 oranında koruduğu tespit edilmiştir. Termal stabilitesi ise 4ºC -60ºC aralığında % 68.7, 65-95ºC aralığında ise ortalama % 60 aktivite göstermektedir. Bütün sıcaklık değerleri incelendiğinde ortalama % 64.9 aktivite elde edilmiştir. İzole selülaz free ksilanaz enzimi bu özellikleri ile çok geniş bir sıcaklık aralığında yaklaşık % 65 düzeyinde aktiviteye sahiptir (Şekil 4.18).Ayrıca 60oC 'de 15-30-45 dk ön inkübasyonda enzimi denatürasyona karşı en iyi koruyan ajanın % 20 (v/v) gliserol olduğu tespit edilmiştir. Metal iyonlarının enzim üzerine etkisine bakıldığında ise hem 5mM hemde10mM konsantrasyonlarda HgCl2 enzim için inhibitördür. Ayrıca kobalt (Co) ksilanaz enziminin enzim aktivitesini % 132'e, mangan (Mn) enzim enzim aktivitesini % 130 çıkararak oldukça stimüle etkisi göstermiştir. İyonik deterjanlar (SDS) enzimler üzerinde inhibitör etkisinde olmasına rağmen iyonik olmayan deterjanlar (Triton X-114) ksilanaz enzimine aynı etkiyi yapmamıştır. Diğer yandan EDTA (% 77), 1,10-Phenanthrolin monohidrat(%89),  β-merkaptoetanol(% 92)inhibe edici etkide bulunduğu tespit edilmiştir. PMSF ise % 111 enzim için de aktivatör etkisi göstermiştir. Ksilan konsantrasyonunun enzim üzerine etkisine bakıldığında ise maksimum enzim aktivitesine % 1.0'lik ksilan konsantrasyonunda ulaştığı tespit edilmiştir. 
Enzimin substratlarına karşı spesifitesi incelendiğinde enzimin selülozu parçalayamadığı ve ksilan üzerine çok etkili olduğu bu sonuçlara dayanarak enzimin selülaz free ksilanaz olduğunu göstermiştir.
SDS-PAGE analizi ile ksilanaz enziminin moleküler büyüklükleri sırasıyla 66 kDa olarak bulunmuştur. İnce tabaka kromotografisi sonuçlarına göre ksilanaz enziminin son ürünleri ksiloz ve ksilooligosakkaritler olmuştur.
 Enzim üretimi üzerine çeşitli faktörlerin etkisine bakıldığında ise en uygun inokülüm hacminin %10 olduğu, enzim üretimi için kullanılan ticari karbon kaynaklarından inhibe etkisinin en yüksek glikoz (%35) olduğu tespit edilmiştir. Organik karbon kaynaklarının hepsi stimüle edici etkide bulunmuş olup stimüle etkisi en yüksek karbon kaynağı olarak buğday samanı (%79) tespit edilmiştir. Enzim üretimi için kullanılan inorganik azot kaynakları ve Organik azot kaynakları test edilmiştir. Enzim üretimi için kullanılan metal iyonlarından Mn (%369) olan üstü bir sitümüle etki göstermiş iken Zn+2, Hg+2 çok yüksek inhibe edici etkide bulunmuştur. Enzim üretiminde kullanılan subsratlardan buğday samanının enzim üretiminde mükemmel bir subsrat kaynağı olduğu tespit edilmiş olup enzim üretiminde en yüksek verimin alındığı subsrat konsantrasyonu ise %1 olarak tespit edilmiştir. 
Bu çalışmalar göstermektedir ki Bacillus sp. ASX42 suşu tarafından üretilen enzimler yukarıda belirtildiği gibi faydalı özellikler taşımaktadır. Bu enzim hayvan yemi, atık uygulamaları, kağıt ve kağıt hamuru ve biyoyakıt üretimi, deterjan, gıda ve fırıncılık, peyzaj ve fidancılık, kimya endüstrilerde kullanılabilme potansiyeline sahiptir. Özellikle tohum kabuk kalınlığından kaynaklı çimlenme problemi yaşayan bitkilerin çimlendirilmesinde çok faydalı olduğu ve bu alanda kullanıla bileceği kanısı oluşmuştur.

Abstract:
Total of 235 Bacillus sp. were isolated from soil samples of Van soda lake shores. Among the isolates 50 strains (22.6%) were cellulase free xylanase producing. The highest xylanase activity showing culture ASX42 enzyme was chosen for enzyme production and characterization. After biochemical and microscobic examinations, the strain was identified as Bacillus sp. The maximum activity of Bacillus sp. ASX42 was obtained at pH 9.0 and 30°C temperature. ASX42 enzyme was stable with   90% of remaining activity between pH 3.5-13.0 for 15 min while it was stable about 71% for 30 minutes. Thermal stability of enzyme, activity was shown average 68.7% at 4-60 ºC and 60% at 65-95 ºC.
The highest thermal stability of xylanase enzyme is observed to be between 15 to 30 minutes at 55°C. In addition, the agent protecting the enzyme from denaturation at 60°C for 15,30 and 45 minutes of incubation has been found  with 20% (v/v) glycerol.  
The effects of metal ions on the enzyme has been tested in 5mM and 10mM concentrations, HgCl2 is a strong inhibitor for both concentrations. Cobalt (Co) with 132% and Manganese (Mn) with 130% have shown a stimulatory affect on the xylanase enzyme activity. Ionic detergents (SDS) have shown an inhibitory effect on the enzyme while non-ionic detergents (Triton X-114) have not shown the same effect. The remaining activity were 77%, 89% and 92% in the presence of EDTA, 1,10-Phenanthroline monohydrate and  β- mercaptoethanol, respectively. PMSF showed an activatory effect (111%) for the enzyme. Xylan concentration (1.0%) effects was also observed to have a maximum activity on the enzyme activity. The substrate specificity have been analyzed and found that the enzyme can not digest cellulose which concluded that the xylanase enzyme is cellulose free. Using SDS-PAGE analysis, the molecular size of xylanase enzyme has been found to be 66 kDa. Thin layer chromatography showed the last products of xylanase enzyme  is xylose and oligosaccharides. The best inoculum volume effecting the enzyme production is 10% of inoculation culture, and the most inhibition for the enzyme production as carbon sources is glucose. 
Among the inorganic and organic nitrogen sources were also tested for enzyme production. Metal ions used for enzyme production such as Mn had a stimulatory effects of 369%, while Zn+2 and Hg+2 were found to be strong inhibitors. For bulk production of enzyme industrially, wheat straw was found to be excellent substrate source and the highest output of substrate concentration was determined to be 1%.
	The studies show that the enzymes produced by Bacillus sp. ASX42 has a beneficial qualities. For this reason, the enzymes could be used in industries such as paper and kraft pulp and biofuels production, provender industry, waste application, detergent, food and bakery, gardening and arboriculture, chemistry.