İstanbul'daki atlarda theileria equi ve babesia caballi'nin yayılışı ve moleküler karakterizasyonu
Prevalence and molecular characterization of theileria equi and babesia caballi  in horses in istanbul
Yazar: FATMA NUR DAL
Danışman: PROF. DR. AYNUR GÜLANBER ; PROF. DR. MUSTAFA NECATİ MUZ
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Parazitoloji Ana Bilim Dalı / Veteriner Parazitoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Parazitoloji = Parasitology ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Bu çalışmada atlarda ekonomik kayıplara neden olan tek tırnaklı piroplasmosisinin etkenleri, Theileria equi ve Babesia caballi' nin, İstanbul' da halk elinde yetiştirilen atlardaki yayılışlarının mikroskobik, serolojik ve moleküler tekniklerle araştırılması, ve etkenlerin filogenetik sınıflandırması yapıldı.
Mayıs-Ekim 2018 tarihleri arasında İstanbul'un Avrupa ve Anadolu yakaları ile Adalar' daki 14 örnekleme merkezinde random örneklenen 400 adet attan EDTA' lı ve serumluk kan örnekleri toplandı. Mikroskobik tanı amacıyla, EDTA' lı kanlardan hazırlanan sürme frotiler, %5 Giemsa solüsyonu ile boyandı, ışık mikroskobunda etkenlerin piroplasm formları açısından incelendi. Serolojik tanı amacıyla, kan örneklerinden hazırlanan serum örnekleri, B. caballi ve T. equi için spesifik ticari kompetatif ELISA (cELISA) tanı kitleri ile test edildi. Moleküler tanı amacıyla EDTA' lı kan örneklerinden genomik DNA izolasyonu yapıldı. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) testi, 18s rRNA gen bölgesinde, etkenlere spesifik bölgeleri hedefleyen primerler ile gerçekleştirildi. Pozitif örnekler, dizi analizi hizmeti veren ticari firmaya gönderildi. Sonuçlar, National Center Biotechnology Information (NCBI) servisinin, Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) web sayfasında sağlanan hizmetten yararlanılarak tanımlandı. İzolatlara ait dizilimler GenBank veri tabanına kaydedildi. Hizmet alımı yoluyla filogenetik sınıflandırma gerçekleştirildi. 
İstanbul' da örneklenen 400 atın 135 tanesinde en az bir tespit yöntemi ile T. equi 135/400 (%33,75) ve 11 tanesinde de B. caballi 11/400 (%2,75) pozitifliği tespit edildi. Mikroskobik incelemede T. equi %1,5 (6/400) oranında tespit edildi, B. caballi' ye rastlanmadı. Serolojik incelemede T. equi'nin seroprevalansı %32 (128/400),  B. caballi' nin seroprevalansı %1,25 (5/400) olarak tespit edildi. Moleküler tanıda, T. equi' nin moleküler prevalansı %20,25 (81/400), B. caballi' nin moleküler prevalansı %2 (8/400) olarak tespit edildi. 
Serolojik ve moleküler incelemede Theileria equi pozitifliği, Avrupa yakasındaki atlarda cELISA %28,2; PZR %19,1; Anadolu yakasındaki atlarda cELISA %30, PZR %13, Adalar' daki atlarda cELISA %42,9, PZR %30,7 oranında tespit edildi. Babesia caballi pozitifliği, Avrupa yakasındaki atlarda cELISA %1; PZR 2,9 %; Anadolu yakasındaki atlarda cELISA %2, PZR %0, Adalar' daki atlarda cELISA %1,1, PZR %2,2 oranında tespit edildi. Örnekleme bölgelerine göre T. equi prevalans oranları arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak önemli bulundu (p<0,05), B. caballi prevalanslarında önemli fark bulunmadı (p>0,05).
Tespit edilen prevalans oranlarının yaş ve cinsiyete göre dağılım oranlarında istatistiksel olarak önemli fark bulunmadı (p>0,05). Enfeksiyon prevalansı, sıcak kanlı ırk atlarda, ılık ve soğuk kanlı ırklardaki atlara göre daha yüksek tespit edildi. Prevalans farklılıkları B. caballi için önemsiz (p>0,05), T. equi için istatistiksel olarak önemli bulundu (p<0,001). Profesyonel kullanıma yönelik olan sportif amaçlı ve damızlık atlarda, fayton ve diğer amaçlar için kullanılan atlardan daha düşük oranda prevalans tespit edildi. Atların kullanım amacı gruplarına göre prevalans farklılıkları, T. equi için istatistiksel olarak önemli (p<0,001), B. caballi için önemsiz bulundu (p>0,05). 
Bu çalışmada elde edilen T. equi ve B. caballi örneklerine ait dizi analizlerinin, dünyadaki önceki örneklerle karşılaştırıldığı moleküler karakterizasyon sonucuna göre, T. equi' nin A, D ve E gruplarında, B. caballi' nin A ve B gruplarında yer aldığı görüldü. 
Theleria equi ve B.caballi' nin İstanbul genelinde yayılış sergilediği ve T. equi'nin, B. caballi'den daha yüksek prevalansa sahip olduğu belirlendi.

Abstract:
This study was aimed to determine the prevalence of Theileria equi and Babesia caballi, the causative agents of equine piroplasmosis, which cause economic losses in horses, by microscopic, serological and molecular techniques in horses in Istanbul, and do filogenetic classification of the agents.
Between May and October 2018, blood samples were collected in tubes with EDTA and anticoagulant free from 400 horses randomly sampled in 14 regions in Istanbul. Thin blood smears were prepared from EDTA samples, stained with 5% Giemsa solution and examined under light microscope for intracellular forms of piroplasms. Sera collected for serological test analysis were used two commercial cELISA T. equi and B. caballi antibody test kits. Genomic DNA isolation from EDTA blood samples was performed using a commercial kit. PZR was performed with primers that amplify agent-specific regions in the 18s rRNA gene region. Positive samples that appeared bright at the end of gel imaging were sent to a commercial company for bidirectional sequencing. The sequences obtained were identified using the Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) web page of the National Centre Biotechnology Information (NCBI) and the sequences of the isolates were registered in the GenBank database. Molecular characterization of the isolates obtained from different parts of the world by comparing them with geographical isolates was carried out by the service procurement.
T. equi positivity detected by at least one diagnostic method in horses sampled in Istanbul was 135/400 (33,75%) and B. caballi 11/400 (2,75%). According to microscopic examination, T. equi was detected in 1,5 % (6/400), B. caballi was not found. The seroprevalence of T. equi was 32% (128/400) and the seroprevalence of B. caballi was 1.25% (5/400) in horses in Istanbul. The molecular prevalence of T. equi was 20,25% (81/400) and the molecular prevalence of B. caballi was 2% (8/400) in horses in Istanbul. Theileria equi positivity was detected by cELISA 28,2% and PZR 19,1% in horses on the European side, cELISA 30% and PZR 13% in horses on the Asian side, cELISA 42,9% and PZR 30,7% in horses on the Prince' Islands. Babesia caballi positivity was detected by cELISA 1 % and PZR 2,9% in horses on the European side, cELISA 2% and PZR 0% in horses on the Asian side, cELISA 1,1% and PZR 2,2% in horses on the Prince' Islands. 
There was no statistically significant difference in the prevalence rates according to age and gender (p>0.05). A higher prevalence of infection was detected in horses of hot blooded breeds than in horses of cold and warm blooded breeds, the differences were insignificant for B. caballi (p>0,05), but statistically significant for T. equi (p<0,001). The prevalence of infection was lower in sport and breeding horses intended for professional use than in horses used for carriage and other activities. The difference in prevalence rates was statistically significant for T. equi (p<0.001), while the difference in prevalence rates was insignificant for B. caballi (p>0.05).
Comparison of the sequences obtained in this study with the sequences of isolates from different geographical regions of the world showed that T. equi isolates were in groups A, D and E, and B. caballi isolates were in groups A and B.
In this study, it was determined that T. equi and B. caballi were distributed in different part of Istanbul and T. equi had a higher prevalence than B. caballi.