Farklı konsantrasyonlarda kullanılan çeşitli irrigasyon solüsyonlarının ve ışık ile aktivasyonunun E.faecalis biofilmi üzerine etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of various irrigation solutions with different concentrations and their activation with LİGHT on E.faecalis biofilm
Yazar: TARIK AHMET
Danışman: PROF. DR. SEMA BELLİ ; DR. MUKADDER İNCİ BAŞER KOLCU
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Endodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Biyofilmler = Biofilms ; Borik asit = Boric acid ; Enterococcus faecalis = Enterococcus faecalis ; Fotoaktivite = Photoactivity ; Hidrojen peroksit = Hydrogen peroxide ; Klorheksidin = Chlorhexidine ; Kök kanalı irrigantları = Root canal irrigants ; İrrigasyon = Irrigation ; İrrigasyon-yara = Irrigation-wound

Özet:
Bu tez çalışmasının amaçı, farklı konsantrasyonlarda kullanılan çeşitli irrigasyon solüsyonlarının ve ışık ile aktivasyonunun Enterococcus faecalis biyofilmi üzerine etkilerini incelemeyi amaçlamıştır. Çalışmada üzerinde biyofilm oluşturulacak substrat olarak klinik ortamın taklidi için standart insan dişlerinden elde edilmiş dentin diskleri kullanıldı, çalışmamızla ilgisi olmayan nedenlerle çekilmiş (sıklıkla periodontal ve ortodontik nedenler) ve tıbbi atık olarak imhası planlanan dişler kullanıldı. Çalışma için 100 adet çekilmiş insan alt küçük azı dişi seçildi. Bu çalışmada, endodontide son irrigasyon solüsyonu olarak kullanımı önerilen ve Germinatör cihazı ile birlikte etkinlik kazandığı bilimsel çalışmalarla kanıtlanmış H2O2 , CHX ve BA solüsyonlarinin farklı konsantrasyonlarla kullanılarak inatçı bir bakteri olan Enterococcus faecalis'in üzerine ne kadar etkili olabileceği araştırılmıştır. Çalışma için dentin diskleri 6 mm genişlikte ve 2 mm yüksekliğinde hazırlandı. Dentin diskleri hazırlandıktan sonra sterilite kontrolü için her gruptan rastgele 2 dentin diski seçildi ve brain-heart infüzyon (BHI) broth'da  24  saat 37ºC'de inkübe  edilerek kontaminasyon kontrolü yapıldı. Enterococcus faecalis(ATCC 29212) suşu kanlı agara (Merck, Almanya) pasajlandı ve 24 saat, 37ºC'de inkübe edildi Steril dentin diskleri 24 kuyucuklu doku kültürü plakalarına yerleştirildi. Biyofilm oluşumu için doku kültürü plakasının her bir kuyucuğuna 1.8 ml %1 glukoz (Merck, Almanya) içeren BHI broth ve 0.2 ml bakteri süspansiyonu konuldu. Aerobik koşullar altında, 21 gün, 37ºC'de inkübe edildi. Dentin diskleri Enterococcus faecalis ile inkübasyon süresinin sonunda rastgele 14 gruba ayrıldı. Her grup 4 dentin diskinden oluşturuldu ve deneyler bir kez daha tekrarlandı (n=8/grup). İrrigasyon solüsyonu uygulanmadan önce dentin diskleri steril bir başka plakaya aktarılarak rastgele gruplar oluşturuldu ve irrigasyon solüsyonları 3 dakika süresince uygulandı. Germinatör kullanılacak gruplarda yer alan kuyucuklardaki dentin diskleri üzerine ışık cihazı ile aktivasyon uygulandı. Uygulama sonrasında dentin diskleri dikkatlice 1 ml BHI broth içeren steril mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı ve ardından biyofilm tabakası 3 kere 30 saniye vorteks, 30 saniye sonikasyona tabi tutularak ayrıldı. Daha sonra canlı bakteri sayımı için homojenattan 0,1 ml alınıp 0,9 ml BHI broth içeren steril mikrosantrifüj tüplerine aktarılarak 106'ya kadar seri dilüsyonları yapıldı. Her bir dilüsyondan ikişer kanlı agara 50 µl ekim yapıldı ve 37ºC'de 24 saat, aerobik koşullar altında inkübe edildi. Süre sonunda koloni sayımı yapıldı ve mililitrede koloni oluşturan birim (CFU/ml) hesaplandı. Bütün deney gruplarından, 2'şer örnek biyofilm oluşup oluşmadığının kontrolü için, 2'şer örnek de antimikrobiyal ajanlarının ve kullanılan aktivasyon yönteminin etkinliğini değerlendirmek için işlem sonrasında gluteraldehit solüsyonuna alınarak fikse edildi. Örnekler laboratuvarda öncelikle saf steril distile su, sonrasında sırasıyla %60, %70, %80, %90 ve %100 saf alkol ile yıkandı ve 37ºC derecede 24 saat inkübatörde bekletilerek dehidrate edildi. Dehitrate edilen örnekler Altın-paladyum kaplama ile kaplanarak SEM'da inceleme yapılabilecek gerekli koşullar oluşturuldu ve sonrasında görüntülendi. Sonuç olarak, elde edilen sonuçlara göre H2O2 solüsyonu ve bu solüsyonun Germinatör cihazı ile aktive edilmesi Enterococcus faecalis biyofilmlerine karşı %100 oranında etkili olmuştur. Bununla birlikte CHX ve H2O2 solüsyonlarının kombine kullanımları Enterococcus faecalis biyofilmlerine karşı etkin olarak belirlense de bu etkinliğin Germinatör cihazı ile arttığı bulunmuştur.  Bu çalışmada ayrıca BA solüsyonunun %5'lik ve %10'luk konsantrasyonlarının Enterococcus faecalis biyofilmlerine karşında antimikrobiyal etkili olduğu belirlenmiş ve bu etkinliğin Germinatör cihazı kullanılarak yapılan aktivasyonla arttığı tespit edilmiştir. Bu sonuçlar göz önüne alındığında H2O2 solüsyonlarının Enterococcus faecalis biyofilmlerine karşı güvenli kullanılabileceği önerilebilir. Ayrıca, Germinatör cihazının endodontik irrigasyon aktivasyon yöntemi olarak kullanımı tavsiye edilebilir. Özellikle CHX ve H2O2 kombinasyonlarında ve BA solüsyonunun kullanımı tercih edildiğinde Germinatör cihazı antimikrobiyal etkinliğin arttırılması amacıyla kullanılabilir.

Anahtar sözcükler: Germinatör, Biofilm, E.faecalis, Borik asit, Hidrojen peroksit, klorheksidin

Abstract:
This study was aimed to evaluate the effects of various irrigation solutions used in different concentrations and their photo-activated forms on Enterococcus faecalis biofilm.In the study, dentin discs obtained from standard human teeth were used as a biofilm substrate to imitate the clinical environment. Extracted teeth for reasons unrelated to our study (often periodontal and orthodontic reasons) and planned to be disposed of as medical waste were used. One hundred extracted human lower premolars were selected for the study.In this study, the effect of irrigation solutions (H2O2 , CHX ve BA) when used in various concentrations and a device in order to increase their efficiency (Germinator) which were proposed and proven by scientific studies on Enterococcus facealis was evaluated. Dentin discs with a width of 6 mm and a height of 2 mm were prepared for this purpose. Two dentin discs were randomly selected from each group for sterility control and contamination control was performed by incubating in brain-heart infusion (BHI) broth for 24 hours at 37°C.Enterococcus faecalis (ATCC 29212) was passaged to blood agar (Merck, Germany) and incubated for 24 hours at 37ºC. Sterile dentin discs were settled on 24-well culture plates. For biofilm formation, 1.8 ml of BHI broth containing 1% glucose (Merck, Germany) and 0.2 ml of bacterial suspension were placed in each well of the well plate  , incubated anearobically for 21 days at 37ºC.Dentin discs were randomly divided into 14 groups at the end of the incubation period. Each group contained 4 dentin discs and the experiments were repeated (n=8/group). Before applying the irrigation solution, dentin discs were transferred to another sterile plate, after randomization and irrigation solutions were applied for 3 minutes. Activation was provided by a photo-activation device on the dentin discs in the Germinator groups. After the application, the dentin discs were carefully transferred to sterile microcentrifuge tubes containing 1 ml of BHI broth, and then the biofilm layer was separated by vortex for 30 seconds and sonication for 30 seconds 3 times. Then, 0.1 ml of homogenate was taken for live bacteria counting and transferred to sterile microcentrifuge tubes containing 0.9 ml of BHI broth and serial dilutions up to 106 were performed. 50 µl of was added on two blood agar from each dilution and incubated for 24 hours at 37 °C under anaerobic conditions. At the end of the period, colony counting was performed and the colony-forming unit per milliliter (CFU/ml) was calculated. From all experimental groups, 2 samples were transferred to gluteraldehyde solution to check whether biofilm was formed and 2 samples were fixed to evaluate the effectiveness of antimicrobial agents. The samples are first purified by sterile distilled water and %60, %70, %80, %90 alcohol respectively. Final wash was done by 100% pure alcohol and dehydrated by keeping it in an incubator for 24 hours at 37ºC. The dehydrated samples were coated with gold-palladium coating for SEM examination. According to the results obtained, the H2O2 solution and the activation of this solution with the Germinator device were 100% effective against Enterococcus faecalis biofilms. However, although the combined use of CHX and H2O2 solutions was determined to be effective against Enterococcus faecalis biofilms, it was found that this effectiveness increased with the Germinator device. This study was also highlighted the antimicrobial properties of BA at 5% and 10% concentrations. The antimicrobial activity of BA was increased by Germinator.  Considering these results, it can be suggested that H2O2 solutions can be used safely against Enterococcus faecalis biofilms. Also, the use of the Germinator device as an activation method of endodontic irrigation can be recommended. Especially in combinations of CHX and H2O2 and when BA solution is preferred as an irrigant, the Germinator device can be used to increase the antimicrobial effectiveness.

Keywords: Germinator, Biofilm, E.faecalis, Boric acid, Hydrogen peroxide, chlorhexidine.