Bazı tetrakis türevlerinin kas hücrelerinde M1 reseptör proteini agonisti olarak kullanımı
Use of some tetrakis derivatives as M1 receptor protein agonists in muscle cells
Yazar: OKAN SEZGİN
Danışman: DOÇ. DR. EMEL ERGENE
Eskişehir Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2022
Konu: Biyofizik = Biophysics ; Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Biyolojik moleküller = Biological molecules ; Nöroblastom = Neuroblastoma ; Organik moleküller = Organic molekules ; İlaç biçimleri = Dosage forms ; İlaç tarama testleri-antitümör = Drug screening assays-antitumor

Özet:
Muskarinik M1 asetilkolin reseptörleri (mAChRs; G-protein bağlı reseptörler); hem merkezi hem de periferal sinir sisteminde birçok önemli fonksiyonu düzenler. Muskarinik asetil 3kolin reseptörü olan M1 reseptörü, beyinin serebral korteksinde, hipokampusunda ve striatumunda geniş olarak görülür. M1 reseptörü insanda öğrenmede ve hafıza süreçlerinde çok önemli görevlere sahiptir. Bu reseptör proteininin 3 boyutlu yapısında meydana gelen değişikliklerde, eksikliğinde ya da ekspresyon sisteminde herhangi bir problem yaşandığında Alzheimer, Parkinson, PSP, DLB ve istemli motor fonksiyonların yerine getirilemediği çeşitli hastalıklar ortaya çıkmaktadır. Bu sebepten bu tezde M1 reseptör proteinine afinite göstermesi amaçlanan agonist molekülleri tasarlanmıştır. Tasarlanan ve sentezlenen tetrakis türevlerinin M1 reseptör protenine bağlanarak aksiyon potensiyeli oluşturması ve çeşitli hastalıklar etkili bir alternatif tedavi oluşturulması planlanmıştır. Bu moleküller in-sliko çalışmalar ile tasarlanmıştır. 1 seri molekülden toplamda 4 adet molekül tasarlanıp sentezlenmiş olup bu moleküllerin NMR, IR ve UV- Vis spektroskopileri ile birlikte karakterizasyonu yapılmıştır. Moleküllerin bağlanma afiniteleri hakkında deneysel yaklaşımlar, in-vitro hücre kültürü çalışmaların da yapılmıştır. İn-vitro çalışmalarda ilk olarak moleküllerin sitotoksit etkilerine C2C12 hücre hattında bakılmıştır. Miyotüp oluşumu gözlenmesi ve nöromüsküler kavşak çalışmalarıyla birlikte moleküllerin kasılma dinamiği gösterebileceği model yapı C2C12 ve SH-SY5Y hücre hatlarıyla PDMS damga ile birlikte jelatin scaffold'lar üzerinde oluşturulması üzerine çalışılmıştır. Nöromüsküler kavşakların oluşumu morfoloji tayini amacıyla f-aktin ve Beta III tubulin proteinlerini sırasıyla phalloidin-TRICT B isotiyosinat ve TUBB3 monoklonal mouse antibody indirekt boyama tekniğiyle boyanarak yapılmıştır. Buna ek olarak nöromüsküler kavşakların oluşumunda kullanılan spesifik ajan alfa-bungarotoksin konjuge CFR ve anti-SV2A antibody (E-8) alexa fluor® 488 kullanılarak sırasıyla nikotinik asetilkolin reseptörleri ve sinaptik vezikül 2 A proteinleri boyanmış oldu. Bu sayede nöromüsküler kavşak bağlantı noktaları immünofloresan olarak gösterilmiştir. M1 reseptörleri retinoik asit varlığında farklılaşan SH-SY5Y hücrelerinin yüzeylerinde oluştuğu bilinmektedir. G-proteinine bağlı reseptör ailesi mensubu olan M1 reseptörleri afinite duyduğu moleküllerle etkileşimleri esnasında ikincil haberleşme yolaklarının yapı taşlarından olan Ca+2'nin sitoplazmadaki yoğunluğunun değişimine ve ATP harcanmasına etki etmektedir. Bu sebeple, agonist moleküllerin etkilerinin gözlenmesi amacıyla Ca+2 ve ATP kitleriyle lüminesans   okumaları yapılmıştır.

Abstract:
Muscarinic M1 acetylcholine receptors (mAChRs; G-protein coupled receptors); regulates many important functions in both the central and peripheral nervous systems. The M1 receptor, the muscarinic acetylcholine receptor, is widely seen in the cerebral cortex, hippocampus, and striatum of the brain. The M1 receptor has a very important role in learning and memory processes in human. Alzheimer, Parkinson, PSP, DLB and various diseases in which the functions of voluntary motor movements cannot be performed occur when there are changes in the 3-dimensional structure of this receptor protein, its deficiency, or any problem in the expression system. It is planned that the designed and synthesized tetrakis derivatives will bind to the M1 receptor protein to create an action potential and to create an effective alternative treatment for various diseases. These molecules are designed by in-silico approaches. Total of 4 molecules were designed and synthesized from 1 serie of molecules, and these molecules were characterized by NMR, IR, and UV-Vis spectroscopy. In in-vitro studies, the cytotoxic effects of molecules were first examined in the C2C12 cell line. It was stained using the indirect dyeing technique. So the specific agent used in the formation of neuromuscular junctions, alpha-bungarotoxin conjugated CFR, 594, and anti-SV2A antibody (E-8) using alexa fluor® 488, nicotinic acetylcholine receptors and synaptic vesicle 2 A proteins were stained, respectively, and neuromuscular junction junctions were demonstrated as immunofluorescence. M1 receptors are known to occur on the surfaces of SH-SY5Y cells that differentiate in the presence of retinoic acid. M1 receptors, which are members of the G protein-linked receptor family, affect the concentration of Ca+2, which is one of the building blocks of secondary communication pathways, in the cytoplasm and the consumption of ATP during their interaction with the molecules that they have an affinity for. For this reason, luminescence readings were made with Ca+2 and ATP kits in order to observe the effects of agonist molecules.