Toksin isteği ile gelen dışkılardan üretilen c.difficile kökenlerinde toksin varyantlarının araştırılması
Investigation of toxin variants in C.difficile strains isolated from stool samples submitted for toxin detection
Yazar: UMUT DENİZ
Danışman: DOÇ. DR. NURVER ÜLGER
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2009
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
C.difficile, antibiyotik kullanımına bağlı, kendiliğinden iyileşen akut ishaldenfulminant pseudomembranöz enterokolite kadar değişen,geniş bir yelpazedehastalıklara yol açan, gram pozitif, sporlu, anaerob bakteridir. Hastalığınpatogenezinden toksin A (enterotoksin) ve toksin B (sitotoksin) üretimisorumludur. Son yıllarda hastane salgınlarına da neden olan ?binary toksin?varlığı tanımlanmıştır. Çalışmamızda, Marmara Üniversitesi HastanesiMikrobiyoloji Laboratuvarına, C.difficile toksin bakılması isteği ile gönderilendışkı örnekleri kullanılmıştır. Örneklerden EIA yöntemi ile toksin varlığınınsaptanması ve aynı örneklerin kültürlerinden ise C.difficile kökenlerininizolasyonunun yapılması amaçlanmıştır. Elde edilen izolatlarda toksinüretiminden sorumlu genlerin belirlenmesi, toksin varyant kökenler veya?binary toksin? geni varlığı saptanmaya çalışılmıştır. Ayrıca rutinde kullanılantoksin testlerinin yeterliliğini araştırmak amacıyla, izole edilen kökenlerin toksinüretimi iki farklı EIA yöntemi ile belirlenip toksini saptama performanslarıkıyaslanmıştır. Eylül 2006-Mart 2008 tarihleri arasında toplam 633 dışkı örneğiişleme alınmış, CCFA (sikloserin,sefoksitin-fruktoz agar) seçici besiyerineekilerek anaerob ortamda inkübe edilmiştir. Gerek dışkı örneği gerekse izoleedilen kökenlerden enzim immunoassay (İmmunocard-Meridian) yöntemi iletoksin A/B varlığı araştırılmıştır. C.difficile üretilen dışkıların 30'unda toksinpozitifliği saptanmış, toksin negatif olan dışkılardan izole edilen dışkılardan 20kökenin kültüründen yeniden toksin çalışıldığında 6 kökende toksin üretimininolduğu saptanmıştır. Kökenler diğer bir enzim immunoassay yöntemi (TriageClostridium difficile Panel-Biosite) ile çalışılmış, toksin A ve ortak antijen(glutamat dehidrogenaz) varlığı araştırılmıştır. Kökenlerin hepsinde ortakantijen pozitif saptanmış, ancak bu yöntemle 22 kökende (%44) toksin Apozitifliği saptanmıştır. Toplam 50 hastadan C.difficile kökenleri izole edilmiş,PZR ile toksin A varlığı için tcdA,toksin B varlığı için tcdB ve ?binary toksin? içincdtA ve cdtB genleri bakılmıştır. Kültürden ve dışkıdan pozitiflik saptanantoplam 36 kökenden (%72) toksin A ve toksin B genleri pozitif bulunmuş, hiçbirkökende ?binary toksin? geni saptanmamıştır. Sonuçlarımız, belli bir zaman7diliminde hastanemizde antibiyotiğe bağlı gelişen ishalli hastalardaki C.difficilekökenlerinin toksin geni durumunun bilinmesi ve ileride gelişebilecekdeğişiklikleri izleyebilmek için bir veri tabanı oluşturacaktır.

Abstract:
Clostridium difficile, is an anaerobic, gram(+), spor forming bacteria, which isthe cause of a wide spectrum diseases; from a self-healing diarrhea tofulminant pseudomembranous enterocolitis; due to antibiotic usage. Toxin A(enterotoxin) an toxin B (cytotoxin) are responsible from pathogenesis of thedisease. İn recent years, ?binary toxin? leading nasocomial infections wasdefined. İn our study, the stool samples which were sent for examiningC.difficile toxin to the Marmara University Microbiology Laboratory, were used.We aimed, to determine the existance of the toxin by EIA metod and makingisolation of the C.difficile isolates from cultures of the same samples. We triedto determine, the genes, Which are responsible from toxin production andexistance of the binary toxin gene or variant isolates, in the obtained isolates.İn addition, for investigating the ability of the toxin production of the isolateswere determined by EIA method and their toxin determining performances, instool were compared. In the period of September 2006-March 2008 totaly 633stool samples were processed and incubated in anaerobic condition byinoculation to CCFA (cycloserin,cefoxitin, fructose agar) selective medium. Thetoxin A/B existance were searched by enzym immunoassay (İmmunocard-Meridian) method from isolates and also from the stool samples. İn 30 of theC.difficile produced stools, toxin positivity ise determined and when wereexamine toxin from cultures of the 20 isolates which were isolated from toxinnegative stools, we determine the toxin production in 6 of them. The isolateswere examined by another enzyme immunoassay method (Triage C.difficilePanel-Biosite) and existance of toxin A and the common antigen (glutamatedehidrogenase) is searched. İn all of the isolates, shared antigens isdetermined, but toxin A positivity is determined in 22 isolates (%44), by thismethod. Totaly from 50 patients, C.difficile isolates were isolated; tdcA gene forthe existance of toxin A, tdcB gene for toxin B and cdtA and cdtB genes for thebinary toxin are searched by PCR. Totaly from 36 isolates (%72) in which thepositivity was determined from culture and stool; toxin A and toxin B geneswere found positive, but binary toxin gene wasn?t found in anyone. Our5results, will form a database for the knowledge of toxin gene situation ofC.difficile isolates in patients with diarrhea due to antibitic usage in a givenperiod of time in our hospital and monitory the posibble changes that maydevelop in future.