Prostat kanseri hücrelerinde nobiletin flavanoidinin TLR4 ve TLR9 reseptörleri üzerine etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effect of flavonoid nobiletin on TLR4 and TLR9 receptors in prostate cancer cells
Yazar: ASUMAN DEVECİ ÖZKAN
Danışman: DOÇ. DR. HACER İLKE ÖNEN ; PROF. DR. SÜLEYMAN KALELİ
Gazi Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Flavonoidler = Flavonoids ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Nobiletin = Nobiletin ; Prostat hastalıkları = Prostatic diseases ; Prostat neoplazmları = Prostatic neoplasms ; Reseptörler-toll like = Receptors-toll like

Özet:
Toll-benzeri reseptörler (TLR) epitelyal, immün ve kanser hücrelerinde ifade edilen ve iyi bilinen bir patern tanıma reseptörü ailesidir. Nobiletin (NOB), kanser karşıtı özelliklere sahip ve prostat kanseri riskini azalttığı bildirilen bir O-metillenmiş flavonoiddir. Bu çalışmada NOB'un etkileri TLR4 ve TLR9 üzerinde PC-3, LNCaP ve HUVEC hücrelerinde araştırılmıştır. Lipopolisakkarit (LPS) ve CpG-oligodeoksinükleotid (CpG-ODN) sırasıyla TLR4 ve TLR9 uyarımı için kullanılmıştır. Hücre canlılığı WST-1 ile analiz edilmiştir. NOB'un inhibe edici konsantrasyonu (IC50) LNCaP için 20 µM, PC-3 ve HUVEC için 40 µM olarak bulunmuştur (p<0,05). TLR4 ve TLR9 genlerinin ifade düzeyi Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) ile analiz edilmiştir. NOB'un TLR4 ve TLR9 genlerinin ifade edilmesini azalttığı PC-3 hücrelerinde gözlenmiştir (p<0,05). Sitokinler (IFN-α ve IFN-β) enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile analiz edilmiştir. NOB'un IFN-α ve IFN-β miktarını LNCaP hücrelerinde azalttığı bunmuştur (p<0,05). TLR4 ve TLR9 sinyal yolaklarını NOB'un özellikle LNCaP hücrelerinde baskıladığı gözlenmiştir (p<0,05). Jelatinaz aktivitesi ve protein miktarı sırasıyla zimografi ve western blot ile analiz edilmiştir. MMP-2 ve MMP-9 jelatinaz aktivitesi PC-3 ve LNCaP için düşük bulunmuştur. MMP-2 aktivitesi HUVEC için yüksek bulunmasına rağmen, MMP-9 aktivitesi gözlenmemiştir (p<0,05). Aynı zamanda NOB'un LNCaP hücrelerine TLR4 ve IRF3 protein miktarını azalttığı bulunmuştur (p<0,05). Tüm sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde, NOB'un anti-tümöral ve anti-metastatik etkisinin varlığı hem TLR4 hem TLR9 sinyal iletim yolu için gösterilmiştir. Araştırmamız NOB'un insanlarda prostat kanserinde immunoteropatik tedavi için iyi bir aday olduğunu ve prostat kanseri hücre canlılığını ve metastazını baskılamada etkili bir aday molekül olabileceğini göstermiştir.

Abstract:
Toll-like receptors (TLRs) are a well-known family of pattern recognition receptors that expressed in epithelial, immune and cancer cells. Nobiletin (NOB) is an O-methylated flavonoid that possesses anti-cancer properties and has been reported to reduce the risk of prostate cancer. In this study we investigated the effects of NOB on TLR4 and TLR9 in LNCaP, PC-3 and HUVEC cells. Lipopolysaccharide (LPS) and CpG-ODN (CpG-oligodinükleotid) were used for TLR4 and TLR9 stimulation, respectively. Cell viability was analyzed with WST-1 assay. Inhibitory concentrations (IC50) of NOB were found 20 µM for LNCaP and 40 µM for PC-3 and HUVEC (p<0,05). TLR4 and TLR9 gene expression was examined by Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR). It was observed that NOB decreased TLR4 and TLR9 gene expression in PC-3 (p<0,05). Cytokines (IFN-α and IFN-β) were analyzed with Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). It was found that NOB reduced the amount of IFN-α and IFN-β in LNCaP (p<0,05). Gelatinase activity and protein level were examined by zymography and western blotting, respectively. Gelatinase activity of MMP-9 and MMP-2 was found low in PC-3 and LNCaP, although there was high MMP-2 activity in HUVEC, MMP-9 activity was not observed (p<0,05). Also it was found that NOB reduced TLR4 and IRF3 protein levels in LNCaP (p<0,05). When all the results are evaluated together, the presence of anti-tumoral and anti-metastatic effect of NOB has been shown for both TLR4 and TLR9 signaling pathway. Our study showed that NOB is a good candidate for immunotherapeutic treatment in human prostate cancer and it may be an effective candidate molecule for suppressing prostate cancer cell viability and metastasis.