Mikrobiyal gübre olarak çeşitli Bacillus biyopreparatlarının optimum üretim koşulları ve performanslarının incelenmesi
Evaluation of various Bacillus biopreparations as microbial fertilizers for optimum production conditions and performance
Yazar: PINAR SÖZER BAHADIR
Danışman: PROF. DR. RENGİN ELTEM
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bacillus = Bacillus ; IAA =   ; Organik tarım = Organic farming

Özet:
Mikrobiyal gübre geliştirmeye yönelik yapılan çalışmalarımızda öncelikle, EÜ Biyomühendislik Bölümü Bakteri Kültür Koleksiyonu"ndan sağlanan 440 adet Bacillus sp. izolatının in vitro'da katı besiyerinde yapılan ön tarama ile inorganik fosfat çözebilme yetenekleri belirlenmiştir. Daha sonra fosfat çözücülüğü pozitif olarak değerlendirilen 51 izolatın sıvı besiyerinde çözebildikleri fosfat miktarları ölçülmüş ve indol-3-asetik asit (IAA) üretme kapasiteleri de belirlenmiştir. Çalışmada bu değerlendirmelerin yanı sıra çeşitli kaynaklardan simbiyotik olmayan yolla atmosferik azotu bağlayabilen Bacillus mikroorganizmalarının izolasyonu yapılmış ve elde edilen 25 izolatın azot tespit edebilme yeteneği asetilen indirgenme testi ile ortaya konmuştur.
In vitro denemeler ile elde edilen kantitatif veriler ışığında (izolatların besin ortamında çözdükleri inorganik fosfat miktarı (ml-1), azot tespit edebilme yetenekleri ve ürettikleri IAA (µg ml-1) miktarına göre) altı farklı Bacillus izolatı seçilmiştir. Seçilen altı adet izolatın açık alanda tek yıllık fide dönemindeki bahçe bitkilerinde (domates, biber, patlıcan) bitki büyüme ve gelişme parametrelerine etkilerinin ortaya çıkarılması ve birbiriyle karşılaştırılabilmesi amacıyla açık alanda saksılarda performans denemesi gerçekleştirilmiştir. Seçilen izolatların ayrıca, in vitro'da bitki tohumlarında çimlenmeye olan etkileri de incelenmiştir.
Bitkilerde yürütülen performans denemeleri sonucunda belirlenen mikrobiyal gübre olmaya aday özelliklere sahip izolatlardan birine (Bacillus subtilis EGE-B-24.4i) özgün olarak, çalkalamalı inkübatörde erlenlerde endospor formunda yüksek sayıda üretimin gerçekleştirilmesi için optimum üretim ortamı ve koşulları belirlenmiştir. Bu çalışmada yanıt yüzeyi yöntemi (RSM) ile endospor üretimini teşvik eden ekonomik ve organik tarımda kullanılmaya uygun içeriklere sahip bir üretim ortamı içeriği elde edilmiştir. Denemeler sonucunda elde edilen optimize edilmiş üretim ortamı ile Bacillus subtilis EGE-B-24.4i'de erlenlerde spor üretimi 3,12x1011 endospor/ml olarak belirlenmiştir.
Maksimum endospor miktarını sağlamak amacıyla optimize edilen üretim ortamı kullanılarak 2 L'lik karıştımalı biyoreaktörde kesikli üretimler sonucu 400 rpm karıştırma hızı ve 2 vvm havalandırma hızı ile birlikte 8,5x1010 endospor/ml sonuç elde edilmiştir. Endospor derişiminin artırılması amacıyla optimize edilen üretim ortamındaki glukozun kesikli olarak derişik çözelti halinde beslendiği kesikli beslemeli üretimler sonucu 3,5x1011 endospor/ml sayıya ulaşılmıştır. Ölçek büyütme çalışmalarında, 30 litre kapasiteli karıştırmalı biyoreaktörde 20 litre çalışma hacminde optimize edilmiş üretim ortamı ile 400 rpm'de 300C'de kesikli üretimler sonrası 2,7x1011 endospor/ml spor sayısı elde edilmiştir. Santrifügasyon ile üretim sıvısından ayrılan 993 gram yaş biyokütle liyofilizasyon ile kurutularak toz haline getirilmiştir. Toz biyopreparatın gramında 5x1011 endospor/g belirlenmiştir. Çalışma sonunda in vitro'da bazı mikrobiyal gübre özellikleri ve bitkiler ile gerçekleştirilen performans denemeleri sonuçları değerlendirilerek mikrobiyal gübre olmaya aday 8 adet yerli Bacillus izolatının türleri moleküler identifikasyonla belirlenmiştir.
Bu tez çalışması ile ülkemiz topraklarından izole edilmiş özgün yerli türlerden oluşan, büyük ölçekli üretime elverişli ve mikrobiyal gübre olarak etkinliği belirlenmiş biyopreparatların geliştirilmesi için önemli bir adım atılmıştır.

Abstract:
In our studies, 440 Bacillus sp. obtained from "EU Bioengineering Department Bacterial Culture Collection" were tested for their inorganic phosphate solubilizing abilities by in vitro pre-screening on solid medium. After that, solubilized phosphate quantities were measured in liquid medium for 51 isolates evaluated as positive for phosphate solubility and indole-3-acetic acid production capabilities were determined. In the study, Bacillus microorganisms which can fix atmospheric nitrogen through non-symbiotic way were also isolated from various sources and the nitrogen fixing abilities of 25 isolated strains were demonstrated by the acetylene reduction assay.
Six different Bacillus isolates were selected according to the quantitative data obtained after in vitro experiments (based on the amount of inorganic phosphate (ml-1), the ability to nitrogen fixation and the amount of IAA (μg ml-1) produced by isolates in the nutrient medium). In order to reveal the effects of the six selected isolates on the one year plants seedlings (tomato, pepper, eggplant) growth and development parameters and to compare them with each other in the open field, performance tests were carried out in pots. The effects of selected isolates on in vitro germination of plant seeds were also investigated.
As a result of the performance tests carried out with the plants, one of the isolates having the characteristics of being designated as microbial fertilizer (Bacillus subtilis EGE-B-24.4i) was specifically studied to determine the optimum medium and conditions for the production of a high number of endospores in the flasks in shaker. In this study, response surface method (RSM) was used to obtain a production medium which is economic and suitable to use in organic agriculture. With the optimized production medium obtained as a result of the experiments, the production of spores in Bacillus subtilis EGE-B-24.4i was determined as 3.12x1011 endospore/ml in flasks.
With the aim of to get maximum endospore count optimized medium was used in a 2 L stirred bioreactor using batch production at 400 rpm agitation speed and 2 vvm aeration rate and 8.5x1010 endospore/mL were obtained. In order to increase the endospore concentration, 3.5x1011 endospore/ml spore count was reached by feeding glucose solution in optimized medium in fed batch production. In the scale up studies, with optimized medium and a working volume of 20 litres in a 30 litre capacity stirred bioreactor at 30°C and 400 rpm, 2.7x1011 endospore/ml spore count was obtained. 993 grams of biomass separated from the production fluid by centrifugation was dried by lyophilization and ground into powder. 5x1011 endospore/g were determined in one gram of the powder biopreparate. At the end of the study, on the basis of their in vitro microbial fertilizer properties and performance tests carried out with plants, 8 indigenous Bacillus isolates selected to become microbial fertilizers were molecularly identified.
With this study an important step has been taken for the development of a biopreparation consisting of the original strain isolated from the soil of our country which is also suitable for large-scale production and determined as efficient microbial fertilizer.