Bakteri yüzey gösterim tekniği ile rekombinant nükleaz enziminin saflaştırılması
Nuclease enzyme purification by bacterial surface display technique
Yazar: YUNUS DOĞAN
Danışman: PROF. DR. GAMZE BAŞBÜLBÜL
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Proteinlerin üretimini kolaylaştırmak ve verimini artırmak için rekombinant teknoloji sürekli geliştirilmektedir. Böylece düşük miktarda üretilen proteinlerin üretimleri artırılabilir ve bunun sonucu olarak maliyetleri düşer. Günümüzde rekombinant protein üretimi için sıklıkla kullanılan tekniklerden biri de gösterim tekniğidir. Gösterim tekniği ile füzyon proteinler hedeflenebilir ve hücre veya bakteriofajın dış yüzey proteinlerine eklenir. Gösterim tekniği yeni protein tasarlamada oldukça kullanışlıdır. 
Hücre içeriğindeki çeşitli proteinler arasından hedeflenen proteini izole etmek karmaşık bir işlemdir. Bu çalışmada gösterim tekniği, sentezlenen hedef protein streptodornazı saflaştırmada kullanılmıştır. Bu amaçla lpp, ompA ve spd1 genleri için primerler dizayn edilmiş, çoğaltılıp birleştirilen bu genler plazmide aktarılmış ve füzyon protein halinde E. coli'de sentezi sağlanmıştır. Ardından E. coli membranı izole edilmiş ve enterokinaz kesimi ile Spd1 enzimi membrandan ayrılmıştır. Membran proteinleri santrifüjle uzaklaştırıldıktan sonra Spd1 enziminin saflaştırıldığı SDS-PAGE yöntemiyle doğrulanmıştır.
Sonuç olarak klinikte kullanım alanı bulunan streptodornaz enziminin bakteri gösterim tekniği ile saflaştırılması ve bu amaçla rekombinant olarak üretilmesi, diğer klasik saflaştırma prosedürlerine kıyasla oldukça hızlı ve düşük maliyette gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmamız kapsamında laboratuvarımızda geliştirilen bu yöntem, diğer pek çok hidrofilik, rekombinant protein için de kullanışlı olacaktır.

Abstract:
Recombinant protein technology is constantly being developed to facilitate the production of proteins and their effiency. Thus, amount of produced protein can be increased by this technique, and as a result, their costs decrease. One of the techniques frequently used to design recombinant protein is display technique. Fusion proteins can be targeted by the display technique and bind to the outer surface proteins of the cell or bacteriophage. The display technique is very useful in designing new proteins.
Targeted protein isolation from any cell is a complex process because cells have many functionally or structurally different proteins. In this study, the display technique is used to purify the target protein which is synthesized by a recombinant E. coli. For this purpose, primers have been designed for lpp, ompA and spd1 genes. These genes were amplified and combined, then transferred in a plasmid and cloned into E. coli as a fusion protein. After that, E. coli membrane was isolated and the Spd1 enzyme was cleavaged by enterokinase. Then membrane proteins were removed by centrifugation, the purified Spd1 enzyme was visualized on SDS-PAGE gel.
As a result, the purification of the streptodornase enzyme, which is used clinically, with bacterial display technique. By this way, it was produced recombinantly with a very fast way and low cost compared to other classical purification techniques. This method, developed in our labratory within the scope of our thesis, will be useful for many other hydrophilic, recombinant proteins.