Tavşan matür skar modelinde rekombinant epidermal büyüme faktörü ile ön koşullandırma sonrası kıkırdak greftinin sağ kalımının değerlendirilmesi /
Yazar: MUSTAFA TAYGUN OLUKLU
Danışman: DOÇ. DR. FATMA NİHAL DURMUŞ KOCAASLAN
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2021
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery

Özet:
Giriş ve Amaç:
	Kıkırdak dokusu, kondrositlerden ve geniş hücre dışı matriksten oluşan avasküler bir dokudur. Temel anatomik çatısı kıkırdaktan oluşan burun ve kulak gibi organların estetik ve rekonstrüktif cerrahi ameliyatlarında kıkırdak grefti kullanımı gereklilik haline gelmiştir. Özellikle sekonder veya tersiyer rinoplastide, travmatik veya onkolojik nedenli kulak ve burun defektlerinin onarımında geçirilmiş cerrahi veya travmaya bağlı oluşan skar dokusunun göreceli olarak hipovasküler veya avasküler alanlar oluşturması, greft sağ kalımının önündeki en büyük engellerden birisidir. Kıkırdak greftlerinin sağ kalım oranı %10-90 olarak bildirilmiştir.
	Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) ve diğer büyüme faktörlerinin doku onarımını uyardığı mekanizmalar, tümör gelişimiyle ilgili olanlarla aynıdır. Hücre proliferasyonu, hayatta kalma, de-novo anjiyogenez ve hücre göçü yaygın kritik süreçlerdir. Tüm bu laboratuvar araştırmalarının ardından Rekombinant İnsan Epidermal Büyüme Faktörü (rhEGF), periferik doku onarımı alanında 1989 gibi erken bir tarihte ABD' de kör, kontrollü bir klinik değerlendirmeye tabi tutulmuştur. Daha sonra, rhEGF müdahaleleri, kronik venöz ülserlerden, pemfigus vulgaris lezyonlarında kadar çeşitli periferik yaraları tedavi etmek için ele alınmıştır. İn-vivo fibroblast kültürlerinde EGF' nin TGF-beta' nın indüklediği kontraksiyonu azalttığı gösterilmiştir.  Bununla birlikte EGF' nin keloid skar içine enjeksiyonun sonrasında TGF-beta' nın ekspresyonunun azaldığı ve tiroidektomi sonrası keloid skar içine enjeksiyonu sonrasında keloid skarda regresyon gözlendiği klinik olarak da gösterilmiştir. Aynı zamanda sıçanlarda intrauterin dönemde erken gestasyon haftalarında sağlıklı ciltteki aşırı EGF mRNA ekspresyonu ve gestasyon haftaları ilerledikçe bu ekspresyonun azalması, intrauterin hayattaki yara izi olmaması ile doğrudan ilişkili olabileceği gösterilmiştir. 
	Kıkırdak grefti uygulamalarında deneysel modellerde çeşitli ilaç ve preperatların kıkırdak grefti sağ kalımına etkisi birçok defa araştırılmıştır. Ancak bu konu ile alakalı olarak Rekombinant Epidermal Büyüme Faktörü' nün (rEGF) etkisini değerlendiren hiçbir araştırma bulunmamaktadır. 
	Bu çalışmanın amacı, matür skar dokusu olan alan rEGF ile ön koşullandırılması sonrası blok olarak kullanılacak kıkırdak greftlerinin sağ kalımı nün artıp artmadığı araştırılacaktır.

	Gereç ve Yöntem:
	Çalışma çift kör randomize bir çalışma olarak tasarlandı. Çalışmada; sekiz adet "New Zealand" cinsi erkek tavşan (ortalama ağırlıkları 2903 gr, yaşları 2-3 ay) kullanıldı. 
	Kıkırdak grefti verici alan olarak kulak ve alıcı alan olarak dorsal interskapular alandaki subkutan bölge kullanıldı. Tavşanın sağ kulağından 4x1 cm boyutunda kıkırdak grefti alınarak 4 eşit parçaya ayrıldı. 1 parça referans kıkırdak olarak saklandı.  Diğer parçalar sırası ile 1. grup skarsız bölgeye konulan kıkırdak, 2. grup salin ile ön koşullandırılmış skarlı bölgeye konulan kıkırdak ve 3. grup rEGF ile ön koşullandırılmış  skarlı bölgeye uygulanan kıkırdak grefti olmak üzere toplamda 3 grup olarak düzenlendi. Sekiz hafta takip süresi sonunda kıkırdak greftleri materyalleri alındıktan sonra, tüm tavşanlar yüksek doz izofluran ile sakrifiye edildi.
	Sekiz haftanın sonunda kıkırdak greftlerinin sağ kalım parametrelerin yanı sıra (metakromazi kaybı, nekroz, glial fibriller asidik protein immunohistokimya) kıkırdak yüzey düzensizliği, kolumnar hücre dizilimi, fibrozis, vaskülarizasyon ve kronik inflamasyon durumları histopatolojik olarak incelendi ve skorlandı.
	İstatiksel analizler SPSS 15.0 ve Instat (graphpad) 3.05 sürümü kullanılarak değerlendirildi. Grupların histolojik skorlarının karşılaştırılmasında 'Kruskal Wallis' testi ve 'Dunn' s Multiple Comparisons Test' kullanıldı. P değerinin 0.05' ten düşük olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
  

	Bulgular: 
	Yapılan histopatolojik değerlendirmelerde kıkırdak viabilitesini gösteren parametrelerden olan metakromazi kaybı (p=0,1036) ve nekrozun (p=0.4413) gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı bulundu. Kıkırdak viabilitesini gösteren bir diğer parametre olan ve kıkırdak proliferasyonunu gösteren GFAP immünohistokimya (+) boyanan hücreler açısından değerlendirdiğimizde ise 3. grubun 1. grup karşısında istatistiksel olarak anlamlı yükseklik gösterdiği görüldü. 
	Gruplar arasında çalışmada değerlendirilen diğer parametrelerden kolumnar hücre dizilimi skoru açısından grup 2 ve grup 3 arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olduğu bulundu. (p<0,05). Kronik enflamasyon skoru açısından grup 1 ve grup 3 arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olduğu görüldü. (p<0,05). Bir diğer parametre olan fibrozis skoru açısından grup 2 ve grup 3 arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olduğu tespit edildi. (p<0,05). Vaskülerizasyon ve kolumnar hücre dizilimi parametrelerinde ise gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık bulunamamıştır.

	Tartışma ve Sonuç:
	Çalışmamızda kıkırdak greftlerinin skarsız veya skarlı alanlardaki sağ kalımı ve karlı dokulardaki kıkırdak sağ kalımına rEGF' ün etkisi araştırılmıştır. 
	Kıkırdak greftlerindeki metakromazi kaybının her ne kadar istatistiksel olarak anlamlı olmasa da rEGF ile prelamine edilmemiş skarlı veya skarsız alanlardaki greftlerde önemli ölçüde arttığını görülmektedir. Bununla birlikte nekroz da aynı şekilde metakromazi kaybı gibi rEGF ile prelamine edilmemiş alanlarda daha yüksek görülmektedir.
	rEGF kullanılan donör alanlardan alınan kıkırdak greftlerinin çevresinde yoğunlaşan mononükleer enflamatuar hücreler ve fibrozisin de beklenildiği üzere diğer gruplara göre istatistiksel olarak da az olduğu bulunmaktadır. Burdan yola çıkarak rEGF' nin yara iyileşmesinde modülasyon görevi gördüğü düşünülmektedir.
	EGF' nin bilenen etkilerinden olan vaskülarizasyon artışı, bizim çalışmamızda değerlendirildiğinde, rEGF kullanılan grupta diğer gruplara göre istatistiksel olarak anlamlı bir artış oluşturmamaktadır. 
	Kolumnar hücre dizilimi ve kıkırdak yüzey düzensizliği parametrelerinde rEGF kullanılan grubun diğer gruplara göre belirgin bir farklılık oluşturduğu aşikardir. Kıkırdak sağ kalımına kuvvetli düzeyde bir katkı oluşturduğu tartışmalı olsa da, kıkırdak şekil bozukluklarını ve fibrozisi önlemede rEGF' nin önemli katkı sağlayacağı düşünülmektedir. 
	Sağ kalımı olumlu yönde etkileyen verilerin olması, yan etkilerinin minimal olması, özellikle kronik inflamasyon ve fibrozis üzerine etkileri düşünüldüğünde, kıkırdak şekil bozukluklarını önlemede özellikle revizyona ameliyatlarında rEGF' nin klinik uygulamalarına girebileceği ve cerrahi başarı şansını arttırabileceği kanaatindeyiz.

Abstract:
Introduction and Purpose:  
	Cartilage is an avascular tissue composed of chondrocytes and a large extracellular matrix. The use of cartilage grafts has become a necessity in aesthetic and reconstructive surgery of organs such as the nose and ear, the basic anatomical framework of which is cartilage. Especially in secondary or tertiary rhinoplasty, in the repair of traumatic or oncological ear and nose defects, the formation of relatively hypovascular or avascular areas of scar tissue due to previous surgery or trauma is one of the biggest obstacles to graft survival. The survival rate of cartilage grafts has been reported to be 10-90%. 
	The mechanisms by which EGF and other growth factors stimulate tissue repair are the same as those involved in tumor development. Cell proliferation, survival, de-novo angiogenesis and cell migration are common critical processes. After all this laboratory research, rhEGF underwent a blinded, controlled clinical evaluation in the field of peripheral tissue repair in the USA as early as 1989. Later, rhEGF interventions were considered to treat peripheral wounds ranging from chronic venous ulcers to lesions of Pemphigus vulgaris. EGF has been shown to reduce TGF-beta-induced contraction in in-vivo fibroblast cultures. Also, it has been clinically shown that expression of TGF-beta decreases after injection of EGF into the keloid scar, and regression is observed in the keloid scar after injection into the keloid scar after thyroidectomy.  At the same time, it has been shown that excessive EGF mRNA expression in healthy skin during early gestational weeks in rats and the decrease in this expression as the gestational weeks progresses may be directly related to the absence of scarring in intrauterine life. 
	The effects of various drugs and preparations on cartilage graft survival have been investigated many times in experimental models in cartilage graft applications. However, there is no research that evaluates the effect of rEGF on this subject.
	The aim of this study is to investigate whether cartilage grafts to be used as blocks by prelaminating the area with mature scar tissue with rEGF increase survival.

	Material and Methods:
	The study was designed as a double-blind randomized trial. In the study; Eight "New Zealand" male rabbits (average weight 2903 g, age 2-3 months) were used. 
	Ear was used as the cartilage graft donor area and subcutaneous area in the dorsal interscapular area was used as the recipient area. A 4x1 cm cartilage graft was taken from the right ear of the rabbit and divided into 4 equal parts. 1 piece of reference cartilage was retained.	The other parts were arranged in 3 groups in total, as the 1st group was the cartilage placed on the unscarred area, the 2nd group was the cartilage placed on the scar area preconditioned with saline, and the 3rd group was the cartilage graft applied to the scar area preconditioned with rEGF. At the end of the eight-week follow-up period, all rabbits were sacrificed with high-dose isoflurane after cartilage graft materials were removed.
	At the end of eight weeks, besides the survival parameters of the cartilage grafts (metachromasia loss, necrosis, glial fibrillar acidic protein immunohistochemistry), cartilage surface irregularity, columnar cell array, fibrosis, vascularization and chronic inflammation conditions were examined and scored histopathologically.
	Statistical analyzes were evaluated using SPSS 15.0 and Instat (graphpad) version 3.05. The 'Kruskal Wallis' test and the 'Dunn' s Multiple Comparisons Test' were used to compare the histological scores of the groups. A P value less than 0.05 was considered statistically significant.
  
	Results:
	In the histopathological evaluations, it was found that there was no statistically significant difference between the groups in metachromasia loss (p=0.1036) and necrosis (p=0.4413), which are parameters showing cartilage viability. When we evaluated another parameter showing cartilage viability in terms of GFAP immunohistochemistry (+) stained cells, which shows cartilage proliferation, it was seen that the 3rd group showed a statistically significant increase compared to the 1st group.
	It was found that there was a statistically significant difference between group 2 and group 3 in terms of columnar cell alignment score, which is one of the other parameters evaluated in the study between the groups. (p<0.05). There was a statistically significant difference between group 1 and group 3 in terms of chronic inflammation score (p<0.05). It was determined that there was a statistically significant difference between group 2 and group 3 in terms of fibrosis score, which is another parameter (p<0.05). There was no statistically significant difference between the groups in vascularization and columnar cell arrangement parameters.

	Discussion and Conclusion:
	In our study, the effect of rEGF on the survival of cartilage grafts in unscarred or scarred areas and cartilage survival in snowy tissues were investigated.
	Although the loss of metachromasia in cartilage grafts is not statistically significant, it appears to increase significantly in grafts from scarred or unscarred areas that have not been preconditioned with rEGF. However, necrosis is also higher in areas not preconditioned with rEGF, such as loss of metachromasia.
	Mononuclear inflammatory cells and fibrosis concentrated around the cartilage grafts taken from donor areas using rEGF were also found to be statistically less than other groups, as expected. Based on this, it is thought that rEGF acts as a modulation in wound healing.
	When the increase in vascularization, which is one of the known effects of EGF, is evaluated in our study, it does not create a statistically significant increase in the rEGF group compared to the other groups.
	It is obvious that the group using rEGF had a significant difference in columnar cell arrangement and cartilage surface irregularity parameters compared to the other groups. Although it is controversial that it makes a strong contribution to cartilage survival, it is thought that rEGF will make an important contribution in preventing cartilage deformities and fibrosis.
	Considering that there are data that positively affect survival, minimal side effects, and especially its effects on chronic inflammation and fibrosis, we believe that rEGF can enter clinical applications and increase the chance of surgical success in preventing cartilage deformities, especially in revision surgeries.