Agresif periodontitiste etkin GLT6D1 geninin zebra balığındaki ortoloğunun tanımlanması
Identification of zebrafish ortholog of agrressive periodontitis associated GLT6D1 gene
Yazar: RAHME BARBAROS
Danışman: DOÇ. DR. GÜLDEN EREŞ
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Periodontoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry ; Genetik = Genetics
Dizin: Genetik = Genetics ; Genler = Genes ; Periodontal hastalıklar = Periodontal diseases ; Periodontitis = Periodontitis ; Polimorfizm-genetik = Polymorphism-genetic ; Zebra balığı = Zebrafish

Özet:
Agresif Periodontitiste Etkin GLT6D1 Geninin Zebrabalığındaki Ortoloğunun Tanımlanması

İn vivo yapılan bu araştırmada, GWAS (Genome Wide Association Studies) çalışmaları sonucunda agresif periodontitisle güçlü ilişkiye sahip olduğu düşünülen ve insanda tanımlı GLT6D1 geninin zebrabalığındaki muhtemel transkript varyantlarının tanımlanması ve zebrabalığı embriyolarında bu genin ifade profilinin ortaya konulması amaçlanmıştır.

Çalışmada zebrabalığının AB suşları kullanıldı. Her gün için ayrı olacak şekilde 2, 3, 4, 5, 6 günlük embriyolardan 30ar adet embriyo toplanarak hem DNA çıkartılarak hem de çıkartılmadan RNA izolasyonu yapıldı. İzole edilen total RNA'dan cDNA sentezlendi. Biyoenformatik ön çalışmalardan elde ettiğimiz bulgulara göre GLT6D1 geninin zebrabalığındaki muhtemel ortoloğunun Gbgt1l3, Gbgt1l1, Gbgt1l4 genlerinden biri olabileceği belirlendi ve bu genler için primer dizaynı yapıldı. Elde edilen primerler ve cDNA'lerle RT-qPCR amplifikasyonu gerçekleştirildi. Deney sonucunda elde edilen Ct (Threshold cycle) değerleri kullanılarak delta Ct (ΔCt) değerleri hesaplandı. 2^(-ΔCt) metoduyla elde edilen verilere göre grafikler çizildi.

GLT6D1 geninin muhtemel ortoloğu zebrabalığı embriyolarının diş gelişimlerinin başladığı gün olan 2. günde ifadesinde artış görülen Gbgt1l3 geni olduğu için, bu genin 1-5, 4-7 ve 1-7 ekzon bölgeleri için ayrı primerler tasarlandı. Optimum bağlanma sıcaklığını tespit etmek amacıyla DNA çıkartımı yapılarak elde edilen embriyo örnekleri ve primerler kullanılarak Gradient PCR yapıldı. Belirlenen optimum sıcaklıkta PCR uygulandı. PCR'dan elde edilen ürünlerle jel elektroforezi gerçekleştirildi ve Gbgt1l3 geninin alternatif kırpılma analizi değerlendirildi.

Gbgt1l3, Gbgt1l1 ve Gbgt1l4 genlerinin DNA çıkartımı uygulanan embriyo örneklerinde ortaya koydukları göreceli ifade profillerini belirlemek için Actb2 ve Elfa referans genleriyle, ilgili genlerin RT-qPCR sonuçları karşılaştırıldı. Bu deneyden elde edilen sonuçlara göre 3. ve 6. günlerde Gbgt1l3 geninin ifadesi artmakta, 6. günde ise maksimum seviyeye ulaşmaktadır. 2, 4, 5 günlük embriyolarda ise genin ifadesi diğer günlere göre daha azdır. Gbgt1l4 geninin DNA çıkartımı uygulanan embriyo örneklerinde ortaya koyduğu göreceli ifade profilinde 3. ve 6. günlerde ilgili genin ifadesinde artış görülmektedir. Bir diğer araştırılan gen olan Gbgt1l1 geninin göreceli ifade profili ise, DNA çıkartımı yapılarak elde edilen 2, 3, 4, 5, 6 günlük embriyo örneklerinin hepsinde düşüktür. Gbgt1l3 geninin alternatif kırpılma gösterip göstermediğini değerlendirmek için yaptığımız jel elektroforez deneyine göre, bu gen için tasarlanan 3 primerin de alternatif kırpılma ortaya koymadığı yani ayni genden oluşan farklı ürünlere sebep olmadığı tespit edildi.
 
Çalışmamızın sonuçlarına göre agresif periodontitisle ilişkilendirilen GLT6D1 geninin zebrabalığındaki muhtemel ortoloğu Gbgt1l3'tür ve bu genin embriyolardaki ifadesi anlamlıdır. Bu tespitle ilgili genin agresif periodontitis üzerindeki rolünü kesinleştirmek için etkisinin azaltılması (knock-down) veya susturulması (knock-out) gibi ileri genetik araştırmalar için temel oluşturan ilk çalışma yapılmış olundu.
 
Anahtar Kelimeler: Agresif periodontitis, GLT6D1 geni, Ortolog gen, Zebrabalığı

Abstract:
Identification of Zebrafish Ortholog of GLT6D1 Gene That is Active in Agrressive Periodontitis 

Results of GWAS (Genome Wide Association Studies) studies revealed a strong association of GLT6D1 gene with aggressive periodontitis and in this in vivo study we aimed to identify possible transcript variants of the gene in zebrafish and to reveal genetic expression profile in zebrafish embryos.

Thirty AB strain embryos from each 2, 3, 4, 5, 6 dpf (fertilizasyondan sonra gün) were collected for total RNA isolation. Total RNA isolation was performed both by DNAse treatment and without. cDNA was synthesized from isolated total RNA. According to our findings from bioinformatics studies; we determined that the Gbgt1l3, Gbgt1l1, Gbgt1l4 genes in zebrafish are possible orthologs of the human GLT6D1 gene and designed primers for these genes. RT-qPCR amplification was performed with the primers and cDNAs obtained. The delta Ct (ΔCt) values were calculated using the Ct (Threshold cycle) values obtained as a result of the experiment. Graphics were created according to the 2^(-ΔCt) method.

Since the possible orthologue of the human GLT6D1 gene in zebrafish is the Gbgt1l3 gene which its expression increases on day 2, the day tooth development begins, specific primers for the 1-5, 4-7 and 1-7 exon regions of this gene were designed. Gradient PCR was performed using the DNAse treated embryo samples and our designed primers in order to determine optimal annealing temperature. PCR was performed at the specified annealing temperature. Gel electrophoresis was run with these PCR products to evaluate the alternative splicing of the Gbgt1l3 gene.

RT-qPCR results of the DNAse treated embryo samples for Gbgt1l3, Gbgt1l1 and Gbgt1l4 genes were compared with the β-actin and Elfa referans gene results in order to determine their relative expression profiles. According to the results obtained from this experiment, the expression of Gbgt1l3 gene increases on days 3 and 6 and reaches its maximum level on the 6th day. Genetic expression of this gene in 2, 4, 5 dpf embryos are lower than in the other days. The relative expression profile of the Gbgt1l4 gene in DNAse treated embryo samples shows an increase on days 3 and 6. The relative expression profile of the Gbgt1l1 gene, another investigated gene, is low in all DNAse treated 2, 3, 4, 5, 6 dpf embryo samples. According to the gel electrophoresis experiment we runned to evaluate the alternative splicing of the Gbgt1l3 gene, it was determined that all the 3 primers designed for this gene did not reveal alternative splicing, ie, did not cause different products of the same gene.
        
According to the results of our study, the possible ortholog of the GLT6D1 gene in zebrafish associated with aggressive periodontitis is Gbgt1l3 and the expression of this gene in embryos is significant. Thus, the first study to establish a basis for further genetic investigations such as gene knock-down and gene knock-out has been performed to confirm the association of the related gene with aggressive periodontitis.

Key Words: Aggressive periodontitis, GLT6D1 gene, Orthologue gene, Zebrafish