Değişik doku örneklerinin farklı saklama sürelerinde korunması ve vitrifikasyon yönteminin primer kültürler üzerine olan etkisinin farklı yöntemler uygulayarak araştırılması
Preservation of different tissue types at different time periods and investigation of effects of vitrification on primary cultures by using different methods
Yazar: ARZU TAŞ ÇAPUTÇU
Danışman: DOÇ. DR. SÜHEYLA GONCA ; PROF. DR. SEZEN ARAT
Kocaeli Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Bilim ve Teknoloji = Science and Technology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Doku kültürü = Tissue culture ; Dokular = Tissues ; Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Kaslar = Muscles ; Kıkırdak = Cartilage ; Vitrifikasyon yöntemi = Vitrification method

Özet:
Sunulan tez çalışmasında koyun ve sığıra ait kas ve kıkırdak dokularına uygulanan farklı saklama süreleri ve vitrifikasyon yönteminin primer kültür ve dokular üzerindeki etkileri incelenmiştir. Bu amaçla, hücre elde edilmesi ve elde edilen hücrelerin canlılık ve kullanılabilirlikleri farklı yöntemlerle araştırılmıştır. Bu çalışma biyobankalar için dokuların saklanabilirliği ve bunlardan elde edilen hücrelerin Nükleer Transfer (NT) çalışmalarında kullanılabilirliğini göstermek amacı ile tasarlanmıştır.  
Çalışmada sığır ve koyun türlerine ait olan kas ve kıkırdak dokuları 4ºC?de 5, 48, 72, 96 ve 216 saat boyunca bekletilmiştir. Belirtilen süreler sonrasında taze (saklama sonrası hemen ekim yapılan) ve vitrifikasyon yöntemi ile dondurulup çözülen dokuların ekim başarısı, saklama süresi ve vitrifikasyonun primer kültür üzerine etkileri incelenmiştir.  
Primer kültürler sonrasında elde edilen hücrelerin antikorlar ile karakterizasyonları yapılmış ve Hematoksilen-Eosin (H-E) boyası ile de morfolojileri incelenmiştir. Popülasyon katlanma zamanları ve proliferatif özellikleri incelenerek hücrelerin aktiviteleri karşılaştırılmıştır. Her grup için apoptotik hücre oranları belirlenmiş ve gruplar arasındaki farklılıklar istatistikî olarak değerlendirilmiştir. Hücrelerin Nükleer Transfer çalışmalarında kullanılabilirliğini göstermek amacıyla hücre süklus fazlarından olan G0-G1 fazı incelenmiştir. 
Sonuçlar, vitrifikasyon yönteminin kas ve kıkırdak dokularında kolaylıkla ve başarı ile uygulanabileceğini göstermiştir. Vitrifikasyon sonrasında her iki tipteki dokudan da başarı ile hücreler elde edilerek tanımlanmıştır. Apoptotik hücre oranlarında gruplar arasında fark bulunmazken hücre siklus analizlerinde G0/G1 fazı bakımından taze ve vitrifiye gruplar arasında fark bulunmuştur. Sonuç olarak; vitrifikasyon yönteminin dokuların saklanması amacıyla biyobankalar için alternatif bir yöntem olarak uygulanabilirliği gösterilmiştir.

Anahtar Kelimeler: Kriyopreservasyon, Kas Dokusu, Kıkırdak Dokusu, Vitrifikasyon, Biyobankalar

Abstract:
In the present study it was aimed to investigate the temporal post-mortem limits, within which there will be guarantees of obtaining living cells from several tissues (muscle and cartilage) of sheep and cattle and the effect of vitrification on the ability of cells from tissues and tissues stored at different times.  For this purpose,  obtaining cells from tissues, their viability and usability were investigated by different techniques. This study was designed to show the cryopreservation of tissue samples for biobanks and the use of cells obtained from vitrified tissues for Nuclear Transfer (NT) studies. 
In this study, the muscle tissue and auricular cartilage from bovine and sheep were stored at 4ºC for 5, 48, 72, 96 and 216 hours post-mortem (hpm). Tissue samples were sorted into two groups: one group was in vitro cultured immediately after storage and the other was vitrified after storage and then in vitro cultured. The effect of vitrification on primary tissue cultures was investigated.
The characterization of cells obtained from primary tissue culture were done with antibodies and general morphological features were investigated by Hematoxylin-eosin staining. The activities of cells were compared by population doubling time and proliferative activity assay. The apoptosis rates were determined for each group and differences between groups were evaluated by statistical analysis. The cell cycle analysis was done and the percentage of cells in G0/G1 phase was determined to show the usability of cells in NT studies. 
The results of the present study showed that vitrification method can be used easily and successfully for muscle and cartilage tissue samples. The living cells could be obtained from both muscle and cartilage tissue samples after vitrification and these cells were characterized. There was no significant difference between fresh and vitrified groups in terms of apoptotic features. However, there was significant difference between fresh and vitrified groups in cell cycle analysis in G0/G1 phase. In conclusion, it was showed that vitrification method would be used as an alternative method for cryopreservation of the different tissue types in biobanking.

Key Words: Cryopreservation, Muscle Tissue, Cartilage Tissue, Vitrification, Biobanks