Bazı polifenolik bileşiklerin antioksidan aktivitelerinin tayini
Determination of antioxidant activity of some poliphenolic compounds
Yazar: SALİHA ESİN KARADEMİR
Danışman: YRD. DOÇ. DR. KUBİLAY GÜÇLÜ
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2005
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
ÖZETBAZI POLİFENOLİK BİLEŞİKLERİNANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİNİN TAYİNİÇeşitli hastalıklara yol açabilen `oksidatif stres'le mücadele etmenin en önemliyollarından biri, antioksidanca zengin fenolik bileşikleri içeren gıdaların mevcut olduğubir beslenmedir. Fenolik antioksidanlar, tükettiğimiz birçok sebze ve meyvede bolmiktarda bulunur. Bu doğal fenolik bileşikleri tanımlamak, yapılarına göresınıflandırmak, antioksidan kapasitelerini belirlemek ve doğal antioksidanlarınbulunduğu gıdaların toplam antioksidan aktivitelerini tayin etmek için bilim dünyasındakabul gören, basit, kullanışlı, hızlı, ucuz ve duyarlı antioksidan aktivite ölçmeyöntemlerine ihtiyaç duyulmaktadır. Bu kapsamda bu tez çalışmasının amaçları;antioksidan karakterli bazı polifenolik bileşikler için tek tek ve bu antioksidanmaddelerin bulunduğu gerçek ve sentetik çözeltiler için toplu analiz yöntemlerigeliştirmek ve bu teknikleri standart referans yöntemlerle karşılaştırarak doğruluğunuispatlamaktır.Bu çalışmada; kromojenik yükseltgeme aracı olarak kullanılan bakır(II)-neokuproin(Cu(II)-Nc) reaktifi varlığında spektrofotometrik yolla polifenolik bileşiklerinantioksidan kapasiteleri tayin edilmiştir. pH 7 ve üzerinde güvenilir sonuçlar verenCu(II)-Nc reaktifi ile antioksidan kapasite tayininin optimum deney koşulları ( reaktifkonsantrasyonu, pH, reaksiyon süresi vb.) belirlenip, polifenolik bileşiklerin Cu(II)-Nckompleksini 450 nm'de maksimum ışık soğurması gösteren Cu(I)-Nc kompleksineindirgeme yeteneğinden yararlanılarak antioksidan kapasite değerleri hesaplanmıştır.Burada antioksidan polifenoller aynı zamanda indirgen maddeler olduklarından,kromojen bir oksidasyon aracı olan Cu(II)-Nc reaktifini indirgemektedirler. Buözelliğinden yola çıkılarak geliştirilen yeni antioksidan kapasite yöntemine `bakır(II)iyonu indirgeme antioksidan kapasite yöntemi' denilmiştir ve kısaca CUPRAC metoduolarak adlandırılmıştır.Bu metod; Cu(II) klorür çözeltisi, neocuproine çözeltisi ve amonyum asetat (pH=7tamponu) çözeltilerinin karıştırılmasından sonra, üzerine tayin edilecek herhangi birantioksidan çözeltisi (direkt veya asid hidrolizi sonunda) ilave edilmesi ve bunu takipeden 30 dakika sonunda içerisinde antioksidan bulunmayan referansa karşı 450 nm'deabsorbans değerlerinin ölçülmesinden ibarettir. Oksidasyona bağlı renk gelişimi;askorbik asid, gallik asid ve kuersetin gibi antioksidanlar için hızlı oluşurken naringinve naringenin gibi antioksidanlar için yavaş olur. Bu sebeple; bu bileşiklerin oksidasyonreaksiyonlarının tamamlanması için, 50ËC'lik su banyosunda (Cu(II)-Nc reaktifiilavesinden sonra) 20 dakika boyunca inkübasyon işlemi uygulanmıştır. Flavonoidglikozidleri, antioksidan güçlerini arttırmak amacıyla 1.2 M HCl içeren %50 MeOHiçerisinde 2 saat reflüks edilerek aglikonlarına hidrolizlenmiştir. Bazı bileşikler de asidhidrolizi sonunda indirgeme kabiliyetlerini tam olarak göstermek için tekrar inkübasyonxiişlemine tabi tutulmuşlardır. Antioksidanların sentetik karışımlarının CUPRACantioksidan kapasiteleri troloks eşdeğeri cinsinden deneysel olarak ölçülüp, karışımıoluşturan bileşiklerin birbirleriyle hiçbir kimyasal etkileşim göstermediğini varsayanabsorbansların toplamsallığı ilkesi kullanılarak elde edilen teorik kapasite değerleriylekarşılaştırılmıştır. CUPRAC metoduyla analiz edilen polifenolik antioksidanlarınkapasiteleri birbirleriyle kıyaslandığında, kapasitelerinin yapılarındaki hidroksilgruplarının sayısı ve pozisyonuna bağlı olarak farklılaştığı görülmüştür. ABTS veDPPH radikalik referans yöntemlerde antioksidanların, model bileşik olarak kullanılanserbest radikalleri süpürme kapasiteleri ölçüldüğünden, bu özelliğin hidroksilgruplarının yüksek reaktivitesine bağlı olduğu beklentisine uygun sonuçlar eldeedilmiştir.Bu kapsamda polifenolik antioksidanların CUPRAC kapasiteleri, diğer antioksidankapasite tayininde kullanılan ABTS/persülfat referans yönteminin bulgularıylakarşılaştırılmıştır. Bu bileşikleri içeren besin maddesi işlevine sahip bazı bitkiselekstraktlar incelenmiş ve test edilen antioksidanların bu ekstraktlar içindeki kalibrasyondoğruları çizilerek absorbansların toplamsallığı hipotezi kanıtlanmıştır. Bir diğer deyişlekompleks matrikslerdeki antioksidan bileşenler, CUPRAC yönteminde Beer Kanunu'ndan kimyasal sapmalar gösterecek şekilde kendi aralarında etkileşmemektedirler.xii

Abstract:
SUMMARYDETERMINATION OF ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF SOMEPOLIPHENOLIC COMPOUNDSOne of the most important ways of combating `oxidative stress? causing variousdiseases is nutrition with a diet rich in antioxidant phenolic compounds. Phenolicantioxidants are abundant in many vegetables and fruits of everyday consumption. Inorder to identify and classify these natural phenolics, and to measure their antioxidantcapacity singly or in real matrices; simple, practical, rapid, low-cost, sensitive andwidely acceptable methods of total antioxidant capacity (TAC) assay are required. Inthis regard, the main purpose of this study is to develop novel analytical methods forTAC assay of polyphenols singly, in synthetic mixtures, or in real matrices, and tocompare the results with those found with standard reference methods for validation.The chromogenic redox reagent used for TAC assay was bis (neocuproine) copper(II)chelate. This reagent was useful at pH values greater than or equal to pH 7, and theabsorbance of the Cu(I)-chelate formed as a result of redox reaction with reducingpolyphenols was measured at 450 nm. The reaction conditions such as reagentconcentration, pH, and oxidation time at room and elevated tempeature were optimised.The novel method was named as the CUPRAC method, meaning `cupric ion reducingantioxidant capacity?.Essentially the method was applied by mixing aqueous CuCl2, ammonium acetatebuffer (at pH 7) and alcoholic neocupoine (Nc) solutions, adding a suitable aliquot ofthe unknown antioxidant solution to this mixture, and reading the absorbance at 450 nmagainst a reagent blank after 30 min. The colour development as a result of oxidation ofpolyphenol coupled to reduction of the reagent was rapid for ascorbic acid, gallic acid,and quercetin, but slow for naringin and naringenin. For slowly reacting antioxidants,the method was modified so as to carry out the reaction at 50ºC for 20 min. Theflavonoid glycosides were hydrolyzed with 1.2 M HCl solution in 50 % MeOH for 2hso as to convert to the corresponding aglycones to exert their full antioxidant power.Incubation was repeated when necessary. Assuming the addivity of absorbances ofindividual antioxidants, the experimental TAC (as trolox-equivalents) of syntheticmixtures of antioxidants were measured, and compared to the theoretically computedTAC value to yield coherent results. When the trolox equivalent antioxidant capacities(as TEAC coefficients) of polyphenols were compared, it was observed that TEACvalues varied as a function of the total number and position of hydroxyl groups in thephenolic compound. Since reference methods using radicalic chromogenic reagentssuch as ABTS and DPPH measure the radical scavenging activity of antioxidants in acertain time period, this antioxidant property showed a hydroxyl groups dependency asexpected.xiiiIn this regard, the CUPRAC antioxidant capacities of polyphenolic antioxidants weremeasured singly and in mixtures, and the results were compared with those ofABTS/persulfate assay. The calibration curves of these antioxidants singly and in anaqueous plant extract consumed as food were shown to be parallel lines, againconfirming the validity of the additivity principle, meaning that these antioxidantcomponents in complex matrices did not interact among each other so as to causechemical deviations from Beer?s law in the CUPRAC method.xiv