Timokinonun inaktif bovine viral diyare aşı uygulamalarında immun cevap üzerine etkilerinin araştırılması
Investigetion of the effects of thymoquinone on immun response in inactive bovine viral diarrhea vaccines
Yazar: MEHMET ULUSAN
Danışman: PROF. DR. VEHBİ GÜNEŞ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İç Hastalıkları (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine

Özet:
Bu tez çalışmasında antiviral, antioksidatif, anti-antikanserojenik, antibakteriyel, antihelmintik, antifungal ve immün sistem üzerine etkileri bulunan timokinon'un (TQ) immün uyaran ile birlikte kullanıldığında farelerde humoral ve sellüler immun sistemde rol alan sitokin ve gen ekspresyonları düzeyindeki etkileri araştırıldı. Primer uyaran olarak inaktif Bovine Viral Diyare (BVD) virus aşısı (BOVILIS ™ BVD MSD Hayvan Sağlığı), kullanıldı. Böylece aşı birlikte iki farklı dozda (0,5 ve 1 mg/kg) TQ kullanıldığında adaptif bağışıklık üzerinde olası etkileri ortaya konuldu. Ayrıca TQ'nun Veteriner sahada kullanılan ticari bir immünmodülatör olan İnaktif Parapoxvirus ovis D1701- Zylexis (Z, Zoetis) ile etkinliği de karşılaştırıldı. Bu amaçla BALB-c fareler 7 farklı gruba ayrıldı. Her grup deney sonuna kadar uygun sıcaklık ve nemde ayrı kafeslerde tutuldu. Tez çalışmasında Grup 1'de 7 adet fare yer aldı; bu farelere 0, 14, 35 ve 65. gün (doz üretici firma tavsiyesi doğrultusunda ayarlandı) 0,1 ml BVD aşısı (Bovilis BVD) intraperitoneal (ip) ve 0,5 mg/kg dozda 60 gün süreyle TQ ip olarak uygulandı. Grup 2'de 7 adet fare yer aldı; bu farelere 0, 14, 35. ve 65. günlerde BVD aşısı 0,1 ml ip olarak ve 1 mg/kg dozda 60 gün süreyle ip olarak TQ uygulandı. Grup 3'te 6 adet fare yer aldı ve 0, 14, 35. ve 65. gün BVD aşısı 0,1 ml ip uygulandı. Grup 4'te 7 adet fare yer aldı 0, 14, 35. ve 65. gün BVD aşısı 0,1 ml ip; 0. Gün, 14. Gün ve 35. gün Z 0,1 ml ip yolla uygulandı. Grup 5'te 8 adet fare yer aldı; 0, 14, 35 ve 65. günlerde BVD aşısı 0,1 ml ip; 0,5 mg/kg dozda TQ 60 gün süreyle ip; 0, 14. ve 35. gün Z 0,1 ml ip yolla uygulandı. Grup 6'da 8 adet fare yer aldı; 0, 14, 35 ve 65. gün BVD aşısı 0,1 ml ip; 1 mg/kg dozda TQ 60 gün ip; 0, 14. ve 35. gün Z 0,1 ml ip yolla uygulandı. Grup 7 de 5 adet fare yer aldı ve herhangi bir uygulama yapılmadı. 70. günde fareler ötenazi edildi. Ötenazi sonrası farelerin kalplerinden kan örnekleri alındı. Alınan kan örnekleri den kan serumları izole edildi. Bu örneklerden spesifik BVD antikor, IL-2, IL-4, IL-5 analizleri yapıldı. Dalak örneklerinden 4 gruptan (Grup 2-, Grup3, Grup 4, Grup 6) 3'er adet rastgele seçilerek RT² profil oluşturucu PCR dizisi fare doğal ve adaptif immmün yanıt panellerinde analiz edildi. Sonuçta Grup 6'nın en başarılı humoral immün aktiviteye sahip olduğu görüldü. TQ uygulaması CCL12 (2,56 kat), CD14 (2,73 kat), FaSL (3,84 kat), H2-Q10 (3,04) kat, IFN-γ (3,43 kat), IL-1R1 (2,27 kat), NOD2 (3,43 kat) ve TBX21 (4,08 kat) genlerinin ekspresyon düzeylerini arttırdı. CCR8 (2,38 kat), CRP (2,81 kat), IFN-α2 (2,47 kat), IL-10 (2,16 kat), IL-13 (5,45 kat), IL-2 (6,39 kat), IL-6 (3,46 kat), RORC (3,32 kat) ekspresyon düzeyleri ise azaldı. Z uygulması ise CCR4 (5,51 kat), CD4 (2,02 kat), FASL (2,51) kat, H2-Q10 (2,19 kat), Ifnar1 (2,22 kat), IFN-γ (2,07 kat), IL-1R1 (2,95 kat), NLRP3 (2,68 kat), NOD2 (5,82), STAT6 (3,11 kat), TBX21 (3,66 kat), TİCAM1 (4,20 kat) gen ekspreyon düzeylerini arttırdı. CCL12 (2,32 kat), CCR8 (2,72 kat), CD40L-Cd154 (2,46 kat), CD80 (2,09 kat), CRP (5,04 kat), CSF2 (2,91 kat), IFN-α2 (3,49 kat), IL-10 (3,37 kat), IL-13 (10,08 kat), IL-2 (2,66 kat), LY96 (2,34 kat), MX1 (2,82 kat), TLR-1 (2,38 kat) gen ekspresyon düzeylerini ise azalttı. Grup 6 da aşı+Z+TQ 1mg/kg kombinasyonu ise APCs (4,71 kat), IFN-γ (2,04 kat), IL-1R1 (2,36 kat), Nod2 (2,44 kat), STAT 6 (2,75 kat), TBX21 (2,12 kat), TİCAM1 (3,50 kat) ekspresyon düzeylerini arttırdı. CASP-1 (2,90 kat), CCR5 (2,10 kat), CCR6 (3,70 kat), CCR8 (5,97 kat), CD40L (3,48 kat), CSF-2 (2,69 kat), CXCL10 (2,71 kat), DDX58 (2,19 kat), IFN-α2 (8,66 kat), IL-10 (4,01 kat), IL-13 (27,10 kat), IL-2 (4,64 kat), IL-6 (2,25 kat), IRF3 (2,34 kat), IRF7 (3,02 kat), TLR-1 (2,20 kat) ekspresyonlarını ise azalttı. 
Sonuç olarak TQ'nun humoral immüniteyi arttırdığı, humoral ve hücresel immünitede rol oynayan gen ekspresyonlarına etkileri dikkate alındığında antiviral, antikanser etkilerinin olduğu ve otoimmün reaksiyonları baskılayıcı etkisinin olabileceği görüldü. Z'nin daha önce bildirilen etkileri ile uyumlu veriler elde edildi. Humoral ve hücresel immüniteye pozitif etkileri görüldü. Aşılar ile birlikte TQ ve Z uygulamalarının faydalı olabileceği kanısına varıldı.

Abstract:
The effects of thymoquinone (TQ), which has antiviral, antioxidant, anti-cancer, antibacterial, antihelmintic, antifungal properties, and effects on the immune system, were investigated when used in conjunction with immunostimulants. As the primary stimulus, an inactivated Bovine Viral Diarrhea (BVD) virus vaccine (BOVILIS™ BVD MSD Animal Health) was used. This allowed for the evaluation of potential effects when TQ was used together with the vaccine. Additionally, TQ's effectiveness was compared with that of a commercially used veterinary immunomodulator, the inactivated Parapoxvirus ovis D1701-Zylexis (Z, Zoetis). For this purpose, BALB/c mice were divided into 7 different groups. Each group was kept in separate cages under appropriate temperature and humidity until the end of the experiment. In the study, Group 1 consisted of 7 mice; these mice received 0.1 ml of BVD vaccine (Bovilis BVD) intraperitoneally (ip) on days 0, 14, 35, and 65 (doses adjusted according to the manufacturer's recommendation) and TQ administered ip at a dose of 0.5 mg/kg for 60 days. Group 2 also consisted of 7 mice; these mice received the BVD vaccine 0.1 ml ip on days 0, 14, 35, and 65 and TQ administered ip at a dose of 1 mg/kg for 60 days. Group 3 included 6 mice and received the BVD vaccine 0.1 ml ip on days 0, 14, 35 and 65. Group 4 consisted of 7 mice that received the BVD vaccine 0.1 ml ip on days 0, 14, 35 and 65; additionally, Z was administered ip at 0.1 ml on days 0, 14, and 35. Group 5 included 8 mice; they received the BVD vaccine 0.1 ml ip on days 0, 14, 35 and 65; TQ at a dose of 0.5 mg/kg for 60 days ip; Z at 0.1 ml ip on days 0, 14, and 35. Group 6 also consisted of 8 mice; they received the BVD vaccine 0.1 ml ip on days 0, 14, 35 and 65; TQ at a dose of 1 mg/kg for 60 days ip; and Z at 0.1 ml ip on days 0, 14, and 35. Group 7 included 5 mice and received no treatment. On the 70th day, the mice were euthanized, blood samples were collected from hearts of the mices. Serum samples were isolated from collected blood samples. These samples were analyzed for specific BVD antibodies, IL-2, IL-4, and IL-5. Three spleen samples from four groups (Group 2 - Vaccine + TQ 1 mg/kg, Group 3 - Vaccine, Group 4 - Vaccine + Z, Group 6 - Vaccine + Z + TQ 1 mg/kg) were randomly selected and analyzed using RT² Profiler PCR Array for innate and adaptive immune response panels.
As a result, Group 6 showed the highest humoral immune activity. TQ administration increased the expression levels of the genes CCL12 (2.56-fold), CD14 (2.73-fold), FasL (3.84-fold), H2-Q10 (3.04-fold), IFN-γ (3.43-fold), IL-1R1 (2.27-fold), NOD2 (3.43-fold), and TBX21 (4.08-fold). However, expression levels of CCR8 (2.38-fold), CRP (2.81-fold), IFN-α2 (2.47-fold), IL-10 (2.16-fold), IL-13 (5.45-fold), IL-2 (6.39-fold), IL-6 (3.46-fold), and RORC (3.32-fold) were decreased. Z administration increased the expression levels of CCR4 (5.51-fold), CD4 (2.02-fold), FASL (2.51-fold), H2-Q10 (2.19-fold), Ifnar1 (2.22-fold), IFN-γ (2.07-fold), IL-1R1 (2.95-fold), NLRP3 (2.68-fold), NOD2 (5.82-fold), STAT6 (3.11-fold), TBX21 (3.66-fold), and TİCAM1 (4.20-fold). Expression levels of CCL12 (2.32-fold), CCR8 (2.72-fold), CD40L-Cd154 (2.46-fold), CD80 (2.09-fold), CRP (5.04-fold), CSF2 (2.91-fold), IFN-α2 (3.49-fold), IL-10 (3.37-fold), IL-13 (10,08-fold), IL-2 (2.66-fold), LY96 (2.34-fold), MX1 (2.82-fold), and TLR-1 (2.38-fold) were reduced. The combination of vaccine + Z + TQ 1 mg/kg in Group 6 increased the expression levels of APCs (4.71-fold), IFN-γ (2.04-fold), IL-1R1 (2.36-fold), Nod2 (2.44-fold), STAT6 (2.75-fold), TBX21 (2.12-fold), and TİCAM1 (3.50-fold).However, CASP-1 (2.90-fold), CCR5 (2.10-fold), CCR6 (3.70-fold), CCR8 (5.97-fold), CD40L (3.48-fold), CSF-2 (2.69-fold), CXCL10 (2.71-fold), DDX58 (2.19-fold), IFN-α2 (8.66-fold), IL-10 (4.01-fold), IL-13 (27.10-fold), IL-2 (4.64-fold), IL-6 (2.25-fold), IRF3 (2.34-fold), IRF7 (3.02-fold), and TLR-1 (2.20-fold) were decreased.
As a result, it was observed that TQ enhances humoral immunity and may exhibit antiviral and anticancer effects, as well as potentially suppress autoimmune reactions, considering its effects on the gene expressions involved in both humoral and cellular immunity. Data consistent with the previously reported effects of Z were obtained, and positive effects on humoral and cellular immunity were observed. It was concluded that the administration of TQ and Z alongside vaccines could provide beneficial effects.