Vaccaria hispanıca (Mill.) Rauschert'de somatik embriyogenesis için embriyojenik kallus elde etme çalışmaları
Obtaining embryogenic callus for somatic embryogenesis in Vaccaria hispanica (Mill.) Rauschert
Yazar: HİLAL BEDİR
Danışman: DOÇ. DR. ESİN ARI
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Ziraat = Agriculture
Dizin: Kallus kültürü = Callus culture ; Kallus oluşumu = Callus formation

Özet:
Vaccaria hispanica (Mill.) Rauschert (Caryophyllaceae) doğada yaygın şekilde yetişen, özellikle triterpenoid saponin ve kaliteli nişasta içeriği çok zengin bir doğal bitkidir. Bu tez çalışmasında literatürde henüz ele alınmamış bir konu olan V. hispanica'da somatik embriyogenesis ile ilgili olarak somatik embriyogenesisin ilk basamağı olan embriyojenik kallusların elde edilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla biri nişasta (Genotip A), diğeri saponin (Genotip B) içeriği yüksek iki V. hispanica genotipinin hipokotil, kotiledon, boğum arası ve yaprak eksplantları, iki grup denemede çok sayıda besin ortamında kültüre alınmıştır. Bu ortamların bazal besin ortamları I. grup kallus denemelerinde MS ve NN ortamları, II. grup kallus denemelerinde ise sadece MS ortamı olup, bazal besin ortamlarına oksin olarak 2,4-D veya NAA nın 0, 1 ve 2 mg/L ile sitokinin olarak da BA veya TDZ nin 0, 0.5, 1 ve 2 mg/L lik konsantrasyonlarından oluşan bitki gelişim düzenleyicileri (BGD) çeşitli kombinasyonlarda ilave edilmiştir. Çalışmada bu ortamların iki V. hispanica genotipine ait farklı eksplant tiplerinde; kallus (%) ve embriyojenik kallus oluşturma (%) ile çeşitli kallus özellikleri ve ayrıca kalluslardan meydana gelebilecek farklı morfolojik yapıları oluşturma üzerine etkileri araştırılmıştır.
Çalışmanın sonuçlarına göre V. hispanica'nın kallus, embriyojenik kallus ve çeşitli morfolojik yapıları oluşturma yönünden çok yüksek rejenerasyon kapasitesine sahip olduğu belirlenmiştir. Bu kapasite; hiçbir hormonun kullanılmadığı kontrol ortamlarında bile çok yüksek oranda kallus, yoğun kök yapıları ve sürgün oluşması nedeniyle, büyük ölçüde V. hispanica'nın yüksek olduğu tahmin edilen içsel hormon seviyelerinden kaynaklanmaktadır. Çeşitli BGD lerin kullanıldığı tüm ortamlarda ise V. hispanica'nın hem A hem de B genotiplerinde içsel oksin düzeyinin de yüksek olması nedeniyle her iki genotipin bütün eksplantlarında oldukça yüksek oranlarda kallus meydana gelmiştir. Bu nedenle V. hispanica'da sadece kallus oluşturma yönünden belirli bir ortam önerisinde bulunmak mümkün değildir. Ancak bu kalluslara embriyojenik özellik kazandırılabilmesi için, hazırlanacak ortamlara oksin olarak 2,4-D ve sitokinin olarak TDZ nin belirli kombinasyonlarda ilave edilmesinin gerekli olduğu belirlenmiştir. Genotip A ve Genotip B'nin tüm eksplantlarında aynı anda en yüksek oranda embriyojenik kallus oluşturabilmek için önerilebilecek en etkili ortamın, MS +  2 mg/L 2.4-D + 0.5 mg/L TDZ içeriğine sahip ortam olduğu tespit edilmiştir. 
Çalışmada elde edilen morfolojik yapılara gelince; çoğunluğu globular aşamada en yüksek embriyo oluşumu her iki genotipte MS + 2 mg/L 2,4-D içeren ortamda meydana gelmiştir. En fazla embriyo oluşumu miktar olarak Genotip A da yaprak, Genotip B de ise kotiledon ve onu takiben yaprak eksplantlarından elde edilmiştir. En fazla sürgün oluşumu Genotip A da hem I., hem de II. grup denemelerde BGD içermeyen kontrol ortamında kültüre alınan boğum arası eksplantlarında,  Genotip B de ise yaprak eksplantlarında gerçekleşmiştir. Farklı yapıdaki köklenmeler yönünden Genotip A ve Genotip B'de; en yüksek orandaki kısa kök oluşumlarının genel olarak sitokininsiz 2,4-D içeren ortamlarda, uzun ve gerçek kök oluşumlarının ise oksinsiz NAA içeren ortamlarda oluştuğu dikkat çekmiştir. Bu çalışmada elde edilen özellikle köklenmelere ait detaylı bulguların, içerik yönünden zengin V. hispanica'da ileride yapılabilek in vitro sekonder metabolit çalışmaları için de faydalı olması umulmaktadır.

Abstract:
Vaccaria hispanica (Mill.) Rauschert (Caryophyllaceae) is a natural plant that grows widely in nature, especially rich in triterpenoid saponin and quality starch. In this thesis, it is aimed to obtain embryogenic calluses which is the first step of somatic embryogenesis related to somatic embryogenesis in V. hispanica which has not been yet studied in the literature. For this purpose hypocotyl, cotyledon, internodal and leaf explants of two V. hispanica genotypes with high content of starch (Genotype A) and saponin (Genotype B) were cultured in several culture media in two groups of trials. The basal nutrient media of these media were MS and NN media in I. group of callus experiments and only  MS medium in II. group callus experiments. Plant growth regulators (BGDs) consisting of 2,4-D or NAA as auxin at 0, 1 and 2 mg/L and BA or TDZ as cytokinin at 0, 0.5, 1 and 2 mg/L of were added to the basal nutrient media in various combinations. The effects of these media on the formation of callus (%), embryogenic callus (%), different callus characteristics and morphological structures that may occur from callus were investigated in different explant types of two V. hispanica genotypes.
According to the results of the study, V. hispanica has a very high regeneration capacity in terms of forming callus, embryogenic callus and various morphological structures. This capacity is largely due to internal hormone levels, which are estimated to be high in V. hispanica, due to the high rate of callus, dense root structures and shoot formation formed even in control cultures in which no hormone was used. In all cultures containing various BGDs, very high rates of callus formed in all explants of both genotypes due to the high internal auxin level of both A and B genotypes of V. hispanica. Therefore, it is not possible to propose a specific culture content in V. hispanica only in terms of callus formation. However, in order to give embryogenic properties to these calluses, it has been determined that 2,4-D as auxin and TDZ as cytokinin should be added in certain combinations. It was specified that the most effective medium was MS + 2 mg / L 2.4-D + 0.5 mg / L TDZ to produce high level of embryogenic callus in all explants of Genotype A and Genotype B.
As for the morphological structures obtained in the study, the highest embryo formation mostly in the globular stage occurred in medium containing MS + 2 mg / L 2,4-D in both genotypes. The maximum embryo formation was obtained from the leaf explant in Genotype A and from the cotyledons followed by leaf explants in Genotype B. The highest shoot formation took place in the internodal explants cultured in the control cultures of both I. and II. group of experiments in Genotype A while in the leaf explants in Genotype B. In regard of different types of rooting in Genotype A and Genotype B, it was noted that the highest rate of short root formation occured mostly in the media containing 2,4-D without cytokinin while the highest long and true root formation in the media containing NAA without auxin. It is hoped that the detailed findings especially on rooting obtained in this study will be useful for in vitro secondary metabolite studies in V. hispanica, which has rich content.