Paraquat ile oluşturulmuş oksidatif stresin HepG2 hücrelerinde apoptozis üzerine etkisinin araştırılması
The Effect of Oxidative Stress Induced by Paraquat on Apoptosis in Hep G2 Cells
Yazar: GÖRKEM KISMALI
Danışman: PROF. DR. TEVHİDE SEL
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Biyokimya = Biochemistry ; Oksidatif stres = Oxidative stress

Özet:
Apoptozisin spesifik olarak kanser hücrelerinde indüklenebilmesi, apoptoziste meydana gelen biyokimyasal değişikliklerin ortaya konulduğu zamandan beri ilgi odağı olmuştur. Uygun zamanda gerçekleşmeyen apoptozis çok sayıda hastalığın etiyolojisinde yer almaktadır. Kaspaz aktivasyonunun kontrolü, apoptoziste kilit rol oynamaktadır. Çünkü kaspazlar apoptoziste meydana gelen biyokimyasal değişikliklerde birincil öneme sahiptir. Kanser gibi yetersiz apoptozisin meydana geldiği hastalıklarda ya da sendromlarda kaspaz aktivasyonunun sağlanabilmesi tedavi için gerekli bir adımdır.Paraquat (PQ), bipyridyl yapısında, herbisit olarak kullanılan, toksik etkileri insanlarda ve hayvanlarda iyi tanımlanmış bir kimyasaldır. Paraquat uygulaması sonrası gözlenen hücresel hasar P450 redüktaza bağımlı olarak reaktif oksijen türlerinin oluşması sonucu meydana gelir. Oksidatif stres sırasında meydana gelen membran lipidlerinin peroksidasyonu, apoptozisin başlatılmasında potansiyel bir hedeftir.Bu çalışmanın amacı, paraquat ile oluşturulmuş oksidatif stresin HepG2 hücre hattında kaspaz bağımlı apoptozis üzerine etkilerini incelemek, sitokrom c düzeylerindeki değişimi ve DNA kırıklarının oluşumunu ortaya koymaktır.MTT hücre canlılık testi, farklı PQ yoğunluklarında ve zaman periodlarında uygulandı. HepG2 hücreleri için 24 saat inkubasyon süresinde PQ'ın IC50 10mM olarak belirlendi. Lipid peroksidasyonunun belirteci olarak malondialdehit düzeyleri TBA testi ile analiz edildi. Kaspaz 3 ve kaspaz 9 düzeyleri, paraquat inkubasyonunun 6., 12. ve 24. saatlerinde kolorimetrik olarak tesbit edildi. Aynı zaman aralıklarında sitokrom c düzeyleri ELISA ile belirlendi. DNA laddering testi, DNA fragmentasyonunu gösterebilmek amacıyla gerçekleştirildi.Sonuç olarak, inkubasyonun 6. ve 12. saatlerinde kaspaz 3 değerleri kontrol ve deneme grupları arasında istatistiksel olarak fark önemli bulunmazken, 24. saatte fark önemli bulundu. Diğer taraftan kaspaz 9 düzeyinde inkubasyonun 12. ve 24. saatlerinde kontrol ve deneme grupları arasında istatistik olarak önemli fark bulundu. Bütün gruplarda ve inkubasyon sürelerinde sitokrom c düzeyleri arasında fark bulunamadı. Ayrıca DNA fragmantasyon analizi sonucunda, kontrol ve deneme gruplarında DNA kırıkları belirlenemedi.HepG2 hücre hattında paraquat ile oluşturulan oksidatif stres sonucunda kaspaz aktivasyonu gözlenmekle birlikte DNA laddering ve sitokrom c salınımı belirlenememiştir.Anahtar Kelimeler: Apoptozis, HepG2, Paraquat, Kaspaz

Abstract:
The capacity to specifically induce apoptosis in cancer cells by manipulating components of the apoptotic pathway has been a goal since this pathway was first described. Inappropriate apoptosis clearly underlies the etiology of several human diseases. The control of caspases, as a key and central component of the biochemical pathway that mediates apoptotic cell death, is an attractive first step in modulating this process. Caspase activation for the treatment of disorders as cancer where insufficient apoptosis occurs.Paraquat (PQ), a bipyridyl herbicide, toxic effects of which have been well described in both humans and animals. The mechanisms of cellular damage after PQ involve the P-450 reductase-dependent formation of reactive oxygen species which have been implicated in the final common pathway that triggers apoptosis; peroxidation of membrane lipids during oxidative stress represents one potential target for signaling apoptosisThe goal of the current study was to evaluate paraquat induced oxidative stress on caspase dependent apoptosis, cytochom c levels and DNA laddering pattern in hepatocellular carcinoma cell line.MTT cell viability and proliferation assay were performed different PQ concentrations and time periods. 24h 10mM paraquat treatment was settled as IC50 for HepG2 cell line. Malondialdehyde, a marker of lipid peroxidation was estimated with TBA method. Caspase 3-9 were analyzed at 6., 12. and 24.h as apoptosis indicator with colorimetric assay. Cytochrom c levels also estimated same time periods. DNA laddering assay performed to evaluate DNA frangemtation during apoptosis.The results indicated that there was no statistically significant after 6.h and 12.h but significant increase in 24.h for caspase 3. On the other hand statistically significant increase has been found 12. and 24.h for caspase 9 compare to control group. In all groups and time periods cytocrom c leves has been found at the same level. DNA fragmentation pattern hasn?t been found in control and experiment groups.Key words: Apoptosis, HepG2, Paraquat, Caspase