Ege ve Akdenizzbölgelerinden toplanan karasinek (Musca domestica L.) populasyonlarında MdaE7 geninin kısmi baz dizi analizinin yapılması ve örneklerde karboksilesteraz enzim aktivitesinin belirlenmesi
Partial base sequence analysis of MdaE7 genes and the determination of carboxylesterase enzyme activities in house fly (Musca domestica L.) populations collected from mediterranean and aegean regions of Turkey
Yazar: FERDA GAÇAR
Danışman: YRD. DOÇ. DR. VATAN TAŞKIN
Muğla Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Esterazlar = Esterases ; Gen amplifikasyonu = Gene amplification ; İnsektisidler = Insecticides

Özet:
Karasinek (Musca domestica L.)'te organofosfat grubu insektisitlere karşı direnç, diğer biyokimyasal mekanizmalarla birlikte karboksilesteraz enzim aktivitesiyle de bağlantılıdır. Esteraz gen ailesinin bir üyesi olan ?E7'nin ürünü enzim ksenobiyotiklerin detoksifikasyonunda rol oynamaktadır. Diyazinona karşı dirençli M. domestica soylarında bu genin baz dizi analizi yapılmış ve duyarlı soylar ile karşılaştırıldığında Gly137 ? Asp değişimi enzimin aktif merkezinde bulunmuştur. Malatyona dirençli soylarda ise Trp251 ? Ser değişimi yine enzimin aktif merkezinde tespit edilmiştir. Bu çalışmada, ülkemizde tarımın yoğun olarak yapıldığı Ege ve Akdeniz bölgelerinde 16 farklı ilden toplanan karasinek örneklerinde genom DNA'sı izole edilmiş ve Md?E7 geni PCR yöntemi kullanılarak çoğaltılmış ve ekson 3 bölgesinin başından ekson 4'ün ortasına kadar olan bölgenin baz dizi analizi yapılmıştır. Bununla birlikte, metiltiyobütirat substratı kullanılarak bu örneklerdeki karboksilesteraz enzim aktivitesi tayin edilmiştir. Deneylerimizde WHO duyarlı soyu standart kontrol grubu olarak kullanılmıştır. Her bölgeden 32 adet olmak üzere toplam 64 birey kullanılarak deneylerimiz gerçekleştirilmiştir. Buna göre, Ege Bölgesi'nde 15 örnekte, malatyon direnç tip alleli olan Gly137- Ser251, 7 örnekte diyazinon direnç tip alleli olan Asp137 - Trp251, 6 örnekte Gly137 - Ser251 / Trp, 2 örnekte Asp137 - Ser251 / Trp alleleri, 1 örnekte duyarlı allel tipi olan Gly137 - Trp251, 1 örnekte ise Gly137 - Ser251 / Leu alleli gözlemlenmiştir.Akdeniz Bölgesi'nde ise çalışılan 19 örnekte diyazinon direnç tip alleli Asp137 - Trp251, 5 örnekte malatyon direnç tip alleli Gly137 - Ser251, 4 örnekte duyarlı tip alleli Gly137 - Trp251, 2 örnekte Asp137 - Ser251 / Trp alleleri, 1 örnekte Gly137 - Leu251, 1 örnekte ise Gly137 - Ser251 / Trp allelleri bulunmuştur. Karboksilesteraz enzim aktivitesi için yapılan ölçümlerde WHO referans soyu için aktivite değeri 142,7 ± 4,3 nmol/dk/mg olarak tesbit edilmiştir. Buna karşın, malatyon ve diyazinon direnç tipi allellerine sahip örneklerde ise aktivite değerleri 31,4 ± 3,5 nmol/dk/mg ile 136,8 ± 36,8 nmol/dk/mg arasında değişmiştir. Sonuçlarımız direnç allellerinin frekans ve dağılımının bölgelere göre değiştiğini göstermiştir. Bu durum ülkemizde insektisit kullanım stratejilerinin yeniden gözden geçirilmesini zorunlu kılmaktadır.

Abstract:
In housefly (Musca domestica L.), in addition to other biochemical mechanisms, organophosphate insecticide resistance is associated with a change in carboxylesterase activity. The product of ?E7 gene, a member of the esterase cluster, probably plays a role in the detoxification of xenobiotic esters. In the diazinon resistant housefly strains, comparing with susceptible ones, Gly137 to Asp substitution was found in the active center of the product of ?E7. A different amino acid substitution, Trp251 to Ser, was identified in the product of Md?E7 in the malathion resistant housefly strains. In this study, the housefly samples were collected from the farms and garbage disposal sites of 16 provinces in the Aegean and Mediterranean Regions of Turkey. After isolating the genomic DNA, the Md?E7 gene was amplified, isolated and sequenced, from the beginning of exon 3 to the middle of exon 4. In addition to this, the carboxylesterase enzyme activities in these samples were assayed by using methylthiobutyrate as a substrate. In our experiments WHO was used as a standart sensitive control. For each region 32 (totally 64) samples were used. In the Aegean Region, 15 of the studied samples have the diagnostic malathion resistance allele Gly137 ? Ser251, 7 of them have diagnostic diazinon resistance allele Asp137 ? Trp251,6 of them have Gly137 - Ser251 / Trp, 2 of them have Asp137 - Ser251 / Trp alleles, 1 of them has diagnostic sensitive allel Gly137 - Trp251, 1 of them has Gly137 - Ser251 / Leu allelles.In the Mediterranean Region, 19 of the samples have diagnostic diazinon resistance alleles Asp137 - Trp251, 5 of them have malathion resistance alleles Gly137 - Ser251, 4 of them have diagnostic sensitive allele Gly137 - Trp251, 2 of them have Asp137 - Ser251 / Trp alleles, 1 of them has Gly137 - Leu251, 1 of them has Gly137 - Ser251 / Trp allelles.A high level of carboxylesterase enzyme activity (142,7 ± 4,3 nmol/min/mg) was detected for WHO strain. However, the enzyme activities for the other samples, having malathion and diazinon resistance alleles, differed between the range of 31,4 ± 3,5 nmol/min/mg to 136,8 ± 36,8 nmol/min/mg. Based on our results; the frequency and distribution of the alleles indicate that they evolved on a regional basis and the pest management strategies for these regions must be evaluated again.