Radyasyon rektiti modelinde ruscogeninin profilaktik ve teröpatik etkisinin değerlendirilmesi (Deneysel çalışma) /
Yazar: ONUR OLGAÇ KARAGÜLLE
Danışman: UZMAN ERKAN YAVUZ
Sağlık Bilimleri Üniversitesi / Bağcılar Eğitim ve Araştırma Hastanesi / Genel Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2017
Konu: Genel Cerrahi = General Surgery
Dizin: HIF-1a = HIF-1a ; Mikroskopi-elektron = Microscopy-electron ; Profilaksi = Prophylaxis ; Radyasyon = Radiation ; Ruscogenin = Ruscogenin ; Terapötik yöntemler = Therapeutics ; Tümör nekroz faktörü-alfa = Tumor necrosis factor-alpha ; Vasküler endotel büyüme faktörleri = Vascular endothelial growth factors ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry ; İnterlökin 1 = Interleukin 1

Özet:
Radyasyon rektiti tedavi amaçlı olarak kullanılan iyonizan radyasyona sekonder olarak ortaya çıkan rektumun inflamasyon ve hasarıdır.ABD'de 200.000'den daha fazla kişi abdominal, pelvik ve retroperitoneal tümörleri için halen radyasyon tedavisi almaktadır. Bu hastaların %75'in den fazlasında akut radyasyon rektiti, %20'inde de kronik radyasyon rektiti semptomları gelişmektedir. Bu nedenle radyasyon sonucu oluşan rektit için etkin tedavi seçenekleri geliştirilmesi önem kazanmaktadır.
İlk olarak Ruscus aculeatus'tan izole edilen ruscogenin, geleneksel Çin bitkisi Ophiopogon japonicus kökünün ana steroidal sapogeninidir ve önemli anti-inflamatuar ve anti-trombotik etkilerinin olduğu bulunmuştur.
Amaç
Radyasyon rektitinin tedavi modalitesinde medikal, endoskopik ve cerrahi tedaviler kullanılmakta olup altın standart bir yöntem yoktur. Bu nedenle  deneysel akut radyasyon rektiti modelinde ruscogeninin anti-inflamatuar etkinliğini imumohistokimyasal belirteçler olan IL-1β, TNF alfa, HIF 1α; anjiyogenezi belirlemek için VEGF ve gelişen fibrozisi belirlemek için FGF2 antikorları kullanarak inceledik. Çalışmamızı histopatolojik bulgularla ve transmisyon elektron mikroskobik görüntüler ile destekleyerek ruscogeninin akut radyasyon rektiti üzerindeki tedavi edici ve koruyucu etkinliğini belirlemeyi amaçladık.
Gereç-Yöntem 
Çalışmada 32 adet Sprague- Dawley rat 8'erli sham, kontrol (hasarlı), tedavi ve profilaksi grubu olmak üzere 4 gruba ayrıldı. Profilaksi grubuna 14 gün boyunca 3mg/kg/gün ruscogenin oral gavaj olarak verildi. 14. günde kontrol ve tedavi grubu ile beraber pelvik bölgeleri rektumu da içerecek şekilde 2500 gray radyasyona maruz bırakıldı. Takiben tedavi grubuna 14. günden başlayarak 2 hafta boyunca oral gavaj olarak 3mg/kg/gün olacak şekilde ruscogenin başlandı. Kontrol grubuna ise ruscogenin verilmeyerek sadece 14. günde radyasyon uygulandı. 28. gün sonunda tüm denekler sakrifiye edilerek rektumları patolog eşliğinde mikroskobik, immunohistokimyal ve elektron mikroskobik değerlendirilme için çıkarıldı ve uygun solüsyonlara konuldu. Histopatolojik olarak lezyon ciddiyeti, lökositler tarafından kript epitelinde sızması (kriptit), kriptlerin bozulması (kript distorsiyonu), epitel hücrelerinin rejeneratif / onarıcı atipisi (reaktif atipi) ve mukoza kalınlığı gruplar arasında karşılaştırmalı olarak incelendi. İmmunohistokimyasal olarak inflamasyon markerları olan TNF-α, HIF-1α, IL-1β ve fibrozis markerı olan fibröz büyüme faktörü 2 (FGF-2) ve anjiogenez markerı olan VEGF proteinlerine karşı olan primer antikorlar kullanılarak antijenlerle pozitif immün işaretlenme gösteren hücreler skorlandı ve dokunun epiteli, kript ve stroması olarak üç bölgeye ayrılarak boyanma şiddeti ve boyanan hücre sayısı açısından semi-kantitatif olarak analiz edildi. Sayısal sonuçlar ortalama olarak ifade edildi. Kategorik sonuçlar ise bir sayı olarak ifade edildi. Ki-kare testi gruplar arasında kategorik değişkenlerin (inflamasyon, kriptte bozulma ve reaktif atipi) farklılıklarını karşılaştırmak için kullanıldı. H-SCORE ortalama değerleri varyansın tek-yönlü analizi (ANOVA) kullanılarak karşılaştırılacak. İstatistiksel anlamlılık için P<0.05 değeri olarak kabul edildi. Veriler GraphPad instat istatistik programı istatistiksel analizler için kullanıldı.
Bulgular    
Işık mikroskobik olarak ölçülen mukoza kalınlıklarında kontrol grubunda diğer gruplara nazaran anlamlı bir artış saptandı (p<0.001). Sham grubu ile tedavi ve profilaksi grupları arasında ise fark gözlenmedi.
Dokularda kriptik apse, kriptit ve reaktif atipi açısından kontrol gruplarında sham gruplarına nazaran istatistiksel olarak anlamlı artışlar gözlenirken (p<0.05) tedavi ve profilaksi gruplarında anlamlı azalmalar görüldü. Kriptit distorsiyonu için tedavi grubunda kontrol grubuna nazaran anlamlı bir azalma izlenirken (p<0.05) profilaksi grubunda önemli bir değişiklik saptanmadı.IL-1β için epitel ve stromada kontrol grubunda diğer gruplara nazaran anlamlı artışlar gözlendi  (p<0.05) ve tedavi ve profilaksi gruplarında anlamlı düşüşler görüldü.
FGF-2 için immünreaktivite açışından gruplar arası herhangi bir fark bulunmadı. TNF- α immünreaktivitesi sadece epitelde kontrol grubunda diğer gruplara nazaran anlamlı bir artış gösterdi (p<0.01) ve tedavi ve profilaksi gruplarında anlamlı düşüşler görüldü. Stroma ve kriptlerde böyle bir fark görülmedi.HIF-1α immünreaktivitesi için de epitel, kriptler ve stromada kontrol grubunda diğer gruplara nazaran anlamlı bir artış görüldü (epitel için p<0.001, kriptler için p<0.01, stroma için p<0.05) ve tedavi ve profilaksi gruplarında anlamlı düşüşler izlendi.VEGF için sadece stromada boyanan damar sayısı karşılaştırıldığında kontrol grubunda anlamlı bir artış görülürken (p<0.01) diğer gruplarda anlamlı düşüşler görülmüştür. Sham, tedavi ve profilaksi grupları arasında VEGF ile boyanan damar sayısı açısından fark gözlenmedi. 
 	Elektron mikroskobik bulgularımız, ışık mikroskobi ile paralel şekilde kontrol grubunda akut radyasyona bağlı histopatolojik değişimler gözlenmiştir. Bezlerde atrofi ve distorsiyon ile glanduler epitelin kısalmış ve yıpranmış; epitel hücrelerinde lümene göç eden nukleuslar ve intersellüler sınırların dilatasyonu görülmüştür. Goblet hücrelerinin sayılarında azalma, mukus salgılarında azalma ve hücrelerde küçülme ve bazı hasarlı kriptik kök hücreler de epitelde izlenmiştir. Epitel hücrelerinin mikrovillusların sayıca azalması ve kısalması ve hücrelerde apikal vakuolizasyon dikkati çekmiştir. Bazı bölgelerde mikrovillusların  tamamen silindiğini, epitellerin nukleuslarının genişlediği, kromatin modellerinin farklılaştığı hatta bazılarının apoptotik görünümler kazandığı dikkati çekmiştir. Stromada fibrozise veya ödeme bağlı ekstrasellüler matrikste ve fibroblast sayısında artış görülmüştür. Özellikle lökosit hücrelerinden nötrofillerin kript duvarına göç ettiği görülmüştür. Apoptotik hücre kalıntılarına da stromada rastlanmıştır. Bazı alanlarda invaginasyon yapmış ve apoptotik hücreleri sindirmek üzere olan büyük makrofajlara rastlanmıştır. Bazı stromal bölgelerde inflamatuar infiltratlar ve submukozada fokal genişlemeler izlenmiştir. Lenfosit infiltrasyonu, mast hücre hiperplazisi,  kriptik apselere bağlı tipik eozinofiller ve damarlarda mikrotrombi ve konjesyona bağlı eritrositik sızıntılar dikkat çekmiştir. Vasküler değişimi belirgin değildir fakat endotelyal hasar bazal membranın düzensizliği ile dikkati çekmiştir. 
Profilaksi ve tedavi gruplarında ise rektum yüzey epitelinde normal kalınlıkta, sayıda ve boyda epitelyal hücreleri ve normal derinlikte düzenli kriptler izlenmiştir. Ancak tedavi grubunda yer yer apoptotik epitel hücrelerine rastlanmıştır. Her iki grupta da mesafelerini korumuş intersellüler sınırlar bazı bölgelerde dilatasyonla birlikte görülmüştür. Tedavi grubunda bu dilatarsyonlara daha çok rastlanmıştır. Sham grubuna benzer şekilde lümene uzanan normal ultrastrüktüre sahip mikrovilluslar sayılarını ve boylarını korumuştur. Çok sayıda sıkı bağlantı da epitelin bütünlüğünü korumuştur. Kontrol grubundan farklı olarak profilaksi grubunda bazal membranın devamlılığını ve homojenisitesini korurken ve intersellüler alanlarda normal dijitasyonların görülürken tedavi grubunda bazal membran devamlılığını ve homojenisitesini yitirmiş, intersellüler alanlarda anormal dijitasyonların izlenmiştir. Profilaksi grubunda lamina propria da az miktarda ekstrasellüler matriks artışı, tedavi grubunda ise normal miktarda fakat düzensiz dağılımda lifler dikkat çekmiştir. Tedavi grubundan farklı olarak profilaksi grubunda lamina propriada özellikle epitele yakın bölgelerde görülen çok sayıda eozinofil, kriptik apselerin tam olarak iyileştirilemediğini göstermiştir. Stroma bölgelerinde her iki grupta da ekstrasellüler matriks artışı devam etmiş ve fibrozis görünümü sergilenmiştir. Tedavi grubunda aktif makrofajlara, lenfositlere ve çok sayıda nötrofillere rastlanmış ancak profilaksi grubunda lenfosit görülmemiştir. Vasküler değişim ise iki grupta da izlenmemiştir.
Sonuç
Bu deneysel modelde akut radyasyon rektitinin profilaksi veya tedavisinde ruscogenin kullanımının histopatolojik ve immünohistokimyasal ajan olarak etkili olduğu ve verilerin istatistiksel olarak anlamlı olduğu görülmüştür. Bu veriler ışık ve elektron mikroskobisi görüntüleriyle desteklenmiştir. Ultrastrüktürel olarak hem tedavi hem de profilaksi gruplarında mukoza ve submukozada iyileşmeler görülmüş ve akut radyasyon rektitin hasarı büyük ölçüde giderilmiştir. Literatürde akut radyasyon rektit ile hasar oluşturulmuş rektumun ultrastrüktürü konusunda raporlar olmasına rağmen ruscogenin etkisini ultrastrüktürel olarak gösteren bir araştırma olmadığı için çalışmamış bu açıdan bir ilktir. Yine de klinik çalışmalarla ve özellikle biyokimyasal çalışmalarla bu verilerin desteklenmesi gerekmektedir. Bizim çalışmamız bu açıdan pilot bir çalışma olma özelliğindedir.
Anahtar sözcükler: Ruscogenin, radyasyon rektiti, transmisyon elektron mikroskobi, immünohistokimya

Abstract:
Radiation proctitis is an inflammation and damage to the rectum secondarily developed by ionization radiation used as therapeutics.
In USA, more than 200 000 patients have already been getting radiation therapy for abdominal, pelvic and retroperitoneal tumors. Symptoms of the acute radiation proctitis have developed in more than 75 percent of these patients and chronic radiation proctitis in approximately 20 percent. Thus, it comes into prominence to improve new effective treatment options for proctitis emerged from radiation. 
Ruscogenin, first isolated from Ruscus aculeatus, also a major steroidal sapogenin of traditional Chinese herb Radix Ophiopogon japonicus, has been found to exert significant anti-inflammatory and anti-thrombotic activities. 
Aim
Many medical, endoscopic and surgical therapies in modality of therapy of radiation proctitis have been used but there has not been any gold standard method. So in this study, we investigated anti-inflammatory effects of ruscogenin in an experimental model of acute radiation proctitis by using immunohistochemical markers of IL-1β, TNF alpha, HIF 1α; to detect angiogenesis by using VEGF antibody and progressive fibrosis by using FGF2 antibody. We aimed to determine therapeutic and protective effects of ruscogenin on acute radiation proctitis, supporting our hypothesis by histopathological and transmission electron microscopic studies.

Material and Methods
In this study, 32 Sprague-Dawley rats were divided into 4 groups as sham, control (proctitis), treatment and prophylaxis groups (n=8). 3 mg/kg/day ruscogenin was applied to the prophylaxis group by oral gavage for 14 days. At 14th day, their pelvic regions were radiated by 2500 gray including their rectums, with control and treatment groups. Subsequent to 14th day, 3 mg/kg/day ruscogenin was given to the treatment group by oral gavage for 2 weeks. Any ruscogenin was not applied to the control group but only radiation was applied at 14th day. At the end of 28th day, all subjects were sacrificed and the rectums were removed and put into suitable solution in company with a pathologist for microscopic, immunohistochemical and electron microscopic evaluations. For histopathology, lesion severity, leucocyte infiltration into cryptic epithelium (cryptitis), degeneration of crypts (distortion of crypt), regenerative / restorative atypia of epithelial cells (reactive atypia) and thickness of mucosa were evaluated by comparing the groups. For immunohistochemical studies, inflammation markers for TNF-α, HIF-1α, IL-1β, fibrosis marker for fibrosis growth factor 2 (FGF2) and angiogenesis marker for vascular endothelial growth factor (VEGF) were used and immunopositive cells stained by these markers were calculated and scored and three different parts of the rectum, namely epithelium, crypts and stroma were analyzed semi-quantitatively according to staining density and to the number of immunopositve cells. Numerical results were given as mean. Categorical results were given as a number. Chi-square test was used to compare the differences of categorical changes (inflammation, cryptitis, cryptic distortion and reactive atypia) between groups. Mean of H-SCORE scores were compared by one-way analysis of variance (ANOVA). P<0.05 was accepted as statistically significant. All data were analyzed by GraphPad instat statistics program.
Results
During light microscopic analysis of rectums, a significant increase in thickness of mucosa was detected in the control group compared to other groups (p<0.001). There was no difference between sham and treatment and prophylaxis groups in terms of thickness. 
In tissues of the control group, statistically significant increases were observed in cryptic apsis, cryptitis and reactive atypia compared to the sham group (p<0.05); whereas, there were significant decreases in the treatment and prophylaxis groups. Cryptic distortion was significantly decreased in the treatment group compared to the control group (p<0.05), while there was no significant change in the prophylaxis group.
Significant increases in IL-1 β reactivity were observed in epithelium and stroma of the control group (p<0.05) and significant decreases were seen in the treatment and prophylaxis groups.
There were no significant differences in immunoreactivity of FGF-2 between groups.
A significant increase in TNF-α immunoreactivity was observed only in epithelium of the control group compared to other groups (p<0.01) and significant decreases were detected in the treatment and prophylaxis groups. There were no such differences in stroma and crypts. 
HIF-1α immunoreactivity were increased significantly in epithelium, crypts and stroma of the control group compared to the other groups (p<0.001, p<0.01 and p<0.05 for epithelium, crypts and stroma, respectively) and there were significant decreases in the treatment and prophylaxis groups.
For VEGF immunoreactivity, only the numbers of stained vessels in stroma regions were compared and there was a significant increase in the control group compared to the other groups (p<0.01). There were not any difference between sham, treatment and prophylaxis groups in terms of immunopositive vessels stained with VEGF.
In parallel to the above light microscopic findings, our electron microscopic analysis showed histopathological changes in the control group due to the acute radiation. In this group, glandular atrophy and distortion; diminished and eroded glandular epithelium; nuclei of the epithelium migrated through lumen and dilatation of intercellular limits were observed. The number of Goblet cells decreased, mucus secretion decreased and the epithelial cells shrank and a few damaged cryptic stem cells were detected. The number of microvilli of epithelial cells were decreased and the length of them were also decreased and some apical vacuolization attracted our attention on apical regions of cells. Some regions were totally nude for microvilli; nuclei of epithelial cells enlarged; chromatin models of nuclei differentiated and even some apoptotic appearances were remarkable. Due to fibrosis or edema, there was increase in extracellular matrix and the number of fibroblasts. Leukocytes, especially neutrophils were seen to migrate to the cryptic wall. Apoptotic cell debris was also discovered in stroma. In some regions, huge macrophages were observed as invaginating and nearly digesting the apoptotic cell debris.  Some stromal regions had inflammatory infiltrates and submucosa had focal enlargements. Lymphocytic infiltration, mast cell hyperplasia, typical eosinophilia depending on cryptic apsis and erythrocytic leakage in vessels depending on microthrombi and congestion were remarkable. Vascular change was not obvious but their endothelial basal membrane was ultrastructurally irregular.
 	Ultrastructure of surface epithelium of rectums in the treatment and prophylaxis groups were normal in thickness, number and length and their regular crypts were regular in depth. However, the treatment group showed local apoptotic cells. Both groups had intercellular limits protecting their distances but some local dilatations were observed. The treatment group had more dilatations than prophylaxis group. In similar to the sham group, microvilli projecting to the lumen had normal structure, regular number and lengths. Many tight junctions protected the integrity of epithelium. Compared to the control group, the prophylaxis group protected the continuity and homogeneity of the basal membrane and normal digitations between intercellular spaces; whereas, the treatment group had abnormal ultrastructure of these regions. In the prophylaxis group, lamina propria had a little increase in extracellular matrix and the treatment group showed irregular fibrils in normal amount. Many eosinophils in lamina propria, especially close to the epithelial regions demonstrated cryptic apsis totally not treated in the prophylaxis group compared to the treatment group. Extracellular matrix increased in stroma regions of both groups and also fibrosis appeared. A few active macrophages, lymphocytes and many neutrophils were demonstrated in the treatment group but any lymphocyte could not be observed in the prophylaxis group. Vascular change was also not observed in both groups. 
Discussion and Conclusion
This experimental model of acute radiation proctitis showed that ruscogenin treatment or prophylactic treatment are effective on histopathological and immunohistochemical progress and our data had statistical significant findings. These findings were supported by light and electron microscopic analysis. Ultrastructurally, both treatment and prophylaxis groups demonstrated improvements in mucosa and submucosa and most of damage depending on acute radiation proctitis was cured. In the literature, there has been reports about the ultrastructure of the rectum damaged by acute radiation proctitis but ultrastructural effect of ruscogenin on proctitis has not been reported yet. Thus, this study is the first in terms of histopathological and anti-inflammatory effects of ruscogenin on ultrastructure of rectum with acute radiation proctitis. Yet, many clinical trials and especially biochemical studies are needed to support our data. Our study may be a pilot research in this respect. 
Key words: Ruscogenin, radiation proctitis, transmission electron microscopy, immunohistochemistry