Hepatoselüler karsinoma hastalığının tanısında ve izlenmesinde kullanılabilecek biyo-belirteç taranması
Screening of bio-markers for diagnosis and monitoring of Hepatocellular carcinoma
Yazar: BURHANETTİN YALÇINKAYA
Danışman: PROF. DR. SADRETTİN PENÇE
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Tıp Ana Bilim Dalı / Moleküler Tıp Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2018
Konu: Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: DNA-mitokondrial = DNA-mitochondrial ; Karsinoma-hepatoselüler = Carcinoma-hepatocellular

Özet:
Hücrelerin kontrolsüz ve düzensiz çoğalması sonucu doku veya organlarda meydana getirdiği anormallikler kanser olarak tanımlanır. Primer karaciğer tümörlerinin %80-90'ını oluşturan Hepatoselüler karsinoma, özellikle kronik Hepatit B (%80) ve kronik Hepatit C enfeksiyonundan kaynaklanır. Günümüzde, araştırmacılar tarafından hastalıkların erken teşhisi için biyo-belirteç analizleri gerçekleştirilmektedir. Bunlardan birisi de serbest DNA analizleridir. Serbest DNA'lar hücre nekrozu veya apoptoz sonucu vücut sıvılarına salınırlar. Hücre nekrozu sonrası vücut sıvılarına salınan DNA, tümör dokuyu temsil etmektedir. Serbest DNA'lar genomik DNA parçaları olduğu gibi mtDNA da olabilmektedir. Tamir mekanizması zayıf olan mtDNA çevresel etmenlere karşı aşırı duyarlı olduğundan kanserin moleküler mekanizmasında önemli rol aldığı bilinmektedir. mtDNA kopya sayısının bazı hastalıklarda artarken bazı hastalıklarda azaldığı bildirilmiştir. 
Prognostik ve prediktif biyobelirteçler olabileceği düşünülen MikroRNA'lar, kodlayıcı özelliği olmayan küçük RNA parçacıklarıdır. Hücrede meydana gelen birçok olayda rol alırlar. 
İmmünolojik aktivasyonda önemli role sahip olan PD-1 proteinin ligana sahip tümörler, T hücrelerindeki PD-L1 ile etkileşime girerek kendilerine karşı gelişen immünolojik savunmayı inhibe eder. Bu özelliğinden dolayı PD-L1 çeşitli kanser türlerinde etkin rol aldığı bilinmektedir.
Bu tez çalışmasında, Hepatoselüler karsinomada mtDNA kopya saysının değişimini belirlemek için 34 hasta ve 34 sağlıklı gönüllüden izole edilen DNA örneklerinde, ilk defa dijital PCR ile ve qPCR ile kesin miktar tayini yapılmıştır. Dijital PCR sonucuna göre hasta ve kontrol grubu arasındaki oranın 2,8 kat olduğu, qPCR analizi sonucu ise 1,7 kat olduğu belirlenmiştir.  
Aynı hasta ve kontrol grubunda (hsa-mir-33a'nın 7,3 kat, hsa-mir-203b'nin 4,6 kat, hsa-mir361-3p'nin 5,1 kat daha az eksprese olduğu ve hsa-mir-424'ün eskpresyon seviyesinin ise hasta ve kontrol grubu arasında anlamlı bir değişim göstermediği belirlenmiştir. Bu çalışmada ayrıca PD-L1 geni ile Beta Aktin geni arasında kopya sayısı değişimi analizi gerçekleştirilmiştir., Hasta ve kontrol grubunda iki gen arasındaki kopya sayısı oran farkı anlamlı bulunmamıştır. Ayrıca, serum/plazma örneklerinden serbest DNA izolasyonu için yöntem geliştirilmesi yapılmıştır. Bu amaçla ikisi ticari kit olmak üzere 9 farklı izolasyon yönteminin hem nükleer DNA hem de mtDNA referans alınarak qPCR ile karşılaştırılması yapılmıştır.
Bu çalışma sonucunda HCC hastalarında, mtDNA kopya sayısının, hsa-mir-33a'nın, hsa-mir-203b'nin ve hsa-mir361-3p'nin sağlıklı bireylere göre anlamlı farkı ortaya konulmuştur.

Abstract:
Abnormalities of tissues or organs caused by uncontrolled and irregular proliferation of cells are defined as cancer. Hepatocellular carcinoma, which constitutes 80-90% of primary liver tumors, is caused by chronic Hepatitis B (80%) and chronic Hepatitis C infection. Nowadays, biomarker analyzes are conducted by the researchers for early diagnosis of diseases. One of them is cell free DNA analysis. Cell free DNAs are released into body fluids as a result of cell necrosis or apoptosis. DNA that is released into body fluids after cell necrosis represents the tumor tissue. Cell free DNAs can be genomic DNA fragments as well as mtDNA. It is known that mtDNA, which has a weak repair mechanism, is hypersensitive to environmental factors and has an important role in the molecular mechanism of cancer. It has been reported that the number of mtDNA copies increased in some diseases and decreased in some diseases.
MicroRNAs, which are considered to be prognostic and predictive biomarkers, are small RNA fragments without coding. They are involved in many events in the cell.
Tumors with PD-1 ligand can interact with PD-L1 in T cells to inhibit immunological defenses that develop against them. Because of this feature, PD-L1 is known to play an active role in various types of cancer.
In this thesis, to determine the change of mtDNA copy number in hepatocellular carcinoma, DNA samples isolated from 34 patients and 34 healthy volunteers were quantified by digital PCR and qPCR for the first time. According to the results of digital PCR, the ratio between the patient and the control group was 2.8 times, and the result of qPCR analysis was 1.7 times. 
In the same patient and control group (hsa-mir-33a 7.3 times, hsa-mir-203b 4.6 times, hsa-mir361-3p 5.1 times less expressed and it was determined that the level of expression of hsa-mir-424 did not show any significant change between the patient and control group. In this study, copy number change analysis was performed between PD-L1 gene and Beta Actin gene.  There was no significant difference in the number of copies between the two genes in the patient and control groups. In addition, new method was developed for cell free DNA isolation from serum / plasma samples. For this purpose, 9 different isolation methods, two of which are commercial kit, were compared with qPCR by reference to both nuclear DNA and mtDNA.
As a result of this study, significant difference was found between the number of mtDNA copies, hsa-mir-33a, hsa-mir-203b and hsa-mir361-3p in HCC patients compared to healthy individuals.