Bazı yenilebilir allıum türlerinde ginogenesis uyartımı ve klonal çoğaltma olanaklarının araştırılması
Bazi yenilebilir allium türlerinde ginogenesis uyartimi ve klonal çoğaltma olanaklarinin araştirilmasi
Yazar: ARZU KASKA
Danışman: DOÇ. DR. ALİ RAMAZAN ALAN
Pamukkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2013
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Allium = Allium ; Allium cepa =  ; Dihaploidizasyon = Dihaploidisation ; Haploidi tekniği = Haploidy technique ; Islah = Improvement

Özet:
Araştırmada, yenilebilir Alliumlar A. cepa L., A. ampeloprasum L. ve A. tuncelianum (Kollmann) N. Özhatay , B. Mathew & Şiraneci  türlerinde çiçek tomurcuğu kültürü yöntemleri ile ginogenik ve somatik bitki elde edilmesi ile ilgili detaylı deneyler yapılmıştır. İki yılda gerçekleştirilen doku kültürü deneylerinde A.cepa'dan 10 donör grubuna ait 45 genotip, A. ampeloprasum'dan altı genotip ve A. tuncelianum'a ait bir populasyonlardan alınan açmamış çiçek tomurcuğu eksplantları, farklı temel besin ortamları, büyüme düzenleyicileri ve sukroz konsantrasyonları uygulamalarına tabii tutulmuşlardır. Temel besin ortamları olarak BDS (Dunstan ve Short, 1977), MS (Murashige ve Skoog, 1962) ve B5 (Gamborg ve diğ., 1968) denenmiştir. Bu temel besin ortamlarına farklı kombinasyon ve konsantrayonlarda bitki büyüme düzenleyicileri ve sukroz eklenmesiyle oluşturulan ortamların ginogenik ve somatik sürgün oluşturma performansları saptanmıştır. Denemelerde benzil amino pürin (BAP; 0, 1 ve 2 mg/l) , 2, 4-dikloro fenoksi asetik asit (2,4-D; 0, 1 ve 2 mg/l) , naftalen asetik asit (NAA; 0,5 ve 1 mg/l), 2-izopenten adenin (2IP; 0, 1, 4 ve 8 mg/l) ve tidizuran (TDZ, 0 ve 2 mg/l) tek başlarına veya birlikte kombinasyonları yapılarak kullanılmışlardır. 
A. cepa deneylerinde iki yılda 10 donör grubundan toplam 387 ginogenik ve 3230 somatik sürgün elde edilmiştir. A. cepa'da ginogenesis uyartımı için en uygun besin ortamının % 0,62 ginogenik bitkicik üretilen BDSA (2 mg/l BAP ve 2 mg/l 2, 4-D ve 100 g/l sukroz içeren BDS) ve somatik sürgün uyartımı için en uygun besin ortamının % 14,33 somatik sürgün üretilen BDSF (2 mg/l 2, 4-D ve 2 mg/l BAP ve 100 g/l sukroz içeren BDS) olduğu tespit edilmiştir. A. cepa denemelerinde yapılan ginogenesis uyartımı ve somatik sürgün uyartımı denemelerinde güçlü genotip ve medya etkilerinin varlığı ortaya çıkmıştır. Flow sitometrik analizle yapılan DNA miktarı ölçümlerinde ginogenik A. cepa bitkilerinin genellikle haploid (n; % 46,37) oldukları bulunmuştur. Diğer ginogenik A. cepa bitkilerinin haploid ve diploid için miksoploid (n+2n; % 0,43), diploid (2n; % 18,84), diploid ve tetraploid için miksoploid (% 2,89) ve tetraploid (4n; % 1,45) oldukları tespit edilmiştir. A. cepa kültürlerinden elde edilen somatik sürgünlerin  büyük bir çoğunluğunun diploid olduğu (% 81,63) ama diğer sürgünler arasında 2n+4n için miksoploid (% 5,10) ve  tetraploid (% 13,26)  oldukları görülmüştür. Diploid, miksoploid ve tetraploid A. cepa bitkileri in vivoya aktarılmış ve daha sonra serada büyütülmüşlerdir. Haploid A. cepa bitkilerinde ise kromozom katlaması uygulaması (400 mg/l Kolçisin içeren MS medyasında de 48 saat) yapıldıktan sonra gelişmeye devam eden üç bitkide in vivoya aktarılmıştır. İki yılda 14 ginogenik A. cepa bitkisinden 29 baş elde edilmiştir. İlk yıl elde edilen iki ginogenik hatta ait 15 baştan 13 tanesi çiçeklenmiş ve bunlardan kendilenmiş tohum elde edilmiştir. Bunlardan bitki başına 63 ile 880 arasında değişen miktarlarda kendilenmiş tohum eldesi sağlanmıştır. İki yılda in vivoya aktarılan 111 somatik A. cepa bitkisinden 384 baş üretilmiştir. İlk yıl elde edilen 180 baştan 146 tanesi çiçeklenmiş ve tohum üretmişlerdir. Somatik bitkilerden bitki başına 0 ile 738 arasında değişen miktarlarda kendilenmiş tohum elde edilmiştir. Ginogenik, somatik ve donör A. cepa bitkilerinden kendileme ile elde edilen tohumlar ekilmiş ve fideler morfolojik özellikler için gözlenmiştir. Ginogenik hatlara ait fidelerde beklenen dışında hiçbir özellik gözlenmezken somatik ve donör bitkilerinden üretilen fideler arasında albinolar tespit edilmiştir. Ginogenik bitkiler kendi içlerinde çok uniform çimlenme ve büyüme göstermişlerdir. 
A. ampeloprasum deneylerinde altı genotipten toplam 48 ginogenik ve 875 somatik bitki üretilmiştir. Bu türde ginogenesis uyartımına en uygun medyaların % 0,22 ginogenik bitkicik üretilen BDSD (2,4-D ve 100 g/l sukroz) ve % 0,21 ginogenik bitkicik üretilen BDSA, somatik sürgün uyartımı için en uygun meydanında % 5,50 somatik sürgün üretilen BDSC olduğu bulunmuştur. Bu sonuçlar A. ampeloprasum türünde de ginogenesis uyartımı ve somatik sürgün uyartımında medyanın ve genotipin  güçlü etkilerinin olduğunu göstermiştir.  Flow sitometrik analizle yapılan DNA miktarı ölçümleri ginogenik A. ampeloprasum bitkilerin çoğunlukla diploid (% 55,56) geriye kalan bitkilerin tetraploid (% 44, 44) olduğu göstermiştir. Bu türe ait kültürlerden elde edilen somatik sürgünlerin hiç birinde ploidi değişikliği gözlenmemiştir. İki yılda in vivo ya 12 ginogenik A. ampeloprasum bitkisi aktarılmıştır. İlk yılda aktarılan bitkiler serada yaşamazken ikinci yılda aktarımı yapılan ginogenik bitkilerden altı tanesi büyümeye devam etmişlerdir. Bunlardan bir tanesi çiçeklenerek 920 kendilenmiş tohum üretmiştir
A. tuncelianum populasyonundan alınıp kültüre konulan açmamış çiçek tomurcuğu kültürlerinden üç ginogenik embriyo, 55 somatik kallus ve altı kallus aracılı somatik sürgün üretilmiştir. Bu türde elde edilen ginogenik embriyoların iki tanesi (% 0,55) MSD (8 mg/l 2IP, 1 mg/l NAA ve 100 g/l sukroz modifiye MS), bir tanesi (% 0,09) BDSA medyasında elde edilmiştir. A. tuncelianum çiçek tomurcuğu eksplantlarında en fazla somatik kallus (% 2,99) ve kallus aracılı sürgün (% 0,56)  BDSA medyasında elde edilmiştir. Flow sitometrik analizle yapılan DNA miktarı ölçümlerinde A. tuncelianum'da nükleer DNA miktarının 34,07 pg/2C DNA olduğu tespit edilmiştir. Elde edilen bir ginogenik bitkide eşit miktarlarda haploid ve diploid ploidi seviyesine sahip çekirdeklere sahip hücreler bulunduğu ve bu nedenle miksoploid (n+2n) olduğu belirlenmiştir. Elde edilen A. tuncelianum somatik sürgünlerin diploid, sürgüne dönüşemeyen kallusların tetraploid ploidi seviyelerine sahip oldukları bulunmuştur.
Bu tez çalışmasında yer alan tüm Allium materyallerinin hepsi ginogenesis ve somatik sürgün uyartımına cevap vermişlerdir. Elde edilen bulgular çalışmaya dahil edilen yenilebilir Allium türlerinde yapılmak istenen ıslah ve klonal çoğaltım uygulamalarının in vitro düzeyde gerçekleştirilebilmesinin mümkün olduğunu göstermektedir. Projenin en önemli çıktılarından birisi önceleri sadece A. cepa için başarılı olduğu düşünülen ginogenesis uyartımının diğer yenilebilir Allium türlerinde de gerçekleştirilebileceğinin ispat edilmiş olmasıdır. Bu tez çalışması bu yönüyle ülkemizde yenilebilir Allium biyoteknolojisi ile ilgili ilk detaylı çalışma olma özelliğine sahiptir.

Abstract:
In this thesis research, detailed experiments were carried out to obtain gynogenic and somatic plants from edible Alliums A. cepa L., A. ampeloprasum L. ve A. tuncelianum (Kollmann) N. Özhatay ,B. Mathew & Şiraneci  by using flower bud culture methods. In two-year tissue culture experiments, unopened flower buds collected from 45 genotypes of 10 A. cepa donör groups, six A. ampeloprasum genotypes and a A. tuncelianum population were cultured on various tissue culture media with varying amounts of growth regulators and sucrose. As basic media BDS (Dunstan and Short, 1977), MS (Murashige and Skoog, 1962) and B5 (Gamborg et al., 1968) were tested. Culture media prepared by adding different types and amounts of growth regulators and sucrose into those basic media were tested for their gynogenic and somatic shoot production potantial. In the experiments, benzil amino purine (BAP; 0, 1 and 2 mg/l) , 2,4–dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D; 0, 1 and 2 mg/l) , napthaleneacetic  acid (NAA; 0,5 and 1 mg/l), isopentenyl adenine (2IP; 0, 1, 4 and 8 mg/l) and thidiazuron (TDZ, 0 ve 2 mg/l) were used alone or in combination with other growth regulators. 
In A. cepa experiments,  total of 387 gynogenic and 3230 somatic shoots were obtained from 10 donör groups in two years. The medium best suited for gynogenesis induction in A. cepa was BDSA (BDS medium combined with 2 mg/l BAP,  2 mg/l 2,4-D and 100 g/l sucrose), which provided 0,62 % gynogenic plantlets. The best medium for somatic shoot induction in A. cepa was the medium coded as BDSF (1 mg/l BAP, 1 mg/l 2,4-D and 100 g/l sucrose containing BDS), which provide 14,33 % somatic shoots. The results obtained indicated that there were strong effects of gynotype and medium in gynogenesis and somatic shoot induction in A. cepa species. In the DNA amount measurements performed with flow cytometry analysis, it was found that  gynogenic A. cepa plants were generally haploid (n; 46,37 %). Other gynogenic A. cepa plants were mixoploid for haploid and diploid (n+2n; 0,43 %), diploid (2n; 18,84 %), mixoploid for diploid and tetraploid (2,89 %) and tetraploid (4n; 1,45 %). Most of the somatic shoots obtained from A. cepa cultures were diploid (81,63 %) but there were also 2n+4n mixoploid (5,10 %) and  tetraploid (13,26 %) plants. Diploid, mixoploid and tetraploid A. cepa plants were transferred to in vivo and grown in a greenhouse. Haploid A. cepa plants were treated for chromosome doubling (48 hrs in liquid MS with 400 mg/l colchicine) and surviving three plants were also transferred to in vivo. Twenty-nine heads were produced from 14 gynogenic A. cepa plants in two years. From 15 heads developed from two gynogenic plants obtained in the first year, 13 of them produced flowers and provided selfed seeds. Selfed seeds produced per gynogenic A. cepa plant varied between 63 and 880, In two years, 384 heads were produced from 111 somatic A. cepa plants. From the 180 heads produced in the first year, 146 of them produced flowers and produced selfed seeds. Selfed seeds produced per somatic plant varied between 0 and 738. Selfed seeds obtained from gynogenic, somatik and donör A. cepa plants were sown and seedlings were observed for morphological traits. There were no unexpected phenotypes among the gynogenic lines while the seedlings from somatic and donör plants had albinos among them. In each gynogenic line, germination and growth were very uniform.
In A. ampeloprasum experiments, 48 gynogenic and 875 somatic plants were obtained from six genotypes. The media best suited for gynogenesis induction in A. ampeloprasum were BDSD (BDS medium combined with 2 mg/l 2, 4-D and 100 g/l sucrose) and BDSA, which provided 0,22 % and 0,21 % gynogenic plantlets. The best medium for somatic shoot induction in A. ampeloprasum was BDSC (2 mg/l BAP and 100 g/l sucrose containing BDS), which provided 5,50 % somatic shoots. The results obtained indicated that there were strong effects of gynotype and medium in gynogenesis and somatic shoot induction in A. ampeloprasum species. In the DNA amount measurements performed with flow cytometry analysis, it was found that  gynogenic A. ampeloprasum plants were mostly diploid (55,56 %) and the others were tetraploid (44,44 %). Somatic shoots obtained in the cultures of this species did not show any ploidy changes. Twenty A. ampeloprasum gynogenic plants were transferred to in vivo in two years. None of the plants survived the transferred in the first year but  six of the plants transferred in the second year survived and continued to grow. One of the gynogenic plants flowered and provided 920 selfed seeds. 
Flower buds collected and cultured from an A. tuncelianum population provided three gynogenic embryos and 55 somaic cali and six callus mediated somatic shoots. Two gynogenic embryos (0,55 %) obtained in this species were induced on MSD (modified MS containing 8 mg/l 2IP, 1 mg/l NAA and 100 mg/l sucrose). One gynogenic embryo (0,09 %) obtained was induced on BDSA medium. The highest amounts of somatic calli (2,99 %) and callus mediated somatic shoots (0,56 %) were obtained from the flower bud explants cultured on BDSA medium. In the DNA amount measurements performed with flow cytometry analysis, it was found that  Nuclear DNA content of A. tuncelianum was determined to be 34,07 pg/2C DNA. One gynogenic A. tuncelianum plant obtained showed equal amounts of haploid and diploid cells. Therefore it was determined to be a mixoploid for n+2n. A. tuncelianum somatic shoots obtained were diploid and calli with no shoot production were tetraploid.
All Allium materials included in this study responded positively to gynogenesis and somatic shoot induction. The data obtained shows that the breeding and clonal propagation applications can be performed in edible Alliums. One of the major outcomes of this project is that it proved the applicability of gynogenesis induction, which was initially thaught to be working for only A. cepa, in other edible Alliums. In this sense this dissertation is the first detailed biotechnology based study on three edible Turkish Allium species.