Süperovulasyon uygulamasının DNA metiltransferaz genlerinin ekspresyonu üzerine etkisinin araştırılması
Investigating the effect of superovulation on the DNA methyltransferase genes expression in mouse oocytes and early embryos
Yazar: FATMA UYSAL
Danışman: PROF. DR. GÖKHAN AKKOYUNLU
Akdeniz Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: DNA = DNA ; Embriyo = Embryo ; Floresan antikor tekniği = Fluorescent antibody technic ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Metiltransferaz = Methyltransferase ; Oositler = Oocytes ; Süperovülasyon = Superovulation

Özet:
Memeli oosit ve erken dönem embriyo gelişiminde, epigenetik mekanizmalardan birisi olan DNA metilasyonu kritik bir öneme sahiptir. DNA metilasyonu, genomdaki CpG ya da CpG olmayan adacıklardaki sitozin nükleotidlerinin 5. karbon atomuna metil grubu takılmasıyla gerçekleştirilir. De novo(yeni baştan) ve sürdürme metilasyon mekanizmalarında, DNA metiltransferaz (DNMT) enzimleri rol oynar. Yapılan çalışmalarda, oosit ve erken dönem embriyo gelişiminde DNMT enzimlerinden olan DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B'nin önemli görevleri olduğu belirlenmiştir. Bu çalışmada, IVF uygulamaları ve deneysel araştırmalarda sıklıkla kullanılan süperovulasyonun DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B proteinlerinin ekspresyonal düzeyleri ve hücre içi yerleşimleri üzerine etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır.
Bu çalışmada Balb/C ırkı 6 haftalık dişi farelerden kontrol, normal doz [5 IU gebe kısrak serum gonadotrophini (PMSG)ve 5 IU insan korionik gonadotrophini (hCG)] ve yüksek doz (7.5 IU PMSG ve 7.5 IU hCG) olmak üzere 3 grup oluşturuldu. Belirlenen zaman çizelgesinde toplanan oosit [germinal vezikül (GV) ve metafaz II (MII)] ve erken dönem embriyolarda (1-hücreli ve 2-hücreli) DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B'nin ekspresyonal düzeyleri ve hücre içi yerleşimleri immünofloresan tekniği ile belirlendi. Elde edilen boyanmalar, ImageJ yazılımı ile analiz edilerek göreli ekspresyonlar belirlenip; One Way Anova istatistiksel testi ile analiz edildi.
Çalışmamızın sonuçlarına göre; DNMT1 ekspresyonu, analiz edilen oosit ve erken dönem embriyolarda nükleer bölgede zayıf, sitoplazmada daha yoğun gözlenirken membrana yakın bölgelerde ise yoğun şiddette olduğu her üç grupta da belirlenmiştir. DNMT3A ve DNMT3B ekspresyonu, nükleer bölgede yoğun iken, sitoplazmik bölgede ise normal şiddette yerleşim göstermiştir. Ayrıca, DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B protein ekspresyonları normal ve yüksek doz gruplarından elde edilen GV ve MII oosit,  1-hücreli ve 2- hücreli embriyolarda kontrol grubuyla karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gözlenmiştir  (P<0.05).
Sonuç olarak, bu çalışma ile süperovulasyonun DNMT proteinlerinin ekspresyonal düzeylerini değiştirdiği ilk defa ortaya konulmuştur. Kontrol grubu dişilerden alınan oosit ve embriyolarda bu proteinlerin hücre içi yerleşimleri ilk defa detaylı olarak incelenmiştir. Deneysel çalışmalarda ve yardımcı üreme tekniklerinde sıklıkla kullanılan süperovulasyonun etkisinin oosit ve erken dönem embriyolarda daha detaylı araştırılması gerekmektedir.

Anahtar Kelimeler: DNMT, Embriyo, Oosit, İmmunofloresan, Süperovulasyon

Abstract:
DNA methylation is one of the epigenetic mechanisms which plays critical role at mammalian oocyte and preimplantation embryo development. DNA methylation materializes by adding a methyl group to the fifth carbon atom of the cytosine residues within cytosine-phosphate-guanine (CpG) and non-CpG dinucleotide sites. DNA methyltransferase (DNMT) enzymes play roles at de novo and maintenance methylation processes. In studies, DNMT1, DNMT3A and DNMT3B which are DNMT enzymes were identified to have important assignments in oocyte and preimplantation embryo development. In this study propose that superovulation which is used frequently in IVF applications and experimental researches that identification expression of protein levels and in subcellular localization of DNMT1, DNMT3A and DNMT3B.
In this study, three groups were formed which included control, normal dose [5 IU pregnant mare's serum gonadotropin (PMSG) and 5 IU human chorionic gonadotropin   (hCG)] and high dose (7.5 IU PMSG and 7.5 IU hCG) from 4-5 weeks female mice (BALB/C). Protein expression level and cellular localization of DNMT1, DNMT3A and DNMT3B were defined by immunofluorescence technique at oocyte [germinal vesicle (GV), metaphase II (MII)] and preimplantation embryos (1-cell and 2-cell) which were picked up in predetermined set of time chart. The images obtained were analyzed by ImageJ software and One Way Anova statistical test so that relative expressions were identified.
According to the results of our study, DNMT1 we identified weak expression pattern in nuclear region, more intensive in cytoplasmic region and the most intensive expression pattern in near the membrane regions at analyzed oocytes and preimplantation embryos for three groups. DNMT3A and DNMT3B expressions have shown intensive localizations in nuclear regions and normal expression in cytoplasmic regions. Additionally, DNMT1, DNMT3A and DNMT3B protein expressions were observed significantly different in normal and high dose groups compared with control groups at GV and MII oocytes, 1-cell and 2-cell embryos (P<0.05).
In conclusion, this study has demonstrated for the first time that superovulation alters expression levels of DNMT proteins. Subcellular localizations of these proteins were examined in detail for the first time at oocytes and embryos obtained from a control group of females. Superovulation is commonly used in experimental studies and assisted reproductive techniques that its effect should be further investigated in the oocytes and preimplantation embryos.

Keywords: DNMT, Embryo, Oocyte, Immunofluorescence, Superovulation