Plasmodıum falciparum apical membran antijen 1 (AMA1)'in klonlanması
Cloning of plasmodium falciparum apical membran antijen 1 (AMA1)
Yazar: FATMA DOĞAN
Danışman: PROF. DR. İZZET ŞAHİN
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Parazitoloji = Parasitology
Dizin: Antijenler = Antigens ; Dizi analizi-DNA = Sequence analysis-DNA ; Klonlama = Cloning ; Plasmodium = Plasmodium ; Plasmodium falciparum = Plasmodium falciparum ; Sıtma = Malaria

Özet:
Dünyada en fazla ölüme sebep olan paraziter hastalık olan sıtma proje konusu olarak seçilmiş ve sıtmaya karşı aşıgeliştirilmesi amaçlanmıştır. DSÖ' nün 2016 raporunda, 2015 yılında dünya genelinde 212 milyon sıtma vakası görülmüştür.2015 yılında, dünya çapında 429 000 kişinin sıtma nedeniyle yaşamını yitirdiği tahmin edilmiştir.Plasmodium' ların insandaenfeksiyona neden olan türleri; Plasmodium falciparum, P.ovale, P.malaria, P.vivax ve P.knowlesi'dir. İnsan, Plasmodium spp.'nin sporozoitlerini taşıyan dişi anofelin kan emmesiyle enfekte olur. Kan dolaşımıyla karaciğere gelip hepatositlere giren sporozoitler burada önce trofozoit, sonrada merozitlere dönüşürler (egzo-eritrositer şizogoni). Merozoitlerle dolu hepatositlerin parçalanması ile serbest kalan merozoitler kana karışarak eritrositleri istila ederler. Eritrositlerde çoğalan (eritrositer şizogoni) parazitler periyodik olarak eritrositlerin parçalanmasına neden olurlar ve bunun sonucu çeşitli semptomların görüldüğü ''Klinik Malaria'' ortaya çıkar. Parazitin insanda geçen yaşam döneminde farklı yaşam formlarında bulunduklarından, sıtma ile mücadele amacıyla bu yaşam formlarına yönelik aşı geliştirme çalışmaları tasarlanmıştır.
Ülkemizde ilk defa yapılacak olan bu çalışma ile P.falciparumAMA1 genin klonlanması amaçlanmıştır.
Çalışmada; PCR ve optimizasyonu,  DNA ekstraksiyonu ve klonlama basamakları uygulanmıştır. P.falciparum genomik DNA'sı elde edildikten sonra spesifik primerler kullanılarak AMA1 geni elde edilmiştir.P.falciparumAMA1 genipJET 1.2vektörüne klonlanmış ve kompetan E.coli hücrelerine transformasyonu yapılarak çoğaltılmıştır. PCR screening ile pozitifliği doğrulandıktan sonra kolonilerden miniprep yapılmıştır. P.falciparum AMA1 DNA'sını içeren rekombinant plazmitler saflaştırılmıştır. Klonlamanın doğruluğunun kesinleşmesi için P. falciparum AMA1 geni için DNA dizi analizi yapılmıştır.
Sonuç olarak; çalışma ileklonlanan P.falciparum AMA1 geniDNA aşısı olarak kullanılabilecektir. Elde edilen rekombinant plazmit tek başına veya farklı antijenlerle ve immun sistemi stimüle edici adjuvantlarla kombine edilerek etkin aşıların elde edilmesine çalışılabilecektir.

Abstract:
Malaria, the parasitic disease that caused the most deaths in the world, was chosen as the project theme and the aim was to develop a vaccine against malaria. There were 212 million cases of malaria worldwide in 2015 according to WHO's 2016 report. In 2015, it has been reported that 429 000 malaria deaths worldwide are estimated. Plasmodium species causing human infection are P. falciparum, P. ovale, P. malaria, and P. vivax and P. knowlesi.  The human is infected by blood sucking of the female Anofel carrying sporozoites of Plasmodium spp. The sporozoites that come into the liver with blood circulation and enter into the hepatocytes first turn into trophozoite later merozoites (exo-erythrosis schizogony). With the degredation of hepatocytes, the released merozoites infiltrate into the blood and invade erythrocytes. Parasites that proliferate in erythrocytes (erythrocytic schizogony) periodically cause the degredation of erythrocytes, which results in clinical malaria which various symptoms are seen.Parasites are found in different life forms during the human stage.Vaccine development studies for these life forms have been designed to combat malaria.This work, which was done for the first time in our country, aims to clone P.falciparum AMA1 genome. The method was used in the study that PCR and optimization consists of DNA extraction and cloning steps. Once the P. falciparum genomic DNA has been obtained then the AMA1 gene was obtained using specific primers. Plasmodium falciparum AMA1 gene was cloned into CloneJET vector then was growed up by transformation into competent E. coli cells. Positive clone was confirmed by PCR screening and were performed miniprep. The recombinant plasmids, containing P. falciparum AMA1 gene region were purified. DNA sequence analysis was performed for Plasmodium falciparum AMA1 gene to confirm the correctness of the cloning. The cloned P. falciparum AMA1 gene may be used as a DNA vaccine after this study. The recombinant plasmid generated may be combined with the immunostimulatory adjuvants alone or with different antigens to obtain effective vaccines.