Yerli kara boğalarda seminal plazma endojen antioksidan kapasitesi ve kriyoprezervasyon öncesi ve sonrası sperma kalitesi ile ilişkisinin incelenmesi
Investigation of seminal plasma endogenous antioxidant capacity and its relationship with semen quality before and after cryopreservation in anatolian black bulls
Yazar: İLKER ÜNAL
Danışman: PROF. DR. HAMDİ UYSAL
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Veteriner Biyokimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Boğalar = Bulls ; Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Sperm = Spermatozoa ; Sperm kalitesi = Sperm quality ; Sığırlar = Cattles ; Veteriner hekimlik = Veterinary medicine

Özet:
Bu tez çalışmasında boğalarda taze ve dondurma çözdürme sonrası sperma kalite parametrelerinin ve seminal plazmadaki antioksidan konsantrasyonlarının belirlenmesi ayrıca seminal plazmadaki antioksidanların çözüm sonu sperma kalitesine etkisinin değerlendirilmesi ve spermanın dondurulabilirliği için belirteç olarak kullanım olasılığının araştırılması amaçlanmıştır. Çalışma için 6 baş Yerli Kara boğadan altı hafta boyunca 72 ejakulat  alınmıştır. Alınan ejakulatların bir kısmı ayrılarak santrifüj edilmiş ve seminal plazmaları ayrılarak analizler yapılana kadar -80oC de muhafaza edilmiştir. Daha sonra spermanın kalan bölümü ile taze sperma kalite değerlendirmesi yapılmış ve ticari sulandırıcı ile sulandırılarak 0,25 ml'lik payetlerde dondurulmuş ve  -196oC de analiz yapılana kadar sıvı azot içerisinde muhafaza edilmiştir. Seminal plazmada katalaz, süperoksit dismütaz, glutatyon peroksidaz, total antioksidan seviye, total oksidan seviye, malondialdehit ve vitamin-E analizleri yapılmıştır. Spermalar çözdürüldükten sonra motiliteleri CASA cihazı ile, plazma membran ve akrozom bütünlüğü (PMAB) ve mitokondiyal membran potansiyeli (MMP) analizleri ise akış sitometri cihazı ile incelenmiştir.
Çalışmada taze spermaların ortalama hacim,  konsantrasyon, total motilite ve progresif motilite değerleri sırasıyla 4,47±0,12 ml,  1264,0±44,4 *10⁶/ml, %93,4±3,77 ve %45,0±6,37 olarak belirlenmiştir. Çözüm sonu total motilite, progresif motilite, PMAB ve yüksek MMP değerleri ise sırasıyla %61,60±1,54 %24,40±0,93 , %46,33±1,12 ve %61,48±1,60 olarak tespit edilmiştir. Ayrıca iki aşamalı kümeleme analizi uygulanarak spermalar çözüm sonu kalite parametreleri baz alınarak iyi dondurulabilir (İDS) ve zayıf dondurulabilir spermalar (ZDS) olarak iki grupta incelenmiştir. Analiz neticesinde PMAB ve çözüm sonu total motilite değerleri İDS grubunda ZDS grubuna göre önemli derecede (P<0,001) yüksek bulunmuştur. Seminal plazma TAS, CAT ve Vit-E değerleri İDS grubunda önemli derecede (P<0,05) daha yüksek bulunurken, TOS ve OSİ değerleri ZDS grubunda önemli derecede (P<0,01) yüksek bulunmuştur. Gruplar arasında SOD, GPx ve MDA değerleri bakımından anlamlı bir fark tespit edilmemiştir. Sonuç olarak Seminal plazma antioksidan içeriğinin spermanın dondurulabilirliğinden sorumlu olduğu ve ayrı ayrı antioksidan enzimlerin bakılması yerine TAS ve TOS analizleri yapılarak belirlenecek olan OSİ değerinin sperma üretim istasyonlarında çözüm sonu sperma kalitesi için belirteç olarak kullanılabileceği gözlemlenmiştir.

Abstract:
In this thesis, it was aimed to determine the quality parameters of fresh and post-thaw semen, and the antioxidant concentrations in seminal plasma in bulls, as well as to evaluate the effect of antioxidants in seminal plasma on the quality of post-thaw semen, and to investigate the possibility of its use as a marker for semen freezability. For the study, 72 ejaculates were collected from 6 Anatolian Black bulls for six weeks. Collected ejaculates were separated into two aliquots. First one was centrifuged, and their seminal plasma was separated and stored at -80oC until analysis. The quality of fresh semen was evaluated with the remaining part of the semen then diluted with commercial extender, frozen in 0.25 ml straws and stored in liquid nitrogen at -196oC until analysis. Catalase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, total antioxidant level, total oxidant level, malondialdehyde and vitamin-E analyzes were performed in seminal plasma. After the sperms were thawed, their motility was analyzed with a CASA, and their plasma membrane and acrosome integrity (PMAI) and mitochondial membrane potential (MMP) analyzes were analyzed with a flow cytometry. 
 
In the study, mean volume, concentration, total motility and progressive motility values of fresh semen were determined as 6.37. 4,47±0,12 ml,  1264,0±44,4 *10⁶/ml, %93,4±3,77 and %45,0±6,37 respectively. Total motility, progressive motility, PMAB, and high MMP values of post-thaw semen were detected as 61.60±1.54%, 24.40±0.93%, 46.33%±1.12%, and 61.48±1.60% respectively. In addition, two-step cluster analysis was applied and semen were examined in two groups as good-freezable semen (IDS) and poor-freezable semen (ZDS) based on the post-thaw quality parameters. As a result of the analysis, PMAI and post-thaw total motility values were found significantly higher (P<0.001) in the IDS group compared to the ZDS group. While seminal plasma TAS, CAT and Vit-E values were significantly higher (P<0.05) in the IDS group, TOS and OSI values were significantly higher (P<0.01) in the ZDS group. There was no statistically significant difference between the groups in terms of SOD, GPx and MDA values. As a result, it has been observed that the seminal plasma antioxidant content is responsible for the freezability of semen, and the OSI value, which can be determined by performing TAS and TOS analyzes instead of looking for separate antioxidant enzymes, can be used as a marker for the quality of post-thaw semen at artificial insemination centers.