Griscelli sendromu uyarılmış pluripotent kök hücre geliştirilmesi, karakterizasyonu ve in vitro hematopoetik farklılaşması
Development, characterization and in vitro hematopoeitic differentiation of griscelli syndrome i̇nduced pluripotent stem cells
Yazar: GÜLEN ESKEN
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ FATİMA AERTS KAYA
Hacettepe Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü
Derece: Doktora, 2018
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Griscelli sendromu tip 2 = Griscelli syndrome type 2 ; Hematopoetik kök hücreler = Hematopoietic stem cells ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Katil hücreler-doğal = Killer cells-natural ; Kemik iliği = Bone marrow ; Kök hücreler = Stem cells ; Pluripotent kök hücreler = Pluripotent stem cells ; T lenfositleri = T lymphocytes

Özet:
GÜNEY ESKEN, G. Griscelli Sendromu Uyarılmış Pluripotent Kök Hücre Geliştirilmesi, Karakterizasyonu ve in vitro Hematopoetik Farklılaşması. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Kök Hücre Programı Doktora Tezi, Ankara, 2018. Griscelli Tip 2 Sendromu (GS-2) nadir, otosomal resesif, kalıtsal immün yetmezliği sendromudur. GS-2 hastalarında RAB27A gen mutasyonu; T ve Doğal Öldürücü hücrelerin fonksiyonlarının bozulmasına neden olmaktadır. Uyarılmış Pluripotent Kök Hücreler (uPKH); somatik veya kök hücrelerin Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc (OSKM) transkripsiyon faktörleri ile yeniden programlaması sonucunda geliştirilmektedir. uPKH'ler, pluripotent genleri ifade eden, sonsuz çoğalabilme ve üç germ yaprağına farklılaşma potansiyeline sahip hücrelerdir. GS-2 patofizyolojisinin daha iyi anlaşılması ve yeni tedavi yöntemlerini test edilmesi için in vitro bir GS-2 modeline ihtiyacı vardır. Bu amaçla, bu tez kapsamında, 3 GS-2 hastasından uPKH klonları oluşturulmuştur ve detaylı karakterizasyonları yapılmıştır. GS-2 uPKH'lerin geliştirmesi için mRNA, Sendai ve lentiviral gen aktarım yöntemleri kullanılmıştır. Lentiviral gen aktarım yöntemi ile geliştirilen uPKH'lerin; immünofloresan boyamalar ile SSEA1, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 ve OCT4 protein ifadeleri; SOX2, NANOG ve OCT4 gen ifadeleri, in vitro hematopoetik farklılaşma ve in vivo teratom deneylerinde üç germ yapraklarına ait hücrelere farklılaşma kapasitesi gösterilmiştir. Ayrıca, tüm GS-2 uPKH'lerin karyotipleri normal (46,XX veya 46,XY) ve ilerleyen pasajlarda başlangıç donör hücrelerin bilinen RAB27A gen mutasyonunu taşıdıkları gözlemlenmiştir. Sonuç olarak, 3 GS-2 hastadan uPKH geliştirilmiştir ve gelecekti yeni ilaçların testinde, hastalığın patofizyolojisi veya rejeneratif tıp araştırmalarında kullanılabilecektir.

Abstract:
GÜNEY ESKEN, G. Development, Characterization and in vitro Hematopoietic Differentiation of Griscelli Syndrome İnduced Pluripotent Stem Cells. Hacettepe University Institute of Health Sciences Stem Cell Doctor of Philosophy Thesis, Ankara, 2018. Griscelli type 2 Syndrome (GS-2) is a rare, autosomal recessive immune deficiency syndrome. The RAB27A gene mutation in GS-2 patients results in the loss of function of T and NK cells. Induced pluripotent stem cells (iPSC) express pluripotency genes, have the capacity for infinite expansion and can differentiate into cells from all three germ layers. They can be induced using integrative and non-integrative systems by the use of the Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc (OSKM) transcription factors. To better understand GS-2 disease and to test novel treatment options, there is a need for an in vitro GS-2 model. For this reason, in this thesis, iPSC clones were made from 3 GS-2 patients and thoroughly characterized. GS-2 iPSCs were stained for SSEA1, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 and Oct4 via immunofluorescent staining's. They also expressed SOX2, NANOG and OCT4, as confirmed by RT-PCR. They were differentiated in vitro into hematopoietic lineage and in vivo in a teratoma assay into cells from all three germ layers. In addition, all GS-2 iPSCs displayed a normal karyotype (46,XX or 46,XY) and were shown to express the RAB27A gene mutation that was present in the original somatic donor cells. In conclusion, using lentiviral transfer of OSKM, we were able to create bona fide iPSCs from 3 GS-2 patients and characterized the cells. These cells can be used in future studies for the development of novel treatment options and to study the pathophysiology of GS-2 disease.