Tütün dumanına maruz kalan ratlarda ellajik asidin testis dokusundaki antioksidan etkisinin incelenmesi
Examination of antioxidant effect of ellagic acid on testicular tissue in rats that were exposed  to tobacco smoke
Yazar: NALAN KAYA
Danışman: PROF. DR. İBRAHİM ENVER OZAN
Fırat Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2015
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Antioksidanlar = Antioxidants ; Biyokimya = Biochemistry ; Ellajik asit = Ellagic acid ; Sigara dumanı kirliliği = Tobacco smoke pollution ; Sıçanlar = Rats ; Testis = Testis ; Tütün = Tobacco

Özet:
Tütün dumanında bulunan kimyasalların dokularda oluşturduğu oksidatif stres sonucunda; hücresel metabolizmada bozukluklar, lipit peroksidasyonu, membran geçirgenliğinde artış, protein ve DNA oksidasyonu meydana gelir. Tütün dumanına maruz kalınması sonucunda, birçok dokunun ve organın zarar gördüğü bilinmektedir. 
Tütün dumanında bulunan ve kan yoluyla vücudun her yerine taşınan toksik maddelerin dokulardaki oksidan - antioksidan sistemler arasındaki dengeyi bozması olasıdır. Bu durumda artan serbest radikaller, doku hasarına yol açacaktır. 
Ellajik asit nar, çilek, böğürtlen, ahududu ve üzüm gibi birçok bitkide bulunan ve dokuları oksidatif hasara karşı koruması ile tanınan polifenolik bir bileşiktir. Ayrıca antikanserojenik, antiapoptotik ve antiinflamatuvar etkileri de bilinmektedir. 
Bu çalışmada tütün dumanının testis dokusunda meydana getireceği oksidatif hasara karşı, güçlü bir antioksidan olan ellajik asidin koruyucu etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır.
Çalışmamızda 8 haftalık ve ortalama 200±10 g ağırlığında 24 adet erişkin Spraque-Dawley cinsi erkek ratlar kullanıldı. Ratlar; grup I (Kontrol),   grup II (Tütün dumanına maruz bırakılan), grup III (Tütün dumanına maruz bırakılan + mısırözü yağı) ve grup IV (Tütün dumanına maruz bırakılan + Ellajik asit) olmak üzere rastgele 4 eşit gruba ayrıldı.
Grup II, grup III ve grup IV' deki ratlar, günde iki defa birer saat tütün dumanına maruz bırakıldı. Grup III' deki ratlara tütün dumanına ilaveten ellajik asidi çözmede kullanılan miktarda mısırözü yağı, grup IV'deki ratlara ise tütün dumanına ilaveten mısırözü yağında çözülmüş ellajik asit 12 mg/kg dozunda gün aşırı oral gavaj yoluyla verildi.
12 haftalık deney süresi sonunda tüm gruplardaki ratlar dekapite edildi. Testis dokuları alınarak rutin histolojik takip serilerinden geçirildi. Elde edilen preparatlar H&E, PAS ve Masson'un üçlü boyası ile boyandı. Ayrıca endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) immünohistokimyasal boyama ve apoptozis için ise TUNEL metodu uygulandı. Kan örnekleri ile biyokimyasal analizler, sperm örnekleri ile de sperm analizleri yapıldı.
Tütün dumanı ve tütün dumanı + mısırözü yağı gruplarındaki ratların ortalama vücut ağırlık değişim yüzdesinde, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir düşüş gözlendi. Tütün dumanı + ellajik asit grubu ile diğer gruplar arasında ise istatistiksel açıdan fark bulunamadı.
Sağ ve sol testis ağırlıkları açısından tütün dumanı + ellajik asit grubunda tütün dumanı grubuna kıyasla istatiksel açıdan anlamlı bir artış gözlendi (p<0,05). Epididimis, prostat bezi ve seminal vezikül ağırlıklarında ise gruplar arası istatistiksel bir farklılık olmadığı tespit edildi.
	Tütün dumanı + ellajik asit grubundaki ratların rölatif testis ağırlıklarında kontrol grubu ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir artış belirlendi. 
Sperm yoğunluğu ve sperm motilitesi değerlerinin gruplar arasındaki farkı istatistiksel açıdan anlamsız bulundu. Tütün dumanı uygulamasının kontrol grubu ile karşılaştırıldığında anormal sperm miktarını anlamlı biçimde arttırdığı tespit edildi. Ellajik asit uygulamasının ise anormal sperm miktarını tütün dumanı grubuna kıyasla ciddi anlamda düşürdüğü tespit edildi. 
Işık mikroskobu altında yapılan histolojik değerlendirmelerde kontrol grubu ile karşılaştırıldığında tütün dumanına maruz bırakılan gruba ait kesitlerde seminifer tübül germinal epitelinde önemli derecede dejenerasyon, seminifer tübülün bazal membranlarında ayrılmalar, vasküler konjesyon, atrofik tübüller, interstisyel alanda ödem, ve bazı tübüllerin lümenlerine dökülmüş immatür hücreler tespit edildi. Tütün dumanı + mısırözü yağı uygulanan gruba ait kesitlerde ise yalnızca tütün dumanına maruz bırakılan grup II ile benzer bulgulara rastlandı.
Tütün dumanı ile birlikte ellajik asit uygulanan grupta ise; testis dokusunda germinal epitel dejenerasyonunda, vasküler konjesyonda, interstisyel ödemde belirgin iyileşme ve seminifer tübül bazal membranlarındaki ayrılmalarda azalma gözlendi.
Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında tütün dumanı ve tütün dumanı + mısırözü yağı gruplarnda TUNEL pozitif hücrelerde anlamlı bir artış vardı. Tütün dumanı + ellajik asit grubunda ise, TUNEL pozitif hücre sayısının kontrol grubu ile benzer olduğu belirlendi.
Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında tütün dumanı ve tütün dumanı + mısırözü yağı gruplarında eNOS immünreaktivitesi açısından anlamlı bir artış tespit edildi. Tütün dumanı + ellajik asit grubunda ise eNOS immünreaktivitesinde azalma tespit edildi.
Malondialdehit (MDA) düzeylerinin kontrol grubuna göre tütün dumanı ve tütün dumanı+ mısırözü yağı gruplarında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde arttığı, ellajik asit uygulamasının ise MDA seviyesini kontrole yakın bir düzeye indirdiği tespit edildi. Katalaz (CAT) ve glutatyon peroksidaz (GSH-Px) enzim aktivitelerinin; kontrol grubuna göre tütün dumanı ve tütün dumanı +  mısırözü yağı gruplarında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde azaldığı bulundu. Tütün dumanı + ellajik asit grubunda ise hem CAT hem de GSH-Px aktivitelerinin tütün dumanı ve tütün dumanı + mısırözü yağı gruplarına kıyasla istatistiksel olarak önemli düzeyde arttığı tespit edildi.
Sonuç olarak yapılan bu deneysel çalışma sonucunda tütün dumanına maruz kalmanın erkek üreme sistemini etkileyerek hasar verdiği tespit edildi. Tütün dumanı maruziyetine karşı koruyucu amaçla kullanılan ellajik asidin ise; antioksidan özelliği sayesinde, tütün dumanının oluşturduğu olumsuz etkileri belirgin biçimde azalttığı gözlendi.

Abstract:
The disorders on cellular metabolism, lipid peroxidation, increase on membrane permeability, protein and DNA oxidation occurs because of the oxidative stress on tissues created by chemicals in tobacco smoke. It is known that exposure to tobacco smoke damages many tissues and organs.
Toxic substances in tobacco smoke which are carried to every part of the body by blood, are likely to disturb the balance between oxidant - antioxidant systems on tissues. In this case, increased free radicals cause tissue damage.
Ellagic acid is a polyphenol compound that found in fruits such as pomegranate, strawberry, blackberry, raspberry and grape. Its known that ellagic acid has protective effects against oxidative damage. Also its anti-cancerogenic, anti-apoptotic and anti-inflammatory effects are known.
In our study, it is aimed to examine the protective effects of ellagic acid, which is a powerful anti-oxidant, against oxidative damage on testis tissue caused by the chemicals in tobacco smoke.
In this study, 8 weeks old and average 200±10 grams weight twenty-four male Spraque-Dawley rats were used. The rats were divided randomly into 4 equal groups: group I (Control), group II (Tobacco smoke), group III (Tobacco smoke + corn oil) and group IV (Tobacco smoke + ellagic acid).
The rats in group II, III and IV were exposed to tobacco smoke 1 hour twice a day. In addition to tobacco smoke exposure, 12 mg/kg and dissolved in corn oil ellagic acid, was applied to the rats in group IV by oral gavage. Equal amount of corn oil used in solving ellagic acid was applied to the rats by oral gavage in group III. 
At the end of the 12 weeks experimental period rats were decapitated. Testicular tissues were removed and processed by using routine parafine techniques. The testis slides were stained by H&E, PAS and Masson's Trichrome methods. Also endothelial nitric oxide synthase (eNOS) immunohistochemical stain and TUNEL methods for apoptosis were applied. Biochemical analyzes on blood samples and sperm analyzes on sperm samples were performed.
A significant decrease of percentage of body weight change was detected in tobacco smoke and tobacco smoke + corn oil groups when compared with control group. There was no significantly difference between tobacco smoke + ellagic acid and the other groups in terms percentage of body weight change.
Right and left testis weights of rats in tobacco smoke + ellagic acid group, significantly increased compared with control group. There was no statistically difference detected in epididymis, prostate and seminal vesicle weights between the groups.
The relative testis weights of rats in tobacco smoke + ellagic acid group were significant increased compared to the control group.
The difference of sperm motility and sperm concentration between the groups wasn't found significant. A significant increase in abnormal sperm amount was detected in tobacco smoke group compared with control group. The reduction in the amount of abnormal sperm was found in tobacco smoke + ellagic acid group compared with tobacco smoke group.
In histological examination with light microscope of rat testis tissues in tobacco smoke group compared with control group; degeneration in seminiferious tubule germinative epitelium, seperation in basement membranes, vascular congestion, atrophic tubules, edema in interstitial area and immature cell debris in tubule lumen were detected. On the other hand, in the rat testis which were experimented tobacco smoke + corn oil,   similiar finding with the tobacco smoke group were detected. 
Significant improvement were observed in germinative epitelium degeneration, seperation of seminiferious tubule basement membranes, vascular congestion and intersititial edema in rat testis tissues of tobacco smoke + ellagic acid group.
In tobacco smoke and tobacco smoke + corn oil groups, a significant increase was detected in TUNEL positive cells number compared to the control group. In tobacco smoke + ellagic acid group, the number of TUNEL positive cells was detected similar to control group.
A significantly increased eNOS immunoreactivity was observed in tobacco smoke and tobacco smoke + corn oil group compared to the control group. On the other hand, eNOS immunoreactivity decreased in tobacco smoke + ellagic acid group.
A significantly increase was detected in the levels of MDA, in tobacco smoke and tobacco smoke + corn oil groups compared with the control group. It was found that ellagic acid administration reduced the MDA levels similar to the control group. CAT and GSH-Px enzyme activities in tobacco smoke and tobacco smoke + corn oil groups were significantly decreased compared to the control group. Also significantly increase in CAT and GSH-Px enzyme activities was detected in tobacco smoke + ellagic acid group compared with the tobacco smoke and tobacco smoke + corn oil groups.  
As a result of this experimental study, it was observed that exposure to tobacco smoke effects negatively the male reproductive system. it was also observed that ellagic acid, which is used as a protector against tobacco smoke exposure, decreases the negative effects of tobacco smoke prominently by means of  its antioxidant property.