Biyoseramik ve biyosinyal moleküllerle desteklenmiş poli(kaprolakton) doku iskeleleri: Sentez, karakterizasyon ve kemik doku mühendisliği uygulamaları
Polycaprolactone scaffolds supported by bioceramics and biosignal molecules: Synthesis, characterization and applications in bone tissue engineering
Yazar: IŞIL GERÇEK BEŞKARDEŞ
Danışman: PROF. DR. MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı / Kimyasal Teknolojiler Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2008
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering ; Polimer Bilim ve Teknolojisi = Polymer Science and Technology
Dizin: Deksametazon = Dexamethasone ; Dondurarak kurutma = Freeze drying ; Polikaprolakton = Polycaprolactone

Özet:
Sunulan tez çalışmasında, kemik doku rejenerasyonunu destekleyecek özelliklere sahip polikaprolakton (PCL)-bazlı doku iskelelerinin üretiminin gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaca yönelik olarak, doku iskelelerinin üretimi ve karakterizasyon çalışmaları yapılmış, ayrıca hücre kültür sistemlerindeki etkinlikleri araştırılmıştır.Tez kapsamındaki çalışmaların ilk aşamasında, %10 ve %20 (w/v) polimer bileşimine sahip 3 boyutlu PCL doku iskeleleri, dondurarak kurutma yöntemiyle hazırlanmıştır. Karakterizasyon çalışmaları kapsamında çekilen taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri, gözenekli doku iskelelerinin kendiliğinden kümelenmiş, nanotopografik yüzey özelliklerine sahip mikrokürelerden oluştuğunu ortaya koymuştur. %10'luk ve %20'lik PCL doku iskelelerindeki mikroküre boyutları, sırasıyla, 50-70 ?m ve 90-100 ?m olarak bulunmuştur. Polimer konsantrasyonunun, doku iskelelerinin gözeneklilik, şişme, hidrofilisite, biyobozunurluk ve mekanik dayanım gibi özelliklerine olan etkisi uygun yöntemler ile belirlenmiştir. Karakterizasyon çalışmalarının sonuçları değerlendirildiğinde, tezin sonraki aşamalarında %20'lik doku iskelesinin kullanılmasına karar verilmiştir.Tez kapsamında kullanılan doku iskelesi üretim yönteminde, ayrı bir mikroküre üretim basamağının olmayışı, dolayısıyla yüzey gerilimini düşüren veya yapıştırıcı olarak kullanılan toksik kimyasallara ihtiyaç duyulmaması, bu çalışmada üretilen doku iskelelerini, literatürdeki benzerlerine göre daha avantajlı kılmıştır.Doku iskelelerinin biyoaktivitelerinin arttırılması için, doku iskeleleri sentetik vücut sıvısı (SBF) konsantrasyonlarının 10 katı iyon içeren SBF benzeri bir kalsiyum fosfat çözeltisi ile farklı sürelerde etkileştirilmiş ve polimer-biyoseramik kompozitleri üretilmiştir. 6 saatlik etkileşim sonucunda apatitik çekirdeklenme noktaları oluşurken, apatitik kalsiyum fosfat yapısına özgü morfolojiye sahip biyoseramik fazı 24 saatte oluşmuştur. X-ışını difraktometresi (XRD) analizi, biyoseramik fazın apatitik kalsiyum fosfattan ve hidroksiapatitten oluştuğunu göstermiştir.%20'lik PCL doku iskelesinin ve kompozit doku iskelelerinin biyoaktivitelerinin belirlenebilmesi için preosteoblast hücre hattı, MC3T3-E1 kullanılmıştır. Hücre üremesi MTT (3-(4,5-dimethylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) analizi ile takip edilmiş, hücre morfolojileri SEM ile görüntülenmiştir. Ayrıca hücre farklılaşması, ALP (alkalen fosfataz) aktivitesinin ve osteokalsin seviyesinin ölçümü ile belirlenmiştir. Sonuçlar, hücrelerin tüm doku iskelelerine yapışıp, yayıldıklarını bununla birlikte kültürün ilerleyen günlerinde, kalsiyum fosfat çözeltisi ile etkileşen doku iskelelerindeki üreme hızının, biyoseramik fazın farklılaşmayı desteklemesi nedeniyle düştüğünü göstermiştir.Tez kapsamında gerçekleştirilen bir diğer çalışma ise doku iskelelerine üretim aşamasında dekzametazon yüklenmesidir. Dekzametazonun yapı içindeki dağılımının belirlenmesi ve in vitro salım deneyleri için doku iskelelerine floresan işaretli dekzametazon yüklenmiştir. Floresan mikroskop ile homojen bir dağılım gözlemlenmiştir. Artan dekzametazon miktarı ile salım süresi uzamıştır. Dekzametazon, doku iskelelerinin bazı fiziksel özelliklerini değiştirdiği için, örnek hazırlamada çeşitli problemler ile karşılaşılmıştır. Buna bağlı olarak hücre kültür çalışmaları başarısızlıkla sonuçlanmıştır.Elde edilen sonuçlar değerlendirilerek, tez kapsamında hazırlanan doku iskelelerinin kemik doku mühendisliği uygulamalarına yönelik olarak geliştirilebilmeleri için önerilerde bulunulmuştur.

Abstract:
The aim of the present study was to fabricate polycaprolactone (PCL)-based scaffolds for bone tissue regeneration. For this purpose, fabrication and characterization of PCL-based scaffolds were done, also their bone bioactivities were investigated by cell culture studies.In the first part of the study, 3 dimensional PCL scaffolds with 10% and 20% (w/v) polymer composition were prepared by freeze drying technique. Scanning electron microscopy (SEM) views demonstrated that, porous scaffolds were composed of agglomerated microspheres which have nanotopographic surface morphology. The diameters of microspheres within 10% and 20% PCL scaffolds were found to be 50-70 ?m and 90-100 ?m, respectively. The effect of polymer composition on physical properties of scaffolds, such as porosity, swelling, hydrophilicity, biodegradation and mechanical strength, was determined by suitable characterization methods. After evaluation of characterization results, PCL scaffold with 20% polymer composition was selected to be used in the following part of the study.Since there is no need for an extra microsphere production step or any toxic chemicals such as surfactants and binders, the scaffolds fabricated in this study were thought to be more advantageous when compared to the other scaffolds with similar structures.In order to enhance the bioactivity of PCL scaffolds, polymer-bioceramic composites were prepared by the immersion of scaffolds in a calcium phosphate solution, which has 10 times of ion concentrations of simulated body fluid (SBF), for different time periods. After 6 hour immersion, apatitic nucleation sites were formed while 24 hour immersion led the formation of characteristic cauliflower morphology of apatitic calcium phosphate on the surface of 20% PCL scaffolds. X-ray diffraction (XRD) analysis showed that bioceramic phase was composed of apatitic calcium phosphate and hydroxyapatite.The bioactivity of PCL scaffolds and composites were investigated by cell culture studies which were carried out with a preosteoblastic cell line, MC3T3-E1. Cell viability and proliferation were analyzed by MTT (3-(4,5-dimethylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay and morphological examination was done with SEM. Also cell differentiation was quantified by detemination of alkaline phosphatase (ALP) activities and osteocalcine levels within the scaffolds. Results demonstrated that cells attached and spread on each scaffold type, however cell proliferation rate in the composite scaffolds started to decrease because of the presence of bioceramic phase which supports osteoblastic differentiation.Another approach used for the enhancement of bioactivity was dexamethasone loading to the scaffolds in the fabrication step. In order to determine the distribution and in vitro release of dexamethasone, fluorescent labled dexamethasone and fluorescence microscope was used. Microscopic views showed that dexamethasone was homogeneously distributed within the PCL scaffolds and dexamethasone release rate decreases with the increasing drug amount. Since the presence of dexamethasone caused some changes in the physical properties of scaffolds, the problems related to sample preparation procedures were arised. Cell culture studies were thought to be failed because of those difficulties occured in sample preparation.After the evaluation and discussion of the results obtained from the characterization and cell culture studies, some proposals were given in order to improve the scaffolds preapared in this study, for bone tissue engineering applications.