Pycnoporus sanguineus kaynaklı rekombinant lakkaz PSLCC2 kullanımı ile tekstil boyalarında renk giderimi
Decolorization of textile dyes using recombinant laccase PSLCC2 from Pycnoporus sanguineus
Yazar: KORAY MALCI
Danışman: PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: DNA-rekombinant = DNA-recombinant ; Mikrobiyal enzimler = Microbial enzymes

Özet:
Endüstriyel enzimler günümüzde pek çok sektörde yaygın şekilde kullanılan biyolojik katalizörlerdir. Gıda ve içecek endüstrisi, tekstil sektörü, deterjan ve kimya endüstrisi, deri sanayi, kozmetik ve medikal ürün sektörlerinde enzimler yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Rekombinant DNA teknolojisinin keşfi ve genetik biliminin ilerlemesiyle enzimlerin, endüstriyel ölçekte üretilmesinin önü açılmış ve oldukça geniş skalada enzim üretimi mümkün hale gelmiştir.
Lakkaz enzimi (EC 1.10.3.2) oksidoredüktaz sınıfına dahil bir enzim çeşididir. Sahip olduğu bazı özelliklerden dolayı günümüzde pekçok sektörlde kullanılmaktadır. Lakkaz üreten çeşitli türlerin var olması farklı fonksiyonlara sahip lakkazların var olmasına ve substrat çeşitliliğinin geniş olmasına sebep olmuştur. Ayrıca bu nedenden ötürü optimum sıcaklık ve pH koşulları da oldukça çeşitlilik göstermektedir. Lakkazın substrat çeşitliliğini ve aktivitesini arttıran mediatörler ile birlikte kullanılabilir oluşu lakkazın performansını arttıran bir diğer husustur. Lakkazların en yaygın kullanıldığı alanlar tekstil, kağıt, gıda ve boya sektörleridir. Ayrıca bazı çevreye zararlı ve toksik özellik gösteren kirleticilerin biyoremediasyonunda da kullanıldığı bilinmektedir.
Yapılan bu çalışmada Pycnoporus sanguineus kaynaklı rekombinant lakkaz PsLcc2 enziminin boya giderim kapasitesi araştırılmıştır. Ayrıca dekolorizasyona uğrayan boyalar üzerinde toksisite analizleri yapılmıştır. Lakkaz enzimi kodlayan Pycnoporus sanguineus MUCL 38531 suşuna aitPslcc2 geni, endüstriyel üretim için oldukça elverişli bir maya türü olan Pichia pastoris'te aktarılarak heterolok enzim üretimi gerçekleştirilmiştir. P. pastoris konakçısında üretilen rekombinant lakkaz PsLcc2 enzimi ile renk giderimi çalışmaları gerçekleştirilmiştir.
Renk giderimi (dekolorizasyon) çalışmalarında Azo ve Triarilmetan sınıfı boya grubuna ait)7 farklı boya kullanılmıştır. Dekolorizasyon çalışmalarında lakkaz enzimi tek başına kullanıldığı gibi üç farklı mediatörle birlikte lakkaz-mediatör sistemi kurularak da çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Bu kapsamda sentetik mediatör olarak ABTS (2,2'-azin-bis 3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit), doğal mediatörler olarak da sringaldehit ve p-kumarik asit kullanılmıştır. Renk giderim çalışmalarının analizleri spektrofotometrik yöntemle gerçekleştirilmiş olup ardından Ames testi kullanılarak mutajenik aktivite analizleri gerçekleştirilmiştir.
Çalışmanın sonucunda rekombinant lakkaz Pslcc2 enzimi ile beraber kullanılan mediatörlerin söz konusu yedi boya üzerindeki renk giderim verimini bir hayli arttırdığı tespit edilmiştir. Ayrıca boya çeşidine göre her mediatörün farklı etki gösterdiği, kullanım amacına ve kullanım alanına göre spesifik lakkaz-mediatör sistemlerinin oluşturulması gerektiği tespit edilmiştir. Yapılan mutajenik aktivite analizleri sonucunda rekombinant lakkaz Pslcc2-mediatör sistemi tarafından dekolorizasyona uğrayan boyaların herhangi bir mutajenik etki göstermediği gösterilmiştir. Kısaca, uygun mediatör varlığında rekombinant lakkaz PsLcc2 enziminin, mutajenik bir ara ürün oluşturmadan, Azo grubu ve Triarilmetan grubu tekstil boyalarını renk giderimindebaşarı ile kullanılabilecek güvenli kuvvetli bir lakkaz olduğu anlaşılmıştır.

Abstract:
Enzymes as biological catalysts are widely used in many industries ranging from processes in the food and beverage industries, the textile industry, the detergent and chemical industries, the leather industry, the cosmetic and medical industries.The discovery of recombinant DNA technology and the advancement of genetic engineering have opened the way for the production of enzymes on an industrial scale and it has become possible to produce enzymes on a very large scale.
Laccases(EC 1.10.3.2) are multioxidoreductases belonging to the multicopper containing oxidasess. The presence of various types of laccase-producing species has led to the existence of laccases with the different functions and the widespread substrate diversity. Also due to this reason their optimum temperature and pH conditions are quite variable. The use of the laccases with mediators that increase their substrate diversity and activity is another aspect that increase the potential use of laccases in various industrial and biotechnological applications. Preferably, laccases are promisingly used for bioremediation of the pollutants which are harmful and toxic to some environment
In this study a laccase gene Pslcc2 isolated from the white-rot fungus Pycnoporus sanguineus MUCL 38531 has been expressed in the Pichia pastoris which is a yeast strain that is very suitable for heterologues protein productions. The decolorization potential of the resultant recombinant laccase was then investigated for synthetic textile dyes. Seven chemically different dyes classified as Azo and triarylmethane dyes were tested in the decolorization studies. Its decolorization efficiencies were analysed in the presence of three different mediators.. ABTS (2,2'-azine-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) was used as a synthetic mediator and syringaldehyde and p-coumaric acid were used as natural mediators. Mutagenicity of these dyes before and after laccase treatment were also investigated by employing Ames test.
As results, it was found that mediators significantly increase the decolorization efficiency of recombinant laccase PsLcc2.Furthermore, in addition to the decolorization of these textile dyes, no mutagenicity was observed after the recombinant PsLcc2 laccase treatment. Briefly, the recombinant laccase PsLcc2 is a promising candidate for decolorization and detoxification of Azo and Triarylmethane dyes.