Havayolu modellemesi amaçlı tasarlanan mühendislik ürünü 3B hücre kültür sistemlerinin geliştirilmesi
Development of engineering product 3D cell culture systems designed for airway modelling
Yazar: SEMA TUNCER
Danışman: PROF. DR. İBRAHİM ÇAĞATAY KARAASLAN
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2022
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering
Dizin: Biyobozunurluk = Biodegradability ; Hava yolları = Airlines ; Hücre kültürü = Cell culture ; Membranlar = Membranes

Özet:
Kronik hava yolu hastalıkları çevresel ve genetik faktörlerin rol oynadığı bir dizi karmaşık mekanizmaya sahiptir. Bu hastalıkların moleküler patolojilerinin çalışılması ve kritik cerrahi ameliyatlar sonrasında ihtiyaç duyulan doku nakli için in vivo ortamı taklit eden uygun hücresel model sistemlerin kurulması oldukça önemlidir.

Literatürde havayolunu modellemek için çeşitli hücresel in vitro model sistemler oluşturulmuştur. Havayolu hücre kültürleri için kullanılan in vitro modeller arasında en yaygın yöntemlerden biri hava-sıvı arayüzü (Air Liquid Interface -ALI-) kültür sistemi ve bu sistemde kullanılan transwell-insert membran yapılarıdır. Ancak halihazırdaki ALI-kültür uygulamalarında transwell membranların her iki yüzüne de ekim yapabilecek pratik bir sistem tasarımı bulunmadığı için hücre-hücre etkileşimi incelenirken ALI kültür sisteminin iki yüzü etkin kullanılamamaktadır. Ticari olarak günümüzde satılan sistemlerin 3 boyutlu (3B) hücre ko-kültür sistemlerine yatkınlığı da son derece kısıtlıdır.

Çalışmanın ilk basamağında; halihazırda ALI kültür sistemlerde kullanılan transwellerin kullanımı daha efektif hale getirilerek modifiye edilmiş ve bu amaçla transwell adaptörler 3B yazıcıdan çıkartılmış, sızıntı denemeleri gerçekleştirilmiş ve ALI sistemine uyarlanarak epitel-fibroblast ko-kültürleri yapılmıştır. Ko-kültür modeller üzerinde immünositokimya ve gerçek zamanlı PZR çalışmaları gerçekleştirilmiş ve modellerin etkinliği doğrulanmıştır. Denemelerin sonucunda 3B ko-kültür sistemine dönüşümünü sağlayan yeni bir ürün geliştirilmiştir. 

Çalışmanın ikinci kısmında epitel doku greft gelişimine uygun transwell yapısında kullanılmak üzere biyobozunur membranlar geliştirilmiştir. Bu amaçla poli (L-laktik asit) (PL24, Corbion, intrinsik viskozite=1.5-2.0 dL/g) ve poli(e-kaprolakton) (PCL12, Corbion, intrinsik viskozite=1.0-1.3 dL/g polimerleri kullanılarak elektroeğirme yöntemiyle örgüsüz nanofiber ağ yapısında membranlar sentezlenmiştir. Optimizasyon ve karakterizasyon çalışmaları yapıldıktan sonra uygun bulunan membranlar 3B ALI-kültür sistemine entegre edilerek hücre kültür sistemlerinde değerlendirilmiştir. Geliştirilen biyobozunur özellikteki membranın, fizyolojik ortamda doğal olarak oluşan bariyer yapısı gibi sürdürülebilir özellikte olduğu ve havayolu modellemesi için ALI-kültür sistemlerinde kullanımının uygun olduğu sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Chronic airway diseases have a complex set of mechanisms in which environmental and genetic factors play a role. It is very important to study the molecular pathologies of these diseases and to establish suitable cellular model systems that mimic the in vivo environment for tissue transplantation needed after critical surgical operations.

Various cellular in vitro model systems have been created in the literature to model the airway. The most prevalent in vitro model for airway cell cultures is the air-liquid interface (ALI)-culture system, which uses transwell-insert membrane structures. However, in current ALI cell culture applications, since there is no practical system design that can seed both sides of transwell membranes, the ALI culture system can not sufficient when examining cell-cell interaction. The tendency of commercially available systems to 3D cell culture systems is also extremely limited.

In the first step of the thesis; the use of transwells currently used in ALI culture systems has been modified by making them more effective and for this purpose, transwell adapters have been printed from a 3D printer, leak tests have been carried out and epithelial-fibroblast co-cultures have been made by adapting them to the ALI system. Immunocytochemistry and real-time PCR studies were performed on co-culture models and the effectiveness of the models was verified. As a result of the trials, a new product has been developed that transforms it into a 3D co-culture system.

In the second part of the study, biodegradable membranes were produced for epithelial tissue graft formation and application in transwell inserts. For this purpose, nonwoven nanofiber mesh membranes were synthesized by electrospinning method using the polymers poly (L-lactic acid) (PL24, Corbion, intrinsic viscosity=1.5-2.0 dL/g) and poly(e-caprolactone) (PCL12, Corbion, intrinsic viscosity=1.0-1.3 dL/g). After the optimization and characterization studies were carried out, the suitable membranes were integrated into the 3D ALI culture-system and evaluated in cell culture systems. The constructed biodegradable membrane was shown to be sustainable, similar to the barrier structure seen in the physiological environment, and acceptable for application in ALI-culture systems for airway modeling.