Rekombinant TNFα proteini ve antikoru aracılığıyla ELİSA kit üretimi
ELİSA kit production through recombinant TNFα protein and antibody
Yazar: GÜLŞAH AKÇADAĞ
Danışman: PROF. DR. EMİNE SÜMER ARAS ; PROF. DR. DEMET CANSARAN DUMAN
Ankara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Adalimumab = Adalimumab ; Antikorlar = Antibodies ; ELISA =   ; Etanersept = Etanercept ; İnfliximab = Infliximab

Özet:
Bu çalışmanın amacı, çeşitli anti-TNFα inhibitörleriyle etkileşime girebilecek aktif formdaki TNFα proteinini klonlamak, eksprese etmek ve saflaştırmaktır. Ayrıca elde edilen TNFα proteine karşı antikor geliştirilmesi ve elde edilen ürünlerle yerli ELISA sistemi oluşturmak hedeflenmiştir. E. coli'ye TNFα (1-233 aa), SUMO etiketli TNFα (1-233 aa) ve sTNFα (77-233 aa) olmak üzere üç gen dizisi klonlanmıştır. Koloni PCR protokolü ile doğrulama yapılmış, üretilen proteinler SDS-PAGE ve western blot ile analiz edilmiştir. sTNFα, boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırılmıştır. ELISA teknikleri, sTNFα'nın bağlanma verimliliğini analiz etmek için kullanılmıştır. Elde edilen sTNFα proteiniyle tavşanlara immünizasyon yapılmış ve yüksek antikor yanıtı elde edilmiştir. Antikorlar amonyum sülfat çöktürmesi ve ultrafiltrasyonla kısmi olarak saflaştırılmıştır. Doğal koşullarda (25°C) sTNFα ve ticari anti-TNFα antikoru arasındaki etkileşim, pozitif kontrole göre 3,970 µg/mL olarak ölçülmüştür. Denatüre edici koşullarda (37°C) bu etkileşim 0,587 µg/mL iken TNFα ve anti-TNFα antikoru için 0,535 µg/mL ve 0.533 µg/mL olarak belirlenmiştir. sTNFα'nın F7 fraksiyonu (920 µg/mL), adalimumab, etanercept ve infliksimab ile ticari TNFα'ya kıyasla aynı veya daha yüksek bağlanma verimliliği göstermiştir.

Bu çalışma, rekombinant üretimi ve saflaştırılması gerçekleştirilmiş sTNFα proteininin üç ana TNFα inhibitörüne (adalimumab, etanersept ve infliksimab) karşı bağlanma verimliliğini analiz eden ilk çalışmadır. Ek olarak aktif formda sTNFα'nın rekombinant üretimi, maliyete etkin bir çözüm sağlamakta ve dışa bağımlılığı azaltmaktadır.

Abstract:
This study aims to clone, express, and purify active TNFα protein capable of interacting efficiently with various anti-TNFα inhibitors. Additionally, it seeks to develop antibodies against TNFα and establish a homemade ELISA system. TNFα (1-233 aa), SUMO-tagged TNFα (1-233 aa), and sTNFα (77-233 aa) were cloned into E. coli. Validation was done using colony PCR, and proteins were analyzed by SDS-PAGE and western blot. sTNFα was purified through size exclusion chromatography. ELISA techniques analyzed the binding efficiency of sTNFα with three different standards. Immunization of rabbits with purified sTNFα resulted in a high antibody response. Antibodies were partially purified using ammonium sulfate precipitation and ultrafiltration. The interaction between sTNFα and commercial anti-TNFα antibody under natural conditions (25°C) was measured as 3.970 µg/mL compared to the positive control. Under denaturing conditions (37°C), this interaction was 0.587 µg/mL, while for TNFα and anti-TNFα antibody, it was 0.535 µg/mL and 0.533 µg/mL. The F7 fraction of sTNFα (920 µg/mL) showed equal or higher binding efficiency compared to commercial TNFα with adalimumab, etanercept, and infliximab. 

This is the first study to analyze the binding efficiency of recombinant, purified, active, and soluble sTNFα against the three main TNFα inhibitors (adalimumab, etanercept, and infliximab) in a single study. Additionally, homemade recombinant production of active sTNFα provides a cost-effective solution and reduces dependence on external sources.