İn-Vitro kan beyin bariyeri modelinde farklı fraksiyondozlarında radyasyonun moleküler bariyer geçirgenliğineetkisinin araştırılması
Investigation of the impact of radiation at different fractionation doses on molecular barrier permeability in an In-Vitro blood brain barrier model
Yazar: MELTEM ÖZTÜRK İYİLİKCİ
Danışman: PROF. DR. EMİNE SERRA KAMER
Ege Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Radyasyon Onkolojisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2024
Konu: Radyasyon Onkolojisi = Radiation Oncology
Dizin: Kan beyin bariyeri = Blood brain barrier

Özet:
Amaç: Günümüzde beyin kanserleri ve metastazları önde gelen ölüm nedenleri arasında yer
almaktadır. Cerrahi, kemoterapi ve radyoterapi gibi pek çok tedavi yaklaşımına rağmen, bu
hastaların sağ kalım sürelerinin uzatılmasında anlamlı başarı elde edilememiştir. Kanserin
biyolojik olarak tedavi edilmesinde kullanılan ilaçlardan elde edilen verim kan beyin bariyeri
(KBB) nedeniyle terapötik ajanların tümöre ulaşması engellendiğinden çok düşüktür.
Amacımız farklı fraksiyon dozlarında radyoterapi ile KBB geçirgenliğindeki geçişin değişimini
değerlendirmek ve bu bozulmuş işleyişinden yararlanabilecek tedavi stratejilerine zemin
hazırlamaktır.
Gereç-Yöntem: İn vitro KBB modeli için gözenekli membran ile ayrılmış insert ve 24
kuyucuklu plakaya hücrelerin ekimi ile yapıldı. Ekim için insan göbek damarı endotel hücreleri
(HUVEC) ve insan astrosit hücreleri (NHA) kullanıldı. Oluşturulan modelin doğruluğu
transendotelyal elektriksel direnç (TEER) ölçümü ile doğrulandı. TEER ölçümü için Fizik
bölümü tarafından geliştirilen cihaz kullanıldı. Radyoterapi; tek fraksiyon ,2, 4, 6, 8, 16 ve 25
Gy dozlarda uygulandı. İyonize radyasyon uygulaması sonrası hücreler TEER cihazı ile her iki
saatte bir ölçüm alınacak şekilde 72 saatlik inkübasyona alındı. Ayrıca membran geçirgenliğine
göre değişebilecek ilaç doz etkinliğinin değerlendirilebilmesi için insertin yerleştirildiği yirmi
dört kuyucuklu plakanın zeminine glioblastom (GBM) hücre hatları ekildi. Işınlanan KBB
modeline iki farklı ilaç uygulandı. ELISA yöntemi ile membran geçirgenliğinin belirlenmesi,
MTT proliferasyon testi ve hücre yara iyileştirme testi kullanıldı.
Bulgular: Işınlama sonrası tüm doz gruplarında kontrol grubu ile kıyaslandığında TEER
değerlerinde anlamlı düşüş saptandı (p<0.001). Fraksiyon dozları kendi içinde
değerlendirildiğinde anlamlı bir fark saptanmadı (p=0.639). Dozdan bağımsız düşüş en belirgin
2.-6. saatler arasında gerçekleşti. Direnç düşüş ivmesindeki değişimin dozla doğru orantılı
olarak arttığı kaydedildi. Işınlama sonrası zemine ekilen GBM hücre hatlarının
proliferasyonunu değerlendirebilmek için uygulanan temozolomidin (TMZ) GBM hücrelerinin
proliferasyonları üzerinde etkili olduğu ve etkin geçiş için en düşük dozun 4 Gy olduğu
gözlendi. Repopulasyon ve onarım kapasitesinin göstergesi olarak yapılan hücre yara
iyileştirme deneyinde de düşük fraksiyon dozlarında ışınlama sonrası TMZ uygulanan
gruplarda erken saatlerde köprüleşme başlarken yüksek fraksiyon dozlarında 72 saatin sonunda
yarada kapanma olmadığı görüldü. TMZ'ye kıyasla 750 kat daha büyük olan Trastuzumab
(TRAS) uygulaması sonrası yapılan ELISA ölçüm sonuçları değerlendirildiğinde 2, 4 ve 6 Gy
uygulanan dozlarda 500 ng/ml altında TRAS düzeyine rastlandı. Sekiz, 16 ve 25 Gy uygulanan
dozlarda ise 1500 ng/ml TRAS seviyesi ölçüldü.
Sonuç: Çalışmamız, farklı dozlarda iyonize radyasyon ile kemoterapi birleştirildiğinde tedavi
edici ajanların tümöre erişimini artırabileceğini ortaya koymakta ve bu ilişkinin zamanla olan
bağlantısını değerlendirmektedir. KBB'den geçişin moleküler ağırlıkla ilişkili olduğu,
fraksiyon dozundaki artışla orantılı olarak daha büyük maddelerin geçişinin arttırılabileceğini
göstermektedir. Çalışmamız; stereotaktik tedaviler, profilaktik beyin ışınlaması ve ilaç
kombinasyonlarının birlikte kullanımıyla intrakranial tümörlerin ve metastazların yönetiminde
farklı bir bakış açısı gerekliliğini ortaya koymaktadır.

Abstract:
Purpose and Objective: Currently, brain cancers and metastases are among the leading causes
of death. Despite many treatment approaches, such as surgery, chemotherapy, and radiotherapy,
no significant success has been achieved in prolonging the survival of these patients. The yield
obtained from the drugs used in the biological treatment of cancer is very low because the
blood-brain barrier (BBB) prevents the therapeutic agents from reaching the tumor. Our aim is
to evaluate the changes in the permeability of the BBB with different fraction doses of
radiotherapy and to prepare the groundwork for treatment strategies that may benefit from this
impaired functioning.
Materials/Methods: For the in vitro BBB model, cells were seeded in a 24-well plate with a
porous membrane-separated insert. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and
human astrocyte cells (NHA) were used for seeding. The accuracy of the model was verified
by transendothelial electrical resistance (TEER) measurement. For TEER measurement, our
own device, which was verified and calibrated in accordance with the literature, was used.
Irradiation doses of 2, 4, 6, 8, 16, and 25 Gy were selected for radiation application. After
ionizing radiation, the cells were incubated for 72 hours with the TEER device in such a way
that measurements were taken every two hours. In addition, glioblastoma (GBM) cell lines were
seeded on the bottom of the twenty-four-well plate, where the insert was placed, in order to
evaluate the drug dose efficiency, which may vary according to membrane permeability. Two
different drugs were applied to the irradiated BBB model. Determination of membrane
permeability by ELISA, MTT proliferation assay, and cell wound healing assay were used.
Results: There was a significant decrease in TEER values in all dose groups after irradiation
compared to the control group (p<0.001). However, no significant difference was found when
fraction doses were evaluated within themselves (p = 0.639). The most significant dose-
independent decrease occurred between the 2nd and 6th hours. It was noted that the change in
resistance decline acceleration increased in direct proportion to the dose. Temozolomide
(TMZ), which was applied to evaluate the proliferation of GBM cell lines seeded on the ground
after irradiation, was effective on the proliferation of GBM cells, and the lowest dose for
effective passage was 4 Gy. In the cell wound healing experiment performed as an indicator of
repopulation and repair capacity, it was observed that while bridging started in the early hours
in the TMZ-treated groups after irradiation at low fraction doses, there was no wound closure
at the end of 72 hours at high fraction doses. When the results of ELISA measurements
performed after the administration of Trastuzumab (TRAS), which is 750 times larger than
TMZ, were evaluated, TRAS levels below 500 ng/ml were found at doses of 2, 4, and 6 Gy. In
doses of 8, 16, and 25 Gy, a TRAS level of 1500 ng/ml was measured.
Conclusion: Our study demonstrates that combining different doses of ionizing radiation with
chemotherapy may increase the access of therapeutic agents to the tumor and evaluates the
relationship with time. In addition, it shows that passage through the BBB is related to
molecular weight and that the passage of larger substances can be increased in proportion to
the increase in fraction dose. Based on our study, the combination of stereotactic treatments,
prophylactic brain irradiation, and drug combinations offers a new perspective in the treatment
of intracranial tumors.