Uzun kodlamayan RNA HIF1A-as2'nin küçük hücreli akciğer kanserinde otofaji ile ilişkili kemoterapötik dirençteki etkinliğinin araştırılması
Investigation of the efficiency of long-noncoding RNA hif1a-AS2 on drugresistance associated with autophagy in small cell lung cancer
Yazar: EBRU GÜÇLÜ
Danışman: PROF. DR. HASİBE VURAL
Necmettin Erbakan Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2020
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Akciğer neoplazmları = Lung neoplasms ; HIF-1a = HIF-1a ; Karsinoma-küçük hücreli olmayan-akciğer = Carcinoma-non small cell-lung ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Otofaji = Autophagy ; Otofaji = Autophagy ; RNA = RNA ; RNA-antisense = RNA-antisense ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-neoplazm = Drug resistance-neoplasm

Özet:
Küçük hücreli-dışı akciğer kanseri (KHDAK) ve küçük hücreli akciğer kanseri (KHAK)
olmak üzere histolojik olarak iki sınıfa ayrılan akciğer kanseri, tüm dünyada kansere bağlı ölümlerin
en yaygın sebeplerinden biridir. KHAK; kemoterapötik ajanlara karşı direncin gözlendiği en agresif
akciğer kanseri türüdür. İlaç direnci, temel mekanizmaların yanı sıra kodlamayan RNA profili,
hipoksi ve otofaji gibi faktörlerle de ilişkilendirilen bir süreçtir. Bu tez çalışmasında hipoksi ile
indüklendiği bilinen bir lncRNA olan HIF1A-AS2'nin KHAK hücrelerinde otofaji üzerinden
kemoterapötik dirençteki olası etkisinin araştırılması amaçlanmıştır.
Doksorubisine duyarlı H69 ve doksorubisine dirençli H69AR KHAK hücrelerinde HIF1AAS2
ifadesi siRNA yöntemi ile susturulmuştur. Ardından, normoksik ve CoCl2 ile indüklenen
hipoksik ortamdaki hücrelerde doksorubisin duyarlılığını belirlemeye yönelik sitotoksisite ve apoptoz
analizleri gerçekleştirilmiştir. HIF1A-AS2'nin susturulmasının doksorubisin varlığında ve
yokluğunda otofaji üzerine etkisi otofaji analizi ile değerlendirilmiştir. HIF1A-AS2'nin
susturulmasının normoksik ve hipoksik ortamda ilaç direnci ve otofaji ile ilişkili genlerin ekspresyon
seviyeleri üzerine etkisi qPZR analizi ile belirlenmiş; MRP1, HIF-1α ve Beclin-1 proteinlerinin
seviyeleri western blot yöntemi ile analiz edilmiştir.
Elde edilen sonuçlara göre; kontrol grupları ile karşılaştırıldığında H69 ve H69AR
hücrelerinde HIF1A-AS2'nin susturulması, normoksik ve hipoksik ortamda doksorubisinin IC50
değerlerini azaltmış, doksorubisine bağlı apoptozu artırmıştır. Ayrıca, doksorubisin varlığında ve
yokluğunda HIF1A-AS2'nin susturulması normoksik ve hipoksik ortamda otofajinin azalması ile
sonuçlanmıştır. qPZR analizi sonuçlarına göre; HIF1A-AS2'nin susturulması, normoksik ve hipoksik
ortamda her iki hücre hattında da ilaç duyarlılığını artıracak ve otofajiyi inhibe edecek şekilde çok
sayıda genin ekspresyonunu etkilemiştir. Western blot analizi sonuçlarına göre, HIF1A-AS2'nin
susturulması ile normoksik ve hipoksik ortamda her iki hücre hattında da HIF-1α ve Beclin-1
proteinlerinin seviyeleri azalmıştır. H69AR hücrelerinde MRP1 protein seviyesinde de azalma tespit
edilmiştir. Ayrıca, hipoksik ortam H69 hücrelerinin ilaç duyarlılığını azaltmıştır, HIF1A-AS2'nin
susturulması ile hipoksinin bu etkisi baskılanmıştır. H69AR hücrelerinde ise hipoksinin ilaç direncini
daha da artırıcı bir etkisi tespit edilmemiştir.
Sonuç olarak, KHAK hücrelerinde HIF-1α'yı pozitif yönde düzenlediği ve hipoksi ile
indüklendiği belirlenen HIF1A-AS2 lncRNA'nın susturulması, KHAK hücrelerinin ilaç duyarlılığını
otofaji ile ilişkili olarak artırmıştır. Dolayısıyla, bu hücrelerde ilaç duyarlılığında hipoksi-HIF1AAS2-
otofaji etkileşiminin belirleyici olduğu düşünülmektedir.
Anahtar Kelimeler: HIF1A-AS2, İlaç direnci, Otofaji.

Abstract:
Lung cancer, which is histologically divided into two classes as non-small cell lung cancer
(NSCLC) and small cell lung cancer (SCLC), is one of the most common causes of cancer-related
deaths in worldwide. SCLC, where resistance against chemotherapeutic agents is observed, is the
most aggressive type of lung cancer. Drug resistance is a process associated with factors such as noncoding
RNA profile, hypoxia and autophagy as well as basic mechanisms. In this thesis, it is aimed to
investigate the possible effect of HIF1A-AS2, a lncRNA known to be induced by hypoxia, on drug
resistance associated with autophagy in SCLC cells.
The expression of HIF1A-AS2 was silenced by siRNA method in doxorubicin sensitive H69
and doxorubicin resistant H69AR cells. Then, cytotoxicity and apoptosis analyzes were carried out to
determine the doxorubicin sensitivity of the cells in the normoxic and CoCl2-induced hypoxic
environment. The effect of silencing of HIF1A-AS2 on autophagy in the presence and absence of
doxorubicin was evaluated by autophagy analysis. The effect of silencing of HIF1A-AS2 on the
expression levels of genes, which are associated with drug resistance and autophagy, in the normoxic
and hypoxic environment was determinated by qPCR analysis, the levels of MRP1, HIF-1α and
Beclin-1 proteins were analysed by western blot method.
According to the results; when compared to control groups, the silencing of HIF1A-AS2 in
H69 and H69AR cells decreased IC50 values of doxorubicin and increased doxorubicin-related
apoptosis in normoxic and hypoxic environment. In addition, the silencing of HIF1A-AS2 in the
presence and absence of doxorubicin resulted in the reduction of autophagy in the normoxic and
hypoxic environment. According to the results of qPCR analysis, the silencing of HIF1A-AS2 in
normoxic and hypoxic environment has affected the expression of many genes that will increase drug
sensitivity and inhibit autophagy in both cell lines. According to results of western blot analysis, the
levels of HIF-1α and Beclin-1 proteins decreased in both cell lines in the normoxic and hypoxic
environment by silencing of HIF1A-AS2. And, a decrease was also detected in level of MRP1 protein
in H69AR cells. In addition, the hypoxic environment reduced drug sensitivity of H69 cells, this
effect of hypoxia was suppressed by silencing of HIF1A-AS2. In the H69AR cells, hypoxia did not
increase the drug resistance.
As a result, the silencing of HIF1A-AS2, which was determined to positively regulate HIF-
1α and was induced by hypoxia in SCLC cells, increased drug sensitivity of cancer cells in relation to
autophagy. Therefore, hypoxia-HIF1A-AS2-autophagy interaction is thought to be determinative in
drug sensitivity of these cells.
Keywords: Autophagy, Drug resistance, HIF1A-AS2.