İnterpolasyon fleplerinde neovaskülarizasyonu hızlandırmak için rat adipoz doku kökenli mezenkimal kök hücre kullanılması
Use of rat adipose-derived mesenchymal stem cell to accelerate the neovascularization of interpolation flap in a rat model
Yazar: HAKKI HAYRETTİN İZMİRLİ
Danışman: DOÇ. DR. M. ŞAHİN ALAGÖZ
Kocaeli Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2011
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Cerrahi = Surgery ; Cerrahi flepler = Surgical flaps ; Deri = Skin ; Deri nakli = Skin transplantation ; Kök hücreler = Stem cells ; Neovaskülarizasyon = Neovascularization ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Plastik cerrahide geniş ve derin defektlerin kapatılması için interpolasyon cilt flepleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Fakat fleplerin pedikül ayrılması için 2?3 hafta beklenmesi hala ciddi bir problem olup tedavi ve hastanede kalma süresini ve dolayısıyla hastane masraflarını artırmaktadır. Bu sorunu çözmek amacıyla, kök hücrelerin anjiogenik potansiyelinden yola çıkarak bunların selektif olarak neovaskülarizasyonu hızlandırıp interpolasyon cilt fleplerinin viabilitesini arttırması ve erken dönemde pedikül ayrılmasını amaçladık.YÖNTEM-GEREÇLER: Planladığımız çalışmada gruplar oluşturulurken pedikülün en erken kaçıncı gün ayrılabileceğinin ve alıcı yataktan flebimizin bu süre içersinde ne kadarının beslenebileceğinin tespiti amaçlanmış ve ortaya iki ana grup ve dörder alt grupluk bir çalışma protokolü çıkarılmıştır. Her sıçanın sırtından 1 adet 6x5 cm boyutlarında, derinin tüm katmanlarını ve pannikulus karnozusu da içeren flep, dorsal santral arter ve ven tabanlı olarak kaldırıldı. Deney grubuna (n=16) ait her flebe green fluorescent protein (GFP) işaretli 3x106 yağ doku kökenli mezenkimal kök hücre (YD-MKH) içeren toplam 1ml'lik süspansiyon; flep distaline cilt altı planda 2 noktada; alıcı yatakta ve yara kenarlarına 4 noktada diffüz olarak enjekte edildi. Kontrol grubunda (n=16) ise deney grubundaki aynı enjeksiyon bölgelerine sadece medium solüsyonu enjekte edildi.Flebin kaldırıldığı alanın distal kısmında 3x5 cm boyutlarındaki bölge dışındaki alan primer kapatıldı. Flep, açık bırakılan bu alana adapte edildi. Postoperatif 5, 8, 11 ve 14. günlerde her gruptan 4 adet sıçanın proksimal pedikülü ayrıldı. Pedikülü ayrılan her flep 7 gün boyunca takip edildi.Her flebin belirtilen günlerde (5, 8, 11, 14) ayrıldıktan 7 gün sonra fotoğrafları çekildi. Fotoğraflar Adobe Acrobat 9 Pro Version 9.0.0 (Adobe Systems) programında flep yasayabilir alanı milimetrik olarak ölçülerek gruplar karşılaştırıldı.Flep belirtilen günlerde (5, 8, 11, 14) ayrıldıktan 7 gün sonra, penil venlerinden 250 ?Ci Tc-99m (MIBI) enjekte edildi. Enjeksiyondan 2 saat sonra deri flepleri tespit edildiği sınırı da içerecek şekilde dış ortama alındı. Gama kamera altında fleplerden 10 dakikalık statik görüntüler alındı. Tüm gruplardan alınan görüntülerden sayısal değerlendirmeler yapılıp sonuçları birbirleriyle istatistiksel olarak karşılaştırıldı. Alınan flepler histolojik olarak incelenerek, yeni oluşan damarlar sayısal olarak karşılaştırıldı. Neovaskülarizasyon ayrıca mikroanjiyografik yöntemle de değerlendirildi. Radyografik görüntüler mamografi cihazı ile alındı ve kantitatif olarak değerlendirildi.BULGULAR: İstatistik sonuçlar değerlendirildiğinde, kök hücre tedavisi gören grubun flep yaşayan alanlarında kontrol grubuna oranla anlamlı derecede artma olduğu görüldü. Sintigrafik incelemelere baktığımızda kök hücre uygulaması yapılan grupta kontrol grubuna göre radyoaktif madde tutulumunun anlamlı derecede yüksek olduğu gözlendi. Sintigrafik sonucun flep yaşayan alan yüzdesi ile körele olduğu görüldü. Histopatolojik incelemede kök hücre grubundaki kapiller dansite kontrol grubuna göre daha yüksek bulundu. Ayrıca, deneyde adipoz doku kökenli kök hücreleri işaretlemek için GFP kullanıldı. Yapılan immunoflouresans boyamalar sonucunda, kontrol hayvanlarının endotelyal örneklerinde GFP (+) hücre izlenmezken, deney grubu hayvanlarının tümünde GFP (+) hücreler izlendi. Kontrol grubu ve deney grubu mikroanjiyografik görüntüleri karşılaştırıldığında deney grubunda kontrol grubuna göre anlamlı ölçüde vaskülarite artışı saptandı.TARTIŞMA: Mevcut çalışmada; interpolasyon fleplerinin neovaskülarizasyonunu hızlandırmada ve pedikül ayırma süresini kısaltmada adipoz doku kökenli mezenkimal kök hücre enjeksiyonunun faydalı olduğu tespit edildi. Uygun doz ve süre mezenkimal kök hücre tedavisi ile interpolasyon cilt fleplerinin morbiditelerinin en aza indirilmesi mümkün görünmektedir.ANAHTAR KELİMELER: İnterpolasyon flebi, kök hücre, neovaskülarizasyon

Abstract:
Interpolation flaps are widely used in Plastic surgery for reconstruction of large or deep defects. However waiting 2?3 weeks for the pedicle divison is still a challenging problem that increases the cost of treatment and the duration of hospital stay. In order to solve this problem, based on angiogenic potential of stem cells accelerating neovascularization and improving flap survival of interpolation flaps, our aim was to divide the pedicle earlier.MATERIALS AND METHOD: Our study groups was designed to determine the most appropriate time for division of an interpolation flap, the minimal amount of time necessary for the development of new vascular channels between the recipient bed and our flap and to assess the surviving area of flap in this period of time. We studied in two main groups and four subgroups of rats. Each animal underwent creation of identical cranially based skin flaps meausiring 6x5 cm. The flap included full-thickness skin, including the panniculus carnosus, and was based on the dorsal central artery and vein. Under each flap of the experimental group (n=16) green fluorescent protein (GFP) labeled adipose derived stemm cells which were suspended in medium at a concentration of 3x106 cells in 1 cc, was injected into the flap?s distal portion at two points; into the subcutaneous fascial layer of the recipient bed and into the wound margins at four points via a 25 G needle. In the control group (n=16), we injected 1 cc of medium solution into both the flap?s distal portion, into subcutaneous fascial layer of the recipient bed and into the wound margins in the same fashion.The distal 3x5 cm part of the flap sutured back to the recipient bed and the proksimal 3x5 cm part under flap closed primary to separate the flap and avoid neovascularization from recipient bed. At a postoperative interval of 5, 8, 11 and 14 days, each proximal pedicle of four rats from each group was divided. At 7 days after the operation, flap survival was measured by millimetric analysis.After 7 days, depending upon the time (5, 8, 11, 14) of division of the pedicles, each flap was photographed by a camera and scanned onto a computer. The survival area of each flap was measured by millimetric analysis, calculated by the Adobe Acrobat 9 Pro Version 9.0.0 (Adobe Systems) program and groups were compared.After 7 days, depending upon the time (5, 8, 11, 14) of division of the pedicles, 250 ?Ci Tc-99m (MIBI) was injected through the penil vein with a 27-gauge needle. Two-hours after of the injection, under gamma camera 10-minute static images were taken. Total activity count of each flap was compared with percentage of the viable flap area of the same flap. Quantitative assessments were made from images taken from all groups. The results were statistically compared with each other. Skin biopsies taken from flaps were examined histologically and the number of new capillaries compared with each other. Additionally, neovascularization were evaluated using microangiography. Radiographic images were taken on a mammography film and evaluated quantitatively.RESULTS: According to statistical evaluation, stem cell-treated group showed a significant increase in flap viability compared to the control group. The ratio of the scintigraphic activity obtained by flaps at stem cell group were found to be significantly higher than the control group. A significant correlation was seen between the scintigraphic activity count of the flaps and the percentage of viable flap surface area . There were obvious differences in the capillary density in between the groups. The capillary density in the flap tissue was clearly increased in stem cell-treated group, when compared with the control group. However in the experiment, we used GFP to label the adipose-derived stem cells. Immunoflouresans staining revealed that all endothelium samples in experimental group were GFP (+) (all of those in the control group were negative), indicating that these endothelial cells were differentiated from the administered adipose-derived stem cells. Microangiographic view of the flaps when compared, stem cell-treated group showed a significant increase in flap vascularity compared to the control group.DISCUSSION: In this study; adipose tissue-derived mesenchymal stem cell administration were found to be useful in accelerating the neovascularization and shortening the pedicle divison time of interpolation flaps. It seems that with an appropriate mesenchymal stem cell dosage and treatment period, it will be possible to reduce the morbidities of interpolation skin flaps.KEY WORDS: Interpolation flap, stem cell, neovascularization