İnsan kalp kapaklarında oluşan kalsifikasyonda sitrik asidin etkisi
The efficacy of citric acid on the removal of the calcification that occures in human heart valves
Yazar: NECMİ KÖSE
Danışman: DOÇ.DR. NEHİR SUCU
Mersin Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Kalp ve Damar Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2007
Konu: Göğüs Kalp ve Damar Cerrahisi = Thoracic and Cardiovascular Surgery

Özet:
ÖZETKalp kapaklarında oluşan yapısal bozulma ve kalsifik dejenerasyon, zamaniçerisinde klinik yetmezliğe neden olan en önemli faktörlerden biridir. Kalpkapaklarında değişik etkenlere bağlı olarak gelişen patolojilerde cerrahi kaçınılmazbir sondur. Özellikle tamirin ön planda olduğu mitral yetmezlik patolojilerinde bile%30 vakada kapak değişimi yapıldığı göz önünde bulundurulacak olursa, nativkapaklardaki bozulmanın önlenmesinin önemi ortaya çıkmaktadır. Bizim amacımız, invitro olarak gerçekleştirilen bu çalışmada hastalarımızdan çıkartılan nativ kapaklarda,sitrik asidin (CA) oluşmuş olan kalsifikasyona etkisini araştırmaktı. Son zamanlardayapılan klinik çalışmalarda, böbrek taşı olan hastalarda alkali sitratların yeni taşoluşumunu engellediği ve kemik deminerilizasyonunu azalttığı gösterilmiştir7. Alkalisitratlar polikistik böbrekli ratlarda interstistisyel fibrozisi ve inflamasyonu azaltarakyeni kistlerin oluşumunu durdurmuştur7. Diğer yandan ratlarda yapılan ex vivo birçalışmada ise CA tuzlarının ratların batınına yerleştirilen rat aortalarındakalsifikasyona bağlı dejenerasyonu önlediği gösterilmiştir8. CA gibi bir şelat olanEtilendiamintetraasetikasit (EDTA) de periferik arter hastalığı ve/veya koroner arterhastalığı olan hastaların yakınmalarında düzelme sağlamış, yapılan bir diğerçalışmada ise koroner arterlerde kalsifikasyondaki gerileme net olarak ortayakonmuştur. Najjar ve arkadaşları da, korneasında kalsifik band gelişen hastalardaeksternal EDTA uygulamasını tedavi protokolüne almışlardır139.Günümüzde gıda endüstrisinde yaygın olarak kullanılan CA'in, yaptığımız exvivo çalışma ile nativ kapaklardaki kalsifikasyonu azalttığını gösterdik. Kalsifikasyonuazaltıcı ve önleyici özelliğinden insanlarda yararlanılabileceğine, bu konuda daha ileriçalışmalar yapılması gerektiğine karar verdikÇalışma 12 hasta üzerinde yapıldı. Çalışmaya alınan 12 hastanın 6'sı erkek 6'sı kadındı. 8 adet mitral kapak eksizyonu ve 6 adet aort kapak eksizyonu yapıldı. İkihastaya hem aort hem de mitral kapak replasmanı uygulandı. Bir hastaya aynı andakoroner by-pass cerrahisi yapıldı. Hastaların genel yaş dağılımı 21-65 (minimum-maksimum), ortalama yaş 44,41Â±7,16 (OrtalamaÂ±standart sapma) olarak bulundu.Kapak replasmanı için operasyona alınan hastaların preoperatifekokardiyografik sonuçları, elde edilen doku örneklerinin peroperatif makroskopikgörüntüleri ve postoperatif doku biyokimyasal analizlerine göre hafif, orta ve ağırderecede kalsifikasyon olarak sınıflandırdık. Mitral kapak ve aort kapak değişimi5yapılan hastaların eksize edilen kapakları alındı. Her bir hastadan alınan kapakörnekleri fosfat tamponlu salin solüsyonu, %0,625' lik gluteraldehit (GA) (0,1 mol pH7.4) içine konarak +4 0C de 48 saat bekletildi. Bu doku örnekleri serum fizyolojik(%0,9 NaCl) ile yıkandıktan sonra Kontrol ve Çalışma grubu olarak ikiye ayrıldı.Kontrol grubundaki kapak örnekleri tazelenmiş %0,625 lik GA (0,1 mol pH 7.4)solüsyonu içinde +4 0C de 5 gün daha bekletildi (toplam 7 gün). Çalışma grubundakiparçalar ise % 3,8 lik CA (pH 7.4) içine konulup 37 0C de 48 saat bekletildi. Bu dokuörnekleri tekrar serum fizyolojikte yıkandıktan sonra aynı özellikleri taşıyan GAsolüsyonuyla 3 gün 37 0C de muamele edildi (toplam 7 gün). Her iki gruptaki parçalaralınarak biyokimyasal inceleme için kuru tüplere, ışık mikroskopik inceleme içinformaldehid solüsyonuna (%3,8) ve elektron mikroskopik inceleme için GAsolüsyonuna (%0,625) konuldu.Bu sonuçlara göre Kontrol grubunda 4 hafif, 5 orta ve 5 ağır kalsifikasyon olankapak örneği saptadık. Ağır kalsifikasyon gösteren doku parçalarının yüksek orandakalsifik görünüme sahip olduğu, aşırı kırılgan ve ileri derecede dejeneratif olduğusaptandı. Çalışma grubunda ise; 6 hafif, 6 orta ve 2 ağır kalsifikasyon gösteren kapakpatolojisi vardı. Kontrol grubunda 5 ağır kalsifikasyon gösteren kapak patolojisisaptanmışken, Çalışma grubunda ağır kalsifikasyon sınıfına giren kapak patolojisisayısı 2 olarak bulunmuştur. Aynı şekilde Kontrol grubunda 5 kapak orta derecedekalsifikasyon gösterirken, Çalışma grubunda 6 kapak, Kontrol grubunda 4 hafifderecede kalsifikasyon gösteren kapak var iken, Çalışma grubunda 6 hafifkalsifikasyon gösteren kapak patolojisi görülmüştür. Çalışma grubundaki ağırkalsifikasyon gösteren kapak sayısı azalırken, orta ve hafif kalsifikasyon sınıfına girenkapak sayısının artması CA'in etkinliğini kanıtlamaktadır.Total olarak bütün kalp kapaklarının (hem aort hem de mitral kapak)biyokimyasal sonuçları incelendiğinde Çalışma grubunda kalsiyum (p=0,007) vefosfat (p=0,042) değerlerinde anlamlı bir düşüş olduğu görüldü. Kontrol grubu ileÇalışma grubu arasında Malondialdehit (MDA), ATPaz ve total protein miktarlarındaçok az değişim saptanmış ve bu da istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. DokuATPaz aktivitesinin ve total protein düzeylerinin azalmamış ve MDA düzeylerinin deyükselmemiş olması hücre bütünlüğünün korunduğuna yönelik bulgulardır.Buna paralel olarak ışık mikroskopisi ile yapılan değerlendirmede Çalışmagrubunda bağ dokusu bileşenlerenin bütünlüğünün daha az bozulduğu, Kontrol6grubunda kalsifikasyonun daha belirgin olduğu tanımlanmıştır. Kontrol grubundakalsifik alanların belirgin olarak görüldüğü, Çalışma grubunda ise kalsifikasyonalanlarının gözle görülür biçimde azaldığı tespit edilmiştir.Elektron mikroskopik incelemelerde Kontrol ve Çalışma grubu kapakörneklerinde normal yapısal bileşenler görülebilmektedir. Hem aort hem de mitralkapak yapılarında kollajen ve elastik liflerdeki artış dikkati çekmektedir. Kollajen lifleretrafında düzensiz ve fuziform görünümde kalsifik yapılar vardır. Bu kalsifik yapılargerek Kontrol gerekse Çalışma grubunda görülmekle beraber Çalışma grubundaki bukalsifik yapılar daha azdır. Kollajen lifler etrafındaki kalsifik yapıların Çalışmagrubunda azaldığı ve kollajen liflerin özelliklerini kaybetmedikleri dikkati çekmiştir.Bu bulgular ışığında bizim yaptığımız bu çalışmanın sonucunda CA'in (% 3,8lik pH 7.4) içine konulup 37 0C de 48 saat bekletilerek yapılan uygulamada dokukalsifikasyonunu azaltması ve doku morfolojisinde etkin bir değişiklik yapmamışolması anlamlıdır. Şelatların sistemik ve lokal olarak uygulanabileceğinin ve hattalokal uygulamalarda kalsifikasyonun çok daha kısa sürede ortadan kaldırılabileceğinifarklı çalışmalardan anlamış bulunuyoruz. Gözden geçirdiğimiz çalışmalar ve bizimyürütmüş olduğumuz çalışmaların ışığı altında kapak etiyopatogenezi ne olursa olsunçoğunluk patolojilerin temeli oksidoinflamatuar hasara bağlıdır ve bu olaylarıntemelinde kalsiyum vardır. Dolayısıyla sitratlarla lokal olarak kalp kapağıdokularındaki kalsifikasyonun azaltılabildiğinin gösterilmesi, kapaklarda geçdönemde oluşabilecek kalsifikasyonların önlenmesinde ve/veya geciktirilmesindeönemli bir yeri olabileceğini düşündürmekle birlikte erken dönemde artan hücre içikalsiyumun da ortamdan uzaklaştırılması sonucunda oksidoinflamatuar hasarın daönlenebileceği fikri çalışma grubumuzca benimsenmiştir. Bundan sonraki aşamadayapacağımız çalışmalarda ilk planda CA'in oksidoinflamatuar yanıt ve kalsifikasyonaolan etkisi in vivo olarak gösterilmeye çalışılacak, sonra da sitratların sistemikuygulamasının kalp kapaklarındaki değişime olan etkisi araştırılacaktır.Anahtar kelimeler: Kalp kapak dejenerasyonu, kalsifikasyon, sitrik asit.7

Abstract:
İNGİLİZCE ÖZET (ABSTRACT)The Efficacy of Citric Acid on the Removal of the Calcification thatOccures in Human Heart ValvesStructural impairment and calcific degeneration that occur in the cardiacvalves are among the most important factors which lead to the clinical valveinsufficiency. Surgery is the inevitable end point of the cardiac valve pathologies thatoccur as a result of various factors. Considering that 30% of the mitral insufficiencycases requiring repairment ends with a valve replacement, the importance ofpreventing nativ cardiac valve impairment is raised. In this in vitro Study, we aimed toinvestigate the effect of citric acid (CA) on the calcific degeneration in human cardiacvalves obtained from our patients. Who underwent valve replacement recent clinicalstudies showed that alkali citrates prevent new urinary stone formation in the patientswith urolithiasis and reduce the bone demineralization. In the rat models withpolycystic kidney disease alkali citrates ceased new cyst formation by reducinginterstitial fibrosis and inflammation. Nevertheless, in an ex vivo Study alkali citratesprevented calcific degeneration of the rat aortas embedded in the rats? abdomen.Ethylenediaminetetraaceticacid (EDTA), a chelating agent like CA, improves thesymptoms of patients with peripheral arterial disease and/or coronary artery diseaseand in a Study its inhibitory effect on the coronary arterial calcification has beenclearly demonstrated. Najjar et al used external EDTA application in patients withcorneal calcific bands as a treatment protocol.In our ex vivo Study, we have showed that CA, nowadays commonly used infood industry, reduces the calcification in native human cardiac valves. We believethat CA can be useful in humans with its property of reducing and preventingcalcification, and suggest advanced studies to be performed in this aspect.We have classified the valvular calcification of the patients who underwentvalve replacement as mild, moderate and severe according to their macroscopicappearance, echocardiographic findings and tissue biochemical analyses. 12patients participated in the Study. The excised valves from the patients whounderwent mitral and aortic valve replacement were used. The excised valvespecimens taken from each patient were treated for 48 hours in a solution composedof phosphate tamponized saline (0,09% NaCl), 0.625% gluteraldehyde (GA) (0.1 molpH 7.4) at +4 0C. These tissue specimens were divided into two groups as the Studyand Control groups after washing with saline solution. The valve specimens in the8Control group were retreated with fresh 0.625% GA solution (0.1 mol pH 7.4) at +40C for 5 days (in total 7 days). The specimens in the Study group were treated with3.8% CA solution (pH 7.4) at +37 0C for 48 hours. After washing with saline solutionthese specimens, were retreated with the fresh 0.625% GA solution at 37 0C for 3more days (totaly 7 days). Every specimen in each group was taken into an emptytube for biochemical analysis, into formaldehyde solution (3.8%) for light microscopy,and into GA (0.625%) solution for electron microscopy.According to these results, in the Control group 4 of the patients have showedmild, 5 of them moderate and 5 of them severe valvular calcification. The specimensobtained from the patients having severe valvular calcification were highly calcific inappearance, excessively fragile and degenerative. In the Study group, 6 of thepatients showed mild, 6 of them showed moderate, and 2 of them showed severevalvular calcification. We have detected 5 severe valvular calcification in the Controlgroup, whereas the number of severe valvular calcification in the Study group was 2.The number of moderate valvular calcification was 5 in the Control group, whereasthis number was 6 in the Study group and 6 mild valvular calcification were detectedin the Study group whereas the number was 4 in the Control group. Both thedecrease in the number of severe valvular calcification and increase in the number ofmild and moderate valvular calcification in the Study group indicates a proof for theefficacy of CA.When the biochemical results of all cardiac valves (mitral and aortic valves)were examined, a statistically significant decrease in the calcium (P=0.007) andphosphate (P=0.042) levels were detected in the Study group. The change in theamount of MDA, ATPase and total protein levels differed very little between the Studyand Control group and were not found to be statistically significant. Tissue ATPaseactivity and total protein levels were not decreased and the Malondialdehite (MDA)level was not increased in the Study group. These findings indicates that the cellularintegrity was preserved.Evaluation of the results obtained by light microscopy revealed that, theintegrity of connective tissue components in the Study group was less impaired, andthe calcification was more evident in the Control group. We noticed that in the Controlgroup the calcific areas were more evidently present, whereas in the Study group thecalcific areas were markedly less.9Both in the Study and Control groups, normal structural components of thecardiac valves could be observed by the electron microscopy. Under electronmicroscopy the collagen and elastic fibrils were noticeable both in the aortic andmitral valve structures. Irregular and fusiform calcifications were observed around thecollagen fibrils. These calcific structures were present both in the Control and Studygroup, but they were much more rare in the Study group. We noticed that the calcificstructures around the collagen fibrils were reduced and the properties of the collagenfibers were preserved.According to these findings of our Study it is clear that locally applied CAdecreases the tissue calcification and does not give nice to significant changes in thetissue morphology. By the interpretation of many different studies, we found out thatchelating agents can both be used locally and systemically and especially the localapplication is able to quickly remove the calcification. According to our present Studyand other studies, we conclude that whatever the valvular ethiopathogenesis is thebasis of most of the valvular pathology is due to the oxidoinflammatory damage inwhich calcium plays a basic role. Consequently, our clinical Study group assumesthat demonstrating the reduction in the valvular calcification with locally appliedcitrates proves their efficacy in the prevention of late calcification in valvularpathologies and they remove the intracellular calcium in the early stage by the waythat they prevent the oxidoinflammatory damage. Our following studies will aim firstlyto search for the effect of CA on the cellular morphology in vivo, and then toinvestigate the effect of systemically applied citrates on the heart valves.Key Words: Calcification, Citric Acid, Heart Valve Degeneration10