Mezenkimal kök hücre uygulamasının ratlarda deneysel periodontitis üzerine etkisi
The effect of mesenchymal stem cell application on experimental periodontitis in rats
Yazar: YUNUS EMRE BALABAN
Danışman: PROF. DR. SEMA HAKKI
Selçuk Üniversitesi / Diş Hekimliği Fakültesi / Periodontoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Diş Hekimliği Uzmanlık, 2022
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Adipoz doku = Adipose tissue ; Gingiva = Gingiva ; Hidrojeller = Hydrogels ; Kök hücreler = Stem cells ; Periodontitis = Periodontitis ; Sıçanlar = Rats

Özet:
Cerrahi ve cerrahi olmayan geleneksel periodontal tedaviler genellikle hastalığın ilerlemesini önlemede başarılı olmakla birlikte kaybedilen periodontal doku rejenerasyonunda sınırlı bir etkinliğe sahiptir. Son dönemlerde yapılan çalışmalar öngörülebilir periodontal rejenerasyon elde etmek için hücre bazlı rejeneratif tedaviler üzerine odaklanmaktadır. Bu çalışmada,  deneysel periodontitis oluşturulmuş ratlarda fibroin/kitosan oligosakkarit laktat hidrojel (F: KOS) yapı içerisinde lokal olarak uygulanan adipoz doku kaynaklı (AMKH) ve gingival fibroblast kaynaklı (GMKH) mezenkimal kök hücrelerin periodontal doku rejenerasyonu üzerine etkisinin değerlendirilmesi amaçlandı. 
Yetmiş beş adet erkek Wistar rat rastgele beş gruba ayrıldı: A) Pozitif kontrol grubu (Periodontal sağlık; n:15), B) Negatif kontrol grubu (Deneysel periodontitis grubu; n:15) C) Sham kontrol grubu (Hücresiz hidrojel grubu; n:15), D) AMKH enjekte edilen grup (n:15), E) GMKH enjekte edilen grup (n:15). Deneysel periodontitis oluşturmak amacıyla maksiller ikinci molar dişlerin çevresine subgingival pozisyonda 3/0 ipek sütür yerleştirildi; 14 gün sonra dikişler alındı. Hücreler, prob ile sonike edilmiş F ve F: KOS hidrojeller içinde kapsüllendi. Hücre canlılığı, live/dead boyamadan sonra Alamar Blue testi ve konfokal görüntüleme ile değerlendirildi.  Green floresan protein (GFP) geni ile transfekte edilmiş GMKH ve AMKH (250.000) içeren F: KOS, ikinci molar dişlerin mezial ve distal interproksimaline uygulandı. Mikro bilgisayarlı tomografi (Mikro-BT) ve histopatolojik inceleme kullanılarak alveolar kemik seviyeleri ölçümleri için hayvanlar 2, 4 ve 8. haftalarda sakrifiye edildi.
Elde edilen mikro-BT verilerinin değerlendirilmesi sonucu GMKH uygulanan grupta 8 hafta sonunda NK grubuna kıyasla istatistiksel olarak anlamlı derecede daha az kemik kaybı olduğu görüldü. SK ve AMKH gruplarında da NK grubuna göre daha az kemik kaybı olduğu görülmekle birlikte bu fark istatistiksel olarak anlamlı değildi. Histolojik kesitler üzerinde yapılan değerlendirmede GMKH grubunda daha belirgin olmakla birlikte kök hücre uygulanan gruplarda kontrol gruplarına kıyasla uzun bağlantı epiteli oluşumun daha az, bağ dokusu ve pdl yapısının sıkı ve düzgün olduğu görüldü. SK grubunda kök hücre uygulanan gruplara kıyasla ataçman kaybı biraz daha fazla olmakla birlikte 8 hafta sonunda epitel ve bağ dokusu görüntüsü NK grubuna göre daha iyi olduğu görüldü. GFP ve PKH ile işaretlenen AMKH ve GMKH'lerin 8 hafta sonunda dokuda varlığını sürdürdüğü gözlendi. F: KOS hidrojellerin etkinliğin değerlendirmek amacıyla yapılan in vitro çalışmalarda; Alamar Blue testi ve konfokal görüntüleme ile kapsüle edilmiş AMKH'lerin ve GMKH'lerin 14 günlük uygulama süresince canlılığının arttığı ortaya çıkarıldı. Hidrojellerde KOS'un dahil edilmesinin, F ve kontrol gruplarına kıyasla hücre canlılığını arttırdığı da bulundu.
Bu çalışma ile F: KOS hidrojel içerisinde uygulanan GMKH ve AMKH'lerin lökosit infiltrasyonunu azaltabileceği, doku iyileşmesini hızlandırabileceği ve periodontal rejenerasyona olumlu yönde katkı sağlayabilecekleri gözlenmiştir. Ancak F: KOS içinde AMKH ve GMKH lerin periodontal rejeneratif tedavilerde uygun bir tedavi alternatifi olabilmesi için ileri çalışmalara ihtiyaç olduğu sonucuna varıldı.

Abstract:
Conventional surgical and non-surgical periodontal treatments are generally successful to prevent disease progression but have limited effectiveness in the regeneration lost periodontal tissue. To achieve predictable periodontal regeneration, studies focused on cell-based regenerative treatments. In this study we aim to investigate the effects of local application of adipose tissue derived (AMSC) or gingiva derived (GMSC) mesenchymal stem cells with fibroin/chitosan hydrogel (FCh)  on periodontal tissue healing in experimental periodontitis in rats.
Seventy-five Wistar rats were divided into five groups as follows: A) Periodontally healthy (H), B) Experimentally induced periodontitis group (P; n:15) C) Hydrogel group without cells (Sham control group; S; n:15), D) AMSC injected group (n:15), E) GMSC injected group (n:15). A 3/0 silk suture was bilaterally placed in a subgingival position around the maxillar second molars; after 14 days sutures were removed. Cells were encapsulated in probe sonicated F and FCh hydrogels. Cell viability was assessed by Alamar blue assay and confocal imaging after live/dead staining. Fibroin/chitosan hydrogel containing GMSCs or AMSCs (250.000), which were transfected with the green fluorescent protein (GFP) gene, were applied to mesial and distal interproximal of second molars. Animals were sacrificed at 2, 4 and 8 weeks for the alveolar bone levels measurements using micro-CT and histopathological examination
As a result of the evaluation of the obtained micro-CT data, it was observed that there was statistically significantly less bone loss in the GMSC group compared to the NK group at the end of 8 weeks. There was less bone loss in the SK and AMSC groups than in the NK group, but this difference was not statistically significant. Histological sections, the stem cell applied groups had less long junctional epithelium formation compared to the control groups, but this difference was more pronounced in the GMSC group. It was observed that the connective tissue and pdl structure were tight and smooth in stem cell applied groups. It was determined that the attachment loss was slightly higher in the SK group compared to the stem cell applied groups, but at the end of 8 weeks, the epithelial and connective tissue appearance was better than the NK group. It was observed that AMSCs and GMSCs marked with GFP and PKH persisted in the tissue at the end of 8 weeks. Alamar Blue and live/dead assays revealed that viability of encapsulated AMSCs and GMSCs increased during 14 days of cultivation. It was also found that incorporation of Ch in hydrogels promoted cell viability compared to F and control groups.
In this study, it is thought that GMSCs and AMSCs applied in F:Ch hydrogel can reduce leukocyte infiltration, accelerate tissue healing and contribute positively to periodontal regeneration. However, further studies are required in order to make LMSCs and GMCHs in F:COS an appropriate treatment alternative in periodontal regenerative treatments.