Düşük dansiteli lipoprotein (LDL) ve okside düşük dansiteli lipoprotein'in (o-LDL) nitrik oksit (NO) aracılı trombosit aktivasyonuna etkilerinin incelenmesi
Investigation of the effects of low density lipoprotein (LDL) and oxidized low density lipoprotein on nitric oxide (NO) mediated platelet activation
Yazar: ELİF ENÇ
Danışman: DOÇ.DR. AZİZE ŞENER
Marmara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2007
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: HDL = HDL ; LDL = LDL ; Nitrik oksit = Nitric oxide ; Trombosit aktivasyonu = Platelet activation

Özet:
Trombositler ve lipoproteinler ateroskleroz ve koroner kalp hastalıklarınınpatogenezinde önemli rol oynarlar. Bu çalışmada insan plazmasından izole edilen LDLve LDL'nin oksidasyonu ile elde edilen okside LDL'nin (o-LDL) trombositaktivasyonu üzerine olan etkilerinin trombosit L-arjinin ve NO yoluyla ilişkisininaydınlatılması amaçlanmıştır.Kesikli dansite gradient ultrasantrifügasyon yöntemi kullanılarak LDL ve HDLfraksiyonları insan plazmasından saflaştırılarak elde edildi. LDL ve HDL'nin saflıklarıtrigliserit , total kolesterol , apoprotein düzeyleri ve lipoprotein jel elektroforezi ilebelirlendi. Elde edilen LDL'nin bir kısmı Cu++ ile okside edilerek o-LDL elde edildi.o-LDL'nin lipid peroksidasyon düzeyi malondialdehid tayini ile belirlendi.Bu çalışmada sağlıklı 7 kişiden alınan kan örneklerinden izole edilen yıkanmıştrombositler öncelikle L-arjinin (1mM) ve L-nitroarjinin metil ester (L-NAME, 1 mM)ile inkübe edilerek Nitrik oksid metabolitlerinin (NOx) düzeyi saptandı. Daha sonraAdenozin difosfat (ADP) indüklü trombositler ortamda L-arjinin varken veya yokkenLDL (100 ?g/ml) , HDL (100 ?g/ml) ve o-LDL (100 ?g/ml) ile ayrı ayrı inkübe edildi.İnkübasyon sonrası trombosit P-selektin ekspresyonları flov sitometrik olarak ölçüldü.Sonuçlar her bir trombosit başına spesifik antikor bağlama kapasitelerine çevrildi.L-arjinin ilavesi trombosit NO düzeylerini kontrol grubuna göre anlamlı olarakartırmıştır (p<0.001). L-NAME ile inkübe edilen trombositlerin NO düzeyleri L-arjininile inkübe edilenlerden anlamlı olarak düşüktür (p<0.001). LDL ve o-LDL trombositbaşına düşen P-selektin düzeylerini anlamlı olarak artırdı (p<0.001). Buna karşılıktrombositlere LDL ve o-LDL ile inkübasyon öncesi L-arjinin ilavesi P selektinreseptörü sayılarının sadece LDL ve o-LDL ilavesine göre anlamlı olarak azalmasınaneden oldu (p<0.01, p<0.001). Trombositlere o- LDL, L-arjinin ile birlikte HDLilavesi ise trombosit P selektin reseptör sayısının azalmasına neden oldu ( p<0.001 ).HDL ile birlikte L-arjinin ilavesi P-selektin sayıları daha da düşük bulundu.Sonuç olarak in vitro olarak önceden eksojen L-arjinin ilavesi trombosit NOdüzeylerini artışına neden olur, bu artış LDL'nin ve o-LDL'nin trombositaktivasyonunu artırıcı etkisini azaltır. HDL'de L-arjininin bu etkisini kuvvetlendirir.Anahtar kelimeler: NO, LDL, o-LDL, HDL, Trombositler.

Abstract:
Platelets and lipoproteins play an important role in atherosclerosis and coronary heartdiseases. The aim of this study was to investigate the relationship between Larginine/NO pathway and isolated lipoproteins from human plasma and oxidized LDL(ox-LDL). Human LDL and HDL were separated by density gradient ultracentrifugationand LDL was oxidized with Cu++ for 24 h at 37 °C. Purity of lipoproteins were assuredby triglyceride, total cholesterol, apoprotein levels and lipoprotein gel electrophoresis.Lipid peroxidation levels of ox-LDL were performed with MDA assay. L-arginine (1mM) and L-nitroarginine methylester (L-NAME, 1 mM) were treated with washedplatelets and Nitric oxide metabolites (NOx) level was measured. Adenosinediphosphate (ADP) induced washed platelets were incubated with LDL (100 ?g/ml) ,HDL (100 ?g/ml) and ox-LDL (100 ?g/ml) with or without L-arginine. Afterincubation, platelet P-selectin levels were measured by flow cytometry. The resultswere converted to specific antibody binding capacities per platelet.After treatment with L-arginine, platelet NO levels significantly increased compared tothe controls (p<0.001). Platelet NO levels decreased with L-NAME compared to Larginine(p<0.001). After incubation with LDL and ox-LDL, P selectin levels perplatelet significantly increased (p<0.001). On the other hand, P selectin levels inplatelets treated with L-arginine+LDL and L-arginine+ox-LDL decreased compared tothe levels in platelets treated with only LDL and ox-LDL (p<0.01, p<0.001). Additionof HDL to L-arginine+ox-LDL caused sifnificant reduction in P selectin receptornumbers per platelet as in the control values (p<0.001).We conclude that pretreatment of platelets with exogenous L-arginine causes enhancedendogen platelet NO levels and negates the effects of LDL and ox-LDL on plateletactivation and that HDL also strengthens this effect of L-arginine.Key Word: NO, LDL, o-LDL, HDL, Platelets.