Aşı suşu olarak kullanılacak şap virusu plak morfolojisindeki farklılıkların genetik olarak incelenmesi
Genetical investigation on the differences of plaque morphology of fmdv which will be used as vaccine strain
Yazar: MÜGE FIRAT SARAÇ
Danışman: PROF. DR. YILMAZ AKÇA
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Viroloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2011
Konu: Genetik = Genetics ; Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Aşılar = Vaccines ; Fenotip = Phenotype ; Genetik teknikler = Genetic technics ; Hücre kültürü = Cell culture ; Şap hastalığı virüsü = Foot and mouth disease virus

Özet:
Bu çalışmada, şap aşılarının hazırlanmasında aşı suşu adayı olarak seçilen saha suşlarının ve güncel bazı aşı suşlarının BHK-21 hücre kültürlerine adaptasyonları sırasında ortaya çıkan farklı plak fenotiplerinin genetik düzeyde incelenmesi ve söz konusu fenotipik değişikliklerden sorumlu olabilecek mutasyonların sorgulanması amaçlanmıştır. Bu amaçla, 2007 yılında Türkiye'nin çeşitli illerinde hastalığa sebep olmuş beş adet A/IRN/2005 suşu ve beş adet O PanAsia-2 suşundan olmak üzere on adet aşı suşu aday virusu ve A22 Irak, A Tur 04-06 ve O1 Manisa olmak üzere üç adet aşı suşu niteliğindeki kontrol virusunun BHK-21 hücre kültürlerine adaptasyon çalışmaları, ELISA ve plak testleri yapılarak, pasajlar arasında plak morfolojilerinde meydana gelen değişiklikler genetik düzeyde incelenmiş ve söz konusu değişikliklerden sorumlu olabilecek mutasyonlar sorgulanmıştır. Viruslara ait orijinal virus süspansiyonları, monolayer BHK-21 An31 hücre kültüründe altıncı pasaj, monolayer BHK-21 An30 hücre kültüründe beşinci pasaj ve süspanse BHK-21 An30 hücre kültüründeki son pasajlarından elde edilen VP1, 3A ve cre genlerine ait nükleotid diziler ve orijinal virus süspansiyonları ile süspanse BHK-21 An30 hücre kültüründeki son pasajlarından elde edilen VP4, VP2 ve VP3 genlerine ait nükleotid diziler her virus için kendi içinde karşılaştırılmıştır.Çalışılan virusların hücre kültürlerine adaptasyonları için yapılan pasajlar sırasında plak ölçülerinde genel olarak küçülme ve heterojen plak morfolojisi oluştuğu tespit edilmiştir. Nükleotid diziler incelendiğinde; VP1 genindeki T48K, H57R, Q110K, Q110R, E138K, E198K ve D199G, VP2 genindeki W129C, E131K, L134R ve L137R ve VP3 genindeki H56R, D60G, D174G ve T178G mutasyonlarının daha önceki çalışmacıların bildirdikleri doğrultusunda plak morfolojisi ile ilişkili olabilecekleri düşünülmüştür. VP1 genindeki T13A, S30T, E83K, T96K, H108R, R172W ve E174A, VP2 genindeki T201A, VP3 genindeki C34R ve 3A genindeki T119A, L129P, N139D ve V143A mutasyonlarının plak morfolojisi ile ilişkisi ise mevcut bilgilerle ortaya konulamamıştır. Pasajlar arasında hiçbir mutasyonun görülmediği cre ve VP4 genlerinin bu çalışma için plak morfolojisi yönünden potansiyel gen bölgeleri olmadıkları düşünülmüştür. İlerleyen hücre pasajlarında plak fenotiplerinde görülen değişimlerin ve diziler arasındaki aminoasit farklılıklarının, şap virusunun tür benzeri doğasının sonucu olarak populasyon içinde değişken ortam şartlarına uyum sağlayan baskın varyantların özelliklerini göstermeleri sonucu şekillendiği düşünülmüştür. Elde edilen bulgular şap aşısı üretimi ve şap virusu ile ilgili yapılabilecek başka çalışmalara bilgi sağlayabilir.Anahtar Sözcükler: Hücre kültürü, genetik analiz, plak fenotipi, şap virusu

Abstract:
In this study, it was aimed to genetically investigate the different plaque phenotypes that occured during the adaptation of field strains which were selected as candidate vaccine strains to prepare vaccine for foot-and-mouth disease and some current vaccine strains to BHK-21 cell cultures and to examine the mutations that may be responsible for such phenotypical alterations. For this purpose; the studies for adaptation to BHK-21 cell lines, ELISA and plaque assays of ten candidate vaccine strain viruses of five A/IRN/2005 strain and five O PanAsia-2 strain which have caused the disease in several provinces of Turkey in 2007 and three vaccine strains A22 Iraq, A Tur 04-06 and O1 Manisa which were used as control viruses were done and the plaque morphology alterations occured between the passages were genetically investigated and the mutations that may be responsible for these alterations were examined. The nucleotide sequences of VP1, 3A and cre genes obtained from the original virus suspensions, the sixth passage in monolayer BHK-21 An31 cell line, the fifth passage in monolayer BHK-21 An30 cell line and the last passage of the viruses in suspension BHK-21 An30 cell line and the nucleotide sequences of VP4, VP2 and VP3 obtained from the original virus suspensions and the last passage of the viruses in suspension BHK-21 An30 cell line were compared in itself for each virus.During the passages of the studied viruses for their adaptation to cell lines, a general decrease in the plaque sizes and heterogeneous plaque morphology formation was determined. When the nucleotide sequences were investigated; T48K, H57R, Q110K, Q110R, E138K, E198K and D199G mutations in VP1, W129C, E131K, L134R and L137R mutations in VP2 and H56R, D60G, D174G and T178G mutations in VP3 were thought to may be related with plaque phenotype according to the declarations of previous researchers. The relationship between mutations T13A, S30T, E83K, T96K, H108R, R172W and E174A in VP1, T201A in VP2, C34R in VP3 and T119A, L129P, N139D and V143A in 3A and plaque morphology were not able to revealed with existent information. It was thought that cre and VP4 genes in which no mutation was observed between the passages were not the potential genes for plaque morphology for this study. The alterations in plaque phenotypes which were observed in progressive cell culture passages and the aminoacid differences between the sequences were thought to show the properties of dominant variants in the population which were accommodated to changeable media conditions occured as a result of quasispecies nature of foot-and-mouth disease virus. The findings obtained may supply information for other studies that will be done about foot-and-mouth disease vaccine production and foot-and-mouth disease virus.Key Words: Cell culture, genetic analysis, plaque phenotype, FMDV