Samsun yöresinde üretilen yumurta örneklerinde tetrasiklin grubu antibiyotik kalıntılarının araştırılması
Investigation of tetracycline residues in EGG samples produced in Samsun province
Yazar: ORAL DİNLER
Danışman: DOÇ. DR. OĞUZHAN YAVUZ
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji ve Toksikoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Antibiyotikler = Antibiotics ; Kromatografi-yüksek basınçlı-sıvı = Chromatography-high pressure-liquid ; Kütle spektrometri = Mass spectrometry ; Tavukçuluk = Chicken farming ; Tetrasiklin = Tetracycline ; Yumurtalar = Eggs ; İlaç kalıntısı = Drug residues

Özet:
Amaç: Bu tez çalışmasının amacı, antibiyotiklerin analizi için hassas bir analiz metodu olan yüksek performanslı sıvı kromatografisi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) yönteminin Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Veterinerlik Farmakoloji ve Toksikolojisi Anabilim Dalı Laboratuvarına uyarlanarak, Samsun ve çevresinde üretilen yumurta örneklerinde halk sağlığı açısından önemli olan tetrasiklin grubu antibiyotik ve önemli metabolit kalıntılarının araştırılması, bu antibiyotikler açısından yumurta örneklerindeki kalıntı boyutunun ortaya konarak gıda güvenliği ve insan sağlığı açısından değerlendirilmesidir. Ayrıca çalışma sonuçlarının güvenirliğinin arttırılması için, tespit edilecek olası tetrasiklin kalıntılarının sıvı kromatografisi sıralı kütle/kütle spektrometrisi (Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry, LC-MS-MS) yöntemi ile doğrulanması hedeflenmiştir.
Materyal ve Metot: Tez çalışması Samsun İlinde faaliyet gösteren yumurtacı tavuk işletmelerinden toplanan yumurta örneklerinde tetrasiklin, oksitetrasiklin, klortetrasiklin, doksisiklin ve bunların metabolizma ürünü olan 4-epimer kalıntılarının araştırılması esasına dayanmaktadır. Bu kapsamda 8 ruhsatlı işletmede bulunan 34 kümesin her birinden 60 adet olmak üzere toplam 2040 yumurta toplandı. Toplananın yumurtaların 10 tanesi bir numune olacak şekilde homojenize edildi ve analiz için toplam 204 numune incelendi. Örneklerin ekstraksiyonunda ve temizleme (clean-up) işleminde sırasıyla sıvı-sıvı ekstraksiyon ve katı faz ekstraksiyonu yöntemleri kullanıldı. Tetrasiklinler HPLC-DAD yöntemi ile analiz edildi ve pozitif örnekler LC-MS-MS yöntemi ile doğrulandı.
Bulgular: Tez çalışması kapsamında kullanılan HPLC metodunun, elde edilen analitik performans parametreleri incelendiğinde; bağıl standart sapma (RSD) değerleri % 0,8-7,6, R2 değerleri 0,9991-0,9998, LOD ve LOQ değerleri ise sırasıyla 14,94-22,49 µg/kg ve 49,81 ve 74,98 µg/kg arasında tespit edildi. İncelenen tetrasiklinlerin geri kazanım değerlerinin ise % 62,1-82,4 arasında olduğu belirlendi. Tetrasiklin kalıntıları açısından incelenen toplam 2040 yumurta örneğinden elde edilen 204 numunenin aynı kümesten alınan 6 tanesinde (% 2,94) 135,82 µg/kg ile 229,53 µg/kg arasında klortetrasiklin kalıntısına rastlandı. Ortalama kalıntı miktarının 176,89±39,36 µg/kg olduğu belirlendi. Pozitif sonuç alınan bu 6 numunenin 2 tanesinde (% 0,98) klortetrasiklin yoğunluğunun yasal limit olan 200 µg/kg'ın üzerinde olduğu (214,80 ve 229,53 µg/kg) tespit edildi. İncelenen numunelerde tetrasiklin, oksitetrasiklin ve doksisiklin ile epimerlerinin kalıntılarına rastlanmadı.
Sonuç: Tez çalışması sonunda kullanılan analitik yöntemlere ait doğruluk ve güvenlik parametrelerinin kabul edilebilir limitler arasında olduğu belirlendi. Her ne kadar sadece 2 yumurta örneğinde MRL düzeylerinin üzerinde ve 4 örnekte MRL değerlerinin altında klortetrasiklin kalıntısı saptanmış olsa da, bu yumurtaları tüketen insanlarda istenmeyen etkilerin ortaya çıkabileceği ve bakterilerde direnç şekillenebileceği göz önüne alınmalıdır. Bu nedenle yumurta ve diğer hayvansal gıdaların tetrasiklin kalıntıları açısından sık aralıklarla izlenmesi ve başka bölgelerde de doğrulama testleri ile birlikte benzer çalışmaların yapılması insan sağlığı açısından önem taşımaktadır. Doğru ve bilinçli antibiyotik kullanımının yanı sıra yasal bekletme sürelerine uyulmasının veteriner hekimlerce takibinin sağlanması ve özellikle üreticilerin ve tüketicilerin bu tür antibiyotik kalıntılarının muhtemel zararları ve bu kalıntıların ortadan kaldırılması için gerekli uygulamalar hakkında düzenli olarak bilgilendirilmeleri gerekmektedir. 

Anahtar Kelimeler: HPLC; kalıntı; LC-MS-MS; tetrasiklinler; yumurta

Abstract:
Aim: The aim of this study is to investigate residues of tetracycline antibiotics and their important metabolites in egg samples produced in Samsun Province and evaluation of detected residues for food safety and human health by the adaptation of a High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method, which is a sensitive technique for antibiotic analysis, to the Laboratory of Department of Pharmacology and Toxicology, Faculty of Veterinary Medicine, Ondokuz Mayis University. Furthermore, confirmation of possible tetracycline residues with a Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS-MS) method was targeted for increasing the reliability of the obtained results. 
Material and Method: The study is based on investigation of tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline, doxycycline and their metabolite products, 4-epimers residues in egg samples collected from commercial layer farms in Samsun Province. In this frame, totally 2040 eggs were collected from 34 coops (60 eggs from each) in 8 layer farms. Ten egg samples was homogenised and totally 204 specimens were obtained. Liquid-liquid extraction and solid phase extraction methods were used for extraction and clean-up of the samples, respectively. Tetracyclines were analysed by HPLC-DAD method and positive samples were confirmed by LC-MS-MS.
Results: Analytical performance parameters of used HPLC method were quite good and satisfactory. Relative standard deviation (RSD) values were 0.8-7.6%, R2 values were 0.9991-0.9998 and LOD and LOQ were 14.94-22.49 and 49.81-74.98 µg/kg, respectively. Recovery values were determined as 62.1-82.4%. Chlortetracyline residues were detected in 6 of 204 samples obtained from 2040 eggs (2.94%), ranged from 135.82 µg/kg to 229.53 µg/kg. Mean residue amount was 176.89±39.36 µg/kg. Two of 6 positive samples (0.98%) were exceeding the maximum residue limit, 200 µg/kg. Tetracycline, oxytetracycline, doxycycline and 4-epimers were not found in the investigated samples. 
Conclusion: At the end of the study, accuracy and reliability parameters of the used method was determined satisfactory. Although, chlortetracyline residues were exceeding the legal limits in only 2 and below the maximum residue limits in 4 samples, it should be considered that serious harmful effects could be seen in humans who consumed those eggs and resistance could generate in bacteria. Therefore, tetracyclines residues should be monitored in eggs and other animal originated foods and further studies should be performed with confirmation tests in different regions for protection of human health. In addition, true and rational antibiotic usage and obeying the legal withdrawal periods should be pursued by veterinarians, and especially farmers and consumers should be regularly informed regarding possible harmful effects of antibiotic residues and required practises for elimination of residues. 

Key Words: egg; HPLC; LC-MS-MS; residue; tetracyclines