Çeşitli klinik örneklerden izole edilen gram negatif enterik bakterilerde karbapenemaz varlığının ve tiplerinin araştırılması
Prevalance and genetic evaluation of carbapenemase production among gram-negative enteric bacteria isolated from various human clinical specimens
Yazar: HÜSEYİN HAYDAR KUTLU
Danışman: DOÇ. DR. EBRU US
Ankara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Elektroforez-agar jel = Electrophoresis-agar gel ; Enterobacteriaceae = Enterobacteriaceae ; Genler-blaOXA = Genes-blaOXA ; Gram negatif bakteriler = Gram negative bacteria ; Karbapenemler = Carbapenems ; İlaç alerjisi = Drug hypersensitivity ; İlaçlara direnç = Drug resistance ; İlaçlara direnç-mikrobiyal = Drug resistance-microbial

Özet:
Çalışmamızda Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İbni Sina hastanesi Merkez Laboratuvarına 2010-2014 yılları arasında çeşitli kliniklerden gönderilen karbapenem direnci gösteren Enterobacteriaceae suşlarında antibiyotik duyarlılık paternleri ve karbapenemaz genleri araştırılarak ülkemize yönelik epidemiyolojik veri sağlamak amaçlanmaktadır. Elde edeceğimiz veriler Türkiye'deki epidemiyolojik verilere önemli bir katkı sağlayacak, yeni tedavi algoritmalarının geliştirilmesinde ve tedavinin yönlendirilmesinde yol gösterici olacaktır.
Çeşitli kliniklerden alınmış, Phoenix otomatize sistemi (Becton Dickinson, ABD) ile identifiye edilerek antibiyotik duyarlılık testleri sonucunda ertapeneme karşı orta duyarlı ya da dirençli bulunan 112 izolat çalışmaya alınmıştır.  Tüm izolatlara Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi ile antibiyotik duyarlılık testleri yapılarak 17 antibiyotik için (amoksisilin-klavulanik asit (20/10 µg), piperasilin-tazobaktam (100/10 µg), sefazolin (30 µg), sefepim (30 µg), seftazidim (30 µg), sefotaksim (30 µg), sefoksitin (30 µg), aztreonam (30 µg), doripenem (10 μg), ertapenem (10 µg), imipenem (10 µg), meropenem (10 µg), gentamisin (10 µg), amikasin (30 µg), siprofloksasin (5 µg), levofloksasin (5 µg), trimetoprim-sülfametoksazol (1.25/23.75 µg)) duyarlılık sonuçları belirlenmiştir. Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemine ek olarak ertapenem ve meropenem stripleri kullanılarak gradiyent difüzyon yöntemiyle izolatların karbapenem MİK değerleri belirlenmiştir. Modifiye Hodge testi CLSI'nın (2015) önerdiği sulandırım basamağı yapılarak ve bu basamak atlanarak iki farklı şekilde yapılmıştır ve testin karbapenemaz varlığını saptamadaki duyarlılık ve özgüllüğü değerlendirilmiştir. Bakteriyel izolatlardan DNA ekstraksiyonu yapılıp polimeraz zincir reaksiyonu yardımıyla 11 adet kazanılmış karbapenemaz geni incelenmiştir. İzolatlar arasındaki klonal ilişki, izolatların Xbal DNA makrorestriksiyon enzimi ile kesimi sonrası PFGE yöntemi ile araştırılmıştır. 
Çalışmamızda 112 bakteriyel izolat incelenmiş olup izolatların çoğunluğunu K.pneumoniae (%70,5) oluşturmakta iken bunu sırasıyla E.coli (%13,4), E.cloacae (%8,9), E.aerogenes (%3,6) ve K. oxytoca (%3,6) takip etmiştir. İzolatlarda en sık olarak OXA-48 geninin varlığı saptanmıştır. Bakteriyel izolatların 83 tanesinde (%74,1) tek başına, yedi tanesinde (%6,3) ise VIM geni ile birlikte OXA-48 tespit edilmiştir. Karbapenemaz genleri arasında ikinci sıklıkta VIM geninin varlığı saptanmış olup toplam dokuz bakteride (% 8) pozitif olarak bulunmuştur. NDM geni ise iki bakteriyel izolatta (%1,8)tanımlanmıştır. Test edilen tüm izolatlar için en yüksek direnç görülen antimikrobiyal ajanlar sefazolin (%100) ve amoksisilin-klavulanik asit (%99,1) olmuştur. En az direnç görülen antimikrobiyal ajanlar ise amikasin (%19,6) ve gentamisin (%29,5) olmuştur. Modifiye Hodge testi CLSI'nın (2015) önerdiği şekliyle 1:10 sulandırım kullanılarak yapıldığında testin duyarlılığı %92,6; özgüllüğü ise %11,1 bulunmuştur. Sulandırım adımı atlanarak yapıldığında OXA-48 üreticileri için duyarlılık %96,7'ye yükselirken VIM ve NDM üreticilerinde bu değer %100 olmuştur. Çalışmamızda PFGE ile incelenen izolatlar arasında K.pneumoniae türündeki 10 izolat aynı PFGE paternine sahip bulunmuş ve pulsotip B olarak isimlendirilen bu izolatlar, izole edildikleri yer, izolasyon tarihleri, antibiyotik direnç paternleri ve taşıdıkları karbapenemaz genleri açısından benzer bulunmuştur ve hastanemiz yoğun bakımlarında ortaya çıkan muhtemel bir salgın olarak değerlendirilmiştir. Çalışmamızda ayrıca polikliniğe başvuran beş hastadan gönderilen klinik örneklerde karbapenemaz genlerine rastlanmıştır. Polikliniğe başvuran hastalarda böyle bir durumun görülmesi, OXA-48 üreticilerinin endemik olduğu ülkemizde karbapenemaz üreticisi Enterobacteriaceae üyelerinin neden olduğu toplum kökenli enfeksiyonların karşımıza çıkabileceğini düşündürmüştür. 
Karbapenemazların hızlı ve doğru tanısı, tedavi stratejilerini belirlemede ve yayılımı önlemede anahtar rol almaktadır. Kombine tedavilerin tercih edildiği karbapenemaz üreticileriyle gelişen enfeksiyonlarda, aminoglikozitler elimizdeki en önemli seçeneklerden biri olarak gözükmektedir. Her ne kadar EUCAST (2015) kılavuzunda önerilmese de OXA-48 üreticilerinin çok yaygın olarak karşımıza çıktığı ülkemizde, karbapenemaz doğrulamasında modifiye Hodge testi yapılması önemli bir alternatif olarak gözükmektedir. Fakat testin özgüllüğü düşük olup yalancı pozitifliklerin olabileceği göz önünde bulundurulmalıdır. Ülkemiz gibi belirli bir karbapenemaz geninin yaygın olduğu bölgelerde, uzun süreli tedaviye rağmen düzelmeyen toplum kökenli enfeksiyonlarda, karbapenemaz üreticisi etkenlerin sorumlu olabileceği akla getirilmelidir.

Abstract:
In this study, it is aimed to obtain national epidemiologic data by examining antibiotic sensitivity patterns and carbepenemase genes for carbapenem-resistant Enterobacteriaceae delivered to Central Laboratory of Ibni Sina Hospital, Faculty of Medicine, Ankara University from various clinics between years 2010 – 2014. Obtained data will provide important contribution for epidemiologic data in Turkey and will be a guiding light on the developmet of the up to date treatmet algorithms.
112 isolates which were collected from various clinics, appeared to be intermediate or resistant to ertapenem as a result of antibiotic susceptibility tests were examined and identified by Phoenix automated microbiology system (Becton Dickinson, USA). All isolates were tested for antibiotic susceptibility by Kirby-Bauer disk diffusion method for 17 following antibiotics (Amoxicillin/Clavulanic Acid (20/10 µg), Piperacillin/Tazobactam 100/10 µg), Cefazolin (30 µg), Cefepime (30 µg), Ceftazidime (30 µg), Cefotaxime (30 µg), Cefoxitin (30 µg), Aztreonam (30 µg), Doripenem (10 μg), Ertapenem (10 µg), Imipenem (10 µg), Meropenem (10 µg), Gentamicin (10 µg), Amikacin (30 µg), Ciprofloxacin (5 µg), Levofloxacin (5 µg), Trimethoprim -Sulfametoxazol (1.25/23.75 µg)). In addition to Kirby-Bauer disk diffusion method, isolates' carbapenem MIC values were determined by gradient diffusion method using ertapenem and meropenem test strips. Modified Hodge test was applied in two ways either with dilution step which is also suggested by CLSI (2015) or skipping this step; and sensitivity and specificity of the test for carbapenemase detection was evaluated. After DNA extraction from the bacterial isolates, 11 acquired carbapenemase genes were examined by polymerase chain reaction. The clonal relationship among the isolates was determined by PFGE method following digestion with Xbal DNA macrorestriction endonuclease.
In our study 112 bacterial isolates were examined and K. pneumoniae appeared to be the majority of isolates (70,5%)  and E. coli (13,4%),  E. cloacae (8,9%),  E. aerogenes (3,6%) and K.oxytoca (3,6%) respectively. OXA-48 gene positivity was found to be the most prevalent. In 83 bacterial isolates (74,1%) OXA-48 was found alone and in other seven (6,3%) it was identified with VIM gene coexistence. Existence of VIM gene was identified in second frequency among the carbapenemase genes, it was found positive in nine bacteria (8%). NDM gene was identified in two bacterial isolates (1,8%). Among all the isolates, cefazolin (100%) and amoxicillin/clavulanic acid  (99,1%) showed highest resistance. Amikacin (19,6%) and gentamicin (29,5%) had lowest resistance rates for antimicrobial agents tested.  Modified Hodge test's sensitivity was 92,6% with 1:10 dilution as suggested by CLSI (2015) and the specifity of the test was 11,1%. Skipping the step of dilution, sensitivity was rised to 96,7% for OXA-48 producers as for VIM and NDM producers this value was 100%. In our study 10 K.pneumoniae isolates had the same PFGE pattern among the isolates, named as pulsotype B, evaluated as a probable intensive care unit outbreak since they carry similar carbapenemase genes and have similar antibiotic resistance patterns, isolation locations and dates. On the other hand carbapenemase genes were seen in the clinical samples collected from five out-patients. We therefore think that community-acquired infections may arise due to carbapenemase producing Enterobacteriaceae in our country where OXA-48 producers are endemic.
Rapid and accurate detection of carbapenemases plays an important role in defining treatment strategies and preventing the spread. Aminoglycoside antibiotics have appeared to be one of the most important alternatives for infections due to carbepenemase producers which are preferred to be treated by combined therapies. Although it is not preferred in EUCAST (2015) guideline, in our country where OXA-48 producers are commonly seen, modified Hodge test has become an important alternative for carbapenemase confirmation. However it should be taken under consideration  its low specificity and that false positivity could occur. In endemic areas for a specific carbapenemase gene, as in our country, it should also be thought that carbapenemase producers may be responsible for community-acquired infections that could not be treated despite long lasting treatments.