Yara iyileşmesine yönelik ekzozom entegre biyoaktif jelatin süngerlerin geliştirilmesi
Development of bioactive gelatin sponges integrated with exosomes for wound healing
Yazar: ELİF CÖNGER
Danışman: PROF. DR. KEZBAN ULUBAYRAM ; DOÇ. DR. NAŞİDE MANGIR
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyomühendislik = Bioengineering

Özet:
Hücrelerarası sinyal iletim aracı olan ekzozomlar, kargolarında taşıdıkları çeşitli biyomoleküller aracılığı ile anjiyogenez, antijen taşıma, apoptoz, pıhtılaşma, hücresel hemostaz, inflamasyon ve hücrelerarası sinyal iletim gibi birçok biyolojik süreçte rol oynamaktadır. Bu etkilerinden dolayı ekzozomlar; nörodejeneratif, kanser ve kardiyovasküler hastalıkların teşhis ve tedavisinde, kemik rejenerasyonunda, ilaç ve aşı araştırmalarında yoğun ilgi görmektedir. Yara iyileşmesinde ise hemostaz, inflamasyon, anjiyogenez, kollajen birikimi, granül doku oluşumu ve epitelizasyon fazlarında etkili olduğu bilinmektedir. Ancak ekzozomların terapötik etki gösterebilmesi için stabilitelerinin ve biyolojik fonksiyonlarının korunması kritik öneme sahiptir. Bu amaçla ekzozomların taşıyıcı sistemlere yüklenerek uygulanması rejeneratif tıp alanında büyük ilgi görmektedir.  Bu tezin amacı yara iyileşmesine yönelik olarak sıçan kemik iliği kök hücre (rt-MKH) kaynaklı ekzozomların jelatin süngerlere yüklenerek biyolojik fonksiyonlarının korunması ve yara bölgesinde uygulama kolaylığı sağlamasıdır. 
Bu amaçla rt-MKH kaynaklı ekzozomlar ultrasantrifüj yöntemi ile izole edilerek partikül boyutları 160-180 nm aralığında bulunmuştur. Ekzozomların CD81 ve CD63 proteinlerini ifade ettiği akış sitometrisi ile tespit edilmiştir. Hücre kaynağı ve kültür koşullarının ekzozom verimine etkisi incelenmiştir. Sıçan yaşının ekzozom veriminde etkili olduğu ve 8 haftalık sıçanlardan elde edilen rt-MKH kaynaklı ekzozom veriminin 5 ve 3 haftalık sıçanlara göre 2 kat fazla olduğu gösterilmiştir. Ayrıca ekzozom içermeyen fetal sığır serumu (Exodep FBS) kullanımı ise FBS'siz ortama göre verimi 2 kat artmıştır (p<0,05). Ekzozomlar, farklı konsantrasyonlarda (0-10 µg/mL) keratinosit hücrelerine (HaCaT) uygulandığında, 0.25 µg/mL konsantrasyonunda hücre proliferasyonunu % 10 artırdığı ve ancak yüksek konsantrasyonlarda (>1 µg/mL) ise anlamlı olarak düşürdüğü gözlenmiştir. rt-MKH kaynaklı ekzozomların hücre migrasyonuna olan  etkisi faklı konsantrasyonlarda (0,25, 1 ve 10 µg/mL) incelenmiş ve 24 saat sonunda insan fibroblast hücrelerine (hFB) 10 µg/mL ekzozom uygulandığında yara alanı %51 oranında azalırken kontrol grubunda ise % 36 oranında azaldığı tespit edilmiştir. HaCaT hücrelerinde ise ekzozomların migrasyona etkisi görülmemiştir. Ekzozomların pro-anjiyojenik etkileri aortik halka ve koryoallantoik membran (CAM) analizleri ile test edilmiş ve ekzozomların endotel filizlenmesini ve yeni damar oluşumunu konsantrasyona bağlı olarak artırdığı izlenmiştir. Ortalama 200–250 µm gözenek çapına ve yüksek su tutma kapasitesine sahip jelatin süngerler dondurarak-kurutma yöntemi ile hazırlanmış ve ekzozomlar jelatin süngerlere yüklenerek biyolojik etkileri araştırılmıştır. CAM analizleri, 5 µg/mL ekzozom entegre edilen jelatin süngerlerin damar yoğunluğunu yaklaşık olarak kontrole göre %50 (p<0,05) oranında artırdığını göstermiştir. Aortik halka deneyinde ise ekzozom entegre jelatin süngerler serbest ekzozomlara göre daha yüksek anjiyojenik yanıt göstermiştir. Sonuç olarak jelatin süngerlerin ekzozom stabilitesini ve biyolojik özelliklerini koruyarak uygulama kolaylığı ile birlikte kronik/kompleks yara tedavisinde etkili bir strateji olacağı sonucuna varılmıştır.

Abstract:
Exosomes are intercellular signal transduction vesicles, that play a role in many biological processes such as angiogenesis, antigen transport, apoptosis, coagulation, cellular hemostasis, inflammation, and intercellular signal transduction through various biomolecules they carry in their cargo. Because of these effects, exosomes gained great interest in the diagnosis and treatment of neurodegenerative, cancer, cardiovascular diseases, bone regeneration, drug and vaccine research. In wound healing, it is known that exosomes are effective in hemostasis, inflammation, angiogenesis, collagen deposition, granule tissue formation, and epithelialization phases. However, preserving their stability and biological functions is critical for exosomes to have a therapeutic effect. For this purpose, the preservation of stability and activity of exosomes by loading them into carrier systems attracts attention in the field of regenerative medicine. The thesis aim is to load rat bone marrow mesenchymal stem cell (rt-MSC) exosomes into gelatin sponges for wound healing, to preserve their biological functions, and provide ease of application in the wound area. For this purpose, exosomes were isolated by ultracentrifugation method from rt-MSC. Particle sizes of exosomes were in the range of 160-180 nm. Also flow cytometry analysis showed that exosomes express CD81 and CD63 proteins. The cell source and culture condition affects on exosome yield were investigated. Results showed that rat age is effective in exosome yield, and exosome yield isolated from 8-week-old rat MSC is two times higher than that of 5- and 3-week-old rats. In addition, the use of exosome-free fetal bovine serum (Exodep FBS) increased exosome yield by two times compared to the medium without FBS (p<0.05). When exosomes were applied to keratinocyte cells (HaCaT) at different concentrations (0-10 µg/mL), cell proliferation increased by 10% at a concentration of 0.25 µg/mL and significantly decreased at higher concentrations (>1 µg/mL). The effect of rt-MSC isolated exosomes on cell migration was investigated at different concentrations (0.25, 1, and 10 µg/mL). At the end of 24 hours, when 10 µg/mL exosome was applied to human fibroblast cells (hFB), the wound area was reduced by 51%, while 36% was in the control group. In HaCaT cells, however, no effect of exosomes on migration was observed. The pro-angiogenic effects of exosomes were tested on the aortic ring and chorioallantoic membrane (CAM) analysis. Exosomes increased endothelial sprouting and new vessel formation in a concentration-dependent manner. Gelatin sponges with an average pore diameter of 200–250 µm and high water absorption capacity were prepared by freeze-drying. The biological effects of exosomes were investigated by loading them into gelatin sponges. CAM analyzes showed that 5 µg/mL exosome-integrated gelatin sponges increased vessel density by approximately 50% (p<0.05) compared to the control. In the aortic ring experiment, however, exosome-integrated gelatin sponges showed a higher angiogenic response than free exosomes. As a result, gelatin sponges would be an effective strategy in chronic/complex wound treatments with ease of application by preserving exosome stability and biological properties.