Cıva (II) iyonuna seçici, merkaptopropiyonik asit ile türevlendirilmiş kromenilyum-siyanin tabanlı yeni bir turn-on floresan sensörün geliştirilmesi
Development of a new – mercury (II) ion selective, chromenyllium-cyanine based turn-on fluorescent sensor derivatived wi̇th mercapto propionic acid
Yazar: VUSLAT BASAN
Danışman: PROF. DR. İSMAİL YILMAZ
İstanbul Teknik Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Kimya = Chemistry
Dizin: Analitik kimya = Analytical chemistry ; Anorganik kimya = Inorganic chemistry ; Kimyasal sensör = Chemical sensor ; Organik kimya = Organic chemistry

Özet:
Hg2+ için floresan bazlı sensörler seçicilikleri, hassasiyetleri, biyouyumlulukları ve tıp alanındaki uygulamaları nedeniyle büyük ilgi görmesine rağmen, bazı sensörler zayıf seçicilik ve hassasiyetin yanı sıra girişim, yavaş yanıt, suda düşük çözünürlük ve kısa emisyon dalga boyunda çalışma gibi bazı dezavantajlar göstermektedir. Ayrıca, Hg2+ iyonuna karşı seçici olduğu bildirilen sensörlerin çoğu görünür bölgede (400-650 nm) emisyon ve absorpsiyon göstermektedir. 
Yakın kızılötesi bölgede çalışan kemosensör platformlarından biri olan kromenilyum-siyanin boyaları, son yıllarda güçlü floresan özellikleriyle dikkat çekmektedir. Yakın kızılötesi bölgede verdiği absorpsiyon ve emisyonundan dolayı, derin doku penetrasyonu, düşük fotohasarı ve otofloresan arka plan gürültüsünden uzak olması nedenleriyle, özellikle hücre içi çalışmalarda hassas analizi mümkün kılar. Kromenilyum siyanin molekülleri birçok yönden rodaminlerden üstündür. Bunlardan biri ve en önemlisi, rodaminler genellikle görünür bölgede (500-600 nm) absorpsiyon ve emisyon gösterirken, kromenilyum siyanin molekülleri NIR (yakın kızılötesi) bölgesinde (>700 nm) hem absorpsiyon hem de emisyon gösterir. Bu nedenle, geleneksel rodamin boyalarına göre daha büyük absorpsiyon uzatma katsayıları, yüksek floresan kuantum verimlilikleri ve yüksek parlaklık gibi üstün özelliklere sahip olabilirler. Bir diğeri, kromenilyum siyanin molekülleri, karboksilik asit tarafından kontrol edilen floresans açma-kapama mekanizmasına sahipken, rodaminlerde benzer bir mekanizma bulunmayabilir. Özetle, kromenilyum siyanin molekülleri, canlı hücrelerde floresan görüntüleme uygulamaları için potansiyel olarak daha uygun olabilirken, rodaminler genellikle diğer uygulamalarda kullanılır. Bu farklar, kromenilyum siyanin moleküllerinin biyolojik görüntüleme alanında rodaminlere göre avantajlı olabileceğini göstermektedir. Rodamin boyalarla  benzer spirolaktam halka açılma ve kapanma mekanizmasına sahip olan kromenilyum-siyanin boyaları türevleri uygun koşullarda halka kapalı formda iken katyon, anyon gibi bir analit varlığında halka yapısı kırılıp tüm molekül boyunca uzun dalga boylu emisyona sahip olmasını sağlayan konjugasyon artışı meydana gelir. Bu modifikasyon, tüm molekül boyunca uzun dalga boylu emisyona neden olur. Buna ek olarak, bir analit varlığında, rodamin ve kromenilyum siyanin bazlı sensörlerin halka açma ve kapama mekanizması benzer şekilde çalışmasına rağmen, rodamin boyaları görünür bölgede çalışır ve bu da onları biyolojik uygulama için çok kullanışlı hale getirmez.
Cıva (Hg), ilaç sentezi ve elektronik ürünlerin üretimi, beyazlatıcı kozmetikler ve diş amalgamı dahil olmak üzere birçok alanda yaygın olarak kullanılmasına rağmen, insan sağlığına ve çevreye ciddi zararlar veren toksik bir metaldir. Yeryüzünde doğal olarak bulunmasının yanı sıra, altın madenciliği, petrol rafinerileri, termik enerji üretimi, su arıtma ve atık yakma tesisleri gibi endüstriyel faaliyetler de cıva kirliliğine ve birikimine neden olarak çevre için ciddi bir tehdit oluşturabilir ve toprağa, suya ve biyolojik çeşitliliğe zarar verebilir. Cıvanın toksisitesi maruziyetin şiddetine ve cıva formuna (organik, inorganik ve metalik) bağlı olarak değişebilir. Cıvanın organik formları inorganik cıva tuzlarından çok daha toksiktir çünkü ppm seviyelerinde bile hücre zarına kolayca nüfuz edebilir, kan-beyin bariyerini geçebilir ve güçlü lipid çözünürlükleri nedeniyle doğrudan olumsuz sonuçlara neden olabilirler. Ancak inorganik cıva kolaylıkla daha zehirli olan organik cıvaya dönüşebilir. İnorganik cıvanın dönüşümü ile oluşan organik cıvanın iyi bilinen bir formu olan metil cıva, 1950'lerde Japonya'da bir su hastalığı salgınına neden olmuştur. Cıva, kaynağı ne olursa olsun tatlı su ve deniz ekosistemlerine girdikçe besin zinciri boyunca birikir ve Hg2+ içeren endüstriyel atıklar nedeniyle karasal ekosistemlerdeki mahsuller boyunca birikir. Besin zincirinin en tepesinde yer alan insanlar en çok zarar görmektedir, bu nedenle kontamine olmuş gıdaların tüketimi insan sağlığını ciddi şekilde etkilemektedir, Japonya'daki Minamata hastalığı ve Irak'taki salgın iyi bilinen örneklerdir. ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA), ciddi toksisitesi nedeniyle içme suyunda izin verilen maksimum inorganik cıva seviyesini 2 ppb (10 nM) olarak belirlemiştir. Cıva su, toprak ve hava gibi çeşitli yollarla yayılarak biyolojik birikime neden olur ve maruziyeti insanlarda sinir sistemi ve beyin, böbrek hasarı, kanser ve üreme sorunları gibi çeşitli hastalıklara neden olabilir. Hg2+ katyonunun yüksek elektrofilik etkisi nedeniyle, fizyolojik süreçlerde hayati rol oynayan merkapto, amino, karbonil ve karboksil gibi gruplara karşı yüksek bir afinite gösterir ve bu grupları içeren biyoaktif gruplarla kolaylıkla reaksiyona girmektedir. Örneğin, Hg2+ katyonunun in vivo redoks düzenleme sürecine katılması için genellikle aktif bölge görevi gören merkapto gruplarıyla güçlü bir şekilde birleşebilir. Dahası, güçlü bir elektrofil olarak, DNA iplikçik kırılmalarına neden olur ve reaktif oksijen salınımını tetikleyerek vücutta bir bozukluğa neden olur. İnsanlara ve çevreye verdiği bu zararlar nedeniyle tespiti büyük önem taşımaktadır.
Cıva analizinde atomik absorpsiyon spektroskopi (AAS), X-ray floresan, indüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (ICP-MS) gibi yöntemler kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin kullanılması için eğitimli operatörlere ihtiyaç duyulmakta ve uzun hazırlık prosedürleri gerektirmektedir. Daha da önemlisi bu yöntemler anlık/saha ölçümleri için pratik değildir. Cıva tayini için klasik yöntemlerde karşılaşılan bu eksiklikler yeni geliştirilen kemosensörlere dayalı spektrofotometrik yöntemlerin geliştirilmesiyle aşılmıştır. Özellikle bu sensörlerin cıvayı seçici, hassas, hızlı şekilde tespit edebilmesi ve anlık/saha ölçümleri için kullanışlı olması nedeniyle sıklıkla tercih edilmektedir.  
Bu çalışmada, merkaptopropiyonik asit ile türetilen yakın kızılötesi bölgede çalışan kromenilyum-siyanin tabanlı bir kemosensör (NIR8) sentezlenmiş ve FT-IR, 1H-NMR, 13C-NMR ve HRMS yöntemleri ile başarılı bir şekilde karakterize edilmiştir. Hg2+ katyonuna karşı yüksek seçiciliğe sahip olan sensörün tespit limiti UV-Gör ve floresan spektroskopisi titrasyon çalışmaları neticesinde, sensörün (NIR8) sırasıyla 2,01 × 10-7 - 1,29 × 10-4 M, 9.81 × 10-5 - 1.52 × 10-4 M aralığında doğrusallığı elde edilmiş ve Hg2+ katyonuna karşı yüksek seçiciliğe sahip olan sensörün tespit limiti bu spektroskopik yöntemler ile sırasıyla 4,93 × 10-8 M (9,86 ppb) ve 1,13 × 10-8 M (2,26 ppb) olarak bulunmuştur. Ayrıca, akıllı telefonla yapılan titrasyon çalışması için doğrusal aralık 2,92 × 10-5 M - 1,16 × 10-4 M olarak ölçülmüştür. Çeşme, musluk ve göl suyu gibi gerçek numunelerde cıva tespit analizleri UV-Gör ve floresan spektroskopisi yöntemleriyle birlikte akıllı telefon ile kolorimetrik olarak yapılmıştır. Ayrıca Job's Metodu sonuçlarına göre sensör ile Hg2+ arasındaki reaksiyon stokiyometrisi 1:1 olarak bulunmuştur. Bağlanma reaksiyonunun analiz sonuçları sayesinde ise sensörün bir kemodozimetre olduğu anlaşılmıştır. Bir sensörün algılama yeteneklerini gösteren gerçek hayat uygulamasına sahip olması mantıklıdır. Bu bağlamda, UV Görünür ve floresan spektroskopik yöntemlerin yanı sıra, NIR8'in bir akıllı telefon kullanarak musluk, göl ve içme suyu gibi gerçek su örneklerinde Hg2+ katyonunu yüksek geri kazanım sonuçlarıyla tespit edebilmesi, NIR8'in gerçek hayat örneklerinde iyi bir uygulanabilirliğe sahip olduğunun kanıtıdır. Tüm bu özelliklerin, çeşitli zorlukların üstesinden gelmeye olanak tanıyan tek bir sensörde birleştirilmesi, bu sensörü yetkin kılmaktadır.

Abstract:
Although fluorescence-based sensors for Hg2+ have attracted much attention due to their selectivity, sensitivity, biocompatibility and applications in medicine, some sensors show poor selectivity and sensitivity, as well as some drawbacks such as interference, slow response, low solubility in water and operation at short emission wavelength. Moreover, most of the sensors reported that selective to Hg2+ ion show emission and absorption in the visible region (400-650 nm). 
Chromenyllium cyanine dyes, which are a platform that have recently gained attention among chemosensors operating in the near-infrared region, have strong fluorescence properties as well as deep tissue penetration due to absorption and emission in the near-infrared region, low photo damage and being away from autofluorescent background noise, especially in intracellular studies. These features of chromenyllium cyanine allow precise analysis. Chromenyllium cyanine molecules are superior to rhodamines in many ways. One of them, and the most important one, is that while rhodamines generally show absorption and emission in the visible region (500-600 nm), chromenyllium cyanine molecules show both absorption and emission in the NIR (near infrared) region (>700 nm). Thus, they may have superior properties over conventional rhodamine dyes, such as larger absorption extension coefficients, high fluorescence quantum efficiencies and high brightness. Another is that molecules have a fluorescence on-off mechanism controlled by carboxylic acid, whereas rhodamines may not have a similar mechanism. In summary, chromenyllium cyanine molecules may potentially be more suitable for fluorescence imaging applications in living cells, while rhodamines are often used in other applications. These differences suggest that chromenyllium cyanine molecules may have an advantage over rhodamines in the field of biological imaging. Having the same spirolactam ring opening and closing mechanism as rhodamine dyes, these chemosensors are in ring-closed form when synthesized. In the presence of an analyte such as a cation or anion, the ring structure is broken and conjugation increase occurs, which ensures long wavelength emission caused by long pi bond conjugation  throughout the entire molecule. This modification results in long-wavelength emission across the entire molecule. In addition, in the presence of an analyte, the ring opening and closing mechanism of rhodamine and chromenylium cyanine-based sensors work similarly, whereas rhodamine dyes operate in the visible region, making them not very useful for biological application. 
Although mercury (Hg) is widely used in many fields, including pharmaceutical synthesis and the manufacture of electronic products, whitening cosmetics and dental amalgam, it is a toxic metal that causes serious harm to human health and the environment. In addition to being found naturally on earth, industrial activities such as gold mining, oil refineries, thermal power generation, water treatment and waste incineration plants can also cause mercury pollution and accumulation, posing a serious threat to the environment and harming soil, water and biodiversity. The toxicity of mercury can vary depending on the severity of exposure and the form of mercury (organic, inorganic and metallic). Organic forms of mercury are much more toxic than inorganic mercury salts because, even at ppm levels, they can easily penetrate the cell membrane, cross the blood-brain barrier and cause direct adverse consequences due to their strong lipid solubility. However, inorganic mercury can easily be converted into the more toxic organic mercury. Methylmercury, a well-known form of organic mercury formed by the transformation of inorganic mercury, was the causative agent in an outbreak of watery disease in Japan in the 1950s. Mercury accumulates along the food chain as it enters freshwater and marine ecosystems regardless of its source and is deposited along crops in terrestrial ecosystems due to industrial wastes containing Hg2+. Humans at the top of the food chain suffer the most, so the consumption of contaminated food seriously affects human health, with Minamata disease in Japan and the outbreak in Iraq being well-known examples. The US Environmental Protection Agency (EPA) sets the maximum allowable level of inorganic mercury in drinking water at 2 ppb (10 nM) due to its serious toxicity. Mercury spreads in various ways such as with water, soil and air, causing bioaccumulation, and its exposure can cause various diseases in humans such as nervous system and brain, kidney damage, cancer and reproductive problems. Due to the high electrophilic effect of the Hg2+ cation, it shows a high affinity for groups such as mercapto, amino, carbonyl and carboxyl, which play a vital role in physiological processes, and easily reacts with bioactive groups containing these groups. For example, it can strongly associate with mercapto groups, which often serve as the active site for the Hg2+ cation to participate in the redox regulation process in vivo. Moreover, being a strong electrophile, it causes DNA strand breaks and triggers the release of reactive oxygen, resulting in a disorder in the body. Due to these harms to humans and the environment, its detection has great importance.
Methods such as atomic absorption spectroscopy (AAS), X-Ray fluorescence, inductively coupled plasma and mass spectrometry (ICP-MS) are used in mercury analysis. However, using these methods requires trained operators and time-consuming preparation procedures. More importantly, these methods are not practical for on-site measurements. These shortcomings encountered in classical methods for Hg2+ ion determination have been overcome with the development of spectrophotometric methods based on newly constructed chemosensors. In particular, these sensors are frequently preferred because they can detect Hg2+ ion selectively, sensitively and quickly, and are useful for on-site measurements.
In this study, a chromenyllium-cyanine based chemosensor operating in the near infrared region derived with mercapto propionic acid was synthesized and characterized successfully by FT-IR, 1H-NMR, 13C-NMR and HRMS methods. Titration studies of UV-Vis and fluorescence spectroscopy demonstrated that the prob (NIR8) works properly in the range 2,01 × 10−7 - 1,29 × 10−4 M, 9,81 × 10−5 - 1,52 × 10−4 M, and limit of detection of the prob which has high selectivity towards Hg2+ was found with these spectroscopy methods as 4,93 × 10-8 M (9.86 ppb) and 1,13 × 10-8 M (2.26 ppb), respectively. Moreover, the linear range was measured as 2,92 × 10-5 M to 1,16 × 10-4 M for the titration study done by smartphone. In real samples such as tap, lake and drinking water, mercury detection analyzes were made colorimetrically with a smartphone, together with UV-Vis and fluorescence spectroscopy methods. In addition, according to Job's Method results, reaction stoichiometry between the prob and Hg2+ as 1:1. It is understood that the prop is a chemodosimeter because of the analysis results of the binding reaction. It makes sense for a sensor to have a real-life application demonstrating its detection capabilities. In this context, besides UV-Visible and fluorescence spectroscopic methods, NIR8's ability to detect Hg2+ cation in real water samples such as tap, lake and drinking water with high recovery results using a smartphone is proof that NIR8 has good applicability in real life examples. It is important that all these features are combined in a single sensor that allows to overcome the various challenges that makes this sensor adequate.