Miyeloproliferatif neoplazilerde asxl1 gen mutasyonlarının klinik seyir ve prognoza etkisi
The affect of asxl1 gene mutations on clinical course and prognosis of myeloproliferative neoplasms
Yazar: NESLİHAN USLU
Danışman: PROF. DR. REYHAN DİZ KÜÇÜKKAYA
İstanbul Bilim Üniversitesi / Tıp Fakültesi / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Hematoloji = Hematology
Dizin: Birincil miyelofibroz = Primary myelofibrosis ; Genler = Genes ; Kemik iliği hastalıkları = Bone marrow diseases ; Miyeloproliferatif hastalıklar = Myeloproliferative disorders ; Mutasyon = Mutation ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polisitemia vera = Polycythemia vera ; Prognoz = Prognosis

Özet:
Amaç: Kronik miyeloproliferatif neoplaziler (MPN), kemik iliğinde her üç hücre serisinde klonal çoğalmayla karakterize hastalıklar grubunu oluşturur. Bu hastalık grubunda yer alan kronik miyeloid lösemi (KML), 'Philedelphia kromozomu' ve bunun onkogeni BCR-ABL pozitif klondan gelişir, farklı klinik özelliklere sahiptir. Ph (-) MPN başlıca; esansiyel trombositemi (ET), polistemia vera (PV) ve primer miyelofibrozis (PMF) olarak gruplandırılır. PV, eritrosit kitlesinde artış, ET, trombosit sayısında artış, PMF ise kemik iliğinde fibrozis ile karakterizedir. 2005 yılında tanımlanan JAK-2 V617F mutasyonu ile PV hastalarının %95-98'inde, ET ve PMF hastalarının %50'sinde klonal gelişimi göstermek mümkün olmuştur. Daha sonra PV'de JAK2 exon-12 mutasyonları, PMF ve ET'de MPL W515L/K ve CALR (kalretikülin) mutasyonları tanımlanmıştır. MPN hastalarında olduğu gösterilen mutasyonlardan biri de ASXL1 gen mutasyonlarıdır. ASXL (Additional sex comb like) 1, ASXL (Additional sex comb like) 2 ve ASXL (Additional sex comb like) 3 ile birlikte HOX genini baskılayan Asx (Drosophilia melanogaster additional sex combs) geni ile ilişkilidir. ASXL1 gen mutasyonları  genelde çerçeve kayması mutasyonları şeklinde olup, genin 12. eksonunda yer alırlar ve genellikle karboksi terminalinde PHD (plant homeofinger domain) kaybı ile kendilerini gösterirler. ASXL1 gen mutasyonları PV'de % 2-7, ET'de % 0-10, PMF'de % 13-32 oranında bildirilmiştir. ASXL1 gen mutasyonlarının miyeloproliferatif neoplazilerin patogenez ve kanser biyolojisinde önemli değişiklikler yaptığı düşünülmektedir. Bu mutasyonların hastalık seyrinde olumsuz etkilerinin olduğunu, bu nedenle mutasyon saptanan hastalarda daha agresif tedavi yaklaşımlarının gerektiğini ileri süren çalışmalar mevcuttur. Bu çalışmada T.C. İstanbul Bilim Üniveristesi Hematoloji Bilim Dalı Polikliniği'nde takip edilmekte olan 103 Ph(-) MPN hastasında ASXL1 gen mutasyonlarının sıklığı incelenerek, bu mutasyonların hastalığın klinik seyir ve prognozuna etkisi araştırılmıştır.
Gereç ve Yöntem: Çalışmaya toplam 103 Ph(-) MPN hastası dahil edilmiştir. Bu çalışma için İstanbul Bilim Üniversitesi Klinik Araştırmalar Etik Kurulu'ndan onay alınmıştır. Hastalardan bilgilendirilmiş onay alındıktan sonra, rutin poliklinik kontrolleri sırasında alınan kan sayımı örnekleri kullanılarak DNA dizi analizi yöntemi ile ASXL1 gen mutasyonları taranmıştır. İstatistiksel analizlerin değerlendirilmesinde ki-kare, Fisher gerçeklik testi, odds ratio (OR) değerleri, Tukey çoklu karşılaştırma testleri kullanılmıştır.
Bulgular: ASXL1 gen mutasyonları; kohortumuzda 6 hastada saptanmıştır (%5,8). Bu mutasyonlar ET hastalarının %6,25'inde (3/48), PV hastalarının %4,35'inde (2/46) ve PMF hastalarının %11,11'inde (1/9) bulunmuştur. ASXL1 gen mutasyonları olanlarda kadın-erkek oranı eşit bulunmuştur. ASXL1 geninin 12. eksonu tarandığında en sık c.1934dupG (p.g646TrpfsX12) mutasyonuna (4 hasta, %66,66), ikinci sıklıkta ise c.1954G.a (p.G652S) mutasyonuna (2 hasta, %33,33) rastlanmıştır, bu mutasyonlar ASXL1'in en sık görülen mutasyonlarıdır. ASXL1 c.1934 dupG (p.g646TrpfsX12) mutasyonu ET tanılı hastaların 3'ünde (%6,25), PV tanılı hastaların 1'inde (%2,22); c.1954g.a (p.G652S) mutasyonu PV tanılı hastaların 1'inde (%2,17) ve PMF tanılı hastaların 1'inde (%12,5) saptanmıştır. ASXL1 gen mutasyonları olanlarda başlangıç hemoglobin ve trombosit ortalama değerleri daha yüksek, başlangıç lökosit ve nötrofil ortalama değerleri daha düşük bulunmuştur. ASXL1 gen mutasyonları olanlarda splenomegali oranları, olmayanlara oranla daha düşük bulunmuştur. ASXL1 gen mutasyonları bulunan grupta tromboz (özellikle arter trombozu) oranlarının daha yüksek olduğu anlaşmıştır. Ortalama takip süresi 4,1 yıl olan MPN grubumuzda hematolojik olmayan kanser oranları (solid tümör) oldukça yüksek bulunmuştur (%14,5). Bu hastaların % 80'inde JAK-2 V617F mutasyonu mevcuttur. JAK-2 V617F mutasyonu pozitif hastaların 2 tanesinde ayrıca ASXL1 c.1954G.a (p.G652S) gen mutasyonu da bulunmaktadır.
Sonuç:	 ASXL1 gen mutasyonları, litaretür verileri ile benzer şekilde ET ve PV'ye kıyasla PMF hastalarında daha yüksek oranda saptanmıştır. ASXL1 gen mutasyonları olanlarda, olmayanlara kıyasla yaş ortalaması daha yüksek bulunmuştur. Kohortumuzda ASXL1 geninin en sık mutasyonları olan c.1934dupG (p.g646TrpfsX12) (4/6) ve c.1954G.a (p.G652S) (2/6) mutasyonları saptanmıştır. ASXL1 gen mutasyonları bulunanlarda tromboz (özellikle arter trombozu) oranları daha yüksek saptanmıştır. Kohortumuzda, hematolojik olmayan kanser oranları (solid tümör) oldukça yüksek bulunmuştur (%14,5). Hastaların % 80'inde JAK-2 V617F mutasyonu mevcuttur. JAK-2 V617F pozitif hastaların 2 tanesinde de ayrıca ASXL1 c.1954G.a (p.G652S) mutasyonu olması dikkat çekici bulunmuştur. Kohortumuzda beş hastada önce MPN tanısıyla hidroksiürea kullanımı ve takibinde hematolojik olmayan kanser tanısı bulunması hidroksiürea kullanımının hematolojik olmayan kanser gelişimine sebep olabileceğini düşündürmektedir. Öte yandan iki hastada ise MPN tanısı aldıktan sonra hidroksiürea kullanmadığı halde sekonder kanser gelişmiş olması hidroksiürea dışında başka faktörlerin de hematolojik olmayan kanser gelişiminde etkili olabileceğini düşündürmektedir.

Abstract:
Aims: Chronic myeloproliferative neoplasms (MPN) are a group of disorders characterized by clonal proliferation in all three cell lines. One of the disorder in this group, namely chronic myelogenous leukemia (CML), develops from Philadelphia chromosome and its oncogene BCR-ABL. CML has different clinical features. Ph (-) MPN is grouped as primary polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF). While increased red blood cell mass is defined as PV, increased number of platelets is called ET. PMF is characterized by the increased bone marrow fibrosis. In 2005 with the definition of the JAK-2 V617F mutation, it became possible to demonstrate the clonal growth in 95-98% of patients with PV, and almost 50% of patients with ET and PMF. Later on, JAK exon 12 mutations in PV patients, MPL W515L/K and CALR (calreticulin) mutations have been identified in ET and PMF patients. One of the mutations shown in MPN patients is the ASXL 1 gene mutations. ASXL 1 (Additional sex comb like1), ASXL 2 ( Additional sex comb like 2) and ASXL 3 (Additional sex comb like 3) are associated with gene Asx (Drosophila melanogaster additional sex combs) which suppresses the HOX gene. ASXL1 gene mutations are generally present in the form of shift mutations located in exon 12 of the gene and have the loss of PHD (plant homeofinger domain) at the carboxy terminus. The incidence of ASXL 1 gene mutations are in PV 2-7%, in ET 0-10%, in PMF 13-32%. ASXL1 gene mutations make some changes in the pathogenesis and cancer biology of myeloproliferative disease. The mutations are negatively impact the prognosis and some studies suggest a more aggressive therapeutic approach in patients who have ASXL1 gene mutations. In this study, we investigated the frequency of ASXL1 gene mutations of 103 Ph(-) MPN patients and how ASXL1 gene mutations affect clinical course and prognosis of the patients followed in T.C. Istanbul Bilim University Department of Hematology.

Materials and Methods : Totaly 103 MPN patients were enrolled in this study. This study was approved by the Clinical Research Ethics Committee of Istanbul Bilim University. After obtaining informed consent from the patients, we performed DNA isolation from the blood that were kept in  EDTA tubes. ASXL1 gene mutation analysis were done by DNA sequence analysis method. Results were evaluated and Fisher reality test, chi-square test, odds ratio and Tukey's multiple comparison tests were performed for statistical analysis.
Results: ASXL1 gene mutations were identified in 6 patients in our cohort. These mutations were found as %6,25 (3/48) in ET, %4,35'(2/46) in PV and %11,11(1/9) in PMF patients. When exon 12 of ASXL1 gene mutations were scanned, the most common mutation was c.1934dupG (p.g646TrpfsX12) and the second was c.1954G.a (p.G652S), these are the most common types of ASXL1 gene mutations. The mutation ASXL1 c.1934 dupG (p.g646TrpfsX12) was found in 3 of ET patients (%6,25) and 1 of PV patients (%2,22). The mutation of c.1954g.a (p.G652S) was found in 1 of PV patients (%2,17) and 1 of PMF patients (%12,5). While the average baseline hemoglobin and platelet values were higher, the average baseline neutrophil and leukocytes were lower in the group with ASXL1 gen mutations than the other group. Splenomegaly was found to be lower and the rate of thrombosis (especially arterial thrombosis) was found to be higher in the group with ASXL1 gene mutations. In our cohort that were followed up for 4,1 years, non-hematologic cancer rates (solid tumors) were found to be quite high (%14,5). Eightly percent of these patients have JAK-2 V617F mutation. Two of these patients with JAK-2 V617F mutation have also ASXL1 c.1954G.a (p.G652S) gene mutation.
Conclusion: Consistent with the literature ASXL1 gene mutations are most common in PMF patients than ET and PV patients. The mean age was higher in the group with ASXL1 gene mutations. In our cohort the most common types of in ASXL1 genes were c.1934dupG (p.g646TrpfsX12) (4/6) and c.1954G.a (p.G652S) (2/6). Thrombosis (especially arterial thrombosis) was found to be higher in the patient with ASXL1 gene mutations. In our cohort non-hematologic cancer (solid tumors) rates were found to be higher (%14,5). Two of the patients with non-hematologıc cancer were found to have both JAK-2 V617F gene mutation and ASXL1 c.1954G.a (p.G652S) gene mutation. In our cohort, five of the patients had used hydroxyurea after the diagnosis of MPN and then they had non-hematological cancers. On the other hand, after the diagnosis of MPN disease, two of the patients who did not use hydroxyurea have had non-hematologic cancer (solid tumors). So we suggest that not only using hydroxyurea but also the other factors may cause non-hematologic cancers (solid tumors) in patients with MPN.