Simvastatin jel formunun tavşan kıkırdak blok halindekigreft viabilitesine etkisi /
Yazar: MUTLUHAN TEMİZSOY
Danışman: PROF. DR. BÜLENT SAÇAK
Marmara Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Plastik ve Rekonstrüktif Cerrahi = Plastic and Reconstructive Surgery

Özet:
ÖZET
Giriş ve Amaç
Kıkırdak doku, vücudu şekillendirmeye yardımcı olan ve sonra onu destekleyen temel
biyolojik malzemedir. Kıkırdak, sıkıştırıcı kuvvetlere direnme, kemik esnekliğini artırma ve
esneklik ihtiyacı olan kemikli alanlarda destek sağlama yeteneği dahil olmak üzere birçok
işleve sahiptir.
Kıkırdak greftleri; estetik burun ameliyatları, konjenital ya da edinsel burun
deformitelerinin düzeltilmesi, mikrotia ve diğer kulak deformitelerinin rekonstrüksiyonu gibi
birçok alanda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte kıkırdak dokusunun greft olarak
aktarımında değişik oranda rezorbsiyon gelişebilmektedir. Greft olarak alınan kıkırdaklar %10-
90 oranında canlılığını sürdürebilmektedir. Bununla birlikte kıkırdak greft yaşayabilirliğini
arttırmak adına literatürde birçok çalışma mevcuttur.Kıkırdak greftinin metil selülöz ile
sarılması,fasya ile sarılması gibi birçok birçok yöntem mevcuttur. Bu çalışmalarda anlamlı
sonuçlar bulunsa da pratik uygulamalarda genel olarak kabul görmüş bir yaklaşım
bulunmamaktadır.
Simvastatin, klinik kullanımda anti-hiperlipidemik ilaç grubunda yer alan bir ilaçtır.
Simvastatinin antihiperlipidemik etkilerinin yanı sıra ratlarda anjiogenezi tetiklediğini gösteren
yayınlar yer almaktadır. Ayrıca simvastatinin kemik iyileşmesini arttırdığı ve inflamasyonu
azalttığı gösterilmiştir. Ratlarda simvastatinin enjekte edilebilir formatının minimal invaziv
periosteal distraksiyon üzerinde etkisini inceleyen çalışma da mevcuttur. Bununla birlikte
bilgimiz dahilinde simvastatinin kıkırdak sağ kalımı üzerine etkisini araştıran yeterli çalışma
bulunmamaktadır.
Bu çalışmanın öncelikli amacı; simvastatinin in vivo olarak uygulanabilen jel formatının
geliştirilmesi, ikincil olarak amacı simvastatinin jel formunun blok halindeki kıkırdak greftleri
çevresine uygulanarak, kıkırdak greftlerinin sağ kalımına etkisinin incelenmesidir.

Gereç ve Yöntem
Bu çalışma in vitro ve in vivo olmak üzere iki aşamalı olarak gerçekleştirildi. İn vitro
aşamasında operasyonlar esnasında alınan kıkırdaklardan elde edilen kondroblastlar çoğaltıldı,
simvastatinin kondroblastlar üzerinde toksik dozu tespit edildi ve simvastatinin jel formatı
üretildi.
Bu çalışma in vivo ve in vitro olmak üzere iki aşamalı olarak gerçekleştirildi. Çalışmanın
in vitro aşamasında operasyonlar esnasında alınan kıkırdaklardan elde edilen kondroblastlar in
vitro ortamda çoğaltıldı, simvastatinin kondroblastlar üzerinde toksik dozu tespit edildi ve
simvastatinin jel formatı üretildi.
Çalışmanın in vivo kısmı çift kör randomize bir çalışma olarak tasarlandı. Çalışmada on
iki adet "Yeni Zellanda" cinsi erkek tavşan her grupta 4 tavşan olacak şekilde, toplamda 3 grup
olarak düzenlendi. Bu gruplar:
Birinci grup: Kıkırdak greftlerinin ek bir işlem yapılamdan acılı sahaya nakledildiği
kontrol grubu
İkinci grup: Kıkırdak greftlerinin simvastatin içermeyen jel sürüldükten sonra alıcı sahaya
yerleştirildiği plasebo grubu
Üçüncü grup: Kıkırdak greftlerinin simvastatin içeren jel sürüldükten sonra alıcı sahaya
yerleştirildiği deney grubu
Tavşanlara cerrahi işlem öncesi, intramuskuler ketamin ve ksilazin ile anestezi sağlandı.
Anestezi derinliği parmak kıstırma, ekstremite çekme yanıtı ve kornea refleksi yoluyla kontrol
edildi. Cerrahi işlem sırasında anestezi derinliğini korumak amacı ile gerekli durumlarda
Ketamin uygulamaları tekrar edildi.
Uygun anestezi derinliği sağlandıktan sonra hayvanın her iki kulak ve sırt bölgesi tıraş
edilerek operasyon masasına yüzüstü yatırıldı. Cerrahi alan Povidon iyot %10 çözelti ile
silinerek antisepsi sağlandı ve steril örtüm uygulandı.
Tavşanların her iki kulağında dorsal yüzde, orta hat boyunca uzanan arter lateralinde
kalacak şekilde 2 cm uzunluğunda vertikal insizyon ile 2×1 cm boyutunda kıkırdak grefti

deperikondriye şekilde elde edildi. Greft dönor alan insizyonları kanama kontrolü sağlandıktan
sonra 4/0 monoflaman polypropylene sütür materyali ile basit sütüre edildi.
Kıkırdak greft dönor alanları için sırtta interskapular bölgede orta hattın 1cm sağ ve sol
tarafında subkutan cepler oluşturuldu. Kontrol grubundaki kıkırdak greftleri ek bir işleme tabi
tutulmadan oluşturulan ceplere yerleştirildi. Plasebo grubu ve simvastatin jel grubundaki
deneklerde kıkırdak greftlerine 1cc jel sürüldü. Deney grubundaki jeller % 1.5 simvastatin
içermektedir. Greftler jel ile birlikte oluşturulan ceplere yerleştirildi. Kesiler 3/0 monoflaman
polypropylene sütür materyali ile horizontal matris yöntemi ile sütüre edildi. Cerrahi süreci
takiben tavşanların tekli kafeslerde uygun koşullarda bakımı ve beslenmesi sağlandı.
Her grupta yer alan deneklerin yarısı dördüncü haftanın sonunda, diğer yarısı ise on ikinci
haftanın sonunda sakrifiye edilerek kıkırdak greftleri alındı. Greft materyalleri Marmara
Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı'nda histopatolojik ve immünokimyasal
olarak değerlendirildi. Alınan kıkırdak dokusu örneklerinde kondrosit nükleus sayısı, kartilaj
matrix metakromazisi, periferal proliferasyon, fibrozis, vasküler proliferasyon, inflamatuar
değişiklikler ve kemik metaplazisi incelendi.
Verilerin istatistiksel analizleri GraphPad Prism (versiyon 8.0; GraphPad Software, ABD)
ile gerçekleştirilmiştir. Verilerin normal dağılıma uygunluğu Kolmogorov Smirnov testi ile
incelendi. Verilerin normal dağılım analizinde gruplardan en az birinin normal dağılım
göstermediği tespit edildi. Bu sebeple verilerin analizleri Kruskal-Wallis testini takiben
Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi ile gerçekleştirildi. Kantitatif verilerin ifade edilmesinde
ortalama ± standart sapma (s.s.). P<0,05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

Bulgular
Kontrol grubunda 4hafta ve 12 hafta sonucunda alınan örneklerde ciddi düzeyde periferal
kıkırdak hücre proliferasyonu, sağlıklı kıkırdak hücreleri izlendi. İnflamatuar hücre
infiltrasyonu, vaskülarizasyon görülmedi. Kemik metaplazisi görülmedi. Masson-trikrom
boyamada fibrozis görülmedi. İmmunohistokimyasal çalışmada ise geçdönemde 1 denek hariç
kuvvetli glial fibrilik asit (GFAP) pozitif boyanma gözlendi.
Plasebo grubunda erken dönemde periferal kıkırdak hücre proliferasyonu ve sağlıklı
kıkırdak hücrelerinde belirgin azalma olduğu görüldü. Yoğun ve şiddetli inflamatuar hücre

infiltrasyonu, yoğun düzeyde vaskülarizasyon izlendi. Orta derecede fibrosiz ve kuvvetli GFAP
pozitif boyaması görüldü. Geç dönemde ise alınan örneklerde kıkırdak dokusu görülmedi.
Deney grubunda ise erken dönemde periferal kıkırdak hücre proliferasyonu ve sağlıklı
kıkırdak hücrelerinde belirgin azalma olduğu görüldü. Yoğun ve şiddetli inflamatuar hücre
infiltrasyonu, yoğun düzeyde vaskülarizasyon izlendi. Orta derecede fibrosiz ve kuvvetli GFAP
pozitif boyaması görüldü. Geç dönemde alınan örneklerde bazı örneklerde benzer bulgular
görüldü, bazı örneklerde ise kıkırdak dokusunun tamamen destrukte olduğu görüldü.
Tartışma ve Sonuç:
Çalışmamızda, simvastatinin jel formatının kıkırdak grefti sağ kalımı üzerine olan etkisi
incelendi.
Çalışmanın sonucunda kondrosit nükleus sayısı, kartilaj matriks kromazisi ve periferal
proliferasyon kontrol grubunda diğer gruplara kıyasla anlamlı olarak yüksek bulunurken;
inflamasyon, vaskularizasyon ve fibrosiz plasebo ve simvastatin grubunda kontrol grubuna
göre anlamlı olarak yüksek bulunmuştur. Plasebo ve simvastatin grupları arasında bu değerler
açısından anlamlı fark bulunmamaktadır. Bununla birlikte kemik metaplazisi ve GFAP
immünreaktivitesi skoru açısından tüm gruplar arasında anlamlı fark bulunmamıştır.
Literatürde yer alan çalışmalar ile bizim çalışmamız sonuçları arasında bazı benzerlikler
ve farklılıklar bulunmaktadır. Bizim çalışmamızda simvastatin inflamasyonu, vaskularizasyonu
ve fibrosizi arttırdığı sonucu çıkmıştır. Ancak literatür bulguları simvastatinin inflamasyonu
azalattığı ve vaskularizayonu arttırdığı yönündedir. Bununla birlikte çalışmamızdaki bu
değişikliklerin simvastatinin kendi etkisi ile değil de enfeksiyona sekonder olarak meydana
gelen değişiklikler olduğu düşünülmektedir.
Kontrol grubunda kıkırdak greft sağ kalımının devam etmesine rağmen, diğer gruplarda
kıkırdak greftlerinin tamamen rezorbsiyona uğraması enfeksiyon, jelin kıkırdak grefti
çevresinde inlamasyonu tetiklemesi ya da jel tabakanın kıkırdak greft çevresinde difüzyonu
engelleyerek greft beslenmesine engel olabilmesi nedeniyle olabileceğini düşündürmektedir.
Sebep bunlardan biri ya da kümülatif etkisi olabilir.

Simvastatinin jel formunun kıkırdak sağ kalımına etkisini değerlendirecek çalışma
yapılmamıştır. Bu nedenle bu çalışma bundan sonra bu konuda yapılacak çalışmalar için fikir
verici bir çalışma niteliğindedir.
ANAHTAR SÖZCÜKLER: Kıkırdak, kıkırdak grefti, kıkırdak grefti sağ kalımı,
simvastatin, simvastatin jel formu

Abstract:
SUMMARY
Introduction and purpose
Cartilage tissue is the basic biological material that helps shaping and supporting the body.
Cartilage has many functions, including the ability to resist compressive forces, increase bone
flexibility, and provide support in bony areas that need flexibility.
Cartilage grafts ; It is widely used in many areas such as aesthetic nose surgeries, correction
of congenital or acquired nasal deformities , reconstruction of microtia and other ear deformities
. However, different rates of resorption may develop in the transfer of cartilage tissue as a graft
. Cartilage graft can maintain its vitality at a rate of 10 -90%. However, there are many studies
in the literature that aim to increase cartilage graft viability. There are several methods for
wrapping the graft ranging from methyl cellulose to fascia . Although there are significant
results in these studies, there is no generally accepted approach in practical applications.
Simvastatin is a drug in the anti- hyperlipidemic drug group in clinical use . In addition to
the antihyperlipidemic effects of simvastatin, there are publications showing that it triggers
angiogenesis in rats. Furthermore, it has been shown that simvastatin increases bone healing
and reduces inflammation. There is also a study that examining the effect of the injectable form
of simvastatin on minimally invasive periosteal distraction in rats. However, according to our
knowledge, there are not enough studies investigating the effect of simvastatin on cartilage
survival.
The primary aim of this study; the development of a gel form of simvastatin that can be
administered in vivo, and the secondary aim is investigating the effect of the gel form of
simvastatin on the survival of cartilage grafts, by applying it around cartilage grafts in block
forms.

Materials and Methods
This study was carried out in two stages, in vivo and in vitro. In the in vitro phase of the
study, the chondroblasts obtained from the cartilages were augmented in vitro, the toxic dose
of simvastatin on chondroblasts was detected and a gel format of simvastatin was produced.
The in vivo part of the study was designed as a double-blind randomized trial. Twelve
"New Zealand " male rabbits were arranged as 3 groups in total, with 4 rabbits in each group.
These groups are:
First group: Control group in which cartilage grafts are transplanted to the recipient site
without any additional operation.
Second group: Placebo group in which cartilage grafts were placed in the recipient site
after application of a simvastatin-free gel
Third group: Experimental group in which cartilage grafts were placed in the recipient site
after applying gel containing simvastatin
Rabbits were anesthetized with intramuscular ketamine and xylazine before the surgical
procedure. The depth of anesthesia was checked by finger pinch, limb pull response and corneal
reflex. Ketamine applications were repeated when necessary in order to maintain the depth of
anesthesia during the surgical procedure.
After providing the appropriate depth of anesthesia, both ears and dorsal region of the
animal were shaved and the animal was placed face down on the operation table. Antisepsis
was achieved by wiping the surgical field with Povidone iodine 10% solution and sterile
dressing was applied.

In the dorsal side of both ears of the rabbits, a 2 cm long vertical incision which is lateral
to the artery running along the midline was made, and a 2×1 cm cartilage graft was obtained
deperichondrially. Graft donor site incisions were simply sutured with 4/0 monoflaman
polypropylene suture material after controlling bleeding.
For the cartilage graft donor sites, subcutaneous pockets were created 1 cm to the right and
left sides of the midline in the interscapular region on the back. Cartilage grafts in the control
group were placed in the pockets that created, without any additional operation. In the placebo
group and simvastatin gel group, 1cc gel was applied to the cartilage grafts. The gels in the
experimental group contain 1. 5% simvastatin. The grafts were placed with the gel in the
pockets that formed. Incisions were sutured with 3/0 monofilament polypropylene suture
material by using the horizontal matrix method. Following the surgical process, the rabbits were
cared for and fed in single cages under appropriate conditions.
Half of the subjects in each group were sacrificed at the end of the fourth week and the
other half at the end of the twelfth week, and cartilage grafts were removed. The graft materials
were evaluated histopathologically and immunochemically in the Pathology Department of
Marmara University Faculty of Medicine. Chondrocyte nucleus number, cartilage matrix
metachromasia, peripheral proliferation, fibrosis, vascular proliferation, inflammatory changes
and bone metaplasia were examined in the cartilage tissue samples.
Statistical analysis of the data was performed by using GraphPad Prism (version 8. 0;
GraphPad Software, USA). The conformity of the data to normal distribution was examined by
Kolmogorov Smirnov test. In the normal distribution analysis of the data, it was detected that
at least one of the groups did not show normal distribution. For this reason, the data were
analyzed by Dunn's multiple comparison test followed by Kruskal-Wallis test. Mean ± standard

deviation (s.s.). P<0,05 values were considered statistically significant in expressing
quantitative data.
Results
In the samples of the control group which taken at the end of 4. and 12. weeks, peripheral
cartilage cell proliferation and healthy cartilage cells were observed at significant level.
Inflammatory cell infiltration and vascularization were not observed. No bone metaplasia was
observed. Masson-trichrome staining showed no fibrosis. In the immunohistochemical study,
strong glial fibrilic acid (GFAP) positive staining was observed except for 1 subject in the late
period.
In the placebo group, there was a significant decrease in peripheral cartilage cell
proliferation and healthy cartilage cells, in the early period. Intense and severe inflammatory
cell infiltration and dense vascularization were observed. Moderate fibrosis and strong GFAP
positive staining were observed. In the late period, no cartilage tissue was observed in the
samples has been taken.
In the experimental group, a significant decrease in peripheral cartilage cell proliferation
and healthy cartilage cells were observed in the early period. Intense and severe inflammatory
cell infiltration and dense vascularization were observed. Moderate fibrosis and strong GFAP
positive staining were observed. In the specimens that has been taken in the late period; it is
observed that, there were similar findings in some specimens, while the cartilage tissue was
completely destructed in the other specimens.
Discussion and Conclusion:
In our study, the effect of simvastatin gel format on cartilage graft survival was
investigated.

As a result of the study, chondrocyte nucleus number, cartilage matrix chromasia and
peripheral proliferation were significantly higher in the control group compared to the other
groups; inflammation, vascularization and fibrosis were significantly higher in the placebo and
simvastatin groups compared to the control group. There is no significant difference between
placebo and simvastatin groups in terms of these values. Besides, no significant difference was
found between all groups in terms of bone metaplasia and GFAP immunoreactivity score.
There are some similarities and differences between the studies in the literature and the
results of our study. In our study, it was concluded that simvastatin increases inflammation,
vascularization and fibrosis. However, literature findings suggest that simvastatin decreases
inflammation and increases vascularization. However, these changes in our study are thought
to be secondary to the infection and not due to the effect of simvastatin itself.
Although cartilage graft survival continued in the control group; complete resorption of
cartilage grafts in the other groups suggests that, infection may be due to the gel triggering
inflammation around the cartilage graft or the gel layer may prevent graft nutrition by
preventing diffusion around the cartilage graft. The cause may be one of these or the cumulative
effect.
There have been no studies in order to evaluate the effect of the gel form of simvastatin
on cartilage survival. For this reason, this study is a suggestive study for future studies on this
subject.
KEY WORDS: Cartilage, cartilage graft, cartilage graft survival, simvastatin , simvastatin
gel form