MCF-7 ve HepG2 hücre kültürlerinde desferoksamin'in Ndrg1 mRNA varyantları üzerindeki etkilerinin araştırılması
Investigation of the effects of desferoxamine on Ndrg1 mRNA variants in MCF-7 and HepG2 cell lines
Yazar: OSMAN ŞALIŞ
Danışman: PROF. DR. ABDULKERİM BEDİR
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2012
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Antifungal ajanlar = Antifungal agents ; Deferoksamin = Deferoxamine ; Gen ifadesi = Gene expression ; Genler = Genes ; Genler-MYC = Genes-MYC ; Hücre kültürü = Cell culture ; Neoplazm metastazları = Neoplasm metastasis ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction

Özet:
Metastaz supresör gen olarak bilinen N-myc downstream-regulated gene1(Ndrg1), prostat, kolon ve meme kanserlerinde downregüle olurken, karaciğer kanserlerinde upregüle olmaktadır. Yapılan çalışmaların sonuçları Ndrg1 geninin farklı kanser türlerinde farklı şekilde etkilendiğini göstermektedir. Ndrg1 geninin düzenlenmesinde transkripsiyonel, posttranskripsiyonel ve translasyonal mekanizmalar rol almaktadır. Ndrg1 gen upregülasyonu ile metastaz ve tümör hücre büyümesi önemli ölçüde durdurulmakta ancak bunun nasıl gerçekleştiği tam olarak bilinmemektedir. Çalışmamızda biyoinformatik analiz ile Ndrg1 mRNA varyantları için spesifik primer ve problar geliştirerek, MCF-7 (Human breast adenocarcinoma) ve HepG2 (Hepatoselüler karsinom) hücre hatlarında Desferoksaminin (DFO), 1.10 phenantrolin (PHEN) ve Trikostatin A (TSA)'nın Ndrg1 varyant dinamiğini nasıl etkilediğini araştırdık. Bu amaçla MCF-7 ve HepG2 hücrelerini uygun medyumlar içerisinde kültüre ettik. xCELLigence cihazı ile büyüme eğrileri analizi yapılarak uygun hücre yoğunluğunu belirledik. 96-kuyucuklu pleytlere ekilen hücreler 24 saat boyunca 25 µM PHEN, 150 µM DFO, 500nM TSA ve bunların kombinasyonu ile muamele ederek RNA'ları izole edildi. Elde edilen RNA'lar cDNA'ya çevrildi. Uygun primerler kullanılarak Ndrg1 mRNA varyantlarına kantitatif Real Time PCR yöntemiyle bakılarek relatif gen ekspresyon analizi (REST) yapıldı. Referans gen olarak GAPDH alındı. Normalizatör olarak kontrol grubu kullanıldı. HepG2 ve MCF-7 hücrelerinin demir şelatörleri ve TSA ile muamelesi sonucunda Ndrg1 mRNA varyantlarında anlamlı (p<0,001) artışlar oldu. HepG2 hücrelerinin DFO ile muamelesi sonucu Ndrg1 varyant1 kontrole göre 3,196, Varyant2 ise 2,49 kat artış oldu. MCF-7 hücrelerinde ise Ndrg1 varyant1 kontrole grubuna göre 5,9, Varyant2 ise 10,6 kat arttı. HepG2 hücrelerinin PHEN ile muamelesi sonucunda Ndrg1 varyant1 ve varyant2 artışı birbirine yakın değerde gerçekleşirken, MCF-7 hücrelerinin PHEN ile muamelesi sonucunda Ndrg1 varyant1 kontrole göre 6,03, Varyant 2'de ise 16,7 kat arttı. Sonuçta PHEN, DFO ve TSA'nın Ndrg1 mRNA varyantlarını gen ekspresyon düzeyinde regülasyona uğrattığı gösterildi.

Abstract:
N-myc downstream-regualted gene (Ndrg1), also known as metastasis supressor gene, is downregulated in prostat, colon and breast cancers whereas it is upregulated in hepatic cancers. Results of previous studies indicate that Ndrg1 is effected differently in different cancers. Transcriptional, posttranscriptional and translational mechanisms play role in the regulation of Ndrg1. Ndrg1 gene upregulation stops the metastatis and cell growth dramatically but this blocking is not fully understood. In this study we investigated the effects of Desferrioxamin (DFO) which is a anticancer agent in MCF-7 (Human Breast Adenocarcinoma) and HepG2 (Hepatocellular carcinoma) cell lines, 1.10 phenantrolin (PHEN) and trichostatin A (TAS) on Ndrg1 variant dynamics by developing specific primers and probs for Ndrg1 mRNA variants using bioinformatic analysis. We cultured MCF-7 and HepG2 cells in appropriate mediums. We determined the appropriate cell density by growth curve analysis using xCELLigence. Cells which were cultured in 96-pitted culture plates were treated with 25 µM PHEN, 150 µM DFO, 500nM TSA and combination of these for 24 hours. RNAs were then extracted. Derived RNAs were converted into cNDAs. Using appropriate primers and Real Time PCR on Ndrg1 mRNA variants, relative gen expression analysis (REST) was performed. GAPDH was accepted as reference gene. Control group was used as normalisator. TSA and iron chelatagent treatments of HepG2 and MCF- cells caused a significant increase in Ndrg1 mRNa variants (p<0,001). DFO treatments of HepG2 cells caused a 3.196 fold increase in Ndrg1 variant1 and 2.49 fold increase in variant 2 compared to controls. DFO treatments of MCF-7 cells caused a 5.9 fold increase in Ndrg1 variant1 and 10.6 fold increase in variant 2 compared to controls. PHEN treatments of HepG2 cells caused similar increases in Ndrg1 variant1 and variant2 whereas PHEN treatments of MCF-7 cells caused 6.03 fold increase in variant1 and 16.7 fold increase in variant2 compared to controls. As a conclusion PHEN, DFO and TSA were shown to regulate Ndrg1 mRNA variants at the level of gene expression.