Klinik örneklerden izole edilen K. pneumoniae suşlarında genişlemiş spektrumlu beta laktamaz enzim varlığının PCR-RFLP yöntemi ile araştırılması
Investigation of extended spectrum beta lactamase enzyme with PCR-RFLP in K. pneumoniae strains isolated from clinical samples
Yazar: EBRU YILMAZ
Danışman: PROF. DR. GÜVEN URAZ
Gazi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Biyoloji = Biology ; Klinik Bakteriyoloji ve Enfeksiyon Hastalıkları = Clinical Microbiology and Infectious Diseases ; Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Bakteriyoloji = Bacteriology ; Biyoloji = Biology

Özet:
Geniş spektrumlu beta laktamazlar (GSBL) gram-negatif basillerde sefalosporinlere (seftazidim, seftriakson, sefotaksim) ve aztreonama dirençten sorumludurlar. Geniş spektrumlu beta laktamaz üreten Klebsiella bakterileri klinisyenler açısından büyük bir problemdir. Bu enzimler, özellikle çocuk hastalar ile tıbbi ve cerrahi birimlerde tedavide başarısızlık nedenidir. Araştırmada geniş spektrumlu beta laktamaz varlığı fenotipik (çift disk sinerji testi ve klavulonik asit kombinasyonu içeren disk kullanımı yöntemi) ve genotipik metodlarla (PZR-RFLP) araştırılmıştır. Ayrıca Klebsiella bakterilerinde plazmid analizi çalışılmıştır.Araştırmada çeşitli klinik mikrobiyoloji laboratuarlarından 128 Klebsiella bakterisi toplanmıştır. Bu bakteriler manuel yöntemlerle ve API 20E test kiti ile adlandırılmıştır. İdentifikasyon sonucu 103 K.pneumoniae (86 idrar kültürü, 7 yara kültürü, 5 kan kültürü, 3 balgam kültürü, 2 trakeal aspirat kültürü, 2 aspirasyon sıvısı kültürü), 25 K.oxytoca (21 idrar kültürü, 2 yara kültürü, 1 trakeal aspirat kültürü, 1 aspirasyon sıvısı kültürü) elde edilmiştir. Çift disk sinerji testi (ÇDST) ile %66 oranında GSBL pozitiflik gözlemlenmiştir. Klavulonik asit kombinasyonu içeren disklerin kulanımı yöntemiyle Klebsiella şuşlarının  %59,37'sinin GSBL pozitif olduğu belirlenmiştir. Yapılan çalışmada; Klebsiella bakterilerinde SHV ve TEM tipi GSBL, spesifik primerler kullanılarak PZR yöntemiyle belirlenmiştir. SHV tip GSBL izolatların %56,25'inde (128 izolatın 72'sinde), TEM tip  GSBL ise izolatların sadece %39,84'ünde (128 izolatın 51'inde) bulunmuştur. Amplifikasyon sonucu sırasıyla 293bp ve 966bp'lik ürünler elde edilmiştir. Bunun yanı sıra SHV ve TEM spesifik PZR ürünlerinin RFLP analizi de çalışılmıştır. Kesim sonucu, PZR ürünlerinin hiçbirinin NheI restriksiyon enzimiyle kesilmediği tespit edilmiştir. Ayrıca, bu çalışmada Klebsiella bakterilerinin plazmid DNA profilleri belirlenmiş ve molekül ağırlıkları tespit edilmiştir. Sonuçlar 42 izolatın plazmid taşıdığını ve molekül ağırlıklarının 1,375 ile >21,226 kb arasında bulunduğunu göstermiştir. Diğer izolatların plazmid DNA taşımadığı belirlenmiştir. Plazmid DNA bulunan 42 izolatın 32'sinde ÇDST yöntemi veya PZR çalışmasında GSBL taşıdığı belirlenmiştir.

Abstract:
Extended-spectrum beta lactamases (ESBLs) are responsible for resistance to cephalosporins (ceftazidime, ceftriaxone, and cefotaxime) and aztreonam in gram-negative bacilli. Extended spectrum beta lactamase producing Klebsiella bacteria are a major problem for clinicians. These enzymes increase are cause of  failure in treatment particularly paediatric patients and also in medical and surgical units. In the research ESBL was investigated by phenotypical (Double disc synergy test, Clavulonic acide combination) and genotypical methods (PCR-RFLP). Plasmid analysis of Klebsiella isolates were also studied in this research.In the research, one hundred twenty eight Klebsiella bacteria were collected from different microbiology laboratories in Ankara. These bacteria were identified with classical methods and API 20E. According to the results of identification, 103 K. pneumoniae (86 urine culture, 7 lesion culture, 5 blood culture, 3 sputum culture, 2 endotracheal aspirates culture, 2 aspirate fluid culture) and 25 K. oxytoca (21 urine culture, 2 lesion culture, 1 endotracheal aspirates culture, 1 aspirate fluid culture) were obtained. ESBL has been detected %66 in Klebsiella bacteria by DDST. It has been detected 59,37% in Klebsiella bacteria by disc method including Clavulonic acide combination. In the present study, SHV and TEM type ESBL was determined in Klebsiella isolates by PCR method using spesific primers. SHV type ESBL was found in 56,25% (72 of 128) of isolates and TEM type ESBL were only  found in 39,84% (51 of 128) of isolates. Amplications of the expected size about 293bp and 966bp were observed, respectively. On the other hand; RFLP analysis of SHV and TEM specific PCR products were also studied. Result of the digestion showed that, any of  the PCR products were digested by NheI restriction enzyme. Moreover; Plasmid DNA profiles of Klebsiella bacteria were determined and their molecular weights were found. The results indicated that fourty two isolates were carried plasmids and their molecular weights were ranged from 1,375 to >21,226 kb. It was also determined that  other isolates were not carried any plasmid DNA. It was also determined that ESBL was detected in 32 of the 42 isolates that are carried plasmid DNA by PCR method or DDST.