Van yöresinde yaşayan kronik hepatit B hastalarındagenotip
subgenotip analizi ve pol / S geni mutasyonlarının değerlendirilmesi / Genotype / subgenotype analyses and determining polymerase / S gene mutation in chronic hepatitis B patients and in Van region.
Yazar: ÜMİT YAKAN
Danışman: YRD. DOÇ. MAHMUT SÜNNETÇİOĞLU
Yüzüncü Yıl Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2015
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Hepatit virüsleri = Hepatitis viruses

Özet:
Amaç: Hepatit B virüs (HBV) enfeksiyonu hem dünyada hem de ülkemizde önemli bir halk sağlığı sorunudur. HBV enfeksiyonu inaktif HBsAg taşıyıcılığından hepatosellüler karsinom, karaciğer yetmezliği ve siroza kadar farklı klinik formlarla karşımıza çıkabilmektedir. Bu çalışmada, Van yöresinde yaşayan ve hastanemize başvuran 150 kronik hepaitit B (KHB) hastası içerisinde sekans analizi yapılabilenlerde HBV genotip ve  subgenotiplerinin tespit edilmesi, pol ve S gen mutasyonlarının saptanması amaçlanmıştır.
Metod: Çalışmamıza Eylül 2014 - Mart 2015 tarihleri arasında toplanan, hepatit B serolojik belirleyicileri (ROCHE COBESE 60I) ve HBV DNA'sı (QIAGEN OIASYMPHONYSP) pozitif 150 hasta serumu dâhil edilmiştir.
HBV genotip ve subgenotip tespiti, bilinen tüm primer/kompansatuvar nükleozid/nükleotid analogları (NA) direnç mutasyonları ve pol geni ile üst üste binen S geni (ADAPVEM) mutasyonları HBV pol geni dizilenerek saptandı. Bu serumlarda HBV pol geninin (ters transkriptaz; RT bölgesi, 80-250. aminoasitler arası) dizi analizi için serum örneğinden HBV-DNA izole edildi (Anatolia Geneworks, Bosphore® Viral DNA Extraction Spin Kit ve Magnesia® 16 Magnetic Bead Extraction System, Istanbul, Türkiye). HBV pol geni amplifikasyonu (742 bp) için ileri (F:5'-tcgtggtggacttctctcaatt-3') ve geri (R:5'-cgttgacagactttccaatcaat-3') primerler kullanıldı. Tüm PCR ürünleri High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Diagnostics, Almanya) ile saflaştırıldı. Dizileme protokolünde Phire Hot Start DNA polimeraz (Finnzymes Oy, Finlandiya) enzimi kullanıldı ve yöntem, The BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc. NJ, ABD), 36 cm kapiller ve POP-7 TM polimer (Applied Biosystems Inc., CA, ABD) kullanılarak üretici firmanın önerileri doğrultusunda (http://www.appliedbiosystems.com) ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems Inc., CA, ABD) platformunda gerçekleştirildi. Hastalarda pol/S gen mutasyonu değerlendirildi ve genotiplendirme/subgenotiplendirme yapıldı.
Bulgular: Çalışma sonucunda 150 KHB hastasından sekans analizi yapılabilen 128 hastanın tümünde (%100) genotip D tespit edildi. Hastaların 108'inde D1 subgenotipi (%84,4), 14'ünde (%10,9) D2 ve 6'sında (%4,7) D3 subgenotipi saptandı. Hastaların HBeAg pozitif veya negatif olmaları ile subgenotip çeşitliliği arasında anlamlı bir ilişki bulunamadı (p:0,147). Hastaların KHB klinik evreleri ve subgenotip çeşitliliği arasında anlamlı bir ilişki saptanmadı (p:0.057). Çalışmamızda HBV DNA sekans analizi yapılabilen 128 hastada 40 pol gen mutasyonu, 47 hastada S gen mutasyonu ve bir hastada ADAPVEM saptandı.
Sonuç: Çalışmada çıkan sonuçlar irdelendiğinde, Akdeniz ülkelerine benzer şekilde Van yöresinde de HBV D genotipi baskın olarak saptanmıştır. Ülkemizde sınırlı sayıda olan subgenotip çalışmalarına benzer şekilde, çalışmamızda 128 hastada %84 oranında D1 subgenotipi saptanmıştır. KHB klinik evreleri veya HBeAg durumu ile subgenotip çeşitliliği arasında anlamlı bir ilişki saptanmamıştır. Çalışma grubumuzda bulunan hastalarda %31 oranında polimeraz gen mutasyonları saptandı. Bu sonuç, pol mutasyonlarına bağlı olarak ortaya çıkabilecek NA karşı direnç gelişimini gerek naif hastalarda gerekse tedavi alan hastalarda dikkate almamız gerektiğini göstermektedir. Hasta grubumuzda HBsAg kaçak mutasyonlarının %36 gibi yüksek bir oranda saptanmış olması nedeniyle gerek bölgemizde gerekse ülkemizde HBsAg kaçak mutasyonu sorunun gittikçe büyüdüğünü ve artık HBV immünizasyon politikaları açısından HBsAg kaçak mutant suşlarının dikkate alınması gerektiğini, HBV immünizasyonuna rağmen mutant HBV enfeksiyiyonlarının gelişebileceği ve HBsAg tanı kaçak suşları tespit edebilecek tanı testleri kullanılması gerekliliğini ortaya çıkarmıştır.
Çalışmamızda elde ettiğimiz HBV'ye ait genotip, subgenotip dağılımı ve pol/S gen mutasyonları verilerinin daha ileri düzey çalışmalarda HBV enfeksiyonu bulunan hastaların tanısında, takibinde ve tedavi stratejilerinde klinisyenlere yardımcı olacağı kanısına ulaşılmıştır.

Abstract:
Aim: Hepatitis B virus (HBV) infection is a significant public health issue worldwide as well as in our country. HBV infection may arise in many clinical forms in a range from inactive HBsAg carrier status to hepatocellular carcinoma, liver failure and cirrhosis. In the present study, it was aimed to detect HBV genotypes and subgenotypes, and to determine pol and S gene mutations in those the sequence analysis has been performed out of 150 patients with chronic hepatitis B (CHB) who live in Van area and applied to our hospital. 
Methods: Serum samples collected from 150 patients between September 2014-March 2015 with positive Hepatitis B serological markers (ROCHE COBESE 60I) and HBV DNA (QIAGEN OIASYMPHONYSP) were included to the study. The determination of HBV genotype and subgenotype, all known primer/compensatory nucleoside/nucleotide analogues (NA) resistance mutations and the S gene mutations (ADAPVEM) overlapping the pol gene was made via sequencing of HBV pol gene.  HBV-DNA was isolated from the serum samples for the sequence analysis of HBV pol gene [reverse transcriptase (RT) region, between 80-250 amino acids] (Anatolia Geneworks, Bosphore® Viral DNA Extraction Spin Kit, and Magnesia® 16 Magnetic Bead Extraction System, Istanbul, Turkey). For the amplification (742 bp) of HBV pol gene, forward 5'-tcgtggtggacttctctcaatt-3' and reverse 5'-cgttgacagactttccaatcaat-3' primers were used. All PCR products were purified using High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Diagnostics, Germany). In the sequencing protocol, Phire Hot Start DNA polymerase (Finnzymes Oy, Finland) enzyme was used, and the method was performed according to the company`s recommendations using The BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc. NJ, US), 36 cm capillary and POP-7 TM polymer (Applied Biosystems Inc., CA, US) on the ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems Inc., CA, US) sequencing platform. Pol/S gene mutations were examined, and genotyping/subgenotyping was made in the patients. 
Findings: In result, the genotype D was detected in all of 128 patients (100%) whose sequence analysis could be made out of 150 patients with CHB. D1, D2 and D3 subgenotypes were determined in 108 (84.4%), 14 (10.9%) and 6 patients (4.7%), respectively. 
No significant association was found between the HBeAg positiveness and subgenotype diversity in the patients (p=0.147). There was no significant relationship between the HBV clinical stages of the patients and subgenotype diversity (p=0.057). Out of 128 patients with successfully performed sequence analysis, a Pol gene mutation was determined in 40 patients, an S gene mutation was detected in 47 patients and ADAPVEM was found in one patient. 
Results: When the study results were scrutinized, HBV-D genotype has been determined dominant in Van area as with the Mediterranean countries. Similar to the subgenotyping studies conducted in our country only at a limited number, D1 subgenotype was determined at 84% among 128 patients in the present study. No significant association was assigned between the clinical stages of CHB or HBeAg status and subgenotype diversity. In the patients involved in our study group, polymerase gene mutations were detected at the rate of 31%. This result showed that we need to take account of the resistance development against NA that could arise related to pol mutations for both naïve patients as well as the patients receiving medical therapy. Due to the detection of HBsAg escape mutations at such a high rate of 36% in our patient group, the present study revealed that the clinical problem of HBsAg escape mutations gradually growing in both our area and the country, and those HBsAg escape mutant strains should be taken into consideration in terms of HBV immunization policy.  The study also suggests that HBV infections may develop in spite of HBV immunization, and it is required to use appropriate diagnostic tests possessing ability to detect HBsAg escape strains. 
	It is concluded that the data involving genotype-subgenotype distribution and pol/S gene mutations obtained in the present study may assist clinicians in the diagnosis, follow-up and therapeutic programs of the patients with HBV infection in further advanced studies.