Bir seri 1,4-benzoksazin-3-on türevi bileşiğin sitotoksik, genotoksik, mutajenik potansiyellerinin araştırılması ve farmakofor modellemesi
Investigation of cytotoxic, genotoxic, mutagenic potentials of a serial 1,4-benzoxazine-3-one derivative compounds and pharmacophore modelling
Yazar: EGEMEN FOTO
Danışman: PROF. DR. NURAN DİRİL
Hacettepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Biyoloji = Biology

Özet:
Bu çalışmada insan DNA topoizomeraz I enzimi (hTopoI) üzerindeki inhibisyon etkileri bilinen 18 adet 2H-3,4-dihidro-1,4-benzoksazin-3-on türevi bileşiğin sitotoksik, genotoksik ve mutajenik potansiyelleri incelenmiş, sonuçlar yapı-aktivite ilişkileri açısından değerlendirilmiştir.
Test edilen bileşiklerin L929 ve Hela hücreleri üzerindeki sitotoksik potansiyelleri sülforodamin B (SRB) testi ile, genotoksik potansiyelleri alkali komet yöntemi ile, genotoksik aktiviteye neden olabilecek DNA hasarlarının tipi modifiye komet yöntemi ile, Salmonella typhimurium TA98 ve TA100 suşları üzerindeki mutajenik potansiyelleri ise Ames Salmonella/mikrozom testi ile araştırılmıştır. Ames test sisteminde mutajenik etkili bileşiklerin minimum mutajenik dozları (d) regresyon analizi ile hesaplanmıştır. Farmakofor modelleme analizlerinde sitotoksisite sonuçları HypoGen ile, mutajenite sonuçları HipHop ile değerlendirilmiş, aktiviteden sorumlu bölgeler tanımlanmaya çalışılmıştır. 
Araştırma sonucunda BS3 (IC50:17.84 µM) ve BS10 (IC50:52.53 µM) bileşiklerinin sadece HeLa hücreleri üzerindeki sitotoksik etkilerinin ve seçicilik indekslerinin (Sİ) yüksek olduğu belirlenmiştir (SİBS3:15.6 ve SİBS10:8.8). Bu bileşiklerden BS3'ün genotoksik ve mutajenik potansiyel taşımadığı görülürken, hTopoI üzerine zehir etkisi gösteren BS10'nun DNA'da zincir kırıklarına sebep olduğu, ancak mutajenik potansiyel taşımadığı saptanmıştır. Her iki hücre üzerinde güçlü sitotoksik etki gösteren BS11 (IC50(HeLa):24.31 µM, IC50(L929): 16.7 µM) bileşiğinin ise HeLa hücreleri için seçici olmadığı (SİBS11:0.2) belirlenmiştir. Ayrıca bu bileşiğin her iki hücre üzerinde güçlü genotoksik etki gösterdiği, ancak mutajenik aktiviteye sahip olmadığı görülmüştür.
HeLa hücrelerinde güçlü genotoksik etki gösteren bileşiklerden BS1, BS4, BS16 'nın formamidopirimidin DNA glikozilaz (Fpg) ve endonükleaz III (Endo III) duyarlı bölge sıklığını artırırken, BS11'in sadece Fpg, BS10'nun ise Fpg ve insan alkil adenin DNA glikozilaz (hAAG) duyarlı bölge sıklığını artırdığı belirlenmiştir. 
Çalışmada kullanılan bileşiklerden sadece BS12, BS13, BS16 ve BS17 bileşiklerinin metabolik aktivasyon varlığında [S9(+)] ve yokluğunda [S9(-)]  hem TA98 hem de TA100 suşları için güçlü mutajenik aktiviteye sahip oldukları ve özellikle TA100 suşunda S9 varlığında pozitif kontrol olarak kullanılan 2-aminoflorenden (d:14.9 µg/plak) bile daha güçlü mutajenik aktiviteye sahip oldukları görülmüştür  [BS12 (d:3 µg/plak), BS13 (d:0.58 µg/plak), BS16 (d:3.5 µg/plak), BS17 (d:0.95 µg/plak)].  
HypoGen farmakofor analiz sonuçlarına göre benzoksazin yapısındaki benzen halkasına sübstitüe hafif elektron çeken grupların (COOC2H5, Cl) sitotoksik aktiviteyi artırdığı, halkayı aktive eden grupların (CH3,NH2) aktiviteyi düşürdüğü gözlemlenmiştir. Benzoksazin halkasına R2 veya R3 konumunda hidrofobik aromatik özellik taşıyan bir yapının eklenmesi durumunda sitotoksik aktivitenin artabileceği tahmin edilmektedir. HipHop farmakofor analiz sonuçlarına göre ise R3 konumunda hidrojen bağı yapabilen ve R2 konumunda hidrofobik özellik gösteren fonksiyonel grupların varlığının mutajenik etkiyi artırdığı belirlenmiştir. Bu konumlarda özellikle aromatik halkayı dezaktive eden grupların (R3 konumu için    -NO2 ve R2 konumu için -Cl) mutajenik etkiyi artırdığı düşünülmektedir.

Anahtar Kelimeler: Benzoksazin türevleri, SRB testi, Komet testi, Fpg, Endo III, hAAG, Ames Salmonella/mikrozom testi, farmakofor analizi, HipHop, HypoGen

Abstract:
In this study, cytotoxic, genotoxic and mutagenic potentials of 18 of 2H-3,4-dihydro-1,4-benzoxazin-3-one derivatives which of their inhibitory effects on human DNA topoisomerase I enzyme (hTopoI) were known, were investigated. Results were then evaluated in the view of the structure activity relationship.
Tested compounds were investigated for their cytotoxic potentials on L929 and HeLa cells with sulphorhodamine B (SRB) assay, for their genotoxic potentials with alkaline comet assay, for the type of DNA damage which caused genotoxic activity with modified comet assay, for their mutagenic potentials on Salmonella typhimurium TA98 and TA100 strains with the Ames Salmonella/microsome assay. Regression analysis was used to calculate minimum mutagenic doses (d) of the mutagenic compounds in the Ames test system. For pharmacophore analaysis, cytotoxicity and mutagenicity results were evaluated by using HypoGen and HipHop, respectively. Finally, it was strived to identify regions that might be responsible for the activity.
As a result of research, It was determined that cytotoxic and selectivitiy indexes (SI) of compounds, BS3 (IC50:17.84 µM) and BS10 (IC50:52.53 µM), were high only against HeLa cells (SİBS3:15.6 and SİBS10:8.8). Furthermore, it was revealed that of these compounds, BS3 did have no genotoxic and mutagenic potentials, whereas BS10, which was hTopoI poison, caused DNA strand breaks but did have no mutagenic potential. It was also determined that compound BS11 which showed strong cytotoxic activity (IC50(HeLa):24.31 µM, IC50(L929): 16.7 µM) against both of the cell lines was not selective for HeLa cells (SİBS11:0.2). Moreover, this compound showed strong genotoxic effect against both cell lines but did have no mutagenic activity.
It was identified that compounds BS1, BS4 and BS16 which showed strong genotoxic effect on HeLa cells, increased formamidopyrimidine DNA glycosylase (Fpg) and endonuclease III (EndoIII)- sensitive sites, whereas BS11 increased only Fpg-sensitive sites and, BS10 caused to increase both Fpg and human alkaline adenine DNA glycosylase (hAAG)-sites.
It was shown that only compounds BS12, BS13, BS16, and BS17 among all tested compounds, had strong mutagenic activities on TA98 and TA100 strains in the presence of metabolic activation [S9(+)] and in the absence of [S9(-)].  Furthermore, they had more mutagenic activity on TA100 strains than positive control 2-aminofluorene (d:14.9 µg/plaque) in the presence of S9 [BS12 (d:3 µg/plaque), BS13 (d:0.58 µg/plaque), BS16 (d:3.5 µg/plaque), BS17 (d:0.95 µg/plaque)].  
According to the results derived from HypoGen pharmacophore analysis, electron-withdrawing groups (COOC2H5, Cl) substituted to benzene ring in the structure of benzoxazine increased the cytotoxic activity and the ring activating groups (CH3, NH2) decreased the activity. It was estimated that cytotoxic activity might be increased in the case of addition of such a structure having hydrophobic aromatic feature through the benzoxazine ring at the position of R2 and R3. According to the results derived from HipHop pharmacophore analysis, it was detected that mutagenic activity increased in the presence of functional groups which might form hydrogen bonds at the position of R3 and hydrophobic groups at the position of R2. Hence, it was anticipated that aromatic ring desactivating groups at these positions increased the mutagenic activity. 

Keywords: Benzoxazine derivatives, SRB assay, comet assay, Fpg, Endo III, hAAG, Ames Salmonella/microsome assay, pharmacophore analysis, HipHop, HypoGen