Deneysel kafa travması modelinde high mobility group box-1 protein düzeylerinin oksidatif stres, apoptoz, serebral ödem ve kan beyin bariyeri üzerine etkilerinin araştırılması
The effect of high mobility group box-1 protein on cerebral edema, blood-brain barrier, oxidative stress and apoptozis in traumatic brain injury
Yazar: ŞEVKET EVRAN
Danışman: DOÇ. DR. MUSTAFA AZİZ HATİBOĞLU
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Beyin ve Sinir Cerrahisi Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2016
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery
Dizin: Apoptozis = Apoptosis ; Beyin yaralanmaları = Brain injury ; HMGB 1 = HMGB 1 ; Kafa yaralanmaları = Head injuries ; Kan beyin bariyeri = Blood brain barrier ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Yaralar ve yaralanmalar = Wounds and injuries

Özet:
Amaç: Travmatik beyin hasarı özellikle genç erişkinlerde en önemli morbidite ve mortalite nedenlerindendir. Kafa travmasında mekanik etkiye bağlı primer hasar önlenemez iken, bu hasarın neticesinde oluşan ve ön planda nöroinflamasyona bağlı geliştiği düşünülen sekonder hasar önlenebilir ve böylece mortalite ve morbidite azaltılabilir. Bu çalışmada amacımız deneysel kafa travması oluşturduğumuz sıçanlarda primer hasar sonucu oluşan nekrotik dokulardan salınan ve travma sonrası nöroinflamatuar süreci başlattığı düşünülen HMGB-1 proteinin; reseptörleri olan TLR-4 ve RAGE düzeylerine, kan beyin bariyerine, serebral ödem miktarına, apoptoz ve oksidatif stres değerlerindeki değişime etkisini incelemektir.
Metod:280-320 g ağırlığında, 10-12 haftalık, toplam 30 adet erişkin erkek sprague-dawley cinsi sıçanlar, kontrol, travma ve travma+etil pirüvat (her bir grupta n=10) olmak üzere 3 gruba ayrıldı.	Yüksekten ağırlık atılarak sağ parietal kontüzyon oluşturuldu. Travma sonrası 24. saatte sıçanlar sakrifiye edilerek, perikontüzyonel beyin dokusu örneklerinde Western Blot ve immunohistokimya yöntemleri ile HMGB1, TLR-4, RAGE, okludin, klaudin-5, ZO-1 düzeylerine bakıldı; apoptoz açısından immunohistokimya ile TUNEL, Western Blot ile bax, bcl-2, kaspaz-3 düzeyleri değerlendirildi. Ayrıca sıçanlardan alınan kan örneklerinde, total oksidan ve antioksidan kapasite ile oksidatif stres indeksi bakıldı. Alınan beyin dokularının yaş ve kuru ağırlıkları tartılarak beyin ödemi derecesi hesaplandı.
Bulgular: Travma sonrasında HMGB-1 protein ekspresyonunun arttığı gözlendi ve bunun da TLR4 ve RAGE düzeylerinde artışa neden olduğu; aynı zamanda KBB'deki sıkı bağlantı molekülleri olan okludin, klaudin-5 ve Zo-1 düzeylerinde azalmaya yol açarak beyin ödemini arttırdığı saptandı. Aynı zamanda, HMGB-1 protein artışı; bax ve kaspaz-3 düzeyini arttırıp, bcl-2 düzeylerinde azalmaya yol açarak apoptozu indüklemiş, ve total oksidatif kapasiteyi artırarak oksidatif hasarda artış meydana getirmiştir. Etil pirüvat verilen grupta ise HMGB-1 inhibisyonu sonucu, bu etkiler kontrol grubuyla benzer düzeylere gelmiştir.
Sonuç: HMGB1 proteini, sekonder hasar mekanizmalarını tetikleyerek kan beyin bariyeri disfonksiyonuna neden olarak ve serebral ödem, oksidatif stres ve apoptozu arttırarak travmatik beyin hasarı patofizyolojisinde anahtar rol üstlenmektedir. HMGB1 proteini, bu özellikleri nedeniyle kafa travması tedavisinde potansiyel hedef olabilir.

Anahtar kelimeler: Apoptoz, beyin ödemi, HMGB-1, travmatik beyin hasarı

Abstract:
Objective: Traumatic brain injury (TBI) is one of the most important causes of morbidity and mortality especially among in young adults. While the primary injury due to mechanical impact is unavoidable, the secondary injury, which  is formed as a result of primary injury and tought to occur due to neuroinflammation, can be prevented and thus the risk of mortality and morbidity can be reduced. The HMGB-1 protein, which is released to cytoplasm or extrasellular space from necrotic tissues after traumatic brain injury and tought to starts neuroinflammatory process, may direct the other secondary injury mechanisms. The aim of this study was to investigate the effects of HMGB-1 on its receptors TLR-4 and RAGE, cerebral edema, blood-brain barrier, oxidative stress and apoptosis in experimental traumatic brain injury.
Materials and methods: A total of 30 adult male Sprague-Dawley rats, weighing 280-320 g with age of 10-12 weeks, were used for the experiments. The rats were randomly assigned to 3 groups: 1) Control, 2) TBI and 3) TBI + ethyl pyruvate group (n=10 for each group). Right parietal cortical contusion was made by using a weight-dropping TBI method. Brain samples were harvested from pericontisuonal area at 24 h after TBI. HMGB1, TLR-4, RAGE, occludin, claudin-5, ZO-1 levels are investigated by Western Blot analyses and immunohistochemistry examinations. To assess apoptosis, TUNNEL for immunohistochemistry and  Western Blot for bax, bcl-2, caspase 3 were performed. In addition, total oxidant and antioxidant capacity and oxidative stress index were evaluated in blood samples. Also, brain water content for determining cerebral edema was calculated by weighing wet and dry weight of the brain tissue.
Results: HMGB-1, TLR-4 and RAGE expressions increased after TBI. Major tight junction proteins in the blood-brain barrier including occludin, claudin-5 and ZO-1 expressions decreased after TBI and brain edema was found to be increased. Also proapoptotic bax and caspase 3 expressions increased, antiapoptotic bcl-2 levels decreased after TBI. Total oxidant status and oxidatif stress increased, total antioxidant status decreased after TBI. These effects came to similar levels as the sham group in the group treated with ethyl pyruvate, a HMGB-1 inhibitor.
Conclusion : HMGB1 protein triggers secondary injury mechanisms by increasing blood-brain barrier dysfunction, cerebral edema, oxidative stress and apoptosis, so HMGB-1 protein plays a key role in the pathophysiology of traumatic brain injury. Our results suggest that HMGB-1 protein may be a potential target for the treatment of TBI. 

Key words: Apoptosis, brain edema, HMGB-1, traumatic brain injury