Kronik strese ve yağlı diyete maruz bırakılan sıçanlarda testis ve spermlerin immunhistokimyasal ve morfometrik yöntemler eşliğinde ışık mikroskobik değerlendirilmesi
Light microscopic evaluation of sperms and testes along with immunohistochemical and morphometric methods in the rats undergone to fatty diet and chronic stress
Yazar: TUBA DEMİRCİ
Danışman: PROF. DR. ELVAN ÖZBEK
Atatürk Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2011
Konu: Histoloji ve Embriyoloji = Histology and Embryology
Dizin: Mikroskopi-ışık = Microscopy-polarization ; Morfometri = Morphometry ; Obezite = Obesity ; Oksidatif stres = Oxidative stress ; Sperm = Spermatozoa ; Sperm mobilitesi = Sperm mobility ; Stres = Stress ; Sıçanlar = Rats ; Testis = Testis ; İmmünohistokimya = Immunohistochemistry

Özet:
Obezite ve stres, organizmanın endokrin ve üreme sistemleri gibi pek çok sistemini olumsuz şekilde etkiler. Bu çalışmada hem kronik stresin hem de obezitenin testis ve spermler üzerindeki olası morfometrik, histopatolojik ve biyokimyasal etkilerini sıçan modeli üzerinde araştırmak amaçlandı.Bu amaçla, 24 adet Sprague Dawley cinsi erkek sıçanlar rastgele 4 gruba (n=6) ayrıldı. Toplam 12 haftalık deney boyunca, kontrol grubu (Grup 1) stres uygulanmadan standart yemle beslendi. Stres grubu (Grup 2) standart yemle beslendi ve deney sürecinin son dört haftasında kronik strese (Chronic Mild Stress, CMS) maruz bırakıldı. Obezite grubu (Grup 3) stres uygulanmadan yüksek yağlı diyetle beslendi. Stres+obezite grubu (Grup 4) yüksek yağlı diyetle beslendi ve deneyin son dört haftasında kronik strese maruz bırakıldı. Deney boyunca haftalık olarak, deneklerin vücut ağırlıkları ve boyları ölçüldü; obezite takibi için vücut kitle indeksleri (VKİ) hesaplandı. Deney sonunda, anestezi altında abdominal aortadan kan örnekleri alındıktan sonra denekler feda edildi. Vas deferens ve epididimden sperm örnekleri elde edildi; epididim ve testisler çıkarıldı. Makler çemberi kullanılarak ışık mikroskobunda sperm konsantrasyonu ve motilitesi değerlendirildi. Sperm yayma preparatları immunsitokimyasal boyandı. Epididimler ve sol testisler biyokimyasal enzim analizlerinde kullanılmak üzere -80 0C'de saklandı. Ağırlıkları ölçüldükten sonra sağ testisler mikroskobik inceleme için Bouin solüsyonunda fikse edildi. Histolojik işlem sonrası parafine gömülen testislerden alınan kesitler Hematoksilen-Eozin (H-E), Periyodik asit-Schiff, Masson Trikrom, Gamma Amino Butirik Asit (GABA) Transporter I (GAT1) proteinine spesifik immunhistokimya ve apoptozise özgün TUNEL boyama yöntemleri ile boyandı ve ışık mikroskobunda incelendi. Spermatogenezi değerlendirmek için, H-E ile boyanmış testis kesitlerinde Johnsen skorlaması yapıldı. Elde edilen tüm sayısal veriler istatistiksel olarak analiz edildi.Deneyin 8. haftasında, yüksek yağlı diyetle beslenen obezite ve stres+obezite gruplarının VKİ değerleri standart yemle beslenen diğer iki gruptan anlamlı derecede yüksek bulundu (p<0,05; Post Hoc Test). Böylece bu iki grupta obezite modeli oluşturulmuş oldu. Sekizinci haftanın sonundan deney bitimine kadar geçen dört hafta boyunca, stres ve stres+obezite gruplarına CMS prosedürü uygulanarak stresin normal ve obez sıçanlardaki etkileri araştırıldı. Stres+obezite grubunda VKİ 8. haftada kontrol grubundan yüksek olduğu halde (p<0,05; Post Hoc Test), deney sonunda kontrol ile stres+obezite grubu arasındaki farkın ortadan kalktığı görüldü (p>0,05; Post Hoc Test). Obezite grubunda deney sonundaki VKİ, kontrol ve stres+obezite grubuna kıyasla anlamlı derecede yüksek bulundu (p<0,05; Post Hoc Test, Tamhane).Testis ağırlığı, stres+obezite grubunda diğer üç gruba kıyasla anlamlı derecede azaldı (p<0,05; Mann-Whitney U test). Kontrolle karşılaştırıldığında, diğer üç grupta epididimal sperm konsantrasyonu ve sperm motilitesi daha düşük bulundu. Ayrıca, obezite ve stres+obezite gruplarının sperm motilitesi, stres grubundan da daha düşüktü (p<0,05; Mann-Whitney U test). Baş ve kuyruk defektli spermlerin sayısı, kontrole kıyasla diğer gruplarda önemli derecede fazla bulundu (p<0,05; Mann-Whitney U test).Stres, obezite ve stres+obezite gruplarının Johnsen skorları, kontrol grubundan oldukça azdı. Ayrıca stres+obezite grubunun Johnsen skoru, obezite grubundan da daha düşüktü (p<0,05; Mann-Whitney U test). Testis kesitlerinin ışık mikroskobik incelemesinde, kontrole kıyasla diğer üç grupta da benzer histopatolojik bulgular saptandı; ancak bu değişiklikler stres+obezite grubunda daha şiddetliydi. Seminifer tübüllerde yapısal bozulma, tübül epitelinde hücresel şişme ve intersellüler ödem, germinal epitel içinde çok sayıda apoptotik hücreler ve cisimler, tübül ile bazal membran arasında iri vakuoller ve bazal membranda kopmalar, interstisyumda hiyalinizasyon ve vakuolleşme gözlendi. Stres, obezite ve stres+obezite gruplarının testislerinde, spermatogonyumlarda piknotik ve sitoplazmik dejenerasyonlar görülen, epitel kalınlığı oldukça azalmış olan ve spermatogenezde duraklama (arrest) saptanan çok sayıda seminifer tübül mevcuttu. GAT1-spesifik immunhistokimyasal boyanmış testis kesitlerinde, kontrole kıyasla diğer gruplarda daha yaygın ve daha yoğun pozitif reaksiyon saptandı. Yayma preparatlarda GAT1 (+) boyanmış sperm sayısı da, kontrol grubu dışındaki gruplarda daha yüksek bulundu (p<0,05; Mann-Whitney U test). TUNEL yöntemi ile stres, obezite ve stres+obezite gruplarına ait kesitlerde kontrole kıyasla daha fazla apoptoz varlığı tespit edildi.Serum kortizol düzeyleri, stres grubunda kontrole ve obezite grubuna kıyasla anlamı derecede yüksek bulunurken (p<0,05; Mann-Whitney U test), stres ve stres+obezite grupları arasında anlamlı fark saptanmadı. Serum testosteron değerleri, kontrole kıyasla diğer üç deney grubunda daha düşük bulundu (p<0,05; Mann-Whitney U test) ve ayrıca, stres+obezite grubunun serum testosteron düzeyi diğer üç gruptan da anlamlı derecede daha düşüktü. İntratestiküler testosteron düzeyleri hem stres hem de stres+obezite gruplarında kontrole göre daha düşük olmakla birlikte, sadece stres+obezite grubundaki düşüş istatistiksel olarak anlamlı bulundu. Obezite grubunun intratestiküler testosteron değerleri kontrolden farklı değildi; ancak, stres ve stres+obezite gruplarından daha yüksekti (p<0,05; Mann-Whitney U test).Dokulardaki oksidatif stres araştırmasında, hem testiküler hem de epididimal glutatyon S transferaz (GST) değerleri, kontrole kıyasla stres ve stres+obezite gruplarında anlamlı derecede daha düşük bulundu (p<0,05; Mann-Whitney U test). Testiküler ve epididimal glutatyon peroksidaz (GSH-Px) ve süperoksit dismutaz (SOD) düzeyleri bakımından 4 grup arasında anlamlı fark yoktu (p>0,05; Mann-Whitney U test). Testiküler malondialdehit (MDA) seviyesi, kontrol grubuna kıyasla diğer üç grupta anlamlı derecede daha yüksekti (p<0,05; Mann-Whitney U test). Epididimal MDA, kontrolle karşılaştırıldığında diğer gruplarda artmış görülmekle beraber, istatistiksel kıyaslamada gruplar arasında anlamlı bir fark bulunmadı.Sonuç olarak, stres ve obezitenin hem ayrı ayrı hem de bir arada olduklarında daha şiddetli biçimde testiste histopatolojik değişikliklere ve apoptoza sebep olduğu, spermatogenezi olumsuz etkilediği, sperm morfolojisini bozduğu, sperm konsantrasyonunu ve motilitesini azalttığı, serum testosteron düzeylerini düşürdüğü, testis ve epididimde oksidatif strese yol açtığı, spermlerde ve testis içinde GAT1 ekspresyonunu arttırarak akrozom reaksiyonu üzerine olumsuz etkiler yapabileceği ve böylece erkek infertilitesi açısından önemli risk faktörleri olabileceği söylenebilir.Anahtar kelimeler: sıçan testisi, stres + obezite modeli, sperm motilitesi, ışık mikroskop, immunhistokimya, TUNEL, biyokimya.

Abstract:
Obesity and stress affect negatively a number of systems such as endocrine and genital systems of the organism. In this study, we aimed to investigate morphometric, histopathologic and biochemical affects of both chronic stress and obesity on the testes and sperms of rat models.With this aim, 24 Sprague Dawley male rats were divided randomly into four groups (n=6). During total 12-week trail, control group (Group 1) was fed by standard food without applying stress. Stress group (Group 2) was fed by standard food and undergone to the stress (Chronic Mild Stress, CMS) during the last four weeks of experiment process. Obesity group (Group 3) was fed by high fatty diet without applying stress. And stress+obesity group (Group 4) was fed by high fatty diet and undergone to chronic stress during the last four weeks of the trail. Throughout the trail, body weights and lengths of the subjects were measured weakly, and Body Mass Indexes (BMI) was calculated for their obesity pursuit. At the end of the trail, after blood samples had been taken under anesthesia from abdominal aorta, the subjects were sacrificed. Sperm samples were obtained from vas deferens and epididymis. Epididymis and testes were excised. By using Makler chamber, sperm concentration and motility were evaluated under the light microscope. Sperm smears were stained with immunohistochemically. Epididymis and left testes were kept at -80 0C for biochemical enzyme analysis. After their weights had been measured, right testes were fixed in Bouin solution for microscopic examination. After histologic process, the sections taken from testes buried in paraffin were stained with Hematoxylin-Eosin (H-E), Periodic acid Schiff, Masson Tricrom immunohistochemistry for Gamma Amino Butyric Acid (GABA) Transporter 1 (GAT1) protein and TUNEL Method specified to show apoptosis, and were examined on light microscope. In order to evaluate the spermatogenesis, Johnsen scoring was carried on the sections stained by H-E. All quantitative data obtained were analyzed by means of statistic methods.In the 8th week of the trail, BMI values of obesity and stress+obesity groups fed by high fatty diets were found statistically different in terms of the other two groups fed by the standard food (p<0,05; Post Hoc Test). Thus, obesity model was formed from two groups. From the end of the eight-week to the end of the trail (totally 12 weeks), CMS procedure was applied to the stress and stress+obesity groups during four weeks, and the effects of the stress on normal and obese rats were investigated. Although BMI in stress+obesity group at the 8th week was higher than control group (p<0,05; Post Hoc Test), it was seen that the distinction between control group and stress+obesity group was not present at the end of the trail (p>0,05; Post Hoc Test). BMI in the obesity group at the end of the trail was found significantly higher than control and stress+obesity groups (p<0,05; Post Hoc Test, Tamhane).The weights of testes in stress+obesity group reduce significantly in comparison to the other three groups (p<0,05; Mann Whitney U Test). When compared to the control group, epididymal sperm concentration and sperm motility of the other three groups were found lower. In addition, sperm motility of the obesity and the stress+obesity groups were lower than that of stress group (p<0,05; Mann Whitney U Test). The number of sperms with defective head and tail was found significantly higher than the other groups (p<0,05; Mann Whitney U Test). Johnsen scores of stress, obesity and stress+obesity groups were lower than those of control group. In addition, Johnsen score of stress+obesity group was lower than obesity group (p<0,05; Mann Whitney U Test). In light microscopic examination of sections of the testes, similar histopthologic findings were detected in the three groups other than control group. But, these changes were more severe in stress+obesity group. It was observed that there were structural impair in seminifer tubules, and cellular swelling in tubul epithel and intercellular edema, a number of apoptotic cells and bodies in germinal epithel, enormous vacuoles between tubul and basal membrane, and breakings in basal membrane, hyalinization in interstitium and vacuole. In the testes of stress and stress+obesity groups, there were a number of seminifer tubules with picnotic and cytoplasmic degeneration in spermatogonyum much decrease epithelial thickness and reduced spermatogenesis (spermatogenic arrest). In GAT1-spesific immunochemical stained-testes sections, there was positive reaction more densely and invasive in the other groups than the control group. In the smears, the number of GAT1 positive stained glasses was found higher in the groups other than control group (p<0,05; Mann Whitney U Test). By means of TUNEL method, more apoptosis existence was detected in the sections belonging to the stress, the obesity and the stress+obesity groups than the control group.While serum cortisol levels were found higher in stress group than control and obesity group (p<0,05; Mann Whitney U Test), there was no significant distinction between the stress and the stress+obesity groups. The levels of serum testosterone were found lower in the other two groups than control group (p<0,05; Mann Whitney U Test). In addition, serum testosterone level of stress+obesity group was significantly lower than the three study groups. While intratesticular testosterone levels were lower in both that of stress and stress+obesity groups than control group, there was statistically significant reduction in only stress+obesity group. Intratesticular testosterone values of obesity group were not different from the control group. But, they were higher in stress and stress+obesity groups (p<0,05; Mann Whitney U Test).In the examination of oxidative stress of the tissue, both testicular and epididymal glutathione S transferase (GST) values were found significantly lower than in stress and stress+obesity groups (p<0,05; Mann Whitney U Test). As regards testicular and and epididymal glutathione peroxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD) levels, there was no significant distinction among four groups (p>0,05; Mann Whitney U Test). The level of testicular malondialdehyde (MDA) was significantly higher in the other three groups than that of control group (p<0,05; Mann Whitney U Test). When epididymal MDA was compared with the control, while it was seen as increased in other groups, there was no statistically significant distinction among the groups.In conclusion, it can be said that stress and obesity, when they are both separate and together, caused histopathologic changes and apoptosis more severely, and affected spermatogenesis negatively, and impaired sperm morphology, and reduced sperm concentration and motility, and reduced the levels of serum testosterone, and caused oxidative stress in testes and epididymis, and might affect acrosome reaction negatively by increasing GAT1 expression in the testes and thus this might be imported risk factor as regards male infertility.Key words: rat testis, stress + obesity model, sperm motility, light microscope, immunohistochemistry, TUNEL, biochemistry.