Fenolik bileşiklerin belirlenmesinde kullanılacak biyoanaliz sistemlerinin hazırlanması ve karakterizasyonu
Preparation and characterization of bioanalysis systems to be used in determining phenolic compounds
Yazar: ELİF ESEN
Danışman: DOÇ. DR. DİLEK ODACI DEMİRKOL
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry

Özet:
Endüstriyel atıkların çevredeki artışıyla birlikte birçok atık türünde doygunluğa ulaşılmıştır ve bu atıkların zararları görülmeye başlamıştır. Bu atıklardan en önemlilerinden olan fenol ve fenol türevleri; patlayıcı madde, farmasötik, plastik, kâğıt, boya, pestisit ve antioksidanların üretimi gibi birçok endüstriyel proseste kullanılmaktadırlar. Bazı fenoller ve aromatik bileşikler yüksek oranda toksisite, kanserojen ve alerjen özellik gösteren maddeler olmaları sebebiyle tayin edilmeleri ve çevreden uzaklaştırılmaları yüksek öneme sahiptir. Bu bileşiklerin tayini amacıyla atık su, içecekler gibi çeşitli ortamlarda kolorimetrik, florometrik, türbidimetrik, spektrofotometrik ve enzimatik yöntemler uygulanmaktadır. Ancak kullanılan bu yöntemlerin oldukça zaman alıcı ve pahalı sistemler olduğu bilinmektedir. Bu tip sistemlere kıyasla biyosensörler ile maliyeti düşük, pratik ve hızlı sonuç veren analizlerin uygulanması mümkündür. Bu tez çalışmasında, fenolik bileşiklerin belirlenmesine yönelik lakkaz (Lac) enzimi kullanılarak biyosensör dizayn edilmiştir. Bu amaçla, kolaylıkla hazırlanabilen ve enzimin kovalent bağlarla immobilize edilmesini sağlayan poliamik asit (PAA) membranlar kullanılmıştır. İlk olarak PAA membranlar florofor bir madde olan antraseni (Ant) içerecek şekilde sentezlenmiştir. Ant-PAA yapısına Lac enzimi, gluteraldehidin çapraz bağlayıcı olarak görev yaptığı bir yöntemle immobilize edilmiştir. 
Oksijenin antrasenin floresans şiddetini sönümlemesi yapılan ölçümlerin temelini oluşturmaktadır. Lac reaksiyonu sırasında fenolik bileşikler yükseltgenirken oksijen suya indirgenir. Ölçüm ortamından oksijenin uzaklaştırılmasıyla floresans şiddeti artmaktadır. Bu prensibin temel alınmasıyla konsantrasyona bağımlı floresans şiddetindeki artış ilişkilendirilerek fenolik bileşiklerin kantitatif tayini yapılmıştır. 
Ant-PAA/Lac sistemi için optimum pH 5,5 olarak bulunmuştur. Fenol 0,05-0,25 mM aralığında tayin edilmiştir. Ayrıca floresans şiddetine girişim yapma olasılığı olan çeşitli bileşiklerin etkisi test edilmiş ve sentetik atık suda fenol tayin yapılmıştır.
Bir sonraki aşamada Paraoksonaz (PON) ve Lakkaz (Lac) enzimleri birlikte immobilize edilerek Ant-PAA/Lac-PON sensör sistemi hazırlanmıştır. Ant-PAA/Lac-PON için optimum pH 8,0 olarak bulunmuş ve fenil asetat için tayin aralığı 0,01-0,5 mM olarak bulunmuştur. Girişimci etkisi test edilmiştir.
Siproflaksasinin PON için inhibitör olduğu bilinmektedir ve Ant-PAA/Lac/PON sistemi inhibitör temelli biyosensör olarak kullanılarak Siproflaksasinin kantitatif tayini yapılmıştır.

Abstract:
Along with the increase of industrial wastes in the world, many types of wastes have reached saturation and the losses of these wastes have started to be seen. Phenol and phenol derivatives, which are the most important of these wastes; Explosives, pharmaceuticals, plastics, paper, paint, pesticides and antioxidants. Certain phenols and aromatic compounds are highly toxic, carcinogenic and allergenic, and therefore have a high level of pre-determination and elimination. In order to determine these compounds, colorimetric, fluorometric, turbidimetric, spectrophotometric and enzymatic methods are applied in various media such as waste water and beverages. However, these methods are known to be quite time consuming and expensive systems. With biosensors, it is possible to apply cost-effective, practical and fast-yielding analyzes compared to such systems.In this thesis study, a biosensor was designed using laccase (Lac) enzyme for the determination of phenolic compounds. For this purpose, polyamic acid (PAA) membranes have been used which are easily prepared and allow the enzyme to be immobilized by covalent bonds. First, PAA membranes were synthesized to include anthracene (Ant), a fluorophore. In the ant-PAA construct, Lac enzyme was immobilized by a method that served as glutaraldehyde cross-linker.
Oxygen is the basis of the measurement of damping fluorescence intensity of anthracene. During the Lac reaction, the phenolic compounds are oxidized while the oxygen is reduced to water. Fluorescence intensity increases when oxygen is removed from the measurement medium. Based on this principle, quantitative determination of phenolic compounds has been made by correlating the increase in concentration-dependent fluorescence intensity.
The optimum pH for the Ant-PAA / Lac system was found to be 5.5. Phenol was determined in the range of 0.05-0.25 mM. In addition, the effect of various compounds likely to interfere with fluorescence intensity was tested and phenol determination was made in synthetic wastewater.
In the next step, the antioxidant enzyme Paraoxonase (PON) and Laccase (Lac) enzymes were immobilized together to prepare the Ant-PAA / Lac-PON sensor system. The optimum pH for Ant-PAA / Lac-PON was found to be 8.0 and the detection range for phenyl acetate was found to be 0.01-0.5 mM. Entrepreneurial influence tested.
Ciproflakasinin is known to be an inhibitor of PON and the quantitative determination of ciproflakasin was performed using the Ant-PAA / Lac / PON system as an inhibitor-based biosensor.