Nükleolar protein 7 geninin ALL-trans retinoik tedavisindeki rolü
The role of the NOL7 gene in ATRAL treatment
Yazar: ZELİHA EMRENCE
Danışman: DOÇ. DR. SEMA SIRMA EKMEKCİ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2016
Konu: Moleküler Tıp = Molecular Medicine ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Genler = Genes ; Hücre farklılaşması = Cell differentiation ; Lösemi = Leukemia ; Lösemi-miyeloid-akut = Leukemia-myeloid-acute ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Retinoidler = Retinoids ; Tretinoin = Tretinoin

Özet:
Akut promiyelositik lösemi (APL) hastalarının %98'inde PML-RARA füzyon geni bulunmaktadır. Bu füzyon gen varlığında retinoik asit reseptörünün (RAR)  fonksiyonu bozulduğundan, RAR'ın ligandı olan retinoik asit'in (RA) fizyolojik miktarı yetersiz kalmaktadır. RA yokluğunda hücre farklılaşması ve büyümesi gibi mekanizmalarda rol alan RAR tarafından düzenlenen genler transkripsiyonel olarak baskılanmaktadır. Baskılanma farklılaşmanın engellenmesine ve hücrelerin promiyelosit aşamasında kalmasına sebep olmaktadır. Ancak farmakolojik miktardaki RA ile RAR aktive olabilmekte ve terminal farklılaşma sağlanabilmektedir. Bundan dolayı tedavide all-trans retinoik asit (ATRA) kullanılmaktadır. Fakat hastaların bir kısmında RA'e direnç gelişmektedir. Direncin olası sebeplerinden biri, retinoik asit hedef genlerinin anlatımının azlığı veya yokluğu olabilir. NOL7 geni RAR-RXR tarafından düzenlenen tümör baskılayıcı bir gendir. AML'de dahil olmak üzere birçok kanserde NOL7 geninin bulunduğu 6p23 bölgesinin delesyonu gösterilmiştir. Bu bilgiler, NOL7 geninin AML'de tümör baskılayıcı olarak rol oynayabileceğini ve RAR-RXR hedef genlerinden biri olduğu için RA tedavisine dirençte etkili olabileceğini düşündürmektedir. NOL7 ve APL ile ilişkili çalışma bulunmamaktadır. Bu sebeplerle, APL hücre soylarında (PML-RARA füzyon geni bulunan NB4 ve bulunmayan HL-60 hücre soylarında) NOL7 geninin etkisini ve ATRA'ya direnç gelişimindeki rolünü araştırmayı amaçladık. Bu amaçla, NB4 ve HL-60 hücre soylarında NOL7 gen anlatımı siRNA kullanılarak baskılandı. Baskılanan hücrelerin bir kısmı ATRA ile uyarılırarak farklılaşması indüklendi. Aynı zamanda kontrol olarak herhangi bir uygulama yapılmamış hücreler ve yalnızca ATRA uygulanmış hücrelerde kullanıldı. Hücrelerde apoptoz, canlılık, proliferasyon ve granülositik farklılaşmanın analizleri yapıldı. Bulgularımız, ATRA uygulanan kontrol hücrelerinde granülositik farklılaşmanın 24/48/72 saat inkübasyon süresi ile orantılı olarak NB4 hücrelerinde daha yüksek olmakla birlikte her iki hücre soyunda arttığını gösterdi. Fakat NOL7 gen anlatımının %81 oranında baskılandığı hücrelerde 24. saatte ATRA uygulanmasına rağmen granülositik farklılaşmanın engellendiği görüldü. 48 ve 72 saat örneklerinde NOL7 gen anlatımındaki artış ile orantılı olarak granülositik farklılaşmanın arttığı görüldü. Apoptoz ve proliferasyon açısından NOL7 siRNA uygulanan hücreler ile kontrol olarak kullanılan hedefsiz siRNA uygulanan hücreler  arasında bir farklılık bulunmadı. Bu bulgular NOL7 geninin baskılanmasının, APL hücre soylarında apoptoz ve proliferasyon üzerinde etkisinin olmadığını gösterdi. Sonuç olarak, PML-RARA füzyon geni içeren NB4 hücre soyunda NOL7 baskılanmasının granülositik farklılaşmayı engellediğini ve ATRA uygulansa bile NOL7 baskılandığında hücrelerin farklılaşmasının gerçekleşmediği gösterildi. Bu bulgular NOL7'nin AML'de tek başına hücre çoğalması ve apoptoz üzerinde etkisi olmadığını, fakat ATRA ile indüklenen farklılaşmada etkili olduğunu ve ATRA direncinde rol oynadığını göstermektedir.

Abstract:
PML-RARA fusion gene is present in 98% of patients with acute promyelocytic leukemia (APL). Due to function of retinoic acid receptor (RAR) is disrupted in presence of this fusion gene, the physiologic doses of retinoic acid (RA) become insufficient. In the absence of RA, RAR-regulated genes are transcriptionally repressed. RAR-regulated genes play significant role in cell differentiation and cell growth. Repression of RA target genes causes to differentiation block and cells remain in promyelocytic stage of hematopoiesis. However RAR is able to activate with pharmacological doses of RA and terminal differentiation is provided. ATRA is used to treat APL patients. Nevertheless, ATRA resistance is developed in 30% of patients. One of the reasons of resistance may be lack or absence of expression of the retinoic acid targeted genes.NOL7 is a tumor suppressor gene regulated by RAR-RXR. 6p23 region where theNOL7 gene is located, is associated with many cancers, including AML. In the light of this information, NOL7 may play a role as a tumor suppressor gene in AML and may be related with the resistance of RA becauseNOL7 is one of the RAR-RXR target genes. However, there are no studies associated withNOL7 and APL. For these reasons, we aimed to investigate the effect of NOL7 gene on the APL cell lines (PML-RARA positive NB4 cell line and PML-RARA negative HL-60 cell line) and the role of NOL7 in ATRA resistance. For this purpose,NOL7 gene expression was repressed by using NOL7 siRNA in NB4 and HL-60 cell lines. Some of the NOL7 knockdown cells were stimulated with ATRA, while some of the cells were not. We used non-targeting siRNA transfected cells as control. At the same time, non-transfected cells and ATRA treated non-transfected cells was used. Apoptosis, cell viability, proliferation and granulocytic differentiation analyses were performed. Our findings showed that granulocytic differentiation in ATRA treated control cells is proportionally increasing with 24/48/72 hours incubation times both cell lines, that increment is higher in NB4 cell line. Although presence of ATRA, granulocytic differentiation was blocked in the NOL7 knock-down NB4 cells in whichNOL7 expression is repressed by 81% at 24th hour. Granulocytic differentiation was increased proportionally withNOL7 gene expression at 48th and 72th hour. Apoptosis and proliferation analysis results showed that there was no difference between cells transfected with non-targeting siRNA and the cells transfected withNOL7 siRNA. Knock-down of NOL7 has no effect on proliferation and apoptosis in APL cell lines. In summary, knock-down ofNOL7 blocks granulocytic differentiation in PML-PARA positive NB4 cell line and cell differentiation was not provided whenNOL7 was down regulated even treated with ATRA. Our results show that NOL7 is not affected on apoptosis and cell growth at AML, but it is effective on cell differentiation and plays role in ATRA resistance is showed in comparison with results.