Karaciğer iskemi reperfüzyon modelinde karaciğer ve uzak organ hasarında endoplazmik retikulum stresinin rolü
Role of endoplasmic reticulum stress in liver and distant organ injury in liver ischemia reperfusion model
Yazar: ERKAN ERMİŞ
Danışman: YRD. DOÇ. HASİBE VERDİ
Başkent Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Cerrahi = Surgery ; Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Karaciğer = Liver ; Karaciğer hastalıkları = Liver diseases ; Reperfüzyon = Reperfusion ; Reperfüzyon lezyonu = Reperfusion injury ; İskemi = Ischemia

Özet:
Amaç: Karaciğer iskemi/reperfüzyon hasarı, pringle manevrası gerektiren karaciğer cerrahisinde ve karaciğer transpantasyonunda geçici iskemi ve sonrasında dolaşımın tekrar sağlanmasıyla oluşmaktadır. Reperfüzyon sırasında açığa çıkan serbest oksijen radikalleri iskemi/reperfüzyon hasarında önemli rol oynamaktadır. Ortaya çıkan bu serbest radikallerin de etkisiyle endoplazmik retikulumda biriken katlanmamış ya da hatalı katlanmış proteinler sonucu endoplazmik retikulum stresi tetiklenmektedir. Bu tez kapsamında karaciğerde oluşan hasarla birlikte hem karaciğerde hem de akciğer, böbrek, beyin gibi uzak organlardaki endoplazmik retikulum stresinin varlığının ve hücre ölümü üzerindeki rolünün araştırılması amaçlanmaktadır.
Gereç ve yöntem: Çalışmamızda ağırlıkları 180-300 gr arasında değişen 15 adet Wistar Albino cinsi erişkin erkek sıçan kullanıldı. Sıçanlar rastlantısal olarak 3 gruba ayrıldı. Grup 1: İskemi/reperfüzyon:  Sıçanlar, orta hat insizyonu ile açılarak karaciğere giden hepatik portal ven ve hepatik arter bulldog klemp ile kapatıldı. 60 dk iskemi süresi sonunda, 60 dk reperfüzyona bırakılmışdı. 60 dk'nın sonunda ise sıçanlar sakrifiye edilip karaciğer, akciğer, böbrek ve beyin dokuları alındı. Dokuların bir kısmı patoloji için yüzde 10'luk formaldehitde saklanıp diğer kısımları ise RNA izolosyonu için, RNAlater'da saklanıp -80 C ye kaldırıldı. Grup 2: Sham: sıçanlar yine orta hat insizyonu ile açılarak 120 dk bekletilip, yine patoloji ve RNA izolasyonu için karaciğer, akciğer, beyin ve böbrekleri alındı. Grup 3: Kontrol: Bu gruptaki sıçanlara hiçbir işlem uygulanmayıp, yine karaciğer, akciğer, beyin ve böbrek dokuları patoloji ve RNA izolasyonu için alındı. Toplanan tüm dokulardan, bir kısmı immünohistokimyasal incelemeler için %10'luk formaline alındı. Bir kısmı ise RNA izolasyonu için kullanıldı. Elde edilen RNA'lar cDNA'ya çevrilip, light cycler 480 cihazında ER stres genleri olan GRP78, PERK, ATF6 ve CHOP ifadelenmelerine bakıldı. Sonuçlar istatiksel olarak student- t testi ile değerledirildi. p≤ 0.05 anlamlı olarak kabul edildi.
Bulgular: Karaciğer, akciğer, böbrek ve beyinde ER stres gen ifadelerinde sham grubuna göre belli oranda bir artış gözlenirken istatiksel olarak anlamlı bulunamadı. Karaciğerde ATF6, PERK ve CHOP genlerinde, aynı zamanda akciğer, böbrek ve beyinde CHOP ifadelenmelerinde istatiksel olarak anlamlı bir artış görüldü. Ayrıca immünohistokimyasal incelemeler sonucunda İskemi/reperfüzyon grubunda,  hepatosit kordonlarında daralma ve hepatoselüler kayıp ile karakterize parankim hücre zedelenmesi ve nötrofil lökosit infiltrasyonu görüldü.
Sonuç: Karaciğer I/R hasarı sonrası karaciğer yanı sıra akciğer, böbrek ve beyin gibi uzak organlarda ER stresinin etkisi gözlendi. Bunun sonucu olarak ER stresinin I/R hem lokal hem de uzak organlarda etkili bir rol oynadığı ve bu stresi azaltmak adına yapılacak olan çalışmalara ışık tutacaktır.

Abstract:
Aim: Liver ischemia / reperfusion injury, occurs in pringle maneuver requiring liver surgery and liver transplantation by transient ischemia, and after that re-establishment of circulation. Free oxygen radicals, which emerge during reperfusion, play an important role in ischemia / reperfusion injury. With the effects of these free radicals, unfolded or missfolded proteins in endoplasmic reticulum can trigger endoplasmic reticulum stress. Them aim of this study to understand role of endoplasmic reticulum stress in cell death and the presence of this stress in both liver and in distant organs such as lung, kidney, brain.
Material and Method: Total 15 adult male Wistar Albino rats, weight between 180-300 gr, was used. Rats were randomized into 3 groups. Group 1: Ischemia / reperfusion: Rats were opened with midline incision and hepatic portal vein and the hepatic artery were closed with a bulldog clamp. At the end of 60 minutes ischemia period, 60 minutes of reperfusion was applied. At the end of reperfusion; rats were sacrified and their liver, lung, kidney and brain tissues were collected. Some of these tissues were stored for pathology in 10% formaldehyde and the remaining tissues were stored at -80 C in RNA later for RNA isolation. Group 2: Sham: rats were opened with midline incision and after waiting for 120 minutes they were sacrified and their liver, lung, kidney and brain tissues were collected for pathology and RNA isolation. Group 3: Control: No procedures were applied to this group, and again their liver, lung, kidney and brain tissues were collected for pathology and RNA isolation. Some of these collected tissues were taken into 10% formaldehyde for Immunohistochemical studies and the remaining parts were used for RNA isolation. RNAs were converted to cDNA and the expression levels of ER stress genes, GRP78, PERK, ATF6 and CHOP, were examined with lightcycler 480 device. Results were evaluated with student-t test p≤ 0.05 was accepted as statistically significant.
Results: There was a slight increase in the expression levels of ER stress genes in liver, lung, kidney and brain when copared with sham group but this difference was not statistically significant. There was a statistically significant increase for the expression levels of ATF6, PERK and CHOP genes in liver and the expression level of CHOP gene in lung, kidney and brain. Moreover as a result of Immunohistochemical studies; there was parenchymal cell injury and neutrophil leukocytes infiltration which was characterized with narrowing of hepatocytes cords and hepatocellular loss in ischemia reperfusion group.
Conclusion: After liver I/R injury; effect of ER stress was observed in distant organs such as lung, kidney and brain in addition to liver. As a result of this we understand that ER stress after I/R can effect both local and distant organs and this study will set light to further studies for reducing this stress.