İnvazif mantar infeksiyonlarının tanımlanmasında moleküler yöntemlerin önemi; uygulanması ve geleneksel yöntemler ile karşılaştırılarak değerlendirilmesi.
The significance and application of molecular methods for description of invasive fungal infections and evaluation and comparison of the test results with conventional methods
Yazar: SERDAR SUSEVER
Danışman: PROF.DR. YILDIZ YEĞENOĞLU
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2006
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
ÖZETSusever S (2006). nvazif mantar infeksiyonlarının tanımlanmasında moleküleryöntemlerin önemi; uygulanması ve geleneksel yöntemler ile karşılaştırılarakdeğerlendirilmesi. stanbul Üniversitesi Sağlık bilimleri Enstitüsü, Mikrobiyoloji veKlinik Mikrobiyoloji ABD. Doktora Tezi. stanbul. 2006.Anahtar Kelimeler: Polimeraz zincir reaksiyonu, multipleks PCR, Candida türleri,Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatusBu çalışma stanbul Üniversitesi Bilimsel Araştirma Projeleri Birimi tarafındanT329/03112003 no'lu proje olarak desteklemiştir.Son yıllarda mantar infeksiyonlarının öneminin artmasından dolayı etken olanmantarların tanısı, tür tayini, tiplendirilmesi ve antifungal dirençlilikle ilgili çalışmalarhız kazanmıştır. nfeksiyon etkeni olan/olabilen gerçek ve fırsatçı patojen mantarlarıntanımlanmasında, doğrudan mikroskopik inceleme ve kültür günümüzde halen altınstandart yöntemler olma değerini korumaktadır. Ancak gerek zaman alıcı olması,gerekse her zaman olumlu sonuç vermemeleri, bazı mantarlar açısından zoruygulanabilir ve yorumlanabilir olması nedeniyle bu yöntemlerin yanı sıra; daha hızlıolan, duyarlılık ve özgüllüğü yüksek yeni tanı yöntemlerine gereksinim duyulmuştur.Çalışmada, moleküler yöntemler kullanılarak bazı mantar infeksiyon ve etkenlerinintür düzeyinde tanılarının, yapılabilmesi amaçlanmıştır. Çalışma boyunca gelenekselyöntemler de paralel olarak uygulanmış ve deneylerin bitiminde her iki yöntemkarşılaştırılarak yorumlanmıştır. Mantar DNA'sını elde etmek için klasik fenol-kloroform-izoamilalkol ve ticari DNA ekstraksiyon kiti kullanılmış, ticari kit ile DNA'nınelde edilmesi 6-7 saatte tamamlanırken, bu süre fenol kloroform izoamilalkolyönteminde yaklaşık 9-10 saat olarak belirlenmiştir. Çalışmada, mantarların ITS1,ITS2, ITS3, ITS4, 5,8S rDNA ve 28S rDNA bölgelerinden seçilen genel ve türe özgüprimerler kullanılmıştır. Genel primer ile 550bp'de mantarlara, türe özgü primerlerinkullanılması ile: 273bp'de C.albicans, 320bp'de C.parapsilosis, 423bp'de C.glabrata,357bp'de C.tropicalis, 385bp'de A.fumigatus ve 136bp'de C.neoformans'a ait bantsaptanmıştır. Mikroskopi, kültür ve PCR olumlu yedi (%19.4); mikroskopi olumsuz,PCR olumlu 16 (%44.4), mikroskopi olumsuz kültür ve PCR olumlu altı (%16), örnekbelirlenmiştir. Hiçbir örneğin PCR'ı olumsuz, kültür ve mikroskopisi olumlubulunmamıştır. 50 immünsupressif hastaya ait klinik örneklerin 27(%54)'sindemultipleks PCR yöntemi ile, 17(%34)'sinde de kültürel yöntemler ile olumlu yanıtalınmıştır. Anamnezlerinde örneklerin gönderildiği dönemde antifungal tedavi altındaoldukları belirtilen ve kültür sonucu olumsuz olarak saptanan 10(%20) hastanın tümümultipleks PCR testi ile olumlu yanıt vermiştir. Çalışmada Kappa istatistiksel analiztesti yardımı ile kültür ve PCR uyumu 0,61(p<0,001), mikroskopi PCR uyumu ise0,24 (p<0,001) olarak saptanmıştır.Uygulanan PCR yönteminin duyarlılığı %100,özgüllüğü ise %69,7 olarak belirlenmiştir.Sonuç olarak geleneksel yöntemlerigözardı etmeden ortam koşulları ve klinik tablo esas alınarak; gerekli testleringereken zamanlarda uygulanması; verilerin klinik, histopatolojik ve görüntülemeteknikleri ile birleştirilip doğru yorumlanabilmesi kanısına varılmıştır.

Abstract:
ABSTRACTSusever S. The significance and application of molecular methods for description ofinvasive fungal infections and evaluation and comparison of the test results withconventional methods. stanbul. 2006. stanbul University, Institute of Health Science,Depatment of Microbiology and Clinical MicrobiologyKey Words: Polymerase chain reaction, multiplex PCR, Candida species,Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatusThis study was supported by The Research Support Unit of stanbul University as theproject no T329/03112003.Since the importance of the fungal infections are increased in last years, studiesrelated to the typing, identification and the antifungal resistance of the causitiveagents have been speed up. In the determination of true or opportunistic pathogensas a causitive agent, direct microscopy and culture techniques are still gold standartbut interpretion and application of these techniques are difficult for some fungi andthey are not time consuming. Because of these reasons, the new and rapidtechniques which have had high sensitivity and specificity are needed. In this studythe causitive agents of the fungal infections were identified in species level by usingthe moleculer techniques and results were compared with the conventional methods.For the isolation of fungal DNA, classical phenol-chloroform-isoamilalcoholprocedure (9-10 hours) and commercial DNA extraction kit (6-7 hours) were used,and general and species specific primers from ITS1, ITS2, ITS3, ITS4, 5,8S rDNAand 28S rDNA regions were choosen. In PCR results, a 550bp band was observedas universal primers. Species-specific primers for C.albicans, C.parapsilosis,C.glabrata, C.tropicalis, C.neoformans and A.fumigatus were occurred 273bp,320bp, 423bp, 357bp, 136bp and 385bp band on gel, respectively. It was found thatall of the samples were positive by microscopy, culture and PCR in 7 samples(19.4%), the number of samples with microscopy negative but PCR positive were 16(44.4%) and the number of samples with microscopy negative but culture and PCRpositive were 6 (16%). There were no samples that PCR negative but microscopyand culture positive.27(54%) and 17 (34%) clinical samples taken from 50immunosuppressive patients were positive when tested by multiplex PCR andcultural methods, respectively.10(20%) samples taken from patients under theantifungal therapy were negative by cultural methods, but they were positive whentested by multiplex PCR. In this study, the agreement between the culture - PCRand microscopy - PCR when calculated with a Kappa statistic was 0.61 (p<001) and0.24 (p<0001), respectively. The sensitivity and specificity of PCR compared withcultural methods were 100% and 69.7%, respectively. In conclusion, not onlyconventional methods and clinical symptoms but also rapid-sensitive andhistopathological test results should combine for the best description of fungalinfections.