Ostolün erektil fonksiyondaki yararlı etkilerinde H2S'in rolünün araştırılması
Investigation of the role of H2S in the beneficial effects of osthole on erectile function
Yazar: ELİF ALAN ALBAYRAK
Danışman: DOÇ. DR. GÜLNUR SEVİN
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Farmakoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology
Dizin: Penis ereksiyonu = Penile erection

Özet:
Erektil fonksiyon, penil dokunun gevşemesiyle ereksiyonun gerçekleşmesini sağlayan nörovasküler bir süreçtir.  Erektil disfonksiyon (ED) ise, cinsel performans için gerekli olan ereksiyona ulaşmada/sürdürmede bozukluk durumudur. 2025 yılında, 322 milyon ED hastası olacağı tahmin edilmektedir. Fosfodiesteraz enzimi (PDE), endotel/NO aracılığıyla üretilen cGMP'yi hidroliz ederek gevşemeyi sonlandırmaktadır. Bu nedenle, ED tedavisinde kullanılan PDE-5 inhibitörlerinin etkilerini gösterebilmeleri için endotelde/NO üretiminde bozukluk olmaması gerekmektedir. Ancak endotel disfonksiyonu kaynaklı vaskülojenik ED'nin, toplumda en sık rastlanan ED tipi olduğu ve PDE-5 inhibitörlerinin, genel hasta popülasyonunun %30-40'ında etkisiz olduğu bildirilmiştir. Bu durum özellikle vaskülojenik ED tedavisinde seçilecek ajanların, endotelden bağımsız etki göstermelerinin kritik önemini ortaya koymaktadır. Hidrojen sülfür (H2S), L-sisteinden, sistatiyonin γ-liyaz (CSE), sistatiyonin β-sentaz (CBS) ve 3-merkaptopiruvat sülfürtransferaz (3-MST) enzimleri aracılığıyla üretilen bir gazotransmitterdir. H2S'nin endotelden bağımsız mekanizmalarla erektil fonksiyonu artırması dikkat çekmekte ve H2S'yi ED tedavisinde önemli bir hedef haline getirmektedir. Ostol, kardiyovasküler sistemde yararlı etkiler gösteren doğal bir kumarindir. Ostolün penil dokuyu, ED tedavisinde kullanılan papaverinden çok daha güçlü bir şekilde gevşettiği bildirilmiştir. Ostolün düz kas gevşetici etkilerini; kalsiyum kanal blokajı, fosfatidilinozitol 3-kinaz (PI3K)/Akt/endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS)/NO yolağı aktivasyonu, çözünebilir guanilat siklaz (sGC) aktivasyonu ve PDE-5 inhibisyonu aracılığıyla gösterdiği rapor edilmiştir. Literatür taramalarımız, ostolün birçok farmakolojik etkisini, H2S ile ortak mekanizmalar üzerinden gerçekleştirdiğini ortaya çıkarmış ve tez kapsamında ilk kez ostolün erektil fonksiyondaki yararlı etkisinde H2S'nin rolünün araştırılması hedeflenmiştir.
Bu amaçla, tezin ilk bölümünde fare korpus kavernozumuyla (FKK), izole organ banyosu, gerçek-zamanlı H2S ölçümü, Western blot deneyleri; tezin diğer bölümde ise TÜBİTAK 2214-A kapsamında Aarhus Üniversitesi'nde sıçan pudendal arteriyle (SPA), H2S mikrosensörü takılı izole organ banyosu deneyleri gerçekleştirilmiştir. Ayrıca ilk kez ostolün erektil fonksiyon üzerindeki etkisi, sıçanlara ostol uygulamasını (intravenöz) takiben intrakavernöz basınç (İKB)/ortalama arteriyel basınç (OAB) ölçülerek in vivo olarak araştırılmıştır. 
Ostol, FKK'de gevşemeye neden olmuş, bu gevşemeler H2S sentez inhibitörü aminooksiasetik asit (AOAA) ile inhibe olmuştur. Ostol, SPA'yı gevşetirken eş zamanlı olarak arter lümeninde endojen H2S üretimini arttırmış; AOAA, ostole bağlı gevşemeleri ve H2S üretimini inhibe etmiştir. Ostol (20 µM), FKK'de, L-sistein, Na2S, asetilkolin ve sodyum nitroprussid gevşemelerini arttırmış, bu artışlar AOAA ile geri dönmüştür. SPA'da ise ostol, L-sistein ve Na2S gevşemelerini ve eş zamanlı olarak arter lümenindeki H2S düzeylerini arttırmıştır. FKK'de yapılan çalışmalar ile kısa süreli (30 dk.) ostol inkübasyonunun, L-sistein ile uyarılan H2S sentezini arttırdığı; daha uzun süreli inkübasyonunun ise (24 saat), CSE ve CBS enzim ekspresyonlarını arttırdığı ve bu artışın enzim aktivitesine yansıdığı saptanmıştır. FKK'de ostol gevşemeleri, L-NAME, ODQ ve glibenklamid ile; SPA'da ise L-NAME, iberitoksin ve linopirdin ile inhibe olmuştur. 
Tüm bu sonuçlar, ostolün, FKK'de ve SPA'da endojen bazal ve L-sistein ile uyarılan H2S sentezini arttırarak gevşemeye neden olduğunu, ostolün NO aracılı gevşetici etkisine H2S'nin katkı sağladığını; sGC enziminin, KATP, BKCa ve KV7 kanallarının ostol gevşemelerinde rol oynadığını göstermektedir. Ayrıca ostolün, ilk kez İKB/OAB'ı arttırdığı ve spontan ereksiyona neden olduğu ön denemelerde gösterilmiştir. Ostolün özellikle endotel disfonksiyonunun eşlik ettiği ED ve NO/H2S biyoyararlanımının azaldığı hipertansiyon, diyabet gibi hastalıkların tedavisinde kullanılma potansiyeli ortaya çıkarılmıştır. Ayrıca çalışmamızda ilk kez pudendal arterden ostol, L-sistein ve Na2S vasküler yanıtları alınmıştır. 
Bu tez ile vasküler yanıtlar alınırken ilk defa eş zamanlı olarak arteriyel lümendeki endojen H2S oluşumunun ölçüldüğü, literatürde herhangi bir benzeri olmayan önemli bir bilimsel bulgu elde edilmiştir. Böylece mevcut literatüre; gazotransmitterlerin, damar fonksiyonu ile ilişkilerinin detaylı bir şekilde incelenmesine olanak sağlayacak yeni bir metodoloji kazandırılmıştır.

Abstract:
Erectile function is a neurovascular process that results in an erection through the relaxation of the penile tissue. Erectile dysfunction (ED) is the inability to achieve/maintain the erection required for sexual performance. It has been predicted that by the year 2025, there will be 322 million patients suffering from ED. Phosphodiesterase enzymes (PDE) terminate relaxation by hydrolyzing cGMP, which is produced via endothelium/nitric oxide (NO) mediation. Consequently, for PDE-5 inhibitors used in the treatment of ED to exert their therapeutic effects, there must be no disruption in endothelium/NO production. However, vasculogenic ED, primarily caused by endothelial dysfunction, is reported as the most common type of ED, with PDE-5 inhibitors being ineffective in 30-40% of patients with ED. This highlights the critical importance of selecting drugs that have effects independent of endothelial function for the treatment of vasculogenic ED. Hydrogen sulfide (H2S) is a gasotransmitter produced by cystathionine γ-lyase (CSE), cystathionine β-synthase (CBS), and 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (3-MST) enzymes from L-cysteine. The capacity of hydrogen sulfide (H2S) to augment erectile function via mechanisms that are independent of endothelium is noteworthy, establishing it as a prominent target in the treatment of ED. Osthole is a natural coumarin known with its beneficial effects on the cardiovascular system. Osthole has been reported to relax penile tissue more potently than papaverine, commonly used in ED treatment. The smooth muscle relaxant effects of osthole are reported to be mediated through mechanisms such as calcium channel blockade, activation of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt/endothelial nitric oxide synthase (eNOS)/NO pathway, soluble guanylate cyclase (sGC) activation, and PDE-5 inhibition. In our literature reviews, it has been revealed that osthole shows its many pharmacological activities through common mechanisms with H2S, prompting this thesis to investigate, for the first time, the role of H2S in the beneficial effects of osthole on erectile function. In this context, in the first part of the thesis, the isolated organ bath, real-time H2S measurement, and Western blot experiments were performed with mouse corpus cavernosum (MCC). The second part, conducted at Aarhus University under the TUBİTAK 2214-A program, involved experiments with rat pudendal artery (RPA) in the H2S microsensor-attached isolated organ bath. Additionally, for the first time, the effect of osthole on erectile function was investigated in vivo by measuring intracavernosal pressure (ICP)/mean arterial pressure (MAP) following intravenous administration of osthole to rats. Osthole caused relaxation in the MCC, which was inhibited by the H2S synthesis inhibitor aminooxyacetic acid (AOAA). In the RPA, osthole not only relaxed the artery but also increased endogenous H2S production in the arterial lumen, with AOAA inhibiting both the relaxation and H2S production induced by osthole. In MCC, osthole (20 µM) enhanced relaxations induced by L-cysteine, Na2S, acetylcholine, and sodium nitroprusside, with these increases in relaxations being reversed by AOAA. In the RPA, osthole increased L-cysteine and Na2S-induced relaxations and H2S levels in the arterial lumen. Short-term (30 min) incubation of MCC with osthole increased L-cysteine-stimulated H2S synthesis, while longer-term incubation (24 hours) increased the expression of CSE and CBS enzymes, and this increase was reflected in enzyme activities. L-NAME, ODQ, and glibenclamide inhibited osthole-induced relaxations in the MCC, while in the RPA, relaxations were inhibited by L-NAME, iberiotoxin, and linopirdine.
These results demonstrate that: i) Osthole causes relaxation by enhancing endogenous basal and L-cysteine-stimulated H2S synthesis in MCC and RPA, ii) H2S contributes to the NO-mediated relaxant effect of osthole, iii) sGC enzyme, KATP, BKCa, and KV7 channels play roles in the osthol-induced relaxations. Moreover, preliminary experiments have shown for the first time that osthole increases ICP/MAP and induces spontaneous erection. The potential of osthole in the treatment of ED, especially related to endothelial dysfunction and in conditions like hypertension and diabetes where NO/H2S bioavailability is reduced, is highlighted. Additionally, vascular responses to osthole, L-cysteine, and Na2S in the RPA have been obtained for the first time in our study. This thesis marks a significant scientific achievement, unprecedented in the literature, by simultaneously measuring the formation of endogenous H2S in the arterial lumen while monitoring the vascular responses. Consequently, this research presents to the existing body of literature a new methodology that could facilitate a detailed examination of the relationships between gasotransmitters and vascular function.