Polifenollerin hipokloroz asit süpürme aktivitelerinin ölçümü için yeni bir spektroflorometrik yöntem geliştirilmesi
Development of a novel spectrofluorometric method for the hypochlorous acid scavenging activity measurement of polyphenols
Yazar: NAZAN DURUSOY
Danışman: DOÇ. DR. MUSTAFA ÖZYÜREK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Analitik Kimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Kimya = Chemistry

Özet:
Hipokloroz asit (HOCl) organizmanın savunmasıyla ilişkili olarak fizyolojik proseslerde yer alan ve radikal olmayan önemli bir reaktif oksijen türüdür. Diğer reaktif oksijen türlerine (ROS) benzer şekilde HOCl üretimi yeterince kontrol altında tutulmadığında antioksidan savunma sistemindeki azalmaya paralel olarak organizmada olumsuz etkilere (inflamatuvar hastalıklar, ateroskleroz, kronik inflamasyon ve bazı kanserlerin oluşumu vb.) neden olmaktadır. HOCl süpürücü polifenolik bileşiklerin ilgili oksidanın (aktive edilmiş fagositler tarafından üretilen ve yüksek reaktivite gösteren bir oksidan) patojenik etki gösterdiği hastalıklara karşı potansiyel tedavi edici özellikleri bulunmaktadır. Gıda bitkilerinde bulunan polifenolik bileşiklerin (flavonoid ve basit fenolik asitler) çeşitli radikal süpürme aktiviteleri (hidroksil radikalleri, süperoksit, nitrikoksit ve peroksil radikalleri vb.) kapsamlı bir şekilde çalışılmış olmasına karşın, bu bileşiklerin HOCl süpürme aktiviteleri ile ilgili olarak literatürde kısıtlı bilgi bulunmaktadır. Genel olarak literatürde HOCl süpürme aktivitesinin belirlenmesi için birçok yöntem olmakla birlikte bu yöntemlerin herbirinin kendilerine özgü çeşitli kısıtlamaları bulunmaktadır. Bu nedenle tüm bu kısıtlamaları ortadan kaldırabilen, polifenolik bileşiklere ve bu bileşikleri içeren gerçek örneklere uygulanarak literatürdeki bu boşluğu doldurabilen yeni HOCl süpürme aktivite tayin yöntemlerine ihtiyaç olduğu düşünülmektedir. Bu bağlamda tez kapsamında HOCl süpürme aktivite tayini için yeni bir florometrik yöntem geliştirilmiştir. Geliştirilen bu yöntem için uygun prob resorsinol (1,3-dihidroksi benzen) bileşiği olarak seçilmiştir. Resorsinol probunun floresans gösterdiği ve HOCl ile klorinasyon reaksiyonu verdiği literatürdeki çalışmalardan bilinmekle birlikte resorsinol, polifenolik bileşiklerin HOCl süpürme aktivite tayini için ilk kez bu tez kapsamında prob olarak kullanılmıştır. Resorsinol probunun HOCl ile reaksiyonu sonunda floresans intensitesinde azalma görülmektedir. Resorsinol, floresan bir prob olmasına karşılık HOCl ile klorinasyon reaksiyonu sonucunda oluşan klorlu türevleri floresans göstermemektedir. İntensite değerindeki bu azalma, yarışmalı kinetik denklemiyle test edilen süpürücü bileşiğin HOCl süpürme aktivitesine bağlı olarak değişmektedir. Böylelikle resorsinol probunun polifenolik süpürücü varlığında ve yokluğunda ölçülen intensite değerleri kullanılarak çalışılan süpürücü bileşikler (polifenolik bileşikler: flavonoidler, basit hidroksisinnamik ve hidroksibenzoik asitler) ve gerçek örnekler (bazı bitki çayları) için IC25 (%25 inhibe edici konsantrasyon) değerleri hesaplanmıştır. Çalışılan bazı polifenolik bileşiklerin geliştirilen yönteme göre süpürme aktivite sırası; epigallokateşin gallat > kuersetin > gallik asit > rutin > kateşin > kaemferol şeklindedir. Bu çalışmada en etkin süpürücü bileşik epigallokateşin gallat olarak bulunmuştur (IC25=0.1 µM). Bitki çaylarının analize hazırlanmasında diğer klasik ekstraksiyon yöntemlerine (Soxhlet ekstraksiyonu, sıvı-sıvı ekstraksiyonu ve kolon kromatografisi-önderiştirmesi vb.) göre maliyet, zaman ve tekrar edilebilirlik bakımından daha avantajlı olan mikrodalga ekstraksiyonu yöntemi kullanılmıştır. Geliştirilen yöntem ile sentetik polifenolik bileşikler ve bitki çayları için elde edilen tüm bu veriler referans yöntemler olarak belirlenen KI/taurin ve HPLC yöntemleriyle elde edilen veriler ile istatiksel olarak karşılaştırılmıştır (ANOVA testi). Her iki yönteme (geliştirilen yöntem ve KI/taurin referans yöntemi) göre en yüksek HOCl süpürme aktivitesi (% inhibisyon) yeşil çay ekstraktı için bulunmuştur (sırasıyla % 54.8 ve % 30.4).
Sonuç olarak tek tek ve karmaşık matriks ortamlarındaki polifenolik bileşiklerin HOCl süpürme aktivitesi ölçümü için literatürde bulunan diğer yöntemlerden daha duyarlı, basit ve seçici bir florometrik bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemin kolaylıkla inhibe edilebilen enzim esaslı olmaması, yöntem için belirlenen probun HOCl analitine seçimli olması (reaksiyon ortamında HOCl dışında bulunabilecek diğer maddeler ile reaksiyon vermemesi), yöntemde ölçüm yapılan dalgaboyunun (λex=277 nm, λem= 304 nm) sadece proba (resorsinol) özgü olması, absorptimetrik yöntemlere göre daha duyarlı olması ve tekabül eden HPLC yöntemlerinden daha az maliyetli ve meşakkatli olması, yöntemin üstünlükleri olarak özetlenebilir.

Abstract:
Hypochlorous acid (HOCl) is an important reactive oxygen species (ROS), non-radical, and taking part in physiological processes concerned with the defense of the organism. When the production of HOCl is not sufficiently controlled, this may give rise to adverse effects (i.e., inflammatory diseases, atherosclerosis, chronic inflammation and some cancers) in the organism parallel to a weakening of the antioxidant defense, similar to other ROS. Polyphenolic compounds as scavengers of HOCl, could have potential therapeutic effects in diseases in which this oxidant (a highly reactive oxidant produced by activated phagocytes) plays a pathogenic role. Flavonoids, simple phenolic acids are polyphenolic substances present in food plants and have been extensively studied for their scavenging acitivities various free radicals (i.e., hydroxyl radicals, superoxide, nitric oxide, and peroxyl radicals), but there has been limited information regarding its scavenging by polyphenolic compounds. Generally, although there are quite a number of methods in literature for the determination of HOCl scavenging activity, all these methods suffer from certain restrictions. For all these reasons, it is evaluated that novel methods for the measurement of HOCl scavenging activity applicable to polyphenolic compounds and their real mixtures need to be devised to eliminate the aforementioned restrictions and to fill in this literature gap. In this regard, a new fluorometric HOCl scavenging activity assay was developed in this thesis. Resorcinol (1,3-dihydroxybenzene) was selected as the probe molecule for the developed method. Although it has been reported in literature that resorcinol is a fluorescent molecule that can be chlorinated with HOCl, it is the first time in this thesis for resorcinol to be used as a probe for HOCl scavenging activity determination of polyphenolic compounds. The fluorescence intensity of resorcinol is attenuated as a result of its reaction with HOCl. Resorcinol is fluorescent, but its chlorination products are not. The attenuated intensity of resorcinol fluorescence is dependent upon the HOCl scavenging activity of the tested compound as measured by competitive reaction kinetics equation. With the aid of resorcinol fluorescence values recorded in the presence and absence of phenolic scavengers, the IC25 (25% inhibitive concentration) of phenolics (polyphenols: flavonoids, simple hydroxybenzoic and hydroxycinnamic acids, etc.) and real samples (some herbal teas) were calculated. The scavenging activities of polyphenolic compounds tested with respect to the developed method decrease in the order: epigallocatechin gallate > quercetin > gallic acid > rutin > catechin > kaempferol. The present study revealed that epigallocatechin gallate (IC25=0.1 µM) was the most effective scavenger agent. In the preparation of herbal tea samples for analysis, the method of microwave extraction was used, having distinct advantages of reduced cost and time and increased reproducibility over classical extraction methods (such as soxhlet extraction, liquid-liquid extraction, column chromatography and preconcentration techniques). The results obtained with the developed method for polyphenolic compounds and herbal teas were statistically compared (using the ANOVA test) to those found by the reference methods KI/taurin and HPLC. The obtained results demonstrate that green tea extract exhibited the highest HOCl scavenging activity (Inhibition, %) by a large difference in both assays (developed method and KI/taurin reference method) (54.8% and 30.4%, respectively).
In conclusion, a fluorometric method for more sensitive, simple and selective measurement of HOCl scavenging activity of antioxidants (individually and in complex matrices) compared to the existing methods in literature was developed. The basic advantages of such a method can be summarized as follows: the method is not enzyme−based, prone to relatively easy inhibition; the optimized probe is selective toward the HOCl analyte (i.e. not reacting with other possible interferents in the medium); the analytical wavelengths of excitation and emission (λex=277 nm, λem= 304 nm) are basically characteristic for the probe (resorcinol); the method is more sensitive than absorptimetric methods; the method is less costly and laborious than the corresponding HPLC methods.