U-937 ve THP-1 hücrelerinin diferansiyasyonu ve polarizasyonunda SIK genlerinin rolü
Role of SIK genes in differentiation and polarization of U-937 and THP-1 cells
Yazar: YASEMİN SEZİKLİ
Danışman: YRD. DOÇ. DR. ALİ OKUYUCU
Ondokuz Mayıs Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2016
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Genler = Genes ; Hücre dizisi = Cell line ; Makrofajlar = Macrophages ; Monositler = Monocytes ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Polarizasyon = Polarization

Özet:
Tümör mikroçevresi, kanser hücreleri ile birlikte birçok farklı hücrenin bir arada olduğu dinamik bir ortamdır. Bu hücreler sürekli birbirleriyle etkileşim ve iletişim halindedir. TAM (Tümör ilişkili makrofaj), tümör mikroçevresindeki inflamatuar hücrelerin büyük kısmını oluşturmaktadır. Makrofajlar inflamasyonla kanser arasında kilit rol oynamaktadırlar. SIK (Salt inducible kinase), AMPK ailesine ait olan bir serin/treonin protein kinazdır. SIK genleri genel olarak karbonhidrat ve lipid metabolizmasında rol alsalar da, kas büyümesi ve diferansiyasyonu, tümör baskılanması, hücre döngüsünün düzenlenmesi ve makrofaj polarizasyonunda da etkili olduğu düşünülmektedir.
Çalışmamızda M1 veya M2 makrofaj polarizasyonuna neden olduğu düşünülen bazı maddelerin uyardığı U-937 ve THP-1 monosit hücrelerinde SIK1, SIK2 ve SIK3 gen ekspresyonlarındaki değişiklikleri görmeyi amaçladık. Bu amaçla 48 saat PMA (Forbol 12-miristat 13-asetat) uygulaması ile monositler makrofaja diferansiye edildi. Flow sitometride CD11b ve CD14 yüzey antijenlerinin varlığı ile bu diferansiyasyon teyit edildi. Diferansiye makrofajlar 24 saat boyunca 10 ng/ml LPS (Lipopolisakkarit), 10 ng/ml LPS+20 ng/ml INF-γ, 20 ng/ml IL-4,  20 ng/ml IL-4+20 ng/ml IL-13,  20 ng/ml IL-10 ve 10 ng/ml TGF-β ile muamele edildi. Daha sonra kantitatif Real Time PCR ile SIK1, SIK2 ve SIK3 gen ekspresyon düzeylerini belirlendi. Ayrıca TNF-α, IL-10 ve IL-12p70 protein düzeylerini de ölçüldü.
LPS uygulamasının THP-1 hücrelerinde SIK3 ekspresyonunu anlamlı bir şekilde azalttığını bulduk, U-937 hücrelerinde ise anlamlı bir değişim yoktu. LPS+IFN-γ kombinasyonu ile ise THP-1 hücrelerinde SIK1, SIK2, SIK3 genlerinin, U-937 hücrelerinde ise SIK1 ve SIK3 genlerinin ekspresyonu artmıştır.
LPS+IFN-γ kombinasyonu LPS'ye göre U-937 hücrelerinde, SIK1 ve SIK3, THP-1 hücrelerinde ise SIK1, SIK2 ve SIK3 gen ekspresyonunu anlamlı bir şekilde artırdı. Her iki hücrede LPS+IFN-γ kombinasyonunun uygulanması tek başına LPS'ye göre farklılık gösterdi. 
U-937 hücrelerinde SIK1 gen ekspresyonunu M2 polarize makrofaj [M (IL-4), M (IL-4+IL-13), M (IL-10), M (TGF-β)] gruplarında M1 polarize makrofaja                [M (LPS+IFN-γ)] göre düşük bulduk. M (IL-4) ve M (IL-4+IL-13)'deki bu azalma anlamlıydı. Tam tersine tüm M2 polarize makrofaj gruplarında SIK2 gen ekspresyonunun M1 polarize makrofajlara göre artmıştı. SIK3 gen ekspresyonunda ise tüm M2 polarize makrofaj gruplarında M1 polarize makrofajlara göre anlamlı olmayan bir azalma görüldü. THP-1 hücrelerinde SIK1 gen ekspresyonu tüm M2 polarize makrofaj gruplarında M1 polarize makrofajlara göre azalmıştı ama özellikle M (IL-4), M (IL-4+IL-13) ve M (IL-10)'da bu azalma anlamlıydı. SIK2 gen ekspresyonunda ise M (TGF-β) hariç tüm M2 polarize makrofaj gruplarında M1 polarize makrofajlara göre anlamlı olmayan bir azalma görüldü. THP-1 hücrelerinde SIK3 gen ekspresyonu tüm M2 polarize makrofaj gruplarında M1 polarize makrofajlara göre anlamlı olarak azalmıştı. Makrofajların sitokin üretimi incelendiğinde THP-1 hücrelerinde M (LPS+IFN-γ) makrofajda TNF-α, IL-12p70 ve IL-10 düzeylerinin diğer gruplardan daha yüksek olduğu görüldü.  U937 hücrelerinde ise IL-10 düzeyleri ve IL-10/IL-12p70 oranı M (IL-4) ve M (IL-4+IL-13) makrofajda M (LPS) veya M (LPS+IFN-γ)'ya göre yüksek, IL-12p70 protein düzeyleri de M (LPS) ve M (LPS+IFN-γ)'da diğer gruplara göre daha yüksekti.
Sonuç olarak her iki hücre grubunda da M2 fenotipi makrofajlarda SIK1 ve SIK3 gen ekspresyonunun azaldığı, SIK2 gen ekspresyonunun ise hücreden hücreye farklılık gösterdiğini gördük. Bu bulgulardan SIK1 ve SIK3'ün biribiri ile uyumlu hareket ederken SIK2'nin ters yönde bir etkiye sahip olduğunu söyleyebiliriz. Bundan sonraki çalışmalarda farklı sürelerdeki SIK gen ekspresyonları ile birlikte SIK protein düzeylerinin de ölçülmesi makrofaj polarizasyonunda SIK genlerinin rolüne açıklık getireceği gibi tümör mikroçevresini gözönünde bulunduran tedavilere yeni bir hedef gösterecektir.

Abstract:
Tumor microenvironment is a dynamic environment that includes cancer cells and many different cell types together. These cells are in continuous interaction and communication with each other. TAM (Tumor assosiated macrophage) form the majority of inflammatory cells in the tumor microenvironment. Macrophages play a key role between cancer and inflammation. SIK (Salt inducible kinase)  isoforms, members of the AMPK family are serine/threonine protein kinases. Although they often have a role in carbohydrate and lipid metabolism, SIK are considered to be effective in muscle growth and differentiation, tumor suppression, regulation of cell cycle and macrophage polarization. 
In our study, we aimed to see the changes in expression of SIK1, SIK2 and SIK3 genes in U-937 and THP-1 monocyte cells by stimulated some agents that are considered to be caused M1 or M2 macrophage polarization. For this purpose, monocytes were differentiated to macrophages by PMA (Forbol 12-miristat 13-asetat) application for 48 hours. The differentiation was confirmed by the presence of CD11b and CD14 surface antigen in flow cytometry. Differentiated macrophages were treated with 10 ng/ml LPS (Lipopolisakkarit), 10 ng/ml LPS+20 ng/ml INF-γ, 20 ng/ml IL-4,  20 ng/ml IL-4+20 ng/ml IL-13,  20 ng/ml IL-10 and 10 ng/ml TGF-β for 24 hours. Then, SIK1, SIK2 and SIK3 gene expression levels were determined by quantitative Real Time PCR. In addition, TNF-α, IL-10 and IL-2p70 protein levels were measured by ELİSA.
It was found that application of the LPS significantly reduces the SIK3 expression in THP-1 cells, while there was no significant change in U-397 cells. Combination of LPS+IFN-γ in THP-1 cells, increased the expression of SIK1-3, in U-937 cells increased the expression of genes SIK1 and SIK3. The implementation LPS+ IFN combination in both cell lines was significantly different compared to only LPS application. 
SIK1 gene expression in U-937 cells was lower in M2 polarized macrophage groups [M (IL-4), M (IL-4+IL-13), M (IL-10), M (TGF-β)] compared to M1 polarized macrophage groups [M (LPS+IFN-γ)]. This reduction was significant in M (IL-4),       M (IL-4+IL-13). On the contrary, in all M2 polarized macrophage groups, SIK2 gene expression was higher than M1 polarized macrophage groups. While SIK3 gene expression was lower all M2 polarized macrophage groups compared to M1 polarized macrophage groups but this reduction was not significant. İn THP-1 cells SIK1 gene expression was reduced in all M2 polarized macrophages compared to M1 polarized macrophages but it was significant only in M (IL-4), M (IL-4+IL-13) and M (IL-10). SIK2 gene expression was lower in all M2 polarized macrophages excluding M (TGF-β) compared to M1 polarized macrophages but none of them was significant. While SIK3 gene expression was significantly decreased in all groups M2 polarized macrophages compared to the M1 polarized macrophages in THP-1 cells. When the cytokine production of macrophages was examined; in THP-1 cells, M (LPS+IFN-γ), macrophages have significantly higher levels of TNF-α, IL-12p70 and IL-10 than  the other groups; in U-937 cells, M (IL-4) ve M (IL-4+IL-13) macrophages have significant higher IL-10 levels and IL-10 / IL-12p70 rate compared to M (LPS) and M (LPS+IFN-γ) groups and besides IL-12p70 protein levels in M (LPS) and M (LPS+IFN-γ) was higher than the other groups.
In conclusion, in M2 macrophages of both cell lines have reduced SIK1 and SIK3 gene expression but SIK2 gene expression has variable pattern from cell to cell was observed. Based on these findings, it is considered that SIK1 and SIK3 are compatible with each other while SIK2 has the opposite effect on this pattern. We believe that this study can be developed by measuring SIK gene expression and the level of SIK protein in different time and with all these shows a new target for therapies to consider the tumor microenvironment.