Mutant proteinlere bağlı endoplazmik retikulum strese cevapta rol oynayan genlerin in vitro analizi
In vitro analysis of genes that involved in response to endoplasmic reticulum stress associated with mutant proteins
Yazar: MUHAMMED ABDULVAHİD KALKAN
Danışman: PROF. DR. BURÇAK VURAL ; DOÇ. DR. AYŞE EVRİM BAYRAK
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2018
Konu: Genetik = Genetics ; Kardiyoloji = Cardiology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine
Dizin: Endoplazmik retikulum = Endoplasmic reticulum ; Genler = Genes ; Kardiyomiyopatiler = Cardiomyopathies ; Mutasyon = Mutation ; Protein kinazlar = Protein kinases ; Proteinler = Proteins ; Stres = Stress ; İn vitro = In vitro

Özet:
Mutant proteinlerin birikmesiyle meydana gelen ER stresinde hücre, IRE1, PERK ve ATF6 proteinlerinin kontrolündeki üç ana yolaktan oluşan katlanmamış protein yanıtı (UPR) adlı sistemini devreye sokmaktadır. Bu çalışmada, PRKAG2 kardiyomiyopatisine sebep olduğu bilinen PRKAG2 genindeki E506K, E506Q ve R531G mutasyonlarının in vitro olarak ER stresi açısından değerlendirilmesi amaçlandı.
Bu amaçla, hem mutant ve normal protein anlatımının yapıldığı hem de ER stres aktivatörü olan Tunikamisin uygulaması yapılmış HEK293 hücre kültüründe UPR yolaklarında rol alan seçilmiş genlerin (BiP, CHOP, GADD34, ATF4, EDEM1, PDIA4, TRAF2, ASK1, XBP1 ve HERP) transkripsiyonel düzeyleri kantitatif RT-PCR (qPZR) yöntemi ile analiz edildi. Doğal-tip ve mutant PRKAG2b transkripti taşıyan hücrelerde IRE1α, PERK, ERO1A ve BiP proteinleri western blot yöntemi ile incelenerek karşılaştırılmaları yapıldı. qPZR analizleri sonucunda, tunikamisin ile oluşturulan ER stresinde GADD34 ve EDEM1 gen ifadelerinde anlamlı bir değişiklik olmadığı, TRAF2 gen ifadesinin azaldığı ve diğerlerinin de arttığı gözlenmiştir. Buna göre her 3 mutant hücrede ise sadece GADD34 ile XBP1 ürünlerinde (us-XBP1 ve t-XBP1) azalmış regülasyon olduğu saptanmıştır. E506Q ve R531G mutant hücrelerde ise HERP, TRAF2 ve EDEM1'in azalmış olarak ifade edildiği belirlenmiştir. Mutant hücrelerin protein analizinde ise E506K mutant hücrelerde, IRE1 ve PERK seviyesi 1.3 kat artmışken (diğer 2 mutant hücrede azalmaktadır) ERO1A ve BiP seviyesi azalmış olarak belirlenmiştir.
Sonuç olarak, in vitro deney şartlarında tunikamisin ile hücre kültüründe başarılı şekilde ER stresi oluşturulabilmiştir. Mutant hücrelerde ise doğal-tip hücrelere göre yapılan kıyaslamada belirgin bir ER stresinin oluşmadığı, ancak UPS sisteminin ana yolaklarındaki genlerin hem transkripsiyonel hem de protein düzeylerinde mutasyonun tipine göre farklılıklar oluştuğu gözlenmiştir.

Anahtar Kelimeler: ER stresi, KatlanmamıĢ Protein Cevabı, AMPK, PRKAG2
Kardiyomiyopatisi, E506K mutasyonu

Abstract:
In the ER stress due to the accumulation of mutant proteins, the cell activates unfolded protein response system consisting of three main pathways controlled by IRE1, PERK and ATF6 proteins. In this study, we aimed to evaluate E506K, E506Q and R531G mutations in PRKAG2 gene in vitro, which are causing PRKAG2 cardiomyopathy, in terms of ER stress.
For this purpose, transcriptional levels of selected genes (BiP, CHOP, GADD34, ATF4, EDEM1, PDIA4, TRAF2, ASK1, XBP1 and HERP) in UPR pathways were analysed by qPCR utilizing HEK293 cell culture, which has both mutant and normal protein expression and treated with ER stress activator tunicamycin. There was no significant change in GADD34 and EDEM1 gene expression, decrease in expression of TRAF2 gene and increase in others. GADD34 and XBP1 products (us-XBP1 and t-XBP1) were decreased in 3 mutant cells. Expression of HERP, TRAF2 and EDEM1 was decreased in E506Q and R531G mutants. IRE1α, PERK, ERO1A and BiP proteins were examined by western blot and compared in cells with wild-type and mutant PRKAG2b transcripts. In protein analysis of mutant cells, IRE1 and PERK levels were increased 1.3-fold (were decreased in other 2 mutants) while ERO1A and BiP levels were decreased in E506K mutants.
Consequently, ER stress could be successfully induced in cell culture with tunicamycin. Mutant cells did not show significant ER stress compared to wild-type cells, but there were differences in the transcriptional and protein levels of genes that in the main pathways of UPS system, depending on the type of mutation.



Key Words: ER Stress, Unfolded Protein Response, AMPK, PRKAG2
Cardiomyopathy, E506K mutation