Kolon kanseri hücreleri üzerine timokinon ve 5-fluorouracilin terapotik etkisinin in vitro ve in vivo araştırılması
In vitro and in vivo investigation of the therapeutic effect of thymoquinone and 5-fluorouracil on colon cancer cells
Yazar: ERAY METİN GÜLER
Danışman: PROF. DR. ABDÜRRAHİM KOÇYİĞİT
Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2019
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Onkoloji = Oncology
Dizin: Antineoplastik ajanlar = Antineoplastic agents ; Flüorourasil = Fluorouracil ; Kolon neoplazmları = Colonic neoplasms ; Neoplazmlar = Neoplasms ; Nigella sativa L. = Nigella sativa L. ; Timokinon = Thymoquinone

Özet:
Kanser, dünya çapında önemli bir halk sağlığı sorunudur. Kolon kanseri, gelişmiş
ülkelerde kadınlarda ve erkeklerde sırasıyla 2 ve 3. sırada yer alan en yaygın görülen
kanser türlerinden biridir. Kolon kanserinde rutin tedavi olan 5-Fluorouracil'in (5-FU)
%30 başarısı alternatif tedavi yöntemleri arayışına neden olmuştur. Son yıllarda
bitkisel kaynaklı doğal etken maddelerin kanser tedavisi üzerinde etkileri yanında
konvansiyonel tedavilerle kombine edilmesi ile ilgili araştırmalar yoğunlaşarak
sürmektedir.
Bu çalışmada amacımız, rutin tedavide kullanılan 5-FU ile Nigella sativa'nın etken
maddesi Timokinon'nun (TQ) kolon kanseri üzerine kombine tedavisinin sitotoksik,
genotoksik, apoptotik ve anti-kanser etkilerinin in vitro ve in vivo yöntemlerle
araştırılması ve olası etki mekanizmaların aydınlatılmasıdır.
Kolon kanser hücrelerine (LoVo) ilk olarak transfeksiyon ile Lusiferaz geni transfekte
edildikten sonra hücre kültürü ortamında farklı konsantrasyonlarda TQ, 5-FU ve
kombinasyonlarına maruz bırakıldı. 24 saat inkübasyondan sonra ATP yöntemiyle
luminometrik olarak sitotoksisite, comet assay yöntemi ile DNA hasarı, luminometrik
yöntem ile hücre içi glutatyon düzeyi, florometrik yöntem ile mitokondriyal membran
potansiyeli, akridin turuncusu/etidyum bromür boyası ile floresans mikroskopta
apoptoz, annexin V-FITC boyası ile akış sitometrisinde apoptoz, pro-apoptotik ve anti-
apoptotik proteinlerin ekspresyonu western blot yöntemiyle çalışıldı. Kontrol, TQ, 5-
FU ve kombine olmak üzere beş grup nude fareye transfekte LoVo hücreleri zenograft
yöntem ile subkutan olarak enjekte edildi. 3 hafta sonra oluşturulan tümörlerin
tedavisine geçilip, yalnız TQ, yalnız 5-FU ve kombine gruplarına 3 hafta boyunca
tedavi uygulandı. Tedavi sonucunda in vivo canlı hayvan görüntüleme sistemi ve
kumpasla tümör boyutları ölçüldü. Ayrıca tedavi bitiminde alınan kanlarda oksidatif
stres ve enflamasyon belirteçleri incelendi. Alınan doku örneklerinde de büyüme
faktörleri ve vaskülerizasyon belirteçleri incelendi.
In vitro ortamda LoVo hücreleri üzerinde TQ ve 5-FU ile yapılan tekli terapiye göre
kombine terapilerin, tekli tedaviye göre düşük dozlarının sitotoksisiteyi, DNA
hasarını, apoptozu ve hücre içi reaktif oksijen türlerinin düzeylerini arttırırken,
mitokondriyal membran potansiyelini ve glutatyon düzeylerini düşürdüğü tespit
edilmiştir. Ayrıca anti-apoptotik protein olan Bcl-2 ekspresyonu düşerken apoptotik
proteinler Bax, Kaspaz-3, Kaspaz-9, P-53 ve P-21'in protein ekspresyonu artmıştır.
Zenografik yöntemle oluşturulan in vivo kolon kanserinde ise kombine tedavinin tekli
terapilere göre daha etkili olduğu bulunmuştur. Tümör boyutu küçülürken, dokuda
TGFβ1 düzeyi ve vaskülerizasyon belirteci VEGF düzeyleri azalmıştır. Tedavi sonrası
alınan plazmalarda pozitif kontrole göre oksidatif stres düzeyleri düşmüştür.
Elde ettiğimiz veriler, rutin tedavide kullanılan 5-FU yanında bitkisel kökenli TQ'nun
kombine kullanımının hem in vitro hem de in vivo oluşturulan kolon kanserinde anti-
tümör etkilerini arttırdığını ve tedaviye bağlı yan etkileri azalttığını göstermektedir.

Abstract:
Cancer is a major public health issue worldwide. In developed countries, colon cancer
is the 2nd most common observed type of cancer in women and the 3rd most common
in men. The 30% success of 5-FU, which is a routine treatment for colon cancer, has
led the researchers to seek different treatment modalities. Therefore, plant-derived
natural substances have become the target of a significant amount of attention. In
recent years, increasing efforts have been made to discover the effects of combined
plant-derived substances with conventional therapy methods on cancer.
This study aimed to investigate the cytotoxic, genotoxic, apoptotic, and anti-cancer
effects of thymoquinone – the active ingredient of Nigella sativa – and 5-Fluorouracil
in combination against in vitro and in vivo colon cancer while illuminating possible
action mechanisms.
Initially, Luciferase transfection was performed in LoVo colon cancer cells to which
TQ, 5-FU, and combinations of different concentrations were given, and they were
incubated for 24 hours. Luminometric cytotoxicity by ATP method, DNA damage by
comet assay, luminometric intracellular glutathione level, fluorometric mitochondrial
membrane potential, apoptosis by fluorescence microscopy with acridine
orange/ethidium bromide dye, apoptosis in flow cytometry by annexin V-FITC dye,
expression of pro-apoptotic and anti-apoptotic proteins with western blot method have
been investigated. Transfected LoVo cells have been injected subcutaneously to five
groups of nude mice for the following: control, TQ, 5-FU, and combined. 3 weeks of
treatment with TQ, 5-FU, and combined therapy have been initiated 3 weeks after the
injection. At the end of this period, tumor size was measured with the IVIS device and
caliper. Also, oxidative stress and inflammation markers were examined in blood and
growth factors, and vascularization markers were examined in tissue samples at the
end of the treatment.
Compared to the monotherapy with TQ and 5-FU on colon cancer, combined treatment
has been found in low doses to increase cytotoxicity, DNA damage, apoptosis and
intracellular reactive oxygen species in the cell culture studies, while decreasing
mitochondrial membrane potential and glutathione levels. Also, the expression of
apoptotic proteins Bax, Caspase-3, Caspase-9, p53, and p21 increased while the anti-
apoptotic protein Bcl-2 expression decreased. Combination therapy was found to be
more effective than mono therapies in vivo colon cancer, which was formed by the
xenographic method. While tumor size decreased, TGFβ1 levels and VEGF levels – a
vascularization indicator – were decreased in the tissue. In the plasma taken after
treatment, oxidative stress levels decreased compared to the positive control group.
According to the data obtained through this study, in colon cancer TQ has been found
to increase the anti-tumor properties of the routine therapy of 5-FU in vitro and in vivo
while diminishing the side effects profile.