Midye (Mytilus galloprovincialis LAM.) hemolenfinden asetilkolinesteraz enziminin saflaştırılması ve kinetik özelliklerinin incelenmesi
Purification of acethylcholinesterase from the haemolymph of the mollusc (Mytilus galloprovincialis Lam.) and investigation of its kinetic properites
Yazar: SERVET DURANAY
Danışman: DOÇ. DR. NURTEN ÖZSOY
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Asetilkolinesteraz = Acetylcholinesterase ; Enzim saflaştırması = Enzyme purification ; Enzimler = Enzymes ; Hemolenf = Haemolymph ; Kinetik = Kinetics ; Midyeler = Mussels ; Mytilus galloprovincialis = Mytilus galloprovincialis

Özet:
Asetilkolin aracılı sinir iletiminde asetilkolinesteraz enziminin rolü yoğun araştırma konusu olmaktadır. Bu çalışmada Mytilus galloprovincialis'den elde edilen hemolenf sıvısından amonyum sülfat çöktürme ve edrofonyum-Sefaroz 6B afinite kromatografisi yöntemleri kullanılarak AChE enzimi 13 kez ve % 3 verimle saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı denatürasyon ve indirgeme koşullarında yapılan SDS poliakrilamid jel elektroforezinde 51000 daltonluk olarak belirlendi. Yapılan çalışma sonucunda saflaştırılan enzimin spesifik aktivitesi 3 U/mg protein olarak hesaplandı. Enzimin optimum pH'sının 7,5 olduğu belirlendi, en yüksek aktivitesini ise 35oC'de gösterdiği görüldü. Enzimin asetiltiyokolin iyodüre karşı gösterdiği Km (Michaelis sabitesi) değerinin ve en yüksek reaksiyon hızının sırasıyla 1,3 mM ve 0,188 mM/mg/dk olduğu bulundu. Bu çalışmada üç metoksiflavon bileşiğinin AChE'ı inhibe edici etkileri incelendi. IC50 değerleri 0,033  0,005, 0,019  0,002 ve 0,016  0,003 mg/ml olan hispidulin (4',5,7-trihidroksi-6-metoksiflavon), 5-hidroksi,6,7,8'4'-tetrametoksiflavon ve gnafalin (5,7-dihidroksi-3,8-dimetoksiflavon)'in AChE'I güçlü inhibe edici etkiye sahip oldukları saptandı. Hispidulin, 5-hidroksi-6,7,8'4'-tetrametoksiflavon ve gnafalin'in Ki (inhibisyon sabiteleri) sırasıyla 3,6x10-2, 10-2 ve 9,4x10-3 mg/ml olarak bulundu. 5-hidroksi-6,7,8'4'-tetrametoksiflavon'un kompetitif, hispidulinin ve gnafalinin ise ankompetitif inhibtör olarak etki ettiği görüldü. 5-hidroksi-6,7,8'4'-tetrametoksiflavon geri dönüşümlü olarak AChE'ı inhibe ettiği için, klinik çalışmalarda potansiyel bir ilaç adayı olabileceği sonucuna varıldı.

Abstract:
The role of acetylcholinesterase in terminating acetylcholine-mediated neurotransmission made it the focus of intense research. In this study the haemolymph AChE from the molusc Mytilus galloprovincialis was purified to homogeneity by (NH4)2SO4 fractional precipitation and afﬁnity chromatography on edrophonium-Sepharose 6B. The enzyme was purified approximatedly 13 fold over the crude extract and was obtained in 3 % yield. The molecule weight of the purified enzyme was calculated as 51000 dalton by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing and reducing conditions. The specific activity of purified enzyme was 3 U/mg protein. The purified enzyme had an optimum pH of 7.5 and showed optimal activity at 35oC. Km (Michaelis constant) and Vmax (maximum velocity of enzyme) for acetylthiocholine iodide were 1.3 mM and 0.188 mM/mg/min, respectively. The inhibition of purified AChE by three methoxyflavones was investigated. Hispidulin (4',5,7-trihidroxy-6-metoxyflavon), 5-hidroxy-6,7,8'4'-tetrametoksiflavon and gnaphalin (5,7-dihidroxy-3,8-dimetoxyflavon) were found to have the strong inhibitory effect on AChE with IC50 values of 0,033  0,005, 0,019  0.002 and 0.016  0.003 mg/ml, respectively. Ki (inhibition constant) for hispidulin, 5-OH,6,7,8'4'-tetrametoksiflavon and gnaphalin were found to be 3.6x10-2, 10-2 ve 9.4x10-3 mg/ml, respectively. 5-hidroxy-6,7,8'4'-tetrametoksiflavon was determined as competitive inhibitor, while hispidulin and gnaphalin were determined as uncompetitive inhibitors. It was concluded that 5-hidroxy-6,7,8'4'-tetrametoksiflavon, which inhibited reversibly AChE might be use as potential drug for clinical use.