İnsan embriyonik böbrek hücrelerinde RIC-8b proteininin golgi organeli fonksiyonları üzerine etkisi
The effect of RİC-8B protein on golgi organelle functions in human embryonic kidney cells
Yazar: MUSTAFA BARAN
Danışman: DOÇ. DR. RAMAZAN KOZAN ; YRD. DOÇ. DR. ÜMİT ŞENER
İstanbul Medeniyet Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Fizyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Fizyoloji = Physiology
Dizin: Böbrek = Kidney ; Embriyo = Embryo ; G proteinleri = G proteins ; Golgi cisimciği = Golgi apparatus ; Guanin nükleotidler = Guanine nucleotides ; Hücre iletişimi = Cell communication ; Hücreler = Cells ; Reseptörler = Receptors ; Sinyal nakli = Signal transduction

Özet:
GİRİŞ: Heterotrimerik G-protein ile kenetli reseptörler (GPKR), G-proteinleri ile etkileşerek hücre dışı sinyalleri hücre içine iletirler. Bu sayede hücresel sinyalin spesifikliği ve etkinliğinde düzenleyici rol oynarlar. Stoplazmadaki guanin nükleotidi değişim faktör (GEF) proteinleri olarak bilinen yardımcı proteinler Gα alt biriminde nükleotit değişimine sebep olurlar. Bu etki G-protein aktivasyonunu arttırır. Reseptörden bağımsız GEF proteini olan Ric-8B (Kolinesteraz inhibitörüne dirençli), GDP-bağlı Gα alt birimiyle etkileşerek nükleotit aktivitesini uyarır. Bu projede, G-proteinlerinin Golgi organelinin fonksiyonları üzerine olan etkisinde Ric-8B'nin rolünüN açıklanması amaçlandı.
MATERYAL-METOD: Ric-8B'nin etkilerini gözlemlemek için insan embriyonik böbrek kültür hücreleri  (HEK-293) kullanıldı. Ayrıca, Golgi'yi parçalayarak protein salgılanmasını büyük oranda bozan ve fungal bir metabolit olan Brefeldin A (BFA)'nın optimizasyonu yapıldı (5 µg/mL 15 dk). Golgi'nin yapısal fonksiyonlarını değerlendirmek için ST-GFP deney sisteminde; kontrol, ST-GFP+BFA, ST-GFP+Ric-8B ve ST-GFP+BFA+Ric-8B grubu olmak üzere dört grup oluşturuldu. Golgi'nin fonksiyonel etkilerini değerlendirmek için VSV-G-GFP deneylerinde; kontrol ve VSV-G-GFP+Ric-8B grubu olmak üzere iki grup oluşturuldu. Böylece, Ric-8B varlığında floresan protein ekleri ile işaretlenmiş ve Golgi kompartımanına özgü bir marker proteini olan ST-GFP'nin hücre içi lokasyonunun nasıl değiştiği takip edildi. İmmünohistokimyasal görüntüleme ile intakt ve dağılmış hücre sayım  işlemleri yüksek çözünürlüklü floresan mikroskop yardımıyla yapıldı.
BULGULAR: HEK-293 hücreleri BFA'ya maruz bırakıldığında (5 µg/mL, 15 dk.) Golgi'nin kompleks yapısı birbirinden ayrılarak kümelenmiş Golgi yığınları gözlendi. ST-GFP+BFA uygulanan grupta hücrelerin ancak %5'inde ST-GFP proteini perinükleer lokalizasyon gösterirken, ST-GFP+BFA+Ric-8B grubunda ise bu oran %43'e çıkmıştır (p<0.0001). VSV-G-GFP deneylerinde ise Ric-8B'nin Golgi organelinin fonksiyonu üzerinde belirgin bir etkisi gözlenmedi.
TARTIŞMA: G-protein sistemini regüle eden yardımcı proteinlerden biri olan Ric-8B'nin, BFA aracılı Golgi vezikülizasyonunu önleyerek Golgi kompleksinin normal stabil yapısını koruduğu ilk defa bu çalışma ile gösterildi. Bu sonuçlar, Golgi organel vezikülizasyonuyla ilişkilendirilen Alzheimer ve Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıkların patogenezinin ve G-proteinlerin Golgi organeli üzerindeki etkilerinin anlaşılmasında fayda sağlayabilir.

Anahtar kelimeler: Ric-8B, GPKR, Golgi Kompleksi, HEK-293 hücre.

Abstract:
AIM: Heterotrimeric G-protein coupled receptors (GPCR ) transmit extracellular signals to the cell by interacting with G-proteins. In this way they regulate specificity and efficiency of cellular signaling patways in cells. There are accessory proteins in sitoplasm called guanine nucleotide exchange factors (GEFs), that induce the nucleotide exchange at Gα subunits, thus promoting G-protein activation. Ric-8B (Resistance to Cholinesterase Inhibitor) is newly identified protein which interact with the GDP-bound form of Gα subunits and stimulate their nucleotide activity, acting as receptor-independent GEFs. In this project, we aimed to unclose G-proteins effect on Golgi organelle functions in the presence of Ric-8B.
METHOD: HEK-293 cells were used  to observe the effect of Ric-8B. Additionally, BFA, which is a fungal metabolite that seriously cripple protein secretion by disrupting the Golgi complex was optimized at 5 μg/mL 15 minutes. To assess the structural function of the Golgi, we created 4 groups for ST-GFP experiments: Control, ST-GFP+BFA, ST-GFP+Ric-8B , and ST-GFP+BFA+Ric-8B groups. To evaluate the functional effects of the Golgi we created control and VSV-G-GFP+Ric-8B groups for VSV-G-GFP experiments. In this way we followed the location of fluorescein tagged marker protein of Golgi complex (ST-GFP) in the presence of Ric-8B. Intact and dispersed Golgi structures in cells were performed with high-resolution fluorescence microscopy.
RESULTS: Treatment of HEK-293 cells with BFA seriously disrupted the Golgi complex (at 5 µg/mL 15 min.) disassembled the complex including the collapse of the Golgi stacks. In ST-GFP+BFA group, only in 5% of cells ST-GFP protein showed perinuclear localization, while ST-GFP+BFA+Ric-8B group this rate increased to 43% (p<0.0001). In the VSV-G-GFP experiments however, there was no any effect of Ric-8B on Golgi's function.
CONCLUSION: With obtained data, it was shown for the first time that Ric-8B is an accessory protein which protect  the normal stable structure of Golgi organelle by preventing  BFA-mediated Golgi vesiculation. These results can provide in comprehending the pathogenesis of neurodegenerative diseases such as Parkinson and Alzheimer which associated with Golgi vesiculation and impact of G-proteins on Golgi organelle. 
Key words: Ric-8B, GPCR, Golgi Complex, HEK-293 cell.