Ankara tekesi sperması dondurulmasında polivinil alkolün spermatozoa canlılığı ve fonksiyonu üzerine etkisi
Effects of polyvinyl alcohol on angora buck spermatozoa survival and function during cryopreservation
Yazar: KORAY TEKİN
Danışman: PROF. DR. ALİ DAŞKIN
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Dölerme ve Suni Tohumlama Ana Bilim Dalı​
Derece: Doktora, 2017
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Ankara = Ankara ; Ankara keçisi = Angora goat ; Ankara keçisi = Angora goat ; Dondurarak saklama = Cryopreservation ; Polivinil alkol = Polyvinyl alcohol ; Polivinil alkol = Polyvinyl alcohol ; Sağkalım = Survival ; Sağkalım analizi = Survival analysis ; Sperm = Spermatozoa

Özet:
Sentetik polimer polivinil alkolün (PVA) küçük konsantrasyonlarının kriyoprotektan solüsyonlarında buz oluşumunu inhibe ettiği bulunmuştur. Bu araştırmada, 3 farklı moleküler ağırlıktaki polivinil alkol (PVA) ile farklı konsantrasyonlarının Ankara keçisi spermasının dondurulabilirliğini değerlendiren bir metodoloji tanımlamayı amaçlanmıştır. Çalışma öncesinde PVA'ün sperma üzerinde sitotoksiste incelemesi MTT ve Neutral Red testi ile belirlendi. Sperma sulandırıcısının çekirdeklenme sıcaklığı HD kamera (JVC, everio HDAVC) ve testo termometresi (Testo 926, Almanya) ile kaydedildi. Çalışmada kullanılan hayvanların seçimi bütünleştirilmiş androlojik muayene sistemine (BAMS) göre yapıldı. Erkek üreme organlarının ölçümleri, elektronik kumpas (Watan, Türkiye), skrotal çevre mezüro ile (Mesitaş, Türkiye) ve görüntülemeler ultrason (MyLabVetTM One, ESAOTE S.p.A.) ile gerçekleştirildi. Spermatolojik parametrelerin belirlenmesi için spermalar transrektal dijital masaj ile alındı. Toplamda 24 hayvana uygulanan BAMS sonrasında, yedi adet olgun Ankara (2,75 ± 1,42 yaş) tekesinden 75 ejakülat suni vajen yardımıyla hafta iki kez toplandı. Sperma alınmasından hemen sonra, taze spermatolojik parametreler kaydedildi. Sperm üç farklı PVA kopolimer 9, 18 ve 100 kDa ile sulandırıldı; Tris yumurta sarısı sulandırıcısına sırasıyla % 0,001, 0,01, 0,1, 1 ve 2 PVA eklenmiştir. Sulandırma sonrası, örnekler 3 saat + 4 ° C ekilibrasyona bırakıldı. Soğutulan örnekler otomoatik sperma doldurma ve kapatma cihazı ile paketlendi ve programlanabilir dondurma makinesi (Digitcool 5300, IMV, Fransa) içinde donduruldu. Çözüm sonrasında aşağıdaki parametreler değerlendirildi: Motilite, progresivite ve kinetik parametreler SCA (Sperm class analyser, Microptics, Spain) ile, canlı spermatozoa, intakt akrozom ile mitokondriyel aktivite plaka okuyucu (SpectraMax® MiniMax ™ 300 Görüntüleme Sitometresi, ABD) ile değerlendirildi.
Çözüm sonu en yüksek motilite, doz gruplarından bağımsız olarak en yüksek PVA (18kDa) 67,72 ± 3,06; doza göre ise PVA (18kDa) %0,1 64,18 ± 1,36; gruplarında elde edildi (P<0,001). Tüm PVA türevlerinin diğer doz gruplarında PVA % 0,001; 0,01; 0,1 ise (PVA 100, % 0,1 hariç) kontrole göre daha yüksek çözüm sonu değerler elde edildi (P<0,001). Çalışmada elde edilen canlı spermatozoa açısından farklı PVA türevleri ve doz grupları arasında bir istatistiksel bir farklılık gözlemlenmiştir (P>0,694; 0,953). Canlı spermatozoa oranları PVA 9, 18 ve 100 için sırasıyla 82,17 ± 1,01; 83,453 ± 1,175; 82,424 ± 1,083 olarak tespit edildi. Kullanılan üç PVA konsantrasyonunun hiçbiri, çözüm sonu spontan AR'nunu indüklememiştir (P>0,001). Grup ve doz etkisinden bağımsız olarak intakt akrozom oranları PVA 9, 18 ve 100 için sırasıyla; 10,83 ± 0,92; 12 ± 1,02; 10,97 ± 0,97 olarak bulundu (P>0,659; 0,975). Sentetik PVA polimerleri buz bloke edici maddeler olarak antifriz proteinlerinden çok daha ucuza üretilebilir ve sperm kriyoprezervasyonunu iyileştirmek için yeni fırsatlar sunabilirler. PVA 100 kDa eklenmesi sperm kinetik parametreler için yararlı iken, PVA 18 kDa grubu ile daha uygun hareket özellikleri elde edilmiştir. % 0,001, 0,01, 0,1 ve 1 w/w'lik (FTS: PVA) PVA kopolimer konsantrasyonları, 100 ml'lik bir hacimde spermanın dondurulması için gereken gliserol konsantrasyonunu sırasıyla % 0, 1, 1 ve 2 w/w düşürmüştür.

Abstract:
Small concentrations of the synthetic polymer polyvinyl alcohol (PVA) were found to inhibit the formation of ice in cryoprotectant solutions. In this research, we aim to define a methodology to evaluate the freezability of Angora goat semen diluted with 3 different molecular weighted polyvinyl alcohol (PVA). Sperm diluent seeding temperature was recorded with HD camera (JVC, everio HD-AVC) and testo thermometer (Testo 926, Germany). Selection of animals was done according to the integrated andrological evaluation system. Monitoring of the male reproductive organs measurement was done with a caliper (Watan, Turkey), SCC with tape (Mesitaş, Turkey) monitoring with ultrasound (US) (MyLabVetTM One, ESAOTE S.p.A.). Initial sperm collected through TDM. In total, 75 ejaculates from seven mature Angora bucks (2 years old) were collected twice a week by an artificial vagina. Immediately after collection, sperm samples were diluted with three different PVA co-polymers 9, 18 and 100 kDa; 0,001 %, 0,01; 0,1; 1 and 2 added to Tris-egg yolk diluent respectively. After dilution semen was loaded into 0,25 ml French straws and cooled down to + 4C in three hours, frozen in a programmable freezing machine (Digitcool 5300,
IMV, France). After post-thaw, following parameters were evaluated; Motility, progressivity and kinetic parameters with computer assisted sperm analysis system (CASA), live spermatozoa, intact acrosome and mitochondiral activity with a plate reader (SpectraMax® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer, ABD). Highest motility was found in PVA 18 group with 67,72 ± 3,06 % regardless of the dosage and was also highest in PVA 100 0,1 % with 64,18 ± 1,36 % (P<0,001). PVA copolymers depentlly in all other dosage groups was 0,001 %; 0,01; 0,1 (PVA 100, except 0,1%) gained higher motility than control (p <0,001). A statistical difference was not observed among the different PVA derivatives and dose groups in terms of live spermatozoa rate (P>0,694,0,953). The live spermatozoa ratios for PVA 9, 18 and 100 were 82,17 ± 1,01; 83,453 ± 1,175; 82,424 + 1,083, respectively. None of the three PVA concentrations used induced spontaneous AR (P>0,001). Independent of group and dose effect, intact acrosomal ratios for PVA 9, 18 and 100 were; 10,83 ± 0,92; 12 ± 1,02; Was found to be 10,97 ± 0,97 (P>0,659, 0,975). Synthetic PVA-derived ice blocking agents can be produced much less expensively than antifreeze proteins, offering new opportunities for improving sperm cryopreservation. While the addition of PVA 100 kDa was beneficial for sperm kinetic parameters, with PVA 18 kDa group, more proper motion characteristics were obtained. PVA copolymer concentrations of 0,001, 0,01, 0,1, and 1 % w/w (FTS: PVA) decreased the concentration of glycerol required to freezing seeding temperature in a 100ml volume by 0, 1, 1, and 2 % w/w, respectively.