Ilımlı halofil Bacillus türlerinden lipaz enziminin izolasyonu
Isolation of lipase enzyme from moderately halophile Bacillus species
Yazar: BURCU SİNEM HOCAOĞLU
Danışman: PROF. DR. AYŞE OGAN
Marmara Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Kimya Ana Bilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Biyokimya = Biochemistry
Dizin: Lipaz = Lipase

Özet:
Trigliseridlerin diaçil, monoaçil gliserollere ve yağ asitlerine hidrolizini katalizleyen lipazlar (EC.3.1.1.3, triaçilgliserol açilhidrolaz) endüstriyel enzim pazarında en büyük paya sahiptirler. Hidrolitik aktivitelerinin yanı sıra lipazlar aynı zamanda esterifikasyon ve transesterifikasyon gibi tersinir reaksiyonları da katalizlerler. Endüstride kullanılan lipazlar doğal veya genetik olarak iyileştirilmiş mikroorganizmalardan elde edilirler. Lipaz üreticisi bakteriler arasında Bacillus cinsleri çok yaygındır ve bu cinsler lipaz üretimi için en bilinen kaynaklardır. Hızlı gelişmeleri ve toksik yan ürünlerinin az olması da bu mikroorganizmaların avantajlarıdır. Bacillus cinsinin ılımlı halofil üyeleri %3-15 NaCl (w/v) içeren besiyerinde optimum olarak gelişebilmektedir. Lipaz üretimi için pek çok değişik ortamdan izole edilen oldukça fazla sayıda Bacillus türü taranmasına rağmen yüksek veya düşük pH ve sıcaklıkta daha iyi lipolitik aktivite gösteren enzimlerin elde edilmesi için çok daha fazla sayıda suşun taranması gerekmektedir. Çalışmamızda kullandığımız Bacillus siamensis, Bacillus tequilensis, Bacillus pumilus, Bacillus safensis ve Bacillus licheniformis test suşları, Biyoloji Bölümümüzde, daha önceden tuzlanmış küçükbaş hayvan derilerinden izole edilmiş ve moleküler yöntemlerle tanımlanmıştır. Biyoteknolojik önemi olabilecek bu suşların lipaz üretim kapasitelerini belirlemek için substrat olarak zeytinyağı içeren besiyeri kullanılmış ve uygun inkübasyon süresini saptamak için suşlar bu besiyerinde 24, 48, 72, 96 ve 120 saat inkübe edilmişlerdir. Bacillus safensis'in en fazla lipaz üreten suş ve en uygun inkübasyon süresinin de 96 saat olduğu bulunmuştur. Tüm izolatların lipaz aktiviteleri kantitatif yöntemle ölçülmüştür. Tüm izolatların optimum karbon kaynağını saptamak ve lipaz üretim maliyetini düşürmek için, büyüme şartları ile inkübasyon süresini optimize ettikten sonra, düşük maliyetlerinden ve yüksek yağ içeriklerinden dolayı endüstriyel bitki yağları olan % 1 (a/h); fındık yağı (FY), hint yağı (HY), ayçiçek yağı (AY), mısırözü yağı (MY), zeytin yağı (ZY) gibi çeşitli bitkisel yağlar ve zeytin yağı fabrikası üretim atıkları olan % 1 (a/h); zeytinyağı üretimi üstü yağlı suyu (ZÜY) ve gliserol (G) substrat olarak kullanılmıştır. Elde ettiğimiz sonuçlara göre, tüm çalıştığımız Bacillus suşları lipaz üretmektedir. Substratlar arasında en etkin substratın fındık yağı ve en iyi lipaz üreten suşun da Bacillus safensis suşu olduğu bulunmuştur. Bu suşun fındık yağı substrat olarak kullanıldığında ürettiği enzim, amonyum sülfat doygunluğunda çöktürülmüş ve anyon değiştirici DEAE-sefaroz kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Saflaştırılan lipazın moleküler kütlesinin yaklaşık 59 kDa olduğu ve pH 8 ve 30-40oC de optimal aktivite gösterdiği saptanmıştır. Enzim çalışma çözeltisine %1 NaCl eklenmesi ile enzim aktivitesinin oldukça fazla arttığı gözlenmiştir. Metal iyonları arasında 5 mM Mg2+ iyonlarının aktiviteyi %120 arttırdığı, Zn+2 iyonlarının düşürdüğü, yüzey aktif maddeler arasında PEG ve organik çözücüler arasında DMSO lipaz enzimi aktivitesi üzerinde çok önemli bir aktivite kaybına sebep olmamışlardır.

Abstract:
Lipases (EC.3.1.1.3, triacylglycerol acylhydrolases) which catalyze the hydrolysis of triglycerides to diacylglycerides, monoglycerides and fatty acids have the greatest share in the industrial enzyme market. In addition to their hydrolytic activity, lipases also catalyze reverse reactions such as esterification and transesterification reactions. Industrial lipases have been produced by native or geneticially engineered organisms. Among the lipase producing bacteria, Bacillus species are diverse and the most popular source of lipases. Rapid growth and low level of toxic by-products are the other advantages of these microorganisms. Moderately halophilic members of the genus Bacillus can grow optimally in media containing 3–15% NaCl. Although numerous Bacillus species from many different environments have been screened for lipase production, more screening studies are needed for obtaining enzymes with better lipolytic activity and stability at high or low pH, salt concentration and temperature. This work screened 5 Bacillus strains; Bacillus siamensis, Bacillus tequilensis, Bacillus licheniformis, Bacillus safensis and Bacillus pumilus which were previously isolated from salted sheep skins and molecularly characterized in our Biology Department for their potential to produce lipase. These strains were screened for their lipase production capacities using olive oil as substrate. They were incubated 24, 48, 72, 96 and 120 h to evaluate the optimum incubation period. Bacillus safensis was found to be best lipase producer strain and 96h was the optimum incubation time. The lipase activities of all isolates were quantitatively measured. After optimizing the growth conditions and incubation time, industrial plant oils; 1% (w/v); olive oil (OO), 1% corn oil (CO), 1% sunflower oil (SO), hazelnut oil (HO), castor oil (CasO) and wastes of an olive oil processing company; 1%; olive oil waste water (OWW) and glycerol (GP) were used as substrates due to low cost and high lipid contents. The lipase activities increased exponentially consistent with time, 96 h was the optimal incubation time. According to our results; the strains were all good lipase manufacturers but, Bacillus safensis displayed the highest lipase activity when hazel nut oil was used as substrate. When nut oil was used substrate, lipase from Bacillus safensis was further purified to homogeneity by ammonium sulphate precipitation and DEAE–Sepharose column chromatography. Its molecular weight was 59 kDa on SDS–PAGE. The enzyme showed maximum activity at pH 8.0 and was stable 30°C-40°C. Activity was considerably enhanced with the addition of NaCl %1 and 5 mM Mg2+ but Zn+2 ions substantially decreased the activity. Among the surfactans; addition of PEG and organic solvents; DMSO did not decrease the lipase activity to a great extent.