Küf sekonder metabolitlerinin insan kanser hücreleri üzerindeki antikanser ve apoptotik etkilerinin bazı hücre yolakları üzerinden araştırılması
Investigation of anti-cancer and apoptotic effects of mold secondary metabolites on human cancer cells via cell pathways
Yazar: GÜRKAN AYKUTOĞLU
Danışman: PROF. DR. MESUT TAŞKIN
Atatürk Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Biyoteknoloji Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2024
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine

Özet:
Amaç: Filamentli mikrofunguslar çeşitli biyoaktif metabolitleri (polisakkarit, peptit, pigment, ergosterol, alkoloidler, fenolikler vb) üretme potansiyeline sahip olan ökaryotik organizmalardır. Bu biyoaktif metabolitler veya bu biyoaktif metabolitleri içeren ekstratlar antikanser, antimikrobiyal, antioksidant, antidiyabetik gibi çok farklı biyolojik aktiviteler sergileyebilmektedir. Mevcut çalışmada, topraktan izole edilen flamentli mikrofungusların kültür filtratlarının ve etil asetat ekstraktlarının biyolojik aktivitelerinin ortaya çıkarılması amaçlanmıştır.
Yöntem: Mikrofungusların izolasyonu patates dekstroz agar (PDA), metabolit üretimi ise patates dekstroz broth (PDB) besiyerinde gerçekleştirilmiştir. En yüksek antikanser aktivite gösteren mikrofungus 18S rRNA sekans analizine göre identifiye edilmiştir. Etil asetat ekstratın antikanser ve deri-yaşlanma karşıtı aktiviteleri in vitro' da WST-1 hücre canlılık testine göre analiz edildi. Antikanser aktivite çalışmalarında gen ekspresyon analizi RT-PCR, protein seviyelerinin analizi ise ELISA yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Ekstratın antimikrobiyal aktivitesi kuyucuk-difüzyon ve antioksidant aktivitesi ise ABTS, DPPH, nitrik oksit ve hidroksil radikallerini giderme testlerine göre analiz edilmiştir. İn vitro deri yaşlanma karşıtı aktivitesi ise insan deri fibroblastları (NHDF) üzerinde test edilmiştir.
Bulgular: İzole edilen mikrofunguslar arasında, kültür filtratı ve etil asetat ekstratı en yüksek antikanser aktivite gösteren izolat (GA7) Alternaria tenuissima (GenBank: PQ302315) olarak teşhiş edildi. Bu izolatın etil asetat ekstratının   A-549, SH-SY5Y, DU-145 ve HT-29 kanser hücre hatlarının hepsine karşı güçlü sitotoksik aktivite gösterdiği ancak normal sağlıklı hücre hatları üzerinde kayda değer bir toksik etki yapmadığı belirlendi. Gen ekspresyon analizlerine göre ekstraktın apoptoz ve otofaji yolaklarını etkileyerek antikanser aktivite gösterdiği tespit edildi. Ekstraktın ABTS, DPPH, nitrik oksit ve hidroksil radikallerine karşı orta seviyede scavenging potansiyeli gösterdi. Ekstrakt iki Gram pozitif (Staphylococcus aureus ve Bacillus cereus) ve iki Gram negatif (Esherichia coli ve Klebsiella pneumoniae) bakteriye karşı güçlü antibakteriyel aktivite sergiledi. Ekstratın H2O2 ile indüklen yaşlanmaya karşı deri fibroblastlarını koruduğu tespit edildi. Ekstraktın antikanser, antioksidant, yaşlanma karşıtı ve antibakteriyel aktivitelerinin doza bağlı olarak arttığı belirlendi.
Sonuç: Alternaria tenuissima GA7 mikrofungusunun kültür süpernatantından hazırlanan etil asetat ekstraktının çok yüksek seviyede antioksidant ve antibakteriyel aktivitelere orta seviyede ise antioksidant aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir.  Ekstrakt ya da bu ekstrakttan saflaştırılacak etken metabolitlerin sağlık alanında önemli potansiyele sahip olabileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Aims: Filamentous microfungi are eukaryotic organisms that have the potential to produce various bioactive metabolites (polysaccharides, peptides, pigments, ergosterol, alkaloids, phenolics, etc.). These bioactive metabolites or extracts containing these bioactive metabolites can exhibit many different biological activities, such as anticancer, antimicrobial, antioxidant and antidiabetic. The current study aimed to reveal the biological activities of culture filtrates and ethyl acetate extracts of filamentous microfungi isolated from soil.
Method: Isolation of microfungi was carried out in potato dextrose agar (PDA), and metabolite production was carried out in potato dextrose broth (PDB) medium. The microfungus showing the highest anticancer activity was identified according to 18S rRNA sequence analysis. The anticancer and skin anti-aging activities of the ethyl acetate extract were analyzed according to WST-1 cell viability assay. In anticancer activity experimenst, gene expression analysis was performed by RT-PCR and protein level analysis was performed by Elisa. The antimicrobial activity of extract was analyzed according to well-diffusion assay and its antioxidant activity according to ABTS, DPPH, nitric oxide and hydroxyl radical scavenging tests. In vitro skin anti-aging activity was tested on human skin fibroblasts (NHDF).
Results: Among the isolated microfungi, to isolate (GA7) with the highest anticancer activity in the culture filtrate and ethyl acetate extract was identified as Alternaria tenuissima (GenBank: PQ302315). It was determined that the ethyl acetate extract of this isolate showed strong cytotoxic activity against all A-549, SH-SY5Y, DU-145 and HT-29 cancer cell lines, but did not have a significant toxic effect on normal healthy cell line (MRC-5). According to gene expression analyzes, it was determined that the extract showed anticancer activity by affecting the apoptosis and autophagy pathways. The extract showed moderate scavenging potential against ABTS, DPPH, nitric oxide and hydroxyl radicals. The extract exhibited antibacterial activity against two gram-positive (Staphylococcus aureus and Bacillus cereus) and two gram-negative (Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae) bacteria. The extract was dtermined to protect skin fibroblasts against H2O2-induced agingThe anticancer, antioxidant, skin anti-aging and antibacterial activities of the extract were determined to increase in a dose-depending manner.
Conclusion: It was determined that the ethyl acetate extract prepared from the culture supernatant of the microfungus Alternaria tenuissima GA7 had very high level antioxidant and antibacterial activities and moderate antioxidant activity. It is thought that the extract or the active metabolites to be purified from this extract may have an important potential to be used in the field of health.