Avanos yöresi sokak köpeklerinde dirofilaria immitis'in PCR ile araştırılması
Investigation of dirofilaria immitis in stray dogs by PCR technique in avanos province
Yazar: FERAY YABANERİ
Danışman: PROF. DR. ABDULLAH İNCİ
Erciyes Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Parazitoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2014
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Dirofilaria = Dirofilaria ; Dirofilaria immitis = Dirofilaria immitis ; Köpekler = Dogs ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Nevşehir-Avanos = Nevşehir-Avanos ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Prevalans = Prevalence

Özet:
Bu çalışma, Avanos ve çevresindeki köpeklerde filarial enfeksiyonların yayılışını tespit etmek amacıyla Mayıs-Eylül 2013 tarihleri arasında toplam 138 köpekte yapılmıştır. Bu amaçla alınan her kan örneği öncelikle natif, Modifiye Knott ve membran filtrasyon yöntemleri daha sonra Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)'na tabii tutularak perifer kandaki mikrofilerler yönünden incelenmiştir. Kan örneği alınan köpeklerin yaş, cinsiyet ve ırkları kayıt altına alınmıştır. Yapılan analizler sonucu Avanos yöresindeki 138 köpeğin 3'ü (%2.17) Dirofilaria immitis pozitif olarak saptanmış, diğer filarial nematod enfeksiyonlarına rastlanmamıştır. Pozitif bulunan 3 örneğin 2'si natif yöntem, modiye knott yöntemi ve membran filtrasyon yöntemi ile pozitif bulunmuştur. Konvansiyonel yöntemlerle pozitif bulunan 2 örnek de dahil olmak üzere toplam 3 örnek PCR tekniği ile pozitif bulunmuştur. D. immitis mikrofilerlerinin natif yöntemde yavaş ve yılanvari hareket edip mikroskop sahası dışına çıkmadığı, Modifiye Knott ve membran filtrasyon yöntemlerinde kılıfsız, ön kısmının konik biçimde sivrilerek sonlanıp kuyruklarının düz olduğu saptanmıştır.  5.8S-ITS2-28S ve cytochrome oxidase subunit 1 (COI) spesifik gen bölgelerini parsiyel olarak amplifiye eden primerler ile yapılan PCR sonucu pozitif belirlenen ve uygun konsantrasyonda olan bir izolat jelden pürifiye edilerek her iki gen bölgesi için çift yönlü sekans analizlerine tabii tutulmuştur. Elde edilen sekans dizilimleri ilgili gen bölgeleri yönünden blastn kıyaslaması yapılan GenBank veri tabanında kayıtlı Dünya'daki diğer bazı D. immitis izolatlarının gen dizilimlerinin filogenetik analizleri ve pairwise kıyaslamaları yapılmıştır. Yapılan analizler sonucu Avanos yöresinden elde edilen D. immitis izolatının 5.8S-ITS2-28S gen bölgesinin pairwise kıyaslamalarına göre dünyadan alignmenta dahil edilen diğer izolatlarla %99.5-%100 oranlarında,  parsiyel COI gen bölgesinin pairwise kıyaslamalarına göre ise %94.3-%100 oranlarında identiklik gösterdiği belirlenmiştir.
Sonuç olarak, bu çalışma ile Avanos yöresi sokak köpeklerinde ilk kez D. immitis enfeksiyonlarının moleküler prevalansı belirlenmiş ve elde edilen izolatın 5.8S-ITS2-28S ve COI gen bölgelerinin moleküler karakterizasyonu ve filogenetik analizi yapılmıştır. 

Anahtar Sözcükler: Dirofilaria immitis, Köpek, Mikrofiler, Prevalans, Moleküler Karakterizasyon, Avanos

Abstract:
This study was carried out between May-September 2013 to determine the prevalence of filarial infections in 138 dogs in Avanos and vicinity. For this aim, first all blood samples were examined by wet mount (direct microscopic examination), Modified Knott's and membrane filtration techniques and then by using Polymerase Chain Reaction techniques in order to detect the circulating microfilaria in peripheral blood. The age, sex and breed of dogs were recorded. Three (%2.17) out of 138 dog blood samples were found to be Dirofilaria immitis positive whereas no other filarial species were found in Avanos and vicinity. Two out of 3 positive samples were found by wet mount (direct microscopic examination), Modified Knott's and membrane filtration techniques and totally three sample were found positive by only using PCR technique. The microfilaries of D.immitis observed to exhibit sluggish and undulating movements and not to move across the field of view in the wet mount technique and in the Modified Knott and membrane filtration techniques, microfilaries determined to be unsheathed, tapered conically from the anterior extremity and straight tailed. Genomic DNAs from blood samples were analyzed by PCR using the primers specific to cytochrome oxidase subunit 1 (COI) and 5.8S-ITS2-28S gene regions. The amplified fragments were sequenced in both directions using the same primers. Pairwise analyses of the obtained DNA sequences and multiple alignments with some other D. immitis strains from different groups available in the GenBank were done and phylogenies were investigated. The identity rates between the obtained D. immitis isolate and other isolates form the world was determined as 99.5%-100% and 94.3%-100% according to the phylogenetic analyses of 5.8S-ITS2-28S and COI gene regions, respectively.
In conclusion, the molecular prevalence of D. immitis from stray dogs of Avanos region was firstly revealed and the molecular characterization and phylogenetic analyses of 5.8S-ITS2-28S and COI gene regions of the obtained isolate were investigated with this study.

Key Words: Dirofilaria immitis, Dog, Microfilaria, Prevalence, Molecular characterization, Avanos