Şanlıurfa bölgesindeki evcil kanatlılardan mycoplasma gallisepticum izolasyonu ve moleküler karakterizasyonu
Isolation and molecular characterization of mycoplasma gallisepticum from domestic poultry in Şanliurfa region
Yazar: AYFER GÜLLÜ YÜCETEPE
Danışman: PROF. DR. OKTAY KESKİN
Harran Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Veteriner Hekimliği = Veterinary Medicine
Dizin: Filogenetik = Phylogenetic ; PCR =

Özet:
Bu çalışma, Şanlıurfa bölgesindeki evcil kanatlılarda yaygın olarak görülen kronik solunum yolu hastalığı (Chronic Respiratory Disease) (CRD)'nın etkeni olan Mycoplasma gallisepticum (M. gallisepticum) (MG)'un yerel suşlarını izole etmek, polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile etkeni moleküler olarak doğrulamak, izole edilen suşların amplifiye edilen mgc2 gen bölgelerine, sekanslama ve Restriction fragment length polymorphism (RFLP) ile filogenetik analiz yapmak, referans M. gallisepticum S6 suşu ve M. gallisepticum 6/85 aşı suşu ile, izole edilen saha suşları arasında protein profillerini karşılaştırmak ve hastalıkta oluşan antikorları saptamak amacı ile Western blot (WB) analizlerinin yapılması amacıyla yürütüldü. Çalışmada hayvan materyali olarak 120 evcil kanatlıya ait trakeal svab ve doku örnekleri etken izolasyonu için kullanıldı. İzolasyon çalışması sonucunda, 3 tanesi tavuklara, 4 tanesi ise hindilere ait olan toplam 120 örneğin 7'sinden (%5.8) M. gallisepticum izole edildi. PCR analizi sonucunda, 120 örneğin 65 (%54.2)'i M. gallisepticum yönünden pozitif bulundu. 62 tavuğun 30 (%48.3) 'unda ve 58 hindinin 35 (%60.3)'inde türe özgü DNA tespit edildi.  Çalışmada kullanılan 84 trakeal svab örneklerinin 42 (%50)'sinde ve 36 doku homojenatı örneklerinin 23 (%63.9)'ünde türe özgü DNA tespit edildi. Mgc2F ve mgc2R hedef gen bölgelerinin 750-800 bp'de amplifiye edilen PCR ürünlerinin sekanslama sonucunda baz aralıkları (bp) MG4 714 bp, MG79 782 bp, MG9 721 bp, MG68 716 bp, MG95 716 bp, MG120 712 bp, MG66 782 bp, M. gallisepticum 6/85, 718 bp ve M. gallisepticum S6, 787 bp'de elde edildi ve kesim bölgeleri sekans baz aralıkları ile analiz edildi. Elde edilen PCR ürünlerinin AluI, HaeII, HinfI Restriksiyon enzimleri (RE) ile kesimleri sonucu 2 farklı PCR-RFLP tipi elde edildi. MG4, MG9, MG68, MG95, MG120 izolatlarının çoğu aynı PCR-RFLP profili gösterirken, MG66 ve MG79 izolatları ise farklı profil gösterdi. Çalışmada değerlendirilen M. gallisepticum 6/85 aşı suşu ise MG4, MG9, MG68, MG95, MG120 saha izolatlarına yüksek oranda benzer RFLP profilleri gösterdi. M. gallisepticum S6 suşu ise yüksek oranda farklı kesim profili şekillendirdi. İzolatların Mgc2 gen bölgesinin filogenetik analizi sonucu; birbirine yüksek oranda benzer 5 saha izolatı birinci grup (Grup 1: MG4, MG9, MG68, MG95, MG120), 2 saha izolatı ise benzer ikinci grup (Grup 2: MG66, MG79) şeklinde oluşturuldu. Grup 1 ve Grup 2' de yer alan saha izolatları, Güney Afrika ve Brezilya'da ki izolatlara %96-99, Hindistan, Amerika ve Avustralya 'da ki izolatlarla ise %96-100 arasında benzerlik gösterdi. Ayrıca Grup 1 ve Grup 2'de yer alan izolatlar, sırasıyla 6/85 aşı suşuna %99.5 ve %97.3 oranında, TS-11 aşı suşuna %89-90 ve %100, M. gallisepticum S6 suşuna ise %96-96.5 ve %97.2 oranında benzerlik gösterdi.  Sadece M. gallisepticum 6/85 ve Grup 1'de yer alan saha izolatlarının mgc2 genine ait nükleotit baz dizisinde 63 nükleotidin delesyona uğradığı tespit edildi. Sodyum Dodesil Sülfat–Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE) analizi sonucu Grup 1 ve Grup 2'de yer alan saha izolatlarının hepsinde belirgin olan 120, 100, 70, 64, 67, 56, 53, 45, 43, 26 kDa ağırlığında protein bantları gözlemlendi. MG68 ve MG95 ile Grup 2'de yer alan izolatlar, diğerlerinden farklı olarak 28 kDa'da bant oluşturdu. Grup 2'deki izolatlar da ayrıca 15 kDa ağırlığında bant oluşturdu.   M. gallisepticum 6/85 aşı suşu ve standart M. gallisepticum S6 suşu'nda belirtilen tüm protein bantları şekillendi. M. gallisepticum türüne özgü proteinlere karşı oluşan antikorların WB analizi Grup 1 ve Grup 2'de yer alan saha izolatların hepsinde p200, p120, p100, p98, p67, p64, p40, p35, p26'ya karşı antikor şekillendi. Grup 1'de yer alan izolatlar da ayrıca p56 ya karşı antikor oluşturdu. WB analizi için poliklonal serum kullanılması ile, bazı M. gallisepticum izolatları arasında antijenik olarak farklılaşma gözlenebilse de, WB analizinde monoklonal antikorların kullanılmasının, antijenite ve immünojenisite açısından daha spesifik ayrım sağlayabileceği tahmin edilmiştir.
Sonuç olarak bu çalışma ile, Şanlıurfa bölgesinde CRD yönünden şüpheli semptom gösteren evcil kanatlılardan patojenik M. gallisepticum etkeninin mevcudiyeti, ve infeksiyonun kanatlı türlerindeki yaygınlığı hakkında ön bilgiler edinildi, hastalık için epidemiyolojik açıdan bir farkındalık oluşturuldu. Kullanılan moleküler yöntemlerin epidemiyolojik yönden saha ve aşı suşlarını ayırt etmede kullanılabileceği, ayrıca bu yöntemlerle izolatlar arasında var olan farklılıkların saptanılabileceği gözlemlendi. Mevcut verilere dayalı olarak saha suşlarının daha fazla tanınması ve tanımlanması için farklı M. gallisepticum genleri üzerinde daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir. Ayrıca bölgede bulunan sonuçların, M. gallisepticum infeksiyonu teşhis olasılığını artıracağı, yani aşı suşuna bağlı nihai hastalığı netleştirmede, aşılanmış sürüleri doğal olarak infekte olmuş sürülerden ayırt etmede ve mikoplazma infeksiyonlarının izlenmesi yönünde etkili olacağı düşülmektedir.

Abstract:
This study was conducted to isolate Mycoplasma gallisepticum (M. gallisepticum) (MG), which is the aetiologic agent of Chronic Respiratory Disease) (CRD) in domestic fowls, molecularly confirm of this agent with polymerase chain reaction (PCR), perform phylogenetic analysis by sequencing and restriction fragment length polymorphism (RFLP) of amplified regions of mgc2 gene of the isolated strains, compare protein profiles of these isolates with reference M. gallisepticum S6 and M. gallisepticum 6/85 vaccine strains and to detect specific antibodies produced against CRD by Western blotting (WB) in Şanlıurfa and its surroundings. Tracheal swabs and tissue samples which were belonged to 120 domestic birds were used to isolate of the agent in this work. Seven M. gallisepticum were isolated from 120 samples (5.8%). Three of the samples were isolated from chicken while four of them from turkeys. PCR analysis was positive for 65 (54.2%) samples for M. gallisepticum specific DNA. Thirty out of 62 (48.3%) chicken and 35 out of 58 (60.3%) turkeys were found positive by PCR with the species-specific primers. Forty two out of 84 (50%) tracheal swabs and 23 out of 36(63.9%) were positive by species specific PCR. PCR amplicons detected between 750-800 bp from Mgc2F and mgc2R target gene regions were 714 bp, 782bp, 721 bp, 716 bp, 716 bp, 712 bp, 782 bp, 718 bp and 787 bp for MG4, MG79, MG9, MG68, MG95, MG120, MG66, M. gallisepticum 6/85, and M. gallisepticum S6, strains, respectively. PCR products digested with AluI, HaeII, HinfI Restriction enzymes (RE) gave two different PCR-RFLP types. While most of the MG4, MG9, MG68, MG95 and MG120 isolates showed similar PCR-RFLP profile, MG66 and MG79 isolates gave different band profile. M. gallisepticum 6/85 vaccine strain showed quite high similar RFLP band profiles to MG4, MG9, MG68, MG95, and MG120 field isolates. On the other hand, M. gallisepticum S6 reference strain was found to have highly different digestion pattern. Phylogenetic analysis results of mgc2 gen region constituted two groups; 5 field isolates that are similar with each other (Group 1: MG4, MG9, MG68, MG95, MG120) and 2 similar field isolates (Group 2: MG66, MG79). Field isolates in Group 1 and 2 showed 96-99% similarity with those of South Africa and Brazil. This similarity was found between 96-100% with the isolates of India, America and Australia. Besides, group 1 and 2 isolates showed similarity to 6/85 vaccine strain, TS-11 vaccine strain and M. gallisepticum S6 with the percentages of 99.5-97.3%, 89-90-100%, %96-96.5 -97.2%, respectively. On the other hand, deletion of 63 nucleotides in base sequences of mgc2 gene was determined in only M. gallisepticum 6/85 and group 1 isolates. According to protein analysis of isolates by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), 120, 100, 70, 64, 67, 56, 53, 45, 43, 26 kDa molecular weight bands were clearly observed in all isolates of group 1 and group 2. Being different from others, MG68, MG95 and isolates in group 2 showed 28 kDa protein band. Also, 15 kDa protein band was observed in Group 2 isolates, which was not found in others.   All the expected protein bands for M. gallisepticum 6/85 vaccine strain and reference M. gallisepticum S6 strains were observed by SDS-PAGE analysis. Antibodies against M. gallisepticum specific proteins were detected by WB analysis in all the isolates of group 1 and 2 at the molecular weight of 200,  120,  100,  98,  67,  64,  40, 35, 26 kDa. Group 1 isolates also showed 56 kDa protein band apart from rest of the isolates. Although using polyclonal sera for WB analysis might give rise to differentiation of some M. gallisepticum isolates antigenically, we predicted that using monoclonal antibodies could give more specific discrimination in terms of antigenicity and immunogenicity in WB analysis.
At the end of study, we obtained valuable preliminary epidemiological data related to the presence of M. gallisepticum infection in domestic fowls manifesting respiratory problems in Şanlıurfa and its vicinity. We concluded that molecular tools can be used to differentiate between field and vaccine strains and these techniques can also be benefited to reveal some discrimination in field isolates. More work on different genes of M. gallisepticum for more specific discrimination between field isolates are needed with available data. As conclusion, our results will be effective to enhance the diagnosis and monitoring of CRD in the region. Besides, naturally infected flocks could be differentiated from vaccinated flocks, which is a very effective control and monitoring way of infection.