Bacillus thuringiensis polifosfat kinaz genine (ppk) ait olası promotorun transkripsiyonel aktivitesinin ölçülmesi
Measurement of transcriptional activity of putative Bacillus thuringiensis polyphosphate kinase gene (ppk) promoter
Yazar: CEYDA KETENCİ
Danışman: DOÇ. DR. SEDEF TUNCA GEDİK
Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2013
Konu: Biyoloji = Biology
Dizin: Polifosfatlar = Polyphosphates

Özet:
Birçok organizma enerjiyi ve fosfatı, polifosfat (poliP) adı verilen ve 3 ile 1000 arasında fosfat rezidüsünden olusan polimerlerde depolamaktadır. PoliP metabolızmasında görevli enzimler; ATPden donüsumlu olarak poliP sentezleyen poliP kinaz (PPK), poliP'i inorganik fosfata hidroliz eden ekzopolifosfataz (PPX), poliP'dan aldığı fosfatı kullanarak AMP'i ADP'a dönüştüren poliP:AMP fosfotransferaz (PAP)'dir. Her canh türünde bulunan poliP polimeri, patojenite, hücre iferisine DNA alımı ve çoklu stres yamtlan gibi birçok önemli hücresel olayda rol oynamaktadır.Polifosfatın onemi son yıllarda ortaya çıkmaya başladığından literatürde bu polimer ile ilgili 50k az çalışma vardir. Bacillus gmbu bakterilerde bu polimer ile ilgili olarak tek bir çalısma bulunmaktadır (Shi ve. ark., 2004). Bu çalısmada, poliP'nin B. cereus'un hareketliligi, biyofilm oluşturulması ve sporulasyonu icin gerekli oldugu gosterilmistir. Biyoinseküsid olarak endüstriyel onemi büyük olan Bacillus thuringiensis'in polifosfat metabolizmasiyla ilgili olarak ise grubumuzca yürütülen çalışmalar dışında, bilgimiz dahilinde baska bir çalışma bulunmamaktadır.Tez 9ahsmasmda, B. thuringiensis subsp. israelensis'te, poliP metabolizmasının kilit enzimlerinden bir tanesi olan PPK'yi kodlayan gene ait promotor bölgesinin tespit edilmesi ve farklı fosfat konsantrasyonlannda ppk geninin transkripsiyonel aküvitesinin ölçülmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, i9inde ppk geninin baslama kodonu bulunan ve bulunmayan olmak uzere iki ayrı promotor bolgesi PCR ile 90galülmis ve lusiferaz haberci geni ppk promotorunun kontrolünde ifade    edilecek    sekilde    klonlanmisür.    Denenen    farkli    yontemlere    ragmen, rekombinant   Bü    suslanyla   yapılan   lusiferaz   olcümlerinden   olumlu    sonuc alinamamisür.Lusiferaz aküvite ölçümlerinden negative sonuc alınınca, ppk geninin farklı fosfat konsantrasyonlarında nasil ifade edildigini arasürmak icin RT-PCR yapilmisür. Bes farkli fosfat konsantrasyonunda buyütülen Bü'm 6. saatte RNA'lari izole edilerek cDNA elde edilmisür. Daha sonra, ppk genine uygun primerler ve cDNA kullamlarak PCR gerceklesürilmisür. ppk geninin ifadesinin, en fazla 40 mM fosfat varliginda gercekleşeceği gorülmüstür. Diger fosfat konsantrasyonlarinda ise ppk geninin ifadesinin, 80mM > 20 mM > 0 mM seklinde oldugu bulunmustur.Anahtar Kelimeler: Polifosfat, polifosfat kinaz, ppk, lusiferaz, RT-PCR, Bacillus thuringiensis israelensis

Abstract:
Many organisms store energy and phosphate in polymers of 3 to 1,000 phosphate residues called polyphosphate. Enzymes involved in the polyP metabolism are; polyP kinase (PPK), which synthesizes polyP reversibly from ATP, exopolyphosphatase (PPX), which hydrolyzes polyP to Pi and poly-PAMP phosphotransferase (PAP), which uses polyP as a donor to convert AMP to ADP. PolyP polymer, which exists in every living organisms, has taken role in many important processes in the cell including pathogenicity, DNA uptake into the cell and multiple stress responses.Since the importance of polyphosphate has revealed lately, there is a few study about this polymer in the literature. There is only one study about the role of this polymer in Bacillus (Shi ve. ark., 2004). In this study it has been shown that polyP is necessary for the motility, biofilm formation and sporulation in Bacillus cereus. To our knowledge, besides our group studies, there is no other study about polyP metabolism of industrially important bioinsecticide Bacillus thuringiensis.In this thesis, it is aimed to detect the promoter region of the gene which encode PPK, which is one of the key enzyme of polyP metabolism in B. thuringiensis subsp. israelensis and to measure the transcriptional activity of ppk gene in different phosphate concentrations. For this purpose, two separate promoter regions, one with and the other without start codon of ppk gene, were amplified by PCR and luciferase reporter gene was cloned under the control of ppk promoter. Although different methods were used, no positive results were obtained on the luciferase measurement carried out with rekombinant Bti strains.When negative results were obtained from luciferase activity assays, RT-PCR was   carried   out  to   investigate ppk  gene   expression   in   different  phosphate concentrations. RNAs from Bti grown in different phosphate concentration for 6 hours were isolated and cDNA was obtained. Then PCR was carried out by using primers specific for ppk gene and cDNA. The highest level of ppk gene expression was obtained at 40 mM phosphate concentration. The gene expression level of ppk in other phosphate concentrations was found to be 80mM > 20 mM > 0 mM.us thuringiensis israelensis