Kırmızıbiberlerde Aspergıllus flavus'un gelişimi, aflatoksin üretimi ve biyosentez yolundaki bazı genlerin ekspresyon düzeyleri üzerine, su aktivitesi, sıcaklık ve zamanın etkisinin modellenmesi
Modelling the effects of water activity, temperature and time on growth, aflatoxin production and expression levels of some biosynthesis genes of Aspergillus flavus in red pepper
Yazar: NURDAN YAPAR
Danışman: DOÇ. DR. ZÜLAL KESMEN
Erciyes Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2015
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering
Dizin: Aflatoksinler = Aflatoxins ; Aspergillus flavus = Aspergillus flavus ; Kırmızıbiber = Paprika

Özet:
Bu çalışmanın amacı, farklı su aktivitesi (aw) ve sıcaklık koşullarında depolanan kırmızıbiberlerde, aflatoksijenik Aspergillus flavus'un aflatoksin üretimi ile aflatoksin biyosentez metabolik yolunda rol alan aflR, nor-1 ve pksA genlerinin ekspresyon düzeyleri arasındaki ilişkiyi tespit etmektir. Çalışmada, kırmızıbiber numunelerinin su aktivitesi değerleri dört farklı seviyeye (0.80, 0.85, 0.90 ve 0.95) ayarlandıktan sonra, NRRL 3357 A. flavus suşu ile kontamine edilmiş ve dört farklı sıcaklıkta (5, 15, 25 ve 35C) toplam 20 gün süreyle inkübasyona bırakılmıştır. Kırmızıbiberlerden belli periyotlarla (0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 ve 20. günler) alınan numunelerde, kültürel yöntemle küf sayıları belirlenmiş ve kromatografik yöntemle aflatoksin tayini yapılmıştır. Ayrıca, kırmızıbiber numunelerinden RNA ekstraksiyonu yapılarak ters transkripsiyon gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (GZ-PZR) ile A. flavus'un aflatoksin biyosentezinde görev alan düzenleyici aflR geni ile yapısal nor-1 ve pksA genlerinin ekspresyon düzeyleri tespit edilmiştir.
Çalışma bulguları, 0.80 ve 0.85 aw değerlerinde depolanan kırmızıbiberlerin küf sayılarının, depolama boyunca, 3. günden sonra test edilen tüm sıcaklıklar için düştüğünü ve en düşük küf sayılarının sırasıyla 0.80 aw-25C ve 0.80 aw-35C koşullarında ve depolamanın 20. gününde olduğunu göstermiştir. 0.95 aw-35C ve 0.95 aw-25C koşullarının ise, çalışma kapsamındaki diğer koşullara kıyasla A. flavus'un gelişimi için en uygun koşullar olduğu ortaya konulmuştur. Aflatoksin B1 (AFB1) analizi sonuçlarından, kontamine kırmızıbiberlerde tüm aw seviyelerinde artan sıcaklık ile birlikte AFB1 miktarının da arttığı gözlenmiştir. Denemeye alınan depolama koşulları içerisinde en düşük AFB1 üretimi, 0.80 aw-5C koşulunda depolanan kırmızıbiberlerde tespit edilmiştir. Çalışmada en yüksek AFB1 değeri (61.56 ppb) ise, 0.95 aw-35C'de 15. günde kaydedilmiş olup bunu 0.95 aw-25C'de 15 gündeki AFB1 miktarı (57.21 ppb) izlemiştir. Ayrıca, A. flavus'un AFB1 üretimi üzerine, su aktivitesi, sıcaklık, zaman, aflR, nor-1 ve pksA gen ekspresyonlarının etkilerini ortaya koymak ve kontamine kırmızıbiberlerde AFB1 miktarını tahmin edebilmek amacıyla, 8 adet matematiksel model oluşturulmuştur. Modellerin uygunluğu, düzeltilmiş determinasyon katsayıları (R2adj) ve artıkların normal olasılık dağılım grafikleri ile değerlendirilmiştir. Buna göre, 25C'de depolanan kırmızıbiberler için elde edilen model (R2adj= %94.68), AFB1 üretimi ile gen ekspresyon düzeyleri arasındaki ilişkiyi en iyi açıklayan model olmuştur. Bu modele göre, 25C'de depolanan kırmızıbiberlerde A. flavus'un AFB1 üretimi üzerine su aktivitesi, zaman ve pksA gen ekspresyonunun etkileri oldukça önemli (p<0.01), nor-1 gen ekspresyonunun etkisi p<0.05 düzeyinde önemli bulunurken, aflR gen ekspresyonunun etkisi önemsiz (p>0.05) bulunmuştur.
Sonuç olarak, bu çalışmada kırmızıbiberlerde su aktivitesi, sıcaklık ve zamana bağlı olarak aflR, nor-1 ve pksA gen ekspresyon düzeyleri ile aflatoksijenik A. flavus'un AFB1 üretimi arasındaki ilişki yanıt yüzey metodu ile oluşturulan bir model ile açıklanmıştır. Ancak, aflatoksin üretimi ile biyosentez metabolik yolundaki genler arasındaki ilişkinin daha kapsamlı olarak ortaya konulabilmesi için, bundan sonraki araştırmalarda, bu çalışmada test edilen genlerin (aflR, nor-1 ve pksA) dışındaki diğer genlerin de ekspresyon düzeylerinin incelenmesinin yararlı olacağı düşünülmektedir.

Abstract:
The aim of this study was to determine the relationship between the aflatoxin production of aflatoxigenic Aspergillus flavus and expression levels of aflatoxin biosynthetic metabolic pathway genes (aflR, nor-1 and pksA) in red pepper stored under different water activities (aw) and temperature conditions. First, water activities of red pepper samples were adjusted to four levels (0.80, 0.85, 0.90 and 0.95 aw), and the samples were inoculated with NRRL 3357 A. flavus strain and incubated at 5, 15, 25 and 35C for 20 days. Cultural mould growth and chromatographic aflatoxin analysis were carried out at 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 and 20th days of incubation. Total RNA was also extracted from red pepper samples and expression levels of the regulatory gene aflR and two structural genes nor-1 and pksA of the aflatoxin biosynthetic pathway were assayed by the reverse transcription real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).
According to the results, mould counts of samples at 0.80 and 0.85 aw decreased starting from the third day of storage for all tested temperatures, and the lowest mould counts were obtained at 0.80 aw-25C and 0.80 aw-35C conditions on the 20th day of storage. However, 0.95 aw-35C and 0.95 aw-25C were the most appropriate conditions in comparison with others for the growth of A. flavus. According to the results of aflatoxin B1 (AFB1) analysis, AFB1 contents of the samples increased with the increment of temperature for all aw levels. The lowest AFB1 production was observed under 0.80 aw-5C conditions in the experiment while the highest AFB1 amount (61.56 ppb) was detected at 0.95 aw-35C on 15th day, and the second highest AFB1 amount was observed at 0.95 aw-25C on 15th day (57.21 ppb) of storage. Furthermore, 8 mathematical models were developed to evaluate the effects of aw, temperature, time, genes (aflR, nor-1 ve pksA) expression on AFB1 production of A. flavus and to predict AFB1 amounts of contaminated red pepper. The fitness of models was assessed via adjusted coefficients of determination (R2adj) and normal probability plots of residuals. The model developed for red pepper stored at 25C had the highest R2adj (= 94.68%) value indicating well explanation of the relationship between AFB1 production and gene expression levels. According the model, the effects of aw, temperature and pksA gene expression were very significant (p<0.01), and the effect of nor-1 gene expression was significant (p<0.05), while the aflR gene expression was insignificant (p>0.05) in explaining of the AFB1 occurence in contaminated red pepper stored at 25C.
In conclusion, it can be suggested that the growth of aflatoxigenic A. flavus, amounts of AFB1, gene expression levels of aflR, nor-1 and pksA depending on the water activity, temperature and time were monitored in red peppers and AFB1 production was modelled with response surface methodology for the first time in this study. Nevertheless, it is thought that it would be useful to examine expression levels of other genes also involved in metabolic pathway to reveal the relationship between the aflatoxin biosynthetic pathway genes and production of aflatoxin comprehensively.