Brüksel lahanasından (Brassica oleracea L. Var. gemmifera) saflaştırılan polifenol oksidaz enziminin biyokimyasal karakterizasyonu ve inhibisyonu
Biochemical characterization and inhibition of purified polyphenol oxidase enzyme from Brussels sprouts (Brassica oleracea L. Bar. gemmifera)
Yazar: MUSTAFA TAHTALIOĞLU
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ELİF DUYGU KAYA
Iğdır Üniversitesi / Lisansüstü Eğitim Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Bu çalışmada polifenol oksidaz enzimi Brüksel lahanasından afinite kromatografisi metodu ile Sepharose-4B-L-tirosin-p-aminobenzoik asit afinite jeli kullanılarak %11,80 verimle 180,01 kat saflaştırıldı. Enzimin saflığı ve molekül kütlesi tayini SDS-PAGE ile 77,52 kDa olarak belirlendi. Enzimin katekol, 4-metil katekol ve L-tirozin substratları varlığında aktivite tayini yapıldı ve en iyi aktiviteyi katekol substratı ile gösterdiği belirlendi. Enzimin optimum pH değeri 6,0; optimum sıcaklığı 20℃ olarak belirlendi. Polifenol oksidaz (PFO) enziminin ısıl kararlığı; 4℃; 20℃; 40℃; 60℃ ve 80℃ aralığında, 30 dk periyotlarla toplamda 90 dk boyunca incelendi ve en kararlı olduğu sıcaklık değeri 4℃ olarak belirlendi. PFO'nun pH kararlılığı pH: 4,0-8,0 aralığında 24 saatlik periyotlarla toplamda 72 saat boyunca izlendi ve en stabil olduğu pH değeri 7,0 olarak belirlendi. Polifenol oksidazın Michaelis constants (KM) değeri 18 mM, maksimum reaksiyon hızları (Vmaks) değeri ise 2.500 EU/mL.dk olarak belirlenmiştir. Katalitik aktivite açısından Vmaks/KM oranı 139 EU/mL/mM olarak belirlenmiştir.  Enzimin L-askorbik asit, giberellik asit, sodyum metabisülfit, L-sistein, salisilik asit, sitrik asit varlığında inhibisyonu araştırılmış IC50 ve Ki değerleri tespit edilmiştir. Enzimin en etkili inhibitörünün en düşük IC50 değerine sahip askorbik asit (IC50: 0,0606 mM; Ki; 0,00233) olduğu ve yarışmalı tip inhibisyon gösterdiği belirlenmiştir.

Abstract:
In this study, the polyphenol oxidase enzyme was purified from Brussels sprouts using affinity chromatography with Sepharose-4B-L-tyrosine-p-aminobenzoic acid affinity gel, achieving a 11,80% yield and a 180,01-fold purification. The purity and molecular weight of the enzyme was determined to be 77,52 kDa by SDS-PAGE. Activity assays were performed in the presence of catechol, 4-methylcatechol, and L-tyrosine substrates, and it was found that the enzyme showed the highest activity with catechol. The optimal pH for the enzyme was determined to be 6,0, and the optimal temperature was 20℃. The thermal stability of polyphenol oxidase (PPO) as examined over a temperature range of 4℃; 20℃; 40℃; 60℃  ve 80℃ in 30 min intervals for a total of 90 minutes, with the enzyme being most stable at 4℃. The pH stability of PPO as monitored over a pH range of 4,0-8,0 in 24-hour intervals for a total of 72 hours, and the enzyme was found to be most stable at pH 7,0. The Michaelis constant (KM) of polyphenol oxidase was determined to be 18 mM, and the maximum reaction velocity (Vmax) was 2.500 EU/mL.min. The Vmax/KM ratio, indicating catalytic activity, was determined to be 139 U/mL/mM. Inhibition of the enzyme in the presence of L-ascorbic acid, gibberellic acid, sodium metabisulfite, L-cysteine, salicylic acid, citric acid was investigated and IC50 and Ki values were determined. It was determined that the most effective inhibitor of the enzyme was ascorbic acid with the lowest IC50 value (IC50: 0,0606 mM; Ki: 0,00233) and showed competitive type inhibition.