İnflamatuvar hastalıklarda kolşisin tedavisinin protein sentezi ve hücre iskeleti bağlamında moleküler mekanizmasının aydınlatılması
Unraveling the molecular mechanism of colchicine treatment in inflammatory diseases in the context of protein synthesis and cytoskeleton
Yazar: EBRU HACIOSMANOĞLU
Danışman: PROF. DR. MUHAMMET BEKTAŞ
İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyofizik Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2017
Konu: Biyofizik = Biophysics
Dizin: Aktinler = Actins ; Hücre iskeleti = Cytoskeleton ; Kolşisin = Colchicine ; Moleküler yapı = Molecular structure ; Protein sentezi = Protein synthesis ; İnflamasyon = Inflammation ; İnterlökin 1 = Interleukin 1

Özet:
Interlökin-1β (IL-1β), çoğunlukla monosit ve makrofajlar tarafından üretilen sitokin ailesinin bir üyesidir. IL-1β, ateş, ağrı gibi inflamasyon yanıttan sorumlu bir düzenleyicidir. Ökaryotik Elongasyon Faktör 2 (eEF2), ribozom üzerindeki peptidil-tRNA'nın translokasyonunu katalize eden, translasyon sonrası modifikasyon (ADP-ribozillenme, fosforillenme) yoluyla hücresel kontrol mekanizmaları oluşturan önemli bir proteindir. İnflamatuvar birçok hastalığın tedavisinde kullanılan kolşisinin farmakolojik etkiyi mikrotübül yıkımı üzerinden gerçekleştirdiği düşünülse de, etki mekanizması tam aydınlatılmamıştır. Hücrede en fazla bulunan protein olan aktin, monomer (G-aktin) ya da filament (F-aktin) şeklindedir ve birçok hücresel işlevi yerine getirebilmek için çok sayıda farklı protein ile etkileşime girdiği bilinmektedir. Bu bilgilerin ışığında, IL-1β etkisinin HUVEC'lerde eEF2'nin endojen ADP-ribozillenmesi ve fosforillenmesinde artışa neden olduğu elektroforez sonrası otoradyogram ve western blot yöntemi ile gösterildi. Protein sentezindeki inhibisyon in vitro protein sentez sistemi (polyPhe) ile incelendi. Çalışmanın ikinci evresinde, kolşisin etkisinde eEF2'nin endojen ADP-ribozillenmesinde artış, fosforillenmesinde ve kaspaz-1 seviyesinde azalma olduğu görüldü. Bununla birlikte kolşisinin tedavi sürecinde etki mekanizmasının aydınlatılması adına, inflamatuvar hücre soylarında (THP-1 ve makrofajlar) aktin-kolşisin etkileşimini göstermek için, in vitro aktin polimerleşmesi (floresan polarizasyon), termal stabilite (TSA), aktin-kolşisin bağlanma deneyleri ve immünfloresan analizler yapıldı. Kolşisinin yüksek dozda ortaya çıkardığı mikrotübül yıkımı yanında toksik olmayan düşük dozlarda da G-aktin ile stokiyometrik oranlarda (1/1) etkileşebildiği ve aktin polimerleşme hızını ve F-aktin miktarını önemli ölçüde arttırdığı görüldü. Aktine özgün bir biçimde bağlanan kolşisin için bağlanma sabiti (Kd=150±15 nM) ve bağlanma bölge sayısı (n=1), çifte resiprokal ve Scatchard çizimleriyle hesaplandı. Deneysel çalışmalar yanında kuramsal olarak aktin ile kolşisin arasındaki olası etkileşim bölgeleri (rezidüler) saptandı. Olası etkileşim bölgesi, monomerin birinci domeyni üzerindeki (Asn 111 ve Arg 116) rezidüler olarak belirlendi. In vivo ve in vitro kolşisin-aktin etkileşimleri, aktin dinamiği açısından önemli bir süreci ve bu sürecin doğal sonucu olarak; hücre iskeleti, inflamasyon, apoptoz ve protein sentez aşamalarında ortaya çıkabilecek yeni veriler tedavideki düşük doz kolşisin etkisini açıklayabilir.

Abstract:
Interleukin-1β (IL-1β) is a member of the cytokine family, mostly produced by monocytes and macrophages. IL-1β is a regulator for the inflammatory response, such as fever and pain. Eukaryotic elongation factor 2 (eEF2) is an important protein that catalyzes the translocation of the peptidyl tRNA on the ribosome and comprises cellular control mechanisms through post-translational modification (ADP-ribosylation, phosphorylation). Colchicine is used for the treatment of various inflammatory disorders. Although its pharmacological effect seems to occur with microtubule destruction, its mechanism of action has not been fully clarified. Actin, the most abundant protein in the cell, is in the form of monomer (G-actin) or filament (F-actin). It interacts with a large number of different proteins in order to accomplish many cellular functions. In consideration of this information, elevation of endogenous ADP-ribosylation and phosphorylation of eEF2 in HUVECs was shown by autoradiogram and Western blot respectively after electrophoresis in the presence of IL-1β. Inhibition of protein synthesis was revealed by in vitro protein synthesis system (polyPhe). In the second part of the study, an increase in endogenous ADP-ribosylation and a decrease in phosphorylation of eEF2 and caspase-1 levels with colchicine effect were observed. Besides, in vitro actin polymerization (fluorescence polarization), thermal shift assay (TSA), actin-colchicine binding assays and immunofluorescence analysis were performed to elucidate the mechanism of action of the colchicine in inflammatory cell lines (THP-1 and macrophages). In addition to microtubule destruction at high doses of colchicine, at low non-toxic doses, colchicine was able to interact with G-actin at stoichiometric ratios (1/1) and significantly increased actin polymerization rate and F-actin level. The binding constant (Kd = 150 ± 15 nM) and the number of binding sites (n = 1) were calculated by double-reciprocal and Scatchard plots for specific binding of colchicine to actin. Along with experimental studies, possible regions (residues) of interaction between colchicine and actin were identified in theoretically. The possible interaction region was identified as residues (Asn 111 and Arg 116) on the 1st domain of actin monomer. Further in vivo and in vitro studies on interactions between colchicine and actin will provide important results in terms of actin dynamics related actin cytoskeleton, inflammation, apoptosis and protein synthesis processes. Then the effect of lower doses of colchicine treatment could be fully explained.