Brucella melitensis suşlarının genetik profillerinin MLVA (Multilokus Değişken Sayıda Ardışık Tekrar Analizi), MLST (Multilokus Dizi Tiplendirme) yöntemleriyle değerlendirilmesi
Evaluation of genetic profiles of brucella melitensis strain by using mlva MLVA (Multilocus Variable Number Tandem Repeat Analysis) and MLST (Multilocus Sequence Typing) techniques
Yazar: KADİR AKAR
Danışman: PROF. DR. OSMAN ERGANİŞ
Selçuk Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology
Dizin: Brusella = Brucella ; Dizi analizi = Sequence analysis ; Gen ifadesi = Gene expression ; Gen ifadesi profili = Gene expression profiling ; Genotip = Genotype

Özet:
Brucella melitensis (B. melitensis) kaynaklı Bruselloz enfeksiyonu ülkemizdeki küçükbaş hayvanlarında yüksek prevalans ile seyretmektedir. Bu çalışmada, 2009 ve 2017 yılları arasında Türkiye'nin yedi coğrafik bölgesinde bulunan farklı çiftliklerden gönderilen atık yapan koyun, keçi ve sığır konakçılarına ait numunelerden izole edilen ve Pendik Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlüğü Brusella Aşıları Üretim ve Referans Laboratuvarında tiplendirilen 50 adet B. melitensis suşunun Multilokus Değişken Sayıda Ardışık Tekrar Analizi (MLVA) ve Multilokus Dizi Tiplendirme (MLST) yöntemleri ile genotiplendirilmesi amaçlandı. 
	Çalışmada kullanılan izolatlar, Serum Dekstroz Agar Besiyerine pasajlandıktan sonra B. melitensis olduklarına teyit etmek amacıyla klasik biyotiplendirme metodu yapıldı ve biyovarlarına göre tiplendirildi. Referans suşları ile 50 adet çalışma izolatının DNA ekstraksyonu ticari kit protokolüne uygun olarak gerçekleştirildikten sonra suşlar MLST ve MLVA ile genotiplendirildi. Sonuçlar Hunter Gaston Diversity Indexe (HGDI) göre değerlendirildi. 
	Genotiplendirme metotları için 17 adet B. melitensis bt1, 2 adet B. melitensis bt2, 23 adet B. melitensis bt3 ve 8 adet atipik B. melitensis izolatı kullanıldı. MLST metodunda 2 profil tespit edildiği ve ayrım gücünün yeterli olmadığından dolayı HGDI değeri hesaplanmamıştır. MLVA metodu için HGDI değerlerinin 0,55 ile 0,88 arasında değiştiği, ama en ayırt edici lokusun Bruce16 (HGDI=0,88) olduğu, onu Bruce04 (HGDI=0,86) ve Bruce30'un (HGDI=0,86) takip ettiği belirlendi. MLVA-16'ya göre çalışılan 50 adet izolatta 46 farklı genotip tespit edildi. Toplam 50 adet izolat profilinin 30 adedinin veritabanı ile birebir eşleştiği, kalan 20 adedinin veritabanında yer almadığı belirlendi. Bu 30 adet izolatın %93,3'ünün insan izolatları ile birebir aynı olduğu belirlendi. MLVA-8'e göre ise tüm izolatlarda genotip 43'ün yaygın olduğu tespit edildi. MLST ile 39 suşta özellikle Doğu Akdeniz Bölgesindeki ülkelere ait izolatlarda baskın olarak belirlenen Sequence Typing (ST8) varlığı tespit edilirken, 11 suşta daha önceden tanımlanmayan bir profil saptandı. ST8'in ve yeni ST'nin dizilimi karşılaştırıldığında, glucokinase geninde varyasyon olduğu tespit edildi. B. melitensis Rev-1 aşı suşu ST7 genotipinde olduğu ve saha izolatları ile tamamen farklı olduğu belirlendi. MLST ve MLVA metodları ile B. melitensis biyovarları arasında ayrım yapılamadı. Bunun yanısıra konakçı, bölge ve yıla göre suşlar arasında önemli farklılıklar bulunamadı. 
	Sonuç olarak, MLVA metodunun ayrım gücünün MLST'e göre daha yüksek olduğu, MLST metodunun önceki yapılan çalışmalara göre belirlenen coğrafik kökenlere göre suşların ayrımında yararlı olduğu belirlendi. Kullanılan her iki yöntemin, yeni çıkacak hastalık vakalarından elde edilen izolatların takip edilmesine ve ayrıca hastalığın kontrol çalışmaları için bölgeye hâkim genotipe göre yapılacak olası aşı çalışmalarına yön verebileceği düşünülmektedir. MLVA metodu ile belirlenen profillerin insandakilerle aynı olmasının konakçılar arası geçiş açısından Tek Sağlık konusunu gündeme getirmektedir. Hayvan sağlığını korumanın insan sağlığı açısından çok önemli olduğu görülmektedir.
Anahtar Kelimeler: Biyovar; Brucella melitensis; Genotiplendirme; MLST; MLVA.

Abstract:
Brucellosis infection caused by Brucella melitensis (B. melitensis) progresses with a high prevalence in ovine animals in our country. In this study, 50 B. melitensis strains isolated from samples belonging to abortion made by cows, sheep and goat hosts sent from different farms in seven geographical regions of Turkey between 2009 and 2017 and typed in Brucella Vaccines Production and Reference Laboratory of Pendik Veterinary Control Institute, was aimed to be genotyped by using Multilokus Variable Numbe Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Multilocus Sequence Typing (MLST) methods.
	After the isolates used in the study were passaged into Serum Dextrose Agar Medium, classical biotyping method was used to confirm that they were B. melitensis and typed according to their biovars. After DNA extraction of reference strains and 50 study isolates was performed in accordance with the commercial kit protocol, the strains were genotyped with MLST and MLVA. The results were evaluated according to the Hunter Gaston Diversity Index (HGDI).
	For genotyping methods, 17 B. melitensis bt1, 2 B. melitensis bt2, 23 B. melitensis bt3 and 8 atypical B. melitensis isolates were used. Since 2 profiles were detected in the MLST method and the discrimination power was not sufficient, the HGDI value was not calculated. It was determined that HGDI values for MLVA method varied between 0.55 and 0.88, but the most distinctive locus was Bruce16 (HGDI=0,88), followed by Bruce04 (HGDI=0,86) and Bruce30 (HGDI=0,86). 46 different genotypes were detected in 50 isolates studied according to MLVA-16. It was determined that 30 of a total of 50 isolate profiles matched exactly with the database, and the remaining 20 were not included in the database. It was determined that 93.3% of these 30 isolates were identical to human isolates. According to MLVA-8, genotype 43 was found to be common in all isolates. According to MLST analysis, the presence of Sequence Typing (ST8), which was determined to be dominant in the isolates belonging to the countries in the Eastern Mediterranean Region, was detected in 39 strains, while a previously undefined profile was detected in 11 strains. When the sequences of ST8 and the new ST were compared, a variation was found in the glucokinase gene. The B. melitensis Rev-1 vaccine strain was determined to be in the ST7 genotype and completely different from the field isolates. No distinction could be made between MLST and MLVA methods and B. melitensis biovars. In addition, no significant differences were found between strains by host, region and year.
	As a result, it was determined that the discrimination power of MLVA method is higher than MLST and MLST method is useful in differentiation of strains according to geographic origins determined according to previous studies. It is thought that both methods used can guide the follow-up of isolates obtained from new disease cases and also possible vaccination studies to be carried out according to the dominant genotype for disease control studies. The fact that the profiles determined by the MLVA method are the same as those in humans brings up the issue of One Health in terms of transition between hosts. It is seen that protecting animal health is very important for human health.
Key Words: Biovar; Brucella melitensis; Genotyping; MLST; MLVA.