Pichia pastoris mayasında GAP promotoru altında deve kimozini ekspresyonu
Production of recombinant camel chymosin enzyme with GAP promotor in Pichia pastoris
Yazar: ÖZGÜL GÜZEL
Danışman: PROF. DR. MEHMET İNAN
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Gıda Mühendisliği = Food Engineering

Özet:
Kimozin rennin olarak adlandırılan bir aspartik proteazdır. Kimozin süt endüstrisinde peynir yapımında kullanılan başlıca enzimdir. Bu enzim memelilerin şirdeninden salgılanır ve sütü pıhtılaştırma özelliği bulunmaktadır. Günümüzde ticari kimozin dört farklı kaynaktan elde edilmektedir. Bunlar hayvansal, bitkisel, mikrobiyal ve rekombinant üretimle elde edilmektedir. Hayvansal kimozini geleneksel olarak sütten kesilmemiş buzağıların abomasumundan elde edilmektedir. Küçük yaşta buzağıların kesilmesi ve dünyada gittikçe artan talep karşısında bu endüstrinin yetersiz kalmasından dolayı, alternatif bitkisel, mikrobiyel ve rekombinant kaynağa yönelim artmıştır.
Pichia pastoris rekombinant protein üretiminde çoğunlukla tercih edilen bir eskpresyon sistemidir. Heterolog protein üretiminde P. pastoris mayası yüksek verim elde edilebilmektedir. P. pastoris birçok promotora sahip olmasına rağmen en sık kullanılan AOX1 ve GAP promotorlarıdır. GAP promotoru; P. pastoris gliseraldehit -3 fosfat dehidrojenaz geninin ekspresyonundan sorumlu bölgedir ve yapısal bir promotordur
Bu araştırmada deve kimozin geni metilotrofik bir maya olan P. pastoris mayasında GAP promotoru kontrolünde pGAPZαA üretim vektörü kullanılarak üretilmiştir. Elektroporasyon ile gen aktarımı yapılan P. pastoris X33 suşlarında bulunan vektör kopya sayısı Southern Blott analizi ile belirlenmiştir. Seçilen tek kopya suşu ile çalkalamalı erlen koşullarında uygun pH (3-7) ve sıcaklık (20-28 oC) aralıkları faktöriyel deneme deseni ile 3 paralel ve 2 tekerrür ile belirlenmiştir. İstatik analizleri sonucunda optimum sıcaklığın 24 ve pH 'ın 3 olduğu belirlenmiştir.
Büyük ölçekli (5-L) kimozin üretimi pH 3.0 ve 24 oC ' de gerçekleştirilmiştir. Fermantasyonun üretim aşaması GAP promotorunun verimli olduğu hipoksik şartlarda 103 saat boyunca sürdürülmüştür. En yüksek enzim aktivitesine 56. saatte ulaşılmış ilerleyen saatlerde enzim aktivitesinde azalma olduğu gözlenmiştir. Rekombinant kimozin aktivitesi yaklaşık olarak 20 IMCU/mL diğer bir ifade ile 2000 Soxhelet Unıt/mL bulunmuştur. Fermantasyon ortamında toplam 214.7 mg/L rekombinant protein olduğu tespit edilmiştir.
SDS-PAGE analizi sonucunda yaklaşık 42kDa büyüklüğünde bir bant olarak gözlenmiştir. Enzimin optimum çalışma sıcaklığı 50 oC, optimum pH'sı 3.0-4.0 arası olduğu belirlenmiştir. Enzim pH 3.0-6.5 arası ve 20-65 oC arası stabilitesini 2 saat koruyabilmektedir. Fakat pH' nın 4 ve sıcaklığın ise 50 oC üzerine çıkması ile enzim
i
aktivitesinin azalmasına neden olmaktadır. Ayrıca enzim 10 Mm Mg+2 ve Fe+2 varlığında aktivitesi sırası ile %129.58 ve % 72.5 artarken; Cu+2, Zn +2 varlığında inhibe olmaktadır. Deve kimozini en yüksek aktiviteyi 20-40 Mm CaCl2 arasında ulaşmışken, bu konsantrasyonun artması ile aktivitesi düşmektedir.
Üretilen rekombinat deve kimozini ile beyaz peynir üretimi gerçekleştirilmiş, üretim sonucunda ticari rekombinant sığır ile rekombinant deve kimozini verimleri kıyaslanmıştır. Ticari kimozin ile üretilen beyaz peynir verimi %14.8 iken; rekombinant kimozin verimi %15.45 bulunmuştur. Bu sonuçlara göre rekombinant deve kimozinin ticari rennet kadar etkili bir enzim olduğu saptanmıştır. Rekombinant deve kimozin enziminin üretim şartlarının optimizasyonu ile verimin arttırılması ve ölçek büyütme çalışmaları gerçekleştirildiği takdirde ticari olarak üretim potansiyeli bulunmaktadır.

Abstract:
Chymosin is the major enzyme to used to make cheese in the dairy industry. This enzyme is secreted by abomasus of mammal and ıt has a milk clotting property. Nowadays commercial chymosin is acquired to four different sources. These are derived from animal, plant, microbial and recombinant production. Animal chymosin is acquired traditionally to abomasus of unweaned calf. Because of increasing demand in the world and slaughter to unweaned calf, alternative source of microbial, plant and recombinant were increased the tendecy for thıs industry is fall shorted.
P. pastoris is commonly prefered that is an expression host for production of recombinant protein. This yield has high yield to production of heterologous protein. Despite Pichia pastoris has several promotors, the most extensively used promotors are AOX1 and GAP promotor. GAP promotor is responsible for region of expression of 3- phosphate dehydrogenase gene and is a constructional promoter.
In this research; camel chymosin gene was expressed to Pichia pastoris which is a methylotrophic yeast, under the control of GAP promotor, using expression vector which is PGAPZαA. P. pastoris X33 strains which are transfered gene by electroporation. Clone copy number was detecded by Southern analysis. Chosen Single of copy strain with conditions of shaking flask, suitable pH (3-7) and temperature ( 20- 28 °C) was determined by factorial experimental design with 3 parallel, 2 repeat. According to statictical analysis, optımum of temperature is 24 and pH is 3 was determined.
High production of fermentation ( 5 –L) was carried out ph 3 and 24°C. The stage of fermentation was maintained at GAP promotor which is efficient at hypoxic conditions through 103 hours. The highest enzyme activity was found approximately 20 IMCU/ mL in other word 2000 SoxhletUnıt/mL in 56.hours. Produced recombinant enzyme is 214.7 mg/ L in stage of fermentation.
According to SDS-PAGE analysis, the molecular weight of the chymosin was found approximately 42 kDa. The optimum conditions of the enzyme were determined pH 3.0- 4.0 and temperature of 50°C. The enzyme is protected stability to 2 hours, ph 3-
iii
6.5 and between 20°C - 65°C but increasing above of pH 4 and temperature of 50°C give rise decreasing of enzyme activity. The camel chymosin was activated by Fe+2 and Mg2+ ; respectively %129.58 and % 72.5 but inhibited by Cu+2, Zn+2. While this enzyme highest activity has between 20 Mm-40 Mm CaCl2 concentration, activity is lost with increasing concentration of calcium.
The pickled cheese was produced to used of recombiant camel chymosin. Rendement of commercial recombinant chymosin with rendement of recombinant rennet were compared. While commercial bovine chymosin has %14.8 rendement, recombinant camel chymosin has % 15.45. According the results; recombinant camel chymosin determined effective rennet as a commercial chymosin. When optimization conditions of production of recombinant camel chymosin with increasing rendement and scale-up works were carried out, camel chymosin which has potential for production of commercial.