Silaj, çiğ süt ve peynir örneklerinde geç şişme etmeni Clostridium türlerinin izolasyonu ve farklı yöntemlerle tanımlanması
Isolation and identification of Clostridium species as a late-blowing factor in silage, raw milk and cheese samples by different methods
Yazar: PELİN ERTÜRKMEN
Danışman: PROF. DR. ZÜBEYDE ÖNER
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Zorunlu anaerobik bakteriler oksijene karşı çok hassastır. Bu nedenle, bunların izolasyonu, kültürü ve sayımının oksijene maruz kalmadan, kısa sürede yapılması gerekir. Günümüzde hızlı, kolay uygulanabilir, yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip yeni tanı yöntemleri tercih edilmektedir. Bu çalışmada, çiğ süt, kaşar peyniri ve mısır silajı örneklerinden izole edilen ve peynirde geç şişme kusuruna neden olan clostridial türlerin; fenotipik yöntemler, Matriks ile Desteklenmiş Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş Zamanı Kütle Spektrometresi (MALDI-TOF MS) ve 16S rRNA dizi analizi kullanılarak tanımlanması amaçlanmış ve MALDI-TOF MS'in potansiyel kullanımı değerlendirilmiştir.
Bu amaçla,  14 mısır silajı, 12 çiğ süt ve 20 kaşar peyniri örneğinde, laktat fermente edici clostridial sporların (LFCS) düzeyi En Muhtemel Sayı (EMS) yöntemi ile belirlenmiştir. Kaşar peyniri örneklerinin 6'sı ile mısır silajı örneklerinin 2'sinde EMS <0.36 log EMS/g sınır değerlerin altında saptanmıştır. Kaşar peyniri ve silaj örneklerinin EMS değerlerinde, yüksek pH'ya bağlı olarak artış gerçekleşmiş ve güçlü bir pozitif korelasyon görülmüştür. EMS sonucu pozitif reaksiyon gösteren gaz tüplerinden 181 olası suş izole edilmiştir. Gram boyama, katalaz ve oksidaz testi, anaerobik gelişim testleri, biyokimyasal testler ve Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile görüntüleme sonuçlarına göre izolatlardan 95 adedi Clostridium spp. özelliklerini göstermiş ve 66 adedi çalışma süresince canlılığını koruyabilmiştir. MALDI-TOF MS etanol-formik asit ekstraksiyon (EFAE) protokolü kullanılarak, izolatların %74.24'ü (49/66)  tanımlanabilmiştir. Tüm izolatlar arasında C. sporogenes suşu, %77.55 ile yaygın tür olarak belirlenmiş ve silaj, süt ve kaşar peyniri örneklerinde eşzamanlı olarak tespit edilmiştir. MALDI-TOF MS'in potansiyel kullanımını değerlendirebilmek amacıyla cins düzeyinde (>1.7'lik düşük skor) tanımlanan suşlar arasından tür farklılıkları, gaz üretim kapasiteleri ve SEM ile morfolojik özellikleri gözlemlenen 17 seçilmiş suşun, 16S rRNA gen dizilimi ile tanımlanmasında başarı oranı %82.35 olarak saptanmıştır. Araştırmada seçilen suşlarda toplam 73 adet uçucu bileşen saptanmış, bunların, 22 ester, 14 alkol, 13 keton, 5 sülfit, 4 karboksilik asit, 5 gaz, 4 aldehit ve 6 diğer bileşik grubundan oluştuğu varlığı GC-MS ile tespit edilmiştir. Bileşenlerden %1'nin üzerinde çıkan bileşen sayısı 18'dir.
Bu çalışma ile, geç şişme kusuruna neden olan clostridial izolatların anaerob bakterilerin tespitinde güncel bir yöntem olan MALDI-TOF MS ile hızlı tanımlanabileceği belirlenmiştir. Bununla birlikte MALDI-TOF MS ile düşük skorlanan izolatların tür düzeyinde doğru tanımlanmasında, 16S rRNA gen diziliminin doğrulayıcı yöntem olarak kullanılabileceği saptanmıştır. MALDI-TOF MS veri tabanının geliştirilmesi amacıyla, suş sayısının arttırılarak bu tür çalışmaların tekrarlanması gerekir.

Abstract:
Obligate anaerobic bacteria are known to be very sensitive to Oxygen. Therefore, their isolation, culture and enumeration must be carried out in a short time without any exposure to Oxygen. Currently, new diagnostic methods are preferred that are rapid, easily applicable, and have high sensitivity and specificity.The present study aimed to identify clostridial species isolated from raw milk, kashar cheese, and corn silage samples that cause late-blowing defect in cheese using phenotypic methods, Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) and 16S rRNA sequence analysis, and to evaluate the potential use of MALDI-TOF MS.
Accordingly, the level of lactate-fermenting clostridial spores (LFCS) was determined by the Most Probable Number (MPN) method in 14 corn silage, 12 raw milk and 20 Kashar cheese samples. As a result, 6 of the Kashar cheese samples and 2 of the corn silage samples were found to be below the MPN<0.36 log MPN/g limit values. The MPN values of Kashar cheese and silage samples increased due to high pH and a strong positive correlation was observed. Similarly, the MPN values of Kashar cheese and silage samples increased due to high pH, and a strong positive correlation was observed. As a result of MPN, 181 possible strains were isolated from gas tubes showing a positive reaction. The results of Gram staining, catalase and oxidase activity, anaerobic development tests, biochemical tests, and Scanning Electron Microscopy (SEM) imaging showed that 95 of the isolates were Clostridium spp. and 66 maintained maintain their viability. Using the MALDI-TOF MS Ethanol-Formic Acid extraction protocol, 74.24% (49/66) of the isolates were identified. Among all isolates, C. sporogenes was determined to be the dominant species (77.55%) and was detected in all silage, milk and Kashar cheese samples. To evaluate the potential use of MALDI-TOF MS, the,  the success rate of identification by 16S rRNA gene sequence in 17 selected strains of which their differences among the strains that are defined at genus-level (>1.7% low score), gas production capacities and morphological features observed by SEM was 82.35%. A total of 73 volatile components were detected in the strains selected, and of these volatile compounds, 22 esters, 14 alcohols, 13 ketones, 5 sulfides, 4 carboxylic acids, 5 gases, 4 aldehydes and 6 other groups of compounds were determined by GC-MS. The number of components that are higher than 1% of the components was 18.
The present study determined that clostridial isolates that cause late-blowing defect can be identified quickly by MALDI-TOF MS, which is a current method for detecting anaerobic bacteria. However, it was determined that 16S rRNA gene sequencing can be used as a confirmatory method for an accurate identification of isolates with low scores by MALDI-TOF MS at the species level. To develop the MALDI-TOF MS database, it is necessary to repeat such studies by increasing the number of strains.