Kaempferol yüklenmiş aljinat/hyaluronik asit mikrokürelerin üretral darlık modelinde etkinliğinin in vitro ve in vivo araştırılması
In vitro and in vivo investigation of the efficacy of kaempferol loaded alginate/hyalurnic acid microspheres in a model of urethral stricture
Yazar: BÜŞRA MORAN BOZER
Danışman: PROF. DR. MUSTAFA TÜRK
Kırıkkale Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2021
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Cerrahi-ürolojik = Surgery-urologic ; Epitel hücreleri = Epithelial cells ; Kan pıhtılaşma faktörleri = Blood coagulation factors ; Kan pıhtılaşma testleri = Blood coagulation tests ; Kontrollü ilaç salımı = Controlled drug release ; Kontrollü salım = Controlled release ; Polimerik mikroküre = Polymeric microshepere ; Teşhis teknikleri-ürolojik = Diagnostic techniques-urological ; Üretra darlıkları = Urethral stricture

Özet:
Üretral darlık fibrotik skar oluşumu ile karakterize, patolojik olarak üretra epitelinde dejenerasyon gösteren ve hastalarda sık tekrar eden bir hastalıktır. Hastalığın etiyoloji ve epidemiyolojisi aydınaltılsa da etkin bir tedavi klinikte halen uygulanamamaktadır. Yapılan bu tez çalışmasında üretral darlık tedavisinde skar oluşumunu engelleme ve yeniden epitelizasyonu sağlama potansiyeli bulunan kaempferolün tek başına ve aljinat/hyalurnik asit (HA) mikrokürelerine yüklenen kaempferolün etkisi in vitro ve in vivo yöntemler ile araştırılmıştır. Bu amaç doğrultusunda kaempferol yüklenen aljinat/HA mikroküreleri sentezlenerek kontrollü salım çalışmaları yapılmıştır. Hazırlanan mikrokürelerin karakterizasyonu için SEM, TGA, FT-IR ve HPLC kullanılmıştır. İn vitro çalışmalar için primer hücre kültürü ile elde edilen üretra epitel hücreleri üzerinde ve L929 fibroblast hücrelerinde; kaempferol yüklenmiş mikroküreler (KYMK), kaempferol yüklenmemiş mikrokürelerin (MK), kaempferolün ve klinikte tedavi amacıyla sık kullanılan mitomycin-c (mit-c)'nin sitotoksik etkilerini belirlemek için MTT ve WST-1 testleri yapılmıştır. Apoptoz ve nekrozun belirlenmesi için double stanning yöntemi uygulanmıştır. Hücre proliferasyonlarına etkilerinin konsantrasyona bağlı belirlemek için x-CELLigence-Gerçek Zamanlı Hücre Analiz Sistemleri kullanılmıştır. Hazırlanan materyallerin genotoksik/karsinojenik/mutajenik etkilerini belirlemek amacıyla; mikronükleus ve AMES testleri yapılmıştır. Ayrıca kaempferol ve kaempferol yüklü mikrokürelerin kanda pıhtılaşma faktörlerine (PF-4, Ne/ELA, TAT, FPA ve ß-TG) etkisi ELİSA yöntemi ile hemolitik etkisi hemoliz testi ile belirlenmiştir. İn-vitro testler ile etkin dozun belirlenmesini takiben sıçanlarda üretral darlık oluşturulmuş ve hazırlanan kaempferol yüklenen ve yüklenmeyen mikroküreler, kaempferol ve mit-c deneklere uygulanmıştır. Uygulamanın ardından sakrifikasyonu yapılan deneklerin üretra dokularında yapılan hematoksilen&eosin boyaması ile inflamasyon, bazal membran bütünlüğü ve skar durumu değerlendirilmiş, masson trikrom boyama ile kolajen seviyeleri belirlenmiştir. Yapılan immunohistokimyasal boyamalar ile fibronektin, kolajen tip 1 ve tip 4'ün protein ekspresyonları belirlenmiştir.
Sentezlenen mikokürelerin 10. güne kadar salım yaptığı ve boyutlarının 52515 µm olduğu tespit edilmiştir. MTT ve WST-1 sitotoksiste sonuçları birbiri ile paralellik göstermiştir. Kaempferol, KYMK ve MK'nın üretra epitel hücreleri üzerinde uygulanan konsantrasyonlarda in vitro sitotoksik etki göstermediği ancak klinikte kullanılan mit-c'nin sistotoksik etki gösterdiği tespit edişmiştir. KYMK ve kaempferolün L929 hücreleri üzerinde in vitro sitotoksik etki gösterdiği belirlenmiştir fakat mit-c'nin bir etki göstermediği tespit edilmiştir.  Üretra epitel hücrelerinde ve L929 fibroblast hücrelerinde KYMK, MK ve kaempferolün apoptotik indeksinin yüksek iken mit-c'nin nekrotik indeksinin yüksek olduğu tespit edildi. Kaempferol, KYMK ve MK'nın genotoksik bir etki göstermediği ancak mit-c'nin genotoksik etki gösterdiği tespit edildi. Hücre yapışma testlerinde; üretra epitel hücrelerinin KYMK'lar üzerinde tutunma oranının L929'dan daha fazla olduğu tespit edildi. HE boyamalarında üretra dokusuna uygulanan kaempferol, KYMK ve MK'nın bazal membran yapısında onarım gösterdiği ancak mit-c'nin bu tip bir etkinin olmadığı, KYMK ve kaempferolün üretra epitelizasyonunda artış gösterdiği ve darlık alanının yeniden yapılandırılarak onarıldığı tespit edildi. Masson trikrom boyama ile kolajen seviyeleri darlık kontrol grupları ile karşılaştırıldığında; KYMK ve kaempferol uygulanan gruplarda ciddi azalma gösterirken mit-c' ve MK'da hafif azalma gösterdiği tespit edildi. Kolajen tip 1 ve tip 4 seviyeleri kaempferol ve KYMK'larda hafif pozitiflik gösterirken; mit-c ve MK uygulanan gruplar ve darlık olmayan kontrol grubunda şiddetli-orta pozitiflik gösterdiği tespit edildi. 
Yapılan in vitro ve in vivo testler sonucunda kaempferol ve kaempferol yüklenen aljinat/hyalurnik asit mikrokürelerinin üretral darlık tedavisinde mit-c'den daha etkin olduğu ve klinik çalışmalarda kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca kaempferol yüklenen mikrokürelerin kontrollü salım göstermesi, aljinat ve hyalurnik asit içeriği sebebiyle kaempferole oranla daha etkin sonuçlar gösterdiği tespit edilmiştir.

Abstract:
Urethral stricture is a disease characterized by fibrotic scar formation, pathologically degeneration of the urethral epithelium, and frequently recurring in patients. Although the etiology and epidemiology of the disease have been clarified, an effective treatment still cannot be applied in the clinic. In this thesis study, the effect of kaempferol, which has the potential to prevent scar formation and re-epithelialization in the treatment of urethral stricture, alone or loaded into alginate/hyalurnic acid (HA) microspheres, was investigated by in vitro and in vivo methods. For this purpose, kaempferol loaded alginate / HA microspheres were synthesized and controlled release studies were carried out. SEM, TGA, FT-IR and HPLC were used for the characterization of the prepared microspheres. For in vitro studies; on urethral epithelial cells which obtained by primary cell culture and L929 fibroblast cells; kaempferol loaded microspheres (KLMS), kaempferol unloaded microspheres (MS), kaempferol and for treatment of clinical common used mitomycin-C (mit-C) with MTT and WST-1 test to determine cytotoxic effects were performed. Double stanning method was applied to determine apoptosis and necrosis. x-CELLigence-Real-Time Cell Analysis Systems were used to determine the effects on cell proliferation depending on the concentration. The materials prepared genotoxic / carcinogenic / mutagenic effects in order to determine; AMES and micronucleus tests were conducted. In addition, the effects of kaempferol and kaempferol loaded microspheres on blood coagulation factors (PF-4, Ne/ELA, TAT, FPA and ß-TG) were determined by ELISA method and hemolytic effect by hemolysis test. Following the determination of the effective dose by in-vitro tests, urethral stricture was created in rats and the prepared kaempferol loaded and unloaded microspheres, kaempferol and mit-c were applied to the subjects. After the application, inflammation, basement membrane integrity and scar status were evaluated with hematoxylin&eosin staining on the urethra tissues of the subjects who were sacrified, and collagen levels were determined by Masson trichrome staining. Protein expressions of fibronectin, collagen type 1 and type 4 were determined by immunohistochemical staining.
It was determined that the synthesized mycospheres were released until the 10th day and their size was 52515 µm. MTT and WST-1 cytotoxicity showed similar results with each other. It was determined that Kaempferol, KLMS and MS didn't show cytotoxic effect in vitro at the concentrations applied to urethral epithelial cells, but mit-c, which was used clinically, showed a cystotoxic effect. It was determined that KLMS and kaempferol showed cytotoxic effects on L929 cells in vitro, but mit-c did not show any effect. It was determined that the apoptotic index of KLMS, MS and kaempferol was high in urethral epithelial cells and L929 fibroblast cells, but the necrotic index of mit-c was higher. It was determined that kaempferol, KLMS and MS didn't show a genotoxic effect, but mit-c had a genotoxic effect. In cell adhesion tests; it was determined that the adhesion rate of urethral epithelial cells on KLMS's was higher than L929. In HE stainings, it was determined that kaempferol, KLMS and MS applied to the urethra tissue repaired the basal membrane, but mit-c didn't show such an effect, KLMS and kaempferol increased the epithelialization of the urethra and the stricture area was repaired by restructuring. When the collagen levels were compared with stricture control groups with Masson trichrome staining; It was determined that mit-c' and MS decreased slightly, while it showed a serious decrease in the groups that were KLMS and kaempferol. Collagen type I and type IV levels show mild positivity in kaempferol and KLMSs; It was determined that the mit-c and Ms applied groups and the control group without stricture showed strong-moderate positivity.
As a result of in vitro and in vivo tests, kaempferol and alginate/hyalurnic acid microspheres loaded with kaempferol are more effective than mit-c in the treatment of urethral stricture, therefore they can be used in clinical studies. In addition, it was determined that microspheres loaded with kaempferol showed more effective results than kaempferol due to the controlled release, alginate and hyalurnic acid content.