Zeytin beta lukozidaz geni'nin pichia pastoris'te ekspresyonu
Expression of olive beta glucosidase in pichia pastoris
Yazar: GÖZDE ZEYTUN
Danışman: YRD. DOÇ. ŞENAY VURAL KORKUT ; DR. GÜNSELİ KURT GÜR
Yıldız Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2016
Konu: Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Beta glukozidazlar (EC.3.2.1.21) glikozidler ve oligosakkaritlerin beta glukozidik bağlarının hidrolizini katalizleyen enzimlerdir. Bitkiler, hayvanlar, bakteriler ve mantarlarda bulunurlar. Hayvanlarda glikolipidlerin ve egzojen glikozidlerin yıkımı, mikroorganizmalarda biyokütle dönüşümü, bitkilerde koku salınımı, lignifikasyon, hücre duvarı oligosakkaritlerinin katabolizmasında önemli rol oynarlar. Beta glukozidazların zeytinde tat ve renk oluşumunda görevli olduğu düşünülmektedir. Çeşitli rekombinant proteinlerin üretiminde kullanılan bir organizma olan Pichia pastoris, beta glukozidaz ekspresyonu çalışmalarında da sıklıkla kullanılmaktadır. Ökaryotik protein üretiminde gerekli olan post translasyonel modifikasyon, protein katlanması ve protein işlenmesini sağlayan Pichia pastoris, yüksek düzeyde protein üretiminin yanı sıra diğer ökaryotik ekspresyon sistemlerine göre daha ucuz, daha kolay ve hızlı üretilebilme avantajına sahiptir. Bu çalışmada; enzimin büyük miktarda üretimi için Pichia pastoris'te, zeytin (Olea europaea L. Gemlik kültivarı) beta glukozidaz geninin heterolog ekspresyonu amaçlanmıştır. Tam boyda beta glukozidaz cDNA'sı, alkol oksidaz (AOX1) promotoru kontrolü altında maya mekik vektörü pPICZB içine klonlanmıştır. Oluşturulan rekombinant DNA, Pichia pastoris'in yabani tip X-33 suşuna kimyasal transformasyon ile aktarılmış ve transformantlar YPDS/Zeo içeren besiyerlerinde seçilmiştir. Zeytin beta glukozidaz geninin P. pastoris genomuna entegrasyonu hem ilgili gene özgü hem de AOX primerleri ile kurulan PCR sonucunda doğrulanmıştır. Kültürler 30°C ve 250 rpm'de farklı besiyerlerinde büyütülmüş ve her gün %1 metanol ilavesi yapılarak heterolog beta glukozidaz ekspresyonu indüklenmiştir. Dört gün boyunca toplanan örneklerdeki rekombinant beta glukozidaz ekspresyonu, yapay substratlarla enzim aktivitesinin belirlenmesi ile analiz edilmiştir. Gelecek çalışmalarda üretilen rekombinant enzimin saflaştırılması ve biyokimyasal karakterizasyonu amaçlanmaktadır.

Abstract:
Beta glucosidases (EC.3.2.1.21) are enzymes which catalyze the hydrolysis of glucosidic linkages of glycosides and oligosaccharides. Beta glucosidases are found in plants, animals, bacteria and fungi. These enzymes have important roles in the catabolism of glycolipids and exogenous glycosids in animals, biomass conversion in microorganisms, scent release, lignification and catabolism of cell wall oligosaccharides in plants. Beta glucosidases are considered to be involved in the formation the taste of olives. Methylotrophic yeast Pichia pastoris is an organism that is used for recombinant production of various proteins. It is also frequently used for heterologous expressin of beta-glucosidases. It has many advantages as being an eukaryotic expression system in that it allows posttranslational modifications including proteolytic processing, folding, disulfide bond formation and glycosylation. Pichia pastoris system is easier, less expensive, faster to use and gives higher expression levels of recombinant proteins compared to other eukaryotic expression systems. In this study it is aimed to make heterologous expression of beta glucosidase in Pichia pastoris for the large scale production of enzyme. Beta glucosidase cDNA was cloned into yeast shuttle expression vector, pPICZB, under the control of alcohol oxidase (AOX) promoter and Pichia pastoris strain X-33 was chemically transformed with recombinant DNA. Transformants were selected on YPDS/Zeo plate. Entegration of gene was screened by PCR with gene specific primers and AOX primers. Cell cultures were incubated at 30°C for four days. Heterologous expression of beta glucosidase was induced by addition of 1% methanol every day. At the end of fourth day samples were collected and analyzed.