Trigeminal nevralji in vitro modeli olarak sıçan trigeminal sinir hücreleri üzerine bevacizumabın tedavi edici etkisinin araştırılması
Investigation of therapeutic effect of bevacizumab on rat trigeminal nerve cells as an in vitro model of trigeminal neuralgia
Yazar: KAAN KIRIMLI
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ALİ RIZA GÜVERCİN
Karadeniz Teknik Üniversitesi / Tıp Fakültesi / Nöroşirürji Ana Bilim Dalı
Derece: Tıpta Uzmanlık, 2023
Konu: Nöroşirürji = Neurosurgery
Dizin: Bevacizumab = Bevacizumab ; Nevralji = Neuralgia ; Nörodejeneratif hastalıklar = Neurodegenerative diseases ; Tedavi = Treatment ; Trigeminal sinir = Trigeminal nerve ; Vasküler endotel büyüme faktörleri = Vascular endothelial growth factors ; İn vitro = In vitro

Özet:
Giriş-Amaç
Trigeminal nevralji (TGN), kişinin yaşam kalitesini düşüren şiddetli ağrılar ile karakterize nöropatik hastalıktır. Teşhisinin zor olması ve bulguların farklı hastalıklarla karışması sebebiyle, hastalığın görülme oranlarının raporlananlara göre yüksek olduğu düşünülmektedir. Trigeminal nevralji (TGN) günümüzde halen büyük bir sorun teşkil etmekte ve tedavisinde en çok zorlanılan hastalıklardan biri olmaya devam etmektedir. Bu durum hem hastalar hem de toplum için hem psikolojik hem de maddi bir sorundur. Bu yüzden günümüzde yeni çıkan moleküller Trigeminal nevralji tedavisinde denenmekte ve umut olabilmektedir.
Trigeminal nevraljide nedenler kesin olmamakla beraber başlangıçta primer olarak herhangi bir lezyonun ya da yapının sinire bası yapması sonucunda trigeminal sinir hücreleri ve etrafındaki nöronlar hasarlanır. Bu durum hücresel düzeydeki inflamatuar kaskadları başlatır. Trigeminal sinirin ihtiyaç duyduğu perfüzyonu bozar ve bu hipoksik durum nöronlarda yapısal hasar meydana getirir. Primer hasardan sonra başlayan ve zamanla devam edebilen bir dizi hücresel değişiklikler oluşur ve genellikle birbiri ardına gelişir. Bu süreçler sonunda trigeminal sinir beslenmesi ve miyelinizasyonu bozulur, ödem gelişir. Demiyelinizasyon sonucu nöronlarda aşırı uyarılabilirlik meydan gelir ve bunun sonucunda ağrı gelişir. Sinir hücrelerinde yenilenme için çalışmalar başlar ancak zayıftır.
Genel olarak deneysel tedaviler sekonder hasarı engelleme ve nörorejenerasyona katkı sağlamaya yöneliktir. Yapılan çalışmalar göstermiştir ki sekonder hasar ve iyileşme dönemindeki en önemli durumlardan bir tanesi basının, ödemin azaltılması bir diğeri de revaskülarizasyon ile hem hasarlı bölgedeki yeniden kanlanmayı ve hücresel düzeyde beslenmeyi sağlamak hem de hasarlı alanındaki serbest radikalleri ve zararlı maddeleri uzaklaştırmaktır. Hedef trigeminal sinirin mikrosirkülasyon bozukluğunu ortadan kaldırmak ve perinöral perfüzyonu geliştirmek yani dolaşım bozukluğunu düzeltmektir. Ancak bu dönemde meydana gelen revaskülarizasyonun belirli bir dengede olması gerekir, hasarlı alanda yeterli perfüzyonun olmaması da gereğinden fazla olması da bir sorundur.
VEGF (Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü) türündeki ilaçlar bu hasar modellerinde daha önce deneysel olarak kullanılmış ve vaskülarizasyonu arttırarak sekonder hasarı azaltıcı etkileri, hasarlanan nöral dokularda nöroprotektif yönde etkileri de gösterilmiştir. Ancak son zamanlarda Anti VEGF türündeki ilaçların da gereğinden fazla olan vaskülarizasyonu engelleyerek iyileşme üzerinde pozitif yönde etki edebileceği düşünülmüştür. Bu etkilerini basitçe hasar sonrası ödemi azaltarak oksijenin ve enerji kaynaklarının hücrelere iletimini kolaylaştırarak yaptığı, limitli bir anjiyogenez sağlayarak sinir hücrelerinin beslenmesinde verimliliği arttırarak yaptığı, böylece nöroprotektif etkilerinin olabileceği düşünülmüştür ancak litaratürde bu konuda yeterli bilgi ve yayın bulunmamaktadır.
Gereç&Yöntem: 
Deneyde 10 adet sıçan kullanılmıştır. Dekapitasyon sonrası trigeminal ganglionları (TG) çıkartıldıktan sonra hücre kültür protokolleri yapılmıştır. Hücreler ayrıştırıldıktan sonra steril şekilde normoglisemik (NG), hiperosmolar (HPO) ve hiperglisemik (HPG) ortamlar oluşturulup xcelligence sisteminde pleytlere 100-200 hücre olacak şekilde yerleştirilmiş ve hücrelerin adhezyonu, büyümesi ve proliferasyonu için RTCA (Real Time Cell Analysis)  yazılımına göre 24 saate kadar biyosensör elektrotlar aracılığı ile empedans ölçümleri gerçekleştirilmiştir. 24 saat sonunda NGF (Nerve Growth Faktör) verilmiş ve empedans ölçümleri 24 saat daha devam etmiştir. 48.saat sonunda her ortama bevacizumab doz 1 (0.025 mg/ml), bevacuzimab doz 2 (0,25 mg/ml), bevacuzimab doz 3 (1 mg/ml), bevacuzimab doz 4 (2.5 mg/ml) şeklinde tedavi dozları verilmiş ve her 15 dakikada bir empedans ölçümleri RTCA yazılımıyla 160 saat sonuna kadar devam edilmiştir.
Bulgular: 
NG ortamda tüm bevacizumab tedavi dozlarının  negatif etkinliğinin olmadığı gösterilmiş ancak bunun yanında  doz 4 de  hücre indeksinde pozitif yönde anlamlı farklılık olduğu görülmüştür (p<0.05). Her ne kadar istatiksel olarak sadece doz 4 ile diğer gruplar arasında anlamlı farklılık olsa da doz arttıkça hücre indeksinde pozitif yönde bir artış olduğu görülmüştür.HPO ortamda bevacizumab tedavisinin tüm tedavi şekillerinde negatif etkisinin olmadığı gösterilmiş ancak hücre indekslerinde doz bağımlı olarak anlamlı farklılık saptanmış olup  pozitif etkinliği gösterilmiştir. Her ne kadar istatiksel olarak tüm dozlar arasında anlamlı farklılık olmasa da doz arttıkça hücre indeksinde pozitif yönde bir artış olduğu görülmüştür. HPG ortamda bevacizumab tedavisinin tüm tedavi şekillerinde negatif etkisinin olmadığı gösterilmiş ancak hücre indekslerinde doz bağımlı olarak anlamlı farklılık saptanmış olup pozitif etkinliği gösterilmiştir. Her ne kadar istatiksel olarak tüm dozlar arasında anlamlı farklılık olmasa da doz arttıkça hücre indeksinde pozitif yönde bir artış olduğu görülmüştür.

Sonuç: 
Anti VEGF tedavisinin trigeminal nevraljide nöronal rejenerasyona katkı sağlayabileceği, fonksiyonel nöronları koruyarak sekonder hasarı azaltıcı ya da sınırlayıcı etkisinin olabileceği düşünülmüştür.

Anahtar Kelimeler: Trigeminal nevralji, Bevacizumab, Anti VEGF, Nörorejenerasyon, xcelligence

Abstract:
Introduction&Goal:Trigeminal neuralgia (TGN) is a neuropathic disorder characterized by severe pain that reduces the quality of life. It is estimated that the incidence in the community is quite high compared to the reported one, since its diagnosis and differential diagnosis are difficult. Trigeminal neuralgia (TGN) is still a major problem today and continues to be one of the most challenging diseases to treat. Therefore it creates both a psychological and financial burden for the individual as well as the society. For this reason, molecules that are newly released and are in the experimental stage can be hope in the treatment of trigeminal neuralgia.
The causes of trigeminal neuralgia, although it is not certain, are primarily damage to the trigeminal nerve cells and surrounding neurons as a result of the compression of any lesion or structure on the nerve. This initiates inflammatory cascades at the cellular level, disrupting the perfusion and the resulting hypoxic state creates structural damage to the neurons. A series of cellular changes that begin after primary injury and continue over time. At the end of these processes, the myelination of the trigeminal nerve is impaired and edema develops. As a result of demyelination, hyperexcitability occurs in neurons and as a result, pain develops. Attempts to regenerate nerve cells begin, albeit weakly.
In general, experimental treatments are aimed at preventing secondary damage and contributing to neuroregeneration. Studies have shown that one of the most important conditions in the preventing secondary damage and recovery period is to reduce the pressure and edema, and providing revascularization and nutrition to the cell as well as removing free radicals and harmful substances in the damaged area. The goal is eliminating the microcirculation disorder of the trigeminal nerve and improving perineural perfusion to eliminate the circulatory disorder. However, the revascularization that occurs during this period must be in a certain balance, and insufficient or excessive perfusion is also an issue.
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) type drugs have been previously used experimentally in these damage models, and their effects on reducing secondary damage by increasing vascularization. Additionally neuroprotective effects on damaged neural tissues have been shown. However, it has recently been thought that anti-VEGF drugs may also have a positive effect by preventing excessive vascularization. It is thought that it does these effects simply by reducing the post-damage edema and facilitating the transmission of oxygen and energy resources to the cells.  Furthermore it may have neuroprotective effects by providing a limited angiogenesis, and increasing the efficiency in the nutrition of nerve cells; however in the literature, there is not enough scientific data.

Material&Methods: 
Ten rats were used in the experiment. Cell culture protocols were performed after trigeminal ganglia (TG) were removed after decapitation. After the cells were separated, sterile normoglycemic (NG), hyperosmolar (HPO) and hyperglycemic (HPG) environments were created and placed on the plates in the xcelligence system with 100-200 cells. For the adhesion, growth and proliferation of cells, impedance measurements were carried out using biosensor electrodes for up to 24 hours according to RTCA (Real Time Cell Analysis) software. After 24 hours, NGF (Nerve Growth Factor) was given and impedance measurements continued for the next 24 hours. At the end of the 48th hour, treatment doses as bevacizumab dose 1 (0.025 mg/ml), bevacuzimab dose 2 (0.25 mg/ml), bevacuzimab dose 3 (1 mg/ml), bevacuzimab dose 4 (2.5 mg/ml) and impedance measurements were continued every 15 minutes with RTCA software until the end of 160 hours.

Results: 
It was shown that all bevacizumab treatment doses did not have negative efficacy in NG medium, however, there was a positive significant difference in cell index at dose 4 (p<0.05). Although there was a statistically significant difference between only dose 4 and other groups, it was observed that there has been a dose-dependent positive effect in cell index. It has been shown that bevacizumab treatment in HPO medium has not a harmful effect in all treatment modalities, but a significant difference was found in cell indices in a dose-dependent manner and positive efficacy was demonstrated. Although there was no statistically significant difference among all doses, it was observed that there was a dose-dependent positive effect in cell index. It has been shown that bevacizumab treatment in HPG media has not a harmful effect in all treatment modalities, but a significant difference was found in cell indices in a dose-dependent manner and positive efficacy was demonstrated. Although there was no statistically significant difference among all doses, it was observed that there was a dose-dependent positive effect in cell index.


Conclusions:
It has been thought that anti VEGF treatment may contribute to neuronal regeneration in trigeminal neuralgia, and may have a reducing or limiting effect on secondary damage by protecting functional neurons.

Key Words: trigeminal neuralgia, trigeminal neuropathy, bevacizumab, anti vegf, neuroregeneration, xcelligence