Kanser tanı ve tedavisinde kullanılmak üzere anti-PD-L1-scFv antikor geliştirilmesi
Development of anti-PD-L1-scFv antibody for use in cancer diagnosis and treatment
Yazar: CANSU BABAHAN
Danışman: PROF. DR. HAKAN AKBULUT
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2023
Konu: Onkoloji = Oncology
Dizin: Antikorlar = Antibodies ; Fajlar = Phages ; Neoplazmlar = Neoplasms ; PD-L1 = PD-L1 ; Tedavi = Treatment

Özet:
Kanser ciddi bir sağlık sorunu olup, dünyada morbidite ve mortaliteye yol açan hastalıkların başında gelmektedir. 
Kanser hücreleri ile mücadelede, vücudun en önemli silahı olan T hücrelerinin antijen tanımasında ve aktivasyonunda rol oynayan mekanizmaların aydınlatılması ile daha spesifik ve etkin tedavi ajanları geliştirilmesi mümkün hale gelmiştir. Aktive T hücrelerinde bulunan PD-1, immünolojik aktivasyonu sınırlandıran ve inhibe eden bir moleküldür. T hücrelerinde bulunan PD-1'e bağlanarak bu inhibisyonun gerçekleşmesini sağlayan başlıca iki ligand (PD-L1 ve PD-L2) bulunmaktadır. Bu ligandlar antijen sunan hücrelerin yanı sıra diğer stromal hücrelerde ve tümör hücrelerinde de bulunmaktadır. Tümör dokusunda PD-L1 ekspresyonunun artışı ile tümörler kendilerine karşı gelişmiş olan spesifik T hücre cevabını baskılayarak immün sistemden kaçar ve büyümeye devam eder. Bu noktadan yola çıkarak, PD-1 reseptörü veya PD-L1 ligandının bloke edilmesiyle tümörlere karşı T hücre cevabının arttırılması için üretilen monoklonal antikor tedavileri son 10 yıl içerisinde ileri evre kanser tedavisinde benzeri görülmemiş bir başarı sergilediğinden onkoloji alanında devrim yaratmıştır. Klinik çalışmalarda tümör dokusunda immunohistokimyasal olarak PD-L1 ekspresyonu olduğu gösterilen hastalarda daha yüksek oranda tedavi yanıtı elde edildiği gösterilmiştir. Tümörlerdeki PD-L1 ekspresyonunun, bu molekülü hedefleyen tedaviler için bir biyobelirteç olabileceği öngörülmektedir. Hastaların önemli bir oranının PD-1/PD-L1 ajanlarından yarar görememesi, tedavilerin hastalarda immün ilişkili toksisiteye neden olması ve tedavi maliyetinin yüksek olması nedeniyle, bu tedavilerin rasyonel kullanımını sağlayarak, immünoterapilerden yarar görecek hasta gruplarının belirlenmesinde prediktif biyobelirteçlere ihtiyaç vardır. 
Tam antikorların, büyük molekül yapıları nedeniyle dokuya geçişlerde sorun oluşturabilmesi ve hastalarda antikorun taşıdığı Fc kısmı nedeniyle ciddi yan etki potansiyeli taşımaları nedeniyle rutin kullanımları kısıtlanmaktadır. Antikor molekülünün scFv fragmenti, bir antikorun antijen bağlayan en küçük fonksiyonel halkasını içerir. scFv antikorunun araştırma, teşhis ve klinik uygulamalar gibi birçok alanda kullanım potansiyeli yüksektir. scFv antikor yapısının tam antikorlara kıyasla daha küçük olması, tümörlere ve diğer dokulara daha hızlı ve eşit bir şekilde nüfuz etmesine olanak sağlar. Bu fragmentlerin kandan daha hızlı atılabilmesinden ve sağlıklı dokunun bu antikorlara düşük oranda maruz kalmasından dolayı scFv antikorları anti-kanser ilaçları ve radyonüklitler ile birleştirilerek kanser tedavisinde ve görüntülenmesinde kullanılabilir.  
Bu çalışmada rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak, PD-L1 antijenine karşı immünizasyon yoluyla elde edilen sıçan dalak hücre cDNA'larının immünglobülin VH ve VL değişken bölgelerinin spesifik primerler ile çoğaltılması ve sonrasında bu bölgeleri birleştiren bağlayıcı diziyi içeren primerler ile birleştirilip bir scFv molekülü oluşturuldu. Elde edilen scFv antikor kütüphanesinin faj gösterim yöntemi aracılığı ile fajların yüzeyinde eksprese ettirilmesi sağlandıktan sonra afinite seçimi yapılarak PD-L1 antijenine en yüksek afinitede bağlanan anti-PD-L1-scFv antikorunun elde edilmesi sağlandı. Yüksek afiniteli anti-PD-L1-scFv antikorunun HEK293 hücrelerinde eksprese ettirilmesi ve IMAC yöntemi ile saflaştırılması sonrası, antikorun antijen bağlama performansları saptandı ve tam anti-PD-L1 antikoru ile in vivo tedavi etkinliği kıyaslandı. 
Elde edilen özgün anti-PD-L1-scFv antikoru doğrudan immün sistemi aktive etmek için kullanılabileceği gibi diğer anti tümör ilaçları ve kimyasalları tümör hücrelerine taşımada güçlü bir taşıyıcı olarak kullanılma potansiyeline sahiptir.  Ayrıca elde edilen anti-PD-L1-scFv antikorunun bir radyonüklid ile bağlanması ile hastaların anlık PD-L1 ekspresyon oranının tespit edilmesi sayesinde doğru PD-L1 ekspresyon seviyesi analizi yapılarak PD-L1'in immünohistokimyasal analizindeki kısıtlıkların giderilmesine katkı sağlayanabilir.

Abstract:
Cancer is a serious health problem and one of the leading diseases that cause morbidity and mortality worldwide.
In the fight against cancer cells, it has become possible to develop more specific and effective treatment agents by elucidating the mechanisms involved in antigen recognition and activation of T cells, the body's most important weapon. PD-1 found in activated T cells is a molecule that limits and inhibits immunological activation. Two main ligands (PD-L1 and PD-L2) enable this inhibition to occur by binding to PD-1 in T cells. These ligands are found on antigen-presenting cells, other stromal cells, and tumor cells. With the increase of PD-L1 expression in tumor tissue, tumors suppress the specific T-cell response developed against them and escape from the immune system and continue to grow. From this point of view, monoclonal antibody therapies produced to increase the T cell response against tumors by blocking the PD-1 receptor or PD-L1 ligand have revolutionized the field of oncology, as they have shown unprecedented success in the treatment of advanced cancer in the last 10 years.
In clinical studies, it has been shown that a higher rate of treatment response was obtained in patients who were shown to have PD-L1 expression in tumor tissue by immunohistochemistry. PD-L1 expression in tumors is predicted to be a biomarker for therapies targeting this molecule. Predictive biomarkers are needed to determine patient groups that will benefit from immunotherapies because a significant proportion of patients do not benefit from PD-1/PD-L1 agents, the treatments cause immune-related toxicity in patients, and the high cost of treatment. The routine use of full antibodies is restricted due to their large molecular structure, causing problems in tissue penetration and the potential for serious side effects in patients due to the Fc part they carry. The scFv fragment of the antibody molecule is the smallest functional link of an antibody that binds antigen. The scFv antibody has a high potential for use in many fields such as research, diagnostics and clinical applications. The smaller scFv antibody structure compared to whole antibodies allows it to penetrate tumors and other tissues more quickly and evenly. Because these fragments can be removed from the blood faster and healthy tissue is less exposed to these antibodies, scFv antibodies can be combined with anti-cancer drugs and radionuclides to be used in cancer treatment and imaging.
In this study, an scFv molecule was formed by obtaining and combining the immunoglobulin VH and VL variable regions from rat spleen cell cDNAs obtained by immunization against PD-L1 antigen using recombinant DNA technology. After the scFv antibody library obtained was expressed on the surface of the phages by means of the phage display method, affinity selection was made to obtain the anti-PD-L1-scFv antibody that binds to the PD-L1 antigen with the highest affinity. After expression of high-affinity anti-PD-L1-scFv antibody in HEK293 cells and purification by IMAC method, the antigen binding performances of the antibody were determined and the in vivo treatment efficacy was compared with the full anti-PD-L1 antibody. The unique anti-PD-L1-scFv antibody obtained can be used to activate the immune system directly, as well as have the potential to be used as a potent carrier in delivering other anti-tumor drugs and chemicals to tumor cells. In addition, by binding the obtained anti-PD-L1-scFv antibody with a radionuclide and detecting the instant PD-L1 expression rate of the patients, accurate PD-L1 expression level analysis can contribute to the elimination of the limitations in the immunohistochemical analysis of PD-L1.