Yüksek azot içerikli organik atıkların havasız arıtımı: Biyogaz potansiyeli ile mikrobiyal türlerin araştırılması
Anaerobic digestion of organic wastes with high nitrogen contents: An investigation on biogas potential and microbial communities
Yazar: TUĞBA SAPMAZ
Danışman: DOÇ. DR. ÇİĞDEM GÖMEÇ
İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Çevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2017
Konu: Çevre Mühendisliği = Environmental Engineering
Dizin: Yenilenebilir enerji = Renewable energy

Özet:
Gelişmekte olan ülkeler kategorisinde bulunan ülkemizde son yıllarda nüfusta meydana gelen hızlı artışa paralel olarak gıda sektöründe de artış gösteren ihtiyacın karşılanabilmesi için bu sektörde birçok farklı kol gelişmiştir. İnsan vücudu için oldukça önemli olan ve hücre yapısının temel organik maddesini oluşturan proteince zengin et ve yumurta gibi iki önemli kaynağın temin edildiği tavukçuluk sektörü, bu kollardan en önemlilerinden birini oluşturmaktadır. Bu bağlamda, beyaz et tüketimi son yıllarda hızla artarak; kanatlı hayvanlardan kaynaklanan atıklar da ekosistemi tahrip ederek; önemli çevre problemlerine sebep olmaktadır. 
2017 yılı, Ocak ayı TÜİK verilerine göre ülkemizde, tavuk yumurtası üretimi bir önceki yıla göre %7.4 oranında artarak yaklaşık 1.6 milyar adet olmuştur. Tavuk eti üretimi ise bir önceki yılın aynı ayına göre yaklaşık %13 oranında artış göstererek, yaklaşık 162000 ton olarak rapor edilmektedir.  
Hayvan dışkısı, altlık malzemeleri, ölü kuşlar, yumurta kabukları, kırılmış yumurtalar, tüyler ve çeşitli kesimhane atıklarını içeren kümes hayvan atıkları, özellikle ülkemizde bu alanda yeterli düzenleme olmadığından dolayı, kontrolsüz bir şekilde tarlalarda gübre olarak; ya da sadece kesimhane atıklarına ait yan ürünlerin değerlendirildiği ünitelerde yem malzemesi olarak kullanılmaktadır. Fakat tavuk atıklarının kontrolsüz bir şekilde yönetimi, çevresel açıdan istenmeyen problemler doğurabilmektedir. Bu sebeple, ülkemizde kümes hayvancılığı sektöründe yaşanan bu gelişme; kanatlı hayvanların yetiştirildiği çiftliklerden kaynaklanan ve gün geçtikçe artan miktarlardaki atıkların ne şekilde bertaraf edilecekleri sorusunu da beraberinde getirmiştir. 
Tarım ve hayvancılık faaliyetleri sonucu oluşan atıklardan biyogaz eldesine olanak sağlayan havasız (anaerobik) arıtma prosesleri, kirlilik yükünü azaltırken aynı zamanda bu proseslerden yenilenebilir bir enerji kaynağı olan biyogaz geri kaznımının da gerçekleşmesi sebebiyle en çok tercih edilen biyolojik arıtma teknolojisidir. Bu tez çalışması kapsamında, sadece yumurta üretiminin gerçekleştirildiği bir tavuk çiftliğinden kaynaklanan hayvansal atıkların, mezofilik sıcaklıkta (35ºC), farklı katı madde (TKM) oranlarında işletilen anaerobik kesikli test düzenekleri ile ilk olarak optimum katı madde yükleme oranı belirlenmiştir. Daha sonra, belirlenen optimum TKM oranında yarı-sürekli anaerobik bir sistem işletilmiş ve yine tavuk atıklarının havasız arıtılabilirliği ile biyogaz potansiyeli araştırılmıştır. Böylelikle, tavuk atıklarının havasız arıtımının gerçekleştirildiği gerçek ölçekte işletilen sistemlerde gözlenebilecek işletme problemlerinin daha temsil edici bir şekilde ortaya konması amaçlanmıştır. 
Bunun yanında, tavuk atıklarının havasız arıtımı sırasında ortamda bulunan organik maddelerin gideriminden sorumlu mikrobiyal komünite ve yine bu proseslerde yüksek azot içeriklerinden dolayı ortaya çıkması muhtemel inhibisyona uyum sağlayabilecek türlerin tespiti, DNA izolasyonunu takiben 'Yeni Nesil Dizileme (NGS)' yöntemi ile bakteriyel ve arkeyal grupların miktarları ise gerçek zamanlı kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) ile belirlenmiştir. Böylece, tavuk atıklarının anaerobik sistemler ile arıtılabilirliği, sadece mühendislik tasarım parametreleri seviyesinde değil aynı zamanda hücre içi seviyede de incelenebilmiştir. 
Bu tez çalışmasının ilk bölümünde, çalışmanın amaç, kapsam ve önemi yer almaktadır. İkinci bölümde ise, anaerobik biyoteknoloji,  tavuk atıklarının havasız arıtımı ve anaerobik arıtımın mikrobiyolojisinin anlatıldığı detaylı bir literatür araştırması yer almaktadır. 
Üçüncü bölümde 'Materyal ve Yöntem' kısmı yer almakta olup; çalışmada substrat olarak kullanılan tavuk atığı ile reaktörlere işletmeye alma dönemlerinde ilave edilen aşı çamurunun karakterizasyonu sunulmuştur. Çalışmada kullanılan reaktörler, ekipmanlar ve analitik yöntemler ile mikrobiyolojik çalışmaların deneysel kısmı da yine üçüncü bölüm içerisinde yer almaktadır. 
Çalışmanın 'Bulgular ve Değerlendirme' kısmının yer aldığı dördüncü bölümde, kesikli test düzeneklerindeki optimizasyon sonuçları ile optimum TKM oranında işletilen yarı-sürekli reaktörde tavuk atıklarının havasız arıtılabilirlik sonuçları konvensiyonel parametreler ve günlük olarak ölçülen biyogaz üretimleri  esas alınarak sunulmuştur. Dördüncü bölüm aynı zamanda Erasmus kapsamında gerçekleştirilen ve aynı tavuk atıkları gibi yüksek organik ve azot içerikli yemek atıklarının, bir yardımcı substrat kaynağı (saman) ile termofilik sıcaklıkta havasız olarak çürütüldüğü çalışma sonuçlarını da içermektedir. Ayrıca, gerek kesikli gerekse yarı-sürekli havasız biyoreaktörlerde tavuk ve yemek atıkları ile gerçekleştirilen mikrobiyolojik çalışmaların sonuçları da yine bu kısımda bulunmaktadır.
Çalışmanın 'Sonuç ve Yorumlar' kısmında, tez çalışmasının tüm bulguları özetlenmiştir. Çalışma sonuçları mezofilik şartlarda (35ºC) farklı katı madde oranlarında işletilen anaerobik kesikli test düzeneklerinde en yüksek biyogaz verimini, TKM=%5.6 olan biyoreaktörde yaklaşık 239 lt/kg UKMbeslenen olarak göstermiştir. Kesikli sistemlerde elde edilen qPCR analiz sonuçlarına göre, biyogaz üretiminin sonlandığı 32 günlük inkübasyon süresi sonunda alınan biyokütle örneklerinde; metanojenlerin miktarı önemli ölçüde artış göstermiştir. İstatistiksel analiz sonuçları da UYA konsantrasyonunda gözlenen tüketim ile toplam metanojenlerin sayıları arasında da belirgin bir uyum olduğunu ortaya koymuştur (p<0.05). 
Kesikli çalışma sonuçlarına göre elde edilen optimum TKM oranında işletilen yarı-sürekli diğer bir anaerobik sistemde ise günlük ortalama biyogaz üretimi 670 ml/gün olarak elde edilmiştir. Bunun yanında, yarı-sürekli reaktörde çKOİ giderim verimi %62, TKM ve UKM giderim verimleri ise sırasıyla %53 ve %54 olarak bulunmuştur. AKM giderimi %50 ve UAKM giderimi ise %61 olarak ölçülmüştür. Kesikli sistemde TAN değişimi yaklaşık 1300 ile 5600 mg/lt aralığında gözlenmiştir. Yarı kesikli sistemde ortalama TAN konstrasyonu yaklaşık olarak 2300 mg/lt iken ortalama FAN konsantrasyonu yaklaşık 250 mg/lt olarak hesaplanmıştır. Çalışma boyunca sistemde pH'ın 8.0 değerinin üzerine çıktığı dönemler dışında; FAN konsantrasyonları literatürde inhibisyon için öngörülen aralıkların altında hesaplanmıştır. Yüksek FAN değerleri, biyogaz üretimleri üzerinde bir miktar olumsuz etki gösterse bile çalışmanın geneli dikkate alındığında serbest amonyaktan kaynaklanan inhibisyonun çok belirgin olmadığı belirlenmiştir. qPCR sonuçları ise bakteri, metanojen ve arke topluluklarının miktarlarında anlamlı artışlar göstermiştir.
Çalışmanın 'Sonuç ve Yorumlar' kısmında ayrıca Erasmus Programı süresince tavuk atığı gibi yüksek organik içerikli bir atık olan yemek atığının farklı organik yükleme hızlarında termofilik şartlardaki anaerobik arıtımı da araştırılmıştır. Bu kapsamda, aynı OYH değerinde; yardımcı substrat olarak %20 oranında saman ilavesi yapılmış olan reaktördeki metan verimi, hiç saman içermeyen kontrol ve %10 oranında saman içeren reaktörlere kıyasla daha fazla olduğu görülmüştür ve bu değerin yaklaşık 563 mL/gUKM/gün olduğu bulunmuştur. Bu reaktörlerde, Euryarchaeota, Proteobacteria ve Actinobacteria'ı takiben Firmicutes ve Bacteroidetesler türlerinin baskın olduğu yapılan NGS çalışmaları sonucunda belirlenmiştir. Erasmus kapsamında yapılan çalışma sonuçları ışığında, ilave yardımcı substrat olan samanın yemek atığının çürütülmesinde anaerobik arıtılabilirlik ve metan verimliliği üzerinde daha etkili olduğunu ortaya koymuştur. Firmicutes, Bacteroidetes ve Euryarchaeota türlerinin yemek atığı ve samanın birlikte çürütüldüğü havasız reaktörlerde baskın filum olarak tespit edilmesi sonucunda; bu üç mikrobiyal türün yemek atığı ve saman içerisinde bulunan organik maddelerin ayrışmasından sorumlu olduklarını ortaya koymuştur. Ayrıca, yemek atığının %20 saman ilaveli reaktörde birlikte çürütüldüğü sistemde en yüksek metan verimi gözlenmiş ve yine en yüksek Euryarchaeota filumu da bu reaktörde tespit edilmiştir.

Abstract:
Food sector in Turkey has developed in various ways during recent years to meet the demand resulting from an increase in population as a developing country. Poultry sector that provides two protein rich sources -meat and eggs- which crucial for the wellbeing of human health, is one of the major sectors of the food industry. However, an increase in the consumption of white meat had resulted in an increase in breeding of these animals and therefore an increase in animal wastes, which disturb the ecosystem and cause environmental problems.
According to TUIK data of January 2017, chicken egg production has increased by 7.4% compared to previous year and reached 1.6 billion. Chicken meat production has also increased by approximately 13% in comparison to 12 months in prior and reported to be 162000 tons. 
Poultry wastes -animal wastes, bedding materials, dead birds, egg shells, broken eggs, feathers and various slaughterhouse wastes- are used as field fertilizer or as feed for rendering units at slaughterhouses without control in Turkey due to lack of relevant regulations. However, uncontrolled management of chicken wastes may cause environmental problems. For this reason, the developing poultry industry requires a solution for the disposal of the increasing amount of waste from poultry farms.
Anaerobic digestion is a technology widely used for treatment of organic wastes. During the process the wastes are degraded with a simultaneous energy production in the form of biogas; hence anaerobic digestion is the most preferred among biological treatment technologies. In addition, anaerobic digestion is a very efficient process for poultry litter that allows collectable biogas production with an average methane content of 60%.
Within the scope of this study, the aim is to determine the optimum solids loading rate using anaerobic batch reactors that are operated at mesophilic temperature (35ºC) at different total solids (TS) ratios and then to investigate the biogas potential of chicken wastes in a semi-continuous system operated at the determined optimum TS ratio. Therefore a clear picture of the management problems that may arise in an operation where the chicken waste is treated through anaerobic digestion in an industrial scale is presented.
In addition, considering the gap in the current literature, anaerobic treatment of chicken wastes was not only investigated at the level of engineering design parameters but also at the intracellular level. In this context, microbial communities responsible for the removal of the organic substances were determined by 'Next Generation Sequencing (NGS)' and bacterial and archael groups were quantified by real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). The species that could adapt to the possible inhibition due to the high nitrogen content in these processes was also determined. 
Anaerobic digestion depends on several parameters (e.g., pH, temperature, substrate type, C/N ratio, and hydraulic retention time) for an effective performance. Different groups of microorganisms are involved and suitable conditions must be established to keep all the microorganisms in balance. 
Anaerobic digestion of animal manure and slurries offers several benefits by improving their fertilizer qualities, reducing odors and pathogens and at the same time producing a renewable fuel (i.e., biogas).
Anaerobic digestion involves four different steps; hydrolysis, acidogenesis, acetogenesis, and methanogenesis. Different bacterial/archaeal communities work in a syntrophic relationship with each other to form methane. In hydrolysis, complex carbohydrates, fats, and proteins are first hydrolyzed to their monomeric forms. In the second phase (acidogenesis), monomers are further degraded into short-chain fatty acids such as acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid, isovaleric acid, caprionic acid etc. During acetogenesis, these short-chain acids are converted into acetate, hydrogen, and carbon dioxide. In the last phase, methanogens convert these intermediate products into methane and carbon dioxide. Almost one-third of methane formation is due to the reduction of carbon dioxide by hydrogen.
The main objective of this study was to investigate the anaerobic treatability of the diluted chicken manure and to determine the optimum solids loading rate using batch reactors and its biogas potential in a lab-scale semi-continuous anaerobic digester. Moreover, the microbial diversity in the samples taken during digestion was also identified using qPCR and Illumina Miseq NGS techniques.
The aim, scope and importance of the study are explained at the first part of the thesis. 
The second part contains detailed information from literature on the anaerobic biotechnology and its microbiology as well as anaerobic treatment of chicken manure. 
Characterization of the chicken waste and the inoculum used in the study are described in the third part namely 'Materials and Methods'. Reactors, equipment and analytical methods used in the study as well as microbiological experiments are presented in this section.
In the fourth section of the study, the optimization results of the batch tests and anaerobic treatability results of the chicken waste in the semi-continuous reactor that have been operated at the optimum TS% are presented based on the conventional parameters and daily biogas productions.
Fourth section also includes results of anaerobic thermophilic digestion of food waste with high organic and nitrogen content – similar to chicken waste- with an co-substrate; a study executed within Erasmus program. Results of microbiological studies conducted on chicken and food waste in fed batch and semi-batch anaerobic bioreactors are also in this section. 
All findings of the thesis study are summarized in "Results and Conclusions" section. Highest anaerobic biogas production per kg of VS was determined as 239 L -5.6% biomass production per VS- at batch reactors run under mesophilic conditions with different solid ratios. According to qPCR results of fed batch systems, methanogens increased significantly in the biomass samples taken after an incubation period of 32 days in which the biogas production is finished. Statistical analysis have also shown that there is a certain trend between total methanogens and VFA consumption (p<0.05). Average daily biogas production was determined as 670 ml in an anaerobic semi-continuous system that ran with an optimum TS ratio determined from fed batch results. Besides, the semi continuous reactor sCOD removal efficiency was 62%, TS and VS removal efficiency were 53% and 54%, respectively. The VS removal was measured as 50% and the VSS 61%. In fed batch system the TAN conversion was observed between 1300 to 5600 mg/L; in semi batch system average TAN concentration was calculated as 2300 mg/l and average FAN concentration was calculated as 250 mg/l. FAN concentration were found to be below the ranges shown in literature for inhibition excluding the periods in which system pH were above 8. Though high FAN values had a certain negative impact on biogas production when the total study is considered it was determined that inhibition from free ammoniac was not very noticeable whereas qPCR results displayed a significant increase in bacteria, methanogen and archea communities.
Results and Conclusions section also includes results of anaerobic thermophilic co-digestion of food waste with high organic and nitrogen contents – similar to chicken waste- with another substrate type namely straw; a study conducted within Erasmus program. In this context methane yield in the reactor with 20% straw addition as the co-substrate was approximately 563 ml/gVS/day which was higher than both the control reactor with no straw addition and 10% straw addition with same OLR value. In these reactors, results of NGS studies has shown Firmicutes and Bacteroidetes species following Euryarchaeota, Proteobacteria and Actinobacteria to be the dominant cultures. 
Based on study results within Erasmus program, straw addition was more effective on anaerobic treatability and methane productivity in the anaerobic digestion of food wastes. As Firmicutes, Bacteroidetes and Euryarchaeota species were found to be dominant in anaerobic digestion of food waste with straw it was determined that these three microbial species were responsible for the digestion of organic matter in food waste and straw. Also highest methane yield was observed in reactor with 20% straw addition and the highest number of Euryarchaeota was also found in this reactor.