Bromodomain inhibitörü "PLX51107" ile HDAC inhibitörü "saha" epigenetik ajanların AML hücre dizisi üzerindeki terapotik etkilerinin araştırılması
Investigation of the therapeutic effects of bromodomain inhibitor PLX51107 and HDAC inhibitor saha epigenetic agents upon AML cell line
Yazar: İLAYDA ALÇITEPE
Danışman: DOÇ. DR. BURÇİN KAYMAZ
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2021
Konu: Tıbbi Biyoloji = Medical Biology
Dizin: Bromodomain = Bromodomain ; Epigenez-genetik = Epigenesis-genetic ; Gen ifadesi = Gene expression ; Histon deasetilaz = Histone deacetylases ; Hücre çoğalması = Cell proliferation ; Lösemi-miyeloid-akut = Leukemia-myeloid-acute ; İnhibitör = Inhibitor

Özet:
Proliferasyon hızı normal hücrelere göre artmış ve spontan apoptozu azalmış hücrelerin klonal proliferasyonu ile seyreden ve prolife olmuş hücrelerin kemik iliği işgali ile devam eden malin bir hastalık grubu olarak karşımıza çıkan akut myeloid lösemi, diğer lösemi türlerinin %20'sini oluşturmaktadır. 
Kanser başlangıcı ve gelişimi süreci, hücrelerin transkripsiyonel ifadelenmesini epigenetik ve genomik değişiklikler sayesinde düzenlemektedir. Nükleozomal histon proteinlerinin post-translasyonel modifikasyonları kanser hücrelerinde ve normal hücrelerde gen ekspresyonun ve kromatin organizasyonunu düzenlemekte olup,  bunlar arasında, N-terminal histon kuyruklarının asetilasyonu ökromatinin ve aktif gen transkripsiyonunun temel epigenetik işaretini temsil etmektedir. 
Kanser tedavisi için epigenetik "reader'ları" yani bromodomainleri hedefleyen klinik çalışmalar, akut myeloid lösemi ve diğer kanser tedavilerinde ekstraterminal (BET) inhibitörleri ve bromodomain (BRD) etkinliğini gösermiştir.Bromodomain ve extra-terminal (BET) proteinleri, asetillenmiş lizin kuyruklarını tanımak için tandem bromodomainleri (BRD) modülleri kullanan epigenetik okuyucular olarak karşımıza çıkmaktadır.  
Transkripsiyonda ve malignitede BET proteinlerinin kritik rolü göz önüne alındığında BET ailesi proteinlerine inhibitörler geliştirmek için önemli çabalar gösterilmiştir. 2000'li yılların sonunda, BRD'ler ve asetil-lizin arasındaki hidrofobik etkileşimin karakterize edilmesinden sonra, BET proteinlerinin ve asetil- lizinin BRD'si arasındaki etkileşimi bozan triazolothienodiazepin bileşikleri sentezlenmiştir. 
Bu tez kapsamında, yeni keşfedilen yapısal olarak farklı, BRD4 proteininin bromodomainlerinde asetillenmiş lizin tanıma motiflerine bağlanarak BRD4'ün histonlar üzerindeki asetillenmiş lizinlere bağlanmasını engelleyen PLX51107 inhibitörü kullanılarak ve HDAC inhibitörü SAHA(vorinostat)'nın tek başına/kombine uygulamaları sonrasında; lösemik hücreler üzerindeki apoptotik, sitotoksik etkilerin değerlendirilmesi, karsinogenetik süreçte önemli seçilmiş genlerin mRNA seviyesindeki ekspresyon değişimlerinin tespiti gibi hücresel yanıtların belirlenmesi amaçlanmıştır.
Uygun koşullar altında HL60 ve lösemi olmayan kontrol grubu çoğaltılarak XTT reaktifi ile proliferasyonu ve sitotoksisite analizleri gerçekleştirilerek,  plx51107 ve vorinostat için IC50 dozu belirlenmiştir. Belirlenen IC50 dozuna göre etken maddelerin hücreler üzeindeki apoptotik etkisi ve seçilmiş hedef genlerin ekspresyon seviyeleri RT-PCR ile değerlendirilmiştir.
Elde edilen veriler ışığında plx51107 ve vorinostat'tın HL60 hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkisi saptanmış olup IC50 değeri; plx51107 için 72.saatte 6,68uM; vorinostat için 48.saatte 4,3uM olarak hesaplanmıştır. Lösemi olmayan kontrol grubu hücre hattı için(NCIBL2171) ise plx51107 için 72.saatte 1,24um; vorinostat için 48.saatte 2,01um olarak hesaplanmıştır. İki etken maddenin kombine uygulaması ile sitotoksisite değerlendirildiğinde NCIBL2171 hücre hattı için dozlar arasında antogonistik bir etki saptandığı için lösemi olmayan kontrol grubunda iki etken maddenin kombinasyonu değerlendirilmeye alınmamıştır. HL60 hücre hattı için kombinasyon analizi değerlendirildiğinde, sinerjistik etkinin, vorinostat IC50 dozu sabit tutularak plx51107 IC50 dozunda ve IC50 dozunun 1,5 katında(10uM) olduğu saptanmıştır. Tespit edilen IC50 dozlarına göre etken maddelerin hücreler üzerindeki apoptotik etkileri Annexin V analizi ile değerlendirilmiştir. Sonuçlara göre etken maddelerin hücreler üzerindeki apoptotik etkileri yaklaşık %80-%97.4 aralığında saptanmıştır. Seçilmiş hedef genlere ilişkin RT-PCR analiz sonuçlarına göre apoptotik genlerden Bcl-2, Casp3 genlerinde sırasıyla 1.23 ve 15.8 kat azalış olduğu gözlenmiştir. Hücre döngüsü genlerinden olan CDKN2A için de plx51107 IC50 dozunun 1.5 katında(10uM) 4.85 kat; combo1 için ise 3.97 kat azalış olduğu belirlenmiştir.
Sonuç olarak bromodomain inhibitörü olan Plx51107, HL60 hücre hattında sitotoksik etki göstererek apoptotik etkiye neden olmuştur ve seçilmiş hedef genlerin ekspresyon düzeylerindeki azalma beklendiği gibi olmuştur. Bu nedenle, PLX51107'nin, diğer hematolojik maliniteler için de önemli bir tedavi yaklaşımı olabileceği ve klinik denemeye hızlı bir şekilde geçmesini destekleyebileceği düşünülmektedir.

Abstract:
Acute myeloid leukemia, which is a malignant disease group that progresses with clonal proliferation of cells with increased proliferation rate compared to normal cells and with reduced spontaneous apoptosis and continues with bone marrow invasion of proliferated cells, constitutes 20% of other leukemia types.
Cancer initiation and development process the transcriptional expression of cells through epigenetic and genomic changes. Post-translational modifications of nucleosomal histone proteins regulate gene expression and chromatin organization in cancer cells and normal cells, among which the acetylation of N-terminal histone tails represents the key epigenetic marker of euchromatin and active gene transcription.
Clinical studies targeting epigenetic "readers", namely bromodomains, for cancer treatment have shown the effectiveness of extraterminal (BET) inhibitors and bromodomain (BRD) in acute myeloid leukemia and other cancer treatments. Bromodomain and extra-terminal (BET) proteins appear as epigenetic readers that use tandem bromodomains (BRD) modules to recognize acetylated lysine tails.
Considering the critical role of BET proteins in transcription and malignancy, considerable efforts have been made to develop inhibitors to BET family proteins. In the late 2000s, after the hydrophobic interaction between BRDs and acetyl-lysine was characterized, triazolothienodiazepine compounds that disrupted the interaction between BET proteins and the BRD of acetyl-lysine were synthesized.
In this thesis, using the newly discovered structurally different PLX51107 inhibitor, which binds to lysine recognition motifs acetylated in bromodomains of the BRD4 protein, preventing BRD4 from binding to acetylated lysines on histones, and HDAC inhibitor SAHA (vorinostat) alone / combined applications, to evaluate the apoptotic, cytotoxic effects on leukemic cells, and to determine the cellular responses such as determining the expression changes in the mRNA level of selected genes in the carcinogenetic process.
Under appropriate conditions, the HL60 and non-leukemia control groups were replicated and proliferation and cytotoxicity analyzes were performed with XTT reagent, and the IC50 dose was determined for P1x51107 and vorinostat. Upon apoptotic effect on cells according to the determined IC50 dose of the active ingredients and the selected target gene expression levels were evaluated by RT-PCR.
The resulting data showed that the cytotoxic effect of Plx51107 and Vorinostat on the HL60 cell line was determined, and the IC50 value was; 6.68uM for plx51107 at 72h; The vorinostat was calculated to be 4.3uM at 48h. For the control group cell line without leukemia (NCIBL2171), 1.24um at 72h for p1x51107; It was calculated as 2.01um at 48h hour for the vorinostat. When the cytotoxicity was evaluated with the combined administration of two active ingredients, the combination of the two active ingredients in this cell line was not evaluated since an antagonistic effect was detected between the doses for the NCIBL2171 cell line. When the combination analysis for the HL60 cell line was evaluated, the synergistic effect was found to be 1.5 times the p1x51107 IC50 dose, keeping the Vorinostat IC50 dose constant. The apoptotic effects of the active substances on the cells according to the determined IC50 doses were evaluated by Annexin V analysis. According to the results, the apoptotic effects of the active ingredients on the cells were found in the range of approximately 80% -97.4%. According to the results of RT-PCR analysis of selected target genes, 1.23 and 15.8 times decrease was observed in Bcl-2 and Casp3 genes, respectively. For CDKN2A, one of the cell cycle genes, P1x51107 was 4.85 times 1.5 times the IC50 dose; For combo1, it was determined that there was 3.97 times decrease.
As a result, Plx51107, a bromodomain inhibitor, showed a cytotoxic effect in the HL60 cell line and caused an apoptotic effect, and the decrease in the expression levels of the selected target genes was as expected. Therefore, it is thought that Plx51107 can be an important treatment approach for other hematological malignancies as well and support the rapid transition to clinical trials.