N. benthamiana'da üretilmiş insan fix'nın hafif ve ağır zincirlerinin tasarlanması, üretimi ve karakterizasyonu
Design, production and characterization of light and heavy chain of human fix produced in N. benthamiana
Yazar: RABİA AKÇORA
Danışman: PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV
Akdeniz Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2019
Konu: Biyoteknoloji = Biotechnology

Özet:
Hemofili B kandaki faktör IX proteini eksikliğine neden olan X kromozomu mutasyonunun neden olduğu kalıtsal bir hastalıktır. Faktör IX proteini aktive olmak için iki aşamalı proteolitik kesime maruz kalmaktadır. Arg145 bölgesinde ki kesilme ile iki zincirli inaktif FIXa oluşur. Bu işlemin ardından Arg180 bölgesinde hidroliz meydana gelir ve hafif zincir (LC) içeren N-terminal ile ağır zincir (HC) içeren C-terminal arasında disülfit bağları oluşarak aktif proteaz Faktör IXab meydana gelir. Aktif Faktör IX, dört yapısal domain içerir: N-terminustan başlayarak γ-karboksiglutamik asit (Gla) domaini, iki tane epidermal büyüme faktör-benzeri domain ve son olarak proteolitik domainidir. Halen, hemofili B'li hastalar ya insan kanından plazmada FIX elde edilerek ya da CHO (Çin hamsteri yumurtalık) hücrelerinde üretilen rekombinant FIX'le tedavi edilmektedir. Bununla birlikte, bu sistem son derece pahalı ve ölçeklendirilmesi zor bir sistemdir. Bitki ifade sistemi ise umut verici bir ifade yöntemi olmuştur ve diğer ifade sistemlerine kıyasla birtakım avantajlara sahiptir. Bu çalışmanın amacı, in vivo olarak bağlanması mümkün olmak üzere bitkide geçici gen ekspresyon sistemi kullanılarak faktör IX'un hafif ve ağır zincir domainlerinin üretimini denemektir. Bu çalışmada, HC ve LC genleri N. Benthamiana kodonları kullanılarak tasarlanmış ve kodon optimizasyonu yapılmıştır. Kodon optimizasyonu yapılmış HC ve LC genleri sentezlenmiş ve daha sonra bitki ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Klonlanmış plazmidler, elektroporasyon yoluyla Agrobacterium tumefaciens'in soyu olan AGL1'e aktarılmıştır. Nicotiana benthamiana bitkileri, HC ve LC genlerini barındıran agro ile infiltre edilmiştir. Ekspresyon ve optimizasyonun onaylanmasından sonra her iki gen, HC ve LC'nin muhtemel bağlanmaları için agro-infiltrasyon yoluyla bitki hücrelerine aktarılmıştır. LC ve HC genleriyle infiltre edilen bitki toplanıp, ekstre edilmiş ve saflaştırılmıştır. Son olarak FIX aktivitesi gerçekleştirilmiştir. Aktivitenin, insan Furine göre %10'dan daha yüksek olmadığı saptanmıştır.

Abstract:
Hemophilia B is an inherited disease caused by a mutation on X chromosome that result the deficiency of factor IX protein  in blood. The Factor IX protein undergoes a two-step proteolytic cleavage to be activated. Two chain inactive Factor IXa are formed with interruption on Arg145. Following this process, hydrolysis occurs in Arg180 region and the disulphide bonds between the N-terminal containing the light chain (LC) and the C-terminus containing the heavy chain (HC) are formed, and the active protease Factor IXab was present. Activated Factor IX contains of four structural domains: the carboxyglutamic acid (Gla) domain as the N-terminus, two epidermal growth factor-like domains and finally the proteolytic domain. Currently, patients with hemophilia B are treated either by obtaining FIX in plasma from human blood or by recombinant FIX produced in CHO (Chinese hamster ovary) cells. Studies have shown recombinant FIX has also been successfully produced in mammalian cell cultures. However, this system extremely expensive and difficult to scale up Plant expression system is promising expression system and has a number of advantages compared to other expression systems. The goal of this study was to attempt the production of factor IX light and heavy chain domains by transient gene expression method in plant for possible of assembly in vivo. In this study, HC and LC genes were engineered and codon optimized using N. benthamiana codons. Codon optimized HC and LC genes were de novo synthesized and then cloned into plant expression vector. Cloned plasmids were transferred into Agrobacterium tumefaciens starin AGL1 by electroporation. Nicotiana benthamiana plants were infiltrated by agro harboring HC and LC genes. After confirmation the expression and optimization, both genes were introduced into plant cells by agroinfiltration for possible assembly of HC and LC. Plant infiltrated with LC and HC genes were harvested, extracted, purified and performed FIX activity. The activity was not higher than 10% relative to human Furin.