Asetilsalisilik asit-hemoprotein etkileşiminin biyoelektrokimyasal olarak belirlenmesi için nanoteknolojik temelli yeni bir biyosensör sistemi geliştirilmesi
Development of a new nanotechnology based biosensor system for bioelectrochemical determination of acetylsalicylic acid-hemoprotein interaction
Yazar: SEVİL MENTEŞ
Danışman: PROF. DR. EROL AKYILMAZ
Ege Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2023
Konu: Biyokimya = Biochemistry ; Biyoteknoloji = Biotechnology
Dizin: Asetilsalisilik asit =   ; Aspirin = Aspirin ; Biyosensörler = Biosensors ; Elektrokimyasal sensörler = Electrochemical sensors ; Hemoglobinler = Hemoglobins ; Metal nanopartiküller = Metal nanoparticles ; Nanoteknoloji = Nanotechnology

Özet:
Bu tez çalışmasının amacı, ağrı, ateş ve enflamasyonu azaltmak için sıklıkla kullanılan aspirinin etken maddesi olan Asatilsalisilik asitin (ASA), hemoglobinin hem grubu üzerideki inhibisyon etkisine dayanarak hemoglobin temelli AuNP/3-MPA modifiye yeni bir altın biyosensörü geliştirmektir. Geliştirilen hemoglobin temelli non-enzimatik 1,8-Oktanditiyol/AuNP/3-MPA/6-ACA nanoteknolojik biyosensör, özellikle Asetilsalisilik Asit başta olmak üzere bazı ilaç etken maddelerinin tayininin duyarlı ve spesifik olarak gerçekleştirilmesini olanaklı kılacaktır.

Sinyal oluşumunun temel ilkesini ortamda ASA yokken ve varken hemoglobinde bulunan hem grubunun, substratı hidrojen peroksite olan aktivitesindeki değişimin elektrokimyasal olarak belirlenmesi oluşturmaktadır. Çalışmanın esasını hedef molekül olan ASA'nın sensör yüzeyinde immobilize edilmiş hemoglobin aktivitesini biyokatalitik esaslı olarak inhibe etmesi oluşturmaktadır. Bu etkileşim sonucu hemoglobin aktivitesindeki düşüşe bağlı olarak elektrokimyasal sinyalde değişim oluşturması ve yeni oluşan sinyalin biyosensör aktif tabakasındaki AuNP yardımıyla hızlı ve efektif bir şekilde belirlenmesi yöntemin esasını meydana getirmiştir. 

Altın elektrot yüzeyinde 1,8-oktanditiyol molekülü kullanılarak kendiliğinden tek tabaka oluşumu gerçekleştirilmiştir. AuNP ve 3-MPA ile modifikasyon sonrası hemoglobin immobilize edilerek biyosensör tasarlanmıştır. 

Hemoglobin temelli biyosensörün biyoaktif tabaka optimizasyonuna ilişkin olarak AuNP boyutu, hemoglobin miktarı çalışmaları yapılmıştır. Çalışma koşullarının optimizasyonu amacıyla optimum pH ve sıcaklığın belirlenmesine yönelik çalışmalar yapılmıştır. Biyosensörün karakterizasyonuna yönelik çalışmalarda ise CV karakterizasyonu, doğrusal tayin aralığı, tekrarlanabilirlik, susbstrat spesifikliği, girişim etkisi ve aspirin tablette örnek tayini yapılmıştır. 

ASA'nın inhibisyon etkisi sayesinde azalan yükseltgenme piklerindeki değişikliklerle akım farklanmasına dair sonuçlar elde edilmiştir. ASA için doğrusal tayin aralığı 10-100 μM olarak belirlenmiştir. Aspirin, C Plus Aspirin, Bebe Aspirini, Coraspin (Bayer) tabletlerinde örnek tayinleri gerçekleştirilmiş ve tekrarlanabilirlik çalışmaları sonrası 50 µM ASA için yapılan 5 ölçüm ile ortalama konsantrasyon değeri (x̄)= 61,78 μM, standart sapma (S.S.) = ± 4,06 μM ve %varyasyon katsayısı (%V.K.) = %9,65 olarak bulunmuştur.

Abstract:
The aim of this thesis study is to develop a new hemoglobin-based AuNP/3-MPA modified gold biosensor based on the inhibition effect of acetylsalicylic acid, the active ingredient of aspirin, which is used to reduce pain, fever and inflammation on the heme group of hemoglobin.The developed hemoglobin-based non-enzymatic 1,8-Octandithiol/AuNP/3-MPA/6-ACA nanotechnological biosensor will enable the sensitive and specific determination of some drug active ingredients, especially Acetylsalicylic Acid.

The basic principle of signal formation is the electrochemical determination of the change in the activity of the heme group in hemoglobin, in the absence and presence of ASA, to its substrate hydrogen peroxide. The basis of the study is that the target molecule, ASA, inhibits the hemoglobin activity immobilized on the sensor surface on a biocatalytic basis. As a result of this interaction, the change in the electrochemical signal due to the decrease in hemoglobin activity and the rapid and effective determination of the newly formed signal with the help of AuNP in the biosensor active layer formed the basis of the method.

Self assembly monolayer (SAM) formation was carried out using 1,8-octandithiol molecule on the gold electrode surface. A biosensor was designed by immobilizing hemoglobin after modification with AuNP and 3-MPA.

Regarding the bioactive layer optimization of the hemoglobin-based biosensor, AuNP size and hemoglobin amount studies were performed. Studies have been carried out to determine the optimum pH and temperature in order to optimize the working conditions. In studies for the characterization of the biosensor, CV characterization, linear detection range, reproducibility, substrate specificity, interference effect and sample determination in aspirin tablets were performed.

Results on current differentiation with decreasing oxidation peaks due to the inhibition effect of ASA were obtained. The linear detection range for ASA was determined as 10-100 µM. Sample determinations were made in Aspirin, C Plus Aspirin, Children Aspirin, Coraspin (Bayer) tablets and after repeatability studies, the mean concentration value (x̄)= 61.78 μM, standard deviation (S.S.) = ± 4,06 μM and %coefficient of variation (%V.K.) = 9,65%. with 5 measurements made for 50 µM ASA.