Eksfoliye süt ve gömülü üçüncü büyük azı dişlerinden izole edilen kök hücrelerin kültivasyonu ve karakterizasyonu
The cultivation and characterization of stem cells from human exfoliated deciduous teeth and impacted third molar teeth
Yazar: BANU KÜRKÇÜ
Danışman: PROF. DR. SERAP ÇETİNER
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Pedodonti Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2010
Konu: Diş Hekimliği = Dentistry
Dizin: Azı dişi-üçüncü = Molar-third ; Dental pulpa = Dental pulp ; Dişler = Teeth ; Doku mühendisliği = Tissue engineering ; Kök hücreler = Stem cells ; Polimeraz zincirleme reaksiyonu = Polymerase chain reaction ; Süt dişleri = Tooth deciduous

Özet:
Çalışmamızda fizyolojik düşme zamanı gelmiş süt dişi ve gömülü üçüncü büyük azı dişinden izole edilen pulpa kök hücreleri çoğaltılıp rhBMP-2 ve rhBMP-7 kullanılarak osteojenik indüksiyonları sağlandıktan sonra meydana gelen hücrelerin moleküler ve yapısal özellikleri mikroskopi ve RT-PCR ile değerlendirilmiştir.Çalışmaya fizyolojik düşme zamanı geldiği için çekim endikasyonu konmuş, 5-8 yaş arası çocuklardan elde edilen çürüksüz üst süt keser dişler ile patolojik değişiklik sergilemeyen 19-25 yaş arası hastalardan elde edilen gömülü üçüncü büyük azı dişleri dahil edilmiştir.Eksfoliasyon zamanı gelmiş süt dişi ve gömülü üçüncü büyük azı dişinden kök hücre izolasyonu için Gronthos ve ark.'nın (2000) yöntemi kullanılmıştır. Kök hücre izolasyonundan sonra, yeterli sayıda hücre elde etmek için hücrelerin subkültürleri yapılmıştır. Kök hücrelerin osteojenik indüksiyonunu sağlamak amacıyla bu hücreler içinde 100 ng/ml rhBMP-2 ve rhBMP-7 bulunan vasatta 21 gün boyunca idame ettirilmiştir. Bu vasat haftada 2 kere değiştirilmiş ve hücreler 7, 14 ve 21. günlerde test edilmiştir.Hücre içi kalsiyum sentezi 7, 14 ve 21. günlerde yapılan Alizarin Red S boyaması, hücre morfolojisi de Hematoksilen Eozin boyaması ile değerlendirilmiştir.Hücrelerin izole edilen RNA'ları üzerinden cDNA sentezi yapıldıktan sonra bu cDNA'lar RT-PCR'de çoğaltılmış ve elde edilen cDNA kütüphanesi üzerinden hedeflenen OC, GAPDH proteinlerine ait DNA dizinlerinin çoğaltılması yapıldıktan sonra, değerlendirmede, 100 bç'lik DNA merdiveni (Fermentas, Litvanya) paralelinde hedeflenen protein (OC, GAPDH) kodlayan DNA fragmanlarına ait büyüklükler karşılaştırmalı olarak izlenmiştir.Çalışmamızın sonuçlarına göre, hem eksfoliasyon zamanı gelmiş süt dişlerinde hem de gömülü üçüncü büyük azı dişlerinde proliferasyon yeteneği fazla, rhBMP-2 ve rhBMP-7 indüksiyonu sonucunda osteo/odontojenik karakterde hücre yapısına dönüşebilme yeteneğine sahip kök hücreler izole edilmiştir. Hücrelerin kültive edildiği ortamın hücre sayısı ve hücre çapı üzerine bir etkisinin olmadığı saptanmıştır.

Abstract:
In this study isolated stem cells from exfoliated deciduous teeth and impacted third molar teeth will be proliferated and their osteogenic induction will be provided by using rhBMP-2 and rhBMP-7. The structural and molecular characteristics of the cells were evaluated by using microscopy and RT-PCR respectively.Normal exfoliated human deciduous upper incisors from 5 to 8-year-old children and impacted third molars showing no pathological symptoms from adults 19-25 years of age were used in this study.For the isolation of stem cells from both exfoliated deciduous teeth and impacted third molar teeth, the isolation method that was determined by Gronthos et al.(2000) was modified and the cells were subcultured in order to provide enough number of cells. 100 ng/ml of rhBMP-2 and rhBMP-7 was added in a medium to induce osteogenic differentiation for 21 days and this medium was changed 2 times a week.Intracellular calcium synthesis was detected by Alizarin Red S staining and Hematoxylin and Eosin staining was used for evaluation of cell morphology on days 7, 14 and 21.cDNA synthesis was achieved from the isolated RNA?s of these cells. These cDNA?s were proliferated in RT-PCR. The DNA sequence of the target OC, GAPDH proteins accessed from cDNA library were proliferated and the size of the DNA fragment coding the target proteins (GAPDH, OC) were determined comparatively.The results of this study show that isolated stem cells from both exfoliated deciduous teeth and impacted third molar teeth are highly proliferative cells capable of differentiating osteo/odontogenic like cells by induction of rhBMP-2 and rhBMP-7. It was concluded that the cultivation medium has no effect on the proliferation and the diameter distribution of the cells.?