Acanthamoeba'nın tespiti için ilmiğe dayalı izotermal çoğaltma yönteminin optimizasyonu
Optimization of loop-mediated isothermal amplification assay for Acanthamoeba
Yazar: AYŞE ÇALIŞ
Danışman: DOÇ. DR. ZUHAL ZEYBEK
İstanbul Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı / Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Biyoloji = Biology ; Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
Acanthamoeba cinsi protozoonlar, toprakta ve tatlı sularda yaygın olarak bulunan serbest yaşayan amiplerdir. Bu nedenle bu mikroorganizmalar ile yaşamımızda sıklıkla karşılaşırız. Patojenik Acanthamoeba türlerinin sebep olduğu önemli bir hastalık Acanthamoeba keratiti (AK) dir. AK ağrılı ve ilerleyici, görmeye engel olan bir hastalıktır ve tüm dünyada artış göstermektedir. Hastalığın klinik tanısı oldukça zordur ve tanı için kültür yöntemi altın standart yöntem olmasına rağmen oldukça zaman alıcıdır (en az 7 gün). Hastalığın erken tanısı için hızlı ve yeni yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. AK'ni tespit edebilmek için klinik örneklerin direk mikroskopi, kültür yöntemi, serolojik yöntemler ve PCR bazlı yöntemler ile incelenmesi bulunmaktadır. Fakat çoğu tanı yönteminin uygulanması için uzman kişilere ve kompleks cihazlara ihtiyaç duyulmaktadır. Bu durum, hastalığın hızlı ve sahada tanısına yönelik geliştirilecek yöntemlerin önünde engel teşkil etmektedir. Günümüzde bazı mikroorganizmaların hızlı tanısında İlmiğe Dayalı İzotermal Çoğaİtma (LAMP) Yöntemi kullanılmaktadır. Bu yöntem, kısa bir sürede (≤60 dakika) tamamlanan hızlı bir izotermal reaksiyondur. Termal döngüleyici gibi pahalı ekipman gerektirmediği için PCR'ye göre daha avantajlıdır. Kapalı bir sistem olması nedeni ile kontaminasyon riski oldukça düşüktür. 
Bu tez çalışması kapsamında, ilimizdeki bir yüzme havuzundan izole edilmiş olan Acanthamoeba castellanii suşu (A10) ve bir adet standart suş (A. castellaniii ATCC 30011) kullanılarak LAMP yöntemi optimize edilmiştir. LAMP yönteminin sıcaklık optimizasyonu 63℃, 64℃, 65℃, 67℃ ve 68℃'lerde gerçekleştirilmiştir. LAMP ürünlerinin saptanmasında, klasik LAMP yöntemi (agaroz jel elektroforez ile), kolorimetrik LAMP ve RT-LAMP yöntemleri kullanılmış, özgüllük ve hassasiyet çalışmaları yapılmıştır. Özgüllük çalışmaları için Acanthamoeba castellanii suşları (A10 ve ATCC 30011) ile 13 bakteri suşu (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus MRSA, Salmonella Typhimurium, Salmonella abony, Klebsiella pneumoniae, Vibrio, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus pneumoniae, Geobacillus stearothermophilus ve Aeromonas hydrophila) test edilmiştir. Acanthamoeba castellanii DNA örneklerinin seri sulandırımları hazırlanarak hassaslık çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Ayrıca amplifiye edilmiş DNA örneklerinin hassasiyet ve özgüllük analizleri RT-PCR yöntemi ile de yapılmıştır.
Klasik LAMP yöntemi ile denenen tüm sıcaklıklarda bant oluşumu gözlenmiştir. Özgüllük çalışmalarından elde edilen veriler, Acanthamoeba'ya özgü tasarlanan LAMP ve RT-PCR primerlerinin test edilen bakteriler karşısında pozitif sonuç vermediğini göstermiştir. Hassasiyet çalışmalarından elde edilen veriler, klasik LAMP yönteminde, A. castellanii A10 tanısı için gereken minimum DNA miktarının 1 ng/μL, A. castellanii ATCC 30011 suşu için 100 pg/μL olduğunu ortaya çıkartmıştır. Kolorimetrik LAMP yöntemi kullanıldığında, her iki suş için de tanı için gereken minimum DNA miktarı 10 pg/μL'ye kadar düşmüştür. Real-Time LAMP yönteminde hem A10 hem de ATCC 30011 suşları için tanı için gereken minimum DNA miktarı 100 pg/μL olarak saptanmıştır. Buna karşılık, Real-Time PCR yönteminde her iki suş için de tanı için gereken en düşük DNA miktarı 10 pg/μL olarak tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, farklı moleküler yöntemlerin Acanthamoeba castellanii'nin hassasiyet analizlerindeki performansını karşılaştırmalı olarak ortaya koymaktadır. 
Sonuç olarak bu tez çalışması LAMP yönteminin hızlı, oldukça hassas ve spesifik olması, nispeten basit, uygun maliyetli bir tanı yöntemi olduğunu göstermektedir. Acanthamoeba castellanii'nin tespitinde LAMP yöntemlerinin ve RT-PCR yönteminin yüksek özgüllük ve hassasiyet sunduğunu, LAMP yöntemi ile tanıda kolorimetrik LAMP yönteminin süre, kullanım kolaylığı ve sahaya uygunluk bakımından daha uygun olduğunu ortaya koymuştur.  
Bu çalışma kapsamında Acanthamoeba castellanii'nin tanısı için optimize edilen LAMP yönteminin, gerekli sertifikasyon ve validasyon işlemlerinin tamamlanmasını takiben saha çalışmalarında yaygın olarak uygulanabileceği öngörülmektedir. Ayrıca kullanılan yöntemlerin bu patojenin klinik örneklerin yanısıra su, toprak gibi çevresel örneklerden de hızlı bir şekilde tespit edilebilmesi için uygun olabileceği düşünülmektedir. Konunun aydınlığa kavuşturulması, ileride yapılacak çalışmalar ile mümkün olacaktır.

Abstract:
The genus Acanthamoeba are free-living amoebae commonly detected in freshwater and soil. Therefore, we often encounter these microorganisms in our lives. An important disease caused by pathogenic Acanthamoeba species is Acanthamoeba keratitis (AK).  AK is a progressive sight-threatening and painful disease and is increasing around the world. The clinical diagnosis of the disease is very difficult and although the culture method is the gold standard method for diagnosis, it is quite time consuming (at least 7 days). Rapid and new methods are needed for the early diagnosis of the disease. In order to detect AK, clinical samples are examined by direct microscopy, culture method, serological methods and PCR-based methods. However, most diagnostic procedures require specialists and complex equipment. This situation constitutes an obstacle to the methods to be developed for rapid and field diagnosis of the disease. Today, the the Loop Based Isothermal Amplification (LAMP) method is used for the rapid diagnosis of some microorganisms. This method is a rapid isothermal reaction that is completed in a short time (≤60 minutes). It is more advantageous than PCR as it does not require expensive equipment such as thermal cyclers. Since it is a closed system, the risk of contamination is very low.
In this thesis, the LAMP method was optimised using Acanthamoeba castellanii strain (A10) isolated from a swimming pool in our province and one standard strain (A. castellaniii ATCC 30011). Optimisation of the temperature of the LAMP method was carried out at 63℃, 64℃, 65℃, 67℃ and 68℃. Classical LAMP method (by agarose gel electrophoresis), colorimetric LAMP and RT-LAMP methods were used for the detection of LAMP products.  For specificity studies, Acanthamoeba castellanii strains (A10 and ATCC 30011) and 13 bacterial strains (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus MRSA, Salmonella Typhimurium, Salmonella abony, Klebsiella pneumoniae, Vibrio, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus pneumoniae, Geobacillus stearothermophilus ve Aeromonas hydrophila) were tested. Sensitivity studies were carried out by preparing serial dilutions of Acanthamoeba castellanii DNA samples. In addition, sensitivity and specificity analyses of amplified DNA samples were performed by RT-PCR method.
The band formation was observed at all temperatures tested with the classical LAMP method. Data obtained from specificity studies showed that Acanthamoeba-specific LAMP and RT-PCR primers did not give positive results against the tested bacteria. Data obtained from sensitivity studies revealed that in the classical LAMP method, the minimum amount of DNA required for the diagnosis of A. castellanii A10 is 1 ng/μL, and for A. castellanii ATCC 30011 strain it is 100 pg/μL. When the colorimetric LAMP method was used, the minimum amount of DNA required for diagnosis was reduced to 10 pg/μL for both strains. In the Real-Time LAMP method, the minimum amount of DNA required for diagnosis was 100 pg/μL for both A10 and ATCC 30011 strains. On the other hand, the minimum amount of DNA required for diagnosis for both strains in Real-Time PCR method was determined as 10 pg/μL. These results demonstrate the comparative performance of different molecular methods in the sensitivity analyses of Acanthamoeba castellanii.
In conclusion, this thesis shows that the LAMP method is a fast, highly sensitive and specific, relatively simple, cost-effective diagnostic method. It has been revealed that LAMP methods and RT-PCR method offer high specificity and sensitivity in the detection of Acanthamoeba castellanii, and that colorimetric LAMP method is more suitable in terms of time, ease of use and field suitability in the diagnosis with LAMP method.  
In this study, it is foreseen that the LAMP method optimised for the diagnosis of Acanthamoeba castellanii can be widely applied in field studies following the completion of the necessary certification and validation procedures. In addition, it is thought that the methods used may be suitable for rapid detection of this pathogen from environmental samples such as water and soil as well as clinical samples. Clarification of the subject will be possible with future studies.