Karpuzda (Citrullus lanatus L.) izole edilmiş ERF transkripsiyon faktör genlerinin karakterizasyonu
Characterization of isolated ERF transcription factor genes in watermelon (Citrullus lanatus L.)
Yazar: ZUHAL KAROĞLU
Danışman: DOÇ. DR. YAŞAR KARAKURT
Süleyman Demirel Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Bahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2012
Konu: Ziraat = Agriculture

Özet:
Karpuz meyvesi etilene oldukça duyarlı olup etilen etkisiyle hızlıca bozulmakta ve iç sulanması (watersoaking) denilen bir fizyolojik bozukluk göstermektedir. Bu çalışmada karpuz meyvesinde etilen sinyalinin iletiminde rol alan ERF transkripsiyon faktör genlerinin elde edilmesi ve karakterizasyonunun yapılması hedeflenmiştir. Diğer türlerden daha önce izole edilen ERF transkripsiyon faktörü genlerinin korunmuş bölgelerinden hazırlanan dejenere primerlerle yapılan PCR sonucunda altı adet kısmi cDNA fragmanı elde edilmiştir. Bu cDNA fragmanları klonlanıp sekanslandıktan sonra BLAST programları yardımıyla ERF transkripsiyon faktörlerine ait sekanslar oldukları kanıtlanmıştır. ERF transkripsiyon faktörü olduğu kanıtlanan herbir cDNA dan spesifik primerler dizayn edilerek bu cDNA'ların tam nükleotid sekanslarının elde edilmesi amacıyla 3' ve 5' RACE analizlerinde kullanılmıştır. Çalışmalar sonucunda iki adet ERF transkripsiyon faktörünün tam nükleotid sekansları elde edilmiş ve bu transkripsiyon faktörleri daha once izole edilen transkripsiyon faktörlerinin sekanslarıda göz önüne alınarak Cl-ERF1 ve Cl-ERF2 şeklinde isimlendirilmişlerdir. Yapılan sekanslama sonucunda Cl-ERF1 ve Cl-ERF2 genlerinin sırasıyla 1007 ve 1160 bazdan oluştukları tespit edilmiştir. Bu genlerden Cl-ERF1 geninin 299 amino asitten oluşan bir proteini kodlayan bir ORF'ye sahip olduğu gözlenmiştir. CL-ERF2 olarak adlandırılan gen ise, 303 amino asidin oluşturduğu bir proteini kodlayan tahmini ORF'den meydana geldiği gözlenmiştir.Çalışmada izole edilen karpuz ERF'lerinin tahmini amino asit sekansları incelendiğinde Cl-ERF1'in Q14 ve D19 içerdiği ve Cl-ERF2'in ise R14 ve V19'a sahip olduğu görülmüştür. Yapılan yapı ve sekans analizleri sonucunda Cl-ERF1 ve CL-ERF2 genlerin Malus x domestica (elma), Arabidopsis and Vitis vinifera (asma) gibi türleri başta olmak üzere diğer türlerden izole edilen Cl-ERF1 ve CL-ERF2 transkripsiyon faktör genlerinin sahip oldukları korunmuş bölgelerin tamamına sahip oldukları ve bu genlere çok yüksek düzeyde hem amino asit hemde nükleotid sekans benzerlikleri gösterdikleri belirlenmiştir.Tam uzunluktaki amino asit sekansları göz önüne alındığında, Cl-ERF1 ve CL-ERF2 transkripsiyon faktör genlerinin AP2/ERF süperailesinde yer alabileceği ortaya konulmuştur. Sekans analizleri izole edilen Cl-ERF1 ve CL-ERF2 transkripsiyon faktör genlerinin DNA bağlanma olayına katılan ERF/AP2 domeyni (59 amino asit) ile tanımlanan AP2/ERF süperailesine ait olduğunu göstermiştir.ERF transkripsiyon faktörlerinin tam nükleotid dizilerinin çıkarılması ile ileride antisens RNA teknolojisi gibi teknikler kullanılarak yapılması düşünülen genetik transformasyon çalışmalarında kullanılabilecek olan genler elde edilmiştir. İzole edilen genler bitki ıslah transformasyon programlarında olgunlaşma şekilleri değiştirilmiş ve etilene bağlı olarak ortaya çıkan fizyolojik bozukluklara karşı dayanıklı çeşitlerin geliştirilmesinde kullanılabilir.Anahtar Kelimeler: Citrullus lanatus, etilen, gen, karpuz, ERF transkripsiyon faktör genleri

Abstract:
Watermelon fruit is very sensitive to ethylene demonstarting rapid tissue deterioration and watersoaking, a physiological disorder, with ethylene exposure. This study was undertaken to isolate and characterize ERF transcription factors involved in ethylene signal transduction in watermelon fruit. As a result of PCR amplification with degenerate primers designed from conserved regions of previously isolated ERF transcription factors from other species, six partial cDNA fragments were obtained. These cDNA fragments were cloned, sequenced and compared with other ERF transcription factor sequences using BLAST program to confirm that they are transcription factor sequences. Spesific primers to each confirmed cDNA fragment were designed and used in 3? and 5? RACE analyses in order to isolate their full length sequences. As a result two full length ERF transcription factors were obtained and designated as Cl-ERF1 and Cl-ERF2 . Upon sequencing Cl-ERF1 and Cl-ERF2 genes were 1007 and 1160 nucleotide in length respectively. The Cl-ERF1 gene had an ORF encoding a protein of 299 amino acids. The gene so called Cl-ERF2 contained an ORF encoding a protein consisting of 303 amino acids. The predictory amino acid sequences of watermelon ERF genes showed that Cl-ERF1 contained Q14 and D19 while Cl-ERF2 had R14 and V19 amino acids. Structural and sequence analyses demonstrated that Cl-ERF1 and Cl-ERF2 had all conserved regions that the previously isolated ERF transcription factors from other species including Malus x domestica, Arabidospsis and Vitis vinifera possesed and showed highly significant amimo acid and nucleotid similarities to the sequences of those isolated genes. Sequence analyses demonstrated that the isolated Cl-ERF1 and Cl-ERF2 transcription factors belonged to AP2/ ERF super family known to posses ERF/AP2 domain (59 amino acids) involved in DNA binding.By isolating the full length nucleotid sequences of genes encoding ERF transcription factors, the genes that may be used in genetic transformation studies were obtained. The isolated genes could be utilized in plant transformation studies with antisense RNA technlogy to develop cultivars with altered ripening behavior and resistant to ethylene-dependent physiological disorders.Key words: Citrullus lanatus, ethylene, gene, watermelon, ERF transcription factors