Saçta olanzapin'in sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) yöntemi ile tayini
Determination of olanzapine in hair with liquid chromatography-tandem mass spectrometry
Yazar: MERVE OKA
Danışman: DR. ÖĞR. ÜYESİ ZEYNEP TÜRKMEN
İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa /  Adli Tıp ve Adli Bilimler Enstitüsü / Fen Bilimleri Ana Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2020
Konu: Adli Tıp = Forensic Medicine ; Eczacılık ve Farmakoloji = Pharmacy and Pharmacology ; Kimya = Chemistry

Özet:
Atipik antipsikotik ilaçlardan olan olanzapin, sadece yetişkinlerde değil aynı zamanda gençlerde de sıklıkla reçete edilen bir ilaçtır.  Özellikle ani kalp ölümleri, epilepside azalmış nöbet eşik seviyesi ve buna bağlı gelişen ölümler, adli toksikolojide olanzapini önemli hale getirmektedir. Literatürde, adli ve klinik toksikolojide sıklıkla kullanılan biyolojik örneklerde (kan, idrar, tükürük ve BOS) kromatografik olarak geliştirilmiş, tek başına Olanzapin ya da metabolitine özgü veya çoklu psikiyatrik ilaçlarla eş zamanlı birçok çalışma bildirilmektedir. 
Olanzapin kanda oldukça kararsız olduğu için postmortem olgularda kanda tespit edilmesi karmaşıktır. Bu olgular dışında, olanzapinin tedavi amaçlı kullanımının yanı sıra suistimal edildiği de görülmektedir. Akut olanzapin toksisitesinin ölüme katkıda bulunduğu görülen birçok olgu sunumu bulunmaktadır. Bu nedenle olanzapinin saç ve tırnak gibi biyolojik örneklerden tayinine yönelik analitik yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. 
Referans Malzeme, bir etken madde için kalite kontrol çalışmalarında kullanılan saf veya bir matrikse özgü oluşturulmuş materyallerdir. Bir Referans Malzemenin, Sertifikalı Referans Malzeme (CRM) olabilmesi için kullanım amacına uygun şekilde matriksin her yerinde özgün bir homojenliğe ve metodun kararlılığının kanıtlanması için olası belirsizliklerin izlenebilirliğini sağlaması gerekmektedir. 
Analitik yöntem validasyonunun amacı, bir analitik yöntemin belirlenen amaç doğrultusunda güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edebileceğinin onaylanmasıdır. Güvenilirliği bilinmeyen bir analitik sonucun hiçbir değeri yoktur. Bu çalışmada en hassas tayin yöntemlerinden biri olan LC-MS/MS ile hızlı ve ucuz bir yöntem valide edilmiş olup, adli toksikolojide olanzapinin dışlanması adına önemli fayda sağlayacağı düşünülmektedir.
Çalışmada, on noktalı kalibrasyon çözeltisi ile olanzapinin doğrusal aralığı 0,1-100 ng/mL olarak belirlendi. Bu aralıktaki korelasyon katsayısı R2= 0.9994 olarak bulundu. Elde edilen LOD ve LOQ değerleri sırasıyla 0.36 ng/mL ve 0.39 ng/mL'dir. Saç örneği üzerinde yapılan sonra spike verilerine göre geri kazanım yüzdesi 0.5 ng/mL'lik konsantrasyonda %82.43±5.46; 5 ng/mL'lik konsantrasyonda %81.80±.2.97; 50 ng/mL'lik konsantrasyonda %96.46±1.69 bulundu. Önce spike ve sonra spike verileri ile matriks etkisinin anlaşılması için 1 ng/mL konsantrasyonda olanzapin ile yapılan 9 tekrarlı deneyler sonucunda, önce spike geri kazanım sonuçlarının (%58.5) sonra spike geri kazanım sonuçlarına (%91.6) göre yaklaşık yarı yarıya azaldığı görülmektedir. Tekrarlanabilirlik için 3 ayrı konsantrasyonda çalışılan geri kazanım numunelerinden; 0.5 ng/mL konsantrasyonundaki 6 adet örneğin ortalaması 0.412±0.027 ng/mL, bağıl standart sapma değeri 6.63, 5 ng/mL konsantrasyonundaki 6 adet örneğin ortalaması 4.09±0.15 ng/mL, bağıl standart sapma değeri 3.64, 50 ng/mL konsantrasyonundaki 6 adet örneğin ortalaması 48.23±0.85 ng/mL, bağıl standart sapma değeri 1.76 olarak tespit edildi. Stabilite çalışması için 7 gün ara ile analiz edilen örneklerdeki değişim %0.0054 bulundu. Bu değer %1'in altında kaldığından geliştirilen yöntemin stabilitesi böylelikle kanıtlamış oldu: Özetle oda sıcaklığında 1 hafta boyunca bekletilen numunedeki değişim oranının epey düşük olması yöntemin sağlamlığının da bir kanıtı olarak görülebilir. 
Ülkemizde olanzapin etken maddesinin diğer biyolojik örneklerden belirlenmesine yönelik çalışmalar yapılmışsa da saç örneğinden tespitine yönelik bir çalışma olmadığından, bu çalışmanın literatüre katkısının önemli olduğu düşünülmektedir. İleriki çalışmalar ile daha düşük tayin limitlerine ulaşabilecek daha hassas yöntemlerin geliştirilmesi hedeflenmektedir.

Abstract:
Olanzapine, one of the atypical antipsychotic drugs, is often prescribed not only in adults but also in young people.  Especially sudden heart deaths, decreased seizure threshold levels in epilepsy and related deaths make the olanzapine important in forensic toxicology. In the literature, many studies are reported simultaneously in biological samples (blood, urine, saliva and BOS), which are frequently used in forensic and clinical toxicology, contemporaneously developed, alone with olanzapine or metabolite-specific or multiple psychiatric drugs.
In postmortem cases, detection of olanzapine is complex because of olanzapine is quite unstable in the blood. Apart from these cases, it is seen that the use of olanzapine for drug of abuse as well as therapeutic purposes. There are many reports of cases that appear to contribute to death of acute olanzapin toxicity. For this reason, analytical methods for the determination of olanzapin from biological samples such as hair and nails are needed.
Reference Material is pure or matrix-specific materials used in quality control studies for a active ingredient. In order a Reference Material to become a Certified Reference Material (CRM), it is necessary to ensure traceability of possible uncertainties in order to prove an original homogeneity and the stability of the method throughout the matrix in accordance with the purpose of use.
The purpose of analytical method validation is to confirm that an analytical method can achieve reliable and reproducible results for the specified purpose. An unreliable analytical result has no any value. In this study, a fast and inexpensive method was validated with LC-MS / MS, which one of the most sensitive methods of determination, and it is believed that it will provide significant benefits in the exclusion of olanzapine in forensic toxicology.
In the study, the linear range of olanzapin with ten-point calibration solution was determined as 0.1-100 ng/mL. The correlation coefficient in this range was R²= 0.9994. The LOD and LOQ values was determined as 0.36 ng/mL and 0.39 ng/mL, respectively. According to after spike data in the hair sample was determined as 82.43±5.46% at a concentration of 0.5 ng/mL; 81.80±.2.97% at a concentration of 5 ng/mL; 96.46±1.69% at a concentration of 50 ng/mL.  
In order to understand the matrix effect with before spike and after spike; 9 repeat experiments with olanzapine at a concentration of 1 ng / mL were carried out. According to these experiments, recovery results of before spike (58.5%) decreased approximately by half compared with recovery results of after spike (91.6%).
From the recovery samples studied in 3 different concentrations for reproducibility; the average of 6 samples with a concentration of 0.5 ng/mL was 0.412±0.027 ng/mL, the relative standard deviation value was 6.63, the average of 6 samples with a concentration of 5 ng/mL was 4.09±0.15 ng/mL, the relative standard deviation value was 3.64, the average of 6 samples with a concentration of 50 ng/mL was 48.23±0.85 ng/mL and the relative standard deviation value was 1.76. The change in the samples analyzed by a 7-day break was 0.0054% for stability study. Since this value remains below 1%, the stability of the method developed has thus been proven: In summary, the fact that the rate of change in the sample, which was held for 1 week at room temperature, can also be seen as proof of the robustness of the method.
Although studies have been carried out to determine the active ingredient of olanzapine from other biological samples in our country, there is no any study for the detection of olanzapin from hair sample. Therefore, the contribution of this study to the literature is considered to be important. With the further studies, it is aimed to develop more sensitive methods that can reach lower determination limits.