Toplum kaynaklı metisilin dirençli staphylococcus aureus (CA-MRSA) suşlarında kromozomal kaset tiplerinin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemleri ile araştırılması
Investigation of cassette chromosome types with polimerase chain reaction (PCR) in community-associated methicillin resistant staphylococcus aureus (CA-MRSA) strains
Yazar: SAEID BARKAR
Danışman: PROF. DR. A. MURAT AKSOY
Ankara Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
Derece: Doktora, 2009
Konu: Mikrobiyoloji = Microbiology

Özet:
S. aureus tüm dünyada toplum ve hastane kaynaklı enfeksiyonlara yol açan en önemli patojenlerden birisidir. Toksik şok sendromu, gıda zehirlenmesi, haşlanmış deri sendromu gibi toksikojenik hastalıklara; impetigo, follikülit, fronkül, karbonkül, sellülit, blefarit, mastit, cerrahi yara enfeksiyonları gibi lokal piyojenik hastalıklara ve endokardit, osteomiyelit, artrit, sepsis, pnömoni, idrar yolu enfeksiyonları, metastatik abseler ve menenjit gibi sistemik enfeksiyonlara yol açmaktadır. Nazal taşıyıcılık S. aureus enfeksiyonları için önemli bir risk faktörüdür. Önceleri bir nozokomiyal enfeksiyon etkeni olarak kabul edilen metisilin dirençli S. aureus (MRSA)'lar, 1980'lerden itibaren toplum kaynaklı enfeksiyonlardan da izole edilmeye başlamıştır. Çalışmanın amacı, konvansiyonel ve moleküler yöntemler kullanarak, çeşitli klinik örneklerden ve çeşitli yaş gruplarındaki sağlıklı taşıyıcılardan izole edilen S. aureus suşlarının direnç profillerinin ve virulans faktörlerinin belirlenmesi ve CA-MRSA suşların kromozomal kaset tiplerinin (SCCmec ve ccr gen kompleks) PCR yöntemleriyle araştırılmasıdır.Bu çalışma Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı'nda yürütülmüştür. Enfeksiyon etkeni olmayan CA-MRSA suşlarının elde edilmesi amacıyla, Ekim 2007-Mayıs 2008 tarihleri arasında, yaşları 4 ile 85 arasında değişen toplam 1040 sağlıklı bireyden burun ve koltuk altı örnekleri alınmıştır. Steril nemlendirilmiş eküvyonlar kullanılarak alınan burun ve koltuk altı örnekleri stuart taşıma besiyeri içerisine alınarak %5 koyun kanlı agar, EMB besiyeri ve antibiyotikli-SDA besiyerlerine inoküle edilerek rutin bakteriyolojik incelemeler yapılmıştır. Enfeksiyon etkeni olan 31 CA-MRSA suşu, 2004-2005 yılları arasında, İstanbul Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi'nin çeşitli polikliniklerine başvuran ve yaşları 4 ile 76 arasında değişen hastalardan alınan örneklerden (idrar, üretral akıntı, burun, püy, yara, eklem sıvısı) enfeksiyon etkeni olarak izole edilmiştir. S. aureus'u düşündüren gram pozitif koklardan katalaz, koagülaz, tüpte koagülaz testleri, mannitol salt agar ve DNaz testi yapılmıştır. Tüm S. aureus suşlarından fenol kloroform yöntemiyle DNA ekstraksiyonu yapılmış, PCR ve multipleks PCR yöntemleriyle mecA, PVL, SCCmec ve ccr gen kompleksi araştırılmıştır.1040 sağlıklı bireyde S. aureus taşıyıcılığı oranı %27,1 olarak hesaplanırken, bu oran erkeklerde (%32,1), kadınlara göre (%21,2) daha yüksek bulunmuştur (p<0,001). S. aureus burun kolonizasyonu %91,8, koltuk altı kolonizasyonu %3,9, hem burun hem de koltuk altı kolonizasyonu %4,3 olarak hesaplanmıştır. Burun taşıyıcılığı, koltuk altı taşıyıcılığına göre yüksek bulunmuştur (p<0,001). S. aureus taşıyıcılığı sağlık kurumlarında çalışanlarda %30,6, öğrencilerde %25,4 ve diğer meslek gruplarında çalışanlarda %25,5 olarak bulunmuştur.PCR ile 18, sefoksitin, oksasilin disk difüzyon, oksasilin tuz tarama agar testleriyle 12 ve ORSAB testiyle 51 MRSA suşu saptanmıştır. CA-MRSA taşıyıcılığı, erkeklerde %2,3 ve kadınlarda %1,1 olmak üzere, ortalama %1,7 olarak bulunmuştur.Enfeksiyon etkeni olmayan CA-MRSA suşlarında, en yüksek duyarlılık vankomisin (%100), trimetoprim/sulfametoksazol (%100) ve kloramfenikole (%100) karşı saptanırken, tetrasiklin ve amoksisilin/klavulanik asit duyarlılığı %16,7 olarak bulunmuştur. Enfeksiyon etkeni olan CA-MRSA suşlarında en yüksek duyarlılık vankomisin (%100) ve kloramfenikole (%96,8) karşı saptanırken, tetrasiklin ve siprofloksazin duyarlılıkları sırasıyla %38,7 ve %35,5 olarak bulunmuştur. Enfeksiyon etkeni olan ve olmayan CA-MRSA suşlarında iMLSB fenotipi sırasıyla %12,9 ve %11,1; MS fenotipi sırasıyla %6,5 ve %0; S fenotipi sırasıyla %80,6 ve %88,9 olarak bulunmuştur. Enfeksiyon etkeni olan ve olmayan CA-MRSA suşlarında cMLSB fenotipi tespit edilmemiştir.Enfeksiyon etkeni olmayan 18 ve enfeksiyon etkeni olan 31 CA-MRSA suşlarının tip tayini için SCCmec ve ccr tiplendirme yöntemleri kullanılmıştır. Kaset kromozom tip tayini sonucunda, enfeksiyon etkeni olmayan CA-MRSA suşlarında tip I %5,6 (1/18), tip II %38,9 (7/18), tip III %11,1 (2/18), tip IV %38,9 (7/18) ve tip V %5,6 (1/18) olarak bulunmuş ve tip VI bulunmamıştır; enfeksiyon etkeni olan CA-MRSA suşlarında ise tip I %9,7 (3/31), tip II %9,7 (3/31), tip III %48,4 (15/31), tip IV %22,6 (7/31) ve tip V %9,7 (3/31) olarak bulunmuş ve tip VI bulunmamıştır. Enfeksiyon etkeni olmayan 18 CA-MRSA suşunda %22,2 PVL pozitifliği saptanırken, enfeksiyon etkeni olan 31 CA-MRSA suşundan hiçbirinde PVL geni bulunmamıştır. SCCmec ve/veya ccr yöntemiyle tiplendirilen 18 MRSA suşundan PVL (+) bulunan 4 suşun hepsi de tip IV olarak tanımlanmıştır. Enfeksiyon etkeni olan ve olmayan CA-MRSA suşlarında PVL pozitifliği arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştır (p<0,014).Enfeksiyon etkeni olan CA-MRSA suşlarının kaset tiplerine, PVL varlığına ve antimikrobiyal duyarlılık profillerine baktığımızda, daha çok HA-MRSA suşlarına benzerlik gösterdikleri görülmüştür.Anahtar Sözcükler: Staphylococcus aureus, CA-MRSA, PVL, SCCmec

Abstract:
S. aureus is one of the major causes of infections in both communities and hospitals worldwide. It is associated with toxigenic diseases such as toxic shock syndrome, food poisoning, scalded skin syndrome; local pyogenic diseases such as impetigo, folliculitis, furuncles, carbuncles, cellulites, blepharitis, mastitis, surgical wound infections; and systemic infections such as endocarditis, osteomyelitis, arthritis, sepsis, pneumonia, urinary tract infections, metastatic abscesses and meningitis. Nasal carriage is an important risk factor for S. aureus infections. Formerly known to be a nosocomial pathogen, methicillin resistant S. aureus (MRSA) has begun to be isolated from community associated infections since the 1980s. The aim of this study is to determine the resistance profiles and virulance factors of S. aureus strains isolated from various clinical specimens and healthy carriers of different age groups, and to investigate the cassette chromosome types (SCCmec ve ccr gen complex) with PCR methods.This study was carried out at Ankara University Faculty of Medicine, Department of Microbiology and Clinical Microbiology. In order to obtain CA-MRSA strains, nasal and axillary specimen were taken from 1040 healthy individuals of ages from 4 to 85, between October 2007 and May 2008. Taken using sterile moistured swabs and carried in Stuart?s transpor media, nasal and axillary specimen were inoculated on to 5% sheep blood agar, EMB media and SDA (including antibiotics) for routine bacteriological examinations. 31 CA-MRSA strains as infectious agents were isolated from urine, uretral discharge, nasal, pus, wound, joint fluid samples of outpatients of ages from 4 to 76 who applied to Istanbul Haydarpaşa Numune, Teaching and Research Hospital between 2004-2005. For all S. aureus strains, DNA extraction was performed by phenol chloroform method and mecA, PVL, SCCmec genes and ccr gene complex was investigated by PCR and multiplex PCR methods.The rate of S. aureus carriers among 1040 healthy individuals was found to be 27,1%, while carriage rates in males and females were found to be 32,1% and 21,2% respectively (p<0,001). S. aureus nasal, axillary, and both nasal and axillary colonisation rates were found to be 91,8%, 3,9% and 4,3% respectively. Nasal carriage was higher than axillary carriage (p<0,001). S. aureus carriage rates were found to be 30,6% among medical workers, 25,4% among students and 25,5% among other occupational groups.18 MRSA strains were determined by PCR method, 12 by cefoxitin, oxacillin disc diffusion and oxacillin-salt screening agar tests and 51 by ORSAB tests. CA-MRSA carriage rates among males and females were found to be 2,3% and 1,1% respectively, while the avarage rate was 1,7%.Among CA-MRSA strains isolated from healthy individuals, highest sensivity were found against vancomycin (100%), trimethoprim/sulfamethoxazole (100%) and chloramphenicol; whereas sensivity against tetracycline and amoxycilline/clavulanic acid was found to be 16,7%. Among CA-MRSA strains isolated from outpatients, highest sensivity rates were found against vancomycin (100%), and chloramphenicol (96,8%), whereas tetracycline and ciprofloxacin sensivities were found to be 38,7% and 35,5% respectively. iMLSB, MS and S phenotypes of CA-MRSA strains isolated from healthy individuals /outpatients were found as 12,9% / 11,1%; 6,5% / 0% and 80,6% / 88,9% respectively. cMLSB phenotypes could not be detected in any of the CA-MRSA strains.SCCmec and ccr typing methods were used for type determination of 18 CA-MRSA strains isolated from healthy individuals and 31 strains isolated from outpatient. Casette chromozomal typing resulted as %5,6 (1/18) type I, %38,9 (7/18) type II, %11,1 (2/18) type III, %38,9 (7/18) type IV and %5,6 (1/18) type V in healthy individual CA-MRSA strains; and %9,7 (3/31) type I, %9,7 (3/31) type II, %48,4 (15/31) type III, %22,6 (7/31) type IV and %9,7 (3/31) type V in outpatients CA-MRSA strains. 22,2% of 18 healthy individuals CA-MRSA strains were found to be PVL positive, while the PVL gene was not found in any of the 31 outpatient CA-MRSA strains. All of 4 PVL positive strains out of 18 healthy individual MRSA strains which were typed by SCCmec and/or ccr methods where found to be type IV. The differentiation of PVL pozitivity between CA-MRSA strains isolated from healthy individuals and from outpatients was statistically found to be significant (p<0,014).When cassette types, PVL positivity and antimicrobial suseptibility test profiles of outpatient CA-MRSA strains were investigated, they were found to be more similar to HA-MRSA strains.Key Words: Staphylococcus aureus, CA-MRSA, PVL, SCCmec