Paroksismal Noktürnal Hemoglobinüri hastalığında potansiyel genetik mekanizmaların araştırılması
Investigation of Potential Genetic Mechanisms in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
Yazar: KUTAY BULUT
Danışman: DOÇ. DR. SUNDE YILMAZ SÜSLÜER
Ege Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı / Tıbbi Biyoloji Bilim Dalı
Derece: Yüksek Lisans, 2024
Konu: Genetik = Genetics ; Hematoloji = Hematology ; Tıbbi Biyoloji = Medical Biology

Özet:
PNH (Paroksismal Noktürnal Hemoglobinüri), ultra nadir olan bir hematolojik kök hücre hastalığıdır. PNH, klasik vakalarda intravasküler ya da ekstravasküler hemoliz ile karakterize, hemolitik bozukluğun nadir görülen bir formudur. Kompleman düzenleyicileri olan CD55 ve CD59 eksikliği nedeniyle kompleman hasarına karşı korunmasız kalan eritrositlerde membran hasarlanması sonucu intravasküler hemoliz ortaya çıkmaktadır. PNH, kırmızı kan hücrelerindeki GPI (glikofosfatidil inositol) proteininin eksikliğine bağlı olarak ortaya çıkan ve eritrositlerin hemolizi ile sonuçlanan hematolojik bir nadir hastalık türüdür. 
PNH tanısı için kullanılan laboratuvar testleri arasında, hemoliz ile ilgili laboratuvar bulgularını içeren Hemogram, Periferik Kan Yayması, Mutlak Retikülosit Sayısı, LDH, Haptoglobin ve Coombs testleri bulunmaktadır. Ayrıca, PNH tanısı için Altın Standart kabul edilen Yüksek Duyarlıklı Akım Sitometri yöntemi (FLAER) ile periferik kan örneğindeki GPI çıpa proteinlerinin eksikliği gösterilerek kandaki PNH klon sayıları analiz edilmekte ve ek olarak yapılan kemik iliği incelemesi ile hastalığın teşhisi konulmaktadır.
Birçok hastalığın ortaya çıkmasında ve hastalığın seyrinde altta yatan bazı moleküler mekanizmalar mevcuttur. Özellikle hematolojik hastalıklarda genetik belirteçler önem arz etmektedir. PNH hastalığı için de saptanabilecek gen veya genlerin ekspresyon seviyelerinin hastalıkla ilişkisi olabileceği düşünülmektedir. 
Bu nedenle literatür araştırılığında önceden yapılan çalışmalardan elde edilen veriler sonucunda hastalarda bazı genlerde ortak mutasyonlar saptanmıştır fakat bu genlerin ekspresyon seviyeleri incelenmemiştir. Bu  çalışmada PNH hastalığının daha iyi anlaşılması, altta yatan moleküler mekanizmaların ve bu gruptaki hastaların ortak genlerin ekspresyonunu bulundurup bulundurmamasına göre birbirinden ayrılması amaçlanmaktadır. Amaç doğrultusunda DNMT3A, ASXL1, TET2, EZH2, RUNX1, IDH1, PIGA, PHF6, U2AF1, ATM genlerinin ve kontrol olarak GAPDH geninin ekspresyon seviyelerinin PNH hastalığını klinikte daha rahat ayırt etmek, buna özgü tanıda biyobelirteç olarak ortaya koymak ve hedeflenen genlerin ekspresyon seviyelerinin PNH ile ilişkilisini araştırmak amaçlanmaktadır.
Gen ekspresyon düzeylerinin araştırılıp incelenebilmesi için Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction - qRT-PCR) analizi hasta gruplarından ve kontrol grubundan elde edilen mRNA örnekleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. PCR analizi gerçekleştirilirken ilgili hedef genler bir housekeeping gen olan GAPDH genine göre kıyaslanmış ve hedef genlerin ekspresyon seviyeleri analiz edilmiştir.
DNA metilasyonu ile ilişkili DNMT3A geninde 1,04 katlık bir ekspresyon artışı, ASXL1 geninde 15,30 katlık bir ekspresyon artışı, TET2 geninde 1,57 katlık bir ekspresyon artışı, IDH1 geninde 0,86 katlık bir ekpresyon azalışı, EZH2 geninde 1,87 katlık bir ekspresyon artışı, hastalıkla ilişkili olan PIGA geninde 0,15 katlık bir ekspresyon azalışı, transkripsiyon ile ilişkili RUNX1 geninde 3,58 katlık bir ekspresyon artışı, PHF6 geninde 2,38 katlık bir ekspresyon artışı, DNA tamiri ile ilişkili ATM geninde 3,43 katlık bir ekspresyon artışı, RNA splice ile ilişkili U2AF1 geninde 3,94 katlık bir ekspresyon artışı tespit edilmiştir.
Bu sonuçlara göre metilasyonla ilişkili genlerin çoğunda ekspresyon artışı gözlemlenmiş ve özellikle ASXL1 genindeki ekspresyon artışı bu genin hastalığın tanı ve tedavisinde önemli bir rol oynacağını düşündürmektedir.

Abstract:
PNH (Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria) is an ultra-rare hematologic stem cell disease. PNH is a rare form of acquired hemolytic disorder characterized by episodes of intravascular hemolysis and hemoglobinuria in classic cases. Intravascular hemolysis occurs as a result of membrane damage in erythrocytes that are vulnerable to complement damage due to deficiency of the complement regulators CD55 and CD59. PNH is a rare hematologic disorder that results in hemolysis of erythrocytes due to deficiency of GPI (glycophosphatidyl inositol) protein in red blood cells.
Laboratory tests used for the diagnosis of PNH include Hemogram, Peripheral Blood Smear, Absolute Reticulocyte Count, LDH, Haptoglobin and Coombs tests, which include laboratory findings related to hemolysis. In addition, the High Sensitivity Flow Cytometry method (FLAER), which is considered the Gold Standard for the diagnosis of PNH, analyzes the number of PNH clones in the blood by showing the deficiency of GPI anchor proteins in the peripheral blood sample and diagnoses the disease with an additional bone marrow examination.
There are some molecular mechanisms underlying the emergence and course of many diseases. Genetic markers are especially important in hematologic diseases. It is thought that the expression levels of the gene or genes that can be detected for PNH disease may be associated with the disease.
Therefore, as a result of the data obtained from previous studies in the literature, common mutations in some genes have been detected in patients, but the expression levels of these genes have not been examined. The aim of this study is to better understand the underlying molecular mechanisms of PNH disease and to differentiate patients in this group according to the expression of common genes. In line with this aim, the expression levels of DNMT3A, ASXL1, TET2, EZH2, RUNX1, IDH1, PIGA, PHF6, U2AF1, ATM genes and GAPDH gene as a control are aimed to differentiate PNH disease more easily in the clinic, to reveal it as a biomarker in specific diagnosis and to investigate the association of expression levels of targeted genes with PNH.
In order to investigate and analyze gene expression levels, Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) analysis was performed on mRNA samples obtained from the patient and control groups. During PCR analysis, the relevant target genes were compared to the GAPDH gene, a housekeeping gene, and the expression levels of the target genes were analyzed.
DNA methylation-related DNMT3A gene showed 1.04-fold overexpression, ASXL1 gene showed 15.30-fold overexpression, TET2 gene showed 1.57-fold overexpression, IDH1 gene showed 0.86-fold expression decrease and EZH2 gene showed 1.87-fold overexpression. 0.15-fold expression decrease in the disease-related PIGA gene, 3.58 overexpression in the transcription-related RUNX1 gene, 2.38 overexpression in the PHF6 gene, 3.43 overexpression in the DNA repair-related ATM gene, and 3.94 overexpression in the RNA splice-related U2AF1 gene were detected.
According to these results, overexpression was observed in most of the methylation-related genes and especially the overexpression in ASXL1 gene suggests that this gene will play an important role in the diagnosis and treatment of the disease.