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ALLEGATO 2 NORME TECNICHE GENERALITÀ Di norma la distanza tra due punti di prelievo adiacenti non dovrà superare i 2 km salvo a ridurla opportunamente nelle zone ad alta densità di balneazione. Per ogni singolo punto di campionamento i prelievi dovranno essere, durante il mese, opportunamente distanziati nel tempo. I prelievi dovranno essere effettuati ad una profondità di circa 30 cm sotto il pelo libero dell'acqua ad una distanza dalla battigia tale che il fondale abbia una profondità di 80-120 cm; in corrispondenza di scogliere a picco o di fondali rapidamente degradanti i prelievi dovranno essere effettuati in punti distanti non più di metri cinque dalla scogliera o dalla battigia; per gli oli minerali, i prelievi vanno effettuati in superficie. I prelievi dovranno essere effettuati dalle ore nove alle ore quindici. I prelievi non dovranno essere effettuati durante e nei due giorni successivi all'ultima precipitazione atmosferica di rilievo ed all'ultima burrasca. I campioni per le analisi microbiologiche dovranno essere prelevati con le comuni bottiglie sterili in uso per i campioni di acque, incartate e successivamente sterilizzate. La bottiglia dovrà essere immersa aperta e trattenuta tramite una pinza od altro idoneo sistema. I campioni dovranno essere trasportati in idoneo contenitore frigorifero e sottoposti ad esame al più presto e comunque entro le 24 ore. Per ogni prelievo dovranno essere rilevati: a) la posizione del punto di prelievo; b) data ed ora del prelievo; c) temperatura dell'aria e dell'acqua; d) vento: direzione (provenienza in funzione dei punti cardinali) e intensità (debole, medio, forte); ((e) stato del mare o del lago (calmo, leggermente mosso, mosso) )); f) corrente superficiale: direzione ed intensità. ((MODALITÀ DI TRASMISSIONE DEI DATI Per la trasmissione dei risultati delle analisi eseguite dovrà essere utilizzato esclusivamente l'allegato modello IPA.01 (allegato 3) compilato secondo le seguenti istruzioni: 1) Avvertenze generali. I dati numerici vanno riportati negli appositi spazi allineando le cifre a destra; le indicazioni numeriche con cifre decimali, ove previste, vanno riportate tenendo conto della virgola già prestampata tra le caselle. Il modello va sottoscritto dal responsabile del laboratorio chimico e dal responsabile del laboratorio micrografico e nell'apposito spazio va riportata la data di compilazione della scheda. 2) Norme di compilazione. Quadro A: Struttura che effettua le analisi: presidio o servizio multizonale/laboratorio di igiene e profilassi: denominazione della struttura come individuata nell'ambito della USL; USL di appartenenza: codice della USL desunto dalla tabella di decodifica di cui all'allegato 4. Quadro B: Estremi del punto di campionamento: Regione (o provincia autonoma) - Provincia: denominazione e relativo codice sia della regione che della provincia: entrambi desunti dalla tabella di decodifica di cui all'allegato 5; per le province autonome di Trento e Bolzano il codice va riportato nel campo «Regione»; comune: denominazione e relativo codice ISTAT; punto di prelievo: riportare il numero assegnato al punto di prelievo; data/ora di prelievo: riportare la data sotto forma di giorno/mese/anno: riportare l'ora del prelievo in ore e minuti primi; acqua di balneazione: barrare la casella cui si riferisce il punto di campionamento. Quadro C: dati ambientali del punto di prelievo: temperatura: riportare, in gradi centigradi, la temperatura dell'aria e dell'acqua; le eventuali frazioni di grado vanno arrotondate (esempio per 15,5 riportare 16; per 20,4 riportare 20); vento: indicare la direzione di provenienza utilizzando esclusivamente le iniziali dei quattro punti cardinali (N, S, E, W) o le possibili combinazioni delle stesse (esempio per nord-est riportare NE, per ovest-sud-ovest riportare WSW, ecc.); l'intensità del vento va riportata in metri al secondo (sono consentiti due decimali); stato del mare/lago: barrare la casella corrispondente allo stato del mare/lago nel momento in cui si effettua il prelievo; corrente superficiale: indicare il verso ove è diretta utilizzando le iniziali dei quattro punti cardinali o le possibili combinazioni delle stesse; l'intensità della corrente va espressa in metri al secondo (sono consentiti due decimali). Quadro D: Analisi effettuate: coliformi totali, coliformi fecali, streptococchi fecali/100 ml: riportare i valori risultanti dalle analisi; qualora si debba segnalare un valore superiore a quello riportato far precedere al valore il segno > (maggiore); salmonelle: barrare la casella corrispondente all'esito della ricerca qualora sia stata effettuata; pH: riportare il valore rilevato; sono previste due cifre intere e due cifre decimali; colorazione: barrare la casella corrispondente al colore delle acque («normale» in assenza di variazioni anomale del colore; «anormale» in tutti gli altri casi); trasparenza: il valore va espresso in metri e frazioni di metro; oli minerali: in presenza di tracce o quantità non dosabili di oli barrare la casella [N.D.]; in assenza di oli riportare il valore 0,000; in tutti gli altri casi riportare il valore risultante dalle analisi; sostanze tensioattive: in presenza di tracce o quantità non dosabili di tensioattivi barrare la casella [N.D.]; in assenza di tensioattivi riportare il valore 0,000; in tutti gli altri casi riportare il valore risultante dalle analisi. fenoli: in presenza di tracce o quantità non dosabili barrare la casella [N.D.]; in assenza di odore specifico riportare il valore 0,000; in tutti gli altri casi riportare il valore risultante dalle analisi; ossigeno disciolto: riportare il valore rilevato: sono previste tre cifre intere e due cifre decimali. Il modello IPA.01 di rilevazione dei risultati delle analisi, la tabella di decodifica delle unità sanitarie locali e la tabella di decodifica delle regioni, province autonome e province, allegate al presente decreto, sono parti integranti del decreto del Presidente della Repubblica 8 giugno 1982, n. 470, e ne costituiscono rispettivamente gli allegati 3, 4 e 5.)) TECNICHE PER LA RICERCA DEI COLIFORMI TOTALI E COLIFORMI FECALI Tecnica dei tubi multipli (M.P.N.) Si seminano 10 ml di acqua per tubo in cinque tubi di brodo lattosato concentrato 2x, ml 1 di acqua per tubo in cinque tubi di brodo lattosato a concentrazione normale e ml 0,1 per tubo in cinque tubi di brodo lattosato a concentrazione normale. Tutti i tubi in cui si sia formata, dopo 24 o 48 ore di incubazione a 37 Gradi C, una qualsiasi quantità di gas, debbono essere sottoposti alle successive prove di conferma. Per la prova di conferma dei coliformi totali le colture positive, passate su terreno lattosio-bile-verde brillante, vengono incubate a 35-37 Gradi C. Si esamina per la presenza di gas dopo 24 ± 2 e dopo 48 ± 3 ore. Vengono considerate positive le provette che hanno dato crescita con sviluppo di gas. La densità dei coliformi totali nel campione di acqua seminato si ottiene applicando la tabella 1. Per la prova di conferma dei coliformi fecali le colture positive passate su terreno lattosio-bile-verde brillante, vengono incubate a 44 Gradi C. Si esamina per la presenza di gas dopo 24+2 ore. Vengono considerate positive le provette che hanno dato crescita con sviluppo di gas. La densità dei coliformi fecali nel campione di acqua seminato si ottiene analogamente applicando la tabella I. Preparazione dei terreni di coltura A) Brodo lattosato: Composizione: estratto di carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 3 peptone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 5 lattosio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 5 acqua distillata. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ml 1000 pH (dopo sterilizzazione) . . . . . . . . . . . . . . = 6,8 - 7,0 È preferibile usare le preparazioni disidradate del commercio seguendo appropriate modalità. Il terreno viene distribuito in tubi (mm 180 x 18 circa) contenenti una provettina capovolta che funge da campanella di raccolta per il gas (tubi da fermentazione). Sterilizzazione in autoclave a 121 Gradi C per 15'. Il terreno alla concentrazione normale indicata è adatto alla semina di quantità non superiori a ml 1 per tubo. Per la semina di volumi più elevati (10 ml) occorrerà preparare il terreno in concentrazione doppia e distribuito nelle quantità di ml 10 circa in tubi da fermentazione di maggiori dimensioni (mm 180 x 22 circa). I tubi da fermentazione pronti per l'uso non debbono essere conservati in frigorifero per evitare che nel successivo riscaldamento durante l'incubazione, la liberazione dei gas disciolti a bassa temperatura provochi la formazione di una bolla nel tubicino interno con conseguenti possibilità di errore al momento della lettura. B) Brodo lattosato con bile e verde brillante. Composizione: peptone. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 10 lattosio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 10 bile disidratata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 20 verde brillante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 0,0133 acqua distillata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ml 1.000 pH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . = 7,2 È da preferirsi l'uso del terreno in polvere del commercio seguendo appropriate modalità. Sciogliere g 40 del terreno in polvere in ml 1.000 di acqua distillata e distribuire in tubi da fermentazione come indicato per il brodo lattosato. Per la sterilizzazione e la conservazione del terreno pronto per l'uso vale quanto riportato per il brodo lattosato. RICERCA DEI COLIFORMI TOTALI CON LA TECNICA DELLE MEMBRANE FILTRANTI ml 100 o quantità inferiore (*) dell'acqua da esaminare vengono filtrati attraverso membrana utilizzando le apparecchiature da filtrazione disponibili in commercio che diano sufficienti garanzie di riproducibilità dei risultati. Si fanno passare circa ml 20 di acqua distillata sterile per lavare la membrana filtrante. Con apposita pinza sterile si afferra la membrana, facendo attenzione a non capovolgerla e si depone sull'adatto terreno di coltura (M-Endo-Broth, vedi), opportunamente predisposto in piastre di Petri. Incubare in termostato a 37 Gradi C per 24 ore. Vengono considerate di coliformi totali tutte le colonie rosse con riflessi metallici che si sviluppano su M-Endo-Broth. RICERCA DEI COLIFORMI FECALI CON LA TECNICA DELLE MEMBRANE FILTRANTI ml 100 dell'acqua da esaminare vengono filtrati attraverso membrana utilizzando le apparecchiature disponibili in commercio che diano sufficienti garanzie di riproducibilità dei risultati. Si fanno passare circa ml 20 di acqua distillata sterile per lavare la membrana filtrante. Con apposita pinza sterile si afferra la membrana facendo attenzione a non capovolgerla e si depone sull'adatto terreno (MFC-Broth, vedi), opportunamente predisposto in piastre di Petri. Incubare a 44,5 Gradi C per 24 ore, in bagnomaria, avvolgendo le piastre in appositi contenitori impermeabili all'acqua. Vengono considerate di coliformi fecali tutte le colonie di colore bleu dopo incubazione in M-FC-Broth. PREPARAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA PER MEMBRANE FILTRANTI M-Endo-Broth: Composizione: estratto di lievito . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 6,0 peptone. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 20,0 lattosio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 25,0 fosfato bipotassico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 7,0 fuesina basica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 1,0 solfito sodico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 2,5 acqua distillata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ml 1.000 Sterilizzazione a 121 Gradi C per 5 minuti: pH (dopo sterilizzazione) . . . . . . . . . . . . . . . . . = 7,5 È preferibile usare le preparazioni disidratate del commercio. Il terreno deve essere preparato giornalmente. Il terreno pronto per l'uso deve essere impiegato utilizzando gli appositi dischi assorbenti predisposti sul fondo delle piastre. M-FC-Broth Composizione: peptone. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 15,0 estratto di lievito . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 3,0 cloruro di sodio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 5,0 lattosio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 12,5 sali biliari. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 1,5 bleu di anilina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 0,1 pH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . = 7,4 È preferibile usare le preparazioni disidratate del commercio. Sospendere g 3,7 del terreno base disidratato in ml 100 di acqua distillata contenente ml 1,0 di una soluzione all'1% di acido rosolico in sodio idrato 0,2 N. Riscaldare agitando fino ad ebollizione. Raffreddare. La soluzione di acido rosolico di cui sopra può essere conservata al buio, in frigorifero per due settimane. Il terreno pronto per l'uso deve essere impiegato utilizzando gli appositi dischi assorbenti predisposti sul fondo delle piastre. RICERCA DEGLI STREPTOCOCCHI FECALI Tecnica in terreno liquido. a) Prova presuntiva. Seminare l'acqua in esame in una serie di tubi di brodo glucosato all'azide sodica (vedi). Per la quantità di acqua da seminare e la sua suddivisione in una o più serie di tubi, valgono i criteri adottati per la colimetria. Incubare a 35-37 Gradi C per 24 e 48 ore. Vengono considerati positivi i tubi torbidi. b) Prova di conferma. Vengono sottoposti a questa prova tutti i tubi risultati positivi nella prova presuntiva dopo 24 o 48 ore di incubazione. Da ciascun tubo positivo fare una semina abbondante in un tubo contenente brodo all'azide sodica e al violetto di etile (vedi). Incubare a 35-37 Gradi C per 48 ore. Vengono considerati positivi i tubi che presentino sul fondo un deposito color porpora. Per il calcolo del numero più probabile (MPN) valgono i criteri adottati per la colimetria e quindi la tabella 1. c) Prova finale. È consigliabile solo in casi particolari, quando cioè sussistano dubbi sulla natura dell'inquinamento e gli "enterococchi" siano l'unico indice di inquinamento presente e soprattutto non siano accompagnati dai coliformi. Da ogni tubo positivo di brodo all'azide sodica e al violetto di etile seminare per isolamento su terreno al TTC (terreno di Slanetz). Le colonie rosse o rosa che si sviluppano su tale terreno dopo 24 ore a 35-37 Gradi C vengono seminate in un tubo di Brain Hearth infusion agar e in un tubo di Brain Heart infusione brodo; incubare a 35-37 Gradi C per 48 ore. Dalla coltura in terreno liquido fare un passaggio in un tubo dello stesso terreno, incubare a 45 Gradi C per 48 ore. Prelevare una ansata della carica batterica cresciuta sul terreno solido e fare una sospensione densa in una soluzione fisiologica; aggiungere qualche goccia di acqua ossigenata e osservare se si verifica sviluppo di gas (prova della catalasi). Gli enterococchi non possiedono catalasi come tutti gli streptococchi. TERRENI DI COLTURA 1) Brodo glucosato all'azide sodica: estratto di carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 4,5 peptone (triptone, polipeptone o altro simile) . . . . . . . g 15 glucosio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 7,5 sodio cloruro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 7,5 azide sodica (azoturo di sodio) . . . . . . . . . . . . . . g 0,2 acqua distillata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ml 1.000 Sterilizzazione a 121 Gradi C per 15': pH (dopo sterilizzazione) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,2 Per la semina di quantità di acqua superiori a ml 1, il terreno viene preparato a concentrazione maggiore, analogamente a quanto indicato a proposito della colimetria. 2) Brodo all'azide sodica e al violetto di etile: Da preferire l'impiego del terreno già preparato in forma disidratata. Composizione: peptone (triptone, tripticase o altro equivalente) . . . . . g 20 glucosio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 5 sodio cloruro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 5 fosfato bipotassico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 2,7 azide sodica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 0,4 violetto di etile . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 0,00083 acqua distillata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ml 1.000 Sterilizzazione a 121 Gradi C per 15': pH (dopo sterilizzazione) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,0 3) Terreno al TTC (M-enterococcus agar) o terreno di Slanetz: Da preferire l'impiego del terreno già preparato in forma disidratata. Composizione: peptone (triptone, tripticase o altro equivalente) . . . . . g 20 estratto di carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 5 glucosio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 2 fosfato bipotassico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 4 azide sodica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 0,4 agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 10-15 2,3,5 trifenil-tetrazolio-cloruro . . . . . . . . . . . . . g 0,1 acqua distillata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ml 1.000 Disciogliere per ebollizione e distribuire in piastre di Petri. Non sterilizzare in autoclave. TECNICA DELLE MEMBRANE FILTRANTI La quantità di acqua da filtrare varia con il grado presumibile di inquinamento del campione in esame; è consigliabile filtrare 100 ml o 10 ml. (*) Dopo avere filtrato la quantità stabilita di acqua, la membrana viene posta sulla superficie del terreno al TTC (terreno di Slanetz) precedentemente versato e lasciato solidificare in una piastra di Petri del diametro di almeno 60 mm. Incubare a 35-37 Gradi C per 48 ore. Le colonie rosa o rosse che si sviluppano in tali condizioni sono considerate di enterococco. Se si ritiene necessario le colonie possono essere sottoposte alla prova finale, già descritta a proposito della tecnica in terreno liquido. TABELLA 1 Parte di provvedimento in formato grafico (*) La quantità di acqua da filtrare varia con il presumibile livello di inquinamento del campione da esaminare fermo restando che il conteggio va riferito a 100 ml di campione. (*) La quantità di acqua da filtrare varia con il presumibile livello di inquinamento del campione da esaminare fermo restando che il conteggio va riferito a 100 ml di campione.