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ALLEGATO 2 UTILIZZO DI TECNICHE ISTOPATOLOGICHE, IMMUNOISTOCHIMICHE E MOLECOLARI PER L'EVIDENZIAZIONZE DI LESIONI E DI MICOBATTERI TUBERCOLARI SU MATERIALE FRESCO E TESSUTI FISSATI DI ANIMALI INFETTI MACELLATI O MORTI; DA EFFETTUARSI OVE RICHIESTO. A. Esame anatomo-isto-patologico. Il medico veterinario deve eseguire una accurata e meticolosa necroscopia del bovino o bufalino abbattuto dopo la reazione tubercolinica positiva. La sua attenzione deve essere volta in particolare agli organi di entrata del micobatterio e cioè polmone, intestino e fegato e soprattutto sui relativi linfonodi regionali. Su di essi devono essere eseguiti più tagli paralleli al fine di evidenziare l'eventuale presenza di tubercoli miliari o submiliari che altrimenti potrebbero sfuggire all'esaminatore. Una volta riscontrata la o le lesioni sospetta/e una parte di esse deve essere fissata in formalina tamponata al 10% per gli esami istopatologici al fine di accertare la diagnosi o, eventualmente, di eseguire una diagnosi differenziale da lesioni simili, da parte del laboratorio autorizzato. Il laboratorio dovrà eseguire sulla sezione istopatologica la ricerca dei micobatteri mediante colorazione di Ziehl-Neelsen. B. Tecniche immunoistochimiche. Mediante l'utilizzo di anticorpi policlonali e monoclonali è possibile evidenziare la presenza di antigeni di micobatteri tubercolari in sezioni di tessuto opportunamente fissate in formalina tamponata al 10% e incluse in paraffina; il prelievo va eseguito subito dopo la macellazione dell'animale, su tessuti con lesioni possibilmente non calcificate. La tecnica consiste in una colorazione immunoistochimica del tipo immunoperossidasi indiretta, in cui l'anticorpo policlonale (diretto contro antigeni comuni ai vari tipi di micobatteri) o monoclonale (diretto contro antigeni specifici dei vari micobatteri) si lega ai rispettivi antigeni presenti nel tessuto. I tessuti infetti presentano pertanto una positività finemente granulare nel citoplasma delle cellule giganti, dei macrofagi e nelle aree necrotiche. Il metodo immunoistochimico presenta numerosi vantaggi. Infatti consente innanzitutto di diagnosticare un'infezione tubercolare molto più rapidamente rispetto all'isolamento. In secondo luogo presenta una maggiore specificità e sensibilità rispetto ai metodi di colorazione istochimica quali la Ziehl-Neelsen, in quanto rileva antigeni di micobatteri, frammenti di microrganismi morti o micobatteri con pareti "difettive" (a differenza della colorazione Ziehl-Neelsen che evidenzia solo micobatteri intatti) e con un notevole vantaggio sull'isolamento, che richiede comunque microrganismi vivi. C. Tecniche di patologia molecolare. C1. Ibridazione in situ. Il metodo dell'ibridazione in situ si basa sull'osservazione che una catena singola di un frammento di DNA o RNA contenente una sequenza complementare si lega al DNA o RNA cellulare se esistono appropriate condizioni di temperatura, forza ionica e pH. Se poi il frammento di DNA o RNA viene preventivamente marcato con sostanze che segnalino l'avvenuta reazione (marcanti radioattivi oppure biotina e sistema ABC) avremo la possibilità di una localizzazione morfologica precisa. Tale tecnica effettuata su materiale fissato in formalina ed incluso in paraffina è in grado di abbinare l'elevata specificità dell'evidenziazione della presenza di DNA o RNA di micobatteri alla localizzazione nella reazione in cellule specifiche. C2. Reazione a catena della polimerasi (PCR). Questa tecnica è una metodica di amplificazione di un segmento di DNA. Essa si basa sull'osservazione che per la sintesi di una nuova catena nucleotidica, una sequenza di DNA complementare, chiamato "primer", deve legarsi agli estremi 3' e 5' terminali del segmento di DNA da amplificare (DNA stampo). In questo modo la sintesi della nuova doppia catena di DNA avverrà ad opera di una DNA-polimerasi termostabile, attraverso l'addizione di nucleotidi complementari alla catena-stampo, nella regione di DNA posta tra i due "primers". Dal momento che la nuova catena di DNA complementare è in grado di legare i "primers", in ogni ciclo replicativo la quantità di DNA sintetizzato doppia rispetto al ciclo precedente, con conseguente incremento logaritmico della sequenza di DNA da studiare. I vantaggi di questa tecnica sono rappresentati dalla purezza del DNA prodotto, dalla elevatissima specificità, dalla rapidità con cui possono essere ottenuti risultati altamente attendibili e dalla possibilità di amplificare sequenze piccolissime di DNA (fino a 1 ng). Quest'ultima caratteristica può essere utilizzata per tipizzare i diversi micobatteri patogeni e non presenti in un determinato campione sulla base di minime differenze specie-specifiche della sequenza nucleotidica del DNA. Per l'effettuazione della reazione deve essere disponibile, almeno nelle fasi iniziali dello studio, materiale fresco o congelato (-20(gradi) C/-80(gradi) C) entro un'ora dalla morte dell'animale. TECNICHE DI ISOLAMENTO E DI IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI 1. Raccolta e trasporto dei campioni. La diagnosi definitiva di tubercolosi, o di altre micobatteriosi, richiede che i micobatteri siano isolati dal materiale inviato al laboratorio per la coltura. L'efficacia diagnostica non dipende solo dai metodi usati per la coltura dei micobatteri ma anche dal modo con cui i campioni sono stati raccolti e trasportati. 1.1. Raccolta. Tessuti, linfonodi, organi: pezzi di tessuto sospetti di contenere micobatteri vengono raccolti asetticamente e messi in contenitori sterili senza conservanti o fissativi. 1.2. Trasporto. Il campione da esaminare deve arrivare il prima possibile e nelle condizioni migliori al laboratorio. Per i tessuti, qualora l'invio al laboratorio non sia immediato, sarà necessario conservare il materiale a 4 (Più o Meno) 2 (gradi) C un massimo di quattro giorni. Diversamente il campione va congelato. 2. Tecniche di colorazione. La presenza dei micobatteri nei materiali clinici può essere dimostrata con l'esame microscopico di strisci colorati utilizzando la tecnica di Ziehl-Neelsen. 3. Operazioni preliminari alla semina: metodi di decontaminazione. Il materiale clinico sospetto di contenere micobatteri, è spesso contaminato anche da altre specie microbiche. Pertanto prima di procedere alla semina, i campioni dovranno essere decontaminati con tecniche a diverso grado di lesività per micobatteri, rispettando strettamente i tempi di contatto con i rispettivi decontaminanti. Le tecniche sotto descritte possono essere impiegate in alternativa. 3.1. Idrossido di sodio 4%. - Trattare l'omogeneato con ugual volume di NaOH al 4% - Mantenere in termostato a 37 (gradi) C per 30' - Neutralizzare il sedimento con acido solforico al 10% goccia a goccia utilizzando il rosso fenolo come indicatore di pH - Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi) C o per 20' a 2.000 g - Eliminare il surnatante - Risospendere il sedimento con 2 ml di tampone fosfato pH 6,8 e inoculare i terreni di coltura con 1 ml; destinare l'altro millilitro, diluito 1/10 in tampone fosfato pH 6,8 alla inoculazione degli animali da esperimento, qualora si voglia ricorrere alla prova biologica. 3.2. Sodiododecilsolfato di sodio (Laurilsolfato di sodio) (SDS) 3,16% + NaOH 1% - Trattare l'omogenato con ugual volume di decontaminante (SDS 3,16% + NaOH 1%) - Mantenere a temperatura ambiente in agitazione per 40' - Aggiungere acido fosforico 1,43% e Porpora di bromocresolo 0,006% fino a viraggio dell'indicatore al giallo arancio - Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi ) C o per 20' a 2.000 g - Eliminare il surnatante - Risospendere il sedimento in 10 ml di soluzione fisiologica sterile - Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi) C o per 20' a 2.000 g - Risospendere il sedimento in 2 ml di tampone fosfato pH 6,8 e inoculare con 1 ml i terreni di coltura; destinare l'altro millilitro, diluito 1/10 in tampone fosfato pH 6,8 alla inoculazione degli animali da esperimento, qualora si voglia ricorrere alla prova biologica. 3.3. Esadecilpiridiniocloruro (HPC) (Cetilpiridiniocloruro CCP) 1,5% - Trattare l'omogenato con ugual volume di HPC 1,5% - Mantenere a temperatura ambiente in agitazione per 30' - Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi) C o per 20' a 2.000 g - Risospendere il sedimento in 2 ml di tampone fosfato pH 6,8 e inoculare con 1 ml i terreni di coltura; destinare l'altro millilitro, diluito 1/10 in tampone fosfato pH 6,8 alla inoculazione degli animali da esperimento, qualora si voglia ricorrere alla prova biologica. 4. Semina e terreni di isolamento. La semina viene effettuata in ragione di 0,2 ml del preparato utilizzando i seguenti terreni colturali solidi preparati a becco di clarino a diversa selettività: - 2 provette di Lowenstein-Jensen - 1 provetta di Lowenstein-Jensen senza glicerina con 0,5% di piruvato di sodio o una provetta ai Stonebrink 5. Incubazione delle colture. I terreni inoculati vanno posti in termostato a 37 (gradi) C e una delle due provette di Lowenstein-Jensen a 43 (gradi) C. È preferibile usare un'atmosfera al 5-10% di CO2. Le colture vanno esaminate in prima lettura dopo 2-5 giorni ed in seguito settimanalmente per 6-12 settimane. 6. Inoculazione di animali da esperimento. Generalmente l'inoculazione in animali viene poco usata, esistendo numerose tecniche in vitro per l'isolamento e l'identificazione più specifiche. Alla prova biologica si può ricorrere in parallelo all'esame colturale, nel caso in cui si sospetti la presenza di micobatteri in scarso numero nel campione o una forte contaminazione di questo. Può essere utilizzata anche a fini identificativi (vedi tabella). La prova biologica classica si effettua inoculando contemporaneamente 1 ml di omogenato decontaminato nel muscolo della coscia di 2 cavie, 1 ml per via intraperitonale in due conigli e 1 ml per via endovenosa in due polli adulti. PATOGENICITÀ DEI MICOBATTERI NEGLI ANIMALI DA LABORATORIO Cavia Pollo Coniglio M. bovis + - + MAI complex - + + M. tuberculosis + - - * M. avium-intracellulare complex 7. Identificazione. Per identificare i micobatteri è necessario basarsi su diversi caratteri: - l'acido resistenza - tempo, temperatura e aspetto di crescita - assenza di pigmento nei principali micobatteri di interesse veterinario - tests biochimici 7.1. Tab. 2. IDENTIFICAZIONE PRESUNTIVA _____________________________________________________________________ | | | | | Micobatteri | Crescita | Ureasi |Riduzione |Riduzione |Niacina |__________| | | | | 37 43 | | tellurito | nitriti | |gradi gradi | | | _______________|__________|_________|___________|___________|________ | | | | | M. bovis | L _ | (+ o -) | (+ o -) | _ | _ MAI complex | L _ | _ | + | _ | _ M. tuberculosis| L _ | (+ o -) | (+ o -) | + | + Micobatteri | | | | | rapida crescita| R _ | + | + | (+ o -) | (+ o -) _______________|__________|_________|___________|___________|________ L = Crescita lenta &amp;gt 7 gg R = Crescita rapida &amp;lt 7 gg Tutte le prove devono essere eseguite a partire da colture abbondanti in attiva fase di crescita e vanno sempre accompagnate da controllo positivo e negativo. 7.2. Ureasi. - Inoculare 1 o 2 ansate di coltura in 4 ml di brodo contenente urea (2%), glucosio (0,1%) e rosso fenolo (0,0012%) (colorazione rosso-arancio) e incubare a 37 (gradi) C per 3 giorni - La reazione è positiva per viraggio del colore del terreno verso il rosso porpora 7.3. Riduzione del tellurito. - Inoculare 1 o 2 ansate di coltura in 5 ml di brodo Middlebrook 7H9 e incubare a 37 (gradi) C per 7 o più giorni, fino a crescita visibile - Aggiungere 0,1 ml di una soluzione acquosa di potassio tellurito allo 0,2% e reincubare per 4 giorni - La reazione è positiva quando compare un precipitato nero 7.4. Riduzione dei nitrati. - Inoculare 1 o 2 ansate di coltura in 1 ml di substrato (Nitrato di sodio 0,01 M in tampone fosfato 1/45 M pH 7) e incubare per 2 ore per 37 (gradi) C - Aggiungere 0,1 ml di una soluzione acquosa di acido sulfanilico allo 0,8% e acido acetico al 28,5% e 0,1 ml di una soluzione acquosa di N,N-Dimetil-1-naftilammina allo 0,6% e acido acetico al 28,5% - La reazione è positiva per comparsa di colore rosso - La reazione è negativa se il colore rosso compare solo dopo aggiunta di polvere di zinco 7.5. Niacina. - Aggiungere 1 ml di acqua distillata sterile ad una coltura in Lowenstein-Jensen, lasciare per 2 ore a temperatura ambiente affinchè avvenga l'estrazione dal terreno - Trasferire 0,5 ml dell'estratto in una provetta, aggiungere un ugual volume di soluzione alcoolica di anilina al 4% e quindi aggiungere 0,5 ml di bromuro di cianogeno al 10% (da non inalare o mettere a contatto con la cute ed eliminare solo dopo alcalinizzazione con NaOH) - Un immediato sviluppo di colore giallo indica la positività della reazione Un'alternativa al metodo sopra descritto è l'utilizzo di strisce per il test Niacina reperibili in commercio.