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ALLEGATO B NORME PER LA FABBRICAZIONE E L'UTILIZZAZIONE DELLE TUBERCOLINE BOVINE ED AVIARIE 1. Le tubercolinizzazioni controllate ufficalmente devono essere effettuate mediante tubercoline PPD o tubercoline preparate sinteticamente e concentrate a caldo ('tubercoline sintetichè). Lo Stato membro che, alla data di adozione della presente direttiva, impiega, per il controllo delle tubercoline cosiddette 'sintetichè, una tubercolina standard conforme al campione internazionale della vecchia tubercolina, può, in deroga alle disposizioni dell'allegato B, punto 1 della direttiva 64/432/CEE, continuare ad utilizzare questo metodo fino all'applicazione di norme internazionali più perfezionate. 2. Gli standard di fabbricazione per il controllo delle tubercoline PPD bovine e delle tubercoline cosiddette 'sintetichè devono essere titolati in unità tubercoliniche comunitarie (UTC) mediante prove biologiche secondo le norme CEE per la tubercolina standard CEE. 3. Gli standard di fabbricazione per il controllo delle tubercoline aviarie devono essere espressi in unità internazionali e titolati per via biologica, secondo lo strandard CEE della tubercolina PPD aviaria. 4. Lo standard CEE per la tubercolina PPD bovina è fornito dal 'Centraal Diergeneeskundig Instituut', Afdeling Rotterdam, Paesi Bassi. 5. Lo standard CEE per la tubercolina 'sinteticà bovina è fornita dall''Institut Pasteur' di Parigi, Francia. 6. Lo standard CEE per la tubercolina aviaria è fornito dal 'Cen- tral Veterinary Laboratory', Weybridge, Surrey, Regno Unito. 7. Le tubercoline bovine devono essere preparate con uno dei ceppi di Mycobacterium bovis indicati qui di seguito: a) An5; b) Vallee. 8. Le tubercoline aviarie devono essere preparate con uno dei ceppi di Mycobacterium avium indicati qui di seguito: a) D4ER; b) TB56. 9. Il pH delle tubercoline deve essere compreso fra 6,5 e 7,5. 10. Per quanto concerne l'aggiunta alle tubercoline di conservanti antimicrobici o di altre sostanze, deve risultare dimostrato, a giudizio dell'istituto statale responsabile del controllo ufficiale della tubercolina, che tale aggiunta non altera l'innocuità né l'efficacia del prodotto. Le concentrazioni massime consentite per il fenolo e la glicerina sono le seguenti: a) fenolo - 0,5% M/v; b) glicerina - 10% v/v. 11. Superata con esito favorevole l'ultima prova di attività, le tubercoline, conservate a temperature comprese fra 2 C e 8 C ed al riparo dalla luce, rimangono valide per tutta la durata dei periodi sotto indicati: a) tubercoline PPD liquide: due anni; tubercoline PPD liofilizzate: otto anni; b) tubercoline 'sintetichè diluite: due anni. 12. Nei rispettivi Paesi, gli istituti statali seguenti sono incaricati del controllo ufficiale delle tubercoline: a) Germania: Paul-Ehrlich-Institut, Frankfurt/Main; b) Belgio: Institut d'hygiene et d'epidemiologie, rue J. Wytsman 14, B 1050 Bruxelles; c) Francia: Laboratoire national des medicaments veterinaires, Fougeres; d) Granducato del Lussemburgo: Istituto del paese fornitore; e) Italia: Istituto superiore di sanità, Roma; f) Paesi Bassi: Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling Rotterdam; g) Danimarca: Statens veterinaere Serumlaboratorium, Kobenhavn V; h) Irlanda: Istituto del paese fornitore; i) Regno Unito: The Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Surrey; j) Grecia: Kthniat Inshtouton Loimvdvn Kai Parasiokvn Noshmatan 1era odos75 Auhnai 301; k) Spagna: Laboratorio de Sanidad y Produccion Animal de Granada; l) Portogallo: Laboratorio Naccional de Investigacao veterinaria - Lisboa. 13. Ciascuna partita di tubercoline infialate e pronte per l'uso deve essere oggetto di un controllo ufficiale. 14. Le tubercoline devono essere controllate con metodi biologici e chimici. 15. Le tubercoline devono essere sterili. Le prove di sterilità devono essere effettuate secondo le norme della farmacopea europea. 16. Le tubercoline devono risultare esenti da proprietà tossiche od irritanti in base a una prova effettuata secondo le norme della farmacopea europea. 17. Le tubercoline devono essere sottoposte a un'analisi chimica per determinare l'esatta concentrazione della glicerina e/o del fenolo, nonché la concentrazione di altri eventuali conservanti. 18. Una prova di non sensibilizzazione alla tubercolina deve essere effettuata secondo le norme della farmacopea europea. 19. L'attività delle tubercoline deve essere valutata con i metodi biologici, applicabili alle tubercoline PPD e a quelle 'sintetichè e basati sul confronto delle tubercoline in esame con tubercoline standard. 20. Il contenuto proteico delle tubercoline PPD (tubercoloproteina) si ottiene secondo il metodo di Kjeldahl. Il fattore di conversione dell'azoto in tubercoloproteine è 6,25. 21. Lo standard CEE per la tubercolina 'sinteticà bovina ha un'attività di 65.000 unità tubercoliniche comunitarie (UTC) provvisorie per ml, e viene distribuito in fiale da 5 ml. 22. Lo standard CEE, per la tubercolina PPD bovina ha un'attività di 50.000 UTC per mg di PPD, e viene distribuito alla stato liofilizzato in fiale contenenti 1,8 mg di PPD (0,00002 mg di PPD corrispondono cioè ad 1 unità tubercolinica comunitaria di attività). 23. La tubercolina PPD aviaria della norma CEE ha un'attività di 50.000 unità internazionali (UI) per mg di derivato proteico purificato essiccato e viene distribuita allo stato liofilizzato in fiale contenenti 10 mg di PPD più 26,3 mg di sali (0,0000726 mg dello standard corrispondono cioè ad 1 unità internazionale di attività). 24. Le tubercoline che i fabbricanti presentano per il controllo agli istituti statali di cui al paragrafo 12 devono essere state oggetto di una prova biologica di attività in paragone con gli opportuni standard elencati ai paragrafi 2 e 3. 25. a) Prove di attività su cavie. La prova deve essere effettuata su cavie albine di peso fra g 400 e 600. Tali cavie devono essere in buona salute al momento dell'inoculazione della tubercolina. Per ciascuna prova vanno impiegate non meno di otto cavie. La prova deve essere effettuata a non meno di un mese di distanza dalla sensibilizzazione. aa) Per il controllo delle tubercoline bovine, le cavie devono essere sensibilizzate con uno dei metodi seguenti: 1) iniezione di Mycobacterium bovis del ceppo AN5, ucciso col calore, in coadiuvante oleoso; 2) iniezione di Mycobacterium bovis del ceppo AN5 vivo in emulsione salina fisiologica: 3) iniezione di vaccino BCG. bb) Per il controllo delle tubercoline aviarie, le cavie devono essere sensibilizzate mediante inoculazione di 2 mg, di micobatteri tubercolari del tipo aviario, uccisi col calore, sospesi in 0,5 ml di paraffina liquida sterile, ovvero mediante inoculazione di micobatteri tubercolari vivi del tipo aviario in emulsione salina fisiologica, Il ceppo da impiegare è quello del tipo aviario D4. cc) Qualunque tubercolina esaminata deve essere titolata mediante inoculazione intradermica in paragone con l'opportuna tubercolina standard, impiegando gruppi di cavie opportunamente sensibilizzate. Le cavie devono essere tosate su due fianchi. La prova deve essere effettuata confrontando le reazioni indotte da una serie di inoculazioni intracutanee di dosi da 0,2 ml al massimo di diluizioni della tubercolina standard in soluzione salina isotonica tamponata contenente lo 0,0005% di Tween 80, con una corrispondente serie di inoculazioni della tubercolina in esame. Le diluizioni devono essere preparate in serie geometrica ed essere iniettate nelle cavie secondo una distribuzione irregolare in quadrato latino (otto iniezioni, da praticarsi in quattro punti su ciascun lato). Il diametro delle aree di reazione su ciascun lato deve essere misurato e registrato dopo 24-28 ore. Per ciascun campione di tubercolina sotto prova deve essere effettuata una valutazione dell'attività relativa e dei suoi limiti di affidabilità, basata su metodi statistici, impiegando come metametri i diametri delle aree di reazione e dei logaritmi delle dosi. L'attività della tubercolina bovina in esame è accettabile se, in base alla valutazione, ogni dose destinata ai bovini risulta contenere 2.000 UTC (+/- 25%). L'attività di qualunque tubercolina in esame deve essere espressa, secondo i casi, in unità tubercoliniche comunitarie o in UI/ml. b) Controllo dell'attività sui bovini. Un controllo dell'attività delle tubercoline bovine può essere effettuato periodicamente su bovini infetti da tubercolosi per via naturale o artificiale. Dette prove di attività, da praticarsi su gruppi di bovini tubercolotici, devono essere effettuate per inoculazione intradermica della tubercolina in esame in quattro o sei punti, in paragone con l'opportuno standard; l'attività della tubercolina deve essere valutata con metodi statistici come nella prova su cavie. 26. Per l'etichettatura dei contenitori e degli imballaggi delle tubercoline devono essere rispettate le seguenti norme. L'etichetta del contenitore e quella dell'imballaggio devono indicare: - il nome del preparato: - per i preparati liquidi, il volume totale del contenitore; - il numero di unità comunitarie o di unità internazionali per ml o per mg; - il nome del fabbricante; - il numero della partita; - per i preparati liofilizzati, la natura e la quantità del liquido di ricostituzione. L'etichetta del contenitore o dell'imballaggio deve indicare: - data di scadenza; - condizioni di conservazione; - denominazione e, se possibile, proporzione di ogni sostanza aggiunta; - tipo di bacillo dal quale è stata ricavata la tubercolina. 27. Dei laboratori comunitari designati conformemente all'art. 3 verranno incaricati di controlli complementari delle tubercoline normalmente utilizzati nei vari Stati membri per assicurare che l'attività di ciascuna di queste tubercoline sia conforme a quella della corrispondente tubercolina standard comunitaria. Tali analisi devono essere effettuate su bovini tubercolotici, su cavie opportunamente sensibilizzate e mediante appropriate reazioni chimiche. 28. Sono riconosciute ufficialmente le seguenti tecniche di intradermotubercolinizzazione: a) intradermotubercolinizzazione unica: inoculazione singola di tubercolina bovina; b) intradermotubercolinizzazione comparativa: inoculazione simultanea delle due tubercoline (aviaria e bovina). 29. La dose di tubercolina inoculata non deve essere inferiore: 1) a 2.000 UTC di tubercolina bovina; 2) a 2.000 u.i. di tubercolina aviaria. Il volume di ciascuna dose non deve superare 0,2 ml. 30. La tubercolinizzazione deve essere effettuata inoculando la tubercolina, o le tubercoline, nella pelle del collo. I punti di inoculazione devono trovarsi al limite tra il terzo anteriore ed il terzo mediano del collo. Quando nello stesso animale vengono inocu- late ambedue le tubercoline il punto di iniezione della tubercolina aviaria deve trovarsi a 10 cm circa dalla cresta del collo ed il punto di inoculazione della tubercolina bovina a 12,5 cm al di sotto di una linea approssimativamente parallela a quella delle spalle, o su diversi punti del collo; negli animali giovani, sul cui collo non vi è abbastanza spazio per effettuare le due inoculazioni a distanza sufficiente sullo stesso lato, ciascuna inoculazione va praticata su uno dei due lati del collo, in punti identici, al centro del terzo mediano del collo. 31. Tecnica ed interpretazione delle reazioni di tubercolinizzazione. a) Tecnica. Tosare e pulire i punti di inoculazione. Prendere fra il pollice e l'indice una piega di pelle in ciascuna delle zone depilate, misurarne lo spessore con calibro e annotarne il risultato. Introdurre obliquamente negli strati più profondi della pelle, tenendo il taglio trasversale della punta rivolto verso l'esterno, un ago corto sterile, collegato ad una siringa graduata caricata con la tubercolina in esame. Iniettare la dose di tubercolina. L'inoculazione è avvenuta in modo corretto se la palpazione rivela un piccolo gonfiore, delle dimensioni di un pisello, in ciascun punto di inoculazione. A distanza di 22 ore dall'inoculazione, misurare nuovamente lo spessore della piega cutanea in ciascun punto di inoculazione e annotarne il risultato. b) Interpretazione delle reazioni. - L'interpretazione delle reazioni deve essere fondata su osservazioni cliniche e sulla registrazione dell'aumento, o degli aumenti, dello spessore della piega cutanea nei punti di inoculazione, 72 ore dopo l'inoculazione della tubercolina o delle tubercoline; ba) reazione negativa: si osserva solo un gonfiore circoscritto con aumento di spessore della piega cutanea non superiore a 2 mm senza segni clinici, quali edema diffuso od esteso, esudazione, necrosi, dolore o infiammazione dei dotti linfatici della regione o dei linfonodi. bb) reazione dubbia: non si osservano segni clinici del tipo di quelli menzionati al punto ba), e l'aumento dello spessore della piega cutanea è superiore a 2 mm ed inferiore a 4 mm. bc) reazione positiva: si osservano segni clinici del tipo di quelli menzionati al punto ba), si riscontra un aumento di 4 mm o più dello spessore della piega cutanea nel punto di iniezione. 32. Interpretazione delle intradermotubercolinizzazioni ufficiali: a) Intradermotubercolinizzazione singola: positiva: reazione secondo la definizione del par. 31 bc); dubbia: reazione secondo la definizione del par. 31 bb); negativa: reazione secondo la definizione del par. 31 ba). Gli animali per i quali l'intradermotubercolinizzazione singola non dà esito conclusivo devono essere sottoposti ad un'altra prova a distanza di almeno quarantadue giorni. Gli animali che non risultano negativi a questa seconda prova devono essere ritenuti positivi. Gli animali che risultano positivi all'intradermotubercolinizzazione singola possono essere sottoposti ad un'intradermotubercolinizzazione comparativa. b) Intradermotubercolinizzazione comparativa per il riconoscimento degli allevamenti ufficialmente indenni da tubercolosi e per il mantenimento di tale qualifica: positiva: reazione bovina positiva, superiore di oltre 4 mm alla reazione alla tubercolina aviaria, ovvero presenza di segni clinici; dubbia: reazione bovina positiva o dubbia, superiore da 1 a 4 mm alla reazione alla tubercolina aviaria, ed assenza di segni clinici; negativa: reazione bovina negativa, ovvero reazione bovina positiva o dubbia, ma di intensità pari o inferiore ad una reazione positiva o dubbia alla tubercolina aviaria ed assenza di segni clinici in ambedue i casi. Gli animali per i quali l'intradermotubercolinizzazione comparativa non dà esito conclusivo devono essere sottoposti ad un'altra prova a distanza di almeno quarantadue giorni. Gli animali che non risultano negativi a questa seconda prova devono essere ritenuti positivi. c) Per gli allevamenti dove siano presenti animali per i quali si ritenga che: 1) abbiano avuto una reazione dubbia ad una intradermotubercolinizzazionesingola, 2) siano risultati positivi all'intradermotubercolinizzazione singola, ma che sono in attesa di un nuovo controllo per intradermotubercolinizzazione comparativa, 3) abbiano avuto una reazione dubbia ad una intradermotubercolinizzazionecomparativa, la qualifica di allevamento ufficialmente indenne da 'tubercolosì può essere sospesa fino al momento in cui sia chiarito lo stato degli animali di cui sopra. 33. Gli animali destinati al commercio intracomunitario devono essere sottoposti a intradermotubercolinizzazione singola nei trenta giorni precedenti lo spostamento; gli animali che mostrano un aumento dello spessore della piega cutanea superiore a 2 mm o la presenza di segni clinici non possono essere ammessi allo scambio intracomunitario. Gli animali provenienti dagli allevamenti di cui al par. 32, lettera c), sono esclusi dagli scambi intracomunitari fino a quando non sarà stato chiarito lo stato sanitario degli animali ivi contemplati.