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ALLEGATO G Capitolo I ALLEVAMENTI, STATI MEMBRI O REGIONI INDENNI DA LEUCOSI BOVINA ENZOOTICA A. Allevamento indenne da leucosi bovina enzootica. 1) Un allevamento nel quale: i) nessun caso di leucosi bovina enzootica sia stato constatato, clinicamente oppure come risultato degli esami effettuati conformemente al capitolo II, né confermato nel corso degli ultimi due anni; e ii) tutti gli animali di età superiore ai ventiquattro mesi abbiano, nel corso dei precedenti dodici mesi, reagito negativamente a due esami praticati conformemente al presente allegato ad un intervallo di almeno quattro mesi; e iii) al termine degli esami di cui al sottopunto ii), si trovino unicamente gli animali nati in detto allevamento o che provengano da un allevamento indenne da leucosi bovina enzootica; e nel quale, dopo la sua qualifica, gli animali di più di ventiquattro mesi abbiano continuato a reagire negativamente ad uno degli esami praticati conformemente al capitolo II ad un intervallo di tre anni e le condizioni previste ai punti i) e iii) continuino ad essere soddisfatte. 2) Un allevamento situato in uno Stato membro o in una regione indenne da leucosi bovina enzootica. B. Stato membro o regione indenne da leucosi bovina enzootica. Uno Stato membro o una regione ai sensi dell'art. 2, lettera o), di tale Stato membro: 1) nel quale o nella quale: a) almeno il 99,8% degli allevamenti bovini siano indenni da leucosi bovina enzootica ai sensi della lettera s), oppure b) da un lato, durante gli ultimi cinque anni precedenti la data di notifica della presente direttiva o durante gli ultimi tre anni successivi a tale data, non sia stato notificato né confermato in alcun modo un caso di leucosi bovina enzootica e, dall'altro, nel corso degli ultimi due anni, i) i controlli estemporanei praticati in tutto il territorio conformemente al capitolo II, effettuati per un periodo di due anni su tutti gli animali di età superiore ai ventiquattro mesi in almeno il 10% degli allevamenti abbiano dato risultati negativi; e ii) tutti gli animali di età superiore ai ventiquattro mesi abbiano reagito negativamente almeno una volta ad uno degli esami di cui al capitolo II; 2) nel quale o nella quale, dopo aver soddisfatto le condizioni di cui al punto 1): i) ogni anno, un campione a caso con un tasso di certezza del 99% abbia dimostrato che meno dello 0,2% degli allevamenti era stato infettato, oppure almeno il 20% di bovini di età superiore ai due anni abbia reagito negativamente ad uno degli esami praticati in conformità del capitolo II, e ii) siano sempre soddisfatti i requisiti di cui al punto A 1). C. Sospensione della qualifica di indennità dopo l'insorgere della leucosi. 1. Se in un allevamento indenne da leucosi bovina enzootica un animale ha reagito positivamente ad uno degli esami di cui al punto ii) viene sospesa la qualifica di tale allevamento fino a quando non vengano adottate le seguenti misure: i) l'animale che ha reagito positivamente e, se si tratta di una vacca, l'eventuale vitello debbono abbandonare l'allevamento ed essere macellati sotto il controllo delle autorità veterinarie; ii) gli altri animali debbono essere sottoposti ad un esame sierologico individuale, che deve dare un risultato negativo, effettuato conformemente al capitolo II almeno tre mesi dopo l'eliminazione dell'animale positivo e della sua eventuale discendenza; iii) un'indagine epidemiologica deve essere svolta e gli allevamenti epidemiologicamente collegati all'allevamento infetto debbono essere sottoposti alle misure di cui al punto ii). Tuttavia, l'autorità competente può concedere una deroga all'obbligo della macellazione del vitello di una vacca infetta, qualora il vitello sia stato separato dalla madre dopo il parto. In questo caso il vitello è sottoposto ai requisiti di cui al punto 2) ii). 2) Se più di un animale di un allevamento indenne da leucosi bovina enzootica ha reagito positivamente, viene sospesa la qualifica di tale allevamento fino a quando non vengano adottate le seguenti misure: i) gli animali infetti e, se si tratta di vacche infette - salvo deroga concessa dall'autorità competente a norma del punto 1) iii), secondo comma -, i loro eventuali vitelli devono abbandonare l'allevamento ed essere macellati sotto il controllo delle autorità veterinarie; ii) gli altri animali - compresi eventualmente i vitelli degli animali infetti - di età inferiore a sei mesi debbono, previa identificazione, restare nell'azienda fino a quando non siano soddisfatte le condizioni relative agli esami di cui al punto A 1) ii); iii) l'allevamento deve restare sotto controllo ufficiale fino a quando non siano nuovamente soddisfatte le condizioni di cui ai punti A 1) ii) e iii); iv) d'evessere effettuata un'indagine epidemiologica e gli allevamenti epidemiologicamente collegati all'allevamento infetto debbono essere sottoposti alle misure di cui al punto A 1) ii). 3) Se la leucosi bovina enzootica è stata constatata e confermata su più dello 0,2% degli allevamenti della regione o dello Stato membro, viene sospesa la loro qualifica e, oltre alle misure di cui al punto 1) o 2), il 20% degli altri allevamenti della regione o dello Stato membro deve essere soggetto ad uno degli esami di cui al capitolo II, entro i termini fissati al punto A 1) ii). La qualifica viene ripristinata in caso di risultato negativo di tali esami. Capitolo II ESAMI PER LA RICERCA DELLA LEUCOSI BOVINA ENZOOTICA La ricerca della leucosi bovina enzootica è effettuata mediante un'esame di immunodiffusione come descritto nelle lettere A e B o meidante un saggio di immunoassorbimento anzimatico (ELISA) come descritto nella lettera C. L'esame di immunodiffusione è effettuato solo in esami individuali. In caso di contestazione debitamente motivata del risultato degli esami, si effettua un controllo complementare mediante un esame di immunodiffusione. A. Reazione di immunodiffusione su gel di agar. 1. L'antigene da impiegare nella prova deve contenere glicoproteine del virus della leucosi bovina. Esso va standardizzato rispetto a un siero di riferimento (siero E 1) fornito dal laboratorio sierologico veterinario statale danese di Copenaghen. 2. La responsabilità della standardizzazione degli antigeni di laboratorio rispetto al siero ufficiale CEE di riferimento (siero E 1) fornito dal laboratorio sierologico veterinario di Stato di Copenaghen è affidata ai seguenti istituti: a) Germania: Bundesforschungsanstaltfur Viruskrankheiten der Tiere - Tubingen; b) Belgio: Institut national de recherches veterinaires, Bruxelles; c) Francia: Laboratoire national des medicamentes veterinaires, Fougères; d) Granducato di Lussemburgo; e) Italia: Istituto zooprofilattico sperimentale, Perugia; f) Paesi Bassi: Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling Rotterdam; g) Danimarca: Statens Veterinare Serumlaboratorium, Kobenhavn; h) Irlanda: Veterinary Research Laboratory, Abborstown, Dublin; i) Regno Unito; 1) Gran Bretagna: The Central Veterinary Laboratory, Weybridge, England; 2) Irlanda del Nord: The Veterinary Research Laboratory, Stormont, Belfast; j) Spagna: Subdireccion general de sanidad animal. Laboratorio de sanidad i produce animal Algete (Madrid). k) Portogallo: Laboratorio Nacional de Investigacao Veterinaria, Lisboa. 3. Gli antigeni standard di laboratorio devono essere presentati almeno una volta all'anno ai laboratori di riferimento CEE elencati al paragrafo 2 per essere esaminati in rapporto al siero CEE. Indipendentemente da detta standardizzazione, l'antigene in uso può essere standardizzato secondo la tecnica descritta alla lettera B. 4. I reattivi da impiegare sono i seguenti: a) antigene: esso dovrà contenere le glicoproteine specifiche del virus della leucosi bovina enzootica standardizzato rispetto al siero ufficiale CEE; b) siero in esame; c) siero di controllo riconosciuto positivo; d) gel di agar 0,8% di agar 8,5 di NaCl tampone Tris 0,05 M a pH 7,2; versare 15 ml di questo terreno in una scatola Petri del diametro di 85 mm, in modo da ottenere uno strato dello spessore di 2,6 mm. 5. Nell'agar sul fondo della scatola ricavare sette pozzetti, esenti da umidità e distribuiti come segue: un pozzetto centrale e 6 pozzetti disposti in cerchio attorno ad esso; diametro del pozzetto centrale: 4 mm, diametro dei pozzetti periferici: 6 mm, distanza fra il pozzetto centrale e i pozzetti periferici: 3 mm. 6. Riempire il pozzetto centrale con l'antigene standard, i pozzetti periferici 1 e 4 (vedi lo schema) con un siero riconosciuto come positivo e i pozzetti 2, 3, 5 e 6 con i sieri in esame. Il riempimento va effettuato fino a scomparsa del menisco. Parte di provvedimento in formato grafico 7. Le quantità di reattivi da impiegare sono dunque le seguenti: antigene: 32 microlitri, siero di controllo: 73 microlitri, sieri in esame: 73 microlitri. 8. Incubare per 72 ore a temperatura ambiente (20-27 C), in atmosfera confinata ed umida. 9. La lettura può essere effettuata dopo 24 e 48 ore, ma non è possibile ottenere il risultato finale prima di 72 ore. a) Il siero in esame è positivo se forma una linea specifica di precipitine con l'antigine del virus della LBE e una linea completa di identità con il siero di riferimento; b) il siero in esame è negativo se non forma una linea specifica di precipitazione con l'antigene della LBE e se non provoca l'incurvamento della linea del siero di riferimento; c) la reazione è considerata non conclusiva: i) se la linea del siero di riferimento si incurva verso l'antigene della LBE senza formare con l'antigene una linea di precipitine visibile, ovvero ii) se non può essere, interpretata come negativa o positiva. Quando la reazione non è conclusiva, la prova può essere ripetuta e può essere impiegato siero concentrato. B. Metodo per la standardizzazione dell'antigene. Soluzioni e materiali necessari: 1. 40 ml di agarosio all'1,6% in tampone Tris/HC1 0,05m a pH 7,2, contenente l'8,5% di NaCl; 2. 15 ml di siero della leucosi bovina, contenente anticorpi delle sole glicoproteine del virus della leucosi bovina, diluito 1:10 in tampone Tris/HCl 0,05m a pH 7,2 contenente l'8,5% di NaCl; 3. 15 ml di siero della leucosi bovina, contenente anticorpi delle sole glicoproteine del virus della leucosi bovina, diluito 1:5 in tampone Tris/HCl 0,05m a pH 7,2 contenente l'8,5% di NaCl; 4. 4 scatole Petri in plastica, del diametro di 85 mm; 5. un punzone del diametro di 4-6 mm; 6. antigene di riferimento; 7. antigene da standardizzare; 8. bagnomaria (56 C). Modo da operare: Sciogliere l'agarosio (1,6%) nel tampone Tris/HCI, riscaldando cautamente a 100 C. Mettere in bagnomaria a 56 C per circa 1 ora. Porre in bagnomaria a 56 C anche le deluizioni di siero della leucosi bovina. Mescolare 15 ml della soluzione di agarosio a 56 C con 15 ml di siero della leucosi bovina (1:10), agitare rapidamente e versare due porzioni da 15 ml della miscela in due scatole Petri. Ripetere il procedimento con il siero della leucosi bovina diluito 1:5. Quando l'agarosio si è solidificato, praticare i pozzetti secondo il seguente schema: Parte di provvedimento in formato grafico Aggiunta di antigene I. Scatole Petri 1 e 3: pozzetto A - antigene di riferimento non diluito, pozzetto B - antigene di riferimento, diluito 1:2, pozzetto C + E - antigene di riferimento, pozzetto D - antigene da controllare, non diluito. II. Scatole Petri 2 e 4: pozzetto A - antigene in esame, non diluito, pozzetto B - antigene in esame, diluito 1:2, pozzetto C - antigene in esame, diluito 1:4, pozzetto D - antigene in esame, diluito 1:8. Istruzioni complementari 1. Per realizzare una precipitazione ottimale, l'esperimento va effettuato con due diluizioni di siero (1:5 e 1:10). 2. Se il diametro di precipitazione è troppo piccolo ad ambedue le diluizioni, il siero va ulteriormente diluito. 3. Se la precipitazione per ambedue le diluizioni è indistinta e il diametro è troppo grande, per il siero va scelta una diluizione inferiore. 4. La concentrazione finale dell'agarosio deve essere dello 0,8%; quella dei sieri deve essere rispettivamente del 5% e del 10%. 5. Riportare i diametri misurati sull'accluso sistema di assi coordinati. La diluzione di lavoro deve corrispondere alla diluzione dell'antigene sotto prova che ha lo stesso diametro dell'antigene di riferimento. Parte di provvedimento in formato grafico Diluizioni dell'antigene C. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la ricerca della leucosi bovina enzootica. 1. Per procedere al saggio ELISA occorrono le attrezzature e i reattivi qui indicati: a) micropiastre, cuvette o qualsiasi altro recipiente per la fase solida; b) l'antigene è fissato sulla fase solida con o senza l'ausilio di anticorpi leganti policlonali o monoclonali. Se la fase solida è rivestita direttamente dall'antigene, tutti i campioni in esame che presentano reazione positiva devono essere riesaminati facendo riferimento all'antigene di controllo. Nel caso dell'E.B.L. l'antigene di controllo dovrebbe essere identico all'antigene in questione, fatta eccezione per gli antigeni del virus della leucosi bovina. Se gli anticorpi leganti sono distribuiti sulla fase solida, gli anticorpi non devono reagire ad antigeni diversi da quelli del virus della leucosi bovina; c) il fluido biologico da esaminare; d) controlli positivi e controlli negativi corrispondenti; e) il coniugato; f) un substrato adatto all'enzima impiegato; g) una soluzione di arresto, se necessario; h) soluzioni per la diluizione dei campioni per la preparazione dei reattivi e per il lavaggio; i) un sistema di lettura corrispondente al substrato impiegato. 2. Standardizzazione e sensibilità della prova: a) Per la leucosi bovina enzootica la sensibilità del saggio ELISA deve essere di livello tale che il siero E4 risulti positivo quando è diluito 10 volte (campioni di siero) o 250 volte (campioni di latte) più della diluizione ottenuta da singoli campioni presi congiuntamente. Nelle prove in cui i campioni (siero e latte) sono esaminati individualmente, il siero E4 diluito nella proporzione di 1:10: (nel siero negativo) o di 1:250 (nel latte negativo) deve presentare una reazione positiva quando è esaminato in una diluizione di prova uguale a quella impiegata per le prove individuali. Gli istituti ufficiali indicati nel punto A.2 sono responsabili del controllo di qualità del metodo ELISA, in particolare per determinare, per ogni lotto di produzione, il numero di campioni da mettere in comune in funzione del titolo ottenuto per il siero E4. Il siero E4 è fornito dal laboratorio veterinario nazionale di Copenaghen. b) Per la brucellosi: 1) i campioni di latte sfuso vengono classificati negativi se danno una reazione inferiore al 50% di quella data da una diluizione 1:10.000 del secondo siero standard internazionale della brucellosi diluito in latte negativo; 2) i campioni singoli di siero vengono classificati negativi se danno una reazione inferiore al 10% di quella data da una diluizione di 1:200 del secondo siero standard internazionale della brucellosi diluito in soluzione salina o qualsiasi altra soluzione riconosciuta secondo la procedura prevista all'articolo 12 previo parere del Comitato scientifico veterinario. Gli standard ELISA della brucellosi devono essere quelli specificati nell'allegato C, punti A.1 e A.2 (da usare alle diluizioni indicate sull'etichetta). 3. Condizioni di impiego del saggio ELISA per la ricerca della leucosi bovina enzootica e della brucellosi bovina: Il metodo ELISA può esser utilizzato su un campione di latte o di siero prelevato dal latte proveniente da un'azienda in cui almeno il 30% delle vacche da latte sono in lattazione. In caso di ricorso alla facoltà precitata devono essere prese misure per assicurare una corrispondenza tra i campioi prelevati e gli animali da cui provengono il latte o i sieri esaminati. In caso di risultato positivo su uno dei campioni, sono applicabili le disposizioni previste nell'allegato A, capitolo II, punto A1 c) i) per quanto concerne la brucellosi bovina e nel presente all'allegato, capitolo I, punto A1 per quanto concerne la EBL.