Document Type: normattiva_dump
Token Count: $#tokens

ALLEGATO C (Art. 4) DETERMINAZIONE DELLA LISINOALANINA (LAL) NELLE PROTEINE DI SOIA ISOLATE RISTRUTTURATE METODO D'ANALISI 1. Principio del metodo. Separazione su resina a scambio ionico, reazione post-colonna con ninidrina e rivelazione fotometrica. 2. Apparecchiatura. 2.1. Analizzatore per amminoacidi 2.2. Bilancia analitica 2.3. Fiale in vetro per idrolisi proteica 2.4. Filtri di carta da 0,45 um 2.5. Stufa 2.6. Resina a scambio cationico 3. Reattivi. 3.1. Soluzione di HCl 6N 3.2. Tampone sodio citrato 0,2N (Na+) portato a pH 2,2 con HCl concentrato 3.3. Tampone di eluizione sodio citrato 0,35 N (Na+), portato a pH 5,3 (Più o Meno) 0,01 con HCl concentrato. 3.4. Soluzione di ninidrina Disciogliere 20 g di ninidrina in 1000 ml di soluzione al 75% di glicole etilenico monometiletere e 25% di tampone sodio acetato 4 N precedentemente sottoposta a flusso di azoto per 15 min.; aggiungere 0,4 g di SnCl2H2O e far gorgogliare di nuovo azoto per 15 min. 3.5. Idrossido di sodio 0,2 N 4. Preparazione del campione. Prelevare una quantità di campione corrispondente a 0,2-0,5 g del prodotto finemente macinato e idrolizzare in 20-50 ml di HCl 6N, a 110 ›C per 24 ore, in modo da mantenere un rapporto campione/HCl pari a 10 mg/ml. L'idrolisi viene eseguita in fiale in cui è stato fatto precedentemente il vuoto. Un'aliquota dell'idrolizzato viene portata a secco; il residuo recuperato con un volume di tampone sodio citrato 0,2 N (Na+) pH 2,2 tale da ottenere una concentrazione di campione di 20 mg/mL. La soluzione viene quindi filtrata su filtro di carta da 0,45 um. 5. Identificazione e dosaggio della lisinoalanina mediante cromatografia di scambio ionico. 5.1. Condizioni cromatografiche 5.1.1. Resina a scambio cationico per analisi di amminoacidi 5.1.2. Tampone di eluizione 0,35 N pH 5,3 5.1.3. Temperatura 52 ›C 5.1.4. Reazione post-colonna con ninidrina 5.1.5. Rivelazione fotometrica alla lunghezza d'onda di 570 nm 5.2. Procedimento 5.2.1. Preparazione della curva di taratura Cromatografare in ordine successivo 100 ul di ciascuna delle soluzioni standard di LAL e riportare su grafico l'area dei rispettivi picchi in funzione delle concentrazioni. 5.2.2. Cromatografare 100 ul della soluzione ottenuta come descritto al punto 4; misurare l'area del picco corrispondente alla LAL e calcolare la concentrazione sulla curva di taratura. ------------- N.B. - I volumi, le concentrazioni e le condizioni operative indicate possono essere modificate in relazione alla strumentazione disponibile all'analista.