Document Type: normattiva_dump
Token Count: $#tokens

ALLEGATO C BRUCELLOSI A. Siero-agglutinazione. 1. Il siero agglutinante tipo deve essere conforme al siero campione preparato dal Veterinary Laboratory Weybridge - Surrey, Inghilterra. L'ampolla deve contenere 1.000 unità internazionali (UI) agglutinanti provenienti dalla liofilizzazione di 1 ml di siero bovino. 2. La fornitura del siero tipo deve essere assicurata dal Bundesgesundheitsamt, Berlino. 3. Il tasso delle agglutine brucellari di un siero deve essere espresso in unità internazionali per ml (ad es.: siero X - 80 u.i. per ml). 4. La lettura della siero-agglutinazione lenta in tubi deve avvenire al 50% o al 75% di agglutinazione; l'antigene utilizzato dovrà essere stato titolato nelle identiche condizioni in presenza di siero tipo. 5. L'agglutinabilità dei vari antigeni nei confronti del siero tipo deve essere compresa entro i seguenti limiti: - se la lettura è fatta al 50%: tra 1/600 e 1/1000; - se la lettura è fatta al 75%: tra 1/500 e 1/750. 6. Per la preparazione dell'antigene destinato alla siero- agglutinazione in tubi (metodo lento) devono essere utilizzati i ceppi Weybridge n. 99 e USDA 1119 o qualsiasi altro ceppo di sensibilità equivalente. 7. I terreni di coltura utilizzati sia per la conservazione del ceppo nel laboratorio che per la produzione dell'antigene devono essere scelti in modo da non favorire la dissociazione batterica (S-R); si dovrà impiegare di preferenza l'agarpatata. 8. L'emulsione batterica deve essere effettuata con soluzione fisiologica (NaCI 8,5%) fenicato allo 0,5%. Non deve essere usato il formolo. 9. Si devono incaricare del controllo ufficiale degli antigeni i seguenti istituti ufficiali: a) Germania: Bundesgesundheitsamt, Berlino; b) Belgio: Institut national de recherches vètèrinaires, Bruxelles; c) Francia: Laboratoire central de recherches vètèrinaires, Alfort; d) Granducato del Lussemburgo: Istituto del paese fornitore; e) Italia: Istituto superiore di sanità, Roma; f) Paesi Bassi: Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling Rotterdam; g) Danimarca: Statens veterinaere Serumlaboratorium, Kobenhavn V; h) Irlanda: The Veterinary Research Laboratory Departement of Agricolture and Fisheries, Thorndale Beaumont Road, Dublin 9; i) Regno Unito: - Gran Bretagna: The Central Veterinary Labora- tory, Weybridge, Surrey England; - Island del Nord: The Veterinary Research Laboratory, Stormont, Belfast; j) Grecia: Kthniatrikon Institoytoy Lovvdvn Kai Parasitikvn Noshmatvn 1era odow75 Auhnai 301; k) Spagna: Laboratorio de Sanidad y Produccion Animal de Granada; l) Portogallo: Laboratorio Naccional de Investigacao veterinaria - Lisboa. 10. Gli antigeni possono essere forniti concentrati purché il coefficiente di diluizione richiesto sia indicato sull'etichetta del flacone. 11. Per effettuare una siero-agglutinazione occorre preparare almeno tre diluizioni per ogni siero. Le diluizioni del siero sospetto devono essere affermate in modo che la lettura della reazione al limite di infezione avvenga nel tubo mediano. In caso di reazione positiva in questo tubo il siero sospetto conterrà quindi almeno la quantità di 30 UI agglutinanti per millilitro. B. Reazione di fissazione del complemento. 1. Come siero standard vale lo stesso substandard del siero della brucellosi di cui al punto A 1 del presente allegato. Oltre alle unità di agglutinazione internazionali (UAI), devono essere presenti in un millilitro di questo siero della brucellosi liofilizzato 1.000 unità sensibilizzanti che fissano il complemento. Queste unità sensibilizzanti sono denominate unità sensibilizzanti CEE (USC). 2. La fornitura del siero standardizzato è assicurata dal BundesgesundheitSamt di Berlino. 3. Il tenore di anticorpi che fissano il complemento, in un siero, va espresso in unità sensibilizzanti CEE (USC) (es.: siero x = USC ml). 4. Un siero contenente in 1/ml 20 unità sensibilizzanti CEE (il che corrisponde ad un'attività del 20% dell'attività del siero di riferimento) o più, deve essere considerato positivo. 5. I sieri devono essere inattivati come segue: a) bovini: 56 - 60C per 30-50 minuti; b) suini: 60C per 30-50 minuti. 6. Per la produzione dell'antigene si devono usare i ceppi Weybridge n. 99 o USDA 1119. L'antigene è costituito da un'emulsione batterica in soluzione fisiologica allo 0,85% o in soluzione tampone veronal. 7. Per la reazione si deve usare una dose di complemento che sia maggiore della dose minima necessaria per una emolisi totale. 8. Nell'esecuzione della reazione, si devono effettuare ogni volta i seguenti controlli: a) controllo dell'effetto anticomplementare del siero; b) controllo dell'antigene; c) controllo delle emazie sensibilizzate; d) controllo del complemento; e) controllo di sensibilità della reazione con l'aiuto di un siero positivo; f) controllo della specificità della reazione con l'aiuto di un siero negativo. 9. La sorveglianza e il controllo ufficiale dei sieri standard e degli antigeni sono affidati agli organismi di cui al punto A 9 del presente allegato. 10. Gli antigeni possono essere forniti in forma concentrata, purché sull'etichetta sia indicato il coefficiente di diluizione necessario. C. Prova dell'anello (Ring Test). 1. La prova dell'anello deve essere effettuata sul contenuto di ogni bidone di latte o sul contenuto di ogni grande contenitore dell'azienda. 2. L'antigene tipo da impiegare deve provenire da uno degli istituti elencati al punto A 9, lettere da a) a j). Si raccomanda di impiegare antigeni standardizzati secondo le raccomandazioni dell'OMS/FAO. 3. L'antigene può essere colorato solo con ematossilina o tetrazolo; occorre dare la preferenza all'ematossilina. 4. Se non sono utilizzati metodi di conservazione, la reazione deve essere effettuata tra la 18a e la 24a ora successiva alla mungitura. Qualora la prova sul latte debba essere effettuata oltre 24 ore dopo il prelievo del campione, si devono adottare sistemi di conservazione. Come conservanti si possono utilizzare il formolo o il cloruro mercurico; in tal caso, la prova deve essere effettuata entro 14 giorni successivi al giorno in cui è stato prelevato il campione. In caso di utilizzazione del formolo, la concentrazione finale nel campione di latte deve essere dello 0,2%; la proporzione tra la quantità del latte e la soluzione di formolo da aggiungere deve essere almeno di 10 a 1. Al posto del formolo si può utilizzare il cloruro mercurico; anche in tal caso la concentrazione finale nel latte deve essere dello 0,2% e la proporzione tra la quantità di latte e la soluzione del cloruro mercurico da aggiungere, di 10 a 1. 5. La reazione deve essere effettuata secondo uno dei seguenti metodi: - su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol- ume di latte di 1 ml cui sono stati aggiunti 0,03 ml di uno degli antigeni standardizzati colorati; - su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol- ume di latte di 1 ml cui sono stati aggiunti 0,05 ml di uno degli antigeni standardizzati colorati; - su un volume di latte di 8 ml cui sono stati aggiunti 0,08 ml di uno degli antigeni standardizzati colorati; - su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol- ume di latte di 2 ml cui sono aggiunti 0,05 ml di uno degli antigeni standardizzati colorati. 6. La miscela di latte e di antigeni deve essere tenuta in termostato a 37 C per almeno 45 e al massimo per 60 minuti. La prova deve essere valutata entro 15 minuti dalla rimozione della soluzione dal termostato. 7. La reazione deve essere valutata secondo il seguente criterio: a) reazione negativa: latte colorato, crema decolorata; b) reazione positiva: latte e crema colorati in modo identico o latte decolorato e crema colorata. D. Prova dell'antigene di Brucella tamponato. La prova all'antigene di Brucella tamponato può essere effettuata secondo uno dei seguenti metodi: A. METODO MANUALE. 1. Come siero standard è impiegato il secondo siero internazionale standard anti-Brucella abortus, fornito dal Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Surrey, Inghilterra. 2. L'antigene è preparato senza riferimento alla concentrazione delle cellule, ma la sua sensibilità deve essere standardizzata rispetto al secondo siero internazionale standard anti-Brucella abortus, in modo tale che l'antigene dia reazione positiva con un siero diluito 1:47,5 e reazione negativa con un siero diluito 1:55. 3. L'antigene deve essere sospeso in diluente per l'antigene di Brucella tamponato a pH 3,65 (Più o Meno) 0,5, e può essere stato colorato mediante rosa Bengala. 4. Per la preparazione dell'antigene devono essere utilizzati il ceppo Weybridge n. 99 oppure l'USDA 1119 o qualunque altro ceppo di sensibilità equivalente. 5. I terreni di coltura impiegati per la conservazione del ceppo in laboratorio e per la produzione dell'antigene devono essere tali da non provocare la dissociazione batterica (S-R); sono raccomandabili il terreno agarpatata oppure i metodi di coltura continua. 6. L'antigene deve essere controllato nei confronti di 8 sieri liofilizzati riconosciuti rispettivamente positivi e negativi. 7. La sorveglianza e il controllo ufficiale dei sieri e degli antigeni standard sono effettuati dagli organismi ufficiali elencati nell'allegato C, punto A 9. 8. L'antigene deve essere fornito pronto per l'uso. 9. La prova dell'antigene di Brucella tamponato deve essere effettuata nel modo seguente: a) porre una goccia (0,03 ml) di antigene a fianco di una goccia (0,03 ml) del siero su una piastra bianca; b) mescolare con un agitatore, prima di linea retta, poi tracciando dei cerchi del diametro di 10-12 mm circa; c) agitare la piastra alternativamente per 4 minuti (circa 30 movimenti al minuto); d) effettuare la lettura della prova in buone condizioni d'illuminazione: in mancanza di agglutinazione la prova sarà considerata negativa; qualsiasi grado di agglutinazione va considerato positivo, salvo quando appare chiara un'eccessiva essiccazione intorno ai margini. B. METODO AUTOMATIZZATO. Il metodo automatizzato deve essere sensibile ed esatto almeno quanto il metodo manuale. E. Prova dell'anello di latte, effettuata su plasma sanguigno. A. PRELIEVO DEL PLASMA SANGUIGNO. Le provette con il sangue teso non coagulabile mediante aggiunta di EDTA sono centrifugate per 3 minuti a 3000 giri al minuto e poi conservate per 12-24 ore a 37 C. B. IMPOSTAZIONE DIAGNOSTICA. Si versano 0,2 di plasma stabilizzato in una provetta contenente 1 ml di latte crudo. Dopo aver agitato, si aggiunge una goccia (0,05 ml) di antigene ABR e si agita nuovamente. L'antigene è standardizzato rispetto ad un antigene standard messo a disposizione dall'istituto menzionato al punto A 9 a). Dopo aver lasciato riposare per 45 minuti ad una temperatura di 37 C, si esamina il risultato entro 15 minuti. La prova è considerata positiva se l'anello di latte ha la stessa colorazione o una colorazione più pronunciata di quella della colonna di latte. F. Agglutinazione del plasma sanguigno. Il plasma sanguigno ottenuto conformemente al metodo di cui alla sezione E, punto A, può essere utilizzato immediatamente dopo centrifugazione senza che sia necessario procedere alla stabilizzazione termica. Si mescolano 0,05 ml di plasma con 1 ml di antigene per la sieroagglutinazione al 50%, il che corrisponde ad un titolo di diluizione 1:20 nel caso della sieroagglutinazione. Si esamina il risultato dopo aver lasciato riposare per 18-24 ore alla temperatura di 37 C. La prova è considerata positiva se l'aggiudicazione è uguale o superiore al 50%. G. Prova di microagglutinazione. 1. Il diluente è preparato da una soluzione salina fisiologica 0,85% fenicata allo 0,5%. 2. L'antigene preparato nel modo descritto nei punti 6,7 e 8 dell'allegato C, punto A, e titolato nel modo descritto al punto A5 dell'allegato C. Al momento dell'uso dell'antigene si aggiunge safranina 0 alla 0,02% (diluizione finale). 3. Il siero standard è lo stesso siero di cui al punto A1 dell'allegato C. 4. La fornitura del siero standard è assicurata dal Bundesgesundheitsamt di Berlino. 5. La prova di microagglutinazione utilizza piastre fornite di pozzetti a fondo conico e della capacità di 0,250 ml. La prova viene eseguita nella maniera seguente: a) prediluizioni dei sieri: a ciascun pozzetto di una piastra contenente 0,075 ml di diluente si aggiungono 0,050 ml di ogni siero in esame. Le mescolanze vengono agitate per 30 secondi. b) Diluizioni scalari dei sieri: per ogni siero preparare almeno tre diluizioni. A tale scopo a partire dalle prediluizioni (1:2,5) si prelevano 0,025 ml di ciascun siero e si trasferiscono su una piastra contenente 0,025 ml di diluizione. In tal modo la prima diluizione viene portata dal valore di 1:5 e le successive vengono eseguite per raddoppio. c) Aggiunta dell'antigene: nei singoli pozzetti contenenti le diverse diluizioni dei sieri in esame si aggiunge antigene in volume di 0,025 ml. Previa agitazione per 30 secondi le piastre vengono chiuse con i rispettivi coperchi e poste a 37 C per 20-24 ore in atmosfera umidificata. d) Lettura dei risultati: si valuta il quadro della sedimentazione dell'antigene mediante esame del fondo del pozzetto riflesso da uno specchio concavo posto al di sotto di esso. Nel caso di prova negativa l'antigene sedimenta sotto forma di un bottone compatto, a margini netti e di colore rosso intenso. In caso di positività si forma invece un velo diffuso, di colorito rosa ed uniformemente distribuito. Le diverse percentuali di agglutinazione vengono determinate per raffronto con controlli dell'antigene indicanti 0,25, 50, 75 e 100% di agglutinazione. Il titolo di ciascun siero viene espresso in UIA/ml. Nella prova è opportuno inserire controlli costituiti da siero negativo e siero positivo diluito in modo da contenere 30 UIA/ml. H. Il saggio ELISA per la brucellosi bovina come descritto all'allegato G.