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ALLEGATO PROVE SIEROLOGICHE PER LA DIAGNOSI DELLA BRUCELLOSI BOVINA Le prove sierologiche per la diagnosi della brucellosi dei bovini sono rappresentate dalle reazioni di siero-agglutinazione rapida con antigene al rosa bengala e di fissazione del complemento, e sono utilizzate per il controllo degli allevamenti bovini secondo quanto disposto nella parte B del presente allegato. Parte A Siero-agglutinazione rapida con antigene al rosa bengala (SAR-Ag: RB). La reazione di SAR-Ag: RB deve essere applicata secondo le seguenti norme tecniche: 1) Il siero di riferimento comunitario è rappresentato da secondo siero internazionale standard anti-Brucella abortus (2nd ISaBS), fornito dal Central Veterinary Laboratory di Weybridge, Surrey, Inghilterra, contenente 1000 unità internazionali agglutinanti per millilitro. 2) Il siero nazionale standard per il controllo della reazione deve essere calibrato sul 2nd ISaBS di Weybridge, deve essere di origine bovina e fornito liofilizzato; il siero nazionale standard deve essere unico per tutte e due le reazioni sierologiche previste dal presente allegato. 3) Il siero di lavoro, di origine bovina, per il controllo giornaliero della reazione deve essere calibrato sul siero nazionale standard. 4) L'antigene al rosa bengala è unico su tutto il territorio nazionale e deve essere: - preparato con il ceppo B. abortus 99 (Waybridge), in fase S, previa clonazione; - sospeso in tampone deve avere pH 3,65 (Più o Meno) 0,05 e essere colorato mediante rosa bengala; - controllato nei confronti di otto sieri liofilizzati riconosciuti rispettivamente positivi e negativi; - standardizzato in modo da dare una agglutinazione visibile alla diluizione 1: 47,5 e non dare agglutinazione alla diluizione 1: 50 del 2nd ISaBS di Weybridge, (GB); - fornito pronto per l'uso; sull'etichetta di confezionamento deve riportare la dicitura pronto per l'uso, la data di scadenza e il numero del controllo ufficiale. 5) La reazione di SAR-Ag: RB deve essere effettuata nel modo seguente: - porre una goccia (0,03 ml) di antigene a fianco di una goccia (0,03 ml) del siero nativo in esame su di una piastra bianca; - mescolare i due reagenti con una bacchetta di vetro o plastica, prima in linea retta, poi tracciando dei cerchi del diametro di 20-30 mm, circa; - agitare manualmente la piastra con movimenti circolari oppure servendosi di un agitatore a movimenti rotatori, a velocità di circa trenta movimenti al minuto, per almeno quattro minuti; - leggere la reazione in buone condizioni di illuminazione: in mancanza di agglutinati la reazione sarà considerata negativa mentre in presenza di qualsiasi grado di agglutinazione la reazione è considerata positiva, salvo quando appare chiara un'eccessiva essiccazione ai margini della reazione. 6) La siero-agglutinazione rapida con antigene al rosa bengala può essere allestita con apparecchiature automatiche. 7) La sorveglianza ed il controllo ufficiale del siero nazionale standard e dell'antigene sono effettuati dall'Istituto superiore di sanità, su ogni serie prodotta. Fissazione del complemento (F.d. C.). La reazione di fissazione del complemento deve essere applicata secondo le seguenti norme tecniche: 1) Il siero di riferimento comunitario è il secondo siero internazionale standard anti-B. abortus (2nd ISaBS) di Weybridge, contenente 1000 unità internazionali fissanti il complemento per millilitro (UIFC/ml). 2) Il siero nazionale standard per il controllo della reazione deve essere calibrato sul 2nd ISaBS di Weybridge, ed essere quello adottato SAR-Ag: RB. 3) Il siero di lavoro, di origine bovina, per il controllo giornaliero della reazione deve essere calibrato sul siero nazionale standard. 4) Un siero in esame contiene venti o più unità internazionali fissanti il complemento per millilitro è considerato positivo. 5) L'antigene è "unico" su tutto il territorio nazionale e deve essere: - preparato con il ceppo B. abortus 99 (Weybridge), in fase S, previa clonazione; - sospeso in soluzione fisiologica salina (0,85 NaCl) e fenolato allo 0,5%; - standardizzato rispetto al secondo siero internazionale standard anti-B. abortus di Weybridge (2nd ISaBS); - fornito concentrato; sull'etichetta di confezionamento deve riportare la diluizione d'uso, la data di scadenza ed il numero di controllo ufficiale. 6) La reazione di F.d. C. deve essere effettuata secondo il seguente schema unificato: a) inattivare i sieri bovini, nativi o prediluiti, a 58 °C per trenta minuti; b) diluire per raddoppio i sieri inattivati; c) distribuire l'antigene alla diluizione d'uso; d) distribuire due unità di complemento; e) agitare e porre in incubazione a 37 °C per trenta minuti; f) aggiungere il sistema emolitico contenente due unità di emolisina ed una concentrazione del 2% di globuli rossi lavati, pari a 5,4 x 10fB0128 cellule per millilitro; g) allestire i seguenti controlli di reazione: - controllo del potere anticomplementare dei sieri; - controllo dell'antigene; - controllo del sistema emolitico; - controllo delle unità di complemento utilizzate; - controllo percentuali di emolisi per la lettura finale; - controllo del siero nazionale standard e/o del siero di lavoro positivo; - controllo del siero negativo; i) agitare e porre in incubazione a 37 °C per trenta minuti; l) verificare la qualità dei controlli; m) leggere il titolo dei sieri in esame rappresentato dalla più alta diluizione che ha determinato il 50% di emolisi o di fissazione, e trasformare il titolo in unità internazionali fissanti il complemento. 7) La reazione può essere allestita con apparecchiature automatiche purché resti sensibile ed esatta. 8) La sorveglianza ed il controllo ufficiale del siero nazionale standard e dell'antigene "unico" sono effettuati dall'Istituto superiore di sanità, su ogni serie prodotta. Parte B APPLICAZIONI PRATICHE Fissazione del complemento (F.d. C.). Dotata di ottima sensibilità e specificità, è da considerare il saggio di base e di riferimento e come tale può trovare applicazione in tutti i casi in cui, nel presente regolamento, si fa menzione ad "esame(i) sierologico(i) ufficiale(i)". In particolare, il suo impiego si impone per il riconoscimento di "allevamento indenne da brucellosi" (art. 16, comma A, lettere b) e c) e per il riaccreditamento degli allevamenti indenni sospetti di reinfezione (art. 16, comma C, punto 1, lettere a) e b). Per le bovine vaccinate con Buck 19 e di età inferiore a 18 mesi è tollerato un titolo di positività, a questa prova, fino a 30 UIFC/ml. Sieroagglutinazione rapida con antigene al rosa bengala (SAR-Ag: RB). Per la sua elevata sensibilità, può trovare impiego in ogni situazione prevista dal presente regolamento, ad esclusione dei casi specifici più sopra indicati nei quali deve preferirsi il ricorso al F.d. C. Tutti i sieri positivi alla SAR-Ag: RB devono essere saggiati con la F.d.