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Il test deve fornire dati sufficienti per poter valutare la probabilità che la sostanza attiva provochi reazioni di sensibilizzazione cutanea. Circostanze di necessità del test. Il test deve essere effettuato sempre, salvo se la sostanza è un noto sensibilizzante. Disciplinare per le prove. Il test deve essere effettuato conformemente alla direttiva 92/69/CEE, metodo B6. 5.3 TOSSICITÀ A BREVE TERMINE. Devono essere approntati studi sulla tossicità a breve termine che forniscano dati sulla quantità tollerabile di sostanza attiva senza effetti tossici nelle condizioni dello studio. Questi studi forniscono dati utili sui rischi per i manipolatori e gli utilizzatori di preparati contenenti la sostanza attiva. In particolare, gli studi di tossicità a breve termine forniscono un quadro essenziale delle eventuali azioni cumulative della sostanza attiva e sui rischi per i lavoratori che vi possono essere esposti intensivamente. Da questi studi si ottengono inoltre utili informazioni per l'approntamento di studi sulla tossicità cronica. Gli studi e i dati da fornire devono essere sufficienti per poter individuare gli effetti dell'esposizione ripetuta e, in particolare, stabilire o indicare: - il rapporto tra dose ed effetti nocivi; - la tossicità della sostanza attiva, ivi incluso, se possibile, il NOAEL; - gli organi bersaglio, se del caso; - il decorso e le caratteristiche dell'avvelenamento con dettagli completi sui mutamenti comportamentali e le eventuali constatazioni patologiche post mortem; - gli effetti tossici specifici e i mutamenti patologici prodotti; - se del caso, la persistenza e la reversibilità di certi effetti tossici osservati, dopo sospensione del dosaggio; - se del caso, le modalità dell'attività tossica; - il relativo rischio associato alle vie differenti di esposizione. 5.3.1 Studio di tossicità orale a 28 giorni. Circostanze di necessità del test. Gli studi a breve termine a 28 giorni, sebbene non obbligatori, possono essere utili come test circa l'estensione del campo d'interesse. Qualora vengano effettuati, i relativi risultati devono essere indicati poiché potrebbero essere di particolare utilità per l'individuazione di risposte adattative eventualmente mascherate negli studi di tossicità cronica. Disciplinare per le prove. Il test deve essere effettuato conformemente alla direttiva 92/69/CEE, metodo B7. 5.3.2 Studio di tossicità orale a 90 giorni. Circostanze di necessità del test. Deve sempre essere riportata la tossicità orale a breve termine (90 giorni) della sostanza attiva sul ratto e sul cane. Qualora risulti che il cane è considerevolmente più sensibile e che probabilmente tali dati sono utili nell'estrapolazione dei risultati all'uomo, occorre effettuare uno studio di tossicità a 12 mesi sul cane e riportarne i risultati. Disciplinare per le prove. Direttiva 87/302/CEE, allegato, parte B, saggio di tossicità orale sub cronica. 5.3.3 Altre vie. Circostanze di necessità dei test. Per la valutazione dell'esposizione degli operatori, possono risultare utili altri studi di tossicità dermica. Per le sostanze volatili (pressione di vapore maggiore di 10 elevata -2 Pa) occorre il parere di esperti per decidere se gli studi a breve termine debbano essere effettuati con esposizione per via orale o inalatoria. Guide per i test. - dermica, a 28 giorni: direttiva 92/68/CEE, metodo B9; - dermica, a 90 giorni: direttiva 87/302/CEE, allegato, parte B, saggio di tossicità dermica subcronica; - inalatoria, a 28 giorni: direttiva 92/68/CEE, metodo B8; - inalatoria, a 90 giorni: direttiva 87/302/CEE, allegato, parte B, saggio di tossicità subcronica inalatoria. 5.4 GENOTOSSICITÀ Scopo del test. Questi studi sono utili per: - predire il potenziale genotossico; - individuare precocemente gli agenti cancerogeni genotossici; - chiarire il meccanismo d'azione di alcuni agenti carcerogeni. Per evitare risposte artefatte del sistema in esame, non devono essere utilizzate dosi estremamente tossiche nelle prove di mutagenesi in vitro o in vivo. Questo approccio deve essere considerato come orientamento generale. È importante che venga adottato un approccio flessibile e che si decida di effettuare ulteriori test in base all'interpretazione dei risultati di ogni fase. 5.4.1 Studi in vitro. Circostanze di necessità dei test. I test di mutagenesi in vitro (prova batterica di mutazione genica, test di clastogenesi in cellule di mammiferi e test di mutazione genica in cellule di mammiferi) devono essere effettuati sempre. Disciplinare per le prove. Esempi di test accettabili: direttiva 92/69/CEE, metodo B14 - Saggio di reversione nella Salmonella Typhimurium; direttiva 92/69/CEE, metodo B10 - Saggio citogenetico "in vitro" nei mammiferi; direttiva 87/302/CEE, allegato, parte B - Cellule di mammiferi in vitro: saggio di mutazione genica. 5.4.2 Studi in vivo su cellule somatiche Circostanze di necessità dei test. Se tutti i risultati dei test in vitro sono negativi, dev'essere effettuata un'ulteriore sperimentazione prendendo in considerazione altri dati pertinenti disponibili (ivi compresi dati tossicocinetici, tossicodinamici e chimico- fisici, nonché dati su sostanze analoghe), la prova può consistere in uno studio in vivo o in vitro, effettuato utilizzando un sistema con metabolismo differente da quello/quelli utilizzati precedentemente. Se l'esito del test di citogenesi in vitro è positivo, deve essere effettuato un test in vivo utilizzando cellule somatiche (analisi della metafase nel midollo osseo di roditori o test del micronucleo in roditori). Se l'esito di almeno uno dei test di mutazione genica in vitro è positivo, occorre effettuare un test in vivo della sintesi non programmata del DNA o un test delle macchie (spot test) sul topo. Disciplinare per le prove. Test accettabili: direttiva 92/69/CEE, metodo B12 - Saggio di micronucleo; direttiva 87/302/CEE, allegato, parte B - Saggio delle macchie (spot test); direttiva 92/69/CEE, metodo B11 - Saggio citogenetico "in vivo" del midollo osseo nei mammiferi; analisi cromosomica. 5.4.3 Studi "in vivo" su gonoblasti. Circostanze di necessità dei test. Se l'esito di uno studio in vivo su cellule somatiche è positivo, può essere giustificato eseguire test in vivo per determinare gli effetti sui gonoblasti. La necessità o meno di questi test sarà valutata caso per caso, tenendo conto dei dati tossicocinetici, dell'utilizzazione e dell'esposizione prevista. Sarebbero necessari test opportuni per esaminare l'interazione con il DNA (ad esempio, il saggio dei letali dominanti) e le potenzialità di effetti ereditari con un'eventuale valutazione quantitativa. Data la loro complessità, si ammette che gli studi quantitativi siano necessari solo se fortemente motivati. 5.5 TOSSICITÀ A LUNGO TERMINE E CANCEROGENESI Scopo dei test. Gli studi a lungo termine, considerati congiuntamente ad altri dati sulla sostanza attiva, devono essere sufficienti per poter individuare gli effetti di un'esposizione ripetuta alla sostanza attiva e, in particolare, per: