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ALLEGATO 2 UTILIZZO DI TECNICHE ISTOPATOLOGICHE, IMMUNOISTOCHIMICHE E MOLECOLARI PER L'EVIDENZIAZIONZE DI LESIONI E DI MICOBATTERI TUBERCOLARI SU MATERIALE FRESCO E TESSUTI FISSATI DI ANIMALI INFETTI MACELLATI O MORTI; DA EFFETTUARSI OVE RICHIESTO. A. Esame anatomo-isto-patologico. Il medico veterinario deve eseguire una accurata e meticolosa necroscopia del bovino o bufalino abbattuto dopo la reazione tubercolinica positiva. La sua attenzione deve essere volta in particolare agli organi di entrata del micobatterio e cioè polmone, intestino e fegato e soprattutto sui relativi linfonodi regionali. Su di essi devono essere eseguiti più tagli paralleli al fine di evidenziare l'eventuale presenza di tubercoli miliari o submiliari che altrimenti potrebbero sfuggire all'esaminatore. Una volta riscontrata la o le lesioni sospetta/e una parte di esse deve essere fissata in formalina tamponata al 10% per gli esami istopatologici al fine di accertare la diagnosi o, eventualmente, di eseguire una diagnosi differenziale da lesioni simili, da parte del laboratorio autorizzato. Il laboratorio dovrà eseguire sulla sezione istopatologica la ricerca dei micobatteri mediante colorazione di Ziehl-Neelsen. B. Tecniche immunoistochimiche. Mediante l'utilizzo di anticorpi policlonali e monoclonali è possibile evidenziare la presenza di antigeni di micobatteri tubercolari in sezioni di tessuto opportunamente fissate in formalina tamponata al 10% e incluse in paraffina; il prelievo va eseguito subito dopo la macellazione dell'animale, su tessuti con lesioni possibilmente non calcificate. La tecnica consiste in una colorazione immunoistochimica del tipo immunoperossidasi indiretta, in cui l'anticorpo policlonale (diretto contro antigeni comuni ai vari tipi di micobatteri) o monoclonale (diretto contro antigeni specifici dei vari micobatteri) si lega ai rispettivi antigeni presenti nel tessuto. I tessuti infetti presentano pertanto una positività finemente granulare nel citoplasma delle cellule giganti, dei macrofagi e nelle aree necrotiche. Il metodo immunoistochimico presenta numerosi vantaggi. Infatti consente innanzitutto di diagnosticare un'infezione tubercolare molto più rapidamente rispetto all'isolamento. In secondo luogo presenta una maggiore specificità e sensibilità rispetto ai metodi di colorazione istochimica quali la Ziehl-Neelsen, in quanto rileva antigeni di micobatteri, frammenti di microrganismi morti o micobatteri con pareti "difettive" (a differenza della colorazione Ziehl-Neelsen che evidenzia solo micobatteri intatti) e con un notevole vantaggio sull'isolamento, che richiede comunque microrganismi vivi. C. Tecniche di patologia molecolare. C1. Ibridazione in situ. Il metodo dell'ibridazione in situ si basa sull'osservazione che una catena singola di un frammento di DNA o RNA contenente una sequenza complementare si lega al DNA o RNA cellulare se esistono appropriate condizioni di temperatura, forza ionica e pH. Se poi il frammento di DNA o RNA viene preventivamente marcato con sostanze che segnalino l'avvenuta reazione (marcanti radioattivi oppure biotina e sistema ABC) avremo la possibilità di una localizzazione morfologica precisa. Tale tecnica effettuata su materiale fissato in formalina ed incluso in paraffina è in grado di abbinare l'elevata specificità dell'evidenziazione della presenza di DNA o RNA di micobatteri alla localizzazione nella reazione in cellule specifiche. C2. Reazione a catena della polimerasi (PCR). Questa tecnica è una metodica di amplificazione di un segmento di DNA. Essa si basa sull'osservazione che per la sintesi di una nuova catena nucleotidica, una sequenza di DNA complementare, chiamato "primer", deve legarsi agli estremi 3' e 5' terminali del segmento di DNA da amplificare (DNA stampo). In questo modo la sintesi della nuova doppia catena di DNA avverrà ad opera di una DNA-polimerasi termostabile, attraverso l'addizione di nucleotidi complementari alla catena-stampo, nella regione di DNA posta tra i due "primers". Dal momento che la nuova catena di DNA complementare è in grado di legare i "primers", in ogni ciclo replicativo la quantità di DNA sintetizzato doppia rispetto al ciclo precedente, con conseguente incremento logaritmico della sequenza di DNA da studiare. I vantaggi di questa tecnica sono rappresentati dalla purezza del DNA prodotto, dalla elevatissima specificità, dalla rapidità con cui possono essere ottenuti risultati altamente attendibili e dalla possibilità di amplificare sequenze piccolissime di DNA (fino a 1 ng). Quest'ultima caratteristica può essere utilizzata per tipizzare i diversi micobatteri patogeni e non presenti in un determinato campione sulla base di minime differenze specie-specifiche della sequenza nucleotidica del DNA. Per l'effettuazione della reazione deve essere disponibile, almeno nelle fasi iniziali dello studio, materiale fresco o congelato (-20(gradi) C/-80(gradi) C) entro un'ora dalla morte dell'animale. TECNICHE DI ISOLAMENTO E DI IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI 1. Raccolta e trasporto dei campioni. La diagnosi definitiva di tubercolosi, o di altre micobatteriosi, richiede che i micobatteri siano isolati dal materiale inviato al laboratorio per la coltura. L'efficacia diagnostica non dipende solo dai metodi usati per la coltura dei micobatteri ma anche dal modo con cui i campioni sono stati raccolti e trasportati. 1.1. Raccolta. Tessuti, linfonodi, organi: pezzi di tessuto sospetti di contenere micobatteri vengono raccolti asetticamente e messi in contenitori sterili senza conservanti o fissativi. 1.2. Trasporto. Il campione da esaminare deve arrivare il prima possibile e nelle condizioni migliori al laboratorio. Per i tessuti, qualora l'invio al laboratorio non sia immediato, sarà necessario conservare il materiale a 4 (Più o Meno) 2 (gradi) C un massimo di quattro giorni. Diversamente il campione va congelato. 2. Tecniche di colorazione. La presenza dei micobatteri nei materiali clinici può essere dimostrata con l'esame microscopico di strisci colorati utilizzando la tecnica di Ziehl-Neelsen. 3. Operazioni preliminari alla semina: metodi di decontaminazione. Il materiale clinico sospetto di contenere micobatteri, è spesso contaminato anche da altre specie microbiche. Pertanto prima di procedere alla semina, i campioni dovranno essere decontaminati con tecniche a diverso grado di lesività per micobatteri, rispettando strettamente i tempi di contatto con i rispettivi decontaminanti. Le tecniche sotto descritte possono essere impiegate in alternativa. 3.1. Idrossido di sodio 4%.