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Le osservazioni, che devono essere effettuate con esperto discernimento scientifico, possono comprendere la numerazione del microrganismo in tutti i tessuti potenzialmente interessati (cioè che presentano lesioni) e negli organi principali (reni, cervello, fegato, polmoni, milza, vescica, sangue, ghiandole linfatiche, tratto gastrointestinale, ghiandola del timo, nonché lesioni nel punto di inoculo) di animali morti o moribondi e al momento del sacrificio intermedio e finale. I dati ottenuti dai test di tossicità acuta, patogenicità e infettività sono di particolare utilità per valutare i possibili pericoli conseguenti ad incidenti e i rischi a cui si espone il consumatore ad eventuali residui. 5.2.2.1. Tossicità orale acuta, patogenicità ed infettività Necessità della prova Devono essere documentate la tossicità orale acuta, la patogenicità e l'infettività del microrganismo. 5.2.2.2. Tossicità acuta per inalazione, patogenicità ed infettività Necessità della prova Devono essere documentate la tossicità acuta per via inalatoria (8), la patogenicità e l'infettività del microrganismo. 5.2.2.3. Dose intraperitoneale sottocutanea singola Il test intraperitoneale/sottocutaneo è considerato un saggio altamente sensibile che consente di dedurre, in particolare, l'infettività. Necessità della prova L'inoculazione intraperitoneale è richiesta in ogni caso per tutti i microrganismi. Tuttavia qualora la temperatura massima di proliferazione e di riproduzione sia inferiore a 37 o C, viene richiesto un test di tipo sottocutaneo. 5.2.3. Prova di genotossicità Necessità della prova Se il microrganismo produce esotossine (cfr. punto 2.8), queste tossine e ogni altro rilevante metabolita pre sente nel terreno di coltura devono essere sottoposti ad una prova di genotossicità. Per queste prove su tossine e metaboliti si dovrebbe utilizzare, se possibile, la sostanza chimica depurata. Se dagli studi di base non risulta la formazione di metaboliti tossici, la ricerca sul microrganismo stesso dipenderà dal giudizio degli esperti la validità e pertinenza dei dati di base. Se si tratta di un virus, si dovrà discutere il rischio di mutagenesi per inserzione nelle cellule dei mammiferi o il rischio di cancerogenesi. Scopo della prova Questi studi sono utili per: * predire il potenziale genotossico, * individuare precocemente gli agenti cancerogeni genotossici, * chiarire il meccanismo d'azione di alcuni agenti cancerogeni. È importante che venga adottato un approccio flessibile e che la scelta di ulteriori test venga effettuata in funzione dell'interpretazione dei risultati di ogni fase. Condizioni sperimentali (9) La genotossicità dei virus va studiata su isolati infettivi. 5.2.3.1. Analisi in vitro Necessità della prova Devono essere descritti i risultati dei test di mutagenesi in vitro (prova batterica di mutazione genica, test di clastogenesi in cellule di mammiferi e test di mutazione genica in cellule di mammiferi). 5.2.4. Coltura di cellule Questa operazione deve essere documentata per i microrganismi che si riproducono all'interno delle cellule, come virus, viroidi o determinati batteri e protozoi, salvo che le informazioni di cui alle sezioni 1-3 dimostrino chiaramente che il microrganismo non si riproduce negli organismi a sangue caldo. Per la coltura cellulare si useranno cellule o tessuti umani prelevati da organi diversi. La scelta può essere determinata dagli organi bersaglio previsti dopo l'infezione. In mancanza di colture di cellule o tessuti umani o di particolari organi, si possono usare colture di cellule e tessuti di altri mammiferi. Per i virus, una considerazione essenziale è la capacità d'interagire con il genoma umano. 5.2.5. Dati sulla tossicità e la patogenicità a breve termine Scopo della prova Gli studi relativi alla tossicità a breve termine mirano a fornire dati sulla quantità di microrganismo tollerabile senza effetti tossici nelle condizioni dello studio. Queste ricerche forniscono dati utili sui rischi per i manipolatori e gli utilizzatori di preparati contenenti il microrganismo. In particolare, gli studi di tossicità a breve termine forniscono un quadro essenziale delle eventuali azioni cumulative imputabili al microrganismo e sui rischi per i lavoratori che possono esservi esposti intensivamente. Da questi studi si ottengono inoltre utili informazioni per la programmazione di studi sulla tossicità cronica. Gli studi, i dati e le informazioni da fornire e da valutare devono essere sufficienti per poter individuare gli effetti conseguenti ad esposizioni ripetute al microrganismo e, in particolare, per stabilire o indicare: * il rapporto tra dose ed effetto, * la tossicità del microrganismo, incluso, se possibile, il NOAEL per le tossine, * se del caso, gli organi bersaglio, * il decorso e le caratteristiche degli effetti, con indicazioni complete sui mutamenti comportamentali ed eventuali conclusioni macropatologiche post mortem, * gli effetti tossici specifici e le modificazioni patologiche prodotte, * se del caso, la persistenza e la reversibilità di taluni effetti tossici osservati, dopo sospensione del dosaggio, * ove possibile, il modello dell'azione tossica, e * il pericolo relativo associato alle diverse vie di esposizione. Nell'ambito degli studi sulla tossicità a breve termine, si deve valutare il tasso di eliminazione del microrganismo dagli organi principali. Si dovranno includere anche ricerche sui parametri di patogenicità e d'infettività. Necessità della prova Deve essere documentata la tossicità a breve termine (minimo 28 giorni) del microrganismo. La scelta delle specie da esaminare deve essere motivata. La scelta della durata dello studio dipende dai dati su tossicità acuta e sulla velocità di eliminazione del microrganismo. Per decidere quale via di somministrazione sia da preferirsi, ci si atterrà al parere degli esperti. 5.2.5.1. Effetti sulla salute conseguenti a esposizioni ripetute per via inalatoria I dati concernenti gli effetti sulla salute conseguenti a esposizione ripetuta per via inalatoria sono ritenuti necessari, in particolare, per la valutazione dei rischi nell'ambiente di lavoro. L'esposizione ripetuta potrebbe influire sulla capacità di eliminazione (per esempio resistenza) dell'ospite (uomo). Inoltre, ai fini di una corretta valutazione del rischio, occorre valutare la tossicità a seguito di esposizione ripetuta a contaminanti, terreno di coltura, altri coformulanti e al microrganismo stesso. Si dovrà tenere conto del fatto che i coformulanti presenti nel prodotto fitosanitario possono influenzare la tossicità e l'infettività di un microrganismo. Necessità della prova Occorrono dati sull'infettività, patogenicità e tossicità a breve termine (per via respiratoria) del microrganismo, salvo se le informazioni disponibili sono sufficienti a valutare gli effetti sulla salute umana. Ciò dicasi nel caso in cui sia dimostrato che il materiale di prova non ha alcuna frazione inalabile e/o che non è prevista un'esposizione ripetuta. 5.2.6. Trattamento proposto: pronto soccorso, terapia medica Devono essere indicate le misure di pronto soccorso in caso di infezione e in caso di contaminazione oculare.