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Sospendere g 3,7 del terreno base disidratato in ml 100 di acqua distillata contenente ml 1,0 di una soluzione all'1% di acido rosolico in sodio idrato 0,2 N. Riscaldare agitando fino ad ebollizione. Raffreddare. La soluzione di acido rosolico di cui sopra può essere conservata al buio, in frigorifero per due settimane. Il terreno pronto per l'uso deve essere impiegato utilizzando gli appositi dischi assorbenti predisposti sul fondo delle piastre. RICERCA DEGLI STREPTOCOCCHI FECALI Tecnica in terreno liquido. a) Prova presuntiva. Seminare l'acqua in esame in una serie di tubi di brodo glucosato all'azide sodica (vedi). Per la quantità di acqua da seminare e la sua suddivisione in una o più serie di tubi, valgono i criteri adottati per la colimetria. Incubare a 35-37 Gradi C per 24 e 48 ore. Vengono considerati positivi i tubi torbidi. b) Prova di conferma. Vengono sottoposti a questa prova tutti i tubi risultati positivi nella prova presuntiva dopo 24 o 48 ore di incubazione. Da ciascun tubo positivo fare una semina abbondante in un tubo contenente brodo all'azide sodica e al violetto di etile (vedi). Incubare a 35-37 Gradi C per 48 ore. Vengono considerati positivi i tubi che presentino sul fondo un deposito color porpora. Per il calcolo del numero più probabile (MPN) valgono i criteri adottati per la colimetria e quindi la tabella 1. c) Prova finale. È consigliabile solo in casi particolari, quando cioè sussistano dubbi sulla natura dell'inquinamento e gli "enterococchi" siano l'unico indice di inquinamento presente e soprattutto non siano accompagnati dai coliformi. Da ogni tubo positivo di brodo all'azide sodica e al violetto di etile seminare per isolamento su terreno al TTC (terreno di Slanetz). Le colonie rosse o rosa che si sviluppano su tale terreno dopo 24 ore a 35-37 Gradi C vengono seminate in un tubo di Brain Hearth infusion agar e in un tubo di Brain Heart infusione brodo; incubare a 35-37 Gradi C per 48 ore. Dalla coltura in terreno liquido fare un passaggio in un tubo dello stesso terreno, incubare a 45 Gradi C per 48 ore. Prelevare una ansata della carica batterica cresciuta sul terreno solido e fare una sospensione densa in una soluzione fisiologica; aggiungere qualche goccia di acqua ossigenata e osservare se si verifica sviluppo di gas (prova della catalasi). Gli enterococchi non possiedono catalasi come tutti gli streptococchi. TERRENI DI COLTURA 1) Brodo glucosato all'azide sodica: estratto di carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 4,5 peptone (triptone, polipeptone o altro simile) . . . . . . . g 15 glucosio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 7,5 sodio cloruro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 7,5 azide sodica (azoturo di sodio) . . . . . . . . . . . . . . g 0,2 acqua distillata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ml 1.000 Sterilizzazione a 121 Gradi C per 15': pH (dopo sterilizzazione) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,2 Per la semina di quantità di acqua superiori a ml 1, il terreno viene preparato a concentrazione maggiore, analogamente a quanto indicato a proposito della colimetria. 2) Brodo all'azide sodica e al violetto di etile: Da preferire l'impiego del terreno già preparato in forma disidratata. Composizione: peptone (triptone, tripticase o altro equivalente) . . . . . g 20 glucosio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 5 sodio cloruro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 5 fosfato bipotassico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 2,7 azide sodica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 0,4 violetto di etile . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 0,00083 acqua distillata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ml 1.000 Sterilizzazione a 121 Gradi C per 15': pH (dopo sterilizzazione) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,0 3) Terreno al TTC (M-enterococcus agar) o terreno di Slanetz: Da preferire l'impiego del terreno già preparato in forma disidratata. Composizione: peptone (triptone, tripticase o altro equivalente) . . . . . g 20 estratto di carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 5 glucosio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 2 fosfato bipotassico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 4 azide sodica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 0,4 agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 10-15 2,3,5 trifenil-tetrazolio-cloruro . . . . . . . . . . . . . g 0,1 acqua distillata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ml 1.000 Disciogliere per ebollizione e distribuire in piastre di Petri. Non sterilizzare in autoclave. TECNICA DELLE MEMBRANE FILTRANTI La quantità di acqua da filtrare varia con il grado presumibile di inquinamento del campione in esame; è consigliabile filtrare 100 ml o 10 ml. (*) Dopo avere filtrato la quantità stabilita di acqua, la membrana viene posta sulla superficie del terreno al TTC (terreno di Slanetz) precedentemente versato e lasciato solidificare in una piastra di Petri del diametro di almeno 60 mm. Incubare a 35-37 Gradi C per 48 ore. Le colonie rosa o rosse che si sviluppano in tali condizioni sono considerate di enterococco. Se si ritiene necessario le colonie possono essere sottoposte alla prova finale, già descritta a proposito della tecnica in terreno liquido. TABELLA 1 Parte di provvedimento in formato grafico (*) La quantità di acqua da filtrare varia con il presumibile livello di inquinamento del campione da esaminare fermo restando che il conteggio va riferito a 100 ml di campione. (*) La quantità di acqua da filtrare varia con il presumibile livello di inquinamento del campione da esaminare fermo restando che il conteggio va riferito a 100 ml di campione.