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ALLEGATO E ((Capitolo I METODI DI RICERCA DELLE TRICHINE I. Esame trichinoscopico A) Attrezzatura. Trichinoscopioalampada incandescente con possiblità d'ingrandimento a 50 e 80-100 volte. Vetri compressori composti da due lastre di vetro che possono essere compresse l'una sull'altra, una delle quali è divisa in zone uguali; forbici curve, pinzetta, un coltello per tagliare i campioni, piccoli contenitori numerati per il deposito dei campioni, un contagocce, un bicchierino contenente acido acetico e uno contenente potassa caustica per chiarificare eventuali calcificazioni o ammollire la carne disseccata. B) Prelievo dei campioni. Quando la carcassa è intera, si prelevi un campione della dimensione minima di una nocciola da entrambi i pilastri del diaframma nella zona di transizione tra la parte muscolare e quella tendinea. Quando vi è un solo pilastro di diaframma, si deve prelevare un campione di dimensione doppia. Qualora manchino i due pilastri di diaframma, devono essere prelevati due campioni aventi circa la dimensione di un nocciola nella parte del diaframma vicino alle coste o allo sterno o dai muscoli linguali o dal massetere oppure dai muscoli addominali. Per le carni in pezzi: da ciascun pezzo tre campioni di muscoli scheletrici, contenenti poco grasso, se possibile della dimensione di una nocciola, e prelevati a dei punti diversi, per quanto possibile presso alle ossa o ai tendini. C) Procedura. Da ciascuno dei campioni di cui sopra, l'analista deve tagliare, nel caso di carcasse in cui esistono i due pilastri di diaframma, 7, quindi complessivamente 14, e se esiste un solo pilastro di diaframma, 14 pezzettini della dimensione di un chicco d'avena da diverse parti, possibilmente nella zona intermedia tra muscolo e tendine e comprimerli tra le lastre del vetro compressore in modo che si possano leggere chiaramente, attraverso i preparati, i consueti caratteri di stampa. Se la carne dei pezzi da esaminare è secca e vecchia, i preparati devono essere immersi, prima della compressione, per 10-20 minuti in una lisciva di potassa caustica diluita con il volume doppio di acqua. Se per il prelievo dei campioni, devono essere utilizzati nelle carcasse la parte del diaframma vicino alle coste o allo sterno, i muscoli linguali o il massetere oppure i muscoli addominali, da ciascun campione si devono tagliare 14, e cioè complessivamente 28 pezzettini aventi la dimensione di un chicco d'avena. Da ciascuno dei campioni prelevati dalle carni in pezzi, il controllore delle trichine deve sezionare 4 pezzettini della dimensione di un chicco d'avena, cioè complessivamente 12 pezzettini. L'esame trichinoscopico deve svolgersi in modo che ciascun preparato si possa esaminare lentamente e accuratamente. Se, nel corso dell'analisi al trichinoscopio, si rilevano posti sospetti la cui natura non può essere accertata, pure con il massimo ingrandimento del trichinoscopio, bisogna procedere ad un esame al microscopio. L'esame al microscopio deve essere effettuato in modo che ciascun preparato possa essere esaminato lentamente e accuratamente con un ingrandimento di 30-40 volte. In caso di dubbio, l'esame va proseguito con altri campioni e preparati, se necessario, con ingrandimenti più forti, finchè si ottiene lo schiarimento. Per l'esame trichinoscopico occorrono almeno tre minuti. Nell'utilizzazione dei campioni sostitutivi prelevati dalla parte del diaframma vicina alle coste o allo sterno, dai muscoli linguali o da massetere oppure dai muscoli addominali, l'esame trichinoscopico deve durare almeno sei minuti. Il tempo minimo fissato per l'esame non comprende il tempo necessario per il prelievo dei campioni e l'approntamento dei preparati. L'analista non potrà esaminare al trichinoscopio generalmente più di 840 pezzettini al giorno, eccezionalmente può arrivare a 1050. II. Metodo della digestione artificiale A) Attrezzatura e materiale. 1) Coltello per il prelievo dei campioni. 2) Piccoli recipienti chiudibili numerati per la conservazione dei campioni, se del caso sino alla ripetizione dell'esame. 3) Stufa. 4) Imbuto di vetro da 2-3 litri con sostegno e tubo di gomma di raccordo, pinze per staccare il tubo di raccordo. 5) Setaccio di plastica (diametro circa 18 cm, ampiezza delle maglie circa 1 mm). 6) Garza. 7) Tubo a punta saldata. 8) Vaschetta. 9) Tritacarne. 10) Stereomicroscopio (da 15 a 40 ingrandimenti) con adeguata illuminazione. 11) Il liquido di digestione ha la seguente composizione: 10 g di pepsina (80 u/g FIP: Federation internationale de pharmacie), 5 ml di HCL (almeno 37%), riempire con acqua corrente a 1 l. B) Prelievo dei campioni. 1) Per le carcasse intere, prelevare un campione di almeno 20 g da un pilastro di diaframma nella zona di transizione tra la parte muscolare e la parte tendinea; qualora non esistano pilastri di diaframma prelevare un campione della stessa dimensione dalla parte di diaframma vicina alle coste o allo sterno o dalla lingua o dal massetere oppure dai muscoli addominali. 2) Per le carni in pezzi: prelevare un campione d'almeno 20 g dai muscoli scheletrici, contenente poco grasso e per quanto possibile vicino alle ossa o ai tendini. C) Metodo. Per l'esame di un campione collettivo prelevato da dieci suini, da ciascun singolo campione (20 g) viene preso un campione di 10 g. I rimanenti 10 g sono conservati per un eventuale esame isolato. Dieci campioni di 10 g ciascuno vengono riuniti per un esame collettivo, tritati in un tritacarne (diametro dei fori del disco pari a 2 mm) e messi, senza premere, nel setaccio munito di una garza. Il setaccio è sospeso in un imbuto collegato con un tubo di gomma a punta saldata; l'imbuto è riempito con il liquido di digestione fino alla copertura completa del materiale di analisi. Il rapporto materiale di esame/liquido di digestione deve essere di circa 1: 20 1: 30. Dopo un'incubazione di 18-20 ore alla temperatura di 37-39 ›C, il tubo aguzzo viene staccato. Eliminare con cura il liquido a galla che si trova nel tubo e raccogliere in una capsula il sedimento che è accuratamente risciacquato. Individuare le trichine con uno stereomicroscopio con ingrandimento di 20-40 volte. In caso di esito positivo o incerto dell'esame di un campione collettivo, si devono analizzare uno alla volta i corrispondenti singoli campioni rimasti, con l'aggiunta di altri 20 g prelevati su ciascun suino, o, nel caso in cui si tratta di carni in pezzi, con l'aggiunta di altri 20 g prevalenti su ciascuno dei pezzi, conformemente al capoverso B) sopracitato. III. Metodo della digestione artificiale su un insieme di prelievi A) Attrezzatura e reattivi.