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ALLEGATO 1 PROVE SIEROLOGICHE PER LA DIAGNOSI DELLA BRUCELLOSI OVI-CAPRINA Le prove sierologiche per la diagnosi della brucellosi degli ovini e caprini sono rappresentate dalle reazioni di siero-agglutinazione rapida con antigene al rosa bengala e di fissazione del complemento. La siero-agglutinazione rapida con antigene al rosa bengala può essere utilizzata come prova per il controllo degli allevamenti ovini o caprini ai fini del rilascio della qualifica di allevamenti ufficialmente indenni o indenni da brucellosi. Allorchè nel corso di tale ricerca mediante la prova con antigene al rosa bengala più del 5% degli animali dell'azienda dà esito positivo, viene praticato un controllo complementare su ogni animale dell'azienda mediante una prova di fissazione del complemento. La fissazione del complemento deve essere impiegata per l'esame individuale degli ovini e caprini. La fissazione del complemento può essere impiegata per gli allevamenti ovini e caprini allo scopo di stabilire la qualifica di allevamenti ufficialmente indenni o indenni da brucellosi. A) SIERO-AGGLUTINAZIONE RAPIDA CON ANTIGENE AL ROSA BENGALA (SAR-Ag: RB) La reazione di SAR-Ag: RB deve essere applicata secondo le seguenti norme tecniche: 1. Il siero di riferimento comunitario è rappresentato dal secondo siero internazionale standard anti-Brucella abortus, fornito dal Central Veterinary Laboratory di Weybridge, Surrey, Inghilterra, contenente 1000 unità internazionali agglutinanti per millilitro (Second Internazional Standard anti-Brucella abortus Serum: 2nd ISaBS). 2. Il siero nazionale standard per il controllo della reazione deve essere calibrato sul secondo siero internazionale standard anti- Brucella abortus di Weybridge. 3. Il siero di lavoro, di origine ovina, per il controllo giornaliero della reazione deve essere calibrato sul siero nazionale standard. 4. L'antigene al rosa bengala è unico su tutto il territorio nazionale e deve essere: - preparato con il ceppo B.abortus 99 o 1119 (USDA) o qualunque altro ceppo di sensibilità equivalente, in fase S; - sospeso in tampone deve avere pH 3,65 (Più o Meno) 0,05 e essere colorato mediante rosa bengala; - controllato nei confronti di otto sieri liofilizzati riconosciuti rispettivamente positivi e negativi; - standardizzato in modo da dare una agglutinazione visibile alla dil. 1:47,5 e da non dare agglutinazione alle dil. 1:50 del 2nd ISaBS di Weybridge, U.K.; - fornito pronto per l'uso e riportare sull'etichetta di confezionamento il periodo di validità. 5. La reazione di SAR-Ag: RB deve essere effettuata nel modo seguente: - porre una goccia (0,03 ml) di antigene a fianco di una goccia (0,03 ml) del siero nativo in esame su di una piastra bianca; - mescolare i due reagenti con una bacchetta di vetro o plastica, prima in linea retta, poi tracciando dei cerchi del diametro di 20-30 mm. circa; - agitare manualmente la piastra con movimenti circolari oppure servendosi di un oscillatore a movimenti rotatori, a velocità di circa 30 movimenti al minuto, per almeno 4 minuti; - leggere la reazione in buone condizioni di illuminazione: in mancanza di agglutinati la reazione sarà considerata negativa mentre in presenza di qualsiasi grado di agglutinazione la reazione è considerata positiva, salvo quando appare chiara una eccessiva essiccazione ai margini della reazione. 6. La siero-agglutinazione rapida con antigene al rosa bengala può essere allestita con apparecchiature automatiche. 7. La sorveglianza ed il controllo del siero nazionale standard e dell'antigene sono effettuati dall'Istituto superiore di sanità, su ogni serie prodotta. B) FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO (F.d.C.) La reazione di fissazione del complemento deve essere applicata secondo le seguenti tecniche: 1. Il siero di riferimento comunitario è il secondo siero internazionale standard anti-B. abortus (2nd ISaBS) di Weybridge, contenente 1000 unità internazionali fissanti il complemento per millilitro (UICFT/ml). 2. Il siero nazionale standard per il controllo della reazione deve essere calibrato sul secondo siero internazionale standard di Weybridge come per il punto 2, sez. A. 3. Il siero di lavoro, di origine ovina, per il controllo giornaliero della reazione deve essere calibrato sul siero nazionale standard come per il punto 3, sez. A. 4. Un siero in esame che contiene 20 o più unità internazionali fissanti il complemento è considerato positivo. 5. L'antigene è unico su tutto il territorio nazionale e deve essere: - preparato con il ceppo B. abortus 99 o 1119 (USDA) o qualunque altro ceppo di sensibilità equivalente, in fase S; - sospeso in soluzione fisiologica 0,85 NaCl e fenolato; - standardizzato rispetto il secondo siero internazionale stand- ard di Weybridge (2nd ISaBS); - fornito concentrato e sull'etichetta di confezionamento riportare coefficiente di dil. e data di scadenza. 6. La reazione di F.d.C. deve essere effettuata secondo il seguente schema unificato: a) inattivare i sieri in esame, nativi o prediluiti, a 60›C per 30'; b) diluire per raddoppio i sieri inattivati; c) distribuire l'antigene alla diluizione d'uso; d) distribuire 2 unità di complemento; e) agitare e porre in incubazione a 37›C per 30'; f) aggiungere il sistema emolitico contenente 2 unità di emolisina ed una concentrazione del 2% di globuli rossi lavati, pari a 54 x 10(elevato a 7) cellule per millilitro; g) allestire i seguenti controlli di reazione: - controllo del potere anticomplementare dei sieri; - controllo dell'antigene; - controllo del sistema emolitico; - controllo delle unità di complemento utilizzate; - controllo di lettura % di emolisi; - controllo del siero nazionale standard e del siero di lavoro positivo; - controllo del siero negativo; h) agitare e porre in incubazione a 37›C per 30'; i) verificare la qualità dei controlli; l) leggere il titolo dei sieri in esame, rappresentato dalla più alta diluizione che ha determinato il 50% di emolisi o di fissazione, e trasformare il titolo in unità internazionali fissanti il complemento. 7. La reazione può essere allestita con apparecchiature automatiche. 8. La sorveglianza ed il controllo del siero nazionale standard e dell'antigene sono effettuati dall'Istituto superiore di sanità, su ogni serie prodotta.