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- Trattare l'omogeneato con ugual volume di NaOH al 4% - Mantenere in termostato a 37 (gradi) C per 30' - Neutralizzare il sedimento con acido solforico al 10% goccia a goccia utilizzando il rosso fenolo come indicatore di pH - Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi) C o per 20' a 2.000 g - Eliminare il surnatante - Risospendere il sedimento con 2 ml di tampone fosfato pH 6,8 e inoculare i terreni di coltura con 1 ml; destinare l'altro millilitro, diluito 1/10 in tampone fosfato pH 6,8 alla inoculazione degli animali da esperimento, qualora si voglia ricorrere alla prova biologica. 3.2. Sodiododecilsolfato di sodio (Laurilsolfato di sodio) (SDS) 3,16% + NaOH 1% - Trattare l'omogenato con ugual volume di decontaminante (SDS 3,16% + NaOH 1%) - Mantenere a temperatura ambiente in agitazione per 40' - Aggiungere acido fosforico 1,43% e Porpora di bromocresolo 0,006% fino a viraggio dell'indicatore al giallo arancio - Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi ) C o per 20' a 2.000 g - Eliminare il surnatante - Risospendere il sedimento in 10 ml di soluzione fisiologica sterile - Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi) C o per 20' a 2.000 g - Risospendere il sedimento in 2 ml di tampone fosfato pH 6,8 e inoculare con 1 ml i terreni di coltura; destinare l'altro millilitro, diluito 1/10 in tampone fosfato pH 6,8 alla inoculazione degli animali da esperimento, qualora si voglia ricorrere alla prova biologica. 3.3. Esadecilpiridiniocloruro (HPC) (Cetilpiridiniocloruro CCP) 1,5% - Trattare l'omogenato con ugual volume di HPC 1,5% - Mantenere a temperatura ambiente in agitazione per 30' - Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi) C o per 20' a 2.000 g - Risospendere il sedimento in 2 ml di tampone fosfato pH 6,8 e inoculare con 1 ml i terreni di coltura; destinare l'altro millilitro, diluito 1/10 in tampone fosfato pH 6,8 alla inoculazione degli animali da esperimento, qualora si voglia ricorrere alla prova biologica. 4. Semina e terreni di isolamento. La semina viene effettuata in ragione di 0,2 ml del preparato utilizzando i seguenti terreni colturali solidi preparati a becco di clarino a diversa selettività: - 2 provette di Lowenstein-Jensen - 1 provetta di Lowenstein-Jensen senza glicerina con 0,5% di piruvato di sodio o una provetta ai Stonebrink 5. Incubazione delle colture. I terreni inoculati vanno posti in termostato a 37 (gradi) C e una delle due provette di Lowenstein-Jensen a 43 (gradi) C. È preferibile usare un'atmosfera al 5-10% di CO2. Le colture vanno esaminate in prima lettura dopo 2-5 giorni ed in seguito settimanalmente per 6-12 settimane. 6. Inoculazione di animali da esperimento. Generalmente l'inoculazione in animali viene poco usata, esistendo numerose tecniche in vitro per l'isolamento e l'identificazione più specifiche. Alla prova biologica si può ricorrere in parallelo all'esame colturale, nel caso in cui si sospetti la presenza di micobatteri in scarso numero nel campione o una forte contaminazione di questo. Può essere utilizzata anche a fini identificativi (vedi tabella). La prova biologica classica si effettua inoculando contemporaneamente 1 ml di omogenato decontaminato nel muscolo della coscia di 2 cavie, 1 ml per via intraperitonale in due conigli e 1 ml per via endovenosa in due polli adulti. PATOGENICITÀ DEI MICOBATTERI NEGLI ANIMALI DA LABORATORIO Cavia Pollo Coniglio M. bovis + - + MAI complex - + + M. tuberculosis + - - * M. avium-intracellulare complex 7. Identificazione. Per identificare i micobatteri è necessario basarsi su diversi caratteri: - l'acido resistenza - tempo, temperatura e aspetto di crescita - assenza di pigmento nei principali micobatteri di interesse veterinario - tests biochimici 7.1. Tab. 2. IDENTIFICAZIONE PRESUNTIVA _____________________________________________________________________ | | | | | Micobatteri | Crescita | Ureasi |Riduzione |Riduzione |Niacina |__________| | | | | 37 43 | | tellurito | nitriti | |gradi gradi | | | _______________|__________|_________|___________|___________|________ | | | | | M. bovis | L _ | (+ o -) | (+ o -) | _ | _ MAI complex | L _ | _ | + | _ | _ M. tuberculosis| L _ | (+ o -) | (+ o -) | + | + Micobatteri | | | | | rapida crescita| R _ | + | + | (+ o -) | (+ o -) _______________|__________|_________|___________|___________|________ L = Crescita lenta &amp;gt 7 gg R = Crescita rapida &amp;lt 7 gg Tutte le prove devono essere eseguite a partire da colture abbondanti in attiva fase di crescita e vanno sempre accompagnate da controllo positivo e negativo. 7.2. Ureasi. - Inoculare 1 o 2 ansate di coltura in 4 ml di brodo contenente urea (2%), glucosio (0,1%) e rosso fenolo (0,0012%) (colorazione rosso-arancio) e incubare a 37 (gradi) C per 3 giorni - La reazione è positiva per viraggio del colore del terreno verso il rosso porpora 7.3. Riduzione del tellurito. - Inoculare 1 o 2 ansate di coltura in 5 ml di brodo Middlebrook 7H9 e incubare a 37 (gradi) C per 7 o più giorni, fino a crescita visibile - Aggiungere 0,1 ml di una soluzione acquosa di potassio tellurito allo 0,2% e reincubare per 4 giorni - La reazione è positiva quando compare un precipitato nero 7.4. Riduzione dei nitrati. - Inoculare 1 o 2 ansate di coltura in 1 ml di substrato (Nitrato di sodio 0,01 M in tampone fosfato 1/45 M pH 7) e incubare per 2 ore per 37 (gradi) C - Aggiungere 0,1 ml di una soluzione acquosa di acido sulfanilico allo 0,8% e acido acetico al 28,5% e 0,1 ml di una soluzione acquosa di N,N-Dimetil-1-naftilammina allo 0,6% e acido acetico al 28,5% - La reazione è positiva per comparsa di colore rosso - La reazione è negativa se il colore rosso compare solo dopo aggiunta di polvere di zinco 7.5. Niacina.