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1) l'esame della letteratura scientifica confermi la sicurezza del ceppo non virulento e l'assenza di effetti negativi sulla salute umana, animale o vegetale; oppure 2) il ceppo sia stabilmente privo di materiale genetico che determina virulenza o presenti mutazioni stabili che notoriamente attenuano in misura sufficiente la virulenza (test di patogenicità, studi genetici, sonde geniche, rilevazione di fagi e plasmidi, mappatura degli enzimi di restrizione, sequenziamento, sonde proteiche) e la cui sicurezza risulti sufficientemente provata. Occorre prendere in considerazione il rischio di inversione della delezione o della mutazione genica a seguito di eventuali nuovi trasferimenti di geni. Qualora l'analisi bibliografica e gli studi tassonomici non consentano di ricavare le informazioni necessarie, occorre effettuare test di patogenicità adatti al microrganismo in questione. I test dovrebbero essere effettuati sull'MGM anche se in alcuni casi potrebbe risultare opportuno effettuarli sul ceppo ricevente o parentale. Tuttavia, se l'MGM è sostanzialmente diverso dai suoi organismi parentali occorre procedere con attenzione per evitare false conclusioni di non patogenicità. Di seguito sono indicati alcuni esempi di ceppi riceventi o parentali di microrganismi per la produzione di MGM in grado di soddisfare i criteri per l'inclusione nell'allegato II, parte C: derivati di ceppi batterici resi sufficientemente inattivi, ad esempio Escherichia coli K12 e Staphylococcus aureus 83254, la cui crescita e sopravvivenza dipendono dall'aggiunta di nutrienti non presenti nel corpo umano o nell'ambiente esterno al mezzo di coltura (ad es. fabbisogno di acido diaminopimelico e auxotrofia di timina); i sistemi di coltura di cellule e tessuti eucariotici (vegetali o animali, inclusi i mammiferi) possono essere considerati come ospiti resi sufficientemente inattivi. Gli MGM basati su tali cellule devono soddisfare gli altri criteri indicati nel presente documento (ad esempio assenza di agenti avventizi nocivi o di vettori mobilizzabili); i ceppi di ospiti non patogeni di tipo selvatico possono avere nicchie ecologiche estremamente specializzate e di conseguenza avere un impatto ambientale minimo in caso di dispersione accidentale, oppure sono talmente diffusi ma inoffensivi da rendere una dispersione accidentale praticamente priva di conseguenze per la salute degli esseri umani, degli animali o delle piante. Di questa categoria fanno parte i seguenti organismi ospiti: batteri lattici, rizobatteri, termofili estremi, batteri o funghi produttori di antibiotici. Deve trattarsi di microrganismi le cui caratteristiche genetiche e molecolari sono ben conosciute e ben documentate. Il vettore e l'inserto, così come presenti nell'MGM finale, non dovrebbero contenere geni che esprimono una proteina attiva o un trascritto (ad esempio determinanti di virulenza, tossine, ecc.) ad un livello e in una forma tali da conferire all'MGM un fenotipo patogeno per gli esseri umani, gli animali e le piante o in grado di produrre effetti nocivi per l'ambiente. È opportuno evitare l'uso di vettori o inserti contenenti sequenze che codificano tratti nocivi in determinati microrganismi, ma che non conferiscono all'MGM un fenotipo patogeno per gli esseri umani, gli animali e le piante o nocivo per l'ambiente. Occorre accertarsi che il materiale genetico inserito non codifichi un determinante di patogenicità in grado di sostituirsi ad una mutazione inattivante presente nell'organismo parentale. Il fenotipo risultante da un vettore può dipendere dall'organismo ricevente o da quello parentale; tuttavia ciò che vale per un ospite non dovrebbe essere dato per scontato anche quando il costrutto è trasferito ad un altro ospite. Ad esempio, un vettore costituito da un retrovirus inattivato, se utilizzato in batteri oppure nella maggior parte delle linee cellulari, non è in grado di produrre particelle virali infettive; tuttavia lo stesso vettore utilizzato in una linea cellulare di packaging potrebbe produrre particelle virali infettive e, in funzione della natura dell'inattivazione e delle sequenze dell'inserto, conferire all'MGM un fenotipo in grado di causare patologie. 2.1.1. Assenza di tossinogenicità. L'MGM non dovrebbe produrre tossine indesiderate, né un aumento della tossinogenicità a seguito della modificazione genetica subita. Tra le tossine microbiche si possono citare ad esempio le esotossine, le endotossine e le micotossine. L'analisi del ceppo ricevente o parentale può fornire utili informazioni al riguardo. È opportuno sottolineare che, sebbene un ceppo ricevente o parentale sia privo di tossine, non si può comunque escludere la possibilità che il vettore o l'inserto introducano tossine oppure ne stimolino o deprimano la produzione. Occorre pertanto verificare attentamente la presenza di tossine, malgrado ciò non impedisca necessariamente l'inclusione dell'MGM nell'allegato II parte C. 2.1.2. Assenza di allergenicità. Sebbene tutti i microrganismi siano in qualche misura potenzialmente allergenici, alcune specie sono espressamente riconosciute come tali; esse sono elencate nella direttiva 93/88/CEE e nella direttiva 95/30/CE e successive modifiche. Occorre stabilire se l'MGM in questione fa parte di questo gruppo specifico di allergeni. Le componenti allergeniche dei microrganismi comprendono le membrane cellulari, le spore, i metaboliti naturali (ad es. enzimi proteolitici) e alcuni antibiotici. Se il vettore e l'inserto sono espressi nell'MGM finale il prodotto genico non deve possedere attività biologiche in grado di generare importanti allergeni. Si deve tuttavia osservare che questo criterio non può essere applicato in termini assoluti. 2.2. Assenza di agenti avventizi nocivi. L'MGM non deve ospitare agenti avventizi noti, ad esempio micoplasmi, virus, batteri, funghi, altre cellule animali o vegetali e simbionti che possano causare effetti nocivi. Un metodo per evitare questo problema consiste nell'utilizzare, ai fini della costruzione dell'MGM, un ceppo ricevente o parentale notoriamente privo di agenti avventizi nocivi; tuttavia non si può presupporre che l'MGM in questione sia privo di agenti avventizi solo perché lo erano gli individui parentali. Infatti, durante la costruzione dell'MGM potrebbero essere stati introdotti nuovi agenti avventizi. Occorre prestare particolare attenzione quando si deve stabilire se le colture di cellule animali contengono agenti avventizi potenzialmente nocivi quali il virus della coriomeningite linfocitica o micoplasmi come il Mycoplasma pneumoniae. Gli agenti avventizi possono risultare di difficile individuazione e occorre dunque tenere conto dei limiti di efficacia dei metodi di screening. 2.3. Trasferimento di materiale genetico. Qualora sia in grado di produrre nel microrganismo ricevente un fenotipo nocivo, il materiale genetico inserito nell'MGM non dovrebbe essere trasmissibile né mobilizzabile. Il vettore e l'inserto non dovrebbero trasferire all'MGM alcun marcatore della resistenza qualora la resistenza possa compromettere un trattamento terapeutico.