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Vengono considerate positive le provette che hanno dato crescita con sviluppo di gas. La densità dei coliformi totali nel campione di acqua seminato si ottiene applicando la tabella 1. Per la prova di conferma dei coliformi fecali le colture positive passate su terreno lattosio-bile-verde brillante, vengono incubate a 44 Gradi C. Si esamina per la presenza di gas dopo 24+2 ore. Vengono considerate positive le provette che hanno dato crescita con sviluppo di gas. La densità dei coliformi fecali nel campione di acqua seminato si ottiene analogamente applicando la tabella I. Preparazione dei terreni di coltura A) Brodo lattosato: Composizione: estratto di carne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 3 peptone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 5 lattosio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 5 acqua distillata. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ml 1000 pH (dopo sterilizzazione) . . . . . . . . . . . . . . = 6,8 - 7,0 È preferibile usare le preparazioni disidradate del commercio seguendo appropriate modalità. Il terreno viene distribuito in tubi (mm 180 x 18 circa) contenenti una provettina capovolta che funge da campanella di raccolta per il gas (tubi da fermentazione). Sterilizzazione in autoclave a 121 Gradi C per 15'. Il terreno alla concentrazione normale indicata è adatto alla semina di quantità non superiori a ml 1 per tubo. Per la semina di volumi più elevati (10 ml) occorrerà preparare il terreno in concentrazione doppia e distribuito nelle quantità di ml 10 circa in tubi da fermentazione di maggiori dimensioni (mm 180 x 22 circa). I tubi da fermentazione pronti per l'uso non debbono essere conservati in frigorifero per evitare che nel successivo riscaldamento durante l'incubazione, la liberazione dei gas disciolti a bassa temperatura provochi la formazione di una bolla nel tubicino interno con conseguenti possibilità di errore al momento della lettura. B) Brodo lattosato con bile e verde brillante. Composizione: peptone. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 10 lattosio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 10 bile disidratata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 20 verde brillante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 0,0133 acqua distillata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ml 1.000 pH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . = 7,2 È da preferirsi l'uso del terreno in polvere del commercio seguendo appropriate modalità. Sciogliere g 40 del terreno in polvere in ml 1.000 di acqua distillata e distribuire in tubi da fermentazione come indicato per il brodo lattosato. Per la sterilizzazione e la conservazione del terreno pronto per l'uso vale quanto riportato per il brodo lattosato. RICERCA DEI COLIFORMI TOTALI CON LA TECNICA DELLE MEMBRANE FILTRANTI ml 100 o quantità inferiore (*) dell'acqua da esaminare vengono filtrati attraverso membrana utilizzando le apparecchiature da filtrazione disponibili in commercio che diano sufficienti garanzie di riproducibilità dei risultati. Si fanno passare circa ml 20 di acqua distillata sterile per lavare la membrana filtrante. Con apposita pinza sterile si afferra la membrana, facendo attenzione a non capovolgerla e si depone sull'adatto terreno di coltura (M-Endo-Broth, vedi), opportunamente predisposto in piastre di Petri. Incubare in termostato a 37 Gradi C per 24 ore. Vengono considerate di coliformi totali tutte le colonie rosse con riflessi metallici che si sviluppano su M-Endo-Broth. RICERCA DEI COLIFORMI FECALI CON LA TECNICA DELLE MEMBRANE FILTRANTI ml 100 dell'acqua da esaminare vengono filtrati attraverso membrana utilizzando le apparecchiature disponibili in commercio che diano sufficienti garanzie di riproducibilità dei risultati. Si fanno passare circa ml 20 di acqua distillata sterile per lavare la membrana filtrante. Con apposita pinza sterile si afferra la membrana facendo attenzione a non capovolgerla e si depone sull'adatto terreno (MFC-Broth, vedi), opportunamente predisposto in piastre di Petri. Incubare a 44,5 Gradi C per 24 ore, in bagnomaria, avvolgendo le piastre in appositi contenitori impermeabili all'acqua. Vengono considerate di coliformi fecali tutte le colonie di colore bleu dopo incubazione in M-FC-Broth. PREPARAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA PER MEMBRANE FILTRANTI M-Endo-Broth: Composizione: estratto di lievito . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 6,0 peptone. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 20,0 lattosio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 25,0 fosfato bipotassico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 7,0 fuesina basica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 1,0 solfito sodico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 2,5 acqua distillata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ml 1.000 Sterilizzazione a 121 Gradi C per 5 minuti: pH (dopo sterilizzazione) . . . . . . . . . . . . . . . . . = 7,5 È preferibile usare le preparazioni disidratate del commercio. Il terreno deve essere preparato giornalmente. Il terreno pronto per l'uso deve essere impiegato utilizzando gli appositi dischi assorbenti predisposti sul fondo delle piastre. M-FC-Broth Composizione: peptone. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 15,0 estratto di lievito . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 3,0 cloruro di sodio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 5,0 lattosio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 12,5 sali biliari. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 1,5 bleu di anilina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g 0,1 pH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . = 7,4 È preferibile usare le preparazioni disidratate del commercio.