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ALLEGATO B NORME PER LA FABBRICAZIONE E L'UTILIZZAZIONE DELLE TUBERCOLINE BOVINE ED AVIARIE 1. Le tubercolinizzazioni controllate ufficalmente devono essere effettuate mediante tubercoline PPD o tubercoline preparate sinteticamente e concentrate a caldo ('tubercoline sintetichè). Lo Stato membro che, alla data di adozione della presente direttiva, impiega, per il controllo delle tubercoline cosiddette 'sintetichè, una tubercolina standard conforme al campione internazionale della vecchia tubercolina, può, in deroga alle disposizioni dell'allegato B, punto 1 della direttiva 64/432/CEE, continuare ad utilizzare questo metodo fino all'applicazione di norme internazionali più perfezionate. 2. Gli standard di fabbricazione per il controllo delle tubercoline PPD bovine e delle tubercoline cosiddette 'sintetichè devono essere titolati in unità tubercoliniche comunitarie (UTC) mediante prove biologiche secondo le norme CEE per la tubercolina standard CEE. 3. Gli standard di fabbricazione per il controllo delle tubercoline aviarie devono essere espressi in unità internazionali e titolati per via biologica, secondo lo strandard CEE della tubercolina PPD aviaria. 4. Lo standard CEE per la tubercolina PPD bovina è fornito dal 'Centraal Diergeneeskundig Instituut', Afdeling Rotterdam, Paesi Bassi. 5. Lo standard CEE per la tubercolina 'sinteticà bovina è fornita dall''Institut Pasteur' di Parigi, Francia. 6. Lo standard CEE per la tubercolina aviaria è fornito dal 'Cen- tral Veterinary Laboratory', Weybridge, Surrey, Regno Unito. 7. Le tubercoline bovine devono essere preparate con uno dei ceppi di Mycobacterium bovis indicati qui di seguito: a) An5; b) Vallee. 8. Le tubercoline aviarie devono essere preparate con uno dei ceppi di Mycobacterium avium indicati qui di seguito: a) D4ER; b) TB56. 9. Il pH delle tubercoline deve essere compreso fra 6,5 e 7,5. 10. Per quanto concerne l'aggiunta alle tubercoline di conservanti antimicrobici o di altre sostanze, deve risultare dimostrato, a giudizio dell'istituto statale responsabile del controllo ufficiale della tubercolina, che tale aggiunta non altera l'innocuità né l'efficacia del prodotto. Le concentrazioni massime consentite per il fenolo e la glicerina sono le seguenti: a) fenolo - 0,5% M/v; b) glicerina - 10% v/v. 11. Superata con esito favorevole l'ultima prova di attività, le tubercoline, conservate a temperature comprese fra 2 C e 8 C ed al riparo dalla luce, rimangono valide per tutta la durata dei periodi sotto indicati: a) tubercoline PPD liquide: due anni; tubercoline PPD liofilizzate: otto anni; b) tubercoline 'sintetichè diluite: due anni. 12. Nei rispettivi Paesi, gli istituti statali seguenti sono incaricati del controllo ufficiale delle tubercoline: a) Germania: Paul-Ehrlich-Institut, Frankfurt/Main; b) Belgio: Institut d'hygiene et d'epidemiologie, rue J. Wytsman 14, B 1050 Bruxelles; c) Francia: Laboratoire national des medicaments veterinaires, Fougeres; d) Granducato del Lussemburgo: Istituto del paese fornitore; e) Italia: Istituto superiore di sanità, Roma; f) Paesi Bassi: Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling Rotterdam; g) Danimarca: Statens veterinaere Serumlaboratorium, Kobenhavn V; h) Irlanda: Istituto del paese fornitore; i) Regno Unito: The Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Surrey; j) Grecia: Kthniat Inshtouton Loimvdvn Kai Parasiokvn Noshmatan 1era odos75 Auhnai 301; k) Spagna: Laboratorio de Sanidad y Produccion Animal de Granada; l) Portogallo: Laboratorio Naccional de Investigacao veterinaria - Lisboa. 13. Ciascuna partita di tubercoline infialate e pronte per l'uso deve essere oggetto di un controllo ufficiale. 14. Le tubercoline devono essere controllate con metodi biologici e chimici. 15. Le tubercoline devono essere sterili. Le prove di sterilità devono essere effettuate secondo le norme della farmacopea europea. 16. Le tubercoline devono risultare esenti da proprietà tossiche od irritanti in base a una prova effettuata secondo le norme della farmacopea europea. 17. Le tubercoline devono essere sottoposte a un'analisi chimica per determinare l'esatta concentrazione della glicerina e/o del fenolo, nonché la concentrazione di altri eventuali conservanti. 18. Una prova di non sensibilizzazione alla tubercolina deve essere effettuata secondo le norme della farmacopea europea. 19. L'attività delle tubercoline deve essere valutata con i metodi biologici, applicabili alle tubercoline PPD e a quelle 'sintetichè e basati sul confronto delle tubercoline in esame con tubercoline standard. 20. Il contenuto proteico delle tubercoline PPD (tubercoloproteina) si ottiene secondo il metodo di Kjeldahl. Il fattore di conversione dell'azoto in tubercoloproteine è 6,25. 21. Lo standard CEE per la tubercolina 'sinteticà bovina ha un'attività di 65.000 unità tubercoliniche comunitarie (UTC) provvisorie per ml, e viene distribuito in fiale da 5 ml. 22. Lo standard CEE, per la tubercolina PPD bovina ha un'attività di 50.000 UTC per mg di PPD, e viene distribuito alla stato liofilizzato in fiale contenenti 1,8 mg di PPD (0,00002 mg di PPD corrispondono cioè ad 1 unità tubercolinica comunitaria di attività). 23. La tubercolina PPD aviaria della norma CEE ha un'attività di 50.000 unità internazionali (UI) per mg di derivato proteico purificato essiccato e viene distribuita allo stato liofilizzato in fiale contenenti 10 mg di PPD più 26,3 mg di sali (0,0000726 mg dello standard corrispondono cioè ad 1 unità internazionale di attività). 24. Le tubercoline che i fabbricanti presentano per il controllo agli istituti statali di cui al paragrafo 12 devono essere state oggetto di una prova biologica di attività in paragone con gli opportuni standard elencati ai paragrafi 2 e 3. 25. a) Prove di attività su cavie. La prova deve essere effettuata su cavie albine di peso fra g 400 e 600. Tali cavie devono essere in buona salute al momento dell'inoculazione della tubercolina. Per ciascuna prova vanno impiegate non meno di otto cavie. La prova deve essere effettuata a non meno di un mese di distanza dalla sensibilizzazione. aa) Per il controllo delle tubercoline bovine, le cavie devono essere sensibilizzate con uno dei metodi seguenti: 1) iniezione di Mycobacterium bovis del ceppo AN5, ucciso col calore, in coadiuvante oleoso; 2) iniezione di Mycobacterium bovis del ceppo AN5 vivo in emulsione salina fisiologica: 3) iniezione di vaccino BCG.