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ALLEGATO 3 MORBO COITALE MALIGNO Preparazione antigene trypanosoma equiperdum. Ratti albini di circa 300-400 gr vengono inoculati intraperitoneo con il sangue di ratti precedentemente infettati, conservato in N2 liquido con l'aggiunta del 10% di Dimetil sulfossido. La dose di inoculazione è di circa 106 Trypanosomi vivi presenti nel sangue dopo scongelamento a 37 °C e si aggira sui 0,9-1 ml per ratto. - Fare almeno tre passaggi usando ogni volta 3-4 ratti. - Il sangue citrato del terzo passaggio nella quantità di 0,2-0,4 ml (contenenti circa 106 trypanosomi) si inocula per via intraperitoneale in un numero di ratti proporzionale alla quantità di antigene che si vuole produrre (con 100 ratti si producono circa 20 ml di antigene). - Previo controllo al microscopio (*), salassare i ratti con citrato di sodio al 3,8% in terza giornata. - Filtrare per garza il sangue e centrifugarlo a 1650 g x 10' (centrifuga Sorvall GLC3 Rotore HL-4 omni-Carrier 6,46; 3000 rpm). - Scartare il supernatante e raccogliere l'interfaccia che si presenta biancastra, evitando, di rimescolare i trypanosomi con i globuli rossi residui. - Dopo l'ultimo lavaggio raccogliere l'antigene con soluzione fisiologica (NaC1 0,85%) (rapporto approssimativo 1 ml Tryp. + 4 ml soluzione fisiologica). ------------------------------------------------------- (*) Con un bisturi tagliare la coda al ratto, far cadere una goccia di sangue su di un vetrino portaoggetti, coprire con vetrino coprioggetti senza premere. Esaminare con obiettivo 10x. Normalmente il salasso è effettuato quando si contano 30-40 Tryp/campo. Conservazione Ag trypanosoma. - Congelatore a -20 °C: distribuire l'Ag in provette di plastica in ragione di 0,5 ml per provetta e porre in congelatore. Quando si è ottenuto un buon antigene si osserva un abbassamento di titolo di circa un logaritmo in circa due mesi. Titolazione antigene trypanosoma (microtitolo). - Il siero positivo standar viene diluito 1:6 (0,2 ml di siero + 1 ml di Tampone al Veronal) (*) ed inattivato per 50' a bagnomaria a 58 °C. - L'antigene trypanosoma (Ag) è diluito come segue: 1:5 (0,2 ml Ag + 0,8 ml di Tampone Veronal) e successivamente 1:20; 1:30; 1:40; 1:50; 1:60 usando come diluitore il Tampone al Veronal. 1. In tutti i pozzetti, tranne che nella colonna n. 1, di una piastrina con fondo ad U per microtitolo, si pongono, con pipetta calibrata, 0,025 ml di diluente (*). 2. Porre 0,025 ml di siero positivo diluito ed inattivato in tutti i pozzetti delle colonne 1 e 2 da A a G: nella colonna 2 vi saranno quindi 0,025 ml di diluente e 0,025 ml di siero (diluizione 1:12 del siero). 3. Usando microdiluitori da 0,025 diluire il siero positivo, partendo dalla colonna n. 2, fino alla colonna n. 11. 4. Fila G = Porre 0,025 ml in tutti i pozzetti (dal n. 1 al n. 12) di antigene diluito 1:60. Fila F = Porre 0,025 ml di Ag diluito 1:50 in tutti i pozzetti (dal n. 1 al n. 12). Fila E = Porre 0,025 ml di Ag diluito 1:40 in tutti i pozzetti (dal n. 1 al n. 12). Fila D = Porre 0,025 ml di Ag diluito 1:30 in tutti i pozzetti (dal n. 1 al n. 12). Fila C = Porre 0,025 ml di Ag diluito 1:20 in tutti i pozzetti (dal n. 1 al n. 12). Fila B = Porre 0,025 ml di Ag diluito 1:10 in tutti i pozzetti (dal n. 4 al n. 12). Fila A = Porre 0,025 ml di Ag diluito 1:5 in tutti i pozzetti (dal n. 1 al n. 12). Parte di provvedimento in formato grafico 5. Porre 0,025 ml di complemento, (C') contenente 2 Unità, in tutti i pozzetti ed incubare a bagnomaria a 37 °C per 12' le piastre, dopo averle agitate e sigillate. 6. Porre 0,025 ml di Sistema Emolitico (SE) (eguale quantità di emolisina contenente 1 UE e GR di montone al 3% sensibilizzati per 15' a 37 °C). 7. Agitare, sigillare ed incubare per 12' a bagnomaria a 37 °C. 8. Lettura: il titolo dell'antigene corrisponderà alla più alta diluizione di Ag che darà completa fissazione alla diluizione 1:96 del siero Standard. Il pozzetto n. 12 di tutte le file (dalla A alla G) serve come controllo di anticomplementarità dell'antigene, pertanto in tali pozzetti non si metterà il siero. ------------------------------------------------------- (*) Tampone al Veronal: Sodio cloruro anidro gr 85; 5:5 acido dietilbarbiturico gr 5,75; Sodio 5:5 dietilbarbiturato gr 3,75; Magnesio cloruro.6 H2O gr 1,68; Calcio cloruro gr 0,28. Sciogliere l'acido dietilbarbiturico in ml 500 di acqua distillata, aggiungere gli altri componenti e portare a lt 2 con acqua distillata. Conservare a +4 °C ben chiuso. Al momento dell'uso diluire 1:5 con acqua distillata, aggiustare il pH a 7,2, conservare a + 4 °C ben chiuso. Diluizione antigene Il pozzetto 1H servirà come controllo del siero: 0,025 ml di diluente; 0,025 ml di Siero 1:6 ; 0,025 ml di Complemento; 0,025 ml di SE. Il pozzetto 2H servirà come controllo del SE in presenza del Complemento: 0,050 ml di diluente; 0,025 ml di Complemento ; 0,025 ml di SE. Il pozzetto 3H servirà come controllo del SE in assenza di Complemento: 0,075 ml di diluente; 0,025 ml di SE. Deviazione del complemento (DDC) per morbo coitale maligno (Microtitolo). Prova principale: - Diluire i sieri 1:6 (0,1 ml di Siero + 0,5 ml di diluente). - Inattivare i sieri già diluiti, come segue: sieri di cavallo: per 50' a bagnomaria a 58 °C; sieri di asino: per 30' a bagnomaria a 65 °C. - Procedere prima alla prova di Anticomplementarità: In una piastra ad U per microtitolo porre 0,025 ml di diluente (*) in tanti pozzetti quanti sono i sieri da saggiare. Porre in ciascun pozzetto 0,025 ml di siero già diluito ed inattivato e 0,025 ml di Complemento corrispondente a 2U. Agitare, sigillare ed incubare a 37 °C per 12'. Aggiungere, quindi 0,025 ml di SE in tutti i pozzetti.