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La Gazzetta Ufficiale n. 312 del 15 novembre 1979 ha pubblicato il testo del decreto del Presidente della Repubblica lo giugno 1979, n. 575, e quelli della convenzione e dell'allegato accordo. Non sono stati inserti nella predetta Gazzetta Ufficiale gli annessi all'accordo che vengono di seguito pubblicati. ANNESSO B NORME IN MATERIA DI FABBRICAZIONE E DI UTILIZZAZIONE DELLE TUBERCOLINE 1. Le tubercolinizzazioni controllate ufficialmente debbono essere effettuate con tubercolina PPD/bovina/ o con tubercolina preparata su terreno sintetico e concentrata a caldo. 2. Per il controllo della tubercolina PPD deve essere usata una tubercolina standard conforme al campione internazionale PPD rilasciato dallo "Staetens Seruminstitut" di Copenaghen. Questa tubercolina standard deve essere distribuita dal "Central Diergeneeskunding Institut Afdeling", Rotterdam. 3. Per il controllo delle tubercoline cosiddette sintetiche deve essere usata una tubercolina standard conforme al campione internazionale di vecchia tubercolina rilasciato dallo "Staetens Seruminstitut" di Copenaghen. Questa tubercolina standard deve essere distribuita dal "Paul Ehrlich Institut" di Francoforte sul Meno. 4. Le tubercoline debbono essere preparate con uno dei sottoindicati ceppi di BK di tipo bovino ed umano: a/An 5; B/ Vallee; C/ Behring; d/ 14 PN. 5. Il PH delle tubercoline deve essere compreso tra 6,5 e 7. 6. Come agente conservativo si può impiegare, nelle tubercoline, solamente il fenolo alla concentrazione dello 0,5 p. 100. 7. I limiti di tempo per l'utilizzazione delle tubercoline; purché esse siano conservate ad una temperatura di circa +4 gradi C, sono i seguenti: a) tubercoline PPD liquide: 6 mesi; tubercolina PPD liofilizzata: 5 anni; b) tubercoline cosiddette sintetiche, non diluite: 5 anni; tubercoline cosiddette sintetiche, diluite: 2 Anni. 8. Le tubercoline devono essere controllate da Istituti ufficiali. 9. Il controllo ufficiale deve essere esercitato sia sulle tubercoline pronte per l'uso e confezionate in flaconi, sia sull'intera quantità di una partita di tubercolina prima del condizionamento, a condizione che il successivo inflaconamento venga effettuato alla presenza di un rappresentante dell'autorità competente. 10. Il controllo delle tubercoline deve essere effettuato sia con metodi biologici, sia anche con il metodo chimico quando trattasi di tubercolina PPD. 11. Le tubercoline devono essere sterili. 12. Un controllo d'innocuità della tubercolina riguardante la non tossicità e l'assenza di proprietà irritanti, deve essere effettuato nel modo seguente: a) Non-tossicità - Le prove devono essere effettuate su topi e Su cavie. Topi - Iniezioni sottocutanea di 0,5 ml. tubercolina su due topi del peso di 16-20 grammi. Se entro due ore non appaiono i sintomi netti di una intossicazione si può ammettere che il prodotto non contenga quantità eccessive d'acido fenico. Cavie - Le cavie devono essere di peso compreso tra 350 e 500 grammi. La dose di tubercolina da iniettare deve essere di 1 ml per 100 grammi di peso vivo. Per quanto riguarda la tecnica da usare in questo caso, bisogna procedere seguendo una delle due metodiche qui sotto descritte: aa) La tubercolina è iniettata soffocate nella regione del ventre di due cavie - Essa può essere considerata come conforme se le cavie così trattate accusano tuttalpiù per due giorni una forte infiltrazione che, senza presentare necrosi, si riassorbe dal terzo giorno e non è più percettibile dopo sei giorni. Se compare necrosi della pelle del ventre o l'infiltrazione non scompare entro sei giorni, la tubercolina è da scartare. bb) La dose di tubercolina viene iniettata intraperitonealmente a due cavie. Gli animali restano in osservazione per sei settimane, durante il quale periodo non deve essere constatato alcun sintomo clinico specifico né perdita di peso. Trascorse le sei settimane gli animali vengono abbattuti e si procede alla verifica dell'assenza di lesioni tubercolari; in particolare vengono allestiti preparati istologici di milza, legato e polmoni. Le stesse operazioni vengono effettuate su ogni animale che venga a morte in questo tasso di tempo. b) Assenza di proprietà irritanti - Si pratica una inoculazione intradermica nella pelle del fianco, precedentemente rasata, di tre cavie, in ragione (li 2.500 unità internazionali di tubercolina in un volume di 0,1 ml. Nessuna reazione deve essere osservata dopo quaranta ore. 13. Le tubercoline devono essere sottoposte ad analisi chimica tendente ad accertare l'esatto dosaggio del fenolo e l'eventuale presenza di un altro agente conservativo. 14. Una prova di non sensibilizzazione alla tubercolina deve essere effettuata nel seguente modo: Tre cavie, mai in precedenza sottoposte a sperimentazioni scientifiche, ricevono per tre volte, con intervalli di cinque giorni, una iniezione intradermica di 500 unità internazionali di tubercolina in un volume di 0,1 ml. Queste cavie vengono sottoposte quindici giorni più tardi ad una iniezione intradermica della stessa dose di tubercolina. Esse non devono presentare una reazione diversa da quella di cavie dello stesso peso, mai in precedenza sottoposte a sperimentazioni scientifiche, trattate, a scopo di controllo, con la stessa dose di tubercolina. 15. Un controllo di attività deve essere effettuato secondo il metodo fisico-chimico e secondo i metodi biologici: a) Metodo fisico-chimico. Questo metodo, valido per la tubercolina PPD, è basato sulla precipitazione della proteina tubercolare mediante acido tricloroacetico. Il tasso d'azoto viene determinato per distillazione con Kjeldahl. Il fattore di conversione dell'azoto totale in PPD è il fattore 6,25. b) Metodi biologici - Questi metodi sono validi per le tubercoline preparate su terreno sintetico e per la PPD: essi sono basati sul raffronto tra le tubercoline da titolare e le tubercoline standards. 16. Il campione internazionale della vecchia tubercolina contiene 100.000 U.I./ml. 17. Il campione internazionale della PPD è rilasciato allo stato liofilizzato, una U.I. = 0,00002 mg di proteina tubercolare. Il flacone contiene 2 mg di proteina tubercolare. Le tubercoline sottoposte dai fabbricati al controllo effettuato da istituti statali ufficialmente autorizzati devono avere la stessa attività della tubercolina campione, cioè devono contenere 100.000 U.I./ml. 18. a) Controllo d'attività su cavie - Devono venir usate cavie albine del peso compreso tra 400 e 600 grammi. Queste cavie albine devono essere in buono stato di salute e si deve verificare, mediante palpazione se, al momento dell'inoculazione della tubercolina, il loro tono muscolare è restato normale malgrado la precedente sensibilizzazione: aa) La sensibilizzazione delle cavie deve essere ottenuta tramite inoculazione sperimentale: