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ALLEGATO III PRESCRIZIONI TECNICHE RIGUARDANTI LA DETERMINAZIONE DELL'ATTIVITÀ DELL'ALAD METODO EUROPEO STANDARDIZZATO PER LA DETERMINAZIONE DELL'ATTIVITÀ DELLA DEITRATASI DELL'ACIDO DELTA-AMINOLEVULINICO Il principio su cui si basa il metodo adottato per determinare l'attività della deitratasi dell'acido delta-aminolevulinico è noto. Esso si basa sull'incubazione dell'enzima con un eccesso di substrato dell'acido delta-aminolevulinico. Il porfobilinogeno che si forma dopo un determinato tempo viene mescolato con il reattivo di Ehrlich modificato, ed il colore ottenuto viene misurato mediante un fotometro usando un mezzo di contrasto. La quantità di porfobilinogeno prodotta è una misura dell'attività dell'ALAD. METODO Effetto della luce. Recenti esperienze hanno dimostrato che il PBG è particolarmente sensibile alla luce. L'analisi completa dovrebbe essere effettuata in assenza totale di luce solare diretta nel laboratorio (e non soltanto nel luogo in cui viene effettuata l'analisi). Prima fase Campionatura del sangue e conservazione prima dell'analisi Eseguire una presa di sangue di 2 ml di sangue venoso per mezzo di una siringa di plastica (non stabilizzata al piombo) in presenza di eparina diseccata (< 5 mg). Preparare immediatamente e raffreddare a 4 °C 4 prelievi di 0,2 ml ripartiti in provette di plastica (non stabilizzate al piombo). L'aspirazione dev'essere effettuata con pipette graduate di tipo Marbourg. Se l'analisi viene effettuata entro un termine di 3 ore, non è necessario il raffreddamento dei prelievi. La durata massima di conservazione dei campioni a 4 °C è di 24 ore. Poco prima dell'analisi è necessario immergere tutti i campioni in un bagno di acqua gelata per 10 minuti. Nota. - Tra le materie plastiche consigliabili, citiamo il polietilene, il polistirene ed il polipropilene. Il tempo di conservazione di 24 ore a 4 °C è calcolato con una stima prudente. Questo lasso di tempo è sufficiente per permettere il trasporto del campione dal luogo della presa di sangue ad un laboratorio centrale per essere analizzato. Sui 4 prelievi di sangue, 3 debbono essere utilizzati per la determinazione dell'ALAD ed uno per la prova di riferimento. Seconda fase Determinazione del valore ematocrito Questa determinazione dev'essere effettuata: contemporaneamente alla presa di sangue; con un metodo capillare che utilizza due campioni. Centrifugazione previa chiusura di un'estremità ad una velocità di almeno 30.000 g minuti (per non meno di 5 minuti). Nota. - È preferibile che questa determinazione venga effettuata sul posto, ma non più di 24 ore dopo la presa di sangue. Se possibile, utilizzare una centrifuga microematocrita. Terza fase Emolisi Emolisi di tre campioni di sangue "scongelati" in precedenza con 1,3 ml d'acqua distillata (portata in precedenza a 37°C) durante 10 minuti a 37°C ± 0,2°C. Aggiunta di acqua preferibilmente per mezzo di una pipetta graduata di 2 ml, indi mescolare a fondo. A questo stadio i campioni non devono più essere agitati. Nota. - Si è deciso di usare acqua e non Triton X 100 per l'emolisi. Esperimenti di emolisi con il Triton X 100 portano ad un rallentamento considerevole dell'attività dell'ALAD, che non si è ancora riusciti a spiegare, ma che potrebbe essere artificiale. Quarta fase Aggiunta della soluzione di ALA all'emolisi Preparare una soluzione di ALA. La soluzione non deve essere preparata da più di 5 ore. Portare tale soluzione a 37°C per almeno 10 minuti prima di aggiungerla. Aggiungere 1 ml di questa soluzione all'emolisato, preferibilmente con una pipetta volumetrica a boccia di 1 ml, indi mescolare. Nota. - È stato accettato un pH di 6,4 poiché degli esperimenti hanno dimostrato che a tale valore di pH corrisponde la miglior correlazione fra le attività dell'ALAD ed i tassi di piombemia per popolazioni normali. Non si tratta di ottenere il massimo di attività (realizzabili elevando il pH) poiché le attività da determinare sono sufficientemente importanti. Quinta fase Preparazione della prova di riferimento Preparare 0,2 ml di sangue trattato come per la determinazione dell'ALAD fino al momento dell'aggiunta della soluzione di ALA; al posto di quest'ultima, aggiungere 1 ml di soluzione HgC12 - TCA, indi 1 ml di soluzione di ALA, quindi procedere come per la determinazione dell'ALAD (vedi in appresso). Per l'aggiunta di cui sopra, si utilizzeranno pipette volumetriche. Nota. - Un solo campione di riferimento viene comparato con una serie di 3 prove per ogni campione di sangue. Se l'O.D. ottenuto per la prova di riferimento è molto alto, si ripeterà l'operazione per controllo. Sesta fase Incubazione 60 minuti a 37°C ± 0,2°C a bagno-maria. Tempo di incubazione a partire dall'aggiunta della soluzione di ALA. Nota. - Il tempo di incubazione di 60 minuti è stato scelto per aumentare in modo naturale l'attività dell'ALAD, dato che nessuna altra fase ha dato luogo ad aumenti artificiali dell'attività. Alcuni esperimenti hanno dimostrato che la relazione tempo di incubazione-attività è lineare per i lassi di tempo che eccedono le due ore. Per ragioni pratiche si è mantenuta la temperatura di incubazione a 37 °C. Settima fase Arresto della reazione PBG Aggiungere 1 ml di soluzione HgC12 - TCA al miscuglio di incubazione, preferibilmente con una pipetta d'aspirazione a goccia di 1 ml. Ottava fase Centrifugazione e filtrazione 30.000 g minuti. Filtrazione con carta Whatman n. 54 o simile (resistente all'acido). Nota. - La centrifugazione deve durare circa 10 minuti. La fase di filtrazione è stata introdotta per evitare l'aspirazione di piccole particelle sulla superficie del liquido che rimane a galla. Queste particelle sembrano produrre una reazione colorata con il reattivo di Ehrlich. Molti esperimenti hanno mostrato che l'introduzione della fase di filtrazione porta ad una migliore riproducibilità. La fase di filtrazione può all'occorrenza essere sostituita da una seconda centrifugazione. Nona fase Reazione con il reattivo di Ehrlich Mescolare 1 ml di liquido galleggiante con 1 ml del reattivo di Ehrlich modificato a mezzo di pipette ad aspirazione a boccia. Mischiare con un mescolatore tipo Vortex per assicurare l'omogeneità. Lasciare reagire per 5 minuti prima di misurare l'estinzione. Nota. - Per assicurare l'omogeneità, è molto importante che il liquido galleggiante filtrato con il reattivo di Ehrlich venga ben mescolato. Decima fase Misura dell'estinzione Lo spettrofotometro verrà tarato per mezzo di una soluzione di fenoftaleina in un tampone basico. Misura di estinzione del campione rispetto al campione di riferimento a 555 nm in una cellula di 1 cm (o di 2 cm se l'assorbimento è molto debole). Undicesima fase Calcolo dell'attività enzimatica L'equazione che permette di calcolare l'attività è: