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- su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol- ume di latte di 1 ml cui sono stati aggiunti 0,03 ml di uno degli antigeni standardizzati colorati; - su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol- ume di latte di 1 ml cui sono stati aggiunti 0,05 ml di uno degli antigeni standardizzati colorati; - su un volume di latte di 8 ml cui sono stati aggiunti 0,08 ml di uno degli antigeni standardizzati colorati; - su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol- ume di latte di 2 ml cui sono aggiunti 0,05 ml di uno degli antigeni standardizzati colorati. 6. La miscela di latte e di antigeni deve essere tenuta in termostato a 37 C per almeno 45 e al massimo per 60 minuti. La prova deve essere valutata entro 15 minuti dalla rimozione della soluzione dal termostato. 7. La reazione deve essere valutata secondo il seguente criterio: a) reazione negativa: latte colorato, crema decolorata; b) reazione positiva: latte e crema colorati in modo identico o latte decolorato e crema colorata. D. Prova dell'antigene di Brucella tamponato. La prova all'antigene di Brucella tamponato può essere effettuata secondo uno dei seguenti metodi: A. METODO MANUALE. 1. Come siero standard è impiegato il secondo siero internazionale standard anti-Brucella abortus, fornito dal Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Surrey, Inghilterra. 2. L'antigene è preparato senza riferimento alla concentrazione delle cellule, ma la sua sensibilità deve essere standardizzata rispetto al secondo siero internazionale standard anti-Brucella abortus, in modo tale che l'antigene dia reazione positiva con un siero diluito 1:47,5 e reazione negativa con un siero diluito 1:55. 3. L'antigene deve essere sospeso in diluente per l'antigene di Brucella tamponato a pH 3,65 (Più o Meno) 0,5, e può essere stato colorato mediante rosa Bengala. 4. Per la preparazione dell'antigene devono essere utilizzati il ceppo Weybridge n. 99 oppure l'USDA 1119 o qualunque altro ceppo di sensibilità equivalente. 5. I terreni di coltura impiegati per la conservazione del ceppo in laboratorio e per la produzione dell'antigene devono essere tali da non provocare la dissociazione batterica (S-R); sono raccomandabili il terreno agarpatata oppure i metodi di coltura continua. 6. L'antigene deve essere controllato nei confronti di 8 sieri liofilizzati riconosciuti rispettivamente positivi e negativi. 7. La sorveglianza e il controllo ufficiale dei sieri e degli antigeni standard sono effettuati dagli organismi ufficiali elencati nell'allegato C, punto A 9. 8. L'antigene deve essere fornito pronto per l'uso. 9. La prova dell'antigene di Brucella tamponato deve essere effettuata nel modo seguente: a) porre una goccia (0,03 ml) di antigene a fianco di una goccia (0,03 ml) del siero su una piastra bianca; b) mescolare con un agitatore, prima di linea retta, poi tracciando dei cerchi del diametro di 10-12 mm circa; c) agitare la piastra alternativamente per 4 minuti (circa 30 movimenti al minuto); d) effettuare la lettura della prova in buone condizioni d'illuminazione: in mancanza di agglutinazione la prova sarà considerata negativa; qualsiasi grado di agglutinazione va considerato positivo, salvo quando appare chiara un'eccessiva essiccazione intorno ai margini. B. METODO AUTOMATIZZATO. Il metodo automatizzato deve essere sensibile ed esatto almeno quanto il metodo manuale. E. Prova dell'anello di latte, effettuata su plasma sanguigno. A. PRELIEVO DEL PLASMA SANGUIGNO. Le provette con il sangue teso non coagulabile mediante aggiunta di EDTA sono centrifugate per 3 minuti a 3000 giri al minuto e poi conservate per 12-24 ore a 37 C. B. IMPOSTAZIONE DIAGNOSTICA. Si versano 0,2 di plasma stabilizzato in una provetta contenente 1 ml di latte crudo. Dopo aver agitato, si aggiunge una goccia (0,05 ml) di antigene ABR e si agita nuovamente. L'antigene è standardizzato rispetto ad un antigene standard messo a disposizione dall'istituto menzionato al punto A 9 a). Dopo aver lasciato riposare per 45 minuti ad una temperatura di 37 C, si esamina il risultato entro 15 minuti. La prova è considerata positiva se l'anello di latte ha la stessa colorazione o una colorazione più pronunciata di quella della colonna di latte. F. Agglutinazione del plasma sanguigno. Il plasma sanguigno ottenuto conformemente al metodo di cui alla sezione E, punto A, può essere utilizzato immediatamente dopo centrifugazione senza che sia necessario procedere alla stabilizzazione termica. Si mescolano 0,05 ml di plasma con 1 ml di antigene per la sieroagglutinazione al 50%, il che corrisponde ad un titolo di diluizione 1:20 nel caso della sieroagglutinazione. Si esamina il risultato dopo aver lasciato riposare per 18-24 ore alla temperatura di 37 C. La prova è considerata positiva se l'aggiudicazione è uguale o superiore al 50%. G. Prova di microagglutinazione. 1. Il diluente è preparato da una soluzione salina fisiologica 0,85% fenicata allo 0,5%. 2. L'antigene preparato nel modo descritto nei punti 6,7 e 8 dell'allegato C, punto A, e titolato nel modo descritto al punto A5 dell'allegato C. Al momento dell'uso dell'antigene si aggiunge safranina 0 alla 0,02% (diluizione finale). 3. Il siero standard è lo stesso siero di cui al punto A1 dell'allegato C. 4. La fornitura del siero standard è assicurata dal Bundesgesundheitsamt di Berlino. 5. La prova di microagglutinazione utilizza piastre fornite di pozzetti a fondo conico e della capacità di 0,250 ml. La prova viene eseguita nella maniera seguente: a) prediluizioni dei sieri: a ciascun pozzetto di una piastra contenente 0,075 ml di diluente si aggiungono 0,050 ml di ogni siero in esame. Le mescolanze vengono agitate per 30 secondi. b) Diluizioni scalari dei sieri: per ogni siero preparare almeno tre diluizioni. A tale scopo a partire dalle prediluizioni (1:2,5) si prelevano 0,025 ml di ciascun siero e si trasferiscono su una piastra contenente 0,025 ml di diluizione. In tal modo la prima diluizione viene portata dal valore di 1:5 e le successive vengono eseguite per raddoppio. c) Aggiunta dell'antigene: nei singoli pozzetti contenenti le diverse diluizioni dei sieri in esame si aggiunge antigene in volume di 0,025 ml. Previa agitazione per 30 secondi le piastre vengono chiuse con i rispettivi coperchi e poste a 37 C per 20-24 ore in atmosfera umidificata. d) Lettura dei risultati: si valuta il quadro della sedimentazione dell'antigene mediante esame del fondo del pozzetto riflesso da uno specchio concavo posto al di sotto di esso.