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ALLEGATO C BRUCELLOSI A. Siero-agglutinazione. 1. Il siero agglutinante tipo deve essere conforme al siero campione preparato dal Veterinary Laboratory Weybridge - Surrey, Inghilterra. L'ampolla deve contenere 1.000 unità internazionali (UI) agglutinanti provenienti dalla liofilizzazione di 1 ml di siero bovino. 2. La fornitura del siero tipo deve essere assicurata dal Bundesgesundheitsamt, Berlino. 3. Il tasso delle agglutine brucellari di un siero deve essere espresso in unità internazionali per ml (ad es.: siero X - 80 u.i. per ml). 4. La lettura della siero-agglutinazione lenta in tubi deve avvenire al 50% o al 75% di agglutinazione; l'antigene utilizzato dovrà essere stato titolato nelle identiche condizioni in presenza di siero tipo. 5. L'agglutinabilità dei vari antigeni nei confronti del siero tipo deve essere compresa entro i seguenti limiti: - se la lettura è fatta al 50%: tra 1/600 e 1/1000; - se la lettura è fatta al 75%: tra 1/500 e 1/750. 6. Per la preparazione dell'antigene destinato alla siero- agglutinazione in tubi (metodo lento) devono essere utilizzati i ceppi Weybridge n. 99 e USDA 1119 o qualsiasi altro ceppo di sensibilità equivalente. 7. I terreni di coltura utilizzati sia per la conservazione del ceppo nel laboratorio che per la produzione dell'antigene devono essere scelti in modo da non favorire la dissociazione batterica (S-R); si dovrà impiegare di preferenza l'agarpatata. 8. L'emulsione batterica deve essere effettuata con soluzione fisiologica (NaCI 8,5%) fenicato allo 0,5%. Non deve essere usato il formolo. 9. Si devono incaricare del controllo ufficiale degli antigeni i seguenti istituti ufficiali: a) Germania: Bundesgesundheitsamt, Berlino; b) Belgio: Institut national de recherches vètèrinaires, Bruxelles; c) Francia: Laboratoire central de recherches vètèrinaires, Alfort; d) Granducato del Lussemburgo: Istituto del paese fornitore; e) Italia: Istituto superiore di sanità, Roma; f) Paesi Bassi: Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling Rotterdam; g) Danimarca: Statens veterinaere Serumlaboratorium, Kobenhavn V; h) Irlanda: The Veterinary Research Laboratory Departement of Agricolture and Fisheries, Thorndale Beaumont Road, Dublin 9; i) Regno Unito: - Gran Bretagna: The Central Veterinary Labora- tory, Weybridge, Surrey England; - Island del Nord: The Veterinary Research Laboratory, Stormont, Belfast; j) Grecia: Kthniatrikon Institoytoy Lovvdvn Kai Parasitikvn Noshmatvn 1era odow75 Auhnai 301; k) Spagna: Laboratorio de Sanidad y Produccion Animal de Granada; l) Portogallo: Laboratorio Naccional de Investigacao veterinaria - Lisboa. 10. Gli antigeni possono essere forniti concentrati purché il coefficiente di diluizione richiesto sia indicato sull'etichetta del flacone. 11. Per effettuare una siero-agglutinazione occorre preparare almeno tre diluizioni per ogni siero. Le diluizioni del siero sospetto devono essere affermate in modo che la lettura della reazione al limite di infezione avvenga nel tubo mediano. In caso di reazione positiva in questo tubo il siero sospetto conterrà quindi almeno la quantità di 30 UI agglutinanti per millilitro. B. Reazione di fissazione del complemento. 1. Come siero standard vale lo stesso substandard del siero della brucellosi di cui al punto A 1 del presente allegato. Oltre alle unità di agglutinazione internazionali (UAI), devono essere presenti in un millilitro di questo siero della brucellosi liofilizzato 1.000 unità sensibilizzanti che fissano il complemento. Queste unità sensibilizzanti sono denominate unità sensibilizzanti CEE (USC). 2. La fornitura del siero standardizzato è assicurata dal BundesgesundheitSamt di Berlino. 3. Il tenore di anticorpi che fissano il complemento, in un siero, va espresso in unità sensibilizzanti CEE (USC) (es.: siero x = USC ml). 4. Un siero contenente in 1/ml 20 unità sensibilizzanti CEE (il che corrisponde ad un'attività del 20% dell'attività del siero di riferimento) o più, deve essere considerato positivo. 5. I sieri devono essere inattivati come segue: a) bovini: 56 - 60C per 30-50 minuti; b) suini: 60C per 30-50 minuti. 6. Per la produzione dell'antigene si devono usare i ceppi Weybridge n. 99 o USDA 1119. L'antigene è costituito da un'emulsione batterica in soluzione fisiologica allo 0,85% o in soluzione tampone veronal. 7. Per la reazione si deve usare una dose di complemento che sia maggiore della dose minima necessaria per una emolisi totale. 8. Nell'esecuzione della reazione, si devono effettuare ogni volta i seguenti controlli: a) controllo dell'effetto anticomplementare del siero; b) controllo dell'antigene; c) controllo delle emazie sensibilizzate; d) controllo del complemento; e) controllo di sensibilità della reazione con l'aiuto di un siero positivo; f) controllo della specificità della reazione con l'aiuto di un siero negativo. 9. La sorveglianza e il controllo ufficiale dei sieri standard e degli antigeni sono affidati agli organismi di cui al punto A 9 del presente allegato. 10. Gli antigeni possono essere forniti in forma concentrata, purché sull'etichetta sia indicato il coefficiente di diluizione necessario. C. Prova dell'anello (Ring Test). 1. La prova dell'anello deve essere effettuata sul contenuto di ogni bidone di latte o sul contenuto di ogni grande contenitore dell'azienda. 2. L'antigene tipo da impiegare deve provenire da uno degli istituti elencati al punto A 9, lettere da a) a j). Si raccomanda di impiegare antigeni standardizzati secondo le raccomandazioni dell'OMS/FAO. 3. L'antigene può essere colorato solo con ematossilina o tetrazolo; occorre dare la preferenza all'ematossilina. 4. Se non sono utilizzati metodi di conservazione, la reazione deve essere effettuata tra la 18a e la 24a ora successiva alla mungitura. Qualora la prova sul latte debba essere effettuata oltre 24 ore dopo il prelievo del campione, si devono adottare sistemi di conservazione. Come conservanti si possono utilizzare il formolo o il cloruro mercurico; in tal caso, la prova deve essere effettuata entro 14 giorni successivi al giorno in cui è stato prelevato il campione. In caso di utilizzazione del formolo, la concentrazione finale nel campione di latte deve essere dello 0,2%; la proporzione tra la quantità del latte e la soluzione di formolo da aggiungere deve essere almeno di 10 a 1. Al posto del formolo si può utilizzare il cloruro mercurico; anche in tal caso la concentrazione finale nel latte deve essere dello 0,2% e la proporzione tra la quantità di latte e la soluzione del cloruro mercurico da aggiungere, di 10 a 1. 5. La reazione deve essere effettuata secondo uno dei seguenti metodi: