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2) Irlanda del Nord: The Veterinary Research Laboratory, Stormont, Belfast; j) Spagna: Subdireccion general de sanidad animal. Laboratorio de sanidad i produce animal Algete (Madrid). k) Portogallo: Laboratorio Nacional de Investigacao Veterinaria, Lisboa. 3. Gli antigeni standard di laboratorio devono essere presentati almeno una volta all'anno ai laboratori di riferimento CEE elencati al paragrafo 2 per essere esaminati in rapporto al siero CEE. Indipendentemente da detta standardizzazione, l'antigene in uso può essere standardizzato secondo la tecnica descritta alla lettera B. 4. I reattivi da impiegare sono i seguenti: a) antigene: esso dovrà contenere le glicoproteine specifiche del virus della leucosi bovina enzootica standardizzato rispetto al siero ufficiale CEE; b) siero in esame; c) siero di controllo riconosciuto positivo; d) gel di agar 0,8% di agar 8,5 di NaCl tampone Tris 0,05 M a pH 7,2 ; versare 15 ml di questo terreno in una scatola Petri del diametro di 85 mm, in modo da ottenere uno strato dello spessore di 2,6 mm. 5. Nell'agar sul fondo della scatola ricavare sette pozzetti, esenti da umidità e distribuiti come segue: un pozzetto centrale e 6 pozzetti disposti in cerchio attorno ad esso; diametro del pozzetto centrale: 4 mm, diametro dei pozzetti periferici: 6 mm, distanza fra il pozzetto centrale e i pozzetti periferici: 3 mm. 6. Riempire il pozzetto centrale con l'antigene standard, i pozzetti periferici 1 e 4 (vedi lo schema) con un siero riconosciuto come positivo e i pozzetti 2, 3, 5 e 6 con i sieri in esame. Il riempimento va effettuato fino a scomparsa del menisco. Parte di provvedimento in formato grafico 7. Le quantità di reattivi da impiegare sono dunque le seguenti: antigene: 32 microlitri, siero di controllo: 73 microlitri, sieri in esame: 73 microlitri. 8. Incubare per 72 ore a temperatura ambiente (20-27 C), in atmosfera confinata ed umida. 9. La lettura può essere effettuata dopo 24 e 48 ore, ma non è possibile ottenere il risultato finale prima di 72 ore. a) Il siero in esame è positivo se forma una linea specifica di precipitine con l'antigine del virus della LBE e una linea completa di identità con il siero di riferimento; b) il siero in esame è negativo se non forma una linea specifica di precipitazione con l'antigene della LBE e se non provoca l'incurvamento della linea del siero di riferimento; c) la reazione è considerata non conclusiva: i) se la linea del siero di riferimento si incurva verso l'antigene della LBE senza formare con l'antigene una linea di precipitine visibile, ovvero ii) se non può essere, interpretata come negativa o positiva. Quando la reazione non è conclusiva, la prova può essere ripetuta e può essere impiegato siero concentrato. B. Metodo per la standardizzazione dell'antigene. Soluzioni e materiali necessari: 1. 40 ml di agarosio all'1,6% in tampone Tris/HC1 0,05m a pH 7,2, contenente l'8,5% di NaCl; 2. 15 ml di siero della leucosi bovina, contenente anticorpi delle sole glicoproteine del virus della leucosi bovina, diluito 1:10 in tampone Tris/HCl 0,05m a pH 7,2 contenente l'8,5% di NaCl; 3. 15 ml di siero della leucosi bovina, contenente anticorpi delle sole glicoproteine del virus della leucosi bovina, diluito 1:5 in tampone Tris/HCl 0,05m a pH 7,2 contenente l'8,5% di NaCl; 4. 4 scatole Petri in plastica, del diametro di 85 mm; 5. un punzone del diametro di 4-6 mm; 6. antigene di riferimento; 7. antigene da standardizzare; 8. bagnomaria (56 C). Modo da operare: Sciogliere l'agarosio (1,6%) nel tampone Tris/HCI, riscaldando cautamente a 100 C. Mettere in bagnomaria a 56 C per circa 1 ora. Porre in bagnomaria a 56 C anche le deluizioni di siero della leucosi bovina. Mescolare 15 ml della soluzione di agarosio a 56 C con 15 ml di siero della leucosi bovina (1:10), agitare rapidamente e versare due porzioni da 15 ml della miscela in due scatole Petri. Ripetere il procedimento con il siero della leucosi bovina diluito 1:5. Quando l'agarosio si è solidificato, praticare i pozzetti secondo il seguente schema: Parte di provvedimento in formato grafico Aggiunta di antigene I. Scatole Petri 1 e 3: pozzetto A - antigene di riferimento non diluito, pozzetto B - antigene di riferimento, diluito 1:2, pozzetto C + E - antigene di riferimento, pozzetto D - antigene da controllare, non diluito. II. Scatole Petri 2 e 4: pozzetto A - antigene in esame, non diluito, pozzetto B - antigene in esame, diluito 1:2, pozzetto C - antigene in esame, diluito 1:4, pozzetto D - antigene in esame, diluito 1:8. Istruzioni complementari 1. Per realizzare una precipitazione ottimale, l'esperimento va effettuato con due diluizioni di siero (1:5 e 1:10). 2. Se il diametro di precipitazione è troppo piccolo ad ambedue le diluizioni, il siero va ulteriormente diluito. 3. Se la precipitazione per ambedue le diluizioni è indistinta e il diametro è troppo grande, per il siero va scelta una diluizione inferiore. 4. La concentrazione finale dell'agarosio deve essere dello 0,8%; quella dei sieri deve essere rispettivamente del 5% e del 10%. 5. Riportare i diametri misurati sull'accluso sistema di assi coordinati. La diluzione di lavoro deve corrispondere alla diluzione dell'antigene sotto prova che ha lo stesso diametro dell'antigene di riferimento. Parte di provvedimento in formato grafico Diluizioni dell'antigene C. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la ricerca della leucosi bovina enzootica. 1. Per procedere al saggio ELISA occorrono le attrezzature e i reattivi qui indicati: a) micropiastre, cuvette o qualsiasi altro recipiente per la fase solida; b) l'antigene è fissato sulla fase solida con o senza l'ausilio di anticorpi leganti policlonali o monoclonali. Se la fase solida è rivestita direttamente dall'antigene, tutti i campioni in esame che presentano reazione positiva devono essere riesaminati facendo riferimento all'antigene di controllo. Nel caso dell'E.B.L. l'antigene di controllo dovrebbe essere identico all'antigene in questione, fatta eccezione per gli antigeni del virus della leucosi bovina. Se gli anticorpi leganti sono distribuiti sulla fase solida, gli anticorpi non devono reagire ad antigeni diversi da quelli del virus della leucosi bovina; c) il fluido biologico da esaminare; d) controlli positivi e controlli negativi corrispondenti; e) il coniugato;