出生名は三宅 竜彦。養子に出されて森田姓となり、大阪に移ってから母方の旧姓の山上姓となる。高校卒業後、大阪の光伸書房（いわゆる日の丸文庫）に入社し、編集の傍ら貸本劇画を描きはじめる。1965年 、日の丸文庫「影 別冊」掲載の『秘密指令0』で正式に漫画家デビュー。以後、SF、ホラーなどを執筆する。雑誌デビューは1968年、芳文社「コミックmagazine」3月12日号掲載の『第七病棟異常なし』。1969年には「週刊少年マガジン」に『二人の救世主』を発表してメジャーデビューを果たす。翌1970年には同誌で初期の代表作である『光る風』の連載を開始。当時の社会情勢を巧みに反映させ、軍国主義の台頭とその恐怖を描いた内容は読者に強い衝撃を与えると同時にポリティカル・サスペンスをいち早く手掛けたことによって、高い評価を受けた。1971年には上京し和光市のアパートに暮らす。同年、練馬区大泉の一軒家に引越し、この場所で数々の傑作を発表することになる。1972年には、『喜劇新思想大系』の連載を開始。これまでのシリアスな内容とはうって変わったスラップスティックで過激なギャグは驚きと絶賛を浴び、ギャグ漫画の新境地を開拓。1974年、「週刊少年チャンピオン」にて連載開始された『がきデカ』が爆発的な大ヒットを記録。『がきデカ』は、水島新司の『ドカベン』や鴨川つばめの『マカロニほうれん荘』と並んで「週刊少年チャンピオン」の部数増に貢献した作品となり、社会現象を巻き起こした。1980年に『がきデカ』の連載を一旦終了。その後の1980年代は作風が変わり、『湯の花親子』に代表されるような「平凡な日常生活に潜む微妙な不条理・違和感」と「日本的な日常風景」を主題としたギャグ漫画を多く描くようになる。一方では、体型が真ん丸なキャラクターたちが活躍する『鬼刃流転―孤高の天才剣士柳左近』のような前衛的なギャグ漫画も発表している。しかし、漫画表現に限界を感じ、1990年の『がきデカ』完結編の脱稿とともに漫画執筆をやめ、小説家に転向したが、近年はまた漫画執筆に意欲を見せ、2004年には『がきデカ』の続編となる『中春こまわり君』を「ビッグコミック」にて発表した。
1985年（昭和60年）10月、新潮社より新たに『井伏鱒二自選全集』の刊行が開始された。この全集は帯文に「米寿をむかえた筆者が、初めて作品を厳選し徹底的な削除・加筆・訂正を行った決定版」と銘打たれており、「山椒魚」もその「訂正」の例外にはならなかった。従来どおり第一巻の巻頭に置かれた「山椒魚」は、その結末部分が10数行に渡ってカットされており、この結果『自選全集』に収められた「山椒魚」は以下の文章で終わるかたちとなっている。更に一年の月日が過ぎた。二個の鉱物は、再び二個の生物に変化した。けれど彼等は、今年の夏はお互い黙り込んで、そしてお互いに自分の嘆息が相手に聞こえないように注意してゐたのである。つまり従来の結末部にあった、「今でもべつにお前のことをおこつてはゐないんだ」でくくられる蛙との和解の場面が丸ごと削除されたのである。また同全集の「覚え書」には、改稿のもととなった井伏の考えがこう記された。「後年になつて考へたが、外に出られない山椒魚はどうしても出られない運命に置かれてしまつたと覚悟した。「絶対」といふことを教えられたのだ。観念したのである。」この末尾の対話の部分は元来武田泰淳や河盛好蔵などから評価を受けていた部分であったこともあり、この突然の改稿は大きな波紋を呼び、削除に対する賛否や作者の真意、そして「作品」はいったい誰のものか、といったことをめぐって文壇を賑わわせただけでなく、その騒動はマスメディアからも注目を受けた。井伏作品を愛読していた野坂昭如は『週刊朝日』誌上で、「山椒魚」はもはや書き手を離れている作品であるはずだと書き、これまでの読者はどうなるのかと強く反発した。井伏の伝記を執筆した安岡章太郎も、当時の講演でこの件に触れ「削ったことによって締まってくるとも思うが、そうすると前の部分が食い足りない」として「十分納得がいかない」心境を語っている。評論家の古林尚は、これは「改訂」ではなく「破壊」ではないかと述懐し、この末尾の削除によって、山椒魚と蛙の関係は単なる「いじめ」の問題に縮小されてしまったと難じた。同年10月10日付けの『朝日新聞』のコラム「天声人語」はこの騒動に触れたうえで、「『山椒魚』の末尾削除は、もしかすると八十七歳になった作家の、人間と現代文明への絶望ではなかったか」と書いている。一方で井伏自身は、『自選全集』と同時期に行われた河盛好蔵との対談で「どうしようもないものだもの。山椒魚の生活は」「ずいぶん迷ったですよ」といった発言をしており、前述の10月10日付けの「天声人語」では「あれは失敗作だった。もっと早く削ればよかったんだ」といった言葉も伝えられている。しかしさらにのちの89歳直前に行われたNHKのインタビューでは「直さないほうがよいようだなあ」「（では戻しますか、という記者の質問に対して）それがよいかもわからん。誰か書いてくれるといいな」と迷いを口に出しており、こうした井伏の言動も自選全集版の「山椒魚」に対する消極的な評価の一因となっている。ただし批評家や研究者からは、読者は読み比べて好きなほうを選べば良いのだとする意見や、改稿後のほうが解釈の幅が広がっているという意見、文体の完成度という観点から新稿のほうを評価する意見なども提示されている。その後、井伏が1993年（平成5年）7月10日に死去するまでの間にも「山椒魚」は複数の作品集に収録されたが、井伏が自選全集収録時の「山椒魚」を再び改訂することはなかった。