慶長4年（1599年）1月、後陽成天皇より従五位下・左衛門佐に叙された。また、豊臣姓を下賜された。この年の6月、秋月種実の娘を妻とした。伊集院忠棟が伏見で誅殺されて、薩摩で庄内の乱が起こると、徳川家康の命令で頼房も鎮圧側で出陣した。また、相良藩でも似たような事件があり、かつて兄・忠房が相続した時、相良頼貞を擁した上村長陸が朝鮮の役の最中に謀叛を企てたという容疑で、瑞祥寺門外でこれを斬った。慶長5年（1600年）の関ヶ原の戦いでは、初めは石田三成の檄に従い、頼房は犬童頼兄を従えて上京。西軍に加わって伏見城の戦いなどに参加し、相良家臣・神瀬九兵衛は先登の功をあげた。しかし他方で、頼兄は、家康家臣の井伊直政と内通して謀議を進めていた。大垣城籠城中の9月15日、関ヶ原本戦で西軍が壊滅すると、頼房は犬童頼兄の策を実行に移し、同じく籠城していた秋月種長・高橋元種兄弟も東軍の水野勝成の工作で内応したこともあり、これと共同で東軍に寝返り、熊谷直盛、垣見一直、木村由信・木村豊統父子らを城内で謀殺し、東軍に降伏した。23日には大垣城守将の福原長堯も城を東軍に明け渡して投降した。福原を謀殺しその首を取ったのも相良の者という説もある。頼房と頼兄は不承不承に西軍についたと主張し、井伊に内通していたことから、家康に所領を安堵を許され、人吉藩2万石の初代藩主となった。犬童頼兄はこの頃より専断の徴候を見せ始め、家康の不興を買ったが、次第に藩政の実権を固めた。この頃から、頼房は人吉城の改築を本格的に始めた。慶長9年（1604年）6月、頼房は伏見にいた老母・了信尼を江戸に人質として差し出したが、これは西国の大名の母としては最初の江戸詰の例だったので、徳川秀忠は喜び、備前実長の刀を授け、老母にも終生月俸50口を与えた。大坂の冬陣には出陣せず、夏の陣には一応出征したが、到着した時には戦闘はすでに終わっていた。慶長12年（1617年）、頼房は嫡子・長寿丸を連れて駿府で家康に拝謁し、江戸でも秀忠に拝謁した。このとき長寿丸は頼尚と名を改めた。元和元年（1620年）、椎葉山騒動があって相良藩も鎮圧に参加したが、幕府軍の山中での戦いは難航。結局は、数百名が斬首され、椎葉村一帯が天領となるが、鎮圧の功績が秀忠に評価されて、その管理と実質的な支配は隣接する相良藩に任された。寛永6年（1629年）、江戸にて名乗りを替えて左衛門佐を主に用いるようになった。寛永9年（1632年）、年老いた頼房は大垣城で裏切り殺した面々と石田三成の追善供養を頼兄に命じた。現在（相良藩菩提寺の）願成寺に石田三成らの供養墓があるのはこのためである。寛永13年（1636年）6月13日に死去した。享年63。跡を長男の頼寛が継いだ。
1513年5月下旬になると、ルイ2世・ド・ラ・トレモイユ率いるフランス軍はアルプス山脈を超えてミラノへ進軍を開始し、時を同じくしてバルトロメオ・ダルヴィアーノとその配下にあるヴェネツィア軍もまたパドヴァを発って西に向かった。スイス傭兵の傀儡と見なされていたマッシミリアーノ・スフォルツァがミラノ公になった事は町の反感を買っていたため、フランス軍は大した抵抗も無くロンバルディにまで到達する事ができた。ミラノを手中に収めた後、トレモイユはスイス傭兵が篭城したノヴァーラへの攻城戦を始めたが、数で劣るスイス側の援軍との戦闘によって敗走に追い込まれた(ノヴァーラの戦い)。スイス傭兵は撤退するフランス軍を執拗に追撃し、賄賂によって撤退するまでにアルプスを越えてフランス中部のディジョンにまで攻め込んでいる。ノヴァーラでの敗北はフランスとその同盟国にとって情勢の決定的悪化をもたらした。ヘンリー8世率いるイングランド軍はフランス北部の都市テルアンヌを包囲し、スパーズの戦いで敗北したラ・パリスは当時フランス領だったトゥルネーを失った。ナバラではアラゴン王フェルナンド2世の軍勢に防衛線を突破され、ギュイエンヌへ攻撃を仕掛けていたイングランドの別働隊との合流を許した。ルイ12世はスコットランド王ジェームズ4世にイングランドへ侵攻するよう要請し、ヘンリー8世の注意をフランスから引き離そうとした。だがフロドゥンの戦いによってスコットランド軍は大敗し、ジェームズ4世の戦死によって彼の目論みは崩れ去った。一方、フランスの支援を受けられなくなったダルヴィアーノとヴェネツィア軍は、カルドナ率いるスペイン軍の追撃を逃れてヴェネト州にまで撤退した。ヴェネツィア人の強い抵抗に直面したスペイン軍はパドヴァの攻略を諦めてヴェネツィア領を突き進み、9月下旬には遂にヴェネツィアの城壁にまで達した。カルドナは都市を占領しようと砲撃や海岸からの上陸作戦を行ったものの、いずれも失敗したためロンバルディに退いた。ヴェネツィア貴族の援助を受けて軍を強化したダルヴィアーノはカルドナを追い、両軍は10月7日にヴィチェンツァで衝突した。ラ・モッタの戦いとして知られるこの戦闘の結果、ヴェネツィア軍は致命的な敗北を喫し、敗戦を恐れた多くの貴族がヴェネツィアから先を争って脱出していった。しかしながら、神聖同盟は一連の勝利を戦争全体の勝利に繋げる事には失敗した。カルドナとダルヴィアーノは1514年を通してフリウーリで小競り合いを続けたものの、両者の決着が着くことは終戦に至るまで遂に無かった。求めていた領地の獲得に失敗したヘンリー8世は同盟を離脱し、単独でフランスと和平を結んだ。決定的だったのは神聖同盟を指導してきた教皇ユリウス2世が死去した事だった。新たに聖座を引き継いだレオ10世は軍事に関心を持たない教皇で、以後教皇軍の動きは防衛的なものとなった。1515年1月1日、ルイ12世が死去し新たにフランソワ1世がフランス王に即位した。彼は自らの戴冠式でミラノ公の称号を受け継いだ事を宣言し、直ちにイタリア半島におけるフランス領の再興を目指した。7月下旬になると、フランソワ1世は軍をドーフィネに集結させ、イタリアへ侵攻する準備を始めた。スイス傭兵と教皇軍はフランス軍のアルプス山脈越えを阻止しようとミラノ北部に防衛線を張ったものの、ジャン・ジャコモ・トリヴルツィオの助言を受けたフランソワ1世はストゥーラ谷を経由する迂回路を進んでイタリアへの侵入を果たした。フランス軍の先遣隊は不意を突かれたミラノの騎兵隊をヴィッラフランカで破り、コンドッティエーレの一人プロースペロ・コロンナを捕らえる事に成功した。一方、フランソワ1世とその主軍はマリニャーノの戦いでスイス傭兵と激突した。序盤はスイス側が優勢だったものの、フランス騎兵隊・砲兵隊の活躍やダルヴィアーノ率いるヴェネツィアからの援軍もあり、フランス側の大勝に終わった。時に1515年9月14日の事であった。