武蔵野線は複数の長大トンネルが存在するため、開業時に本路線において運行が許容されていた車両は運輸省通達A基準を満たす101系1000番台であった。緊急時に列車側部からトンネル内に脱出するための幅が確保されていることと、のちに新製された車両はより厳しいA-A基準を満たしているため、現在では系列を問わず運行が可能である。武蔵野線に導入された車両は開業時の101系1000番台をはじめ、首都圏の各線区から転属した車両が大半を占めており、直接配置された新型車両は1991年の205系のみとなっている。車両の方向は、南船橋駅 - 海浜幕張駅間において京葉線の車両と揃えられている。そのため、東京発着の列車は、東京駅 - 市川塩浜駅間では武蔵野線と京葉線で車両の方向が前後逆になっている。
本路線を介して毎日多くの貨物列車が首都圏を縦断して貨物輸送を行っている。線内に越谷・新座・梶ヶ谷の各貨物ターミナルを擁し、東海道本線方面と東北本線方面を結ぶ貨物輸送の大動脈となっている。府中本町駅で南武線を経て中央本線方面、武蔵浦和駅で越谷方面と東北貨物線大宮方面、南流山駅で越谷方面と常磐線土浦駅方面および隅田川駅の両方面と、西船橋駅で京葉線千葉貨物駅方面と、それぞれ接続されており、全線を通してJR貨物による貨物列車が毎日運転されている。新小平駅で新座方面と中央本線立川駅方面を結ぶ線路にも、北長野駅 - 隅田川駅間で平日1往復の貨物列車が設定されている。かつては新秋津駅付近から西武線所沢駅の間も貨物列車が運行されていたが、現在は西武鉄道の車両の甲種輸送にのみ用いられている。過去に最新式の自動化設備を備えた武蔵野操車場が設けられていたが、1984年のヤード集結型貨物輸送の廃止にともない機能を失い、1986年に正式に廃止された。
鶴見駅が起点のため、府中本町・東所沢行きは「上り」列車になり、西船橋方面行きは「下り」列車として運転される。武蔵野線内で「下り」列車として運転される東京行きの列車は、西船橋駅を境に「上り」列車に変わる。列車番号のアルファベットはE。むさしの号、しもうさ号（大宮駅 - 武蔵浦和駅間）の列車番号のアルファベットはM。
土曜・休日を中心に武蔵野南線・武蔵野線を経由して東海道本線・横須賀線方面と東北本線・常磐線方面とを結ぶ臨時の快速列車「ホリデー快速鎌倉号」・「ぶらり高尾散策号」、中央本線方面に臨時特急「むさしのかいじ」が設定されている。2015年1月までは急行列車「ぶらり鎌倉号」が設定されていたが、同年3月の上野東京ライン開業時に同路線経由となり武蔵野線内での運行は終了した。2017年4月からは中央線方面と東武日光線方面とを結ぶ臨時特急「はちおうじ日光」が、それまでの新宿駅経由から武蔵野線経由の運行に変更された。府中本町駅は東京競馬場、船橋法典駅は中山競馬場、とそれぞれ公営競技場に隣接しており、競馬開催日は混雑緩和のため時刻表に記載の無い区間運転の臨時列車を運行することがある。主にメインレース終了直後の16時前後を中心に、東京競馬場が開催の場合は府中本町発南越谷行き、中山競馬場が開催の場合は西船橋発吉川美南行きなどが運行されることがある。土休日ダイヤが昼間10分間隔運転となる以前は、時刻表にも「競馬臨時列車」の記載があった。
シーボルトは「チンギスカンの伝説的な系譜を重要視しているわけではなく、憶測を逞しくしようとは思わず、義経が蒙古の戦場に登場することに推測を加えることで、歴史家の注目を集めたいのである」と結んでいる(『シーボルト日本』)。追放処分から30年後再び来日（1861年）し、幕府の顧問になるが、西洋書籍の分析機関『蕃書調所』に勤めた西周 (啓蒙家)に再三に渡って「義経＝チンギスカン説」を正史として認めるよう薦めている。(『末廣の壽』1869年）蘭学者調所の教授手伝の大島総左衛門高任が手塚律蔵好盛とオランダの尺度エル（el)とフート(voet)のことで議論していたが、判らないのでシーボルトに質問すると、フートは日本の尺と変わらず、元の太祖以下二世三世がヨーロッパに侵攻したとき、日本の尺度を彼らに伝えたからである。蒙古人がなぜ日本の尺度を用いたかと云えば、その太祖が日本人だったからに外ならず、彼の名は〇〇〇というが、圓牆を避けて蝦夷地に逃げたが、土人を征服したため益々兄の怒りを買い、討伐の風評に恐れをなして満州に渡った。ついで蒙古に入って一地を攻略し次第に近隣諸国を併合してついに國を元とした。自分が去年支那に渡航したとき、元の太祖の建立に関わる健靖寧寺記と題する碑文を示されたことがあるが、大意が上に述べた事であり、碑の側面には鳥居が刻んであった。因に明治にこの碑文が問題にされたとき、健セリュウ（青竜）寺記と聞き間違われ、義経の墓ともされてしまった。大島は碑文を写し、西周もシーボルトからの太祖は義経、妖僧は弁慶と聞かされたが、信じなかった。蒙古字の碑文も示されたが、漢字、ラマ教の名があったと記されている。(『義経入夷渡満説書誌』Ｐ61『末廣の壽』1869年からの引用)