「マフィア主犯説」は、かつてジアンカーナらがケネディ本人や父のジョセフ・ケネディ・シニアによる依頼を受けて、大統領選挙におけるケネディ陣営の資金集めや不正を手伝ったにもかかわらず、その後ケネディがフーヴァーやロバートの忠告を受けてジアンカーナや共通の友人であるフランク・シナトラらとの関係を突然断った上に、ケネディ政権がロバートを中心にしてマフィアに対する壊滅作戦を進めたことを「裏切り」と受け取ったジアンカーナらを中心としたマフィアが、「裏切り」への報復と壊滅作戦の停止を目論んで行ったとするものである。しかし、これには反論もある。大統領をいきなり暗殺することで生じる国家安全保障上のリスクを引き起こしたマフィアに対し軍部、諜報組織などから報復措置が全くとられていないという事実から考えて、彼らが事件の主導者であったとは考えにくいという意見である。第一、彼らがどれほどケネディを憎んでいたとしても、犯罪組織としての利益のみで核戦争のリスクに関わる事態を引き起こすことは自らをテロ組織として位置づけることとなり、国家安全保障上の脅威としてアメリカのみならず主要国から一斉に弾圧の対象にされてもおかしくないリスクとなるはずであり、マフィアがその問題をどう解決できるのかという疑問が生じてしまうのである。その為、この事件ではマフィアは実行部隊としては動くことは出来ても計画と手配を推し進める政治力に欠けており、実行部隊の中心にはなりえても、計画の立案から証拠の揉み消しを含めた論議の沈静化を図れるほどの実力は無く、事件に関与はできても主導する組織とはなりえないとする意見が多い。
オズワルドによる単独の犯行であったとする政府の公式説明に納得せず、何らかの陰謀があったと主張するものも多い。2003年の世論調査では、70パーセントの人々がケネディ暗殺は単独犯ではなく複数犯による犯行であったと考えている。実行犯についてもオズワルド以外に狙撃したものがいたとする説もある。証拠物件の公開が政府によって不自然にも制限されたり、大規模な証拠隠滅が行われたと主張するものもいる。リー・ハーヴェイ・オズワルドがダラス市警察本部でジャック・ルビーに射殺され、さらにジャック・ルビーが服役中に病死したのは口封じのためであるとする意見もある。陸井三郎は目撃証言者12人が変死または怪死していると主張している。今日までに下記のような仮説、陰謀説が提示されている。
この報告書が出てから9年後の1973年1月にジョンソン前大統領が世を去ったが、亡くなる前に「自分はオズワルドが引き金を引いたことまでは承服できる。だが委員会が暗殺事件を徹底的に掘り下げたかどうかは確信がない。私のカンだが、オズワルドは失敗に終わったキューバ侵攻作戦への復讐を狙うキューバ人と関連があったのではないか」と語っている。また、1975年4月25日の夕方のCBSイブニングニュースでウォルター・クロンカイトは、ジョンソンがケネディ暗殺がオズワルドの単独犯行だとは一度も考えたことがないとそれよりも6年前の1969年にインタビューで述べていたことを明らかにした。また、最初にCIAを疑ったロバート・ケネディだが、50年後の2013年1月に息子のロバート・ケネディ・ジュニアがテレビでのインタビューで、父親がウォーレン委員会の答申を全く受け入れていなかったことを明らかにした。
1976年に、下院で1960年代のケネディ兄弟とキング牧師らの相次いだ暗殺事件について真相解明のための特別委員会下院暗殺調査委員会が設置されて2年間（1976年-78年）の調査が行われた。このケネディ暗殺から13年後の調査によると、暗殺前後の数分間、ダラス警察の白バイ警官のマクレーン（H・B・McLain）の無線は「送信」状態にされ、警察無線の通信指令席でレコーダー（プラスチックベルト）に記録されたとされる。下院暗殺調査委員会は、この口述録音機用録音テープの証拠の研究から、銃声は4発であるとして、狙撃者はオズワルド以外にもう一人いた可能性が高いと結論した。このテープはアメリカ国立公文書記録管理局に保管されているが、証拠能力には議論がある。下院暗殺調査委員会は音声記録の証拠認定を後に取り消している。
委員会は暗殺時に三つの弾丸が発射され、二発の弾丸がケネディ大統領とコナリー知事に命中した。その弾丸は全てリー・ハーヴェイ・オズワルドがパレード車列の後方にあったテキサス教科書倉庫から発射した物として結論を下した。委員会の判断はケネディ大統領の上背部に命中した弾丸は、首の正面近くを貫通し、コナリー知事を負傷させたと思われる。一発は車列から外れたと考えられる（三発の内の何射目かは特定できない）。そして最後の弾丸は大統領の頭部に命中し致命傷となった。委員会は教科書倉庫の6階で3つの薬莢が発見されたことに注目していた。ライフル銃は近くに隠されていたことが判明した。ケネディとコナリーは別々の弾丸で傷つけられたのではなく、両者とも同じ弾丸で傷ついたとするのが適当だと提示した。弾丸はほとんど形状を保ったまま 担架（stretcher） から発見されたとされる。この説はシングル・バレット・セオリーとして知られるようになった。銃弾の入口とされるコナリー知事の背部（右半身）の傷は、出口とされる胸部（右半身）の傷より小さかった。銃弾の入口とされる右手首（甲側）の傷は出口（掌側）よりも大きかった。この問題について、胸部を貫通した銃弾が回転し、前後逆に手首に侵入したとする「回転説（Tumbling Theory)」がある。
慶長3年（1598年）の秀吉死後は徳川家康に接近し、石田三成や前田利家ら反家康派との調整・周旋を務めた。慶長4年（1599年）2月5日付で家康の重臣・井伊直政が吉晴に対して周旋に対する感謝状を贈っている。そして老齢を理由に慶長4年（1599年）10月1日、家督を次男の忠氏に譲って隠居した。その際、家康から越前府中に5万石を隠居料として与えられている。これは家康から知行を与えられた最初の例である。慶長5年（1600年）の関ヶ原の戦いでは東軍に与した。家康が会津征伐に赴く際に浜松において忠氏と共に歓待し、家康に従軍を求めた。しかし従軍は忠氏のみでよいとして、吉晴には越前への帰国を命じられた。その帰国途上の7月、三河刈谷城主・水野忠重、美濃加賀野井城主・加賀井重望らと三河国池鯉鮒（現在の愛知県知立市）において宴会中、重望が忠重を殺害した。吉晴も17か所の槍傷を負ったが、重望を討った。なお、吉晴の菩提寺である京都市春光院に残る吉晴木像には左頬に深い傷跡が彫りこまれており、この際の傷ではないかと推測されている。また、事件の際は殺害現場を見た忠重の家臣に殺害の主犯と勘違いされたという逸話も伝わる。このため9月の本戦には参加できずに越前に帰国した。代わって出陣した忠氏が戦功を賞され出雲国富田24万石に加増移封された。なお、吉晴は密かに近江、北国の情勢を家康に報せていたともされている。