キャラクターデザインの貞本義行によると、キャラクターのイメージはルパン三世（旧シリーズ）の峰不二子を基にして、前髪のデザインをアニメ『美少女戦士セーラームーン』の月野うさぎから拝借したもの。その後、担当の声優が同じ三石に決まったことを聞き苦笑いをした。庵野秀明は、「何かの宴会で三石の姿を見て、葛城ミサトのキャラクターイメージを得た」と語っている。また設定資料集には、杉本彩みたいなルックアイとの記述がある。なお、TV版および新劇場版の次回予告は三石琴乃が担当している。予告や宣伝での「サービス、サービスぅ」の台詞は本編で使われたことはない。2012年10月、動画共有サービス「ニコニコ動画」とヱヴァンゲリヲン新劇場版のコラボレーションが実現し、動画閲覧ページと生放送ページが「ニコニコ動画：Q」「ニコニコ生放送：Q」にバージョンチェンジした。その中で、閲覧しようとした動画が削除されていた場合、その旨を案内するナレーターを務めている。
『新世紀エヴァンゲリオン2』では、条件を満たしていると戦略自衛隊の攻撃で死亡しない。その場合は戦略自衛隊の兵士を予め通路に仕掛けておいた爆薬で爆殺し、チルドレンを無事にEVAの元に送り届け、発令所に戻って量産機戦の指揮を執るといったストーリー展開になる。『名探偵エヴァンゲリオン』では、特務機関NERV戦術作戦部作戦局第一課所属一尉であると同時に、シンジたちが通う学校の教師も兼任している。また、本作では唯一シンジたちの敵になるというエピソードがある。プレイステーション3にて、ニュース読み上げサービスソフト『葛城ミサト報道計画』が2009年6月6日より配信されていた（2010年6月5日サービス終了）。ミサトがニュースキャスターに就任し、インターネット経由で配信されるニュースを読み上げるという設定である。演じる三石琴乃の声をサンプリングした合成音声による読み上げのため、通常のニュース原稿読み上げとはアクセントやイントネーションに違いが出る。「スーパーロボット大戦シリーズ」に『エヴァ』が登場する際にはミサトも登場しているが、そのうちの1つ『スーパーロボット大戦Scramble Commander』では実質的な主人公として登場する。
階級は一佐に昇進。愛車のA310（『序』よりナンバープレートが「東2 ネ 33-10」と設定される。「33-10」は「3（ミ）」「3（サ）」「10（ト）」の語呂合わせ）は第7使徒戦で2号機の着陸に巻き込まれ大破。以降はマツダ・コスモスポーツに乗る。携帯電話の着信音に科学特捜隊作戦室の電話の音を使用している。
階級は二佐。旧世紀版ではリリスの安置された部屋の扉を開ける権限は持っていなかったが、新劇場版ではNERV職員にリリスの存在が認知されているので扉を開ける権限を持っており、レベルEEEフロアのリリスをシンジに見せており、シンジがパイロットとして再起させるきっかけを作った。旧世紀版と比べると、シンジに対する言葉にも変化がみられる。例として、ミサトがシンジに「エヴァに乗る気はあるの？」という問いかけへのシンジの返答に対して旧世紀版では「嫌ならここから出ていきなさい！」という厳しい口調だったが、新劇場版では「嫌ならここから出て行ってもいい。すべてあなたの自由よ」とセリフがある程度ソフトな口調に変わっている。これより少し前の第5の使徒戦で命令を無視したシンジを咎めた時に彼の態度に腹を立てて殴ろうとするが、シンジが去った直後に指導力の低さを後悔する描写がある。第6の使徒戦ではシンジを更迭しようとしたゲンドウを制止し、「自分の息子を信じて下さい」と説得している。
特務機関NERV（ネルフ）戦術作戦部作戦局第一課所属で階級は『序』では二佐、『破』で一佐に昇進。碇シンジと式波・アスカ・ラングレーの保護者兼上司で、エヴァンゲリオン（EVA）の戦闘指揮官。葛城家にシンジとアスカを住まわせている。ペットにペンギンのペンペンがいる。
シンジと同居を始めたのは、孤独な彼に同情した行為からであった。公式の場では「シンジ君」と呼ぶが、プライベートでは「シンちゃん」となる。年齢的に姉と母の中間になるが、綾波レイとの関係を冷やかしたり、年上の友達としてくだけた付き合い方もしている。アルミサエル戦でレイが死亡した時は、傷心のシンジをセックスで慰めようとしたとも思われるような身体的接触を試みるが、結局シンジに拒否された。劇場版第25話でも、死の直前に恋人のような会話を交わす。このようにシンジとの関係は、親・姉・友・恋人と多面的な側面を持っている。シンジを家族のように大切に思っている。
一年の中で最も寒い時期の、未明から明け方の時間に行われる。昨今は社会・生活背景などもあって、暦の上での大寒の前後に行われる稽古を指す。また神道や修験道、仏教の一部などで寒修行または寒行と称して、海・川などの水に入る、或いは滝に打たれる滝行などをして精神を鍛錬していることから、武道の寒稽古でこれを取り入れていることも多い。武道では極限状態まで自らの身体・精神を追い込み、そこで自らの弱さに打ち勝ち(克己)自らの前途を開くことを一つの眼目としている。また、武道の失われつつある特性を見ることのできる数少ないものの一つである。俳句の季語としても用いられることもある。寒稽古は根本的に科学トレーニング、一般トレーニングとは正反対で非効率的であり、寒い時には屋内である程度温度を高くした状態でトレーニングや稽古を行う方が効果が高く怪我や負傷も減る。しかし、日本の伝統的な身体操法の練習方法（立切り稽古・暑中稽古・百人組手等）においては体力・技術的レベルの向上よりも精神鍛錬に重点が置かれていることが多く、効率性や練習するのに快適・適切な環境というものは排除される傾向にある。