基本的に地下ホームは8・10両編成（各駅停車）が、地上ホームはロマンスカーと10両編成（急行・快速急行）が始発として運転する。当駅に到着する際は全ての列車が両数に関係なく最奥（最も西口地上／地下改札に近いところ）の一定の場所に停車・到着する。乗車と降車で別のホームを用いるが、朝のラッシュ時間帯は乗車ホーム側にも乗客を降車させる。特急ロマンスカーは乗客を降車させた後に車内の清掃と点検を行い、同じホームから乗車させる。回送運転で到着した場合には到着後すぐに乗車できる。地上ホームの隣の駅は代々木上原が表示されている。ここから出発する列車は特急ロマンスカー・快速急行・急行であり、特急ロマンスカーを除いては次の停車駅が同駅であるからである。また、地下ホームの隣の駅は各駅停車の南新宿が記載されている。なおかつて区間準急が運転されていたころの地下ホームは南新宿と代々木上原が併記されていた。ホームののりば案内では、のりばの番号と種別（または降車専用）が表記されており、具体的な駅名は記載されていない。地上線と地下線の分岐点（合流点）は都道四谷角筈線踏切を跨いだ先の隣の南新宿駅すぐ近くにあり、そこまでが新宿駅の構内となる。すなわち、4線が併走する部分を長く取ることによって、終日間断なく発着する列車を捌いている。
東寄りの階段またはエスカレーターを乗り継ぐと地下1階で、ここに京王新線口改札口があり、京王モールの南の地下広場に出る。改札手前の北寄りに京王線の3番線乗車ホームに抜ける通路とトイレがある。また地下4階から大江戸線ホームに抜ける連絡通路がある。そしてホームから西寄りの階段を上がると地下1階に新都心口改札口がある。トイレは京王新線口北寄りの京王線3番線乗車ホームへの通路の脇にあるが、車椅子などでの利用には対応していない。改札外の京王新線口と新都心口をつなぐ連絡通路（フレンテ新宿）には車椅子などでの利用に対応したトイレが設置され、併設された多機能トイレに温水洗浄便座が設置されている。エレベーターは改札内と改札外を直結するものとホーム・大江戸線連絡通路（後述）・京王新線口を改札内で結ぶものの2基がある。このうち前者は業務用であるため一般の客は利用できない。エスカレーターは新都心口から途中の地下4階→ホーム（地下5階）がない他は改札とホームの間のみを移動する。定期券うりばは2006年（平成18年）6月まで京王と都営で共用していたが、翌7月から別々になった。なお、京王側は2009年（平成21年）末に廃止されている。
7 - 16番線の北端を東西に連絡する地下通路である。東端は東口でルミネエスト新宿の地下1番街に出る。西端は西口で小田急百貨店新宿店の階下であり、西口地下広場に出てバスターミナルに連絡している。共に地下改札であるが、地上にもみどりの窓口がある。東口手前から後述の中央通路に通じる地下通路があり、「アルプス広場」と呼んでいる。そのアルプス広場には7・8番線用の上下のエスカレーターやトイレのほか、BECK'S COFFEE SHOPがある。15・16番線から北通路へのエスカレーターは下り方向のみであり、大久保・新大久保方に設置されている。SuiPo（Suica連動型広告、後述）が東口付近に設置されている。北通路を17mから25mに拡幅した上で、東口と西口の改札を北通路の南側に移設して北通路を自由通路化させる工事が進められており、2020年7月に供用予定である。これにより駅周辺の歩行者が改札内に入らずに東口・西口間を移動する際に、南側の甲州街道や北側のメトロプロムナード（地下街）や角筈ガードや大ガード（靖国通り）に迂回する必要がなくなり、利便性が飛躍的に向上する予定である。
JR東日本では、ヤマハに発車メロディ放送システムの開発を依頼し、1989年（平成元年）3月11日に当駅と渋谷駅に首都圏で初となる発車メロディを試験的に導入した。この目的は、従来より不評であった電子ベルによるイライラ感を解消するためであった。ヤマハが制作した曲には、ピアノやハープ、マリンバなどの音色の後ろに鈴、川のせせらぎ、鳥のさえずりといった人の心を落ち着かせる音が入っている、長さ数秒程度のシンプルで素朴なものだった。この取り組みは乗客に好評だったため、他の駅にも発車メロディが導入される運びとなったが、以後、水戸駅を除きヤマハが制作した発車メロディが他駅に導入されることはなかった。長年、当駅のオリジナル曲として使用されていたが、放送機器の老朽化により、1997年（平成9年）11月29日の3・4番線を皮切りに順次テイチク制作の曲への変更が行われ、2001年（平成13年）12月16日の1・2番線の変更を以て全ホームの発車メロディの変更が終了した。
人間の血を吸うほかは、赤いバラやそのエキスを食用とし、基本的にそれ以外の食べ物は摂（と）らない。また、ある程度の技量があれば、相手をバンパネラ化させることなく血を吸うことができ、触れるだけで生気を吸い取れるという（「ポーの村」）。ただし、血を吸われた者がバンパネラ化しなかった場合、バンパネラの因子が体内に潜伏して子孫の代で発現する可能性がある（「小鳥の巣」）。また、バンパネラ同士で血を分け合うといった描写も見られる。映らないとされる鏡に映るよう偽装することができる（「ポーの一族」）。さらに本来は呼吸、脈拍、体温も持たないが、同様に偽装できる。ただし、脈拍/体温は、大ケガをするなど体力が弱っていると、偽装しても通常の人間より少ない/低い（「エヴァンズの遺書」）。一般的に吸血鬼の弱点とされる日光は平気で日中でも出歩いている。十字架や聖書も慣れることである程度苦手を克服できるが、十字架そのものよりも、それに込められた信仰が彼らにとっての脅威となる。銀の弾丸や杭またはこれに類する先のとがったもので胸を貫かれると消滅する。「春の夢」にてポーの一族以外の吸血鬼が初めて登場し、同じ吸血鬼であっても血統によって能力に違いがあることが明らかにされた。ポーの一族は眠って過ごす者が多く、またヴァンピールのファルカはエドガーにはない吸血鬼の能力を持っている。