南北朝時代には南朝方に属し、北朝方と戦った。南北朝の争乱が一段落した後は島津氏に服属していたが、戦国時代に入ると領土問題から島津氏と対立し、日向の伊東氏と手を結んで島津氏と争う。第16代当主肝付兼続は名将で、竹原山の戦いで島津忠将（島津貴久の弟）を討ち取ったり、志布志郡を奪取したりなどして、一時的には島津氏を圧倒していたが、永禄8年（1566年）、島津軍の反攻に遭って自害してしまった（ただし、自殺を否定する説もある）。これにより、肝付氏は急速に衰退してゆく。第18代当主肝付兼亮は、父の復讐を果たさんと島津氏に反抗したが、天正元年（1573年）、それをかえって親島津氏の家臣たちと義母・御南（島津貴久の姉）に反対されて、当主の座を追われてしまうこととなる。第19代当主に擁立された肝付兼護は、天正2年（1574年）に島津氏に臣従して、家名こそ存続することはできたが、天正8年12月（1581年1月）には領地も没収されて、島津氏の一家臣となる。これにより、大名としての肝付氏は滅亡したのである。慶長5年（1600年）に関ヶ原の戦いで兼護が討死すると、長男・兼幸は琉球国王尚寧王を江戸に連行した島津忠恒(家久)に同行した際、帰国途中の筑前国愛島で暴風雨に遭い溺死した（享年19）。子孫は島津氏一族の新納家からの養子を迎え薩摩藩士として存続した。庶流は早くから島津氏に仕えて重用され、江戸期には喜入領主、家格は一所持（5500石）として存続した。同家より小松清廉（小松帯刀）が出る。その他の庶流も薩摩藩士、佐土原藩士として多くが残っている。声優の肝付兼太（本名：肝付兼正）も肝付氏庶流の末裔である。
本姓は伴氏である。平安時代に伴兼行（伴善男の玄孫、善男 → 中庸 → 仲兼 → 兼遠 → 兼行）が薩摩掾に任命されて下向した。兼行の子に行貞がおり、その子兼貞（妻は島津荘開墾者・大宰大監平季基の娘、又は季基の子・兼輔の娘）は大隅国肝属郡の弁済使となり、その子の兼俊の代に郡名を取って肝付（旧字体: 肝属）を名乗った。
永正5年（1508年）、蒲生高郷の子として誕生。父と共に南近江の戦国大名・六角氏の家臣として仕えた。定秀の父・高郷は蒲生氏の分家で、本家の家督は定秀の従兄弟・蒲生秀紀が継いでいたが、秀紀が幕府寄りであったのに対し、高郷・定秀は主君・六角定頼の信任を受けていたため、その後ろ盾を得て「定」の一字を賜って定秀と名乗った。また六角家中有数の重臣である馬淵氏から正室を迎え、六角家中での地位を固めた。大永2年（1522年）に音羽城の蒲生秀紀を攻撃し、翌大永3年（1523年）3月に8ヶ月に及ぶ籠城戦の末に秀紀を降服させ、六角定頼の仲裁で秀紀から定秀に蒲生家の家督を譲る事で和睦が成立し、蒲生家の家督を相続した。また、当時の蒲生氏の居城であった音羽城はこの時に定頼によって破却されている。さらに大永5年（1525年）、鎌掛城にあった秀紀を謀殺。その後、天文年間前半に日野城（中野城）を築き居城とした。定秀は定頼の家臣として享禄3年（1530年）の京都出陣や享禄4年（1531年）の浅井亮政との戦いなどでは29の首級を挙げるなど（蓑浦の戦い）、定頼の主要な合戦の大半に参加し、大いに武功を挙げた。天文8年（1539年）、定頼に従って上洛。天文18年（1549年）には三好長慶と摂津国で戦っている。天文21年（1552年）の定頼死後はその子・六角義賢に仕え、伊勢国攻略を任されるなど活躍した。永禄元年（1558年）に出家する。永禄2年（1559年）には浅井久政の属城であった佐和山城、永禄5年（1562年）には種村三河守が守る八仏手城を攻めている。同年、義賢に従って上洛。次男・茂綱を佐々木一族の青地氏へ、三男・実隆を伊勢攻略の前任者である小倉氏の養子に入れ、娘を伊勢の関盛信、神戸具盛に嫁がせるなど、婚姻政策によって独自の勢力を築いた。内政面にも優れ、定頼の信任を受けて城下町の形成や商業対策などを行なっている。日野椀の製造は城下町の成立と共に始められた。また、鉄砲の重要性を早くから認識しており、日野城下に鉄砲職人を招聘している。永禄6年（1563年）、六角氏内部にて観音寺騒動が起こると、後藤高治、続いて主君・六角義治を匿ってその調停と収拾に尽力した。永禄7年（1564年）に小倉宗家に養子に入れていた実隆が小倉西家（小倉氏庶流家の一つ）との抗争の中で敗死すると、定秀は小倉西家の拠点である山上城や八尾城を報復攻撃し、小倉西家を滅ぼして所領を拡大した。永禄10年（1567年）の六角氏式目にも六角氏の宿老として署名している。永禄11年（1568年）、六角氏が滅亡した後は織田信長に仕えた。天正7年（1579年）に死去。享年72。