26回放送分の内、前半部は2話または3話構成のオムニバス形式となっている。鉄人登場編2話、モンスター編3話、スリルサスペンス編3話、ケリー編3話、短編集3話、京都編2話となっている。短編集3話では鉄人はほとんど活躍せず、正太郎の少年探偵としての活躍を描いている。それぞれの部分は独立性を持ちながらも、後半部の伏線として、「戦争と兵器」、「人造人間」、「善悪はリモコン次第」、「超人間」、「科学者の悲劇」、「人工知能」についてを説明している。後半部は連続したストーリーであり、まだら岩編4話、黒部編6話となっている。この部分は原作の設定がかなり変えられた部分が多い。大塚署長が更迭され、敷島博士が自殺し、鉄人の行動が制限され、少年探偵としての活動もできなくなり、金田邸も取り上げられて、暗い雰囲気が漂っている。大塚署長と敷島博士の関係も、前半では公人としての関係を保っていたが、後半は無二の親友に切り替えられている。ただし、結末に関しては本来原作者である横山がやりたかったとされるものを元にしている。予算面から大型ロボットの格闘シーンは少なくならざるを得ず、その代わりに正太郎とその「父」である金田博士、大塚署長、敷島博士らとの親子の情愛が強く描かれている。科学技術に溺れる科学者とその悲劇を繰り返し描いている。しかし、科学や科学者自体を否定的に描写するのではなく、時代の流れからやむをえないものとして捉えている。
原作の連載時期である昭和30年代を舞台に、「もはや戦後ではない」と言われた当時の日本の風物を積極的に取り入れ、ノスタルジックな雰囲気を醸し出しているのが特徴。原作のイメージを重視しているがストーリーはアニメオリジナルで、ロボット活劇よりも鉄人も含めた太平洋戦争の残した闇の遺産の数々に、戦時中の記憶を持たない少年である金田正太郎が直面するヒューマンドラマが重視されている。オープニング映像は、アニメ第1作の雰囲気を残しながら鉄人の勇姿を描いている。昭和30年代の東京上空を鉄人が飛び、夜の銀座交差点、跳ね上げ式の勝鬨橋、隅田川土手、おばけ煙突などが登場する。放送中の2004年4月15日に原作者の横山光輝が急逝したため、追悼文を画面上部に流した（ローカル編成の深夜アニメのため、追悼文が流れた日付や話数はネット局によって異なる）。
本作品はメディアミックス戦略を取り、同時期にPlayStation 2によるビデオゲーム、音楽集CD、本作品のDVD化、オリジナルアニメ（モノクロ版）DVDの再パッケージ販売、フィギュア付き食玩の販売、超合金ミニチュアの販売、鉄人28号解説本、実写版映画の公開、劇場版アニメの製作が行われた。また、原作漫画の完全復刻版の発売も開始された。2007年3月には本作の作風（一部キャラクター設定については、相違あり）をベースにした劇場アニメが公開された（詳細は『鉄人28号 白昼の残月』を参照）。
尿素回路の反応速度はN-アセチルグルタミン酸の濃度に依存している。なぜなら第一段階の反応であるアンモニアと炭酸からカルバモイルリン酸を生成する反応を触媒する酵素：カルバモイルリン酸シンテターゼ I (CPS I)は、N-アセチルグルタミン酸によってアロステリックに活性化されるためである。アミノ酸分解の速度が上がるとその脱アミノ反応によりグルタミン酸の合成速度が上がり、これがシグナルとなってN-アセチルグルタミン酸の合成速度が上がる。その結果、CPS I が活性化されて尿素回路が活発になる。N-アセチルグルタミン酸はグルタミン酸N-アセチルトランスフェラーゼによってグルタミン酸とアセチルCoAから合成され、特異的ヒドラーゼによって分解される。
1994年にはセカンド・アルバムとなる『ザ・ダウンワード・スパイラル』をリリースした。このアルバムはビルボード誌のチャートで初登場2位を記録し、NINの評価を決定的にする作品となった。2003年にローリングストーン誌が企画した「500 greatest albums of all time」の200位にランクインし、2005年のスピン誌が企画した「100 Greatest Albums, 1985–2005」の25位にランクインを果たした。NINはこのアルバムのフォロー・アップツアーとして「セルフ・ディストラクションツアー」と冠されたツアーを行った。このツアーの中で「ウッドストック 1994」に参加した。「ウッドストック 1994」は土砂降りの雨中でライブが行われた。泥まみれの観客が待つ中、バンドメンバーも泥まみれの姿でステージに登場したNINのパフォーマンスはNINのキャリアの中で最も有名なエピソードの一つとなった。「ライブの直前はいつも吐きそうな気分だった、それは本当にナーバスな日だった。ステージに向かう途中で俺がDannyを押したら、奴は顔から泥に突っ込んだんだ。で、奴が俺にタックルしてきて、それは男だけの泥レスリングみたいなのに変わった。それをやった後、不安はすっかり消えたんだ。」とトレントは言っている。さらに、トレントはオリバー・ストーン監督の『ナチュラル・ボーン・キラーズ』のサウンドトラックをプロデュースした。NINはこのサウンドトラックに「サムシング・アイ・キャン・ネヴァー・ハヴ」、「ア・ウォーム・プレイス」、そして当時未発表曲の「バーン」を提供している。1995年にはセカンド・アルバムのリミックス作品となる『ザ・ファーザー・ダウン・ザ・スパイラル』(Further Down the Spiral) をリリースした。この作品はUS盤とUK盤の2種類が発売されており、それぞれ収録曲が異なっている。本作ではエイフェックス・ツイン、有名プロデューサーのリック・ルービンらがリミックスを手がけている。なお、リック・ルービンのリミックスにはジェーンズ・アディクションのギタリストであるデイヴ・ナヴァロがギターで参加している。同年、デヴィッド・ボウイのシングル「The Hearts Filthy Lesson」のリミックスを手掛け、ボウイと共に「ディソナンス・ツアー」と冠されたツアーを行った。これはまず前座のNINが演奏し、その後ステージにデヴィッド・ボウイが登場してそれぞれ互いの曲を共演、そしてNINがステージを降りデヴィッド・ボウイの演奏に移行するというものであった。ボウイはトレントと共に「レプタイル」や「ハート」を歌った。トレントの愛犬、ゴールデン・レトリバーのMaiseが3階から落下して死亡。