登場時から1997年10月の京都市営地下鉄東西線開業までは京津線の準急にも使われていたが、以降は800系が京津線で使用され、本系列は600形とともに石山坂本線で運用されている。なお、京津線で使用されていた名残で現在でも方向幕には三条・四宮・浜大津（三条は準急のみ、四宮・浜大津は普通・準急それぞれ存在するほか、浜大津は種別が併記されていないものも入っている）の表示が残されている。1997年10月以降京津線には定期運用上入線することはないが、夏のビール電車や冬のおでん電車等の臨時列車として四宮まで入線することもある。2005年2月13日には、703-704編成に春待ち灯りトレインに使用され、当時おけいはんを演じていた江本理恵が一日車掌を務めた。
ロコ1000形は竣工後、阪和電鉄線の主力電気機関車として重用された。その使用範囲は単なる貨物列車牽引に留まらず、間合い運用で東和歌山駅での南紀直通列車黒潮号用客車の省線との受け渡しに伴う入れ替え作業などにも用いられていた。本形式は阪和電気鉄道の南海鉄道への合併後も改番されず同社山手線となった旧阪和電鉄線でそのまま使用され、その間に最後の増備車となったロコ1004が完成している。さらに、戦時買収による国有化後も阪和線となった旧阪和電鉄線で運用され続けた。摩耗部品を中心とした機器の国鉄標準品への換装や1基搭載であったロコ1004へのパンタグラフ1基の追加搭載などといった整備が進んだ1952年には、「ED38形」という国鉄称号を与えられED38 1 - ED38 4となったが、その時点でも主任務は阪和線区間貨物列車牽引で、新造以来の運用がほぼそのまま継続されていた。その後は老朽化が進行したことなどから代替機の投入が検討された。しかし、旅客用並に定格速度が高く実際にも高速で運行可能なその特性と、社線時代のままの設備で待避線が短く大型のF級電機を区間貨物用として投入しにくい、という阪和線の施設事情故に、国鉄の既存標準型機関車には適切な代替機を欠いていた。阪和線そのものについては、戦中・戦後の混乱期には8620形やC58形といった蒸気機関車の他、東鉄局より貸し出しの形でEF51形とED17形が鳳区に配置されて電装品が故障して自走不能の電車牽引に当たったものの、後者はそれ自体も酷使で故障が頻発するという有様で、この段階ではED38の代替を検討出来る状況ではなかった。その後、やや情勢が落ち着いてきてから旅客・貨物用として1952年以降EF52形の残存全車（EF52 1 - EF52 7）と旧富士身延鉄道が保有した買収機であるED20形3両が転入してきたが、EF52形は速度面では充分な性能を備えていたものの、21mにおよぶ国鉄制式F級電機中でも最長の車体故に区間貨物には充当が難しく、またED20形も車体が短く牽引力も申し分なかったものの、歯数比が低く高速運転性能に難がある、という問題を抱えていずれも一長一短であった。このため、これらの転入車、特にEF52形は紀勢線直通旅客列車を中心とする運用に充当された。また、阪和線区間貨物列車の牽引機については、EF15形の新製投入で余剰を来していたED16形が上越線より転属し、一時は10両を数えたものの、こちらもやはり牽引力重視のギア比がもたらす低い定格速度が祟って不評を買い、結局ED38形の代替車たり得なかった。この問題は1959年から1960年にかけて実施した、強力かつコンパクトな新型機であるED60形5両（ED60 4 - ED60 8）の新製投入でようやく解決を見ている。このED60形の新製投入で余剰となった本形式は、まず戦時設計のED38 4が1959年9月に三岐鉄道に貸し出され、黒部ダム建設向けセメント輸送の任に就いたが同年12月に返却された。これは同月21日付けで除籍されたものの引き取り手は現れず、長く鷹取工場に留置された後、1964年に解体されている。また、残る3両もED60形が出揃った1960年中に除籍された。このうちED38 2は一旦大井川鉄道に払い下げられ同社E105として客貨牽引に、他の2両は秩父鉄道に払い下げられて旧番号のまま同社デキ1形と共通運用で主に武甲線からの貨物列車牽引に用いられた。その後大井川へ譲渡されたE105（旧ED38 2）は大井川水系のダム建設工事と、これに伴う資材輸送が一段落付いた1967年に秩父鉄道に再譲渡されてED38 2に再改番され、この結果ED38 1 - ED38 3が同社に揃うこととなった。秩父鉄道への譲渡後、ED38 2は1974年に休車となり、長期休車の後、スペアパーツの入手が困難な他の2両の部品取り車として1980年1月31日付けで廃車された。残り2両もより高出力の新製電機の増備に伴って余剰化し、3号機が1981年3月14日に除籍、解体されている。最後に残った1号機は長期休車を経て1988年に廃車されたが、解体されず長らく留置された後、再整備の上で三峰口駅構内に保存展示された。なお、ED38形は先従輪無しのB-B軸配置機関車であり、しかも一般的な電気機関車より高速運転を行っていたという事情から、戦後に国鉄がEH10形電気機関車を開発する際、本形式が詳細に調査されている。EH10形のDT101ウィングばね式ボギー台車の設計にあたっては本形式の台車の構成が参考になっているという。