2008年6月16日に110mハードルで13秒43（+0.9）のチェコ記録（当時）を樹立し、1987年にJiří Hudecがマークした13秒48を21年ぶりに塗り替えた。2008年9月に年間王者決定戦と呼ばれたワールドアスレチックファイナルの110mハードルに出場すると、自己ベスト（当時13秒29）に迫る13秒33（-1.3）をマークし、デビッド・オリバー（13秒22）に次ぐ2位に入った。2009年8月に世界選手権の110mハードル準決勝を全体4位の記録となる13秒33（+0.9）で突破し、チェコスロバキア時代を含めてもこの種目でチェコ勢初のファイナリストとなった。決勝は13秒38（+0.1）とタイムを落とし6位に終わった。2011年3月にヨーロッパ室内選手権の60mハードル決勝を7秒49で制し、チェコになってからはこの種目でチェコ勢初、チェコスロバキア時代を含めると1988年ブダペスト大会のAleš Höffer（男子）以来となる金メダルを獲得した。2011年4月にグラン・カナリア島で行っていたトレーニングキャンプ中に脚を負傷。これ以降は怪我に苦しみことになり、アキレス腱の手術を複数回重ねた結果、2014年にようやく復帰することができた。2012年9月にチェコの棒高跳選手のジリナ・スヴォボドヴァ（2014年ソポト世界室内選手権銀メダリスト）と結婚したが、2014年に離婚した。
2001年7月2日、GKとしては史上最高額の移籍金となる5230万ユーロ（約56億円・当時）でマルチェロ・リッピ監督率いるユヴェントスFC（以下ユーヴェと表記）に加入。当初はGKにこれほど多額の移籍金を支払ったユーヴェに懐疑的な見方をする専門家が多かったが、「サッカーをよく理解していない者の戯言」とブッフォンは反論し、その年のスクデット獲得に貢献をした。2002-03シーズンでは、セリエA連覇を達成。UEFAチャンピオンズリーグでは、準決勝2nd legのレアル・マドリード戦でルイス・フィーゴのPKを止めるなど活躍し、決勝進出。しかし、オールド・トラッフォードで行われたミランとの決勝戦でPK戦の末に敗れて準優勝に終わった。なお、このシーズンはUEFAチャンピオンズリーグのMVP（GKとしては史上唯一）と最優秀GKに選出された。2004年3月にFIFAが100周年を迎えるにあたって、元ブラジル代表ペレが選出したFIFA 100（偉大なサッカー選手125人）に選出された。2005-06シーズンでは、8月14日に行われたミランとの親善試合でカカと激突し、右肩を脱臼。長期の戦線離脱を余儀なくされ、ユーヴェはその代役としてクリスティアン・アッビアーティをミランから獲得。一旦、同年12月1日のコッパ・イタリア、ACFフィオレンティーナ戦で復帰するが、カペッロ監督のまだ十分に回復していないとの判断により、その後の試合には出場せず。1月15日のレッジーナ・カルチョ戦で再度復帰。以降は正GKの座を奪還した。2006年6月-7月に、カルチョ・スキャンダルでイタリアサッカー界が揺れる中、ブッフォン自身にも違法なサッカー賭博に関与したのではないかとの容疑が掛かり、パルマ地検とトリノ地検から事情聴取を受ける（後に無実であることが判明）。2006年8月、所属チームであるユーヴェの八百長行為によりチームがセリエBへ降格することが決定し、カンナヴァーロやジャンルカ・ザンブロッタなど多くのチームメイトが移籍していく中、アレッサンドロ・デル・ピエロやパベル・ネドベドらと同じくユーヴェに残留する意向であることを代理人を通じてラジオで発表した。2006年11月、2006 FIFAワールドカップでの活躍によりバロンドール受賞が噂されたが、投票の結果2位に終わり、イタリア代表のチームメイトであるカンナヴァーロにその栄誉を譲った。2006-07シーズンでは、チーム最多となる38試合に出場し、ユーヴェをセリエB優勝に導いた。シーズン中からUEFAチャンピオンズリーグ出場のため、他チームへ移籍するのではないかと噂されたが、シーズン終了後にユーヴェとの契約を2012年まで延長した。2007-08シーズンでは、2008年3月14日にユーヴェとの契約を2013年まで延長した。2009-10シーズンでは、シーズン開幕から好調を維持していたが、2009年12月12日に左膝半月板の手術を行った。2010/11シーズン2010 FIFAワールドカップのイタリア代表メンバー23人に選ばれたが、連覇を狙ったこの大会でグループリーグ初戦のパラグアイ戦で負傷退場。その後、椎間板ヘルニアのため手術を受けた。11月に練習に復帰し、12月にはベンチ入りも果たしたが暫くはマルコ・ストラーリの控えとして過ごした。2011年1月14日のコパ・イタリア5回戦のカルチョ・カターニア戦で実戦復帰。その後1月16日のASバーリ戦でリーグ戦初出場を果たした。このシーズンは、本来のプレーには程遠く移籍後最少の16試合の出場に留まり、チームも7位に沈んでチャンピオンズリーグはおろかヨーロッパリーグの出場権すら獲得できなかった。2011/12シーズン久々にシーズン開幕から好調を維持し、セリエAでチーム2番目となる35試合に出場した。チームはセリエA最小失点（20失点）で2002-03シーズン以来9年ぶりの優勝（38戦無敗）に貢献した。また、個人的にもサッカー統計組織「国際サッカー歴史統計連盟(IFFHS)」が21世紀のベストGKランキングを発表し、1位に選ばれた。2015-16シーズン2016年3月20日のトリノFCとのトリノダービーで1993-94シーズンに元イタリア代表GKセバスティアーノ・ロッシが記録した929分のセリエAにおける無失点記録を更新する「974分」の無失点記録を達成。2016-17シーズン、10月、ゴールキーパーとしては初の、ゴールデンフットアワードを受賞、1月には11度目のセリエA最優秀ゴールキーパー賞、またセリエAベストイレブンに選ばれた。2017年3月19日のUCサンプドリア戦ではユベントスにおいて史上最多出場記録となる3万9706分を記録した。チャンピオンズリーグ準決勝ASモナコとのファーストレグの試合でチャンピオンズリーグ100試合出場を達成。またモナコの決定機を数回防ぎ、チャンピオンズリーグ史上初の6試合連続無失点試合を達成した。チームはセリエAとコッパ・イタリアと史上初の3年連続国内二冠を達成し、チャンピオンズリーグでもブッフォン自身3度目となる決勝へ進出した。しかし、カーディフでのレアル・マドリードとの決勝ではクリスティアーノ・ロナウドに2ゴールを決められるなど4失点を喫し1-4で敗れ、またしても初のチャンピオンズリーグのタイトルを逃した。2016年11月にはJリーグのサガン鳥栖が、退団予定のあった林彰洋の後釜を獲るべくオファーを送ったが、重要な戦力であるとしてユーヴェ側が放出を拒んだ。2017-18シーズンのチャンピオンズリーグ準々決勝第2戦では0-3とリード（トータルスコアでは3-3）の中、試合終盤にPKの判定を不服とし審判に猛抗議、退場処分となった。この1点が試合を決め、2試合合計3-4で敗れた。その後欧州サッカー連盟は主催大会3試合の出場停止処分を科すと発表した。2018年5月17日、会見を開きシーズン終了後にユーヴェを退団すると発表した。セリエAで前人未踏の7連覇を成し遂げ、最終節で退団のセレモニーが行われた。