5000系は1986年7月10日から営業運転を開始した。営業運転開始前に試乗会が実施されたが、1日1往復2日間の予定に対して応募者の数が当初予想を大きく上回ったため、急遽1日3往復2日間に変更されるほどの評判の高さであった。当初は計画どおり本線、網干線の普通運用に充当された。登場翌年の1987年には3000系の代走で特急運用に充当されたほか、早春の観梅シーズンに運転されていた網干線直通の臨時特急である「観梅号」にヘッドマークを掲出して充当された。1988年には5000・5002編成を4両編成化、ラッシュ時を避けた限定運用ながら、特急での運用を開始した。また、同年8月から5000編成が車内広告の代わりに沿線小学校の児童の絵を掲出するようになり、「クレヨン号」のヘッドマークを掲出して運転されるようになった。1991年4月の明石周辺の連続立体化工事完成を機に、山陽電鉄では特急を6両編成で運行することとなった。山陽電鉄車両による6両編成での営業運行は初めてであるため、データ収集のための試運転も行われた。当初は夜間が主体であったが、1989年10月24日には初の6両編成による昼間試運転が東二見 - 霞ヶ丘 - 高砂 - 東二見間の各駅間において実施され、5016編成と5018編成の3両編成を2編成組み合わせた編成が充当された。1998年2月、山陽姫路と阪神梅田を結ぶ直通特急の運行が開始された。一方、阪急神戸線への乗り入れ運用が六甲から三宮までに短縮され、阪急線内に本系列が入線する機会は減少した。2016年3月より阪神特急の運用が誕生。同年1月現在、本系列は60両が在籍し、5030系2次車8両を含む6両編成が10編成は5030系と共通運用で、直通特急や特急を主体に運用され、4両編成のまま残された2編成は3000系・3050系4両編成と共通運用で、S特急や普通運用を中心に運行されている。
1995年1月17日に発生した阪神・淡路大震災では、発生時5022編成が上り阪急三宮行き特急として神戸高速鉄道大開駅付近を走行中で、トンネルが崩落した大開駅は間一髪のところで通過していたものの、全車軸のうち3軸が脱線し、また架線破断のため4基すべてのパンタグラフが破損して同駅東側に停止した。車体に大きな被害はなく、脱線復旧後新開地駅に引き上げ、地下線内の狭いスペースの中で検査とパンタグラフの換装が実施された。このほか5018編成が新開地に取り残されており、高速神戸駅に取り残されていた3070編成とともに、同年2月6日の高速神戸 - 新開地間の復旧後は同様に同区間に取り残されていた阪神5131形5131編成・5139編成の2編成と併せて新開地 - 阪神本線三宮間の運用に充当され、復旧区間の拡大に伴って岩屋駅、西灘駅へと運行区間を延長した。特に5018編成と5022編成は4両編成であった残り3本とは異なり、収容力の大きな6両編成であったことから輸送力の確保に貢献、同年6月1日の花隈 - 阪急三宮間の復旧以降は阪急線内への乗り入れも再開した。6月下旬には阪神本線も全線復旧したことから、運行区間も新開地 - 六甲・大石間と東側は旧に復したが、肝心の西側は大開の駅施設が崩落したことから復旧が8月13日までずれ込み、これらの編成は復旧前夜になってようやく山陽線内に引き上げられた。それまでの運用中は洗車ができないため、新開地・高速神戸両駅の停車時間中（4分間）に検車係員が化学ぞうきんで順次車体を拭いていく等の対応をとった。このほか、地震発生当時山陽須磨駅に停車していた5016編成4連は、揺れのためホームと車体が接触し損傷を受けている。山陽須磨駅付近の線路も被害を受け走行不能となっており、5016編成は須磨寺 - 山陽須磨間の復旧が完了した4月8日（営業運行再開の前日）に至って東須磨車庫に収容された。また、震災の前後には6両編成運用の増強のために5次車の製造が進められていたが、震災の影響によって竣工が6月にずれ込んだ。
1865年4月14日、フォード劇場においてリンカーン大統領がアメリカ連合国の信奉者ジョン・ウィルクス・ブースに銃撃され、翌4月15日朝に死亡した。国務長官ウィリアム・スワードと国務次官補フレデリック・スワードもまたブースの共犯者ルイス・パウエルによって重傷を負わされた。ホルトは連合国大統領ジェファーソン・デイヴィスとその支持者5人を容疑者として逮捕するため、新大統領アンドリュー・ジャクソンが逮捕命令書に署名を行う準備を整えた。ブースは1865年4月26日に農園の小屋に隠れているところを発見され、ボストン・コーベット軍曹によって撃たれ、その傷がもとになって死んだ。ホルトは陸軍法務総監として、合衆国下院議員ジョン・ビンガムおよび名誉准将ヘンリー・ローレンス・バーネットの2人を法務副総監に据えた。そしてホルトはリンカーン大統領暗殺に関与した被告人に対する裁判で、裁判長を務めた。被告人はジョージ・アツェロット、デイヴィッド・ヘロルド、ルイス・パウエル、サミュエル・アーノルド、マイケル・オローリン、エドマン・スパングラー、サミュエル・マッド、メアリー・サラットの8人であった。裁判は1865年5月10日に開廷した。ホルトら3人の裁判官はこの裁判において、陪審員からの評決を待つためにおよそ2ヶ月を費やした。3人は被告人の容疑について概ね慎重に審議したが、ホルトとビンガムは被告人らが計画した2件の謀略については深く追求をしなかった。1件はリンカーン大統領を誘拐し、合衆国が拘束した連合国の囚人と交換させること。もう1件はリンカーン大統領、ジョンソン副大統領、スワード国務長官を暗殺し、政府に混乱を引き起こすことであった。これらの謀略に深く立ち入らないことは、ブースから日記を入手した事実を隠蔽しておきたかった検察当局にとっては重要なことであった。だが意外なことに、弁護側はブーンの日記の提示を要求しなかった。そのため日記の存在が明らかになったのは、しばらく経過した後であった。その後ホルトは証拠を隠匿したとして告訴されたが、明らかな証拠は挙がらなかった。1865年6月29日、ホルトは8人の被告人に対して、大統領暗殺に関する有罪判決を下した。アーノルド、オローリン、マッドの3人に対しては終身刑が、スパングラーに対しては6年の懲役刑が言い渡され、アッツアーロット、ヘロルド、パウエル、サラットの4人に対しては絞首刑が言い渡された。4人の絞首刑は1865年7月7日に執行された。またオローリンは1867年に刑務所内で死亡した。アーノルド、スパングラー、マッドの3人は1869年にアンドリュー・ジョンソン大統領から恩赦を受け、釈放された。ホルトの公的な人物像は、この裁判によって大きく悪化した。後世の歴史家の大部分は、この裁判によってホルトの政治生命が終了したと考えた。1866年、ホルトは「売国者による不正な中傷、偽証者および偽証教唆者による自白、およびジェファーソン・デイヴィスの利益行動から導かれる、法務総監ホルトの正当性」と題した論説を発表し、事件に関する混乱を収拾しようとした。