京浜東北線は近年ダイヤの乱れが多く、そのうち人身事故の発生件数で見ると2004年 - 2008年は中央線快速を上回っている（2006年は京浜東北線27件・中央線快速15件、2007年は京浜東北線38件・中央線快速29件）。また、209系の機器劣化による車両故障などのトラブルの多発や、大宮駅 - 横浜駅までの全区間が他の路線と並走しているため隣接する他路線のトラブルを起因とする京浜東北線のダイヤ乱れや運転見合わせが頻繁に発生していた。なお、2007年12月からは、故障に強いE233系1000番台にて車両を置き換えた。
列車番号は、3-4桁の数字とその末尾にA-Cのアルファベットが付き、最初の3-4桁の数字の上2桁（時間帯により1桁）は始発駅の発車時間帯（24時制）を表し、下2桁は運用番号となる方式を採用している。運用番号は01から始まり、南行電車では、下1桁に奇数を用いた運用番号となるが、北行電車では、その運用番号から1を減じた偶数を用いた列車番号となっている（東海道本線と列車の方向と列車番号の奇偶数を合わせるため）。末尾のアルファベットは、運用当日の出庫場所によって異なり、Aはさいたま車両センター・元下十条運転区にある留置線から出庫の運用、Bは大船・磯子・桜木町・上野・大宮を始発駅とする運用と鎌倉車両センターの磯子派出所・東神奈川派出所から出庫の運用、Cは大田運輸区（旧蒲田運輸区）の留置線から出庫の運用となっている。
E233系6000番台で運用されている横浜線直通電車以外の電車はE233系1000番台（10両編成）を使用し、保安装置は全線ATC方式となっている。2003年12月21日より南浦和駅 - 鶴見駅間でデジタル式ATC (D-ATC) が導入され、日本国内の在来線鉄道では初の事例となった。この結果、翌2004年3月13日のダイヤ改正で朝のラッシュ時に上下各2本の増発が実施されている。なお、2009年8月14日にはD-ATCが全線に拡大された。
首都圏のJR線では、最も運転本数や保有車両の編成数が多い路線である。大宮駅 - 大船駅間を直通運転する系統と、途中駅の南浦和駅・赤羽駅・東十条駅・上野駅・蒲田駅・鶴見駅・東神奈川駅・桜木町駅・磯子駅が始発・終点となる系統がある。車両基地の存在や折り返し設備の関係で、浦和駅・川崎駅・横浜駅などの主要駅より1駅手前までの運行となる電車が多く運転されていることが特徴となっている。朝夕ラッシュ時は約2 - 3分間隔、日中時間帯は約4 - 5分間隔（1時間に11 - 12本程度）で運行されている。ただし、大宮駅 - 南浦和駅間および蒲田駅 - 横浜駅 - 磯子駅 - 大船駅間では運行間隔が広がる部分がある。日中時間帯は全列車が快速（後述）として運行されている。早朝・深夜以外（日中時間帯が中心）には東神奈川駅 - 桜木町駅・磯子駅・大船駅間で横浜線の電車（8両編成、列車番号末尾K）が乗り入れてくるが、運転系統と使用車両は相互に独立している。
一般的に日本の鉄道では当該路線の起点駅から離れていく列車を「下り」、その逆を「上り」としているが、東北本線と東海道本線の起点となる東京駅を挟んで運転する京浜東北線にはこの定義は当てはまらない。したがってJR内部では大船方向への電車を「南行」（なんこう・みなみゆき）、大宮方向への電車を「北行」（ほっこう・きたゆき）と呼んで区別している。ただし、旅客案内上は原則として「大船方面行」「大宮方面行」などと表現される（他の同様な例はダイヤグラムを参照）。
大宮駅 - 横浜駅間では、京浜東北線は東北本線・東海道本線の電車線として全区間で独立して走行できる専用の複線が確保されている。田端駅 - 品川駅間では、東京都心を環状運転する山手線と並行するが、このうち品川駅以外では、同線と同一ホームでの乗り換えが可能な方向別配線となっており、旅客の利便性が図られている。また全区間で、主要駅のみに停車する中距離電車の系統である宇都宮線・高崎線・東海道線（上野東京ライン、東北本線・東海道本線の列車線）に対する各駅停車としての役割を担っているが、これらの路線との接続は特に図られていない。
ゾーン券はそのエリアと発売額が決められており、ゾーンに指定された区間内では特急・急行・快速・普通列車の普通車自由席に乗車できる。ゾーンによっては私鉄やバスが含まれているものもあり、その区間内も乗降自由となる。ただしゾーン内に含まれる区間でも高速バスは除外されるなど条件付きの場合がある。ただし、特急・急行列車の指定席やグリーン車、寝台車に乗車する場合は乗車券としての効力のみとなり、それぞれ指定席料金やグリーン料金、寝台料金だけでなく、特急・急行料金も必要となる。ゆき券またはかえり券とゾーン件を併用し、ゾーン外からゾーン内へ（ゾーン内からゾーン外へ）直通する特急・急行列車で自由席を利用する場合は入口駅からの（出口駅までの）特急・急行料金が必要となる。また、快速・普通列車のグリーン車（指定席、自由席）、普通車指定席を利用する場合は、それぞれグリーン料金、指定席料金が必要となる。また、俗に“ヒルネ”と呼ばれる寝台特急の座席利用についても、別途「立席特急券」を購入しなければならない（立席特急券の料金は、自由席特急券と同額であるが、立席特急券は指定券の一種であるため）。2012年3月31日まで設定されていたゾーンには新幹線区間（自由席利用）が含まれているものも存在した。