ゲーム版はシリアスで恋愛が中心の作品であるのに対し、2012年までに製作された過去の森脇版アニメはギャグやコメディが中心の作品であった。その内容に合わせ、ゲーム版の主人公・小林オペラは森脇版アニメにはほとんど登場せず、代わりの4名が主人公となった。しかし、視聴者から「ゲーム版のように小林先生が主人公のアニメを見たい」との要望が多数寄せられたことを受け、ゲーム版に完全準拠する新たなアニメ製作が決定した。本作の内容について、『メガミマガジン』では「ゲーム版のイメージを踏襲した本格推理活劇」と報じており、「小林のもとで4人が推理に挑むため、テレビ版では見られなかった彼女たちのまじめな一面が描かれる」と評している。同様に『アニメージュ』では「今回はちゃんと推理します!」との見出しを掲げたうえで、本作の内容について「探偵らしく活躍する!」と報じている。『月刊ニュータイプ』では「シリアスな世界観で、小林とミルキィホームズの推理が光る!」と謳い、『ニャンタイプ』では「今回はシリアスな世界観でまじめに推理」と伝えるなど、各マスコミとも総じて従来の森脇版アニメシリーズとは一線を画した内容について大きく取り上げている。また、内容の変更にともない、従来の森脇版アニメからスタッフが一新されることになった。プロデューサーの中村伸行は「本作はテレビ版とは路線がまったく違うので、監督を岩崎良明さん、脚本を伊神貴世さんというように、新たな布陣で製作されています」と説明している。時系列的には、ゲーム『探偵オペラ ミルキィホームズ』での事件を解決した直後とされており、イギリスに渡って活躍する小林オペラを追って、教え子のミルキィホームズがロンドンを訪れるところからはじまる。そこでミルキィホームズは、犯罪者に襲われていたイギリスの探偵学校の生徒を助けたことで、事件に巻き込まれることになる。イギリスでの小林のライバルとなるスコットランドヤードの警察官や、イギリスの探偵学校の生徒、さらには新たな怪盗らが登場する。プロデューサーの中村伸行は「小林先生の指揮のもと、知恵とチームワークで捜査」する点と「怪盗を追いかけるチェイスシーン」の2つを挙げている。本作は主にロンドンを舞台としており、Project MILKY HOLMESの各作品としては初めて偵都ヨコハマ以外が主要な舞台となる。また、小林オペラが主要な登場人物としてテレビアニメに登場するのも初めてであり、彼の声を演じる森嶋秀太にとっては本作が初のテレビアニメ主演作品となる。
『粛宗実録』巻三〇 二十二年九月戊寅備辺司が安龍福等に推問した。彼は東莱（現在の釜山）に住んでおり帰省し母に会うため蔚山に赴くと、ちょうど僧の雷憲等に逢った。近年鬱陵島に往来した事を説明し、またこの島は海産物が豊富だと言うと、雷憲等は心を動かされ遂に船に同乗した。寧海の蒿仕事の劉日夫等を奮い立たせ、ともに出発しその島に到着した。主な山は三つの峰が三角にそびえている。南北にも、東西にも2日程かかる。山は雑木・鷹・鳥・猫が多く、倭の船もまた来泊していたので船人は皆恐れた。彼は先に「鬱陵島は本来我領域だ。倭人は何故敢えて越境侵犯するのだ。おまえら皆縛り上げるぞ。」と言って、進み寄り船頭を大喝すると、倭人は「我らは本来松島に住んでいる。偶然漁に出て来ただけで、今ちょうどそこへ帰るところだ。」と言うので、「松島はすなわち子山島で、これもまた我国の地だ。おまえらは何故敢えてそこに住むのだ。」と言った。そして翌暁、船を曳いて子山島に入ると、倭人達は釜を並べ魚の膏を煮ていた。杖で撞いてひっくり返し、大いに叱り付けると、倭人達は片付け船に乗せ、帆を揚げ帰り去った。彼はなお船に乗り追いかけたが、狂風に遭遇し隠岐に漂着した。島主が入来の訳を聞いたので、彼は「近年私がここへ来たとき、鬱陵子山島等を以て朝鮮の地界と定めた関白（ここでは将軍の意味。以下同様。）の書契があるが、この国は徹底していない。今又我境界を侵犯するとはどういう訳なのだ。」と言った。そこで、伯耆州にこれを伝えるように言ったが、久しく消息がない。彼は我慢しきれなくなって、船に乗り直接伯耆州に向かった。「鬱陵子山両島監税将」と仮称し、人を使い通告すると、本島（本土）は人馬を送って迎えた。彼は青帖裏（官服）を着て、黒い布の笠をかぶり、靴を履き、籠に乗り、他の者は並んで馬に乗り、この州を進んで行った。彼は島主（鳥取藩主）を奮い立たせ対座し聴かせ、多くの人が並んでその下に下座した。島主（鳥取藩主）は入来の訳を聞いたので、「先日両島の事で書契をもらったのは明白であるが、対馬島主が書契を奪い取り、間で偽造し数人を遣わし倭は非法に（鬱陵子山島等を）横取りしている。私は関白に上訴し罪状を陳情する。」と答えた。島主（鳥取藩主）はこれを許したので、遂に李仁成を使い訴状を提出しようとすると、島主（対馬藩主）の父が伯耆州に来て、「もしこの訴状が提出されると、我が子は必ずや死罪になる。」と言い、この話はなかったことにしてくれと頼むので、関白に上訴することができなかった。しかし、先日国境を犯した倭の十五人は摘発され処罰された。そして、「両島があなたの国に属した後、更に国境を越える犯人がいたり、島主（対馬藩主）が横取りするようなことがあれば、国書を作り官吏を送り重大事とする。」と言ったと言う。そして、食料を与え代わりに倭が護送すると言ったが、彼は退去するので好意を断ると、雷憲ら他の者も同じように断ったと言う。備辺司は、後日その対処が決定するまでしばらく待つことを承知するよう申し付けた。