7月のジャマイカ選手権男子100m決勝で9秒96（+0.7）の2位に終わり、ヨハン・ブレークに0秒01差で敗れ2年ぶりの優勝を逃すと、2連覇のかかった200m決勝でもヨハン・ブレークに0秒16差で敗れ、20秒45（-1.5）の2位に終わった。オリンピック初出場となった8月のリオデジャネイロオリンピックでは男子100mと200mと4×100mリレーに出場したが、100mと200mは準決勝で敗退して決勝に進めなかった。しかし、4×100mリレーでは予選と決勝でジャマイカチームの3走を務めると、アサファ・パウエル、ヨハン・ブレーク、アシュミード、ウサイン・ボルトのオーダーで臨んだ決勝は37秒27をマークして優勝し、自身初のオリンピックメダルを獲得するとともに、ジャマイカチームの3連覇に貢献した。
6月のジャマイカ選手権男子100m決勝で自己ベスト（9秒90）に迫る9秒91（+0.9）をマークしたものの、アサファ・パウエル（9秒84）に次ぐ2位で2連覇を逃した。しかし、200m決勝では20秒36（-2.6）をマークしてウォーレン・ウィア（20秒39）らに競り勝ち、この種目で2度目の優勝を成し遂げた。8月の北京世界選手権では男子100mと200mと4×100mリレーに出場すると、100mは準決勝で敗退して2大会連続の決勝には進めず、200mは3大会連続の決勝に進出するも20秒33（-0.1）の8位に終わり、個人種目でのメダル獲得はならなかった。しかし、ジャマイカチームの3走（ネスタ・カーター、アサファ・パウエル、アシュミード、ウサイン・ボルト）を務めた4×100mリレー決勝では37秒36をマークしての優勝に貢献し、2大会連続となる金メダルを獲得した。
5月24日に世界リレー男子4×200m決勝でジャマイカチームの1走（アシュミード、ウォーレン・ウィア、ジャーメイン・ブラウン、ヨハン・ブレーク）を務め、1分18秒63の世界記録を樹立しての金メダル獲得に貢献した。6月のジャマイカ選手権では男子100m決勝を10秒06（-1.5）で制し、ジェイソン・リバーモア（10秒11）らに競り勝ち、この種目での初優勝を成し遂げた。
8月にモスクワ世界選手権の男子100mと200mと4×100mリレーに出場すると、100mは準決勝を9秒90（+0.4）の自己ベストおよび全体トップのタイムで通過し、決勝でも9秒台の9秒98（-0.3）をマークしたが、3位のネスタ・カーターと0秒03差の5位に終わった（4位のケマー・ベイリー＝コールとは同タイム着差あり）。2大会連続で決勝に進出した200mは20秒05（0.0）をマークしたが、カーティス・ミッチェル（20秒04）に次ぐ4位で惜しくもメダルを逃した。ジャマイカチームの3走（ネスタ・カーター、ケマー・ベイリー＝コール、アシュミード、ウサイン・ボルト）を務めた4×100mリレーでは37秒36をマークしての金メダル獲得に貢献し、シニアの世界選手権で獲得した自身初のメダルが金メダルとなった。
7月1日のジャマイカ選手権（ロンドンオリンピック代表選考大会）男子200mでは決勝に進出し、大邱世界選手権に続くジャマイカ代表の座を狙うも、ヨハン・ブレーク（19秒80）、ウサイン・ボルト（19秒83）、ウォーレン・ウィア（20秒03）に次ぐ20秒16（-0.5）で4位に終わり、ジャマイカ代表の座を逃した。8月30日にダイヤモンドリーグのヴェルトクラッセチューリッヒ男子200mに出場すると、200mの今シーズン最後のポイント対象レースとなった今大会で19秒85（0.0）の自己ベストをマークし、ウサイン・ボルト（19秒66）に次ぐ2位に入り4ポイントを獲得した。この結果、総合ポイントは15ポイントになり、今シーズンの200mツアーチャンピオンに輝いた。
フランス留学後の1950年、ロンドン大学のキングス・カレッジに研究職を得て、X線結晶学の研究に没頭した。X線結晶学とは、結晶へのX線照射による物質の散乱パターンを逆フーリエ解析を用いて解き、当該物質の分子構造を解明していこうというものである。彼女にあたえられた研究テーマは、X線によるDNA結晶の解析であった。ロザリンドは順調に研究を進め、着手後およそ1年で、DNAには水分含量の差によって2タイプ（A型とB型）存在することを明らかにし、それを互いに区別して結晶化する方法を確立させた。また、そこにX線を照射して散乱パターンの写真撮影に成功していた。さらに、これらについてはデータを公表せず数学的解析を自力で進めていた。1953年には、DNAの二重らせん構造の解明につながるX線回折写真を撮影している。しかし、フランクリンはDNAの研究をめぐり、彼女が来る以前からDNAを研究していたモーリス・ウィルキンスとしばしば衝突していた。そして、ウィルキンスはケンブリッジ大学キャベンディッシュ研究所に在籍していたジェームズ・ワトソンとフランシス・クリックに彼女の撮影した写真を見せる。このことは、二重らせん構造解明の手がかりとなったものの、のちに大問題となった。この時の事情について、ワトソンとウィルキンスの言い分は異なっている。ワトソンは、著書『二重らせん』で、ウィルキンスがフランクリンと険悪な関係に陥ったために写真を自分たちにこっそり見せた、と述べている。しかし、ウィルキンスは著書『二重らせん 第3の男』で、あくまでフランクリンのデータを閲覧する権限が自分にあり、フランクリンもそれを認めていた、と釈明している。また、フランクリンは1952年に自分の非公開研究データをまとめたレポートを年次報告書として英国医学研究機構に提出しているが、その研究レポートは、英国医学研究機構の予算権限を持つメンバーの一人でありクリックの指導教官にあたる立場の研究者であるマックス・ペルーツが入手し、そこからクリックの手に渡った。この非公開レポートには、DNA結晶の生の解析データだけでなく、フランクリン自身の手による測定数値や解釈も書き込まれており、DNAの結晶構造を示唆するものであった。この件についてクリックは何も語っていない。