1886年6月から7月にかけて総選挙が行われた。グラッドストンはアイルランド自治を訴えて精力的に演説を行ったが、そのアイルランド一辺倒は有権者から選挙の関心を奪った。選挙の投票率は低く、保守党が316議席、自由党が196議席、自由統一党が74議席、アイルランド国民党85議席をそれぞれ獲得した。自由党の惨敗だったが、得票総数で見ると野党（保守党と自由統一党）との差は10万票に過ぎず、議席に大きな差が出たのは小選挙区制度のマジックであった。ともかくこの議席差では政権運営は不可能であり、グラッドストン内閣は7月30日には総辞職した。【↑目次へ移動する】
ハーティントン侯爵やブライトの協力が期待できない以上、チェンバレンを重用すべきだったが、グラッドストンはそれにも失敗した。チェンバレンは植民地大臣としての入閣を希望していたが、グラッドストンは「議員生活10年の政治家に植民地相は格が高すぎる」として拒否し、自治大臣職を彼に与えた。またグラッドストンは緊縮のため、政務次官の一律減俸を行ったが、チェンバレンは先の総選挙の「3エーカーの土地と一頭の牛」キャンペーンの功労者であるジェス・コリングスの俸給まで減らされることに反発した。さらにグラッドストンは後述するアイルランド自治法案の起草に熱中する余り、チェンバレンが作成した地方自治法案を閣議でまったく取り上げようとしなかった。このようなことが重なってチェンバレンの不満は高まっていった。
第二次グラッドストン内閣は、第一次グラッドストン内閣ほどには強力な政権運営はできない立場にあった。第二次内閣では革新系議員の中心が急進派からジョゼフ・チェンバレンら新急進派に変わっていたためである。彼らは古風な自由主義者と異なり、金持ちから高税を取り立てて社会保障費に回そうという過激な主張をしていた。そのためホイッグ派の新急進派に対する嫌悪感は急進派に対する嫌悪感以上に強く、内閣の不統一感は発足当初から強かったのである（ちなみに新急進派の社会保障論はグラッドストンにも受け入れられない物だった。グラッドストンは大衆の自助の促進を目指しており、そのための改革はためらわなかったが、国が金をやる方式の社会保障では大衆が自助から遠ざかってしまうと考えていた）。
すでに64歳だったグラッドストンは、自由党党首も辞職して政界引退を考えていた。貴族院自由党の指導者グランヴィル伯爵ら党幹部から慰留されたが、グラッドストンの決心は固かった。首相退任から1年弱の1875年1月に正式に自由党党首職をハーティントン侯爵に譲り、グラッドストンは一自由党議員に戻った。しかしハーティントン侯爵よりもはるかに権威があるグラッドストンは、GOM（Grand Old Man、大老人）と呼ばれて畏敬されていた。【↑目次へ移動する】
1868年12月1日、59歳の誕生日を目前にしたグラッドストンがハワーデン城で木を伐採していた時、女王の近臣であるチャールズ・グレイ将軍がそちらへ向かうという電報が彼の下に届けられた。それを読んだグラッドストンは「非常に重大だ」と一言だけ述べ、木の伐採に戻ったという。その翌日にグレイ将軍が到着し、ウィンザー城への参内を求める勅書をグラッドストンに手渡した。グラッドストンはただちにウィンザー城へ向かい、12月3日に女王の引見を受けた。そこで組閣の大命を受けたグラッドストンはこれを拝受し、第一次グラッドストン内閣を組閣した。
1867年12月に自由党党首ラッセル伯爵が76歳の高齢を理由に党首職を辞した。当時首相を務めないと党首を名乗れない慣習があったので、正式な就任ではないが、実質的にグラッドストンが党首となった。この頃、アイルランド独立を目指す秘密結社フェニアンの暴動がイングランドで多発していた。アイルランド問題の解決が政治の緊急の課題となり、グラッドストンはアイルランド国教会の廃止、アイルランド教会の国教会からの分離を党の目玉公約とすることを決定した。30年前の著書『教会との関係における国家』の中でアイルランド人がどう思おうが、国教会が唯一の真理なので押し付けるべきと主張していた彼が自由主義化の果てにとうとうこのような結論に達したのだった。【↑目次へ移動する】
第一次パーマストン内閣期の野党時代にグラッドストンは古代ギリシアの詩人ホメーロスの研究に打ち込んだ。その成果は1858年3月にオックスフォード大学から出版された著書『ホメーロスとその時代』（全3巻）にまとめられた。この著作はホメーロスの著作にはキリスト教の萌芽が見られると主張するものだった（たとえばゼウス・ポセイドン・ハーデスはキリスト教の三位一体にあたると主張している）。しかし一般的にはこの著作は荒唐無稽と評価された。グラッドストンがこの本の出版を決意したのはギリシャ正教会とイングランド国教会の統一を希望していたためであるといわれる。古代ギリシャやホメーロスはグラッドストンが生涯を通じて興味を持っていた分野であり、この後もしばしばこの分野の本を出版する。【↑目次へ移動する】
廃棄された資料の一部は、江戸～明治の産業機械情報をまとめた個人サイト「幻の国立産業技術史博物館」で見ることができる。このサイトを主催する雑誌編集者の探検コムは、ネットで大阪のローカルな記事を見つけて興味を持ち、仕事で取材。資料の廃棄現場に立ち会って写真を撮影した。撮影した写真は本業の記事であまり使うことができず、もったいないと思いデジタル記録として自分のサイトに掲載したという。探検コムは「2009年3月、予算難のために2万3000点以上の資料すべて廃棄処分になってしまいました。いくらなんでもひどすぎる……そう思い、なんとか記録を残そうと思いたったのです」「これまで僕が書いてきた産業遺産に関する原稿を転載していき、最終的には日本最大の産業技術史博物館を目指すことにします」と述べている。