250形は登場後普通運用を主体に使われることとなったが、軽量で神姫1形譲りの主電動機特性の良さから全界磁で70km/hと均衡速度も高く、ロングシート車で詰め込みもきくことから、ラッシュ時を中心に特急運用に充当されることがあった。また、256 - 257は17mロングシート車の2両編成で、当時の山陽では700形に次いで詰め込みのきく車両であったことから、ラッシュ時には重宝された。また、1950年代半ばには250 - 255の塗り分けも820形と同一のものに変更されている。その後、1968年の神戸高速鉄道開業までは250 - 253の制御器をCS5に換装しATSが設置された程度で、外観には大きな変化はないままに推移した。1968年11月に発生した衝突事故によって253が1969年に廃車されたほか、3連化の進展に伴って250形は同じ車体長の300形か270形と3連を組むこととなり、1970年に250 - 252・254・256が運転台の撤去改造を実施され、250 - 252は300形2両編成の中間車として組み込み、254・256の神戸寄りに300・270形を増結して、300形 - 254 - 255、および270形 - 256 - 257で3両編成とした。その際に270形のそれと近接する257のパンタグラフを撤去した。この他、1970年代前半には257の前面に行先方向幕および種別表示幕の取付改造を実施したが、前面貫通化改造は行われなかった。250形のうち250 - 255の15m車グループは、1970年代に入ると老朽化してきたことと、ドア数が300形と異なり2扉であることから乗車位置にばらつきが出るために置き換えの対象となり、3050系の増備によって1973年に252を除いて廃車され、252も1979年に廃車となった（最終期は、組み込み先が270形に変更されていた）。一方、256 - 257の編成は17m車で収容力の点で問題がなかったことと、編成を組んでいる270形が2扉であったことから、他の17m2扉車グループと共通運用で普通列車運用に充当されていたが、1977年より再開された3050系増備に伴い、状態の悪かった820形820 - 825に続く形で1980年に廃車された。250形は全車廃車となったが、廃車後一部の車両の廃車体が東二見車庫や飾磨車庫で倉庫などとして使用されていたが、飾磨車庫のものは現在は撤去されている。254はしばらく救援車として使用され、255は両運転台化改造の上で東二見車庫の構内入換車として2000年に内燃式の構内入換車（アント）が導入されるまで使われていた。また、256・257が装着していたBW-3のうち1両分が廃車後交通博物館に寄贈され、東京地下鉄道1000形の復元に役立てられた。
縄張り意識が強く同種他個体とは集団繁殖地（コロニー）で争うことが多いものの、同所的に分布し繁殖地で混群も形成するジェンツーペンギン・マゼランペンギン・ロイヤルペンギンなどの他属他種と遭遇しても避けて歩き警戒したり攻撃することはない。遊泳速度は平均時速8.4キロメートル。同属のコウテイペンギン（主に水深180メートル未満）と比較してより深く潜水する傾向があり、水深220メートル以上まで潜水することも多い。最深潜水記録は344.4メートルで、平均7 - 8分の潜水を行う。ハダカイワシ類などの魚類を好むが、イカを食べることもありこれらがいなければ甲殻類を食べることもある。繁殖期には体重維持および回復・ヒナに給餌する分も含めて1日あたり3.2 - 3.6キログラムの獲物を捕らえる。時計や温度センサーなどを含むデータロガーおよびそれを飲み込ませた個体の胃の内容物調査から昼間に採食を行う傾向が強いこと、大型の魚類よりも小型の魚類を好むとする報告例もある。成鳥の捕食者はシャチ・ヒョウアザラシが挙げられ、卵やヒナの捕食者はトウゾクカモメ科・オオフルマカモメ・サヤハシチドリが挙げられる。産卵のピークは初夏にあたる12月半ばから1月頃である。この時期になると繁殖地の海岸には多くの親鳥が集まり、繁殖を始める。キングペンギンはヒナを育てる途中で越冬するのが特徴で、繁殖期間が1年以上に及ぶ。繁殖のペースは2年に1度、多くても3年に2度である。後述するようにヒナがほぼ死亡してしまうのに遅い時期にも繁殖を行う理由として、繁殖の際のエネルギーが通常の繁殖よりも抑えられるためとする説もある。同じペアで複数回繁殖することはまれで、離婚率は約80 %に達する。巣は作らない。一腹卵数は1個で、卵は後肢の上にのせ、抱卵嚢（ほうらんのう）と呼ばれる腹部のだぶついた皮をかぶせて抱卵する。コウテイペンギンと同じく産む卵は1つで、足の上にのせ、抱卵嚢をかぶせて温める。足の上で卵を温めるので構造物としての巣は持たないが、縄張り意識は強く、繁殖地では等間隔を保った親鳥たちが立って並ぶこととなる。孵化してから5週間から6週間は親鳥の育児嚢の下で生活するが、それ以降はヒナ同士で形成する群れ「クレイシ」に合流する。クレイシの合流後も親鳥から給餌されるが、冬季が来る前に成鳥はコロニーを分散し冬季の5か月は数回のみ給餌し約3か月も放置されることもある。卵は54日ほどで孵化するが、それまではオスとメスが交代で抱卵する。夏の海は餌が多いので、オスとメスはこの機を活かしてヒナに多くの餌を与える。秋を迎える6月までには、ヒナの体重は成鳥の8割ほどになる。給餌中の親は、昼夜を問わず潜水して餌取りを行い、ハダカイワシの仲間やタコ、イカを多く食べる。しかし寒さが厳しくなると、親鳥はほぼ給餌をやめてしまい、2週間に1回ほどしかヒナに餌を与えなくなる。よってヒナは体に蓄えた脂肪を消費しながら寒さと飢えに耐えなければならない。ヒナはヒナ同士で集まる「クレイシ」を作り、身を寄せ合って寒さをしのぐ。春までにヒナの体重は半分にまで減少する。ちなみにヒナの体は半分以上を胃でしめている。温暖になると親鳥が再び頻繁に給餌するようになる。春となる9月頃には再び親鳥の給餌が始まる。ヒナが褐色の羽毛を換羽して巣立つのは、10月末から1月頃となる。2月以前に産まれたヒナでないと一定の体重に達しないため冬を越すことができずにほぼ死亡し、仮に冬を越せても海に入るとすぐ死亡することが多いため成鳥になることはまれ。この後に2月頃から繁殖する親鳥もいるが、この場合はヒナが小さなうちに冬が来てしまうため、冬の間に多くのヒナが死んでしまう。これらのヒナが巣立つのは翌年の1月から4月頃である。繁殖成功率は低く、1回の繁殖で巣立ちを迎えるヒナは0.3 - 0.5羽とされる。また、地球温暖化も餓死の原因にもなっており、約70％が今世紀末までに死滅、最悪絶滅する恐れがあるとの研究結果もある。