王寺駅 - 生駒駅間の全線運転列車が1時間に4本運転されているほか、平日朝に東山駅 - 生駒駅間の区間運転がある。全列車が各駅に停車し、通過駅を伴う列車の運行はない。2019年1月現在、本数の少ない暫定ダイヤでの運行が続いている（詳細は後述）。2004年3月18日から全列車でワンマン運転を実施している（20m車両4両編成によるワンマン運転は近鉄では初めて）。過去には車庫があった南生駒駅発着の列車もあったが、1987年9月のダイヤ変更で萩の台駅発着となり、1993年の東山駅の移設後に実施したダイヤ変更（1994年3月）以後は東山駅発着となった。運転本数に関してはここ数年変動はなく、2012年3月20日変更のダイヤでは、王寺駅 - 生駒駅間の全線運転列車は平日ダイヤ・土休日ダイヤともに1日74往復、東山駅 - 生駒駅間の区間運転列車は平日ダイヤの朝方に7往復、それぞれ運転されている。東山駅 - 王寺駅間の単線区間では平群駅でほぼ終日にわたって列車交換が行われる「ネットダイヤ」を形成している。2017年10月23日の台風21号による勢野北口駅 - 竜田川駅間の土砂災害以降、同区間の一部で徐行運転が行われ、2019年10月現在も継続中である。この区間は単線であり、従来約15分間隔、1時間に4本を基本とするダイヤで運転されていた。2017年10月25日に運転は再開されたが、被害による徐行のため遅延が常態化し、15分間隔の運行が維持できなくなった。このことから、同年11月6日より、東山駅 - 王寺駅間は約20分間隔、1時間に3本運転（一部時間帯は4本）を基本とする臨時ダイヤに変更された。また、このダイヤ変更でそれまでは運行されていなかった平日夕方や土休日朝夕にも、東山駅発着の区間運転列車が設定された。2018年3月17日のダイヤ変更でもこの運行形態が継承されている。臨時ダイヤの詳細は「1988年からの近畿日本鉄道ダイヤ変更#2017年（未実施）」を参照。大晦日から元旦にかけての終夜運転は、2000年代以降は生駒駅 - 王寺駅間に普通を60分間隔で運転しているが、2009年12月31日から2010年1月1日にかけての終夜運転では、2010年が「寅年」で信貴山朝護孫子寺への初詣客が例年より多くなることが予想されたことから、例年よりやや多い10往復が運転された。
奈良県西部にある生駒山地の東側を走る。沿線には住宅地が広がり大阪・奈良への通勤路線となっている。一部の駅をのぞきほぼ全線で複線化の用地が確保されているが複線化は生駒よりの一部区間に留まっている。なお、正式な起点は王寺駅だが、列車運行上は生駒駅から王寺駅へ向かう列車が下り、逆方向が上りとなっている。スルッとKANSAI対応カードおよびJスルーカード（自動券売機での乗車券引き換えのみ）や、PiTaPa・ICOCA・Suicaなどの全国相互利用サービスのIC乗車カードが使用できる。
全列車が西田原本駅 - 新王寺駅間の通し運転の普通である。2018年3月17日のダイヤ変更以降は平日ダイヤが60往復、土休日ダイヤが58往復運転されている。1時間あたり朝・夕は4本（4編成使用）、昼間時は2 - 3本（3編成使用）の設定となっている。途中の交換可能駅は箸尾駅・大輪田駅のみであり、ほぼ終日にわたって両駅で列車交換が行われる「ネットダイヤ」を形成しているため、全区間の所要時間は朝・夕よりも昼間時のほうが列車によって数分長くなっている。大型車が入れない要因となっていた一部区間の曲線の緩和を完了した直後の1990年7月1日より大型車の導入を開始した。大型車導入当時は800系や820系を置き換える形で8000系の3両編成が運用されていた。1992年3月19日に全列車でワンマン運転を開始し、これにより800系・820系・8000系は撤退し、以後はワンマン運転対応の8400系の3両編成が使用されている。途中の駅はすべて無人駅であるが、ホーム側のすべてのドアが開く。ワンマン化される前には、新王寺駅 - 大輪田駅間の区間運転列車が設定されていた。これは鋼索線をのぞく近鉄の営業列車としては最短距離 (1.9 km) であった。なお、大晦日から元旦にかけての終夜運転は、田原本線では1997年12月31日から1998年1月1日にかけて実施されたのを最後にそれ以降は実施されていない。両端駅が独立しているため、線内運転のみであったが、沿線の馬見丘陵公園で「全国都市緑化ならフェア」が開催されるのに合わせ、2010年（平成22年）9月18日から20日にかけてと11月13日・14日に、大和西大寺発西田原本経由新王寺行臨時急行「やまと花ごよみ号」（各日1本）が設定された。この急行は橿原線との連絡線を経由して運行され、途中西ノ京駅、近鉄郡山駅、平端駅と西田原本駅から新王寺駅までの各駅に停車した。この列車は2011年10月1日にも馬見丘陵公園フリーハイキング実施に合わせ運行された。また、2014年10月5日には生駒線・田原本線近鉄合併50周年を記念して生駒発新王寺行臨時急行が運転された。2018年4月1日より、田原本線の開業100周年を記念して8400系の3両編成のうち1編成に820系の復刻塗装を施して運行している。さらに同年7月18日より復刻塗装の第2弾として8400系の別の1編成がダークグリーンに塗装されて営業運転に入った。