植生同様当研究林内には多くの生物が生息しており、哺乳類ではツキノワグマやニホンカモシカ、ニホンザル、ニホンジカ、イノシシ、タヌキ、アカギツネ、ニホンアナグマ、ニホンノウサギなどといった中大型の哺乳類をはじめ、ヤマネ、ムササビといった小型の哺乳類も生息しており、その中にはクロホオヒゲコウモリやミズラモグラなどの貴重な種も生存している。鳥類ではコノハズクやヤマセミ、オシドリなどをはじめオオタカやハイタカなどの猛禽類も見られ、まれにイヌワシも見られる。爬虫類ではニホンマムシやヤマカガシ、アオダイショウ、シマヘビ、ニホンカナヘビ、ニホンイシガメ、ジムグリ、シロマダラを見ることができる。両生類では特別天然記念物であるオオサンショウウオをはじめ、ハコネサンショウウオやヒダサンショウウオ、モリアオガエルやカジカガエルなどを見ることができる。昆虫もカブトムシやクワガタ、ミヤマカラスアゲハをはじめとした大型の個体から小型の個体まで、多く見られる種から貴重な種まで多種多様な昆虫が生息しており、中には芦生で新たに記録された種もいくつか見られる。
前述のように当研究林が日本海側気候と太平洋側気候の移行帯に位置していることから、植生区分の上でも暖温帯林と冷温帯林の移行帯に属し、植物の種類が多い。当研究林内で確認されている種数は、木本植物が243種、草本植物が532種、シダ植物が85種を数える。その中には、下枝が雪の重みで接地することで発根し、やがて一個体として独立して増殖する、多雪地帯に特有の伏条更新を行うことで知られるアシウスギやアシウテンナンショウのように「芦生」の地名を冠した学術上貴重な植物が含まれている。また、多雪地帯に特有のエゾユズリハ、ヒメアオキ、ヒメモチ、ハイイヌガヤなどの植物が自生しているほか、氷河期の遺存種であるニッコウキスゲやリュウキンカも生育している。この他、年間降水量が多いことから、ナメコやヒラタケ、ツキヨタケをはじめ多様なきのこ類が繁殖している。天然林では標高600m以下ではコナラやウラジロガシ、ソヨゴといった暖温帯林構成種が見られ、それ以上の標高になるとブナ、ミズナラなどを主体とした冷温帯林構成種が見られるが、その境界は不明瞭である。また、斜面に対応して樹木が分布しており、斜面上部ではアシウスギの分布密度が高く、中腹ではブナを主としてミズナラなどが優先し、沢筋ではトチノキやサワグルミなどが多く分布する。このような植生の多様性から、植物学者で東京大学教授の中井猛之進が『植物ヲ学ブモノハ一度ハ京大ノ芦生演習林ヲ見ルベシ』と研究誌に書いたことでも知られている。当研究林は後述のように古くから利用されてきた森林であり、木材の伐採のほか、野田畑周辺では茅場として使用するために火入れが行われていた。演習林の開設後は、戦前は森林軌道が開通した由良川源流域を中心に伐採が行われ、伐採跡にはスギの造林が行われた。戦後は林道の開設に伴って大規模伐採を実施、1950年代後半から1960年代中期にかけてピークを迎えた。その後伐採規模は縮小し、1990年代以降はほとんど伐採されることがなくなった。現在、当研究林の総面積4,200haの約半分に当たる2,150haは少なくとも開設後は手の入っていない天然林で、この中には森林の成立以降人為的な力の加わっていないと考えられる原生林がある。天然林の伐採跡地のうち、大半の面積を占める約1,800haは伐採後再生した天然林（二次林）で、スギを主体とした人工造林の面積は約250haである。二次林にはミズメ、シデやクロモジなどが多い。
当時、1989年に起きた宮崎事件の影響によるオタクバッシングや、1990年8月に和歌山県田辺市の主婦による「出版物の行き過ぎを規制するよう行政当局の対策を強く促したい」という旨の投書が地方紙「紀州新報」に掲載された事を契機として主婦を中心とする住民運動に発展して性描写を含む青年向けコミック誌を警察・行政に持ちこんだことに端を発する有害コミック騒動の流れが続いた。そんな中、1991年2月、男性向け同人誌を委託販売していた東京都内の書店、「コミック高岡」・「まんがの森」新宿店・「書泉ブックマート」の店長及び店員が猥褻図画販売目的所持で警察の取締りを受ける。また、『ミニーズクラブ』等美少女系同人誌サークルが摘発を受ける。この他印刷業者なども含め女性3人を含む総計75人が逮捕または書類送検されている。そういった最中、幕張メッセを管轄する千葉西警察署に届けられた拾得物の中に無修正の同人誌が含まれていた。この同人誌を問題視した千葉西署は、コミックマーケット準備会（以下準備会）と幕張メッセに対し事情聴取を行った。社会的認知度の高いイベントへの貸し出しを優先する方針をとっていた幕張メッセはこの事情聴取を受けて、春頃、すでにコミケの開催告知やサークル申込が済んでいたにもかかわらず、使用拒否を通告した。これを受け準備会は急遽古巣である晴海の東京国際見本市会場に会場使用を依頼した。この時もし晴海の会場から断られた場合、コミケは開催の目処の立たないまま終了するしかないという切迫した状況にあった。晴海会場側は、見本誌の内容チェックを通じて猥褻図画とみなされる同人誌が持ち込まれることのないよう十分な対策を取ること、各同人誌印刷所への協力の要請を行うことを旨とした申し出に応じて開催許可を出し、コミケ40は期日的には予定通りの開催に漕ぎつけた。その後千葉県では1994年春に青少年健全育成条例が改正され、ページ全体の20％以上もしくは20ページ以上の性表現を含む本をほぼ自動的に「有害図書」指定する（包括指定）という厳しいものとなり、同人誌即売会は千葉県では事実上開催不能に至った。このため1994年10月2日に幕張メッセで開催予定だった同人誌即売会・コミックシティは、千葉県警からの注意を受けて直前になって中止を決定した。この事件は幕張コミックシティ中止事件と呼ばれる。この後コミックシティは1994年11月3日に晴海にて「コミックシティイン東京・晴海」を開催したが、その際に主催の赤ブーブー通信社は千葉県の条例とほぼ一致する「赤ブーブー通信社コミックシティにおける自主倫理規定 18歳未満に販売できない図書の基準」を作成し、出展サークルに対してその遵守を求めた。しかしこれは同人誌業界内外で批判を浴び、数ヵ月後に撤回している。