1940年11月にハンガリー、ルーマニア、スロバキア独立国が、1941年（昭和16年）3月にはブルガリア、6月にはクロアチア独立国が軍事同盟に加盟した。またユーゴスラビアも1941年3月末に同盟に加盟しているが、加盟に反対する国軍がクーデターを起こし、親独政権が崩壊した結果、加盟は取り消されている。さらに1941年11月にはデンマークも加盟した。また枢軸国の一員となったフィンランドは1940年8月にドイツと密約を、やはり枢軸国として名を連ねたタイも1941年12月日本と日泰攻守同盟条約をそれぞれ結んだが三国同盟には加盟しなかった。満州国は三国同盟に加盟しなかったものの、軍事上は事実上日本と一体化していた。また防共協定に加盟したスペイン（フランコ政権）も三国同盟には加わらなかったが、戦争の前半期においては協力的な関係を持った（第二次世界大戦下のスペイン）。ドイツとソ連の間では重大な動きがあった。1940年11月15日、ソ連のモロトフ外相はフリードリヒ・ヴェルナー・フォン・デア・シューレンブルク駐ソ・ドイツ大使をクレムリンに招き、ソ連は「日独伊ソ四国同盟」を締結する準備があると告げた。条件は、ドイツ軍のフィンランドからの撤退、ソ連ブルガリア協定の締結、ボスポラスとダーダネルス両海峡における海軍基地建設のための長期借地権、北サハリンにおける日本の石炭・石油採掘権の放棄だった。スターリンは四国同盟の調印を了承していたが、ソ連侵攻を考えていたヒトラーは返答しなかった。スターリンは最後まで四国同盟締結の希望を失わず、ドイツ軍の奇襲を許してしまった。松岡外相は三国同盟にソ連も参加させた四国によるユーラシア枢軸構想（四国連合構想）によってアメリカに対抗しようと考えていた。松岡はそのため1941年3月から独・ソ・伊三国を歴訪し、それぞれの指導者を歴訪した。この結果日ソ間で結ばれたのが日ソ中立条約である。リッベントロップも同じような構想を抱いていた。イタリアは既に1933年に伊ソ友好中立不可侵条約を結んでいた。しかし日伊に通告なく始められた独ソ戦によってその構想は消えてしまった。近衛は、独ソ戦によって三国同盟の意味が無くなったとして同盟を破棄することも考えたが、陸軍の反発を恐れて結局この考えを公に提起することは無かった。松岡は直ちに対ソ攻撃するよう主張したが、陸軍内部ではソ連の敗北が明らかになってから参戦する「熟柿論」が台頭したため、結局参戦を見合わせた。
条約締結後の外務省情報部長須磨弥吉郎は10月4日、「9月27日は日本のみならず世界の史的転換への一日であった」とラジオ演説を行い、条約の意義を強調した。当時アメリカは第三条の自動参戦条項が松岡によって骨抜きにされていたことを知らず、対日警戒感をいっそう強めた。条約締結を知った駐日アメリカ大使ジョセフ・グルーは日米両国の友好関係継続は「絶望」になったとみなし、「これは、過去に私が知っていた日本ではない」と嘆いた。イギリスは10月に閉鎖される予定だった援蒋ビルマルートの継続を通知した。中国国民党との和平交渉桐工作も中止が命令された。アメリカが自動参戦条項の実態を知ったのは、終戦後の1946年に、連合国軍に抑留されたオットとスターマーを尋問した時と見られている。
条約調印式はベルリンで行われ、ドイツ外相ヨアヒム・フォン・リッベントロップ、イタリア外相ガレアッツォ・チャーノ、日本からは特命全権大使の来栖三郎が条約に調印した。条約原文は英文テキストでこれにベルリンで署名調印され、約3週間後に日本で印刷されたテキストを駐日ドイツ大使館クーリエに依りドイツに運ばれ改めて署名調印された。現在見られるのは後者の方で外務省外交史料館に展示されている。
新たに編成される水陸機動団は西部方面隊直轄部隊である西部方面普通科連隊を基盤に、3個連隊を基幹に編成され、約3,000人規模の部隊となる予定である。この3個連隊の内、主戦力となる第1連隊は西部方面普通科連隊を発展的に改組し団本部と共に佐世保市（相浦駐屯地及び海上自衛隊佐世保地方隊崎辺地区）に拠点を置くとされ、第2および第3連隊はそれぞれ700人から900人規模の部隊となる予定。各連隊の編成は本部中隊、AAV中隊、ヘリボーン中隊およびボート中隊（強襲戦闘偵察用ボートを装備）からなるとされる。水陸機動団の活動用地確保のため、相浦駐屯地に所在する西部方面混成団は平成29年度末（2017年度末）をもって団本部と第5陸曹教育隊を久留米駐屯地へ移駐する計画であることが発表され（先行処置として第118教育大隊を2017年（平成29年）3月26日付で久留米駐屯地に移駐）、2018年（平成30年）3月26日をもって混成団本部と第5陸曹教育隊は移駐完了した。2017年（平成29年）3月27日には、水陸機動団に配属される隊員の教育部隊が駐屯地内で発足した。このほかに、諸部隊の駐屯地として、大分県の玖珠駐屯地・湯布院駐屯地が挙がっている。水陸両用車を装備した新部隊は南西諸島が侵攻された際、戦闘地域から数キロメートル離れた海域から上陸部隊を進発、戦闘部隊を揚陸させ島嶼部の確保を図る。また住田和明陸幕防衛部長（当時）は、3カ所の事態に対して同時3個の初動部隊を投入できるようにする、と説明している。以下は2015年の平成27年版防衛白書「図表II-2-3-1」より抜粋した水陸機動団の編成および、長崎新聞に掲載された編成表を示す。ヘリボーンについては陸上自衛隊航空科部隊が支援を行う。西部方面隊直轄部隊及び4師団、8師団の隷下部隊を基幹として設立し、当初は1個水陸機動連隊を欠いた定員約2,100人の編成だが、将来的には3,000人規模まで拡大・充足させる予定である（31中期防において、1個水陸機動連隊の新編が盛り込まれた）。水陸機動団の設立準備に備え、第4戦車大隊に水陸両用車（AAV7）が訓練用として1両先行配備されたほか、西部方面特科隊第112特科大隊などでは現行装備から120mm迫撃砲への転換訓練を行っていた。また、西部方面普通科連隊では、他編成部隊の隊員向けへの転換教育や資格取得を支援していた。なお、水陸機動団所属隊員の部隊章（師団等標識）は第1空挺団同様、独自のものが設定されている。