優等列車として新宿方面から特急「あずさ」が定期または臨時で、名古屋方面から特急「しなの」が臨時でいずれも白馬駅または南小谷駅まで直通運転されている。しかし、1997年10月1日の北陸新幹線高崎駅 - 長野駅間の先行開業後は、それまで中央東線・大糸線を利用していた首都圏 - 大北地域間の旅客が、新幹線と路線バスを長野駅で乗り継ぐルートに移行し、以降は新宿方面からの直通列車は減少傾向にある。ただし、冬季は中央東線沿線からのスキー客輸送で一定の需要はある。このほか、急行「アルプス」のダイヤを引き継いだ夜行の快速「ムーンライト信州」も臨時で運転されていたが、2019年3月以降、使用車両である189系の廃車に伴い、運転されていない。普通列車は松本駅 - 信濃大町駅間と、それに接続する信濃大町駅 - 南小谷駅間の列車が主体であり、1日に数本が松本駅 - 南小谷駅間を直通する。朝夕には松本駅 - 穂高駅・有明駅間の区間列車も運行されている。一部は松本駅から篠ノ井線やさらに先の中央本線へ乗り入れ、塩尻駅や岡谷駅（辰野支線辰野駅経由含む）・上諏訪駅・富士見駅まで直通する列車もある。朝や夜間一部列車は快速運転を行っている。なお、松本駅 - 南小谷駅間ではE127系100番台によるワンマン運転が行われており、信濃大町駅 - 南小谷駅間については全列車がE127系100番台によるワンマン運転となる。運行本数は松本駅 - 信濃大町駅間で1時間に1 - 2本程度、信濃大町駅 - 南小谷駅間は1 - 3時間に1本程度である。2010年10月2日からはハイブリッドシステムを搭載したリゾートトレインHB-E300系「リゾートビューふるさと」による臨時列車が運転されている。
運行系統は電化区間であるJR東日本管轄の松本駅 - 南小谷駅間と、非電化区間であるJR西日本管轄の南小谷駅 - 糸魚川駅間に分かれており、南小谷駅を越えて運行される定期列車は1995年の集中豪雨被害で線路が寸断された際に運行を停止して以来、運転されなくなった。かつては大糸線全線を走破する列車として、1960年代 - 1970年代に新宿駅 - 糸魚川駅間で急行「アルプス」（1968年までは「白馬」と称していた）と、1971年から松本駅 - 金沢駅間で急行「白馬」が運転されていたが、急行「アルプス」の糸魚川駅発着列車は1975年に、急行「白馬」は1982年に、それぞれ廃止されている。
北アルプス（飛騨山脈）の東側を、長野県大町市以南は高瀬川、その北は日本海へと注ぐ姫川に沿って走る。沿線には立山黒部アルペンルート東の玄関口である大町市を控え、仁科三湖（木崎湖・中綱湖・青木湖）などの行楽地やスキー場が多く、行楽客や白馬岳などへの登山者の足であるとともに、松本市・安曇野市など沿線都市への通勤・通学路線としても機能している。広域輸送としては主に中央本線からの特急列車が直通している。2015年3月14日の北陸新幹線長野駅 - 金沢駅間の開業により、並行在来線である北陸本線金沢駅 - 直江津駅間は経営分離され、本路線の南小谷駅 - 糸魚川駅間はJR東日本の在来線およびえちごトキめき鉄道と、北陸新幹線のJR西日本所管区間のみに接続し、JR西日本の在来線路線としては孤立している。同区間については地元自治体との協議も予定されていたが、引き続きJR西日本が管轄し、糸魚川駅など新潟県上越地方と長野県大北地域を結ぶアクセス路線となっている。JR東日本区間のラインカラーはパープル。
山地で多く見られ、非繁殖期はおもに森林に生息するが、繁殖期の4月から7月にかけては生息地付近の湖沼や水田、湿地に集まる。成体は他のカエルと同様に肉食性で、昆虫類やクモ類などを捕食する。一方、成体の天敵はヤマカガシ、ニホンイタチ、ニホンアナグマ、タヌキなどである。モリアオガエルの生活史の特性は、特に産卵生態によって特徴付けられる。カエルは水中に産卵するものがほとんどだが、モリアオガエルは水面上にせり出した木の枝や草の上、地上などに粘液を泡立てて作る泡で包まれた卵塊を産みつける。泡の塊の中に産卵する習性は多くのアオガエル科のカエルで共通しているが、モリアオガエルは産卵場所が目立つ樹上であることもあり、日本本土産のアオガエル科のカエルでは他に泡状の卵塊を形成する種が地中産卵性で小型のシュレーゲルアオガエルしかいないこともあって特に目立った存在となっている。繁殖期になると、まずオスが産卵場所に集まり、鳴きながらメスを待つ。鳴き声は「カララ・カララ」と鳴いた後、「コロコロ」「クックック」と続く。メスが産卵場所にやってくるとオスが背中にしがみつき、産卵行動が始まるが、卵塊の形成が進むに連れて1匹のメスに数匹のオスが群がる場合が多い。産卵・受精が行われると同時に粘液が分泌されるが、この粘液を集まったオスメスが足でかき回し、受精卵を含んだ白い泡の塊を作る。直径10-15 cmほどの泡の塊の中には黄白色の卵が300-800個ほど産みつけられる。泡の中では複数のオスの精子がメスが産んだ未受精卵をめぐって激しい競争を繰り広げると考えられており、モリアオガエルの精巣の大きさが際立って大きいことの原因と推測されている。泡は表面が乾燥して紙のようなシートとなって黄白色の卵塊となり、孵化するまで卵を守る役割を果たす。約1週間ほど経って卵が孵化する。孵化したオタマジャクシは泡の塊の中で雨を待ち、雨で溶け崩れる泡の塊とともに下の水面へ次々と落下する。孵化したばかりのオタマジャクシは腹部に卵黄を抱えているため腹が黄色をしているが、やがて卵黄が吸収され、全身が灰褐色となる。オタマジャクシは藻類や動物の死骸などを小さな歯で削りとって食べる。オタマジャクシは1ヶ月ほどかけて成長するが、この間の天敵はヤゴ、ゲンゴロウ、タイコウチ、アカハライモリなどである。イモリは、幼生が泡巣から落下する時に、その真下で待ちかまえていて、落ちてくる幼生をぱくぱく食べる。前後の足が生えてカエルの姿になった幼体は上陸し、しばらくは水辺で生活するが、やがて森林で生活を始める。冬眠は浅い土中やコケの下で行われる。