1882年（明治15年）6月25日に、新橋と日本橋の間を結んで営業を開始した。停留所は基本的に汐留本社、新橋、終着地のみで、途中の停留所は存在せず利用者が降りたい所を車掌に言えば下車できた。乗るのも手を上げれば乗れたらしい。1882年（明治15年）10月1日には、日本橋 - 上野 - 浅草 - 日本橋間の環状線も短時間で竣工させた。開業当初に営業運転に当たった馬車は31両あり、すべて英国製で一等車が29両でオールドバリー製で、二等車がスターバック製であった。二等車のうち1両が「夏用車」と謳ってありこの馬車は現在で言うとオープンカー形状の馬車であり、当時好評でかなり使われていた。夏用車（オープンカー）車体天井部分には東京市街馬車鉄道と記してあり側面には車体番号が記してあった。逸話として当初、1、2両を試験的に英国から輸入し、あとは東京馬車鉄道が国内で模造し量産するつもりでいたが、依頼先の鉄道局で製作する材料と車輪鉄具の製作ができず、仕方なく夏用車をすべて輸入したようである。馬は宇都宮や関東地区近隣から購入して使った。開業時47頭。開業年の末には226頭に増やした。新橋から全区間の所要時間は2時間程度で、新橋から浅草橋経由浅草広小路までは46分、新橋から万世橋経由浅草広小路まで42分、浅草広小路から上野広小路まで16分であった。料金は3区分制を採っており一区あたり一等車3銭、二等車2銭であった。一等車3銭は2000年代の流通貨幣で1,500円程度の価値である。全区間（3区間）×3銭を乗車すると2000年代の流通価値で4,500円、2等の場合でも3,000円の金額になる。2000年代のタクシー乗車金額相当の運賃であり、庶民が毎日使えるものではなかった。
初めの計画者は当時鉄道作業局長であった松本荘一郎、富田鉄之助などであったが種田誠一、谷元道之、河村伝衛、久原庄三郎に譲り、五代友厚の後ろ楯により実現化していった。
フッ化物の歴史については、専門書に詳しいが、ここでは簡潔に記述する。19世紀のヨーロッパにおいて、フッ化物がう蝕（虫歯）の予防に効果的であるという議論がなされていたが、水道水へのフッ化物の添加は歯科医のフレデリック・マッケイの研究に依拠するところが大きい。フレデリック・マッケイはコロラド州において当時コロラド褐色斑と呼ばれる、コロラド地方の子供達の間でみられた歯の茶色い染みの調査に関わった。1909年にマッケイによって診られた2945人の子供の87.5%に茶色の染みや斑点が見られた。それらの子供達はロッキー山脈のパイクス山の地域に住んでいる子供達に限られていたという。茶色の染みがあり、見た目にも健全な歯には見えなかったが、茶色い染みのある歯をした子供達は他の地域の白い歯をした子供達よりも虫歯の発生率が低かったという。グリーン・バーディマン・ブラックがこのことに注目したことで、歯科医や歯科の専門家達の間でコロラド褐色斑に対して大きな関心が寄せられるようになった。研究の初期段階では歯の茶色い染みは栄養失調や豚肉、牛乳の摂取過多、ラジウム汚染、当地で手に入る水のカルシウム不足等の仮説が唱えられた。1931年には、コロラド褐色斑の原因が、当地で手に入る飲料水のフッ化物濃度（2 - 13.7ppm）にあることが明らかとなった。パイクス山周辺の岩石には氷晶石というフッ化物を含む物質が存在しており、雨や雪解け水が氷晶石のフッ素化合物を取り込みながら川を流れ、飲料用水として取水されたと考えられている。その後、フッ化物濃度の安全基準に関する調査が開始された。この調査の目的は二つあり、一つはパイクス山に住む住民のコロラド褐色斑（現在では歯のフッ素症と呼ばれる）の発生を抑える事であり、もう一つが水道水に低濃度のフッ化物を加えて多くの人々の虫歯予防に役立てることであった。1934年に、米国公衆衛生局の歯科医官である歯科医師トレンドリー・ディーンによって飲料水における最適なフッ化物濃度を調べる疫学研究が行われた。彼はコロラド州、イリノイ州、インディアナ州そしてオハイオ州などの21都市の7000名に上る子供を調査して、フッ化物と虫歯の関係を研究し、結果を1942年に公表した。それによると、歯のフッ素症を防ぎながら、一方で虫歯を予防できるフッ化物の最適含有量は1ppmであると結論付けられた。1939年にはジェラルド・コックス博士はフッ化物に関する研究を行い、口内衛生を向上させることを目的として飲料水や牛乳、瓶詰め飲料水等にフッ化物を添加することを提案した。1937年の段階では既にアメリカ先住民族に対して行った研究資料を分析した歯科医師ヘンリー・クレインとキャロル・パーマーによって、フッ化物の摂取と虫歯の予防の可能性が予想されていた。クレインは後（1937年 - 1941年）に一連の研究において、米国公衆衛生局ではまだ重要視されていなかった、小児の歯の発生上の発見と、虫歯の有病割合の疫学調査における課題をまとめた。1940年代半ばにはフッ化物を実際に水道に添加している都市としていない都市で比較が行われ、フッ化物の有効性が調査された。ミシガン州のマスキーゴンとグランドラピッズ（1945年1月25日に世界で初めてフッ化物を水道に添加した都市）が1つ目の比較都市の組であり、そのほかにニューヨーク州キングストンとニューバーグ、イリノイ州オークパークとエバンストン、カナダ・オンタリオ州サーニアとブラントフォードが比較都市として組み合わされた。これらの比較調査の結果、フッ化物を添加した水道を供している都市において虫歯の発生率が低くなるということが判明した。