応永35年（1428年）正月、将軍・足利義持が後継者不在のまま亡くなり、正長2年（1429年）3月、くじ引きで選ばれた足利義教が新たな将軍となる。鎌倉公方・足利持氏は、自らが将軍になる野心を持っていたため、京都の幕府・義教との関係はさらに悪化した。永享10年（1438年）8月、持氏は京都との調停役となっていた関東管領・上杉憲実討伐を始めた（永享の乱 ）。しかし幕府が軍事介入すると、持氏から離反するものが相次ぎ、憲実討伐に失敗して降伏。さらに義教は憲実の助命嘆願も無視し、永享11年（1439年）2月、持氏と嫡子・義久を攻め滅ぼした。このとき持氏に対して厳しい姿勢を示した義教も、鎌倉府そのものは否定しなかった。新たな鎌倉公方として、自らの子息を鎌倉に下向させ、鎌倉府を再興させようとする。この構想は、嘉吉元年（1441年）6月の義教暗殺（嘉吉の乱）により白紙化されるが、文安4年（1447年）3月、鎌倉府は持氏の遺児・足利成氏のもとで再興された。永享の乱とその後の結城合戦を経て、上杉氏と伝統的豪族層・国人層との対立が顕在化すると、両者ともにそれぞれの思惑から新たな鎌倉公方を必要としたのである。しかし、対立は解消されないまま、成氏は幕府および関東管領・上杉氏と対立し、享徳3年（1454年）12月に始まった享徳の乱にて、鎌倉を離れ下総・古河に移座した。崩壊した鎌倉府は古河公方・古河府に継承される。
上杉禅秀の乱で禅秀に与した関東武士は、鎌倉公方・足利持氏からの弾圧から逃れるために、幕府との結び付きを強め、京都扶持衆と呼ばれる集団を形成した。一旦確立した鎌倉府管轄国の内部に、幕府があからさまに干渉を始め、持氏は危機感を強める。持氏は鎌倉府管轄外だった越後、信濃、駿河に干渉して、逆に「鎌倉扶持衆（関東扶持衆）」と呼ぶべき集団を形成し、鎌倉府と幕府との対立が深まっていった。
第2代鎌倉公方・足利氏満、第3代満兼期に確立された鎌倉府体制は、第4代足利持氏期（応永16年・1409年～）に崩壊に向かう。その端緒となるのが、応永23年（1416年）10月の上杉禅秀の乱であった。関東管領・犬懸上杉氏憲（禅秀）の家臣・越幡氏の所領を持氏が没収すると、禅秀は「不義の御政道」と批判して関東管領を辞職、持氏は禅秀と対立していた山内上杉憲基を新たな関東管領とした。これを不満とする禅秀は、下総の千葉氏、上野の岩松氏、甲斐の武田氏、常陸の山入氏・大掾氏、下野の那須氏・宇都宮氏の支持を得て反乱を起こす。一旦は公方・持氏は鎌倉から放逐されたが、幕府の支援により反撃し、鎌倉を奪還・禅秀勢を打ち破った。しかし、このとき多くの関東武士が禅秀を支持していた、その背景には「公方権力の絶対化にともなう新たな抑圧と統制への反発」があったと考えられる。乱を契機に、持氏を支持した新興勢力と、禅秀を支持した伝統的豪族層・国人層の対立が顕在化し、鎌倉府の権力基盤が弱体化した。かつて足利尊氏・直義兄弟が懸念した関東の不安定化が再び現実化する。
中世には松浦党などの海賊衆（水軍）が興り、対馬を含め各地が倭寇の根拠地となった。1274年（文永11年）（文永の役）、1281年（弘安4年）（弘安の役）の元寇では対馬、壱岐、鷹島に元・高麗軍が襲来したが、「神風」（大型台風）が九州を襲い元軍が退却したのはこれらの島々が破壊しつくされた後であり、これらの島々に神風の恩恵は全く無かった。室町時代に入り、1419年には応永の外寇、1507年には五島で玉之浦納の反乱が起こっている。1550年には、ポルトガル船が平戸に来航した。これを知ったフランシスコ・ザビエルは鹿児島を出発し平戸を訪れ、布教を開始した。貿易都市となった平戸であったが、1561年に起きた宮ノ前事件によりポルトガル船は横瀬浦港（現在の西海市）に入港するようになった。ところが2年後の1563年、横瀬浦は武雄領主後藤貴明の焼き討ちに合い、壊滅。ポルトガル船は再び平戸に戻った。しかし、イエズス会の宣教師コスメ・デ・トーレスの意向により、今度は大村領の福田浦（現在の長崎市）に入港することになった。この間、大村純忠はキリスト教の洗礼を受け、初のキリシタン大名となっている。1567年には、ポルトガル船が有馬領の口之津港に入港し、後にセミナリヨが建てられるなど、有馬は九州におけるキリスト教布教の拠点となっていった。大村純忠の兄である有馬義貞も口之津で洗礼を受けている。大村純忠は、ポルトガル貿易を自分の領地で行えるよう働きかけを行い、1571年に貿易港が口之津から長崎に移された。1580年には長崎をイエズス会に寄進した。1582年には天正遣欧少年使節が長崎港を出発し、スペイン、イタリア、ポルトガルを訪問した。1588年、豊臣秀吉が長崎などを直轄地とした。2年後には天正遣欧少年使節が長崎に戻り、秀吉に謁見している。1592年には文禄・慶長の役により、松浦鎮信、有馬晴信、大村喜前、宗義智らが朝鮮に出兵している。南蛮貿易を継続させたい意向もあり、強硬な禁教は行っていなかった秀吉であったが、すでにバテレン追放令が出されており、1597年には長崎西坂でカトリック信者26人が処刑されている。二十六聖人という。