その後、メアリーはボスウェル伯に心を寄せるようになった。1567年2月10日、エディンバラのカーク・オ・フィールド教会（現在のエディンバラ大学構内）でダーンリー卿が殺害されているのが発見された。ボスウェル伯はメアリーに結婚を申し込み、その数日後ダンバー城にメアリーを連行し、結婚に踏み切らせ、5月15日に2人は結婚式を挙げた。当時、ダーンリー卿殺害の首謀者はボスウェル伯、共謀者はメアリーであると見られており（実際の証拠はなかったが）、カトリック・プロテスタント双方がこの結婚に反対した。間もなく、第4代モートン伯爵ジェイムズ・ダグラスら反ボスウェル派の貴族たちが軍を起こした。6月15日にメアリーはエディンバラの東のカーバリー・ヒルで反乱軍に投降した。メアリーはロッホ・リーヴン城に移され、7月26日に廃位された。歴史小説家のJean Plaidyはこのペンネームで書いた伝記の中で、メアリーがよく行っていたエクスチェッカー・ハウスという小さく、一人でこもれる家の隣の住人がボスウェルの元召使いであり、ボスウェルがよく逢い引きに使っていたことから、ダーンリー卿殺害以前からメアリーとボスウェルが恋人であったと断じている。また、メアリーの連行は、合意の上での拉致の演技だという。また、メアリーがジェームズの王位継承権を損なわない形でダーンリーを排除したいという言葉が、事実上の殺人命令だったとしている。カトリックのメアリーには、継承権を損なわない離婚ができないからである。
1565年8月1日、マリ伯がエリザベス1世からの援助を取り付け、1200人の兵力を集めてメアリーに反乱を起こした。メアリーはこの反乱を鎮圧するため、ゴードン家にも恩赦を与えて地位を回復させた。マリ伯の期待していたイングランドからの援軍は現われず、スコットランド南部でボスウェル伯率いるスコットランド軍に敗北し、彼はイングランドに亡命した。1566年3月9日、ホリールード宮殿で食事をとっているとき、武器を手にしたルースベン・モートンなどの数人の貴族達がリッチオを拉致し、ダーンリー卿の部屋に近い謁見室、しかもメアリーの目前で殺害するという事件が起きた。メアリーは流産の危機を迎えたが、6月19日無事に息子ジェームズ（後のイングランド王兼スコットランド王ジェームズ1世（6世））を出産した。リッチオの子だと噂する者がいたため、メアリーは床についたまま、ダーンリーの子であることを誓い、ダーンリーにも認めるよう迫った。しかし、ジェームズが大きくなっても、ダヴィデ（デイヴィッド）の子を意味する「ソロモン」と呼ぶ者がいた。子どもは生まれたが、しかしダーンリー卿との仲は冷え切ったままだった。当時のスペイン大使によれば、メアリーにダーンリー卿暗殺を提案した者さえもいたが、メアリーは受け入れなかったという。
ダーンリー卿ヘンリーは、メアリー女王と同じくイングランド王ヘンリー7世の王女マーガレットの孫であり、テューダー家の血を引いている。加えて、カトリック教徒であった点も、メアリーにとっては都合が良かった。しかし、この結婚にもマリ伯やエリザベス1世が強硬に反対した。特にエリザベス1世は、イングランドの有力な王位継承権を持つダーンリー卿との結婚によって、メアリーの王位継承権が強化されることを恐れた。そこでダーンリーにすぐさまイングランドに戻るよう命令し、従わないと反逆罪と見なすとして、ダーンリー卿の母マーガレット・ダグラス（マーガレット・テューダーの娘でジェームズ5世の異父妹、エリザベス1世の従姉）をロンドン塔に幽閉したが、ダーンリー卿は従わなかった。しかし、エリザベス1世と首相のウィリアム・セシルは、性格的に弱いダーンリー卿をスコットランドに送り込むことにより、スコットランドの国力低下を計ろうとしたという説もある。1565年7月29日、メアリーはダーンリー卿ヘンリーと再婚した。メアリーはヘンリーに対し、王族にしか与えられなかったロス伯、オールバニ公の位を与え、また王位継承もあらためて与えるなどして、多くの貴族の反感を買った。しかし、両親から甘やかされてきたヘンリーの傲慢な性格がわかるにつれて、メアリーの愛情も冷めていった。やがてピエモンテ人の音楽家で、有能で細やかな気づかいをする秘書のデイヴィッド・リッチオを寵愛し、重用するようになった。
1997年4月28日にジョージア大学で開催された対テロリズム対策会議において、アメリカ国防総省長官ウィリアム・コーエンが、「幽霊スパイ」や「ウソの脅威による恐怖」について、アメリカの作家であり未来学者であるアルビン・トフラーやウイルス兵器（生物兵器)に言及しながら、環境型テロリズム(eco-type of terrorism)や、電磁波によって意図的に惹き起こされる地震や火山活動などの自然災害、すなわち気象兵器について言及した。「特定の人種や民族を抹殺するため、一部の科学者が人種に特異的に作用する病原体を生み出そうとしている」と記している。　。アメリカ国防総省　国防長官ウィリアム・Ｓ・コーエン［1997年4月28日の発言］以下　原文の英語を機械翻訳したものを一部抜粋。「例えば、一部の国がエボラウイルスのようなものを構築しようとしているという報告がありますが、これは非常に危険な現象です。Alvin Toefflerは、特定の民族集団や人種を排除できるように特定の種類の病原体を考案しようとしている研究所の科学者について、これについて書いている。他の人たちはある種の工学、ある種の昆虫を設計して、特定の作物を破壊することができます。他の人々は、電磁波の使用によって遠隔地で地震や火山を襲う気候を変えることができるエコタイプのテロリズムでさえも従事している。だから、他の国に恐怖を起こす方法を見つけている職場には、多くの独創的な考えがあります。それは本当のことです。それが私たちの努力を強化しなければならない理由です。そのため、これがとても重要です。」とアメリカ国防総省国防長官ウィリアム・Ｓ・コーエンは1997年4月28日に発言している。