ロドス島包囲戦はオスマン帝国の勝利に終わった。東地中海の重要拠点を獲得したことで、コンスタンティノープルとカイロの間で容易に連絡が取れるようになった。後の1669年、オスマン帝国はヴェネツィア領クレタ島征服の際にロドス島を拠点として大いに利用した。聖ヨハネ騎士団はシチリア島などを転々とした後、神聖ローマ皇帝カール5世からマルタ島、ゴゾ島、北アフリカのトリポリを与えられた。その後のロドス島奪回の試みは成功しなかったが、43年後のマルタ包囲戦ではオスマン帝国の撃退に成功した。
12月22日、ラテン市民とギリシア市民のそれぞれの代表がスレイマンの和平案を受け入れた。騎士団は12日以内にロドス島を退去するよう求められたが、この際武器や宗教的な宝物・絵画を持ち出すことを認められるという極めて寛大なものだった。島民のうち離島を望むものはその自由と3年の猶予を与えられ、残留を望むものはオスマン帝国の支配下に入っても5年の間納税を免除された。キリスト教の教会が汚辱をうけたりモスクに改められたりすることもなかった。1523年1月1日、最後に残っていた騎士が市街を発った。彼らは騎士団旗をはためかせ、ドラムを鳴らし、軍装に身を固めて行進するという名誉の撤退ぶりであった。彼らは離島する住民数千人とともに50隻の船に乗り、ヴェネツィア領クレタ島へ退去した。
1291年にパレスチナにおける十字軍最後の拠点アッコが陥落したのち、聖ヨハネ騎士団は14世紀初頭にビザンツ帝国領のロドス島を占領した。この島はエーゲ海交易の要衝であり、騎士団はイスラーム諸国相手に活発な海賊活動を行って東地中海を支配した。オスマン帝国はメフメト2世の時代の1480年に最初のロドス島攻撃を行ったが、これは失敗に終わっていた。アナトリアからレバントへ勢力を広げようとするオスマン帝国にとって、ロドス島の聖ヨハネ騎士団は避けようがない障害となっていた。聖ヨハネ騎士団は十字軍の時代から要塞構築とその防衛を基本戦略としてきたが、1480年の戦争以降、大砲の火線と連携を重視する新技術である星型要塞の理論を積極的に取り入れ、従来のロドス島の城塞に数々の改良を施していた。陸伝いでの攻撃が最も激しくなると予想される方面では空堀の広さを倍にし、従来の傾斜防壁を多くの凹角堡に置き換え、ほとんどの塔の周囲に堡塁を設け、また堀の中で敵に縦射をしかけるカポニールをつくった。城門の数は減らされ、旧式の胸壁は砲撃を想定して傾斜したものに替えられた。この工事には多くの石工や労働者が動員されたが、特に騎士団に捕らえられ奴隷にされたムスリムは最も厳しい重労働を強いられた。1521年、フィリップ・ヴィリエ・ド・リラダンが聖ヨハネ騎士団の総長に選出された。オスマン帝国の侵攻が迫る中、リラダンは要塞の増築を進める一方で、ヨーロッパに散らばっている騎士団員をロドス島に集め、防衛体制を固めた。しかし、ヴェネツィアがクレタ島から派遣した援軍を除き、ヨーロッパ諸国は聖ヨハネ騎士団に一切支援を行わなかった。また聖ヨハネ騎士団内でも、ラングエ・イングランドからの参戦者はジョン・ローソン一人であった。ロドスの町は、二重もしくは三重の石壁と、いくつかの大きな堡塁で防衛されており、それぞれの堡塁は1301年に定められた割り当て通りに各ラングエが担当した。最終的に防衛に参加した騎士の出身国は、スペイン、フランス、ドイツ、イタリア、イングランド、ポルトガルだった。港は聖ヨハネ騎士団の船を収容したのち、オスマン海軍の侵入を防ぐため巨大な防鎖で封鎖された。
前作『必殺仕事人』最終回で、仕事人グループが解散してから、月日が経ち、中村主水も裏稼業から足を洗い、その影響で、やや肥り気味になるほどの怠けた生活を送っていた。しかし、ある日、江戸を離れていた加代が、ぼろぼろの姿で、主水の前に現れた。主水は加代に金を渡し、お互い会わなかったことにして、その場を立ち去る。秀も江戸に舞い戻っており、3人の仕事人は再会を果たした。加代は「3人で、裏稼業を再開しよう」と持ち掛けるが、2人ともその気は全く無かった。一度辞めてしまった命がけの仕事を再開するのに必要な気持ちの張りもなく、いつ返り討ちにあうかも知れない恐怖にも嫌気が差していたのだ。その上、秀には大店への婿入りの話があった。加代は仕方なく門付けを始めるために壊れた三味線の修理を頼みにある三味線屋に向かい、2人の親子に出会う。この親子は普段は江戸の柳橋で、小さな三味線屋を営んでいるが、実は闇の仕事人のおりくと勇次であった。加代が訪れた頃から、おりくはある人物から、仕事人であることをネタに強請られていた。加代は2人の只者ではない気配を感じ、親子を監視し、勇次に捕まる。強請られていた、おりくの様子を暗に察していた勇次は加代が強請り主だと思ったからであった。秀の助けで、その場の難は逃れたが、主水とおりくも強請りがらみで、偶然にも、お互いが仕事人であることがわかる。その後、ある人物に強制されて、おりくを強請っており、最終的に飛び降り自殺した女の最期の恨みの言葉を聞いた主水は裏稼業への復帰を決意。加代と秀を呼び出し、仕置を宣言した。そこへおりくと勇次が現れ、主水たちに協力を申し出る。敵に回して容易に済む相手では無いと悟った主水は一度切りの条件付で手を組み、一味を抹殺した。おりくと勇次の殺しの凄腕振りを見届けた主水は「再会できるだろうか?」と呟く加代に対し、「別に会いたくもない」と一蹴する。だが、別の事件をきっかけに、2つの仕事人グループは1つに統合。かくして不信感に満ちた、新しい仕事人グループが誕生した。