2013年に発表されたある研究によると、2009年にH1N1インフルエンザが大流行した際に用いられたワクチンのひとつである「H1N1インフルエンザASO3アジュバント添加ワクチン」の接種者において、ナルコレプシーの発生率が増加していることが確認されており、この機序を解明することによって、ナルコレプシーが自己免疫疾患であることが示唆された。この研究では、「H1N1インフルエンザASO3アジュバント添加ワクチン」は、オレキシン(ヒポクレチン-1)と類似しており、ナルコレプシー発症の原因となり得るとされていた。ただし、上記の主旨で発表された2013年の論文は、論文の構成上重要な実験が再現できなかったとして、2014年に著者により取り下げられている。
路線は全区間が高架で、東北・上越新幹線の高架に沿って敷設されており、ほとんどの区間で橋脚を新幹線と共用している。複線区間である大宮駅 - 丸山駅間は、東北・上越新幹線の高架橋の両側に、単線区間である丸山駅 - 内宿駅間は、上越新幹線の西側（下り線側）に、それぞれ沿って路線が敷設されている。単線区間では全ての駅で上り・下り列車の交換ができる。起点の大宮駅ではループ線式の折り返しを採用しており、終点の内宿駅や、車庫のある丸山駅では通常の折り返しであるため、列車の向きが一往復するごとに反対になることが大きな特徴である。上り線の加茂宮駅 - 鉄道博物館駅間では、NTT東日本東大成ビル（電話局）が新幹線の高架線に近接しており、線路を敷設する空間が確保できなかったため、ビルを避けて新幹線高架下に線路を通したが、勾配と急カーブが生じて速度制限がかかり、同駅間の所要時間は上り列車の方が1分長くなっている。新幹線の高架の高さを走るため、進行方向左側の車窓からは、さいたま市・上尾市・伊奈町の景色を眺めることができる。特に下り列車からは、よく晴れた日には秩父の山並みや富士山も見通せ、埼玉新都市交通では眺望のよさをアピールしている。進行方向右側（内宿駅→丸山駅間では左側）の車窓からは、路盤が新幹線の線路より高い区間では、並走する新幹線列車を望むこともできるが、低い区間ではコンクリート壁に視界を遮られる。大宮駅以外の駅舎は新幹線高架真下の地上コンコースと高架ホームの2階建て構造である。中央自由通路と連結した大宮駅以外は、開業当初の垂直移動は階段のみであった。2000年代後半に入り、交通バリアフリー化の一環で、鉄道博物館・加茂宮・東宮原・原市・沼南・丸山・伊奈中央・羽貫・内宿の各駅には沿線自治体の助成によりエレベーターが設置された。鉄道博物館駅にはエスカレーターも設置されている。伊奈線は自動列車運転装置 (ATO) を採用しておらず、自動列車制御装置(ATC)による車内信号閉塞方式での運転士による手動運転（ワンマン運転）となっている。将来の自動運転に対応できるように、車両側には、ATOの運転装置が搭載されている。駅に停車した際の車両のドアの開閉は、進行方向先頭の運転室（乗務員室）で運転士による車掌スイッチの操作により行なっている。丸山・内宿以外では、運転席側である左側の扉を開けるため、単線区間の各駅（島式ホーム）では、他の多くの日本の鉄道路線の左側通行と違い、右側通行で進入する。各駅にはホームドアは設置されておらず、ホーム上には車両のドアの位置だけ省いた安全柵が設置されており、「線路は高圧電流が流れているので絶対立ち入らない」旨の注意書きが多数掲示されている。これらの点はゆりかもめや金沢シーサイドラインなどと異なっている。手動運転かつホームドア無しのAGTは他に西武山口線と山万ユーカリが丘線があるが、これらはATCではなくATSを使用しており、加えてユーカリが丘線は中央案内式である。駅業務についても自動化されておらず、自動改札機は駅員（社員）が常駐している大宮駅と鉄道博物館駅のみの設置となっている。その他の駅は、経費圧縮のために直営の駅売店販売員が駅員として改札業務を兼務するというユニークな形態を採っており、早朝深夜を除いてパートタイマーの嘱託駅員が交代制で改札業務と駅売店業務を行っている。スタンド式の売店の横に、券売機と改札窓口がある。交通系ICカードは簡易Suica改札機で対応している。駅での放送は接近案内のみであるが、電車到着時には、車内と車外両方のスピーカーで到着駅名の自動放送がされ、駅舎側の到着時放送を兼ねている。12.7kmの路線に13駅があり、駅間の平均距離は約980mだが、加茂宮 - 沼南間は800mごと、志久 - 内宿間は1.1kmごととなっている。大宮の市街地寄りの方が駅間が離れており、最も離れているのはJR高崎線・川越線と旧中山道を跨ぐ鉄道博物館 - 加茂宮間の1.7kmであり、JRの車両工場の中を通る大宮 - 鉄道博物館間も1.5kmある。案内軌条式鉄道は、通常の鉄道と違い、ゴムタイヤを装着して走行するため、比較的雨や雪に強いとされているが、当路線は弱い。これは地上にある丸山車両基地と高架である本線との間がコンクリート製のスロープ軌道で繋がれているが、この傾斜が他の案内軌条式鉄道路線と比べて急であるため、大量の降雨や、降雪などによる軌道内の結氷で軌道面が滑りやすくなると、安全の観点から運行を見合わせざるを得ないためである。