全国の幹線・亜幹線に普及し、至る所でその姿は見られた。ただし、四国では土讃本線限定で使用された。貨物用のため地味な存在だったが、中央本線（中央東線・中央西線とも）や函館本線の“山線”区間（長万部 - 小樽間）などのように急勾配区間の多い路線では、急行をはじめとする優等列車を含む旅客列車の牽引に使われることも多く、羽越本線などのような平坦路線でも旅客列車牽引に使われた例があった。D51形は軸重が重いため、多くは東海道本線や山陽本線、東北本線などの幹線の貨物列車を中心に牽引した。中にはお召し列車を牽引した車両や、先述のD51 65のように新鶴見操車場や吹田操車場などの基幹ヤードでハンプ押上げ用として使用された車両もある。運転・保守両面では一部勾配線（後述）を除き概ね好評を博し、全国的に鉄道車両の保守状態が劣悪だった第二次世界大戦終結直後でも、D51形は9割を超える車両が稼働状態にあったといわれる。また、D51以前の機関車は乗務員が慣れるまでの評価が低いものが多かったが、D51は予想以上の好評で迎えられ、一番扱いやすいカマであったとの証言も残っている。しかし、勾配での重量貨物列車牽引においては、出力の増大と入線範囲拡大を目的とした動軸重の減少、それに車体長短縮などの設計上の無理に起因する不適切な動軸重配分によって、上り勾配での牽き出し時に生じる重心移動で空転しやすい傾向があり、勾配線では基本となったD50形の方が有利な局面が多々存在した。また、車体長短縮のために生じた前後方向の重心位置のアンバランスを運転台の小型化で是正しようとするなど、乗務員の作業環境を無視した設計となっていたため、運転台が広くしかも乗り心地に優れるD50形を運用していた各区からは酷評を受けた。中でも初期型（ナメクジ型）の評価が特に低く、事例として1・2号機をはじめとする初期型の新製配置先だった敦賀機関区や松本機関区、それに木曽福島機関区などの各機関区は一旦は初期型を受け入れたものの、ほぼ例外なく2年前後、最短では約10か月で他区へ転出させ、その後は他に選択肢が存在しない状況になるまで初期型を受け入れない対応を行っていた。標準形が浜松工場で急遽試作され、重心位置を修正し、空転問題を多少なりとも改善した背景には、これら勾配線担当各区の受け取り拒否に等しい厳しい対応が影響している。さらに前記の各区は標準形についても否定的で、一例として上諏訪機関区では1941年にD51形が3両新製配置されたが、その年のうちに全数を他区へ転属させてD50形に戻している。これに対して平坦線を担当する各区は稲沢機関区を筆頭に否定的な反応を示しておらず、高速走行時の脱線対策が採られていたこともあって比較的スムーズに導入が進んだ。戦時中には輸送力増強のためボイラー増圧に伴う空転対策が必要となったことから、平坦線各区に配置された車両を含め、本形式は初期形を中心にコンクリート製の死重をフロントデッキに搭載するなどの対策が講じられている。これにより、動輪上重量が15tに増えたほか、シリンダー牽引力がD50より8パーセント上昇した。 なお、すべての勾配線で本機が否定的に扱われていたわけではない。一例として、「矢岳超え」こと33.0‰の急勾配が存在する人吉～吉松間を受け持つ、人吉機関区では勾配用機関車E10よりも曲線での空転が発生しにくいことから  、昭和47年にDD51へ置き換えられるまで本機が使用され続けている。1941年から生産されたC59形は、当初の計画では本形式とボイラーを共通設計として量産効果や保守の容易化といったメリットが出る予定だったが、本形式において前後方向の重心問題が解決しなかったことで共通設計を断念し、対策として本形式のものを基本としつつ煙管長を500mm延長して重心を前方にシフトさせた専用ボイラーを別途設計することを強いられている。しかも、それでさえ従軸の軸重が過大で列車牽き出し時に車輪の割損事故を引き起こすなど、ボイラー火室付近の重量が過大であることを示すトラブルが頻発しており、この点からも、本形式のボイラーは機関車の重心設計という点で決して好ましいデザインではなかったことが見て取れる。国鉄形蒸気機関車の中でも特にその末期まで残存した両数の多さと、知名度の高さにより、「名機」、「代表機」、「代名詞」などと表現されることもある本形式であるが、その広範な運用と知名度は、戦時体制に伴う貨物機大量需要から来た膨大な量産と、無理のあるコンパクト化によって軸量や転車台、曲線性能の関係で入線可能な区間が多かった結果に過ぎなかった。もっとも、これだけ生産されながら余剰機が出始めたのは動力近代化の進んだ1960年代からであり、各地の幹線・亜幹線で活躍し輸送力増強に貢献している。設計上の無理が生じた車両長の短縮についても、幹線は電化による近代化が進められていくことから、亜幹線でも十分な性能を発揮できるよう考慮されてのことであった。夕張線（現・石勝線）・室蘭本線の貨物列車牽引では、夕張方面の炭鉱から室蘭港へ向かう2,400tの運炭列車をD50形とともに単機で牽引する運用をしていたことがあった。1953年（昭和28年）時点では本形式で函館本線小樽築港 - 滝川間と室蘭本線岩見沢 - 追分間で牽引定数が換算185両 (=1,850t)、追分 - 室蘭間で換算260両 (=2,600t) を設定。1952年（昭和27年）2月に追分 - 室蘭間で3,000tの牽き出し試験をしたところ、成績は良好だったものの単線区間の線路有効長の関係で実施に至らなかった。ここは従輪を持たず牽き出し性能で有利な9600形が2,000t牽引を行っていた区間であるが、夕張方面の炭坑から追分駅を経て苫小牧駅付近までの片勾配のゆるい下り坂区間においては、いかに長大とはいえセキの積車状態の編成であれば走行抵抗が小さく、D51形の単機でも牽き出しさえすれば、後は室蘭港まで引っ張っていけた。なお、牽き出しは非常にゆっくりしたもので、一両ずつ連結器がぶつかる音をたてながら行われた。この列車の尋常ではない長さは、空車のときにはゆるい上り勾配であることとあわせ、多く連なるセキが空気を巻き込んで抵抗が増え、速度が上らなかったほどである。大戦中は10‰勾配区間でD51形に8620形を補機としてつけることとして1,200t列車の計画が立てられたが、機関車の所要数の増加を招くことから中止となった。旅客列車の牽引では、函館本線の急行の牽引が特筆される。これは函館 - 長万部を単機で、長万部 - 小樽の通称「山線」を重連で牽引するも、高速運転で各部の損耗の速さによる検修の負担と、振動の激しさと連続力行で助士2人乗務で投炭することによる乗務員の負担過大からC62形への転換が行われ、1971年にはDD51形ディーゼル機関車に置き換えられた。山線区間の仕業は機関車、乗務員ともに限界に挑むものであり、牽引機が更新されるたび、運転時分も短縮していった。電化やディーゼル化の影響による余剰廃車が本格的に出始めたのは1967年ごろからのことで、蒸気機関車の最後の時期まで多くのD51形が残っていた。特に1960年代から1970年代にかけて石北本線、東北本線、奥羽本線、伯備線などの急勾配区間において重連や3重連などで活躍する姿は当時の「SLブーム」の波に乗り、鉄道ファンや写真家、マスコミ関係者などの間で大変な人気を集めた。また、羽越本線をはじめとする日本の原風景が残っていた線区を走る雄姿を撮影する鉄道ファンの姿も多かった。しかし、製造両数が多いこともあって、当然蒸気機関車の中でも残存両数が多く、他の機関車よりも多く見ることができたため、鉄道撮影を主とするファンの中には他の少数派形式が来ることを期待していて、D51形が来ると「またD51か」とため息を漏らす者や、D51形牽引列車の場合はシャッターを切らない者も少なからず居たという。最後に残ったのは北海道の追分機関区に所属していた5機で、C57 135牽引（現・鉄道博物館所蔵）の国鉄最終蒸機牽引旅客列車運転から10日後の1975年12月24日まで使用され、この日は241号機が担当した。これが国鉄における蒸気機関車牽引の最終貨物列車（夕張線6788列車）ならびに国鉄最後の蒸機本線走行となった。これらの国鉄蒸気機関車の最後を飾った追分区所属のD51形は、地元、追分町（現・安平町）（241号機）や東京都台東区上野の国立科学博物館（国鉄工場最終出場蒸気機関車603号機）などといった各地に保存が決定していたが、1976年4月13日深夜に発生した追分機関区扇形庫火災により、国鉄最後の蒸気牽引入れ換え運用機79602号機や、配属されたばかりの新鋭ディーゼル機関車（DD51形）8両とともに4両（241・465・603・1086号機）が焼失した。現在、安平町の鉄道資料館には旧追分機関区の機関庫の火災で焼失した当初の静態保存予定機である241号機他の代わりとして、小樽築港機関区や追分機関区などで使用されていた320号機が静態保存されている。320号機は、本来は静態保存を予定していなかったが、急遽、静態保存機となったものである。また、国立科学博物館には同じく予定されていた603号機の代替として231号機が保存された。なお、最終5機の内、916号機のみが前橋市前橋こども公園に保存されている。日本国外では、台湾でDT650形として37両が使用された。台湾で使用されていたものは既に全車廃車となっているし、うち4両が静態保存されていたが、2011年11月に、DT668は動態保存にして復活された。これから観光用、イベント用として運用する予定。サハリンで使用されたものは引退後6両（1・2・23・25・26・27）が帰国し、各地に保存されているほか、現地でも4号機が観光列車として運行されている。