1941年（昭和16年）3月7日、「瑞穂」は第七航空戦隊旗艦となる。3月27日、横須賀に帰投。4月10日附で第七航空戦隊は第十一航空戦隊に改称。「瑞穂」は横須賀で修理に従事しており、作戦行動をおこなう状態ではなかった。当事の横須賀には戦艦2隻（陸奥、長門）、第四戦隊（高雄、愛宕、鳥海、摩耶）、第2駆逐隊（夕立、五月雨、春雨）、第9駆逐隊（朝雲、峯雲、山雲、夏雲）、特務艦「宗谷」等が停泊し、横須賀海軍工廠では「翔鶴」が完成間近、剣埼型潜水母艦1番艦「剣埼（祥鳳）」が空母改造工事中、戦艦「比叡」や空母「赤城」の修理を行っていた。4月29日、第十一航空戦隊旗艦は本艦から「千歳」に変更される。機関修理と並行し、2隻（千歳、瑞穂）は日本列島沿岸を航海して訓練に従事した。9月1日、河瀬少将（第十一航空戦隊司令官）は海軍水雷学校校長へ転任、後任の第十一航空戦隊司令官には第三水雷戦隊司令官藤田類太郎少将（旗艦「川内」）が任命される。後任の三水戦司令官は橋本信太郎少将。9月5日、瑞穂艦長は澄川大佐から大熊譲大佐（軍務局、情報局等勤務）に交代した。後日、澄川大佐は空母飛鷹艦長や、空母大鳳初代艤装員長等を歴任した。11月24日、呉を出撃。12月2日、パラオ到着。太平洋戦争開戦時、本艦は比島部隊（第三艦隊基幹。指揮官高橋伊望第三艦隊司令長官、第十六戦隊、第五戦隊、第二水雷戦隊、第四水雷戦隊、第五水雷戦隊、第四航空戦隊、第一根拠地隊、第二根拠地隊等）に所属していた。瑞穂搭載機は零式水上観測機12機、九四水偵3機であった。太平洋戦争緒戦ではパラオから出撃し、フィリピンの戦い、南方作戦、蘭印作戦に従事する。12月29日から31日にかけてパラオ滞在。1942年（昭和17年）1月4日、ダバオのマララグ湾に、フィリピン南部の攻略を終えた比島部隊主力艦（妙高、那智、羽黒、長良、那珂、神通、千歳、瑞穂、平安丸、南海丸、雪風等）は集結・停泊していた。ところがB-17重爆8機の空襲を受け、「妙高」が中破、「瑞穂」に損害はなかった。1月9日午前、第二航空部隊の「千歳」と「瑞穂」はスラウェシ島最北端のメナド攻略作戦に従事するため、マララグ湾およびパキプタン水道より出撃した。搭載機をもって輸送船団および第二護衛隊（第二水雷戦隊基幹）の対潜、対空直衛などにあたり、1月11日にスラウェシ島バンカ泊地に到着。同地でも対潜・対空直衛・対地協力を実施した。この日、大型飛行艇9・爆撃機4機と交戦し飛行艇2機撃墜・零観3機を喪失した。なお、「瑞穂」から発進した零式水上観測機が友軍の九六式陸上輸送機1機を誤射して撃墜している。これは海軍の空挺部隊の横須賀鎮守府第一特別陸戦隊（略称「横一特」）によるメナドへの第一次降下部隊324名を九六式陸上輸送機27機に各12名づつ分乗させてメナドへ向かっていた内の1機であり、搭乗員5名と降下員12名の全員が戦死した。その後も対潜哨戒・上空警戒・対地攻撃支援に従事するが、飛来する連合国軍重爆（B-17やB-24）に対し、水上偵察機は無力であった。1月21日、東方攻略隊（指揮官高木武雄第五戦隊司令官《那智、羽黒》、直接指揮/第一根拠地隊指揮官久保九次少将）はスラウェシ島ケンダリ攻略をめざしてバンカ泊地を出撃、第二航空部隊（千歳、瑞穂）は攻略部隊の対空・対潜・前路哨戒を実施した。久保少将が率いる攻略隊の主戦力は、軽巡（旗艦）長良、第15駆逐隊（夏潮、黒潮、親潮、早潮）、第16駆逐隊（雪風、時津風、天津風、初風）、第二航空部隊（千歳、瑞穂）等であった。1月24日、船団はケンダリーに到着した。これを見た水上機母艦「チャイルズ」(USS Childs, AVD-1)はケンダリーを脱出して南方への逃走を開始、第11航空戦隊艦載機は同艦を追撃して空襲をおこなうが、撃沈に失敗した。これ以外の攻略作戦は順調に進み、25日に飛行場を占領、27日には第21航空戦隊（陸攻27機）が進出している。1月26日、第11航空戦隊司令官の藤田少将は、第五戦隊司令官高木武雄少将に第二航空部隊（千歳、瑞穂）のアンボン島攻略作戦参加を意見具申、これにより本艦のアンボン攻略作戦投入が決まった。27日、第11航空戦隊司令官藤田少将は、第二護衛隊指揮官田中頼三少将（第二水雷戦隊司令官）と会合を行い、攻略作戦における千歳・瑞穂の任務区分（船団前路警戒、対潜直衛、対空直衛、泊地哨戒）を決定した。同日には第7駆逐隊（潮、漣、曙）も蘭印部隊に加わり、アンボン攻略作戦に投入された。1月29日以降、本艦はアンボン攻略部隊（第二護衛隊〔第二水雷戦隊神通、第8駆逐隊《大潮、朝潮、満潮、荒潮》、第15駆逐隊《陽炎型4隻》、第16駆逐隊《陽炎型4隻》、掃海隊〕、輸送船11隻）を支援する。1月30日に千歳と合同後、2隻は31日にセラム島（アンボン北方）ケラン泊地に到着、艦載機による対地攻撃を実施して陸戦部隊を支援した。アンボン攻略作戦は、機雷の掃海や一部陸上戦闘の苦戦により、予想以上の時間をかけることになった。「瑞穂」は2月3日に第39号哨戒艇（旧駆逐艦蓼）・監視艇3隻に護衛されケラン泊地を出発、ケンダリーへ向かった。「千歳」は2月6日までアンボン作戦に従事した。2月6日以降、水上機母艦2隻（千歳、瑞穂）はスラウェシ島マカッサル攻略作戦に従事した。当初は本艦のみマカッサル作戦投入と計画されていたが、2月3日アンボンのラハ飛行場占領にともない基地航空隊が進出、「千歳」をマカッサル作戦に投入する余裕が出来たのである。2月8日、「瑞穂」は「千歳」と合流、攻略作戦を支援した。本作戦の主力部隊は軽巡洋艦「長良」（2月2日復帰）、第21駆逐隊（初霜、子日、若葉）、第24駆逐隊、第15駆逐隊（2月4日以降編入）、第8駆逐隊（2月5日以降編入）で、2月5日ケンダリーを出撃、2月8日の攻略を目指した。攻略作戦成功後の2月11日、3隻（瑞穂、第39号哨戒艇、第2号駆潜艇）はケンダリーへ向かった。2月17日以降、東方攻略部隊（指揮官高木第五戦隊司令官《直率：那智、羽黒、曙、雷》）および東方攻略部隊・第二護衛隊（指揮官田中二水戦司令官：神通、第15駆逐隊《夏潮欠》、第16駆逐隊、第7駆逐隊第1小隊《潮、漣》、第21掃海隊の掃海艇2隻《第7号、8号》、瑞穂、哨戒艇3隻《1号、2号、39号》、輸送船4隻）は小スンダ列島のティモール島攻略を実施。本作戦に際し、第21航空戦隊司令官は「ケンダリー基地からチモールまで385浬あり、基地航空隊が常に上空掩護を行うのは難しい」として第11航空戦隊の協力を要請、これに第二水雷戦隊も同調し、蘭印部隊指揮官高橋伊望中将は2隻（瑞穂、第39号哨戒艇）の第二護衛部隊編入を下令したのである。2隻（瑞穂、第39号哨戒艇）は2月18日朝から夕刻までビノンコ島に臨時水上基地を設置、19日にはロンブレン島北岸レワリン岬沖に到着して水上基地を設置、輸送船団の上空支援を行った。2月20日朝、「瑞穂」はアロール島南方海面を行動し、艦載機による上空掩護・対地支援攻撃を行う。同日、東ティモールのデリー攻略に向かった第7駆逐隊（潮、漣）と第二梯団は上陸に成功、その日のうちにデリー飛行場を占領し、24日に第7駆逐隊はマカッサルへむかった。2月21日、蘭印部隊指揮官高橋中将はジャワ島攻略作戦の切迫（カレル・ドールマン少将ひきいるABDA艦隊出現）により、2隻（瑞穂、第39号哨戒艇）の蘭印部隊復帰を下令、2隻はスラウェシ島にむかった。クーパン（西ティモール）攻略も23日までに成功し、24日夕刻をもって第二護衛隊は解散。第二水雷戦隊（神通、雪風、初風、時津風、天津風）は東部ジャワ攻略作戦に参加、第15駆逐隊はジャワ南方機動作戦に参加、第21掃海隊と第1哨戒隊は同地残留と決定し、各隊は各方面へ移動を開始した。2月18日の時点で本艦が所属する第二航空部隊は、第11航空戦隊（千歳、瑞穂）、哨戒艇3隻（34号《薄》、38号《蓬》、39号《蓼》）、佐連特銃兵1個小隊、漁船6、海上トラック1隻という戦力だった。第二航空部隊は東部ジャワ攻略輸送船団の対潜哨戒および上陸戦闘に協力することになった。「瑞穂」は23日バタマラン島（スラウェシ島ボネ湾）に到着、27日にはボルネオ島プチン角（バンジェルマシン西方）に移動して「千歳」と合流、南下して28日にバウエアン島西岸（ジャワ島スラバヤ北方）へ進出した。すでにスラバヤ沖海戦の主要海戦は終わって日本艦隊は勝利しており、第11航空戦隊（千歳、瑞穂）はバウエアン島を基地として輸送船団の上空掩護を実施する。3月1日、英重巡「エクセター」、駆逐艦2隻（エンカウンター、ポープ）攻撃のため1240に零観11機（爆装）を派遣するが、天候のため敵艦を発見できなかった。水上機部隊が味方部隊を発見した時にはエクセターとエンカウンターは沈没、ポープは空母龍驤艦載機および日本艦隊によってとどめをさされた後だった。スラバヤ攻略作戦において、第二航空部隊（第11航空戦隊《千歳、瑞穂》）は延べ643機を投入、敵機撃墜3、撃破19、車輌撃破22、駆逐艦1隻廃艦、商船1撃沈1撃破、潜水艦2隻撃破不確実という戦果を報じた。「瑞穂」は船体・機関修理のため3月4日ケンダリーへ回航（3月6日スターリング湾着）、9日以降スラバヤ方面に再進出して「千歳」と合流した。3月9日のオランダ軍降伏によりジャワ島方面での作戦は概ね完了、第11航空戦隊（千歳、瑞穂）は3月14日マカッサルに到着した。その後、本艦は日本本土へ帰投、「千歳」と分離した（千歳はニューギニア攻略作戦従事）。3月19日から22日までダバオ停泊。3月26日、行動予定を通報。3月28日、本艦は横須賀に到着した（同日、浦賀船渠で駆逐艦風雲が竣工）。