1927年の長編映画へのトーキー導入は映画産業を震撼させ、アニメーション産業もまた2年後に同様の改革期を迎えた。ウォルト・ディズニーは社運を賭けた博打に打って出て、自身初のトーキー短編アニメーション『蒸気船ウィリー』（原題：Steamboat Willie）を公開した。この作品はミッキーマウスが登場した3番目の作品である。このカートゥーン映画は記録的な売り上げを達成し、大衆を魅惑し、ディズニーが彼の経歴の中で成し遂げた幾つもの偉業の口火を切ることになった。1930年代前半を通して、アニメーション業界は三つの派閥に分割されているように見えた。ウォルト・ディズニーとフライシャー兄弟、そして「それ以外」である。ミッキーマウスはその驚異的な人気により、チャーリー・チャップリンと並ぶ世界で最も有名な銀幕のスター達の一人として迎え入れられた。ディズニーの触れる物はすべて黄金に変わるかのように見えた。ディズニー作品に基づく関連商品は、多くの企業を大恐慌による財政的な窮地から救い出した。またディズニーはこの人気に乗じ、アニメーションに更なる改革を加えた。映画における3ストリップ・テクニカラー方式の発達でディズニーの果たした役割は大きく（テクニカラー社はこの方式を完成させるにあたり、ディズニーと提携していた）、総天然色で上映された最初のアニメーション作品は、ディズニーの短編映画『花と木』（1932年、原題：Flowers and Trees）であった。また、ディズニーはライフライク・アニメーションの分野でも他の追随を許さなかった。ディズニーの制作スタッフたちは、二次元画像で描写されるアニメーションに遠近感を与えるマルチプレーン・カメラを開発し、『風車小屋のシンフォニー』(原題：The old mill)でそれを初めて導入。その結果、アカデミー賞二部門を受賞するという成功を得た。その一方で、大当たりしたディズニーの別作品『三匹の子ぶた』（1933年、原題：Three Little Pigs）では、脚本技術の発展と特徴的なキャラクター描写が強調された。この作品は複数のキャラクターの性格を描き分けた最初のアニメーション作品であると見なされている。1940年代までにディズニーの前には無数の競争相手が立ちはだかったが、いずれもフライシャーを除いて、ディズニーをその王座から追いやるには至らなかった。サイレント期、ディズニー以前に王座の位置にいたパット・サリヴァン・スタジオは、フィリックス・ザ・キャットをトーキー化しようとする不成功に終わった試みの後に、その最大の没落に直面していた。1930年代から40年代初期にかけて、アニメーションの品質においてディズニーと王者の座を争った競争相手がフライシャー・スタジオの代表者マックス・フライシャーであった。彼らは、ディズニーの『蒸気船ウィリー』が公開される何年も前から、多くの短編トーキーアニメーションを作ってきた。代表作としてあげられるのは、『おおメイベル（原題：Oh Mabel、1924年）』『懐かしいケンタッキーの家（原題：My Old Kentucky Home、1926年）』であり、前者は映像と音楽を、後者は映像とセリフを世界で初めて完全にシンクロさせたアニメーションである。しかし当時、電気式スピーカーを備えた劇場は極少数で、これらのトーキーアニメーションは余り注目を浴びなかった。こんなサイレント期を通じてアニメーションの改革と創作を行い続けてきたフライシャー兄弟は、ディズニーとは異なる都会的でハイカラなフライシャー独自のスタイルを生み出し、セクシーな『ベティ・ブープ』物とシュールな『ポパイ』物によって大当たりを飛ばした。特に、ベティ・ブープは戦前の日本でも大人気を博し、日本の美少女キャラクターの原型にもなったと言われている。また、1930年代のポパイの人気は当時のミッキーマウスのそれに匹敵し、ミッキーのファンクラブを模したポパイ・ファンクラブがアメリカ中で発生した。また、ロトスコープを採用した、ベティの短編3作品『ベティの家出（原題：Minnie the Moocher、1932年）』、『ベティの白雪姫（原題：Snow White、1933年）』、『ベティと山の老人（原題：The Old Man of the Mountain、1933年）』は、ジャズシンガーであるキャブ・キャロウェイを音楽に起用しており、そのうち、『ベティの家出』と『ベティの白雪姫』は、歴史的に永久保存されるべき作品として、アメリカ国立フィルム登録簿に登録されている。さらにフライシャーは、三次元の奥行きを再現するため、「ロトグラフ方式」という撮影方式を開発した。それはカメラに平面のセルをセットし、その後ろに回転式テーブルの上に置いてあるミニチュアを置いて撮影する方式であり、後にディズニーが開発する「マルチプレーンカメラ」の元になったとも言われている。しかし、1930年代初期に最高潮に達した映画内の不道徳描写に対する抗議活動により、映画産業は1934年に映画内の暴力・猥褻描写を一掃するヘイズ規制（Production Code）を採用した。この自主検閲制度はミッキーマウスのようなカートゥーン作品にまで適用され、その行いを改めさせることを強制した。この変化の中でベティ・ブープからセクシーさを奪われたフライシャー兄弟はとりわけ手痛い打撃を受けた。1930年代後半配給元であるパラマウント映画の要求でディズニーを模そうとする浅はかな試みを行っていたが、『ポパイ』シリーズは依然として根強い人気を保っていた。一方で元ディズニーのアニメーターヒュー・ハーマンとルドルフ・アイジングは、ワーナー・ブラザースの配給するカートゥーン作品を制作する契約を1929年に結んだ。チャールズ・ミンツのスタジオを離れ、自身のスタジオを設立していた二人は、ワーナーのサイレント映画で字幕を担当していた、パシフィック・アンド・アーツスタジオに所属していた、レオン・シュレジンガーと契約を交わし、手始めにルーニー・テューンズのパイロットフィルムである、『インク少年ボスコ』（原題：Bosko the Talk - Ink Kid）を黒人少年ボスコを主人公に制作、その翌年の1930年に、『ルーニー・テューンズ』の第1作『浮世風呂(原題：Sinkin' in the Bathtub)』をボスコ主演で公開、一躍ボスコは人気者となり、翌年の1931年には、より音楽を重視した『メリー・メロディーズ』が公開された。これらの作品は単体で見れば成功していたものの、ハーマンとアイジングはディズニーのような革新的な才能を欠いており、彼らの作品の多くは「かわいらしさ」という欠点ゆえに、観客に見た目のインパクトを与えるのに失敗していた。1930年代前半のハーマンとアイジングによるワーナー・ブラザース作品の多くは、今日では忘れ去られている。これらはカートゥーンの改革を志した正統派作品であったが、ディズニーの成功を模するには至らなかった。1933年に、ハーマン=アイジングは作品の質を上げる為に大きなスタジオ施設を要求したことに対しシュレジンガーと衝突。ボスコと共にメトロ・ゴールドウィン・メイヤーへと去っていった。その後、ワーナー兄弟からの要求でシュレジンガーはワーナー系列のアニメスタジオであるレオン・シュレジンガー・プロダクション（Leon Schlesinger Production）を開設し、元ディズニーのアニメーターであるトム・パーマーやジャック・キングらをスタジオに招き入れた。彼らによって白人少年バディの短編が製作されたが、短命に終わった。しかしながら、1935年にシュレジンガーが新しく雇ったアニメーション監督により、このスタジオは俄然活気を増すこととなった。テックス・エイヴリーである。ウォルター・ランツのスタジオに所属していたエイヴリーは荒々しく風変わりな作風のアニメーションをこのスタジオに持ち込み、ワーナーは一躍アニメーション業界の首位に上り詰めた。エイヴリーの影響によりワーナーが新たに生み出したポーキー・ピッグ(1935年の『楽しい母親参観(原題：I Haven't Got a Hat)』でデビュー)、ダフィー・ダック(1937年の『ポーキーのアヒル狩り（原題：Porky's Duck Hunt）』でデビュー)、バッグス・バニー(1940年の『野生のバニー(原題：A Wild Hare)』でデビュー)その他の無数の人気キャラクターたちの名は、全世界に広まった。初期のエイヴリーは、当時モノクロ作品で制作費の安い『ルーニー・テューンズ』を主に担当し、テクニカラー作品で制作費の高い『メリー・メロディーズ』は、前述したハーマン=アイジングの元アニメーターで、後にチャック・ジョーンズらと共にワーナーのアニメーション監督の中枢となるフリッツ・フレレング（Friz Freleng）が主に担当した。そのフレレングは1938年にワーナーを一時的に離れ、MGMに移籍したが、1940年に再びワーナーに戻った。ハーマンとアイジングは新たにMGMと契約し、さらにより好待遇の下で高予算のカートゥーンを制作し始めた。彼らがMGMに提供した無数の豪華なアニメーション作品は、魅惑的なまでに優れたアニメーション場面を特徴としていた。しかし、ハーマンとアイジングの物語描写のスタイルは彼らの作品の欠点でもあった。目にも鮮やかな視覚美術の前に、物語そのものはしばしば忘れ去られた。1930年代を通じてハーマン=アイジングスタジオはこの状況に甘んじていたが、その作品はしばしばアカデミー賞の候補となった。1937年に、フレッド・クインビーがMGMのアニメーションスタジオを設立すると、ハーマン=アイジングは、手掛けていた作品を終わらせ、1939年に入社した。これらの制作会社に加えて、1930年代にはその他の多数のアニメーション制作会社が繁栄していた。ウォルター・ランツと彼の仲間ビル・ノーランはニューヨークでアニメーション制作者としての経歴を積んでいたため、ウォルター・ランツ・スタジオの初期作品がフライシャー作品のような乱暴かつシュールな作風を取っていたのも不思議ではなかった。当時のランツの主要な手持ちのキャラクターは、ウォルト・ディズニーとチャールズ・ミンツから手に入れたオズワルド・ザ・ラッキー・ラビットであった。1933年の作品『Confidence』では、ウサギのオズワルドは合衆国大統領フランクリン・ルーズベルトを訪問する。作中でルーズベルトはその席から歩み出て、世界大恐慌を終わらせるための信頼（Confidence）を広めるとオズワルドに約束する。その一方で、オズワルドの以前の持ち主であるチャールズ・ミンツは、ジョージ・ヘリマンの漫画『クレイジー・カット』（原題：Krazy Kat）のアニメーション化と、ディック・ヒューマーにより1931年に生み出された少年スクラッピーを主人公とするシリーズの制作に携わっていた。ポール・テリーは『イソップス・フェーブル』（原題：Aesop's Film Fables）をヴァン・ビューレン・スタジオに譲り渡した後に、テリートゥーンと名付けた新しい制作会社を起こした。しかしながら初期テリー作品の娯楽としての品質の高さにも関わらず、テリートゥーンはディズニーを筆頭とする主要な競争相手のような成功は収められなかった。ヴァン・ビューレン・スタジオの作品も同様の短所を示していた。ディズニーの長年の親友であり協力者であったアブ・アイワークスは、ついにディズニー・スタジオを離れるという決断を下し、彼自身の制作会社を1930年に起こした。短期間で終わったアイワークス・スタジオでの活動の間に、アイワークスは3本の主要なシリーズを生み出した。『カエルのフリップ』（原題：Flip the Frog）、『ウィリー・ホッパー』（原題：Willie Whopper）、『コミカラー・カートゥーン』（原題：ComiColor Cartoon）である。アイワーク・スタジオは短命に終わったが、アイワークスの作品はその型破りな作風により、観客や批評家に人気があった。1937年、ウォルト・ディズニーが史上初の総天然色長編アニメーション映画『白雪姫』（原題：Snow White and the Seven Dwarfs）を公開した。この長編は1934年に製作を初め、3年間に及ぶディズニー・スタジオの努力の結晶であった。短編アニメーションによる収入ではスタジオの収益を長く保てないと確信したディズニーは、再び社運を賭けた博打に打って出たのである。『白雪姫』はディズニーを破産に導くだろうと多くの者が予想したが、この評価は間違っていたと証明された。『白雪姫』は全世界で莫大な興行収入を上げ、更には芸術形式としてのアニメーションの発展を示す道標となった。しかしながら、ディズニーは一巻物よりも長いアニメーション作品の最初の制作者ではなかった。1936年には、フライシャー・スタジオが2巻物の『ポパイ』のテクニカラー短編、『ポパイと船乗りシンドバッド』（1936年、原題：Popeye the Sailor Meets Sindbad the Sailor、上映時間16分）『ポパイのアリババ退治』（1937年、原題：Popeye the Sailor Meets Ali Baba's Forty Thieves、上映時間17分）『ポパイとアラジンの魔法のランプ』（1939年、原題：Aladdin and His Wonderful Lamp、上映時間22分）を公開していた。フライシャー兄弟は、ディズニーが『白雪姫』の製作を始めた1934年から長編アニメーション映画の製作の許可をパラマウント側に求めていたが、パラマウントはフライシャー兄弟に高品質な長編アニメーションを制作できるかという点については疑問の余地があったため彼らの提案を却下し続けていた。しかし、ディズニーの『白雪姫』の成功を知るや否や、フライシャーの提案を許可した。1938年にフライシャー・スタジオはニューヨークからフロリダ州マイアミにその本拠を移し(しかし、ニューヨークでも製作は続けられた)、1939年にアニメーション版『ガリバー旅行記』を公開した。この映画はそこそこの成功を収め、続いて1941年に『バッタ君町へ行く』（原題：Mr. Bug Goes to Town）が制作され、100万ドルの予算が掛けたが、この作品は真珠湾攻撃の二日前に公開されたということもあり、興行収入は予算のわずか5分の1しか回収できなかった。その結果スタジオは大赤字となり、1942年5月、フライシャー兄弟が彼ら自身のスタジオから解雇される形で1921年から約20年続いたスタジオは倒産し、今やその所有権を完全に握ったパラマウントは社名をフェイマス・スタジオに改名し、再び本社をニューヨークに復帰させた。1930年代にディズニー以外に世界で唯一カラー長編アニメーションを手掛けた制作者という点で、フライシャー兄弟は特筆に価する。フライシャー・スタジオの倒産により、長編映画はここからしばらくディズニーの独壇場となることになる。ディズニーは長編アニメーションの制作に集中することになり、彼個人が以前のような形で短編を監督することはなくなった。ディズニーの短編作品は相変わらず工夫に満ち、面白く、精妙なアニメーションを特徴としていたものの、その脚本は時代遅れで先の読める物になり始めた。この結果、レオン・シュレジンガープロダクションのターマイト・テラスに集まった有望なアニメーター達に道が開かれ、新世代のアニメーターたちによるサイドスプリッティングリー・ファニー・カートゥーン（爆笑アニメ）が怒涛のごとくアニメーション業界に押し寄せた。この時期にシュレジンガーの下にいるカートゥーン制作者らはその本領を発揮し、1940年代のフリズ・フレリング、チャック・ジョーンズ、ボブ・クランペットの作品群は伝説となっている。