鎌倉時代初期には関東御分国の1つとして鎌倉幕府の知行国であった。その後の知行権は公卿や興福寺・東大寺等の有力寺院の手に移るが、在庁官人や国人衆の幕府御家人化が進み、京都の遙任国司や知行国主、荘園領家らの影響力は薄れ、鎌倉幕府の介在なしには税の徴収も困難となり、「国司その用あてざる国」と揶揄された（『明月記』）。戦国時代まで存在した守護職には比企氏や執権北条氏、小笠原氏、諏訪氏、吉良氏、上杉氏、斯波氏、武田氏らがいた。幕府樹立後、初代の信濃守護には比企能員が就任し、信濃国目代を兼帯して国衙機構も掌握したが、建仁3年（1203年）の比企能員の変で北条時政に滅ぼされ、将軍源頼家の近習で、十三人の合議制に対抗する側近であった中野能成や小笠原長経も連座した。時政は比企氏以外にも幕府重臣の粛清を進め、元久2年（1205年）には平賀義信の次男平賀朝雅を傀儡の新将軍として擁立しようとしたが、失脚した（牧氏事件）。建暦3年（1213年）、御家人泉親衡が、信濃武士と結んで頼家の遺児千寿丸を将軍に擁立し、信濃守護も兼帯する執権北条義時の打倒を図る陰謀が発覚した（泉親衡の乱）。承久3年（1221年）の承久の乱では幕府の仁科盛遠への処遇も乱勃発の一端となった。信濃武士の多くは幕府方につき、東山道軍の武田信光、小笠原長清に従い、後鳥羽上皇方の仁科氏らは北条朝時の北陸道軍に敗れた。幕府方についた信濃武士は新補地頭として西国に所領を得たが、それまで東国に限定的であった幕府の権威を浸透させる目的で西遷を余儀なくされた者も多かった。また幕府が朝廷に対して優位に立ち、信濃国内における北条氏の所領も関東御領の春近領を中核として拡大すると、宝治合戦で武功を挙げた諏訪盛重や内管領を務めた諏訪盛経に代表されるように、北条氏の得宗被官（御内人）として活躍する者も現れた。この時代の仏教の信者で多いのが臨済宗、曹洞宗などの禅宗と一向宗、浄土宗（禅林寺派）などである。特に塩田北条氏の塩田荘は「信州の学海」（『仏心禅師大明国師無関大和尚塔銘』）と称されるほど、禅宗文化の中心地となった。弘安年間、興福寺が知行国主であった時、目代に補任された願舜坊定尭なる僧は信濃からの検注物や年貢を横領し、弘安7年（1284年）、本所法である「満寺評定」によって、国外追放刑となった。延慶2年（1309年）の国衙領の検注の調進は国司目代が行っているが、応安6年（1373年）には守護使に代わっている。このように信濃においても国衙は次第に形骸化され、国司の権能は守護に遷移していったことが伺える。鎌倉時代末期、元弘元年（1331年）からの元弘の乱では、信濃の御家人は、信濃守護を兼帯する探題北方北条仲時に従い、後醍醐天皇の拠る笠置山や赤坂城を攻めた（『光明寺残篇』）。しかし元弘3年/正慶2年（1333年）に後醍醐天皇が鎌倉幕府追討の宣旨を下し、足利尊氏、新田義貞ら有力御家人が幕府から離反すると、小笠原貞宗もこれに従って鎌倉攻めに加わり、後に新たな信濃守護に補任された。一方、北条仲時は京都から逃る途中で自害に追い込まれた。東勝寺合戦では御内人の諏訪直性が得宗北条高時に殉じて自害するが、高時の遺児北条時行は諏訪氏に匿われた。建武2年（1335年）、諏訪神党の諏訪頼重や滋野氏らは時行を奉じて挙兵し、鎌倉を奪還したが（中先代の乱）、わずか20日で鎮圧され、諏訪氏らは自害し、時行は逃亡した。翌年に入ると北条時興が南朝に呼応して京都から麻績御厨に入って挙兵し（『市河家文書』）、小笠原貞宗や村上信貞の軍勢と衝突したが破れた。その後は吉良満義が守護となり、北条残党一掃のため吉良時衡が派遣された。後醍醐天皇の建武の新政では公家中心の政治に対して武士の不満が高まった。延元の乱で尊氏が建武政権から離反すると、天皇方は鎌倉に向けて東海・東山両道に大軍を発し、忠房親王率いる東山道軍が大井城を落城させた。尊氏の新帝擁立で朝廷が二つに分かれた南北朝時代に入ると、南朝方の諏訪氏や仁科氏・香坂氏・祢津氏・望月氏・海野氏らと北朝方の小笠原氏や村上氏・高梨氏との間で抗争が繰り広げられた。暦応3年/興国元年（1340年）には、北条時行が遠江国から伊那谷に入り大徳王寺城に拠ったが、小笠原氏がこれを破った。観応元年（1350年）の観応の擾乱では南朝方足利直義派の諏訪直頼らも呼応して挙兵し、高師冬を討つなどの戦功を挙げ、直義が守護の任免権も掌握すると、観応2年（1351年）には直頼が信濃守護に補任されたが、尊氏派が勢力を盛り返すと薩埵山体制により守護は小笠原氏に復した。南朝方は後醍醐天皇の皇子で、興国5年（1344年）から信濃に入国した征夷大将軍宗良親王（信濃宮）を奉じて、香坂高宗の拠る伊那谷に一大拠点を築いた。文和元年（1352年）には親王が信濃の南朝勢を糾合して武蔵野合戦に出陣したが敗北し、文和4年（1355年）の桔梗ヶ原の戦いでも小笠原氏に敗北すると、信濃における南朝勢力の衰微は決定的となり、諏訪氏や仁科氏なども北朝側に寝返って、ついには将軍足利義詮に従属するようになり、文中3年（1374年）親王も信濃を去った。信濃は暦応2年/延元4年（1339年）から康永3年/興国5年（1344年）までと、貞治4年/正平20年（1365年）から応安3年/建徳元年（1370年）まで、室町幕府から鎌倉府の管轄に移行したが、再び幕府に取り戻された。幕府と鎌倉府の融和によって、鎌倉府の推挙で上杉朝房が守護に任じられたが、将軍足利義満と公方足利氏満が対立すると、信濃は鎌倉府監視の最前線となり、鎌倉時代とは一変して、京都の政情が大きく影響するようになった。天授5年/康暦元年（1379年）の康暦の政変での大幅な守護改替により斯波義種が守護に補任された。明徳3年（1392年）の明徳の和約による南北朝の合一後、幕府は在地豪族の荘園や公領の横領・濫妨を守護に命じて停止させようとしたため、複雑な対立関係が発生し、斯波氏に対する国人衆の反乱が起きた。その後、明徳の乱や応永の乱で武功を上げ信濃守護に復した小笠原氏と在地豪族の代表格村上氏が、国人衆（大文字一揆）を巻き込んで争い（大塔合戦）、小笠原長秀は京都へ追放された。応永9年（1402年）信濃は室町幕府料国（直轄地）となり、政所の直接支配下に置かれ、守護職は空白化した。その間、幕府代官として細川氏が派遣されたが、応永10年（1403年）から翌年にかけて、村上氏や高梨氏を中心とした国人衆の反乱が起きた。その後は将軍と鎌倉公方、鎌倉公方と関東管領との対立が大きく影響を及ぼし、強力な支配権を持つ自立した大名が登場することはなかった。将軍足利義教により信濃守護に復し、上杉禅秀の乱や永享の乱、結城合戦などで活躍した小笠原政康は、公方足利持氏派の村上氏を抑えて信濃を一時平定したが、嘉吉の乱で義教の後ろ盾を失い、政康の没後、小笠原氏の家督相続と守護叙任に幕府有力者の畠山氏と細川氏の対立関係が絡んで、小笠原氏は三家に分裂した。幕府による享徳の乱への出陣命令にも応えられないほど衰亡し、守護権力も地に堕ち、上杉房定に半国守護を抑えられた。室町末期にかけて下克上の様相を呈し、在地豪族の諸勢力が拮抗を続けた。埴科郡を拠点に北部や東部に勢力を拡大する村上氏、諏訪大社の信仰を背景とする諏訪氏、信濃守護家として幕府と強い繋がりを持つ小笠原氏、木曽谷に割拠する木曾氏らがその代表格であり、この4氏を後世「信濃四大将」と呼ぶ。他にも小笠原一族で守護代を務め、幼少期の古河公方足利成氏を庇護した大井氏、越後長尾氏と縁戚関係を結ぶ高梨氏、関東管領山内上杉氏を後ろ盾とした海野氏、逸早く土着し信濃源氏の祖となった井上氏、京武者として朝廷と強く結びつき、安曇郡に拠って一大勢力を築く仁科氏などの旧来の名族も健在であった。応仁元年（1467年）からの応仁の乱では仁科氏、木曾氏、伊那小笠原両氏、諏訪大社上社などが東軍（細川勝元）、府中小笠原氏が西軍（山名宗全）についた。長享元年（1487年）の長享・延徳の乱に始まる幕府の六角氏征伐では、仁科氏、木曾氏、村上氏、海野氏、小笠原氏らが将軍足利義尚、足利義稙に従って出兵した。戦国時代には隣国甲斐国や越後国との関係が深くなった。諏訪氏は甲斐守護武田氏と同盟を結び天文10年（1541年）には諏訪氏、村上氏は武田信虎と共同して小県郡へ侵攻し海野氏を駆逐するが（海野平の戦い）、同年に甲斐で晴信（信玄）への当主交代が起こると武田と諏訪の関係は手切となり、諏訪大社上社（諏訪氏）と下社（金刺氏）、諏訪宗家と高遠諏訪家の対立が絡んで、晴信による信濃侵攻が本格化する。武田氏は諏訪頼重、仁科盛政を滅ぼし、守護小笠原長時や村上義清らを追い、木曾義康や真田幸隆を従属させ、佐久郡において関東管領上杉憲政を破ると（小田井原の戦い）、信濃の大半を領国化し有力国衆を家臣団として従えていくが、それに対して、高梨氏や井上氏など北信国衆は越後の長尾景虎（上杉謙信）を頼り、武田・長尾（上杉）間の北信・川中島を巡る川中島の戦いへと展開する。弘治3年（1557年）の第三次合戦後には将軍足利義輝は甲越間の調停を行い、翌弘治4年に晴信は信濃守護に補任されている。川中島の戦いは最大の衝突となった永禄4年（1561年）の第四次合戦を契機に収束し、その後も甲越関係は対立し北信地域は最前線として緊張状態にあったが、以後は安定して信濃の武田領国化が続く。晴信は元亀2年（1571年）、三河国山間部を攻略する過程で、同国加茂郡から現・根羽村の地域を信濃国に編入し伊那郡の一部とした。武田晴信の死後、その後を継いだ武田勝頼が上杉景勝と同盟を結び、信濃を統一支配したが、天正10年（1582年）、織田信長に敗れて滅亡し、高遠城主仁科盛信らが戦死した。その後は織田家の版図に加えられ、森長可（北信）、滝川一益（東信）、毛利長秀（伊那）、河尻秀隆（諏訪）、木曾義昌（安曇、筑摩）らに与えられた。しかし約三ヵ月後には本能寺の変が起き、信濃においても一向一揆が発生したことで織田家の勢力は瓦解し、権力の空白地帯となった信濃には徳川氏・後北条氏・上杉氏の勢力が進出した（天正壬午の乱）。やがて後北条氏は徳川氏と和解・同盟して領地交換により関東へ撤退した。この結果、北信濃四郡は上杉氏、それ以外は徳川氏の領国となったが、両者の対立の狭間で第一次上田合戦を生じた。この対立はのちに徳川家康と豊臣秀吉の対立に転じ、家康が秀吉と和睦し後に臣従することで、天正18年（1590年）に関東に移封されると、徳川方の国衆も随行し、譜代大名や旗本となった者も多かった。信濃は豊臣方の武将の支配下に収まり、仙石秀久（佐久）、石川数正（安曇、筑摩）、毛利秀頼（伊那）、日根野高吉（諏訪）が入封し、木曽は秀吉の蔵入地となった。さらに慶長3年（1598年）に北信濃四郡を治めた上杉景勝が越後から会津に移封されると、北信濃には関一政、田丸直昌が入封したが、秀吉の死後、家康は両者を美濃に移し、代わって配下の森忠政を入封させた。真田氏はかつては徳川氏に仕えながら豊臣氏の配下に転じ、関ヶ原の戦いにおいて西軍方についたため、徳川秀忠の軍勢は、小山評定から関ヶ原に向けて中山道を進軍する途上、真田昌幸、信繁父子の居城上田城を攻めたが敗れた（第二次上田合戦）。しかし石田三成ら西軍首脳が本戦で敗れたため、昌幸は高野山に流罪となった。その後、東軍の真田信幸が上田から松代城に入った。西軍の真田信繁は豊臣方について後年の大坂の役で武名を挙げた。