1942年（昭和17年）1月19日、大本営海軍部は山本五十六連合艦隊司令長官にラエ・サラモア・ツラギ・ポートモレスビーの攻略を指示、これを受けて南洋部隊指揮官井上成美第四艦隊司令長官（旗艦鹿島）は、3月にラエ・サラモア、4月にツラギ・ポートモレスビーを攻略する計画を示した。3月10日、ラエ、サラモアをアメリカ軍機動部隊が空襲し、損傷艦が続出（ラエ・サラモアへの空襲）。ポートモレスビー作戦は1ヶ月近く延期された。これはポートモレスビー攻略部隊は、同基地航空部隊とアメリカ軍機動部隊の双方に対処せねばならぬことを意味し、南洋部隊（第四艦隊）所属の軽空母1隻（祥鳳）では対処しきれず、南洋部隊は連合艦隊に有力な空母部隊の派遣を強く要望する。空母加賀はパラオで座礁した損傷修理のため内地に帰投しており、4月中の派遣は困難と見られていた。その後のミッドウェー作戦実施予定に鑑み、ポートモレスビー攻略作戦は5月上旬実施に決定する。そこで、南洋部隊の従来戦力（第六水雷戦隊、第六戦隊、第十八戦隊、、第十九戦隊、鹿島、祥鳳等）に加えて、インド洋作戦に参加していなかった加賀及び第五戦隊（妙高、羽黒）、水上機母艦瑞穂、第27駆逐隊（時雨、白露、有明、夕暮）等を投入する事がきまる。ところが、日本軍基地航空隊は第二十五航空戦隊しか配備されず大型空母の加賀でも要求される任務に対処できない見込みとなった。第四艦隊は第二航空戦隊（蒼龍、飛龍）の派遣を希望したが、連合艦隊は第五航空戦隊（瑞鶴、翔鶴）の派遣を決定した。この編成替えには、一航戦や二航戦に対し技量で劣る五航戦に実戦経験を積ませ練度向上を狙うという意図もあった。また、MO機動部隊の戦力を空母3隻（瑞鶴、翔鶴、祥鳳《戦闘機のみ搭載》）とすることも検討されたが（祥鳳側も希望した）、第四艦隊司令部は輸送船団の援護を優先し、同艦に船団の直接護衛を命じた。以上の作戦方針により、インド洋から帰投途中であった4月12日、第五航空戦隊、第五戦隊、第27駆逐隊の南洋部隊編入が発令された（4月18日附）。五航戦は4月14日にシンガポール沖で他の空母と別れ、駆逐艦3隻（秋雲、萩風、舞風）とともに台湾の馬公に向かった。馬公には4月18日に到着、正式に第27駆逐隊（時雨、白露、有明、夕暮）が五航戦の指揮下に入る。同日には日本本土初空襲（ドーリットル空襲）があった。4月19日、補給を終えた五航戦は第27駆逐隊とともに出港して北上。だが、同日中に元の部署への復帰命令があったためトラックへと向かい、4月25日に到着した。そして第五航空戦隊、第五戦隊、第7駆逐隊、第27駆逐隊、油槽船東邦丸で『MO機動部隊』が編成された。編成時の第五航空戦隊（翔鶴、瑞鶴）の搭載機は、翔鶴計54機（艦戦17、艦爆21、艦攻16）・瑞鶴計63機（艦戦20、艦爆22、艦攻21）、2隻で計117機であった。4月中旬には暗号解読により日本軍の作戦を察知していたアメリカ軍は、ポートモレスビー周辺に戦力を集中する。そして空母2隻（レキシントン、ヨークタウン）を基幹とする第17任務部隊（司令官フランク・J・フレッチャー少将：空母2、重巡7、軽巡1、駆逐艦13、水上機母艦1、油槽船2）を迎撃に向かわせた。エンタープライズ、ホーネットは東京空襲を実行したため真珠湾で補給を行う必要があり、海戦が長引いた場合には珊瑚海へ投入されることになった。5月1日、MO機動部隊（翔鶴、瑞鶴、時雨、白露、有明、夕暮）はトラックを出撃した。ラバウルへ零戦9機を輸送するため南下したが悪天候に見舞われ、5月3日には翔鶴の零戦1機が海中に転落した。5月7日朝、翔鶴の索敵機はアメリカの油槽艦ネオショー(USS Neosho, AO–23)を米空母と誤認して報告。日本軍攻撃隊78機（瑞鶴37機《艦戦9・艦爆17・艦攻11》、翔鶴41機《艦戦9・艦爆19・艦攻13》）はネオショーと護衛駆逐艦シムス(USS Sims, DD-409)を撃沈したが、周辺の敵機動部隊を捜索したため数時間を費やした。また瑞鶴艦爆1機が撃墜された。この間にMO攻略部隊主隊（青葉、加古、衣笠、古鷹、祥鳳、漣）がアメリカ軍機動部隊の空襲を受け、祥鳳沈没という損害を出した。翔鶴索敵機の偵察員は補欠予備員で、正規偵察員は腹痛のため出撃できなかったという。2機の翔鶴索敵機は帰投の際に機位を失って母艦に戻れずインディスペンサブル礁に不時着、翌日になり機動部隊より派遣された有明に救助された。ネオショーへの攻撃を終えた飛行隊を収容したのち、MO機動部隊は『本当の米軍機動部隊の位置』に向けて西進を開始、五航戦司令官原忠一少将は薄暮攻撃を企図する。技量優秀者を選抜。攻撃隊27機（翔鶴12機《艦爆6・艦攻6》、瑞鶴15機《艦爆6・艦攻9》）を出撃させたが、米艦のレーダーに捉えられた。これに誘導された戦闘機F4Fワイルドキャットに襲撃されて艦攻隊は大損害（翔鶴艦攻3、瑞鶴艦攻5）を受けた。翔鶴艦攻のうち1機（萩原努大尉機）は翔鶴附近まで帰還していたが、最終的に行方不明となっている。また艦爆隊は爆弾を捨てて帰投中に、米空母に着艦しかけるアクシデントもあった。この時、対空砲火で瑞鶴艦爆1機を喪失。帰投した攻撃隊は17機（翔鶴8機《艦攻2・艦爆6》、瑞鶴9機《艦攻4・艦爆5》）であった。翔鶴搭乗員戦死者は9名であり、5月7日は翔鶴にとって不運の日となった。5月8日の珊瑚海海戦は、ほぼ互角の戦力をもつ日米機動部隊の正面対決となった。朝、MO攻略部隊より第六戦隊第2小隊（衣笠、古鷹）が合流。空母2隻（瑞鶴、翔鶴）、重巡4隻（第五戦隊《妙高、羽黒》、第六戦隊《衣笠、古鷹》）、駆逐艦5隻（第7駆逐隊《潮、曙》、第27駆逐隊《時雨、白露、夕暮》）でアメリカ軍機動部隊との決戦に臨んだ。午前6時以降の索敵では、翔鶴索敵機（機長:菅野兼蔵飛行兵曹長、操縦:後藤継男一等飛行兵曹、電信員:岸田清次郎一等飛行兵曹長）がアメリカ軍機動部隊を発見、同機は燃料切れを覚悟で日本軍攻撃隊を誘導し、未帰還となった。3名は山本五十六連合艦隊司令長官からその功績を認められ、死後二階級特進・金鵄勲章を授与されている。翔鶴飛行隊長高橋赫一が指揮する日本軍攻撃隊69機（瑞鶴31機《艦戦9・艦爆14・艦攻8》、翔鶴38機《艦戦9・艦爆19・艦攻10》）は空母レキシントン(USS Lexington, CV-2)を撃沈、ヨークタウン(USS Yorktown, CV-5)撃破という戦果をあげた。翔鶴隊は主にレキシントンを、瑞鶴隊は主にヨークタウンを攻撃している。フレデリック・C・シャーマン(レキシントン艦長)は、「(翔鶴隊の攻撃は)みごとに協調が取れていた」と回想している。一方、対空砲火とアメリカ軍機動部隊上空の空戦で計20機（瑞鶴5機《艦爆2・艦攻3》、翔鶴15機《艦戦3・艦爆7・艦攻5》）を喪失。瑞鶴は46機（瑞鶴24機《艦戦8・艦爆12・艦攻4》、翔鶴22機《艦戦9・艦爆7・艦攻6》）を収容。収容機中、瑞鶴所属機6と翔鶴所属機6を損傷のため海中投棄した。また後述の攻撃で大破した翔鶴に艦戦1・艦爆1が強行着艦している。瑞鶴艦攻1機が不時着して白露に救助、瑞鶴艦爆1機が神川丸に救助、古鷹が翔鶴艦戦3(直衛機)と艦爆2・瑞鶴艦爆1、勝泳丸が翔鶴艦爆1を救助した。翔鶴搭乗員戦死者は36名であった。しかし、第17任務部隊も撃破される前に攻撃隊計82機（75機とも）を発進させていた。アメリカ軍攻撃隊はスコールに隠れた瑞鶴を見逃し、翔鶴に殺到した。MO機動部隊の陣形は混乱しており、相互掩護できる状態ではなかった。ヨークタウン攻撃隊（艦戦6、艦爆24、艦攻9）は翔鶴に対し爆弾6発、魚雷命中3本を報告。レキシントンの攻撃隊（艦戦9、艦爆22、艦攻12）は爆弾3発、魚雷命中5本、翔鶴撃沈確実を報告した。アメリカ軍側は多数の魚雷命中を報告しており、命中していたが不発だった可能性もある。だが爆弾は大きな損害を与えた。午前9時40分以降、計3発の爆弾が命中、至近弾8発を記録。最初の1発は艦首前甲板左舷に命中して両舷主錨を吹き飛ばし前部エレベーターは陥没して停止、飛行甲板前部も損傷したため、さらに前甲板右舷下方の航空用ガソリン庫に引火し大火災が発生した。2発目は飛行甲板右舷後部（後部短艇甲板附近）に命中し、短艇が火災を起こした。3発目は艦橋後方の機銃台・信号マスト付近に命中、艦橋勤務兵や付近の機銃要員に多数の死傷者が出た。最終的に戦死者109名、重軽傷者114名に及んだ。瑞鶴からは水平線上にマストだけ見えていた翔鶴から火柱があがり、黒煙に包まれる光景が目撃された。瑞鶴の見張員が「翔鶴沈没」と錯覚するほどの様子だったという。だが機関は無事（30ノット発揮可能）だったため、第六戦隊第2小隊（衣笠、古鷹）、駆逐艦2隻（夕暮、潮）と共に戦場を離脱する。不時着機の捜索に2隻（時雨、白露）を派遣したので瑞鶴の随伴艦は曙のみとなった。このあと火災は鎮火したため、3隻（衣笠、古鷹、潮）は反転。潮は燃料補給に向かい、夕暮のみ随伴して共に避退した。夕暮は潮に『翔鶴ハ何処ヘ向ヒシヤ、翔鶴ニ着イテ行ク必要ナキヤ』と発信した。退避する翔鶴の速度については、翔鶴運用長福地周夫少佐は「艦は三十ノットの速力で猛進している」と記述している。翔鶴軍医官渡辺直寛中尉は「これは偏に航海長塚本朋一郎中佐による操艦の賜物と評判高い。最大戦速34.5ノットで取舵一杯、面舵一杯にして爆弾・魚雷を避けたと云う。」と記述している。翔鶴艦爆整備兵西村敏勝海軍一等兵曹は「たえず変針する三〇ノット以上の全力航行での振動の凄まじさは、爆弾の直撃以上」と記述している。。瑞鶴の護衛にあたった第七駆逐隊司令部（駆逐艦潮）付通信兵大高勇治は、損傷した翔鶴が40ノット以上を発揮していたと記述している。5月9日、2隻（翔鶴、夕暮）は横須賀回航を命じられた。祥鳳が沈没と翔鶴が大破、多数の艦載機を喪失したことにより南洋部隊指揮官の井上成美第四艦隊司令長官はポートモレスビー作戦の中断を命じた。井上司令長官の姿勢を消極的だと判断した山本五十六連合艦隊司令長官は、断固として追撃するよう命令する。しかしヨークタウンは逃走しており、追撃は空振りにおわった。またポートモレスビー作戦の海上攻略作戦も中止された。後日、南洋部隊機動部隊は山本長官より感状を贈られた。