亀山は、朝廷の訴訟処理機構の整備を進め、また公家社会の身分秩序を律する「弘安礼節（弘安書札礼）」を制定するなど、意欲的に政務に取り組んだ。この時期を「弘安の徳政」とも呼ぶ。同じころ幕府でも安達泰盛が主導する徳政が行われており、亀山と泰盛とのあいだには文化交流など個人的なつながりもあることから、公武両徳政には密接な連関があるものと考えられている。しかし、弘安8年（1285年）に泰盛とその与党が平頼綱らのクーデタである霜月騒動により殺害・追放されて幕府の政策が転換すると、その影響が朝廷にも及び、亀山の院政は動揺した。このころ後深草も後嵯峨は亀山を後継者に指名してはいない旨を幕府に申し入れるなどの工作を行っている。亀山が倒幕を考えている、という噂が立つなどの政情不安のなか、結局、弘安10年（1287年）になって幕府は治天・天皇の交替を要求し、皇太子煕仁（23歳、伏見天皇）が践祚して後深草による院政が開始された。正応2年（1289年）にはこれも幕府の指名により伏見の第1皇子胤仁親王（2歳）が皇太子に立てられ、さらに同年後深草の皇子久明親王が鎌倉殿として幕府に迎えられた。後深草はこれを見届けると正応3年（1290年）に出家（48歳）し、治天の政務も伏見に譲って引退した。この時点では、まだ両統迭立が完全には定着しておらず、貴族たちもいずれか一方の皇統にのみ仕えて派閥を形成するということはなかったため、それまで大覚寺統の治天に仕えていた貴族たちはそのまま持明院統の治天に仕えることになり、大覚寺統は一気に勢力を失った。亀山は失意のうちに正応2年に出家（41歳）し、翌正応3年に霜月騒動で所領を失った武士浅原為頼らが内裏に乱入し伏見を殺害しようとする事件が起きると関与を疑われ、起請文を幕府に提出して身の潔白を主張しなければならなかった。治天となった伏見は、亀山が政務を執った時代に整備された訴訟処理機構をさらに拡充し、家柄にとらわれない人材登用を積極的にめざすなど、政務の振興に努力した。伏見が抜擢した人物としてもっとも著名なのは京極為兼である。為兼は伏見の信任を背景に二条家と並ぶ歌壇の一方の指導者となっただけでなく、政務にも深く関与した。ただ、為兼の強烈な個性は多くの敵をつくり、伏見の積極的な政治姿勢とも相まって、関東申次西園寺実兼との対立や幕府の警戒を呼ぶ結果となった。伏見は永仁6年（1298年）に皇太子胤仁（10歳、後伏見天皇）に譲位したが、次の皇太子の人選をめぐって大覚寺統の巻き返しが起こり、実兼もこれに加担した。結局、皇太子には後宇多天皇の第1皇子邦治親王（14歳）が指名された。伏見は引き続き政務を執ったが政権は安定せず、正安3年（1301年）、幕府は治天・天皇の交替を要求し、邦治（17歳、後二条天皇）が践祚して後宇多による院政が開始された。両統迭立が鎌倉幕府（最高権力者は得宗北条貞時）の公式な方針として表明されたのは、この交替のときが最初である。以後滅亡まで幕府はこの方針を堅持した。王家の分裂を固定化する意図によるものとする説と、皇位継承を王家の自律に任せ直接的な関与を避ける意図によるものとする説とが対立している。両統迭立の定着にともない、一方の皇統に専属的に仕える貴族が出現しはじめ、また治天の側も貴族たちにそれを求めた。王家の分裂が公家社会全体の分裂へと発展してゆくことになった一方、貴族たちの治天への従属は深まった。また、政務の交替とともに朝廷の高官・要職が一斉に入れ換えられ、一方の皇統の治天が下した訴訟の判決が他方の皇統の治天によって安易に覆されるなどの混乱も生じ、朝廷そのものの権威はかえって地盤沈下してゆくことになった。更にこの混乱は幕府へも思わぬ影響を及ぼした。治天が下した判決を執行するための警察力・軍事力を欠いていた朝廷では、六波羅探題にその執行を命じる勅命（違勅綸旨・違勅院宣）を送ってその検断権に基づく執行を命じたからである。この結果、敗訴した側は朝廷に逆らう「悪党」として討伐の対象となり、一方的に「悪党」と認定された側も激しく抵抗した。ところが、治天の交替によって判決がひっくり返されると、今度は対立していた側が同様の目に遭わされた。このため、訴訟当事者たちの朝廷に対する怒りが六波羅探題とその後ろにいる幕府にも向けられた。しかも、訴訟当事者の中に御家人がいた場合でも六波羅探題や幕府は勅命や院宣に逆らってまで彼らを保護することが出来なかった。このため、悪党の活発化や御家人の幕府への不信を招く結果となり、幕府の権威もまた傷つく結果となったのである。両統迭立の方針に基づき、次の皇太子は持明院統から出すこととされた。13歳の後伏見にはまだ皇子がなく、伏見の第4皇子富仁親王（5歳）が皇太子となった。2つに分裂した王家がさらに分裂する可能性が生じ、伏見は持明院統の分裂を防止するため富仁を後伏見の猶子とする措置をとっている。大覚寺統では、すでに後二条には正安2年（1300年）に第1皇子邦良親王が生まれて将来の皇位継承が予定されていたにもかかわらず、亀山が乾元2年（1303年）に生まれた自分の皇子恒明親王を偏愛するあまり、邦良に代えて恒明を皇位につけることを後宇多と伏見に約束させて、さらなる皇統分裂の種を蒔いた。嘉元2年（1304年）に後深草が62歳で死去、翌嘉元3年（1305年）には亀山が57歳で死去し、両統迭立は第2世代の時代に入った。それに先立つ正安4年（1302年）、伏見は2年前に死去した室町院より相続した持明院を新たな御所とした。一方、後宇多は徳治3年（1308年）になって大覚寺を再興して自らの御所とした。近藤成一の研究によれば、後深草・亀山両院の存命中はそれぞれ冷泉富小路殿と冷泉万里小路殿を拠点としており、「持明院統」「大覚寺統」の名称の由来となった持明院と大覚寺は自己の系統を新たな皇統として位置づけることに成功した伏見と後宇多という第2世代を象徴する殿舎であったと指摘している。両統迭立の影響は芸能面にも見られるようになる。豊永聡美の研究によれば、後鳥羽天皇が愛好した影響により、鎌倉期よりそれまでの笛に代わって琵琶が天皇の教養として必須の楽器となっており、後深草もその例に倣って琵琶を習得していたのに対し、亀山は笛を重んじた。これは亀山が皇位継承者として浮上する以前から笛を習得していたことに加えて何らかの政治的判断も働いた可能性がある（後深草も亀山の了承を得た上で、持明院統の笛説を天皇家代々の藤井流から地下官人の大神氏に伝わる大神流に切り替えている）。実際には亀山も習得の開始は遅いながらも琵琶にも優れており、兄の後深草よりも先に秘曲を習得することが出来た（ただし、秘曲の伝授の時期は政治的な問題も絡んでおり、習得時期の前後と能力の優劣は無関係である）。以降、持明院統の天皇は琵琶を、大覚寺統の天皇は笛を、必須の楽器とした（なお、後年の持明院統（北朝）の分裂の際にも、後光厳天皇が兄である崇光天皇流（持明院統嫡流）に対抗する意図で琵琶から笙に切り替えている）。それでも、後深草・亀山の存命中は亀山が朗詠や蹴鞠を後伏見に伝授したり、管弦の会で両統の天皇や院が共演して演奏したりする交流の機会もあったが、両院の没後はそうした機会も減少していく。後宇多もやはり政務に精励することで自己の皇統の正統性を補強しようと努力している。また、真言密教に傾倒して、徳治2年（1307年）には出家している（41歳）。これも個人的な信仰だけでなく、宗教的権威により皇統の正統性を強化する意図を含むものである。しかし、徳治3年（1308年）に後二条（24歳）が急死して皇太子富仁（12歳、花園天皇）が践祚し、伏見による院政が再開された。大覚寺統から皇太子が選ばれることになったが、後宇多天皇は、皇太子として嫡孫邦良（9歳）ではなく第2皇子尊治親王（21歳）を選んだ。邦良の幼少と病弱を考慮し、また恒明を立太子を要求する勢力を抑えるための措置だったが、結局これも問題をさらに複雑なものにした。なお、伏見も正和2年（1313年）に出家し、治天の政務を後伏見に譲っている。両統迭立の定着により、両統とも時期を待てばいずれ政務を執ることができるようになると、今度は両統ともその時期をなるべく早めようとする。それは、具体的にはもっぱら鎌倉幕府へ特使を派遣して現任の天皇を譲位させるように請願するかたちで行われた。特にこのころ、伏見は第1次の院政期から引き続いて幕府から警戒されており、かつての亀山のように倒幕を考えているという噂も立つほどで、正和5年（1316年）には、伏見は幕府に告文を提出して潔白を訴えている。当然、治天・天皇の交替を求める大覚寺統からの圧力は増大した。対応に苦しんだ幕府は、文保元年（1317年）、次回の皇位継承については両統の協議により決定し、特使の派遣はやめるように指示した。協議の場で後宇多は花園が皇太子尊治に譲位すること、次の皇太子には邦良を立てることを求めた。伏見は花園の譲位は受け入れたが、皇太子には後伏見の第1皇子量仁親王（5歳）を立てることを求めた。協議はいったん決裂したが、同年伏見が53歳で死去すると両統の力関係は持明院統に不利となり、後宇多は再び花園の譲位を要求し、後伏見はこれを拒むことができず、翌文保2年（1318年）には尊治（31歳、後醍醐天皇）が践祚し、邦良（19歳）が皇太子となった。交換条件として、後宇多は邦良の次の皇太子には量仁を立てることを後伏見に約束している。両統迭立は、すでに当然のこととして定着していた。後醍醐の践祚とともに後宇多の院政が再開されたが、後宇多は大覚寺門跡を創設して自ら門主となるなど密教への傾倒をさらに深め、また年齢とともに体調を崩してしだいに政務に倦み、元亨元年（1321年）には治天の政務を後醍醐に譲り、元亨4年（1324年）には58歳で死去した。両統迭立は第3世代の時代を迎える。