オペロンの歴史は、1940年にジャック・モノーがβ-ガラクトシダーゼ の発現について研究し始めたときから始まる。ラクトースを代謝するこの酵素はラクトースやほかのガラクトシドの存在で増えることを発見した。モノーとメルビン・コーン (Melvin Cohn) らは抗体を用いてこのことを確認し、遺伝子が誘導されることが原因と知った。モノーはβ-ガラクトシダーゼを産生できるのにラクトースを栄養に増殖できない変異についての研究から、同時に転写される遺伝子群の存在を知る。野生型と変異型に放射性ガラクトシドを与えたところ、β-ガラクトシダーゼ遺伝子が誘導されていないとどちらも摂取することができなかった。誘導すると野生型はできるが、変異型はしなかった。このことは、変異型はガラクトシドを取り込むのに必要な物質が欠けており、そしてそれはβ-ガラクトシダーゼとともに発現することを意味する。この仮想物質をモノーはガラクトシドパーミアーゼと名付けた。しかし、単離して存在を確認する前にタンパク質を命名したことは共同研究者の非難を招いた。モノーは後に「伝統的な二人の英国紳士は、名前や評判を互いによく知っていたとしても、正式に紹介されるまでは互いに話しかけたりしないという話を思い出した」と述べる。実験後にガラクトシドパーミアーゼの精製は行ったが、その過程でガラクトシドトランスアセチラーゼも得た。このタンパク質はβ-ガラクトシダーゼとガラクトシドパーミアーゼとともに発現するためだ。こうして、1950年代までにモノーは、3つの酵素をガラクシドは同時に誘導することを確かめた。また、誘導を必要としない構成性変異体 constitutive mutation も発見していた。これは常に3つの遺伝子を覚醒させている。そこで、遺伝学が研究を大いに推し進めると考え、パスツール研究所で廊下のちょうど向こうで働いていたフランソワ・ジャコブ François Jacob と共同研究することにした。アーサー・パルディー Arthur Pardee の協力もあり、誘導を必要とする(誘導性 inductive )野生型の対立遺伝子と構成性変異体のとの両方を持つ部分二倍体 merodiploid の作製に成功した。誘導性対立遺伝子が優勢であることは証明され、誘導前に発現を防ぐのは遺伝子ではなく別の物質であると判明する。構成性変異体はlac リプレッサーの遺伝子(lacI )が欠損していることはすぐに確認された。lac リプレッサーLacIはDNAの特定領域に結合すると予想するのはたやすい。ジャコブとモノーはこれをオペレーターと名付け、変異の影響に大きな影響を受けると考えた。これもまた構成性変異の一つだ。存在を確かめるために2人は、lacI とは別の個所での変異が構成性変異を引き起こすことを証明することにした。区別の方法は、lacI の変異が優勢であるのに対し、オペレーターのそれは劣勢であるという理論だ。ジャコブはこの理論を次のように譬えた。細菌の部分二倍体における誘導性と構成性変異の両オペレーターを、1つの家に入るドアを制御する二つのラジオ受信機に、また二つのリプレッサー遺伝子を、ドアを閉じた状態にする同じ信号を送る送信機とする。一つのリプレッサー遺伝子が変異することは、送信機の一つが壊れることと同じである。しかし、もう一つの送信機は生きているので、両方のドアは閉ざされてしまう。すなわち両方の遺伝子群は抑制されるので、この変異は劣勢だ。一方で、構成性変異の異常がオペレーターでのこととすると、受信機の一つは壊れることを意味する。閉鎖命令を受け付けないのでドアは開きっ放しになる。対してもう一つの機能する受信機のドアは閉ざされたままだ。すなわち、遺伝子の発現は行えるのでこの変異は優勢のはずだ。このような、同じ遺伝子についてのみ優勢で、部分二倍体のもう一つのDNA上では劣勢な変異を、シス優勢 cis-dominant という。ジャコブとモノーはシス優勢（構成性オペレーター operator constitutive からOᶜで表す）を発見し、オペレーター存在の証明を果たした。ジャコブとモノーの先駆的な研究ののち、1960年代にウォルター・ギルバート Walter Gilbert とBenno Muller-Hillはlac リプレッサーの部分的な精製に成功した。当時、遺伝子クローニングはまだ開発されておらず、最も感受性の強いバイオアッセイは特異的に結合するイソプロピルチオガラクトシド isopropylthiogalactoside:IPTG だった。しかし、そのままでは細胞をすり潰して得る粗抽出液のlac リプレッサー濃度は低すぎて検出できない。そこで、通常よりもIPTGに強く結合する変異 lacIᵗ を持つ大腸菌を使用した。DNAと結合したlac リプレッサーLacIをニトロセルロースフィルター結合法で検出できる。このことを利用し、ギルバートの方法で精製したlac リプレッサーを濃度ごとに分けて、メルビン・コーンは人工の誘導因子であるIPTGがあるかないかで結合する割合を調べた。この結果は誘導因子がオペレーターへの接近を阻害することを示す。コーンらは別の実験で、構成性変異オペレーター(lacOᶜ)を含むDNAは、同程度結合されるために野生型のそれよりも高濃度を要求することも明らかにした。このことから、ジャコブとモノーがオペレーターとして定義したDNA領域はリプレッサーに結合されることを確かめられる。オペレーターの占有がなぜ負の制御につながるかは諸説あるが、少なくとも転写を実行する酵素 RNAポリメラーゼ RNA polymerase を妨害すると考えられている。RNAポリメラーゼは転写を開始するためにプロモーターへ結合する必要があるが、それはちょうどオペレーターの隣だ。負の制御の解明は紆余曲折を経てきた。当初、lac リプレッサーはプロモーターに近づけさせない障害物だと考えられた。しかし、1971年にIra Pastanはlac リプレッサー存在下でも強固な結合は起きることを明らかにした。2つはDNAに同時に結合できることも、1987年にSusan StraneyとDonald Crothersらにより確認された。これらにより、以降しばらくlac リプレッサーは、DNAに結合した後のRNAポリメラーゼに影響すると考えられることになる。Barbara KrummelとMichael Chamberlinらは初期転写複合体の脱出を阻害すると考えた。この仮説が正しければ、アボーティブ転写産物は作られることになるが、Jookyung LeeとAlex Goldfarbらはlac リプレッサー存在下で6ntのRNAを得た。しかしながらLeeとGoldfarbらの実験と引用したほかの実験の条件は、RNAポリメラーゼとlac リプレッサーの濃度がはるかに大きいなど生体条件からかけ離れたものだった。そこで、Thomas Recordらは生体に近い条件でアボーティブ転写産物の合成速度を計測した。RNAポリメラーゼとラクトースオペロンプロモーターの複合体を作成し、(1)単独の場合(2)転写阻害剤のヘパリンを加えた場合(3) lac リプレッサーを加えた場合(4)複合体がない場合の4つを行った。(1)ではアボーティブ転写産物は問題なく合成されたが、(2)と(3)の結果は同様の阻害が起こったことを示す。ヘパリンは遊離しているときに結合し、DNAと結合しないようにするタンパク質であり、すなわちDNAとの間でどちらが先にRNAポリメラーゼに出会うか競合する。このような阻害様式は競合阻害といい、lac リプレッサーがこの形式の阻害剤であることは明らかだ。現在ではDNA結合をRNAポリメラーゼと競合するという初期の仮説が有力だ。1978年にウィリアム・レズニコフはラクトースオペロンの主要なプロモーターの22 bp上流に別のプロモーターがあることを発見する。1984年にWing Wuとドナルド・クラザーズ (Donald Crothers) はCAP-cAMPによるDNAの屈曲 DNA bending を電気泳動により測定した。DNAは曲がると移動度が小さくなり、折れた部分が中央に近いほど顕著になる。クラザーズはこれを利用した。まず、アクチベーター結合部位が異なる同じ長さのDNA断片を複数用意し、全てCAP-cAMP複合体に結合させた。電気泳動にかけ、測定した移動度の差から屈曲の角度を90°と見積もった。これは1991年に修正され、トーマス・アーサー・スタイツ Thomas Arthur Steitz により約100度であると決定された。1996年にミッチェル・ルイス (Mitchell Lewis) はlac リプレッサーおよびオペレーターを含む21 bpのDNA断片との複合体をX線結晶構造解析した。この結果、lac リプレッサー四量体の2つの二量体はそれぞれDNAの異なる部位に結合することは明らかになった。2002年にリチャード・エブライトが、DNAとCAP-cAMP複合体とRNAポリメラーゼのαCTDとの複合体をX線結晶構造解析した。αCTDが結合しやすいよう、CAP結合部位に隣接する配列を親和性の大きいA-T高含有配列(5’-AAAAAA-3’)に変えた。