1942年6月、ミッドウェー海戦に参加。ミッドウェー海戦は、ミッドウェー島攻略を目的にしたミッドウェー作戦の前哨戦であった。準備期間は一か月もなく、時期尚早と一航艦司令部から反対があった。作戦事前研究会で山口多聞少将と源田実中佐が連合艦隊司令部に反対と食いついたが、連合艦隊司令部は決定済みとして取り合わなかった。ミッドウェー島占領後、基地航空隊の司令となる予定の森田大佐、飛行隊長、整備員達が赤城に乗り込み、士官室は手狭になった。淵田美津雄中佐(赤城飛行隊長)や村田重治少佐(雷撃隊隊長)ら飛行搭乗員達は、山本連合艦隊長官と戦艦の大和が南雲機動部隊の300浬後方をついてくることに「戦争見物でもするつもりか」と怒りを隠さなかった。5月27日の海軍記念日に赤城以下南雲機動部隊は日本から出撃する。6月4日、艦橋の周辺にハンモックを丸めたマントレットを装着した。また珊瑚海海戦の戦訓から敵味方識別のため、日本空母の飛行甲板前部には巨大な日の丸が描かれていたが、これはアメリカ軍急降下爆撃隊にとって絶好の的となった。日本時間6月5日午前1時30分、日本軍南雲機動部隊はミッドウェー島のアメリカ軍基地に攻撃部隊を発進させた。赤城からは零戦9機(空中戦で1機喪失)、九九艦爆の稼働全18機が発進した。空中攻撃隊総指揮官を務めるはずだった淵田美津雄中佐は盲腸手術からの回復期で出撃できず、飛行甲板から攻撃隊を見送った。その彼の足元の航空機格納庫では、魚雷を搭載した九七式艦上攻撃機が米軍機動部隊出現に備えて待機している。第一次攻撃隊発進後、魚雷を搭載した第二次攻撃隊の九七艦攻が飛行甲板に揚げられた。午前4時、ミッドウェー基地攻撃を終えた第一次攻撃隊が「第二次攻撃の必要性あり」と伝達する。南雲司令官は兵装転換を各艦に命令、第一航空戦隊(赤城、加賀)では飛行甲板の九七艦攻を格納庫に戻して魚雷を外し、陸用爆弾に転換する作業が始まった。その最中、南雲機動部隊はミッドウェー基地から飛来したアメリカ軍航空機の空襲を受けた。赤城は攻撃を全て回避し、直衛の零戦を発進させてアメリカ軍機の攻撃を撃退した。午前4時40分、重巡洋艦利根の零式水上偵察機が「敵らしきもの10隻みゆ」と報告したため、南雲司令部は兵装転換を45分に一時中止する。中止したのは、直前の珊瑚海海戦で翔鶴索敵機がタンカーネオショーと米空母を取り違えて誤認報告し、その索敵情報を鵜呑みにしたMO機動部隊（瑞鶴、翔鶴）が見当違いの方向に攻撃隊を送り出した戦訓に鑑みたものという意見もある。利根機の報告を受け、参謀長の草鹿龍之介少将は、空母が付近にいると思うと同時に「敵らしき」だけでは命令の変更には不十分であり、「艦種知らせ」と利根機に指示した。利根機からの電報を受ける直前あるいは受けた後に、飛龍の山口司令が掌航海長の田村士郎兵曹長に指示して「本朝来種々の敵機来襲にかんがみ、敵機動部隊出撃の算あり。考慮せられたし」という信号文を赤城に送ったという主張もある。5時20分に詳細が入り、敵空母の存在を確認。5時30分、ミッドウェー基地への攻撃をとりやめ、アメリカ軍機動部隊を攻撃するため魚雷兵装転換命令を出す。さらに南雲機動部隊上空に帰還した第一次攻撃隊の着艦や、直衛戦闘機の燃料・弾薬補給の着艦・発艦を優先させた。結果的に、この決定で攻撃隊を発進させる前にアメリカの航空機の攻撃を受け、赤城は攻撃の機会を逃すことになるが、6月4日の午前7時45分(現地時間)には、南雲に後知恵という便利なものはなかった。赤城の艦橋はあまりにも狭く、空襲・潜望鏡発見・着艦・発艦のたびに騒々しくなり、南雲が考えをまとめるのは困難だったという意見もある。その赤城の格納庫では兵装転換を終えていた15～16機の九七艦攻への魚雷再装着作業が始まる。格納庫には、取り外された爆弾が乱雑に転がっている状態となった。赤城は第一次攻撃隊27機の収容を優先し、午前6時18分に収容を終えた。その後もアメリカ軍は南雲機動部隊に波状攻撃を行い、直掩の零戦隊はアメリカ軍のTBFアベンジャー雷撃機に対応するため海面付近に降下した。各艦の注意が低空に向いていた日本時間午前7時26分、赤城は米空母エンタープライズから発進した艦上機SBD ドーントレスの急降下爆撃を受ける。攻撃隊指揮官マクラスキー少佐（エンタープライズ）は戦闘機乗りから急降下爆撃機に転向したばかりなので戦術的過ちを犯し、指揮下のドーントレス32機すべてを空母加賀に集中させた。そこで第六爆撃飛行隊のディック・ベスト大尉は部下の小隊機（3機乃至5機）をひきいて赤城に向かった。ベスト隊が直上にきていたのに赤城は高射砲も撃たず、飛行機の発進準備をしつつ（零戦1機が発艦するのが見えたという）直進していた。急降下爆撃がはじまってから面舵にて回避に努めたが2発が命中、1発が至近弾となった。至近弾となった最初の1発は艦橋左舷数十mで炸裂、命中した2発は1発目が中部エレベーター付近に命中し、飛行甲板を突き破って格納庫内で炸裂。2発目が左舷後部甲板縁で炸裂、舵は取舵20度で固定し、赤城は旋回しかできなくなる。赤城の飛行甲板にいた牧島カメラマンによれば、初弾が左舷艦橋附近至近弾、次発が飛行甲板中央命中、三発目が艦尾至近弾となり、飛行甲板後部がめくれあがったという。艦橋にいた増田飛行長や橋本信号兵曹も、三発目は命中弾ではなく艦尾至近弾と回想している。草鹿参謀長は、攻撃隊に準備ができたものから発艦するように命じ、攻撃隊の戦闘機が飛び立とうとしたところに爆撃を受け、あと5分あれば攻撃隊は発艦できたと回想している。これは「運命の5分間」と言われたが、実際には攻撃隊の準備はできておらず、5分で発艦するのは不可能だった。当時、赤城の飛行甲板上では直衛戦闘機の発艦準備中で、零戦1機（木村惟雄一飛曹）が発艦を終えた直後だった。木村によれば、加賀・蒼龍が被弾炎上するのを見て、咄嗟に発進準備中の隊長機に乗り発進したと回想している。滑走中だった二番機は甲板中央で逆立ちとなり、炎上した。当時、赤城の格納庫内には3機の零戦、魚雷装備艦攻18機、第一次攻撃隊として着艦収容したばかりの艦爆18機があった。特に九七艦攻はアメリカ軍機動部隊攻撃のため燃料を満載し、魚雷を装備中だった。その周囲には艦攻から外した陸用爆弾が散乱していたという。中央部に命中したアメリカ軍機の爆弾により、これらが誘爆を始め、赤城の致命傷となった。増田(赤城飛行長)は四空母幹部との対談で「四万トンの『赤城』が250キロの爆弾一発でもってゲームセット。全くこれはあっけなかった。脆弱性を如実に示しているんでしょうね」と語っている。仮にベスト大尉率いる5機のドーントレスが攻撃に失敗した場合、健在艦は空母2隻（赤城、飛龍）となるため、本海戦の流れ全体が変わっていた可能性がある。機械には異状がなかったが、右舷機関室の兵員は炎上格納庫から流れ込んだ熱気のために全員戦死した。三浦航海長が罐室から機械へ送る蒸気を止めたため、午前7時42分に赤城は洋上に停止。乗組員は炎上する飛行甲板にいられず、前部錨甲板か後部甲板に追い詰められてしまう。艦橋にも炎に追われた乗組員が逃げ込んだが、その艦橋にも逆立ちとなった炎上零戦から延焼し、南雲中将や草鹿龍之介参謀長ら司令部は艦橋前面の小窓から飛行甲板に下りた。彼らは艦首前甲板に移り、短艇で赤城を脱出し、午前7時46分に南雲第一航空艦隊司令長官と司令部人員は軽巡洋艦長良(第十戦隊旗艦)に移乗した。長良への移乗の経路には諸説ある。第十駆逐隊司令艦風雲（駆逐隊司令阿部俊雄大佐）の吉田正義駆逐艦長によれば、赤城内火艇で南雲長官以下司令部が風雲に移乗、続いて長良に移っていったという。従軍カメラマン牧島貞一や赤城信号員の橋本広の回想では、長良に直接移乗している。上空の木村も、赤城から長良へ向かうカッターボートを目撃している。橋本によれば、駆逐艦の嵐(第四駆逐隊司令駆逐艦)が赤城左舷後部至近距離に停泊して南雲司令部の移乗を待っていたところ、赤城の左舷前方500mに停泊した長良からも迎えの短艇2隻が来たため、第十戦隊の旗艦である長良に移乗艦を変更したと回想している。戦闘詳報や戦史叢書では、この時接近した駆逐艦を野分と記している。この南雲司令部が移乗につかったボートは長良艇ではなく野分のものだった可能性もある。長良移動後の南雲中将は第十戦隊司令官木村進少将に長良による赤城曳航を命じたが、不可能だった。