Funktionelle Charakterisierung von CKX7 und cytokininregulierten Transkriptionsfaktorgenen in Arabidopsis thaliana (2009)

Das Pflanzenhormon Cytokinin beeinflusst auf vielfältige Weise das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen. Cytokininoxidase/-dehydrogenase Enzyme (CKX) bauen Cytokinine irreversibel ab. Die CKX Gene von Arabidopsis werden differentiell in der Pflanze exprimiert und die CKX Enzyme kommen in verschiedenen subzellulären Kompartimenten vor. Verschiedene Substratspezifitäten der Enzyme und unterschiedliche phänotypischen Auswirkungen einer Überexpression der einzelnen CKX Gene in Pflanzen weisen darauf hin, dass die Cytokininpools verschiedener Kompartimente anscheinend unterschiedlich reguliert werden und möglicherweise einzelne Cytokinintypen spezifische Prozesse unterschiedlich beeinflussen. In dieser Promotionsarbeit wurde CKX7 funktionell charakterisiert. Durch die Expression von CKX7 unter Kontrolle des starken, konstitutiv aktiven 35S Promotors in Arabidopsis und Tabak wurde gezeigt, dass CKX7 ein funktionelles cytokininabbauendes Enzym ist. Die Analyse der subzellulären Lokalisation zeigte, dass CKX7 als einziges Mitglied der CKX Familie zytoplasmatisch lokalisiert ist. Die Überexpression von CKX7 führte nur zu einer geringfügigen Veränderung des Sprosswachstums. Durch CKX7 abgebaute Cytokininmetabolite oder der Ort ihres Abbaus haben demnach keine große Bedeutung für das Sprosswachstum. Die Expression von CKX7 beschränkte sich auf das Leitgewebe im Keimlingsstadium sowie spezifische Domänen des weiblichen Gametophyten. Das Wurzelwachstum CKX7 überexprimierender Keimlinge war im Gegensatz dazu stark reduziert. Die Primärwurzel war extrem kurz, unverzweigt und wies strukturelle Defekte im radiären Aufbau auf. Die Wurzelmeristemaktivität war stark reduziert. Das Leitgewebe war vollständig zu Protoxylem differenziert, sodass kein Metaxylem und kein Phloem gebildet wurden. Dieser Defekt ist von Mutanten mit starker Reduktion der Cytokininsignaltransduktion in den vaskulären Initialen der embryonalen Wurzel bekannt, zum Beispiel von der AHK4/CRE1 Mutante wooden leg (wol). Die jeweils durch Ausschalten von AHP6 und AHK4/CRE1 bewirkte Komplementationen des Wurzelphänotyps zeigte, dass in CKX7 überexprimierenden Keimlingen die Cytokininsignaltransduktion vermutlich stark reduziert ist. Das Auftreten eines wol ähnlichen Wurzelphänotyps ist möglicherweise die Folge einer den Signalweg negativ regulierenden Phosphatase-Aktivität von AHK4/CRE1. Da in anderen cytokinindefizienten Keimlingen, die CKX1 oder CKX2 überexprimieren, dieser wol ähnliche Wurzelphänotyp nicht auftritt, sind spezifische, durch CKX7 abgebaute Cytokininmetabolite wahrscheinlich in den vaskulären Initialen besonders wichtig oder stellen die Mehrheit in diesen Zellen dar. Potenzielle, besonders wichtige Cytokininmetabolite sind cZ, cZ9G und iP9G, welche in CKX7 überexprimierenden Keimlingen sehr stark reduziert waren. Zusammenfassend hat die funktionelle Analyse von CKX7 neue Hinweise auf die Bedeutung der subzellulären Kompartimentierung von Cytokininen und auf die mögliche Bedeutung der Wirkung spezifischer Cytokininmetabolite während der Wurzelentwicklung geliefert. Der zweite Schwerpunkt lag in dieser Arbeit auf der Identifizierung cytokininregulierter Transkriptionsfaktoren und der Untersuchung einer möglichen Beteiligung dieser an der Vermittlung cytokininregulierter Wachstums- und Entwicklungsprozesse in der Pflanze. Dreizehn in einem Microarray-Experiment im Vorfeld identifizierte cytokininregulierte Gene für Transkriptionsfaktoren wurden untersucht und ihre Regulation durch Cytokinin mittels unabhängiger Methoden größtenteils bestätigt. In einer loss-of-function Analyse wurden für sieben der Gene T-DNA Insertionsmutanten isoliert. Vier durch Cytokinin positiv regulierte Gene wurden zusätzlich in einer gain-of-function Analyse untersucht, indem transgene Pflanzen, die diese Gene unter der Kontrolle des 35S Promotors exprimieren, hergestellt und analysiert wurden. Die phänotypischen Veränderungen der T-DNA Insertionsmutanten waren von geringem Ausmaß und betrafen ausschließlich das Wurzelwachstum oder den Chlorophyllgehalt. Eine Beteiligung von HSFA2, MYB60 und HAT3 an der cytokininvermittelten Lateralwurzelbildung ist anzunehmen. MYB48 spielt vermutlich eine Rolle beim cytokininregulierten Primärwurzellängenwachstum. Von HAT3 ist zudem eine Beteiligung an der cytokininregulierten Unterdrückung der dunkel-induzierten Seneszenz wahrscheinlich. Die phänotypischen Veränderungen der Pflanzen, welche einzelne Transkriptionsfaktorgene überexprimieren, betrafen sowohl das Wurzel- als auch das Sprosswachstum. GATA22 spielt eine Rolle während der Wurzelentwicklung, die im Falle der Lateralwurzelbildung zudem cytokininabhängig ist. Die Bildung von Chlorophyll in der Primärwurzel als Folge der ektopischen Expression von GATA22 weist darauf hin, dass GATA22 eine Rolle bei der Chloroplastenentwicklung spielt. Weiterhin wurde eine Hypothese aufgestellt, nach der Cytokinin die Schattenvermeidungsreaktion durch eine Regulation von HAT4 beeinflusst. HAT22 reguliert das Primärwurzelwachstum positiv, den Chlorophyllgehalt negativ und fördert die natürliche Seneszenz. Veränderungen der Cytokininsensitivität der einzelnen untersuchten Prozesse deuten darauf hin, dass HAT22 die Cytokininwirkung vermutlich sowohl im Licht und im Dunkeln als auch im Spross und in der Wurzel gegensätzlich vermittelt. bHLH64 wurde als negativer Regulator der Lateralwurzelbildung und des Chlorophyllgehaltes identifiziert. Eine cytokininabhängige Veränderung dieser Prozesse in bHLH64 überexprimierenden Pflanzen konnte jedoch nicht eindeutig ermittelt werden. Der pleiotrope Phänotyp der stark exprimierenden Linie 35S:bHLH64-88 gab Anlass zur Vermutung, dass in dieser Linie durch die ektopische Expression von bHLH64 auch Veränderungen des Licht- und des Gibberellinsignalweges verursacht wurden. Für eine abschließende Beurteilung der funktionellen Relevanz der untersuchten cytokininregulierten Gene für Transkriptionsfaktoren sind weitere Experimente notwendig.