Designed ankyrin repeat proteins for targeted cancer therapy (2010)

Neue Generationen von bindenden Molekülen, die nicht auf dem Immunglobulin-Gerüst basieren, sind zu einer attraktiven Alternative zu Antikörpern geworden. Während die Spezifität von Antikörpern erhalten bleibt, bieten diese neuen Generationen von Bindungsproteinen mehrere Vorteile gegenüber Antikörper in Bezug auf molekulare Robustheit als Voraussetzung für z.B. Affinitätsmaturierung, sowie Stabilität und Wirtschaftlichkeit der Produktion. Ein Beispiel für eine solche Alternative sind Designed Ankyrin Repeat Proteine (DARPin). Der Schwerpunkt dieser Arbeit war die Generierung von spezifischen DARPins, die das tumorassoziierte Antigen EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) erkennen, und deren Verwendung als Trägersubstanz für ein Biotoxin zur tumorgerichteten Therapie. Die Wahl von EpCAM als Zielstruktur beruht auf dessen vorteilhaften Eigenschaften als Bindungsstellen auf Tumorzellen wie zum Beispiel die Überexpression in zahlreichen soliden Tumoren, der geringen Expression und anatomisch bedingten schlechteren Zugänglichkeit in normalen epithelialen Geweben, der stabilen Expression ohne "shedding" und der Fähigkeit, nach Ligandenbindung in die Zelle zu internalisieren. All diese Eigenschaften machen EpCAM zu einer idealen Zielstruktur für die tumorgerichtete Behandlung mit hochzytotoxischen Krebsmedikamenten einschliesslich Biotoxine, die ohne diese Tumorselektivität nicht anwendbar sind. Das günstige therapeutische Fenster EpCAM-spezifischer Krebstherapien wurde bereits in früheren Studien bestätigt.\nDer erste Schritt zum spezifischen EpCAM Targeting war die Selektion und Charakterisierung von DARPins, die gegen die extrazelluläre Domäne von EpCAM gerichtet sind. Phage-Display- und Ribosome-Display Methoden wurden angewandt, um eine erste Generation von Bindern gegen EpCAM zu erhalten, die anschliessend durch Affinitätsreifung noch weiter verbessert wurden. Die zweite Generation von Bindern wurde charakterisiert, und die sechs besten EpCAM- spezifischen DARPins wurden ausgewählt. Sie waren sehr gut exprimierbar, monomerisch und erkannten nicht nur das lösliche EpCAM, sondern konnten auch im zellulären Kontext an EpCAM binden. Basierend auf der Affinität, wählten wir einen dieser Binder, EC4, zur weiteren Analyse als Targeting-Einheit für die EpCAM-gerichtete Krebsbehandlung mit einem hochgiftigen Biotoxin. Hierfür wurde Ec4 C-terminal mit einer verkürzten Form des Pseudomonas Exotoxin A (ETA) ohne dessen bindende Domäne fusioniert. Ec4-ETA" war löslich und in grossen Mengen im Zytoplasma von E. coli exprimierbar. Der Vorteil der Verwendung eines DARPins für die Generierung des Fusionsproteins wird dadurch verdeutlicht, dass dieses Fusionstoxin zu einer 50 mal höheren Ausbeute und wesentlich vereinfachter Aufreinigung führte, verglichen mit einem EpCAM-spezifischen scFv, der mit ETA" fusioniert ist und im Periplasma exprimiert wurde. Nach biochemischer Charakterisierung des DARPin-ETA'' Fusionsproteins wurde die Zytotoxizität gegen Tumorzellen in vitro und in vivo analysiert. EC4-ETA" erwies sich als hochzytotoxisch gegen verschiedenen humane Krebszellen, dabei war dieser Effekt abhängig von der Expression von EpCAM. So wurde nur eine sehr geringe Hintergrundaktivität gegen EpCAM- negative Zellen gemessen und die Zytotoxizität von Ec4ETA" wurde auch durch Zugabe von löslichem EC4 DARPin als Kompetitor gehemmt, nicht aber durch Zugabe eines unspezifischen DARPins. In vivo Fluoreszenz-Bildgebung in Nacktmäusen mit subkutan wachsenden HT29 Kolonkarzinomen zeigte, dass sich EC4-ETA" in Tumoren ansammelt mit Maximalwerten 48 bis 72 Std. nach intravenöser Injektion, während eine unspezifische DARPin ETA"-Fusion keine Tumorlokalisation zeigte. Dieses günstige Tumorlokalisierungsprofil korrelierte direkt mit der Antitumoraktivität des Fusionstoxins, so kam es nach Injektion von Ec4-ETA" in gut verträglicher Dosierung zu einer deutlichen Hemmung des Wachstums der Kolonkarzinome mit vereinzelt sogar kompletten Regressionen. Zusammenfassend haben wir erstmals hochaffine und stabile EpCAM- spezifische DARPins hergestellt und charakterisiert. Am Beispiel einer hochzytotoxischen DARPin-Biotoxin Fusion konnten wir zudem deren Eignung für die tumorgerichtete Krebstherapie in vitro und in vivo demonstrieren. \n\n\nSummary \nNew generations of binding molecules not based on the immunoglobulin scaffold have become an attractive alternative to antibodies. While keeping the same affinity and specificity of antibodies, they can provide several advantages over them concerning robustness, stability and economy of production. An example of such an alternative scaffold is the Designed Ankyrin Repeat Protein (DARPin). The focus of this thesis was on the generation of specific DARPins recognizing the clinically validated tumor-associated antigen epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) and their use as a vehicle for the delivery of a highly potent biotoxin. The choice of EpCAM as a target was based on its favorable characteristics as a tumor-associated antigen such as overexpression in numerous tumor types, low expression and poor accessibility on normal tissues, no considerable shedding or downregulation and its ability to internalize upon ligand binding. All these characteristics make EpCAM an ideal target for the tumor-targeted delivery of cytotoxic payloads. Moreover, the reasonable therapeutic window offered by EpCAM targeting has been demonstrated by several approaches. The first step to achieve highly specific targeting of tumor cells was the selection and characterization of DARPins against the extracellular domain of EpCAM. Phage display and ribosome display were applied to obtain a first generation of EpCAM binders which were then further improved by affinity maturation. The second generation of improved binders was characterized and the six best EpCAM-specific DARPins were chosen. They could prove to be well-expressing monomers and recognized EpCAM not only insoluble form, but also bound to epitopes accessible in the cellular context. Based on the affinity, we chose one of these binders, Ec4, for further analysis as a vehicle for targeted delivery of a highly potent biotoxin to human tumor cells. To this end, Ec4 was C-terminally fused to a truncated form of Pseudomonas exotoxin A (ETA") lacking the cell-binding domain. Ec4-ETA" was expressed in soluble form and at high yields in the cytoplasm of E. coli. The advantage of using a DARPin for the generation of the fusion protein was thus convincingly demonstrated by a 50-fold higher production yield, and more simplified purification steps compared to its counterpart, an EpCAM-specific scFv-ETA" immunotoxin, which insoluble form only expressed in the periplasm. Upon biochemical characterization, the DARPin-ETA’’ fusion protein was analyzed for cytotoxicity and antitumor activity in vitro and in vivo. Ec4-ETA" was highly cytotoxic to an EpCAM-positive tumor cell lines of various histotypes. This effect was EpCAM-dependent, as cytotoxicity was reduced to background levels on EpCAM-negative cells and further analysis revealed that it was also abolished upon addition of soluble Ec4 as a competitor, but not an irrelevant unspecific DARPin. In vivo fluorescence imaging in nude mice bearing human HT29 colon carcinoma xenografts demonstrated that Ec4-ETA" accumulated in tumors with peak levels achieved 48 h to 72 h after injection, whereas an irrelevant unspecific DARPin-ETA fusion did not show tumor localization. The favorable tumor targeting of properties of Ec4-ETA" also translated into potent antitumor activity resulting in a strong inhibition of tumor growth at well-tolerated doses with some mice showing even complete regressions. In conclusion, we generated and characterized for the first time EpCAM- specific DARPins of high affinity and stability, and in the form of a second-generation fusion toxin as an example demonstrated their potential for use in tumor targeting and therapy.