Espressione e funzione di proteine codificate da geni localizzati sui loci di suscettibilità per la psoriasi nei cheratinociti umani (2003)

E’ ormai consolidato che l’espressione delle integrine -1 e -4 caratterizzi una sottopopolazione di cheratinociti staminali (CS) all’interno del compartimento basale dell’epidermide unama. I CS che esprimono livelli aumentati di integrine -1 e -4 sembrano giocare un ruolo fondamentale nella patogenesi della psoriasi, essendo i portatori del difetto iperproliferativo. Inoltre, l’integrina -1 è up-regolata nella psoriasi e induce la iperproliferazione dei cheratinociti. Siccome i CS sono protetti dall’apoptosi tramite una via di trasduzione che coinvolge le integrine, ipotizziamo che questa stessa via possa essere alterata nella psoriasi. Quindi, scopo di questo progetto è la valutazione del processo apoptotico indotto dall’inibizione del pathway dell’integrina -1 nei CS psoriasici.Innanzitutto compareremo i livelli di integrina -1 e -4 nei cheratinociti psoriasici e in quelli normali. Quindi esamineremo la capacità adesiva dei cheratinociti normali e lesionali. In seguito isoleremo i CS e determnineremo se i CS derivati da lesioni psoriasiche esprimano livelli maggiori di integrina -1 rispetto a quelli derivati da cute normale. Successivamente valuteremo se il blocco dell’integrina -1 è in grado di indurre apoptosi nei CS e nelle cellule TA derivate da lesioni psoriasiche in misura differente rispetto alla cute normale. In seguito misureremo i livelli di diverse proteine apoptotiche nei CS e nelle cellule TA di lesioni psoriasiche e cute normale.Infine, confronteremo il livello di proteine apoptotiche nella cute normale rispetto a quella psoriasica e nei cheratinociti normali rispetto a quelli psoriasici in coltura.In particolare, in una fase preliminare, valuteremo con citofluorimetria i livelli di integrine e la capacità adesiva dei cheratinociti normali e psoriasici. Il progetto sarà diviso in due fasi.Fase 1. I cheratinociti possono essere divisi in base all’espressione delle integrine -1 e -4. In questo studio sfrutteremo queso approccio per isolare tre popolazioni di cellule dopo l’adesione al collagene di tipo IV. Cheratinociti derivati da cute normale e da lesioni psoriasiche verranno seminati su collagene di tipo IV. Saranno prima lasciati aderire alla matrice extracellulare (ECM) per 5 minuti, quindi le cellule non adese saranno trasferite su piastre rivestite di collagene e lasciati di nuovo aderire tutta la notte. Infine, i cheratinociti non ancora attaccati dopo una notte saranno piastrati sul collagene di tipo IV per ottenere la terza popolazione. I cheratinociti adesi rapidamente saranno ulteriormente arricchiti per mezzo di biglie magnetiche coniugate con integrina -4. Questa popolazione rappresenterà i CS mentre i cheratinociti adesi alla ECM dopo una notte saranno le cellule “young TA”. Infine, i cheratinociti non aderenti rappresenteranno le cellule TA. Al fine di meglio definire i CS, valuteremo la clonogenicità tramite la efficienza di formazione delle colonie. Essendo stato recentemente identificato p63 come marker dei CS, analizzeremo questa proteina tramite western blot.Fase 2. La caratterizzazione dei CS sarà approfondita per mezzo dello studio del ciclo cellulare e dell’apoptosi. In particolare, valuteremo con conte cellulari e citofluorimetria, la proliferazione dei CS rispetto alle cellule TA. L’apoptosi sarà studiata con la TUNEL in situ e la citofluorimetria dopo trattamento dei CS e delle cellule TA derivati da cheratinociti normali e psoriasici con anticorpi neutralizzanti anti--1 integrina. L’espressione dei seguenti anticorpi sarà a sua volta valutata nei cheratinociti normali e psoriasici così come nell’epidermide normale e psoriasica con una metodica semiquantitativa basata sulla densitometria eseguita su western blot: anti-BID e altri anticorpi contro la famiglia di Bcl-2, anti-caspasi-3, anti-caspasi-8, anti-caspasi-9, anti-caspasi-10, anti-caspasi-14, anti-cIAP 1 and 2, anti-Nac, anti-TUCAN, anti-citocromo c, anti-TRAF-4, anti-FAP1. Inoltre, le neurotrofine e i loro recettori saranno valutati nei cheratinociti derivati da cute normale e psoriasica. Ancora, analizzeremo l’espressione della survivina citosolica e nucleare. Siccome sembra che localizzazioni subcellulari distinte correlino con differenti funzioni della survivina, studieremo la localizzazione subcellulare della survivina nei cheratinociti normali e psoriasici. Utilizzeremo western blot, microscopia confocale e RT-PCR per identificare la survivina, la survivina 2B (isoforma citoplasmatica) e la survivina Ex3 (isoforma nucleare).Infine, per definire i meccanismi apoptotici, esamineremo innanzitutto l’attivazione delle caspasi a tempi diversi nei cheratinociti normali e psoriasici dopo neutralizzazione dell’integrina -1. Nel dettaglio, definiremo se l’apoptosi segua la via estrinseca o quella intrinseca aggiungendo un inbitore rispettivamente della caspasi-8 o della caspasi-9. Inoltre, valuteremo se ci sia qualche differenza nell’attivazione delle caspasi tra i cheratinociti psoriasici e quelli normali.