Verbreitung und Rekombination von Genen zur Synthese von Toxinen und Peptiden in Cyanobakterien (2013)

Die planktisch lebenden Cyanobakterien sind durch die Produktion von Toxinen in Binnengewässern bekannt. Es ist daher wichtig die Vererbung und Verbreitung der genetischen Basis zur Synthese dieser Toxine zu erforschen. Die filamentösen Cyanobakterien der Gattung Planktothrix kommen weltweit in Binnengewässern vor und produzieren neben dem bekannten toxischen Heptapeptid Microcystin auch noch zahlreiche bioaktive Peptide. Aufgrund der Fähigkeit von Planktothrix Algenblüten zu bilden, können gesundheitsgefährdende Konzentrationen dieser Toxine, z.B. Microcystine auftreten. Neben den Microcystinen werden die bioaktiven Peptide Aeruginosin, Anabaenopeptin, Cyanopeptolin, Microginin, Microviridin und Planktocyclin produziert. Diese Peptide fungieren zum Teil als Protease Inhibitor und tragen z.B. zum Fraßschutz bei. Das Toxin Microcystin und die Peptide Aeruginosin, Anabaenopeptin, Cyanopeptolin und Microginin werden nach dem Prinzip des Multienzyme Thiotemplate Mechanismus der nicht-ribosomalen Peptidsynthese (wie z.B. die klassischen Peptidantibiotika) synthetisiert. Die anderen Peptide (Microviridin und Planktocyclin) werden jedoch ribosomal durch posttranslationale Modifikationen der Prä-Peptide, welche in Precursorgene kodiert sind realisiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 142 Isolate von Planktothrix, die von verschiedenen Klimazonen stammen auf ihre genetische Basis zur Produktion dieser Peptide untersucht. Hierfür wurden alle Isolate mittels PCR mit spezifischen Primern auf das Vorhandensein der einzelnen Peptidgencluster untersucht. Einige Peptidgencluster, die nicht nachgewiesen werden konnten, wurden einer erneuten Suche nach Resten dieser Peptidgencluster unterzogen. Weiters wurde die genetische Variation innerhalb des Genclusters des ribosomal synthetisierten Peptids Microviridin untersucht. Dabei wurde neben dem Vorhandensein von akzessorischen Enzymen, auch die Variabilität der Precursorgene überprüft. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass man generell bei Isolaten der gemäßigten Breiten wie P. agardhii und P. rubescens sechs verschiedene Peptidgencluster (Aeruginosin, Anabaenopeptin, Cyanopeptolin, Microginin, Microcystin, Microviridin und Planktocyclin) findet. Im schon sequenziertem Genom von P. agardhii sind drei Peptidgencluster (Anabaenopeptin, Cyanopeptolin und Microviridin) direkt benachbart. Dieser Multipeptidgencluster konnte auch bei der überwiegenden Mehrheit der 142 Isolate von Planktothrix nachgewiesen werden. Es war auffällig, dass eine größere Anzahl der Isolate den Microcystingencluster verloren haben und nur noch Genreste aufwiesen. Im Gegensatz dazu wurde der Verlust des Anabaenopeptin- und Cyanopeptolingenclusters nur bei einigen Isolaten festgestellt. In einzelnen Fällen könnte dieser Verlust auch die Auflösung des Multipeptidgenclusters bedeuten. Der Gencluster für das Peptid Microginin wurde nur in einzelnen Isolaten nachgewiesen. Überaschenderweise wurde bei den Isolaten aus der tropischen Klimazone von der Gattung P. pseudagardhii keine dieser bekannten Gencluster gefunden. Es konnten lediglich Fragmente der Cyanopeptolin- und Microcystingencluster identifiziert werden. Da die beobachtete Variabilität der gefundenen Gencluster durch Verlustprozesse zustande gekommen ist, muss man daraus schließen, dass bei der Vererbung der Gencluster der horizontale Transfer innerhalb der Gattung Planktothrix keine Rolle spielt. Einzig die geringe Abundanz des Microginin Genclusters könnte durch horizontalen Gentransfer verursacht sein. Innerhalb der Planktothrix Isolate unterschied sich die Microviridinsynthese vor allem im Vorhandensein der Acetyltransferase (ACT) und der Anzahl der Precursorgene. Das Vorhandensein der ACT geht wahrscheinlich auf ein Rekombinationsereignis zurück, da bei den Isolaten ohne ACT kein Hinweis für einen Genabbau festgestellt wurde. Es wurden Isolate mit einem, zwei oder drei Precursorgene festgestellt. Die Mehrheit der Isolate (2/3) wiesen nur ein Precursorgen auf, wobei sich innerhalb dieser Isolate die Variabilität auf nur zwei Prä- Peptid (Corepeptid) Varianten beschränkt. Eine kleinere Anzahl an Isolaten, die zwei oder drei Precursorgene hatten, zeigten mit 17 verschiedenen Corepeptid Varianten eine viel höhere Variabilität. Bei einigen Isolaten wurde innerhalb des Microviridingenclusters noch kurze Insertionen in der „intergenic spacer“ (IGS) Region, ein hypothetisches Protein mit einer möglichen Funktion zur Plasmidstabilisierung und Reste eines Precursors gefunden. Diese hohe genetische Variation innerhalb der Precursorpeptide kam wahrscheinlich ebenfalls durch zahlreiche regelmäßige Rekombinationsereignisse zustande, was letztendlich auch in einer hohen Anzahl an Microviridin Strukturvarianten resultieren sollte. Da die Microviridine ribosomal synthetisiert werden ist auch eine genaue Vorhersage der Masse anhand der Sequenz der Corepeptide möglich. Unter Zuhilfenahme von massenspektrometrischen Verfahren konnte gezeigt werden, dass einzelne Isolate mit einem zweiten Precursorgen auch eine weitere Microviridin Strukturvariante produzieren.