Promena boje cveta perunike (Iris germanica L.) genetičkom modifikacijom biosinteze karotenoida (2013)

Boja cveta perunike (Iris germanica L.) je određena na osnovu dva odvojena biohemijska puta sinteze biljnih pigmenata. Na osnovu biosinteze karotenoida dobijaju se cvetovi žute, narandžaste i ružičaste boje, dok biosinteza antocijanina dovodi do plave, ljubičaste i bordo boje cvetova. Crvene perunike ne postoje u prirodi, i do danas nisu dobijeni kultivari sa ovom bojom primenom konvencionalnih načina oplemenjivanja. U ovoj disertaciji ispitana je mogućnost primene metoda genetičkog inženjeringa sa ciljem dobijanja perunika sa crvenim cvetovima. Za ostvarenje ovog osnovnog cilja razvijeni su protokoli za regeneraciju perunike (I. germanica L. ‘Skating Party’) iz ćelijskih suspenzija, protokoli za efikasnu genetičku transformaciju kao i genetičku transformaciju sa ciljem modifikacije biosintetskog puta karotenoida kod perunika.\nZa genetičku transformaciju perunika su korišćene dve nezavisne metode, jedna zasnovana na biolističkoj transformaciji (bombardovanje mikroprojektilima) pomoću PDS-1000/He (Particle Delivery System) i druga zasnovana na Agrobacterium-posredovanoj transformaciji. Ovo su prve poznate metode za genetičku transformaciju vrsta roda Iris, koji će omogućiti dalje oplemenjivanje ovih ukrasnih vrsta primenom savremenih molekularnih metoda. Protokol zasnovan na Agrobacterium-posredovanoj transformaciji se pokazao kao bolji od biolističke transformacije u smislu efikasnosti i jednostavnosti primene. Ispitana je osetljivost ćelija perunika na dejstvo nekoliko antibiotika i pokazano je da su higromicin i gentamicin (G418) najpogodniji za selekciju transformisanih ćelija. Soj A. tumefaciens LBA 4404 koji nosi superbinarni vektor pTOK233 je bio najefikasniji za transformaciju perunika. Više od 300 morfološki normalnih transgenih perunika je dobijeno posle 6 meseci. Oko 80% regeneranata je pokazalo pozitivnu reakciju za marker gen ß-glukuronidazu (GUS) i gen za neomicin fosfotransferazu II (NPTII) (paromomicin-rezistencija) koji se nalaze na plazmidu za transformaciju. Integracija transgena u genom jedra transformisanih perunika je potvrđena Southern blot-analizom.\nSa ciljem razvoja metoda za modifikaciju karotenoidnog biosintetskog puta kod perunika, prvo je transformisan kultivar ‘Fire Bride,’ koji ima ružičaste cvetove sa bakterijskim genom za fitoen sintazu (crtB) iz Pantoea agglomerans pod kontrolom promotorskog regiona gena za kapsantin-kapsorubin sintazu iz Lilium lancifolium (PLlccs). Ovaj pristup imao je za cilj da poveća protok prekursora karotenoida i dovede do povećanja koncentracije likopena i na taj način izazove pojavu tamnijih nijansi ružičaste ili crvenih nijansi cvetova perunika. U kalusnim kulturama ovog kultivara došlo je do povećane ekspresije crtB gena i promene boje kalusa od žute u ružičasto-narandžastu i nijanse crvene usled povećane akumulacije likopena. Cvetovi transgenih biljka dobijenih iz transgenih kalusa ovog kultivara su pokazali značajniju promenu boje plodnika i cvetnih drški (od zelene ka narandžastoj) kao i antera (od bele ka ružičastoj). Nisu uočene značajnije promene u boji perigona cvetova (standardima i folovima) u odnosu na kontrolne biljke. Rezultati ukazuju da su ovi geni u zelenim delovima cvetova perunike pod drugačijom regulacijom od delova cveta koji nisu zeleni. Kao generalni zaključak dobijamo da se ektopijska ekspresija gena crtB može uspešno koristiti za delimično menjanje boje delova cvetova kultivara perunike ‘Fire Bride’ ali nije najpogodaniji metod za značajnije menjanje boje u standardima i folovima...