Biochemical and molecular biological characterization of a lipase produced by the fungus Rhizopus delemar (1999)

The results of a comprehensive biochemical and molecular biological investigation of the lipase produced by the mycelial fungus Rhizopus delemar are described. This enzyme cleaves and synthesizes primary esters and related bonds, exhibits 1,3-positional selectivity in its actions on glycerides, and is a member of a family of enzymes that have been widely used in applied biocatalysis. Use of glycerol as main carbon source rather than glucose or lipid supported mycelial growth and lipase production. The enzyme was purified to homogeneity and characterized. Pure lipase was crystallized and its three-dimensional structure determined. The enzyme was found to adopt a configuration similar to those of other members of its homologous family. The structural data also indicated that lipases possess greater configurational mobility than had been previously appreciated. A complementary DNA clone was isolated that contained the full length lipase gene. The nucleic acid sequence of this cDNA indicated that it was initially synthesized as a preproenzyme, and allowed determination of the complete predicted amino acid sequence of the lipase, and its comparison to the sequences of related enzymes. Truncated forms of the cloned cDNA were produced that encoded either mature or prepro-lipase. These DNAs were introduced into a tightly regulated E. coli expression system, overcoming the toxicity of the enzyme while also allowing overproduction of lipase. Molecular modelling was employed to guide the rational mutagenesis of the enzyme, identifying sites within the substrate binding region that regulated substrate selectivity. Mutant lipases were generated with altered substrate specificities, creating novel enzymes and beginning the definition of structure-function relationships in the lipolytic enzymes. Biochemische und molekularbiologische Charakterisierung einer von dem Pilz Rhizopus delemar produzierten Lipase. Die Ergebnisse einer umfassenden Untersuchung der biochemischen und molekularbiologischen Eigenschaften einer von dem Pilz Rhizopus delemar produzierten Lipase werden beschrieben. Dieses Enzym spaltet und synthetisiert primäre Ester und verwandte Bindungen, zeigt 1,3-Positionsspezifität gegenüber Glyceriden und gehört zur Familie von Enzymen, die breit in der angewandten Biokatalyse eingesetzt werden. Der Einsatz von Glycerin als Hauptkohlenstoffquelle anstelle von Glucose oder Lipiden unterstützt das mycelare Wachstum und die Lipaseproduktion. Das Enzym wurde bis zur Homogenität aufgereinigt und charakterisiert. Die reine Lipase wurde kristallisiert und die dreidimensionale Struktur bestimmt. Dies ergab, daß das Enzym eine Konfiguration aufweist, die der anderer Mitglieder der homologen Familie entspricht. Die Strukturdaten deuten auch darauf hin, daß die Lipase eine größere konfigurative Mobilität besitzt, als bisher angenommen wurde. Ein komplementärer DNA-Klon, der das komplette Lipase-Gen enthält, wurde isoliert. Die Nukleinsäuresequenz dieser cDNA deutet darauf hin, daß das Enzym ursprünglich als Preproenzym synthetisiert wurde und erlaubte die Bestimmung der kompletten vorhergesagten Aminosäuresequenz der Lipase sowie einen Sequenzvergleich mit verwandten Enzymen. Verkürzte Formen der klonierten cDNA, die entweder für reife oder Prepro-Lipase kodierten, wurden hergestellt. Diese DNAs wurden in ein streng reguliertes E. coli-Expressionssystem eingeführt, um eine Toxizität des Enzyms zu vermeiden und zusätzlich eine Überproduktion zu ermöglichen. Molekulares Modelling diente zur rationalen Mutagenese des Enzyms durch Identifizierung von Positionen, die in der Substratbindungsregion die Substratselektivität bestimmen. Lipasemutanten mit veränderter Substratspezifität wurden hergestellt. Diese neu geschaffenen Enzyme dienen als Startpunkt für eine Definition der Struktur-Funktionsbeziehungen lipolytischer Enzyme.