Etablierung eines Wirts-induzierten RNAi-Systems für die Kontrolle des Asiatischen Sojabohnenrostes Phakopsora pachyrhizi (2015)

Der Erreger des asiatischen Sojabohnenrostes Phakopsora pachyrhizi ist ein bedeutendes Pathogen für den globalen Sojaanbau und kann innerhalb kürzester Zeit zu erheblichen Ernteausfällen führen. Bislang erfolgt die Bekämpfung von Phakopsora pachyrhizi hauptsächlich durch den Einsatz von Fungiziden und diverse Kulturmaßnahmen. Eine vielversprechende Methode für die zukünftige Kontrolle obligat biotropher Parasiten, wie Phakopsora pachyrhizi, ist die RNA-Interferenz (RNAi) vermittelte Wirts-induzierte Genstilllegung (engl. Host-induced Gene Silencing, HIGS). HIGS basiert auf der transgenen Expression von doppelsträngiger RNA (dsRNA) in der Wirtspflanze, welche eine RNAi gegen die zu dieser dsRNA komplementären mRNA des Pathogens induziert. Die Expression von dsRNA kann dabei entweder durch die stabile Transformation der Wirtspflanze mit dsRNA-Konstrukten, oder durch transiente Expressionssysteme erreicht werden.\nIn jüngerer Vergangenheit wurde HIGS in verschiedenen obligat biotrophen Parasiten, wie dem Getreidemehltau Blumeria graminis oder den Getreiderosten Puccinia striiformis f. sp. tritici und Puccinia triticina, demonstriert. Darüber hinaus sprechen Arbeiten an verschiedenen Fusarium spp. dafür, dass HIGS auch auf nektrotrophe Parasiten übertragbar ist. Obwohl es bei den Getreiderosten beachtliche Fortschritte bei der Entwicklung von HIGS gegeben hat, steht bislang kein vergleichbares System für die Verwendung bei Leguminosenrosten zur Verfügung. Aufgrund der immensen ökonomischen Bedeutung von Phakopsora pachyrhizi, bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit in der Etablierung eines HIGS-Systems, für die Verwendung im obligat biotrophen Pathosystem Phakopsora pachyrhizi vs. Glycine max. Als Zielgene wurden dafür zehn Gene mit wichtigen Funktionen in essentiellen Signal- und Stoffwechselwegen aus einer haustoriellen Transkriptomdatenbank von Phakopsora pachyrhizi ausgewählt. Die Expression von dsRNA erfolgte mittels eines auf dem Bean Pod Mottle Virus (BPMV) basierenden, viralen Vektorsystems. Die Inokulation von Glycine max mit rekombinanten Viren erfolgte sowohl biolistisch, als auch über mechanische Verfahren. Die Expression rekombinanter Viren, induzierte für die drei Zielgene Pp_contig01251, Pp_contig05320 und Pp_contig3015 eine partielle Genstilllegung, welche in Form einer reduzierten relativen Transkripthäufigkeit beobachtet werden konnte. Für Pp_contig05320 war zudem ein negativer Einfluss auf das Wachstum von Phakopsora pachyrhizi erkennbar. Als eine alternative Methode für die Expression von doppelsträngiger Haarnadel-RNA (engl. hairpin RNA, hpRNA) in Glycine max wurde die Agroinfiltration getestet. Da diese Methode jedoch zu einer starken Schädigung des infiltrierten Blattgewebes führte, konnte die Agroinfiltration im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen nicht etabliert werden. Allerdings gelang es, die erfolgreiche transiente Transformation von Glycine max mittels Agroinfiltration über die Expression eines Markergenkonstruktes nachzuweisen und damit die prinzipielle Eignung dieser Methode für die transiente Transformation von Glycine max zu belegen. \nAufgrund der Verwendung der RT-qPCR für die Quantifizierung der relativen Transkripthäufigkeit, wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Gene von Phakopsora pachyrhizi und Glycine max auf ihre Eignung als Referenzgene für die Normalisierung untersucht. Durch die Verwendung der Algorithmen geNorm und NormFinder gelang es, stabil exprimierte Referenzgene aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien von Phakopsora pachyrhizi zu identifizieren. Zudem wurde die stabile Expression verschiedener Referenzgene von Glycine max im zeitlichen Verlauf einer Infektion mit Phakopsora pachyrhizi analysiert und stabil exprimierte Referenzgene identifiziert. Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse belegen, dass das Prinzip der Wirts-induzierten Genstilllegung auch auf Phakopsora pachyrhizi übertragbar ist. Darüber hinaus ermöglicht die Identifizierung stabil exprimierter Referenzgene die Erhebung valider Expressionsdaten in zukünftigen Arbeiten. Offene Fragen bestehen insbesondere hinsichtlich der Faktoren, welche die Eignung eines Gens als Zielgen für HIGS definieren und den molekularen Mechanismen, die an der Aufnahme und Verbreitung von Silencing-Signalen in Phakopsora pachyrhizi beteiligt sind. Die Beantwortung dieser Fragen in weiterführenden Arbeiten wird dazu beitragen, HIGS als eine Perspektive für den modernen Pflanzenschutz zu etablieren.