Interaktionen niedermolekularer Antagonisten mit dem Thyreotropin-Rezeptor zur pharmakologischen Intervention bei der Endokrinen Orbitopathie (2020)

In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion des niedermolekularen Liganden S37 mit dem Thyreotropin-Rezeptor (TSHR) untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Bindungsstelle des Antagonisten am TSHR identifiziert, was zu einem verbesserten Verständnis der intramolekularen Signaltransduktion im Rezeptor führte. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Potenzial von S37 für die Therapie der Autoimmunkrankheit Endokrine Orbitopathie (EO) untersucht. Dabei ist hervorzuheben, dass die für die EO entscheidende TSHR-Aktivierung durch Autoantikörper mit S37 in vitro bzw. ex vivo gehemmt wurde. Im Rahmen einer Schilddrüsenüberfunktion entwickelt sich bei einigen Patienten die EO am Augenhintergrund, eine potenziell visusbedrohende Krankheit, deren Hauptursache – die TSHR-Überaktivierung durch funktionale aktivierende Antikörper in Orbitafibroblasten – bisher nicht pharmakologisch behandelbar ist, sodass für schwere EO-Fälle eine therapeutische Lücke besteht. Der TSHR ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR). Wie die nah verwandten Gonadotropin-Rezeptoren FSHR und LHCGR gehört der TSHR zur Subfamilie der Glykoproteinhormon-Rezeptoren (GPHR). Er weist eine große extrazelluläre Domäne mit leucinreichen Wiederholungen (LRRD) auf, an der das Hormon TSH oder funktionale Autoantikörper binden. In der transmembranären Domäne (TMD) des TSHR ist eine allosterische Bindungstasche zwischen den Transmembranhelices (TMH) 3, 5 und 6 beschrieben, in der niedermolekulare allosterische Modulatoren binden. Der Rezeptor wird durch die extrazelluläre Bindung von TSH aktiviert und kann von transmembranär bindenden negativen allosterischen Modulatoren (NAM) inhibiert werden oder von positiven allosterischen Modulatoren (PAM) unabhängig vom Hormon aktiviert werden. Der intramolekulare Mechanismus für die Weiterleitung des Signals von der extrazellulären zur transmembranären Domäne des TSHR ist nicht vollständig geklärt. In vorangegangenen Arbeiten wurde der selektive TSHR-Antagonist S37 identifiziert. Diese Substanz hatte eine charakteristische gebogene Struktur, lag jedoch als Racemat vor. S37 inhibierte die intrazelluläre cAMP-Bildung mit mikromolarer Affinität und war im Gegensatz zu bisher bekannten TSHR-Antagonisten TSHR-selektiv, inhibierte also nicht die homologen Gonadotropin-Rezeptoren. Daher war S37 besonders interessant als Leitstruktur für die Entwicklung eines Wirkstoffes zur Behandlung der EO. Die bisherigen Versuche wiesen darauf hin, dass S37 kompetitiv zum Hormon wirkt und demzufolge möglicherweise nicht in der bekannten allosterischen Tasche in der TMD bindet. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit sollte die strukturelle Interaktion von S37 mit dem TSHR im Detail untersucht werden, um die unbekannte Bindungsstelle zu identifizieren. Parallel wurden Struktur-Funktions-Untersuchungen verschiedener S37-Derivate und -Analoga durchgeführt. Im zweiten Teil der Arbeit ging es darum, Endpunkte zu untersuchen, die für die Therapie der EO entscheidend sind, insbesondere die Inhibition von TSHR-stimulierenden EO-Patientenseren ex vivo. Zuerst wurde das Racemat chiral getrennt und das aktive Enantiomer S37a bzw. dessen dreidimensionale Struktur identifiziert. Mithilfe N-terminal trunkierter TSHR-Konstrukte mit sukzessiver Verkürzung der Ektodomäne sowie durch TSHR-FSHR-Chimären wurde die Bindungsregion von S37a auf die TMD eingegrenzt. Im cAMP-Assay war S37 nicht-kompetitiv zum PAM C2, von dem bekannt war, dass es in der allosterischen Bindungstasche zwischen TMH 3, 5 und 6 bindet. Dadurch wurde deutlich, dass es eine weitere, bislang unbekannte Bindungsstelle für kleine Moleküle an der TMD des TSHR geben muss. Die Bindungsregion wurde mithilfe von TSHR-Mutationen weiter eingegrenzt. Die beiden TSHR-spezifischen Residuen E404 und H478 zeigten bei Austausch mit Alanin einen Verlust der Interaktion mit S37a. In der Arbeitsgruppe konnte die Verbindung plausibel in das TSHR-Modell in eine Tasche zwischen internem Agonisten vor der TMH 1, extrazellulärer Helix der Hinge-Region (EH) und extrazellulärem Loop (ECL) 1 gedockt werden. Dadurch konnte das Homologiemodell in diesem Bereich verfeinert werden und das Verständnis der intramolekularen Signalweiterleitung von der Ektodomäne zur TMD verbessert werden. Zusammengefasst kommt es durch die Bindung von TSH an die LRRD des TSHR zur Delokalisierung der EH, vermittelt über eine Disulfidbrücke. Über ein benachbartes Disulfid wird das Signal von der EH auf den internen Agonisten übertragen. Die Konformationsänderung des internen Agonisten, der in Kontakt zu allen drei ECL steht, führt zur Weiterleitung des Signals zu den TMH und zur intrazellulären Seite des Rezeptors. In der identifizierten Bindungstasche interferiert der NAM S37a in diese intramolekulare Aktivierungskaskade an der Schnittstelle zwischen Ektodomäne und TMD des TSHR. Durch die gefundene Docking-Position wurde eine Grundlage für die gezielte Verbesserung der Affinität der Leitverbindung S37a geschaffen. Für die Struktur-Funktions-Untersuchungen wurden einerseits von Kooperationspartnern Synthesen von S37-Derivaten durchgeführt und außerdem kommerziell erhältliche S37-Analoga erworben. Obwohl kein deutlich stärkerer TSHR-Antagonist als S37a identifiziert wurde, lieferten die Struktur-Funktionsanalysen neue Hinweise für weitere Optimierungen an den Phenylringen sowie am heterozyklischen Grundgerüst von S37a für gezielte hydrophile Interaktionen mit dem Rezeptor. Bei den Untersuchungen der für die Therapie der EO potenziell relevanten Endpunkte wurden drei wichtige Ziele erreicht: 1.) Es wurde der Grundsatznachweis erbracht, dass S37a die erhöhte TSHR-Aktivierung durch stimulierende Antikörper inhibieren kann, und zwar sowohl monoklonale Antikörper in vitro, als auch TSHR-aktivierende Seren von EO-Patienten ex vivo. 2.) Es konnte gezeigt werden, dass S37a und dessen Derivate hochselektiv nur den TSHR und nicht die homologen Gonadotropin-Rezeptoren inhibieren. 3.) In ersten in-vivo-Untersuchungen zur Pharmakokinetik in Mäusen war S37a nicht toxisch und es wurde eine geeignete orale Bioverfügbarkeit erreicht. Die Untersuchungen bieten eine Grundlage, durch rationales Wirkstoffdesign weitere hochaffine, TSHR-selektive Verbindungen zu synthetisieren, die für die klinische Prüfung geeignet sind.