Untersuchungen zur Konformation und Dynamik der Reversen Transkriptase von HIV-1 durch ESR- und Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie (2000)

Die Konformationsanalyse von HIV-1 RT mittels ESR-Spektroskopie, in Kombination mit zweifach spinmarkiertem Enzym zeigt erstmalig, daß die ligandenfreie RT in Lösung in einem temperaturabhängigen Gleichgewicht zwischen zwei definierten Konformationen, einer offenen und einer geschlossenen, vorliegt. Die maßgeblich für die Konformationsänderung verantwortliche Daumen-Domäne nimmt bei physiologischen Temperaturen die geschlossenen Form ein. Demgegenüber ist bei tiefen Temperaturen (170K) die offene Konformation bevorzugt. Konkrete Aussagen hinsichtlich der biologischen Funktion dieser Domänenbewegung zu machen ist allerdings schwierig. Die durch die vorliegenden Experimente erstmals gezeigte, hohe Flexibilität dieser Domäne in Lösung, in Kombination mit Röntgenstrukturdaten legen jedoch nahe, daß sie an der Translokation des Nukleinsäure-Substrats während der Polymerisationsreaktion beteiligt sein könnte. Weiterhin haben die ESR-Strukturanalysen gezeigt, daß der mit Hilfe der SELEX Methode identifizierte pseudoknot-RNA-Inhibitor für die geschlossene Konformation der RT selektiert wurde. Dies kann als ein Grund für die extrem feste Bindung des Inhibitors zur RT angeführt werden. In Einzelmolekül-FRET-Experimente konnte zum ersten Mal durch die strukturelle Analyse einzelner RT-Nukleinsäure Komplexe in Lösung gezeigt werden, daß die RT-Primer/Matrize Komplexe mindestens zwei eindeutig unterschiedliche Konformationen annehmen. Des weiteren wird durch die Ergebnisse der Einzelmolekül-FRET-Experimente das vorgestellte kinetische Modell vollständig unterstützt. Die Experimente belegen die Existenz eines postulierten "dead end"-Komplexes und geben Hinweise darauf, daß in diesem Komplex das Substrat nicht in der Nukleinsäurebindungsfurche lokalisiert ist. Des weiteren kann man aus den Einzelmolekül-Untersuchungen schließen, daß sich die Konformationen des produktiven und unproduktiven Komplexes nicht wesentlich voneinander unterscheiden. Dies unterstützt die dem Modell zu Grunde liegende Theorie, daß sich die Struktur der Nukleinsäuren im produktiven und unproduktiven Komplex nur in den ersten Basen, in der Nähe des aktiven Zentrums der Polymerase-Domäne, unterscheiden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Testsysteme zur Konformationsanalyse der RT und ihrer Nukleinsäure-Komplexe, stellen methodische Weiterentwicklungen in der ESR-Spektroskopie und der Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie dar. So konnte durch die erstmalige zweifache Spinmarkierung eines Enzyms mir der perdeuterierten 15N-Spinsonde MTSL-15N-d15, eine ausgesprochen gute Trennung dipolar verbreiteter ESR-Spektren von unverbreiterten Spektren erreicht werden. Dadurch konnten verschiedene Konformationen der RT in Lösung identifiziert und vor allem quantifiziert werden. Durch die ortsspezifische Fluoreszenzmarkierung von RT und Nukleinsäure-Substrat konnte, in Kombination mit der Methode der Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie, zum ersten Mal durch Einzelmolekül-FRET-Experimente zwischen verschiedenen Konformation eines Enzym-Substrat-Komplexes unterschieden werden.