Diseño y evaluación de test rápidos para la detección de antibióticos y sulfamidas en carne (2013)

En las ultimas decadas, la seguridad alimentaria se ha convertido en una de las prioridades de las autoridades sanitarias europeas y de los propios consumidores. Los principales problemas sanitarios originados por el consumo de alimentos son los causados por la presencia de microorganismos patogenos y los residuos de insecticidas y drogas de uso veterinario que estos pueden vehicular. Tras la utilizacion de productos terapeuticos es necesario respetar un periodo de supresion antes del sacrificio de los animales para garantizar la eliminacion de los residuos de sus tejidos por debajo de los limites maximos establecidos legalmente. De no ser asi, existe un riesgo elevado de que los residuos de medicamentos o sus metabolitos persistan en el animal en el momento del sacrificio, llegando a la cadena de alimentacion humana. Por otra parte, la deteccion de antibioticos en alimentos es un problema antiguo que en la actualidad permanece sin resolver de una forma adecuada. La diversidad quimica de este amplio grupo de farmacos hace que resulte inviable en la practica el desarrollo de un protocolo de analisis quimico sistematico, dado el elevado numero de muestras a analizar y la diversidad de tecnicas analiticas precisas para su adecuado control. Aunque en los ultimos anos se han producido importantes mejoras y simplificaciones de los equipos necesarios para este tipo de analisis quimicos, basicamente el problema practico sigue siendo el mismo: la necesidad de tecnicas de cribado rapidas que permitan discriminar un elevado numero de muestras. Los test de cribado utilizados son en su mayoria de base biologica, y en general se basan en detectar el efecto inhibidor de una muestra de alimento sobre el crecimiento de una especie microbiana de referencia, cultivada en un medio adecuado. En los ultimos anos se han desarrollado test comerciales en formato de placas microtiter que han facilitado enormemente la realizacion de este tipo de analisis, como por ejemplo en el sector lacteo, si bien es cierto que no son aplicables a todas las matrices alimentarias, como por ejemplo en el sector carnico, donde los esfuerzos por adaptar los test comerciales del sector lacteo no han dado buenos resultados. Esta investigacion se inicio con el objetivo de contribuir a un mejor control de la calidad y seguridad de la carne y los productos carnicos mediante el diseno de un test rapido de deteccion de antibioticos y sulfamidas, util tanto a nivel de laboratorio como de granja, que pudiera comercializarse listo para su uso y ser utilizado por personal sin capacitacion tecnica previa. Por otra parte, pretendiamos tambien poner a disposicion de los interesados un protocolo de analisis de residuos de antibioticos y sulfamidas en carnes, semejante al actualmente utilizado en el sector lacteo, que fuera rapido, fiable y de bajo coste, de forma que facilitase la aplicacion del Plan Nacional Integrado de residuos (P.N.I.R.) y, por tanto, contribuyese a proteger la salud publica. Para ello, y dada la imposibilidad de adquirir, por su inexistencia, muestras contaminadas de referencia, decidimos, como primer paso, crear un banco de muestras. Este banco se creo a partir de un lote de corderos que se ?blanquearon? durante un mes y posteriormente se inocularon, en lotes de cinco animales, con cada uno de los antibioticos. Tras aplicar las dosis terapeuticas prescritas, cada uno de los cinco corderos se sacrificaron tras distintos dias de supresion. Posteriormente se despiezaron las canales, se envasaron a vacio las piezas y se congelaron para su conservacion. Ello nos permitio conseguir muestras contaminadas con distintas concentraciones de cada antibiotico. Para la comparacion del prototipo necesitariamos utilizar un metodo de referencia. Decidimos utilizar para ello el ?Test de las 4 placas?, recomendado por la Union Europea. Desafortunadamente existe muy poca bibliografia cientifica sobre la eficacia del test y la influencia sobre su comportamiento de los distintos factores ambientales. Decidimos por ello hacer un estudio exhaustivo sobre su comportamiento y los factores que lo afectaban; de hecho, en algunas circunstancias incluso intentamos mejorar su comportamiento. Quizas nuestra aportacion mas importante en este apartado, fuera de los objetivos inicialmente planteados, es que estudiamos la respuesta a cada uno de los antibioticos de cada una de las placas, aspecto sobre el que existen muy pocos datos. Posteriormente pasamos al diseno y desarrollo del test de deteccion de antibioticos. Las investigaciones fueron reorientandose durante el desarrollo de los trabajos, a veces como consecuencia de los resultados obtenidos, a veces por sugerencia de la industria colaboradora, con la consecuencia de que realmente disenamos distintos prototipos cada uno con sus particularidades especificas. Todos tienen en comun que la especie testigo es G. stearothermophilus y que el indicador del metabolismo es purpura de bromocresol. El prototipo I fue disenado con una fase liquida inoculada con el microorganismo testigo y donde se puede anadir como muestra un trocito de carne, y una fase solida que actua como filtro permitiendo ver unos virajes claros e incluso una lectura espectrofotometrica. Su principal inconveniente es que el tiempo de analisis es relativamente largo (unas 5 horas), por el retraso adicional que supone la migracion de los hidrogeniones al medio solido. El prototipo II (test Gold), consta unicamente de una fase liquida donde se deposita la muestra de suero. En realidad tambien aqui se disenaron diversas variantes que permitian distintos tipos de muestreo: anadir directamente unas gotitas de suero extraidas por calentamiento de la carne, anadir discos de papel impregnados con el suero, anadir hisopos empapados con el suero al ser introducidos en un pequeno corte de la pieza de carne, etc. En cualquiera de estas modalidades se podian detectar la mayor parte de las sustancias antibacterianas a concentraciones proximas al LMR o ligeramente superiores. El test es, comparado con la competencia, especialmente bueno para la deteccion de tetraciclinas y sulfamidas. El tiempo de analisis es razonablemente rapido, alrededor de 3 horas, con un viraje claro. Tras definir el industrial la variante de test que mas se ajustaba a sus deseos, procedimos a realizar los ultimos ajustes y a definir las condiciones de produccion. Se elaboraron los primeros test en la industria y procedimos a hacer los controles de calidad y estabilidad del producto. Como paso previo a su posible comercializacion, se llevo a cabo un estudio interlaboratorial en el que participaron 5 laboratorios que representaban a los distintos sectores que podrian estar interesados en el test. Este estudio sirvio, junto con los datos anteriores, para la redaccion del informe tecnico del producto. Finalmente disenamos un protocolo de analisis de residuos que incluia como metodo de cribado al test Gold y otros dos disenados paralelamente por la empresa. Para comprobar la validez/utilidad del protocolo y para tener datos sobre la incidencia real de antibioticos en carne, decidimos hacer un estudio adicional. En el estudio participaron cinco laboratorios de ambitos distintos coordinados por el nuestro. En el estudio se analizaron 1280 muestras de aves, 1283 de ovino, 1302 de bovino y 984 de porcino; en otra palabras, casi 5000 muestras, lo que le hace ser, que nos conste, el mas amplio realizado hasta la fecha. Al margen de los resultados concretos, que se incluyen en el texto, el trabajo demostro que el Test de las 4 placas recomendado por la UE, no es un buen test de cribado, pues apenas hubiese detectado la mitad de las muestras positivas. Por otra parte, el estudio de campo puso de relieve que el numero de muestras positivas es mayor que el que se desprende del P.N.I.R., lo que parece logico dado que la metodologia que utiliza no es la adecuada, y que el protocolo de analisis con cribado y preidentificacion mejoraria mucho los actuales sistemas de analisis.