Engineering and characterization of a binder to inhibit in vivo α-synuclein aggregation (2015)

α-Synuclein ist ein neuronales Protein, das vorwiegend in der Umgebung von Vesikeln in den prasynaptischen Nervenenden lokalisiert ist. Die genaue Funktion von α-Synuclein ist zwar wenig bekannt, dennoch ist das Protein an der Pathogenese der Parkinson-Krankheit und weiterer Synucleinopathien beteiligt. Fehlfaltung und Aggregation von α-Synuclein, die der Entstehung der loslichen Oligomeren und fibrillaren Ablagerungen zugrunde liegen, werden durch aberrante Ereignissen, einschlieslich bestimmter Mutationen und Polymorphismen der SNCA-Gen, hervorgerufen. Deshalb konnte die Stabilisierung von α-Synuclein, die zur Verhinderung der Selbsassoziation des Proteins fuhren soll, als Ansatzpunkt fur die Arzneimittelentwicklung dienen. β-Wrapine sind kleine Bindepoteine, die aus kombinatorischen Proteinbibliotheken basierend auf ZAβ3 selektiert werden. Das β-Wrapin AS69 weist eine hohe Bindungsspezifitat fur α-Synuclein auf und inhibiert dessen Aggregation durch Beschlagnahmung der hydrophoben β-Haarnadel-Region, die sich bei der Bindung bildet. AS69 ist ein Homodimer, in dem die einzelnen Untereinheiten uber eine Disulfidbrucke zwischen den Cys-28-Resten kovalent verknupft sind. Diese Arbeit befasst sich mit der Herstellung einer Einzelketten-Version von AS69, in der die Untereinheiten in einem Head-to-Tail Format durch einen Linker verknupft sind. Die Ergebnisse zeigen dass die Wahl eines geeigneten Linkers fur die Erhaltung der Bindung von AS69 an α-Synuclein unerlasslich ist. Ein Vergleich mehrerer Konstrukte zeigt Eignung eines Glycin-Serin-reichen flexiblen Linkers. Der Einbau der Linker-Sequenz ergibt das AS69-GS3 Einzelketten-Homodimer, das mit dem ausschlieslich Disulfid-gebundenen AS69 funktionale Paritat aufweist. AS69-GS3 wurde unter oxidierenden und reduzierenden Bedingungen charakterisiert, um die Auswirkungen der Cys28-Disulfidbindung auf die Struktur, Stabilitat und Bindung an α-Synuclein zu beurteilen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Bildung der Disulfidbindung zu einer Kompaktierung des Fusionsproteins fuhrt, dessen Thermostabilitat erhoht, und fur Hochaffine Bindung unerlasslich ist. Daruber hinaus tragt die Linkersequenz zu einer erhohten Stabilitat des Konstrukts bei und fordert α-Synuclein-Bindung durch beschleunigte Ausbildung der Disulfidbrucke. Angesichts der Anfalligkeit der Disulfidbindung gegenuber reduzierenden Bedingungen, stellt das AS69-GS3 ein geeignetes Konstrukt fur die in vivo Anwendung dar. Der zweite Teil dieser Arbeit beschaftigt sich mit der Untersuchung der Auswirkung der β-Wrapine auf die durch α-Synuclein induzierte Toxizitat in einem Zellkulturmodell. Hier wird der MTT-Toxizitattest eingesetzt um die Viabilitat humaner SH-SY5Y-Neuroblastomzellen zu bestimmen. Ergebnisse zeigen, dass bei stochiometrischen Konzentrationen von AS69-GS3 die Zellviabilitat vollstandig gerettet wird, wahrend sie bei substochiometrischen Konzentrationen deutlich verbessert wird. Das β-Wrapin AS10 ist ebenso effektiv bei der Hemmung der Aggregation und Zytotoxizitat von α-Synuclein. Daruberhinaus inhibiert AS10 auch die Aggregation und Zytotoxizitat des Amyloid-β Peptids und des Insel-Amyloid-Polypeptids. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die Stabilisierung der monomeren α-Synuclein eine umsetzbare Strategie zur Verhinderung der Aggregation und Pathogenese der Parkinson-Krankheit und anderer Synucleinopathien darstellt.