Die Glucose-Dye-Oxidoreduktase in der klinischen Diagnostik (2005)

Die Aufgabenstellung dieser Arbeit betraf die kinetische Charakterisierung des Wildtyps sowie der Mutanten E und G der Glucose-Dye-Oxidoreductase (GlucDOR) mit den N-substituierten p-Nitrosoanilinen BM-53.0861, BM-31.1008 und BM.31.1144 (firmeninterne Bezeichnungen) und den Zuckern Glucose, Maltose und Galaktose als Zweitsubstrate. Diese Mediatoren finden bei der Firma Roche Diagnostics GmbH ihre praktische Anwendung und befinden sich unter anderem auf dem Testsreifensystem, welches zur Blutzuckerbestimmung bei Diabetikern benutzt wird. Mit Hilfe der in dieser Arbeit gewonnenen Daten bezuglich z.B. der Substratspezifitat, Stabilitat der drei Enzyme sollte abgeschatzt werden, in wie weit eine praktische Anwendung der Mutanten E und G moglich und auch sinnvoll ware. Die Charakterisierungen mit den Zuckern Glucose, Maltose und Galaktose und Mediator BM-53.0861 als Zweitsubstrat zeigten, dass beide Mutanten eine bessere Spezifitat fur die Glucose gegenuber der Maltose aufwiesen. Dabei war die Mutante G mit einem Quotienten vmaxMaltose/vmaxGlucose von 0,018 wesentlich spezifischer als die Mutante E, bei der der Quotient 0,10 betrug. Ein Vergleich der Spezifitat fur Glucose gegenuber der Galaktose zeigte, dass beide Mutanten eine schlechtere Spezifitat als der Wildtyp hatten. Die Berechnungen der 3D-Struktur der Mutanten E und G brachten einige strukturelle Hinweise, durch die die veranderten Substratspezifitaten gegenuber dem WT, besonders im Fall der Maltose, erklart werden konnten. So ragt z.B. Tyrosin 343 bei den Mutanten weiter in das aktive Zentrum als beim WT und kommt so der Maltose ziemlich nahe. Dadurch konnte es zu sterischer Hinderung kommen. Beim Vergleich der kinetischen Parameter der Mutanten E und G fur die Glucose mit den Zweitsubstraten BM-53.0861, BM-31.1008 und BM-31.1144 mit denen des WTs, sprechen die Ergebnisse nicht gegen eine Anwendung der Mutanten auf den Teststreifen. Weder die leicht niedrigeren Hemmkonstanten der Mediatoren, noch die hoheren kM-Werte fur die Glucose bei den Mutanten sollten ein Hindernis darstellen, da das Enzym auf den Teststreifen in grosem Uberschuss vorliegt. Ein Aspekt, der bei der praktischen Anwendung zu Problemen fuhren kann, ist die verringerte Thermostabilitat beider Mutanten. Sie zeigten bei 60 °C einen erheblichen Stabilitatsverlust gegenuber dem WT der GlucDOR. Nach einer halben Stunde Inkubationzeit hatten sie weniger als 10 % Restaktivitat. Im Falle der Mediatoren BM-31.1008 und BM-31.1144 konnte durch ESR-Untersuchungen festgestellt werden, dass das Phenylendiaminradkal, welches sich im nichtenzymatischen Gleichgewicht zwischen den entsprechenden Chinondiiminen und Phenylendiaminen befindet, nicht fur die auftretende Hemmung verantwortlich ist. Mit einem Abnehmen der Umsatzraten sank auch die Konzentration an Phenylendiaminradikal, was im Falle einer durch das Radikal verursachten Hemmung nicht sein durfte. Ebenfalls konnte durch die ESR-Untersuchungen gezeigt werden, dass wahrend einer konstanten enzymatischen Umsetzung auch die Konzentration des Phenylendiaminradikals konstant blieb. Das spricht fur ein konstantes Redoxpotential des Testsystems wahrend der Umsetzung. Das Radikal kann als eine Art Marker fur die Gesamtkonzentration an Chinondiimin und Phenylendiamin angesehen werden. Insgesamt zeigt die Arbeit, dass die beiden Mutanten E und G der GlucDOR fur die Anwendung auf Teststreifen zur Blutzuckerbestimmung geeignet sind, wenngleich sie eine gewisse Thermoinstabilitat im Vergleich zum Wildtyp aufweisen. Diesbezuglich sollten noch Verbesserungen vorgenommen werden.