A novel mechanism of CRISPR RNA maturation by a trans-acting small RNA and the host RNase III (2011)

Streptococcus pyogenes, auch bekannt als GAS (Gruppe A Streptococcus), ist ein streng menschlicher Kranheitserreger der ein breites Spektrum an Krankheiten verursacht, beginnend bei den nicht bedrohlichen Pharyngitis und Impetigo, bis zu den todlichen nekrotisierende Fasciitis und Streptokokken-induziertes Toxisches Schocksyndrom (STSS). Laut WHO gibt es mehr als 18 Millionen Falle von schweren GAS Erkrankungen weltweit, mit mehr als 500.000 Todesfalle pro Jahr. 
Mehrere Studien der Virulenzregulation von S. pyogenes zeigten, dass in dem komplexen regulatorischen Netzwerk, bestehend aus zwei-komponenten Systemen (TCS) und „stand-alone“ Regulatoren, kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs) eine signifikante Rolle spielen. Trotz der kleinen Grosse (50-250 nt), beeinflussen sRNAs unterschiedliche Stuffen der Genexpression und dadurch auch den metabolischen Status der Zelle, was eine schnelle Anpassung an die Umgebung erlaubt. Nur drei kleine RNAs, involviert in Virulenzregulation, wurden bisher in S. pyogenes bekannt, nahmlich pel, fasX and rivX. Diese begrenzte Zahl initiierte unsere Studie, die als Ziel die Identifizierung und Validierung neuer nicht-kodierender sRNAs in GAS hatte. Weiterhin sollte die biologische Rolle der Kandidaten etabliert werden. 
RNomics, angekoppelt mit 454 Pyrosequenzierung, weiters dRNA-seq genannt, wurde als Methode gewahlt. Circa 40.000 cDNA Sequenzen von S. pyogenes SF370 (M1 Serotyp) wurden analysiert und 25 sRNA Kandidaten wurden gewahlt, basierend auf bestimmten Kriterien. Die Expression von 20 Kandidaten wurde bestatigt und deren strukturellen und metabolischen Eigenschaften wurden weiters untersucht. Stabilitat der sRNAs wurde mittels Rifampicin Experimenten bestimmt und die 5‘ und 3‘ Enden mittles head-to-tail Circularization definiert. Die 5‘ Enden wurden zusatzlich durch Primer extension bestatigt. Mehrere interessante Kandidaten wurden fur detallierte Analyse selektiert, darunter die SPync013 und SPync031, reguliert durch die Zwei-Komponenten System CiaRH. Weitere aufregende Feststellungen unserer Studie, die den Anfang eines zweiten Projektes definiert haben, wаren das Vorhandensein eines funktionellen CRISPR Lokus und einer hochexprimerten, trans-kodierte sRNA in der unmittelbaren Nahe. 
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Systeme sind bemerkenswert in ihrer Natur, indem sie Immunitat gegen infektiose Phagen und Plasmide gewahren. Bezeichnet als die bakterielle RNA Interferenz (RNAi) System in mehreren Publikationen, der CRISPR Lokus hat unsere Aufmerksamkeit erregt und wurde in Details analysiert. Das aktuelle Modell fur CRISPR Aktivitat basiert sich auf Studien in Escherichia coli und Pyrococcus furiosus und deutet darauf hin, dass Prozessierung von CRISPR pre-crRNA, weiters pre-crRNA genannt, durch Cas Proteine erfolgt und zur Bildung von aktiven crRNAs leitet. Die crRNAs bestehen aus spezifischen spacer-repeat Fragmente, die zur sequenzspezifischen Hemmung der fremden Nukleinsauren fuhrt. 
Es stellte sich heraus, dass die Architektur des CRISPR01 Lokus von S. pyogenes sich betrachtlich von den bisher beschriebenen Lozi unterscheidet. Zusatzlich, wurden Homologen der Cas Endoribonukleasen CasE, Cas6 und Csy4, verantwortlich fur pre-crRNA Prozessierung in E. coli und P. furiosus, in unserem Organismus nicht gefunden. Die hohe Menge an Transkripten gewonnen durch dRNA-seq, die von der ~511nt pre-crRNA herstammen, deutete darauf hin, dass der CRISPR Lokus in vivo aktiv ist. Sechs crRNAs mit 39-42 nt in Lange wurden in der totalen cDNA Bibliothek, aber nicht in der Bibliothek angreichert mit primaren Transkript detektiert, hinweisend darauf dass die reifen Spezies entsprechen. 
Des Weiteren wurde ein trans-kodierte kleine RNA, tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA) in der unmittelbarer Nahe von dem CRISPR Lokus gefunden. Northern Blot Analyse bestatigte die Expression der sRNA und zeigte vier unterschiedliche Transkripte mit einer Langer von 171, 89, 75 und 65 nt. Die 171 und 89 nt Formen entsprechen primare Transkripte und die 75 nt Form resultiert von deren Prozessierung. Sequenzanalyse von tracrRNA zeigte eine 24 nt Region, komplementar zu CRISPR01 repeats, hinweisend auf eine mogliche Basenpaarung von tracr- und pre-crRNAs. Der Duplex Region enthaltete die Prozessierungsstellen beider sRNAs, ein Indiz fur potentielle Co-Prozessierung. Northern Blot Analyse mit tracr- und pre-crRNA defizienten Stammen zeigte, dass prozessierte Formen beider sRNAs in dem jeweiligen Partner Stamm fehlen, und bestatigte somit die essentielle Rolle, die tracrRNAs fur crRNA Reifung hat. Laut dRNA-seq, Co-Prozessierung von tracr- und pre-crRNAs resultiert in kurze 3‘ Uberhange, erinnernd an Spaltung durch die Endoribonuclease RNase III. Aufgrund der Abwesenheit von CasE-, Cas6- oder Csy4-ahnliche Endoribonucleasen in CRISPR01 Lokus, behaupteten wir eine mogliche Beteiligung der endogenen RNase III in pre-crRNA Prozessierung, abgesehen von den intrinsische Cas Proteine. Northern Blot Analysen mit Δrnc Stamm und Stammen mit einzelnen nicht-polaren Deletionen von Cas Proteinen bestatigten die Rolle der RNase III in der Prozessierung und indizierten Csn1 wie das einzige Cas Protein, beteiligt in dem Prozess. 
Weiters, um eine Phagenifektion nachzumachen, haben wir Experimente mit Protospacer-entahltendes Plasmid durchgefuhrt. Erwartungsgemas, war der Wild-Typ Stamm resistent gegen Transformation mit dem Plasmid, wobei das gleiche Plasmid in Δpre-crRNA, ΔtracrRNA, Δrnc und Δcsn1 Stamme toleriert wurde. Diese Ergebnisse bestatigten die Aktivitat des CRISPR01 Lokus in vivo. 
Im Ganzen fuhrte unsere Studie zur Identifizierung mehreren neuen sRNA Kandidaten und einen funktionellen CRISPR Lokus in dem humanen Pathogen S. pyogenes. Die detallierte Analyse des CRISPR01 Lokus etablierte einen neuen Weg fur crRNA Reifung, der eine trans-kodierte kleine RNA, das Csn1 Protein und die endogene RNase III involviert