Entwicklung von Realtime-PCR-Methoden zur Analyse von DNA-Methylierung (2007)

DNA-Methylierung spielt eine wichtige Rolle bei einer Reihe biologischer Prozesse wie Imprinting, X-chromosomaler Inaktivierung und Genexpression. DNA-Hypermethylierung ist häufig assoziiert mit einer verminderten Transkription, während Hypomethylierung oft mit einer Aktivierung der Transkription einhergehen kann. Veränderte DNA-Methylierungsmuster sind sowohl bei der Tumorgenese als auch bei einigen genetischen Krankheiten beschrieben. Die Analyse der DNA-Methylierung eignet sich daher zur Klassifizierung von Krebs und anderen Krankheiten. Die schnelle und einfache Detektion von Tumor-DNA in Körperflüssigkeiten anhand ihrer veränderten DNA-Methylierung ist ein innovatives und vielversprechendes Verfahren zur Früherkennung von Krebs. Für diagnostische Zwecke ist die Realtime-PCR besonders geeignet, da sie sich durch Genauigkeit, Schnelligkeit und Automatisierbarkeit auszeichnet. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand daher die Entwicklung von drei Messverfahren zur Methylierungsanalyse im Realtime-PCR-Format sowie die Etablierung einer Methode zur PCR-Kontaminationsvermeidung.\nHeavyMethyl-Assay (HM-Assay): Die Anreicherung methylierter DNA in einer PCR kann mit Hilfe von Blockeroligonukleotiden erreicht werden (HeavyMethyl-Assay). Ziel dieser Arbeit war es, dieses Assayformat in ein Realtime-PCR-Format zu übertragen und ein generelles Konzept zur Etablierung von HM-Assays zu erarbeiten. Die Leistungsfähigkeit des Detektionsverfahrens wurde am Beispiel der Entwicklung und Validierung des GSTp1-HM-Assays demonstriert. Das Detektionslimit dieser PCR lag bei 15ipg methylierter DNA. Das entspricht etwa 4i-i5 methylierten Genkopien. Dieser Nachweis gelang auch in einem hohen Hintergrund nicht methylierter DNA, dabei lag das relative Detektionslimit bei mindestens 1:4000. Mit dem GSTp1-HM-Assay wurden anschließend Gewebeproben aus Prostatatumoren analysiert. Die klinische Sensitivität betrug hier 79i% bei einer Spezifität von 95i%. Die Kombination des GSTp1-HM-Assays mit einer GSTp1-Referenz-PCR in einer Duplex-Reaktion erlaubte die gleichzeitige Analyse von methylierter und Gesamt-DNA und erhöhte die Effizienz der Methode. Die Realtime-HM-Technologie ist inzwischen als Standardmethode zur Detektion von Tumor-DNA in Körperflüssigkeiten etabliert und wird bereits in mehr als 20 weiteren Realtime-PCRs zur Detektion von methylierter DNA erfolgreich angewendet.\nQuantitativeMethylation-Assay (QM-Assay): Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Weiterentwicklung des QM-Assays, einem Realtime-PCR-Verfahren, das die genaue Bestimmung des Anteils methylierter DNA in Gewebeproben ermöglicht. Durch die neuartige Kombination von SNP-spezifischen und methylierungsspezifischen Sonden konnte erstmals eine allelspezifische, quantitative Analyse von DNA-Methylierung mit einem Realtime-Verfahren realisiert werden. Mit allelspezifischen QM-Assays wurden primordiale Keimzellen aus Mausembryonen untersucht. Für die H19-Region wurde zwischen den Tagen 9,5 und 10,5 nach der Befruchtung eine signifikante Abnahme der parentalen Methylierung gemessen. In der IGF2/DMR2-Region wurde am Tag 9,5 keine Methylierung detektiert, während am Tag 10,5 sowohl maternales als auch paternales Allel geringe Methylierung aufwiesen.\nHeavyQuantitativeMethylation-Assay (HQM-Assay): Aus der Kombination von HM-Assay und QM-Assay wurde ein neuartiges Verfahren der Methylierungsanalyse, der HQM-Assay, entwickelt. Dieses Realtime-PCR-Verfahren vereint die Vorteile beider Technologien, die hohe relative Sensitivität des HM-Assays mit den guten quantitativen Eigenschaften des QM-Assays. Es handelt sich dabei um eine Duplexreaktion aus zwei HM-Assays, deren Signale nach dem Prinzip eines QM-Assays ausgewertet werden. Dabei werden methylierte und nicht methylierte DNA des gleichen Locus parallel amplifiziert und analysiert. Mit dem TMEFF2-HQM-Assay konnten DNA-Mischungen mit einem Anteil von 0,1 % und 0,5 % methylierter DNA exakt quantifiziert und damit im Vergleich zu einem QM-Assay eine 10 mal niedrigere Grenze für die quantitative Detektion methylierter DNA erreicht werden. \nVerfahren zur Vermeidung von PCR-Kontaminationen: Für die Methylierungsanalyse, basierend auf Bisulfit-DNA, standen bisher keine Verfahren zur Vermeidung von PCR Kontaminationen zur Verfügung. In der Arbeit wurde ein Protokoll für die Bisulfit-Konversion entwickelt, das auf der Herstellung sulfonierter DNA (SafeBis-DNA) basiert. Dieses Protokoll ermöglicht die Anwendung von Uracil-DNA-Glycosylase zum Abbau kontaminierender PCR-Produkte. Die Analyse von Tumorproben ergab die gleichen Ergebnisse unter Verwendung von SafeBis-DNA mit UNG im Vergleich zur Analyse von Standard-Bisulfit-DNA ohne UNG. In dieser Arbeit wurde also erstmalig eine Methylierungsanalyse mit einer effizienten Kontaminationskontrolle durchgeführt. Damit wurde eine weitere Voraussetzung geschaffen, Methylierungsanalysen als diagnostische Tests in der klinischen Routine einzusetzen.