Regulation and function of CD70 and its clinical relevance in clear cell renal cell carcinoma (2015)

As treatment response for advanced renal cell carcinoma (RCC) is still limited, biomarkers to diagnose and predict the applicability of drugs are needed. The deregulation of the Von HippelLindau protein (pVHL)/hypoxiainducible factor (HIF) axis is a hallmark of clear cell RCC (ccRCC). Consequently, protein products of HIFregulated genes are considered potential therapeutic targets of this tumor type. In a previous work mass spectrometry analysis of RCC cell lines was used to define the ccRCC protein surfaceome. The expression pattern of these proteins was further validated on mRNA level. The overall objective of my PhD project was to select and analyse potential candidates of the RCC surfaceome for clinical applications. We focused our interest on the mechanism of the aberrant and frequent upregulation of CD70 in ccRCC. Since the discovery of the frequent overexpression of CD70 ccRCC in 2005, therapeutic antibodies targeting CD70 were developed, which are already under clinical evaluation. However, studies elucidating the regulation of the CD70 expression in RCC and the consequences of the constant interaction of CD70 with its unique receptor CD27 within the tumor microenvironment, are lacking. Immunohistochemical analyses of 667 RCC revealed elevated CD70 protein expression in 80% of primary tumors and metastases of ccRCC and in 32% of papillary RCC. We have found that in ccRCC abundant and frequent CD70 expression is directly driven by HIF. By analyzing VHL mutations, mRNA and protein expression patterns of pVHL, HIFα and several HIF targets in RCC tissues and cell lines, we found that CD70 upregulation is linked to the inactivation of pVHL. Reexpression of pVHL in pVHLdeficient cell lines as well as silencing of HIFα lead to attenuated CD70 expression, whereas transient overexpression of HIFα and hypoxia lead to increased CD70. Gene promoter analyses revealed that HIF directly binds to specific hypoxia response elements within the promoter of CD70 thereby activating its transcription. Furthermore, CD27+ lymphocytes preferentially infiltrate CD70expressing ccRCCs, which seems to be linked to a more aggressive biological behavior. Coculturing of RCC cell lines with peripheral blood mononuclear cells induced significant increase of soluble CD27 levels in the presence of CD70. This may explain the high soluble CD27 levels observed in the sera of patients with CD70expressing ccRCC infiltrated by CD27+ lymphocytes, thus suggesting soluble CD27 as diagnostic tool for ccRCC patient monitoring&#13;\n2 Zusammenfassung Aufgrund des begrenzten Behandlungserfolgs von fortgeschrittenem Nierenzellkarzinom (NZK), bedarf es Biomarkern zur Diagnose und Prognose der Anwendbarkeit von Medikamenten. Die Aufhebung der „Von Hippel‐Lindau‐Protein (pVHL)/ Hypoxie‐ induzierbarer Faktor (HIF)“‐Achse ist ein Merkmal des klarzelligen NZK (kzNZK). Daraus ergibt sich die Möglichkeit, dass Gene, die von HIF gesteuert werden als therapeutische Ziele für diese Tumorart genutzt werden können. In einer früheren Arbeit wurde das Oberflächenproteom des kzNZK durch eine massenspektrometrische Analyse definiert. Das Expressionsmuster dieser Proteine wurde weiterhin auf mRNA‐Ebene validiert. Das Hauptanliegen meines PhD‐Projektes lag in der Auswahl und Analyse potentieller Kandidaten des NZK‐Oberflächenproteoms für deren klinische Anwendbarkeit. Wir richteten unser Interesse auf die Ursache der häufigen und fehlgeleiteten Überexpression von CD70 im kzNZK. Seit der Entdeckung der hohen und häufigen CD70‐Expression im kzNZK im Jahre 2005 wurden CD70‐zielgerichtete therapeutische Antikörper entwickelt, die schon klinisch getestet werden. Dennoch gibt es keine Studien, die veranschaulichen, wodurch die kontinuierliche Hochregulierung von CD70 im NZK gesteuert wird und was die Folgen der konstanten Interaktion von CD70 mit seinen einzig bekannten Rezeptor CD27 für die nahe Umgebung des Tumors sind. Immunhistochemische Analysen von 667 NZK ergaben eine erhöhte CD70‐ Expression in 80% der Primärtumoren und Metastasen des kzNZK und in 32% des papillären NZK. Wir haben herausgefunden, dass die hohe und häufige Expression von CD70 im kzNZK direkt durch HIF angetrieben wird. Durch die Analyse der VHL‐Mutationen, der mRNA‐ und Protein‐Expressionsmuster von pVHL, HIFα und verschiedener HIF‐gesteuerter Gene in NZK‐ Gewebe und ‐Zelllinien, haben wir entdeckt, dass CD70 mit der Inaktivierung von pVHL verknüpft ist. Die Wiederexpression von pVHL in pVHL‐defizienten Zelllinien als auch das Gen‐ Silencing von HIFα führten zu einer Abschwächung der CD70‐Expression, wohingegen eine vorübergehende Überexpression von HIFα und Hypoxie CD70 erhöhten. Genepromoter‐ Analysen legten dar, dass HIF direkt an spezifische Hypoxie‐Antwort‐Elemente innerhalb des Promoters von CD70 bindet und dadurch dessen Transkription auslöst. Des Weiteren infiltrieren CD27+ Lymphozyten bevorzugt CD70‐expreimierende kzNZK, was mit einem vermehrt aggressiven biologischen Verhalten zusammenzuhängen scheint. Kokultivierung von NZK‐Zelllinien mit mononukleären Zellen des periphären Blutes induzierten einen signifikanten Anstieg der gelösten CD27‐Menge an Anwesenheit von CD70. Dies könnte die Ursache der erhöhten gelösten CD27‐Mengen im Blutserum von Patienten mit CD70‐ exprimierenden NZK, die von CD27+ Lymphozyten infiltriert sind, sein. Deshalb ist der Einsatz von gelöstem CD27 als diagnostisches Instrument für die kzNZK‐Patientenbeobachtung denkbar.