Molecular dissection of the plant acyl-acyl carrier protein thioesterases (1998)

The plant acyl-acyl carrier protein (ACP) thioesterases (TEs) are key enzymes in seed oil biosynthesis. TEs can be classified into two evolutionarily related families, namely FatA and FatB, with distinct substrate selectivity. Amino acid sequence comparison shows that the two classes of TEs can be dissected into several primary structural modules, which may be described as partially homologous, highly conserved, or highly variable. The substrate specificity of a TE is largely determined by the C-terminal half of the protein. Behind the plastidial signal peptides, the FatB enzymes have a class-specific N-terminal segment that does not affect enzyme activity in vitro or in vivo. The first 18 amino acids of this segment have been predicted to form a strong, “outside to inside” transmembrane helix, indicating its role of being a transmembrane anchor. The FatB family is also characterized by a unique C-terminal segment of variable length. Deletion of this module does not affect the substrate specificity but reduces enzyme activity. This suggests that the region is not critical for substrate selectivity but may play a role in stabilizing the overall structure. The FatA TEs contain a unique segment close to the C-terminal end, which is absent in FatB. Swapping the C-terminal portion of the FatB with the counterpart from FatA results in a nonfunctional protein. The other signature of the TEs is a highly variable section close to the center of the polypeptides. It is apparent that this variable module is not the sole determinant for substrate specificity, since replacement of this region in FatB with the equivalent part from FatA does not change the specificity. Combining this change with the C-terminal swapping results in a nonfunctional protein. The active-site module contains a partially homologous region between two conserved boxes where the catalytic histidine and cysteine reside. The two residues are exactly 34 amino acids apart. Transplanting the active-site module from FatB to FatA results in a functional hybrid with FatA specifity, suggesting that the folded structures of the active sites are extremely conserved within plant TEs. Our results have defined the roles of certain modules in the plant TEs, and suggested that the functions of differenet modules are highly cooperactive. Molekulare Analyse der pflanzlichen Acyl-Acyl-Carrier-Protein-Thioesterasen Die pflanzlichen Acyl-Acyl-Carrier-Protein-Thioesterasen sind Schlüsselenzyme in der Fettsynthese in den Samen. Thioesterasen (Tes) können in zwei evolutionär verwandte Familien eingeteilt werden, die FatA- und FatB-Thioesterasen mit jeweils unterschiedlicher Substratspezifität. Der Vergleich der Aminosäuresequenzen zeigt, daß diese zwei Klassen Thioesterasen in verschiedene Primärstruktureinheiten zerlegt werden können, welche als partiell homolog, hochkonserviert oder hochvariabel bezeichnet werden können. Die Substratspezifität der Thioesterasen wird im wesentlichen durch das C-terminale Ende des Proteins bestimmt. Hinter den plastidiären Signalpeptiden haben FatB-Enzyme ein klassenspezifisches N-terminales Segment, welches die Enzymaktivität weder in vitro noch in vivo beeinflußt. Den ersten 18 Aminosäuren dieses Segments schrieb man eine feste “outside to inside”-Transmembranhelix zu, was auf ihre Rolle als Transmembrananker hinweist. Die FatB-Familie ist zudem durch ein für sie typisches C-terminales Segment variabler Länge charakterisiert. Deletion innerhalb dieser Einheit beeinflußt die Substratspezifität nicht, reduziert jedoch die Enzymaktivität. Diese Region scheint daher nicht entscheidend für die Substratselektivität zu sein, sondern spielt vielmehr eine Rolle in der Stabilisierung der Gesamtstruktur. Die FatA-Thioesterasen besitzen ein für sie typisches Segment, welches nicht in FatB vorkommt, nahe des C-terminalen Endes. Ein Austauschen des C-terminalen Bereiches von FatB gegen den entsprechenden von FatA resultiert in einem nichtfunktionalen Protein. Eine weitere Eigenschaft der Thioesterasen ist eine hochvariable Sektion in der Nähe des Zentrums der Polypeptide. Es ist offensichtlich, daß diese variable Einheit nicht der einzige bestimmende Faktor für die Substratspezifität ist, da der Ersatz dieser Region in FatB durch das Äquivalent in FatA die Spezifität nicht verändert. Kombiniert man diese Änderung mit dem C-terminalen Austausch, so erhält man ein nichtfunktionales Enzym. Das aktive Zentrum besteht aus einer partiell homologen Region zwischen zwei konservierten Boxen, in denen das katalytische Histidin und Cystein sitzen. Diese zwei Bereiche sind exakt 34 Aminosäuren auseinander. Überträgt man das aktive Zentrum von FatB in FatA, so erhält man ein funktionales Hybrid mit FatA-Spezifität, was darauf hinweist, daß die aktiven Zentren extrem konserviert innerhalb der pflanzlichen Thioesterasen sind. Unsere Ergebnisse haben die Rolle verschiedener Einheiten der pflanzlichen Thioesterasen definiert, und sie zeigen auch, daß diese verschiedenen Einheiten eng zusammenwirken.