Arrêté du 5 avril 1971 relatif aux méthodes officielles d'analyse des cosmétiques et produits de beauté
   Les laboratoires chargés de concourir à l'application de la réglementation relative à la répression des fraudes sont tenus d'employer, pour l'analyse des cosmétiques et produits de beauté, les méthodes décrites en annexes.

AnnexesMéthode officielle pour la détermination de l'indice d'irritation primaire cutanée.Méthode officielle pour l'évaluation de l'irritation oculaire.Méthode officielle pour l'appréciation de l'agressivité superficielle cutanée par applications itératives pendant vingt-huit jours consécutifs d'un produit cosmétique ou d'hygiène corporelle.METHODE OFFICIELLE D'EVALUATION DU POTENTIEL IRRITANT PAR APPLICATION SUR LA MEMBRANE CHORIO-ALLANTOÏDIENNE DE L'OEUF DE POULE
   1. Objet.
   La présente méthode est utilisée pour la détermination de l'indice d'irritation primaire cutanée d'un produit cosmétique ou d'hygiène corporelle.
   2. Domaine d'application.
   La méthode s'applique aux produits ne colorant pas la peau d'une manière indélébile.
   3. Principe.
   La méthode est fondée sur l'observation des réactions cutanées provoquées par l'application unique du principe.
   4. Animaux d'expérience et équipement.
   4.1. Lapins albinos mâles, de souche définie, de 2,5 kg environ. Les animaux doivent avoir séjournés dans l'animalerie en cage individuelle, une semaine au minimum afin d'être parfaitement acclimatés et reçoivent, dès leur arrivée, une alimentation de composition constante et équilibrée.
   4.2. Dispositif de maintien permettant la bonne réalisation du protocole expérimental.
   4.3. Tondeuse électrique pour animal, munie d'un peigne (hauteur de coupe 0,05 mm).
   4.4. Vaccinostyles stériles.
   4.5. Pièces de gaze hydrophile Codex à 8 épaisseurs d'une surface de 6,2 cm carrés (carrées de 2,5 cm de côté, ou rondes de 2,8 cm de diamètre), dont une des faces est recouverte d'une pellicule adhésive hypoallergénique et imperméable, ou tout système équivalent (par exemple une capsule souple et inerte empêchant la diffusion des liquides très fluides à l'extérieur du pansement).
   4.6. Bande de fixation microporeuse adhésive hypoallergénique de largeur 50 mm, ou tout système équivalent non occlusif.
   4.7. Compresse de protection en gaze hydrophile Codex de dimensions appropriées.
   4.8. Dispositif de maintien souple et aéré des pansements (bande lissée ou sparadrap).
   4.9. Seringue stérile de 1 ml au dixième.
   4.10. Balance de laboratoire sensible au moins au milligramme.
   5. Mode opératoire.
   5.1. Préparation de la peau.
   5.1.1. La veille de l'application du produit, tondre le dos et les flancs de lapins (4.1.) à la tondeuse (4.3.) pour dégager une surface d'environ 14 cm X 14 cm ; opérer avec précaution de manière à éviter toute irritation. Vérifier l'état de la peau pour ne retenir que six animaux présentant une peau saine et glabre.
   5.1.2. Effectuer à la droite de l'axe vertébral, à l'aide d'un vaccinostyle (4.4.), trois scarifications parallèles sur une longueur d'environ 2,5 cm, espacées de 0,5 cm environ. Les scarifications de l'épiderme sont réalisées sans atteindre le derme, c'est-à-dire sans saignement.
   5.2. Application du produit :
   5.2.1. Appliquer le produit sur la peau (zones scarifiées et non scarifiées), soit directement, soit après l'avoir déposé sur les pièces de gaze, de manière à éviter toute perte, à raison de :
    Produits liquides : 0,5 ml.
    Produits semi-liquides et pâteux : 0,5 ml ou 0,5 g.
    Produits solides et pulvérulents : 0,5 g.
   5.2.1.1. Les produits liquides seront déposés, à l'aide de la seringue (4.9.) sur deux pièces de gaze (4.5.) que l'on appliquera immédiatement sur la peau (5.2.1.).
   5.2.1.2. Les produits semi-liquides et pâteux seront appliqués directement sur la peau (5.2.1.), puis recouverts des pièces de gaze (4.5.).
   5.2.1.3. Les produits solides et pulvérulents seront appliqués sur la peau (5.2.1.), puis recouverts des pièces de gaze (4.5.) préalablement humidifiées par 0,5 ml d'eau distillée ou de qualité équivalente.
   5.2.2. Maintenir en contact avec la peau le produit et la pièce de gaze sur chacune des deux zones avec la bande de fixation (4.6.).
   5.2.3. Placer la compresse de protection(4.7.).
   5.2.4. Maintenir l'ensemble par le dispositif de pansement (4.8.) qui sera précisé dans le compte rendu d'expérimentation.
   5.2.5. Enlever le pansement et les pièces de gaze vingt-quatre heures après l'application du produit.
   5.3. Evaluation de l'irritation primaire cutanée :
   L'irritation primaire cutanée doit être évaluée trente minutes environ après enlèvement du pansement et de nouveau quarante-huit heures plus tard, c'est-à-dire environ soixante-douze heures après l'application du produit. Les observations sont faites sur les deux zones, scarifiée et non scarifiée, selon l'échelle numérique suivante :
   5.3.1. Erythème et formation d'escarres :
   - Pas d'érythème : 0.
   - Léger érythème (à peine visible) : 1.
   - Erythème bien visible : 2.
   - Erythème important : 3.
   - Erythème grave (rouge pourpre) avec ou sans escarres (lésions profondes) : 4.
   5.3.2. Formation d'oedème :
   - Pas d'oedème : 0.
   - Très léger oedème (à peine visible) : 1.
   - Léger oedème (contours bien définis, gonflement apparent : 2.    - OEdème moyen (épaisseur environ 1 mm) : 3.
   - OEdème grave (épaisseur supérieure à 1 mm et surface supérieure à celle de la zone d'application) : 4.
   6. Détermination de l'indice d'irritation primaire.
   6.1. Additionner les chiffres obtenus pour l'érythème et pour l'oedème après vingt-quatre heures et soixante-douze heures, d'une part, sur les six zones non scarifiées, d'autre part, sur les six zones scarifiées.
   6.2. Additionner les chiffres ainsi obtenus et calculer la moyenne en divisant le total par 24.
   Cette moyenne représente l'indice d'irritation primaire cutanée (I.P.).
   7. Expression des résultats.
   Non irritant : IP supérieur ou égal à 0,5.
   Légèrement irritant : IP supérieur à 0,5 et inférieur ou égal à 2.    Irritant : IP supérieur à 2 et inférieur ou égal à 5.
   Très irritant : IP supérieur à 5 et inférieur ou égal à 8.
   Nota :
   1. En cas d'impossibilité absolue d'utiliser la méthodologie décrite, l'expérimentateur devra mentionner avec précision et justifier dans son compte rendu les modifications apportées.
   2. Les animaux morts en cours d'essai seront remplacés par d'autres animaux qui seront traités dans les mêmes conditions.

   I. - Objet.
   La présente méthode est utilisée pour l'évaluation de l'irritation oculaire par un produit cosmétique ou d'hygiène corporelle.
   On considère généralement comme inutile d'effectuer l'essai avec des produits très alcalins (pH + 11,5) ou très acides (pH , 2) en raison de leurs propriétés corrosives probables.
   II. - Principe.
   La méthode est fondée sur l'observation des réactions oculaires provoquées par l'instillation unique du produit.
   III. - Animaux de laboratoire et équipement.
   3.1. Lapins albinos, de souche définie, de même sexe et pesant 2,5 kg environ.
   Les animaux doivent avoir séjourné dans l'animalerie, en cage individuelle, une semaine au minimum afin d'être parfaitement acclimatés et reçoivent, dès leur arrivée, une alimentation de composition constante et équilibrée.
   3.2 Dispositif de maintien permettant la bonne réalisation du protocole expérimental.
   3.3. Seringue stérile de 1 ml graduée au centième.
   3.4. Solution aqueuse de fluorescéine sodique à 2 p. 100 m/v, de préférence préparée extemporanément.
   3.5. Solution de chlorure de sodium à 9 p. 1000 m/v, ou isotonique aux larmes ou solution équivalente.
   3.6. Lampe torche.
   3.7. Ophtalmoscope.
   3.8. Lampe loupe U.V. de type utilisé en ophtalmologie.
   3.9. Balance de laboratoire sensible au moins au milligramme pour la pesée du produit.
   IV. - Mode opératoire.
   Cet essai doit être effectué sur trois lapins ayant les yeux sains et sans défaut.
   4.1. Appliquer directement le produit dans le sac conjonctival de l'un des yeux de chaque lapin à raison de :
   Produits liquides : 0,1 ml ;
   Produits semi-liquides et pâteux : 0,1 ml ou 100 mg ;
   Produits solides et pulvérulents : 100 mg ou le volume de 0,1 ml dans le cas de poudres de faible densité.
   4.2. Maintenir les paupières fermées pendant 10 secondes, afin d'éviter toute perte.
   4.3. Maintenir les animaux pendant une heure dans le dispositif (3.2) afin qu'ils ne puissent pas se frotter l'oeil, puis les remettre dans leur cage.
   4.4. Observer l'oeil des lapins une heure, puis un, deux, trois, quatre et sept jours après l'instillation, en utilisant l'oeil non instillé comme témoin pour évaluer une irritation éventuelle de l'oeil traité.
   Effectuer les examens dans l'ordre suivant :
   - conjonctive (chemosis, larmoiement, rougissement) ;
   - iris ;
   - cornée (degré et surface d'opacification).
   L'observation des lésions de la conjonctive, de l'iris et de la cornée se fera par examen direct (3.6 et 3.7). L'observation de la cornée sera complétée (à l'exclusion de la lecture à une heure) par un examen après instillation de la solution de fluorescéine (3.4) et rinçage à l'aide de la solution (3.5). Elle sera poursuivie en utilisant la lampe U.V. (3.8).
   4.5. Les animaux morts en cours d'essai seront remplacés par d'autres animaux qui seront traités dans les mêmes conditions.
   V. - Notation.
   5.1. Procéder aux différents temps à l'évaluation des lésions dans l'ordre d'instillation des animaux.
   5.2. Noter les observations à l'aide de l'échelle d'évaluation numérique ci-après.
   VI. - Evaluation numérique des lésions oculaires.
   6.1. Conjonctive :
   Commencer l'évaluation du chemosis et du larmoiement avant d'ouvrir les paupières de l'animal.
   6.1.1. Chemosis (A) :
   Pas de gonflement : 0.
   Gonflement léger, y compris la membrane nictitante : 1.
   Gonflement avec éversion de paupière : 2.
   Gonflement avec paupières à demi fermées : 3.
   Gonflement avec paupières fermées plus qu'à moitié ou complètement : 4.
   6.1.2. Larmoiement (B) :
   Absence de larmoiement : 0.
   Larmoiement léger (ne pas tenir compte des légères sécrétions existant normalement dans l'angle interne) : 1.
   Larmoiement avec humidification des paupières et des poils avoisinant les paupières : 2.
   Larmoiement avec humidification des paupières et des poils sur de larges surfaces autour de l'oeil : 3.
   6.1.3. Rougissement de la conjonctive palpébrale (C) :
   Vaisseaux normaux : 0.
   Vaisseaux nettement plus injectés que la normale : 1.
   Vaisseaux difficiles à distinguer individuellement :
   - couleur rouge vif, diffuse : 2.
   - couleur rouge foncé, diffuse : 3.
   6.1.4. Additionner les trois notes et multiplier le total par 2 :
 (A + B + C)"2 :
   Maximum = 20.
   6.2. Iris (D) :
   Normal : 0.
   Nettement plus plissé que la normale, congestion, gonflement, iris réagissant encore à la lumière, même lentement (une ou plusieurs de ces caractéristiques) : 1.
   Pas de réaction à la lumière, hémorragie, destruction importante (une ou plusieurs de ces caractéristiques) : 2.
   6.2.1. Multiplier la note obtenue D par 5 : D x 5 :
   Maximum = 10.
   6.3. Cornée :
   Ne tenir compte que de la zone présentant le degré de lésion le plus élevé.
   6.3.1. Degré d'opacification cornéenne (E) :
   Aucune modification visible à l'examen direct (perte de brillant ou de poli) ou après instillation de fluorescéine : 0.
   Présence de zones translucides ( diffuses ou disséminées), détails de l'iris clairement visibles : 1.
   Présence d'une zone translucide facilement identifiable, détails de l'iris légèrement masqués : 2.
   Présence d'une zone opalescente, aucun détail de l'iris visible, contour de la pupille à peine discernable : 3.
   Présence d'une opacité cornéenne totale rendant l'iris et la pupille invisibles : 4.
   6.3.2. Surface d'opacité (F) :
   Un quart (ou moins mais non nulle) : 1.
   Entre le quart et la moitié : 2.
   Entre la moitié et les trois quarts : 3.
   Des trois quarts à toute la surface : 4.
   6.3.3. Faire le produit des deux notes et le multiplier par 5 :
 E x F x 5 :
   Maximum = 80.
   VII. - Détermination des indices d'irritation oculaire.
   7.1. Additionner pour chaque lapin les notes obtenues, à chaque temps d'observation. On obtient ainsi les indices d'irritation oculaire individuels : I.O.I.
   7.2. Faire à chaque temps la moyenne des I.O.I. des trois lapins. On obtient ainsi l'indice d'irritation oculaire moyen : I.O.
   7.3. Noter parmi les I.O. celui qui a la valeur la plus élevée. On obtient ainsi l'indice d'irritation oculaire maximum : I.O.Max. Le temps d'apparition de celui-ci sera précisé au rapport d'essai.
   VIII. - Expression des résultats.
   L'appréciation du produit examiné sera faite en fonction de l'indice d'irritation oculaire maximum mentionné au point VII, selon le tableau suivant :
   I.O.max. et appréciation :
   Inférieur ou égal à 15 : Faiblement irritant.
   Supérieur à 15 et, inférieur ou égal à 30 : Moyennement irritant.
   Supérieur à 30 et, inférieur ou égal à 50 : Irritant.
   Supérieur à 50 : Très irritant.
   IX. - Rapport d'essai.
   Le rapport d'essai doit comporter toutes les indications prévues par les règles de bonnes pratiques de laboratoire.
   Dans ses conclusions l'expérimentateur tiendra compte de toutes les observations et des résultats des examens, une attention particulière étant portée à la réversibilité des effets.
   En cas d'impossibilité absolue d'utiliser la méthodologie décrite, l'expérimentateur devra mentionner avec précision et justifier les modifications apportées.

   1. Objet.
   La présente méthode officielle est utilisée pour apprécier l'agressivité superficielle cutanée d'un produit cosmétique ou d'hygiène corporelle par applications itératives, en système ouvert, pendant vingt-huit jours consécutifs.
   En l'absence de toute réaction décelable à l'examen clinique au cours des deux premières semaines de traitement, l'expérimentateur a la faculté d'écourter la durée de l'essai.
   2. Animaux de laboratoire et équipement
   2.1. Lapins albinos de souche définie, de même sexe et pesant 2,5 kilogrammes environ au début de l'essai. Les animaux doivent avoir séjourné dans l'animalerie en cage individuelle, une semaine au minimum afin d'être parfaitement acclimatés, et reçoivent, dès leur arrivée, une nourriture de composition constante et équilibrée.
   2.2. Balance d'animalerie.
   2.3. Tondeuse électrique pour animal, munie d'un peigne fin.
   2.4. Doigtier à usage unique de qualité chirurgicale.
   2.5. Matériel d'application approprié.
   2.6. Micromètre à pression constante, plateau de 30 millimètres environ.
   2.7. Bistouri d'Arouette de 5 millimètres de diamètre environ.
   3. Mode opératoire
   Cet essai doit être effectué sur six lapins recevant le produit à expérimenter (lot 1) et sur six lapins témoins (lot 2).
   3.1. Peser chaque animal au début de chaque semaine et à la fin de l'expérimentation.
   3.2. Tondre la région dorsale rétroscapulaire des lapins dans le sens caudocrânien de part et d'autre de la colonne vertébrale, sur 8 centimètres de largeur et 15 centimètres de longueur, en laissant intact le poil présent au niveau du rachis, afin de bien séparer les deux plages, la droite et la gauche.
   Laisser les animaux au repos pendant au moins quatre heures.
   3.3. Les six lapins du lot reçoivent l'application du produit à tester, de manière uniforme, sur le côté droit ; masser légèrement.
   Le côté gauche ne reçoit pas de produit mais subit un massage identique.
   Si nécessaire, éliminer le surplus de produit.
   Doses à administrer tout au long de l'expérimentation : 2 grammes par animal et par jour (ou 2 millilitres par animal et par jour pour les produits de faible densité).
   3.4. Les six lapins du lot 2 subissent chaque jour un massage sur le côté gauche comme les animaux du lot 1.
   3.5. Veiller à ce que les animaux du lot 1 ne se lèchent pas après l'application du produit. Les animaux des deux lots seront soumis aux mêmes contraintes.
   3.6. Effectuer les applications sept jours sur sept, pendant vingt-huit jours consécutifs, aux mêmes moments de la journée.
   3.7. Tondre l'ensemble des animaux, à nouveau, au début de chaque semaine, côté témoin et côté traité, au minimum quatre heures avant l'application du produit. Si nécessaire, renouveler la tonte en cours de semaine, dans les mêmes conditions.
   3.8. A l'issue des vingt-huit jours d'expérimentation, effectuer un prélèvement, à l'aide du bistouri d'Arouette, au milieu de la zone d'application et au milieu de la zone témoin, sur chacun des animaux.
   Procéder à l'examen histologique de la peau des lapins du lot 1 ; si nécessaire, procéder également à l'examen histologique de la peau des lapins du lot 2.
   3.9. Si nécessaire, garde les animaux en observation pendant une semaine supplémentaire et procéder à de nouvelles biopsies cutanées en vue d'un examen histologique complémentaire.
   4. Observations et notations
   4.1. Avant chaque application de produit, vingt-quatre heures après la dernière et pendant la semaine supplémentaire d'observation, effectuer un examen portant sur :
   - l'aspect général des animaux ;
   - la repousse du poil ;
   - les réactions d'intolérance ;
   - la souplesse et l'état de la peau.
   4.2. A chaque examen, rechercher et noter la formation d'érythème et d'oedème à l'aide de l'échelle numérique ci-dessous :
   a) Erythème et formation d'escarres :
   - pas d'érythème : 0.
   - léger érythème (à peine visible) : 1.
   - érythème bien visible : 2.
   - érythème important : 3.
   - érythème grave (rouge pourpre) avec formation de légères escarres (lésions profondes) : 4.
   b) Formation d'oedème :
   - pas d'oedème : 0.
   - très léger oedème (à peine visible) : 1.
   - léger oedème (gonflement nettement visible) : 2.
   - oedème moyen (épaisseur d'environ 1 millimètre) : 3.
   - oedème grave (épaisseur supérieure à 1 millimètre) : 4.
   4.3. Mesurer l'épaisseur du pli cutané à l'aide du micromètre à pression constante chez tous les animaux du côté témoin et du côté traité, avant la première application puis chaque semaine.
   4.4. Compléter ces observations macroscopiques par les résultats des examens histologiques des zones cutanées traitées et non traitées.
   5. Calculs et expression des résultats
   5.1. Dresser la courbe de croissance pondérale moyenne de chacun des lots traité et témoin.
   5.2. Erythème et oedème : calculer, pour chaque lot, l'indice journalier moyen en additionnant les notes obtenues pour l'érythème et l'oedème et en divisant le total par le nombre d'animaux. Calculer pour chaque semaine l'indice hebdomadaire moyen (IH1 à IH4) en faisant la moyenne hebdomadaire des indices journaliers.
   Noter également :
   L'indice journalier maximal (IMax) observé lors de l'essai (en précisant le moment de son apparition) ;
   L'indice journalier final (IF1) observé vingt-quatre heures après la dernière application ;
   Le cas échéant, l'indice journalier final (IF2) observé à la fin de la semaine supplémentaire d'observation.
   5.3. Pli cutané : l'épaisseur du pli cutané (E), mesurée chaque semaine, est exprimée en pourcentage de variation selon la formule suivante, les mesures étant effectuées avec une précision du 1/10 de millimètre :
   E = <(T - t) : t> x 100.
   où
   T = mesure du côté traité,
   t = mesure du côté témoin.
   6. Rapport d'essai
   Le rapport d'essai doit comporter au moins les précisions méthodologiques prévues par les règles des bonnes pratiques de laboratoire.
   Dans ses conclusions, l'expérimentateur tient compte de toutes les observations et des résultats des examens histologiques, une attention particulière étant portée à la réversibilité des effets observés.
   En cas d'impossibilité absolue d'utiliser la méthode décrite, l'expérimentateur devra mentionner avec précision et justifier dans le rapport d'essai les modifications apportées.

Objectif et principe
Cette méthode est une alternative à l'expérimentation animale pour l'évaluation du potentiel irritant des produits cosmétiques. 
Le principe en est basé sur l'observation, par une personne entraînée, des effets irritants (hyperémie, hémorragie, coagulation) pouvant survenir dans les cinq minutes suivant le dépôt d'un produit sur la membrane chorio-allantoïdienne (MCA) d'oeuf de poule embryonné, au dixième jour d'incubation. 
Dans le cas des produits cosmétiques, notamment à base de tensioactifs, cette méthode est applicable à l'évaluation du potentiel irritant oculaire. 
Matériel (liste indicative) 
OEufs de poule embryonnés (la souche White Leghorn est recommandée), d'un poids compris entre 50 et 65 g le jour de la réception. 
Enceinte thermostatée. 
Incubateur à oeufs. 
Lampe à mirer les oeufs. 
Pince anatomique droite (pince à disséquer, brucelles,...) à bouts mousse et sans mors. 
Ciseaux à bouts ronds. 
Bain thermostaté à 37° C. 
Chronomètre. 
Pipettes, tubes à essai, béchers... 
Seringues de 1 ml à 5 ml. 
Balance de précision. 
Soluté injectable de pentobarbital. 
Eau pour préparations injectables. 
Soluté isotonique de NaCl à 0,9 p. 100. 
Protocole expérimental
Réception des oeufs
Dès réception, les oeufs fêlés ou cassés sont éliminés. Les autres sont conservés à l'abri de la lumière et à une température de 12° C ù 1° C (enceinte ou local adapté) pendant au moins vingt-quatre heures avant de les placer en couveuse. 
Mise en couveuse
Les oeufs sont pesés et identifiés puis placés dans l'incubat euros (température optimale : 37,8° C, humidité comprise entre 50 et 60 p. 100). Si l'incubateur n'est pas équipé d'un système de retournement automatique, les oeufs doivent être retournés manuellement au moins deux fois par jour. 
Pendant toute la durée de l'incubation, la température et l'humidité sont contrôlées et réglées si nécessaire. 
Les oeufs sont placés en position verticale (poche d'air vers le haut) dès le début dans le cas d'incubateurs équipés de plateaux oscillants et au huitième jour d'incubation dans les autres cas. 
Vérification des oeufs
Au dixième jour d'incubation, les oeufs sont mirés et les oeufs défectueux sont rejetés. 
Essai proprement dit
Les différentes étapes de l'essai sont enchaînées rapidement sous un éclairage d'une intensité suffisante ne dégageant pas de chaleur afin de ne pas dessécher la MCA. Dans le cas contraire, l'atmosphère est humidifiée à l'aide, par exemple, d'un brumisateur.
L'oeuf étant placé verticalement sur un support (poche d'air vers le haut), la coquille est entaillée au niveau de la poche d'air en prenant soin de ne pas léser la MCA.A l'aide d'une pince ou d'une paire de ciseaux à bouts ronds, la coquille est enlevée jusqu'au niveau de la membrane coquillière. Toute la surface de la membrane coquillière est alors humidifiée avec du soluté isotonique de chlorure de sodium tiédi à 37° C. Le soluté est ensuite éliminé par inclinaison de l'oeuf. Avec une pince la membrane coquillière est décollée délicatement puis retirée afin de découvrir la membrane chorio-allantoïdienne sous-jacente. 
Tout oeuf dont la membrane chorio-allantoïdienne est défectueuse ou présente des traces d'hémorragie est rejeté. 
0,30 ml du produit à l'essai (pur ou dilué), maintenu à 37° C, sont alors déposés délicatement sur la MCA à l'aide d'une seringue ou d'une pipette et le chronomètre est aussitôt déclenché. Après 20 secondes de contact, la membrane est rincée avec 5 ml de soluté isotonique de chlorure de sodium (maintenu à 37° C) à l'aide d'une seringue en évitant toute projection brutale. Le liquide de rinçage est éliminé par inclinaison de l'oeuf. Les éventuels phénomènes d'irritation sont observés pendant 5 minutes selon la procédure décrite ci-après. Le temps exact d'apparition de chaque phénomène est relevé.
L'effet irritant du produit à l'essai (ou de chacune de ses dilutions) est évalué sur quatre oeufs. En fin d'essai, les oeufs reçoivent une injection de pentobarbital puis sont éliminés. 
Procédure de lecture
Les observations prises en compte pour la notation du produit doivent être réalisées à l'oeil nu. 
Les phénomènes observés (hyperémie, hémorragie, coagulation) ne sont pas retenus en fonction de leur intensité mais en fonction de leur présence : il s'agit d'une réponse de type tout ou rien. 
Le temps est noté à l'apparition de chacun des phénomènes. 
Hyperémie
Phénomène observé : des capillaires non visibles avant l'ajout du produit deviennent visibles, alors que les capillaires visibles se dilatent et deviennent plus rouges. Ce phénomène peut également affecter les vaisseaux de diamètre supérieur. 
Hémorragie
Phénomène observé : libération de sang s'échappant des vaisseaux et / ou des capillaires, pouvant se présenter sous différents aspects, et notamment en " chou-fleur ", en nappe, en voile diffus, en piqueté (le sang s'échappe ponctuellement à différents endroits de la membrane). 
Il est à noter que :
-l'hémorragie peut présenter un caractère éphémère ; elle doit néanmoins être prise en compte ;
-l'observation, dans les 30 premières secondes, d'une hémorragie massive impose la prise en compte de l'hyperémie masquée. 
Coagulation (opacité et / ou thrombose) 
Opacité : 
Phénomène observé : apparition sur tout ou partie de la membrane, soit d'un voile opalescent évoluant éventuellement vers une opacification, soit d'une opacification directe. 
Il est nécessaire de vérifier que le phénomène n'est pas lié au comportement physicochimique du produit en milieu aqueux (par exemple formation d'un colloïde, d'un précipité,...). 
Thrombose : (schéma non reproduit) 
Phénomène observé : rupture du flux sanguin dans les vaisseaux se traduisant par un aspect segmenté (alternance d'étranglements et de zones turgescentes plus ou moins sombres). 
Il est à noter que les observations ne doivent pas prendre en compte les modifications intervenues au niveau des capillaires. 
Résultats
Les phénomènes observés sont quantifiés selon le tableau ci-après, en fonction de leur délai d'apparition : 
Notation en fonction du temps

PHENOMENE : Hyperémie
TEMPS : t inférieur ou égal à 30 s
NOTATION : 5

PHENOMENE : Hyperémie
TEMPS : t supérieur à 30 s et inférieur ou égal à 2 mn
NOTATION : 3

PHENOMENE : Hyperémie
TEMPS : t supérieur à 2 mn et inférieur ou égal à 5 mn
NOTATION : 1

PHENOMENE : Hémorragie
TEMPS : t inférieur ou égal à 30 s
NOTATION : 7

PHENOMENE : Hémorragie
TEMPS : t supérieur à 30 s et inférieur ou égal à 2 mn
NOTATION : 5

PHENOMENE : Hémorragie
TEMPS : t supérieur à 2 mn et inférieur ou égal à 5 mn
NOTATION : 3

PHENOMENE : Coagulation () 
TEMPS : t supérieur à 30 s et inférieur ou égal à 2 mn
NOTATION : 7

PHENOMENE : Coagulation () Coagulation = opacité et / ou thrombose. 
Le score pour chaque oeuf est la somme des notes d'hyperémie, d'hémorragie et de coagulation. La notation du produit testé est la moyenne arithmétique, arrondie à une décimale des scores obtenus sur quatre oeufs. La notation maximum est 21. 
Le potentiel irritant sur la membrane chorio-allantoïdienne du produit à l'essai (pur ou dilué) est donné par l'échelle suivante : 
Notation (N) 
N inférieur à 1. 
Classification : Pratiquement non irritant.
N supérieur ou égal à 1 et inférieur à 5. 
Classification : Faiblement irritant.
N supérieur ou égal à 5 et inférieur à 9. 
Classification : Modérément irritant.
N supérieur ou égal à 9. 
Classification : Irritant. 
Remarques importantes
Il est à noter que la reproductibilité des résultats est d'autant meilleure que la personne réalisant l'essai est entraînée et que les conditions expérimentales sont respectées. 
De manière à vérifier la qualité des conditions opératoires et celle des expérimentateurs, il est conseillé de procéder régulièrement à des contrôles à l'aide d'une référence.A cet effet, l'établissement préalable d'une courbe étalon avec des solutions aqueuses à 0,05 p. 100-0,4 p. 100 et 3,2 p. 100 (m / v) de lauryl sulfobétaïne est recommandé.
L'expérimentateur appréciera le potentiel irritant du produit à l'essai par comparaison aux données acquises pour des produits de même catégorie. 
Le rapport d'essai doit comporter toutes les indications prévues par les règles de bonne pratique de laboratoire. 
Bibliographie
LUEPKE N.P. The Hen's egg test (HET) : " An alternative toxicity test ". Brit J. Dermatol. 1986,115, Suppl. 31,133-135. 
LUEPKE N.P. & KEMPER F.H. The HET-CAM test : " An alternative to the Draize eye test ". Food Chem. Toxicol. 1986,24, n° 6 / 7,495-496.