Arrêté du 2 juin 1955 portant description de méthodes d'analyse en vue du contrôle de la qualité bactériologique des laits destinés à la consommation humaine
   En application des dispositions du décret n° 55-771 du 21 mai 1955, les prélèvements d'échantillons et les examens relatifs :
   A la détermination de la propreté des laits ;
   A l'épreuve au bleu de méthylène ;
   Au dénombrement microbien ;
   A la recherche des germes indologènes ;
   Au contrôle indirect du chauffage du lait par l'épreuve de la phosphatase ou de la péroxydase, sont effectués suivant les méthodes décrites à l'annexe du présent arrêté.

   La recherche des germes pathogènes peut être effectuée selon les techniques particulières de laboratoires spécialisés.

AnnexesI - Détermination de la propreté.II - Prélèvements des échantillons de lait en vue de l'analyse bactériologique.III - Epreuve au bleu de méthylène (réductase microbienne).IV - Dénombrement microbien.V - Recherche des germes indologènes.VI - Contrôle indirect du degré de chauffage du lait
   A - Lactofiltreur fonctionnant par gravité.
   Cet appareil est constitué par une bouteille de verre sans fond dont le goulot, d'un diamètre de 30 à 35 mm, comporte un dispositif à fermeture canette permettant de fixer sur l'orifice de la bouteille un filtre (feuille d'ouate, rondelle de tissu blanc serré, tel que finette, feutre, etc.), retenu par un grillage métallique.
   Pour l'emploi, cette bouteille est disposée, goulot en bas, sur un support approprié, au-dessus d'un récipient destiné à recueillir le lait filtré.
   La bouteille sans fond est souvent remplacée par un récipient cylindro-conique en verre ou en métal, comportant au niveau de la petite base du tronc de cône un dispositif de fixation de la partie filtrante.
   Dans tous les cas, le dispositif peut être complété par une soufflerie permettant de produire à la surface du lait une pression d'air destinée à en accélérer la filtration.
   B - Lactofiltreur fonctionnant sous vide.
   Cet appareil, réservé au travail de laboratoire, est constitué par une fiole conique à vide, surmontée, par l'intermédiaire d'un bouchon de caoutchouc perforé, d'une tulipe de verre portant un creuset de Gooch (creuset de porcelaine à fond perforé de 35 mm de diamètre) maintenu sur la tulipe à l'aide d'une bague de caoutchouc.
   La substance filtrante (rondelle d'ouate ou de tissu) est déposée au fond du creuset de Gooch.
   Pour l'emploi, l'ajutage latéral de la fiole inférieure est relié à une trompe à vide.
   C - Pompes de filtration.
   Ces appareils sont basés sur le principe des seringues. Dans le corps cylindrique, d'un volume d'un demi-litre, se meut un piston capable d'aspirer ou de refouler le lait à travers une membrane de filtration fixée à l'extrémité du corps cylindrique. L'appareil est complété par un ajutage de longueur suffisante pour permettre de réaliser l'aspiration du lait au fond d'un bidon.
   Ces appareils réalisent la filtration soit à l'aspiration, soit au refoulement.
   Le filtre est généralement constitué par un disque d'ouate encastré entre deux rectangles de carton que l'on insère dans le logement prévu à cet effet à la base du corps cylindrique de la pompe.
   D - Examen et conservation des épreuves de filtration.
   Les rondelles d'ouate ou de tissu où sont rassemblées les impuretés sont séchées et examinées. L'aspect, la nature et l'abondance des impuretés, de même que la coloration éventuelle de la rondelle permettent le classement des laits en plusieurs catégories (par exemple : très propre, propre, légèrement sale, sale, très sale, etc.).
   Pour conserver les rondelles de filtration, il convient de les "monter" entre une feuille de papier fort et un carré de matière plastique transparent fixé au papier sur les bords.
   Les membranes filtrantes utilisées dans les pompes ou certains appareils statiques sont directement montés à l'avance sur carton ou sur papier imperméable. Elles sont conservées dans cet état.

   La technique de prélèvement diffère suivant que le lait est conditionné en bouteilles ou en récipients de plus grande capacité :
   - dans le premier cas, l'échantillon sera constitué par une bouteille choisie au hasard et disposant d'une obturation totale. A cette occasion, l'agent effectuant le prélèvement s'assurera que la fermeture de la bouteille est satisfaisante ;
   - dans le second cas, le prélèvement doit être effectué en s'assurant de toutes les garanties d'asepsie.
   A - Matériel nécessaire.
   Tube de prélèvement. Il est constitué par une pipette de grandes dimensions (longueur totale : 60 cm au moins) en verre Pyrex épais, munie au voisinage d'une extrémité d'une panse cylindrique allongée d'environ 100 ml. La pointe de la pipette est renforcée à la flamme et rétrécie à 6-8 mm intérieur. Ce tube est stérilisé dans un étui et ne doit servir qu'à un seul prélèvement.
   Flacon pour échantillonnage bactériologique. Les prélèvements réalisés à l'aide du tube précédent sont introduits dans des canettes bactériologiques de 125 ml, préalablement stérilisées à l'autoclave.
   Fiole de prélèvement. Elle est constituée par un flacon à large col en verre Pyrex d'une contenance de 150 ml environ, renfermant un certain nombre de billes de verre destinées à le lester et muni d'une chaînette métallique d'un mètre de longueur fixée au col du flacon. La fiole est bouchée au coton. La chaînette est enroulée autour du col. L'ensemble est enveloppé dans du papier et stérilisé.
   B - Mode opératoire.
   Cas d'un bidon. Le bidon étant ouvert, le tube de prélèvement est introduit dans la masse du lait en imprimant à celle-ci une agitation modérée grâce à des mouvements de rotation et de translation du tube de prélèvement lui-même. Après avoir entretenu cette agitation pendant environ une demi-minute, le tube est sorti de la masse du lait pour vider la panse et réintroduit dans le fond du bidon. L'extrémité supérieure du tube est alors bouchée avec le doigt, le tube est sorti du bidon et son contenu est recueilli aseptiquement dans le flacon canette.
   Dans le cas de laits congelés, il est nécessaire de décongeler complètement le lait et de l'agiter avant de procéder au prélèvement.
   Cas d'un bac ouvert. La lait contenu dans des bacs ouverts est d'abord agité à l'aide du dispositif habituel utilisé pour le rendre homogène (généralement longue tige de métal portant une plaque perforée à l'extrémité). Lorsque cette agitation préalable est réalisée, procéder au prélèvement en immergeant le tube de prélèvement dans la masse du lait. En boucher l'extrémité supérieure avec le doigt, le sortir de la masse de lait et recueillir son contenu aseptiquement dans le flacon canette.
   Cas d'un tank muni d'un agitateur mécanique. Mettre l'agitateur en mouvement pendant au moins quinze minutes. Arrêter l'agitateur. Par le trou d'homme supérieur plonger dans la masse du lait la fiole de prélèvement lestée de billes de verre, tenue par l'extrémité de la chaînette. Sortir la fiole pleine de lait. Rejeter une certaine quantité de lait de manière à dégager largement le col et boucher aseptiquement.
   Cas d'une citerne de transport. Opérer le prélèvement comme dans le cas précédent.
   C - Remarque importante.
   Quelle que soit la nature du prélèvement, l'échantillon devra être immédiatement plongé dans la glace pilée où il sera maintenu jusqu'au moment de l'analyse. L'analyse devra être effectuée au plus tard dans les huit heures qui suivent le prélèvement.

   Principe.
   La plupart des microbes du lait (ferments lactiques et saprophytes divers) modifient au cours de leur développement son potentiel d'oxydo-réduction). Cette modification peut être mise en évidence en additionnant le lait d'une substance colorée qui donne par réduction des dérivés de couleur différente.
   La rapidité du changement de coloration de cette substance est fonction du nombre de microbes présents. La mesure du temps de changement de coloration peut donc permettre de se faire une idée du degré de contamination du lait.
   Le produit coloré choisi est le bleu de méthylène qui donne par réduction un leuco-dérivé incolore.
   Réactifs.
   Solution de bleu de méthylène à la dose de 5 mg 100 ml d'eau distillée stérile (1).
   Conserver cette solution à l'abri de la lumière et au froid.
   Appareillage.
   Bain-marie couvert, à thermostat, on étuve à 37 degrés C.
   Tubes à essais stérilisés de 16 x 160 mm ou 14 x 140 mm.
   Bouchons de caoutchouc correspondants, bouillis pendant cinq minutes immédiatement avant l'emploi.
   Pipettes stérilisées de 10 ml et 1 ml.
   Mode opératoire.
   Introduire aseptiquement dans un tube à essais stérile :
   10 ml de lait ;
   1 ml de la solution de bleu de méthylène récemment préparée (une semaine). Boucher. Mélanger en retournant et redressant deux fois chaque tube. Porter au bain-marie ou à l'étuve. Dans ce dernier cas, il faut prendre soin de plonger auparavant les tubes dans un bain-marie à 37 degrés C ;
   Couvrir le bain-marie ;
   Mélanger à nouveau toutes les heures ;
   Noter le temps de décoloration en observant la teinte du mélange aux temps suivants :
   - immédiatement ;
   - après quinze minutes ;
   - après une heure ;
   - après trois heures.
   Négliger l'anneau bleu pâle non réduit qui persiste à la surface du lait par suite d'une réoxydation au contact de l'air.
   Interprétation des résultats.
   Une décoloration avant quinze minutes indique un lait très fortement contaminé. Si la décoloration a lieu en moins d'une heure, le lait est fortement contaminé. Entre une heure et trois heures, le lait est légèrement contaminé. Au-dessus de trois heures, le lait est considéré comme étant de qualité satisfaisante sous les réserves suivantes :
   a) Certains microbes, tels que le streptocoque de la mammite contagieuse, ne décolorent pas le bleu de méthylène ;
   b) Lorsque le lait a été additionné de formol en vue de sa conservation, on observe une décoloration plus rapide du bleu de méthylène due à l'enzyme de Schardinger.
   (1) La dissolution d'une tablette de bleu de méthylène Orla-Jensen (Blauenfeld Tvede) dans 800 ml d'eau donne sensiblement cette concentration.


   A - Dispositions générales.
   La numération microbienne est exprimée par la moyenne arithmétique des nombres de colonies décomptables à la loupe sur deux boîtes de Pétri ensemencées chacune avec une dilution convenable du lait à étudier.
   L'incubation à l'étuve est réalisée à la température de 31 degrés C avec une tolérance de 1 degré C en plus ou en moins. La durée d'incubation est de soixante-douze heures.
   B - Milieu de culture.
   Composition :
     Peptone pancréatique de viande, 5 g.
     Glucose pur, 1 g.
     Lait écrémé, 5 g.
     Gélose, 15 g.
     Eau distillée dans un appareil en verre ou en silice, 1.000 g.
   Après dissolution à chaud et filtration, la réaction du milieu de culture est ajustée à pH 7,4 (plus ou moins 0,2).
   Stérilisation :
   Le milieu de culture est ensuite réparti par doses de 15 ml environ, en tubes bouchés au coton, stérilisés à l'autoclave à 115 degrés C pendant vingt minutes.
   C - Technique de dilution.
   Le flacon contenant l'échantillon du lait à étudier est extrait de son emballage isotherme immédiatement avant d'effectuer les dilutions. Il est agité pendant dix secondes au moins.
   Dans le cas de prélèvement en flacons canettes, le col du flacon est stérilisé par immersion dans un liquide antiseptique constitué par de l'alcool à 90 degrés iodé à 1 pour mille, puis égoutté et ouvert aseptiquement.
   Dans tous les cas et quel que soit le flacon, l'ouvrir aseptiquement et flamber l'ouverture.
   1 ml du lait ainsi préparé est prélevé aseptiquement à l'aide d'une pipette stérile en ayant soin de ne pas plonger la pipette plus de 1 à 2 cm dans le lait. Le lait est aspiré et refoulé au moins une fois dans la pipette avant d'effectuer le prélèvement.
   La prise d'échantillon est introduite aseptiquement dans un tube contenant 9 ml d'eau stérile salée à 8 ou 9 pour mille. La pipette ne doit pas entrer en contact avec le liquide de dilution.
   Le tube est agité doucement pour rendre la dilution homogène.
   Après avoir aspiré et refoulé le mélange au moins une fois, 1 ml de la première dilution au 1/10 est prélevé à l'aide d'une nouvelle pipette stérile de 1 ml plongeant de 1 à 2 cm dans le liquide.
   Le ml de dilution est introduit dans un deuxième tube contenant 9 ml d'eau salée stérile en prenant les mêmes précautions que ci-dessus.
   Une troisième opération est effectuée de la même manière afin d'obtenir une dilution de 1/1.000.
   D - Technique d'ensemencement.
   Les ensemencements sont effectués simultanément sur deux boîtes de Pétri.
   1 ml de la dilution retenue pour l'examen est prélevé à l'aide d'une pipette stérile de 1 ml et introduit aseptiquement au centre d'une boîte de Pétri stérile.
   10 ml environ du milieu gélosé, totalement liquéfié au bain-marie bouillant, puis refroidi à 48 degrés C environ, sont versés dans la boîte de Pétri ayant reçu immédiatement auparavant 1 ml de dilution.
   Il ne doit pas s'écouler plus de quinze minutes entre le moment où le lait est dilué et celui où la gélose est introduite dans la boîte de Pétri.
   Le mélange de "l'inoculum" et du milieu de culture est réalisé immédiatement par agitation horizontale.
   Les boîtes sont laissées au repos pendant une heure environ, puis retournées au moment d'être introduites dans l'étuve, afin d'éviter les condensations sur le couvercle.

   A - Milieu de culture : eau peptonée.
     Peptone bactériologique exempte d'indol, 15 g.
     Chlorure de sodium, 5 g.
     Eau distillée Q.s.p., 1.000 ml.
   Dissoudre à chaud ; amener le pH entre 7 et 7,4, s'il y a lieu.
   Répartir en tubes à essais à raison de 10 ml environ par tube et stériliser à l'autoclave à 115 degrés C pendant vingt minutes.
   B - Réactif : réactif d'Ehrlich-Kovacs.
     Paradiméthylaminobenzaldéhyde, 3 g.
     Alcool amylique ou isoamylique du Codex, 75 ml.
     Acide chlorhydrique (D. 1,19), 25 ml.
   Triturer au mortier la diméthylaminobenzaldéhyde avec l'alcool amylique ou isoamylique pur. Ajouter lentement l'acide chlorhydrique. Le réactif obtenu doit être incolore ou très faiblement coloré et conservé à l'obscurité.
   C - Mode opératoire.
   a) A partir des trois dilutions en eau salée stérile (au 1/10, 1/100, 1/1.000) préparées en vue du dénombrement microbien, porter respectivement 1 ml (c'est-à-dire 1/10, 1/100, 1/1.000 de ml de lait) dans trois tubes d'eau peptonée stérile.
   b) Si l'on désire vérifier l'absence de tout germe indologène dans 1 ml de lait, porter, en outre, 1 ml de lait lui-même dans un ballon de 100 ml environ, contenant au moins 60 ml de la même eau peptonée.
   Après quarante-huit heures de séjour à l'étuve à 37 degrés C, rechercher la formation d'indol en ajoutant dans chaque tube environ 0,5 ml du réactif d'Ehrlich-Kovacs : l'apparition d'un anneau de coloration rouge vif à la surface de la culture témoigne de la présence d'indol (réaction positive). Dans le cas du ballon, verser quelques millilitres de la culture de quarante-huit heures dans un tube à essais et procéder comme il vient d'être dit. Si, dans ce cas, la réaction de l'indol est négative, il est indiqué de repiquer 1/10 de millilitre de la culture dans un tube d'eau peptonée qui sera placé à l'étuve à 37 degrés C pendant quarante-huit heures ; après ce délai, on recherchera l'indol.
   Dans tous les cas, examiner d'abord la culture contenant la dilution de lait la plus grande (tube au 1/1.000), puis celle contenant la dilution au 1/100 et ainsi de suite. En opérant dans cet ordre, le premier tube positif indique l'ordre de grandeur du nombre des indologènes (plus de 1.000, entre 100 et 1.000, entre 10 et 100, entre 1 et 10, moins de 1).
1° Par l'épreuve de la phosphatase.
   Principe.
   Tout lait pasteurisé correctement doit avoir une phosphatase négative.
   La phosphatase, enzyme constamment présente dans le lait cru et progressivement inactivée par un chauffage à température supérieure à 60 degrés C, doit être absente dans un lait correctement pasteurisé.
   A la sortie du pasteurisateur, l'absence de cette enzyme thermolabile permet de présumer que la pasteurisation a été effectuée à une température suffisamment élevée pour assurer la destruction des germes pathogènes normalement détruits par la pasteurisation.
   La phosphatase pourra être recherchée par deux méthodes : l'une, simple, rapide (test d'Ashaffenburg et Muellen), qui convient au contrôle courant ; l'autre, plus délicate, plus précise (méthode de P. Sanders et O. Sager), convenant particulièrement en cas d'analyses contradictoires.
   A - Méthode de P. Sanders et O. Sager.
   La présence de la phosphatase active dans le lait peut être mise en évidence, notamment par sa propriété de libérer par hydrolyse le phénol d'une solution de phénylphosphate disodique. L'activité de l'enzyme est alors mesurée en appréciant par comparaison colorimétrique avec un témoin la quantité de phénol libéré.
   Réactifs.
   1° Tampons.
   a) Tampon de baryte-acide borique pH 10,6.
   Dissoudre 25 grammes de baryte hydratée fraîche Ba (OH)2 5 H2 O dans de l'eau distillée et amener à 500 ml. Dissoudre 11 grammes d'acide borique Bo3 H3 dans de l'eau distillée et amener à 500 ml.
   Mélanger les deux solutions après réchauffage à 50 degrés C. Agiter, refroidir jusqu'à 20 degrés et filtrer. Conserver le filtrat en flacon bouché.
   b) Tampon pour le développement de la couleur : pH 9,8.
   Dissoudre 6 grammes de métaborate de sodium BO2 Na et 20 grammes de chlorure de sodium dans de l'eau distillée. Amener à 1 litre.
   2° Substrat tamponné au phénylphosphate disodique.
   Dissoudre 0,10 gramme de phénylphosphate disodique sans phénol dans un mélange composé de 50 ml de tampon I a et de 50 ml d'eau distillée.
   3° Défécant au zinc-cuivre.
   Dissoudre 3 grammes de sulfate de zinc (SO4 Zn 7 H2 O) et 0,6 gramme de sulfate de cuivre SO4 Cu 5 H2 O dans de l'eau distillée. Amener à 100 ml.
   4° Réactif de Gibbs au 2,6 dibromoquinonechlroimine (BQC).
   Dissoudre 40 mg de BQC en poudre dans 10 ml d'alcool éthylique absolu ou d'alcool méthylique. Conserver le réactif au froid dans un flacon de verre coloré bien bouché. Ne plus l'utiliser dès qu'il commence à brunir.
   Appareillage.
   Bain-marie couvert permettant le chauffage à 100 degrés C de tubes de 18 x 180 mm placés verticalement.
   Bain-marie ou étuve à 37-38 degrés C.
   Electrophotomètre.
   Mode opératoire.
   1° Introduire 1 ml de lait dans un tube et 1 ml de lait dans un autre tube qui servira de témoin ;
   2° Chauffer le témoin au bain-marie bouillant pendant 1 minute ;
   3° Ajouter dans chaque tube 10 ml de substrat tamponné 2, boucher les tubes et agiter ;
   4° Les placer au bain-marie ou à l'étuve à 37-38 degrés C pendant une heure en les agitant de temps en temps.
   5° Les porter au bain-marie bouillant pendant une minute. La température du liquide dans les tubes doit atteindre au moins 85 degrés C. On peut contrôler cette température en plaçant un thermomètre aiguille dans un tube contenant le même volume de liquide plongé dans le bain-marie bouillant. Refroidir à la température ambiante.
   6° Ajouter dans chaque tube 1 ml de défécant au zinc-cuivre et agiter vigoureusement. Le pH du mélange doit être 9 à 9,1.
   7° Filtrer sur papier filtre Laurant 1 B, et recueillir 5 ml du filtrat dans un tube jaugé.
   8° Ajouter 5 ml de tampon I b. Le pH du mélange doit être 9, 3-9, 4.
   9° Ajouter 4 gouttes de BQC. Mélanger et laisser la teinte se développer pendant trente minutes à la température ambiante : teinte bleue en présence de phosphatase.
   10° Comparer à l'électrophotomètre en lumière rouge le contenu des deux tubes dans la bande 600-700 microns de longueur d'onde.
   Avec le photomètre P. Meunier, utiliser l'écran 70. Déduire du nombre lu pour le test celui lu pour le témoin.
   Soit n la différence.
   Se reporter ensuite à la courbe d'étalonnage du photomètre préalablement établie. Multiplier n par 1,2. On a la valeur en phénol correspondant à 0,5 ml de lait.
   Etalonnage de l'électrophotomètre.
   a) Préparer une solution mère contenant 1 g de phénol pur dans 1 litre d'eau.
   b) Prendre 10 ml de cette solution, amener à 1 litre et mélanger (1 ml de solution contient 10 upsilon de phénol).
   c) A partir de b, préparer des solutions plus diluées : par exemple (pour 100 ml d'eau) :
   5 ml (1 ml contient 0,5 upsilon) ; 10 ml (1 ml contient 1 upsilon) ; 20 ml (1 ml contient 2 upsilon) ; 50 ml (1 ml contient 5 upsilon).
   Préparer ainsi une série de tubes standard contenant 0 à 40 upsilon de phénol. Pour améliorer la stabilité de la couleur, ajouter dans chaque tube 1 ml d'une solution aqueuse de sulfate de cuivre 0,05 p. 100. Ajouter ensuite 5 ml d'un tampon obtenu en diluant à 1 litre avec de l'eau distillée, 100 ml de tampon I b. Ajouter quatre gouttes de BQC. Agiter et laisser reposer pendant trente minutes à la température ambiante. Faire la lecture à l'électrophotomètre.
   Pour tracer la courbe d'étalonnage, porter en ordonnées les nombres lus sur le tambour du photomètre et en abscisses les doses de phénol correspondantes. La courbe obtenue est une droite.
   Interprétation des résultats.
   On considère qu'un lait est bien pasteurisé quand la quantité de phénol ne dépasse pas 2 upsilon pour 0,5 ml de lait.
   Cette méthode permet de déceler 0,3 p. 100 de lait cru additionné à du lait pasteurisé.
   Remarques.
   1° Cas des laits acides : pendant le séjour au bain-marie, le pH doit rester dans les limites déterminées (9,8 - 10,2). Lorsque le lait analysé est acide, il faut modifier ainsi la composition des réactifs :
   a) Substrat tamponné au phénylphosphate : dissoudre 0,10 gramme de phénylphosphate dans 10 ml de tampon I a ;
   b) Défécant au zinc : solution aqueuse de sulfate de zinc à 6 p. 100.
   Ces deux réactifs remplacent le substrat tamponné 2 et le défécant zinc-cuivre. Les volumes utilisés sont les mêmes.
   2° Il est possible pour un opérateur expérimenté de comparer à l'oeil nu les teintes des tubes tests et des tubes témoins.
   Dans la plupart des cas, cette comparaison suffit pour savoir si le degré de chauffage est suffisant.

   B - Test d'Ashaffenburg et Muellen.
   Préparation de la solution tampon : faire dissoudre 3,5 grammes de carbonate de soude anhydre et 1,5 gramme de bicarbonate de soude pour un litre d'eau distillée. Il s'agit bien entendu de substances chimiquement pures, pour analyses.
   Préparation du réactif : placer 0,15 gramme de paranitrophényl phosphate disodique dans un ballon jaugé de 100 ml. Compléter au trait de jauge avec la solution tampon ci-dessus formulée. Conserver à la glacière et jeter le réactif non utilisé une semaine après sa préparation. La solution doit être incolore.
   Mode préparatoire : faire bouillir environ 5 ml du lait suspect, pour la préparation d'un témoin. Dans deux tubes de 150 x 15 mm introduire 5 ml de réactif. Boucher. Placer les tubes à l'étuve ou au bain-marie à 37 degrés C pendant environ deux minutes. Ajouter dans l'un des tubes 1 ml du lait à examiner, et dans l'autre tube 1 ml du même lait, mais ayant subi l'ébullition. Boucher. Mélanger. Incuber à 37 degrés C pendant trente minutes et deux heures. Effectuer une première lecture après une demi-heure d'incubation et une seconde lecture une heure et demie plus tard. Pour effectuer cette lecture, agiter les tubes, placer l'échantillon bouilli dans le comparateur de Lovibond, au-dessous du disque coloré et l'échantillon non bouilli à côté. Tourner le disque jusqu'à égalisation des couleurs dans les deux voyants. Examiner à la lumière naturelle diffuse. Lire dans le voyant spécial l'indication correspondante. Le disque "ATPW 7" donne 7 teintes jaunes de référence correspondant à 0,6, 10, 14, 18, 25 et 42 microgrammes de nitrophénol par ml de lait.
   Interprétation du test.
   a) Première lecture après trente minutes :
   0 : Absence de phosphatase.
   6 : Réaction douteuse.
   10 : et au-dessus : présence de phosphatase.
   b) Deuxième lecture après deux heures au total :
   0 à 10 : absence de phosphatase.
   10 à 18 : réaction douteuse.
   18 et au-dessus : présence de phosphatase.
   2° Par l'épreuve de la péroxydase.
   Lorsque la pasteurisation a été effectuée à une tempéature d'au moins 80 degrés C, la recherche de la phosphatase peut être remplacée par celle de la péroxydase dont la technique est plus simple. Mais il est nécessaire dans le cas d'une réaction positive de la péroxydase de vérifier que la réaction de la phosphatase est négative pour s'assurer que la pasteurisation du lait a été faite à une température suffisamment élevée.
   Principe.
   La péroxydase, enzyme toujours présente dans le lait cru est inactivée à une température de 80 degrés C ou plus, maintenue pendant quelques secondes. Une pasteurisation haute efficace doit donc la détruire totalement.
   La présence de péroxydase peut être mise en évidence par sa propriété de décomposer l'eau oxygénée en libérant de l'oxygène atomique capable de se fixer sur une substance oxydable telle que le gaïacol, en donnant un produit d'oxydation de coloration rose saumon.
   Matériel.
   Tube à essai 18 x 180 mm.
   Pipettes jaugées de 2 ml.
   Flacon compte-gouttes.
   Réactifs.
   Solution aqueuse saturée de gaïacol (environ 2 p. 100).
   Eau oxygénée à 10 volumes.
   Mode opératoire.
   Introduire dans un tube à essai :
   2 ml de lait à examiner.
   2 ml de la solution saturée de gaïacol.
   1 goutte d'eau oxygénée à 10 volumes.
   Agiter et garder le tube dans la main afin de maintenir le mélange à une température de 20 degrés à 30 degrés C.
   On considère que le lait est bien pasteurisé lorsqu'on n'observe aucun changement de coloration après une minute environ. Réaction négative.
   Remarques.
   La réaction est en défaut :
   a) Lorsque le lait contient certains éléments qu'il a solubilisés (cuivre, etc.) et qui rendent la réaction positive. Dans ce cas, recommencer l'épreuve avec un même lait que l'on aura soumis à l'ébullition et ensuite ramené à 20 degrés - 30 degrés C ; si la réaction devient négative, il s'agissait bien d'un lait n'ayant pas la pasteurisation haute ;
   b) Lorsque le lait est trop acide (acidité supérieure à 30 degrés Dornic) ;
   c) Lorsque le lait renferme du bichromate de potassium (la réaction est toujours positive).
   Lorsque le lait renferme du formol, la réaction n'est pas en défaut.