Arrêté du 12 janvier 1999 relatif aux méthodes de dosage des vitamines B 1, B 2 et B 6 dans les denrées et boissons destinées à l'homme
   Les laboratoires chargés de concourir à l'application de la réglementation relative à la répression des fraudes sont tenus d'employer, pour effectuer le dosage des vitamines B 1, B 2 et B 6 dans les denrées et boissons destinées à l'homme, les méthodes décrites aux annexes au présent arrêté.


   L'arrêté du 21 octobre 1987 relatif aux méthodes officielles de dosage des vitamines B 1 et B 2 dans les produits diététiques et de régime est abrogé.


Le directeur général de la concurrence, de la consommation et de la répression des fraudes est chargé de l'exécution du présent arrêté, qui sera publié au Journal officiel de la République française.


AnnexesMÉTHODE OFFICIELLE DE DOSAGE DE LA VITAMINE B 1 (THIAMINE) DANS LES DENRÉES ET BOISSONS DESTINÉES À L'HOMMEMÉTHODE OFFICIELLE DE DOSAGE DE LA VITAMINE B 2 (RIBOFLAVINE) DANS LES DENRÉES ET BOISSONS DESTINÉES À L'HOMMEMÉTHODE OFFICIELLE DE DOSAGE DE LA VITAMINE B 6 DANS LES DENRÉES ET BOISSONS DESTINÉES À L'HOMME1. Domaine d'application
      Cette méthode permet la détermination de la teneur en vitamine B 1 dans les denrées et boissons destinées à l'homme.
   Le taux moyen de recouvrement de cette méthode est toujours supérieur à 90 %, quel que soit l'aliment analysé, sauf pour les aliments contenant du chocolat. Lorsque le taux moyen de recouvrement est inférieur à 90 %, le déterminer pour chaque analyse et rendre un résultat corrigé.
 2. Définition
      La teneur en vitamine B 1 est le résultat, exprimé en mg/100 g, mg/100 ml ou mg/l de produit tel quel, obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Conventionnellement, ce résultat est exprimé en thiamine base.
 3. Principe
      Extraction de la vitamine B 1 (thiamine) par hydrolyses acide et enzymatique, puis oxydation de la thiamine en thiochrome par le ferricyanure de potassium. Dosage du thiochrome par fluorimétrie après isolement de ce composé par chromatographie liquide haute performance en phase inverse.
 4. Réactifs
      Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée est de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
 4.1. Solution d'acide chlorhydrique à environ 0,1 mol/l.
 4.2. Solution d'acétate de sodium à 2,5 mol/l.
 4.3. -amylase.
 4.4. Takadiastase.
 4.5. Solution à 1 % (m/v) de ferricyanure de potassium (conservation une semaine à + 4 °C).
 4.6. Solution à 15 % (m/v) d'hydroxyde de sodium.
 4.7. Solution oxydante (à préparer extemporanément) : ajouter 1 ml de la solution de ferricyanure de potassium (4.5) à 24 ml de la solution d'hydroxyde de sodium (4.6).
 4.8. Méthanol (qualité pour chromatographie).
 4.9. Solution d'acétate de sodium à 0,05 mol/l.
 4.10. Solution éluante : mélange 70:30 (v/v) de méthanol (4.8) et d'eau distillée.
 4.11. Chlorhydrate de thiamine (PM = 337,3) C12 H18 Cl2 N4 OS.
 4.12. Solution contenant 1 g/l de vitamine B 1 (thiamine base ; PM = 300,8) dans de l'eau distillée.
 5. Appareillage
      Toutes les opérations analytiques doivent être réalisées avec de la verrerie brune ou, à défaut, à l'abri de la lumière solaire directe.
 5.1. Mixeur-broyeur.
 5.2. Bain d'eau.
 5.3. pH-mètre.
 5.4. Etuve à 37  3 °C.
 5.5. Cartouche Sep Pak C18Société Waters.
 ou équivalent.
 5.6. Membrane d'acétate de cellulose 0,45 micro m.
 5.7. Appareil de chromatographie liquide haute performance avec détection par fluorimétrie.
5.8. Colonne contenant une phase inverse greffée de type octadécylsilane (5 micro m) (longueur de 15 à 30 cm et diamètre intérieur 4 mm) ou une phase inverse greffée de type octylsilane (5 micro m) (longueur de 15 à 30 cm et diamètre intérieur 4 mm), traitée pour la séparation des composés basiques.
 6. Mode opératoire
   6.1. Préparation de l'échantillon pour essai.
   Homogénéiser l'échantillon après l'avoir broyé finement (si nécessaire). Peser exactement environ M grammes (ou millilitres) de cet échantillon dans un erlenmeyer de 250 ml (M de l'ordre de 5 grammes pour un échantillon contenant approximativement 0,8 mg/100 g de vitamine B 1). Ajouter 65 ml de la solution d'acide chlorhydrique 0,1 mol/l (4.1) et mettre au bain d'eau à 100 °C pendant 30 minutes. Refroidir et ajuster à pH 4,5 par addition de solution d'acétate de sodium (4.2). Ajouter ensuite 50 mg de -amylase et 500 mg de takadiastase et agiter. Mettre à l'étuve à 37 °C pendant une nuit. Transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 125 ml et ajuster avec de l'eau distillée. Filtrer le surnageant. (Si la filtration est longue, il est possible de refaire l'analyse en utilisant pour l'hydrolyse une solution d'acide chlorhydrique 0,5 mol/l.)
   Mettre 1 ml du filtrat obtenu dans un bécher de 15 ml. Ajouter 3 ml de la solution oxydante (4.7). Agiter puis laisser au repos 1 minute exactement. Faire passer cette solution ainsi que les eaux de lavage sur une cartouche Sep Pak C18 (conditionnée par passage de 2 ml de méthanol [4.8] et 5 ml d'eau). Laver la cartouche avec 10 ml de solution d'acétate de sodium (4.9) puis éluer avec 8 ml de la solution (4.10). Compléter à 10 ml avec cette même solution et filtrer si besoin sur membrane d'acétate de cellulose (5.6) (solution échantillon à injecter dans le chromatographe).
 6.2. Préparation des témoins.
   Faire une dilution au 1/100 avec de l'eau distillée à partir de la solution mère (4.12). Puis faire trois dilutions au 1/50, 1/25 et 1/10 à partir de la solution précédente. Prélever exactement 1 ml de chaque solution obtenue et les introduire dans des béchers de 15 ml. Ajouter dans chaque bécher 3 ml de la solution oxydante (4.7). Agiter, puis laisser au repos 1 minute. Faire passer ces solutions, ainsi que les eaux de lavage sur des cartouches Sep Pak C18 conditionnées par passage de 2 ml de méthanol (4.8) et 5 ml d'eau distillée. Laver les cartouches avec 10 ml de solution d'acétate de sodium (4.9) puis éluer avec 8 ml de la solution (4.10). Compléter à 10 ml avec cette même solution et filtrer chaque solution témoin sur une membrane d'acétate de cellulose (5.6) (solutions témoins contenant respectivement 0,020 micro g/ml, 0,040 micro g/ml et 0,100 micro g/ml de thiamine à injecter dans le chromatographe).
 6.3. Conditions chromatographiques :
   - phase mobile : mélange 30/70 (v/v) de méthanol (4.8) et de solution d'acétate de sodium (4.9) (ces proportions peuvent éventuellement être modifiées si nécessaire) ;
   - débit de la phase mobile : 0,7 à 1 ml par minute ;
   - détection par fluorescence : longueur d'onde d'excitation :
 366 nm ; longueur d'onde d'émission : 435 nm ;
   - volume injecté : 20 micro l à 100 micro l.
 6.4. Taux de recouvrement.
   Pour l'aliment étudié, peser exactement deux séries de deux échantillons. Analyser selon le mode opératoire (6.1) les deux échantillons de la première série (échantillons 1 et 2). Dans les deux échantillons de la deuxième série (échantillons 3 et 4), ajouter une certaine quantité de thiamine avant de procéder à l'hydrolyse acide, puis procéder à l'analyse selon (6.1). Le taux de recouvrement moyen de la méthode (t) est donné par la relation :
 t =  2 (x3 + x4) - (x1/M1 + x2/M2) (M3 + M4) 
 4z
 dans laquelle :
 M1, M2, M3 et M4 sont les masses (en g) des prises d'essai des différents échantillons, x1, x2, x3 et x4 sont les quantités de vitamine, exprimées en micro g/ml de thiamine, dans les différentes solutions injectées,
 et z est la quantité de thiamine ajoutée (en micro g/ml) présente dans les solutions injectées pour les échantillons 3 et 4.
   Nota. - Le taux moyen de recouvrement de cette méthode est toujours supérieur à 90 %, quel que soit l'aliment analysé, sauf pour les aliments contenant du chocolat. Dans ce dernier cas, le taux de recouvrement est beaucoup plus faible et doit être déterminé pour chaque analyse.

 7. Expression des résultats
   7.1. Mode de calcul et formule.
   Soit x la quantité de vitamine B 1 (thiamine base) exprimée en mg contenue dans 1 ml de la solution injectée dans le chromatographe (valeur obtenue à l'aide de la courbe d'étalonnage) et M la prise d'essai (en g ou en ml). La teneur en vitamine de l'échantillon à analyser exprimée en mg de thiamine base pour 100 g (ou 100 ml) est donnée par la relation :
 125 x
 M
 7.2. Fidélité.
   Dix laboratoires ont participé à un essai interlaboratoire organisé par la commission générale d'unification des méthodes d'analyses. Les résultats statistiques présentés dans le tableau en annexe ont été déterminés selon la norme NF ISO 5725.
 7.2.1. Répétabilité.
         La différence absolue entre deux résultats d'essais individuels et indépendants, obtenus dans le même laboratoire, par le même opérateur utilisant le même appareillage et dans un court intervalle de temps, ne doit pas être supérieure aux valeurs de répétabilité mentionnées dans le tableau de résultats statistiques en annexe.
 7.2.2. Reproductibilité.
         La différence absolue entre deux résultats d'essais individuels obtenus dans des laboratoires différents, par des opérateurs différents, utilisant des appareillages différents, ne doit pas être supérieure aux valeurs de reproductibilité mentionnées dans le tableau de résultats statistiques suivant.
 8. Résultats statistiques de l'essai interlaboratoire
   Tableau non reproduit
   A E : aliment entéral ; P P : petit pot pour bébé ; L P : lait en poudre ; P C : poudre chocolatée ; F F : farine de fruits ; B C :
 barres de céréales ; LEV : levure ; CE : céréales ; C A : complément alimentaire.
1. Domaine d'application
      Cette méthode permet la détermination de la teneur en vitamine B 2 dans les denrées et boissons destinées à l'homme.
   Le taux moyen de recouvrement de cette méthode est toujours supérieur à 90 %, quel que soit l'aliment analysé, sauf pour les aliments contenant du chocolat. Lorsque le taux moyen de recouvrement est inférieur à 90 %, le déterminer pour chaque analyse et rendre un résultat corrigé.
 2. Définition
      La teneur en vitamine B 2 est le résultat, exprimé en mg/100 g, mg/100 ml ou mg/l de produit tel quel, obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Conventionnellement, ce résultat est exprimé en riboflavine base.
 3. Principe
      Extraction de la vitamine B 2 (riboflavine) par hydrolyses acide et enzymatique et dosage de ce composé par fluorométrie après isolement par chromatographie liquide haute performance en phase inverse.
 4. Réactifs
      Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée est de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
 4.1. Solution d'acide chlorhydrique à environ 0,1 mol/l.
 4.2. Solution d'acétate de sodium à 2,5 mol/l.
 4.3. -amylase.
 4.4. Takadiastase.
 4.5. Méthanol (qualité pour chromatographie).
 4.6. Solution d'acétate de sodium à 0,05 mol/l.
 4.7. Vitamine B 2 (riboflavine) C17 H20 N4 O6.
 4.8. Solution d'acide acétique à 0,02 mol/l.
 4.9. Solution mère de vitamine B 2 (PM = 376,4) à 0,1 mg/ml. Peser exactement environ 50 mg de riboflavine dans un erlenmeyer de 500 ml. Ajouter 400 ml d'acide acétique (4.8). Agiter à l'aide d'un agitateur magnétique chauffant jusqu'à dissolution de la vitamine B 2 (environ 1 heure). Refroidir la solution et amener le pH à 4,5 avec la solution d'acétate de sodium (4.2). Transvaser dans une fiole jaugée de 500 ml et ajuster avec de l'eau distillée.
 5. Appareillage
      Toutes les opérations analytiques doivent être réalisées avec de la verrerie brune ou, à défaut, à l'abri de la lumière solaire directe.
 5.1. Mixeur-broyeur.
 5.2. Bain d'eau.
 5.3. pH-mètre.
 5.4. Etuve à 37  3 °C.
 5.5. Agitateur magnétique chauffant.
 5.6. Membrane d'acétate de cellulose 0,45 micro m.
 5.7. Appareil de chromatographie liquide haute performance avec détection par fluorimétrie.
 5.8. Colonne contenant une phase inverse greffée de type octadécylsilane (5 micro m, longueur 15 à 30 cm et diamètre intérieur 4 mm) ou une phase inverse greffée de type octylsilane (5 micro m, longueur 15 à 30 cm et diamètre intérieur 4 mm), traitée pour la séparation des composés basiques.
6. Mode opératoire
   6.1. Préparation de l'échantillon pour essai.
   Homogénéiser l'échantillon après l'avoir broyé finement (si nécessaire). Peser exactement environ M grammes (ou millilitres) d'échantillon dans un erlenmeyer de 250 ml (M de l'ordre de 5 grammes pour un échantillon contenant approximativement 0,8 mg/100 g de vitamine B 2). Ajouter 65 ml de la solution d'acide chlorhydrique (4.1) et mettre au bain d'eau à 100 °C pendant trente minutes. Refroidir et ajuster à pH 4,5 par addition de solution d'acétate de sodium (4.2). Ajouter ensuite 50 mg de -amylase et 500 mg de takadiastase (4.4). Agiter. Mettre à l'étuve à 37 °C pendant une nuit. Transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 125 ml et ajuster avec de l'eau distillée. Filtrer le surnageant (solution à injecter dans le chromatographe).
 6.2. Préparation des témoins.
   Faire une dilution au 1/20 avec de l'eau distillée à partir de la solution mère (4.9). Puis faire trois dilutions au 1/25, 1/10 et 1/5 à partir de la solution précédente. Filtrer chaque solution témoin sur une membrane d'acétate de cellulose (5.6) (solutions témoins à injecter dans le chromatographe contenant respectivement 0,20 micro g/ml, 0,50 micro g/ml et 1,00 micro g/ml de riboflavine).
 6.3. Conditions chromatographiques.
   Phase mobile : mélange 30:70 (v/v) de méthanol (4.5) et de solution d'acétate de sodium (4.6) (ces proportions peuvent éventuellement être modifiées si nécessaire).
   Débit de la phase mobile : 0,7 à 1 ml par minute.
   Détection par fluorescence : longueur d'onde d'excitation :
 422 nm ; longueur d'onde d'émission : 522 nm.
   Volume injecté : 20 micro l à 100 micro l.
 6.4. Taux de recouvrement.
   Pour l'aliment étudié, peser exactement deux séries de deux échantillons. Analyser selon le mode opératoire (6.1) les deux échantillons de la première série (échantillons 1 et 2). Dans les deux échantillons de la deuxième série (échantillons 3 et 4), ajouter une certaine quantité de riboflavine avant de procéder à l'hydrolyse acide, puis procéder à l'analyse selon (6.1). Le taux de recouvrement moyen de la méthode (t) est donné par la relation
 t =  2 (x3 + x4) - (x1/M1 + x2/M2) (M3 + M4) 
 4z
 dans laquelle :
 M1, M2, M3 et M4 sont les masses (en g) des prises d'essai des différents échantillons, x1, x2, x3 et x4 sont les quantités de vitamine, exprimées en micro g/ml de riboflavine, dans les différentes solutions injectées,
 et z est la quantité de riboflavine ajoutée (en micro g/ml) présente dans les solutions injectées pour les échantillons 3 et 4.
   Nota. - Le taux moyen de recouvrement de cette méthode est toujours supérieur à 90 %, quel que soit l'aliment analysé, sauf pour les aliments contenant du chocolat. Dans ce dernier cas, le taux de recouvrement est beaucoup plus faible et doit être déterminé pour chaque analyse. Il est possible d'utiliser HCl 0,5 N pour l'hydrolyse.

 7. Expression des résultats
   7.1. Mode de calcul et formule.
   Soit x la quantité de vitamine B 2 (riboflavine) (exprimée en micro g) contenue dans 1 ml de la solution injectée dans le chromatographe (valeur obtenue à l'aide de la courbe d'étalonnage) et M la prise d'essai (en g). La teneur en vitamine de l'échantillon à analyser (exprimée en mg de riboflavine pour 100 g ou pour 100 ml) est donnée par la relation :
 12,5 x 
 M
 7.2. Fidélité.
   Un essai interlaboratoire organisé par la commission générale d'unification des méthodes d'analyses a été réalisé par 11 laboratoires. Les résultats statistiques présentés dans le tableau en annexe ont été déterminés selon la norme NF ISO 5725.
 7.2.1. Répétabilité.
         La différence absolue entre deux résultats d'essais individuels et indépendants, obtenus dans le même laboratoire, par le même opérateur utilisant le même appareillage et dans un court intervalle de temps, ne doit pas être supérieure aux valeurs de répétabilité mentionnées dans le tableau de résultats statistiques en annexe.
 7.2.2. Reproductibilité.
         La différence absolue entre deux résultats d'essais individuels obtenus dans des laboratoires différents, par des opérateurs différents, utilisant des appareillages différents, ne doit pas être supérieure aux valeurs de reproductibilité mentionnées dans le tableau de résultats statistiques suivant.
 8. Résultats statistiques de l'essai interlaboratoire
   Tableau non reproduit
   A E : aliment entéral ; P P : petit pot pour bébé ; B C : barres de céréales ; F F : farine de fruits ; P C :
 poudre chocolatée ; L P : lait en poudre ; CE : céréales ; LEV :
 levure ; C A : complément alimentaire.
1. Domaine d'application
      Cette méthode permet la détermination de la teneur en vitamine B 6 dans les denrées et boissons destinées à l'homme.
 2. Définition
      La teneur en vitamine B 6 est le résultat, exprimé en mg/100 g, mg/100 ml ou mg/l de produit tel quel, obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Conventionnellement, ce résultat est exprimé en pyridoxol base.
 3. Principe
      Hydrolyse acide de l'échantillon à analyser (s'il contient de l'amidon) puis hydrolyse enzymatique afin d'obtenir la pyridoxamine, le pyridoxal et le pyridoxol sous forme libre. Traitements par l'acide glyoxylique, en présence d'ions ferreux Fe2+ comme catalyseur, afin de transformer la pyridoxamine en pyridoxal et par le borohydrure de sodium en milieu alcalin pour transformer le pyridoxal en pyridoxol. Dosage du pyridoxol par fluorométrie après isolement de ce composé par chromatographie liquide haute performance en phase inverse par appariement d'ions.
 4. Réactifs
      Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée est de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
 4.1. Pyridoxamine dichlorhydrate (PM = 241,1) C8H14 N2 O2 Cl2.
 4.2. Pyridoxal chlorhydrate (PM = 203,6) C8 H10 NO3 Cl.
 4.3. Pyridoxol chlorhydrate (PM = 205,6) C8 H12 NO3 Cl.
 4.4. Acide sulfurique à 0,1 mol/l.
 4.5. Solution contenant 1 g/l de pyridoxamine base (PM = 168,2) dans l'acide sulfurique à 0,1 mol/l.
 4.6. Solution contenant 1 g/l de pyridoxal base (PM = 167,2) dans l'acide sulfurique à 0,1 mol/l.
 4.7. Solution contenant 1 g/l de pyridoxol base (PM = 169,2) dans l'acide sulfurique à 0,1 mol/l.
      Les solutions (4.5), (4.6) et (4.7) se conservent quatre semaines à + 4 °C à l'abri de la lumière.
 4.8. Solution d'acétate de sodium à 2,5 mol/l.
 4.9. Solution d'acétate de sodium à 0,05 mol/l et à pH 4,5 (le pH est ajusté à 4,5 à l'aide d'acide acétique glacial).
 4.10. Solution d'acide glyoxylique à 1 mol/l et pH 4,5 (dissoudre 4,70 g d'acide glyoxylique monohydrate dans environ 30 ml d'acétate de sodium à 2,5 mol/l ; ajuster à pH 4,5 avec la solution d'acétate de sodium à 2,5 mol/l. Compléter à 50 ml avec de l'eau distillée).
 4.11. Solution à 2 g/l de sulfate ferreux anhydre dans la solution d'acétate de sodium à 0,05 mol/l et de pH 4,5.
 4.12. Phosphatase acide de pomme de terre ou de germe de blé.
 4.13. Solution d'hydroxyde de sodium à 0,2 mol/l.
 4.14. Solution de borohydrure de sodium à 0,1 mol/l dans la solution (4.13).
 4.15. Acide acétique glacial.
 4.16. Acide orthophosphorique minimum 85 %.
 4.17. Heptane sulfonate de sodium.
 4.18. Octane sulfonate de sodium.
 4.19. Dihydrophosphate de potassium.
 4.20. Acétonitrile (qualité pour chromatographie).
4.21. Acide chlorhydrique à 1 mol/l.
 5. Appareillage
      Toutes les opérations analytiques doivent être réalisées avec de la verrerie brune ou, à défaut, à l'abri de la lumière solaire directe.
 5.1. Mixeur-broyeur.
 5.2. Etuve à 37 ù 3 °C.
 5.3. Membrane d'acétate de cellulose 0,45 mm.
 5.4. Bain d'eau ou autoclave.
 5.5. Appareil de chromatographie liquide haute performance avec détection par fluorométrie.
 5.6. Colonne contenant une phase inverse greffée de type octylsilaneMerck Lichrospher 60 RP Select B granulométrie 5 mm, exemple de phase stationnaire appropriée utilisée pour l'analyse interlaboratoire.
 (5 mm, longueur 15 à 25 cm et diamètre intérieur 4 mm), traitée pour la séparation des composés basiques.
 5.7. Précolonne contenant une phase inverse greffée de type octadécylsilaneMerck RP 18, exemple de phase stationnaire appropriée utilisée pour l'analyse interlaboratoire.
 (10 mm, longueur 0,4 cm et diamètre intérieur 0,4 cm) si nécessaire.
 6. Mode opératoire
   6.1. Préparation de l'échantillon pour essai.
   Homogénéiser l'échantillon après l'avoir broyé finement. Peser exactement environ M grammes (ou millilitres) de cet échantillon dans un erlenmeyer de 100 ml (M de l'ordre de 2,5 g si la teneur en vitamine B 6 dépasse 0,20 mg/100 g, de l'ordre de 5 g si la teneur en vitamine B 6 est inférieure à cette valeur). Ajouter 25 ml de solution d'acétate de sodium (4.9), 2,5 ml de solution d'acide glyoxylique (4.10), 400 ml de solution de sulfate ferreux (4.11) et 20 mg de phosphatase acide (4.12). Laisser incuber une nuit à 37 °C. Après refroidissement du mélange réactionnel, ajuster à 50 ml dans une fiole jaugée à l'aide d'eau distillée. Après agitation, centrifuger si nécessaire et filtrer. Prélever 5 ml du filtrat, y ajouter 5 ml de solution de borohydrure de sodium (4.14). Après agitation, filtrer sur membrane acétate de cellulose (5.3) et injecter.
   En cas d'interférence chromatographique due à l'excès de borohydrure de sodium, ajouter 4,5 ml de solution de borohydrure de sodium (au lieu de 5 ml) puis, après réaction, compléter par 0,5 ml d'acide acétique glacial (le pH est ainsi ramené à 4,5).
   En cas de difficulté lors de la filtration après l'étape d'hydrolyse enzymatique, due à la présence de quantité notable d'amidon dans l'échantillon à analyser, procéder à une hydrolyse acide avant le traitement enzymatique. Ajouter pour cela 45 ml d'eau à 50 °C à l'échantillon préalablement pesé dans un erlenmeyer de 250 ml. Homogénéiser et ajouter au minimum 5 ml d'acide chlorhydrique (4.21). Bien mélanger et mettre au bain d'eau à 100 °C (ou à l'autoclave à 120 °C, si nécessaire) pendant trente minutes. Après refroidissement, ajuster à pH 4,5 par addition d'acétate de sodium (4.8). Procéder ensuite au traitement par l'acide glyoxylique (4.10) et la phosphatase acide (4.12), puis par le borohydrure de sodium (4.14) comme indiqué ci-dessus (dans ce cas, le volume du milieu réactionnel sera ensuite ajusté à 100 ml dans une fiole jaugée (et non à 50 ml, comme dans le cas général) à l'aide d'eau distillée.
 6.2. Solutions témoins de pyridoxol (à préparer extemporanément).
   Faire une dilution au 1/100 dans l'eau distillée de la solution mère de pyridoxol (4.7). Faire des dilutions de cette solution au 1/100, 1/20 et 1/10 dans l'eau distillée pour obtenir des solutions témoins respectivement à 0,10 mg/ml, 0,50 m/ml et 1,00 m/ml. Filtrer ces solutions sur membrane acétate de cellulose (5.3) et injecter.
 6.3. Conditions chromatographiques.
   Phases mobiles (au choix) :
 A
         Acétonitrile 4 % (4.20), solution de dihydrophosphate de potassium (4.19) à 0,05 mol/l contenant de l'heptane sulfonate de sodium (4.7) à 0,5.10-3 mol/l (96 %). Le pH est ajusté à 2,5 à l'aide d'acide orthophosphorique (4.16) ;
 B
         Acétonitrile 4 % (4.20), solution de dihydrophosphate de potassium (4.19) à 0,05 mol/l contenant de l'octane sulfonate de sodium (4.18) à 0,3.10-3 mol/l (96 %). Le pH est ajusté à 2,5 à l'aide d'acide orthophosphorique (4.16) ;
   Débit de la phase mobile : 0,7 à 1 ml par minute.
   Détection par fluorescence : longueur d'onde d'excitation :
 290 nm ; longueur d'onde d'émission : 395 nm.
   Volume injecté : 20 micro l à 100 micro l.
 6.4. Taux de recouvrement.
   Broyer et homogénéiser environ 30 g de l'échantillon à analyser. Les répartir en quatre séries (0, 1, 2, 3) de trois échantillons exactement pesés. Suivre le protocole habituel (6.1) pour les trois échantillons de la série 0. En ce qui concerne les autres séries d'échantillons, ajouter, avant de procéder à l'incubation à 37 °C (voir 6.1) :
   50 micro l de la solution de pyridoxamine (4.5) dans les trois échantillons de la série 1 ;
   50 micro l de la solution de pyridoxal (4.6) dans les trois échantillons de la série 2 ;
   50 micro l de la solution de pyridoxol (4.7) dans les trois échantillons de la série 3, puis suivre le protocole habituel (6.1).
   Le taux de recouvrement obtenu pour chaque échantillon d'une même série est donné par la relation :
 ti =  xi - k Mi 
zi
 dans laquelle :
 i
      représente le numéro de la série : 1 (addition de pyridoxamine), 2 (addition de pyridoxal), 3 (addition de pyridoxol) ;
 k
      la valeur moyenne, pour les trois échantillons de la série 0, du rapport entre la concentration en pyridoxol (en micro g/ml) présent dans la solution injectée dans le chromatographe et le poids (en g) de la prise d'essai de l'échantillon ;
 xi
      la concentration en pyridoxol (en micro g/ml) présent dans la solution injectée dans le chromatographe, obtenue pour les échantillons de la série i ;
 zi
      la concentration de pyridoxol (en micro g/ml) présent dans la solution injectée dans le chromatographe, résultant de la transformation des différentes formes de vitamine B 6 ajoutée, en supposant que les taux de transformation pyridoxamine/pyridoxol et pyridoxal/pyridoxol sont égaux à 100 % (z1 = 0,503 micro g/ml, z2 = 0,506 micro g/ml, z3 = 0,500 micro g/ml).
   Le taux de recouvrement de la méthode pour l'aliment étudié est la valeur moyenne obtenue à partir des neuf taux de recouvrement calculés. Il est supérieur à 90 % pour les différents aliments étudiés lors de l'analyse interlaboratoire dont les résultats sont donnés en annexe. En cas de dosage de vitamine B 6 dans des aliments de matrices différentes, le taux de recouvrement de la méthode doit être préalablement mesuré.
 7. Expression des résultats
   7.1. Mode de calcul et formule.
   Soit x la quantité de pyridoxol (exprimée en micro g) contenue dans 1 ml de la solution injectée dans le chromatographe (valeur obtenue à l'aide de la courbe des témoins) et M la prise d'essai (en g). La teneur en vitamine B 6 de l'échantillon à analyser (exprimée en mg/100 g de pyridoxol base) est donnée par la formule :
 10 x 
 M
   Nota. - Si l'échantillon à analyser est soumis initialement à une hydrolyse acide, la formule à appliquer devient :

 20 x 
 M
 7.2. Fidélité.
   Un essai interlaboratoire organisé par la commission générale d'unification des méthodes d'analyses a été réalisé par douze laboratoires. Les résultats statistiques présentés dans le tableau en annexe ont été déterminés selon la norme NF ISO 5725.
 7.2.1. Répétabilité.
         La différence absolue entre deux résultats d'essais individuels et indépendants obtenus dans le même laboratoire, par le même opérateur utilisant le même appareillage et dans un court intervalle de temps, ne doit pas être supérieure aux valeurs de répétabilité mentionnées dans le tableau de résultats statistiques en annexe.
 7.2.2. Reproductibilité.
         La différence absolue entre deux résultats d'essais individuels obtenus dans des laboratoires différents, par des opérateurs différents, utilisant des appareillages différents, ne doit pas être supérieure aux valeurs de reproductibilité mentionnées dans le tableau de résultats statistiques suivant.
 7. Résultats statistiques de l'essai interlaboratoire
   Tableau non reproduit
   P P : petit pot pour bébé ; BIS :
 biscuit ; CE B : céréale B ; LEV : levure ; A E : aliment entéral ; P C : poudre chocolatée ; CE A : céréale A ; L P : lait en poudre.