Arrêté du 2 septembre 1983 relatif aux méthodes officielles d'analyses relatives à la détection des antibiotiques et des sulfamides dans les laits destinés à l'alimentation humaine ou animale
   Les laboratoires chargés de concourir à l'application de la réglementation relative à la répression des fraudes sont tenus d'employer, pour la détection des antibiotiques et des sulfamides dans les laits destinés à l'alimentation humaine ou animale, les méthodes décrites en annexe.

AnnexesMéthodes officielles pour la détection des antibiotiques et des sulfamides dans les laits destinés à l'alimentation humaine ou animale.
   1. Objet et domaine d'application.
   Les présentes méthodes ont pour objet la mise en évidence des antibiotiques et des sulfamides, elles ne visent pas à déterminer leur identité.
   Elles sont applicables au lait cru, au lait traité thermiquement, au lait partiellement ou totalement déshydraté destinés à la consommation humaine ou animale, sous réserve de cas particuliers signalés au paragraphe mode opératoire.
   Selon le type de lait à examiner, en cas de nécessité, les échantillons doivent être conservés au voisinage de 0 degré C jusqu'au lendemain au plus tard, ou à l'état congelé à une température inférieure ou égale à - 25 degrés C lorsque l'examen doit être reporté de plusieurs jours.
   2. Définition.
   Les méthodes présentement décrites permettent à l'aide de micro-organismes sensibles la détection de résidus appartenant à deux groupes de produits utilisés en thérapeutique vétérinaire :
   - les antibiotiques, tels que pénicillines, tétracyclines, aminosides, macrolides et chloramphénicol ;
   - les sulfamides.
   3. Principe.
   La détection des antibiotiques et des sulfamides nécessite l'application successive de deux types de méthodes.
   3.1. Méthode d'acidification.
   Ensemencement d'une souche de Streptococcus thermophilus dans l'échantillon de lait préalablement chauffé et additionné d'extrait de levure, d'un indicateur de pH et de triméthoprime.
   Après incubation à 45 degrés C, la production d'acide est comparée à celle d'une culture témoin préparée à partir d'un lait exempt d'antibiotique.
   En présence d'antibiotiques ou de sulfamides, la production d'acide est ralentie ou complètement inhibée.
   L'échantillon de lait positif ou douteux doit être soumis à des épreuves de confirmation.
   3.2. Méthodes de confirmation.
   Elles impliquent la mise en oeuvre de techniques de diffusion en gélose, qui comportent :
   L'ensemencement d'un micro-organisme sensible aux antibiotiques, aux sulfamides ou aux deux à la fois dans un milieu nutritif solide qui est coulé dans une boîte de Petri ;
   Le dépôt d'un disque de papier filtre imprégné de lait à la surface du milieu ensemencé suivi d'une incubation à la température optimale de l'espèce bactérienne utilisée.
   Les antibiotiques et les sulfamides éventuellement présents inhibent la croissance de l'organisme test ; il en résulte la formation d'une zone transparente autour du disque.
   Les méthodes de confirmation requièrent l'utilisation des trois espèces suivantes : Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis et Bacillus megaterium.
   L'addition de triméthoprime, lors de la réalisation de la méthode d'acidification et de la méthode de diffusion à l'aide de Bacillus megaterium, permet la détection des sulfamides dans le lait, cela grâce à l'action synergique du triméthoprime et des sulfamides.

4. Milieux de culture, diluants et réactifs. 
4. 1. Composants de base. 
Pour améliorer la reproductibilité des résultats il est recommandé d'utiliser pour la préparation des milieux de culture des composants de base déshydratés ou des milieux complets déshydratés. 
Les produits chimiques utilisés doivent être de qualité analytique.
L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou déminéralisée exempte de substances pouvant inhiber la croissance des micro-organismes dans les conditions de l'essai. 
La mesure de pH doit être effectuée au pH-mètre à 25 degrés C ou après correction de la température. 
Si les milieux et le diluant ne sont pas utilisés extemporanément, ils doivent être conservés à l'obscurité entre 0 et + 5 degrés C dans des conditions évitant toute modification de leur composition pendant un mois au maximum ou en respectant les prescriptions indiquées. 
4. 2. Méthode d'acidification. 
4. 2. 1. Lait écrémé reconstitué. 
Composition : 
Lait en poudre écrémé séché par atomisation (" spray ") exempt d'antibiotiques ou autres substances inhibitrices : 100 g
 Eau : 1000 ml
 Préparation : 
Dissoudre la poudre de lait dans l'eau à 45-50 degrés C. 
Répartir à raison de 12 ml dans des tubes de 18 x 180 mm (5. 13) avec bouchon à vis. 
Stériliser à l'autoclave à 115 plus ou moins 1 degré C pendant 20 minutes. 
4. 2. 2. Solution d'extrait de levure. 
Composition : 
Extrait de levure déshydraté : 10 g
 Eau : 100 ml
 Préparation : 
Dissoudre l'extrait de levure dans l'eau. 
Répartir à raison de 50 ml dans des flacons (5. 8.). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant 20 minutes. 
4. 2. 3. Solution de pourpre de bromocrésol. 
Composition : 
Pourpre de bromocrésol : 250 mg
 Eau : 100 ml
 Préparation : 
Dissoudre le pourpre de bromocrésol dans l'eau. 
Répartir à raison de 50 ml dans des flacons (5. 8). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant 20 minutes. 
4. 2. 4. Solution de triméthoprime. 
Composition : 
Triméthoprime : 100 mg
 Acide acétique, solution à 5  % v / v : 10 ml
 Eau q. s. p. : 1000 ml
 Préparation : 
Introduire le triméthoprime dans une fiole jaugée de 1000 ml (5. 12), faire dissoudre dans l'acide acétique, compléter avec de l'eau. 
Cette solution est conservée au réfrigérateur (0 à 5 degrés C) et peut être utilisée pendant deux semaines au maximum. 
Le triméthoprime est disponible au Laboratoire central d'hygiène alimentaire, 43, rue de Dantzig, 75015 Paris. 
4. 3. Méthodes de confirmation. 
4. 3. 1. Technique de diffusion à l'aide de Bacillus stearothermophilus. 
4. 3. 1. 1. Bouillon nutritif. 
Composition : 
Peptone pancréatique de caséine (tryptone) : 20 g
 Extrait de levure déshydraté : 10 g
 Glucose : 0, 5 g
 Eau : 1000 ml
 Préparation : 
Dissoudre les ingrédients dans l'eau à 45-50 degrés C. 
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7, 0 plus ou moins 0, 1 à 25 degrés C. 
Répartir à raison de 15 ml dans des tubes de 18 x 180 mm (5. 13). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
Au moment de l'emploi, répartir aseptiquement le bouillon à raison de 10 ml par fiole (5. 11) stérile. 
4. 3. 1. 2. Milieu pour les cultures de réserve. 
Composition : 
Preptone pepsique de viande : 5 g
 Extrait de levure déshydraté : 2 g
 Extrait de viande déshydraté : 1 g
 Chlorure de sodium : 5 g
 Agar-agar en poudre (selon les propriétés gélifiantes) 12 à 18 g
 Eau : 1000 ml
 Préparation : 
Dissoudre les ingrédients dans l'eau en portant à l'ébullition. 
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7, 4 plus ou moins 0, 1 à 25 degrés C. 
Répartir à raison de 10 ml dans des tubes de 16 x 160 mm (5. 13). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
Après stérilisation, laisser refroidir en position inclinée de façon à obtenir une pente d'environ 10 cm. 
4. 3. 1. 3. Milieu pour l'épreuve de diffusion. 
Composition : 
Peptone pancréatique de caséine (tryptone) : 5 g
 Extrait de levure déshydraté : 2, 5 g
 Glucose : 1 g
 Agar-agar en poudre (selon les propriétés gélifiantes) 12 à 18 g
 Eau : 1 000 ml
 Préparation : 
Dissoudre les ingrédients dans l'eau en portant à l'ébullition. 
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7, 0 plus ou moins 0, 1 à 25 degrés C. 
Répartir à raison de 100 ml dans des flacons (5. 8). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
4. 3. 2. Technique de diffusion à l'aide de Bacillus subtilis. 
4. 3. 2. 1. Gélose n° 11 de Grove et Randall. 
Composition : 
Peptone pepsique de viande : 6 g
 Peptone pancréatique de caséine (tryptone) : 4 g
 Extrait de levure déshydraté : 3 g
 Extrait de viande déshydraté : 1, 5 g
 Glucose : 1 g
 Agar-agar en poudre (selon les propriétés gélifiantes) 12 à 18 g
 Eau : 1000 ml
 Préparation : 
Dissoudre les ingrédients dans l'eau en portant à l'ébullition. 
Ajuster le pH, de sorte qu'après stérilisation il soit de 7, 9 plus ou moins 0, 1 à 25 degrés C. 
Répartir à raison de 100 ml dans des flacons (5. 8). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
4. 3. 3. Technique de diffusion à l'aide de Bacillus megaterium. 
4. 3. 3. 1. Solution tampon. 
Composition : 
Dihydrogénophosphate de potassium (KH2 PO4) : 34 g
 Eau : 500 ml
 Préparation : 
Introduire le dihydrogénophosphate de potassium dans une fiole jaugée de 1000 ml (5. 12) et faire dissoudre dans l'eau. 
Ajuster le pH à 7, 2 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium 1 Mol / litre compléter à 1 litre avec de l'eau. 
Répartir à raison de 100 ml dans des flacons (5. 8). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
Au moment de l'emploi, introduire 1, 25 ml de ce tampon dans un flacon (5. 9) stérile et diluer avec de l'eau stérile afin d'obtenir 1 litre de solution tampon diluée. 
4. 3. 3. 2. Diluant, solution tryptone-sel. 
Composition : 
Peptone pancréatique de caséine (tryptone) : 1 g
 Chlorure de sodium : 8, 5 g
 Eau : 1000 ml
 Préparation : 
Dissoudre les ingrédients dans l'eau à 45-50 degrés C. 
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7, 0 plus ou moins 0, 1 à 25 degrés C. 
Répartir à raison de 100 ml dans les flacons (5. 8). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
Au moment de l'emploi, distribuer aseptiquement le diluant à raison de 9 ml dans des tubes de 20 x 200 mm (5. 13) stériles. 
4. 3. 3. 3. Milieu de Mueller-Hinton. 
Utiliser le milieu déshydraté Difco 0252 ou tout autre milieu donnant des résultats identiques. 
Composition : 
Hydrolysat de caséine : 17, 5 g
 Macération de viande de boeuf : 300 g
 Amidon : 1, 5 g
 Agar-agar en poudre : 17 g
 Eau q. s. p. : 1000 g
 Préparation : 
Dissoudre le milieu complet déshydraté dans l'eau en suivant les prescriptions du fabricant. 
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7, 4 plus ou moins 0, 1 à 25 degrés C. 
Réparti à raison de 10 ml dans des tubes de 16 x 160 mm (5. 13) et de 100 ml dans des flacons (5. 8). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
Après stérilisation, laisser refroidir les tubes en position inclinée de façon à obtenir une pente d'environ 10 cm. 
4. 3. 3. 4. Milieu à 0, 01 micron de ml de triméthoprime, pour l'épreuve de diffusion. 
Avant de répartir le milieu 4. 3. 3. 3 ajouter par litre : 
1 ml de la solution de triméthoprime (4. 2. 4) diluée au 1 / 10 au moment de l'emploi. 
Mélanger soigneusement. 
Répartir à raison de 100 ml dans des flacons (5. 8). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
Conserver au réfrigérateur 0 à + 5 degrés C pendant un mois au maximum. 
4. 3. 3. 5. Milieu de sporulation. 
Composition : 
Peptone pepsique de viande : 3 g
 Peptone pancréatique de caséine (tryptone) : 2, 5 g
 Extrait de levure déshydraté : 4 g
 Extrait de viande déshydraté : 2, 5 g
 Monohydrogenophosphate de potassium (K2HPO4) : 2 g
 Sulfate de manganèse (MnSO4H2O) : 10 mg
 Agar-agar en poudre (selon les propriétés gélifiantes) 12 à 18 g
 Eau : 1000 ml
 Préparation : 
Dissoudre les ingrédients dans l'eau en portant à l'ébullition. 
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 8, 0 plus ou moins 0, 1 à 25 degrés C. 
Répartir à raison de 250 ml dans des fioles de Roux (5. 10). Boucher. 
Stériliser à l'autoclave à 121 plus ou moins 1 degré C pendant quinze minutes. 
Après stérilisation, laisser refroidir les fioles (5. 10) en position horizontale.

5. Appareillage et verrerie. 
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et notamment : 
5. 1. Etuves à 30 plus ou moins 1 degré C, à 37 plus ou moins 1 degré C, à 55 plus ou moins 1 degré C. 
5. 2. Congélateur dont la température doit être inférieure ou égale à-25 degrés C. 
5. 3. Bains d'eau réglables à 80 plus ou moins 1 degré C et à 100 degrés C. 
5. 4. Bains d'eau réglables à 40 plus ou moins 1 degré C, à 45 plus ou moins 0, 5 degré C et à 55 plus ou moins 1 degré C. 
5. 5. Centrifugeuse réfrigérée permettant d'opérer à 3 degrés C et à une vitesse d'environ 5000 g. 
5. 6. Agitateur électrique pour tubes à essai. 
5. 7. Agitateur électromagnétique avec barreau aimanté stérilisable. 
5. 8. Flacons col à vis d'une capacité de 125 ml. 
5. 9. Flacons gradués à 1000 ml. 
5. 10. Fioles de Roux de 1000 ml. 
5. 11. Fioles d'Erlenmeyer de 150 ml. 
5. 12. Fioles jaugées de 100 ml et de 1000 ml. 
5. 13. Tubes à essai de 16 x 160 mm, de 18 à 180 mm avec et sans bouton à vis et de 20 x 200 mm. 
5. 14. Tubes de centrifugation d'une capacité d'environ 50 ml. 
5. 15. Pipettes de 10 ml graduées en 0, 5 ou 0, 1 ml. 
5. 16. Pipettes de 2 ml et 1 ml graduées en 0, 1 ml. 
5. 17. Billes de verre d'un diamètre d'environ 5 mm. 
5. 18. Boîtes de Petri, en verre ou en matière plastique, d'un diamètre de 100 mm, à fond parfaitement plat. 
5. 19. Disques de papier filtre d'un diamètre de 9 mm, de qualité répondant aux exigences du mode opératoire. 
5. 20. Papier filtre stérile. 
5. 21. Pince à bouts pointus. 
5. 22. Balance de précision analytique. 
5. 23. pH mètre (permettant de mesurer le pH des milieux et réactifs préparés avec une précision de réglage de plus ou moins 0, 1 unité de pH à 25 degrés C). 
5. 24. Anse bouclée en nickel chrome. 
6. Préparation des micro-organismes sensibles. 
6. 1. Méthode d'acidification : 
Organisme test : Streptococcus thermophilus souche TJ. 
Cette souche est disponible au Laboratoire de Biochimie et Technologie Laitières CNRZ, 78350 Jouy-en-Josas. 
6. 1. 1. Cultures de réserve. 
Une culture lyophilisée de Streptococcus thermophilus est réhydratée puis remise en activité par trois repiquages successifs dans le lait stérile (4. 2. 1) avec incubation à 37 degrés C (5. 1) pendant seize à dix-huit heures. 
La culture ainsi obtenue sert à ensemencer, à raison de 2  %, des tubes de lait stérile (4. 2. 1) qui sont placés ensuite dans un congélateur (5. 2). Ils constituent des " cultures de réserve " qui peuvent être utilisées pendant trois mois au maximum. 
6. 1. 2. Culture d'épreuve. 
La veille de l'examen, décongeler un tube de culture de réserve en le plaçant dans un bain d'eau à 40 degrés C environ. Après agitation, incuber à l'étuve à 37 degrés C pendant seize à dix-huit heures. La culture ainsi obtenue doit être coagulée sans présenter d'exsudation de sérum. La culture d'épreuve est préparée en mélangeant aseptiquement :
-10 ml de la culture précédente dont a désagrégé le coagulum par agitation à l'aide d'un agitateur électrique (5. 6).
-5 ml de solution d'extrait de levure (4. 2. 2).
-10 ml de la solution de pourpre de bromocrésol (4. 2. 3). 
6. 2. Méthodes de confirmation. 
6. 2. 1. Technique de diffusion à l'aide de Bacillus stearothermophilus (méthode de Galeslott et Hassing). 
Organisme test : Bacillus stearothermophilus variété calidolactis souche C 953. 
Cette souche est disponible au Laboratoire de Biochimie et Technique Laitières C.N.R.Z., 78350 Jouy-en-Josas. 
6. 2. 1. 1. Culture pour remise en activité. 
Une culture lyophilisée de Bacillus stearothermophilus est réhydratée puis remise en activité par trois repiquages successifs à l'aide d'une anse bouclée (5. 24) dans 10 ml de bouillon (4. 3. 1. 1) en fiole Erlenmeyer (5. 11) stérile avec incubation à l'étuve à 55 degrés C (5. 1) pendant seize heures. 
6. 2. 1. 2. Cultures de réserve. 
La culture obtenue précédemment sert à ensemencer en stries des tubes de gélose inclinée (4. 3. 1. 2). 
Les tubes ensemencés sont placés pendant quarante-huit heures à l'étuve à 55 degrés C. 
Ces cultures de réserve peuvent être conservées plusieurs mois au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C). 
6. 2. 1. 3. Culture d'épreuve. 
Une culture fraîche de l'organisme test est préparée la veille de l'essai. Inoculer une fiole contenant 10 ml de bouillon (4. 3. 1. 1) avec une anse de la culture décrite en 6. 2. 1. 1, à condition qu'elle ait été conservée au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C) pendant un délai n'excédant pas une semaine. 
La fiole de bouillon ensemencé est placée à l'étuve à 55 degrés C pendant six heures au minimum et seize heures au maximum. 
Lorsque l'on repart d'une culture de réserve, il est nécessaire d'effectuer au moins un repiquage intermédiaire selon le mode opératoire décrit ci-dessus. 
6. 2. 1. 4. Préparation des boîtes de Petri. 
La culture obtenue en 6. 2. 1. 3 sert à ensemencer le jour de l'essai le milieu gélose (4. 3. 1. 3). 
Ce milieu gélosé, préalablement fondu puis refroidi à 55 degrés C est inoculé au moyen de la culture liquide de Bacillus stearothermophilus à raison d'une partie de celle-ci pour cinq parties de milieu. Le mélange est ensuite réparti, par fractions de 6 ml, dans des boîtes de Petri de 100 mm de diamètre (5. 18) préalablement réchauffées à l'étuve à 55 degrés C. Laisser solidifier le milieu sur une surface froide et horizontale. 
Les boîtes ainsi préparées peuvent être utilisées dans un délai de deux jours au maximum à condition de les refroidir immédiatement après la préparation et de les conserver au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C). 
6. 2. 2. Technique de diffusion à l'aide de Bacillus subtilis. 
Organisme test : Bacillus subtilis ATCC 6633. 
6. 2. 2. 1. Suspension de spores. 
Utiliser des préparations commerciales de l'espèce donnée en référence. 
6. 2. 2. 2. Etalonnage de la suspension de spores. 
Chaque lot de suspension de spores doit être vérifié afin d'en déterminer la concentration. Le dénombrement des spores est effectué à partir des dilutions décimales de la suspension de spores, réalisées à l'aide du diluant (4. 3. 3. 2), utiliser le milieu gélosé (4. 3. 2. 1) et incuber les boîtes à l'étuve à 30 degrés C (5. 1) pendant vingt-quatre heures. 
6. 2. 2. 3. Préparation des boîtes de Petri. 
Le jour de l'épreuve, ensemencer la suspension de spores dans le milieu gélosé (4. 3. 2. 1), préalablement fondu puis refroidi à 55 degrés C, de façon à obtenir une concentration d'environ (5. 10 puissance 5) spores par ml de milieu. 
Le milieu ensemencé est ensuite réparti, par fractions de 6 ml, dans des boîtes de Petri de 100 mm de diamètre (5. 18). Laisser solidifier le milieu sur une surface froide et horizontale. 
Les boîtes ainsi préparées sont utilisées dans la journée ; entre-temps les conserver au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C). 
6. 2. 3. Technique de diffusion à l'aide de Bacillus megaterium. 
Organisme test : Bacillus megaterium ATCC 9885. 
Cette souche est disponible au Laboratoire de Biochimie et Technologie Laitières C.N.R.Z., 78350 Jouy-en-Josas. 
6. 2. 3. 1. Culture pour remise en activité. 
Une culture lyophilisée de la souche est réhydratée puis remise en activité par culture sur un tube de gélose inclinée de Mueller-Hinton (4. 3. 3. 3). 
Incuber à l'étuve à 37 degrés C (5. 1) pendant seize à dix-huit heures. 
6. 2. 3. 2. Préparation de la suspension de spores. 
Récolter la culture développée sur gélose inclinée à l'aide de 2 ml de la solution tampon diluée (4. 3. 3. 1). 
Transférer la suspension obtenue à la surface du milieu gélosé de sporulation (4. 3. 3. 5) réparti en boîtes de Roux (5. 10). 
Introduire une vingtaine de billes de verre stériles (5. 17) pour permettre de répartir l'inoculum et faciliter la récolte de la culture de Bacillus megaterium après incubation. 
Incuber à l'étuve à 37 degrés C pendant 4 jours. 
Recueillir la culture à l'aide de 50 ml de solution tampon diluée (4. 3. 3. 1). 
Centrifuger la suspension de spores à 3000-5000 g pendant 15 minutes à 3 degrés C. Eliminer le surnageant, répéter le lavage trois fois. 
Reprendre le culot avec 50 ml de solution tampon diluée. 
La suspension de spores dans la solution tampon diluée est conservée au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C) pendant 6 mois au maximum. 
6. 2. 3. 3. Etalonnage de la suspension de spores. 
Chaque lot de suspension de spores doit être vérifié afin d'en déterminer la concentration. Le dénombrement des spores est effectué à partir des dilutions décimales de la suspension de spores, réalisées à l'aide du diluant (4. 3. 3. 2) utiliser le milieu gélosé de Mueller-Hinton (4. 3. 3. 3) et incuber les boîtes à l'étuve à 37 degrés C (5. 1) pendant quarante-huit heures. 
6. 2. 3. 4. Préparation des boîtes Petri. 
Le jour de l'épreuve, ensemencer la suspension de spores dans 100 ml de milieu gélosé de Mueller-Hinton additionné de triméthoprime (4. 3. 3. 4), préalablement fondu puis refroidi à 55 degrés C, de façon à obtenir une concentration d'environ (5. 10 puissance 5) spores par ml de milieu. 
Ce mélange est ensuite réparti, par fractions de 5 ml, dans des boîtes de 100 mm de diamètre (5. 18). Laisser solidifier le milieu sur une surface froide et horizontale. 
Les boîtes ainsi préparées sont utilisées dans la journée, entre-temps les conserver au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C).

7. Préparation des échantillons de lait témoin. 
Des échantillons de lait témoin contenant des antibiotiques et un sulfamide de référence doivent être préparés au moment de chaque essai. Ils permettent de vérifier que les milieux de culture utilisés sont satisfaisants, et que les conditions de la manipulation, notamment la concentration, le développement, et la sensibilité du micro-organisme sont correctes. 
7. 1. Echantillon de lait témoin contenant de la pénicilline. 
Une solution-mère de pénicilline contenant 1 mg de pénicilline par millilitre est préparée en fiole jaugée (5. 12) en dissolvant 100 mg de pénicilline G (Benzylpénicillinate de sodium) dans 100 ml d'eau stérile. Cette solution est conservée au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C) et peut être utilisée pendant deux semaines au maximum. 
Le jour de l'essai, préparer une dilution au 1 / 10000 de la solution-mère en effectuant deux dilutions successives au 1 / 100 dans de l'eau stérile. Ajouter 6 ml de cette dilution à 94 ml de lait reconstitué selon la formule donnée en (4. 2. 1). Le lait pénicilliné obtenu contient 0, 006 micron de gramme de pénicilline par millilitre, équivalent à 0, 01 U.I. de pénicilline par millilitre. 
7. 2. Echantillon de lait témoin contenant de la streptomycine. 
Une solution-mère de streptomycine contenant 1 mg de streptomycine par millilitre est préparée en fiole jaugée (5. 12) en dissolvant
 100 mg de sulfate de streptomycine dans 100 ml d'eau stérile. Cette solution est conservée au réfrigérateur (0 à 5 degrés C) et peut être utilisée pendant deux semaines au maximum. 
Le jour de l'essai, préparer une dilution au 1 / 100 de la solution-mère dans de l'eau stérile. Ajouter 5 ml de cette dilution à 95 ml de lait reconstitué selon la formule donnée en (4. 2. 1). Le lait ainsi préparé contient 0, 5 micron de gramme de streptomycine par millilitre. 
7. 3. Echantillon de lait témoin contenant du chloramphénicol. 
Une solution-mère de chloramphénicol contenant 1 mg de chloramphénicol par millilitre est préparée en fiole jaugée (5. 12) en dissolvant 100 mg de chloramphénicol dans 100 ml d'eau stérile. 
Cette solution est conservée au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C) et peut être utilisée pendant deux semaines au maximum. 
Le jour de l'essai, préparer une dilution au 1 / 10 de la solution-mère dans de l'eau stérile. Ajouter 2, 5 ml de cette dilution à 97, 5 ml de lait reconstitué selon la formule donnée en (4. 2. 1). Le lait ainsi préparé contient 2, 5 microns de gramme de chloramphénicol par millilitre. 
7. 4. Echantillon de lait témoin contenant du sulfathiazol. 
Une solution-mère de sulfathiazol contenant 1 mg de sulfathiazol par millilitre est préparée en fiole jaugée (5. 12) en dissolvant 100 mg de sulfathiazol (sel de sodium) dans 100 ml d'eau stérile. Cette solution est conservée au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C) et peut être utilisée pendant deux semaines au maximum. 
Le jour de l'essai, préparer une dilution au 1 / 10 de la solution mère dans de l'eau stérile. Ajouter 1 ml de cette dilution à 99 ml de lait reconstitué selon la formule donnée en (4. 2. 1). Le lait ainsi préparé contient 1 micron de gramme de sulfathiazol par millilitre. 
8. Préparation de l'échantillon de lait en vue de l'examen. 
Selon le type de lait examiné, la détection des antibiotiques et des sulfamides peut s'effectuer d'une manière directe ou après une préparation de l'échantillon. 
8. 1. Type de lait ne nécessitant aucune préparation : lait cru, lait pasteurisé, lait stérilisé et lait stérilisé U.H.T.. 
Dans le cas où l'échantillon de lait cru ou de lait pasteurisé est conservé à-25 degrés C ou au voisinage de 0 degré C, le décongeler ou le réchauffer en le plaçant dans un bain d'eau à 40 degrés C. 
8. 2. Type de lait nécessitant une préparation. 
8. 2. 1. Lait totalement déshydraté : lait en poudre. 
Les épreuves de détection sont appliquées sur une solution à 10  %, obtenue par l'introduction de 5 grammes de lait en poudre dans 45 ml d'eau stérile préchauffée à 45 degrés C. La dissolution est réalisée par agitation manuelle ou électromagnétique à l'aide de l'appareil (5. 7). La solution de lait doit être exempte de grumeaux. 
8. 2. 2. Lait partiellement déshydraté : lait concentré sucré, lait concentré non sucré (stérilisé ou pasteurisé). 
Les épreuves de détection sont appliquées sur une solution de lait obtenue après dilution à la concentration du lait initial. 
9. Mode opératoire. 
9. 1. Méthode d'acidification. 
Cette méthode est applicable à tous les types de lait mentionnés au domaine d'application excepté le lait concentré sucré. 
Elle est inapplicable lorsque le lait est acide et coagule à l'ébullition. 
9. 1. 1. Traitement préalable de l'échantillon et du lait témoin contenant de la pénicilline. 
Pour la préparation de l'échantillon, si nécessaire, se référer au paragraphe 8. 
Agiter l'échantillon de lait à examiner de façon à bien mélanger éventuellement la crème avec le lait. 
Introduire 2 ml de lait dans un tube stérile de 16 X 160 ml (5. 13), en prenant soin de ne pas mouiller les parois du tube. 
Placer le tube dans un bain d'eau à 100 degrés C (5. 3) pendant cinq minutes, le niveau du lait étant au moins à 2 cm au-dessous de celui de l'eau. Refroidir à 45 degrés C (5. 4). 
Préparer un tube témoin négatif avec 2 ml de lait reconstitué selon la formule donnée en (4. 2. 1) et un tube témoin positif avec 2 ml de lait contenant 0, 01 U.I. / ml de pénicilline (7.1) et soumettre ces tubes aux conditions de chauffage indiquées ci-dessus. 
9. 1. 2. Technique d'acidification. 
Introduire ensuite dans chaque tube 0, 1 ml de la culture d'épreuve (6. 1. 2) et 0, 2 ml de la solution de triméthoprime (4. 2. 4). 
Placer tous les tubes dans un bain d'eau à 45 plus ou moins 0, 5 degré C pendant deux heures trente minutes.
A la fin de cette période d'incubation, le tube témoin négatif doit être jaune et le tube témoin positif, contenant 0, 01 U.I. / ml de pénicilline, bleu. 
9. 2. Méthodes de confirmation. 
Les trois méthodes de diffusion en gélose à l'aide de Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis et Bacillus megaterium sont applicables à tous les types de lait mentionnés au domaine d'application. 
Elles sont inapplicables lorsque le lait est acide et coagule à l'ébullition. 
9. 2. 1. Traitement préalable de l'échantillon. 
Pour la préparation de l'échantillon, si nécessaire, se référer au paragraphe 8. 
Agiter l'échantillon de lait à examiner de façon à bien mélanger éventuellement la crème avec le lait. 
9. 2. 1. 1. Lait cru. 
Introduire 2 ml de lait dans un tube de 16 X 160 mm (5. 13) stérile, en prenant soin de ne pas mouiller les parois du tube. Placer dans un bain d'eau réglé à 80 degrés C (5. 3) pendant dix minutes, le niveau de lait étant au moins à 2 cm au-dessous de celui de l'eau. Refroidir à la température ambiante. 
9. 2. 1. 2. Lait traité thermiquement, lait partiellement ou totalement déshydraté. 
Ces divers types de lait ne sont pas soumis au chauffage à 80 degrés C. 
9. 2. 2. Technique de diffusion. 
Prélever au moyen d'une pince (5. 21) flambée un disque de papier filtre stérile de 9 mm de diamètre (5. 19). Mettre en contact le bord du disque avec la surface de lait jusqu'à ce que le disque soit complètement imprégné de lait.L'excès de lait est éventuellement éliminé en égouttant le disque contre la paroi du tube. Déposer ensuite le disque sur une feuille de papier filtre stérile (5. 20), le retourner puis, à l'aide de la pince, le déposer à plat à la surface du milieu gélosé en pressant légèrement. 
Cette opération est pratiquée sur une boîte de Petri préparée selon 6. 2. 1. 4, 6. 2. 2. 3 et 6. 2. 3. 4. 
De manière identique, déposer dans chacune de ces boîtes six disques correspondant aux échantillons de lait à examiner et un disque imprégné de lait témoin contenant l'antibiotique ou le sulfamide (cf. 9. 2. 2. 1, 9. 2. 2. 2. et 9. 2. 2. 3). 
Ces laits témoins ne sont pas soumis au chauffage à 80 degrés C. 
Tous les disques doivent se situer sur un cercle à 1 cm de la périphérie de la boîte. Aucun disque ne doit être placé au centre de la boîte. 
Appliquer ce mode opératoire aux trois épreuves de diffusion en respectant les indications suivantes : 
9. 2. 2. 1. Bacillus stearothermophilus. 
Utiliser les boîtes de Petri préparées en 6. 2. 1. 4. 
Déposer un disque imprégné de lait témoin contenant de la pénicilline (7. 1). 
Les boîtes ainsi préparées sont placées, couvercle en dessous, dans une étuve à 55 plus ou moins 1 degré C pendant deux heures et demie.A l'issue de l'incubation, le disque imprégné de lait témoin contenant à 0, 01 U.I. de pénicilline par ml doit présenter une zone d'inhibition nette, d'environ 12 mm de diamètre. 
9. 2. 2. 2. Bacillus subtilis. 
Utiliser les boîtes de Petri préparées en 6. 2. 2. 3. 
Déposer un disque imprégné de lait témoin contenant de la streptomycine (7. 2). 
Les boîtes ainsi préparées sont placées, couvercle en dessous, dans une étuve à 30 plus ou moins 1 degré C pendant seize à dix-huit heures.A l'issue de l'incubation, le disque imprégné de lait témoin contenant 0, 5 micron de gramme de streptomycine par ml doit présenter une zone d'inhibition nette, d'environ 12 mm de diamètre. 
9. 2. 2. 3. Bacillus megaterium. 
Utiliser les boîtes de Petri préparées en 6. 2. 3. 4. 
Déposer un disque imprégné de lait témoin contenant du chloramphénicol (7. 3) et un disque imprégné de lait témoin contenant du sulfathiazol (7. 4). 
Les boîtes ainsi préparées sont placées, couvercle en dessous, dans une étuve à 37 plus ou moins 1 degré C pendant cinq heures.A l'issue de l'incubation, les disques imprégnés de lait témoin contenant 2, 5 microns de gramme de chloramphénicol par ml et de lait témoin contenant 1 micron de gramme de sulfathiazol par ml doivent présenter des zones d'inhibition nettes d'environ 12 mm de diamètre. 
10. Expression des résultats. 
10. 1. Méthode d'acidification à l'aide de Streptococcus thermophilus. 
Si le lait examiné est jaune, le résultat est considéré comme négatif. 
Si le lait examiné est bleu, le résultat est considéré comme positif. 
Si le lait présente une coloration intermédiaire entre celle du témoin positif (bleue) et celle du témoin négatif (jaune), le résultat est considéré comme douteux. En présence de ces deux dernières réactions, l'échantillon doit être soumis le plus rapidement possible aux trois épreuves de confirmation. 
10. 2. Méthodes de confirmation. 
10. 2. 1. Technique de diffusion en gélose à l'aide de Bacillus stearothermophilus. 
Sont considérés comme positifs les échantillons de lait donnant des zones d'inhibition d'au moins 10 mm de diamètre. 
Cette technique permet de détecter plus particulièrement les pénicillines et les tétracyclines. 
10. 2. 2. Technique de diffusion en gélose à l'aide de Bacillus subtilis. 
Sont considérés comme positifs les échantillons de lait donnant des zones d'inhibition d'au moins 10 mm de diamètre. 
Cette technique permet de détecter plus particulièrement les aminosides (streptomycine, néomycine, kanamycine, etc.) et les macrolides (érythromycine, spiramycine, etc.). 
10. 2. 3. Technique de diffusion en gélose à l'aide de Bacillus megaterium. 
Sont considérés comme positifs les échantillons de lait donnant des zones d'inhibition d'au moins 10 mm de diamètre. 
Cette technique permet de détecter un certain nombre de sulfamides et d'antibiotiques, en particulier le chloramphénicol. 
10. 3. Conclusion. 
Sont considérés comme contenant des antibiotiques et / ou des sulfamides les échantillons de lait trouvés positifs par l'une au moins des techniques de diffusion en gélose.